/
Author: Кристиан Г.
Tags: аналитическая химия физическая химия химическая физика химия
ISBN: 978-5-94774-389-0
Year: 2009
Text
ЛУЧШИЙ ЗАРУБЕЖНЫЙ УЧЕБНИК
АНАЛИТИЧЕСКАЯ
ХИМИЯ
2
ANALYTICAL CHEMISTRY
Sixth Edition
Gary D. Christian
University of Washington
JOHN WILEY & SONS. INC.
ЛУЧШИЙ ЗАРУБЕЖНЫЙ УЧЕБНИК
Г. КРИСТИАН
АНАЛИТИЧЕСКАЯ
ХИМИЯ
В двух томах
2
Перевод с английского
канд. хим. наук А. В. Гармаша,
канд. хим. наук Е. Э. Григорьевой,
канд. хим. наук А. В. Иванова,
канд. хим. наукТ. П. Мосоловой,
канд. хим. наук Г. В. Прохоровой
Москва
БИНОМ. Лаборатория знаний
2009
УДК 543
ББК 24.5я73
К82
Кристиан Г.
К82 Аналитическая химия : в 2 томах. / Г. Кристиан ; пер. с
англ. — М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. — (Лучший
зарубежный учебник).
ISBN 978-5-94774-389-0 (БИНОМ. ЛЗ)
ISBN 0-471-21472-8 (англ.)
Т. 2. — 504 с. : ил.
ISBN 978-5-94774-391-3
В учебном издании, написанном американским ученым и талант-
ливым преподавателем, методически выдержанно изложен универси-
тетский учебный курс по аналитической химии, причем рассмотрены
новейшие методы анализа, а также анализ важнейших для современ-
ной аналитической практики объектов (клинический и экологический
анализ). В заключительном разделе приведено 40 лабораторных работ.
В русском издании выходит в двух томах. В т. 2 вошли гл. 16-26,
практические работы, приложения, ответы к задачам и предметный
указатель.
Для студентов вузов, изучающих аналитическую химию, аспирантов
и преподавателей.
УДК 543
ББК 24.5я73
Первый тираж издания осуществлен при финансовой поддержке
Российского фонда фундаментальных исследований по проекту № 06-03-46018
Учебное издание
Серия: «Лучший зарубежный учебник»
Кристиан Гэри
АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
В двух томах
Том 2
Ведущий редактор канд. хим. наук Т. И. Почкаева
Редактор канд. хим. наук Д. К. Новикова
Художник С. Инфантпэ, Н. А. Новак. Художественный редактор О. Г. Лапко
Компьютерная верстка: Л. В. Катуркина
Подписано в печать 01.12.08. Формат 70x100/16.
Усл. печ. л. 40,95. Тираж 1700 экз. Заказ 3772.
Издательство «БИНОМ. Лаборатория знаний»
125167, Москва, проезд Аэропорта, д. 3
Телефон: (499) 157-5272, e-mail: binom@Lbz.ru, http://www.Lbz.ru
ISBN 978-5-94774-391-3 (Т. 2)
ISBN 978-5-94774-389-0 (БИНОМ. ЛЗ)
ISBN 0-471-21472-8 (англ.)
Copyright © 2004 John Wiley & Sons, Inc.
All rights reserved.
Authorized Translation from
the English language edition
published by
John Wiley & Sons, Inc.
© Перевод, оформление,
БИНОМ, Лаборатория
знаний, 2008
Глава 16
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Я не могу быть равнодушным к цвету.
Я радуюсь ярким цветам и искренне огорчаюсь
блекло-коричневым.
Уинстон Черчилъ
Методы молекулярной спектрометрии, особенно в видимой области, — одни из
наиболее широко применяемых методов анализа. Они используются, в частно-
сти, в клинических лабораториях и в лабораториях, где изучают окружающую
среду. Оборудование для этих методов доступно, и обычно с ним достаточно
просто работать. В этой главе мы, во-первых, рассмотрим процесс поглощения
излучения молекулами и его взаимосвязь со строением молекул; во-вторых,
приведем количественные соотношения, связывающие количество поглощен-
ного излучения с концентрацией поглощающего аналита (определяемого соедине-
ния); и, в-третьих, ознакомимся с оборудованием, необходимым для проведения
анализа. Измерения можно проводить в инфракрасной (ИК), видимой и ультра-
фиолетовой (УФ) областях электромагнитного спектра. Выбор рабочего диапазона
определяется доступностью приборов, наличием или отсутствием у анализируемо-
го вещества окраски (или возможностью превращения его в окрашенное произ-
водное), присутствием функциональных групп, которые поглощают в УФ- или
ИК-областях, и других поглощающих примесей. ИК-спектрометрия меньше
подходит для количественного анализа, но более информативна для качествен-
ного (область «отпечатков пальцев») по сравнению со спектрометрией в УФ- и
видимой областях. Спектрометры для видимой области обычно дешевле и про-
ще, чем приборы для УФ-области.
Мы ознакомимся также с родственным методом — флуориметрией, в кото-
ром количество света, испущенного в результате возбуждения, связано с кон-
центрацией. Это чрезвычайно чувствительный аналитический метод.
16.1. Взаимодействие электромагнитного излучения с веществом
В спектрометрических методах образец раствора поглощает электромагнитное
излучение от подходящего источника, причем количество поглощенного излу-
чения зависит от концентрации исследуемого соединения в растворе. Голубой
цвет раствора, содержащего ионы меди, обусловлен поглощением излучения до-
полнительного (желтого) цвета из белого света и пропусканием излучения голу-
6
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Кто был первым спектроскопистом?
Вероятно, первым ученым-спектроскопистом можно считать Йоханнеса Маркуса Марци
из Кронланда в Восточной Богемии (1595-1667). Он интересовался явлением радуги и
проводил опыты для его объяснения. В его книге, опубликованной приблизительно в
1648 г. и название которой можно перевести как «Книга Таумеса о небесной радуге и
природе цветов, которые мы видим, а также о происхождении радуги и причинах ее по-
явления», он описал при каких условиях возникает радуга и рассказал о получении спек-
тра при прохождении света через призму. Это явление (и радуга) было верно объяснено
дисперсией света. Спустя 20 лет Ньютон провел аналогичные опыты и дал более строгое
объяснение цветам радуги. Ньютон получил большую известность, но все-таки Марци
был первым!
бого цвета (табл. 16.1). В спектрометрическом методе количество поглощенного
желтого излучения должно быть измерено и соотнесено с концентрацией. Для
лучшего понимания абсорбционной спектроскопии рассмотрим электромагнит-
ный спектр и механизмы поглощения излучения молекулами.
Электромагнитный спектр
Для наших целей электромагнитное излучение можно рассматривать как
форму лучистой энергии, которая распространяется в виде поперечной вол-
ны. Колебания происходят в направлениях, перпендикулярных направлению
распространения; волновая природа излучения проиллюстрирована на
рис. 16.1. Для описания волн используют или длину волны (расстояние, на ко-
торое волна распространяется за один цикл), или частоту (число циклов в еди-
ницу времени). Величина, обратная длине волны, называется волновым
числом; оно соответствует числу волн, приходящихся на единицу длины. Для
более детального изучения природы света и цвета можно рекомендовать сайт
Таблица 16.1
Цвета и интервалы длин волн в спектре
Поглощаемая длина волны, нм Поглощаемый цвет Пропускаемый цвет (дополнительный)
380-450 Фиолетовый Желто-зеленый
450-495 Голубой Желтый
495-570 Зеленый Фиолетовый
570-590 Желтый Голубой
590-620 Оранжевый Зеленовато-голубой
620-750 Красный Сине-зеленый
16.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ С ВЕЩЕСТВОМ
7
ф
Направление распространения
РИС. 16.1. Распространение волны электромагнитного излучения
http://science.csustan.edu/tutorial/color/index.htm, где также описаны основные
цвета и их взаимодействие (сложение и вычитание).
Соотношение между длиной волны и частотой описывается формулой
(16.1)
где X — длина волны в сантиметрах (см)*, v — частота в обратных секундах (с-1)
или герцах (Гц), с — скорость света (3 • 1О10 см/с). Волновое число обозначается
v и измеряется в см-1:
X с
(16.2)
Длины волн электромагнитного излучения охватывают диапазон от нескольких
ангстрем до нескольких метров; для них используются следующие единицы из-
мерения:
ангстрем (А) = 1О-10 м = 10-8 см = 1СН мкм
нанометр (нм) = 10-9м = 10 А = 10-3>мкм
микрометр (мкм) = 10-6 м = 104 А
Длины волн ультрафиолетового и видимого излучения измеряются в наномет-
рах, а инфракрасного излучения — в микрометрах**. В инфракрасной области
спектра часто вместо длин волн используют волновые числа. Величины длин
волн УФ- и видимого излучения составляют порядка нанометров; для ИК-излу-
Точнее, единицы измерения должны быть следующими: см на 1 цикл (для длины волны) и число циклов в
секунду (для частоты), но обычно это просто подразумевается. Вместо [цикл/с] в настоящее время исполь-
зуют герц [Гц].
При обозначении размерности величин вместо миллимикронов [ммк] предпочтительнее использовать на-
нометры [нм], аналогично в ИК-области термин «микрометр» [мкм] предпочтительнее, чем микрон [ц].
8
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
чения — порядка микрометров, но обычно используют обратные величины
(волновые числа, см-1). (Определения ультрафиолетовой, видимой и инфракрас-
ной областей спектра приведены ниже.)
Электромагнитное излучение обладает определенной энергией. Энергия
кванта излучения, называемого фотоном, связана с частотой или длиной волны
следующим уравнением:
Z7 1 hc
Е = hv = —
X
(16.3)
где Е—энергия фотона в эргах, h — постоянная Планка, равная 6,62 • 10-34 Джс =
= 6,62 • 10-27 Эрг-с. Очевидно, что чем меньше длина волны или больше частота,
тем выше энергия. Вот почему УФ-излучение солнца обжигает нас!
Следует отметить, что рождение квантовой теории было связано с попытка-
ми объяснить электронное строение атомов и свойства света. К концу XIX в. ста-
ло очевидно, что классические законы физики (т. е. классическая механика,
созданная Исааком Ньютоном в XVII в.) не применимы для описания электрон-
ного строения. Новая теория, развитая в начале XX в., а именно квантовая меха-
ника, стала научным достижением, изменившим взгляд ученых на атом.
Как уже было отмечено, электромагнитный спектр можно разбить на области
в соответствии с длиной волны излучения. Эти области показаны на рис. 16.2.
В этой главе мы не будем рассматривать у-излучение и рентгеновское излуче-
ние, хотя эти высокоэнергетические виды излучения, в принципе, можно испо-
льзовать так же, как и излучение с более низкой энергией. Ультрафиолетовая
область охватывает диапазон длин волн от 10 до 380 нм, но для аналитических
целей наибольшее значение имеет интервал от 200 до 380 нм, называемый
ближней ультрафиолетовой областью (или областью кварцевого ультрафи-
олета). Излучение с длиной волны менее 200 нм заметно поглощается воздухом,
поэтому приходится работать в вакууме; отсюда произошло название область
Ультрафиолет
ИК-область
V (см-1)
V (Гц)
10 нм 100 нм 1000 нм (мкм) 10 мкм
106 105 104 1000
3 1016 3 • 1015 3 1014 3 • 1013
100 1000
100 10
3 • 1012 3 • 1011
РИС. 16.2. Спектр электромагнитного излучения
16.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ С ВЕЩЕСТВОМ
9
вакуумного ультрафиолета. Область видимого излучения представляет со-
бой лишь малую часть электромагнитного спектра. Излучение с этими длинами
волн воспринимается глазом человека как цвет. Видимая область охватывает
диапазон от ближней УФ-области (380 нм) до -780 нм. Область инфракрасно-
го (ИК) излучения простирается от -0,78 мкм (780 нм) до 300 мкм, но для ана-
литических целей чаще всего используется диапазон от 2,5 до 15 мкм, что
соответствует волновым числам от 4000 до 667 см-1. Диапазон от 0,8 до 2,5 мкм
называется ближней инфракрасной областью, диапазон от 2,5 до 16 мкм —
средней ИК-областью (областью NaCl), а более длинным волнам соответству-
ет дальняя ИК-область. Низкоэнергетическое излучение (радио- или микровол-
ны) мы также не будем рассматривать в этой главе. Такое излучение применяется,
например, в спектроскопии ядерного магнитного резонанса — широко распро-
страненного аналитического метода, который предоставляет информацию о яд-
рах атомов из исследования взаимодействия низкоэнергетического излучения
с ними.
Каким образом вещество поглощает излучение?
Качественную картину поглощения излучения можно получить, рассматривая
поглощение видимого света. Мы видим объекты окрашенными, потому что они
пропускают или отражают только часть видимого света. Когда полихроматиче-
ское излучение (белый свет), содержащее весь спектр длин волн из видимого
диапазона, проходит через объект, последний поглощает излучение определен-
ных длин волн и пропускает остальное. Это прошедшее через объект излучение
и воспринимается как цвет. Этот цвет является дополнительным к цвету погло-
щенного излучения. Аналогично, непрозрачные объекты поглощают часть излу-
чения и отражают остальную, которая и создает цвет объекта.
В табл. 16.1 показано, как соотносятся воспринимаемые цвета с длиной вол-
ны излучения. Например, раствор перманганата калия поглощает зеленый свет с
максимумом около 525 нм, а мы видим его фиолетовым.
Молекула может поглощать излучение в результате трех основных процес-
сов; в любом случае она при этом переходит в состояние с более высокой внутрен-
ней энергией, причем приращение энергии равно энергии фотона поглощенного
излучения (Av). Три типа внутренней энергии квантуются; это значит, что энер-
гия может принимать только определенные значения, образуя систему дискрет-
ных уровней. Во-первых, молекула вращается вокруг своих различных осей;
находясь на определенном уровне вращательной энергии, молекула может за
счет поглощения излучения перейти на более высокий уровень вращательной
энергии. Это — вращательные переходы. Во-вторых, атомы или группы ато-
мов в молекуле колеблются относительно друг друга, и энергия этих колебаний
также квантуется. Молекула может поглотить дискретное количество энергии и
перейти на уровень с более высокой колебательной энергией. Это — колебате-
льные переходы. В-третьих, электроны молекулы могут переходить на более
высокие уровни электронной энергии. Это — электронные переходы.
10
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Поскольку все эти виды энергии квантованы, соответствующие переходы
могут происходить только при определенном значении длины волны, когда энер-
гия фотона hv равна интервалу между дискретными уровнями внутренней энер-
гии. Однако для каждого типа переходов существует много разных возможных
уровней энергии, поэтому может поглощаться излучение с разными длинами
волн. Обычно переходы изображают с помощью диаграммы энергетических
уровней (рис. 16.3). Относительные энергии переходов убывают в ряду: электрон-
ные > колебательные > вращательные, причем они различаются приблизительно
на порядок. Для вращательных переходов достаточно низкой энергии (большие
длины волн, микроволновая или дальняя ИК-область). Колебательные переходы
требуют большей энергии (ближняя ИК-область), а для осуществления электрон-
ных переходов необходима еще более высокая энергия (видимая и УФ-области).
Вращательные переходы
Чисто вращательные переходы могут происходить в дальней ИК- или микро-
волновой области электромагнитного спектра (приблизительно от 100 мкм до
10 см), энергия в которых недостаточна для осуществления колебательных или
электронных переходов. При комнатной температуре молекула обычно нахо-
дится на нижнем уровне электронной энергии, называемом основным состояни-
ем (Ео). Таким образом, чисто вращательные переходы происходят в основном
электронном состоянии (А на рис. 16.3), хотя возможна и заметная заселенность
РИС. 16.3. Диаграмма энергетических уровней, иллюстрирующая изменения энергии при погло-
щении электромагнитного излучения: А — чисто вращательные переходы (дальняя ИК-область);
В — вращательно-колебательные переходы (ближняя ИК-область); С—вращательно- колебатель-
но-электронные переходы (видимая и УФ-области). Ео — основное электронное состояние, Е} —
первое возбужденное электронное состояние
энергии
Уровни
колебатель-
ной энергии
16.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ С ВЕЩЕСТВОМ 11
возбужденных состояний молекулы. Когда происходят только вращательные
переходы, спектр поглощения состоит из дискретных линий, длины волн которых
соответствуют определенным переходам. Следовательно, можно получить важную
информацию о энергетических уровнях молекул, соответствующих вращательным
переходам. Однако для аналитических целей этот диапазон используется редко.
Колебательные переходы
По мере увеличения энергии (уменьшения длины волны) к вращательным пере-
ходам добавляются колебательные, в результате становятся возможны различ-
ные вращательно-колебательные переходы. Молекула с каждого вращательного
уровня нижнего колебательного уровня может перейти на разные вращательные
уровни возбужденного колебательного уровня (В на рис. 16.3). Кроме того, мо-
жет быть несколько разных возбужденных колебательных уровней со своим на-
бором вращательных уровней у каждого. В результате наложения множества
дискретных переходов получается спектр в виде полосы, огибающей «пики», соот-
ветствующие этим переходам. Длины волн этих полос можно связать с опреде-
ленным типом колебаний молекулы. Такие спектры наблюдаются в средней и
дальней ИК-областях. Типичные ИК-спектры показаны на рис. 16.4.
Электронные переходы
При еще более высоких энергиях (в видимой и УФ-областях) становятся воз-
можны переходы между различными электронными уровнями, на которые до-
полнительно накладываются вращательные и колебательные переходы (С на
рис. 16.3). В итоге появляется огромное число возможных переходов. И хотя все
виды энергии квантованы и переходам соответствуют дискретные значения
длин волн, их слишком много и они слишком близко расположены, чтобы разре-
шаться в виде отдельных линий или колебательных полос. Спектры получаются
еще более «смазанными». Результирующий спектр содержит широкие (огибаю-
щие) полосы поглощения; типичные примеры показаны на рис. 16.5 и 16.6.
Что же происходит с поглощенным излучением?
Время жизни возбужденных состояний молекулы очень мало, молекулы теряют
энергию возбуждения и возвращаются в основное состояние. Однако большин-
ство молекул не испускает эту энергию в виде фотона для той же длины волны,
что и поглощенной, а дезактивируются в процессе столкновений, при этом из-
быток энергии теряется в виде теплоты, количество которой слишком мало, что-
бы его можно было детектировать, а кинетическая энергия сталкивающихся
молекул увеличивается. Именно по этой причине раствор или вещество окраше-
ны. Если бы излучение испускалось обратно, то они выглядели бы бесцветны-
ми.* Иногда излучение все же испускается, обычно более длинноволновое. Это
явление подробнее будет обсуждено в разд. 16.15 при рассмотрении явления
флуоресценции.
В случае плоскополяризованного излучения раствор все равно будет окрашен, так как испускаемое излу-
чение должно распространяться во все стороны, как от точечного источника.
12
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Рис. 16.4
Типичные
инфракрасные спектры
[26 Frequently Used
Spectra for the Infrared
Spectroscopist, Standart
Spectra-Midget Edition].
Публикуется
с разрешения Sadtler
Standard Spectra®.
© Sadtler Research
Laboratories, Inc.
1,4-Диоксан
микроны
Тетрахлорид углерода
микроны
16.2. ЭЛЕКТРОННЫЕ СПЕКТРЫ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА
13
Рис. 16.5
Типичный спектр поглощения в видимой
области. Винная кислота взаимодействует
с р-нафтолом в серной кислоте: 1 — образец;
2 — раствор сравнения. С разрешения Pergamon
Press, Ltd [G. D. Christian, Taianta, 16 (1969) 255]
Рис. 16.6. Типичный УФ-спектр для 5-метокси-6-(и-метоксифенил)-4-фенил-2(1Н)-пиридона
в метаноле [Sadtler Standard Spectra-u.v.]. Публикуется с разрешения Sadtler Standard Spectra®.
© Sadtler Research Laboratories, Inc.
16.2. Электронные спектры и молекулярная структура
Электронные переходы в видимой и УФ-областях спектра обусловлены погло-
щением излучения особыми группами, связями и функциональными группами,
входящих в состав молекулы. Длина волны и интенсивность поглощения зави-
сят от природы группы. Длина волны поглощаемого излучения соответствует
14
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
энергии, необходимой для перехода, а интенсивность поглощения определяется
вероятностью перехода при взаимодействии электронной системы с излучением
и полярностью возбужденного состояния.
Излучение Тип переходов
Микроволновое Инфракрасное Ближнее ИК Видимое УФ Вращательные Вращательные/колебательные Колебательные Электронов валентных орбиталей Электронные
Типы переходов
Электроны в молекуле можно классифицировать по четырем различным типам.
1 - Электроны заполненных оболочек, которые не участвуют в связывании.
Энергии их возбуждения очень высоки, и они не вносят вклада в поглоще-
ние в видимой и УФ-областях.
2- Электроны ковалентных одинарных связей (а-связей). Их энергии возбуж-
дения также слишком высоки, чтобы давать вклад в поглощение в видимой
и УФ-областях (например, одинарные связи в насыщенных углеводородах
—СН2—СН2—).
3- Электроны свободных (несвязывающих) электронных пар валентной обо-
лочки атомов (^-электроны), например, в атомах N, О, S и галогенов. Эти
электроны связаны менее прочно, чем а-электроны, и могут возбуждаться
под действием видимого и УФ-излучения.
4- Электроны л-орбиталей (л-электроны), например, двойных и тройных свя-
зей. Эти электроны возбуждаются легче всего и обусловливают большин-
ство электронных спектров поглощения в видимой и УФ-областях.
Электроны располагаются на орбиталях. В молекуле есть также незаселен-
ные в нормальном состоянии орбитали, называемые разрыхляющими орбита-
лями. Они соответствуют энергетическим уровням возбужденных состояний и
обозначаются как а*- или л*-орбитали. Поглощение излучения приводит к пе-
реходу электрона на разрыхляющую орбиталь. Чаще всего совершаются перехо-
ды с л- и валентных (п) орбиталей на л*-разрыхляющие орбитали: л л* или
и —> л* соответственно. Несвязывающие ^-электроны под действием коротко-
волнового излучения (длина волны менее 200 нм) могут также быть возбуждены
до разрыхляющих сг*-состояний: п и*.
16.2. ЭЛЕКТРОННЫЕ СПЕКТРЫ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА
15
Переходы типов 71^л*ии—>л* характерны для молекул кетонов
О
II
R—С —R'
Электронные переходы можно представить с помощью схемы валентных
связей:
7г —тг* -переход
С=О--> С=о
п —> тг*-переход
Например, в спектре поглощения ацетона наблюдается интенсивный переход
тг —> тг* и слабый переход п л*. Другой пример: для простых эфиров характер-
ны переходы п тг*-типа (R—О—R'). Однако они происходят под действием
излучения с длиной волны менее 200 нм, поэтому простые эфиры, а также про-
стые тиоэфиры (R—S—R'), дисульфиды (R—S—S—R), алкиламины (R—NH2)
и алкилгалогениды (R—X) прозрачны (т. е. не имеют полос поглощения) в види-
мой и УФ-областях.
Вероятность переходов тг тг* выше, чем п -> тс*-переходов; интенсив-
ность полос поглощения для первых выше. Типичные значения молярного коэф-
фициента поглощения 8 — количественного критерия интенсивности полосы —
в максимумах полос тс -> тс*-переходов составляют от 1000 до 100000, в то время
как для п тс*-переходов они меньше 1000.
Поглощение изолированными хромофорами
Поглощающие группы в молекуле называют хромофорами. Молекулы, содержа-
щие хромофоры, называются хромогенами. Другие группы — ауксохромы —
сами не поглощают излучение, но они могут усиливать поглощение хромофора
или сдвигать полосу поглощения последнего, если расположены рядом в моле-
куле. Примерами ауксохромов служат гидроксильные группы, аминогруппы и
атомы галогенов. Все они имеют необобществленные (л) электроны, которые мо-
гут взаимодействовать с тс-электронами хромофора (л-тс-сопряжение).
Изменения в спектрах можно классифицировать следующим образом:
1) батохромный сдвиг — максимум поглощения смещается в сторону более
длинных волн; 2) гипсохромный сдвиг — максимум поглощения смещается в
16
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
сторону более коротких волн; 3) гиперхромный эффект — коэффициент мо-
лярного поглощения увеличивается; 4) гипохромный эффект — коэффициент
молярного поглощения уменьшается.
Небольшие структурные отличия в других частях молекулы мало влияют
на спектры поглощения хромофоров. Например, ацетон (слева) и 2-бутанон
(справа)
О
II
СНз—с—сн3
о
II
СН3—С—СН2СН3
дают спектры очень похожие по форме и интенсивности полос. Но если струк-
турное изменение более существенное или расположено рядом с хромофором,
различие в спектрах можно заметить.
Поглощение двух изолированных хромофоров в молекуле (разделенных, по
крайней мере, двумя одинарными связями), в принципе, независимо и аддитив-
но. Так, в молекуле CH3CH2CNS максимум поглощения группы CNS приходит-
ся на 245 нм, 8 = 800. В молекуле SNCCH2CH2CH2CNS максимум поглощения
приходится на 247 нм и приблизительно вдвое интенсивнее (8 = 2000). Взаимо-
действие между хромофорами может повлиять на уровни электронной энергии и
изменить спектр.
В табл. 16.2 перечислены наиболее типичные хромофоры и указано положе-
ние максимумов их поглощения.
Следует отметить, что точное значение длины волны полосы поглощения и
ее интенсивность (вероятность перехода) рассчитать нельзя, поэтому для анали-
тических целей всегда используют стандартные образцы, находящиеся в строго
определенных условиях (температура, растворитель, концентрация и т. д.), из-
мерения выполняют на приборах одного и того же типа. Современные компью-
теризированные приборы могут содержать каталог стандартных спектров для
сравнения.
Поглощение сопряженными хромофорами
Если кратные (т. е. двойные, тройные) связи в молекуле разделены только одной
одинарной связью, их называют сопряженными. к-Орбитали перекрываются,
что уменьшает разницу в энергиях между соседними уровнями (орбиталями).
В результате в спектрах поглощения наблюдается батохромный сдвиг и, как
правило, увеличение интенсивности полос. Чем выше степень сопряжения
(т. е. чем протяженнее система чередующихся двойных или тройных и одинар-
ных связей), тем значительнее сдвиг. Сопряжение кратных связей с несвязываю-
щими электронами (и-л-сопряжение) также приводит к изменениям в спектре
(например, С=СН—NO2 ).
16.2. ЭЛЕКТРОННЫЕ СПЕКТРЫ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА
17
Таблица 16.2
Полосы поглощения типичных хромофоров
Хромофор X нм max, ^max
Название Формула
Амин —nh2 195 2800
Этилен —с = с— 190 8000
195 1000
Кетон с=о 270-285 18-30
Альдегид — СНО 210 Интенсивная
280-300 11-18
Нитрогруппа —no2 210 Интенсивная
Нитритогруппа — ONO 220-230 1000-2000
ЗОО-ЛОО 10
Азогруппа — N=N — 285Л00 3-25
Бензол 184 46700
202 6900
255 170
Нафталин 220 112000
275 5600
312 175
Антрацен 252 199000
375 7900
[М. М. Willard, L. L. Merritt, J. A. Dean, Instrumental Methods of Analysis, 4th ed. Copyright © 1948,1951,
1958, 1965, by Litton Educational Publishing, Inc., с разрешения Van Nostrand Reinhold Company]
Поглощение ароматическими соединениями
Ароматические соединения, содержащие фенильные группы или бензольные
кольца, хорошо поглощают УФ-излучение. Для этих систем характерно сопря-
жение связей. Однако их спектры отличаются от спектров других сопряженных
о
систем, в частности тем, что они заметно сложнее. В спектре бензола \_/ при-
сутствует интенсивная полоса поглощения при 200 нм (етах = 6900) и слабая по
сравнению с ней полоса (стах = 170) в диапазоне от 230 до 270 нм (рис. 16.7). Сла-
бая полоса имеет тонкую структуру, обусловленную плохо разрешенными коле-
бательными переходами.
Введение заместителей в бензольное кольцо обычно приводит к сглажива-
нию тонкой структуры, батохромному сдвигу и увеличению интенсивности по-
глощения. Например, гидроксильная (—ОН), метоксильная (—ОСН3), амино-
(—NH2), нитро- (—NO2) и альдегидная (—СНО) группы усиливают поглощение
приблизительно в 10 раз; такое сильное влияние объясняется и-л-сопряжением.
Атомы галогенов и метильная (—СН3) группа действуют как ауксохромы.
18
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Рис. 16.7
Ультрафиолетовый спектр бензола
Длина волны, нм
Полиядерные ароматические соединения (с конденсированными бензоль-
ными кольцами), например нафталин > характеризуются более высокой
степенью сопряжения, поэтому они поглощают в более длинноволновой облас-
ти. Нафтацен (четыре цикла) имеет максимум поглощения при 470 нм (видимая
область) и желтую окраску; у пентацена (пять циклов) максимум наблюдается
при 575 нм, и он имеет голубую окраску (см. табл. 16.1).
В полифенильных соединениях \—/ \—/ \—/ связанные в ияря-поло-
жении (1,4) циклы способны к резонансному взаимодействию (сопряжению) в
пределах всей системы; увеличение числа связанных циклов приводит к бато-
хромному сдвигу (например, от 250 до 320 нм при изменении и от 0 до 4). В то же
время циклы, связанные в л/еиш-положении (1,3), к такому сопряжению не спо-
собны, и батохромный сдвиг не наблюдается вплоть до п = 16. Однако интенсив-
ность поглощения увеличивается из-за аддитивности эффектов идентичных
хромофоров.
Многие гетероциклические ароматические соединения, например пиридин
\__/ , поглощают в УФ-диапазоне; введение заместителей вызывает в спектрах
изменения, аналогичные описанным выше для фенильных соединений.
Индикаторные красители, применяемые в кислотно-основном и окислитель-
но-восстановительном титровании (см. гл. 8 и 14), представляют собой системы
с обширным сопряжением и поэтому поглощают в видимой области. Удаление
или присоединение протона или электрона заметно изменяет электронное рас-
пределение, и, соответственно, изменяется их цвет.
16.2. ЭЛЕКТРОННЫЕ СПЕКТРЫ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ СТРУКТУРА
19
Что делать, если молекула не поглощает излучение?
Если соединение (органическое или неорганическое) не поглощает в УФ-или
видимой областях, можно попытаться получить его производное, которое будет
поглощать в этом диапазоне. Например, белки образуют окрашенные комплек-
сы с медью(П) (биуретовая реакция). Металлы образуют интенсивно окрашенные
хелаты со многими органическими осадительными реагентами (перечисленными в
табл. 10.2 и др.), которые, в свою очередь, могут быть растворены или экстрагирова-
ны (см. гл. 18) с помощью такого органического растворителя, как этиленхлорид, и
тогда светопоглощение раствора можно измерить методом спектрометрии. Меха-
низм поглощения излучения неорганическими соединениями обсуждается ниже.
Спектрометрия в видимой и УФ-областях (особенно в видимой) широко ис-
пользуется в клинических лабораториях, часто с применением характерно
окрашенных производных или продуктов реакции определяемого соединения.
Например, креатинин крови реагирует с пикрат-ионом в щелочном растворе с
образованием окрашенного продукта, поглощающего излучение с длиной вол-
ны 490 нм. Железо взаимодействует с о-фенантролином, и продукт реакции по-
глощает при 535 нм; неорганический фосфат образует с молибденом(У1)
комплекс, который восстанавливается до молибденовой сини [содержащей
Mo(V)], поглощающей при 660 нм; мочевая кислота окисляется щелочным фос-
форовольфраматом, образующийся при этом синий продукт восстановления
фосфоровольфрамата поглощает при 680 нм. Измерения в УФ-области исполь-
зуют для определения барбитуратов в щелочном растворе при 252 нм, а также
контроля многих ферментативных реакций посредством наблюдения за измене-
нием поглощения при 340 нм. Это связано с изменениями концентрации восста-
новленной формы никотинамидадениндинуклеотида (NADH) — широко
распространенного реагента или продукта в ферментативных процессах. Более
подробно клинические измерения рассмотрены в гл. 24.
Почему неорганические хелаты поглощают так интенсивно?
Поглощение в УФ- или видимой области, характерное для многих комплексных
соединений металлов, можно объяснить с помощью переходов следующих ти-
пов: 1) возбуждение иона металла', 2) возбуждение лиганда', 3) переход с перено-
сом заряда. Возбуждение ионов металла в комплексе обычно характеризуется
очень маленьким молярным коэффициентом поглощения (от 1 до 100), что неу-
добно для аналитических целей. Большинство используемых лигандов — это
органические хелатообразующие реагенты, поглощение которых обсуждалось
выше (возможны л л*- и п л*-переходы). Комплексообразование с ионом
металла, подобно протонированию молекулы, приводит к изменению длины
волны и интенсивности поглощения, однако, как правило, эти изменения слабые.
Интенсивная окраска хелатов часто обусловлена переходами с переносом за-
ряда, которые представляют собой перемещение электронов с иона металла на ли-
ганд или, наоборот, с лиганда на ион металла. При этом электроны переходят с
л-уровней лиганда или связывающих а-орбиталей на свободные орбитали иона
металла, либо со связывающих а-орбиталей на свободные л-орбитали лиганда.
20
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
При таких переходах по сути происходит внутримолекулярная окислитель-
но-восстановительная реакция с участием иона металла и лиганда. Обычно ион
металла восстанавливается, а лиганд окисляется, причем длина волны (энергия) в
максимуме поглощения зависит от того, насколько легко происходит перенос
электрона. Ион металла в низшей степени окисления в комплексе с лигандом с
высоким сродством к электрону может быть окислен и без разрушения комплек-
са. Важным примером служит хелат железа(П) с 1,10-фенантролином.
Переходы с переносом заряда чрезвычайно интенсивны (типичные значе-
ния 8 лежат в интервале от 10 000 до 100 000) и наблюдаются как в видимой, так
и в УФ-областях. Интенсивность (легкость переноса заряда) увеличивается при
увеличении степени сопряжения в лиганде. Такие комплексы металлов ярко
окрашены благодаря сильному поглощению и очень удобны для определения
следовых количеств металлов.
16.3. Поглощение в области инфракрасного излучения
и молекулярная структура
Инфракрасная спектрометрия очень удобна для получения качественной инфор-
мации о молекулах. Но для поглощения в ИК-диапазоне молекула должна обла-
дать определенными свойствами.
Поглощение инфракрасного излучения
Не все молекулы поглощают в ИК-области. Для того чтобы поглощение проис-
ходило, дипольный момент (полярность) молекулы должен изменяться. Двух-
атомная молекула, чтобы поглощать, должна иметь постоянный дипольный
момент, т. е. полярную ковалентную связь, в которой пара электронов обобще-
ствлена не поровну. (Исключение составляют более крупные молекулы, к кото-
рым это не относится.) Например, молекула азота N=N не имеет дипольного
момента и не может поглощать в ИК-диапазоне. Несимметричные двухатомные
молекулы, такие как монооксид углерода, имеют постоянный дипольный мо-
мент и поэтому поглощают в этой области. Молекула диоксида углерода
О=С=О не имеет постоянного дипольного момента, но при колебаниях моле-
кулы он может возникать. Так, колебание типа 0<=С<=0 приводит к дипольно-
му моменту, и молекула может поглощать ИК-излучение (такой дипольный
момент называют индуцированным или наведенным в отличии от симметрично-
го колебания 0=>С<=0, в результате которого дипольный момент не возникает).
Типы групп и молекул, поглощающих в ИК- и других областях, будут рассмат-
риваться ниже.
Наше обсуждение ограничивается рассмотрением молекул, поскольку поч-
ти все поглощающие частицы в растворах имеют молекулярную природу. В слу-
чае же отдельных атомов (которые существуют в пламени или электрической
дуге), очевидно, наблюдаются только электронные спектры, состоящие из узких
линий, соответствующих определенным переходам. Подробнее атомные спект-
ры рассмотрены в гл. 17.
16.3. ПОГЛОЩЕНИЕ В ОБЛАСТИ ИНФРАКРАСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ
21
Инфракрасные спектры
Различные группы атомов поглощают ИК-излучение определенных интервалов
длин волн, точное положение которых зависит от соседних групп. Полосы по-
глощения в этом диапазоне спектра намного уже, чем в УФ- и видимой областях,
и их легче идентифицировать. Кроме того, каждый вид молекул имеет свой уни-
кальный спектр поглощения; таким образом получают как бы «отпечаток паль-
цев» молекулы (см., например, верхний спектр на рис. 16.4). Такие данные по
ИК-спектрам для большого числа соединений содержаться в специальных ката-
логах, доступных на сегодняшний день (см. ссылки в конце главы и Интернет-ад-
рес в конце этого раздела). Спектр смеси поглощающих веществ, естественно,
представляет собой наложение спектров отдельных соединений. Но даже в та-
ких случаях часто можно идентифицировать индивидуальные соединения по
пикам поглощения характеристических групп в молекулах. В их число входят
гидроксильные, сложноэфирные карбонильные и ненасыщенные (алкеновые и
ароматические) углеводородные группы. На рис. 16.8 показаны диапазоны по-
глощения ИК-излучения различными группами. Поглощение в интервале длин
волн от 6 до 15 мкм сильно зависит от строения молекулы в целом; эта область
называется областью отпечатков пальцев. Сравнивая спектр поглощения в
этом интервале с известными спектрами в каталоге, можно идентифицировать
соединение.
Хотя наибольшее значение ИК-спектрометрия имеет для идентификации и
структурного анализа, метод удобен и для количественного анализа сложных
смесей родственных соединений, так как некоторые пики поглощения при опре-
деленных длинах волн очень чувствительны к изменениям строения молекулы, а
их интенсивность пропорциональна концентрации поглощающих частиц. Срав-
нение данных о наиболее типичных полосах поглощения, приведенных на сайте
http://science.csustaniedu/tutorial/ir/index.htm и на рис. 16.8, позволит легко по-
нять, каким образом по комбинациям полос (в том числе с учетом отсутствия
некоторых полос) можно идентифицировать соединения различных типов.
Применение ИК-спектрометрии в повседневной жизни
Инфракрасная спектрометрия широко используется в количественном анализе
для самых различных целей, включая контроль за безопасностью промышлен-
ного производства и качеством воздуха. При проверке выхлопных газов автомо-
бильного двигателя ИК-датчик помещается в выхлопную трубу для измерения
содержания СО, СО2 и углеводородов (с учетом среднего коэффициента мо-
лярного поглощения углеводородов).
При подозрении водителя в управлении автомобилем в нетрезвом состоя-
нии содержание алкоголя в крови также определяют с помощью ИК-прибора,
измеряющего содержание алкоголя в выдыхаемом воздухе. При выдохе в труб-
ку альвеолярный воздух из глубины легких, находящийся в равновесии с кро-
вью капилляров, попадает в специальную камеру. Содержание алкоголя в
выдыхаемом воздухе определяется по интенсивности полосы поглощения при
3,44 мкм. Эта полоса не является характеристической для спирта, здесь погло-
22
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Волновые числа, см
5000 4000 3000 2500 2000 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 700
валент. кол. О-Н и N-H валент. кол. С=О валентные колебания С-0
валент. кол. С-Н валент. кол. C=N валент. кол. C-N
валент. кол. С=С и C^N валент. кол. С=С валент. кол. С-С
N-H деформационные колебания деформационные колебания N-H
деф. кол. С-Н деф. кол. С-Н
I I I I I I I I I I i I I I I I I I I I I l I !Д|е?)!Ки'|С>~’Н N I I I I I I I I ! I I I I I I I I ! I I I I I I I I ! 1 i I
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Длина волны, мкм
Рис. 16.8. Области характеристических групповых колебаний в ИК-диапазоне [R. Т. Conley, Infra-
red Spectroscopy, 2nd ed. Boston: Allyn and Bacon, Inc., 1972]. С разрешения Allyn and Bacon, Inc.
щает и ацетон, который может появиться в выдыхаемом воздухе при ацидозе
(кетозе), если человек страдает диабетом или длительное время не ел. Поэтому
чтобы избежать ошибки, измеряют также поглощение при 3,37 мкм, где ацетону
соответствует интенсивная полоса, а спирту — слабая. Расчет по двум полосам
поглощения дает правильную оценку. Вдувая в аналитическую ячейку воздух,
проходящий через стандартный водный раствор спирта при определенной тем-
пературе, осуществляют градуировку. Содержание алкоголя в воздухе пересчи-
тывается в содержание (в %) его в крови с помощью среднего коэффициента
2100 : 1. Во многих государствах установлен допустимый уровень алкоголя в
крови ниже 0,08%, т. е. считается, что при более высокой концентрации алкоголь
оказывает влияние на поведение человека. Во многих европейских странах допу-
стимый уровень еще ниже. Для несовершеннолетних граждан нормой часто счи-
тается 0%, при нарушении запрета можно лишиться водительских прав до
совершеннолетия.
16.4. Инфракрасная спектрометрия в ближней области -
недеструктивный метод анализа
Средняя ИК-область (от 1,5 до 25 мкм) широко используется для качественного
анализа благодаря тонкой структуре спектров в этом диапазойе. Для целей коли-
чественного анализа она менее удобна, так как для измерений нужны разбавленные
образцы, а подобрать растворитель, не поглощающий в этой области, достаточно
трудно. Область электромагнитного спектра рядом с видимым излучением с X от
0,75 до 2,5 мкм (от 750 до 2500 нм) называют ближней ИК-областью. Полосы
поглощения в этом диапазоне являются слабыми и не имеющими тонкой струк-
туры, но удобными для недеструктивных количественных измерений, напри-
мер, для анализа твердых образцов.
16.4. ИНФРАКРАСНАЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ В БЛИЖНЕЙ ОБЛАСТИ
23
Обертоны и комбинационные переходы
в ближней ИК-области
Поглощение в ближней ИК-области обусловлено колебательными обертонами
и комбинационными (составными) переходами, которые относятся к запре-
щенным переходам. Их вероятность поэтому мала, а соответствующие полосы
слабые. Эти переходы связаны с фундаментальными (основными) колебаниями
в средней ИК-области. Обертоны возникают при переходе возбужденной моле-
кулы из основного колебательного состояния на более высокое, для которого ко-
лебательное квантовое число и > 2. Так, первый обертон отвечает переходу с
уровня и = 0 на и = 2, а второй и третий обертоны — переходам с уровня о = 0 на
уровни и = 3 и и = 4 соответственно. Составные полосы поглощения появляются
при одновременном возбуждении двух различных молекулярных колебаний. При
переходе к каждому последующему обертону интенсивность полос уменьшается
приблизительно на порядок. Поглощение в ближней ИК-области обусловлено в
основном валентными и деформационными колебаниями связей С—Н, О—Н и
N—Н.
Коротковолновая и длинноволновая части
ближней ИК-области
В ближней ИК-области можно, в свою очередь, выделить коротковолновый (от
750 до 1100 нм) и длинноволновый (от 1100 до 2500 нм) диапазоны. Такое деле-
ние связано только с типом используемых детекторов: кремниевых для первого
диапазона и детекторов на основе PbS, InGaAs или германия — для второго.
В коротковолновом диапазоне ближней ИК-области поглощение обычно сла-
бее, поэтому для проведения исследований можно применять кюветы длиной от
1 до 10 см. Для длинноволнового диапазона нужны кюветы размером от 1 до
10 мм. Это очень важное различие, поскольку при большей длине кювет
(т. е. большей длине пути луча) измерения получаются более надежными. Как
правило, поглощение в ближней ИК-области в 10-1000 слабее, чем поглощение
в средней ИК-области, поэтому в этой области обычно изучают «чистые» образ-
цы, т. е. порошки, суспензии или растворы без разбавления. При измерениях в
средней ИК-области образцы обычно разбавляют (таблетки с КВг, тонкие плен-
ки, пасты или растворы), а размер кювет составляет от 15 мкм до 1 мм.
Особенности градуировки для недеструктивного анализа
в ближней ИК-области
Хотя в ближней ИК-области спектры не имеют характерных особенностей, а по-
глощение мало, отношение сигнал/шум является высоким благодаря использо-
ванию в этой области интенсивных источников излучения и чувствительных
детекторов. В средней ИК-области уровень шумов обычно составляет тысячные
доли единицы оптической плотности, в то время как для детекторов в ближней
ИК-области эта величина составляет миллионные доли единицы оптической
плотности, т. е. в 1000 раз ниже (определение оптической плотности см. ниже).
24
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
При использовании соответствующей градуировки можно достичь очень высо-
кой точности результатов результатов.
Благодаря способности излучения ближней ИК-области проникать через
неразбавленные образцы и возможности использования относительно длинных
кювет, оно удобно для недеструктивного и быстрого анализа самых разных об-
разцов, например, зерна для определения содержания в нем белка. Однако низ-
кое аппаратурное разрешение в течение многих лет ограничивало применение
метода, пока не появились достаточно небольшие по размерам компьютеры и не
были разработаны статистические (хемометрические) методы для «обучения»
приборов распознавать и выделять спектры отдельных соединений в сложных
спектрах образцов (например, метод анализа главных компонент). В основу хемо-
метрических методов положены алгоритмы многомерных математических мно-
гопараметрических вычислений, при которых измеряются сразу все параметры
(компоненты), а не по одному. В настоящее время создано программное обеспе-
чение для автоматической градуировки. Градуировочные стандарты, содержа-
щие определяемое вещество в различных концентрациях в матрице образца,
используются в качестве обучающего набора; из их спектров соответствующие
программы могут выделить спектр определяемого соединения и построить гра-
дуировочную кривую. При этом обычно регистрируют сразу весь спектр
(см. разд. 16.8) и для анализа используют данные измерений при сотнях и даже
тысячах значений длин волн. Для количественного анализа (что и составляет
основную цель спектрометрии в ближней ИК-области) состав стандартных об-
разцов должен быть известен или определен стандартным методом.
Применение спектрометрии в ближней ИК-области
Основное использование спектрометрии в ближней ИК-области связано с опре-
делением питательных веществ в обмолоченном зерне (пшенице, кукурузе,
рисе, овсе). Классические методы анализа таких образцов включают метод Кьель-
даля для определения белков, экстракцию Сокслета для жиров, высушивание на
воздухе для определения влаги и рефрактометрические измерения для углево-
дов. Проводя соответствующие градуировки по смесям из перечисленных ком-
понентов, можно поместить муку из зерна в анализатор и провести полный
анализ в течение нескольких минут. Однако каждый вид образцов (пшеница, ку-
куруза и т. д.) требует отдельного набора стандартов для градуировки, поскольку
для точного анализа составы образца и стандартов в целом должны совпадать.
Даже для анализа одного вида зерна из разных географических районов могут
потребоваться отдельные градуировки. И обычно нужны сотни стандартных
смесей. Поэтому быстрота и гибкость метода в значительной степени нивелиру-
ются временем и усилиями, затрачиваемыми для приготовления стандартов и
калибровки прибора, и его целесообразно использовать лишь в тех случаях, ког-
да необходимо проанализировать тысячи образцов. Другой пример применения
спектрометрии в ближней ИК-области — измерение октанового числа, давления
паров, содержания ароматических соединений в нефтехимической промышлен-
ности. Все эти характеристики связаны с составом углеводородов, спектры ко-
торых измеряют.
16.6. РАСТВОРИТЕЛИ ДЛЯ СПЕКТРОМЕТРИИ
25
16.5. Спектральные базы данных:
идентификация новых соединений
Среди ссылок, приведенных в конце главы, перечислен целый ряд ценных ката-
логов спектров в УФ-, видимой и ИК-областях. Библиографический список ра-
бот, посвященных интерпретации спектров можно найти в обзоре [Bourassa
et al., Spectroscopy, 12(1) (January) (1997) 10].
Доступны также мощные и удобные коммерческие базы данных; имеются и
базы данных в свободном доступе. Некоторые из них перечислены ниже. Более
подробную информацию можно найти на Интернет-сайте учебника.
1. www.galactic.com/ — спектральная база данных в свободном доступе, бо-
лее 6000 спектров (www.galactic.com/spconline).
2. www.acdlabs.com/ — перечень нескольких доступных баз данных.
3. http://webbook.nist.gov/ — доступ к базе спектров в УФ-, видимой и ИК-об-
ластях Национального института стандартов и технологий США (NIST, USA).
4. www.chemie.uni-erlang.en.de/services/telespec/ — моделирование ИК-спек-
тров.
5. www.ftirsearch.com/ — платная библиотека спектров для небольших лабо-
раторий (71 000 спектров).
6- www.chemicalconcepts.com/ — «World’s largest spectra collection» — самое
большое в мире собрание спектров (660 000 спектров).
7> www.mattsonir.com/ — содержит библиотеку ИК-фурье-спектров неорга-
нических соединений.
8. www.sadtler.com/ — объединенная система УФ-, видимых, ИК- и других
спектральных данных.
16.6. Растворители для спектрометрии
Очевидно, что растворитель, необходимый для приготовления образца, не дол-
жен заметно поглощать в той области, где проводят измерения. При работе в ви-
димой области серьезных проблем с этим никогда не возникает. Известно много
бесцветных растворителей (к которым, конечно же, относится вода), используе-
мых для растворения неорганических соединений. Воду можно использовать и в
УФ-области. Многие вещества, изучаемые в УФ-области, представляют собой
органические соединения, нерастворимые в воде. Для их растворения применя-
ют органические соединения. В табл. 16.3 перечислен ряд растворителей для
спектрометрии в УФ-области. Край (или граница) поглощения — это минималь-
ная длина волны, при которой оптическая плотность (см. ниже) достигает еди-
ницы при использовании в качестве эталона для сравнения кюветы толщиной
1 см с водой. Все эти растворители можно применять, по крайней мере, до види-
мой области.
26
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Выбор растворителя иногда влияет на вид спектра в УФ-области из-за взаи-
модействия растворенного вещества с растворителем. При переходе от неполяр-
ных растворителей к полярным может пропадать тонкая структура, а максимумы
поглощения могут сдвигаться (будут наблюдаться батохромный или гипсохром-
ный сдвиг в зависимости от вида перехода и типа взаимодействий растворенное
вещество—растворитель).
Выбор подходящего растворителя для ИК-области представляет более се-
рьезную проблему, так как трудно найти растворитель, который полностью прозра-
чен в этом диапазоне. Часто необходимо использовать весьма концентрированные
растворы образцов. Тетрахлорид углерода или дисульфид углерода (ОПАСЕН
ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ!) поглощают в обычном рабочем диапазоне от 2,5 до 15 мкм
(см. рис. 16.4). Вода дает интенсивные полосы поглощения в ИК-области, поэто-
му ее можно использовать только на определенных участках спектра. Кроме
того, необходимы специальные материалы, совместимые с водой; кюветы для
ИК-области обычно делают из NaCl, потому что стекло поглощает излучение,
однако NaCl растворяется в воде. Кюветы из NaCl пригодны только для раство-
рителей, не содержащих влагу.
Таблица 16.3
Нижние пределы пропускания растворителей в УФ-области
Растворитель Граница поглощения, нма Растворитель Граница поглощения, нм а
Вода 200 Дихлорметан 233
Этанол (95%) 205 Бутиловый эфир 235
Ацетонитрил 210 Хлороформ 245
Циклогексан 210 Этилпропионат 255
Циклопентан 210 Метилформиат 260
Гептан 210 Тетрахлорид углерода 265
Гексан 210 Н,И-Диметилформамид 270
Метанол 210 Бензол 280
Пентан 210 Толуол 285
Изопропанол 210 л^-Ксилол 290
Изооктан 215 Пиридин 305
Диоксан 220 Ацетон 330
Диэтиловый эфир 220 Бромоформ 360
Глицерин 220 Дисульфид углерода 380
1,2-Дихлорэтан 230 Нитрометан 380
а Длина волны, соответствующая единичной оптической плотности в 1-сантиметровой кювете с водой в каче-
стве раствора сравнения.
16.7. ВЫЧИСЛЕНИЯ В КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ
27
16.7. Вычисления в количественном анализе
Долю излучения, поглощенную раствором аналита, можно количественно свя-
зать с концентрацией раствора. Приведенные ниже расчеты используют для
определения концентрации одного типа частиц, а также поглощающих частиц
разных типов в смеси.
Закон Бера: соотношение между количеством
поглощенного излучения и концентрацией
Количество монохроматического излучения, поглощенное образцом, подчиня-
ется закону Бугера-Ламберта-Бера, который чаще называют законом Бера. По-
смотрим на рис. 16.9. Монохроматическое излучение от источника с мощностью
Ро проходит через раствор поглощающих частиц с концентрацией с и толщиной
слоя Ь, выходящее излучение имеет мощность Р. Мощность излучения количе-
ственно измеряется детекторами. Бугер в 1729 г. [₽. Bouguer; Essai d ’otique sur la
gradation de la lumier, Paris, 1729] и Ламберт в 1760 г. [J. Н. Lambert, Photometria,
Ausburg, 1760] установили, что при поглощении электромагнитного излучения
мощность пропускаемого излучения уменьшается в геометрической прогрессии
(экспоненциально). Предположим, что 25% лучистой энергии (см. рис. 16.9) по-
глощается при толщине слоя Ь. Следующие 25% (от оставшегося излучения, т. е.
25% от О,75Ро) будут поглощены при прохождении еще одного слоя толщиной Ь;
при этом останется 56,25% от исходной мощности излучения. На следующем от-
резке b будет поглощено еще 25% энергии и т. д. Таким образом, для поглоще-
ния всей лучистой энергии необходим слой раствора бесконечной толщины.
Поскольку доля проходящего излучения уменьшается экспоненциально с рас-
стоянием, можно записать
Т = — = 10’** (16.4)
Ро
где к — постоянная; Т — безразмерная величина, называемая пропусканием, и
равная доле пропускаемой лучистой энергии. Прологарифмировав уравнение
(16.4), получаем
\gT = \g~—= -kb
Рис. 16.9
Поглощение излучения:
Ро — мощность падающего излучения, Р — мощность
прошедшего излучения, с — концентрация,
b — оптическая длина пути
(16.5)
28
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
В 1852 г. Бер [A. Beer, Лии. Physik Chem., 86 (1852) 78] и Бернард [F. Bernard, Лии.
Chim. et Phys., 35 (1853) 385] независимо друг от друга установили, что анало-
гичный закон верен для соотношения между Гис:
Т = — = 10~*'с
р0
(16.6)
где к* — другая постоянная.
Или, в логарифмической форме,
\%Т = \%^ = -к'с (16.7)
М)
Объединив эти два закона, можно получить закон Бера, связывающий пропуска-
ние Т с длиной пути и концентрацией:
Т = — = \.0~аЬс
Р0
(16.8)'
где а — постоянная, объединяющая км к!. Или, в логарифмической форме,
lg Т = 1g — = -abc
Ро
(16-9)
Отбросив для удобства знак «-» в правой части уравнения, введем новую вели-
чину — оптическую плотность (Л):
A=-\gT = 1g у = lg = abc
(16.10)
Это наиболее часто используемая форма записи закона Бера, которую легко за-
помнить — это просто abc\ Следует обратить внимание, что оптическая плот-
ность прямо пропорциональна концентрации.
Величина пропускания в % задается выражением
%Т = — -100
р,
(16.11)
Уравнение (16.10) можно преобразовать. Поскольку Г= %Г/100,
А = 1g= IglOO- 1g %Г
16.7. ВЫЧИСЛЕНИЯ В КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ
29
Или
А = 2,00 - 1g %Т
и
%Т= antilg (2,00 - Л) = Ю(2’00-л)
(16.12)
В качестве примера ниже приведены расчеты, выполненные с помощью элек-
тронных таблиц, и график зависимости оптической плотности от пропускания.
Длина пути b излучения, проходящего через раствор, в уравнении (16.10)
выражается в сантиметрах, а концентрация с — в граммах на литр. Постоянная а
называется коэффициентом поглощения и зависит от длины волны и природы
поглощающего вещества. В спектре поглощения оптическая плотность изменя-
ется с изменением длины волны прямо пропорционально величине а(Ьис при
измерении постоянные). Произведение коэффициента поглощения и молеку-
лярной массы поглощающих частиц называют молярным коэффициентом по-
глощения £. Таким образом,
A = ebc (16.13)
если с выражена в молях на литр. Длина кюветы при измерениях в УФ- и видимой
областях часто равна 1 см; размерность £ — см-1 • моль-1 • л (£ = а • М), размер-
ность а — см-1 • г-1 - л. Коэффициент поглощения может иметь и другую размер-
А I В- С D L Е F G Н I
1 Сравнение оптической плотности и пропускания
2 т А
3 0,001 0,001 3,0000
4 0,010 0,010 2,0000 Оптическая плотность и пропускание
5 0,050 0,050 1,3010
6 0,100 0,100 1,0000 3,0
7 0,200 0,200 0,6990 2,' 2,( 1 '
_8 0,300 0,300 0,5229 ) _
9 0,400 0,400 0,3979 —Пропускание —— Оптическая плотность
10 0,500 0,500 0,3010
11 0,600 0,600 0,2218
12 0,700 0,700 0,1549 1,1 0 '
*
13 0,800 0,800 0,0969
14 15 0,900 0,900 0,0458 0.0
1,000 1,000 0,0000
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
16
17
18
19
20 Ячейка СЗ: А = -IgT = -LOG10(B3:
21 Копировать формулу вниз
22 Строить графики ВЗ:В15 от АЗ:А15 и СЗ.С15 от АЗ:А15
30
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Таблица 16.4
Спектрометрическая номенклатура
Рекомендовано Устаревшие названия и обозначения
Оптическая плотность А Коэффициент поглощения Оптическая длина пути b Длина волны в нм Экстинкция Коэффициент экстинкции, коэффициент погашения / или d в мц (миллимикрон)
ность (не только г - л-1); например, концентрация может быть выражена в млн1.
Но в публикациях рекомендуется использовать описанные выше размерности.
Закон Бера строго выполняется только для монохроматического излучения, так
как величина а зависит от длины волны.
В настоящем учебнике использованы символы и терминология, рекомендо-
ванные журналом Analytical Chemistry. В литературе, особенно более ранней,
встречаются и другие названия и обозначения (табл. 16.4), но их применение не-
желательно.*
Пример 16.1
Установлено, что образец, помещенный в кювету, толщиной в 1 см, пропускает
80% света определенной длины волны. Какова концентрация вещества, если ко-
эффициент поглощения вещества при этой длине волны равен 2,0?
Решение
Пропускание 80% означает, что Т= 0,80. Тогда:
1g —= 2,0 [л / (см • г)] • 1,0 [см] • с = 2,0 [см-1 • г-1 • л] • 1,0 [см] • с
0,80
1g 1,25 = 2,0 [л/г] • с = 2,0 [г-1 • л] • с
с = 22° = о,О5О [г/л]
2,0
Следует подчеркнуть, что по рекомендациям ИЮПАК вместо терминов «оптическая плотность» (optical
density) и «коэффициент поглощения» (extinction coefficient, absorbing index) следует использовать терми-
ны absorbance и absorptivity соответственно (от absorption — поглощение). Очевидно, что по чисто грам-
матическим причинам аналогичные термины в русском языке невозможны. — Прим, перев.
16.7. ВЫЧИСЛЕНИЯ В КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ
31
Пример 16.2
Установлено, что раствор, содержащий 1,00 мг железа (в виде тиоцианатного
комплекса) в 100 мл, пропускает 70,0% излучения по сравнению с соответству-
ющим эталоном, а) Рассчитайте оптическую плотность раствора при этой длине
волны, б) Какую долю излучения будет пропускать раствор железа, если его кон-
центрация увеличится в четыре раза?
Решение
а) Г =0,700
A = lg —^— = 1g 1,43 = 0,155
0,700
б) 0,155 = ab (0,0100 г/л)
ab = 15,5 л/г
Отсюда А = 15,5 л/г (4 • 0,0100 г/л) = 0,620
lg 1 = 0,620
7=0,240
Оптическую плотность нового раствора можно рассчитать и проще:
А{ _ abc{ _ с{
А2 abc2 с2
А2=А{ .£2- =0,155--=0,620
Ci 1
Пример 16.3
Амины RNH2 взаимодействуют с пикриновой кислотой с образованием пикра-
тов, которые дают интенсивную полосу поглощения при 359 нм (г = 1,25 • 104).
Неизвестный амин (0,1155 г) растворен в воде (объем раствора 100 мл). Для из-
мерений аликвоту 1 мл этого раствора разбавили до 250 мл. Рассчитайте молеку-
лярную массу амина, если молярный коэффициент поглощения этого конечного
раствора при 359 нм и толщине кюветы 1 см равен 0,454. Какой может быть его
формула?
Решение
А = гЬс
0,454 = 1,25 • 104 [л/(см • моль)] • 1,00 [см] • с
32
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
с = 3,63 • 1О-5 [моль/л]
3,63-10 5 [моль/л]-0,250 [л] ~
—--------------—— -------— • 100 [мл] = 9,08 • 10“^ [моль в исходной колбе]
1,00 [мл]
0,1155 [г] г / п
-----------—-----= 127,9 [г/моль]
9,08-10’14 [моль]
Молекулярная масса хлоранилина C1C6H4NH2 равна 127,6. Таким образом, воз-
можно, это был хлоранилин.
Пример 16.4
В образце в виде пикрата определяли содержание хлоранилина (как описано в
примере 16.3). Образец в количестве 0,0265 г обработали пикриновой кисло-
той, затем раствор разбавили до 1 л. В кювете толщиной в 1 см оптическая
плотность раствора оказалось равной 0,368. Найдите содержание хлоранилина
в образце (в %).
Решение
А = &Ьс
0,368 = 1,25 • 104 [л/(см • моль)] • 1,00 [см] • с
с = 2,94 • 10-5 [моль/л]
2,94 • 10-5 [моль/л] • 127,6 [г/моль] = 3,75 • 10-3 [г хлоранилина]
3,75-10~3 [г хлоранилина] 1()()% = 2%
2,65 • 10-2 [г образца]
Смеси поглощающих частиц
Рассмотрим методику проведения количественного анализа, если в растворе
присутствуют два вида поглощающих частиц с перекрывающимися спектрами.
Из закона Бера следует, что полная оптическая плотность А для данной длины
волны равна сумме оптических плотностей всех поглощающих частиц. Для час-
тиц двух видов, если с выражена вг • г1,
А = ахЬсх + ауЬсу
(16.14)
16.7. ВЫЧИСЛЕНИЯ В КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ
33
или, если с выражена в моль • л-1,
A = ^xbcx + s^Cy
(16.15)
Здесь нижние индексы относятся к веществам х и у соответственно.
В качестве примера определим концентрации двух веществ, хи у, чьи инди-
видуальные спектры при данной концентрации показаны сплошными линиями
на рис. 16.10. На этом же рисунке спектру смеси соответствует штриховая линия.
Поскольку имеются две неизвестные величины, нужно составить два уравнения,
которые следует решать одновременно и выполнить два измерения. Следует вы-
брать две длины волны для измерений: Xj (максимум поглощения вещества х) и
Х2 (максимум поглощения вещества у). Тогда можно записать:
А1 = Ах1 + Ау1 = Zxlbcx + Sylbcy
А2 = Ах2 + Ау2 = ex2bcx + еу2Ьсу
(16.16)
(16.17)
где A j и А2 — оптические плотности смеси при длинах волн 1 и 2 соответствен-
но; Ах1 и Ау[ — вклады в оптическую плотность при Xj веществ х и у соответст-
венно; Ах2 и Ау2 — их вклады при Х2. Аналогично, 8х1 и 8у1 — молярные
коэффициенты поглощения веществ* иу при Хр 8х2 и 8у2 — те же коэффициенты
при Х2. Молярные коэффициенты поглощения определяют с помощью измере-
ний для чистых растворов (известной молярной концентрации) веществ х иу при
РИС. 16.10
Спектры
поглощения чистых
веществ х и у
и их смеси (1 : 1)
Длина волны
34
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
длинах волн Xj и Х2. Таким образом, в уравнениях (16.16) и (16.17) остаются то-
лько две неизвестные величины — сх и с 9 которые можно найти, решая уравне-
ния одновременно.
Пример 16.5
Спектры дихромата калия и перманганата калия в 1 М H2SO4 перекрываются.
Максимум поглощения для К2Сг2О7 находится при 440 нм, полоса поглощения
КМпО4 — при 545 нм (максимум этой полосы приходится на 525 нм, но обычно
измерения проводят при большей длине волны, где вклад К2Сг2О7 меньше). Для
анализа смеси в кювете толщиной 1 см измеряли оптическую плотность при
двух длинах волн. Получили значения: A^q = 0,405, Л545 = 0,712. Зная значения
оптической плотности для чистых растворов К2Сг2О7 (1,00 • 10-3 М) и КМпО4
(2,00 • 10-4 М) в 1 М H2SO4 в той же кювете (АСт440 = 0,374, АСт>545 = 0,009, ^^440 =
= 0,019, ЛМп545 = 0,475), рассчитайте концентрации дихромата и перманганата
калия в растворе образца.
Решение
Точное значение величины b неизвестно, но оно постоянно, так как для анализа
использовалась одна и та же кювета. Из градуировочных измерений можно рас-
считать произведение гЬ = к и пользоваться им в расчетах.
0,374 = &Сг>440 • 1,00 • Ю-з *сг>44о = 374
0,009 = ^ 1,00 10-з &Сг>545 = 9
0,019 = ЛмП)440 • 2,00 • 10~* &Мп,440 = $5
0,475 = *Мп>545 • 2,00 • 1(Н £Мп>545 = 2,38 • 103
-^440 = ^Сг,44о[Сг20 7 ] + &Мп440[МпО4]
^545 = ^Сг,545[^Г2<-)7 ] + ^Mn,54s[MnO 4 ]
0,405 = 374[Сг2О^] + 95[МпО^]
0,712 = 9[Сг2О^] + 2,38 • Ю3[МпО;]
Решением этой системы уравнений является
[Сг2О?"] = 1,01 • 10-3 м, [МпО;] = 2,95 • 1(Н М
Обратите внимание, что для Сг при 545 нм, где его поглощение перекрывается с
основным пиком для Мп, оптическая плотность измеряется с одной значащей
цифрой, поскольку она слишком мала. Это очень хорошо. Чем меньше необхо-
димая поправка, тем лучше. В идеале она должна быть равна нулю.
16.7. ВЫЧИСЛЕНИЯ В КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ
35
Упражнение для вычислений с помощью электронных таблиц:
расчет состава смеси
Чтобы выполнить вычисления для этой задачи, воспользуемся программой Excel.
Обозначив две концентрации X и У, мы решим уравнения для У, а затем найдем
по соответствующей формуле X. Запишем:
Ax = kxXX+kyXY (1)
A2 = kx2X+ky2Y (2)
Из уравнения (1):
Х=(Ах-ку1У)/кхХ (3)
Подставим (3) в уравнение (2):
А2 = кх2(Ах-kylY)/kxl+ky2Y (4)
Преобразуем уравнение (4):
kx2(A{-kyiY)/kxi+ky2Y-A2 = 0 (5)
По уравнению (5) рассчитаем У с помощью электронной таблицы, которая вхо-
дит в компакт-диск, прилагаемый к учебнику (см. гл. 16).
Введите формулу (3) для автоматического расчетами сравните значенияX
и У, рассчитанные с помощью электронной таблицы, с результатами, получен-
ными в примере 16.5.
Электронную таблицу можно использовать для расчета состава любой
двухкомпонентной смеси, подставляя соответствующие значения А р А2, кх1, к 19
кх2 и ку2. (Прежде чем пользоваться таблицей с компакт-диска, убедитесь, что вы
скопировали ее на рабочий стол компьютера.)
Если две спектральные кривые перекрываются только при одном из значе-
ний длин волн, решение упрощается. Например, если спектр веществах не пере-
крывается со спектром вещества у при длине волны Х2, концентрацию у можно
рассчитать из одного измерения при этой же длине волны, как для индивидуаль-
ного вещества. Концентрацию вещества х можно затем вычислить по оптиче-
ской плотности при длине волны вычитая вклад вещества у в оптическую
плотность [т. е. по уравнению (16.16)]. Молярный коэффициент поглощения ве-
щества у, конечно, должен быть определен при Если спектры не перекрыва-
ются при рабочих длинах волн (обычно это максимумы поглощения), каждое
вещество можно определить обычным способом.
В проделанных выше расчетах мы предполагали, что закон Бера выполняет-
ся во всем диапазоне концентраций. Если концентрация одного вещества намно-
го больше, чем другого, его оптическая плотность может быть выше при обеих
длинах волн. В результате определение второго вещества будет не очень точ-
ным.
36
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
А В С I D Е F G н I
1 Использование электронных таблиц для решения системы уравнений относительно концентраций компонентов в двухкомпонентной смеси (пример 16.5)
2 А, = kx1X + k^Y А,= 0,405 374 kyi * 95
3 A2 = kx2X + ky2Y А2 = 0,712 Кс2 = 9 ky2 = 2,38Е+03
4 Используем Поиск решения для расчета Y (Ячейка С9). Затем по значению Y рассчитывается X
5 J
6 X = (Arky1Y)/kx1 = Ячейка С8 формула в С8 = ($D$2-$H$2*C9)/$F$2
7
8 Х = 0,001008
9 Y = 0,000295
10 Поиск решения: С9 = Изменяя ячейку
11
12 формула: -1,57Е-14 Поиск решения:
13 В12 = целевая ячейка
14 Установить значение 0
15 формула: kx2((A1-ky1Y)/kx1 + ky2Y - А2 = 0 (0 не вводится)
16 формула в В12 = $F$3*(($D$2-$H$2*C9)/$F$2)+$H$3*C9-$D$3
17 L
18 Мы использовали Поиск решения для расчета Y (ячейка С9). Значение подставляется в С8 для расчета X.
19 Можно сначала рассчитать X и использовать его значение для расчета Y.
20 Внимание: Нельзя вычесть формулу в ячейке АЗ из формулы в ячейке А2, приравнять результат
21 (А-! - А2) и использовать Поиск решения для изменения X и Y, чтобы получить ответ, так как
22 будет бесконечное число итераций.
23 »
24 Эту же таблицу можно использовать для других задач по смесям компонентов, заменяя значения,
25 веделенные полужирным шрифтом (А15 А2, кх1, ку1, кх2, ку2)
Современные цифровые приборы, которые регистрируют весь спектр рас-
твора, часто включают программы для расчета концентраций нескольких анали-
тов с перекрывающимися спектрами по значениям оптической плотности при
многих длинах волн (избыточные данные позволяют повысить надежность ре-
зультатов). Одновременно можно определять полдюжины и даже более компо-
нентов! — см. разд. 16.9 и рис. 16.24. (Информация о спектрометрах с матрицей
(линейкой) диодов приведена в разд. 16.10.)
Упражнение для вычислений с помощью электронных таблиц:
расчет неизвестной концентрации по градуировочному графику
Для определения содержания железа проводят измерение светопоглощения его
комплексного соединения с 1,10-фенантролином, поглощающего при 510 нм. Для
серии стандартных растворов получены следующие значения оптической плотно-
16.7. ВЫЧИСЛЕНИЯ В КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ
37
сти: 0,100 млн-1 — 0,081; 0,200 млн-1 — 0,171; 0,500 млн-1 — 0,432; 1,0 млнг1 —
0,857. Оптическая плотность раствора исследуемого образца составила 0,463.
Составьте электронную таблицу для построения градуировочной кривой и рас-
считайте концентрацию раствора образца.
Построенная с помощью линейного метода наименьших квадратов прямая
имеет тангенс угла наклона, равный 0,861, а отсекаемый осью ординат отрезок
равен -0,002 (используйте Параметры (Option) в подменю Диаграмма (Chart)
=> Добавить параметры линии (Add Trendline), выделяя диаграмму или ли-
нию). Следовательно, в соответствии с формулой, приведенной ниже в электрон-
ной таблице, определяемая концентрация равна (0,463 - 0,002)/0,861= 0,540 млнг1.
