Text
                    ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ

Immimologische Arbeitsmethoden Herausgegeben von Prof. Dr. sc. med. Helmut Friemel Bereich Medizin der Wilhelm — Pieck — Universitat Rostock VEB GUSTAV FISCHER VERLAG JEXA 1984
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Под редакцией Г. Фримеля Перевод с немецкого кандидата биологических наук А. П. Тарасова Москва «Медицина» 1987
ББК 53.4 И53 УДК 616-078.73 Издание рекомендовано к переводу академиком Р. В. ПЕТРОВЫМ, ди- ректором Института иммунологии АМН СССР. Иммунологические методы/Под ред. Г. Фримеля, Пер. И53 с нем. А. П. Тарасова. — М.: Медицина, 1987, 472 с.: ил., [2] л. ил. В книге представлены современные методы клинической и эксперименталь- ной иммунологии. Рассмотрены принципы определения активности антител, реак- ции антиген — антитело, электрофоретическое исследование белков, культивиро- вание лимфоцитов и других клеток иммунной системы, изотопные методы и пр. Материал представлен согласно единому плану: принцип метода, методика, оцен- ка и практическое использование. Для иммунологов, иммунохимиков, микробиологов, вирусологов, врачей-ла- борантов. 4109000000—338 И 039(01)—87 120—87 ББК 53.4 ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ Монография Зав. редакцией В. С. Залевский Редактор В. А. Архипова Художественный редактор Г. А. Красильщикова Переплет художника Е. Э. Рыбниковой Технический редактор Н. М. Гаранкина Корректор Л. П. Тарарина ИБ № 4719 Сдано в набор 29.04.87. Подписано к печати 25.08.87. Формат бумаги бОХЭО'/н. Бумага тип. № 1. Гарнитура литерат. Печать высокая. Усл. печ. л. 29,75. Усл. кр.-отт. 30,5. Уч.-изд. л. 32,76. Тираж 15 000 экз. Заказ 990. Цена 2 р. 60 к. Ордена Трудового Красного Знамени издательство «Медицина». 101000, Москва, Петро- веригский пер., 6/8. Московская типография № И Союзполнграфпрома при Государственном комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли. 113105, Москва, Нагатнискан УЛ., д. 1. © VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1984 © Перевод на русский язык. Издатель- ство «Медицина», Москва, 1987
СОДЕРЖАНИЕ 1. АНТИТЕЛА.................................................... 9 1.1. Получение антисывороток от различных животных. X. Амброзиус (Н. Ambrosius)................................................. 9 1.2. Получение моноклональных антител путем слияния клеток. X. Фи- бих (Н. Fiebig)................................................20 1.3. Образование антител культурами клеток. 3. Вихнер (S. Wichner) 34 1.4. Определение аффинности антител. X. Фибих, X. Клейст (Н. Fiebig, Н. Kleist).....................................................42 1.5. Метод локального гемолиза. К- Мальберг, Э. Зигль (К. Malberg, Е. Siegl)......................................................57 2. РЕАКЦИИ АНТИГЕН — АНТИТЕЛО............................................73 2.1. Иммунодиффузия. Э. Бем (Е. Behm)..................................... 73 2.2. Иммуноэлектрофорез (микрометод). X. Фримель (Н. Friemel) 89 2.3. Электроиммунный анализ. Э. Бем (Е. Behm)..............................97 2.4. Встречный электрофорез. К- Вильмс (К. Wilms).........................103 2.5. Анализ иммунных преципитатов в гелях. X. Фримель (И. Friemel) 108 2.6. Фотометрическое определение иммунных агрегатов. X. Тишнер (Н. Tischner)....................................................115 2.7. Определение растворимых иммунных комплексов. П. Фальк (Р. Falck)..........................................................120 2.8. Иммунофлюоресценция. X. Шторц (И. Storz).............................128 2.9. Радиоиммунологический анализ. П. Фальк (Р. Falck) . . 148 2.10. Иммуиоферментный анализ. X. Фримель, Г. Хольцхайот (Н. Frie- mel, G. Holzheidt)............................................ 2.11. Титрование комплемента. М. Зейфарт (М. Seybarth) .... 171 2.12. Комплементзависимая цитотоксичность. 3. Вегенер (S. Wegener) 176 2.13. Реакция связывания комплемента тромбоцитами. 3. Леееренц (S. Leverenz)....................................................186 2.14. Реакция связывания комплемента. А. Штельцнер (A. Stelzner) 193 2.15. Антителозависимая клеточная цитотоксичность. Ю. Миллек (J. МИ- leek).........................................................205 2.16. Реакция гемагглютинации. К- Мальберг (К. Malberg) . . . 211 2.17. Агглютинация латекса. К- Вильмс (К. Wilms)................219 2.18. Реакция агглютинации лейкоцитов. 3. Вегенер (S. Wegener) . . 222 з. клетки иммунной системы.................226 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. 3.10. Разделение клеток иммунной системы. Р. Эккерт (R. Eckert) Определение клеточных маркеров методом мембранной иммуно- флюоресценции. В. Шторх, Й. Эммрих (W. Storch, J. Emmrich) Метод Е-розеток. Г. Фримель (И. Friemel)..................... Метод ЕАС-розеток. X. Крузе, Г. Эггерс (И. Kruse, G. Eggers) Метод иммунных розеток. X. Зауэр (Н. Sauer).................. Цитотоксические лимфоциты. X. А. Шульце (И. A. Schulze) Реакция бласттрансформации лимфоцитов. X. Шютт (Ch. Schutt) Смешанная культура лимфоцитов. X. Шютт (Ch. Schutt) Реакция торможения миграции лейкоцитов (капиллярный метод). X. Фримель (Н. Friemel)...................................... Реакция миграции лейкоцитов под слоем агарозы. Й. Эммрих, Ф. Фельбер (J. Emmrich, F. Felber) ........ 226 254 269 272 278 282 294 303 308 ЗП 5
3.11. Определение электрофоретической подвижности макрофагов. X. Келер (Н. Kohler)..............................................317 3.12. Реакция торможения адгезии лейкоцитов. 3. Альбрехт, Г. Пастер- нак (S. Albrecht, G. Pasternak)...................................321 3.13. Реакция торможения распластывания макрофагов. К. Дрёсслер (К. Drossier).....................................................327 3.14. Выявление хемотаксических факторов. И. Бланк (I. Blank) . . 333 3.15. Кожнореактивный фактор. Б. Фальбущ, В. Цшише (В. Fahlbusch, W. Zschiesche)....................................................338 3.16. Кожные реакции замедленного типа. В. Цшише, X. Хайнеке Н. Heinecke)......................................................342 3.17. Трансплантация кожи. Э. Зигль (Е. Siegl).......................348 3.18. Анафилактические реакции. X. Реннер, Ш. Шницлер (Н. Renner, S. Schnitzler)....................................................354 3.19. Культивирование макрофагов и моноцитов. П. Дёрфлинг (Р. Dor- fling) ...........................................................366 3.20. Выделение макрофагов из суспензии сплеиоцитов. П. Дёрфлинг, 3. Вихнер (Р. Dorfling, S. Wischner)............................373 3.21. Фагоцитоз. А. Штельцнер (A. Stelzner)..........................378 4. ИММУНОХИМИЯ.....................................................390 4.1. Получение препаратов иммуноглобулинов. И Брок (J. Brock) 390 4.2. Фрагментирование иммуноглобулинов. И. Брок (J. Brock) . . 413 4.3. Иммуносорбенты. И. Брок (J. Brock)..............................427 4.4. Приготовление конъюгированных антигенов. И. Брок (J. Brock) 432 4.5. Получение тканевых экстрактов (3 M-KCI-метод). X. Вернер (Н. Werner) ....................................................442 4.6. Выделение трансфер-фактора. И. Шрёдер (I. Schroder) . . . 451 4.7. Введение радиоактивной метки в белки. X. Шульфе (Н. A. Schulze) 457 Предметный указатель.................................................467
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ААО — аитигеи, ассоциированный с опухолями ААТ — аутоантитела АГ — антиген АЗКЦ — антителозависимая кле- точная цитотоксичность АМА — антимитохоидриальиые антитела АМС — аитимакрофагальная сы- воротка АНТ — антиген нормальной ткани АНАЭ — а-нафтилацетатэстераза АЭТ — аитигеи эмбриональной ткаии АС — антисыворотка АТ — антитело АФП — а-фетопротеии АЯФ — антиядерный фактор Б ДБ — бис-диазотированный бен- зидин БНФ — бесклеточная надосадоч- иая фракция БПК — бензилпенициллина калие- вая соль БСА — бычий сывороточный аль- бумин ВИЭФ — встречный иммуноэлект- рофорез ГА — гемагглютинация ГАТ — гипоксантин, амииопте- рин, тимидин (среда) ГГФРТ — гипоксаитингуаниифос- форибозилтраисфераза ГЗТ — гиперчувствительность за- медленного типа ГЭПЭС — N-2-гндроксиэтилпнпе- разин-Ы-2-этансульфо- иовая кислота ДМСО — додецилсульфоксид ДНФ — 2,4-динитрофеиол ДРИД — двойная радиальная им- мунодиффузия ДСН — додецилсульфат натрия ДЭЛ — диамид экстракта лейко- цитов ИД — иммунодиффузия ИК — иммунный комплекс ИЭФ — иммуноэлектрофорез КИПЭ — клетки индуцированного перитонеального экссуда- та КоиА — коикаиавалии А ЛДГ — лактатдегндрогеназа ЛПС — липополисахарид ЛРК— лимфоциты с рецептора- ми комплемента МБГСЭ — т-малеимидобеизоил-N- гидроксисукцинимидный эфир МИР — метод иммунных розеток МИФ — мембранная иммуиофлюо- ресцеицня МКАТ — моноклональные антитела НАФ — неполный адъювант Фрейида ОЛГ — обратный локальный ге- молиз ОП — оптическая плотность ПААГ — полиакриламид ПАФ — полный адъювант Фрейнда ПВХ — поливинилхлорид ПМЯЛ — полиморфно-ядерные лей- коциты ПХМБ — парахлормеркурибензоат ПЭГ — полиэтиленгликоль РАА — р-ция адгезии лейкоцитов РИА — радиоиммунологический анализ РЛЦ — реакция лимфоцитолиза РТАЛ — реакция торможения ад- гезии лейкоцитов РОК — розеткообразующие кл-ки РЭФП — реакция электрофоретиче- ской подвижности СИ —степень йодирования СКЛ — смешанная культура лей- коцитов СППТ — N-сукцинимидил-З- (2-пи- ридилтио) -пропионат СЭБ — суспензия эритроцитов барана ТГ — титр гемолизина ТК — тимидиикииаза ТНБК — 2,4,6-тринитробензол- сульфоиовая кислота ТНС — тетразолий нитросииий ТНФ — 2,4,6-тринитрофенил ТРИТЦ — тетраметилродаминизо- тиоциаиат ТХУ — трихлоруксусная кислота ТФ —трансфер-фактор ФИТЦ — флюоресцеииизотиоциаиат ФСБ — фосфатио-солевой буфер ЧГГ — гамма-глобулин человека ЧСА—сывороточный альбумин ЭБ — эритроциты барана ЭКДИ — 1-этил-1,3 (3-диметилами- нопропил) карбодиимид Ig — иммуноглобулин LIF — фактор, тормозящий миг- рацию лейкоцитов MIF — фактор, тормозящий миг- рацию макрофагов MSF — фактор, тормозящий электрофоретическую по- движность макрофагов Rz — букв, число чистоты фер- мента МЕМ — электрофоретическая по- движность макрофагов
ПРЕДИСЛОВИЕ К 3-МУ ИЗДАНИЮ Настоящее, третье, издание книги было задумано с учетом изменений, вызванных развитием иммунологии. Расположение материала книги по схеме: антитела-^реакции антиген — анти- тело-?-клетки иммунной системы-5-иммунохимия должно облег- чить ориентировку. Авторский коллектив в составе 41 ученого, согласившийся принять участие в работе, предоставил для этой цели свои знания и методологический опыт в области иммуно- логии. Редактор, авторы и издательство благодарят всех, кто прислал свои замечания и предложения по улучшению книги, которые в значительной мере были учтены. Благодаря слаженной работе всех участников вышла в свет эта книга, которая, как мы надеемся, окажется весьма полез- ной при внедрении современных иммунологических методов в лабораторную практику. Росток, июль, 1984 г. Редактор
I. АНТИТЕЛА 1.1. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТОК ОТ РАЗЛИЧНЫХ ЖИВОТНЫХ 1.1.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Для большинства иммунологических и серологических методов исследования необходимо иметь соответствующие антисыворот- ки. Антисыворотки к так называемым стандартным антигенам, например человеческому IgG, имеются в продаже, к нестандарт- ным антигенам антисыворотки приходится получать в лаборато- рии. Основные требования к таким сывороткам — специфич- ность и достаточное содержание антител (АТ). Иммунологиче- ская специфичность не абсолютна, она тесно связана со струк- турой антигена (АГ). Белки ввиду относительного многообразия составляющих их аминокислот и практически неограниченной возможности их комбинирования представляют собой природ- ные соединения с исключительно разнообразным строением. С точки зрения иммунологии это означает, что антитела к опре- деленному белковому антигену могут реагировать только с ним и родственными по структуре белками. Под последними следует понимать гомологичные протеины родственных биологических видов, а также белки, образующие одно «семейство», например гонадотропины. Все они имеют общую a-цепь, в то время как р-цепи содержат полипептидные последовательности, индивиду- альные для каждого гормона. Способность к перекрестным ре- акциям антител с антигенными детерминантами структурно близких белков находит практическое применение. Допустим, требуется получить антитела к какому-либо гормону гипофи- за человека; получение антисыворотки невозможно ввиду отсут- ствия достаточного количества человеческих гормонов. В то же время получение этих гормонов из гипофиза свиней или быков вполне осуществимо. При использовании бычьего гормона для получения антител существует высокая вероятность того, что индуцированные АТ будут давать выраженную перекрестную реакцию с аналогич- ным гормоном человека и, следовательно, окажутся пригодными для постановки специфических проб. Не следует, конечно, ожи- дать, что антитела к какому-либо определенному белку будут реагировать со структурно неродственным белком; избиратель- ность иммунологических реакций обусловлена их высокой спе- цифичностью. Углеводы, липиды и особенно нуклеиновые кис- 9
Вторичный ответ Первичный ответ 1------> 4 Время (нед} Рис. 1. Схематическое изображение хода различных процессов при первич- ном и вторичном иммунном ответе кролика иа введение белковых АГ. лоты в отличие от белков состоят из сравнительно малого числа структурных элементов, возможность комбинирования которых ограничена по сравнению с белками. Можно с большой степенью вероятности предположить, что вещества такого типа, будучи выделены из разных источников, будут обладать выраженным структурным сходством. С иммунологической точки зрения это означает, что антитела к углеводам, липидам и нуклеиновым кислотам в отличие от АТ к белкам будут активно вступать в перекрестные реакции с филогенетически неродственными анти- генами. Подобные взаимодействия отличаются низкой специ- фичностью, ограничивающей их использование в иммунологиче- ских исследованиях. Это порождает необходимость разработки дополнительных тест-систем. Для практической иммунологии можно сделать следующее заключение: антитела к белкам об- ладают высокой специфичностью, они удобны для определения антигенов; антитела к липидам, углеводам и нуклеиновым кис- лотам малоспецифичны, что приводит к не всегда желательным перекрестным реакциям (рис. 1). Для получения сывороток с высоким титром АТ необходимо учитывать и соответствующим образом использовать механизмы регуляции гуморального им- мунного ответа. Например, введение больших доз антигена может индуцировать образование супрессорных клеток, подав- ляющих выработку АТ, и, наоборот, использование феномена «иммунологической памяти» может существенно облегчить по- лучение сыворотки с высоким титром антител. Введение антиге- на приводит не только к образованию антител, но и к появле- нию «клеток памяти» — лимфоцитов со специфической реактив- ностью в отношении вызвавшего иммунную реакцию антигена. «Клетки памяти» распространяются по всему организму и оседа- ют в периферических органах лимфатической системы. Повтор- ное введение антигена приводит к заметному увеличению выра- 10
ботки антител по сравнению с первичным иммунным ответом; антитела вторичного иммунного ответа циркулируют в крови более продолжительное время (см. рис. 1). Поскольку образо- вание «клеток памяти» — процесс довольно длительный, не сле- дует выбирать слишком маленький промежуток времени между первичным и повторным введением антигена. Показано, что для мышей оптимальный промежуток времени после первого введе- ния АГ составляет 90 дней [14]. Скорость возникновения имму- нологической памяти зависит от природы антигена, принято считать что у кроликов и морских свинок она возникает не ра- нее чем через 6 нед, у крыс и мышей не ранее чем через 4 нед, у низших позвоночных не ранее чем через 3 мес. Гуморальный иммунный ответ можно усилить при помощи адъювантов, этот способ известен давно. Наиболее распространены полный адъ- ювант Фрейнда и гидроокись алюминия. В последнее время в качестве адъювантов применяли мурамилпептиды. Полный адъювант Фрейнда (ПАФ) выпускается в виде коммерческого препарата, в его состав входит минеральное масло, эмульгатор и убитые микобактерии туберкулеза. ПАФ смешивают с водным раствором антигена до получения стабильной водно-масляной эмульсии. На процесс эмульгирования следует обращать особое внимание, так как адъювантный эффект наиболее выражен у стабильных эмульсий. Гидроокись алюминия не обладает столь выраженными стимулирующими свойствами, как ПАФ, но по сравнению с последним имеет то преимущество, что при много- кратном введении не вызывает изменений в периферических лимфатических органах. Вопрос выбора адъюванта решается в каждом случае индивидуально. По-видимому, идеальные анти- сыворотки можно получать, используя гибридомную технологию (см. раздел 1.2), разработанную в лаборатории Мильстайна (Кембридж). Получают клеточные гибриды из лимфоцитов им- мунизированного животного и культивируемых in vitro миелом- ных клеток; из полученных гибридов отбирают клоны клеток, синтезирующих определенные АТ. Моноклональные антитела обладают абсолютно одинаковой специфичностью в отличие от поликлональных антител, содержащихся в обычных сыворотках, имеющих различную специфичность и дающих перекрестные ре- акции. 1.1.2. МЕТОДИКА 1.1.2.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ Несколько лет назад Р. F. Schollander на заседании физиологов сказал: «Для специалистов по медицинской энзимологии чело- век состоит из сердца и почек собаки, мышц лягушки, кишеч- ника крысы, генов дрозофилы и т. д. Для меня всегда было за- гадкой такое „антропоидное поведение'1 животных». Для 99% иммунологов и тех, кто пользуется иммунологической техникой, И
не существует других животных, пригодных для получения ан- тисывороток, кроме кроликов, морских свинок, крыс и мышей. Это тем более необъяснимо, что еще в начале XX века было известно, что сила иммунного ответа и его специфичность зави- сят от степени биологической близости животных, от которых получают антиген, и животных — продуцентов антисыворотки. Общих рецептов на этот счет не существует, но можно приве- сти примеры, показывающие, что необходимо тщательно выби- рать экспериментальных животных, не ограничиваясь приняты- ми в обычных случаях видами. В качестве иллюстрации можно привести работу van der Giessen с соавт. [6]. В ней были пред- приняты попытки получить антисыворотки к 4 классам имму- ноглобулинов человека. Иммунизации подвергались обезьяны, кролики, морские свинки, бараны, куры и одна коза; для инъ- екции использовали продукты биосинтеза соответствующих мие- лом и 3 различные адъюванта. Антисыворотки кур, козы и ба- ранов не обладали субклассовой специфичностью. По отношению к птицам, которые филогенетически далеко отстоят от человека, этого следовало ожидать. Обратная картина должна наблю- даться у обезьян, они филогенетически близки человеку, их им- мунная система должна относительно легко улавливать анти- генные различия субклассов иммуноглобулинов. И действитель- но, обезьяны представляют собой удобный источник антисыво- роток к субклассам IgGa, IgG3 и IgG4, но не IgGj. При получе- нии антисывороток к какому-либо гормону, помимо иммуно- логических, имеют значение физиологические факторы. В этом случае стараются выбирать животное, наименее чувствительное к данному гормону, поскольку гормональный фон оказывает влияние на иммунный статус организма. Так, например, птицы реагируют на введение гормонов, в том числе инсулина, не так резко как млекопитающие, в то же время они образуют антите- ла приблизительно с такой же интенсивностью. В многочислен- ных экспериментах было установлено, что животные различных инбредных линий по-разному реагируют на один и тот же анти- ген. В качестве примера, имеющего практическое значение, можно привести работу Shen с соавт. [17] о получении специ- фических антисывороток к антигенам мембран лимфоцитов. Одни линии и гибриды активно продуцировали антитела, в то время как другие не образовывали их даже в следовых количе- ствах. Низших позвоночных, например рыб, очень удобно ис- пользовать для получения антисывороток, хотя они очень удоб- ны в содержании и продуцируют большие количества антител. Рыбы особенно пригодны для работы с так называемыми «кон- сервативными антигенами», т. е. с такими, которые медленно изменялись в ходе эволюции. Медленно эволюционирующие ан- тигены млекопитающих, как правило, не вызывают иммунного ответа у млекопитающих другого вида ввиду минимальных структурных различий. В таких случаях экспериментальных жи- вотных нужно выбирать из филогенетически отдаленных клас- 12
сов позвоночных. В частности, карликовый сом продуцирует ан- тисыворотки с высоким титром АТ против групповых антигенов крови человека в ответ на введение им слюны секреторов. Рыбы оказались удобными продуцентами антител, применяемых для изучения филогенетического родства белков иммунохимически- ми методами. [7]. Следует отметить, что у низших позвоночных иммунный ответ зависит от температуры тела. Интенсивное ан- тителообразование наблюдается только при содержании живот- ных у верхней границы физиологических значений температуры. Не последнее место в выборе подопытных животных занимают экономические соображения. Для получения большого количе- ства АТ не всегда есть возможность содержать 100 кроликов или 1 лошадь. С этой точки зрения представляет интерес следу- ющее наблюдение: беременных коров можно иммунизировать без вреда для плода, после отела удается получить несколько литров молозива, в котором содержание антител в несколько раз превышает их концентрацию в сыворотке крови. Эту техно- логию использовали для получения больших количеств АТ к Н-антигену сальмонелл, ферритину, IgG кролика и человека. 1.1.2.2. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТОК К БЕЛКОВЫМ АНТИГЕНАМ Ранее было отмечено, что оптимальный способ иммунизации за- висит от природы антигена, вида подопытного животного и це- ли, которой будет служить антисыворотка. В качестве примера можно привести получение антисывороток путем иммунизации кроликов и карпов белковыми антигенами в нашей лаборато- рии. Этот метод применим и к другим моделям. Далее описыва- ется способ иммунизации, основанный на применении очень ма- лых количеств антигена. В заключение рассматривается вопрос о возможности получения моноспецифических сывороток. 1.1.2.2.1. Иммунизация кроликов белковыми антигенами Материалы и оборудование: для получения одного антигена не- обходимо 3 кролика любой породы, желательно с большими ушами для удобства отбора крови из ушных вен; 0,14—14 мг антигена на кролика; ПАФ; шприц для инъекций (2 мл) с иг- лой № 16, раствор NaCl1 (9 г/л). Проведение иммунизации: первую иммунизацию проводят с ПАФ. Каждому кролику вводят смесь 0,5 мл антигена (20— 2000 мкг) с 0,5 мл ПАФ. Для получения стабильной эмульсии смесь многократно набирают в шприц и с силой выпускают че- рез тонкую иглу. О качестве препарата судят по тому, что кап- ли эмульсии при попадании в воду не распадаются в течение получаса и более. Смесь антиген-ПАФ в количестве 1 мл вво- 1 В тех случаях, когда концентрация NaCl не указана, речь идет об изо- тоническом растворе натрия хлорида. — Примеч. пер. 13
дят внутрикожно в подушечки стоп всех четырех конечностей. Последующую иммунизацию проводят через 8 нед после первой, таким же количеством антигена в 0,5 мл 0,15 М NaCl. В первый день последующей иммунизации антиген вводят внутримышеч- но в верхнюю часть бедра, а на 2-й и 3-й дни внутривенно в ухо. Через неделю иммунизацию повторяют по той же схеме. Забор крови производят через 7—10 дней после последней им- мунизации. 1.1.2.2.2. Иммунизация карпов белковыми антигенами Материалы и оборудование: для получения одного антигена не- обходимы 5 карпов с массой тела 500—1500 г. Рыб адаптируют к температуре воды 24 °C в течение 2 нед и содержат при этой температуре весь период иммунизации. Как правило, карпы продуцируют летом больше антител, чем зимой. Необходимо иметь 1—2 мг антигена на каждую особь, ПАФ, неполный адъ- ювант Фрейнда (НАФ), шприц (2 мл) с иглой № 16, раствор NaCl (60 г/л). Проведение иммунизации: первичную иммунизацию прово- дят с ПАФ. Раствор антигена в количестве 0,25 мл (100— 1000 мкг) тщательно смешивают с ПАФ и вводят получившуюся эмульсию внутрибрюшинно. Повторную иммунизацию проводят через 2 мес. Затем 0,25 мл раствора антигена (1000—2000 мкг) смешивают с 0,25 мл НАФ и вводят внутрибрюшинно. Через 2 нед забирают кровь из сердца и анализируют сыворотку. Ес- ли количество антител недостаточно, то через 4 нед проводят третью иммунизацию с 0,5 мл раствора антигена без адъюван- та. Забор крови производят через 2 нед после последней имму- низации. 1.1.2.2.З. Метод эффективной иммунизации кроликов небольшими количествами антигена Материалы и оборудование (см. в разделе 1.1.2.2.1). В основу этого метода положена индукция локальной иммунной реакции лимфатических узлов малой дозой антигена. Образующиеся клетки памяти распределяются по всему организму, последую- щее введение соответствующего антигена стимулирует популя- цию сенсибилизированных лимфоцитов, начинающих интенсив- но синтезировать антитела. Готовят эмульсию антигена и ПАФ. Содержание антигена должно быть не менее 10 мкг/мл. Каждо- му кролику вводят около 1 мл эмульсии. Большим и указатель- ным пальцами находят подколенный лимфатический узел зад- ней ноги. Для этого необходим определенный навык, приобре- таемый при работе с животным, которому за неделю до этого вводили ПАФ под кожу верхней части бедра. Эта инъекция приводит к увеличению лимфатических узлов,, которые становятся доступными для пальпации. Однако эти жи- вотные вследствие структурных изменений лимфатических узлов' по меньшей мере в течение 2 мес непригодны для иммунизации. 14
Животных, ранее бывших в опыте, не следует иммунизировать. После того как лимфатический узел найден, его фиксируют кон- чиками пальцев. В лимфатический узел тонкой иглой вводят 0,3 мл эмульсии. При попадании материала в лимфатический узел последний вздувается под пальцами экспериментатора. Наш опыт показывает, что даже при инъецировании окружаю- щих лимфатический узел тканей наблюдается выраженный им- мунный ответ. Точно также антиген вводят в симметричный лимфатический узел. Оставшиеся 0,4 мл смеси вводят равными частями подкожно в подушечки стоп задних конечностей. Не ранее чем через 6, а лучше через 8 нед проводят повторную им- мунизацию. Для этого антиген вводят с НАФ или в растворе NaCl. Каждому кролику вводят не менее 10 мкг материала; по 0,1—0.2 мл смеси вводят подкожно в каждую конечность. Подкожные инъекции повторяют с недельным интервалом до достижения достаточного титра антител. 1.1.2.2.4. Получение моноспецифических сывороток при отсутствии полностью очищенного антигена Во многих случаях очень сложно или даже невозможно полу- чить нужный антиген в чистом виде. Существует несколько спо- собов получения моноспецифических сывороток без полной очи- стки антигена. Иммунизация белками, разделенными в полиакриламидном геле: при помощи диск-электрофореза, изоэлектрофокусирова- ния можно получить отдельные фракции антигена, свободные от примесей. Поскольку полиакриламид обладает свойствами адъюванта, можно проводить иммунизацию непосредственно ку- сочками полиакриламида, содержащими соответствующий ком- понент. Достаточно взять 1 мкг белка. В остальном иммуниза- цию проводят так же, как в случаях с небольшими количества- ми антигена. Иммунизация антигеном из зоны преципитации при иммуно- электрофорезе: этот метод существенно отличается от обычных способов очистки антигена. Подопытное животное, например кролика, иммунизируют неочищенным препаратом антигена. После получения сыворотки с высоким титром АТ проводят им- муноэлектрофорез в микромодификации на предметном стекле. Затем идентифицируют линию преципитации соответствующего антигена, для чего используют селективное окрашивание, фер- ментативные реакции или сравнение со стандартным антигеном. После идентификации иммуноэлектрофорез проводят парал- лельно на большом количестве стекол. Линию преципитации ан- тигена тщательно вырезают, избегая мест перекрещивания с другими линиями преципитации. Вырезанные фрагменты отмы- вают в течение 2 дней в растворе NaCl с многократной сменой раствора, затем в течение 1 дня дистиллированной водой с до- бавлением цитостатиков, например мертиолята. После отмывки фрагменты геля подвергают механическому измельчению 15
Рис. 2. Иммуноэлектрофореэ с применением антисыворотки к бычьему ^-глобулину. В качестве АГ использовали грубо* очищенную фракцию глобулинов (вверху) н сыворотку крупного ро- гатого скота (внизу). (скальпелем и ножница- ми) и суспендируют в 1 мл раствора NaCl. Сус- пензию эмульгируют с ПАФ. Эмульсию вводят кролику в лимфатические узлы и подушечки стоп. В отличие от других схем иммунизации повторную иммунизацию проводят через 6 нед с использованием ПАФ, а не НАФ. Эмульсию преципитат-адъювант в количестве 0,4 мл медленно вводят в вены уха, остальное количество вво- дят подкожно в конечности. Через 7 дней определяют титр сы- воротки иммунизированных животных в иммуноэлектрофорезе. При низких титрах проводят повторную иммунизацию отмытым преципитатом без адъюванта подкожно. Повторные иммуниза- ции проводят с недельным интервалом. Если же антисыворотка не обладает моноспецифичностью, прибегают к иммунизации других животных преципитатами, полученными при помощи оли- госпецифической сыворотки. До настоящего времени нам всегда удавалось получить моноспецифическую сыворотку от одного или двух животных, задействованных в эксперименте (рис. 2). Получение моноспецифической сыворотки путем адсорбции: олигоспецифическую сыворотку можно сделать моноспецифиче- ской, удалив антитела с нежелательной специфичностью с по- мощью адекватных сорбентов. Как правило, для этого исполь- зуют нерастворимые иммуносорбенты, получаемые при соедине- нии антигена с инертным носителем, например, при помощи глютарового альдегида. 1.1.2.3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТОК К НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМ ВЕЩЕСТВАМ Антитела к небольшим молекулам представляют значительный интерес в биохимических и фармакологических исследованиях, их можно также использовать в клинической диагностике. По- лучение таких антител осложнено тем, что низкомолекулярные вещества, как правило, неиммуногенны и сами по себе не инду- цируют антителообразование. Антигенные детерминанты таких веществ (участок поверхности антигена, связываемый антите- лом) состоят из небольшого числа аминокислотных или угле- водных остатков. Чтобы перевести небольшие молекулы в им- муногенное состояние, можно агрегировать их в частицы боль- 16
шего размера, или присоединить к соответствующему носителю.. Предпочтительнее пользоваться вторым способом, важное зна- чение при этом имеет правильный выбор носителя. Ниже при- водится несколько примеров, они помогают понять ход последу- ющих рассуждений. Наиболее часто в качестве носителя ис- пользуют альбумин. Так были получены антитела к витамину А. путем его присоединения к человеческому сывороточному аль- бумину (ЧСА) и последующей иммунизацией кроликов [3]. Им- мунизируя кроликов конъюгатом трийодтиронина с бычьим сы- вороточным альбумином (БСА), можно индуцировать образо- вание антител к трийодтиронину, с помощью которых можно определять до 20 пкг трийодтиронина. Перекрестная реакция с тироксином наблюдалась примерно в 0,4% случаев [8]. Значе- ние природы носителя для успеха иммунизации становится оче- видным из следующего примера: лизин-вазопрессин и парати- \ реоидный гормон конъюгировали с БСА, яичным альбумином и - ' некоторыми синтетическими полимерами аминокислот. Провер- \ ’> ка конъюгатов на 70 кроликах и морских свинках показала. полное отсутствие иммуногенности. Присоединение этих гормо- нов к тиреоглобулину позволило получить препараты, индуци- рующие образование антисывороток с высоким титром АТ у ' всех животных [18]. Антитела, получаемые при иммунизации конъюгатами на основе белка, в основном принадлежат к клас- х су IgG. Это не всегда удобно, так как для реакции связывания '' комплемента предпочтительнее использовать антитела класса IgM. Для индукции этих антител удобно использовать в качест- ве носителя бактериальные клетки [5]. Конъюгация АМФ с клетками Е. coli позволила получить кроличьи антитела к АМФ IgM и IgG. В качестве перспективных носителей предлагают использовать пневмококки, полисахаридный антиген которых относится к тимуснезависимым антигенам и индуцирует интен- сивный иммунный ответ, вероятно, путем подавления механиз- мов его регуляции. К формалинизированным клеткам пневмо- кокка штамма R36A присоединяли неиммуногенные вещества: полимер у-2-М-морфолинил-этил-Е-глутамина, лизоцим и сополи- мер глутаминовой кислоты, D-лизина и аланина. Проиммунизи- рованные этими конъюгатами кролики образовывали антитела в больших количествах: 16 мг/мл сыворотки, 15 мг/мл и 10 мг/мл- соответственно [13]. 1.1.2.4. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИСЫВОРОТОК К АНТИГЕНАМ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН Одной из сложнейших задач является получение сывороток с высоким титром АТ к мембранным компонентам различных клеток. Перекрестные реакции с аналогичными компонентами Других клеток могут сущ^^юятр’^Иекайсатъ результаты. Веро- ятно, стандартные антистайрдЯФё? ^Дчества удастся по- лучить, используя те^^гогию клеточных гйбриДов. Ввиду раз- 2—990
нообразия проблем, связанных с мембранными антигенами, мы ограничимся всего несколькими примерами для иллюстрации применяемых методов. Известно получение гетерологической кроличьей антисыворотки против Т-лимфоцитов мыши путем иммунизации препаратами мембран тимоцитов. После первых этапов адсорбции эти антитела реагировали с 95—100% клеток тимуса и 35—40% клеток селезенки в иммунофлюоресцентной пробе и в тесте на цитотоксичность. Последующей адсорбцией удалось повысить специфичность антисыворотки к мембранному антигену до такой степени, что она реагировала только с 0-по- зитивными спленоцитами. Иммунизацией кроликов препаратами эмбрионального мозга человека была получена антисыворотка, которая после соответствующей адсорбции реагировала с оп- ределенными субпопуляциями Т-лимфоцитов. Она оказалась пригодной для дифференциальной диагностики Т-клеточных лейкозов (хронические лимфоцитарные лейкемии) [2]. Оказав- шееся необычно полезным разделение Т-лимфоцитов мыши по Ly-антигену, которое впервые позволило четко разделить Т-лим- фоциты на субпопуляции по функциональным признакам, так- же основано на получении специфических антисывороток [17]. Благодаря им стало возможным выводить инбредные линии мышей с определенными иммунологическими характеристиками. «Голых» мышей принято считать В-клеточными мышами, кото- рые представляют собой идеальных доноров для получения ан- ти-В-лимфоцитарных сывороток. В частности, введением клеток из лимфатических узлов «го- лых» мышей кроликам была получена специфическая антисы- воротка против В-клеток [9]. Она с успехом применяется для анализа стадий созревания В-лимфоцитов при их превращении в антителообразующие клетки. Антисыворотка, полученная пу- тем введения субпопуляции клеток мышиной плазмоцитомы кро- ликам, после адсорбции не реагировала с клетками тимуса или с нестнмулированными спленоцитами. Она не реагировала со спленоцитами, стимулированными ФГА или Кон-А, но взаимо- действовала со спленоцитами, стимулированными липополиса- харидом (ЛПС) или со стимулированными В-лимфоцитами [16]. Все вышеприведенные примеры показывают, какое важное значение могут иметь антисыворотки при исследовании процес- сов клеточной дифференцировки и регуляции. 1.1.2.5. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ ИЗ ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ Выше была описана возможность использования молозива ко- ров в качестве высокотитражного источника антител. Введени- ем термоагрегированного у-глобулина человека совместно с ПАФ за 7, 6 и 2 нед до отела в дозе 300 мг на одну иммуниза- цию было получено молозиво с высоким титром соответствую- щих антител [4]. Можно предположить, что иммунизация мень- 18
шими дозами антигена окажется столь же эффективной. Асци- тическая жидкость мышей в качестве источника АТ использу- ется давно [ 11]. Наибольшее количество антител образуется при введении антигена вместе с асцитообразующим материалом в полость брюшины. С точки зрения выхода антител безразлич- но, был ли асцит индуцирован введением клеток асцитной кар- циномы Эрлиха или ПАФ. В среднем у одной мыши можно по- лучить 5 мл асцитической жидкости, титр антител в которой составляет 50—100% от титра сыворотки. Это относится и к антителам к ДНК в асцитической жидкости мышей [10]. Для их получения рекомендуют использовать линию DDV, поскольку животные этой линии образуют наибольшие количества асци- тической жидкости. Хорошие результаты получены при использовании клеток саркомы 180/TG для индукции асцита у мышей Charles—River. На основании имеющихся данных можно сделать следующие рекомендации: мышам (исследовано много штаммов) с недель- ным интервалом 7-кратно вводят 0,4 мл раствора антигена [0,2 мг антигена в ПАФ (1:1) внутрибрюшинно]. Через 7— 10 дней после окончания инъекций отбирают асцитическую жид- кость через полую иглу после прокалывания брюшной стенки. По меньшей мере у 80% животных отбирают по 5 мл и более асцитической жидкости. 1.1.3. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМЫХ СЫВОРОТОК Поскольку сыворотки сильно различаются по своему предна- значению, например, сыворотки для иммунофлюоресценции, ра- диоиммунологического анализа (РИА), или цитотоксических реакций к определенным популяциям клеток, то невозможно предложить универсальный тест для их оценки. Основным тре- бованием является контроль специфической сыворотки в соот- ветствующей тест-системе или в тест-системе с большей чувст- вительностью. Например, недопустимо проверять специфичность сывороток для РИА (очень чувствительная проба) посредством иммуноэлектрофореза. В этом случае следует ставить реакцию торможения в радиоиммунологическом тесте. Целесообразно распространить этот принцип на все методы оценки качества сывороток. 1.1.4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Binaghi R. A., Perrudet-Badoux A., Boussac-Aron У. Rapid and high produc- tion of precipitating antibodies in rats. — J. Immunol. Methods, 1975, 7, 65—68. 2. Brouet J. C., Toben H. Characterisation of a subpopulation of human T-lim- phocites reactive with an heteroactiserum to human brain. — J. Immunol., 1976, 116, 1041—1047. 3. Conrad D. H., Wirth G. H. Characterisation of antibodies to vitamin A.— Immunochem., 1973, 10, 273—275. 4. Fey H. R., Biltler R., Marti F. The production in the pregnant cow of anti- 2* 19
human immunoglobulin to be used for the antiglobulin test.—Vox Sang., 1973, 25, 245—253. .'5. Furuchl K-, Sasaki T., Koyama J. Production of IgM and IgG antibodies specific for AMP in rabbits by immunisation with AMP-E. coli conjugate.— J. Biochem, 1973, 74, 451—457. 6. Giessen van der M., de Lange B., van der Lee B. The production of predipi- tating antiglobulin reagents specific for the subclasses of human IgG.— Immunology, 1974, 27, 655—663. 7. Hadge D„ Fiebig FL, Ambrosius H. Evolution of low molecular weight immu- noglobulins I. Relationship of 7S immunoglobulins of various vertebrates to chicken IgY. — Devel. Compar. Immunol., 1980, 4, 501—514. 8. Heisch R. D., Hujner M. Highly specific antibodies to triiodthyronine. — Acta biol. med. germ., 1972, 28, 861—864. 9. Kakiuchi T., Nariuchi FL, Tamura N. Preparation and effects of an anti-B- cell serum. — 1976, 116, 1224—1230. 10. Kitagawa Y., Okuhara E. A method for producing anti-DNA antibodies in ascetic fluid of mice. — J. Immunol, methods, 1976, 10, 151—159. 11. Krebs M., Schimke R., Ambrosius H. Peritonealflussigkeit als zusatzliche Quelleder der Anticorpergewinnung.— Allergie und Immunol., 1973, 19, 49—50. 12. Mayer R. G., Walker J. FL Immunochemical methods in the biological scien- ces: enzymes and proteins. — London, Academic Press, 1980. .13 . McDonald H. C., Odstrchel G„ Maurer P. H. Hyperimmune response to a protein and a polypeptide antigen coated on Pneumococcus R 36A.— J. Im- munol., 1972, 109, 881—883. .14 . Nakashima L, Ohta F., Kobayashi T. et al. Effect of antigen doses and time intervals between antigen injections on secondary, tertiary and quarternary antibody responses. — Immunology, 1974, 26, 443—457. .15 . Nielsen K. Preparation of antisera to the ц-chain of IgM. — J. Immunol, methods, 1976, 11, 77—82. 16. Proctor M. L., Herscowitz FL B. Preparation and properties of an anti-plasma cell serum directed against a defined plasmocytoma cell population. — J. Im- munol., 1975, 115, 1642—1649. 17. Shen F. W., Boyse E. A., Cantor FL Preparation and use of Ly antisera.— Immunogenetics, 1975, 2, 591—595. 18. Skowsky W. R., Fisher D. A. The use of thyroglobulin to in duce antigenecity to small molecules. — J. Lab. Clin. Med., 1972, 80, 134—144. 1.2. ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПУТЕМ СЛИЯНИЯ КЛЕТОК (ГИБРИДОМНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ) 1.2.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Количество возможных вариантов антител у млекопитающих очень велико, оно составляет приблизительно 1ХЮ7- К одной детерминанте может образовываться до 8000 вариантов моле- кул антител. В условиях обычного иммунного ответа из всего видового потенциала антител у данного индивида образуется небольшое количество типов антител, представляющих собой случайную выборку из числа всех возможных вариантов. В свя- зи с этим невозможно получить сыворотки от различных инди- видов, обладающие одинаковым набором антител. В случае сложных антигенов, например ксеногенных клеток, иммунный ответ наблюдается в отношении приблизительно ста поверхно- 20
Синтез нуклеотидов de novo ГГФРТ 8-Азагуанин Рис. 3. Механизм селекции на среде ГАТ. стных антигенов, каждый из которых обладает несколькими де- терминантами. Учитывая случайный выбор вариантов антител к каждой отдельной детерминанте, становится понятным, что антисыворотки от двух разных особей могут довольно сильно отличаться между собой. Невозможность воспроизвести на дру- гом животном набор антител, получаемых от какого-либо опре- деленного животного, сильно осложняет процесс стандартиза- ции сывороток. Для получения сывороток против отдельных де- терминант ксеногенных клеток приходится использовать весьма трудоемкие и длительные методы адсорбции, что часто приво- дит к выделению антисывороток с крайне низким титром анти- тел. Эти недостатки можно устранить, применяя моноклональ- ные антитела к определенным клеточным детерминантам; мо- ноклональные антитела продуцируются постоянно культивируе- мыми линиями клеток. В 1975 г. Кёлер и Милыптейн впервые добились слияния короткоживущих лимфоцитов, продуцирующих антитела, и по- стоянно растущих клеток плазмоцитомы. Это открытие дало возможность получать теоретические «бессмертные», непрерывно культивируемые клоны гибридных клеток — продуцентов анти- тел (гибридомы). Образуемые гибридомами моноклональные антитела имеют сходное молекулярное строение и обладают одинаковой специфичностью. Первоначально слияние проводили при помощи вируса Сендай. Применение полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве агента, стимулирующего этот процесс, позво- лило существенно увеличить частоту слияний. Неслившиеся лимфоциты отмирают через несколько дней после гибридизации. Отделение неслившихся плазмоцитомных клеток от гибридом возможно только при использовании селективной среды ГАТ (см. ниже). Предпосылкой для ГАТ-зависимой селекции являет- ся наличие вариантов плазмоцитомных клеток, дефектных по гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе (ГТФРТ) или по тимидинкиназе (ТК). Эти клетки отмирают в культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ), поскольку не обладают способностью обойти аминоптериновый блок основного пути биосинтеза ДНК за счет биосинтеза ги- поксантина и тимидина (рис. 3). Только гибридные клетки, по- 21
лученные слиянием ГГФРТ-негативных или ТК-негативных плазмоцитомных клеток и нормальных лимфоцитов (ГГФРТ- и ТК-позитивных), выживают в среде ГАТ, преодолевая амино- птериновый блок. Дефектные по ГГФРТ линии плазмоцитом получают путем селекции клеток, резистентных к 8-азагуанину. Линии, дефектные по ТК, выделяют по резистентности к 5-бром- дезоксиуридину. Среди растущих на среде ГАТ гибридом выде- ляют и селекционируют те клоны, которые продуцируют имму- ноглобулины (1g) нужного класса и определенной специфич- ности. Выявленные антителопродуцирующие клоны гибридных кле- ток (гибридомы) можно культивировать in vivo и in vitro, в за- висимости от этого моноклональные антитела получают из ас- цитической жидкости или из надосадочной фракции культу- ральной среды. 1.2.2. МЕТОДИКА 1.2.2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Среду для культивирования клеток RPMI-1640 (SIFIN, Бер- лин) разводят бидистиллированной водой и вносят следующие добавки: бикарбонат натрия — 2 г/л (х. ч.), 20 мМ ГЭПЭС (Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-2-этансульфоновая кислота, х. ч.), 2 мМ L-глутамина (отбирают из замороженного маточного 200 мМ раствора), 5ХЮ”5 М 2-меркаптоэтанола (х. ч., из 0,1 М маточного раствора), 100 мг/л гентамицина (Фармахим, Со- фия). Раствор стерилизуют и добавляют по 100 мл стерильной сыворотки плода коровы (SIFIN, Берлин) на 1 л среды. В та- ком виде среда может храниться в течение 6 нед при 4 °C. При работе с надежными клеточными культурами можно заменять фетальную сыворотку коров, неонатальной сывороткой или в некоторых случаях нормальной лошадиной сывороткой. Вместо гентамицина можно использовать смесь пенициллина и стреп- томицина. Среда для слияния клеток: к среде RPMI-1640 добавляют 2 г/л бикарбоната натрия, 20 мМ ГЭПЭС и 100 мг/л гентами- цина; сыворотку не добавляют. Селективная среда ГАТ состоит из полной среды для куль- тивирования, к которой добавлено 20 мл/л стерильного маточ- ного раствора ГАТ. Конечные концентрации компонентов: 1ХЮ-4 М гипоксантина, 4ХЮ-7 М аминоптерина, 1,6ХЮ-5 М тимидина. Среда ГТ (гипоксантин, тимидин) состоит из полной культуральной среды, к которой добавлено 10 мл/л стерильного маточного раствора ГТ. Приготовление маточных растворов ГТ и ГАТ: в дистиллиро- ванной воде растворяют хроматографически чистый гипоксантин (Реанал, Будапешт) до концентрации 1ХЮ-2 М путем нагре- вания при 45—50 °C в течение 1 ч. К этому раствору добавляют 22
тимидин (Sigma, Мюнхен) до конечной концентрации 1,6Х Х10~3 М. Этот 10-кратный раствор (ГТ) фильтруют в стериль- ных условиях и хранят при температуре —20 °C. Раствор аминоптерина 4ХЮ~5 М получают путем добавления 1,76 мг аминоптерина (Schuchardt, Мюнхен) и 0,5 мл 1 М NaOH к 90 мл дистиллированной воды. Доводят объем дистиллирован- ной водой до 100 мл, нейтрализуют раствор 0,5 мл 1 М НС1 и фильтруют в стерильных условиях. ГАТ (50-кратный раствор) готовят смешиванием растворов ГТ и аминоптерина в соотношении 1 : 1, раствор разливают по 2 мл и хранят при —20 °C. Следует защищать растворы, содержа- щие аминоптерин, от действия света. Раствор ПЭГ: 5 г ПЭГ (относительная молекулярная масса 1540, ф. ч. Polyscience Inc., США, или относительная молеку- лярная масса 4000 чист, для газовой хроматографии, Merck, Дармштадт) смешивают с 5 мл культуральной среды для слия- ния, одновременно растворяют и стерилизуют автоклавировани- ем в течение 20 мин. Непродолжительное время раствор ПЭГ может храниться при 4 °C. Для длительного хранения раствор лучше замораживать. Посуда для культивирования: — микропланшеты для титрования с плоским дном и крышкой 96X200 мкл (Flow Labs, ФРГ); — планшеты для культуры тканей с плоским дном и крышкой 24X2 мл (Linbro); — пластиковые культуральные сосуды (5, 25, 50 мл). Кроме того, необходимы: стеклянные пипетки (1, 2, 5 и 10 мл), пастеровские пипетки, автоматические пипетки и выдерживаю- щие автоклавирование сменные наконечники к ним (тип 1 и 2), центрифужные стаканы (10 и 25 мл). Вся посуда, применяемая для работы с культурой ткани, долж- на быть стерильна. Прочие материалы и посуду для стерильных манипуляций и подсчета клеток см. в разделе 1.3. Оборудование: ламинарный бокс (VEB, Electromat, Дрезден), СОг-инкубатор, устройство для стерильной фильтрации (мемб- ранные фильтры), инвертированный микроскоп Telaval (VEB, Карл Цейсс, йена), водоструйный насос, центрифуга с охлажде- нием (К24). 1.2.2.2. ЛИНИИ ПЛАЗМОЦИТОМ ГАТ-чувствительные, ГГФРТ-дефектные линии плазмоцитом из- вестны в настоящее время у мышей [2, 5, 8, 9, 10, 14], крыс [4] и человека [1, 13] (табл. 1). Эти клеточные линии можно селек- ционировать по резистентности к 8-азагуанину (от 20 до 60 мг/л). До настоящего времени реверсий не наблюдалось. Все же время от времени желательно культивировать эти клетки в среде, содержащей 8-азагуанин. Аналогичным образом дефект- ные по ТК клетки могут быть получены селекцией в среде, со- держащей 5-бромдезоксиуридин (30 мг/л). Для получения мо- 23
Таблица 1. ГАТ-чувствительиые линии плазмоцитомиых клеток, пригодные для получения гибридов Вид (штамм) Линия плазмоцитом Число хромо- сом Иммуно- глобулины Литератур- ный источник Мышь BAlB/c МРС 11-45.6TG1.7 62 y2b [10] BAlB/c РЗ X 63-Ag8 65 Vi [8] BAlB/c NS1-A 4/1 65 X Внут- [9] BAlB/c Х63-А 8.653 58 рикл. [5] BAlB/c S Р 2/0-Ag 14 72 — [14] BAlB/c Крысы — Lou FO 210-RCY 3.Ag 1,2.3. 72 39 и [4] Человек Миелома GM 1500 GM 1500 6Tg-AL-2 ?2 X [1] Миелома U-266 SKO-007 — ?2, [13] Миелома ARH-77 LICR-LON-HMy 2 — Y1, х [13] номинальных антител оптимальными являются линии плазмо- цитом, полностью утратившие способность синтезировать цепи собственных иммуноглобулинов. Получаемые из них гибридные клетки содержат только активные гены L- и Н-цепей антитело- образующих лимфоцитов, поэтому образование гибридных мо- лекул иммуноглобулинов исключено. 1.2.2.З. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛООБРАЗУЮЩИХ ЛИМФОЦИТОВ В дальнейшем речь пойдет только о слиянии клеток плазмоци- томы мыши с лимфоцитами того же вида. Слияние клеток плаз- моцитомы и лимфоцитов человека или крысы имеет свои осо- бенности. 1.2.2.З.1. Иммунизация Для иммунизации используют инбредные линии мышей (ВА1 В/с), сингенные, по отношению к плазмоцитоме или аллогенным штаммам. В последнем случае для лучшего роста гибридных клеток после слияния следует использовать гибриды Fi мышей ВА1В/с и мышей, иммунизированных с целью выделения у них нормальных клеток селезенки. Для культивирования гибридом in vivo также необходимо использование гибридов Fi. Для про- ведения иммунизации подходят любые схемы, стимулирующие образование выраженного гуморального иммунного ответа. Ре- комендуется повторное введение антигена за 4 дня до слияния. Антиген в этом случае вводится внутрибрюшинно или внутри- венно без адъюванта. Лучший эффект достигается при исполь- зовании более высоких доз антигена, чем на предыдущих стади- ях иммунизации. 24
1.2.2.3.2. Получение клеток Мышей забивают цервикальной дислокацией, извлекают в усло- виях стерильности селезенку и готовят суспензию отдельных клеток. Клетки селезенки трижды отмывают средой для слия- ния, не содержащей сыворотки. Суспензию, содержащую 2Х107 лимфоцитов, переносят в центрифужный стакан объемом 25 мл. Если число лимфоцитов меньше предусмотренного, то к суспензии добавляют еще 2ХЮ8 ядерных клеток селезенки. 1.2.2.4. СЛИЯНИЕ КЛЕТОК Плазмоцитомные клетки в количестве 2ХЮ7 (например, Х63 Ag 8.653), взятые в логарифмической фазе культивирования и дважды отмытые культуральной средой для слияния, добавля- ют к отмытым клеткам селезенки мыши (рис. 4). Суспензию клеток тщательно перемешивают и центрифугируют при 300 g. После отсасывания надосадочной фракции осадок ресуспенди- руют в небольшом количестве среды. Затем в течение 2 мин по каплям добавляют 1 мл раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ), следя за равномерным смешиванием жидкостей. Избыток ПЭГ разводят добавлением бессывороточной среды для слияния. Для этого при постоянном покачивании сосуда с интервалом в 2 мин последовательно прибавляют I, 2, 4 и 8 мл среды для слияния. Добиваются равномерного распределения клеток во всем объ- еме жидкости. Клетки собирают центрифугированием при 300 g, надосадочную фракцию отбрасывают. Все процедуры проводят в условиях минимальной обсемененности микробами (в лами- нарном боксе) при комнатной температуре. 1.2.2.5. СЕЛЕКЦИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК НА СРЕДЕ ГАТ Слившиеся клетки аккуратно ресуспендируют в 40 мл среды ГАТ. К этой суспензии для поддержания роста добавляют 1ХЮ7 свежевыделенных ядерных клеток селезенки (см. раздел I.2.2.3.1). Можно также применять перитонеальные макрофаги, получаемые смывом раствора глюкозы. Как показывают наши наблюдения, нет необходимости облучать поддерживающие клетки дозой в 2 Дж/кг (200 рад), хотя некоторые авторы это рекомендуют. Из суспензии клеток отбирают 192 пробы по 200 мкл и вносят их в плоскодонные планшеты для микрокуль- тур альных работ. Культуры клеток инкубируют в водонасыщен- ной атмосфере, содержащей 5% СОг при 37 °C. Начиная с 4-го дня после слияния, производят замену половины надосадочной фракции в лунках с культурой свежей порцией среды ГАТ; за- мену повторяют каждые 3 или 4 дня. Для этого половину над- осадочной фракции клеточной культуры аккуратно отсасывают стерильными пастеровскими пипетками, соединенными с водо- 25
