ЛАБОРАТОРНЫЙ
ПРАКТИКУМ
по технологии
ферментных
препаратов
Допущено Министерством высшего и среднего
специального образования СССР в качестве учеб-
ного пособия для студентов пищевых специаль-
ностей высших учебных заведений
Москва
«Легкая и пищевая промышленность»
1982
ББК 36
Л 12	!
УДК 663.521.002(076.
И. М. Грачева
Ю. П. Грачев
М. С. Мосичев
Е. Г. Борисенко
С. В. Богатков
М. В. Гернет
Л12 Лабораторный практикум по технологии фер-
ментных препаратов. Учебное пособие для ву-
зов/[И. М. Грачева, Ю. П. Грачев, М. С. Мосичев
и др.] — М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982.—
240 с.
В пер.: 45 к.
Изложены биохимические и физико-химические методы анализа
микробных ферментных препаратов, их активностей: лабораторные
работы по следующим темам: поверхностное культивирование микро-
скопических грибов и бактерий; экстракция ферментов из выращен-
ных культур; глубинное культивирование микроорганизмов; концент-
рирование ферментных растворов; выделение и очистка ферментных
препаратов; стабилизация готовых препаратов.
Даны темы для выполнения студенческих научно-исследовательских
работ.
Описаны методы математического планирования и обработки ре-
зультатов экспериментов.
Для студентов вузов, обучающихся по специальности 1015 «Тех-
нология микробиологических производств».
„ 2910000000—082
Л --------------82—82
044(01)—82
ББК 36
6П8
Рецензенты: кафедра микробиологических и витаминных произ-
водств Киевского технологического института пишевой
промышленности (канд. биол. наук СЛЮСАРЕН-
К'О Т. П.), ВНИИбиотехника (д-р техн, наук, проф.
КАЛУНЯНЦ К. А.)
@ Издательство «Легкая и пищевая промышленность». 1982 г,
ПРЕДИСЛОВИЕ
Лабораторный практикум по технологии фермент-
ных препаратов является учебным пособием, предназна-
ченным для подготовки инженеров-технологов по специ-
альности 1015 «Технология микробиологических произ-
водств». Этот практикум введен на кафедре технологии
микробиологических производств Московского техноло-
гического института пищевой промышленности и поэто-
му, естественно, он ориентирован на изучение методов
работы с ферментами микробного происхожде-
ния.
В практикуме предусмотрены лабораторные работы
по культивированию микроорганизмов — продуцентов
ферментов — поверхностным и глубинным способами, ме-
тодам экстрагирования ферментов из микробных куль-
тур, очистке и концентрированию ферментов и изучению
их свойств.
Важным этапом исследования получаемых фермен-
тов является изучение кинетики ферментативных реак-
ций, что дает ценные сведения о строении ферментов,
их активных центров и о механизме их действия. Такие
исследования необходимы для грамотного использова-
ния ферментов в различных отраслях промышленности,
поэтому они и включены в настоящий практикум.
В последнее время высшая школа ставит перед со-
бой задачу всячески развивать самостоятельность сту-
дентов. Учебно-исследовательская работа студентов
(УИРС) и научно-исследовательская работа студентов
(НИРС) являются методами развития этой самостоя-
тельности. Сведения о том, по каким основным направ-
3
Лениям следует организовать исследовательскую работу
студентов в области технологии ферментных препаратов
и как эту работу студенту вести, представлены в епе-
циальной главе, посвященной научно-исследовательской
работе студентов.
В практикуме широко используются статистические
методы анализа экспериментальных данных, их форма-
лизация методом наименьших квадратов. Некоторые ла-
бораторные работы предусматривают использование ма-
тематических методов планирования экспериментов, по-
зволяющих получить математическую модель изучаемо-
го процесса и использовать ее для формулирования оп-
тимальных условий. Необходимые справочные сведения
о методах статистической обработки экспериментальных
данных и о планировании экспериментов даются в при-
ложении. Основным критерием при подборе приведен-
ных здесь методик выделения и очистки ферментов и
определения их активности являлась достаточная их
воспроизводимость в условиях практикума. Учитывалась
также доступность реактивов, источников исходного ма-
териала и оборудования, которые требуются для прове-
дения работы.
Изложенный в практикуме материал рассчитан на
самостоятельную работу студентов, обязанных не толь-
ко выполнить анализ или провести то или иное исследо-
вание, но и самостоятельно приготовить реактивы, смон-
тировать и демонтировать приборы и т. д.
Все описанные в практикуме технологические прие-
мы и методы исследования доступны для студентов и,
как показывает опыт работы, с интересом ими выпол-
няются.
ГЛАВА I
МЕТОДЫ АНАЛИЗА МИКРОБНЫХ
ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ
§ 1. БИОХИМИЧЕСКИЕ \МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Определение общего азота
МЕТОД КЬЕЛЬДАЛЯ
Метод основан на минерализации навесок ^при на-
гревании с концентрированной серной кислотой в при-
сутствии катализатора (металлической ртути и селена,
оксида меди). Для повышения температуры в реакцион-
ную колбу добавляют сульфат калия. Добавление окис-
лителей, например пероксида водорода, также ускоря-
ет реакцию.
Серная кислота при нагревании распадается на три-
оксид серы (SO3) и активный кислород, за счет кото-
рого и происходит интенсивное окисление органических
веществ.
Продуктами окисления являются диоксид углерода
(СО2), диоксид серы (SO2), вода и аммиак. Последний,
находясь в реакционной колбе, связывается с серной
кислотой с образованием аммиачной соли. Полученную
соль разлагают 40%-ным раствором гидроксида натрия,
освободившийся при этом аммиак отгоняют в титрован-
ный раствор серной кислоты.
В схематическом виде весь процесс можно предста
вить следующим образом:
2H2SO4—>2SO3 + 2Н2О + О2;
NH2CH2COOH + 3H2SO4-> 2СО2 + 3SO2 + 4Н2О + NH3;
NH4HSO4 + 2NaOH—>Na2SO4 + 2H2O + NH3.
Необходимые реактивы. 0,1 н. раствор H2SO4; 0,1 н.
раствор NaOH; концентрированная химически чистая
серная кислота (относительная плотность 1,833); сме-
5
тайный индикатор — 50 см3 раствора метилового сине-
го (1 г метилового синего в 800 см3 95 %-кого спирта)
смешивают со 100 см3 раствора метилового красного
(1 г метилового красного в 750 см3 95%-ного спирта),
в кислом растворе индикатор дает красно-фиолетовое
окрашивание, а в щелочном — зеленое, в переходной
стадии, при pH 5,5, индикатор бесцветен; селеновый ка-
тализатор — готовят растиранием и смешиванием 100 г
сульфата калия, 10 г сульфата меди и 2 г селена; 33%-
ный раствор технической щелочи.
Техника определения. Навеску исследуемого вещест-
ва от 0,1 до 2 г (берут с таким расчетом, чтобы в ней
содержалось от 20 до 40 мг азота) взвешивают на ана-
литических весах, переносят в сухую колбу Кьельдаля,
следя за тем, чтобы вещество не осталось на горлышке
колбы (при определении азота не в сухом веществе, а ;
в растворе он вносится в колбу пипеткой таким обра-
зом, чтобы пипетка не касалась горла колбы). Затем
в колбу добавляют 20 см3 концентрированной химиче-
ски чистой серной кислоты и катализатор (0,5—1,0 г).
Содержимое колбы встряхивают в течение 5—7 мин, об-
ращая внимание на то, чтобы на стенках не оставалось
комочков вещества. Затем колбу ставят на нагреватель-
ный прибор в вытяжном шкафу, закрыв ее воронкой или
специальным шаровидным затвором. Колбу устанавли-
вают в наклонном положении во избежание выбрасыва-
ния содержимого во время кипения. Нагревание ведут
сначала на маленьком пламени при частом перемешива-
нии содержимого колбы, при этом происходит обуглива-
ние вещества и смесь пузырится с выделением SO3.
Раствор в колбе нагревают до полного осветления
жидкости. Сжигание считают законченным, когда исчез-
нут все твердые обуглившиеся частицы навески, рас-
твор станет прозрачным и в присутствии сульфата меди
приобретет светло-зеленую окраску.
После сжигания смеси колбе дают остыть, прилива-
ют в нее небольшое количество воды и затем вместе с
промывными водами осторожно переносят содержимое
в перегонную колбу 1, входящую в прибор для отгонки
азота (рис. 1). Объем жидкости в колбе доводят до
300—350 см3 и закрывают ее пробкой.
В делительную воронку наливают 80 см3 33%-него
раствора NaOH (из расчета 4 см3 раствора NaOH на
/
определения
Рис. 1. Прибор для
азота по Кьельдалю:
1 — перегонная колба;
ная воронка; 3 — каплеуловитель; 4 —-
холодильник; 5 — приемная колба
2 — делитель-
каждый 1 см3 H2SO4, взя-
тый на сжигание), в при-
емную колбу наливают
20—25 см3 0,1 н. раствора
серной кислоты и 2—3
капли метилового красно-
го. Необходимо следить,
чтобы трубка холодиль-
ника была опущена в ра^
створ, налитый в прием-
ную колбу для улавлива-
ния выделяющегося ам-
миака.
। Раствор NaOH выди-
рают из делительной вот
Iронки в перегонную кол-
обу и начинают нагрева-
ние. Когда в приемник nej
регонится 2/3 всей жидко-
сти, находящейся в кол-
бе, отгон заканчивают,
поднимают конец трубки
холодильника, дают стечь
последним каплям жид-
кости, обмывают трубку
дистиллированной водой,
выключают нагрев. Избыток H2SO4 в приемнике отти-
тровывают 0,1 н. раствором NaOH. Разница между коли-
чеством кислоты, налитой в приемник, и щелочи, израс-
ходованной на титрование, покажет количество серной
кислоты, связанной аммиаком. По этой разности вычис-
ляют содержание азота, зная, что количество серной
кислоты, содержащейся в 1 см3 0,1 н. раствора, эквива-
лентно 0,0014 г азота.
Содержание азота Су (в %) вычисляют по уравне-
нию
сN = 0,0014 (VKTK - УщТщ) 100 : а = 0,14 (VKTK - УЩТЩ) : а,
где VK — объем 0,1 н. раствора кислоты, налитый в при-
емник, см3; 17щ — объем 0,1 н. раствора щелочи, пошед-
ший на обратное титрование, см3; Tv, Тщ— титры соот-
ветственно кислоты и щелочи; а — навеска исследуемо-
то вещества, г.
7
6
При анализе следует ставить контрольный опыт на
применяемые реактивы и делать поправку при расчете
основного определения. Для этого берут то же количе-
етво реактивов, что и в опыте, за исключением навески
исследуемого материала.
Для пересчета на белковые вещества найденное зна-
чение содержания азота умножают на коэффициент 6,25,
условно принимая азот за белковый. Величина этого
коэффициента определена, исходя из среднего содержа-
ния азота в белках 16% (/<=100:16 = 6,25).
ПОЛУМИКРОМЕТОД
Метод применим для быстрого определения содер-
жания малых количеств азота.
Необходимые реактивы. Используются те же реакти-
вы, что и при определении азота по Кьельдалю.
Техника определения. Точную навеску исследуемого
вещества, содержащую 4—5 мг азота, помещают в кол-
бу Кьельдаля на 50 см3, прибавляют 1 см3 концентриро-
ванной серной кислоты и 0,3—0,5 г смеси сульфата меди
и сульфата калия в соотношении 1 :3. Сжигание прово-
дят так же, как и при определении содержания общего
азота по Кьельдалю.
Рис. 2. Прибор Парнаса — Ваг-
нера:
1 — сосуд для стока пробы (паро-
образователь); 2 — изогнутая труб-
ка; 3 — воронка; 4 •— каплеулови-
тель; 5 — основной сосуд; 6 — хо-
лодильник; 7 — приемная колба
После сжигания и ох-
лаждения смеси в остыв-
шую колбу приливают 4—
5 см3 воды и отгоняют ам-
миак в приборе модифика-
ции Парнаса — Вагнера
(рис. 2).
Перед началом опреде-
ления прибор в собранном
виде пропаривают 15—
20 мин. Жидкость из колбы
Кьельдаля через воронку
переносят в сосуд 5. Колбу
несколько раз ополаскивают
небольшими порциями воды,
которые сливают в этот же
сосуд. К содержимому ос-
новного сосуда через ворон-
ку приливают 7 см3 33% -ко-
го раствора NaOH (из рас-
чета 7 см3 на 1 см3 H2SO4), также смывая воронку не-
большими количествами воды. Общий объем жидкости
в сосуде не должен превышать 50 см3. Необходимо сле-
дить, чтобы трубка холодильника была опущена в при-
емную колбу с- 5—15 см3 (в зависимости от предпола-
гаемого содержания азота) 0,05—0,1 н. раствора серной
или соляной кислоты.
Отгонку аммиака ведут, пропуская пар через сосуд
в реакционную жидкость. Этот сосуд служит для соз-
дания вакуума и регулирования давления пара и тем
самым позволяет промывать и отсасывать отработавшие
и промывные воды.
Отгонка заканчивается за 10—15 мин. После этого
приемную колбу опускают и, чтобы обмыть трубку хо-
лодильника внутри, продолжают перегонку еще 2 мин.
Снаружи трубку также обмывают водой, которую со-
бирают в ту же колбу, Избыток кислоты оттитровыва-
ют из микробюретки раствором щелочи той же кон-
центрации, что и кислоты.
По окончании анализа открывают зажим, сообщаю-
щий сосуд с атмосферой, и закрывают на несколько се-
кунд зажим, соединяющий прибор с парообразователем.
Благодаря более быстрому охлаждению сосуда 1 обра-
зуется вакуум и вся жидкость из сосуда 5 перетекает
в сосуд 1. После промывания прибор готов к новому
определению.
Содержание азота рассчитывается по той же форму-
ле, что и при определении по Кьельдалю.
Установление нормальности H2SO4. Точную нормаль-
ность приготовленного 0,1 н. раствора серной кислоты
удобно устанавливать по перекристаллизованной буре
(Na2B4O7- ЮН2О).
Для определения титра серной кислоты в колбы по-
мещают навески буры (0,18—0,20)±0,0001 г, приливают
50 см3 горячей дистиллированной воды и несколько ка-
пель смешанного индикатора. Смесь титруют 0,1 н. рас-
твором H2SO4 до появления малиновой окраски. Титр
кислоты Т устанавливают по следующей формуле: Т —
= а-1000/(190,61 Ь), где а — навеска буры, г; b — количе-
ство H2SO4, пошедшей на титрование, см3.
Примечание. Титр серной кислоты и щелочи необходимо
устанавливать для каждых вновь приготовленных растворов.
9
8
Определение белка в материалах И пробах
МЕТОД ЛОУРИ
Метод основан на реакции белков с реактивом Фоли-
на, дающей синее окрашивание. Метод применяют для
определения в растворах белка с концентрацией от 10
до 100 мкг.
Необходимые реактивы. Раствор А —2%-ный рас-
твор Na2CO3 в 0,1 н. растворе NaOH; раствор В —
0,3%-ный раствор CuSC>4-5H2O в 1%-ном растворе дву-
замещенного виннокислого натрия или калия; раствор
С — опытный раствор, готовят в день определения (го-
ден в течение одного дня), смешивая 50 мл раствора А
и 1 мл раствора В; реактив Фолина — 100 г вольфра-
мата натрия (Na2WO4-2H2O) и 25 г молибдата натрия
(Na2MoO4-2Н2О) растворяют в 700 см3 воды, добавля-
ют 50 см3 85%-ного раствора ортофосфорной и 100 см3
соляной кислот. Смесь кипятят в течение 10 ч с обрат-
ным холодильником в вытяжном шкафу. После этого
в колбу добавляют 150 г сульфата лития, 50 см3 дистил-
лированной воды и 5 капель бромной воды. Смесь кипя-
тят 15 мин в вытяжном шкафу для удаления избытка
брома, охлаждают и доводят до 1 дм3. Реактив фильт-
руют и хранят в темной склянке с притертой пробкой.
Раствор должен быть ярко-желтого цвета. Раствор мож-
но хранить длительное время; раствор Д — реактив Фо-
лина, разбавленный водой в соотношении 1:1.
Техника определения. К 0,4 см3 раствора белка до-
бавляют 2 см3 раствора С. Смесь перемешивают и че-
рез 10 мин приливают к ней 0,2 см3 рабочего раствора
Фолина. Интенсивность окраски определяют на ФЭК-М
с красным светофильтром (или на спектрофотометре
при длине волны 750 нм) через 30 мин. Количество бел-
ка находят по калибровочной кривой.
Для построения калибровочной кривой 100 мг чисто-
го белка (сывороточного у-глобулина, кристаллического
альбумина и т. п.) растворяют в 100 см3 0,1 н. раствора
NaOH (1 см3 содержит 1 мг белка). В 9 мерных колб
на 100 см3 приливают раствор белка в возрастающих
количествах: 0,5 см3, а затем от 1 до 8 см3. Раствор в
колбах доводят водой до метки, перемешивают и из
каждой колбы берут по 0,4 см3 для определения кон-
центрации белка колориметрическим методом. По по-
лученным данным вычерчивают калибровочную кривую.
Ю
БИУРЕТОВЫЙ микрометод ПО ЯРОШ
Метод используется для определения в растворах
белков с концентрацией от 0,04 до 1,6 мг/см3.
Необходимые реактивы. Биуретовый реактив — в мер-
ную колбу на 1 дм3 наливают 400 см3 0,2 н. раствора
NaOH, добавляют 9 г калия-натрия виннокислого, пе-
ремешивают до полного растворения, добавляют 3 г
сульфата меди (порошка) и 5 г йодистого калия, объем
доводят до метки 0,2 н. раствором NaOH; раствор моче-
вины— к 300 г мочевины (карбамида) прибавляют ку-
сочек тимола величиной с горошину, приливают 700 см3
дистиллированной воды и смесь нагревают, затем при-
бавляют 3 г активного угля, тщательно перемешивают
и фильтруют в мерную колбу на 1 дм3; объем доводят
до метки дистиллированной водой.
Техника определения. В пробирку наливают 2,4 см3
раствора мочевины, 0,1 см3 раствора белка и 2,5 см3
биуретового реактива. Смесь хорошо перемешивают и
пробирки помещают в водяную баню или в термостат
при 40°С на 10 мин. Затем их охлаждают до 20°С. Че-
рез 30 мин после добавления биуретового реактива рас-
твор колориметрируют на ФЭК-М при длине волны
545 нм. Количество белка находят по калибровочной
кривой, составленной по яичному альбумину.
Для построения калибровочной кривой готовят ис-
ходные водные растворы с содержанием 15, 20, 25, 30,
35, 40, 45 и т. д. мг белка в 10 см3. Из полученных рас-
творов отбирают в пробирки по 0,1 см3, добавляют
2,4 см3 раствора мочевины и 2,5 см3 биуретового раство-
ра и ведут определение описанным выше методом.
Определение белкового азота по Барнштейну
Метод основан на денатурировании и осаждении
белков из водных растворов с последующим определе-
нием выделенного азота по Кьельдалю.
Необходимые реактивы. 6%-ный раствор сульфата
меди (CuSO4-5H2O); 1,25%-ный раствор NaOH; 5%-ный
раствор хлорида бария.
Техника определения. 1—2 г мелко размолотого ве-
щества помещают в химический стакан на 100—150 см3,
размешивают в 50 см3 горячей дистиллированной воды
и нагревают до кипения. Затем приливают 25 см3 6%-
11
ного раствора CuSO4-5H2O, смесь размешивают и до-
бавляют 25 см3 1,25%-ного раствора NaOH. Раствору
дают постоять не менее 1 ч для полного осаждения
осадка, а затем сливают декантацией. Осадок, остаю-
щийся на фильтре, многократно (не менее 10—12 раз)
промывают кипящей дистиллированной водой, сливая
каждый раз промывную воду на фильтр. Промывание
продолжают до прекращения появления мути в про-
мывных водах от прибавления 10 капель 5%-ного рас-
твора хлорида бария. Промытый осадок подсушивают
вместе с фильтром на воронке в термостате, завертыва-
ют в сухую фильтровальную бумагу и, сжигая в колбе
Кьельдаля, определяют содержание в нем азота.
Осаждение белка можно проводить и другими соеди-
нениями, в частности трихлоруксусной кислотой. Даль-
нейшее определение ведут, как описано выше.
Разность между содержанием общего азота и бел-
кового составит небелковый азот пробы (азот аммиака,
аминов и аминокислот).
Определение азота аммиака
Метод, разработанный Ивановым, основан на коли-
чественном определении аммиака, отгоняемого из испы-
туемой жидкости, подщелоченной известковым молоком,
в условиях вакуума при низкой температуре.
Необходимые реактивы. Известковое молоко; 0,1 н.
раствор серной кислоты; 0,1 н. раствор NaOH.
Техника определения. Анализ проводится в специ-
альном приборе, состоящем из двух колб Вюрца: пере-
гонной вместимостью 1,0—1,5 дм3 и приемной вместимо-
стью 0,65 дм3. В перегонную колбу Вюрца глубоко встав-
ляется делительная воронка с краном. Отводная трубка
перегонной колбы соединяется с помощью резиновой
пробки с приемником так, чтобы ее конец был погру-
жен в жидкость. Отводная трубка приемной колбы при-
соединяется к водоструйному насосу через предохрани-
тельную склянку и манометр.
Фильтрат после осаждения белка или вытяжку в ко-
личестве 30 см3 наливают в перегонную колбу Вюрца.
Для уменьшения толчков при кипении в колбу бросают
несколько кусочков пемзы. Колбу плотно закрывают
пробкой, в которую вставлена делительная воронка с
12
хорошо пришлифованным краном и длинной трубкой,
кончающейся над уровнем жидкости. Через воронку в
колбу приливают 20'—30 см3 хорошо прокипяченного и
охлажденного известкового молока до щелочной реак-
ции (устанавливается по лакмусовой бумажке). В при-
емную колбу наливают точное количество (20—30 дм3)
0,1 н. раствора H2SO4. Затем включают вакуум-насос и,
обеспечив снижение давления до 15—20 мм рт. ст., при-
ступают к перегонке. Для этого перегонную колбу по-
мещают в водяную баню, температуру которой поддер-
живают на уровне 40°С, а приемную колбу охлаждают
льдом или струей воды.
Для уменьшения вспенивания перегоняемой жидко-
сти и ускорения процесса перегонки аммиака из дели-
тельной воронки в перегонную колбу несколько раз при-
ливают по каплям по 3—4 см3 этилового спирта. Пере-
гонку ведут почти до полного выпаривания жидкости в
течение 30—40 мин.
По окончании отгона закрывают зажим между водо-
струйным насосом и предохранительной склянкой и
осторожно открывают кран делительной воронки. Когда
давление выравняется, прибор разбирают, вынимая сна-
чала пробку из перегонной колбы, а затем из колбы
приемника, и тщательно промывают отводную трубку
перегонной колбы; находившуюся в кислоте промывную
воду собирают в приемную колбу. Избыток H2SO4 от-
титровывают 0,1 н. раствором NaOH в присутствии ин-
дикатора.
Содержание азота аммиака Саз.а (в г на 100 см3) вы-
числяют по следующей формуле: Саз.а = 0,014(а—Ь) 100 :
: 50 = 0,028 (а—&), где а — количество 0,1 н. раствора
H2SO4 в приемной колбе, ом3; b — количество 0,1 н. рас-
твора NaOH, пошедшего на титрование, см3.
Определение амидного азота
Метод основан на способности амидов кислот выде-
лять аммиак при нагревании с разбавленными кислота-
ми. Реакция протекает по уравнению
СН2—CONt-I,	СН2СООН
2 |	+ 2Н2О 4- H2SO4 = 2 |	+ (NH4)2SO4.
CHNH2COOH	CHNHjCOOH
13
Необходимые реактивы. Известковое молоко; 0,1 н.
раствор H2SO4; 0,1 н. раствор NaOH; концентрированная
серная или соляная кислота.'
Техника определения. К 100 см3 раствора (после
осаждения из него белков) прибавляют 5 см3 концен-
трированной соляной или 2,0—2,5 см3 концентрирован-
ной серной кислоты и кипятят в течение 1,0—1,5 ч в кол-
бе с обратным холодильником. После охлаждения жид-
кость нейтрализуют до слабокислой реакции раствором
NaOH и определяют в ней азот аммиака (см. с. 12). В
качестве контроля определяют азот аммиака
варительного гидролиза кислотой. Умножая
найденного аммиака на коэффициент 10,42,
количество амидного азота.
без пред-
количество
вычисляют
Определение азота аминокислот
МЕТОД, ОСНОВАННЫЙ НА ОПРЕДЕЛЕНИИ ЧИСЛА
КАРБОКСИЛЬНЫХ ГРУПП В ВОДНО-СПИРТОВЫХ
РАСТВОРАХ
По этому методу число карбоксильных групп амино-
кислот и полипептидов определяется по результатам тит-
рования проб раствором щелочи. Данным методом мож-
но определить до 99% аминокислот от их общего коли-
чества в водно-спиртовых растворах.
Необходимые реактивы. 96%-ный этиловый спирт;
0,1 н. раствор КОН; раствор тимолфталеина (0,1 г в
125 см3 этилового спирта).
Техника определения. К 5 см3 водного раствора гид-
ролизата белка прибавляют 50 см3 этилового спирта,
4—5 капель тимолфталеина и титруют 0,1 и. раствором
КОН до появления синего окрашивания.
Параллельно ведут титрование контрольной пробы
(вода, спирт, тимолфталеин) до появления такого же
оттенка, как в опытной пробе.
Разность объемов раствора КОН, пошедших на тит-
рование опытной и контрольной проб, умножают на титр
щелочи по азоту и получают количество азота в пробе.
ЙОДОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Метод основан на способности аминокислот и раз-
личных пептидов образовывать комплексные раствори-
мые соединения с медью, которая определяется йодо-
14
метрически после перевода ее в соли уксусной кислоты.
Необходимые реактивы. Раствор хлорида меди —
27,3 г СиС12 в 1 дм3 воды; раствор ортофосфата нат-
рия— 64,3 г Na2HPO4 растворяют в 500 см3 дистиллиро-
ванной воды, добавляют 7,2 г NaOH и доводят объем до
1 дм3; боратный буфер —57,21 г буры растворяют в 1,5 г
воды, добавляют 100 см3 1 н. раствора НС1 и доводят
водой до 2 дм3; суспензия ортофосфата меди — один
объем раствора хлорида меди добавляют к двум объе-
мам раствора ортофосфата натрия и хорошо смешива-
ют, затем приливают два объема буферной смеси (сус-
пензия не должна содержать свободной меди, поэтому
ее следует готовить по мере надобности и хранить не
более 2—3 дней); раствор тимолфталеина — 0,25 г ти-
молфталеина растворяют в 100 см3 50 %-ного этилового
спирта; 0,01 н. раствор тиосульфата натрия — готовится
путем разбавления 0,1 н. раствора Na2S20s, титр уста-
навливается по KJO3; 1%-ный раствор крахмала, насы-
щенный NaCl (см. с. 53); 1 н. раствор NaOH; 80%-ный
раствор или ледяная уксусная кислота; KJ кристалли-
ческий.
Техника определения. В мерную колбу на 25 см3 на-
ливают 1—2 см3 исследуемой жидкости, 1—2 капли рас-
твора тимолфталеина и по каплям 1 н. раствор NaOH
до слабо-голубого окрашивания. Затем в колбу прили-
вают 10—15 см3 суспензии ортофосфата меди и дистил-
лированную воду до метки. Колбу хорошо встряхивают
и затем раствор центрифугируют или фильтруют через
плотную бумагу. 5 или 10 см3 совершенно прозрачного
фильтрата отмеряют в фарфоровую чашку или колбу,
подкисляют 0,25—0,50 см3 80%-ной или ледяной уксус-
ной кислоты, добавляют 0,2—0,4 г KJ и титруют выде-
лившийся йод свежеприготовленным 0,01 н. раствором
тиосульфата натрия, приливая к концу титрования 2—
4 капли раствора крахмала до исчезновения синей
окраски.
Содержание аминного азота Сам.а (в мг на 100 см3)
рассчитывается по формуле Сам.а = 0,28Ь-100 : а=28й :
где 0,28 — коэффициент, учитывающий, что 1 см3
0,01 н. раствора тиосульфата натрия соответствует
0,28 мг аминного азота; b — количество 0,01 н. раствора
тиосульфата натрия, пошедшее на титрование, см3; а —
количество фильтрата, взятого на титрование, см3.
15
Фотометрический мЕТоД
Метод основан на переводе аминокислот в раствори-
мые медные соли по методу Попе и Стивенса и после-
дующем фотометрическом определении меди. Медь опре-
деляют в виде ферроцианида CuFe(CN)6, дающего ро-
зовую окраску при малых концентрациях.
Необходимые реактивы. 0,16 н. раствор хлорида ме-
ди— 27,3 г СиС12 в 1 дм3 воды; раствор ортофосфата
натрия Na3PO4 — 64,5 г Na2HPC>4- 12Н2О растворяют в
500 см3 дистиллированной воды, добавляют 7,2 г NaOH
и доводят объем до 1 дм3; боратный буфер с pH 8,9;
суспензия ортофосфата — готовят перед употреблением,
смешивая один объем раствора меди с двумя объемами
раствора ортофосфата натрия и двумя объемами буфер-
ного раствора; ферроцианидный реактив — готовят пе-
ред употреблением, смешивая в равных объемах 1%-ный
раствор нитрата аммония и 1%-ный раствор K4Fe(CN)6;
стандартный раствор хлорида меди для построения ка-
либровочной кривой — 0,6092 г СиС12-Н2О в 100 см3 во-
ды; 1 см3 этого раствора содержит 6,092 мг медной соли
или 2,27 мг азота.
Техника определения. В коническую колбу на 50 см"
наливают 5 см3 освобожденного от белка раствора, при-
бавляют 5 см3 суспензии ортофосфата меди и взбалты-
вают в течение 10 мин. Одновременно таким же обра-
зом готовят контрольный образец, приливая вместо
фильтрата 5 см3 воды. Содержимое колб фильтруют
через небольшие воронки и берут по 5 см3 фильтрата в
обычные пробирки, калиброванные на 10 см3, подкис-
ляют 0,1 см3 10%-ного раствора НС1, прибавляют по
1 см3 ферроцианида (определению меди мешает присут-
ствие в растворе иона трехвалентного железа, для свя-
зывания этого иона к раствору прибавляют сегнетовую
соль) и после энергичного взбалтывания доводят водой
до метки и перемешивают. Интенсивность окраски ра-
створа измеряют фотоколориметром, используя для
сравнения контрольный раствор.
Концентрацию меди в исследуемом растворе нахо-
дят по калибровочной кривой. Для построения калиб-
ровочной кривой исходный стандартный раствор медной
соли разбавляют водой в 10 раз. Из полученного рабо-
чего раствора готовят серию стандартных образцов.
Для этого прибавляют в каждую пробирку от 0,1 до
16
1 см3 рабочего раствора медной соли с интервалов й
0,1 см3 и в каждую пробирку доливают воды до 1 см3.
В одну пробирку наливают только воду. Оптические
плотности стандартных растворов соответствуют возра-
стающим концентрациям 0,001; 0,002 и так до 0,01 мг
аминного азота.
Оптические плотности и соответствующие им кон-
центрации аминного азота наносят на график и получа-
ют калибровочную кривую; по графику составляют таб-
лицу данных последовательно возрастающих оптических
плотностей и соответствующие им концентрации амин-
ного азота.
______________
рассчитывается по формуле Сам.а
денное по калибровочной кривой, мг/см3;
следуемого раствора, соответствующий навеске
ла, см3; b — навеска материала, г.
Содержание аминного азота Сам.а (в мг на 100 г)
ра^-ш.-0-v.v.. -- Т ~	=100av : b, где а — ко-
личество аминного азота в исследуемом растворе, най-
v — объем ис.
материа-
Определение содержания различных сахаров
в растворах
МЕТОД БЕРТРАНА
Метод основан на способности сахаров, имеющих
свободные альдегидные или кетонные группы (глюкоза,
фруктоза), в определенных условиях восстанавливать
щелочные растворы оксида меди (II). Образующийся
при этом оксид меди (I) может быть учтен массовым
или объемным методом. Метод дает хорошие результа-
ты при содержании глюкозы в испытуемом растворе от
10 до 90 мг.
При кипячении щелочного раствора оксида меди (I)
с раствором сахара образуется осадок оксида меди (II),
который обрабатывается подкисленным серной кисло-
той раствором сульфата оксида железа (III). При этом
оксид меди (II) превращается в окисную форму, а ок-
сид железа (III) восстанавливается: Cu2O-FFe2(SO4)3-F
+ H2SO4 = 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O. Количество восстанов-
ленного железа определяют титрованием раствора пер-
манганатом калия: 10FeS04+2KMn04 + 8H2S04=
= 5Fe2 (SO4) 3 + K2SO4+2MnSO4+ 8Н2О.
Титр перманганата калия устанавливают по щавеле-
вой кислоте (5C2H2O4 + 2KMnO4+3H2SO4=10CO2 +
17
1
+ 2MnSO4+K2SO4+8H2O) или по меди—1 см3 точно
0,1 н. раствора КМпО4 соответствует 6,36 мг Си.
Необходимые реактивы. Раствор Фелинга I — 40 г
сульфата меди растворяют в 1 дм3 дистиллированной
воды; раствор Фелинга II — 150 г гидроксида натрия и
200 г сегнетовой соли растворяют в 1 дм3 дистиллиро-
ванной воды; 0,1 н. раствор перманганата калия — 3,16 г
КМ.ПО4 растворяют в 1 дм3 горячей дистиллированной
воды, после охлаждения до 20°С доводят до метки во-
дой; железоаммиачные квасцы — 100 г железоаммиач-
ных квасцов растворяют в 500 см3 воды, водный раствор
квасцов переносят в мерную колбу на 1 дм3 и осторож-
но вливают 100 см3 концентрированной серной кислоты,
после охлаждения доводят объем до метки.
Техника определения. В коническую колбу на 100—
150 см3 вносят пипеткой 20 см3 испытуемого раствора
сахара (в пробе должно содержаться 50—60 мг сахара;
если его больше, то производят необходимые разведе-
ния). к раствору добавляют 20 см3 раствора Фелинга I
и 20 см3 раствора Фелинга II, перемешивают, кипятят в
течение 3 мин (с момента появления первых пузырьков),
накрыв колбу часовым стеклом. Жидкость после кипя-
чения должна иметь синий цвет; если синяя окраска от-
сутствует, следовательно, в пробе содержалось более
100 мг сахара; определение следует повторить, разбавив
сахарный раствор.
Образовавшемуся осадку оксида меди (II) дают от-
стояться и осторожно по палочке сливают жидкость на
фильтр через одно и то же место края колбочки. При
этом фильтр, вставленный в колбу Бунзена, должен
быть присоединен к вакуум-насосу. Осадок стараются
по возможности не переносить на фильтр. После слива
синей жидкости осадок в колбе промывают струей горя-
чей свежепрокипяченной воды, которую тоже сливают
на фильтр, оставляя над осадком небольшое количество
воды во избежание окисления его на воздухе. Осадок,
стенки колбы и фильтра тщательно промывают водой
до исчезновения щелочной реакции на лакмус. Затем
фильтр снимают с колбы Бунзена и переносят его на
такую же, но чистую колбу. К осадку оксида меди (II)
приливают 5—10 мл железоаммиачных квасцов, пере-
мешивают и сливают на фильтр. Следует добиться полно-
го растворения осадка, при этом поверхностный слой
18
Табл „п методу Бертрана							нт ц а 1 ЮМ веществ
Медь 1 Глюкоза II Медь	Глюкоза	Медь	Глюкоза	Медь	Глюкоза
2	0.93	27	13.5	g.™ 3	;•£	§	1'®	55	2?:«	80	Д® 1	1',2?	3?	14.90	55	28 10	81	«1.94 !	8	!	1	!	Й	I	Й I	Й	I	i	=	В	i	1 15	7,35	40	19,95	66	33,21	91 :? а и	В й Й Й	™	35'94	Й 20	93’10	72	36 47	97	50 94 21	10’30	оМ2	уз	37 00	98	51,50 22	10,80	47	23,63	73	3/,ии	» - i к ; ж 25	12135	1?	25’21	77	39 17	102	53,81 26	12,85	51	25,74	77	39,1/	- 52	26,26	106					
при выключенном ва-
и фильтр промывают
..............j слегка взмутить
куум-насосе. После этого колбу
асбеста можно
Куум-насиис. nwo-v -----------а
холодной свежепрокипяченной водой до исчезновения
в промывных водах кислой реакции на лакмус. Образо-
вавшийся оксид железа (III) титруют 0,1 н. раствором
КМпО4 до перехода зеленого цвета в розовый. Одна
лишняя капля раствора КМпО4 дает устойчивую розо-
вую окраску.
Для расчета количества сахара q сначала определя-
ют содержание в пробе меди: qcn=n(T, где qca — содер-
жание Меди, мг; п — количество 0,1 н. раствора КМпО4,
пошедшее на титрование, см3; Г —титр раствора КМ1ПО4
по меди (1 см3 точно 0,1 н. раствора КМпО4 соответст-
й, вует 6,36 мг Си).
а	19
Затем по табл. 1 определяют
в пробе и вычисляют количество
дения исследуемого раствора.
количество сахара q
сахара с учетом разве-
Пример. В мерную колбу на 100 см3 отобрали 5 см3 гидроли-
зата и довели до метки дистиллированной водой; оттуда взяли
2)0 см3 на определение сахара. На титрование пошло 10,4 см3 О;! н.
раствора КМпО4, титр которого по меди равен 6,24, gcu = 10,4x
X6,24 = 64,8 мг. По табл. 1 находим, что данное количество меди
соответствует 32„57 мг глюкозы. Количество глюкозы в исходном
гидролизате <7 = 3й,57-1’00(/ (5-2Ю) =32,57 мг/см3.
ПОЛУМИКРОМЕТОД
Для определения сахара в пробе в количестве 0,1 —
9,0 мг может быть использован полумикрометод, отли-
чающийся от метода Бертрана тем, что работа ведется
с меньшими объемами растворов сахаров и для титрова-
ния применяется более разбавленный раствор перманга-
ната калия (0,5 г КМпО4 растворяют в 1 дм3 воды, по-
лучают 0,01574 н. раствор; 1 см3 раствора соответствует
1 мг меди).
Определение ведется так же, как и при определении
сахаров по Бертрану, а содержание сахара вычисляют
по данным табл. 2.
Таблица 2
Соотношение между содержанием глюкозы (в мг) и количеством
восстановленной меди (в мг) при определении редуцирующих веществ
полумикрометодом
Медь | Глюкоза	Медь	Глюкоза	Медь	Глюкоза
0,55	0,10 0,80	0,20 1,00	0,30 1,15	0,40 1,35	.0,50 1,60	0,60 1,80	0,70  2,00	0,80 2,20	0,90 2,40	1,00 2,60	1,ю 2,80	1,20	3,00 3,20 3,40 3,60 3,80 4,00 4,15 4,30 4,80 5,30 5,75 6,20	1,30 1,40 1,50 1,60 1,70 1,80 1,90 2,00 2,25 2,50 2,75 3,00	7,10 8,00 9,00 9,95 10,80 11,90 12,80 13,90 14,90 15,90 16,90 17,80	3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00
АНТРОНОВЫЙ МЕТОД
Метод основан на определении содержания раство-
римых углеводов (гексоз и пентоз) в окрашенном рас-
творе, полученном после реакции с антроном, по интен-
сивности окраски раствора. Метод позволяет определять
сахара в концентрации до 0,2 мг.
Необходимые реактивы. 0,2%-ный раствор антрона
в концентрированной серной кислоте, выдерживающей
пробу Савалля,— 0,9175 г химически чистого антрона по-
мещают в мерную колбу на 250 см3, добавляют 100—
150 см3 серной кислоты и перемешивают до полного
растворения антрона. Затем объем жидкости доводят
серной кислотой до метки. Приготовленный раствор вы-
держивают при комнатной температуре в течение 4 ч
в темном месте, после чего реактив готов к употребле-
нию. Раствор антрона следует хранить при температуре
4—6°С в темном месте и можно использовать для ана-
лиза в течение 12—15 сут.; 0,5%-ный раствор H2SO4 —
2,8 см3 серной кислоты плотностью 1,84 растворяют в
1 дм3 дистиллированной воды; 30%-ный раствор суль-
фата цинка; 15%-ный раствор гексацианоферроата ка-
лия K4Fe(CN)6.3H2O.
Техника определения. В пробирку на 10—15 см3 с
притертой пробкой наливают 5 см3 антронового реакти-
ва и осторожно по стенке доливают 2,5 см3 испытуемого
раствора, следя за тем, чтобы жидкости не смешива-
лись, а образовывали два слоя. Параллельно подобным
же образом готовят холостую пробу, добавляя к 5 см3
реактива 2,5 см3 дистиллированной воды. Пробирки за-
крывают притертыми пробками, встряхивают в течение
Ю с, ставят в штатив и погружают в кипящую водяную
баню. Общее время выдерживания в бане должно быть
6 мин. Затем штатив с пробирками охлаждают до 20°С.
Растворы после реакции приобретают синевато-зеле-
ную окраску. Оптические плотности полученных окра-
шенных растворов определяют, используя кюветы с дли-
ной грани 5 мм, применяя светофильтры с длиной вол-
ны 610 и 413 нм.
В результате анализа получают два значения опти-
ческой плотности Di и О2 и по уравнению определяют
содержание растворимых углеводов Ср.у (в г на 100 мл)
в растворе: Ср.у= 18,9(7)1—D2)п : 1000, где 18,9 —посто-
20
21
янный коэффициент, полученный экспериментальным пу-
тем; п — коэффициент разведения.
Оптические плотности растворов можно определять
на фотоэлектроколориметрах ФЭК-Н-57, ФЭК-М,
ФЭК-60, ФЭК-56М, необходимо только, чтобы свето-
фильтры имели указанные длины волн — 610 и 413 нм.
Определение содержания фосфора по Нейману
Метод основан на взаимодействии ортофосфорной
кислоты с молибдатом аммония. Образующийся при
этом фосфомолибдат аммония взаимодействует затем с
гидроксидом натрия и разлагается с образованием ди-
гидрофосфата натрия и солей молибденовой кислоты.
Необходимые реактивы. Концентрированная серная
кислота; 2,5%-ный раствор молибдата аммония — 25 г
чистого молибдата аммония растворяют в 300’ см3 воды
в мерной колбе на 1 дм3, приливают 500 см3 10 н. рас-
твора серной кислоты, доводят объем до метки дистил-
лированной водой и раствор фильтруют; 0,1 н. раствор
NaOH; 0,1 н. раствор H2SO4.
Техника определения. Навеску материала в количест-
ве 2—5 г переносят в колбу Кьельдаля, добавляют
20 см3 H2SO4 и катализатор и сжигают. Затем содержи-
мое колбы охлаждают, переводят дистиллированной во-
дой в мерную колбу на 100 см3, доводят объем до метки
при 20°С, закрывают резиновой пробкой и тщательно
перемешивают.
Для определения содержания фосфора отмеривают
пипеткой 50 см3 исследуемого раствора в химический
стакан на 200 см3, добавляют 30 см3 дистиллированной
воды и нагревают до кипения.
В другой стакан на 100 см3 наливают 25 см3 раство-
ра молибдата аммония, нагревают до 60 °C и сразу при-
ливают его к анализируемому раствору. Полученную
смесь перемешивают и выдерживают 3 ч при температу-
ре 15—20°С. Раствор фильтруют через фильтр Нутча,
осадок тщательно промывают до нейтральной реакции.
К промытому осадку приливают 20 см3 0,1 н. раствора
NaOH до полного растворения осадка. Затем промыва-
ют фильтр до исчезновения щелочной реакции и рас-
твор оттитровывают 0,1 и. раствором H2SO4.
Содержание фосфора Сф (в %) рассчитывают по
22
уравнению Сф = (ViKi—н2Х2)0,000309н3- 100/(ош4), где
Vl — объем 0,1 н. раствора NaOH, взятый на реакцию,
см3; % —объем 0,1 н. раствора H2SO4, пошедший на об-
ратное титрование, см3; Ki и Кг— поправочные коэффи-
циенты; 0,000309 — количество фосфора, отвечающее
1 см3 0,1 н. раствора NaOH, г; ц3—объем, до которого
была разбавлена навеска продукта после сжигания; ц4—
объем разбавленного раствора, взятого на реакцию с
молибдатом аммония, см3; а — навеска вещества, взя-
тая для определения фосфора, г.
