Предисловие
Глава 1. Организация и оснащение патогистологической лаборатории
Глава 2. Взятие и фиксация материала
Глава 3. Обезвоживание и заливка материала
Глава 4. Приготовление гистологических срезов
Глава 5. Общие принципы и методы окрашивания гистологических препаратов
Глава 6. Основные гистохимические реакции
Глава 7. Современные иммуноморфологические методы
Глава 8. Поляризационная микроскопия
Глава 9. Принципы электронно-микроскопического исследования и организация работы электронно-микроскопической лаборатории
Глава 10. Подготовка материала к исследованию в трансмиссионном электронном микроскопе
Глава 11. Приготовление полутонких срезов и их окрашивание
Глава 12. Приготовление ультратонких срезов и их окрашивание
Глава 13. Подготовка материала к исследованию в сканирующем электронном микроскопе
Глава 14. Светомикроскопическая радиоавтография
Глава 15. Электронно-микроскопическая радиоавтография
Глава 16. Принципы цитологического исследования, способы получения материала и техника приготовления цитологических препаратов
Глава 17. Основные методы окрашивания цитологических препаратов
Глава 18. Выявление простейших, бактерий, вирусов и грибов
Глава 19. Культивирование клеток и тканей
Глава 20. Окрашивание нервной ткани
Глава 21. Окрашивание ткани эндокринных желез и элементов АПУД-системы
Глава 22. Окрашивание соединительной и мышечной тканей
Глава 23. Особенности исследования костной ткани
Глава 24. Особенности обработки биопсийного и операционного материала
Глава 25. Особенности работы с экспериментальным материалом
Приложение
Рекомендуемая литература
Предметный указатель
Оглавление
Иллюстрации
Text
                    РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК
МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ
ТЕХНИКА
РУКОВОДСТВО
ДЛЯ ВРАЧЕЙ И ЛАБОРАНТОВ
Под редакцией Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова
МОСКВА «МЕДИЦИНА» 1996


ББК 28. 86 М59 УДК 615. 471:616-076. 4(035) Издание одобрено и рекомендовано к печати редакционно-издательским советом при президиуме Российской академии медицинских наук Микроскопическая техника: Руководство/Под ред. Д.С. Сар- М59 кисова и Ю.Л. Перова.- М.: Медицина, 1996.- 544 с: ил. 15ВЫ 5-225-02820-9 В руководстве представлены сведения по применению современных микроскопических методов исследования в патоморфологических лабораториях. Изложены вопросы организации работы лабораторий, описаны различные этапы и методы обработки тканей и органов для последующего микроскопического исследования, способы выявления их различных структурных и химических компонентов. Большое внимание уделено особенностям работы с материалом эндоскопических, пункционных и других биопсий. Специальные разделы руководства посвящены методикам цитологического исследования и основам электронной микроскопии, которые все шире используют в диагностической практике. Впервые в отечественной литературе с практических позиций рассмотрены современные иммуно- морфологические методы. Для патологоанатомов, судебных медиков, специалистов по лабораторной диагностике М 4^000000-75 Без объявл ББК 28 86 039(01 )-96 15ВЫ 5-225-02820-9 © Коллектив авторов, 1996
ПРЕДИСЛОВИЕ Общение с широким кругом специалистов, использующих в своей профессиональной деятельности микроскопические методы, убеждает в том, что давно назрела необходимость в современном руководстве по микроскопической технике. Переведенные на русский язык в 50 —60-х годах работы Б. Ромейса, Э. Пирса, Р. Лилли и других известных авторов давно стали библиографической редкостью и в чем-то устарели. В значительной мере это относится и к руководствам, написанным С.С. Вайлем и Г.А. Меркуловым, сослужившим хорошую службу не одному поколению патоморфо логов и гистологов. Со времени последнего, 5-го, издания руководства Г.А. Меркулова прошло более 25 лет, и молодые врачи, научные работники и лаборанты практически лишены возможности им пользоваться. Настоящее руководство, подготовленное большим авторским коллективом, должно восполнить этот пробел и служить специалистам, применяющим в своей работе микроскопические методы, справочным пособием, отражающим современные достижения микроскопической техники. Составители и редакторы руководства стремились к тому, чтобы включенные в него материалы при сохранении авторского стиля изложения были максимально доступны специалистам, имеющим разные подготовку и опыт работы. Список литературы включает основные руководства, монографии и обзоры. При составлении руководства использован опыт работы па- то логоанатомических отделений и бюро, а также научных лабораторий Москвы, Санкт-Петербурга, Львова, Чернигова, Ташкента, Вильнюса и др., а также Института патологии Берлинского университета им. Гумбольдта и других зарубежных пато- морфологических лабораторий. Редакторы приносят глубокую благодарность всем коллегам, предоставившим необходимую информацию для настоящего руководства или поделившимся своим опытом. Академик РАМН Д. С. САРКИСОВ, профессор Ю.Л. ПЕРО В 3
ГЛАВА 1 ОРГАНИЗАЦИЯ И ОСНАЩЕНИЕ ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Гистологическая (патоморфологическая) лаборатория размещается в типовом или специально приспособленном помещении. Она должна быть оснащена необходимыми оборудованием, инструментами, лабораторной посудой и химическими реактивами. Рабочие помещения лаборатории — комната, в которой производят вырезку секционного, биопсийного или экспериментального материала; рабочая комната лаборантов; комната для размещения аппаратуры и моечная. Рабочие помещения должны быть оснащены приточно-вы- тяжной вентиляцией. В лаборатории необходимо строго соблюдать правила противопожарной безопасности и работы с летучими и токсичными веществами. В рабочей комнате лаборанта должны быть вытяжной шкаф, химический и физический столы, шкаф и сейф для хранения химических реактивов. Лабораторная мебель, выполненная из древесины, малопригодна для работы с многими токсичными веществами, используемыми в патоморфологии, поскольку затруднена ее последующая санитарная обработка, поэтому предпочтение следует отдавать специальной лабораторной мебели из металла и пластика, которая снабжена выдвижными частями, подводкой воды, вакуума, воздуха и газа. Рабочий стул должен иметь регулируемую высоту сиденья и спинки и легко перемещаться по полу. Перечень необходимого оборудования лаборатории включает технические и аналитические весы, рН-метр, микротомы (санные, ротационные, замораживающие), криостат или криокит, водяную баню, столик для расплавления парафиновых срезов, комплекты автоматических пипеток, термостаты, холодильники, микроскопы, автоматы для проводки материала и др. ЛАБОРАТОРНОЕ СТЕКЛО, ПОСУДА, ИНСТРУМЕНТЫ Бесперебойная работа любой гистологической лаборатории возможна лишь при наличии достаточного набора лабораторного стекла и посуды. Наиболее часто используют чашки Петри, 4
банки с притертыми пробками, бюксы, кюветы, химические стаканчики, предметные и покровные стекла. Чашки Петри — плоские, широкие стеклянные чашки с крышками — используют для вырезки биопсийного материала, в них можно окрашивать «свободно плавающие» срезы, ставить гистоэнзиматические реакции в термостате и т.д. Банки с притертыми пробками вместимостью 1—3 л чаще используют для приготовления музейных макропрепаратов, хранения и фиксации кусочков тканей, обезжиривания предметных стекол в смеси Никифорова или кислотах. Большие банки можно применять для хранения летучих веществ. Банки вместимостью 50 — 200 мл чаще используют для хранения летучих химических реактивов, а также для подготовки кусочков тканей к заливке (в такой посуде проводят материал, полученный при гастро- и бронхобиопсии, а также пункционных биопсиях). Бюксы — стаканчики различной вместимости (чаще 10 — 100 мл) с притертой пробкой, которые используют для проведения гистологических окрасок и гистохимических реакций. Для постановки реакции на целлоидиновых и замороженных срезах применяют плоские бюксы диаметром около 50 мм. Кюветы — прямоугольные стаканчики различной высоты с крышками — используют при проведении гистологических, гистохимических, ферментохимических реакций для одновременной окраски нескольких срезов, наклеенных на предметные стекла. Химические стаканчики вместимостью 50—100 мл используют для проведения гистохимических и ферментохимических реакций. Предметные стекла размером 76 х 26 мм и толщиной 2 мм служат для приготовления гистологических препаратов. Для проведения гистохимических, в том числе гистоэнзиматических, реакций желательно использовать стекла толщиной 1 мм. Покровные стекла — тонкие и хрупкие стеклянные пластинки толщиной 0,15 — 0,2 мм. Чаще используют покровные стекла размером 18 х 18 и 24 х 24 мм. В лаборатории должны быть также воронки разных размеров, фарфоровые стаканчики, ступки и мерная посуда (колбы, стаканы, цилиндры и мензурки). Колбы из термостойкого стекла позволяют готовить реактивы, требующие нагревания. Большие колбы, как правило, служат для проточной и дистиллированной воды, а маленькие с притертыми пробками пригодны для хранения химических реактивов. В патогистологических лабораториях применяют простые и гРадуированные пипетки. Вместимость последних составляет обычно от 0,1 до 100 мл; их используют при постановке гистохимических реакций и приготовлении реактивов. ^
Вся используемая лабораторная посуда должна быть снабжена этикетками и рационально размещена, что позволяет избежать ошибок при ее применении. В набор используемых в гистологической лаборатории инструментов входят пинцеты (хирургические, анатомические и глазные), ножницы (анатомические, хирургические и глазные), скальпели, препаровальные иглы, шпатели — прямые и изогнутые металлические лопатки (чаще применяют при приготовлении срезов на замораживающем микротоме и целлоидиновых срезов), хирургические ножи для вырезки материала и ножи с двойным лезвием для получения тонких срезов ткани мозга. Для вырезки мелких объектов используют лезвия безопасной бритвы. УЧЕТНАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ И ЕЕ ВЕДЕНИЕ Правильное ведение учетной документации позволяет сотрудникам патогистологической лаборатории эффективно использовать рабочее время и облегчает работу с архивным материалом. К документации, ведение которой является обязательным, относятся: алфавитный журнал для регистрации биопсийного и операционного материала; журнал регистрации выдачи биопсийного и журнал регистрации секционного материала; направления на патогистологическое исследование. Кроме того, у старшей сестры (старшего лаборанта) должны быть книги учета спирта, ядовитых химических реактивов, драгоценных металлов, медикаментов и каталог учета химических реактивов, по которому легко находят нужный для работы реактив.
ГЛАВА 2 ВЗЯТИЕ И ФИКСАЦИЯ МАТЕРИАЛА Важнейшими условиями получения высококачественных гистологических препаратов являются возможно более раннее получение материала, минимальное травмирование ткани и адекватная фиксация. Эти условия относительно просто выполнимы при работе с биопсийным, операционным и экспериментальным материалом, тогда как при секционном исследовании часто наблюдаются явления аутолиза. ТЕХНИКА ВЫРЕЗКИ МАТЕРИАЛА Оптимальная площадь кусочков ткани 2 — 3 см2, толщина 5 — 7 мм. Если возможна повторная вырезка материала (например, при секционных исследованиях), то кусочки могут быть большего размера. Вырезанные кусочки ткани непосредственно с лезвия ножа погружают в фиксатор и смачивают в холодном изотоническом растворе хлорида натрия, что позволяет избежать высыхания материала. Недопустимы сдавливание кусочков, промывание их водой, а также очистка поверхности органа, особенно слизистой оболочки, инструментами, пальцами и т.д. После погружения кусочков в сосуд с фиксатором туда же опускают этикетку с номером (шифром), написанным карандашом или тушью на матовой поверхности фотобумаги. В тех случаях, когда возникает необходимость маркировки каждого кусочка, его вместе с этикеткой завязывают в марлевый мешочек. Возможно также нанизывание кусочков на нитку: сначала 2 — 3 раза прошивают этикетку первого кусочка, затем сам кусочек, потом следующую этикетку и так далее до 10—15 кусочков. При наличии патологически измененных участков тканей и органов кусочки вырезают на границе с нормальной тканью. Кусочки полых органов вырезают таким образом, чтобы в препарате были видны все слои стенки. Для изучения стенки сосуда на большом протяжении его разрезают вдоль, свертывают в виде рулона и прошивают посередине. Кусочки стенки полого органа удобно предварительно распластывать на фотобумаге. Для исследования рыхлой соединительной ткани готовят пленчатые препараты: после осторожной препаровки соедини- 7
тельнотканную пленку натягивают пинцетом на обезжиренное предметное стекло и фиксируют. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ФИКСАЦИИ Фиксация обеспечивает стабилизацию тканевых структур и их уплотнение. Механизм действия фиксаторов основан на коагуляции белков и стабилизации липидов. Фиксация всегда приводит к большим или меньшим изменениям структуры и объема ткани, степень выраженности которых зависит от рН фиксатора, его концентрации, температуры, продолжительности воздействия и других факторов. Концентрация ионов водорода фиксатора должна соответствовать таковой в тканях, поэтому фиксатор должен иметь рН, близкий к нейтральному. Увеличение температуры фиксатора ускоряет процесс, но вызывает еще большие изменения в тканях. Слишком продолжительная фиксация приводит к значительному уплотнению материала, что в дальнейшем затрудняет его обработку. Для каждого конкретного вида исследования подбирают наиболее приемлемый фиксатор. Полноценная фиксация материала обеспечивается при соблюдении ряда требований. 1. После вырезки кусочка ткани его немедленно погружают в фиксатор. 2. Объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 10 — 20 раз, так как тканевая жидкость может существенно изменить концентрацию фиксатора. 3. В том случае, если цвет фиксатора изменяется после погружения в него кусочков ткани, фиксатор необходимо немедленно сменить. 4. Недопустимо повторное использование фиксаторов. 5. Для каждого фиксатора следует соблюдать установленное время фиксации. Длительное пребывание материала возможно лишь в некоторых фиксаторах, например 10 % нейтральном формалине, жидкости Буэна. Для фиксации лучше использовать емкости с широким горлом, чтобы не возникло проблем с извлечением фиксированного материала. Равномерность фиксации некоторых рыхлых тканей, например легочной, достигается помещением их на дно банки, а поверх них — прокладки из слоя марли или ваты. Чаще материал фиксируют при комнатной температуре, но для некоторых видов исследования (гистохимических, электронно-микроскопических и др.) необходимо проводить фиксацию при 4 °С. Материал срочных биопсий фиксируют при повышенной температуре фиксатора. В экспериментальных исследованиях применяют также прижизненный перфузионный метод фиксации и его сочетание с обычным погружением в фиксирующую жидкость. 8
ПРОСТЫЕ ФИКСИРУЮЩИЕ ЖИДКОСТИ Формалин. Основным, широко применяемым фиксатором служит формалин, представляющий собой 40 % раствор формальдегида. Из него готовят нейтральный (забуференный до рН 7,0) 10—12 % формалин. Для этого в банку с 40 % формалином засыпают карбонат кальция или магния либо смесь этих солей — доломит из расчета 100 г на 1 л формалина. Для получения 10 % нейтрального формалина через 24 ч к 1 части 40 % нейтрального формалина добавляют 9 частей водопроводной воды. Продолжительность фиксации 24 —48 ч при 20 °С. Универсальным фиксатором, пригодным для гистологических и большинства гистохимических исследований, является нейтральный формалин по Лилли. А. 100 мл 40 % формалина + 900 мл дистиллированной воды. Б. 4 г дигидроортофосфата натрия моногидрата (однозамещенного фосфата натрия). В. 6,5 г гидроортофосфата натрия (двузамещенного фосфата натрия). Если на дне банки с 40 % формалином образовался осадок белого цвета (параформальдегид), то его можно растворить, подогрев до 70 — 80 °С (в вытяжном шкафу!), и использовать для фиксации. Очищенный коммерческий параформальдегид применяют как составную часть многих фиксаторов для гистохимических и электронно-микроскопических исследований. Этиловый спирт (80 %, 90 %, 96 % и 100 %). Его применяют в качестве фиксатора для выявления гликогена, железа, амилоида, но он растворяет липиды. Механизм действия основан на осаждении белков, при этом происходит обезвоживание объектов, что значительно ускоряет проводку. Продолжительность фиксации от 2 ч до 1 сут. Увеличение длительности фиксации, особенно в 100 % спирте1, нежелательно, так как материал значительно уплотняется и происходит его пересушивание. Оптимальная температура для фиксации материала в спирте +4 °С, но ее можно проводить и при комнатной температуре. Если после спиртовой фиксации предстоит резать ткань на замораживающем микротоме или криостате, то кусочки промывают в течение 1 —2 ч до их полного погружения на дно банки, при этом происходит насыщение ткани водой. Ацетон (его действие подобно действию спирта). Ацетон используют для увеличения скорости фиксации. Применяют 100 % ацетон, для получения которого в коммерческий ацетон засыпают прокаленный сульфат меди (медный купорос) или силикате ль. В ацетоне фиксируют кусочки толщиной 3 — 4 мм в течение 2 ч при 20 °С или 30 мин— 1 ч в термостате при 60 °С в Здесь и далее термином «спирт» обозначается этиловый спирт (этанол). 9
плотно закрытой посуде. Ацетон значительно уплотняет ткань и при увеличении продолжительности фиксации возможно сморщивание объектов. Чаще ацетон применяют для обработки материала срочных биопсий при его заливке в парафин. Сулема (дихлорид ртути). Сулему применяют в качестве фиксатора с начала развития гистологии. Готовят насыщенный раствор: 10 г сулемы на 100 мл дистиллированной воды или изотонического раствора хлорида натрия доводят до кипения, охлаждают, фильтруют. Продолжительность фиксации кусочков толщиной 3 мм 6—12 ч при 20 °С. При фиксации сулемой возможно появление в тканях кристаллического осадка, который удаляют путем обработки срезов йодированным 70 % спиртом (на 50 мл 70 % спирта — 5—10 капель 5 % спиртового раствора йода до появления оранжевого цвета). По мере обесцвечивания йодированного спирта со срезами его заменяют свежей порцией вплоть до полной потери цвета, затем срезы промывают в 3—4 сменах 70 % спирта. СЛОЖНЫЕ ФИКСАТОРЫ Составными частями сложных фиксаторов являются простые. Существует множество вариантов фиксирующих смесей. Ниже приведены наиболее распространенные. Спирт-формол по Шафферу — 10 % нейтральный формалин, который готовят из 1 части нейтрального 40 % формалина и 2 — 3 частей 96 % спирта. Продолжительность фиксации 24 —48 ч. Дальнейшая промывка в воде не требуется, и материал сразу же помещают в 96 % спирт. Солевой формол Нейтральный 40 % формалин 100 мл Хлорид натрия 8,5 г Водопроводная вода 900 мл Продолжительность фиксации 48 ч при 20 °С с последующей промывкой в проточной воде в течение б —12 ч. Жидкость Буэна — классический фиксатор для экспериментальных исследований. Насыщенный раствор пикриновой кислоты 75 мл Нейтральный 40 % формалин 25 мл Ледяная уксусная кислота 5 мл Продолжительность фиксации 1 — 24 ч при 20 °С. Насыщенный раствор пикриновой кислоты готовят заранее из расчета 3 г кристаллической пикриновой кислоты на 1 л горячей дистиллированной воды. После фиксации кусочки отмывают от избытка пикриновой кислоты в 70 % спирте, затем заливают в парафин. 10
Кальций-формол по Бейкеру используют для фиксации лили дов. А. 10 мл 40 % формалина + 90 мл дистиллированной воды. Б. 1 г хлорида кальция. Растворы А и Б смешивают. Продолжительность фиксации 24 —48 ч при 20 °С. Для гистохимических исследований с успехом применяют фиксатор Бейкера, приготовленный из параформальдегида. А. К 50 г параформальдегида и 500 мл дистиллированной воды добавляют с одновременным встряхиванием несколько капель 1 н. гидроксида натрия до исчезновения осадка. Б. 10 г хлорида кальция + 500 мл дистиллированной воды. Растворы А и Б смешивают, добавляют 0,5 г активированного угля. Перед использованием фильтруют. Продолжительность фиксации 24 —48 ч при 20 °С. Жидкость Карнуа — универсальный фиксатор для большинства гистологических и гистохимических исследований (кроме выявления липидов). Спирт 100 % или 96 % 60 мл Хлороформ 30 мл Ледяная уксусная кислота 10 мл Продолжительность фиксации 2 —4 ч при 4 °С или 1 —2 ч при 20 °С. Затем материал помещают в 100 % спирт. Если материал не сразу подлежит проводке, то его можно перенести в 96 % спирт и держать в нем до 3 сут. Используется также фиксатор Карнуа I, в состав которого входят 75 мл 100 % спирта и 25 мл ледяной уксусной кислоты. Условия фиксации те же. В случае отсутствия этилового спирта вместо жидкости Карнуа можно использовать смесь следующего состава. Изопропиловый спирт 60 мл Пропионовая кислота 30 мл Ацетон 10 мл Диоксан 10 мл Продолжительность фиксации 12 — 24 ч при 20 °С; для промывки и обезвоживания применяют изопропиловый спирт. Жидкость Ценкера — сулемовая смесь. Жидкость Бихромат калия 2,5 г Сульфат натрия 1 г , Мюллера Дистиллированная вода 100 мл ) Сулема 5 г Ледяная уксусная кислота 5 мл 11
Ледяную уксусную кислоту можно заменить нейтральным 10 % формалином (фиксатор Максимова, ценкер-формол). Продолжительность фиксации 1—24 ч при 20 °С. После фиксации материал в течение 12 — 24 ч отмывают в проточной воде и помещают в йодированный 70 % спирт для удаления остатков сулемы. При добавлении 10 мл 2 % раствора тетраоксида осмия хорошо фиксируются и окрашиваются липиды. В последнее время для гистологических исследований часто применяют глутаровый альдегид, параформальдегид, фиксаторы Ито, Замбони и др., особенно в тех случаях, когда материал предназначается одновременно для нескольких видов исследования (иммуноморфологического, электронно-микроскопического), а его количество ограничено, например при пункционных биопсиях. ПРАВИЛА РАБОТЫ С ФИКСАТОРАМИ Практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам (альдегиды, ацетоны, спирты), некоторые ядовиты (сулема, тетраоксид осмия, метанол), поэтому необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с реактивами, которые используют в гистологической практике. Фиксацию и вырезку материала необходимо производить в вытяжном шкафу. Материал, извлеченный из фиксатора, содержащего формалин, желательно в течение нескольких минут промыть в проточной воде, так как пары формалина оказывают раздражающее действие на слизистые оболочки глаз и органов дыхания. БЫСТРАЯ ФИКСАЦИЯ МАТЕРИАЛА СРОЧНЫХ БИОПСИЙ Доставленный в лабораторию материал в случае необходимости вырезают или разрезают на несколько кусочков и фиксируют с помощью одного из способов быстрой фиксации. Если возможно, то следует часть материала сохранить для изготовления постоянных препаратов. 1. Материал помещают в металлический сосуд с ручкой и заливают теплым 10 % нейтральным формалином, доводят до кипения, затем промывают проточной водой в течение 2 — 5 мин и режут на замораживающем микротоме или криостате. 2. Кусочки фиксируют в 100 % ацетоне в термостате при 56 °С в течение 15 мин, затем помещают в хлороформ или ксилол для последующей заливки в парафин. 3. Материал фиксируют в смеси 10 % нейтрального формалина и 96 % спирта (1:1) в течение 15 мин при 56 °С, затем промывают в 96 % спирте и обезвоживают в 100 % спирте. 4. М. Утс1 и соавт. (1990) предложили метод фиксации кусочков ткани объемом 0,5—1 см3 с применением микроволновой техники. Материал в растворе альдегида помещают на 20 с в 12
микроволновую печь (2,5 Гц/500 В), а затем оставляют на 10 — 30 мин при комнатной температуре в том же фиксаторе. Микроволновое излучение способствует быстрому проникновению альдегидов в клетки и ткани, в результате чего улучшается качество фиксации. Этот способ позволяет проводить не только обычные гистологические, но и ультраструктурные цитохимические, иммуноморфологические исследования, а также рентгенологический микроанализ. ВОЗМОЖНЫЕ АРТЕФАКТЫ, СВЯЗАННЫЕ С ФИКСАЦИЕЙ, И ИХ УСТРАНЕНИЕ При фиксации формалином, особенно кислым, возможно появление в срезах темно-коричневого пигмента в виде зернышек или глыбок (результат реакции формалина с гемоглобином ткани). Пигмент удаляют, помещая срезы на 15 — 20 мин в 1 — 5 % раствор аммиака или 70 % спирт. После промывания водой препарат можно окрашивать. Хорошо удаляется пигмент в растворе 1 % гидроксида калия в 80 % спирте (1:25): после 10-минутной экспозиции препарат промывают в проточной воде в течение 5 мин. В случаях значительного уплотнения ткани в результате слишком продолжительной фиксации кусочки помещают на 1 — 2 ч в 10 % раствор лимонной кислоты, в результате чего материал становится более мягким и пригодным для исследования. Кристаллический осадок, образующийся после фиксации с применением сулемы, удаляют из кусочков или лучше срезов с помощью йодированного 70 % спирта.
ГЛАВА 3 ОБЕЗВОЖИВАНИЕ И ЗАЛИВКА МАТЕРИАЛА После фиксации, для которой применялся формалин, кусочки промывают в течение 6, 12 или 24 ч в проточной воде: на водопроводный кран надевают резиновую трубку, конец которой опускают в широкогорлую банку, закрытую марлей. Для промывки удобно использовать эксикаторы разных размеров, снабженные краном: в отверстие крышки эксикатора опускают шланг, по которому подают воду, а через кран эксикатора ее сливают. В том случае, если в состав фиксатора входила пикриновая кислота, материал следует промыть в нескольких сменах 70 % спирта, после фиксации с использованием сулемы — в йодированном 70 % спирте. Материал, фиксированный для некоторых гистохимических реакций, электронно-микроскопического и иммуноцитохимического исследований, отмывают от фиксаторов в различных буферных смесях. В случае необходимости кусочки тканей перед обезвоживанием можно уменьшить, подровнять. Если материал после фиксации не сразу подлежит проводке, то его можно оставить в 70-80 % спирте. СПОСОБЫ ОБЕЗВОЖИВАНИЯ ТКАНЕЙ Перед заливкой материала в парафин или целлоидин его необходимо обезводить. Существует несколько традиционных способов обезвоживания. Самым распространенным является обезвоживание в спиртах восходящей концентрации, начиная с 70 %. Обычно применяют батарею спиртов, состоящую из двух порций 96 % и двух — 100 % спирта. Продолжительность процесса обезволшвания в спиртах в среднем 48 ч в зависимости от качества материала (содержания жира в ткани) и размера кусочков, а также от их количества. При использовании автомата для заливки количество спиртов увеличивают, а при проведении кусочков по спиртовой батарее вручную их осторожно промокают фильтровальной бумагой или салфеткой из марли, что позволяет реже менять спирты в батарее. Процесс обезвоживания можно ускорить, периодически встряхивая кусочки в банках со спиртами или поместив их в термостат при 37 °С. Спирты в батарее необходимо своевремен- 14
но заменять. Контролировать пригодность спирта позволяет проба с водой. В отлитое из банки небольшое количество спирта добавляют 1 каплю воды. Помутнение раствора свидетельствует о необходимости замены спирта в батарее. Абсолютный спирт можно приготовить из 96 %. Для этого применяют сульфат меди, который помещают в ступку и прокаливают на спиртовке или в термостате, периодически растирая и размешивая до консистенции пыли и бледно-голубого цвета. Затем сульфат меди (1 часть) засыпают в банку с 96 % спиртом (4 или 6 частей), плотно закрывают ее крышкой, взбалтывают и оставляют на несколько дней, периодически встряхивая. Сульфат меди адсорбирует воду из спирта и вновь приобретает синюю окраску. Перед использованием абсолютного спирта проводят его контроль спиртометром или в пробирку с небольшим количеством ксилола (4 — 5 мл) добавляют каплю приготовленного спирта (раствор мутнеет, если спирт недостаточно обезвожен). Хорошим адсорбентом воды из спирта является также силикагель после предварительного просушивания его в термостате. При отсутствии 100 % спирта в батарею включают еще одну порцию 96 % спирта. Однако в этом случае всегда есть опасность недостаточного обезвоживания и возникновения трудностей при получении срезов. С целью ускорения обезвоживания применяют ацетон без примесей (ЧДА), предварительно добавив в него силикагель для удаления остатков воды или дистиллированный ацетон. Обезвоживание проводят в 2 — 3 сменах ацетона от нескольких часов до 1 сут в зависимости от величины объектов Обезвоживание тканей возможно с помощью 99 % изопропи- лового спирта, который непосредственно смешивается с парафином без промежуточных растворителей (ксилол, хлороформ и др.). Таким же свойством обладает диоксан, однако в связи с высокой токсичностью он не нашел широкого применения в па- тогистологической технике Для обезвоживания глицерином [Беккер Г.М., 1958; \МоН ]., 1939, и др.] кусочки ткани последовательно помещают в 60 %, 80 % и 100 % глицерин на 3 — 4 ч, а затем в смесь, состоящую из равных частей 100 % глицерина и ксилола. Выраженное влияние на скорость обезвоживания оказывает микроволновое излучение. Объекты в 70 % спирте помещают на 20 с в микроволновую печь (2,5 Гц/500 В), а затем дообезво- живают в абсолютном спирте в течение 30 — 60 мин. Секционный и биопсийный материал часто обезвоживают в аппаратах типа АТ-5 и др. с последующим пропитыванием толуолом, хлороформом или их смесью с парафином. При этом применяют две порции 96 % спирта и две — 100 %. Общая продолжительность обезвоживания 48 ч. Преимущество использования аппаратов состоит в том, что в них материал постоянно перемешивается и находится во взвешенном состоянии. Однако аппа- 15
рат не включается автоматически после внезапного перепада напряжения в электрической сети, что может привести к пересушиванию большого количества материала. ЗАЛИВОЧНЫЕ СРЕДЫ Для получения тонких (до 6 мкм) гистологических срезов необходимо фиксированный и промытый материал залить в плотную среду, предварительно пропитав ею кусочки тканей. В зависимости от способа растворения все заливочные среды разделяют на растворимые в органических растворителях и водорастворимые. К первым относятся парафин, пластические полимеры на основе парафина, целлоидин, ко вторым — желатин, полиэтиленгликоли, полиэфиры, некоторые метакрилаты и т.д. Заливка ткани в парафин Парафин — смесь высокомолекулярных предельных углеводородов, продукт перегонки нефти; растворяется в анилине, бензоле, бергамотном масле, целлозольве, хлороформе, декалине, диоксане, бутаноле, пропаноле, толуоле, трихлорэтилене, ксилоле. Каждый из этих растворителей можно использовать в качестве промежуточной среды между спиртом и парафином. Температура плавления различных парафинов от 27 до 62 °С. В гистологической технике применяют парафин с температурой плавления 56 °С. Зарубежные фирмы производят специальный парафин для гистологических исследований, содержащий различные пластические полимеры, такие как диметилсульфоксид. Их коммерческие названия «Парапласт», «Парапласт плюс», «Гистопласт С», «Гистозес». Важнейшим условием успешной заливки материала является своевременная смена реактивов в процессе их загрязнения, а также соблюдение рекомендуемых временных и температурных параметров. Кроме того, нужно стремиться к тому, чтобы одновременно заливать одинаковые по толщине и плотности кусочки ткани. Схема Меркулова Фиксация: формалин 10 % спирт-формол жидкость Карнуа спирт 96-100 % промывание в проточной воде Обезвоживание: спирт 96 % I спирт 96 %П спирт 100 % I спирт 100 % II 24 ч 24 ч 2-4ч 12-24ч 12-24ч 24 ч 2ч 24 ч 2ч 16
Заливка в парафин: спирт+хлороформ (1:1) или спирт+ксилол (1:1) или хлороформ или ксилол хлороформ+парафин (1:1 — или ксилол+парафин (1:1 — парафин I 56 °С парафин II 56 °С «каша») 37 °С «каша») 37 °С 6-12ч 1-Зч 6-12ч 1-6ч 2-Зч 1-2ч 2ч 1 ч Схема Волковой—Елецкого Обезвоживание спирт 50 % 2 —4 ч спирт 60 % 2 —4 ч спирт 70 % 12-24ч спирт 96 %1 12 ч спирт 96 % II 12 ч спирт 100 %1 1-12ч спирт 100 % II 12 ч Заливка в парафин: спирт 100 % + хлороформ (1:1) 2 —3 ч хлороформ I 1,5 ч хлороформ II 0,5 ч хлороформ III 0,5 ч хлороформ+парафин (1:1) 37 °С 3 —6 ч хлороформ+парафин (1:1) 56 °С 0,5—1 ч парафин I 56 °С 2 ч парафин II 56 °С 2 ч парафин III 56 °С 1ч Заливка по Ромейсу ручным способом I вариант Фиксация в 10 % формалине 12 ч Промывание в проточной воде 3 ч Спирт 50 % 2 ч Спирт 70 % 3 ч Спирт 96 % 4 ч Спирт 100 % I 4 ч Спирт 100% II 4 ч Метилбензоат I 2 ч Метилбензоат II 2 ч Бензол 2 ч Бензол+парафин (1:1) 1ч Парафин 60 °С 8 ч Продолжительность 47 ч II вариант Фиксация в 10 % формалине 12 ч Промывание в проточной воде 3 ч Изопропиловый спирт 50 % 2 ч Изопропиловый спирт 75 % 3 ч Изопропиловый спирт 90 % 6 ч 17
Изопропиловый спирт 100 % 1 4 ч Изопропиловый спирт 100 % II 4 ч Изопропиловый спирт+парафин (1:1) 60 °С 12 ч Парафин 60 °С 8 ч Продолжительность 54 ч Заливка в парапласт с помощью автомата Фиксация в 5 % формалине 2 ч Спирт 70 % I 2 ч Спирт 70 % II 1ч Спирт 96 % I 1ч Спирт 96 % II 1ч Спирт 100 % I 1ч Спирт 100 % II 1ч Спирт 100 % III 1 ч Хлороформ I (бензол) 1 ч Хлороформ II (бензол) 1 ч Парапласт I 60 °С 2 ч Парапласт II 60 °С 3 ч Продолжительность 17 ч Заливка в парапласт с помощью вакуум-автомата 5 мин 12 мин 12 мин 12 мин 12 мин 12 мин 12 мин 15 мин 15 мин 15 мин 25 мин Продолжительность 12 ч 27 мин Быстрая заливка биопсийного материала в парапласт с помощью автомата Фиксация в 5 % формалине при 60 °С 10 мин Ацетон I 30 мин Ацетон II 30 мин Ацетон III 30 мин Ацетон IV 30 мин Ацетон-ксилол (1:1) 10 мин Ксилол 10 мин Парапласт плюс 60 °С 30 мин Продолжительность 3 ч Наиболее быстрым, простым, не требующим применения специальной аппаратуры методом заливки материала является Спирт 70 % I Спирт 70 % II Спирт 96 % I Спирт 96 % II Спирт 100 % I Спирт 100 % II Спирт 100 % III Бензол I Бензол II Парапласт плюс Парапласт плюс 160°С II 60 °С 18
способ, разработанный Н.Н. Золотых в патологоанатомическом отделе Института хирургии им. А.В. Вишневского. Фиксация в 96 % спирте 15 мин Спирт 100 % 15 мин Хлороформ 15 мин Хлороформ-парафин при 56 °С 15 мин Парафин при 56 °С, энергично встряхивая 1 мин Парафин при 56 °С 45 мин Продолжительность 2 ч 30 мин Особенности заливки в парафин крупных объектов Заливка в парафин позволяет получать гистологические срезы больших размеров (гистотопографические срезы), например срезы всего органа (матка, почка) или его значительной части (доля легкого). Заливку проводят вручную, и для нее требуется дополнительное время на всех этапах. Для приготовления таких срезов из ткани головного мозга с помощью мозгового ножа делают срез свежей ткани толщиной около 1 см и закладывают в ванну с фиксатором. Для того чтобы сохранить плоскую конфигурацию среза, его кладут между двумя проволочными сетками, которые притягивают друг к другу резиновыми кольцами. Продолжительность фиксации 48 ч. После промывки в проточной воде (3 — 4 ч) следует обезвоживание в 70 %, 96 % и 100 % спирте (по 2 смены) в течение 48 ч. Для обезвоживания можно применить изопропиловый спирт, обеспечивая частую его смену и температуру 45 °С (в термостате). Это позволяет избежать получения чрезмерно жестких препаратов. В качестве промежуточной среды используют метилбензоат или хлороформ — 3 смены по 3 дня. Объекты заливают в парафин или парапласт, имеющие температуру плавления 56 — 58 °С. Приготовление парафиновых блоков Пропитанные парафином кусочки ткани выкладывают в специальные формочки и заливают расплавленным в термостате или на водяной бане при 60 °С парафином, в который добавлено 1 — 3 % воска. Для получения парафиновых блоков нужной формы используют различные приспособления. К ним относятся изготовляемые самим лаборантом бумажные коробочки, на дно которых выкладывают кусочки, а рядом к боковой стенке ставят этикетку номером кнаружи; металлические Г-образные угольники или разъемные формочки, которые перед употреблением смазывают глицерином и помещают на нагретую металлическую пластинку, выполняющую роль дна формочек. Применяют также различные пластмассовые коробочки и формы, в частности исполь- 19
зуемые в микробиологии, особенно при заливке мелких объектов, таких как материал пункционных биопсий. Специальные импортные аппараты для заливки в парафин (так называемые заливочные центры) снабжены набором различных формочек (кассет) и пинцетов. В них обеспечивается автоматическая подача дробных доз парафина оптимальной температуры. Раскладывание кусочков в формочки и их ориентирование нужно проводить быстро теплым пинцетом. Если материала для заливки много и он быстро остывает, то можно использовать парафин, подогретый на водяной бане до 60 °С. Для охлаждения формочки с материалом рекомендуют помещать в воду при 10— 18 °С, но не погружать в нее. При застывании парафина поверхность блока стягивается, и в нем образуется кратерообразное углубление. Это нужно учитывать при заливке кусочков и в дальнейшей работе с блоками. Парафин должен на 3 — 4 мм выступать над поверхностью блока, если предстоит монтировать его на деревянную колодку. Возможны также заливка блока большим количеством парафина и резка без использования деревянных колодок, с успехом применяемая даже на санном микротоме. В большинстве руководств рекомендуют после подравнивания и удаления лишнего парафина наклеивать блоки на деревянные бруски с помощью подогретого на спиртовке металлического шпателя или скальпеля. Затем для обеспечения более прочного приклеивания основания блок оплавляют с четырех боковых сторон тем же горячим шпателем или скальпелем. Заливка ткани в целлоидин Целлоидин — хорошо растворяющаяся в эфире нитроклетчатка. В гистологической практике применяют 2 %, 4 % и 8 % растворы целлоидина, которые готовят из целлоидиновых пластин или отмытой от эмульсии и высушенной рентгеновской пленки. Для приготовления 500 мл 2 % раствора целлоидина 10 г сухого целлоидина заливают 250 мл 100 % спирта и оставляют на 1 сут, затем добавляют 250 мл безводного эфира, который растворяет набухший в спирте целлоидин. Для приготовления 4 % и 8 % растворов количество целлоидина увеличивают соответственно в 2 и 4 раза. Растворы хранят в плотно закрытой посуде. Заливка ткани в целлоидин стала в настоящее время менее популярной, чем парафиновая, и ее применяют главным образом для обработки труднорежущихся тканей и объектов больших размеров, с которых трудно получить хорошие парафиновые срезы. Целлоидиновую заливку используют также в тех случаях, когда необходимо избежать воздействия на исследуемый материал высоких температур. Кроме того, заливка материалов в целлоидин позволяет получить лучшие результаты при 20
наличии в объектах больших полостей, лакун и слоев различной консистенции. Эфир и сухой целлоидин огнеопасны, поэтому при работе с ними необходима осторожность. Обезвоженный материал помещают в смесь 100 % спирта с эфиром (1:1) на 4 —6ч, переносят в 2 % раствор целлоидина на 2--3 дня, затем в 4 % и 8 % растворы на 5 —7 дней в каждый. Пропитанный кусочек заливают свежим 8 % целлоидином и уплотняют в парах хлороформа (в эксикаторе). Уплотненный таким образом материал заливают 70 % спиртом для хранения. Вырезанные блоки наклеивают густым целлоидином на деревянные колодки на 1 сут перед резкой. Заливка в целлоидин по Меркулову Фиксация: Формалин 10 % 24 ч Жидкость Карнуа 2 —4 ч Спирт 96% 12 ч Промывание в воде после формалина 24 — 48 ч Обезвоживание: Спирт 96 % 24 ч Спирт 100 % 24 ч Заливка в целлоидин Спирт 100 % + эфир (1:1) 6-24 ч Целлоидин 2 % 2 — 4 дня Целлоидин 4 % 2 — 4 дня Целлоидин 8 — 10 % 1—2 дня Хлороформ 2 — 3 дня Спирт 70 % хранение Заливка в целлоидин по Ромейсу Спирт-эфир (1:1) Целлоидин 2 % Целлоидин 4 % Целлоидин 8 % Целлоидин 16 % Спирт 70 4-6ч 2 дня 2 дня 8 дней уплотнение в эксикаторе до образования поверхностной корочки в парах хлороформа хранение Особенности заливки в целлоидин крупных объектов Целлоидиновая заливка, так же как и заливка в парафин, позволяет получать гистотопографические срезы. Пластины ткани органа толщиной 1 см кладут между двумя проволочными сетками (как для заливки в парафин), фиксиру- 21
ют, промывают и обезвоживают. Общая продолжительность процесса заливки в целлоидин крупных объектов 2 — 2,5 мес. С помощью целлоидиновой заливки можно получить гистотопо- графические срезы толщиной около 20 мкм. Схема заливки в целлоидин материала для гистотопограмм по Меркулову Формалин 10—15 % 1— 2 нед Промывание в проточной воде 1 сут Спирт 70% 1-2 дня Спирт 96 %1 1-2 дня Спирт 96 % II 3 — 4 дня Спирт 96 % III 5 дней Спирт 100 % 2 дня Спирт 100 % + эфир (1:1) 4-5 дней Целлоидин 2 % 2 — 3 нед Целлоидин 8 % 7—10 дней Хлороформ (уплотнение блоков) 4 — 7 дней Спирт 70 % хранение Заливка в целлоидин-парафин Этот метод рекомендуется для обработки объектов, которые легко сжимаются при парафиновой заливке, например органов кроветворения, мезенхимной ткани, а также органов и тканей, имеющих многослойное строение (трахея, кожа и др.). Фиксация в 10 % формалине 24 ч Промывание в проточной воде 6— 12 ч Обезвоживание в спиртах 2 — 3 дня Спирт 100 % + эфир (1:1) 3-6 ч Целлоидин 2 % 1—2 дня Хлороформ 6—18 ч Хлороформ + парафин (1:1) при 37 °С 2 —3 ч Парафин I при 56 °С 1 — 2 ч Парафин II при 56 °С 1 — 2 ч Используют также смесь целлоидина с касторовым маслом (1:1), пребывание в которой объектов в течение 1—2 дней улучшает их пропитывание. Затем для удаления касторового масла материал промывают в трех порциях хлороформа. Заливка в желатин Для исследования липидов в рыхлых тканях и органах, а также при изучении эмбриональных объектов с успехом применяют заливку в водорастворимый биополимер желатин. Используют кристаллический прозрачный пищевой желатин, из которого готовят 25% и 12,5% растворы. К 25 г желатина добавляют 75 мл 1 % водного раствора фенола (карболовая вода) и помещают в термостат при 37 °С. Же- 22
латин набухает, и после перемешивания образуется густой 25 % раствор. Из него при разбавлении теплой (37 °С) карболовой водой в 2 раза получают 12,5 % раствор желатина. Приготовленные растворы разливают в чистые сухие пробирки для однократного использования и закрывают пробкой. В застывшем состоянии желатин можно долго хранить в темном прохладном месте. Схема заливки в желатин по Волковой—Елецкому Фиксация в 10 % формалине 24 — 48 ч Промывание в проточной воде 18 — 24 ч Желатин 12,5 % при 37 °С в закрытой посуде 3 —20 ч (в зависимости от величины объекта) Желатин 25 % при 37 °С 3-20 ч Заливка свежим 25 % желатином в формочки Застывание в формочках в холодильнике Формалин 20 — 25 % (уплотнение блоков) 24 ч Формалин 10 % хранение Залитый в желатин материал режут на замораживающем микротоме. Из полученных срезов удаляют желатин, чтобы избежать окрашивания фона. Для этого срезы помещают на 30 мин в 10 % раствор гидроксида калия при 37 °С. Затем их промывают в водопроводной воде и окрашивают. Окрашенные срезы заключают в поливиниловый спирт или глицерин-желатин. Приготовление поливинилового спирта: порошок поливинилового спирта отмывают в 96 % спирте (2 смены), эфире (3 смены) и высушивают. К 16 г отмытого порошка добавляют 100 мл дистиллированной воды, оставляют на 12 ч для набухания. Полученную массу нагревают в течение 20 — 30 мин на кипящей водяной бане. На поверхности густой мутноватой жидкости образуется пленка с пузырями, которую удаляют, а раствор фильтруют через 4 слоя марли. Поливиниловый спирт можно использовать как промежуточную среду для получения постоянных препаратов после резки на замораживающем микротоме. Сначала на срез, расправленный на стекле, наносят поливиниловый спирт, затем после образования тонкой пленки (через 6—12 ч) препарат заключают в полистирол или бальзам. Приготовление глицерин-желатина: к 7 г желатина добавляют 41 мл дистиллированной воды и оставляют для набухания 3 —4 ч. Затем добавляют 50 мл глицерина и 1 г фенола. Смесь нагревают на водяной бане, постоянно помешивая. Раствор фильтруют через крупнопористый фильтр, разливают по пробиркам, закрывают пробками и хранят в холодильнике. Срезы ткани, залитой в желатин, полученные на замораживающем микротоме, можно обезводить в спиртах, просветлить в карбол-ксилоле и заключить в бальзам или полистирол. 23
В других схемах рекомендуют иные концентрации желатина и продолжительность пребывания в нем объектов. Схема заливки в желатин Гаскелла-Граффа Фиксация в 10 % формалине 48 ч Промывание в водопроводной воде 2 —6 ч Желатин 10 % при 37 °С 2 —6 ч Желатин 20 % при 37 °С 2 —б ч Заливка в свежую порцию 10 % желатина при 37 °С Застывание формочек с кусочками в холодильнике Вырезка блоков Уплотнение блоков в 10 % формалине Заливка в водорастворимые пластмассы Для целей гистохимии, особенно для выявления липидов и ферментов, хорошо себя зарекомендовала заливка ткани в синтетические водорастворимые пластмассы — полиэтиленгликоль, поливакс, метилметакрилат и др. Заливка в полиэтиленгликоль различной молекулярной массы по Ринерхарту—Абуль-Хею Вариант I Фиксация в 5 % формалине 24 — 48 ч Промывание в проточной воде 12 ч Полиэтиленгликоль-400 + дистиллированная вода (1:1) 30 мин Полиэтиленгликоль-400 + дистиллированная вода (3:1) 30 мин Полиэтиленгликоль-400 30 мин Полиэтиленгликоль-1000 при 40 °С 30 мин Заливка смесью полиэтиленгликоль-1550 + полиэтилен- гликоль-4000 (1:9) при 58 °С 30 мин Вариант II Фиксация в 5 % формалине 24 — 48 ч Промывание в проточной воде 12 ч Заливка смесью полиэтиленгликоль-1550 + полиэтилен- гликоль-4000 (1:9) при 58 °С 1 -3 ч Заливка свежей порцией смеси при 58 °С 30 мин Заливка смесью при 58 °С Срезы с залитых в полиэтиленгликоль блоков готовят на замораживающем микротоме, окрашивают, помещают на предметное стекло и заключают в смесь глицерина и желатина или раствор диэтиленгликоля (диэтиленгликоля — 4 части, дистиллированной воды — 5 частей, 40 % формалина — 1 часть). Заливка в поливакс по Стидмену Поливакс (полиэстервакс) представляет собой смесь полиэтилен- гликоля-400-дистеарата и ацетил алкоголя в соотношении 9:1. 24
Фиксация в 5 % формалине 6 — 24 ч Промывание в проточной воде 6— 12 ч Обезвоживание в 70 % и 96 % спиртах 24 ч Спирт 96 % + поливакс (1:1) 2 ч Поливакс при 40 °С 3 ч Свежая порция поливакса при 40 °С 3 ч Заливка в поливакс при 40 °С Застывание блоков при комнатной температуре Заливка в метилметакрилат по Хиршу—Болларду Смола имеет сложный состав и состоит из четырех компонентов, которые смешивают в определенной последовательности: 10 мл метилметакрилата (А) + 5 мл полиэталенгликоля (Б) + 3 мл дибутилфталата (В) + 0,2 г бензоилпероксида (Г). Фиксация в 5 % формалине 6— 12 ч Промывание в 70 % спирте 10 мин Ополаскивание в 96 % спирте 2 мин Спирт 96 % 2 ч Метилметакрилат 2 ч Смесь (А+Б+В+Г) при 50 °С 2 ч Свежая порция этой смеси при 50 —60 °С 6— 10 ч Затем материал выдерживают при комнатной температуре в течение 1 сут
ГЛАВА 4 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕЗОВ Для получения гистологических срезов применяют специальные микротомные ножи, различающиеся по форме, длине и углу сечения лезвия. По форме они представляют собой сложный стальной клин, у которого режущий край имеет дополнительную клиновидную заточку. Длина ножа может составлять от 8 до 50 см. По конфигурации лезвия различают три группы микротомных ножей: А, В и С. У микротомных ножей, относящихся к группе А, одна поверхность ровная, а другая вогнутая (их называют плоско-вогнутыми с большой кривизной вогнутой поверхности). Эти ножи чаще всего изготовлены из мягкой или относительно мягкой стали и предназначены для резки объектов, залитых в целлоидин. Ножи, относящиеся к группе В, называются плоско-вогнутыми, но кривизна вогнутой поверхности у них значительно меньше, чем у ножей группы А. Они изготовлены из более твердой стали, используют их для приготовления целлоидиновых и целлоидин-парафиновых срезов. У ножей, относящихся к группе С, обе поверхности клинка плоские. Их изготавливают из твердой стали и применяют для резки объектов, залитых в парафин, а также для получения срезов на замораживающем микротоме. Кроме того, для приготовления парафиновых и полутонких срезов на микротомах и ультратомах используют металлические магнитные лезвия и стеклянные ножи. Металлическое магнитное лезвие (одноразовый нож) позволяет получить срезы с 50 — 60 парафиновых блоков, затем лезвие меняют. Изготовление и применение стеклянных ножей — см. главу 12. ЗАТОЧКА МИКРОТОМНЫХ НОЖЕЙ Получить качественные гистологические срезы при целлоидиновой, целлоидин-парафиновой и парафиновой заливке материала можно с помощью микротомного ножа, толщина лезвия которого должна быть от 3 до 5 мкм. Для работы на замораживающем микротоме необходимо иметь острый нож без зазубрин на лезвии. Нож необходимо своевременно точить, а перед каждой рез- 26