+ Среда ГАТ 192 отдельные культуры (200 мкл) 4 дня замена половины среды ГАТ свежей Проверка активности антител Рис. 4. Гибридомная технология: слияние клеток, ГАТ-селекция, выявление гибридом. струйным насосом. Под действием ГАТ дефектные по ГГФРТ плазмоцитомные клетки отмирают. Остаются неслившиеся клет- ки селезенки и гибридомы, образовавшиеся из клеток плазмоци- томы и ГГФРТ-положительных лимфоцитов. Скорость деления клеток селезенки невелика, в то время как скорость деления гибридных клеток примерно такая же, как у клеток плазмоци- 26
томы, поэтому быстрорастущие клоны гибридом становятся раз- личимы в виде плотных колоний клеток. Рекомендуется как можно раньше заносить в протокол количество растущих гиб- ридных клонов, поскольку позднее это становится затрудни- тельным из-за слияния отдельных клонов и образования дочер- них колоний. Подсчет количества клонов гибридных клеток луч- ше всего производить при помощи инвертированного микроско- па Televal на 6-й день, а затем незадолго до проверки антите- лообразующей способности (с 15-го до 18-й день). В обычных условиях частота слияний составляет 10~5 (образуется 1 гиб- ридная клетка на 105 исходных клеток плазмоцитомы), что со- ответствует образованию 1 гибридного клона в 1 культуральной лунке. При оптимальных условиях достигается частота слияний, равная 10“4. 1.2.2.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛОПРОДУЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ГИБРИДОМ При обычных условиях культивирования через 2—3 нед количе- ство клеток в гибридном клоне достигает величины, делающей возможной определение антител. Из культуральных лунок отби- рают при помощи автоматической пипетки по 50 мкл надосадоч- ной фракции. Для обнаружения антител можно использовать любой высокочувствительный метод. Наиболее оправдал себя на практике метод, представленный на рис. 6. 1.2.2.6.1. Определение моноклональных антител к растворимым антигенам при помощи радиоиммунологического анализа А. Гибкие планшеты для микротитрования (V-образные) или штампованные поливинилхлоридные (ПВХ) листы для упа- ковки таблеток «нагружают антигеном». Для этого углубле- ния в ПВХ-листах заполняют на 2—12 ч раствором антигена при комнатной температуре. Концентрация антигена может составлять от 5 до 200 мг/л. Раствор антигена может исполь- зоваться для «нагрузки» много раз, при этом следует учиты- вать, что разведенные растворы истощаются быстрее. Б. Нагруженные ПВХ-листы трижды отмывают 0,15 М NaCl. В. Внесением нейтрального белка (10 г/л человеческого или бычьего сывороточного альбумина, разведенного в соотноше- нии 1:100 сывороткой плода коров или нормальной лошади- ной сыворотки) «закрывают» те участки поверхности носите- ля, с которыми не связался антиген. Г. Трижды проводят отмывку 0,15 NaCl. После высушивания на воздухе ПВХ-листы, нагруженные антигеном, могут не- сколько месяцев храниться при 4 °C без потери связывающей активности. 27
Рис. 5. РИА для определения АТ, продуцируемых гибрндомами. Планшеты из ПВХ, сенсибилизированные ДНФ-ЧСА, ннкубнруют с культуральной жид- костью (50 мкл на 1 лунку). Связавшиеся АТ выявляют при помощи ‘"[Il-IgM к 1g мыши. Контроль; ФСБ, культуральная жидкость плазмоцитомы X 63-Ag8. 653 (КЖ), ряд разведений моноклональных аитн-ДНФ-антнтел E7/F3. Е. Надосадочную жидкость в количестве 50 мкл из культураль- ной лунки вносят в лунку, содержащую антиген. В качестве контроля используют надосадочные фракции культур клеток селезенки, плазмоцитомы или, если возможно, гибридных клеток, продуцирующих антитела другой специфичности. Листы с антигеном выдерживают 2 ч при 4 °C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа для выравнивания значе- ний pH со значением pH надосадочных фракций. ж. Троекратно отмывают ПВХ-листы холодным 0,15 М NaCl. 3. Связанные мышиные антитела определяют при помощи спе- цифического кроличьего антимышиного ИГ, меченного 1261, который вносят по 50 мкл в лунку (около 20 000 имп/лунку; см. раздел 4.6). К раствору антител добавляют ЧСА до 10 мг/мл. ПВХ-листы инкубируют в течение 4—18 ч при 4 °C. Дальнейшие опера- ции проводят в соответствии с пунктом Ж- И. Отмытые ПВХ-листы разрезают и определяют связанную ра- диоактивность в каждой лунке с помощью автоматического гамма-счетчика. Антителообразующими гибрндомами счита- ют те, которые продуцируют надосадочные фракции, связы- вающие по меньшей мере в 4 раза больше радиоактивного антимышиного ИГ, чем надосадочные фракции контрольных , проб (рис. 5). 28
®ое®©о Надосадочная фракция (100 мнл>« Счетчик гамма-излучения* Рис. 6. Гибридомная технология: выявление антител, клонирование, массо- вое культивирование, культивирование. 1.2.2.6.2. Определение моноклональных антител к поверхностным антигенам методом радиоиммунологического связывания А. Гибкие ПВХ-планшеты для микротитрования (лунки U-об- разной формы) заполняют разведенной 1:100 сывороткой (сыворотка плода коров или лошадей), инкубируют 30 мин при комнатной температуре и трижды отмывают 0,15 М- 29
6. В каждую лунку вносят по 5ХЮ5 клеток (например, лимфо- циты крови) в 50 мкл раствора NaCl; планшеты центрифу- гируют при 300 g в течение 5 мин. В каждую лунку вносят по 50 мкл 0,5% глютарового альдегида. В этом растворе клетки могут сохраняться в течение нескольких недель при 4 °C. Перед употреблением клетки трижды отмывают рас- твором NaCl, в течение 2 ч инкубируют с ЧСА (10 г/л) и еще раз троекратно отмывают раствором NaCl. В. Вносят по 50 мкл надосадочной фракции клеточных культур или контрольного образца. Остальные этапы см. в разделе 1.2.2.6.1. Вместо меченных изотопами антител можно использовать конъ- югированные с ферментами антитела для иммунофлюоресцент- ного анализа (ИФА) (см. 2.10). В качестве альтернативы можно применять другие разновидно- сти РИА (см. 2.9): локальный гемолиз в геле (см. 1.5), нейт- рализацию фагов и непрямую флюоресценцию (см. 2.8). 1.2.2.7. КЛОНИРОВАНИЕ Антителопродуцирующие клетки называют гибридомами. В экс- перименте не всегда образуется только один гибридный клон. Довольно часто образуется несколько гибридных клонов. Эти немоноклональные культуры подлежат клонированию. Первич- но моноклональные культуры также следует время от времени реклонировать, поскольку возникают клетки, не продуцирующие антитела, но зачастую растущие быстрее антителопродуцирую- щих и даже заглушающие рост последних. Для клонирования чаще всего применяют метод предельного разведения. Гибрид- ные клетки осторожно суспендируют в 2 мл культуральной сре- ды, определяют концентрацию жизнеспособных клеток. Суспен- зию разводят так, чтобы в 1 мл содержалось 150 гибридных клеток. К 1 мл этой суспензии добавляют 2ХЮ7 сингенных яд- росодержащих клеток селезенки и доводят объем до 20 мл культуральной средой. В планшет с плоскодонными лунками вносят 96 аликвот по 200 мкл. В тех лунках, где образовались моноклональные культуры (микроскопия), проверяют наличие антител. 1.2.2.8. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГИБРИДОМ IN VITRO Когда клетки становятся достаточно многочисленными, их пере- носят в лунки объемом 1—2 мл. Для этого за 2 дня до переноса гибридом в планшеты для культивирования (например, Linbro с 24 лунками) вносят ядросодержащие сингенные клетки селе- зенки (по 5Х105 клеток в лунку). Гибридомы аккуратно сус- пендируют при помощи движений поршня пипетки и переносят по 100 мкл из каждой исходной лунки в 2 лунки объемом 1 мл. .Начиная с 5-й нед после слияния, трижды производят замену 30
среды (ГТ, а не ГАТ). В дальнейшем можно вести культивацию в обычной культуральной среде. В лунках объемом 2 мл гиб- ридомы так разрастаются, что их переносят в планшеты с че- тырьмя лунками по 5 мл. Стабильные гибридомы можно пере- носить в культуральные сосуды по 25—50 мл. На этой стадии можно заменять сыворотку плода коровы нормальной сыворот- кой коров или лошадей. В этих сосудах среду следует также менять каждые 3—4 дня. На этом этапе можно получить до- статочное количество клеток для культивирования in vivo на сингенных мышах. Отбираемые при смене среды моноклональ- ные антитела можно использовать для характеристики специ- фичности и молекулярных особенностей ИГ. В среднем концент- рация моноклональных антител в культуральной среде состав- ляет 10—50 мкг/мл. 1.2.2.9. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГИБРИДОМ IN VIVO Сингенным мышам предварительно вводят внутрибрюшинно 0,5 мл полужидкого парафина (DAB 7, VEB Leunawerke, Mer- seburg) или пристана (Koch-Light Lobs). Через 1—4 нед после предварительной обработки внутрибрюшинно вводят по 2Х107 гибридных клеток каждому животному. В асцитической жидко- сти мышей концентрация моноклональных антител может до- стигать 5—10 мг/мл. Содержащиеся в асцитической жидкости гибридомы можно перевивать другим мышам после предвари- тельной обработки (см. выше). 1.2.2.10. КОНСЕРВИРОВАНИЕ ПРИ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ Необходимо замораживать, гибридомы как можно раньше, на- чиная со стадии, когда культуры развиваются в лунках объ- емом 2 мл, не дожидаясь получения массовой культуры. Это позволит возобновить культуру в случае ее гибели на поздних стадиях вследствие внесения инфекции. Стабильные культуры гибридом можно подвергать многократному замораживанию. В стеклянные ампулы вносят в стерильных условиях по 106 гиб- ридных клеток, суспендированных в среде RPMI 1640 с добав- лением 20% сыворотки плода коровы и диметил сульфоксида (70 г/л). После охлаждения до 4°C клетки переносят в сосуд Дьюара с сухим льдом, выдерживают их в течение 2 ч и пере- носят в жидкий азот. При размораживании клетки помещают в водяную баню при 37 °C, немедленно после оттаивания их пере- носят в центрифужную пробирку, содержащую 5 мл культу- ральной среды. Осажденные центрифугированием клетки снова суспендируют в среде и переносят в заранее подготовленные- лунки с двухдневной культурой спленоцитов. Проводят иссле- дование на антителообразующую способность, в зависимости от результатов которого либо выделяют массовую культуру, либо< 31
Надосадочная фракция культур гибридом -Y2b \\1// \\|// п1 1m ,25(П-аити 1g. -И- Счетчик гамма-излучения t + + ---- Фис. 7. Определение класса (субкласса) гибридомных АТ при помощи -меченных 125[I]-антител к иммуноглобулинам. проводят реклонирование. Если гибридные клетки взяты из сре- ды, содержащей ГТ или ГАТ, то их следует культивировать на ГТ среде. 1.2.2.11. ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГИБРИДОМНЫХ АНТИТЕЛ Типирование гибридомных антител должно проводиться на воз- можно более ранних стадиях (см. раздел 1.2.2.6.1). Изотип свя- завшихся с ПВХ-листами антител определяют путем проявления меченной 1251-антисывороткой к тотальному препарату иммуно- глобулина или к различным тяжелым цепям (ц, yi, уга, угЬ, -уза (рис. 7). Обычно используют большое количество метки (до 150 000 имп/50 мкл) в отличие от экспериментов с высоко- очищенными антителами. Биохимическими методами изотип можно определять при помощи электрофореза в полиакрил- амидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (ДСН), раз- деляя восстановленные моноклональные антитела. Единообра- .зие антител доказывается при помощи электрофореза и изо- электрофокусирования ИГ получивших витальную метку 14С. 32
1.2.3. ОЦЕНКА МЕТОДА Основное преимущество моноклональных антител (МКАТ) — их специфичность. Правда, сама природа взаимодействия АГ-АТ может обуславливать иногда возникновение перекрестных реак- ций и с моноклональными антителами. Еще одной отличитель- ной чертой МКАТ является их молекулярная однородность и доступность в относительно больших количествах при сравни- тельно низкой себестоимости. Поскольку гибридомы теоретиче- ски бессмертны и легко культивируются после хранения в за- мороженном состоянии, они могут быть использованы для полу- чения долгосрочно воспроизводимых результатов. МКАТ от- крывают новые перспективы в таких областях исследования как изучение антигенов клеточных мембран (антигены диффе- ренцировки и антигены, ассоциированные с опухолями). Работ в этой области много, мы же ограничиваемся цитированием только 3 литературных источников [6, 11, 12]. 1.2.4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Croce С. М., Linnebach A., Hall W. et al. Production of human hybridomas secreting antibodies to measle virus. — Nature, 1980, 288, 488—489. 2. Fazekas de St. Groth S., Scheidegger D. Production of monoclonal antibodies: strategy and tactics. — J. Immunol. Meth., 1980, 35, 1—24. 3. Galfre G., Howe S. C., Milstein C. et al. Antibodies to major histocompati- bility antigens produced by hybrid cell lines. — Nature, 1977, 266, 550—552. 4. Galfre G., Milstein C., Wright B. Rat x rat hybrid myelo mas and a mono- clonal anti Fd portion of mouse IgG. — Nature, 1977, 131—133. 5. Kearney J. F., Radbruch A., Liesegang B., Rajewsky K. A new mouse myelo- ma cell line that had lost immunoglobulin ex pression but permits the construction of antibody secreting hybrid cell lines. — Immunol., 1979, 123, 1548—1550. 6. Kennet R. H., McKearn T. J., Bechtol К- B. Ed Monoclo nal antibodies-hybri- domas a new dimention in biological analyses. — New York and London; Plenum Press, 1981. 7. Klinman. N. R., Press J. L. The В-cell specificity repertoire: its relationship to definable populations. — Transplant. Rev., 1975, 24, 49—83. 8. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. — Nature, 1975, 256, 495—497. 9. Kohler G., Milstein C. Derivation of specific antibody — producing tissue cul- ture and tumor lines by cell fusion. — Eur. J. Immunol., 1976, 6, 511—519. 10. Margulies D. H., Kuehl W. M., Scharff M. D. Somatic cell hybridisation of mouse myeloma cells. — Cell, 1976, 8, 405—415. 11. Melchers F. M„ Potter M., Warner N. (Ed.). Lymphocyte hybridomas. Cur- rent topics in microbiology and immunology. — Berlin: Springer, 1978, 81. 12. Moller R. H. (Ed.). Hybrid myeloma monoclonal antibodies against MHC products. — Immunol. Rev., 1979, 47, 1—252. 13. O'Hare M„ Edwards P. New success with human Hybrids. — Immunol today, 1981, i—ii. 14, Schulamn M., Wilde C. D., Kohler G. A better line for making hybridomas secreting specific antibodies. — Nature, 1978, 276, 269—270. 15. Stahll C„ Staehelin T„ Miggiano V. et al. High frequencies of antigen-speci- fic hybridomas: dependence on immunisation patterns and prediction by spleen cell analysis. — J. Immunol. Meth., 1980, 32, 297—307. 3-990 33
1.3. ОБРАЗОВАНИЕ АНТИТЕЛ КУЛЬТУРАМИ КЛЕТОК 1.3.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Метод, описанный в данном разделе, основан на способности суспензии клеток лимфоидных органов формировать культуры, продуцирующие антитела вне исходного организма. Образова- ния антител in vitro можно добиться различными путями: 1. От животных, подвергшихся стимуляции определенным анти- геном, получают культуру клеток, которые продолжают in vitro синтезировать антитела без дополнительного введения антигена. 2. От иммунизированных животных после угасания иммунного ответа получают культуру клеток. Повторное введение того же антигена вызывает вторичный иммунный ответ in vitro. 3. Культуру клеток, полученных от неиммунизированного жи- вотного, используют для выработки первичного иммунного ответа путем непосредственного контакта с антигеном. Индукция первичного иммунного ответа, сопровождающаяся проявлением in vitro всех этапов полного гуморального иммун- ного ответа, методически наиболее трудна. Удовлетворительные результаты впервые были получены в 1967 г. одновременно тре- мя группами исследователей [2, 10, 9]. Методы, предложенные Mishell и Dutton (рис. 8, а) [10] и Marbrook (рис. 8,6) [9], по- лучили широкое распространение и стали стандартными мето- дами. Позднее к ним добавился метод микрокультивирования Lefkovitz (рис. 8, в) [8]. При всех трех способах получения культур клеток используется исходная питательная среда, обо- гащенная специфическими добавками и сывороткой плода коро- вы. В питательную среду вносят антиген (обычно эритроциты барана, ЭБ) и суспензию клеток (чаще спленоциты, или какую- либо субпопуляцию спленоцитов мыши); инкубацию проводят в течение 3—7 дней в атмосфере, обогащенной СОг. При наиболее распространенном способе культивирования, предложенном Mishell и Dutton, используют пластиковые чаш- ки Петри небольшого размера. Этот способ очень прост в ис- полнении, однако для оптимизации роста клеток требуются пи- тательные добавки. Система выращивания клеток, предложен- ная Marbrook, основана на использовании стеклянных сосудов, нижняя часть которых закрыта мембраной, непроницаемой для клеток, но пропускающей питательные вещества. Клетки растут на поверхности мембраны. Сосуд с клетками погружают в со- суд большего размера с питательной средой. Хотя такой метод требует больших затрат рабочего времени и материалов, он по- зволяет оптимизировать процесс питания клеток. Его преимуще- ством является и то, что в одном сосуде можно использовать несколько мембран, каждая из которых «заселена» клетками 34
Рис. 8. Системы культивирования клеток для выявления антителообразо- ваиня. а — по методу Mishell и Datton; б — по методу Marbrook; в —по методу Lefkovitz. одного типа. Lefkovitz предложил использовать планшеты для микротитрования, что позволяет обходиться небольшими коли- чествами среды и клеток. Правда, при этом способе нет воз- можности получать антителообразующие клетки в значительных количествах. Преимуществами его являются простота реализа- ции, малый расход реактивов, возможность выделения отдель- ных клонов клеток. Мы приводим описание модифицированного метода Mishell и Dutton, получившего наибольшее распростра- нение [15]. 1.3.2. МЕТОДИКА 1.З.2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Для работы необходимы: однополые мыши инбредных штаммов СВА, С57Ы или DBA в возрасте 8—12 нед; эритроциты барана в растворе Олсвера или в дефибринированной крови; чашки Петри диаметром 50 мм (Anumbra, Венгрия); колбы Эрленмейе- ра объемом 25, 100, 500 и 1000 мл; градуированные пипетки (1, 10 и 25 мл); подставки для пипеток; пипетки для подсчета эритроцитов и лейкоцитов; стеклянный стерилизующий фильтр G5 (Saale — Gias, Иена, ГДР); стеклянные стаканы объемом на 400 мл; центрифужные пробирки (10 и 20 мл); камеры для подсчета клеток по Barker и Thoma; силиконовые пробки для колб Эрленмейера; шприцы (10 мл) с иглами № 16; алюминие- вая фольга; бунзеновская горелка; ножницы; пинцеты; формы для льда; чашки с замороженным льдом с плоской поверхно- стью льда; среды Игла-МЕМ и Хенкса в сухом виде (Госу- дарственный институт иммунопрепаратов и питательных сред, Берлин); сыворотка плода коровы (например, «Rehatuin» Rebe- ls Chemical Company, Phoenix USA); заменимые аминокисло- ты: Ser, Pro, Gly, Asp кислота (x. ч., или для культуры тканей); L-глютамин, х. ч.; пируват натрия, х. ч.; пенициллин, стрептоми- цин 2-меркаптоэтанол (Koch-Light, Англия); NaHCO3; 2,5% раствор трипанового синего в 0,15 М NaCl; тридистиллирован- ная вода; сухожаровой шкаф, термостат, настольная центрифу- з* 35
га, микроскоп, весы (тарирующие); баллоны со сжатым возду- хом, содержащим 7,5% СОг; эксикатор диаметром 40 см; лабо- раторное помещение, приспособленное для стерильных работ. 1.3.2.2. ПОДГОТОВКА СТЕКЛЯННОЙ ПОСУДЫ Работы по культивированию требуют строгого соблюдения сте- рильности; можно использовать только безупречно чистые по- суду и растворы. Стеклянную посуду ополаскивают водопро- водной водой и кипятят в течение часа в растворе моющих средств. После повторного ополаскивания посуду замачивают в 20% серной кислоте не менее чем на 6 ч. Затем посуду тщатель- но моют водопроводной водой и дважды ополаскивают дистил- лированной водой. Лабораторное стекло высушивают в су- шильном шкафу при 100 °C до исчезновения воды и пятен кон- денсации пара, после чего посуду заворачивают в алюминиевую фольгу и стерилизуют 2 ч при 180 °C. Подготовленную таким образом посуду хранят в помещении, предназначенном для сте- рильных работ. 1.З.2.З. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД Раствор Хенке а. В соответствии с прописью изготовителя 9,77 г сухого вещества растворяют в 1 л тридистиллированной воды, с помощью 1 М NaOH доводят pH до 7,4, стерилизуют фильтрованием и хранят при 4 °C. Среда Игл а-М Е М. В соответствии с прописью изготови- теля 10,8 г сухого вещества растворяют в 1 л тридистиллиро- ванной воды, затем к этому раствору добавляют следующие компоненты (из расчета на 1 л раствора): 8 мг глицина, 10 мг L-Ser, 12 мг L-Pro, 14 мг L-Asn, 9 мг L-Ala, 13,3 мг L-Asp, 15 мг L-Glu, 290 мг L-Geln, ПО мг пирувата натрия. После полного растворения всех компонентов pH доводят до 7,4 с помощью 1 М NaOH и фильтруют через фильтр G 5. Раствор может хра- ниться при +4 °C в течение 4—6 нед. Раствор антибиотиков. Растворяют 1 г сульфата стрептомицина и 1 000 000 ЕД бензилпенициллина натриевой соли в 100 мл тридистиллированной воды, стерилизуют фильтро- ванием, разливают по 2 мл в стерильные сосуды и хранят в за- мороженном состоянии. Исходный раствор в 100 раз концентри- рованнее рабочих растворов. Раствор 2-м е р к а п т о э т а н о л а. Растворяют 0,7 мл 2-меркаптоэтанола в 100 мл стерильной тридистиллированной воды; 0,25 мл полученного раствора смешивают с 24, 75 мл сте- рильного раствора Хенкса; хранят при 4°. Концентрация исход- ного раствора в 20 раз выше концентрации рабочего раствора. Раствор NaHCO3. По меньшей мере 1 раз в 4 нед гото- вят свежий раствор бикарбоната натрия в тридистиллированной воде и стерилизуют фильтрованием. 36
Предпочтительнее готовить полную питательную среду для клеточных культур ex tempore из отдельных составляющих ее растворов. Для получения 100 мл питательной среды смешива- ют 82 мл среды Игла-МЕМ, 10 мл сыворотки плода коровы (ко- нечная концентрация 10%), 5 мл раствора 2-меркаптоэтанола (конечная концентрация 0,005 %), 2 мл раствора бикарбоната натрия (конечная концентрация 0,2%). 1.З.2.4. ПОЛУЧЕНИЕ СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ Получение суспензии клеток селезенки и последующая работа с культурой клеток должны проводиться в стерильных условиях с соблюдением всех правил асептики и антисептики. Подходящим помещением для этих целей может служить бокс со шлюзом. Необходимое количество мышей забивают без эфирного нарко- за путем цервикальной дислокации. Для стерильного удаления селезенки делают поверхностный надрез и отодвигают шкуру в стороны от разреза по направлению к конечностям. После вскрытия брюшной полости селезенку стерильно извлекают и помещают в охлажденный до 4 °C раствор Хенкса, налитый в чашку Петри, диаметром 12 см, установленную на горизонталь- ной поверхности льда. На каждую извлеченную селезенку рас- ходуется 5 мл раствора Хенкса. Селезенки измельчают стериль- ными пинцетами без следов ржавчины. Путем осторожного из- мельчения кусочков органов стараются перевести в суспензию возможно большее число спленоцитов. Клеточную суспензию набирают в 10-миллилитровый шприц (игла № 16). При этом большие скопления клеток остаются, а малые распадаются при прохождении через узкую иглу. Содержимое шприца переносят в центрифужные пробирки объемом 20 мл и центрифугируют в течение 5 мин при 150 g в настольной центрифуге без охлажде- ния (в стерильном боксе). Надосадочную фракцию отсасыва- ют, осадок дважды отмывают равным объемом охлажденного раствора Хенкса путем ресуспендирования. Суспензию клеток при отмывке несколько раз набирают и спокойно выпускают пипеткой (10 мл). После отмывки осадок клеток ресуспендиру- ют в таком объеме раствора Хенкса, чтобы клетки, полученные из 4 или 5 селезенок, содержались в 1 мл суспензии. После от- бора небольшой порции для подсчета клеток и определения их жизнеспособности суспензию хранят в ледяной бане не более чем 1 ч. Определение количества клеток и их жизнеспособности проводят в нестерильных условиях, при помощи окрашивания трипановым синим, в камере Biirker. Приготовленная вышеопи- санным способом суспензия клеток селезенки содержит 96—98% жизнеспособных лимфоцитов, выход составляет в среднем 70— 100 млн спленоцитов с каждой селезенки. 37
1.З.2.5. ПОЛУЧЕНИЕ СУСПЕНЗИИ ЭРИТРОЦИТОВ Применяемые в качестве антигена эритроциты барана отбирают в условиях стерильности. Эритроциты, независимо от того, хра- нили ли их в растворе Олсвера или в дефибринированной кро- ви, трижды отмывают в 10-кратном объеме охлажденного сте- рильного раствора Хенкса. Из полученного осадка клеток гото- вят 20% суспензию эритроцитов; точное число клеток подсчиты- вают в камере Thoma. Из основной суспензии готовят исходный раствор антигена, содержащий в 1 мл 2ХЮ8 эритроцитов. 1.З.2.6. ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК Рассчитывают количество культуральной среды, необходимое для опыта, и готовят суспензию из хранящихся в ледяной бане клеток селезенки так, чтобы в 1 мл среды содержалось 107 жиз- неспособных клеток. Суспензию разливают по 2 мл в стеклян- ные чашки Петри диаметром 50 мм. Для индукции антитело- образования в ряд чашек вносят по 0,1 мл исходной суспензии ЭБ (конечная концентрация 107 эритроцитов в пробе). Эритро- циты распределяют равномерно по чашке осторожными враща- тельными движениями. Посев культуры клеток следует произ- водить непрерывно, поскольку бикарбонат натрия вызывает нарастающее ощелачивание среды, а клетки селезенки очень чувствительны к колебаниям pH в щелочной области. Чашки с культурой немедленно помещают в эксикатор (он выполняет роль инкубатора), который заполняют через антибактериальный фильтр воздухом, содержащим 7,5% СОг. Стационарная газо- вая фаза достигается пропусканием в течение 30 с через экси- катор газовой смеси под давлением 5 атм. Описанный выше ме- тод позволяет получать в стеклянных чашках Петри оптималь- ное число антител при соблюдении следующих условий: в чашку вносят 2 мл полной питательной среды; содержание—107 кле- ток в 1 мл, содержание антигена (эритроциты барана) —5X106 клеток в 1 мл. 1.З.2.7. ОЦЕНКА АНТИТЕЛООБРАЗОВАНИЯ Культуры инкубируют в стационарной газовой фазе в течение 4 дней при 37 °C без встряхивания и добавления питательных веществ. После извлечения чашек с культурой из инкубатора работу проводят в нестерильных условиях. Культивируемые клетки, образующие отчетливо видимый «газон» на дне чашки, соскабливают с поверхности стекла. Для этого используют стек- лянную палочку, на нижний конец которой надет кусок пласт- массового шланга, край которого выступает примерно на 1 мм. Суспензию клеток переносят в центрифужную пробирку (10 мл) и центрифугируют 5 мин при 150 g. После удаления надосадоч- ной жидкости осадок клеток суспендируют в 1—2 мл охлаж- 38
денного раствора Хенкса и хранят в ледяной бане. Определе- ние жизнеспособности выросших клеток проводят в камере Вйг- рег при помощи раствора трипанового синего. Подсчет антите- лообразующих клеток (АОК) производят при помощи методов прямого и непрямого локального гемолиза в геле (см. раздел 1.5). С клетками из каждой чашки проводят по меньшей мере два параллельных определения. Интенсивность антителообразо- вания определяют как количество АОК на каждые 106 жизне- способных клеток. 1.3.2.8. МОДИФИКАЦИИ МЕТОДА Система, о которой шла речь выше, позволяет наблюдать пер- вичный иммунный ответ in vitro даже в том случае, когда в ка- честве антигена используются не цельные эритроциты, а соот- ветствующий лизат. Она также может использоваться для на- блюдения за индуцированным in vivo иммунным ответом, напри- мер, с ее помощью можно оценивать in vitro вторичный иммун- ный ответ на эритроциты барана. Следует помнить, что первич- ное образование антител к ЭБ возможно при использовании клеток селезенки кролика, но не крысы. Иногда первичную ин- дукцию антителообразования удается получать при использо- вании динитрофенол-фиколла (ДНФ-фиколл) и ДПС Oi27; о по- явлении антител в этом случае можно судить по реакции ло- кального гемолиза (см. раздел 1.5). Сыворотку плода коровы заменяют иногда человеческой плацентарной сывороткой или подходящей донорской сывороткой. Можно использовать как пластиковые чашки Петри, так и стеклянные. Покачивание культур при инкубации практически не влияет на уровень анти- телообразования. Ежедневное подкармливание культур клеток в соответствии с оригинальным методом [10], хотя и увеличивает число антителообразующих клеток, все же не оказывает замет- ного влияния на качественные результаты опыта. Такая моди- фикация повышает стоимость исследования и задерживает про- ведение по времени эксперимента, особенно если не обеспечено «подкармливание» культур в конце недели. При соблюдении со- ответствующих условий вместо чашек Петри можно использо- вать планшеты для микротитрования с плоским дном [13], на- пример фирмы Nunc, Дания. В каждую лунку вносят ЗХЮ8 с.членоцитов в 0,3 мл культуральной среды, стимулируют их ДНФ-фиколлом и эритроцитами барана; образование АОК при этом вполне сопоставимо с тем, которое наблюдается на стек- лянных чашках Петри, в расчете на 106 жизнеспособных кле- ток. Имеются предварительные данные об индукции первично- го иммунного ответа у лимфоцитов из миндалин и крови чело- века. От 23 здоровых доноров были выделены лимфоциты и моноциты центрифугированием в градиенте плотности [1]. В 13 случаях наблюдали стимуляцию под влиянием ДНФ-фи- колла, ЭБ и конъюгированных с тринитрофенильной группой 39
(ТНФ) ЭБ. Показать образования антител в культуре клеток человека можно, удлиняя время культивирования до 7 дней и увеличивая продолжительность воздействия конплемента в ре- акциях прямого и непрямого локального гемолиза до 2 ч [1]. Зоны гемолиза, образуемые АОК человека, имеют меньший диа- метр, чем зоны, образованные аналогичными клетками мыши. Выход АОК из клеток донорской крови можно увеличить, до- бавляя к культуральной среде кон-А (1 мкг/мл) либо добавляя автологичную и АВ-сыворотку вместо сыворотки плода коровы, либо снижая содержание моноцитов путем одночасовой адгезии на стекле полученных центрифугированием в градиенте плот- ности форменных элементов крови. Лимфоциты из миндалин выделяют точно так же, как и клетки селезенки мыши. При культивировании клеток из миндалин необходимо добавлять нистатин (Sqibb, Англия) в количестве 20 ЕД/мл. 1.3.3. ОЦЕНКА МЕТОДА Современное состояние знаний о механизме антителообразова- ния в значительной степени основывается на данных, получен- ных при исследовании первичной стимуляции культур клеток [14]. Для оценки современного и будущего значения, а также преимуществ данной системы следует учитывать следующие мо- менты: 1. Процесс антителообразования во всей его сложности вычле- няется из организма животных и делается доступным для прямых наблюдений. 2. Все стадии процесса происходят в известных постоянных, воспроизводимых и направленно изменяемых условиях. 3. Становится возможным анализ роли различных типов кле- ток, принимающих участие в антителообразовании — Т-лим- фоцитов, В-лимфоцитов, макрофагов путем их совместного или раздельного культивирования. 4. Вещества, секретируемые в ходе кооперативного взаимодей- ствия клеток, например, медиаторы регуляции, могут быть выделены и идентифицированы, а механизм их действия де- тально изучен. 5. Механизм антителообразования в организме человека до- ступен изучению почти исключительно методом культивиро- вания клеток [5, 6]. 6. Применение системы культивирования клеток человека дает возможность выделять клетки, стимулированные определен- ными антигенами, и затем получать моноклональные анти- тела человеческого происхождения [4, 7, 11, 17]. 7. В будущем, вероятно, смогут быть выявлены причины де- фектов гуморального иммунитета, сопровождающиеся пато- логическими проявлениями, станет возможным корригировать отклонения в образовании антител адекватными терапевти- ческими мерами. 40
Следует помнить, что изучение первичного иммунного ответа в культуре клеток позволяет получать данные, которые можно переносить на живой организм с известными оговорками. Все существующие системы культивирования используют клеточные суспензии, содержащие продукты отмирания клеток, которые могут оказывать искажающее влияние на рост культуры. Выс- вобождающиеся в процессе жизнедеятельности биологически активные вещества могут изменять потребности некоторых ти- пов клеток в питательных веществах. Ограниченность общих выводов, которые обычно делают при работе с культурой кле- ток, связана с тем, что удается выращивать in vitro клетки не- большого числа видов животных, причем далеко не все антиге- ны в этих условиях индуцируют иммунный ответ. Между индук- цией и образованием антител в культуре протекает много каче- ственно различных стадий: захват антигена, «узнавание» анти- гена, переваривание и презентация антигена, кооперативное взаимодействие клеток, деление и дифференциация клеток, био- синтез белка. Каждая из этих стадий требует своих особых, оп- тимальных условий среды и, кроме того, весьма чувствительна к различным неблагоприятным воздействиям. Этим объясняется ют факт, что многочисленным исследовательским группам не удалось включить метод культивирования АОК в свой арсенал, н зачастую даже при успешном культивировании не удалось до- биться эффективной продукции антител. По нашим собствен- ным наблюдениям, антителообразования не наблюдается в при- близительно 10% экспериментов. При постановке параллельных серий экспериментов количество антителообразующих клеток в разных чашках дает разброс 23%, причем для метода локаль- ного гемолиза разброс не превышает 15%. Неодновременная постановка опытов приводит к еще большему разбросу резуль- татов (от 600 до 4000 АОК в различных чашках). Максимум антителообразования в культуре обычно наблюдается к 4-му дню, причем в ряде случаев он к этому времени уже прошел, в других — еще не наступил. В последнее время все чаще ис- пользуют 2-меркаптоэтанол в качестве обязательного компо- нента культуральных сред. Это вещество благоприятно влияет на выживаемость клеток и заметно повышает количество АОК [31. Функциональная активность системы культивирования за- висит от типа используемой сыворотки. Почти во всех без ис- ключения случаях используют сыворотку плода коровы. Не все компоненты этой сыворотки, однако, пригодны в одинаковой мере. Неблагоприятное воздействие некоторых составляющих сыворотки может быть нейтрализовано добавлением 2-меркап- тоэтанола [12]. Несмотря на высокую стоимость, подвержен- ность искажениям и ограниченность возможных областей при- менения, методы исследования первичного иммунного ответа in vitro могут стать незаменимым средством анализа механизмов гуморального иммунного ответа. 41
1.3.4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Boyutn A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. — Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1968, 21 (suppl. 77), 77. 2. Bussard A. E., Lurie M. Primary antibody response in peritoneal cells. — J. Exp. Med., 1967, 125, 873. 3. Chen C., Hirsch J. G. The effects of mercaptoethanol and of peritoneal mac- rophages on the antibody-forming capacity of nonadherent mouse spleen in vitro.—J. Exp. Med., 1972, 136, 604. 4. Croce C„ Linnebach A., Hall W. et al. Production of human hybridomas secre- ting antibodies to measle virus. — Nature, 1980, 288, 488. 5. Delfrassy J., Galanaud P„ Dormont J., Wallon C. Primary in vitro antibody response from human peripheral blood lymphocytes. — J. Immunol., 1977, 118, 630. 6. Hoffman M. K. Antigen-specific induction and regulation of antibody synthe- sis in cultures of human blood mononuclear cells. — Proc. Nat. Acad. Sci., 1980, 77, 1139. 7. Kozbor D., Roder I. C. Requirements for the establishment of high-titered human nomoclonal antibodies against tetanus toxoid using the Epstein Barr virus technique. — J. Immunol., 1981, 127, 1275. 8. Lefkovits I. Induction of antibody forming cell clones in microcultures.— Europ. J. Immunol., 1972, 2, 360. 9. Marbrook J. Primary immune response in cultures of spleen cells. — Lancet, II, 1667, 1279. 10. Mishell R. I., Dutton R. IF. Immunization of dissociated spleen cell cultures from normal mice. — J. Exp. Med., 1967, 126, 423. 11. Olson L., Kaplan H. S. Human-human hybridomas producing monoclonal antibodies of predefined autogenic specificity. Proc. Nat. Acad. Sci., 1980, 77, 5429. 12. Opitz H., Opitz U., Lemke H. et al. The role of fetal calf serum in the primary immune response in vitro. — J. Exp. Med., 1977, 145, 1029. 13. Schimpl A., Wecker E. Replacement of T-cell function by a T-cell product.— Nature, 1972, 237, 15. 14. Schreter M. H. The antibody response in vitro: Dissection of a complex system. — Lymphokines.— 1980, 2, 31. 15. Wichner S., Dorfling P„ Hilscher H. Beitrag zur Methode der Antikorperbil- dtmg in Zellkulturen. — Allergie und Immunol., 1973, 19, 155. 16. B. J. M. Zegers, С. J. Heijnen, IF. Kuis et al. T-cell regulatory function in patients with various immunodeficiencies as studied by in vitro antibody response of the blood lymphocytes. — In: Primary immunodeficiencies. In- serm symposium No 16. Eds/M. Seligmann, W. H. Hitzig. Elsevier. Amster- dam: North-Holland Biochemical Press, 1980, 129. 17. Zurawski V. R. Jr., Black P. M„ Haber E. Continuously proliferating human cell lines synthesizing antibody of predetermined specificity. — In: Monoclo- nal antibodies, Hybridomas. A new Dimension in Biological Analyses/Eds. R. H. Klennet, T. J. McKearn, К. B. Bechtol. — New York and London: Ple- num Press, 1980, 19. 1.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФФИННОСТИ АНТИТЕЛ 1.4.1. ВВЕДЕНИЕ Эффективность иммунных сывороток в организме и в реакциях АГ—АТ зависит не только от содержания антител, но и от силы связывания антигенов этими антителами. Сила связывания АТ может быть охарактеризована авидностью и аффинностью. 42
1.4.1.1. АВИДНОСТЬ Иммунизация позвоночных высокомолекулярными антигенами вызывает образование антител к различным детерминантам ан- тигена. Более того, антитела к одной и той же детерминанте ге- терогенны. Если бы было возможным определить каким-либо методом взаимную силу притяжения всех содержащихся в сы- воротке антител с полидетерминантным антигеном, то получен- ное значение отражало бы авидность системы. Речь шла бы при s i ом об относительных значениях, которые не были бы сравни- мы с данными, получаемыми на других моделях. При анализе такого рода взаимодействий следует учитывать вторичные реак- ции, приводящие к образованию нерастворимых комплексов; часто эти вторичные реакции используют для индикации. В та- ких сложных системах об авидности судят по способности сы- вороток образовывать нерастворимые комплексы с различными концентрациями антигена. Оставляя в стороне неточности изме- рения, можно утверждать, что данные об авидности антисыво- ротки (АС) имеют ограниченное значение для выяснения рас- пределения АТ по силе их связывания с отдельными детерми- нантами. Изучение авидности, хотя и помогает в решении некоторых биологических вопросов, все же недостаточно для детального анализа иммунного ответа. 1.4.1.2. АФФИННОСТЬ Под аффинностью понимают силу связывания активного центра молекулы АТ с соответствующей детерминантой АГ [3]. Для точного измерения аффинности необходимо, во-первых, ограни- чить гетерогенность исследуемых антител и, во-вторых, не до- пускать образования нерастворимых комплексов, т. е. исследо- вать обратимую реакцию. Первое требование может быть до- стигнуто использованием для иммунизации конъюгатов гаптен- носитель. В этом случае гаптен выступает в роли доминантной пммуподетерминанты известного химического строения и анти- тела образуются преимущественно к гаптену. Пока нет способа предотвратить образование гетерогенных антител к гаптену. Для реакции АГ—АТ используют только моновалентные гапте- ны. что позволяет избегать образования нерастворимых комп- лексов. Антитела к носителю не влияют на результаты измере- ний. Обратимая реакция связывания антидетерминанты АТ с моновалентным гаптеном (Г—) приводит в соответствии с за- коном действия масс к образованию растворимого комплекса антитело — гаптен АТ-ГГч^комплекс АТ—Г. 43
Аффинность в данном случае можно выразить константой ассо- циации Ка: или при использовании других символов: V ь Ка~ (N — Ь)-с • где Ка — константа ассоциации, b — концентрация связанного с АТ гаптена (в молях), с — концентрация свободного гаптена (в молях), N — концентрация антидетерминант антител (в мо- лях). Константа ассоциации равна обратной величине значения концентрации свободного гаптена (с) при условии, что полови- на антидетерминант связана с гаптеном (Ь), а другая половина не связана (N—Ь), т. е. N—b = b. Важнейшим условием оценки аффинности является определение концентрации антидетерми- нант (N). В простейшем случае для этого пользуются специфически очищенными антителами; возможно также определение антиде- терминант самостоятельными методами, например РИА, и коли- чественным осаждением (преципитацией). Можно определять концентрацию антидетерминант при помощи методов оценки аф- финности в условиях очень высоких концентраций гаптенов. В таких условиях вероятность насыщения участков связывания антител довольно высока и, зная Ь, можно вычислить N. Основ- ная проблема определения аффинности заключается в опреде- лении первых значений b и с в возможно более обширной обла- сти значений степени насыщения антидетерминант гаптеном. Для этой цели было предложено много методов: равновесный диализ [3], модифицированный метод осаждения сульфатом аммония [Ю], гашение флюоресценции [4], усиление флюоресценции [8], торможение преципитации гаптеном [9]. В настоящей главе мы ограничимся описанием первых трех ме- тодов. Реакции АГ—АТ могут быть изучены и другими метода- ми, например путем измерения степени поляризации флюорес- ценции [2, 7]. Последний метод пригоден также для исследова- ния кинетики реакций и равновесных состояний. 1.4.2. РАВНОВЕСНЫЙ ДИАЛИЗ 1.4.2.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Равновесный диализ представляет собой классический метод определения параметров связывания низкомолекулярных ли- гандов с биополимерами, в том числе аффинности антител. Рас- 44
твор АТ известной концентрации приводится в соприкосновение с раствором гаптена через полупроницаемую мембрану. Оба компонента растворены в одинаковом буфере для того, чтобы исключить разницу pH и ионной силы. Молекулы антител не приходят через мембрану, молекулы гаптена диффундируют че- рез нее в раствор антител и частично связываются с ними. Со- стояние равновесия достигается, когда концентрация свободного гаптена становится одинаковой по обе стороны мембраны. Вре- мя диффузии зависит от проницаемости мембраны, природы гаптена и температуры. Измерив концентрацию свободного гап- тена по обе стороны мембраны, можно определить количество гаптена, связанного с антителами. В процессе измерения сле- дует учитывать мембранные эффекты, например, адсорбцию. Поскольку молекулы антител несут определенный заряд, следу- ет учитывать эффект Доннана в том случае, если гаптен тоже заряжен. Обычно для проведения диализа используют целлофа- новые пакеты или специально сконструированные диализные ячейки. Данному вопросу посвящен исчерпывающий обзор Ei- sen [4]. 1.4.2.2. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Сосуд для диализа, раствор АТ, раствор гаптена, спектрофото- метр или радиометр, термостат. В качестве растворителя чаще всего используют 0,01 М фосфатный буфер pH 7,4 или 0,1 М трис-НС1-буфер, pH 7,4. Величина pH и ионная сила могут варьировать в зависимости от целей эксперимента. Для умень- шения эффекта Доннана целесообразно использовать забуфе- ренный 0,15 М раствор NaCl. Выбор концентрации гаптена и антител зависит от ожидаемой величины константы равновесия (табл. 2). Таблица 2. Примерная концентрации АТ для равновесного диализа при различных константах ассоциации Константа ассоциации М-' Концентрация антител г/л 1ХЮ5 3,6 1ХЮ6 0,36 1ХЮ7 0,36 1.4.2.З. ПОСТАНОВКА ОПЫТА В ячейку для диализа (в данном случае диализный мешок) вно- сят 2 мл раствора антител. Завязанный с обоих концов мешок помещают в подходящий сосуд, например, закрывающуюся стеклянную пробирку 10X75 мм. Затем в жидкость, против ко- 45
Рис. 9. Схема диализного устройства: кружками обозначены антитела, точ- ками — гаптен. Рис. 10. Схематическое изображение равновесного диализа (после достиже- ния состояния равновесия): светлыми кружками обозначены АТ, темными — АТ+гаптен, точками — гаптен. торой ведут диализ, вносят 2 мл раствора гаптена (рис. 9). Для эксперимента используют несколько пробирок с различны- ми исходными концентрациями гаптена, это позволяет получить более точные значения константы ассоциации. Кроме того, не- обходимо проводить контрольный диализ, для чего диализные мешки, внутри которых находится только буфер, помещают в растворы гаптена с различными по меньшей мере двумя кон- центрациями. Это необходимо для определения момента наступ- ления равновесия. Можно также определить количество гапте- на, неспецифически связанного с материалом диализного меш- ка. Пробирки с образцами устанавливают в штатив и инкубиру- ют в термостате при постоянном покачивании или вращении. Время наступления равновесия может колебаться от 4 при 30 °C до 20—40 ч при более низкой температуре. Определение концентрации гаптена. Кон- центрацию окрашенных гаптенов можно определять с помощью спектрофотометрии. Для измерения концентраций гаптенов, меченных радиоак- тивными изотопами, применяют счетчики ионизирующего излу- чения. Сначала определяют в отсутствие АТ количество неспе- 46
Таблица 3. Определение количества неспецнфически связанного гептена Исходная концентрация 10-6 М Равновесная кон- центрация при отсутствии неспецифического связывания I0-® М Измеренная концентрация в равновесном состоянии Неспецифическое связывание (% от концент- рации свободного гаптена) внутри снаружи 9,82 4,91 4,39 4,40 11,6 8,06 4,03 3,51 3,46 15,6 5,20 2,60 2,20 2,24 17,1 2,55 1,27 1,09 1,09 16,5 1,04 0,52 0,455 0,476 11,8 цифически связанного гаптена. Это можно сделать, измерив ко- личество гаптена в диализном мешке и в жидкости, омывающей мешок, после наступления равновесия. Количество неспецифиче- ски связанного гаптена равно разности между первоначально внесенным количеством гаптена и суммарным количеством гап- тена по обе стороны диализной мембраны. В табл. 3 приведены примеры подобных определений для пяти исходных концентра- ций. Условия опыта следующие: в диализной жидкости — 2 мл 14С-2,4-дннитроанилина, внутри диализного мешка 2 мл буфер- ного раствора (0,1 М трис-НС1, pH 7,4; 0,1 М КС1). Продолжи- тельность диализа составляет 5 ч при 30 °C в условиях медлен- ного вращения; специфическая активность гаптена — 520 имп/ /нМоль. Измерения проводили с помощью жидкостного сцинти- ляционного счетчика. Данные, приведенные в табл. 3, представ- ляют собой среднее значение данных, полученных в двух оди- наковых измерительных стаканах. Учет неспецифически связан- Таблица 4. Определение количества гаптена, связанного антителами. Результаты измерений Концентрация гаптена в диализ- ной жидкости (вне мешка) перед началом опыта 10-® М Концентрация свободного гаптена в диализ- ной жидкости при равновесии 10-е м Равновесная концентрация гаптена после внесения поправки I0-® М Количество гаптена, связан- ного антителами, нМоль Число молей связанного гаптена на 1 Моль АТ 9,82 3,34 4,41 4,28 1,60 8,06 2,52 3,65 4,52 1,69 5,20 1,41 2.39 3,92 1,47 2,55 0,48 1,20 2,88 1,08 1,03 0,083 0,51 1,71 0,64 Условия опыта: диализная жидкость вне мешка—2 мл иС-2,4-диннтроаиилииа s различных концентрациях. В диализном мешке 2 мл раствора антител (240 мкг/мл, очищенных антител, специфичных к динитрофенильной детерминанте). Буфер: 0,01 М трис-НС1, pH 7,5, 0,1 М КС1; продолжительность диализа 5 ч прн медленном вращении и температуре 30 °C. Данные в колонке Ш табл. 4 откорригированы на 15% в соответствии с данными колонки II табл. 3. В колонке IV табл. 4 приводятся данные о количестве связанного антителами гаптена с учетом исходных концентраций н разностей значений в колонках И и III (молярное соотношение гаптена, связанного с Ат, приведено в колонке V). 47
ного гаптена облегчает расчет количества гаптена, связанного антителами (рис. 10). В табл. 4 приведены данные измерений со- вместно с данными расчета. Поправка за неспецифическое свя- зывание антигена была принята равной в среднем 15% (см. табл. 3). 1.4.2.4. ОЦЕНКА МЕТОДА Методы определения гаптенов могут варьировать в зависимости от природы гаптена и ожидаемой константы ассоциации. При использовании окрашенных гаптенов в значениях констант ас- социации от 103 до 10s М-1 измерить концентрацию гаптена по оптимальной плотности. При исследовании систем с Ка выше 106 М-1 нужны более чувствительные методы, целесообразно ис- пользовать гаптены, меченные 14С. Радиоактивные гаптены весь- ма эффективны для определения Ка в области 106—107 Е-1. Для определения констант ассоциации в области 107—108 М-! необходимы гаптены, меченные тритием. При еще более высо- ких константах ассоциации гаптен находится в основном в свя- занном состоянии и его прямое определение затруднено. Следу- ет также учитывать, что при низких Ка необходимые для про- ведения измерений количества гаптена должны быть достаточ- но высокими, чтобы определить разницу между свободным и общим гаптеном внутри диализного мешка. Вследствие этого точное измерение концентрации АТ затруднено. При проведе- нии равновесного диализа не обязательно использовать высо- коочищенные антитела. 1.4.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФФИННОСТИ МЕТОДОМ ОСАЖДЕНИЯ СУЛЬФАТОМ АММОНИЯ 1.4.З.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Определение свободного (с) и связанного (Ь) гаптена необхо- димо для оценки аффинности, оно требует разделения обоих компонентов. Иммуноглобулины осаждаются в мягких услови- ях из раствора при 33—55% насыщения сульфатом аммония бед потери сродства к гаптену. Поэтому относительно просто изме- рить количество гаптена, связанного находящимися в осадке АТ и свободного гаптена в надосадочной жидкости. В дальней- шем этот метод будет подробно описан для оценки взаимодейст- вия анти-ДНФ-антител с 8-ДНФ-Ь-лизином [5, 10]. 1.4.З.2. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Для работы необходимы: анти-ДНФ-антисыворотка или специ- фически очищенные анти-ДНФ-антитела; 3Н-8-ДНФ-Ь-лизин; нормальная сыворотка, фосфатный буфер (0,01 М фосфат pH 7,4; 0,15 М NaCl); насыщенный на холоду раствор сульфата 48