Выполним тот же расчет без построения градуировочной кривой и с учетом
стандартного отклонения для концентрации раствора образца.
2
3_
4-
5^
£
_8
9
Конц., млн-1
________0,100
________0,200
________0,500
1,000
Образец
у = mx + b
х = (у - Ь)/т
Оптическая плотность
0,081
0,171
0,432
0,857
0,463
10 Ячейка В12 : = х = (В6+0,0022)70,8609
12
13
14
Образец =
0,540365
А
В
С
Стандартное отклонение значения концентрации образца
Введем некоторые новые статистические функции, которые позволят рассчиты-
вать стандартное отклонение (Sc) для неизвестной концентрации, определяемой
по градуировочной кривой. Эти функции основаны на использовании следую-
щих характеристик: число измерений (7V), тангенс угла наклона (т) градуиро-
вочной кривой, средняя оптическую плотность (yave), сумма квадратов
отклонений (Sxx) отдельных концентраций (xz) от среднего значения х (xave) и
стандартное отклонение относительно уравнения регрессии (Sr). Прежде все-
го, из разд. 3.20 вспомним использование статистических функций из Excel
ДИНЕИН, а затем обратимся к некоторым новым статистическим функциям для
выполнения расчета (см. разд. 3.8).
38
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Определим следующие понятия:
N— число измерений (используем СЧЁТ для расчета)
М— число параллельных опытов, или повторных анализов неизвестной
величины (М = 1, параллельные опыты не проводятся)
Tave — среднее значение у для N градуировочных данных (используем
СРЗНАЧ для расчета)
— сумма квадратов отклонений от среднего значения xave
= S(xz - xave)2 (используем N*ДИСПРА для расчета) (16.18)
S — сумма квадратов отклонений от значения yave
Syy = Е( - yave)2 (используем N*ДИСПРА для расчета) (16.19)
Sr — стандартное отклонение относительно уравнения регрессии = стан-
дартная погрешность оценки = стандартная погрешность определе-
ния у (ДИНЕИН рассчитывала эту величину для градуировочной
кривой на рис. 3.10):
-т^
Sr = J —-— (используем CTOIIIYX для расчета) (16.20)
Нам нужно рассчитать стандартное отклонение для концентрации, получаемой
по градуировочной кривой:
g _ ___р 1_р Ус У&VQ
mVM N m2Srr
(16.21)
Как говорилось выше, значения Sr и Sxx можно рассчитать с помощью статисти-
ческих функций программы Excel (не нужно рассчитывать S для определения
Sr, так как программа делает это за нас). Для выполнения расчетов составляется
таблица (табл. см. на след. стр.).
Стандартное отклонение для неизвестной концентрации Sc равно 0,0051;
концентрация железа составляет 0,5403 млн-1; таким образом, можно записать
0,540 ±0,005 млн-1.
Количественные измерения по ИК-спектрам
Инфракрасные спектрометры обычно регистрируют пропускание в % как функ-
цию длины волны. Присутствие рассеянного излучения, особенно при более вы-
соких концентрациях, затрудняет применение закона Бера. Кроме того, из-за
весьма слабой интенсивности источников излучения необходимо использовать
относительно широкие щели (что также приводит к отклонениям от закона Бера,
см. ниже). Таким образом, в количественном анализе методом ИК-спектромет-
рии прибегают к эмпирическим подходам, соблюдая постоянство условий экс-
16.7. ВЫЧИСЛЕНИЯ В КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ
39
А В С D Е
1 Конц., млн-1 Оптическая плотность
2 0,100 0,081 N: 4
3 0,200 0,171 М: 1
4 0,500 0,432 т: 0,860918
5 1,000 0,857 Vave- 0,38525
6 Образец (ус) 0,463 $хх: 0,49
7 Sr: 0,003629
8 Ячейка Е2 = N = СЧЁТ(В2:В5) SC= 0,0051
9 Ячейка ЕЗ = М = число параллельных измерений = 1
10 Ячейка Е4 = тангенс угла наклона = m = НАКЛОН(В2:В5,А2:А5)
11 Ячейка Е5 = yave = СРЗНАЧ(В2:В5)
12 Ячейка £6 = 8^ = М*ДИСПРА(А2:А5) = Е2*ДИСПРА(А2:А5)
13 Ячейка Е7 = S,. = СТОШУХ(В2:В5,А2:А5)
14 Ячейка Е8 = Sc = S/m((1/M + 1/N + .
15 = Е7/Е4*((1/ЕЗ+1/Е2+(В6-Е5)/(Е4л2*Е6))л0,5)
16
17 Ячейка B18 = b = OTPE3OK(B2:B5,A2:A5)
18 = >0,0021633
19 Ячейка B20: Образец = x = (yc-b)/m = (В6-В18)/Е4
20 = 0,54031054
21 Образец = 0,540+/-0,005 млн*1
перимента. Часто используют метод базовой
линии (метод отношений), который проил-
люстрирован на рис. 16.11. Сначала выбира-
ют пик, который расположен не слишком
близко к другим пикам спектра. В основании
полосы проводят прямую линию и измеряют
величины Р и Ро. (По отношению к обычно-
му спектру поглощения кривая имеет пере-
вернутый вид, потому что регистрируется
пропускание в зависимости от длины волны.)
Затем строят график зависимости 1g {PJP) от
концентрации. Найденные значения для не-
известных концентраций сравнивают с дан-
ными для стандартных образцов, получен-
ными в тех же экспериментальных условиях.
Этот метод минимизирует относительные по-
грешности, пропорциональные размеру об-
разца, но не устраняет аддитивные погреш-
ности, связанные, например, с дрейфом базо-
вой линии.
РИС. 16.11
Метод базовой линии для количе-
ственных измерений в ИК-диапа-
зоне
40
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Рис. 16.12. Блок-схема спектрометра
16.8. Оборудование для проведения спектрометрических
исследований
Спектрометр или спектрофотометр — это прибор, который позволяет разло-
жить полихроматическое излучение в спектр по длинам волн. Блок-схема спек-
трометра показана на рис. 16.12. Все спектрометры включают:
1) источник непрерывного излучения в интересующем диапазоне длин волн;
2) монохроматор для выделения узкого интервала длин волн из спектра ис-
точника;
3) кювету для образца;
4) детектор (приемник) для превращения энергии излучения в электриче-
скую энергию;
5) устройство для регистрации отклика детектора.
Образец может устанавливаться до или после монохроматора. Устройство всех
частей спектрометра (кроме регистрирующего устройства) определяется дли-
ной волн рабочего диапазона.
Источники
Источник должен иметь достаточно высокую мощность излучения во всем рабо-
чем диапазоне длин волн, однако эта характеристика ни у одного источника не
постоянна. В видимой области чаще всего используют лампу накаливания с во-
льфрамовой нитью. Зависимость спектральной мощности такой лампы от дли-
ны волны показана на рис. 16.13. Ее рабочий диапазон составляет от ~325 или
350 нм до 3 мкм, что обуславливает применение данной лампы в ближних ИК- и
УФ-областях. Максимум излучения лампы накаливания можно сдвинуть в сто-
рону более коротких длин волн, увеличивая напряжение и, следовательно, тем-
пературу нити, но при этом сокращается срок службы лампы. Поэтому для
питания лампы нужен стабильный регулируемый источник напряжения. Это же
относится к источникам излучения и в других областях спектра. Иногда в каче-
стве источника напряжения используют аккумуляторную батарею с напряжени-
ем 6 В.
16.8. ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПРОВВДЕНИЯ СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ИССЛВДОВАНИЙ
41
Рис. 16.13
Зависимость интенсивности
излучения от длины волны для
обычной вольфрамовой лампы
накаливания (3000 К)
Длина волны, нм
В УФ-области в качестве источников излучения обычно используют водо-
родные или дейтериевые газоразрядные лампы. С ними можно работать в диа-
пазоне от 185 до -375 нм, причем дейтериевая лампа втрое превосходит по
мощности водородную. Выходные окошки делают из кварца, так как стекло не-
прозрачно для ультрафиолета. Часто применяют водяное охлаждение для отво-
да генерируемого тепла.
Рабочие диапазоны распространенных источников в видимой и УФ-областях:
• импульсная ксеноновая дуга: 180-2500 нм
• дейтериевая лампа постоянного тока: 185-2500 нм
• дуга постоянного тока: 200-2500 нм
• галогеновая лампа из кварцевого стекла с вольфрамовой нитью: 220-2200 нм
Инфракрасное излучение — это, по сути, тепловое излучение, поэтому в
качестве источников используют раскаленную проволоку, лампы накаливания,
раскаленные керамические стержни. Максимум распределения энергии излуче-
ния абсолютно черного тела приходится на диапазон от 100 до 2000 нм (ближняя
ИК-область), а «хвост» тянется в среднюю ИК-область. Инфракрасные спектро-
метры обычно работают в диапазоне от 2 до 15 мкм. Поскольку в этой области
интенсивность излучения невелика, приходится использовать относительно ши-
рокие щели для увеличения интенсивности проходящего излучения. Но это при-
водит к уменьшению разрешающей способности. По этой причине предпочтение
отдается интерферометрам с повешенной светосилой (обсуждение ИК-фурье-
спектрометров см. в разд. 16.11). Типичный источник ИК-излучения — штифт
Нернста. Это стержень, состоящий из смеси оксидов редкоземельных элемен-
тов. Он имеет отрицательный температурный коэффициент сопротивления и
при комнатной температуре является изолятором. Таким образом, для возбуждения
излучения его нужно нагреть, однако в рабочем состоянии он становится проводя-
щим и дает максимум излучения около 1,4 мкм (7100 cnt1) (при 1500-2000 °C).
Другой источник ИК-излучения — глобар. Это стержень из спеченного карбида
42
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
кремния, который нагревают до температуры 1300-1700 °C. Максимум его из-
лучения приходится на -1,9 мкм (5200 см"1), при работе его необходимо охлаж-
дать водой. Глобар — менее интенсивный источник, чем штифт Нернста, но он
больше подходит для диапазона длин волн более 15 мкм, вследствие не такого
быстрого снижения интенсивности его излучения с увеличением длины волны.
Источники ИК-излучения не защищают от влияния атмосферных условий, так
как для этих целей нет подходящего материала.
В методе флуоресцентной спектрометрии интенсивность флуоресценции
пропорциональна интенсивности источника излучения (см. разд. 16.15). Для
возбуждения флуоресценции используют различные непрерывные источники
УФ-излучения (см. ниже). Но особенное значение приобрели лазеры, так как эти
источники монохроматического излучения могут иметь высокую относитель-
ную интенсивность. В табл. 16.5 перечислены рабочие длины волн и мощности
некоторых типов лазеров. Для возбуждения флуоресценции пригодны только те,
чья рабочая частота находится в УФ-области. Азотный лазер (337,1 нм), кото-
рый может работать только в импульсном, а не в непрерывном режиме, удобен
для накачки лазеров на красителях с перестраиваемой частотой. Лазеры на кра-
сителях содержат растворы органических соединений, которые флуоресцируют
в УФ, видимой или ИК-области. Обычно их можно перестраивать в интервале
длин волн 20-50 нм. Перестраиваемые лазеры также очень удобны в качестве
источников излучения в абсорбционной спектрометрии, так как они обеспечива-
ют хорошее разрешение (-1 нм) и высокую светосилу, хотя они менее стабильны,
чем непрерывные источники излучения. Перестраиваемые лазеры охватывают
диапазон от 265 до 800 нм, причем для этого необходимо несколько красителей.
Ниже мы увидим, как оборудование для проведения спектрометрических
исследований приспосабливают для того, чтобы учитывать изменения интенсив-
ности источника и чувствительности детектора в зависимости от длины волны.
Монохроматоры
Монохроматор состоит из линз или зеркал для фокусировки излучения, входной
и выходной щелей для ограничения нежелательного излучения и контроля за
спектральной чистотой излучения, испускаемого монохроматором, и дисперги-
рующего элемента для разложения в спектр полихроматического излучения ис-
точника. Диспергирующим элементом может быть призма или дифракционная
решетка. Используют также различные оптические фильтры для выделения из-
лучения с определенной длиной волны.
1. Призмы. Когда электромагнитное излучение проходит через призму, его
лучи преломляются, потому что показатели преломления материала призмы и
воздуха различаются. Показатель преломления зависит от длины волны; следо-
вательно, от нее зависит и степень преломления. Более короткие волны прелом-
ляются сильнее, чем более длинные. В результате полихроматическое (белое)
излучение «раскладывается» в спектр по длинам волн (рис. 16.14). Поворотом
призмы можно направлять излучение с определенной длиной волны на выходную
16.8. ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПРОВВДЕНИЯ СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ИССЛВДОВАНИЙ
43
Таблица 16.5
Характеристики наиболее распространенных лазеров
Тип лазера Длина волны, нм Мощность, Вт
На ионных кристаллах рубин а) Nd:YAGa)>6) Газовые He-Ne He-Cd 694,3 1-10 МВт 1064,0 25 МВт (8-9 нс) 632,8 0,001-0,05 441,6 0,05 325,0 0,01
Аг+ 514,5 7,5 496,6 2,5 488,0 6,0 476,5 2,5 465,8 7,0 457,9 1,3 333,6-363,8 (4 линии) 3,0
Кг+ 752,5 1,2 647,1 3,5 530,9 1,5 482,5 0,4 468,0 0,5 413,1 1,8 406,7 0,9 337,5-356,4 (3 линии) 2,0
Азота) 337,1 200 кВт
а) Действуют в импульсном режиме; приведены значения пиковой мощности (в скобках указана длина импульса)
® Иттрий-алюминиевый гранат, активированный неодимом. — Прим, перев.
[G. D. Christian, J. Е. O’Reilly, Instrumental Analysis, 2nd ed. Boston: Allyn and Bacon, Inc., 1986]. С разрешения
Allyn and Bacon, Inc.
Белый свет / Красный (более длинные волны)
Z-----------------А Синий (более короткие волны)
РИС. 16.14. Дисперсия (разложение в спектр) полихроматического света призмой
44
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
щель, чтобы оно проходило через образец. Призмы удовлетворительно работа-
ют в УФ- и видимой областях и могут быть использованы в ИК-области. Однако
из-за нелинейной дисперсии они более эффективны в области коротких волн.
Призмы хорошо диспергируют коротковолновое излучение и плохо — длинно-
волновое (ИК) излучение. В видимой области можно применять стеклянные
призмы и линзы, а для УФ-области они должны быть сделаны из кварца или
кварцевого стекла (эти материалы годятся и для видимой области).
В ИК-области стекло (в том числе и кварцевое) пропускает излучение пло-
хо, поэтому призмы и другие оптические детали изготавливают из крупных кри-
сталлов галогенидов щелочных или щелочноземельных металлов, прозрачных
для ИК-излучения. Наиболее широко применяется хлорид натрия, который под-
ходит для диапазона длин волн от 2,5 до 15,4 мкм (от 4000 до 650 см"1). Для бо-
лее длинных волн используют КВг (от 10 до 25 мкм) или CsI (от 10 до 38 мкм).
Детали из галогенидов металлов (и весь монохроматор в целом) необходимо за-
щищать от влаги.
2. Дифракционные решетки. Дифракционная решетка состоит из большого
числа параллельных штрихов (углублений), нанесенных на тщательно отполи-
рованную поверхность (например, из алюминия). Для УФ- и видимой областей
число штрихов должно составлять 15000-30000 на дюйм, а для ИК-области —
1500-2500 на дюйм. Штрихи служат центрами рассеяния для лучей, падающих
на решетку. В результате в спектре одного порядка получается равномерное
смещение по длинам волн, т. е. наблюдается линейная дисперсия (рис. 16.15).
Разрешающая способность решетки зависит от количества штрихов; обычно
разрешающая способность дифракционных решеток выше, чем призм. Кроме
Рис. 16.15
Дифракция излучения
на дифракционной решетке
16.8. ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПРОВВДЕНИЯ СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ИССЛВДОВАНИЙ
45
того, решетки можно использовать во всех спектральных диапазонах. Особенно
удобны они для ИК-области, так как одинаково эффективны и для длинных
волн. Изготавливать дифракционные решетки трудно, поэтому оригиналы
очень дороги. Однако с оригинальной решетки можно сделать много реплик
(копий). Для этого исходную решетку покрывают пленкой из эпоксидной смо-
лы, которую отделяют после затвердевания, и получают копию. Для улучшения
отражающей способности копии ее поверхность алюминируют. Такие копии на-
много дешевле и используются в небольших недорогих приборах.
Пучок исходного излучения падает на поверхность дифракционной решетки
под углом z к ее нормали (см. рис. 16.15) и отражается под углом 0 с другой сторо-
ны нормали. Расстояние между штрихами обозначим d. Разность хода для двух
лучей, падающих под углом z, равна d sin z, а для двух отраженных лучей — d sin 0.
Разность хода для падающих и отраженных лучей составляет (J sin z - d sin 0).
Если эта разность хода равна целому числу длин волн, то в результате интерфе-
ренции возникает яркое изображение. Соответствующее уравнение таково:
nk = d (sin z - sin 0)
(16.22)
где n — порядок спектра (целое число). Очевидно, что, если п возрастает, а дли-
на волны во столько же раз уменьшается, эти короткие волны будут отражаться
под тем же углом 0. Их следует отфильтровывать до того, как они достигнут де-
тектора (см. ниже). Для разложения в спектр полихроматического излучения
дифракционную решетку поворачивают, чтобы изменялся угол z.
Дисперсия решетки при заданной величине угла г задается уравнением
dQ _ п
dk dcos 0
(16.23)
т. е. она равна порядку спектра, деленному на произведение постоянной решет-
ки и косинуса угла отражения. Разрешающая способность решетки — это произ-
ведение числа штрихов на порядок. Таким образом, разрешающая способность
больших решеток выше, чем маленьких.
Интенсивность излучения, отраженного дифракционной решеткой, зависит
от длины волны, причем длина волны максимума интенсивности определяется
углом, под которым излучение отражается от поверхности штриха решетки.
Следовательно, штрихи решетки должны быть нанесены под определенным уг-
лом для конкретного диапазона длин волн; и решетка, изготовленная для голубого
видимого света, будет неэффективна в ИК-спектрометре. Как уже упоминалось,
дифракционная решетка также порождает излучение с длинами волн, кратными
по отношению к исходному излучению (см. рис. 16.15). Это излучение образует
спектры высших порядков (второго, третьего и т. д.). Таким образом, дифрак-
ционная решетка порождает основной спектр первого порядка и дополнительно
спектры второго, третьего и т. д. порядков, причем спектры более высоких по-
рядков характеризуются большей дисперсией и лучшим разрешением. Из-за су-
ществования спектров высших порядков излучение с более короткими волнами,
не входящее в изучаемую область спектра, должно отсекаться с помощью филь-
46
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
тров; в противном случае его спектры высших порядков перекроют интересую-
щую область длин волн. Для этого используют фильтры разных типов (см.
ниже), которые пропускают излучение с длиной волны, превышающей некото-
рое определенное значение. Так, при измерении флуоресцентного излучения,
испускаемого образцом в диапазоне 400-700 нм, излучение источника, скажем,
при 325 нм даст максимум второго порядка при 650 нм, который перекроется со
спектром флуоресцентного излучения первого порядка. В такой ситуации
фильтр следует разместить между излучающим образцом и дифракционной ре-
шеткой, чтобы отсечь излучение с длиной волны < 400 нм; таким образом, излу-
чение с X = 325 нм не достигнет дифракционной решетки. (См. также разд. 16.9
об однолучевых спектрометрах.)
При работе со штриховыми дифракционными решетками существуют
проблемы с так называемыми «призраками» дифракционной решетки — лож-
ными линиями, возникающими из-за нарушения строгой эквидистантности в
расположении штрихов у нарезных дифракционных решеток (подобные нару-
шения обусловлены самой технологией изготовления решетки, так как резец пе-
редвигается от штриха к штриху с помощью прецизионных винтов). «Призраки»
особенно мешают, если используются интенсивные источники излучения (на-
пример, для флуоресцентной спектрометрии, см. ниже). Эти ложные линии су-
щественно слабее у голографических решеток. Для их изготовления слой
фоторезиста на соответствующей подложке подвергают воздействию интерферен-
ционной картины от двух пучков монохроматического (когерентного) лазерного
излучения; после соответствующей обработки экспонированного фоторезистного
слоя образуются углубления, на последнем этапе наносится отражающее покры-
тие. Такие решетки обладают более гладким профилем, в результате чего рассе-
яние излучения уменьшается. Голографические решетки можно изготавливать и
на вогнутых поверхностях; такие решетки выполняют роль как диспергирую-
щей, так и фокусирующей системы; при этом становятся ненужными зеркала и
линзы, которые ослабляют интенсивность излучения. Хотя голографические ре-
шетки дороже нарезных, в современных спектрометрах обычно используются
именно они, особенно для анализа излучающих образцов (флуоресцентный ана-
лиз). В целом, в большинстве современных приборов дифракционные решетки
заменили призмы.
3. Оптические фильтры. Для выделения излучения с определенными длинами
волн используют оптические фильтры разных типов: узкополосные фильтры,
фильтры с крутым срезом и интерференционные фильтры. Фильтры двух пер-
вых типов обычно делают из стекла; они содержат красители, которые поглоща-
ют все нежелательное излучение. Фильтры с крутым срезом поглощают все
излучение до определенной длины волны и пропускают более длинноволновое
излучение.
Интерференционные фильтры состоят из двух слоев стекла, внутренние по-
верхности которых покрыты тонкой полупрозрачной металлической пленкой, и
промежуточного слоя прозрачного материала типа кварца или флюорита. Излу-
чение, падающее на фильтр, подвергается интерференции, в результате чего че-
16.8. ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПРОВВДЕНИЯ СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ИССЛВДОВАНИЙ
47
рез фильтр проходит только излучение с очень узком интервалом длин волн.
Ширина полосы пропускания фильтра уменьшается, если интенсивность прохо-
дящего излучения увеличивается.
Кюветы для образцов
Кювета для образца (образцом обычно является раствор), естественно, должна
быть прозрачна в исследуемом диапазоне длин волн. Для изготовления кювет
используют те же материалы, что и для оптических деталей.
Кюветы для спектрометров, работающих в видимой и УФ-областях, обычно
имеют толщину {внутреннее расстояние между параллельными стенками) 1 см,
хотя могут применяться кюветы разной толщины и разного объема (рис. 16.16).
Для ИК-спектрометров используют кюветы различных типов. Наиболее распро-
странены кюветы с окошками из NaCl и фиксированной толщиной. Разумеется,
растворитель не должен взаимодействовать с NaCl. Такие кюветы нужно защи-
щать от атмосферной влаги (хранить в эксикаторе) и от растворителей, содержа-
щих воду. Окошки этих кювет требуют периодической полировки для удаления
потускнения, возникающего под действием влаги. Для влажных образцов и во-
дных растворов удобны окошки из хлорида серебра, которые, однако, мягкие и
постепенно темнеют под действием видимого света.
Область изучения Материал для изготовления кюветы Рекомендуемая длина оптического пути
УФ кварц 0,1-1 см
Видимая область стекло, кварц 0,1-1 см
ИК кристаллы солей
800-1100 нм 5-10 см
(ближняя)
1100-3000 нм 0,1-2 см
В табл. 16.6 приведены свойства ряда материалов, прозрачных в ИК-облас-
ти. В ИК-спектрометрии используют тонкие кюветы; при этом трудно сохранять
постоянство длины хода лучей через образец, особенно при необходимости пе-
риодической полировки окошек. Поэтому количественный анализ в этой области
РИС. 16.16
Типичные кюветы для УФ- и видимого
диапазонов
48
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Таблица 16.6
Характеристики материалов, прозрачных в ИК-области
Материал Рабочий диапазон, см 1 Характеристики
NaCl 40000-625 Гигроскопичен, растворим в воде, дешев, наиболее распространенный материал
КС1 40000-500 Гигроскопичен, растворим в воде
КВг 40000-400 Гигроскопичен, растворим в воде, немного дороже, чем NaCl, и более гигроскопичен
CsBr 40000-250 Гигроскопичен, растворим в воде
CsI 40000-200 Очень гигроскопичен, растворим в воде, удобен для исследований, проводимых в области длинных волн (малых волновых чисел)
LiF 83333-1425 Слегка растворим в воде, удобен для исследований, проводимых в УФ-диапазоне
CaF2 77000-1110 Нерастворим в воде, устойчив к большинству кислот и щелочей
BaF2 67000-870 Нерастворим в воде, хрупок, растворим в кислотах и NH4C1
AgCl 10000-400 Нерастворим в воде, вызывает коррозию металлов, темнеет под действием коротковолнового видимого излучения (хранят в темноте)
AgBr 22000-333 Нерастворим в воде, вызывает коррозию металлов, темнеет под действием коротковолнового видимого излучения (хранят в темноте)
KRS-5a) 16600-285 Нерастворим в воде, высокотоксичен, растворим в основаниях, мягок, удобен для метода нарушенного полного внутреннего отражения
ZnS 50000-760 Нерастворим в воде, обычных кислотах и щелочах, хрупок
ZnSe 20000-500 Нерастворим в воде, обычных кислотах и щелочах, хрупок
Ge 5000-560 Хрупок, имеет высокий показатель преломления
Si 83333-1430 400-30 Нерастворим в большинстве кислот и оснований
УФ-кварц 56800-3700 Устойчив к воде и большинству растворителей
ИК-кварц 40000-3000 Устойчив к воде и большинству растворителей
Полиэтилен 625-10 Дешевый материал для работы в дальней ИК-области
а) KRS-5 — бромид-иодид таллия Т1[Вг,1]. — Прим, перев.
Публикуется с разрешения [McCarthy Scientific Со. Catalogue 489] в адаптированном виде.
16.8. ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПРОВВДЕНИЯ СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
49
не очень надежен, но применение внутренних стандартов позволяет решить эту
проблему. Длину хода лучей для пустой кюветы можно измерить по интерфе-
ренционной картине. Существуют также кюветы с изменяемой длиной хода лу-
чей, толщина которых варьируется от 0,002 до 3 мм.
Если образец представляет собой жидкость, его обычно анализируют в
ИК-области без разбавления. Так часто бывает в тех случаях, когда химик-орга-
ник пытается идентифицировать неизвестное вещество или установить молеку-
лярную структуру нового соединения. Для этих целей толщина кюветы должна
быть небольшой, чтобы поглощение было оптимальным (обычно 0,01-0,05 мм).
Если приходится готовить раствор образца, обычно используют очень высокие
концентрации, так как ни один растворитель не прозрачен полностью в ИК-об-
ласти. И в этом случае нужны тонкие кюветы: 0,1 мм или менее.
Твердые вещества часто недостаточно растворимы в подходящих для
ИК-области растворителях, тогда как необходимы растворы высокой концент-
рации. В таких случаях вещество можно истолочь в порошок и исследовать в
виде суспензии или пасты (тонкодисперсная структура в вязких жидкостях).
В ИК-области показатель преломления практически не зависит от длины волны,
а рассеяние излучения меньше, чем в видимой области. Образец обычно расти-
рают в нуйоле (минеральном масле) — см. рис. 16.4. Вместо нуйола, который не
позволяет идентифицировать С—Н-связи, можно использовать хлорфторугле-
роды. Применение паст удобно для качественного анализа, но малоприменимо
для количественного анализа из-за трудности получения воспроизводимых ре-
зультатов. Твердые образцы можно также растирать с КВг (прозрачен в ИК-об-
ласти), спрессовывать в таблетку и поместить на держатель для измерений.
Газы тоже можно исследовать в ИК-области. Для этого обычно используют
длинные кюветы (до 10 см), в специальных исследованиях — длиной до 20 м.
Некоторые типичные кюветы показаны на рис. 16.17.
Рис. 16.17
Типичные кюветы для
ИК-диапазона:
а — с фиксированной
оптической длиной пути
(с разрешения Barnes
Engineering Со.);
6 — с переменной
оптической длиной пути.
С разрешения Wilks
Scientific Corporation
50
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Детекторы
Детекторы в УФ- и видимой областях. Выбор детектора, естественно, опреде-
ляется длиной волны регистрируемого излучения. В УФ- и видимой областях
обычно используют фотоэлементы. Фотоэлемент состоит из излучающего ка-
тода и анода. Между ними подается высокое напряжение. Когда фотон попадает
в окошко элемента и достигает катода, последний испускает электрон, который
притягивается к аноду. В результате возникает электрический ток, который
можно усилить и измерить. Отклик материала катода зависит от длины волны,
поэтому для разных участков спектра необходимы разные фотоэлементы. На-
пример, один может быть использован для голубого и УФ-излучения, а дру-
гой — для красного.
Фотоэлектронные умножители (фотоумножители ФЭУ) более чувст-
вительны к излучению в УФ- и видимой областях, чем фотоэлементы. ФЭУ со-
стоит из фотоизлучающего катода, на который падает фотон, и ряда
электродов (динодов), положительный потенциал которых при переходе к
каждому последующему (от 50 до 90 В) все более увеличивается. Когда фотон
попадает на фотоизлучающую поверхность, он выбивает первичный электрон
(это явление названо фотоэффектом; в 1921 г. Альберту Эйнштейну присужде-
на Нобелевская премия по физике именно за это открытие, совершенное им в
1905 г., а не за специальную теорию относительности, которую он также разра-
ботал в 1905 г. —CM.www.lucidcafe.com/lucidcafe/library/96mar/einstein.html).
Первичный электрон, вылетевший из катода, ускоряется по пути к первому ди-
ноду. Удар этого электрона о динод вызывает испускание многих вторичных
электронов, которые, в свою очередь, ускоряются при движении к следующему
диноду. Там каждый вторичный электрон выбивает другие электроны и т. д. (мо-
жет быть до 10 стадий усиления). В конечном итоге электроны собираются на ано-
де. Выходной сигнал ФЭУ может быть дополнительно усилен.
Различные ФЭУ различаются по чувствительности в разных диапазонах
длин волн. На рис. 16.18 показаны зависимости чувствительности нескольких
типичных ФЭУ с разными излучающими поверхностями от длины волны. Попу-
лярность ФЭУ 1Р28 (поверхность S-5) обусловлена его универсальностью, по-
скольку он может работать как в УФ-, так и в видимой областях. ФЭУ 7102
(поверхность S-1) подходит для красной области. Поскольку чувствительность
ФЭУ достаточно высока, можно использовать более узкие щели (меньшую ин-
тенсивность излучения), что позволяет достичь лучшего разрешения.
Были созданы ФЭУ, чувствительные только в УФ-диапазоне (от 160 до
320 нм) — так называемые ФЭУ с солнечной блендой. Они помогают снизить
помехи от видимого света и удобны в качестве УФ-детекторов в недиспергиру-
ющих системах.
В спектрометрах, которые регистрируют одновременно весь спектр (см.
разд. 16.10), в качестве детекторов используют матрицы (линейки) фотодиодов.
Линейка фотодиодов — это сотни фотодиодов, расположенных рядом друг с
другом на одном монокристалле кремния (чипе). С каждым связано конденса-
торное запоминающее устройство, которое собирает и интегрирует фототок, гене-
16.8. ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПРОВВДЕНИЯ СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ИССЛВДОВАНИЙ
51
Рис. 16.18
Кривые спектральной
чувствительности для
некоторых ФЭУ.
S-5 — RCA 1Р28;
S-4 —RCA 1Р21;
S-1—RCA7102
[G. D. Christian, J. Е. O’Reilly,
Instrumental Analysis, 2nd ed.
Boston: Allyn and Bacon, Inc.,
1986]. С разрешения Allyn
and Bacon, Inc.
рируемый при ударе фотона о фотодиод. Информация считывается посредством
периодической разрядки, которая занимает от 5 до 100 мс. Если излучение, «раз-
вернутое» по длинам волн, падает на поверхность линейки диодов, можно зареги-
стрировать весь спектр. Внешний вид фотодиодных линеек, длиной в несколько
сантиметров, показан на рис. 16.19. Кремниевая линейка диодов обладает чувст-
Рис. 16.19 . Внешний вид линеек диодов из 1024 элементов. С разрешения Hamatsu Photonics, К. К.
52
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Рис. 16.20
Типичная кривая
спектральной
чувствительности,
полученная с помощью
линейки диодов
[М. Kendall-Tobias,
Am. Lab., March, 1989,
р. 102]. С разрешения
International Scientific
Communications, Inc.
Длина волны, нм
вительностью в области от -180 до 1100 нм (от УФ- до ближней ИК-области)
(рис. 16.20). Этот диапазон шире, чем для ФЭУ, и квантовый выход выше.
Устройство спектрометров с линейкой фотодиодов описано в разд. 16.10.
Еще один тип матричного детектора—приемник с зарядовой связью (ПЗС).
Двумерные матрицы ПЗС применяются в цифровых камерах.
В недорогих спектральных приборах часто используются дешевые кремни-
евые диоды или фотоэлементы. Они состоят из кремниевого кристалла, допиро-
ванного определенным элементом; попадание фотона вызывает электрический
импульс (ток), который затем усиливают. Изготавливают и диоды, чувствитель-
ные к определенному цвету излучения.
Спектрометры, в которых детекторами служат фотоэлементы или ФЭУ
(или линейки диодов), называют спектрофотометрами, а соответствующие из-
мерения — спектрофотометрией. Более строго, по определению журнала Analyti-
cal Chemistry, спектрофотометр — это спектрометр, который измеряет отношение
мощностей двух лучей, т. е. Р/Р& и поэтому может непосредственно регистриро-
вать оптическую плотность. Мощности двух лучей могут измеряться как одно-
временно, так и по отдельности (см. ниже о двухлучевых и однолучевых
приборах). На практике приборы с фотоэлементами или ФЭУ почти всегда испо-
льзуются именно для измерения отношения мощностей. Исключение составляет
ситуация, когда необходимо измерить спектр и интенсивность излучения излу-
чающего образца (см. ниже о флуоресцентной спектрометрии). Если вместо мо-
нохроматора (с призмой или решеткой) в приборе стоит узкополосный
оптический фильтр, прибор может называться фотометром.
ИК-детекторы. Детекторы, пригодные для УФ- и видимой областей, не работа-
ют в ИК-диапазоне. Однако инфракрасное излучение — это тепловое излуче-
ние, поэтому можно использовать детекторы, которые преобразуют теплоту в
электрический сигнал, например, термопары (термоэлементы) и болометры.
Термопара состоит из двух разных металлических проволок (например, из
сурьмы и висмута), соединенных в двух точках. Когда между этими точками су-
16.8. ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ПРОВВДЕНИЯ СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИХ ИССЛВДОВАНИЙ
53
ществует разность температур, возникает разность потенциалов, которую мож-
но измерить. Одна из точек соединения помещается на пути излучения от
монохроматора. Термоэлектрическая батарея может содержать до шести тер-
мопар в ряд, смонтированных в вакууме, чтобы минимизировать потери тепла за
счет теплопроводности. Половина из них служат датчиками, а другая половина
соединена с основой. Термобатареи характеризуются временем отклика ~30 мс.
Болометры и терморезисторы (термисторы) сконструированы из мате-
риалов, сопротивление которых зависит от температуры. Термисторы изготав-
ливают из спеченных оксидов кобальта, марганца и никеля. Изменение их
сопротивления измеряется с помощью моста Уитстона. Их преимущество перед
термопарами заключается в меньшем времени отклика (4 мс вместо 60 мс), что
улучшает разрешение и позволяет использовать более высокую скорость скани-
рования. Однако чувствительность у них хуже. Стоит отметить, что чувствите-
льность термических датчиков практически не зависит от длины волны.
Для быстрых измерений, необходимых в ИК-спектрометрах с преобразова-
нием Фурье, и в тех случаях, когда нужна высокая чувствительность, использу-
ют полупроводниковые детекторы. Примерами могут служить твердотельные
фотопроводящие детекторы на основе сульфида свинца (PbS), селенида свинца
(PbSe) или арсенида галлия-индия (InGaAs). Детекторы, работающие на эффек-
те возникновения фото-ЭДС, реагируют еще быстрее (~20 нс) и обладают более
высокой чувствительностью, но требуют охлаждения жидким азотом. Детектор
на основе InSe работает в диапазоне до 5,5 мкм, а детектор на основе PbSnTe — в
интервале 5-13 мкм. Самой высокой чувствительностью в ближней ИК-области
обладает детектор на основе InGaAs.
Перечислим самые распространенные детекторы и диапазоны длин волн ре-
гистрируемого с их помощью излучения:
• фотоумножители — 160-1100 нм;
• линейка фотодиодов на кремниевой основе — 180-1100 нм;
• приемники с зарядовой связью (ПЗС) — 180-1100 нм;
• кремниевые фотодиоды — 350-1100 нм;
• детектор на основе InGaAs — 800-1700 нм;
• детектор на основе PbS — 1000-3000 нм.
Физическая и спектральная ширина щели
Выше уже было отмечено, что с помощью монохроматора невозможно получить
излучение строго определенной длины волны. Монохроматор пропускает полосу
излучения в некотором интервале длин волн, причем ширина этой полосы зави-
сит как от дисперсии решетки или призмы, так и от ширины выходной щели.
Дисперсия призмы определяется длиной волны излучения и материалом, а так-
же геометрией призмы. Дисперсия дифракционной решетки зависит от числа
штрихов на дюйм. Помимо этого, дисперсия возрастает при увеличении рассто-
яния до щели.
54
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Рис. 16.21
Распределение по длинам волн
излучения, выходящего
из щели монохроматора
После того, как излучение подвергается дисперсии, определенная его часть
попадает на выходную щель. От ширины этой щели зависит, насколько широкая
(по длинам волн) полоса пройдет через образец до детектора. На рис. 16.21 по-
казано распределение по длинам волн для излучения, прошедшего через щель.
Номинальная длина волны — та, которую указывает прибор; она соответству-
ет максимуму интенсивности. Интенсивность излучения с длиной волны по обе
стороны от номинальной снижается. Ширина полосы на половине высоты на-
зывается спектральной шириной полосы. Спектральная ширина щели была
бы равна удвоенной ширине полосы (если бы полоса на рис. 16.21 имела форму
равнобедренного треугольника). Она служит мерой интервала длин волн излу-
чения, проходящего через щель. Необходимо подчеркнуть, что спектральная
ширина щели — совсем не то же самое, что ее физическая ширина, которая мо-
жет изменяться от нескольких микрометров до миллиметра и более (спектра-
льная ширина щели характеризует полосу излучения, проходящего через
физическую щель, и измеряется в единицах длины волны). Теоретически на ин-
тервал в пределах спектральной ширины приходится 75% интенсивности излу-
чения.
Если интенсивность источника и чувствительность детектора достаточно
велики, спектральная чистота может быть улучшена (спектральная ширина по-
лосы уменьшена) за счет сужения щели. Однако это уменьшение имеет предел,
который определяется оптической аберрацией и дифракционными эффектами,
порождаемыми слишком узкой щелью. Дифракция увеличивает эффективную
спектральную ширину щели. На практике предел чувствительности прибора
обычно достигается до того, как дифракционные эффекты становятся значимыми.
При использовании в качестве диспергирующего элемента дифракционной
решетки ширина пропускаемой полосы или спектральная ширина щели посто-
янна для всех длин волн спектра данного порядка (при постоянной физической
16.9. ТИПЫ СПЕКТРАЛЬНЫХ ПРИБОРОВ
55
ширине щели). При применении призм это не так, поскольку дисперсия призмы
зависит от длины волны. Ширина пропускаемой полосы будет меньше для ко-
ротких волн и больше — для длинных.
Калибровка прибора по длине волны и оптической плотности
Значение длины волны, показываемое спектрофотометром, можно проверить с
помощью растворов с известными максимумами и минимумами поглощения.
Дихромат калия при pH 2,9 имеет максимумы при 257 и 350 нм, а минимумы —
при 235 и 313 нм. Фильтр из оксида гольмия имеет узкие полосы поглощения
при 279,2, 222,8, 385,8, 446,0, 536,4 и 637,5 нм.
Национальный институт стандартов и технологий США (NIST) предостав-
ляет стандартные эталонные материалы (SRM) для проверки точности опреде-
ления длины волны и оптической плотности (пропускания). Так, для УФ- и
видимой областей SRM 930Е состоит из трех стеклянных фильтров средней
плотности и стандартной толщины с номинальным пропусканием 10, 20 и 30%.
Другие эталонные материалы представляют собой стандартные растворы (на-
пример, дихромата калия или кислого фталата калия в хлорной кислоте). По-
дробности можно узнать на сайте NIST (www.nist.gov). Просмотрите каталог
стандартных эталонных материалов и кликните, например, по номерам, 931F,
935А и 2031 А. Эталон 1921А — это полистирольная пленка для калибровок в
ИК-области. (См. также [R. A. Spragg, М. Billingham, Spectroscopy, 10(1) (1995) 41]
о корректировках, учитывающих влияние разрешения, алгоритма выделения пи-
ков и температуры на положение полос.)
Существуют и коммерческие источники эталонных материалов для спект-
ральных калибровок, которые проверяются по стандартам NIST. Подробнее
ознакомиться с некоторыми такими предложениями можно, например, на сайте
www.stamacells.com (Stama Cells, Inc.).
16.9. Типы спектральных приборов
Хотя в целом все спектральные приборы соответствуют блок-схеме, приведен-
ной на рис. 16.12, существуют множество вариантов их исполнения, связанных с
особенностями различных фирм-производителей, рабочим диапазоном длин
волн, требуемым разрешением и т. д. Подробное обсуждение этой темы выходит
за рамки данного учебника, мы рассмотрим только некоторые общие характери-
стики спектрометров.
Однолучевые спектрометры
Приборы этого типа чаще всего используются в студенческих лабораториях, так
как они относительно недороги и в то же время позволяют получать очень хоро-
шие результаты. На рис. 16.22 показана оптическая схема спектрофотометра
Spectronic 20 (фирма Bausch and Lomb) с фотоэлементом в качестве детектора. Ис-
точником видимого света служит вольфрамовая лампа накаливания, а диспергиру-
56
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Лампа
длин волн
Рис. 16.22. Оптическая схема спектрофотометра Spectronic 20, разработанного фирмой Bausch
and Lomb (вид сверху). С разрешения Bausch and Lomb, Inc.
ющим элементом — недорогая реплика штриховой дифракционной решетки
(600 штрихов на 1 мм); рабочий диапазон длин волн составляет 330-950 нм. Вы-
ходная щель позволяет получить полосу излучения шириной 20 нм. Например,
если установлена длина волны 480 нм, то через щель проходит излучение в ин-
тервале 470^490 нм. Поворачивая ручку установки длин волн, можно повора-
чивать дифракционную решетку, изменяя полосу проходящего излучения (на
рисунке после отражения от дифракционной решетки показан путь этого луча).
С помощью фильтра отсекаются спектры второго и более высоких порядков,
чтобы они не попали в щель (иначе могут появиться ложные линии). Выбор филь-
тра определяется тем, какое излучение следует отсечь. В большинстве случаев
используют фильтры с крутым срезом, которые пропускают излучение с дли-
ной волны меньше определенной величины, а более длинноволновое, где могут
проявляться спектры высших порядков, отсекают. Для некоторых целей удоб-
нее узкополосные фильтры; например, красный фильтр удаляет весь свет, не
являющийся красным, так что до детектора доходит почти чистый красный
свет (см. ниже).
Все излучение, не поглощенное образцом, попадает на детектор, где оно
превращается в электрический сигнал, который затем усиливается и регистриру-
ется измерительным прибором. У фотоэлемента для видимой области максимум
чувствительности приходится на 400 нм, а чувствительность при 625 нм состав-
ляет лишь 5% от максимальной. Измерения при длинах волн более 625 нм лучше
проводить с фотоэлементом, чувствительным к красному свету (RCA 6953), ис-
пользуя одновременно красный фильтр для удаления спектра второго порядка
(фильтр пропускает нужное красное излучение и отсекает ненужные спектры
высших порядков).
16.9. ТИПЫ СПЕКТРАЛЬНЫХ ПРИБОРОВ
57
Спектрофотометры Spectronic 20 существуют в виде моделей с аналоговым
(модель 20+) или цифровым (модель 20D+) считывающим устройством. На ана-
логовой модели можно устанавливать определенную длину волны, есть ручка
установки нуля и существует возможность калибровки по Т или А. Оптическая
плотность считывается аналоговым измерительным прибором. Выходной сиг-
нал аналогового прибора можно устанавливать в диапазоне 0-1,0 В (постоянный
ток) и регистрировать аналоговым самописцем или цифровым устройством.
Цифровые приборы показывают на дисплее длину волны и Т (в %), А или кон-
центрацию. В режиме FACTOR прибор преобразует значения оптической плот-
ности в единицы концентрации, умножая оптическую плотность на коэффициент
(factor), который был установлен путем градуировки.
Мы уже говорили, что спектральная интенсивность источника и чувствитель-
ность детектора зависят от длины волны излучения. Следовательно, нужно ка-
ким-то образом сделать так, чтобы электрический сигнал на выходе детектора
был одинаковым при всех длинах волн. Этого можно добиться двумя способа-
ми: изменяя ширину щели, чтобы на детектор попадало больше или меньше све-
та, или изменяя усиление выходного сигнала детектора.
Однолучевые приборы снабжены заслонкой, расположенным перед детек-
тором, чтобы постороннее излучение не достигало детектора. В модели Spectro-
nic 20 она автоматически падает, когда в приборе нет кюветы для образца. Когда
заслонка перекрывает световой поток, с помощью ручки регулировки темнового
тока устанавливают точку отсчета на нуль пропускания (бесконечная оптиче-
ская плотность). Темновой ток — это слабый ток, который может течь в отсут-
ствие света из-за термоэмиссии электронов из катода фотоэлемента. Затем на
пути луча света ставят кювету с растворителем и открывают заслонку. Меняя
ширину щели (т. е. регулируя количество прошедшего излучения) или «чувстви-
тельность» (усиление сигнала), добиваются того, чтобы сигнал детектора соот-
ветствовал 100%-му пропусканию (нулевой оптической плотности). Эти
операции обычно повторяют несколько раз, чтобы убедиться, что корректиров-
ки не влияют друг на друга. После этого шкала считается оталиброванной и
можно измерять неизвестную величину оптической плотности. Описанные
выше операции следует повторять для каждой длины волны.
При изучении серии образцов измерения проводят с использованием рас-
творов сравнения*. Если оптические плотности раствора сравнения чистого рас-
творителя достаточно заметно различаются (> 0,01 А для Spectronic 20), то
значение, полученное в опыте с раствором сравнения, вычитают из значений для
растворов аналита. Если же поглощение раствора сравнения мало, его часто ис-
пользуют вместо растворителя для калибровки 100%-го пропускания. При этом
поглощение такого раствора затем будет автоматически вычитаться. Этот спо-
соб пригоден только когда поглощение раствора сравнения невелико и постоян-
но. Наконец, в случае, когда поглощение раствора сравнения велико, для его
компенсации потребуется большее усиление сигнала детектора, а это приведет к
увеличению уровня шумов. Устанавливая приборный нуль по раствору
Раствор сравнения — это раствор, который содержит все вещества образца, кроме аналита.
58
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
сравнения, мы получаем то преимущество, что устраняется необходимость еще
одного измерения, которое всегда содержит некоторую экспериментальную по-
грешность. При использовании этой методики следует проверять положение
«нуля» со всеми растворами сравнения, чтобы быть уверенным в его постоянстве.
Двухлучевые спектрометры
Это более сложные в работе приборы, но они имеют ряд преимуществ. В основ-
ном двухлучевые спектрометры используются как записывающие приборы: т. е.
длина волны автоматически изменяется, а оптическая плотность как ее функция
регистрируется. В таких приборах один луч проходит через кювету с образцом, а
другой — через кювету сравнения. Как правило, излучение источника падает на
колеблющееся или поворачивающееся зеркало, которое поочередно направляет
луч то на образец, то на кювету сравнения; в обоих случаях потом излучение по-
падает на детектор. В результате детектор улавливает излучение от образца и
раствора сравнения, а выходной сигнал детектора пропорционален отношению
их интенсивностей (P/Pq).
Выходной сигнал получается переменным, причем его частота равна часто-
те колебания (вращения) зеркала. Для усиления такого сигнала используется
усилитель переменного тока, и ложные постоянные сигналы не регистрируются.
Длина волны меняется с помощью двигателя, который перемещает диспергиру-
ющий элемент с постоянной скоростью. Для сохранения постоянства энергии
пучка от кюветы сравнения специальный двигатель непрерывно перестраивает
ширину щели. Таким образом, автоматически устанавливается 100%-ное пропус-
Однолучевой или двухлучевой?
Используемые ранее (1950-х гг.) спектрофотометры для УФ/видимой и ИК-областей
были громоздкими и обычно имели двухлучевые монохроматоры для компенсации оп-
тического дрейфа и электронных шумов. Такие приборы работали медленно и обладали
лишь умеренной чувствительностью. Совершенствование оптики и электроники избави-
ло от необходимости использовать двухлучевые системы, снижающие энергию проходя-
щего излучения. Современные однолучевые приборы меньше по размерам, более
быстродействующие, чувствительные и экономичные, чем старые модели. Однако двух-
лучевые спектрометры обеспечивают более высокую стабильность измерений. Таким
образом, выбор определяется требованиями конкретной задачи. Все современные дис-
пергирующие ИК-спектрометры однолучевые.
Спектрометры также сильно различаются по разрешению: от учебных приборов с низ-
ким разрешением (например, 20 нм для модели Spectronic 20) до исследовательских при-
боров с двумя дифракционными решетками с разрешением 0,05 нм. Наиболее
распространены приборы с разрешением ~2 нм; они снабжены программным обеспече-
нием для градуировки по нескольким стандартам, построения полиномиальных градуи-
ровочных кривых и статистической обработки результатов измерений.
16.10. СПЕКТРОМЕТРЫ С ДИОДНЫМИ МАССИВАМИ - РЕГИСТРАЦИЯ ВСЕГО СПЕКТРА
59
кание через кювету сравнения (обычно с растворителем или раствором срав-
нения).
Приведенное описание двухлучевого прибора достаточно упрощено. Суще-
ствуют разные варианты устройства и действия таких спектрометров. Они очень
удобны для качественного анализа, когда необходимо получить весь спектр из-
лучения. Кроме того, в них автоматически компенсируется поглощение раство-
ра сравнения, а также дрейф интенсивности источника излучения.
16.10. Спектрометры с диодными массивами -
регистрация всего спектра
Обсуждая детекторы, мы упомянули использование линеек фотодиодов для од-
новременной регистрации всего спектра в течение нескольких миллисекунд.
Основные узлы спектрометра с таким детектором показаны на рис. 16.23. В этом
случае полихроматический свет проходит через образец, после которого распо-
ложен диспергирующий элемент. Выходная щель отсутствует, и диспергиро-
ванное излучение попадает на поверхность линейки фотодиодов, каждый диод
которой фактически действует как выходная щель монохроматора. Разрешение
ограничено размерами элемента детектора; обычно оно вдвое превышает размер
элемента.
Источник
Образец
Рис. 16.23 . Схема спектрометра с линейкой диодов
60
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Такие спектрометры очень удобны для анализа смесей поглощающих час-
тиц с перекрывающимися спектрами. Использование традиционного подхода,
основанного на решении системы уравнений, ограничено исследованием двух-
и трехкомпонентных смесей (поглощение измеряют при двух или трех длинах
волн), причем спектры компонентов должны существенно различаться. С помо-
щью спектрометров с линейками диодов можно измерять поглощение во многих
точках, т. е. использовать данные на «склонах» полос поглощения, а не только в
максимумах. Использование таких «избыточных» данных («переопределенно-
сти»), когда точек измерений больше, чем аналитов, повышает надежность ко-
личественных измерений, позволяя определять до шести и более компонентов, а
также анализировать более простые смеси веществ с подобными спектрами.
В качестве примера многокомпонентного анализа можно привести одновремен-
ное определение пяти гемоглобинов (рис. 16.24). Пять спектров были количест-
венно разрешены путем сравнения со стандартными спектрами всех компо-
нентов, хранящимися в памяти компьютера. Для анализа полного спектра суще-
ствует разное программное обеспечение. Для градуировки могут подойти смеси
стандартов; таким образом можно учесть возможные взаимодействия между
компонентами.
Длина волны, нм
Спектры поглощения:
--------НЬ (гемоглобин) ---------------------Hi (метгемоглобин)
........НЬО2 (оксигемоглобин) --------- -----SHb (сульфгемоглобин)
---------НЬСО (карбоксигемоглобин)
РИС. 16.24. Спектры поглощения пяти гемоглобинов. С разрешения [A. Zwart, A. Buursma,
Е. J. van Kampen, W. G. Zijlstra, Clin. Chem., 30 (1984) 373]
16.11. ИНФРАКРАСНЫЕ ФУРЬЕ-СП ЕКТРОМЕГРЫ
61
В современных спектрометрах уже не используют аналоговые самописцы.
Вместо этого спектр отражается на экране монитора и выводится на печать.
Быстродействие спектрометров с диодными детекторами позволяет прово-
дить повторные измерения (параллельные опыты), обрабатывать результаты
статистическими методами и тем самым получать более надежные количествен-
ные данные. Например, для одной точки за 1 с можно сделать 10 измерений и для
каждого рассчитать стандартное отклонение. Затем с помощью компьютера ме-
тодом наименьших квадратов можно обработать полученные результаты, учи-
тывая точность каждого значения. Такой метод «наибольшего правдоподобия»
минимизирует влияние ненадежных точек на количественные расчеты.
16.11. Инфракрасные фурье-спектрометры
Традиционные ИК-спектрометры называют диспергирующими приборами.
С появлением компьютеров и микропроцессоров они были в значительной сте-
пени вытеснены ИК-фурье-спектрометрами, которые обладают рядом преиму-
ществ. Для получения спектра в таких спектрометрах используется не
монохроматор, а интерферометр.
Схема устройства интерферометра показана на рис. 16.25. Излучение от
обычного источника делится на два луча светоделителем; один луч попадает на
неподвижное зеркало, а другой — на подвижное. Когда лучи отражаются, они
слегка смещаются по фазе относительно друг друга, так как проходят разные
расстояния до зеркал из-за движущегося зеркала. В результате, при их объедине-
нии, возникает интерференционная картина (для всех длин волн) до прохожде-
ния лучей через образец. Через образец проходит излучение всех длин волн
одновременно. Интерференционная картина изменяется во времени, поскольку
зеркало непрерывно движется (удаляется и приближается) с постоянной линей-
ной скоростью. В результате поглощения излучения образцом возникает спектр
с временной разверткой, называемый интерферограммой (зависимость ин-
тенсивности поглощения от разности хода двух лучей).
Рис. 16.25
Схема интерферометра для
ИК-фурье-спектрометра
62
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Рис. 16.26
Типичная интерферограмма. В точке
«О» оба зеркала интерферометра
находятся на одинаковых
расстояниях от делителя.
С разрешения [D. W. Ball,
Spectroscopy, 9(8) (1994) 24]
Положение подвижного зеркала
Типичная интерферограмма показана на рис. 16.26. Высокий пик соответст-
вует ситуации, когда два зеркала находятся на одинаковых расстояниях от све-
тоделителя. Эта часть интерферограммы называется точкой нулевой разности
хода. По обе стороны от нее интенсивность быстро падает из-за интерференции.
С помощью компьютера такой сигнал преобразуется в частотный спектр по-
средством математической операции, называемой преобразованием Фурье
(отсюда название фурье-спектрометр). В результате получается традиционный
ИК-спектр.
Как уже было сказано, приборы с интерферометром имеют ряд преиму-
ществ. Во-первых, это большая светосила (выигрыш Жакино), обусловленное
тем, что образец подвергается действию всего диапазона излучения, а не его ма-
леньких порций, разбитых по длинам волн. В результате этого возрастает отноше-
ние сигнал/шум. Кроме того, применение интерферометра делает возможным
проведение анализа всех частот ИК-диапазона одновременно, позволяет полу-
чить спектр с разрешением сравнимым (или лучше) с разрешением при исполь-
зовании дифракционной решетки всего за несколько секунд (т. е. сказывается
наличие мулътиплекс-фактора — выигрыш Фелжета).
При регистрации множества интерферограмм и их усреднения с целью уве-
личения соотношения сигнал/шум компьютер должен каждый раз устанавливать
точку нулевой разности хода строго в одном положении вдоль пути движения зер-
кала. Для этого интерферометр снабжается маленьким красным гелий-неоно-
вым (He-Ne) лазером, монохроматическое излучение которого проходит через
интерферометр так же, как излучение источника. После наложения сигналов ин-
терферограмма содержит полосы, расстояния между которыми в точности рав-
ны длине волны лазера — 632,8 нм. По этим полосам проводят калибровку
положения зеркала, чтобы компьютер мог синхронизировать все спектры.
Принцип действия интерферометра и преобразование Фурье были известны
уже столетие назад, однако их практическое использование стало возможным лишь
16.12. СПЕКТРОМЕТРЫ ДЛЯ БЛИЖНЕЙ ИК-ОБЛАСТИ
63
с появлением быстродействующих компьютеров. Инфракрасные фурье-спектро-
метры производят в виде как портативных моделей для полевых условий, так и
более сложных лабораторных приборов. Все они снабжены светоделителем
(обычно изготовленным из германия или бромида калия), подвижным зеркалом
(движение осуществляется посредством точной механики или на воздушной по-
душке), твердотельным или криогенным детектором и компьютером для преоб-
разования интерферограммы в частотный спектр. Для калибровки длин волн
устанавливается монохроматический лазер с диодным детектором.
Существуют также (хотя и менее распространены) быстродействующие
сканирующие диспергирующие приборы, в которых интерферометр заменен бо-
лее экономичным монохроматором. Эти приборы обеспечивают скорость реги-
страции и разрешение, сравнимые с аналогичными характеристиками фурье-
спектрометров, но не имеют выигрыша Фелжета, который понижает уровень
шумов.
Современные ИК-спектрометры часто позволяют регистрировать спектры
отражения; при этом отпадает необходимость в кюветах с соляными окошками
и упрощается подготовка образца. Наиболее удобен метод внутреннего отра-
жения, называемый спектрометрией нарушенного полного внутреннего отраже-
ния. При этом образец должен быть размещен определенным образом,
обеспечивая тесный контакт с алмазной призмой (подложкой). Инфракрасное
излучение проникает в образец, претерпевает внутреннее отражение и затем
попадает в детектор.
16.12. Спектрометры для ближней ИК-области
Источники излучения в ближней ИК-области обычно работают при температуре
2500-3000 К (в средней ИК-области — при температурах —1700 К). Их излуче-
ние примерно в 10 раз более интенсивное, чем для источников в средней ИК-обла-
сти. Соответственно, улучшается отношение сигнал/шум. По мере повышения
температуры максимум интенсивности сдвигается в ближнюю ИК-область. При
более высокой температуре излучение в средней ИК-области становится слабее,
а в ближней — усиливается. Для диапазона 800-1100 нм используют вольфра-
мовую галогеновую лампу, дающую интенсивное излучение в этой области.
В ближней ИК-области обычно используют детекторы на основе GalnAs;
они приблизительно в 100 раз чувствительнее детекторов для средней ИК-обла-
сти. Сочетание интенсивного излучения источника с чувствительными детекто-
рами приводит к очень низкому уровню шумов (на уровне миллионных долей
оптической плотности). В ближней ИК-области стекло и кварц прозрачны, поэ-
тому с оптикой и кюветами возникает меньше проблем, чем для средней ИК-обла-
сти. Излучение в ближней ИК-области можно передавать на большие расстояния
с помощью волоконной оптики; промышленные и портативные (для полевых
условий) приборы часто используют волоконно-оптические сенсоры (см. ниже)
для недеструктивного анализа образцов.
64
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
16.13. Погрешности спектрометрических методов анализа
При определении оптической плотности или пропускания всегда существуют
некоторые погрешности измерения или невоспроизводимое™ данных. Неопре-
деленность в показаниях прибора зависит от ряда инструментальных факторов и
от диапазона, в котором находится измеряемая величина, т. е. от концентрации
аналита.
Поскольку между пропусканием и концентрацией наблюдается логарифми-
ческая зависимость, небольшие погрешности в измерении пропускания приво-
дят к большим относительным погрешностям в величине концентрации и при
низком, и при высоком пропускании. Очевидно, что, если образец поглощает
лишь очень малое количество света, даже небольшое изменение в величине про-
пускания приведет к заметной относительной погрешности результата. Если
же образец поглощает почти весь свет, необходим чрезвычайно стабильный в
работе прибор, чтобы точно измерить сильное снижение пропускания. Таким
образом, существует некоторое оптимальное значение пропускания (оптической
плотности), при котором относительные погрешности будут минимальными.
Пропускание, отвечающее минимальной относительной погрешности, мож-
но вывести из закона Бера с помощью соответствующих преобразований. При этом
обычно предполагают, что погрешности в основном связаны с неопределенностью
в считывании показаний со шкалы прибора и что абсолютная погрешность в
определении пропускания постоянна, т. е. не зависит от величины пропускания.
В результате можно получить, что минимальная относительная погрешность в
определении концентрации соответствует Т= 0,368 или А = 0,434.
На рис. 16.27 показана зависимость относительной погрешности концент-
рации от пропускания, рассчитанная для постоянной погрешности измерения Т,
равной 0,01. Хорошо видно что приблизительно постоянная (и близкая к мини-
мальной) погрешность сохраняется в диапазоне Тот 20 до 65% (от 0,7 до 0,2 еди-
Рис. 16.27
Относительная погрешность
в определении концентрации
как функция пропускания
при 1%-й неопределенности
16.14. ОТКЛОНЕНИЯ ОТ ЗАКОНА БЕРА
65
ниц Л). Чтобы избежать больших погрешностей при спектрофотометрических
измерениях пропускание должно попадать в интервал от 10 до 80% (Л = 1-0,1).
Следовательно, образцы при необходимости нужно разбавлять (или концентри-
ровать), а стандартные растворы готовить так, чтобы величина оптической плот-
ности попадала в оптимальный диапазон.
Необходимо отметить, что зависимость, показанная на рис. 16.27, на самом
деле типична только для приборов с детекторами, характеризующимися шумом
Джонсона, или тепловым шумом. К ним относятся детекторы на основе фото-
проводников типа CdS или PbS (от 400 до 3500 нм), термопары, болометры и де-
текторы Галея в ИК-области. Шум Джонсона возникает из-за хаотического
теплового движения носителей заряда.
В детекторах на основе фотоэлементов и ФЭУ (фотоэмиссионных детекто-
рах для видимой и УФ-областей) тепловые шумы незначительны по сравнению
с дробовыми шумами. Дробовый шум — это хаотические флуктуации электри-
ческого тока от поверхности, испускающей электроны (т. е. через переход от ка-
тода к аноду). В ФЭУ он усиливается и становится главным шумом. В приборах
с такими детекторами абсолютная погрешность не постоянна во всем диапазоне
значений Г, и выражение для спектрофотометрической погрешности становится
более сложным. Расчеты показывают, что в этом случае минимальная погреш-
ность соответствует Т= 0,136 или А = 0,87; рабочий диапазон приборов — от ~0,1
до 1,5 единиц Л.
16.14. Отклонения от закона Бера
Закон Бера выполняется не всегда. Иногда линейность зависимости оптической
плотности от концентрации нарушается. Отклонения от закона Бера связаны с
химическими и инструментальными факторами. Большинство «отклонений» на
самом деле являются кажущимися, поскольку если учесть все факторы, вызыва-
ющие нелинейность, то исправленная зависимость оптической плотности от
концентрации будет линейной. Истинные же отклонения от закона Бера возни-
кают в том случае, когда концентрация так высока, что показатель преломления
раствора отличается от показателя для раствора сравнения. Подобная ситуация
применима к смесям органических растворителей с водой, поэтому состав рас-
твора сравнения должен быть приближен к составу образца. Кроме того, раство-
ритель может влиять на коэффициент поглощения аналита.
Химические факторы
Химические факторы, вызывающие нелинейность, проявляются при смещении
химического равновесия. Примером может служить слабая кислота, для которой
молекулярная форма поглощает в определенном интервале длин волн, а ее ани-
он не поглощает:
НА Н+ + А-
(поглощает) (не поглощает, прозрачен)
66
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Соотношение молекулярной и анионной форм, естественно, зависит от pH
(см. гл. 7). Если при измерениях используется буферный раствор или раствор яв-
ляется очень кислым, это соотношение будет оставаться постоянным при всех
концентрациях кислоты. Однако в небуферном растворе степень диссоциации
будет увеличиваться по мере разбавления кислоты, т. е. равновесие сдвигается
вправо. Таким образом, в разбавленном растворе доля поглощающих частиц
меньше, что вызывает кажущееся отклонение от закона Бера. В результате в
области более высоких концентраций (где меньше степень диссоциации) возни-
кает положительное отклонение от линейности. Если бы, наоборот, поглощала
анионная форма, отклонение было бы отрицательным. Аналогичные рассужде-
ния применимы к окрашенным (поглощающим) комплексам ионов металлов
(в частности, хелатам) в отсутствие большого избытка комплексообразующего
реагента, так как в таких системах степень диссоциации также увеличивается по
мере разбавления. Иногда ситуацию чрезвычайно сложно предсказать, так как ком-
плекс может диссоциировать последовательно, образуя другие комплексы, которые
могут поглощать, а могут и не поглощать при данном значении длины волны. На
эти равновесия также влияет значение pH.
Кажущиеся отклонения могут также возникать в том случае, если вещество
способно существовать и в виде димера, и в виде мономера. Положение равнове-
сия опять же зависит от концентрации. Примером служит поглощение метилено-
вого голубого, которое демонстрирует отрицательное отклонение при высоких
концентрациях красителя.
Самый лучший способ минимизировать эти обусловленные химическими
факторами отклонения от закона Бера состоит в использовании соответствую-
щих буферных растворов, добавлении большого избытка комплексообразующе-
го реагента, подборе определенной ионной силы раствора и т. д. Построение
градуировочного графика во всем диапазоне измерений позволяет нивелировать
большинство отклонений.
Если поглощают обе частицы, участвующие в химическом равновесии, и их
спектры частично перекрываются, длина волны, при которой кривые поглоще-
ния пересекаются, называется изобестической точкой; молярные коэффициен-
ты поглощения обеих частиц в этой точке равны (рис. 16.28). Приведенные на
этом рисунке спектры записаны при разных значениях pH, чтобы нивелировать
влияние среды, приводящее к сдвигу равновесия. Влияние pH можно устранить,
если проводить измерения в изобестической точке, но следует отметить, что
чувствительность в этом случае будет ниже. В сильнокислом или сильнощелоч-
ном растворе преобладает один вид частиц, поэтому измерения в таких условиях
более чувствительны.
Для двухкомпонентной системы, в которой обе поглощающие частицы на-
ходятся в равновесии, все кривые поглощения пересекаются в изобестической
точке (где одно и то же значение 8). Наличие изобестической точки — это необ-
ходимое (но не достаточное) условие для утверждения, что в равновесии участвуют
только два вида частиц с перекрывающимися спектрами. Если закону Бера подчи-
няются растворы обоих видов частиц, спектры поглощения любой равновесной
смеси этих двух частиц пересекаются при фиксированном значении длины волны.
16.14. ОТКЛОНЕНИЯ ОТ ЗАКОНА БЕРА
67
Рис. 16.28
Положение изобестической точки
для бромтимолового голубого
(501 нм): Л— pH 5,45;
В — pH 6,95; С —pH 7,50;
D — pH 11,60
Так, различно окрашенные формы индикатора (например, красная и желтая формы
метилового оранжевого), находящиеся в равновесии, часто имеют в спектрах изобе-
стическую точку, подтверждая тем самым, что две и только две окрашенные части-
цы участвуют в равновесии.
Наличие изобестической точки не означает, что присутствуют только два
компонента. Может быть третий компонент с 8 = 0 для данной длины волны.
В то же время отсутствие изобестической точки надежно указывает на присутствие
третьего компонента при условии, что отклонение от закона Бера в двухкомпонент-
ной системе можно не учитывать. В двухкомпонентной системе изобестическая
точка—это единственное значение длины волны, которое пригодно для количе-
ственного определения общего содержания двух поглощающих частиц, находя-
щихся в равновесии.
Инструментальные факторы
В основе закона Бера лежит предположение о монохроматичности применяемого
излучения. Но выше уже говорилось о том, что из излучения с непрерывным спек-
тром невозможно выделить строго монохроматическое излучение. В действите-
льности есть полоса излучения, ширина которой зависит от диспергирующего
элемента и ширины щели. В спектре поглощения излучение с различными длина-
ми волн поглощается в разной степени, т. е. коэффициент поглощения изменяется
с длиной волны. При длинах волн, соответствующих достаточно широкому макси-
муму в спектре, излучение в пределах всей полосы будет поглощаться в при-
близительно одинаковой степени. Однако на крутом участке спектра это не так.
Наклон полосы спектра увеличивается по мере увеличения концентрации, в резу-
льтате степени поглощения излучения с разными длинами волн могут изменяться,
особенно при наличии дрейфа в настройках прибора во время измерений. По этой
причине наблюдается отрицательное отклонение зависимости поглощения от
концентрации. Чем круче наклон полосы спектра, тем это отклонение сильнее.
68
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Очевидно, что измерения следует проводить, если это возможно, в макси-
мумах пиков поглощения; при этом минимизируется описанное выше отклоне-
ние и достигается максимальная чувствительность. При переходе от одного
прибора к другому в зависимости от разрешения, ширины щели и формы макси-
мума поглощения наблюдаемый коэффициент поглощения при данной длине
волны может изменяться. Таким образом, не следует полагаться на литератур-
ные данные о величине 8, правильнее проверять коэффициент поглощения и ли-
нейность градуировочной зависимости на своем спектрометре. Обычно строят
градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации, а
не полагаются на прямые вычисления концентрации по закону Бера.
При наличии посторонних поглощающих частиц, спектр поглощения ко-
торых перекрывается со спектром анализируемого вещества, зависимость об-
щей оптической плотности от концентрации аналита может оказаться
нелинейной. Это обстоятельство можно учесть, добавляя в стандартные образ-
цы для построения градуировочного графика мешающее соединение в соот-
ветствующей концентрации. Однако нужно учитывать, что этот метод
пригоден только в том случае, если концентрация примеси постоянна и отно-
сительно невелика. В противном случае необходимо анализировать образец
как смесь (см. выше).
Другие инструментальные факторы, которые могут вносить свой вклад в
отклонения от закона Бера, — это постороннее излучение, попадающее в моно-
хроматор и детектор, внутреннее отражение в монохроматоре и неодинаковая
толщина кювет, используемых для разных растворов аналита или в двухлучевом
спектрометре (когда поглощение растворителя или раствора сравнения доста-
точно велико). Постороннее излучение (любое излучение, которое не поглоща-
ется образцом или находится вне выбранной полосы длин волн) — наиболее
распространенная причина отрицательных отклонений от закона Бера — стано-
вится особенно значимым при высоком поглощении. В соответствии с законом
Бера интенсивность падающего на детектор света стремится к нулю при беско-
нечно большой концентрации (весь свет поглощается). Но это невозможно, если
на детектор падает постороннее излучение. Шум, возникающий от такого излу-
чения, также вносит существенный вклад в инструментальную погрешность при
высоком поглощении. Излучение, которое не взаимодействует с образцом, мо-
жет возникать из-за утечек излучения в приборе, из-за рассеяния света на опти-
ческих деталях или самом образце. Ложные сигналы, эквивалентные 0,1%
пропускания, приводят к погрешности в 0,4% для образца с оптической плотно-
стью, равной 1.