кой объектов править. Микротомные ножи затачивают с помощью специальных аппаратов, например «5акига» (Япония). Однако до сих пор не потеряла актуальности и применяется во многих лабораториях ручная заточка ножей. Вручную микротомные ножи точат на камне, имеющем форму бруска. Желтый, так называемый бельгийский камень используют для заточки первым, затем продолжают заточку на белом камне (арканза- се), который имеет более мелкую зернистость. Можно использовать природный аспидный камень, который также имеет крупнозернистую и мелкозернистую поверхность. Перед заточкой на поверхность камня наносят машинное масло или керосин, глицерин, разведенный 70 % спиртом (1:1), мыльную воду. На спинку ножа надевают специальный обушок (желательно постоянно используемый для заточки одних и тех же ножей — это определяет угол заточки), а в стержень или отверстие в торцевой части ножа вкручивают ручку. Затем нож кладут обушком на камень, по которому скользит и лезвие под действием собственной тяжести. Нож проводят по камню с одного конца на другой, а затем, поворачивая через обушок, осуществляют движение в обратном направлении. Продолжительность процесса зависит от квалификации лаборанта и состояния режущей кромки ножа. В среднем она составляет от 30 мин до 1 ч. Периодически контролируют качество заточки, осторожно укладывая нож на предметный столик микроскопа и перемещая его так, чтобы режущая кромка проходила через поле зрения при малом увеличении. Затем нож правят на широком ремне, натянутом на деревянную колодку. Правку проводят так же, как и заточку (через обушок). МИКРОТОМЫ И ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ НА НИХ Микротомы — это приборы, с помощью которых получают срезы тканей, залитых в различные среды, а также замороженных и нефиксированных. Микротомы позволяют получать гистологические срезы различной толщины. По принципу действия различают санные, ротационные, замораживающие микротомы, а также криостаты и вибратомы. Санные микротомы характеризуются горизонтальным движением ножа и вертикальным подъемом блокодержате- ля. Их с успехом используют для резки объектов, залитых в целлоидин, целлоидин-парафин и парафин. Основные части микротома располагаются на специальных салазках, отсюда происходит его название. Принцип работы санного микротома заключается в том, что при обратном ходе ножа ножевые салазки толкают стержень со шкалой регулятора подачи, вызывая его перемещение. Движение стержня передается на тягу, которая с помощью «собачки» поворачивает храповик. Вращение 27
храповика передается микровинту, который с помощью разъемной гайки перемещает салазки с блоком вверх. С каждым срезом блок поднимается все выше на расстояние, соответствующее толщине среза. После того как блокодержатель достигнет высшей точки, с помощью разъемной гайки надо опустить салазки с механизмом в крайнее нижнее положение. Существуют другие разновидности санных микротомов с различными вариантами способов подачи, зажимов для ножей и т.д. Ротационные микротомы предназначены для резки парафиновых блоков, с их помощью можно получать серийные срезы. Важнейшая часть ротационного микротома — механизм микроподачи, который включает в себя храповик, дифференциальный механизм, микровинт, лимб, косозубую передачу и кулачок. Приводной механизм при повороте вала с помощью «собачки» поворачивает на заданное количество зубьев храповик, на оси которого находится зубчатое колесо, передающее через шестерню вращение микровинту. Винт перемещает каретку подачи объектодержателя. Толщина срезов устанавливается поворотом лимба. Объектодержатель ротационного микротома — винтовой зажим, вмонтированный в шаровую оправу каретки подачи. Шарнирный механизм позволяет подать блок под любым углом. Объектодержатель фиксируется в зажиме специальной рукояткой. Держатель для ножа — массивная подставка с двумя вертикальными стойками, в которые вмонтированы двигающиеся держатели, приспособленные для установки ножа под нужным углом. Фиксация ножа осуществляется винтами. В переднезад- нем направлении нож перемещается по специальным направляющим с помощью винта. Постепенно приближая нож к объекту и одновременно поворачивая колесо подачи, подравнивают площадь резания, а затем нож фиксируют. Ротационные микротомы снабжены специальной транспортной лентой, на которую с ножа попадает полоска (серия) срезов. На ленте их разделяют препаровальными иглами и производят дальнейшие манипуляции. Снимать срезы с ножа ротационного микротома можно кисточкой или препаровальной иглой. Замораживающие микротомы используют для резки не залитых, но фиксированных объектов, материала, залитого в желатин и водорастворимые пластмассы. Особенно широко применяются замораживающие микротомы для изготовления препаратов при исследовании материала срочных биопсий. По своей конструкции замораживающие микротомы относятся к микротомам санного типа, но в их устройстве есть некоторые особенности. Станина имеет приспособление для крепления к столу. Нож устанавливают под нужным углом в подвижной ручке с помощью одного или двух зажимов. Автоматическая подача осуществляется при каждом размахе ручки с ножом 28
через систему рычагов. Замораживающий столик снабжен приспособлением для подачи углекислоты или охлаждается термоэлектрически с помощью полупроводниковых элементов. Криостаты, вибратомы. С развитием гистохимии ферментов и иммуноморфологии возникла необходимость в обработке нефиксированного материала, которая была реализована с помощью специальных приборов — криостатов. Позднее появились криокиты и вибратомы. Криостат — специализированная холодильная камера с установленным в ней микротомом, в которой имеются отверстия для рук, люминесцентная лампа и смотровое стекло. Надежная изоляция позволяет поддерживать в криостате температуру от -5 до -25 °С. Отрицательными моментами при работе с крио- статом являются значительное переохлаждение рук оператора, недостаточная освещенность рабочего поля, а также невозможность ориентировать объект относительно кромки ножа. Эти недостатки практически устранены в криокитах зарубежного производства, управление которыми вынесено за пределы морозильной камеры. В них можно отдельно регулировать температуру объекта и ножа. Через 3 — 5 мин после включения прибора достигается низкая температура, причем охлаждение возможно до -65 °С, что предотвращает образование кристаллов в тканях. Уход за микротомами и микротомными ножами. Все скользящие поверхности микротомов должны быть чистыми и смазаны тонким слоем машинного или вазелинового масла. При постоянной работе на микротоме все скользящие поверхности необходимо один раз в неделю протирать тряпочкой, смоченной бензином или толуолом, и смазывать. После окончания работы на микротоме объектодержатель и станину очищают от остатков парафина, предварительно вынув микротомный нож и убрав его в футляр. Микротомные ножи никогда не оставляют в микротоме или на рабочем столе! Замораживающие микротомы и криостаты через 30 мин после выключения вытирают насухо и винтовую подачу смазывают вазелиновым маслом. РЕЗАНИЕ ПАРАФИНОВЫХ БЛОКОВ НА САННОМ МИКРОТОМЕ Парафиновый блок, наклеенный на деревянную колодку или без нее (с большим слоем парафина), зажимают в объектодержатель. Установив нужный угол наклона ножа (оптимальный 13—15°) в зависимости от плотности ткани, медленно подводят нож к блоку, регулируют его высоту до соприкосновения с ножом. Сначала выравнивают поверхность блока, установив микрометрическую шкалу на получение толстых (20 — 25 мкм) срезов, затем шкалу переводят на 6 —8 мкм и приступают к ре- 29
занию материала. Как правило, нож располагается перпендикулярно, но возможно также получение срезов (особенно с более плотных объектов) ножом, который установлен под углом к станине микротома. Срезы с блока осторожно снимают с помощью сухой или смоченной в спирте кисточки, используют также изогнутую препаровальную иглу или скальпель. Срезы обычно переносят в коробку, дно которой выстлано бумагой черного цвета, и укладывают матовой стороной вверх. После получения нужного количества срезов рядом с ними кладут блок или этикетку с номером. Удобнее сразу обработать 20 — 30 блоков, а затем приступить к монтированию срезов на предметные стекла. Часто срезы наклеивают на предметное стекло непосредственно с ножа. Для этого их переносят в склянку с теплой (35 — 40 °С) дистиллированной или кипяченой водой, а затем вылавливают на предметные стекла, которые предварительно обезжиривают и натирают белком с глицерином. Срезы приклеивают на предметное стекло блестящей, обращенной к ножу стороной. Небольшие складочки на срезе можно расправить, осторожно дотрагиваясь до них углом согнутой препаровальной иглы. Можно расправлять срезы непосредственно на стекле с помощью специального приспособления для сушки и расправления парафиновых срезов. Для этого на предметное стекло пипеткой наносят каплю воды и в нее опускают срез. Стекло со срезом помещают на нагреваемый столик прибора, где срез постепенно расправляется. После удаления избытка воды пипеткой или фильтровальной бумагой стекло со срезом подсушивают и одновременно срез плотно фиксируется на предметном стекле. На нагреваемом столике прибора помещается одновременно 45 предметных стекол, при его использовании не требуется дальнейшего просушивания стекол со срезами в термостате. Имеются специальные импортные ванночки для расправления срезов и переноса их на стекло. В них постоянно поддерживается оптимальная температура воды 38 °С. Продолжительность просушивания срезов в термостате при 37 °С 6— 12 ч. В случае необходимости проведения срочной окраски срезы можно поместить на 10—15 мин в термостат при 56 °С до начала плавления парафина, что способствует лучшей фиксации среза на предметном стекле. Однако при этом несколько затрудняется депарафинирование: требуется применение дополнительной порции ксилола и увеличение продолжительности депарафинирования. Существует сухой способ приклеивания срезов к стеклу, который пригоден только для срезов отличного качества. На предметное стекло, смазанное тонким слоем белка с глицерином, помещают срез, аккуратно расправляют его препаровальной иглой или скальпелем и слегка подогревают на спиртовке или нагреваемом столике. 30
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЦЕЛЛОИДИНОВЫХ СРЕЗОВ Для приготовления целлоидиновых срезов используют ножи типа А и Б. Целлоидиновые блоки закрепляют так же, как и парафиновые. После установки ножа в микротом к нему пододвигают объектодержатель с укрепленным в нем блоком. Выравнивают поверхность блока до тех пор, пока полностью не обнажится ткань кусочка, а затем приступают к приготовлению срезов желаемой толщины. Во время резания нож и объект обильно смачивают 70 % или 80 % спиртом, пользуясь кисточкой. Нож по салазкам микротома ведут плавно, без давления. Полученный срез расправляют на ноже с помощью кисточки, после чего срез снимают с ножа на подушечку указательного пальца, подложенного под нож. Срезы кладут в склянки с 70 % спиртом. ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ НА РОТАЦИОННОМ МИКРОТОМЕ Парафиновый блок приклеивают к металлическому блокодер- жателю и оплавляют горячим скальпелем с четырех сторон. Затем блокодержатель с объектом закрепляют в винтовой зажим и переводят в среднее положение (на уровне лезвия ножа). Нож, закрепленный под углом 7 — 9°, подводят до соприкосновения с объектом. После этого микрометрическую шкалу устанавливают на 20 мкм и выравнивают поверхность блока, затем переводят шкалу на 6 —7 мкм. Первые срезы, как правило, не используют, а последующие получают в виде серии при нескольких круговых поворотах рукоятки микротома. Серию срезов (4 — 6) осторожно отделяют от лезвия ножа и с помощью кисточки и препаровальной иглы переносят в коробочку с черной бумагой для дальнейшего разъединения и выбора лучших срезов. После получения срезов парафиновые блоки снимают с бло- кодержателя с помощью скальпеля и убирают в архив. Р. Лил- ли (1969) рекомендует обрабатывать поверхность блока горячим парафином, что предохраняет ткань от высушивания и загрязнения. ПРИЧИНЫ ОШИБОК, ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ ПРИ РЕЗАНИИ МАТЕРИАЛА, ЗАЛИТОГО В ПАРАФИН, И ИХ УСТРАНЕНИЕ 1. Парафин крошится: 1) он слишком тверд, 2) медленно охлаждался при заливке, 3) низкая температура окружающей среды, 4) большой угол наклона ножа. Устранение: 1) перед получением среза подышать на блок, 2) изменить угол наклона ножа, 3) перезалить объект. 31
2. Ткань отделяется от парафина: 1) заливка проводилась холодным парафином, 2) плохая пропитка материала, 3) при проводке остались следы спирта. Устранение: перезалить блок, предварительно поместив его в промежуточную среду (для удаления спирта). 3. Материал плохо режется, ткань белесого цвета, срезы сморщенные, плохо расправляются: недостаточное обезвоживание ткани. Устранение: блок расплавляют в термостате и пропускают по батарее в обратном порядке до 100 % спирта, затем снова заливают по схеме. 4. Нож как бы подскакивает, не срезая ткань или на срезах образуются поперечные полосы: переуплотнение или пересушивание материала при фиксации или обезвоживании. Устранение: резать материал, поместив на него кусочек льда; если срезы не получаются, то из архива надо вырезать новый кусочек, обезводить по схеме и перезалить. 5. Срезы сморщенные, прилипают к поверхности ножа, закручиваются: 1) недостаточный угол наклона ножа, 2) высокая температура в помещении, 3) материал залит в легкоплавкий парафин. Устранение; 1) изменить угол наклона ножа, 2) перед получением срезов поместить материал в холодильник, 3) перезалить в более тугоплавкий парафин. 6. Срезы покрыты полосами и легко разрываются: 1) плохое качество ножа (зазубрины), 2) загрязнение парафина (плотные соринки), 3) наличие в ткани солей кальция. Устранение: 1) передвинуть нож или сменить его на хорошо заточенный, 2) декальцинировать объект или воспользоваться микротомом-пилой со специальными ножами, предназначенными для плотных тканей, керамики, синтетики и др. 7. Срез прилипает к ножу (электризация). Устранение: перед получением среза надо подышать на блок. ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ НА ЗАМОРАЖИВАЮЩЕМ МИКРОТОМЕ Материал, залитый в формалин или спирт, тщательно промывают в воде, затем вырезают кусочек толщиной 3 — 5 мм и смачивают его водой, а также смачивают водой кусочек фильтровальной бумаги площадью 2 — 3 мм . Сначала на столик микротома кладут фильтровальную бумагу, а на нее — кусочек ткани, после чего, слегка придерживая его пальцем, начинают замораживание. Для этого открывают вентиль баллона, затем, то открывая, то закрывая кран у столика микротома, выпускают углекислоту небольшими порциями. Для лучшего и* экономичного замораживания кусочка часто используют маленький стаканчик или металлический колпачок, входящий в набор 32
микротома, которым накрывают кусочек. Углекислота скапливается под стаканчиком, что способствует быстрому замораживанию кусочка. Кусочек начинает белеть, т.е. замораживаться, снизу. После полного замораживания столик вместе с кусочком осторожно подводят под нож и медленными движениями углом ножа ровняют поверхность объекта. Столик подают рукой до тех пор, пока вся поверхность кусочка не станет ровной. Затем прекращают подачу столика вручную и передвигают нож так, чтобы его середина проходила над объектом. Устанавливают нужный угол наклона ножа и регулируют подачу (до 5 — 6 мкм), переходя на автоматическую резку. Срезы с микротомного ножа снимают подушечкой указательного пальца и переносят в воду. Перемороженная ткань может крошиться; для устранения этого недостатка поверхность кусочка «подогревают» пальцем. Если на ноже образуется соскоб ткани, то для получения качественных срезов ткань следует слегка подморозить. Замороженные срезы обычно хранят в 5— 12 % формалине или 70 % либо 96 % спирте. ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕЗОВ С КРУПНЫХ ОБЪЕКТОВ (ГИСТОТОПОГРАММ) Срезы с крупных объектов можно получить на замораживающем, санном и ротационном микротомах. На последних можно резать блоки диаметром до 60 мм, для резания более крупных объектов применяют специальные большие микротомы со сменными столиками диаметром 75—160 мм. Фирмы «М1сгот» (Германия), «5сЬапс1оп» (Великобритания), «ЬКВ» (Швеция) и др. выпускают микротомы, предназначенные для резания крупных объектов, в частности твердых тканей, например неде- кальцинированной костной ткани. На замораживающем микротоме фиксированные в 10 % формалине и отмытые в воде пластины органа или ткани толщиной 1 — 1,5 см обильно поливают водой и замораживают углекислотой или термопарой. Срезы с ножа перекладывают в большой бюкс с водой, обезжиривают и окрашивают. Окрашивание и заключение крупных срезов проводят по обычной схеме с использованием посуды большей вместимости и предметных стекол соответствующих размеров в зависимости от величины объекта. После осторожного расправления на предметном стекле (им может быть отмытая от эмульсии фотопластинка) срезы заключают в водную или синтетическую среду и покрывают отмытой от эмульсии и высушенной рентгеновской пленкой. Для топо- графоанатомических исследований срезы можно заключить между двумя предметными стеклами. 33
ПОДГОТОВКА ПРЕДМЕТНЫХ СТЕКОЛ Предметные стекла, применяемые для получения гистологических препаратов, необходимо предварительно подготовить. Исключение составляют готовые к использованию и специально упакованные импортные предметные стекла. Предметные стекла моют в теплой мыльной воде или кипятят в 2 — 3 % растворе гидрокарбоната натрия, затем ополаскивают горячей водой и промывают в течение нескольких часов в проточной воде. Вымытые стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и на несколько дней помещают в смесь Никифорова: 96 % спирт и эфир (1:1). Обезжиренные стекла извлекают пинцетом из этой смеси, протирают чистой тканью и складывают в коробочку. Для обезжиривания предметных стекол используют также хромовую смесь, в состав которой входят 100 г бихромата калия, концентрированной серной кислоты и 1000 мл горячей воды. Бихромат калия растворяют сначала в горячей воде, затем раствор охлаждают и после этого по стеклянной палочке осторожно по каплям добавляют серную кислоту. Стекла выдерживают в хромовой смеси 2 — 3 дня, а затем тщательно промывают в проточной воде в течение 1 — 2 дней. Предметные стекла также хорошо обезжириваются в крепком растворе соляной кислоты. Через несколько суток их промывают проточной водой и высушивают. Качество обезжиривания можно проверить, капнув на предметное стекло воду из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не собирается в каплю. Для лучшей фиксации срезов на стекле его предварительно смазывают смесью белка с глицерином. Свежий яичный белок взбивают и фильтруют через крупнопористый фильтр, смоченный дистиллированной водой, затем размешивают с равным объемом глицерина и добавляют несколько кристаллов тимола. Смесь хранится в течение нескольких месяцев. Применяют также смесь, в состав которой входят 15 мл сыворотки крови, 5 мл дистиллированной воды и б мл 5 % формалина. После фильтрации смесь готова к нанесению на предметные стекла. Ее использование дает лучшие результаты, чем применение яичного белка, так как при окрашивании не образуется фон. Для нанесения белка на обезжиренные предметные стекла в одну руку берут 5 — 6 стекол в виде веера, а в другую — чистую стеклянную палочку, которой наносят белок, прикасаясь к каждому стеклу. Затем белок растирают обезжиренным спиртом пальцем по поверхности стекла до его середины, прилагая небольшое усилие. Некоторые авторы рекомендуют натертые белком стекла прогревать в термостате, но опыт показывает, что это излишне так как после переноса срезов на стекла их поме- 34
щают в термостат или на специальный столик для просушивания, где одновременно происходит коагуляция белка. Разработан способ фиксации среза к предметному стеклу без предварительного натирания последнего белком с глицерином. В ванночку с теплой дистиллированной водой капают несколько капель жидкого казеинового клея и перемешивают. В полученную мутноватую жидкость опускают срезы, расправляют препаровальной иглой и вылавливают на чистое обезжиренное стекло. Этот способ дает неизменно хороший эффект и вокруг среза отсутствует окрашенный фон, как это часто бывает при применении белка.
ГЛАВА 5 ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ И МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ В основе окрашивания клеток и тканей лежат физико-химические процессы (диффузия, адсорбция, абсорбция, растворимость и др.), происходящие как в красителе, так и в микроструктурах. Большое значение имеют плотность ткани и дисперсность красителя, которые определяют последовательность и скорость окрашивания. Целью окрашивания является более отчетливое выявление различных компонентов клеток и тканей. Некоторые красители обеспечивают этот эффект, растворяясь в выявляемых компонентах, например нейтральных жирах. Другие красители вызывают химическую реакцию, например выявление железа с образованием берлинской лазури в кислой среде. Во многих случаях процесс окрашивания возможен только при наличии протравы, например гематоксилин окрашивает ткань в присутствии солей металлов. В гистологической практике применяют основные, кислотные и нейтральные красители. Основные, или ядерные, красители — это основания или их соли, которые окрашивают структуры кислой природы (хроматин ядер, ядрышко и др.) и называются базофильными. К ним относятся гематоксилин, тионин, кармин, метиловый зеленый и др. Кислотные красители — это кислоты или их соли, с помощью которых выявляют вещества и структуры основной природы (цитоплазматические структуры клеток, эритроциты и т.д.). Таковыми являются эозин, кислый фуксин, конго красный (конгорот), эритрозин. Нейтральные красители: судан III, судан IV, метиленовый синий. Процесс гистологического окрашивания условно подразделяют на прогрессивный и регрессивный, прямой и непрямой, простой и сложный. При прогрессивном типе окрашивания процесс идет до тех пор, пока не достигается интенсивное проникновение красителя в ткань. Регрессивный тип основан на первоначальном перекрашивании структур с последующей дифферен- цировкой до нужного уровня. Если раствор красителя непосредственно действует на ткань, то говорят о прямом окрашива- 36
нии. Окрашивание после предварительной подготовки ткани (протравливания) называется непрямым. Окрашивание одним красителем — простое, а при использовании нескольких красителей — сложное. Для получения оптимальных результатов окрашивания гистологических препаратов нужно использовать растворы, приготовленные в точном соответствии с рекомендуемой прописью. Перед приготовлением нужно внимательно осмотреть реактивы, так как возможны изменение цвета, окисление, кристаллизация и т.п. По мере инактивации, разбавления и изменения концентрации растворов красителя при длительном использовании его необходимо своевременно заменять свежим. Для хранения красителей и проведения окраски применяют химически чистую маркированную посуду. После приготовления новых порций красителя, особенно при использовании различных партий реактивов окраску нужно контролировать под микроскопом. Продолжительность окрашивания реактивами различных фирм варьирует. ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ПОДГОТОВКА СРЕЗОВ К ОКРАШИВАНИЮ Депарафинирование срезов Парафиновые или целлоидин-парафиновые срезы перед окрашиванием освобождают от парафина с помощью любого его растворителя — бензола, толуола, ксилола, бензина. Особенно тщательно удаляют парафин перед исследованием ткани в поляризационном микроскопе, так как парафин обладает двоякопре- ломляющим свойством. Депарафинирование осуществляют по следующей схеме. Ксилол I 10—15 мин (можно в термостате при 37 °С) Ксилол II 3 — 5 мин Спирт 100 % I 1-2 мин Спирт 100 % II ополоснуть Спирт 96 % I » Спирт 96 % II » Дистиллированная вода 2 смены После депарафинирования 100—150 препаратов реактивы нужно менять. Депарафинированные препараты готовы к окрашиванию сразу же после промывания в дистиллированной воде, но во избежание отклеивания срезов, особенно при окраске по Ван-Гизону, их лучше подсушить на воздухе. Если окрашивание производят не сразу, то депарафинированные и высушенные препараты аккуратно, чтобы не повредить срезы, складывают в коробки и окрашивают по мере необходимости. 37
Подготовка целлоидиновых срезов и срезов ткани, залитой в желатин Для получения хороших результатов окраски препаратов ткани, залитой в целлоидин, не требуется специальная подготовка срезов. Их переносят из 70 % спирта в 50 %, а затем в дистиллированную воду. В тех случаях, когда применяемый краситель окрашивает целлоидин, его можно удалить из ткани. Для этого целлоидиновые срезы наклеивают на покрытые белком с глицерином предметные стекла, плотно прижимают фильтровальной бумагой, смоченной в 70 % спирте, и заливают гвоздичным маслом; через 1 мин срез на стекле обрабатывают ацетоном или абсолютным спиртом. После удаления целлоидина срез со стекла переносят в склянку с 70 % спиртом, а затем — в дистиллированную воду. Желатин невозможно удалить из срезов, если блоки уплотнялись в формалине. Желатиновые срезы, не обработанные в формалине, наклеивают на стекло, покрытое белком с глицерином, подсушивают, заливают 2 —4 % раствором уксусной кислоты и помещают на 10—15 мин в термостат при 37 °С. Затем срезы промывают в дистиллированной воде и окрашивают. ЗАМЕЧАНИЯ ПО ТЕХНИКЕ ОКРАШИВАНИЯ При окраске водными красителями срезы переносят в краситель из дистиллированной воды, а при окраске спиртовыми — из соответствующего раствора спирта. После того как препарат приобретает интенсивную окраску, его промывают в воде или спирте для удаления избытка красителя (дифференцировка), контролируя этот процесс под микроскопом. Срезы тканей после целлоидиновой и парафиновой заливки, а также полученные на замораживающем микротоме окрашивают в широкогорлых бюксах или на часовых стеклах. Одновременно окрашивают несколько срезов, но промывают, дифференцируют и т.д. каждый срез отдельно. Препараты можно помещать в красящий раствор в специальных контейнерах, предназначенных для одновременного окрашивания большого количества стекол. Если препаратов немного, то рациональнее краситель наносить непосредственно на срез по каплям с помощью пипетки. Остатки красителя можно слить в склянку и использовать повторно. Д. Кисели (1962) предлагал накрывать при этом срезы стеклянным колпаком, а для увлажнения среды оставлять под колпаком смоченную водой вату. 38
ПРОСВЕТЛЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ СРЕЗОВ Одним из основных условий, определяющих пригодность гистологических препаратов к микроскопическому исследованию, является их прозрачность. Кроме того, препараты должны быть защищены от высыхания и загрязнения. Все это обеспечивается просветлением и заключением в специальные среды, которые можно подразделить на смешивающиеся с водой (глицерин, гуммиарабик, поливиниловый спирт, желатин) и не смешивающиеся с водой (ксилол, толуол, их смеси с фенолом, эфирные масла). Смешивающиеся с водой просветляющие вещества одновременно являются средой для заключения и приготовления постоянных препаратов. Заключение в среды, смешивающиеся с водой Из этих сред чаще применяют глицерин-желатин. Используют также чистый глицерин, однако этот метод не позволяет приготовлять постоянные препараты. Р. Л ил ли рекомендует для этих целей гумми-сироп Апати: чистый гуммиарабик 50 г сахар-рафинад 50 г дистиллированная вода 50 мл Смесь растворяют на водяной бане при постоянном помешивании, затем добавляют 500 мг тимола. Используют также поливиниловый спирт. Среды, смешивающиеся с водой (кроме глицерина), предварительно нагревают на водяной бане, капают нагретой стеклянной палочкой или пипеткой на расправленный срез, слегка подсушивают и покрывают чистым и сухим покровным стеклом. Чистой стеклянной палочкой или обезжиренным пальцем слегка прижимают покровное стекло. При этом излишки среды выдавливаются и их аккуратно удаляют чистой тканью. Для длительного хранения препаратов, чтобы избежать их высыхания, многие авторы рекомендуют окантовывать покровное стекло тонким слоем парафина или целлоидина. Однако опыт показывает, что заключенные в глицерин-желатин препараты и без окантовки хорошо сохраняются свыше 10 лет. Просветление препаратов и заключение в среды, не смешивающиеся с водой Срезы или наклеенные на стекло препараты тщательно обезвоживают в спиртах (70 %, 96 % и 100 %), а затем помещают в любые из просветляющих веществ. Установлено, что для раз- 39
ных исследований предпочтительнее то или иное просветляющее вещество. Так, при окраске по Нисслю и методу Грама — Вейгерта лучшим просветляющим и одновременно дифференцирующим средством является анилиновое масло, но для просветления препаратов при окраске по Ван-Гизону использование его недопустимо. Наиболее распространенными и индифферентными по отношению к красителям веществами являются толуол и ксилол, а также их смеси с фенолом (кристаллический фенол расплавляют в термостате при 56 °С и смешивают с ксилолом в пропорции 1:4 или 1:6). Хорошо обезвоженные в спиртах и просветленные в карбол- ксилоле, а затем в чистом ксилоле препараты готовы к заключению в специальные смолы. С этой целью применяют смолы растительного происхождения — бальзамы (канадский, пихтовый и сибирский кедровый). Все они хорошо растворяются в толуоле и ксилоле. Метод растворения: в склянку с сухой смолой заливают толуол, который постепенно растворяет верхние слои смолы. Процесс можно ускорить, если склянку поместить в термостат при 37 — 40 °С. Полученный густой раствор сливают в другую банку и добавляют новую порцию толуола, одновременно перемешивая раствор и доводя до консистенции жидкого меда. Слишком жидкий раствор по мере испарения толуола вновь загустевает. Приготовленный бальзам хранят в плотно, закрытой посуде. В практической патоморфологии широко используют синтетическую пластмассу — полистирол. Способ применения этого пластического материала предложен Д.С. Саркисовым и подробно изложен в руководстве Г.А. Меркулова «Курс патолого- гистологической техники» (1969). Полистирол хорошо растворяется в ксилоле и толуоле, прозрачен и быстро затвердевает под предметным стеклом, образуя тончайшую пленку. Метод растворения тот же, что и для смол растительного происхождения. Однако со временем полистирол становится хрупким, в пленке появляются трещины, что затрудняет микроскопическое исследование и совершенно неприемлемо для микросъемки. Для предотвращения этих недостатков в 30 % раствор полистирола в ксилоле добавляют пластификатор, придающий пленке эластичность и гибкость, устраняя все недостатки полистирола. В настоящее время в качестве пластификатора используют ди- бутилфталат, широко применяемый в электронной микроскопии. Существует несколько вариантов приготовления полистирола для заключения препаратов: 1) 94 мл 30 % раствора полистирола в ксилоле смешивают с 6 мл дибутилфталата; 2) смесь, состоящую из 100 г полистирола, 100 мл ксилола и 12 мл дибутилфталата, растворяют при 22 °С или в термостате при 37 °С, периодически перемешивая. 40
Готовую синтетическую смолу хранят в плотно закрытой посуде. Технология заключения срезов та же, что и при применении водорастворимых сред. ЯДЕРНЫЕ КРАСИТЕЛИ И ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЕ Окрашивание ядер клеток обусловлено двумя механизмами химического взаимодействия: 1) основные красители, например анилиновые, образуют соли в присутствии ДНК и РНК; 2) образуются комплексы с ионами металлов при применении протравы. В практической работе чаще используют протравные красители. К ним относятся гематоксилин, кармин, сафранин, галлоцианин, ализарин. Хорошо окрашивают ядра такие красители, как янус зеленый, основной коричневый, оксазиновые красители (крезиловый фиолетовый, нильский голубой), тиа- нин, азуры, метиленовый синий, основной фуксин, метиловый зеленый и др. Следует упомянуть о хороших результатах окраски ядер соком черники, которая предложена М.Д. Лавдовским еще в 1887 г. Гематоксилин и способы его приготовления Гематоксилин имеет растительное происхождение: его получают из эфирного экстракта кампешевого дерева. Гематоксилин хорошо растворяется в спирте и плохо в воде. Красящими свойствами обладает продукт окисления гематоксилина — гематеин, поэтому краситель становится пригодным только после созревания — окисления, на которое требуется от 10 дней до 2 — 3 нед. Созревание можно ускорить с помощью солей алюминия, хрома, железа и др. Гематоксилин Эрлиха Гематоксилин кристаллический 2 г Спирт 96% 100 мл Дистиллированная вода 100 мл Глицерин 100 мл Алюмокалиевые или алюмоаммонийные квасцы 3 г Ледяная уксусная кислота 10 мл Гематоксилин растворяют в спирте, а квасцы — в дистиллированной воде, смешивают оба раствора и затем добавляют остальные компоненты. Раствор периодически перемешивают. Через 10—14 дней он приобретает темно-вишневый цвет, что свидетельствует о готовности красителя. Продолжительность окрашивания гематоксилином Эрлиха 4 — 6 мин. Затем следуют промывание в дистиллированной, потом в водопроводной воде, дифференцировка в 1 % солянокислом спирте, восстановление в 41
аммиачной воде и окончательное промывание в дистиллированной воде. Для приготовления солянокислого спирта к 100 мл 70 % спирта добавляют 1 мл концентрированной соляной кислоты; для приготовления аммиачной воды к 50 мл дистиллированной воды добавляют 2 капли крепкого аммиака. Результат: ядра клеток (оболочка, хроматин) темно-синие, ядерный матрикс бледно-голубой или прозрачный. Гематоксилин Делафильда Гематоксилин кристаллический 4 г Спирт 96 % 25 мл Алюмокалиевые или алюмоаммонийные квасцы 40 г Дистиллированная вода 400 мл Растворенный в спирте гематоксилин смешивают с раствором квасцов, смесь держат на свету 3 — 4 дня, периодически перемешивая, затем фильтруют и добавляют 100 мл глицерина и 100 мл метилового спирта. Раствор оставляют на свету 3 — 4 дня, фильтруют, хранят в банке с притертой пробкой. Перед применением краситель разбавляют в 2 раза дистиллированной водой или слабым 2 % раствором алюмокалиевых квасцов. Продолжительность окрашивания 4 — 6 мин, затем следуют промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, восстановление в аммиачной воде и окончательное промывание в дистиллированной воде. Результат: хроматин и кариолемма ярко-синие. Гематоксилин Гарриса Гематоксилин кристаллический Спирт 96 % Алюмоаммонийные квасцы Дистиллированная вода Смешивают растворы I и II, затем добавляют 60 мл глицерина и 2,5 г оксида ртути (красной или желтой). Раствор нагревают до 100 °С, остужают, фильтруют. Перед использованием к 100 мл раствора добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты. Преимуществами гематоксилина Гарриса являются быстрота приготовления и четкость окраски ядер. Продолжительность окрашивания 3 — 4 мин. Затем следуют промывание и дифференцировка, восстановление в аммиачной воде и окончательное промывание в дистиллированной воде. Результат: ядра ярко-синие. Гематоксилин Гарриса в модификации Кисели Д. Кисели исключил из прописи квасцы, считая, что для окисления гематоксилина достаточно желтого оксида ртути. Зо'мл ) Раствор 1 1000Гмл I Раств°Р П 42
Гематоксилин кристаллический 1 г ] „ Спирт 96% 10 мл | раст»»Р1 Гематоксилин кристаллический 20 г 1 „ тт Дистиллированная вода (теплая) 200 мл \ Растворы I и II смешивают и доводят до кипения, в кипящую смесь добавляют 500 мг желтого оксида ртути. Полученный раствор охлаждают, фильтруют. Он сразу пригоден к применению. Продолжительность окрашивания 4 — 6 мин. Затем следуют те же процедуры, что и при окрашивании гематоксилином других модификаций. Результат: ядра ярко-синие. Гематоксилин Ганзена Гематоксилин кристаллический 1 г 1 „ т Спирт 100% 10 мл | РЛС**°Р1 Алюмокалиевые квасцы 20 г Дистиллированная вода 100 мл Раствор II Растворы I и II смешивают и добавляют 3 мл насыщенного раствора перманганата калия. Смесь нагревают до кипения, охлаждают, фильтруют. Раствор сразу готов к применению. Продолжительность окрашивания 3 — 4 мин. Затем следуют те же процедуры, что и при окрашивании гематоксилином других модификаций. Результат: ядра красно-фиолетовые. Гематоксилин Маллори (водный) Гематоксилин кристаллический 2,5 г Алюмоаммонийные квасцы 50 г Дистиллированная вода 1000 мл Раствор выдерживают 10 сут при 25 °С, добавляют 440 мг перманганата калия и 2,5 г тимола. Перемешивают несколько раз, перед окрашиванием фильтруют. Продолжительность окрашивания 3 — 4 мин. Затем следуют те же процедуры, что и при окрашивании гематоксилином других модификаций. Результат: ядра синие. Кислый гемалаун Майера (водный) Гематоксилин кристаллический 1 г Алюмоаммонийные квасцы 50 г Дистиллированная вода 1000 мл Йодат натрия 200 мг Хлоралгидрат 50 г Лимонная кислота 1 г 43
Квасцы растворяют в воде без нагревания, затем добавляют и растворяют гематоксилин, йодат натрия, лимонную кислоту и последним — хлоралгидрат. После растворения всех компонентов краску фильтруют, и она готова к применению. Продолжительность окрашивания 4 — 6 мин. Результат: ядра красно-фиолетовые. Гематоксилин Кораци (водный) Гематоксилин кристаллический 0,1 г Йодат калия 2 — 3 кристалла Алюмокалиевые квасцы 5 г Дистиллированная вода (теплая) 100 мл Смесь перемешивают до полного растворения и добавляют 25 мл глицерина. Раствор перед использованием фильтруют. Продолжительность окрашивания 1—2 мин. Результат: ядра ярко-синие. Железный гематоксилин Гейденгайна Гематоксилин кристаллический 1 г Спирт 96% 10 мл Дистиллированная вода 90 мл Краситель созревает 4 нед. Добавление 100 мг йодата натрия ускоряет «созревание» — он готов к использованию уже через 1 ч после приготовления. Окрашивание проводят разведенным в 2 раза раствором. Продолжительность окрашивания 1 — 36 ч. Методика окрашивания 1. Препарат помещают в 2,5 % раствор железоаммонийных квасцов на 2 — 12 ч. 2. Ополаскивают в дистиллированной воде. 3. Окрашивают гематоксилином Гейденгайна 1 — 36 ч. 4. Промывают в водопроводной воде — 3 смены по 10 мин, затем обезвоживают, просветляют, заключают. Результат: ядра и цитоплазматические структуры черные и синевато-черные. Железный гематоксилин Брусси Гематоксилин кристаллический 1 г 1 раствор \ Дистиллированная вода при 40 °С 100 мл ) Железоаммонийные квасцы 8 г 1 Дистиллированная вода при 40 °С 100 мл } РаствоР п Растворы I и II смешивают, фильтруют. 44
Продолжительность окрашивания 30 с—1 мин. Затем промывают в водопроводной воде, обезвоживают, просветляют и заключают. Результат: ядра синевато-черные. Железный гематоксилин Вейгерта Гематоксилин кристаллический 1 г Спирт 96% 100 мл Раствор трихлорида железа гексагидрата 50 % 4 мл Дистиллированная вода 95 мл Концентрированная соляная кислота 1 мл Раствор А Раствор Б Растворы хранят в отдельных склянках с притертыми пробками. Перед использованием нужное для окрашивания количество краски получают путем смешивания растворов А и Б в пропорции 1:1. Продолжительность окрашивания 1—2 мин, затем промывают в водопроводной воде. Результат: ядра черно-синие. Другие ядерные красители Кармин Кармин Дистиллированная вода 1 г 100 мл Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют, добавляют 10 мл 40 % формалина. Продолжительность окрашивания 30 мин —24 ч. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, обезвоживание, просветление и заключение. Результат: ядра ярко-красные. Сафранин Обеспечивает получение хороших результатов после фиксации ткани в тетраоксиде осмия и особенно после применения фиксаторов, содержащих хром. Сафранин 10 г Спирт 96% 155 мл Дистиллированная вода 145 мл Основной раствор 20 мл Спирт 50 % 80 мл Основной раствор Краситель Продолжительность окрашивания 24 ч. Затем следуют промывание дистиллированной водой, дифференцировка в соляно- 45
кислом спирте, дистиллированная вода, обезвоживание, просветление и заключение. Результат: хроматин ядер и кариолемма ярко-красные. Галлоцианин Рекомендуется для окрашивания тканей, залитых в желатин. Галлоцианин 100 г Хромовые квасцы 5 г Дистиллированная вода 100 мл Сначала растворяют квасцы, затем добавляют галлоцианин, раствор кипятят при постоянном помешивании, охлаждают, фильтруют. Срок годности красителя 1 мес. Продолжительность окрашивания 24 — 48 ч. Затем следуют промывание в 2 сменах дистиллированной воды, обезвоживание, просветление и заключение. Результат: хроматин и тигроидное вещество синевато-черные. Сок черники Свежие чистые ягоды черники разминают в фарфоровой ступке, смешивают с равным объемом 96 % спирта, настаивают 1 — 2 сут и фильтруют. Перед окрашиванием часть раствора разводят равным количеством 2 % водного раствора алюмокалиевых квасцов и добавляют 2 — 3 кристаллика тимола. Продолжительность окрашивания 5 — 7 мин. Затем следуют промывание в дистиллированной воде, дифференцировка в солянокислом спирте, промывание в дистиллированной воде, обезвоживание, просветление и заключение. Результат: ядра темно-фиолетовые. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ КРАСИТЕЛИ Окрашивание цитоплазмы клеток происходит в результате связывания оснований и белков кислотными красителями. В группу диффузных (кислых) красителей входят карбоновые и суль- фоновые кислоты, нитро-, азокрасители и др. В гистологической практике постоянно применяют эозины, пикриновую кислоту, оранжевый Г, кислый фуксин, конго красный (конгорот), азокармин, эритрозин. Чаще используют 1 % водные растворы этих красителей, но можно применять и 1 % спиртовой раствор. Продолжительность окрашивания колеблется от 5 с до 3 — 5 мин в зависимости от сорта и серии красителя. Если препарат перекрашивается, то излишек краски легко удаляется при ополаскивании в дистиллированной воде и последующем обезвоживании препарата или среза в спиртах. 46
Смесь кислого фуксина и пикриновой кислоты (пикрофук- син) готовят из насыщенного водного раствора пикриновой кислоты и 1 % водного раствора кислого фуксина (см. главу 22). МЕТОДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ В арсенале патоморфологической лаборатории должны быть отработаны и в любой момент применены следующие методики: окраска гематоксилином и эозином, резорцин-фуксином, по Ван-Гизону, методы окраски, предназначенные для выявления амилоида, фибрина, кератина и слизи по Крейбергу, извести по Косее, железа по Перлсу, липидов Суданом III и Суданом черным. Методика окраски гематоксилином и эозином Процедура окрашивания срезов, полученных на замораживающем микротоме, после парафиновой или целлоидиновой заливки различается лишь по техническим приемам, а порядок проведения окраски одинаков. Дистиллированная вода ополоснуть Раствор гематоксилина 1 — 20 мин Дистиллированная вода ополоснуть Солянокислый спирт дифференцировка Аммиачная вода срезы синеют (контроль под микроскопом) Проточная вода 5—10 мин Дистиллированная вода ополоснуть Раствор эозина 10 с —3 мин Спирт 96 %, карбол-ксилол, заключение. Результат: ядра синие, цитоплазма и межклеточное вещество розовые. Методы выявления амилоида Окраска генциановым или метиловым фиолетовым по Варшавскому и Проскурневой Окрашивают срезы, полученные на замораживающем микротоме или после заливки в парафин, но не приклеенные на предметное стекло. Генциановый фиолетовый (1 % водный раствор) 2—15 мин Водопроводная вода ополоснуть Уксусная кислота (2 % раствор) до красновато-фиолетового оттенка Водопроводная вода ополоснуть 47
Срезы, полученные на замораживающем микротоме, извлекают на предметное стекло и переносят в 50 % водный раствор ацетата калия. Применение глицерин-желатина приводит к исчезновению метахроматического (розово-фиолетового) окрашивания. Плавающие парафиновые срезы вылавливают на предметное стекло и высушивают в течение 2 —3 ч в термостате при 37 °С, затем депарафинируют в ксилоле и заключают в бальзам. Результат: амилоид красновато-фиолетового цвета, прочие ткани синего. Окраска конго красным Конго красный (1 % водный раствор) 1 —3 мин Водопроводная вода ополоснуть Спирт 70 % или 80 % дифференцировка до бледно-розового цвета Водопроводная вода ополоснуть Квасцовый гематоксилин для докраски ядер 2 — 3 мин Водопроводная вода ополоснуть Затем обезвоживают, просветляют, заключают в смолу. Результат: амилоид красного цвета, ядра синеватые. Можно вначале окрасить ядра гематоксилином, отдифференцировать в солянокислом спирте, а затем окрашивать конго красным. Элективный метод выявления фибрина [Зербино Д.Д. и др., 1983] Методика пикро-Маллори 1. Срезы помещают в гематоксилин Гарриса на 4 —6 мин. 2. Промывают в дистиллированной воде в течение 10 мин. 3. Переносят в пикрофуксиновый раствор (0,2 г пикриновой кислоты + 0,8 г кислого фуксина + 2мл ледяной уксусной кислоты + 98 мл дистиллированной воды) на 5 мин. 4. Промывают в 2 % растворе ледяной уксусной кислоты и переносят на 5 мин в дифференцирующий раствор. Его готовят из основного раствора (25 г фосфорно-вольфрамовой кислоты + 2,5 г пикриновой кислоты + 100 мл 96 % спирта), к 40 мл которого добавляют 60 мл дистиллированной воды. 5. Ополаскивают в проточной воде и переносят на 5— 10 мин в 1 % раствор анилинового голубого. 6. Промывают в 2 % растворе уксусной кислоты и переносят на 2 —5 мин в дифференцирующий раствор (10 мл основного раствора + 90 мл дистиллированной воды). 7. Промывают в 2 % растворе ледяной уксусной кислоты. 8. Обезвоживают, просветляют, заключают в бальзам. 48
Методика пикро-Маллори для быстрой окраски 1. Срезы помещают в гематеин Майера на 4 —6 мин. 2. Ополаскивают в дистиллированной воде. 3. Переносят в раствор пикро-Маллори (к 98 мл дистиллированной воды последовательно добавляют 0,2 г пикриновой кислоты, 1 г кислого фуксина, 2 г анилинового голубого, 1 г фос- форно-вольфрамовой кислоты; смесь доводят до кипения и охлаждают, затем добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты и фильтруют на 5 мин. 4. Промывают в 2 % растворе уксусной кислоты. 5. Переносят в дифференцирующий раствор (10 мл основного раствора + 90 мл дистиллированной воды) на 2 —5 мин. 6. Промывают в 2 % растворе уксусной кислоты. 7. Обезвоживают, просветляют, заключают в бальзам. Результат: «молодой» и «зрелый» фибрин окрашиваются в красный цвет, «старый» фибрин в синий, эритроциты в оранжевый, мышечная ткань в фиолетовый, соединительная ткань в голубой. Выявление кератина и слизи по Крейбергу Фиксированный в 10 % растворе формалина материал заливают в целлоидин или парафин. Для окрашивания готовят алыдиано- вый синий, сафранин и эритрозин. 1. Альциановый синий: 50 мл 1 % водного раствора альциа- нового синего + 50 мл 1 % раствора уксусной кислоты + 10 мг тимола. 2. Сафранин: 5 г сафранина смешивают в термостойкой посуде со 100 мл 100 % спирта, затем кипятят на водяной бане 1 ч. Полученный раствор сливают в бутылку и к осадку добавляют еще 100 мл 100 % спирта. Вновь кипятят, повторяя эту процедуру не менее 5 раз. Полученный экстракт (700 мл раствора позволяют окрасить 1000 срезов) фильтруют и хранят в тщательно закрытой посуде. 3. Эритрозин: на водяной бане готовят 1 % водный раствор эритрозина, затем фильтруют и добавляют 10 мг тимола. Методика окраски 1. Депарафинированные срезы ополаскивают в дистиллированной воде. 2. Ядра окрашивают любым гематоксилином без длительной дифференцировки. 3. Очень быстро дифференцируют в 0,5 % растворе соляной кислоты. 4. Тщательно просушивают фильтровальной бумагой. 49
5. Переносят в раствор эритрозина на 5 мин. 6. Очень быстро ополаскивают в дистиллированной воде, 96 % спирте, дистиллированной воде. 7. Переносят в раствор альцианового синего на 3 — 5 мин. 8. Быстро обезвоживают в 96 % спирте. 9. Погружают в раствор сафранина — 5 мин. 10. Ополаскивают в 2 сменах 100 % спирта. 11. Просветляют и заключают по любой методике. Результат: ядра клеток темно-синие, кислые гликозамино- гликаны голубые, клетки красные, прочие ткани розовые и фиолетовые.