аммония; центрифуга с охлаждением; пластиковые пробирки^ автоматические пипетки (50 и 100 мкл); жидкостный сцинтил- ляционный счетчик. 1.4.З.З. ПОСТАНОВКА ОПЫТА Для проведения эксперимента можно использовать очищенные- антитела или просто антисыворотки. Очищенные антитела раст- воряют в нормальной сыворотке, разведенной в соотношении 1 :5 или 1:10, обладающей низким сродством к соответствую- щему гаптену. Исследуемые антисыворотки, если они содержат достаточное количество белка, также разводят в соотношении 1 : 5 или 1:10. При необходимости делают дальнейшие разведе- ния. К 50 мкл раствора антител приливают пипеткой 50 мкл рас- твора гаптена. В качестве контроля неспецифического связыва- ния используют нормальную сыворотку в тех же степенях разве- дения. В зависимости от необходимой точности для определения аффинности применяют 5—20 различных концентраций гапте- на, перекрывающих охватывающую три порядка область кон- центраций (например, от 10~5 М до 10-7 М). Оба компонента тщательно перемешивают и выдерживают при 4 °C в течение 1 ч. Затем прибавляют равный объем (100 мкмл) насыщенного раствора сульфата аммония при температуре 4 °C и немедленно перемешивают, чтобы избежать денатурации АТ. После 30-ми- нутной инкубации при 4 °C, в течение которой дважды проводят кратковременное встряхивание, пробирки центрифугируют в те- чение 15 мин при 5000 об/мин при той же температуре. Надоса- дочную фракцию в количестве 100 мкл, в которой определяют концентрацию свободного гаптена, переносят в 10 мл сцинтил- лятора (жидкость Брея). Измеряют радиоактивность образца с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. 1.4.3.4. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ Количество свободного гаптена (с) определяют непосредствен- но по радиоактивности материала. Количество связанного с ан- тителами гаптена (Ь) вычисляют по разности между радиоак- тивностью надосадочной фракции раствора, содержащего спе- цифические антитела, и раствора, содержащего нормальную сы- воротку. Если концентрация антител известна, то может быть преобразовано в г (молярное соотношение Г/АТ). 1.4.3.5. ОЦЕНКА МЕТОДА Метод осаждения сульфатом аммония технически проще и тре- бует меньше времени, чем равновесный диализ. Значения Ка, получаемые с его помощью, отличаются от получаемых равно- весным диализом, но обладают хорошей воспроизводимостью [5, 6]. Обсчет результатов по уравнению Сипса часто приводит 4-990 49
к высоким индексам гетерогенности, что с точки зрения условий связывания соответствует несколько меньшей гетерогенности по- пуляции АТ. Антитела с низкой аффинностью так сильно изме- няются при осаждении, что теряют способность связывания, это в свою очередь приводит к искажению спектра антител, обус- ловленному техникой измерения. Это следует особенно учиты- вать при анализе систем с большой долей низкоаффинных анти- тел, следует также контролировать результаты, получаемые при осаждении сульфатом аммония методом равновесного диализа. 1.4.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АФФИННОСТИ ПУТЕМ ИЗМЕРЕНИЯ ГАШЕНИЯ ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ 1.4.4.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Еще один метод определения константы ассоциации антител основан на феномене гашения флюоресценции при взаимодейст- вии с некоторыми гаптенами [6]. Молекулы антител, облучае- мые УФ лучами с длиной волны 280—295 нм, испускают флюо- ресцентное излучение с длиной волны 345 нм. Такое соотноше- ние длин волн возбуждающего и эмиссионного излучения харак- терно для триптофана. Другие ароматические аминокислоты (тирозин и фенилаланин) также флюоресцируют, но их абсорб- ционные и эмиссионные максимумы находятся в области еще более коротких длин волн и отличаются малой интенсивностью. Связывание подходящего лиганда антителами сопровождается переносом энергии возбужденных остатков триптофана на свя- занный лиганд, что сопровождается исчезновением флюоресцен- ции в типичной области. Результатом переноса энергии, таким образом, является гашение триптофановой флюоресценции мо- лекул АТ. Энергия возбуждения может передаваться внутри молекулы антитела на расстояние Fab-фрагмента, т. е. прибли- зительно на 5 нм. Эффективность переноса энергии зависит, во- первых, от ориентации возбужденных остатков триптофана по отношению к связанному лиганду, во-вторых, от степени пере- крывания спектра флюоресценции антитела и спектра поглоще- ния лиганда. Особенно хорошо наблюдается тушение с нитро- ароматическими лигандами, например, ДНФ и ТНФ. Полное замещение лигандами участков связывания АТ приводит к га- шению определенной части общей триптофановой флюоресцен- ции. Эта максимальная степень гашения флюоресценции (Qmax) должна быть определена в эксперименте, поскольку различные параметры антител неоднородны в этом отношении. В первом приближении степень гашения флюоресценции зависит от числа «занятых» участков связывания антител. При известной кон- центрации АТ и лиганда по степени гашения Qi/Qmax можно су- дить о количестве связанного с антителами лиганда (г) и свобод- ного лиганда (с). В настоящей главе этот метод будет рассмот- рен применительно к анти-ДНФ-антителам. 50
1.4.4.2. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Спектрофотометр; очищенные специфические анти-ДНФ-антите- ла, нормальный 1g того же вида, раствор гаптена, например е-ДНФ-Ь-лизина. 1.4.4.З. ПОСТАНОВКА ОПЫТА В термостатируемую кювету флюориметра вносят 1 мл раство- ра антител. После стабилизации температуры образец облуча- ют УФ светом с длиной волны 280—295 нм и регистрируют ин- тенсивность флюоресценции на длине волны 345 нм. В получен- ные данные вводят поправку на флюоресценцию растворителя. Раствор АТ облучают УФ светом только во время измерения флюоресценции. Раствор гаптена добавляют вначале порциями по 10 мкл, затем — по 20 мкл, до тех пор пока объем добавлен- ного гаптена не достигнет 200 мкл. Концентрация е-ДНФ-Ь-ли- зпна должна составлять около 10“5 М. После каждого прибав- ления гаптена смесь необходимо тщательно перемешивать. Можно наносить раствор гаптена пипеткой на стеклянную па- лочку с расплющенным концом, который затем переносят в рас- твор антител и перемешивают. После каждого добавления гап- тена измеряют интенсивность флюоресценции (Qi). Для оцен- ки связывания необходимо определять максимальное гашение флюоресценции (Qmax) для каждого препарата антител. Насы- щение участков связывания АТ устанавливают титрованием 1X10~3 М раствором гаптена. Получаемое при такой концент- рации гаптена гашение флюоресценции должно быть откорри- гировано параллельным титрованием нормального ИГ. Титрова- ние проводят до молярного избытка гаптена, равного 200:1, к участкам связывания АТ. При этом практически все участки связывания оказываются «занятыми». Дальнейшее увеличение концентрации гаптена не увеличивает специфического гашения флюоресценции. 1.4.4.4. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ На рис. И представлены кривые титрования для определения Qmax и аффинности анти-ДНФ-кролика. Количество связанного гаптена после каждой добавки рассчитывается по следующей формуле: Qi b = n-АК уз-> Ч-тах где Qi — гашение флюоресценции после внесения соответствую- щего гаптена; b — количество связанного гаптена; АК — моляр- ная концентрация антител; п — число участков связывания на молекулу AT; Qmax — максимальное гашение флюоресценции при полном связывании антител гаптеном. При помощи (Ь) рас- 4* 51
о I I I I I I III I I О 50 100 200 300 12345 Концентрация гаптена (нмоль) Фис. 11. Гашение флюоресценции при помощи специфических кроличьих аити-ДНФ-антител при титровании гаптеном — е-ДНФ-Ь-лизином. Справа: титрование двух различных препаратов АТ с целью определения их аффинно- сти. Низкоаффинные АТ (1): Ко=6ХЮ5 М-1; высокоаффннные АТ (2): Ко=1,5Х108 М“‘. Слева: определение максимального гашения флюоресценции (Qmax==70%). Неспецифи- ческое гашение вследствие высоких концентраций гаптена корригируется параллельным титрованием с нормальным IgG. Область колебаний Qmax для кроличьих анти-ДНФ-ан- тител составляет 60—75% (прерывистые линии). считывают молярное соотношение связанного гаптена с антите- ламп (г). Количество свободного гаптена (с) равно разности количеств добавленного гаптена и связанного гаптена (Ь). Оп- ределение истинной средней константы ассоциации проводят по уравнению Сипса. 1.4.4.5. ОЦЕНКА МЕТОДА Изучение гашения флюоресценции при оценке аффинности АТ имеет по сравнению с другими описанными методами то пре- имущество, что оно требует очень малого количества антител, оно в 100—10 раз меньше, чем необходимо при использовании других методов. Титрование не занимает много времени, при- близительно 15 мин. Также становится возможным исследова- ние АТ в экстремальных условиях (температура, pH, ионная сила, влияние макромолекул), приводящих к денатурации бел- ков при длительном воздействии. К числу недостатков метода следует отнести неудобства, связанные с использованием высо- коочищенных антител и ограниченного круга гаптенов. Наилуч- шие результаты до настоящего времени получены при работе с нитрофенильным гаптеном. Данные, полученные методом гаше- ния флюоресценции, менее точны, чем при равновесном диали- зе, поскольку определение аффинности основано на вторичном -феномене связывания гаптена антителами. 52
4.4.5. ОЦЕНКА ДАННЫХ 1.4.5.1. ОБСУЖДЕНИЕ УРАВНЕНИЙ Вышеперечисленные методы пригодны в равной степени для определения концентрации участков связывания антител и для оценки их аффинности. Получаемые в эксперименте данные измерений касаются концентрации свободного гаптена (с), кон- центрации связанного гаптена (Ь) и, следовательно, молярного соотношения связанного с АТ гаптена (г). Взаимодействие ан- титела с моновалентным гаптеном представляет собой обрати- мую реакцию, подчиняющуюся закону действующих масс. АТ 4- Г = комплекс АТ — Г, (1) Константа ассоциации этой реакции рассчитывается по следую- щей формуле: Да“=[АТ](Г) или с применением символов: ка = (N —Ь)-с ’ Ка — константа ассоциации (М.-1), b — концентрация связанно- го с АТ гаптена (М), с — концентрация свободного гаптена (М), N — концентрация участков связывания АТ (М). Последнее уравнение может быть преобразовано в координатах Скэтчарда: 4 = N.KA-b-KA. (4) Ка может быть рассчитана, только если известна концентрация участков связывания антител. Эта предпосылка осуществима при работе с высокоочищенными АТ, но не с АС или гамма-гло- булиновой фракцией. Поэтому возникает необходимость в до- полнительных методах (радиоиммуносорбция, количественная преципитация) или в заранее определенных результатах. Кон- центрацию участков связывания АТ можно получить экстрапо- ляцией при графической обработке данных по связыванию в соответствии с уравнением Скэтчарда [4]. Строят график за- висимости b/с от Ь. Кривая, полученная соединением экспери- ментальных точек, экстраполируется для ее пересечения с осью абсцисс (рис. 12). Точка пересечения кривой и оси абсцисс со- ответствует N при теоретически бесконечно высокой концентра- ции гаптена и полном насыщении антител. с >- оо, —► Ь/с ► О 0=» Кл(N — Ь) -->- N = Ь. 63
Рис. 12. Оценка результатов связывания при определении аффинности. Слева: определение концентрации участков связывания антител (N) путем распределе- ния данных измерений в соответствии с уравнением Скэтчарда и экстраполяция до абс- циссы. Справа: оценка одинаковых данных по связыванию при помощи уравнения Сип- са. Представлены два различных по аффинности препарата аити-ДНФ-аитител кролика: (1) Ко=5.6Х1О5 М-\ а-ОД N-10.6X10-® М; (2) Ко-4,9X10® М-1, а=0,7, N-5.6X10-® М. Другие обозначения см. раздел 1.4.5.1. Уравнение 4 может быть преобразовано [9] в следующее урав- нение: 1 _ 1 1 b = NcKa + N • (5> Для построения графика этого уравнения 1/Ь наносится по от- ношению к 1/с, экстраполяцию проводят до их слияния при бесконечно высокой концентрации гаптена. с ---> оо , —► 1 /с--> 0 1 1 “* b “ N • Значение N может быть получено графически. Этот процесс имеет смысл только в том случае, когда используются высокие концентрации гаптена, приводящие к максимальному насыще- нию в экспериментальных условиях, в противном случае ошиб- ка при экстраполяции становится недопустимо большой. Приве- дение данных связывания различных систем АТ—Г при помо- щи уравнения Скэтчарда к графическому виду [4] наглядно показывает, что линейная зависимость характерна только для гомогенных антител. Суммарные препараты АТ к гаптену всег- 54
да дают более или менее изогнутую кривую. Такой вид графи- ка обусловлен гетерогенностью АТ по аффинности. В этих усло- виях невозможно получить репрезентативную константу ассо- циации. Наиболее точно можно судить о ней по уравнению Сип- са [5]. При помощи этого уравнения можно вычислить среднюю константу ассоциации (Ко), которая больше соответствует рас- пределению АТ по их аффинности. Уравнение Сипса основано на предпосылке, что значения аффинности распределяются рав- номерно и симметрично: Для практических целей лучше использовать логарифмическую форму уравнения Сипса: log(b/N — b) = a-logc 4-a-logKo, (7) Ко — истинная средняя константа ассоциации (М-1), а — индекс гетероген- ности (0<а<1). Значение индекса, равное 1, соответствует гомогенной по аф- финности популяции антител. Уменьшающиеся значения а ука- зывают на все большее отклонение Ка определенных популяций антител от средней константы ассоциации (Ко). Строят график зависимости log (b/N—b) от log с. По одной точке измерения можно построить уравнение прямой по методу наименьших квадратов. Индекс гетерогенности а соответствует при этом на- клону прямой. Истинная средняя константа ассоциации (так же, как и Ка) по определению равна обратной величине кон- центрации свободного гаптена (с) при условии, что половина связей АТ занята молекулами гаптена. Теоретические сообра- жения и вариабельность экспериментальных данных часто вы- зывали критику определения Ко при помощи уравнения Сипса. Причина этих отклонений — несоответствие реально существую- щего в природе распределения АТ по аффинности равномер- ному и симметричному распределению, принятому Сипсом. Бы- ли описаны сложные математические методы решения, берущие за основу непредетерминированное и предетерминированное распределение значений аффинности [I]. К тому же при рабо- те этими методами требуются такие затраты реактивов (увели- чение b и с) и времени подсчета данных, что их ценность для рутинной работы утрачивается. 1.4.5.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВАЛЕНТНОСТИ АНТИТЕЛ При наличии очищенных специфических антител становится возможным соотнести в молях количество связанного гаптена с количеством антител [3]. Молярное соотношение Г/АТ=(г) заменяет b в уравнениях 3—7. Крайние значения г, наблюдае- мые при полном насыщении участков связывания антител гап- 55
теном соответствуют валентности N-антител. Уравнение Скэт- чарда применительно к данному случаю выглядит следующим образом: — «= пКа — гКд (8> (обозначения см. уравнения 3—7). Для определения средней истинной константы ассоциации (Ко> можно использовать уравнение Сипса в следующей форме: log(r/n — г) = a-log с 4-a-log ко. (9) 1.4.5.З. РАСЧЕТ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИХ ВЕЛИЧИН КОНСТАНТ АССОЦИАЦИИ Значение константы ассоциации делает возможным расчет сво- бодной энергии по формуле: AG° = - RT In Ко, где R — универсальная газовая постоянная, Т — абсолютная температура. Определив Ко для.двух различных температур, можно опреде- лить энтальпию Н° по формуле, преобразовав ее b In Ко ДН« ЬТ •= R-Ta в уравнение: , K»j ДН»(Т2 —Т1) Og К01>- 2.303КТ2-Т1 ' Величину энтропии AS° определяют по формуле: AGO = ДНО - TAS0. 1.4.6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Bruni С., Germani A., Koch G., Strom R. Derivation of antibody distribution from experimental binding data. — J. Theor. biol., 1976, 61, 143. 2. Dandliker W. G„ Levison S. A. Investigation of antigen-antibody kinetics by fluorescence polarization. — Immunochemistry, 1967, 5, 171—173. 3. Eisen H. N. Equilibrium dialysis for measurement of antibody-hapten affini- ties.— Methods Med. Res., 1964, 10, 106—114. 4. Eisen H. N. Determination of antibody affinity for hapten by means of fluo- rescence quenching. — ibid. 115, 5. Fiebig H., Ambrosius H. Valenz und affinitat von Anti-Dinitrophenyl-Anti- korpern. — Acta Biol. Med. Germ., 1975, 34, 1681—1695. 6. Larralde C., Farber S. Confidence intervals for affinity constants, heteroge- neity indices and concentration of reactive sites estimated by 50% ammonium sulphate method on rat’s anti-DNP sers. — Immunochemistry, 1972, 9, 699. 7. Levison S. A., Portman A. J., Kierzenbaum F„ Dandliker W. B. Kinetic beha- vior of anti-hapten antibody of restricted heterogeneity by stopped flow fluo- rescence polarization kinetics. — Biochem. Biophys. Res. Comm., 1971, 43, 258—266. 56
8. Parker C. W. — In: The handbook of experimental Immunology/Ed. by D. M. Weir. Oxford, Blackwell Scientific Publication, 1967. 9. Pressman 0., Grossberg A. L. The structural basis of antibody specificity. — Amsterdam, W. A. Benjamin Inc. N. Y. — 1968. 10. Stupp K, Yoshida T., Paul W. E. Determination of antibody-hapten equilib- rium constant by an ammonium sulphate precipitation technique. — J. Im- munol., 1969, 103, 625—627. 11. Velick S. F., Parker C. W„ Eisen H. N. Exitation energy transfer and the quantitative study of the antibody hapten reaction. — USA, Proc. Nat. Acad, Sci., 1960, 46, 1470. 1.5. МЕТОД ЛОКАЛЬНОГО ГЕМОЛИЗА 1.5.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Метод локального гемолиза используется для выявления клеток, образующих антитела. Метод позволяет осуществлять количест- венные исследования сложного процесса образования В-лимфо- цитами антител in vivo и in vitro. Лимфоциты лимфоидных ор- ганов, периферической крови или культур клеток смешивают с густой суспензией индикаторных эритроцитов, распределяют суспензию тонким слоем и иммобилизуют ее. При последующей инкубации плазматические клетки синтезируют антитела, кото- рые диффундируют в окружающую среду и фиксируются на эритроцитах. В присутствии комплемента происходит лизис красных кровяных клеток. Образуются зоны гемолиза — свет- лые крупные пятна (иногда их называют бляшками), различи- мые невооруженным глазом (рис. 13). В центре каждой зоны гемолиза находится АОК—антителообразующая клетка (рис. 14). В целом число АОК соответствует числу зон гемолиза. Ес- ли известно количество внесенных ядросодержащих клеток (лимфоциты), то можно определить число АОК на 106 клеток исследуемого лимфоидного органа. Метод локального гемолиза (ЛГ) позволяет обнаружить и точно определить количество АОК в большой популяции лимфоцитов. Этим так называемым прямым методом определяют клетки, образующие IgM-антите- ла, высокоэффективные при гемолизе (рис. 15, а). Клетки, не секретирующие IgM-антитела, могут быть обнаружены так на- зываемым непрямым методом с антииммуноглобулиновой сыво- роткой, так называемой «проявляющей» сывороткой (рис. 15, б). Антииммуноглобулиновые антитела связываются с секретиро- ванными АТ, фиксированными на эритроцитах. Наличие IgG-ан- тииммуноглобулиновых комплексов на мембране эритроцитов способствует гемолизу в присутствии комплемента. Количест- во «непрямых» АОК можно определить по разности данных, по- лученных прямым и непрямым методами. Точные методы опре- деления АОК, синтезирующие 1g, не относящиеся к классу IgM, будут описаны ниже. При помощи метода локального гемолиза можно обнаружить не только АОК> синтезирующие 1g против 57

Рис. 15. Прямой (а) н непрямой (б) методы локального гемолиза в геле. ПС — проявляющая сыворотка. эритроцитарных АГ, но и вы- являть клетки, продуцирую- щие антитела к белкам, бак- териальным полисахаридам и гаптенам, если использо- а 1д М -антитела вать индикаторные эритро- циты, на мембране которых сорбированы соответствую- щие антигены. Эритроциты подвергаются пассивному лизису после образования комплексов АГ—АТ на их поверхности. Используя эри- троциты с фиксированным Комплемент 30 мин Комплемент ЗОмин на их поверхности протеи- ном А из золотистого ста- филококка [8] или антитела к IgG [6] в качестве прояв- ляющей сыворотки, можно обнаружить любые Ig-npo- цуцирующие клетки, незави- симо от их специфичности (поликлональная В-лимфо- цинарная реакция). Поскольку Лизис в отличие от оригинального ме- тода поликлональные антитела обнаруживают при помощи про- теина А и антител, конъюгированных с эритроцитами, эта моди- фикация получила название непрямого локального гемолия. Подстановка ЛГ может сильно варьировать в зависимости от используемых добавок или носителей (табл. 5). Обе важнейшие модификации ЛГ представлены на рис. 16. 1.5.2. МЕТОДИКА 1.5.2.1. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.5.2.2.1. Материалы и оборудование Для работы необходимы: шприцы для инъекций; иглы № 20; ножницы и пинцет; гомогенизатор или дедероновое (или из нер- жавеющей стали) сито; тонкая марля; чашки Петри диаметром Рис. 13. Зоны гемолиза, стандартная методика (прн рассматривании нево- оруженным глазом). Рис. 14. Антителообразующая клетка в центре зоны гемолиза (X100). 59
Таблица 5. Модификации метода локального гемолиза Предназначение Обозначение Определение АОК Определение Ig-образу- ющих клеток Тип антигена Добавки к суспензиям клеток Другое оборудование 1. IgM-АОК 2. не IgM-AOK 1. Изотипы 1g 2. Аллотипы 1g 3. Идиотипы 1g 1. Эритроциты 2. Растворимые антиге- ны, сорбированные на эритроцитах 1. Гели (агар, агароза) 2. Полутвердые добавки (карбоксиметилцеллю- лоза) 3. Без добавок 1. Чашки Петри 2. Планшеты для мик- • рокультур 3. Плоские стеклянные камеры Прямой ЛГ Непрямой ЛГ Обратный Л Г Прямой или непрямой; стандартный метод Пассивный ЛГ, прямой или непрямой Локальный гемолиз в геле (метод Джериа » Нордииа, 1963) Ингрема и Бюссара» 1965 Безгелевый ЛГ по Кан- нингему, 1965 Макро-ЛГ Безгелевый ЛГ Рис. 16. Стандартный метод (вверху) и метод Gunningham (внизу). 60
5 и 8 см; предметные стекла; пробирки; обоюдоклейкая лента (Scotch Таре № 410, Minnesota Mining Со); водяная баня на 47—49°С, центрифуга (ТЗО или Т23); автоклав; термостату влажная камера; лупа; микроскоп; счетная камера; механиче- ское счетное устройство; лампа для микроскопа или другой ис- точник света; раствор Тюрка; 0,2% раствор трипанового синего в 0,15 М NaCl; очищенный агар, очищенная агароза (например, Ferak, Западный Берлин); диэтиламиноэтил-(ДЭАЭ)-декстран (Pharmacia, Швеция); 2-меркаптоэтанол (Ferak, Западный Бер- лин); глютаровый альдегид (Serva, ФРГ); КонА; протеин А (Pharmacia, Швеция); парафиновая смазка; суспензия эритро- цитов барана (СЭБ), по меньшей мере однонедельной давно- сти, 20 или 10% в 0,15 М NaCl. Предварительно определяют гематокрит при помощи гематокритной центрифуги ТН1 или ТН2, разводят исходную суспензию сывороткой морской свин- ки. Адсорбированную СЭБ и разведенную в соотношении 1 : 10 средой Игла сыворотку морской свинки используют в качестве- источника комплемента. Необходима также анти-IgG сыворот- ка (проявляющая сыворотка, ПС). 1.5.2.1.2. Прямой метод локального гемолиза Подготовка чашек Петри (посуды): на дно чашек петри диаметром 8 см наносят слой агара в среде Игла с до- бавлением ДЭАЭ-декстрана, концентрация агара — 1,4%; до- давляют ДЭАЭ-декстран до концентрации 1 мг/мл, подавляю- щий антикомплементарное действие агара. Агар сравнительно' труднорастворим. Первоначально готовят двойную концентра- цию взвеси агара (2,8%) в дистиллированной воде, растворяют ее автоклавированием в течение 10 мин при 120 °C. Одновремен- но готовят среду Игла с добавлением ДАЭ-декстрана, оба рас- твора смешивают, когда агар несколько охладится. Величина pH золя должна составлять 7,4. В каждую чашку Петри вносят 3—4 мл золя агара. После застывания чашки могут храниться в холодильнике в течение 1—2 нед. Основной слой можно фор- мировать без добавления ДЭАЭ-декстрана. Перед использова- нием чашки инкубируют при 37 °C в течение 1,5 ч для удаления» воды с поверхности агара. Получение лимфоидных клеток. Грубую кле- точную суспензию из лимфоидных органов (селезенка, лимфати- ческие узлы, тимус) можно получить тремя различными мето- дами: размельчением органа в гомогенизаторе с притертым теф- лоновым пестиком в среде Игла, протиранием через тонкое си- то из дедерона или нержавеющей стали, измельчением пинце- том и ножницами. Последний метод наиболее щадящий (боль- шая доля живых клеток), но обычно выход клеток невелик. При обработке больших количеств материала с целью получе- ния максимального количества клеток экономнее использовать- сито или гомогенизатор. Время между забоем животного и по- 61
мещением суспензии клеток на водяную баню не должно превы- шать 15 мин. Обломки клеток и грубые агрегаты удаляют цент- рифугированием при 1g в течение нескольких минут или фильт- рованием через тонкую марлю. Гомогенность суспензии улуч- шается при ее многократном пропускании через шприц с тон- кой иглой (№ 20). Суспензию клеток костного мозга получают путем смыва длинных трубчатых костей мелких животных или путем пункции у человека. При определении АОК в перифери- ческой крови необходимо получить суспензию лимфоцитов, сво- бодную от автогенных эритроцитов, в противном случае можно пропустить лизис тестерных эритроцитов (см. раздел 3.1). По- лученную суспензию центрифугируют при 350 g и 4 °C, дважды отмывают в среде Игла и суспендируют в этой среде. Конечный объем взвеси зависит от концентрации клеток, которая опреде- ляется в предварительных опытах так, чтобы получать 200— 300 зон гемолиза на чашку. Клетки должны быть использованы в опыте не позднее чем через 1 ч после приготовления суспен- зии. Если обстоятельства не позволяют уложиться в этот срок, то клетки лучше хранить в виде осадка. Число АОК остается в этом случае неизменным. Всю работу до момента смешивания с золем проводят при 0—4 °C. Живые клетки подсчитывают на основании их резистентности к окрашиванию трипановым си- ним (мертвые клетки окрашиваются в голубой цвет). Приготовление верхнего слоя, постановка опыта (см. рис. 16): Расплавленную агарозу или агар (0,7% раствор в среде Игла, pH 7,4) с добавлением 1 мг/мл ДЭАЭ-дек- страна разливают в пробирки по 1 мл и выдерживают при 47— 49 °C в водяной бане. Затем добавляют 0,1 мл 10% суспензии ЭБ и выдерживают еще 10—15 мин при той же температуре, наконец вносят 0,1 мл охлажденной клеточной суспензии и тща- тельно перемешивают, избегая образования воздушных пузы- рей. Немедленно смесь переносят в заранее прогретую чашку Петри со сформированным нижним слоем и равномерно распре- деляют ее по поверхности. Во время застывания агарозы чаш- ки помещают на горизонтальную подставку, чтобы верхний слой геля был повсюду одинаковой толщины. Подготовленные чашки инкубируют во влажной камере в течение 2 ч при 37 °C. Нельзя допускать высыхание поверхности, так как это может умень- шить размер зон гемолиза ввиду образующихся при высыхании гипертонических условий инкубационной среды. В заключение наслаивают 1,5 мл комплемента морской свинки в разведении 1 : 10, инкубируют ЗОмин при 37 °C и производят подсчет зон ге- молиза. В нашей лаборатории для этой цели с успехом приме- няли прибор Dokumator DL II (VEB Carl Zeiss, JENA). Под- счет можно проводить при помощи стереомикроскопа или спе- циального устройства для подсчета колоний. Сомнительные зо- ны исследуют под микроскопом. В центре каждой зоны должна находиться лимфоидная клетка (см. рис. 14). После смывания компемента средой Игла пластины геля можно фиксировать 62
0,25% раствором глютарового альдегида в 0,9% NaCl или па- рами формалина. В этом случае подсчет зон гемолиза можно проводить и позднее. 1.5.2.1.3. Непрямой метод локального гемолиза Секвенциальный метод. После подсчета зон гемолиза, образовавшихся в прямом методе ЛГ, смывают комплемент 2— 3 мл среды Игла. Инкубируют чашки в течение 1 ч при 37 °C с разведенной антиглобулиновой сывороткой («проявляющей» ПС). Подбор оптимального разведения ПС имеет важное прак- тическое значение для успешной постановки непрямого ЛГ. Вы- сокие концентрации сыворотки маскируют «непрямые зоны», слишком низкие неэффективно «проявляют» их. Эффективность «проявления» следует контролировать для каждой серии анти- глобулиновой сыворотки. Для работы лучше всего использовать селезеночные клетки мыши, иммунизированной за 8—12 дней 4Х108 ЭБ. В каждой селезенке образуется приблизительно в 10 раз больше непрямых АОК, чем прямых. После удаления проявляющей сыворотки проводят повторную инкубацию с комплементом (30 мин); повторно подсчитывают зоны гемолиза. Разность числа зон гемолиза, определяемых прямым и непря- мым методами, дает количество АОК, не продуцирующих IgM. Торможение локального гемолиза (IgM) 2-м е р к а п т о э т а н о л о м или Ко нА. По окончании первой инкубации слой агарозы инкубируют еще 1 ч при 37 °C с 0,15 М 2-меркаптоэтанолом или раствором КонА (0,4 мг/мл в 0,9% NaCl). Агарозу троекратно отмывают с интервалом в. 10 мин раствором NaCl при 20 °C. Непрямые зоны гемолиза проявляют, как было описано выше, при помощи ПрС и комп- лемента. Наоборот, 2-меркаптоэтанол и КонА блокируют обра- зование прямых зон гемолиза (IgM) и практически не влияют на формирование IgG-зависимых зон гемолиза. Торможение IgM-зависимого локального гемолиза анти-ц- сывороткой. В ходе приготовления верхнего слоя к ЭБ и лимфоидным клеткам в зоне агарозы добавляют 0,05 мл анти-ц- сыворотки в оптимальном разведении (конечное разведение- 1 : 2000 и более). После 2-часовой инкубации при 37°C выявля- ются непрямые зоны гемолиза. Блокада IgM основана на специ- фическом взаимодействии с анти-р-антителами, препятствую- щем образованию IgM-зависимых зон гемолиза. 1.5.2.2. БЕЗГЕЛЕВЫЙ МЕТОД Гемолиз происходит в безгелевой среде. АОК и эритроциты смешивают в одном слое. Смесь клеток контактирует с комп- лементом в закрытой камере (см. рис. 16). Установка камер. Обезжиренные предметные стекла складывают бок о бок и соединяют обоюдоклейкой лентой по краям и по середине. Затем снимают верхний защитный слой' 63
тклейкой ленты и складывают оба стекла (как страницы книги), с тем чтобы получилось их полное наложение. Образующиеся при этом двойные камеры могут быть снова легко разделены. Каждая двойная камера имеет объем около 0,15 мл. Заполнение камер. Для прямого метода используют следующую смесь: 0,3 мл 20% суспензии ЭБ+0,1 мл свежего абсорбированного комплемента+0,5 мл среды Игла; для непря- мого метода — 0,3 мл 20% суспензии ЭБ-|-0,1 мл свежего аб- сорбированного комплемент а+ 0,2 мл анти-1§-сыворотки в раз- ведении 1 :40-4-0,4 мл среды Игла. К 0,4 мл каждой из этих смесей добавляют по 0,2 мл суспензии лимфоцитов с установ- ленным содержанием клеточных элементов (1—10ХЮ6/мл)> тщательно перемешивают и вносят по 0,15 мл в камеру. Если камера заполнена не до конца, объем доводят суспензией эрит- роцитов. Камеры герметизируют парафином, инкубируют 1 ч при 37 °C. Подсчет зон гемолиза проводят в течение ближайших 4 ч. Для предотвращения образования пузырей воздуха в камере непосредственно перед заполнением суспензию клеток подогре- вают до комнатной температуры; предметные стекла должны быть безукоризненно чистыми. В этом смысле хорошо зареко- мендовало себя многочасовое отмывание в проточной водопро- водной воде с последующей отмывкой дистиллированной водой и абсолютным этанолом. 1.5.2.3. ПАССИВНЫЙ МЕТОД ЛОКАЛЬНОГО ГЕМОЛИЗА Основную сложность пассивного метода ЛГ представляет со- бой непосредственный контакт индикаторных эритроцитов с ан- тигеном в одном слое, причем эритроциты не должны самопро- извольно разрушаться и в то же время должны быть доступны для антител и комплемента. Принципиально известны два спо- соба присоединения антигена к эритроцитам — химический и иммунологический. Описаны многочисленные варианты этих ме- тодов. Мы приводим выборочно некоторые из них с учетом при- меняемых антигенов и способов их конъюгирования с эритро- цитами. Получение индикаторных эритроцитов Белки: известны три метода химической конъюгации. Прежде всего это метод с применением ЭКДИ [1-этил-1,3 (3-диметил- аминопропил) карбодимида-HCl]. К 3 мл раствора белка (10— 80 мг/мл в зависимости от используемого блека) добавляют 0,1 мл 50% СЭБ (лучше использовать эритроциты козы), за- тем 0,5 мл раствора ЭКДИ (100 мг/мл). В качестве растворите- ля для всех компонентов применяют фосфатно-солевой буфер (ФСБ). После одночасовой инкубации при 2°C в покое эритро- циты отмывают ФСБ с 1% сывороткой. При помощи ЭКДИ получают сохраняющие стабильность в течение нескольких ме- сяцев эритроциты-мишени, особенно если к нативным или тио- 64
гликолированным эритроцитам присоединяют сукцинил- или 3- (2-пиридилтио)пропионил-производные белков [9, 10]. Самый простой метод конъюгирования белков с эритроцита- ми основан на использовании хлорида хрома. Процесс идет при следующих оптимальных условиях: 1 объем 50% сус- пензии ЭБ смешивают с 1 объемом 0,5 мМ СгС13 и */ю объема 2% БСА, тщательно перемешивают. Исходный 1% водный рас- твор хлористого хрома хранится в темной посуде при 4 °C в те- чение нескольких недель. Все компоненты смеси приготовляют на 0,15 М NaCl. Рекомендуется соблюдать последовательность операций. Смесь инкубируют в течение 1 ч при 37 °C, перемеши- вая ее несколько раз. Эритроциты трижды отмывают ФСБ (фос- фат ингибирует реакцию). Описаны и другие условия постанов- ки реакции [16]. Для постановки реакции локального гемолиза возможно использование ЭБ, конъюгированных с сывороточны- ми белками при помощи бис-д и а з от и р о в а н н о г о бен- зидина (БДБ) [12]. Белок в количестве 10—15 мг растворя- ют в 18 мл ФСБ, приливают к 0,5 мл 50% суспензии ЭБ, тща- тельно перемешивают на водяной бане со льдом. БДБ, который хранится при —70 °C, размораживают, берут 0,2 мл и немед- ленно смешивают с 2,8 мл 0,1 М фосфатного буфера (pH 7,4). Полученную смесь (3 мл) немедленно приливают к охлажден- ной до 0 °C СЭБ. Конъюгация происходит при 0°С в течение 30 мин при постоянном помешивании. Объем смеси доводят ФСБ до 50 мл. Отмывают эритроциты ФСБ. Приготовленные таким образом индикаторные эритроциты сохраняются при 4 °C в течение нескольких часов. Методы иммунологической конъюгации основаны на прямом или непрямом связывании белков с антителами к эритроцитам барана. АОК к гетерологическим иммуноглобули- нам, бычьему и человеческому (БГГ, ЧГГ) обнаруживаются сравнительно просто. ЭБ сенсибилизируют субгемолитическими количествами анти-ЭБ-антител. АОК против БГГ обнаружива- ют при помощи ЭБ, инкубированных с разведенной сывороткой против ЭБ крупного рогатого скота. Смешивают равные объемы 2,5% суспензии ЭБ и разведенной в соотношении 1:200 сыво- роткой против ЭБ (титр гемолизинов неразведенной сыворотки равен 1: 160, все компоненты растворяют в 0,15 М NaCl), инку- бируют 1 ч при 37 °C, смесь несколько раз перемешивают. Пос- ле отмывки эритроциты готовы к употреблению. Вместо вало- вых иммуноглобулинов можно использовать моновалентные Fab-фрагменты антител к эритроцитам или IgG кур (IgG птиц не связывает комплемент млекопитающих) в высоких концент- рациях, что исключает связывание комплемента с сенсибилизи- рованными эритроцитами. Оба эти способа можно с успехом использовать для конъюгирования различных гаптенов. Связы- вание белков с антителами или их фрагментами глютаровым альдегидом трудноосуществимо, применительно к ЛГ оно себя не оправдало. Индикаторные клетки после конъюгации иммуно- 5—990 65
логическим методом можно хранить в холодильнике в течение многих дней. Бактериальные полисахариды. Конститутивные полисахариды, например эндотоксины грамотрицательных бак- терий или капсульные углеводы пневмококка, могут быть ад- сорбированы на эритроцитах. В зависимости от метода их по- лучения они содержат различную долю фосфолипидов и бел- ков. Эндотоксин. Для конъюгации эндотоксинов с ЭБ пред- ложено большое количество сходных способов. Мы рекоменду- ем следующий метод: ЛПС сальмонелл (коммерческий препарат или препарат по Вестфалю) перед употреблением разводят да 0,1% концентрации в 0,15 NaCl, затем кипятят в течение 1 ч, охлаждают и прибавляют к 2—10 мл смеси 1 мл осадка ЭБ. Инкубируют 30 мин при 30 °C, затем трижды отмывают эрит- роциты. Особое внимание при выборе ЛПС и эритроцитов сле- дует обращать на перекрестные реакции антигенов эритроцитов с ЛПС бактерий. Капсульные антигены пневмококка. Строение этих АГ точно установлено, например, АГ пневмококка III ти- па представляет собой полимер З-р-О-гликозил-4-р-О-глюкуро- новой кислоты. Собирают надосадочную фракцию 8—12-часовых культур, pH которых доводили до 7,0 добавлением ИаНСОз. К Ю мл 1% суспензии ЭБ добавляют 0,9 мл фильтрата надоса- дочной фракции и инкубируют 45 мин при 37 °C. После инкуба- ции эритроциты трижды отмывают. Оптимальный объем фильт- рата для сенсибилизации ЭБ определяют эмпирически. Если сорбции подлежат нейтральные или безлипидные полисахариды, например декстран, то для оптимизации сорбции используют липоиды, например стеариновую кислоту. Процесс сенсибилиза- ции очень прост: к 1 мл 1% СЭБ добавляют 20 мкг О-стеарин- декстрана (1% остатков стеариновой кислоты) в объеме 20 или 50 мкл, перемешивают, смесь инкубируют 30 мин при 37 °C. Трижды отмывают ФСБ. Гаптены. К эритроцитам можно присоединять значитель- ное количество гаптенов, применяемых для обнаружения АОК. Антигенные детерминанты можно фиксировать на мембране эритроцитов непосредственно или с помощью конъюгатов бе- лок— гаптен. При последнем способе меньше повреждаются мембраны эритроцитов, чем при прямом химическом присоеди- нении гаптена. Мы приводим в качестве примера три различных способа прямого конъюгирования. Нитрофенилирование. К эритроцитам могут быть присоединены самые различные нитрофенильные производные. Наиболее часто применяемые ДНФ- и ТНФ-гаптены присоеди- няют при помощи водорастворимых реагентов, таких как бен- золсульфонат и динитрофторбензол [17]. Сульфоновокислотный метод. 20 мг 2,4,6-тринит- робензолсульфоновой кислоты (ТНБК) растворяют в 7 мл 66
0,26 М какодилатного буфера с pH 6,9. Добавляют 1 мл осев- ших ЭБ, суспензию перемешивают 10 мин при 23—25 °C. На- груженные эритроциты отмывают в холодном ФСБ до тех пор, пока надосадочная фракция не станет бесцветной. Все процеду- ры, в том числе и связывание гаптена, проводят в темноте для предотвращения его фотоиндуцированного отщепления. Ацилазидный метод. Для присоединения к эритроци- там 4-гидрокси-3,5-динитрофенилацетазид (NNP)- и З-йод-4- гидрокси-5-нитрофенилацетазид (NIP)-групп используют ацил- азидные производные, образующие амидные связи с аминогруп- пами мембран эритроцитов. Конъюгация NNP-азида с ЭБ про- ходит в 0,12 М карбонатбикарбонатном буфере с pH 9,25. Сус- пензию отмытых ЭБ (1%) смешивают с NNP-азидом в концент- рации 0,001—1 мг/мл. После 16-часовой инкубации при 4 °C конъюгированные эритроциты отмывают 3 раза. Диазотирование. Диазотирование относится к про- стейшим способам конъюгации. Для проведения реакции сме- шивают равные объемы 0,002—0,005 М диазореактива и 50% СЭБ, доводят pH до 7,4—7,8, инкубируют 1—2 ч при 20 °C или оставляют на ночь при 4 °C. Для повышения стабильности конъюгированных эритроцитов небольшой избыток диазореакти- ва нейтрализуют прибавлением ароматического амина, избыток нитрита нейтрализуют 0,1 М мочевиной. После диазотирования ЭБ отмывают в растворе альбумина или сыворотки с целью удаления не связанных ковалентно продук- тов реакции. При помощи этого метода можно обнаруживать АОК, продуцирующие ИГ против азобензоларсоната, азобензол- сульфоната и азобензилгалактозида. Пенициллиновая конъюгация. Бензилпеницилли- на калиевая соль (БПК) присоединяется к ЭБ в изотоническом триметиламиновом буфере с pH 10 или в 0,14 М глициновом буфере с pH 10 [15]. Растворяют 600 мг БПК (1,6 мМоль или 106 ME) в 20 мл буфера и прибавляют 1 мл осадка эритроци- тов. Смесь инкубируют при 25 °C в течение 50 мин, клетки от- мывают 4 раза. При описанных условиях бензилпенициллоиль- иые группы ковалентно связываются через амидные группы с мембраной эритроцитов. 1.5.2.4. ОБРАТНЫЙ ЛОКАЛЬНЫЙ ГЕМОЛИЗ (ОЛГ) Основные этапы ОЛГ представлены на рис. 17. В настоящее время используют преимущественно нагруженные протеином А индикаторные эритроциты барана, поскольку протеин А пред- ставляет собой более доступный продукт, чем антиглобулиновые антитела, очищенные методом аффинной хроматографии. Про- теин А легче конъюгируется с ЭБ, чем антиглобулиновые анти- тела. ОЛГ с протеином А [8]. Протеин А из золотистого ста- филококка присоединяют к ЭБ при помощи СгС13. Все реаген- 5* 67
Рис. 17. Непрямой метод локального гемолиза для определения Ig-продуци- рующнх клеток. ты растворяют в 0,15 М NaCl. Один объем осадка отмытых эрит- роцитов смешивают с одним объемом раст- вора протеина А (0,5 мг/мл). Прибавляют 10 объемов 2,5хЮ-4 М раствора СгС1з-6Н2О, инкубируют 45 мин при 37°C, многократно от- мывают. При постанов- ке ЛГ в геле полезно последовательно инку- бировать пробу с ПС и комплементом в тече- ние 1 ч, т. е. общая продолжительность ин- кубации составляет 3 ч. Предварительно опре- деляют оптимальную концентрацию ПС с целью избежать эф- фекта прозоны. Следует отдавать предпочтение кроличьим АС перед козьими, поскольку они эффективнее связывают проте- ин А и, кроме того, содержат меньше АТ, не связывающих комп- лемент. Технические усовершенствования протеин-А-зависимо- го ЛГ описаны в работах [2, 18]. 1.5.3. ОЦЕНКА МЕТОДА Локальный гемолиз (стандартная методика) в отличие от дру- гих методов позволяет обнаруживать и количественно опреде- лять единичные АОК среди нескольких миллионов клеток в те- чение 2 ч. Существенное значение для успеха эксперимента име- ет выбор агара. Оптимальным следует считать формирование верхнего и нижнего слоя геля на агарозы, т. к. агароза не инактивирует комплемент. При использовании чистого агара возникает необходимость внесения ДЭАЭ-декстрана. Этот поли- катион адсорбирует сульфополисахариды, выделяющиеся при кипячении агара, которые связывают ионы Са2+ и Mg2+. Имен- но образованием сульфополисахаридов обусловлено ингибирую- щее действие агара на комплемент. Колебания концентрации агара в пределах 0,4—1% не влияют на число зон гемолиза и их диаметр. Повышение концентрации свыше 1 % снижает число зон гемолиза и уменьшает их размеры. Для ЛГ лучше всего ис- пользовать ЭБ, хранившиеся в течение 1—3 нед в растворе Оле- 68
вера. Свежие эритроциты малочувствительны к иммуногемоли- зу; длительно хранившиеся клетки, напротив, чрезмерно хруп- ки. Следует всегда помнить об генетически обусловленной раз- личной чувствительности эритроцитов разных особей [1]. По- этому желательно всегда использовать эритроциты одного и того же животного. При меньшей концентрации ЭБ образуются зоны гемолиза большего размера, причем их число не уменьша- ется. Однако при рекомендованных нами концентрациях до- стигается большая надежность результатов, особенно если ЭБ отличаются повышенной хрупкостью. Температура 47—49 °C не влияет на индикаторные эритроциты, но лишает лейкоциты жизнеспособности. В связи с этим смешивание лимфоидных клеток с расплавленной агарозой представляет собой самую тонкую операцию при постановке ЛГ. Оно должно проводиться почти одновременно с распределением цитосодержащего золя по поверхности нижнего слоя стереотипными, отработанными движениями рук. Удлинение периода инкубации перед внесени- ем комплемента не оказывает влияния на размер и величину зон гемолиза. Температура инкубации менее 37 °C приводит к снижению зон гемолиза. В качестве источника комплемента ча- ще всего используют сыворотку морской свинки, адсорбирован- ную ЭБ; этот препарат дает наилучшие результаты с мышины- ми АТ к ЭБ. Если иммунизируют другие виды животных раз- личными эритроцитами, то следует также подбирать подходя- щие сыворотки различных животных в качестве источника комплемента с целью получения оптимальных результатов. Зо- ны ЛГ, образующиеся до внесения комплемента и не содержа- щие в центре клетки с ядром, — ложные и исключаются при подсчете результатов. Причиной образования ложных зон ЛГ могут служить трещины или нерастворившиеся кусочки агара, дегенерировавшие клетки или агрегаты клеток, колонии гемоли- тических бактери и в редких случаях клетки донора эритроци- тов, образующие гемолизины. Еще одной причиной образова- ния ложных зон ЛГ может стать перенос пассивно адсорбиро- ванных антител, о возможности которого всегда необходимо помнить [14]. Существуют методы непосредственного определения и подсчета так называемых непрямых, т. е. He-IgM-продуцирующих АОК. Эти методы свободны от неопределенностей конвенциональных методов, в которых подсчет He-IgM-продуцирующих АОК осно- ван на учете разности количества зон ЛГ наблюдаемых прямым и непрямым методом. Даже при оптимальном разведении ПС вследствие анти-ЕаЬ-активности ПС, учитывая неодинаковое торможение образование IgM-зависимых зон ЛГ, эти методы приводят к заниженным оценкам непрямых АОК. Элиминация IgM-зависимых зон ЛГ не только снижает затраты времени (2-кратный подсчет зон ЛГ), но, что еще более важно, исклю- чает стадию проявления непрямых IgM-образующих клеток по- лпспецифической анти-IgM сывороткой. При наличии моноспе- 69
цифических АС можно определять различные алло- и изотипы иммуноглобулинов в реакции непрямого ЛГ. Наиболее прост, экономичен и чувствителен безгелевый метод. Он особенно удо- бен при микроманипуляциях и морфологическом исследовании отдельных живых АОК- Высокая чувствительность метода обусловлена ограниченной диффузией антител в монослое ин- дикаторных ЭБ; лизис даже 7 отдельных эритроцитов приводит к появлению заметной зоны гемолиза. Этим обусловлен и боль- ший диаметр зон ЛГ, чем тот, который наблюдается при работе с гелем. Недостатком безгелевого метода является необходи- мость подсчета зон гемолиза в течение нескольких часрв и не- возможность фиксации препарата. Можно исследовать лишь ограниченное число лимфоидных клеток. При концентрации лим- фоцитов 5Х107/мл бйльшая часть зон ЛГ маскируется автоло- гичными эритроцитами и лейкоцитами. Этих недостатков лишен модифицированный метод [12], при котором монослой индика- торных эритроцитов связан с поверхностью пластика. Предло- жено много вариантов постановки реакции локального гемолиза, важнейшие из иих перечислены в табл. 5. Часто вместо геля ага- ра или агарозы применяют полутвердые субстанции, например, карбоксиметиллюлозу (КМ) в закрытых или открытых системах. Системы с КМ-целлюлозой пригодны не столько для рутинных работ, сколько для наблюдения за АОК в течение длительных периодов, так как известно, что КМ-целлюлоза создает опти- мальные условия для выживания клеток. Многие авторы отка- зываются от чашек Петри, распределяя смесь золя агарозы с клетками по поверхности предметного стекла с преформирован- ным слоем 0,1—0,2% агарозы. Эта модификация особенно удоб- на при работе с моноспецифическими сыворотками и небольши- ми количествами конъюгированных с различными веществами эритроцитов. Она непригодна для работы с большими количе- ствами лимфоцитов ввиду многочисленности зон ЛГ. Сверхтон- кий слой агара на предметных стеклах особенно удобно при- менять для цитологических и авторадиографических исследова- ний. Микромодификация ЛГ позволяет проводить прямое ис- следование культур В-лимфоцитов в микропланшетах [11]. Пассивный ЛГ представляет собой довольно тонкий метод, при- менение которого требует от экспериментатора большого мас- терства. Условия конъюгирования, при которых получают оп- тимальную поверхностную плотность детерминант на эритроци- тах, как правило, подбираются экспериментально. Методы конъюгирования, описанные для РПГА, не пригодны для реак- ции ЛГ, поскольку эритроциты, подготовленные для гемагглю- тинации, содержат очень мало детерминант для того, чтобы после наслоения АТ и комплемента образовались зоны ЛГ. Раз- витие ЛГ в геле зависит от изотипа и аффинности выделяемых АОК антител. Заниженное число АОК в реакции пассивного ЛГ обусловлено неадекватной конъюгацией эритроцитов. Спе- цифичность ЛГ можно повысить, тормозя реакцию введением 70
Рис. 18. Образование анти- телообразующих клеток в селезенке мышей, иммунизи- рованных эритроцитами ба- рана, в ходе первичного (1) и вторичного (2, 3) иммун- ного ответа. 1, 2 —прямые АОК (IgM); 3 — непрямые АОК (не IgM). в агар свободного ан- тигена или гаптена. Та- ким же путем можно оценивать авидность секретируемых АОК антител [3]. Этот ме- тод основан на извест- ном факте избиратель- ного торможения ма- лыми концентрациями свободного антигена и гаптена локального ге- молиза, обусловленно- го высокоавидными антителами, по сравнению с ЛГ, обуслов- ленным низкоавидными антителами. Для статистической обра- батки результатов локального гемолиза в геле рекомендуется представлять данные в виде десятичных логарифмов, что позво- ляет получить распределение отдельных результатов в выборке, приближающееся к биноминальному [7]. Ошибка метода ЛГ составляет около 15%. Колебания, обусловленные качеством материала, полученного от животных, существенно выше, коэф- фициент вариации в данном случае может достигать 0,5. ЛГ имеет важное значение для фундаментальных иммунологиче- ских исследований. Благодаря этому методу были получены весьма существенные результаты в области исследования регу- ляции гуморального иммунитета и изучения структуры и жизне- деятельности АОК in vivo и in vitro. В качестве примера на рис. 18 представлена кинетика первичного и вторичного иммун- ного ответа мыши, выражающаяся в изменении количества АОК в селезенке. ЛГ уже в течение некоторого времени исполь- зуется в клинике, в частности при исследовании периферической крови пациентов с различными заболеваниями иммунной систе- мы. Определяют, в частности, способность В-лимфоцитов к об- разованию специфических ИГ, а также контроль активности лимфоцитов со стороны регуляторных клеток [4, 5]. 1.5.4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Обзоры 1. Dresser D. W., Greaves М. F. Assays for antibody-producing cells. — In: Handbook of experimental Immunology/Ed. D. M. Weir. — V. 2, chap- ter 27. — Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1973. 71
2. Jerne N. К., Henry С., Nordin A. A. et al. Plaque-forming cells: methodology and theory. — Transplant. Rev., 1974, 18, 130—131. 3. lerne N. K., Henry C., Nordin A. A. et al. Plaque techniques for recognising individualy antibody-formong cells. — In: Methods in Ummunology and Im- munochemistry/Eds. C. A. Williams and M. W. Chase. — Vol. V, 335—370.— New York: Academic Press, 1976. Цитированные литературные источники 1. Bell D. A., Leblond P. F., Leddy J. R. et al. Immune hemolysis. I. Differing susceptibility of three genetic types of sheep red cells. — J. Immunol., 1972, 108, 467—479. 2. Burns G. F., Pike B. L. Sontanious reverse haemolitic plaque formation. Technical aspects of the protein A assay. — J. Immunol., 1981, 41, 269— 277. 3. De Lisi C., Goldstein B. The kinetics of hemolitic plaques formation II and III. —J. Theor. Biol., 1975, 51, 313—346. 4. Fauci A. S. Human В-cell function in a polyclonally induced PFC system. Cell triggering and immunoregulation. — Immunol. Rev., 1979, 45, 93— 116. 5. Geha R. S. Regulation of Human В cell activation. — Immunol. Rev., 1979, 45. 275—305. 6. Ginsburg W. W., Finkelman F. D., Lipsky P. E. Circulating and mitogen induced immunoglobulin-secreting cells in human peripheral blood: evaluting by a modified reverse hemolitic plaque assay. — J. Immunol., 1978, 120, 33—39. 7. Gottlieb C. F. Application of transformations to normalize the distribution of plaque forming cells. — J. Immunol., 1974, 113, 51—57. 8. Gronowicz A., Coutinho A., Melchers F. A plaque assay for all cells secreting Ig of given type or class. — Europ. J. Immunol., 1976, 6, 588—590. 9. Jou I. H., Bankeri R. B. Coupling of protein antigens to erythrocytes through disulfide bond formation: Preparation of stable and sensitive target cells for immune hemolysis. — Proc. Natl. Acad. Sci-. USA, 1981, 78, 2493—2496. 10. Jou У. H., Jonsos G., Pressman D. Succinilation of haptenprotein conjugates facilitates coupling to erithrocytes by water soluble carbodiimide: preparation of stabel and sensitive target cells for use in hemolitic assays. — J. Immunol., 1981, 42, 79—92. 11. Kappler J. W. A micro-technique for hemolitic plaque assays. — J. Immunol., 1974, 112, 1271. 12. Kennedy 1. C., Axelrad M. A. An improved assay for hemolitic plaque for- ming cells. — Immunology, 1971, 20, 253—257. 13. Lefkovits I., Cosenza H. Assay for plaque forming cells.— In: Immunolo- gical methods/Eds. I. Lefkovitz, B. Pernis. New York, Academic Press, 1979, p. 277—285. 14. Muchmore A. V., Koshi I., Dobley N., Blaese R. M. Artifactual plaque forma- tion in vitro and in vivo due to passive transfer of specific antibodies. — J. Immunol., 1976, 116, 1016—1019. 15. Naor D., Негу C., Fudenberg H. H, An in vitro immune response to penicil- lin.— J. Immunol., 1971, 107, 302—305. 16. Sweet G. H., Welborn F. C. Use of chromium chloride as the coupling agent in a modified plaque assay of cells producing antiprotein antibody. — J. Im- munol., 1971, 106, 1407—1410. 17. Trump G. N. Preparation of dinitrofluorbenzene-treated sheep erythrocytes for detection af anti-DNP-plaque forming cells. — J. Immunol., 1972, 109, 754—760. 18. Van Oudenaren A., Hooijkaas H., Benner P. Improvement of the protein. A aue assay for immunoglobulin secreting cells by using immunoglobulin- eted guinea pig serum as a source of complement. — J. Immunol. Methods, 1981, 43, 219—224.