Можно перечислить и еще несколько химических и инструментальных фак-
торов, приводящих к нарушениям линейной зависимости при измерениях оптиче-
ской плотности: образование водородных связей, взаимодействие с растворителем,
нелинейность характеристик детектора и электроники, непараллельность излу-
чения и высокий уровень сигнала (насыщение).
На результаты количественного анализа может также влиять непостоянство
толщины кюветы. Это достаточно серьезная проблема, особенно в ИК-спектро-
метрии, где используются кюветы с прокладками. Пузырьки воздуха могут вли-
16.15. ФЛУОРИМЕГРИЯ
69
ять на длину оптического пути и вызывать рассеяние света, поэтому их очень
важно удалять, особенно в кюветах для ИК-области спектра.
16.15. Флуориметрия
Флуориметрический анализ характеризуется исключительной чувствительно-
стью и широко используется в биохимии, клинической химии и аналитической
химии в целом.
Сущность явления флуоресценции
Когда молекула поглощает электромагнитное излучение, его энергия обычно
рассеивается в виде теплоты, т. е. молекула дезактивируется в результате столк-
новений. Однако некоторые молекулы (~5-10%), особенно при поглощении вы-
сокоэнергетического излучения (УФ-излучения), через столкновения теряют
только часть энергии, другая же ее часть превращается в испускаемое излуче-
ние: электрон переходит обратно на основной уровень и при этом испускается
фотон с меньшей энергией (большей длиной волны), чем поглощенный фотон.
Обратимся к рис. 16.29.
При комнатной температуре молекула обычно находится в основном состо-
янии. Основное состояние, как правило, является синглетным (So): все электроны
спарены. Спаренные электроны, занимающие одну молекулярную орбиталь, име-
РИС. 16.29. Диаграмма энергетических уровней; указаны процессы поглощения, релаксации и их
скорости
70
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
ют противоположные спины. Если два электрона имеют одинаковые спины —
они являются неспаренными, а молекула находится в триплетном состоянии.
Термины «синглетное» и «триплетное» характеризуют мультиплетность со-
стояния молекулы. Процесс, приводящий к испусканию фотона в результате
флуоресценции, начинается с поглощения фотона (на это требуется 10~15 с) мо-
лекулой флуоресцирующего соединения, в результате чего происходит возбужде-
ние электрона на уровень с более высокой энергией (возбужденное состояние).
Для молекул большинства органических соединений при комнатной температу-
ре это поглощение соответствует переходу с нижнего колебательного уровня
основного состояния на один из колебательных уровней первого или второго
возбужденного электронного состояния той же мультиплетности (515 S2). Распо-
ложение колебательных и вращательных уровней на высших электронных со-
стояниях порождает спектр поглощения молекулы.
Если осуществился переход на более высокое состояние, чем то проис-
ходит быстрая внутренняя конверсия. Полагают, что возбужденная молекула
переходит с колебательного уровня этого возбужденного электронного состоя-
ния на верхний колебательный уровень состояния который равен по энергии
исходному возбужденному состоянию. Столкновение с молекулами растворите-
ля в этот момент быстро удаляет избыток энергии и переводит молекулу с верхнего
колебательного уровня на более низкий. Этот процесс называют колебательной
релаксацией. Указанные процессы потери энергии (внутренняя конверсия и ко-
лебательная релаксация) протекают очень быстро (~10-12 с), из-за чего испуска-
ние флуоресценции из более высоких состояний, чем встречается редко.
При достижении молекулой первого возбужденного синглетного состояния
начинается внутренняя конверсия в основное состояние — процесс более мед-
ленный. Поэтому переход из первого возбужденного состояния путем испуска-
ния фотона — флуоресценция — может эффективно конкурировать с другими
процессами потери энергии. Обычно после возбуждения флуоресценция проис-
ходит в течение ПУ^-Ю-9 с. Следовательно, глаз не может воспринимать излуче-
ние флуоресценции после удаления источника возбуждения. Поскольку
флуоресценция происходит с нижнего возбужденного состояния, ее спектр (т. е.
длина волны испускаемого излучения) не зависит от длины волны возбуждаю-
щего излучения. Однако интенсивность испускаемого излучения пропорциона-
льна интенсивности исходного излучения (т. е. числу поглощенных фотонов).
Еще одна особенность рассматриваемых переходов состоит в том, что самому
длинноволновому возбуждению соответствует самое коротковолновое испуска-
ние. Это полоса «0-0», отвечающая переходу между нулевыми колебательными
уровнями состояний 50 и Sj (см. рис. 16.29).
Пока молекула находится в возбужденном состоянии, у одного из электро-
нов может измениться спин, и молекула перейдет в более низкое по энергии
триплетное состояние посредством интеркомбинационной конверсии. Благо-
даря процессам внутренней конверсии и колебательной релаксации молекула
затем быстро достигает нижнего колебательного уровня первого возбужденного
триплетного состояния (7^). Отсюда молекула может вернуться в основное состо-
яние 50 путем испускания фотона. Это испускание называют фосфоресценцией.
16.15. ФЛУОРИМЕГРИЯ
71
Поскольку переходы между состояниями с разной мультиплетностью запреще-
ны, время жизни состояния Тх намного превышает время жизни 51? и фосфорес-
ценция — процесс более продолжительный, чем флуоресценция (>1(Н с). Этим
объясняется часто наблюдаемое «послесвечение» фосфоресценции, длящееся
после удаления источника возбуждения. Кроме того, из-за большого времени
жизни безызлучательные процессы более эффективно конкурируют с фосфорес-
ценцией, чем с флуоресценцией. По этой причине фосфоресценция обычно не
наблюдается в растворах из-за столкновений с молекулами растворителя или
кислорода. Для того, чтобы измерить фосфоресценцию образцы замораживают,
охлаждая их до температуры жидкого азота (-196 °C), при этом столкновитель-
ные процессы сводятся к минимуму. Твердые образцы также фосфоресцируют:
многие неорганические минералы демонстрируют длительную фосфоресцен-
цию. Проводились исследования, в которых молекулы из раствора адсорбирова-
лись на твердую подложку, где они могли фосфоресцировать.
Типичный спектр возбуждения и испускания флуоресцентной молекулы
показан на рис. 16.30. Спектр возбуждения по форме обычно очень похож на
спектр поглощения молекулы. Часто (но не всегда) между структурами спектров
возбуждения и испускания наблюдается близкое соответствие. У многих отно-
сительно крупных молекул расположение колебательных уровней в возбужден-
ных состояниях (особенно 50 и в состоянии 50 очень похожи. Таким образом,
форма спектра испускания, возникающего при переходах на различные колебатель-
ные уровни состояния 50, стремится походить на зеркальное отображение спектра
возбуждения, отвечающего за переходы на различные колебательные уровни воз-
бужденного состояния (например, 50. Тонкая структура обусловлена также еще и
различными вращательными уровнями на каждом колебательном уровне.
Самое длинноволновое излучение в спектре поглощения и самое коротко-
волновое в спектре флуоресценции близки друг к другу по частоте и примерно
РИС. 16.30
Спектр возбуждения
и испускания
флуоресцирующей
молекулы
72
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
соответствуют частоте перехода «0-0» на рис. 16.29. Некоторые различия между
ними обусловлены различиями в теплотах сольватации молекул в возбужден-
ном и невозбужденном состоянии.
Флуоресцировать могут только те молекулы, которые поглощают излуче-
ние (обычно в УФ-области). Из поглощающих молекул флуоресцируют лишь
-5-10%. Это хорошо с той точки зрения, что число мешающих определению ве-
ществ невелико. Испускаемое излучение может наблюдаться в УФ-области, осо-
бенно если соединение поглощает излучение с длинами волн менее 300 нм,
однако более обычна флуоресценция в видимой области. Именно испускаемое из-
лучение измеряют и соотносят с концентрацией.
Строение молекулы и флуоресценция
В принципе любая молекула, которая поглощает УФ-излучение, может флуо-
ресцировать, однако по множеству причин этого часто не происходит. Мы не бу-
дем углубляться в этот вопрос, а просто укажем, для каких веществ можно
ожидать флуоресценцию.
Прежде всего, чем сильнее поглощение, тем интенсивнее флуоресценция.
Флуоресцируют многие ароматические и гетероциклические соединения, осо-
бенно если содержат определенные заместители. К флуоресценции склонны
также соединения с сопряженными кратными связями. Электронодонорные
группы —ОН, —NH2 и —ОСН3 усиливают флуоресценцию. Флуоресцируют
полициклические соединения типа витамина К, пуринов, нуклеозидов и сопря-
женные полиены типа витамина А. Группы —NO2, —СООН, —СН2СООН,
—Вг, —I и азогруппа подавляют флуоресценцию. Другие заместители могут из-
менять интенсивность флуоресценции. Флуоресценция многих молекул сильно
зависит от pH, потому что только одна из форм (ионизированная или неиони-
зированная) может оказаться способной флуоресцировать. Например, фенол
С6Н5ОН флуоресцирует, а его анион С6Н5О~ — нет.
Если соединение само не флуоресцирует, его можно превратить в производ-
ное, которое будет флуоресцировать. Например, нефлуоресцирующие стероиды
можно превратить во флуоресцирующие соединения дегидратацией под дейст-
вием концентрированной H2SO4. Аналогично, двухосновные кислоты типа ма-
леиновой могут взаимодействовать с Р-нафтолом в концентрированной серной
кислоте с образованием флуоресцирующего производного. Уайт и Аргауэр раз-
работали флуориметрический метод определения многих металлов в виде хелатов
с органическими соединениями [23]. Антитела можно сделать флуоресцирующими
реакцией конденсации с флуоресцеинизоцианатом, который взаимодействует
со свободными аминогруппами белков. Флуоресцирует восстановленная форма
никотинамидадениндинуклеотида (NADH). Это соединение участвует во мно-
гих ферментативных реакциях (см. гл. 24), и его флуоресценция служит основой
для чувствительного метода количественного определения ферментов и их суб-
стратов. Большинство аминокислот не флуоресцирует, но при взаимодействии с
дансилхлоридом образуются флуоресцирующие производные.
16.15. ФЛУОРИМЕГРИЯ
73
Тушение флуоресценции
Проблема, с которой часто встречаются при применении флуориметрии в ко-
личественном анализе, состоит в тушении флуоресценции многими вещест-
вами.
Эти вещества конкурируют за использование энергии электронного воз-
буждения и снижают квантовый выход (т. е. эффективность превращения по-
глощенного излучения в излучение флуоресценции, см. ниже). Чрезвычайно
эффективный тушитель — иодид-ион. Атомы I и Вг в качестве заместителей
снижают квантовый выход. Соединения такого типа можно определять косвен-
но, измеряя степень тушения флуоресценции. Некоторые молекулы не флуорес-
цируют, потому что содержат связи, энергия диссоциации которых меньше
энергии излучения. Иными словами, связь может рваться, предотвращая флуо-
ресценцию.
Присутствие окрашенных частиц, поглощающих излучение флуоресцен-
ции, в растворе с флуоресцирующими частицами также могут сказаться на анали-
зе. Это проявление так называемого эффекта внутреннего фильтра. Например,
в растворе карбоната натрия дихромат калия имеет максимумы поглощения при
245 и 348 нм. Они перекрываются с полосами возбуждения (275 нм) и флуорес-
ценции (350 нм) триптофана и мешают его определению. Подобный эффект может
возникать и при слишком высокой концентрации флуоресцирующего вещества.
Некоторые молекулы вновь поглощают излучение, испущенное соседними мо-
лекулами (см. ниже обсуждение вопроса о соотношении интенсивности флуо-
ресценции и концентрации).
Соотношение между концентрацией
и интенсивностью флуоресценции
Из закона Бера легко вывести (см. задачу 48) уравнение, определяющее интен-
сивность флуоресценции:
F= фР0(1 - 10-^)
(16.24)
где ф — квантовый выход, т. е. постоянная, которая характеризует долю погло-
щенных фотонов, превратившихся в фотоны флуоресценции (таким образом,
квантовый выход меньше или равен 1). Остальные члены уравнения те же, что в
уравнении (16.10). Легко заметить, что интенсивность флуоресценции пропор-
циональна интенсивности источника, а оптическая плотность от F не зависит.
В таком случае, если произведение abc велико, член 10“aZ?c становится пренебре-
жимо малым по сравнению с 1, и F становится постоянной:
^=фр0
(16.25)
74
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
С другой стороны, если abc мало (< 0,01), с помощью разложения в ряд можно
показать*, что хорошим приближением служит выражение
F= 2,ЗОЗфРоа6с (16.26)
Таким образом, для низких концентраций интенсивность флуоресценции прямо
пропорциональна концентрации. Она также пропорциональна интенсивности
возбуждающего излучения.
Уравнение (16.26) обычно справедливо для концентраций до нескольких
миллионных долей (в зависимости от вещества). При более высоких концентра-
циях интенсивность флуоресценции с увеличением концентрации может снижать-
ся. Причину можно объяснить следующим образом. В разбавленном растворе
поглощаемое излучение равномерно распределяется по всей толщине раствора,
а в растворе с высокой концентрацией большую часть излучения поглощает пер-
вый слой раствора на пути излучения. Поэтому уравнение справедливо, когда
основная часть излучения проходит сквозь раствор (более 92%).
Оборудование для проведения флуоресцентного анализа
Для измерения флуоресценции необходимо отделять испускаемое излучение от
исходного. Проще всего это сделать, измеряя излучение флуоресценции под
прямым углом к исходному излучению. Излучение флуоресценции испускается
во всех направлениях, а исходное излучение проходит прямо сквозь раствор.
Схема простейшего флуориметра, для которого необходим источник УФ-
излучения, показана на рис. 16.31. Большинство флуоресцирующих молекул по-
глощает УФ-излучение в широком интервале длин волн, поэтому простой ис-
точник линейчатого спектра годится во многих случаях. Таким источником
служит ртутная лампа. В ней реализуется разряд в парах ртути при низком дав-
лении, основные линии испускания: 2537, 3650, 5200 (зеленая), 5800 (желтая) и
7800 (красная) А. Излучение с длиной волны менее 3000 А опасно для глаз, поэто-
му на источник коротковолнового УФ-излучения смотреть нельзя. Пары ртути
сами поглощают большую часть излучения с длиной волны 2537 А, а чтобы
отсечь видимый свет, используют синий фильтр. Таким образом, для активации
молекул в основном применяется линия 3650 А. В более сложных приборах, ко-
торые сканируют спектр (спектрофлуориметрах), используют ксеноновые лам-
пы высокого давления (источник непрерывного спектра излучения). Давление в
лампе составляет 7 атм при 25 °C и 35 атм при рабочей температуре. (Необходи-
ма осторожность при работе!)
В простом приборе (см. рис. 16.31) первичный фильтр (фильтр 1) служит
для отделения излучения с длиной волны, близкой к излучению флуоресцен-
ции, потому что на практике часть излучения рассеивается. Первичный фильтр
* Известно, что е~х = 1 -х + х2^! ... и что 10-х = е-2’303х. Таким образом, 1 - е"2’303в5с = 1- [1 - 2,303а6с +
+ (2,303aZ>c)2/2! ...]. Квадратичным членом и членами высших порядков можно пренебречь, если abc <0,01,
поэтому разложение сводится к 2,303abc. Это ряд Тейлора.
16.15. ФЛУОРИМЕГРИЯ
75
Рис. 16.31
Блок-схема простого флуориметра
Фильтр 1
• . Детектор
пропускает только излучение с длиной волны возбуждения. Вторичный фильтр
(фильтр 2) пропускает излучение флуоресценции, но не излучение возбужде-
ния (которое может рассеиваться). Иными словами, фильтр 1 не пропускает из-
лучение, которое прошло бы через фильтр 2 и воспринималось бы как
флуоресценция. Фильтр 2 не пропускает рассеянное излучение возбуждения и
пропускает излучение флуоресценции. Так как обычное стекло пропускает
значительную часть излучения с длиной волны 3650 А, кюветы и фильтры из-
готавливают из стекла. Однако лучше использовать кварцевое стекло (сущест-
вуют специальные нефлуоресцирующие сорта). Такой простой прибор годится
для многих целей.
Измерения флуоресценции (флуориметрические методы анализа) в 1000 раз
чувствительнее по сравнению с измерениями оптической плотности (абсорбци-
онная спектрометрия). Это легко понять, используя образное мышление. Напри-
мер, измерение оптической плотности можно сравнить со взвешиванием
корабля с капитаном и отдельно корабля, чтобы определить массу капитана
(р = Ро - Р), т. е. при анализе измеряется разность двух сигналов Ро и Р. Чувстви-
тельность определяется возможностью различить их; она зависит (среди прочих
факторов) от стабильности работы прибора. При флуоресцентном анализе мы
«взвешиваем» только капитана: измеряется разность между нулем и некоторой
конечной величиной, поэтому предел детектирования определяется интенсив-
ностью источника, а также чувствительностью и стабильностью детектора
(«дробовые» шумы). Кроме того, в флуориметрии сигнал линейно зависит от
концентрации в широком диапазоне, поэтому для флуориметрических методов
анализа не только выше чувствительность, но и намного шире диапазон опреде-
ляемых концентраций.
В спектрофлуориметре измерение также проводят под прямым углом к ис-
ходному излучению. Однако вместо фильтров прибор включает два сканирую-
щих монохроматора: один выделяет длину волны возбуждающего излучения,
другой — флуоресценции. В случае источника непрерывного спектра можно
сканировать длину волны возбуждения и измерять флуоресценцию при разных
76
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
длинах волн. Интенсивность флуоресценции зависит от длины волны возбужде-
ния (подобен спектру поглощения). Это позволяет определить длину волны
максимального возбуждения флуоресценции. Затем, установив длину волны
возбуждения на это значение, можно сканировать по длинам волн излучение
эмиссии, чтобы найти длину волны максимума флуоресценции. При сканирова-
нии этого спектра обычно наблюдается ложный пик, соответствующий длине
волны возбуждающего излучения и вызванный рассеянием излучения.
В спектрофлуориметрическом анализе трудно учесть изменения в интен-
сивности излучения источника или в чувствительности детектора при различ-
ных длинах волн, поэтому для конкретных условий эксперимента обычно строят
градуировочные графики. При этом, поскольку интенсивность источника и чув-
ствительность детектора могут изменяться день ото дня, прибор калибруют по
стандартным растворам (измеряя их флуоресценцию и устанавливая соответст-
вующее значение на шкале). В качестве стандарта, как правило, используют раз-
бавленный раствор хинина в разбавленной серной кислоте.
Иногда требуется получить истинный спектр флуоресцирующего соедине-
ния для расчета квантовых выходов различных переходов. Для этого необходи-
ма поточечная корректировка изменений регистрируемого сигнала из-за
изменений инструментальных параметров. Для получения таких скорректиро-
ванных спектров разработаны специальные приборы. При этом вносят поправки
на нестабильность источника, облучая образец потоком света с постоянной
энергией, и на колебания чувствительности детектора. Регистрируемый спектр
представляют непосредственно в квантах испускаемого излучения на единич-
ный интервал длин волн.
16.16. Оптические сенсоры: волоконная оптика
В последние годы большой интерес вызывала разработка оптических сенсоров,
действующих аналогично электрохимическим сенсорам (см. гл. 15). Это стало
возможным после создания волоконно-оптических кабелей, передающих свет
по гибкому кабелю (волноводу, световоду). Оптические волокна были сначала
разработаны для систем связи, которые использовали передачу света на боль-
шие расстояния. Но они также оказались очень полезны и для передачи света к
спектрометрам и создания сенсоров, селективных к определенному аналиту, по-
средством объединения волоконной оптики и химических реакций. При использо-
вании оптических волокон нет необходимости помещать образец в спектрометр,
так как свет может передаваться к образцу и возвращаться обратно по кабелям.
Свойства оптических волокон
Схематическое изображение волоконно-оптического кабеля показано на рис. 16.32.
Он состоит из действующей как волновод (световод) цилиндрической сердцеви-
ны, окруженной оболочкой с меньшим показателем преломления, и защитного
слоя. Свет распространяется вдоль световода благодаря эффекту полного внут-
16.16. ОПТИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ: ВОЛОКОННАЯ ОПТИКА
77
Теряющееся излучение
РИС. 16.32. Структура оптического волокна
Сердцевина
Защитный слой
Оболочка
реннего отражения на границе сердцевина-оболочка. Апертурный угол Qa—это
максимальный угол излучения между оптической осью сердцевины волоконно-
го световода и лучом, которое полностью отражается при данной разности пока-
зателей преломления сердцевины и оболочки. Свет, входящий под большим
углом, не будет передаваться; 0а определяет числовую апертуру волокна (NA,
numerical aperture):
NA = next sin 0 a = -J«i2 -«2 (16.27)
где n2 — показатель преломления оболочки; nx — показатель преломления серд-
цевины; Hext — показатель преломления внешней среды. Чем больше величина
NA, тем больше способность волокна собирать свет.
В качестве характеристик различных волокон производитель обычно ука-
зывает числовую апертуру, а также потери света на единицу длины для излуче-
ния различных длин волн (в виде спектральной кривой, которая показывает
оптические потери в зависимости от длины волны). Как правило, этот параметр
выражают в децибелах на километр (дБ/км):
дБ = 101g
(16.28)
где Ро и Р — интенсивности входящего и выходящего излучения соответствен-
но. Так, оптические потери для волокон из кварцевого стекла при 850 нм состав-
ляют -10 дБ/км. Следует отметить, что дБ = 10 х Оптическая плотность. Поэтому
у 10-метрового (0,010 км) волокна оптическая плотность составляет 0,01, что со-
ответствует 97,7%-му пропусканию.
В продаже имеются оптические волокна, которые пропускают излучение в
диапазоне от УФ- (190 нм) до ИК- (>5 мкм) области, однако для каждого сорта
рабочий диапазон ограничен. Для коротких кабелей в видимом диапазоне испо-
льзуют пластиковые и многокомпонентные стекла, а волокна из кварцевого
стекла можно использовать от УФ- до ближней ИК-области (2,3 мкм), но они
очень дороги. Для более дальних ИК-диапазонов изготавливают волокна из фто-
ридных и халькогенидных стекол.
78
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
При подсоединении оптоволокна к спектрометру нужно выдержать баланс
между желательным увеличением числовой апертуры (чтобы собрать больше
света) и углом сбора самого спектрометра, значение которого обычно ограниче-
но. Это связано с тем, что свет, собранный с числовой апертурой, превышаю-
щей предел спектрометра, не будет «увиден» прибором. Обсуждение
конструкционных проблем соединения волоконной оптики со спектрометром
можно найти в книге [23].
Волоконная оптика может применяться при создании датчиков для тради-
ционного спектрометрического и флуоресцентного анализа. Для этого свет нуж-
но передавать от источника излучения к образцу и обратно в спектрометр. Хотя
существуют устройства, позволяющие пропускать и возвращать обратно свет по
одному и тому же кабелю, обычно используют двухжильный (бифуркатный)
кабель. Он состоит из двух волокон в одной оболочке, расщепленной на том
конце, который идет к источнику излучения и спектрометру. Часто кабели со-
держат несколько десятков тонких волокон, на одном конце половина из них
случайным образом отделена от остальных. Для измерения поглощения малень-
кое зеркало присоединяют к кабелю на расстоянии нескольких миллиметров от
его конца. Излучение от источника проникает через раствор образца и отражает-
ся обратно в волокно для сбора и передачи в спектрометр. Длина хода излучения
равна удвоенному расстоянию между волокном и зеркалом.
Измерения флуоресценции проводят аналогичным способом, но без зерка-
ла. Излучение, выходящее из конца волокна в форме конуса, возбуждает в раство-
ре образца флуоресценцию, излучение которой собирается обратным кабелем и
посылается в спектрометр. Часто для повышения интенсивности флуоресценции
используют лазерные источники излучения.
Длина волны, нм
РИС. 16.33. Спектры ФИТЦ, иммобилизованного на пористой стеклянной подложке при pH 3,4,5,
6 и 7. С разрешения [M.-R. S. Fuh, L. W. Burgess, Т. Hirschfeld, G. D. Christian, F. Wang, Analyst, 112
(1987) 1159]
16.16. ОПТИЧЕСКИЕ СЕНСОРЫ: ВОЛОКОННАЯ ОПТИКА
79
Волоконно-оптические сенсоры
Волоконно-оптический зонд можно превратить в селективный сенсор (с исполь-
зованием поглощения или флуоресценции) путем иммобилизации подходящих
реагентов на конце волоконно-оптического кабеля. Их преимущество перед
электрохимическими сенсорами состоит в том, что для работы не нужен элект-
род сравнения (и солевой мостик); кроме того, электромагнитное излучение не
влияет на отклик такого сенсора. Например, флуориметрический датчик pH можно
получить химической иммобилизацией индикатора флуоресцеинизотиоцианата
(ФИТЦ) на пористой стеклянной подложке, которая присоединяется к концу во-
локна эпоксидной смолой. Спектр флуоресценции ФИТЦ изменяется с измене-
нием pH (рис. 16.33) в интервале pH от ~3 до 7 (середина этого интервала
находится вблизи рК индикатора). Интенсивность флуоресценции, измеренную
в максимуме, сопоставляют со значением pH при помощи градуировочного гра-
фика. Градуировочная кривая имеет S-образную форму, так как, по сути, пред-
ставляет собой кривую титрования индикатора. Ограничения, связанные с
применением волоконно-оптических сенсоров для измерения pH и активности
ионов, указаны в [31, 32].
РИС. 16.34. Миниатюрный волоконно-оптический спектрометр. Коробка — это сам спектрометр.
Справа расположен источник излучения, которое по волоконно-оптическому кабелю попадает в
кювету. Второй кабель передает прошедшее через образец излучение в спектрометр.
(С разрешения Ocean Optics, Inc.)
80
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Если фермент, например пенициллиназа, иммобилизован вместе с соответ-
ствующим индикатором, сенсор превращается в биосенсор для определения пе-
нициллина. Фермент катализирует гидролиз пенициллина, при этом образуется
пеницилловая кислота, что вызывает уменьшение pH.
Волоконно-оптические датчики разработаны для кислорода, СО2, щелоч-
ных металлов и других аналитов. Для их успешной работы индикаторная реак-
ция должна быть обратимой.
Миниатюрные волоконно-оптические спектрометры
Созданы недорогие спектрометры, в которых оптические волокна использованы
или для пропускания света через кювету, или как датчики. Примером может слу-
жить спектрометр Ocean Optics S2000 (www.oceanoptics.com). Он содержит
2048-элементный матричный приемник с переносом заряда (ППЗ) — матричный
кремниевый детектор, который воспринимает световое излучение, прошедшее по
одножильному оптическому волокну, и диспергирует его посредством неподвиж-
ной дифракционной решетки по всей матрице. Внешний вид этого компактного
спектрометра показан на рис. 16.34. Есть модели для УФ, видимой и ИК-областей
(от 200 до 1100 нм) с различными источниками, решетками, оптическими волок-
нами и детекторами. Прибор предоставляет весь спектр в рабочем диапазоне длин
волн и снабжен программным обеспечением для анализа спектров.
Что мы узнали из этой главы?
• Длина волны, частота и энергия фотона [основные уравнения
(16.1Н16.3)] — стр. 6
• Как молекулы поглощают электромагнитное излучение — стр. 9
• Поглощение в УФ- и видимой областях и строение молекул — стр. 13
• Поглощение в ИК-области и строение молекул — стр. 20
• Инфракрасная спектрометрия в ближней области — стр. 22
• Спектральные базы данных — стр. 25
• Расчеты, основанные на законе Бера [основные уравнения (16.10),
(16.13)] —стр. 27
• Расчеты для смесей веществ [основные уравнения (16.16), (16.17)] — ис-
пользование электронных таблиц для вычислений — стр. 32, 35
• Использование электронных таблиц для расчета неизвестных концентра-
ций и их стандартных отклонений по градуировочному графику — стр. 36
• Спектрометры для УФ-, видимой и ИК-областей и их составные части—стр. 40
• Инфракрасные фурье-спектрометры — стр. 61
• Погрешности в спектрометрических методах анализа — стр. 64
• Флуориметрия — стр. 69
• Оптические сенсоры и волоконная оптика — стр. 76
ВОПРОСЫ
81
Вопросы
Поглощение излучения
1. Опишите процессы поглощения в дальней ИК, средней ИК- и видимой/
УФ-областях спектра.
2. Какие электроны обычно обусловливают поглощение УФ- или видимого
излучения?
3. Какие электронные переходы чаще всего происходят при поглощении
электромагнитного излучения? Какие из них дают наиболее сильное по-
глощение? Приведите примеры.
4. Какое условие необходимо для поглощения в ИК-области?
5. Какие типы молекулярных колебаний связаны с поглощением в ИК-области?
6. Чем отличается поглощение в ближней ИК-области от поглощения в сред-
ней ИК-области? Каковы основные преимущества измерения поглощения
в ближней ИК-области?
7. Дайте определения следующих понятий: хромофор, ауксохром, батохромный
сдвиг, гипсохромный сдвиг, гиперхромный эффект, гипохромный эффект.
8. Какое соединение в перечисленных ниже парах будет поглощать излуче-
ние с большей длиной волны и с большей интенсивностью?
а) СН3СН2СО2Н или СН2=СНСО2Н
б) СН3СН=СНСН=СНСН3 или СН3С=С—с=ссн3
в) ОСНз СН3
<5 <5
9. Смещается ли максимум поглощения в длинноволновую область и увели-
чивается ли интенсивность поглощения при переходе от первого соедине-
ния ко второму в перечисленных ниже парах?
а)
б)
в)
82
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
10. Почему кислотно-основные индикаторы изменяют цвет при переходе от
кислого раствора к щелочному?
11. Каков механизм поглощения излучения комплексами металлов?
Количественные соотношения
12. Дайте определение следующим понятиям: поглощение, оптическая плот-
ность, пропускание, пропускание в %.
13. Что такое коэффициент поглощения и молярный коэффициент поглощения?
14. Почему в максимуме полосы поглощения градуировочная кривая линейна
в более широком интервале концентраций, чем на плече полосы поглоще-
ния?
15. Перечислите растворители, которые можно использовать в УФ-, видимой и
ИК-областях. Укажите ограничения по длинам волн.
16. Что такое изобестическая точка?
17. Опишите и сравните различные причины отклонений от закона Бера. Что
такое истинные и кажущиеся отклонения?
Оборудование
18. Опишите источники излучения и детекторы для УФ-, видимой и ИК-облас-
тей спектра.
19. Опишите два типа монохроматоров (диспергирующих устройств), использу-
емых в спектрофотометрах, перечислите достоинства и недостатки каждого.
20. Обсудите влияние ширины щели на разрешение спектрометра и выполне-
ние закона Бера. Чем отличается ширина щели от спектральной ширины
щели?
21. Сопоставьте принцип работы одно- и двухлучевого спектрофотометров.
22. Почему приборы в ближней ИК-области демонстрируют хорошую чувст-
вительность, несмотря на слабое поглощение в этой области?
23. Опишите действие спектрометра с датчиком в виде линейки диодов.
24. Опишите действие интерферометра. В чем его преимущества?
25. Обратившись к рис. 16.28, ответьте на вопросы: какой цвет имеют кислый и
щелочной растворы в максимумах поглощения; какие должны быть свето-
фильтры для анализа этих растворов методом колориметрии? (Светофильтр
заменяет призму и щель.)
Флуоресценция
26. Опишите сущность явления флуоресценции. Почему флуориметрия обыч-
но более чувствительна, чем абсорбционная спектрометрия?
27. При каких условиях интенсивность флуоресценции пропорциональна кон-
центрации?
ЗАДАЧИ
83
28. Опишите оборудование для флуориметрии. Что такое первичный и вторич-
ный фильтры?
29- Предложите методику флуориметрического определения иодид-иона.
Задачи
Длина волны, частота, энергия
30- Выразите длину волны 2500 А в микрометрах и нанометрах.
31- Определите частоту (в Гц) и волновое число (в см-1), соответствующие
длине волны 4000 А.
32. Для ИК-спектрометрии чаще всего используют диапазон от ~2 до 15 мкм.
Выразите этот диапазон в ангстремах и обратных сантиметрах.
33. Моль фотонов (число фотонов, равное постоянной Авогодро) называется
эйнштейном излучения. Рассчитайте энергию (в кал) одного эйнштейна из-
лучения с длиной волны 3000 А.
Закон Бера
34. Некоторые спектрофотометры имеют шкалы, по которым можно считы-
вать или оптическую плотность, или пропускание в %. Какая оптическая
плотность соответствует пропусканию 20%; 80%? Какое пропускание со-
ответствует оптической плотности 0,25; 1,00?
35. Оптическая плотность раствора (концентрация 20 млн-1) ДНК неизвестной
молекулярной массы, выделенной из Escherichia со И, равна 0,80 в кювете
толщиной 2 см. Рассчитайте коэффициент поглощения молекулы.
36. Соединение с молекулярной массой 280 поглощает 65,0% излучения с
определенной длиной волны в кювете толщиной 2 см при концентрации
15,0 мкг/мл. Рассчитайте молярный коэффициент поглощения для данной
длины волны.
37. Титан взаимодействует с пероксидом водорода в 1 М серной кислоте с об-
разованием окрашенного комплекса. Рассчитайте: (а) оптическую плот-
ность, пропускание в %; (б) поглощение в % для 6,00 • 10-5 М раствора, если
2,00 • 10-5 М раствор поглощает 31,5% излучения с длиной волны 415 нм.
38. Соединение с относительной молекулярной массой 180 имеет коэффици-
ент поглощения 286 л/(см • моль). Чему равен молярный коэффициент по-
глощения?
39. Анилин (C6H5NH2) при взаимодействии с пикриновой кислотой дает сое-
динение, которое имеет коэффициент поглощения 134 л/(см • моль) при
359 нм. Чему будет равна оптическая плотность в кювете толщиной 1,00 см
1,00 • Ю-4 М раствора анилина после реакции с пикриновой кислотой?
84
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Количественные измерения
40. Лекарство толбутамин (молекулярная масса 270) имеет молярный коэффи-
циент поглощения 703 при 262 нм. Одну таблетку растворяют в воде и объ-
ем раствора доводят до 2 л. Оптическая плотность полученного раствора
составляет 0,687 в УФ-диапазоне при 262 нм (кювета 1 см). Сколько грам-
мов толбутамина содержится в таблетке?
41. Амины (слабые основания) образуют соли с пикриновой кислотой (тринит-
рофенолом); все пикраты аминов имеют максимум поглощения при 359 нм
с молярным коэффициентом поглощения 1,25 • 104. Навеску анилина
(C6H5NH2) 0,200 г растворяют в 500 мл воды. К аликвоте этого раствора
(25,0 мл) добавляют пикриновую кислоту и доводят объем до 250 мл. Алик-
воту (10,0 мл) полученного раствора разбавляют до 100 мл; этот раствор
анализируют при 359 нм в кювете толщиной 1 см. Если оптическая плот-
ность равна 0,425, какова чистота анилина (в %)?
42. Для определения фосфора мочу обрабатывают молибденом(У1) и затем
фосфомолибденовый комплекс восстанавливают аминонафтолсульфоно-
вой кислотой до молибденовой сини, которая поглощает при 690 нм. Паци-
ентом за 24 ч собрано 1270 мл мочи, ее pH 6,5. Аликвота (1,0 мл) мочи была
обработана молибдатом и аминонафтолсульфоновой кислотой, и объем
раствора был доведен до 50,0 мл. Ряд стандартных растворов фосфата был
также обработан аналогичным образом. Измерение оптической плотности
этих растворов при 690 нм относительно раствора сравнения дало следую-
щие результаты:
Раствор Оптическая плотность
1,00 млн-1 Р 0,205
2,00 млн-1 Р 0,410
3,00 млн-1 Р 0,615
4,00 млн-1 Р 0,820
Образец мочи 0,625
а) Определите количество фосфора (в г), выделенного за сутки.
б) Рассчитайте концентрацию фосфата в моче в ммолях на литр.
в) Рассчитайте соотношение НРО4" и Н2РО4 в моче. Для Н3РО4:
Кх = 1,1 • IO"2; К2 = 7,5 • 10“8; К3 = 4,8 • 10~13
43. Для спектрофотометрического определения железа(П) проводят его реак-
цию с 1,10-фенантролином, в результате которой образуется комплекс, интен-
сивно поглощающий при 510 нм. Рабочие стандартные растворы готовили из
исходного раствора железа(П), полученного растворением 0,0702 г сульфа-
та железа(П)-аммония (соли Мора) Fe(NH4)2(SO4)2 • 6Н2О в воде с добавкой
2,5 мл H2SO4 и доведением объема раствора до 1 л. Серию стандартных
ЗАДАЧИ
85
растворов готовили следующим образом: аликвоты исходного раствора
(1,00, 2,00, 5,00 и 10,00 мл соответственно) помещали в мерные колбы на
100 мл, добавляли раствор гидрохлорида гидроксиламина для восстановле-
ния следов железа(Ш) до железа(П), затем раствор фенантролина и, нако-
нец, общий объем доводили до 100 мл. Анализируемый образец помещали в
мерную колбу на 100 мл и обрабатывали таким же способом. Для приготов-
ления раствора сравнения добавили такое же количество реагентов в колбу
и довели объем до 100 мл. Определите содержание в образце железа (в мг),
если при измерении оптической плотности относительно раствора сравне-
ния были получены следующие результаты:
Раствор А
Стандарт 1 0,081
Стандарт 2 0,171
Стандарт 3 0,432
Стандарт 4 0,857
Образец 0,463
44. Нитратный азот в воде определяют реакцией с фенолдисульфоновой кис-
лотой, в результате которой образуется желтое соединение, имеющее мак-
симум поглощения при 410 нм. Образец объемом в 100 мл стабилизируют,
добавляя 0,8 мл H2SO4 на литр, и обрабатывают сульфатом серебра для
осаждения мешающих хлорид-ионов. Осадок отфильтровывают и промы-
вают, промывочную воду объединяют с фильтратом. Доводят pH получив-
шегося раствора до 7 с помощью разбавленного NaOH и выпаривают
досуха. Сухой остаток обрабатывают раствором фенолдисульфоновой кис-
лоты (2,0 мл) и нагревают на водяной бане, чтобы ускорить растворение. За-
тем добавляют 20 мл дистиллированной воды и 6 мл водного аммиака для
развития окраски. Объем полученного раствора доводят до 50 мл дистилли-
рованной водой. Раствор сравнения готовят из тех же реагентов, начиная с
дисульфоновой кислоты. Стандартный раствор нитрата готовят растворе-
нием 0,722 г безводного KNO3 и доведением объема до 1 л. Для градуиров-
ки по способу добавок в другую порцию образца (100 мл) добавляют
1,00 мл стандартного раствора и проводят все те же процедуры. Были полу-
чены следующие значения оптической плотности: раствор сравнения —
0,032; образец — 0,270; образец со стандартным раствором — 0,854. Чему
равна концентрация нитратного азота в образце (в млн-1).
45. Два бесцветных соединения А и В реагируют с образованием окрашенного
комплекса АВ, который поглощает при 550 нм и имеет молярный коэффи-
циент поглощения 450. Константа диссоциации комплекса равна 6,00 • 10^.
Определите значение оптической плотности раствора, полученного смеше-
нием равных объемов 0,0100 М растворов А и В (550 нм; толщина кюве-
ты — 1 см)?
86
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Расчеты для определения состава смесей
(Для решения систем уравнений можно использовать электронные таблицы.)
46- Соединения А и В поглощают в УФ-области. У соединения А максимум по-
глощения наблюдается при 267 нм (a = 157), а плечо — при 312 нм (а = 12,6).
Соединение В проявляет максимум поглощения при 312 нм {а = 186), по-
глощение при 267 нм отсутствует. Оптическая плотность раствора этих
двух соединений (толщина кюветы — 1 см) составляет 0,726 и 0,544 при
267 и 312 нм соответственно. Чему равны концентрации А и В (в мг/мл)?
47. Титан(ГУ) и ванадий(У) образуют окрашенные комплексы при обработке
пероксидом водорода в 1 М серной кислоте. Максимум поглощения тита-
нового комплекса наблюдается при 415 нм, а ванадиевого — при 455 нм.
Оптическая плотность раствора комплекса титана (1,00-10-3 М) составляет
0,805 при 415 нм и 0,465 при 455 нм, в то время как оптическая плотность
раствора комплекса ванадия (1,00-10-2 М) — 0,400 и 0,600 при 415 и 455 нм
соответственно. Образец сплава (1 г), содержащего титан и ванадий, рас-
творили, обработали избытком пероксида водорода и разбавили до объема
100 мл. Полученный раствор имеет оптическую плотность 0,685 при 415 нм
и 0,513 при 455 нм. Найдите содержание (в %) титана и ванадия в сплаве.
Флуоресценция
48. Выведите уравнение (16.24), связывающее интенсивность флуоресценции
с концентрацией.
Рекомендуемая литература
Общая
1. D. F. Swinehart, «The Beer-Lambert Law», J. Chem. Ed., 39 (1962) 333.
2. J. C. Lindon, Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry, G.E. Tranter and
J. L. Holmes, eds. San Diego: Academic, 1999. (В 3-х томах.)
3. J. Workman and A. Springsteen, Applied Spectroscopy. A Compact Reference
for Practitioners. San Diego: Academic, 1998. (Охватывает спектрометрию в
УФ, видимой и ближней ИК-областях.)
4. J. М. Chalmers, ed., Spectroscopy in Process Analysis. Boca Raton, FL: CRC
Press, 2000.
5. J. Workman, Handbook of Organic Compounds. NIR, IR, Raman, and UV-Vis
Spectra Featuring Polymers and Surfactants. San Diego: Academic, 2000.
(В 3-х томах.)
6. R. M. Silverstein and F. X. Webster, Spectrometric Identification of Organic
Compounds, 6th ed. New York: Wiley, 1997. (Есть перевод 3-го изд.: Р. Силь-
верстейн, Г. Басслер, Т. Моррил. Спектрометрическая идентификация ор-
ганических соединений. — М.: Мир, 1977.)
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
87
7. G. D. Christian and J. В. Callis, eds., Trace Analysis: Spectroscopic Methods for
Molecules. New York: Wiley, 1986.
8. G. H. Morrison and H. Freiser, Solvent Extraction in Analytical Chemistry. New
York: Wiley, 1975, pp. 189-247. (Колориметрическое определение метал-
лов.)
Каталоги спектров
9- Catalogue of Infrared Spectral Data. Washington, DC: American Petroleum Ins-
titute, Research Project 44. (Многотомная серия, начатая в 1943 г.)
10. Catalogue of Ultraviolet Spectral Data. Washington, DC: American Petroleum
Institute, Research Project 44. (Многотомная серия, начатая в 1945 г.)
11. «Infrared Prism Spectra», in The Sadtler Standard Spectra, Vols. 1-36; «Stan-
dard Infrared Grating Spectra’, in The Sadtler Standard Spectra, Vols. 1-16. Phi-
ladelphia: Sadtler Research Laboratories.
12. L. Lang, ed., Absorption Spectra in the Ultraviolet and Visible Regions, Vols.
1-23. New York: Academic, 1961-1979.
13. U.V. Atlas of Organic Compounds, Vols. I-V. London: Butterworths,
1966-1971.
14. «Ultraviolet Spectra», in The Sadtler Standard Spectra, Vols. 1-62. Philadelp-
hia: Sadtler Research Laboratories. (Обширный каталог ультрафиолетовых
спектров органических соединений.)
15. D. L. Hansen, The Spouse Collection of Spectra. I. Polymers, II. Solvents by Cy-
lindrical Internal Reflectance, III. Surface Active Agents, IV. Common Solvents —
Condensed Phase, Vapor Phase and Mass Spectra. Amsterdam: Elsevier Science,
1987-1988. (Общедоступное исследовательское программное обеспечение
с таблицами пиков.)
И К- спектрометрия
16. Р. R. Griffiths, Fourier Transform Infrared Spectrometry, 2nd ed. New York: Wi-
ley, 1986.
17. В. C. Smith, Fundamentals of Fourier Transform Infrared Spectroscopy. Boca
Raton, FL: CRC Press, 1996.
18. В. C. Smith, Infrared Spectral Interpretation. A Systematic Approach. Boca Ra-
ton, FL: CRC Press, 1999.
19. B. R. Singh, Infrared Analysis ofPeptides and Proteins. Washington, DC: Ame-
rican Chemical Society, 1999.
20. D. A. Bums and E. W. Ciurczak, eds. HandbookofNear-InfraredAnalysis, 2nd ed.
New York: Marcel Dekker, 2001.
21. R. Raghavachari, ed., Near-Infrared Applications in Biotechnology. New York:
Marcel Dekker, 2000.
88
ГЛАВА 16. МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ
Флуориметрия
22. A. Sharma and S. G. Schulman, An Introduction to Fluorescence Spectroscopy.
New York: Wiley, 1999.
23. С. E. White and R. J. Argauer, Fluorescence Analysis'. A Practical Approach.
New York: Marcel Dekker, 1970.
24. R. J. Hurtubise, Phosphorimetry. Theory, Instrumentation and Applications.
New York: VCH, 1990.
Волоконная оптика
25. К. T. Grattan and В. T. Meggitt, Optical Fibre Sensor Technology. Chemical and
Environmental Sensing, Vol. 4. Boca Raton, FL: CRC Press/Chapman Hall,
1999.
26. O. S. Wolfbeis, ed., Fiber Optic Chemical Sensors and Biosensors, Vols. 1 and 2.
Boca Raton, FL: CRC Press, 1991.
27. L. W. Burgess, M.-R. S. Fuh, and G. D. Christian, «Use of Analytical Fluores-
cence with Fiber Optics», in P. Eastwood and L. J. Cline-Love, eds. Progress in
Analytical Luminescence, ASTM STP 1009, Philadelphia: American Society for
Testing and Materials, 1988.
28. M. J. Webb, «Practical Consideration When Using Fiber Optics with Spectrome-
ters», Spectroscopy, 4 (1989) 9.
29. W. R. Seitz, «Chemical Sensors Based on Fiber Optics», Anal. Chem., 56 (1984)
16A.
30. W. R. Seitz, «Chemical Sensors Based on Immobilized Indicators and Fiber Op-
tics», CRC Crit. Rev. Anal. Chem., 19 (1988) 135.
31. J. Janata, «Do Optical Fibers Really Measure pH?» Anal. Chem., 59 (1987) 1351.
32. J. Janata, «Ion Optrodes», Anal. Chem., 64 (1992) 921 A.
33. M. A. Arnold, «Fiber-Optic Chemical Sensors», Anal. Chem., 64 (1992) 1015A.
Глава 17
МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
В предыдущей главе были рассмотрены методы спектрометрического определе-
ния веществ в растворе, основанные на поглощении энергии молекулами (органи-
ческими или неорганическими). Данная глава посвящена атомной спектроскопии.
Поскольку атомы представляют собой самую простую форму вещества и не мо-
гут вращаться или колебаться как молекулы, при поглощении ими энергии про-
исходят только электронные переходы. А так как переходы эти дискретны
(энергия квантована), получаются линейчатые спектры. Получение свободных
атомов (атомного пара) и измерения поглощаемого или испускаемого ими излу-
чения осуществляют по-разному.
В число основных методов, описанных в этой главе, входит пламенная
эмиссионная спектроскопия, в которой атомы в виде атомного пара образуются
в пламени; часть из них возбуждается термически или в результате столкнове-
ний до более высокого уровня электронной энергии, а потом возвращается в
основное состояние, испуская фотоны и порождая линейчатый спектр испуска-
ния (эмиссии). Описана также атомная абсорбционная спектроскопия, результа-
ты которой основаны на измерении количества излучения, поглощенного
атомами, генерированными в пламени или в минипечи и находящимися в основ-
ном состоянии. При этом получаются также линейчатые спектры поглощения.
Кроме того, в главе обсуждаются разные виды пламен, применяемых для испуска-
ния или поглощения, возможные мешающие влияния в пламени и использование
непламенных атомизаторов (электротермических минипечей) для повышения
чувствительности измерений в атомной абсорбции.
Атомная спектроскопия широко используется во многих лабораториях,
особенно при необходимости определения элементов, находящихся в образцах в
следовых количествах. Пробы из окружающей среды анализируют на содержа-
ние тяжелых металлов; в фармацевтических образцах определяют примеси ме-
таллов. Сталеплавильное производство нуждается в определении как примесных
компонентов, так и основных. Выбор конкретного метода анализа зависит от
требуемой точности, количества образцов для анализа, а также от необходимо-
сти проведения одно- или многоэлементного анализа. Далее мы узнаем о воз-
можностях разных методов.
90
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
17.1. Пламенная эмиссионная спектроскопия*
В этом методе, который прежде называли пламенной фотометрией, источником
энергии возбуждения служит пламя. Это низкоэнергетический источник, а сле-
довательно, спектры эмиссии просты и содержат небольшое число линий. Об-
разец вводится в пламя в виде раствора, поэтому метод очень удобен для
количественного анализа.
Суть метода состоит в том, что раствор вводится в пламя в тонкораспылен-
ном виде (в виде аэрозоля). Для этого используют горелки-распылители самых
разнообразных типов. Механизм получения атомного пара сложен, схема на
рис. 17.1 иллюстрирует этот процесс. Растворитель испаряется, остается дегид-
ратированная соль, которая в газовой фазе диссоциирует на свободные атомы,
исходно находящиеся в основном состоянии. Определенная часть этих атомов
может поглотить энергию пламени и перейти в возбужденное электронное со-
стояние. Однако время жизни атомов в возбужденном состоянии мало, поэтому
они возвращаются в основное состояние, испуская фотоны** с характеристиче-
ской длиной волны и энергией, равной hv. Их можно детектировать с помощью
обычных систем, включающих монохроматор и детектор.
Интенсивность эмиссии прямо пропорциональна концентрации определяе-
мого вещества в распыляемом растворе. Поэтому для градуировки строят кри-
вую интенсивности эмиссии как функции концентрации.
Как видно из рис. 17.1, побочные реакции в пламени могут снижать количе-
ство свободных атомов и, следовательно, испускаемый сигнал. Подробнее об
этом рассказано в разд. 17.3.
Ранее в пламенной фотометрии использовали относительно холодные пла-
мена. Но, как далее будет упомянуто, лишь малая часть атомов большинства
Са°*
Энергия
возбуждения
Энергия
Раствор Распыление диссоциации
СаС12 --------------► СаС12(г)------------
hv (Испускание)
Са’(г) +2СГ(г)
СаО* Энергия СаО Газы
СаОН* возбуждения СаОН * пламени
Энергия Энергия л .
----------► Са+-----г------►Са
ионизации возбуждения
В пламенных эмиссионных методах мы измеряем количество Са°*. В атомно-абсорбционных—Са°.
РИС. 17.1. Процессы, происходящие в пламени
Различие между терминами «спектрометрия (спектроскопия)» и «спектрофотометрия» объяснено в гл. 16.
Эта ситуация противоположна той, что наблюдается в растворах, где вероятность столкновений с молеку-
лами растворителя или другими частицами намного выше. В пламени же вероятность столкновений мала,
так как молекул мало. Поэтому многие атомы теряют энергию возбуждения в виде электромагнитного из-
лучения, а не в виде теплоты.
17.2. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЖДУ ОСНОВНЫМ И ВОЗБУЖДЕННЫМ СОСТОЯНИЯМИ
91
элементов возбуждается в пламени, поскольку доля возбужденных атомов рас-
тет с увеличением температуры. Таким образом, с помощью традиционной
пламенной эмиссионной спектроскопии можно было определять лишь относи-
тельно небольшое число элементов; круг таких элементов сужался еще и тем,
что не все элементы могли давать линейчатые спектры (некоторые элементы мо-
гут существовать в пламени лишь в виде молекулярных частиц, в частности ок-
сидных, и испускать молекулярные спектры). Поэтому методом пламенной
фотометрии в клинических лабораториях определяли только легко возбуждае-
мые щелочные металлы (натрий, калий и литий). В настоящее время, используя
такие пламена, как кислородно-ацетиленовое или М2О-ацетиленовое, определя-
ют более 60 элементов. И это несмотря на то, что лишь малая часть возбужден-
ных атомов способна к эмиссии. Высокая чувствительность достигается
благодаря тому, что здесь (как и для флуоресценции, см. гл. 16) сигнал (даже
слабый) измеряют относительно сигнала фона, имеющего очень низкое значе-
ние и принимаемого за нуль. Поэтому очень важно поддерживать на должном
уровне такие характеристики, как отклик и стабильность работы детектора и
стабильность (уровень шума) работы горелки.
17.2. Распределение между основным
и возбужденным состояниями: большинство атомов
находится в основном состоянии
Относительные заселенности основного (Nq) и возбужденного (Ne) состояний
при данной температуре пламени можно оценить с помощью уравнения Макс-
велла-Больцмана:
Ne _Se &-(Ее-Ей)/кТ
No go
(17.1)
где ge и g0 — статистические ёеса возбужденного и основного состояний соот-
ветственно, Ее и Ео — энергии двух состояний (Ее = hv, Eq обычно принимают
равной нулю); £—постоянная Больцмана (1,3805 • 10-16Эрг К-1); Т—абсолют-
ная температура. Статистический вес представляет собой число различных
электронных состояний с данной энергией; его можно найти с помощью кванто-
вомеханических расчетов.* (См. задачу 21.)
Статистический вес определяется выражением (2J +1), trqJ=L + S или L - S (взаимодействие Рассела-
Саундерса); L — квантовое число полного орбитального момента, представляемое узкой (sharp, 5), глав-
ной (principal, Р), диффузной (diffuse, D) и фундаментальной (F) сериями (L = 0, 1, 2 и 3 соответственно);
S — спин (±-|). Вся эта информация записывается в виде символа терма где N— главное квантовое
число, М— мультиплетность. Например, переход для линии натрия 589,0 нм (если опустить главное кван-
товое число N) записывается как 2SL-2PL, и ge/gQ = [2± + 1 ]/[2^ + 1] = | = 1.
92
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Почти все атомы определяемого элемента в газовой фазе находятся в основ-
ном состоянии. Высокая чувствительность в атомной эмиссии объясняется теми
же причинами, что и в флуориметрии. В отличие от абсорбционных методов
здесь измеряют сам сигнал, а не его уменьшение.
Относительные заселенности уровней для некоторых элементов при 2000,
3000 и 10000 К приведены в табл. 17.1. Видно, что даже для легко возбуждаемых
элементов (натрий) возбужденное состояние заселено мало, если не создавать
температур —10000 К, как в плазме. Элементы с линиями испускания в более ко-
ротковолновой области спектра (с более высокой энергией Av) требуют значите-
льно более высоких энергий для возбуждения; для них пламенная эмиссионная
спектроскопия, где температура редко превышает 3000 К, обладает низкой чув-
ствительностью. Для элементов с линиями испускания в более длинноволновой
области спектра характерна большая чувствительность метода. В случае измере-
ний сигнала, формируемого атомами в основном состоянии, как и в описывае-
мой далее атомной абсорбционной спектроскопии, чувствительность меньше
зависит от длины волны (т. е. от природы элемента). Из табл. 17.1 также можно за-
метить, что доля атомов, находящихся в возбужденном состоянии, зависит от тем-
пературы, а доля атомов в основном состоянии практически постоянна (так как в
основном состоянии при любой температуре остается —100% атомов).
Таблица 17.1
Значения Ne/NQ для разных линий испускания
Линия, нм N/N. е 0
2000 К 3000 К 10000 К
Na 589,0 9,9 • КГ6 5,9 • 10~4 2,6 • 10-'
Са 422,7 1,2- 10“7 3,7 • 10“5 1,0- ю-'
Zn 213,8 7,3 • IO’15 5,4 • 10-'° 3,6 • 10“3
В эмиссионных методах анализа сигнал формирует атомы в возбужденном
состоянии, а в атомно-абсорбционных методах (см. далее) — в основном состоя-
нии. Из-за протекания химических реакций в пламени, разница в чувствительно-
сти между пламенными эмиссионными и абсорбционными методами в области
длин волн более 300 нм не столь велика, как можно было бы ожидать из распреде-
ления Больцмана. Например, многие элементы частично реагируют с газами пла-
мени, образуя частицы оксидов или гидроксидов металлов. Такого рода реакции
одинаково влияют на заселенность основного и возбужденных состояний и оди-
наково зависят от температуры в методах обоих типов.
17.3. Атомно-абсорбционная спектроскопия
Атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС) родственна пламенной эмиссион-
ной спектроскопии, поскольку в обоих случаях для атомизации образца исполь-
зуется пламя. Мы обсудим факторы, влияющие на поглощение света атомами, и
сравненим эти методы между собой.
17.3. АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
93
Основы метода
Как и в пламенной эмиссионной спектроскопии раствор образца распыляют в
пламя, где элемент превращается в атомный пар. Некоторые из атомов элемента
подвергаются термическому возбуждению. Большинство же атомов остается в
основном состоянии, как видно из табл. 17.1. Эти атомы могут поглощать излуче-
ние определенной длины волны, которое генерируется специальным источником,
содержащим определяемый элемент (см. разд. «Источники»). Таким образом дли-
ны волн излучения источника такие же, как длины волн излучения, поглощаемого
атомами в пламени.
В своей основе ААС ничем не отличается от абсорбционной спектрофото-
метрии, описанной в гл. 16. Поглощение подчиняется закону Бера, т. е. оптиче-
ская плотность прямо пропорциональна длине оптического пути в пламени и
концентрации атомного пара в пламени. Обе эти величины трудно измерить, но
длину оптического пути можно поддерживать постоянной, а концентрация атом-
ного пара прямо пропорциональна концентрации аналита в распыляемом рас-
творе. Для проведения анализа строят градуировочный график в координатах
концентрация раствора—оптическая плотность.
Основной недостаток метода ААС (как мы увидим ниже) состоит в том, что
для каждого элемента нужен свой особый источник излучения.
Оборудование
Как и в случае молекулярной абсорбционной спектрофотометрии, прибор для
ААС должен иметь источник излучения, монохроматор и детектор, в роли «кю-
веты» выступает пламя, находящееся между источником и монохроматором.
Блок-схема атомно-абсорбционного спектрофотометра приведена на рис. 17.2
(показан двухлучевой прибор, который измеряет соотношение Pq/P). Пучок из-
лучения от источника с помощью прерывателя поочередно направляется то че-
рез пламя, то в обход его. Детектор также поочередно измеряет проходящее
излучение, и на дисплей выводится логарифм отношения Ро/Р. Усилитель детек-
на частоту
прерывателя)
Выходной сигнал
есть отношение
интенсивностей
двух лучей
Рис. 17.2. Блок-схема атомно-абсорбционного прибора [G. D. Christian and F. J. Feldman, Atomic
Absorption Spectroscopy. Applications in Agriculture, Biology, and Medicine. New York: Interscience,
1970]. С разрешения John Wiley & Sons, Inc.
94
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
тора настроен на излучение, модулированное частотой работы прерывателя, таким
образом устраняется постоянная составляющая, связанная с излучением пламени.
Двухлучевые спектрометры позволяют проводить коррекцию фонового по-
глощения (с применением дейтериевой лампы, см. ниже). Однако использова-
ние делителя излучения приводит к снижению лучистой энергии и увеличению
уровня шумов (уменьшению отношения сигнал/шум). Наряду с этим в настоя-
щее время существуют и однолучевые спектрометры с источниками излучения
высокой мощности, позволяющие осуществлять коррекцию фона путем измере-
ния фонового поглощения при длине волн, близкой к аналитической. В этом
случае достигается высокое соотношение сигнал/шум. Такие приборы меньше
по размерам и даже могут быть портативными.
Рассмотрим подробно узлы атомно-абсорбционного спектрофотометра.
1. Источники. В методе ААС требуется источник линейчатого спектра излуче-
ния, так как линии поглощения очень узкие (их полуширина составляет от не-
скольких тысячных до одной сотой нанометра). При использовании источника
непрерывного спектра через образец проходило бы и попадало бы на детектор
лишь очень маленькая доля излучения.
В ААС в качестве источника почти всегда используют лампы с полым ка-
тодом (рис. 17.3). Это источник линейчатого спектра, испускающий практически
монохроматическое излучение с характеристической длиной волны, энергия ко-
торого в точности соответствует энергии перехода поглощения атомов аналита.
Лампа состоит из цилиндрического полого катода, изготовленного из определя-
емого элемента или его сплава, и вольфрамового анода. Катод и анод помещены
в стеклянную трубку обычно с окошком, сделанным из кварца, поскольку инте-
ресующие линии часто находятся в УФ-области. Трубка заполнена инертным газом
(аргоном или неоном) при пониженном давлении. К электродам прикладывается
высокое напряжение, которое вызывает ионизацию атомов газа у анода. Поло-
жительно заряженные ионы разгоняются по направлению к катоду. Когда они
бомбардируют катод, то вызывают испарение некоторой части металла. Ионы
металла в парах возбуждаются до более высокоэнергетических электронных со-
стояний в результате столкновений с ионами газа. При возвращении электронов
в основное состояние испускается характеристическое для данного металла из-
лучение. Атомы газа, заполняющего лампу, также возбуждаются и излучают, но
линии этого излучения в спектре находятся далеко от аналитических линий и по-
этому не мешает анализу.
Атомный Анод Инертный
Полый катод
Устройство лампы с полым катодом
17.3. АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
95
Излучение лампы с полым катодом состоит из линий с длинами волн, рав-
ным длинам волн линий поглощения определяемого элемента, и потому при
прохождении через пламя поглощается этими атомами. Как правило (но не все-
гда), наиболее сильно поглощается линия, отвечающая наиболее вероятному
электронному переходу: обычно — из основного состояния в самое нижнее воз-
бужденное состояние. Эта линия называется резонансной. Линии, испускаемые
лампой-источником, уже, чем линии поглощения элемента в пламени, посколь-
ку в пламени температура и давление выше, чем внутри лампы. Поэтому линии,
испускаемые источником, поглощаются во всем их спектральном диапазоне.
Высокая селективность ААС обусловлена также тем, что вероятность перекры-
вания линий поглощения разных элементов очень мала (известны лишь единич-
ные случаи).
Иногда полый катод можно изготовить из сплава нескольких элементов, та-
кая лампа испускает линии всех этих металлов. Это так называемые многоэле-
ментные лампы с полым катодом. Их можно использовать в качестве источника
для определения двух или трех элементов. Срок службы такой лампы может
быть короче, чем у одноэлементной лампы, из-за селективного улетучивания
(«дистилляции») одного из элементов из катода с конденсацией на стенках
лампы.
2. Горелки. В большинстве коммерческих приборов используются горелки с
камерой предварительного смешения (смесительной камерой), иногда их на-
зывают горелками с ламинарным потоком (рис. 17.4). Топливо и газ-окисли-
тель смешиваются в камере, до того как попадают в сопло горелки (через щель),
где они сгорают. Раствор образца засасывается через капилляр вместе с га-
зом-носителем (обычно воздухом) благодаря эффекту Вентури. Воздух создает
разрежение на конце капилляра, заставляя раствор образца продвигаться по ка-
пилляру. На его конце раствор превращается в тонкий аэрозоль. Этот процесс
называется распылением.* Более крупные капли аэрозоля (до 90%) конденси-
руются и стекают из камеры. Оставшиеся (10%) мельчайшие капли смешивают-
ся с топливными газами и попадают в пламя.
Горелки со смесительными камерами обычно применимы только для пламен
с относительно низкой скоростью горения. Хотя большая часть распыленного
образца теряется в камере, эффективность атомизации (эффективность образо-
вания атомного пара) той части образца, которая попадает в пламя, высока, поско-
льку капли очень мелкие. Кроме того, велика оптическая длина пути. Горение в
таких горелках очень спокойное. Распространенный вариант горелки со смеси-
тельной камерой — горелка Бойлинга. Она имеет сопло с тремя щелями и дает
широкое пламя, что уменьшает искажение проходящего излучения на краях пла-
мени (рис. 17.4, б). Такая горелка деформируется легче, чем другие, поэтому не-
обходимо не допускать ее перегрева.
В методе ААС мы часто говорим об атомизации, имея в виду образование атомного пара. Не следует пу-
тать это с описанным выше процессом (на стадии распыления атомизация еще не происходит).
96
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
РИС. 17.4. Горелка со смесительной камерой: а — распылитель, камера и горелка; б — сопло
горелки [G. D. Christian and F. J. Feldman, Atomic Absorption Spectroscopy. Applications in Agriculture,
Biology, and Medicine. New York: Wiley-Interscience, 1970]. С разрешения John Wiley & Sons, Inc.
3. Типы пламен. Основные типы используемых в ААС и эмиссионной спек-
троскопии пламен перечислены в табл. 17.2; там же приведены их максималь-
ные температуры. Чаще всего в ААС применяют воздушно-ацетиленовое и
К2О-ацетиленовое пламена в горелках со смесительной камерой. Последнее
пламя является высокотемпературным. Оно не всегда необходимо и во многих
случаях может даже приносить вред, потому что вызывает ионизацию атомов
(см. ниже). Однако его использование очень удобно для элементов, склонных к
образованию термически устойчивых оксидов, не разрушаемых в воздушно-
ацетиленовом пламени (тугоплавкие металлы). Воздушно-ацетиленовое пламя
и другие пламена на основе углеводородов поглощают значительную часть из-
лучения с длинами волн менее 200 нм, поэтому в указанной области спектра для
обеспечения лучших результатов определения больше подходит аргоново-во-
дородно-воздушное пламя — бесцветное пламя, в котором окислителем слу-
жит воздух. Оно используется для определения таких элементов, как мышьяк
(193,5 нм) и селен (197,0 нм), которые выделяют из растворов образцов в виде
летучих гидридов (AsH3, H2Se) и в таком виде подают в пламя. Это пламя явля-
ется достаточно холодным, поэтому побочные химические реакции сильнее ска-
17.3. АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
97
Таблица 17.2
Температуры и скорости горения для распространенных видов пламени
Состав Максимальная скорость, см/с Максимальная температура, °C
Водород-кислород - 2677
Водород-воздух - 2045
Пропан-воздух - 1725
Пропан-кислород - 2900
Ацетилен-воздух 160 2250
Ацетилен-кислород ИЗО 3060
Ацетилен-Ы2О 180 2955
Водород-аргон-воздух - 1577
Данные взяты из книги [G. D. Christian and F. J. Feldman, Atomic Absorption Spectroscopy. Applicati-
ons in Agriculture, Biology, and Medicine. New York: Wiley-Interscience, 1970]. С разрешения John Wi-
ley & Sons, Inc.
зываются на результатах анализа (см. ниже). Н2О-Ацетиленовое пламя имеет
преимущества в тех случаях, когда возможны помехи из-за присутствия моле-
кул. Собственное поглощение этого пламени в области коротких длин волн от-
носительно невелико.
Для определения большого числа элементов методом пламенной эмиссион-
ной спектроскопии необходимо горячее пламя, поэтому используют Н2О-ацети-
леновое пламя. Кислородно-ацетиленовое пламя имеет высокую скорость
горения, и его температура слишком высока: это может вызвать расплавление
обычной горелки со смесительной камерой. Поэтому нужны горелки со специ-
альным соплом из толстой нержавеющей стали. Для определения легко воз-
буждаемых элементов (натрий, калий) методом пламенной эмиссионной
спектроскопии предпочтительны «холодное» воздушно-пропановое пламя или
другие подобные пламена, так как при этом уменьшается степень ионизации
этих элементов.
Факторы, влияющие на результаты определения
(мешающие влияния)
Эти факторы можно разделить на три группы: спектральные, химические и фи-
зические. Мы кратко обсудим факторы каждой группы и отметим их роль в
эмиссионных и абсорбционных измерениях.
1 - Спектральные помехи. Они возникают в эмиссионном анализе, если другая
линия или полоса молекулярной эмиссии расположена настолько близко к ли-
нии определяемого элемента, что не отделяется монохроматором. Наиболее ме-
98
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
шает молекулярная эмиссия (оксидов или других молекул). Если атомы
постороннего элемента или молекулы способны поглощать излучение источни-
ка в ААС, то и там наблюдаются спектральные помехи. При применении источ-
ников линейчатого спектра излучения эта опасность становится меньше, но не
исчезает полностью.
Еще один источник помех в ААС — рассеяние или поглощение света твер-
дыми частицами, неиспарившимися каплями растворителя или молекулами в
пламени. Эта проблема особенно серьезна при работе в области длин волн менее
300 нм и при распылении растворов с высоким содержанием солей. Это погло-
щение называемое фоновым, можно учесть, измеряя поглощение при длине
волны вблизи линии определяемого элемента, но при которой элемент не погло-
щает. Фоновое поглощение наблюдается в достаточно широком диапазоне длин
волн, поэтому при длине волны резонансной линии и вблизи ее оно будет прак-
тически одинаковым.
Измерение фонового поглощения следует проводить при длине волны,
смещенной от линии поглощения по крайней мере, на удвоенную ее ширину
(см. гл. 16). Линия излучения, которая используется для коррекции, может при-
надлежать газу, заполняющему лампу с полым катодом, или быть «нерезонанс-
ной» линией какого-либо другого элемента. Можно также использовать близкую
линию излучения, испускаемого другой лампой.
В УФ-области, где поглощает большинство элементов и фоновое поглоще-
ние особенно велико, коррекцию фонового поглощения можно осуществлять
с помощью водородного или дейтериевого источника непрерывного спектра.
В видимой области можно использовать вольфрамовую лампу. Монохроматор
устанавливают на длину волны резонансной линии. Линейчатое излучение, ис-
пускаемое лампой с полым катодом, поглощается как атомами определяемого
элемента, так и фоном, а широкополосное от источника непрерывного спект-
ра — только фоном. Поэтому оптические плотности, зарегистрированные с по-
мощью лампы с полым катодом и источника непрерывного спектра, можно
просто вычесть друг из друга. На этом основано действие автоматических кор-
ректоров фона. Зеркало поочередно направляет на пламя излучение лампы с по-
лым катодом и излучение источника непрерывного спектра, поглощение
каждого измеряется и оптическая плотность для источника непрерывного спект-
ра автоматически вычитается из оптической плотности для излучения от лампы.
В результате получается значение оптической плотности атомов определяемого
элемента.
2. Влияние ионизации. В очень горячих пламенах заметная часть атомов ще-
лочных и щелочноземельных, а также некоторых других элементов может иони-
зироваться. Поскольку регистрируют сигнал только неионизованных атомов,
это может привести к уменьшению и сигнала эмиссии, и сигнала абсорбции, к
снижению чувствительности и нарушению линейности градуировочной зависи-
мости. Однако если в образце присутствуют другие легко ионизирующиеся эле-
менты (например, калий или цезий), то это приводит к увеличению концентрации
свободных электронов в пламени и подавляет ионизацию определяемого эле-
17.3. АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
99
мента. При этом сигнал испускания или поглощения увеличивается. Поэтому
влияние ионизации можно скомпенсировать, вводя постоянное количество лег-
ко ионизирующегося элемента в стандартные растворы и в раствор образца.
Признаком ионизации может служить отклонение градуировочного графика
вверх при более высоких концентрациях, поскольку ионизация усиливается при
низких концентрациях.