ГЛАВА б ОСНОВНЫЕ ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ Цель гистохимии как раздела гистологии и цитологии — микроскопическая локализация химических соединений в клетке и тканях при сохранении их структуры, а также изучение механизмов и специфичности реакций, используемых с этой целью. Результат гистохимического анализа в равной мере зависит от качества проведения гистохимической реакции и подготовки материала. Процесс подготовки включает взятие образца ткани, фиксацию, промывание, обезвоживание, заливку в парафин или синтетические смолы и приготовление срезов, мазков или отпечатков. На каждом из этих этапов важно правильно выбрать конкретную методику, обеспечивающую наилучшую сохранность исследуемых веществ при одновременной сохранности, насколько это возможно, прижизненной структуры клеток и тканей. Для последующего гистохимического анализа наиболее важен выбор метода фиксации. ФИКСАЦИЯ Целью фиксации биологического материала для гистохимического анализа является перевод живого вещества из лабильного состояния в стабильное, т.е. прекращение процессов аутолиза и стабилизация веществ и структур клетки в такой мере, при которой их локализация, целостность и взаимное расположение практически не изменяются при последующем обезвоживании, заливке в парафин или в смолу, приготовлении срезов, а также под воздействием пучка электронов, если проводится ультрацитохимический анализ. Для достижения этой цели возможны три подхода: высушивание, замораживание и химическая фиксация. Наиболее часто как в гистологической, так и гистохимической практике используют метод химической фиксации. На его результаты влияют время, прошедшее после взятия материала, продолжительность фиксации, рН и изотоничность фиксирующей среды, температура и химические свойства выбранного фиксирующего реагента. Очень важное значение имеет время, прошедшее от прижизненного взятия материала из организма До начала фиксации. Этот срок должен быть максимально со- 51
кращен, желательно до нескольких минут, хотя неплохая морфологическая сохранность, достаточная для идентификации ткани, клеток и веществ с целью патоморфологической диагностики, может быть обеспечена при фиксации материала через 30 — 90 мин после операции. Температура фиксирующего раствора для гистохимических целей в большинстве случаев устанавливается от 0 до 4 °С для замедления аутолитических процессов и для снижения скорости возможной диффузии исследуемого вещества. Фиксация на холоду особенно рекомендуется для энзимогистохимических и ультрацитохимических исследований. В химической фиксации для гистохимических целей используют в первую очередь альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид и др.), тетраоксид осмия, хромовую кислоту и ее соли, спирты (этанол, метанол и др.), ацетон, соли ртути (например, сулема), уранилацетат и кислоты (например, уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, азотная и др.). Формальдегид и смеси с формальдегидом Фиксатор, наиболее широко используемый как в гистологии, так и в гистохимии,— формальдегид. Это газ, растворимый в воде до концентрации 40 % по массе; именно в такой концентрации он и поступает в продажу под названием «формалин». В гистологической практике обычно используют 10 % раствор формалина, что соответствует 4 % раствору формальдегида. В водных незабуференных растворах формальдегид со временем превращается в муравьиную кислоту, метиловый спирт и ацетон, которые существенно ухудшают качество фиксации, особенно для гистохимии, электронной микроскопии. К недостаткам формальдегида относится также его довольно высокая способность к полимеризации и выпадению белого осадка пара- формальдегида. В результате этих процессов точную концентрацию формальдегида в растворах формалина установить не представляется возможным. Формальдегид и смеси с формальдегидом можно использовать в большинстве гистохимических исследований. Особенно хорошо зарекомендовали себя при выявлении ферментов, главным образом гидролитических и липидов, кальций-формол по Бейкеру, а для выявления нуклеиновых кислот фиксатор ФСУ (формалин — спирт — уксусная кислота). Фиксатор Лилли для кислых гликозаминогликанов: нитрат свинца 8 г 40 % раствор формальдегида 10 мл вода 10 мл этанол 80 мл 52
Продолжительность фиксации 24 ч при комнатной температуре, 2 — 3 дня при 4 °С, 10—14 дней при -25 °С. Для фиксации гликогена наряду с известным фиксатором Буэна используют раствор Жандра, в котором к формалину, помимо пикриновой и уксусной кислот, добавлен этанол. Фиксатор Жандра для гликогена: пикриновая кислота (насыщенный раствор в 96 % спирте) 85 частей раствор формальдегида 40% 10 частей ледяная уксусная кислота 5 частей В рутинной электронной микроскопии и электронно-микроскопической гистохимии формальдегидные фиксирующие смеси проявили себя вначале не с лучшей стороны, что было обусловлено наличием в формальдегиде вредных примесей, главным образом метанола (до 16 %). Свободный от метанола формалин, полученный из параформальдегида, обеспечивает практически такую же ультраструктурную сохранность клеток, как и глута- ровый альдегид, поэтому его с успехом применяют для многих гистохимических реакций. Метод приготовления свободного от метанола 4 % раствора формальдегида из параформальдегида по Гайеру: 2 г параформальдегида в 50 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4 — 7,6) нагревают, помешивая, до 70 °С до просветления раствора, а затем охлаждают и фильтруют; 4 % раствор формальдегида в 0,1 М фосфатном буфере имеет рН 7,3 — 7,5. Метод приготовления свободного от метанола 40 % раствора формальдегида из параформальдегида по Глауэрт: готовят 40 % раствор параформальдегида, растворяя 40 г порошка формальдегида в 100 мл дважды дистиллированной воды при нагревании до 65 °С, постоянно помешивая. Добавляют несколько капель 40 % гидроксида натрия до просветления раствора. Полученный раствор 40 % параформальдегида охлаждают перед смешиванием с другими компонентами фиксирующей смеси. Состав фиксирующей смеси из 2 % формальдегида и 2,5 % глутарового альдегида по Карновски: 0,1 М фосфатный или какодилатный буфер (рН 7,2 — 7,4) 40 мл 4 % раствор формальдегида на 0,1 М фосфатном или како- дилатном буфере (рН 7,2 — 7,4) 50 мл 25 % раствор глутарового альдегида 10 мл Главным преимуществом формальдегида по сравнению с глу- таровым альдегидом и тетраоксидом осмия является его более высокая проникающая способность. Однако его взаимодействие с белками идет медленно и, что не следует забывать, процесс обратим. Следовательно, длительное отмывание кусочков от формальдегидного фиксатора нежелательно. 53
Глутаровый альдегид Глутаровый альдегид обеспечивает наилучшую морфологическую сохранность и стабилизацию многих ферментов, поэтому его наиболее часто используют в электронной микроскопии и ультрацитохимических исследованиях ферментов. Состав фиксирующей смеси с глутаровым альдегидом: 0,2 М фосфатный или какодилатный буфер (рН 7,2 — 7,4) 50 мл дистиллированная вода 40 мл 25 % глутаровый альдегид 10 мл сахароза 8,5 г Глутаровый альдегид не защищает липиды от последующего вымывания, и если не провести дофиксации в тетраоксиде осмия, то до 95 % липидов вымывается спиртами и /или ацетоном в процессе обезвоживания материала. Некоторые авторы рекомендуют использовать лишь свежие фиксирующие альдегидные смеси, хотя из практики известно, что они хорошо сохраняются в холодильнике в течение нескольких месяцев; в таких случаях необходимо лишь контролировать рН раствора. Тетраоксид осмия Тетраоксид осмия — дорогой реагент. Он поступает в продажу в запаянных стеклянных ампулах по 0,5 — 2 г. Для получения водных растворов тетраоксида осмия чисто вымытую ампулу обертывают чистой плотной бумагой, раздавливают щипцами или молотком, вместе с осколками стекла помещают в дистиллированную воду нужного объема и выдерживают не менее 24 ч, так как он плохо растворяется в воде. Соблюдение чистоты при этой операции и хранение в чистой посуде позволяют сохранить водные 1—4 % растворы в течение многих месяцев даже при комнатной температуре. При этом флакон с раствором необходимо закрыть хорошо притертой пробкой и хранить в темноте. Для первичной фиксации липидов используют 1 % раствор тетраоксида осмия на 0,1 М фосфатном буфере, а также в смеси с хромовой или уксусной кислотой. Состав смеси для вторичной фиксации: 2 % раствор тетраоксида осмия в дистиллированной воде 5 мл сахароза 850 мг 0,2 М фосфатный или какодилатный буфер (рН 7,2 — 7,4) 5 мл Раствор тетраоксида осмия 2 % готовят не менее чем за 1 сут; для лучшей сохранности липидов добавляют хлорид кальция или магния до конечной концентрации 1—3 ммоль. Если смесь используют для первичной фиксации, то вместо сахарозы добавляют хлорид натрия. 54
Раствор Флемминга: 2 % раствор тетраоксида осмия на дистиллированной воде 2 мл 1 % раствор хромовой кислоты на дистиллированной воде 7,5 мл ледяная уксусная кислота 0,5 мл В этом растворе можно фиксировать блоки тканей толщиной не более 2 мм в течение 12 — 24 ч. Промывают 12 ч в воде и перед обезвоживанием выдерживают в течение нескольких часов в 70 % спирте. Смешивать три компонента раствора Флем- минга следует непосредственно перед использованием. Для приготовления фиксирующего раствора 2 части жидкости Марчи (2,5 г бихромата калия, 1 г сульфата натрия и 100 мл дистиллированной воды), приготовленной непосредственно перед использованием, смешивают с 1 частью 1 % раствора тетраоксида осмия. Прекрасная морфологическая сохранность клеток при осмиевой фиксации, в том числе и на ультраструктурном уровне, объясняется главным образом воздействием на белки, которые при этом не коагулируют, а желатинизируются, что практически не сопровождается сморщиванием ткани. Тетраоксид осмия реагирует не только с аминогруппами, главным образом триптофана, цистеина и гистидина, но и с этиленовыми группами ненасыщенных липидов, которые восстанавливают его с образованием осмиевой черни. Благодаря этому тетраоксид осмия действует не только как фиксатор, но и как контрастирующее вещество, в связи с чем он нашел широкое применение в электронной микроскопии. Это свойство в последние годы стало играть большую роль в электронной гистохимии при использовании 3,3'-диаминобензидина, превращающегося в гистохимических реакциях в процессе окислительной полимеризации в избирательно осмирующийся продукт. В электронной микроскопии тетраоксид осмия используют преимущественно для вторичной фиксации (или постфиксации) после первичной фиксации (или префиксации) в растворах альдегидов. Осмиевая постфиксация уменьшает потери липидов при последующих обезвоживании и заливке в смолы. При этом не только липидные структуры, но также клеточный матрикс, митохондрии и клеточные мембраны лучше контрас- тируются. Хорошего контрастирования клеточных структур можно достичь также путем постфиксации в 1 % растворе тетраоксида осмия с 1,5 % гексацианоферратом (феррицианидом) калия на 0,1 М фосфатном буфере: 4 % раствор тетраоксида осмия на дистиллированной воде 0,5 мл 6 % раствор гексацианоферрата калия на дистиллированной воде 0,5 мл 0,2 М фосфатный буфер (рН 7,2) 1 мл 55
Продолжительность постфиксации 2 ч при комнатной температуре. Этот вариант постфиксации рекомендуется как для морфологических, так и особенно для электронно-микроскопических гистохимических исследований, поскольку достигаемый при этом «мягкий» контраст не маскирует продукт гистохимической реакции и позволяет не проводить дополнительное контрастирование цитратом свинца по Рейнольдсу. Хромовая кислота и хроматы Хроматы дают нерастворимые соединения с белками и липида- ми, образуют комплексы с водой. Такие комплексы, подобно формальдегиду, могут образовывать связи с реакционноспособ- ными группами белков, что и оказывает фиксирующий эффект. Хроматы могут быть также использованы для стабилизации ли- пидов благодаря их способности окислять ненасыщенные жирные кислоты. Их можно применять для фиксации гликогена и нуклеиновых кислот. Наиболее часто используют фиксатор Элфтмана (бихромат- сулема), содержащий 2,5 % бихромат калия и 5 % сулему: сулема 5 г бихромат калия 2,5 г дистиллированная вода 100 мл Продолжительность фиксации 3 дня при комнатной температуре. Уранилацетат Уранилацетат обычно используют в электронной микроскопии как третий фиксатор после фиксации в альдегиде и тетраоксиде осмия и одновременно как контрастер. Он особенно хорошо выявляет мембраны благодаря стабилизации фосфолипидов, хотя при этом другие компоненты, например гликоген, могут исчезать или терять способность окрашиваться. Уранилацетат применяют в концентрации 0,25 — 2 % в воде, в 50 — 70 % спирте, в веронал-ацетатном или натрий-малеатном буфере (рН 5,0) в процессе обезвоживания и при контрастировании срезов. Фосфатный и какодилатный буферы нельзя использовать из-за образования осадков, а ткани, фиксированные тетраоксидом осмия на этих буферных смесях, подлежат длительной промывке (от нескольких часов до 1 сут и более) перед фиксацией в урани л ацетате. Со временем красящие свойства уранилацетатных растворов ослабевают и возможно образование осадков. Эти растворы обычно хранят в темноте при комнатной температуре. Можно, однако, насыщенный раствор ура- 56
нилацетата в 50 % спирте (продолжительность окрашивания 8 мин) хранить в течение многих лет в холодильнике и пользоваться им без фильтрования, если образующиеся после контрастирования игольчатые кристаллы уранилацетата на ультратонких срезах непродолжительно отмывать в 50 % спирте подогретом до 31 — 35 °С. В гистохимических исследованиях имеют значение не только фиксирующие свойства уранилацетата, но и его красящие свойства при выявлении нуклеопротеидов методом дифференциального контрастирования по Бернару. Уранилацетат используют также для стабилизации ДНК и других компонентов клетки. Кислоты Чистые кислоты для фиксации биологических объектов используются реже. Однако благодаря своему более быстрому проникновению в ткань по сравнению с другими компонентами фиксирующей смеси они оказывают смягчающее действие и таким образом препятствуют сморщиванию ткани, воздействуя в процессе гидролиза на гетерополярные валентные связи и ослабляя состояние гидратации. Кислоты (пикриновая, уксусная, трихлоруксусная, азотная) входят в различных сочетаниях с формальдегидом и спиртом во многие известные фиксирующие смеси (по Буэну, Жандру, Карнуа, Лилли, Ценкеру, Бродскому и др.), используемые для фиксации нуклеопротеидов, полисахаридов, а также простейших и сперматозоидов. Кроме того, азотная, муравьиная и трихлоруксусная кислоты входят в различные сочетания с формальдегидом и спиртом в состав декальцинирующих смесей. 5. Но и М.^ Кагпоузку (1968) получили более полную сохранность химических компонентов и антигенных структур, используя смеси формальдегида и глутарового альдегида с пикриновой кислотой (тринитрофенол) и другими соединениями с тремя иитрогруппами. Спирты и ацетон Спирты и ацетон наиболее часто используют для осаждения белков. Они одновременно обезвоживают и уплотняют ткань. При длительном выдерживании ткани в абсолютных спиртах и ацетоне ткань становится настолько плотной, что приготовление срезов практически невозможно. Спирты и ацетон обеспечивают хорошую морфологическую сохранность бактерий, фибрина, эластических волокон и мазков клеток. В гистохимии, как и в гистологии, .спирты и ацетон используют не только как фиксирующие, но и как обезвоживающие агенты. В гистохимических исследованиях их применяют в чистом виде при фиксации многих окислительно-восстановитель- 57
ных ферментов, однако при этом подавляется активность ряда фосфогидролаз. Спирты и ацетон используют также в различных сочетаниях с кислотами, солями металлов и альдегидами для фиксации нуклеопротеидов и полисахаридов. Фиксация 0,65 % раствором хлорида магния в безводном ацетоне обеспечивает хорошую сохранность фосфолипидов [Бухвалов И.Б., 1969]. Фиксация и одновременное обезвоживание проводятся при комнатной температуре в двух сменах фиксатора по 60 мин. ГИСТОХИМИЯ БЕЛКОВ Белки принимают участие в построении практически всех структур клеток и тканей. Для гистохимии представляет интерес не подтверждение наличия белков в тех или иных клеточных и тканевых структурах, а оценка его содержания или усуа- новление класса белка. Гистохимические методы выявления белка берут начало от классических реакций аналитической, органической и биологической химии. К ним относятся: реакция Миллона на тирозин; диазониевая реакция на тирозин, триптофан и гистидин; ксан- топротеиновая реакция на фенольные производные; реакция Сакагуши на аргинин; нитропруссидная реакция на сульфгид- рильные группы; нингидриновая реакция на свободные МНЬ- группы; реакция сулема —бромфеноловый синий; реакция ди- нитрофторбензола с ароматической группой тирозина по Сэнге- РУ и др. Строго говоря, эти реакции позволяют в большей или меньшей мере установить наличие только определенных аминокислот, однако положительную реакцию можно также считать доказательством присутствия белка в целом, поскольку в гистологических и цитологических препаратах свободные аминокислоты не встречаются. Для цитоспектрофотометрической оценки содержания белка в гистологических срезах и цитологических препаратах можно рекомендовать окраску на гистоны прочным зеленым РСР по Ол- ферту и Гешвинду и окраску нафтоловым желтым 5 при рН 2,8 на основные группы лизина, аргинина и гистидина по Дейтчу. Общие реакции на белок Окраска суммарного белка бромфеноловым синим по Бонхегу 1. Материал фиксируют в 1 % формалине, жидкости Карнуа, заливают в парафин или получают криостатные срезы. 2. Доводят парафиновые срезы до воды. 58
3. Окрашивают в течение 2 ч при комнатной температуре в 2 % водном растворе уксусной кислоты с 1 % раствором сулемы и 0,05 % раствором бромфенолового синего. 4. Промывают срезы в течение 5 мин в 0,5 % уксусной кислоте. 5. Переносят непосредственно в трет-бутанол. 6. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам или синтетическую среду. Результат: белки окрашиваются в темно-синий цвет. Диазониевая реакция Паули и методы тетразониевого сочетания по Даниелли В 1904 г. РаиН предложил использовать в качестве реагента на тирозин и гистидиндиазобензолсульфокислоту, которая относится к классу диазосоединений, содержащих диазогруппу. Изомер диазогруппы, состоящий из трех- и пятивалентного атомов азота, называемый диазонием, определяет высокую реактивность диазосоединений. Диазосоединения вступают в реакцию азосочетания с ароматическими аминами, фенолами и нафтолами с образованием азокрасителя, и их широко применяют в промышленном производстве красителей. Диазобензосульфокислота в щелочных растворах взаимодействует с фенольной группой тирозина, индольной группой триптофана и гетероциклической имидазольной группой гистидина с образованием окрашенных продуктов реакции. Применив эту реакцию в гистологических исследованиях, ОашеШ (1947) нашел ее недостаточно интенсивной, поэтому он в качестве индикатора вместо диазосоединений использовал тетразосоедине- ния, т.е. соединения, содержащие две диазогруппы. В качестве таковых он применил двойные диазониевые соли — тетразоти- рованный бензидин или его диметоксипроизводное — тетразо- тированный о-дианизидин (прочный синий В). Этот широко используемый в гистохимии метод тетразониевого сочетания по Даниелли основан на взаимодействии аминокислот, в частности тирозина, триптофана и гистидина, с тетразотированным бензи- дином и последующем сочетании оставшейся свободной диазогруппы с (3-нафтолом или Н-кислотой. Реакция тетразониевого сочетания по Даниелли в модификации Кисели Готовят 40 % раствор параформальдегида, растворяя 40 г порошка формальдегида в 100 мл дважды дистиллированной воды при нагревании до 65 °С с постоянным помешиванием. 1. Материал фиксируют в 1 % формалине, спирте, с помощью лиофильной сушки, наиболее пригодна фиксация по Кар- 59
нуа. Заливают в парафин. Полученные срезы толщиной 5 — 7 мкм депарафинируют, промывают в дистиллированной воде и веронал-ацетатном буфере (рН, 9,2). 2. Обрабатывают свежететразотированным бензидином на ледяной бане в течение 20 мин. Тетразотированный бензидин готовят следующим образом: 18 мг бензидина растворяют с добавлением 0,83 мл концентрированной соляной кислоты в 50 мл дистиллированной воды. Раствор охлаждают на ледяной бане, затем добавляют 14 мг нитрита натрия, растворенного в 1 мл дистиллированной воды, и в течение 10 мин часто помешивают, затем подщелачивают 10 — 20 % раствором гидроксида натрия или калия до рН 9,0. В процессе подщелачивания раствор приобретает коричневый цвет. Срезы помещают в щелочной раствор тетразотированного бензидина. Этот раствор нестоек, и его следует использовать сразу после приготовления. Вместо него можно использовать 0,2 % водный раствор прочного синего В в трис-НС1-буфере (рН 9,2); инкубировать 5 мин при комнатной температуре. 3. Промывают дистиллированной водой, затем охлажденной 0,1 н. соляной кислотой и вновь дистиллированной водой. 4. Проводят реакцию азосочетания в веронал-ацетатном буфере (рН 9,2), насыщенном р-нафтолом или Н-кислотой в течение 15 мин. 5. Промывают дистиллированной водой, затем 1 % уксусной кислотой и вновь дистиллированной водой. 6. Обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам или дистрен-дибутилфталат ксилол. Результат: белки тканей окрашиваются в различные оттенки красновато-коричневого цвета. При использовании (3-нафтола обезвоживание следует проводить быстро. После фиксации в формалине интенсивность реакции немного уменьшается, так как атомы водорода ароматических колец тирозина, триптофана, гистидина и фенилаланина необратимо блокируются формальдегидом. Реакция с динитрофторбензолом для выявления общего белка по Даниелли 2,4-Динитрофторбензол (ДНФБ) реагирует количественно со свободными аминогруппами белков, 1-группами лизина, фе- нольными ОН-группами тирозина, имидазольными группами гистидина. Соединения с тирозином и гистидином бесцветны, а соединения со свободными аминогруппами имеют слабо-желтую окраску. ДНФБ может также реагировать с 5Н-группами, но эта реакция, по-видимому, не стехиометрична. ДНФБ можно использовать как блокирующий агент для всех указанных реактивных групп. 60
Реакция с динитрофторбензолом для выявления общего белка по Даниелли в модификации Берстона 1. Материал фиксируют в спирте, ацетоне, формальдегиде, заливают в парафин. 2. Промывают депарафинированные срезы в спирте. 3. Обрабатывают 1 % раствором ДНФБ в 90 % спирте, содержащем 0,01 н. (0,04 %) гидроксида натрия, при комнатной температуре 20 — 24 ч. 4. Промывают в четырех сменах 90 % спирта. 5. Промывают в дистиллированной воде. 6. Восстанавливают 5 % дитионитом натрия 40 мин при 45 — 60 °С (при этом желтая окраска обесцвечивается; при комнатной температуре продолжительность восстановления нитро- групп больше). 7. Для диазотирования помещают срезы на 5 мин при температуре от 0 до 4 °С в следующий раствор: 3 мл 10 % серной кислоты доводят до 50 мл 5 % нитритом натрия (растворы перед сливанием следует охладить до 4 °С). 8. Промывают в дистиллированной воде. 9. Обрабатывают холодным (4 °С) веронал-ацетатным буфером (рН 9,2), насыщенным Н-кислотой или р-нафтолом, 15 мин. 10. Промывают в дистиллированной воде и 70 % спирте, содержащем 1 % соляную кислоту. 11. Обезвоживают, просветляют в ксилоле и заключают в синтетическую среду. Результат: положительная реакция выражается в образовании комплекса азокрасителя красновато-оранжевого цвета. Поскольку выявляемые группы встречаются повсюду, окрашивание наблюдается во всем срезе. Интенсивно окрашиваются эластические, коллагеновые волокна и эритроциты. Реакции на аминогруппы Реакция нингидрин-Шифф Под действием нингидрина происходит окислительное дезами- нирование аминокислоты белков с образованием углекислоты, альдегида и красителя. Этот краситель голубовато-фиолетового цвета легко подвержен диффузии, легко распадается и не удовлетворяет современным гистохимическим требованиям. Однако можно использовать окислительные свойства нингидрина и выявить образующиеся альдегидные группы с помощью реактива Шиффа. Наряду с нингидрином можно использовать аллоксан и другие окислители, например гипохлорит натрия и хлорамин Т. 61
Нингидрин-Шифф(аллоксан-Шифф)-реакция для выявления МН2-групп по Яшуме и Ичикаве 1. Материал фиксируют в жидкостях Карнуа, Ценкера, этиловом спирте с 5 % уксусной кислотой, заливают в парафин. 2. Депарафинируют срезы и промывают в 2 сменах 100 % спирта. 3. Обрабатывают 0,5 % нингидрином или 1 % раствором ал- локсана в 100 % спирте (16 — 20 ч при 37 °С). 4. Промывают проточной водой 2 — 5 мин. 5. Переносят в реактив Шиффа на 30 мин при комнатной температуре. 6. Промывают в 3 — 4 сменах смеси, состоящей из 200 мл дистиллированной воды, 10 мл 10 % гидросульфита натрия и 10 мл 1 н. соляной кислоты 2 мин. 7. Промывают проточной водой 10 мин. 8. Обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле; заключают в бальзам. Результат: ЫЬЬ-группы, связанные с белком, приобретают окраску от красной до красно-фиолетовой. Примечание. П. 6 можно опустить. После п. 7 можно провести докрашивание ядер, например гемалауном. Поскольку МН2-группы широко представлены в белках, реакции с нингидрином или аллоксаном можно использовать также для ориентировочного изучения распределения белков. Этот методический подход с использованием образующихся на промежуточном этапе альдегидных групп широко применяют в гистохимии, например при выявлении ДНК, полисахаридов и ряда ферментов, катализируюших реакции с образованием альдегидов. Гистохимическое выявление тирозина: реакция Миллона в модификации Бейкера 1. Материал фиксируют в формальдегиде, заливают в парафин или целлоидин. 2. Депарафинированные срезы проводят через 50 % спирт до дистиллированной воды. Целлоидиновые срезы толщиной 20 — 30 мкм проводят так же. 3. Помещают в стеклянный сосуд с реактивом Миллона: к 100 мл 10 % раствора серной кислоты добавляют 10 г сульфата ртути (II), при нагревании растворяют; раствор охлаждают и доводят дистиллированной водой до 200 мл; к 5 мл этого раствора перед использованием добавляют 0,5 мл 0,25 % раствора нитрита натрия и нагревают до кипения. 4. Охлаждают до комнатной температуры в течение нескольких минут. 5. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды по 2 мин. 62
6. Заключают в глицерин-желатин или обезвоживают в спирте и заключают в бальзам через ксилол. Результат: положительная реакция проявляется красным или желтовато-красным окрашиванием, интенсивность которого зависит от количества тирозина в структурах, содержащих белок. Гистохимическое выявление триптофана: реакция с диметил-аминобензальдегид-нитритом по Адамсу 1. Материал фиксируют в 4 — 10 % формалине 4 — 12 ч; в 80 % спирте с 1 % трихлоруксусной кислотой 24 ч, заливают в парафин. 2. Депарафинированные в ксилоле срезы проводят через 100 % спирт, просушивают при температуре 30 — 40 °С. 3. Обрабатывают 50 % п-диметиламинобензальдегидом в концентрированной соляной кислоте 1 мин. 4. Помещают в 1 % нитрит натрия в концентрированной соляной кислоте на 1 мин. 5. Промывают срезы в проточной воде 30 с. 6. Быстро промывают в 1 % солянокислом спирте. 7. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, просветляют в ксилоле, заключают в бальзам. Результат: белки, содержащие триптофан, окрашиваются в темно-синий цвет различной интенсивности; интенсивно окрашиваются гранулы клеток Панета, гранулы пепсиногена в главных клетках желез желудка, зимогенные гранулы экзокринных клеток поджелудочной железы, мышцы, фибрин, фибриноген, нейрокератин, чехлы волосяных луковиц. Примечание. Вп.2 вместо высушивания можно после удаления спирта покрывать срезы тонкой пленкой целлоидина (0,25 % раствор целлоидина в смеси спирта с эфиром в соотношении 1:1). Для приклеивания срезов более пригоден хромат- желатин, чем белок-глицерин. Гистохимическое выявление аргинина: реакция Сакагучи для выявления аргинина в модификации Бейкера 1. Материал фиксируют в жидкостях Ценкера, Буэна, Кар- нуа, «Суза» (допустима также фиксация в нейтральном формалине), заливают в парафин. 2. Депарафинированные в ксилоле или толуоле срезы после обработки 100 % спиртом покрывают тонкой пленкой целлоидина (1 % раствор целлоидина в смеси спирта с эфиром 1:1) и уплотняют в 70 % спирте. 3. Доводят через 50 % спирт до дистиллированной воды и тщательно промывают. 63
4. Извлеченные из воды срезы высушивают на воздухе. 5. Обрабатывают 15 мин раствором сс-нафтол-гипохлорита натрия, который готовят непосредственно перед использованием: к 4 мл 1 % гидрооксида натрия добавляют 4 капли 1 % а-нафтола на 70% спирте и 8 капель 1 % гипохлорита натрия. Реакция окрашивания развивается в реакционной смеси постепенно. 6. Сливают реактив с предметного стекла, препараты осторожно просушивают фильтровальной бумагой и помещают на 3 мин в смесь высушенного пиридина и безводного хлороформа. 7. Заключают под покровное стекло в смесь пиридина с хлороформом или в безводный пиридин. Поскольку сохранность таких срезов непродолжительна, рекомендуют просматривать и фотографировать их сразу после приготовления. Результат: белки, содержащие аргинин, окрашиваются в оранжевый цвет разных оттенков. Примечание. При интерпретации результатов реакции следует учитывать, что: а) стабильность окраски низка; б) для проявления окрашивания требуется гипохлорит, который, однако, мешает реакции образования красителя; в) щелочная реакционная среда оказывает разрушающее действие на ткань; г) точная локализация реакции затруднена из-за возможной диффузии продукта. Реакции на связанные с белками дисульфидные (цистин) и сульфгидрильные (цистеин) группы Значение гистохимического выявления сульфгидрильных (5Н=) и дисульфидных (-§=3-) групп определяется наличием в белковых молекулах цистина и цистеина. Свободные сульфгидрильные группы в тканях легко окисляются, частично под влиянием гистологической фиксации, поэтому количественно оценивать их содержание следует с осторожностью. Гистохимическое выявление серосодержащих аминокислот возможно только для цистина и цистеина, связанных с белковыми молекулами и присутствующих в достаточно высокой концентрации. Свободный цистин и цистеин, а также глутатион гистохимически не выявляются, так как они присутствуют в очень низких концентрациях и вымываются из тканей в процессе их обработки. Гистохимические реакции, направленные на определение сульфгидрильных групп, могут быть применены в случае дисульфидных групп, но при этом последние перед проведением гистохимической реакции должны быть восстановлены до сульфгидрильных групп. 64
Совместное и раздельное выявление сульфгидрильных и ди- сульфидных групп возможно с помощью диоксидинафтилди- сульфид-реакции (ДДД-реакции) на трех параллельных препаратах (срезах): на первом выявляются свободные реактивные сульфгидрильные группы; на втором дисульфидные группы восстанавливаются до сульфгидрильных (например, тиоглико- латом натрия, цианидом калия, сульфидом аммония, аскорбиновой кислотой и др.), и выявляют их вместе; на третьем свободные сульфгидрильные группы блокируют (например, ацети- лиодидом или М-этилмалеимидом), а дисульфидные группы восстанавливают до сульфгидрильных в условиях сохранения блокирования имеющихся свободных сульфгидрильных групп. Сопоставление таких препаратов дает представление о локализации сульфгидрильных и дисульфидных групп. Метод выявления сульфгидрильных групп Баррнетта—Зе- лигмана основан на том, что в щелочной среде дисульфиды избирательно окисляют только тиоловые группы в белках. Ди- сульфидный реагент — 2,2'-диокси-6,б'-динафтилдисульфид специфически реагирует с сульфгидрильными группами фиксированных белков при рН 8,5 с образованием комплекса, не растворимого в воде и органических растворителях. После тщательного отмывания непрореагировавшего реагента и побочных продуктов (6-тио-2-нафтол) образовавшийся комплекс преобразуют в азокраситель путем сочетания с солью диазония, например тетразотированным диортоанизидином (прочным синим В). ДДД-реакция для выявления связанных с белком сульфгидрильных групп по Баррнетту—Зелигману 1. Материал фиксируют 24 ч в смеси трихлоруксусной кислоты и спирта (1 % трихлоруксусная кислота в 80 % спирте), жидкости Карнуа, формалине. 2. Быстро заливают в парафин (лучше в вакуумном сушильном шкафу); парафиновые срезы прикрепляют небольшим количеством смеси белка и глицерина на предметное стекло. 3. Срезы депарафинируют и через спирт понижающейся концентрации доводят до дистиллированной воды. Варианты: срезы, депарафинированные в ксилоле, промывают в 100 % спирте и покрывают 0,5 % целлоидином (0,5 г целлоидина растворяют в 100 мл смеси 100 % спирта с эфиром в соотношении 1:1). Тонкую пленку целлоидина на срезах просушивают, уплотняют в 70 % спирте, переносят срезы в дистиллированную воду. 4. Срезы обрабатывают (в кювете) ДДД-реагентом (50 мг 2,2- диокси-6,6-динафтилдисульфида + 30 мл 100 % спирта + 70 мл натрий-веронального буфера, рН 8,5) при 50 °С 1 ч. 5. Кювету со срезами охлаждают при комнатной температуре +10 мин. 65
6. Быстро промывают срезы в дистиллированной воде, затем промывают 10 мин в дважды сменяемой дистиллированной воде, подкисленной до рН 4,0 — 4,5 уксусной кислотой. 7. После проведения через ряд спиртов возрастающей концентрации промывают срезы в двух сменах 100 % эфира 5 мин. 8. Доводят через спирт до дистиллированной воды и ополаскивают в ней. 9. Срезы при комнатной температуре помещают на 2 мин в свежеприготовленный 0,1 % раствор тетразотированного диор- тоанизидина (соль прочного синего В) на 0,1 М фосфатном буфере Серенсена (рН 7,4). 10. Промывают в проточной воде, а затем в дистиллированной. И. Монтируют в глицерин-желатин или проводят через серию спиртов возрастающей концентрации и ксилол, заключают в бальзам. Результат: структуры с большим количеством активных сульфгидрильных групп окрашиваются в синий цвет, при меньшем количестве более рассеянных 5Н-групп возникает красное окрашивание. Примечание. Для прохождения реакции имеет значение оптимальная концентрация используемой соли диазония; более высокие концентрации ведут к получению непостоянных результатов. Вместо прочного синего В можно использовать другие соли диазония: прочный красный КС, прочный синий КК, прочный черный К. ДДД-реакция допускает проведение микроспектрофотометрической количественной оценки содержания сульфгидрильных групп в срезах тканей. ДДД реагент можно также использовать для химического определения сульфгидрильных групп в белках. Практически из всех аминокислот, встречающихся в тканях человека, положительную реакцию Сакагучи дает только аргинин, гуанидин, креатинин и мочевина дают отрицательную реакцию. По существу почти все клеточные белки содержат аргинин, но реакция Сакагучи идет только в тех случаях, когда аргинин содержится в значительных концентрациях, как, например, в основных белках, в частности в гистонах, поэтому реакция Сакагучи имеет важное значение для выявления основных белков в тканях. Метод окисления надмуравьиной кислотой для выявления дисульфидина по Пирсу 1. Материал фиксируют в кальций-формоле, формалине, заливают в парафин. 2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды. 3. Обрабатывают 10 — 30 мин раствором надмуравьиной кислоты (к 40 мл 98 % муравьиной кислоты добавляют 4 мл 30 % 66
свежей перекиси водорода и 0,5 мл концентрированной серной кислоты; смесь готовят за 1 ч до использования и применяют не более 24 ч). 4. Срезы промывают в дистиллированной воде. 5. Помещают на 30 — 60 мин в реактив Шиффа (особенно пригодны реактивы Шиффа, приготовленные по Де Томасси или Итакаве). 6. Промывают в проточной слегка теплой воде 10 мин. 7. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам. Результат: структуры, содержащие цистин, в зависимости от его количества окрашиваются в цвета от розового до темно- красного. Особенно интенсивно окрашиваются кератинсодержа- щие структуры. Четкую реакцию дают нейромедиаторы, содержащие дисульфидные группы, а также базофильные клетки передней доли гипофиза. Вариант. После окисления надмуравьиной кислотой срезы окрашивают 10—15 мин 0,0005 М метиленовым синим (молекулярная масса 319,8) в 0,1 М веронал-ацетатном или глициновом буфере (рН 2,6 — 2,8) вместо реактива Шиффа, затем промывают дистиллированной водой и накрывают покровным стеклом для непосредственного микроскопирования или быстро обезвоживают в спиртах и т.д. Блокирование и превращение реакционноспособных групп в белках Реакции блокирования и превращения реакционноспособных групп аминокислот могут служить не только контролем на специфичность гистохимической методики, но и, как это видно при рассмотрении некоторых реакций гистохимии белков, быть одновременно решающим этапом при гистохимическом выявлении реактивных групп (например, окислительное дезаминиро- вание, реакция с динитрофторбензолом). В табл. 1 представлены наиболее часто используемые реакции подобного рода. ГИСТОХИМИЯ НУКЛЕОПРОТЕИДОВ В связи с исключительно важной биологической ролью нуклео- протеидов в белковом синтезе и генетических механизмах необходимо их отдельное рассмотрение. Нуклеопротеиды состоят из белкового компонента, в котором преобладают основные белки типа гистонов и протаминов, и небелкового компонента, или простетической группы — нуклеиновой кислоты. В тканях животных и растений, а также в микроорганизмах встречаются два типа нуклеиновых кислот — дезоксирибонук- леиновая кислота (ДНК) и рибонуклеиновая кислота (РНК), 67
Таблица 1. Блокирование и превращение реакционноспособных групп в белках [1_ирре, 1980] Метод Дезаминирование Динитрофенилирование Анилирование Нитробензоплирование Метилирование в «мягких» условиях в «жестких» условиях Деметилирование Окисление надмуравьиной кислотой Окисление надуксусной кислотой Окисление персульфатом Йодирование Окисление йодом Карбоксиалкилирование Блокирование малеинимидом Блокирование меркаптидом* а) хлоридом ртути б) хлоридом фенилртути Восстановление тиогликолатом Блокирование группы или аминокислоты -ын2 N1^2-, фенольные, имидазольные, 5Н-группы КН2-, окси-, фенольные и 5Н-группы ЫН2-, тирозил-ОН соон- СООН-, КГН2- Этерифицированные кислые группы вновь высвобождаются Триптофан, цистин То же Триптофан Тирозин (триптофан) -5Н -5Н -5Н -5Н -5Н -5-5- | представляющие собой высокополимерные молекулы полинук- леидов, образованные из мононуклеотидов. Каждый мононук- леотид состоит из пентозы (дезоксирибозы или рибозы), орто- фосфорной кислоты и пуринового или пиримидинового основания. Пентоза связана диэфирной связью с фосфорной кислотой и гликозидной — с основанием. Мононуклеотиды объединены в полинуклеотидную цепочку через фосфатную группу. В ДНК пентоза представлена дезоксирибозой, пуриновые основания — аденином и гуанидином, а пиримидиновые основания — тимином и цитозином. В РНК пентоза находится в виде рибозы, а тимин замещен урацилом. Различия по тимину и ура- цилу позволяют проводить дифференцированное радиоавтографическое изучение ДНК и РНК с соответствующим радиоактивным предшественником тимидином для ДНК и уридином для РНК. Другое важное различие — спиральная двухцепочечная структура и значительно большая молекулярная масса (1 — 8 млн) у ДНК по сравнению с РНК, имеющей, как правило, одиночную цепь и существенно меньшую степень полимеризации,— обусловливает их различное окрашивание основными красителями — метиловым зеленым и пиронином. 68
Гистохимическое выявление нуклеиновой кислоты можег быть направлено на любой из трех ее компонентов: 1) пуриновые и пи- римидиновые основания выявляют по поглощению ультраоиоле- тового излучения; 2) углеводный компонент определяют пс образующимся в результате кислотного гидролиза альдегидным группам с помощью реактива Шиффа или его аналогов; 3) фосфорную кислоту выявляют по сродству к основным красителям. Кроме того, разработаны и обоснованы методы ферментатизной и химической экстракции нуклеиновых кислот, повышающие надежность и специфичность гистохимических методов. Выявление пуриновых и пиримидиновых оснований Гетероциклические кольца пуриновых и пиримидиновых оснований ДНК и РНК специфически поглощают ультрафиолетовое излучение при длине волны 260 нм. Количественную оценку содержания нуклеиновых кислот проводят по оптической плотности при указанной длине волны. Дифференцированное выявление ДНК и РНК на основании различий в поглощении ультрафиолетового излучения осуществляют с помощью специфического экстрагирования ДНК- и РНК-азой. Выявление углеводного компонента ДНК по Фельгену Принцип этого метода выявления ДНК заключается в том, что в результате мягкого гидролиза под влиянием 1 н. соляной кислоты в фиксированных препаратах происходит специфическое отщепление от ДНК пуриновых оснований (аденина и гуаниди- на), связанных с С-атомом дезоксирибозы. Удаление пуриновых оснований раскрывает потенциальные альдегидные группы, которые после этого способны реагировать с реактивом Шиффа и образовывать кислотостойкий краситель красно-фиолетового цвета. Образовавшийся окрашенный комплекс очень стабилен. Фуксин может быть экстрагирован из соединения только после обработки горячими кислотами или щелочами. Метод Фельгена прост и надежен, но условия кислотного гидролиза играют в нем решающую роль. Продолжительный гидролиз приводит к ослаблению окрашивания, причиной которого может быть деполимеризация и экстрагирование ДНК, а также химические изменения. Оптимальная продолжительность кислотного гидролиза 1 н. соляной кислотой при 60 °С определяется выбором фиксатора. Нейтральный 10 % формалин 8 мин Жидкость Карнуа 8 мин Спирт 80 % 5 мин Формалин-спирт-уксусная кислота 7 мин Жидкость Буэна 22 мин Жидкость Ценкера 5 мин 69
При обследовании указанных условий гидролиза РНК практически полностью вымывается из срезов, поэтому не происходит образования альдегидов из рибозы и при правильном проведении реакции Фельгена РНК всегда остается неокрашенной. Стандартная реакция Фельгена 1. Материал фиксируют одним из перечисленных фиксаторов, заливают в парафин или готовят мазки суспензированных клеток. 2. Срезы депарафинируют и через ряд спиртов убывающей концентрации доводят до воды. 3. Быстро промывают в холодной 1 н. соляной кислоте. 4. Помещают при 60 °С в 1 н. соляную кислоту на оптимальное время гидролиза (от 8 до 22 мин). Хорошие результаты дает также гидролиз в 5 н. соляной кислоте при 37 °С. 5. Быстро промывают в 1 н. соляной кислоте, затем в дистиллированной воде. 6. Переносят в реактив Шиффа на 45 мин. 7. Промывают в 3 сменах свежей смеси, состоящей из 5 мл 10 % пиросульфита калия, 5 мл 1 н. соляной кислоты, дистиллированной воды до 100 мл) по 2 мин в каждой. 8. Промывают в дистиллированной воде 2 мин. 9. Возможна докраска 1 % водным раствором светло-зеленого (1 мин) или 0,5 % спиртовым раствором прочного зеленого 1 мин. 10. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам. Результат: структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в красно-лиловый цвет. После обработки дезоксирибонуклеазой реакция отрицательна. Приготовление реактива Шиффа. Существуют различные способы приготовления реактива Шиффа. Состав реактива (содержание фуксина, кислотность, насыщение сернистым газом) оказывает выраженное влияние на реакцию с альдегидами, причем не все партии фуксина удовлетворительного качества. Готовый реактив следует хранить в холодильнике в полностью заполненном сосуде с хорошо притертой пробкой. Реактив может сохраняться в течение нескольких месяцев и внезапно терять красящие свойства. Слабая розовая окраска реактива не влияет на его специфичность и может быть устранена с помощью активированного угля. 1. Метод ди Томаси. Растворяют 1 г основного фуксина в 200 мл кипящей дистиллированной воды. Охлаждают до 52 °С. Фильтруют и добавляют 1 г пиросульфита натрия или калия. После выдерживания раствора в темноте 16 — 24 ч, добавляют 2 г активированного угля, встряхивают и фильтруют в сосуд для хранения. 70
2. Метод Итакавы и О г у р ы. Растворяют 1 г основного фуксина в 200 мл кипящей воды. Охлаждают и фильтруют через пористый стеклянный фильтр, в раствор пропускают сернистый ангидрид (свежегенерированный или из газового баллона). После того как красный раствор станет прозрачным, сосуд закрывают пробкой и оставляют на ночь при комнатной температуре. Добавляют 500 мг активированного угля, хорошо встряхивают и фильтруют. 3. Метод Элфтмана (модификация «холодного» метода Лилли). Добавляют 1 г основного фуксина и 2 г гидросульфита натрия к 100 мл 0,2 н. соляной кислоты в колбу на 150 мл. Встряхивают 2 ч, добавляют 500 мг активированного угля, хорошо встряхивают и фильтруют. Окрашенные по методу Фельгена препараты можно хранить бесконечно долго, выцветание их незначительное: согласно результатам цитоспектрофотометрии, 3 — 4 % за 1-й год хранения. Продукт реакции Фельгена удовлетворяет требованиям закона Ламберта—Бера, что позволяет проводить цитоспектрофотомет- рический анализ препаратов. Абсорбционный максимум красителя составляет 585 нм. Несмотря на сравнительную простоту метода Фельгена и надежность современной техники для цитоспектрофотометрии, могут быть получены ошибочные данные об уменьшении содержания ДНК в ядрах клеток опухолей вплоть до появления гаплоидного класса клеток. Такие ошибки исключаются при цито- фотометрировании не гистологического препарата, а мазков из суспензированной ткани. Реакция выявления фосфорной кислоты основными красителями Основные, или катионные, красители обладают свойством более или менее избирательно связываться с отрицательно заряженными кислотными группами. Эти реакции не строгоспецифичны к фосфатным группам нуклеиновых кислот, поэтому необходим контроль (блокирование, а также химическая или ферментативная экстракция). В гистохимии нуклеиновых кислот используют красители ти- азинового или оксазинового ряда, например тионин. Для тиози- новых красителей характерно наличие тиазониевого катиона с выровненными связями (заряд равномерно распределен между атомами серы и азота), поэтому цвет катиона тиозиновых красителей от голубого до синего. Широко известный метиленовый синий является тетраметильным производным тионина. При рН от 3,0 до 5,0 он окрашивает не только нуклеиновые кислоты, но и кислые гликозаминогликаны. Их можно дифференцировать в контрольных опытах с нуклеазами. К тиазиновым красителям 71
относятся толуидиновыи синий, который связывается с ДНК при рН 4,0 — 6,0 в стехиометрических соотношениях, и крезило- вый фиолетовый, связывающийся с РНК при рН 4,2 стехиомет- рически, поэтому может быть использован для цитофотометри- ческого определения содержания РНК. Окраска комплексом галлоцианин-хромовые квасцы Принадлежащий к оксазиновым красителям галлоцианин в водных растворах существует в виде катиона и может образовывать комплексы с металлами (в частности, с хромом), специфически связывающиеся с нуклеиновыми кислотами. С помощью цитофотометрических исследований установлено, что при выявлении РНК и ДНК каждый их мононуклеотид через фосфатную группу связывается с одним катионом красителя. В результате этой реакции РНК и ДНК окрашиваются в серо-голубой цвет. При рН от 1,5 до 1,7 специфичность связывания красителя с нуклеиновыми кислотами довольно высока. Поскольку краситель связывается с субстратом в стехиометрических соотношениях, этот метод может быть использован в количественных цитофотометрических исследованиях. Выявление ДНК и РНК смесью галлоцианина и хромовых квасцов 1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в жидкости Карнуа или спирте в течение 2 —4 ч при температуре 2 —4 °С и заливают в парафин. 2. Депарафинированные срезы проводят через спирты убывающей концентрации до воды. 3. Помещают на 24 — 48 ч при комнатной температуре в раствор смеси галлоцианина и хромовых квасцов. 0,15 г галлоцианина кипятят в 10 мл 5 % раствора хромовых квасцов; после охлаждения фильтруют и доводят дистиллированной водой до 100 мл; рН красящего раствора доводят до 1,64 (можно 1 н. соляной кислотой). 4. Дифференцируют в дистиллированной воде, спиртах возрастающей концентрации, заключают в бальзам. Результат: ядра и цитоплазматические структуры, содержащие РНК (например, тельца Ниссля в нервных клетках), окрашиваются в темно-синий или черный цвет. Примечание. Продолжительность окрашивания можно уменьшить (правда, при одновременном усилении неспецифического окрашивания) путем повышения температуры (44 — 56 °С) до 4 ч. Смесь галлоцианина с хромовыми квасцами можно также использовать для докрашивания ядер при радиоавтографии. 72
Окраска ДНК и РНК метиловым зеленым-пиронином по Браше в модификации Курника 1. Материал фиксируют в 10 % нейтральном формальдегиде 4—12 ч или жидкости Карнуа 4 —24 ч при 4 °С; заливают в парафин. 2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды. 3. Окрашивают срезы в смеси метилового зеленого-пирони- на (12,5 мл 2 % пиронина С5 + 7,5 мл 2 % метилового зеленого + 30 мл дистиллированной воды) б мин при температуре 18-24 °С. 4. Просушивают фильтровальной бумагой. 5. Дифференцируют в 2 сменах н-бутанола по 5 мин. 6. Просветляют в 3 сменах ксилола по 5 мин. 7. Заключают в бальзам. Результат: структуры, содержащие ДНК, окрашиваются в голубовато-зеленый цвет, а содержащие РНК — в красный. Контроль. Предварительная обработка срезов рибонук- леазой или деоксирибонуклеазой; в зависимости от фермента остаются неокрашенными участки, в которых локализуются РНК или ДНК. Примечание. Метиловый зеленый обычно содержит примесь метилового фиолетового, который перед использованием рекомендуется удалять с помощью экстракции в хлороформе, лучше всего путем встряхивания в делительной воронке. При оценке содержания РНК в клетке следует учитывать, что пиронин частично экстрагируется из срезов при промывании и обезвоживании. Метод регрессивного контрастирования рибонуклеопротеидов по Бернару В основе этого метода лежит дифференцирование с помощью комплексообразователей — ЭДТА или цитрата. Согласно К. Вегпаг, ультратонкие срезы для электронной микроскопии контрастируют водным раствором уранилацетата, а затем обрабатывают в ЭДТА или цитратном буфере, в результате чего ионы уранила вымываются из хроматина гораздо быстрее, чем из рибонуклеопротеинов (РНП). В предварительных опытах отрабатывают такую продолжительность дифференцирования в ЭДТА, чтобы РНП в отличие от хроматина еще сохранили бы связанные ионы уранила и могли бы быть контрастированы цитратом свинца. Материал, фиксированный тетраоксидом осмия, для этой цели непригоден. 73
Регрессивное контрастирование рибонуклепротеидов по Бернару в модификации Бурглена Для приготовления раствора ЭДТА 7,44 г динатриевой соли ЭДТА помещают в 50 мл дистиллированной воды и ставят на магнитную мешалку. Медленно, по каплям, добавляют свежеприготовленный 1 н. гидроксид натрия до полного просветления раствора и доводят рН до 7,0. Добавляют дистиллированной воды до 100 мл. Раствор оставляют в течение 4 дней при 4 °С. Его можно использовать в течение нескольких месяцев. 1. Ультратонкие срезы материала, фиксированного в альдегидных растворах и залитого в гликольметакрилат или эпон, на медных сеточках контрастируют 30 мин 5 % водным раствором уранилацетата при 37 °С. 2. Осторожно промывают дистиллированной водой. 3. Переносят в раствор ЭДТА на 5—15 мин. 4. Осторожно промывают дистиллированной водой. 5. Контрастируют цитратом свинца 5—10 мин. 6. Промывают дистиллированной водой. Специфичность метода Бернара по отношению к РНП может быть повышена при использовании его в сочетании с экстракцией нуклеазами. Однако в большинстве случаев в этом нет необходимости, так как метод применяют главным образом для изучения РНП в ядре, где другие структуры, выявляемые этим способом, отсутствуют. Ферментативный и химический гидролиз нуклеопротеидов Дальнейший анализ нуклеиновых кислот осуществляют посредством ферментативной или химической экстракции. Преимуществом нуклеаз по сравнению с другими агентами является высокая специфичность, однако эффективность их использования зависит от способа фиксации, заливочной среды и других факторов. Наиболее эффективно действие ДНК- и РНКазы на ткани, фиксированные в формальдегиде. После фиксации тет- раоксидом осмия возможно переваривание РНКазой, но не ДНКазой. Ферментативное расщепление лучше проводить на замороженных срезах, но можно и в кусочках ткани, и на депа- рафинированных срезах. Для электронно-микроскопической гистохимии лучше использовать заливку в гликольметакрилат после фиксации в формальдегиде: при этом сохраняется как структура, так и чувствительность к действию РНК- и ДНКазы. Для химического гидролиза ДНК и РНК используют хлорную, трихлоруксусную и соляную кислоты. Все нуклеиновые кислоты удаляют из срезов ткани путем обработки 5—10 % трихлоруксусной кислотой при 90 °С в течение 10 мин или 10 % перхлоруксусной кислотой при 70 °С в течение 20 — 30 мин. Для экстракции РНК рекомендуется использовать холодную 10 % 74