2. РЕАКЦИИ АНТИГЕН-АНТИТЕЛО 2.1. ИММУНОДИФФУЗИЯ 2.1.1. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ Развитие техники иммунодиффузии (ИД) стало возможным благодаря использованию гелевых носителей. В 1946 г. Уден описал метод простой линейной иммунодиффузии. Он основан на следующем принципе: стеклянные пробирки заполняют жид- ким агаром, содержащим антисыворотку. После застывания ге- ля (агара) раствор АГ (например, сыворотка) наслаивают на гель (нисходящая ИД), или же нижний, открытый, конец про- бирки с гелем погружают в сыворотку так, что АГ проникают в столб геля снизу (восходящая ИД по Удену). В зависимости от специфичности заключенных в геле АТ, в ходе ИД возникает одна из нескольких полос преципитации, длину пробега которых от линии старта можно измерить. Длина пробега полосы преци- питации при прочих равных условиях пропорциональна кон- центрации АГ. Простая линейная диффузия по Удену внесла существенный вклад в исследование теоретических основ ИД. Впоследствии этот метод был вытеснен более совершенными. В 1947 г. Ухтерлони в Швеции и в 1948 г. Elek в Англии описа- ли двойную радиальную иммунодиффузию. В 1963 г. Манчини впервые описал простую радиальную ЙД (см. 2.1.2 и 2.1.3). 2.1.1.1. ГЕЛИ И ИХ СВОЙСТВА Основная функция геля — локализация преципитата. Она ста- новится возможной, если растворенные АГ и АТ легко диффун- дируют в геле, но образующиеся иммунные комплексы ввиду их величины остаются внутри ячеек геля. Благодаря локализации преципитата достигается следующее: а. В множественных системах АГ-АТ отдельные компоненты ре- акции диффундируют с различной скоростью, обусловлен- ной неодинаковой величиной молекул и их концентрацией. В связи с этим могут образовываться множественные прост- ранственно разделенные преципитаты, т. е. создается возмож- ность анализа множественных систем. б. По форме и расположению преципитатов можно судить о диффузионных свойствах и, следовательно, об относительной молекулярной массе АГ или АТ. в. Порядок расположения линий преципитации по отношению друг к другу позволяет делать выводы об полном или час- 73
тичном иммунохимическом сходстве, а также об отсутствии такового. г. Исходя из величины ареала и удаленности от линии старта иммунных комплексов, можно проводить их количественное определение. Наиболее распространены гели агара и агарозы; гели жела- тины, пектина, крахмала, полиакриламида или ацетата целлю- лозы применяются в реакциях иммунодиффузии реже. 2.1.1.2. ДИФФУЗИЯ И ПРЕЦИПИТАЦИЯ В ГЕЛЕ При концентрации агара 20 г/л средний размер пор геля со- ставляет Знм. Можно считать достоверным, что обычно приме- няемые концентрации геля от 3 до 15 г/л существенно не влия- ют на диффузию большинства компонентов реакции АГ—АТ. Поэтому для всех компонентов процесса до их соединения спра- ведливы законы свободной диффузии. В соответствии со вторым законом Фика концентрация вещества (С) на определенном расстоянии от линии старта (h) является функцией времени (t) 6С 8С & t=D Ы* • D — коэффициент диффузии, зависит от температуры, вязкости среды и ра- диуса диффундирующей молекулы. где R — универсальная газовая постоянная, N — число Авогадро, Т — темпе- ратура в градусах Кельвина, ц — вязкость среды, г — молекулярный радиус. При прочих равных условиях D представляет собой постоянную величину. Это означает, что для получения сравнимых результа- тов при ИД необходимо стандартизовать такие показатели, как концентрация геля, температура и время диффузии, концент- рация АГ и АТ. Это особенно важно, когда к моменту оценки диффузия еще не завершена (простая линейная ИД, простая радиальная ИД в модификации Фехей и Мак-Келви [8]). Встреча компонентов реакции АГ—АТ изменяет или прекраща- ет свободную диффузию. Последнее имеет место в случае обра- зования стойких преципитатов, например при простой или двой- ной радиальной ИД. Важно отметить, что наиболее выражен- ная преципитация наблюдается в зоне эквивалентности. Опти- мальную пропорцию можно определить при взаимном проник- новении компонентов реакции. Это становится более понятным из рис. 19. В данном случае мы полагаем, что два наиболее важных фактора образования преципитата — коэффициент диф- фузии и относительные концентрации — примерно равны. В ме- сте первого контакта молекул АГ и АТ (линия 2) образуются преципитаты, которые увеличиваются в размерах по мере по- 74
Рис. 19. Схематическое изображе- ние процессов, протекающих при двойной иммунодиффузии. 1 — градиент концентрации АГ и АТ вско- ре после внесения растворов в резервуары; 2 — первый контакт партнеров реакции; 3 — процесс диффузии в основном окончен, преципитат полностью сформирован. ступления эквивалентных коли- честв партнеров реакции. Пре- ципитация становится полной при нивелировании градиента концентрации (линия 3). По Ухтерлони система называется сбалансированной, если место первого образования иммунных агрегатов и место их последую- щего отложения совпадают. Если один из компонентов реакции диффундирует медленнее, чем другой, то комплексы АГ—АТ, возникшие при первом контакте, медленно растворяются вслед- ствие смещения зоны эквивалентности под влиянием притока более медленно диффундирующего партнера компонента. Вновь образующиеся комплексы формируются все ближе и ближе к резервуару быстро диффундирующего компонента. В соответствии с вышеизложенным в данном случае можно говорить о несбалансированной системе. Перемещение линии преципитации является, таким образом, следствием образова- ния преципитата, распада комплексов, повторного выпадения преципитатов и т. д. 2.1.1.3. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ПРЕЦИПИТАЦИЮ Образование первичных комплексов после контакта АГ и АТ происходит в течение нескольких минут. Для полной преципи- тации необходимо 24—48 ч. Для высокомолекулярных компо- нентов при наличии «слабых» сывороток время полной преци- питации увеличивается до 8 дней. Температура не играет осо- бой роли, она может быть 0—4 °C, 20 °C или 37 °C. Антисыво- ротки лошади дают лучшую преципитацию при температуре, ниже комнатной; эта закономерность отсутствует при использо- вании сыворотки морской свинки. Колебания pH в пределах 6,4—8,5 на процесс преципитации влияния не оказывают. АС млекопитающих дают оптимальную преципитацию при физио- логических концентрациях NaCl; АС птиц лучше преципитиру- ют специфические АГ в средах с высокой ионной силой, напри- мер, в 1,2 М NaCl. Наличие детергентов, органических раство- рителей, мочевины и других соединений может препятствовать образованию иммунных агрегатов. Они могут вызывать дена- турацию или распад молекул белка на субъединицы. АС лоша- 75
Рис. 20. Схема классифика- ции методов иммунодиф- фузии по Ухтерлони. Темные области — растворы АГ; заштрихованные области — АТ или гель с антисывороткой; бе- лые области — нейтральный гель. ди, как правило, дают преципитацию в зоне эквивалентности (обыч- но довольно широкая), они образуют резкие тонкие полосы. Преципитаты, образуемые АС морских свинок или АС «типа морских свинок» со специфическими АГ, образуют более широкие зоны. При избытке АТ такого типа образуются так называемые «флаги», «шлейфы» и др. Преимуществом сы- вороток «типа морской свинки» является возможность исследо- вать с их помощью обширную область концентраций, так как даже при избытке антител возникают преципитирующие комп- лексы. 2.1.1.4. КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ИММУНОДИФФУЗИИ Различают простую и двойную иммунодиффузию. В первом случае диффундирует один компонент,-во втором оба, в зависи- мости от того происходит ли диффузия по одной общей оси или во все стороны радиально, из резервуара в среду. ИД называет- ся линейной или радиальной. Даже расположенные под углом друг к другу резервуары представляют известные удобства для определенных целей. Общая схема методов диффузии представ- лена на рис. 20. 2.1.1.5. СИСТЕМЫ АНТИГЕН—АНТИТЕЛО В зависимости от состава различают простые, сложные и мно- жественные системы. В простых системах АГ, несущий детерми- нанту «а», реагирует с АТ, несущим антидетерминанту «анти- а». В результате взаимодействия АГ с АТ в геле появляется ли- ния преципитации. Если молекула АГ содержит несколько де- терминант различной структуры (а, Ь, с), к каждой из которых в сыворотке имеются соответствующие АТ со специфичностью А, В, С, то в этом случае образуется только одна линия пре- ципитации, т. е. система является простой. К сложным систе- мам относят такие, в которых ввиду структурного сходства различных молекул антигенов наблюдаются перекрестные реак- ции. О множественных системах говорят в тех случаях, когда одновременно происходят реакции нескольких простых или сложных систем. Эти данные приведены на рис. 21. 76
Рис. 21. Варианты систем АГ—АТ при постановке реакции иммунодиффу- зии (объяснение в тексте). 2.1.1.6. СПЕЦИФИЧНОСТЬ, ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ, ОШИБКИ МЕТОДА Высокая специфичность представляет собой важнейшее пре- имущество методов иммунологического анализа. Для количест- венного или качественного определения изучаемого АГ в рас- творе нескольких веществ необходимо иметь соответствующие моноспецифические сыворотки. Моноспецифичность проверяют в данном случае методом двойной радиальной ИД или методом иммуноэлектрофореза, при необходимости нежелательные АТ устраняются адсорбцией. Что касается чувствительности мето- дов ИД, то, согласно мнению многих авторов, при концентра- ции белка 50—5 мкг/мл в соответствующих системах АГ—АТ еще можно наблюдать образование преципитатов. Если в лун- ку вносят 2—10 мкл раствора, то удается определить присутст- вие белка в растворе в количестве 10—500 нг. Разброс данных при постановке серии количественных определений составляет около 5% (3—7%). 2.1.2. ДВОЙНАЯ РАДИАЛЬНАЯ ИММУНОДИФФУЗИЯ 2.1.2.1. ПРИНЦИП МЕТОДА В слое агара равномерной толщины на определенном расстоя- нии друг от друга делают лунки для АГ или АС. После внесе- ния растворов в лунку эти компоненты начинают диффундиро- вать радиально в гель. Встречаясь друг с другом, АГ и АТ на- 77
чинают образовывать иммунные комплексы, которые преципи- тируют в ячейках геля и становятся видимыми как линии пре- ципитации. Двойную радиальную иммунодиффузию проводят на предметных стеклах (микрометод). 2.1.2.2. МЕТОДИКА 2.1.2.2.1. Материалы и оборудование Для работы необходимо иметь моно- и полиспецифические сы- воротки, чистый агар (специальный агар Noble или очищенный агар Difko, США), который можно заменить агарозой. В каче- стве растворителей для агара используются самые разнообраз- ные растворы, мы приводим состав трех из них: — 0,15 М NaCl; — забуференный раствор NaCl с pH 7,2, состоящий из 9 частей 0,15 М NaCl и 1 части 0,07 М фосфатного буфера по Серен- сену. Состав фосфатного буфера: КН2РО4— 9,073 г/л; Na2HPO4-2H2O—11,87 г/л; раствор КН2РО4 в количестве 29,6 мл доводят раствором Na2HPO4 до 100 мл. В результа- те получается 0,07 М фосфатный буфер с pH 7,2; — натрий-ацетат — натрий-диэтилбарбитуратный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1 (веронал-ацетатный буфер по Backhausz) Na-диэтилбарбитурат — 9,75 г; Na-ацетат — 6,47 г; 0,1 М НС1 — 60 мл; дистиллированная вода до 1000 мл. 2.1.2.2.2. Приготовление геля и проведение иммунодиффузии Расплавляют 1,5 г агара в 100 мл буфера (одного из трех пред- ложенных) на водяной бане. Порциями по 3 мл горячий агаро- вый золь наносят на строго горизонтально установленные пред- метные стекла, для того чтобы получить равномерный слой ага- ра толщиной приблизительно 1,5 мм. После застывания агара пластинки готовы к употреблению. Рекомендуется сначала на- носить на стекла по 1 мл горячего золя агарозы (10 г/л), кото- рый затем высушивают при 70 °C. Образующаяся при высуши- вании пленка агара усиливает сцепление геля с поверхностью' стекла. В зависимости от характера иммунохимических иссле- дований в агаре делают лунки для АГ или АТ при помощи го- товых штампов или вырезают их стеклянной (можно металли- ческой) трубочкой. Лунки должны отстоять друг от друга по меньшей мере на 4 мм, расстояние более 10 мм употребляется редко. На рис. 22 схематично представлены возможные вариан- ты расположения лунок в слое геля. После внесения растворов иммунодиффузию проводят во влажной камере при температу- ре 4°, 20° или 37 °C. Продолжительность диффузии зависит от целей исследования, она должна быть не менее 24 ч и в неко- торых случаях может достигать 6—7 дней. Более продолжи- тельная инкубация не приводит к изменениям преципитатов. В случае продолжительной ИД пластины следует ежедневно- 78
Рис. 22. Двойная радиальная иммунодиффузия: возможные варианты рас- положения резервуаров для растворов АГ (заштрихованы) и сыворотки (черные). контролировать. По окончании ИД можно либо непосредствен- но оценивать результаты по влажному препарату, либо сначала отмыть непреципитирующие субстанции. Для этого замачивают пластины 2—3 раза на 12 ч в 0,15 М растворе NaCl. Затем на поверхность геля кладут фильтровальную бумагу, смоченную дистиллированной водой, и гель высушивают при 40—50 °C или при комнатной температуре. Высушенные пластины геля окра- шивают обычно амидо черным 10 В, после чего оценивают ре- зультаты иммунодиффузии. 2.1.2.2.3. Оценки результатов Количество линий преципитации. Во множествен- ных системах всегда существует вероятность того, что два или более комплекса АГ—АТ вследствие одинаковой скорости диф- фузии будут образовываться в одном и том же участке геля, формируя, следовательно, одну линию преципитации. Кроме того, концентрация АТ и АГ или соотношение компонентов ре- акции может быть настолько неблагоприятным, что видимые преципитаты не будут образовываться. Поэтому число видимых линий преципитации, как правило, меньше числа систем АГ—АТ или в лучшем случае равно ему. Расположение преципитатов между лунками. При оптимальном соотношении между АГ и АТ после оконча- ния диффузии линия преципитации располагается примерно на середине расстояния между лунками. Если один из компонен- тов реакции присутствует в большем количестве, чем другой, то линия преципитации сдвигается в сторону лунки с меньшим со- держанием реагента. Если соотношение концентраций реаген- тов может измениться в месте первичного выпадения предме- тов, например, вследствие избыточного поступления одного из 79
Рис. 23. Расположение линий преципитации при сравнительных исследова- ниях методом двойной радиальной иммунодиффузии. а —1—4 варианты преципитации; б —анализ органоспецифических антигенов. В цент- ре— антисыворотка к экстракту почек (АСЭП): ЭП — экстракт почек; СЧ — сыворотка человека. В сыворотке человека и в экстракте почек присутствует один общий АГ (иден- тичная реакция). Второй антиген присутствует только в экстракте почек (перекрестная реакция с первым АГ) (препарат проф. Frlemel). компонентов, это приводит к смещению линии преципитации. Часть иммунных агрегатов, особенно в зоне избытка антител, может оставаться на старом месте в виде вуали и расширения линии преципитации. Именно возможность возникновения таких процессов обусловливает необходимость ежедневных проверок пластин геля при длительно протекающей иммунодиффузии. Взаимное расположение линий (сравнительный ана- лиз). Для выявления полной или частичной идентичности обыч- но располагают лунки в углах треугольника, в две помещают растворы сравниваемых АГ, в третью — АС. Принципиально возможны четыре варианта расположения линий преципитации: 1. Обе линии преципитации полностью сливаются. Это говорит об идентичности обоих антигенов. 2. Линии преципитации пересекаются. Это значит, что реаги- рующие с АС детерминанты АГ неидентичны и, следователь- но, сами антигены различны. 3. Одна линия длиннее и продолжается за другую в виде так называемой „шпоры”. „Шпора” часто бывает тоньше основ- ной линии преципитации. Линия преципитации от второй лунки с АГ сливается с первой линией. Это означает, что оба антигена обладают некоторыми общими детерминантами и образуют с соответствующими АТ иммунные комплексы, приводящие к слиянию линий. Кроме того, один из АГ имеет больше детерминант, чем другой, что при наличии соответ- ствующих АТ в антисыворотке приводит к образованию, „шпоры”. 4. Обе линии преципитации перекрещиваются и сливаются од- новременно. Это означает, что оба антигена содержат как 80
Рис. 24. Двойная радиальная иммуно- диффузия. Титрование раствора АГ (титр 1 : 16). одинаковые, так и различные де- терминанты, которые вступают в реакцию с антителами полиспе- цифической антисыворотки. Основные типы преципита- ции представлены на рис. 23. 2.1.2.2.4. Модификация метода Вышеописанная методика имму- нодиффузии на предметных Исходный 1.32 раствор АГ стеклах представляет собой микровариант метода, предложен- ного Ухтерлони в 1949 г. В условиях макрометода слой геля, создаваемый в чашках Петри, составляет 2—3 мм, лунки и со- ответственно объемы реагентов довольно велики, лунки отодви- нуты друг от друга на значительные расстояния, линии преци- питации длинные и хорошо выраженные. Титрование. Для титрования растворов АГ или АС рас- полагают лунки так, как показано на рис. 24. Одинаковые объ- емы растворов антигена, приготовленных двукратным разведе- нием, вносят в периферические лунки. Такой же объем антисы- воротки вносят в центральную лунку. При оценке иммунодиф- фузии учитывают: 1. Расстояние от линии преципитации до центральной и перифе- рической лунок. 2. Наибольшее разведение антигена, при котором еще заметно образование преципитата. 3. Интенсивность и ширину полос преципитации. Наибольшее разведение, при котором еще образуются види- мые преципитаты, дает значение титра. Этим способом можно также определять количество преципитирующих антител в раз- личных АС, которые, например, можно сравнивать в реакции иммунодиффузии со стандартным раствором АГ. Полуколичественное определение антигенов. Титрование часто используют для полуколичественного опреде- ления АГ [2]. Вокруг центральной лунки с антисывороткой формируют четыре лунки для антигена. Чем выше концентра- ция АГ, тем ближе к центральной лунке будут расположены полосы преципитации. Путем сравнения со стандартным раство- ром АГ можно определить неизвестную концентрацию антигена в исследуемой пробе. 2.1.2.3. ОЦЕНКА МЕТОДА Двойная радиальная иммунодиффузия представляет собой прежде всего метод количественного анализа. Ее применяют для определения количества АГ в жидкостях (сыворотка крови, 6 -990 81
цереброспинальная жидкость, экстракты тканей). Ее также при- меняют для проверки чистоты препаратов, при получении анти- сывороток животных и оценке эффективности иммунизации. Титрование и полуколичествепное определение АГ расширяет возможности применения метода. Определение отдельных анти- генов в многокомпонентных растворах требует применения мо- носпецифических антисывороток. Метод двойной радиальной им- мунодиффузии можно использовать также для анализа трудно- растворимых субстанций, таких, как кератин и прокератин, с условием предварительной их солюбилизации ДСН, гуанидин- хлоридом (до 6 М), мочевиной (до 8 М). После солюбилизации эти вещества продолжают реагировать с соответствующими АТ в геле агарозы. 2.1.3. ПРОСТАЯ РАДИАЛЬНАЯ ИММУНОДИФФУЗИЯ 2.1.3.1. ПРИНЦИП МЕТОДА На плоской поверхности создают равномерный слой геля, со- держащего антисыворотку. Из лунок, проштампованных в геле и заполненных раствором антигена, молекулы АГ диффундиру- ют в гель и образуют кольца преципитации с соответствующи- ми АТ. Диаметр колец преципитации увеличивается до тех пор, пока не истощится раствор антигена. Этот метод впервые опи- сал Манчини (Mancini) в 1963 г. Известны многочисленные мо- дификации этого метода, мы приводим описание, основанное на методике, изложенной в монографии Мауег и Walker (см. список литературы). 2.1.3.2. МЕТОДИКА 2.1.3.2.1. Материалы и оборудование Для работы необходимы моноспецифические АС, стандартные препараты, контрольные сыворотки, буферные растворы, агар, рамки для закрепления предметных стекол, штативы для этих рамок, измерительное устройство с точностью до 0,1 мм, микро- шприцы для внесения объемов 1—10 мкл. 2.1.3.2.2. Последовательность этапов исследования Растворяют 1,5 г агара в 100 мл буфера (см. раздел 2.1.2) на водяной бане, охлаждают до 48 °C и смешивают с АС, жела- тельно подогретой до той же температуры, в небольшой про- порции. Наносят пипеткой 2 мл смеси на предметное стекло, установленное строго горизонтально на подставке, нагретой до 35—40 °с. Золь агара, содержащий АТ, распределяется по по- верхности предметного стекла и застывает слоем толщиной приблизительно 1 мм. Рекомендуют также наносить на пред- метные стекла по 1 мл горячего раствора агара (10 г/л) и вы- 82
Рис. 25. Простая радиаль- ная иммунодиффузия. Эта- пы работы. суживать их при 70 °C перед использованием. Если пластины для простой радиальной иммунодиффузии будут храниться перед упот- реблением в течение 2—3 нед (во влажной камере при 4°C), то к гелю добавляют кон- серванты (мертиолят, 0,1 г/л, азид натрия, 0,2 г/л). На предмет- ном стекле в слое ге- ля вырезают по 8 лу- нок при помощи от- шлифованной стеклян- ной трубки, соединен- ной с водоструйным на- сосом (таким образом создают пониженное давление). В каждую из лунок вносят по- 2 мкл раствора антигена. Реакцию простой радиальной ИД проводят во влажной камере. Если линии преципитации доста- точно выражены, оценку результатов можно проводить прямо на влажной пластинке. В тех случаях, когда оценку проводят немедленно, пластинки с гелем отмывают 2—3 раза в 0,15 М NaCl; каждая отмывка длится 12 ч. Этим достигается удаление непреципитировавших белков. После отмывки препараты высу- шивают и окрашивают, например, амидо черным 10 В. После- довательность операций представлена на рис. 25. 2.1.3.2.3. Калибровочная кривая К моменту завершения диффузии наблюдается прямая линей- ная зависимость между исходной концентрацией АГ и площадью преципитата. Это можно видеть на примере графика определе- ния IgA (рис. 26). Для построения графика берут логарифм концентрации АГ и как функцию от него площадь преципитата, квадрат диаметра зоны преципитации или логарифм диаметра преципитата. Во всех случаях зависимость носит линейный ха- рактер и описывается уравнением: 5 = К-<Здг +$о, где S — общая площадь зоны преципитации, включая So, So — площадь стар- товой лунки, Qa — площадь антигена. 6* 83
ротки. Рис. 26. Простая радиаль- ная иммунодиффузия. Кри- вая для определения IgA. D2 — квадрат диаметра диф- фузии. Наклон прямой К нахо- дится в обратной зависи- мости от концентрации ан- тител в геле: 1 К г=п-~^— + т, САТ Cat — концентрация АТ в геле, т — точка пересече- ния прямой с ординатой. Снижая уровень АС в геле, можно после- довательно увеличи- вать диаметр зоны пре- ципитации. При этом К возрастает и увели- чивается экономичность и чувствительность ме- тода. Снижение кон- центрации реагентов возможно только до определенных пределов, так как может воз- никнуть ослабление преципитации. В каждом отдельном случае концентрацию АС в геле подбирают в зависимости от титра ан- тител. Обычно рекомендуют использовать 1—5% антисыво- 2.1.3.2.4. Температура и продолжительность иммунодиффузии Температура существенно не влияет на результаты диффузии. Опыт можно ставить при 4 °C, 20 °C или 37 °C. Обычно простую радиальную ИД проводят в холодильнике при 4—6 °C с целью предупреждения роста грибов и бактерий. Следует избегать резких колебаний температуры (размах не более +5°C). Про- цесс иммунодиффузии при работе, например, с альбумином и ферритином, завершается через 48 ч; с IgG и IgA — через 2— 3 дня; с IgM, а2-макроглобулином и другими белками с круп- ными молекулами — через 5—7 дней. Первый ориентировочный замер диаметра преципитата можно получить уже через 4 ч. Существует модификация простой радиальной ИД с постоян- ным временем диффузии, равным 24 ч [3]. Это означает, что диффузия АГ по крайней мере при его высокой концентрации полностью не заканчивается. Получаемые результаты вполне сопоставимы с результатами простой линейной ИД (см. раз- дел 2.1.1). Соответственно наблюдается линейная зависимость между логарифмом концентрации АГ и радиусом преципита- 84
ции. Раньше считалось, что эта модификация уступает по чув- ствительности методу, предложенному Манчини. Недавние ис- следования указывают, что оба метода имеют одинаковую чув- ствительность [5]. 2.1.З.2.5. Подготовка пластин для иммунодиффузии Во избежание погрешностей следует обращать особое внимание на поддержание температуры расплавленного агара при внесе- нии антисыворотки (48 °C, максимально 50 °C), на правильный расчет концентрации АС в геле, на количество агара, наносимое на каждую пластину, и на строго горизонтальное расположение пластины. Поскольку толщина слоя геля уменьшается по на- правлению к периферии пластины, то следует добиваться того, чтобы кольца преципитации располагались не ближе 5 мм от края. 2.1.3.2.6. Значение свойств антигена Как правило, иммунохимические и физико-химические свойства стандартного и исследуемого антигенов должны быть сходны. Иногда это требование трудновыполнимо. Например, диффу- зионные свойства могут изменяться, когда молекулы антигена обладают склонностью к агрегации или, наоборот, к диссоциа- ции. Это приводит к изменению условий диффузии, возможно даже к маскировке одних детерминант антигенов и демаскиров- ке других. Тенденцию к агрегации можно наблюдать, в частно- сти, в очищенных препаратах сывороточного альбумина после их повторного растворения. Если такой раствор предназначен для использования в качестве стандартного при калибровке, то аг- регаты удаляют гель-фильтрацией на сефадексе G-200. IgA со- держится в сыворотке в виде молекул с различной степенью полимеризации. Обычно соотношение моно-, ди- и тримеров не- известно. Приходится в данном случае ориентироваться на ус- редненные результаты анализов большого числа сывороток нор- мальных доноров или на существующие стандарты ВОЗ. В не- которых случаях завышенные результаты получаются вследст- вие преобладания быстродиффундирующих фрагментов (субъ- единиц) [7]. Это наблюдение справедливо для IgM, при работе с которым наблюдаются по меньшей мере две линии преципи- тации. Длительное хранение сывороток при 4 °C может приво- дить к частичному распаду белков вследствие остаточной про- теолитической активности. 2.1.З.2.7. Модификации метода По различным причинам в стандартную методику приходится вводить ряд изменений. Для повышения чувствительности ме- тода используют более толстые слои геля и более вместитель- ные лунки для АГ (до 20 мкл). Слабые преципитаты становятся лучше различимыми после обработки танином. Танин использу- ют в концентрациях от 0,2 до 4% при pH 1,5. Усиление действия 85
танина наблюдается при обработке прокрашенных препаратов раствором дигидроксифениланилина. Использование подобных приемов позволяет определять даже IgE у верхней границы нормальной концентрации [10]. Усиление преципитации наблю- дается при добавлении к смеси агароза — АС карбовакса 20 М в количестве до 20 г/л [1]. Внесение неионных полимеров (по- лиэтиленгликоль, карбовакс, оксидвакс) в лунки для АГ или обработка пластин для ИД антииммуноглобулиновой сыворот- кой также усиливает преципитацию [10]. Некоторые изменения при постановке простой радиальной ИД связаны с экономией антисыворотки. Определенное небольшое количество АС до или после диф- фузии АГ наносится на область предполагаемой преципитации на поверхности геля. АГ, диффундирующие радиально, и АТ, диффундирующие соответственно вертикально, встречаются в толще геля и образуют преципитаты. При этом следует избе- гать подогревания геля. Простая радиальная ИД пригодна в равной мере для количественного и для качественного анали- за [6] иммунохимически близких белков. Если количество в лунках постоянно, можно судить о титре АТ в антисыворотках различных животных по величине колец преципитации при точ- но известном содержании АС в геле. Для определения титра АТ смешивают гель в установленной пропорции с АГ, антитела диффундируют в гель (так называемая обратная радиальная ИД). Радиус колец преципитации пропорционален титру. Вме- сто агара или агарозы в реакции простой радиальной ИД мож- но использовать пленку ацетата целлюлозы [9]. Разработан ин- тересный вариант данного метода, позволяющий количественно оценить степень структурного сходства родственных антиге- нов [4]. 2.1.З.З. ОЦЕНКА МЕТОДА В пределах своей чувствительности простая радиальная ИД пригодна для определения любых АГ при условии, что имеются соответствующая моноспецифическая АС и чистые или стан- дартные АГ для калибровки системы. Обычно ПРИД используют для определения белков в био- логических жидкостях, таких как сыворотка крови, цереброспи- нальная жидкость, секреты желез или экстракты различных ор- ганов и т. д. (рис. 27). Этот метод прочно удерживается в ла- бораториях. Многие белки можно определять, используя ком- мерческие наборы стандартов или даже готовые иммунодиффу- зионные пластинки. Специфичность метода описывается в раз- деле 2.1.1. Ошибка метода при работе с одной серией реагентов составляет 3—7% (литературные и собственные данные). Конт- рольные измерения изо дня в день в течение длительного вре- мени дают коэффициент вариации 8—10% для оценки ИГ. Из- вестно, что в норме содержание многих сывороточных белков 86
б Рис. 27. Простая радиальная иммунодиффузия. а — определение IgG на пластинах 100X70 мм (препарат д-ра Linneke, Внсмар); б — определение IgM на предметных стеклах. Два противоположных резервуара на узких сторонах стекла служат для внесения контрольной пробы. сильно колеблется, например IgG от 8 до 18 г/л. С учетом этого средняя ошибка определения нижних границ концентрации со- ставляет для сывороточного IgA— 18,3%, для IgG— 17,4%, для IgM—15,7%, для гаптоглобина—13,6%, для трансферрина — 9,8%. Соответствующие значения для верхней границы состав- ляют 8,6%, 6,5%, 7,3%, 7,1% и 5,2% (60—70 измерений после- довательно в течение 26 дней). Необходимо помнить, что кон- центрации ИГ, определяемые методом простой радиальной ИД у здоровых лиц, не укладываются в нормальную кривую рас- пределения результатов; об этом следует помнить при статисти- ческой обработке данных[11]. Относительно простая постановка опыта, несложное оборудование, надежность метода способст- вуют широкому использованию простой, радиальной ИД. К чис- 87
лу недостатков метода следует отнести большую длительность реакции по сравнению с другими методами, в основе которых лежит образование иммунных преципитатов. С точки зрения клиницистов, например специалистов в области клинической им- мунологии, этот недостаток не столь существен, поскольку си- туации, когда необходимо знать концентрацию ИГ в день взя- тия пробы, встречаются редко. 2.1.4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Обзоры и монографии 1. Mayer R. J., Walker J. Н. Immunochemical methods in the biological sciences: enzymes and proteins. — London, 1980. Academic Press, 1980. 2. Stites D. P. Clinical laboratory methods for detection of antigens and anti- bodies.— In: Basic and clinical immunology. Lange Medical Publications./ Eds, H. H. Fudenberg, D. P. Stites et al. — Los Angeles, 1980. Цитированная литература 1. Bohout В. A., van Asten Noordijk J. J. L. Divergent results in radial immu- nodiffusion. III. Isolation and specificity test of class specific antibodies. — J. Immunol. Methods, 1979, 27, 101—109. 2. Darcy D. A. Antigen and antibody concentration in relative units on diffu- sion plates. — In: Methods in Immunology and Immunochemistry./Eds. C. A. Williams and M. W. Chase. — New York: Academic Press, 1971, 200— 209. 3. Fahey J. L., McKelvey E. M. Quantitative determination of serum immuno- globulins in antibody-agar plates. — J. Immunol., 1965, 94, 84—90. 4. Gaffney P. J., Mahmoud M„ Kirkwood T. B. L. Quantitative immunorecogni- tion by a radial diffusion technique. — J. Immunol. Meth., 1977, 14, 25—29. 5. Lamerz R., Fateh-Moghadam A., Knedel M. Zur quantitativen iminunologi- shen Bestimmung von Serumproteinen. — Ztschr. klin. Chem. klin. Biochem., 1973, 11, 491—500. 6. Mancini G., Nash D. R„ Heremans J. F. Further studies on single radial immunodiffusion. 111. Quantitative analysis of related and unrelated anti- gens.— Immunochemistry, 1970, 7, 261—264. 7. Mulder J., Sloots L. С. E., Verhaar M. A. T. Molecular heterogeneity effects of IgM immunoglobulins in radial immunodiffusion. — J. Immunol. Meth., 1972, 2, 89—98. 8. Oberdorfer A., Blaufuss H. Zur bestimmung prazipitierender Antikorper mit der umgekehrten einfachen radialen Immunodiffusion. — Ztschr. klin. Chem. klin. Biochem., 1972, 10, 385—390. 9. Pizzolato M. C., Pizzolato M. A., Agostini A. Single radial immunodiffusion of undiluted serum proteins. — Clin. Chem., 1972, 18, 237—238. 10. Schwartze G., Thiman И. H„ Fiedler H. Zur quantitativen Bestimmung des Immunoglobulins E in Serum mit der einfachen radialen Immunodiffusion.— Dtsch. Ges.-Wesen, 1977, 32, 299—303. 11. Stein S. F., Ware J. H., Wood R. Serum immunoglobulins. Methods for the determination of normal values in international units. — J. Immunol. Meth., 1977, 16, 371—384. 88
2.2. ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ (МИКРОМЕТОД) 2.2.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Иммуноэлектрофоретический анализ представляет собой соче- тание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией. Им- муноэлектрофорез (ИЭФ) впервые описали Грабар и Уильямс в 1953 г. В 1955 г. Шейдеггер предложил микромодификацию этого метода, применив обычные предметные стекла. Принцип ИЭФ состоит в следующем. Вначале проводят электрофоретиче- ское разделение белков в забуференном геле агара; после раз- деления в канавку, которая идет в направлении миграции бел- ков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. АГ и АС диффундируют в геле навстречу друг другу, и в месте их взаи- модействия возникают дугообразные линии преципитации, чис- ло, положение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов (рис. 28). 2.2.2. МЕТОДИКА 2.2.2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Для работы нужно иметь предметные стекла, пробирки с проб- ками, пипетки (10 мл), очищенный агар или агароза, консер- вант (например, мертиолят), препаровальную иглу или неболь- шой шприц с иглой; микропипетку со шлангом и мундштуком или микрошприц (50—100 мкл), фильтровальную бумагу, на- пример, FN 14; NaCl ч. д. а, ледяную уксусную кислоту, амидо черный 10 В, веронал-натрий, NaCH3COO-3 Н2О, 0,1 н. НС1; комплект приборов для электрофореза, в который входят ис- точник тока, электрофоретическая камера, штампы, водяная баня, стеклорез, уровень, ванночки для окрашивания предмет- ных стекол. Рис. 28. Принцип иммуноэлектрофореза. 89
2.2.2.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АГАРОВОГО ГЕЛЯ Суспендируют 1,5 г очищенного агара в 100 мл веронал-ацетат- ного буфера (pH 8,6, ионная сила 0,1), добавляют мертиолятдо конечной концентрации 0,1% и нагревают суспензию на водяной бане до полного расплавления агара (раствор становится про- зрачным). Состав буфера: веронал-натрий —29,43 г ацетат натрия (ЗН2О) — 19,42 г 0,1 М НС1 180,0 мл дистиллированная вода до 3000,0 мл Горячий прозрачный раствор агара разливают по пробиркам (заполнять только до половины), закрывают пробками, дают остыть при комнатной температуре и после охлаждения хранят в холодильнике при 4 °C. 2.2.2.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АГАРОВЫХ ПЛАСТИНОК Тщательно очищенные и обезжиренные предметные стекла над- писывают стеклорезом и помещают на горизонтальную плос- кость (рис. 29). Несколько пробирок с 1,5% гелем агара нагре- вают на водяной бане. При помощи предварительно нагретой пипетки (10 мл) на каждое предметное стекло наносят по 2,5 мл горячего золя агара. Раствор агара должен равномерно распре- делиться по обезжиренной поверхности стекла и после затверде- ния образовать однородный слой геля. - 22.2.4. ФОРМИРОВАНИЕ ЛУНОК И КАНАВОК В ГЕЛЕ При помощи штампов в слое геля вырезают лунки для антиге- нов и канавки для антисывороток. Выбор подходящего штампа определяется задачей исследования. Очень удобны штампы с из- меняемым профилем (см. рис. 29). Вырезанные фрагменты геля удаляют иглой или при помощи водоструйного насоса. В обра- зовавшиеся лунки вносят примерно по 2 мкл исследуемого ма- териала микрошприцем. Полоски геля, образовавшиеся после вырезания канавок, также следует удалить до электрофореза, так как после это будет трудно сделать вследствие нагревания геля. Вырезанные фрагменты геля удаляются гораздо легче, если пластинки на 1—2 мин поместить в морозильник. 2.2.2.5. ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Электрофоретическую камеру присоединяют к источнику посто- янного тока, выдерживающего нагрузку до 100 мА (рис. 30). Электродные отсеки заполняют веронал-ацетатным буфером с pH 8,6 и устанавливают камеру строго горизонтально по уровню. 90
Рис. 29. Юстировочный столик, штатив для пластин и гелевый штамп. Рис. 30. Камера для проведения иммуноэлектрофореза с источником пи- тания. Рис. 31. Сосуды для диффузии и элюции. Справа штатив для пластин.
2.2.2.6. ВНЕСЕНИЕ АНТИСЫВОРОТКИ После электрофоретического разделения белков в продольную канавку вносят 0,03—0,05 мл преципитирующей иммунной сы- воротки. Сыворотка не должна переливаться через край канав- ки, иначе расположение линий преципитации будет искажено. 2.2.2.7. ИММУНОДИФФУЗИЯ, ЭЛЮИРОВАНИЕ, ОКРАШИВАНИЕ Иммунодиффузия продолжается не менее 24 ч во влажной ка- мере (рис. 31). Затем сразу же начинают элюировать белки, которые не участвовали в преципитации, с помощью 0,15 М NaCl. Элюирование проводят 3 сут с ежедневной сменой рас- твора. После этого пластины геля накрывают фильтровальной бумагой (не оставляя пузырьков воздуха) и высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температу- ре не выше 40 °C. Для окрашивания белков чаще всего приме- няют амидо черный 10 В, лиссаминовый (светлый) зеленый, азокармин В или пунцовый 2R. Липопротеиды окрашивают су- даном черным В. При этом важно окрашивать полностью высу- шенный препарат, так как судан черный В нерастворим в воде и не воспринимается влажным гелем или образует неспецифи- ческие осадки. Об окрашивании ферментов см. раздел 2.5. Им- мунофореграмма белков сыворотки человека, проявленная по- лиспецифической антисывороткой кролика, представлена на рис. 32. 2.2.2.8. МОДИФИКАЦИЯ МЕТОДА Использование чистых АГ. Иногда одного окрашива- ния недостаточно для идентификации неизвестного антигена. В этом случае полезно сравнивать исследуемый АГ с известны- ми чистыми АГ. Реагенты располагают так, как показано на рис. 33. Различие в электрофоретической подвижности являет- ся доказательством неидентичности антигенов. Рис. 32. Иммуноэлектрофореграмма сыворотки человека, проявленная поли- специфической кроличьей антисывороткой. 92
Рис. 33. Идентификация антигенов при помощи чис- того АГ: сравнение элект- рофоретической подвиж- ности. Рис. 34. Идентификация антигена при помощи мо- носпецифической антисы- воротки. Рис. 35. Идентификация антигенов по методу Ос- сермана. Рис. 36. Идентификация антигенов по методу Гере- манса. Полиспецифическая иммунная сыворотка Известный АГ Применение моноспецифичес к их иммунных сывороток. Если исследователь заранее предполагает, что в изучаемом образце присутствует какой-либо определенный антиген, он может попытаться идентифицировать его при помо- щи моноспецифической сыворотки (рис. 34). Линия преципита- ции, образованная на одной стороне иммуноэлектрофореграммы полиспецифической сывороткой, может слиться с другой лини- ей, которую на другой стороне образует моноспецифическая сыворотка. Такое слияние свидетельствует об идентичности дан- ного компонента антигенной смеси тому АГ, к которому была получена моноспецифическая сыворотка. Однако этот простой 93
и изящный метод идентификации АГ часто бывает неприменим из-за отсутствия соответствующих моноспецифических сыво- роток. Метод Оссермана. Для идентификации по Оссерману требуется контрольный раствор, содержащий только известные антигены в возможно меньшем числе (рис. 35). Еще лучше ис- пользовать чистые антигены. Контрольный раствор АГ вносят в одну из канавок, и он, диффундируя в сторону канавки с АС, образует линию преципитации, параллельную канавкам. В том месте, где контрольный АГ встречается с идентичным компо- нентом исследуемой смеси антигенов, линия преципитации ис- кривляется и переходит в дугу идентичного антигена. Четкая картина получается лишь тогда, когда контрольный раствор со- держит минимальное число известных АГ. В противном случае на иммуноэлектрофореграмме возникает множество беспорядоч- но расположенных полос и дуг, интерпретировать которые трудно или даже невозможно. Метод Гереманса. В основе метода Гереманса лежит реакция двух различных АГ с антисывороткой, содержащей АТ к ним обоим. Исследуемый АГ сравнивают с контрольным по электрофоретической подвижности и одновременно проводят реакцию на иммунологическую идентичность. С этой целью в канавке для АС оставляют агаровую перемычку, положение которой определяется в предварительном опыте. Поэтому ме- тод Германса называют также «методом разделенной канавки» (рис. 36). Перемычка должна находиться в том месте, где ожи- дают слияния полос преципитации исследуемого и контрольно- го АГ (в случае их идентичности). Если по обе стороны пере- мычки будут находиться идентичные или перекрестно реагирую- щие АГ, произойдет полное слияние дуг преципитации или (при неполной идентичности) образование шпоры. 2.2.3. ОЦЕНКА МЕТОДА Иммуноэлектрофорез — один из широко распространенных ме- тодов качественного анализа антигенов. Располагая соответст- вующими преципитирующими АС, с его помощью можно иссле- довать любую антигенную смесь. В частности, успешно анализи- руются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки раститель- ного и бактериального происхождения. В клинике этот метод чаще всего используется при диагностике парапротеинемий и иммунодефицитных состояний. В судебной медицине с его по- мощью анализируют системы гаптоглобина и группоспецифиче- ского компонента Gc. В научно-исследовательской работе им- муноэлектрофорез служит основным методом идентификации белков, содержащихся в сложных смесях. Он незаменим как ме- тод последовательного наблюдения за процессом очистки бел- 94
Рис. 37. Устройство для проведения электрофореза в геле агара. ковых препаратов. Его часто используют также для контроля подлинности и чистоты этих препаратов. Естественно, что ме- тод, имеющий столь широкое применение, должен был видоиз- меняться и совершенствоваться в различных направлениях. Были предложены новые носители: гель агарозы, ПААГ, аце- тат-целлюлозные пленки. Вместе с тем ИЭФ стали комбиниро- вать с различными методами специфического окрашивания и флюорохромироваиия, чтобы выявлять ферменты, углеводы, липопротеиды, нуклеопротеиды. В результате комбинации с дру- гими методами анализа возникли диск-иммуноэлектрофорез, иммуноэлектрофокусирование, радиоиммуноэлектрофорез и др. Для количественного определения с помощью полиспецифиче- ских АС недавно был предложен двухмерный ИЭФ. Особая мо- дификация двухмерного ИЭФ может повысить его чувствитель- ность до уровня РИА. Это достигается электрофоретической элюцией антигена из малых стеклянных резервуаров объемом 0,1—10 мл [3]. Для ИЭФ с охлаждением Виме сконструировал прибор, автоматически поддерживающий постоянную темпера- туру и силу тока в процессе разделения (рис. 37). Этот прибор очень удобен для определения электрофоретической подвижно- сти различных веществ. Использование в этом приборе термо- электрического охлаждения (батарея Пельтье) следует особен- но рекомендовать в случае работы с ферментами и другими термолабильными веществами [2]. Недавно был предложен про- стои способ разделения белков в двухмерном электрофорезе [1]. Известен чувствительный способ определения непреципи- тирующих систем АГ—АТ, основанный на применении ЛАКАТ, так называемый каскадный ИЭФ, включающий фиксацию АГ после электрофореза, присоединение к АГ антител, удаление связанных АТ и их количественная оценка [5]. В случае имму- нофиксационного электрофореза разделяются АТ, а не антиген. Это быстрый и экономичный метод, он особенно пригоден для Массового обследования с целью выявления парапротеинемии, 95
и для получения препаратов белков [4]. При ИЭФ нередко наб- людаются нарушения нормального течения процесса, и не всег- да удается сразу обнаружить их причину. Если, например, ис- пользуется недостаточно очищенный агар, но это чаще всего приводит к трем нарушениям: плохому образованию геля, силь- ному электросмосу, плохому обесцвечиванию препаратов. Недо- статочно чистый агар всегда подлежит очистке. Приступая к работе с новой порцией агара, нужно сначала испытать его годность. Часто обнаруживается, что одни и те же АГ имеют разную электрофоретическую подвижность и по-разному окра- шиваются при употреблении различных партий агара. Причи- ной нарушений при ИЭФ может быть гидролиз агара, вследст- вие многократного или слишком длительного нагревания. О гидролизе свидетельствует ослабление гелеобразующих свойств и возникновение неровностей на поверхности геля. Элек- трофоретическое разделение может быть нарушено при исполь- зовании неподходящего буферного раствора. Большинство буфе- ров служит хорошей питательной средой для бактерий и плес- невых грибков. Поэтому запас буфера следует хранить в холо- дильнике или добавлять к нему консервант. Буфер, заполняю- щий электрофоретическую камеру, следует менять не реже од- ного раза в неделю. При многократном использовании электрод- ного буфера необходимо после каждого разделения менять по- люса электродов. Величина напряжения на клеммах камеры обычно не позволяет судить о физической силе тока, проходя- щего через гель, поэтому в цепь нужно последовательно вклю- чить миллиамперметр. В процессе разделения сила тока почти всегда повышается. Это явление обусловлено нагреванием геля, которое нарастает с увеличением продолжительности электро- фореза. Однако после первоначального подъема сила тока в цепи может упасть. Часто это происходит из-за подсыхания полосок фильтровальной бумаги, соединяющих гель с буфером, или даже из-за подсыхания самого геля. В этом случае следует уменьшить ионную силу буфера или напряжение на клеммах камеры. Кроме того, высыхание можно предотвратить, если пе- ред электрофорезом обернуть пластинку геля и полоски бумаги полимерной пленкой. Удобнее всего работать с источником, ко- торый обеспечивает постоянную силу тока (стабилизациятока). •Самой собой разумеется, что результаты ИЭФ зависят от ка- чества антигенов и антисывороток. 2.2.4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Обзоры и монографии 1. Arquembourg Р. С. Immunoelectrophoresis. Theory, methods, identification, interpretation. — Basel, Karger, 1975. .2. Axelsen N. H. (Ed) Quantitative immunoelectrophoresis: New developments and applications. — Scand. J. Immunol., Suppl. No. 2, Oslo, 1975. 96
Цитированная литература 1. Crowle A. J. Templates for antiserum application in Immunoelectrophoresis and two-dimensional electroimmunophoresis. — J. Immunol. Methods, 1977, 14, 197—200. 2. Kleist КЦ Frietnel H., Brock J. et al. Thermoelectishe kuhleinrichtung fur die Gel- und Immunoelektrophorese. — Ztschr. med. Labortechnik, 1970, 11, 351— 355. 3. Kroll J. Immunoelectrophoretic quantitation of trace proteins. — J. Immunol. Meth, 1976, 13, 333—339. 4. Otto S. Reversed immunofixation agar gel electrophoresis. Immunol. Letters, 1982, 4, 85—86. 5. Shainhoff J. R., Dardic B. D. Cascade immunoelectrophoresis: Combined electrophoretic and solid-phase processing of immunoreactive protein by zonal immobilisation. — J. Immunol. Methods, 1981, 42, 229—241. 2.3. ЭЛЕКТРОИММУННЫЙ АНАЛИЗ 2.3.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Гель агарозы, содержащий АС, распределяют равномерным слоем по плоской поверхности. Из лунок, вырезанных в геле, под воздействием постоянного электрического тока АГ мигриру- ют в слой агарозы, где они взаимодействуют с 1g. В результа- те этого взаимодействия образуются преципитаты АГ—АТ в краевой зоне «молекулярного облака». Процесс продолжается до тех пор, пока все молекулы АГ не окажутся включенными в состав преципитатов, приобретающих вытянутую, заостренную форму. Длина зоны преципитации при прочих равных условиях находится в прямой зависимости от концентрации АГ (под «ус- ловиями» следует понимать концентрацию геля, концентрацию АС в геле, толщину его слоя и режим электрофореза). Предпо- сылкой метода служит неподвижность (довольно условная) Ig в геле. Она достигается применением агарозы с низкими зна- чениями электроэндоосмоса буфера с pH 8,6. При таких усло- виях возникает очень незначительный катодный ток воды, анод- ное движение АТ практически не проявляется [6]. Метод впер- вые был предложен Дореллом в 1966 г. В 1967 г. Меррил пред- ложил способ количественного определения Ig в АС-содержа- щем геле, названный им «электроиммунной диффузией». Это на- звание утвердилось, хотя оно не вполне правильно. Явление им- мунодиффузии следует как раз избегать при определении АГ этим методом. Термин иммуноэлектрофорез соответствует су- ществу метода Дорелла не вполне точно, так как речь идет в действительности об «электрофоретической» иммунодиф- фузии. Поэтому можно использовать термин «электроиммунный анализ». В лабораторной практике часто употребляют термин «ра- кетный иммуноэлектрофорез». 7—990 97
2.3.2 МЕТОДИКА 2.З.2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Для работы необходимы моноспецифические, стандартные и контрольные сыворотки, буферные растворы. Можно использо- вать самые разнообразные буферы. В качестве примера мы при- водим состав трех из них: натрий ацетат-натрий-диэтилбарбиту- ратный буфер pH 8,6 (см. 2.1.2.2.1). Барбитуратный буфер pH 8,6, 0,075 М [9]: Барбитурат натрия 77,0 г Барбитуровая кислота 13,8 г Лактат кальция 3,85 г Азид натрия 1,0 г Дистиллированная вода до 5000 мл Перед употреблением буфер можно разводить в 2 раза. Вероналовый буфер pH 8,6, 0,075 М [11]: Диэтилбарбитурат натрия 131,4 г Диэтилбарбитуровая кислота 20,7 г Лактат кальция 4,0 г Дистиллированная вода до 10 л Прочие буферные растворы описаны в других работах [И]. Рекомендуется барбитуровую или диэтилбарбитуровую кислоты растворить в 1—2 л воды при нагревании, внести прочие ком- поненты, а затем довести смесь до нужного объема дистиллиро- ванной водой. Можно использовать агарозу производства раз- ных фирм, например, Feinchemie, Kallis KG (ГДР); Behring- werke AG (ФРГ); Ferak (Западный Берлин); Lindustrie biolo- gique Franijaise (Франция) и др. Желательно всегда пользо- ваться агарозой одной марки и одной серии. Новые образцы агарозы следует подвергать предварительной оценке на год- ность. Кроме этого, необходимы электрофоретическая камера с охлаждением, микрошприцы для отбора проб (1—10 мкл), из- мерительное устройство для определения расстояний с точно- стью до 0,1 мм. 2.3.2.2. ПРОВЕДЕНИЕ ОПЫТА Расплав агарозы (1,5%) в барбитуратном буфере с pH 8,6при температуре 48 °C смешивают с моноспецифической сыворот- кой. Концентрация АС в зависимости от титра, свойств АГ и других факторов может колебаться в широких пределах. Чаще всего используют концентрации 1—5%. На предметное стекло размером 120X60X2 мм наносят 10 мл смеси, равномерно рас- пределяют ее по поверхности. Пластины рекомендуется подго- тавливать нанесением слоя водной агарозы (см. 2.1.3.2.2). Пла- стины располагают на подогреваемом (35—40 °C) горизонталь- ном столике. После застывания геля образуется равномерный слой толщиной около 1 мм. Рекомендуется применение U-образ- 98
Рис. 38. Электроиммуииый ана- лиз: этапы работы. ных рамок из пластика вы- сотой 1 мм. Два стекла складывают с помощью та- кой рамки, образуется пло- ская камера, которую за- полняют золем АС-содержа- щей агарозы, стараясь из- бегать образования пузы- рей. После застывания геля одно стекло удаляют; плас- тина с гелем готова для ис- пользования. На расстоянии 8 мм от длинного края пла- стины в слое геля проделы- вают лунки для АГ диамет- ром 4 мм. Лунки должны отстоять друг от друга по меньшей мере на 6 мм. В каждую лунку вносят 10 мкл раствора АГ и проводят элект- рофорез. Лунки для АГ расположены на катодной части пласти- ны. Напряжение может составлять 20 В/см; температура должна поддерживаться на уровне 4—10 °C. Продолжительность элект- рофореза может составлять 3—18 ч для разных систем АГ — АТ. Оценка результатов проводится на влажном препарате немед- ленно по окончании электрофореза. Если прецитаты недостаточ- но различимы, пластины с гелем отмывают для удаления непре- ципитирующих белков, высушивают и окрашивают; затем про- водят оценку результатов. На рис. 38 представлены основные этапы метода, на рис. 39 — электрофореграмма. Рис. 39. Электроиммуииый анализ: определение количества альбумина. 7* 99
2.3.2.3. ОБРАБОТКА ПЛАСТИН, ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ Лунки в геле следует вырезать очень тщательно, края должны быть ровными, гель не должен отставать от стекол, наполнять лунки следует до краев. Электрофорез начинают немедленно после внесения образца в лунки, это делается для предотвраще- ния ИД. Лунки для АГ можно заполнять даже под слабым на- пряжением, которое затем увеличивают до полного. Концентра- цию АГ следует подбирать таким образом, чтобы образовыва- лись преципитаты длиной 10—50 мм. Все разведения АГ готовят на буфере для электрофореза. При оптимальных условиях элек- троиммунного анализа (ЭИА) формируются узкие, остроконеч- ные преципитаты. Точные измерения показывают, что площадь образующихся преципитатов находится в прямой зависимости от концентрации белка (рис. 40). При условии, что преципита- ты будут иметь описаннную выше форму, для практических це- лей можно ограничиться измерением длины зоны преципи- тации. 2.3.2.4. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ Преципитаты приобретают характерную вытянутую форму только при достаточной длительности электрофореза. Необхо- димое для этого время зависит от исследуемой системы и от приложенного напряжения. Создать достаточно эффективное напряжение можно только при надлежащем охлаждении каме- ры. Обычно напряжение варьирует от 5 до 20 В/см. Ионная сила буферов составляет 0,02—0,1. В зависимости от имеюще- гося оборудования можно вносить те или иные методические из- менения. При большой длительности электрофореза и низком напряжении можно отказаться от охлаждения и уменьшить со- держание АС в геле до 0,3%• 2.3.2.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ При ЭИА иммуноглобулины, как правило, проявляют незначи- тельную подвижность как в катодном, так и в анодном направ- лении. Это наблюдение относится к IgG и IgM. Вокруг старто- вой лунки образуется широкий двойной «шлейф». Для преду- преждения этих явлений пользуются следующими приемами: I. Вместо агарозы используют 1% агар, учитывая его повышен- ный электроэндоосмос. Образуются довольно широкие, с за- кругленным концом преципитаты, направленные к катоду. 2. Широкое распространение получила обработка белков, на- пример сыворотки, 2 М раствором KCNO. Один объем сы- воротки смешивают с двумя объемами раствора цианата ка- лия при комнатной температуре и оставляют смесь на ночь или равные объемы обоих растворов инкубируют 30 мин при 1С0
Рис. 40. Электроиммуиный анализ: кривая для определения альбумина. Концентрация альбумина (г/л) 45 °C. Затем делают необ- ходимое разведение верона- ловым буфером и проводят электрофорез. Цианат реа- гирует со свободными NH2- и SH-группами [8], повы- шая общий отрицательный заряд белковых молекул, что приводит к более быст- рому их передвижению в сторону анода. 3. Похожие результаты полу- чаются при обработке об- разцов сыворотки 0-пропиолактоном [9]. Это вещество не ме- няет антигенные свойства 1g. 4. Для заливки пластин с гелем используют карбамилирован- ную АС. Электрофорез проводят при pH 5 — изоэлектриче- ской точке карбамилированных 1g. В этих условиях иммуно- глобуллины АС остаются неподвижными в геле, a 1g иссле- дуемого образца мигрируют только в сторону катода [2]. 5. Образцы сыворотки обрабатывают глютаровым альдегидом, что приводит к конъюгированию 1g с электрофоретически бо- лее подвижными белками, в первую очередь с альбумином. Антигенные детерминанты 1g остаются «свободными», по- этому преципитаты образуются в анодной области в условиях электрофореза при pH 8,6. 2.3.2.6. МОДИФИКАЦИИ МЕТОДА ЭИА можно проводить на ацетат-целлюлозных пленках [10]. Для осуществления такого анализа требуются меньшие количе- ства АС. Дальнейшим развитием ЭИА является двумерный ко- личественный иммуноэлектрофорез. При помощи ЭИА с неболь- шими модификациями можно идентифицировать различные АГ и оценивать количество перекрестно реагирующих АТ в антисы- воротке [4]. Обратный ЭИА позволяет устанавливать титр АТ в АС. Электрофорез проводят при pH 4,85, т. е. изоэлектриче- ской точке альбумина. Мигрируют только АТ и только в катод- ном направлении (см. выше). Для определения продуктов рас- щепления фактора комплемента 3 (С Зс и С 3d) используют «двухслойный» ЭИА [3]. АГ сыворотки начинают двигаться в геле без АС, переходят в гель, содержащий АС к С Зс, снова переходят в зону геля без АС и, наконец, оказываются в слое геля с АС к С 3d. Секреторный SIgA и секреторный компонент (СК) могут определяться одновременно в одной пластине с ге 101
лем, состоящим из смеси агара и агарозы и содержащим каль- циевую соль этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) и карбамили- рованную сыворотку. В этих условиях SIgA мигрирует в сторо- ну катода, СК—в сторону анода [5]. В заключение следует упомянуть о том, что ЭИА может быть использован для опре- деления нерастворимых белков эпидермиса, ногтей и волос, на- пример кератина. Электрофорез проводят в присутствии дена- турирующих реагентов (ДСН, мочевина) [7]. 2.3.3. ОЦЕНКА МЕТОДА ЭИА по Лореллу используют для количественного определения белка в жидкостях организма. Методу ЭИА можно в принципе дать ту же оценку, что и простой радиальной ИД, однако он имеет большее количество ограничений. Дополнительные слож- ности возникают с АГ, медленно мигрирующими при pH 8,6. Более сложное оборудование для ЭИА также относится к чис- лу его недостатков. Существенным преимуществом ЭИА по сравнению с простой радиальной ИД является быстрота получе- ния результатов. Коэффициент вариации при ежедневном конт- роле составляет 3—6%. 2.3.4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Axelsen N. Н., Svendsen Р. J. Reverced rocket Immunoelectrophoresis.— Scand. J. Immunol., 1973, suppl. 1, 2, 155—157. 2. Bjerrum O. J., Ingild A., Lowenstein H., Weeke B. Carbamylated antibodie used for quantitation of human IgG. — Scand. J. Immunol., 1973, 2, suppl. 1, 145—148. 3. Brandslund I., Siersted H. C„ Svehag S. E., Teisner B. Double decker rocket immunoelectrophoresis for direct quantitation of complement C 3 split pro- ducts with C3d specificities in plasma. — J. Immunol. Methods, 1981, 44, 63—71. 4. Grubb A. Analysis of immunochemical relationship between antigens by electrophoresis in agarose gels containing antibodies. — Scand. J. Clin.-Lab. Invest., 1972, 29, suppl. 124, 7—19. 5. Kosaka T., Asahina T„ Kobayashi N. Differential quantification of SIgA and SC by two-directional rocket method. — Immunology, 1980, 40, 597—604. 6. Laurell С. B. Electroimmunoassay. — Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972, 29, suppl. 124, 21—37. 7. Lee L. D., Baden H. P„ Cheng С. K. Rocket immunoelectrophoresis in the presence of denaturating agents.—J. Immunol. Methods, 1978, 34, 155— 162. 8. Raisys V. A., Arvan D. A. Determination of proteins in biological fluids by electroimmunodiffusion and two-directional immunoelectrophoresis. — Clin. Chem., 1971, 17, 745—750. 9. Stephan W., Eram U. Quantitative Simultan-Immunoelektrophorese. Ztschr. klin. Chem. klin. Biochem., 1971, 9, 224—228. 10. Watkins J. B., Atkins B., Holborrow E. J. Quantitative estimation of protein by electroimmunodiffusion on cellogel acetate membranes. — J. Clin. Pathol., 1971. 24. 665—667. 11. Weeke B. Rocket Immunoelectrophoresis. — Scand. J. Immunol., 1973, 2, suppl. No 1, 37—46.