§ 2, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Определение содержания влаги в образцах
ускоренный метод с использованием
ПРИБОРА ЧИЖОВОЙ
Этим методом определяют влажность сырья, пита-
тельной среды, биошрота, неочищенного ферментного
препарата. Сущность метода заключается в высушива-
нии инфракрасными лучами навески исследуемого ве-
щества, помещенной между двумя нагретыми металли-
ческими плитами прибора Чижовой (рис. 3). Прибор
имеет два диапазона нагрева: сильный и слабый. Для
разогрева прибора пользуются сильным нагревом, для
поддержания температуры — слабым.
Для определения влажности предварительно из не-
проклеенной бумаги заготавливают два пакета, нуме-
руют их простым каранда-
шом и сушат в течение
3 мин при 165—170 °C. За-
тем их охлаждают в экси-
каторе в течение 5—6 мин
и взвешивают на техниче-
ских весах с точностью до
0,01 г. В заготовленные та-
ким образом пакеты отве-
шивают из средней пробы
образца около 5 г вещества.
Навеску равномерно (встря-
хиванием) распределяют
внутри пакета, затем пакет
Рис. 3. Прибор Чижовой для
определения влажности:
/ — металлические плиты; 2 — вил-
ки для регулирования диапазона
нагрева; 3 — шарнир; 4 — тер-
мометр
23
С влажной навеской взвешивают, закладывают в при-
бор и высушивают при 165—170 °C в течение 6 мин,
После высушивания пакеты с навесками охлаждают в
эксикаторе и взвешивают.
Влажность W (в %) рассчитывают по формуле № =
=[(а—в)/(а—б)]100, где а — масса сухого пакета с на-
веской до сушки, г; б— масса пустого высушенного па-
кета, г; в — масса пакета с навеской после сушки, г.
МЕТОД ВЫСУШИВАНИЯ ДО ПОСТОЯННОЙ МАССЫ
Этот метод является более точным и может быть ис-
пользован для определения влажности любого объекта.
В предварительно высушенный и доведенный до по-
стоянной массы бюкс отвешивают 1—2 г исследуемого
вещества с точностью до 0,0001 г. Бюкс помещают на
2 ч в сушильный шкаф с температурой 60—80°С, затем
температуру повышают до 105°С. В процессе высуши-
вания бюкс периодически взвешивают: первый раз че-
рез 4 ч, затем через каждый час. Перед взвешиванием
бюкс охлаждают до комнатной температуры в эксика-
торе. Образец считается высушенным до постоянной
массы, когда разность между двумя последними взве-
шиваниями не превышает 0,001 г.
Влажность W (в %) рассчитывают по формуле W=
= (а—в/а) 100, где а — масса навески перед сушкой, г;
в — масса навески после сушки, г.
Определение содержания сухих веществ
в растворах
АРЕОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Концентрацию сухих веществ экстрактов, сиропов,
культуральных жидкостей определяют с помощью арео-
метра следующим образом. Исследуемый раствор, тем-
пература которого доведена до 20°С, наливают в стек-
лянный или медный цилиндр, поставленный на строго
горизонтальную поверхность. Сухой чистый ареометр
осторожно погружают в цилиндр так, чтобы он не при-
касался к стенкам и не погружался в раствор полно-
стью. Показания снимают с непогруженной части при-
бора, которая выступает над поверхностью жидкости, с
точностью до 0,1°.
24
При отсчете глаз наблюдателя должен находиться
точно на уровне мениска. Правильный результат полу-
чается только в том случае, если измерение проводят
точно при 20°С. При малейшем отступлении от этой
температуры следует вводить поправку. После работы
прибор следует промыть и вытереть досуха.
рефрактометрический метод
Известно, что показатель преломления раствора за-
висит от его концентрации, причем при малых концент-
рациях наблюдается прямая пропорциональная зависи-
мость между ними. Концентрацию растворов по показа- .
телю преломления можно определить на специальных
приборах — рефрактометрах различных марок (РЛ,
РПЛ, ИРФ и др.).
Если раствор содержит несколько разнородных ве-
ществ, то рефрактометр покажет их суммарный показа-
тель преломления и, следовательно, общую концеитра-
цию сухих веществ.
Наиболее простое устройство имеет сахарный реф-
рактометр (рис. 4). Для работы на нем исследуемый
7
через
направ-
раствор наносят на ниж-
нюю призму и закрывают
верхней. Против каждой
призмы в камере имеется
световая	•
которую
ляется на
средственно
зеркальца.
темноокрашенных
творов открывают
нижней призмы,
щель,
свет
призму непо-
с помощью
При анализе
рас-
щель
свет-
Рис. 4. Рефрактометр
РПЛ-3:
1 — рычажок для вращения
компенсатора; 2 — зеркальце;
3 — камера для призм; 4 —
верхняя подвижная часть ка-
меры; 5 — термометр; 6 —
штифт; 7 — шкала; 8— оку-
ляр; 9 — рукоятка для пере-
движения окуляра: 10 — кор-
пус
8
д
2.
1
25
лых — верхней. Поворотом рычажка окуляра устраняют
радужность и устанавливают резкость поля. Вращением
головки окуляр устанавливают на фокус, затем пере-
двигают рукоятку окуляра до совпадения визирной ли-
нии с границей света и тени и фиксируют наблюдаемые
показания.
Шкала рефрактометра имеет два ряда делений: сле-
ва нанесены значения показателя преломления, спра-
ва — процентное содержание сухих веществ.
Исследуемый раствор смывают с призм дистиллиро-
ванной водой или спиртом, призмы вытирают ватой или
мягкой тряпочкой.
Измерение обычно проводят при температуре 20°С,
которая достигается пропусканием воды через полые ме-
таллические оправы призм. Наблюдения за температу-
рой ведут по термометру.
Перед началом работы проверяют нулевую точку
прибора по дистиллированной воде. С этой целью 2—
3 капли воды наносят между двумя призмами, рукоят-
ку окуляра перемещают по шкале до тех пор, пока ви-
зирная линия не совпадет с линией раздела светлой и
темной частей поля. При правильной установке прибора
показатель преломления должен быть равен 1,333, а
концентрация сухих веществ — нулю. Если этого нет, то
нужно подтянуть винт в требуемое положение при по-
мощи штифта.
ИНТЕРФЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Метод основан на явлении дифракции параллельных
лучей и реализуется на специальном приборе — интер- -
ферометре (рис. 5).
Прибор ИТР-2 смонтирован в цилиндрическом кор-
пусе, корпус камеры вставлен в кожух и закреплен вин-
том. С одной стороны имеется зрительная труба с ци-
линдрическим окуляром. Рядом с окуляром находятся
щель, зеркала и лампа с конденсором. Эти детали со-
ставляют коллиматор прибора, и весь узел называется
автоколлимационным окуляром. К нему хомутиком при-
креплен микрометрический винт компенсатора. Подвиж-
ная пластина компенсатора имеет оправу с рычагом.
Рычаг опирается на микрометрический винт, и при его
перемещении рычаг поворачивается и поворачивает пла-
стину, Микрометрический винт имеет две шкалы, из ко-
26
торых одна (неподвиж-
ная) содержит 30 деле-
ний, а вторая (вращаю-
щаяся) — ЮО делений.
Вся шкала компенсации
имеет 3000 делений.
У другого конца кор-
пуса находятся диафраг-
ма со щелями и зеркало.
Эти детали наглухо за-
креплены внутри корпуса.
В верхней части кор-
пуса имеется окно, через
которое вставляют кюве-
ты. Так как показатель
преломления зависит от
температуры, кюветы по-
мещают в термокамеру —
сосуд с двумя прозрач-
ными окнами для прохож-
дения лучей. Термокаме-
ру заполняют жидкостью
(желательно растворите-
лем). Для выравнивания
температур жидкость пе-
ремешивают мешалкой.
Рис. 5. Интерферометр ИТР-2:
/ — микрометрический винт; 2 —
окуляр; 3 — патронодержатель
для лампочки; 4 — термометр;
5 — мешалка; 6 — термокамера;
7 — корпус; 8 — кран для сли-
ва жидкости; 9 — трансформатор;
J0 _ кожух с ручкой
выпуска термостатирую-
щей жидкости снизу имеется кран.
Снизу к корпусу прикреплен понижающий трансфор-
матор для питания лампочки накаливания напряжени-
ем 8 В.
С помощью такого интерферометра нельзя измерять
абсолютные значения показателей преломления, а мож-
но только сравнивать их для двух разных прозрачных
сред (например, показатели преломления раствора и
чистого растворителя). В левую кювету наливают жид-
кость с более высоким показателем преломления, в пра-
вую—с более низким. При прохождении света .через
кюветы между лучами, идущими от разных щелей, об-
разуется оптическая разность хода, которая приводит
к сдвигу интерференционной картины в сторону от сред-
ней между щелями точки. В верхней части картина не
изменяется, так как кюветы вводятся лишь в верхнюю
часть лучей. Нижняя же система дифракционных полос
27
Меняется (она является индикатором) и относительно
нее наблюдают смещение верхней системы полос.
Измеряя величину смещения интерференционных по-
лос, определяют разность показателей преломления рас-
творов. Так как прямое измерение смещения интерфе-
ренционной картины практически неудобно, пользуют-
ся приемом компенсации. Изменяя угол наклона пла-
стинки компенсатора, можно получить почти любую
разность хода лучей и таким образом скомпенсировать
сдвиг и вернуть интерференционную картину в первона-
чальное положение.
Для определения содержания сухих веществ в рас-
творе предварительно включают освещение и наблюда-
ют в окуляр дифракционную картину (без растворов).
Если полосы в нижней части поля зрения плохо видны,
то, вращая окуляр, добиваются хорошей видимости.
Если в верхней части поля зрения полосы отсутствуют
или сдвинуты относительно нижних, вращением микро-
метрического винта полосы совмещают. Это совмещение
должно получиться при показании микрометра, близ-
ком к нулевому.
Затем наливают в термокамеру термостатирующую
жидкость (растворитель), при этом полосы наклоняют-
ся. Перемешивая воду, добиваются снова хорошей види-
мости и совмещения полос.
После этого в две кюветы наливают растворитель
или контрольный раствор. Вращением винта компенса-
тора полосы совмещают. Показание микрометра пред-
ставляет собой нулевой отсчет.
Заменяя растворитель или контрольный раствор в
левой кювете опытным раствором, снова совмещают по-
лосы и отмечают показания микрометра.
Чувствительность прибора и точность измерения на-
ходятся в прямой зависимости от длины кюветы: чем
длиннее кювета, тем выше точность измерения. С другой
стороны, увеличение длины кюветы уменьшает интервал
значений разности показателей преломления Дщ кото-
рые можно измерять в этом случае. Предельные значе-
ния для кювет с различной толщиной слоя указываются
в инструкции по эксплуатации прибора.
При совмещении системы полос надо иметь в виду
следующее:
неокрашенная светлая полоса в верхней части поля
28
зрения должна приходиться над неокрашенной полосой
в нижней части;
совмещение надо производить не менее 5 раз и брать
среднее .из полученных отсчетов;
во все показания следует вносить поправки на нуле-
вой отсчет (каждый раз надо вычитать это нулевое по-
казание).
Для определения концентрации исследуемого раство-
ра строят калибровочную кривую. Для этого готовят
растворы известной концентрации для данной пары ве-
щество— растворитель и производят измерения на ин-
терферометре. На основании полученных данных строят
график, откладывая по оси абсцисс концентрацию рас-
творов, а по оси ординат — показания микрометра.
На калибровочную кривую наносят название систе-
мы растворитель — растворенное вещество, номер кюве-
ты, значение температуры, при которой производят ка-
либровку, и отделения кюветы, в которые наливают рас-
творитель и раствор.
ПОЛЯРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Этот метод позволяет определять концентрацию оп-
тически активных веществ в растворах. К оптически
активным органическим веществам относятся глюкоза,
сахароза, фруктоза, крахмал, аминокислоты и др. Эти
вещества обладают свойством отклонять плоскость по-
ляризации проходящего чере
ного луча.
Угол поворота плоскости
поляризации измеряют с по-
мощью оптических прибо-
ров — поляриметров (рис.
6). Наибольшее распростра-
нение получили поляримет-
ры-сахариметры СУ-2 и
СУ-1 с нормальной сахар-
ной шкалой. Схема устрой-
ства оптической системы по-
ляриметра представлена на
Рис. 7.
их растворы поляризован-
Рис. 6. Поляриметр СУ-2:
1 — винт; 2 — окуляр; 3 — лупа;
4 — поляриметрическая трубка:
5 — камера; 6 — поляризатор;
7 — осветительный узел; 8 —
трансформатор
Поляриметр состоит из
Двух поляризационных
призм Николя, установлен-
29
Рис. 7. Оптическая схема поляриметра:
1 — светофильтр; 2 — двояковыпуклая линза; 3 — поляризатор; 4, 8
диафрагмы; 5, 7 — защитные стекла; 6 — трубка с испытуемым ра
Л — кварцевый компенсатор; 10 — анализатор; 11 — зритель
(2 объектива и окуляр)
створом; 9
иая трубка
ных таким образом, что плоскости их главных сечений
взаимно перпендикулярны. Между призмами разме-
щается трубка с раствором оптически активного веще
ства. Ближайшая к источнику света призма (поляри-
затор) служит для поляризации световых лучей, вторая
(анализатор)—для компенсации угла вращения плос-
кости поляризации.
При отсутствии раствора в трубке поляризационный
свет через анализатор не пройдет и мы будем наблю-
дать полную темноту; при наличии раствора в анализа-
торе можно видеть свет, ослабленный по сравнению
с исходным. Яркость его тем больше, чем более кон-
центрированный раствор.
Практически трудно отличить полную темноту от
очень слабого света. В настоящее время используют по-
лутеневые поляриметры, в которых устанавливают до-
полнительную призму, благодаря чему получаются два
одинаковых полукруга. Для измерения концентрации ве-
щества в растворе освещенность обеих половин вырав-
нивают.
В полутеневом приборе обе призмы установлены не-
подвижно, а освещенность полей регулируется кварце-
вым компенсатором. Кварц является веществом, близ-
ким по оптическим свойствам к сахарозе. Таким обра-
зом, вместо измерения угла поворота анализатора изме-
ряют толщину компенсирующей вращение кварцевой
пластины. Величина угла вращения плоскости поляри-
зации а при определенных условиях зависит от концент-
рации раствора. Для характеристики каждого оптически
активного вещества вводится понятие удельного враще-
ния [“Гр- т. е. угла вращения, которым обладает
раствор, содержащий в 100 см3 100 г вещества при дли-
не трубки 100 мм.
30
Угол вращения определяют обычно при 20°С в моно-
хроматическом свете.
Концентрацию раствора оптически активного вещест-
ва С (в г на 100 см3) находят по формуле С=100а//[а],
где I — длина трубки, мм.
Пользуясь сахариметром, можно определить процент-
ное содержание сахарозы в сахаросодержащих продук-
тах. При анализе крахмалистых материалов вводят рас-
четный коэффициент, исходя из величины удельного вра-
щения крахмала и взятой на анализ навески.
Поляриметр-сахариметр имеет две шкалы: основную
и нониусную (рис. 8). Целые градусы определяют по
положению черты «0» нониуса по основной шкале, де-
сятые доли — по шкале-нониусу; угол вращения раство-
ра находят по этим двум шкалам.
Перед началом работы
проверяют нулевую точку	Нониус
прибора, т, е. освещенность ю Q
поля при нулевом положе-	,,,,, i
НИИ ОСНОВНОЙ И нониусной I 1 1 1 11 1 1 1 I |пл'| |'| 1|||||Г| 1П-
шкалы — она должна быть К
одинаковой.
Затем заполняют поля-
риметрическую трубку так,
чтобы в ней не оставалось
пузырьков воздуха. Покров-
ные стекла должны быть
чистыми. Температура раствора 20 °C. Помещают трубку
в камеру прибора. Поле поляриметра наблюдают через
окуляр, компенсатор перемещают винтом до получения
одинаковой освещенности поля зрения, показания отсчи-
тывают по шкале через лупу.
Поляризационная трубка на 200 мм считается нор-
мальной. При использовании трубок длиной 100 или
400 мм показания поляриметра увеличивают или умень-
шают соответственно в 2 раза.
10
Шкала
Шкалы поляриметра
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Спектрофотометр предназначен для измерения свето-
пропускания (или оптической плотности) образца отно-
сительно эталона, светопропускание которого принима-
ется за 100%, а оптическая плотность — равной нулю.
31
Прибор позволяет ^.производить измерения в широкой
области спектра — от 220 до 1100 нм.
Эталон и образец поочередно устанавливают на пути
света определенной длины волны, выходящего из моно-
хроматора. Отношение величины светового потока, про-
шедшего через образец, к величине светового потока,
прошедшего через эталон или падающего на образец,
определяется по шкале пропускания отсчетного потен-
циометра.
Оптическая схема монохроматора прибора СФ-4А
изображена на рис. 9. Свет от источника 9 или 9' попа-
дает на зеркальный конденсор. Который собирает его
и направляет на плоское зеркало. Зеркало отклоняет
пучок лучей на угол 90° и направляет на линзу и вход-
ную щель. От зеркального объектива параллельный пу-
чок лучей попадает на диспергирующую призму, кото-
рая разлагает его в спектр. Диспергированный пучок
направляется обратно на объектив и фокусируется им
на выходной щели. Вращая призму, можно получить
на выходе монохроматора свет различных длин волн,
который, пройдя выходную щель, кварцевую линзу,
фильтр, поглощающий рассеянный свет, эталон (обра-
зец) и защитную пластинку, попадает на светочувстви-
тельный слой фотоэлемента. Для измерений в области
спектра 220—650 нм используют сурьмяноцезиевый фо-
тоэлемент, для измерений в области спектра 600—
1100 км — кислородно-цезиевый.
Источниками сплошного излучения служат водород-
ная (дейтериевая) лампа при работе в области спектра
220—350 нм и лампа накаливания при работе в обла-
сти спектра 320—1100 нм.
Кварцевая призма, зеркальный объектив и щели —
основные элементы монохроматора—смонтированы
внутри литого чугунного корпуса, закрытого кожухом
(рис. 10). Призма укреплена в оправе, ось которой
соединена со шкалой длин волн. Шкала нанесена по
спирали Архимеда. Поворот призмы осуществляется вра-
щением рукоятки 23.
Входная и выходная щели расположены одна над
другой. Рабочая высота каждой щели 13 мм. Регулиро-
вание величины щелей (от 0 до 2 мм) осуществляется
рукояткой 7 и с.~..--- -------------с
Для установки образцов
mcnvu
отсчитывается по шкале 6.
предусмотрена
кюветная
Рис. 9. Оптическая схема, спектрофотометра СФ-4А:
1 — зеркальный объектив; 2 — диспергирующая призма; 3 — квар-
цевая линза; 4 — фильтр; 5 — эталон; 6 — защитная пластинка;
7 — фотоэлемент; 8 — зеркальный конденсор; 9,	9' — источник
света; 10 — плоское зеркало; 11 — линза; 12 ~ входная щель
32
камера. В комплекте при-
бора имеются кюветы и
держатель с четырьмя
окнами для твердых об-
разцов. Держатель уста-
навливается в каретку,
которая перемещается с
помощью рукоятки /6.
Каретка имеет четыре
фиксируемых положения.
Между корпусом при-
бора и кюветной камерой'
помещен блок, в котором
имеется плоское зеркало,
направляющее пучок лу-
чей на входную щель мо-
нохроматора.
С помощью регулиро-
вочного винта 8 можно
изменять направление
светового пучка.
Рис. 10. Спектрофотометр СФ-4:
шкала длин волн;
20,
1 — корпус; 2	______ .,
3, 7,	13, 14,	16,	17,	18,	19,
21, 23 — рукоятки настройки; 4
шкала отсчета; 5 — амперметр; 6
шкала щели; 8 — регулировочный винт:
9 — блок; 10 — переключатель; 11 —
патрон; /2—-камера для фото-
элемента и усилителя; 15 —- кюветная
камера; 22 — панель; 23 — освети-
тель; 24 — стабилизатор
2 Зак. "91
33
Для поглощения рассеянного излучения на пути лу-
ча устанавливают движок с фильтрами, который пере-
мещается вращением рукоятки 17.
Фотоэлементы и усилитель размещены в герметич-
ной камере. Включение фотоэлементов производится с
помощью рукоятки 13. Для плавной регулировки темно-
вого тока включают потенциометр с помощью рукоятки
14. Излучение попадает на фотоэлемент через окно в
камере, закрываемое шторкой, связанной с переключа-
телем 10.
На передней стенке прибора укреплена панель, на
которой расположены рукоятка 18 переключателя гру-
бой компенсации темнового тока, рукоятка 19 переклю-
чения пределов измерения, рукоятка 20 переключателя
изменения чувствительности ступенями, рукоятка 21 по-
тенциометра плавного изменения чувствительности.
Используемые в приборе источники света (лампа на-
каливания и водородная лампа) установлены в держа-
телях в осветителе 9 (см. рис. 9). Осветитель (лампы и
конденсор) закрыт кожухом. Устанавливая конденсор в
положение I или II, можно посылать в монохроматор
свет от разных источников.
Отдельным блоком прибора является стабилизатор,
накрытый кожухом. На передней панели стабилизатора
расположены кнопка выключения высокого напряже-
ния, рукоятка реостата регулировки тока накаливания
водородной лампы, рукоятка для подачи сетевого на-
пряжения на трансформатор и включения лампы нака-
ливания, тумблер, включающий в цепь стабилизатора
водородную лампу или лампу накаливания. Отверстие
в передней стенке шасси открывает доступ к шлицу оси
потенциометра установки тока стабилизатора.
Для работы на приборе следует установить необхо-
димый источник излучения в осветителе (водородную
лампу или лампу накаливания), рукоятка 10 при этом
должна находиться в положении «закрыт»; включить
прибор по инструкции, прилагаемой к каждому прибо-
ру; поставить рукоятку 18 в одно из положений «1»,
«2», «3», «4», потенциометр чувствительности — в сред-
нее положение; вращая рукоятку 23, установить требуе-
мую длину волны; установить при помощи рукоятки 17
светофильтр для данной области спектра; перемещая
каретку рукояткой 18, установить на пути светового пуч-
34
ка эталон; поставить рукоятку переключателя 19 в по-
ложение «выкл.»; скомпенсировать темновой ток фото-
элемента рукоятками грубой 18 и плавной 14 регули-
ровки темнового тока; открыть фотоэлемент, поставив
рукоятку 10 шторки переключателя в положение
«откр.»; вращая рукоятку 7 механизма изменения ши-
рины щели, установить стрелку миллиамперметра на ус-
ловный нуль (стрелка миллиамперметра подводится к
условному нулю плавно рукояткой 21 потенциометра
чувствительности. При необходимости изменить рабочую
ширину щели переключают рукояткой 20 пределы чув-
ствительности и снова компенсируют темновой ток); пе-
ремещая каретку рукояткой 16, установить на пути све-
тового пучка образец и спять показания прибора.
§ 3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ
АКТИВНОСТЕЙ В РАСТВОРАХ
Приготовление ферментных растворов
При определении ферментативных активностей вна-
чале готовят исходные ферментные растворы, а затем в
зависимости от метода определения ферментативной ак-
тивности соответствующим разведением приготавлива-
ют рабочие растворы.
Исходный раствор из поверхностной культуры гото-
вят следующим образом: берут 10 г сырой культуры
(влажностью 40—50%) или 5 г воздушно-сухой куль-
туры (влажностью не более 12—14%) и помещают в
фарфоровую ступку. Отдельно в мерном цилиндре гото-
вят 10%-ный буферный раствор (10 см3 соответствую-
щего буфера и 90 см3 дистиллированной воды).
Взятую навеску культуры тщательно растирают пе-
стиком с кварцевым песком или толченым стеклом с
Ю—20 см3 забуференной воды (10 см3 буферного рас-
твора и 90 см3 дистиллированной воды) в течение 10—
15 мин, затем, если позволяют размеры ступки, выли-
вают оставшуюся забуференную воду, перемешивают
и помещают эту смесь на 30 мин в термостат при 30°С.
Если вместимость ступки небольшая, после растирания
содержимое ее переносят количественно в стакан с по-
мощью оставшейся забуференной воды (общий объем
ее должен быть 100 см3) и также выдерживают 30 мин
2*	35
при 30°С. Выдержка в термостате необходима для наи-
более полного извлечения ферментов из культуры про-
дуцента. После настаивания смесь отфильтровывают че-
рез складчатый бумажный фильтр и фильтрат исполь-
зуют как исходный раствор при определении фермента-
тивных активностей.
Ферментативные активности в культуральной жидко-
сти, диффузионной вытяжке или жидком концентрате
определяют непосредственно в данных растворах или
производя необходимые разведения с учетом особен-
ностей методов определения активностей.
При определении ферментативных активностей очи-
щенных препаратов, полученных осаждением органиче-
скими растворителями, высаливанием или высушива-
нием на распылительной сушилке, в качестве исходного
раствора используют 0,1%-ные растворы препаратов.
Наилучшее растворение препаратов достигается при
растирании их в фарфоровой ступке с небольшим коли-
чеством толченого стекла и 10—15 см3 забуференной во-
ды. После растирания смесь переносят количественно
в мерную колбу на 100 см3 и доводят до метки забуфе-
ренной водой. При наличии нерастворенного осадка его
отфильтровывают через складчатый фильтр; прозрачный
фильтрат служит исходным раствором для определения
ферментативной активности.
Раствор ферментных препаратов может храниться в
течение одних суток при температуре от +2 до —4°С.
Определение протеолитической
активности (ПС)
МЕТОД АНСОНА В МОДИФИКАЦИИ
Метод основан на гидролизе белка казеината натрия
препаратом фермента, находящимся в исследуемом рас-
творе, с последующей инактивацией фермента и осаж-
дением негидролизованного белка трихлоруксусной кис-
лотой (ТХУ).
Протеолитическая активность характеризует способ-
ность ферментов катализировать расщепление белка до
пептидов и аминокислот и выражается числом единиц
протеазы в 1 г препарата.
За единицу протеолитической активности (ПС) при-
нимают такое количество фермента, которое за 1 мин
36
при 30°С превращает в неосаждаемое трихлоруксусной
кислотой состояние казеинат натрия в количестве, соот-
ветствующем 1 мкмоль тирозина (1 мкмоль тирозина
равен 0,181 мг).
Активность грибных и бактериальных протеиназ
определяют при следующих значениях pH: 2,5±0,2—
кислая протеиназа; 3,5±0,2 — кислая протеиназа; 7,2±
±0,2 — нейтральная протеиназа; 9,5±0,2 — щелочная
протеиназа.
Необходимые реактивы. 0,1 М универсальный буфер-
ный раствор — готовится смешиванием равных объемов
растворов А (0,1 М раствор уксусной кислоты — 5,7 см3
ледяной уксусной кислоты растворяют в 1 дм3 дистил-
лированной воды), В (0,1 М раствор ортофосфорной кис-
лоты— 6,45 см3 ортофосфорной кислоты растворяют в
1 дм3 дистиллированной воды) и С (0,1 М раствор орто-
борной кислоты — 6,18 см3 ортоборной кислоты раство-
ряют в 1 дм3 дистиллированной воды) и различных ко-
личеств 1 н. раствора гидроксида натрия (40 г NaOH
растворяют в 1 дм3 воды) —получают буферные раство-
ры с pH от 1,8 до 12,0; 0,5 М универсальный буферный
раствор — готовится смешиванием пятикратных коли-
честв растворов А, В и С; 0,01 М универсальный буфер-
ный раствор—-готовится смешиванием девяти объемов
дистиллированной воды с одним объемом 0,1 М универ-
сального буферного раствора; 0,3М раствор трихлорук-
сусной кислоты (ТХУ) — 50 г трихлоруксусной кислоты
разводят дистиллированной водой в мерной колбе на
1 дм3 и фильтруют; 1 н. раствор соляной кислоты —
82,2 см3 соляной кислоты разбавляют в 1 дм3 дистилли-
рованной воды; 0,5 М раствор карбоната натрия — 53 г
безводного карбоната натрия разводят дистиллирован-
ной водой в мерной колбе на 1 дм3; реактив Фолина
(основной раствор) — 100 г вольфрамата натрия и 25 г
молибдата натрия вносят в круглодонную колбу вме-
стимостью 2 дм3 с пришлифованным обратным холо-
дильником, добавляют 700 см3 дистиллированной воды,
50 см3 85%-ного раствора ортофосфорной кислоты плот-
ностью 1,869 г/см3 и 100 см3 концентрированной соля-
ной кислоты; смесь кипятят на слабом огне на асбесто-
вой сетке в течение 10 ч, охлаждают, переносят в колбу
Эрленмейера, стенки колбы и холодильник ополаскива-
емо см3 воды, затем туда же добавляют 150 г суль-
37
фата лития и 5 капель брома. Открытую колбу нагре-
вают и кипятят содержимое под тягой на слабом огне
15—20 мин, чтобы удалить пары брома (раствор дол-
жен иметь желтую окраску. Если раствор зеленый, то
обработку бромом повторяют). После охлаждения рас-
твор доводят дистиллированной водой до 1 дм3 и фильт-
руют через трубку Аллина, заполненную стеклянной ва-
той. Концентрацию кислоты проверяют титрованием
разбавленного в десять раз реактива Фолина 0,1 и. рас-
твором NaOH по фенолфталеину. Приготовленный рас-
твор хранят в склянке из темного стекла. Рабочий рас-
твор Фолина готовят разведением основного раствора
дистиллированной водой в два раза; 0,2 н. раствор со-
ляной кислоты—16,45 см3 соляной кислоты разбавля-
ют дистиллированной водой до 1 дм3.
Приготовление растворов ферментных препаратов.
0,1—1,0 г исследуемого препарата отвешивают на ана-
литических весах, тщательно растирают в стаканчике
стеклянной палочкой с небольшим количеством ОДЛА
универсального буферного раствора с pH соответственно
для кислых протеиназ 2,5± 0,2 и 5,5±0,2; для нейтраль-
ных— 7,2±0,2, для щелочных — 9,5±0,2. Затем коли-
чественно переносят в мерную колбу вместимостью
100 ом3 и доводят этим же универсальным буферным
раствором объем жидкости до метки.
Приготовление 2%-ного раствора казеината натрия
(субстрат). 2 г воздушно-сухого казеината натрия рас-
творяют в 90 см3 0,1 М буферного раствора с pH соот-
ветственно для кислых протеиназ 3,5 (pH раствора за-
тем доводят до 2,5 добавлением 1 н. раствора соляной
кислоты) и 5,5 (для доведения pH до 5,5 также исполь-
зуется 1 н. раствор соляной кислоты), для нейтраль-
ных— 7,2 (доводят с помощью 1 н. раствора NaOH), для
щелочных — 9,5 (также используется 1 н. раствор
NaOH). Затем раствор переносят в мерную колбу на
100 см3 и доводят объем до метки 0,1 М универсальным
буферным раствором с соответствующим pH.
Для сокращения времени растворения казеината
натрия раствор готовят при нагревании до 70°С на маг-
нитной мешалке. Срок хранения 2 %-кого раствора ка-
зеината натрия не более 2 сут (в холодильнике).
Техника определения. Для определения фермента-
тивной протеолитической активности проводят фермен-
38
тативный гидролиз при 1%-ной концентрации белка-суб-
страта в растворе (после смешивания раствора субстра-
та и раствора фермента). Количество взятого фермента
должно быть рассчитано так, чтобы присутствовал боль-
шой избыток субстрата и чтобы измеряемые величины
оптической плотности лежали в области 0,07—0,85 для
кислых протеиназ и 0,20—0,60 — для нейтральных и ще-
лочных протеиназ.
В две пробирки наливают по 2 см3 субстрата и по-
мещают их в ультратермостат при 30°С. Примерно че-
рез Ю мин в каждую пробирку приливают по 2 см3
раствора фермента, пробирки встряхивают и оставляют
на гидролиз ровно на 10 мин при 30 °C. Через 10 мин
добавляют в обе пробирки по 4 см3 0,ЗМ раствора ТХУ,
чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить бе-
лок и высокомолекулярные продукты гидролиза. Быстро
перемешивают смесь и для обеспечения полного осаж-
дения выдерживают пробирки со смесью при 30°С еще
20 мин, затем фильтруют через маленькие воронки с бу-
мажными фильтрами в сухие пробирки. Фильтрат дол-
жен быть совершенно прозрачен. Отбирают в чистые
пробирки по 1 см3 фильтрата, добавляют по 5 см3 0,5 М
раствора карбоната натрия, перемешивают и быстро,
при непрерывном перемешивании, приливают по 1 см3
рабочего раствора реактива Фолина. Дают реакцион-
ной смеси постоять 20 мин. После реакции растворы
приобретают голубую окраску, интенсивность которой
определяют на фотоэлектроколориметре.
Одновременно готовят контрольную пробу, приливая
реактивы в обратной последовательности: к 2 см3 фер-
ментного раствора того же разведения, как и в опыте,
добавляют 4 см3 ТХУ, выдерживают в ультратермоста-
те при 30°С 10 мин, а затем вносят 2 см3 субстрата.
Через 20 мин раствор фильтруют, отбирают в сухую
пробирку 1 см3 фильтрата, при перемешивании вносят
5 см3 0,5М раствора карбоната натрия и 1 см3 реакти-
ва Фолина.	-4
Оптическую плотность опытного раствора определя-
ют по отношению к контрольному на фотоэлектроколо-
Риметре при длине волны 656—670 нм в кюветах с тол-
щиной поглощающего свет слоя 10 мм.
Построение градуировочной кривой. Для расчета про-
теолитической активности необходимо построить градуи-
39
X	,	.........*».*^^*^ А AJ1. 1\иц-
центрация тирозина Ci при этом составляет 0,2-10-4М,
ИЛИ 0 02
С2 = 0,4-
ровочную кривую по тирозину. Затем по градуировочной
кривой вычислить тирозиновый эквивалент ТЭ, т. е. ту
оптическую плотность, которую бы дал 1 мкмоль тиро-
зина в 1 см3 стандартного раствора. Этот эквивалент
необходимо устанавливать для каждой новой партии
реактива Фолина и каждого фотоэлектроколориметра.
Для построения градуировочной кривой готовят рас-
твор тирозина концентрацией 10-3М. Для этого
181,19 мг чистого тирозина растворяют в 0,2 н. растворе
соляной кислоты в мерной колбе вместимостью 1 дм3
(готовят 2 параллельные пробы). Из этого исходного
раствора тирозина готовят дальнейшие разведения сле-
дующим образом;
раствор 1 — в мерную колбу вместимостью 50 см3
вносят 1 см3 исходного раствора тирозина и доводят
объем до метки 0,2 н. раствором соляной кислоты. Кон-
или 0,02 мкмоль/см3;
раствор 2 — 2 см3 исходного
•10—4М, или 0,04 мкмоль/см3;
раствор 3 — 4 см3 исходного
• 10~4 М, или 0,08 мкмоль/см3;
раствор 4 — 5 см3 исходного
•10~4М, или 0,10 мкмоль/см3;
раствор 5—7,5 см3 исходного
• 10-4М, или 0,15 мкмоль/см3;
раствор 6—10 см3 исходного
• 10~4М, или 0,20 мкмоль/см3;
раствор 7—45 см3 исходного
•10~4М, или 0,30 мкмоль/см3.
Затем в пробирки вносят по 1 см3
------- — -
раствора;
раствора;
Сз = 0,8-
раствора;
С4=1,0-
С5— 1,5-
раствора;
раствора;
С6 = 2,0-
раствора;
С7 = 3,0-
— d ириинрли вносят по 1 смл раствора тирозина
разной концентрации. Добавляют в них при постоянном
помешивании по 5 см3 0,5М раствора карбоната натрия
и 1 см3 рабочего раствора Фолина. Контрольный опыт
готовят так же, но вместо раствора тирозина берут
1 см3 дистиллированной воды. Дают реакционной жид-
кости постоять 20 мин.
Интенсивность окраски опытного раствора опреде-
ляют по сравнению с контрольным при длине световой
волны 656—670 нм в кюветах с толщиной поглощаю-
щего свет слоя 10 мм. По средним данным, полученным
из двух опытов, строят градуировочную кривую. На оси
абсцисс откладывают количество тирозина С
40
(в мкмоль/см3), на оси ординат — соответствующие зна-
чения оптической плотности D.
Протеолитическую активность ПС (в ед./г или ед./см3)
вычисляют по формуле ПС = £М-1000/ (ТЭ-10 т),
где D — оптическая плотность, измеренная на фотоэлек-
троколориметре при толщине поглощающего свет слоя
10 мм; 4—'Отношение объемов реакционной смеси и рас-
твора фермента после добавления ТХУ; 1000 — коэффи-
циент перевода полученных единиц на 1 г ферментного
препарата; ТЭ — тирозиновый эквивалент, определяе-
мый по градуировочной кривой; 10 — время гидролиза
субстрата, мин; m—количество ферментного препара-
та, взятого на протеолиз, мг на 1 см3 ферментного рас-
твора.
МЕТОД ВИЛЬШТЕТТЕРА И ВАЛЬДШМИДТ-ЛЕИТЦА
В МОДИФИКАЦИИ
Метод основан на определении свободных карбо-
ксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и
полипептидов.
Активность (ПС) выражают количеством милли-
граммов аминного азота, которое образуется при гидро-
лизе определенного количества 5%-ного раствора жела-
тина с pH 7,3—7,5 1 г препарата или 1 см3 ферментно-
го раствора за 1 ч при температуре 40°С.
За единицу протеолитической активности принимают
количество фермента, которое образует 1 мг аминного
азота за 1 ч в принятых условиях опыта.
Необходимые реактивы. Фосфатный буферный рас-
твор с pH 7,3—7,5; 5%-ный раствор желатина (суб-
страт)— 5 г желатина предварительно замачивают в
стеклянном стаканчике в 15—20 см3 дистиллированной
воды в течение 20—30 мин. Набухший белок заливают
20—25 см3 буферного раствора температурой 70—80°С
и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Рас-
творившуюся часть сливают в мерную колбу на 100 см3,
к нерастворившейся части добавляют еще 20—25 см3
буферного раствора и снова переносят полученный рас-
твор в эту же колбу. Так повторяют до полного раство-
рения желатина. Охлажденный до 40°С раствор желати-
на доводят до метки буферным раствором такой же тем-
пературы. Готовый раствор желатина должен храниться
41
в холодильнике при температуре от 2 до 5°С и может
быть использован для анализа в течение 2 сут. Перед
анализом раствор желатина нагревают до 40°С на водя-
ной бане; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина —
1 г кристаллического тимолфталеина растворяют в
96%-ном спирте-ректификате в мерной колбе на 100 см3
и после растворения доводят до метки, закрывают проб-
кой и хранят в темном месте; 0,1 н. раствор гидроксида
натрия — 4 г кристаллического NaOH растворяют в 1дм3
дистиллированной воды; 96°/о-ный этиловый спирт.
Техника определения. К 10 см3 5%-ного раствора
желатина с pH 7,3—7,5 приливают 2 см3 испытуемого
ферментного раствора и сразу же отбирают 1 см3 реак-
ционной смеси в коническую колбу на 50—100 см3, куда
предварительно налито 20 см3 96%-ного этилового спир-
та и 0,2 см3 1 %-ного раствора тимолфталеина. Пробу
тут же титруют 0,1 н. раствором NaOH. После появле-
ния голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 кап-
ли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титро-
вание проводят из микробюретки с ценой деления
0,02 см3.
Оставшуюся смесь желатина с ферментным раство-
ром помещают в термостат с температурой 40°С для гид-
ролиза. Через 3 ч 1 см3 реакционной смеси отбирают
во вторую коническую колбочку на 50—100 см3, куда
предварительно налито 20 см3 96%-ного этилового спир-
та и 0,2 см3 1 %-ного раствора тимолфталеина, и титру-
ют аналогично контролю.
Расчет протеолитической активности ПС ведут по
формуле HC = AI(tP), где А— количество аминного азо-
та, накопленное за время опыта в реакционной смеси,
мг; t—время протеолиза, ч; Р — коэффициент, учиты-
вающий разведение и пересчет на 1 г препарата или
1 см3 жидкого ферментного раствора.
Величина А рассчитывается по формуле Д =
= (а—ак)1,4 К, где а — количество 0,1 н. раствора NaOH,
пошедшее на титрование 1 см3 опытной пробы, см3; ак—
то же, для контрольной пробы; 1,4 — коэффициент пе-
ресчета количества 0,1 н. раствора щелочи в миллиграм-
мы азота аминокислот и полипептидов; К— поправка к
титру щелочи.
Пример. На титрование 1 см3 опытной пробы пошло 1,0$ см3
0,1 н. раствора NaOH, а на титрование 1 см3 контрольной пробы —
42
0 68 см3. Время ферментолиза было 3 ч. Поправка к титру NaOH
Х'=1,0б. Следовательно, Д=(1,08—0,6'8)1,4-1,06 = 0,59 мг.
Исходная 10|%-ная вытяжка была приготовлена из сырой по-
верхностной культуры с влажностью 50%, фильтрат вытяжки из
культуры в количестве 2 см3 был добавлен к 10 см3 5%-ного рас-
твора желатина, из реакционной смеси на анализ отобрали 1 см3.
Схема разведения имеет вид: 10->-100»-»J2->il2r*.l.
Подсчитываем ПС: ПС=4/(tP) =0,59-12 • 100/(3 • 1 - 2 • 10) = 11,8 ед.
на 1 г культуры.
Если требуется пересчитать протеолитическую активность на
сухое вещество культуры, то расчет ведется по формуле ПСсв =
= ПС-1100/(100-W7) =1111,8-100/(10(4-610) =2(3,6 ед./г.
Если ведется определение активности в очищенном препарате,
то составляется соответствующая схема разведения и делается ана-
логичный расчет.
МЕТОД ЛЕЙЛЯН-ФОЛЬГАРДА В МОДИФИКАЦИИ
Метод основан на гидролизе ферментами щелочных
растворов казеина и оттитровывании свободной соляной
кислоты. Протеолитическая активность по этому методу
выражается в количестве 0,1 н. раствора NaOH (в см3),
пошедшего на титрование свободной соляной кислоты,
не связанной казеином в результате воздействия 1 г
или 1 см3 ферментного препарата на казеин в течение
1 ч при 37—40°С.
Необходимые реактивы. 0,2 н. раствор соляной кис-
лоты— 16,4 см3 х. ч. концентрированной соляной кисло-
ты плотностью 1,189 разбавляют дистиллированной во-
дой до 1 дм3; 15%-ный раствор сульфата натрия— 15 г
соли растворяют при нагревании в 85 см3 дистиллиро-
ванной воды; 0,1 н. раствор гидроксида натрия — 4,0 г
NaOH растворяют в дистиллированной воде и объем до-
водят до 1 дм3; 1%-ный раствор крезолрота (индика-
тор); 5%-ный щелочной раствор казеина — 5 г казеина
(сухого, измельченного) помещают в стакан, заливают
небольшим количеством (30—40 см3) теплой воды и
оставляют на 30 мин для набухания, затем стакан по-
мещают в баню с температурой 60—70 °C и при переме-
шивании добавляют небольшими порциями 5 см3 1 н. ра-
створа NaOH, помешивая до тех пор, пока казеин пол-
ностью не растворится; растворенный казеин количест-
венно переносят в мерную колбу на 100 см3, после ох-
лаждения раствор доводят до метки дистиллированной
водой. Казеином можно пользоваться 2—3 дня, если
хранить его в холодильнике при температуре не выше
2 3 °C.
43
Техника определения. Раствор казеина перед опреде-
лением нагревают до температуры 37°С. В две колбочки
на 100 см3 наливают по 20 см3 5%-ного раствора ка-
зеина. Затем в опытную колбочку добавляют 10 см3 ис-
следуемого раствора и колбу помещают в термостат с
температурой 37°С на 1 ч. В контрольную колбочку так-
же добавляют 10 см3 исследуемого раствора и быстро
осаждают казеин 0,2 н. раствором НС1 и 10 см3 15%-но-
го раствора Na2SO4. Выпавший осадок отфильтровыва-
ют и отбрасывают. Через 1 ч проводят точно такое же
осаждение и в опытной колбочке.
В чистые колбы отмеривают по 10 см3 фильтрата из
опытной и контрольной колбочек, добавляют по 2 капли
крезолрота и титруют 0,1 н. раствором NaOH до ярко-
малинового окрашивания.
Величину протеолитической активности ПС
(в ед./см3) находят по разнице количеств 0,1 н. раство-
ра NaOH, пошедших на титрование опытной и контроль-
ной пробы: ПС=(а—ак) К : Р, где а и ак — количество
0,1 н. раствора NaOH, пошедшее на титрование соответ-
ственно опытной и контрольной пробы, см3; К — поправ-
ка к титру щелочи; Р — коэффициент, учитывающий
разведение и пересчет на 1 г препарата культуры или
на 1 см3 жидкого ферментного препарата.