хлорную кислоту (18 ч при 4 °С). Успех химической экстракции, особенно на ультратонких срезах, также зависит от способа фиксации, заливочной среды, толщины среза и т.д., поэтому в каждом случае следует находить оптимальные условия в предварительных опытах. ГИСТОХИМИЯ УГЛЕВОДОВ Биологическая роль углеводов многообразна. В организме они выполняют опорные и энергетические функции, некоторые углеводы являются составными частями биологически важных соединений (АТФ, циклической АМФ, нуклеиновых кислот, гепарина, витамина С и др.). Гликопротеиды как специфический компонент иммуноглобулинов играют важную роль в иммунных механизмах, определяя антигенную активность сывороточных и клеточных факторов. Кроме того, продукты расщепления углеводов используются для синтеза практически всех классов соединений в живой клетке. Классификация углеводов В живой клетке углеводы существуют в форме моно-, олиго- и полисахаридов. В гистологических препаратах они сохраняются практически только в виде полисахаридов: во всяком случае только полисахариды могут быть с достоверностью выявлены гистохимически. Правда, возможно также гистохимическое выявление глюкозы и витамина С. Общепринятой классификации полисахаридов не существует. Для практических гистохимических целей достаточно разделить полисахариды на гомо- и гетерополисахариды. Гомополисахариды построены из остатков молекул моносахаридов, главным образом пентозы и гексозы, соединенных между собой кислотными мостиками. Гомополисахаридами являются крахмал, инулин, клетчатка, гликоген. К ним с определенными оговорками можно также отнести хитин и полигалак- туроновую кислоту. Гетерополисахариды разделяют на гликозаминогликаны (ГАГ) и гликопротеины. К кислым гликозаминогликанам ГАГ относят гиалуроновую кислоту, молекула которой построена из остатков глюкуроновой и уксусной кислот и гексозамина; хонд- роинин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматан-сульфат, кератан-сульфат, гепаритин-сульфат, гепарин, молекулы которых содержат остатки гексозамина, глюкуроновой или уроно- вой кислот, серной и уксусной кислот в различных сочетаниях. В тканях кислые ГАГ, кроме гепарина, находятся в соединении с белками. Такие комплексы, в которых к белковому стержню присоединены полисахаридные цепи, носят название «протео- 75
гликаны». Все эти соединения входят в состав матрикса соединительной ткани, крови, синовиальной жидкости, слизи. Гликопротеины являются белками, к молекуле которых ко- валентно присоединены олигосахариды: гексозы, гексозамины, сиаловые кислоты, фу козы и др. Такие соединения являются составной частью клеточных мембран, слизистых секретов желез, сывороточных белков, ферментов, гормонов, «неколла- геновых белков» соединительной ткани и т.д. Гистохимическая идентификация углеводов Выявление углеводов основано, как правило, на методах общего анализа химических групп. Используются методы окисления, метахроматическое окрашивание основными красителями, реакции связывания коллоидных металлов, выявление базофи- лии, окрашивание кармином, реакции блокирования и превращения реакционноспособных групп, методы ферментативного гидролиза, радиоавтографию, иммуногистохимию. Методы окисления 1,2-гликолей до альдегидов Реакция Шифф-йодной кислотой (ШИК-реакция) Метайодная кислота селективно окисляет и расщепляет -С=С- связи не только в 1,2-окси-, но также в 1-окси-2-амино-1-окси-2- алкиламино- и 1-окси-2-кетогруппах. В результате этого образуется одна кетогруппа или две альдегидные группы, как, например, в глюкозе. Альдегидные группы реагируют с реактивом Шиффа (фуксин-сернистой кислотой) точно так же, как и в реакции Фельгена. С помощью этого метода выявляют все соединения, содержащие оксигруппы, которые в результате окисления метайодной кислоты могут превращаться в альдегидные группы. Однако в гистологических срезах практически лишь гликоген и гликопротеины, сохраняющиеся в достаточных количествах, могут быть выявлены с помощью ШИК-реакции. Гликоген можно дифференцировать от гликопротеинов путем переваривания в амилазе или диастазе. Для окисления -С-С-связей в полисахаридах предпринимались попытки использовать, помимо одной кислоты, другие окислители — хромовую кислоту, перманганат калия, тетрааце- тат натрия и т.д. Наиболее удачной является модификация ШИК-реакции, предложенная А.Л. Шабадашем (1949). 1. Материал фиксируют в 10 % формалине, жидкостях Кар- нуа, Ценкера, заливают в парафин. 2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды. 3. При комнатной температуре срезы окисляют 0,5—1 % водным раствором орто- или метайодной кислоты в течение 2 — 76
10 мин. Окисление можно также проводить по Шабадашу в 0,001—0,01 М метаперйодате калия или натрия в течение 7 — 25 мин. Раствор хранят в темноте. Рабочую концентрацию этого раствора и продолжительность инкубации в ней подбирают в зависимости от объекта. , 4. Промывают в дистиллированной воде 1<Ншн. 5. Помещают срезы в реактив Шиффа на 10 — 30 мин при комнатной температуре в темноте. Реактив Шиффа по Грауман- ну: 0,5 г парарозанилина (парафуксин, свободный от акридина, стандартный) полностью растворяют в 15 мл 1 н. соляной кислоты без нагревания при помешивании и доводят до 85 мл дистиллированной водой с растворенными в ней 0,5 г пиросульфи- та калия; прозрачный интенсивно-красный раствор, помещенный в темноту в сосуде с плотно прилегающей пробкой, в течение 24 ч приобретает желтоватый оттенок, его встряхивают 2 мин с013 г активированного угля (порошок) и затем дважды фильтруют. Такой раствор готов к использованию и его можно хранить в сосудах коричневого цвета с пришлифованной пробкой по крайней мере в течение 2 мес. 6. Срезы промывают сернистой водой (600 мл дистиллированной воды + 30 мл 10 % пиросульфита калия + 30 мл 1 н. соляной кислоты) три раза по 2 мин. Сернистую воду можно также готовить (непосредственно до проведения реакции) по рекомендации А.Л. Шабадаша следующим образом: к 200 мл дистиллированной воды добавить 10 мл 10 % раствора натрия гидросульфита и 10 мл 1 н. соляной кислоты. 7. Тщательно промывают в проточной и дистиллированной воде, ядра можно докрасить 0,5 % светлым зеленым или кислым гемалауном. 8. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, заключают в бальзам. Результат: углеводы, содержащие гексозу, окрашиваются в красно-лиловый цвет, гликоген — в более интенсивный темно- красный. Контроль: расщепление гликогена амилазой или диастазой, реакция ацетилирования для блокирования гидроксильных групп. Примечание: необходимо пользоваться химически чистой посудой, стеклянными палочками; нельзя работать с металлическими крючками или иголками; окрашивание срезов в реактиве Шиффа следует проводить в темноте. Метахроматическое окрашивание кислых гликозаминогликанов Метахромазия — это изменение спектров поглощения используемых красителей. Метахромазию можно получить при использовании очень широкого набора красителей (табл. 2). 77
Таблица 2. Спектры поглощения красителей, дающих метахромазию [Ке1- 1у, 1956] Краситель Толуидиновый синий Азур А Метиленовый синий Крезиловый синий Кристаллический фиолетовый Основной фуксин Тионин Максимум поглощения, им ортохроматический 630 620 665 625 590 543 597 мсгахроматический 480-540 480-530 570 530 510 510 557 Пригодность красителя для выявления метахромазии определяется тем, насколько ортохроматический и метахроматичес- кий максимумы поглощения отдалены друг от друга. В гистохимии под метахромазией подразумевают практически только явления, наблюдающиеся при использовании красителей тиазиновой группы, а именно те изменения окраски от синего через фиолетовый до красного, которые происходят при окрашивании тканей разбавленными водными растворами красителей названной группы. Типичным примером метахромазии служит окрашивание ти- азиновыми красителями (тионин, толуидиновый синий и т.п.) лаброцитов (тучных клеток), при котором гранулы этих клеток окрашиваются в фиолетово-красный цвет, тогда как другие структуры воспринимают оригинальный синий цвет красителя. Метахроматическое окрашивание не связано ни с определенной химической структурой, ни с определенным химическим соединением, а обусловлено плотностью анионов на поверхности молекулы субстрата, а также степенью ионизации. Наличие метахромазии свидетельствует только о наличии некоторой минимальной плотности свободных отрицательных поверхностных зарядов на молекулах субстрата. В животной ткани метахрома- тически окрашиваются главным образом кислые ГАГ, характеризующиеся высокой молекулярной массой и большим количеством свободных анионных групп (К=0=50"з, К~0=НРО-з, К=СОО). Все приемы подготовки срезов и следующей за окрашиванием обработки влияют на метахромазию, поэтому предпочтительнее использовать криостатные срезы с непродолжительной последующей фиксацией. Окрашенные срезы перед обезвоживанием и заключением в бальзам рекомендуется предварительно просматривать в дистиллированной воде под покровным стеклом. Существуют также методы сохранения метахромазии в постоянных препаратах [Кутах Г.Н., Шубич М.Г., 1965]. 78
Реакции связывания коллоидных металлов Подобно основным (катионным) красителям, катионы некоторых металлов также образуют соединения с анионами кислых ГАГ. С этой целью используют коллоидные растворы золота, тория, платины, железа, а также ионы бария и висмута. Торий, платину, барий и висмут применяют главным образом для контрастирования кислых ГАГ в электронно-микроскопической гистохимии. В светооптической гистохимии применяется в первую очередь метод Хэйла, основанный на связывании в кислой среде (рН < 2) коллоидных мицелл гидроксида железа (III) с карбоксильными и сульфоновыми группами кислых ГАГ и последующем выявлении связанного железа с помощью гексацианофер- рата (ферроцианида) калия в реакции берлинской лазури. Нуклеиновые кислоты и белки также могут связывать коллоидный гидроксид железа, но при более высоких значениях рН. Выявление кислых гликозаминогликанов с помощью коллоидного железа (модификация реакции Хэйла по Грауманну—Клаусу) 1. Материал фиксируют в забуференном 10 % формалине, жидкостях Карнуа, Жандра, спирт-формоле (лучше пользоваться безводными фиксаторами) и заливают в парафин; возможна обработка срезов без фиксации или криостатных срезов. 2. Срезы депарафинируют и через ряд спиртов убывающей концентрации доводят до дистиллированной воды. Обработку свежих криостатных срезов начинают с п. 3. Фиксированные срезы хорошо промывают в дистиллированной воде. 3. Помещают срезы на 10 мин в раствор коллоидного железа, подкисленного уксусной кислотой (маточного раствора 10 частей, 96 — 99 % уксусной кислоты 4 части). Маточный раствор: 750 мл дистиллированной воды доводят до кипения и добавляют 12 мл 32 % раствора трихлорида железа. Образовавшийся гидроксид железа можно хранить в течение 1 мес. 4. Промывают в 2 сменах 5 % уксусной кислоты по 5 мин в каждой. 5. Срезы помещают в свежеприготовленный раствор, включающий 30 мл 2 % гексацианоферрата калия + 60 мл 1 % соляной кислоты на 10 мин. 6. Срезы проводят через 2 смены дистиллированной воды по 2 мин. 7. Обезвоживают в ряду спиртов возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам. Результат: структуры, в которых содержатся кислые ГАГ, окрашиваются в синий цвет. 79
Реакция Хэйла специфична для выявления свободных кислотных групп, например эфиров серной и фосфорной кислот, свободных гидроксильных групп уроновой и моноаминодикарбоновой кислот белков. Специфичность метода Хэйла для выявления кислых мукоидных веществ следует контролировать с помощью вспомогательных реакций. Ложную положительную реакцию, обусловленную присутствием железа в тканях, можно исключить путем обработки контрольных срезов в растворе гексацианофер- рата калия и соляной кислоты (5-й этап данного метода). Реакцию связывания железа можно комбинировать с ШИК- реакцией. В этом случае после п. 6 следует окисление метайод- ной кислотой. В результате этого кислые ГАГ окрашиваются в темно-синий цвет, белковые структуры — в светло-синий, а нейтральные гликопротеины — в красный цвет различных оттенков. Эта комбинация двух методов позволяет получить контрастную гистологическую картину при исследовании ткани почек и кожи. Окраска альциановым синим В гистохимической практике используют несколько фталоциа- ниновых красителей: альциановые синие — 8 СХ, 8 ЗХ, 8 С8, 8 СИ, 5 СХ, 150,альциановые зеленые — 2 СХ, 3 ВХ, люксоло- вый прочный синий, астрасиний и др. Альциановый синий обладает большими преимуществами по сравнению с другими красителями кислых мукоидных веществ, прежде всего быстротой окрашивания и простотой применения. Прослеживается параллель между окрашиванием альциановым синим и метахрома- зией при изменении рН и концентрации красителя. На соответствующих объектах могут быть получены хорошие результаты в случае прижизненного окрашивания альциановым синим. Окраска альциановым синим при рН 2,5 1. Материал фиксируют в формалине, формалин-этаноле, смесях Ценкера, Буэна, Карнуа и заливают в парафин (можно использовать криостатные срезы). 2. Депарафинированные срезы окрашивают в свежеотфильт- рованном 1 % растворе альцианового синего 8 СХ в 3 % уксусной кислоте (рН 2,5) в течение 30 мин. 3. Промывают в проточной воде в течение 5 мин. 4. Обезвоживают в ряду спиртов возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам. Результат: слабокислые сульфатированные ГАГ (гиалуроно- вая кислота) и сиалогликопротеины приобретают темно-синюю окраску. Сильнокислые сульфатированные ГАГ окрашиваются слабо или совсем не окрашиваются. 80
Окраска альциановым синим при рН 1,0 1. Срезы помещают в дистиллированную воду. 2. Окрашивают в 1 % растворе альцианового синего 8 ОХ в 0,1 н. соляной кислоте (рН 1,0) в течение 30 мин. 3. Просушивают фильтровальной бумагой. 4. Обезвоживают в этаноле, проводят через ксилол, заключают в бальзам. Результат: окрашиваются только сульфатированные ГАГ. Примечание. Вместо альцианового синего 8 ОХ можно использовать альциановый синий 8 ОМ, альциановый зеленый 3 ВХ или альциановый зеленый 2 ОХ. Для окрашивания очень кислых мукоидных веществ рекомендуется модификация окраски альциановым синим по Гомори. Окраска метиленовым синим Тиазиновый краситель метиленовый синий позволяет отделить кислые ГАГ от нейтральных гликопротеинов и дифференцировать сульфатные, фосфатные и карбоксильные группы путем выявления их базофилии при различных рН. Степень базофи- лии определяется наличием свободных анионов полисахаридов. По мере снижения рН интенсивность окрашивания отдельных структур снижается. Это явление носит название «экстинкция» (от лат. ехИпсио — гашение). Окрашивание анионных групп метиленовым синим при различных значениях рН (экстинкция метиленового синего) рН Окрашиваемые группы или вещества 1,5 504 2,8 Р04(504)* кислые ГАГ 4,0 СООН(Р04, 504)* 5,0 Все кислые группы > 5,0 Нейтральные гликопротеины В присутствии электролитов, таких как соляная кислота, хлорид натрия и калия, окрашивание альциановым синим усиливается. При концентрациях хлорида магния ниже 0,3 М альциановый синий связывается кислыми ГАГ, содержащими сульфатированные и карбоксильные группы, а при концентрациях хлорида магния 0,8 М и выше окрашиваются исключительно вещества, содержащие 504-группы. Эти факты свидетельствуют о Труппы, указанные в скобках, ионизированы, поэтому также дают окрашивание. 81
ведущей роли электростатических сил при связывании альциа- нового синего с субстратом. Для определения экстинкции метиленового синего можно использовать растворы 0,0005 — 0,005 М (приблизительно 0,1 — 0,01 %) метиленового синего в веронал ацетатном буфере или ацетатном буфере Михаэлиса при различных рН (от 2,6 до 8,0 с интервалами 0,5). Наибольший интерес представляют значения рН ниже 4,0, так как анионные группы белков, прежде всего карбоксильные группы, значительно осложняющие интерпретацию результатов, теряют свой заряд. При рН 3,0 метиленовый синий связывается также нуклеиновыми кислотами, но для них характерна другая локализация, и их можно дифференцировать с помощью специфических реакций. Кроме того, их окрашивание можно ослабить путем добавления хлорида магния к раствору красителя. Вместо метиленового синего можно использовать растворы (0,02 %) азура А в НСЬфосфатном или фосфат-цитратном буфере. К.С. Митин (1966) показал, что коллагеновые волокна не окрашиваются мети леновым синим при рН 5,0 —6,0,а основное вещество средней оболочки аорты, построенное из хондроитин- сульфатов, обладает метахромазией при рН 2,5 — 3,0, интима обесцвечивается при рН 4,0, а лаброциты (тучные клетки) и нейроны окрашиваются в фиолетовый цвет при рН 1,5 — 2,0. Окраска рутениевым красным Рутениевый красный давно используют в световой микроскопии для окрашивания пектина, растительных муцинов, целлюлозы, крахмала, инулина и лигнина, гранул лаброцитов, основного вещества хряща и т.д. Специфичность этого окрашивания невысока, однако благодаря методу контрастирования рутениевым красным по Лафту значительно дополнены сведения о гликокалик- се — слое мукоидов, окружающих плазмалемму. При использовании этого метода на первом этапе образуется связь между катионом рутениевого красного и анионными группами кислых ГАГ, при этом субстрат окрашивается в красный цвет. Электронно- микроскопическое контрастирование происходит при последующей обработке тетраоксидом осмия в окислительно-восстановительной реакции, катализируемой рутениевым красным, при которой низшие окислы осмия осаждаются на окисленном субстрате. Поскольку рутениевый красный плохо проникает в ткани, его рекомендуется добавлять прямо в фиксирующую смесь. Контрастирование рутениевым красным по Лафту 1. Кусочки ткани фиксируют в растворе глутарового альдегида и рутениевого красного (0,5 мл 3,6 % глутарового альдеги- 82
да + 0,5 мл 0,5 М какодилатного буфера рН 7,3 + 0,5 мл 0,15 — 0,3 % водного раствора рутениевого красного) в течение 1 ч при 4°С. 2. Промывают в 0,15 М какодилатном буфере 3 раза по 3 мин. 3. Дополнительно фиксируют в течение 3 ч при 20 °С в следу ющем растворе: 0,5 мл 5 % тетраоксида осмия + 0,5 мл 0,2 М какодилатного буфера рН 7,3 + 0,5 мл 0,15 — 0,3 % раствора рутениевого красного. 4. Быстро промывают в буферном растворе, обезвоживают в спиртах, заливают в эпоксидную смолу. Результат: контрастируются полианионы с умеренной и высокой плотностью заряда, представленные в тканях главным образом внеклеточными кислыми ГАГ. Для очистки рутениевого красного рекристаллизацией 1 г рутениевого красного помещают в 10 мл 0,5 н. раствора аммиака при 60 °С. Нерастворимый остаток отделяют от горячего раствора центрифугированием. Надосад очную жидкость остужают до 0 °С. Образующийся при этом осадок промывают водой, охлажденной до 0 °С, спиртом и диэтиловым эфиром, а затем высушивают на воздухе при комнатной температуре. Окраска кармином по Бесту Классическая ШИК-реакция и различные ее модификации, направленные на выявление гликогена, не могут быть рекомендованы для всех случаев, особенно если ткань содержит вещества, имеющие ту же локализацию, что и гликоген, дающие положительную ШИК-реакцию: мукопротеиды, гликопротеиды и ненасыщенные липиды. В таких случаях лучшие результаты может дать карминовый метод Беста, хотя применение этого чисто эмпирического метода трудно «примирить» со строгими гистохимическими требованиями. Действующим началом природного кармина является карминовая кислота. Ее способность окрашивать гликоген зависит от ряда не до конца понятых физических и стереохимических факторов. Для лучшей сохранности гликогена в первоначальных прописях рекомендовалась заливка в целлоидин, однако можно использовать и парафиновые срезы, если перед перенесением в раствор Беста покрыть их тонким слоем целлоидина. Целлоиди- рования срезов можно избежать, фиксируя ткань в жидкости Марчи в течение 12 — 20 ч при 4 °С, промывая затем при 4 °С в течение 10—12 мин в 30 % спирте, инкубируя также при 4 °С в красящем растворе кармина и после дифференцирования быстро обезвоживая в двух сменах абсолютного ацетона. При использовании этого метода необходимо проводить контрольные реакции с перевариванием гликогена амилазой, диа- стазой или слюной. 83
1. Материал фиксируют по Лилли, Жандру, Россману, Кар- нуа, Шабадашу, Буэну или в 100 % спирте; заливают в парафин; можно также использовать целлоидиновые или замороженные срезы. 2. Депарафинированные срезы доводят до абсолютного спирта. 3. Целлоидируют срезы в 1 % растворе целлоидина (в смеси равных частей спирта и эфира) в течение 2 мин. 4. Просушивают срезы на воздухе, уплотняют в 70 % спирте и помещают в дистиллированную воду. 5. Проводят интенсивное окрашивание ядер в гемалауне по Майеру или в гематоксилине по Эрлиху. 6. Промывают в дистиллированной воде, в случае необходимости дифференцируют в солянокислом спирте и снова промывают в воде. 7. Окрашивают в растворе кармина в течение 10 — 30 мин. Маточный раствор кармина: 2 г кармина, 1 г карбоната калия и 5 г хлорида калия растворяют в 60 мл дистиллированной воды и кипятят несколько минут на слабом огне. Раствор после охлаждения фильтруют и добавляют в него 20 мл раствора аммиака (плотность 0,880). Раствор готов к непосредственному применению, его можно хранить в темной колбе в течение нескольких недель, в холодильнике — до 3 мес. Красящий раствор кармина: 20 мл профильтрованного маточного раствора кармина + 30 мл раствора аммиака + 30 мл метанола (сохранность несколько дней). 8. Переносят срезы непосредственно в смесь для дифференцирования (40 мл метанола + 50 мл абсолютного этанола + 100 мл дистиллированной воды). Дифференцируют в двух порциях до тех пор, пока видимые глазом следы красителя перестанут выходить из среза в раствор — от нескольких секунд до нескольких минут. 9. Промывают в 80 % спирте, обезвоживают в абсолютном спирте, проводят через ксилол, заключают в бальзам. Результат: гликоген окрашивается в интенсивный красный цвет, ядра — в темно-синий. Контрольные реакции в гистохимии углеводов Описанные методы выявления углеводов являются в основном лишь реакциями на химические группы. Для установления специфичности проведенной реакции и для дифференциальной локализации полисахаридов используют методы блокирования ре- акционноспособных групп и ферментативного гидролиза. Кислые группы (карбоксильные, фосфатные и сульфатные) можно блокировать метилированием в растворах метанол-НС1, метанол-тионилхлорида и метанол-метилиодида. В результате этого ослабляются базофилия и метахромазия элементов ткани. 84
Метилирование по Белло—Гайеру 1. Депарафинированные срезы промывают в двух сменах абсолютного спирта, а затем в двух сменах абсолютного метанола. 2. Помещают срезы при 24 °С на 4 —б ч в следующий раствор: 1 мл тионилхлорида медленно добавляют в 50 мл абсолютного метанола (перед использованием раствор можно хранить в течение ночи). Контрольные срезы — без обработки тио- нилхлоридом. 3. Промывают в 70 % спирте и дистиллированной воде. 4. Проводят соответствующее окрашивание. Результат: 6-часовая обработка полностью устраняет базофи- лию ткани. Базофилия цитоплазмы, обусловленная СООН- группами и РНК, снимается через 30 мин, а базофилия, обусловленная присутствием сульфатированных ГАГ,— через 4 ч. Для дифференциации кислых ГАГ и нейтральных гликопро- теинов обычно используют переваривание гиалуронидазой и нейраминидазой. Гиалуронидаза В, выделенная из культур пневмококков, стрептококков, стафилококков и СЛозЫсНит \уе1сЬи, расщепляет гиалуроновую кислоту, а гиалуронидаза А, полученная из семенников быка, гидролизует, помимо гиалуроновои кислоты, еще и хондроитинсульфаты А и С. Удаление кислых гликозаминогликанов путем ферментативного гидролиза с гиалуронидазой 1. Материал фиксируют в одной из смесей, рекомендованных для фиксации полисахаридов, заливают в парафин. 2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды через ряд спиртов убывающей концентрации. 3. Обрабатывают срезы в течение 4 —6 ч при 37 °С следующим раствором: 0,3 — 0,6 мг/мл гиалуронидазы из семенников в 0,1 н. фосфатном или ацетатном буфере (рН 6,0). Контрольные срезы инкубируют в буфере в таких же условиях. 4. Окрашивают контрольные срезы и срезы, обработанные в растворе гиалуронидазы, 0,1 % раствором толуидинового синего в течение 1 — 2 ч. 5. Тщательно промывают в дистиллированной воде. 6. Заключают в глицерин-желатин или после обезвоживания и просветления в ксилоле в бальзам. Результат: метахроматическое окрашивание в контрольных срезах и отсутствие его в срезах, обработанных гиалуронидазой, свидетельствуют о наличии гиалуроновои кислоты или хондроитинсульфатов А и С. Нейраминидаза (сиалидаза, выделенная из культуральных сред С1оз<:пс1шт рег{гт§епз и У1Ъпо сЬо1егае, а также из противогриппозной вакцины) селективно удаляет из гистологических 85
срезов сиаловую кислоту, уменьшая окраску ШИК-позитивных гликопротеинов, а также ослабляя метахромазию. Следует учитывать, что буферный раствор, не содержащий нейраминидазы, может переводить в раствор значительную часть связанной нейраминовой кислоты в составе сиаломукоидов. Ферментативное переваривание гликогена на гистологических срезах проводят с помощью диастазы, амилазы или слюны. Обычно используют диастазу солода по Лилли, которая катализирует гидролиз гликогена, главным образом до дисахарида мальтозы. Ферментативный гидролиз диастазой для удаления гликогена по Лилли 1. Деиарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды. 2. Обрабатывают в 0,1 — 1 % растворе диастазы солода на изотоническом растворе хлорида натрия при комнатной температуре в течение 2 ч или при 37 °С 30 — 40 мин. 3. Промывают в дистиллированной воде и проводят окрашивание на гликоген (ШИК-реакция или окрашивание кармином по Бесту). Результат: вещества, которые в прямом опыте окрашиваются при ШИК-реакции или кармином по Бесту, но исчезают из среза после обработки диастазой, следует считать гликогеном. Примечание. Различия между молекулами гликогена с разветвленными и неразветвленными цепями могут быть выявлены в срезах путем их обработки 0,5 % р-амилазой в 0,004 М ацетатном буфере (рН 5,0) вместо ос-амилазы. р-Амилаза расщепляет только молекулы с разветвленными цепями. ГИСТОХИМИЯ ЛИПИДОВ Собирательный термин «липиды» охватывает жиры (т.е. три- глицериды) и жироподобные вещества растительного и животного происхождения. Это преимущественно неполярные соединения, основным компонентом которых являются жирные кислоты. Липиды нерастворимы или плохо растворимы в воде, но хорошо растворяются в типичных жирорастворителях: бензине, хлороформе, четыреххлористом углероде, ацетоне, эфире, пет- ролейном эфире, горячем спирте и т.п. Не все липиды растворимы в указанных растворителях одинаково, на этом основаны дифференциальная экстракция липидов и выявление их с помощью жирорастворимых красителей. С учетом гистохимических свойств и химической структуры липиды делят на простые (нейтральные жиры, воски, стериды) и сложные (фосфолипиды, цереброзиды, ганглиозиды, сульфо- липиды). 86
Гистохимическая идентификация липидов Гистохимическое выявление липидов возможно с помощью физических и химических методов. К физическим относятся методы экстракции, поляризационная микроскопия и окрашивание жирорастворимыми красителями, к химическим — подавляющее большинство гистохимических методов выявления липидов, направленных главным образом на определение активных функциональных групп. Экстракция липидов В основе методов экстракции липидов лежат законы растворимости, известные из аналитической органической химии. Их необходимо также учитывать при подготовке тканей для проведения гистохимического анализа липидов. Первые потери водорастворимых липидов происходят уже при фиксации в альдегидах или тетраоксиде осмия и продолжаются в процессе обезвоживания и заливки. После первичной фиксации в тетраоксиде осмия вымываются главным образом насыщенные липиды. Особенно велики суммарные потери липидов в тканях, фиксированных в альдегидах. После двойной фиксации в альдегидах и тетраоксиде осмия достигается хорошая стабилизация структур, содержащих ненасыщенные липиды. Наибольшие потери липидов наблюдаются во время пропитки ткани парафином и эпоксидными смолами, но их можно уменьшить путем более быстрого обезвоживания и замены этанола на ацетон. Стабилизация липидов может быть значительно усилена путем добавления к альдегидной фиксирующей смеси хлорида кальция, как, например, в кальций-формоле по Бейкеру или при использовании хроматов, способных окислять ненасыщенные липиды, как в фиксаторе Элфтмана, содержащем бихромат калия и сулему. Хорошо сохраняются фосфолипиды при фиксации с одновременным обезвоживанием в ацетоне с 0,65 % хлоридом магния. Управляя процессом экстрагирования липидов и применяя его в сочетании с методами окрашивания, гистохимия обеспечивает контроль специфичности окрашивания и дифференцированно выявляет различные липидные фракции. Экстракция липидов по Кейлигу позволяет провести разделение четырех фракций липидов, при этом тонкие, нефиксированные кусочки ткани обрабатывают четырьмя растворителями: а) холодным ацетоном (удаляет глицериды, холестерин, холес- териды и кетостероиды); б) горячим ацетоном (удаляет цереб- розиды); в) горячим эфиром (удаляет лецитины и кефалины) ; г) горячим метанол-хлороформом (удаляет все липиды). Применяют по три порции каждого растворителя, сменяя их соответственно через 3, 3 и 12 ч. Для горячих растворителей можно использовать аппарат Сокслета или более простой при- 87
бор. После экстракции кусочки ткани промывают водой, и кри- остатные срезы окрашивают раствором Судана черного В в 70 % спирте. Следует помнить, что при использовании этого метода не удается полностью исключить диффузию, что затрудняет точную локализацию липидов, однако все же они остаются в срезе и окрашиваются Суданом. Экстракция пиридином по Бейкеру обеспечивает удаление всех липидов. Ее проводят на тонких кусочках ткани, фиксированных слабым раствором фиксатора Буэна в течение 20 ч. После фиксации их следует промыть в спирте для удаления пикриновой кислоты, обработать пиридином сначала при комнатной температуре 30 мин, затем при 60 °С 20 ч, промыть в проточной воде в течение 2 ч, перенести в бихромат-кальциевый раствор (5 % бихромат калия и 1 % хлорид кальция на дистиллированной воде) и окрасить материал Суданом и черным В или любым другим жировым красителем. Разработаны приемы липидной экстракции, обеспечивающие хорошую ультраструктурную сохранность ткани для целей электронно-микроскопической гистохимии. Поляризационная микроскопия липидов В нативном состоянии большинство нейтральных липидов находится в жидком состоянии и не дает двойного лучепреломления в поляризованном свете; это свидетельствует об их аморфном (изотропном) состоянии. Однако при охлаждении нейтральные липиды переходят в анизотропное состояние и могут образовывать двоякопреломляющие кристаллы. При поворачивании предметного столика поляризационного микроскопа с исследуемым препаратом на 360° можно отметить четыре положения, при которых интенсивность пришедшего света минимальна. Подобным образом ведут себя все липиды. Если же в препарате выявляется анизотропный эффект мальтийского креста, то можно сделать вывод о присутствии фосфатидов, цереброзидов или эфиров холестерина. В целом же возможности этого метода ограничены. Флюоресцентная микроскопия липидов Небольшая часть липидов обладает собственной, или первичной, флюоресценцией в ультрафиолетовом свете. Липопигмен- ты светятся желтым или желто-зеленым светом, липиды с растворенным каротином дают зеленую флюоресценцию, так же как и стероидные гормоны, но зеленая флюоресценция последних меняется во времени. Практическое значение имеет выявление витамина А. Методы вторичной флюоресценции, в основе которых лежит растворение флюоресцирующих веществ (флюорохромов) в ли- 88
пидах тканей, позволяют устанавливать присутствие липидов в клетках и тканях точнее, чем многие другие методы. С этой целью использовали ряд флюоресцирующих красителей, в том числе метиленовый синий, тиоф лавин, родамин В, бенгальский розовый, фосфин ЗК, бензпирен и др. Возможность применения водных растворов таких красителей обеспечивает сохранность самых мелких капелек жира. С помощью этого метода выявляют липиды и липопротеиды в очень низких концентрациях. Особенно это относится к флюорохромированию бензпиреном. Этот высокочувствительный метод позволяет выявлять липиды в тонких структурах, входящих в состав липопротеидных комплексов или тонкодисперсных образований. Выявление бензпиреном по Бергу 1. Материал фиксируют в формалине или кальций-формоле. Срезы толщиной 10 мкм получают на замораживающем микротоме. 2. Обрабатывают срезы в течение 20 мин раствором бензпи- рен-кофеина (к 100 мл насыщенного отфильтрованного 1,5 % раствора кофеина в воде добавляют 0,002 г 3,4 бензпирена; раствор выдерживают 2 дня при 37 °С, отфильтровывают и разводят равным объемом дистиллированной воды. Оставляют на 2 ч и вновь фильтруют. Колбу с раствором плотно закрывают и помещают в темное место; в таком виде его можно хранить несколько месяцев). 3. Срезы быстро промывают в дистиллированной воде. 4. Заключают под покровное стекло с водой и сразу же исследуют под флюоресцентным микроскопом. Результат: липиды выделяются своей синей или бело-синей флюоресценцией. Примечание. Этот метод не позволяет дифференцировать липиды разных классов; цвет флюоресценции — от сине- зеленой до бело-синей и бело-желтой, по-видимому, зависит от концентрации липидов. Флюорохромирование Липидов фосфином ЗП по Фольку—Попперу Флюорохром — фосфин ЗК — обусловливает яркую серебристо- белую флюоресценцию, которую легко отличить от естественной флюоресценции тканей, даже не пользуясь контрольными препаратами сравнения. 1. Материал фиксируют в кальций-формоле. Срезы толщиной 10 мкм готовят на замораживающем микротоме. 2. Срезы помещают в дистиллированную воду, затем обрабатывают 0,1 % водным раствором фосфина ЗК. 3. Быстро промывают в дистиллированной воде. 89
4. Заключают в 90 % глицерин или дистиллированную воду, исследуют под флюоресцентным микроскопом. Результат: липиды, включая эфиры холестерина, дают серебристо-белую флюоресценцию. Исключение составляют жирные мыла и холестерин. Окраска жирорастворимыми красителями Для всех жировых красителей единственным общим признаком является отсутствие солюбилизирующих сульфогрупп (-ЗОзН) или карбоксильных (-СООН)-групп. Это диазокрасители, в основном красного цвета. Судан черный В обладает более выраженными, чем суданы III и IV, красящими свойствами, хотя он может давать и гораздо более слабое окрашивание белков и кислых ГАГ. Окраска Суданом черным по Лизону 1. Материал фиксируют в кальций-формоле, готовят срезы на замораживающем микротоме или заливают в поливакс. 2. Промывают срезы в 70 % спирте. 3. Окрашивают Суданом черным (насыщенный раствор Судана В в 70 % спирте, профильтрованный перед использованием) 20 — 30 мин. 4. Промывают в 70 % спирте 30 с. 5. Быстро промывают в дистиллированной воде. 6. Окрашивают 1 % ядерным прочным красным 1 мин. 7. Быстро промывают в дистиллированной воде и заключают в глицерин-желатин или глицерин. Результат: липиды окрашиваются в цвета от черного до темно-синего, ядра — в красный цвет; окраску воспринимают также фосфолипиды. Для контроля неспецифического окрашивания за счет адсорбции используют экстракцию ацетоном или этанолом. Окраска масляным красным О в изопропаноле по Лилли 1. Материал фиксируют в кальций-формоле, срезы получают на замораживающем микротоме. 2. Срезы переносят в дистиллированную воду и быстро промывают в 60 % изопропаноле. 3. Срезы окрашивают 10 — 20 мин в растворе масляного красного О (0,05 г масляного красного О растворяют в 100 мл 98 % изопропанола, перед использованием разводят дистиллированной водой в пропорции 6:4, выдерживают 24 ч и затем фильтруют). 4. Быстро дифференцируют в 60 % изопропаноле или сразу же промывают в дистиллированной воде. 90
5. Промывают в проточной воде 10 мин. 6. Срезы заключают в глицерин-желатин. Результат: нейтральные жиры окрашиваются в красный цвет, ядра — в синий. Примечание. Масляный красный О можно также использовать в виде насыщенного отфильтрованного раствора в 70 % спирте. Вместо масляного красного О можно применять масляный красный 7В, который окрашивает липиды в ярко- красный цвет. В качестве растворителей для жировых красителей используют 55 — 70 % спирт, 65 — 98 % изопропанол, пропи- ленгликоль, а также смесь Герксхаймера, состоящую из равных частей 70 % спирта и ацетона. Гистохимическое выявление фосфолипидов Для гистохимического выявления фосфолипидов наиболее пригодны методы с использованием кислого гематеина. По методу Бейкера ткани после фиксации в кальций-формоле подвергают длительному хромированию в бихромат-кальциевой смеси, в результате чего фосфолипиды образуют нерастворимые комплексы с хромом. Эти комплексы реагируют с кислым гематеи- ном, который получают при окислении гематоксилина метайо- датом натрия. Связанный с фосфолипидами хром, взаимодействуя с кислым гематеином, образует соединение хром-гематеин темно-синего цвета. Окраска фосфолипидов кислым гематеином Бейкера в модификации Бухвалова 1. Кусочки размером 2 — 4 мм фиксируют в 2 сменах ацетона с 0,65 % раствором хлорида магния по 60 мин. 2. Помещают в ксилол — 2 смены по 5—10 мин. 3. Переносят в горячий парафин — 2 смены по 30 мин. 4. Заливают в парафин и получают срезы. 5. Срезы проводят через ксилол — 2 смены по 5 мин. 6. Помещают в ацетон с 0,65 % раствором хлорида магния — 2 смены по 5 мин. 7. Переносят в дистиллированную воду — 2 смены по 1 мин. 8. Помещают срезы в 5 % раствор бихромата калия при 60 °С на 4 ч. 9. Промывают в нескольких сменах дистиллированной воды. 10. Помещают срезы при температуре 37 °С на 0,5-5 ч в раствор кислого гематеина (50 мг кристаллического гематоксилина растворяют в 50 мл 0,1 % раствора метайодата натрия при нагревании до кипения, охлаждают и добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты). 11. Промывают в дистиллированной воде. 91
12. Дифференцируют при комнатной температуре в 0,25 % водных растворах дибората натрия, декагидрата и гексациано- феррата калия 18 ч. 13. Промывают в дистиллированной воде. 14. Обезвоживают в 2 сменах ацетона с 0,65 % хлоридом магния по 5 мин. 15. Проводят через 2 смены ксилола по 5 мин и заключают в бальзам. Результат: фосфолипиды окрашиваются в черно-синие тона. Окраска железным гематоксилином по Элледеру и Лойде для выявления фосфолипидов 1. Срезы получают на замораживающем микротоме. 2. Срез А в сухом состоянии обрабатывают 10 мин при температуре от 0 до 4 °С абсолютным ацетоном и высушивают на воздухе. Срез Б при комнатной температуре обрабатывают 10 мин смесью хлороформа с метанолом, а затем быстро промывают в ацетоне и дистиллированной воде. 3. Срезы А и Б фиксируют в кальций-формоле (5—10 мин), а затем промывают в дистиллированной воде. 4. Оба среза окрашивают смесью растворов I (3 части) и II (1 часть) 6 — 8 мин. Раствор I: 298 мл дистиллированной воды + 2мл концентрированной соляной кислоты + 2,5 г дихлорида железа гексагид- рата + 4,5 г сульфата железа гептагидрата. Раствор II: 1 г гематоксилина растворяют при слабом нагревании в 100 мл дистиллированной воды. 5. Промывают в дистиллированной воде, затем несколько раз в 0,2 % растворе соляной кислоты. 6. Хорошо промывают в проточной воде. 7. Заключают под покровное стекло в глицерин-желатин или после обезвоживания в ацетоне и просветления в ксилоле — в бальзам. Результат: фосфолипиды окрашиваются в темно-синий цвет. Их можно идентифицировать, лишь сравнив с окрашиванием срезов, обработанных ацетоном и смесью хлороформа с метанолом; последние не должны давать окрашивания, обусловленного присутствием липидов. Можно использовать также замороженные срезы тканей, фиксированных в формалине. Перед экстракцией ацетоном такие срезы следует подсушить. Продолжительность экстракции в смеси хлороформа с метанолом после фиксации в формалине должна составлять 1 — 2 ч. С помощью обработки срезов гидроксидом натрия после экстракции ацетоном удается выявить сфингомиелин. Плазмалогены можно удалять с помощью гидролиза в 1 % водном или солянокислом (1 н.) растворе суле- 92
мы в течение 10 мин. Преимуществом этого метода являются быстрота и надежность. Выявление ненасыщенных липидов Для гистохимического выявления важна легкая окисляемость ненасыщенных липидов. Продуктом окисления непредельных связей липидов, проводимого с помощью надмуравьиной или надуксусной кислоты, в большинстве случаев являются альдегидные группы, которые могут быть выявлены с помощью реактива Шиффа. Непредельные связи в липидах ответственны также за восстановление тетраоксида осмия и за превращение его в диоксид осмия (осмиевую чернь). На связывание тетраоксида осмия, по-видимому, влияет также ориентация липидных молекул в тканях. На этом принципе основан тест Марчи с тетраоксидом осмия на дегенериро- ванный миелин. Механизм реакции Марчи был детально изучен АсЗашз (1959), который разработал метод одновременного выявления нормального и дегенерированного миелина с помощью тетраоксида осмия и а-нафтиламина. По АсЬтз, гидрофобные липиды дегенерированного миелина окрашиваются в черный цвет в результате восстановления оксида осмия до его тетраоксида. Гидрофильные липиды нормального миелина окрашиваются в красный цвет в связи с образованием хелата осмий-а-на- фтиламина. Таким образом, этот метод позволяет различать три типа липидов: ненасыщенные гидрофобные (черный цвет), ненасыщенные гидрофильные (красный цвет) и насыщенные (бесцветные). К первому типу относятся олеиновая кислота, трио- леин и олеат холестерина, ко второму — лецитин, кефалин, сфингомиелин и цереброзид, к третьему — стеариновая кислота, тристеарин, стеарат холестерина и холестерин. Если перед реакцией по Адамсу провести гидролиз в 2 н. гидроксида натрия при 37 °С в течение 1 ч, то окрашиваются только устойчивые к щелочному гидролизу липиды, из которых наиболее важным в биологическом отношении является сфингомиелин; также, по-видимому, окрашивается кефалин В. Окраска с применением тетраоксида осмия и а-нафтиламина по Адамсу 1. Материал фиксируют в кальций-формоле, срезы толщиной 10—15 мкм получают на замораживающем микротоме. 2. Обрабатывают свободноплавающие срезы 18 мин в смеси, в состав которой входят 1 часть 1 % тетраоксида осмия и 3 части 1 % перхлората калия. 3. Промывают в дистиллированной воде 10 мин. 4. Срезы монтируют на покровные стекла. 93
5. Обрабатывают 10 — 20 мин при 37 °С насыщенным водным раствором а-нафтиламина (готовят путем добавления а-нафтил- амина к дистиллированной воде и последующего фильтрования после нагревания до 40 °С). 6. Промывают в дистиллированной воде 5 мин. 7. Окрашивают 2 % альциановым синим в 5 % уксусной кислоте от 15 до 60 с (под контролем микроскопии). 8. Заключают в глицерин-желатин. Результат: фосфолипиды окрашиваются в оранжево-красный цвет, эфиры холестерина и триглицериды — в черный. Примечание. Гидрофобные липиды, окрашенные в черный цвет, во многих случаях могут маскировать имеющиеся в тканях фосфолипиды. В результате гидролиза свободноплавающих срезов в 2 н. растворе гидроксида натрия в течение 1 ч при 37 °С глицерофосфолипиды вымываются, а устойчивые к действию щелочи сфингомиелины сохраняются и окрашиваются в оранжевый цвет. Этот метод выявления надежен лишь при условии предварительной фиксации срезов в абсолютном ацетоне. Выявление холестерина Для гистохимического выявления холестерина применяют метод Адамса с хлорной кислотой и нафтохиноном, а также метод Шультца. В основе последнего лежит окисление холестерина до оксихолестерина под действием ультрафиолетового излучения (в первоначальном варианте) или аммонийных квасцов. Хотя с помощью реакции Шультца выявляют не только холестерин и его эфиры, метод можно считать достаточно специфичным . Модифицированная реакция Шультца для выявления холестерина и его эфиров 1. Материал фиксируют в кальций-формоле 2 — 3 дня в холодильнике. Срезы толщиной 20 — 30 мкм получают на замораживающем микротоме. 2. Свободноплавающие срезы промывают в нескольких сменах дистиллированной воды 24 ч. 3. Срезы помещают на 7 дней при 37 °С в забуференный раствор железоаммонийных квасцов [2,5 % раствор железоаммо- нийных квасцов (фиолетовые кристаллы) в 0,2 М ацетатном буфере, рН 3,0; окончательная величина рН раствора около 2,0]. 4. Срезы промывают в 0,2 М ацетатном буфере — 3 смены по 1 ч. 5. Промывают в дистиллированной воде. 6. Переносят в 5 % раствор формалина на 10 мин, а затем монтируют на предметные стекла, осторожно давая жидкости стечь, просушивают фильтровальной бумагой. 94
7. На покровное стекло наносят одну каплю смеси равных частей химически чистых уксусной и серной кислот (серную кислоту осторожно, по каплям, добавляют к уксусной кислоте, при этом колбу лучше охлаждать на ледяной бане). Перевернутое предметное стекло со срезом осторожно кладут на покровное и слегка прижимают так, чтобы жидкость равномерно распределилась по срезу. 8. Препарат сразу же исследуют под микроскопом. Результат: холестерин и его эфиры через несколько секунд приобретают сине-зеленое окрашивание, через 30 — 60 мин цвет меняется на синий. Свободный холестерин и другие Зр-оксистерины могут быть выявлены также на ультраструктурном уровне благодаря их способности образовывать нерастворимые в воде соединения с дигитоксином. Эту реакцию проводят одновременно с альдегидной фиксацией или после нее. Выявление плазмалогенов Плазмалогены, или ацетальфосфатиды, — это модифицированные глицерофосфатиды, содержащие ненасыщенный ацеталь с альдегидом. Природа этих альдегидных групп, которые высвобождаются из плазмалогенов под действием сулемы или мягкого кислотного гидролиза, точно неизвестна. В основе метода Фельгена и Фойта лежит выявление реактивом Шиффа высших альдегидов, высвобождаемых из плазмалогенов после непродолжительного воздействия сулемы. Этот же принцип реакции использован в реакции Хайеса. Плазмалевая реакция по Хайесу . 1. Материал фиксируют в кальций-формоле 3 —6 ч. Срезы получают на замораживающем микротоме. 2. Срезы прикрепляют к предметному стеклу. 3. Обрабатывают в 1 — 5 % растворе сулемы 10 мин. 4. Промывают в 3 сменах дистиллированной воды. 5. Помещают срезы в реактив Шиффа на 20 мин. 6. Промывают срезы в 3 сменах сернистой воды по 1 мин. 7. Промывают в проточной воде 20 мин. 8. Заключают под покровное стекло в глицерин-желатин. Результат: в срезах, обработанных сулемой, плазмалогены окрашиваются в красно-фиолетовый цвет. Контрольные срезы после п. 2 переносят непосредственно в реактив Шиффа; эти срезы, не обработанные раствором сулемы, должны оставаться неокрашенными. Примечание. Появление красноватого окрашивания — признак псевдоплазмалевой реакции, обусловленной окислением ненасыщенных липидов. Высвобождаемые в результате гидроли- 95
за липиды блокируются с помощью соответствующих реакций сочетания. Реактив Шиффа можно заменить фенилгидразином. От плазмалевой реакции следует отличать псевдоплазмале- вую реакцию тканевых и клеточных компонентов, окрашиваемых реактивом Шиффа при различных условиях. Химическая природа соединений, дающих псевдоплазмалевую реакцию, неизвестна. Ызоп (1953) выделяет две группы таких соединений. К первой относятся соединения, окрашиваемые реактивом Шиффа без предварительной обработки, содержащиеся в элас- тиновых волокнах, миелине, некоторых клетках гипофиза, цитоплазме яйцеклеток и нервных волокнах. Во вторую группу входят соединения, реагирующие с реактивом Шиффа после предварительной обработки. В первую очередь это липиды, легко окисляемые йодной кислотой и некоторыми другими слабыми окислителями. Обычная формалиновая фиксация подавляет плазмалевую реакцию. Интенсивность последней, наоборот, увеличивается при продолжительной фиксации формалином. Выявление жирных кислот и триглицеридов Для гистохимического выявления жирных кислот существуют два подхода: образование солей красителя в реакциях жирных кислот с некоторыми основными красителями и омыление жирных кислот солями металлов. Более интенсивно разрабатывается второй подход. В методе Хольцингера ионы меди, связываемые жирными кислотами, выявляются рубеановодородной кислотой, которая образует с ними окрашенное комплексное соединение. Выявление жирных кислот по Хольцингеру 1. Срезы нефиксированного материала получают на замораживающем микротоме. 2. Обрабатывают 0,05 % водным раствором ацетата меди 3 — 5 ч. 3. Промывают в 2 сменах 0,1 % раствора динатриевой соли ЭДТАпри рН 7,1 по 10 с. 4. Промывают в дистиллированной воде. 5. Обрабатывают в течение 10 мин в 0,1 % растворе рубеановодородной кислоты в 70 % спирте (100 мл рубеановодородной кислоты растворяют в 70 мл абсолютного спирта при легком нагревании, после охлаждения раствор доводят до 100 мл дистиллированной водой). 6. Промывают несколько минут в 70 % спирте, а затем в дистиллированной воде. 7. Окрашивают (в случае необходимости) ядерным прочным красным. 96
8. Заключают в глицерин-желатин. Можно обезводить в спиртах возрастающей концентрации, провести через ксилол и заключить в бальзам. Результат: жирные кислоты окрашиваются в зеленовато-черный цвет. Реакция омыления лежит также в основе метода Адамса для выявления жирных кислот триглицеридов. При этом эфирные связи триглицеридов сначала расщепляются липазой, а затем высвободившиеся жирные кислоты переводятся в осадок в виде нерастворимых кальциевых мыл. С целью электронно-микроскопического выявления проводят обмен оснований с образованием свинцовых мыл. Для обнаружения продуктов гистохимической реакции в световой микроскопии препарат обрабатывают раствором сульфида аммония с образованием коричневого осадка сульфида свинца. Специфичность этой реакции может быть проконтролирована с помощью ингибиторов липазы: 0,01 М растворов цинка, свинца, меди и ЭДТА. Выявление триглицеридов по Адамсу 1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в течение 4 ч при 4 °С в 3 % глутаровом альдегиде на 0,067 М какодилатном буфере (рН 7,4). 2. Промывают в 7,5 % сахарозе на буфере в течение 18 ч. 3. Срезы толщиной 50 мкм получают на замораживающем микротоме. 4. Срезы инкубируют в течение 30 мин в среде, в состав которой входят 50 мг панкреатической липазы, 10 мл 2 % раствора хлорида кальция, 15 мл 0,2 М трис-буфера (рН 7,0) и 25 мл дистиллированной воды. 5. Тщательно промывают в дистиллированной воде. 6. Помещают срезы на 15 мин в 1 % раствор нитрита свинца. 7. Промывают в дистиллированной воде. 8. Дополнительно фиксируют в 1 % растворе тетраоксида осмия в течение 18 ч. 9. Обезвоживают, заключают. Результат: в участках прохождения реакции выявляются оптически плотные игольчатые кристаллы свинцового мыла. ГИСТОХИМИЯ БИОГЕННЫХ АМИНОВ Биогенные амины — низкомолекулярные органические основания — образуются в процессе декарбоксилирования и последующих ферментативных превращений аминокислот. С помощью гистохимических методов выявляют две группы биогенных аминов — катехол амины и индол амины. Их концентрация в большинстве органов низкая, поэтому для гистохимического выявления пригодны лишь высокочувствительные реакции. 97
Биогенные амины в тканях. выявляют с помощью хромаф- финной и аргентаффинной реакции, реакций окрашивания и конденсации и других методических подходов, которые подробно изложены в главе 21. ГИСТОХИМИЯ ПИГМЕНТОВ Термин «пигменты» охватывает группу веществ, поглощающих свет в видимом спектре и наблюдаемых в неокрашенных клетках и тканях. Под это определение подходят вещества различного происхождения, состава и функционального назначения. По происхождению пигменты можно разделить на экзогенные (в частности, угольная или известковая пыль, отложения металлов, химиотерапевтических веществ и др.) и эндогенные. Эндогенные пигменты разделяют на гематогенные (например, гемоглобин и его производные) и негематогенные, или аутогенные (например, меланин и жировые пигменты — липофусцины и каротиноиды). В гистохимическом отношении пигменты мало различаются. Несмотря на то что химический состав ряда пигментов выяснен не до конца, гистохимически их можно выявить с достаточно высокой степенью надежности, тем более что большинство из них имеет характерную тканевую локализацию. Выявление гемосидерина и гемоглобина Гемосидерин — железосодержащий пигмент, образующийся из гемоглобина в результате внутриклеточных превращений. Для выявления гемоглобина пригодна реакция псевдопероксидазы с бензидином, а идентификация гемосидерина основана на определении содержащегося в нем железа с помощью реакции Перл- са с кислым ферроцианидом. Кроме того, гемосидерин дает положительную ШИК-реакцию, обусловленную его нахождением в белково-полисахаридном комплексе. Резко положительна реакция этого комплекса с тетразолием после бензотирования. Выявление гемоглобина бензидином по Пикворту 1. Материал фиксируют в формалине, заливают в парафин. 2. Депарафинированные срезы доводят до воды. 3. Промывают в метаноле. 4. Перевернутое стекло со срезом помещают в раствор бензидина (0,2 г бензидина и маленький кристаллик нитропруссида натрия растворяют в 15 мл метанола, добавляют 4 капли ледяной уксусной кислоты и встряхивают) в чашке для окрашивания на 5— 10 мин. 5. Смывают бензидин озонированным эфиром (50 мл 3 % перекиси водорода, 100 мл метанола и 50 мл эфира). 98