2.4. ВСТРЕЧНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ 2.4.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Принцип электросинереза или встречного электрофореза при- менил в 1969 г. Бедарида для обнаружения преципитатов АГ—АТ. Иммунопреципитация происходит в слое носителя, причем в отличие от метода Ухтерлони контакт АГ с АТ проис- ходит не вследствие свободной диффузии, а под влиянием по- стоянного электрического поля. Белки представляют собой ам- фолиты; ввиду различий аминокислотного состава они могут мигрировать в щелочной среде с разной скоростью и в разных направлениях (анодном, катодном). Если АГ и соответствую- щая преципитирующая АС мигрируют в разных направлениях, становится возможным их движение друг навстречу другу в слое геля или на ацетат-целлюлозной пленке. Преципитация и одно- временно накопление в одном месте участников реакции наблю- дается между стартовыми лунками обоих компонентов в течение 30—180 мин в зависимости от приложенного напряжения. Встречный иммуноэлектрофорез (ВИЭФ) предназначен для об- наружения и идентификации преципитирующих систем АГ—АТ при условии, что АГ обладает электрофоретической подвиж- ностью, отличной от той, которой обладают иммуноглобу- лины. Эксперимент проводится с компонентами, мигрирующими в противоположных направлениях или в одном направлении, но с различной скоростью. В настоящее время ВИЭФ применяют в основном для определения поверхностного антигена гепати- та В (HBsAg), а-фетопротеина (АФП) и антител к ним. Необ- ходимым условием для ВИЭФ является наличие моноспецифиче- ской преципитирующей сыворотки. Движение АТ в электриче- ском поле может искажаться под влиянием электроэндоосмоса. Электроэндоосмос представляет собой медленное движение жидкой среды в сторону катода, возникающее вследствие увле- чения жидкости частицами твердой фазы с прилегающими к ним положительно заряженными молекулами воды. Катодный ток жидкости может снизить скорость движения частиц белка к аноду или даже изменить его на обратное. АФП и HBsAg перемещаются в аа-области к аноду, в то время как ИГ в щелочной среде перемещаются к катоду. При контакте обоих партнеров реакции образуются резкие полосы преципитации, хорошо заметные при боковом освещении и на темном фоне. Модификации этого метода получили в работах разных авто- ров самые различные названия: иммуноэлектродиффузия [1], контраиммуноэлектрофорез [4], иммуноэлектроосмофорез [10], встречный (cross — over) электрофорез [8], иммунопреципита- ционный электрофорез [3]. Предложенный в 1970 г. Коном ме- тод определения АФП основан на этом же принципе [5]. 103
2.4.2. МЕТОДИКА 2.4.2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Для работы можно использовать любое электрофоретическое устройство с регулируемым напряжением (до 300 В), например, камеру FK66 (Росток) или Цейссовский прибор для электро- фореза; предметные стекла или стеклянные диапозитивные пла- стины 5x5 см, агар (например, Difco Agar Noble) или агарозу, или смесь агар — агароза; ацетат-целлюлозная мембрана (Sar- torius, Геттинген); трубки для вырезания лунок в геле, водо- струйный насос для удаления вырезанных гелевых цилиндров; влажную камеру, фильтровальную бумагу для замыкания кон- тактов геля с буфером. Антисыворотки (например, лошадиная анти-HBsAg сыворотка, анти-АФП сыворотка, Institut fiir Imf- stoffe (Дессау), Behringwerke (Марбург), буферные растворы, состав которых приводится ниже. Буферные растворы: Барбитал-натрий CH3COONa-3H2O 0,1 М НС1 Дистиллированная вода или г г мл А 9,75 6,47 60,0 до 2000 м pH 8,6; ц=0,05 Б 8,142 г 0,476 г 90,0 мл до 1000 мл pH 8,3—8,4; ц = 0,1 2.4.2.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГЕЛЯ Расплавляют 1,5 г агара, агарозы или смеси обоих веществ в 100 мл барбитал-ацетатного буфера на кипящей водяной бане. В качестве консерванта можно добавить 2 мл 0,1% раствора тио- мерсала (мертиолята). Стеклянные пластины обезжиривают, слегка подогревают и наносят на них равномерным слоем агар Натод Рис. 41. Схема расположения лунок при проведении встречного иммуно- электрофореза. А — место нанесения АГ, Б — место нанесения антисыворотки, В — место нанесения оха- рактеризованного АГ для выявления антител. 104
Рис. 42. Схема расположения лунок для реагентов прн постановке ВИЭФ по Kohn [5]. Рис. 43. Прецнпнтат НВз-антнген/анти-НВв-антитела в геле агарозы (боль- шое увеличение). из расчета 0,15 мл на 1 см2. После застывания геля на расстоя- нии около 7 мм друг от друга вырезают лунки диаметром 3 мм, гелевые цилиндры удаляют с помощью водоструйного насоса. Если одновременно хотят обнаружить антитела, то лунки выре- зают триадами (рис. 41). В зависимости от цели исследования расположение лунок может быть и таким, как показано на рис. 42 (в и г); особое внимание следует обращать на точное соблюдение расстояний между лунками. Если лунки располо- жены так, как это показано на рис. 42 (в), то, варьируя соотно- шение АГ—АТ и заполняя исследуемым образцом оба резер- вуара (без положительного контроля), можно наблюдать (соот- ветственно избегать) феномен прозоны вследствие избытка АГ или АТ. При помощи пипетки в лунки с катодной стороны вно- сят антиген, с анодной — антисыворотку. 2.4.2.3. ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА Оба отделения камеры для электрофореза заполняют барбитал- ацетатным буфером. Пластины с гелем укладывают в соответ- ствии с расположением полюсов и замыкают электрическую цепь полосками бумаги, смоченной буферным раствором. При напряжении 150—200 В (3—4 мА на 1 см ширины агарового геля) продолжительность электрофореза составляет от 1 до 3 ч. Увеличивая напряжение до 300 В, можно сократить продолжи- тельность электрофореза до 30 мин, но для этого необходимо обеспечить охлаждение камеры. В геле агара преципитаты HBsAg—анти-НВэ-антитела образуются возле лунки с антисы- вороткой, в геле агарозы — посередине между лунками с АГ и с АТ (рис. 43, 44). 105
Рис. 44. АФП/анти- АФП преципитат в ге- ле агара. а — антисыворотка, б — ис- следуемая сыворотка, в — позитивная контрольная сы- воротка. 2.4.2.4. ВСТРЕЧНЫЙ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗ НА АЦЕТАТ-ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ МЕМБРАНАХ Смоченные в буферном растворе мембраны из ацетат-целлюло- зы слегка высушивают фильтровальной бумагой, кладут их на три слоя фильтровальной бумаги и специальным штампом де- лают углубления, вмещающие 5 мкл жидкости. Эти углубления хорошо сохраняются при последующей обработке мембран и помогают точно определять положение полос преципитации. На- пряжение 100 В позволяет завершить электрофорез за 20 мин. Линии преципитации на мембране не видны, для их визуализа- ции необходимо окрашивание. Мембраны отмывают проточной водопроводной водой, окрашивают амидо черным 10 В или ни- грозином и обесцвечивают водой. Весь процесс занимает не бо- лее 15 мин. ВИЭФ на ацетат-целлюлозных мембранах имеет не- сомненные преимущества при массовых обследованиях, так как расход антисыворотки составляет всего лишь 5 мкл на один анализ. 2.4.3. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ Результаты реакции оценивают визуально, в некоторых случаях используют лупу; пластины геля рассматривают при косом ос- вещении или на темном фоне. Реакция считается положитель- ной, если картина преципитации такая же, как в контрольных лунках. В случае слабой преципитации или при сомнительных результатах делают ряд разведений исследуемого образца или АС для предотвращения эффекта прозопы. Едва заметные пре- ципитаты можно сделать более отчетливыми, если хорошо от- мытые пластины геля погрузить на 10 мин в 1% раствор тан- иина. Окрашивание пластин амидо черным 10 В или нигрозином обычно не улучшает результаты. Расположение преципитатов 106
зависит как от природы геля, так и от концентрации АГ и АТ. В геле агарозы преципитаты располагаются посередине между лунками; в геле агара АТ быстрее продвигаются к катоду, и преципитаты образуются ближе к лунке с АГ. Для выявления АГ лучше использовать гель агарозы или смешанный гель ага- ра-агарозы. АТ удобнее определять в геле агара. Однако при использовании агара следует учитывать опасность того, что преципитаты могут образовываться непосредственно у лунки с АГ и в случае использования мутной АС их невозможно об- наружить. Еще одним источником ошибок может стать продол- жительность электрофореза; время электрофореза должно быть тщательно установлено в системе контрольный АГ — конт- рольная АС (заниженное время приводит к ложноотри- цательным результатам, завышенное, при трехлуночной си- стеме расположения образцов, — к ложноположительиым). Неспецифические преципитаты могут формироваться в виде сла- бых диффузных полос, если использовать очень свежую или, наоборот, очень старую сыворотку. Опытный экспериментатор должен уметь отличать их от истинных преципитатов. Количест- венная оценка результатов возможна при использовании ряда последовательных разведений исследуемого образца и сыворо- ток с известным титром. 2.4.4. ОЦЕНКА МЕТОДА Оценка метода обнаружения HBsAg. ВИЭФ пред- ставляет собой аналитический метод второго поколения и по сравнению с двойной ИД по Ухтерлони (первое поколение) име- ет следующие преимущества: 1. Чувствительность ВИЭФ в 10 раз выше, могут быть исполь- зованы антигены, выявление которых методами диффузии не оправдывает себя. 2. Результаты можно учитывать через 1 ч, максимум через 3 ч, тогда как для полноценной диффузии необходимо не менее 24 ч. Попытки усовершенствования методики привели к разработке специальных модификаций для обнаружения HBsAg. Упрощение методики достигается использованием ацетат-целлюлозной мем- браны [И], длительность процесса сокращается применением высоковольтного электрофореза [2]. Все же микромодификации не способны повысить чувствительность метода. ВИЭФ высоко- специфичен при поиске HBsAg, но он уступает чувствительно- сти методам третьего поколения, РИА, иммунофлюоресцентный анализ (ИФА). Методы третьего поколения относительно доро- ги, поэтому ВИЭФ имеет преимущество перед ними при массо- вых обследованиях. Оценка метода обнаружения АПФ. Чувствитель- ность метода двойной диффузии при определении АФП состав- ляет около 10 мг вещества на 1 л сыворотки. Применение ВИЭФ 107
позволяет повысить чувствительность в 1,5—3 раза [7], т. е. до 3,6 мг/л. Небольшое повышение чувствительности достигается окраской нигрозином или применением флюоресцирующих АТ [6]. Положительная реакция на АФП позволяет предположить наличие первичного рака печени или злокачественной тератобла- стомы. Ложноположительные результаты определения АФП при помощи ВИЭФ наблюдаются примерно в 3 случаях из 100 [7]. Отрицательные результаты ввиду относительно малой чув- ствительности ВИЭФ не позволяют исключить диагноз рака пе- чени. Более чувствительные методы, такие как пассивная ге- магглютинация и радиоиммунологический анализ могут обна- руживать повышение АФП в крови и при других раковых забо- леваниях, причем необязательно при метастазировании в печень. Поэтому только неуклонное повышение уровня АФП в течение всего периода наблюдения типично для начинающегося рака пе- чени. Для более точного контроля рекомендуется применять ко- личественные методы Манчини и Лорелла. 2.4.5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Duquesnoy К. J., Becker G. G. Rapid screening for hepatitis antigen by immunoelectrodiffusion using paper discs. — Transfusion, 1970, 10, 221. 2. Frank К. H., Reimann W. Schneller, empfindlicher Nachweis des Au-SH-Anti- gens mittels Mikroubereinwanderungselektrophorese.— DTSCH. Ges.-wesen, 1971, 26, 1042. 3. Geserick G. Das Australia-Antigen (Au/SH/HAA). Serologische untersuchun- gen zu Nachweismethodik, Vorkommen, Eigenschaften und Bedeutung des Antigens. — Dissertation B, Berlin, 1972. 4. Goeke D. J., Howe C. Rapid detection of Australia antigen by counterimmu- noelectrophoresis. — J. Immunol., 1970, 104, 1031. 5. Kohn J. Method for the detection and identification of apfetoprotein in serum. —J. Clin. Path., 1970, 23, 733. 6. Kohn. J. Alphapfetoprotein: Laborbestimmung und klinische Bedeutung. — Arztl. Lab., 1972, 18, 307. 7. Lehmann F. Q., Lehmann D. Vergleich verschidener Methoden zum serolo- gischen Nachweis von ai-fetoprotein im serum. — Ztschr. klin. Chem. klin. Biochem., 1973, 11, 58. 8. Pesendorfer F„ Krassnitzki O., Wewalka F. Immunoelektrophoretischer Nach- weis von «Hepatitis associated antigen» (Au-SH-antigen).— Klin. Wschr., 1970, 48, 58. 9. Porstmann T., Porstmann B., Schmechta H. et al. Entwicklung eines Doppel- Sandwich Enzymimmunoassays zum quantitativen Nachweis von HBsAg.— Dtsch. Ges.-wesen, 1980, 35, 598—600. 10. Prince A. M., Burke K. Serum hepatitis antigen (SH): Rapid detection by high-voltage immunoelectroosmophoresis.— Science, 1970, 169, 593. 11. Vergani C. Crossover electrophoresis for the rapid detection of serum hepati- tis (Au) antigen and antibody. — J. clin. Pathol., 1971, 24, 86. 2.5. АНАЛИЗ ИММУННЫХ ПРЕЦИПИТАТОВ В ГЕЛЯХ Для анализа иммунных преципитатов в гелях (иммунодиффу- зия, иммуноэлектрофорез) применяют различные варианты окрашивания, ферментативные реакции, радиоактивную и им- 108
мунофлюоресцентную метки, определение электрофоретической подвижности. Кроме того, при иммунодиффузии и иммуноэлек- трофорезе применяют референс-антигены и моноспецифические сыворотки (см. 2.1, 2.2). 2.5.1. ОКРАШИВАНИЕ КАК СПОСОБ АНАЛИЗА ПРЕЦИПИТАТОВ Окрашивание преципитатов в гелях повышает контрастность препарата, а также делает видимыми неразличимые невоору- женным глазом преципитаты. Перед окрашиванием необходимо удалить из геля все белки, не имеющие отношения к формиро- ванию преципитатов (отмывка гелей 0,15 М NaCl). Окрашива- ние преципитатов позволяет получать более тонкую и дифферен- цированную характеристику антигенов (1 — белки, 2 — липопро- теиды, 3 — гликопротеиды, полисахариды, нуклеопротеиды, ме- таллопротеиды) (см. цв. вклейку, рис. 1). 2.5.1.1. ОКРАШИВАНИЕ БЕЛКОВ Для выявления белков в составе преципитатов чаще всего ис- пользуют амидо черный, световой зеленый, азокармин, пунцо- вый, нигрозин, кумасси синий и бромфеноловый синий. Боль- шинство красящих растворов перед употреблением фильтруют. Продолжительность окрашивания зависит от толщины слоя геля, но оно редко длится более 10—20 мин. Обесцвечивание геля проводят до тех пор, пока участки геля, не содержащие белка, становятся совершенно прозрачными. Часто для обесцвечива- ния достаточно простой водопроводной воды. Амидо черный. Применяются как водные, так и спирто- вые растворы. Хорошо зарекомендовала себя смесь следующего состава: Амидо черный 10 В 1,0 Ледяная уксусная кислота 100,0 Дистиллированная вода до 1000,0 Продолжительность окрашивания высушенных иммунофоре- грамм составляет около 10 мин; обесцвечивание проводят 7% раствором уксусной кислоты или водопроводной водой. Полосы преципитации имеют темно-синюю окраску, фон — бесцветный. Световой (светлый) зеленый. Краситель окрашива- ет у-глобулины почти так же интенсивно, как альбумины. Линии преципитации имеют ярко-зеленый цвет. Состав смеси сле- дующий: Световой зеленый SF 2,0 Ледяная уксусная кислота 100,0 Дистиллированная вода до 1000,0 Продолжительность окрашивания— 1—2 ч. Обесцвечивание про- водят водопроводной водой в течение нескольких минут. Азокармин. Этот вид окрашивания позволяет получать темно-красные полосы преципитации. Окрашивание очень стой- 109
кое, при фотографировании получаются контрастные снимки. Состав смеси: Азокармин 2,5 Ледяная уксусная кислота 100,0 Дистиллированная вода до 1000,0 Окрашивание длится 10 мин. Обесцвечивание проводят водопро- водной водой. Пунцовый. Этот краситель окрашивает преципитаты в светло-красный цвет. Краситель особенно удобен для окраши- вания преципитатов в условиях определения ферментативной ак- тивности. Пунцовый 2R 3,0 Ледяная уксусная кислота 100,0 Дистиллированная вода до 1000,0 Продолжительность окрашивания составляет несколько часов. Отмывают препарат водопроводной водой. 2.5.1.2. ОКРАШИВАНИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ Для выявления липопротеидов в преципитатах пригодны судан черный, жировой красный и нильский голубой. Необходимо, чтобы пластины геля были совершенно сухими; влажный гель плохо прокрашивается. Недостаточно высушенные препараты могут обусловливать выпадение неспецифического осадка крас- ки, поскольку все вышеперечисленные красители водонераство- римы. Судан черный. Состав красящего раствора: Судан черный 1,2 1 М NaOH 20,0 Дистиллированная вода 380,0 Абсолютный этанол до 1000,0 Смесь непродолжительное время кипятят, после остывания пе- реливают в темную склянку с хорошо притертым горлышком. Для окрашивания полностью высушенные пластины помещают на 3 ч в красящий раствор. Обесцвечивают 50% этанолом до полного просветления фона. Липопротеиды окрашиваются в темно-синий цвет. Жировой красный. Окрашивание этим красителем при- дает препарату незначительную контрастность. Липопротеиды окрашиваются в бледно-красный цвет. Состав смеси: Жировой красный 2,0 Этанол 70% 1000,0 После непродолжительного кипячения и охлаждения раствор фильтруют. В свежеприготовленном растворе пластины геля вы- держивают несколько часов; обесцвечивают 70% этанолом. Одновременное окрашивание липопротеидов и белков. Комбинируя азокармин с Суданом черным, можно за один цикл окрашивания получить белки в виде красных, ПО
а липопротеиды в виде темно-синих полос. Состав красящей смеси: Азокармин В 0,5 60% этанол, насыщенный судаком черным до 1000,0 Обесцвечивание фона проводят 50% этанолом, содержащим 1% уксусную кислоту. 2.5.1.З. ГЛИКО-, НУКЛЕО- И МЕТАЛЛОПРОТЕИДЫ По аналогии с электрофорезом на бумаге окрашивание углево- дов можно проводить перйодатным методом Шиффа. Разумеет- ся, неоправданно применение агара в качестве носителя, по- скольку он сам, будучи углеводом, дает положительную реак- цию. Поэтому предпочтительнее использовать ацетат-целлюлоз- ную мембрану. Нуклеопротеиды можно окрашивать пирони- ном Y. Продажные препараты пиронина содержат примеси, ко- торые можно удалить многократной экстракцией хлороформом. 20% раствор пиронина Y в дистиллированной воде 10,0 0,2 М ацетата натрия 45,0 0,2 М уксусная кислота 45,0 Высушенные пластины с гелем выдерживают в красящем рас- творе в течение 60 мин, фон обесцвечивают в ацетатном буфере. Преципитаты, содержащие нуклеопротеиды, окрашиваются в красный цвет. Выявление металлопротеидов. Преципитаты, содер- жащие ионы меди, окрашиваются ализариновым синим в синий цвет. Реакция специфична в отношении ионов. Исходный раствор: насыщенный раствор ализаринового си- него в уксусной кислоте Рабочий раствор: 1 часть исходного раствора+9 частей 70% уксусной кислоты (использовать немедленно). Высушенные пластины с гелем помещают на 30 мин в красящий раствор. Обесцвечивают пластины 70% СН3СООН. Белки, со- держащие ионы меди, окрашиваются в синий цвет. Железосо- держащие белки, например сывороточный трансферрин или ге- моглобинсвязывающие белки, выявляют при помощи реакций, сопровождающихся образованием берлинской лазури или бен- зидиновой пробой. 2.5.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ИММУННЫХ ПРЕЦИПИТАТОВ Определение ферментативной активности может служить не только для характеристики иммунных преципитатов, но и для повышения чувствительности метода. Блокада активных центров фермента в результате иммунной реакции наблюдается редко. 111
Как правило, активность фермента сохраняется и после реакции антиген — антитело. Ферменты и изоферменты можно выявлять после элюции из геля, окрашивать непосредственно в геле, поль- зоваться гелем, содержащим субстрат, применять сэндвич-ме- тод или метод контактной пленки. Ввиду термолабильности большинства ферментов пластины с гелем в ходе электрофореза необходимо охлаждать. Обычно пластины с гелем, подлежащие выявлению ферментативной активности, не высушивают. От- дельные ферменты, например, карбоксиэстеразы сохраняют ак- тивность и в высушенных пластинах. Мы приводим только не- сколько методик выявления ферментативной активности в им- мунных преципитатах в гелях. Исчерпывающие данные имеются в публикациях Uriel и Clausen [2,1]. 2.5.2.1. ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ Л а кта тд еги д р оген а з а (ЛДГ) КФ 1.1.1.27: Раствор 1. KCN 50 мг Хлористый диметилтиазо- лилтетразолий (или нитро- синий хлористый тетразо- лий) 30,0 мг 0,1 М фосфатный буфер pH 7,5 Раствор 2. Феназинметосульфат 10,0 мг Дистиллированная вода 10,0 мл Оба раствора можно хранить раздельно в течение 4 нед при 4 °C. Раствор 2 хранят в темной склянке. Среду для инкубации готовят непосредственно перед использованием. Среда для инкубации: Раствор 1 7,2 мл Раствор 2 0,2 мл НАД 5,0 мг DL-лактат лития 25,0 мг Определение изоферментов ДЛГ проводят во влажной пластине после удаления непреципитировавших белков. Реакция заканчи- вается через 1—2 ч при 37 °C. Первые видимые полосы прояв- ляются через 20 мин. Фиксацию проводят при комнатной темпе- ратуре в течение 30 мин спиртовым раствором уксусной кис- лоты: Этанол 150,0 мл Ледяная уксусная кислота 10,0 мл Дистиллированная вода 40,0 мл Препараты, содержащие компоненты с активностью ЛДГ, дают полосы преципитации сине-фиолетового цвета. Церулоплазмин (пара-дифенолоксидаза, КФ 1.10.3.2). 21,6 мг пара-фенилендиамина растворяют в 100 мл натрий-аце- татного буфера (0,1 М, pH 5,7), подогревают до 37 °C и немед- ленно используют. Инкубация продолжается 2 ч, после инкуба- ции проводят отмывку смесью спирта и натрий-ацетатного бу- фера: 112
0,2 М ацетат натрйй 50,0 0,2 М уксусная кислота 50,0 50% этанол 100,0 Церулоплазмин, обладающий оксидазной активностью, окраши- вается в сине-фиолетовый цвет. Для контроля в параллельном опыте используют ингибирующее влияние азида натрия на окси- дазы (добавляют к инкубационной смеси 1 мл 0,1 М NaNs)h которое предотвращает окрашивание. 2.5.2.2. ГИДРОЛАЗЫ Карбоксилэстераза (КФ 3.1.1.1) В качестве субстрата используют а-нафтилацетат, расщепляе- мый ферментом на нафтол и уксусную кислоту, с солями диазо- ния а-нафтол реагирует, образуя азокрасители, которые могут служить индикатором реакции. Среда для инкубации готовится непосредственно перед употреб- лением: а-Нафтилацетат 10,0 мг Ацетон 0,25 мл Оба компонента смешивают, затем добавляют: 0,1 М фосфатный буфер pH 7,4 25,0 мл Прочный синий В 20,0 мг Раствор необходимо профильтровать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30— 60 мин. Преципитаты, обладающие активностью карбоксилэсте- разы, окрашиваются в коричнево-красный цвет. Щелочная фосфатаза Раствор для инкубации: Нафтилфосфат натрия Прочный синий В 0,1 М веронал-солянокис- лый буфер pH 9,0 Раствор фильтруют. Пластины 60 мин при комнатной температуре, фиксируют 5% уксусной кислотой, отмывают водой в течение 1 ч. Ферментативная ак- тивность проявляется винно-красным окрашиванием. (КФ зл.3.1) 20,0 20,0 мг мг мл 20,0 инкубируют в течение 30— 2.5.3. РАДИОАВТОГРАФИЯ, ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ Радиоавтография представляет собой более чувствительный, чем окрашивание, метод исследования связывающей способно- сти веществ и их подвижности в геле. Чистые АГ метят 13Ч, 82Br, 69Fe, вносят их в смесь АГ. После преципитации высушен- ные пластины с гелем накладывают на куски рентгеновской пленки и оставляют их на несколько дней или недель. Радиоак- тивные преципитаты вызывают потемнение соответствующих участков пленки. Определение железосвязывающих трансферри- 8—990 ИЗ
R Рис. 45. Определение электрофоретической мо- бильности при иммуно- электрофорезе. А— альбумин, Т — трансферрин, G — IgG, R — резервуар с анти- геном, IS — канавка для иммун- ной сыворотки, АВ — расстояние между вершинами дуг А и Т, АХ — расстояние между верши- нами дуг А и G. нов, например, оказывается довольно простой процедурой — к смеси АГ перед анализом добавляют небольшое количество S9Fe. После высыхания пластины с гелем накладывают на рент- геновскую пленку; полосы трансферрина становятся хорошо различимыми на пленке. При помощи радиоактивных изотопов можно исследовать связывание витаминов, гормонов и некото- рых лекарственных препаратов с сывороточными белками. Если антигены или антитела маркировать флюоресцирующими ве- ществами, например, флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), то образующиеся иммунные преципитаты также будут флюоресци- ровать. Это позволяет проводить анализ в УФ лучах. Перед ис- следованием препаратов в УФ свете необходимо удалить избы- ток флюоресцирующего красителя из изучаемого препарата с помощью диализа или гель-фильтрации. 2.5.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ПОДВИЖНОСТИ Определение относительной электрофоретической подвижности может служить для характеристики неизвестных белков. Абсо- лютной электрофоретической подвижностью называют действи- тельную длину пробега исследуемого вещества, деленную на на- пряжение и время (размерность 10-5 см2 В-1 сек-1). Для опре- деления нулевой точки электроэндоосмоса, которая при электро- форезе в агаровом геле не совпадает с точкой старта, исполь- зуют вещества, электрически нейтральные и обладающие огра- ниченной диффузией (леван, декстран, цианкобаламин). В слу- чае, если иммуноэлектрофорез протекает в геле агара, путь, пройденный молекулами белка, представляет собой результи- рующую величину электрокинетического потенциала и электро- осмотического потока. Поэтому электрофоретическую подвиж- ность белка получают сложением видимой электрофоретической подвижности и электроосмотической подвижности. Можно вооб- ще не определять нулевой точки электроосмоса для изучаемого белка, если на той же пластине вместе с ним мигрируют по крайней мере два белка с известной электрофоретической по- движностью. В этом случае подвижность исследуемого белка оп- ределяется по следующей формуле (рис. 45): АХ их = иа-(иа-иь)-дв-, 114
где Ux — подвижность исследуемого белка; Ua и 15ь— подвижности известных белков; АХ — расстояние между белками с известной и неизвестной подвиж- ностью; АВ — расстояние между белками с известной подвижностью. В качестве референс-белков удобно использовать сывороточ- ный альбумин и сывороточный трансферрин человека. Абсолют- ная подвижность сывороточного альбумина при pH 8,6 составля- ет 6,1-10-5 см2 В-1 сек-1, трансферрина — 3,1-10~5 см2 В-1 сек-1,. Относительную электрофоретическую подвижность определяют как подвижность исследуемого белка по сравнению с сыворо- точным альбумином. Подвижность сывороточного альбумина принимают равной 1,0. 2.5.5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Clausen J. Immunochemical techniques for the identification and estimation of macromolecules (2-nd edition). Amsterdam, Elsevier Biomedical press, 1981. 2. Uriel J. Characterisation of precipitates in gels. — Methods Immunol. Immu- nochem., 1971, 3, 294—317. 2.6. ФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУННЫХ АГРЕГАТОВ 2.6.1, ПРИНЦИП МЕТОДА Инкубация раствора АГ с моноспецифической сывороткой приводит к образованию иммунных агрегатов. Эта разновид- ность иммунных комплексов рассеивает проходящий световой поток, интенсивность которого можно измерить прямо или кос- венно. При турбодиметрических измерениях определяют раз- ность AU между исходной величиной Uo и получаемой величи- ной Ui светового потока. В случае нефелометрии определяют количество света, отраженного под определенным углом к на- правлению падения светового потока. Интенсивность рассеянно- го света, или разность светового потока, прямо пропорциональ- на числу и величине иммунных комплексов [1, 2]. Соблюдая постоянные объемы реагирующих растворов, разведение сыво- ротки, время и температуру инкубации, можно определять кон- центрацию антигена в растворе при помощи калибровочной кри- вой. Калибровочную (стандартную) кривую получают, измеряя рассеяние света в растворах с известным содержанием антигена. На рис. 46 представлен ход лучей в лазерном нефелометре. Осо- бая геометрия устройства позволяет улавливать свет, рассеи- ваемый иммунными комплексами (ИК), под очень небольшими углами. В современных лазерных нефелометрах достигается полное поглощение света, идущего в прямом направлении; этого эффекта не удается достичь с обыкновенными лампами ввиду непараллельности их лучей. Высокое постоянство излучения ла- зера позволяет получать хорошо воспроизводимые результаты^ 8* 115
—| 17,77 | Цифровой _ l, „ _ вольтметр Система диафрагм Кювета Диафрагма Система линз Фотодиод Гелий-неоновый лазер Рис. 46. Ход лучей в лазерном нефелометре. На других факторах, влияющих на воспроизводимость (длина волны, качество фотодиодов, обусловленное кюветой рассея- ния), мы не будем останавливаться, так как они влияют на ме- тодику косвенным образом. Следует упомянуть о том, что при турбидиметрических измерениях рекомендуется пользоваться по возможности коротковолновым светом, поскольку он лучше рас- сеивается по разным направлениям. Особенно важно избегать при работе длины волн, совпадаю- щие с областями поглощения гемоглобина (400—420 и 500нм). Хорошо воспроизводимые результаты были получены нами при длине волны 450 нм. 2.6.2. МЕТОДИКА 2.6.2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Фосфатио-солевой буфер: 11,9 г Na2HPO4-2H2O и 9,1 г NaH2PO4 растворяют по отдельности в 1000 мл 0,15 М NaCl; 85,2 мл рас- твора Na2HPO4 доводят до 100 мл раствором NaH2PO4; получа- ют буферный раствор с pH 7,5. Моноспецифическая сыворотка; стандартный раствор: стандартная сыворотка для лазерной не- фелометрии с известным содержанием белка (смесь сывороток здоровых доноров, стабилизированная удалением термолабиль- ных компонентов); фреон (С2С13Рз) для осветления мутных сы- вороток; центрифуга на 16 000 g; микрокюветы из синтетических материалов (кюветы Sarstedt для лазерной нефелометрии); ла- зерный нефелометр, например He-Ne лазерный нефелометр (Behring Werke, Марбург). 2.6.2.2. ПОСТРОЕНИЕ СТАНДАРТНОЙ КРИВОЙ Для каждого белка строят стандартную кривую на основе 5— 6 разведений. Лучше использовать геометрический ряд разведе- ний стандартных сывороток для лазерной нефелометрии в фос- фатно-солевом буфере с pH 7,5 от 1: 10 до 1:640. Для IgG и IgA используют разведения 1:20— 1:640, для IgM и СЗс — 1:10—1: 160. Коммерческие препараты АС для лазерной нефе- лометрии обычно разводят в соотношении 1:5 (50 мкл АС + + 200 мкл буфера) в сосудах, не содержащих даже следов пыли. Лучше использовать стеклянные сосуды, так как пласт- массовая посуда притягивает пыль ввиду своих электростатиче- ских свойств. В измерительные кюветы вносят по 100 мкл раз- 116
веденного стандартного раствора и по 200 мкл различных раз- ведений сыворотки. В случае IgG берут только 10 мкл стандарт- ного раствора. Образцы инкубируют в течение 1 ч при комнат- ной температуре, затем проводят измерения на лазерном нефе- лометре. Кюветы опускают в шахту нефелометра, данные счи- тывают с цифрового табло. 2.6.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В СЫВОРОТКЕ БОЛЬНЫХ Исследуемые сыворотки подвергаются осветлению (центрифуги- рование при 16000 g в течение 10 мин) и обработке фреоном (1 мл сыворотки смешивают с 1,5 мл фреона, перемешивают в горизонтальном направлении, центрифугируют 10 мин при 1000 g). Такая обработка приводит к получению относительно прозрачной сыворотки. Сыворотки разводят в отношении 1 + +100 (50 мкл сыворотки + 5 мл буфера). К 100 мкл разведенной сыворотки прибавляют 200 мкл, разведенной 1 + 4 антисыворот- ки. Смесь инкубируют в кюветах, проводят измерение (табл. 6). Таблица 6. Схема разведений и используемых объемов Разведение стандарта Разведение АС Разведение исследуемой сыворотки Объемы реагентов стандарт или иссле- дуемая сыворотка анти- сыворотка IgG 1:20, 1,40, 1:80 1:60, :320, 1:640 1+4 1 + 100 10 мкл 200 мкл 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 1+4 1+500 100 мкл 200 мкл IgA 1:20, 1:40, 1:80 1:160, 1:320 1+4 1+100 100 мкл 200 мкл IgM 1:10, 1:20, 1:40 1:80, 1:160 1+4 1+100 100 мкл 200 мкл СЗс 1:10, 1:20, 1:40 1:80, 1:160 1+4 1+100 100 мкл 200 мкл 2.62.4. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ Получаемые на цифровом табло значения светорассеяния в вольтах и соответствующие значения концентраций стандартных растворов наносят на двойную логарифмическую или простую миллиметровую бумагу. Данные измерений образуют калибро- вочную кривую. На рис. 47 и 48 представлены калибровочные 117
Рис. 47. Калибровочная кривая для IgG. кривые для IgG и IgM. Одной и той же калибро- вочной кривой можно пользоваться, пока рабо- та осуществляется с од- ними и теми же реаген- тами. Рекомендуется все же контролировать изме- рения со стандартной сы- вороткой. Значения све- торассеяния, полученные с исследуемыми сыворот- ками, переводят в кон- центрацию с учетом ис- пользованных разведений. Полученные значения должны нахо- диться в средней части стандартной кривой, в противном случае приходится пользоваться другими разведениями. 2.6.2.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ Находящиеся в сыворотке иммунные комплексы могут быть оп- ределены при помощи преципитации ПЭГ 6000 (см. раз- дел 2.7). Исследуемые образцы сывороток после обработки фреоном (см. выше) разводят боратным буфером в соотноше- нии 1 + 2. Состав буфера: 6,7 г Н3ВО3, 13,4 г Na2B4O7-ЮН2О растворяют в 1000 мл Н2О; pH 8,4. Смешивают 200 мкл разве- денной сыворотки с 2 мл боратного буфера, во втором сосуде смешивают 200 мкл разведенной сыворотки с 2 мл боратного буфера, содержащего 4% ПЭГ 6000. Инкубируют 45 мин при комнатной температуре. Проводят измерения на лазерном нефе- лометре. Значения контроля (исследуемая сыворотка+борат- ный буфер) не должны превышать 0,3 В. Значения светорассея- ния в пробах, содержащих ПЭГ, соответствуют концентрации иммунных комплексов. Результаты можно оценивать косвенно по калибровочной кривой с искусственно полученными иммун- ными комплексами с известным содержанием белка. Чаще всего используют преципитирующие in vitro комплексы БСА — анти-БСА. Для получения таких комплексов смешивают равные количества БСА в 0,15 М NaCl и анти-БСА крысы, инкубируют в течение 30 мин при 37 °C и разводят в соответствии с геомет- рическим рядом. 2.6.3. ОЦЕНКА МЕТОДА Область измерений лазерного нефелометра охватывает данные, характерные для большинства нормальных и патологических состояний. Правда, можно предположить, что в случае парапро- 118
теинемий количество ан- тигена будет соответство- вать зоне избытка АГ (восходящая часть кри- вой Гейдельбергера). Из- быток АГ можно опреде- лить очень просто. После считывания результатов реакции к смеси добавля- ют 100 мкл разведенной антисыворотки. Через 15 мин производят по- вторное измерение. Если результаты повышаются более чем на 25%, то Рис. 48. Калибровочная кривая для IgM. имеет место избыток антигена. В этом случае измерения прово- дят с более высокими разведениями. Лазерная нефелометрия в последние годы получает все более широкое распространение. Точность метода очень высока. Коэффициент вариации, по дан- ным литературы, колеблется для одной серии в пределах 1-7%. Ежедневные повторные измерения указывают на вариацию в пределах 4—10% [1, 5]. Эти результаты можно еще улучшить, если автоматизировать анализ. Существует очень высокая кор- реляция между данными радиальной иммунодиффузии и лазер- ной нефелометрии [1]. Наибольшие отклонения наблюдаются при использовании мутных сывороток. Мутность не всегда можно устранить соответствующими процедурами. С этим всег- да приходится считаться в лабораторных исследованиях. 2.6.4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Conrad A., Schurman J., Kreuz F. Н., Sieber A. Elaboration of a method for the quantitative determination in the measurement of serum proteins by lazer nephelometry in the clinical routine laboratory. — Clin. Chem., 1978, 16, 299— 305. 2. Gressner A. M., Wallraf P. Der Einsatz der Laser-Nephelometrie zur bestim- mung und rechnerunterstiitzen. Auswertung der Fibronectinkonzentration in verschidenen Korperfliissigkeiten. — J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1980, 18, 797—805. 3. Gross J. Nephelometry: Principles and Methods. Abstracts of the Behring Symposium, International Meeting on Nephelometry, Paris, 22—23, 11, 1980. 4. Lakomec H. J., Jacobi E., Husmann K., Krusketnper H. L. Zur Diagnostik des systemishen Lupus erythematosus. — Dtsch. med. Wschr., 1979, 104, 980— 982. 5. Munster P. J. J., van Hoelen G. E. J. M., Samwel-Manting M., Holtman-van- Meurs M. A turbidimetric immunoassay (T1A) with automated individual blank compensation. — Clin. Chem. Acts, 1977, 76, 377—388. 6. Ripoll J. P., Roch A. M., Quash G. A., Grange J. An automatic continuous flow method of determination of antipelyamine antibodies in human sera. — J. Im- munol. Methods, 1980, 33, 159—173. 7. Ziegler G. B., Strobel G. J. Laser nephelometrische Plasma-proteinbestimmung: Immunokomplexe als Fehlerquellen. — Diagnostic Intens intherapie, 1978, 3, 74—78.
2.7. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАСТВОРИМЫХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ 2.7.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Экзо- или эндогенные АГ могут образовывать в организме им- мунные комплексы (ИК) с соответствующими АТ. Этот процесс может стать причиной системной или органной патологии. Судь- ба циркулирующих ИК зависит от их величины и от индивиду- альной активности фагоцитирующей системы. АТ в составе ИК могут включать каскад активации комплемента; кроме того, IgG- и IgM-антитела могут оказывать влияние на функции клеток, связываясь с их Fc-рецепторами [11]. Во многих рабо- тах описано повышение концентрации циркулирующих ИК при системных, аутоиммунных и инфекционных заболеваниях (леп- ра, шистосомиаз), а также при злокачественных новообразова- ниях. Значение анализа растворимых ИК для постановки диаг- ноза и понимания патогенеза еще раскрыто не до конца [14]. Величина и состав растворимых ИК зависят как от свойств АГ, так и от свойств АТ и в то же время от их относительной и аб- солютной концентрации [1]. Высокомолекулярные растворимые ИК преимущественно образуются из олиговалентных АГ и IgM-антител. Соотношение АГ/АТ в составе ИК зависит от от- носительных концентраций обоих компонентов; образующиеся при избытке АГ иммунные комплексы, как правило, меньше по размеру, чем формирующиеся в зоне эквивалентности. В отли- чие от олиговалентных поливалентные АГ легче преципитиру- ются избытком АТ. Взаимосвязь авидности и величины ИК, об- разующихся при использовании анти-ДНК-антител, можно про- следить на гибридах NZB/WF1 [12]. Наши знания о природе АГ, входящих в состав ИК, еще недостаточны. В некоторых случаях в составе ИК находили ДНК, инсулин, IgG и антигены вирусов гепатита; и все же антигенный состав ИК, как правило, не уда- ется охарактеризовать полностью. Специфические АГ можно обнаружить только в случае довольно ограниченного числа за- болеваний. Принято считать, что ИК, возникающие в условиях небольшого избытка АГ, представляют наибольшую опасность ввиду длительности их циркуляции и высокой комплементакти-- вирующей способности [10]. 2.7.2. МЕТОДИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ В 1976—1981 гг. было описано около 40 различных тест-систем. Это позволило провести в рамках международных исследований сравнение 18 различных методов определения ИК. Только 6 из них оказались пригодными в отношении точности, специфично- сти, чувствительности и воспроизводимости результатов [7]. Вместо широко применявшихся ранее физических методов в на- стоящее время чаще используют биологические. 120
Таблица 7. Методы определения растворимых НК, не основанные на антигенной специфичности Физические 1. Гель-фнльтрация 2. Центрифугирование в градиенте плотности 3. Криопреципитация 4. Осаждение ПЭГ Биологические Бесклеточные системы, взаимодействие с: 1. Комплементом 2. Конглютиннном 3. Ревматоидным фактором Системы с использованием клеток: 1. Взаимодействие с Fc-рецепторами 1.1. Проба на агрегацию тромбоцитов 1.2. Торможение АЗКЦ 1.3. Тест торможения активности макрофагов 2. Взаимодействие с С-рецепторами: тест с клеточной линией Raji 3. Взаимодействие с протеином А 2.7.2.1. ОСАЖДЕНИЕ ПЭГ Метод [2] основан на различной растворимости мономеров ИГ в составе ИК при наличии в среде полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000. Исследуемые сыворотки хранят при 4 °C после добавления 0,02% азида натрия. Сыворотки разводят 0,1 М боратным буфе- ром (pH 8,4) в соотношении 1 :24. К 4 мл разведенной сыворот- ки добавляют равный объем 7% раствора ПЭГ 6000 в 0,1 М боратном буфере и выдерживают смесь при 4 СС в течение 18 ч. После центрифугирования при 20 000 g в течение 20 мин осадок 1 раз отмывают 3,5% раствором ПЭГ, затем растворяют его в 5 мл 0,1 М NaOH. Содержание белка определяют по Лоури или по оптической плотности при длине волны 280 нм. В нор- мальных сыворотках преципитаты не дают значений оптической плотности более 0,12. Оценка результатов: как и в случае ульт- рацентрифугирования, гель-фильтрации и криопреципитации,по- ложительный ответ можно дать только после дополнительного определения IgG или Clq в сыворотках или преципитатах. Этот метод, широко применяемый в лабораториях, подвергся в по- следнее время критике [5], авторы даже объявили метод совер- шенно непригодным. Они полагают, что ПЭГ следует приме- нять только для получения ИК, которые в дальнейшем будут подвергнуты более детальному иммунохимическому анализу. 2.7.2.2. ТЕСТ НА СВЯЗЫВАНИЕ Clq Антитела (IgG 1, 2, 3 и IgM), входящие в состав ИК, и обла- дающие свойством связывать Clq, можно легко обнаружить при помощи Clq, меченного 125[1]. Выделение ИК со связанным 121
Рис. 49. Стандартная кри- вая, построенная с исполь- зованием термоагрегиро- ванного у-глобулина, в 7S-IgG. Суспензия в нормальной сыво- ротке в присутствии ЭДТА. 1 — в нормальной сыворотке; 2 — в сыворотке, прогретой при 66 °C; 3 —7S-IgG в нормальной сыво- ротке. 12S[I]-Clq проводят в присутствии 2,5% ПЭГ 6000. Clq с со- храненной реактив- ностью получают из сыворотки человека, используя Н2О2 и лак- топероксидазу. Приме- няемый для анализа препарат должен обладать специфической активностью около 1 мкКи/мкг. Если он разделен на аликвоты по 10 мкКи и хранится при —70 °C, его можно считать пригод- ным для работы в течение 6 нед. Перед употреблением 10 мкКи 125[I]-Ciq смешивают с 5 мл веронал-NaCl буфера (pH 7,2, 1% БСА) и центрифугируют в течение 40 мин при 18 000 g. Из надосадочной фракции отбирают пробы по 50 мкл (около 0,1 мкКи) в каждую пробирку. К 50 мкл исследуемой сыворотки добавляют 100 мкл раствора ЭДТА (0,2 МЭДТА pH 7,5) и ин- кубируют 30 мин при 37 °C. После охлаждения смеси до 0°С к ней прибавляют 50 мкл 125[I]-Clq и 1 мл 3% раствора ПЭГ (30 г ПЭГ 6000 в 1 л 0,1 М Н3ВОз, 0,025 М тетраборат Na, 0,075 М. NaCl, pH 8,3). Пробиркам со смесью дают постоять 60 мин и центрифугируют их в течение 20 мин при 1500 g, над- осадочную фракцию отсасывают и отбрасывают, измеряют ра- диоактивность. Полученное значение радиоактивности относят к количеству 125[I]-C[I]q, осаждаемому 1 мл 20% ТХУ. Ранее для уменьшения неспецифической преципитации 125[I]-Clq применяли прогревание сывороток в течение 30 мин при 56 °C. Использова- ние ЭДТА позволяет повысить чувствительность метода до 50 мкг, а также предотвратить как переход в иммунные комп- лексы Clq-связывающих компонентов из сыворотки, так и рас- пад существующих ИК (рис. 49). Оценка получаемых результа- тов: использование термоагрегированного человеческого IgG в качестве стандарта позволяет повысить чувствительность мето- да до 50 мкг, однако это не всегда бывает достаточно. Особое внимание следует уделять чистоте препаратов Clq. Присутству- ющий в них в качестве примеси IgG может соединяться с ревма- тоидным фактором и симулировать наличие ИК. Потенциально с Clq могут также связываться ДНК, гепарин, различные поли- сахариды и фибриноген. 122
2.7.2.3. ТВЕРДОФАЗНЫЙ АНАЛИЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Clq Адсорбированный на твердую фазу Clq сохраняет способность связываться с Fc-концом IgG 1, 2, 3 и IgM., входящих в состав ИК. Использование твердой фазы позволяет сравнительно прос- то удалять компоненты, не связывающие Clq [3]. Адсорбция до- стигается инкубацией в течение 3 дней при 4 °C пластиковых пробирок с 1 мл раствора Clq (10 мг человеческого Clq в 1 л ФСБ pH 7,2; 0,01 М Na2HPO4, 0,15 М NaCl). Пробирки трижды ополаскивают холодным ФСБ и инкубируют с ФСБ, содержа- щим 0,1% раствор желатина. Затем проводят троекратное опо- ласкивание ФСБ, после чего пробирки готовы к использованию (их можно хранить в холодильнике). К 50 мкл исследуемой сы- воротки добавляют 100 мкл 0,2 М ЭДТА pH 7,5, инкубируют смесь в течение 30 мин при 37 °C. После охлаждения до 0 °C отбирают аликвоты различных разведений сыворотки объемом 50 мкл, смешивают их с 950 мкл 0,05% раствора твин-20 в ФСБ (ФСБ-твин) и вносят в «сенсибилизированные» Clq пробирки, которые затем инкубируют 1 ч при 37 °C и еще 30 мин при 4 °C. Несвязавшийся материал удаляют 3—4-кратным ополаски- ванием 1,5 мл ФСБ-твина, 125[I]-IgG человека в количестве 1 мкг, содержащего специфические антитела (около 0,25 мкКи/мл), растворяют в 1 мл ФСБ-твина, вносят в пробир- ки и инкубируют их в течение 1 ч при 37 °C, затем еще в течение 30 мин при 4 °C. После удаления 12S[I]-AT измеряют радиоак- тивность твердой фазы. Неспецифическое связывание 12S[I]-ан- тител проверяют на пробирках, «нагруженных» только жела- тином. Если вместо желатина использовать БСА, а концентра- цию твин-20 повысить до 0,1%, то неспецифическое связывание уменьшается до такой степени, что им можно пренебречь [3]. Связывание 1g человека с адсорбированным Clq в области кон- центраций 0,1—10 мкг носит в отсутствие мо- - ioooo-j номерного IgG линей- § ный характер (рис. 50). f В присутствии 25 мкл ° нормальной человече- s ской сыворотки этим | методом удается выя- S. св О О X Рис. 50. Связывание агре- g тированного человеческого “ IgG с Clq, адсорбирован- « ным на пластиковых про- § бирках. « Меченный 125[1] агрегированный х IgG вносили в различных кон- центрациях, степень связывания определяли после отмывки. 123
Рис. 51. Определение агрегирован- ного IgG в присутствии 25 мкл нормальной сыворотки человека. вить 1 мкг Ig человека; пока- затель связывания выходит на плато при 25—50 мкг Ig че- ловека (рис. 51). Оценка получаемых результатов. Как упоми- налось выше, чувствительность метода на модели Ig человека составляет 1 мкг/мл. По срав- нению со связыванием Clq (меченным 1251) в жидкой фазе становятся весьма заметными искажения, вносимые состав- ными частями сыворотки, не относящимися к ИК. Приме- няемый для работы Clq не должен содержать примесей иммуноглобулинов. Отсутствие ИГ следует устанавливать ме- тодом ИЭФ с моно- и полиспецифическими АС. Было предложе- но использовать в качестве твердой фазы пластиковые шарики [9], при этом отмечалось снижение количества адсорбируемого Clq на 10%, что существенно снижало издержки анализа. Дру- гим вариантом твердофазного связывания с Clq может стать применение энзим-меченных антител [13]. Использование в анализе класс-специфических АТ позволяет отдифференциро- вать IgG от IgM в составе ИК- Хорошим индикатором может стать 125[1]-протеин А, заменяющий 125[I]-IgG против АГ чело- века. 2.7.2.4. СВЯЗЫВАНИЕ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ СО СТАФИЛОКОККОМ А Клеточные системы для количественной оценки связывания рас- творимых ИК можно разделить на две группы в соответствии с задействованными клеточными рецепторами. В тесте с исполь- зованием линии клеток Raji—это рецепторы типа C3(b, d). Тромбоциты, макрофаги или К-лимфоциты связывают раство- римые ИК за счет Fc-рецепторов. При постановке клеточных проб Fc-рецепторного типа основное значение приобретает из- бирательное связывание IgG, входящего в состав ИК, но не мономерного IgG. Описана индикаторная система, в которой первичным агентом связывания служат инактивированные на- греванием клетки Staphylococcus aureus, штамм Cowan I [8]. Содержащийся в их наружной мембране протеин А обладает селективными свойствами по отношению к Fc-рецепторам. 124
Рис. 52. Стандартная кривая опреде- ления агрегированного глобулина в присутствии нормальной сыворотки человека. Для реакции применяли меченный 125[П IgG человека (1) или поливалентные спе- цифические антитела (2) [8]. Подготовка стафи- лококков. Штамм Cowan I после культивации инактиви- руют нагреванием в течение 2,5 мин при 80 °C и хранят при —70 °C. После оттаивания микробные клетки остаются пригодными для работы в те- чение 4 нед. Для постановки пробы используют 0,8% (по объему) суспензию микробов в БСА — ФСБ (0,5% БСА, 0,01 М Кг НРО4, 0,15 М NaCl, 0,1% NaN3, pH 7,2). Индикаторная система. Для количественной оценки растворимых комплексов 50 мкл человеческой сыворотки сме- шивают с 150 мкл ЭДТА-буфера (0,2 М натриевая соль ЭДТА, pH 7,4), затем добавляют 1 мл 6% раствора ПЭГ 6000 в 0,1 М боратном буфере (см. выше). Пробирки с пробами оставляют на ночь при 4 °C, затем центрифугируют их 20 мин 1000 g. Каж- дый осадок ресуспендируют в 1 мл 5% раствора ПЭГ и снова центрифугируют. На этом этапе удаляется мономерный IgG. Надосадочную фракцию сливают, осадок растворяют в 200 мкл ФСБ; добавляют при комнатной температуре аликвоту объемом 100 мкл к такому же объему суспензии стафилококков и инку- бируют 2 ч при 37 °C. Связывающиеся в этих условиях с про- теином А иммунные комплексы после предварительного добав- ления к смеси 0,5 мл 0,5% раствора БСА—ФСБ осаждаются вместе с микробами центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин. Перед последующей обработкой пробирки выдерживают некоторое время при 0—4 °C. Осадки дважды отмывают БСА— ФСБ и растворяют в 100 мкл ФСБ, содержащего 5 мг/мл IgG кролика. Определение связавшихся ИК проводят при помощи 100 мкл препарата меченных 12S[I] кроличьих антител к IgG человека (0,04 мкКи/мкг). Для постановки этой пробы необхо- дим избыток меченых АТ. Меченые АТ титруют клетками золо- тистого стафилококка, нагруженными человеческим IgG. Реак- цию индикации проводят приблизительно в течение 12 ч при 4 °C, непрореагировавшие АТ остаются в надосадочной фракции после центрифугирования в течение 10 мин при 1000 g. Осадок трижды отмывают ФСБ, затем измеряют радиоактивность. При измерениях, проводимых с 1g человека в пределах 0—200 мкгг 125
стандартная кривая имеет линейный характер; обработка осад- ка поливалентными 125[1]-анти-^О-антителами приводит к вы- сокому, почти 50% уровню неспецифической сорбции, вследст- вие чего стандартная кривая приобретает уплощенный вид (рис. 52). Оценка результатов. Метод не подвержен искажени- ям со стороны клеточных процессов и сывороточных антител в отличие от тест-систем, использующих живые клетки (тест агглютинации тромбоцитов, тест с линией клеток Raji, тест тор- можения активности макрофагов). Будучи комплементнезависи- мым методом, он позволяет получать результаты, которые не за- висят от содержания комплемента в сыворотке. К недостаткам метода следует отнести то, что он применим к ИК, содержащим только IgG. Чувствительность по 1g человека составляет 10 мкг/мл и почти не зависит от степени агрегации белка. 2.7.3. ПРИМЕНЕНИЕ АГРЕГИРОВАННОГО НАГРЕВАНИЕМ IgG ЧЕЛОВЕКА В КАЧЕСТВЕ СТАНДАРТА Оценка чувствительности методов обнаружения ИК, как прави- ло, связана с применением стандарта по 1g человека. По таким показателям, как активация комплемента, связывание с макро- фагами и способность индуцировать феномен Артюса, 1g чело- века сходен с растворимыми ИК. Применяя растворимые ИК, можно стандартизовать различные тест-системы на ИК и выра- жать получаемые значения в эквивалентах 1g человека. Имеют- ся работы, посвященные изучению его характеристик и стабиль- ности [4, 6]. Ультрацентрифугированием агрегированного при 63 °C IgG человека было показано, что степень агрегации зави- сит от продолжительности тепловой обработки (рис. 53). Усиле- ние процесса агрегации наблюдалось после хранения при —70 °C. Введение 0,5% БСА заметно тормозило этот процесс. Агрегаты 1g человека, состоящие из 48—80 молекул IgG, после хранения в течение 15 мес не изменяли своей способности акти- вировать комплемент и связываться в двух других тестах при добавлении 0,5% БСА [4, 6]. Приготовление 1g человека. Растворяют 20—50 мг мономерного человеческого IgG в 1 мл ФСБ и инкубируют 20 мин при 63 °C. Последующие операции проводят при 0— 4 °C. Легко седиментирующие агрегаты удаляют из опалесци- рующего раствора центрифугированием в течение 15 мин при 3000 g. Термическая обработка переводит в агрегированную форму не более 50% исходного материала. Различные способы определения ИК неодинаково зависят от размера частиц 1g че- ловека или ИК, поэтому построение стандартной кривой требу- ет его фракционирования и удаления мономеров IgG. Для уст- ранения нежелательных компонентов можно применять гель- фильтрацию через сефакрил S-200, сефарозу 4 В, и особенно 126
Рис. 53. Седиментационный профиль агрегированного глобулина [6]. IgG человека инкубировали при 63 °C в течение 10 мни (1); 20 мии (2); 30 мни (3): контроль (4). После удаления нерастворимых агрегатов препараты фракционировали методом зонального центрифугирования при 263 000g в течение 2 ч (ротор SW — 40Ti) в градиенте плотности сахарозы с добавлением Б С А. ультрацентрифугирование Ig человека в градиенте плотности са- харозы 10—30%. В присутствии маркеров можно получать агре- гаты вполне определенной величины. Градиент приготовляют на БСА-боратном буфере с pH 7,2 (0,1 М Н3ВО3, 0,14 М NaCl, 0,5% ВС А). К числу недостатков центрифугирования относится то, что выход Ig человека составляет не более 10 мг, кроме того, необходимо удалять сахарозу диализом. 2.7.4. ОЦЕНКА МЕТОДА В основе методов определения растворимых ИК лежит исполь- зование комплемента или ИГ, входящих в состав ИК, а также С или Fc-рецепторов клеток. На чувствительность этих методов оказывают влияние различные факторы (pH, ионная сила, раз- мер ИК, соотношение АГ/АТ, наличие эндогенного комплемента, природа АГ). С учетом этого становится понятной малая сопо- ставимость 18 различных способов определения ИК [7]. Сравнительное изучение показало, что для вывода о нали- чии растворимых ИК желательно параллельное проведение ис- следования двумя различными способами, основанными на раз- ных тест-системах. Для сравнения результатов желательно ис- пользовать достаточно изученные референс-препараты (Ig чело- века, ИК)- Достоверность наличия циркулирующих ИК может быть повышена исследованием системы активности комплемен- та (С-профиль) и обнаружением отложения компонентов ком- племента или иммуноглобулинов в стенке сосудов [5]. 127
2.7.5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Barnett Е. V. Circulating immune complexes: their immunochemistry, detec- tion and importance. — Ann. Int. Med., 1979, 91, 430—440. 2. Digeon M., Laver M., Riza J., Bach J. F. Detection of circulating immune complexes in human sera by simplified assays with polyethylene glycol. — J. Immunol. Methods, 1977, 16, 165—183. 3. Falck P., Meffert H. et al. Radioimmunologischer Nachweis von loslichen Immuncomplexen in Serum. — Dermatol. Monatsschr., 1979, 165, 276—281. 4. Kaufmann R. H., van Es L. A., Doha M. R. Aggregated human immunoglobu- lin G stabilised by albumin: a standard for immune complex detection.— J. Immunol. Methods, 1979, 31, 11—22. 5. Klein M., Simonovitch K. The significance and limitations of current methods for detecting immune complexes. — J. Reumatol., 1981, 8, 188—192. 6. Knutson D. V., Kijlstra A., Lentz H., van Es L. A. Isolation of stable aggre- gates of IgG by zonal centrifugation in sucrose gradients containing albu- min.— Immunol. Comm., 1979, 8, 337—345. 7. Lambert P. H. et al A WHO collaborative study for the evaluation of methods for detection of immune complexes in serum. — J. Clin. Lab. Immunol., 1978, 1, 1—15. 8. Me. Dougal J. S., Beredcha P. B. et al. Binding of IgG aggregated and immune complexes in serum to staphylococci containing protein A. — J. Clin. Invest., 1979, 62, 627—636. 9. Pohl D. A., Tsai С. C., Roodman S. T. Detection of immune complexes using a solid phase Clq polystyrene ball assay. — J. Immunol. Methods, 1981, 40, 313—330. 10. Scherzer H„ Ward P. A. Lung injury produced by immune complexes of varying composition. — J. Immunol., 1978, 121,947—952. 11. Sedlacek H. H. Pathophysiological aspects of immune complex deseases.— Klin. Wschr., 1980, 58, 543—550, 593—605. 12. Steward M. W., Katz F. E., West M. J. The role of low affinity antibodies in immune complex desease. — Clin. Exptl. Immunol., 1975, 21, 121—130. 13. Wehler C., Andrews J. M„ Bing D. H. The use of solid phase Clq and hor- seradish peroxidase conjugated goat and anti-goat anti-IgG for the detection of immune complexes in human serum. — Molecul. Immunol., 1981, 18, 157— 162. 14. Zubler R. H„ Lange G. et al. Detection of immune complexes in unbeaded sera by a modified 125I-Clq binding test. — J. Immunol., 1976, 116, 232— 235. 2.8. ИМУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИЯ 2.8.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Иммунофлюоресценция — это метод, основанный на использова- нии специфичности иммунологической реакции и чувствительно- сти флюоресцентной микроскопии. В отличие от других методов маркировки постановка пробы и точная локализация иммунной реакции на поверхности клетки или ткани происходят довольно быстро. Один из компонентов иммунной реакции, как правило АТ, метится флюоресцирующим красителем (маркировка, конъюгирование). После возбуждения флюоресцирующего агента положение АГ становится доступным непосредственному наблюдению вследствие развития флюоресценции (рис. 54). Предложенный в 1941 г. Кунсом, этот метод после многочислен- 128
Прямой метод Непрямой метод Инкубация Инкубация Объяснение условных знаков АГ АТ Анти-АТ Рис. 54. Принцип иммуиофлюорес- центного анализа. Флюорохром Антикомплемент Комплемент ных усовершенствований прочно вошел в лабораторную прак- тику. Метод включает следующие важные этапы: — получение, характеристика и маркировка антисывороток; — получение антигенного субстрата; — проведение анализа, т. е. обработка флюоресцирующими АТ; — микроскопический анализ флюоресценции препаратов. В настоящее время используют преимущественно коммерче- ские препараты флюоресцирующих АС. Если необходимых флюоресцирующих сывороток нет, можно воспользоваться не- прямым методом флюоресцентного маркирования, присоединив к исследуемому объекту АГ, к которому имеются меченые АТ. Очень редко приходится разрабатывать собственный препарат меченых флюоресцентным красителем АТ. Работа с флюорес- цирующими АТ, особенно оценка получаемых с их помощью ре- зультатов, требует определенных навыков. Всегда следует про- водить анализ с учетом неспецифической или нежелательной специфической флюоресценции. Необходимо учитывать факто- ры, которые могут оказывать влияние на флюоресцентный ана- лиз. К ним относятся: — желательная специфическая флюоресценция: специфическое связывание меченых АТ с соответствующим АГ; — неспецифическая флюоресценция: неспецифическое отложе- ние флюоресцирующих конъюгатов на различных тканевых структурах, например, вследствие избытка красителя или взаимодействия меченых АТ с Fc-рецепторами; включение метки в другие сывороточные белки, кроме 1g, и неспецифи- ческое связывание этих белков, например альбумина, фибро- нектина, аутофлюоресценция; 9-990 129
— нежелательная специфическая флюоресценция: наличие пе- рекрестных реакций или недостаточная специфичность са- мого конъюгата. В случае прямого иммунофлюоресцентного анализа возможно неспецифическое отложение меченых АТ. Путем соответствующего контроля (см. ниже) удается избе- жать ложных результатов, обусловленных присутствием посто- ронней иммунофлюоресценции. 2.8.2. МАРКИРОВКА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Получение и очистка АС описаны в разделах 1.1 и 1.2. Для по- лучения у-глобулиновой фракции можно использовать 4—5- кратное переосаждение сульфатом аммония. Избыток соли ме- шает маркировке и должен быть предварительно удален диали- зом. Перед маркировкой необходимо также определить реактив- ность АТ (см. разделы с 2.1 по 2.4) и содержание белка в пре- парате. Практически для всех экспериментов можно в качестве флюоресцирующего красителя использовать ФИТЦ (флюорес- цеинизотиоцианат). Для двойной маркировки можно использо- вать добавочное введение ТРИТЦ (тетраметилромадинизотио- цианат). Спектр флюоресценции этих красителей различен. Ус- ловия их конъюгирования с Ig одинаковы. Мечение Ig не долж- но сопровождаться снижением их специфической активности. Увеличение числа молекул красителя, связанных с каждой мо- лекулой Ig, одновременно повышает чувствительность и усили- вает неспецифические реакции с таким конъюгатом. Оптималь- ное молярное соотношение флюорохрбм/Ig составляет 2—3 для ФИТЦ и 1—2 для ТРИТЦ [5, 13]. Известны краткосрочное (2 ч при комнатной температуре) и длительное маркирование (12—18 ч при 4°C), которому мы отдаем предпочтение. После введения метки в молекулу Ig избыток красителя удаляют. Различными видами очистки, например адсорбцией ацетоновым порошком тканей, можно удалить АТ, содержащие наибольшее количество красителя. Рекомендуется для каждого конъюгата определять молярное соотношение краситель/белок. 2.8.2.1. МАРКИРОВАНИЕ БЕЛКОВ ФИТЦ И ТРИТЦ 2.8.2.1.1. Материалы и оборудование ФИТЦ, изомер I (например, фирмы Baltimore Biological, США) или ТРИТЦ; 0,1 М. Na2HPO4; диметилсульфоксид (ДМ.СО) (на- пример, Реахим, СССР); карбонат-бикарбонатный буфер с pH 9,5 (17,3 г NaHCO3, 8,6 г Na2CO3 в 1000 мл дистиллирован- ной Н2О); 0,01 М и ФСБ с pH 7,2 (1,72 г Na2HPO4‘2H2O, 0,5 г КН2РО4, 7,2 г NaCl, дистиллированная Н2О до 1000 мл); 0,01 М фосфатный буфер с pH 7,5; сефадекс G-25 средний (Pharmacia, Швеция); ПЭГ 20000 (Ferak, Зап. Берлин). Диализный матери- ал, магнитная мешалка, хроматографическая колонка [4]. 130
2.8.2.1.2. Методика Перед маркировкой раствор белка (концентрация 15—25 г/л) в течение ночи диализуют при 4 °C против карбонат-бикарбо- натного буфера. На каждый грамм белка расходуется 12,5 мг флюоресцентного красителя (ФИТЦ, ТРИТЦ), этим достигается оптимальное соотношение краситель/белок. Растворяют 1 мг ФИТЦ в 2 мл 0,1 М Na2HPO<, 1 мг ТРИТЦ растворяют в 1 мл ДМСО. Раствор красителя медленно, по каплям, добавляют к раствору белка при постоянном помешивании. Необходимо контролировать и поддерживать pH на уровне 9,3. Конъюгиро- вание продолжается в течение 18 ч при 4 °C в темноте. После окончания процесса избыток красителя удаляют гель-фильтра- цией на колонке с сефадексом G-25. Сефадекс кипятят в тече- ние 4 ч, густую суспензию заливают в колонку, нижнее отвер- стие которой закрыто нейлоновой сеткой или стеклянной ватой. После того как сефадекс осядет, колонку заполняют и уравно- вешивают ФСБ. Раствор, содержащий меченые белки и свобод- ный краситель, осторожно наносят на колонку, колонку промы- вают ФСБ. Меченые белки движутся через сефадекс быстрее, чем свободный краситель, и при прохождении через колонку видны в виде окрашенной полосы. Для концентрирования по- лученных фракций мы рекомендуем диализ против раствора ПЭГ (250 г ПЭГ на 1 л 0,01 М фосфатного буфера с pH 7,5). Раствор концентрируют до нужной степени и собирают. Колонку с сефадексом можно многократно использовать для фильтра- ции. В перерывах между работой к раствору, заполняющему ко- лонку, добавляют консервант (мертиолат). 2.8.2.2. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ И ОРИЕНТИРОВОЧНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СООТНОШЕНИЯ КРАСИТЕЛЬ/БЕЛОК 2.8.2.2.1. Материалы и оборудование ДЭАЭ-целлюлоза 0,6—0,8 мэкв/г (Ренал, Будапешт), 0,02 М фосфатный буфер с pH 7,5, растворы NaCl (0,1 М; 0,2 М; 0,4 М; 0,6 М; 0,8 М). Маленькая хроматографическая колонка или пластиковый шприц. Спектрофотометр UV vis (Zeiss, йена) [4, 7]. 2.8.2.2.2. Методика ДЭАЭ-целлюлозу уравновешивают 0,01 М фосфатным буфером с pH 7,5, заполняют сорбентом колонку. На колонку наносят исследуемую фракцию меченых белков. Вначале колонку про- мывают буфером без NaCl, затем буферными растворами с воз- растающей концентрацией соли (0,05 М; 0,1 М; 0,2 М; 0,3 М; 0,4 М). Растворы для элюции получают смешиванием фосфат- 9* 131
Таблица 8. Ориентировочное определение концентрации белка (Кб) и молярного соотношения краситель/белок (Кр/б) конъюгатов путем измерения оптической плотности (ОП) на различных длинах волн [4, 12]. Конъюгаты белок— ФИТЦ разводят 0,1 М NaOH, конъюгаты белок —ТРИТЦ—ФСБ ФИТЦ ТРИТЦ v, . , , ОП280—(0,35x017455) Кб (мг/мл) =------------------—-— 1 >4 Ко/б = 2’87хОПш р/ ОП280-(0,35ХОП40.) При оп- ОПл». тималь- ——>0,5<Ч,5 ном Кр/б ОП280 пгт (O>56xnsso ^280— г-: 1 >4 ____4,47хОГТ55о____ ОП288—(0,56x017550 >.я п ного буфера и растворов NaCl в соотношении 1 + 1. Белки, ме- ченые ФИТЦ, сходят с колонки с 0,4 М NaCl, белки, меченые ТРИТЦ, —с 0,05—0,01 М NaCl. Удаление избыточно меченых АТ можно осуществить осаж- дением протаминсульфатом [5]. Для точного определения ко- личества белка мы рекомендуем пользоваться биуретовым ме- тодом. Ориентировочно количество белка можно определить спектрофотометрически, используя в качестве стандарта рас- твор у-глобулина. Содержание ФИТЦ определяют, используя в качестве стандарта раствор флюоресциндиацетата. Зная коэф- фициент экстинкции ФИТЦ и ТРИТЦ, можно определить ко- личество связанного красителя и молярное соотношение краси- тель/белок (табл. 8). 2.8.2.3. АДСОРБЦИЯ ПОРОШКОМ ТКАНИ Если конъюгат в прямой реакции с тканью дает неспецифиче- скую или нежелательную специфическую флюоресценцию, то адсорбцией конъюгатов порошком соответствущей ткани можно устранить это явление. Этот метод оказался полезным при об- работке коммерческих препаратов, дающих перекрестные реак- ции с тканями различных животных. 2.8.2.З.1. Материалы и оборудование Необходимо иметь свежую мышиную или крысиную печень, ФСБ с pH 7,2 ацетон, гомогенизатор, термостат, марлю. 2.8.2.3.2. Методика Извлекают печень мыши или крысы (промывают ее перед из- влечением холодным ФСБ через систему нижней полой вены), измельчают ножницами, затем гомогенизируют. Гомогенат ткани фильтруют через несколько слоев марли, марлю аккуратно выжимают. К фильтрату при постоянном по- 132
мешивании добавляют 4-кратное количество ацетона. После центрифугирования (20 мин, 4000 g) осадок промывают дистил- лированной водой до полного исчезновения следов гемоглобина. Осадок высушивают ацетоном ,3—5 раз (суспендируют в ацето- не и центрифугируют 20 мин при 2000 g). Порошок сушат в те- чение ночи при 37 °C, разделяют на порции и хранят без досту- па воздуха при 4 °C. Адсорбцию проводят, смешивая 50 мг су- хого порошка печени с 1 мл конъюгата и инкубируя их в тече- ние 1 ч при комнатной температуре. Порошок ткани удаляют центрифугированием в течение 30 мин при 15000 g. Адсорбиро- ванный конъюгат диализуют, разделяют на порции и лиофили- зируют. 2.8.2.4. ХРАНЕНИЕ СЫВОРОТОК И КОНЪЮГАТОВ Конъюгаты и сыворотки можно хранить без потери ими актив- ности при —20 °C в течение года и более. Повторное замора- живание и оттаивание снижает активность в меньшей степени, чем хранение при комнатной температуре или микробный про- рост. Порции, на которые разливают препараты при хранении, не должны быть слишком маленькими, иначе происходит холо- довое высушивание образцов, которое резко снижает актив- ность. Идеальным способом хранения конъюгатов является лио- филизация и последующее хранение при 4 °C. Сильно разве- денные сыворотки или конъюгаты рекомендуется использовать в день разведения. При хранении материала при 4 °C рекомен- дуется добавлять консервант (мертиолат). 2.8.3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СУБСТРАТОВ В качестве антигенных субстратов, как правило, используют срезы ткани, клетки, клеточные органеллы. Во время подготов- ки объекта следует обращать внимание как на морфологиче- скую сохранность объекта, так и на сохранность антигенного со- става. В большинстве случаев приходится отказываться от фиксации тканей и срезов. Если все же фиксация необходима в силу отсутствия криотома, растворимости АГ или невозмож- ности удержать объект на предметном стекле, то необходимо за- ранее определить, какое воздействие оказывает фиксатор на ан- тигенность. При плохом прилипании объекта к стеклу можно по- пытаться очистить его нитросерной кислотой, обработать смесью хромовых квасцов с желатином, формваром (Serva) или мета- силикатом [6]. Перед работой анализируемые препараты под- сушивают на воздухе в течение 10—20 мин. Препараты можно сохранять в отсутствие доступа воздуха при —20 °C, если пред- варительно дать им подсохнуть при 40—50 °C в течение 30 мин. Известны способы консервации антигенов на срок более года [7]. После осторожного подсушивания препарат нагревают в течение 10 мин при 100 °C и осторожно завертывают в алю- 133
I ---Стеклянная палочка Рис. 55. Специальные приспособления для им- мунофлюоресцентного анализа. а—устройство для шок-замораживания (медный ци- линдр, погружаемый в сосуд Дьюара с жидким азо- том); б — инкубационная камера; в — устройство для получения отпечатков ткаии; г — штамп для пред- метных стекол; д — устройство для повторного отыс- кания микрообъектов.