Пример. На определение протеолитической активности очищен-
ного препарата взяли 10' см3 0,1%-ного раствора препарата!. На
титрование опытной пробы пошло 3,5 см3 0,1.н. раствора NaOH,
на титрование контрольной пробы—1,5 см3. Поправка к титру ще-
лочи — 1„02.
Исходный раствор ферментного препарата имел концентрацию
0,1%. На анализ взяли 10 см3 этого ра,створа и провели реакцию
в объеме 30 см3, а затем объем довели до 50 см3 и оттуда отобра-
ли на непосредственный анализ 10 см3 смеси. Схема разведения
'имеет вид: 1 г-*-4(ЮН-.10->5|ОН"10.(
Подсчитываем величину ПС: ПС=(3,5—1,5) 1,02-50-100/(10-10-
•0,1) = 10'10 ед. на 1 г препарата.
Определение пектолитической
активности (ПкА)
МЕТОД ПО ГОСТ 20264.3—74
Метод основан на определении пектолитических фер-
ментов при каталитическом расщеплении пектина. За
единицу пектолитической активности в данном методе
44
принято такое количество фермента, которое катализи-
рует гидролиз 1 г пектина до продуктов, не осаждаемых
ZnSCU, при проведении гидролиза при температуре 30°С
в течение 1 ч при pH реакционной среды 4,0 и соотноше-
нии фермент— субстрат в реакционной среде, обеспечи-
вающем гидролиз 30% пектина, взятого на реакцию.
Пектолитическую активность выражают числом ука-
занных единиц в 1 г испытуемого препарата. Количест-
во продуктов гидролиза пектина, не осаждаемых суль-
фатом цинка, определяют на интерферометре ИТР-2.
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор пектина
(субстрат); 15%-ный раствор сульфата цинка—15 г
ZnSC>4 растворяют в 100 см3 дистиллированной воды.
Приготовление 1%-ного раствора пектина (субстрат).
Навеску пектина, взятую с таким расчетом, чтобы в
250 см3 раствора было 2,5 г чистого пектина (по данным
испытания), тонкой струей всыпают при непрерывном
перемешивании в коническую колбу вместимостью
300 см3, куда предварительно наливают около 130 см3
дистиллированной воды. Перемешивают 10 мин, после
чего раствор оставляют на 3 ч при комнатной темпера-
туре. По истечении этого времени в раствор добавляют
при перемешивании определенное количество концентри-
рованного раствора аммиака для установления pH 4,0.
Затем объем раствора доводят дистиллированной водой
до 250 см3, тщательно перемешивают и фильтруют через
два слоя марли. Раствор пектина готовят за 2—3 ч до
проведения испытания. Окраска раствора должна быть
светло-серой. Раствор пектина можно использовать
в течение 4 сут при условии хранения его в холодиль-
нике.
Техника определения. Для испытания берут несколь-
ко (по количеству исследуемых проб) пробирок диамет-
ром 2 см и высотой 18 см. В каждую пробирку налива-
ют по 20 см3 субстрата и ставят их на 10 мин в ультра-
термостат или водяную баню с постоянной температу-
рой 30±0,2°С, чтобы растворы приняли постоянную
температуру. Затем, не вынимая пробирки из ультра-
термостата, наливают в каждую по 10 см3 испытуемого
ферментного раствора, содержимое каждой пробирки
тщательно перемешивают и оставляют в ультратермо-
етате при 30°С на 1 ч для проведения пектолиза. По
истечении этого времени пробирки с реакционной смесью
45
вынимают из ультратермостата, добавляют по 2 см3
15%-ного раствора ZnSO4 для инактивации фермента и
осаждения продуктов пектолиза. Содержимое пробирок
тщательно перемешивают и фильтруют через бумаж-
ный фильтр. Если фильтрат будет мутным, необходимо
заново профильтровать раствор через тот же фильтр до
получения прозрачного раствора. Полученный раствор
является исследуемым.
Одновременно готовят контрольный раствор. Для это-
го в пробирку наливают 2 см3 15%-ного раствора ZnSO4,
10 см3 исследуемого ферментного раствора и 20 см3 суб-
страта. Содержимое пробирки тщательно перемешивают
в течение 2—3 мин и фильтруют. Затем исследуемый
раствор помещают в левое отделение кюветы интерфе-
рометра с длиной грани 4 см, а контрольный раствор —
в правое отделение и измеряют величину смещения ин-
терференционных полос, возникающую вследствие раз-
личных показателей преломления контрольного и иссле-
дуемого растворов. Отсчет ведут по шкале барабана при-
бора (п). Для обеспечения точности испытания необхо-
димо разведение ферментов подбирать таким образом,
чтобы получать показания от 400 до 1250.
Пектолитическую активность ПкА (в ед./г) вычис-
ляют по формуле ПкА= (0,06425п+ 19,62)/ (т-1000),
где 0,06425; 19,62; 1000—постоянные коэффициенты,
полученные при математической обработке эксперимен-
тальных данных по изучению зависимости между коли-
чеством образующихся продуктов гидролиза пектина в
условиях метода и количеством единиц активности фер-
мента, взятого на анализ; п — показание прибора для
данного разведения; т — количество ферментного пре-
парата, содержащееся в 10 см3 ферментного раствора,
взятого на определение, г.
ОБЪЕМНЫЙ МЕДНЫЙ МЕТОД
Метод заключается в определении йодометрическим
способом связанной меди — медной соли пектиновой кис-
лоты— до и после гидролиза 1 %-ного раствора пектина
в течение 1 ч при температуре 37—38°С. Пектолитиче-
ская активность по этому методу выражается в едини-
цах количества фермента, которое катализирует рас-
щепление в этих условиях 1 мг пектина.
46
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор пектйнй
(свекловичного) — 10 г пектина растворяют в 1 дм3 ди-
стиллированной воды; 0,1 н. раствор гидроксида нат-
рия— 4 г кристаллического NaOH растворяют в 1 дм3
дистиллированной воды; I н. раствор уксусной кисло-
ты— 60,12 г ледяной уксусной кислоты растворяют в
1 дм3 дистиллированной воды; 5%-ный раствор сульфа-
та меди — 50 г CuSO4 растворяют в 1 дм3 дистиллиро-
ванной воды; 0,01 н. раствор тиосульфата натрия; 2 н.
раствор серной кислоты — 98 см3 концентрированной
H2SO4 плотностью 1,84 растворяют в 1 дм3 дистиллиро-
ванной воды; 1%-ный раствор крахмала; растворы фер-
ментных препаратов и вытяжки.
Техника определения. Для определения пектолитиче-
ской активности фермента в четыре сухие эрленмейеров-
ские колбы вместимостью 100 см3 отбирают по 50 см3
1%-ного раствора пектина, предварительно нагретого
до температуры 37—38°С.
В первую и вторую колбы добавляют по 5 см3 иссле-
дуемого ферментного раствора, в третью и четвертую —
по 5 см3 дистиллированной воды (контрольные пробы).
Общий объем реакционной смеси как опытных, так и
контрольных проб равен 55 см3.
После этого содержимое колб перемешивают, закры-
вают колбы ватными пробками и ставят в термостат
при температуре 37—38°С на 2 ч для проведения гидро-
лиза пектина.
Затем из каждой колбы отбирают по 5 см3 реакцион-
ной смеси в сухие химические стаканы вместимостью
400 см3, добавляют по 50 см3 0,1 н. раствора NaOH и
проводят омыление негидролизованного пектина в тече-
ние 12—16 ч.
После омыления во все стаканы добавляют по 50 см3
1 н. раствора уксусной кислоты для нейтрализации ще-
лочи и через 5 мин — по 50 см3 5%-ного раствора CuSO4
Для осаждения пектиновой кислоты в виде пектата ме-
Ди. Реакционную смесь выдерживают 30—40 мин при
комнатной температуре, после чего содержимое стака-
нов подогревают до кипения и образовавшийся осадок
пектата меди отфильтровывают через беззольный
фильтр (диаметр 9 см).
Осадок тщательно промывают горячей дистиллиро-
ванной водой до исчезновения в промывных водах реак-
47
ции на ион меди. Для этого берут 1 см3 25%-ного рас-
твора аммиака и к нему прибавляют 2—3 капли про-
мывных вод из воронки. Осадок считается промытым,
когда при прибавлении промывных вод к аммиаку не
образуется голубовато-синего окрашивания.
Промытый осадок пектата меди вместе с фильтра-
том переносят в эрленмейеровскую колбу вместимостью
250 см3 для титрования. В эту же колбу добавляют
40 см3 горячей дистиллированной воды, 8—10 капель
25%-ного раствора аммиака и перемешивают. Затем
к раствору прибавляют 10 см3 2н. раствора H2SO4, 5 г
йодида калия (кристаллического) и оттитровывают вы-
делившийся йод 0,01 н. раствором тиосульфата натрия
в присутствии 1 %-ного раствора крахмала (2—3 кап-
ли), как индикатора.
Величина пектолитической активности ПкА фермент-
ных препаратов определяется по следующей формуле:
ПкА=с(а—Ь)В1(ГаП1), где с — количество пектина,
определяемое для каждой партии пектина кальций-пек-
татным методом, содержащееся в 5 см3 раствора, взято-
го на омыление, мг; а — количество 0,01 н. раствора тио-
сульфата натрия, пошедшее на титрование 5 см3 конт-
рольного раствора пектина, см3; b — количество 0,01 н.
раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование
5 см3 раствора пектина после обработки ферментным
препаратом, см3; В — общий объем реакционной смеси,
см3; Г — количество реакционной смеси, взятое на омы-
ление, см3; П — количество препарата, содержащееся в
объеме ферментного раствора, взятого на определение
с учетом разведения, г; t — время гидролиза пектина, ч.
Для определения пектолитической активности уста-
навливаются величины а и Ь, и если b составляет боль-
ше 60% °т величины а, то полученные показатели под-
ставляют в расчетную формулу для нахождения ПкА.
Если величина b составляет меньше 60% от а, то опре-
деление активности проводится при меньшем разведе-
нии ферментного препарата, т. е. берут не 5, а 2,5 см3
раствора.
Пример. На анализ взято 0,05 г препарата. На титрование
контрольной пробы пошло 9,14 см3 0,01 н. раствора тиосульфата
натрия, или с учетом поправки к титру (0,96) а=9,14-01,96=8,77 см3,
На титрование опытной пробы пошло 7,44 см3 0,01 н. раство-
ра тиосульфата натрия, или с учетом поправки к титру (0,96) й =
=7,44-0,9'6=7,14 см3.
При условии содержания в свекловичном пектине 78,8% пек-
тина в 55 ом3 реакционной смеси содержится 0,5-78,8 :1010= 0;394 г
пектина.
Из 55 см3 на омыление берется 5 ом3, следовательно, с=0„394-
.5:55 = 0,00518 г, или 35,8 мг пектина.
Время гидролиза пектина ч.
Объем реакционной смеси 5=55 см3.
Количество реакционной смеси, взятой иа омыление, Г=5 см3.
Следовательно,	ПкА=с(а—b)В](Г Пей) =35,8(8,77—7,14) •
• 55/(8,77-5-0,005-2) =7319 ед. па 1 г препарата.
КАЛЬЦИЙ-ПЕКТАТНЫЙ МЕТОД
Метод заключается в количественном определении
высушенного до постоянной массы осадка пектата каль-
ция, образующегося в результате обработки хлоридом
кальция продуктов гидролиза пектина (в частности,
пектиновой кислоты) пектолитическими ферментами.
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор пектина
(подсолнечного или свекловичного) — 10 г пектина рас-
творяют в 1 дм3 дистиллированной воды; 1 н. раствор
уксусной кислоты — 60,03 г СНзСООН разбавляют ди-
стиллированной водой до 1 дм3; 2 н. раствор хлорида
кальция — 230—250 г СаС1г растворяют в 1 дм3 дистил-
лированной воды; 0,1 н. раствор гидроксида натрия—
4 г NaOH растворяют в 1 дм3 дистиллированной
воды.
Техника определения. Свежеприготовленный 1%-ный
раствор пектина нагревают на водяной бане до темпе-
ратуры 37—38°С и пипеткой порциями по 50 см3 разли-
вают в заранее приготовленные сухие эрленмейеровские
колбы вместимостью 100 см3. В эти же колбы добав-
ляют ферментный раствор в количестве от 1 до 5 см3
(для препарата) или 0,5 см3 10%-ной вытяжки из куль-
туры гриба. Смесь тщательно перемешивают, колбы за-
крывают ватными пробками и ставят на пектолиз в тер-
мостат с температурой 37—38°С.
Одну колбу с раствором пектина на пектолиз не ста-
вят (контроль), а берут из нее 5 см3 раствора, добав-
ляют 50 см3 0,1 н. раствора NaOH, перемешивают и
оставляют на омыление на ночь.
Через 4 ч пектолиза из всех остальных колб отби-
рают пипеткой по 5 см3 раствора в чистые сухие хими-
ческие стаканы вместимостью 400 см3. В каждый ста-
48
49
кан добавляют 50 см3 0,1 н. раствора NaOH, перемени-
вают и оставляют на омыление на ночь.
После омыления во все стаканы с пробами, включая
и контрольный, добавляют по 50 см3 1 н. раствора
СНзСООН, перемешивают, через 5 мин добавляют по
50 см3 2н. раствора СаС12 и снова хорошо перемешива-
ют—выпадает осадок пектата кальция. Раствору дают
постоять 30—40 мин, после чего содержимое стаканов
кипятят в течение 5 мин.
Полученный после кипячения осадок отфильтровыва-
ют на заранее высушенных до постоянной массы без-
зольных фильтрах и тщательно промывают горячей во-
дой до исчезновения в промывной воде иона хлора (про-
ба с нитратом серебра). Затем осадок вместе с фильт-
ром переносят в тот же бюкс, в котором высушивался
ранее фильтр, и высушивают до постоянной массы в су-
шильном шкафу при температуре 103—105°С. Для вы-
числения истинного содержания пектина полученную ве-
личину массы умножают на коэффициент 0,92.
Пример. Масса бюкса с высушенным до постоянной массы
фильтром— 25,6660 г, масса бюкса с осадком на фильтре —
23,7847 г, масса осадка — ОДОЙ? г-—эту массу принимаем за 100%
содержания пектина. Таким же образом рассчитываем содержание
пектина в опытных пробах. Например, получена масса осадка
0,0442 г. Процент расщепления пектина за определенный промежу-
ток времени (4 или 24 ч) находим по следующей пропорции:
0.11'87 г—100(% нерзацепленного пектина, 0,0442 г—х, x=37,2filo
нерасщепленного пектина, отсюда количество расщепленного пекти-
на составляет 62,8%.
ВИСКОЗИМЕТРИЧЕСКИИ МЕТОД
Метод основан на гидролизе пектина ферментным
препаратом и определении степени его расщепления по
величине снижения вязкости. Поскольку главную роль
в снижении вязкости играет эндополигалактуроназа, ме-
тод в основном характеризует активность этого фер-
мента.
За единицу пектолитической активности в этом мето-
де принимают такое количество фермента, которое в
строго определенных условиях при температуре 30°С за
10 мин катализирует гидролиз 1 г пектина со сниже-
нием вязкости раствора на 30%.
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор пектина (ре-
комендуется яблочный пектин с содержанием метоксиль-
50
ных групп 5—5,5% на воздушно-сухое вещество. При
отсутствии яблочного пектина допускается использова-
ние свекловичного пектина с такими же показателями.
Относительная вязкость 1%-ного раствора пектина при
30°С должна быть в пределах 16—19); раствор фер-
мента.
Техника определения. Сухой вискозиметр Оствальда
с диаметром капилляра 0,8 мм помещают в водяную
баню с температурой 30°С. Пипеткой вводят в него
10 см3 1%-ного раствора пектина. Через 5 мин вводят
необходимое количество дистиллированной воды и рас-
твор фермента (от 1 до 5 см3). Общий объем реакцион-
ной смеси в вискозиметре должен быть равен 15 см3.
После введения фермента сразу же по секундомеру от-
мечают начало пектолиза и одновременно тщательно
перемешивают содержимое вискозиметра воздухом при
помощи груши, надетой на узкое колено вискозиметра.
Ровно через 10 мин после введения фермента замеряют
вязкость по времени истечения реакционной смеси.
Параллельно ставят контрольный опыт определения
вязкости (времени истечения) исходного раствора пек-
тина, который проводят так же, только без фермента,
а с добавлением 5 см3 воды.
При анализе малоактивных препаратов контрольное
определение следует проводить с ферментным раство-
ром, инактивированным кипячением в водяной бане в
течение 1 ч.
В большинстве случаев при анализе активных пре-
паратов на определение берут растворы с таким раз-
бавлением, что вязкость их практически не отличается
от вязкости воды.
Контрольное определение вязкости проводят в том
же вискозиметре, что и опытное. Можно использовать и
Другой вискозиметр, но в этом случае водное число при-
бора не должно отличаться от опытного более чем на
0,5 с.
^Водное число вискозиметра, взятое для исследова-
ний при температуре 30°С, составляет 30—40 с.
Степень гидролиза пектина, определяемую по вели-
чине снижения вязкости В (в %), рассчитывают по фор-
муле B~(tK—t) 100/ (/к—tB), где tK — время истечения
контрольного раствора пектина с водой или инактивиро-
ванным ферментом, с; t — время истечения опытного
51
раствора (после пектолиза), с; — время истечения во.
ды, с.
Величина В должна находиться в пределах 20—40%
Изменением дозировки ферментного препарата добива.
ются получения не менее двух значений В в этих пре-
делах, одно из которых должно быть меньше 30%. г
другое больше.
На основании полученных данных строят график, щ
оси абсцисс которого откладывают количество фермент-
ного препарата в миллиграммах, по оси ординат — вели-
чину снижения вязкости В (1 см3=1%). Полученные
точки соединяют прямой и интерполированием находят
количество препарата в миллиграммах, которое дает
снижение вязкости на 30%.
Определение полигалактуроназной
активности1 (П гС)
Метод основан на учете количества конечных альде-
гидных групп, образующихся в результате гидролиза
гликозидных связей пектовой кислоты.
За единицу полигалактуроназной активности принято
такое количество фермента, которое в строго определен-
ных условиях при температуре 30°С катализирует за
1 мин гидролиз 1 мкэкв гликозидных связей в молекуле
пектовой кислоты.
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор пектовой
кислоты (субстрат); 1М раствор карбоната натрия —
106 г Ыа2СОз растворяют в дистиллированной воде и до-
водят объем до 1 дм3; 0,1 н. раствор йода —25 г йодида
калия растворяют в минимальном количестве воды, до-
бавляют 12,7 г йода и объем доводят до 1 дм3; 0,05 н.
раствор тиосульфата натрия—12,5 г Na2S2O3 растворя-
ют в бидистилляте и объем доводят до 1 дм3, раствор
хранят в склянке из темного стекла с сифоном и бюрет-
кой с хлоркальциевой трубкой, заполненной натронной
известью; 2М раствор серной кислоты — 200 г концент-
рированной H2SO4 разбавляют водой до 1 дм3; 0,5 и 1 н.
растворы гидроксида натрия; 0,5н. раствор НС1; 1%-ный
раствор крахмала в насыщенном растворе хлорида нат-
рия (индикатор).
Приготовление 1%-ного раствора пектовой кислоты.
30 г свекловичного пектина заливают 600 ом3 дистилли-
рованной воды и оставляют в холодильнике для набуха-
ния и растворения на ночь. Затем к раствору пектина
приливают 50 см3 0,5 н. раствора NaOH и перемешива-
ют до полного растворения пектина. Раствор сразу же
фильтруют на воронке Бюхнера через два слоя марли,
между которыми проложен слой ваты, и к фильтрату
прибавляют вторую половину раствора NaOH. Смесь
оставляют на 1 ч в холодильнике для омыления. Затем
осаждают пектовую кислоту прибавлением примерно
900 см3 0,5 н. раствора соляной кислоты. Выпавшую в
осадок пектовую кислоту сразу же отжимают через
бязь, помещают в стакан, заливают 70%-ным раствором
спирта, тщательно перемешивают, растирая комки, и
фильтруют на воронке Бюхнера через бязь, промывая
ее сначала 70%-ным раствором этанола до отсутствия
ионов хлора, а затем 50 см3 96%-ного этанола. Получен-
ную пектовую кислоту сушат на воздухе, затем в ва-
куумном сушильном шкафу при комнатной температуре.
Порошок просеивают через сито с ячейками 0,25 мм
(остаток на сите отбрасывают). Влажность продукта
составляет обычно 10—15%.
Для приготовления 1 %-ного раствора пектовой кис-
лоты берут такую навеску порошка, чтобы в 100 см3
раствора содержался 1 г кислоты. Навеску высыпают
при тщательном перемешивании в стакан с дистиллиро-
ванной водой и из бюретки по каплям при перемешива-
нии добавляют 1 н. раствор NaOH, доводя pH раствора
пектовой кислоты до 4,0. Необходимое для этого коли-
чество щелочи устанавливают заранее опытным путем
Для каждой партии пектовой кислоты. Полученный
раствор пектовой кислоты количественно переносят в
мерную колбу на 100 см3, доводят до метки дистиллиро-
ванной водой, тщательно перемешивают и фильтруют
чеРез два слоя марли на воронке Бюхнера. Раствор
используют в день приготовления.
Приготовление 1 %-ного раствора крахмала в насы-
щенном растворе хлорида натрия (индикатор). Раствор
готовят в день проведения испытания.
1 г крахмала с учетом влажности помещают в мер-
ную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 25 см3
насыщенного раствора NaCl и перемешивают до полно-
го Растворения. Затем добавляют в колбу еще 25 см3 ра-
створа NaCl, помещают колбу с содержимым в кипя-
52
53
щую водяную баню, непрерывно перемешивая до полщ
го растворения крахмала. Затем раствор охлаждаю;
добавляют 10 см3 буферного раствора (ацетатного
pH 4,7 при анализе грибных препаратов, фосфатного
pH 6,0 при анализе бактериальных препаратов), объе
жидкости доводят до метки раствором хлорида натри
и содержимое колбы перемешивают.
Для проверки.оптической плотности полученного ра;
твора 10 см3 субстрата (1%-ного раствора пектовой кис
лоты) наливают в пробирку, добавляют 5 см3 дистилди
рованной воды и тщательно перемешивают. Зате
0,5 см3 раствора переносят в коническую колбу, в кото
рую предварительно налито 50 см3 раствора йода. Полу
ченный окрашенный раствор колориметрируют на фото
электроколориметре при длине волны ^ = 656 нм проти:
дистиллированной воды в кювете с толщиной поглощаю
щего свет слоя 1 см. Оптическая плотность должна бып
не менее 0,690.
Техника определения. 10 см3 1%-ного раствора пек
товой кислоты вносят в колбы вместимостью 100 см3 -
помещают их в термостат с температурой 30±0,2°С
Через 10 мин в колбы добавляют необходимое количе
ство дистиллированной воды и от 1 до 5 см3 ферментно
го раствора (в зависимости от активности ферментной
препарата). Общий объем реакционной смеси должен
быть 15 см3. Растворы тщательно перемешивают.
Через определенное время (10, 20, 30 или 60 мин £
зависимости от ферментативной активности) в эти Ж
колбы добавляют по 1,8 см3 1М раствора карбоната нат-
рия и по 10 см3 0,1 н. раствора йода. Все тщательно пе
ремешивают, закрывают стеклянными пробками и остав
ляют стоять точно 20 мин в защищенном от света месте
Затем вносят в колбы по 2 см3 2М раствора H2SO< <
оттитровывают избыток йода 0,05 н. раствором тиосуДЬ'
фата натрия в присутствии крахмала.
Одновременно ставят контрольный опыт с таким $
количеством всех реагентов, только ферментный раство;
вводят после добавления карбоната натрия непосредс?
венно перед прибавлением раствора йода.
При испытании ферментных препаратов, активност1
которых неизвестна, следует несколько изменить техШ1'
ку проведения опыта: брать не 10, а 50 см3 раствору5
субстрата и от 1 до 25 см3 ферментного раствора (о°'
54
щий объем реакционной смеси 75 см3). Из этой реакцион-
ной смеси каждые 5—10 мин отбирают по 15 см3 в кол-
бы, куда предварительно налито по 1,8 см3 1М раство-
ра карбоната натрия, далее поступают, как описано ра-
нее.
Полигалактуроназную активность ПгС (в ед./г), из-
меренную по нарастанию количества альдегидных групп,
вычисляют по формуле ПгС = 51,3	где 51,3 —
число альдегидных групп, соответствующих 1 см3 0,1 н.
раствора йода, мкэкв; а — количество 0,1 н. раствора
йода, израсходованное на окисление образовавшихся при
пектолизе альдегидных групп (находят по разности тит-
рований раствором тиосульфата натрия опытной и конт-
рольной проб), см3; t — время гидролиза пектина, мин;
т — количество препарата в пробе, взятое на титрова-
ние, г.
Для расчета ПгС могут быть использованы данные
нарастания количества альдегидных групп вплоть до
20%-ного гидролиза пектовой кислоты.
Определение пектинэстеразной
активности (ПэС)
Метод основан на гидролизе раствора пектина ис-
следуемым ферментным препаратом с последующим ко-
личественным (титрометрическим) определением освобо-
дившихся в результате гидролиза карбоксильных групп.
Пектинэстеразная активность характеризует способ-
ность фермента катализировать гидролиз сложноэфир-
ных связей в молекуле пектина с образованием мети-
лового спирта и свободных карбоксильных групп.
За единицу активности пектинэстеразы принято такое
количество фермента, которое катализирует гидролиз
1 мкэкв сложноэфирных связей в молекуле пектина за
1 мин при 30°С. Пектинэстеразную активность выража-
ют числом единиц фермента в 1 г (или 1 см3) исследуе-
мого препарата.
Определяемая величина пектинэстеразной активно-
сти находится в непосредственной зависимости от степени
и этерификации пектина; сравнимые результаты при ра-
Оте с различными субстратами можно получить лишь
при пересчете полученных данных на субстрат со 100%-
°й степенью метоксилирования. В принятых условиях
55
МЕТОД
определения количество расщепленных сложноэфирны
связей прямо пропорционально количеству фермента _„пп0М NaOH до pH 7,5, используя для этой цели
пределах 20%-ного гидролиза.	рЭ иниометр.
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор высоком^ П°Тгтектинэстеразную активность ПэС (в ед./г или
токсилированного пектина (субстрат); инактивирован „/мл) вычисляют по формуле ПэС = 100а-100/(/щс),
ный ферментный раствор; 0,1 н. раствор гидроксид; е р inn___число гидролизованных сложноэфирных свя-
натрия.	ГД соОтветстВуЮЩее 1 ,смз 0,1 н. раствора NaOH, мкэкв;
Приготовление 1%-ного раствора высокометоксили.	’ количество 0,1 н. раствора NaOH, необходимое для
рованного пектина (субстрат). Навеску пектина, взятук ™тпОвания освободившихся в результате действия фер-
с таким расчетом, чтобы в 100 см3 раствора был 1 г пек ™рта карбоксильных групп (находят по разности меж-
тина, медленно всыпают при тщательном перемешива- nv количеством щелочи, израсходованным на ^титрова-
степень этерификации пектина, на которую ведут рас-
чет- f — время гидролиза, мин; т — количество фермент-
ного препарата, взятое для испытания, г; с степень
этерификации пектина, используемого в качестве суб-
страта.
Определение амилолитической
активности (АС)
КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ
(ПО ГОСТ 20264.4—74)
Метод основан
амилолитического
молекулярной массы.
Амилолитическая активность
ность амилолитических ферментов катализировать гид-
ролиз крахмала до декстринов различной молекулярной
массы и выражается числом единиц указанных фермен-
тов в 1 г препарата.
За единицу активности амилолитических ферментов
принято такое их количество, которое в строго опреде-
ленных условиях температуры, pH и времени действия
катализирует до декстринов различной молекулярной
массы 1 г растворимого крахмала, или 30% от введен-
ного в реакцию.
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор крахмала
(субстрат); ацетатный буферный раствор с pH 4,7; 0,1 н.
Раствор НС1 — 8,2 см3 концентрированной соляной кис-
лоты разбавляют дистиллированной водой до 1 дм3; ос-
новной и рабочий растворы йода; основной и рабочий
Растворы ферментного препарата; основной и рабочий
Растворы культуры гриба.
_	-г..	----uvHv»lvwniM. ду количеством Ш.СЛМ-1П,
нии стеклянной палочкой в стакан с дистиллированно!, ние опытного и контрольного РаСТ_в_Р__/%
водой (70 см3 на 1 г пектина) и оставляют на 2 ч прк
комнатной температуре для набухания и растворения,
после чего помещают на ночь в холодильник (темпера-
тура от 4 до 6°С). На следующий день раствор нагрева-
ют до 20°С, количественно переносят в мерную колбу
соответствующей вместимости, доводят дистиллирован-
ной водой до метки, тщательно перемешивают и фильт-
руют через два слоя марли с ватой на воронке Бюхнера,
Раствором можно пользоваться двое суток при условия
хранения его в холодильнике. Используемый пектин
должен иметь степень метоксилирования не менее 80%
Приготовление инактивированного ферментного рас-
твора. Для инактивации фермента, применяемого в конт-
рольном опыте, 25 см3 основного ферментного раствора
помещают в колбу вместимостью 50 см3, закрывают
пробкой с воздушным холодильником и выдерживают
в кипящей бане 1 ч.
Техника определения. В четыре стакана вместимо-
стью по 50 см3 наливают но 20 см3 1 %-ного раствора
пектина, накрывают стаканы часовыми стеклами и ста-
вят с промежутками в 15 мин в термостат с температу-
рой 30±0,5°С. Через 15 мин в первые два стакана при-
бавляют по 10 см3 ферментного раствора, а в другие
два — по 10 см3 инактивированного фермента (общий
объем реакционной смеси должен быть равен 30 см3-
Если для испытания берут менее 10 см3 ферментного
раствора, то недостающий объем дополняют дистилли-
рованной водой, которую вводят перед добавлением
ферментного раствора).
Через 1 ч после введения фермента пробу вынимают
из термостата и быстро титруют из микробюретки 0,1 н-
56
крахмала ферментами
декстринов различной
характеризует способ-
на гидролизе
комплекса до
57
Приготовление 1%-ного раствора крахмала (су ПРпеносят в мерную колбу вместимостью см , Д
страт). 1 г крахмала с учетом влажности помешают пат дистиллированной водой до метки, Д^ре- |
мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 25 с-.,, при необходимости фильтруют. Основной р т р ф р
воды и перемешивают. Затем добавляют в колбу ец< рентного препарата может храниться в течен
25 см3 воды, помещают колбу с содержимым в кипящу} суток при температуре от +2^до^--4^-	___________
водяную баню, непрерывно перемешивая до полного ра. "	” """""""
творения крахмала. После этого содержимое
охлаждают, добавляют 10 см3 ацетатного буферног
раствора с pH 4,7, объем жидкости доводят до метк
дистиллированной водой и содержимое колбы персхц
шивают. Раствор крахмала готовят в день проведенл
анализа.
Приготовление растворов йода. Для приготовлснп
основного раствора 0,5 г йода и 5 г йодида калия ра,
творяют в бюксе с притертой крышкой в малом код
честве воды. Содержимое осторожно перемешивают пр
плотно закрытой крышке бюкса. Раствор после полю
го растворения йода переносят в мерную колбу с пр?
тертой крышкой вместимостью 200 см3, объем доводя
дистиллированной водой до метки. Основной раствс
хранят в темноте и используют в течение 1 мес.
Для приготовления рабочего раствора йода 2 см3 о;
новного раствора разводят 0,1 н. раствором соляной кис
лоты в мерной колбе вместимостью 100 см3. Перед упо
треблением рабочего раствора фотоэлектроколоримес
ром проверяют его оптическую плотность, пользуясь све
тофильтром с' максимумом светопропускания при 7=
= 453 нм и кюветами с толщиной поглощающего све
слоя 1 см. Оптическая плотность раствора йода долж
на быть равна 0,160±0,01. Оптическая плотность рабе
чего раствора йода на ФЭК-60, ФЭК-56, ФЭК-56М со
ставляет 0,220±0,01. В случае отклонения оптическо!
плотности раствора от этой величины добавляют к рас
твору несколько капель кислоты или основного раствс
ра йода.
Все пипетки, используемые при испытании, должн-1
иметь ватные тампоны (во избежание попадания в ра£
твор слюны, содержащей амилазу).
Приготовление растворов ферментного препарат’
Для приготовления основного раствора 0,1 г исслеДУ’
мого препарата взвешивают в стаканчике вместимость’
25—30 см3. Навеску тщательно растирают стеклянн01
палочкой с небольшим количеством воды, количествен!)1
58
Рабочий раствор фермента готовят из основного рас-
колб. твора, разбавляя его так, чтобы в 5 см3 рабочего раство-
ра содержалось такое количество фермента, которое
обеспечивает в принятых условиях гидролиз крахмала
от 20 до 70%- Для этого берут различное количество
основного раствора (в зависимости от активности иссле-
дуемого препарата) и разбавляют его водой до 50 см3
(при испытании препарата с активностью от 20 до
700 ед./г) и до 200 см3 (при активности 700 ед./г и
выше).
Количество основного раствора препарата, которое
необходимо взять для приготовления рабочего раствора
фермента, находят по табл. 3.
Таблица 3
Зависимость количества основного раствора на разбав 1ение
от активности препарата
Амилолитическая активность препарата, ед./г (предполагаемая)	Количество препарата в 5 см3 рабочего раствора, мг	Количество основного раствора, необхо- димое для вторичного разбавления, см3	Общий объем разбавленного раствора, см3
20—80	5,0	50	50
81—150	2,0	20	50
151—300	1,0	10	50
301—700	0,5	5	50
701 — 1200	0,25	10	200
1201—2500	0,125	5	200
2501—5000	0,05	2	200
Свыше 5000	0,025	1	200
Приготовление растворов		из культуры	гриба. Для
ГОт„ОВЛения основного раствора (вытяжки) 5 г иссле-
^Уемой культуры гриба, предварительно растертой в
пЛПКе’ взвешивают в стаканчике вместимостью 50 см3,
ДоГОСЯТ В К0НИЧе0КУЮ колбу вместимостью 250 см3,
ивляют 90 см3 дистиллированной воды и 10 см3 аце-
59
татного буфера с pH 4,7. Смесь выдерживают в теч^
ние 1 ч в термостате при температуре 30°С, периодпче
ски перемешивая, и затем фильтруют. Фильтрат исполь.
зуют в качестве основного раствора.
Рабочий раствор культуры гриба готовят из основ
ного раствора. В. зависимости от активности исследуй
мой культуры гриба рабочий раствор разбавляют др
стиллированной водой до 100 см3 (при испытании ку.д.
туры гриба с активностью от 5 до 100 ед./г) и до 200 см
(при активности 100 ед./г и выше).
Количество основного раствора культуры гриба, ко-
торое необходимо взять для приготовления рабочей
раствора, находят по табл. 4.
Таблица 4
Зависимость количества основного раствора на разбавление
от активности культуры
Амилолитическая активность культуры гриба, ед./г (предполагаемая)	Количество культуры в 5 см8 рабочего раствора, мг	Количество основного раствора, необходимое для вторичного разбавления, см3	Общий объем разбавленного раствора, см3
5—15	37,5	15	100
16-50	10,0	4	100
51 — 100	2,5	1	100
101 — 150	1,25	1	200
151—300	0,625	0,5	200
Техника определения. В две пробирки диаметром 2
и высотой 18 см наливают по 10 см3 1%-ного раствора
крахмала и ставят их в ультратермостат или водяную
баню с температурой 30±0,2°С на 5—10 мин. Затем, №
вынимая пробирок из термостата, наливают в первую
пробирку 5 см3 дистиллированной воды (контрольная),
во вторую — 5 см3 ферментного раствора (опытная)
Смеси быстро перемешивают и выдерживают в ультра-
термостате 10 мин (по секундомеру). Затем из реакци-
онных смесей (контрольного и опытного растворов) от-
бирают по 0,5 см3 раствора и переносят их в колбы с
предварительно налитыми туда 50 см3 рабочего раство-
ра йода. Содержимое колб перемешивают. Получений
60
растворы приобретают следующую окраску: контроль-
ный—синюю, опытный — фиолетовую различной интен-
сивности в зависимости от количества непрогидролизо-
ванного крахмала.
Непосредственно после смешивания растворов опре-
деляют их оптическую плотность на фотоэлектроколори-
метре, используя светофильтр с максимумом светопро-
пускания при Х = 656 нм, пользуясь кюветами с толщи-
ной поглощающего свет слоя 1 см. Контрольным рас-
твором при колориметрировании исследуемых растворов
является дистиллированная вода.
Оптическая плотность контрольного раствора Di со-
ответствует количеству исходного крахмала субстрата.
Оптическая плотность опытного раствора соответ-
ствует количеству крахмала, оставшегося после действия
фермента. Разница между показателями оптических
плотностей растворов соответствует гидролизованному
количеству крахмала субстрата.
Количество гидролизованного крахмала С (в г) опре-
деляют по формуле С = 0,1 (£>i—D2) :Di, где 0,1 —коли-
чество крахмала, взятое для испытания в качестве суб-
страта, г.
Если количество гидролизованного крахмала меньше
0,02 или больше 0,07 г, то испытание повторяют. Для
этого при приготовлении рабочего раствора фермента
берут большее или меньшее количество исходного рас-
твора для разбавления.
Если в результате ферментативной реакции количе-
ство превращенного крахмала находится в указанных
пределах, полученные данные используют для расчета
амилолитической активности.
Амилолитическую активность АС (в ед./г) препара-
тов бактериального происхождения определяют по фор-
муле АС= (5,885С +0,001671) 1000 : п, а амилолитиче-
скую активность ACt (в ед./г) препаратов грибного про-
исхождения— по формуле ACi= (7,264С—0,03766) 100 :
А где 5,885; 0,001671; 7,264; 0,03766 — коэффициенты
Расчетного уравнения, полученные при математической
обработке экспериментальных данных зависимости ко-
личества гидролизованного крахмала от количества фер-
мента, взятого для испытания. В коэффициенты введен
множитель для пересчета на 1 ч действия фермента; С—
оличество прогидролизованного крахмала, г; 100,
61
1 000 — коэффициенты пересчета миллиграммов в Грам,
мы; п— количество ферментного препарата, взятое дл«
испытания, мг.
КАПЕЛЬНЫЙ МЕТОД
(ПО КЛИМОВСКОМУ И РОДЗЕВИЧ)
Амилолитическая активность, обусловленная в основ,
ном наличием в препарате а-амилазы, характеризует
способность фермента катализировать гидролиз крахма-
ла до неокрашиваемых йодом продуктов. При нали-
чии в препарате а-амилазы и глюкоамилазы этим мето-
дом определяется суммарное действие всех амилолити-
ческих ферментов.
За единицу амилолитической активности в этом ме-
тоде принято такое количество фермента, которое ката-
лизирует расщепление 1 г растворимого крахмала до
продуктов, неокрашиваемых йодом, за 1 ч при темпе-
ратуре 30°С в строго определенных условиях. Амилоли-
тическую активность АС выражают числом указанных
единиц в 1 г препарата, культуры или 1 см3 раствора.
АС показывает, сколько граммов крахмала может быть
гидролизовано до неокрашиваемых йодом продуктов 1г
препарата, культуры или 1 см3 раствора за 1 ч в усло-
виях определения. Конец реакции контролируют визу-
ально по йодной пробе.
Чувствительность метода определяют минимальным
количеством времени, за которое можно визуально уло-
вить изменение окраски йода. Допускают, что скорость
ферментативной реакции прямо пропорциональна коли-
честву примененного фермента и остается постоянной на
протяжении от 5 мин до 1 ч, т. е. реакция подчиняется
закону реакции нулевого порядка. Кроме того, установ-
лено влияние величины pH и химической природы буфе-
ра на величину АС. С ацетатным буфером (pH 4,7) ве-
личина АС у грибных препаратов в среднем в 1,5 раза
выше, чем при определении с фосфатным буфером
(pH 6,0). Поэтому при определении АС грибных куль-
тур рекомендуется брать ацетатный буфер.
Недостатком метода является нечеткость визуаль-
ного определения конца реакции.
Необходимые реактивы. Ацетатный буфер с pH
для ферментов грибного происхождения; фосфатный бу-
62
фер с pH 6,0 для ферментов бактериального происхож-
дения; 1%-ный раствор крахмала (раствор крахмала,
употребляемый для анализа грибных препаратов, дол-
жен иметь pH 4,7, для анализа бактериальных препа-
ратов— 6,0); растворы йода — для приготовления основ-
ного раствора йода в тарированный стаканчик с притер-
той крышкой отвешивают 4,4 г йодида калия, 1,4 г ме-
таллического йода и добавляют около 2,0 см3 дистилли-
рованной воды. Стаканчик закрывают крышкой, содер-
жимое перемешивают и по растворении йода переводят
раствор в мерную колбу на 100 см3 с притертой проб-
кой. Доводят объем дистиллированной водой до метки.
Содержимое колбы хранят в темном прохладном месте.
Основным раствором йода можно пользоваться в тече-
ние 30 дней со дня его приготовления. Рабочий раствор
йода готовят из основного раствора: для этого 20 см3
основного раствора йода наливают в мерную колбу вме-
стимостью 100 см3, добавляют 4,4 г KJ и доводят объем
раствора до 100 см3. Рабочий раствор йода может упо-
требляться в течение 6 дней после его приготовления.
Техника определения. Для определения АС важно
строго соблюдать температурные условия реакции. Для
этого предварительно все растворы — субстрат (1%-ный
раствор крахмала), раствор фермента и дистиллирован-
ная вода —должны быть нагреты до 30°С.
25 см3 субстрата помещают в широкую пробирку, в
которую вставлена стеклянная палочка. 30 см3 вытяжки
и 30 см3 воды наливают в отдельные пробирки, поме-
щают в ультратермостат и выдерживают при температу-
ре 30°С в течение 10 мин.
Затем в широкую пробирку к раствору крахмала, не
вынимая пробирок из термостата, с помощью пипеток
Добавляют от 1 до 25 см3 исходного ферментного раство-
ра и соответствующее количество воды так, чтобы общий
объем реакционной смеси был 50 см3. Если ферментная
вытяжка малоактивна, то можно внести только ее в
количестве 25 см3, а воду вообще не добавлять.
Содержимое в пробирке перемешивают палочкой и
отмечают время по секундомеру, когда была добавлена
вытяжка к раствору крахмала. Каждые 60 с из пробир-
Кй> не вынимая ее из термостата, отбирают палочкой
каплю пробы. Каплю помещают на белую фарфоро-
вУю пластину, соединяют эту каплю с каплей рабочего
63
г
раствора йода и наблюдают окраску. Реакция расщеп-
ления крахмала считается оконченной, когда йод пере,
стает давать изменение окраски при соединении с кап.
лей испытуемого раствора в течение первых 10 с. Изме-
нение окраски йода отчетливо видно на границе сопри-
косновения двух капель — йода и реакционной смеси.*
Время, за которое происходит расщепление крахма-
ла до продуктов, не окрашивающихся йодом, должно
быть в пределах 10—20 мин.
Если время гидролиза крахмала менее 10 мин, тс
определение повторяют, беря на гидролиз меньше вы-
тяжки и больше воды. Если гидролиз крахмала не за-
канчивается в течение 20 мин, то анализ также повторя-
ют, беря на определение больше ферментной вытяжке
и меньше воды. Количество ферментной вытяжки, ко-
торое необходимо брать на повторный анализ, вычис-
ляют с учетом полученного времени гидролиза.
Если ферментная вытяжка имеет малую или слиш-
ком высокую активность и количество ферментного рас-
твора от 1 до 25 см3 не обеспечивает длительности гид-
ролиза крахмала в течение 10—20 мин, для анализа
берут не 25 см3 раствора крахмала, а большее или мень-
шее его количество, например 10 или 40 см3, внося соот-
ветствующую поправку в расчетную формулу (соответ-
ственно 0,1 или 0,4 вместо обычных 0,25 г).
Величину амилолитической активности АС (в ед./г)
рассчитывают по формуле АС = 0,25-60/(пт), где 0,25-
количество крахмала, которое находится в 25 см3 его
1%-ного раствора, г; 60 —пересчет на 1 ч; « — количе-
ство фермента, участвующего в реакции, г или см3 (эта
величина определяется с учетом концентрации исходной
вытяжки и последующего разведения); т — время, за ко-
торое произошло расщепление крахмала до неокраши-
ваемых йодом продуктов, мин.