6. Помещают срез на 10 мин в свежую порцию озонированного эфира. 7. Промывают в проточной воде 10—15 мин. 8. Докрашивают ядра в 1 % водном растворе нейтрального красного 3 мин. 9. Промывают, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в дистрен-дибутил-ксилол. Результат: гемоглобин и некоторые «оксидазные» гранулы лейкоцитов окрашиваются в темно-синий цвет, ядра — в красный. Трехцветный метод выявления билирубина, гемосидерина и липофусцина по Гленнеру 1. Срезы толщиной 10 мкм готовят в криостате, наклеивают на стекла и подсушивают при комнатной температуре. 2. Погружают на 5 мин в 2 % раствор гексацианоферрата калия. 3. Обрабатывают 20 мин свежеприготовленной смесью равных частей 2 % гексацианоферрата калия и 5 % уксусной кислоты. 4. Ополаскивают в проточной воде и обрабатывают в течение 15 мин 3 % раствором бихромата калия с рН 2,2. 5. Промывают в воде. 6. Окрашивают свежепрофильтрованным раствором жирового красного О в изопропаноле 20 мин. 7. Промывают в проточной воде в течение 5 мин. 8. Заключают в сироп Апати. Результат: липофусцины окрашиваются в оранжево-красный цвет, гемосидерин — в синий, билирубин — в темный изумрудно-зеленый. Примечание. Гемосидерин растворяется в кислотах, поэтому для его выявления не следует применять кислые фиксаторы. Выявление желчных пигментов Желчные пигменты, как и гемосидерин, являются продуктом разложения гемоглобина и других железосодержащих белков. Основные желчные пигменты — билирубин и биливердин — обладают кислотными свойствами и образуют со щелочноземельными металлами соли, не растворимые в воде. Их идентификация возможна с помощью окраски метиленовым синим, реакций Гмелина и Штейна. Реакция Гмелина основана на окислении билирубина азотной кислотой, а реакция Штейна — на окислении его йодом. Метод Штейна позволяет выявить все желчные пигменты. 99
Реакция с йодом на желчные пигменты по Штейну 1. Материал фиксируют в формалине или спирте, заливают в парафин. 2. Депарафинированные срезы доводят до воды. 3. Обрабатывают 12—18 ч йодным реактивом (2 части раствора Люголя и 1 часть 10 % раствора йода на 96 % спирте). 4. Промывают в проточной воде 5 мин. 5. Обесцвечивают 5 % раствором тиосульфата натрия 30 с. 6. Промывают и докрашивают квасцовым кармином Майера 3-18ч. 7. Промывают в воде, обезвоживают абсолютным ацетоном, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Результат: желчные пигменты окрашиваются в темно-зеленый цвет, ядра — в красный. Выявление меланина Меланин имеет сложную полимерную структуру и обычно окрашен в черно-коричневый цвет, хотя имеются и другие оттенки — до желтого и даже фиолетового. Как правило, он встречается в форме гранул — меланосом — в клетках тканей эктодерма льного происхождения — в эпидермисе, волосах, волосяных фолликулах, меланомах кожи, пигментном эпителии радужки, сетчатке. В нервной системе присутствует разновидность меланина — нейромеланин. Меланин синтезируется в промеланосо- мах через окисление тирозина до ДОФА при участии тирозина- зы и пероксидазы. На этом основаны методы специфического контрастирования и электронно-микроскопического гистохимического выявления промеланосом по положительной реакции на тирозиназу. Выявление меланина основано на его способности образовывать комплексы с ионами двухвалентного железа, которые легко обнаруживаются гексацианоферратом калия в реакции турнбулевой сини. На этом принципе основан метод Ли л ли. «Железный» метод выявления меланина по Лилли 1. Материал фиксируют в различных смесях, заливают в парафин. 2. Депарафинированные срезы доводят до воды. 3. Помещают в 2,5 % раствор сульфата железа гептагидрата на 60 мин. 4. Промывают в 4 сменах дистиллированной воды по 5 мин. 5. Помещают в 1 % раствор гексацианоферрита (III) калия в 1 % уксусной кислоте на 30 мин. 6. Промывают в 1 % уксусной кислоте. 7. При желании докрашивают пикрофуксином по Ван-Гизону. 100
8. Проводят через спирт возрастающей концентрации и ксилол, заключают в бальзам. Результат: меланин окрашивается в темно-зеленый цвет на бесцветном фоне; такой же цвет имеет гемосидерин. Меланин, как и липофусцин, обладает способностью восстанавливать раствор аммиачного серебра. На этом основан принцип электронно-микроскопического гистохимического выявления промеланосом и меланосом по Мисиме. Раздельное выявление меланина и липофусцина возможно по их разному окрашиванию нильским синим. Кроме того, липофусцин в отличие от меланина дает видимую собственную флюоресценцию в ультрафиолетовом свете. Импрегнация серебром промеланосом и меланосом по Мисиме 1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в 10 % формальдегиде на фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 1 ч при 4 °С. 2. Тщательно промывают в дистиллированной воде. 3. Инкубируют в растворе аммиачного серебра 40 — 60 мин при 58 °С. 4. Промывают в нескольких сменах дистиллированной воды. 5. Кусочки ткани помещают на 1 — 2 мин в раствор трихлори- да золота (5 мл 6 % тиосульфата натрия смешивают с 5 мл 6 % тиоцианата аммония и добавляют по каплям 2 % раствор трих- лорида золота до образования розовато-красного осадка). 6. Кусочки ткани помещают сразу в 0,6 % раствор тиосульфата натрия на 8 мин. 7. Тщательно промывают в дистиллированной воде. 8. Дополнительно фиксируют в 0,6 % забуференном растворе перманганата калия или в 1 % забуференном растворе тетра- оксида осмия (рН 7,4) 1 ч при 4 °С. 9. Обезвоживают и заливают. Результат: серебрятся меланосомы и премеланосомы. Гранулярные отложения металлического серебра выявляются и в тех пре- меланосомах, в которых меланин не образуется (у альбиносов). Выявление липофусцина и меланина с применением нильского синего по Лилли 1. Материал фиксируют в любом фиксаторе, заливают в парафин. 2. Депарафинированные среды доводят до воды. 3. Окрашивают в течение 20 мин 0,05 % раствором нильского синего А в 1 % серной кислоте. 4. Промывают в проточной воде 10 — 20 мин. 5. Можно также быстро ополоснуть в 1 % растворе серной кислоты и обезводить в 4 порциях абсолютного ацетона. 101
6. Заключают после п. 3 в глицерин-желатин или после п. 4 проводят через ксилол и заключают в синтетическую среду. Результат: если обработка включала пп. 4 и 6, то липофусцины окрашиваются в темно-синий или зеленый цвет, меланин — в темно-зеленый; при обработке с включением пп. 5 и 6 меланин окрашивается в темно-зеленый цвет, а липофусцины сохраняют свою первоначальную окраску. Метод дифференцировки меланина от липофусцина по Хужу 1. Материал фиксируют в любом фиксаторе, заливают в парафин. 2. Депарафинированные срезы помещают в дистиллированную воду. 3. Срезы окрашивают свежеприготовленным насыщенным водным раствором нильского синего 30 мин. 4. Промывают в дистиллированной воде. 5. Обесцвечивают 10 % перекисью водорода 24 ч. 6. Промывают в проточной воде. 7. Заключают в глицерин-желатин. Результат: липофусцин окрашивается в синий цвет, меланин в результате обработки перекисью водорода обесцвечивается. Выявление жировых пигментов Наряду с липофусцином к жировым пигментам относятся гемо- фусцин, цероид, псевдомеланин, железосодержащие липопиг- менты и каротиноиды. Липофусцин обладает выраженной базофилией и сильной восстанавливающей способностью, на чем основана реакция Шморля — основная реакция на липофусцин. Липофусцин окрашивается также нильским синим. Выявление кислотоустойчивых липофусцинов по Цилю—Нильсену 1. Материал фиксируют в различных смесях, заливают в парафин. 2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды. 3. Окрашивают срезы в течение 3 ч при 60 °С в растворе кар- бол-фуксина (10 г основного фуксина + 50 г фенола + 100 мл спирта + 1000 мл дистиллированной воды). 4. Промывают в проточной воде. 5. Дифференцируют в 1 % солянокислом спирте до тех пор, пока эритроциты не станут розовыми. 6. Промывают в дистиллированной воде. 102
7. Докрашивают в железных квасцах или 0,5 % растворе то- луидинового синего. 8. Промывают в проточной воде. 9. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам. Результат: кислотоустойчивые липофусцины окрашиваются в ярко-красный цвет, а липопротеиды приобретают красноватый оттенок; ядра окрашиваются в темно-синий или синий цвет. Примечание. Из-за базофилии липофусцинов слишком сильная докраска обусловливает развитие темно-красного окрашивания. В присутствии фенола растворимость красителей в липидах повышается. Метод Шморля для выявления липофусцина 1. Материал фиксируют в формалине, заливают в парафин или получают срезы на замораживающем микротоме. 2. Срезы промывают в дистиллированной воде. 3. Помещают срезы на 5 — 20 мин в реакционную смесь [3 части 1 % раствора дихлорида железа смешивают с 1 частью 1 % раствора гексацианоферрата (III) калия; смесь используют в течение 30 мин после приготовления]. 4. Срезы хорошо промывают в проточной воде. В особенно важных случаях рекомендуется проводить микроскопию срезов, заключенных в воду. 5. Быстро обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам. Результат: липофусцин и меланин окрашиваются в темно- синий цвет. Кроме того, положительную реакцию дают арген- таффинные гранулы, а также ткани, содержащие активные 5Н- группы. Примечание. После п. 4 можно провести окрашивание ядер 1 % нейтральным красным в течение 3 мин. ГИСТОХИМИЯ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ Гистохимическое выявление неорганических веществ сопряжено с трудностями, обусловленными прежде всего их легкой растворимостью и тем, что концентрация их в клетках редко бывает достаточно высокой для определения гистохимическими методами. В связи с этим для локализации неорганических элементов предпочтение следует отдавать гистофизическим методам, используемым в растровой (сканирующей) электронной микроскопии,— дифракции электронов и электронного зонда. Из гистохимических методов выявления неорганических веществ ограничимся рассмотрением наиболее надежных и до- 103
ступных — реакций выявления железа, калия, натрия, группы тяжелых металлов и хлора. Выявление железа Выявляется только свободное железо. Определить железо, входящее в состав органических молекул (например, гемоглобина, цитохрома, ферритина), можно только после его высвобождения из органических связей. Выявление двухвалентного железа (ферро-иона) по Тирману и Шмельцеру основано на образовании турнбулевой сини в результате реакции ионов железа (II) тканей с гексацианоферра- том калия. Выявление железа (II) по образованию турнбулевой сини 1. Материал фиксируют в формалине, заливают в парафин или получают срезы на замораживающем микротоме. 2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды (если срезы дополнительно обработать 10 % раствором сульфида аммония в течение 1 — 24 ч, то выявляется также трехвалентное железо). 3. Тщательно промытые в дистиллированной воде срезы обрабатывают свежеприготовленным раствором, состоящим из равных частей 20 % водного раствора гексацианоферрата (III) калия и 1 % соляной кислоты, в течение 10 — 20 мин. 4. Срезы тщательно промывают в дистиллированной воде. 5. При желании ядра можно докрасить ядерным прочным красным. 6. Промывают в дистиллированной воде. 7. Проводят через спирты возрастающей концентрации и ксилол заключают в бальзам. Результат: соединения железа (II) окрашиваются в темно- синий цвет. Примечание. Надежность этого метода можно повысить путем контрольной экстракции железа. С этой целью ткань фиксируют в 80 % спирте, насыщенном сероводородом, в течение 24 ч при 4 °С обрабатывают при комнатной температуре в следующем растворе: 1 г 1,10-фенантролинийхлорида + 100 мл дистиллированной воды. Этот раствор сменяют несколько раз до исчезновения красного окрашивания, после чего срезы промывают в дистиллированной воде. Проводят реакцию выявления железа. Выявление иона трехвалентного железа (ферри-иона) по Перлсу основано на образовании берлинской лазури (ферроци- анида) в результате реакции ионов железа (III) с гексациано- ферратом калия тригидридом в кислом растворе. 104
Метод Перлса для выявления железа (III) с помощью реакции берлинской лазури по Лизону 1. Материал фиксируют в формалине (применение кислых фиксаторов и смеси с хромом недопустимо), заливают в парафин (замороженные срезы менее пригодны). 2. Депарафинированные срезы доводят до дистиллированной воды. 3. Срезы помещают в свежеприготовленный раствор, состоящий из равных частей 2 % гексацианоферрата (II) калия три- гидрата и 2 % соляной кислоты, на 30 — 60 мин (новый раствор использовать спустя 30 мин). 4. Промывают в дистиллированной воде. 5. В случае необходимости ядра окрашивают ядерным прочным красным, после этого промывают дистиллированной водой. 6. Проводят через спирты возрастающей концентрации и ксилол, заключают в бальзам. Результат: соединения железа (III) окрашиваются в темно- синий цвет. Примечание. Следует избегать контакта срезов с металлическими инструментами. Возможно проведение контрольной реакции с экстракцией железа Выявление кальция В тканях животных нерастворимый кальций присутствует большей частью в виде фосфатов и карбонатов. Метод Даля основан на образовании комплексов ализариновых красителей с металлами, окраска которых зависит от величины рН. При рН 4,1 — 4,3 комплекс с кальцием избирательно окрашивается в оранжево-красный цвет. Выявление кальция по Далю в модификации Мак Ги—Рассела 1. Материал фиксируют в формалине или формалин-этаноле, заливают в парафин (кислые или металлосодержащие фиксирующие среды менее пригодны). 2. Депарафинированные срезы помещают в 50 % спирт. 3. Быстро промывают дистиллированной водой. 4. Под контролем микроскопии окрашивают ализариновым красным 5 (в 2 % раствор ализаринового красного 5 добавляют слабый раствор аммиака — 1:100, доводя рН до 4,1—4,3) 30 с — 5 мин. 5. Срезы без промывания подсушивают фильтровальной бумагой. 6. Помещают в абсолютный ацетон на 10 — 20 с. 105
7. Проводят через ацетон-ксилол (1:1) 10 —20 с, ксилол и заключают в бальзам. Результат: отложения кальция окрашиваются в оранжево- красный цвет, неорганическое железо — в пурпурный, остальные структуры — в розовый. Примечание. При изменении рН могут окрашиваться другие неорганические соединения. Выявление калия В тканях животных калий находится преимущественно в ионизированной растворенной форме, поэтому основные процедуры проводят при низкой температуре и предпочтение отдают работе с лиофилизированными срезами. Современные приемы гистохимического выявления калия основаны на методе Макаллума: срезы обрабатывают нитритом кобальта-натрия, который образует с калием микрокристаллический осадок тройной соли — кобальта калия нитрит. В некоторых модификациях этот осадок желтовато-коричневого цвета преобразуют в сульфид кобальта. Выявление калия по Макаллуму в модификации Краута и Дженнингса 1. Материал замораживают, высушивают и заливают в парафин. 2. Лиофилизированные парафиновые срезы толщиной 10 мкм переносят для депарафинирования непосредственно в пет- ролейный эфир (срезы к предметному стеклу не прикреплять!). 3. Свободноплавающие срезы помещают в новую смену пет- ролейного эфира. 4. Срезы прикрепляют к предметному стеклу (без покрытия стекол белком с глицерином) и высушивают на воздухе, после чего слегка прижимают их фильтровальной бумагой. 5. Обрабатывают раствором нитрита кобальта (25 г нитрита кобальта растворяют в 7 мл воды, добавляют 12,5 мл уксусной кислоты; 120 г нитрита натрия растворяют в 180 мл дистиллированной воды; к первому раствору добавляют 210 мл второго. Смесь охлаждают на воздухе 1 — 2 ч для удаления диоксидеазо- та, затем в холодильнике и фильтруют перед применением на холоду). 6. Просушивают фильтровальной бумагой, промывают в трех сменах дистиллированной воды, охлажденной на льду, по 15 с в каждой (пока не перестанут отделяться желтоватые облачка красителя). 7. Проводят через спирты возрастающей концентрации и ксилол, заключают в бальзам. Результат: кобальта калия нитрит выпадает в осадок в виде желтовато-коричневых кристаллов. 106
Выявление тяжелых металлов Тяжелые металлы присутствуют в тканях обычно в виде легкорастворимых солей. Методы гистохимического выявления основаны прежде всего на их обработке сероводородной водой или растворами сульфидов для перевода в нерастворимые сульфиды данного металла. Некоторые авторы в эксперименте прибегают к перфузии органов раствором сульфида после непродолжительной перфузии альдегидного фиксатора или объединяют процессы фиксации и образования сульфида, используя в качестве фиксатора раствор альдегида, насыщенный сероводородом. Для лучшего выявления осадка Т1тт (1958) рекомендовал осаждение на нем металлического серебра из восстанавливающей среды, содержащей нитрит серебра. Эти приемы используют и для определения в ткани тяжелых металлов в электронно- микроскопической гистохимии. Выявление тяжелых металлов с помощью сульфида серебра по Тимму Необходимые растворы: а) раствор гуммиарабика: 20 или 40 г неизмельченного гуммиарабика растворяют в 100 мл дистиллированной воды, оставив раствор стоять 7 — 14 дней (100 мл); б) свежеприготовленный 10 % водный раствор нитрата серебра (1 мл); в) восстанавливающая среда: 5 г лимонной кислоты и 2 г гидрохинона растворяют в 100 мл бидистиллированной воды (100 мл). Растворы а, б и в (проявляющий раствор) смешивают непосредственно перед применением. 1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в 70 % спирте, насыщенном сероводородом (добавить 2 капли концентрированного аммиака к 100 мл) в течение 10 — 12 ч, заливают в парафин. 2. Срезы толщиной 6 — 8 мкм, прикрепленные к предметным стеклам без приклеивающего вещества, доводят через ксилол и спирт убывающей концентрации до дистиллированной воды. 3. Срезы, прикрепленные к предметным стеклам, помещают в плоские чашки, осторожно заливают проявляющим раствором и проявляют в темноте при 20 °С до тех пор, пока они не приобретут светло-коричневый цвет, обычно в течение 20 — 60 мин, максимально 6 ч 4. Промывают в дистиллированной воде. 5. Ядра докрашивают ядерным красным или гемалауном. 6. Промывают в дистиллированной или проточной воде. 7. Проводят через спирты и ксилол, заключают в бальзам. Результат: тяжелые металлы окрашиваются в темно-коричневый цвет, ядра — в синий (гемалауном) или в красный (ядерный прочный красный). 107
Примечание. Специфичность реакции можно повысить, используя контроли. Образование осадка в процессе окрашивания можно уменьшить с помощью бидистиллированной воды и кварцевого стекла. Выявление тяжелых металлов с помощью сульфида серебра для криостатных срезов по Брунку и Шеельду 1. Из свежей ткани вырезают тонкие кусочки (максимальная толщина 2 мм). 2. Обрабатывают во влажной камере при 20 °С парами сероводорода в течение 20 мин. 3. Криостатные срезы толщиной 6 — 8 мкм прикрепляют на предметные стекла. 4. Дальнейшую обработку проводят по стандартному методу Тимма, начиная с п. 3. Выявление натрия Натрий, как и калий, присутствует в тканях в легко диффузи- руемой, чаще всего ионизированной, форме Однако ионы натрия могут быть стабилизированы для электронно-микроскопического исследования уже в процессе фиксации путем его осаждения гексагидроксоантимонатом калия по Комнику. С этой целью можно использовать также пироантимонат калия. Осадок гексагидроксоантимоната натрия малорастворим и хорошо выдерживает последующую обработку тканей для электронной микроскопии. Осадок обладает высокой электронной плотностью. Специфичность этого метода, однако, невысока. Помимо гексагидроксоантимоната натрия в осадок могут выпадать соли некоторых других металлов; может также вступать в реакцию гликоген. Выявление хлора Для гистохимического обнаружения хлора в настоящее время применяют исключительно методы серебрения. Использовавшиеся ранее растворы перманганата калия и нитрата серебра не позволяли надежно установить локализацию легко диффунди- руемых ионов хлора, так как эти соли серебра, являющиеся сильными осадителями белков, проникают в ткань медленно и на небольшую глубину. Лучше проявили себя ацетат и лактат серебра. Осаждение хлора проводят в процессе фиксации ткани, при этом принимают меры против смешения ионов хлора. 108
Электронно-микроскопическое выявление хлора по Комнику Принцип метода заключается в осаждении хлора ацетатом или лактатом серебра. 1. Маленькие кусочки ткани фиксируют, постоянно помешивая (1 ч), в темноте или при слабом красном свете в течение 2 ч. Фиксирующая смесь: 1,5 % тетраоксидосмия, 1 % лактат серебра в 0,05 — 0,1 М какодилат уксусном буфере (рН 6,4 — 6,6). 2. Кусочки ткани переносят в темноте или при слабом красном свете в 10 % и 30 % ацетон на 5 мин в каждый. 3. Дифференцируют в 2 сменах 0,1 н. азотной кислоты в 50 % ацетоне по 5 мин. 4. Обезвоживают в 2 сменах (70 % и 90 %) ацетона по 5 мин и в 3 сменах абсолютного ацетона по 10 мин. 5. Заливают в эпоксидные смолы и полиэфиры. Результат: хлорид серебра выпадает в виде электронно-плотного мелкозернистого осадка. ГИСТОХИМИЯ ФЕРМЕНТОВ В настоящее время известно около 1000 ферментов, но лишь около 100 из них доступны гистохимическому изучению. Вместе с тем информация, получаемая с помощью гистохимических методов, гораздо более ценная, чем это может показаться на первый взгляд. Во-первых, при изучении обмена веществ в конкретном типе клеток или ткани необязательно анализировать все или большинство ферментов, достаточно выявить ключевой фермент исследуемого цикла. Во-вторых, энзимогистохимичес- кие методы позволяют исследовать ферменты в тканях и клетках т 81(Л1, не подвергая их разрушению, связанному гомогенизацией, аутолизом, элюцией и резорбцией в процессе выделения, что может привести к ошибочной интерпретации результатов. С помощью гистохимических подходов удается обнаруживать ферменты не только на тканевом, но также часто на клеточном и субклеточном уровнях. Основные принципы гистохимического выявления ферментов В основе энзимогистохимических методов лежит выявление продукта ферментативной реакции. При этом, строго говоря, определяется не сам фермент, а его активность. Гистохимическая реакция выявления ферментативной активности состоит из двух этапов — собственно ферментативной реакции и одновременной или последовательной реакции «захвата» с образованием окрашенного конечного продукта гистохи- 109
мической реакции (нерастворимого хромогена) по следующей схеме: субстрат -> первичный продукт реакции -> реакция «захвата» -> конечный продукт реакции (нерастворимый хромоген). Все известные гистохимические реакции определения ферментативной активности можно разделить на реакции осаждения ионами металлов, окислительно-восстановительные реакции, индигогенные методы, реакции азосочетания, реакции со вспомогательными ферментами и реакции синтеза. Реакции осаждения ионами металлов Реакция Гомори Реакция Гомори (определение активности кислой фосфатазы) — самая простая и одна из наиболее демонстративных. Обычно в этой реакции используют натриевую соль р-глицерофосфата. Для осуществления одновременной реакции «захвата» в инкубационную среду в качестве осаждающего агента вводят ионы свинца. Образующийся осадок фосфата свинца имеет белый цвет и обнаруживается при световой микроскопии. Для его выявления в новой среде проводят реакцию превращения: белый осадок фосфата свинца переводят в темно-коричневый осадок сульфида свинца путем обработки срезов раствором сульфида аммония или натрия. Для электронно-микроскопической гистохимии третий этап (реакция превращения) необязателен, так как осадок фосфата свинца имеет высокую электронную плотность и прекрасно виден в электронном микроскопе. Реакция Карновски—Рутса Реакция Карновски — Рутса является модифицированной реакцией Гомори, которую применяют для определения активности холинэстеразы. В ней в качестве осаждающего агента используют ионы трехвалентного железа (гексацианоферрат калия). Феррицианид под действием образующегося в ферментативной реакции тиохолина восстанавливается в ходе реакции превращения до ферроцианида, который в свою очередь, взаимодействуя затем в реакции «захвата» с ионами меди, образует нерастворимый ферроцианид меди (так называемый коричневый пигмент Хэтчетта). Окислительно-восстановительные реакции Индикаторы — акцепторы электронов (водорода) В гистохимических реакциях, используемых для определения активности окислительно-восстановительных ферментов, в капо
честве индикаторов, которые, принимая на себя водород, меняют окраску и выпадают в осадок, применяют соли тетразолия Пригодность солей тетразолия для гистохимических целей определяется прежде всего их окисляющей способностью, или окислительно-восстановительным потенциалом, т.е. готовностью принимать на себя водород (электроны), который, проходя через систему переносчиков в дыхательной цепи, соединяется с молекулярным кислородом. Наряду с солями тетразолия способностью «снимать» электроны с дыхательной цепи обладает феррицианид, который взаимодействует с дыхательной цепью на участке дегидрогеназы и цитохрома С. В условиях гистохимической реакции феррицианид восстанавливается преимущественно или исключительно де- гидрогеназой. Индикаторы — донаторы электронов (водорода) В 1885 г. П. Эр лих открыл индофеноловую реакцию, которая затем получила название «НАДИ-реакция» по первым двум буквам участвующих в ней реагентов — нафтола и диамина. Впоследствии было установлено, что в НАДИ-реакции выявляется не ци- тохромоксидаза, а ее субстрат — цитохром С, причем в окисленной форме однако участие цитохромоксидазы в этой реакции обязательно. Запас окисленного цитохрома С в ткани ограничен, и реакция возможна лишь при постоянном окислении цитохромок- сидазой цитохрома С, восстанавливаемого в индофенолоксидаз- ной реакции. Таким образом, речь идет о «непрямом» гистохимическом выявлении цитохромоксидазы, основанном на способности ароматических аминов восстанавливать цитохром С. Принципиальная схема индофенолоксидазной реакции Эр- лиха лежит в основе ряда других гистохимических реакций выявления оксиредуктаз, из которых наибольшее значение имеет реакция с 3,3-диаминобензидином (ДАБ) для выявления перок- сидазы по Карновски — Грэхему и цитохромоксидазы по Зелиг- ману и соавт. ДАБ, так же как и НАДИ-реагенты, является донатором электронов для цитохромоксидазы и других терминальных оксидаз. Индигогенные методы Многие растения, например разновидности индигофера, содержат глюкозид индикан, который при кислотном или ферментативном гидролизе распадается на глюкозу и индоксил. Важнейшей особенностью последнего является его легкая окисляемость под действием кислорода воздуха, особенно в щелочных растворах. Окисление идет недостаточно быстро для того, чтобы исключить диффузию молекул индоксила от места локализации фермента, поэтому для увеличения скорости образование конеч- 111
ного окрашенного продукта — индиго в инкубационную среду добавляют окисляющий агент — феррицианид, феназинмето- сульфат или соль тетразолия. Азосочетание (одновременное и последовательное) Азосочетанием называется взаимодействие ароматических диа- зосоединений, содержащих диазогруппу (-К=М-), с веществами, имеющими способный к замещению атом водорода, связанный с атомом углерода. Изомер диазогруппы, состоящий из трехвалентного и пятивалентного атомов азота, который называется диазонием (=№=Ю, определяет высокую реактивность диазосоединений. Наибольшее практическое значение в гистохимии имеет азосочетание с производными нафтолов, нафтила- мина и индолиламина. В качестве сочетающихся агентов могут быть использованы соединения не только с одной, но и с двумя азогруппами, т.е. тетразотированные производные, и с тремя азогруппами — гек- сазотированные производные. В продажу эти соединения поступают в стабильной (прочной) форме в виде диазониевых солей, поэтому в их названии присутствует слово «прочный». Другая составляющая их названия — «синий», красный» или «гранатовый» — характеризует цвет азокрасителя, образующегося после реакции азосочетания. В гистохимической практике наибольшее значение имеют следующие соли диазония: прочный синий В, прочный синий КК, прочный красный ТК, прочный гранатовый ВС, прочный синий УВ, гексазотированный парарозанилин и гексазотированный новый фуксин. Если реакции ферментативного расщепления и сочетания проводят одновременно в одной среде, то их называют реакциями одновременного азосочетания. Если же эти реакции осуществляют в разное время и в двух разных средах, то их называют реакциями последовательного азосочетания. В реакциях последовательного азосочетания растворимые субстраты после их ферментативного гидролиза превращаются в менее растворимые продукты и концентрируются в местах локализации фермента. Для выявления гидролизованного субстрата в новой среде проводят реакцию сочетания с солью диазония. При этом не исключается возможность артефактов вследствие диффузии продуктов первичной (ферментативной) реакции. Обычно к методу последовательного сочетания прибегают для выявления ферментов, активность которых подавляется диазониевыми солями, как, например, в случае гетерогалактозидазы. Реакции с вспомогательными ферментами В тех случаях, когда конечный продукт ферментативной реакции не поддается гистохимическому выявлению, его можно из- 112
менить с помощью вспомогательного фермента и сделать доступным для обнаружения. Так поступают при выявлении окси- даз, таких как моноаминооксидаза и глюкооксидаза. Одним из конечных продуктов реакции в этих случаях является перекись водорода, локализация которой может быть установлена во вспомогательной реакции с экзогенной пероксидазой и донором электронов, например ДАБ. Реакция синтеза В тех случаях, когда из низкомолекулярного субстрата под действием фермента синтезируется высокомолекулярный нерастворимый продукт, последний может быть локализован с помощью обычных гистохимических методик в новой среде. Этот принцип используют для определения активности глико- зилтрансфераз. Ее выявление проводят в две стадии в разных средах. 1. Стадия синтеза: фермент отщепляет О-глюкозу от растворимого субстрата (О-глюкозо-1-фосфата, уридиндифосфатглю- козы) и образует из нее полигликан, характеризующийся значительно меньшей растворимостью, чем субстрат. 2. Стадия гистохимического окрашивания: синтезированный полигликан визуализируется с помощью раствора Люголя или ШИК-реакции. Особенности заливки и фиксации ткани при гистохимическом выявлении ферментов В обычной патоморфологической (диагностической) лаборатории специфические требования гистохимии ферментов и соответствующей обработки материала могут быть удовлетворены лишь в ограниченной степени. Тем не менее параллельно с получением постоянных гистологических препаратов можно проводить выявление ряда ферментов (кислая и щелочная фосфа- тазы, пептид азы, глюкоамилазы, эстераза и др.) с помощью быстрой заливки в парафин. Для этого материал фиксируют в альдегидах в течение 2 — 3 ч при 4 °С, промывают дважды по 60 мин в буферном растворе, 5 % сахарозе или изотоническом растворе хлорида натрия при 4 °С, обезвоживают 30 — 45 мин при 4 °С в 50 % ацетоне, а затем в 3 сменах 100 % ацетона 3 —24 ч. В последней смене ацетона материал оставляют на 1 — 2 ч при комнатной температуре. Затем тканевые блоки просветляют в 3 сменах (по 10 мин каждая) бензола, толуола или ксилола, промокают фильтровальной бумагой, помещают в парафин на 30 — 45 мин при 56 °С и переносят в контейнеры для заливки в новой смене парафина. 113
Выявление неспецифических кислых фосфатаз по Гомори 1. Кусочки ткани фиксируют в холодном кальций-формоле по Бейкеру. Получают срезы на замораживающем микротоме или криостатные срезы с постфиксацией в холодном кальций- формоле в течение 10—15 мин или в холодном ацетоне в течение 15 — 30 мин. 2. Срезы инкубируют до 30 мин при 37 °С в свежеприготовленном растворе субстрата: 0,05 М ацетатный буфер (рН 5,3) 50 мл 3 % р-глицерофосфат натрия 5 мл ацетат или нитрат свинца 80 мг 3. Срезы промывают в 4 сменах дистиллированной воды всего в течение 1—2 мин. 4. Обрабатывают 0,5—1 % раствором сульфида аммония около 1 — 2 мин. 5. Срезы тщательно промывают в нескольких сменах дистиллированной воды. 6. Заключают в глицерин-желатин или обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Результат: активность фермента проявляется коричневато- черным окрашиванием в местах выпадения осадка сульфида свинца. В контроле после инкубации без субстрата или после добавления 0,01 М фторида натрия в инкубационную среду реакция должна быть отрицательной. Примечание. Наиболее надежные результаты получают на свободноплавающих срезах. При фиксации ацетоном с последующей заливкой в парафин под вакуумом продолжительность инкубации в зависимости от исследуемой ткани следует увеличивать до 4 ч. Обезвоживание срезов и заключение через ксилол в бальзам или другие синтетические заливочные среды приводят к небольшим потерям осадка сульфида свинца, указывающего на локализацию ферментативной активности. Кусочки ткани, фиксированные в холодном формалине, хранят в 0,88 М сахарозе или 1 % гуммиакации (4 °С) несколько недель без значительных потерь ферментативной активности. Выраженных посмертных изменений в локализации кислой фосфатазы в первые 6 ч не наблюдается. Выявление щелочной фосфатазы методом азосочетания по Гомори в модификации Берстона 1. Фиксацию образцов тканей проводят различными способами (так же как в аналогичном методе с солями металлов). Можно также использовать криостатные срезы нефиксированной ткани, монтированные на предметных стеклах. Вегз1:оп 114
(1965) рекомендует такие срезы фиксировать в течение нескольких минут в ацетоне. Особенно четко щелочная фосфатаза выявляется в срезах тканей, залитых в парафин после фиксации и обезвоживания в холодном ацетоне (без использования спирта), или после лиофильной сушки. 2. Промывают в 3 сменах 8,5 % сахарозы по 5, 10 и 30 мин или в течение ночи при -4 °С. Допустимо промывание в изотоническом растворе хлорида натрия или проточной воде продолжительностью не более 2 ч. 3. Инкубируют при комнатной температуре или 37 °С в течение 5 — 30 мин или более в зависимости от уровня активности фермента в среде следующего состава: приблизительно 10 мг натриевой соли р-нафтилфосфата растворяют в нескольких миллилитрах дистиллированной воды, добавляют 2 —4 мл 5 % раствора тетрабората натрия, 40 мл холодной дистиллированной воды, несколько капель 10 % раствора хлорида или сульфата магния, 20 — 50 мг соли диазония (прочный синий В, УВ или КК, прочный красный КС, О или др.), раствор встряхивают и фильтруют; рекомендуется встряхивать сосуд в процессе инкубации. 4. Промывают в растворе сахарозы, изотоническом растворе хлорида натрия или проточной воде. 5. В случае необходимости докрашивают ядерным красителем и дифференцируют в подкисленном 70 — 80 % спирте. 6. Промывают и заключают в глицерин-желатин или обезвоживают и заключают в бальзам, если краситель нерастворим в органических растворителях. Азокраситель, образованный (3-на- фтолом и тетразотированным о-дианизидином (прочным синим В), нерастворим в спиртах и ксилоле, по растворим в их смеси, поэтому срезы перед переносом из последнего спирта в ксилол следует осторожно промокнуть фильтровальной бумагой. Большинство других азокрасителей более или менее растворимы в абсолютном спирте и особенно в ксилоле. Примечание. Вместо (3-нафтилфосфата в качестве субстрата можно использовать фосфаты нафтолов А5-МХ, А5-Аг\[, А5-С1, А5-КВ, А5-ТК, А5-В1, А5-Е и др. В этом случае инкубационную среду готовят следующим образом субстрат (фосфат нафтола А5) 5 мг (растворить в 0,25 мл диметилформамида или диметилсульфоксида) дистиллированная вода 25 мл 0,2 М трис-НС1-буфер (рН 8,3-9,3) 25 мл Соль диазония (прочный синий В или др ) 30 мг Раствор встряхивают и фильтруют. Срезы инкубируют от 5 мин до нескольких часов. Промывают в проточной воде и заключают в глицерин-желатин или обезвоживают и заключают в бальзам либо смолу. Особенно высокое оптическое качество 115
препаратов получают при обезвоживании 80 % спиртом и заключении в раствор поливини л ацетата в 80 % спирте. Можно использовать стабильный основной раствор, содержащий субстрат и буфер. Для этого 50 мг субстрата растворяют в 20 мл ММ-диметилформамида. Добавляют 20 мл воды и доводят до рН 8,0 с помощью 1 М раствора карбоната натрия (требуется 0,5— 1 мл раствора; рН на этой стадии нельзя проверять по индикаторной бумаге). Добавляют 600 мл дистиллированной воды и доводят до 1 л 0,2 М трис-НС1-буфером (рН 8,3 — 8,6). После добавления буфера раствор обычно становится опалесци- рующим: Основной раствор устойчив при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. Для гистохимического применения к 50 мл основного раствора добавляют соль диазония, встряхивают и фильтруют в сосуд Коплина. Выявление неспецифической кислой фосфатазы с нафтолом А5-В1-фосфатом и гексазотированным парарозанилином по Лойде 1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в кальций-формоле по Бейкеру при 4 °Св течение 12 — 24 ч; срезы получают на замораживающем микротоме или используют криостатные срезы. Постфиксацию свежих замороженных срезов проводят в холодном кальций-формоле в течение 15 — 60 мин; промывают в холодной воде 5 мин. 2. Инкубацию осуществляют в течение 30 — 90 мин при комнатной температуре (при 37 °С продолжительность инкубации уменьшается) или в холодильнике (несколько часов) в следующем растворе: фосфат нафтола А5-В1 5 мг (свежерастворенный в 0,25 мл диметилформамида) 0,1 М ацетатный буфер (рН 5,0 — 5,5) 10 мл (добавляют сразу) 5 % хлорид магния 1 — 2 капли гексазотированный парарозанилин 0,3 — 0,9 мл Проверить и, если необходимо, установить нужную величину рН; раствор профильтровать! Для приготовления гексазотированного парарозанилина равные части холодного 4 % парарозанилина в 2 н. соляной кислоте и холодного 4 % водного нитрата натрия сливают при постоянном помешивании на ледяной бане, пока раствор не приобретет бледно-желтый цвет (около 1 — 2 мин); 1 н. гидроксид натрия добавляют по каплям до рН 6,0 (из-за быстрого испарения жидкости проверку рН следует проводить быстро!). 3. Срезы промывают в дистиллированной и проточной воде. 4. Заключают в глицерин-желатин. 116
Результат: активность неспецифической кислой фосфатазы проявляется выпадением осадка светло-красного красителя. Контроль — как в методе Гомори. Примечание. Перед приготовлением замороженных или криостатных срезов рекомендуется промывать кусочки ткани, фиксированные в кальций-формоле в течение 3 —4 ч или дольше в холодном 7,5 % растворе сахарозы. Светло-желтое окрашивание раствора гексазотированного парарозанилина не мешает реакции. Загрязнение красителя, а также неполное гекса- зотирование иногда приводят к сильному неспецифическому окрашиванию. Выявление АТФазной активности с солями свинца по Гомори в модификации Бухвалова 1. Маленькие кусочки ткани фиксируют при 4 °С в кальций- формоле по Бейкеру или в 2 % формальдегиде, свежеприготовленном из параформальдегида, на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2 — 7,4) 2 — 24 ч или в смеси такого же формальдегида и 0,2 % глутарового альдегида 1—4 ч. 2. Промывают при 4 °С в 3 сменах 8,5 % сахарозы в течение 2 ч и в случае необходимости хранят при 4 °С в 8,5 % сахарозе от 1 до нескольких суток. 3. Готовят в криостате или на вибратоме срезы ткани толщиной 10 мкм (для световой микроскопии) или 50 мкм (для электронной микроскопии). Для световой микроскопии можно использовать свежезамороженные нефиксированные срезы. 4. Инкубируют в течение 30 — 60 мин при 37 °С в среде следующего состава (в скобках указана конечная концентрация): АТФ (натриевая соль) 12 мг (2 мМ) дистиллированная вода 5,6 мл 0,2 М трис-малеатный буфер 4 (80 мМ) 4,3 % ацетат магния или 4,9 % сульфат магния 0,1 мл (2 мМ) сахароза 850 мг (0,25 мМ) 2 % нитрат или ацетат свинца 0,3 мл (2 мМ) Раствор соли свинца (II) добавляют в последнюю очередь по каплям при интенсивном помешивании. 5. Дальнейшая обработка срезов: а) для световой микроскопии промывают в дистиллированной воде, помещают в 1 % сульфид аммония или сульфид натрия на 1 мин, промывают в дистиллированной воде и заключают под покровное стекло в глицерин-желатин; б) для электронной микроскопии промывают срезы в 8,5 % сахарозе, контрастируют в 1 % тетраоксида осмия, гексацианоферратом калия на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0 — 7,4) в течение 1 —2 ч, помещают в 70 % спирт на ночь при 4 °С, обезвоживают и заливают в эпон, аралдит или весто- 117
пал, готовят ультратонкие срезы и желательно без дополнительного контрастирования, просматривают в электронном микроскопе Возможно также осмирование в стандартном растворе тетраоксида осмия и контрастирование у ранил ацетатом, а также цитратом свинца, если последний не будет маскировать продукт гистохимической реакции. Результат: локализацию ферментативной активности определяют по коричнево-черному осадку сульфида свинца в световом микроскопе или электронно-плотным гранулам фосфата свинца в электронном микроскопе Примечание. При электронно-гистохимическом изучении локализации активности АТФазы и других нуклеозид-фос- фатаз в суспензиях клеток оптимальные результаты получают при фиксации клеток в 2 % формальдегиде, свежеприготовленном из параформальдегида, в течение 1 ч и хранении в 8,5 % сахарозе при 4 °С в течение 18 — 24 ч. Выявление фосфогидролаз на основе свинцового метода Гомори в модификациии Бухвалова 1. Первые четыре этапа обработки материала соответствуют пунктам 1—4 предыдущего метода. Можно также использовать и нефиксированные суспензии клеток и субклеточных фракций в 0,25 М сахарозе, содержащей ионы М§ (3 ммоля), или срезы нефиксированной ткани, приготовленные на вибратоме без замораживания. В этом случае альдегидную фиксацию осуществляют после инкубации в соответствующей среде с субстратом. 2. Инкубация в течение 30 — 60 мин при 37 °С в соответствующей исследуемому ферменту среде с субстратом (табл. 3). 3. После инкубации материал обрабатывают соответственно п. 5 предыдущей методики. Результат: локализацию ферментативной активности определяют по коричнево-черному осадку сульфида свинца в световом микроскопе или электронно-плотным гранулам фосфата свинца в электронном микроскопе. В контроле (инкубация в среде без субстрата; сравнение результатов гистохимической реакции с различными субстратами в аналогичных инкубационных средах; добавление в инкубационную среду инкубатора — 0,01 М фторида натрия для кислой фосфатазы, 2,5 М п-хлоромеркурибензоата для Са-активируемой АТФазы и 0,05 М Ь-фенилаланина для щелочной фосфатазы) указанные продукты должны отсутствовать. Выявление неспецифической эстеразы по Дэвису—Орнштейну 1. Маленькие кусочки ткани фиксируют в кальций-формоле по Бейкеру или в 2 — 3 % глутаровом альдегиде при 4 °С; гото- 118
Таблица 3. Состав унифицированной среды для выявления активности АТФазы, 5'-нуклеотидазы, глкжозо-6-фосфатазы и неспецифической фосфа- тазы Компонент среды Субстрат Дистиллированная вода 0,2 М трис-малеатный буфер 0,2 М трис-НС1-буфер 0,2 М ацетат магния (4,3 %) или сульфат магния (4,9 %) Сахароза Ацетат или нитрат свинца 2 % АТФаза 12 мг АТФ 5,6 мл 4 мл (рН 7,2) 0,1 мл 850 мг 0,3 мл 5'-Нук;1со- тидаза 7.5 мг 5'-АМФ 5.6 мл 4 мл (рН 7,2) 0,1 мл 850 мг 0,3 мл Глюко ю-6- фосфагага 20 МГ 5,6 мл 4 мл (рН 6,7) 850 мг 0,3 мл Нес исцифическая фосфата за 5 мг р-глице- рофосфата 5,6 мл 4 мл (рН 5,0, или 6,0, или 7,2) 4 мл (рН 9,0) 0,1 мл 850 мг 0,3 мл 1 вят замороженные или криостатные срезы толщиной 10 — 15 мкм; нефиксированные замороженные или криостатные срезы дофиксируют в течение 10—15 мин. 2. Срезы промывают в дистиллированной воде и инкубируют при комнатной температуре в течение 10—15 мин. Инкубационная среда: 15 мг р-нафтилацетата на водяной бане расплавляют при температуре до 50 — 55 °С при энергичном встряхивании (до помутнения), добавляют 2 — 3 мл дистиллированной воды и доводят объем 0,2 М гидроортофосфатом натрия до 25 мл. К этому раствору добавляют диазолированный парарозанилин (4 % парарозанилин в 2 н. соляной кислоте + 8 капель 4 % нитрата натрия при помешивании на ледяной бане); рН инкубационной смеси доводят 0,2 М дигидроортофосфатом натрия от 8,0 — 8,5 до 7,0 — 7,1. 3. Срезы промывают в дистиллированной воде и заключают в глицерин-желатин. Результат: эстеразная активность проявляется красно-коричневым окрашиванием. Контроль — инкубация без субстрата, после которой тщательно промыть срезы в дистиллированной воде. Указанное окрашивание не выявляется. Выявление ацетилхолинэстеразы с ацетилхолиниодидом по Гомори 1. Материал фиксируют в холодном кальций-формоле по Бейкеру. Замороженные или криостатные срезы дофиксируют в холодном кальций-формоле по Бейкеру (10—15 мин) с после- 119
дующим тщательным промыванием в дистиллированной воде. Можно использовать нефиксированный материал. 2. Инкубируют свободноплавающие срезы либо срезы, прикрепленные на покровные или предметные стекла при 37 °С в свежеприготовленном инкубационном растворе в течение 10 — 60 мин. Инкубационный раствор готовят следующим образом. А Маточный раствор* сульфат меди пентагидрат 0,3 г глицин 0,375 г хлорид магния гексагидрат 1 г малеиновая кислота 1,75 г гидрокснд натрия 4 % 30 мл сульфат натрия 40 % (насыщенный при подогреве, рН 6,0) 170 мл Б. Инкубационный раствор 20 мл ацетилхолиниодида растворяют в нескольких каплях дистилированной воды и добавляют 10 мл маточного раствора 3. Промывают в 3 сменах насыщенного раствора сульфата натрия. 4. Помещают срезы в раствор сульфила аммония на 2 мин. 5. Быстро промывают в проточной и дистиллированной воде и заключают в глицерин-желатин. Результат: активность ацетилхолинэстеразы проявляется окрашиванием различных оттенков — от коричневого до черного. Контроль — инкубация без субстрата; инкубация с 10 М эзери- ном (физостигмина салицилат) в инкубационной среде без субстрата (предварительная инкубация), в среде с субстратом (основная инкубация для подавления ацетилхолинэстеразной и холинэстеразной активности). Примечание. Реакция дает надежные результаты и пригодна как для проведения исследования, так и в практической работе. Для выявления холинэстеразной активности вместо ацетил- тиохолиниодида можно использовать бутирилтиохолиниодид. Выявление ацетилхолинэстеразы с использованием тиохолина и ферроцианида меди по Карновски—Рутсу (для электронной микроскопии) 1. Фиксация: а) фиксация перфузией 3 % глутаровым альдегидом на фосфатном буфере (рН 7,6) в течение 15 — 30 мин, с последующей фиксацией погружением на 2 — 4 ч при температуре 2—4 °С; б) маленькие кусочки ткани фиксируют в 4 % формалине на 0,75 М фосфатном буфере (рН 7,6) с добавлением 0,44 М сахарозы в течение 2 —4 ч при температуре 2 — 4 °С. 2. Фиксированную ткань просушивают фильтровальной бумагой и промывают в 0,44 М сахарозе в течение 16 ч при температуре 2 — 4 °С. 120
3. Срезы толщиной 50 — 80 мкм готовят на резаке или толщиной 50 мкм на замораживающем микротоме и помещают в 0,44 М сахарозу при температуре 2 — 4 °С. 4. Предварительную инкубацию срезов проводят с ингибитором в 0,1 М натрий-малеатном буфере (рН 6,0) в течение 1 ч при температуре 2 — 4 °С. Ингибитор — 10 М изо-ОМФА (ингибитор холинэстеразы). 5. Инкубируют в течение 15—120 мин при 0 °С (ледяная баня) в среде следующего состава: ацетилхолиниодид 5 мг 0,1 М натрий-малеатный буфер (рН 6,0) 6,5 мл 0,1 М цитрат натрия 0,5 мл 30 мМ сульфат меди 1 мл ингибитор 10 М изо-ОМФА 1 мл 5 мМ гексацианоферрат калия 1 мл сахароза 1,5 г Рекомендуется прежде всего растворитель в буфере ацетилхолиниодид, после чего добавить все остальные компоненты инкубационной среды в указанном порядке. Растворы для инкубационной среды готовят накануне; используют дистиллированную воду, перегнанную в стеклянной посуде. 6. Дважды промывают срезы в холодной 0,44 М сахарозе по 4 мин. 7. Дофиксируют в 1 % тетраоксиде осмия на коллидиновом буфере (рН 7,2), возможна дофиксация в тетраоксиде осмия на фосфатном буфере. 8. Обезвоживают, заливают в эпон или микропал (весто- пал), контрастируют в нитрате свинца по Рейнолдсу в течение 10— 15 мин. Результат: активность ацетил холинэстеразы, считающаяся специфичной после подавления холинэстеразы с помощью изо- ОМФА, определяют по осадку ферроцианида меди. Для выявления неспецифической холинэстеразной активности вместо ацетилхолиниодида можно использовать бутирилтиохолинио- дид, а в качестве специфического ингибитора ацетилхолинэсте- разы -ЮМ ВШ284 С 51. Выявление сукцинатдегидрогеназы 1. Готовят нефиксированные замороженные или криостатные срезы толщиной 5—10 мкм. 2. Срезы подсушивают и инкубируют в течение 10 — 60 мин в среде следующего состава: 2,5 М динатрий-сукцинат 1 мл (6,75 г в 10 мл, нейтрализовать 121
1 н соляной кислотой) нитросиний тетразолий (4 мг/мл) 2,5 мл 0,2 М трис-НС1 буфер (рН 7,4) 5,5 мл 5 мМ хлорид магния 1 мл дистиллированная вода 3 мл 100 мМ цианид калия (65,1 мг в 10 мл) 1 мл Проверяют рН и, если необходимо, доводят с помощью маточного раствора триса или 1 н. соляной кислоты до рН 7,0 — 7,1. 3. Инкубационную смесь стряхивают со срезов и фиксируют их в 10 % нейтральном формалине в течение 15 — 30 мин. 4. Промывают в проточной воде 2 мин, затем в дистиллированной. 5. Заключают в глицерин-желатин или обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации, проводят через ксилол, заключают в бальзам. Результат: места сукцинатдегидрогеназной активности маркируются кристаллами формазана красного или синего цвета. Контроль — инкубация без субстрата. Примечания. Вместо нитросинего тетразолия можно использовать нерастворимый в липидах тринитросиний тетразолий в той же концентрации. Ингибирование системы цитохро- мов с помощью цианида калия усиливает реакцию, поскольку на восстановление соли тетразолия остается больше водорода. Непродолжительная фиксация маленьких кусочков ткани формальдегидом или глутаровым альдегидом способствует сохранению локализации фермента; однако она приводит к его частичной инактивации и затрудняет определение истинной ферментативной активности. Согласно Апйегзоп Ноег (1973), хорошая локализация фермента т зки без потерь достигается с помощью фиксации в 1 % забуференном, свободном от метанола формальдегиде, приготовленном из параформальдегида (рН 7,2 устанавливается 0,2 М фосфатным буфером). Продолжительность фиксации 5 мин при температуре от 0 до 4 °С. Кусочки ткани следует вырезать быстро, толщина их должна быть не более 1 — 2 мм. Такая фиксация способствует проникновению нитросинего тетразолия в ткань и повышает субстантивность формазана. Выявление пероксидазы с использованием диаминобензидина по Грэхему—Карновски 1. Кусочки ткани толщиной 3 — 4 мм фиксируют в смеси формалина и глутарового альдегида (буфер рН 7,2) в течение 5 ч при комнатной температуре. 2. Кусочки промывают в течение ночи в 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,2). 122
3. Готовят замороженные или криостатные срезы толщиной 10 — 40 мкм; срезы, приготовленные на резаке, могут иметь толщину 50 мкм. 4. Инкубируют в течение 3—10 мин при комнатной температуре в среде следующего состава: 5 мг 3,3-диаминобензидинтет- рагидрохлорида растворить в 10 мл 0,05 М трис-НС1-буфера (рН 7,6) и добавить 0,2 мл 1 % перекиси водорода (свежеприготовленной из 30 % раствора). Сохранность инкубационной среды около 1 ч. 5. Срезы промывают в 3 сменах дистиллированной воды. Для световой микроскопии заключают в глицерин-желатин. 6. Для электронной микроскопии срезы следует дофиксиро- вать в 1 — 2 % тетраоксида осмия на 0,2 М фосфатном или кол- лидиновом буфере (рН 7,2 — 7,4) в течение 90 мин. 7. Обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации и заливают в эпон. 8. Срезы толщиной 0,5—1 мкм для световой микроскопии подвергают непродолжительному окрашиванию толуидиновым синим. Ультратонкие срезы контрастируют растворами свинца. Результат: в световом микроскопе места ферментативной активности (пероксидаза, каталаза) после п. 5 окрашиваются в коричневый цвет. При электронно-микроскопическом гистохимическом исследовании продукт реакции представляет собой гомогенный электронно-плотный осадок. Выявление пероксидазы с использованием З-амино-9-этилкарбазола по Грэхему—Ландхолму—Карновски 1. Маленькие кусочки ткани фиксируют при 0 °С в забуфе- ренном растворе формалина и сахарозы в течение 18 ч с последующим промыванием в холодном 8,5 % растворе сахарозы в течение 24 ч. 2. Криостатные срезы толщиной 5—10 мкм наносят на покрытые желатином покровные или предметные стекла и подсушивают на воздухе. 3. Срезы инкубируют при комнатной температуре в среде следующего состава: 2 мг З-амино-9-этилкарбазола растворить в 0,5 мл диметилформамида и добавить 9,5 мл 50 мМ ацетатного или трис-НС1-буфера (рН 5,0). Непосредственно перед употреблением добавить 1—2 капли 30 % перекиси водорода. 4. Срезы промывают в дистиллированной воде и заключают в глицерин-желатин. Результат: пероксидазную активность выявляют по красному цвету продукта реакции. 123
Выявление монооксидазы с использованием тетразолия по Гленнеру 1. Нефиксированные замороженные или криостатные срезы толщиной 10 — 40 мкм помещают на покровное или предметное стекло и быстро просушивают. 2. Инкубируют 30 — 45 мин при 37 °С в среде следующего состава: триптамина гидрохлорид 25 мг сульфат натрия 4 мг 3. Промывают в дистиллированной воде и заключают в глицерин-желатин .