миниевую фольгу. Препараты сохраняют при —20 °C, перед употреблением длительно акклиматизируют. Для быстрого ана- лиза препарата рекомендуют окрашивание акридиновым оран- жевым (100 мг/л, 10 с, отмывка водопроводной водой); рассмат- ривают в тех же условиях, что и препараты, окрашенные ФИТЦ. В зависимости от величины препарата приходится про- сматривать различное число полей зрения. Маленькие объекты удобно рассматривать на специальных шаблонах (рис. 55). 2.8.З.1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КРИОСРЕЗОВ 2.8.З.1.1. Материалы и оборудование Для работы необходимы: изопентан (Fluka), жидкий азот, ОСТ (Miles, США); предметные стекла нефлюоресцирующие, очи- щенные нитросерной кислотой (20 г нитрата калия в 1 л кон- центрированной серной кислоты); криотом. 2.8.3.1.2. Методика Образцы только что полученной ткани (толщиной не более 5 мм) подвергают шок-замораживанию изопентаном, охлажден- ным жидким азотом. Для охлаждения можно также использо- вать смесь ацетона и сухого льда. Небольшие кусочки ткани (например, биопсийный материал) перед замораживанием за- ключают в ОСТ, 20% желатин или печень крысы. Высыхание за- мороженной ткани можно предотвратить, помещая образцы в небольшие пластиковые пакетики или сосуды. В случаях быст- рого использования (до 8 нед) ткань можно хранить при —20 °C. Если возникает необходимость более длительного хра- нения, рекомендуется использовать жидкий азот. Криосрезы толщиной 4—6 мкм прикрепляют к предметному стеклу и обра- батывают, как описано выше. 2.8.3.2. ПРЕПАРАТЫ КУЛЬТУР КЛЕТОК, МАЗКИ И ОТПЕЧАТКИ Из суспензии культуры клеток (оптимальное число клеток в 10 мкл — 5-104Хувеличение объектива) можно приготовлять мазки для иммунофлюоресцентного анализа. Для предотвраще- ния смывания клеток при последующих процедурах необходимо проводить специальную обработку стекла (см. выше) или фик- сировать препарат. Клеточная суспензия лучше распределяется по стеклу при добавлении сывороточного альбумина в количест- ве 5 г/л. После этого необходима фиксация препарата. Культу- ры клеток на покровных стеклах очень удобны для иммуно- флюоресцентного анализа. Покровные стекла перед анализом укрепляют на предметных стеклах пиафлексом или энтелланом (см. ниже). Отпечатки особенно удобно использовать для изу- 135
чения ядер. Поверхностью свежего среза несколько раз прикаса- ются к предметному стеклу. Перез каждым новым срезом кусо- чек ткани несколько выдвигают из держателя (см. рис. 55,в). 2.8.3.3. СРЕЗЫ ПАРАФИНИРОВАННЫХ ТКАНЕЙ Если необходимо очень высокое качество гистологических пре- паратов или отсутствует криотом, то образцы тканей можно в добавление к фиксации спиртом или формалином [8] заклю- чать в парафин. Влияние этих манипуляций на иммунологиче- ские свойства АГ выяснены еще недостаточно. Если в резуль- тате фиксации антигены маскируются, обработка ферментами может частично или полностью восстановить их доступ- ность [8]. 2.8.4. ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ Известны прямой и непрямой методы иммунофлюоресцентного анализа (см. рис. 54). В прямом методе искомый антигенный субстрат отыскивают в ткани посредством соответствующей АС. Сам антиген может быть антителом; в таком случае конъюгат будет представлять собой меченое анти-антител о. Непрямой ме- тод применяется при определении антител (антигенов) в жид- костях или в том случае, когда, как упоминалось выше, нет под- ходящей меченой антисыворотки. Специальной формой непря- мого метода является фиксация комплемента антителами. Чув- ствительность метода, возможность ошибок и количество необ- ходимых контрольных операций возрастают параллельно ус- ложнению процедуры иммунофлюоресцентного анализа. В ходе анализа реакция АГ—АТ протекает непосредственно на суб- страте, все непрореагировавшие компоненты удаляют смыва- нием. 2.8.4.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Для работы необходимы ФСБ с pH 7,2; лепиналовый буфер с pH 7,2; 0,575 г лепинала, 0,185 г лепинал-натрия, 0,028 г СаС1, 0,168 г MgC12-6H2O, 8,5 г NaCl, дистиллированная вода до 1000 мл. Среда для заключения ткани: глицерин на лепинало- вом буфере с pH 8,6 (10,3 г лепинал-натрия, 6,2 г NaCl, дистил- лированная вода до 1000 мл). Подводят pH до 8,6 HCI и смеши- вают с глицерином в соотношении 1 + 3. Также нужны пипетки с поршнем, инкубационная камера (см. рис. 55), кюветы для окрашивания, устройство для встряхивания. 2.8.4.2. МЕТОДИКА Растворы при помощи поршневых пипеток осторожно наносят на препараты, следя за тем, чтобы они были полностью покры- ты жидкостью. Инкубацию проводят при комнатной температу- 136
ре во влажной камере в течение 30 мин. После инкубации рас- творы отсасывают очень осторожно, чтобы не сдвинуть с места соседние препараты. Отмывают препараты фосфатно-солевым буфером в кюветах, на аппарате для встряхивания. Буфер меня- ют с различной частотой в зависимости от цели исследования (см. ниже). Прямой метод иммунофлюоресцентного анализа — Препарат отмывают ФСБ в течение 10 мин (однократная смена буфера), высушивают. — Инкубируют препарат с различными разведениями конью- гата. — Препарат промывают ФСБ в течение 30 мин (троекратная смена буфера). — Препарат высушивают и заключают в подходящий мате- риал. Непрямой метод иммунофлюоресцентного анализа — Препарат инкубируют с исследуемым раствором. — Отмывают ФСБ в течение 20 мин (двухкратная смена бу- фера). — Инкубируют с различными разведениями конъюгата. — Отмывают в ФСБ в течение 30 мин (троекратная смена бу- фера). — Препарат высушивают, заключают в подходящий материал. Определение комплементсвязывающих антител После первой инкубации с инактивированной сывороткой (30 мин, 56°C), последующей отмывки, как при прямом иммуно- флюоресцентном анализе, и высушивания проводят следующие манипуляции: — Инкубация со свежей человеческой сывороткой (разведение 1+9) в качестве источника комплемента. — Отмывка в фера). ФСБ в течение 20 мин (двухкратная смена бу- — Инкубация с антителами к комплементу человека (СЗ), ме- чененными ФИТЦ. — Отмывка в ФСБ в течение 30 мин (троекратная смена бу- фера). — Высушивание и заключение в подходящую ткань. Комплемент рекомендуется разливать на небольшие порции и хранить в жидком азоте. Нужную порцию комплемента размо- раживают перед употреблением и разводят лепиналовым буфе- ром с pH 7,2. Применение двойной флюоресцентной метки Для одновременного анализа различных АГ в одной и той же ткани, например в клетках одного типа, применяют антисыво- ротки, меченные различными флюорохромами (ФИТЦ,ТРИТЦ). 137
Примеры использования этого метода приведены в главе 3.2, Такая маркировка применяется при диагностике лимфом и точ- ного анализа антигенов, вызывающих образование аутоантител. 2.8.4.3. ОКРАШИВАНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНЫМ ЦВЕТОМ Окрашивание дополнительным цветом применяется для облег- чения ориентации в полях зрения, облегчения установки нужных деталей, повышения контрастности. Усиления контрастности можно достичь за счет подавления фоновой флюоресценции синим Эванса (0,1 г/л, 30—60 с, последующая отмывка ФСБ дважды по 5 мин). Для облегчения установки нужных деталей, особенно в случае объектов с незначительной нежелательной флюоресценцией, можно воспользоваться дополнительным окра- шиванием альбумином, меченным родамином или бромистым этидием (10 мг/л, 2 мин). Ядра нежизнеспособных клеток при- обретают оранжево-красную окраску. 2.8.4.4. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА АНАЛИЗА В иммунофлюоресцентном анализе используют различные виды контроля для предотвращения ошибок и правильной оценки данных. Контроль собственой флюоресценции объекта: проверяют объект без специальной обработки, например только после про- мывания. Контроль конъюгата: объект инкубируют только с конъюга- том. Этот вид контроля применяется в непрямом методе ана- лиза. Контроль позволяет установить наличие собственной флюоресценции препарата, а также наличие нежелательных ре- акций конъюгата с объектом. Отрицательный контроль: в прямом методе анализа приме- няется для гарантии отсутствия соответствующего антигена (ткань, заведомо не содержащая соответствующего АГ). В не- прямом методе анализа используют сыворотку, которая не со- держит АТ к исследуемому объекту, например донорские сыво- ротки. Обработку материала проводят, как для положительного контроля. Отрицательный контроль устанавливает неспецифиче- скую флюоресценцию объекта вследствие неспецифического свя- зывания ИГ. По отношению к этому контролю оценивают раз- ведения исследуемых сывороток. При высоких разведениях наб- людается такая же картина, как при контроле конъюгата. Положительный контроль: в прямом методе используют пре- парат, оказавшийся положительным в ранее проведенных ис- следованиях. В непрямом методе в качестве положительного контроля используют заведомо положительную сыворотку. Контроль устанавливает реакционную способность ткани или конъюгата. В случае многоступенчатых реакций контролю дол- 138
жен подвергаться каждый этап. Определение комплементсвязы- вающих антител: Контроль комплемента: ткани или клетки, заведомо не со- держащие комплементсвязывающие АТ, инкубируют с компле- ментом или конъюгатом. Контроль показывает, содержит лн сы- воротка с комплементом антитела к антигенам исследуемого препарата. Для оценки специфичности АГ или АТ можно вос- пользоваться адсорбцией сывороток определенным АГ с после- дующим отделением иммунных комплексов. Можно применять предварительную инкубацию препарата с антителами соответ- ствующей специфичности, но принадлежащими другому биоло- гическому виду (лучше всего к тому, от которого получена сы- воротка для конъюгата); положительная реакция в этих случа- ях выражена слабее или вообще не наблюдается. 2.8.4.5. ТИТРОВАНИЕ В ШАХМАТНОМ ПОРЯДКЕ Каждую новую серию конъюгата с целью определения опти- мального разведения для непрямого метода проверяют титро- ванием в шахматном порядке с позитивными и негативными контрольными сыворотками. Схема перекрестной проверки пред- ставлена в табл. 9. Таблица 9. Пример титрования в шахматном порядке для определения оптимального рабочего разведения конъюгата Сыворотка Конъюгат, разведение 1:2 1:5 1:10 1:20 1:40 | КП ♦ 1:80 1’160 Позитивная 1:640 0 0 0 0 0 0 0 сыворотка 1:320 ± ± ± ± ± ± 0—ВСП 1:160 + + + + + ± 0 1:80 ++ ++ Ч—h Ч—h —ь + 0 1:40 ч—н ++ Ч—F 4-4- --+ + ± 1:20 Ч—1—Ь Ч—1—Ь +4-4- ++ + ± Негативная 1:80 0Х 0 0 0 0 0 0 сыворотка 1:20 0Х 0Х 0Х 0Х 0 0 0 Контроль конъюгата 0Х 0Х 0Х 0 0 0 0 Обозначения: 0 — отрицательная реакция, т. е. отсутствие субъективного восприятия специфической флюоресценции; X — и нтенсивная неспенифическая (или нежелательная специфическая флюо- ресценция; ± — слабая специфическая флюоресценция; субъективно ее можно спутать с отрицательным контролем; + , ++, + + Н---специфическая флюоресценция от отчетливой до очень сильной. КП — конец плато, здесь при разведении конъюгата 1 : 80; всп — выход титра сыворотки на плато, здесь 1 : 320; Рекомендуемое рабочее разведение конъюгата: 2—4-кратная концентрация конъюгата в КП; рекомендуется разведение 1:30. 139
2.84.6. СРЕДЫ ДЛЯ ЗАКЛЮЧЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ Заключение препаратов в водосодержащие среды при pH 8,6 обеспечивает самую высокую степень флюоресценции и наи- меньшее «выцветание». Препараты, высушенные и заключенные в неполярные среды, например иммерсионное масло (Piaflex хи- мический комбинат Пистериц), энтеллан (Merck, Дармштадт), UV инертную (Serva, Гейдельберг), обладают только 50% ин- тенсивностью флюоресценции и вдвое более сильным «выцве- танием» по сравнению с препаратами, заключенными в водные среды [13]. Среда для заключения расходуется экономно и по возможности без образования пузырей воздуха. Референс-пре- параты в высушенном виде хранятся при 4 'С, в среде для за- ключения — при —20 °C. 2.8.5. ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА При возбуждении светом определенных длин волн флюорохро- мы начинают флюоресцировать. Кванты флюоресцентного излу- чения обладают меньшей энергией, чем кванты возбуждающего излучения, это означает, что флюоресцентное излучение имеет большую длину волны, чем возбуждающее (правило Стокса). Необходимо добиваться четкого разделения возбуждающего и флюоресцентного излучения. Этого можно достичь использова- нием фильтров и подбором длин волн возбуждающего излу- чения. Микроскоп. Иммунофлюоресценцию исследуют при помощи специальных микроскопов, включающих такие детали, как спе- циальные источники света, фильтры, УФ-оптика и др. Нет смыс- ла рекомендовать для работы какой-нибудь один тип микроско- па, подходит любой вариант, обеспечивающий необходимые ус- ловия. Для работы с ФИТЦ рекомендуется узкополосное голу- бое освещение, для ТРИТЦ — зеленое. В качестве источников света, как правило, используют ртутные лампы высокого дав- ления (линейчатый спектр излучения). Возбуждающее излуче- ние голубого и зеленого цвета получают пропусканием света та- ких ламп через светосильный интерференционный фильтр. Мож- но использовать галогеновые лампы иа 12 В (50 илн 100 Вт), они более удобны в обращении, быстрее нагреваются, дешевле прн одинаковой с ртутными лампами интенсивности излучения. Фильтры необходимы для того, чтобы пропускать из спектра лампы только тот участок, который необходим для возбужде- ния флюорохрома (первичный фильтр, или фильтр возбужде- ния), а также задерживать возбуждающее излучение и пропус- кать только излучение флюоресценции (вторичный илн запи- рающий фильтр) (рис. 56). Прочие важные характеристики 140
Рис. 56. Ход лучей в флюоресцентном микроскопе на примере Fluoval 2 VEB Carl Zeiss. 1 — источник света; 2 — первичный фильтр; 3 — дихроматическое разделяющее зеркало; 4 — объектив; 5 — запирающий фильтр; 6 — окуляр; 7 — проекторное устройство. Рис. 57. Кривые пропускания света важнейших типов фильтров, применяемых в флюоресцентной микроскопии. Прочие характеристики фильтров см. в табл. 10.
Таблица 10. Классификация важнейших типов фильтров, применяемых для флюоресцентной микроскопии Обозначение фильтра А КР 490 В КР 560 с BG 12 D BG 23 Е GG 5 р OG 4 Тип фильтра Металлический интерференционный Стеклянный адсорбционный Стеклянный пропускающий Характеристика фильтра Узкополосный Широкополосный Функция фильтра на примере голу- бого возбуж- дающего излу- чения Первич- ный фильтр Первичный или вто- ричный вспомога- тельный фильтр, су- живающий нлн отсе- кающий красный свет Первич- ный фильтр Первич- ный вспо- мога- тель- ный фильтр, отсе- кающий крас- ный свет Первич- ный вспо- мога- тель- ный фильтр сужива- ющий Вто- рич- ный фильтр фильтров можно получить из рис. 57 и табл. 10. Проницаемость фильтров или их комбинаций для изучения может быть низко- или широкополосной, в качестве границы между этими града- циями принята полоса излучения шириной 50 нм. Сужение полосы спектра возбуждения или флюоресценции оп- равдано только в случае применения фильтров с четким «ок- ном» пропускания и высокой прозрачностью, но и в этих случа- ях наблюдается снижение интенсивности. Более удобным ока- зывается узкополосное возбуждение, получаемое за счет погло- щения или блокирования аутофлюоресценции, которая возбуж- дается излучением близкого УФ или фиолетового цвета. Несмот- ря на снижение интенсивности флюоресценции, в этих случаях контрастность изображения и, следовательно, разрешающая спо- собность увеличиваются. Оптика, как правило, должна быть све- тосильной, т. е. обладать широкой апертурой, поскольку интен- сивность изображения пропорциональна квадрату апертуры. Оп- тимальным можно считать увеличение объекта, равное 20—100, поскольку в этом случае объектив может служить для освеще- ния объекта. Сила объектива при этом удваивается для флюо- ресцентного излучения. Поэтому стараются использовать объек- тивы с максимальной апертурой, причем не обязательно апохро- матические. Увеличивающая оптика второй ступени (окуляры, проекционная оптика) должна, напротив, обладать минималь- ным увеличением для получения изображения максимальной ос- 142
вещенности. Иногда представляет большой интерес помещение флюоресцирующих объектов в нефлюоресцирующую ткань и микроскопия в других условиях освещения или в фазовом контрасте. Особенно выгодные возможности для этого предо- ставляет люминесцентная микроскопия. Комбинация флюорес- ценции с микроскопией в светлых или темных полях зрения только в редких случаях дает удовлетворительные результаты. Лучшие результаты дает применение фазово-контрастной мик- роскопии со специальными объективами, пригодными также и для иммунофлюоресцентного анализа. Хорошее контрастиро- вание (слабый эффект Гало) весьма выгодно при рассматрива- нии мелких объектов (микроорганизмы, отдельные клетки), но не дает существенных преимуществ при микроскопии срезов тканей. В работе с такими объектами (большая площадь) лучше использовать интерференционное контрастирование. В любом случае контраст зависит от разности коэффициентов преломле- ния объекта и среды, в которую он заключен. Изменением среды (например, увеличением пропорции глицерина) можно добить- ся изменения контрастности. При комбинации флюоресцентного анализа с оптической поляризацией следует помнить, что ди- хроматический разделяющий слой зеркала (см. рис. 56) сам по себе обладает способностью поляризировать свет. 2.8.6. ОЦЕНКА ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ 2.8.6.1. СУБЪЕКТИВНАЯ ОЦЕНКА ИССЛЕДУЕМЫХ ОБЪЕКТОВ Если флюоресцирующие объекты оцениваются по контрасту, т. е. по сравнению флюоресценции объекта с флюоресценцией фона, всегда следует учитывать данные отрицательного контро- ля. Если при отрицательном контроле на соответствущих струк- турах не наблюдается нежелательной флюоресценции, вопрос решается просто: по типу да/нет. Как правило, приходится стал- киваться с ситуацией, когда необходимо решать, не усиливается ли специфическая флюоресценция нежелательной флюоресцен- цией (отрицательный контроль). Это означает, что минимально воспринимаемая специфическая флюоресценция зависит от сте- пени неспецифической нежелательной флюоресценции. Вследст- вие несовершенства органа зрения (адаптаия) при незначитель- ном контрасте необходимо чаще прибегать к сравнению с из- вестными препаратами. Если наблюдения ведутся над одним единственным АГ, интенсивность флюоресценции будет расти пропорционально увеличению концентрации меченых АТ, пока не останется свободных детерминант. Если оценивают содержа- ние нескольких АГ, различных по количеству и по аффинности к меченым АТ, то интенсивность флюоресценции не зависит от 143
концентрации АТ в применяемом растворе. Специфическую флюоресценцию можно оценивать по степени интенсивности (см. табл. 9). Эта система оценки зависит от всех методических и инструментальных факторов, влияющих на контрастность, в том числе от положительного и отрицательного контроля. Ста- новится ясно, что такая система оценки имеет смысл только в пределах одной лаборатории. 2.8.6.2. ТИТРОВАНИЕ Одним из вариантов количественной оценки АТ в растворах мо- жет служить ступенчатое разведение раствора с целью опреде- ления максимального разведения, при котором еще наблюдает- ся специфическая флюоресценция. Это разведение принимают за титр АТ. Для того чтобы сравнивать результаты с результатами других лабораторий, необходимо время от времени проводить исследования со стандартными сыворотками. Этим способом можно установить разницу в чувствительности применяемых ме- тодов и стандартизовать данные поправками титра. 2.8.6.3. МИКРОФЛЮОРИМЕТРИЯ— МИКРОФОТОГРАФИЯ Количественная оценка флюоресценции при помощи флюори- метрии порождает много проблем [14, 15]. Необходимой пред- посылкой является стандартизация метода. Следует стремиться сократить до минимума ошибки и по возможности определить их абсолютное значение (ошибки, связанные с «выцветанием», фокусировкой, толщиной исследуемого объекта). В отличие от адсорбционной микрофотометрии, в которой сравнение произво- дят с данными, получаемыми без объекта исследования, микро- флюориметрия вынуждена использовать флюоресцентный стан- дарт, чтобы проводить по нему калибровку оборудования и реагентов. Нити уранового стекла, заключенные в пиафлексили энтеллан, могут служить легкодоступными стандартами [13]. Поскольку интенсивность флюоресценции зависит от толщины объекта, то очень трудно проводить сравнение разных срезов (из-за неодинаковой толщины). В этом случае можно восполь- зоваться соотношением интенсивности флюоресценции различ- ных клеточных структур (контраст) или изменением интенсив- ности флюоресценции во времени (выцветание) [13, 16]. Для документации исследований необходимо делать микрофотогра- фии флюоресцирующих объектов. Следует отметить, что микро- фотография не может служить доказательством положительной реакции даже в сравнении с микрофотографией заведомо нега- тивного стандартного препарата вследствие эффекта Шварц- шильда (Schwarzshild). Слабая интенсивность освещения всег- да вызывает эффект Шварцшильда при микрофотографирова- нии, другими словами делает необходимым добавочное время 144
освещения к автоматически регулируемому времени достиже- ния необходимого усиления окраски. Величина эффекта Шварц- шильда, т. е. удлинение времени освещения, зависит от интен- сивности флюоресценции, типа пленки и эмульсии. Вследствие этой и других проблем (выцветание, эффект темного поля) не- обходимо соблюдать следующие условия: применять высокочув- ствительные сорта фотопленки, например ORWO-RS2, NP27, оп- ределять время экспозиции на образцах исследуемой фото- пленки, помнить, что установка автоматической регуляции экс- позиции не приносит ощутимых преимуществ, так как необходи- мы пробные испытания с каждой новой серией фотоэмульсии. Ввиду незначительных изменений оптических условий при лю- минесцентной микроскопии можно производить смену объекти- вов, рассчитывая изменения времени экспозиции заранее. Для цветной фотосъемки можно использовать пленки, применяемые как для съемок при естественном освещении (ORWO chrom UT18), так и при искусственном освещении (ORWO chrom UK17). Пленки для искусственного освещения рекомендуются в тех случаях, когда приходится фотографировать объекты пос- ле дополнительного окрашивания синим Эванса или бромистым этидием. Для съемки объектов с монохроматическим флюорес- центным излучением черно-белые пленки используются наравне с цветными. 2.8.6.4. ИСТОЧНИКИ ОШИБОК Приводимое ниже перечисление источников возможных ошибок не претендует на исчерпывающую полноту, оно скорее представ- ляет собой выборку из наиболее часто встречающихся вариан- тов ошибок. Обычно легко путают верхний и нижний, а также правый и левый края предметных стекол. Для предотвращения таких ошибок рекомендуется асимметрично располагать образ- цы или маркировать предметные стекла всегда в одном и том же углу. — Долго или неправильно хранившийся конъюгат может вы- зывать образование флюоресцирующих выпадений по всему субстрату. Опыт повторяют с заведомо пригодной сывороткой. — Если во влажной камере во время инкубации недостаточно жидкости или камера не препятствует испарению жидкости, может наблюдаться так называемый краевой эффект. Кон- центрация меченых АТ будет большей на периферии и при- ведет к ложноположительному результату. — Если было допущено присыхание сывороток или конъюгата к препарату, возникает сильная неспецифическая флюорес- ценция, которая исключает правильную оценку результатов. — Если в лаборатории проводят эксперименты с другими флюо- рохромами, например с акридиновым оранжевым, то даже ничтожные следы этого соединения, попадающие в препарат,. 10—990 145
могут вызывать флюоресценцию ткани, особенно ядер, при- водя к ложноположительным результатам. В случае применения высокотитражных сывороток возможно взаимное влияние двух различных препаратов, подвергаю- щихся одновременной отмывке. -— При любом методе окрашивания препаратов с флюорохром- содержащими АТ следует пользоваться одним и тем же объ- ективом для получения сравнимых результатов, так как субъективно воспринимаемая интенсивность флюоресценции зависит от апертуры объектива. -— Смеси антител к различным АГ исследуемого препарата мо- гут давать различного рода искажения ввиду взаимного влияния АТ. Например, антимитохондриальные АТ исклю- чают возможность одновременного определения антител к обкладочным клеткам и мешают определению АТ к глад- кой мускулатуре. 2.8.6.5. ТЕНДЕНЦИИ РАЗВИТИЯ МЕТОДА Наибольший интерес представляют собой две тенденции. В пер- вом случае АГ присоединяют к твердой фазе (сефадекс, плас- тиковые поверхности), что позволяет улучшить количественную оценку иммунофлюоресценции. Во втором случае предпринима- лись попытки повысить чувствительность тест-системы без уси- ления неспецифических реакций. Этого можно достичь присо- единением АТ к флюоресцирующим частицам, например липосо- мам, или присоединением АТ к промежуточно связывающимся соединениям, например биотину [2. 10]. 2.8.7. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ИММУНОЛОГИИ, ОБНАРУЖЕНИЕ АУТОАНТИТЕЛ Важнейшей областью применения непрямого иммунофлюорес- центного анализа является обнаружение аутоантител (ААТ) в сыворотках пациентов с аутоиммунными заболеваниями. Во многих случаях этот метод занял прочное место в лабораторной диагностике, например, в определении антиядерного фактора (АЯФ), антимитохондриальных антител (АМА), АТ к щитовид- ной железе, АТ при пузырчатке и пемфигоиде. Выбор антиген- ного субстрата для определения ААТ должен учитывать их спе- цифичность (тканевую или органную). Поскольку многие разно- видности ААТ можно обнаруживать или исключать при помо- щи одного субстрата, часто применяют комбинации тканей раз- личных органов, таких как печень, желудок, почки крыс или мышей, иногда с добавлением ткани щитовидной железы чело- века. Иммунофлюоресцентный анализ применительно к обнару- 146
жению ААТ имеет несомненные преимущества по сравнению с другими методами, а именно простота методики, малый расход времени и реагентов, высокая чувствительность и гибкость ана- лиза, доступность коммерческих препаратов конъюгатов. Опре- деляющим моментом анализа является дифференциация раз- личных типов флюоресценции. Требуется большой опыт, чтобы обнаружить типичную флюоресценцию ААТ в препарате. Гиб- кости анализа, т. е. возможности определять несколько разно- видностей ААТ при помощи одного антигенного субстрата, со- держащего большое количество разных АГ, сопутствует опре- деленный недостаток; в частности, не всегда можно точно уста- новить наличие искомого АГ или ААТ в флюоресцирующем препарате. Картина иммунофлюоресценции, характерная для различных ААТ, описывается в литературе с учетом относитель- ной интенсивности флюоресценции, при помощи микрофотогра- фий или вербально; например, АЯФ — как гомогенную, крапча- тую, периферическую или нуклеолярную флюоресценцию. Та- кую информацию нельзя считать достаточной во всех случаях, поэтому возникает необходимость консультации с другими ла- бораториями, обмена позитивными сыворотками для получения сравнимых результатов и т. д. Хотя многие ААТ не обладают органной и видовой специфичностью, например АЯФ, выбор под- ходящего субстрата имеет решающее значение, поскольку кон- центрация или доступность АГ может быть различной у разных видов [9, 11]. Сравнимость результатов можно обеспечить или использованием одинаковых субстратов, или сравнением чувст- вительности применяемых систем. При определении ААТ следует делать различие между минимальным определяемым титром и титром, имеющим клиническое значение. Первый зависит от не- желательной флюоресценции в области расположения соответ- ствующего АГ и сильно варьирует для различных ААТ; напри- мер, для АЯФ титр составляет 1: 1, титр АТ к гладкой муску- латуре— 1:40, а к скелетной мускулатуре 1:80 [1]. Клиниче- ски значимый титр зависит от распространенности типа ААТ в группе здоровых или соответственно в группе страдающих оп- ределенным заболеванием пациентов. Поскольку этот титр за- висит в значительной степени от вида применяемого антигенно- го субстрата, невозможно получить общезначимые выводы о диагностически важных титрах определенных групп больных. До настоящего времени при использовании тест-систем, ос- нованных на иммунофлюоресцентном анализе, приходится об- следовать также большую контрольную группу пациентов. Дан- ные об обнаружении ААТ могут иметь важное клиническое значение как в диагностике, так и в решении вопроса о выборе терапии. Имеет значение только обнаружение присущих для данной нозологической формы ААТ в диагностических титрах [17]. Сыворотки рекомендуется с самого начала апробировать в тех разведениях, которые наиболее подходят для получения клинически значимых титров. Одновременно испытывают более 10* 147
высокое разведение (4-кратное) с тем, чтобы в случае положи- тельного результата можно было точнее оценить необходимую степень разведения. 2.8.8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .1. Baumann I. Immunfluorescenzoptischer Nachweis von Skelettmuskelantikor- pern unter besonderer Berucksichtigung der Myastenia gravis. — Promotion- schrift, Leipzig, 1981. 2. Berman J. IT. Amplification of the biotin-avidin immunofluorescence techni- que.— J. Immunol. Methods, 1980, 36, 335—339. .3. Berod A., Hartman В. K.., Pujol J. F. Importance of fixation in immunohisto- chemistry: use of formaldehyd solution at variable pH for the localisation of thyrosine hydrolase. — J. Histochem. Cytochem., 1981, 29, 844—850. -4. Forni L. Reagents for immunofluorescence and their use for studying lym- phoid cells products. — In: Immunological methods/Eds. J. Lefkovits & B. Per- nis. New York. Acad. Press, 1979, 151—167. '5. Frantz H., Mohr J. Reinigung und Spezifitatskontrolle von markierten Anti- korpern. — Acta histochem. Suppl., 1980, XXII, 41—46. 6. Frietzler M. J. Fluorescent antinuclear antibody test. — In: Manual of clini- cal immunology, 2nd ed./Eds. N. R. Rose & H. Friedman. — Washington, Amer. Soc. Microbiol., 1980, 852—857. 7. Gernard K-, Rost D., Hanke E„ Bent H. Eine einfache Fixierung von Antigen- substraten fur den Autoantikorpernachweis. — Acta histochem. Suppl. 1980, XXII, 99—100. 8. Hed J., Enestrom S. Detection of immune deposits in glomeruli: The masking effect of antigenicity of formalin in the presence of proteins. — J. Immunol., 1981, 41, 57—63. 9. Helmke K.., Scheuermann R. et al. Nachweise und Bedeutung antinucleare Antikorper in der Diagnostik der Erkrankungen des rheumatischen Formen- kreises. — Klin. Wschr., 1981, 59, 287—296. 10. Huang A., Kennel S. J., Huang L. Immunoliposome labeling: a sensitive and specific method for cell surface labeling. — J. Immunol. Methods, 1981, 46, 141—151. 11. Me. Carty G. A., Rice J. R. Characterisation and comparison of commercially available antinuclear antibody kits using single pattern index sera. — J. Rheu- matol., 1980, 7, 339—347. 12. Storch W. Ringsversuch zum Nachweiss von Autoantikorpern durch indirekte Immunfluorescenz. — Allergie u. Immunologie, 1980, 26, 199—205. 13. Storz H. Untersuchungen zum Ausbleiben von Immunfluoreszenzobjekten und von Moglichkeiten zur Beinflussung dieses Effektes. — Jenaer Rundschau, 1981, 26, 87—88. 14. Storz H. Anmerkungen zur Fluoreszenzmukrofotografie. — Jenaer Rundschau, 1983, 28, 79—81. 15. Storz H. Geratetechnik-bedingte Probleme bei der Immunfluoreszenzmikro- skopie. — Ztschr. ges. inn. Med., 1983, 38, 101—104. 16. WHO-report. The use and abuse of immunological tests. — Clin. Immunol. Newsletter, 1981, 2, 178—186. 2.9. РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ В 1960 г. Ялоу и Берсон опубликовали статью «Иммунологиче- ское определение эндогенного инсулина в плазме человека», по- ложившую начало эпохе радиоиммунологических исследований. Радиоиммунологические методы имеют особое значение для ко- личественного определения гормонов [2]. Различия в концен- трациях этих веществ в биологических жидкостях (сыворотка 148
крови, моча и т. д.) находятся в относительной простой зависи- мости от различных патологических состояний, что позволяет -производить in vitro функциональную оценку деятельности щи- товидной железы, надпочечников и поджелудочной железы. Все возрастающее значение имеет определение ассоциированных с опухолями АГ, канцерогенных производных ДНК, фар- мацевтических препаратов и ИГ радиоиммунологическими ме- тодами. Эти методы широко применяются при изучении вирус- ных АГ, противовирусных АТ, в диагнЬстике аутоиммунных за- болеваний (системная красная волчанка), а также для опреде- ления циркулирующих иммунных комплексов. Исчерпывающее изложение вопросов, связанных с проблематикой радиоиммуно- логического анализа (РИА), можно найти в обзорах [7, 13]. 2.9.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Характерной чертой радиоиммунологических методов является сочетание специфичности, свойственной реакциям АГ—АТ, с простотой и высокой чувствительностью определения, которые дает применение радиоактивных изотопов, введенных в состав АГ или АТ. По сравнению с обычными методами анализа пре- имущество РИА состоит в том, что отсутствует необходимость оценивать протекающую реакцию по вторичным проявлениям, таким как агглютинация, преципитация, лизис эритроцитов. Важнейшим условием использования РИА является возмож- ность соединения измеряемой радиоактивной субстанции с ком- понентами реакции АГ—АТ, как, впрочем, и наличие специфи- ческих сывороток и высокоочищенных антигенов. Получение высокотитражных сывороток к большинству белковых гормонов не представляет особых сложностей. Вещества, являющиеся гап- тенами, например стероиды, медикаменты и продукты их мета- болизма, простагландины, циклические нуклеозидмонофосфаты, можно легко перевести в иммуногенное состояние [3]. АГ и АТ весьма удобны для прямого и непрямого введения радиоактив- ной метки [1]. Необходимая для исследований специфическая радиоактивность метки должна рассчитываться исходя из за- данной чувствительности. Радиоактивность АГ, применяемых в РИА, обычно составляет 100—200 мкКи/мкг, радиоактивность АТ — 20 мкКи/мкг, а для модификации РИА с двойными АТ — 0,1 мкКи/мкг. Возможность проводить конкурентный анализ, а также анализ в жидкой или твердой фазе приводит к созда- нию большого числа различных методик. Мы рассмотрим эту проблему на четырех характерных примерах. 2.9.2 РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Реакция АГ с АТ приводит с течением времени к состоянию равновесия между свободным и связанным АГ. Характерным для РИА является то обстоятельство, что меченый и немеченый 149
антигены конкурируют за ограниченное число участков связы- вания. После инкубации в пределах определенной области кон- центраций АГ, количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого АГ обратно пропорционально количеству немеченого АГ в пробе. Основные реакции представлены на сле- дующей схеме: АГ АГ —АТ , АГ „ т^-п^+т I + АГ ' АГ—АТ АГ III ~ VI + VII I — специфическое антитело, II — меченый антиген, III — немеченый антиген (стандарт или образец), IV — иммунные комплексы, состоящие из АТ и мече- ного АГ, V — свободный меченый АГ, VI — иммунные комплексы, состоящие из АТ и немеченого АГ, VIII — свободный немеченый АГ Для того чтобы происходило конкурентное взаимодействие, должна существовать определенная степень родства между ме- ченым и немеченым антигеном. Теоретически РИА можно про- водить как вариант сатурационного анализа. В этом специаль- ном случае связывающий компонент Q представлен специфиче- ским АТ, метка вводится в составе АГ. Детально теоретические аспекты рассматриваются в работе Walker и Keane [18]. Кроме того, определенный интерес представляют вопросы, касающиеся различий связывания меченых и немеченых АГ, влияния темпе- ратуры, авидности и концентрации компонентов реакции [7,13]. Для оценки качества АС необходимо знание константы авидно- сти К. Ее можно определить по методу Скэтчарда и Михаэли- са— Ментен [13]. Отклонения от идеальной формы кривой можно рассматривать как выражение гетерогенности реакции связывания, которая обусловлена негомогенностью популяции антител. Наиболее удачные концентрации АТ оказываются рав- ными 3/К меченого антигена 4/К. Между чувствительностью ме- тода (S) и авидностью существует соотношение: S=0,1/К Заключение о степени конкуренции между меченым АГ и АГ исследуемой пробы можно сделать только после отделения об- разовавшихся ИК от несвязанного меченого антигена. Для от- деления ИК используют самые разнообразные методы, осно- ванные на различиях в растворимости, коэффициенте седимен- тации, заряде, молекулярной массе и др. В некоторых случаях на способ выделения ИК оказывают влияние специфические свойства исследуемого АГ. Для того чтобы разделение меченого несвязавшегося АГ и ИК было удовлетворительным, необходи- мо соблюдение трех условий: 1) процесс разделения не должен оказывать влияния на состоя- ние равновесия; 150
2) отделение связанных с АТ молекул от несвязанных должно носить количественный характер; 3) затрата рабочего времени и стоимость процесса должны быть незначительными. Известно много способов достижения вышеперечисленных условий [13]. Различия в заряде и относительной молекуляр- ной массе позволяют проводить разделение при помощи элект- рофореза или гель-хроматографии. В некоторых случаях воз- можна селективная адсорбция АГ на тонко измельченном таль- ке, кварце, декстране или целлюлозе, соединенных с активиро- ванным углем. Связанные АГ можно улавливать при помощи иммобилизованных АТ, например полимеризованных АТ, или осаждением ИК специфической АС. Конъюгация АТ с железо- содержащими частицами энзакрила позволяет проводить разде- ление в магнитном поле [12]. Различные способы разделения АГ и ИК требуют неодинаковых затрат времени, их воспроизво- димость также неодинакова. То же самое относится к возмож- ности автоматизации отдельных этапов анализа. Наибольшее внимание привлекают к себе в настоящее время методы, осно- ванные на использовании двойных АТ. Известным упрощением метода является использование связанных с целлюлозой вто- ричных АС, так называемая технология двойных АТ на твердой фазе. Оптимальное для РИА разведение АС устанавливается по 50% связыванию меченого АГ. АС в данном разведении в присутствии меченого АГ смешивается с возрастающим коли- чеством немеченого АГ. Зависимость связывания меченого АГ от концентрации стандартного АГ можно представить в виде различных графиков. Часто используют график зависимости процента связывания меченого АГ от концентрации немеченого. Уже упоминавшиеся во введении Берсон и Ялоу предложили ис- пользовать соотношение связанного меченого АГ к несвязанно- му в качестве оценки концентрации немеченого АГ. При ис- пользовании арифметических координат получается экспоненци- альная кривая, полулогарифмических — кривая с прямолиней- ным участком, логарифмических — кривая с увеличенным пря- молинейным участком. Особый интерес представляет возмож- ность конкурентного взаимодействия с чужеродными вещества- ми, например медикаментами. Специфичность метода оценивают также по перекрестной реактивности с применяемыми сыворот- ками; заключение в этом случае выносится на основании опре- деления меченого АГ в присутствии сопутствующего АГ. Ошиб- ки, связанные с вышеперечисленными модификациями, можно устранить, используя дополнительную очистку реагентов, что, однако, увеличивает стоимость исследования. Все чаще начина- ют применять моноклональные антитела для РИА. Уже описа- ны [16, 17] радиоиммунологические способы определения мор- фина и человеческого лейкоцитарного интерферона с использо- ванием моноклональных или полученных аффинной очисткой АТ. В случае конкурентного анализа белкового связывания вместо 151
антисывороток используют транспортные белки. Следует учи- тывать, что специфичность их связывания и авидность не всегда, удовлетворительны. 2.9.2.1. ТВЕРДОФАЗНЫЙ РАДИОИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Впервые в качестве водонерастворимого носителя для белков была применена пара-аминобензилцеллюлоза. В последующее время было описано большое количество твердых носителей, на- шедших применение в секвенировании, синтезе и других мани- пуляциях с белками. Эти носители, соединяясь с АГ или АТ, не изменяют их иммунологические свойства. Полимеры, например сефадекс и сефароза, после их обра- ботки бромцианом приобретают способность связывать белки. В дальнейшем была установлена способность многих полимеров (полиэтилен, полипропилен, полистирол), называемых обычно матрицами, связывать различные биологические макромолекулы без всякой предварительной химической обработки. Оказалось, что полимеры обладают способностью связывать АТ, которые можно использовать для определения различных гормонов (хо- рионического гонадотропина, лютеотропного гормона, тиреости- мулирующего гормона, гормона роста и др.) методом РИА. Связанный с твердой фазой комплекс АГ—АТ легко отделяется от несвязавшегося биологического материала, кроме того, он обладает высокой стабильностью. Меченый АГ, необратимо свя- зываясь с фиксированными на матрице АТ, позволяет проводить высокочувствительный анализ биологического материала. АТ можно присоединять к активированной или неактивирован- ной матрице. Основной проблемой будет в обоих случаях точ- ное дозирование связавшихся с матрицей АТ. 2.9.2.1.1. Связывание антител с матрицей Нефракционированные АС кроликов с известным титром ней- трализации бактериофагов ТЗ и Т4 разводили 0,1 М карбонат- бикарбонатным буфером с pH 9,6. Сыворотки в различных раз- ведениях вносили в пластиковые пробирки по 0,5 мл. Пробирки закрывали и выдерживали в течение 2 ч при комнатной темпе- ратуре, затем удаляли жидкую фазу. Легко десорбирующиеся АТ удаляли двукратным ополаскиванием в 0,14 М NaCl (по 1 мл). Затем проводили инкубацию с 0,01 М калий-фосфатным буфером с pH 7,4, содержащим 0,14 М NaCl и 0,5% ЧСА, для насыщения свободных участков пластиковой поверхности ней- тральным белком. Пластиковые пробирки с адсорбированными АТ можно использовать немедленно или хранить в холодиль- нике в течение 4 нед. 152
2.9.2.1.2. Мечение антигена Бактериофаги ТЗ и Т4 после маркирования их 131 [I] или 125[1] сохраняют полностью иммунологическую реактивность. Йодиро- вание проводили Т-хлораминовым методом. Специфическая ра- диоактивность фагов составляла 0,3—7,2 мкКи/мкг. В целом бо- лее высокая специфическая радиоактивность повышает чувст- вительность анализа. После удаления радиоактивного йода гель- фильтрацией через сефадекс и диализа препарат радиоактив- ных фагов разводят калий-фосфатным буфером с pH 7,4 (см. выше) для предотвращения радиолиза. 2.9.2.1.З. Оптимизация анализа Вначале определяют оптимальное разведение АТ и меченого фага для достижения максимального связывания материала с твердой фазой. Исследовалась также зависимость этих про- цессов от времени. На рис. 58 представлены данные, относя- щиеся к фагу ТЗ, меченному 13Ч. Аналогичные данные были по- лучены для фага Т4. Соотношение связанный/несвязанный (с/н) меченый фаг отражает воздействие различных факторов. Наи- лучшие результаты были получены при разведении сыворотки 1:500 или 1: 1000 и при концентрации меченого материала 0,0125 мкКи (около 16000 имп/мин; расчет ведется на 1 пласти- ковую пробирку). Зависимость от времени исследовали в тече- ние 48-часовой инкубации при температуре 37 °C. Вначале наб- людается быстрое увеличение количества связанной метки, к 12 ч инкубации оно заметно снижается, а затем выходит на плато. Время (ч) Рис. 58. Зависимость связывания мечеиых фагов ТЗ с АТ, адсорбированными на пластиковой поверхности от времени инкубации, разведения сыворотки, титра антисыворотки, концентрации меченого свидетеля. Пластиковые про- бирки обрабатывали двумя антисыворотками к фагу ТЗ с различными титра- ми нейтрализации. Антисыворотка 7: К=150, антисыворотка 8: К=370. 1 — антисыворотка 8,1 : 100, 0,05 мкКи метки; 2 — антисыворотка 8,1 : 1000, 0,05 мкКн метки; 3 — антисыворотка 7,1 : 1000, 0,025 мкКи метки; 4 — антисыворотка 8,1 : 1000, 0,025 мкКи метки. 153
Рис. 59. Стандартная кривая ео- для фага ТЗ. Пластиковые пробирки обраба- тывали антисывороткой 1 : 1000. Количество метки — 0,025 мкКи 50" на пробирку. Специфическая ак- тивность 2,3 мкКи/мкг. 1 — вне- сеиие меченого свидетеля после ~ удаления неактивного АГ; 2— «40- совместиое введение меченого «• и немеченого антигенов. ' з X <0 ” 30- О) о 30- Рис. 60. Стандартная кри- вая для фага Т4. 4.6 Пластиковые пробирки обраба- тывали антисывороткой 1 : 1000. Количество метки — 0,025 мкКи на пробирку. Специфическая ак- тивность 7,2 мкКи/мкг. 1 — ме- 4.6*10 4.6 хЮ2 4.6 хЮ3 4,6 хЮ4 Количество фагов (нг).логарифм ченый свидетель и немеченый АГ внесены одновременно; 2 — меченый свидетель внесен по- сле удаления немеченого АГ. 2.9.2.1.4. Тест-системы РИА на фаги ТЗ и Т4 Пробирки, обработанные специфической АС в разведении 1 : 1000, инкубировали с неизвестным количеством АГ, раство- ренного в 0,5 мл калий-фосфатного буфера с pH 7,4 в течение 18 ч при 37 °C. После удаления образца с фагом и двукратного отмывания охлажденным до О °C 0,14 М NaCl в каждую про- бирку вносят по 0,0125 мкКи меченого АГ, растворенного в 0,5 мл буфера (см. выше). Заключительная инкубация продол- жается 24 ч; если ее продолжительность сократить до 22 ч, то это несколько снизит чувствительность анализа. Количество связавшегося меченого АГ определяют после отмывки проби- рок раствором NaCl. Измерение радиоактивности проводят на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Эффективность счета 154
125[I] составляла 54%. Получаемая зависимость носит харак- тер, представленный на рис. 59 и 60. Линейная зависимость наблюдалась в области концентраций немеченого АГ от 18 до 1800 нг для фага ТЗ и от 46 до 4600 нг для фага Т4. 2.9.2.2. МЕТОД ДВОЙНЫХ АНТИТЕЛ Определяли IgE в крови нормальных и страдающих аллергией пациентов при помощи вторичной преципитирующей АС. В ка- честве первичного связывающего агента использовали моноспе- цифическую кроличью антисыворотку к Fc-фрагменту IgE. Чис- тый IgE получали из плазмы пациента, страдающего IgE про- дуцирующей миеломой. Специфическая активность меченого АГ составляла 150—250 мкКи/мкг. Все разведения готовили на 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,5) с добавлением 1% БСА. Определение IgE в сыворотке человека. Стан- дарт IgE или анализируемую сыворотку доводят БСА-фосфат- ным буфером до объема 0,5 мл. Специфическую кроличью анти-IgE сыворотку в разведении 1:50 000 вносят аликвотами по 0,1 мл в измерительные сосуды. В таком же объеме вносят 0,1 нг меченого АГ. После инкубации (24—96 ч при 4 °C) до- бавляют 0,15 мл козьей АС к IgG кролика и 0,15 мл разведен- ной в соотношении 1:20 нормальной сыворотки кролика. На- личие нормальной сыворотки облегчает преципитацию в зоне эквивалентности на последней стадии инкубации. Этот этап за- нимает 18—72 ч при 4 °C. Надосадочную фракцию после 30-ми- нутного центрифугирования при 3500 g отбрасывают. Процент адсорбированной радиоактивности используется для построения стандартной кривой. В описанных условиях можно определять 1—14 нг IgE (рис. 61). Добавление ИГ других классов (2 мг IgA, 0,5 мг IgM, 4 мг IgG) вызывало снижение включения мет- ки всего лишь на 6%. 2.9.3. МЕТОД ФАРРА 2.9.3.1, ПРИНЦИП МЕТОДА В 1958 г. Фарр предложил методику определения связывающей способности антисывороток, в принципе применимую ко всем АГ. Модифицировав эту методику, можно также определять АТ. Сходный с ней метод радиоиммунопреципитации с использова- нием меченых вирусов, например вирусов полиомиелита, приме- няется для диагностики инфекционных заболеваний. В под- тверждении диагноза системной красной волчанки (СКВ) ме- тод Фарра нашел самое широкое применение. Для постановки эксперимента необходимо наличие радиоактивно меченых АГ. Его иммунореактивные свойства не должны изменяться после маркировки, и он должен легко отделяться в связанном с АТ виде от нес вязавшегося АГ. Для маркировки in vitro и in vivo 155
Рис. 61. Стандартная кривая для оп- ределения IgE методом двойных ан- тител. наиболее подходят 3[Н], 14[С]„ 32[Р] и 125[1]. Для облегчения седиментации связанного АТ антигена применяют насыще- ние сульфатом аммония до 50%. В этих условиях преци- питируют ИГ, а также связан- ный с ИГ антиген. Для этих же целей можно использовать ПЭГ или вторую АС; в любом случае необходимым условием1 остается полная растворимость АГ. По своей эффективности ультрацентрифугирование, при- менение второй антисыворотки и хроматография приблизи- тельно одинаковы. Для отделе- ния ИК можно использовать фильтры Миллипор. При СКВ образуются ААТ к ДНК- Эти ААТ исследуют в отношении специфичности к нативной (н) и денатурированной (д) ДНК. Ниже будет описан способ, осно- ванный на применении меченой химическим способом ДНК [6]. 2.9.3.2. МАРКИРОВАНИЕ АНТИГЕНА Растворяют 0,1 мг денатурированной ДНК (содержание белка 1%) или 0,6 мг нативной ДНК (содержание белка 2%) в 0,6 мл буфера (0,1 М ацетат аммония, 0,04 М уксусная кислота» pH 5,0). Добавляют к смеси 0,1 мл К1 (0,0025 М), 1 мКи 125[1] и 0,1 мл Т1С13 (0,0015 М). После нагревания в течение 20 мин при 60 °C добавляют 0,1 мл 0,05 М Na2SO3 и 0,2 мл буфера с pH 9,0 (1 М уксусная кислота, 0,05 М аммиак). Нагревают еще раз в течение 20 мин при 60 °C. Несвязавшийся 125[I] уда- ляют гель-хроматографией на сефадексе G-50 или диализом против фосфатного буфера (0,1 М Na2HPO4, 0,14 М NaCl, pH 8,0, в дальнейшем обозначаемый, как буфер Фарра). Специ- фическая радиоактивность д-ДНК составляет 2 мкКи/мкг, а н-ДНК — 0,3 мкКи/м кг. 2.9.3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИТЕЛ К ДНК К 50 мкл разведенной в соотношении 1 + 9 буфером Фарра сы- воротке пациента добавляют 0,02 мкКи меченой ДНК (100 нг), растворенной в 50 мкл буфера Фарра. В контрольные пробы добавляют такое же количество немеченой ДНК- Инкубируют смесь в течение 1 ч при 37 °C и в течение 16 ч при 4 °C. Добав- ляют 100 мкл насыщенного раствора сульфата аммония (если используют д-ДНК) или 100 мкл антисыворотки козы к у-гло- булину человека, разведенной в соотношении 1 + 2 (если ис- 156
дДНК Насыщенный (NH4) 2 SO 4 (100 мн л) j--------- 125 \ . [|]-ДНН.О.О2мкНи(5О мил)4-----нДНН---* Сыворотка.разведение 1; 10 (50 мкл) Антисыворотки, разведение 1:3 (100 мкл) 4°С 24 ч 4°С J 2000g 15 мин J 2000g 30 мин R S надосадочная франция,100 мл>- S (надосадочная’ франция,100 мл) Рис. 62. Определение антител к ДНК. пользуют н-ДНК). Для определения ДНК, связанной антитела- ми, измеряют радиоактивность 100 мкл надосадочной фракции (S) и 100 мкл надосадочной фракции, а также радиоактивность осадка (R) после центрифугирования (рис. 62). С использова- нием вышеописанного метода и химически меченой ДНК в ка- честве антигена можно определять способность сывороток свя- зывать АГ, а также построить кривые титрования. Кроме того, увеличивая количество ДНК в пробе при постоянном разведе- нии сыворотки, можно сравнивать авидность АТ. При наличии сильного неспецифического связывания рекомендуется использо- вать детергенты или буферы с высокой ионной силой [5]. 2.9.4. МЕТОДЫ, ОСНОВАННЫЕ НА ПРИМЕНЕНИИ МЕЧЕНЫХ АНТИТЕЛ Меченые радиоактивными изотопами антитела представляют со- бой универсальные реагенты для определения различных АГ (вирусы, гормоны и т. д.). Существенным отличием от обычного РИА является то, что меченый компонент должен содержаться в избытке. После окончания реакции в одном из вариантов им- мунорадиометрического анализа избыток меченых АТ удаляют АГ, адсорбированным на твердой фазе. В случае использования так называемого сэндвич-метода необходима длительная отмыв- ка после первого этапа использования твердой фазы. На рис. 63 и 64 схематически представлены основные этапы анализа. Сте- пень связывания в иммунорадиометрическом анализе опреде- ляется путем измерения радиоактивности надосадочной фрак- ции после центрифугирования. В процессе оптимизации анализа- определяющими факторами являются неспецифическое связы- вание, продолжительность инкубации и концентрация мече- ных АТ. Неспецифическое связывание можно уменьшить, рабо- тая с высокоочищениыми АТ, кроме того, оно зависит от ион- ной силы; его уменьшения можно добиться добавлением жела- тина или сывороточного альбумина. Использование избытка ме- ченых АТ позволяет сократить время инкубации; правда, это приводит к снижению чувствительности [10]. Применяемые для «сэндвич-метода» АТ должны относиться только к классу IgG; их довольно легко получать, и, кроме того, они пригодны для 157
АГ »гроба) специфические АТ Рис. 63. Принцип им- мунор адиометрического анализа. АГ на твердой фазе ИннуСаии® • --------------► Центриф,! ар. в'чие Осадок Аллерген IgE (проба) на твердой Фазе |И[1)анти1дЕ-АТ, избыток Рис. 64. Схема «сэндвич- метода». Инкубация Центрифуг ировгние Надосадочная фракци> о о + работы с самыми различными АГ. Применяя АТ со специфич- ностью к Н-цепям иммуноглобулинов, можно установить класс первично связывающих АТ. Использование меченых АТ пред- ставляется приемлемой альтернативой в тех случаях, когда по- лучение меченого АГ является неэффективным или дорогостоя- щим процессом. Меченые 1251 АТ получаются сравнительно лег- ко, кроме того, они сохраняют специфическую иммунореактив- ность в течение длительного времени [15]. Методы, основанные на применении меченых АТ, давно уже вошли в практику мно- гих лабораторий. Количественное определение АТ затруднено ввиду их различной авидности, для проведения стандартизации необходимо применение референс-сывороток [15]. Применяя ан- титела, модифицированные 2,4-динитрофенилсульфоновой кис- лотой, можно количественно определять различные АГ, если имеются меченые 125[1] анти-ДНФ антитела; одновременно с этим наблюдается повышение чувствительности. Этот вариант анализа с успехом применяли для определения ферритина, овальбумина, gs-антигена аденовирусов и НВе-антигена. Иммунорадиометрическое определение при помощи антител, специфических к ДНФ-группе. IgG очищают при помощи хро- матографии на ДЭАЭ-целлюлозе из соответствующих АС. В концентрации 100 мкг/мл в 0,1 М трис-НС1-буфере с pH 8,8 158