3. Образование термически устойчивых соединений. Раствор образца мо-
жет содержать химические частицы (обычно это анионы), которые в пламени
образуют с определяемым элементом термически устойчивые соединения. На-
пример, фосфат-анион с ионами кальция в пламени может давать пирофосфат
Са2Р2О7. Это приводит к уменьшению оптической плотности, поскольку сиг-
нал формируется свободными атомами. Обычно эту проблему можно устра-
нить или хотя бы уменьшить химическими приемами. В приведенном выше
примере в раствор можно добавить хлорид стронция или нитрат лантана в вы-
соких концентрациях (~1%). Эти вещества называют высвобождающими реа-
гентами, поскольку стронций или лантан связывают фосфаты и предотвращают
их взаимодействие с кальцием. Можно также добавить ЭДТА в достаточно вы-
сокой концентрации для образования хелата с кальцием. Этим его реакция с
фосфатом будет предотвращена, а хелат Са-ЭДТА легко диссоциирует в пла-
мени с образованием пара атомарного кальция. Подобные проблемы характер-
ны как для абсорбционных, так и для эмиссионных методов. Для их решения
можно также использовать более высокотемпературное пламя, например
М2О-ацетиленовое.
Более серьезные проблемы возникают, если анализируемый металл взаи-
модействует с газами, присутствующими в пламени. Такие элементы, как алю-
миний, титан, молибден и ванадий, реагируют с частицами О или ОН с
образованием термически устойчивых оксидов или гидроксидов металлов.
Они разлагаются только в высокотемпературных пламенах. Некоторые из этих
элементов не проявляют заметного поглощения или испускания в обычном
воздушно-ацетиленовом пламени. В таких случаях удобнее Ы2О-ацетиленовое
пламя. Обычно его используют в восстановительных условиях (при избытке
горючего газа). При этом образуется красная зона «вторичной реакции», со-
держащая много радикалов-восстановителей (CN, NH и других), которые в
условиях высокой температуры пламени разрушают оксиды или предотвраща-
ют их образование.
4. Физические факторы. Многие факторы, которые влияют на скорость подачи
образца в горелку и эффективность атомизации, можно рассматривать как фак-
торы физической природы. В их число входят непостоянство скорости газового
потока и вязкости образца (последнее связано с непостоянством температуры
или растворителя), высокое содержание твердых веществ, колебания температу-
ры пламени. Эти проблемы обычно разрешают или частой градуировкой, или
применением внутренних стандартов, что частично компенсирует изменения
физических параметров (см. ниже).
100
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Подготовка образца
В пламенных методах затраты времени на подготовку образца к анализу часто
сводятся к минимуму. Если мешающие факторы химической и спектральной
природы отсутствуют, то требуется лишь приготовить образец в виде разбавлен-
ного и профильтрованного раствора. Часто химическая форма аналита не имеет
значения, поскольку в пламени происходит диссоциация до атомарного состоя-
ния. Таким образом, некоторые элементы можно определять в крови, моче,
спинномозговой жидкости и других биологических жидкостях при помощи про-
стого распыления образца. Обычно их нужно разбавить водой, чтобы предотвра-
тить засорение горелки.
Следует отметить, что при приготовлении стандартных растворов всегда
необходимо соблюдать их соответствие матрице образца. Так, если требуется
определять свинец в бензине, для стандартов нужно использовать такой же со-
став растворителей, а не воду.
Химические факторы, мешающие анализу, часто можно устранить простым
добавлением раствора соответствующего реагента. Так, при определения каль-
ция сыворотку крови разбавляют в соотношении 1:20 раствором, содержащим
ЭДТА, чтобы предотвратить взаимодействие кальция с фосфатами. Натрий и ка-
лий в концентрациях, равных их содержаниям в сыворотке крови, добавляют к
стандартным растворам кальция, чтобы устранить влияние ионизации.
В обзоре [9] обсуждается применение метода ААС к анализу биологических
образцов. Этот метод широко используется для определения металлов в биоло-
гических жидкостях и тканях, в пробах окружающей среды (воздух, вода), а так-
же в анализах, связанных с профессиональными заболеваниями. Рутинное
применение пламенной эмиссионной спектроскопии к биологическим образцам
обычно ограничено определением щелочных и щелочноземельных металлов.
В клинических химических лабораториях пламенный эмиссионный метод в зна-
чительной степени вытеснен измерениями с помощью ионселективных электро-
дов (см. гл. 13).
Пределы обнаружения в атомно-абсорбционной
и пламенной эмиссионной спектроскопии
Пределы обнаружения различных элементов методом ААС и пламенным эмис-
сионным методом приведены в табл. 17.3. Следует различать чувствительность
и предел обнаружения в методе ААС. В литературе, посвященной ААС, под
чувствительностью понимают концентрацию, которая соответствует поглоще-
нию в 1% (0,0044 Л). Это лишь мера наклона градуировочной зависимости, кото-
рая ничего не говорит об отношении сигнал/шум (signal/noise, S/N). Предел
обнаружения — это концентрация, необходимая для получения сигнала, пре-
вышающего фоновый на утроенное его стандартное отклонение (см. гл. 3).
В целом для метода ААС характерны более низкие по сравнению с пламен-
ной эмиссионной спектроскопией пределы обнаружения для тех элементов, ко-
торые испускают излучение с длиной волны менее 300 нм. Для возбуждения их
17.3. АТОМНО-АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
101
Таблица 17.3
Пределы обнаружения для атомно-абсорбционной (ААС)
и пламенной эмиссионной (ПЭС) спектроскопии
Элемент Длина волны, нм Предел обнаружения, млн 1
ААСа ПЭС6
Ag 328,1 0,001 (в) 0,01
Al 309,3 0,1 (N)
396,2 0,08
Au 242,8 0,03 (N)
267,7 3
Са 422,7 0,003 (в) 0,0003
Си 324,8 0,006 (в) 0,01
Ей 459,4 0,06 (N) 0,0008
Hg 253,6 0,8 (в) 15
К 766,5 0,004 (в) 0,00008
Mg 285,2 0,004 (в) 0,1
Na 589,0 0,001 (в) 0,0008
Т1 276,8 0,03 (в)
535,0 0,03
Zn 213,9 0,001 (в) 15
а В качестве топлива взят ацетилен. Буква в скобках обозначает окислитель: в — воздух, N—N2O.
6 ИгО-ацетиленовое пламя.
эмиссии нужна очень высокая тепловая энергия. В интервале длин волн
300-400 нм оба метода показывают сопоставимые пределы обнаружения. В то
же время в видимой области преимущества у пламенной эмиссионной спектро-
скопии.
Электротермические атомизаторы
Хотя распыление в пламени — наиболее удобный и хорошо воспроизводимый
способ получения атомного пара, он относится к наименее эффективным с точки
зрения полноты превращения определяемого элемента в атомный пар. Общая эф-
фективность превращения в атомы присутствующих в растворе образца ионов
оценивается в -0,1%. Другой недостаток пламени — необходимость для распы-
ления довольно больших объемов (несколько миллилитров) анализируемого рас-
твора (несколько миллилитров) анализируемого раствора. Поэтому в ААС вместо
пламени используют и атомизаторы другого типа — электротермические.
102
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Электротермический атомизатор — это вид минипечи, в которой капля об-
разца испаряется и потом разлагается при высокой температуре, превращаясь в
облако атомного пара.
Эффективность атомизации для электротермических атомизаторов прибли-
жается к 100%, поэтому абсолютные значения пределов обнаружения нередко
уменьшаются в 100 и даже в 1000 раз по сравнению с использованием распыле-
ния в пламени. Рассмотрим атомизаторы, выполненные в виде печей сопротивле-
ния (графитовых печей). Хотя с ними не очень удобно проводить эмиссионные
измерения, они очень подходят для атомно-абсорбционных измерений. Схема
типичного электротермического атомизатора показана на рис. 17.5.
Обычно несколько микролитров образца помещают в расположенную гори-
зонтально графитовую трубку, на угольный стержень или танталовую ленту.
Трубка или стержень нагреваются за счет пропускания через них электрическо-
го тока. Образец сначала высыхает при низкой (-100-200 °C) температуре в те-
чение нескольких секунд, затем происходит пиролиз при температуре от 500 до
1400 °C и разрушение органического вещества. Оно приводит к образованию
дыма, который может рассеивать свет от источника. Дым удаляют потоком арго-
на. Наконец, образец подвергается быстрой термической атомизации при высо-
кой температуре (до 3000 °C).
Через атомизатор проходит луч света. Когда атомное облако достигает
луча, в течение короткого времени регистрируется узкий пик оптической плот-
ности. Его высота и площадь прямо пропорциональны количеству паров опреде-
ляемого элемента. Нагревание проводится в инертной атмосфере (например,
аргона) для предотвращения окисления графита или угля и образования терми-
чески устойчивых оксидов металлов.
Дейтериевая лампа
для коррекции
фонового поглощения
К источнику
напряжения
РИС. 17.5. Блок-схема спектрометра с электротермическим атомизатором
17.4. ГРАДУИРОВКА ПО МЕТОДАМ ВНУТРЕННЕГО СТАНДАРТА И СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК
103
Основная трудность в использовании электротермических атомизаторов
связана с тем, что мешающие факторы здесь выражены сильнее, чем в случае
пламени. Иногда их можно нивелировать, применял градуировку с добавлением
стандартного раствора непосредственно к пробе (способ добавок).
Часто при изменении состава матрицы меняется высота и форма аналитиче-
ского сигнала. В таких случаях большая точность результатов достигается в ре-
зультате интегрирования сигнала, т. е. измерения его площади.
Фоновое поглощение при электротермической атомизации более значите-
льно, чем при пламенной, особенно при анализе биологических образцов или
проб окружающей среды. Это связано с присутствием в последних оставшихся
после пиролиза органических веществ или солей матрицы. Поэтому обычно не-
обходима специальная коррекция ионового поглощения (см. выше).
Пределы обнаружения, указываемые производителями электротермиче-
ских атомизаторов, обычно находятся в диапазоне 10-1°-10-12 г и даже менее!
Пределы обнаружения в единицах концентрации зависят от объема образца. По-
следний, в свою очередь, зависит от состава матрицы и содержания определяе-
мого элемента. Предположим, что образец объемом 10 мкл анализируют на
содержание элемента с пределом обнаружения 10-11 г. Тогда предел обнаруже-
ния в единицах концентрации составляет 10-11 г на 0,01 мл или 10-9 г/мл. Это
соответствует 1 нг/мл или 1 млрд-1. Таким образом, даже при очень малом объе-
ме образца этот метод чрезвычайно высоко чувствителен.
Электротермические методы хорошо дополняют пламенные методы. По-
следние более пригодны в тех случаях, когда концентрация определяемого эле-
мента в образце достаточно высока и для выполнения исследования доступен
достаточный объем раствора. Они обеспечивают высокую воспроизводимость,
мешающие факторы обычно можно легко скомпенсировать. Когда же концентра-
ция аналита или доступный объем образца малы, необходимо применять электро-
термические методы, причем твердые вещества можно анализировать без
приготовления растворов. Электротермические методы относятся к наиболее
чувствительным аналитическим методам, поэтому градуировка и их проведение
обычно требуют большей тщательности.
17.4. Градуировка по методам внутреннего стандарта
и стандартных добавок
В методах атомной спектроскопии интенсивность сигнала часто меняется во
времени из-за непостоянства скорости газового потока и скорости распыления.
Точность анализа можно повысить с помощью метода внутреннего стандарта.
Например, простой пламенный эмиссионный спектрометр, предназначенный
для одновременного определения натрия и калия в сыворотке крови с примене-
нием излучения фиксированных длин волн и двумя детекторами, обычно
включает третью длину волны и соответствующий детектор для лития (внут-
ренний стандарт). Определенное количество лития добавляют во все стандарт-
104
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
ные растворы и образцы. Внутренний стандарт испытывает такие же мешающие
влияния, как и аналит. Прибор регистрирует и показывает отношение сигна-
лов K/Li и Na/Li. Например, если скорость распыления колеблется, каждый
сигнал реагирует на это в одинаковой степени, поэтому при данной концентра-
ции К или Na отношения сигналов остаются постоянными. В качестве примера
проведения градуировки с внутренним стандартом по сигналам аналита и
внутреннего стандарта можно рассмотреть задание с использованием элект-
ронных таблиц, приведенное в разд. 20.5.
Элемент, служащий внутренним стандартом, должен быть химически по-
добен аналиту; длины их волн поглощения не должны слишком сильно отлича-
ться. Обсуждение выбора внутреннего стандарта см. в работе [8].
Вторая трудность, с которой часто встречаются в пламенной спектроско-
пии, состоит в подавлении (или иногда усилении) сигнала матрицей образца, на-
пример, из-за высокой вязкости или химического взаимодействия с аналитом.
Чтобы уменьшить связанные с этим погрешности, используют градуировку по
способу стандартных добавок. Сначала измеряют сигнал образца. Затем к от-
дельной порции образца добавляют известное количество стандартного раство-
ра и снова измеряют сигнал. При обоих измерениях влияние матрицы
одинаково, а увеличение сигнала соответствует количеству определяемого ком-
понента в добавленном стандартном растворе. Отсюда можно рассчитать содер-
жание аналита при условии, что градуировочный график линеен. Чтобы
убедиться в этом, рекомендуется провести еще не менее двух измерений с до-
бавлением разных количеств стандарта.
Пример 17.1
Образец сыворотки крови анализируют на содержание калия методом пламен-
ной эмиссионной спектроскопии с применением добавки стандарта. К двум
аликвотам по 0,500 мл добавили по 5,00 мл воды. К одной порции добавили
еще 10,0 мкл 0,0500 М раствора КС1. Сигналы эмиссии в произвольных едини-
цах равны 32,1 и 58,6 соответственно. Чему равна концентрация калия в сыво-
ротке?
Решение
Количество добавленного стандарта
0,0100 мл • 0,0500 М = 5,00 • 10-4 ммоль
Ему соответствует сигнал
58,6 - 32,1 = 26,5 произв. ед.
17.4. ГРДЦУИРОВКА ПО МЕТОДАМ ВНУТРЕННЕГО СТАНДАРТА И СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК
105
Тогда количество калия в образце равно
5,00 • 10-4 ммоль • —е— = 6,06 • 10-4 ммоль
26,5 ед.
Это количество калия содержится в 0,500 мл сыворотки, т. е. его концентрация
равна
6,06 10-4 ммоль 1 1Л о ,
—----------------= 1,21 • 10-3 ммоль/мл сыворотки
0,500 мл сыворотки
Обычно при использовании метода добавок строят градуировочный гра-
фик, подобный тому, что показан на рис. 14.6; по оси Y откладывают сигнал
атомной эмиссии или оптическую плотность. Если объемы добавляемых стан-
дартных растворов значительны, проводят корректировку сигналов на разбавле-
ние, умножая их на (+ v)/ И-, где V]—исходный объем, v—добавленный объем
раствора.
Использование электронных таблиц:
способ нескольких добавок
Определение кальция в речной воде осуществляют методом электротермиче-
ской ААС, используя добавление нескольких порций стандартного раствора.
Четыре аликвоты объемом по 25,0 мл поместили в мерные колбы на 50 мл. Стан-
дартом служит раствор с концентрацией 2,50 млн-1. Его добавили во 2-ю, 3-ю и
4-ю колбы в объемах 1,00, 2,00 и 3,00 мл соответственно (в 1-ю колбу стандарт-
ный раствор не добавляют). Затем объемы всех растворов довели до 50 мл. Для
измерения взяли фиксированный объем каждого раствора. В результате были
получены следующие значения оптической плотности: 0,101, 0,183, 0,238 и
0,310 соответственно. Чтобы построить градуировочный график для расчета
концентрации кальция в образце и ее стандартного отклонения, используем
электронные таблицы.
Обратимся к уравнениям (16.18)-( 16.21) и приведенным рядом с ними элек-
тронным таблицам (см. гл. 16). Помимо описанных там статистических соотно-
шений, нам еще нужно выражение для вычисления стандартного отклонения
результата определения х (5Х):
g = $г / 1 |
m2Sxx
(17.2)
106
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Обратите внимание на сходство этого уравнения с уравнением (16.21). Значение
ус в данном случае равно нулю, поскольку нас интересует отрезок, отсекаемый
на оси абсцисс. Используем это уравнение для расчета стандартного отклонения
концентрации:
$ __CXSX __cxsx с bv - b! т (17.3)
Мы поставили знак минус, так как отсекаемый на оси отрезок есть число отрица-
тельное, в результате получается положительное значение Sc.
Суммарная оптическая плотность At является аддитивной величиной опти-
ческих плотностей образца и добавленного стандарта:
At = Ax + As (17.4)
V К A. = кСх — + кС. xVt Vt (17.5)
где Vx — объем образца (25,0 мл); Vs — объем добавленного стандарта; Vt — об-
щий объем (50,0 мл); Сх — неизвестная концентрация; Cs — концентрация стан-
дартного раствора (2,50 млн-1); к— константа пропорциональности. Поскольку
Vt — величина постоянная,
At = k!CxVx + k’CsVs (17.6)
где к! = k/Vt. График значений At в зависимости от Vs для серии растворов дает
прямую линию с тангенсом угла наклона к! Сs и отсекаемым на оси ординат от-
резком к! СXVX.
т = к’Сх (17.7)
b = k!CxVx Объединяя эти выражения, получаем (17.8)
сх = — mVx (17.9)
Далее можно перейти к следующим выражениям:
-b _ СХУХ т Cs (17.10)
Сх — Vr т (17.П)
(Здесь -Ыт — отрезок, отсекаемый на оси абсцисс.) Для расчета b и т будем ис-
пользовать электронную таблицу, а потом из них выразим Сх.
17.4. ГРАДУИРОВКА ПО МЕТОДАМ ВНУТРЕННЕГО СТАНДАРТА И СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК
107
А В С D Е . F - G н
1 Способ нескольких добавок: график и вычисления.
2 Объем с неизв. конц. Vx = 25,0 мл
3 Конц, станд. раств. Cs = 2,50 МЛН-1
Градуировочный график для способа добавок v = О ORRQ y 4- П 102Q
4 Vs, мл А.
5 0,00 0,101
6 1,00 0,176 птическая плотность о р р р < ГО GO \ о -г j о \О ООО R2 = 0,9988
7 2,00 0,238
8 ; 3,00 0,310
9
10 Наклон, гл: 0,0689
11 Отрезок на оси у, Ь: 0,1029
12 Отрезок на оси х, bv (-b/m): -1,49347 ( 3 Х<000
13 Сх, млн-1 0,149347 2,00 0,00 2,00 4,00
14 Объем стандартного раствора, мл
15 Sr: 0,003788
16 N:' 4
17 $ХХ- 5
18 Уave' 0,21
19 Станд. откл. для объема = Sv: 0,078569
20 Станд. откл. для неизв. конц. Сх = Sc: 0,007857
21 Ячейка СЮ = НАКЛОН(В5:В8,А5:А8)
22 Ячейка С11 = ОТРЕЗОК(В5:В8,А5:А8)
23 Ячейка С12 = Отрезок на оси х (bv) = -b/m =-С10/С11
24 Ячейка С13 = Неизв. конц. = Сх = -(Cs/Vx) х (bv) = ~(ВЗ/В2)*(С12)
25 Ячейка С15 = Sr = СТОШУХ(В5:В8,А5:А8)
26 Ячейка С16 = N = СЧЁТЗ(В5:В8)
27 Ячейка С17 = = Ы*ДИСПР(А5:А8) = С16*ДИСПР(А5:А8)
28 Ячейка С18 = yave = СРЗНАЧ(В5:В8)
29 Ячейка С19 = Станд. откл. для объема = Sr/m(1/N + ((0-yave)2)/((m2) х Sxx))1/2
30 = С15/С10*SQRT(1/C16+((0-С18)'2)/((С10-2)*С17))
31 С20 = Станд. откл. для неизв. конц. = Sc = -(Сх х Sv)/bv
32 = [-(С13*С19/С12)]
Найденное значение концентрации составляет (0,149 ± 0,008) млн-1. Обра-
тите внимание, что отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, равен -1,49 мл. Это соот-
ветствует добавлению 1,49 мл стандартного раствора с концентрацией 2,50 млн-1
к 50 мл; при разбавлении в соотношении 1 : 33,6 концентрация раствора образца
в колбе становиться равной 0,0745 млн-1. Образец объемом 25,0 мл был разбавлен
вдвое, поэтому концентрация образца составила (2 • 0,0745) или 0,149 млн-1, как и
рассчитано в ячейке С13:
-(CJVx){-blni) = -2,5/25(-1,49)
108
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Тот же результат можно получить другим путем: 1,49 мл • 2,50 мг/мл =
= 3,72 мг/50 мл = 0,0745 мг/мл в колбе с образцом (0,0745 млн-1), что соответст-
вует 0,149 млн-1 в исходном образце.
Предположим, что мы не разбавили растворы до 50 мл после добавления
аликвот стандартного раствора. Тогда Vt будет величиной переменной. Для п до-
бавлений общий добавленный объем VSn равен
п
VSn =TvSi
1=1
(17.12)
Например, для двух добавлений VSn = KS1 + что составляет 1,00 + 2,00 = 3,00 мл.
Общий объем VTn после п добавлений равен
VTn=yx+VSn=Vx^VSi
1=1
(17.13)
В том же примере после двух добавлений VTn = 25,0 + 3,00 = 28,0 мл.
Выражение для суммарной оптической плотности АТп при п добавлениях
может быть записано аналогично (17.5):
Аг„ = кСх^- + кС. (17.14)
JL П А уу □ уг V '
VTn УТп
где Сх — неизвестная концентрация в исходном объеме образца; Cs — концент-
рация исходного стандартного раствора; VTn — величина переменная, известная
для каждого добавления. Умножая правую и левую части на VTn, получаем
ATnyTn = kCxVx + kCsVSn (17.15)
Сравним полученное выражение с уравнением (17.6). Точно так же график зави-
симости ATnVTn от VSn (п — независимая переменная) дает прямую линию тан-
генсом угла наклона kCs и отрезком на оси ординат kCxVx\
m = kCs (17.16)
b = kCxVx (17.17)
От последних выражений можно перейти к уравнению (17.9), а затем — к (17.10)
и (17.11) для расчета неизвестной концентрации. Аналогичным образом можно
использовать электронную таблицу, но вместо зависимости At от строить гра-
фик зависимости ATnVTn от VSn. Это сделать несколько сложнее, зато, используя
такие расчеты, можно в ходе анализа не доводить растворы до заданного объема.
Можно модифицировать электронную таблицу так, чтобы из Vx и VSn автомати-
чески рассчитывалось значение VTn, а из него — значение ATnVTn.
ВОПРОСЫ
109
Что мы узнали из этой главы?
• Пламенная эмиссионная спектроскопия — стр. 90
• Распределение атомов в пламени по уровням энергии [основное уравнение
(17.1)] —стр. 91
• Атомно-абсорбционная спектроскопия: пламенная и электротермиче-
ская — стр. 92
• Внутренний стандарт и градуировка по способу добавок, использование
электронных таблиц [основные уравнения (17.5), (17.11)] — стр. 103, 105
Вопросы
Основные положения
1. Какую примерно долю составляют атомы в пламени, находящиеся в воз-
бужденном состоянии?
2. Опишите основы методов пламенной эмиссионной спектроскопии и атом-
но-абсорбционной спектроскопии.
3. Сравните методы пламенной эмиссионной спектроскопии и ААС по аппа-
ратурному оформлению, чувствительности и мешающим факторам.
4. Почему для ААС желателен источник линейчатого спектра излучения?
5. Объясните, почему пламенная эмиссионная спектроскопия часто не усту-
пает по чувствительности методу ААС, хотя лишь малая часть атомов мо-
жет быть термически возбуждена в пламени.
6 - В соответствии с уравнением Максвелла-Больцмана доля атомов в возбуж-
денном состоянии в пламени сильно зависит от температуры и от длины
волны излучения, а доля атомов в основном состоянии всегда остается при-
мерно постоянной и очень большой. Однако на практике в пламенной
эмиссионной спектроскопии и ААС для многих элементов зависимости
сигналов от температуры (при длинах волн линий >300 нм) примерно
одинаковы. Почему?
7- Объясните, почему спектры поглощения атомов состоят из дискретных ли-
ний, а не из широких полос, как у молекул.
8. Чем вызвано образование красной зоны в восстановительном М2О-ацетиле-
новом пламени?
9. Объясните, почему использование электротермического атомизатора при-
водит к значительному увеличению чувствительности в методе ААС.
10. Объясните, почему применение внутреннего стандарта («элемента сравне-
ния») повышает точность измерений в методе ААС.
Оборудование
11. Объясните принцип действия лампы с полым катодом.
12- Опишите горелку со смесительной камерой. Для каких пламен она подходит?
110
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
13. Объясните, почему излучение источника в атомно-абсорбционных спек-
трометрах обычно модулируют.
Факторы, влияющие на результаты анализа
14. Содержание свинца в морской воде определяли методом ААС. Комплекс
свинца с пирролидинкарбодитионатом (в виде аммониевой соли) проэкст-
рагировали метилизобутилкетоном и распылили в пламя. Со стандартным
раствором и раствором контрольного опыта поступили аналогичным обра-
зом. Раствор контрольного опыта показал нулевое значение поглощения
(измерения проводили на длине волны 283,3 нм). Однако из данных незави-
симого определения с применением инверсионной анодной вольтамперо-
метрии следовало, что атомное поглощение должно быть около 100%.
Предполагая, что результат вольамперометрического анализа верен, пред-
положите возможную причину ошибочных результатов атомно-абсорбци-
онного анализа и способ избежать этого в последующем.
15. Почему в методе ААС иногда необходимо высокотемпературное М2О-аце-
тиленовое пламя?
16. Почему в пламенных абсорбционных или эмиссионных методах к стандар-
там и образцам иногда добавляют соли калия высокой концентрации?
17. Химические факторы, влияющие на результаты анализа, сильнее проявля-
ются в «холодном» пламени, например воздушно-пропановом, однако это
пламя предпочтительно для определения щелочных металлов. Почему?
18. Проводя анализ раствора натрия с концентрацией 1 млн-1 с помощью пла-
менного эмиссионного метода, аналитик зафиксировал сигнал, равный 110.
Тот же раствор, содержащий дополнительно 20 млнг1 калия, дает сигнал,
равный 125. Сам по себе раствор калия этой концентрации сигнала не дает.
Объясните эти результаты.
Задачи
Чувствительность
19. Раствор свинца с концентрацией 12 млнг1 в атомно-абсорбционном методе
дает сигнал, соответствующий 8%-му поглощению. Какова чувствитель-
ность методики?
20. Для серебра чувствительность при определенных условиях атомно-абсорб-
ционного определения составляет 0,050 млн-1. Рассчитайте поглощение
для раствора серебра с концентрацией 0,70 млн-1.
Распределение Больцмана
21. Линии-228,8 нм у атома кадмия отвечает переход ^о-1^ • Рассчитайте отно-
шение Ne/N0 в воздушно-ацетиленовом пламени. Чему равна доля (в %)
атомов, находящихся в возбужденном состоянии? Скорость света —
3,00 • Ю10 см/с, постоянная — Планка6,62 • 10-22Эрг • с, постоянная Боль-
цмана— 1,380 • 10-16 Эрг • К-1.
ЗАДАЧИ
111
Количественные расчеты
22- Содержание кальция в растворе образца определяли методом ААС. Исход-
ный стандартный раствор кальция готовили растворением 1,834 г
СаС12 • 2Н2О в воде и доведением объема до 1 л. Затем этот раствор разбав-
ляли в соотношении 1:10. Для приготовления рабочих стандартов второй
раствор разбавляли в соотношениях 1 : 20, 1 : 10 и 1 : 5 соответственно. Об-
разец разбавляли в соотношении 1 : 25. Для устранения влияния фосфат-
ионов ко всем растворам до их разбавления добавляли хлорид стронция
так, чтобы получалась концентрация 1% (масса: объем). В качестве раство-
ра контрольного опыта был приготовлен 1%-й раствор SrCl2. Получены
следующие значения оптической плотности, зарегистрированные на лен-
точном самописце при распылении растворов в воздушно-ацетиленовом
пламени: контрольный опыт— 1,5 см; стандарты—10,6,20,1 и 38,5 см; об-
разец — 29,6 см. Найдите значение концентрации кальция в образце
(в млн-1).
23. Методом пламенной эмиссионной спектроскопии с использованием граду-
ировки по способу добавок определяли литий в сыворотке крови больных
маниакально-депрессивным психозом, принимающих карбонат лития. Об-
разец (100 мкл сыворотки, разбавленной до 1 мл) дает сигнал испускания
6,7 см (на самописце). Аналогичный раствор с добавкой 10 мкл 0,010 М
раствора LiNO3 дает сигнал 14,6 см. Предполагая линейную зависимость
между сигналом эмиссии и концентрацией лития, рассчитайте концентра-
цию лития в сыворотке (в млн-1).
24. Хлорид-ионы в образцах воды определяют косвенным методом с помощью
ААС, осаждая их в виде AgCl известным избыточным количеством AgNO3,
отфильтровывая осадок и измеряя концентрацию серебра, оставшегося в
фильтрате. Аликвоты по 10 мл образца и стандартного раствора хлорида
(концентрация 100 млн-1) были помещены в отдельные сухие конические
колбы . Затем в каждую пипеткой добавляли по 25 мл раствора нитрата се-
ребра. После некоторого времени, необходимого для осаждения, смеси
были частично перенесены в сухие пробирки для центрифугирования. По-
сле проведения центрифугирования каждый фильтрат исследовали методом
ААС с распылением образца. Раствор для контрольного опыта был обрабо-
тан так же, но вместо образца в него добавляли 10 мл деионизированной ди-
стиллированной воды. Рассчитайте концентрацию хлорид-ионов в воде,
если получены следующие результаты:
Контрольный опыт: 12,8 см
Стандартный раствор: 5,7 см
Образец: 6,8 см
112
ГЛАВА 17. МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Рекомендуемая литература
Общая
1 - L. Ebdon and Е. Н. Evans, eds., An Introduction to Analytical Spectrometry,
2nd ed. Chichester: Wiley, 1998.
2 - J. W. Robinson, Atomic Spectroscopy, 2nd ed. New York: Marcel Dekker, 1996.
3 - Web: G. M. Hieftje, «Atomic Spectroscopy-A Primer», www. spectroscopynow. com,
link to Education: Tutorials, or News & Features: Archives.
Пламенная эмиссионная и атомно-абсорбционная спектроскопия
4- J. A. Dean, Flame Photometry. New York: McGraw-Hill, 1960. Классический
учебник по основам методов.
5- Р. М. Hald, «Sodium and Potassium by Flame Photometry», in D. Seligson, ed.,
Standard Methods of Clinical Chemistry, Vol. II. New York: Academic, 1958,
pp. 165-185. Описано исследование сыворотки крови.
6- G. D. Christian and F. J. Feldman, Atomic Absorption Spectroscopy. Applicati-
ons in Agriculture, Biology, and Medicine. New York: Wiley-Interscience, 1970.
Описана процедура приготовления образцов.
7- К. W. Jackson, ed., Electrothermal Atomization for Analytical Atomic Spectro-
metry. New York: Wiley, 1999.
8. F. J. Feldman, «Internal Standartization in Atomic Emission and Absorption
Spectrometry», Anal. Chem., 42 (1970) 719.
9- G. D. Christian, «Medicine, Trace Elements, and Atomic Absorption Spectros-
copy», Anal. Chem., 41(1) (1969) 24A. Приведены данные о содержании мик-
роэлементов в биологических образцах.
Глава 18
ПРОБОПОДГОТОВКА:
ЖИДКОСТНАЯ И ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ
В следующей главе начинается обсуждение метода хроматографии, применяе-
мого для анализа проб сложного состава, в ходе которого множество аналитов
проходят через колонку, разделяются и детектируются на выходе из нее. Но очень
часто перед введением в хроматографическую колонку пробу нужно «очистить».
Для выделения аналитов из матриц сложного состава перед хроматографическим
анализом очень удобны жидкостная и твердофазная экстракция (сорбция) — два
родственных метода*. Экстракция оказывается полезной и для спектрофотомет-
рического анализа.
Экстракция основана на распределении растворенного вещества между
двумя несмешивающимися жидкими фазами. Этот метод исключительно удо-
бен для быстрого и полного разделения как органических, так и неорганических
веществ. В этой главе мы познакомимся с процессом распределения вещества
между двумя фазами и использованием его в химическом анализе для разделе-
ния веществ. Отдельно будет рассмотрена экстракция ионов металлов в органи-
ческие растворители.
Твердофазная экстракция (сорбция)** осуществляется на частицах твердой
фазы, с поверхностью которых связаны гидрофобные функциональные группы,
действующие подобно органической фазе в жидкостной экстракции. При этом
отпадает необходимость использования больших объемов органических раство-
рителей.
18.1. Константа распределения
Если растворенное вещество S распределяется между двумя фазами, то в усло-
виях равновесия (после встряхивания и расслоения фаз) с некоторыми допуще-
В дальнейшем, в соответствии с традицией, укоренившейся в отечественной литературе, жидкостная экст-
ракция будет, как правило, называться просто «экстракцией». —Прим, перев.
В отечественной литературе твердофазную экстракцию чаще рассматривают как разновидность не экст-
ракционных, а сорбционных методов. — Прим, перев.
114
ГЛАВА 18. ПРОБОПОДГОТОВКА: ЖИДКОСТНАЯ И ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ
ниями можно считать, что отношение концентраций вещества в обоих фазах
есть величина постоянная:
_[Sh
D [S]2
(18.1)
Величина KD называется константой распределения. Нижние
индексы относятся к фазам: фазе 1 (например, органический
растворитель) и фазе 2 (например, вода). Если константа распре-
деления велика, вещество будет обладать склонностью к пере-
ходу в фазу 1 вплоть до полного извлечения ее из фазы 2.
Основным оборудованием для экстракции служат делитель-
ные воронки. Пример одной из них изображен на рис. 18.1. Как
правило, вещества экстрагируют из водных растворов в органи-
ческие растворители, не смешивающиеся с водой. При этом
нейтральные органические вещества склонны переходить из
воды в органические растворители — «подобное растворяется в
подобном». После встряхивания смеси в течение некоторого
времени (обычно в пределах минуты) фазам дают расслоиться, а
затем сливают слой нижнего (более тяжелого) растворителя.
Многие вещества, например, слабые кислоты, в водных рас-
творах частично находятся в ионизированной форме. В таких
случаях на распределение веществ влияет pH. В качестве приме-
ра рассмотрим экстракцию бензойной кислоты (HBz) из водного
раствора в эфир. Будучи слабой кислотой, бензойная кислота ха-
рактеризуется константой кислотности Ка [см. уравнение (18.4)].
Константа распределения будет записана как
[HBz]e
[HBz]a
Рис. 18.1
Делительная
воронка
(18.2)
Здесь индекс е (ether) относится к фазе эфира, a a (aqueous) — к водной фазе. В то
же время часть бензойной кислоты в водной фазе находится в форме Bzr, доля
которой зависит от соотношения величин Ка и pH водного раствора. Поэтому ко-
личественного извлечения в этом случае можно и не достичь.
18.2. Коэффициент распределения
Более целесообразным бывает описание процесса распределения с помощью
другой величины — коэффициента распределения, представляющего собой
отношение общих (суммарных) концентраций вещества в каждой фазе. Для рас-
сматриваемого случая коэффициент распределения запишется как
18.2. КОЭФФИЦИЕНТ РАСПРВДЕЛЕНИЯ
115
[НВг]е
[HBz]a +[Bz-]a
(183)
Можно вывести соотношение между D и KD, используя выражения протекаю-
щих в системе равновесий. Константа кислотной диссоциации кислоты в водной
фазе Ка определяется выражением
_[H+]a[Bz~]a
[HBz]a
(18.4)
Отсюда
[Bz-]a
_*a[HBz]a
[Н+]а
(18.5)
Из уравнения (18.2) следует, что
[HBz]e = A?£)[HBz]a
Подставляя выражения (18.5) и (18.6) в (18.3), получаем:
^O[HBz]0
(18.6)
D =
[HBz]a +2Ca[HBz]a/[H+]a
(18.7)
D =-----------
1 + Ка/[Н+]а
(18.8)
В соответствии с этим уравнением в случае, если [Н+]а величина!) практи-
чески равна KD и, если значение KD велико, бензойная кислота будет экстрагиро-
ваться в эфирный слой. В этих условиях величина D максимальна. С другой
стороны, если [Н+] << Ка, то значение D оказывается практически равным вели-
чине KD\\^}a/Ka. Эта величина может быть малой, и бензойная кислота останется
в водной фазе. Таким образом, в щелочных средах бензойная кислота ионизирует-
ся и не экстрагируется, в то время как в кислых она существует главным образом
в недиссоциированной форме. Впрочем, этот вывод достаточно очевиден.
Как видно из выражений (18.8) и (18.1), полнота экстракции не зависит от
исходной концентрации экстрагируемого вещества. Это одно из важных досто-
инств экстракционного метода, благодаря которому он в равной мере применим
как к следовым содержаниям веществ (например, радиоактивных), так и к их вы-
соким концентрациям. Полнота экстракции не будет изменяться по крайней
мере до тех пор, пока не будет достигнута предельная растворимость в одной из
фаз или не начнутся побочные реакции в органической фазе — например, диме-
ризация проэкстрагированного вещества.
116
ГЛАВА 18. ПРОБОПОДГОТОВКА: ЖИДКОСТНАЯ И ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ
Разумеется, с изменением концентрации ионов водорода коэффициент рас-
пределения Z), характеризующий полноту экстракции, будет изменяться. В дан-
ном примере с ростом концентрации бензойной кислоты в растворе (если только
он не содержит буфера, поддерживающего величину pH постоянной — см. гл. 7)
кислотность будет увеличиваться.
При выводе уравнения (18.8) мы пренебрегли той долей бензойной кисло-
ты, которая находится в органической фазе в виде димера, и не стали включать
соответствующее слагаемое в числитель дроби. В соответствии с принципом Ле
Шателье с ростом концентрации степень димеризации возрастает. За счет этого
экстракционное равновесие сдвигается в сторону более полного перехода веще-
ства в органическую фазу. В подобных случаях полнота экстракции возрастает с
ростом концентрации. В качестве примера в задаче 12 предлагается вывести бо-
лее сложное выражение для коэффициента распределения бензойной кислоты.
18.3. Степень извлечения
Коэффициент распределения D не зависит от отношения объемов фаз. В то же
время доля вещества, переходящего в органическую фазу, от этого отношения
зависит. При использовании большего объема органической фазы в нее должно
перейти и большее количество вещества с тем, чтобы отношение его концентра-
ций в фазах осталось на прежнем уровне, удовлетворяющем выражению для ко-
эффициента распределения.
Доля проэкстрагированного вещества равна отношению его количества
(ммоль) в органической фазе к общему его количеству. Количество вещества
равно произведению молярной концентрации на объем. Отсюда степень извле-
чения равна
где Vo и Va — объемы органической и водной фаз соответственно. Из этого урав-
нения можно вывести (см. задачу 11), что степень извлечения связана с коэффи-
циентом распределения как
Если Vo = Va, то
100Z)
D + 1
(18.11)
18.4. ЖИДКОСТНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ
117
При равенстве объемов фаз вещество можно считать совершенно не экстрагиру-
ющимся, если D меньше, чем 0,001. Если же D больше 1000, экстракцию можно
считать количественной. С ростом величины D от 200 до 1000 степень извлече-
ния изменяется всего лишь от 99,5 до 99,9%.
Пример 18.1
20 мл водного раствора 0,10 М масляной кислоты встряхнули с 10 мл эфира. По-
сле разделения фаз с помощью титрования было установлено, что в водной фазе
осталось 0,5 ммоль кислоты. Найдите значения коэффициента распределения и
степень извлечения.
Решение
Общее количество масляной кислоты составило 2,0 ммоль, поэтому проэкстраги-
ровало 1,5 ммоль. Концентрация в фазе эфира составляет 1,5 ммоль /10 мл = 0,15 М.
Концентрация в водной фазе равна 0,0 ммоль/20 мл = 0,025 М. Отсюда
0,025
= 6,0
Поскольку проэкстрагировало 1,5 ммоль, степень извлечения составляет
(1,5/2,0) • 100% = 75%. Эту величину можно рассчитать и из полученного значе-
ния коэффициента распределения:
%£=-10°А°
6,0 + 20/10
= 75%
Из уравнения (18.10) видно, что степень извлечения можно увеличить за счет
уменьшения отношения Va/V0 — например, увеличивая объем органической
фазы. Однако более эффективный способ состоит в том, чтобы использовать тот
же самый суммарный объем органической фазы, но разделить его на маленькие
порции и последовательно экстрагировать ими вещество. Например, при вели-
чине Z), равной 10, и Va/V0 = 1, степень извлечения составляет около 91%. Если
уменьшить отношение Va/Vo до 0,5 (увеличив объем органической фазы вдвое),
степень извлечения возрастет до 95%. Однако если провести две последователь-
ные экстракции при Va/V0 = 1, общая степень извлечения составит 99%.
18.4. Жидкостная экстракция ионов металлов
Одно из важнейших областей применения экстракции — разделение катионов
металлов. После проведения соответствующих химических реакций ион метал-
ла можно перевести в органическую фазу. Экстракция ионов металлов позволя-
ет отделить их от мешающих компонентов матрицы, либо (опять-таки, после
118
ГЛАВА 18. ПРОБОПОДГОТОВКА: ЖИДКОСТНАЯ И ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ
необходимых химических превращений!) селективно отделить группу металлов
от остальных. Этот способ широко используется при спектрофотометрическом
определении ионов металлов, поскольку реагенты, необходимые для экстрак-
ции, очень часто образуют с ионами металлов окрашенные комплексы. Экстрак-
цию применяют и в пламенном варианте атомного абсорбционного анализа,
вводя пробу в пламя для повышения чувствительности в виде органического
раствора, а также для устранения матричных эффектов.
Экстракционное разделение ионов металлов можно осуществить несколь-
кими путями. Как отмечено ранее, незаряженные органические молекулы склон-
ны к переходу в органическую фазу, в то время как заряженные анионные
частицы остаются в полярной водной фазе. Это пример правила «подобное рас-
творяется в подобном». Ионы металлов не склонны переходить в органическую
фазу сами по себе. Чтобы заставить их это сделать, необходимо, во-первых, ней-
трализовать их заряд и, во-вторых, связать с каким-то веществом, подобным по
свойствам органическому растворителю. Есть два принципиально различных
способа осуществления этого.
Экстракция ионных ассоциатов
Один из способов состоит в том, что ион металла включают в состав объемной
частицы, которую затем связывают с ионом противоположного заряда с образо-
ванием ионной пары. Как правило, ион, образующий ионную пару, должен
быть большого размера. Например, хорошо известно, что Fe(III) можно количе-
ственно проэкстрагировать из солянокислых сред диэтиловым эфиром. Меха-
низм этой реакции еще не полностью изучен, однако существуют данные, что
хлоридный комплекс железа координируется с атомом кислорода растворителя
(вытесняющего связанную воду) и образует ассоциат с молекулой растворителя,
в свою очередь, координирующего протон:
{(С2Н5)2О: Н+, FeCl4[(C2H5)O]2}
Подобным образом ион уранила UO 2+ экстрагируется из азотнокислых растворов
в изобутанол в результате ассоциации с двума нитрат-ионами (UO , 2NO 3). При
этом ионы урана, вероятно, сольватируются молекулами растворителя и стано-
вятся ему подобными. Перманганат-ионы образуют ионные пары с ионами тет-
рафениларсония [(C6H5)4As+, МпО4]. Они подобны органическим веществам и
экстрагируются метиленхлоридом. Есть и множество других примеров экстрак-
ции ионных ассоциатов.
Экстракция хелатов металлов
Самый распространенный способ экстракции ионов металлов состоит в образо-
вании хелатных комплексов с органическими реагентами.
Как отмечено в гл. 9, хелатообразующий реагент содержит две или более
комплексообразующие группы. Многие из таких реагентов образуют окрашен-
18.4. ЖИДКОСТНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ
119
ные хелатные комплексы с ионами металлов; на этом основано спектрофотомет-
рическое определение соответствующих ионов. .Часто хелаты нерастворимы в
воде и выпадают в осадок. Но при этом они обычно растворимы в органических
растворителях — таких, как, например, метиленхлорид. Многие из органиче-
ских осадителей, упомянутых в гл. 10, могут быть использованы и для экстрак-
ции.
Процессы, протекающие при экстракции хелатов металлов
Большинство хелатообразующих реагентов являются слабыми кислотами и дис-
социируют в воде. При образовании хелата происходит замещение протона на
ион металла, и исходный заряд иона металла оказывается нейтрализованным.
Примером может служить дифенилтиокарбазон (дитизон), образующий хелат-
ный комплекс с ионом свинца:
Как правило, хелатообразующий реагент HR используют в виде раствора в
органическом растворителе. Он распределяется между двумя фазами и в водной
фазе диссоциирует как слабая кислота. Далее ион металла Ми+ взаимодействует
с п ионами R", образуя хелат MRn, который, в свою очередь, переходит в органи-
ческую фазу. Коэффициент распределения металла представляет собой отноше-
ние концентрации хелатного комплекса в органической фазе к концентрации
иона металла в водной фазе (концентрацией хелатного комплекса в водной фазе
часто можно пренебречь). Можно получить следующее выражение для коэффи-
циента распределения:
п = = (18.12)
[ми+]а [н+]:
Константа К включает в себя константу кислотности HR (Ка), константу устой-
чивости комплекса MRn (А^) и константы распределения (KD) для HR и MRn. Об-
ратите внимание, что коэффициент распределения не зависит от концентрации
металла (если только не превышена растворимость хелатного комплекса в орга-
нической фазе). HR часто берут в большом избытке, поэтому его концентрацию
можно считать величиной постоянной. Полнотой экстракции можно управлять,
изменяя значение pH или концентрацию реагента. Увеличение концентрации
120
ГЛАВА 18. ПР0Б0П0ДГ0Т0ВКА: ЖИДКОСТНАЯ И ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ
реагента в 10 раз увеличивает экстракцию в той же мере, что и увеличение pH на
одну единицу (т. е. снижение [Н+] в 10 раз). С увеличением п каждый из этих эф-
фектов становится выраженным сильнее. Если использовать высокие концент-
рации реагента, экстракцию можно проводить в более кислых средах.
Хелатные комплексы различных металлов экстрагируются при различных
значениях pH — некоторые практически при любой кислотности, некоторые то-
лько в щелочных растворах. Выбирая pH подходящим образом, можно достичь
селективной экстракции. Селективность можно повысить также разумным вы-
бором маскирующих реагентов, предотвращающих образование хелатных ком-
плексов с ионами посторонних металлов.
18.5. Ускоренная экстракция и экстракция в микроволновом поле
Ускоренная жидкостная экстракция — эффективный способ извлечения анали-
та из твердой матрицы в растворитель. Пробу и растворитель помещают в автоклав
и нагревают до 50-200 °C. При этом возникает высокое давление, позволяющее
проводить нагревание до температур выше температуры кипения. Под действи-
ем высокой температуры растворение аналита ускоряется. Как время экстрак-
ции, так и требуемый объем растворителя оказываются значительно меньше,
чем в случае экстракции при атмосферном давлении.
В ходе экстракции в микроволновом поле растворитель нагревают под
действием энергии микроволнового излучения. И в этом случае частицы анали-
та переходят из матрицы пробы в раствор. Этот способ является развитием метода
кислотного разложения в автоклавах, описанного в разд. 2.10. Автоклав, содер-
жащий пробу и растворитель, помещают в микроволновую печь таким же обра-
зом, как показано на рис. 2.27. Скорость экстракции определяется температурой
и природой выбранного растворителя (или смеси растворителей). Температура
нагревания при атмосферном давлении ограничена температурой кипения раство-
рителя. В автоклавах под давлением порядка 10 атм обычно создается темпера-
тура порядка 150 °C, что намного выше, чем типичные температуры кипения
большинства растворителей (50-80 °C). Смеси растворителей используют в тех
случаях, когда один из растворителей не поглощает микроволнового излучения.
Например, гексан прозрачен для микроволнового излучения и не нагревается в
микроволновом поле, но смесь гексана и ацетона нагревается быстро.
Материал для автоклавов должен быть инертным по отношению к исполь-
зуемым растворителям и прозрачным для микроволнового излучения. Их корпу-
са изготавливают обычно из полиэфиримидов, а вкладыши — из тефлона PFA.
В печь можно поместить несколько сосудов одновременно.
Микроволновую экстракцию можно проводить и при атмосферном давле-
нии. В этом случае необходимость в автоклавах отпадает (см. [6]). Для предот-
вращения испарения растворителя процесс проводят, чередуя циклы нагревания
и охлаждения. И в этом случае время экстракции существенно сокращается. Ин-
формацию о коммерческих системах для экстракции в микроволновом поле
можно получить на сайте http:www.cem.com.
18.6. ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ (СОРБЦИЯ)
121
18.6. Твердофазная экстракция (сорбция)
Несмотря на многие достоинства, метод жидкостной экстракции имеет свои
ограничения. Использующиеся растворители (при анализе водных растворов)
не должны смешиваться с водой. При встряхивании смесей растворителей часто
образуются эмульсии, а применение относительно больших объемов раствори-
телей создает проблему их последующей утилизации. Операции часто прихо-
дится выполнять вручную. Иногда требуется реэкстракция.
Использование твердофазной экстракции позволяет избежать множества
из этих трудностей. Этот метод получил широкое распространение для отделе-
ния аналитов от матрицы и их концентрирования — в частности, в ходе хроматог-
рафического анализа (см. следующую главу). В качестве твердой фазы применяют,
например, порошкообразный кремнезем с
химически привитыми к поверхности гидро-
фобными органическими группами или си-
ликагель (наиболее часто используемый) с
размером частиц порядка 40 мкм, к поверхно-
сти которых привиты углеводородные цепи
С18. Привитые цепи взаимодействуют с гид-
рофобными органическими веществами за
счет вандерваальсовых сил и извлекают их из
водной фазы при соприкосновении с нею по-
верхности сорбента. Такие же сорбенты испо-
льзуются и в высокоэффективной жидкостной
хроматографии (см. гл. 21).
Порошкообразную твердую фазу обычно
помещают в маленький патрончик наподобие
пластмассового шприца. Сверху наливают рас-
твор пробы и пропускают его через слой сор-
бента при помощи поршня (под действием
избыточного давления), вакуумного насоса
(под действием отрицательного давления) или
центрифугирования (рис. 18.2). При этом про-
исходит извлечение следовых количеств орга-
нических веществ, их концентрирование на
колонке и отделение от матрицы пробы. По-
сле этого сорбированные вещества элюируют
подходящим растворителем (например, мета-
нолом) и определяют— например, методом
хроматографии (см. гл. 19-21). Перед выпол-
нением анализа элюат можно дополнительно
сконцентрировать, выпаривая растворитель.
Рис. 18.2
Патрончик с твердой фазой и
шприц для элюирования под дей-
ствием избыточного давления
122
ГЛАВА 18. ПРОБОПОДГОТОВКА: ЖИДКОСТНАЯ И ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ
Кремнезем (основа)
--►Силы Ван- Привитая
дер-Ваальса группа
(С8)
Кремнезем (основа)
^•"Диполь-дипольное
притяжение или
водородные связи
OCON(CH3)2
РИС. 18.3. Твердофазные экстрагенты с различными механизмами действия (неполярные, поляр-
ные, ионные взаимодействия). По данным [N. Simpson, Am. Lab., August, 1992, р. 37]. Воспроизве-
дено с разрешения American Laboratory, Inc.
Для обеспечения экстракции веществ различных классов природу экстраги-
рующей фазы можно варьировать. На рис. 18.3 показаны примеры привитых фаз,
действие которых основано на силах Ван-дер-Ваальса, образовании водородных
связей (диполь-дипольном притяжении) и электростатическом притяжении.
После прививания гидрофобных групп частицы кремнезема приобретают
водоотталкивающие свойства. Поэтому сорбент необходимо кондиционировать
для того, чтобы он смог взаимодействовать с растворенными в воде веществами.
Для этого через слой сорбента пропускают метанол или аналогичный раствори-
тель. Он глубоко проникает в поры сорбента, после чего становится возможной
диффузия к привитой фазе молекул воды и аналитов. После кондиционирования
через сорбент пропускают воду, чтобы удалить избыток растворителя перед вво-
дом пробы.
Обычная последовательность действий в ходе твердофазной экстракции
проиллюстрирована на рис. 18.4. После кондиционирования осуществляется
сорбция аналита и других компонентов пробы на экстрагирующем сорбенте.
В процессе промывания удаляются некоторые мешающие компоненты, а в ходе
элюирования смывается аналит. При этом часть других компонентов пробы,
возможно, остается на сорбенте (это определяется соотношением их сил взаимо-
действия с твердой фазой и растворимости в элюенте). Подобная процедура ис-
пользуется для определения органических веществ в официальной методике
американского Агентства по защите окружающей среды (ЕРА) [9].
Патрончики для твердофазной экстракции
Сорбенты для твердофазной экстракции выпускают упакованными в шприце-
вые патрончики из полипропилена. Как правило, масса сорбента составляет
500 мг, а объем патрончика — 3-5 мл. Все большую популярность приобретают
патрончики меньшего объема— 1 мл, содержащие 100 мг сорбента. При их исполь-
зовании требуются меньшие количества пробы и растворителей, а время процесса
сокращается. Существуют патрончики еще меньшего размера, с содержанием
сорбента начиная с 10 мг. Однако маленькие патрончики, естественно, имеют
меньшую емкость. Для проб большого объема необходимо применять более
18.6. ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ (СОРБЦИЯ)
123
КОНДИЦИОНИРОВАНИЕ
Кондиционирование сорбента перед его
использованием позволяет обеспечить
воспроизводимость сорбции
интересующего (выделяемого) компонента
СОРБЦИЯ
Сорбированный аналит
• Мешающие компоненты матрицы
* Другие мешающие компоненты матрицы
ПРОМЫВАНИЕ
▲ Промывание колонки для удаления
части мешающих компонентов матрицы
ЭЛЮИРОВАНИЕ
• Оставшиеся мешающие компоненты
остаются на колонке
Очищенный и сконцентрированный
аналит готов к анализу
Рис. 18.4. Основные этапы твердофазной экстракции [N. Simpson, Am. Lab., August, 1992, р. 37].
Воспроизведено с разрешения American Laboratory, Inc.
крупные патрончики. Это может потребоваться, например, при анализе объек-
тов окружающей среды — таких, как воды с высоким содержанием загрязнений,
которые мешают определению и которые необходимо удалить.
Патрончики для твердофазной экстракции применяют для выделения фи-
зиологически активных веществ (лекарственные препараты, наркотики) из биоло-
гических проб. В этих случаях для повышения производительности их обычно
используют сериями, по 12 или 24 штук одновременно, в сочетании с вакуум-
ным насосом и автоматизированными жидкостными системами (рис. 18.5).
Наконечники для пипеток с твердофазными сорбентами
Процесс твердофазной экстракции можно автоматизировать. Используемые для
этого роботизированные системы на сегодняшний день сменили трехкоординатные
системы для манипуляций с жидкостями. Их основная функция — распределение
жидких проб при помощи наконечников для пипеток, заполненных твердофазным
экстрагентом и разработанных специально для этих целей (рис. 18.6). Их можно
использовать и при работе с ручными многоканальными пипетаторами (см. гл. 2).
124
ГЛАВА 18. ПРОБОПОДГОТОВКА: ЖИДКОСТНАЯ И ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ
Рис. 18.5
Вакуумный планшет
с 16 входами для
твердофазной экстракции.
С любезного разрешения
Alltech
Поток жидкости можно пропускать в обоих направ-
лениях, осуществляя, например, забор жидких проб
снизу, а пропускание элюента— сверху. Промыш-
ленно выпускаемые наконечники предназначены для
решения различных задач. Например, наконечник
ZipTipC4 производства фирмы Millipore служит для
обессоливания проб объемом 1 мкл, содержащих по-
рядка 100 фемтомолей (1 фмоль = 1 • 10-15 моль)
пептидов перед их определением методом жидко-
стной хромато- масс-спектрометрии. Каждый нако-
нечник используют только один раз и после этого
выбрасывают. Тем самым предотвращается опас-
ность любых взаимных загрязнений. Примеры разде-
лений при помощи наконечников с твердофазными
сорбентами, включая газовые хроматограммы слож-
ных смесей после их предварительной очистки,
можно увидеть на интернет-странице компании EST
Analytical (http://www.estanalytical).
Рис. 18.6
Одноразовые наконечники
пипеток для твердофазной
экстракции. С любезного
разрешения EST Analytical
Диски для твердофазной экстракции
Наконечники для твердофазной экстракции имеют малое поперечное сечение и
при работе с белковыми пробами часто забиваются. Однако твердофазные экст-
рагенты существуют и в виде фильтров (экстракционные диски), в которых час-
тицы кремнезема размером 8 мкм впрессованы в сеть из тефлоновых волокон.
Существуют и диски на основе стекловолокна, обладающие большей жестко-
стью. Экстракционные диски характеризуются большим сечением и меньшей
18.6. ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ (СОРБЦИЯ)
125
толщиной слоя сорбента. Поэтому при их использовании достигаются более вы-
сокие скорости потоков. Это бывает важно при анализе объектов окружающей
среды, когда приходится анализировать пробы больших объемов с низкими со-
держаниями аналитов. Кроме того, для дисков нехарактерно образование каналов
при протекании жидкости, что часто наблюдается для набивных патрончиков.
Однако если проба содержит твердые частицы, то может забиться и диск, поэто-
му их часто применяют в сочетании с предварительными фильтрами. Существу-
ют и дисковые патрончики; работа с ними не отличается от работы с обычными
патрончиками.
96-луночные планшеты для твердофазной экстракции
Для быстрого и селективного определения лекарственных и наркотических
средств очень удобна жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектро-
метрией (см. гл. 21). Время анализа пробы составляет 1-3 мин. Поэтому для об-
работки большого числа проб нужны особенно быстрые способы их подготовки.
В автоматизированных приборах для обработки большого числа проб широко
применяются 96-луночные планшеты с маленькими лунками (так называемые
микролитровые планшеты).
Для микролитровых 96-луночных планшетов разработаны специальные си-
стемы твердофазной экстракции, которые могут работать в автоматическом режи-
ме. Одна пластинка включает в себя сорбирующие элементы (в виде упакованных
слоев или дисков, содержащих частицы сорбента), расположенные рядами в
виде прямоугольника 8x12 (рис. 18.7). Такая пластинка покрывает стандартный
Рис. 18.7. 96-луночный планшет для твердофазной экстракции и вакуумное устройство с план-
шетом для сбора фракций
126
ГЛАВА 18. ПРОБОПОДГОТОВКА: ЖИДКОСТНАЯ И ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ
96-луночный планшет для биохимических исследований. С точки зрения химии
все процессы, протекающие при работе с такими планшетами, не отличаются ка-
кой-либо спецификой. Пропускание жидкости осуществляется при помощи ва-
куумного насоса или центрифуги (с использованием специального держателя).
Колонки имеют объем 1-2 мл и содержат 10-100 мкг сорбента. От количества
сорбента зависят объемы пробы и элюента, а также емкость по отношению к
аналиту и матричным компонентам. Чтобы сократить время сорбции и умень-
шить расход элюента, а также время, требуемое для выпаривания растворителя
после элюирования, следует использовать наименьшее количество сорбента,
обеспечивающее необходимую емкость.
Для разработки оптимальных условий твердофазной экстракции необходи-
мо исследовать влияние ряда факторов: природы твердой фазы, ее массы, объема
растворителя для кондиционирования, количества пробы, природы раствори-
телей для промывания и элюирования, размера частиц сорбента. Все эти факто-
ры легко изучить с использованием колонок. Однако для этого может потребо-
ваться лишь часть из 96 лунок стандартного планшета. Расходовать на это
целиком весь планшет было бы неэкономичным, поэтому разработаны модуль-
ные луночные планшеты со съемными пластмассовыми патрончиками, плотно
закрепляемыми в лунках. При такой конструкции возможно использовать лишь
часть патрончиков для разработки методики.
Другие сорбенты для твердофазной экстракции
Для выделения гидрофобных молекул имеются сорбенты с длинными углеводо-
родными цепями (С2(> или Сзо). Созданы так называемые «универсальные сорбен-
ты», позволяющие сорбировать группу структурно близких веществ. В качестве
примера на рис. 18.8, а изображена структура синтетического полимера на осно-
ве N-винилпирролидона (верхняя часть молекулы) и дивинилбензола (нижняя
часть молекулы). Он обладает гидрофильностью, достаточной для того, чтобы
смачиваться водой, и достаточной гидрофобностью для того, чтобы сорбиро-
вать органические вещества. Сульфированный вариант этого соединения
(рис. 18.8, 6) представляет собой смешанный сорбент, обладающий свойствами
как ионообменника, так и экстрагента; он способен удерживать большое число
физиологически активных веществ кислотной, нейтральной и основной приро-
ды. Такие смачиваемые сорбенты не нуждаются в кондиционировании.
Полимерные фазы
Наряду с наиболее распространенными твердофазными экстрагентами на осно-
ве кремнезема существуют и сорбенты на полимерной основе. Их достоинства-
ми являются устойчивость в широком интервале pH и отсутствие остаточных
силанольных групп, которые могут взаимодействовать, например, с ионами ме-
таллов или другими веществами катионной природы. Кроме того, частицы та-
ких сорбентов имеют сферическую форму, в то время как твердые экстрагенты
на основе кремнезема — неправильную форму. Можно создать полимерные ма-
18.6. ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ (СОРБЦИЯ)
127
Рис. 18.8
Структурные формулы «универсальных
сорбентов» производства Waters' Oasis:
а — сорбент HLB; б — сорбент МХС на
полимерной основе (внизу) и вещество
(лекарственное средство) пропанолол
основной природы — вверху); показаны
возможные виды взаимодействий
сорбируемого вещества с сорбентом
[D. A. Wells, LC-GC, 17(7) (1999) 600].
Воспроизведено с разрешения LC-GC
териалы, смачиваемые водой. Как правило, у полимерных сорбентов более вы-
сокая емкость, чем у сорбентов на основе кремнезема.
Двойные фазы
Расширить круг экстрагируемых соединений позволяет использование двух раз-
личных твердых фаз. В твердофазной экстракции работают со смешанными,
слоистыми и каскадными фазы Смешанная фаза представляет собой смесь сор-
бентов с двумя различными привитыми фазами, помещенную в один патрончик.
Примером может служить смесь силикагеля-С8 и катионообменника. Слоистые
фазы — это два слоя различных сорбентов, расположенные в патрончике друг
над другом. Система с каскадными фазами представляет собой два отдельных
патрончика, соединенные последовательно для более надежного разделения ве-
ществ. В первых двух случаях используется только один патрончик, поэтому со-
ответствующие системы легче поддаются автоматизации.
Твердофазная микроэкстракция
Твердофазная микроэкстракция — это вариант метода, требующий крайне
малых количеств растворителей и используемый обычно для концентрирования
аналита для газовой хроматографии (см. гл. 20). В его основе лежит явление ад-
сорбции. Адсорбция осуществляется на нити из плавленого кварца, покрытой
твердым адсорбентом, иммобилизованным полимером или их сочетанием. На
128
ГЛАВА 18. ПРОБОПОДГОТОВКА: ЖИДКОСТНАЯ И ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ
рис. 18.9 изображен микрошприц для твердо-
фазной микроэкстракции. Размеры нити
обычно составляют 1 см х ПО мкм. Нить
вставлена в игольчатый шприц. При помощи
твердофазной микроэкстракции можно рабо-
тать с твердыми, жидкими или газообразными
пробами. В течение определенного времени
при определенной температуре нить выдер-
живается в непосредственном контакте с про-
бой, если она газообразная или жидкая, или с
ее парами, если она твердая или жидкая. Для
повышения эффективности адсорбции анали-
та пробу во многих случаях перемешивают.
Затем аналит подвергают термической десор-
бции — как правило, уже непосредственно в
газовом хроматографе, вводя микрошприц в
инжектор.
Число пригодных для твердофазной мик-
роэкстракции адсорбентов невелико. Чаще
всего используют полидиметилсилоксан, эф-
фективный, в частности, для обзорного анали-
за летучих компонентов ароматизаторов,
применяемых в пищевой промышленности
(напитки, продукты питания и др.). Для сор-
бции неполярных летучих соединений толщи-
на покрытия составляет 100 мкм. Другим
примером адсорбентов служит полиакрилат,
используемый в виде покрытия толщиной
85 мкм. Этот полимер относительно неполя-
рен ввиду наличия метильных групп. Однако
за счет карбонильных групп он более полярен,
чем полидиметилсилоксан, и подходит для
экстракции полярных веществ средней лету-
чести.
Эпоксидный
полимер
Стержень из
нержавеющей
стали
Крышка
-*—Плунжер
Игла
шприца
Нить
Рис. 18.9
Схема устройства для твердофаз-
ной микроэкстракции [С. L. Art-
hur, D. W. Potter, К. D. Buchholz,
S. Motlagh and J. Pawliszn, LC-GC,
10(9) (1992) 656]. Воспроизведено
с разрешения LC-GC
Что мы узнали из этой главы?
• Константа распределения, коэффициент распределения [основные уравне-
ния (18.1), (18.3), (18.8)]—стр. 113, 114
• Степень извлечения [основное уравнение (18.10)] — стр. 116
• Жидкостная экстракция комплексов металлов, в том числе хелатных —
стр. 117
ЗАДАЧИ
129
• Ускоренная экстракция и экстракция в микроволновом поле — стр. 120
• Твердофазная экстракция (сорбция) — стр. 121
• Твердофазная микроэкстракция — стр. 127
Вопросы
1. Что такое константа распределения и коэффициент распределения?
2. Предложите способ отделения анилина C6H5NH2 (органическое основа-
ние) от нитробензола C6H5NO2 (крайне токсичен!).
3- Охарактеризуйте две принципиально различные экстракционные системы
для экстракции ионов металлов. Приведите примеры.
4. Какие равновесия имеют место при экстракции хелатных комплексов ме-
таллов?
5 - Чем определяется наибольшая концентрация хелатного комплекса металла
в органической фазе при его экстракции? А наименьшая концентрация?
6 - Объясните влияние pH и концентрации реагента на процесс экстракции хе-
латных комплексов металлов.
7. Что лежит в основе ускоренной экстракции?
8- На чем основана экстракция в микроволновом поле?
9- В чем отличие твердофазной экстракции от жидкостной?
10- Что такое твердофазная микроэкстракция?
Задачи
Количественные характеристики экстракции
11 - Выведите уравнение (18.10) из уравнения (18.9).
12. При выводе уравнения (18.8) мы пренебрегли тем обстоятельством, что
бензойная кислота в органической фазе частично существует в виде димера
(2HBz (HBz)2; константа димеризации Кр = [(HBz)2]/[HBz]2). Выведите
уравнение для коэффициента распределения бензойной кислоты с учетом
этого равновесия.
13- При экстракции 100 мл водного раствора двумя порциями органического
растворителя по 50 мл экстрагируется 97% вещества. Чему равно значение
коэффициента распределения?
14. Коэффициент распределения PdCl2 между три-н-бутилфосфатом и 3 М НС1
составляет 2,3. Какая доля (в %) PdCl2 будет проэкстрагирована из 25,0 мл
его 7,0 • 10-4 М раствора в 3 М НС1 10 мл три-н-бутилфосфата?
15. При использовании равных объемов водной и органической фаз экстраги-
руется 90% хелатного комплекса металла. Какой станет степень извлече-
ния, если объем органической фазы удвоить?
130
ГЛАВА 18. ПР0Б0П0ДГ0Т0ВКА: ЖИДКОСТНАЯ И ТВЕРДОФАЗНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ
Многократная экстракция
16- Покажите расчетами, какой способ экстракции будет более эффективным
для вещества с коэффициентом распределения 25,0 из 10,0 мл его водного
раствора: 10 мл органического растворителя или двумя порциями по 5,0 мл
того же растворителя.
17- Мышьяк(Ш) экстрагируется на 70% из 7 М НС1 равным объемом толуола.
Сколько мышьяка (в %) останется в водной фазе после трех экстракций то-
луолом?
Рекомендуемая литература
Экстракция
1 - G. Н. Morrison, Н. Freiser. Solvent Extraction in Analytical Chemistry. New
York: Wiley, 1957. Классическое издание. Подробным образом рассмотре-
на экстракция металлов.
2- J. Stary, The Solvent Extraction of Metal Chelates. New York: Macmillan, 1964.
Ускоренная экстракция и экстракция в микроволновом поле
3. В. Е. Richter, В. A. Jones, J. L. Ezzell, N. L. Porter, N. Avdalovic, and C. Pohl,
Jr., «Accelerated Solvent Extraction: A Technique for Sample Preparation»,
Anal. Chem., 68 (1996) 1033.
4. A. Zlotorzynski, «The Application of Micro wave Radiation to Analytical and
Environmental Chemistry», Crit. Rev. Anal. Chem., 25 (1997) 43.
5- ZuB. W. Renoe, «Microwave Assisted Extraction», Am. Lab., August (1994) 34.
6- K. Ganzler, A. Salgo, and K. Valeo, «Microwave Extraction. A Novel Sample
Preparation Method for Chromatography», J. Chromatogr., 371 (1986) 371.
Твердофазная экстракция
7- N. J. K. Simpson, ed., Solid-Phase Extraction, Principles, Techniques, and Ap-
plications. New York: Marcel Dekker, 2000.
8. J. S. Fritz, Analytical Solid-Phase Extraction. New York: Wiley-VCH, 1999.
9- Methods for the Determination of Organic Compounds in Drinking Water (Sup-
plement 1). Cincinnati Environment Monitoring Systems Laboratory, Office of
R&D, U. S. Environmental Protection Agency, 1990.
Твердофазная микроэкстракция
10- SPME Applications Guide Supleco (www.sigma-aldrich.com/). Более 600
ссылок, классифицированных в соответствии с областью применения, ти-
пом аналита или матрицы, условий экстракции.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
131
11. S. В. Hawthorn, D. J. Miller, J. Pawliszn, and C. L. Arthur, «Solventless Deter-
mination of Caffeine in Beverages Using Solid Phase Microextraction with Fu-
sed Silica Fibers», J. Chromatogn, 603 (1991) 185.
12. C. Arthur, L. Killiam, K. Buchholz, and J. Pawliszn, «Automation and Optimiza-
tion of Solid Phase Microextraction», Anal. Chem., 64 (1992) 1960.
13. Z. Zhang and J. Pawilszyn, «Headspace Solid Phase Microextraction», Anal.
Chem., 65 (1993) 1843.
14. J. Pawiliszyn and R. M. Smith, eds., Applications of Solid Phase Micro-extracti-
on. Berlin: Springer, 1999.
15. S. A. S. Wercinski, ed., Solid Phase Microextraction. A Practical Guide. New
York: Marcel Dekker, 1999.
Глава 19
ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
В 1906 г. русский ученый М. С. Цвет сообщил о разделении окрашенных компо-
нентов экстрактов из листьев растений на колонке, заполненной карбонатом
кальция, оксидом алюминия и сахарозой*. Предложенный им термин «хро-
матография» происходит от греч. хромо — цвет и графо — записывать. В тече-
ние десятилетий опыты Цвета оставались незамеченными; позднее были предло-
жены похожие методы, и сегодня известно несколько вариантов хроматографии.
Наиболее общее определение хроматографических методов звучит так: хрома-
тография — метод разделения компонентов, основанный на распределении этих
компонентов между двумя фазами — неподвижной и подвижной (вовсе не обя-
зательно, чтобы это происходило внутри колонки).
ИЮПАК рекомендует использовать следующее определение: хроматогра-
фия — физический метод разделения веществ, в котором разделяемые компо-
ненты распределяются между двумя фазами, одна из которых неподвижна, а
другая движется в определенном направлении относительно первой [L. S. Ettre.