Пример. Для анализа приготовлена ферментная вытяжка 5
воздушно-сухой культуры гриба. Исходный раствор приготовш-'
из расчета 5 г культуры на 100 см3 забуференной воды; Известие
что данная культура очень активна, поэтому сделано дополнитель-
ное разведение исходного раствора: 20 см3 доведено в мерной ко’'
бе до 50 см3 дистиллированной водой и оттуда па анализ взят5
2 см3, т. е. получена такая последовательность разведений: 5 г-*
->100 см3->20 см3->50 см’->-2 см3.
Для гидролиза 0,25 г крахмала (25 см3 1%-ного раствора крзХ'
мала) ферментным раствором последнего разведения (2 см3) потре'
64
бова-лось 12 мин. Тогда АС воздушно-сухой культуры составит
0,25-60-50-100-16(12-2-20-5) =31,25 ед./г. '
При пересчете ферментативной активности на абсолютно сухое
вещество ферментного препарата следует учитывать влажности и
производить пересчет по формуле: АСсв = АС-(1ОСИ(1О0—IE), где
1)7—влажность культуры или препарата, %.
Определение глюкоамилазной
активности (ГлА)
Метод основан на количественном определении глю-
козы, образующейся при гидролизе растворимого крах-
мала ферментом глюкоамилазой. Глюкоамилазная ак-
тивность ГлА характеризует способность ферментного
препарата катализировать расщепление растворимого
крахмала до глюкозы и выражается числом единиц ак-
тивности в 1 г препарата.
За единицу глюкоамилазной активности принято та-
кое количество фермента, которое, гидролизуя раствори-
мый крахмал при температуре 30°С и pH 4,7 в течение
1 мин, освобождает 1 мкмоль глюкозы.
Фермент глюкозооксидаза катализирует окисление
d-глюкозы кислородом воздуха до глюконовой кислоты.
Вторым продуктом реакции является пероксид водоро-
да. Оба конечных продукта образуются в количествах,
эквимолярных окисленной глюкозе. Пероксид водорода
под влиянием фермента пероксидазы окисляет гексациа-
но-(II)-феррат калия (калий железистосинеродистый,
желтая кровяная соль), который переходит в ферроциа-
нид калия, окрашенный в лимонно-желтый цвет. Интен-
сивность окраски .пропорциональна количеству образую-
щейся глюкозы.
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор крахмала
(субстрат, употребляемый для анализа грибных препа-
ратов, например Asp. niger, Asp. awamori, должен иметь
pH 4,7, что достигается добавлением ацетатного буфера
с pH 4,7; для анализа дрожжевых препаратов, например
Endomycopsis sp. 20-9, pH субстрата должен быть ра-
вен 5,6, что достигается добавлением фосфатного буфе-
ра с pH 5,6); 1 М фосфатный буферный раствор с pH
'>5—смешивают равные объемы КН2РО4 (136 г безвод-
ного КН2РО4 в 1 дм3 дистиллированной воды) и КОН
(об г КОН в 1 дм3 дистиллированной воды); насыщен-
ная бензойная кислота — 2,7 г бензойной кислоты рас-
3 Зак, 791
65
творяют в дистиллированной воде в мерной колбе на
1 дм3; 0,1%-ный раствор глюкозы в бензойной кислоте;
рабочий раствор ферментных препаратов (раствор С) —
готовят смешиванием равных объемов раствора Д
(0,1 г гексациано-(II)-феррата калия растворяют в воде
в мерной колбе вместимостью 100 см3; раствор готовят
непосредственно перед определением) и Б (5,6 мг глюко-
зооксидазы, соответствующих 500—600 ед./г фермента-
тивной активности при активности глюкозооксидазы
10000 ед./г, растворяют в 1 М. фосфатном буфере с
pH 7,5 в мерной колбе на 50 см3, затем добавляют
2 мг пероксидазы. Объем доводят до метки 1 М. фосфат-
ным буфером). Полученный раствор хранят в темной
склянке в холодильнике в течение 2—3 сут.
Техника определения. 5 см3 исследуемого раствора
ферментного препарата, нагретого до 30°С, приливают
к 10 см3 1%-ного раствора крахмала, нагретого до этой
же температуры, и инкубируют 10 мин в ультратермо-
стате при 30°С. Точно через 10 мин отбирают 1 см3 гид-
ролизата, переносят его в маленькую пробирку, поме-
щенную в кипящую водяную баню, инактивируют фер-
мент в течение 2 мин и затем охлаждают холодной во-
дой. Для определения содержания глюкозы в каждую
пробирку с охлажденным гидролизатом вносят по 3 см3
рабочего раствора С, перемешивают и оставляют на
45 мин при комнатной температуре.
Одновременно с исследуемой пробой готовят конт-
рольную. Для этого 5 см3 раствора ферментного препа-
рата кипятят на водяной бане в течение 10 мин (для
инактивации фермента), затем раствор охлаждают и до-
бавляют 10 см3 1%-ного раствора крахмала.
Все последующие операции с контрольными пробами
проводят так же, как с опытными.
Кроме указанной контрольной пробы на инактивиро-
ванный фермент ставят контрольную пробу на рабочий
раствор С. Для этого к 3 см3 рабочего раствора прили-
вают 1 см3 дистиллированной воды.
Интенсивность окраски полученных растворов опре-
деляют на фотоэлектроколориметрах ФЭК-56, пользуясь
светофильтром с Л = 400 нм, и ФЭК-60 — при Z = 390 и
418 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя
10 мм.
66
Для построения градуировочной кривой используют
стандартные растворы глюкозы, содержащие в 1 см3 50,
100 и 150 мкг глюкозы. К 1 см3 раствора глюкозы до-
бавляют 3 см3 рабочего раствора С. Окраска развивает-
ся в течение 45 мин, после чего измеряют оптическую
плотность растворов на фотоэлектроколориметре. По по-
лученным значениям строят градуировочную кривую,
откладывая по оси абсцисс количество глюкозы, по оси .
ординат — соответствующую оптическую плотность. Ра-
бочая зона градуировочной кривой лежит в области
10—150 мкг.
Если контрольные пробы на инактивированный фер-
мент имеют заметную окраску, исследуемый раствор ко-
лориметрируют, взяв в качестве раствора сравнения ра-
бочий раствор. Величина оптической плотности должна
лежать в рабочей зоне градуировочной кривой, т. е. в
пределах оптической плотности, соответствующей коли-
честву глюкозы от 10 до 150 мкг.
Если при измерении интенсивности окраски исследуе-
мой пробы полученные значения не укладываются в
градуировочную кривую, опыт повторяют с меньшим ко-
личеством исследуемого ферментного препарата.
По полученным значениям экстинкций исследуемой
пробы находят количество глюкозы, образовавшейся в
результате действия фермента.
Глюкоамилазную активность ГлА (в ед./г или
ед./см3) определяют по формуле ГлА=а/(Ь-180-10),
где а —количество глюкозы, образовавшейся в 1 см3
гидролизата за счет действия фермента, мкг; b — коли-
чество фермента в 1 см3 гидролизата, г или см3; 180 —
молекулярная масса глюкозы (пересчет микрограммов в
микромоли); 10 — время гидролиза, мин.
Пример. 100 мг препарата растворили в колбе вместимостью
100 см3 и довели объем до метки дистиллирован,ной водой. Затем
15 см3 приготовленного раствора внесли в мерную колбу вмести-
мостью 100 см3 и довели объем до метки дистиллированной водой.
На определение взяли 5 см3 исследуемого раствора; объем реак-
ционной смеси 15 см3. Определяем количество фермента в гидро-
-^ООООб соот®е'гствии с Разведением: 0,1 15-5,0/(1’001- 10Ю-;1Б) ==
В результате колориметрирования этого раствора получена ве-
личина £>=0,173. По градуировочной кривой эта величина соответ-
твует 87 мкг глюкозы. Подставляя ее в формулу, определяем зна-
ение глюкоамилазной активности (в ед./г): ГлА=87/(0;ООООб-18Й-
•10) =967.
3*	67
fit
Определение осахаривающей
активности (ОС)
Метод основан на гидролизе растворимого крахмала
в пределах 25% гликозидных связей исследуемым фер-
ментом с последующим йодометрическим определением
количества образовавшихся сахаров.
Осахаривающая активность ОС характеризует спо-
собность амилолитических ферментов катализировать
осахаривание крахмала до восстанавливающих саха-
ров— мальтозы или мальтозы в смеси с глюкозой.
За единицу осахаривающей активности принято та-
кое количество фермента, которое в строго определен-
ных условиях за 1 мин при 30°С катализирует расщеп-
ление до восстанавливающих сахаров 1 мкэкв гликозид-
ных связей. ОС выражается в ед./г.
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор крахмала
(субстрат); ацетатный буферный раствор с pH 4,7; 0,1 н.
раствор йода — 25 г йодида калия растворяют в мерной
колбе вместимостью 1 дм3 в минимальном количестве
дистиллированной воды, туда же вносят 12,7 г йода и
доводят дистиллированной водой до метки; 0,1 н. рас-
твор тиосульфата натрия (гипосульфита) —25 г Na2S2O3
растворяют в мерной колбе вместимостью 1 дм3 в ди-
стиллированной воде, не содержащей СО2, хранят в
склянке из темного стекла с сифоном и бюреткой с
хлоркальциевой трубкой, заполненной натронной изве-
стью, титр устанавливают обычным методом по дихро-
мату калия; раствор серной кислоты (1:4) —к четырем
объемам дистиллированной воды приливают один объем
концентрированной H2SO4; 0,1 н. раствор NaOH или
КОН — 4 г гидроксида натрия или 5,6 г гидроксида ка-
лия растворяют в дистиллированной воде в мерной кол-
бе вместимостью 1 дм3, объем доводят до метки; 1 н.
раствор НС1 — 82,2 см3 концентрированной соляной кис-
лоты разбавляют дистиллированной водой в мерной
колбе вместимостью 1 дм3; фосфатный буферный рас-
твор с pH 6,0 — готовят смешиванием девяти объемов
раствора А (9,077 г КН2РО4 растворяют в дистиллиро-
ванной воде в мерной колбе вместимостью 1 дм3) и од-
ного объема раствора Б (11,876 г Na2HPO4 растворяют
в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью
1 дм3).
Техника определения. При анализе культур и препа-
ратов из грибов, например Aspergillus oryzae, в эрлен-
мейеровские колбы вместимостью 50 см3 вводят пипет-
кой по 20 см3 1 %-ного раствора крахмала и погружают
их в водяную баню с температурой 30±0,2°С. Через
10 мин в колбы добавляют от 1 до 10 см3 ферментного
раствора и тщательно перемешивают. Общий объем ре-
акционной смеси должен быть 30 см3. Если на определе-
ние берут меньше 10 см3 раствора фермента, то недо-
стающий объем дополняют дистиллированной водой, ко-
торую вводят непосредственно перед добавлением фер-
ментного раствора.
Через 10 мин после добавления ферментного раство-
ра действие фермента приостанавливают добавлением
2 см3 1 н. раствора НС1.
Для определения образовавшейся мальтозы содержи-
мое колбы после осахаривания количественно переносят,
смывая дистиллированной водой, в коническую колбу
вместимостью 300—400 см3, туда же добавляют пипет-
кой 20 см3 0,1 н. раствора йода и 60 см3 0,1 н. раствора
NaOH или КОН. Щелочь приливают по каплям при пе-
ремешивании, затем колбу накрывают часовым стеклом
и оставляют на 15 мин в защищенном от света месте.
Через 15 мин вводят 2 см3 H2SO4 (1:4) и титруют выде-
лившийся йод 0,1 н. раствором тиосульфата натрия.
Одновременно ставят контрольный опыт в конической
колбе с теми же количествами всех реагентов, только
ферментный раствор вводят после добавления 2 см3 1 н.
раствора НС1 (без выдержки в водяной бане).
Расхождение между результатом титрования конт-
рольного и опытного растворов должно составить 0,5—
6,0 см3 0,1 н. раствора тиосульфата натрия. Если рас-
хождение меньше 0,5 или больше 6 см3, то анализ по-
вторяют с большим или меньшим количеством фермент-
ного раствора.
При определении осахаривающей активности бакте-
риальной культуры, например Вас. subtilis, вводятся
следующие дополнения:
Для приготовления 1 %-ного раствора крахмала в ка-
честве буферного раствора используют фосфатный бу-
ферный раствор с pH 6,0. В 100 см3 раствора крахмала
Должно быть 10 см3 фосфатного буферного раствора,
68
69
после введения 20 см3 0,1 н. раствора йода к смеси
добавляют 52,5 см3 0,1 н. раствора NaOH или КОН.
Осахаривающую активность ОС\ (в ед./г) в культу-
рах и препаратах Aspergillus oryzae определяют по фор-
муле ОСу=е/ (mt), где е — количество единиц активно-
сти, найденное по табл. 5 в соответствии с результатами
Таблица 5
Перевод количества 0,1 н. раствора тиосульфата натрия
в единицы ОС
Количество 0J и. раствора тиосуль- фата Na, см3	Единицы, ос (О	Количество 0,1 н. раствора тиосуль- фата Na, см3	Единицы ОС (е)	Количество 0,1 и. раствора тиосуль- фата Na, см3	Единицы ОС (е)
о,1	5,0	2,1	118,9	4,1	273,8
0,2	10,0	2,2	125,5	4,2	283,2
0,3	15,0	2,3	132,1	4,3	292,8
0,4	20,2	2,4	138,9	4,4	302,7
0,5	25,5	2,5	145,8	4,5	312,8
0,6	30,8	2,6	152,8	4,6	323,1
0,7	36,2	2,7	159,9	4,7	333,6
0,8	41,6	2,8	167,1	4,8	344,4
0,9	47,0	2,9	174,5	4,9	355,5
1,0	52,6	3,0	181,9	5,0	366,9
1,1	58,2	3,1	189,5	5,1	378,6
1,2	63,9	3,2	197,2	5,2	390,6
1,3	69,7	3,3	205,1	5,3	402,9
1,4	75,5	3,4	213,1	5,4	415,6
1,5	81,5	3,5	221,3	5,5	428,8
1,6	87,6	3,6	229,6	5,6	442,3
1,7	93,6	3,7	238,1	5,7	456,2
1,8	99,8	3,8	246,8	5,8	470,6
1,9	106,1	3,9	255,6	5,9	485,0
2,0	112,5	4,0	264,6	6,0	501,2
титрования (разность титрований контрольного и опыт-
ного растворов 0,1 н. раствором тиосульфата натрия),
микроэквивалент гликозидных связей; т — навеска пре-
парата, г; t — время гидролиза, мин.
Осахаривающую активность ОСг (в ед./г) в культу-
рах и препаратах Aspergillus awamori определяют по
формуле ОСг= (К—0)50/(mt), где (К—О)—разность
титрований контрольного и опытного растворов 0,1 н.
раствором тиосульфата натрия, см3; 50—коэффициент
пересчета на микроэквивалент гликозидных связей.
70
Расхождение результатов титрований контрольного и
опытного растворов не должно превышать 6,0 см3 0,1 н.
раствора Na2S2O3 (1 см3 0,1 н. раствора тиосульфата
натрия соответствует для данного количества субстрата
гидролизу 4% гликозидных связей). Если оно меньше
0,5 или более 6,0 см3, то определение повторяют с боль-
шим пли меньшим количеством препарата.
Осахаривающую активность ОС3 (в ед./г) в культу-
рах и препаратах Bacillus subtilis определяют по фор-
муле ОС3 = е}/(mt), где — количество единиц активно-
сти, найденное по табл. 6 в соответствии с результатами
Таблица 6
Перевод количества 0,1 н. раствора тиосульфата натрия
в единицы ОС
Количество 0,1 н. раствора тиосуль- фата Na, см3	Единицы ОС (cj	Количество 0.1 н. раствора тиосуль- фата Na, см3	Единицы ОС (ej	Количество 0,1 н. раствора тиосуль- фата Na, см3	Единицы ОС
0,9	45,0	2,0	113,1	3,1	250,6
1,0	52,1	2,1	119,9	3,2	278,2
1,1	58,7	2,2	128,8	3,3	312,1
1,2	63,3	2,3	138,0	3,4	366,2
1,3	67,8	2,4	150,3	3,5	452,3
1,4	74,7	2,5	158,3	3,6	517,9
1,5	81,4	2,6	169,7	3,7	585,7
1,6	85,9	2,7	180,9	3,8	662,7
1,7	92,7	2,8	192,3	3,9	740,3
1,8	99,6	2,9	209,9	4,0	811,9
1,9	108,5	3,0	226,1	4,1	891,6
				4,2	968,1
титрования (разность титрований контрольного и опыт-
ного растворов 0,1 н. раствором тиосульфата натрия),
микроэквивалент гликозидных связей.
Определение мальтазной
активности (МС)
Метод основан на гидролизе мальтозы исследуемым
Ферментом с последующим йодометрическим определе-
нием образующихся сахаров.
Мальтазная активность ЛАС характеризует способ-
ность ферментного препарата катализировать расщеп-
71
ление дисахарида мальтозы до глюкозы и выражается
числом единиц мальтозы в 1 г препарата.
За единицу мальтазной активности принято такое
количество фермента, которое в строго определенных
условиях за 1 ч при 30°С катализирует расщепление
1 г мальтозы до глюкозы при степени гидролиза 30%.
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор мальтозы
(субстрат) — 1,05 г чистой мальтозы (моногидрата) рас-
творяют в дистиллированной воде, добавляют 10 см3
ацетатного буферного раствора с pH 4,7 и доводят объ-
ем водой до метки в мерной колбе вместимостью 100 см3;
1 н. ацетатный буферный раствор с pH 4,7; 1%-ный рас-
твор крахмала (индикатор); 0,1 н. раствор тиосульфата
натрия; раствор серной кислоты (1:4); 0,1 н. раствор
NaOH или КОН; 1 н. раствор НС1; 0,1 н. раствор йода.
Техника определения. В две пробирки длиной 18 и
диаметром 2 см вводят пипеткой по 10 см3 1%-ного рас-
твора мальтозы. Пробирки с субстратом помещают на
10 мин в термостат с температурой 30±0,2°С. Через
10 мин в пробирки вводят от 1 до 5 см3 исследуемого
ферментного раствора. Общий объем реакционной сме-
си должен быть 15 см3. Если на определение берут мень-
ше 5 см3 ферментного раствора, недостающий объем до-
полняют дистиллированной водой непосредственно перед
введением ферментного раствора.
Через 1 ч после введения фермента действие его
приостанавливают добавлением 2 см3 1 н. раствора НС1.
Содержимое пробирок после осахаривания количест-
венно переносят, смывая дистиллированной водой, в ко-
ническую колбу вместимостью 300—400 см3, туда же до-
бавляют пипеткой 20 см3 0,1 н. раствора йода и сразу
же 60 см3 0,1 н. раствора NaOH или КОН. Щелочь при-
ливают по каплям при перемешивании. Затем колбу на-
крывают часовым стеклом и оставляют на 15 мин в за-
щищенном от света месте. Через 15 мин вводят 2 см3
серной кислоты (1:4) и титруют выделившийся йод
0,1 н. раствором тиосульфата натрия в присутствии ин-
дикатора— раствора крахмала.
Одновременно с основным опытом ставится конт-
рольный, в котором к 10 см3 1%-ного раствора мальто-
зы добавляют сначала 2 см3 1 н. раствора НС1, а затем
ферментный раствор. По разности между количеством
0,1 н. раствора тиосульфата натрия, израсходованного
72
на титрование контрольного ц основного опыта, опреде-
ляют количество гидролизованной мальтозы. Титрова-
ние контрольных опытов проводят в течение 1 ч.
Расхождение между результатами титрования конт-
рольного и основного опытов должно составлять не ме-
нее 0,5 и не более 4,4 см3 0,1 н. раствора Na2S2O3, что
соответствует гидролизу мальтозы в пределах 8—75%.
Мальтазную активность МС (в ед./г или ед./см3)
ферментных препаратов определяют по формуле МС =
= е-5Р/(т1000), где е — величина активности, найден-
ная по табл. 7 в соответствии с результатами титрова-
Перевод количества 0,1 в единицы МС		Таблица 7 н. раствора тиосульфата натрия			
Количество 0,1 и. раствора тиосуль- фата Na, см3	Единицы МС (М	Количество 0.1 и. раствора тиосуль- фата Na, см3	Единицы МС (е)	Количество 0,1 н. раствора тиосуль- фата Na, см3	Единицы МС (с)
0,5	1,51	1,8	6,19	3,1	12,71
0,6	1,82	1,9	6,61	 3,2	13,34
0,7	2,15	2,0	7,05	3,3	13,98
0,8	2,47	2,1	7,49	3,4	14,66
0,9	2,81	2,2	7,94	3,5	15,35
1,0	3,16	2,3	8,41	3,6	16,10
1,1	3,51	2,4	8,89	3,7	16,87
1,2	3,86	2,5	9,39	3,8	17,67
1,3	4,23	2,6	4,90	3,9	18,51
1,4	4,61	2,7	10,43	4,0	19,40
1,5	4,99	2,8	10,97	4,1	20,34
1,6	5,38	2,9	11,53	4,2	21,38
1,7	5,78	3,0	12,11	4,3	22,38
ния (разность титрований контрольного и опытного ра-
створов 0,1 н. раствором 'Na2S2O3); Р — разведение; т —
количество ферментного раствора, взятое для испытания,
см3; Ю00 — перевод миллиграммов в граммы.
Определение активности
глюкозоизомеразы (ГлИ)
Метод основан на изомеризации раствора D-глюко-
зы с определением образовавшегося количества D-
Фруктозы.
73
За единицу активности глюкозоизомеразь! принима-
ется такое количество фермента, которое обеспечивает
превращение 1 ммоля £)-глюкозы в D-фруктозу за 1 ц
при температуре 70°С и pH реакционной смеси 7,5.
Необходимые реактивы. Смесь для проведения изо-
меризации— 2,5 см3 0,2 М фосфатного буфера с pH 7,0,
1 см3 1,0 М раствора D-глюкозы, 0,5 см3 0,1 М раствора
MgSO4-7H2O; 1,5%-ный раствор хлорида цистеина;
0,12%-ный раствор карбазола в спирте; H2SO4 (190см:|
дистиллированной воды и 450 см3 концентрированной
H2SO4); 0,5 М раствор НС1.
Техника определения. В пробирку вносят последова-
тельно смесь для изомеризации и ферментный раствор
(его объем не должен превышать 6 см3). Общий объем
должен быть равен 10 см3. Если ферментного раствора
вносят меньше 6 см3, то недостающее количество заме-
няют дистиллированной водой.
После внесения ферментного раствора содержимое
пробирки тщательно перемешивают и сразу же отби-
рают 2 см3, которые переносят в пробирку с 2 см3 0,5М
раствора НС1. Данная проба является контрольной.
Оставшееся количество смеси (8 см3) инкубируют в
термостате при 70 °C в течение 60 мин (опытная
проба).
Образцы контрольной и опытной проб разводят во-
дой с таким расчетом, чтобы содержание сахаров в них
в пересчете на фруктозу составляло от 10 до 60 мкг/см3,
и определяют в обеих пробах содержание фруктозы ци-
стеин-карбазольным методом. Для этого к 1 см3 иссле-
дуемого разведенного образца приливают 0,2 см3 раство-
ра хлорида цистеина, 6 см3 H2SO4 и 0,2 см3 раствора
карбазола.
Содержимое пробирки тщательно перемешивают и
помещают в водяную баню с температурой 40 °C па
30 мин. Ровно через 30 мин пробирку помещают в ле-
дяную баню (/ = 0°С).
Измерение оптической плотности исследуемого об-
разца проводят при Л=560 нм против контрольного об-
разца в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя
10 мм. Зная показания оптической плотности, по калиб-
ровочной кривой находят содержание фруктозы в рас-
творе.
74
Определение активности липазы ,(ЛС)
(модифицированный метод Ота, Ямада)
За единицу ферментативной активности липазы при-
нимают такое количество фермента, которое освобожда-
ет 1 мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии
оливкового масла при pH 7,0 и температуре 37°С в те-
чение 1 ч.
Метод основан на определении путем титрования
щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием
липазы при использовании в качестве субстрата олив-
кового масла.
Необходимые реактивы. Раствор оливкового масла
(субстрат); 2%-ный раствор поливинилового спирта;
1 н. раствор НС1; 0,05 н. раствор NaOH; фосфатно-цит-
ратный буфер с pH 7,0; 1%-ныи раствор фенолфталеи-
на; 90%-ный раствор спирта; 1%-ный раствор фер-
мента.
Приготовление субстрата. 100 см3 оливкового масла
смешивают со 150 см3 2 %-ного раствора поливинилово-
го спирта в эмульгаторе. Полученную эмульсию выдер-
живают на льду в течение 60 мин. Если расслаивания
не наблюдается, субстрат пригоден к использованию.
Если замечено расслаивание, перемешивание необходи-
мо повторить.
Приготовление раствора поливинилового спирта. 20г
спирта помещают в мерную колбу на 1 дм3 и добавля-
ют 800 см3 дистиллированной воды. Суспензию выдер-
живают в течение 30 мин при комнатной температуре,
затем добавляют 0,5 см3 1 н. раствора НС1 и непрерыв-
но перемешивают при температуре 80—90°С в течение
1 ч. Затем раствор охлаждают, доводят до pH до 7,0 рас-
твором NaOH, объем доводят до 1 дм3 дистиллирован-
ной водой и полученный раствор фильтруют.
Приготовление ферментного раствора. 200 мг испы-
туемого образца растворяют в 200 см3 дистиллирован-
ной воды. Фермент разводят таким образом, чтобы раз-
ница между контрольным и опытным титрованием рас-
твором NaOH равнялась от 0,8 до 1,5 мг.
Техника определения. 5 см3 эмульсии субстрата и
4 см3 буфера с pH 7,0 помещают в колбу Эрлеимейера
на 100 см3, которую закрывают пробкой. Смесь выдер-
живают на водяной бане при температуре 37°С в тече-
75
&
ние 10 мин. Затем к смеси добавляют 1 см3 раствора
фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь
выдерживают при температуре 37°С в течение 60 мин,
после чего немедленно добавляют 30 см3 этанола для
прекращения реакции. Раствор титруют 0,05 н. раство-
ром NaOH в присутствии 1%-ного раствора фенолфта-
леина до исчезновения окраски.
Контрольную пробу готовят следующим образом.
К смеси субстрата и буфера с pH 7,0, выдержанной
при 37°С, добавляют 30 см3 этанола, затем 1 см3 фер-
ментного раствора и смесь немедленно титруют.
Разность между результатами титрований контроль-
ной и опытной проб соответствует количеству 0,05 н.
раствора NaOH, которое пошло на нейтрализацию жир-
ных кислот, образовавшихся из оливкового масла под
действием фермента.
Липазную активность фермента ЛС (в ед./г) опре-
деляют по формуле ЛС = АТ-50/В, где Л — разность
между результатами титрований опытной и контрольной
Проб, см3; Т — титр щелочи; В — концентрация образ-
ца ферментного раствора, г/см3.
Определение активности
пероксидазы (ПА)
Метод основан на определении скорости реакции
окисления бензидина до образования синего продукта
окисления определенной концентрации, заранее устанав-
ливаемой на фотоэлектроколориметре.
Необходимые реактивы. Ацетатный буфер с pH 4,7;
раствор бензидина в ацетатном буфере —в мерную кол-
бу на 200 см3 наливают около 100 см3 дистиллирован-
ной воды, прибавляют 2,3 см3 ледяной уксусной кисло-
ты и 184 мг бензидина, колбу нагревают на водяной
бане до 60°С, после полного растворения бензидина до-
бавляют 5,45 г ацетата натрия, охлаждают и доводят
дистиллированной водой до метки; 3%-ный раствор пе-
роксида водорода.
Техника определения. Для определения активности
пероксидазы в ферментных препаратах или других объ-
ектах следует брать такое разведение растворов, чтобы
изменение окраски происходило за 20—50 с.
76
В 2 кварцевые кюветы (2 см) приливают по 2 см3
ферментной вытяжки или центрифугата, 2 см3 бензиди-
на, 2 см3 воды. Измерение оптической плотности смеси
проводят на фотоэлектроколориметре со светофильтром,
имеющим максимум светопропускания при .7 = 656 нм.
Вначале устанавливают нулевую точку, затем правым
барабаном отводят стрелку гальванометра в крайнее
правое положение (£' = 0,125 или 0,250). В левую кюве-
ту наливают 2 см3 воды, а в правую (опытную) 2 см3
пероксида водорода из пипетки с широким отверстием.
С внесением первой капли включают секундомер. После
вливания раствора пероксида водорода стрелка гальва-
нометра начинает двигаться от края шкалы к нулевому
делению. Секундомер останавливают, когда стрелка до-
стигнет нулевого деления.
По найденной скорости реакции вычисляют актив-
ность фермента ПА (в ед./г): ПА = £абв/(с/), где £ 
экстинкция (£ = 0,125); а —отношение количества жид-
кости, взятой для приготовления вытяжки (в см3), к
массе культуры (в г); б — степень дополнительного раз-
ведения вытяжки (при необходимости); в — степень по-
стоянного разведения вытяжки в реакционной смеси (в
кювете); с — толщина слоя (2 см); t— время, с.
Определение активности каталазы
Сущность метода состоит в разрушении пероксида
водорода каталазой на кислород и воду (2Н2О2 = 2Н2О +
+ О2) и последующем газометрическом определении ак-
тивности фермента, заключающемся в улавливании и
измерении объема выделившегося кислорода после при-
бавления к водному экстракту каталазы пероксида во-
дорода.
Активность каталазы выражают в кубических санти-
метрах кислорода, которые выделяются ферментом, со-
держащимся в 1 г семян, за 1, 3 или 6 мин.
Необходимые реактивы. Пероксид водорода концент-
рацией не ниже 3% (за 10—12 ч до употребления этот
Раствор нейтрализуют, прибавляя около 1 г СаСО3 на
100 см3 раствора, и хорошо перемешивают); 5%-ный
Раствор серной кислоты.
Техника определения. Определение ведется на при-
оре (рис. 11), который состоит из двух параллельно
77

Рис. 11. Прибор для газомет-
рического определения катала-
зы s
1 — сосуд для выполнения реак-
ции со стаканчиком для перокси-
да водорода: 2 — измерительная
трубка; 3 — «груша» с раствором
серной кислоты; 4 — трубка для
облегчения установки уровня
укрепленных на штативе
бюреток на 50 или 100 с.\р
диаметром ГО—42 мм, со-
единенных в суженной ча-
сти резиновыми трубочками
с трехконцевой «гребенкой».
Третий конец «гребенки» со-
единен резиновой трубкой
со стеклянной грушей. Та-
ким образом, получается си-
стема сообщающихся со-
судов.
Бюретка с отчетливыми
делениями служит для из-
мерения объемов газа. Вто-
рая бюретка или стеклян-
ная трубка служит для бы-
строй и правильной уста-
новки уровня газа при от-
счете. Бюретка для измере-
ния в верхней части закры-
та резиновой пробкой с от-
верстием, в которое встав-
лен маленький тройник. На
один конец этого тройника
надет кусочек толстостенной
эластичной резиновой труб-
ки и винтовой зажим. Вто-
рой конец тройника, слегка
изогнутый, соединен с длин-
ной резиновой трубкой, за-
крытой с другой стороны
стеклянной трубочкой с резиновой пробкой. Этой проб-
кой закрывают реакционную баночку.
Воронку и измерительную часть аппарата заполняют
5%-ным раствором серной кислоты. Серная кислота
уменьшает растворимость газов в воде и препятствует
размножению водорослей и грибов. Уровень этой жид-
кости в аппарате устанавливают на нуле. Это достига-
ется закреплением кольца, на котором находится «гру-
ша», на постоянной высоте.
Все отверстия для сообщения с воздухом должны
быть закрыты ватными пробками.
Перед измёрением все части аппарата проверяют на
герметичность.
Для определения активности каталазы в толстостен-
ные реакционные баночки, подобранные к прибору, отме-
ривают по 10 см3 центрифугата, туда же добавляют
10 см3 воды и ставят при помощи пинцета маленький
стаканчик с 5 см3 3%-ного раствора пероксида водоро-
да (если концентрация Н2О2 иная, то его наливают в
таком объеме, чтобы при разложении пероксида водо-
рода выделилось 68—70 см3 кислорода). Средняя на-
чальная концентрация пероксида водорода в реакцион-
ной баночке в общей смеси составит 0,8%.
Горлышко баночки закрывают пробкой с трубкой,
соединенной с измерительной бюреткой прибора, уста-
навливают баночку в баню с температурой 20°С. Прове-
ряют и регулируют уровень жидкости в приборе, за-
крывают сообщение с воздухом винтовым зажимом и
опускают «грушу» в нижнее положение. После этого
вращательным движением опрокидывают стаканчик с
пероксидом водорода в банке и в этот же момент пус-
кают секундомер. В течение 10 с содержимое банки
взбалтывают (вращательным движением). Баночку
опять опускают в водяную баню с температурой 20°С.
Для предотвращения вспенивания смеси рекомендуется
добавлять 1—2 капли толуола.
Количество выделившегося кислорода определяют,
поднимая «грушу» до соответствующего уровня за Юс
до отсчета. Отсчет делают ровно через 1,3 и 6 мин. Пос-
ле каждого отсчета реакционную смесь перемешивают
в течение 10 с.
Титр пероксида водорода может быть определен при
помощи прибора непосредственно по объему кислорода,
выделившемуся при 30-минутной реакции в присутствии
каталазы. Для этого поступают точно так же, как и при
определении активности фермента. Чтобы определить,
какой объем кислорода может быть получен из взятого
количества пероксида водорода, применяют для его раз-
ложения масличные семена (льна, подсолнечника и др.),
обладающие высокой активностью каталазы.
Определение активности р-глюкозидазы
Метод основан на гидролизе р-глюкозидазой р-глю-
козидных связей амигдалина, линамарина и др. Актив-
78
79
ность [3-глюкозидазы определяется одновременно с циа-
ногенной активностью, в качестве субстрата используют
раствор амигдалина. В этом случае наиболее удобно
активность р-глюкозидазы учитывать по приросту вос-
станавливающей способности, связанной с отщеплением
глюкозы, а цианогенное действие — по накоплению си-
нильной кислоты.
Активность фермента выражают в микромолях глю-
козы и синильной кислоты, полученных при действии
фермента за 1 ч, на 100 мг белка или в миллиграммах
на 1 г взятого для исследования материала.
Необходимые реактивы. 1%-ный раствор амигдали-
на (в случае учета только р-глюкозидазы применяют
раствор арбутина или салицина)—0,57 г глюкозида
растворяют в 100 см3 ацетатного буфера с pH 4,7;
10%-ный раствор серной кислоты.
Техника определения. В 2 конические колбы на
100 см3 наливают по 5 см3 раствора глюкозида и по
20 см3 раствора ферментного препарата (ФП). Для
контрольных определений используют 2 другие колбы,
в которые наливают по 20 см3 раствора ФП. Колбы с
растворами нагревают и кипятят с обратным холодила
ником в течение 10—15 мин, охлаждают и приливают
по 5 см3 раствора глюкозида. Все колбы закрывают ре-
зиновыми пробками с укрепленными внутри пикриновы-
ми бумажками и ставят в термостат с температурой
25°С на 4—18 ч.
Разведение ФП и время действия фермента подбира-
ют так, чтобы в пробе на момент анализа оставалось
до 50% глюкозида от взятого исходного вещества. По
истечении установленного времени действие фермента
приостанавливают прибавлением 2 см3 10%-ного раство-
ра серной кислоты.
Активность цианогенного фермента определяют по
изменению окраски пикриновой бумажки, сравнивая
окраску со стандартной шкалой. По приросту сахара,
образующегося в результате гидролиза глюкозида, опре-
деляют накопление р-глюкозидазы (сахар определяют
полумикрометодом). Разница в содержании сахара меж-
ду опытными и контрольными пробами получается тем
больше, чем выше активность р-глюкозидазы при одних
и тех же условиях проведения опыта.
ГЛАВА II
ЛАБОРАТОРНЫЕ работы по технологии
ферментных препаратов
§ 1. ПОЛУЧЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ПОВЕРХНОСТНОМ
и ГЛУБИННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Лабораторная работа №1
Культивирование микроорганизмов — продуцентов
ферментов — поверхностным способом на твердых
питательных средах
Микроорганизмы, растущие на твердых средах, в
процессе своей жизнедеятельности выделяют во внеш-
нюю среду различные гидролитические ферменты. Куль-
тура микроорганизма, полученная таким способом, яв-
ляется исходным материалом для получения фермент-
ных препаратов различной степени очистки, а в высу-
шенном состоянии она может быть готовым техническим
препаратом.
Комплекс ферментов, синтезируемый микроорганиз-
мами при поверхностном культивировании, зависит от
физиологических особенностей продуцента, состава пи-
тательной среды и условий выращивания. В качестве
продуцентов ферментов могут быть использованы акти-
номицеты, мицелиальные грибы, бактерии, дрожжи. Но
чаще всего при поверхностном способе культивирования
используют микроскопические грибы.
В данной лабораторной работе удобнее всего ис-
пользовать микроскопические грибы или дрожжеподоб-
Hbie микроорганизмы, например такие, как Asp. oryzae,
Asp. flavus, Asp. awamori, Asp, niger, Rh, delemar, En-
Qomycopsis fibuliger и др.
Целью настоящей работы является выращивание
продуцентов различных ферментов на твердых сыпучих
средах и анализ полученных культур на активность со-
держащихся в них ферментов.
Эта работа выполняется за 2 занятия, так как тре-
Уется определенное время для роста культуры.
Если перед студентом стоит задача выполнить на эту тему -
УЧ’Но-иоследовательскую работу (НИРС) с оптимизацией процес-
80
81
са по двум и более факторам, количество времени для ее прове-1
дения значительно возрастает. Обычно оптимизация осуществляет.t
ся по планам дробного, реже полного факторного эксперимента!
(см. приложение I, § 3). Исследование может заканчиваться no.iv.
чен-нем уравнения процесса и соответствующей интерпрета
влияния на процесс исследуемых факторов или даже составлю
программы оптимизации и ее осуществлением с расчетом пол;
ного эффекта. В этом случае работа ведется с применением у
до,в математического анализа.
За 6—7 дней до проведения работы культура из ис-
ходной коллекционной пробирки, хранящейся в Myaet
лаборатории, пересевается на свежескошенный сусло-
агар (5—6%-ное сладкое пивное сусло с добавление.'-:
1,5—2,0% агара) в пробирки с большим диаметре»
(18 мм). Посевы микроорганизмов на косом сусло-ага-
ре помещаются в термостат с температурой 30°С на
3—4 сут. Рост гриба заканчивается обильным спороно
шением.
За 3 дня до начала основной работы повторно пере-
севают продуцент из пробирок на твердую питательную .
среду, обычно на увлажненные пшеничные отруби. Для
этого в конические колбы вместимостью 250 см3 поме- .
щают по 15—20 г пшеничных отрубей влажностью 45%, :
закрывают их ватными пробками, надевают бумажный
колпачок, чтобы не намокла пробка при стерилизации, >
и затем автоклавируют 1 ч при 120°С.
После естественного охлаждения среды в колбах дс
35—40°С ее в стерильных условиях засевают суспензи-
ей спор микроскопического гриба. Суспензию спор по-
лучают, смывая спороносящую культуру продуцента '
косого сусло-агара в большой пробирке 10 см3 стериль
ной воды. В каждую колбу со стерильной средой внося'
по 1 см3 споровой суспензии. После тщательного пере-
мешивания колбы с засеянной средой ставят в термостат
с температурой 30°С на 2—3 сут. За это время мицелий
гриба полностью пронизывает питательную среду, обра'
зуется рыхлый корж, густо покрытый конидиями гриба
желто-зеленого цвета. Эта культура на отрубях, выра-
щенная в колбах, является исходным посевным мате'
риалом для засева кювет во время лабораторных занЯ'
тий.
Посевной материал анализируется на микробиолог^
ческую чистоту и на содержание конидий. Хороший п°'
севной материал не должен -содержать посторонней ми*’
82
рофлоры и должен иметь в 1 г посевной культуры от
1,5 до 3 миллиардов спор (в пересчете на абсолютно
сухое вещество).
Первое занятие
Первое занятие состоит из следующих операций:
подготовка посуды и ее стерилизация;
приготовление питательной среды и ее стерилизация;
определение исходной влажности среды и содержа-
ния в ней основных лимитирующих процесс роста мик-
роорганизма компонентов;
расчет количества воды, необходимой для увлажне-
ния питательной среды;
увлажнение стерильной питательной среды, ее засев
и раскладка в кюветы для выращивания;
определение параметров воздуха в растильной ка-
мере.
Подготовка посуды к стерилизации. Вся посуда пе-
ред стерилизацией должна быть тщательно вымыта и
высушена в сушильном шкафу.
Металлическую кювету (рис. 12) перед стерилиза-
цией в собранном виде вместе с крышкой и листом не-
Рис. 12. Металлическая кювета с крышкой для выра-
щивания микроорганизмов на твердой питательной сре-
де поверхностным способом:
а — общий вид кюветы; б — вид перфораций на дне кюве-
ты; в — крышка к кювете; г — кювета в собранном виде в
разрезе (/ — кювета; 2 — крышка; 3 — лист непроклеенной
бумаги; 4 — питательная среда)
83
проклеенной бумаги, но без питательной среды необхо-
димо взвесить и записать эту массу (Р) в протокол на-
блюдений. Для стерилизации следует завернуть в бума-
гу, не нарушая ее целости, и аккуратно завязать вере-
вочками следующие предметы: кювету, крышку к кюве-
те вместе с вырезанным по размерам крышки листом
непроклеенной бумаги, низкий широкий сосуд вместимо-
стью 1,5—2,0 дм3, где будет проводиться увлажнение
среды и ее засев, мерный цилиндр на 250 см3 для заме-
ра необходимого количества стерильной воды, стеклян-
ную палочку или лопатку для перемешивания посевной
культуры в посевной колбе. Кроме того, следует просто-
рилизовать в колбе 250 см3 водопроводной воды.
Стерилизацию посуды и воды следует проводить в
автоклаве при температуре 120°С в течение 0,5 ч.
Стерильная посуда после автоклавирования должна
быть подсушена в сушильном шкафу при Ю5°С, так кав
бумага при стерилизации слегка увлажняется.
Приготовление и стерилизация питательной среды
Для каждого конкретного микроорганизма готовится
своя питательная среда, обладающая набором специфи-
ческих соединений, обеспечивающих биосинтез опреде-
ленных ферментов.
Для Asp. oryzae, например, используются следующие варианты
питательных сред (в %): пшеничных отрубей—100; пшеничных от-
рубей— 70, солодовых ростков (или подсолнечной лузги, или дре-
весных опилок, или кукурузного жмыха) — 30; пшеничных отру-
бей— ЭД, свекловичного жома — 90; пшеничных отрубей — ЭД, вы-
жимок винограда — 20; солодовых ростков — 50; рисовой шелу-
хи — Э0.
Если задание связано с оптимизацией состава питательной сре-
ды, то каждый из перечисленных вариантов может служить цент-
ром эксперимента. Интервалы варьирования факторов студенты
должны назначать самостоятельно с учетом физиологических осо-
бенностей продуцента и литературных данных.
Если компонент среды имеет очень крупные частииы
(например, подсолнечная лузга), его перед введением
в среду следует измельчить.
Компоненты среды отвешиваются на технических ве-
сах, тщательно перемешиваются и после этого из смеси
отбирается средняя проба для последующих анализов-
обычно она составляет около 40—60 г. На эту величИ’
ну следует увеличивать рассчитанную для опыта массу'
среды. Например, опыт проводится в трех параллельно’
84
стЯх, в каждую кювету входит 80 г среды (по воздушно-
сухой массе), т. е. 240 г на три кюветы. Тогда общее
количество приготовляемой среды будет 300 г.
Среда для каждой кюветы стерилизуется отдельно.
Приготовленная среда помещается либо в пакет, либо
в многослойную салфетку из марли, либо в широкий
стеклянный стакан. Емкость для стерилизации предва-
рительно должна быть взвешена (а). Стерилизация сре-
ды ведется при 120°С в течение 1 ч в биксе. Емкость
вместе со стерильной средой вновь взвешивается (В).
При необходимости оценить доверительную ошибку*
взвешивания следует взять 5—6 одинаковых навесок на
технических весах, а затем проверить их массу на ана-
литических весах. По методике, изложенной в прило-
жении I, § 1, рассчитать оценку дисперсии единичного
взвешивания и его доверительную ошибку.
Определение исходной влажности среды (Ц7,тех) и со-
держания в ней основных лимитирующих процесс роста
микроорганизма компонентов. Определение влажности
сыпучей среды ведется в трех параллельных пробах по
ускоренной методике, на приборе Чижовой, в сушиль-
ном шкафу с ИК-лампой либо высушиванием до посто-
янной массы. Результаты в трех повторностях дают воз-
можность убедиться в отсутствии грубых ошибок и,
кроме того, рассчитать доверительную ошибку опреде-
ления влажности, которую следует в дальнейшем учесть
при балансовых расчетах.