ГЛАВА 7 СОВРЕМЕННЫЕ ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Иммуноцитохимические методы основаны на высокоспецифическом взаимодействии антигена с антителом, что при наличии соответствующих меченых антител позволяет выявить практически любой тканевый или клеточный антиген. В качестве такого антигена могут выступать как целые фракции (митохондри- альная, ядерная и др.), так и отдельные химические соединения (белки, пептиды и др.). В первые годы развития иммуноцитохимии гистологи были вынуждены либо сами, либо совместно с иммунологами и биохимиками получать антитела к интересующему их антигену. В настоящее время производят коммерческие поли- и монокло- нальные антитела к широкому спектру антигенов (Са1ЫосЬет, З^та, ВюзоЛ и др.). Тем не менее проблема выработки антител к некоторым, в основном нестандартным, антигенам в лабораторных условиях до сих пор достаточно актуальна. Этому вопросу посвящены многие руководства [Ро1ак ]., Уап №югс!еп 5., 1986; Са<±у Э., 1988]. Антитела образуются в ответ на введение в организм чужеродного антигена В-лимфоцитами, на поверхности которых расположены иммуноглобулиновые рецепторы к антигену, точнее, к его антигенным детерминантам. Сами антитела являются иммуноглобулинами, образованными четырьмя полипептидными цепями — двумя тяжелыми и двумя легкими с общей молекулярной массой около 150 000. Молекула антитела бифункциональна. На изменяющемся М-конце молекулы, образованном тяжелой и легкой цепью, имеются два участка, где происходит связывание антигена. Относительно постоянный С-концевой участок молекулы обеспечивает связывание комплемента (С1д, С4) и клеточных Рс-рецепторов [Са1±у В., 1988]. Поликлональные антисыворотки, получаемые при иммунизации животных, обычно кроликов, коз или овец, содержат антитела к различным эпитопам иммуногена. Наиболее важным преимуществом поликлональной антисыворотки является то, что она образует крупные нерастворимые интенсивно окрашиваемые при иммуногистохимическом исследовании комплексы с антигеном благодаря одновременному связыванию антител с многими эпитопами антигена. Высокая гетерогенность поликлональной антисыворотки, обусловленная одновременной выра- 125
боткой антител к различным эпитопам иммуногена, обусловливает и ее недостатки. Так, например, плазма животного, иммунизированного комплексом гаптен —белок —носитель, включает в себя антитела к различным фрагментам не только молекулы гаптена, но и белка носителя. В связи с этим необходимо использовать дополнительные подходы для повышения специфичности антисыворотки: в приведенном примере наиболее эффективным приемом является преабсорбция антисыворотки очищенным белком-носителем [СаНу В., 1988]. Недостатки поликлональных антисывороток удалось устранить О. КоЫег и С. МИз^ет (1975), которые предложили метод с использованием моноклональных антител. В основе метода лежит создание гибридомы путем слияния В-лимфоцитов селезенки иммунизированного животного (обычно мыши или крысы) и культуры клеток миеломы, полученных из плазматических клеток опухоли того же животного. Эти гибридомы обладают, с одной стороны, способностью В-лимфоцитов синтезировать однородные антитела к одному из эпитопов антигена, а с другой — свойством клеток миеломы расти и пролиферировать неопределенно длительное время в культуре ткани. Каждая гибридная клетка дает начало клону клеток, продуцирующих однородные антитела. С помощью последующего скрининга культу- ральной среды каждого клона и ее анализа на содержание антител с применением радиоиммунологического метода, ЕЫ5А- теста или иммуногистохимии выделяют клон или клоны клеток, которые далее будут использованы для получения моноклональных антител. Важным преимуществом моноклональных антител, продуцирующихся в большом количестве одиночными клонами клеток гибридомы, является то, что они идентичны по молекулярной организации, специфичности и сродству к антигену. Однако специфичность к определенному эпитопу антигена не исключает перекрестные реакции, так как структура эпитопа иммуногена может быть характерна также для других известных и неизвестных соединений. Недостатками моноклональных антител по сравнению с поликлональными антисыворотками является то, что: а) они связываются только с одним участком молекулы антигена, и это обусловливает низкую чувствительность метода, проявляющуюся в слабом иммуноокрашивании на срезах; б) при единственном эпитопе высока вероятность того, что фиксатор сделает его недоступным для антител, в результате чего не произойдет им- муноокрашивания. Указанные трудности можно отчасти преодолеть, если для выявления антигена использовать смесь моноклональных антител, выработанных к различным эпитопам одного и того же иммуногена, а для иммунизации — «фиксированный» антиген [Ро1ак ^ , Уап Ыоогскп 3., 1987; Са11у Э., 1988]. 126
СВЕТООПТИЧЕСКАЯ ИММУНОЦИТОХИМИЯ Иммуноцитохимия в настоящее время представляет собой группу методов, позволяющих идентифицировать тканевые компоненты т зИи благодаря специфической реакции антиген — антитело, продукт которой при определенных условиях становится видимым в световом и/или электронном микроскопе. Существует несколько классификаций иммуногистохимических методов: по метке антител— иммунофлюоресцентный, иммунофер- ментный, иммуноизотопный и др.; в зависимости от выявления антигена до или после заключения ткани в заливочную среду — «пре-имбеддинг» и «пост-имбеддинг» [Угрюмов М.В., 1991]. В основу наиболее распространенной классификации, которая приведена ниже, положен принцип либо непосредственного взаимодействия меченого антитела с антигеном, либо опосредованного — через немеченые антитела [Ро1ак ]., Уап №югс1еп §., 1986]. Первичная обработка ткани Обработка ткани, предшествующая иммунологическому выявлению антигена, преследует две цели — с одной стороны, обеспечить удовлетворительную сохранность самой ткани, а с другой — иммобилизовать антиген т зИи, обеспечив при этом максимальную сохранность его антигенной активности. Важнейшим этапом обработки материала до получения срезов является фиксация, хотя изредка иммуноцитохимическую реакцию проводят и на замороженных срезах нефиксированной ткани. В экспериментальной и клинической практике чаще всего используют химическую фиксацию свежей ткани, к которой предъявляют определенные требования. Так, «мягкая» фиксация — непродолжительная при низкой концентрации фиксирующего агента, как правило, не обеспечивает удовлетворительной сохранности ткани, в то время как «жесткая» приводит к значительной потере антигенной активности. Это означает а рпоп, что идеальный результат не может быть получен, а оптимальный является компромиссом. Таким образом, залогом успешного использования иммуногистохимических методов является подбор адекватного фиксатора для конкретных тканей и антигенов. Фиксация Как в фундаментальных — биологических, так и в прикладных медицинских иммуноцитохимических исследованиях на светооп- тическом уровне чаще всего используют фиксаторы, приготовленные на основе формалина/параформальдегида: 4 % парафор- мальдегид, фиксатор Замбони, жидкость Буэна, формол-солевой, формол-уксусный, формол-ртутный фиксаторы и др. 127
Параформальдегидный 4 % фиксатор. Для приготовления 100 мл фиксатора: 1) 4 г порошка параформальдегида насыпают в 50 мл дистиллированной воды и, помешивая, нагревают до 60 — 70 °С на водяной бане; 2) продолжая помешивать, добавляют 1 — 2 капли 1 н. гид- роксида натрия до просветления раствора, фильтруют и охлаждают до комнатной температуры; 3) добавляют 50 мл 0,2 М фосфатного буфера (рН 7,2 — 7,4) и проверяют рН конечного раствора, который должен сохраниться в том же диапазоне. Фиксатор Замбони. Для приготовления 100 мл фиксатора: 1) 2 г порошка параформальдегида насыпают в 15 мл насыщенной профильтрованной кислоты и, помешивая, нагревают до 60 — 70 °С на водяной бане; 2) продолжая помешивать, добавляют по 1 — 2 капли 1 н. гидроксида натрия до просветления раствора и охлаждают до комнатной температуры; 3) добавляют 85 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2 — 7,4). В случае необходимости рН можно довести 1 н. соляной кислотой. Модифицированный фиксатор Замбони для электронн о-м икроскопической иммуно- цитохимии. Для приготовления 100 мл фиксатора: 1) 4 г параформальдегида насыпают в 99,6 мл 0,2 М фосфатного буфера (рН 7,2 — 7,4), нагревают до 60 °С при постоянном помешивании; 2) добавляют несколько капель гидроксида натрия до просветления раствора и охлаждают до комнатной температуры; 3) в полученный раствор добавляют 0,4 мл 25 % коммерческого глутарового альдегида; 4) растворяют 50 мг порошка пикриновой кислоты и фильтруют. Проверяют рН и в случае необходимости доводят 1 н. соляной кислотой. Формол-солевой 10 % фиксатор. Для приготовления 100 мл фиксатора 850 мг хлорида натрия растворяют в 10 мл формалина и добавляют 90 мл дистиллированной воды. Формол-уксусный 2,5 % фиксатор. Для приготовления 100 мл фиксатора к 10 мл формалина добавляют 90 мл дистиллированной воды и растворяют 4 г дигидроортофосфата натрия моногидрата и 6,5 г гидроортофосфата натрия, к полученному раствору добавляют 5 % раствор ледяной уксусной кислоты. Формол-сулемовый фиксатор. Для приготовления 100 мл фиксатора смешивают 90 мл насыщенного раствора дихлорида ртути и 10 мл формалина. Жидкость Буэна. Для приготовления 100 мл фиксатора к 75 мл насыщенного и профильтрованного раствора пикрино- 128
вой кислоты добавляют 25 мл формалина и 5 мл ледяной уксусной кислоты. Входящие в состав этих фиксаторов параформальдегид и формалин обеспечивают иммобилизацию тканевых антигенов. В случае легкодиффундируемых антигенов, например коротких пептидов, в фиксатор дополнительно вводят химически более активные альдегиды — глутаровый альдегид или акролеин [Ко- гЬшзЫ С, №1ауег С, 1983]. Другие компоненты фиксаторов, такие как пикриновая кислота, вызывают преципитацию белков с образованием пикратов, а уксусная кислота обеспечивает хорошую сохранность антигенной активности [^опез Е., Сге§огу ]., 1988]. Продолжительность фиксации устанавливают эмпирически в зависимости от используемого фиксатора, фиксируемой ткани и выявляемого антигена. При этом необходимо учитывать, что недофиксированный материал плохо сохраняется, а в перефиксированной ткани альдегидные группы настолько сильно «сшивают» белковые молекулы, что нередко затрудняют доступ антител к антигену [Уап №югс1еп 5., 1986]. Значительно реже для решения специальных задач используют и другие методы фиксации. В экспериментальных исследованиях наиболее часто в качестве фиксатора используют 4 % параформальдегид, модифицированный фиксатор Замбони (рН 7,2 — 7,4), а также жидкость Буэна, которые особенно эффективны при фиксации железистой и нервной тканей. Фиксации, как правило, предшествует перфузия наркотизированных животных в течение 3 — 5 мин изотоническим раствором хлорида натрия или 2 М фосфатным буфером (рН 7,2 — 7,4), приготовленном на изотоническом растворе хлорида натрия (ПБС) при 37 °С, в состав которого включают антикоагулянт (гепарин) и/или вазодилататор (0,1 % нитрит натрия). Для перфузии используют специальную систему по типу системы для переливания крови, но с меньшей производительностью, или перистальтическую помпу, подающую жидкость с регулируемой скоростью. Конец канюли, по которой протекает раствор, вводят в левый желудочек сердца и оставляют там или продвигают дальше — в восходящую часть аорты. Одновременно вскрывают правое предсердие для свободного оттока крови. Отмывание крови особенно важно при последующем использовании антител, меченных пероксидазой, так как форменные элементы крови богаты эндогенной пероксидазой. Затем в течение 15 мин животное продолжает перфузи- ровать охлажденным фиксатором. После этого вырезают интересующую ткань и дофиксируют в том же растворе при 4 °С в течение 2 —48 ч, а иногда и дольше. Очевидно, что в определенных условиях, особенно при использовании секционного или биопсийного материала, отмывание ткани от крови и фиксация с помощью перфузии неосуществимы. После фиксации материал тщательно отмывают от фиксатора в течение 2 —48 ч. 129
Приготовление срезов Иммуноцитохимической реакции предшествует приготовление срезов, обычно вибратомных, замороженных и парафиновых. Техника получения этих срезов и необходимая предварительная подготовка материала для резки существенно различаются, поэтому рассматриваются раздельно. Вибратомные срезы Важнейшим преимуществом вибратомных срезов является то, что их готовят сразу после фиксации. Тем самым, с одной стороны, ускоряют иммуногистохимический процесс в целом, а с другой — исключают негативные влияния на антиген в процессе дополнительной физической (высокая температура) или химической (органические растворители) обработки материала перед резкой. Таким образом, с помощью вибратомных срезов можно добиться максимальной сохранности антигенной активности. Вибратомные срезы, толщина которых обычно 50 мкм, инкубируют свободноплавающими в соответствующих растворах, что способствует наилучшему проникновению антител и других реагентов к антигенам. При этом иммуногистохимическая реакция проходит по всей толще среза, что позволяет использовать вибратомные срезы для объемных реконструкций. Наряду с достоинствами имеются и определенные недостатки: а) фиксация материала должна быть достаточно «жесткой», чтобы кусочек не деформировался в процессе резки; б) качество срезов ухудшается по мере увеличения их площади; в) обычно достаточно трудно, а при некоторых вариантах фиксации невозможно получить срезы толщиной менее 50 мкм, вследствие чего уменьшается разрешающая способность метода. Основной принцип работы вибратома — обеспечение вибрации режущего лезвия в горизонтальной плоскости с частотой 50 Гц, что позволяет приготавливать срезы из свежефиксированного, не залитого в синтетическую среду материала. Прибор полуавтоматический. В нем задаются такие параметры, как амплитуда, скорость поступательного движения лезвия, т.е. скорость резки, и угол наклона ножа. Толщину среза регулируют вертикальной подачей держателя с блоком, теоретически с точностью до 1 мкм. Неудобство в работе с прибором заключается в том, что подъем ^столика перед началом приготовления каждого нового среза осуществляют вручную. Указанные параметры резки подбирают эмпирически с учетом характера фиксации и вида ткани. В случае необходимости, например при недостаточно «жесткой» фиксации или слишком большой площади срезов, качество срезов можно несколько улучшить, увеличивая амплитуду ножа и уменьшая скорость резания. С этой же целью кусочки материала можно покрывать желатиновой или агаровой капсулой [Угрюмов М.В , 1991]. 130
Практические рекомендации. Режущее лезвие (ЗсЫск 5и- рег СЬготшт или какое-либо другое) вставляют в держатель чаще всего под углом 15 — 20°. Блок ткани размером не более 8x8x8 мм подсушивают фильтровальной бумагой. На поверхность металлического столика наносят каплю специального циа- нолитного клея (5ирег С1ие, Еаз1:тап 910 и др.) и выжидают 2 — 3 мин, пока он немного подсохнет. После этого наклеивают блок ткани на поверхность столика. В ванночку заливают охлажденный до 4 °С ПБС до погружения в него кромки лезвия, одновременно в раствор должен полностью погрузиться блок ткани. Столик с блоком поднимают до уровня кромки лезвия и делают первые срезы, подбирая оптимальные параметры резки. Амплитуду можно регулировать, обычно она колеблется от 0,5 до 1 мм. Далее можно начать приготовление стандартных срезов толщиной 50 мкм, которые хранят в охлажденном до 4 °С ПБС до последующей обработки. Мягкий блок покрывают агаровой капсулой. Для этого предварительно приготавливают 2 — 3 % агар в дистиллированной воде, который хранят в термостате при 56 °С. Агар капают на приклеенный к столику блок ткани до образования капсулы, охлаждают в течение нескольких минут при 4 °С и помещают в вибратом. Криостатные срезы Техника приготовления криостатных срезов для иммуноцитохи- мических исследований мало отличается от техники их получения для других морфологических исследований. Парафиновые срезы В отличие от вибратомных и криостатных парафиновые срезы могут быть подготовлены для иммуногистохимических исследований только после дегидратации кусочка ткани в спиртах возрастающей концентрации, его просветления в ксилоле или хлороформе и заливки в парафин при довольно высокой температуре (45 — 56 °С). Очевидно, что в процессе проводки значительно снижается антигенная активность. С учетом этого обстоятельства для просветления ткани предпочитают применять хлороформ. Кроме того, для заливки необходимо использовать парафин с наименьшей точкой плавления, который при комнатной температуре остается все же достаточно твердым для приготовления тонких (5 — 7 мкм) срезов. В климатических условиях нашей страны наиболее пригодным является парафин с точкой плавления 56 °С, а в северных районах, вероятно, может быть использован и парафин с точкой плавления 45 °С. Температура парафина с тканью ни в коем случае не должна превышать 60 °С, поскольку при этой темпе- 131
ратуре начинается полимеризация некоторых синтетических примесей парафина, которые впоследствии практически невозможно удалить из срезов. Приготовленные на микротоме срезы монтируют на стекла, высушивают, депарафинируют и регидратируют. После этого срезы считаются подготовленными для последующих инкубации, предшествующих иммуномечению. Практические рекомендации. Кусочки фиксированной ткани последовательно инкубируют в 70 % спирте 2 ч, 90 % спирте — 2 ч, 100 % спирте — в двух сменах по 2 ч в каждой, в хлороформе — 16 ч, парафине — в трех сменах по 3 ч в каждой. После этого их помещают в ванночки со свежим расплавленным парафином и охлаждают. С полученных таким образом блоков на микротоме приготавливают срезы толщиной 3 — 7 мкм. Следует отметить, что даже незначительные механические повреждения срезов из-за дефектов на ноже в дальнейшем могут привести к локальному неспецифическому окрашиванию. Срезы снимают в ванночку на воду, температура которой должна быть несколько ниже точки плавления парафина, и затем монтируют на чистые стекла или стекла, предварительно обработанные белком, желатином либо поли-Ь-лизином. Затем срезы на стеклах сушат в термостате при 37 °С в течение ночи и охлаждают до комнатной температуры. В процессе дальнейшей обработки срезов — их депарафинирования и регидратации — стекла помещают в постоянно перемешиваемый ксилол на 1 — 2 мин. Иногда для полного депарафинирования срезов этого недостаточно и в этом случае стекла со срезами, предварительно нагретые до 60 °С, помещают в ксилол не более чем на 1 мин (в противном случае значительно снижается антигенная активность). После обработки в ксилоле срезы быстро ополаскивают абсолютным спиртом и помещают в ванночку с постоянно перемешиваемым абсолютным спиртом на 1 мин. Далее срезы промывают в проточной воде или в нескольких сменах ПБС. Подготовка срезов к иммуномечению Для успешного проведения иммуноцитохимической реакции необходимо создать определенные оптимальные условия, которые, с одной стороны, повысили бы эффективность взаимодействия антигена с антителом, а с другой — свели бы к минимуму неспецифическое окрашивание (фон). С этой целью применяют комплекс приемов обработки срезов перед их инкубацией с первыми (специфическими) антителами, причем их применение должно быть обусловлено особенностями каждой ткани и выявляемого антигена. Другими словами, вопрос о целесообразности той или иной предварительной обработки срезов нужно решать эмпирически. 132
Протеолитические ферменты Как отмечалось выше, альдегидные фиксаторы способствуют «сшиванию» белковых молекул и образованию внутримолекулярных связей, часто затрудняющих доступ антитела к антигену. Общепринято, что разрушение этих связей протеолитическими ферментами, такими как трипсин, протеиназа, пепсин и др., облегчает взаимодействие антитела с антигеном. Однако следует иметь в виду, что наряду с благоприятным действием протеолитические ферменты могут, с одной стороны, повреждать структуру самого антигена, а с другой — расщеплять молекулу предшественника с образованием антигеноподобной структуры. В том и другом случае в результате иммуноцитохимичес- кой реакции проявится неспецифическое окрашивание. Кроме того, инкубация с протеолитическими ферментами ухудшает общую сохранность ткани. При этом наиболее щадящее и легко контролируемое действие оказывает трипсин [Ро1ак ]., Уап №югс!еп 5., 1986; ^пез Е., Сге^огу ]., 1988]. Практические рекомендации, а) Приготовить 0,1 % раствор трипсина Ш^со) и 0,1 % хлорида кальция на ТБС (0,05 М трис-НС1-буфер в изотоническом растворе хлорида натрия, рН 7,6). б) Инкубировать срезы в среде «а» при 37 °С в течение 30 мин при постоянном медленном перемешивании среды. Концентрация трипсина и время инкубации срезов должны быть подобраны эмпирически. Помимо трипсина, можно использовать протеазу, которая является более активным протеолитическим ферментом. Согласно протоколу [Лопез Е., Сге^огу ]., 1988], срезы инкубируют в 0,05 % растворе протеазы (51§та: тип XXIV) на трис-НС1- буфере (рН 7,4) в течение 30 — 60 мин при 37 °С. Детергенты Уже в начале развития иммуноцитохимии было очевидно, что проникновение таких высокомолекулярных соединений, как антитела (иммуноглобулины), через мембраны, а следовательно, и их доступ к внутриклеточным антигенам весьма ограничены. С целью увеличения проницаемости мембран в настоящее время широко применяют такие вещества-детергенты, как тритон Х-100 или сапонин, повреждающие липидную компоненту мембран. Изредка с этой целью используют и другие приемы, например осмотический шок мембран, вызываемый дегидратацией срезов в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле с последующей их регидратацией [Вегой А. е! а1., 1981; Ро1ак ]., Vап Ыоогйеп 3., 1986, и др.]. Однако при увеличении проницаемости мембран, особенно в случае использования детергентов, появляется вероятность диффузии антигена. Следует отметить, что упомянутые выше детергенты не только влияют на проница- 133
емость мембран, но и отчасти предотвращают неспецифическую адсорбцию белков на срезах, снижая таким образом неспецифический фон реакции. Практические рекомендации. При использовании тритона в качестве детергента срезы инкубируют в 0,1 —0,3 % тритоне Х-100 на ПБС в течение 20 — 30 мин при комнатной температуре. Коммерческий (100 %) тритон (51§та и др.) обладает высокой вязкостью, вследствие чего он неудобен в работе, поэтому сначала целесообразно приготовить 10 % водный (маточный) раствор тритона, который можно хранить длительное время при 4 °С. Неиммунная сыворотка Трудности в использовании иммуноцитохимических методов связаны с появлением при определенных обстоятельствах высокого неспецифического фона, т.е. окрашивания, не обусловленного реакцией антиген —антитело. Наиболее частой причиной возникновения такого фона является наличие в ткани высокозаряженных неантигенных молекул, с которыми и связываются антитела за счет ионных сил. Наиболее эффективный способ снижения такого фона — предшествующая иммунологической реакции инкубация срезов с неиммунной сывороткой животных, у которых получены вторые антитела. Эта сыворотка в концентрации 2 —5 % блокирует высокозаряженные участки ткани, оставляя, однако, свободными антигены для связывания со специфическими антителами. Фон может быть также несколько снижен путем разведения первой антисыворотки. При использовании моноклональных антител нет необходимости в преинкубации с неиммунной сывороткой, так как при их оптимальном разведении фон практически отсутствует. Практические рекомендации. Учитывая то, что вторые антитела обычно вырабатываются у козы или овцы, используют неиммунную сыворотку этих же животных. Срезы инкубируют в 2 —5 % неиммунной сыворотке, приготовленной на ПБС, при комнатной температуре в течение 10 — 30 мин. Ингибирование эндогенных ферментов При использовании ферментов в качестве маркеров антител существует опасность появления неспецифического фона в связи с наличием в ткани таких же эндогенных ферментов. Наиболее часто в качестве маркера антител используют пе- роксидазу, которая в большом количестве содержится в некоторых клетках, например клетках крови. Ингибирование эндогенной пероксидазы обеспечивают путем инкубации срезов с перекисью водорода, метанолом, соляной кислотой, боргидридом натрия, йодноватой кислотой и т.д. Однако следует отметить, 134
что подавление эндогенной пероксидазной активности на криос- татных срезах нередко приводит к снижению их антигенной активности. В связи с этим ингибирование эндогенной пероксида- зы рекомендуют проводить после инкубации криостатных срезов с первыми антителами, т.е. после образования т зИи недиф- фундируемого комплекса антиген —антитело. В качестве маркера антител также довольно широко используют щелочную фосфатазу, содержание которой особенно велико в желудочно-кишечном тракте. Этот эндогенный фермент блокируется левамизолом [Ропйег В., \УПкт5 М., 1981]. При использовании авидин-биотинового метода источником фона может явиться эндогенный биотин, которым особенно богаты печень и почки. Эндогенный биотин можно заблокировать свободным авидином с последующим насыщением его связей немеченым биотином. Поскольку молекула биотина обладает только одной связью с авидином, описанные выше манипуляции приводят к устранению или по крайней мере к значительному снижению фона. Практические рекомендации. Для ингибирования эндогенной пероксидазы срезы чаще всего инкубируют с 0,2—1,0 % перекисью водорода на ПБС в течение 30 мин при комнатной температуре. С этой целью используют и другие растворы: а) 1 % перекись водорода на метаноле в течение 10 мин при комнатной температуре; б) 2 % соляную кислоту на метаноле в течение 30 мин; в) 1 % нитроферроцианид натрия и 0 2 % уксусную кислоту на метаноле; г) 2 % йодноватую кислоту в течение 10 мин. В последнем случае необходима дополнительная постинкубация в водном растворе бо- рогидрида натрия (0,1 мг/мл) в течение 10 мин для уменьшения образования альдегидов. Для блокирования эндогенной активности биотина срезы необходимо последовательно инкубировать с авидином (1 мг/мл) 20 мин и биотином (0,1 мг/мл) 20 мин. После каждой из этих двух инкубации срезы промывают ПБС или ТБС по 5 мин. Иммуномечение Прямой метод Прямой метод явился первым и наиболее простым иммуноцито- химическим подходом, основанным на непосредственном выявлении антигена в ткани с помощью меченых антител. В качестве метки антител чаще всего используют флюоресцирующие красители, реже — пероксидазу хрена. Независимо от модификации иммуноцитохимического метода у препаратов с флюоресцентной и пероксидазной меткой имеются определенные недостатки и достоинства. Так, на приготовление препаратов с пероксидазной меткой затрачивают больше времени из-за дополнительных операций — подавления активности эндоген- 135
ной пероксидазы и гистохимического выявления фермента с помощью широкого круга хромогенов. Меченные пероксидазой препараты можно дегидратировать, заключать в синтетическую среду и таким образом хранить в течение длительного периода времени, используя для анализа обычный световой микроскоп. Препараты с флюоресцентной меткой, наоборот, короткоживу- щие, и для их анализа должен быть использован специальный флюоресцентный микроскоп. Наиболее важным преимуществом антител, меченных пероксидазой, является возможность использования полученного материала не только на светооптичес- ком, но и на электронно-микроскопическом уровне. В целом же прямой метод наименее чувствителен по сравнению с остальными модификациями, однако чрезвычайно прост, поэтому его до сих пор часто используют при экспресс-анализе [Ро1ак }.у Уап Ыоогёеп 5., 1986]. Одним из наиболее важных условий успешного проведения любой иммуноцитохимической реакции является подбор оптимального разведения первых (специфических) антител. Этот параметр зависит от ряда факторов: температуры, при которой осуществляют инкубацию срезов; длительности инкубации; типа срезов (вибратомные, замороженные или парафиновые); длительности фиксации; типа фиксации; предшествующей обработки срезов (протеолитическими ферментами, тритоном и др.). Практические рекомендации. Подбор оптимального разведения первых антител проводят эмпирически по результатам инкубации срезов с удваивающимся разведением антисыворотки (1:5, 1:10, ..., 1:320, ...). Инкубация с первой антисывороткой может продолжаться 30 — 60 мин при комнатной температуре или 12 — 48 ч при 4 °С. В первом случае необходимо использовать более концентрированную антисыворотку, обычно с разведением 1:50—1:300, а во втором — с большим разведением — 1:100—1:30 000. При оптимальном разведении антисыворотки наблюдается максимальная разница в окрашивании срезов между сигналом и фоном. Эта разница, как правило, больше при длительной инкубации срезов в сильно разведенной антисыворотке на холоду, чем при кратковременной инкубации в концентрированной антисыворотке при комнатной температуре. При особенно длительной инкубации срезов в первую антисыворотку следует добавлять бактериостатики — азид натрия (0,01—0,1 %) или мертиолат (0,01 %). Применение азида натрия для консервации антител, меченных пероксидазой хрена, полностью исключается, так как этот бактериостатик ингибиру- ет активность пероксидазы. После иммунологической реакции срезы отмывают в 3 — 5 сменах ПБС по 30 мин в каждой для удаления избытка первых меченых антител [Ро1ак ]., Уап 1Моог- с!еп 5., 1986; ^пез Е., Сге^огу ]., 1988]. Следует отметить, что независимо от модификации иммуно- цитохимического метода инкубацию плавающих срезов осу- 136
ществляют в небольшом объеме антисывороток (0,5—1,5 мл) — в маленьких бюксах или пенициллиновых пузырьках, причем для лучшего доступа антисывороток к ткани количество срезов не должно превышать 10—15 в одном пузырьке. От антисывороток срезы отмывают в гораздо большем объеме ПБС (30 — 50 мл) — в стеклянных кристаллизаторах. В случае применения антисывороток и промывочного ПБС растворы необходимо постоянно перемешивать путем медленной ротации сосудов или их плавного покачивания. В том случае, если срезы наклеены на предметные стекла, инкубацию с антисыворотками осуществляют на самих стеклах. Для этого края стекол, влажных после промывания срезов в ПБС, протирают насухо краем фильтровальной бумаги, в результате чего создается несмачиваемая краевая зона. После этого на слегка увлажненные ПБС срезы из автоматической микропипетки капают антисыворотку, обычно около 100 — 200 мкл на стекло, а при определенном навыке и меньше. Стекла помещают в горизонтальном положении во влажную камеру — пластмассовую коробку с вмонтированным штативом для стекол, дно которой покрыто пропитанной дистиллированной водой фильтровальной бумагой. Находясь в холодильнике в таком состоянии, срезы не подсыхают в течение 2 — 3 дней. После инкубации антисыворотки аккуратно собирают со срезов пипеткой, а стекла со срезами помещают в специальные штативы и отмывают в ванночках, заполненных ПБС. Метод гистохимического выявления пероксидазы хрена — см. раздел «Метод немеченых антител». Непрямой метод В случае применения непрямого метода первичные (специфические) немеченые антитела выявляют с помощью меченых вторичных антител к иммуноглобулинам животного, у которого выработаны первичные антитела. Это означает, например, что кроличьи антитела к тканевому антигену в свою очередь выступают в роли иммуноглобулина антигена для вторичного меченого антитела, выработанного в любом другом животном, чаще всего в овце или козе. В качестве метки вторых антител используют флюоресцентные красители, пероксидазу хрена и др. Наибольшей чувствительностью обладает модификация метода с использованием связанных с биотином вторых антител, которые выявляют с помощью авидина, меченного пероксидазои или флюоресцентным красителем [С1 С. еЬ а1., 1986]. Преимущества непрямого метода по сравнению с прямым заключаются в том, что: а) антисыворотка к иммуноглобулинам чрезвычайно гипериммунна и обладает высоким сродством к ним; 6) с каждой молекулой первичного антитела связываются две молекулы вторичных антител, в результате чего значитель- 137
но повышается чувствительность метода и можно использовать первую антисыворотку в большем разведении; в) все первые антитела, выработанные у одного и того же вида животного к различным антигенам, могут быть выявлены с помощью одних и тех же меченых антител [Ро1ак ]., Уап Ькюгйеп 5., 1986]. Недостатки метода — большие затраты времени и возникновение дополнительной опасности неспецифических реакций. Практические рекомендации. В случае применения непрямого метода необходимо эмпирически подбирать разведения не только первой, но и второй антисыворотки, например по схеме, предложенной в 1988 г. Е. ,1опе5 и ]. Сге§огу (табл. 4). Таблица 4 Схема подбора оптимального разведения антисывороток для непрямого метода Первые антитела 1/50 1/200 1/500 1/1000 Вторые антитела 1/50 1/100 1/200 При использовании коммерческих антисывороток первичная информация об их разведении может быть получена из сопроводительного описания. Как упоминалось выше, иммуноцитохимический процесс при использовании непрямого метода двухэтапный: 1) обычно инкубацию с первыми антителами проводят в таких же условиях, как и в случае применения прямого метода: 30 — 60 мин при комнатной температуре или 12 — 48 ч при 4 °С, однако разведение первых антител в обоих случаях должно быть выше. После этого срезы отмывают в трех сменах ПБС по 30 мин в каждой; 2) инкубацию со вторыми мечеными антителами в подобранном разведении (обычно 1/30 — 1/100) проводят в течение 30 — 60 мин при комнатной температуре с последующим отмыванием срезов в трех сменах ПБС по 30 мин в каждой. Метод немеченых антител Если непрямой метод является «двухслойным», то метод немеченых антител, предложенный Ь.А. 51:егпЬег§ег и соавт. (1970), «трехслойный». Первый слой, как и в предыдущих модификациях, образован немечеными антителами (обычно кроличьими) к тканевому антигену, второй — немечеными антителами (обычно овцы или козы) к иммуноглобулинам животного, у которого выработаны первые (специфические) антитела, третий 138
слой представляет собой антитела к метке, выработанные в животном того же вида, в котором получены антитела к тканевому антигену (обычно кролик). Таким образом, в третьем слое антитела связаны с меткой иммунологически. Следует отметить, что вторые антитела способны выполнять функцию мостика между первыми и третьими только при условии их избыточной концентрации по отношению к первым антителам. В этом случае лишь один РаЬ-фрагмент второго антитела связывается с первым антителом, а второй РаЬ-фрагмент сохраняется свободным для связи с третьим антителом. Метод немеченых антител, наиболее широко применяемый в настоящее время в иммуноцито- химии, имеет несколько модификаций в зависимости от используемой метки третьего уровня и характера ее связи с третьими антителами. Пероксидаза-антипероксидазный метод В начале 70-х годов Ь. 51егпЬег§ег и соавт. предложили использовать в качестве третьего уровня в технике немеченых антител пероксидаза-антипероксидазный (ПАП) комплекс, который образован молекулами пероксидазы, связанными с антителами к пероксидазе, выработанными в животном того же вида, которое было использовано для получения первых антител (обычно кролик). Этот метод характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью, так как на каждую молекулу первого антитела приходится три молекулы пероксидазы, причем при иммунологическом образовании ПАП-комплекса активность пероксидазы полностью сохраняется. В то же время такая высокая концентрация пероксидазной метки позволяет значительно увеличить разведение первой антисыворотки, что в свою очередь приводит к резкому снижению концентрации побочных антител (например, антител к примесям иммуногена) и падению фона. Низкий фон при использовании ПАП-метода также обусловлен высокой очисткой коммерческого ПАП-комплекса и блокированием потенциальных мест его неспецифического связывания тканью путем предварительной инкубации материала с нормальной сывороткой животного того вида, у которого были выработаны вторые антитела. Единственными недостатками ПАП-метода являются его относительная трудоемкость и расходование некоторых дополните 1ьных реактивов [Ро1ок ]., Уап Моогйеп 5., 1986]. Конечный этап иммуноцитохимической реакции — выявление маркерного фермента — пероксидазы хрена (ПХ) с помощью субстрата ферментативной реакции — перекиси воздуха и хромогена. В процессе реакции образуется комплекс пероксидазы с перекисью водорода, взаимодействующий с донором электронов, в результате чего образуется нерастворимый окрашенный продукт реакции и вода. 139
В качестве донора электрона чаще всего используют ДАБ — 3,3'-диамино6ензидинтетрагидрохлорид (§1§та), обеспечивающий образование темно-коричневого нерастворимого осадка в месте реакции. Нерастворимый осадок дает также п-фениленди- аминдигидрохлорид/пирокатехол (Напкег —Уа1ез), однако реакция с его участием довольно плохо воспроизводима. Для выявления пероксидазы используют и другие хромогены: 3-амино- 9-этилкарбазол и 4-хлоро-1 -нафтол, образующие соответственно красный и синий депозиты. Серьезным недостатком обоих хромогенов является растворимость в спиртах продукта их реакции, т.е. невозможность приготовления долгоживущих (постоянных) препаратов. Важным преимуществом ПАП-метода с последующим выявлением ДАБ-продукта гистохимической реакции является возможность увеличения его оптической плотности — в основном за счет осаждения в местах реакции таких металлов, как кобальт, никель, серебро, золото, осмий и др. Такого рода интенсификация позволяет, с одной стороны, существенно увеличить разрешающую способность иммуноцитохимического метода, а с другой — использовать его для «двойного» мечения. Практические рекомендации. Обработку материала при использовании метода немеченых антител проводят в такой последовательности. 1. Инкубация отмытых в ПБС срезов с первой антисывороткой в тех же условиях, что и в случае применения других методов, однако обычно при большом ее разведении. После инкубации срезы отмывают в трех сменах ПБС по 30 мин в каждой. 2. Инкубация со второй антисывороткой (МогсНс, З^та), обычно в разведении 1/100, в течение 2 ч при комнатной температуре с последующей стандартной отмывкой в ПБС. 3. Инкубация с ПАП-комплексом (51§та, Бакораиз), обычно в разведении 1/200, в течение 1 ч при комнатной температуре. На этом этапе особенно важно тщательно отмыть избыток ПАП- комплекса в нескольких сменах ПБС в течение нескольких часов. Желательно перед выявлением пероксидазы в ПБС оставить материал на ночь в холодильнике. В том случае, когда исследователь имеет дело с совершенно незнакомыми ему тканью и антигеном, рекомендуется подбирать оптимальные разведения второй и третьей антисывороток по схеме, предложенной в 1988 г. Е. ^пез и ]. Сгедогу (табл. 5). 4. Выявление пероксидазы хрена. Поскольку пероксидаза оказалась универсальным маркером антител, был разработан ряд методов ее выявления и интенсификации первичного продукта гистохимической реакции. В большинстве рутинных им- муноцитохимических исследований для выявления пероксидазы срезы инкубируют в среде, содержащей 0,01—0,06 % ДАБ и 0,01—0,03 % перекись водорода на 0,05 М трис-НС1-6уфере (рН 7,6) или ПБС (рН 7,2), в течение 5 — 20 мин. Реакцию кон- 140
Таблица 5. Схема выбора оптимального разведения второй антисыворотки и ПАП-комплекса ПАП-комплекс 1/50 1/100 1/200 Вторые антитела 1/50 1/100 1/200 тролируют под бинокулярной лупой или световым микроскопом, однако при минимальном освещении реакционной среды ввиду ее нестабильности. Несмотря на то что представления о канцерогенном эффекте диаминобензидина существенно пересмотрены, все же необходимо соблюдать определенную технику безопасности — работать с ДАБ в резиновых перчатках в вытяжном шкафу. Помимо ДАБ, окрашивающего продукт реакции в коричневый цвет, для выявления пероксидазы используют и другие хромогены, окрашивающие его в другие цвета: З-амино-9-этилкар- базол — в красный, 4-хлоро-1-нафтол — в синий, п-фениленди- аминдигидрохлорид/пирокатехол, о-дианизидин ди-НС1 — в зеленый, а-нафтол с пиронином — в красный. Протоколы приготовления инкубационной среды для выявления пероксидазы с наиболее широко применяемыми хромогенами приведены в Приложении. Интенсификация ДА Б-п родукта реакции. 1. В самом простом варианте оптическую плотность ДАБ-про- дукта можно несколько увеличить при добавлении в инкубационную среду обычного состава на ПБС (рН 7,0) 10 мМ имида- зола (51§та) [51гаиз \У., 1982]. 2. Более эффективной является модификация реакционной среды с добавлением в нее п-кризола. Состав среды: 0,07 % (объемных) п-кризола + 0,01 % перекиси водорода + 0,01 % ДАБ на 0,05 М лимонной кислоты — 6,2 М ацетата аммония (рН 6,5). 3. Наиболее эффективной, но в такой же степени трудоемкой и несколько «капризной» является интенсификация ДАБ-про- дукта серебром и золотом. После окончания ДАБ-реакции среды: а) отмывают в двух сменах 2 % ацетата натрия по 15 мин в каждой при комнатной температуре; б) инкубируют в водном растворе 10 % тиогликолевой кислоты (Пика) в течение 6—12 ч при 4 °С, что предотвращает не- специфическое связывание тканью серебра. Тиогликолевая кислота чрезвычайно токсична, поэтому с ней необходимо работать в резиновых перчатках в вытяжном шкафу; 141
в) отмывают в четырех сменах 2 % ацетата натрия по 15 мин в каждой при комнатной температуре; г) проявляют в течение 5—15 мин в свежеприготовленном «физическом проявителе» при комнатной температуре. Реакцию осуществляют в идеально чистых, без механических дефектов стекла кристаллизаторах вместимостью 20 — 50 мл. Проявление необходимо проводить в темноте, однако время от времени контролируя его под бинокулярной лупой или микроскопом. Реакцию доводят до отчетливого почернения ДАБ-иммунопози- тивных структур и появления небольшого сероватого фона; д) инкубируют в 1 % растворе уксусной кислоты в течение 5 мин при комнатной температуре с целью остановки процесса интенсификации серебром; е) отмывают в 2 % ацетате натрия в течение 5 мин при комнатной температуре; ж) инкубируют в 0,05 % водном растворе золотохлористоводо- родной кислоты в течение 8—10 мин при 4 °С, что обеспечивает еще большее увеличение оптической плотности ДАБ-продукта; з) снова отмывают в 2 % ацетате натрия в течение 5 мин при комнатной температуре; и) инкубируют в двух сменах 3 % водного раствора тиосульфата натрия по 10 мин в каждой при комнатной температуре для удаления неспецифически адсорбированного на срезах серебра; к) отмывают сначала в двух сменах 2 % ацетата натрия по 5 мин в каждой, а затем в ПБС еще в течение 10 мин. Существуют и другие менее трудоемкие способы интенсификации ДАБ-продукта. 4. Интенсификация осмием. После ДАБ срезы инкубируют в 1 % водном растворе тетраоксида осмия. Реакцию контролируют под световым микроскопом. 5. Интенсификация хлоридом кобальта. К 100 мл ДАБ-рас- твора добавляют, помешивая, 2 мл 1 % хлорида кобальта. Среды инкубируют в этом растворе в течение 6 мин, после чего добавляют в него необходимое количество перекиси водорода [Нзи §., 5оЬап Е., 1982]. 6. Интенсификация никелем. Проявление срезов после инкубации с ПАП-комплексом осуществляют в среде, состоящей из 0,035 % ДАБ, 2,5 % никеля-аммония сульфата, 0,01 % раствора перекиси водорода в 0,1 М ацетатном буфере (рН 6,0). Авидин-биотиновый метод По чувствительности авидин-биотиновый (АБС) метод превосходит даже ПАП-метод и в последнее время все больше вытесняет его из экспериментальной практики [Нзи 5. еЬ а1., 1981; С1 С. е1 а1., 1986]. В основе АБС-метода лежит способность к прочному связыванию высокомолекулярного гликопротеи- 142
на — авидина, получаемого из яичного белка, с низкомолекулярным витамином — биотином, входящим в состав яичного желтка. Кроме того, биотин способен связываться в высокой пропорции с высокомолекулярными соединениями, такими как антитела (иммуноглобулины) и пероксидаза хрена. Так, с одной молекулой антитела связывается до 150 молекул биотина. Авидин также может образовывать комплексы с различными маркерами, включая ферменты (пероксидаза, фосфатаза, р-га- лактозидаза), флюоресцентные красители (родамин, флюорес- цеин), коллоидное золото, ферритин и др. Важной особенностью третичной структуры молекулы авидина является наличие на его поверхности четырех гидрофобных «карманов», обеспечивающих специфическое связывание четырех молекул биотина. Однако авидин не лишен некоторых недостатков, поскольку его молекула характеризуется высокой изоэлектрической точкой (10,5) и наличием олигосахаридных фрагментов. С помощью этих фрагментов авидин может связываться с лектинопо- добными эндогенными белками и некоторыми другими соединениями, в то время как при нейтральном рН весьма вероятно связывание авидина отрицательно заряженными участками ткани, например клеточными мембранами и ядрами, что в целом приводит к появлению фона. Эти трудности можно преодолеть, заменив авидин на стрептавидин — высокомолекулярный белок, получаемый из культуральной среды 51;гер{;отусе5 аУ1сНш. Как и молекула авидина, молекула стрептавидина обладает четырьмя субъединицами с сильным сродством к молекулам биотина. В то же время молекула стрептавидина характеризуется наличием нейтральной изоэлектрической точки и отсутствием олигосахаридных фрагментов. Все это в совокупности приводит к значительному уменьшению вероятности ее неспецифического связывания тканью [С1 О. еЬ а1., 1986]. Указанные выше особенности авидина (стрептавидина) и биотина позволяют использовать их в различных комбинациях практически во всех модификациях иммуноцитохимического метода. Наибольшее признание получил непрямой метод с использованием коммерческого авидин-биотин-пероксидазного комплекса (АБС-метод), с помощью которого выявляют биоти- нилированные лектины, гормоны, молекулярные зонды нуклеиновых кислот и др. Особенностью всех иммуноцитохимических методов, в основе которых лежит взаимодействие авидина и биотина, является использование биотинилированных антител: первых антител в случае применения прямого метода и вторых — при использовании непрямого метода. В свою очередь биотинилированные антитела выявляют с помощью: а) меченого авидина; б) авидина, выполняющего роль мостика между антителами и биотини- лированным ферментом; в) АБС-метода. 143