Nomenclature for Chromatography. Pure and Appl. Chemistry, 65(4) (1993) 819-872].
Обычно неподвижная фаза находится в колонке, но она может быть нанесена и
на плоскость. Хроматографические методы приобрели значение при разделении
и анализе сложных смесей, существенно расширив возможности аналитической
химии. В этой главе изложены теоретические основы различных видов хрома-
тографии, включая процессы хроматографического разделения в колонке.
Все хроматографические методы относятся либо к газовой хроматографии
(ГХ), либо к жидкостной хроматографии (ЖХ)**. В газовой хроматографии раз-
деляют вещества, находящиеся в газообразном состоянии, используя различия в
адсорбции из газовой фазы. Этот метод основан на распределении вещества
между неподвижной твердой и подвижной газовой фазами (см. гл. 20). Жид-
костная хроматография подразделяется на эксклюзионную (ситовую) хроматог-
рафию (разделение основано на различиях в размерах частиц), ионообменную
(разделение основано на различиях в величине и знаке зарядов частиц) и высо-
Цвет открыл явление в 1903 году, причем он использовал только карбонат кальция для изучения хрома-
тографических процессов. — Прим, перев.
Второе сокращение в отечественной литературе используют редко. — Прим, перев.
19.1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ
133
коэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ; разделение основано на
различиях в адсорбции или распределении веществ). Основы жидкостной хро-
матографии (включая и плоскостной вариант — тонкослойную хроматографию,
ТСХ) изложены в гл. 21. Там же описан метод электрофореза, в котором разделе-
ние обусловлено электроосмотическими свойствами потока и зависит от знака и
величины зарядов частиц разделяемых веществ и их мобильности.
Наиболее широко применяются газовая хроматография (ГХ) и высокоэф-
фективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).
Зарождение современных методов жидкостной и газовой хроматографии
В июне 1941 г. в Лондоне на заседании Биохимического общества английские химики
А. Дж. П. Мартин и Р. Л. М. Синдж сообщили о разделении аминокислот белка шерсти
методом жидкостной хроматографии (названным ими распределительной хроматогра-
фией). За эту работу [Biochem. J. 35 (1941) 91 ] эти ученые в 1952 г. были удостоены Нобе-
левской премии (www.almz.com/nobel). В следующей статье ими уже было отмечено, что
«.. .подвижная фаза не обязательно должна быть жидкостью, в ее качестве может высту-
пать и пар, причем очень хорошее разделение летучих веществ может быть достигнуто в
колонках, в которых инертный газ пропускают над гелем, пропитанным нелетучим рас-
творителем». Однако вторая статья вышла во время Второй мировой войны и не была
замечена, поскольку многие библиотеки не получали журналов. Лишь в 1950 г., когда
на октябрьском заседании Биохимического общества Мартин со своим учеником
А. Т. Джеймсом успешно выступили с докладом о газожидкостной распределительной
хроматографии [А. Т. James, A. J. Р. Martin. Biochem. J. Proc., 48(1) (1950)], метод полу-
чил всеобщее признание. Так появились два наиболее мощных метода анализа, широко
используемых сегодня. Те, кто интересуется историческими аспектами этих открытий,
могут обратиться к статье [L. S. Ettre. The Birth of Partition Chromatography, LC-GC, 19(5)
(2001) 506].
19.1. Теоретические основы хроматографического разделения
В основе всех хроматографических методов лежит процесс установления равно-
весия между неподвижной и подвижной фазами. На рис. 19.1 схематически
изображен процесс разделения компонентов в хроматографической колонке.
Небольшой объем образца помещают в верхнюю часть колонки, заполненной
частицами неподвижной фазы. Подвижная фаза (растворитель) подается в ко-
лонку сверху и медленно по ней передвигается. Индивидуальные вещества взаи-
модействуют с неподвижной фазой по-разному.
(19.1)
134
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
Равновесие описывается константой распределения
К -[ХЬ
с [Х]т
(19.2)
где [Х]5 — равновесная концентрация компонента X в неподвижной (stationary,
индекс «5») фазе при достижении равновесия, [X]w — его равновесная концент-
рация в подвижной (mobile — индекс «т») фазе. На величину константы равно-
весия влияют температура и природа подвижной и неподвижной фазы.
В распределительной хроматографии эту константу также называют коэффици-
ентом распределения. Вещества с большими коэффициентами распределения
удерживаются неподвижной фазой сильнее, чем вещества с малыми коэффици-
ентами распределения и выходят из колонки (элюируются) позже. Отметим, что
полное равновесие между двумя фазами все же не достигается; часть молекул
аналита отстает, поэтому происходит уширение хроматографической зоны ве-
щества. Величина уширения зависит от скорости потока подвижной фазы и от
Рис. 19.1
Принцип хроматографического разделения
19.2. КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
135
РИС. 19.2. Распределение двух веществ А и В по мере продвижения по хроматографической ко-
лонке при хроматографическом разделении
степени сродства аналита к неподвижной фазе. Процесс хроматографического
разделения можно изобразить с помощью хроматограммы — зависимости кон-
центрации элюируемых компонентов от времени или от объема подвижной
фазы, пропущенной через колонку. На рис. 19.2 показано постепенное разделе-
ние двух компонентов А и В по мере передвижения хроматографических зон по
колонке. Заметим, что по мере продвижения веществ по колонке все хроматогра-
фические зоны уширяются, однако площадь, ограниченная хроматографическим
пиком, постоянна. Приемы уменьшения уширения пиков будут рассмотрены
ниже. Современные хроматографы оснащены проточной ячейкой детектора для
автоматического измерения концентрации элюируемых веществ.
Несмотря на то, что существует много различных видов хроматографии, в
первом приближении любой процесс хроматографического разделения можно
описать единообразно, с использованием выражения равновесия между двумя
фазами — подвижной и неподвижной. (Напомним, что полное равновесие ни-
когда не достигается.) При непрерывном поступлении подвижной фазы в колонку
анализируемые вещества распределяются между двумя фазами и элюируются, в
случае присутствия частиц со значительно различающимися коэффициентами
распределения смесь можно разделить.
19.2. Классификация хроматографических методов
Хроматографические процессы можно классифицировать по типам устанавли-
вающихся равновесий, которые зависят от природы неподвижной фазы.
Основные виды равновесий — это адсорбция, распределение, ионный обмен и
проникновение во внутренние поры.
136
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
Адсорбционная хроматография
В этом виде хроматографии неподвижная фаза является твердым веществом, на
котором адсорбируются компоненты пробы. Подвижная фаза может быть жид-
костью (жидкостно-твердофазная хроматография) или газом (газо-твердо-
фазная хроматография)} компоненты распределяются между двумя фазами в
результате протекания процессов сорбция/десорбция. Тонкослойная хроматог-
рафия (ТСХ) — отдельный вид адсорбционной хроматографии, в котором непо-
движная фаза является плоскостью, так как она нанесена на инертную пластинку,
а подвижная фаза является жидкостью.
Распределительная хроматография
В распределительной хроматографии неподвижная фаза — это жидкость, кото-
рую наносят на твердое инертное вещество. Подвижная фаза в этом виде хрома-
тографии может быть жидкостью (жидкостно-жидкостная распределительная
хроматография) или газом (газожидкостная хроматография, ГЖХ).
В обычном варианте жидкостно-жидкостного распределения используют
полярную неподвижную фазу (например, метанол, нанесенный на кремнезем) и
неполярную подвижную фазу (например, гексан). В результате полярные сое-
динения удерживаются, а неполярные элюируются. Такой вариант называют
нормально-фазовой хроматографией. Если применяют неполярную подвиж-
ную фазу и полярную подвижную фазу, то лучше удерживаются неполярные ве-
щества, а полярные вещества легко элюируются. Этот вариант называют
обращенно-фазовой хроматографией, и он более распространен.
Ионообменная и эксклюзионная хроматография
В ионообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используют
ионообменную смолу. Механизм разделения основан на ионообменных равно-
весиях. В эксклюзионной хроматографии сольватированные молекулы разделя-
ются по размерам и способности проникать через ситообразную структуру
неподвижной фазы.
Приведенная классификация — лишь одна из возможных классификаций ви-
дов хроматографии, и некоторые виды хроматографии можно рассматривать вме-
сте, например, газовую хроматографию для газо-твердофазной и газожидкостной
хроматографии. В любом случае именно от равновесных процессов будет зави-
сеть, какие вещества будут удерживаться, а какие — передвигаться вместе с элю-
ентом (подвижной фазой). В колоночной хроматографии колонку заполняют
маленькими частицами, которые можно использовать непосредственно в качестве
неподвижной фазы (для адсорбционной хроматографии) или покрывать тонким
слоем жидкой фазы (для распределительной хроматографии). В газовой хрома-
тографии в настоящее время наиболее часто пользуются капиллярными колонка-
ми, заполненными микрочастицами, или длинными капиллярами, внутренние
стенки которых покрыты жидкостью. Такие приемы, позволяющие значительно
повысить эффективность разделения, будут подробно рассмотрены в гл. 20.
19.2. КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
137
Номенклатура и терминология в хроматографии
При описании хроматографических процессов следует использовать терминологию и
обозначения, рекомендованные ИЮПАК (1993, [5]). Список терминов и определений в
хроматографии достаточно велик и содержит 54 страницы. Наиболее часто применяе-
мые термины в хроматографии и список их сокращений были опубликованы Л. С. Эттре,
возглавляющим комитет ИЮПАК [L. S. Ettre «The New IUPAC Nomenclature for Chroma-
tography». LC-GC, 11(7) (1993) 502]. Можно также обратиться к периодически обновляе-
мому словарю Мейджорса и Карра «Glossary of Liquid-Phase Separation Terms»
[R. E. Majors and P. W. Carr, LC-GC, 19(2) (2001) 124], www.chromatographyonline.com],
полный текст которого доступен на сайте www.zichiom.com/pdf/glossary.pdg. Авторы
включили в словарь терминологию, рекомендованную ИЮПАК.
Ниже приведены устаревшие термины и их современные эквиваленты:
Старое название Новое название
а Коэффициент селективности а Фактор разделения а
НЕТР (ВЭТТ) Высота, эквивалентная теоретической тарелке Н Высота тарелки 6
к’ Коэффициент емкости к Фактор удерживания
п Число теоретических тарелок N Эффективность, выраженная числом тарелок а
neff Эффективное (или действительное) число теоретических тарелок в еп То же самое г
Время выхода неудерживаемого компонента («мертвое» время) Время выхода неудерживаемого компонента («мертвое» время)
tr Время удерживания Ч Время удерживания
Исправленное время удерживания Исправленное время удерживания
W Ширина пика у его основания Wb То же самое г
а Пока в отечественной литературе эти термины встречаются редко. — Прим, перев.
6 Этот термин у нас не используют. — Прим, перев.
в Термин используется крайне редко, можно встретить его в переводе книги «Современное состоя-
ние жидкостной хроматографии» под ред. Дж. Киркленда, М.: Мир, 1974. —Прим, перев.
г В отечественной литературе разницы между старым и новым термином нет. — Прим, перев.
138
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
Кроме перечисленных терминов, в следующей главе будет использован еще
ряд понятий и их обозначений, характеризующих процессы, протекающих в га-
зовой и жидкостной хроматографии. Для большего удобства они приведены в
ниже:
А — вихревая диффузия = 2Xdp
X — коэффициент гомогенности упаковки колонки
dp— средний диаметр частиц
В — продольная (молекулярная) диффузия ~ 2yDM
у — коэффициент ограничения диффузии сорбентом
DM — коэффициент диффузии в подвижной фазе
С — сопротивление массопереносу между фазами
1
(кинетический фактор) =--—
6 DM
Ст — сопротивление массопереносу в подвижной фазе
Cs — сопротивление массопереносу в неподвижной фазе
L — длина колонки
и — линейная скорость подвижной фазы, см/с
й — средняя линейная скорость подвижной фазы, см/с
v —приведенная скорость
h — приведенная высота тарелки (ВЭТТ, деленная на диаметр частиц)
Rs — разрешение (пиков)
19.3. Теория эффективности хроматографических колонок
Уширение пиков в колоночной хроматографии — результат влияния несколь-
ких факторов, которое сказывается на эффективности разделения. Это влияние
поддается количественной оценке.
Концепция теоретических тарелок
Эффективность разделения на колонке можно выразить числом теоретических
тарелок (т. т.) данной колонки. Термин «теоретическая тарелка» взят из теории
дистилляционных процессов; в хроматографии теоретической тарелкой называ-
ют поперечное сечение колонки, на котором происходит один акт сорбции/десор-
бции, приводящий к установлению равновесия. Чем больше число теоретических
тарелок, тем выше эффективность колонки. Высоту, эквивалентную теорети-
19.3. ТЕОРИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНОК
139
ческой тарелке (ВЭТТ), Н, находят делением длины колонки на число теорети-
ческих колонок. Для того, чтобы избегать использования очень длинных
колонок, необходимо стремиться к тому, чтобы ВЭТТ была как можно меньше.
Концепция теоретических тарелок применима ко всем формам колоночной хро-
матографии, но легче всего параметры тарелок определить в газовой хроматог-
рафии.
На основании экспериментальных данных ВЭТТ можно рассчитать как
функцию дисперсии хроматографической зоны пика с2 и расстояния х, которое
эта зона прошла по колонке: с2/х (где и — стандартное отклонение хроматогра-
фического пика Гауссовой формы). Ширина пика на 1/2 его высоты, wh, равна
2,35с, а у основания пика — 4а (рис. 19.3). Число теоретических тарелок (N) для
вещества, элюирующегося из колонки длиной L, составляет L/H=Ьх/<з2 = Ь2/<з2.
Для полной длины колонки (х = L) N= 16 L2/w2b.
Тогда число теоретических тарелок, характеризующее эффективность ко-
лонки, можно рассчитать из хроматограммы как
(t Y
N=16
\™ь J
(19.3)
где N— число теоретических тарелок в колонке по отношению к конкретному
веществу; tR — время удерживания этого вещества; wb — ширина пика у его осно-
вания, измеренная в тех же единицах, что и время удерживания (см. рис. 19.3).
Вместо времени удерживания можно использовать объем удерживания VR. Сле-
РИС. 19.3. Определение числа теоретических тарелок при wb = 4сг
140
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
дует заметить, что w — на самом деле ширина, полученная продолжением каса-
тельных с каждой стороны пика до базовой линии. Чем уже пик, тем выше число
теоретических тарелок.
Число теоретических тарелок можно также оценить, исходя из ширины
пика на его полувысоте
N = 5-^k
w2h
(19.4)
Пример 19.1
Рассчитайте число теоретических тарелок по результатам хроматограммы, пред-
ставленной на рис. 19.3.
Решение
С помощью линейки измерим время удерживания (52,3 мм) и ширину пика (9,0 мм).
( 52 3 У
W=16 =540.
< 9,0 J
Как мы увидим ниже, полученный результат характеризует низкую эффектив-
ность этой колонки.
Из теоретического числа тарелок в колонке можно рассчитать эффектив-
ное (реальное) число тарелок с учетом поправки на «мертвый» (пустой) объем:
^eff
(е V
=16
)
(19.5)
где t'R — исправленное время удерживания'.
tR
(19.6)
a tM — время, необходимое для прохождения подвижной фазы через колонку,
т. е. время выхода неудерживаемого компонента. В газовой хроматографии пик
воздуха, введенного в колонку вместе с образцом, часто можно считать пиком
неудерживаемого компонента и принимать время его появления за tM.
Представленные уравнения, в которых для расчетов используют максиму-
мы пиков, справедливы для гауссовых пиков (см. рис. 19.3). Для асимметричных
же пиков (т. е. с размытым задним фронтом) эффективность лучше рассчитывать
с помощью уравнения Фолея-Дорсея [J. Р. Foley, J. G. Dorsey. «Equations for Cal-
culation of Figures of Merit for ideal and skewed Peaks», Anal. Chem, 55 (1983)
19.3. ТЕОРИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНОК
141
730-737]. Для графического расчета времени удерживания из максимума пика
опускают перпендикуляр и находят левую (А) и правую (В) составляющие ши-
рины пика на высоте 10% от полной высоты: А + В = w0 Р Отношение А/В есть
эмпирический фактор асимметрии (если пик симметричен, то А = В = | ширины
пика на высоте 10%).
По Фолею и Дорсею число теоретических тарелок находится как
= 41,7(^/w0;1)2
sys Л/5+1,25
(19.7)
Это уравнение связывает время удерживания и число теоретических тарелок со-
ответствующих пикам, уширяющихся по мере продвижения колонки.
Для симметричного пика (AIB = 1) N = 18,53(^/w01)2, что близко к теоре-
тическому числу Nq j = 18,42(^/w0 j)2. Таким образом, предложенное уравнение
подходит как для симметричных, так и асимметричных пиков.
Если число теоретических тарелок изве-
стно, то высоту Н, эквивалентную теоретиче-
ской тарелке (ВЭТТ), находят делением длины
колонки на число N (Н = L/N). Таким обра-
зом, ширина пиков связана с 77; пики стано-
вятся более узкими при меньших значениях
77. ВЭТТ может быть выражена в сантимет-
рах, миллиметрах и т. ^Действительную (или
эффективную) ВЭТТ (77eff) рассчитывают, ис-
ходя из действительного числа теоретических
тарелок (Heff = LWeff).
Как правило, ВЭТТ рассчитывают для
компонента, который элюируется из колонки
последним. В высокоэффективной жидкостной хроматографии для правильно
приготовленной колонки при размере частиц 5 мкм ВЭТТ должна составлять
2-3 диаметра частиц. Обычно ВЭТТ принимает значение от 0,01 до 0,03 мм.
Эффективность в газовой хроматографии.
Уравнение Ван Деемтера
Выражение зависимости ВЭТТ от суммарного влияния факторов различной
природы, проявляющегося в уширении пиков, для набивочной газохроматогра-
фической колонки называется уравнением Ван Деемтера:
Н = А + ~+Сй
и
(19.8)
где константы для заданной системы А, В и С являются тремя главными факторами,
определяющими ВЭТТ, aw — средняя линейная скорость газа-носителя (см/с).
142
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
Уравнение Ван Деемтера также подходит и для жидкостной хроматографии, в
которой влияние диффузии выражено слабее, а константы равновесия существенно
увеличиваются (см. ниже). Для жидкостной хроматогра-
фии й обозначает линейную скорость жидкой подвиж-
ной фазы.
Средняя линейная скорость й определяется как дли-
на колонки, деленная на время выхода неудерживаемого
компонента (см. рис. 19.3):
й = — (19.9)
Общей характеристикой потока в хроматографии
является линейная скорость потока (и). Но в газовой
хроматографии линейная скорость изменяется по длине
колонки в зависимости от сжимаемости газовой фазы.
Для этого в расчетах используют среднюю (усреднен-
ную) линейную скорость потока (и). В жидкостной хро-
матографии сжимаемостью подвижной фазы можно
пренебречь и поэтому можно считать, что й = и. В даль-
нейшем чаще будет применено обозначение и.
Влияние составляющих Л, В и С в набивочных ко-
лонках для газовой хроматографии представлено на рис.
19.4, на котором показана графическая зависимость
ВЭТТ от линейной скорости газа-носителя. На графике
А обозначает вихревую диффузию, зависящую от изви-
Вихревая диффузия
Продольная диффузия
Рис. 19.4
Кривая Ван Деемтера:
зависимость ВЭТТ от
линейной скорости потока
19.3. ТЕОРИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНОК
143
листых, различающихся по длине путей между частицами сорбента в колонке и
не зависящую от скорости газа-носителя или жидкой подвижной фазы. Этот па-
раметр учитывает неравномерность распределения частиц по размерам и неидеа-
льность геометрии частиц в колонке:
A =2Xdp (19.10)
где X — эмпирический параметр, характеризующий набивку колонки, и прини-
мающий значение для правильно заполненных колонок от 0,8 до 1,0; dp — сред-
ний диаметр частиц. Параметр А снижается при использовании частиц меньшего
размера правильной формы, и при более плотном заполнении (которое, к сожа-
лению, создает противодавление). Однако очень мелкие частицы твердого носите-
ля трудно поддаются плотной и равномерной упаковке в колонке, что способствует
появлению вихревой диффузии.
Параметром В обозначена продольная (осевая), или молекулярная, диф-
фузия компонентов пробы в потоке газа-носителя или жидкой подвижной фазы
вследствие концентрационного градиента внутри колонки. В результате моле-
кулы будут диффундировать к тем участкам, где их концентрация меньше. Диф-
фузия в подвижной фазе определяется как:
B=W>M (19.11)
где у — коэффициент, обычно равный 0,6-0,8; Dm — коэффициент диффузии.
Молекулярная диффузия зависит как от природы разделяемых компонентов, так
и газа-носителя (в газовой хроматографии этот параметр важнее). Поскольку
природа разделяемых компонентов для данного разделения постоянна, то изме-
нять значения В или В/й можно подбором газа-носителя, рабочего давления и
скорости потока. Высокие скорости потока снижают молекулярную диффузию,
особенно для более плотных газов, таких как азот или диоксид углерода, в отли-
чие от гелия или водорода. В отличие от газовой хроматографии в жидкостной
хроматографии вклад молекулярной диффузии в неподвижной фазе существен-
но меньше. В ГХ молекулярная диффузия будет существенна при линейных ско-
ростях ниже оптимального значения wopt, а в ЖХ она чаще всего незначительна
при обычных экспериментальных условиях. Обычно работают при линейной
скорости больше оптимальной, поскольку ВЭТТ практически не увеличивается,
а разделение происходит быстрее.
Параметр С характеризует сопротивление массопереносу между фазами
(в отечественной литературе его называют кинетическим фактором, или внут-
ренней диффузией). Он зависит от времени установления равновесия распреде-
ления компонента между двумя фазами и времени переноса вещества между
подвижной и неподвижной фазами. Параметр С также зависит от коэффициента
диффузии и размера частиц (поскольку при меньших размерах сокращается рас-
стояние между частицами, через которые диффундирует разделяемое вещество)
и приблизительно может быть рассчитан как:
1
С = -—^- (19.12)
144
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
Кроме этого, на параметр С влияют коэффициенты распределения и, следователь-
но, относительная растворимость компонента в жидкости, нанесенной на непо-
движную фазу (т. е. природа и количество жидкой фазы, а также и температура).
В адсорбционной хроматографии параметр С зависит от способности компонента
адсорбироваться на неподвижной фазе. Повышением растворимости газообразных
компонентов пробы в жидкости на неподвижной фазе (в газовой хроматографии) за
счет снижения температуры можно достичь такого уменьшения С, которое нель-
зя получить при увеличении вязкости жидкой фазы с целью более длительного
установления равновесия. Произведение Си также снижается при уменьшении
скорости потока, поскольку требуется большее время для установления равно-
весия. Кроме того, произведение Си можно минимизировать созданием более
тонких пленок жидкости на неподвижной фазе, поскольку при этом уменьшает-
ся диффузия внутрь этой фазы. В жидкостной хроматографии этот параметр яв-
ляется основным, поскольку диффузия в жидкой подвижной фазе — процесс
достаточно медленный. Здесь параметр С минимизируют, используя малые час-
тицы правильной формы, тонкие пленки на неподвижных фазах, подвижные
фазы с низкой вязкостью и высокие температуры.
Из уравнений (19.10), (19.11) и (19.12) получаем уравнение для правильно
заполненной колонки:
п 1 /7^
Н = \,5d +
Р й 6DM
(19.13)
Задача 11 и прилагаемый компакт-диск позволят вам провести подробные
вычисления в соответствии с уравнением Ван Деемтера и построить графики за-
висимости параметров Л, В/й к Си он линейной скорости й.
Поскольку скорость потока газа-носителя пропорциональна его линейной
скорости, можно получить зависимость ВЭТТ от скорости потока, подобной
представленной на рис. 19.4. Константы А, В и С будут иметь другие численные
значения, поскольку в уравнении (19.8) вместо линейной скорости й использо-
вана скорость потока.
Скорость потока следует подбирать таким образом, чтобы достичь оптима-
льного соотношения между молекулярной диффузией и массопереносом (кине-
тическим фактором). Для наиболее трудно элюируемых компонентов пробы с
целью достижения минимально возможной ВЭТТ все три параметра — Л, В/й и
Си — стремятся минимизировать. Наиболее удобно это делать с помощью гра-
фического решения уравнения Ван Деемтера (19.8), которое дает следующие па-
раметры /Zmin = А + 2-JBC при й = ^В/С). Большое значение также имеет и
форма зависимости графика при скорости выше оптимального значения z7opt.
Чем меньше наклон у правой ветви графика, тем большей эффективности можно
достичь при скоростях, близких к оптимальной линейной скорости.
19.3. ТЕОРИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНОК
145
Обычно эффективные набивочные колонки для газовой хроматографии со-
держат несколько тысяч теоретических тарелок, капиллярные колонки — около
10000 т. т. Значение ВЭТТ для колонки длиной 1 м при числе теоретических та-
релок 10000 составляет 100 см/10000 т. т. = 0,01 см*. В высокоэффективной жидко-
стной хроматографии обычно достигается эффективность до 400 т. т. на сантиметр,
а длина колонок составляет от 10 до 50 см.
Приведенная высота теоретической тарелки
в газовой хроматографии
Для сравнения эффективности различающихся колонок применяют относитель-
ный параметр — приведенную высоту теоретической тарелки (Л), не имеющую
размерности. Этот параметр получают делением ВЭТТ на диаметр частиц сор-
бента:
h = — (19.14)
dP
В правильно заполненной сорбентом колонке приведенная высота при оптималь-
ной скорости потока равна 2 или меньше. Для открытых капиллярных колонок
h = ^~ (19.15)
dC
где dc — внутренний диаметр колонки.
Для того, чтобы можно было сравнивать различные колонки в широком
диапазоне экспериментальных условий, расчеты приведенной высоты тарелки
проводят с использованием параметра приведенная скорость v, которую рассчи-
тывают по следующей формуле:
- d»
v — u—^— (19.16)
DM
(Для открытых капиллярных колонок вместо dp используют dc). Тогда приведен-
ное уравнение Ван Деемтера будет выглядеть:
h = A+—+Cv (19.17)
V
а уравнение (19.13) в приведенной форме:
й = 1,5 + — + - (19.18)
V 6
* Неудачный пример: в капиллярных колонках число т. т. обычно составляет от нескольких десятков тысяч
до сотни тысяч. 0,01 см (или 0,1 мм) — это очень большое значение для ВЭТТ. Оно должно быть примерно
в 10 раз ниже!). —Прим, перев.
146
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
Открытые капиллярные колонки в газовой хроматографии
Как будет показано в гл. 20, капиллярные колонки нашли широкое применение в
газовой хроматографии благодаря их высокой эффективности. Эти колонки не
заполняют сорбентом, поэтому параметр уравнения Ван Деемтера, характеризу-
ющий вихревую диффузию, для них отсутствует. Таким образом, для открытых
капиллярных колонок используют модифицированное уравнение Ван Деемтера,
или уравнение Голея\
Я = £+Сй
и
(19.19)
Голей предложил использовать капиллярные колонки в газовой хроматографии.
Он первым описал различия между ними и набивными колонками.
Высокоэффективная жидкостная хроматография.
Уравнения Губера и Нокса
Если уравнение Ван Деемтера применить к ВЭЖХ, то при больших скоростях
наблюдается значительное отклонение экспериментальных данных от теорети-
ческой кривой. Губер показал, что для адекватного учета кинетических факторов
необходимо дополнительно принимать во внимание массоперенос в неподвижной
и подвижной фазах:
(19.20)
Н = А+ В/и + Сти + Csu
Здесь й — линейная скорость подвижной фазы; константы Ст и Cs характеризу-
ют массоперенос в подвижной и неподвижной фазах соответственно. Это уравне-
ние известно как уравнение Губера. Параметр В этого уравнения, ответственный
за продольную диффузию, за исключением очень низких скоростей подвижной
фазы пренебрежимо мал. Он зависит от вязкостей подвижной фазы и анализиру-
емого компонента. Параметром А (вихревая диффузия), не зависящим от скоро-
сти, для жидких фаз можно пренебречь. Тогда ВЭТТ оценивают как:
Н = Стй + Csu (19.21)
Параметр Cs относительно постоянен; в этом случае образование застойных зон
подвижной фазы учитывает Ст (в порах частиц сорбента). На рис. 19.5 показана
зависимость ВЭТТ от линейной скорости в высокоэффективной жидкостной
хроматографии для частиц различного диаметра.
При очень низких скоростях для частиц малого диаметра молекулярная
диффузия ощутима и ВЭТТ увеличивается слабо. Причем для малых частиц сор-
бента в ВЭЖХ зависимость ВЭТТ от скорости потока выражена более слабо по
сравнению с зависимостью в газовой хроматографии. Для колонок, правильно
заполненных частицами с диаметром 5 мкм (этот размер частиц используется
наиболее часто), значения ВЭТТ обычно находится в диапазоне 0,01-0,03 мм
(10-30 мкм). Заметим, что рис. 19.5 соответствует этому.
19.3. ТЕОРИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНОК
147
Рис. 19.5
Кривые Ван Деемтера в ВЭЖХ для частиц
разного диаметра, иллюстрирующие
большую эффективность при
использовании наименьших частиц,
особенно при высоких скоростях потока.
Данные получены для образца
тл^ети-бутилбензола; внутренний диаметр
колонки — 4,6 мм, подвижная фаза: 65%
ацетонитрила — 35% воды [М. W. Dong,
М. R. Gant. LC-GC, 2 (1984) 294].
Опубликовано с разрешения
Эмпирическое уравнение для жидкостной хроматографии, учитывающие
отклонения от уравнения Ван Деемтера, было предложено Ноксом. В уравнении
Нокса, содержащем корень третьей степени из скорости, входят безразмерные
величины, поскольку физический смысл включенных в него параметров неясен:
Л = Лг1/3 +- + Cv
V
(19.22)
Параметр А обычно составляет от 1 до 2, причем большее значение характерно
для плохо заполненных колонок; В — около 1,5 и С—около 0,1. Таким образом,
для хорошей хроматографической колонки применимо следующее уравнение:
A = V1/3 + —+0,lv
V
(19.23)
Эффективность и размер частиц в ВЭЖХ
Эффективность колонки связана с размером частиц. Как уже было сказано ра-
нее, для хорошо заполненных в ВЭЖХ колонок высота тарелки составляет 2-3
средних диаметра частиц:
H = (2-3)dp (19.24)
На рис. 19.6 показаны зависимости числа теоретических тарелок от линейной
скорости при различном диаметре частиц (число тарелок приведено в логариф-
мическом масштабе). Влияние различий в размерах частиц наиболее существен-
но проявится в колонках равного диаметра при близких значениях продольной
148
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
Рис. 19.6
Зависимость числа
тарелок от линейной
скорости подвижной фазы
для 10-сантиметровых
колонок, заполненных
частицами разного
размера [J. Maclennan,
В. Murphy. Today's
Chemist at Work, February
(1994) 29]. Опубликовано
с разрешения Waters
Corporation
диффузии*. Более крупные частицы приведут к возникновению застойных зон в
колонке, поскольку молекулы анализируемого вещества будут проходить боль-
ший путь внутри пор частиц, что и приведет к уширению пиков.
Фактор удерживания в хроматографии
Фактор удерживания (коэффициент емкости) для пика вещества определяется как:
к _ ~ _ 2k
(19.25),
где tR — время удерживания (т. е. время, необходимое для выхода максимума
хроматографического пика), tM — время выхода неудерживаемого компонента
[см. уравнение (19.6)]. Большие значения фактора удерживания, с одной сторо-
ны, приводят к лучшему разделению, а с другой стороны, — к увеличению време-
ни элюирования. Таким образом, необходимо подбирать оптимальные условия
исходя из эффективности разделения и времени разделения. Фактор удержива-
ния можно повысить, увеличив объем неподвижной фазы. Изменение фактора
удерживания отражает частичное разрушение неподвижной фазы в колонке.
Через фактор удерживания и общее число тарелок можно выразить эффек-
тивное число тарелок:
( к л2
= (19.26)
I А: +1)
Объем хроматографической колонки включает объем неподвижной фазы и
пустоты, которые заполняются подвижной фазой. Объем пустот можно опреде-
Особого смысла в этом нет: поскольку сопротивление диффузии также зависит от размера частиц, то значе-
ние продольной диффузии тоже будет варьироваться при варьировании размеров продольных частиц. —
Прим, перев.
19.3. ТЕОРИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНОК
149
лить, исходя из объемной скорости подвижной фазы. Пустой объем эквива-
лентен объему подвижной фазы, необходимому для однократного промывания
колонки.
Пример 19.2
Рассчитайте фактор удерживания для хроматографического пика, изображенно-
го на рис. 19.3.
Решение
С помощью линейки измеряем следующие характеристики: tR = 52,3 мм и
tM = 8,0 мм. Тогда
^5ДЗ-Л0
8,0
Желательно, чтобы фактор удерживания принимал значение от 1 до 5. Если зна-
чение к слишком низкое, вещества будут быстро элюироваться из колонки и раз-
деление будет недостаточным. Большие значения к приводят к значительному
удерживанию и, таким образом, к увеличению времени разделения.
Разрешение в хроматографии
Разрешение двух хроматографических пиков рассчитывают по формуле:
^2 “ *Я1
(wM+ww)/2
(19.27)
где tRX и tR2 — времена удерживания двух соседних пиков (вещество 1 элюирует-
ся первым); wb — ширина пиков у основания. Величина^ характеризует способ-
ность колонки к разделению пиков двух веществ. Разрешение 0,6 необходимо для
того, чтобы различить два пика одинаковой высоты*. Разрешение 1,0 при пере-
крывании двух пиков равной ширины на 2,3% — минимальное требование для
надежного качественного анализа. При значении 1,5 и перекрывании площадей
пиков на 0,1% для пиков равной ширины и высоты удается достичь разделения
пиков до базовой линии.
Можно описать разрешение с использованием термодинамических пара-
метров без учета ширины пика. Фактор разделения (коэффициент селективно-
Обычно достаточным считают разрешение не менее 0,75. — Прим, перев.
150
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
сти) а — термодинамическая величина, которая характеризует относительное
удерживание разделяемых веществ:
а=й1 = ^.
б?1 ^1
(19.28)
где tRi и tR2 — исправленные времена удерживания [см. уравнение (19.6)]; кх и
к2 — соответствующие факторы удерживания [см. уравнение (19.5)]. Таким об-
разом, можно описать условия, когда пики будут хорошо разделяться, не учиты-
вая ширину пиков. Тогда разрешение можно записать как:
rs=l^[—-Y—'
4 V а Д *ave +1J
(19.29)
где kave — среднее из факторов удерживания двух пиков. Эта формула, показы-
вающая взаимосвязь удерживания и эффективности, уширения пиков и времени
удерживания [см. уравнение (19.3)], называется уравнением разрешения, или
уравнением Пурнелла. Поскольку число теоретических тарелок пропорционально L,
разрешение будет также пропорционально 7Z (только для набивных колонок),
т. е. увеличение длины колонки в 2 раза увеличит разре-
шение в д/2, или в 1,4 раза, а четырехкратное увеличение
длины колонки — в 2 раза. Естественно, времена удержи-
вания возрастут прямо пропорционально увеличению дли-
ны колонки. В случае асимметричных пиков при расчете
коэффициента селективности используют время удержи-
вания, которое определяют опусканием перпендикуляра
из максимума пика.
Число теоретических тарелок, необходимое для до-
стижения заданного разрешения пиков, можно рассчи-
тать по следующей формуле:
Z \2/ , 1\2
NTea = 167?2 ave +
4 1а-1Д k2 )
(19.30)
С учетом уравнения (19.26) можно рассчитать эффектив-
ное число теоретических тарелок:
Z х2
^req) =167?2
-17
(19.31)
Рисунки справа показывают, как увеличивается раз-
решение при увеличении N, к и а. Следует заметить, что
увеличение к связано с повышением времени удержива-
ния и уширением обоих пиков. Для колонок, заполненных
19.3. ТЕОРИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ КОЛОНОК
151
малыми частицами правильной формы, ширина хроматографических зон увели-
чивается в степени | в зависимости от расстояния, пройденного веществом по
колонке, в то время как разница между максимумами пиков прямо зависит от
пройденного расстояния. Разделение пиков достигается тем, что перемещение
хроматографических зон идет быстрее, чем их уширение.
Как уже было отмечено выше, для повышения разрешения пиков можно
увеличить число теоретических тарелок, т. е. длину колонки, однако это приве-
дет к возрастанию давления в системе. Более эффективно все же оптимизиро-
вать условия (например, состав сорбента и подвижной фазы), чтобы увеличить
селективность и фактор удерживания. Увеличение времени удерживания приве-
дет к большей продолжительности анализа, поэтому приходится выбирать меж-
ду продолжительностью процесса и разрешением.
Пример 19.3
Для этанола и метанола в капиллярной колонке для газовой хроматографии по-
лучили времена удерживания 370 и 385 с и ширину пиков у основания (и^) 16,0 и
17,0 с соответственно. Пик неудерживаемого компонента выходит за 10,0 с. Вы-
числите коэффициент разделения и разрешение пиков.
Решение
Используя уравнение (19.3), найдем число теоретических тарелок для наиболее
удерживаемого компонента
#=16^—^ =8,21103 т.т.
<17,0 )
Тогда из уравнения (19.28) можно определить коэффициент разделения
385-10
а -------
370-10
= 1,042
и из уравнения (19.25) — факторы удерживания
370-10
10,0
= 36,0
385-10
10,0
= 37,5
A?ave = (36,6 + 37,5)/2 = 36,8
Из уравнения (19.29) находим разрешение
Rs = | д/8,21 -103f1,042 1Y 37,5 1 = 0,91
4 1,042 J<36,8 + 1J
152
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
Тот же результат получается при использовании уравнения (19.27):
_385-370_
(17,0 + 16,0)/2
19.4. Программное обеспечение для моделирования
хроматографических процессов
Допустим, исследователю нужно продумать осуществление какого-то опреде-
ленного хроматографического разделения. Для этого нужно выбрать природу
колонки (неподвижной фазы) и задать параметры колонки, подобрать подвиж-
ную фазу — например, содержание органического растворителя, определить
условия элюирования: с градиентом концентрации растворителя или с темпера-
турным градиентом и т. д. Оптимизация условий требует проведения ряда хрома-
тографических экспериментов. Для сокращения продолжительности оптимизации
и снижения расхода реагентов следует использовать пакеты программ для моде-
лирования хроматографических процессов, представленных на сайтах компа-
ний: DryLab (LC Resources): www.lcresources.com; ACD/GC Simulator, ACD/LC
Simulator, ACD/ChromManager (ACD/Labs), www.acdlabs.com; ChromSword®
AUTO (Merck KGaA), www.hii.hitachi.com/LC%20ChromSword.htm.
19.5. Коммерческие базы данных для хроматографии
Компания Agilent Technologies (www. chem. agilent.com) предлагает базу данных,
включающую условия проведения газовой и жидкостной хроматографии, ко-
торые были подобраны сотрудниками компании (www.chem.agilent.com/
scripts/chromatograms. asp). На этой же странице представлены характеристики
колонок для ВЭЖХ. Также можно посмотреть информацию по хроматографиче-
ским базам данных на сайтах фирмы Supelco (www.sigmaaldrich.com) и Hamilton
(www. hamiltoncompany.com).
Что мы узнали из этой главы?
• Разделение веществ на колонке — стр. 133
• Виды хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионообменная,
эксклюзионная — стр. 135
• Номенклатура и терминология в хроматографии — см. табл, на стр. 137
• Теория эффективности колонок — стр. 138
ЗАДАЧИ
153
• Число теоретических тарелок [основное уравнение (19.3)] — стр. 139
• Уравнение Ван Деемтера для набивных колонок в газовой хроматогра-
фии [основные уравнения (19.8), (19.13)] — стр. 141
• Уравнение Голея для капиллярных колонок в газовой хроматографии
[основное уравнение (19.19)] — стр. 146
• Уравнения Губера и Нокса для колонок в ВЭЖХ [основные уравнения
(19.20, 19.22)] —стр. 146
• Фактор удерживания [основное уравнение (19.25)] — стр. 148
• Разрешение хроматографических пиков [основные уравнения (19.27),
(19.29)] —стр. 149
• Фактор разделения (или коэффициент селективности) [основное уравне-
ние (19.28)] — стр. 149
• Программное обеспечение для проведения расчетных хроматографических
процессов и базы данных — стр. 152
Вопросы
1 - Дайте определение хроматографии.
2 - Расскажите о принципах, положенных в основу хроматографии.
3 - Классифицируйте виды хроматографии по технике выполнения, приведите
примеры их применения.
4 - Что описывает уравнение Ван Деемтера? Объясните смысл каждого пара-
метра.
5 . Чем отличается уравнения Голея от уравнения Ван Деемтера?
6 . Чем отличаются уравнения Губера и Нокса от уравнения Ван Деемтера?
Задачи
Разрешение хроматографических пиков
7 - Время удерживания некоторого вещества в газовой хроматографии состав-
ляет 65 с, а ширина пика у его основания — 5,5 с. Определите ВЭТТ, если
длина хроматографической колонки составляет 3 м.
8 - Необходимо достичь разрешения двух пиков, имеющих времена удержива-
ния 85 и 100 с соответственно, при ВЭТТ 1,5 см. Какая для этого должна
быть длина колонки? Ширину пиков у основания считайте одинаковой.
9 . При введении пробы н-гексана объемом 2 мкл в колонку длиной 3 м полу-
чены следующие данные (см. стр. 154).
154
ГЛАВА 19. ХРОМАТОГРАФИЯ: ПРИНЦИПЫ И ТЕОРИЯ
Объемная скорость потока, мл/мин (пик В03ДУха)> мин t'R, мин Ширина пиков, мин
120,2 1,18 5,49 0,35
90,3 1,49 6,37 0,39
71,8 1,74 7,17 0,43
62,7 1,89 7,62 0,47
50,2 2,24 8,62 0,54
39,9 2,58 9,83 0,68
31,7 3,10 11,31 0,81
26,4 3,54 12,69 0,95
Найдите число теоретических тарелок и ВЭТТ для каждой объемной скоро-
сти потока, постройте зависимость ВЭТТ от объемной скорости и из графика
определите оптимальную скорость. В расчетах используйте исправленное
время удерживания t'R.
10 - Для трех веществ А, В и С на колонке, содержащей только 500 т. т., получе-
ны следующие факторы удерживания: кА = 1,40, кв = 1,85, кс = 2,65. Можно
ли для них достичь минимального разрешения 1,05?
Задача с использованием электронных таблиц
11 - Постройте зависимость ВЭТТ для уравнения Ван Деемтера при теоретиче-
ских параметрах Л = 0,5 мм, В = 30 мм • мл/мин, С=0,05 мм • мин/мл и сред-
ней линейной скорости 4, 8, 12, 20, 28, 40, 80 и 120 мл/мин.* Постройте
также графики для параметров А, В/ й, С й от скорости й и проанализируйте
их вклад в значение ВЭТТ. Вычислите при i7opt и найдите значения
B/uopt, Cwopt. Проверьте полученные результаты по ответам, приведенным
в приложенном компакт-диске (см. гл. 19).
Рекомендуемая литература
Общая
1. J. С. Giddings, Unified Separation Science, New York: Wiley-Interscience,
1991.
2. С. E. Meloan, Chemical Separations: Principles, Techniques, and Experiments,
New York, Wiley, 1999.
3. J. Cazes, ed., Encyclopedia of Chromatography, New York: Marcel Dekker,
2001.
В условии везде вместо [мл] должно быть [см], т. к. речь идет о линейной скорости и связанных с ней вели-
чинах. — Прим, перев.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
155
4- R. Е. Majors and Р. W. Carr, «Glossary of Liquid-Phase Separation Terms»,
LC-GC, 19(2) (2001) 124.
5- L. S. Ettre, «Nomenclature for Chromatography», Pure Appl. Chem., 65 (1993)
819.
Исторические аспекты
Следующие источники содержат подробное описание развития различных хро-
матографических методов до настоящего времени. Особое внимание уделено
созданию различных сорбентов.
6- Н. J. Isaaq, ed., A Century of Separation Science, New York: Marcel Dekker,
2002.
7. L. S. Ettre, «The Birth of Partition Chromatography», LC-GC, 19(5) (2001) 506.
8- M. S. Lesney, «Creating a Central Science. A Brief History of “Color Writing”»,
Today's Chemist at Work, September, 1998, 67.
9- «Chromatography. Creating a Central Science», Today's Chemist at Work (Sup-
plement), September, 2001. Статья, объемом в* 88 страниц, посвященная со-
вершенствованию хроматографических методов.
Компьютерное моделирование
10- J. W. Nolan and L. R. Snyder, «Gradient Elution Chromatography», in Encyclo-
pedia of Analytical Chemistry, Vol. 13, Theory and Instrumentation, 11342
Chichester: Wiley, 2000.
11. R. G. Wolcott, J. W. Dolan, and L. R. Snyder, «Computer Simulation for the
Convenient Optimization of Isocratic Reversed-Phase Liquid Chromatography
Separations by Varying Temperature and Mobile Phase Strength», J. Chroma-
togr. A, 869 (2000) 3.
12. J. W. Dolan, L. R. Snyder, L. C Sander, R. C. Wolcott, P. Habner, T. Baczek, and
R. Kaliszan, J. Chromatogr. A, 857 (1999) 41.
Глава 20
ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Газовая хроматография (ГХ) — один из наиболее многосторонних и повсемест-
но распространенных аналитических лабораторных методов. Ее широко исполь-
зуют для определения органических веществ. Разделить бензол и циклогексан
(температура кипения 80,1 и 80,8 °C) с помощью газовой хроматографии не
представляет труда, тогда как это совершенно невозможно сделать перегонкой.
Хотя Мартин и Синдж предложили жидкостно-жидкостную хроматографию в
1941 г., развитие газожидкостной распределительной хроматографии Джей-
мсом и Мартином десятью годами позже получило немедленное и более широкое
признание по двум причинам. Во-первых, в отличие от неавтоматизированной на
тот момент жидкостно-жидкостной колоночной хроматографии, ГХ потребова-
ла создания и развития новых приборов при участии химиков, инженеров и физи-
ков; при этом анализ проводился гораздо быстрее и не требовал проб большого
объема. Во-вторых, во время развития метода ГХ нефтяной промышленности
потребовался надежный метод мониторинга, в качестве которого хорошо подо-
шел именно метод газовой хроматографии. Так, всего за несколько лет ГХ стала
основным методом определения органических соединений самых разных типов.
С помощью этого метода можно разделять даже очень сложные смеси. Если в
методе ГХ в качестве системы детектирования применить масс-спектрометрию,
то при очень высокой чувствительности можно идентифицировать все элюиро-
ванные соединения, т. е. разработать очень мощную аналитическую систему.
Существуют два варианта газовой хроматографии — газо-твердофазная
(адсорбционная) хроматография и газожидкостная (распределительная) хро-
матография. Наиболее важным методом является газожидкостная хроматогра-
фия, особенно при использовании капиллярных колонок. В этой главе
рассмотрены принципы газовой хроматографии, типы колонок и детекторы для
ГХ. Также изложены основные положения масс-спектрометрического детекти-
рования (МС) в сочетании с газовой хроматографией (ГХ-МС).
20.1. Осуществление газохроматографического разделения
В газовой хроматографии образец переводят в газообразное состояние (если он в
обычных условиях не является газом), и он распределяется между неподвижной
20.1. ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ
157
фазой и подвижной фазой, в качестве которой используют газ-носитель. Равно-
весия в газовой фазе устанавливаются быстро, поэтому разрешение (и число тео-
ретических тарелок) будут достаточно высокими. Неподвижной фазой обычно
является нелетучая жидкость, нанесенная на стенки капилляра или на инертные
частицы сорбентов (например, кизельгур, полученный из остатков морских од-
ноклеточных водорослей, нанесенный на оксид кремния, в который для прочно-
сти часто добавляют соединения кальция). Так, например, получают сорбенты
Chromosorb Р или Chromosorb W. Существует большое число различных подвиж-
ных фаз в зависимости от требуемых разделений, но наиболее важен в газовой
хроматографии выбор природы неподвижной фазы. Природа жидкой или твердой
фазы определяет равновесия, устанавливающиеся в системе, а также влияет на
растворимость или сорбционную способность определяемого вещества. При этом
необходимо учитывать полярность неподвижной фазы и анализируемого образца,
возможность образования водородных связей и других специфических взаимо-
действий. Большинство часто используемых условий разделения были подобра-
ны опытным путем, хотя сейчас эту информацию можно получить из баз данных.
На рис. 20.1 представлена схема газового хроматографа, а на рис. 20.2 —
фотография современной газохроматографической системы. Образец быстро
вводят в колонку с помощью микрошприца (см. рис. 2.11) через силиконовый
уплотнитель. Инжектор, колонку и детектор нагревают до температур, при кото-
рых образец имеет давление пара не менее 10 мм рт. ст. — обычно на 50 °C выше
температуры кипения наиболее высококипящего вещества в образце. Темпера-
туру инжектора и детектора обычно поддерживают более высокой, чем в колонке,
для более быстрого перевода образца в газообразное состояние и предотвращения
конденсации паров внутри детектора. Для набивных колонок вводят от 0,1 до
10 мкл жидких образцов или от 1 до 10 мл газообразных веществ. При вводе га-
Измеритель
скорости
потока
Сброс (выход)
Регистрирующее
устройство
Поток газа-
носителя с
разделяемыми
Поток газа- веществами
Колонка
(набивная или
Термостат
Рис. 20.1. Схема газового хроматографа
Ем кость
с газом -
носителем
капиллярная)
158
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
РИС. 20.2. Современная автоматизированная газохроматографическая система. Представлена с
разрешения фирмы Shimadzu
зов, как правило, используют специальный шприц для ГХ, который позволяет
поддерживать постоянный объем. В капиллярные колонки обычно помещают
около 0,01 указанных выше объемов из-за их более низкой емкости. Часто хро-
матографы с капиллярными колонками оснащены специальным делителем об-
разцов (дозатором) для того, чтобы подавать в колонку очень малые порции
образца с фиксированным объемом. Инжекторы с делителями пробы в послед-
нее время стали использовать и в хроматографах с набивными колонками.
Разделение достигается за счет установления равновесия газообразных ве-
ществ между газом-носителем и неподвижной фазой. В качестве газа-носителя
используют химически инертные газы, доступные в чистом виде: аргон, гелий
или азот. Газ с большей плотностью позволяет достичь лучшей эффективности
из-за меньшей диффузии, однако газы с меньшей плотностью позволяют сокра-
тить продолжительность анализа за счет более высокой скорости потока. Выбор
газа-носителя часто связан с типом применяемого детектора.
Компоненты образца автоматически детектируют на выходе из колонки.
Существуют различные типы детекторов, отклик которых зависит от состава га-
зообразной фазы, выходящей из колонки (см. ниже). Обычно детектор содержит
два капилляра, по одному из которых проходит чистый газ-носитель, а по дру-
гому — газ-носитель с разделенными компонентами, вышедшими из колон-
ки. Таким образом, можно измерить сигнал разделяемых веществ за вычетом
сигнала газа-носителя и получить хроматограмму. Измерив времена удержива-
ния (время, прошедшее с момента ввода пробы до появления максимума хроматог-
рафического пика) и сравнивая их с временами, полученными для стандартных
20.1. ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ
159
веществ, можно идентифицировать пики веществ. (Необходимо отметить, что
соответствие времен удерживания двух веществ еще не гарантирует полную иден-
тификацию вещества.) Площадь хроматографического пика пропорциональна кон-
центрации; на основании этого можно определить содержание вещества. Для очень
острых и узких пиков концентрацию вещества часто находят по высоте пиков.
Большинство хроматографических систем детектирования автоматически регист-
рирует как времена удерживания (идентификация веществ), так и площади пиков
(количественное определение), что делает измерения более быстрыми и удобными.
Возможности газовой хроматографии проиллюстрированы на примере, пред-
ставленном на рис. 20.3. Поскольку хроматографические пики регистрировали
автоматически, продолжительность анализа для такой сложной смеси достаточ-
но мала. Быстрота получения результатов анализа в сочетании с очень малыми
объемами пробы способствуют распространению метода. Многие образцы, ко-
торые достаточно легко разделить методом газовой хроматографии, практиче-
ски невозможно проанализировать другими методами.
В случае смесей сложного состава бывает трудно идентифицировать каждый
пик. В таком случае используют газовые хроматографы в сочетании с масс-спек-
трометрами, которые позволяют определять вещества в соответствии с их молеку-
лярными массами. Этот важный аналитический метод, о котором более подробно
будет рассказано дальше, называют газовой хроматографией в сочетании с
масс-спектрометрией (ГХ-МС). Масс-спектрометр — очень чувствительный и
селективный детектор, и при использовании капиллярных газохроматографиче-
ских колонок (для которых характерно очень высокое разрешение—см. разд. 20.2)
вариант капиллярной ГХ-МС позволяет идентифицировать и определить даже
следовые количества компонентов в сложных смесях. Например, можно исследо-
вать выбросы, содержащие сотни веществ, определить следы лекарственных
препаратов в моче и крови или важные загрязнители в водах. Для лучшей чувст-
вительности и достижения очень низких пределов обнаружения иногда применя-
ют детекторы, селективные на какой-либо элемент или класс веществ.
Какие соединения можно определить методом ГХ ?
Очень и очень многие соединения можно определить с помощью газовой хроматографии.
Однако не все. Для этого вещества должны быть летучими и устойчивыми в диапазоне тем-
ператур от 50 до 300 °C. Обычно объектами исследования с применением газовой хроматог-
рафии являются:
• все газы;
• большинство неионизованных органических молекул, твердых или жидких веществ, со-
держащих до 25 атомов углерода;
• многие металлоорганические соединения, для которых можно получить летучие комплексы.
Если соединения нелетучи или нестабильны, часто получают их производные, которые мож-
но анализировать методом ГХ. Газовая хроматография не применима для солей или молекул,
однако их можно определить с помощью ВЭЖХ или другими методами.
Образец — бензин, не содержащий свинца
Колонка:
Газ-носитель:
Температурный градиент:
Инжектор:
Детектор:
DB-Petro 100
100 м х 0,25 мм
размер частиц — 0,5 мкм
гелий при скорости 25,6 см/с
0 °C в течение 15 мин
от 0 до 50 °C при скорости 1 °С/мин
от 50 до 130 °C при скорости 2 °С/мин
от 130 до 180 °C при скорости 4 °С/мин
180 °C в течение 20 мин
дозатор 1: 300 (200 °C)
1 мкл нагретого образца
пламенно-ионизационный
(250 °C) в атмосфере азота,
подаваемого со скоростью 30 мл/мин
1 — метан
2 — н-бутан
3 — изопентан
4 — н-пентан
5 — н-гексан
6 — метилциклопентан
7 — бензол
8 — циклогексан
9 — изооктан
10 — н-гептан
11 — толуол* 21 — изопропилбензол
12 — 2,3,3-триметилпентан 22 — пропилбензол
13 — 2-метилгептан
14 — 4-метилгептан
15 — н-октан
16 — этилбензол
17 — м-ксилол**
18 — /7-КСИЛОЛ
19 — о-ксилол
20 — н-нонан
23 — 1,2,4-триметилбензол
24 — изобутилбензол
25 — втор-бутилбензол
26 — н-декан
27 — 1,2,3-триметилбензол
28 — бутилбензол
29 — н-ундекан
30 — 1,2,4,5-тетраметилбензол
31 — нафталин
32 — додекан
33 — тридекан
перекрывание 11 и
перекрывание 17 и
12 пиков на 22%
18 пиков на 13%
17
С 165
РИС. 20.3. Пример хроматограммы сложной смеси, разделенной на капиллярной колонке. С разрешения компании Agilent Technologies
20.2. КОЛОНКИ ДЛЯ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
161
20.2. Колонки для газовой хроматографии
В газовой хроматографии применяют набивные колонки и капиллярные ко-
лонки. Первоначально используемые для ГХ набивные колонки постепенно
стали вытесняться капиллярными колонками, которые на сегодняшний день ис-
пользуют более широко. Но, тем не менее, работают и с набивными колонками —
в тех случаях, когда не требуется достижения высокого разрешения или необхо-
дима высокая нагрузочная емкость колонок.
Набивные колонки
При больших объемах пробы целесообразно использовать набивные колонки.
Они могут иметь любую форму: быть спиральными, U-образными или W-образ-
ными трубками. Спиральные колонки встречаются гораздо чаще. Типичные на-
бивные колонки имеют длину от 1 до 10 м и диаметр от 0,2 до 0,6 см. Правильно
заполненные колонки могут содержать до 1000 т. т. на метр, и наиболее распро-
страненные колонки длиной 3 м в таком случае содержат 3000 т. т. Короткие ко-
лонки делают из стекла, более длинные — из нержавеющей стали. Последние
проще правильно заполнить сорбентом. В последнее время колонки делают из
тефлона. При изготовлении длинных колонок с точки зрения инертности мате-
риала предпочтение отдают стеклу. Разрешение пиков для набивных колонок
возрастает пропорционально квадратному корню из длины колонки. Но более
длинные колонки приводят к возрастанию давления в системе и к большей про-
должительности анализа, поэтому их используют только тогда, когда это дейст-
вительно необходимо. Чаще всего для разделения выбирают колонки длиной
1-3 м. Если же полное разделение на такой колонке не достигается, только тогда
переходят к более длинным колонкам.
Колонку заполняют мелкими частицами, которые сами могут служить не-
подвижной фазой (в адсорбционной хроматографии) или, чаще, их покрывают
нелетучей жидкой фазой различной полярности (в распределительной хрома-
тографии). Газо-твердофазную хроматографию (адсорбционную) обычно испо-
льзуют для разделения газов с низкой молекулярной массой, таких как Н2, N2,
СО2, СО, О2, NH2, СН4 и летучих углеводородов; в качестве сорбентов с высоко-
развитой поверхностью применяют неорганические наполнители, например, ок-
сид алюминия А12О3 или Chromosorb (на основе полиароматической матрицы с
поперечными сшивками), отличающиеся структурой одинаковой формы и раз-
мером пор. Газообразные вещества удерживаются за счет адсорбции на части-
цах наполнителя колонки. Газо-твердофазная хроматография предпочтительна
для образцов, содержащих водные пары.
Твердый носитель для жидкой фазы в газораспределительной хроматогра-
фии должен иметь высокоразвитую поверхность, покрытую химически инерт-
ной жидкой фазой. Он должен быть термически стабильным и иметь частицы
правильной формы. Наиболее часто в качестве носителей используют кизель-
гур. Известно много коммерческих носителей, производимых различными фир-
мами. Chromosorb W — кизельгур, предварительно нагретый в потоке раствора
162
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
щелочи для снижения его общей кислотности; он слегка окрашен. Chromosorb Р —
измельченный огнеупорный материал, общая кислотность которого гораздо
выше, чем у Chromosorb W, поэтому он реагирует предпочтительно с полярны-
ми растворами, особенно с содержащими функциональные группы.
Полярность сорбента Chromosorb Р можно значительно снизить, силанизи-
ровав его поверхность гексаметилдисилазаном [(CH3)3Si]2NH. Принципы выбо-
ра твердых носителей, как кизельгура, так и пористых полимеров, подробно
рассмотрены Оттенштейном [7].
Носитель для заполнения колонки покрывают слоем рассчитанного количе-
ства жидкой фазы, растворенной в низкокипящем растворителе (например, в
ацетоне или пентане). Около 5-10% (масс.) покрытия образует тонкий слой. По-
сле этого растворитель удаляют нагреванием и встряхиванием; остатки обычно
удаляют под вакуумом. Только что приготовленная колонка должна быть обра-
ботана (уравновешена) пропусканием газа-носителя при повышенных темпера-
турах в течение нескольких часов. Принципы выбора жидких фаз обсуждены
ниже.
Для правильного заполнения колонки частицы должны быть одинаковыми
по форме и размеру: например, их диаметр может изменяться в интервале значе-
ний 60-80 меш (0,25-0,18 мм), 80-100 меш (0,18-0,15 мм), 100-120 меш
(0,15-0,12 мм). При использовании частиц меньшего диаметра в колонке может
возникнуть повышенное давление.
Капиллярные колонки и их широкое применение
В 1957 г. М. Голей опубликовал статью «Vapor Phase Chromatography and the Te-
legrapher’s Equation (Дифференциальный подход к описанию парофазной хрома-
тографии)» [Anal. Chem. 29 (1957) 928]. В уравнении, предложенном в этой
статье, предсказано значительное увеличение числа теоретических тарелок в уз-
ких открытых капиллярных колонках с неподвижной фазой, нанесенной на
внутренние стенки. В такой колонке удается избежать размывания хроматогра-
фических зон за счет многочисленных путей (отсутствие вихревой диффузии).
В узких колонках скорость массопереноса возрастает за счет сокращения пути
диффузии молекул. Более высокие скорости потока, обусловленные снижен-
ным давлением в колонке, приводят к снижению молекулярной диффузии. Ра-
бота Голея привела к развитию направления разработки разнообразных
открытых капиллярных колонок, что позволило достичь значительно боль-
шей эффективности разделения в газохроматографических методах анализа.
Эти колонки делают на основе тонких слоев кварца, покрытых полиимидным
полимером для защиты ломких капилляров, и такие капилляры можно свер-
нуть в спираль. Полиимидный слой придает коричневатый оттенок таким ко-
лонкам и со временем (при использовании) сам темнеет. Внутреннюю
поверхность капилляров подвергают химической обработке для уменьшения
взаимодействия образца с остаточными силанольными группами (Si-OH) ка-
пилляра — экранируя силанольные группы различными силанами, например,
диметилдихлорсиланом.
20.2. КОЛОНКИ ДЛЯ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
163
Капилляры также делают из нержавеющей стали. Нержавеющая сталь взаи-
модействует со многими соединениями, по этой причине ее поверхность тоже
переводят в инертное состояние, обрабатывая диметилдихлорсиланом. В ре-
зультате получаются тонкие цепи кремнезема, на которых можно иммобилизо-
вать неподвижную фазу. Колонки из нержавеющей стали прочнее кварцевых
капилляров, и их часто применяют в тех случаях, когда для разделения требует-
ся высокая температура.
Внутренний диаметр капилляров составляет от 0,10 до 0,53 мм, а длина —
от 15 до 100 м, что приводит к очень высокому числу теоретических тарелок, от
нескольких сотен тысяч до миллиона. Обычно капилляры сворачивают в виде
спирали с диаметром петли около 0,2 м (рис. 20.4). Использование капиллярных
колонок приводит к таким преимуществам, как высокое разрешение для узких
пиков, меньшая продолжительность анализа, высокая чувствительность (осо-
бенно в сочетании с современными методами детектирования), однако для ка-
пиллярных колонок легче возникает перегрузка при вводе большого количества
образца. Инжектор с делителем заметно облегчает проблему перегрузки колонки.
На рис. 20.5 показано улучшение разрешающей возможности колонки при
переходе от набивной колонки (6,4 х 1,8 м) к очень длинной, но еще достаточно
широкой стальной капиллярной колонке (0,76 мм х 150 м), наконец, к узкому и бо-
лее короткому стеклянному капилляру (0,25 мм х 50 м). Заметим, что разрешение
возрастает в случае более узкой колонки (даже если колонка более короткая).
Рис. 20.4
Капиллярная колонка для газовой
хроматографии (с разрешения Quadrex
Corp., Woodbridge)
164
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Рис. 20.5
Три поколения колонок для газовой
хроматографии. Разделение
компонентов перечной мяты
на набивной колонке
6,4 х 1,8 м (вверху), в стальной
капиллярной колонке
0,76 мм х 150 м (в центре)
и в стеклянном капилляре
0,25 мм х 50 м (внизу).
[W. Jennings. J. Chromatogr. Sci.
17 (1979) 363]. Опубликовано
с разрешения журнала
Существует три типа открытых капиллярных (трубчатых) колонок. В ко-
лонках с модифицированными внутренними стенками вся внутренняя по-
верхность капилляра покрыта тонкой пленкой жидкости. Это осуществляется
следующим образом. Разбавленный раствор жидкой фазы медленно пропуска-
ют через капилляр; растворитель удаляют при пропускании газа-носителя через
колонку, а жидкую фазу закрепляют на стенках капилляра за счет поперечной
сшивки. Окончательная толщина слоя жидкой неподвижной фазы составляет от
0,1 до 5 мкм. Увеличение толщины пленки на поверхности капилляра приводит
к возрастанию емкости колонки, однако также увеличивается высота теоретиче-
ской тарелки и продолжительность анализа. Открытые капилляры с модифици-
рованными внутренними стенками обычно характеризуются 5 000 т. т./м, что в
случае 50-метровой колонки составляет 250 000 т. т.
20.2. КОЛОНКИ ДЛЯ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
165
В капиллярных колонках, заполненных модифицированными носите-
лями, твердые покрытые неподвижной фазой микрочастицы (гораздо меньшие,
чем в набивных колонках) закреплены на стенках капилляра. У таких колонок
высокая удельная поверхность и более высокая емкость, чем у капиллярных ко-
лонок с модифицированными стенками. Давление в системе для более длинных
капилляров несколько возрастает, а емкость приближается к емкости набивных ко-
лонок. «Мертвый» объем системы незначителен, особенно при сокращении соеди-
нения между колонкой и детектором. В большинстве случаев деление образца
на малые порции не требуется, можно вводить около 0,5 мкл пробы или меньше.
Если для разрешения требуется более 10 000 т. т., то капилляры с модифициро-
ванными носителями предпочтительнее, чем набивные колонки.
Третий тип — капиллярные колонки с пористым слоем — содержат час-
тицы твердой фазы, закрепленные на стенках капилляра для проведения адсорб-
ционной хроматографии. Обычно это частицы оксида алюминия или пористого
полимера (так называемые молекулярные сита). Эти колонки, подобно набив-
ным колонкам для газо-адсорбционной хроматографии, используют для разде-
ления достаточно инертных газов, например, летучих углеводородов.
Разрешающая способность капилляров снижается в ряду: капиллярные ко-
лонки с модифицированными стенками > капиллярные колонки, заполненные
модифицированными носителями > капиллярные колонки с пористым слоем.
Более широкие (0,5 мм) колонки содержат более толстый слой жидкой фазы (бо-
лее 0,5 мкм), что приближает их по емкости к капиллярам, заполненными мо-
дифицированными носителями, однако разрешающая способность при этом
снижается.
В капиллярные колонки можно вносить только весьма ограниченные коли-
чества аналита, иначе наступит перегрузка колонки, приводящая к уширению
пиков и изменению времени удерживания. Без перегрузки можно вносить около
100 нг в капилляры диаметром 0,25 мм с толщиной пленки 0,25 мкм и до 5 мкг—
в колонки диаметром 0,53 мм, содержащие слой неподвижной фазы толщиной
до 5 мкм.
Капиллярные колонки, наиболее широко используемые на сегодняшний день в
газовой хроматографии, производят многие компании, среди которых Alltech
Associates, Inc. (www. altechweb.com), Agilent Technologies (www.chem.agilent.
com/Scripts/PHome. asp), Perkin-Elmer Instruments (http://instruments, perkinelmer.
com), Quadrex Corp, (www.qudrexcorp.com), Restek Corp, (www.restekcorp.com),
SGE, Inc. (www.sge.com), Sigma-Aldrich (Supelco) (www.sigmaaldrich.com).
Неподвижные фазы -- основа различных разделений
Предложено свыше тысячи различных неподвижных фаз для газовой хроматог-
рафии, многие из которых коммерчески доступны. Сотни фаз используют для
набивных колонок, обладающих невысокой эффективностью, поэтому выбор
фаз существен для достижения селективности разделения. Предприняты попыт-
ки предсказать ожидаемые свойства жидкой иммобилизованной фазы, не прибе-
гая к экспериментальному методу «проб и ошибок» (см. ниже).
166
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Жидкие неподвижные фазы выбирают с учетом полярности анализируемых
соединений, исходя из эмпирического правила «подобное растворяется в подоб-
ном». Другими словами, полярная неподвижная фаза в большей степени взаимо-
действует с полярными веществами, и наоборот. Следует выбирать такую фазу,
в которой анализируемое вещество незначительно растворяется. Неполярные
жидкие фазы обычно неселективны из-за незначительного взаимодействия ана-
лизируемого вещества и растворителя, и обычно разделение достигается за счет
различия в температурах кипения растворенных веществ: первым элюируется
вещество с наименьшей температурой кипения. Полярные же жидкие фазы ха-
рактеризуются самыми различными типами взаимодействий с анализируемыми
веществами: дипольными взаимодействиями, образованием водородных связей,
индуктивным эффектом; поэтому четкой корреляции между летучестью анали-
зируемых веществ и порядком их элюирования не прослеживается.
Для кварцевых капилляров большинство разделений можно провести с ис-
пользованием всего только 10 жидких фаз различной полярности. Это связано с
высокой разрешающей способностью капиллярной ГХ, где селективность непо-
движной фазы не столь критична. Неподвижные фазы в этом случае являются
высокомолекулярными соединениями, термически стабильными, обычно в виде
жидкостей или резиноподобных материалов. Чаще всего применяют полисилок-
саны или полиэтиленгликоли (Карбовакс). Молекулы полисилоксанов
Ri
Г 1 1
-О—Si—
L । J«
r2
содержат функциональные группы (R), определяющие ее полярность, например,
метил (СН3), фенил цианопропил (CH2CH2CN), трифторпропил
(CH2CH2F3). В табл. 20.1. представлены наиболее часто используемые непо-
движные фазы. Фазы, содержащие цианидные функциональные группы, чувстви-
тельны к воздействию воды или кислорода. Карбоваксы должны быть жидкими
при рабочих температурах. Включение фенильных или карборановых групп в
силоксановый полимер придает прочность и жесткость полимерному каркасу,
что замедляет деградацию неподвижной фазы при высоких температурах и сни-
жает потери неподвижной фазы из колонки. Такие колонки особенно важны при
использовании высокочувствительного масс-спектрометра для детектирования,
когда следует избегать потерь неподвижной фазы и попадания ее в детектор.
Индексы удерживания для жидких неподвижных фаз
Как уже было отмечено выше, для набивных колонок очень важен правильный
выбор неподвижной фазы среди всех возможных фаз самой различной природы.