Лимитирующими компонентами в среде могут быть
источники углерода, азота, некоторые соли. Чаще всего
пРи поверхностном способе культивирования большое
значение имеет наличие в среде крахмала, целлюлозы,
гемицеллюлозы, пектина, которые не только являются
источником питания, но и способствуют образованию
Микроорганизмом определенных ферментов. Например,
Для получения амилолитических ферментов необходимо
наличие в среде значительных количеств крахмала, а для
ектолитических ферментов наряду с крахмалом в среде
Д°лжно быть повышенное содержание пектина и т. п.
б зависимости от поставленной задачи определяют наи-
лее важное лимитирующее рост микроорганизма сое-
ненпе и биосинтез им требуемого комплекса.
ни Насчет количества воды, необходимой для увлажне-
питательной среды. Для нормального развития мик-
85
роскопического гриба и интенсивного образования фе,
ментов необходимо, чтобы среда имела влажность 581
63%.
Расчет количества добавляемой воды проводится ц
следующим данным:
А ср — масса питательной среды с исходной влажность;
1^исх;
Вер — содержание абсолютно сухого вещества в ис.хо;
ной пробе;
Сср — масса питательной среды с требуемой влажностью
Ц7тр, которая равна Вср• 100 : (100—ТГтр);
Гер — масса питательной среды после стерилизации, ра;
ная (В—а);
Д — количество воды, которое необходимо добавит
для получения питательной среды требуемо'
влажности, равное (Сср—Гер).
Пример. Исходными данными для расчета являются Дсс--
= 1'00,0 г; ГИСХ=|1О%; №тр=601%.
В результате расчета получено ВСр —100,0(10(0—*10)/100=90,0 t
В='125 г; я=(15 г; Сс р=90,0 • 100/(100-60) =225 г; ГсР=12б'-15=
= 110 г; Д=205—110=1116 г. Таким образом, в результате расчет
установлено, что для увлажнения среды до 60% требуется добг
вить к стерильной среде 1,16 г стерильной воды.
Увлажнение стерильной питательной среды, засев ei
чистой культурой продуцента и раскладка засеянно!
среды в кюветы для выращивания. Эти операции вы
полняются с соблюдением правил асептики при горя
щем факеле или с использованием газовой горелки. За
сев может быть осуществлен в специальном помещения
предназначенном для посевов, — боксе, который пере
посевом облучается бактерицидными лампами в те'г"
ние 2,5—3,0 ч.
На чистом столе помещается вся необходимая сте
рильная посуда: колба со стерильной водой, стери-11"
ная питательная среда в перфорированной емкости f
биксе, кювета, крышка, завернутые в бумагу, стеклянн?1
палочка и колба с посевной культурой гриба. Руки ра
ботающих должны быть защищены резиновыми перча1'
ками, которые тщательно протираются этиловым спС
том.
86
Увлажнение и засев осуществляют в следующем по-
рядке. Осторожно частично развертывают пустой сосуд
вместимостью 1,5—2,0 дм3 и в него высыпают стериль-
ную среду, после чего сосуд прикрывают краем стериль-
ной бумаги.
Частично развертывают цилиндр и в непосредствен-
ной близости от огня в него наливают рассчитанное ко-
личество стерильной воды (Д). Затем с соблюдением:
правил асептики открывают колбу с посевным материа-
лом, вносят туда стерильную палочку и наливают при-
близительно 2/3 отмеренной стерильной воды из цилинд-
ра. Содержимое колбы перемешивают палочкой с во-
дой и в виде водной суспензии переносят в сосуд со сре-
дой. Затем посевную колбу еще раз ополаскивают
оставшейся в цилиндре водой, которую присоединяют к
увлажняемой среде. Пустую колбу с оставшейся в ней
стеклянной палочкой закрывают пробкой.
Содержимое сосуда тщательно перемешивают рукой
в резиновой перчатке. Такое перемешивание необходимо
для того, чтобы влага и посевной материал равномерно
распределились по всей массе среды.
Засеянную среду переносят в заранее взвешенную
стерильную кювету (Р), равномерно распределяют в ней
и закрывают кювету сначала листом непроклеенной бу-
маги, а затем крышкой. Закрытую кювету со средой
взвешивают (Д). Затем кювету надписывают простым
карандашом и помещают в специальную растильную ка-
меру или термостат.
Протокол наблюдений по первому занятию имеет
следующий вид:
№ П/п ———		Вариант использу- емой среды	Исходная влажность среды IF исх о/ /о	Содержание лимитирующего компонента		Количество среды с %, <ССР>’ г	Количество добавля- емой воды Д, см3
				Спсх’ %	^СВ’ 0/0		
		£		2	3	4	5	6	7
							
87
М-сса кюветы, г		Количество влажной среды в кювете после засева г	Сухое вещество среды после засева (Мсв), Г	Параметры воздуха в растиль^ камере		
пустой (Р)	со средой ('<)			температура, 'С		относите,] И<:я влажное? % ‘
				сухого термометра	влажного термометра	
8	9	10	11	12	1 3	и
						—
П римеч анке. При заполнении протокола наблюдений измеренные величи.
ны там, где это возможно, записываются в виде среднеарифметического с доверь
тельной ошибкой при Р==0,95; например, масса кюветы со средой рав.ъ
Второе занятие
На втором занятии проводят следующие операции:
определяют массу сырой готовой культуры;
определяют влажность культуры и рассчитывают ее
выход от массы исходной питательной среды;
определяют активности ферментов в культуре.
Определение массы сырой готовой культуры. Из пер
вого занятия известны масса пустой кюветы и листа не-
проклеенной бумаги (Р), масса влажной среды в кювете
(Л1Вл) и масса сухого вещества среды в кювете (Мсв)
Из массы кюветы с культурой (Ki) вычитается мас-
са пустой кюветы (Р) и получается масса сырой гото-
вой культуры (Ан) в граммах: AK = Ki—Р.
Если известны доверительные ошибки массы кюветы
пустой (Р) и с культурой (К\), то масса готовой сырой
культуры (Ак) будет иметь доверительную ошибку,
равную сумме доверительных ошибок определения мас-
сы пустой кюветы е (Р) и с готовой сырой культурой
е (Кг) (см. приложение I, § 1):
е (Л) =	(Р) + е» (KJ.
Определение влажности культуры и расчет ее вых<г
да он массы исходной питательной среды. Сырую куль
ТУРУ гриба вынимают из кюветы и переносят в широкую
емкость типа кристаллизатора, где тщательно измель'
чают и перемешивают. Отбирают среднюю пробу, Р
которой отвешивают с точностью до сотых две-три И3'
88
еСки для определения влажности по ускоренной мето-
дике, на приборе Чижовой или методом высушивания
io постоянной массы в сушильном шкафу.
Д Убедившись в отсутствии грубых ошибок (см. при-
ложение I, § 1), рассчитывают доверительную ошибку
среднеарифметической величины массы навески. Если
эта доверительная ошибка превышает 0,1—0,2% самой
навески, то следует повторить взятие навески при боль-
шем числе повторностей. Можно попытаться в этом слу-
чае рассчитать необходимое число повторностей, поль-
зуясь методикой, изложенной в приложении I, § 1, а
затем сравнить полученные результаты по величинам
доверительных ошибок.
Выход культуры определяется по следующей схеме:
рассчитывается содержание сухого вещества в готовой
культуре (В,;) по формуле Вк = Д1:(100—11%.ср) : ЮО; из
предыдущего занятия известно содержание сухого ве-
щества в исходной среде (Мсв); выход культуры ц (в °/о
по отношению к исходной среде) составит -р = Вк • 100 :
: Мсв.
Пример. Известно, что Ki = 2i7(\0 г; Р =4 60,0 г; ,ci>=46i%;
Мсв=86,О г. Требуется определить Ак, В„ и р.
ДК=27О— 100=4:10 г; Вк=1111О(.10Ю—46) :.10Ю=59,4 г; п = 59,4-
• 100: 86,, 0=70,0%.
Примечание. Приведенная схема расчета не учитывает ре-
зультаты проведенного ранее статистического анализа, в частности
наличие оценок доверительных ошибок результатов прямых изме-
рений.
Следует, учитывая методику определения доверительных ошибок
Функций (см. приложение I, § 1), рассчитать доверительную ошиб-
ку оценок выхода культуры Вк и ц.
Определение активностей ферментов в культуре.
В зависимости от вида продуцента и синтезируемых им
Ферментов выбирается метод определения активности
(см. главу I). Следует позаботиться о наличии оценки
ошибки метода определения активности. Если такой
оценки в литературе нет, то, осуществив 5—6 определе-
ний Активности в одном и том же препарате, можно эту
оценку получить (см. приложение I, § 1). Необходимо
ДЛя Дальнейших расчетов знать влажность культуры, ве-
личину навески, взятой для приготовления вытяжки из
Ультуры, количество вытяжки, используемой для опре-
деления активности, и доверительные ошибки этих ве-
Ич«н. Активность культуры выражается в единицах
89
ферментативной активности (ФА) на 1 г влажной и cv пеходят и другие растворимые вещества, такие, как ами-
хой культуры.	" нокислоты, низкомолекулярные углеводы, соли, кислоты
за 100%, то при экстракции 22—33% их переходит в
раствор, ферменты же извлекаются почти полностью
(на 90—95%), поэтому активность препарата на 1 г су-
хого вещества после экстракции повышается в 3,0—
3,5 раза.
Экстракция ферментов осуществляется при темпера-
туре 25—27°С водопроводной водой. Экстрагирование
ферментов из поверхностной культуры осуществляется в
аппаратах различных систем, но для изучения этого
процесса в учебных целях наиболее наглядна и доступ-
на диффузионная установка, состоящая из нескольких
аппаратов —диффузоров (рис. 13).
Лабораторная установка, состоящая из 7 диффузо-
ров, представлена на рис. 14. Объем каждого диффузо-
ра 0,55—0,60 дм3. В диффузор загружается 150 г куль-
туры.
Так как за время одного
Протокол наблюдений по второму занятию имеет еле- и т- дАо?СЛИ ПРИНЯТЬ сУхие вещества^ и сходной культуры
дующий вид:
«
о
S



а
е
%
к
5
*
<л
2
1 Ч
i *
3
4
Вых ад культуры
Активность
ферментов (Фд,
5
к
О 3
6
е=а
X Q.
К L. >•
си 5
Ш X
7

s
Е
Примечание, При заполнении протокола наблюдений уьат
ваются также те доверительные ошибки, которые были получены при
ботке результатов данной лабораторной работы.
При составлении протокола наблюдений, если рабо
тает целая группа студентов с одним продуцентом к
разных средах, желательно по предлагаемой схеме н:
доске заполнить все варианты. Это даст возможное!:
проследить, как состав среды влияет на способной:
микроорганизма синтезировать те или другие ферменть'
Лабораторная работа №2
Экстрагирование ферментов из культур
микроскопических грибов, выращенных
поверхностным способом
Поверхностная культура микроскопических грибе
содержит 67—78% нерастворимых веществ. Фермент
являются в подавляющем большинстве растворимый
белковыми веществами и легко извлекаются из культ!
ры продуцента методом водной экстракции. Внеклетс1
ные ферменты культуры очень легко извлекаются в-
дой, а успех извлечения внутриклеточных ферментов з-
висит от степени проницаемости клеточных стенок.
При экстракции из поверхностных культур микро°:
ганизмов одновременно с ферментами в экстрагент Я1
лабораторного занятия не-
возможно вывести батарею
па установившийся режим
работы, то лабораторная ра-
бота проводится в пределах
одного оборота батареи с
длительностью экспозиции в
каждом диффузоре 20 мин
при числе диффузоров 7,
т- е. длительность экстрак-
ции в этой батарее состав-
ляет 20-7:60 = 2 ч 20 мин.
Если такой установки в
лаборатории нет, то можно
Попользовать любую модель
^тракционного аппарата.
n jV'°'<<ho также изучать
Ринцип процесса экстрак-
и 11 в самых общих чертах,
„ ЯтиРУя работу батареи,
Ро ТЛИВая КУЛЬТУРУ в ши-
том Х стаканах с экстраген-
определенное время, пе-
Рис. 13. Лабораторный экст-
рактор (диффузор):
1 — корпус; 2 — рубашка; 3 —
нижняя поддерживающая сетка;
4 — марлевый двухслойный ме-
шочек с культурой; 5 —- верхняя
прижимная сетка; 6 —- резиновое
уплотнительное кольцо; 7 — опор-
ные ножки; 8 — крышка
90
91
к
Рнс. 14. Схема лабораторной установки ;
экстракции ферментов из поверхнос’”
культур микроорганизмов:
1 — емкость для боды; 2 — кран для р
ровки подачи воды; 3 — воронка, в кс
свободно стекас! экстрагент из емкости
экстрактор; 5 — мерный стакан на 75'
6, 6' — краны на подводящей коммунищ,_
7 — кран для отбора проб; 8, 9 и т. д’
тройники с краном для сброса воздуха из
стемы; 8', 9' н т. д, — краны на подводят
коммуникациях
риодически декантируя его и вновь помещая в cat
дующий стакан на свежую культуру и т. д., а освобол
денную от экстрагента культуру в самом первом стакан;
каждый раз после декантации заливать свежей пор
цией воды. Такое проведение работы дает только при
близительное представление о процессе экстракт!’
ферментов из поверхностной культуры.
Целью настоящей работы является изучение пронос
са извлечения ферментов из поверхностной культур-
методом водной экстракции для последующего получ<
ния на основе этих экстрактов очищенных ферментные
препаратов.
Работа состоит нз следующих операций:
подготовка батареи диффузоров, загрузка ее, нус
батареи;
составление баланса воды при экстракции;
определение активности ферментов и содержан?
сухих веществ в экстракте из каждого диффузора;
‘составление баланса экстрагируемых ферментов.
92
Подготовка батареи диффузоров, загрузка ее и пусК.
Все диффузоры монтируются на стенде на одинаковой
высоте от крышки лабораторного стола. Рубашки диф-
фузоров последовательно соединяются между собой и
замыкаются на ультратермостат. Вода подается снизу
в рубашку первого диффузора и затем перетекает из
верхней части первого в нижнюю часть рубашки второго
диффузора и т. д. Из рубашки последнего диффузора
вода сбрасывается в ультратермостат.
На дно каждого диффузора помещают сетку, кото-
рая упирается в коническую часть диффузора, затем
взвешивают 150 г культуры, пересыпают ее в двухслой-
ный марлевый мешочек и помещают его вместе с куль-
турой в диффузор. Сверху мешочек прижимают верхней
сеткой так, чтобы выходное отверстие для экстракта
оказалось над сеткой. Таким образом заполняют все
диффузоры.
Экстракцию обычно ведут водой. Точно отмеренное
количество воды заливают в склянку .с нижним тубу-
сом, вода из которой через кран поступает в открытую
воронку, а затем по шлангу в нижний патрубок диффу-
зора. Крышка диффузора в пусковой момент открыта.
Краны 8 и 8' закрыты.
Как только вода пройдет через всю толщу культуры
в первом диффузоре и дойдет до верхнего края его, за-
крывают кран 6' и завинчивают крышку, положив под
нее прокладку. Культура настаивается первые 20 мин.
Затем открывают краны 6 и 8. Как только появится
вода из крана 8, его закрывают и открывают кран 8'.
Через открытую крышку второго диффузора наблюдают
За появлением экстрагента. Краны 9 и 9' закрыты. Как
только экстрагент поднимется до верхнего края диф-
фузора, краны 6 и 8 закрывают, крышку диффузора
тщательно завинчивают и оставляют экстрагент в систе-
Ме еще на 20 мин. Такие манипуляции продолжают до
Тех пор, цока все диффузоры не будут заполнены экст-
рагентом и в последнем диффузоре культура не будет
8 контакте с экстрагентом 20 мин. После этого пере-
бывают краны 8', 9' и т. д., под спусковые патрубки
Подставляют химические мерные стаканы на 750 см3,
°твинчивают крышки на диффузорах и открывают
баны 7. Трубопроводы и отводящие шланги перед кра-
нами освобождают от экстрагента, открывая краны 8,
93
5 и т. д. Через 2 ч 20 мин без учета времени на зап
некие экстрагентом диффузоров заканчивается пери,,,
оборот батареи.
Анализируя содержание сухих веществ и активносц
ферментов в каждой порции экстрагента, можно охарак-
теризовать процесс извлечения ферментов из поверхно-
стной культуры.
Чтобы составить баланс процесса экстракции, необ-
ходимо знать влажность исходной культуры и ее исход
ную активность, которые определяются в соответствш.
с методами, изложенными в главе I.
Примечание. При выполнении НИРС по этой теме неоод,
димо провести 2—<3 оборота батареи и только при установившем!
режиме снимать характеристику процесса.
Составление баланса воды при экстракции. Общее
количество воды, пошедшее на экстракцию, определи
ется по разности между исходным количеством воды i
емкости, например 6 дм3, и количеством воды, оставшим-
ся после заполнения последнего диффузора. Например,
осталось 1,1 дм3, следовательно, израсходовано всеп:
4,9 дм3.
Экстрагент из каждого диффузора после окончание
процесса слит в емкости и замерен. Например, в перво.'
стакане собрано 300 см3, во втором — 290, в третьем -
310, в четвертом — 300, в пятом — 300, в шестом — ЗЮ
в седьмом — 290 см3, итого в сумме, 2,1 дм3. Ушло №
смачивание культуры 4,9—2,1 =2,8 дм3.
В процессе экстракции переходит в раствор от 22 Д'
33% сухих веществ культуры. Если предположить, чт.
исходная влажность культуры 10%, то сухих вещесп
в 150 г будет 150-0,9 = 135 г. Условно принимаем, чь
1/з сухих веществ перешла в раствор, тогда в диффузор'
осталось 135-2 : 3 = 90 г сухих веществ.
Можно предположить, что на смачивание культуРь
в каждом диффузоре ушло одинаковое количество в о А
тогда 2,8: 7 = 0,4 дм3 воды должно смачивать биошр^
(нерастворимый твердый остаток), содержащий 90 
сухих веществ, Влажность биошрота составит 400-ЮО
: 490 = 81,6%.
Теоретически, без учета потерь, можно посчита1;
объем экстракта в каждом диффузоре. Он складыва61
ся из объема смачивающего биошрот экстрагента (в 1)2
94
щеМ случае он принят 400 см3) и объема жидкости, сли-
той из каждого диффузора в стакан.
Определение активности ферментов и содержания су-
хих веществ в экстракте из каждого диффузора. Содер-
жание сухих веществ может быть определено путем вы-
сушивания пробы до постоянной массы, но этот метод
очень трудоемок, длителен и применяется только в от-
ветственных опытах. Для того чтобы судить ориентиро-
вочно о полноте извлечения сухих веществ, обычно ис-
пользуют рефрактометрический метод.
Активность ферментов определяют по методикам,
приведенным в главе I. Эти данные заносят в протокол
наблюдений и оформляют графически (рис. 15).
Составление баланса экстрагируемых ферментов.
На основе проведенного эксперимента можно сделать
только приблизительный расчет потерь, так как не
определяются истинная влажность биошрота и количе-
ство неизвлеченного фермента.
Выше был проведен подсчет объема экстракта в каж-
дом диффузоре. Умножив активность фермента
(ед.ФА/см3 экстракта) на объем экстракта в каждом
диффузоре (в см3), получают сумму единиц ФА в каж-
дом диффузоре в жидкой фазе и подсчитывают общее
количество единиц ФА в экстракте во всех диффузорах:
2ФА экстракта = ФА1 (активность фермента в 1-м диф-
фузоре) + ФА2 + ...
и т. д.
Затем подсчитывают
общее количество единиц
в культуре, помещен-
ной в диффузоры: 2ФА
культуры = 135 п ФА экс-
тракта, где 135 — содер-
жание сухих веществ в
образце; п — количество
Диффузоров (п=7). Ве-
личину 2ФА культуры
принимают равной 100 %.
огда количество неэкс-
дРагируемых фер ментов
(Дет равно (£ФА куль-
 ^ФА экстпакта) :
РА культуры па 100 %.
95
S
8 7 6 5 4 5 2 1 Фузора
—।—।—,_____i__, 1 . Длительность
20 У0 60 ВО 100 120 М экстракции,
мин
Рис. 16. Графическое изображение
процесса экстракции ферментов из
поверхностной культуры микроор-
ганизмов
Данными для составления протокола наблюдений ял.
ляются: общий объем воды перед началом опыта в со-
суде (в дм3), объем воды в сосуде после заполнение
последнего диффузора (в дм3), количество культура
внесенное в каждый диффузор (в г), влажность куль-
туры (в %), активность фермента в культуре (вед.ФА?
абсолютно сухого вещества).
Протокол имеет следующий вид:
Примечание. Осуществить экстрагирование культуры в иесколь-h
ких повторностях в условиях учебной лаборатории практически невозможна®
Если все же ставится задача определить доверительную ошибку величинн®
извлечения ферментов из культуры при данных параметрах процесса, можно®,
оценив доверительные ошибки при определении объемов, ферментативное^
активности, влажности, определить эту ошибку (см. приложение I, §
приняв, конечно, все другие факторы, влияющие на процесс, нензменны-ч'
Лабораторная работа №3
Культивирование микроорганизмов — продуцентов
ферментов — глубинным способом
Микроорганизмы — продуценты ферментов — част
выращивают глубинным способом в жидкой питател:”
ной среде определенного состава. Подавляющее болт
шинство таких микроорганизмов является аэробами
требует интенсивной аэрации питательной среды.
В зависимости от вида продуцента и синтезируемо'-
фермента он может накапливаться либо во внешн^
среде, либо внутри микробной клетки, либо в клетке :
среде одновременно. В зависимости от локализации Фс?'
мента выделение ферментных препаратов проводят 11;
фильтрата культуральной жидкости или из биомассы
продуцента.
Состав среды и условия культивирования микроор-
ганизмов оказывают существенное влияние на образую-
щийся комплекс ферментов. Оптимизация состава среды
и условий выращивания проводятся для каждого проду-
цента и не могут быть едиными для всех микроорга-
низмов.
При проведении групповых лабораторных занятий
по культивированию микроорганизмов глубинным спо-
собом целесообразно выращивать их в колбах на качал-
ках, так как только при этих условиях можно получить
много вариантов опытов.
Для глубинного способа культивирования могут быть
использованы самые разнообразные микроорганизмы:
микроскопические грибы, дрожжи, актиномицеты и бак-
терии. Наиболее часто используются: Asp. oryzae, Asp.
usamii, Asp. terricola, Asp. awamori, Asp. foetidus, Asp.
batatae. Asp. flavus, Asp. niger, Mucor pusillius, Tricho-
derma viride, Trich. longibrachiatum, Trich. koningii,
Geoth. candidum, Act. venezuelae, Act. olivochromogenes,
Act. griseus, End. fibuliger, Sacch. cerevisiae, Lactobac.
brevis. Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Clost. pectino-
fermentens и др.
Целью настоящей работы является выращивание
продуцентов различных ферментов на жидких пита-
тельных средах глубинным способом и анализ получае-
мых культур микроорганизмов на содержание в них
определенных ферментов.
Для выполнения этой работы необходимы как мини-
мум два занятия, так как требуется значительное вре-
мя (от 18 до 120 ч) для выращивания микроорганиз-
мов.
вКак и в первой лабораторной работе, необходимо
предварительно получить посевной материал, который
бычно готовят, выращивая продуцент в несколько пас-
а>кей на агаризованных средах в пробирках или в мат-
Рацах и в виде водной суспензии вводя его в стериль-
ые питательные среды при засеве.
Проще всего вести лабораторное занятие с микро-
скопическими грибами, так как для их культивирования
^пользуются сравнительно простые среды, очень четко
Пен даже визуально рост культуры, легко определя-
4	г91	97
96
ется ’биомасса продуцента и сравнительно просто разру.
шается мицелиальная масса, что позволяет дифферент
рованно определять содержание как внутриклеточные
так и внеклеточных ферментов.
При глубинном способе культивирования отдельна
компоненты среды строго лимитируются и индивидуала
но подбираются для каждого штамма микроорганизма
Среда должна обеспечивать и рост продуцента и обра
зование им максимальных количеств фермента. Сре..
должна содержать углеводы, белки, аминокислоты, с
ли, стимуляторы роста и вещества, способствующие би
синтезу определенных ферментов, и т. д. Например, пр
культивировании продуцентов амилаз в среду целесос/
разно вводить крахмал, а для продуцентов пектиназ-
пектиновые вещества и т. п.
Не меньшее влияние, чем -состав среды, на биосинте
микроорганизмами ферментов оказывают условия куль
тивирования: pH среды, доза и возраст посевного май
риала, температура выращивания, степень аэрации ср;
ды, длительность культивирования и т. д.
Изучить влияние состава среды и всех других факторов в х
ках лабораторного практикума невозможно, поэтому задача трупе
вых занятий значительно уже, она может быть расширена толь-
при выполнении на эту тему НИРС, когда есть возможность пр-
вести оптимизацию состава среды и условий культивирования с г-
пользованием математических методов планирования экспер
мента.
Для данной лабораторной работы можно использ'
вать любые продуценты ферментов с известными физи
логическими и продуцирующими способностями. В й
честве примера для данного занятия можно использ-
вать следующие штаммы микроскопических грибов -
продуцентов ферментов: Aspergillus oryzae 8Fi — npol1
цент комплекса протеолитических ферментов широко-
диапазона действия с оптимумами pH от 2,0 до Ю-1
Aspergillus terricola 3374 — продуцент протеолитическ»
ферментов с оптимумом действия в области нейтраль-
ного и щелочного pH; Aspergillus oryzae 3-9-15, А*
oryzae И-476 — продуценты а-амилазы; Asp. batatae-o
Asp. usamii 3758-45 — продуценты амилолитических
ментов осахаривающего типа; Asp. niger П, Asp. f°e
dus, Asp. awamori-16 — продуценты пектолитичес^
ферментов; Asp. awamori-22 — продуцент фермента г-1111
коамилазы; Trichoderma viride— продуцент целлюлозо-
литических ферментов, разрушающих целлюлозу, и т. д.
Первое занятие
На этом занятии осуществляются следующие опера-
ции:
приготовление питательной среды и подготовка необ-
ходимой посуды, их стерилизация;
определение pH среды;
характеристика исходного состава среды;
приготовление посевной суспензии и засев питатель-
ной среды;
характеристика условий культивирования.
Приготовление питательной среды и подготовка по-
суды, их стерилизация. Для каждого конкретного мик-
роорганизма можно назвать несколько вариантов сред,
которые обеспечивают его рост и образование тех или
других ферментов (табл. 8).
В лабораторной работе -студент готовит 0,7 дм3 пи-
тательной среды, произведя предварительный пере-
счет величины навески каждого компонента среды на
700 см3 -среды. Первоначально на технических весах
взвешивается стакан, а затем поочередно в этот стакан
отвешиваются все необходимые компоненты среды.
Жидкие компоненты среды отмериваются по объему или
отвешиваются отдельно.
Соли растворяются без особых предосторожностей.
Крахмал или мука обычно смешиваются в соотношении
1: 10 с холодной водой и при постоянном помешивании
увариваются на кипящей водяной бане. Количество до-
бавляемой воды рассчитывается с учетом всех жидких
компонентов среды. .
Прежде чем готовить среду, следует убедиться, что
ясна последовательность смешивания ее отдельных ком-
ментов, иначе, выполнив трудоемкую работу по взве-
яванию, можно не получить хорошей среды.
те Приготовление, смешивание и разваривание пита-
стиЬц°^ бРеды осуществляются в эмалированной емко-
питательную среду после одлажде-
Ва Д° 40—45°С при перемешивании отмеряют и зали-
Наз Т В спеЦиальные конические колбы на 750 см3, пред-
аченные для культивирования микроорганизмов на
4*
99
98
Таблица
Варианты питательных сред для культивирования микроорганизм,
продуцентов ферментов
Компоненты питательной среды	Варианты питательных сред н содержг: компонентов, %		
	I	II	ш
Asp.	oryzae 8 1ц		
Кукурузный экстракт	0,3	0,4	0,3
Соевая мука	0,5	4,0	2,0
Кукурузная мука	2,0	—	2,0
Кормовые дрожжи	—	—	0,5
Карбонат кальция	0,1	0,2	0,2
Asp. terricola 3374
Нитрат натрия	0,91	—	—
Хлорид калия	, 0,05	0,05	—
Сульфат магния	0,05	0,05	—
Дигидроортофосфат калия	0,10	0,10	—
Сульфат железа	0,001	0,001	—
Растворимый крахмал	6,0	3,0	—
Кукурузная мука	—	—	3,0
Глюкоза	—	—	1,5
Казеин	—	0,2	—
Кукурузный экстракт	—	—	0,3
Карбонат кальция	—	0,50	1,0
Asp. oryzae 3-9-15
Нитрат натрия	0,02	0,2	0,9
Хлорид калия	0,005	0,005	0,9
Сульфат магния	0,005	0,005	—•
Дигидроортофосфат калия	0,01	0,01	—•
Сульфат' железа	0,0001	0,0001	—
Кукурузная мука	6,0	—	6,0
Картофельный крахмал	—•	6,0	—•
Asp. bctatae-61
Фильтрат послеспиртовой	98,3	96,8	—
барды			
Кукурузный крахмал	1,5	—	1,0
Технический магнезит	0,2	0,2	0,2
Ржаная мука	—	2,5	I,5
Кукурузный экстракт	0,2	0,5	1,0
100
Продолжение табл. 8
Компоненты питательной среды	варианты питательных сред и содержание компонентов, % I	II	III
Asp. niger П (Asp. awamori-16) Свекловичный жом	1,0	2,0	4,0 Свекловичный пектин	1,0	0,5	— Кукурузная мука	1,5(—)	1,0 (—)	0,5 (—) Солодовые ростки	(—) (3,0)	(—)	(2,0)	(—)	(1,0) Гидроортофосфат аммония	0,4 (—)	0,5 (—)	0,7 (—) Сульфат аммония	0,4 (0,5)	(—)	(0,6)	(—)	(0,7) Сульфат магния	0,05	0,05	0,05 Trichoderma viride Фильтровальная бумага	2	—	— Сульфитная целлюлоза	—	2	— Свекловичный жом	—	—	2 Кукурузный экстракт	0,5	0,5	0,5 Сульфат аммония	0,5	0,5	0,5 Гидроортофосфат аммония	0,2	0,2	0,2 Мочевина	0,3	—	0,1	
Примечания: I. Соли КН2РО4, MgSO4, KCl, FeSO4, NaNOj—
среда Чапека. 2. В скобках даио содержание) компонентов в среде для
\sp. awamori-16.
качалках. Для каждого варианта берут по четыре кол-
бы, в каждую наливают по 120 см3 приготовленной сре-
ды (в зависимости от продуцента объем среды может
быть иной). Колбы закрывают ватными пробками, проб-
ки прикрывают бумажными плотными колпаками, что-
бы они не увлажнялись при стерилизации. Одновремен-
Но с качалочными колбами на стерилизацию ставят
колбу с 50 см3 среды для последующего определения
ее pH. Кроме того, стерилизуют завернутые в бумагу
четыре (одна из них запасная) пипетки на 2 см3, за-
крытые с широкого конца ватными тампонами (стери-
изацию пипеток можно проводить в металлических пе-
алах сразу для всей группы) и 2 пробирки (одна за-
васная) ,с 10 см3 водопроводной воды, также закрытые
Тнь1ми пробками и бумажными колпачками. Стери-
120“СИЮ ПРОВОДЯТ в автоклаве в течение 30 мин при
101
Если студент (или студенты) получил задание на оптимизацию
цесса по тем или иным факторам, необходимо составить плаи ДФЭ2п
или ПФЭ2П (см. приложение I, § 3), приняв за центр эксперимента тот и.1;!
иной рекомендованный состав питательной среды и назначив с учетом сооб-
ражений, изложенных в приложении I, § 3, величины интервалов варьирова-
ния. Это большая работа, которая обычно выполняется в виде НИРс
В рамках обычного занятия задача значительно сужается. Преподава-
телем предлагается определенный состав среды и продуцент. Студент дОл.
жен в этом случае поставить на культивирование микроорганизм на рекомев-
дованном варианте среды в трех параллельных колбах.
Определение pH среды. pH среды определяют элек-
трометрическим методом дважды: до и после стерили-
зации, осуществляя каждый раз по три повторной;!
этих определений и анализируя затем достоверность
этих результатов (см. приложение I, § I).
Характеристика исходного состава среды. Чтобы пр
следить потребление из среды ее компонентов, необхо-
димо знать их исходное содержание в среде. Здесь мо-
гут контролироваться самые различные соединения. На-
пример, при биосинтезе амилаз важно знать характер
потребления крахмала и других углеводов из среды,
при биосинтезе целлюлаз — целлюлозы, пектиназ — пех
тиновых веществ и т. д. Кроме того, в исходной сре.и
определяют содержание аминного и общего азота, фос-
фора. Перечень определяемых компонентов среды огова-
ривается в каждом индивидуальном задании.
Если в среде есть нестабильные компоненты (например, фрукто-
за, сахароза, витамины), которые могут изменяться при воздейс?
вин высоких температур и избыточного давления, целесообразно оп-
ределить и.х содержание после стерилизации. Для этого можно ж-
пользовать пробу среды (50 см3), в которой определяли pH пос.:е
стерилизации.
Точность определения в среде тех или иных компо-
нентов оценивается в виде доверительной ошибки, рас-
считываемой по результатам нескольких повторности
опыта (>3) после исключения из полученных резу>
татов грубых ошибок (см. приложение I, § 1).
Засев питательной среды. После того как стерилиз^'
ция окончена и автоклав открыт, пипетки помещают
10—15 мин в горячий сушильный шкаф (температур2
70—80°С) для подсушивания бумаги, колбы и остаТ’'
ную посуду оставляют в автоклаве на 15—20 мин с тс?':
чтобы бумажные колпачки подсохли в токе горячей’
воздуха. Затем колбы с питательной средой вынимаю1
и, если позволяет время, оставляют на столе для охла*
102
пения их до температуры 30—35°С; если же времени нет,
колбы можно поместить в ванну с холодной водой, но
так, чтобы не намокли пробки, и после охлаждения на-
сухо вытереть и снять бумажные колпачки.
' Засев питательной среды проводят в боксе. Бокс пе-
ред посевом в течение 2—3 ч облучают бактерицидной
лампой. Готовясь к посеву, ставят на стол штатив с про-
бирками посевной культуры и стерильной воды, пустой
высокий стакан для грязных пипеток, четыре стериль-
ные градуированные пипетки на 2 см3 или пенал с пи-
петками, колбы со стерильной средой и горелку.
Засев желательно вести вдвоем. Один из студентов
садится против горелки, слева стоит второй студент.
Первый студент берет в руки две пробирки: в левую
пробирку с продуцентом, в правую —со стерильной во-
дой. Мизинцем левой руки захватывает пробку пробир-
ки со стерильной водой и обжигает верхний край про-
бирки. Затем мизинцем правой руки открывает пробир-
ку с культурой и содержимое первой пробирки выливает
в пробирку -с чистой культурой. После этого обе пробир-
ки закрывает. Пустую пробирку из-под воды, закрытую
пробкой, ставит в штатив. Вторую пробирку с культу-
рой и водой помещает между ладонями вертикально и
плавно вращает в течение 2—3 мин, затем ставит про-
бирку в штатив. Первый же студент освобождает сте-
рильную пипетку от бумаги в непосредственной близо-
сти от пламени горелки, держа ее за верхний край
в правой руке. Берет пробирку с суспензией конидий,
открывает ее и, обжигая на огне края пробирки и пи-
петки, вводит пипетку в пробирку. Содержимое пробир-
ки осторожно перемешивает, отбирает 2 см3 посевной
суспензии, закрывает пробирку пробкой и ставит ее в
щтатив. В это время второй студент, участвующий в по-
севе, открывает колбу со средой, обжигая горлышко и
пробку, и подводит край колбы под пипетку. Содержи-
мое пипетки выливает в колбу, колбу закрывает пробкой
и ее содержимое тщательно перемешивает вращатель-
нь1мц движениями. Грязную пипетку ставит нижним кон-
Ром в стакан. Затем, используя имеющуюся конидиевую
суспензию, второй стерильной пипеткой засевает среду
0 второй колбе и в третьей.
Четвертую колбу со средой центрифугируют для
Ределения твердой фазы среды. Надосадочную жид-
103
кость декантируют, а содержимое центрифужного ста-
кана переносят в бюкс в 10 см3 10%-ного раствора эти-
лового спирта и высушивают до постоянной массы в су-
шильном шкафу.
По окончании засева пробки колб накрывают мар.
левыми салфетками и закрепляют резинками. Это щ.
обходимо для того, чтобы предохранить пробки от .4;-.
грязнения и укрепить их при качании.
На колбах, почти у самого дна, пишут фами?
студента восковым карандашом. Выше писать пел.
так как при качании надпись стирается от трения о :
жатель. Можно наклеить на верх колбы неболы
кусочек лейкопластыря и написать на нем фамилию <
дента.
Характеристика условий культивирования. Колбы
устанавливают на качалку и закрепляют удерживающим
диском или же в специальных держателях. Качалка ра-
ботает непрерывно в течение требуемого для роста куль-
туры времени с частотой качаний 180—200 мин-1. Тем-
пература культивирования обычно 30°С. Для поддержа-
ния такой температуры в качалочную комнату пода?’
стерильный подогретый воздух (2—3 объема воздуха
объем качалочной комнаты за сутки).
Протокол наблюдений по первому занятию иж
вид:
Продуцент:------------
Состав среды:------------------
pH			Содержание анализируемых компонентов среды, г или мг на 100 см3					
исходной среды		культу- ральной жигкост	Исходная среда			Готовая культур^4 жидкость		
до стери- лизации	после стерили- зации		РВ	азот	и т. д.	РВ	азот	И Т
Примечание. В протоколе наблюдений помимо среднеарифм*-';
ских значений приведенных в таблице параметров следует указать вел!1'1'1
доверительных ошибок экспериментальных оценок, если таковые были ка-
чественно определены в ходе обработки экспериментальных данных.
104
Второе занятие
На втором занятии осуществляются следующие опе-
рации:
отделение биомассы гриба и твердой фазы среды;
определение количества сухой массы мицелия гриба;
характеристика фильтрата культуральной жидкости;
приготовление вытяжки из мицелия гриба;
определение активности ферментов в фильтрате куль-
туральной жидкости и в мицелиальной массе гриба;
расчет продуцирующей способности гриба.
Отделение биомассы гриба и твердой фазы среды.
В колбах, снятых с качалки, объем готовой культуры
всегда немного меньше объема исходной среды, так как
влага во время стерилизации и культивирования испа-
ряется через ватную пробку. Естественная убыль состав-
ляет около 6—9%.
Чтобы определить количество образовавшейся био-
массы, заранее подготавливают и высушивают до по-
стоянной массы два бумажных фильтра для воронки
Бюхнера. Содержимое двух колб поочередно фильтру-
ют под вакуумом через воронку Бюхнера. Если в колбах
остается на стенках взвесь, ее можно смыть фильтратом,
возвращая его в колбу. Осадки следует слегка отсу-
шить на фильтре и затем вместе с фильтром высушить
До постоянной массы.
Содержимое третьей колбы фильтруют через обыч-
ньгй фильтр или через четыре слоя марли. В получен-
ном осадке определяют активность ферментов. Биомас-
са микроскопических грибов обычно легко- отделяется,
после фильтрации ее просто снять с фильтра или с
^арли.
Из-за сложности постановки опытов определение активности
осадке обычно ведется в одной пробе, что, конечно, накладывает
ЧРеделенный элемент случайности. Чтобы этого избежать, необ-
одимо увеличить число параллельных опытов как минимум до че-
“рех (две пробы для определения активности).
После отделения осадков на каждый вариант опыта
Меются три пробы фильтрата. В фильтрате каждой кол-
°пределяют активность ферментов и содержание в
!?м Декоторых веществ (РВ, азота, фосфора и т. д.),
1 °водят анализ достоверности экспериментальных дан-
105
ных й расчет доверительных ошибок (см. приложение]
§ О-
Определение количества сухой массы мицелия гриба,
Фильтры вместе с осадками из первой и второй колб,
помещают в предварительно взвешенные донышки ча-
шек Петри и высушивают в ПК сушильном шкафу д
постоянной массы в течение 15—30 мин. Можно вести
высушивание до постоянной массы и в обычном су
шильном шкафу при 105 °C или даже в приборе Чижо-
вой. После охлаждения фильтра в эксикаторе его взве-
шивают и определяют содержание сухой массы мице,цо
гриба.
Расчет количества биомассы Бм проводится по фо;
муле Бм=Д—(tz+5+С) : 1,2, где Д — масса фильта.
с биомассой, помещенных в чашку Петри, после высу
шивания, г; а — масса сухого фильтра, г; В — масса д
пышка чашки Петри, г; С — масса твердой взвеси в :i„
тательной среде, г; 1,2 — коэффициент пересчета к.
100 см3 культуральной жидкости. Расчет проводится бс.
учета выпаренной влаги при стерилизации и культпвг
ровании.
Примечание. Такой расчет биомассы можно вести в ж
случае, если известно, что твердые включения в среду не потрь
ляются в процессе роста микроорганизма. Обычно такой расе
Цевозможен, если микроорганизм синтезирует ферменты» разрушав
щие целлюлозу и гемицеллюлозы.
Характеристика фильтрата культуральной жидкости
Прежде всего в фильтрате определяют pH, затем все ь
компоненты культуральной жидкости, которые анализ:
ровали в исходной среде. На анализ надо брать проб£
большего объема, так как основная часть этих соедп^
ний потреблена микроорганизмом в процессе роста.
Приготовление вытяжки из мицелия гриба. Мицелй
из третьей колбы после отделения жидкой части культу
ральной жидкости промывают двумя порциями (по
25 см3) холодной воды (2—3°С) и переносят в фарФ!
ровую ступку, где тщательно растирают в течение Ю'
15 мин с кварцевым песком (добавляют приблизите-1
но 0,2—0,3 г кварцевого песка) и дистиллирована
водой температурой 30°С. Количество воды должно бь-
около 30 см3. Затем содержимое ступки переносят в
ную колбу на 50 см3, настаивают 15—20 мин, охлаж'-
ют до 20°С и доводят дистиллированной водой до меть-
В результате этих операций извлекаются фермеН
оставшиеся в мицелии, что дает возможность опреде-
тить сумму всех ферментов, синтезированных микроор-
ганизмом за весь цикл культивирования.
Содержимое мерной колбы тщательно перемешивают
и фильтруют через складчатый фильтр. Фильтрат ис-
пользуют для определения активностей ферментов.
Определение активности ферментов в фильтрате
культуральной жидкости и в мицелиальной массе гриба.
Анализ ведется в зависимости от вида выбранного про-
дуцента и синтезируемого им комплекса ферментов. Ак-
тивности ферментов определяют в фильтратах культу-
ральной жидкости и в биомассе микроорганизма. Так
как в мицелии обычно находится очень мало фермента,
то на определение берут в 5—10 раз больше вытяжки,
чем при анализе фильтрата культуральной жидкости.
Ферментативные активности (ФА), полученные в
фильтрате культуральной жидкости и в вытяжке из ми-
целия, выражаются в соответствующих единицах на
1 см3 культуральной жидкости; суммой единиц ФА во
всем объеме фильтрата культуральной жидкости (объ-
ем составляет 120-0,93 см3, где 0,93 — коэффициент, учи-
тывающий условно все виды потерь и сухой остаток);
в соответствующих единицах на 1 -см3 вытяжки из ми-
целия; в единицах на весь объем (50 см3) вытяжки из
мицелия (Е ФА мицелия); в единицах на 1 г мицелия
(для этого сумма единиц ФА мицелия делится на коли-
чество сухой массы микроорганизма во всем объеме).
Расчет продуцирующей способности гриба. Обычно
в научно-исследовательских работах по физиологии мик-
роорганизмов приводится показатель продуцирующей
способности биомассы (Пс) того или другого микроор-
ганизма. Пс— это то количество единиц активности
Ферментов, которое при данных условиях способен син-
тезировать 1 г биомассы микроорганизма (в пересчете
ва сухую массу).
Чтобы рассчитать Пс, необходимо знать сумму еди-
ниц ФД во всем мицелии (v фд мицелия); сумму еди-
ниц фд во ,всем обЪеме фильтрата культуральной жид-
ности (2 ФА фильтрата); сухую массу мицелия (в г)
° всем объеме: Пс=(ЕФА мицелия+ S ФА фильтра-
га): S Бм.