Наиболее широко используемый АБС-метод, как и ПАП- метод, состоит из трех неидентичных этапов: а) связывание первых (специфических) антител (обычно кроличьих) с тканевым антигеном; б) взаимодействие вторых антител (обычно козы против иммуноглобулинов кролика), связанных с биотином, с первыми антителами; в) взаимодействие биотина вторых антител с авидином авидин-биотин-пероксидазного комплекса. Третий слой в эгом «сэндвиче» — комплекс авидина и биотина, связанного с иероксидазой. Взаимодействие авидина и меченого биотина осуществляется в такой пропорции, при которой часть потенциальных связей биотина на молекуле авидина остается свободной. За счет именно этих связей на третьем этапе имму- ногистохимической реакции взаимодействуют биотин, связанный со вторыми антителами, и авидин авидин-биотин-пероксидазного комплекса. В конечном счете на каждую молекулу антигена приходится много молекул пероксидазы, что обусловливает высокую чувствительность метода [Нзи 5. е1: а1., 1981; Со8§1 О. е* а1., 1986; Ро1ак ]., Уап №югс1еп 5., 1986]. Помимо авидин-биотин-пероксидазного комплекса, в световой иммуноцитохимии применяют, хотя и крайне редко, ави- дин-биотиновые комплексы, меченные радионуклидами или коллоидным золотом. Практические рекомендации. 1. Прямой АБС-метод: а) инкубация срезов с сильно разведенными биотинилиро- ванными первыми антителами 0,5 — 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °С; б) отмывание в ПБС или ТБС — три смены по 5 мин в каждой при комнатной температуре; в) инкубация с авидином, меченным флюоресцентным красителем (например, флюоресцеин-изотиоционатом или тетраме- тилродамин-изотиоцианатом) или пероксидазой в течение 30 мин при комнатной температуре; г) отмывание в ПБС или ТБС; д) выявление пероксидазы. 2. Непрямой метод с помощью меченого авидина: а) инкубация с сильно разведенной немеченой первой антисывороткой 0,5 — 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °С; б) отмывание в трех сменах ПБС или ТБС по 5 мин в каждой при комнатной температуре; в) инкубация со вторыми биотинилированными антителами (Уес1:ог) 30 мин при комнатной температуре; далее в случае флюоресцентной или пероксидазной метки те же манипуляции, что и при использовании прямого метода (см. «в», «г», «д»). В случае же применения авидина или стрептавидина, меченного коллоидным золотом, инкубации срезов с первыми антителами предшествует преинкубация их в трех сменах ПБС или ТБС, содержащем 2,5 % хлорид натрия и 0,5 % Твин 80 (Т^ееп 144
80), по 5 мин в каждой. Этот же раствор используют для отмывания срезов после антисывороток. Этапы «а» и «6» повторяют без изменений, после чего следуют: в) инкубация с 1 % бычьим сывороточным альбумином на ПБС или ТБС (рН 8,2) в течение 5 мин; г) инкубация со стрептавидином, меченным золотом, на ПБС или ТБС в течение 30 мин при комнатной температуре; д) повторение этапа «д»; е) повторение преинкубации; ж) отмывание в трех сменах дистиллированной воды по 5 мин в каждой. На этом этапе коллоидное золото можно интенсифицировать серебром. С этой целью следует: а) проявить срезы в специальном растворе в течение 5 мин в темноте; б) остановить проявление в фотографическом фиксаже, разведенном в 4 раза, в течение 2 мин; в) промыть срезы в проточной воде в течение 5 мин. 3. Непрямой метод с помощью авидин-биотин-пероксидазно- го комплекса: а) до пункта «в» повторить все действия, как при использовании предыдущего (непрямого) метода; б) инкубация авидин-биотин-пероксидазным комплексом, приготовленным за 30 мин до ее начала, или с комплексом стрептавидин — биотинилированная пероксидаза в разведении 1:200 (АтегзЬат) в течение 30 мин при комнатной температуре; в) стандартная отмывка в ПБС или ТБС; г) выявление пероксидазы. Неспецифическое окрашивание (фон) Как уже отмечалось, несмотря на высокую специфичность реакции антиген —антитело, иммуногистохимики часто сталкиваются с проблемой неспецифического окрашивания — фона, который может быть диффузным или иметь вид избирательно окрашенных структур или участков ткани. Существует ряд причин возникновения фона, которые при определенных условиях могут быть устранены. 1. Материал, используемый для иммуногистохимических исследований, особенно криостатные срезы, обладает рецепторами к Рс-фрагменту иммуноглобулинов, что приводит к неспецифическому связыванию антител. Как отмечалось ранее, этого можно избежать, добавляя в антисыворотки и промывочные буферы нормальную, обычно 1 %, сыворотку того вида животного, у которого получены вторые антитела. При этом тканевые рецепторы к Рс связываются по конкурентному принципу иммуноглобулинами нормальной сыворотки и становятся, таким образом, недоступными для первых антител. В свою очередь вторые антитела не будут связываться с этими иммуноглобулина- 145
ми, поскольку они получены у одного и того же вида животного. С этой же целью иногда используют гомогенаты печени. 2. Иммуноглобулины также могут связываться неспецифически с тканью, особенно с ее заряженными участками, с помощью гидрофобных или электростатических сил. Таким же образом с тканью может взаимодействовать комплемент, что также приводит к неспецифическому связыванию иммуноглобулинов, которое можно предотвратить: а) как можно большим разведением первой и второй антисывороток; б) инактивацией комплемента всех сывороток при нагревании до 56 °С в течение 30 мин; в) увеличением ионной силы антисывороток или промывочных буферов путем повышения концентрации хлорида натрия в этих растворах до 2,5 % или использования трис-НС1-6уфера, обладающего большей ионной силой по сравнению с фосфатным буфером. Иногда с этой же целью в растворы антисывороток и промывочные буферы добавляют тритон Х-100 [Ро1ак ]., Уап Ккюгскп 5., 1986]. 3. Причиной появления фона может послужить и то, что антитела к иммуноглобулинам одного вида животных окажутся реактивными и по отношению к иммуноглобулинам других видов. Это означает, что вторые антитела могут связываться с тканью, хотя и специфически, но не с комплексом антиген — первое антитело. Эту проблему можно решить, добавив ко второй антисыворотке 5 % нормальную сыворотку того животного, у которого выявляется антиген. 4. В случае фиксации материала параформальдегидом или глутаровым альдегидом источником фона могут быть свободные альдегидные группы, связывающие иммуноглобулины, в частности антитела. Это особенно отчетливо проявляется при недостаточно тщательном отмывании ткани от фиксатора. Такого рода фон можно снизить путем связывания свободных альдегидных групп борогидридом калия или натрия. 5. При использовании пероксидазной метки постоянно существует опасность появления фона, обусловленного эндогенной пероксидазой. В этом случае необходимо использовать фармакологические подходы, обеспечивающие инактивацию этого фермента. В некоторых случаях, например при работе с криос- татными срезами, ингибирование пероксидазной активности можно проводить только после инкубации материала с первой антисывороткой, т.е. после образования недиффундируемого комплекса антиген —антитело. 6. В состав поликлональной антисыворотки входят не только антитела к выявляемому антигену, но также антитела к макромолекуле, с которой он связан (в случае низкомолекулярных антигенов), некоторым компонентом ткани, примесям в имму- ногене и т.д. При высоком титре антител фон может быть значительно снижен за счет высокого разведения антисыворотки. Полностью устранить такой фон можно только при использовании моноклональных антител. 146
Методы контроля специфичности иммуноокрашивания Помимо специальных иммунологических тестов, для определения специфичности антител существуют методы контроля специфичности имммуноокрашивания на срезах. К ним в первую очередь относятся позитивный и негативный контроль, контроль с преабсорбцией. Позитивный контроль. Идея позитивного контроля состоит в выявлении антигена при обычной иммуноцитохимической проводке в биологическом тест-объекте, т.е. в той ткани, в которой он заведомо содержится. Желательно, чтобы содержание антигена в биологическом тест-объекте было невелико, так как в противном случае антиген будет выявляться даже при малоэффективных антисыворотках и других реагентах [Ро1ак ]., Уап №югс!еп 5., 1986]. Негативный контроль. Существуют две разновидности негативного контроля. В одном случае при обычной иммуноцитохимической проводке используют ткани, в которых антиген заведомо отсутствует. В другом случае при выявлении антигена в ткани, в которой он есть или может быть, в процессе обычной иммуноцитохимической проводки исключают один из принципиально важных этапов, например инкубацию с первыми (специфическими) антителами, или заменяют ее инкубацией с антителами к другому антигену, а также с неиммунной сывороткой. Во всех приведенных случаях должна отсутствовать иммунопо- зитивная реакция. Контроль с преабсорбцией. Он основан на потере иммуно- реактивности антител в результате их предварительной преаб- сорбции с избытком антигена, к которому они выработаны. При этом иммунореактивность антител не должна снижаться после преабсорбции антисыворотки аналогичным количеством веществ, по структуре похожих на антиген. В контроле с преабсорбцией желательно использовать синтетический антиген, исключающий реакцию с антителами, выработанными на возможные примеси в антигене. Контроль с преабсорбцией целесообразно использовать в случае новых антител. При этом важно оценить количество антигена, необходимое для инактивации антисыворотки при оптимальном ее разведении. Для этого в равные порции антисыворотки добавляют антиген в постепенно снижающейся концентрации, обычно от 10 до 0,001 нМ/мл. Как правило, иммунореактивность полностью нивелируется антигеном в концентрации 10 — 0,1 нМ/мл, тогда как при меньшей концентрации (0,01—0,001 нМ/мл) этот эффект проявляется лишь частично. Такого рода количественная оценка позволяет сравнить реакцию антител одного вида на разные антигены или, наоборот, реакцию различных антител на один и тот же антиген. 147
Гистологическое окрашивание и заключение срезов После проведения иммуноцитохимической реакции срезы можно подкрасить и заключить. Характер соответствующих процедур зависит от того, в какой степени растворим продукт иммуноцитохимической реакции или первичная метка. Если продукт реакции или метка нерастворима в воде и спиртах (например, ДАБ-продукт), то срезы можно дегидратировать в спиртах, просветлить в ксилолах и заключить в бальзам, пермо- унт и другие среды, обеспечивающие длительное хранение препаратов. Напротив, если продукт реакции или метка растворимы (флюоресцентные красители, хлоронафтолпродукт и др.), то срезы можно заключить только в водорастворимые среды (например, глицерин с различным содержанием ПБС), которые не обеспечивают сохранность срезов в течение длительного периода времени. Двойное иммуномечение Перед исследователями нередко встает задача выявить на одном и том же срезе два или более антигенов, содержащихся как в разных клетках, так и в пределах одной и той же клетки. Классическим примером являются нейросекреторные нейроны, продуцирующие одновременно несколько физиологически активных веществ — пептидов и/или моноаминов. С помощью двойного иммуноцитохимического мечения можно решить и многие другие задачи, например определить природу иннервации нейронов строго определенной эргичности и др. [Угрюмов М.В., 1989]. Для решения этих задач используют несколько стандартных методических приемов. Двойное мечение на серийных срезах Наиболее простой способ идентифицировать два антигена в одной и той же структуре — выявить их иммуноцитохимически на двух последовательных срезах. Если размеры интересующей структуры, например клетки, соизмеримы с толщиной среза, то антигены необходимо выявлять на «зеркальных» срезах. Для этого один из двух последовательных срезов переворачивают таким образом, чтобы одна и та же пересеченная ножом структура была на поверхности обоих срезов. После этого на первом срезе выявляют один антиген, а на втором — другой. Далее срезы фотографируют и производят наложение изображения одного среза на изображение другого, идентифицируя таким образом структуры, содержащие оба антигена. 148
Двойное мечение прямым методом В этом случае два антигена выявляют с помощью двух первых антител, меченных различными флюорофорами, например флюоресцеином и родамином. Дальнейшее использование соответствующих красителям фильтров позволяет различить метки и таким образом локализовать оба антигена на срезах. Этот метод, однако, малоэффективен в случае значительного преобладания внутри клетки одного антигена над другим, так как при этом одна метка маскирует другую. Двойное мечение непрямым методом Непрямой метод предполагает использование двух видов первых антител соответственно к двум разным антигенам. Первые антитела выявляются вторыми антителами с различной меткой. Необходимым условием применения этого метода является использование первых антител, полученных у разных видов животных, и отсутствие перекрестной реакции у вторых, меченых, антител. В качестве первых антител можно также использовать моноклональные антитела, относящиеся к разным классам иммуноглобулинов . Двойное иммунопероксидазное мечение с элюированием Этот метод предполагает последовательное использование первых антител, выработанных к разным антигенам у одного и того же вида животного. Пероксидазная метка вторых антител выявляется при этом с помощью различных хромогенов (ДАБ, а-на- фтол, пиронин), обеспечивающих образование продукта реакции разной окраски (коричневый, красный). Перед выявлением второго антигена всю цепочку предыдущей иммуноцитохими- ческой реакции, начиная с первых антител, вымывают (элюиру- ют) путем длительной инкубации в кислом буфере (например, в глицин-НС1-буфере). Окрашенный продукт реакции сохраняется при этом т зИ;и. Этап элюирования является принципиально важным в процессе двойного мечения, так как при этом: а) устраняется пе- роксидаза, сохранившая свою активность после выявления первого антигена; б) исключается возможность связывания первых антител, выработанных против второго антигена, с вторыми антителами первой иммуноцитохимической реакции. Элюирова- ние в кислом буфере малоэффективно лишь в случае высокого сродства антител к антигену. В этом случае диссоциация комплекса антиген — первое антитело обеспечивается путем короткого окисления перманганатом калия. Несмотря на то что теоретически с помощью такого метода можно выявить несколько антигенов на одном и том же срезе, в 149
настоящее время мало кто использует данный подход. Это объясняется тем, что он требует большого количества довольно трудоемких методов контроля. Так, перед выявлением каждого последующего антигена необходимо быть уверенным в том, что продукт предыдущей иммунологической реакции — комплекс антитело —антиген, действительно полностью элюирован. В противном случае неизбежны перекрестная реакция между первыми антителами и /или выявление остаточной активности пе- роксидазной метки. Кроме того, в реальных условиях довольно трудно определить оптимальную концентрацию элюирующего раствора для каждого антигена. Двойное мечение без элюирования Проблема перекрещивания двух последовательных иммуноци- тохимических реакций с целью выявления двух антигенов на одном и том же срезе эмпирически успешно решена Ь. 31:егпЬег- §ег и Р. ^зерЬ (1979). Они установили, что интенсивное проявление пероксидазы первой реакции блокирует (маскирует) реактивные участки на всем срезе, предотвращая таким образом неспецифическое связывание компонентов последующей имму- ноцитохимической реакции. Если для выявления пероксидазы первой реакции в качестве хромогена обычно используют ДАБ, то во второй реакции проявление пероксидазы проводят в присутствии 4-хлоро-1-нафтола. Как упоминалось выше, продукты реакции этих хромогенов резко различаются по цвету. Существенным недостатком этого варианта двойного мечения является то, что продукт реакции, образующийся в присутствии 4-хлоро- 1-нафтола и большинства других хромогенов, за исключением ДАБ, растворяется в воде и спирте, т.е. в этой ситуации срезы нельзя дегидратировать и заключить в стойкую среду. Упомянутого выше недостатка лишен иммунопероксидазный метод без элюирования, предложенный венгерскими исследователями [Ыроз^з 2. еЬ а1., 1983]. Первый антиген выявляют классическим ПАП-методом с получением конечного продукта ДАБ-реакции, который затем интенсифицируют серебром и золотом. Потенциальные места неспецифического связывания в процессе последующей иммуноцитохимической реакции блокируются не только интенсивным проявлением пероксидазы, но и довольно длительной (2 —б ч) инкубацией в тиогликолевой кислоте, предшествующей интенсификации. Однако следует иметь в виду, что эти же процедуры приводят к значительному снижению активности второго антигена, поэтому важно первым выявлять антиген с низкой активностью, а вторым — с высокой. После окончания интенсификации срезы тщательно промывают и затем полностью повторяют цикл иммуноцитохимической реакции с целью выявления второго антигена. Этот процесс заканчивается ДАБ-реакцией второго антигена. В результате двойного
го мечения продукт гистохимической реакции, соответствующий локализации первого антигена, окрашивается в интенсивно черный цвет, в то время как продукт гистохимической реакции второго антигена — в коричневый. Практические рекомендации. 1. Фиксация, срезы: а) перфузия крысы под наркозом ПБС (80— 150 мл), фиксатором — 4 % параформальдегидом сначала при рН 6,5 (150 мл), а затем при рН 10,5—10,8 (150 мл) при комнатной температуре; б) фиксация мозга иммерсией в щелочном параформальдеги- де в течение 2 — 3 дней при 4 °С; в) приготовление вибратомных срезов толщиной 40 мкм и отмывание их в восьми сменах ПБС по 15 мин в каждой. 2. Выявление первого антигена: г) инкубация срезов с 0,2 % тритоном Х-100 на ПБС в течение 20 мин при комнатной температуре и отмывание в трех сменах ПБС по 5 мин в каждой; д) инкубация в 2 % нормальной (неиммунной) сыворотке козы на ПБС 30 — 60 мин при комнатной температуре; е) инкубация с первой антисывороткой (кролика против ти- розингидроксилазы) на ПБС, включающем 1 % нормальную сыворотку козы и 0,1 % азид натрия, 36 — 48 ч при 4 °С и промывать в восьми сменах ПБС по 15 мин в каждой; ж) инкубация со вторыми антителами (козы против иммуноглобулинов кролика) в разведении 1:100 в течение 1,5 ч при комнатной температуре и промывание срезов ПБС в течение 1 ч; з) инкубация с ПАП-комплексом в разведении 1:100 в течение 1,5 ч при комнатной температуре и последующее промывание в ПБС в течение 2 ч; и) выявление пероксидазы ПАП-комплекса с помощью метода, разработанного Р. З^гек, ]. КеиЫ (1977), в инкубационной среде следующего состава: 0,01 % ДАБ, 0,0024 % перекись водорода, 0,075 % п-крезол на 0,1 М буфере, содержащем лимонную кислоту и ацетат аммония (рН 5,1), в течение 5 — 20 мин под контролем светового микроскопа и отмывание срезов в ПБС. 3. Интенсификация ДАБ-продукта первого антигена: к) инкубация в водном 10 % растворе тиогликолевой кислоты («Пика», Швейцария) в течение 2 ч при 4 °С и отмывание срезов в 2 % ацетате натрия в течение 2 ч; л) проявление срезов в физическом проявителе под контролем светового микроскопа или бинокулярной лупы в течение 5— 15 мин; м) остановка проявления в 1 % растворе уксусной кислоты в течение 5 мин и промывание в 2 % ацетате натрия в течение 10 мин; н) инкубация в 0,05 % растворе золотохлористоводородной кислоты в течение 10 мин при 4 °С и отмывание в 2 % ацетате натрия в течение 10 мин; 151
о) инкубация в 3 % растворе тиосульфата натрия в течение 10 мин при комнатной температуре и промывание ПБС в течение такого же периода времени. 4. Выявление второго антигена: п) инкубация с 2 % нормальной (неиммунной) сывороткой козы на ПБС в течение 10 мин при комнатной температуре; р) инкубация с первой антисывороткой против второго антигена (антисыворотка кролика против кортиколиберина в разведении 1:2000) в течение 36 — 48 ч при 4 °С. Далее повторить «ж», «з», «и». 5. Приготовление препаратов для световой микроскопии: с) поместить срезы на предметные стекла и высушить их в течение нескольких часов при 37 °С; т) дегидратировать в спиртах возрастающей концентрации, просветлить в ксилолах; у) заключить в бальзам, пермоунт или любую другую среду. Модификация метода, разработанного 2з. Ыроз^з и соавт. (1984), предложенная японскими и отечественными исследователями [0§гитоу М. еЬ а1., 1989], преследует цель улучшить сохранность второго антигена и таким образом увеличить разрешающую способность метода в целом. С этой целью предлагают: а) уменьшить продолжительность инкубации с первыми антителами с 36 — 48 до 6 ч и таким образом уменьшить вероятность диффузии второго антигена; 6) уменьшить длительность обработки срезов тиогликолевой кислотой с 2 — 6 ч до 30 мин, обеспечив лучшую сохранность второго антигена; в) увеличить продолжительность инкубации со вторыми (биотинилированны- ми) антителами с 1,5 до 12 ч при выявлении второго антигена; г) использовать вместо ПАП-комплекса АБС-комплекс, позволяющий повысить чувствительность метода. Однако наиболее принципиальное значение имеет изменение последовательности обработки срезов. Так, после выявления ДАБ-продукта реакции первого антигена срезы тщательно отмывают и инкубируют с первыми антителами против второго антигена, а далее — со вторыми биотинилированными антителами. Только после того, когда комплекс второй антиген — антитело уже иммобилизован т зИи, осуществляют интенсификацию ДАБ-продукта реакции первого антигена. Вслед за этим срезы инкубируют с АБС-ком- плексом и выявляют пероксидазную метку второго антигена. Существенно ограничивает применение всех модификаций иммунопероксидазного метода без элюирования то обстоятельство, что они пригодны только для выявления антигенов, содержащихся в разных клетках. Это объясняется тем, что продукт первой иммуноцитохимической реакции настолько интенсивно окрашен, что маскирует близлежащий продукт второй реакции. Еще одна модификация метода двойного меченпя без элюирования предложена Е. ДУап§ и Ь. Ьагззоп (1985). Как и в предыдущих случаях, два антигена выявляют путем последова- 152
тельных иммуноцитохимических реакций с использованием первых антител, выработанных у животных одного и того же вида. Для последующего определения первых антител обычно используют антитела, меченные различными красителями и коллоидным золотом. В этой модификации места потенциального неспецифического связывания иммуноглобулинов, сохранившиеся после первой иммуноцитохимической реакции, блокируют парами формальдегида перед инкубацией срезов с первыми антителами ко второму антигену. Двойное иммуноферментное мечение без элюирования Этот метод существенно отличается от предыдущих тем, что срезы инкубируют одновременно с первыми антителами к двум разным антигенам. Эти поликлональные антитела должны быть выработаны у животных разных видов, например у кролика и мыши. Возможно также использование моноклональных антител, выработанных у животных одного вида, но принадлежащих двум разным подклассам иммуноглобулинов. Вторые антитела должны быть выработаны против иммуноглобулинов животных, у которых получены первые антитела, например антитела козы против иммуноглобулинов кролика и антитела козы против иммуноглобулинов мыши. При использовании в качестве первых моноклональных антител вторые антитела должны быть выработаны против соответствующих им (первым антителам) подклассов иммуноглобулинов. Ферментная метка, например пероксидаза и щелочная фос- фатаза, могут быть связаны как со вторыми, так и с третьими антителами в зависимости от характера используемого иммуно- цитохимического метода Далее два разных фермента проявляют отдельно с образованием по-разному окрашенного продукта реакции, например в коричневый цвет в случае применения пе- роксидазы и синий — в случае использования щелочной фосфа- тазы. С этой же целью с успехом было применено сочетание ПАП-комплекса (коричневое окрашивание) и глюкозооксидаза- антиглюкозоксидазного комплекса (синее окрашивание). Если оба антигена находятся в соизмеримой концентрации в одной и той же клетке, то наложение продуктов реакции приводит к окрашиванию в фиолетово-серый цвет. Однако если концентрация одного антигена существенно ниже концентрации другого, то соответствующая ему окраска может быть вообще не различима на фоне окрашивания второго антигена. Комбинирование иммуноцитохимии с другими гистологическими (гистохимическими) методами Использование комбинации иммуноцитохимии с другими гистологическими и физиологическими подходами позволяет решить 153
многие принципиально важные проблемы фундаментальной и прикладной науки. Например, комбинацию иммуноцитохимии с гистофлюоресцентным или радиоавтографическим выявлением моноаминов широко используют для двойного мечения пептид- и моноаминергических структур мозга с целью изучения их структурно-функциональных взаимоотношений [Угрюмов М.В., 1989]. Радиоавтография Сочетание радиоавтографии с иммуноцитохимией в экспериментальной практике сопровождается взаимопроникновением или чередованием специфических этапов, характерных для обоих методов [Во51ег О. е1 а1., 1986]. Как правило, эксперимент начинают с введения животному (или в культуру клеток) соответствующего радиоактивно меченного соединения, например 3Н- тимидина при изучении митотически делящихся клеток, 3Н-мо- ноаминов при изучении моноаминергических структур нервной ткани, 3Н-аминокислот при использовании их в качестве маркеров цито(аксо)плазматического транспорта и т.д. Через определенный промежуток времени после введения радиоактивно меченного вещества животное фиксируют перфузией, а затем вырезают интересующую ткань и дофиксируют ее иммерсией. Состав фиксатора определяется тем, что, с одной стороны, он должен обеспечить максимальную иммобилизацию радиоактивно меченного соединения т 5И:и, а с другой — минимально снизить активность антигена, предназначенного для последующего иммуноцитохимического выявления. Так, например, при использовании 3Н-тимидина можно ограничиться непродолжительной (минимум 1 —2 ч) фиксацией параформаль- дегидом невысокой концентрации (2 — 4 %). В случае легко диффундируемых моноаминов фиксация, наоборот, должна быть более продолжительной (минимум 3 ч) и в фиксатор необходимо ввести активные альдегиды (глутаровый, акриловый и т.д.) в высокой концентрации, с тем чтобы «пришить» моноамины альдегидными мостиками к клеточным белкам. Однако следует иметь в виду, что добавка к фиксатору глутарового альдегида даже в невысокой концентрации (0,1 — 0,5 %) приводит к резкому снижению антигенной активности. После фиксации чаще всего проводят полный иммуноцито- химический цикл на вибратомных срезах с помощью ПАП- или лучше АВС-метода. Интенсифицировать ДАБ-продукт реакции каким-либо образом (особенно серебром и золотом) не рекомендуют, так как это приводит к маскировке последующей радиоавтографической реакции. Иммуноцитохимическую реакцию, предшествующую радиоавтографии, можно также проводить на замороженных и парафиновых срезах. В случае «плавающих» (вибратомных или замороженных) срезов после иммуноцитохимической реакции они должны быть 154
дегидратированы, пропитаны эпоксидной смолой и залиты в эту же смолу. С полученных блоков на ультрамикротоме приготавливают так называемые полутонкие срезы — толщиной 1 — 3 мкм и монтируют их на предметные стекла. В случае парафиновой заливки срезы толщиной 5 — 6 мкм приготавливают на микротоме, монтируют на предметные стекла, депарафинируют, регидратируют, после чего проводят иммуноцитохимическую реакцию. В таком виде срезы готовы для последующей рутинной радиоавтографической обработки. В литературе приводятся другие комбинации иммуноцитохи- мического и классических гистохимических методов, например сочетание гистофлюоресценции с иммуноцитохимией для одновременного выявления нейропептидов и моноаминов и т.д. ИММУНОЦИТОХИМИЯ НА ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОМ УРОВНЕ Несмотря на то что иммуноцитохимия на светооптическом уровне чрезвычайно обогатила биологию и теоретическую медицину, а также предоставила прецизионный подход к оценке патологических процессов в клинической медицине, ее разрешающая способность оказалась недостаточной для исследования биологических процессов на субклеточном и молекулярном уровнях. Этот пробел был восполнен путем разработки и внедрения электронно-микроскопической иммуноцитохимии. Электронно-плотные маркеры Для решения определенной цитологической или молекулярно- биологической задачи прежде всего необходимо выбрать адекватный маркер антител. Согласно М. НопзЪегдег (1984), электронно-плотные маркеры по их основным характеристикам разделяют на: а) маркеры, применяемые для решения широкого круга проблем (коллоидное золото, ферритин, ПАП- и АВС- комплексы) или узкоспециализированных задач (гликозилиро- ванные ферритин и пероксидаза); б) диффузные маркеры (пероксидаза) или имеющие вид частиц (ферритин, коллоидное золото); в) маркеры, соединенные с антителами нековалентными связями (коллоидное золото), ковалентными связями (ферритин, пероксидаза) или путем специфических взаимодействий (ПАП- и АБС-комплексы). Кроме того, устанавливают пригодность маркеров для одно- или многоэтапного маркирования, использования не только в просвечивающей, но и сканирующей электронной микроскопии, а также для количественной оценки результатов. 155
Ферритин Основным источником коммерческого ферритина является селезенка лошади. Молекула ферритина (молекулярная масса 750 000) образована белковой оболочкой с внешним диаметром 12 нм, окружающей мицеллу гидроокиси железа диаметром 5,5 — 6 нм. На каждую молекулу ферритина приходится около 2000 атомов железа. Ферритин связывается ковалентно с антителами с помощью таких химических агентов-мостиков, как глу- таровый альдегид, мета-ксилендиизоцианат или толуен-2,4-ди- изоцианат. Разрешающая способность электронно-микроскопической иммуноцитохимии с использованием ферритина в качестве маркера приближается к 30 нм. К недостаткам использования ферритина относятся: а) снижение активности антител в процессе связывания ферритина; б) низкий контраст частиц ферритина на неконтрастированных ультратонких срезах; в) неспецифическая адсорбция ферритина тканью при проведении иммуноцитохимической реакции на ультратонких срезах за счет отрицательного заряда молекулы ферритина при нейтральном рН. Для преодоления указанных трудностей для мечения рекомендуют антисыворотку с высоким титром антител или, что еще лучше, очищенные с помощью аффинной хроматографии или другими способами антитела. Некоторые недостатки, обусловленные химическим связыванием ферритина с антителами, удалось также преодолеть с помощью «гибридных» антител. Коллоидное золото Применение коллоидного золота в качестве маркера основано на адсорбции макромолекул на поверхности частиц золота при строго определенных значениях рН, концентрации реагента и ионной силы раствора. При этом практически не происходит химического связывания и не теряется биологическая активность антител. Исключением является только каталаза. В результате адсорбции макромолекул на поверхности гидрофобных отрицательно заряженных частиц золота сами частицы стабилизируются, будучи защищенными от последующей агрегации электролитами. Достоинствами коллоидного золота как маркера является его высокая электронная плотность, четкая гранулированная форма и градация размеров частиц от 5 до 150 нм, что обеспечивает высокую эффективность использования этого маркера в просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии, для количественного анализа и двойного мечения. Важной характеристикой является также и незначительное неспецифическое связывание антител, меченных золотом. Недостатком меченных золотом макромолекул является их низкая стабильность. При недостаточно плотном покрытии час- 156
тицы золота макромолекулами существует опасность агрегации этих комплексов электролитами, что является недостатком использования коллоидного золота в качестве маркера [Кота- по Е., Котапо М., 1984] Коллоидное золото применяли в качестве маркера поверхностных клеточных антигенов, вирусов, бактерий, а также для выявления внутриклеточных антигенов. С этой целью коллоидное золото связывали с иммуноглобулинами, антигенами, лек- тинами и стафилококковым белком А. Последний вариант мече- ния нашел особенно широкое применение в экспериментальной практике. Этот метод основан на способности белка А связываться с Рс-фрагментом иммуноглобулинов многих видов животных. Наиболее прочные связи образуются с большинством подклассов иммуноглобулинов человека, кролика, морской свинки и собаки. Менее прочно белок А связывается с иммуноглобулинами коровы, мыши, лошади и совсем слабо — с иммуноглобулинами овцы, козы, крысы и цыплят. Потенциальные возможности комплекса коллоидное золото — белок А в значительной степени определяются его важнейшими физико-химическими характеристиками: а) молекулярная масса 42 000; б) белок А имеет вытянутую форму; в) коэффициент экстинк- ции 1 % раствора равен 1,65 при длине волны 275 нм; г) изо- электрическая точка белка А равна 5,1. Это означает, что для получения стабильных комплексов растворы белка А и коллоидного золота должны смешиваться в диапазоне рН 4,6 — 5,6, т.е. как можно ближе к изоэлектрической точке; д) белок А, выделенный из интактного 51:арЬу1ососси5 аигеиз, обладает четырьмя потенциальными связями с Рс-фрагментами иммуноглобулинов, в то время как этот же белок, выделенный из оболочки бактерии, имеет только две связи, т.е. бивалентен. Пероксидаза хрена Пероксидазную метку наиболее широко используют в современной биологии и медицине. Это объясняется такими специфическими положительными характеристиками пероксидазы, как стабильность, относительно небольшая молекулярная масса (40 000), обеспечивающая проникновение в ткани, не очень большая потеря активности при химическом связывании с антителами, возможность параллельного исследования в световом и электронном микроскопах. Для выявления пероксидазы на электронно-микроскопическом уровне, как правило, используют ДАБ, который обладает достаточно высокой электронной плотностью вследствие повышенной осмиофильности. ДАБ-про- дукт распределяется несколько диффузно и по сравнению с коллоидным золотом приводит, с одной стороны, к увеличению чувствительности метода, с другой — к снижению его разрешающей способности. 157
Наряду с упомянутыми в качестве маркера в электронно- микроскопических иммуноцитохимических исследованиях применяют радионуклиды, тяжелые металлы (железо, уран, ртуть и др.), полиэтиленамин и др. Методы электронно-микроскопической иммуноцитохимии Предложено множество методов иммунохимического выявления тканевого антигена на электронно-микроскопическом уровне, которые различаются по используемому маркеру, характеру фиксации, заливочной среде и т.д. Одной из наиболее важных характеристик метода является момент выявления антигена по отношению к остальным этапам гистологической обработки материала. По этому принципу методы электронно-микроскопической иммуноцитохимии подразделяют на нонимбеддинг (без заливки), преимбеддинг (до заливки) и постимбеддинг (после заливки). Нонимбеддинг-метод В основе методов этой группы лежит выявление антигена на замороженных ультратонких срезах префиксированной ткани. После «мягкой» фиксации ткань обрабатывают криопротектором и мгновенно замораживают. Из замороженной ткани приготавливают ультратонкие срезы и монтируют их на напыленные углем медные сеточки. Затем на сеточках осуществляется иммуноцитохими- ческая реакция. Этот подход особенно важен при выявлении антигена, который экстрагируется из ткани в процессе гистологической проводки или теряет активность при нагревании. Практические рекомендации. 1. Ткань фиксируют парафор- мальдегидом и/или глутаровым альдегидом. 2. Блоки ткани объемом около 0,5 мм3 инкубируют с криопротектором, чаще всего 0,6 — 2,3 М сахарозой. 3. Ткань замораживают обычно в изопентане, охлажденном жидким азотом. 4. Готовят замороженные ультратонкие срезы и высушивают их на сеточках. 5. Отмывают срезы от сахарозы, помещая сеточки срезами вниз на поверхность влажной пластины — 0,3 % агарозы и 0,01-0,02 М глицина. 6. «Желатинизацию» срезов проводят, помещая сеточки срезами вниз на каплю 2 % желатина в ПБС на 10 мин. 7. Промывают срезы в ПБС в течение 10 мин и затем инкубируют в 1 % свежеприготовленном борогидриде натрия на ПБС в течение 10 мин. 8. Отмывают срезы в ПБС и инкубируют с первыми антителами (оптимальные температуру, длительность инкубации и 158
разведение антисыворотки подбирают эмпирически для каждой антисыворотки и каждого антигена). 9. Отмывают срезы в ПБС и инкубируют их со вторыми антителами, меченными золотом (параметры инкубации, как и в случае первых антител, подбирают эмпирически). 10. Отмывают в ПБС и постфиксируют 2 % глутаровым альдегидом на дистиллированной воде в течение 5 мин. 11. Отмывают в дистиллированной воде и контрастируют. Преимбеддинг-метод Иммуноцитохимическую реакцию осуществляют на относительно толстых, не заключенных в какую-либо среду, обычно виб- ратомных срезах. После завершения иммуноцитохимической реакции толстые срезы постфиксируют тетраоксидом осмия, что, с одной стороны, способствует лучшей сохранности ткани на ультраструктурном уровне при дальнейшей проводке срезов через органические растворители, с другой стороны, в случае пероксидазной метки, повышает электронную плотность ДАБ- продукта гистохимической реакции. После дегидратации и пропитывания срезы заливают в синтетическую среду. Только после этого становится возможным приготовление ультратонких срезов для электронно-микроскопического исследования. Основным преимуществом преимбеддинг-метода является то, что иммуномечение предшествует дегидратации, постфиксации тетраоксидом осмия и заливке толстых срезов в синтетическую среду, как правило, при повышенной температуре. Все эти процедуры и применяемые химические агенты, особенно тетраок- сид осмия, и такой физический фактор, как высокая температура полимеризации синтетической среды, приводят к резкому снижению антигенной активности. Это означает, что преимбеддинг-метод особенно целесообразно использовать при низкой концентрации тканевого антигена и его высокой чувствительности к заливке. Преимбеддинг-метод характеризуется строго определенной последовательностью принципиально важных этапов: фиксация ткани -» приготовление толстых срезов -> иммуноокрашивание -> постфиксация тетраоксида осмия -» заключение в синтетическую среду -> приготовление ультратонких срезов -> исследование в электронном микроскопе. Фиксация ткани Как и в случае световой иммуноцитохимии, значение фиксации в преимбеддинг-методе заключается, с одной стороны, в иммобилизации антигена т зИи, а с другой — в обеспечении хорошей сохранности ультраструктуры клеток. Однако «жесткая» фиксация концентрированным фиксатором в течение длитель- 159
ного периода времени приводит к плохой сохранности антигенной активности, и, наоборот, «мягкая» фиксация обеспечивает хорошую сохранность антигенной активности при плохой сохранности ткани. Возможно, отрицательное влияние фиксатора на выявление антигена заключается не в снижении самой антигенной активности, а в затруднении доступа антител к антигену. Таким образом, подбор оптимального фиксатора должен быть компромиссом. На практике в качестве фиксатора в преимбеддинг-методе используют параформальдегид или смесь параформальдегида и глутарового альдегида. Считают, что оптимальной формальде- гидной фиксации можно добиться с помощью 4 % параформальдегида, сначала фиксируя материал при рН, близком к нейтральному (рН 5,6), а затем сдвинув рН в щелочную сторону (рН 11,0). Такое комбинирование рН растворов фиксатора, по мнению А. Вагой и соавт. (1981), обеспечивает быстрое и равномерное проникновение фиксатора в ткани без видимого повреждения мембран. В современных исследованиях наиболее часто используют смешанные фиксаторы — 4 % параформальдегид и 0,05 — 0,5 % глутаровый альдегид при нейтральном рН (7,2 — 7,4). Точный состав фиксатора подбирают эмпирически с учетом конкретных антигена и антител. В некоторых случаях необходима гораздо более высокая концентрация глутарового альдегида, например для выявления допамина — 5 % раствор. Однако повышение концентрации глутарового альдегида не только оказывает негативное действие на антигенную сохранность, но и приводит к возрастанию фона. Антигенная активность после такой фиксации может быть частично восстановлена путем инкубации срезов с борогидридом натрия. В электронно-микроскопической иммуноцитохимии используют и другие фиксаторы: акролеин, перйодат-лизин-параформаль- дегид, модифицированный фиксатор Замбони, состоящий из пикриновой кислоты, параформальдегида и глутарового альдегида. Таким образом, в начале каждого исследования следует подобрать оптимальный фиксатор, контролируя иммуноцитохими- ческую реакцию на светооптическом уровне. Необходимым требованием к любому фиксатору является его быстрое и равномерное проникновение в ткани. Помимо оптимального химического состава фиксатора, этому способствует перфузия животного фиксатором, предшествующая фиксации вырезанной ткани путем иммерсии [РпезИеу ]., 1984]. Приготовление вибратомных срезов и их предварительная подготовка В большей части работ, выполненных преимбеддинг-методом, использовали вибратомные срезы, которые обеспечивают впол- 160
не удовлетворительную сохранность ткани. Изредка с этой же целью применяли замороженные срезы, однако даже при наличии криопротектора сохранность ультраструктуры клеток, как правило, была неудовлетворительной. Существенным недостатком вибратомных срезов префикси- рованной ткани, особенно в тех случаях, когда в состав фиксатора входит глутаровый альдегид или акролеин, является плохое проникновение антител и других химических ингредиентов в глубь среза, иногда не более чем на 10 мкм. С целью увеличения проницаемости ткани для антител используют детергенты, в частности тритон Х-100, что, однако, ухудшает сохранность мембран. Гораздо менее травматичным для мембран является применение другого детергента — сапонина. В ряде случаев вообще отказываются от применения детергентов, ограничивая таким образом зону и интенсивность иммуноцитохимической реакции, но обеспечивая при этом хорошую сохранность ткани. В некоторых работах использован принципиально иной подход с целью увеличения проницаемости антител. Блоки ткани, предварительно обработанные криопротектором, быстро замораживают и затем оттаивают. Предполагают, что такое воздействие приводит к возникновению микроповреждений мембран, которые, однако, остаются невидимыми в электронном микроскопе. Еще один способ увеличения проницаемости ткани для антител заключается в дегидратации и последующей регидрата- ции вибратомных срезов перед проведением иммуноцитохимической реакции. Однако в этом случае мембраны сохранены наихудшим образом. Иммуномечение При использовании ПАП-метода в электронной микроскопии им- муноцитохимические процедуры — инкубация срезов с первыми и вторыми антителами, ПАП-комплексом и выявление пероксида- зы, мало отличаются от таковых в световой микроскопии. Тем не менее в электронно-микроскопической иммуноцитохимии все этапы сокращены до минимума для обеспечения лучшей сохранности ткани на ультраструктурном уровне. С этой же целью практически исключается введение детергентов в антисыворотки и промывочные буферные растворы. Для лучшего проникновения антител и химических реагентов в ткани осуществляют постоянное перемешивание инкубационных сред. Из многочисленных хромогенов только ДАБ может быть использован в электронной микроскопии, так как продукт гистохимической реакции с другими хромогенами либо растворим в спиртах и ацетонах, либо недостаточно хорошо локализован в местах реакции. С целью более эффективной иммобилизации ДАБ-продукта т зки рекомендуют перед дегидратацией срезов постфиксировать их в глутаровом альдегиде довольно высокой концентрации — 2,5 %. 161
Постфиксация, обезвоживание и заливка После выявления антигена срезы подвергают рутинной обработке для электронно-микроскопического исследования, т.е. пост- фиксируют тетраоксидом осмия, дегидратируют в спиртах или ацетонах возрастающей концентрации, пропитывают смолой и заливают в нее. Естественно, продолжительность проводки виб- ратомных срезов значительно меньше по сравнению с длительностью проводки блоков ткани размером 1 — 2 мкм3, которые обычно используют в рутинной просвечивающей электронной микроскопии. В начале процесса дегидратации, на уровне 70 % спирта или ацетона, срезы можно дополнительно контрастировать уранилацетатом. Для лучшей ориентации в залитом материале нередко используют двухэтапный процесс плоскопараллельной заливки, что позволяет предварительно оценить реакцию на светоопти- ческом уровне и выбрать наиболее интересные участки для последующего электронно-микроскопического анализа. При приготовлении ультратонких срезов следует иметь в виду, что обычно поверхностная зона вибратомного среза (2 — 3 мкм) характеризуется интенсивной иммунной реакцией, но большими деструктивными изменениями, далее следует зона толщиной 5—10 мкм с отчетливой реакцией и удовлетворительной сохранностью ткани, наконец, в более глубоко расположенном отделе сохранность ткани идеальная, однако реакция практически отсутствует. Это означает, что средний слой является наиболее приемлемым для электронно-микроскопической имму- ноцитохимии. При интерпретации полученных микрофотографий необходимо учитывать, что во время фиксации возможна диффузия антигена, а во время электронно-микроскопической проводки — ДАБ-продукта. Практические рекомендации. Как и во всех других методах иммуногистохимии, протокол преимбеддинг-метода подбирают эмпирически для каждой ткани, каждого антигена и первых антител. В качестве примера приведен сводный протокол, использованный ]. РпезИеу (1984) и М. ^гитоу (1989) в основном для выявления нейропептидов и ключевых ферментов специфических синтезов в ЦНС у крыс с помощью ПАП-метода. В скобках указаны некоторые детали и модификации. В тех случаях, когда возможно использование принципиально разных промежуточных этапов исследования, под буквенными обозначениями приводят наиболее распространенные из них. Первый день. 1. Фиксация с помощью перфузии: крысе под наркозом проводят перфузию через левый желудочек сердца сначала ПБС, раствором Тироде или раствором Креб- са —Рингера при 37 °С в течение 2 — 5 мин (50 — 70 мл), а затем фиксатором смесью 4 % параформальдегида и 0,05 — 0,2 % глу- тарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2 — 7,4) 162