Обычно выбор из групп фаз основывают на их способности к удерживанию ве-
ществ, в. частности, на полярности фаз. Возможные материалы для неподвиж-
ных фаз можно разделить на группы, исходя из индексов удерживания Ковача
Таблица 20.1. (начало) Неподвижные фазы для кварцевых капилляров
Фаза Полярность
Диметилполисилоксан 100%-й Неполярная
СНз
О —Si—1
I J-
сн3
Дифенил, диметилполисилоксан Q 4-0 —Si—4 fo — Si—4- L 1 Jx% L | -*100 —x% 0 " 5% — низкая 35%, 65% — средняя 65%, 35% — средняя
Цианопропилфенил-диметилсилоксан 14% : 86% r G г “s 4-0-Si l-o-Si k L 1 J14% L | -186% 6 Средняя
Область применения Zmax,
Основная фаза для рутинного анализа. 320
Углеводороды, полиароматические
соединения, полихлорированные
бифенилы
Для рутинного анализа; хорошие 320
высокотемпературные характеристики. 399
Пестициды
Разделение хлорзамещенных пестицидов. 280
Чувствительна к воздействию влаги или
кислорода
Таблица 20.1. (окончание)
Неподвижные фазы для кварцевых капилляров
Фаза Полярность Область применения t ,°С max’
Бис-цианопропил-цианопропилфенилполисилоксан 80% : 20% । CL gcn L I J 80% L 1 -120% ^cn 0 Очень полярная Свободные кислоты, полизамещенные жирные кислоты. Следует избегать полярных растворителей — воды или метанола 275
Арилены г I1 ул + o—Si—(z y—Si k L | W | R.2 R4 Различная в зависимости otR Устойчива при высокой температуре; низкие потери фазы 300-350
Карбораны (затемненные атомы — углерод; светлые — бор) Пэ""1 сн3- Si- СН3 'Нэ1 сн3 Различная в зависимости от R Устойчива при высокой температуре; низкие потери фазы 430
Полиэтиленгликоль (Карбовакс) -fo-CH2CH2^-n Очень полярная Спирты, альдегиды, кетоны, ароматические изомеры — например, ксилены 250
20.2. КОЛОНКИ ДЛЯ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
169
и констант Роршнайдера. Для облегчения этого выбора Супиной и Роузом [8]
были составлены таблицы с константами Роршнайдера для 80 наиболее часто
применяемых жидких фаз. Это очень удобно и в том смысле, что таким образом
легче идентифицировать жидкие фазы, подобные по свойствам и различающие-
ся только коммерческой маркой. Мак-Рейнольдс предложил подобный подход,
основанный на описании фаз с помощью констант (константы Мак-Рейнольдса
[6]). Он использовал стандартный набор тестовых веществ для нахождения вре-
мен их удерживания при 120 °C на колонках при 20%-й нагрузке, чтобы класси-
фицировать неподвижные фазы.
Еще одни правила выбора неподвижных фаз содержит руководство «Guide to
Stationary Phase for Gas Chromatography» (Analabs, Inc., North Haven, CT, 1977).
Для идентификации веществ по отношению времен их удерживания и по-
добных соединений того же гомологического ряда (которые отличаются числом
атомов углерода в подобных структурах, например, в насыщенной углеводород-
ной цепи) используют также индексы удерживания Ковача. Индекс Ковача I
определяется как:
/=100
П + 1§^?(неизв.) tR(ns)
1g ^/?(неизв.) “ 1g ^R{ns)
(20.1),
где ns и nt — число атомов углерода в «меньшем» и в «большем» гомологах соот-
ветственно; t'R — исправленные времена удерживания [см. уравнение (19.6)].
Индекс Ковача для неизвестного соединения сравнивают с систематизирован-
ными в каталогах индексами на различных колонках для более точной иденти-
фикации. В гомологическом ряду соединений логарифм времени удерживания
линейно зависит от числа атомов углерода.
Летучесть анализируемых соединений
В предыдущих разделах подчеркивалась важная роль полярности неподвижной
фазы (и, естественно, анализируемых соединений) для обеспечения эффектив-
ного разделения. Другой важный фактор — относительная летучесть анализиру-
емых образцов. Более летучие компоненты будут перемещаться по колонке с
большей скоростью. Также быстро перемещаются газообразные вещества, осо-
бенно малые молекулы, такие, как СО. Фактор удерживания к [см. уравнение
(19.25)] связан с летучестью:
1п£ = ДЯ/ЯГ-1пу + С
где A//v — теплота испарения вещества, большее значение которой (т. е. более
высокая температура кипения) приведет к более низкой летучести и, следователь-
но, к большему фактору удерживания. Увеличение температуры Т снижает ее
вклад в удерживание. За вклад взаимодействий с неподвижной фазой (поляр-
ность и т. п.) отвечает In у (уменьшение этого вклада приводит к увеличению
фактора Л); С—константа; R — универсальная газовая постоянная. Достаточная
селективность в соответствии с температурами кипения и возможность разделе-
ния обеспечиваются факторами, зависящими от Г в этом уравнении. Именно по-
этому используют температурные градиенты.
170
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Итак, выбор хроматографических условий (колонки, температуры, скоро-
сти газа-носителя) зависит от летучести, молекулярной массы и полярности сое-
динений.
20.3. Детекторы в газовой хроматографии
С тех пор как начали проводиться эксперименты по газохроматографическим
разделениям, было предложено около 40 различных типов детекторов. Часть из
них разработана для детектирования большинства веществ*, другие были пред-
ложены как селективные на определенный тип соединений. Подробно рас-
смотрим только наиболее широко используемые виды детекторов, сравнение
которых по их применению, чувствительности и диапазону линейности приве-
дено в табл. 20.2.
Специально для ГХ разработан детектор по теплопроводности — катаро-
метр. Когда через ячейку с нагретым элементом (проволокой) пропускают газ,
температура и, следовательно, отклик нагретой проволоки будут связаны с теп-
лопроводностью газа. Над одной проволокой в ячейке пропускают чистый газ-
носитель, а над другой проволокой в ячейке (для сравнения) — газ, выходящий
из колонки и содержащий разделяемые компоненты. Эти две проволоки являют-
ся сравнительными цепями в мосте Уитстона, что позволяет измерить разность
в их сопротивлениях. В случае, когда из колонки выходит также чистый газ-но-
ситель, не содержащий анализируемых веществ, отклик обоих нитей в мосте
Уитстона будет одинаковым. Как только из колонки будет выходить компонент,
появится изменение сопротивления во второй части цепи моста Уитстона. Изме-
нение сопротивления, пропорциональное концентрации компонента анализиру-
емого образца в потоке газа-носителя, приведет к появлению сигнала, что будет
отмечено записывающим устройством. Катарометр особенно часто применяют
при анализе газообразных смесей или инертных газов, таких, как СО2.
При использовании катарометра в качестве газов-носителей наиболее пред-
почтительны водород и гелий, поскольку их теплопроводность гораздо выше,
чем у многих других газов, что вызывает значительное изменение в сопротивле-
нии ячейки при элюировании компонентов образца из колонки. Еще более пред-
почтителен по соображениям безопасности гелий. Теплопроводность водорода
составляет 53,4 • 10-5 кал/(°С • моль), а гелия — 41,6 • 10~5 кал/(°С • моль) при
100 °C, в то время как у аргона, азота, оксида углерода, многих органических га-
зообразных соединений она в 10 раз ниже. Преимущества катарометра — в его
технической простоте и примерно равном отклике для большинства соедине-
ний, а также в хорошей воспроизводимости сигнала. Однако чувствительность
детектора по теплопроводности невысока.
Большинство органических соединений способны ионизироваться в пламе-
ни, образуя, в основном, катионы типа СНО+. На этом основано применение очень
чувствительного универсального детектора, называемого пламенно-ионизаци-
онным детектором (ПИД). Ионы собираются у противоположно заряженных
* Такие детекторы в отечественной литературе называют универсальными. — Прим, перев.
Таблица 20.2
Сравнительные характеристики детекторов для газовой хроматографии
Тип детектора . Область применения Чувствительность Диапазон линей- ности Примечания
Катарометр Общая, дает отклик на все анализируемые соединения Хорошая, 5-100 нг, 10 ppm— 100% Хороший, исключая слишком высокие температуры Чувствителен к изменениям температуры и скорости потока; концентрационный тип
Пламенно- Для всех органических соединений; Очень хорошая, 10-100 пкг, Отличный, до Требует стабильного потока
ионизационный некоторые окисленные формы дают слабый отклик. Лучше всего для углеводородов 10 ppb — 99% 6 порядков газа-носителя; чувствителен к воде в случае 1047106-кратного избытка; массочувствительный
Пламенно- фотометрический Для серосодержащих (393 нм) и фосфорсодержащих (526 нм) соединений Очень хорошая, 10 пкг для серосодержащих, 1 пкг для фосфорсодержащих Отличный —
Пламенно- термоионный Для всех азот- и фосфорсодержащих соединений Отличная, 0,1-10 пкг, 100 ppt —0,1% Отличный Требуется напыление соли натрия на экранирующую сетку, массочувствительный
Ячейка на силикате рубидия Селективно для азот- и фосфорсодержащих соединений Отличная - Массочувствительный
Детектор ионизации аргона (на 0-лучах) Для всех органических веществ; при использовании сверхчистого гелия в качестве газа-носителя — для неорганических веществ и инертных газов Очень хорошая; 0,1-100 нг, 0,1-100 ppm Хороший Очень чувствителен к присутствию загрязнений или следов воды; требуются очень чистые газы в качестве носителей: концентрационный тип
Детектор электронного захвата Для всех веществ, способных к захвату электронов; не дает отклик для алифатических углеводородов и нафтенов Отличная для галогенсодержащих соединений, 0,05-1 пкг, 50 ppt—1 ppm Низкий Очень чувствителен к загрязнениям и к изменениям температуры; концентрационный тип
Масс-спектрометр Практически для всех соединений. Отклик зависит от способа ионизации Отличная Отличный Позволяет определить структуру и молекулярную массу соединений
ppb — частей на миллиард; ppm — частей на миллион; ppt — частей на триллион.
172
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
электродов в ячейке детектора. Отклик, пропорциональный количеству ионов,
зависит от числа атомов углерода в анализируемом веществе и степени их окис-
ления. Атомы, находящиеся в высшей степени окисления, не ионизируются, поэто-
му соединения с большим числом атомов углерода в низких степенях окисления
дают больший сигнал. Этот детектор обладает отличной чувствительностью, по-
зволяющей определять многие компоненты на уровне ppb. Он примерно в 1000
раз чувствительнее, чем катарометр, и его также очень широко используют. Од-
нако при такой чувствительности количество вводимого в систему образца огра-
ничено объемом 0,1 мкл или даже меньше. Природа газа-носителя для ПИД не
столь существенна (как правило это гелий, азот и аргон). Пламенно-ионизацион-
ный детектор нечувствителен по отношению ко многим неорганическим соеди-
нениям, включая воду, поэтому в систему можно вводить водные растворы.
Если вместо воздуха для поддержания пламени используют кислород, то можно
определять и многие неорганические компоненты, поскольку при более высо-
кой температуре пламени они тоже будут ионизироваться. Из-за чрезвычайно
высокой чувствительности ПИД в большинстве случаев требуется подходящая
дозирующая система при вводе порций образцов.
Когда в пламенно-ионизационный детектор поступают серо- или фосфорсо-
держащие соединения, то под действием высокой температуры они начинают
люминесцировать при 393 нм (сера) и 526 нм (фосфор). Используя подходящие
монохроматоры (светофильтры), можно чувствительно измерить интенсивность
их излучения. Такой детектор называется пламенно-фотометрическим (ПФД).
Пламенно-термоионный детектор представляет собой двухстадийный пла-
менно-ионизационный детектор, разработанный специально для повышения
сигнала азот- и фосфорсодержащих соединений. Второй пламенно-ионизацион-
ный детектор расположен выше первого — так, чтобы горящие газы поступали
из первого детектора во второй. Оба детектора разделены экраном из проволочной
сетки, покрытой солями щелочных металлов или основаниями, например, NaOH.
Газ, выходящий из колонки, поступает в первый детектор, который работа-
ет как обычный ПИД, и его сигнал регистрируют. В расположенный выше второй
детектор подают небольшие потоки, где происходит их испарение и ионизация
натрия на экранирующей сетке. Однако, если вещество, содержащее азот или
фосфор, сгорает в первом детекторе, ионы способны значительно повысить ле-
тучесть щелочного металла, нанесенного на экранирующую сетку. Это, по край-
ней мере, в сотни раз повышает чувствительность отклика ПИД на азот и
фосфор. Записывая сигналы от обоих детекторов, мы получим обычную хрома-
тограмму, характерную для ПИД, во второй же хроматограмме вычленяются то-
лько те пики, которые относятся к азот- или фосфорсодержащим соединениям,
значительно отличающихся от фона других компонентов. Предложенный детек-
тор еще называют азотно-фосфорным детектором.
В аргоно-ионизационном детекторе, или детекторе p-излучения, обра-
зец ионизируется Р-лучами от радиоактивного источника (например, строн-
ция-90). В качестве газа-носителя используют аргон, который метастабилен в
присутствии Р-частиц. Энергия возбуждения для аргона составляет 11,5 эВ, что
гораздо выше, чем потенциал ионизации для большинства органических соеди-
20.3. ДЕТЕКТОРЫ В ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
173
нений, и молекулы веществ ионизируются при столкновении с возбужденными
атомами аргона. Ионы детектируют подобно тому, как это происходит в пламен-
но-ионизационном детекторе. Этот детектор очень чувствительный, хотя и менее
точный, и следует отметить, что источник P-излучения потенциально опасен, поэ-
тому его следует хорошо экранировать. Чувствительность детектора Р-излуче-
ния примерно в 300 раз выше, чем у катарометра.
Детектор электронного захвата (ДЭЗ) очень чувствителен и селективен
для определения соединений, содержащих электроотрицательные атомы. По
техническому исполнению он похож на детектор P-излучения, за исключением
того, что в поток аргона в качестве газа-носителя добавляют азот или метан. Эти
газы имею/г низкие энергии возбуждения, сравнимые с энергией возбуждения
аргона, и тогда ионизироваться, захватывая электроны, будут только те вещест-
ва, которые проявляют высокое сродство к электронам.
Катод ячейки детектора выполнен из материала, насыщенного Р-излучаю-
щим элементом, обычно тритием или никелем-63. Первый из них позволяет до-
стичь более высокой чувствительности, однако его применение ограничено
температурой свыше 220 °C из-за возможных потерь трития. С никелем-63 мож-
но работать и при температурах до 350 °C, что актуально, так как никель легче
очистить, чем тритиевый источник; поверхность этих источников со временем
неизбежно покрывается пленкой, что снижает интенсивность P-излучения, а
следовательно, и чувствительность детектирования. Обычно для очистки поверх-
ности используют 30%-й раствор КОН.
Ячейка детектора поляризуется при приложенном потенциале, и электроны
(Р-лучи), испускаемые источником на катоде, ударяют по молекулам газа, выби-
вая из них электроны. В результате получается устойчивый поток электронов,
который устремляется к аноду. Если вещество, попавшее в ячейку, обладает
сродством к электрону, оно захватывает электроны, образуя большой отрица-
тельно заряженный ион. Подвижность отрицательных ионов в электронном
поле в 100 000 раз ниже, чем у электронов, что и приводит к изменению сигнала.
Относительно небольшое число соединений обладает заметной электроот-
рицательностью, поэтому захват электронов — достаточно селективный про-
цесс, позволяющий определять даже следовые количества таких веществ в
присутствии соединений, не способных захватывать электроны. Наибольшее
сродство к электронам проявляют галогены, карбонильные соединения, нитро-
группы, некоторые ароматические соединения и металлы. ДЭЗ чаще всего приме-
няют для определения пестицидов или полихлорзамещенных бифенилов. Наиме-
нее чувствителен ДЭЗ при определении углеводородов, кроме ароматических.
Соединения с низким сродством к электрону можно определять, проводя
наиболее подходящую реакцию дериватизации. Например, многие биологиче-
ски важные вещества проявляют низкую способность к захвату электронов. Стеро-
иды, например, холестерин, можно определить в виде хлорацетатных производных.
Некоторые элементы, например, алюминий, хром, медь, бериллий, определяют
на уровне нг или пкг в виде летучих трифторацетилацетоновых хелатов. Хлорид
метилртути, встречающийся в тканях заболевших рыб, определяют на уровне
нанограммов.
174
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Для детектирования отдельных веществ или элементоорганических соеди-
нений к газовому хроматографу присоединяют атомно-спектроскопический де-
тектор. Этот мощный комбинированный прибор используют для определения
различных форм токсичных элементов в объектах окружающей среды. Напри-
мер, атомно-эмиссионный детектор с индуктивно связанной плазмой в потоке
гелия позволяет чувствительно определить в микроволновом диапазоне летучие
метильные или этильные производные ртути в тканях рыб после газохромато-
графического разделения. Газовые хроматографы часто сочетают с индуктивно
плазменным масс-спектрометром (ИСП-МС), в котором изотопы образцов из
плазмы попадают в масс-спектрометр (см. разд. 20.10 с более подробным описа-
нием масс-спектрометрии), для чувствительного одновременного определения
некоторых элементоорганических соединений или их производных.
Детекторы могут быть чувствительны к концентрации определенного ком-
понента или к массопереносу в целом. Сигнал для концентрационно-чувствите-
льного детектора напрямую зависит от концентрации определяемого вещества и
снижается в зависимости от разбавления газом-носителем. Образец в таких де-
текторах обычно не разрушается, а такие детекторы называют недеструктивны-
ми. К концентрационно-чувствительным типам детекторов относятся катарометр,
аргоно-ионизационный детектор, детектор электронного захвата. В детекторах,
реагирующих на массоперенос, сигнал пропорционален скорости, с которой мо-
лекулы веществ попадают в детектор, и не зависит от газа-носителя. Обычно в
таких детекторах происходит разрушение образца, например, в пламенно-иони-
зационном детекторе или пламенно-термоионном*. Иногда для повышения раз-
решения используют двухколоночный вариант газовой хроматографии, когда
отдельные фракции газа после первой колонки поступают во вторую колонку
для дальнейшего разделения. В этом случае первый детектор должен быть неде-
структивным, чтобы отдельные порции газа с неполностью разделенными веще-
ствами можно было отделить и направить во вторую колонку.
20.4. Выбор рабочей температуры
Выбор температуры для газохроматографического разделения представляет собой
поиск компромисса между определенными факторами. Температура устройства
для ввода пробы (инжектора) должна быть относительно высокой, чтобы, с од-
ной стороны, достичь максимальной скорости испарения образца в ограничен-
ном объеме перед вводом в колонку (и этим снизить размывание пробы и
увеличить разрешение), а, с другой стороны, вещество все еще должно быть тер-
мически стабильным. При слишком высокой температуре инжектора также мо-
жет разрушиться его резиновый уплотнитель, что вызовет засорение системы его
частицами. Температуру колонки приходится подбирать так, чтобы достичь ком-
промисса между скоростью, чувствительностью и разрешением. При высоких
температурах разделяемые вещества находятся преимущественно в газовой фазе
Такие детекторы в отечественной литературе называют деструктивными. — Прим, перев.
20.5. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ
175
и поэтому выходят из колонки значительно быстрее, однако разрешение при
этом недостаточное. При низких температурах вещества остаются главным об-
разом на неподвижной фазе и поэтому элюируются из колонки медленно; при
этом достигается высокое разрешение, однако чувствительность определения
понижается из-за размывания задних фронтов пиков. Температура детектора
должна быть достаточной для того, чтобы избежать конденсации паров образца
в ячейке. Чувствительность катарометра понижается при повышении темпера-
туры, и поэтому его температуру поддерживают как можно более низкой.
Разделение можно значительно улучшить, используя программирование
температурного режима (или температурного градиента), и многие современ-
ные газовые хроматографы оснащены таким устройством. Градиент температу-
ры от низких значений к более высоким позволяет заметно ускорить процесс
разделения. Прочно сорбирующиеся компоненты будут выходить из колонки
быстрее при более высоких температурах. Компоненты, элюирующиеся быстро,
будут лучше разделяться при более низких температурах. Температуру повыша-
ют с заранее выбранной скоростью во время проведения хроматографирования
образцов либо линейно, либо экспоненциально, либо ступенчато и т. д. В этом
случае вещества, которые сложно элюировались из колонки без программирова-
ния температуры, будут выходить за разумное время.
На рис. 20.6. показано разделение сложной смеси углеводородов в условиях
температурного градиента. Первые 12 газообразных или легких углеводородов
разделяются и выходят из колонки при фиксированной температуре 100 °C в те-
чение 5,5 мин, в то время как для других соединений требуется более высокая
температура. После этого температуру колонки линейно повышают со скоро-
стью 5 °С/мин в течение 20 мин до достижения 200 °C, и затем поддерживают на
таком уровне до тех пор, пока последние два компонента не выйдут из колонки.
Если определяемое вещество не обладает достаточной летучестью в рабо-
чем интервале температур, то получают его летучие производные. Например,
нелетучие жирные кислоты определяют в виде летучих метиловых эфиров этих
кислот. При высоких температурах достаточно летучи некоторые галогениды,
поэтому их можно определять методом газовой хроматографии. Металлы также
можно определять в виде летучих производных, например, в виде хелатов с
трифторацетилацетоном.
20.5. Количественные хроматографические измерения
Площадь пиков элюируемых соединений на хроматограмме пропорциональна
их концентрации. Электронные интеграторы, используемые для регистрации
хроматограмм в ГХ, позволяют вывести на печать площадь пиков, времена их
удерживания и некоторую общую информацию. Также в отдельных случаях
можно построить градуировочный график зависимости высоты пиков от кон-
центрации компонента, который обязательно должен быть линейным.
Наиболее часто для градуировки используют метод стандартных добавок,
особенно в случае редко встречающихся, непривычных образцов. Одну или не-
сколько аликвот образца вводят в инжектор вместе с добавкой стандарта (образ-
Анализ углеводородов
Колонка: GS-Alumina 30 м х 0,53 мм
Газ-носитель: гелий при скорости 51 см/с (6,8 мл/мин); измерено при 100 °C
Температурный градиент: 1000 °C в течение 5 мин
от 100 до 200 °C при скорости 5 °С/мин
200 °C в течение 15,5 мин
Инжектор: дозатор 1:10 (250 °C)
4 мкл нагретого образца
Детектор: пламенно-ионизационный (250 °C)
в атмосфере азота, подаваемого
со скоростью 30 мл/мин
1 — метан
2 — этан
3 — этилен
4 — пропан
5 — пропилен
6 — изобутан
7 — н-бутан
8 — транс-2-бутен
9—1 -бутен
10 — цис-2-бутен
11 — изопентан
12 — н-пентан
13 — циклогексан
14 — гексан
15 — гептан
16 — бензол
17 — изооктан
18 — октан
19 — толуол
20 — нонан
21 — этилбензол
22 — пара-ксилол
23 — мета-ксилол
24 — орто-ксилол
25 — декан
Анализ углеводородов на колонке можно
проводить как для природных, так и модельных
смесей
Рис. 20.6. Анализ в условиях температурного градиента (с разрешения Agilent Technologies)
20.5. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ ИЗМЕРЕНИЯ
177
ца сравнения) при известной концентрации, увеличение площади пика при этом
будет пропорционально концентрации добавленного стандарта. Метод хорош
только тогда, когда время удерживания неизвестного компонента совпадает со
временем удерживания стандарта (т. е. это одно и то же вещество).
Более важный метод количественного анализа в хроматографии — исполь-
зование внутреннего стандарта. В этом случае образец и стандарт вводят в ин-
жектор одновременно с равным количеством* такого вещества, время удерживания
которого близко к времени удерживания определяемого компонента. Отноше-
ние площади пиков стандарта или определяемого вещества к площади пика
внутреннего стандарта используют для построения градуировочного графика и
определения концентрации определяемого компонента. Метод позволяет ниве-
лировать влияние некоторых физических параметров, вызванных ошибками при
отборе и вводе малых (на уровне микролитров) объемов образца или незначите-
льном изменении объема пробы и некоторых хроматографических условий. При
этом относительное удерживание должно оставаться постоянным, даже если
изменяют скорость потока газа-носителя.
Использование электронных таблиц
в градуировке по внутреннему стандарту
Если водитель задержан и отстранен от управления машиной по подозрению в
алкогольном опьянении, необходимо точно определить, насколько уровень ал-
коголя превышает допустимые пределы. Измерение количества выдыхаемых
паров алкоголя обычно используют при экспрессном и рутинном контроле со-
стояния водителей, поскольку применение такого метода не нарушает прав че-
ловека, и сразу же пересчитываются в концентрацию алкоголя в крови. При этом
результат иногда может быть ошибочным вследствие индивидуальных биологи-
ческих особенностей данного человека. Однако при несчастном случае, силь-
ных ранениях, наконец, в случае смерти, алкоголь в крови обычно определяют
непосредственно в пробе крови методом газовой хроматографии.
Образец крови в количестве 5,00 мл перемешали с добавкой (0,50 мл) 1%-го
водного раствора пропанола в качестве внутреннего стандарта. Пробу (10 мкл)
полученной смеси ввели в газовый хроматограф и зарегистрировали хроматог-
рафические пики. Стандартные вещества обрабатывали и хроматографировали
в тех же условиях. Получены следующие результаты:
Этанол, % (масса : объем) Площадь пика этанола Площадь пика пропанола
0,020 114 457
0,050 278 449
0,100 561 471
0,150 845 453
0,200 1070 447
Неизвестное содержание 782 455
Чаще — с равным объемом пробы. — Прим, перев.
178
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
В программе Excel создайте лист и внесите эти данные для построения градуи-
ровочного графика (отношение площадей пиков этанола и пропанола от кон-
центрации этанола). Рассчитайте неизвестную концентрацию и стандартное
отклонение. Для этого воспользуйтесь уравнениями (16.18) и (16.21) и приве-
денной там же электронной таблицей.
Полученная концентрация алкоголя в крови составляет (0,142 ± 0,003)%, это
высокий уровень. Допустимый предел для водителей в большинстве стран —
А В С D Е F G н I 1
1 Газохроматографическое определение этанола в крови с использованием пропанола в качестве внутреннего стандарта
2 %ЕЮН Площадь пика Площадь пика Отношение площадей пиков
3 ЕЮН РгОН EtOH/PrOH
4 0,020 114 457 0,249453
5 0,050 278 449 0,619154
6 0,100 561 471 1,191083
7 0,150 845 453 1,865342
8 0,200 1070 447 2,393736
9 Неизв. образец (ус) 782 455 1,718681
10
11 Тангенс угла наклона, пл: 12,0286923 Г азохроматографическое определение этанола в крови
12 Отсекаемый осью отрезок, Ь: 0,01276953 <
13 Содерж. алк., % ВАС, С: 0,14182022 ф 9 3 1 2,5 - 2 - 1.5 - 1 - 0,5 - 0 - у= тг.игчх - и.ит^в Я2 = 0,9988*
14 го 9
15 S' 0,0345743 5 m с о
16 N: 5 ® 1
17 Sxx' 0,02132 ф В о
18 Уave’ 1,2637535 I н О
0,( )00 0,100 0,200 0,300
19 М: 1 Содержание алкоголя в крови, %
20 ?с: 0,0033365
21
22 Ячейка D4 = отношение = В4/С4 (копировать формулу вниз)
23 Ячейка С11 = m = HAKnOH(D4:D8,A4:A8)
24 Ячейка С12 = b = OTPE3OK(D4:D8,A4:A8)
25 Ячейка С13 = С - (yc-b)/m = (отношениес - b)/m = (D9-C12)/C11
26 Ячейка В15 = Sr = CTOLJJYX(D4:D8,A4:A8)
27 Ячейка В16 = N = СЧЁТ(А4:А8)
28 Ячейка В17 = Sxx = Ы*ДИСПРА(А4:А8) = В16*ДИСПРА(А4:А8)
29 Ячейка В18 = yave = CP3HA4(D4:D8)
30 Ячейка В19 = отклик образца = М =1
31 Ячейка В20 = станд. откл. Sc = Sr/m((1/M + 1/N + (ус - УауеУт2*2хх))1/2
32 =B15/C11*((1/B19+1/B16+(D9-B18)/C11A2*B17))A0.5
20.7. ТЕРМОДЕСОРБЦИЯ
179
0,08% (масса: объем) алкоголя в крови. Влияние содержания алкоголя в крови на
внимание и реакцию водителя растет экспоненциально, приблизительно в два
раза на каждые 0,05% алкоголя. Таким образом, при увеличении содержания ал-
коголя от 0,05% до 0,20% реакция водителя становится в 8 раз хуже!
20.6. Анализ паров летучих веществ
В главе 18 были описаны процессы экстракции растворителями и твердофазной
экстракции — методы пробоподготовки, часто применяемые и в сочетании с га-
зохроматографическим определением. Общепринятый способ пробоподготовки
летучих образцов — анализ паров летучих веществ (или парофазный ана-
лиз), избавляющий от необходимости экстрагирования летучих компонентов.
Образец запечатывают в ампуле и выдерживают при фиксированной температу-
ре в течение, например, 10 мин для установления равновесия между фазами. За-
тем отбиранэт пары образца и вводят их в инжектор газового хроматографа.
Обычную стеклянную ампулу на 20 мл запечатывают силиконовой пробкой с
прокладкой из политетрафторэтилена (тефлона). Иголку шприца вводят в спе-
циальное отверстие для отбора 1 мл образца. Или сжатые пары попадают в петлю
для образца объемом 1 мл при атмосферном давлении, и затем вспомогательный
поток газа-носителя переносит образец из петли в инжектор хроматографа.
Определяемый таким образом уровень содержания летучих компонентов в твер-
дых или жидких образцах — ррш или даже ниже. Лекарственные препараты
можно растворить в водном растворе сульфата натрия для подготовки к анализу
паров летучих компонентов. В приложенном компакт-диске на рис. 1 (см. гл. 20)
представлена хроматограмма летучих соединений в образце крови.
20.7. Термодесорбция
Способ термической десорбции заключается в нагревании твердого или аморф-
ного образца в потоке инертного газа. Летучие и полулетучие органические сое-
динения извлекаются потоком газа из матрицы образца и непосредственно
поступают в газовый хроматограф. Образцы обычно взвешивают в тефлоновой
ампуле, которую затем помещают в тубус из нержавеющей стали, где и проводят
нагревание.
Термическую десорбцию проводят при температурах ниже температуры
разрушения других компонентов или матрицы образца. Твердые материалы
должны обладать высокоразвитой поверхностью (т. е. быть в виде порошков,
гранул, волокон). Перед взвешиванием объемные образцы выдерживают над ох-
ладителем, таким, как твердый СО2. Такой подход упрощает пробоподготовку
образцов и позволяет избежать растворения образца или экстракции растворите-
лями. Термодесорбция особенно хорошо подходит для сухих или гомогенизиро-
ванных образцов: полимеров, восков, порошков, лекарственных препаратов,
косметических средств, мазей, кремов и т. п. Для этих материалов какой-либо
специальной пробоподготовки не требуется.
180
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Примером использования термодесорбции при анализе может служить опре-
деление органических летучих веществ в водорастворимых красителях. Тубус, в
котором проводят термодесорбцию, комбинируют со вторым тубусом, содержа-
щим сорбент-поглотитель для удаления воды, которая не должна попадать
внутрь капиллярной колонки для газовой хроматографии. Аликвоты красителя
(например, 5 мкл) помещают на стекловолокно и вносят в тубус для термодесор-
бции. При этом твердые вещества из красителя, которые могут испортить колон-
ку для ГХ, остаются.
Литературу по выбору сорбентов для термодесорбции можно посмотреть на
сайте www.markes.com.
20.8. Очистка и улавливание примесей
Техника очистки и улавливания примесей представляет модификацию техни-
ки термодесорбции. Сначала летучие компоненты очищают (отделяют) от жид-
кого образца, помещенного в сосуд, через который пропускают пузыри газа
(например, воздуха), выделившиеся при этом летучие компоненты собирают в
адсорбционном тубусе, в котором находится подходящий адсорбент-поглоти-
тель. Затем поглощенные адсорбентом летучие компоненты термически десорби-
руют и определяют методом ГХ. Этот способ одновременно является и вариантом
парофазного анализа, в котором определяемые компоненты сначала концентри-
руют, а замет уже вводят в газовый хроматограф. Наиболее типичный сорбент
представляет собой гидрофобное вещество, способное поглощать органические
компоненты в соответствии с их летучестью от гексана до С16 или выше. Приме-
рами таких сорбентов могут служить Тенакс ТА или графитированный уголь.
Эти сорбенты позволяют пропускать большие количества полярных растворите-
лей, таких как вода или этанол, без потерь на поверхности сорбента. На практике,
например, они используются для определения содержания С4-С6-этилэфиров в
виски — показателя готовности продукта, при этом спиртовая матрица образца
ни коем образом не сказывается на виде хроматограммы.
Техника очистки и улавливания примесей применима для негомогенизиро-
ванных образцов, поскольку позволяет работать с достаточно большими объема-
ми проб, или для образцов с большим содержанием влаги. В качестве примеров
таких образцов можно привести пищевые продукты — пиццу или фрукты. Изме-
рение содержания зловонных органических летучих компонентов в парах над
образцом испортившихся пищевых продуктов позволяет определить, насколько
соблюдались требования (условия) его хранения. Пробу пищевого продукта, по-
мещенную в большую емкость для очистки, нагревают в потоке воздуха, и затем
пары вещества направляют в емкость с поглотителем.
Можно использовать и более селективные, чем Тенакс, адсорбенты, а в ряде
случаев — два или несколько последовательно расположенных адсорбентов для
поглощения веществ различных классов. В качестве адсорбентов можно приме-
нять материалы для хроматографии, такие как оксид алюминия, силикагели, Фо-
рисил, древесный уголь от кокосовой пальмы, Поропак, Хромосорб и т. д.
20.9. МИКРОКОЛОНОЧНАЯ СКОРОСТНАЯ ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
181
Некоторые из них покрывают специальными модификаторами, например, по-
верхность силикагеля обрабатывают серной кислотой или гидроксидом натрия
для поглощения оснований или кислот соответственно.
Другая важная область применения улавливания примесей — анализ газо-
образных образцов, таких как воздух. Пробу пропускают непосредственно через
трубку с сорбентом, а поглощенные летучие примеси десорбируют или удаляют
с сорбента экстракцией. Этот способ широко используют для мониторинга воз-
духа внутри помещений и снаружи.
Более полную информацию по адсорбентам, методике термической десорб-
ции и ее применению можно получить на сайтах SKC (www. skcinc. com) и Mar-
kes International (www. markes.com). На сайте SKC есть список адсорбентов с
указанием их областей применения.
20.9. Микроколоночная скоростная газовая хроматография
Преимущество автоматизированного, компьютеризованного сбора данных де-
лает возможным использование нового поколения хроматографических коло-
нок с тонкой пленкой жидкой фазы. Сочетание коротких капиллярных колонок
малого диаметра, запрограммированного быстрого температурного градиента и
водорода в качестве газа-носителя, обладающего большой скоростью массопе-
реноса, позволяет проводить анализ за очень короткое время, например, в тече-
ние нескольких секунд. В указанных системах реализуются высокие скорости
потока при высоких давлениях. Скоростное элюирование определяемых компо-
нентов требует быстрого отклика детектора, а также быстрой обработки данных,
поскольку ширина пиков в таких условиях может составлять только 0,5 с, по
сравнению с более широкими (в 5-10 раз) пиками в обычной капиллярной газо-
вой хроматографии. Высокоскоростная хроматография на коротких колонках
приводит к тому, что селективность колонки начинает играть более значимую
роль, чем в обычной капиллярной ГХ. На рис. 20.7 показано скоростное газохро-
матографическое разделение углеводородов, проведенное менее чем за 10 с, на
колонке диаметром 0,32 мм и длиной 5 м, заполненной слоем неподвижной фазы
толщиной 0,25 мкм (по сравнению с обычной ГХ, где на аналогичное разделение
потребовалось 10 мин).
Более короткие колонки и быстрое изменение температуры вызывают неко-
торое ухудшение в разрешении, однако это можно частично компенсировать
при использовании колонок с меньшим внутренним диаметром и более тонкими
пленками жидкости в качестве неподвижных фаз.
В настоящее время приборы для микроколоночной газовой хроматографии
выпускают многие производители. Их применение для общих задач ограничено
главным образом небольшими размерами термостата, но для решения узкоспе-
циализированных задач они подходят идеально [С. Henry. «Taking the Show on
the Road. Portable GC and GC/MS» (Product Review). Anal. Chem. 69(5) (1997)
195А].
182
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
РИС. 20.7. Разделение углеводородов С9-С17 методом скоростной хроматографии с быстрым тем-
пературным градиентом. Условия: колонка 5 м х 0,32 мм, слой неподвижной фазы 0,25 мкм; 60 °C,
температурный градиент 19,2 °С/с [G. L. Reed, К. Clark-Baker, Н. М. McNair. J. Chromatogr. Sci., 37
(1999) 300]. Опубликовано с разрешения редакции журнала/. Chromatogr. Sci. Preston Publications,
A Division of Preston Industries, Inc.
20.10. Сочетание газовой хроматографии с масс-спектрометрией
Появление хроматографического пика при определенном времени удерживания
не всегда гарантирует точную идентификацию этого вещества или его присутст-
вие в анализируемой смеси. Вероятность правильной идентификации зависит от
таких факторов, как тип соединения, сложность состава и даже от способа про-
боподготовки. Газовая хроматограмма образца крови, разбавленного раствором
внутреннего стандарта (для подтверждения времени удерживания и нахождения
относительной площади пиков), содержит большой пик, предположительно от-
носящийся к алкоголю, что, казалось бы, надежно свидетельствует о наличии
алкоголя в крови, однако это может быть и результатом присутствия нескольких
нетоксичных веществ в крови или их взаимного влияния. (Как правило, это явля-
ется результатом вдыхания паров алкоголя, и подтверждением тому может быть
небольшое значение его концентрации.) Однако, при появлении пика кокаина на га-
зовой хроматограмме нельзя так безапелляционно говорить о присутствии кокаи-
на в лекарственном препарате — в подобных случаях необходимо искать более
веские доказательства. В этом может оказаться полезной информация, получен-
ная с помощью спектрометрических методов, например, в инфракрасной или
ультрафиолетовой области. Наиболее широкими возможностями и надежной
идентификацией веществ может обладать сочетание газовой хроматографии с
масс-спетрометрией (хромато-масс-спектрометрия) — метод, также называе-
мый ГХ-МС.
Используемые ранее системы ГХ-МС обычно были очень громоздкими и
стоили сотни тысяч долларов. В настоящее время предложены относительно не-
дорогие компактные настольные системы, и их часто можно встретить в лабо-
раториях. Современный хромато-масс-спектрометр показан на рис. 20.8.
20.10. СОЧЕТАНИЕ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКГРОМЕГРИЕЙ
183
РИС. 20.8. Настольная система для проведения хромато-масс-спектрометрических исследовани-
ем (с разрешения Agilent Technologies)
Рассмотрим вначале принципы масс-спектрометрии и различные виды прибо-
ров в этом методе анализа, а далее обсудим методику совмещения газовой хро-
матографии и масс-спектрометрии.
Основные принципы масс-спектрометрии
Масс-спектрометрия — сложнейший инструментальный метод анализа, кото-
рый основан на образовании, разделении и определении ионов в газовой фазе.
Основные узлы прибора масс-спектрометра показаны на рис. 20.9. Пробу при
умеренно высоком давлении паров вводят через систему ввода, работающую
практически в вакууме (lO^-lO-7 мм рт. ст.) и при высокой температуре
(до 300 °C). Проба испаряется и поступает в ионный источник. Нелетучие сое-
динения можно перевести в парообразное состояние посредством искрового
разряда или другим способом. Обычно молекулы аналитов находятся в незаря-
женном состоянии, и их надо ионизировать. Ионизацию можно провести раз-
личными способами, но чаще всего это делают с помощью бомбардировки
образца электронами с высокой энергией в электронно-импульсном источнике.
Ниже будут описаны наиболее часто используемые ионные источники.
Рис. 20.9. Блок-схема масс-спектрометра
184
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Ионы разделяются в спектрометре при их ускорении в масс-анализаторе
(см. ниже). Разделение ионов достигается в соответствии с определенным для
каждого иона отношением массы к заряду (т/е). Мы не будем подробно рассмат-
ривать правила, как устанавливать структуру вещества по его молекулярному
спектру, однако коснемся только одного из них, особенно важного при иденти-
фикации заряженных молекул (молекулярных ионов), — так называемого азот-
ного правила. Согласно этому правилу М+ рассматривают как высшую массу
для данного иона, не принимая во внимание изотопный состав. Такая молеку-
лярная масса принимает четное значение, если молекула содержит четное число
атомов азота — 0,2,4 и т. д., и нечетное значение в других случаях — когда она
содержит нечетное число атомов азота. Если вещество не содержит атомов азо-
та, то значение будет четным. Азотное правило применимо в тех случаях, когда
молекулярная масса принимает целочисленное четное или нечетное значение.
Тоже самое будет логичным и по отношению к фрагментам молекул с потерями
атомов. Например, органические молекулы редко отдают более 4 атомов Н, об-
разуя фрагменты с массой М-4. Другие потери мы можем ожидать для потерь
метильных групп (М-15), NH2 или О (М-16), ОН или NH3 (М-17), Н2О (М-18),
F (М-19) HF (М-20) или С2Н2 (М-26). Следует учесть также, что не может быть
потерь в интервале от 4 до 14 и от 21 до 25 массовых единиц. Но это правило не
распространяется на смеси.
Разрешение
Разрешающая сила в масс-спектрометрии определяется способностью разли-
чать две массы и может быть рассчитана как номинальная масса, деленная на
разницу в массах двух веществ, которые можно разделить:
R= —
Ат
(20.2)
где Ат — разница в массах двух компонентов, дающих разрешенные пики; т —
номинальная масса, при которой проявляется пик компонента.
Разница масс обычно измеряется при некотором фиксированном значении
фракции высот пиков, например, при 10%. Разрешение 1000 означает, что молекула
с отношением m/z = 1000 будет отделяться от молекулы с отношением m/z =1001
(и наоборот) или молекулы при отношении m/z = 500 от молекул с отношением
m/z = 500,5.
Термин единичное разрешение иногда используют для характеристики
способности системы отличать компоненты, массы которых отличаются на еди-
ницу. Единичное разрешение позволяет отличить отношение m/z 50 от 51, или
отношение m/z 100 от 101, или m/z 500 от 501. Обычно чем выше молекулярная
масса, тем лучшего разрешения R можно достичь. Разрешение на уровне 500 до-
стигается во многих случаях при сочетании масс-спектрометрии с газовой хро-
матографией.
20.10. СОЧЕТАНИЕ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СП ЕКТРОМЕГРИ ЕЙ
185
Ионные источники
В табл. 20.3 перечислены источники ионизации, наиболее часто используемые в
методах ГХ-МС и ЖХ-МС (см. гл. 21). Самая распространенная методика
ионизации — это ионизация электронным ударом. Молекулы газообразных
веществ бомбардируют узконаправленным потоком электронов с высокой
энергией (как правило, 70 эВ), получаемым на вольфрамовой нити. При столк-
новении с нейтральной молекулой электрон может передать ей достаточную
энергию для того, чтобы молекула отдала свой электрон, образовав при этом од-
нозарядный ион:
М + е~ —> М+ + 2е_,
где М — молекула аналита; М+ — ионизованная молекула (называемая также
молекулярным ионом) или родственный ион.
Образующиеся ионы М+ обладают различной внутренней энергией и нахо-
дятся на разных энергетических уровнях (вращательных, колебательных, элект-
Таблица 20.3
Сравнение методик ионизации*
Методика ионизации Типичные определяемые вещества Способ ввода образца Диапазон молекулярных масс Характеристики
Электронный удар Относительно небольшие молекулы, летучие соединения После ГХ или жидкостно-твердый зонд До 1000 дальтон Методика «жесткой» ионизации, дает наиболее полную информацию о структуре
Химическая ионизация Относительно небольшие молекулы, летучие соединения После ГХ или жидкостно-твердый зонд До 1000 дальтон Методика «мягкой» ионизации. Идентификация по пикам ионизованных молекул [М + Н]+
Бомбардировка пучком ионов Пептиды, белки, нелетучие соединения После жидкостной хроматографии или с помощью шприца До 200000 дальтон Методика «мягкой» ионизации. Часто образуются многозарядные ионы
Лазерная десорбция с твердой матрицы Пептиды, белки, нуклеотиды Образец, перемешанный с твердой матрицей До 500000 дальтон Методика «мягкой» ионизации для соединений с очень высокой молекулярной массой
*Материал взят с web-страницы профессора В. Высоцки, Университет Аризоны. Опубликовано с разрешения.
186
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
ровных переходов) и за счет участия в реакциях распадаются на отдельные
фрагменты с более низкими молекулярными массами, ионизируясь под действи-
ем дальнейшей электронной бомбардировки или без нее. Состав и строение
фрагментарных, частиц в достаточной мере зависит от того, в каких условиях
проводили бомбардировку (прежде всего, от энергии потока электронов). Чаще
всего молекулярные ионы распадаются на фрагменты, незатронутым остается
лишь их незначительное количество, причем такие молекулярные ионы характери-
зуются наибольшей массой в спектре (при условии, что в веществе не содержатся
различные изотопы для одного и того же элемента). Соединения с ароматическим
кольцом или другими циклическими структурами или с двойными связями лег-
че образуют пики молекулярных ионов (ионизованных молекул), поскольку
из-за делокализации электронной плотности снижается вероятность фрагменти-
рования на отдельные части. На рис. 20.10 показан простой электронно-ударный
спектр малой молекулы — метанола. Как правило, пики нормируют по одному
из них — с наибольшим содержанием изотопа (относительное содержание
100%); этот пик называют основным пиком. Молекулярный пик наблюдается
при отношении m/z = 32 (что соответствует молекулярной массе метанола,
СН3ОН). Заметим, что в спектре присутствует маленький пик при m/z = 33. Это и
есть молекулярный ион в случае присутствия изотопа 13С в метаноле, относи-
тельное содержание которого составляет 1,11% по сравнению со 100% для 12С.
Основной пик наблюдается при m/z = 31, что соответствует фрагменту СН2ОН+.
В табл. 20.4 приведены относительные количества наиболее распространенных
элементов.
Рис. 20.10
Масс-спектр метанола, полученный
способом электронного удара.
С разрешения NIST MassSpec Data Center
20.10. СОЧЕТАНИЕ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЕЙ
187
Таблица 20.4
Относительное содержание и точные массы
наиболее распространенных элементов*
Элемент Изотопы Массы Относительное содержание, %
Водород ‘Н 1,007825 100,0
2Н 2,014102 0,0115
Углерод 12с 12,000000 100,0
13с 13,003355 1,07
Азот 14N 14,003074 100,0
15N 15,000109 0,369
Кислород 16Q 15,994915 100,0
17О 16,999132 0,038
180 17,999160 0,205
Сера 32s 31,972071 100,0
33s 32,971450 0,803
34S 33,967867 4,522
Хлор 35С1 34,968852 100,0
37С1 36,965903 31,96
Бром 79Вг 78,918338 100,0
81Вг 80,916291 97,28
*Наиболее распространенному изотопу приписывают содержание 100%, содержание остальных
изотопов нормировано к его содержанию.
Источник химической ионизации
Способ ионизации электронным ударом называют способом «жесткой» иониза-
ции, поскольку в результате образуется множество фрагментов молекулы, что
способствует более точной идентификации аналита, а от неионизованных моле-
кул практически ничего не остается. Однако последовательный распад ионизо-
ванных молекул на отдельные фрагменты может привести к тому, что ионы с
низкой молекулярной массой будут составлять большую часть от общего числа
ионов, при этом многие аналитически важные фрагменты останутся в незначи-
тельном количестве или вообще будут потеряны. Способ химической ионизации
более «мягкий», поскольку он не приводит к столь заметному фрагментированию
молекул, а вызывает образование ионизованных молекул, преобладающих в
масс-спектре. В этом способе газ-реагент (например, метан, изобутан или амми-
ак) вводят в камеру для электронно-ударной ионизации при определенном дав-
лении (от 1 до 10 мм рт. ст.), с тем, чтобы он вступал во взаимодействие с
молекулами аналита с образованием ионов за счет переноса протонов или гид-
188
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
рид-ионов. Процесс химической ионизации начинается с ионизации газа-реа-
гента. Например, в случае метана электронный удар приводит к образованию ионов
CHJ и СН3, которые затем реагируют с СН4 с образованием ионов СН5 и С2Нз:
СН4 +СН4 ->СН5 +СН3
СН3 +СН4 н>С2Н5 +Н2
Эти ионы реагируют с молекулами образца с переносом протона Н+, или гид-
рид-иона Н~, или электрона, что увеличивает заряд молекулы на единицу:
СН5 + МН->МН2 +СН4
С2Н5 +мн->мн+ +С2Н6
МН 2 и М+ могут дальше распадаться на отдельные фрагменты, образуя соответ-
ствующие сигналы в масс-спектре. Иногда в спектре не наблюдается сигналов,
отвечающих ионам М+, однако молекулярные массы образовавшихся ионов со-
ответствуют ионам М+Н или М-Н. Слабые кислоты образуют в газовой фазе
ионы, что приводит к возникновению простых спектров. Ион С4Н^ из изобутана
и NH 4 из аммиака при ионизации также становятся переносчиками протонов,
однако их низкая энергия приводит к тому, что ион МН2 минимально распада-
ется на фрагменты. В табл. 20.5 приведены характеристики источников химиче-
ской ионизации при использовании различных реагентов. Способ химической
ионизации — наиболее универсальный и чаще всего применяется в современ-
ных приборах для ГХ-МС при определении молекулярных масс разделяемых
компонентов, особенно в тех случаях, когда «жесткие» способы ионизации при-
водят к чрезмерному фрагментированию молекул аналита.
Другие источники ионизации рассмотрены в гл. 21 и 25.
Таблица 20.5
Характеристики источников химической ионизации
при использовании различных реагентов
Реагент Образующиеся ионы (аддукты) Область применения/ограничения
Метан М-Н+, М-СН3 Для идентификации большинства органических соединений. Аддукты не всегда образуются в большом количестве. Чрезмерное фрагментирование
Изобутан М-Н+, М-С4Н9 Менее универсальный источник. Аддукты образуются в достаточном количестве. Частичное фрагментирование
Аммиак М-Н+ (основания) M-NH4 (полярные соединения) Для идентификации полярных соединений и оснований. Остальные соединения не ионизируются. Практически без фрагментирования
20.10. СОЧЕТАНИЕ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЕЙ
189
Масс-анализатор
Масс-спектрометры, принцип работы которых основан на действии магнитного
поля, широко используют в органической химии для установления молекуляр-
ной структуры соединений. В них происходит отклонение ионов в искривлен-
ной трубке под действием магнитного поля вследствие различий в кинетической
энергии ионов, зависящей от их массы, заряда и скорости. Магнитное поле ска-
нируют для измерения параметров различных ионов. Масс-анализатор — очень
мощный прибор с большими аналитическими возможностями и высоким разре-
шением, однако он занимает достаточно большое пространство и имеет высокую
стоимость, что не позволяет его применять в сочетании с обычными газовыми
хроматографами. Большинство ГХ-масс-спектрометров сегодня — это удобные
компактные системы, в которых используются менее дорогие масс- анализато-
ры с низким разрешением. Это делает метод ГХ-МС более доступным для реше-
ния рутинных задач.
1 - Квадрупольный масс-фильтр. Квадрупольный масс-анализатор можно назвать
«масс-фильтром», избирательно пропускающим только определенные ионы. Его
наиболее часто применяют в методе ГХ-МС. На рис. 20.11 показана принципиаль-
ная схема этого прибора. Он состоит из четырех параллельных металлических
проволок, на которые подают постоянный потенциал (СТ) и потенциал с синусои-
дальной разверткой в диапазоне радиочастот (Кcos art, где со обозначает часто-
ту, a t — время). Два противоположных полюса заряжены положительно, а два
других — отрицательно, и их полярность изменяется по мере проведения экспе-
римента. Приложенные потенциалы на полюсах составляют (U + Vcos coz) и
- (С/ + Vcos coz) соответственно. Потенциал влияет на траекторию ионов, проле-
тающих между четырьмя полюсами. Как только ионы от источника ионизации
Резонирующий ион
Детектор
Нерезонирующий
ион
Поток газа
из
капиллярной
хроматогра-
фической
колонки
Нить (спираль)
для потока
ионизирующих
электронов
Источник постоянного тока
в сочетании с генератором
радиочастот
РИС. 20.11. Квадрупольный масс-спектрометр
190
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
попадают в радиочастотное поле, создаваемое вдоль оси z (т. е. вдоль оси элект-
родов), они начинают осциллировать вдоль этой оси. Только те ионы, которые
имеют определенное отношение массы к заряду, могут давать резонанс в маг-
нитном поле и стабильно поступать через поле к детектору. Другие ионы, нерезо-
нирующие, будут отклоняться от прямого пути и сталкиваться с поверхностью
электродов, в результате оставаясь на этой поверхности, или, другими словами,
будут отфильтровываться. При варьировании скорости (частоты) развертки по-
тенциала ионы с той или иной массой будут проходить через магнитное поле без
отклонений и попадать в детектор. Частоту со можно варьировать, поддерживая
постоянными значения Un V, либо одновременно изменяя Un V. но сохраняя по-
стоянным отношение U/V.
Квадрупольный анализатор имеет ряд преимуществ, что делает его просто
«идеальным» для применения в ГХ-МС. Путь ионов не зависит от их кинетиче-
ской энергии (т. е. от скорости) или от углового отклонения поступающих в ана-
лизатор ионов. Таким образом, скорость переноса велика. Поскольку в ходе
эксперимента требуется только изменение потенциала, полное сканирование
выполняется очень быстро. Можно получить 8 и более масс-спектров за секунду
в диапазоне до 800 массовых единиц. Быстрое сканирование необходимо при
мониторинге пиков веществ после разделения методом ГХ, поскольку некото-
рые пики могут иметь ширину на уровне секунд. Можно достичь разрешения до
1500, тогда как газохроматографическая система обычно обеспечивает единич-
ное разрешение. Наконец, квадрупольные анализаторы — достаточно компакт-
ные и недорогие приборы.
2- Время-пролетный анализатор. Второй широко используемый тип масс-ана-
лизатора в методе ГХ-МС — это время-пролетный анализатор. На рис. 20.12 по-
для потока ускорителя
ионизирующих
электронов
РИС. 20.12. Время-пролетный масс-анализатор
20.10. СОЧЕТАНИЕ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЕЙ
191
казаны основные узлы масс-спектрометра с время-пролетным анализатором.
Ионы образуются в камере для ионизации, затем ионизация усиливается при
прохождении веществ через пластины акселератора (ускорителя), на которые
подают напряжение 3000 В с частотой импульсов от 3000 до 20000 в секунду.
Поток образовавшихся ионов с постоянной кинетической энергией попадает
внутрь трубки, где ионы с различным отношением m/z перемещаются с разной
скоростью. Кинетическая энергия ионов, выходящих из источника ионизации,
выражается как:
= (20.3)
где т — масса иона; v — скорость иона; V — напряжение ускорителя; q — заряд
иона. После преобразования получаем:
V = J^~ (20.4)
V т
Таким образом, скорость иона обратно пропорциональна квадратному корню из
массы иона. Время / необходимое для достижения детектора, равно L/v, где L —
длина пролетной трубки. Разность во времени достижения At для двух ионов для
их разделения составляет
(20.5)
и также пропорциональна квадратным корням из масс этих ионов.
Поскольку продолжительная (непрерывная) ионизация и ускорение могут
привести к непрерывному потоку всех ионов с совпадающими массами, необ-
ходим импульсный способ ускорения. Последовательность операций при им-
пульсном способе состоит во включении источника электронов на 10-9 с для
образования группы ионов, и затем (в течение 1(H) подаче ускоряющего напря-
жения для направления потока ионов внутрь трубки с бесполевой областью. По-
сле этого источник отключают на некоторое время, чтобы остаточные ионы
прошли по трубке к детектору.
Время-пролетные анализаторы, такие как квадрупольный, позволяют про-
сканировать масс-спектр очень быстро. Можно достичь разрешения на уровне
500. Эти анализаторы наиболее часто используют для детектирования ионов боль-
шой массы, поскольку для них нет верхних ограничений по массе.
Масс-спектрометрия в сочетании с газовой хроматографией
Одной из наиболее серьезных проблем на ранних этапах развития хромато-
масс-спектрометрии было присоединение выхода хроматографической колонки
к масс-спектрометру. Использовали набивные колонки, и большие объемы как
образца, так и газа-носителя перегружали (переполняли) масс-спектрометриче-
скую систему, которая работала при низких давлениях, поэтому требовалось
сконструировать специальное «стыкующее» устройство. С появлением кварце-
192
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
вых капиллярных колонок появилась возможность разработки такого устройст-
во для ГХ-МС с тем, чтобы элюат из колонки можно было бы непосредственно
направлять в источник ионов. Очень важно при этом минимизировать потери
неподвижной фазы из колонки, поскольку масс-спектрометр будет детектировать
и частицы неподвижной фазы. Вымывание неподвижной фазы из колонки можно
предотвратить химическим путем, закрепляя на стенках колонки алкилсилокса-
ны. О других неподвижных фазах, для которых характерны очень незначитель-
ные потери за счет вымывания, уже было сказано выше.
Естественно, непрерывный контроль (мониторинг) пиков в газовой хрома-
тографии — несколько раз в секунду — приводит к очень большому объему ин-
формации (объемам данных). Развитие современных компьютеров с быстрыми
процессорами, дисками высокой емкости и другими преимуществами позволи-
ло использовать метод ГХ-МС в рутинных целях.
Разделенные ионы детектируют с помощью электронного умножителя, по-
добного по устройству фотоумножителю, рассмотренному в гл. 16. Чувствите-
льность детектирования — обычно на уровне нанограммов.
Существуют разные варианты работы масс-спектрометра. При мониторин-
ге общего потока ионов (total ion current, TIC) он суммирует потоки от всех
фрагментов ионов и молекул для всех хроматографических пиков веществ, про-
ходящих через детектор, и полученный график при этом напоминает хроматог-
рамму с несколькими пиками, характерную для газовой хроматографии. В ион-
селективном варианте ведут мониторинг ионов с определенным соотношением
m/z, и тогда детектор реагирует только на те фрагменты молекул или ионов, ко-
торые характеризуются таким соотношением. В режиме масс-спектра сигнал
каждой детектируемой молекулы сохраняют в оцифрованном виде в компьюте-
ре, присоединенном к системе, и тогда масс-спектр, соответствующий искомому
хроматографическому пику, можно вывести на просмотр. Масс-спектр является
наиболее общей, полной характеристикой данного вещества (если хроматогра-
фический пик соответствует только одному компоненту), своего рода «отпечатком
пальцев» вещества при различных соотношениях m/z. При этом определенные
пики будут преобладать по интенсивности.
На рис. 20.13 приведены примеры идентификации кокаина в образце подо-
зрительного порошка, растворенном в метаноле, с помощью ГХ-МС. На верхнем
рисунке представлена хроматограмма образца, полученная в режиме общего по-
тока ионов (TIC). Пик, вышедший при 11,5 мин, соответствует времени удержи-
вания, ожидаемому для кокаина. На среднем рисунке приведен масс-спектр,
соответствующий веществу с временем удерживания 11,5 мин, и на нижнем ри-
сунке — масс-спектр стандартного образца кокаина. Масс-спектры вещества в
пробе и стандартного образца идентичны. Кроме того, пик исходного («роди-
тельского») иона наблюдается при значении m/z, соответствующем форме М+
для кокаина (относительная молекулярная масса 303,35). (Небольшой пик при
отношении m/z, равном 304, соответствует ионной форме МН+, также часто об-
разующейся при расщеплении.)
Масса/заряд
1,2Е6
1,0Е6
8,0Е5
6,0Е5
4,0Е5
2.0Е5
О 100 150 200 250 300
Масса/заряд
РИС. 20.13. Подтверждение присутствия кокаина методом ГХ-МС. Вверху', газовая хроматограмма
кокаина в образце мочи, снятая в режиме TIC. В центре', масс-спектр для компонента, имеющего
пик при 11,5 мин. Внизу', масс-спектр для газохроматографического пика, полученного для стан-
дартного образца кокаина с таким же временем удерживания
194
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Фрагментарные образцы часто образуют пики, соответствующие потере
специфических групп в составе молекул, например, СО2 или NH2, что дает даль-
нейшую уверенность в присутствии молекул данного соединения или может
быть использовано для получения информации о структуре молекулы. Произво-
дители масс-спектрометров предоставляют компьютерные базы данных по
масс-спектрам (библиотеки масс-спектров) для тысяч соединений, и, таким об-
разом, можно провести компьютерный поиск спектров, подходящих к спектру
неизвестного вещества.
База данных NIST/EPA/NIH «Mass Spectra Library 1998» (www.nist.gov/srd/
analy. htm) — наиболее полный, всеобъемлющий многолетний продукт, содер-
жащий ссылки на масс-спектры наиболее применяемых во всем мире соедине-
ний; она может быть представлена как в ASCII-кодах (т. е. в простом текстовом
режиме), так и в виде Windows-приложения. В библиотеке содержатся сведения
по электронно-ионизационным спектрам, структуре и молекулярным массам
для 108 000 соединений. База данных доступна вместе с программой поиска
NIST MS Search Programm for GC/MS, что позволяет проводить расшифровку и
интерпретацию масс-спектров и химический структурный анализ. Масс-спект-
ры более 12 000 соединений содержит находящаяся в свободном доступе система
NIST chemistry WebBOOK (http:/ / webbook.nist.gov) — стандартная программа,
содержащая также ссылки на спектры в ИК-, УФ- и видимом диапазоне.
База данных Wiley/NIST Registry of Mass Spectral Data (изд. 7-e, 1999) содер-
жит ссылки на более 390 000 спектров. В нее также включен 32-битное програм-
мное обеспечение для поиска и идентификации спектров неизвестных соединений.
Можно проводить поиск масс-спектров по их виду, молекулярным массам или
положению характерных пиков.
Сочетание газовой капиллярной хроматографии с масс-спектрометрией при-
вело к созданию чрезвычайно мощного аналитического метода. Капиллярная
ГХ при эффективности в тысячи тарелок обеспечивает разрешение сотен соеди-
нений на отдельные пики, а масс-спектрометрия отвечает за их идентификацию.
Даже если пик содержит два или более неразделенных соединения, все равно
можно провести надежную идентификацию, особенно в сочетании с данными
по удерживанию компонентов.
Что мы узнали из этой главы?
• Устройство газового хроматографа — стр. 157
• Колонки для ГХ: набивные, капиллярные — стр. 161
• Неподвижные фазы: полярные и неполярные — стр. 165
• Детекторы для ГХ (см. табл. 20.2) — стр. 170
• Программирование температурного режима — стр. 175
• Количественный анализ: внутренние стандарты, использование электрон-
ных таблиц — стр. 175
ЗАДАЧИ
195
• Анализ летучих веществ, термическая десорбция, очистка и улавливание
примесей — стр. 179, 180
• Микроколонки для экспрессного разделения — стр. 181
• Метод ГХ-МС, масс-анализаторы — стр. 182, 189, 191
Вопросы
1 - Опишите принципы газовой хроматографии.
2. Какие соединения можно определять методом газовой хроматографии?
3- Назовите основные виды газовой хроматографии.
4. Сравните эффективность набивных и капиллярных колонок по числу тео-
ретических тарелок.
5. Сравните по разрешающей способности капиллярные колонки с модифи-
цированными внутренними стенками, капиллярные колонки, заполненные
модифицированными носителями, и колонки с капиллярами с пористым
слоем.
6. Опишите принципы работы следующих типов детекторов для газовой хро-
матографии: а) катарометра; б) пламенно-ионизационного; в) электронно-
го захвата.
7. Сравните детекторы, перечисленные в вопросе 6 по их чувствительности и
возможности определения различных классов веществ.
8. Как с помощью программирования температуры улучшить разделение?
9. Что необходимо для осуществления экспрессного газохроматографическо-
го анализа?
10. Опишите принципы хромато-масс-спектрометрии. Каковы преимущества
метода ГХ-МС?
11. Что такое молекулярный ион?
12. Сформулируйте «азотное правило».
13. Какие источники ионизации обычно используют в ГХ-МС?
14. Какие масс-анализаторы обычно используют в ГХ-МС?
Задачи
15. Какое необходимо разрешение в масс-спетрометрии, чтобы достичь еди-
ничного разрешения для молекулярных масс 600 и 601?
16. Масс-спектрометр имеет разрешение 5000. Как близко будут находиться
два разделенных пика с номинальной массой 600?
17. Редуктор газового баллона для хроматографии обычно отградуирован в
единицах psig (фунт на квадратный дюйм выше атмосферного давления).
196
ГЛАВА 20. ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Зная, что нормальное атмосферное давление составляет 760 мм рт. ст.,
или 14,7 psi, рассчитайте давление на входе в газовый хроматограф
(в мм рт. ст.) для значения 40 psig, если при этом окружающее давление
745 мм рт. ст.
Задача с использованием электронных таблиц
18- Методом анализа летучих компонентов в водной пробе определяют следы
бензола. Пробу и стандартные образцы смешали с постоянным количест-
вом толуола в качестве внутреннего стандарта. При этом получены следу-
ющие данные:
Бензол, ppb Площадь пика бензола Площадь пика толуола
10,0 252 376
15,0 373 370
25,0 636 371
Проба 533 368
Какова концентрация бензола в пробе? Подготовьте для вычислений элект-
ронную таблицу, как это было описано выше, и постройте градуировочный
график.
Литературный поиск
19- Если в вашей библиотеке есть Chemical Abstracts или SciFinder Scholar (см.
Приложение А), найдите из этого источника по крайней мере одну статью
по газохроматографическому определению следов этанола в крови. Прочи-
тайте ее и составьте краткий реферат о принципах метода, особенностях эк-
спериментальной методики, включая пробоподготовку. Есть ли в статье
информация о правильности и воспроизводимости методики?
Рекомендуемая литература
Общая
1 - Н. М. McNair and J. М. Miller, Basic Gas Chromatography. New York: Wi-
ley-Interscience, 1997.
2. W. Jennings, E. Mittlefehldt, and P. Stremple, eds., Analytical Gas Chromatog-
raphy. 2nd ed. San Diego: Academic, 1997.
3. D. Rood, A Practical Guide to Care. Maintenance, and Troubleshooting of Ca-
pillary Gas Chromatography. New York: Wiley, 1999.
4- A. Van Es, High-Speed Narrow-Bore Capillary Gas Chromatography. Heidel-
berg: Huthig, 1992.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
197
5. В. Kolb and L. S. Ettre, Static Headspace-Gas Chromatography. New York: Wi-
ley, 1997.
6. W. O. McReynolds, «Characterization of Some Liquid Phases», J. Chromatogr.
Sci.,Z(\91O) 685.
7. D. M. Ottenstein, «Column Support Materials for Use in Gas Chromatography»,
J. Gas Chromatog., 1 (4) (1963) 11.
8. W. R. Supina and L. P. Rose, «The Use of Rohrschneider Constants for Classifi-
cation of GLC Columns», J. Chromatogr. Set, 8 (1970) 214.
Хромато-масс-спектрометрия
9. M. C. McMaster and C. McMaster, GC/MS: A Practical User's Guide. New
York: Wiley, 1998.
10. H.-J. Hubschmann, Handbook of GC/MS. New York: Wiley, 2001.
11. M. Oehme, Practical Introduction to GC-MS Analysis with Quadrupoles. New
York: Wiley, 1999.
Интернет-сайты
12. Scientific Instrument Services, www.sisweb.com — приведен масс-конвертер.
13- JEOL USA, Inc., www.jeol.com — даны определения основных понятий
масс-спектрометрии и примеры использования метода для анализа. Ссыл-
ки на другие Интернет-источники.
Глава 21
ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Газовая хроматография (ГХ), благодаря своей экспрессности, чувствительности
и достаточно широким возможностям, получила более широкое применение,
чем жидкостная хроматография. Поскольку примерно 85% известных соедине-
ний не обладают летучестью и термической стабильностью, достаточными для
разделения этих веществ газовой хроматографией, для их анализа стали разраба-
тываться новые методические подходы. Изобилие информации, первоначально
полученной методом газовой хроматографии, было суммировано и обработано,
что и привело в дальнейшем к созданию метода высокоэффективной жидкост-
ной хроматографии (ВЭЖХ), который конкурирует с газовой хроматографией
по разрешающей способности и позволяет проводить разделение и измерения в
течение нескольких минут. ВЭЖХ — вид жидкостной хроматографии, во мно-
гом схожий с газовой хроматографией. «Секрет успеха» этого метода обуслов-
лен использованием мелких частиц одинаковой формы, что снижает вихревую
диффузию и приводит к быстрому массопереносу. Основным фактором для
того, чтобы газовая хроматография получила повсеместное распространение в
1950-х гг., была ее интеграция в нефтехимическую промышленность. Напротив,
применение ВЭЖХ к задачам фармацевтического производства началось в бо-
льшинстве фармацевтических лабораторий только в 1970-х гг., и теперь прибор-
ный парк аппаратуры для ВЭЖХ представлен гораздо шире, чем для газовой
хроматографии.
В данной главе описаны принципы высокоэффективной жидкостной хрома-
тографии и этапы ее развития, которые привели к современному «триумфу»
ВЭЖХ. Мы рассмотрим различные виды хроматографии: нормально-фазовую и
обращенно-фазовую (в которых разделение основано на различии в полярно-
сти), эксклюзионную (где разделение происходит в соответствии с размерами
молекул) и ионообменную хроматографию (разделение основано на различии в
зарядах частиц). Обсудим тонкослойную, или планарную, хроматографию.
В заключение мы остановимся на капиллярном электрофорезе — методе, в ко-
тором разделение аналитов происходит под действием приложенного электри-
ческого поля в соответствии с величиной и знаком заряда частиц.
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
199
21.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография
В 1964 г. Дж. Кельвин Гиддингс из Университета Юты опубликовал статью
«Comparison of the Theoretical Limit of Separation Ability in Gas and Liquid Chro-
matography (Сравнение теоретической разрешающей способности в газовой и
жидкостной хроматографии» [Anal. Chem., 36 (1964) 1890]. В обычной жидкост-
ной хроматографии до этого преимущественно работали с большими колонка-
ми, заполненными большими же частицами, подвижную фазу подавали просто
«самотеком» — под действием силы тяжести, фракции эффлюента собирали
вручную и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре. Гиддингс
предсказал значительное улучшение эффективности в жидкостной хроматогра-
фии при использовании мелких частиц и при подаче подвижной фазы под давле-
нием, что привело бы к значительному увеличению числа теоретических тарелок.
Спустя несколько лет Шаба Хорват и его коллега С. Р. Липски из Йельского уни-
верситета впервые осуществили хроматографическое разделение в варианте, на-
званном ими жидкостной хроматографией под высоким давлением. Но это
случилось уже в 1970-х гг., после того, как была разработана технология получе-
ния мелких частиц оксида кремния с силанированной поверхностью, что позволи-
ло использовать длинные колонки с малым внутренним объемом, необходимые
для более высокого разрешения. В настоящее время метод известен как высоко-
эффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ, HPLC).
Теоретические основы
Классическая жидкостная хроматография в значительной степени вытеснена на-
много более пригодной для аналитических целей формой ВЭЖХ, основные
узлы которой изображены на рис. 21.1; на рис. 21.2 представлена фотография со-
временного прибора для ВЭЖХ. Такие приборы обычно выпускают в виде от-
дельных блоков для сборки в отличие от большинства газовых хроматографов,
что позволяет пользователю заменять или комбинировать различные составля-
ющие части прибора.
Скорость распределения растворенных веществ между неподвижной и по-
движной фазами в классической жидкостной хроматографии главным образом
зависит от скорости диффузии. Диффузия в жидкостях происходит значительно
медленнее, чем в газах. Чтобы минимизировать процессы диффузии и тем са-
мым снизить время, необходимое для перемещения компонентов пробы к реак-
ционным центрам внутри колонки и от них, необходимо выполнить два условия.
Во-первых, колонка должна быть очень тщательно заполнена сферическими ча-
стицами одинакового размера—для достижения оптимальной плотности запол-
нения и их гомогенного распределения; во-вторых, неподвижная фаза должна
представлять собой тонкий равномерный слой без застойных зон. Первое усло-
вие приводит к уменьшению параметра Л в уравнении Ван Деемтера (т. е. к уме-
ньшению вихревой диффузии), второе — к уменьшению параметра С (т. е. к
более быстрому массопереносу между фазами, что необходимо при высокой
скорости потока). Поскольку молекулярная диффузия в жидкостях незначитель-
200
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Демпфер для
снижения
Рис. 21.1 . Основные узлы хроматографа для ВЭЖХ (опубликовано с разрешения Analabs, Inc.