Кроме того, подсчитывается процентное содержание
ферментативной активности в фильтрате культуральной
107
106
жидкости и в мицелии по отношению к общей сухиь
единиц ферментативной активности в культуре (2 ф;
культуры).
Результаты всех определений и расчетов заносят^
в сводную таблицу протоколов наблюдений.
Протокол наблюдений второй части лабораторий
работы имеет вид:
Продуцент_______________
Состав среды:_______________
Условия культивирования: объем среды---------см3; объем качало’
колбы---------см3; температура культивирования—»------°C; час
вращения качалки---------мин""1 и т. д.
Ферментативная активность (ФА), соответствуют!
единицы
Биомасса микроорганизма
фильтрат культураль-
ной жидкости
мицелий
суммарная
ФА в мицелии
суммарная
ФА
в фильтрате
е
я
Примечание. Наряду со среднеарифметическими величинами ПР
мых измерений или результатами вычислений в таблице должны быть пр/,|?
дены величины доверительных ошибок (см, приложение I, § 1).
< 2. КОНЦЕНТРИРОВАНИЕМ ОЧИСТКА
ФЕРМЕНТНЫХ растворов
Лабораторная работа №4
Очистка ферментных растворов
от низкомолекулярных веществ
методом диализа
Диализом называется .процесс разделения низко- и
высокомолекулярных веществ с использованием полу-
проницаемых перегородок (мембран). Молекулы низко-
молекулярных веществ, диаметр которых значительно
меньше диаметра пор, свободно проходят через мембра-
ну в раствор, тогда как для высокомолекулярных соеди-
нений мембрана непроницаема. Этот принцип положен
в основу использования диализа в препаративных целях.
Чтобы процесс диализа был высокоэффективен, не-
обходимо длительное время поддерживать значительную
разность концентраций по ту и другую сторону полу-
проницаемой мембраны. Этого можно достигнуть в спе-
циальных аппаратах — диализаторах, работающих в не-
прерывном режиме при различном протоке для диали-
зуемого раствора и омывающего мембраны раствора.
Установки для диализа (рис. 16) состоят из набора
кассет (ячеек), в которых чередуются каналы для про-
тока воды и ферментного раствора, разделенные полу-
проницаемыми мембранами.
В лабораторной практике для диализа чаще всего используют
специальные трубки из модифицированной целлюлозы либо мешоч-
ки, изготовленные из листового целлофана. Наибольшей известно-
стью пользуются специальные трубки для диализа (Viskingcellulose
bbing). Характеристика различных типов диализных трубок «Vis-
ing» представлена в табл. 8 приложения II.
Часто диализные трубки и листовой целлофан для придания
эластичности пропитывают при изготовлении смесью глицерина
° водой, которая легко удаляется при промывании водой. Отмытый
°т смягчителей материал не следует держать на воздухе, так как
делается ломким и, кроме того, tip и высыхании изменяется сте-
пень породности. Влажные трубки для диализа целесообразно хра-
Ить в замороженном состоянии или же в присутствии антисеп-
гвя ^0СК0ЛЬкУ партии целлофана и диализных трубок бывают за-
еТСяНень1 н могут содержать примеси ионов металлов, рекомеиду-
ч ‘ непосредственно перед использованием прокипятить их в те-
пе 2—5 мин в 0,01—0,005 М. растворе этилендиаминтетраацетата
108
109
Рис. 16. Установка для непрерывного диализа:
а — общий вид; б — ячейка; 1 — верхняя пластина; 2 — отверстия для
крепежных болтов; 3 — делительная воронка для ферментного раствора;
4 — патрубок для ввода ферментного раствора; 5 — канавка с отверстия-
ми, ведущими в коллектор; 6 — резиновые прокладки; 7 — нижняя пла-
стина; 8 — приемник для диализованного раствора с ледяной баней; 9 -
патрубок для ввода воды; 10 — бороздки треугольной формы; 11 — полу-
проницаемая мембрана	’
(ЭДТА) при pH 7 и затем отмыть несколько раз водой. Трубь’
мешочек или плоский диализатор перед диализом необходимо пр'
верить иа герметичность.
При установке образца на диализ необходимо доба-
вить к нему антисептик и проследить за тем, чтобы уро-
вень жидкости в мешочке был на 1—2 мм выше уровне
внешней жидкости в сосуде, что позволяет определит’
возможную утечку диализуемого раствора.
По мере выравнивания градиента концентрации ско-
рость диализа замедляется, поэтому рекомендуется про-
водить вначале обычный диализ, а на завершающи'
стадиях для удаления трудноудаляемых балластных
ществ пользоваться электродиализом.
Для обработки ферментных растворов чаще веек
НО
^пользуется обычный изотонический диализ, позволяю-
щий избавиться от 2/3 балластных веществ, повысить в
З—Ю раз активность ферментных препаратов (в пере-
сЧете на сухое вещество), провести некоторое фракцио-
нирование комплекса ферментов по молекулярной массе
и т. д. Но во всех случаях наблюдается увеличение
объема диализируемого раствора в 1,1 —1,4 раза.
Целью настоящей работы является изучение процес-
сов диализа и электродиализа экстракта из поверхност-
ной культуры микроскопических грибов. Объектом ис-
следования может быть любой раствор ферментов, кото-
рый помимо белков содержит значительное количество
низкомолекулярных примесей. Работа проводится в два
занятия.
Первое занятие
На первом занятии осуществляются следующие опе-
рации:
получение экстракта из поверхностной культуры гри-
ба;
очистка экстракта от взвеси;
анализ исходного экстракта;
монтаж диализационной установки и проведение
диализа или электродиализа.
Получение экстракта из поверхностной культуры
гриба. Для проведения группового занятия (8—10 сту-
дентов) желательно взять готовую поверхностную куль-
туру влажностью 10—12% двух или трех продуцентов
ферментов.
Перед проведением диализа готовят экстракт в диф-
фузионной батарее (см. рис. 14) либо простым настаи-
ванием, не заботясь о том, чтобы все ферменты перешли
в раствор. В последнем случае для приготовления экст-
ракта берут 0,5 кг воздушно-сухой культуры, добавляют
К ней 3 дм3 водопроводной воды, подогретой до 30°С,
тщательно все перемешивают и оставляют настаивать-
ся 10—15 мин. Затем смесь фильтруют через два слоя
^арли и слегка отжимают. При таком способе удается
°тделить 1,2—1,5 дм3 фильтрата. Этот фильтрат исполь-
3У»т для повторного настаивания на свежей культуре,
п°Л°РУю добавляют в фильтрат в количестве 0,25—
>40 кг. После настаивания смесь снова фильтруют и от-
ирают 0,6—0,7 дм3 второго фильтрата. Вновь повторя-
111
ют настаивание, внося во второй фильтрат 0,10—0,15
свежей культуры. Объем третьего фильтрата обычно
превышает 0,25—0,30 дм3. Содержание сухих венд
в таком экстракте составляет около 10%.
Очистка экстракта от взвеси, Экстракт из поверх,
ностной культуры, полученный таким способом, обычно
содержит значительное количество взвеси. Его необ.х-,.
димо либо профильтровать через бумажный фильтр
воронке Бюхнера, либо процентрифугировать при част •
те вращения 5000 мин-1 и осторожно декантировать .
осадка. Экстракт должен быть абсолютно прозрачен
не должен содержать взвеси.
Анализ исходного экстракта, Перед проведением диа-
лиза часть экстракта (30—50 см3) отбирается для опрс
деления содержания сухих веществ, активности фер.\п
тов, pH экстракта, содержания белка, золы, редуциру
щих веществ. Методики определения этих показател
изложены в главе 1.
Анализ осуществляется в 2—3 повторностях, что
зволяет убедиться в отсутствии грубых ошибок и рассь,
тать доверительные ошибки экспериментальных оцеп:
(см. приложение I, § 1).
Характеристика исходного экстракта оформляется
виде таблицы:
Примечание. В таблице помимо среднеарифметических значен-'-
поименованных параметров должны указываться величины доверительна'
ошибок опенок этих параметров.
Монтаж диализационной установки и проведение
диализа или электродиализа. Для проведения лабора-
112
Рис. 17. Установка для периодиче-
ского электродиализа:
/ — водоотводящая система; 2 — ме-
шалка с электрическим приводом;
3 — отсеки для воды; 4 — электроды;
5 — полупроницаемая мембрана; 6 —
система, подводящая воду
горных занятий монти-
руется диализационная
установка непрерывного
(см. рис. 16) или перио-
дического (рис. 17) дей-
ствия. При работе на
пластинчатом непрерыв-
нодействующем диализа-
торе студент собирает
диализную ячейку и тща-
тельно проверяет ее на
герметичность на воде.
Затем нижнюю пластину
ячейки присоединяет к
напорной склянке с во-
дой, регулируя скорость
подачи воды краном. От-
ходящая вода сбрасыва-
ется в канализацию.
воронку на 0,5 дм3 и присо-
верхней пластины; скорость
Диализуемый раствор
заливают в делительную
единяют ее к коллектору
подачи ферментного раствора регулируется краном де-
лительной воронки или зажимом и задается прибли-
зительно в 15—25 раз меньшей, чем скорость воды.
Приемник для диализованного раствора помещают в
емкость со льдом. Когда содержимое делительной во-
ронки почти полностью пройдет через диализатор, про-
цесс можно повторить, залив ферментный раствор из
приемника вновь в делительную воронку и т. д.
Необходимо точно замерить объем ферментного рас-
твора до диализа и после, чтобы можно было опреде-
лить степень разбавления его водой.
При работе на электродиализаторе студент заливает
3 Две крайние секции воду, а в центральную — фермент-
ИЫЙ раствор. Вода в отсеки подается снизу и отбирается
сверху. В секции с водой вводит пластины электродов
От электровыпрямителя, в секцию с ферментным раство-
ром — мешалку.
Длительность диализа периодического с перемеши-
ванием и наложением электрического поля — 4—6 ч, не-
пРерывный диализ осуществляется за 3—4 ч (2 оборо-
113
Второе ранятие
На втором занятии проводится всесторонний анализ
диализованного раствора.
По истечении назначенного времени диализа из диа-
лизатора сливают продиализованный раствор, демонти-
руют установку и тщательно ее моют.
При анализе диализованного раствора замеряют
объем полученного раствора, определяют содержание в
нем сухих веществ, рассчитывают степень разбавления
его по отношению к исходному экстракту, сумму сухих
веществ во всем объеме исходного экстракта и во всей
объеме диализованного раствора (разность этих вели-
чин покажет количество сухих веществ, диффундиро-
ванных в процессе диализа через мембрану).
. Например, известно, что иа диализ было поставлено 300 см
(раствора с содержанием сухих веществ, определенных рефракто
метрически, 9,3%, а после диализа собрано 350 см3 диализоваиногс
раствора с содержанием сухих веществ 5,1%, следовательно, в ис-
ходном растворе содержалось 9,3-300:1001=27,90 г СВ, в диали-
зованном растворе — 5,1 • 350 :100=17,85 г СВ. Степень разбавле
ния по данным этого опыта составляет 350 : 30Q=tl(,;17 раза. Коли-
чество веществ, вымытых при диализе, равно 27,910—(17,85= 10,05 г.
что по отношению к исходным сухим веществам составляй
10,05-100 : 27,90=36,02)%.
Далее в диализованном растворе определяются
все те показатели, которые определялись в исходном
экстракте (pH, редуцирующие вещества, белок, зола,
активность ферментов и т. д.). Все эти показатели и их
доверительные ошибки вносятся в протокол наблюде-
ний.
Протокол наблюдений имеет следующий вид:
Наименование продуцента фермента------------------------—
Концентрация сухих веществ в экстракте------%
Количество экстракта, поставленное на диализ, см3
Скорость протока воды--------дм3/ч
Наименование и характеристика полупроницаемой мембраны
Скорость протока ферментного раствора (при использовании диализатор3
непрерывного действия)-------см3/ч
114
Объем диализованного раствора----------дм3
Содержание сухих веществ в диализованном растворе—--------------%
Затем рассчитывается степень вымывания каждого
анализируемого вещества при диализе, строится диа-
грамма и составляется итоговая таблица.
Анализируемые показатели
Содержание
во всем объеме
до	после
диализа	диализа
Степень
вымывания
при
диализе,
%
Содержание сухих веществ, г
Содержание редуцирующих веществ, мг
Белок, мг
Зола, мг
Сумма единиц ФА
Если ставится задача в НИРС по изучению процесса диализа,
то прежде всего каждый опыт проводится в 3—5 параллельностях
Для установления достоверности полученных результатов и расчета
Доверительных ошибок среднеарифметических оценок.
Затем снимаются пробы в динамике процесса и строятся гра-
фические зависимости. Можно изучать влияние иа процесс исход-
ного рн, присутствия солей, концентрации сухих веществ, качества
марки целлофана, величины протока воды и экстракта и т. д.
Ри изучении влияния иа процесс нескольких параметров следует
нсп°льзоваггь математические методы планирования миогофактор-
•X экспериментов (см. приложение I, § 3).
115
Лабораторная работа№5
Концентрирование ферментных растворов
Традиционным способом концентрирования фермер;
ных растворов служит вакуум-выпаривание. Однако <
связи с тепловой инактивацией ферментов выпаривай:;
на вакуум-выпарных установках необходимо вести П'
низких температурах кипения растворов. Другим пут<
предотвращения потерь активности ферментами при в.
куум-выпаривании является сведение к минимуму ко -
такта раствора с теплоагентом. В среднем потери акта,
ности при вакуум-выпаривании составляют 5—25%.
Широкое распространение в последние годы получи
метод ультрафильтрации растворов высокомолекуля'
ных веществ. Сущность этого метода сводится к форс;
рованному прохождению растворителя через полупрон
цаемую мембрану, задерживающую растворенные вепь.
ства. Прилагаемое положительное или отрицательн
давление отличает ультрафильтрацию от диализа, осн
ванного на обычной диффузии, где направление движ
ния молекул определяется градиентом концентрации.
Благодаря ультрафильтрации появляется возмол.
ность проведения процесса концентрирования без фаз
вых превращений при температуре окружающей средь'
а также возможность глубокой очистки ферментных рас-
творов от балластных соединений.
Концентрирование раствора ультрафильтрацией ш
сопровождается увеличением содержания низкомолек'
лярных веществ и повышением ионной силы. Частип:
и молекулы с размерами меньше диаметра пор при ул.,
трафильтрации проходят через фильтр (полупроницас
мую мембрану) вместе с током жидкости.
Наилучшие результаты дает метод ультрафильтр'
ции глобулярных белков, где существует достаточно че:
кая корреляция между диаметром частицы и ее филь
руемостью.
Ультрафильтрация через фильтр даже дистиллированной во;
в конце концов приводит к замедлению этого процесса. При фи.т
трации жидкостей биологического происхождения это замедлен
наступает гораздо быстрее. В принципе такое замедление связа'
с действием* как минимум трех факторов: первичной адсорбции
т. е. ионной и молекулярной адсорбцией частиц на поверхнос
мембраны и на стенках пор; так называемой блокировкой, т. е. м
ханической задержкой частиц внутри пор и образованием пл-о.'
проходимого или вовсе непроходимого слоя для жидкости из бол
116
оупных частиц над поверхностью мембраны; концентрационной
поляризацией.
Адсорбирующая способность чистой целлюлозы мала, еще мень-
не она у таких ее производных, как нитро- или ацетатцеллюлоза,
но пористые целлюлозные структуры ведут себя в этом отношении
иначе' Так, на 1 см2 мембранного фильтра (около 3 мг сухой клет-
чатки) поверхность пор достигает 10 м2, для миллилоровых фильт-
ров эта величина в 5—10 раз выше. Такая поверхность может ад-
сорбировать в виде моносл-оя 10—50 мг белка.
Помимо молекулярной адсорбции практически для всех ультра-
фильтров весьма высока и ионная адсорбция, обусловленная отри-
цательным зарядом целлюлозы, стекла, инфузорной земли и других
материалов, из которых готовят фильтры. Первичная адсорбция
веществ на фильтре, как правило, уменьшается при увеличении
разности давлений. Ее уменьшению в сильной степени способствует
присутствие поверхностно-активных веществ в фильтруемом рас-
творе.
Блокировка пор резко увеличивается в концентрированных рас-
творах. Ей способствует также образование белками на внутренней
поверхности пор монослоев, что ведет к сужению диаметра пор.
Действие этих неблагоприятных факторов не ограничивается
лишь замедлением скорости фильтрации. Фильтры, как правило,
удерживают значительное количество частиц, диаметр которых
меньше диаметра пор. Причины, обусловливающие этот феномен,
весьма, разнообразны. Главные из них: адсорбция под влиянием
ван-дер-ваальсовых сил, попадание частиц в дефектные поры, ад-
сорбция на ранее задержавшихся частицах и агрегация самих ча-
стиц, ведущая к завышению их истинного размера.
Из всех вариантов ультрафильтрации в препаративных целях
наилучшие результаты дает проточный метод фильтрации. В этом
случае образование на поверхности фильтра плохо проницаемого
слоя («динамической» мембраны) из задерживаемых частиц сни-
жается при помощи постоянного движения жидкости параллельно
поверхности фильтра. Блокировка пор при проточной ультрафильт-
рации не предотвращается.
При ультрафильтрации происходит удаление тех ком-
понентов, размеры которых меньше диаметра пор. Ско-
рость ультрафильтрации для компонентов с коэффици-
ентом v<l, т. е. меньшим, чем у воды, и v>0, т. е. боль-
шим, чем у нефильтрующихся частиц, является неоди-
наковой и пропорциональна размерам частиц. Поэтому
при ультрафильтрации концентрация веществ -с v=l
бУДет оставаться неизменной, содержание в концентра-
те веществ с v = 0 будет возрастать в степени, пропор-
циональной фактору концентрации, тогда как величины
концентрации компонентов с i>v>0 -будут промежу-
точными.
Используемые для ультрафильтрации мембраны дол-
жны обладать определенным размером пор, пропускать
117
раствор с достаточно высокой скоростью и иметь мп;:
мальную адсорбирующую способность. В настоян
время ряд отечественных предприятий и зарубежю
фирм выпускает мембраны для фильтрации, в болыт
или меньшей степени удовлетворяющие этим требоз
ниям.
Наибольшее распространение получили анизотр-;
ные ацетатцеллюлозные мембраны, которые наклады,
ются на пористые подложки. В каталогах указаны ве i
чины молекулярных масс веществ, задерживаемых М'.
браной, но в действительности мембраны задерживав
не 100% соответствующих макромолекул, а несколы
меньше. Отсюда следует, что для более полной задери, >
следует брать мембрану с меньшими, чем указано в
талоге, величинами пор. Следует также помнить, ч
способность проходить через мембрану зависит не тол
ко от молекулярной массы, но и от формы молекул.
Целью настоящей работы является получение к <
центрированного ферментного раствора методами уль
рафильтрации и вакуум-выпаривания.
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ МЕТОДОМ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ
Работа состоит из следующих операций:
анализ исходного ферментного раствора;
проведение процесса ультрафильтрации;
анализ концентрированного раствора и ультрафиль
рата.
Анализ исходного ферментного раствора. В фермен
ном растворе определяют содержание сухих вещее'
(рефрактометрически), белка (по модифицированно'-
методу Лоури) и ферментативную активность (по ста
дартиому методу для соответствующего фермента).
Проведение процесса ультрафильтрации. В л а бор
тории ультрафильтрацию небольших объемов раствор!
проводят в отечественных аппаратах с постоянным пе"-
мешиванием жидкости над мембраной УФ-10—50—2!
(СКВ БФА) либо в аппаратах фирмы Amicon (США
В аппарат в зависимости от его объема заливается опр1
деленное количество исходного раствора. Аппарат уст
навливается на магнитную мешалку и через редукъ
подключается к баллону с азотом. После включен
мешалки в аппарате создается давление порядка 0,3
118
0,5 МПа. Ультрафильтрат в Процессе опыта собирается
в’ мерный цилиндр. Процесс прекращают, когда количе-
ство концентрата составит 5—7 см3. Концентрат слива-
ют, а ультрафильтрационный аппарат тщательно про-
мывают водой.
Анализ концентрированного раствора и ультрафиль-
трата. В концентрате и ультрафильтрате определяют
те же показатели, что и в исходном ферментном рас-
творе.	।
Результаты анализов заносят в протокол наблюде-
Исходный фермент-
ный раствор
Концентрат
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ МЕТОДОМ ВАКУУМ-ВЫПАРИВАНИЯ
Работа состоит из следующих операций:
анализ исходного ферментного раствора;
проведение процесса вакуум-выпаривания;
анализ концентрированного раствора.
Анализ исходного ферментного раствора. В исходном
ферментном растворе определяют содержание сухих ве-
ществ (рефрактометрически), белка (по модифициро-
ванному методу Лоури) и ферментативную активность
(по стандартному методу для соответствующего фермен-
та).
Проведение процесса вакуум-выпаривания. В лабо-
ратории вакуум-выпаривание проводят на отечественном
Роторном испарителе. Предварительно аппарат в усло-
ВДях вакуума проверяется на герметичность при помо-
ги мыльной воды. В приемную колбу заливается опре-
деленное количество исследуемого раствора. После окон-
чания процесса выпаривания концентрат сливают и за-
веряют его объем в мерном цилиндре.
119
1
Анализ концентрированного раствора. В концентра,
те определяют те же показатели, что и в исходном фер.
ментном растворе.
Результаты анализов заносят в протокол наблюде-
ний, который имеет следующий вид:
Время опыта.
мин
Анализируемый продукт
Исходный ферментный раствор
Концентрат
Лабораторная работа №6
Осаждение ферментов из водных (растворов
Ферментные растворы представляют собой сложи:
коллоидные системы, состоящие из двух фаз: жидко,
дисперсионной среды и твердой (коллоидной) дисперг
ной фазы. Размеры частиц дисперсной фазы от 1 ..
100 мкм.
Коллоидные растворы не являются стабильными, пр:
определенных условиях их частицы агрегируются и м
гут выпасть в осадок. Сольватная оболочка белка со.
дается особо ориентированными молекулами воды и св
бодными радикалами, притягиваемыми к молекуле. Че\
больше сольватный слой, тем стабильнее коллоидна:
раствор. Сольватная оболочка является связующим звс
ном между растворителем и коллоидной частицей.
Осаждение ферментов из водных растворов можг
вести органическими растворителями (этиловым и изо-
пропиловым спиртом, ацетоном) и различными солями
(сульфатами аммония, цинка, натрия, хлоридом натрия)-
Введение в водный раствор осадителя вызывает
уменьшение притяжения молекул воды к молекуле фер-
мента, а с увеличением концентрации осадителя падает
количество молекул воды, участвующих в образовании
сольватной оболочки молекулы белка. Сольватная обо-
лочка фермента разрушается, сила притяжения к моле-
120
кулам осадителя падает, происходит уменьшение общей
энергии сольватации всех молекул фермента. В какой-то
момент при определенной концентрации осадителя в ере-
де энергия сольватации становится меньше энергии
связи между двумя молекулами белка и наступает яв-
ление агрегации молекул и коагуляции белка.
Способность ферментов терять растворимость в при-
сутствии органических растворителей и солей связана
с диэлектрической постоянной, ее снижение в присут-
ствии осадителей влечет за собой выпадение белков в
осадок. А так как диэлектрическая постоянная для раз-
личных осадителей различна, то и концентрация их,
вызывающая полное осаждение ферментов, будет раз-
лична. Кроме того, ферменты по-разному относятся к
различным осадителям, что часто дает возможность
фракционировать комплекс ферментов.
Оптимальные условия осаждения определяются экс-
периментальным путем в каждом конкретном случае.
Помимо вида и концентрации органического раствори-
теля и соли на процесс осаждения и сохранение актив-
ности ферментов в осадке влияют присутствие в растворе
электролитов, температура осаждения, время контакта
с растворителем, pH, при котором ведется осаждение,
концентрация сухих веществ в ферментном растворе, их
состав и т. д.
Целью. настоящей работы является изучение влия-
ния природы осадителя и условий осаждения на полно-
ту выпадения в осадок ферментов.
ОСАЖДЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ
РАСТВОРИТЕЛЯМИ
Работа состоит из следующих операций:
приготовление водного экстракта (вытяжки) из по-
иерхностной культуры гриба или фильтрата (концентра-
Та) из глубинной культуры;
определение активности ферментов в вытяжке или
Фильтрате;
осаждение ферментов органическими растворите-
лями;
анализ полученного осадка.
Приготовление водного экстракта (вытяжки) из по-
Верхностной культуры гриба или фильтрата (концент-
121
рата) из глубинной культуры. Способ приготовления
вытяжки (экстракта) подробно описан в лабораторной
работе № 4 по диализу. Вытяжку следует либо отфильт.
ровать, либо тщательно отцентрифугировать, чтобы в ней
не было взвеси. Прозрачная вытяжка (экстракт) с со-
держанием сухих веществ 7—10% является исходным
раствором для осаждения ферментов. Для выполнения
работы требуется 250—300 см3 экстракта по каждому
варианту.
Если предполагается проводить осаждение из глу-
бинной культуры, то прежде всего следует отделить ее
от твердой взвеси среды. Это можно -сделать -центрифу-
гированием или фильтрацией через бумажный фильтр
на воронке Бюхнера.
Если микроорганизм выращивался на обедненной
среде, то готовая культуральная жидкость может иметь
очень низкое -содержание сухих веществ, что затрудняет
выделение ферментов в осадок. Желательно повысить
содержание сухих веществ любым из известных спосо-
бов: вакуум-выпариванием, ультрафильтрацией и т. д,
Определение активности ферментов в вытяжке или
фильтрате. В зависимости от продуцента ферментов
определяется их активность по методикам, приведенным
в главе I. Следует только иметь в виду, что так как вы-
тяжка и фильтрат — это концентрированные растворы
ферментов, их надо разводить в несколько раз.
Осаждение ферментов органическими растворителя-
ми. Вытяжку или фильтрат (концентрат) культуральной
жидкости охлаждают до 2—3°С. Осадитель (этиловый
спирт, изопропиловый спирт, ацетон) охлаждают пред-
варительно до —5ч—10°С. При проведении этой рабо-
ты можно изучать влияние на полноту осаждения фер-
ментов концентрации осадителя, электролитов, pH фер-
ментного раствора, температуры осадителя и ферментно-
го раствора, длительности контакта осадителя с фермен-
том и т. д.
Предположим, что в работе поставлена задача изучить влияние
концентрации осадителя и pH среды на полноту осаждения феР'
ментов из водной вытяжки культуры микроскопического гриб2,
обладающего способностью синтезировать а-амилазу и протеазу'-
Вытяжка содержит 9% сухих веществ, ее pH 5,0 и активность фер-
ментов 20 ед.АС/см3 и 5 ед.ПС/см3. Для осаждения используе5*
три осадителя и диапазон pH от 2,5 до 9,0. Для данной конкрет-
ной задачи можно предложить варианты, представленные в табл-^'
122
Таблица 9
Варианты видов растворителей и pH среды для изучения осаждения  ферментов из растворов			
.—		 Растворитель (осадитель)	Соотношение объемов раствора фермента и осадителя	рн ферментного раствора	Активность фермента, определяемая в осадке
Ацетон	1:1,0 ) 1:1,5 1:2,0 J	5,0	АС, ПС
Этиловый спирт	1:2,0	) 1:2,5	1 1:3,5 J	5,0	АС, ПС
Изопропиловый спирт	1:1,0 ) 1:1,3 1:2,0 J	5,0	АС, ПС
Ацетон	1:2,0	2,5 4,0 5,0 6,0 7,5 9,0	АС, ПС
Этиловый спирт	1:3	2,5 4,0 5,0 6,0 7,5 9,0	АС, ПС
Изопропиловый спирт	1:1,3	2,5 4,0 5,0 6,0 7,5 9,0	АС, ПС
Осаждение лучше всего вести в центрифужных ста-
дах на 150—200 см3. Осаждение проводится в трех
ПаРаллельностях из объема 25 см3 вытяжки или фильт-
рата (концентрата) культуральной жидкости. Две про-
Ь1 используются для определения активности фермен-
123
тов в осадке, третья проба предназначается для опреде.
ления выхода препарата по массе.
Рассмотрим порядок проведения эксперимента впер,
вом варианте задачи. Вначале из общего объема вытяж-
ки или фильтрата перед осаждением отбирается сред-
няя проба в количестве 30—50 см3. В ней определяются
активности ферментов и содержание сухих веществ.
Для осаждения берут 9 сухих центрифужных стака-
нов, помечают их, три центрифужных стакана взвеши-
вают с точностью до сотых. Во все девять центрифуж-
ных стаканов вливают по 25 см3 охлажденного фермент-
ного раствора. Затем в химические стаканы наливают
по тонкой стеклянной палочке необходимое количество
осадителя (в первом варианте—ацетона): в три стака-
на по 25 см3; в три других — по 37,5 см3; в три следую-
щих— по 50 см3. В каждом варианте осаждения должен
быть один взвешенный центрифужный стакан. Химиче-
ские стаканы с осадителем устанавливают в строгой по-
следовательности непосредственно за штативом -с цент-
рифужными стаканами. Затем поочередно при помеши-
вании палочкой осадитель вносят в центрифужный ста-
кан с ферментным раствором. Палочку смывают послед-
ними 2—3 см3 растворителя, после чего центрифужные
стаканы устанавливают в гнезда ротора. Центрифугиро-
вание ведут в течение 5 мин при частоте вращения ро-
тора 8000—10000 мин-1. Затем центрифугу выключают
и после полной остановки ротора вынимают стаканы.
Надосадочную жидкость декантируют, а содержимое то-
го стакана, масса которого известна, ставят на высуши-
вание до постоянной массы при 105°С на 3—4 ч — опре-
деляют выход осадка по сухой массе. Две другие пробы
являются параллельными, и в них определяют активно-
сти ферментов, содержание углеводов, белка, золы.
Чтобы избежать лишних пересчетов, содержимое
каждого центрифужного стакана осторожно очень малы-
ми порциями воды смывают при интенсивном переме-
шивании и растворении в мерную колбу на 25 см3, т. е-
объем растворенного осадка точно равен объему исход
ного ферментного раствора, пошедшего на осаждение-
Несколько сложнее проводится эксперимент, если
требуется очень точно определить содержание фермеД
тов в осадке и в надосадочной жидкости. Тогда после
декантации надосадочной жидкости к осадку добавляю1,
124
осадитель той же концентрации, что была принята для
данного опыта, перемешивают осадитель с осадком и
вновь центрифугируют, так повторяют 2—3 раза. Все
промывные смеси из одного стакана объединяют с пер-
вой надосадочной жидкостью.
Если изучаемый фермент очень лабилен, следует ана-
лизировать его в центрифуге с охлаждением и держать
при -всех манипуляциях в емкости, опущенной в ледя-
ную баню.
При изучении влияния на степень осаждения фер-
ментов величины pH среды раствор обычно подщелачи-
вают аммиаком (10%-ным раствором) или подкисляют
серной кислотой (6%-ным раствором), контроль за ве-
личиной pH ведется по потенциометру. Так как объем
меняется, подтитровка проводится сразу 75 см3 фермент-
ного раствора и объем после достижения нужного зна-
чения pH доводится до 100 см3. Это разведение (75 см3
исходного раствора до 100 см3) учитывается при балан-
совых расчетах.
Анализ полученного осадка. Массу осадка, по-
лученную после высушивания центрифугированной про-
бы (25 см3) до постоянной величины, определяют в двух
параллельных образцах по разности масс центрифуж-
ного стакана с раствором до осаждения и после осажде-
ния ферментов и высушивания. Пересчитав полученную
величину на 100 см3, находим выход препарата.
Зная содержание сухих веществ в исходном растворе
и приняв его за 100%, можно подсчитать выход препа-
рата в процентах от исходных сухих веществ. Осадок
после установления его выхода в случае необходимости
может быть использован для определения зольности.
Активность ферментов определяют в рас-
творах осадков в тех же разведениях и тем же методом,
что и в исходном растворе перед осаждением.
Содержание в растворе белка чаще
всего определяют по методу Лоури, либо биуретовым
микрометодом по Ярош, либо каким-то другим методом,
требующим небольшого количества пробы на анализ.
Содержание углеводов определяют после
пРедварительного гидролиза раствора 2%-ной соляной
кислотой в течение 2—2,5 ч по накоплению редуцирую-
щих веществ, которые могут быть определены любым
Известным методом.
125
На определение зольности осадка берут тщатель
но перемешанную суспензию осадка (часть осадка не ра.
створяется после осаждения), и пробу помещают в ти-
гель, предварительно высушенный до постоянной массы
Если берут для определения зольности высушенный оса-
док (это удобнее), то необходимо точно знать навеску,
взятую на анализ. Определение зольности ведется
обычным методом сжигания в муфельной печи.
Протокол наблюдений по данной работе имеет еле
дующий вид:
Наименование продуцента ферментов------------------------------
Способ получения ферментного раствора
Содержание сухнх веществ в ферментном растворе-------------%
pH ферментного раствора------------------
Активность ферментов в экстракте илн фильтрате
культуральной жидкости-------------ед./г
pH исход-
ного рас-
твора
Содержание
сухих веществ
в исходном
растворе
Характеристика осадка
содержание сухих веществ
в г на
25 см3
2 5 см3
в об. %
от резуль-
татов в
графе 4
в % на
I 00 см3
исходного
раствора
Характеристика осадка
ферментативная активность
ед. ФА
иа 1 см3
исходного
раствора
X ед. ФА
в 25 см3
2 ед, ФА
в осадке
ед. ФА
на 1 г
сухого
вещества
осадка
ед, ФА
на 1 мг
белка
выход
активного
фермента,
%
Методика проведения осаждения с указанием всех
участвующих в определениях объемов и разведений за-
писывается как можно подробнее.
Если необходимо проанализировать надосадочну>°
жидкость, следует предварительно под вентилятором
или в вакуум-сушильном шкафу при температуре не вы-
ше 28—30 °C удалить растворитель и после этого пр°"
вести анализ с учетом всех разведений.
126
В протоколе следует также отразить процентное со-
держание в препарате углеводов, белка и золы.
Следует построить графические зависимости выхода
активности ферментов в осадок в процентах от исход-
ной величины и концентрации растворителя в смеси, а
также выхода массы осадка.
В случае изучения влияния pH на полноту осажде-
ния строится зависимость выхода препарата и актив-
ности ферментов от величины pH.
Примечание. Все вышесказанное относится к опыту в од-
ной повторности. Однако лишь какне-то чрезвычайные ^обстоятель-
ства могут оправдать проведение эксперимента в одной повторно-
сти. Ка« неукоснительное правило, принято проводить опыты в трех
(редко в двух) и более повторностях. Это позволяет рассчитать
среднеарифметические оценки измеряемых параметров, убедиться
в отсутствии грубых ошибок, рассчитать доверительные-ошибки по-
лученных оценок (см. приложение I, § 1). Ввиду большого объема
экспериментов данная работа может быть проведена в 2 занятия,
но объекты анализа должны быть обеспечены гарантированными
условиями хранения, предусматривающими стабильность ферментов
и сохранение нми активности.
ОСАЖДЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ СОЛЯМИ
Объектом высаливания могут быть фильтрат или
концентрат культуральной жидкости продуцентов раз-
личных ферментов, а также экстракты из поверхностных
культур микроорганизмов с концентрацией сухих ве-
ществ 7—10 %.
Работа состоит из следующих операций:
подготовка объекта исследования;
осаждение ферментов солями;
анализ препаратов.
Подготовка объекта исследования. В данной лабора-
торной работе процесс высаливания рассматривается на
Примере осаждения комплекса амилолитических фермен-
тов из глубинной культуры Endomycopsis fibuliger
сульфатом аммония.
При глубинном культивировании этот дрожжеподоб-
ный организм образует комплекс ферментов: а-амилазу,
тлюкоамилазу и гликозилтрансферазу. Для дальнейше-
г° использования препаратов из данной культуры неже-
лательно присутствие в них гликозилтрансферазы. Из
литературы известно, что высаливанием сульфатом ам-
мония при определенной его концентрации достигается
127
к
фракционирование комплекса ферментов и в осадок вь:
падает преимущественно глюкоамилаза без сопутствуй,-
щей ей гликозилтрансферазы.
Культуральная жидкость Endomycopsis fibuliger кон-
центрируется методом ультрафильтрации до содержант
сухих веществ в концентрате 5—7%. В этом концентр;
те определяется содержание сухих веществ (рефракто-
метрически), pH (потенциометрически), активность ц
глюкоамилазы и гликозилтрансферазы, содержание бел-
ка.
Полученные данные заносятся в протокол наблюде-
ний. Активности ферментов рассчитываются на 1 см
концентрата, на 1 г сухих веществ и на 1 мг белка.
Осаждение ферментов солями. При проведении это
работы можно предложить следующие варианты зада'!
I — изучение влияния концентрации сульфата аммони
на осаждение ферментов, их фракционирование
частичное освобождение от балласта (берется кон
центрация соли 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 и 100°
от полного насыщения);
II — изучение влияния pH ферментного раствора н
полноту осаждения при определенной концентра-
ции соли (pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9);
III — изучение влияния концентрации сухих веществ :
ферментном растворе на процесс осаждения (кон
центрация СВ 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0
7,0%);
IV — изучение влияния температуры и длительности вы-
саливания на полноту осаждения ферментов (тем
пература 5, 20 и 35°С, длительность высаливани-
0,25; 1,0; 2,0 ч).
Рассмотрим порядок выполнения работы на приме-
ре I варианта. Каждый опыт проводится в трех парад
лельных пробах, одна из которых предназначена для
определения массы (выхода) препарата, а две другие -
для определения всех показателей в препаратах.
Осаждение проводится всей группой студентов из оД'
ного концентрата или фильтрата культуральной жидко-
сти. Точно записывается режим осаждения (например-
температура 20°С, длительность высаливания 1 ч, вы-
держка 30 мин; осадок отделяется на центрифуге npi'
частоте вращения 8000 мин-1 в течение 20 мин и т. Д-)
Осаждение проводится из 50 см3 ферментного раство-
128
ра. Чтобы за осаждением легко было наблюдать, целе-
сообразно высаливание проводить в стеклянных высо-
ких стаканах вместимостью 150 -см3.
Перед взвешиванием сульфат аммония тщательно из-
мельчают в ступке, просеивают через шелковое сито с
размером отверстий 0,1 мм и взвешивают на техничес-
ких весах в выпарные чашки с точностью до десятых.
В каждый стакан вносят пипеткой Мора по 50 см3
ферментного раствора с температурой 20°С. Туда же
опускают тонкую стеклянную палочку с резинкой на
конце. Соль вводят в ферментный раствор очень мед-
ленно, маленькими порциями, при постоянном помеши-
вании. Следующую порцию -соли вводят в раствор толь-
ко после того, как предыдущая порция растворится.
После введения всей соли ее остатки из выпарной чаш-
ки можно смыть тем раствором, в который она вноси-
лась. Затем стакан оставить в покое на некоторое вре-
мя. При небольших насыщениях целесообразно поме-
стить стакан на некоторое время в холодильник.
Когда осадок сформируется, его отделяют центрифу-
гированием, содержимое одного центрифужного стака-
на после декантации надосадочной жидкости переносят
50%-ным этанолом (5—10 см3) в предварительно дове-
денный до постоянной массы бюкс (спирт добавляется
для ускорения высушивания) и высушивают осадок до
постоянной массы в вакуум-сушильном шкафу или в
обычном сушильном шкафу при 105°С.
Две другие пробы также переносят в центрифужные
стаканы, центрифугируют, жидкость декантируют, а оса-
док дистиллированной водой или соответствующим бу-
фером переносят в мерную колбу на 50 см3 (исходный
объем). Полученные растворы являются исходным ма-
териалом для анализа.
Анализ препаратов. Обычно не принято в такого
Рода опытах высушивать полученные препараты, так как
при высушивании возможна дополнительная инактива-
ция ферментов, что искажает общую картину высали-
вания. Поэтому, как было сказано выше, осадок сразу
^е после декантации надосадочной жидкости растворя-
107 и доводят объем раствора до исходного объема фер-
ментного раствора до высаливания, т. е. до 50 см3.
Обычно осадок до конца не растворяется ввиду частич-
ной денатурации белка и поэтому при отборе проб для
5 Зак. 791	129
определения содержания в осадке белка, углеводов, а
лы и т. д. содержимое колбы тщательно перемешиЕ
ется.
Активность ферментов определяется в фильтра
после отбора проб на общий анализ. Методики анали
препаратов можно выбрать в главе I. Все полученн:.
результаты исследования вносят в протокол наблю,:..
ний и статистически обрабатывают.
Протокол имеет следующий вид:
Продуцент фермента-----------------------
Осадитель-----------------------------------
Содержание сухих веществ в исходном ферментном растворе--------
Активность ферментов---------ед./см3 исходного раствора,
ед./г сухих веществ, ед./мг белка
Выход осадка
Методика проведения процесса высаливания с ук-
занием всех участвующих в определениях объемов
разведений записывается как можно подробнее.
§ 3. ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СВОЙСТВ
ФЕРМЕНТОВ
Лабораторная работа №7
Ионообменная хроматография белков
Ионообменная хроматография, получившая за
следнее время широкое распространение в химии и би-'
химии, в принципе, сводится к двум операциям: связы-
ванию обменником исследуемых ионов и их последуй
щему дифференциальному элюированию, в процео’
которого достигается разделение этих ионов. Первь11
130
процесс проводится в условиях, обеспечивающих макси-
мальное взаимодействие исследуемых соединений с об-
менником. Обычно для достижения этого состояния не-
обходима низкая ионная сила раствора и такая величи-
на pH, которая способствует максимальной ионизации
компонентов исследуемой смеси.
Сорбируемость белков на обменниках определяется
в основном электростатическими силами, поэтому ре-
шающее значение при выборе обменника и условий
сорбции имеют величина заряда, pH и ионной силы рас-
твора. В слабых буферных растворах, когда влиянием
последнего фактора можно пренебречь, следует руковод-
ствоваться изоэлектрической точкой белка, которая дает
представление о величине суммарного заряда и pH рас-
твора.
Интенсивное использование хроматографических ме-
тодов для фракционирования различных высокомолеку-
лярных белков началось после введения в биохимиче-
скую практику целлюлозных ионообменников, а позд-
нее—ионообменных полимеров декстрана (сефадекс),
обладающих в отношении белков сравнительно высокой
емкостью и низкой величиной необратимой адсорбции
(см. табл. 4 приложения II).
Амфотерность белков обусловливает ряд особенно-
стей ионообменного процесса, в частности возможность
проведения как анионообменной, так и катирнообменной
хроматографий, хотя по ряду причин первый вид пред-
почтительнее. Большая популярность анионитов обус-
ловлена тем, что подавляющая часть белков представ-
ляет собой слабокислые электролиты, которые в нейт-
ральных средах ведут себя как анионы. Поскольку ней-
тральные среды являются областями наибольшей ста-
бильности белков, а в таких условиях адсорбционная
емкость максимальна у анионитов, то это и определяет
выбор ионообменника.
Если обозначить ионогенные группы белка через
"-ООС—р_Nh£,	то его реакцию обмена с аниони-
ТО!Л (I) или катионитом (II) можно записать следую-
щим образом
I ОБ+он~ + ~ООС—R—мн+д±ов+ ~ООС—R—NH2 + НаО
п ОБ~н+ 4- +NH3—R—COO- д±ОБ- +NH3—R—СООН
5*	131

При хроматографии белков на анионообменниках р]-|
элюирующего раствора должен быть выше изоэлектри-
ческой точки. В обоих случаях будет иметь место пере-
зарядка белка. В результате белковая молекула приоб-
ретет заряд того же знака, что и обменник, и между ни-
ми возникнут силы электрического отталкивания, т. е.
создадутся условия для десорбции и элюирования. Бел-
ки будут диффундировать в растворитель и вместе
проходящим через ионообменник раствором элюента f
дут .выводиться из колонки.
Целью настоящей работы является фракционирова-
ние комплексного ферментного препарата и его после-
дующее исследование. Работа проводится в два заня-
тия.
Первое занятие
На «первом занятии студент осуществляет следующие
операции:
выбирает подходящий ионообменник;
готовит ионообменник;
готовит колонки и вносит ионит.
Выбор подходящего ионообменника. В адсорбции
ной хроматографии белков могут быть использованы в.
анионо-, так и катионообменникн. Лимитирующим ф.>
тором является стабильность белка, в частности фп
мента. Суммарный заряд белковой молекулы являе:'
функцией pH. Ниже изоэлектрической точки белок иж-
суммарный положительный заряд и адсорбируется ка
онообменником. Выше изоэлектрической точки белок :
сет суммарный отрицательный заряд и может адсор<"
роваться анионообменником. В этом случае выб
ионообменника определяется зоной рН-стабильности
следуемого белка.