Рис. 66. Стандартная кривая для определения НВе-антигена. 1 — непрямой <сэндвич-метод>; 2 — прямой «сэидвич-метод» [10]. IgG используют для обработки пластиковых гранул диаметром 8 мм. Такой препарат IgG используют для получения 2,4-динит- рофенильного производного. Анти-ДНФ антитела получают им- мунизацией кроликов ДНФ-БСА. Специфические антитела вы- деляют, добавляя 10 мг ДНФ-апоферритина к 2 мл антисыво- ротки, что вызывает иммунопреципитацию. Иммунные комплек- сы осаждают центрифугированием при 90 000 g в течение 1 ч, осадок в 1 мл фосфатного буфера с мочевиной (0,01 М фосфат с pH 8,0; 0,1% нонидет Р40; 8 М мочевина). После хромато- графии на колонке с 2 мл ДЭАЭ-целлюлозы фракция, содер- жащая IgG, диализуется против 0,05 М боратного буфера с pH 8,5 и метится реагентом Bolton-Hunter (специфическая ра- диоактивность 125[1] 1,2 мкКи/мкг). Адсорбция антигена на пластиковых гранулах происходит в течение ночи при 20 °C в 400 мкл нормальной сыворотки. Гранулы отмывают буфером (0,01 М трис-HCl буфером с pH 8,0, 0,14 М NaCl, 0,1% нони- дет Р40). В каждую пробиркув носят 0,6—2,5 мкг антигенспе- цифических ДНФ-АТ и инкубируют 2 ч при 37 °C. Затем вносят 0,1 мкКи 125[1]-АТ, специфических к ДНФ группам, также рас- 159
творенным в 400 мкл нормальной сыворотки. После инкубации в течение 2 ч при 37 °C и повторной отмывки тем же буфером измеряют количество специфических 125[I]-антител. Чувствительность определения овальбумина и ферритина со- ставляет соответственно 0,8 и 0,2 нг/мл; сравнительно с прямым твердофазным анализом с применением 125[I]-антител чувстви- тельность определения увеличивается в 4 или 15 раз соответ- ственно (рис. 65). Чувствительность за счет эффекта амплифи- кации при использовании анти-ДНФ-антител увеличивается также и в отношении НВе-антигена (рис. 66). Известен метод твердофазного анализа, основанный на применении 125[1]-про- теина А для определения специфических АТ [9]. Хотя этот ме- тод основан на избирательном сродстве протеина А к Fc-фраг- менту IgG, фиксация АГ на матрице должна осуществляться без участия антител. 2.9.5. ОЦЕНКА МЕТОДА РИА прочно вошел в арсенал современных лабораторных кли- нических исследований. Обилие методических вариантов свиде- тельствует о том, что не всегда можно придерживаться одной схемы и что следует учитывать качество реагентов. Методы, ос- нованные на использовании твердой фазы (пластмасса, целлю- лоза, сефадекс), привели к существенному упрощению процес- са. За исключением у-счетчика, метод не требует сложного обо- рудования. Процедуры, занимающие длительное время (отбор проб, отмывание и измерение радиоактивности), могут быть ав- томатизированы. Колебания в серии измерений (и = 5) не пре- вышают, как правило, 10%. Перекрестная реактивность АТ вследствие фиксации на твердой фазе не претерпевает сущест- венных изменений. Адсорбция сывороточных белков приводит к тому, что те из них, которые обладали ингибирующей или протеолитической активностью, оказываются не в состоянии влиять на результаты анализа. Метод двойных АТ, при котором происходит отделение ИК за счет второй сыворотки, обладает очень высокой воспроизводимостью, но требует много времени (3—7 дней). К числу преимуществ данной методики относится небольшой расход сыворотки на одно исследование. Это обстоя- тельство может иметь важное значение при работе со слабо им- муногенными веществами, для которых получение АС представ- ляет известные трудности. Обе основные реакции различаются по тому, в какой области концентраций они происходят: конку- рентная реакция протекает при концентрациях порядка нано- граммов вещества, преципитация — микрограммов вещества. Воз- можные ошибки во вторичной реакции можно уменьшить, ис- пользуя очищенные фракции у-глобулина или предварительное прогревание. Еще одним способом, которым можно избежать не- специфические реакции, является использование препреципити- .рующих антител или присоединение вторичной сыворотки 160
к твердой фазе (целлюлоза). Однозначно судить о преимущест- вах РИА или метода двойных АТ нельзя. На примере опреде- ления хорионического гонадотропина видно, что присоедине- ние АТ к твердой фазе бромциановым методом приводит к за- метному снижению их специфической иммунореактивности, что означает также снижение чувствительнеости. Сравнение метода двойных АТ и двух твердофазных методов в отношении опреде- ления IgE свидетельствует о том, что с нормальными сыворот- ками первый дает заниженные результаты, а в случае патологии результаты, получаемые всеми тремя методами, совпадают. Ме- тод двойных АТ обладает несомненными преимуществами пе- ред методом преципитации сульфатом аммония [8]. После конъ- югации активность АТ к гормонам с высокой относительной мо- лекулярной массой (6000—26000) снижалась на 10—15% с па- раллельным уменьшением чувствительности. Эти различия, ве- роятно, обусловлены различной степенью доступности связан- ных АТ для АГ. Метод Фарра занимает достаточно прочные позиции в клинической диагностике, по крайней мере в отноше- нии определения антител к ДНК и РНК. К тому же остаются нерешенными вопросы стандартизации антигенов и неспецифи- ческого связывания. Важным преимуществом метода Фарра яв- ляется то, что используются различные связывающие и преци- питирующие АТ. РИА с использованием меченых АТ находит применение для определения веществ, присутствующих в коли- чествах, измеряемых пикограммами, таких как специфические IgE-антитела и некоторые вирусные и бактериальные АГ. Осо- бенно выгодно использовать данную модификацию, когда име- ются трудности с мечением АГ. При этом преодолеваются слож- ности с антигенами, которые по своей иммунореактивности отли- чаются от меченых стандартных АГ. Взаимодействие меченого АТ с другим АТ (в качестве АГ) приводит к амплификации данных измерений. Определение содержания тех или иных ве- ществ на основе реакции АГ—АТ не дает непосредственной кор- реляции с их биологической активностью. Для подтверждения заключений на основе РИА требуется дополнительная биопро- ба. Использование АТ в качестве первичного связывающего агента позволяет обойти это ограничение. До настоящего вре- мени в клинике используют анализ пептидов, стероидных гор- монов, гликопротеидов при помощи радиолигандов и клеточных рецепторов. Можно получать стандартизованные по сравнению с антисыворотками препараты АТ, но они не отличаются доста- точной стойкостью. Особенности радиоиммунологической техни- ки, такие как необходимость защиты от излучения, ограничен- ное время жизни реагентов, привели к поиску альтернативных методов маркировки. Было описано применение бактериофагов, флюорохромов, ферментов, твердофазных частиц и даже ато- мов металлов в качестве маркеров. Но все эти методы пока не могут вытеснить радиоиммунологические методы иследова- ния [14]. 11-990 161
2.9.6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Bolton. А. Е„ Bennie J. G., Hunter W. М. Innovations in labelling technique for RIA. — In: Protides in the biological fluids/Ed. H. Peters. — Oxford, Pergamon Press, 1976. 2. Breuer H., Hamel D., Kriiskemper H. L. Methoden der Hormonbestimmung. — Suttgart, Thieme Verlag, 1975. 3. Broughton A., Strong J. E. RIA of antibiotics and chemotherapeutic agents. — Clin, chem., 1976, 22, 726—732. 4. Cleiland R., Christenson J. et al. Detection of drug abuse by RIA: a summary of published data and some new information. — Clin, chem., 1976, 22, 712— 725. 5. Etzrodt H. The use of tween 20 in the double antibody RIA. — Hoppe-Sey- lers Z. Physiol. Chem., 1976, 357, 1205—1208. 6. Falck P. Radioimmunologisher Nachweis DNA-spezifischer Antikorper. — Acta biol. med. germ., 1976, 35, 93—101. 7. Hunter W. M. Radioimmunoassay. — In: Handbook of experimental immuno- logy/Ed. D. M. Weir. — Oxford, Blackwell Scient. Publ., 1978, vol. 1, 1-1.1— 1.40. 8. Kirkpatric A„ Wepsic T. H., Nakamura R. M. Comparision of double-antibody RIA with Farr-technique RIA and double antibody enzyme assay for a-feto- protein. — Clin, chem., 1977, 23, 50—59. 9. Marler R„ Jansen M„ Andriole U. T. A new method for measuring antibody using radiolabeled protein A in solid phase RIA. — J. Immunol, methods., 1979, 28, 41—49. 10. Miles L. E. M. Immunoradiometric assay, new developments in theory and practice. — In: Protides of the biological fluids (Ed. H. Peters). Oxford, 1976, 695—704. 11. Neurath A. R., Strick N. 1257-labeled anti-2,4-dinitrophenyl (DNP) antibodies: a universal reagent for solid phase immunoassays. — Molec. Immunol., 1979, 16, 625—628. 12. Nye L., Forrest G. C. et al. Solid-phase magnetic particle RIA. — Clin. chim. Acta, 1976, 69, 387—396. 13. Parker C. W. Radioimmunoassay of biologically active compounds. New Jer- sey, Prentice-Hall Inc. Englewood Cliffs, 1976. 14. Schall R. F., Tenesco H. J. Alternatives to RIA: labels and methods. — Clin. Chem., 1981, 27, 1157—1164. 15. Schellenberg R. R., Adkinson N. F. Measurement of absolute amounts of anti- gen-specific human IgE by a RAST elution technique. — J. Immunol., 1975, 115, 1577—1583. 16. Secher D. S. Immunoradiometric assay of human leucocyte interferon using monoclonal antibodies. — Nature, 290, 501—503. 17. Steiner M„ Spratt J. L. Solid-phase RIA for morphine with use of an affinity- purified morphine antibody. — Clin, chem., 1978, 24, 339—342. 18. Walker W. H. C., Keane P. M. Theoretical aspects of RIA. — In: Handbook of radioimmunoassay/Ed. G. M. Abraham. New York — Basel, Marcel Dekker Inc., 1977, 87—130. 2.10. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ 2.10.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на том же принци- пе, что и РИА, только вместо радиоактивной метки применяется ферментная. Метод иммуноферментного анализа был предло- жен в начале 70-х годов тремя независимыми группами иссле- дователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США. АГ или АТ, 162
вступающее в иммунную реакцию, метится ферментом. По пре- вращению субстрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции АГ—АТ. Чувствительность ИФА позволяет определять минимальные ко- личества вещества (нанограммы). Известно много вариантов постановки ИФА [2]. Различают гомогенный и гетерогенный ва- риант иммуноферментного анализа. В основе гомогенного ИФА, применяемого для определения низкомолекулярных субстанций (гаптены), лежит ингибирование активности фермента при со- единении его с гаптеном (активность фермента восстанавлива- ется в результате реакции АГ—АТ) либо, наоборот, потеря ак- тивности маркерного фермента в результате реакции АГ—АТ [7]. Поэтому удаление свободного АГ из смеси, содержащей АГ в связанном виде, в составе иммунных комплексов невозможно. В противоположность этому при гетерогенном ИФА АГ или АТ фиксируется „а твердой фазе (как правило, пластик), а непро- реагировавшие компоненты реакции удаляются многократным от мыванием. 2.10.2. ВАРИАНТЫ МЕТОДИКИ В РИА, так же как в ИФА, различают методы конкурентного и неконкурентного анализа [2]. 2.10.2.1. КОНКУРЕНТНЫЙ МЕТОД Если существует необходимость количественного определения АГ, который может быть получен в чистом виде, то адекватный анализ при помощи конъюгата антиген-фермент и фиксирован- ных на твердой фазе АТ может быть проведен в форме конку- рентного взаимодействия (рис. 67). Первым этапом в этом слу- чае будет присоединение АТ к носителю за счет химической ре- акции или физико-химических взаимодействий. Избыток АТ удаляют отмыванием и, внося строго определенное количество меченого АГ и различные количества немеченого АГ, строят ка- либровочную кривую. По окончании реакции АГ—АТ иммунные комплексы оказываются присоединенными к твердой фазе за счет АТ; избыток АГ удаляют отмывкой, добавляют субстрат для фермента, останавливают реакцию по истечении определен- ного времени и проводят колориметрическое определение про- дуктов ферментативной реакции. В другом варианте конкурент- ного ИФА с твердой фазой первично связывается АГ. После отмывки добавляют меченые энзимом АТ и стандартный или исследуемый АГ. Связывание меченых АТ конкурентно тормо- зится растворенным АГ. Количество продуктов ферментативной реакции обратно пропорционально концентрации растворенно- го АГ (рис. 68). Этот метод может включать использование вто- рого энзим-меченого АТ, специфичного по отношению к IgG, первично реагирующему с фиксированным на твердой фазе АГ. Н* 163
АПП 1. Рис. 67. Схема конкурентного ИФА, антитела сорбированы на твердой фазе, антиген мечей ферментом [2]. 1 - АТ, связывание с твердой фазой; 2 —отмывка; 3 — инкубация с меченным фермен- том АГ в присутствии (а) и в отсутствие (б) исследуемой пробы; 4 —отмывка; 5 —ин- кубация с субстратом (светлые кружочки) и измерение количества продуктов реакции (темные кружочки). Рис. 68. Схема конкурентного ИФА, антиген сорбирован на твердой фазе, антитела мечены ферментом [2]. 1—связывание АГ с твердой фазой; 2 —отмывка; 3 — инкубация меченных ферментом АТ в присутствии (а) или в отсутствии (б) исследуемой пробы; 4 — отмывка; 5 — инку- бация с субстратом (светлые кружочки) в измерение количества продукта реакции (тем- ные кружочки). 2.10.2.2. НЕКОНКУРЕНТНЫЕ МЕТОДЫ К числу неконкурентных методов относится метод двойных ан- тител, или, как его иногда называют, «сэндвич-метод» (рис. 69). Фиксированные на твердой фазе АТ инкубируют со стандарт- ным или анализируемым АГ. После отмывания добавляют избы- ток меченых АТ (специфичных к этому же АГ), несвязавшиеся АТ отмывают. Продукт ферментативной реакции образуется в количествах, пропорциональных количеству связанного АГ. Довольно часто используют немеченые вторые АТ; о реакции в данном случае судят по связыванию энзим-меченых АТ, спе- (ифичных по отношению к IgG (вторые антитела). В любом случае первые и вторые АТ должны принадлежать животным разных видов. Для иммуноферментного определения антител часто используется непрямой, неконкурентный ИФА (рис. 70). Антиген фиксируют на твердой фазе, после отмывания проводят инкубацию с раствором АТ. Если произошло специфическое 164
1, Рис. 69. Схема «сэндвич-ИФА> (метод двойных антител для определения ан- тигена. I—-АТ, связывание с твердой фазой; 2 —отмывка; 3 —инкубация с пробой, содержа- щей АГ; 4 — отмывка; 5 —инкубация с конъюгатом АТ-фермент; 6 —отмывка; 7 —ин- кубация с субстратом (светлые кружки) и измерение количества продукта реакции (тем- ные кружочки). Рис. 70. Схема непрямого ИФА для определения антител при помощи фер- ментмеченого аитиглобулина. I — связывание АГ с твердой фазой; 2 — отмывкай 3 — инкубация с пробой, содержащей АТ; 4 — отмывка; 5 —инкубация с конъюгатом аитиглобулнн-фермент; 6 —отмывка; 7 — инкубация с субстратом (светлые кружочки) н измерение количества продукта ре- акции (темные кружочки). связывание АТ, их можно количественно определить при помо- щи меченой ферментом аитиглобулиновой сыворотки, фермента- тивной реакции. Прочие неконкурентные методы ИФА представ- ляют собой различные модификации конкурентного метода. Вместо совместной инкубации меченых и немеченых АГ со свя- занными антителами можно непосредственно инкубировать только стандартный или анализируемый АГ, а затем после от- мывания проводить инкубацию с избытком энзим-меченого АГ, который взаимодействует с «незанятыми» АТ. Кроме того, стан- дартный или анализируемый АГ можно инкубировать с избыт- ком энзим-меченых антител и по окончании иммунной реакции добавлять эту смесь к антигену, фиксированному на твердой 165
фазе. Определяют количество свободных энзим-меченых АТ, свя- занных антигеном на твердой фазе. В обоих случаях концентра- ция продукта ферментативной реакции пропорциональна кон- центрации анализируемого антигена. 2.10.3. ПРИМЕР ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Последующее описание основывается на гетерогенном ИФА при- менительно к определению HBs-антигена двойным «сэндвич-ме- тодом» [10, 11]. 2.10.3.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Для работы необходимы: полистироловые пробирки или план- шеты (Polypast, Хальберштадт), анти-НВд-гамма-глобулин морской свинки (первые АТ), анти-НВэ-гамма-глобулин кроли- ка (вторые АТ), бараньи антитела к IgG кролика, меченые пе- роксидазой (фракция IgG), HBs-стандарт (Austria II, Abbott lab., Чикаго), HBs-позитивная сыворотка (вторичный стандарт), ФСБ (0,1 М фосфатный буфер с pH 7,2, 1 М NaCl), человече- ский сывороточный альбумин (Институт вакцин, Дессау), орто- дианизидин (Serva, Гейдельберг), Н2О2 (целлулоидная фабри- ка, Эйленберг), сорбитовый эфир полиоксиэтилена (Serva, Гей- дельберг), НС1 5 М, спектрофотометр (например, Бреко! 20, Карл Цейсс, Йена). 2.10.3.2. МЕТОДИКА Полистироловые пробирки в течение ночи при 4 °C инкубируют с 200 мкл анти-НВз-гамма-глобулина морской свинки (10 мг/л в ФСБ), после инкубации трижды отмывают порциями ФСБ по 600 мкл. В подготовленные таким способом пробирки добав- ляют по 200 мкл различных разведений стандарта или анализи- руемых сывороток. Пробы инкубируют 2 ч при 37 °C или 16 ч при комнатной температуре, затем трижды отмывают ФСБ. Свя- завшийся с первыми АТ HBs-антиген на следующем этапе на- сыщается вторыми АТ. Для этого в пробы добавляют по 200 мкл анти-НВэ-гамма-глобулина кролика (10 мг/л в ФСБ, содержа- щем 0,5 мМ ЧСА), снова инкубируют в течение 2 ч при 37 °C, трижды отмывают ФСБ и вносят в пробы по 200 мкл антител к IgG кролика, меченых пероксидазой (1,2 мг/л ФСБ, содержа- щем 0,5 мМ ЧСА). Инкубируют еще 2 ч при 37СС. После трое- кратного отмывания ФСБ проводят ферментативную реакцию. В пробы вносят по 500 мкл субстрата (о-дианизин 0,32 мМ, Н2Ог 0,7 мМ, сорбитовый эфир полиоксиэтилена 1,1 г/л ФСБ). Инкубируют их 2 ч при комнатной температуре, останавливают ферментативную реакцию добавлением 500 мкл 5 М НС1 и из- меряют экстинкцию при длине волны 535 нм в объеме 1 мл. 166
На рис. 71 схематически по- казан ход работы, на рис. 72 — калибровочная кривая. 2.10.4. ОЦЕНКА МЕТОДА Область применения и чув- ствительность ИФА соответ- ствуют радиоиммунологиче- ским методам исследования. Но ИФА по сравнению с РИА обладает целым рядом преимуществ: не использу- ются радиоактивные изото- пы, стабильность конъюга- тов позволяет хранить их в течение длительного време- ни1, измерение оптической плотности проводят в опти- ческом диапазоне, результа- ты ИФА можно оценивать полуколичественно без при- менения аппаратуры (ви- зуально). ИФА очень легко поддается автоматизации, может быть использован, наконец, в иммуногистоло- гических исследованиях и реакциях иммунопреципита- ции. Для ИФА используются более дешевые материалы и приборы, чем для РИА. И отчасти в связи с этим об- ласть применения ИФА Рис. 71. Схема количественного опреде- очень широка (см.табл. 11). ления HBs-антигена при помощи ИФ.и Так же как в РИА, специ- фичность и чувствительность ИФА даже при оптимальных усло- виях зависят от качества сыворотки. Рекомендуется использо- вать только высокоавидные и высокоспецифические АТ. Антите- ла достаточной для ИФА степени чистоты легко могут быть по- лучены путем иммуноадсорбции (см. раздел 4.3), вс время кото- рой удаляются неспецифические и могущие быть помехой АТ. Кроме того, необходимо исключить возможные перекрестные реакции с другими антигенами. Специфичность реакции может быть уменьшена неспецифической адсорбцией антител или эн- 1 Конъюгаты фирмы Labsystems сохраняют активность в течение года при температуре 4°C. — Примеч. пер. 167
зим-меченых компонентов реакции на твердой фазе. Самыми сложными и важными этапами ИФА являются получение и очистка ферментных конъюгатов. Для присо- единения ферментов к белкам чаще всего ис- пользуют глутаральдегид- ный метод (см. раз- дел 4.3). Поскольку на- личие неконъюгирован- ных белков снижает спе- цифичность реакции, не- обходимо проводить очистку конъюгатов гель- фильтрацией или любым другим методом. При по- лучении конъюгатов пе- роксидаза — иммуногло- булин молярное соотно- шение фермент/ИГ рас- считывается по соотноше- Рис. 72. Калибровочная кривая для опреде- НИЮ ЭКСТИНКЦИИ при ДЛИ- ления HBs-антигена методом ИФА. Н,е ВОЛНЫ 405 И 208 нм. Иммунологическая харак- теристика фермент-белковых конъюгатов исследуется при по- мощи метода иммунодиффузии (см. разделы 2.1, 2.2). Для раз- работки системы ИФА лучше использовать общедоступные ан- тигенонезависимые конъюгаты, такие как антитиповые АТ к ИГ или протеин А, конъюгированные с ферментом [10]. Такие конъюгаты дают возможность распространять иммунофермент- ную диагностику на ряд других антигенов. В качестве маркеров для ИФА чаще всего используют пероксидазу, щелочную фос- фатазу или глюкозооксидазу (табл. 12). Коммерческие препа- раты пероксидазы хрена требуют дополнительной очистки aoRZ более 2,5. RZ (нем. Reinheit-Zahl— буквально число чистоты) определяется как соотношение экстинкции на длинах волн 405 и 280 нм. Высокоочищенные препараты пероксидазы имеют RZ 3,0 и выше. Воспроизводимость результатов ИФА зависит от многих факторов, в том числе от условий измерения, оптимиза- ции фермент-субстратного взаимодействия, толщины слоя и по- глощающих свойств анализируемых растворов. Негомогенность материала планшетов (неконтролируемый фактор) отрицатель- но влияет на воспроизводимость. Отмывки между отдельными этапами анализа моющими средствами, добавлением БСА и др. также влияют на нее. Коэффициент вариации ИФА составляет менее 10%. В качестве твердой фазы для ИФА применяют та- 168
Таблица 11. Применение ИФА в медико-биологических исследованиях [3, 4, 5, 6, 8, 9, 12, 13, Обзоры 1 и 2] Объект исследования Примеры Микроорганизмы (АТ или АГ) Вирусы Коксаки В, гепатита А и В, простего герпеса, инфлюэнцы, краснухи; бруцеллы, холер- ный вибрион, кишечная палочка, сальмонеллы, трепонемы; амебы, плазмодии, токсоплазмы, трипаносомы, столбнячная палочка Гельминты Белки сыворотки Филярии, шистосомы, трихинеллы а-Фетопротеин, канцероэмбриональный антиген, фактор VIII, ферритин, фибронектин, гаптогло- бин, IgA, S-IgA, IgE, IgG, IgM Г ормоны Кортизон, человеческий хорионический гонадо- тропин, человеческий плацентарный лактоген, ин- сулин, эстрогены, прогестерон, тестостерон, ре- нин, соматостатин, тироксин, тиреотропин Медикаменты Хинидин, кодеин, дигоксин, гентамицина сульфат, метотрексат, морфнн, препараты группы пеницил- лина, фенобарбитал, новокаинамид, пропанолол (Propanolol) теофиллин и др. Разное Аденозин, ДНФ-IgG, С-реактивный белок Таблица 12. Ферменты-маркеры, наиболее часто используемые в ИФА Фермент Индикатор реакции Реагент, останавливающий реакцию Длина волны для оценки реакции Пероксидаза КФ 1.11.1.7 Н2О2 орто-дианизидин (или ортофениленди- НС15 М 535 амии); Na2SO4 2 М 2,2-азино-диэтилбензтиа- золинсульфат (АБТС) NaOH 1 М 405 405 Щелочная фосфатаза КФЗ.1.2.1 Пара-нитрофенилфосфат NaOH 1 М 402 Глюкозооксидаза КФ 1.1.3.4 Н2О2 (пероксидаза) о-ди- анизиднн или АБТС H2SO4 0,5 М 405 D-fJ-галактозидаза КФ 3.2.1.23 Пара-нитрофенил-P-D' галактозид 366 кие материалы, как полистирол, поливинилхлорид, полипропи- лен, полиакриламид, агарозу, целлюлозу и др. Твердая фаза мо- жет быть использована в виде пробирок, планшетов для микро- титрования, бусин, шариков, гранул, пленок и т. д. Необходи- мым прибором для ИФА является спектрофотометр. При анали- 169
зе больших серий материала желательно использовать автомати- ческие пипетки и автоматические ридеры (приборы для автома- тического считывания результатов ИФА, от англ, read — чи- тать). В будущем ИФА, вероятно, сможет полностью вытеснить РИА, если удастся преодолеть некоторые сложности: снизить затраты ручного труда путем автоматизации, исключить кова- лентное или адсорбционное связывание АГ или АТ с твердой фазой, а также освоить приготовление конъюгатов ферментов с небольшими молекулами. 2.10.5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Обзоры 1. Maggio Е. Т. Emzyme immunoassay. Florida, CRC Press, Boca Raton, 1981. 2. Oellerich M. Enzyme immunoassay in clinical chemistry. Present status and trends. — J. Clin. chem. biochem., 1980, 18, 197—208. Цитированная литература 1. Butler 1. E., McGivern P. L., Cantarero L. A. Application of the amplified enzyme-linked immuno-sorbent assay: comparative quantitation of bovine serum IgGi, IgG2, IgA and IgM. antibodies. — Amer. J. veterinary research, 1.980, 41, 1479—1491. 2. Clark R., Engvall E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Theoreti- cal and practical aspects. Enzyme-Immunoassay (E. T. Maggio ed.). Boca Raton, Florida, 1981, 167—179. 3. Grenner G., Schmidtberger E. Enzymimmunoassay zum Nachweis von Anti- HBs (Antikorper gegen Hepatitis B-Oberflachen Antigen). Ztschr. Anal. Chem., 1980, 301, 125—128. 4. Hannah D., Gotze M. A., Katterman R. Bestiipmung der Gesamtostrogene im Serum mit einem heterogenen Enzymimmunoassay. — Z. Anal. Chem., 1980, 301, 131—132. 5. Jennings R. T., Smith T., Potter C. IT. Use of the enzyme-linked immunosor- bent assay (ELISA) for the estimation of serum antibodiesin an influenza virus vaccine study. — Med. Microbiol. Immunol., 1981, 169, 247—258. 6. Lindenschmidt E. C., Muller F. Demonstration of specific 19S (IgM) anti- bodies in untreated and treated syphilis. — Br. J. Vener, Dis., 1982, 58, 12—17. 7. Mohr P., Zschische IT. Enzymimmunoassays in der medizinischen Diagnos- tik. — Wissenschaft und Fortschritt, 1981, 31, 374—379. 8 Oellerich TH. Enzyme immunoassays in clinical chemistry. Present status and trends.—J. clin. chem. clin. biochem., 1980, 18, 197—208. 9. Poskitt P., Poskitt T. A quantitative enzyme-linked immunoassay for scrum immune. — J. Clin. Lab. Immunol., 1981, 5, 125—128. 10. Porstmann T. et al. Entwicklung eines Doppel-Sandwich-Enzymimmunoassay zum quantitativen Nachweis von HbsAg (1. Mitteilung). Dt. Gesund. Wes., 1980, 35, 598—600. 11. Portsmann T. et al. Entwicklung eines Doppel-Sandwich-Enzymimmunoassays zum quantitative Nachweis von HBsAg (Mitteilung), 1980, Dt. Gesundh. Wes. 35, 1587—1593. 12. Salonen E. M. A rapid and sensitive solid-phase enzyme immunoassay for C-reactive protein. — J. Immunol. Meth., 1982, 48, 45—50. 13. Tole K„ Schenck K., Brandzaeg P. Enzyme linked immunosorbent assay for human IgG, IgA, and IgM antibodies to antigens from anaerobic cultures of seven oral bacteria. — J. Immunol. Methods, 1981, 45, 27—40. 14. Vejtorp M. Solid phase anti-IgM ELISA for detection of rubella specific IgM-antibodies. — Acta Path. Microbiol. Scand., 1981, 89, 123—128. 15. Vuento M. et al. Competitive enzyme immunoassay for human plasma fibre- nectin. — J. Immunol. Meth., 1981, 40, 101—108. 170
2.11. ТИТРОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА 2.11.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Количественное определение комплемента производится в на- стоящее время, как правило, методом иммунного гемолиза. Метод основан на комплементзависимом лизисе нагруженных АТ эритроцитов барана. Для полного гемолиза необходимо наличие всех компонентов комплемента. В соответствии с меж- дународным стандартом за единицу активности комплемента принимается такое его количество, которое вызывает 50% гемо- лиз в стандартных условиях. Единица активности комплемента называется также гемолитической единицей и обозначается СН50. В рутинных лабораторных исследованиях пользуются обычно полуколичественным определением гемолиза в агарозе, оно проще и занимает меньше времени, чем определение СН50. 2.11.2. МЕТОДИКА 2.11.2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Растворы: 1) раствор Alsever (глюкоза 21,0 г, цитрат нат- рия 8,0 г, NaCl 4,0 г, дистиллированная вода до 1000 мл), ав- токлавируют; 2) калийно-боратный раствор (калия сульфата 10,0 г, борная кислота 4,0 г, дистиллированная вода до 100 мл); 3) барбиталовый буфер (исходный раствор, NaCl 42,5 г, бар- битал 2,875 г, барбитал-натрий 1,875 г, СаС12-6Н2О 0,164 г, MgC’i2-6H2O 0,616 г, дистиллированная вода до 1000,0 мл); 4) раствор желатина (желатин 2,0 г, дистиллированная вода до 100,0 мл); 5) рабочий буфер (барбиталовый буфер, исход- ный раствор 200 мл, дистиллированная вода 800 мл, раствор желатина 10 мл, pH должна составлять 7,2, доводят pH 0,1 М. ХаОН). Все разведения готовят на рабочем буфере. Оборудование: водяная баня с регуляцией температуры от 35 до 56 °C, термостат, центрифуга (например, Т 23, Zentri- fugenbau, Энгельсдорф), гематокритная центрифуга (например, TH 12, Zentrifugenbau, Энгельсдорф), гемолизины к ЭБ, в ка- честве амбоцептора (Саксонский сывороточный завод, Дрез- ден); суспензия ЭБ в растворе Олсвера (1—16-педельной дав- ности), сыворотка морской свинки, по возможности свежая или из глубокой заморозки (источник комплемента), сапонин по- рошкообразный, фотоизмеряющее устройство на 541 нм (на- пример, Specol Carl Zeiss, Йена), агароза чистейшая, стеклян- ные пластины подходящего размера (например, 100X200X3 мм)» разграфленная бумага с абсциссами, имеющими логарифмиче- ские деления. 171
2.11.2.2. ПОДГОТОВКА СЫВОРОТКИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ Забор крови проводят без антикоагулянтов, пробе дают по- стоять 1 час при комнатной температуре, центрифугируют (10 мин при 1000 g) и отделяют сыворотку. Рекомендуется проводить титрование комплемента сразу после получения сы- воротки. Если это не удается, то сыворотку ввиду термола- бильности комплемента рекомендуется хранить в шкафу глу- бокого охлаждения (—80°C). Применение плазмы в данном случае не дает никаких преимуществ. После разведения сыво- ротки калий-боратным буфером в отношении 1 + 2 ее можно хранить в течение нескольких недель при 4 °C без потери ак- тивности комплемента [6]. Этот метод консервации применяют довольно часто. Для определения гемолитической активности в агарозе пробы сыворотки хранят в течение 24 ч при 4 °C [6]. 2.11.2.3. ПОЛУЧЕНИЕ СУСПЕНЗИИ ЭРИТРОЦИТОВ БАРАНА ЭБ трижды отмывают в рабочем буфере (центрифугируют 10 мин при 650 g), из отмытых эритроцитов готовят 4% сус- пензию. Это соответствует 6.5Х107 клеток в 1 мл. Концентра- цию суспензии определяют фотометрически и устанавливают оптическую плотность (ОП) 0,375. Для этого 0,2 мл суспензии ЭБ лизируют добавлением 4,8 мл дистиллированной воды и определяют ОП против дистиллированной воды. Конечный объем суспензии рассчитывают по формуле: , г 0П Ve = Va- 0 375 , где Ve — конечный объем суспензии, Va — исходный объем суспензии. 2.11.2.4. ТИТРОВАНИЕ ГЕМОЛИЗИНОВ Титрование гемолизинов проводят в пробирках. В каждую из 8 пробирок вносят по 0,5 мл рабочего буфера. В первую про- бирку вносят 0,5 мл гемолизина в разведении 1 : 100. Делают геометрический ряд разведений, перенося по 0,5 мл содержи- мого первой пробирки в пробирки 2—8. Добавляют 0,5 мл суспензии ЭБ и инкубируют 30 мин при 37°C. Затем в каждую пробирку вносят по 5,5 мл рабочего буфера и по 1,0 мл сыво- ротки морской свинки, разведенной в соотношении 1:200. После повторной инкубации в течение 60 мин при 37 °C про- бирки центрифугируют (10 мин, 800 g) и измеряют ОП надо- садочной фракции. С увеличением концентрации гемолизинов (уменьшение разведения сыворотки) гемолиз (ОП) возрастает, достигая плато. Наибольшее разведение гемолитической сыво- 172
ротки, при котором ОП все еще находится на плато, называет- ся гемолитической единицей. В коммерческих препаратах она составляет от 1:4000 до 1 :6000. Титрование можно также проводить в микротитраторе (планшет Takatsy) аналогичным образом. Каждая новая партия гемолизинов должна тестиро- ваться с одинаковыми реагентами, контроль следует проводить один раз в 14 дней. 2.11.2.5. СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ ЭРИТРОЦИТОВ БАРАНА К 1 объему суспензии ЭБ добавляют равный объем разведен- ной гемолитической сыворотки, содержащий 4 гемолитические единицы. Тщательно перемешивают жидкости и инкубируют в течение 30 мин при 37 °C. Во время инкубации смесь не- сколько раз встряхивают. Сенсибилизированные эритроциты должны быть использованы в тот же день, до использования их хранят при 4 °C. Сенсибилизированные ЭБ называются гемо- литической системой, которую используют как для титрования комплемента в пробирке, так и для гемолиза в агарозе. 2.11.2.6. ГЕМОЛИЗ В АГАРОЗЕ 2.11.2.6.1. Постановка опыта Получают 2% золь агарозы в рабочем буфере и охлаждают его до 50 °C. Затем на водяной бане (48 °C) смешивают рав- ные объемы агарозы и сенсибилизированных ЭБ, предваритель- но нагретых до этой температуры. Суспензию постепенно зали- вают между двумя стеклами, имеющими зазор 1,5 мм. Мы ис- пользовали пластины 100X200X3 мм, между которыми вмеща- лось 23 мл агарозы. После охлаждения одну из пластин уда- ляют и в геле проделывают специальным штампом по шаблону отверстия диаметром 3 мм на расстоянии 15 мм друг от друга (всего до 60 отверстий). В каждое отверстие вносят по 5 мкл неразведенной сыворотки. Пластину инкубируют 18 часов при 4 °C для того, чтобы прошла диффузия, и еще 2 часа при 37 °C для того, чтобы произошел гемолиз. После чего зоны гемолиза становятся хорошо различимыми на свету. Для консервации гелей их заворачивают в слой фильтровальной бумаги, смочен- ной физиологическим раствором (без образования под бумагой пузырей воздуха), насыпают сверху слой целлюлозы толщиной 1 см и кладут груз с таким расчетом, чтобы масса 10 г прихо- дилась на 1 см2. Через 15 мин груз снимают, убирают целлю- лозу и бумагу, высушивают гель на воздухе. Пластины для гемолиза можно сохранять при 4 °C в течение 3—4 дней без ущерба для качества анализа. 173
2.11.2.6.2. Оценка результатов Зоны гемолиза оценивают визуально, иногда со слабым увели- чением. Пластины с гелем можно фотографировать. Величина зоны гемолиза пропорциональна активности комплемента. Ис- пользуя стандарты и разведения исследуемой пробы, можно оценивать процесс количественно [1]. Мы использовали гемо- лиз в агарозе для полуколичественной оценки в качестве ориен- тировочного анализа. 2.11.2.7. ТИТРОВАНИЕ КОМПЛЕМЕНТА 2.11.2.7.1. Постановка опыта Исследуемая сыворотка разводится рабочим буфером в отно- шении 1 + 2. Если сыворотка уже разведена калий-боратным буфером, то разведения рабочим буфером уже не требуется. Разведенную сыворотку в количестве 0,5 мл смешивают с 2,55 мл рабочего буфера, что соответствует разведению 1 : 12,2. В остальных пробирках готовят ряд разведений в соответствии с табл. 13. В пробирку № 12, где должен быть 100% гемолиз, добавляют следовые количества сапонина. Все пробы инкуби- руют на водяной бане в течение 45 мин при 37°C. Затем цент- рифугируют 10 мин при 800 g и измеряют оптическую плот- ность надосадочной фракции в 11-й пробирке (0% гемолиз). 2.11.2.7.2. Обработка результатов Результаты определения ОП корригируют по значению ОП контроля (пробирки 11 и 12). Рассчитывают процент гемолиза. Для построения графической зависимости используют логариф- мическую бумагу. Значение каждого разведения сыворотки (12,2, 15,2, 18,5 и т. д.) отмечают на оси абсцисс. На осн ордн- Таблнца 13. Схема титрования комплемента Номера п; сбирок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 12 Разведение (1 :) 12,2 15,2 18.5 24,5 30,5 38,0 47,5 59,5 75 93 0% гемолиз 100% гемолиз Реагенты (мл) Рабочий буфер 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 Сыворотка 0,4 1,6 смешивают н переносят IO — — 1 : 12,2 1,6 мл в последующи проопрки Рабочий буфер 0,8 0.8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 —. Дистиллнро- 1,2 ванная вода Гемолнтнче- 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 ская система 174
нат откладывают соответствующий процент гемолиза. Получае- мые точки соединяют и по графику тут же определяют разве- дение сыворотки, при котором наступает 50% гемолиз. Число гемолитических единиц в 1 мл сыворотки рассчитывают по формуле: СН50/мл = . а — фактор первоначального разведения сыворотки (равен 12,2), х—объем сыворотки, вызывающий 50% гемолиз. 2.11.3. ОЦЕНКА МЕТОДА Определение общей активности комплемента при помощи вы- шеописанного метода позволяет сделать заключение о его ли- тической способности. Это важная величина, но она не отра- жает всех биологических свойств комплемента. Приведенная схема анализа позволяет получить только полуколичественную оценку, поскольку значение СН50 зависит от используемых компонентов реакции. Скорость лизиса определяется наиболее медленной составляющей каскада реакций. Хотя в гемолизе принимают участие все компоненты от С1 до С9, количествен- ные изменения их соотношений вышеописанная система не от- ражает [3]. Для стандартизации исследований можно приме- нять референс-препарат ВОЗ для определения СН5() [7]. В ре- зультате обширных исследований было установлено, что коэф- фициент вариации одноразовых определений СН50 очень не- значителен. Ошибка метода меньше, чем изменения активности комплемента, обусловленные циркадными ритмами [3]. Для обычных лабораторных исследований предпочтительнее проводить гемолиз в геле агарозы. Гемолиз сенсибилизирован- ных ЭБ применяется для определения активации комплемента по классическому пути. Для определения активации компле- мента по альтернативному пути используют несенсибилизиро- ванные эритроциты морской свинки или кролика [1, 3, 4]. В этом случае следует обращать внимание на катионный со- став проб. Наши опыты с эритроцитами морской свинки в ра- створе Олсвера 1—3-недельной давности показали, что опти- мальной является 1% концентрация. При исследовании альтер- нативного пути активации комплемента также следует обра- щать внимание на своевременное охлаждение пластин ввиду возможного преждевременного гемолиза. Ввиду термолабиль- ности комплемента следует тщательно соблюдать условия сбора и хранения исследуемых сывороток. Этот вопрос в общих чертах приходится решать при постановке гемолиза в агарозе [6]. Уже упоминавшаяся консервация калий-боратным раство- ром позволяет осуществлять довольно длительное хранение при 4 °C. Титрование комплемента не дает сведений о состоянии от- дельных компонентов системы комплемента, например, при 175
нормальном СН50 содержание С4 может быть крайне низким. Значения СН50 могут быть снижены ввиду снижения уровня С2. Известны генетические нарушения, встречающиеся весьма редко, которые приводят к снижению значений СН50 [2]. В настоящее время отдельные компоненты системы комплемен- та определяют иммунохимически при помощи специфических антисывороток [3, 4]. Антисыворотки к Cl, СЗ, СЗЬ, активатору СЗ, С4, С5 имеются в продаже. Определение отдельных компо- нентов проводят по Манчини, нефелометрически, турбидимет- рически или при помощи электроиммунодиффузии [4, 5]. Для клинических целей, как правило, достаточно определять СН50 и содержание компонентов СЗ и С4 {7]. 2.11.4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Fong J. F. С., Renaud L. A hemolitic plate method for alter native pathway complement activity assay. — Amer. J. clin. path., 1978, 69, 156—160. 2. Hobart M. J., Lachmann P. J. Allotypes of complement components in man.— Transpl. Rev., 1976, 32, 26. 3. Lachmann P. J., Hobart M. J. Complement technology. — In: Handbook of experimental Immunology. 3-rd ed./Ed. M. D. Weir. Oxford: Blackwell Scien- tific Publications, 1978. 4. Laurell A. B., Martennsson U., Sjoholm A. G. The development of simple tests for Clq, Clr, Cis and C2 and the determination of properdin. — In: Clinical aspects of the complement System/Eds. W. K. Opferkuch et al.— Stutgart: Thieme-Verlag, 1978. 5. Naish P. F., Barrat J., Collins C. A new haemolitic assay for the second component of complement (C2) in human serum. — Clin. exp. Immunol., 1976, 25, 487—492. 6. Truedsson L., Sjoholm G. and Laurell A. B. Screening for deficiencies in the classical and alternative pathways of complement by hemolysis in gel.—Acta path, microbiol. scand. Sect. C, 1981, 89, 161—166. 7. WHO-report. Use and abuse of laboratory tests in clinical immunology: critical considerations of eight widely-used diagnostic procedures. — Report of IUIS/WHO working group. Geneva, 1981, Allergie Immunol., 1982, 28, 21—35. 2.12. КОМПЛЕМЕНТЗАВИСИМАЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ 2.12.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Известны 4 основные механизма цитотоксических реакций: 1. Комплементзависимая цитотоксичность. 2. Антителозависимый фагоцитоз. 3. Антителозависимая клеточная цитотоксичность. 4. Прямая, опосредованная клетками цитотоксичность. Реакция АГ и АТ может происходить независимо от нали- чия комплемента и не сопровождаться видимыми изменениями клеток. Только после добавления комплемента наблюдается обусловленная реакцией АГ—АТ активация комплемента, при- водящая к повреждению клеточной мембраны и цитолизу 176
Антитела. Рис. 73. Комплементзависимая цитотоксичность, принцип метода. (рис. 73). Определение комплементзависимой цитотоксичности удобно проводить на легко получаемых клетках крови. В случае использования эритроцитов реакция проявляется в виде гемо- лиза; цитолиз лейкоцитов наблюдают при помощи специальных методов (фазовый контраст, витальное окрашивание, изотоп- ные методы). 2.12.2. РЕАКЦИЯ ЛИМФОЦИТОЛИЗА Классическая форма реакции лимфоцитолиза (РЛЦ) предло- жена Горер и О’Горман в 1956 г. Применение микроварианта РЛЦ позволило выявить наиболее часто встречающиеся анти- гены HLA (human leukocyte locus А) в течение всего несколь- ких лет. Жизнеспособные лейкоциты при инкубации с цитоток- сическими АТ в присутствии комплемента подвергаются лизису,, если они содержат соответствующий АГ. Реакцию оценивают по исключению красителя. Живые клетки в отличие от погиб- ших не окрашиваются. Для получения суспензии лимфоцитов пригоден любой метод, который позволяет получать жизнеспо- собные лимфоциты с выходом 95—100%. Обычно используют метод флотации ввиду хорошей воспроизводимости и простоты. Лимфоциты могут быть отделены от более тяжелых клеточных элементов крови фракционированием в среде с плотностью, 1,076 г/л. 2.12.2.1. ПОСТАНОВКА ОПЫТА 2.12.2.1.1. Материалы и оборудование Для работы необходимы: тестерные сыворотки «анти-HLA»; полиспецифическая сыворотка «анти-HLA» (положительный контроль); АВ-сыворотка без антител (отрицательный конт- 12—990 177
роль); АВ-сыворотка, инактивированная нагреванием (добавка к среде); комплемент кролика; фосфатный буфер XVI (1,15 г двузамещенного фосфата натрия, 0,200 г однозамещенного фос- фата калия, 0,200 г хлорида калия, 8,00 г хлорида натрия ра- створяют в 1000,0 мл дистиллированной воды, pH 7,2); раствор Хенкса (Государственный институт иммунных препаратов и пи- тательных сред, Берлин); среда для сепарации (5,6 г фиколла) (Pharmacia, Швеция), 94,4 мл дистиллированной воды, 20,0 мл Visotrast 370 (Fahlberg List, Магдебург) с плотностью 1,076 или 6,0 г декстрана (сывороточное предприятие, Вернбург), 16,0 мл Visotrast, дистиллированная вода до 100 мл (плот- ность 1,076 г/л); водный раствор натриевой соли эозина 50 г/л (Laborchemie, Апольда); азид натрия 0,1%; гепарин (Гедеон Рихтер, Будапешт); полужидкий парафин; безкислотный фор- малин с pH 7,2 (содержание формальдегида около 300 г/л); культуральные среды, RPMI или Игла (например, Институт им- мунологических препаратов, Берлин); меченная ФИТЦ антисы- воротка к IgG человека (Behring Werke, Марбург); этидий-бро- мид (Ferak, Западный Берлин); ЭДТА 60 г/л; найлоновая вата, найлоновые волокна (Fenwal Lab., США); соломка для питья (Sweethart Straw, США); глазная вата (Vliestextilien, ГДР); микрокамеры для постановки реакции (так называемые камеры Терасаки, Polypast, Хальберштадт или Microtest Tissue Culture Plats № 3034 США); микрошприцы (Hamilton № 705 с дози- рующим устройством № РВ-600); фазово-контрастный мик- роскоп, инвертированный микроскоп для люминесцентной мик- роскопии, камера для тестирования HLA-DR (Hamax-Kammern, Норвегия). 2.12.2.1.2. Получение лимфоцитов Суспензию лимфоцитов получают из свежей гепаринизирован- ной или дефибринпрованной крови при помощи флотации. Для этого 2 мл гепаринизированной венозной крови (5 ME ге- парина) смешивают с 2 мл фосфатного буфера XVI или с со- левым раствором Хэнкса. Наслаивают эту смесь в центрифуж- ную пробирку, содержащую 2 мл среды для сепарации. После центрифугирования в течение 10 мин при 2000 g или 30 мин при 300 g между плазмой и средой для сепарации образуется резко очерченный слой лимфоцитов (цветная вкладка II). Сус- пензию лимфоцитов отсасывают пипеткой и центрифугируют 10 мин при 100 g (дифференциальное центрифугирование для удаления тромбоцитов), надосадочную фракцию отбрасывают, осажденные лимфоциты отмывают фосфатным буфером XVI и снова осаждают центрифугированием в течение 5 мин при 1000 g. Дефибринирование свежеотобранной крови позволяет удалить примесь тромбоцитов перед флотацией. Дефибриниро- вание проводят путем встряхивания 10—20 мл венозной крови с 20 стеклянными бусинами диаметром 4—6 мм в колбе Эр- 178
ленмейера в течение 10—15 мин. Не позднее чем через 2 часа дефибринировапная кровь должна быть использована для дальнейшей работы. Готовая суспензия лимфоцитов может хра- ниться до 24 часов при 4°C в культуральной среде. Длительное хранение суспензии возможно в жидком азоте (—196 °C) после добавления криоконсерванта диметилсульфоксида (ДМ.СО). 2.12.2.1.3. Микромодификация реакции лимфоцитолиза Свежеполученную суспензию лимфоцитов разводят до кон- центрации 3-109 клеток/л. В ячейки для реакции камеры Те- расаки осторожно вносят вазелиновое масло (2—3 мл в каме- ру) с тем, чтобы последующие реакции проходили в отсутствие зоздуха. При частом употреблении камеры можно отказаться от использования вазелинового масла, если под крышку поло- жить полоску фильтровальной бумаги, смоченной водой для создания водонасыщепноп атмосферы [10]. В каждую лунку добавляют 1 мкл исследуемой сыворотки и 1 мкл суспензии лимфоцитов. После 30 мин инкубации при 22 °C добавляют 5 мкл комплемента морской свинки и инку- бируют еще 60 мин при 22 °C. Для окрашивания мертвых клеток в каждую лунку вносят no 1—3 мкл раствора эозина (рис. 2, 3 на цв. вклейке). При ис- пользовании парафиновых камер цветную реакцию фиксируют через 2 мин 8—10 мкл раствора формальдегида. Для седимен- тации клеток камеру оставляют на 60 мин при 22 °C. После фиксации оценку результатов можно проводить через 24 или 48 часов. При использовании камер без вазелинового масла реакцию останавливают осторожным приливанием фосфатного буфера XVI (см. рис. 2 на цв. вклейке). После этого смесь можно немедленно анализировать под микроскопом. После при- ливания буфера считывание результатов возможно не более чем через 2—3 часа при выдерживании камеры при 4 °C. 2.12.2.1.4. Оценка результатов Микроскопию проводят при 100—200-кратном увеличении, по возможности в условиях фазового контраста (рис. 3, 4, 5, 6 на цв. вклейке). Количество неживых клеток учитывают по степе- ни выраженности в крестах или словесно. Степень выраженности (кресты) Неживые клетки (%) 0—10 —отрицательная 11—20 — 1+ 21—50 — 2+ 51—75 — 3+ 76—100 —4+ 12* 179
Степень выраженности (словесное в ы р а ж е- н и е) Неживые клетки (%) 0—10 —отрицательная 11—20 — отрицательная (?) 21—40 —положительная (?) 41—80 —положительная 81—100 —резко положительная Контроль: ставят отрицательный контроль с АВ-сывороткой и положительный контроль с высокореактивной полиспецифиче- ской HLA-сывороткой. 2.12.2.2. КОМПЛЕМЕНТ В качестве источника комплемента для ЛЦТ используют пудо- вую сыворотку морских свинок (не менее чем от 6 животных). Поскольку активность комплемента у различных животных может сильно вырьировать, желательно, чтобы общий пул сы- воротки составлял 3—5 л (хранение осуществляют в заморо- женном состоянии небольшими порциями). При оценке новых серий комплемента необходимо исполь- зовать одинаковые сыворотки и планерные лимфоциты для создания определенных, постоянных условий эксперимента. Хороший комплемент дает реакцию 4+ в разведении 1+2 [9]. Помимо титра, определяют оптимальное время реакции, для чего инкубацию проводят в предел ах, 1—3 часов и определяют минимальное время наиболее выраженной реакции. Комплемент хранят при температуре —196 °C или —80 °C, транспортируют в лиофилизированном состоянии при температуре 2°—8 °C. По- вторное замораживание и оттаивание комплемента недопу- стимо. 2.12.2.3. ТИПИРУЮЩИЕ СЫВОРОТКИ Анти-НЬА-сыворотки получают от иммунизированных доноров. Иммунизация может быть вызвана беременностью (у 10—20% беременных вырабатываются АТ к HLA-антигенам плода от- цовского происхождения), переливанием крови или трансплан- тацией органов. Направленная иммунизация доноров пересад- кой кожи, переливанием крови или лейкоцитарной массы при- водит к появлению высокоактивных АТ к HLA-антигенам [12]. Ксено-антисыворотки (кроличьи, шимпанзе) не используются в рутинной лабораторной практике, поскольку их получение требует наличия очищенных антигенов или адсорбции получае- мых сывороток. Ксеногенные моноклональные АТ до настоя- щего времени используются только в немногих лабораториях [2, 5], несмотря на их явные преимущества. Моноклональные АТ следует в первую очередь применять для стандартизации или исследования антигенных структур [2]. Для определения 180
HLA-антигенов необходимы по меньшей мере 3 различные тест-сыворотки, из которых хотя бы 2 дают реакцию 3+[9]. Для титрования HLA используют добавку донорской сыворот- ки (пул составляет приблизительно 120 человек). Эти сыворот- ки можно заранее поместить в тест-камеры и сохранять в те- чение нескольких месяцев при —20 °C под слоем вазелина. Безвазелиновые камеры после внесения в них сыворотки вы- держивают на воздухе в течение 1 часа при 22 °C для высы- хания сыворотки. В таком виде тест-камеры можно даже пере- сылать по почте. Перед использованием в каждую лунку вно- сят по 1 мкл дистиллированной воды и под крышку подклады- вают лист влажной фильтровальной бумаги. 2.12.3. ИСТОЧНИКИ ВОЗМОЖНЫХ ОШИБОК И ИХ ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ 2.12.3.1. КЛЕТОЧНЫЕ СУСПЕНЗИИ Отрицательный контроль (АВ-сыворотка) не должен давать более 10% .неживых клеток, поскольку при более высо- ких значениях оценка результатов становится затруднительной. Большие количества неживых клеток в контроле встречаются в образцах крови, хранившихся более суток. Контаминация гранулоцитами. У пациентов с «левым сдвигом», особенно у потенциальных доноров почки, суспензия лимфоцитов может содержать значительную примесь гранулоцитов, которые во всех случаях разрушаются компле- ментом морской свинки, что весьма затрудняет оценку резуль- татов [3]. Незрелые гранулоциты имеют такую же плотность, как лимфоциты, поэтому они не удаляются при отмывке. В та- ких случаях можно рекомендовать адсорбцию на глазной вате, к волокнам которой прикрепляются гранулоциты. Для этого в шприц (20 мл), неплотно заполненный глазной ватой, нано- сят 10 мл дефибринированной крови или надосадочной фракции после осаждения декстраном, инкубируют 30 мин при 37 °C в термостате, затем промывают шприц из пипетки 10 мл раство- ра Хэнкса, вату осторожно отжимают. Контаминация тромбоцитами. Тромбоциты уда- ляют из гепаринизированной крови двукратным отмыванием при 100 g. Это необходимо, поскольку тромбоциты как носите- ли HLA-A, HLA-В и HLA-С локусов адсорбируют анти-HLA- иммуноглобулины и могут вызывать ложноотрицательные реак- ции. 2.12.3.2. ТИПИРУЮЩИЕ СЫВОРОТКИ «Проросшие» сыворотки могут вызывать ложноположительные реакции. В качестве консерванта рекомендуется азид натрия в концентрации 0,1%. Анти-HLA-сыворотки необходимо прове- 181
рять па наличие слабых перекрестно реагирующих HLA-антител и антиэритроцитарных антител (особенно анти-А и анти-Le’) перед их использованием. 2.12.3.3. КОМПЛЕМЕНТ Способы проверки качества комплемента см. в разделе 2.12.2. 2.12.3.4. ПРОЧИЕ РЕАГЕНТЫ Вазелиновое масло, используемое для предотвращения высы- хания жидкости в тест-камерах, не должно обладать токсич- ностью и способностью ингибировать комплемент. Раствор формальдегида (для фиксации) доводят карбонатом натрия до pH 7,2, поскольку при pH ниже 7,0 невозможно проводить различие между живыми и мертвыми клетками. 2.12.4. ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА Определение HLA-A-, -В-, и -С-а н т и г е и о в. Лимфоцито- токсический тест применяют для определения HLA-антигенов перед проведением трансплантации и гемотрансфузии [1, 8], в связи с болезнями, ассоциированными с HLA [4], для уста- новления отцовства [11]. Поскольку типирование по HLA тре- бует особого навыка, его проводят только в условиях специаль- ных лабораторий. Поиск антител. Лимфоцитотоксический тест может применяться для определения цитотоксических АТ к HLA-анти- гепам в сыворотке. Методику проведения теста см. в разделе 2.12.2. Исследуемую сыворотку проверяют по меньшей мере с 20 различными суспензиями лимфоцитов, по возможности со- держащими HLA-A, -В-, -С-антигены. Проба на АТ к HLA считается положительной, если одна или две суспензии лимфо- цитов дают реакцию 2+ в параллельных пробах [9]. Перекрестный тест с лимфоцитами. Этот тест служит для выявления апти-НЬА-антител у возможных реци- пиентов органных трансплантатов или клеточных масс (грану- лоцитарной, тромбоцитарной) [8]. Для проведения анализа смешивают 1 мкл суспензии лимфоцитов донора с 1 мкл сыво- ротки предполагаемого реципиента (микрометод см. в разде- ле 2.12.2). 2.12.5. ТИПИРОВАНИЕ ПО HLA-DR HLA-DR-антигены (англ. HLA-D-related antigens) тесно ассо- циированы или идентичны HLA-D-антигенам, они выявлены только у В-лимфоцитов, макрофагов, клеток эндотелия и спер» матозоидов [4]. Их определяют модифицированным лимфоци- тотоксическим методом с В-лимфоцитами. В-лимфоциты выде- 182
ляют на найлоновой вате, -при помощи метода розеток (ЭБ) или флотации (получаются меченные флюорохромом клетки, двойная флюорохромная метка). 2.12.5.1. ВЫДЕЛЕНИЕ В-ЛИМФОЦИТОВ Получают лимфоциты по меньшей мере из 10 мл крови (см. 2.12.2) и суспендируют в 0,5 мл среды (RPMI +5% сыворотки АВ) [6]. Сепарация В-лимфоцитов на найлоновой вате (так называемый метод «соломки для питья»). Приготовление колонки из найлоновой ваты: пласти- ковую «соломку для питья» (длиной 19,5 и 0,6 см в диаметре) сваривают по одному концу под углом 45°. В нижнем конце сварного шва прорезают отверстие диаметром 1 мм, через ко- торое будет медленно вытекать суспензия клеток. Колонку за- полняют 0,1 г найлоновой ваты на высоту 6 см (1—2 см от верхнего конца остаются незаполненными), выдерживают 4 дня в дистиллированной воде, затем промывают нагретой до 37 °C средой. Наличие воздушных пузырей недопустимо, поскольку они вызывают цитолиз. Подготовленная таким способом колон- ка пригодна для получения 150Х106 клеток. Закупоренные ко- лонки можно длительное время хранить в замороженном со- стоянии. Найлоновую вату после употребления можно промы- вать водопроводной водой и использовать повторно (много- кратно). После промывания подогретой средой колонку инку- бируют в горизонтальном положении в течение 30 мин при 37 °C. Суспензию лимфоцитов осторожно наносят на верхний конец колонки, наклоненной под углом 45°. В заполненную суспензией колонку вносят еще 0,2 мл среды для предотвраще- ния высыхания. Колонку кладут в горизонтальном положении в термостат (37 °C) на 30 мин, а затем ставят вертикально в сосуд и промывают 5 мл среды, нагретой до 37 °C. На этом этапе удаляются неадгезировавшие клетки (Т-лим- фоциты). Еще раз повторяют промывку 5 мл среды. Адгезиро- вавшие клетки (В-лимфоциты) вымывают средой, охлажденной до 4 °C, при равномерном надавливании, повторяют процедуру. Собранные клетки отмывают средой и осаждают центрифуги- рованием в течение 5 мин при 100 g; доводят концентрацию клеток до ЗХ Ю9 клеток/л. Контроль выделения В-клеток. В-лимфоциты должны составлять не менее 80% выделенной популяции кле- ток, для того чтобы можно было проводить титрование по HLA-DR. Позитивный контроль проводят с полиспецифической HLA-DR-антисывороткой, которая вызывает полный лизис В- лимфоцитов и не лизирует Т-лимфоциты. Дополнительный контроль можно проводить маркировкой В-лимфоцитов мечен- ной ФИТЦ антисывороткой против иммуноглобулинов человека (см. раздел 2.12.5). 183