при 4 °С (200 — 300 мл). В случае поверхностного расположения в ткани интересующей области пункт 1 можно опустить. 2. Фиксация с помощью иммерсии: вырезают кусочки и до- фиксируют в том же фиксаторе, которым проводили перфузию, при 4 °С обычно в течение 2 —4 ч, а иногда до 12 ч и более. 3. Увеличение проницаемости ткани для реагентов: а) ткань помещают в ПБС, содержащий 30 % сахарозу, на 6 — 8 ч. Затем быстро замораживают блоки в жидком азоте или, лучше, в изопентане, охлажденном жидким азотом. «Оттаивают» блоки в первоначальном буфере с сахарозой и ткань переносят в фосфатный или трис-НС1-буфер. В электронно- микроскопической иммуноцитохимии предпочтение отдают трис-НС1-буферу на изотоническом растворе хлорида натрия (ТБС). Модификации «б» и «в», используемые с той же целью — обеспечить доступ реагентов к внутриклеточным антигенам, реализуют после пункта 5 (см. ниже), б) вибратомные срезы инкубируют в течение 20 мин в 0,1 % тритоне Х-100 на ПБС/ТБС при комнатной температуре; в) вибратомные срезы никак не обрабатывают с целью увеличения проницаемости ткани. 4. Приготовление толстых срезов. Чаще всего срезы толщиной 30 — 50 мкм приготавливают на вибратоме в охлажденном ПБС/ТБС. 5. Подавление эндогенной пероксидазной активности: при использовании пероксидазы в качестве маркера антител и при наличии в изучаемой ткани эндогенной пероксидазы необходимо подавить ее активность, инкубируя срезы с 0,1 % перекисью водорода в течение 20 мин при комнатной температуре борогид- ридом натрия и желатином. 6. Блокирование неспецифического связывания иммуноглобулинов: вибратомные срезы инкубируют с 10 % нормальной сывороткой животного, у которого выработаны вторые антитела (например, козы), в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее срезы отмывают в ПБС/ТБС в течение 1 ч при комнатной температуре. 7. Инкубация с первыми (специфическими) антителами. Срезы инкубируют с первой антисывороткой (например, выработанной у кролика) обычно в разведении 1:300—1:5000 на ПБС/ТБС с добавлением 1 % нормальной сыворотки животного, у которого выработаны вторые антитела, в течение ночи при 4 °С. Второй день. 1. Промывание срезов в трех сменах ПБС/ТБС с 1 % нормальной сывороткой по 15 мин в каждой. Далее инкубация срезов со второй антисывороткой (например, выработанной у козы против иммуноглобулинов кролика) в разведении 1:10—1:100 в течение 1 — 2 при комнатной температуре. 163
2. Стандартное промывание срезов (см. п. 1) и инкубация с ПАП-комплексом в разведении 1:50—1:200 в течение 1 — 1,5 ч при комнатной температуре. 3. Тщательное отмывание срезов минимум в трех сменах ПБС/ТБС по 30 мин в каждой. Выявление пероксидазной метки путем инкубации срезов в среде, содержащей 0,03 — 0,06 % ДАБ и 0,01 % перекись водорода на ТБС (рН 7,6), в течение 5—15 мин. В отличие от световой иммуноцитохимии срезы нужно проявлять до получения максимальной специфической реакции независимо от появления и нарастания фона. Это возможно потому, что даже ярко выраженный при светооп- тическом анализе фон на толстых (вибратомных) срезах практически нивелируется на ультратонких срезах из-за их небольшой толщины. Реакцию останавливают, перенося срезы в фосфатный буфер и тщательно промывая их в нем. 4. Постфиксация. После ДАБ-реакции срезы постфиксируют сначала в 2,5 % глутаровом альдегиде, а затем в 1 —2 % тетраок- сиде осмия на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2 — 7,4) по 30 — 60 мин в каждом при 4 °С. Постфиксацию глутаровым альдегидом используют крайне редко, хотя она способствует стабилизации ДАБ-продукта. 5. Дегидратация и контрастирование. Дегидратацию проводят в спиртах или ацетонах возрастающей концентрации: 50 % — две смены по 5 мин, 70 % — две смены по 5 мин, но можно оставить на более длительный срок, 80 % — две смены по 5 мин, 96 % — две смены по 10 мин, 100 % (дегидратированный силикагелем или хлоридом кальция) — три смены по 10 мин. Преимуществом ацетонов является растворимость в них эпоксидных смол, используемых для заливки. По ходу дегидратации срезы могут быть контрастированы путем их инкубации в 0,5 % уранилацетате на 70 % ацетоне в течение 2— 12 ч при 4 °С. 6. Пропитывание смолой и заливка. Срезы помещают в смесь 100 % ацетона с заливочной смолой (со всеми компонентами) сначала в соотношении 2:1, а затем 1:2 на 1 ч в каждую, а затем переносят в чистую смолу минимум на 3 ч при комнатной температуре. В случае необходимости срезы в смоле можно оставить при 4 °С на ночь. После пропитывания срезы заливают в смолу и осуществляют полимеризацию блоков. С этой целью используют два способа: а) из вибратомных срезов под контролем бинокулярной лупы вырезают небольшие участки ткани с удовлетворительной реакцией, переносят их в небольшой капле смолы на кончике препаровальной иглы на чистое предметное стекло и накрывают желатиновой капсулой, предварительно наполненной смолой. В таком виде блоки полимеризуют в термостате при 56 °С в течение 2 — 5 сут. Блоки необходимо отделить от стекол в самом термостате, пока они не охладились. Если блоки успели охла- 164
диться, то для отделения от стекол их следует слегка нагреть, например, на спиртовке; б) согласно второму способу, вибратомный срез, пропитанный смолой, переносят на предметное стекло с ограниченной каким- либо валиком ячейкой высотой 2 — 3 мм. Ячейку заливают смолой и производят ее полимеризацию. После полимеризации такой срез можно изучать в световом микроскопе и даже фотографировать. После того как под световым микроскопом найдена интересующая зона, ее аккуратно вырезают лезвием и наклеивают на верхушку эпоксидного блока смолой или цианолитным клеем. С этого участка готовят ультратонкие срезы, которые далее анализируют в электронном микроскопе [РпезИеу ]., 1984]. Модификация «а» проще, однако может быть использована в основном при интенсивной иммуноцитохимической реакции в однородной ткани, в то время как модификация «б» чрезвычайно важна при низкой антигенной активности в неоднородной ткани. 7. Приготовление ультратонких срезов. При проведении последнего этапа электронно-микроскопического иммуноцитохими- ческого исследования залогом успеха является приготовление серийных ультратонких срезов высокого качества с вибратом- ных срезов на глубине 3—10 мкм. Такие срезы можно получить при определенном навыке с помощью специального ножа с алмазной кромкой. На обычных (стеклянных) ножах довольно быстро возникают дефекты режущей кромки, в том числе под воздействием твердого ДАБ-продукта. Ультратонкие срезы дополнительно контрастируют цитратом свинца и в случае необходимости уранилацетатом. Постимбеддинг-метод В отличие от предимбеддинг-метода этот метод характеризуется иммунохимическим выявлением антигена после того, как материал залит в смолу — на ультратонких срезах. Необходимость в разработке метода была обусловлена в основном стремлением преодолеть такие недостатки преимбеддинг-метода, как неудовлетворительная фиксация ткани вследствие длительной инкубации в антисыворотках и использования детергентов, плохая проницаемость клеточных мембран для антител и высокомолекулярных маркеров. Теоретически постимбеддинг-метод лишен таких недостатков, так как в плоскости ультратонкого среза находятся пересеченные и таким образом доступные для антисывороток антигены. Что касается сохранности ткани, то до заливки осуществляют лишь ее минимальную обработку — фиксацию и дегидратацию. Более того, в постимбеддинг-методе нередко используют водорастворимые смолы, что позволяет свести дегидратацию материала к минимуму. Несмотря на теоретические преимущества постимбеддинг-метода, в практической работе возникают значительные трудности. 165
Фиксация ткани Как в любой иммуноцитохимической реакции, при использовании постимбеддинг-метода фиксация приводит к снижению антигенной активности. Особенно выраженное отрицательное влияние на нее оказывает осмиевый фиксатор, что вынуждает полностью исключить его из проводки. Это в свою очередь приводит к повышенной экстракции некоторых веществ, особенно липидов, в процессе дегидратации и заливки и, следовательно, значительному ухудшению сохранности ткани. Для того чтобы свести к минимуму экстракцию веществ в отсутствие осмия, необходимо использовать более «жесткую» альдегидную фиксацию — наиболее реактивными альдегидами в высокой концентрации в течение длительного периода времени. Так, например, фиксация 1 — 2 % глутаровым альдегидом в течение 3 — 4 ч обеспечивает гораздо лучшую сохранность, чем фиксация парафор- мальдегидом такой же концентрации. «Жесткая» фиксация также дает побочные негативные эффекты, поскольку альдегиды «сшивают» белки, делая при этом антигены малодоступными для антител. К альдегидному фиксатору рекомендуют добавлять пикриновую кислоту, которая способствует преципитации белков, обеспечивая таким образом лучшую сохранность мембран и цитозоля и практически не влияя на антигенную активность. Таким образом, для фиксации материала с высокой антигенной активностью целесообразно использовать параформаль- дегид-глутаральдегидный фиксатор, в то время как при низкой антигенной активности — смесь глутарового альдегида с пикриновой кислотой. Желательно, чтобы фиксации иммерсией предшествовала фиксация перфузией. Практические рекомендации. Обычно для фиксации ткани перфузией и /или иммерсией используют глутаровый альдегид в концентрации 0,5 — 4 %, смесь параформальдегида (2 — 4 %) с глутаровым альдегидом (0,1—2 %), смесь 1 % глутарового альдегида и 0,2 % пикриновой кислоты. Фиксаторы обычно приготавливают на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,3). Размер блоков ткани, фиксирующихся иммерсией, не должен превышать 1 — 2 мм3. Если наблюдается сжатие (сморщивание) ткани, то концентрацию буфера снижают до 0,05 М. Продолжительность фиксации колеблется от 30 мин до 4 ч [Иедутап С, ^заш В., 1984]. Дегидратация и заливка Существует большой арсенал сред, в которые можно заключать ткани для иммуноцитохимического выявления внутриклеточных антигенов на ультратонких срезах. В зависимости от заливочной среды в той или иной степени происходит дегидратация ткани. При подборе реагентов, используемых в указанных про- 166
цессах, необходимо отчетливо представлять себе их основные физико-химические характеристики и учитывать возможное влияние на сохранность ткани и антигенную активность. Дегидратирующие (спирты, ацетон) и просветляющие (ксилолы) реагенты, как и эпоксидные, и полиэстеровые смолы, очень липофильны, следствием чего является плохая сохранность мембран и клеточных органелл. Полиэстеровые и эпоксидные смолы (аралдит, эпон, спурр) практически непроницаемы для водных растворов при нейтральном рН. Это обусловливает необходимость «разрыхления» залитой ткани, для того чтобы сделать внутриклеточные антигены доступными для антител. Отчасти этого можно достичь путем обработки ультратонких срезов 10 % перекисью водорода в течение нескольких минут. Существенным недостатком использования эпоксидных смол является также то, что их полимеризация происходит в течение довольно длительного периода времени (18 — 24 ч) при высокой температуре (60 °С), что оказывает пагубное влияние на сохранность антигенной активности, особенно термолабильных антигенов (вазоактивный интестинальный пептид и др.). Эти трудности отчасти можно преодолеть, используя ультрафиолетовое излучение, в условиях которого полимеризация проходит при комнатной температуре в течение 10 — 21 сут [Уагпс1е11 Ь., Ро1а1и., 1986]. Попытки использовать вместо эпоксидных смол метакрила- ты пока не увенчались успехом, так как при этом возникли качественно иные проблемы — плохая сохранность ткани в результате нестабильной полимеризации и недостаточная устойчивость ультратонких срезов к действию электронного пучка в микроскопе. Кроме того, использование метакрилатов все же не исключает необходимости «разрыхления» ткани ультратонких срезов перед иммуноцитохимической реакцией [№\\гтап С, 1азаш В., 1984]. В последние годы появились новые заливочные среды — ак- рилы, например «ловикрил» (Ьо\У1сгу1) и ЛР-уайт (Ь.К. \УЫ1;е, ЬопсЬп Кезт Сотрапу, Вазт§з1;оке, Нап^з., II.К.), обладающие важными преимуществами по сравнению с эпоксидными и полиэстеровыми смолами. Полимеризация смолы «ловикрил» происходит при температуре 30 °С или даже ниже, что сводит к минимуму денатурацию и экстракцию белков. Эти смолы гидрофильны, что гарантирует проникновение в них водных растворов и позволяет осуществлять лишь частичную дегидратацию ткани. Практически это означает, что можно ограничиться дегидратацией в 70 % спирте и таким образом существенно улучшить сохранность антигенной активности. Растворимость липи- дов в смолах крайне незначительна, что является залогом хорошей сохранности внутриклеточных структур и особенно их мембранных компонентов даже без дополнительной фиксации тет- раоксидом осмия. Смолы, с одной стороны, не обладают специ- 167
фическим сродством к антителам, а с другой — не препятствуют их связыванию с тканевыми антигенами, поэтому перед им- муноцитохимической реакцией не требуется какой-либо дополнительной обработки, «разрыхляющей» ткани (гидролитическими ферментами и др.). Ультратонкие срезы, залитые в эти смолы, устойчивы к действию электронного пучка. При этом нет необходимости в использовании подложки, следовательно, иммуноцитохимическую реакцию можно проводить с обеих сторон среза. Практические рекомендации. 1. Дегидратация. Дегидратацию можно начинать с 70 % спирта, причем в этой среде в течение 1 — 2 ч из ткани вымываются активные пикраты и свободные альдегиды. Если эта процедура приводит к сжатию (сморщиванию) ткани, то перед применением 70 % спирта материал нужно поместить на 15 мин в 50 % спирт. Если в состав фиксатора входят только альдегиды, то перед дегидратацией материал можно отмыть в буфере/ПБС, что позволит в дальнейшем уменьшить продолжительность проводки по спиртам. При наличии в фиксаторе пикриновой кислоты материал из фиксатора переносят сразу же в спирты, как указано выше. 2. Заливка в водорастворимую смолу (ЛР-уайт). Из 70 % спирта материал переносят в первую порцию ЛР-уайта. Если эта процедура приводит к сжатию ткани, то в промежутке ее необходимо поместить в смесь 70 % спирта и смолы (1:2). После первой порции смолы материал помещают во вторую порцию и оставляют на ночь на медленно вращающейся «вертушке». Далее материал переносят на 1 ч в третью порцию смолы и после этого осуществляется его заливка. Теоретически полимеризация должна проходить в анаэробных условиях, однако при использовании неповрежденных и плотно закрывающихся, например, желатиновых капсул, в этом практически нет необходимости. Для того чтобы снизить побочные негативные эффекты — денатурацию белков, полимеризацию проводят при как можно более низкой температуре. Так, удовлетворительную полимеризацию ЛР-уайта можно получить при температуре 50 °С в течение 24 ч. Иммуномечение Для иммуномечения в постимбеддинг-методе используют в основном иммунокомплексы с пероксидазой (ПАП, АБС и др.) или тяжелыми металлами (железо, золото и др.). Как правило, иммунопероксидазные комплексы характеризуются меньшими размером и массой, что обусловливает их относительно хорошее проникновение в ткани, особенно залитые в водорастворимые смолы. Иммунопероксидазные методы обладают большей чувствительностью, но меньшей разрешающей способностью по сравнению с методами, в которых используют иммунокомплексы с 168
тяжелыми металлами. В свою очередь высокая чувствительность пероксидазного метода позволяет использовать первые антитела в большом разведении, обычно в диапазоне от 1:100 до 1:100 000. При выявлении пероксидазы электронную плотность ДАБ-продукта реакции можно увеличить не путем осмирования материала, а с помощью 0,1 % хлорида золота, который обладает большей электронной плотностью при менее выраженном фоне. Иммунопероксидазные методы. В постимбед- динг-методе широко применяют иммунопероксидазные ПАП- и АБС-комплексы, подробно описанные выше. «И ммунозолотые» методы. Широкое применение в электронно-микроскопической иммуноцитохимии нашли методы, основанные на использовании в качестве метки частиц коллоидного золота строго определенного размера в комплексе со стабилизирующими белками-«носителями» (белок А или иммуноглобулины). Разработаны точные количественные и качественные [Ое Мау ]., 1986] реакции определения минимального количества белка, необходимого для стабилизации в растворе коллоидного золота, по существу эквивалентного количеству белка, которое может связаться с определенным количеством коллоидного золота. «Иммунозолотые» методы обладают более высокой разрешающей способностью, но меньшей чувствительностью по сравнению с иммунопероксидазными. Кроме того, в отличие от им- мунопероксидазных методов мечение коллоидным золотом используют в основном в электронной микроскопии. Существует несколько модификаций этого метода [УагпйеП Ь., Ро1ак ]., 1984]. 1. Прямое иммуномечение. В этой реакции, чувствительность которой невелика, используют первые антитела, меченные коллоидным золотом. 2. Непрямое иммуномечение. Антиген, высокоочищенный или синтетический, связывается с частицами коллоидного золота. Срез обрабатывают антителами, выработанными против антигена, а затем комплексом антиген — коллоидное золото. Поскольку антитела бивалентны, они образуют связь, с одной стороны, с тканевым антигеном, а с другой — с выделенным или синтезированным антигеном, меченным золотом. 3. Непрямое иммуномечение с помощью комплекса белок А — коллоидное золото. Метод основан на чрезвычайно высоком сродстве белка А, выделяемого из 51арЬу1ососсиз аигеиз, к иммуноглобулинам большинства видов млекопитающих. Таким образом, для выявления первых антител, связанных на срезе с антигеном, используют белок А, меченный частицами коллоидного золота разного размера. Недостатком метода является то, что нельзя использовать иммуноглобулины, блокирующие места неспецифического связывания. 169
Практические рекомендации. 1. Непрямое иммуномечение на срезах ткани, залитой в смолу [УагпёеП Ь., Ро1ак ]., 1984]: а) приготавливают ультратонкие срезы, серебристые или серебристо-серые в отраженном свете, монтируют их на никелевые или золотые сеточки с подложкой или без нее и высушивают при 20 — 35 °С в течение 2 — 24 ч; б) в случае необходимости «разрыхляют» поверхность среза, помещая сеточки срезами вниз на каплю одного из окисляющих растворов: 10 % перекиси водорода на 10 мин, 1 % йодноватой кислоты на 1 мин, 1 % метоксид натрия в абсолютном этаноле на 10 — 30 мин. После этого срезы необходимо хорошо промыть сначала в соответствующем растворителе, а затем в ПБС или ТБС при рН 7,2 — 7,6; в) блокируют реактивные альдегидные группы (-СНО), которые образуются в процессе фиксации и «разрыхления» срезов. С этой целью сеточки помещают на/в раствор, блокирующий эти связи, на 10 — 60 мин при комнатной температуре. В качестве такого раствора обычно используют: 0,1 М трис-глицино- вый буфер (рН 7,2), свежеприготовленный 1 % борогидрид натрия, 1 — 10 % сывороточный альбумин, яичный белок или неиммунную сыворотку того же вида животного, у которого получена вторая антисыворотка. Следует помнить, что для блокирования неспецифического связывания нельзя использовать глобулины, так как они активно реагируют с белком А. После этой процедуры сеточки аккуратно промокают фильтровальной бумагой, но не высушивают; г) срезы инкубируют с первой антисывороткой на ТБС (рН 7,2), в которую добавляют 0,1 % сывороточный альбумин быка (очищенный от глобулинов) и 0,01 % азид натрия. Разведение антисыворотки, продолжительность инкубации и температуру подбирают эмпирически; д) тщательно промывают в ТБС/ПБС; е) инкубируют с белком А, связанным с коллоидным золотом. Оптимальное разведение, время и температуру подбирают эмпирически; ж) промывают в ТБС/ПБС; з) промывают в дистиллированной воде; и) в случае необходимости срезы дополнительно контрастируют [Уагпс1е11 Ь., Ро1ак ]., 1984]. 2. Непрямое иммуномечение на замороженных ультратонких срезах [5Ы; ]., Сеиге Н., 1984]. Для иммуноцитохимической реакции используют замороженные срезы ткани, предварительно фиксированной глутаровым альдегидом и/или параформальде- гидом и обработанной криопротектором (2,3 М сахароза). Эти срезы монтируют на напыленные углеродом сеточки и далее в процессе иммуноцитохимической реакции помещают их на каплю соответствующего раствора при комнатной температуре: а) 2 % желатин на ПБС — 10 мин; 170
б) 0,02 М глицин на ПБС — 10 мин. Вместо глицина может быть использован 1 % борогидрат на ПБС; в) специфические иммуноглобулины, желательно высоко- очищенные, в концентрации примерно 25 мкг/мл (для инкубации достаточно 1 капли объемом 4 мкл) — 30 мин; г) ПБС — 4 смены по 1 мин в каждой; д) комплексы белок А или иммуноглобулины —золото, разведенные непосредственно перед инкубацией ПБС и содержащие 1 % сывороточный альбумин быка (для инкубации достаточна капля объемом 5 мкл) — 30 мин; е) ПБС — 4 смены по 5 мин; ж) дистиллированная вода — 3 смены по нескольку секунд в каждой; з) 2 % уранилацетат на 0,15 % щавелевой кислоты, доведенной до рН 7,5 % МН4ОН, - 10 мин; и) дистиллированная вода — 3 смены по нескольку секунд в каждой; к) 2 —4 % уранилацетат — 10 мин; л) дистиллированная вода — 1 с; м) водный раствор 1,5 % метилцеллюлозы (Ту1озе МН 300 или Ме1Ьосе1 МС 400,сР, фирма «Р1ика» Швейцария); н) сеточку удаляют из метилцеллюлозы, аккуратно промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе. Двойное мечение Преимбеддинг-метод Первоначально для двойного иммуномечения использовали сочетание антител, меченных радиоактивно и пероксидазой. При этом пероксидазу выявляли на вибратомных срезах до их дегидратации и заливки в смолу, в то время как радиоактивную метку определяли радиоавтографически — на ультратонких срезах, покрытых жидкой эмульсией фирмы «Шогй Ь4» (Франция) или «Койак» (США). В последнее время наиболее распространено двойное иммуномечение по методу, предложенному 2з. Ыроз^з и соавт. (1983), или по более поздней и более чувствительной модификации этого метода [и^штоу М. еЬ а1., 1989]. В обоих вариантах используют первые немеченые антитела к двум различным антигенам, выработанные у одного и того же животного, обычно у кролика. Первые антитела выявляют ПАП- или АБС-методами. Продукт ДАБ-реакции, соответствующий локализации первого антигена, интенсифицируют серебром и золотом, что и дает возможность отличить его от неин- тенсифицированного ДАБ-продукта, соответствующего локализации второго антигена. Практические рекомендации. Модифицированный протокол оригинального метода [11§гитоу М. е! а1., 1989]. 171
1. Фиксация, срезы: а) перфузия крысы под наркозом сначала ПБС (раствором Тироде, изотоническим раствором хлорида натрия и др.) в течение 2 — 3 мин при комнатной температуре, а затем охлажденным модифицированным фиксатором Замбони (4 % параформальде- гид, 0,1 % глутаровый альдегид, 0,05 % пикриновая кислота на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,3). В случае поверхностного расположения интересующих участков ткани перфузию можно не проводить и начать с «б»; б) фиксация вырезанного кусочка ткани иммерсией модифицированным фиксатором Замбони в течение 3,5 — 6 ч при 4 °С и отмывание в ПБС в течение 2 ч; в) приготовление вибратомных срезов толщиной 40 — 50 мкм. 2. Начало выявления первого антигена: г) инкубация срезов с 0,1 % перекисью водорода на ПБС в течение 20 мин при комнатной температуре и тщательное промывание в 2 — 3 сменах ПБС в общей сложности в течение 1,5 ч; д) инкубация срезов с 0,1 % тритоном Х-100 на ПБС в течение 30 мин при комнатной температуре; е) инкубация с первыми антителами (кролика) против первого антигена (например, люлиберина) в разведении 1:2000 в ПБС с 1 % нормальной сывороткой козы или экстрактами печени и отмывание в 3 сменах ПБС по 15 мин в каждой; ж) инкубация с биотинилированными вторыми антителами (козы против иммуноглобулинов кролика) в ПБС в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Приготовление: одну каплю компонента «В» (Уес^азЪет АВС КИз Уес1;ог ЬаЬога1огу, ВигП- §ате, СА) растворяют в 1 мл ПБС. Отмывание в 3 сменах ПБС по 15 мин в каждой; з) инкубация с авидин-биотин-пероксидазным комплексом в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Приготовление: одну каплю компонента «АВС» (Уес*;а51ет АВС Ккз Уес<:ог ЬаЬога- *;огу, ВигП§ате, СА) растворяют в 1 мл ПБС. Отмывание в 3 сменах ПБС по 30 мин в каждой; и) инкубация в 0,03 % ДАБ и 0,01 % перекиси водорода на трис-НС1-буфере в течение 5—15 мин при комнатной температуре и тщательное отмывание в четырех сменах ПБС по 30 мин в каждой. 3. Начало выявления второго антигена: к) инкубация с первыми антителами (кролика) против второго антигена (например, тирозингидроксилазы) в разведении 1:2000 в ПБС с 1 % нормальной сывороткой козы или экстрактами печени в течение 38 ч при 4 °С и промывание в 3 сменах ПБС по 15 мин в каждой; л) инкубация с биотинилированными вторыми антителами (козы против иммуноглобулинов кролика) в течение 12 ч при комнатной температуре и промывание в 3 сменах ПБС по 15 мин в каждой. 172
4. Окончательное выявление первого антигена (интенсификация ДАБ-продукта): м) инкубация в водном 10 % растворе тиогликолевой кислоты («Пика», Швейцария) в течение 1 ч при 4 °С и отмывание срезов в 2 % ацетате натрия в течение 2 ч; н) проявление срезов в физическом проявителе под контролем светового микроскопа или бинокулярной лупы в течение 5—15 мин; о) остановка проявления в водном 1 % растворе уксусной кислоты в течение 5 мин и промывание в 2 % ацетате натрия в течение 10 мин; п) инкубация в водном 0,05 % растворе золотохлористоводо- родной кислоты в течение 10 мин при 4 °С и промывание в 2 % ацетате натрия в течение 10 мин; р) инкубация в водном 3 % растворе тиосульфата натрия в течение 10 мин при комнатной температуре и промывание ПБС в течение такого же времени. 5. Окончательное выявление второго антигена: с) инкубация с авидин-биотин-пероксидазным комплексом в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Приготовление: одну каплю компонента «АВС» (Уес1аз1:ет АВС КИз Уес^ог ЬаЬога- 1огу, ВигП^ате, СА) растворяют в 1 мл ПБС. Промывание в 3 сменах ПБС по 30 мин в каждой; т) инкубация в 0,03 % ДАБ и 0,01 % перекиси водорода на трис-НС1-буфере в течение 5 — 15 мин при 32 °С в течение 10 — 20 мин и тщательное отмывание в четырех сменах ПБС по 30 мин в каждой. 6. Постфиксация, дегидратация, заливка: у) постфиксация сначала в 2,5 % глутаровом альдегиде, а затем в 1 — 2 % тетраоксиде осмия на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2 — 7,4) при 4 °С по 30 — 60 мин в каждом. Остальные этапы (постфиксация, контрастирование урани - лацетатом в блоках, дегидратация, заливка и приготовление ультратонких срезов для электронно-микроскопического анализа) описаны выше. Постимбеддинг-метод Существует несколько вариантов двойного мечения на электронно-микроскопическом уровне с использованием этого метода. 1. Выявление двух антигенов на соседних срезах. Этот метод позволяет определить два антигена в субклеточных структурах, больших или соизмеримых по размеру с толщиной ультратонких срезов. 2. Выявление двух антигенов на противоположных сторонах среза. Как показали специальные исследования, иммуномече- ние осуществляется только в самом поверхностном слое ультра- 173
тонкого среза, т.е. полностью исключается перекрест реакций антител, выявляющих антиген на противоположных сторонах одного и того же среза. Для двойного мечения ультратонкие срезы монтируют на сеточку без подложки. В качестве метки используют белок А в комплексе с частицами коллоидного золота различного размера, например 4 и 12 нм. Для выявления первого антигена сеточку помещают на каплю первой антисыворотки. При этом с ней соприкасается только одна поверхность срезов. Таким же образом осуществляется последующее связывание первыми антителами комплекса белок А — частицы золота строго определенного размера (например, 4 нм). Далее выявляют второй антиген, но при этом меняют поверхность сеточки (среза), которая соприкасается с антисывороткой, и используют белок А, меченный частицами золота другого размера — 12 нм. «Прилипание» ультратонких срезов к сеточке можно улучшить путем предварительной обработки сеточек 20 % уксусной кислотой в течение нескольких секунд, после чего сеточки промывают 90 % спиртом и дистиллированной водой. 3. Выявление двух антигенов на одной и той же поверхности среза [УагпйеП Ь., Ро1ак ]., 1984]. Этот метод предполагает последовательное выявление двух антигенов на одной и той же поверхности ультратонкого среза с использованием первых антител, а в качестве маркера — комплекса белка А с частицами золота различного размера. Необходимым условием метода является то, что после выявления первого антигена с помощью первых антител и комплекса белок А —частицы золота определенного размера срезы инкубируют с избыточной концентрацией первых антител против второго антигена. Последние, с одной стороны, связываются со вторым антигеном на срезе, а с другой — блокируют свободные связи белка А с иммуноглобулинами. Возможной причиной перекрестной реакции, однако, можс! быть то обстоятельство, что первые антитела против второго антигена, связанные с белком А первого антигена, могут также связываться с комплексом белок А — золото, используемое для мечения второго антигена. Практические рекомендации. 1. Фиксация, проводка, заливка, срезы а) фиксация кусочков ткани иммерсией в смеси 1 % парафор- мальдегида и 2,5 % глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 2 ч при 4 °С; б) отмывание материала в фосфатном буфере с 0,1 % сахарозой в течение 30 — 60 мин и постфиксация 1 % тетраоксидом осмия на фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 1 ч при 4 °С. На этом этапе можно ограничиться промыванием материала в буфере; в) дегидратация и заливка материала в аралдит, эпон или спурр. Полимеризацию проводят при комнатной температуре в 174
условиях постоянного ультрафиолетового освещения в течение 10 — 21 дня. Возможна также заливка в акриловые смолы; г) нанесение ультратонких срезов ткани, не обработанной тетраоксидом осмия, на никелевые или золотые сеточки с 300 ячейками и высушивание на воздухе в течение ночи. Все последующие инкубации проводят в ячейках специальных пластин объемом 15 — 20 мкл. 2. Иммуномечение: д) обработка срезов 10 % перекисью водорода в течение 10 мин при комнатной температуре и промывание в дистиллированной воде; е) инкубация в 3,3 % нормальной сыворотке козы в течение 30 мин при комнатной температуре и подсушивание срезов фильтровальной бумагой; ж) инкубация с двумя первыми антисыворотками, выработанными у разных животных (например, кролика и морской свинки) в течение 1 ч при комнатной температуре. Антисыворотки в оптимальной для них концентрации разводят в ПБС, содержащем 0,1 % сывороточный альбумин быка («51§та», V фракция, очищенная от глобулинов) и 0,01 % азид натрия; з) последовательное промывание срезов в 50 мМ трис-НС1- буфере (рН 7,2) — три смены по 15 мин, в 50 мМ трис-НС1-бу- фере, содержащем 0,2 % сывороточный альбумин быка,— три смены по 15 мин; в трис-НС1-буфере (рН 8,2), содержащем 1 % сывороточный альбумин быка,— 5 мин; и) инкубация в смеси двух вторых антител (козы против иммуноглобулинов морской свинки и кролика), меченных коллоидным золотом с частицами размером соответственно 20 и 10 или 40 нм. Коллоидное золото перед использованием разводят трис-НС1-буфером (рН 8,2) с 1 % сывороточным альбумином быка и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин с целью удаления микроагрегатов коллоидного золота; к) последовательное промывание трис-НС1-6уфером с 0,2 % сывороточным альбумином быка, чистым трис-НС1-буфером и, наконец, дистиллированной водой (в трех сменах каждого раствора по 15 мин); л) высушивание срезов фильтровальной бумагой и дополнительное контрастирование тяжелыми металлами. 2. Контроли специфичности иммунной реакции: а) вместо инкубации с первыми антителами проводят инкубацию с нормальной неиммунной сывороткой кролика и/или морской свинки; б) инкубация с первыми антисыворотками, преабсорбиро- ванными с соответствующими антигенами, их молекулярными Фрагментами или гомологичными молекулами; в) исключение одной или обеих первых антисывороток из проводки; г) дополнительное мономечение антигена на соседнем срезе. 175
Комбинированные методы Двойное мечение можно получить с помощью комбинации пре- и постимбеддинг-метода, а также сочетания иммуноцитохимиче- ских и других методов — гистохимических, радиоавтографических и т.д. Сочетание пре- и постимбеддин г-м е т о д о в. Первый антиген выявляют преимбеддинг-методом — на вибра- томных срезах, обычно с использованием пероксидазы в качестве маркера. После этого вибратомные срезы обрабатывают по протоколу постимбеддинг-метода и второй антиген выявляют на ультратонких срезах, обычно с помощью комплекса белок А — коллоидное золото. Этот вариант двойного иммуномечения особенно показан в том случае, когда первый антиген, например некоторые ферменты синтеза катехоламинов, невозможно выявить постимбеддинг-методом, так как их антигенная активность резко снижается в процессе постфиксации и заливки в смолу. ПРИЛОЖЕНИЕ Растворы для выявления пероксидазы хрена и интенсификации ДАБ-продукта 3,3-Диаминобензидинтетрагидрохлорид (ДАБ). В состав инкубационной среды входят: 0,01—0,06 % 3,3-диаминобензи- динтетрагидрохлорид и 0,01 — 0,03 % перекись водорода на 0,05 М трис-НС1-буфере (рН 7,6) или ПБС (рН 7,2). Приготовление: а) в 100 мл 0,05 М трис-НС1-6уфера или ПБС растворяют 10 — 60 мг ДАБ и полученный раствор фильтруют. Этот раствор можно разлить на аликвоты, например по 10 мл, и хранить в течение длительного периода времени в темноте при -20 °С; б) перед применением к 10 мл ДАБ-раствора добавляют 33 — 100 мкл 3 % перекиси водорода. Наибольшей растворимостью обладает ДАБ производства фирмы «§1§та» (Германия). После добавления перекиси водорода среда сохраняет стабильность в течение 45 мин. З-амино-9-этилкарбазол 0,4 %. Маточный раствор (стабильный при комнатной температуре): 0,4 % З-амино-9-этилкар- базол в диметилформамиде. Инкубационная среда: 0,5 мл маточного раствора + 9,5 М ацетатного буфера (рН 5,0) + 0,15 мл 3 % перекиси водорода, раствор профильтровать. 4-хлор-1 -нафтол: а) растворяют 3 мг 4-хлор-1-нафтола в 0,1 мл абсолютного спирта; 176
б) раствор «а» прилить к 10 мл 0,05 М трис-НС1-6уфера (рН 7,6) при постоянном помешивании; в) добавить в раствор «6» 0,1 мл перекиси водорода; г) профильтровать, удалив при этом белый осадок. п-Фенилендиаминдигидрохлорид/пирокатехол («Нап- кег —Уа1ез», Германия): а) смешивают 5 мг п-фенилендиаминдигидрохлорида с 10 мг пирокатехола; б) полученную смесь растворяют в 10 мл 0,05 М трис-НС1- буфера (рН 7,6); в) к раствору «а» добавляют 1 мл 3 % перекиси водорода. Среда для выявления пероксидазы с использованием п-кре- зола: а) 100 мл 0,1 М цитратно-ацетатного буфера (рН 5,1) нагревают до 40 — 50 °С; б) при постоянном помешивании в растворе «а» растворяют 10 мг ДАБ и 75 мкл п-крезола («Мегск», Германия); в) раствор «6» фильтруют и охлаждают до комнатной температуры; г) перед использованием добавляют 8 мкл 30 % перекиси водорода. Раствор никеля-аммония сульфата гексагидрата 2,5 %: а) 18 мг ДАБ растворяют в 25 мл 0,1 М ацетатного буфера (рН 6,0) и фильтруют; б) 1,25 г никеля-аммония сульфата гексагидрата растворяют в 25 мл 0,1 М ацетатного буфера СрН 6,0) и фильтруют; в) сливают растворы «а» и «б», добавляют 50 мкл 9 % перекиси водорода. Физический проявитель для интенсификации ДАБ-продукта серебром и золотом [Ырозйз 2з. еЬ а1., 1984]. Проявитель состоит из двух маточных растворов — А и Б. Раствор А — 5 % карбонат натрия в дистиллированной воде. Для приготовления 100 мл раствора Б необходимо в 100 мл дистиллированной воды последовательно и тщательно растворить 200 мг нитрата аммония, 200 мг нитрата серебра, 1 г кремниевовольфрамовой кислоты и 0,35—0,5 мл 35 % формальдегида. Для получения готового проявителя растворы «А» и «Б» смешивают в пропорции 1:1 непосредственно перед использованием. При этом раствор А медленно вливают в раствор «Б» при постоянном помешивании. Для успешного приготовления проявителя необходимо использовать тщательно вымытую посуду, деионизированную воду и светонепроницаемые колбочки для приготовления и хранения растворов А и особенно Б. Сразу после приготовления проявителя необходимо убедиться с помощью бинокулярной лупы, что в нем не происходит преципитация серебра. 177
АБС-комплекс [Содд1 С. е* а1., 1986] За 30 мин до инкубации смешивают 1,3 мл раствора авидина (концентрация 1 мг/мл) с 1 мл биотинилированной пероксида- зы (концентрация 33 мг/мл). Полученный раствор разводят ПБС в пропорции 1:20. Интенсификация коллоидного золота, связанного с авидином и серебром Растворяют 850 мг гидрохинона в 85 мл цитратного буфера (рН 3,5 — 3,9) и НО мг лактата серебра в 15 мл дистиллированной воды, после чего смешивают оба раствора. Раствор готовят непосредственно перед инкубацией.
ГЛАВА 8 ПОЛЯРИЗАЦИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ Поляризационная микроскопия — один из высокоэффективных методов морфологического исследования, обладающий широкими возможностями идентификации биологических структур, что в сочетании с доступностью и относительной простотой обусловливает его высокую ценность. Метод позволяет познавать не только тонкости гистологического строения объекта, но и некоторые его гистохимические параметры, а в некоторых аспектах — и ультраструктурные особенности. Недаром в 40 —50-х годах XX в. поляризационную микроскопию относили к ультраструктурным методам. Поляризационная микроскопия предназначена для изучения свойств гистологических структур, обладающих способностью двоякого лучепреломления (анизотропия) — раздвоения светового луча при прохождении его через анизотропную среду. Световая волна в анизотропной среде распадается на две волны с взаимно перпендикулярными плоскостями колебаний электромагнитных волн. Эти плоскости называются плоскостями поляризации. Поляризованный свет отличается от обычного (неполяризо- ванного) тем, что в последнем колебания световых волн происходят в различных плоскостях, а в поляризованном свете — лишь в определенной плоскости. Для создания эффекта поляризации в поляризационном микроскопе имеются два поляризационных фильтра, один из которых, помещаемый между источником освещения и гистологическим объектом, называется поляризатором, а другой, находящийся между гистологическим объектом и глазом исследователя,— анализатором. И поляризатор, и анализатор в оптическом отношении представляют собой совершенно одинаковые поляризационные фильтры, поэтому их можно менять местами. Ранее для поляризационной микроскопии применяли изготавливаемые из исландского шпата призмы Николя, Аренса или Томсона. У этих призм ограничен угол преломления света. В настоящее время вместо них используют плоские поляризационные фильтры, продуцирующие широкопольный поляризованный свет. В создании поляризованного света определяющую роль играет взаимное расположение поляризатора и анализатора относительно оптической оси микроскопа. Если они ориентированы 179
Рис. 1. Расположение поляризационных фильтров в поляризационном микроскопе. а — совпадение плоскостей поляризации поляризатора и анализатора (светлое поле зрения); б — перпендикулярное расположение плоскостей поляризации поляризатора и анализатора (темное поле зрения). ПП — плоскость поляризации поляризатора, АА — плоскость поляризации анализатора. ОО — оптическая ось микроскопа. таким образом, что тот и другой пропускают поляризованный свет в одной и той же плоскости, т.е. при совпадении их плоскостей поляризации, оба поляризационных фильтра способны пропускать поляризованный свет; поле зрения микроскопа при этом светлое (рис. 1,а). Если же плоскости поляризации поляризационных фильтров взаимно перпендикулярны (этого достигают путем поворота анализатора на 90° вокруг оптической оси микроскопа), то поляризованный свет не проходит и исследователь видит темное поле зрения (рис. 1,6). При повороте поляризатора на 360° в процессе его вращения поле зрения дважды полностью затемнено и дважды полностью просветлено. В прошлом применяли фильтры Бернауэра, при использовании которых затемненное поле зрения имеет красноватый оттенок. При применении черных зеркальных фильтров затемненное поле зрения выглядит не полностью темным, а слабо подсвеченным . В тех случаях, когда при скрещенном положении поляризационных фильтров (т.е. в темном поле зрения) на пути поляризованного света встречаются анизотропные субстанции, содержащиеся, например, в гистологическом препарате, эти субстанции, точно так же, как и поляризационные фильтры, расщепляют поляризованный свет на два луча с взаимно перпендикулярными плоскостями колебаний световых волн. Световые лучи с плоскостью колебаний, совпадающей с плоскостью поляризации, проходят через анализатор, а с перпендикулярной — абсорбируются, вследствие чего интенсивность светового потока, попадающего в глаз исследователя, составляет лишь половину 180
интенсивности исходного светового пучка. В результате описанных процессов анизотропные субстанции, находящиеся между двумя скрещенными поляризаторами, видны на темном фоне в виде светлых светящихся объектов. При этом изотропные структуры, не обладающие способностью двоякого лучепреломления, остаются темными. В биологических тканях имеется достаточное количество структур, дающих эффект двоякого лучепреломления,— это элементы сократительного аппарата мышц, коллагеновые образования, некоторые липиды, ряд кристаллов и др. Расщепленные в анизотропном объекте и проходящие через анализатор световые лучи характеризуются неодинаковой скоростью распространения волн. В зависимости от величины этой разницы (ее еще называют величиной задержки светового луча) и от различий абсорбции света в анализаторе свечение анизотропных объектов может быть белым или цветным. В последнем случае речь идет о феномене дихроизма (двойная абсорбция). Цветовые эффекты при исследовании в поле поляризации дают, например, многие кристаллы. Процесс двоякого лучепреломления может быть значительно усилен путем применения определенных красителей, молекулы которых обладают способностью ориентированно откладываться на анизотропных структурах. Гистохимические реакции, в результате которых возникает эффект анизотропии, были названы О. КотЬапу1 топооптическими реакциями. Различают две разновидности таких реакций — аддитивные и инверсивные. При аддитивных реакциях задержка светового луча увеличивается, что называют положительной анизотропией, при инверсивных реакциях она уменьшается — отрицательная анизотропия. АППАРАТУРА И ОБОРУДОВАНИЕ Поляризационную микроскопию проводят с помощью специальных поляризационных микроскопов. В качестве примера можно назвать отечественные микроскопы МП-1, МП-2, МПД-1. Большинство современных световых микроскопов оснащено приспособлениями, позволяющими проводить поляризационную микроскопию. Для поляризационной микроскопии можно приспособить любой световой микроскоп. Достаточно иметь два поляризационных фильтра, один из которых, выполняющий функцию поляризатора, помещают между источником света и препаратом, а другой, играющий роль анализатора,— между препаратом и глазом исследователя. Поляризатор обычно вставляют под конденсор микроскопа в оправу светофильтра, а анализатор — в окуляр. В бинокулярных микроскопах анализатор размещают над объективом. При использовании монокулярных и биноку- 181
11 10- 4 Рис. 2. Поляризационный микроскоп (схема). I — источник света; 2 — зеркало; 3 — поляризатор; 4 — конденсор; 5 — предметный столик; 6 — гистологический препарат; 7 — объектив; 8 — тубус; 9 — компенсатор; 10 — анализатор; II — окуляр. ^ ] лярных микроскопов с наклонным тубусом следует иметь в виду, что поляризующие свойства поляризатора могут нейтрализоваться эффектом отражения в призме. Для того чтобы устранить этот побочный эффект, нужно повернуть поляризатор в условиях затемненного поля зрения таким образом, чтобы красноватый оттенок поля зрения сменился зеленоватым. В этой позиции достигается максимальное гашение отраженного света. Влияние призмы можно полностью устранить, если разместить анализатор непосредственно над объективом под призмой. На рис. 2 представлена принципиальная схема поляризационного микроскопа. Помимо общих для всех световых микроскопов компонентов, в поляризационном микроскопе имеется два поляризационных фильтра (поляризатор, размещаемый обычно под конденсором, и анализатор, находящийся в окуляре), а также компенсатор. Один из поляризационных фильтров должен обязательно вращаться, причем для определения степени вращения необходима соответствующая градуированная шкала. В поляризационном микроскопе используется источник освещения, обеспечивающий высокую плотность светового пучка. В качестве такого источника рекомендуют применять лампу мощностью 100 Вт при напряжении 12 В. Для некоторых видов исследования требуется монохроматический свет. С этой целью используют металлический интерференционный фильтр, который лучше поместить над зеркалом [ЗсЬеипег С, Ни^зсЬепге- Нет ]., 1972]. Рассеивающее свет матовое стекло помещают перед поляризатором, т.е. между ним и источником освещения, но ни в коем случае не после поляризатора, так как при этом нарушается функция поляризационного фильтра. В поляризационном микроскопе используют только ахроматические, а не апохроматические объективы и не флюоритные 182
стекла. Апохроматические объективы можно применять лишь в тех случаях, когда требуется нормальная цветопередача при микрофотографировании [АрреИ; Н., 1955]. Поляризационные микроскопы оснащены вращающимся предметным столиком, положение которого относительно оптической оси можно менять. Угол поворота столика измеряют с помощью градусной шкалы, нанесенной по его окружности. Одним из обязательных условий, обеспечивающих эффективное применение поляризационной микроскопии, является тщательная центровка вращающегося предметного столика с помощью центровочных винтов. Важным элементом поляризационного микроскопа является компенсатор, помещаемый между объективом и анализатором, обычно в тубусе микроскопа. Компенсатор представляет собой пластинку, изготавливаемую из особых сортов гипса, кварца или слюды. Он позволяет измерять разницу хода расщепленных световых лучей, выражающуюся в нанометрах. Функционирование компенсатора обеспечивается его способностью изменять разницу хода световых лучей, низводя ее до нуля либо увеличивая до максимума. Это достигается вращением компенсатора вокруг оптической оси. Микрофотосъемка препаратов при поляризационной микроскопии имеет некоторые особенности. В качестве негатив