В случае отсутствия данных об изоэлектричесь
точке белка проводят предварительные испытания. Д'
испытания анионообменника готовят буфер с pH 8,0
для катионообменника — с pH 5,0. Отвешивают по 0,0
каждого ионообменника в отдельную пробирку и доб>
ляют по 30 см3 соответствующего буфера 0,1 М. Ур
новешивают ионообменник путем его промывания е
как минимум двумя равными объемами буфера. Да
ионообменнику осесть и сливают супернатант так, 4
бы объем, занимаемый ионообменником, был раВ
132
10 см3. К каждому ионообменнику добавляют равное ко-
личество раствора фермента. Суспензию перемешивают,
чтобы весь ферментный раствор проконтактировал с
понообменником. После оседания взвеси супернатант от-
деляют и в нем определяют активность исследуемого
фермента. Отсутствие активности в супернатанте свиде-
тельствует об адсорбции активного белка ионообменни-
ком.
Подготовка ионообменника. Независимо от того, в
какой форме находится ионообменник, при первом ис-
пользовании его желательно последовательно обрабо-
тать кислотой и щелочью, чтобы обеспечить регенера-
цию, удаление следов тяжелых металлов и получение
нужной формы. Последнее обстоятельство определяет
последовательность обработки кислотой или щелочью,
концентрация которых при работе с целлюлозным или
декстрановым материалом никогда не должна превы-
шать 0,5 н., а продолжительность контакта должна огра-
ничиваться 2 ч.
Так, если при работе с анионитами типа ДЭАЭ желательно
получить обменник в ОН_-форме, то вначале его суспендируют в
0,5 н. растворе НС1, а затем в 0,,5 и. растворе NaOH. Если жела-
тельна С1_-форма, то последовательность операций должна быть
обратной. Аналогичная последовательность обработки применяется
и в отношении катионитов. Объем кислоты и щелочи, применяе-
мых в этих случаях, должен как минимум в 15 раз превосходить
объем навески обменника.
Вначале навеску обменника суспендируют в дистил-
лированной воде или в слабом буфере для набухания.
В случае ионообменных сефадексов эта операция вы-
полняется по прописи, приведенной в разделе «Исследо-
вание ферментов методом гельфильтрации».
В случае целлюлозных порошков и гранулированной
Целлюлозы специальная стадия набухания может быть
°пУЩена и совмещена с отмучиванием.
Для целлюлозных анионитов рекомендуется после
^скольких часов набухания в слабом буфере (0,005—
>01 М, pH 7,Q) суспендировать ионообменник в свежей
и°рции буфера из расчета 1 г сухого порошка на 30 см3
Раствора. Если для анализа используется уже бывший
работе сырой ионообменник, достаточно 6 см3 раство-
на 1 г массы. После тщательного перемешивания в
Рном цилиндре суспензию оставляют отстаиваться.
133
Набухший и отмученный декстрановый или целлю-
лозный ионообменник (или сухой целлюлозный поро,
шок) суспендируют в 15 объемах кислоты или щелочи
(0,5 н.) и оставляют на 30—60 мин при комнатной тем-
пературе. Слишком энергичного размешивания следует
избегать как на этой, так и на всех последующих ста-
диях. Надосадочную жидкость сливают или отфильтро-
вывают, а осадок промывают дистиллированной водой
до слабокислой реакции среды (pH 4,0) при отмывании
от кислоты или до слабощелочной реакции (pH 8,0) при
отмывании от щелочи. Отмытый осадок снова суспенди-
руют в 15 объемах 0,5 н. раствора щелочи (при преды-
дущей обработке кислотой) или 0,5 н. раствора кислоты
(при предыдущей щелочной обработке). После 30 мин
инкубации надосадочную жидкость сливают и осадок,
не промывая, заливают свежей порцией такого же рас-
твора, чтобы обеспечить полное замещение нужным про-
тивоионом. Далее материал отмывают на фильтре ди-
стиллированной водой до нейтральной реакции.
Регенерированный ионообменник подвергают либо
непродолжительному отмыванию, либо, наоборот, тща-
тельному промыванию буферными растворами. За по-
следней операцией закрепился специальный термин
«уравновешивание». Необходимость промывания ионо-
обменников после регенерации буферными растворами
диктуется тем, что при адсорбции белков и при после-
дующем элюировании pH раствора ,в колонке может
резко изменяться. Поэтому регенерированный ионооб-
менник должен быть отмыт слабым буфером. Эта опе-
рация в ряде случаев нужна также для того, чтобы обес-
печить требуемую величину pH и ионной силы в момент
адсорбции. До этих же величин pH и ионной силы дово-
дится и опытный раствор, наносимый на колонку.
Подготовка колонок и внесение ионита. Ионообмен-
ные сефадексы вносятся в колонку так же, как и обыч-
ные сефадексы соответствующих но^меров,— после преД'
варительной деаэрации суспензий. Последняя особенно
важна в случае анионитов, связывающих ССД ДеаэрЗ’
цию в этом случае рекомендуется выполнять следующий
образом: анионит суспендируют в кислом компоненте
рабочего буфера с таким расчетом, чтобы величина р^
была около 4,5. Суспензию помещают в бюхнеровску’10
колбу с магнитной мешалкой и подсоединяют к вакуу-'*'
134
нОй системе, способной обеспечить разрежение ниже
13 кПа. Откачка продолжается до тех пор, пока не пре-
кратится выделение пузырьков. Слишком глубокий ва-
куум нежелателен, так как жидкость может «закипеть».
Далее к смеси добавляют щелочной компонент буфера
с таким расчетом, чтобы получить нужное значение pH,
и суспензию сразу же вносят в колонку.
Оптимальный объем суспензии порошковых деллю-
дозных материалов при внесении в колонку составляет
150% от объема слоя набухшего обменника после его
оседания в мерном цилиндре при отмучивании.
Как только вся суспензия оказалась в колонке, по-
следняя немедленно подключается к системе, прогоняю-
щей через колонку буфер со скоростью 45 см3/ч на 1 см2
поверхности, что при наличии тока жидкости предот-
вращает конвекционные потоки в оседающем ионообмен-
нике.
Не рекомендуется оставлять ионообменник с адсорбированным
материалом на ночь. Необходимо помнить, что целлюлозные порош-
ки во влажном состоянии сравнительно быстро разрушаются цел-
люлолитическими ферментами бактерий и грибов. Поэтому буфер-
ные растворы по возможности должны содержать антисептик.
Несмотря на сравнительную инертность целлюлозной и дек-
страновой матрицы периодические контакты со Щелочью и кислотой
при регенерации способствуют расщеплению гликозидных и галак-
тозидных связей соответственно, что приводит к постепенной дегра-
дации матрицы. Этому же способствуют и механические факторы
при размешивании и ресуопендировании. В результате в препарате
накапливаются мельчайшие частицы, резко замедляющие фильтра-
цию растворов.
После заполнения колонки рекомендуется наслоить
0,5 см сефадекса G-25, растворенного в том же буфере,
чтобы защитить поверхность ионообменника. Высота
слоя ионообменника 20 см обычно бывает достаточной,
чтобы вещества адсорбировались слоем 1—2 см. Диа-
Метр выбирают в зависимости от требуемой поверхности
ионообменника.
Второе занятие
На втором занятии осуществляются следующие опе-
рации:
нанесение анализируемого образца и элюция белка;
определение оптической плотности и ферментативной
Живности во фракциях.
135
Нанесение анализируемого образца и элюция белк;1
Анализируемый образец на колонку наносится обычн,
образом.
Десорбция белка с ионообменника достигается Л1
путем увеличения концентрации соли в растворе, ли
путем изменения pH раствора. Существуют два способ,
создания градиента концентрации: непрерывный и ст\-
пенчатый. Каждый из способов создания градиенд
имеет свои недостатки и преимущества и в связи с эти?
собственные области применения. Непрерывный способ
создания градиента применяется значительно чаще, а
аналитических работах он занимает монопольное поло-
жение.
Определение оптической плотности и ферментативной
активности во фракциях. Оптическая плотность каждой
фракции измеряется на фотоэлектроколориметре пр
светофильтре с максимумом светопропускания при /
= 280 нм. После измерения оптической плотности р,>
творы используют для определения ферментативной
тивности (двух и более ферментов). Методики опре.
ления соответствующей активности ферментов да
в главе I.
После анализа всех фракций составляется протоь
наблюдений, включающий описание ферментного пре;
рата (его активность, содержание в нем белка, объ
пробы, нанесенной на колонку), колонки (ее диам(
и высоту, тип ионообменника, градиент, скорость эл1
ции), результаты анализа полученных фракций (их ;
тивность в ед./см3). В заключение строится хрома:
грамма.
Лабораторная работа №8
Диск-электрофорез белков и ферментов
Разделение белков и ферментов с помощью дне
электрофореза имеет ряд преимуществ перед обычн'
ми методами зонального электрофореза: возможное
исследовать малые количества материала (1 —100 мк'
работать с разбавленными растворами веществ, под-’'
жащих разделению, простота аппаратуры, быстрей
разделения (30—60 мин), высокая разрешающая сг
собность для молекул различного размера и формы, -х
136
оошая воспроизводимость разделения. Благодаря этим
достоинствам метод применяется для самых разнооб-
разных целей: для испытания чистоты препаратов и хро-
матографических фракций, оценки методов экстракции,
очистки и т. д.
Диск-электрофорез применяется не только- для ана-
литических целей, но и для препаративного разделения,
а также в качестве ультрамикроаналитического метода,
когда количество вещества измеряется в нано- и пико-
граммах.
Диск-электрофорез представляет собой метод, в ко-
тором используется неоднородная разделяющая система
с полиакриламидным гелем в качестве носителя.
Полиакриламидный гель представляет собой продукт сополи-
меризации акриламида СН2=СН—СО—NH2 и какого-либо сшиваю-
щего агента, чаще всего N'N'-метиленбисакрпламида: СН2—СН—
—СО—NH—СН2—NH—СО—СН=СН2. Благодаря образованию по-
перечных связей между растущими соседними полиакриламидными
цепями, возникающими в результате полимеризации винильных
групп, такой гель имеет структуру трехмерной сетки. Вязкость, эла-
стичность и прочность геля зависят как от степени полимеризации,
так и от степени сшивци (системы гелей для диск-электрофореза
приведены в табл. 8 приложения II).
При диск-электрофорезе используют пары буферов
разного состава и с разными значениями pH, а носитель
состоит из отдельных слоев геля, различающихся по
Размерам пор. Благодаря этому разделяемые вещества
концентрируются сначала в очень узкой стартовой зоне,
что имеет решающее значение для четкого разделения
смеси.
Высокая разрешающая способность диск-электрофо-
Реза базируется на двух физических явлениях: эффекте
концентрирования и эффекте молекулярного сита. При
Разделении растворимых компонентов смеси веществ эта
СМесь сначала концентрируется в узкой поло-се крупно-
пористого полиакриламидного геля, а затем в мелкопо--
РИстом геле ее компоненты распределяются по величи-
е’ Форме и заряду молекул.
При диск-электрофорезе обычно пользуются малень-
кими колонками полиакриламидного геля, состоящими
л ^ВУХ частей: крупнопористого концентрирующего ге-
щ’ в котором происходит концентрирование подлежа-
х Разделению веществ, и мелкопористого разделяю-
137
щего геля, в котором эти вещества разделяются. В ко 
лект установки для диск-электрофореза входят тар
электроды, сосуды для электродов, заполненные буф.
ным раствором, и источник питания.
Ионы, движущиеся во время электрофореза в од:
направлении с фракционируемыми веществами и об;,
ловливающие эффект концентрирования, можно разбг
на два типа: ведущие и замыкающие. В начале рар
ления ведущие ионы находятся во всех частях коло:
а замыкающие — только в электродном буфере.
Значения pH буфера и концентрирующего геля
бирают так, чтобы ионы по эффективной подвижно
располагались в следующем ряду: ведущие ионы, бе.г
замыкающие ионы. Так как подвижность белков р
колько ниже подвижности ведущих ионов, но выше г
вижности замыкающих ионов, белки концентрирую
в узкой зоне, передним фронтом которой служит г.
вижная граница. Отдельные белки последовательно р
полагаются в колонке между ведущими и замыкаю:,
ми ионами в соответствии со своей подвижностью,
разуя диски толщиной в несколько микрон.
Когда движущаяся белковая зона, «втиснутая» м>
ду ведущими и замыкающими ионами, достигает гра
цы между концентрирующим и разделяющим геля-,
она встречается с двойным «нарушением непрерыв
сти», так как разделяющий гель характеризуется а
гими значениями pH и другими размерами пор. На-
значение pH в разделяющем геле подбирают с таг
расчетом, чтобы степень диссоциации замыкаюы
ионов увеличилась во много раз. В результате замык.
щие ионы приобретают подвижность, близкую к и
вижности ведущих ионов, поэтому они перегоняют б-
ки и движутся впереди них непосредственно за веда'т:
ми ионами. При этом происходит изменение электр:'
ского поля, и теперь уже белки движутся в облает
постоянной напряженностью поля и с постоянным з
чением pH; здесь они подвергаются истинному зона-
ному электрофорезу и разделяются по своим размер3
форме и электрическому заряду молекул. У белков -
разной молекулярной массой, даже если они обладав 
одинаковой свободной подвижностью, скорость дви±
ния тоже оказывается различной, и тем самым д°с
гается их разделение,
Таким образом, сочетание эффекта концентрирования
п эффекта молекулярного сита при диск-электрофорезе
обусловливает в конечном счете высокую разрешающую
способность этого метода. Из сказанного ясно, что необ-
ходимо всегда учитывать влияние величины pH на веще-
ства, подлежащие разделению с помощью диск-электро-
фореза.
Общий принцип состоит в том, что буферная система
должна обеспечивать максимальное разделение веществ,
не изменяя ни их растворимость, ни химическую и био-
логическую устойчивость. Разделяемые вещества при
значениях pH концентрирующего и разделяющего гелей
должны нести заряд того же знака, что и ведущие и за-
мыкающие ионы. Величина pH раствора разделяемых
веществ должна быть такой, чтобы при внесении его в
колонку заметного изменения pH концентрирующего ге-
ля не происходило. Поэтому перед внесением раствора
рекомендуется измерять pH и; если необходимо, дово-
дить его до величины pH буфера ±0,7'5.
Прибор для проведения диск-электрофореза завода
«Реанал», модель 71, показан на рис. 18, а. Основными
частями прибора являются два квадратных, вертикаль-
но расположенных сосуда» для электродных буферов,
соединенных с помощью ножек. Имеющиеся в середине
сосудов углубления в форме круга служат для закреп-
ления цилиндрических электрод-держателей. Отверстия,
просверленные на сторонах электрод-держателя, позво-
ляют электродам не быть зависимыми от уровня буфе-
ра. Электроды имеют спиральную форму, изготовлены
они из специального сплава.
Под разливку гелей и для их закрепления на время
электрофоретического процесса используются стеклян-
ные трубочки 4 длиной 100 и внутренним диаметром 6 мм
и трубочки 3 длиной 120 и внутренним диаметром 12 мм.
На время электрофореза трубочки закрепляются в ос-
новании верхнего сосуда в резьбовых отверстиях. Для
аналитических целей используют трубочки диаметром
*00 мм, для препаративных — диаметром 120 мм. При-
боР в процессе электрофореза закрывается крышкой, к
второй подсоединен автоматический выключатель. Вы-
ключатель с помощью соединительных проводов подсо-
Динен к источнику питания при стабилизированном на-
пряжении. В случае поднятия крышки прибора, находя-
138
139
Рис. 1$. Прибор для проведения диск-электрофореза в полиакрил-
амидном геле (модель 71):
а — прибор в сборе (Д 2 — сосуды для электродных буферов; 3 — тр.
бочки длиной 120 мм; 4 — трубочки длиной 100 мм; 5 — электрод-дерям
тель; 6 — соединительные ножки; 7 — уплотняющая система с автомат
ческим выключателем); б — штатив для трубочек прибора (I — уплотня
щая гайка; 2 — прокладочное кольцо; 3 — резиновое кольцо-прокладк i
щегося в рабочем состоянии, выключатель автоматиче-
ски отключает прибор от источника питания.
Для стеклянных трубочек прибора, имеющих ра. •
ный размер, прилагаются два разливочных штатик
(см. рис. 18,6), представляющих собой пластинку -
резьбовыми углублениями. Стеклянные трубочки в пла-
стинке закрепляются во время проведения полимериза-
ции геля с помощью уплотняющей системы в порядк-
описанном выше.
При разделении ферментного препарата с помощь1
диск-электрофореза студенты проводят следующие опе-
рации:
определяют содержание белка в ферментном препа-
рате и готовят раствор для электрофореза;
готовят гели и буферный раствор;
проводят электрофорез;
окрашивают белковые зоны;
определяют ферментативную активность в белковый
фракциях.
140
к
Определение содержания белка в ферментном пре-
парате и приготовление раствора для электрофореза. Со-
держание белка в препарате определяется модифици-
рованным методом Лоури. На основании данных о про-
центном содержании белка в ферментном препарате го-
товят пробу для испытания. В пробе с 5%-ным содер-
жанием сахарозы должно быть 50—100 мкг белка, а ее
объем не должен превышать 0,1 см3.
Приготовление гелей и буферного раствора. Гели и
электродный буферный раствор готовят по прописи, при-
веденной в табл. 8 приложения II. Обычно 7,5%-ный
полиакриламидный гель оказывается пригодным для
электрофоретического разделения белковых компонентов
многих ферментных препаратов. С целью проверки пол-
ноты разделения белкового комплекса необходимо по-
ставить проверочные опыты с концентрацией акрилами-
да в пределах 3,45—15%.
Проведение электрофореза. После нанесения испы-
туемой пробы на поверхность геля стеклянные трубоч-
ки устанавливают в гнезда прибора для электрофореза.
В верхний и нижний резервуары наливают буферный
раствор, после чего электроды подключают к источнику
постоянного тока. Окончание процесса электрофореза
определяют по моменту, когда полоска бромфенолового
синего в контрольной трубочке подойдет к нижнему ее
краю.
Окрашивание белковых зон. Гель извлекают из труб-
ки и переносят в широкий химический стакан вместимо-
стью 400—600 см3. В стакан наливают раствор красите-
ля (амидовый черный 10В; процион бриллиантовый си-
ний RS; кумаси бриллиантовый синий R250). Периоди-
чески перемешивая, гель выдерживают в красителе от
0,5 до 2 ч. Затем раствор красителя сливают и отмыва-
ют избыток красителя 7%-ным раствором уксусной кис-
лоты. Отмывание — длительный процесс, требующий
многократной смены раствора уксусной кислоты, но так
как в работе не предусмотрено денситометрическое опре-
деление, можно не добиваться полного удаления фона.
Определение ферментативной активности в белковых
Фракциях. На ровной поверхности параллельно друг
Другу располагают окрашенный и неокрашенный гель с
одинаковым испытуемым образцом. Из неокрашенного
Гс'ля вырезают фрагменты, соответствующие окрашен-
141
ним зонам геля. Отдельные кусочки гомогенизируют ;;
соответствующем буфере, и в элюатах определяют а<
тивность фермента.
.При выполнении этой работы в виде самостоятельной НИР<
необходимо проводить опыты не менее чем в трех повторностг,.
что позволяет выявить возможные грубые ошибки в экспериме
тальных данных и рассчитать величины доверительных ошибок п
лученных средних результатов (см. приложение I, § 1).
В качестве дополнительного задания может быть поставлен
/задача определения оптимальных условий электрофореза. В этс 
«случае следует применить математические методы планировал!
(многофакторных исследований (см. приложение I, § 3) с последу!
щим поиском оптимальных условий.
Протокол наблюдений по данной работе долже
включать описание (характеристику) исходного фе]
ментного препарата на содержание белка по активно
стям ферментов и системы геля; объем и количестг
белка в испытуемой пробе; подробное описание условп
электрофореза (температура, сила тока, накладываема
на гель, длительность и т. д.); рисунок трубки геля
окрашенными белковыми фракциями; схему разрезаны
столбика геля; данные по активности фермента или фер
ментов в отдельных фракциях, сведенные в таблиц}
Лабораторная работа №9
Изоэлектрическое фокусирование белков
Метод изоэлектрического фокусирования позволяе;
разделить белки, различающиеся своими изоэлектриче-
скими точками. В данном методе используется так на
зываемый естественный градиент pH.
Механизм образования такого градиента можно объяснить еле
дующим образом. В растворе любого электролита в электрическое
поле у катода и анода соответственно будут накапливаться, на
пример, КОН и H2SO4. Если к раствору добавить какой-либо орав
нительно низкомолекулярный амфолит типа смеси пептидов, то }
отрицательно заряженного катода в основной среде пептид приоб
ретет отрицательный заряд, а у положительно заряженного анода
в кислой среде заряд пептида станет положительным. Поэтому пел-
тиды будут отталкиваться от близлежащего электрода к центр)
камеры или колонки до тех пор, пока не займут такого положения
в котором их общий заряд будет равен величине pH электролита
Если в системе будет присутствовать смесь пептидов, различаю-
щихся по величине и знаку заряда, то они будут располагаться
в соответствии с величинами их изоэлектрических точек: наиболее
основные пептиды вблизи катода, наиболее кислые — вблизи анода.
142
пептиды с промежуточными изоэлектрическими точками — между
этими крайними полюсами. Таким образом, в результате электро-
форетического процесса возникает естественный градиент pH, ста-
бильный и неподвижный в течение длительного времени, пока к си-
стеме приложена разность потенциалов.
Решающую роль в этой системе играют амфотерные электро-
литы, предназначенные для создания естественного градиента pH.
Такую роль могут выполнять только такие амфотерные электроли-
ты, которые обладают хорошей буферной емкостью и хорошей про-
водимостью в области своих изоэлектрических точек. Кроме того,
эти вещества должны обладать сравнительно небольшой молеку-
лярной массой, чтобы быстрее достигалось равновесие и они легко
отделялись диализом, и быть инертными по отношению к исследуе-
мым объектам.
Фирма LKB производит целую серию таких амфотерных элек-
тролитов (торговое название Ampholin—амфолин), представляю-
щих собой алифатические аминокарбоновые кислоты, строение кото-
рых можно представить следующей формулой
_-СН2—N—(СНа)ж—N—СН2—
где х=2 или 3; й=Н или —(СН2)х—СООН.
Изоэлектрические точки амфолинов покрывают интервал pH от
3,0 до 10,0, а также любой из более узких интервалов в этом диа-
пазоне. Молекулярная масса различных амфолинов лежит .в, преде-
лах 300—600, они легко удаляются диализом и обладают низкой
величиной светопоглощения при Л=280 нм.
Разрешающая способность метода с имеющимися в продаже
амфолииами равна 0,0® ед. pH, что дает возможность разделять
вещества, изоэлектрические точки которых различаются между со-
бой на указанную величину.
Недостатком метода является необходимость работать в бессо-
левой среде, что в ряде случаев может способствовать инактивации
ферментов. Кроме того, в изоэлектрической точке, особенно при вы-
сокой локальной концентрации, многие белки выпадают в осадок.
Частичное уменьшение растворимости в изоиопном состоянии
можно компенсировать добавлением мочевины (до 2<—4 М), если
только мочевина сама по себе не оказывает денатурирующего дей-
ствия.
Фирма LKB выпускает специальные колонки для ра-
боты по описанному методу вместимостью 110 и 440 см3
(рис. 19). В центре колонки по ее длинной оси распо-
ложен электродный сосуд в форме трубки с вентилем
на его нижнем конце. Вентиль открывается и закрыва-
ется с помощью специального регулятора в верхней ча-
сти электродной трубки. Регулятор и вентиль соедине-
ны тефлоновым стержнем, на который намотана плати-
143
новая проволока, служащая од-
ним из электродов (катодом).
Второй платиновый электрод
(анод) помещается в верхней ча-
сти колонки так, что анодное ц
катодное отделения сообщаются
при открытом вентиле. Нижний
конец колонки закрыт тефлоно-
вой насадкой с капилляром, че-
рез который колонка после окон-
чания фракционирования опо
рожняется.
Целью настоящей работы яв
ляется разделение комплекса
ферментов в соответствии с их
изоэлектрическими точками. Ра-
бота проводится в два занятия.
Рис. 19. Аппарат для изоэлектрофоку-
сирования в градиенте плотности:
1 — электродный сосуд; 2 — тефлоновый
стержень с электродом; 3 — насадка с
капилляром
Первое занятие
На первом занятии проводят изоэлектрофокусирова-
ние ферментов в градиенте плотности сахарозы.
Эксперимент с изоэлектрическим фокусированием на
колонке описанного типа ставят следующим образом.
Вначале готовят два раствора: тяжелый и легкий. Пер-
вый (60 см3) содержит 0,75 г амфолина, покрывающего
нужный диапазон pH, и 28 г сахарозы, растворенных в
дистиллированной воде. Второй раствор (60 см3) содер-
жит 0,25 г амфолина. Исследуемое вещество добавляют
к легкому раствору. Порядок добавления зависит от то-
го, как будет создаваться стабилизирующий градиент
плотности сахарозы. При непрерывном градиенте, соз-
даваемом в смесителе, образец суспендируется во всем
объеме легкого раствора. Если создается ступенчатый
градиент путем смешивания в определенной пропорции
обоих растворов, то образец суспендируется в послед-
ней порции легкого раствора, наслаиваемой последней
на верх колонки. В случае, когда исследуемый белок
144
находится в растворе, соответствующий объем этого
раствора приливают к легкому раствору.
Приготовленный тем или иным образом градиентный
раствор при закрытом вентиле вносят в колонку черед
верхнее отверстие. Затем в электродную трубку (катод)
заливают какое-либо сильное органическое основание
(например, этаноламин), а на верхнюю часть градиент-
ного раствора, примыкающую к аноду,— раствор силь-
нокислого электролита (например, фосфорной кисло-
ты). Затем включают охлаждение, создаваемое с по-
мощью холодильной камеры «Колора», открывают
вентиль и подключают прибор к источнику постоянного-
тока. Через 1—2 дня достигается равновесие, в резуль-
тате которого создается описанный выше градиент pH,.
Этот процесс сопровождается постепенным уменьшением
силы тока, проходящего через колонку, так как по мере
потерь амфолинами зарядов в изоэлектрических точках,
их способность служить переносчиком заряда уменьша-
ется. После того как сила тока достигнет стабильной
величины, можно использовать напряжение около 700 В.
В течение 1 дня после достижения равновесия смесь ис-
следуемых веществ дает четкие полосы в области своих
изоэлектрических точек. Как правило, чем выше моле-
кулярная масса, тем острее зона, в процессе же термо-
диффузии происходит расширение зон, занимаемых низ-
комолекулярными веществами.
Второе занятие
На втором занятии студенты осуществляют следую-
щие операции:
отбирают фракции после проведения эксперимента;
определяют pH, оптическую плотность и фермента-
тивную активность во фракциях;
„строят график распределения белка и ферментатив-
ной активности по фракциям в градиенте pH.
После окончания опыта содержимое колонки выпус-
кается с помощью перистальтического насоса. Выход
°елка можно фиксировать с помощью автоматического
Регистратора оптической плотности раствора «Увикорд»
На самописце «Сервогор» или путем измерения оптиче-
ек°й плотности каждой фракции на спектрофотометре
Ри светофильтре с максимумом светопоглощения при
' = 280 нм.
145
В собранных фракциях измеряется pH и определят]
<ся ферментативная активность, затем рассчитывают,
статистические оценки в виде доверительных ошиб
(см. приложение I, § 1).
Полученные результаты заносятся в протокол наблк
дения:
№ фракции________________________________________
pH	______________________________________
^280
Ферментативная
активность, ед./см3
По полученным данным строится график распредс
ления белка и ферментативной активности по фракция
в градиенте pH. По оси ординат откладываются знач<.
ния /?28о по фракциям и ферментативная активность,
по оси абсцисс — номера соответствующих фракций.
Лабораторная работа №10
Исследование ферментов методом
гельфильтрации
Метод гельфильтрации предназначен для решен,
экспериментальных проблем аналитического и препар
тивного характера.
Материал, используемый в данном методе в качес
ве неподвижной фазы,— сефадекс — представляет соб<
нерастворимый в воде высокогидрофильный декстран
поперечными сшивками, имеющий пористую структур
Благодаря многочисленным гидрофильным группам 1
способен разбухать в воде и водных растворах соле
образуя гель, который может выполнять роль молек
лярного сита при разделении веществ разной молек
лярной массы. Размер пор этого сита определяется ч
стотой поперечных сшивок в декстране: чем ближе ра
положены поперечные сшивки, тем плотнее пространс
венный каркас геля и соответственно меньше спосо
ность сефадекса связывать воду.
Если раствор, содержащий вещества различной м
лекулярной массы, пропустить через колонку, заполне-
ную гелем сефадекса, то более мелкие молекулы пр
146
никнут во внутреннюю часть гельобразующих гранул, н
в результате их миграция через колонку будет замед-
лена. В то же время вещества большей молекулярной
массы не проникают внутрь гранул геля и мигрируют
быстрее мелких молекул. Разные скорости миграции"
приводят к разделению веществ при их прохождении
через «молекулярные сита».
фирма Pharmacia (Швеция) выпускает 18 типов сефадексов-
(без ионообменных свойств), которые различаются частотой по-
пеперечных сшивок. Важнейшие свойства сефадексов приведены
в табл. 4 приложения II. Символ, указывающий тип сефадекса
(G-25, G-50 и т. д.), обозначает пористую структуру (G) и вели-
чину поглощения воды на 1 г сухой массы сефадекса, т. е. указы-
вает частоту поперечных сшивок декстрана. У сефадексов с высо-
ким значением индекса цифра указывает ннжний предел молеку-
лярной массы веществ (в тысячах), не проникающих внутрь гранул
геля. Например, вещества с молекулярной массой меньше 100 000
могут проникать внутрь гранул сефадекса G-1OQ, тогда как веще-
ства с более крупными молекулами выходят в раствор.
Благодаря перечисленным выше свойствам сефадексы широко*
используются при изучении структуры белков. Чаще всего их при-
меняют для разделения белков в зависимости от молекулярной.'
массы, для очистки белковых фракций, для концентрирования раз-
бавленных растворов белка и для обессоливания белковых препа-
ратов.
<
Фракционирование с помощью полиакриламидного
геля дает такие же результаты, как и гельфильтрация на
сефадексе. В отличие от природного декстранового геля,
каким является сефадекс, полиакриламидный гель пред-
ставляет собой гель синтетического полимера, обладаю-
щий чрезвычайно малыми адсорбционными свойствами.
Поэтому разделение на полиакриламидном геле можно
провести практически без потерь фракционируемого ма-
териала. Молекулярная масса фракционируемых ве-
ществ также очень существенна для разделения на по-
лиакриламидном геле: чем она ниже, тем меньше ин-
декс биогеля, который целесообразно использовать для
Фракционирования.
Возможность применения гельфильтрационных мето-
дов разделения молекул с помощью препаратов сефа-
Дексов и биогелей ограничивается молекулярными мас-
рами разделяемых веществ порядка 200 000—400 000.
стественно, что такое ограничение исключает примене-
ие этого чрезвычайно мягкого и эффективного метода
Ля высокомолекулярных веществ типа нуклеиновых кис-
147
лот, некоторых белков и др. Лишь развитие молекуляр.
но-ситовой хроматографии на основе агара или агаро-
зы, а также на коммерческих препаратах — сефарозе, са-
гаваке, АДО-Cel и некоторых других — дало возмож-
ность расширить применение этого метода.
Целью настоящей работы является фракционирова-
ние комплексного ферментного препарата с определе-
нием молекулярных масс фракций. Работа проводится
з три занятия.
Первое занятие
На первом занятии студенты выбирают и монтируют
колонки, готовят гель, заполняют колонки гелем, ана-
лизируют исходный ферментный препарат и готовят
пробы для гельфильтрации.
Выбор колонки. Для получения хороших результатов
при гельфильтрации необходимо правильно подобран,
колонку. Независимо от типа колонки «холостое» про-
странство у ее дна должно быть минимальным. Если
-объем «холостого» пространства довольно большой, мо-
жет происходить смешивание уже разделенных фрак-
ций.
Для того чтобы частицы геля не забивали поры под-
держивающей пластинки, расположенной на дне колот
ки, необходимо на пористую пластинку помещать кру
жок фильтровальной бумаги.
Длина колонки выбирается в зависимости от роди
разделения. Для обессоливания могут использоваться'
короткие колонки (30—50 см),.для фракционирования-
более длинные (до 100 см). В колонках большого диг
метра (25—30 мм) «пристеночный» эффект в меньше
степени препятствует разделению, поэтому широкие кс
лонки дают лучшие результаты, чем узкие (10 мм) ;
длинные. Однако для аналитической гельфильтрацп
целесообразно использовать колонки диаметром 10 м>’
Методика приготовления геля. Соответствующее кс
личество суспендируют в 5—10-кратном объеме дистил-
лированной воды или буфера. После оседания основно
массы частиц сефадекса мелкие плавающие в надоса
дочной жидкости частицы декантируют. Эту процедур
повторяют несколько раз, пока надосадочная жидкост'
не станет совершенно прозрачной. После этого сефадек
оставляют для набухания на различное время (табл. 1™'
148
Таблица 10
Время набухания сефадекса
Тип сефадекса	Минимально требуемое время	
	при комнатной температуре	в кипящей водяной бане
G-10; G-15; G-25; G-50	3 ч	1 ч
G-75	24 ч	3 ч
G-100; G-150; G-200	3 сут	5 ч
G-20	3 ч	—
В процессе набухания нужно избегать чрезмерных
перемешиваний, так как это может привести к разру-
шению частиц сефадекса.
Заполнение колонки гелем. Перед заполнением ко-
лонки необходимо буфер и гель уравновесить при рабо-
чей температуре, чтобы избежать в последующем обра-
зования пузырьков в колонке с гелем. Колонка должна
быть установлена строго вертикально. Свободный объем
под сеткой должен быть заполнен буфером. Осторожно
перемешав,гель сефадекса, суспензию переливают по
стеклянной палочке в колонку. Рекомендуется по воз-
можности залить в колонку в один прием весь необхо-
димый объем суспензии. После образования слоя геля
толщиной 2—5 см открывают кран, выпускающий бу-
ферный раствор. Скорость протекания буферного рас-
твора при заполнении колонки должна быть ниже той,
которую устанавливают после нанесения препарата
(20—30 см3/ч).
После заполнения колонки верхняя поверхность геля
Должна быть горизонтальной и постоянно защищена
слоем буфера. Колонка перед работой промывается 2—
3 объемами требуемого буфера или солевого раствора.
Анализ ферментного препарата и подготовка проб
Для гельфильтрации. Исходный ферментный препарат
Диализируется на ферментативную активность и содер-
жание белка.	-j
При аналитической гельфильтрации объем наносимо-
Го препарата должен быть минимальным (3—5 см3), но
не менее 0,02% объема геля. При обессоливании объем
Образца может составлять 25% от объема геля.
149
Большая вязкость проб вызывает нестабильность зо-
и неправильный сход с колонки. Желательно в наноси
мом объеме иметь 100—200 мг ферментного препарат,-
в зависимости от вязкости раствора.
Второе занятие
На втором занятии студенты осуществляют следую
щие операции:
вводят образец в колонку и фракционируют его;
регенерируют колонку;
анализируют полученные фракции;
строят хроматограммы.
Введение в колонку анализируемого материала и его
фракционирование. При внесении материала в колонка
необходимо выполнить два условия: осуществить равно
мерное распределение раствора по поверхности геля i
не нарушить при этом его упаковку. При внесении ма
териала лучше всего пользоваться специальным фирмен
ным приспособлением Pharmacia.
При отсутствии приспособления избыток жидкостт
осторожно отсасывают и на поверхность защитного дис
ка медленно, по каплям, из пипетки наносят материал
Затем открывают выходной кран и устанавливают нуж-
ную скорость протекания раствора. В момент входа
последней порции материала в гель кран перекрывают
и внутренние стенки омывают минимальным количест
вом элюента. После прохождения этой порции добав-
ляют большое количество элюента и колонку соединяют
с резервуаром.
Фракции, отбираемые с колонки, можно в дальней-
шем объединить в соответствии с кривой оптической
плотности элюента при Z = 280 нм, полученной на «Уви-
корде» или на спектрофотометре. После элюции колон-
ку отмывают не менее чем двумя объемами буфера.
Регенерация колонки. Эта операция осуществляется
простым пропусканием через колонку любого раствори-
теля или (при необходимости удаления механических
примесей, попавших в нее в процессе работы) отмучива-
нием. Частые перебивки колонки с гелем нецелесообраз-
ны, правильно заполненная колонка может быть исполь-
зована 5—10 раз.
Очень часто в колонках после завершения цикла
очистки нарушается правильная укладка верхнего слоя,
150
особенно в случае мелкозернистых и крупнопористых
частиц. Если размеры повреждения не слишком вели-
ки, то можно внести в колонку 0,5—1,0 см3 свежего ге-
ля и взмутить столб на глубину 2—3 см.
При длительной работе колонок желательно добав-
ление к пропускаемым растворам антисептиков, таких
как хлороформ, толуол, крезол, 0,001 %-ный раствор тио-
мертполата, 0,02%-ный раствор NaN3 и т. п. Использо-
вание грмс-буфера обеспечивает нормальную работу ко-
лонок в течение длительного времени.
Анализ полученных фракций. Собранные фракции
после измерения их оптической плотности используют
для определения ферментативной активности (двух и бо-
лее ферментов).
Построение хроматограммы. В случае отсутствия
«Увикорда» можно после замера оптической плотности
(L>28o) и определения ферментативной активности во
всех фракциях построить хроматограмму, По оси орди-
нат откладывается оптическая плотность; по оси абс-
цисс — номера фракций. На этом же графике строится
зависимость ферментативной активности от номера
фракции. По совмещенному графику можно судить о
степени разделения комплекса ферментного препарата
при данных условиях гельфильтрации.
Третье занятие
На этом занятии студенты калибруют колонку и
определяют молекулярную массу фермента.
Калибровать колонку нужно в том случае, если тре-
буется при помощи гельфильтрации определить молеку-
лярную массу неизвестного соединения. В качестве стан-
дартов используют белки, молекулярная масса которых
известна, например бычий сывороточный альбумин,
бычью рибонуклеазу и бычий у-глобулин. Готовят рас-
творы соответствующих белков, содержащие 10 мг бел-
ка в I см3. К раствору каждого белка в качестве марке-
ра прибавляют небольшое количество фенолового крас-
ного. В колонку вводят 2,5 см3 этого раствора (25 мг
белка) и при помощи спектрофотометра определяют со-
держание белка в соответствующих фракциях. Полу-
ченные результаты используют для построения калибро-
вочной кривой, откладывая по оси ординат логарифм
Молекулярной массы белка, а по оси абсцисс — номера
151
соответствующих фракций. В основе данного метода
определения молекулярной массы лежат данные Вита-
кера о том, что между логарифмом молекулярной массы
указанных выше белков и объемом, в котором они элю-
ируются из данной колонки, существует прямая зависи-
мость.
При пропускании через колонку неизвестного белко-
вого соединения определяем объем, в котором оно элюи-
руется. Затем по калибровочной кривой можно опреде-
лить его молекулярную массу.
Определение молекулярной массы неизвестного сое-
динения является ответственной задачей, выполнить ко-
торую можно, лишь осуществив несколько повторностей
опыта (>3), используя полученные результаты для от-
браковки грубых ошибок и определения доверительных
ошибок (см. приложение I, § 1).
После проведения испытаний составляют протокол
наблюдений, включающий характеристику ферментного
препарата (его активность, содержание белка, объем
пробы, нанесенной на колонку), характеристику колон-
ки (ее диаметр и высоту, марку сефадекса, скорость
протекания буферного раствора), результаты анализа
полученных фракций (активность в ед./см3 и содержа-
ние белка в мкг/см3), хроматограмму и калибровочную
кривую.
Лабораторная работа №11
Исследование кинетики ферментативной реакции
Кинетическое исследование представляет собой один
из важнейших этапов исследования ферментов, дающих
ценные сведения о строении ферментов, их активных
центрах и механизме их действия. Эти исследования
необходимы для грамотного использования ферментов.
Характеристика кинетики изучаемого фермента скла-
дывается из нескольких показателей. Прежде всего
определяется скорвсть ферментативной реакции, кото-
рая представляет собой производную d[C\/dx, где [С] —-
концентрация исходного субстрата, на который действует
фермент, т — время.
Если определение проводится при постоянных внеш-
них условиях (температура, давление, растворитель к
т. д.), то скорость реакции описывается уравнением
152
v = й[Л]Пл[В] Пв,
(1)
где А и В—изменяющиеся при реакции соединения
(квадратные скобки показывают, что речь идет о кон-
центрации этих веществ); п — порядок реакции, кото-
рый может быть выражен целыми и дробными числа-
ми; k— коэффициент пропорциональности, или констан-
та скорости реакции.
Для большинства простых реакций (кроме реакций
нулевого порядка) кинетическая кривая, т. е. зависи-
мость [С] от т, обычно имеет вид, показанный на рис. 20.
Текущая скорость v определяется путем построения ки-
нетической кривой в крупном масштабе и отождествле-
ния ее малых участков с прямолинейными.
Для простых реакций с участием одного соединения
или нескольких соединений с одинаковой начальной кон-
центрацией уравнение приобретает вид v=—d [Л]/£/т=*[Л],г,
откуда lg v = \gk+n lg![A].
Строя зависимость lgo = /lg[A], необходимо прове- .
рить исходное предположение о подчинении реакции
уравнению (1), и если такое подчинение имеет место, то
определить п и k.
Аналоппйтый расчет можно провести, исходя из зна-
чений начальных скоростей t»o при нескольких различ-
ных начальных концентрациях [А]о: v0 = — (d [Л]/</т)0 =
= *[Л1о> откуда lg v0 = lg k+n lg{A]0.
Константы скорости реакции определяются рядом
методов, но чаще всего для моно- и бимолекулярных
необратимых реакций по следующим формулам:
для мономолекулярной реакции (1-го
порядка), имеющей вид А-*-Р, о = /г[А]т, k= (2,3/т) X
XIg([A]0/[A]r ), или fe=(2,3/T)lg([P]co/{[P]0o-[P]T }),
где [Р]т и [Р]оо —концентрация продукта реакции в
Данный момент времени и после завершения реакции
соответственно, или k= (2,3/т) 1g [1/(1— х)], где х—
«степень превращения», равная [Р]т /[А]о;
Для бимолекулярной реакции (2-го по-
Рядка), имеющей вид А + В-+Р, при равных на-
Ильных концентрациях реагентов ([А]о =
^[В]о), а = й[Л]т[В]х=й[Л]2,	/г=(1/[А]от) {([А]о—[А]т)},
йли*=(1/[Л]от)[х/(1-х)];
Для бимолекулярной реакции при
153
разных начальных концентрациях ре
тентов ([Л]о>[В]о) ц = £[Д]г[В] т, £ = 2,3/{т([Д]п-
-Ио) } 1g { ( [Д ] О- [Р] г ) [В] о/ ([В]о-[Р]г) И]о}.
Кроме того, величину k определяют графически г
тангенсу угла наклона зависимости 1g ([Д] о/[Д]-г ) от
или —1§[Д]т от т для реакций 1-го порядка;	(
т для реакций 2-го порядка при [Д]о=[Р]о и lg{(H]o-
- РЬ)/([В]о- [Р]г )} от т для реакций 2-го поряд
ка при [Д]0>[В]0.
Существуют и другие методы определения этих кон-
стант. Ферментативные реакции обычно включают две
стадии: образование фермент-субстратного комплекса
ES (Е— фермент, S — субстрат) и его распад (E + S5±
ES-+E + P), где Ks = [E][S]/[£'S]—константа скоро-
сти образования фермент-субстратного комплекса; k2 —
константа скорости его распада. При [S]0^>[E]0 уравне-
ние скорости такой реакции имеет вид v = k£E\^
X [5]т/ (Ks + [S]T).
Поскольку большинство ферментативных реакций
ингибируется их продуктами, исследование проводят
при начальных скоростях, когда расходом субстрата
можно пренебречь ([S]T =[S]o), и уравнение принимав
вид u = £2[E]o[S]o/(fts + [S]o)-
Обычно же ферментативная реакция протекает в и
сколько стадий, т. е. сложнее, чем представлено выш
Однако и в этом случае можно использовать последи'
уравнение, записывая его в виде уравнения Михаэл
са — Ментен: o = ^naTL£']o['Sb/(/C?,i + [S]o). Это уравн
ние имеет вид гиперболы (рис. 21).
Произведение /гкат на [Е]о имеет размерность скор
сти и называется максимальной скоростью Утах; пр
[5]о>Лм ^=Утах. Величина Лм (константа Михаэ.т;
са) численно равна концентрации субстрата, при кот
РОЙ 0=Утах/2.