Модифицированный микро тест на л и м ф о- цитотоксичность. Тест проводят в условиях, соответствую- щих описанным в разделе 2.12.2, но время инкубации увели- чивают: антисыворотки + В-лимфоциты инкубируют 60 мин, после добавления комплемента инкубацию проводят еще в те- чение 120 мин при 22 °C. 2.12.5.2. МЕТОД ДВОЙНОЙ ФЛЮОРЕСЦЕНТНОЙ МЕТКИ Выделение лимфоцитов. Лимфоциты из 5 мл гепари- низированной или дефибринированной крови трижды отмывают в растворе Хэнкса, ресуспендируют в 1 мл среды и доводят концентрацию клеток до 5Х109 клеток/л. Мечение В-клеток. К суспензии лимфоцитов (5Х X 106 клеток) добавляют 15 мкл меченной ФИТЦ антисыворот- ки к ИГ человека, инкубируют 10 мин при 37 °C и трижды отмывают раствором Хэнкса. Ресуспендируют клетки в 0,15 мл среды и устанавливают концентрацию 8Х109 клеток/л. Постановка опыта. Антисыворотку (0,5 мкл) смеши- вают с 0,5 мкл клеточной суспензии под слоем вазелинового масла и инкубируют 45 мин при 22°С. Добавляют 2 мкл кро- личьего комплемента и инкубируют 120 мин при 22 °C. Готовят исходный раствор этидий-бромида Ц0 мг красителя в 50 мл 5% раствора ЭДТА в 0,15 М NaCl). Разводят исходный раствор этидий-бромида 1:230 (растворитель, как для исходного раст- вора). Для окрашивания к инкубационной смеси добавляют 0,5 мкл разведенного раствора этидий-бромида. Результаты учитывают при помощи инвертированного [микроскопа в люми- несцентном свете (фильтр № 12 для Ploempak 2 Лейц). В-лим- фоциты могут быть идентифицированы по зеленой флюорес- ценции (так же как и моноциты); у мертвых клеток ядро окра- шивается в оранжевый цвет (этидий-бромид). Учитываются только клетки с зеленой флюоресценцией с неокрашенным ядром (живые) и клетки с оранжевым ядром (мертвые клетки, положительная проба). 2.12.5.3. СЫВОРОТКИ ДЛЯ HLA-DR Антисыворотки к HLA-DR получают от иммунизированных до- норов. Поскольку они также, как правило, содержат антитела к HLA-A, -В, -С, последние должны быть адсорбированы тром- боцитами, содержащими антигены HLA-A, -В -С, и не содер- жащими антигенов HLA-DR. Для этого сыворотку смешивают с равным объемом осадка тромбоцитов, инкубируют при 22°C, постоянно помешивая. Тромбоциты удаляют центрифугирова- нием (1000—2000 g). Повторяют адсорбцию со свежей порцией тромбоцитов. Адсорбированные сыворотки не должны реагиро- вать с Т-лимфоцитами. Тромбоциты получают с донорских пунк- 184
тов. После 25-минутной отмывки 0,14 М NaCl тромбоциты сус- пендируют в 0,1% азиде натрия и хранят при 4°C до 3 месяцев. Пул тромбоцитов собирают по меньшей мере из 100 лейкоци- тарных пленок, что обеспечивает присутствие всех вариантов HLA-A, -В-, -С-антигенов. 2.12.6. ОЦЕНКА МЕТОДА При наличии антисывороток достаточно хорошего качества реакция лимфоцитолиза ввиду ее хорошей воспроизводимости (свыше 95%) представляется наиболее адекватным методом типирования по HLA. Наибольшее распространение получил микрометод. Вместо суправитального окрашивания эозином и трипановым синим можно метить живые клетки флюоресцеин- диацетатом или 51[Сг]. Для определения анти-НЬА-иммуногло- булинов можно применить реакцию лимфоцитолиза в антигло- булиновом варианте [7]. К числу недостатков метода относится использование в роли носителя антигенов живых клеток. Это приводит к тому, что иногда свежевыделенные препараты клеток приходится сохра- нять в жидком азоте. Типирование HLA-DR в последние годы приобрело особенное значение в связи с выявлением тесной ассоциации HLA-DR-антигенов с предрасположенностью к опре- деленным заболеваниям .[4], а также в связи с ролью этих антигенов в -приживлении трансплантатов [1]. Воспроизводи- мость результатов типирования HLA-DR все еще не вполне удовлетворительна, поскольку aHTH-HLA-DR-сыворотки хороше- го качества встречаются довольно редко. Пока еще не получе- ны моноклональные антитела к HLA-DR с полным набором специфичностей [2]. Определенные преимущества создает ме- тод двойной флюоресцентной метки, поскольку снижает расход типирующих сывороток и сокращает потребление крови. Наибо- лее экономичный метод получения лейкоцитов основан на ис- пользовании найлоновой ваты. 2.12.7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Albrechtsen D., Bratlie A. et al. Significance of HLA matching in renal Trans- plantation.— Transplantation, 1979, 28, 280—284. 2. Ax IV. Monoklonale Antikorper durch Lymphozyten-Hibridisierung — Beh- rings Laboratoriumsblatter, 1980, 30, 89—99. 3. Bender K. Das HLA-System — Biotest—Mitteilungen (1979). 4. Bertrams J., Rittner C. Der HLA-Komplex. —Dtsch. med. Wschr., 1981, 106, 952—958. 5. Ceppelinl R., Carotta G., Trucco M. M. Evaluation of zenogenic monoclonal antibodies as HLA typing reagents. Histocompatibility testing, 1980, 924, UCLA, Los Angeles. 6, Danilovs I. A., Ayoub G., Terasaki P. I. В lymphocyte isolation by thrombin- nylon wool. — Histocompatibility testing, 1980, UCLA tissue Typing Lab. Los Angeles, p. 287—288. 7. Jager L. Klinische Immunologie und Allergologie. 2. Auflage Fischer Verlag, Jena, 1983. 8. Johanson A. H. Antiglobulin microcitotoxicity test — NIAD Manual of tissue 185
typing techniques/Ed. Ray J. G. jr, DHEW Publ. No. (NIH) 80—545, 1979, 178—180. 9. Mayr W. R. Die Bedeutung des HLA-Systems fur die Transfusionmedizin.— Biotest Mitt., 1979, 37, 191—196. 10. Richter K., Brandsadter W., Rackow S. Vorschlag zum 2. Arzneibucli der DDR, Diagnostische Laboratoriumsmethoden. — Zbl. Pharm., 1979, 118, 949— 955. 11. Thorsby E. The human major histocompatibility complex HLA: some recent developments. — Transplant. Proc., 1979, XI, 616—623. 12. Wegener S. Gewinnung und Anwendung von HLA-Testseren. — Disserta- tion B, Wilhelm-Pieck-Universitat Rostock 1983. 13. Wegener R., Haferland W. Probleme der biostatischen Wertung von HLA- Befunden im Paternitatsgutachten. — Kriminalistik und forensische Wissen- schaften, 1981, 44, 17—21. 2.13. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА ТРОМБОЦИТАМИ 2.13.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Реакция связывания комплемента (РСК) введена в серологию тромбоцитов Аккроидом (Ackroyd) в 1951 г. В последующие годы разные авторы использовали ее с некоторыми методиче- скими изменениями для определения антитромбоцитарных АГ. Ее применяют для количественных и качественных исследова- ний. Так как антигены гистосовместимости обнаружены во всех клетках организма, в том числе и в тромбоцитах, и при- обретают все большее значение, возрастает интерес к методам выявления этих АГ. На IV международной конференции по гистосовместимости в 1970 г. была предложена одновременно многими авторами микромодификация РСК [1]. Антитела, взаимодействуя с соответствующим АГ, связывают комплемент. Уменьшение количества комплемента определяется при помощи сенсибилизированных ЭБ (вторая система АГ—АТ). Если ком- племент не связывается в йервой системе, наблюдается 100% лизис сенсибилизированных ЭБ. 2.13.2. МЕТОДИКА \ 2.13.2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Для работы необходимы: 0,9% раствор NaCl; 5% раствор ЭДТА в 0,15 М NaCl, 0,1% раствор азида натрия в 0,15 М NaCl, барбиталовый буфер, гемолизин (гемолитическая сыворотка) к бараньим эритроцитам, комплемент, тромбоциты, исследуемая сыворотка, вазелиновое масло, камеры для микрокультивирова- ния № 3034 (Falcon, Швейцария), гамильтоновские микрошпри- цы 705N и 710N, микродозатор РВ 600-1 (Hamilton, Нидерлан- ды), термостат на 37 °C, водяные бани на 37 °C и 56 °C, центри- фуги, холодильник, вибрационный смеситель, центрифужные пробирки, пробирки для титрования, мерные пипетки. Для по- 186
стоянкой работы требуется большой запас посуды и материалов. Вся стеклянная посуда должна быть идеально чистой и свобод- ной от бактериального загрязнения. Посуду рекомендуется мыть хромовой смесью. Барбиталовый буфер, pH 7,4 (исходный раст- вор): Барбитал — 5,75 г Барбитал-натрий — 3,75 г NaCl — 85,0 г 1 М MgCl2— 5,0 мл 1 М СаС12— 1,5 мл Бидистиллированная вода до 2000,0 мл Исходный раствор автоклавируют, перед употреблением разво- дят в 5 раз дистиллированной водой. Гемолизин, готовят стабилизированный раствор гемоли- тической АС 1 : 100. Он сохраняет стабильность в течение не- скольких недель: 0,9% раствор NaCl — 94,0 мл 5% фенол в 0,9% NaCl — 4,0 Гемолитическая АС— 1,0 Глицерин — 1,0 Перед употреблением гемолизин выдерживают 3—4 дня. Эритроциты барана: эритроциты барана стерильно отбирают в гемостабилизатор и перед использованием выдер- живают около 6 дней при 4 °C. Комплемент: сыворотки АВ, свежая пудовая сыворот- ка, проверенная на активность комплемента (минимальный титр 1:25). АВ-сыворотку здоровых, не получавших гемотранс- фузий доноров мужского пола, хранят небольшими порциями в жидком азоте или при —80 СС. В жидком азоте комплемент сохраняет стабильность в течение нескольких месяцев. Комплемент морской свинки: смешивают сыворотки живот- ных с титром комплемента не менее 1:60, немедленно замо- раживают небольшими порциями или лиофилизируют. Ввиду высоких титров комплемента сыворотку морских свинок можно хранить несколько дней при —20 °C. РСК более чувствитель- на, если в качестве источника комплемента используется сыво- ротка АВ. Суспензия тромбоцитов: 10—60 мл крови собирают в отношении 1+9 в 5% раствор Кта2-ЭДТА, выдерживают смесь 60 мин при комнатной температуре для оседания эритроцитов. Центрифугируют 10 мин при 200 g и сливают около 4/5 надо- садочной фракции (плазма, обогащенная эритроцитами). Если присутствует примесь эритроцитов, плазму центрифугируют еще раз 10 мин при 200 g. Надосадочную фракцию, содержащую только тромбоциты, центрифугируют 15 мин при 1600 g. Оса- док тромбоцитов трижды отмывают 0,9% NaCl с 0,1% азидом натрия, доводят концентрацию суспензии до 2хЮ6 клеток/мкл, сохраняют при 4 °C. При соблюдении стерильных условий из- 187
готовления суспензия сохраняет пригодность в течение 12 ме- сяцев. Для работы используют суспензию 0,5х Ю6 клеток/мкг. Свежеприготовленная суспензия тромбоцитов связывает меньше комплемента, чем суспензия, «созревшая» за 24 часа [8];. Сус- пензию тромбоцитов из крови, взятой в оксалат аммония, можно использовать тотчас же после приготовления [4]. Сыворотки: для выявления антигенов HLA на тромбо- цитах и других клетках используют сыворотки беременных, пациентов, перенесших гемотрансфузию или трансплантацию, а также сыворотки специально иммунизированных доноров. Сыворотки получают по возможности стерильно и хранят их при —20 °C или в жидком азоте. Желательно избегать много- кратных замораживаний и оттаиваний. Обычно полученные сыворотки полиспецифичны, но с помощью адсорбции и элю- ции можно получить сыворотки, приближающиеся к моноспе- цифическим ;[7]. Все сыворотки инактивируют нагреванием при 56 °C в течение 30 мин. Сыворотки разводят барбиталовым бу- фером, если разведение более 1: 10, к вероналовому буферу добавляют 10% инактивированной сыворотки АВ. 2.13.2.2. ПОСТАНОВКА ОПЫТА 2.13.2.2.1. Сенсибилизация эритроцитов барана ЭБ 3—4 раза отмывают 0,15 М NaCl, последнюю отмывку де- лают барбиталовым буфером. Из осадка готовят суспензию ЭБ в том же буфере (4Х106 клеток/мкл). Для сенсибилизации к суспензии эритроцитов медленно добавляют равный объем ге- молизина, титр которого подбирают в предварительном опыте. Смесь инкубируют 30 мин на водяной бане при 37 °C, много- кратно ее перемешивая, затем охлаждают до 4 °C. Сенсибили- зированные эритроциты готовят в день опыта. 2.13.2.2.2. Определение титра гемолизина Готовят разведения гемолитической сыворотки от 1:400 до 1/ 12 800 с двукратным шагом, по 2 мл каждого разведения. ,К 2 мл каждого разведения гемолизина приливают равный объем суспензии ЭБ (4Х106 клеток/мкл), происходит сенсиби- лизация. Реакцию ставят в камере для микротитрования под слоем вазелинового масла. Комплемент добавляют в избытке (сыворотку АВ в разведении 1 : 10 или сыворотку морской свинки в разведении 1 : 20). Наибольшее разведение гемолизина, при котором еще на- блюдается полный гемолиз, содержит 1 гемолитическую еди- ницу. Для постановки основного опыта используют 4 гемоли- тические единицы. 188
Таблица 14. Схема титрования гемолизина Разведение гемолизина 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 Комплемент (мкл) 2 2 2 2 2 2 Барбиталовый буфер (мкл) 0,1% азид натрия в 0,15 М 2 2 2 2 2 2 NaCl (мкл) 2 2 2 2 2 2 Суспензия сенсибилизирован- ных эритроцитов барана 2X106 клеток/мкл 2 2 2 2 2 2 Инкубация 30 мин прн 37 ®С; непродолжительное центрифугирование, оценка. Пример: если полный гемолиз наблюдается при разведении гемолизина 1:3200, то для опыта используют разведение 1 :800. При повседневном проведении РСК с одними и теми же реа- гентами титр гемолизина определяют 1 раз в неделю. Если титр комплемента известен, можно провести перекрестное тит- рование гемолизина. В приведенную выше (табл. 14) схему титрования вводят разведения комплемента, указанные ниже. 2.13.2.2.3. Определение титра комплемента Все разведения комплемента готовят на барбиталовом буфере. Вспомогательное титрование и основной опыт проводят в оди- наковых условиях. Титр комплемента определяют -каждый раз в день постановки опыта. Чтобы повысить чувствительность РСК, приготовляют следующие разведения комплемента: 1:6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 24, 28, 32. Камеру для титрования запол- няют 6—8 мл вазелинового масла. Все пробы дублируют (табл. 15). Таблица 15. Схема титрования комплемента Разведение комплемента 1:6 1:8 ' 1:10 — 1:28 1:32 Контроль Барбиталовый буфер 4 4 4 — 4 4 6 (мкл) Комплемент (мкл) 2 2 2 2 2 — Сме вшиваю т, инку бирукл 60 мин при 37 °C Сенсибилизированные ЭБ 2 2 2 2 2 2 (мкл) Смешивают, инкубируют 30 мин при 37 С Результаты реакции легче учитывать после осаждения эритро- цитов центрифугированием. Степень гемолиза оценивают ви- зуально по окраске надосадочной фракции и величине осадка эритроцитов в баллах от 0 до 4 (табл. 16). 189
Таблица 16. Оценка степени гемолиза Гемолиз (%) 0 25 50 75 100 Балл 4 3 2 1 0 Количество негемолизиро- ванных эритроцитов (%) 100 75 50 25 0 Наибольшее разведение комплемента, которое еще дает полный гемолиз, принимают за 1 гемолитическую единицу комплемента. В основном опыте используют 2 единицы ком- племента. Если, например, комплемент в разведении 1 :24 вы- зывает полный гемолиз ЭБ, для основного опыта используют разведение 1 :12. При использовании одной гемолитической единицы чувствительность РСК возрастает, но возрастает так- же влияние помех. 2.13.2.2.4. Международная стандартизированная методика РСК для определения НLA-антигенов на тромбоцитах Заливают камеры для титрования 6—8 мл вазелинового масла. В лунки вносят по 2 мкл следующих реагентов: Антитела (сыворотка в различных разведениях, элюаты). Антиген (суспензия тромбоцитов 0.5Х106 клеток/мкл). Комплемент (сыворотка АВ 1 ЕД/мкл). Смешивают, инкубируют 60 мин при 37 °C. Сенсибилизированные ЭБ (2Х106 клеток/мкл). Смешивают, инкубируют 30 мин при 37 °C. Центрифугируют, учитывают результаты реакции. Для каждой серии суспензии тромбоцитов и для каждой сыворотки ставят следующие контроли: Контроль антигена: барбиталовый буфер 2 мкл суспензия тромбоцитов 2 мкл комплемент 2 мкл суспензия сенсибилизированных ЭБ 2 мкл Контроль антител: сыворотка 2 мкл барбиталовый буфер 2 мкл комплемент 2 мкл суспензия сенсибилизированных ЭБ 2 мкл Если нет подходящей центрифуги, микропланшеты оставляют на 30 мин при комнатной температуре или 4СС для полного осаждения негемолизированных эритроцитов. Учет реакции проводят, как и при титровании комплемента, в баллах. В круп- ных лабораториях проводят количественную РСК на автомати- ческом микроскопе-денситометре [5]. Причинами ложнополо- жнтельных или ложноотрицательных результатов могут быть [8]: — загрязнение центрифужных пробирок, микропланшетов, пи- петок, шприцев и т. д.; — нежелательные примеси в сыворотках, суспензиях тромбо- цитов или растворах; 190
— контаминация сывороток, суспензий тромбоцитов и раство- ров бактериями или грибами; — неправильное хранение сыворотки, приводящее и ингибиро- ванию комплемента; — подавление цитратом и другими антикоагулянтами актив- ности комплемента. В связи с этим необходимо тщательно отмывать клетки от антикоагулянтов. Сыворотки, получен- ные методом плазмафереза, также ингибируют комплемент; — потеря некоторыми препаратами тромбоцитов антигенности при хранении свыше 4 мес при 4 °C; — изоагглютинины анти-А и анти-В, присутствующие в иссле- дуемой сыворотке, могут вызывать ложноположительную реакцию, если суспензия тромбоцитов содержит большую примесь эритроцитов, которые связывают комплемент; 1— суспензия тромбоцитов может быть использована не ранее, чем через сутки после ее получения, в противном случае наблюдается отрицательная реакция. 2.13.3. ОЦЕНКА МЕТОДА Прежде РСК применяли главным образом для определения специфических тромбоцитарных АГ и АТ. В новом, более про- стом, микроварианте ее стали использовать для выявления АГ или AT HLA-A и -В-локусов тромбоцитов. По воспроизводимо- сти результатов и затратам времени (2—3 часа) РСК не усту- пает широко применяемой реакции лимфоцитолиза. С хороши- ми сыворотками оба метода дают воспроизводимость около 99%. Однако РСК менее чувствительна, чем реакции лейкоаг- глютинации и лимфоцитолиза, поэтому многие АС оказывают- ся в РСК неактивными, что ограничивает ее применение. Со- здать достаточно полный набор типирующих сывороток весьма сложно. Особую ценность имеют сыворотки реципиентов, полу- чавших многократные переливания крови. В более чувствитель- ной реакции лимфоцитолиза эти сыворотки проявляют поли- специфичность, но в менее чувствительной РСК они нередко ведут себя как моноспецифические и считаются хорошими реа- гентами. Самый чувствительный вариант РСК основан на ко- личественном измерении степени гемолиза при помощи спект- рофотометра. Эту реакцию ставят в пробирках с относительно большими объемами АГ и АС, поэтому ее едва ли можно ре- комендовать как метод для массовых обследований. Реакция используется главным образом для количественного определе- ния АГ и АТ. Более простая модификация количественного определения антигенов HLA-A предложена Коломбани [3]. Как и любой метод исследования, РСК имеет свои преимуще- ства и недостатки [2, 10]. К преимуществам относится более легкое получение тромбоцитов из крови, чем лимфоцитов, а также возможность довольно длительного хранения. Это по- зволяет использовать клетки из одной и той же взвеси в реак- 191
циях как с известными, так и с плохо изученными или новыми сыворотками. Реакция учитывается невооруженным глазом, возможен также автоматический учет ее результатов. Можно производить количественное определение антигенов. РСК позволяет определять антигены HLA не только на тром- боцитах, но и на других клетках, например, на перевиваемых лимфобластах, фибробластах и опухолевых клетках. При этом можно не только идентифицировать известные антигены HLA, но и вести поиск новых специфичностей этой и других антиген- ных систем [9, 10]. Все варианты выявления антитромбоцитар- ных АТ в РСК имеют общие недостатки — относительно низ- кую чувствительность, подверженность влиянию помех и зна- чительные трудности получения антисывороток, а также то, что взвесь тромбоцитов нельзя использовать тотчас после при- готовления. Данные о том, что HLA-A, -В-, -С-антигены выра- жены на тромбоцитах слабее, чем на лимфоцитах, до настоя- щего времени не получили подтверждения [6, 11]. Подводя итоги, можно сказать, что микровариант РСК при тщательной постановке служит весьма полезным методом вы- явления антигенов HLA и тромбоцитоспецифических антигенов, а также соответствующих АТ [12]. О взаимодействии АГ с АТ в этой реакции судят по фиксации комплемента, которую можно учитывать полуколичественно [1] или количественно [3]. Именно по фиксации комплемента часто оценивают актив- ные сыворотки анти-HLA, «моноспецифические» как в РСК, так и в реакции лимфоцитолиза [8]. В-РСК происходит взаимо- действие многочисленных реагентов — гемолизина, комплемен- та, антигена и антител, а также необходим подсчет клеток в камере; поэтому успешное овладение этим методом требует большой тщательности и опыта. С помощью РСК можно вы- являть антигены не только тромбоцитов, но и других клеток, параллельно или в дополнение к реакции лимфоцитолиза [9]. 2.13.4. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ~^Г.~Сд1отЬап1 J., D'Amaro J., Gabb В. et al. International Agrement on a Micro- technique of Platelet Complement Fixation. — Transplant. Proc. Ill, 1971, III, 121—126. 2. Colombani J. Blood Platelet in HLA serology. —- Transplant. Proc., 1971, III, 1078—1087. 3. Colombani J„ Colombani M. Principles and applications of a quantitative complement fixation microtechnique. — Symp. Series immunobiol. Standard., 1973, 18, 89—92. 4. Colombani M., Colombani J., Dehay C., Dausset J. A Microtechnique of Pla- telet Complement Fixation. Results Obtained with Sera and Eluates as the source of Antibody. — Histocompatibility Testing 1970. Munksgaard, Copen- hagen, 1970, 553—559. 5. D’Amaro J., Hensen E„ van Rood J. The Micro-complement Fixation Test. III. Automatic Quantitative Scoring with a Microscope Densitometer. — Tis- sue Antigens, 1971, 1, 171—177. <5. Duquesnoy R. Filip D. J., Tomasulo P. A., Aster R. H. Role of HLA-C Matching in Histocompatible Platelet Transfusion Therapy of Alloimmunized Thromobocytopenic Patients. —- Transplant. Proc., 1977, IX, 1827—1828. 192
7. Heinrich D., Mueller-Eckhardt Ch. HL-A-spezifische, C-fixirende antithrobo- zytare Antikorper. II. Absorptions- und Elutionsuntersuchungen an Schwan- gerenseren mit HLA-spezifischen Antikorpern. — Blut, 1971, XXIII, 267— 8. Kissmeyer-Nielsen F., Thorsby E. Human Transplantation Antigens. — Trans- plantation Reviews, 1970, 4, 134—147. 9. Lepage V., Gaudy Y., Terrier E. et al. Screening and use of high titerd Anti- HLA-DR Sers in PHA-Blast Complement Fixation and B-Lymphozytotoxicity Techniques. — Tissue Antigens, 1981, 17, 37—42. 10. Mittal K. K., Mickey M. R., Terasaki P. I. Heterogeneity of HLA Specificities shown by Platelet Complement fixation. — Tissue Antigens, 1971, 1, 279— 11. Mueller-Eckhardt C. Histocompatibilitat und Thrombozytentrans fusion.— Blut, 1977, 34, 261—270. 12. Mueller-Eckhardt G., Breidenbach M„ Mahn I., Mueller-Eckhardt C. The role of Alloimmunisation in Platlet Survival Studies. — Blut, 1980, 41, 93—99. 2.14. РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА 2.14.1. ПРИНЦИП МЕТОДА Реакция связывания комплемента (РСК)—это метод серо- логического анализа, который по своей чувствительности срав- ним с методами преципитации, агглютинации и нейтрализации, т. е. позволяет определить до 0,05 мкг±5% азота антител. РСК представляет собой метод, включающий две независимо протекающие реакции: первичную и вторичную. Для проведе- ния РСК необходимы 5 компонентов: диагностируемый АГ и диагностические АТ, антиген-индикатор (эритроциты барана), индикаторные АТ (кроличьи амбоцепторы), комплемент. Коли- чество применяемых в РСК реагентов привело к возникнове- нию путаницы в различных модификациях этого метода. 2.14.1.1. ВАРИАНТЫ МЕТОДИКИ Первый вариант: связывание комплемента рассматри- вается как простая линейная зависимость от количества им- мунных комплексов. По мере прибавления комплемента линей- ная зависимость достигает своего максимума. Комплемент по- степенно добавляют, пока не будет достигнуто 50% связыва- ние. Титр рассчитывают методом экстраполяции. Его опреде- ляют как число СН50 (единица активности комплемента, вы- зывающая 50% гемолиз), которое необходимо прибавить к 0,05 мл антисыворотки, чтобы оставалась свободная 1 CHsq. В данном методическом варианте определяют количество свя- зывающегося комплемента, причем возможно одно-, двух- и трехкомпонентное титрование. Однокомпонентное: определяют разведение сыворотки, ан- тигена, комплемента, вызывающее 50% гемолиз. Двухкомпонентное: определяют необходимое количество комплемента, вызывающее 50% гемолиз в условиях различных 13—990 193
разведений АС при постоянном количестве АГ или в условиях различных разведений АГ при постоянном количестве АС. Трехкомпонентное: определяют количество комплемента, вызывающее 50% гемолиз для каждого соотношения АГ-АТ. Второй вариант: используют постоянные количества комплемента, оптимальную дозу антигена и различные разве- дения сывороток. Измеряют количество комплемента, связанное различными формами иммунных комплексов. Количество ком- племента соотносится графически с количествами сыворотки, титр определяют как обратную величину количества сыворот- ки, которое необходимо для связывания от 50 до 100 СН50. Для выявления АТ можно пользоваться вариантом 1. При постановке РСК необходимо обратить внимание на следующие факторы: подбор эритроцитов и их концентраций, качество амбоцептора, время и температуру инкубации, объ- емы реагентов, ингибирующее и активирующее комплемент действие антигенов, сывороток, эффект прозоны и др. 2.14.1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕДИНИЦЫ КОМПЛЕМЕНТА Делают несколько рядов разведений комплементсодержащей сыворотки и смешивают их с сенсибилизированными эритро- цитами. Середина сигмовидной кривой гемолиза соответствует наивысшей чувствительности и, следовательно, наиболее при- годна для титрования. Процесс гемолиза можно описать следующим уравнением Y X = К- р _ Yji/п • X — количество внесенного комплемента; Y — лизис в %; К — константа, зави- сящая от концентрации клеток и участвующих в реакции объемов. Согласно вышеприведенной формуле Krogh, отношение кон- центрации адсорбированного вещества у к концентрации ад- сорбирующего вещества х при 1/п пропорционально концент- рации остающегося всщества. Если в серии опытов 1—у У ' v = k, то -p = -^-(l_y)i/n. Преобразование уравнения в логарифмическую форму дает следующее выражение: У 11, log —= log-j- 4- log (1 —у). Л Л 11 Этому выражению соответствует уравнение прямой u = a-f-b-v. На графике v откладывают по оси абсцисс, ап — по оси орди- 194
нат, В в этом случае будет касательной к углу наклона: 1 / у \ log X = log К-Ь ~ log (т=у)- К и 1/п — константы, п определяют исходя из уравнения каса- тельной. 1/п зависит от количества комплемента, эта величина растет с уменьшением количества комплемента, log х можно получить линейной интерполяцией по log . Интенсивность реакции снижается как в случае избытка антигена, так и ан- тител. Mayer и сотр. пришли к выводу, что степень связывания комплемента следует оценивать по остаточной гемолитической активности с последующим вычитанием этой величины из сред- ней величины активности в контроле (буфер, антиген, антите- ла). Было установлено, что чем сильнее сенсибилизация анти- телами, тем быстрее, при постоянном количестве комплемента происходит лизис клеток. При одной и той же степени сенси- билизации снижение количества комплемента вызывает умень- шение скорости гемолиза. Значение СН50 поэтому зависит от используемой системы определения активности комплемента. По Mayer, за 1 СН50 принимают такое количество мл свежей сыворотки морской свинки, которое вызывает лизис 2,5Х108 оптимально сенсибилизированных эритроцитов из общего коли- чества 5x10s клеток, суспендированных в 7,5 мл буфера с ионной силой 0,147 и с оптимальным содержанием Са2+ и Mg2+ в течение 1 ч при 37°C. Графическое изображение ре- зультатов гемолиза на логарифмической бумаге позволяет пре- вратить сигмоидальную кривую в прямую. Калибровочную кри- вую рассчитывают по выражению logH% = m-log (Ext X ЮО) -f- b, где m — угол наклона, вычисляемый графически и аналитически, b — точка пересечения прямой гемолиза с ординатой Е — 0,01 log Н %Е OiO1 t= log Н % — п • и m/log tg + Ig [lg (E • 100)]. Соответствующую калибровочную кривую получают на фото- метре в предварительном эксперименте. Графический пример приведен на рис. 74. 2.14.1.3. ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГЕНОВ Особое значение для точности РСК имеет вид антигена и спо- соб его внесения. Оценка АГ проводится в отношении его спе- цифического антигенного действия и его способности ингиби- ровать комплемент. Одной из важных характеристик компле- мента являются кривые изофиксации при различных концент- рациях комплемента (рис. 75). При этом можно количественно и качественно сравнивать антигены и иммуноглобулины. Изме- няя относительные концентрации антигенов, удается наблюдать расщепления «плеча антител», предпринимались также попыт- 13* 195
Рис. 74. Определение активности комплемента при помощи логарифмической сетки. Комплемент I: 50% гемолиза—38 ЕД, 100% гемолиза=26 ЕД. Комплемент II: 50% гемо- лиза—51 ЕД, 100% гемолиза—27 ЕД. ки дифференцировать антигены по изменению форм кривых при минимально определяемых количествах антител. В систе- ме логарифмических координат можно провести линии макси- мума антигенов и сывороток, включающих так называемую упрощенную макси- мальную линию. Учи- тывая весьма различ- ное качество антиге- нов, на практике быва- ет очень трудно точно определить эти линии. Относительно антисы- вороток следует ска- зать, что, очевидно, не- достаточно установить Рис. 75. Кривые изофикса- ции антигена при различных разведениях комплемента. SV — разведение сыворотки; AgV — разведение комплемента; ML — максимальные линии, AML — максимальные линии ан- тигена. 196
оптимальное соотношение АГ и данной сыворотки, т. е. следует также обращать внимание на тип сыворотки и состав им- муноглобулинов антисыворотки. Для установления оптимальных количеств антигена, связывающего комплемент, применяемых в РСК, необходимо определить следующие параметры: кривые изофиксации с различными разведениями комплемента, область прозоны, тип кривых изофиксации и зоны максимума (напри- мер, максимум антигена), а также дфференцировать ингибирую- щее комплемент и специфическое антигенное действие, опреде- лить оптимальное комплементзависимое разведение антигена, оценить величину ожидаемого рассеяния результатов, расши- рить имеющиеся сведения путем уточнения типа 1g, установить группы кривых изофиксации. 2.14.2. ПОСТАНОВКА ОПЫТА 2.14.2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Реагенты Вероналовый буфер: NaCl 85,0 г Диэтилбарбитуровая кислота 5,75 г Диэтилбарбитурат натрия 3,76 г MgCl2-6H2O 1,68 г СаС12 (безводный) 0,28 г Дистиллированная вода до 2000,0 мл pH Раствор Витте для консервации компле- мента: Сульфат калия 10,0 г Борная кислота 4,0 г Дистиллированная вода 100,0 мл Раствор автоклавируют в течение 1 ч. Раствор Олсвера: Глюкоза 24,6 г Нитрат натрия 9,6 г Хлорид натрия 5,04 г Дистиллированная вода 1200 мл Эритроциты: отбирают в стерильных условиях кровь в раствор в соотношении l-f-2. Разливают смесь по стерильным пробиркам. Перед употреблением выдерживают смесь 2 дня. Сохранность — 6—8 нед. Гемолизин: используют амбоцепторы государственного института иммунопрепаратов в Берлине. Амбоцепторы не долж- ны агглютинировать эритроциты. Разведения свыше 1:1200 не используются. Комплемент: используют свежие лиофилизированные или консервированные сыворотки (валовую сыворотку, взятую от 197
возможно большего числа животных). Кровь для сывороток получают пункцией сердца или вскрытием сонной артерии с целью предотвращения бактериального загрязнения. Посколь- ку не всегда имеются коммерческие препараты комплемента, можно использовать комплемент, консервированный раствором Витте. Активность таких препаратов сохраняется при 5°C в те- чение 6 месяцев. В любом случае препарат комплемента не должен быть загрязнен специфическими антителами, сыворот- ки, содержащие менее 50 ЕД активности в мл, для работы не пригодны. Антигены: для диагностики рекомендуется использовать официально стандартизованные препараты, но и в этом случае желательно точно установить, кривые изофиксации. Оснащение: Фотометр (например, Carl Ziss, Йена); микропланшеты для титрования (U-образная форма лунок), микрошприцы на 25 мкл, устройство для отмывки планшет, автоматизирован- ная микросистема для титрования (для РСК в 0,2 мл), стек- лянные пробирки и штативы, термостат на 37 °C, водяная баня для инактивации комплемента (56°C), холодильник, центри- фугу. 2.14.2.2. ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА Получение суспензии эритроцитов барана Законсервированные эритроциты барана трижды отмывают буфером. Получают 3% суспензию. 0,5 мл этой суспензии сме- шивают с 4,5 мл дистиллированной воды, определяют экстинк- цию при длине волны 540 нм в односантиметровом кювете. Получают 1,5% суспензию: V — наличный объем, Е — измеренная экстинция. Проверка гемолизинов (амбоцептора) 1 часть = 25 мкл (микропроба) или 200 мкл (макро = РСК) Определение титра агглютинации: (исключительно при холодовом связывании): Состав реакционной смеси: 1 часть амбоцептора (начиная с 1 :30, 1 = 2) 1 часть 1,5% суспензии эритроцитов Инкубация 18 часов при 5 °C Визуальный учет Определение необходимого разведения гемолизина: Состав реакционной смеси: 1 часть амбоцептора 198
1 часть 1,5% суспензии эритроцитов 2 части буфера 1 часть комплемента 1 : 30 Инкубация 45 мин при 37 °C Определяют 4—5-кратный титр 100% гемолиза Определение авидности: Состав реакционной смеси: 2 ряда разведений 1 часть комплемента (начиная с 1 :37,5; (=1,25) 2 части буфера 2 части гемолитической системы (1 часть 1% суспензии эритроцитов + 1 часть рабочего разведения гемолизина) Инкубация 15 мин и соответственно 45 мин при 37 °C определяют титр 95% гемолиза (ТГ) г 95% ТГ за 15 мин Степень авидности =—---------------- 95% ТГ за 45 мин Степень авидности должна быть по возможности не выше 0,9 и не ниже 0,7. Гемолизин и эритроциты в день эксперимента смешивают в равных объемах и сохраняют при 5 °C, перед ис- пользованием прогревают в течение 30 мин при 37°C на водя- ной бане. Ряды разведений f = 2: пример: 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40, 1 :80 и т. д. f=l,25: пример: 1:10, и т. д. 1:1,25, 1:15,7; 1:19,6, 1:24,5 2.14.2.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АНТИГЕНА Часто в практике научных исследований приходится пользо- ваться нестандартизованными антигенами. Эти АГ следует как можно тщательнее очистить от сопутствующих примесей, спо- собных привести к ложноположительным результатам. Поэтому настоятельно рекомендуется проводить дифференциацию меж- ду комплементингибирующим и специфическим антигенным действием. Для этой цели предназначен контроль 2. Для по- становки контроля 1 необходимы тщательно охарактеризован- ные реагенты (антигены, сыворотки и т. д.). Учитывая жела- тельную точность результатов, оценки антигенов проводят мак- рометодом. Во всех случаях необходимо не только использо- вать оптимальные дозы АГ, но также контролировать его спе- цифичность. Контроль 1 (предварительный опыт) Состав реакционной смеси: 1 часть АГ (начиная с разведения 1 :8, f = 2) 1 часть АС (начиная с 1 : 10, f = 2) 1 часть комплемента (2 ЕД активности; разведение 1:25 или 1 :20) 199
Рис. 76. Определение комп- лементингибирующего дей- ствия АГ. К — контрольное значение гемо- лиза. Инкубация 18 ч при 5 °C, затем 10 мин при 37 °C. 2 части гемолитической системы Наблюдение за полно- той гемолиза в конт- рольной пробирке Для этого экспери- мента используют тит- рование по схеме так называемой шахматной доски или блок-титро- вание, в котором ана- лизируют ряд разведе- ний АГ относительно ряда разведений анти- сыворотки. Степень , торможения гемолиза оценивается по четырехбалльной системе. В качестве единицы АГ берут такое его максимальное разведение, которое способно связывать 3—4 максимальных разведения сыворотки. Исследуе- мый и контрольный антигены, контрольная антисыворотка не должны давать торможения гемолиза. В основном опыте ис- пользуют 2 единицы антигена. Контроль 2 (предварительный опыт) Определение комплементингибирующего действия (в пробир- ках) Состав реакционной смеси: 0,2 мл комплемента (начиная с разведения 1:37,5; f —1,25) 0,2 мл антигена (начиная с разведения 1:8, f=2) 0,2 мл буфера Инкубация 18 ч при 5 °C 0,4 мл гемолитической системы Инкубация 45 мин при 37 °C Фотометрическое определение 95% ТГ Расчет фактора потребления комплемента для каждого разведения АГ См. пример на рис. 76. Необходимо проверять наличие неспецифического комплемент- ингибирующего действия. В целом оно должно проявляться не 200
Рис. 77. Определения факто- ра потребления комплемен- та. v ~ К-95 % НТ R1 КоЬ“ 95 % НТ R2 ’ KoF: для К (2,5) =3,0; KoF: для К (3,0) =3,6. более чем в 1—2 раз- ведениях (при шаге= = 1,25) по сравнению с контролем. Расчет фактора по- требления комплемен- та (ФПК). ФПК опре- деляют для каждого разведения АГ по фор- муле: ФПК = К-95% ТГ без антигена = 95% ТГ с антигеном ' для разведения сыво- ротки 1:5 — 1:20 к=з,о для разведения сыворотки начиная с 1:40 К=2,5 Для определения ФПК ставят контроль 2, так как значение ФПК необходимо знать для многих диагностически важных АГ в предварительной оценке комплемента. Это можно пояс- нить примером на рис. 77. Определение антигенного действия: Состав реакционной смеси: 1 часть антисыворотки 1 часть антигена (начиная с разведения 1:8, f = 2) 1 часть разведенного комплемента (95% ТГ; количество комплемента, равное ФПК для соответствующего разведения АГ) Инкубация 18 ч, 4 °C 2 части гемолитической системы Инкубация 45 мин, 37 °C Визуальная оценка результатов: 1—4-кратный положительный результат 2.14.2.4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОМПЛЕМЕНТА Опыт 1. Подбор ведут в присутствии 2 ЕД антигена Состав реакционной смеси: 0,13—0,05 мл комплемента (разведение 1:20) 201
0,2 мл антигена 0,27—0,35 мл буфера Инкубация 30 мин, 37 °C 0,5 мл гемолитической системы Инкубация 30 мин, 37 °C Визуальный учет результатов Опыт 2. Состав реакционной смеси: 1,0 мл разведенного комплемента (1:37,5; f = l,25) 2,0 мл буфера 2,0 мл гемолитической системы Инкубация 45 мин 37 °C Фотометрическое определение 50% или соответственно 95% ТГ Оценку результатов см. рис. 74. 2.14.2.5. АНТИСЫВОРОТКИ Сыворотки пациентов не должны обладать гемолитической ак- тивностью, их инактивируют в течение 30 мин на водяной бане (56°C). Последующую инактивацию проводят при той же тем- пературе в течение 10 мин. Особое значение имеет использо- вание точно охарактеризованных контрольных иммунных сы- вороток. Если это человеческие сыворотки, то они должны иметь максимально высокий титр; смесь сывороток реконвалес- центов разливают по 1 мл в ампулы и хранят при —20°C или в лиофилизированном виде. Сыворотки, хранящиеся в шкафу глубокого охлаждения в открытых сосудах, могут повреж- даться углекислым газом. Многократное замораживание и от- таивание также противопоказано. Определяют наличие ком- плементингибирующей активности, стараются использовать сы- воротки наиболее подходящего вида животных. 2.14.2.6. ОСНОВНОЙ ОПЫТ Оценка результатов РСК сильно зависит от того, каким обра- зом измеряют торможение гемолиза. Фотометрическое опреде- ление степени 50% гемолиза, несмотря на точность измерения, практически не всегда удобно. Гораздо чаще используют ви- зуальную оценку для определения 100% или 50% гемолиза. Для более точной градации можно использовать четырехбалль- ную шкалу. За положительный результат принимают 3—4-крат- ное торможение (0—50% гемолиза). Опыт 1. Состав реакционной смеси: 1 часть сыворотки начиная с разведения 1 :10, f=2) 1 часть антигена (2 АЕ) 202
1 часть комплемента (2 ФПК) Инкубация 18 ч при 5 °C и 10 мин при 37 °C Внесение 0,5 мл гемолитической системы Инкубация 15—30 мин при 37 °C Визуальная оценка торможения гемолиза Опыт 2. Состав реакционной смеси: 1 часть сыворотки (разведения начиная с 1:10; f = 2). 1 часть разведенного антигена 0,2 мл разведенного комплемента Инкубация 18 ч при 5 °C, затем 30 мин при 37 °C 0,4 мл гемолитической системы Инкубация 45 мин при 37 °C Визуальная оценка торможения гемолиза 2.14.2.7 . ВАРИАНТЫ КОНТРОЛЯ Проводят позитивный и негативный контроль антигена и сы- воротки. Контроль антигена: 0,2 мл буфера 0,2 мл разведенного антигена 0,2 мл разведенного комплемента Контроль сыворотки: 0,2 мл буфера 0,2 мл разведенной сыворотки 0,2 мл разведенного комплемента 2.14.2.8 . МИКРОМЕТОД Любой вариант РСК можно осуществлять в микромодифика- ции. Необходимым в данном случае является подбор опти- мальных реагентов. Используемые парциальные объемы могут составлять 25 или 50 мкл. Особое внимание следует обращать на чистоту планшетов и тщательное перемешивание компле- ментов. Водяную баню можно заменить термостатом. Оцени- вается не столько число лизированных эритроцитов, сколько количество нелизированного осадка эритроцитов. 100—50% ли- зис осадков рассматривается как отрицательный результат. Положительными результатами считаются следующие: + + +осадок эритроцитов почти неизмененной величины со слегка окрашенной надосадочной фазой; + Н—Н+осадок эритроцитов максимального размера, гемолиз отсутствует. Для предотвращения влияния субъективных оценок резуль- таты должны оцениваться одним и тем же исследователем. Определенные проблемы создает соотнесение предварительного и основного опытов. Трудности возникают, когда титр гемоли- 203
опытах. Многообразия единиц антигена Рис. 78. Определение титра 50% гемолиза. По ординате — степень гемоли- за, по абсциссе: внизу — номера пробирок, вверху — тнтр сыво- ротки. за в обоих опытах раз- личается, например 50 и 100%. Это связано с тем, что 100% гемо- лиз установить слож- нее, чем 50%. Фото- метрия, особенно с при- менением логарифми- ческой бумаги, по- зволяет преодолеть эти сложности. Их легко избежать, если поль- зоваться одинаковой методикой в предвари- тельном и основном и комплемента можно не опасаться, если исходить не из принципа чистоты компонентов, а из принципа оптимальной, т. е. относящейся к области эквива- лентности, дозы. 2.14.3 . ОЦЕНКА МЕТОДА РСК нашла самое широкое распространение в микробиологи- ческой и серологической диагностике, особый интерес она пред- ставляет для клинической иммунологии. Результаты исследо- вания выражаются в титрах. За титр принимают количество комплемента, связываемое в присутствии оптимальной дозы антигена и сыворотки, разведенной 1-}-2. Наибольшее распро- странение получил метод Кольчера, названный также методом разведения сыворотки. Этим методом в присутствии постоян- ной дозы антигена определяют обратный титр сыворотки, т. е. выбирают разведение сыворотки, при котором связывается такое количество комплемента, что происходит 50% или полное ингибирование гемолиза. Стремление стандартизовать условия опыта для определения титра позволяет прийти к следующей формуле: &г Ет = Ед Ет — активность сыворотки (ЕД/мл); Еа — среднегеометрическое значение ак- тивности исследуемой сыворотки; St — настоящее среднегеометрическое зна- чение активности стандартной сыворотки; Sa — активность стандартной сы- воротки; 204
Титр может быть выражен по 100% торможению гемолиза или, при более точном титровании, 50% торможению гемолиза. Пример приведен на рис. 78. Важное значение для оценки результатов имеет их специфичность. Для этого используют очистку реагентов,, определяют зону эквивалентности, устанав- ливают состав иммуноглобулинов антисыворотки, проводят контроль специфичности при помощи перекрестного титрования с известными антигенами и антисыворотками. В случае инфек- ционных заболеваний или иммунизации такие исследования позволяют наблюдать по меньшей мере 4-кратное повышение титра. Отдельно взятые значения результатов РСК, так же как и так называемый базисный титр, следует оценивать весьма критически. 2.14.4 . СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Morenz J. Methodik der KBR.— Ztschr. med. Labortechn., 1970, 11, 249— 271. 2. Muller G„ Tielecke К. H., Budek I., Scabinski G. Eine neue automatisierte Methode fur die KBR. — Ztschr. med. Labortechnik, 1975, 16, 267—271. 3. Palmer D. F. Complement fixation Test. — In: Manual of Clinical Immunology (2-nd ed.). — Amer. Soc. Microbiol., 1980, 35—47. 4. Stelzner A., Holtz A. Vergleichende Untersuchungen zur Durchfurung der Komplementbindungsreaktion. 1. Mitteilung: Studied zur Ermittelung der Antigengebrauchsverdunnung unter Verwendung eines Ornithose—Antigens. — Ztschr. med. Labortechnik, 1975, 16, 197—210. 5. Stelzner A., Stein G. Moglichkeiten zur hamolytischen Aktivitatsmessung von Gesamtkomplement — theoretische Grundlagen und methodische Hinweise. — Wiss. Ztschr. Friedr. — Schiller-Univ. Jena, Math.-Naturwis., 1971, Reihe 20, 933—941. 6. U. S. Dept. Health, Education and Wellfare, Public Health Service Atlanta: A Guide to the performance of standardized diagnostic CF method and adap- tation to micro test. — Revised Ed. 1974. 2.15. АНТИТЕЛОЗАВИСИМАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ Антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗКЦ) может рассматриваться как вариант клеточной цитотоксичности, при которой в присутствии специфических АТ к клеткам-мишеням происходит разрушение последних под воздействием лейкоци- тов-эффекторов. Специфичность реакции определяется антите- лами. Эффекторные клетки действуют неспецифически, оии связываются благодаря Fc-рецепторам с находящимися на по- верхности клеток-мишеней комплексами АГ—АТ (рис. 79). Независимый от комплемента цитотоксический эффект впер- вые наблюдал Moller в 1965 г; более подробные исследования были проведены группой ученых под руководством MacLennan [8]. Этот вопрос рассматривается также в обзорах [3, 7, 14]. В реакции АЗКЦ разрушаются все типы клеток, это относится также к бактериям и паразитам [2]. Для исследовательских 205
Рис. 79. Принцип АЗКЦ. клетка (лейкоцит с Fc-рецепторами) целей наиболее часто используют эритроциты, лейкоциты, фибробласты или опухолевые клетки. Для выявления цитолиза применяют мечение клеток-мишеней 51Сг (в форме хромата натрия). Хромат поглощается клетками и связывается с бел- ками в виде трехвалентного хрома [17], в ходе лизиса радио- активный изотоп быстро высвобождается. В микроварианте цитотоксического теста (см. 3.6) АЗКЦ можно проводить с не- мечеными клетками. Для определения единичных эффекторных клеток был разработан специальный метод [19]. Антитела, участвующие в АЗКЦ, в основном относятся к классу IgG, в некоторых случаях это могут быть IgM- или IgE-антитела [4, 7]. АТ без Fc-фрагмента неэффективны. Ком- плексы АГ—АТ или термоаггрегированный у-глобулин неспе- цифически тормозят реакцию [14]. На развитие цитотоксиче- ской реакции оказывают влияние различные факторы. Классы АТ, возможно, также субклассы, определяют, какой тип эф- фекторных клеток вступит в реакцию. Клетки-мишени, к кото- рым присоединился IgG, лизируются эффекторными клетками с Fc- (IgG)-рецепторами, если клетки-мишени адсорбировали IgM, то во взаимодействие вступают клетки-эффекторы с Fc-(IgM)-рецепторами. Непременной предпосылкой АЗКЦ яв- ляется наличие у лейкоцитов Fc-рецепторов и цитотоксической активности. Нормальные В-лимфоциты, хотя и имеют Fc-рецеп- торы, лишены цитотоксичности. Т-киллеры ввиду отсутствия у них Fc-рецепторов не в состоянии лизировать покрытые анти- телами клетки-мишени. В случае некоторых генетических на- рушений, например, у больных синдромом Чедиака — Хигаси или у бежевых мышей, наблюдается утеря цитотоксической активности лейкоцитов с Fc-рецепторами [15, 16]. Эффектор- ными клетками АЗКЦ могут быть лимфоциты, моноциты, гра- нулоциты, а также эозинофилы [8]. Особенно активны неспо- собные к адгезии, не фагоцитирующие мононуклеарные лейко- циты. Вследствие отсутствия классических маркеров Т- и В-кле- ток эти клетки называются «нуль»-лимфоцитами, или нулевы- ми клетками. Для эффективных в АЗКЦ нулевых клеток было предложено название «К-клетки» [13, 14]. С К-клетками в близком родстве состоят К-клетки (англ, natural killer cells), 206
спонтанно, без помощи АТ, лизирующие некоторые чувстви- тельные клетки-мишени. К- и К-клетки человека, очевидно, про- исходят от одной клеточной популяции. Речь идет о крупных зернистых лимфоидных клетках [18] с особым дифференциро- вочным антигеном [1]. У человека К- и К-клетки обнаружи- ваются прежде всего в костном мозге, крови и селезенке и не обнаруживаются в лимфоузлах, миндалинах, тимусе {5, 10]. Считается, что 5—10% лимфоцитов крови относится к К- или NK-типу ,[1, 13]. АЗКЦ можно проверять на аллогенных, син- генных или аутологических компонентах. Физиологическая роль АЗКЦ, как и других цитотоксических реакций, еще не вполне ясна. Вероятно, она участвует в механизмах отторжения транс- плантатов, противоопухолевого иммунитета, а также аутоим- мунных заболеваний. В практической иммунологии АЗКЦ по- зволяет обнаруживать АТ в больших разведениях, например тогда, когда метод определения комплементзависимой цитоток- сичности недостаточно чувствителен [9]. Выявление антител в сыворотке больных с трансплантированной почкой также осуществляется при помощи АЗКЦ. Положительный результат теста на АЗКЦ также доказывает наличие Fc-рецепторов на применяемых лейкоцитах. АЗКЦ используют для определения поверхностных клеточных антигенов, например, Н-2-антигена мышей. В данном случае специфическая антисыворотка к Н-2- антигену подавляет активность эффекторных клеток [6]. 2.15.2. ПОСТАНОВКА ОПЫТА Ниже будет описан метод, основанный на цитолизе меченных 51Сг асцитно-лейкемических клеток мыши в присутствии спе- цифических АТ и эффекторов: сингенных перитонеальных кле- ток или лейкоцитов крови человека. 2.15.2.1. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ Подходящей средой является RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной сыворотки плода коровы. Для поддержания постоянного pH к сыворотке добавляют 10—20 мМ буфера на основе ГЭПЭС. Добавляемая сыворотка не должна содержать у-глобулинов, которые могут образовывать агрегаты и тормо- зить АЗКЦ. Для постановки эксперимента необходимы чистые, ополоснутые бидистиллированной водой центрифужные пробир- ки на 10 и 20 мл, небольшие пробирки (10X40 мм) с круглым дном и пастеровские пипетки. Необходимы также Ыаг 51СгО4 (Центральный институт ядерных исследований АН ГДГ), лпм- фопреп (Nyegaard, Норвегия) или смесь фиколл — визотраст равной плотности, настольная центрифуга с бакет-ротором, счетчик у-излучения. 207
2.15.2.2. ПОДГОТОВКА КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ Из полости брюшины мышей отбирают асцитическую жидкость, содержащую лейкемические клетки, индуцированные вирусом Graffi (перевивку проводят еженедельно на сингенных мышах штамма XVII/Bln. Осаждают клетки центрифугированием, сус- пендируют в среде и снова центрифугируют. Содержащиеся в осадке эритроциты могут быть удалены холодной водой (1 часть осадка клеток + 2 части дистиллированной воды; 10 сек). После отмывки готовят суспензию, содержащую 1— 5ХЮ7 клеток/мл. В суспензии должно быть не более 5—10% неживых клеток (окрашивание трипановым синим). 2.15.2.3. МЕЧЕНИЕ КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ 51[Сг] Суспензию клеток асцитической жидкости (0,15 мл) в малень- кой пробирке (10X40 мм) смешивают со 100 мкКи 51[Сг] в 0,1 мл 0,15 М NaCl; инкубируют 90 мин при 37 °C, часто встряхивая. Суспензию переносят пастеровской пипеткой в центрифужную пробирку, разводят небольшим количеством среды и центрифугируют 6 мин при 200 g. Надосадочную фрак- цию осторожно удаляют. Осадок клеток трижды промывают средой (порциями по 8 мл). Рекомендуется перед последним центрифугированием дать постоять суспензии клеток 20 мин, чтобы сорбировавшийся на внешней- мембране Na251[Cr]O4 мог диффундировать в среду. Готовят из осадка суспензию 2,5Х105 клеток/мл. Следует указать, что не все клетки асци- тической жидкости могут быть клетками-мишенями. Некоторые типы клеток характеризуются высоким спонтанным уровнем высвобождения 51 [Сг]. Рекомендуется работать с линиями кле- ток, адаптированными к культивированию in vitro. 2.15.2.4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АНТИСЫВОРОТКИ Кролику с интервалом в неделю делают внутривенно 5 инъек- ций по 108 лейкемических асцитных клеток. Через неделю пос- ле последней инъекции получают сыворотку, инактивируют ее 30 мин при 56 °C и при —20 °C. Для удаления видоспецифиче- ских антител сыворотку разводят физиологическим раствором в соотношении 1: 10 и трижды адсорбируют эритроцитами мы- ши (3—4 части разведенной сыворотки %1 часть осадка от- мытых эритроцитов). Затем дважды на холоду адсорбируют сыворотку спленоцитами мыши (1 часть сыворотки +1 часть отмытого осадка спленоцитов; инкубация 1 ч). Специфичность сыворотки можно проверить в реакции комплементзависимой цитотоксичности (см. раздел 2.12) с лейкемическими, а также с нормальными клетками тимуса, селезенки, брюшной полости. 208
2.15.2.5. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭФФЕКТОРНЫХ КЛЕТОК Перитонеальные клетки мыши получают путем смыва с брю- шины холодным 0,15 М NaCl или солевым раствором Хенкса; мононуклеарные лейкоциты человека получают градиентным центрифугированием гепаринизированной крови по Бейюму (Boyum) (см. раздел 3.1). Клетки отмывают 2—3 раза, ресус- пендируют в среде и подсчитывают. Для получения дозозави- симого эффекта готовят несколько суспензий эффекторных клеток разной концентрации. 2.15.2.6. ПОСТАНОВКА ПРОБЫ В маленькие пробирки (10x40 мм), двойное или тройное по- вторение проб, последовательно вносят по 0,05 мл среды, 0,05 мл антисыворотки, 0,2 мл суспензии клеток-мишеней и 0,2 мл суспензии эффекторных клеток (общий объем 0,5 мл). Для контроля ставят следующие пробы: клетки-мишени + + среда, клетки-мишени + антисыворотка, клетки-мишени+ + эффекторные клетки. Пробирки центрифугируют (800 g; 2 мин), при этом клетки-мишени и эффекторные клетки входят в тесное соприкосновение, пробирки закрывают резиновыми пробками и инкубируют 4 ч при 37°C. Затем добавляют по 0,5 мл охлажденного 0,15 М NaCl, осторожно, но энергично встряхивают и центрифугируют (5 мин; 1200 g). Из надосадоч- ной фракции отбирают 0,5 мл для измерения уизлучения. Ра- циональнее проводить исследование в микропланшетах (Flow — Labs). В этом случае объем пробы составляет 0,11 мл (0,05 мл суспензии клеток-мишеней, 0,05 мл суспензи