Research Notes. Copyright ©1971)
на, то и параметр В в уравнении (19.8) мал. Таким образом, существенного, как
на рис. 19.4, возрастания высоты теоретической тарелки //при низких скоростях
потока не наблюдается. Значение Н в ВЭЖХ главным образом определяется
скоростью массопереноса. Зависимость Н от линейной скорости потока для
жидкостной хроматографии выражается уравнениями Губера (19.21) и Нокса
(19.23), приведенными в гл. 19, и графически представлена на рис. 21.3.
Неподвижные фазы
Изначально в качестве сорбентов для ВЭЖХ использовали частицы неправиль-
ной формы на основе силикагеля или оксида алюминия размером 10 мкм или
меньше. Впоследствии перешли к сферическим частицам, более равномерно
заполняющим колонку и тем самым обеспечивающим более высокую эффектив-
ность метода (рис. 21.4). Это частицы на основе сверхчистого оксида кремния с
низким содержанием следов металлов, с типичным диаметром от 5 до 10 мкм,
хотя частицы с диаметром 3 мкм нашли более широкое применение для высоко-
скоростной хроматографии (см. ниже). Диаметр пор обычно составляет от 60 до
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
201
Рис. 21.3
Кривая Ван Деемтера для ВЭЖХ
Рис. 21.2
Хроматограф для ВЭЖХ.
С разрешения Agilent
Technologies
Средняя линейная скорость подвижной фазы ц, см/с
100 А, однако в случаях разделения больших биомолекул для их лучшего про-
никновения в поры подходят и частицы с диаметром пор 300 А или даже выше.
В основном ВЭЖХ-разделения выполняют в жидкостно-жидкостном вари-
анте (распределительная хроматография), но адсорбционную хроматографию
202
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
также используют для решения широкого круга задач. Жидкими неподвижными
фазами либо покрывают частицы сорбента, либо закрепляют их химическим
способом.
Наиболее часто применяют микропористые частицы, проницаемые для
растворителя (рис. 21.5, а). Высокая удельная площадь поверхности достигается
главным образом за счет внутренней поверхности пор. Подвижная фаза движет-
ся вокруг частиц сорбента, и растворенные вещества за счет диффузии проника-
ют внутрь пор с застоявшейся подвижной фазой, где взаимодействуют с
неподвижной фазой, а затем вновь диффундируют в движущуюся подвижную
фазу. При использовании более мелких частиц расстояние, необходимое для
диффузии, снижается и тем самым уширение пиков происходит в меньшей степе-
ни. На рис. 21.4 показаны микропористые частицы кремнезема, на рис. 21.6, а —
агрегированные (сплавленные) сферические частицы с 50%-й пористостью (диа-
метр пор —100 А). На следующей фотографии (рис. 21.6, б) представлен широко
применяемый «губчатый» силикагель с 70%-й пористостью и таким же средним
диаметром пор, но с большей удельной поверхностью; однако поры этого сили-
кагеля имеют больший разброс по размерам, а его химическая стабильность в
щелочных растворах несколько ниже.
СНЧ
Экранирование силаноль-
ных групп на поверхности
сорбента. Экранирована
средняя свободная группа
SiOH
РИС. 21.4. Сферические пористые частицы оксида кремния, 10 мкм
(800-кратное увеличение). Диаметр пор в частицах 100 А. Область
применения: основный кремнезем для адсорбционной хроматогра-
фии, либо в сочетании с химически закрепленной неподвижной
фазой (сорбент Astrosil®). Опубликовано с разрешения компании
Stellar Phases, Inc.
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
203
Жидкость или
а - микропористая
частица
б - перфузионная частица
с транспортными
макропорами
в - непористая
частица
Рис. 21.5. Различная структура частиц сорбентов для ВЭЖХ [D. С. Scott, Modem Practice of Liquid
Chromatography. Ed. J. J. Kirkland, New York: Wiley-Interscience, 1971]. Опубликовано с разрешения
Кремнеземы склонны к постепенному
разрушению при pH выше 8, поэтому для
разделения оснований применяют полимер-
ные частицы с поперечными сшивками —
например, сшитые полистирол или полиме-
тилметакрилаты. Они остаются химически
стабильными и в сильнощелочных раство-
рах, хотя и проявляют более низкую эффек-
тивность, чем кремнеземы.
На поверхности частиц кремнезема на-
ходятся силанольные группы —SiOH. Их
используют при химическом модифициро-
вании поверхности неподвижной фазы
хлорсиланами:
СН3 СН3
I III
—Si—ОН + Cl—Si—R—> — Si—О—Si—R + HC1
CH3 CH3
Химически модифицированные непо-
движные фазы (с привитыми группами) более
стабильны. В химическом модифицировании
а
ZORBAX Ra-SIL
(золь оксида
кремния)
б
Xerogel на основе
оксида кремния
Рис. 21.6
Фотографии: а -— микросфериче-
ской частицы пористого кремнезе-
ма Zorbax (50%-ная пористость,
диаметр пор 100 А); б — частица
силикагеля Xerogel (70%-ная пори-
стость, диаметр пор 100 А). С раз-
решения Agilent Technologies
участвуют свыше половины силанольных
групп, а оставшиеся переводят в нереакционноспособное состояние — экрани-
руют триметилсилановыми группами. У сорбента Zorbax силанольные группы
204
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
на поверхности частиц также экранированы пространственно расположенными
СН3
I
изопропильными группами —С—СН3 вместо двух метильных групп в составе
СН3
органохлорсиланового реагента.
Большинство неполярных химически модифицированных неподвижных фаз
для обращенно-фазовой хроматографии содержит группы С18 или С8 (показано
выше), причем группу С18 (так называемый октадецилсилан — ОДС) используют
намного чаще; группы С8 проявляют среднюю гидрофобность, а группы С18 —
наиболее неполярные. Также часто применяют фенильные группы [(СН2)3С6Н5].
Сорбенты, модифицированные группами С5, используют для ВЭЖХ в сочета-
нии с масс-спектрометрией, поскольку для них характерны очень низкие потери
неподвижной фазы. Полярные фазы для нормально-фазовой хроматографии
представлены (в порядке увеличения полярности) цианогруппами [(CH2)3CN],
диольными группами [(СН2)2ОСН2СН(ОН)СН2ОН], аминогруппами [(CH2)3NH2]
и диметиламиногруппами [(CH2)3N(CH3)2].
Когда частицы сорбента покрывают жидкой фазой, прежде чем закрепить
ее химическим способом, силанольные группы на поверхности дезактивируют
триметилхлорсиланом.
Перфузионные наполнители с транспортными макропорами, предло-
женные Ф. Ренье и сотрудниками из Университета Пурду, содержат как боль-
шие сквозные поры, так и малые поры для диффузии (рис. 21.5, б). Поры для
диффузии, как и в микропористых частицах, обеспечивают сорбционную ем-
кость. Сквозные транспортные поры позволяют подвижной фазе свободно про-
ходить прямо через сорбент, тем самым увеличивая скорость массопереноса в
подвижной фазе. Поскольку растворенное вещество в этом случае затрачивает
меньше времени для полного массопереноса, то пики сужаются; процесс в це-
лом представляет собой сочетание диффузии и конвекции. Такие сорбенты име-
ют большие размеры частиц, чем микропористые наполнители — обычно около
12 мкм в диаметре. Их можно использовать при более высоких скоростях пото-
ка, при этом они наиболее эффективны при разделении макромолекул, напри-
мер, белков. Также их часто применяют в препаративной хроматографии.
Непористые наполнители (рис. 21.5, с) как на основе оксида кремния, так
и на основе полимерных смол характеризуются очень малым диаметром —
от 1,5 до 2,5 мкм, с закрепленным на них тонким пористым слоем. В этом случае
удается избежать образования застойных зон подвижной фазы, что способству-
ет заметному увеличению скорости массопереноса. Большие или малые молеку-
лы можно разделить в течение нескольких минут. Однако такой тонкий
сорбционный слой приводит к очень малой нагрузочной емкости колонки, а
противодавление внутри колонки создается значительно больше, чем в случае
заполнения колонки пористыми частицами с диаметром 3 или 5 мкм. Давление
на входе в колонку обратно пропорционально квадрату диаметра частиц, таким
образом, уменьшение диаметра в 2 раза приводит к четырехкратному возраста-
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
205
нию противодавления. По этой причине использование малых пористых частиц
предпочтительнее в большинстве случаев, при этом разделение на колонках с по-
ристыми частицами диаметром 3,5 мкм и с непористыми модифицированными
частицами диаметром 1,5 мкм происходит за сравнимое время, но вместе с тем
для пористых наполнителей входное давление заметно ниже, а рабочая скорость
потока — выше. Непористые частицы нашли свое применение для разделения
сложных пептидных смесей (за достаточно короткое время, иногда — на уровне
секунд), а также в ионной хроматографии (см. ниже).
Монолитные колонки — альтернативный подход к снижению давления на
входе в систему и увеличению скорости массопереноса. Они представляют собой
твердые стержни из пористого кремнезема вместо обычно используемых частиц
неподвижной фазы. Подобно перфузионным наполнителям они характеризуются
бимодальным распределением пор по размерам (рис. 21.7). Макропоры, играю-
щие роль сквозных транспортных пор для подвижной фазы, обычно имеют диа-
метр свыше 2 мкм. Стержень из кремнезема содержит еще и мезопоры с диаметром
около 13 нм (130 А). Их внутренняя поверхность может быть химически моди-
фицирована группами С18. Внешняя поверхность пористого стержня обычно защи-
щена пленкой полиэфирэфиркетона (ПЭЭК, РЕЕК) во избежание «пристеночного
эффекта» для потока раствора, проходящего вдоль зазора между стенками ко-
лонки и стержнем. Удельная площадь поверхности мезопор превышает 300 м2/г,
общая пористость — 80%, что сравнимо с пористостью для частиц кремнезема
(65%). Кривая Ван Деемтера, построенная для монолитной колонки, выглядит
примерно так же, как и для колонок, заполненных частицами с диаметром
3,5 мкм, при этом эффективность оказывается значительно выше, чем для час-
тиц с диаметром 5 мкм. Поскольку входное давление для монолитных колонок
намного ниже, то можно работать при скорости потока 9 мл/мин и выше, что за-
метно ускоряет разделение. Массоперенос облегчается за счет конвекции в до-
полнение к диффузии, поэтому такие колонки можно применять для разделения
белков, пептидов, полинуклеотидов и т. п. так же успешно, как и для разделения
низкомолекулярных веществ. Полимерные монолитные колонки достаточно ко-
ротки, поэтому число теоретических тарелок слишком мало для успешного
РИС. 21.7. Мезопоры (а) и макропоры (б) в монолитном стержне (вид в электронный микроскоп).
[D. Lubda, К. Cabrera, W. Krass, С. Schaefer, D. Cunningham. LC-GC, 19(12) (2001) 1186]. Опублико-
вано с разрешения
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
изократического разделения сложных смесей, но в этих случаях используют
прием последовательного соединения нескольких колонок. Монолитные колон-
ки выпускает фирма Merck KgaA (Дармштадт, Германия, сайт производителя
www.merck.de) под коммерческой маркой Chromolith.
При разработке новых типов сорбентов для ВЭЖХ пробовали самые раз-
личные подходы, кроме того, были предложены сорбенты на основе полимер-
ных материалов, которые можно использовать как при очень высоких, так и
низких значениях pH. Высокие значения pH необходимы при разделении осно-
ваний. Прочность частиц кремнеземов обычно ограничивается при pH выше 8,
поскольку силанольные связи гидролизуются в этой области pH; с другой сторо-
ны при pH ниже 2 они также не устойчивы. Компанией Waters Corporation
(www.waters.com) предложены гибридные частицы на основе кремнезема со
слоем полимера (коммерческое название Xterra). Частицы получают при сме-
шивании двух мономеров с высокой степенью очистки, один из которых образу-
ет цепочку SiO2, а другой — цепочку RSiOj 5, где R — метильный радикал.
В полученную структуру включают органосиланольные группы, а затем к ним
химическим способом прививают обращенную фазу (например, группы С18).
Устойчивость частиц в более кислой среде обусловлена тем, что при их форми-
ровании в первую очередь участвуют трифункциональные силаны, а не моно-
функциональные. Поскольку основа частицы уже содержит метилсилоксановые
группы, то от 30 до 50% остаточных силанольных групп связывается и экрани-
руется, что в итоге приводит к уменьшению размывания хроматографических
пиков. Такие частицы устойчивы и при высоких (выше 11), и при низких значе-
ниях pH.
П. Карр (Университет Миннесоты) предложил использовать пористые час-
тицы оксида циркония ZrO2, так как они устойчивы в широком диапазоне pH
(от 1 до 14) и термостабильны до 200 °C. Эти сорбенты, производимые в настоя-
щее время фирмой ZirChrom Separations, Inc. (www.zirchrom.com), получают
направленной полимеризацией из агрегированных коллоидных частиц оксида
циркония (размером 1000 А); при этом полученные монодисперсные частицы
имеют правильную сферическую форму с диаметром 3 мкм. Иногда коллоидные
частицы сплавляют при 900 °C для получения моноклинных кристаллов оксида
циркония. Для получения обращенной неподвижной фазы частицы можно хи-
мически модифицировать различными группами, например, покрывая оксид
циркония тонким слоем полибутадиена или полистирола. Так же получают час-
тицы с очень тонким слоем элементного углерода на поверхности матрицы.
Фирмой разработана технология ковалентного связывания, применяемая для за-
крепления групп С18 на поверхности, модифицированной слоем углерода. Более
полную информацию по каждому из перечисленных типов сорбентов можно
найти на сайте фирмы ZirChrom. (На сайте также выложена бесплатная версия
программы для расчетов при приготовлении буферных растворов.) Полный об-
зор свойств неподвижных фаз на основе оксида циркония опубликован в журна-
ле Anal. Chem, 73 (2001) 598А.
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
207
Оборудование для ВЭЖХ
За более быстрое, эффективное разделение приходится «платить» возрастанием
давления в системе при заполнении колонок частицами малого диаметра и необ-
ходимостью приобретения специального оборудования для управления всем
процессом в целом. Для обеспечения скорости потока 1-2 мл/мин при использо-
вании колонок с внутренним диаметром 3-5 мм и длиной 10-30 см давление в
системе должно достигать от 1000 до 3000 psi (фунт/дюйм2, или около 70 атм),
хотя на определенных участках хроматографа оно может возрасти и до 6000 psi.
По большей части, от 80 до 90% разделений в варианте ВЭЖХ получено при дав-
лении не ниже 1200 psi, и только в отдельных случаях в качестве материала для
колонок можно применять полиуретановые смолы, выдерживающие давление
чуть выше атмосферного.
Хроматограф для ВЭЖХ состоит из следующих основных узлов.
1. Система для подачи подвижной фазы. Эта система включает насос высоко-
го давления и, как правило, устройство для градиентного элюирования (напри-
мер, для изменения концентрации компонентов элюента, таких как растворитель,
электролит, Н+ и т. д.). Емкости для растворителей могут быть заполнены рас-
творителями с разной полярностью, но при этом хорошо смешивающимися
между собой, либо растворами с различным pH для получения буферного рас-
твора при их смешивании. Растворители должны быть чистыми, дегазированными
во избежание образования пузырей газа и возникновения «воздушных затворов» в
кранах и клапанах насоса. Образование пузырей также может вызвать возникно-
вение ложных пиков при прохождении через ячейку детектора. Возникновение
пузырей — особенно серьезная проблема при смешивании растворителей (на-
пример, ацетонитрила или метанола с водой), поскольку растворимость воздуха
в смеси ниже, чем в чистых растворителях, и когда смешивают растворители,
находящиеся в равновесии с воздухом, появляются пузыри. Необходима систе-
ма дегазации для понижения избыточного содержания воздуха до приемлемого
уровня. Наиболее часто используемые способы дегазации — пропускание гелия
(позволяет удалить до 80% растворенного воздуха) или вакуумная дегазация
(удаляет около 60% воздуха). При пропускании гелия могут частично испарять-
ся некоторые летучие растворители, однако современные системы дегазации со-
держат устройства, позволяющие значительно уменьшить потери растворителей.
Многие производители включают в состав хроматографических систем прибор
для непосредственной вакуумной дегазации, в которой раствор пропускают че-
рез присоединенную к вакуумной емкости полимерную трубку с пористыми
стенками, выполненную, например, из тефлонов различных марок — аморфных
полимеров, при этом скорость диффузии газов возрастает в 2-3 раза. Некоторые
хроматографисты предпочитают вначале пропустить гелий в течение короткого
времени, а затем поместить подвижную фазу в вакуумный дегазатор для даль-
нейшего снижения содержания растворенного газа.
Типичные значения скоростей потока при работе с колонками диаметром
4,6 мм составляют 1-2 мл/мин. Применяемые растворители должны удовлетво-
рять требованиям по чистоте (ТУ «для ВЭЖХ»). Это означает, что растворители
208
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
были профильтрованы на фильтре с диаметром пор 0,2 мкм. Соблюдение этих
правил увеличивает срок службы насоса и позволяет избежать загрязнения филь-
тров на входе в колонку.
Наиболее часто используемый тип насоса для ВЭЖХ — насос с двойным
ходом поршня. У него есть малая камера с клапаном, которая попеременно за-
полняется подвижной фазой и вновь опустошается при движении клапана впе-
ред-назад. При этом создается поток с флуктуациями (пульсациями), которые
необходимо сглаживать. Насосы с двойным ходом поршня обладают рядом пре-
имуществ: малым внутренним объемом, высоким давлением на выходе насоса, и
с ними можно работать в режиме градиентного элюирования. Такие насосы
обеспечивают постоянную скорость потока, не зависящую от вязкости раство-
рителя и сопротивления наполнителя в колонке. Другие типы насосов — насосы
шприцевого типа и пневматические насосы постоянного давления.
2. Система для ввода пробы. Типичное устройство для ввода пробы (инжек-
тор, или кран-дозатор) показано на рис. 21.8. Оно содержит кольцо из нержавею-
щей стали, снабженное шестью входными и выходными отверстиями, к одному
из которых подключена колонка. Подвижный тефлоновый конус внутри кольца
содержит три открытых сегмента, каждый из которых соединяет попарно внеш-
ние отверстия инжектора. Два внешних отверстия присоединены к внешней пет-
ле фиксированного объема. В первой позиции конус внутри инжектора
позволяет потоку подвижной фазы поступать непосредственно в колонку, а пет-
лю инжектора в это время можно заполнить образцом. Затем тефлоновый конус
поворачивается на 30°, тем самым переключая поток подвижной фазы на петлю,
и образец из петли поступает вместе с подвижной фазой в колонку. Такое
Петля для
а - Заполнение пробой
петли инжектора
б - Ввод пробы в поток
подвижной фазы
Рис. 21.8 . Петлевой кран-дозатор (инжектор) [D. С. Scott, Modem Practice of Liquid Chromatogra-
phy. J. J. Kirkland, ed. New York: Wiley-Interscience, 1971]. Опубликовано с разрешения
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
209
устройство предусматривает введение проб, объем которых составляет всего не-
сколько микролитров при давлении в системе до 6000 psi.
Вводить пробы в петлю инжектора можно и вручную с помощью специаль-
ного шприца. В последнее время широко используют автоматизированные инжек-
торы, соединенные непосредственно с автоматическим устройством пробоотбора
(автосамплером). Основное ограничение при работе кранов-дозаторов вызвано
тем, что при фиксированном объеме пробы приходится заменять петлю инжек-
тора для варьирования объема пробы. Существуют автоматические управляемые
шприцы, которые создают достаточное давление для предотвращения вытекания
пробы назад через инжектор.
3. Колонка. Наилучшие колонки делают на основе прямых трубок правильной
формы из нержавеющей стали (рис. 21.9). Для различных практических нужд
выпускают колонки различного внутреннего диаметра и длины. Наиболее часто
встречаются колонки с внутренним диаметром 3,9 или 4,6 мм. Колонка диамет-
ром 4,6 мм, правильно заполненная частицами с диаметром dp = 5 мкм, должна
иметь эффективность от 60000 до 90000 т. т./метр при скорости потока 1 мл/мин.
Типичная колонка длиной 15 см и внутренним диаметром 4,6 мм имеет эффек-
тивность 15000 т. т. при заполнении частицами диаметром 3 мкм, 9000 т. т. —
при заполнении частицами диаметром 5 мкм, и 5000 т. т. — для частиц диамет-
ром 10 мкм. При использовании частиц меньшего диаметра длина колонки
ограничена 25 см или даже меньше из-за роста входного давления. Например,
при длине колонки 25 см и числе теоретических тарелок 50000 можно работать
с водно-метанольными подвижными фазами при входном давлении 5000 psi.
В таких условиях можно разделить до 50 или до 100 пиков, что для обычных ва-
Рис. 21.9. Различные типы колонок для ВЭЖХ (с разрешения Waters Corporation)
210
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
риантов ВЭЖХ составляет предельную возможность. Как мы увидим ниже, су-
ществует вариант скоростной хроматографии на коротких колонках с
широкими каналами, однако лучшее разрешение достигается для более узких
колонок.
Ниже приведены некоторые правила для выбора неподвижной и подвижной
фаз. Контроль температуры колонки в варианте жидкостно-твердофазной хро-
матографии обычно не требуется, если только нет необходимости работы при
повышенных температурах, однако он желателен в других вариантах жидкост-
ной хроматографии (жидкостно-жидкостной, эксклюзионной, ионообменной).
Некоторые детекторы, особенно рефрактометры, очень чувствительны к изме-
нениям температуры: и если колонка работает при температуре более высокой,
чем окружающая среда, то необходим охлаждающий защитный кожух между
выходом колонки и детектором, чтобы понижать температуру подвижной фазы
до температуры окружающей среды.
Небольшие колонки длиной от 3 до 10 см, называемые предколонками, по-
мещают между инжектором и аналитической колонкой. Обычно их заполняют
тем же сорбентом, что и аналитическую колонку. Эти колонки включают в хро-
матографическую систему по двум причинам. Во-первых, они задерживают
мелкие частицы, которые могут попасть из каналов насоса или из компонентов
образца в аналитическую колонку и испортить ее, снизив эффективность и се-
лективность. Во-вторых, на предколонке удерживаются сильносорбируемые
компоненты пробы, которые в случае их сорбции на аналитической колонке
было бы трудно элюировать. Таким образом, предколонка продлевает срок
службы аналитической колонки. Предколонки можно легко заменять или перио-
дически регенерировать. Некоторые аналитические колонки уже содержат интег-
рированную предколонку без соединительных капилляров, что сделано специально
для уменьшения «мертвого» объема системы и возможного уширения хроматог-
рафических пиков. Также между насосом и инжектором на пути потока подвиж-
ной фазы можно поставить фильтр.
4. Детектор. Для высокоэффективной жидкостной хроматографии необходимы
детекторы с высокой чувствительностью, позволяющие определять вещества на
уровне мкг-нг. Очень часто применяют рефрактометрические детекторы или
фотометрические детекторы в УФ-диапазоне. Дифференциальный рефракто-
метр часто называют универсальным типом детектора. Он реагирует на измене-
ния показателя преломления подвижной фазы, содержащей элюируемые из
колонки вещества. Однако его практически невозможно использовать в режиме
градиентного элюирования из-за постоянного изменения базовой линии (при
смене растворителя в градиентном режиме происходят соответствующие изме-
нения показателя преломления элюента), а также в тех случаях, когда показатели
преломления растворителя и растворенных веществ имеют достаточно близкие
значения. Кроме того, рефрактометрический детектор чрезвычайно чувствите-
лен к колебаниям температуры. Этот тип детектора обладает невысокой чувст-
вительностью и способен определять концентрации выше, чем 10-5—10-6 г/мл
(на уровне 10-1 ppm). Ультрафиолетовый детектор обладает лучшей чувстви-
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
211
тельностью, обычно доходящей до 10“8 г/мл (0,01 ppm). Он не реагирует на коле-
бания температуры, относительно недорог, и с ним можно работать в режиме
градиентного элюирования. УФ-детектор чувствителен к широкому спектру ор-
ганических соединений. Благодаря этим преимуществам, его используют пример-
но в 80% проводимых хроматографических исследований. Исключения составляют
случаи, когда растворители обладают значительным светопоглощением в
УФ-области, либо когда определяемые компоненты не поглощают в этой же об-
ласти спектра.
Многие УФ-детекторы — достаточно простые устройства с набором интер-
ференционных светофильтров, которые могут измерять светопоглощение только
при нескольких определенных длинах волн. В более дорогих моделях детекторов
есть монохроматоры, которые позволяют выбирать необходимые длины волн.
Причем возможен вариант снятия спектров поглощения для идентификации ве-
ществ при остановке потока подвижной фазы. Наиболее распространенный тип
детектора для ВЭЖХ — спектрофотометр, работающий в УФ- и видимой облас-
тях спектра. Он позволяет определять нанограммовые количества аналитов либо
поглощающих в УФ-области, либо окрашенных, поглощающих в видимой обла-
сти. Обычно в аналитические колонки вводят до 100 мкл пробы, поэтому при ис-
пользовании детекторов такого типа можно определять концентрации на уровне
10 ppb.
Наиболее современный вариант детектора для ВЭЖХ содержит линейку
фотодиодов (подробное описание приведено в гл. 16). Прибор обладает допол-
нительными возможностями для идентификации веществ и хорошей разреша-
ющей способностью; кроме того, он оснащен мощным устройством для
немедленного сохранения снятых спектров поглощения. Сфокусированный пу-
чок радиационного излучения проходит сквозь ячейку детектора и диспергиру-
ющее устройство (например, дифракционную решетку) и поступает на линейку
фотодиодов для детектирования. С помощью математического аппарата можно
добиться разрешения перекрывающихся спектров и тем самым дополнительно
увеличить «разделяющую способность» колонки, если получающиеся хрома-
тографические пики содержат два или несколько аналитов.
Флуоресцентные детекторы намного более селективны, чем УФ-детекто-
ры, поскольку только некоторые вещества способны к флуоресценции (см. гл. 16).
По чувствительности флуоресцентный детектор не уступает УФ-детектору, а
иногда и немного превосходит его, что определяется пространственным распо-
ложением источника возбуждения в конструкции детектора, интенсивностью
источника и квантовым выходом флуоресценции. Амперометрический детек-
тор (см. гл. 15) удобен при определении электроактивных веществ и в настоящее
время находит новое широкое применение в биохимическом анализе, например,
при ВЭЖХ-разделении и определении следовых количеств катехоламинов в ве-
ществе мозга.
При конструировании приборов для ВЭЖХ важно, чтобы «мертвый» объем
между инжектором для ввода пробы и колонкой, а также между колонкой и де-
тектором был минимальным, чтобы минимизировать размывание пиков и до-
стичь максимальной эффективности системы. Обычно для соединения колонки
212
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
с детектором используют 20-сантиметровые капилляры из нержавеющей стали,
что практически не снижает эффективность хроматографической системы в це-
лом. Внутренний объем ячейки детектора также должен быть минимальным —
как правило, около 1 мкл; однако у детекторов для капиллярной жидкостной
хроматографии объем ячейки бывает намного меньше микролитра. Ячейка спек-
трофотометрического детектора обычно имеет Z-образную конфигурацию с
кварцевым окном для горизонтального прохождения луча света вдоль потока
эффлюента. Это увеличивает длину оптического пути, повышает светопоглоще-
ние и тем самым — чувствительность.
Колонки и растворители, применяемые
в различных вариантах ВЭЖХ
Существует два основных варианта высокоэффективной жидкостной хроматог-
рафии — жидкостно-твердофазная, или адсорбционная, и жидкостно-жидкост-
ная, или распределительная. Наиболее часто применяют распределительную
нормально-фазовую (НФ) или обращенно-фазовую (ОФ) хроматографию. Как
адсорбционная, так и распределительная ВЭЖХ основаны на различии в поляр-
ности растворов, поскольку и сорбируемость, и растворимость определяются
полярностью веществ. Процессы распределения между двумя несмешивающи-
мися жидкостями достаточно чувствительны даже к незначительным изменени-
ям в молекулярной массе аналитов, поэтому их предпочитают использовать для
разделения веществ, принадлежащих к гомологическому ряду. С другой стороны,
процессы адсорбции чувствительны к стерическим эффектам в молекулах ана-
литов, и поэтому они удобны для разделения изомеров, имеющих различную
пространственную конфигурацию. Для адсорбционного варианта ВЭЖХ в каче-
стве сорбентов применяют частицы оксидов алюминия или кремния.
Высокополярные соединения разделяют, главным образом, в варианте рас-
пределительной хроматографии, в то время как неполярные соединения — в ва-
рианте адсорбционной хроматографии. Для аналитов средней полярности можно
осуществлять оба варианта ВЭЖХ. Соединения можно расположить по увели-
чению полярности в следующий ряд: углеводороды и их производные < кисло-
родсодержащие углеводороды < соединения-доноры протонов < соединения с
ионной связью: RH < RX < RNO2 < ROR (простые эфиры) = RCO2R (сложные
эфиры) = RCOR (кетоны) = RCHO (альдегиды) = RCONHR (амиды) < RNH2,
R2NH, R3N (амины) < RCOH (спирты) < Н2О < АгОН (фенолы) < RCO2H (карбо-
новые кислоты) < нуклеотиды < +NH3RCOO2 (аминокислоты). В адсорбционной
хроматографии сорбент обычно оставляют неизменным, а полярность элюента
увеличивают до тех пор, пока определяемые компоненты не будут элюировать-
ся. Наиболее часто используемые растворители располагаются по увеличению
полярности в такой последовательности: легкие бензиновые фракции (гексан,
гептан, петролейный эфир) < циклогексан < трихлорэтан < толуол < дихлорме-
тан < хлороформ < диэтиловый эфир < этилацетат < ацетон < н-пропанол < этанол <
< вода. В некоторых случаях для элюирования может потребоваться настолько
полярный растворитель, что определяемые компоненты могут элюироваться с
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
213
колонки практически одновременно, без разделения. Тогда следует перейти к
менее полярному сорбенту.
В нормально-фазовом (НФ) варианте хроматографии неподвижная фаза
является полярной, а в качестве подвижной фазы используют такие неполярные
растворители, как н-гексан, метиленхлорид, хлороформ. Поверхность непо-
движной фазы модифицируют силоксанами с полярными функциональными
группами в соответствии с увеличением полярности: цианогруппа < диольная
группа < аминогруппа < диметиламиногруппа. Такие сорбенты удерживают
преимущественно полярные, а не неполярные соединения.
В обращенно-фазовой (ОФ) хроматографии используют относительно не-
полярную неподвижную фазу в сочетании с полярными подвижными фазами,
такими как метанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран, вода, или, еще чаще, смеси
воды с органическими растворителями. Органические растворители в этом слу-
чае называют модификаторами, чаще всего в качестве модификатора приме-
няют ацетонитрил. Для достижения необходимой полярности варьируют
соотношение вода/органический растворитель. Метанол обычно служит для
разделения кислотных соединений, а ацетонитрил — для основных соединений.
Тетрагидрофуран используют при разделении веществ с большим дипольным
моментом. Эти растворители прозрачны в УФ-области и обладают низкой вяз-
костью. В качестве неполярных групп на поверхность сорбента прививают w-ок-
тадецил (С18), w-октил (С8) или фенильные радикалы. Полярные колонки для
обращенно-фазовой хроматографии содержат полиэтиленгликоль (ПЭГ) с
эфирными группами, которые взаимодействуют с полярными аналитами. Та-
кие колонки используют для разделения органических веществ: фенолов, по-
лиароматических углеводородов или соединений с гидроксильной группой.
При разделении на сорбентах с группами С18 пики таких соединений могут
значительно перекрываться. На колонках с ПЭГ следует ожидать обратного
порядка элюирования.
В водно-органических смесях можно растворять органические соединения
различных классов с тем, чтобы затем разделить их в варианте обращенно-фазо-
вой хроматографии, что и делает ОФ ВЭЖХ наиболее применяемым методом.
Если вещества можно разделить как в НФ-, так и в ОФ-вариантах ВЭЖХ, то по-
рядок элюирования обычно обращается, хотя и не всегда на полностью противо-
положный исходному. Естественно, если образец достаточно неполярный и не
растворим в водно-органических смесях, то переходят к нормально-фазовой
хроматографии. В обратных случаях используют ОФ ВЭЖХ.
1. Выбор растворителя. В отличие от газожидкостной хроматографии, где
газ-носитель в эксперименте оставляют одним и тем же, а варьируют полярность
неподвижной фазы для достижения приемлемого разделения, в жидкостно-жид-
костной распределительной хроматографии исследователь как раз может варьи-
ровать подвижные фазы, или «элюирующую силу» растворителя. Это гораздо
легче сделать, чем менять колонки, и выбор подвижной фазы является важной
частью разработки методик разделения в жидкостной хроматографии.
214
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
В большинстве случаев использование чистого растворителя не приводит к
эффективному разделению соединений, и тогда переходят к смесям двух или не-
скольких растворителей. Если обозначить растворитель с меньшей элюирую-
щей силой как А, а с большей — В, то для достижения эффективного разделения
надо экспериментально подобрать оптимальное содержание В в смеси. Нас ин-
тересуют при этом два фактора оптимизации разделения: фактор удерживания к,
т. е. параметр полярности, и фактор разделения а, т. е. коэффициент селектив-
ности [см. уравнение (19.28)]. Мы будем подбирать растворители с такой элюи-
рующей силой, чтобы все значения к для всех элюируемых веществ попадали в
диапазон от 0,5 до 20. Добиваясь приемлемого удерживания, нельзя забывать о
том, что разделение большинства хроматографических пиков должно быть как
можно более полным (по возможности до базовой линии). Если мы добились не-
полного разделения при содержании растворителя В, например, 35%, то изменив
его содержание до 40 или 45%, удается получить лучшее разделение хроматогра-
фических зон веществ и, следовательно, улучшить разрешение. Однако это мо-
жет привести к более значительному перекрыванию зон других компонентов,
чем это было при меньшем содержании В. С помощью смеси двух сильных рас-
творителей, например ацетонитрила (AcN) и метанола (МеОН), с водой можно
снизить перекрывание хроматографических зон и достичь приемлемого разделе-
ния (рис. 21.10). На примере двух первых экспериментов с различным содержа-
нием ацетонитрила AcN в смеси (80 и 40%) продемонстрировано, как можно
добиться попадания факторов удерживания в требуемый диапазон при варьиро-
вании силы элюента; в случае 40%-го AcN факторы удерживания увеличивают-
ся, но разделение при этом далеко не полное. Переход от AcN к 50%-му раствору
80% AcN 40% AcN
I—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—। ।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—[—
0 10 0 10
о io 6 io
РИС. 21.10. Эмпирический подход к выбору состава подвижной фазы, начиная от смеси 80% аце-
тонитрила — 20% воды. Из [L. R. Snyder, J. J. Kirkland and J. L. Glajch. Practical HPLCMethod Deve-
lopment, 2nd ed. New York: Wiley-Interscience, 1998]. Опубликовано с разрешения
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
215
метанола МеОН позволил полностью разделить неразделенные ранее компонен-
ты, но при этом зоны других веществ начинают перекрываться. Наконец, при ис-
пользовании смеси двух растворителей (смесь 1 : 1 применяемых ранее 40%-го
AcN и 50%-го МеОН) достигается некоторое «усредненное» разделение при до-
пустимом разрешении пиков. Предложенный эмпирический подход при выборе
растворителей работает в большинстве случаев.
2. Выбор колонки. Существует около 100 различных торговых марок колонок с
обращенной фазой. В паспорте колонки производители указывают число теоре-
тических тарелок, селективность, воспроизводимость результатов по мере исполь-
зования колонок, давление на входе в колонку и т. д. Эта информация помогает
исследователю выбрать наиболее подходящую колонку в зависимости от решае-
мой задачи.
Можно воспользоваться классификацией колонок для ОФ ВЭЖХ по како-
му-либо параметру и оценить качество работы колонки. Один из способов —
сравнение относительного удерживания определенного вещества, например, ас-
пирина, на серии колонок с одинаковой полярностью. Другой подход — накоп-
ление массива результатов и статистическая обработка для сравнения серий
колонок по эффективности, симметричности пика и размыванию заднего фрон-
та пиков. Эти методы позволяют выявить относительно небольшие различия
между марками колонок или сериями колонок одного производителя. Наконец,
качество колонки часто оценивают эмпирически, воспроизводя эксперименты в
условиях, рекомендованных производителем. Это наилучший способ оценки и
выбора подходящей колонки.
На сайте www.mac-mod.com/comparison guide.html приведено подробное
сравнение 60 наиболее распространенных колонок с обр!ащенной фазой С18. Ко-
лонки сгруппированы по относительной гидрофобности и полярности; указана
их эффективность по отношению к нейтральным или основным соединениям.
Полную информацию можно также найти на сайте http://ois. nistgov.srmcatalog/
certificates /870. pdf.
3. Градиентное элюирование. Приемы улучшения разделения, используемые
в газовой хроматографии (увеличение скорости или задание температурного
градиента) в методе ВЭЖХ имеют очень ограниченные возможности (за исклю-
чением скоростной хроматографии — см. ниже). Основной способ оптимиза-
ции, невозможный в случае газовой хроматографии — использовать градиент
состава подвижной фазы. Градиентное элюирование в жидкостной хроматогра-
фии — наиболее эффективный путь разделения аналитов с достаточно различа-
ющимися временами удерживания. При изократическом элюировании часто
наблюдается недостаточное разрешение пиков слабоудерживаемых веществ,
либо, в случае длительного удерживания компонентов, уширение пиков. В вари-
анте ОФ ВЭЖХ градиент состава подвижной фазы создают постепенным увели-
чением содержания органического модификатора, например, метанола. При
этом слабоудерживаемые вещества будут элюироваться позже и будут разде-
ляться лучше, чем в случае изократического элюирования, а сильноудерживае-
216
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
мые — наоборот, элюироваться за более короткое время. Результатом является
«компактная» хроматограмма (т. е. полученная за меньшее время), с хорошо раз-
деленными острыми пиками и, возможно, с меньшими пределами обнаружения,
поскольку размывание хроматографических зон будет меньше.
Так же, как и температурный градиент в ГХ, градиентное элюирование мо-
жет быть ступенчатым или непрерывным. Систему насосов программируют так,
чтобы общая скорость потока оставалась постоянной. Исходный раствор дол-
жен иметь полярность, достаточную для элюирования и разделения первых, сла-
боудерживаемых, компонентов, а затем элюирующую силу подвижной фазы
повышают до тех пор, пока не получают разрешение пиков сильноудерживае-
мых веществ за разумное время. Метод выбора состава подвижной фазы, опи-
санный выше, позволяет определить начальную и конечную полярность.
Одна из проблем, возникающих при градиентном элюировании в обращен-
но-фазовой хроматографии, — это необходимость регенерации, или переурав-
новешивания, колонки перед началом следующего эксперимента. Обычно для
регенерации требуется пропустить начальный раствор в объеме, равном не ме-
нее 15-20 объемов колонки. Дж. Дорси из Университета Флориды предложил
методику регенерирования колонки за существенно более короткое время путем
контроля в течение хроматографического процесса степени сольватации приви-
тых алкильных групп [L. A. Cole and J. G. Dorsey, Anal. Chem., 62 (1990) 16]. Суть
подхода состоит в том, что 3%-й раствор изопропанола примерно на монослой
покрывает алкильные цепи С18 на поверхности сорбента, и тогда добавление 3%
изопропанола к каждому компоненту в подвижной фазе сокращает время реге-
нерации на 75%. Кроме того, вымачивание сорбента в изопропаноле может привес-
ти к повышению эффективности, особенно на начальном участке хроматографии,
когда содержание воды в подвижной фазе высоко. Более подробно теоретиче-
ское обоснование и практическое применение этого описано в статье [D. L. War-
ner and J. G. Dorsey, LC-GC, 15(3) (1997) 254].
Градиентное элюирование успешно используют в распределительной хро-
матографии на химически модифицированных сорбентах или в адсорбционной
хроматографии. В жидкостно-жидкостной хроматографии этот способ элюиро-
вания практически не встречается.
Высокоскоростная хроматография: лучше меньше, да лучше
Если взять короткую колонку и плотно заполнить ее очень малыми частицами,
то на ней можно разделить смесь всего за несколько секунд, что примерно в 10
раз быстрее, чем в варианте ВЭЖХ на обычной колонке (где время разделения в
большинстве случаев составляет около 20 мин). Колонки для высокоскоростной
жидкостной хроматографии, как правило, имеют такой же диаметр, как и обыч-
ные колонки для ВЭЖХ (т. е. 4,6 мм), но, в отличие от 25-сантиметровых
ВЭЖХ-колонок, их длина составляет от 1 до 3 см. Чаще всего их заполняют час-
тицами диаметром 3 мкм (в ВЭЖХ — 5 мкм), и пропускают элюент со скоростью
1-3 мл/мин. Высота, эквивалентная теоретической тарелке (Н), при высоких ско-
ростях потока меняется очень плавно от линейной скорости (и) (см. рис. 19.5), по-
скольку у таких малых частиц сопротивление массообмену мало (параметр С
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
217
в уравнении Ван Деемтера). Так как при заполнении малыми частицами сущест-
венно возрастает давление на входе в колонку, приходится использовать корот-
кие колонки, в среднем содержащие около 4000 т. т., что вполне достаточно для
большинства разделений. За 30 с можно получить, по крайней мере, около 20 пи-
ков веществ. Даже при том, что в условиях скоростной хроматографии полного
разделения не достигается, такие эксперименты часто ставятся для решения мно-
жества аналитических задач, например, в фармацевтической промышленности,
что уже составляет примерно половину задач, решаемых методами ВЭЖХ. При
контроле качества лекарственных препаратов аналитикам часто требуется сле-
дить за определенными активными добавками в составе таблеток или за полным
качественным составом препарата в целом.
Почему используют высокоскоростную жидкостную хроматографию? По-
мимо очевидных преимуществ экспрессного анализа в скоростной хроматографии
экономится растворитель — его расходуется на 50-80% меньше, и, соответственно,
слив из колонки становится меньше. В 3-5 раз возрастает чувствительность, по-
тому что разбавление определяемого вещества в соответствующей хроматогра-
фической зоне в плотноупакованных коротких колонках с малым внутренним
объемом заметно меньше. Но такие плотноупакованные колонки более склонны
забиваться посторонними частицами. Поэтому между инжектором и аналитиче-
ской колонкой обязательно нужно устанавливать фильтр или, еще лучше, пред-
колонку.
Если нужно улучшить разрешение пиков при использовании короткой ко-
лонки, можно оптимизировать состав подвижной фазы так, чтобы значение фак-
тора удерживания к находилось в диапазоне от 1 до 10 и чтобы элюирование
аналитов шло медленнее. В этом случае разделение может проходить, скажем,
за 10 мин вместо 30 с. Например, если в высокоскоростной жидкостной хрома-
тографии применяют элюент с 50%-м содержанием ацетонитрила, то для улуч-
шения разрешения пиков нужен элюент только с 20% ацетонитрила.
Как и в скоростной газовой хроматографии, для рассматриваемого варианта
жидкостной хроматографии требуются детекторы с практически мгновенным
откликом, а также электронные интеграторы для измерения и обсчета узких
(около 0,5 с или 3 мкл) быстро элюируемых пиков. Детекторы должны реагиро-
вать на все изменения в потоке эффлюента каждые 50 или 100 миллисекунд, а
лучше еще чаще. Интеграторы должны обрабатывать, по крайней мере, 10 точек
в секунду, а в случае детектора с линейкой фотодиодов — не менее 5 сканирова-
ний в секунду. При таких быстрых измерениях существенное негативное влия-
ние на результаты может оказать внеколоночное уширение пиков, поэтому
необходимо минимизировать «мертвый» объем системы одним из возможных
способов, например: уменьшением объема проточной ячейки детектора (менее
3 мкл); избеганием размывания пробы в инжекторе (промышленностью произ-
водятся инжекторы с очень малым объемом внутренней петли); использованием
коротких и узких капилляров в качестве соединительных частей хроматографа.
Но в ячейках столь малого объема путь для детектирования (например, длина
оптического пути) становится короче, что может привести к снижению чувстви-
тельности, поэтому иногда встает задача поиска оптимальных условий.
218
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Колонки с узкими каналами: высокая чувствительность
и малый расход элюентов
Если же мы возьмем более узкую колонку, то снизим пределы определения за
счет получающихся более узких и высоких пиков. Например, если 4 мкл пробы
ввести в колонку с диаметром 2,1 мм, то разбавление пробы будет примерно в
5 раз меньше, чем при введении ее в колонку такой же длины с диаметром
4,6 мм, а хроматографические пики будут примерно в 5 раз выше. Объемная ско-
рость потока пропорциональна квадрату диаметра колонки, и оптимальная ско-
рость для достижения такого же разрешения, как на обычной колонке, должна
быть в 5 раз ниже, что и приведет к меньшему размыванию пробы. Разумеется,
такой же чувствительности можно достичь и на стандартной колонке, вводя в
нее пятикратно увеличенный объем пробы, т. е. 20 мкл. Однако иногда количе-
ство анализируемого образца ограничено, и мы должны стараться достичь более
высокой чувствительности, используя узкие колонки. Количество расходуемого
на анализ элюента также сокращается в 5 раз, а объем пробы, наносимой на ко-
лонку с диаметром 2,1 мм, не должен быть больше 5 мкл, чтобы уменьшить вли-
яние инжекционных пиков. Объем ячейки детектора в этом случае составляет от
3 до 5 мкл. Основная область применения узких колонок — жидкостная хрома-
тография в сочетании с масс-спектрометрией (ЖХ-МС — см. ниже), поскольку
масс-спектрометр работает при низкой объемной скорости потока и меньших
объемах аналитов (во избежание перегрузки прибора).
Пример 21.1
Рассчитайте объем пробы (в мкл), который займет зону в 1 мм по высоте колон-
ки с внутренним диаметром: (а) 2,1 мм и (б) 4,6 мм, при условии, что подвижная
фаза занимает 65% от внутреннего объема колонки.
Решение
а) Рассчитаем объем пробы в см3:
Е=£лг2 = 0,1 см • 3,14 (0,105 см)2 = 0,0035 см3 = 3,5 мкл
Поскольку подвижная фаза занимает 65% внутреннего объема колонки, то
рассчитаем действительный объем пробы:
3,5 мкл • 0,65 = 2,3 мкл
б) Действуя аналогично, получаем:
0,1 см • 3,14 (0,23 см)2 • 0,65 = 0,0108 см3 = 10,8 мкл
Это означает, что высота хроматографического пика будет одинакова, если
ввести 2,3 мкл пробы в колонку с внутренним диаметром 2,1 мм или
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
219
10,8 мкл — в колонку с внутренним диаметром 4,6 мм, т. е. при 5-кратном
различии в объеме пробы. Поэтому, если ограничений по объему пробы
нет, то вовсе не обязательно использовать более узкую колонку.
Пример 21.2
Найдено, что оптимальная скорость потока для колонки с внутренним диаметром
4,6 мм, заполненной сорбентом с размером частиц 5 мкм, составляет 1,5 мл/мин.
Какова будет оптимальная скорость потока для колонки с внутренним диамет-
ром 2,1 мм, заполненной такими же частицами? Сколько потребуется элюента
для 10-минутного разделения на каждой из колонок?
Решение
Объемная скорость пропорциональна квадрату внутреннего диаметра колонки:
2
Скорость (для 2,1 мм) =1,5 мл/мин • ММ^ = 0,31 мл/мин
(4,6 мм)2
Для колонки с внутренним диаметром 4,6 мм расходуется 15 мл элюента, а для
колонки диаметром 2,1 мм — только 3,1 мл, т. е. практически в 5 раз меньше.
На рис. 21.11 для сравнения приведены хроматограммы, полученные в уз-
кой колонке (внутренний диаметр 2,1 мм, длина 20 см), заполненной сорбентом
С18 с размером частиц 2,5 мкм, и в стандартной колонке для ВЭЖХ (внутренний
диаметр 4,6 мм, длина 5 см), заполненной аналогичным сорбентом, но с разме-
ром частиц 5 мкм. Время, необходимое для разделения смеси, для второй колон-
ки увеличивается в 3 раза. Колонки с узкими каналами часто нагревают для
снижения вязкости элюента, тем самым — снижается сопротивление при про-
хождении потока через плотноупакованную неподвижную фазу.
Кварцевые капилляры с внутренним диаметром 0,25 или 0,32 мм, заполнен-
ные 3- или 5-микрометровыми частицами, сейчас широко применяют в варианте
жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. В капиллярные
колонки можно вводить очень малые объемы проб, обычно не больше микро-
литра. Объемная скорость подвижной фазы обычно составляет несколько мик-
ролитров в минуту. Разделение при этом получается примерно таким же, как и
на стандартных аналитических колонках.
220
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЙ
Пики вещества:
1 - 1-гидрокси-7-азобензатриазол
2 - 4-метилбензолсульфамид
3 - метил-3-
аминотиофенокарбоксилат
4 - 4-аминобензофенол q
2
।-----1----1-----г
0 12 3
Время, мин
РИС. 21.11. Сравнение хроматограмм, полученных в различных колонках: а — узкая колонка с
внутренним диаметром 2,1 мм, длиной 2,0 см, заполнена сорбентом С18 (размер частиц 2,5 мкм).
60 °C, объем пробы 1 мкл; б — обычная колонка для ВЭЖХ с внутренним диаметром 4,6 мм, дли-
ной 5,0 см, заполнена сорбентом С18 (размер частиц 5,0 мкм), 30 °C, объем пробы 3 мкл. С разреше-
ния Waters Corporation
Влияние температуры
Как уже отмечалось выше, частицы оксида циркония стабильны и при высоких
температурах. Пористые частицы оксида циркония, покрытые слоем полистирола,
используют при температуре выше 200 °C. П. Карр из Университета Миннесоты,
разрабатывая высокотемпературную высокоскоростную жидкостную хромато-
графию, показал, что эффективность колонки при высокой скорости потока
улучшается, если работать в области высоких температур, причем такое улучше-
ние эффективности особенно проявляется для сильноудерживаемых веществ.
Кроме того, при повышении температуры кривая Ван Деемтера становится бо-
лее ровной и пологой. В своей работе Карр приводит примеры разделения при
следующих условиях: температура 150 °C, скорость потока 15 мл/мин, колонка
50 х 4,6 мм, заполненная частицами с диаметром 3 мкм.
Жидкостная хроматография в сочетании
с масс-спектрометрией
В жидкостной хроматографии, как и в газовой, сочетание масс-спектрометрии
для идентификации и детектирования веществ позволяет разработать очень
мощный аналитический метод, отличающийся высокой чувствительностью и
селективностью, особенно при качественном и количественном анализах слож-
ных смесей. Принципы масс-спектрометрии и типы приборов, используемых
для детектирования в хроматографии, представлены в гл. 20.
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
221
Рис. 21.12
Современная лабораторная
система для ЖХ-МС.
С разрешения Agilent Technology
Однако основная трудность состоит в «состыковке» жидкостного хроматог-
рафа с масс-спектрометром, поскольку предварительно необходимо удалять по-
движную фазу. Кроме того, аналиты могут быть нелетучими и термически
неустойчивыми, а их необходимо переводить в газообразную форму. Первые ва-
рианты сочетания жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии, образно
говоря, можно назвать «неравным браком», и для разработки надежного и вмес-
те с тем достаточно простого в работе типа прибора потребовалось несколько
лет. На сегодняшний день существует несколько вариантов приборов для жид-
костной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХ-МС), которые можно при-
менять и для рутинных анализов. Промышленностью производятся компактные
настольные системы для ЖХ-МС (рис. 21.12).
Наиболее часто в масс-спектрометрии используют источники электронной
ионизации, но также распространены и источники термической ионизации, хи-
мической ионизации при атмосферном давлении и ионизации частиц направ-
ленным лучом. Выбор способа ионизации определяется главным образом
полярностью и термической устойчивостью аналитов. Электронную ионизацию
в основном применяют при определении полярных или ионных соединений, а
также для макромолекул, таких как белки и пептиды. Метод химической иониза-
ции при атмосферном давлении используется также при определении больших
молекул и неполярных соединений. Метод термической ионизации, который
был первым действительно удачным методом, применимым как для полярных,
так и для неполярных соединений, в настоящее время в значительной мере вы-
теснен химической ионизацией при атмосферном давлении. Ионизацию частиц
направленным лучом используют для относительно летучих как полярных, так и
неполярных веществ с небольшой массой (менее 1000 дальтон).
Устройство для ионизации частиц направленным лучом схематически
показано на рис. 21.13. Подвижную фазу, выходящую из ВЭЖХ-колонки, распы-
ляют в атмосфере гелия для получения аэрозоля в камере с пониженным давлени-
ем, нагретой до 70 °C. Камера завершается конусом с маленьким отверстием, что
и создает зону пониженного давления. Различие в давлении приводит к сверх-
звуковому распространению аэрозоля в камере. Гелий и молекулы растворителя
222
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Ионный источник
из колонки
(эффлюент)
РИС. 21.13. Устройство для ионизации частиц направленным лучом [A. N. Eaton, Today s Chemist
at Work, October (1994) 34, American Chemical Society]. Опубликовано с разрешения Micromass Ltd.
намного легче, чем молекулы аналитов, и, следовательно, легче перемещаются
от основного потока и с помощью дополнительных насосов откачиваются из ка-
меры. Оставшийся поток молекул проходит через второй конус с еще более низ-
ким давлением, и в результате аналиты в парообразном состоянии попадают в
ионный источник. Ионизация частиц направленным лучом позволяет получить
спектры электронной ионизации, аналогичные получаемым в методе ГХ-МС, и
эти спектры можно в дальнейшем использовать для идентификации веществ.
В устройстве для термической ионизации образец после колонки пропус-
кают через нагретую трубку, на выходе из которой в виде струи аэрозоля он
очень быстро наполняет нагретую вакуумную камеру. Растворитель также рас-
пыляется, при этом его частицы приобретают электростатический заряд. Капе-
льки растворителя быстро откачивают из камеры, а статический заряд при этом
передается частицам, которые поступают через фильтр в масс-спектрометр. Та-
кая «мягкая» термическая ионизация сопровождается либо незначительной
фрагментацией молекул, либо фрагментация вообще не происходит, поэтому
подходит для осторожной ионизации нелетучих, термически неустойчивых ор-
ганических веществ. В полученных спектрах главным образом проявляются ли-
нии протонированных молекулярных ионов.
Наиболее часто используют устройства для электронной ионизации (иони-
зации электронным ударом). При этом также наблюдается «мягкая» иониза-
ция. Раствор образца распыляют из иглы через малое отверстие в поле с высокой
разностью потенциалов (до нескольких тысяч вольт) — рис. 21.14. Нагревание и
пропускание потока газа вызывает образование мельчайших заряженных ка-
пель, которые передают свой заряд молекулам определяемых компонентов, по-
ступающим в масс-спектрометр. При ионизации электронным ударом образуются
многозарядные ионы, причем заряд увеличивается с ростом молекулярной мас-
сы компонентов. Например, множество заряженных участков образуется на
макромолекулах пептидов и белков. Таким образом, можно определять компо-
21.1. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
223
К вакуумному насосу
— Подвижная фаза из
колонки (эффлюент)
Высокое
напряжение
РИС. 21.14. Устройство для ионизации электронным ударом в методе ЖХ-МС
ненты с относительно большой молекулярной массой, лучше всего — за преде-
лами отношений m/z от 2000 до 3000 дальтон/заряд, особенно при использовании
квадрупольного масс-спектрометра. Такие измерения можно проводить даже
для белков с молекулярной массой 50000 дальтон и выше. Естественно, для это-
го необходимо оценить число заряженных участков в составе макромолекулы:
сначала сравнивают две заряженные формы, отличающиеся на единичный за-
ряд, и решают уравнение, затем идентифицируют компоненты с таким же заря-
дом, но с отличающейся молекулярной массой, и, наконец, оценивают отношения
m/z для разрешенных изотопных кластеров. Ионизацию электронным ударом
лучше всего применять при определении заряженных, полярных соединений
или соединений с основными свойствами.
Для химической ионизации при атмосферном давлении используют
устройство, подобное применяемому в методе ионизации электронным ударом,
однако отличие состоит в коронарном выпускном отверстии камеры, где и про-
исходит ионизация аналита при атмосферном давлении (это устройство иониза-
ции отличается от источника химической ионизации для ГХ-МС, описанного в
гл. 20). Ионизация в газовой фазе более эффективна для веществ с невысокой по-
лярностью в отличие от ионизации электронным ударом, но определяемый круг
аналитов ограничен соединениями, молекулярная масса которых не превышает
2000 дальтон. Методы ионизации электронным ударом и химической ионизации
при атмосферном давлении часто взаимно дополняют друг друга. В выпускае-
мых промышленностью масс-спектрометрах источники термической ионизации
в последнее время все чаще заменяют источниками химической ионизации.
В качестве масс-анализатора для метода ЖХ-МС наиболее часто применя-
ют квадрупольный масс-фильтр из-за его относительно низкой стоимости, малых
размеров и стабильности в работе. В последние годы разработаны и время пролет-
ные анализаторы для их использования в сочетании с источниками ионизации
электронным ударом.
224
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Некоторые области применения ВЭЖХ
Высокоэффективную жидкостную хроматографию широко применяют в таких
областях, как клинические исследования, судебная медицина, охрана окружаю-
щей среды, а также в различных отраслях промышленности. В судебной меди-
цине в настоящее время ВЭЖХ уже вытесняет газовую хроматографию, особенно
при обнаружении следов лекарственных препаратов или наркотиков. Различные
примеры использования ВЭЖХ в химическом анализе приведены в хроматогра-
фических базах данных (список Интернет-сайтов см. в конце гл. 19). Например,
в базе данных фирмы Supelco можно ознакомиться с вариантом определения
взрывчатых веществ, извлеченных твердофазной микроэкстракцией из воды
(о методе твердофазной экстракции рассказано в гл. 18). Можно также найти
пример экспрессного обнаружения наркотиков и множество других примеров
применения ВЭЖХ.
21.2. Эксклюзионная хроматография
Эксклюзионная хроматография (называемая также молекулярной или гель-хро-
матографией) — разновидность хроматографии, в которой роль неподвижных фаз
выполняют молекулярные сита. Последние используют как в обычных колонках
для препаративных разделений под действием силы тяжести, так и в колонках для
ВЭЖХ. Молекулярные сита представляют собой полимерные углеводы или акри-
ламиды, имеющие открытую каркасную структуру, образованную путем попереч-
ной сшивки полимерных цепей. Они гидрофильны и, следовательно, способны
адсорбировать воду, при этом набухание приводит к раскрытию этой структуры.
Размер полученных пор будет определяться степенью поперечной сшивки.
Сольватированные молекулы, имеющие больший размер, чем максималь-
ные по размеру поры набухшего геля, не способны проникать в его частицы и,
следовательно, свободно проходят через колонку в пространстве между части-
цами. Меньшие же по размеру молекулы будут в различной степени проникать
внутрь открытой структуры частиц, в зависимости от их размера и формы. Сле-
довательно, молекулы будут по-разному удерживаться на колонке и элюирова-
ться в порядке уменьшения размеров. Гели с высокой степенью набухания
используют для фракционирования больших молекул (обычно высокомолеку-
лярных соединений), в то время как более плотные — для разделения веществ с
низкой молекулярной массой.
Данная методика обозначается также термином гель-фильтрационная
хроматография (с водой в качестве подвижной фазы), чаще применяемым в
биохимии, и термином гель-проникающая хроматография (с органическими
растворителями в качестве подвижной фазы), обычно встречающимся в химии
полимеров. Однако термин эксклюзионная хроматография является обще-
принятым. С помощью данного метода можно получить распределение полимер-
ных молекул по массе, а также разделить белки, ферменты, пептиды, нуклеиновые
кислоты, гормоны и полисахариды.
21.2. ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
225
Наибольшую массу молекул, способных проникать в гель и удерживаться
на нем, называют пределом эксклюзии. Данная величина, в зависимости от
конкретного геля, может принимать значения в диапазоне от 1000 до нескольких
миллионов. Следует отметить, что разделения в большей степени осуществляют-
ся за счет различий в размерах и конфигурации молекул, нежели за счет разницы
в молекулярных массах, но тут имеется определенная корреляция. Обычно мо-
лекулы, имеющие размер меныиий, чем предел эксклюзии, могут быть фракцио-
нированы вплоть до определенного предельного размера (табл. 21.1).
Перед использованием гели должны быть приведены в равновесное состоя-
ние (т. е. кондиционированы) путем контакта с растворителем, который будет
применяться для дальнейшей работы. На это уходит несколько часов или суток в
зависимости от состава подвижной фазы. В случаях, когда разрушаются попе-
речные сшивки полимерных веществ, требуется большее время вымачивания.
Sephadex — хорошо известный молекулярно-ситовый материал для разде-
ления белков. Он представляет собой углеводный полимер, который ввиду нали-
чия гидроксильных групп является достаточно полярным и поэтому адсорбирует
воду. В процессе приготовления таких сорбентов степень сшивки можно конт-
ролировать, получая при этом материалы с различными диаметрами пор и пре-
делами эксклюзии. Гели характеризуют по степени набухания, отражающей их
«сродство к воде», и обычно выражают числом, присутствующим в названии.
Например, Sephadex G-10 имеет сродство к воде 1 мл/г сухого геля, a Sephadex
G-200 — около 20 мл/г. Некоторые типы Sephadex гелей, а также диапазоны
фракционирования разделяемых ими молекул приведены в табл. 21.1. Гели Sep-
hadex нерастворимы в воде и устойчивы к действию как слабых окислитель-
но-восстановительных реагентов, так и оснований и слабых кислот.
Таблица 21.1
Характеристики гелей Sephadex a и Bio-Gelb
Тип Sephadex Диапазон фракционирования67 для пептидов и глобулярных белков Тип Bio-Gel Диапазон фракционирования
G-10 До 700 Р-2 100-1 800
G-15 До 1 500 Р-4 800-4 000
G-25 1 000-5 000 Р-6 1 000-6 000
G-50 1 500-30 000 Р-10 1 500-20 000
G-75 3 000-70 000 Р-30 2 500-40 000
G-100 4 000-150 000 Р-60 3 000-60 000
G-150 5 000-400 000 Р-100 5 000-100 000
G-200 5 000-800 000 Р-150 15 000-150 000
Р-200 30 000-200 000
Р-300 60 000-400 000
а Данные любезно предоставлены Pharmacia Fine Chemical, Inc.
b С разрешения Bio-Rad Laboratories.
c Верхний предел соответствует пределу эксклюзии.
226
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Bio-Gel, состоящий из полиакриламидов, является представителем более
инертных молекулярно-ситовых гелей. Такие материалы нерастворимы в воде и
большинстве органических растворителей и могут использоваться в диапазоне
pH от 2 до 11. Инертный гель снижает способность полярных веществ к адсорб-
ции, степень которой можно варьировать с помощью Sephadex, изменяющего
хроматографическое поведение этих веществ. Различные препараты BioGel, и
их разделяющие свойства также приведены в табл. 21.1.
Styragel представляет собой гель на полистирольной основе, весьма полез-
ный для разделений в неводных средах, таких как хлористый метилен, толуол,
трихлорбензол, тетрагидрофуран, крезол, диметилсульфоксид и т. д. Его нельзя
использовать в воде, ацетоне или спиртовых средах. Данные гели могут быть по-
лезны для получения сорбентов с пределами эксклюзии относительных молеку-
лярных масс от 1600 до 40 миллионов.
Молекулярные сита можно применять для обессоливания белков, получен-
ных путем высаливания концентрированными растворами солей. Гели с низким
пределом эксклюзии, например Sephadex 25, позволяют белковым молекулам
свободно проходить сквозь колонку, удерживая при этом растворенные соли, а
разбавление белка будет ограничено элюирующим объемом колонки (т. е. объе-
мом, оставшимся после заполнения колонки набухшим гелем).
Для высокоэффективных хроматографических разделений используют мел-
кие частицы полистирола или микропористого силикагеля диаметром 5-10 мкм
и размером пор от нескольких нанометров до нескольких сотен нанометров.
Отобранные частицы силикагеля покрывают гидрофильной фазой с целью сни-
жения адсорбции растворенного вещества. Полимерные частицы могут быть ис-
пользованы в широком диапазоне pH (от 2 до 12), в то время как частицы
силикагеля — только при pH 2-7.
21.3. Ионообменная хроматография
В отличие от многих других типов хроматографии, используемых главным об-
разом для разделения органических веществ, ионообменная хроматография осо-
бенно подходит для разделения неорганических ионов, причем как катионов,
так и анионов, поскольку это разделение основано на ионном обмене в непо-
движной фазе. Данный метод оказался весьма полезным для разделения амино-
кислот.
Неподвижная фаза в ионообменной хроматографии состоит из шариков со-
полимера стирола и дивинилбензола. Этот сшитый полимер (смола) имеет в
своей цепи свободные фенильные группы, которые можно модифицировать с
целью введения ионных функциональных групп. В табл. 21.2 приведены основ-
ные сведения о четырех типах ионообменных смол, используелмых в аналитической
химии. Подобно эксклюзионной хроматографии, в ионообменной хроматографии
применяются набивные колонки как для разделения под действием силы тяже-
сти, так и в варианте ВЭЖХ. В последнем случае метод разделения называют
ионной хроматографией (описание см. далее).
21.3. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
227
Таблица 21.2
Типы ионообменных смол
Тип ионообменника Функциональная ионообменная группа Торговая марка
Катионообменники Сильнокислотные Сульфогруппа Dowex* 50; Amberlite^ IR120; lonac c CGC-240; RexynJ 101; Permutit6 Q
Слабокислотные Карбоксильная группа Amberlite IRC 50; lonac CGC-270; Rexyn 102; Permutit H-70
А нионообменники Сильноосновные Четвертичное аммониевое основание Dowex 1; Amberlite IRA 400; lonac AGA-542; Rexyn 201; Permutit S-1
Слабоосновные Аминогруппа Dowex 3; Amberlite IR 45; lonac AGA-316; Rexyn 203; Permutit W
а Dow Chemical Company.
b Mallinckrodt Chemical Works.
c J. T. Baker Chemical Company.
d Fisher Scientific Company.
e Matheson Coleman & Bell.
Катионообменные смолы
Смолы данного типа содержат кислотную функциональную группу, введенную
в ароматическое кольцо полимера. Сильнокислотными катионообменниками
являются смолы, имеющие сульфогруппу —SO3H, которая подобно серной кис-
лоте является сильной кислотой. Слабокислотные катионообменные смолы имеют
карбоксильную группу —СООН, которая диссоциирует лишь частично. Протоны
этих групп могут замещаться на другие катионы:
hRzSO3H+ + М"+ (RzSO3)„M + пН+ (21.1)
и
hRzCO^H* + М"+ (RzCO2)„ М + пЛ+ (21.2)
где Rz — фаза катионообменника. Данные равновесия могут быть смещены вле-
во или вправо путем увеличения или уменьшения [Н+] или [М+] по отношению к
количеству присутствующего ионообменника.
Катионообменные смолы обычно поставляются в Н+-форме, при этом про-
тоны легко заменяются на катионы натрия после обработки ионообменников
растворами соответствующих солей. В дальнейшем ионы натрия подвергаются
замещению на другие катионы. Обменную емкость катионообменников выра-
жают общим числом эквивалентов способного к замещению водорода в единице
228
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
объема или массы смолы и определяют числом и силой ионных групп, закреп-
ленных на ее поверхности. Обменная емкость напрямую связана с удерживанием
ионов раствора, и катионообменники высокой емкости наиболее часто используют
для разделения сложных смесей, где увеличение удерживания способствует
лучшему разрешению.
Слабокислотные катионообменные смолы могут быть применены в более
узком диапазоне pH от 5 до 14, в то время как сильнокислотные катионообмен-
ники — в диапазоне pH от 1 до 14. Причина этого заключается в том, что при
низких значениях pH катионообменные группы слабокислотных смол слишком
сильно удерживают протоны для протекания обменной реакции. Помимо этого
(в отличие от ионообменных групп сильнокислотных смол) они не способны пол-
ностью принимать катионы слабых оснований. Такое поведение, по сути, анало-
гично незавершенности реакции между слабой кислотой и слабым основанием.
Слабокислотные смолы обычно используют для разделения сильных оснований
или же многофункциональных ионогенных веществ, таких как белки или пепти-
ды, которые зачастую слишком сильно удерживаются на сильнокислотных ка-
тионообменниках, обычно применяющихся для разделения сложных смесей.
Анионообменные смолы
Основные группы на поверхности смол, в которых гидроксильные группы спо-
собны к обмену на другие анионы, являются составной частью анионообменных
смол. Существуют как сильноосновные (четвертичные аммониевые основания),
так и слабокислотные (аминогруппы) анионообменники. Происходящие в них
реакции ионного обмена можно представить следующим образом:
hRzNR * ОН- + А"- (RzNR3)„ А + «ОН~ (21.3)
и
ttRzNH + ОН" + А"- (RzNH3)n А + ЮН’ (21.4)
где R — органический радикал, чаще всего метил.
Сильнокислотные анионообменники можно использовать в диапазоне pH
от 0 до 12, в то время как слабоосновные — только при pH от 0 до 9. Слабые ани-
онообменники не способны к нейтрализации очень слабых кислот, но они явля-
ются более предпочтительными для разделения сильных кислот, которые
слишком сильно удерживаются на сильнокислотных анионообменниках (таких,
как сульфонаты).
Поперечная сшивка
Варьируя степень поперечной сшивки у полимерной смолы, можно получать
ионообменники с разной селективностью. Чаще всего дополнительная сшивка
увеличивает механическую прочность, но при этом уменьшает пористость и
способность к набуханию, а также растворимость полимерных смол. Материалы
средней пористости используют для разделения ионов низкомолекулярного
типа, в то время как высокопористые — для ионов с большими молекулярными
21.3. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
229
массами. Степень поперечной сшивки производители обычно выражают в виде
процентного содержания дивинилбензола. Чаще всего применяют материалы со
степенью поперечной сшивки от 8 до 10%.
Влияние pH на разделение аминокислот
На ионные формы многих веществ влияет pH раствора эффлюента. Так, с помо-
щью pH можно контролировать степень гидролиза ионов металлов солей слабых
кислот и оснований. Слабые кислоты практически не диссоциируют при высо-
ких концентрациях и при этом не вступают в реакции ионного обмена, равно как
и слабые основания в сильнощелочных растворах. Контроль уровня pH имеет
важное значение при разделении аминокислот, являющихся амфолитами
(т. е. способными выступать как в качестве кислоты, так и в качестве основа-
ния). Существуют три формы аминокислот:
+н* R—СН—СО2Н R—СН—СО2 1 -н+ R—СН—СО2 1
NH3+ 1 NH3 1 nh2
А в с
Форма В, называемая цвиттер-ионом, преобладает при значениях pH, близких к
изоэлектрической точке аминокислоты. Изоэлектрической точкой называют
значение pH, при котором суммарный заряд молекулы равен нулю. В более кис-
лых растворах группа —СОО- протонируется, при этом молекула аминокисло-
ты переходит в форму катиона (форма А), в то время как в более щелочных
растворах группа —NH| теряет протон и образует анион (форма С). Изоэлект-
рическая точка у разных аминокислот имеет разное значение — в зависимости
от относительной кислотности или основности карбоксильной и аминогрупп.
Таким образом можно осуществлять групповые разделения на основании разни-
цы в изоэлектрических точках соответствующим подбором pH.