Целью настоящей работы является получение пии-
тических характеристик фермента на примере щелочи-
фосфатазы (Н. Ф. 3.1.3.1 — фосфогидролаза моноэфир'
ортофосфорной кислоты) или на любом другом фе
менте.
154
Рис. 20 Типичные кинетические
кривые:
1 — расходование субстрата; 2 —
накопление продукта
Рис. 21. Типичная зави-
симость скорости фер-
ментативной реакции от
начальной концентрации
субстрата (кривая Ми-
хаэлиса — Ментен)
При проведении лабораторной работы осуществляют-
ся следующие операции: снимается кинетика превраще-
ния субстрата; снимаются характеристики процесса при
изменяющейся концентрации субстрата; устанавливают-
ся кинетические параметры в зависимости от концентра-
ции фермента, pH, температуры и т. д.; вычисляются
константы уравнения и строятся графические зависимо-
сти.
Снятие кинетики превращения субстрата. Кинетика
превращения субстрата в продукт снимается при неко-
торой определенной концентрации фермента и при
стандартных условиях реакции (температура, pH и т. д.).
Определение ведется на начальной стадии процесса,
когда убылью субстрата можно пренебречь.
Щелочная фосфатаза принадлежит к классу гидро-
литических ферментов, расщепляющих сложноэфирную
связь ,в моноэфирах фосфорной кислоты, она также об-
ладает трансферазной активностью. Весьма удобна для
анализа щелочная фосфатаза, синтезируемая кишечной
палочкой Е. coli.
В качестве субстрата для проведения кинетических
^следований удобно использовать п-нитрофенилфосфат
щ-Нфф). в результате ферментативного гидролиза
^-Нфф образуется n-нитрофенол, который ионизируется
п Нейтральной и слабощелочной среде, давая
'-'|О2С6Н4О_-анион, обладающий интенсивным погло-
155
щением света при длине волны 400 нм (га-НФФ при это?
длине волны не поглощает свет). Это позволяет приме^
нить высокочувствительный и точный спектрофотометр]],
ческий метод контроля за ходом реакции. Поскольку
в соответствии с законом Ламберта — Бэра D = ecl (г/с
D — оптическая плотность; е—’Молекулярный коэффц.
циент поглощения, равный для п-нитрофенолят-ионь
18200 л/(моль-см) при Z=400 нм; с — концентрация по-
глощающего свет вещества; I — толщина кюветы, чаще
всего /=1 см), степень накопления продукта реакции
Дс = Д[Р] = AD/е/ и скорость реакции [в мкмоль/(см3>
Хмин)] описывается уравнением
v=d[P]/dx= (ДОДт) (Ю3/е/).	(2)
Величина ЛД/Лт определяется как тангенс угла на-
клона экспериментальной кинетической кривой в коор-
динатах (О-—т. Более строго величина углового коэффи-
циента может быть определена по методу наименьших
квадратов (см. приложение I, § 1).
Для того чтобы ферментативный гидролиз шел на на-
чальных скоростях, реакцию следует вести в разбавлен-
ных растворах субстрата и фермента. Такие растворы
сложно приготовить из навески, поэтому, как правило,
готовят более концентрированные растворы (основные),
а из них путем разбавления — рабочие растворы требу-
емой концентрации.
Для щелочной фосфатазы реакцию следует вести
при pH 9,0 в 0,05М карбонатном буфере с ионной си-
лой 1,0. Его готовят путем смешивания 45,9 см3 1М вод-
ного раствора бикарбоната натрия, 4,1 см3 1 М водного
раствора карбоната натрия, 942 см3 1 М водного раств
pa NaCl и 8 см3 воды. Вода для приготовления буфе}
должна быть дистиллированной, не содержащей иош
меди и других тяжелых металлов.
Если активность препарата неизвестна, ее необход
мо определить экспериментально. Для этого используй
один из методов (А или Б), приведенных ниже, но ко
центрация субстрата в рабочем растворе должна соста
лять (4—5)10-3М. Скорость, вычисленная при этом г
формуле (2), соответствует активности фермента (в е
ФА/см3). Зная концентрацию белка (в мг/см3), вычи
ляют активность исходного препарата фермента (в е
ФА на 1 мг белка).
156
Измерение скорости гидролиза п-нитрофенилфосфата
в кювете спектрофотометра непрерывным способом (ме-
тод А), 0,1 —1,0 см3 основного раствора субстрата (кон-
центрация 0,02 М) разбавляют буферно-солевым рас-
твором до общего объема 10 см3. Необходимые количе-
ства полученного раствора (для кювет с толщиной слоя
1 см 3,5—4,0 см3) вносят в контрольную и рабочую кю-
веты спектрофотометра, которые помещают в термо-
блок, установленный в кюветной камере. После термо-
статирования в течение 5—10 мин при 25°С в рабочую
кювету микропипеткой вносят 0,02—0,04 см3 основного
раствора фермента с таким расчетом, чтобы активность
фермента в кювете составляла (2—3) 10—3 ед./см3 (для
обычных препаратов щелочной фосфатазы это соответ-
ствует по массе концентрации 0,004—0,008 мг/см3). Од-
новременно с введением фермента пускается секундо-
мер— этот момент времени принимается за нулевой.
Кювету быстро встряхивают и вновь помещают в тер-
моблок. Через определенные промежутки времени (2—
4 мин в зависимости от концентрации субстрата) в те-
чение 15—25 мин (6—8 измерений) фиксируют оптиче-
скую плотность D раствора в рабочей кювете при %=
= 400 нм. Результаты зайеров записывают в прото'кйле
наблюдений, они служат исходными данными для рас-
чета скорости реакции и по уравнению (2) и для по-
строения кривой в координатах D—т.
Измерение скорости гидролиза п-нитрофенилфосфата
методом аликвотных проб (метод Б). 0,25—2,5 см3 ос-
новного раствора субстрата (концентрация 0,02М) раз-
бавляют буферно-солевым раствором в мерной колбе
на 25 см3. Колбу термостатируют 5—10 мин при 25°С
и Доводят до метки тем же раствором. 0,7 см3 получен-
ного раствора субстрата разбавляют 5 см3 0,1 н. раство-
ра NaOH и вносят в контрольную кювету (если в тече-
ние опыта в контрольной кювете будет наблюдаться по-
желтение раствора, надо вместо раствора субстрата по-
местить в нее буферно-солевой раствор без субстрата,
Разбавленный в 5 раз 0,1 н. раствором NaOH). Затем
8 колбу вносят 0,5—1,0 см3 основного раствора фермен-
Та с таким расчетом, чтобы его активность в колбе со-
ставляла (1—2) 10~2 ед./см3 (0,02—0,05 мг/см3), быстро
ВстРяхивают колбу и пускают секундомер. Через опре-
деленные промежутки (3—5 мин в зависимости от кон-
157
центрации субстрата) в течение 20—30 мин (6—8 ра3)
-отбирают аликвотные пробы объемом 0,5 см3 (при [$] ^
>10~3) или I см3 (при [So]< 10_3 М), которые вливают в
колбы с 5 см3 0,1 н. раствора NaOH для остановки реак-
ции. Полученный раствор переносят в рабочую кювету и
определяют оптическую плотность при Z = 400 нм. Ре.
зультаты замеров в нескольких параллельных определе-
ниях заносят в протокол наблюдений, данные обрабаты-
вают статистически (см. приложение I, § 1); они служат
исходными данными для расчета скорости реакции по
уравнению (2) и для построения кривой в координатах
D—т.
Протокол наблюдений по этой части работы имеет
следующий вид:
№ параллельных
опытов
Время от начала
реакции, мин
Количество прогидролизован*
ного субстрата или накопив*
шегося продукта реакции
1
2
3
i
‘Среднеариф-
метическое
Границы достовер-
ных отклонений
Снятие характеристик процесса при изменяющей^
концентрации субстрата. Эта часть работы проводит'
для определения констант Михаэлиса (Утах, /См). Пост
новка эксперимента аналогична той, что дана в перв<
части работы. Серия опытов (3—5 повторностей) пров
дится при варьировании концентрации субстрата [S]o
соблюдении на стабильном уровне всех остальных усл
вий проведения реакции гидролиза (pH, температур
длительность инкубации, дозировка фермента и т. Д-
При проведении каждой серии опытов определяет!
соответствующая скорость реакции V, на основании п
лученных данных строится кривая Михаэлиса. В идеал
ном случае экспериментальные точки должны охват!
вать все участки кривой: начальный, линейный, коне'-!
ный при у = Утах = const и промежуточный.
158
Известно, что Км для субстрата n-НФФ лежит в пределах от
З-Ю-4 до 1-10~3М в зависимости от происхождения фермента и
условий определения. Поскольку для получения надежных значе-
ний кинетических параметров необходимо измерять скорость реак-
ции как при [5]о<-Км, так и при [К]0Жм, в данном разделе ра-
боты следует выбрать диапазон варьирования концентрации субстра-
та в рабочем растворе от 2-1O-4 до 2<1О~3М (2-1Й-4, 4-10'-‘,
10"4, I -НО-3 и 2-1!0-3М). Использование более высоких концент-
раций субстрата может приводить к отклонениям от уравнения
Михаэлиса—Ментен за счет ингибирования щелочной фосфатазы
избытком субстрата.
Основной исходный раствор n-НФФ готовится рас-
творением точной навески n-НФФ в 10 (для варианта
метода А) или 25 см3 (для варианта метода Б) буфер-
но-солевого раствора так, чтобы концентрация /г-НФФ
в нем составляла 0,02 М. Раствор стабилен несколько
дней при хранении в холодильнике.
Данные спектрометрического анализа заносят в про-
токол наблюдений, который имеет следующий вид:
2.10~4	2
и т. д.	3
Среднеариф-
метическое
Границы
отклонений
Установление кинетических параметров в зависимо-
сти от концентрации фермента, pH, температуры. Мето-
дика проведения этой работы не отличается от двух
пРедыдущих. На фоне стационарных условий реакции
измерение ее скорости осуществляется либо при раз-
Л11чных pH, либо при разных концентрациях фермента^
-тибо при различной температуре в инкубационной сре-
^е> в присутствии солей и т. д.
159
Для щелочной фосфатазы влияние pH реакционной
среды изучается в сравнительно узких пределах: от 7
до 10, так как оптимальный для действия фермента pH
.лежит выше 8,7, однако при использовании среды
рН>9,6—-10,0 возможно искажение результатов за сч
явления щелочного гидролиза п-НФФ.
Влияние концентрации фермента на скорость фс
ментативной реакции изучается, исходя из предполаг;..
мой скорости образования продукта реакции. Посколь-
ку максимальная точность спектрофотометрического оп-
ределения достигается при Д7)<0,8 (в диапазоне 0,2—
0,8), в соответствии с формулой (2) концентрация про-
дукта реакции [Р] в ходе эксперимента должна менять-
ся от 0 до ~4,5-10-5М при работе в кювете (метод А)
и от 0 до ~4-10-4М. при работе методом аликвотных
проб (метод Б). С другой стороны, оптимальное время
определения одной кинетической кривой составляет 15-
30 мин, что в пересчете на желательную скорость пре-
вращения субстрата составляет ~2•10_3 мкмоль/(см3Х
Хмин) по методу А и ~ 1 • 10-2 мкмоль/(см3-мин) по ме-
тоду Б. В обоих случаях за время опыта достигается
превращение от 1 до 15% субстрата, что позволяет пре-
небречь изменением его концентрации, т. е. можно счи-
тать, что получаемый участок кинетической кривой пря-
молинеен.
Поскольку за единицу активности фермента прини-
мается такое его количество, которое катализирует пре-
вращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин, скорости соответ-
ствуют содержанию фермента 0,002 ед. ФА/см3 и 0,01 еД-
ФА/см3. Наиболее распространенные препараты щелоч-
ной фосфатазы имеют активность 0,3—0,7 ед./мг белка,
следовательно, концентрация белка в рабочем растворе
должна составлять 0,004—-0,008 мг/см3 и 0,02—0,05 мг/мг
белка соответственно.
Основной раствор фермента готовится растворение'5
точной навески фермента в 2—10 см3 буферно-солево"'1
раствора с pH 9 с таким расчетом, чтобы концентрат
белка в нем составляла 1 мг/см3 (активность 0,3—0,5 с
ФА/см3); такой раствор стабилен в течение суток. Р-1,
творы для более долгого хранения готовятся в 0,01 
трис-буфере (см. приложение II) с pH 8,0, содержаИ11" 
10~2—10-3М MgCh, и хранятся при температуре ни»'-
— 10°С.
160
Результаты снятия кривых скорости ферментативной
реакции в зависимости от концентрации фермента, pH
среды (в диапазоне 7—10), температуры (от 25 до 40°С),
содержания в среде Mg2+ и неорганического фосфата за-
носят в протокол наблюдений, аналогичный приведенно-
му во втором разделе работы.
При выполнении этой части работы можно провести однофак-
торные исследования (см. приложение I, § 2) и по их результатам
получить уравнения, описывающие влияние этих факторов на па-
раметры Км и Vmax. Однако более эффективным будет многофак-
торное исследование, базирующееся на планах дробного или полного
факторного эксперимента, позволяющее получить одно уравнение,
описывающее влияние на процесс всех принятых к исследованию
факторов. Это уравнение может быть также использовано для поис-
ка оптимальных величин этих факторов по схемам, изложенным
в приложении I, § 3i
Вычисление констант уравнения и построение гра-
фических зависимостей. Экспериментальные данные, за-
несенные в протоколы наблюдений, после статистической
обработки выражают первоначально в координатах v
от т, затем в виде кривой Михаэлиса — Ментен в коор-
динатах v от [S] о или от других внешних условий прове-
дения эксперимента. Далее проводят линеаризацию в
координатах Лайнуивера — Берка (и-1 —[S]^1)
0-l=VmaX+KWmax[SU	(3)
и в координатах Иди (о—n/[S]o)
У= Гтах — ^Mt>/[S]e.	(4)
Константы уравнения Михаэлиса (Vmax, Км) вычис-
ляют с помощью уравнений (3) и (4).
График зависимости в координатах Лайнуивера—
верка имеет вид прямой линии, пересекающей оси абс-
цисс и ординат в точках —	соответственно
(рис. 22), тангенс угла наклона ее равен Лм/Vmax-
График зависимости в координатах Иди имеет вид
пРямой линии, пересекающей оси абсцисс и ординат в
т°Чках Vmax и Vmax/^См соответственно (рис. 23), тан-
ине угла наклона ее равен — /См.
и При необходимости получить особенно точные значения Ушах
м обработка уравнений (3) и (4) может быть проведена мето-
наименьших квадратов (см. приложение I, § 1’, 2).
6 Зак. 791	16i
Рис. 23. Определение кинетич
ских параметров ферментати
ной реакции методом Иди
Рис. 22. Определение кинети-
ческих параметров фермента-
тивной реакции методом Лай-
нунвера — Берка
На основании кривой Михаэлиса — Ментен можно с\
дить о правильности выбора диапазона концентрат!
субстрата и об отсутствии субстратного ингибировани?
При линеаризации кривой Михаэлиса — Ментен п
двум вышеприведенным методам кинетические параме!
ры реакции — Км и Vmar должны быть одинаковым,
кроме того, величина Vinax должна совпадать с величн
ной активности фермента в рабочем растворе.
Исследования при различных pH и температурах
присутствии активаторов процесса (ионов Mg2+) пр
их концентрациях от 0 до 0,1 М п при ингибирована
реакции конкретным ингибитором / (щелочной фосфа
тазой Na3PO4) при концентрации от 0,5-10~4 до 2-Ю-3-'
помогают изучить влияние этих факторов на кинетичес
кие параметры.
При наличии ингибитора в системе уравнение Мпхаэ
лиса — Ментен принимает вид v= 1/тах[5]о/{Л’м(И
+ [/Жг) +[S]o}.
Это означает, что при варьировании концентрации ингп
битора наблюдаемая Vmax не меняется, а наблюдаема
Км растет пропорционально росту концентрации ингибп
тора [/].
В координатах Лайнуивера — Берка это выражаете
в возникновении прямых, каждая из которых отвечав
162
Рнс. 24. График Лайнунвера —
Берка при конкурентном ингиби-
ровании фермеитатнвиой реакции
фиксированному значе-
нию [/], пересекающихся
на оси ординат (рис. 24).
Величина Kj, харак-
теризующая сродство, ин-
гибитора к ферменту, мо-
жет быть получена по-
строением зависимости
Км—И	(тангенс угла
наклона ее равен К?1 )
либо аналитически для
каждой комбинации зна-
чений [S]o и [/] по фор-
муле Kj = [/] {(Vu—Vj) —
-1} Km/{Km+(S]0}, где
Vj—скорость реакции при
данных значениях [S]o и [/]; у0 — скорость реакции при
том же значении [S]o в отсутствии ингибитора (£ZJ = O).
При исследовании ингибирования ферментативной
реакции можно рассчитать величины Км, Vmax и Kj.
Все экспериментальные данные, графический и рас-
четный материалы оформляются в виде таблиц, графи-
ков и обобщающих выводов в целом по всей работе.
ГЛАВА III
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА
СТУДЕНТОВ (НИРС)
Научно-исследовательская работа студентов являет-
ся важным этапом обучения в вузе и в настоящее время
включена официально в учебный план. Она имеет своей
келью систематизацию, закрепление и расширение тео-
ретических знаний студентов, углубленное изучение кон-
кретных вопросов, связанных с микробиологическими
производствами, в соответствии с темой работы, овладе-
ние навыками самостоятельного проведения анализов,
их систематики, .принятия верных решений и построения
Четких, конкретных выводов.
_По завершении обязательных для каждого студента
•лабораторных работ он получает задание на выполнение
6*	163
ПРИЛОЖЕНИЕ II
НЕКОТОРЫЕ СПРАВОЧНЫЕ ТАБЛИЦЫ
Таблица 1
Приготовление трис-буфера (трис-оксиметиламинометана—НС1)
с pH 7,2—9,1
Для получения 0,05 М буфера 0,2 М раствор шэис-буфера (24,23 г в
1 дм3 воды) смешивают с 0,1 н. раствором НС1 в мерной колбе на 100 см3
(доводят до метки водой) в следующих соотношениях;
pH при температу- ре, С		ъ о “ cs S	aS	pH при температу- ре, °C		гвор >а, см5	твор [СЛОТЫ,
		0,2 М рас1 трис-буфе]	0,1 н. рас соляной ни см3	04	£	0,2 М рас: mpuc-буфе!	0,1 н. рас соляной кв см*
9,10	8,95	25	5,0	8,05	7,90	25	27,5
8,92	8,78	25	7,5	7,96	7,82	25	30,0
8,74	8,60	25	10,0	7,87	7,73	25	32,5
8,62	8,48	25	12,5	7,77	7,63	25	35,0
8,50	8,37	25	15,0	7,66	7,52	25	37,5
8,40	8,27	25	17,5	7,54	7,40	25	40,0
8,32	8,18	25	20,0	7,36	7,22	25	42,5
8,23	8,10	25	22,5	7,20	7,05	25	45,0
8,14	8,0	25	25,0				
Таблица 2
Приготовление ацетатной буферной смеси. 1 н. растворы уксусной кислоты
Ледяная уксус- 1	1	1	1	1	1	2	4	8	16	32
ная кислота—
60,12 г в 1 дм3
воды
Ацетат натрия— 32	16	8	4	2	1	1	1	1	1	1
136,09 г в 1 дм3
воды
226
Таблица 3
Приготовление фосфатного буфера с pH 4,94—9,18. Для приготовления
смеси растворяют 11,876 г Na2HPO4-12НгО в 1 дм3 воды и 9,078 г
КН2РО4 в 1 дм3 воды. Для получения приведенных значений pH
растворы смешивают в следующих соотношениях:
pH	Na2HPO4, см’	КН2РО4, см3	рн	Na2HPO4, см3	КН,РО4, см
4,94	1,о	99,0	6,98	60,0	40,0
5,29	2,5	97,5	7,17	70,0	30,0
5,59	5,0	99,5	7,38	80,0	20,0
5,91	10,0	90,0	7,73	90,0	10,0
6,24	20,0	80,0	8,04	95,0	5,0
6,47	30,0	70,0 .	8,34	97,5	2,5
6,64	40,0	60,0	8,67	99,0	1,0
6,81	50,0	50,0	9,18	100,0	0,00
t
Характеристика сефадексов
Таблица 4
Тип сефадекса	Размер частиц, мкм	• Поглощение воды, см3 на 1 г сухого геля	Объем на- бухшего геля, см5 на 1 г су- хого геля	Область разде- ления по мо- лекулярной массе (ММ)
G-10	40—120	1,0+0,1	2—3	—700
G-15	40—120	1,5+0,2	2,5—3,5	—1500
G-25 крупнозернистый	100—300	2,5+0,2	4—6	1000—5000
G-25 среднезернистый	50—150	2,5+0,2	4—6	1000—5000
G-25 мелкозернистый	20—80	2,5+0,2	4—6	1000—5000
G-25 сверхмелкий	10—40	2,5+0,2	4-6	1000—5000
G-50 крупнозернистый	100—300	5,0+0,3	9-Н	1500—30000
G-50 среднезернистый	50—150	5,0+0,3	9-11	1500—30000
G-50 мелкозернистый	20—80	5,0+0,3	9—11	1500—30000
G-50 сверхмелкий	10—40	5,0±0,3	9—11	1500—30000
G-75	40—120	7,5±0,5	12—15	3000—70000
G-75 сверхмелкий	10—40	7,5+0,5	12—15	3000—70000
G-100	40—120	10,0+1,0	15—20	4000—150000
G-100 сверхмелкий	10—40	10,0+1,0	15—20	4000—150000
G-150	40—120	15,0+1,5	20—30	5000—400000
G-150 сверхмелкий	10—40	15,0+1,5	20—30	5000—400000
G-200	40—120	20,0+2,0	30—40	5000—800000
G-200 свёрхмелкий	10—40	20,0+2,0	30—40	5000—800000
227
Таблица 5
Характеристика биогелей
Тип биогеля	Размер частиц, меши	Предел исключе- ния по мо- лекуляр- ной массе (ММ)	Область раз- деления по ММ	Объем набухше- го геля, см8/мг	Поглоще- ние воды, г/г сухого биогеля	Скорость протека- ния, см3/(ч-см2}
Р-2	50—100	2600	200—2600	3,8	1,5	250
Р-2	100—200	2600	200—2600	3,8	1,5	150
Р-2	200—400	2600	200—2600	3,8	1,5	40
Р-2	—400	2600	Для тонкослойной	хроматографии
Р-4	50—100	3600	500—4000	5,8	2,4	225
Р-4	100—200	3600	500—4000	5,8	2,4	125
Р-4	200—400	3600	500—4000	5,8	2,4	40
Р-4	—400	3600	Для тонкослойной	хроматографии
Р-6	50—100	4600	1000—5000	8,8	3,7	200
Р-6	100—200	4600	1000—5000	8,8	3,7	ПО
Р-6	200—400	4600	1000—5000	8,8	3,7	40
Р-6	—400	4600	Для тонкослойной	хроматографии
Р-10	50—100	12000	5000—17000 12,4	4,5	200
Р-10	100—200	12000	5000—17000 12,4	4,5	100
Р-10	200—400	12000	5000—17000 12,4	5,5	35
Р-10	—400	12000	Для тонкослойной	хроматографии
Р-30	50—100	30000	20000—50000 14,8	5,7	150
Р-30	100—200	30000	20000—50000 14,8	5,7	90
Р-30	—400	30000	Для тонкослойной	хроматографии
Р-60	50—100	60000	30000—70000 19,0	7,2	125
Р-60	100—200	60000	30000—70000 19,0	7,2	40
Р-60	—400	60000	Для тонкослойной	хроматографии
Р-100	50—100	100000	40000—	19,0 100000	7,5	90
Р-100	100—200	100000	40000—	19,0 100000	7,5	40
Р-100	—400	100000	Для тонкослойной	хроматографии
Р-150	50—100	150000	50000—	24,0 150000	9,2	60
Р-150	100—200	150000	50000—	24,0 150000	9,2	35
Р-150	—400	150000	Для тонкослойной	хроматографии
Р-200	50—100	200000	80000—	34,0 300000	14,7	30
Р-200	100—200	200000	80000—	34,0 300000	14,7	15
Р-200	—400	200000	Для тонкослойной	хроматографии
Р-300	50—100	300000	100000—	40,0 400000	18,0	20
Р-300	100—200	300000	100000—	40,0 400000	18,0	8
Р-300	—400	300000	Для тонкослойной	хроматографии
228
Таблица 6
Характеристика ионообменников
Сокращенное обозначение	pH элюи- рования	Функциональные группы, участвующие в ионном обмене	
		белок	ионообменник
ДЭАЭ-целлюлоза (анионит)	8,0—5,0	— СООН	- N+ Н (С.,Н5)2 -
Ф-целлюлоза	4,7—7,0	— NH,	— РО?-
(катионит)			
КМ-целлюлоза	4,5—8,0	— nh2	— соо-
(катионит) ДЭАЭ-сефадекс	* 2,0—9,0	— СООН	- С2Н4 N+ (С,Н5), Н
(аннонит)			
ОАЭ-сефадекс	2,0—10,0	— СООН	— С2Н4 N+ (С2Н3), СН2 CH X
(анионит) КМ-сефадекс	6,0—10,0	— NH,	х (ОН) СН3 — сн, соо-
(катионит)			
SP-сефадекс	2,0—10,0	-nh2	С3Н6 SO,
(катионит)			
Таблица 7
Характеристика диализных трубок
Тип	Диаметр, мм	Ширина, мм	Толщина стенки, мм
8/32	7	9	0,064
18/32	15	—	0,017
20/32	16	24	0,020
25/32	19	—	0,027
27/32	21	33	0,025
36/32	38	44	0,025
С/65	40	65	0,040
С/110	70	100	0,090
С/150	100	150	0,100
229
Системы гелей для диск-электрофореза
Принятые сокращения: «Трис»—трис (оксиметил) аминометан; ПСА—
ТЕМЕД—N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамин; ЛАБА—N, N'-мети
слота; ММ—молекулярная масса.
| № п/п	1	Система геля	Область применения (примеры)	pH		Растворы разделяющего геля			
			Концентри- । роваиие	Разделение		Составные части на 100 мл раствора	к	Соотноше- ние рас- творов в смеси
1	pH 8,9; 7,5% (среднепори- стый гель)	Белки с ММ IO1 —106; оп- тимальное разделение при ММ 3-1 0* —3-1 0s (сывороточные белки)	8,3	9,5	1 21 3	1 н. HCI 48,0 см3 Трис 3 6,6 г ТЕМЕД 0,23 см3 Акриламид 30,0 г МБА 0,8 г ПСА 0,14 г	8,9	1 часть № I 2 части № 2 1 часть Н2О 4 части № 3
2	pH 8,9; 15% (мелкопори- стый гель)	Белки с ММ <3-10*	8,3	9,5	8	Акриламид 60,0 г МБА 0,4 г		1 часть № 1 2 части № 8 4 части № 3
3	pH 8,9; 30% (мелкопори- стый гель)	Белки с ММ I04 (минимум около 2000)	8,3	9,5	9	ПСА 0,18 г		1 часть №1 1 4 части № 8 3 части № 9
4	pH 8,9; 3,75% (крупнопори- стый гель)	Белки с ММ 1 О6 (максимум около 2-10°)	8,3	9,5	10	Акриламид 15,0 г МБА 0,4 г		1 часть № 1 2 части № Ю 1 часть №6 4 части Н2О
5	pH 7,3; 7,5% (средиепорн- стый гель)	Основные бел- кн, которые в системе № I движутся об- ратно к катоду	8,3	6,6	И4 12	1 и. кон 8,0 см1 Глицин 19,0 г ТЕМЕД 0,08 см3 Акриламид 60,0 г МБА 1,6 г ПСА 0,56 г	7,3	6 частей № 11 1 часть № 12 1 часть № 13
6	pH 7,5; 7,5% (среднепори- стый гель)	Белки (особен- но ферменты), для которых оптимальное разделение достигается при pH 8 (при рН>8 не- устойчивы)	7,0	8,0	15	1 н. НС1 48,0 см3 Трис 6,85 г ТЕМЕД 0,46 см3	7,5	1 часть № 15 2 части № 2 I часть Н2О 4 части № 3	
230
Таблица 8
персульфат аммоний (NFIJaSjO,,; РФ—рибофлавин; Сах.—сахароза;
ленбисакриламид; ЭДА—этилендиакрилат; АсОН—ледяная уксусная ки-
Растворы концентрирующего геля				Электродный бу- ферный раствор		Полюса	
	Составные части на 100 мл раствора	X о.	Соотношение растворов в смеси	Составные час- ти на 1000 мл раствора	К	верхний	нижний
42 1 М Н3РО4 2 5,6 см3
Трис 5,7 г
5 Акриламид 10,0 г
1 часть № 4	Трис 6,0 г 8,3
2 части № 5	Глицин 28,8 г
I часть № 6	
4 части № 7	Используют 1 0%-ный водный раствор
МБА 2,5 г
6	РФ 4,0 см3
7	Сах. 40,0 г
Как для системы № 1
То же, что для
системы № 1
То же, что 8,3
для системы
№ 1
Как для системы дъ I
То же	То же 8,3—	4“
Как для системы № 1	То же, что для системы	То же, что для системы	8,3 -	+
	№ 1	№ I		

14	1 н. КОН 48,0 см3 Глицин 4,8 г ТЕМЕД 0,46 см3	10,3	1 2 4 1	часть № I4 части № 5 части № 7 часть № 13	Глицин 13,7 г 2,6-диметилпи- ридин 38,2 см3 (2,6-Лутидин) Используют 10%-ный водный раствор	8,3 +	
16	1 М Н3РО4 39,0 см3 Трис 4,95 г. ТЕМЕД 0,46 см3	5,5	I 2 I 4	часть № I6 части № 5 часть № 6 части № 7	Диэтилбарби- туровая кис- лота 5,52 г Трис 1,0г	7,0 -	+
231
Система геля	Область применения (примеры)	pH		Растворы разделяющего геля			
		Коицеитриро- । вание	i	Разделение	£	Составные части на 100 мл раствора	X а	Соотноше- ние раство- ров в смеси
7	pH 4,3; 15%	Основные	5,0	3,8	17	1 н. КОН	4,3	1 часть
8	(мелиопорис- тый гель) pH 4,3; 7,5% (среднепори- стый гель)	белки с ММ около 2-10* (например, гистоны) Основные белки с ММ 2-10*	5,0	3,8	18	48,0 см3 АсОН 17,2 см3 ТЕМЕД 4,0 см3 ПСА 0,28 г		№ 17 2 части № 8 1 часть Н2О 4 части № 1 8 1	часть № 17 2	части № 2 1 часть Н2О 4 части № 1 8
9	pH 2,9; 7,5% (среднепори- стый гель)	Сильно основ- ные белки с ММ 2 10*	4,0	2,3	20 21	1 н. КОН 12,0 см3 АсОН 53,25 см3 ТЕМЕД 1,15 см3 ПСА 2,80 г	2,9	4 части № 20 2 части № 2 2 части № 21
10	pH 2,9; 20% (мелкопори- стый гель)	Основные белки (гистоны)			23 24 25 26	КОН 224,0 мг ТЕМЕД 0,4 см3 АсОН до нуж- ного pH Акриламид 60,0 г МБА 1,2г ПСА 1,0г	2,9	5 частей № 23 5 частей № 24 5 частей Ns 25 2 части № 26
11 pH 9,4; 4% Н-и L-поли-
(крупиопори- пептидные
стЬ1й гель) цепи v-C-им-
муноглобули-
нов (антитела)
— 27	Акриламид	1	часть
16,0 г	№ 27
МБА 0,8 г	1	часть
1 0 М мочевн-	№ 28
на5 до 100 см*	2	части
№ 29
232
Продолжение табл. 8
Растворы концентрирующего геля				Электродный бу- ферный раствор		Полюса	
£	Составные части на 100 мл раствора	X	Соотношение растворов в смеси	Составные части на 1000 мл раствора	X	верхний	1	нижний
19	1 н. КОН	6,7	1 часть № 19	0-Валин 31,2 г 4,5 4-
				АсОН 8,0 см8
	48,0 см3		2 части № 5	Используют
	АсОН 2,87 см3		1 часть № 6	10%-ный ра- створ
	ТЕМЕД 0,46 см3		4 части Н2О	
Как для системы № 7
Как для
системы № 7
Как для си- 5,0 +
стемы № 7
22	1 и. КОН 48,0 см8
АсОН 2,95 см8
5,9	1 часть № 22
2 части № 5
1 часть № 6
4 части Н2О
Глицин 2 8,1 г 4,0 +
АсОН 3,06 см8
Используют
1 0%-ный вод-
ный раствор
Концентрирующий гель
не используется
(приготовление раство-
ра разделяющего
геля № 23: КОН ра-
створить в 75 см8
Н2О, добавить ТЕМЕД
и установить pH 2,9
при помощи АсОН)
Акриламид 8,0г
МБА 0,8 г
1 0 М мочевина6
ДО 1 дм’
6,74	1 часть № 3 0
при 1 часть № 31
25 ГС 2 части № 32
Берх- Ниж-
ний иий
буфер буфер
233
№ п/п
Система геля	Область применения (примеры)	pH		Растворы разделяющего геля			
		Концентриро- вание	Разделение		Составные части на 1 0 0 мл раствора	X а	Соотноше- ние растворов в смеси
28 Трис 18,15 г 9,4
1 н. НС! при
24,0 см1 * 3 4 * * 25 С
ТЕМЕД
0,24 см3
1 0 М мочеви-
на9 до 100 см3
29 ПСА 0,14 г
1 0 М мочеви-
на9 до 100 см3
12	pH 8,7; 7,5% (средиепори- стый гель)	Цитоплазма- тические белки ткаии мозга	33 34 35	Трис 4,4 8 г 1 н. НС1 до нужного pH ТЕМЕД 1,0 см3 ПСА 1,2г	8,7	2 части № 33 4 части № 2 I часть лр2 34 1 часть № 3 5
13	pH 6,5; 7,5% (среднепори- стый гель)	L-пептидные цепи антител	37	NaOH 31,6 см3 ТЕМЕД 0,115 см3 Какодиловая кислота 1,887 г	6,5	1 часть № 37 1 часть № 3 8 2 части № 39
			38	Акриламид 30,0 г ЭДА 2,0г		
			39	ПСА 70,0 см3		
14	pH 2,1; 7,5% (среднепори- стый гель) 82	Белки, для 2,1 2,5 которых оптимальное разделение достигается при pH 2,5 (при pH 3 ас- социируют)	40 41 42	4М пропионо- вая кислота ПСА 0,023 г NaHSO3 0,035 г		1 часть № 40 1 часть дъ 38 1 часть № 41 1 часть № 42
1 Для 7%-ного геля раствор № 2 заменяют иа № 2а; акриламид 28,0, МБА
1 Раствор Л’о 4 можно заменить на 4а; 1 н. НС! около 48 см3, трис
* Смесь подвергают фотополимеризации.
4 Хранить при 4-20 СС.
6 Мочевину необходимо предварительно обессолить (например, путем хромате
этого электропроводность не должна превышать 1/5 Ом.
234
Продолжение табл. 8
	Растворы концентрирующего геля				Электродный бу- ферный раствор		Полюса	
	я	Составные части на 100 мл раствора	X р.	Соотношение растворов в смеси	Составные части на 1 00 0 мл раствора	X р.	верхний	нижний
	31	Трис 2,2 3 г 1 М Н2РО4 12,8 см3 ТЕМЕД 0,1 см3 1 ОМ мочевина до 10 0 см3		Трис 8,91 5,16 г Глицин 3,48 г 1 ОМ мочевина до 7 00,0 см3	Трис 8,07 14,5 г 1 н. НС1 60 см3		-	+
32
РФ 1,0 см8
ПСА 40 см3
1 ОМ мочевина до 1 дм3
36 Трис 0,726 г 6,7
1 и. до нужного pH
I часть № 36
4 части № 5
1 часть № 34
8 частей Н2О
1 часть № 35
Трис 6,0 г 8,3
Глицин 28,8 г
Концентрирующий
гель не используется
(раствор веществ,
подлежащих разделе-
нию, должен иметь
ионную силу ниже,
чем раствор № 34)
Раствор № 37
6,5
Концентрирующий
гель не используется
(необходим предвари-
тельный электрофорез
Вещества, подлежа-
щие разделению,
растворяют в 0,2М
пропионовой кислоте)
1М пропионо- 2,1 4-
вая кислота
0,735 г.
5,98 г, ТЕМЕД 0,46 см8, pH 6,7.
графирования на ионообменнике со смешанным слоем
анионита и катионита);
после
235
список рекомендуемой литературы
Березин И. В., Клесов А. А. Практический курс химической и
ферментативной кинетики,—М.: МГУ, 1976,— 320 с.
Грачев Ю. П. Математические методы планирования экспери-
ментов.— М.: Пищевая промышленность,, 1979.— 200 с.
Грачева И. М. Технология ферментных препаратов.— М.: Пище-
вая промышленность, 1975.— 392 с.
Грачева И. М., Смирнова Т. А., Лущик Т. А. Общая техноло-
гия микробиологических производств (приложение к лабораторному
практикуме для студентов технологического факультета). — Мл
МТИПП, 1971,— 16'0 с.
Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки: перевод
с английского (под ред. и с предисл. Р. G. Незлина, пер. А. Н. Ма-
ца.—М.: Мир, 1976 — 364 с.
Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: перевод с английского (под ред.
и с предие.1. акад. А. Опарина. — М.: Мир, 1966. — 728 с.
Инструкция по технохимическому и микробиологическому конт-
ролю производства ферментных препаратов при поверхностном
культивировании плесневых грибов.— М., 1972.— 217 с.
Калунянц К. А., Голгер Л. И. Микробные ферментные препара-
ты (технология п оборудование). — М.: Пищевая промышленность,
1979^ — 304 с.
Клесов А- А., Березин И. В, Ферментативный катализ.— Изд-во
МГУ, 19'80,— 264 с.
Матвеев В. Е. Основы асептики в технологии чистых микробио-
логических пооизводств. — М.: Легкая и пищевая промышленность,
198!. —ЗИ с.
Методы биохимического исследования растений: под ред.
А. И. Ермакова.—2-е изд., перераб. н доп-—М.: Колос. Ленинград-
ское отделение, 1972.— 456 с.
Методы современной биохимии,—М.: Наука,, 1975,— 176 с.
Рухлядева А. П,, Полыгалина Г. В. Методы определения актив-
ности гидролитических ферментов. М.: Легкая и пищевая промыш-
ленность, 1981. — 288 с.
Яковлев В. А. Кинетика ферментативного катализа.— М.: Нау-
ка, 1966.— 248 с.
236
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие
Глава I. Методы анализа микробных ферментных препа-
ратов ............................................... °
§ 1. Биохимические методы исследования ферментных
препаратов ....................................... °
Определение общего азота........................ “
Метод Кьельдаля............................. g
Полумикрометод.............................. °
Определение белка в материалах и	пробах	...	10
Метод Лоури.................................10
Биуретовый микрометод по Ярош	....	П
Определение белкового азота	по Барнштейну	.	.	11
Определение азота аммиака.......................12
Определение амидного азота	.....................13
Определение азота аминокислот.................' .	14
Метод, основанный на определении числа карбо-
ксильных групп в водно-спиртовых	растворах	.	14
Йодометрический метод.......................14
Фотометрический метод.......................16
Определение содержания различных сахаров в рас-
творах .............................................17
Метод Бертрана..............................17
Полумикрометод..............................20
Антроновый метод............................21
Определение содержания фосфора по	Нейману	.	.	22
§ 2. Физико-химические методы исследования ферментных
препаратов........................................23
Определение содержания влаги в образцах	...	23
Ускоренный метод с использованием прибора Чи-
жовой ..........................................23
Метод высушивания до постоянной массы .	.	24
Определение содержания сухих веществ в	растворах	24
Ареометрический метод....................24
Рефрактометрический метод................25
Интерферометрический метод .....	26
Поляриметрический метод..................29
Спектрофотометрический метод.............31
237
§ 3. Методы определения ферментативных активностей в
растворах.....................................35
Приготовление ферментных растворов	....	35
Определение протеолитической активности	(ПС)	.	36
Метод Айсона в модификации.................36
Метод Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в мо-
дификации ...................................
Метод Лейлян-Фольгарда в модификации
Определение пектолитической активности (ПкА)
Метод по ГОСТ 20264.3—74	......
Объемный медный метод........................
Кальций-пектатный метод......................
Вискозиметрический метод.....................
Определение полигалактуроназной активности (ПгС)
Определение пектинэстеразной активности (ПэС)	.	°5
Определение амилолитической активности (АС)	.	57
Колориметрический метод (по ГОСТ 20264.4—74)	57
Капельный метод (по Климовскому и Родзевич) 62
Определение глюкоамилазнон активности (ГлА)	.	65
Определение осахаривающей активности (ОС) .	.	68
Определение мальтазной активности (МС) ...	71
Определение активности глюкозоизомеразы (ГлИ)	.	73
Определение активности липазы (ЛС) (модифициро-
ванный метод Ота, Ямада)............................75
Определение активности пероксидазы	(ПА) .	.	76
Определение активности каталазы	...	77
Определение активности (З-глюкозидазы	....	79
Глава II. Лабораторные работы по технологии ферментных
препаратов .	.	................81
§ 1. Получение препаратов при поверхностном и глубин-
ном культивировании микроорганизмов .
Лабораторная работа № 1. Культивирование микро-
организмов — продуцентов ферментов — поверхност-
ным способом на твердых питательных средах
Лабораторная работа № 2. Экстрагирование фермен-
тов из культур микроскопических грибов, выращен-
ных поверхностным способом.......................
Лабораторная работа № 3. Культивирование микро-
организмов — продуцентов ферментов — глубинным
способом .....................................
§ 2. Концентрирование и очистка ферментных растворов
Лабораторная работа № 4. Очистка ферментных рас-
творов от низкомолекулярных веществ методом диа-
лиза ...............................................
Лабораторная работа № 5. Концентрирование фер-
ментных растворов ...............................
Концентрирование методом ультрафильтрации
Концентрирование методом вакуум-выпаривания
Лабораторная работа № 6. Осаждение ферментов из
водных растворов..................................
Осаждение ферментов органическими растворите-
лями ....	.	.	.	.	•	•
Осаждение ферментов солями .	.	.	.	-
81
81
90
96
109
109
116
118
119
120
121
127
238
§ 3-	Изучение некоторых свойств ферментов .	.	.	130
Лабораторная работа № 7. Ионообменная хромато-
графия белков............................»	130
Лабораторная работа № 8. Диск-электрофорез бел-
ков и ферментов ..........	136
Лабораторная работа № 9. Изоэлектрическое фоку-
сирование белков .	 142
Лабораторная работа № 10. Исследование ферментов
методом гельфильтрации.............................146
Лабораторная работа № 11. Исследование кинетики
ферментативной реакции ........................... 152
Глава III. Научно-исследовательская работа студентов
(НИ PC)...................................................163
§ 1.	Подбор литературы по изучаемому вопросу	.	.	164
§ 2.	Сбор собственного фактического материала и его
обработка ..................................... .....	167
§ 3.	Литературное оформление научной работы .	.	.	175
§ 4.	Примерные планы тем научно-исследовательских ра-
бот студентов (НИРС)..............................180
Приложения..............................................  186
Приложение I. Планирование эксперимента и обра-
ботка полученных результатов.....................  .	186
§ 1.	Обработка экспериментальных данных ....	186
Экспериментальные оценки истинного значения опре-
деляемого параметра и его дисперсии ....	186
Однородность оценок дисперсий................188
Исключение грубых ошибок.....................188
Доверительный интервал экспериментальных	оценок	191
Однородность средних результатов различных	опытов	192
Доверительный интервал функций (закон накопления
ошибок)............................................193
Определение коэффициентов аппроксимирующей зави-
симости методом наименьших квадратов . .	.	194
Проверка адекватности аппроксимирующей зависимо-
сти ...............................................198
§ 2.	Однофакторный эксперимент..................198
Планирование однофакторного эксперимента	.	.	198
Обработка полученных результатов.............200
Определение необходимого числа повторностей	опыта	200
§ 3.	Многофакторный эксперимент .	.	....	201
Условия получения независимых оценок линейных эф-
фектов факторов.................................202
Полный факторный эксперимент	ПФЭ211 .	.	.	203
Дробный факторный эксперимент	ДФЭ2П~П'	.	.	209
Симплексное планирование ......................... 212
Композиционный ортогональный план второго по-
рядка ............................................214.
Композиционный униформ-ротатабельиый план второ-
го порядка......................................217
Приложение II. Некоторые справочные таблицы	.	226
Список рекомендуемой литературы ..........................236
239