При заданном значении pH аминокислоты можно разделить на три группы
их пропусканием через анионообменную и катионообменную колонки. Не име-
ющие заряда цвиттер-ионные формы (при pH, равном изоэлектрической точке)
будут проходить через обе колонки, в то время как положительно или отрицате-
льно заряженные аминокислоты будут удерживаться на одной из двух колонок.
Затем каждую из этих групп можно подвергнуть дальнейшему разделению соот-
ветствующим подбором pH.
Мур и Стейн [J. Biol. Chem., 192 (1951) 663] успешно разделили 50 амино-
кислот и сопутствующих веществ на катионообменной колонке Dowex-50 с испо-
льзованием контроля pH и температуры (которая также влияет на равновесные
процессы в системе).
В настоящее время серийно выпускаются автоматические аминокислот-
ные анализаторы, в основе которых лежат процессы ионного обмена. Момент
элюирования каждой аминокислоты регистрируется автоматически путем изме-
рения светопоглощения, полученного по реакции нингидрина с аминокислотой,
230
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
по мере выхода последней из колонки. Используя давление в несколько сотен
psi, можно проводить измерения в течение ~3,5 ч. Данные анализаторы оказа-
лись полезными биохимикам для изучения структуры белков. При этом фраг-
менты белков расщепляют на аминокислоты с последующим их определением.
Влияние комплексообразующих реагентов на разделение
катионов металлов на анионообменных колонках
Многие металлы можно разделять на анионообменных колонках путем их пред-
варительного превращения в анионы с помощью комплексообразования. В каче-
стве комплексообразующего аниона могут выступать хлорид-, бромид- или
фторид-ионы. Незаряженные комплексообразующие реагенты также могут вли-
ять на равновесие, если они образуют комплекс, который должен диссоцииро-
вать перед вступлением катиона металла в реакцию ионного обмена, или же они
влияют на его размер. Многие комплексообразующие реагенты являются слабы-
ми кислотами или основаниями либо их солями, что и является причиной слож-
ного характера взаимосвязи pH и комплексообразования.
С использованием анионообменных колонок был проведен ряд наиболее
успешных разделений ионов металлов. При этом концентрированный раствор кис-
лоты, играющей роль комплексообразующего вещества, добавляют к раствору соли
металла с последующим образованием анионных комплексов. Концентрирован-
ная хлороводородная кислота образует анионные хлоридные комплексы с боль-
шим числом металлов, за исключением щелочных и щелочноземельных, а также
А1(Ш), Ni(II) и Сг(Ш). Все получившиеся соединения способны адсорбировать-
ся на анионообменной колонке с четвертичными аммониевыми группами.
21.4. Ионная хроматография
Применение технического оснащения ВЭЖХ к ионообменной хроматографии
получило название ионная хроматография. Данный метод сочетает разделяю-
щие возможности ионного обмена с универсальностью кондуктометрического
детектора. В одноколоночном варианте ионообменной хроматографии приме-
нение кондуктометрического детектора ограничено ввиду высокой электропро-
водности фона подвижной фазы. В 1970 г. сотрудник Dow Chemical Company
Уильям Бауман предложил способ уменьшать электропроводность элюента с
помощью второй подавляющей ионообменной колонки и таким образом осу-
ществлять детектирование определяемых ионов высокочувствительным кондук-
тометрическим детектором. В подавляющей колонке ионы элюента удаляются, и
определяемый ион заменяется на Н+ (для катионов) или ОН (для анионов). При
определении анионов она представляет собой катионообменную колонку в
Н+-форме, а при определении катионов, соответственно, анионообменную ко-
лонку в ОН_-форме. В ионной хроматографии обычно применяют ионообмен-
ники низкой емкости. Основные принципы ионной хроматографии показаны на
рис. 21.15.
21.4. ИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
231
Рис. 21.15
Принцип ионной хроматографии
- _____ Измерение ____________ М+ОН”
электропроводности н п
Анализ Анализ
анионов катионов
Допустим, соль МА с анионом А- разделяется на анионообменнике с испо-
льзованием NaOH в качестве элюента. Соответственно на выходе из разделяю-
щей колонки будет выходить раствор смеси МА и NaOH. При пропускании
элюата через катионообменную подавляющую колонку произойдут следующие
реакции:
RZSO3 Н+ + М+ + А" -> RZSO3 М+ + Н+ + А-
RZSO3Н+ + Na+ + ОН" -> RzSO^Na* + Н2О
Таким образом, NaOH переходит в Н2О, а определяемый ион — в кислоту НА,
которая, в свою очередь, регистрируется кондуктометрическим детектором.
В случае же определения катионов на выходе из первой (разделяющей) колонки
будет смесь МА и НС1. Далее они будут вступать в реакцию с анионообменными
группами в подавляющей колонке по следующей схеме:
RZNR3 ОН- + М+ + А- -> RZNR3 А- + М+ + ОН-
RzNR^OH- + Н+ + Cl" -> RzNR^Cl- + Н2О
Как мы видим, НС1 переходит в Н2О, а определяемый катион — в основание
МОН, определяемые кондуктометрическим детектором.
Очевидно, что со временем подавляющая колонка становится непригодной
для использования (ввиду постепенной потери своих реакционных групп), а по-
тому ее следует периодически регенерировать (например, раствором НС1 в слу-
чае катионообменника и раствором NaOH в случае анионообменника). Обычно
232
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
подавляющая колонка представляет собой небольшую по объему колонку, за-
полненную ионообменником высокой емкости с целью уменьшения размывания
на ней пиков определяемых компонентов. Поскольку чаще всего определяют
микрограммы или меньшие количества веществ, применяют разделяющую ко-
лонку низкой емкости в сочетании с низкой концентрацией элюента (от 1 до
10 ммоль/л).
Ионная хроматография имеет важное значение для определения анионов.
В этом случае в качестве подвижной фазы часто используют обладающую низ-
кой электропроводностью смесь NaHCO3 и Na2CO3, которая превращается в
угольную кислоту. Такие анионы, как F~, Cl~, Br-, I~, NO2, NO3, SO 4“, РО^-,
SCN-, Ю3 и CIO 4, а также органические кислоты и их соли можно определять
всего за несколько минут даже при их концентрации в образце, не превышаю-
щей ppm и менее.
Если раствор является слишком разбавленным для непосредственного ана-
лиза, определяемые компоненты можно предварительно сконцентрировать на
ионообменной концентрирующей колонке. В этом случае нижний предел опре-
деляемых концентраций — ppb.
Появление высокоэффективных кондуктометрических детекторов с широ-
ким динамическим диапазоном и электронной системой подавления фоновой
электропроводности способствовало развитию ионной хроматографии без по-
давляющих колонок. Например, для определения анионов в этом случае исполь-
зуют разделяющую колонку низкой емкости в сочетании с элюентом низкой
концентрации, которым обычно является гидрофталатный буферный раствор.
Преимущество ионной хроматографии без подавляющей колонки состоит в
устранении размывания хроматографических пиков, к тому же при этом проще
определять анионы слабых кислот, таких как цианид и борат, ввиду низкой
ионизации последних в нейтральных или слабокислых растворах.
Ионообменные частицы для ионной хроматографии представляют собой
либо частицы полимерных смол с привитыми функциональными группами,
либо частицы малопористого силикагеля, покрытые ионообменной пленкой,
либо мелкие частицы ионообменников (см. рис. 21.4). В качестве ионообменных
смол обычно используют сополимеры стирола и дивинилбензола с привитыми
функциональными группами и полиметакрилаты.
На рис. 21.16 представлен типичный результат анализа методом ионной
хроматографии. Подобный результат зачастую сложно осуществить другими
методами. Ионная хроматография является также основой автоматических ами-
нокислотных анализаторов.
Перед проведением анализа образцы часто подвергают предварительной
обработке пропусканием их через небольшую ионообменную колонку. Данный
прием способствует концентрированию определяемых ионов и одновременно
позволяет отделить нерастворимые примеси. Затем ионы поступают в разделяю-
щую колонку. Для концентрирующей колонки можно использовать тот же элю-
ент, что и для разделения, при условии, что емкость колонки-концентратора
менее чем на 40% превосходит емкость разделяющей колонки. С помощью при-
21.5. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
233
Рис. 21.16. Разделение анионов методом ионной хроматографии (предоставлено компанией
Hewlett-Packard)
ема концентрирования ионов из 20 мл пробы можно определять концентрации
менее ppb. Более подробные сведения, а также практические аспекты ионной
хроматографии приведены в работе [С. A. Lucy, LC-GC, 14(5) (1996) 406].
21.5. Тонкослойная хроматография
Тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой планарную разновид-
ность хроматографии, подходящую для проведения широкомасштабных качест-
венных скрининговых анализов, а также количественных определений. В качестве
неподвижной фазы применяют тонкий слой мелкодисперсного адсорбента, на-
несенного на стекло, алюминиевую пластинку или пластиковую полоску. Мож-
но использовать любой сорбент, применяемый в колоночной хроматографии,
при наличии подходящего связующего состава для оптимального контакта с по-
верхностью пластинки.
Каплю образца наносят на пластинку микропипеткой и далее «развивают»
хроматограмму помещением нижней части пластинки или полоски (но не точки
с образцом) в подходящий раствор (рис. 21.17). Растворитель поднимается вверх
по пластинке под действием капиллярных сил, при этом компоненты пробы под-
нимаются с разными скоростями, в зависимости от их растворимости и степени
удерживания на неподвижной фазе. После окончания развития хроматограммы
отмечают пятна разделенных компонентов раствора или же переводят их в ви-
димую форму путем обработки реагентом, образующим с разделенными ком-
понентами окрашенные продукты. Точки перемещаются с определенной
234
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
скоростью, меньшей скорости растворителя, и эта скорость характеризуется
параметром R^:
Расстояние, пройденное растворенным веществом
R f =---------------------------------------------
Расстояние, пройденное фронтом подвижной фазы
(21.5)
где расстояние измеряют от середины точки нанесения пробы в нижней части
пластинки. Фронт подвижной фазы будет представлять собой прямую, пересе-
кающую пластинку. Расстояние, пройденное растворенным веществом, измеряют
в центре его пятна или места с максимальной его плотностью, если наблюдается
размывание. Величина Яу, таким образом, зависит от используемых подвижной
и неподвижной фаз. Поскольку данные по разным пластинкам всегда немного
отличаются, желательно определять R? в каждом отдельном случае.
Получение хроматограмм
Типичная установка для тонкослойной хроматографии приведена на рис. 21.17.
Для точного измерения R? на расстоянии нескольких сантиметров от нижнего
края пластинки тонким карандашом помечают стартовую линию для нанесения
пробы. Точка нанесения образца должна быть как можно меньшей по размеру
для лучшего разрешения и меньшего размывания. Удобнее всего это осуществ-
лять по каплям с одновременным теплым обдувом (например, бытовым феном)
для полного испарения раствора после каждой капли. Далее пластинку помеща-
ют в емкость, погружая ее конец в подвижную фазу. При этом следует использо-
вать закрытую емкость с воздухом, насыщенным парами подвижной фазы для
предохранения ее от испарения с поверхности пластинки. Получение хромато-
грамм обычно занимает от 10 мин до 1 ч, но присутствие оператора не требуется.
Скорость развития хроматограммы зависит от состава разделяемой смеси. При
Рис. 21.17
Установка для
тонкослойной
хроматографии
Точки
нанесения
пробы
21.5. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
235
использовании широкой пластинки, на нее можно помещать несколько проб,
разделяя их затем одновременно.
Если время развития не превышает 5 мин, то анализ можно осуществлять с
применением специальных микроскопических пластинок для ТСХ и по полу-
ченным результатам предварительного разделения определить оптимальные
условия развития. Как правило, размер пробы составляет от 10 до 100 мкг на точ-
ку нанесения (например, от 1 до 10 мкл 1%-го раствора), при этом точки нанесе-
ния имеют диаметр 2-5 мм.
Основное преимущество данной методики состоит в том, что на ее основе
можно существенно улучшить разделяющие возможности путем использования
двумерной тонкослойной хроматографии, в которой применяют пластинки
большей площади, а каплю пробы помещают в нижний ее угол. После развития
хроматограммы с использованием первой подвижной фазы пластинку поворачи-
вают на 90° и дальнейшее развитие получают с подвижной фазой другого состава.
Таким образом, в случае, когда два или более компонентов не удается разделить с
помощью одной подвижной фазы, можно разделить их со второй подвижной фа-
зой. Для получения эффективных разделений часто важен контроль pH.
Обнаружение пятен разделяемых компонентов
Если растворенное вещество флуоресцирует (например, ароматические соеди-
нения), его месторасположение на пластинке можно определить освещением
ультрафиолетовой лампой. Для фиксирования точного месторасположения пя-
тен следует обвести их карандашом. Зачастую также используют цветообразую-
щие реагенты. Например, амины и аминокислоты обнаруживают визуально,
распыляя на пластинку раствор нингидрина, образующего соединения голубого
или фиолетового цвета. После идентификации пятен их можно соскоблить и смыть
специальным растворителем, а затем определить их количество каким-либо чувст-
вительным методом.
Бесцветные и нефлуоресцирующие пятна зачастую можно сделать видимы-
ми помещением развитой пластинки в атмосферу паров иода. Последний взаимо-
действует с компонентами пробы как химически, так и вследствие растворения с
образованием окраски. Производятся пластинки и полоски для тонкослойной
хроматографии, уже включающие флуоресцирующий краситель в порошке ад-
сорбента. Под действием ультрафиолетового излучения в местах расположения
компонентов пробы появляются темные пятна вследствие тушения люминес-
ценции пластинки.
Распространенная методика, используемая для визуализации пятен органи-
ческих веществ, заключается в распылении на пластинку раствора серной кис-
лоты с последующим нагреванием до обугливания соединений и появлении
соответствующих пятен. К сожалению, данный метод мешает проведению коли-
чественного анализа путем выскабливания пятен и вымывания растворенных
веществ.
236
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Неподвижные фазы в ТСХ
Неподвижные фазы в тонкослойной хроматографии обычно представляют со-
бой тонкие порошки (с размером частиц от 10 до 50 мкм), в качестве которых мо-
гут быть использованы адсорбенты, ионообменники, молекулярные сита, или
же подложки для нанесения пленки жидкости, т. е. те же неподвижные фазы, что
и в колоночной хроматографии. Сначала готовят водную суспензию порошка с
добавлением такого связующего состава, как алебастр, гипс или поливиниловый
спирт, способствующего надежному удерживанию на носителе. Далее суспен-
зию распыляют на пластинку тонким слоем, обычно толщиной от 0,1 до 0,3 мм, с
помощью специальных распыляющих насадок, обеспечивающих постоянную
толщину. Такие насадки имеются в серийном производстве. Затем испаряют
растворитель, а адсорбент активируют выдерживанием при 110 °C в течение не-
скольких часов. Обширный выбор пластинок и полосок для ТСХ также имеются
в серийном производстве.
В качестве неподвижных фаз наиболее часто используются адсорбенты,
наиболее распространенными из которых являются силикагель, оксид алюми-
ния, а также порошкообразная целлюлоза. На поверхности частицы силикагеля
находятся гидроксильные группы, способные образовывать водородные связи с
полярными молекулами. Адсорбированная вода препятствует доступу других
полярных молекул к поверхности, поэтому гель активируют нагреванием до
удаления поглощенной воды. Оксид алюминия также содержит гидроксильные
группы и атомы кислорода. Сорбенты на основе оксида алюминия более пред-
почтительны для разделения малополярных соединений, в то время как силика-
гели подходят для разделения полярных веществ, таких как аминокислоты и
сахара. Также в качестве сорбентов можно использовать силикаты кальция и
магния, а также активный древесный уголь. В некоторых случаях, когда погло-
щенная вода сама выступает в качестве неподвижной фазы, сорбенты не активи-
руют нагреванием.
Тонкопленочные жидкие неподвижные фазы получают для разделения
методом жидкостно-жидкостной распределительной хроматографии. Пленку,
обычно состоящую из воды, закрепляют на материале типа силикагеля или диа-
томита, подобно колоночной хроматографии. Как силикагели, так и диатомиты
можно подвергнуть силанизации для закрепления на их поверхности неполяр-
ных метильных групп для обращенно-фазовой тонкослойной хроматографии.
Ионообменные смолы, пригодные для использования в пластинках для
ТСХ, имеют размер частиц от 40 до 80 мкм. В качестве примера можно привести
сильнокислотный катионообменник Dowex 50W и сильноосновный анионооб-
менник Dowex 1, обычно в натриевой или протонированной и хлоридной формах
соответственно. Для приготовления пластинок водную суспензию, состоящую из
6 частей ионообменной смолы и 1 части порошкообразной целлюлозы, распыля-
ют слоем толщиной от 0,2 до 0,3 мм.
Эксклюзионные тонкослойные материалы можно приготовить из Sepha-
dex Superfine. Гель вымачивают в воде в течение трех суток до полного набуха-
ния, а затем наносят на пластинку. Полученные пластинки не высушивают, а
21.5. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
237
сохраняют во влажном состоянии. Скорость движения под действием капилляр-
ных сил через полученные молекулярные сита существенно меньше, чем в тонких
слоях других типов, как правило — всего 1-2 см/ч, а потому развитие хроматог-
рамм занимает 8-10 ч по сравнению с 30 мин в других неподвижных фазах.
Подвижные фазы для ТСХ
В адсорбционной хроматографии наблюдаются те же закономерности, что и в
колоночной: элюирующая сила подвижной фазы возрастает с увеличением по-
лярности (например, гексан < ацетон < спирт < вода). По возможности в качест-
ве подвижной фазы следует использовать либо одно соединение, или хотя бы
двух-трехкомпонентную смесь, поскольку смешанные подвижные фазы имеют
тенденцию к изменению состава по мере продвижения вверх по пластинке. По-
следнее может привести к варьированию значений в зависимости от расстоя-
ния, пройденного пятнами на пластинке.
Раствор, применяемый в качестве подвижной фазы, должен состоять только
из очень чистых компонентов. Присутствие малых количеств воды или других
примесей способно повлиять на воспроизводимость хроматограмм.
Количественные измерения
Широкие возможности двумерной тонкослойной хроматографии по разделению
можно сочетать с количественными расчетами, основанными на оптических из-
мерениях плотности хроматографических пятен. Это можно сделать измерения-
ми либо пропускания света через хроматографическую пластинку, либо отражения
света, ослабленного окраской определяемого вещества, а также измерением интен-
сивности флуоресценции, полученной при облучении ультрафиолетом. В насто-
ящее время существуют приборы, способные регистрировать полный спектр сразу
при нескольких длинах волн.
Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)
Возможности тонкослойной хроматографии были расширены разработкой хро-
матографических приемов, улучшающих скорость и эффективность разделе-
ния, а также совершенствованием автоматических систем пробоотбора, систем
детектирования и способов получения хроматограмм на месте. Использование
слоев, состоящих из частиц очень малого размера, приводит к более быстрому и
эффективному разделению. Это происходит ввиду более узкого распределения
по размерам частиц со средним диаметром 5 мкм, чем традиционных для ТСХ
частиц с диаметром 20 мкм. Применение специализированных механических
устройств для нанесения капель образца позволяет улучшить воспроизводи-
мость стартовых пятен при уменьшении их размера. Уменьшение размеров про-
бы примерно в 10 раз по сравнению с классическими методами ТСХ позволяет
во столько же раз сократить время разделения. Наряду с ТСХ-слоями на основе
силикагеля применяют также материалы с химически привитыми фазами, по-
добные тем, что используют в нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ.
238
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Частицы мелкого размера, используемые в ВЭТСХ, замедляют продвиже-
ние подвижной фазы даже на сравнительно короткое расстояние. Для устранения
данного эффекта применяют методику «форсированного потока», с использовани-
ем герметизированных камер. При этом с помощью насоса подвижная фаза с по-
стоянной скоростью поступает через щель в пластиковом покрытии, нанесенном
на неподвижную фазу. С подробностями этого подхода можно ознакомиться в
работах Калаца и его сотрудников [J. Chromatogr. Sci. 18 (1980) 324; Chromatog-
raphia, 18 (1984) 628].
Современная тонкослойная хроматография способна служить некоторым
дополнением к методам ВЭЖХ. Это позволяет осуществлять параллельную об-
работку многих образцов, делая доступными серийные определения низкой сто-
имости для простых смесей при большом числе анализируемых проб.
Пластинки ТСХ играют роль своего рода архива определений в случае их сохра-
нения.
21.6. Электрофорез
В основе электрофоретических методов разделения веществ лежит явление вли-
яния электрического поля на удельные (отношение заряда к массе) заряды этих
частиц. Данные методы широко используют для заряженных коллоидных час-
тиц или ионов макромолекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты и полиса-
хариды. Существует несколько разновидностей электрофореза, но наиболее
распространенным является зонный электрофорез.
В зонном электрофорезе белки взаимодействуют с твердой подложкой, поэ-
тому помимо электрических миграционных сил на эффективность разделения
могут влиять также традиционные хроматографические взаимодействия. В за-
висимости от типа подложек различают семь типов зонного электрофореза. Наи-
более распространены подложки на основе гелей крахмала, полиакриламидных
гелей, полиуретановых пен и бумаги. Методика проведения электрофореза с ис-
пользованием гелей крахмала нашла наибольшее распространение (хотя в послед-
нее время ее постепенно вытесняют методики с применением полиакриламидных
гелей, позволяющие уменьшить конвекцию и диффузионные эффекты).
Сначала готовят пластинку с гелем крахмала, затем наносят образец на тонкую
полосу (линию) в центре пластины, к концам которой прикреплены электроды по-
средством контактных мостиков. При пропускании электрического тока через по-
лученную ячейку разделяемые компоненты смеси перемещаются с различными
скоростями в зависимости от их заряда, размеров и формы. Во время электрофо-
реза отрицательно заряженные компоненты мигрируют по направлению к ано-
ду, а положительно заряженные — к катоду. В результате получается серия
разделенных полос компонентов образца.
С помощью зонного электрофореза можно разделять очень сложные смеси.
Например, известно крахмал-гель электрофоретическое разделение белков плаз-
мы, включающей 18 компонентов. С помощью денситометра можно измерить
интенсивность полученных окрашенных зон, получив тем самым количествен-
21.7. КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
239
ные результаты. Одним из перспективных вариантов подобных электрофорети-
ческих методов разделения является капиллярный гель-электрофорез.
Скорость миграции каждого вещества зависит от приложенного напряже-
ния и от pH буферного раствора. Рабочее напряжение в электрофорезе выражают
в вольтах на единицу длины (обычно В/см). Обычно напряжение не превышает
500 В в электрофоретических методах низкого напряжения и может достигать
нескольких тысяч вольт в электрофоретических методах высокого напряжения.
Последние применяют для высокоскоростных разделений низкомолекулярных
веществ. Макромолекулы обладают меньшей ионной подвижностью и менее
склонны к разделениям под действием высоких напряжений.
Зонный электрофорез широко используют в клинической химии и биохи-
мии для разделения аминокислот и белков. Эти вещества содержат амино- и кар-
боксильные группы, способные к ионизации или протонированию в зависимости
от pH. При определенном значении pH суммарный заряд аминокислоты равен
нулю, и она представляет собой цвиттер-ион (см. гл. 8), не обладающий элект-
рофоретической подвижностью и не способный к миграции. Это значение pH
называют изоэлектрической точкой аминокислоты.
В главе 25 будет описано применение гель-электрофореза для разделения
нуклеиновых кислот в последовательности ДНК.
21.7. Капиллярный электрофорез
Капиллярный электрофорез (КЭ) пред-
ставляет собой сравнительно новую мето-
дику, с помощью которой возможно
осуществление разделения малых коли-
честв веществ за сравнительно короткое
время и с высокой эффективностью. Дан-
ным методом можно анализировать нано-
литры (10-9 л) образца, с эффективностью
свыше 1 миллиона теоретических тарелок и
Кварцевый капилляр для КЭ
чувствительностью по отношению к вво-
димым компонентам до аттомоля (10-18 моль) и менее.
Базовая установка для осуществления данной методики приведена на
рис. 21.18. Аппаратурные требования здесь очень просты (за исключением, воз-
можно, детектора), а использование такого прибора не вызывает затруднений.
Разделение осуществляется в капиллярной кварцевой трубке (например, диа-
метром 25-75 мкм и длиной 25-100 см), заполненной соответствующим элект-
ролитом. Малый объем пробы вводят в один из концов трубки (см. ниже), и
затем оба конца погружают в буферный раствор электролита (обычно того же
состава, что и в трубке). Платиновые электроды, погруженные в каждый из рас-
творов, подсоединяют к источнику высокого постоянного напряжения, способ-
ного обеспечивать токи до 250 мкА при напряжении от 1000 до 30000 В.
240
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Детектор
Платиновый
катод (-)
Рис. 21.18. Система для капиллярного электрофореза
Детектор, например, фотометрический в УФ-области, помещают на конце
капиллярной трубки либо недалеко от нее. Пучок сфокусированных лучей про-
ходит через капилляр и далее собирается линзой, сопряженной с фотоэлектрон-
ным умножителем. Чувствительному детектированию мешает малая длина пути
(от 10 до 100 мкм), но малые пиковые объемы, зачастую меньшие, чем 1 нл, при-
водят к низким пределам обнаружения даже при использовании детекторов с
умеренной чувствительностью (поскольку растворенное вещество концентри-
руется в очень малом объеме). Применение лазерных источников излучения,
особенно для флуоресцентного детектирования, снижает пределы обнаружения
до 10-21 моль! Фотография прибора для капиллярного электрофореза показана
на рис. 21.19.
Как работает КЭ? Сила электроосмотического потока
Капилляры изготавливают из кварцевого стекла. На стенках их внутренней по-
верхности содержатся силанольные группы (SiOH). Капилляр заполняют буфер-
ным раствором. При pH > 2 силанольные группы ионизируются с образованием
отрицательного заряда на поверхности капилляра, который называют дзета-по-
тенциалом. Под его влиянием катионы буферного раствора притягиваются к
стенке, формируя возле них двойной электрический слой (рис. 21.20). При пода-
че высокого постоянного напряжения положительно заряженные частицы по-
движной фазы, находящиеся в диффузной части двойного электрического слоя,
мигрируют в направлении катода. Поскольку ионы в растворе сольватированы,
молекулы буферного раствора также будут перемещаться под действием мигри-
рующих зарядов, формируя основной поток раствора со скоростью, достигаю-
щей нескольких сотен нанолитров в минуту (в зависимости от pH, концентрации
буферного раствора и других определяющих величину дзета-потенциала факто-
ров). Этот поток называют электроосмотическим. В то же время молекулы опре-
деляемых компонентов подвержены электрофоретической подвижности, т. е.
катионы притягиваются к аноду, а анионы — к катоду. Но общее движение пото-
ка растворителя в направлении катода приводит к иному направлению движе-
21.7. КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
241
РИС. 21.19. Прибор для капиллярного электрофореза (предоставлено Agilent Technology)
Электрофоретическая
миграция
+
Анод
Основной
раствор
Диффузный слой
Катод
Электроосмотический
поток **
Двойной электрический слой + + + + + +
Стенка капилляра
SiO SiO SiO SiO SiO SiO
_i_____i____i_____i____i_____i__
РИС. 21.20. Распределение зарядов и электроосмотический поток в кварцевом капилляре
ния всех определяемых компонентов, независимо от их заряда. Маленькие,
имеющие больший положительный заряд ионы мигрируют быстрее и будут об-
наружены детектором в первую очередь, в то время как большие по размеру и
имеющие большой отрицательный заряд будут мигрировать с наименьшей ско-
ростью. Нейтральные молекулы будут мигрировать со скоростью электроосмо-
тического потока, поскольку они не ускоряются и не удерживаются электрическим
полем. При этом не будет происходить их разделения.
242
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
В чем заключается высокая разрешающая способность КЭ?
Особенности электроосмотического потока
Понять суть различия между хроматографическим движением под действием
внешнего давления в ВЭЖХ и электроосмотическим движением в КЭ можно с
помощью сравнения профилей потока (рис. 21.21). При движении под действи-
ем давления профиль имеет параболическую форму, при этом скорость потока в
центре вдвое выше средней скорости (ламинарный поток). Это приводит к
уширению пиков и заставляет пики в газовой или жидкостной хроматографии
размываться со временем. В КЭ же электроосмотический поток формируется по
всей длине капилляра, оставаясь при этом постоянным в любой его точке (кроме
непосредственной близости к стенкам капилляра, где находится двойной элект-
рический слой). В результате этого мы имеет плоский профиль потока, где моле-
кулы анализируемого образца движутся с одной и той же скоростью по всей
длине капилляра, что уменьшает дисперсию молекул и способствует формиро-
ванию очень острых пиков.
Эффективность разделений КЭ в 10-100 раз превосходит эффективность
разделений в ВЭЖХ. Здесь нет каких-либо наполнителей или неподвижных фаз.
Поэтому в КЭ остается лишь молекулярная диффузия (член В), а вихревая диф-
фузия (член А) и равновесный массоперенос (член С) отсутствуют. Ключом к
высокой разрешающей способности данного метода является большая величина
отношения площади к объему капилляра, что делает возможным эффективное
охлаждение путем рассеяния теплоты через стенки капилляра. Это уменьшает
уширение пиков за счет тепловых эффектов, вызванных омическим сопротивле-
нием. Действительно, Джоулева теплота, вырабатываемая под действием высо-
кого напряжения, является параметром, ограничивающим величину рабочего
напряжения в прочих электрофоретических методиках, а следовательно, и ско-
рость таких разделений. Капилляры, используемые в КЭ, имеют тонкие стенки,
это способствующие повышенной теплоотдаче.
Вы, вероятно, заметили, что механизм КЭ не включает процессы хромато-
графического распределения. Следовательно, он применим как к макромолеку-
лам, так и к молекулам малых размеров. Например, КЭ имеет большое значение
в разделении крупных биомолекул. Для устранения адсорбции белков на стен-
ках капилляров часто требуется химическое модифицирование стенок (из силика-
геля) либо добавление поверхностно-активных веществ в фоновый электролит.
Ввод пробы в КЭ
Пробу, обычно в количестве нескольких нанолитров, вводят в капилляр путем
гидростатических инъекций (под действием силы тяжести, давления или
насоса) либо электромиграции. В общем случае объем вводимой пробы не дол-
Рис. 21.21
Профили потоков при прокачивании под
давлением и электросмотическом
прокачивании
Ламинарный
поток
Электроосмоти-
ческий поток
21.7. КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
243
жен превышать 2% от общей длины капилляра. При введении пробы под дейст-
вием силы тяжести конец специального капилляра опускают в образец (объем
которого может составлять всего 5 мкл), а затем, через определенное время, по-
сле заполнения капилляра пробой, извлекают. Другой подход состоит в опуска-
нии капилляра в сосуд, находящийся под давлением для принудительного
набора образца в капилляр или же втягивание всасыванием с другого конца ка-
пилляра. После ввода пробы сосуд с образцом заменяют на емкость с буферным
раствором. Альтернативный способ введения пробы состоит в погружении ка-
пилляра в раствор пробы, а затем кратковременной подаче относительно низко-
го напряжения, например, 2000 В в течение 10 с. При этом проба вводится под
действием электроосмотического потока.
Воспроизводимость гидростатических инъекций составляет порядка 1-2%.
Преимущество электроосмотической инъекции заключается в возможности вве-
дения проб большого объема, что способствует снижению предела обнаружения.
Недостатком такого способа введения пробы являются различия в подвижнос-
тях ионов, вследствие чего состав раствора, входящего в капилляр, несколько
отличается от реального состава пробы.
Один из подходов, разработанный для увеличения резкости зоны при элект-
роосмотической инъекции и, тем самым, улучшения разрешения, чувствитель-
ности и представительности, заключается в использовании раствора пробы с
меньшей ионной силой, чем у разделяющего электролита, который применяют
при обычной электроосмотической инъекции. В этом случае напряженность
поля в зоне образца будет больше, и ионы образца будут быстро мигрировать в
направлении капиллярного буфера, пока не достигнут границы электролиты с
более слабым электрическим полем. Эта методика, называемая также «стэкинг»,
способствует уменьшению ширины зоны вводимой пробы примерно в 10 раз.
При этом пробу следует готовить в разведенном (1:10) водой растворе капил-
лярного электролита либо (что лучше) в воде.
Детекторы в КЭ
Детектор помещают вблизи катодного конца капилляра, по которому течет рас-
твор. Чувствительному детектированию мешает малая длина пути через капил-
ляр, но малые пиковые объемы, зачастую меньшие, чем 1 нл, приводят к низким
пределам обнаружения даже при использовании детекторов с умеренной чувстви-
тельностью (поскольку растворенное вещество концентрируется в малом объеме).
Наиболее часто применяют фотометрический детектор в УФ-области. Сфо-
кусированный пучок лучей проходит через капилляр (там, где удален защитный
кожух) и далее собирается линзой в паре с фотоэлектрическим умножителем.
Для увеличения длины пути пучок света располагают под углом к капилляру, при
этом он проходит через специальное отверстие в защитном чехле, затем отражается
от внутренней поверхности и выходит из капилляра через отверстие на другой сто-
роне. На стенку капилляра можно наносить специальное отражающее покрытие.
В капилляр можно вставить проточную ячейку. На рис. 21.22 показано по-
перечное сечение серийно выпускаемой Z-ячейки, в которой луч света с целью
увеличения пути проходит вдоль горизонтальной оси z капилляра. Для обнаруже-
244
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
ния флуоресцирующих веществ используют флуоресцентные детекторы. Приме-
нение лазерных источников (флуоресценция, индуцируемая лазером) снижает
пределы обнаружения до уровня цептомоля (10-21).
Реже используют электрохимические детекторы, такие как кондуктометри-
ческие или амперометрические. В последнее время становится очень популярным
масс-спектрометрическое детектирование с использованием электрических рас-
пылителей и квадрупольных масс-спектрометров (аналогичным детекторам из
ВЭЖХ). Сильное электрическое поле на краю капилляра создает аэрозоль, со-
стоящий из заряженных микрокапель, при этом растворитель испаряется, обра-
зуя ионный газ.
Теория: характеристики разделения методом КЭ
Как и в хроматографии, в КЭ мы можем определить понятие эффективности раз-
деления. Размывание в КЭ вызвано молекулярной диффузией растворенного ве-
щества. Если пренебречь другими причинами размывания полос (в том числе и
тепловыделением), то высоту теоретической тарелки можно выразить в виде:
(21.6)
Рис. 21.22
Поперечное сечение Z-ячейки для
капиллярного электрофореза
(предоставлено Agilent Technology)
21.7. КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
245
Величина й практически равна м, поскольку скорость потока постоянна по всей
длине колонки. Общая подвижность растворенного вещества \inet равна сумме
электрофоретической подвижности \хер и скорости электроосмотического пото-
ка
№net №ер
(21.7)
Электрофоретическая подвижность определяется как:
z
№ер ~ 2
6ТГГ|Г
(21.8)
где z — число ионных зарядов растворенного вещества; т| — вязкость раствора;
г — ионный радиус. Данная величина принимает положительное значение для
катиона и отрицательное — для аниона. Число теоретических тарелок определя-
ется тремя факторами:
Ту = ^net^
2D
(21.9)
где V — напряжение, приложенное к ячейке; D — коэффициент диффузии рас-
творителя, см2/с. Таким образом, число теоретических тарелок увеличивается с
ростом напряжения. Большие молекулы, такие как молекулы белков и нуклеоти-
дов, имеют очень малые коэффициенты диффузии, что позволяет получать для
них значения N порядка нескольких миллионов. Стоит отметить, что в отличие
от хроматографии число теоретических тарелок не зависит от длины колонки,
поэтому для получения высоких значений N можно использовать большие на-
пряжения с большими длинами колонок.
Пример 21.3
Для капиллярной колонки длиной 50 см и рабочем напряжении 30000 В общая
подвижность для 10-минутной миграции равна 2 • 10-8 м2/(В • с). Определите чис-
ло теоретических тарелок для иона Li+ (D = 1,0 • 10-9 м2/с) и молекулы белка с от-
носительной молекулярной массой 100 000 с коэффициентом D = 3 • 10-11 м2/с.
Решение
Для иона Li+:
.. 2 10-8 м2/(Вс)-30000 В _nnnnn
N =----------i-----------= 300 000 т. т.
2 (1,0 10“9 м2/с)
246
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Для молекулы белка:
^(210-8м2/(В-с)-30000В= 1()ооо ооот т
2 (3 -10-11 м2/с)
Мы видим, что для молекул белка число теоретических тарелок в 30 раз больше!
Однако на практике обычно не удается достичь столь высоких чисел теоретиче-
ских тарелок ввиду наличия факторов, вызывающих размывание полос. К ним
относятся: ширина полосы вводимой пробы, наличие некоторого тепловыделе-
ния в капилляре, «мертвый» объем детектора и т. д. В обычных анализах чаще
всего достигают значений около 100 000 и лишь изредка порядка 1 миллиона.
Скорость миграции v иона в электрическом поле является функцией длины
колонки £:
v=PnetE=Pnety (21-10)
где Е—напряженность электрического поля (В/см). Время достижения детекто-
ра tD равно отношению расстояния от ввода пробы до детектора lD к скорости:
^=- = -Ц- (21.11)
v VnetV
Б случае, если детектор расположен на конце капилляра, tD = L2/{\ine(V). Таким
образом, для быстрых разделений к колонкам малой длины мы должны приме-
нять большие напряжения. На скорость миграции влияет температура, посколь-
ку в уравнение (21.8) входит вязкость, которая уменьшается с повышением
температуры.
Скорость электроосмотического потока можно определить с использовани-
ем нейтральной молекулы-маркера, например, метанола, ацетона или бензола,
по времени, необходимому для достижения ею детектора:
Цео=-=^ (21.12)
EtD
Далее, используя уравнение (21.7), можно определить электрофоретическую по-
движность иона. На скорость электроосмотического потока влияет величина
дзета-потенциала, который является функцией pH.
Возможности КЭ для разделения и его чувствительность проиллюстриро-
ваны на рис. 21.23. Смесь из 18 аминокислот разделяется за 30 мин, при этом
количества разделяемых компонентов составляют от 2 до 7 аттомоль. Амино-
кислоты переводят во флуоресцирующее состояние по реакции с изотиоциана-
том флуоресцеина (ФИТЦ) и далее используют флуориметрический детектор.
Пределы обнаружения составляют от 1О-20 моль в 1 нл, что соответствует
10-11 М и 6000 молекул!
21.7. КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
247
РИС. 21.23. Разделение 18 аминокислот при их концентрации 2-7 аттомоль методом капиллярно-
го зонного электрофореза под действием потенциала 25 кВ с использованием буферного раствора
с pH 10. Ввод пробы осуществляется в течение 10 с при 2 кВ. Аминокислоты: 1 — аргинин, 2 —ли-
зин; пики, связанные с раствором реагента: 3 — лейцин, 4 — изолейцин, 5 — триптофан, 6 — мети-
онин, 7 — фенилаланин, валин, гистидин и пролин, 8 — треонин, 9 — серин, 10 — цистеин,
11 — аланин, 12 — глицин, 13 — тирозин, 14 — глутаминовая кислота и 15 — аспарагиновая кис-
лота [N. J. Dovichi и Y. F. Cheng, Am. Biotech. Lab, February (1989)]. Опубликовано с разрешения
Разделение ионов малого размера методом КЭ
Капиллярный электрофорез является достойной альтернативой ионной хрома-
тографии и атомно-абсорбционной спектрометрии при количественном опреде-
лении неорганических ионов вследствие возможности совместного определения
нескольких ионов, экспрессности, высокой разрешающей способности и чувст-
вительности при относительно малой стоимости. Из-за относительно высокой
электрофоретической подвижности малых ионов продолжительность их опре-
деления можно сократить, заставив двигаться эти частицы в направлении электро-
осмотического потока. В случае катионов методика не требует никаких изменений,
поскольку они перемещаются в том же направлении и имеют очень малые вре-
мена миграции. В то же время малые однозарядные ионы будут иметь меньшую
скорость миграции, чем большие однозарядные. Однако из-за большой электро-
форетической подвижности маленьких ионов их общая скорость будет замедле-
на, поскольку электрофоретические силы будут уносить их в направлении от
детектора. В случае анионов стенки капилляра могут быть модифицированы ал-
киламмониевыми солями R4N+, например, бромидом цетилтриметиламмония.
Положительно заряженные группы R4N+ прикрепляются к поверхности с отри-
цательно заряженными силанольными группами с образованием двойного анион-
ного слоя, что вызывает обращение электроосмотического потока (по направлению
к аноду). При этом детектор помещают со стороны анода. Другой подход в слу-
чае анионов сводится к работе при низких значениях pH, когда силанольные
группы не ионизированы и электрофоретическая миграция происходит преиму-
щественно в направлении анода.
248
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Разделение нейтральных молекул:
мицеллярная электрокинетическая хроматография
Мы уже упоминали о том, что нейтральные молекулы под действием электроос-
мотических сил мигрируют с одинаковой скоростью, вследствие чего не могут
быть разделены с помощью капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ). Но
если ввести в подвижную фазу анионное поверхностно-активное вещество, спо-
собное к образованию мицелл, например додецилсульфат, появится возможность
разделения и нейтральных молекул. При превышении
определенной концентрации, называемой критической
концентрацией мицеллообразования (ККМ), молеку-
лы ПАВ становятся способными к самоагрегации с об-
разованием мицелл, в которых гидрофобные хвосты
обращены внутрь, образуя неполярное ядро. При этом
отрицательно заряженные ионогенные группы распола-
гаются с внешней стороны мицеллы.
Нейтральные молекулы будут распределены между
мицеллами и буферным раствором, так же как это на-
блюдается в ВЭЖХ, причем разные молекулы будут
Мицелла
взаимодействовать по разному. Поскольку мицеллы
имеют отрицательный заряд, они будут электрофоретически мигрировать по на-
правлению к аноду, в то время как основной поток под действием электроосмо-
тических сил устремится к катоду, но с меньшей скоростью. Необходимо
учитывать, что нейтральные молекулы будут перемещаться со скоростью элект-
роосмотического потока, при этом их движение будет замедляться после прихо-
да в равновесие с мицеллами. Таким образом, чем дольше нейтральные вещества
пребывают внутри мицелл, тем больше времени им потребуется до достижения
детектора. Данная методика получила название мицеллярная электрокинети-
ческая хроматография (МЭКХ). Она представляет собой разновидность хро-
матографии, в которой мицеллы выполняют роль псевдостационарной фазы, и
на движение катионов влияют электростатические взаимодействия с заряжен-
ными мицеллами. МЭКХ является ценным методом разделения таких нераство-
римых в воде нейтральных веществ, как стероиды.
Капиллярная электрохроматография
Гибридный метод, сочетающий возможности капиллярного электрофореза и
ВЭЖХ, носит название капиллярная электрохроматография (КЭХ) и исполь-
зуется для разделения нейтральных молекул. При этом капилляр заполняют об-
ращенно-фазовыми частицами, например, частицами силикагеля С18 диаметром
1,5-3 мкм. Поскольку при электроосмотическом прокачивании внешнее давле-
ние не требуется, частицы могут быть очень мелкими. Также можно применять
колонки большой длины. Перемещение полярной подвижной фазы под действи-
ем электроосмотического потока более предпочтительно, чем под действием
внешнего давления. В качестве несущего буфера обычно используют раствор,
содержащий от 40 до 80% органического растворителя, такого как ацетонитрил
ЧТО МЫ УЗНАЛИ ИЗ ЭТОЙ ГЛАВЫ?
249
или метанол. Подобно ВЭЖХ, разделение основано на распределении раство-
ренных компонентов между подвижной и неподвижной фазами. В результате
электроосмотического прокачивания получается плоский профиль потока вмес-
то параболического, что приводит к более узким пикам и высоким эффективно-
стям разделения (разрешающая способность КЭХ вдвое больше, чем ВЭЖХ).
Объемы проб могут быть очень малыми. Метод КЭХ при использовании коло-
нок тех же длин и таких же размеров частиц, что и в методе ВЭЖХ, обычно дает
вдвое большее число теоретических тарелок. Сочетание же в КЭХ частиц мало-
го размера с колонками большей длины делает возможным получение колонок с
числом теоретических тарелок от 100 000 до 500 000 по сравнению с 25 000 в
ВЭЖХ.
КХ является достоверной хроматографической методикой, удобной для
разделения биомолекул. В методе КЗЭ, где зачастую также достигаются боль-
шие числа теоретических тарелок, при увеличении размера частиц уменьшают-
ся различия в соотношении заряда к массе, что затрудняет разделения. В этом
случае метод КЭХ оказывается более предпочтительным.
Капиллярный гель-электрофорез
Данная разновидность КЭ является аналогом традиционного зонного гель-электро-
фореза при сопутствующем разделении макромолекул по их размерам. Капилляр
заполняют пористым полимерным гелем, что обусловливает молекулярно-сито-
вый эффект при продвижении через него молекул. Таким образом, разделение
здесь основано как на электрофоретической подвижности, так и на различиях в
размерах молекул, за счет чего достигается большая разрешающая способность
метода. Проводятся исследования по заполнению капилляра жидким гелевым
наполнителем (гелевыми растворами, способными к прокачиванию, например,
обработанной целлюлозой, растворенной в буфере). Это позволяет заменить
гель в капилляре с целью устранения проблем загрязнения фиксированного геля
матрицей анализируемого образца. Данную методику широко используют для
разделения нуклеотидов в последовательности ДНК — дезоксирибонуклеино-
вой кислотой (см. гл. 25).
Что мы узнали из этой главы?
• Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — стр. 199
• Неподвижные фазы, частицы — стр. 200
• Оборудование для ВЭЖХ — стр. 207
• Варианты ВЭЖХ: выбор колонки и подвижной фазы — стр. 212
• Высокоскоростная ЖХ — стр. 216
• Колонки малого диаметра — стр. 218
• Жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией
(ЖХ-МС) — стр. 220
250
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
• Эксклюзионная хроматография — стр. 224
• Ионообменная хроматография — стр. 226
• Ионная хроматография: подавляющие колонки — стр. 230
• Тонкослойная хроматография: двумерная, высокоэффективная — стр. 233
• Электрофорез — стр. 238
• Капиллярный электрофорез (КЭ): электроосмотический поток и электрофо-
ретическая подвижность; эффективность КЭ [основное уравнение (21.6)] —
стр. 239
• Капиллярная электрохроматография (КЭХ) — стр. 248
• Капиллярный гель-электрофорез — стр. 249
Вопросы
1 - Каковы отличия высокоэффективной жидкостной хроматографии от тра-
диционной?
2. Опишите детекторы, наиболее часто используемые в жидкостной хрома-
тографии, и принципы их работы.
3- В каком порядке будут элюироваться следующие компоненты из колонки,
наполненной оксидом алюминия, при использовании н-гексана в качестве
подвижной фазы: СН3СН2ОН; СН3СНО; СН3СООН?
4. Какую подвижную фазу следует выбрать при разделении группы алканов
СН3(СН2)ХСН3 на колонке с оксидом алюминия?
5- Что такое нормально-фазовая хроматография? Что такое обращенно-фазо-
вая хроматография?
6- Каковы наиболее распространенные типы ВЭЖХ? Почему?
7- Почему в частицах с привитой обращенной фазой силанольные группы эк-
ранированы?
8- Перечислите наиболее часто используемые привитые фазы для обращен-
но-фазовой ВЭЖХ. Какие привитые фазы применяют для нормально-фазо-
вой хроматографии?
9- Назовите основные отличия между микропористыми, перфузионными и
непористыми частицами. Каковы особенности этих частиц?
10- Что такое предколонка и для чего ее используют?
11 - Что такое метод разделения путем подбора нескольких растворителей? Ка-
кие два фактора оптимизируют при выборе подвижной фазы?
12. Для чего нужны градиенты подвижной фазы в ВЭЖХ?
13- Чем отличается скоростная ЖХ от традиционной ВЭЖХ?
14- Какое преимущество дает применение узких колонок в ВЭЖХ?
15- Как влияет температура на разделения методом ВЭЖХ?
ЗАДАЧИ
251
16- Перечислите наиболее часто используемые устройства для ионизации в
ЖХ-МС.
17- Опишите основы эксклюзионной хроматографии. Что такое предел экск-
люзии?
18- Что такое молекулярные сита?
19- Объясните различия между катионообменными и анионообменными смо-
лами?
20- Перечислите факторы, влияющие на селективность ионообменных смол.
21 - Опишите основы ионной хроматографии.
22. Что такое время удерживания? Что такое
23. Какие наибольшие и наименьшие значения может принимать 7?у?
24- На чем основано разделение в электрофорезе?
25- Каковы принципы разделения в методе капиллярного электрофореза?
В чем его преимущества?
Задачи
26- Ионы щелочных металлов можно определять титриметрически, пропуская
их раствор через катионообменную колонку, находящуюся в протониро-
ванной форме. При этом в эффлюент выделится эквивалентное количество
протонов, которое можно определить методом титрования. Сколько мил-
лимолей катиона К+ содержится в 1 л раствора, если эффлюент, полученный
из аликвоты объемом 5 мл, после пропускания ее через катионообменную
колонку потребовал для титрования 26,7 мл 0,0506 М раствора NaOH?
27. Путем пропускания 200 мл раствора, содержащего 10 г/л NaCl, через катио-
нообменную колонку необходимо полностью удалить катионы натрия. Ка-
кая для этого потребуется минимальная масса сухой катионообменной
смолы, если ее обменная емкость составляет 5,1 моль экв./г?
28. Каким будет состав эффлюента при пропускании через катионообменную
колонку в протонированной форме разбавленного раствора следующего
вещества: a) NaCl; б) Na2SO4; в) НС1О4; г) FeSO4; д) (NH4)2SO4?
Рекомендуемая литература
Высокоэффективная жидкостная хроматография
1 - V. R. Meyer, Practical High-Performance Chromatography, 3rd ed. New York:
Wiley, 1999.
2. L. R. Snyder, J. J. Kirkland, and J. L. Glajch, Practical HPLC Method Develop-
ment, 2nd ed. New York: Wiley, 1997.
3- A. Weston and P. R. Brown, HPLC and CE: Principles and Practice. San Diego:
Academic, 1997.
252
ГЛАВА 21. ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
4- U. D. Neue and М. Zoubair, HPLC Columns: Theory, Technology, and Practice.
New York: Wiley, 1997.
5- R. P. W. Scott, Liquid Chromatography for the Analyst. NewYork: Dekker,
1994.
6- P. C. Sadek, The HPLC Solvent Guide. New York: Wiley, 1996.
7. L. Huber and S. A. George, eds., Diode-Array Detection in HPLC. New York:
Dekker, 1993.
8. R. L. Cunico, К. M. Gooding, and T. Wehr, Basic HPLC and CE of Biomolecu-
les. Hercules, CA: Bay Analytical Laboratory, 1998.
9. W. M. A. Niessen, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, 2nd ed. New
York: Marcel Dekker, 1999.
Эксклюзионная хроматография
10. Sephadex-Gel Filtration in Theory and Practice, Pharmacia Fine Chemicals,
Upsalla, Sweden. Эта компания ежегодно выпускает буклеты с ссылками по
хроматографии.
Ионообменная и ионная хроматография
11. J. Inczedy, Analytical Applications of Ion Exchangers. Oxford: Pergamon, 1996.
12. O. Samuelson, Ion Exchange Separations in Analytical Chemistry. New York:
Wiley, 1963.
13. J. S. Fritz and D. T. Gjerde, Ion Chromatography, 3rd ed. New York: Wiley,
2000.
14. H. Small, Ion Chromatography. New York: Plenum, 1989.
15. H. Small and B. Bowman, «Ion Chromatography: A Historical Perspective», Am.
Lab., October 1998, 56C. Авторы книги — основатели ионной хроматогра-
фии.
16. Р. К. Dasgupta, «Ion Chromatography. The State of the Art», Anal. Chem., 64
(1992) 775A.
Тонкослойная хроматография
17. В. Fried and J. Shenna, Thin-Layer Chromatography, 4th ed. New York: Marcel
Dekker, 1999.
18. J. Shenna and B. Fried, eds., Handbook of Thin-Layer Chromatography, 2nd ed.
New York: Marcel Dekker, 1996.
Капиллярный электрофорез
19. G. Lunn, Capillary Electrophoresis Methods for Pharmaceutical Analysis. New
York: Wiley, 1999.
20. S. M. Palfrey, ed., Clinical Applications of Capillary Electrophoresis. Totowa,
NJ: Humana, 1999.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
253
Капиллярная электрохроматография
21 - I. S. Krull, R. L. Stevenson, К. Mistry, and М. Е. Schwartz, Capillary Electro-
chromatography and Pressurized Flow Capillary Electrochromatography: An
Introduction. New York: HNB, 2000.
22. A. L. Crego, A. Gonzalez, and M. L. Marina, «Electrochromatography», CRC
Crit. Rev. Anal. Chem., 26 (1996) 261.
23. K. D. Altria, N. W. Smith, and С. H. Turnbull, «А Review of the Current Status
of Capillary Electrochromatography Technology and Applications», Chroma-
tographia, 46 (1997) 664.
24. L. A. Colon, K. J. Reynolds, R. Aliceamaldonado, and A. M. Fermier, «Advan-
ces in Capillary Electrochromatography», Electrophoresis, 18 (1997) 2162.
25. www.ceandcec.com/ — приведена основная информация по капиллярному
электрофорезу, капиллярной электрохроматографии; есть ссылки на дру-
гие Интернет-ресурсы.
Глава 22
КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Все течет, все изменяется.
Гераклит
В главах би 14 мы упоминали об использовании катализаторов для ускорения
ряда окислительно-восстановительных реакций — например, титриметриче-
ской реакции As(III) с Ce(IV), катализируемой с помощью OsO4. Для того, чтобы
реакция началась немедленно, катализатор добавляют в довольно высокой кон-
центрации. Если же концентрация катализатора и скорость реакции низки, то
можно измерить скорость реакции и по ее величине судить о концентрации ката-
лизатора. В данной главе мы опишем основы кинетики скоростьопределяющих
реакций, а далее обсудим реакции, ускоряемые особыми катализаторами — фер-
ментами, и рассмотрим способ измерения скорости реакции с целью определе-
ния как концентрации фермента, так и содержания каталитического субстрата
путем добавления к анализируемым растворам одного и того же количества фер-
мента.
22.1. Основы химической кинетики
Закономерности, связанные со скоростями реакций, описывает химическая
кинетика. Порядок реакции определяет зависимость скорости реакции от кон-
центрации реагентов. Эта экспериментально определяемая величина не обязатель-
но связана со стехиометрией конкретной реакции. Чаще всего она определяется
механизмом реакции, т. е. числом частиц, которые должны соединиться друг с
другом для того, чтобы произошла данная реакция.
Реакции первого порядка
Реакции, скорость которых прямо пропорциональна концентрации только одно-
го вещества, называют реакциями первого порядка. Рассмотрим реакцию:
А—>Р
(22.1)
Вещество А может быть соединением, которое разлагается с образованием од-
ного или более продуктов. Скорость данной реакции равна скорости расходова-
ния вещества А и пропорциональна его концентрации:
22.1. ОСНОВЫ ХИМИЧЕСКОЙ КИНЕТИКИ
255
^ = *[А]
dt
(22.2)
Данное выражение скорости реакции называется кинетическим законом. Знак
минус, помещенный в начале уравнения, означает уменьшение количества ве-
щества А со временем. Величину к называют константой скорости, которая для
данной реакции является величиной постоянной, зависящей от температуры и
измеряемой в обратных единицах времени, с-1. Порядок реакции определяют
как сумму показателей степеней, в которые возведены концентрации в выраже-
нии для скорости. Таким образом, скорость реакции первого порядка зависит то-
лько от концентрации вещества А.
Уравнение (22.2) называют дифференциальной формой кинетического за-
кона для реакций первого порядка. Интегральная форма уравнения имеет вид:
16[А1=1ЙА1°-^
(22.3)
где [А]о — начальная концентрация вещества А (/ = 0) и [А] — концентрация
спустя время t после начала реакции. Данное уравнение определяет количество
вещества А, вступившего в реакцию к определенному моменту времени. Эта за-
висимость линейна и графически представляет собой прямую lg[А] =/(t) с тан-
генсом угла наклона, равным —А72,303, и отрезком, отсекаемым на оси ординат,
равным lg[A]0. Таким образом можно определить константу скорости.
Из уравнения (22.2) следует, что скорость реакции (но не константа скоро-
сти) будет уменьшаться по мере протекания реакции, так как концентрация ве-
щества А будет также уменьшаться. Поскольку уменьшение [А] от времени
происходит по логарифмической зависимости [см. уравнение (22.3)], то скорость
реакции со временем уменьшается экспоненциально. Время, в течение которого
прореагировала половина исходного вещества, называют периодом полупрев-
ращения данной реакции — t у. В этот момент времени соотношение [А]/[А]0
равно Путем подстановки этого в уравнение (22.3) с целью выражения t у на-
ходим, что для реакций первого порядка:
0,693
(22.4)
После того, как реакция пройдет наполовину, половина оставшихся реагентов
будет взаимодействовать в течение такого же промежутка времени tу и т. д. Но,
так как эта зависимость подчиняется экспоненциальному закону, теоретически
для полного завершения реакции требуется бесконечно много времени. С прак-
тической же точки зрения реакцию можно считать завершенной (99,9%) после
10 периодов полупревращения. Важно отметить, что период полупревращения,
256
ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
а значит, и общее время протекания реакции, в реакциях первого порядка не за-
висят от концентрации.
Одним и5 характерных примеров реакций первого порядка является радио-
активный распад.
Реакции второго порядка
Рассмотрим следующую реакцию:
А + В -» Р (22.5)
Скорость данной реакции равна скорости расходования как вещества А, так и ве-
щества В. Если экспериментально найдено, что
^ = -^ = 4А][В]
dt dt
(22.6)
то, рассматриваемая реакция имеет первый порядок по отношению к [А] и к [В]
и второй порядок в целом (сумма показателей степеней при концентрациях рав-
на двум). Константа скорости реакции в данном случае имеет размерность об-
ратных единиц времени и концентрации, например, с-1М-1.
Интегральная форма уравнения (22.6) зависит от того, равны ли начальные
концентрации А и В ([А]о и [В]о). Если они равны, уравнение имеет вид:
,„_[А]0-[А]
[А]0[А]
Если же, [А]о и различны.
2,303 [А]0[В]
[В]0-[А]0 [В]0[А]
(22.7)
(22.8)
В случае, когда концентрация одного из реагентов, например В, намного
превосходит концентрацию остальных веществ, но при этом его концентрация в
ходе реакции меняется несущественно, уравнение (22.6) сводится к уравнению
для реакции первого порядка:
-^ = *'[А] (22.9)
dt
где к' = А[В], при этом интегральная форма принимает вид:
fe = 2303 [А]о
[В]о [А]
(22.10)
22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
257
Поскольку [В]о постоянна, уравнение (22.10) идентично уравнению (22.3). Та-
кие реакции называют реакциями псевдопервого порядка.
Период полупревращения для реакции второго порядка, в которой
[А]о = [В]о равен
t\ —-------
г £[А]0
(22.11)
Таким образом, в отличие от реакций первого порядка период полупревращения
реакций второго порядка зависит от начальной концентрации.
Далеко не всегда реакция между веществами А и В имеет второй порядок.
Куда более распространенными являются реакции с дробными порядками. На-
пример, реакция вида 2А + В -» Р может иметь как третий (скорость пропорцио-
нальна [А]2[В]), так и второй (скорость пропорциональна [А][В]) или же более
сложный (даже дробный) порядок.
Время протекания реакции
Время полного протекания реакции будет зависеть от константы скорости & и, в
случае реакций второго порядка, от начальных концентраций. Реакции первого
порядка протекают практически мгновенно при значениях к > 10 с-1 (99,9% пре-
вращения менее чем за 1 с). Если же к< 10-3 с-1, время, соответствующее 99,9%
превращения, превосходит 100 мин. Хотя предсказание времени реакций второ-
го порядка является более сложной задачей, их зачастую можно считать мгно-
венными при значениях & больше 103—104 с-1М-1. Если же к< 10-1 с-1М-1, то для
завершения такой реакции потребуется несколько часов.
22.2. Ферментативный катализ
Ферментами называют особые природные белки, которые с высокой эффектив-
ностью ускоряют специфичные реакции. Относительная молекулярная масса
ферментов обычно составляет от 10000 до 20000. Эти природные катализаторы
неразрывно связаны с биохимическими реакциями организма и процессами
жизнедеятельности. Определение некоторых ферментов в организме человека
играет важную роль в диагностике заболеваний. Но помимо этого ферменты
оказались чрезвычайно полезными для определения субстратов — веществ, ре-
акции с участием которых ускоряются данными ферментами.
Ферментативная кинетика
Для описания скорости ферментативных реакций можно использовать простую
модель. Так, типичную ферментативно-каталитическую реакцию можно пред-
ставить следующим образом:
258
ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
*1 к3
E + S±=?ES—>Р + Е
(22.12)
где Е — фермент, S — субстрат, ES — активированный комплекс, образова-
ние которого приводит к снижению энергетического барьера реакции, Р — про-
дукт (продукты) и к—константы скорости для каждой стадии. Фермент образует
комплекс с субстратом, который затем распадается с образованием продукта ре-
акции (рис. 22.1). Скорость реакции R прямо пропорциональна концентрации
комплекса, а следовательно — концентрации субстрата и фермента.
R = Ar3[ES] = Ar[S] [Е]
(22.13)
Если допустить, что константы кх и к2 намного больше к3, то скорость реакции
будет определяться скоростью распада активированного комплекса.
Зависимость скорости ферментативно-каталитической реакции от концент-
рации субстрата приведена на рис. 22.2. Фермент характеризуют каталитиче-
ским числом (или числом каталитических циклов, или кругооборотным
числом*), т. е. количеством молекул субстрата, с которыми он может вступать в
реакцию с образованием комплекса в единицу времени с последующим превра-
щением (конвертацией) до продуктов реакции. До тех пор, пока концентрация
субстрата достаточно мала по сравнению с концентрацией фермента и не превы-
шает каталитическое число фермента, скорость реакции прямо пропорциональ-
на концентрации субстрата и имеет первый порядок по субстрату [см. уравнение
(22.13)]. Если при этом концентрация фермента остается постоянной, то резуль-
тирующая реакция имеет первый порядок, а ее скорость прямо пропорциональна
концентрации субстрата, т. е. £[Е] = const в уравнении (22.13). Эта закономерность
служит основой для определения содержания субстратов**. Однако в случае,
Рис. 22.1
Приводится с официального
разрешения]
Механизм ферментативной
активности.
[D. Leja, Национальный
институт генома человека
(www.nhgri.nih.gov).
Субстрат
Фермент
Продукты
реакции
Ферментно-субстратный
комплекс
Кругооборотное число, дословный перевод с английского, в последнее время все чаще используется среди
биохимиков. — Прим, перев.
Концентрацию субстратов не нужно определять по скорости реакции. Лучше подождать полного заверше-
ния реакции, когда субстрат будет полностью конвертирован до продуктов реакции, и воспользоваться
данными о концентрации продукта реакции до и после реакции. Более детальное описание каждой из этих
методик приведено ниже в разделе, посвященном определению ферментов и их субстратов.
22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
259
Рис. 22.2
Зависимость скорости
ферментативно-каталитической реакции от
концентрации субстрата. При высоких
концентрациях, когда фермент становится
насыщенным по отношению к субстрату, скорость
реакции достигает своего максимального
значения и далее не изменяется ввиду постоянства
[ES] — см. уравнение (22.13)
когда количество субстрата превосходит каталитическое число присутствующе-
го фермента, последний приходит в состояние насыщения по отношению к при-
соединяемым молекулам и скорость реакции достигает своего максимального
значения. С этого момента скорость реакции перестает зависеть от концентра-
ции субстрата, таким образом порядок реакции становится псевдонулевым при
постоянной концентрации фермента (см. рис. 22.2). В этом случае [ES] в уравне-
ния (22.13) становиться величиной постоянной и R = const.
Когда фермент насыщен по отношению к субстрату, реакция имеет первый
порядок по отношению к ферменту, т. е. &[S] = const в уравнении (22.13). Посколь-
ку зависимость между его концентрацией и скоростью реакции будет линейной,
это является основой для определения концентрации фермента. Но так как субст-
рат расходуется в процессе реакции, то для того чтобы реакция имела нулевой по-
рядок по отношению к нему в течение всего времени реакции (т. е. в случае, когда
фермент остается насыщенным), субстрат должен присутствовать в заведомо вы-
сокой концентрации. С течением времени при высоких концентрациях фермента
последний станет доступен для связывания с находящимся в недостаточном коли-
честве субстратом, и график зависимости примет вид, изображенный рис. 22.2.
Свойства ферментов
Скорость ферментативных реакций зависит от множества факторов, включая
температуру, pH, ионную силу и т. д. С увеличением температуры скорость ре-
акции сначала будет возрастать. Но по достижении определенной температуры
активность фермента снизится, поскольку, будучи белковой молекулой, он под-
вергнется денатурации (свертыванию), которая заключается в разрушении тре-
тичной структуры фермента по мере разрыва водородных связей. (Аналогичным
образом денатурирует белок яйца при его приготовлении.) Важную роль в ката-
литическом механизме фермента играет его стерическая природа. Большинство
ферментов животного происхождения подвергаются денатурации при темпера-
турах выше 40 °C.
Как и в случае других каталитических реакций, изменения температуры в
условиях анализа на 1-2 °C могут привести к ускорению скорости реакции на
10-20%. Поэтому при измерениях параметров ферментативных реакций важно
контролировать температуру.
260
ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Ферменты следует хранить при температурах не превышающих 5 °C, посколь-
ку они подвержены постепенной денатурации со временем даже при относительно
низких температурах. Некоторые ферменты теряют активность при заморажи-
вании.
Скорость ферментативных реакций будет максимальна при определенном
значении pH ввиду существования ряда кислотно-основных взаимодействий, та-
ких как кислотная диссоциация между субстратом, активированным комплек-
сом и продуктами. Максимальная скорость ферментативной реакции может
также зависеть от ионной силы и типа используемого буферного раствора. На-
пример, скорость реакции аэробного окисления глюкозы под действием фермента
глюкозооксидазы имеет максимальное значение при pH 5,1 в среде ацетатного бу-
ферного раствора и уменьшается при его замене на фосфатный буферный рас-
твор при прежнем значении pH.
Активность ферментных препаратов различна в зависимости от их источ-
ника, поскольку обычно ферменты не очищают до 100%-й чистоты. По этой
причине процентное содержание фермента меняется в каждом заново изготовлен-
ном препарате. Активность приготовленных ферментов измеряют в международ-
ных единицах (I.U.). Международная единица была введена Международным
союзом по биохимии как «...количество, которое при определенных условиях
катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту». Определен-
ные условия включают температуру и pH. Например, некоторые коммерческие
препараты глюкозооксидазы могут иметь активность 30 единиц на миллиграмм.
Таким образом, для определения субстрата берется определенное количество
единиц фермента. Под удельной активностью понимают число единиц фер-
мента на миллиграмм белка. Молекулярную активность определяют как число
единиц на молекулу фермента, т. е. она представляет собой число молекул суб-
страта, превращаемых в минуту одной молекулой фермента. Концентрацию
фермента в растворе следует выражать числом единиц в миллилитре или литре,
т. е. в активностях, а не в молярных концентрациях.
Ингибиторы и активаторы ферментов
Несмотря на то, что ферменты катализируют только определенные реакции или
типы реакций, здесь также возможны влияния со стороны других веществ. При
образовании активированного комплекса субстрат адсорбируется на активных
центрах фермента. Подобным образом на активных центрах могут адсорбиро-
ваться и другие вещества, имеющие сходные размеры и форму. Но после по-
добных присоединений к ферменту они не будут подвергаться каким-либо
превращениям. При этом они конкурируют с субстратом за активные центры
фермента, снижая скорость каталитической реакции. Данное явление называют
конкурентным ингибированием. Например, фермент янтарная дегидрогеназа
специфично ускоряет дегидрирование янтарной кислоты с образованием фума-
ровой кислоты. Но другие вещества, сходные по строению с янтарной кислотой,
могут конкурентно ингибировать эту реакцию. К таким веществам относятся
другие дикарбоновые кислоты, например, малоновая и щавелевая. Конкурент-
ное ингибирование можно снизить увеличением концентрации субстрата по
22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
261
сравнению с мешающими компонентами — для того, чтобы увеличить вероят-
ность соединений молекул ферментов именно субстратом.
Неконкурентное ингибирование встречается в случаях, когда ингибиру-
ющий эффект зависит только от концентрации самого ингибитора. Обычно оно
обусловлено адсорбцией ингибитора на центрах, отличных от активных, но тем
не менее участвующих в активации. Другими словами, образуется неактивная
форма фермента. Примером могут послужить реакции тяжелых металлов, таких
как ртуть, серебро и свинец, с сульфгидрильными группами (—SH) на поверхно-
сти молекул фермента. Дело в том, что сульфгидрильные группы необратимо
связываются тяжелыми металлами (ESH + Ag+ -> ESAg + Н+). Именно по этой
причине тяжелые металлы являются ядами для организма.
Некоторые ферменты требуют присутствия определенных металлов для ак-
тивации, возможно, для образования комплексов определенной стехиометрии.
Любое вещество, способное к комплексообразованию с ионами металлов, мо-
жет выступать затем в качестве ингибитора. Например, катионы магния являют-
ся активатором для большого числа ферментов. Оксалат- и фторид-ионы могут
образовывать с катионом магния комплекс, становясь ингибиторами. Активато-
ры ферментов иногда называют коферментами.
Ингибирование субстрата иногда встречается в случаях, когда субстрат
присутствует в избыточном количестве. В таких случаях реакция замедляется
после достижения максимальной скорости. Полагают, что причиной данного яв-
ления является сильная конкуренция молекул субстрата за активные центры на
поверхности фермента, при которой происходит блокировка центров с предот-
вращением занятия мест другими молекулами субстрата.
Константа Михаэлиса
Как уже было упомянуто, при заданной концентрации фермента и по мере возра-
стания концентрации субстрата фермент становится насыщенным по отноше-
нию к субстрату и скорость реакции достигает максимального значения 7?тах
Уравнение Лайнуивера-Берка описывает взаимосвязь каталитической эффек-
тивности фермента с максимальной скоростью реакции:
I _ I , кт
R ^max ^max[S]
(22.14)
где Кт — константа Михаэлиса, которая является мерой активности фермента.
С использованием уравнения (22.12) можно показать, что Кт = (к2 + к^/кх.
Константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, соответствующей по-
ловине максимальной скорости реакции, J?max/2, что можно проиллюстрировать
с помощью уравнения (22.14) путем подстановки в него R = Rmax/2. График зави-
симости 1/R от 1/[S] представляет собой прямую, имеющую тангенс угла на-
клона, равный Km/Rmax, и свободный член, или отсекаемый осью ординат
отрезок, равный 1/Лтах. Используя это, можно определить константу Михаэлиса
как характеристику субстрата и фермента.
262
ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Пример 22.1
В результате ферментативной реакции были получены следующие изменения
оптической плотности в зависимости от концентрации субстрата:
[S], моль/л R, АЛ/мин
0,0400 0,093
0,0100 0,231
0,0400 0,569
0,0800 0,758
0,120 0,923
0,160 0,995
0,240 1,032
Используя электронные таблицы, постройте график зависимости Лайнуиве-
ра-Берка, определите константу Михаэлиса и максимальную скорость реакции.
Решение
А I L в С D E
1 Зависимость Лайнуивера-Берка
2 [S], моль/л R, ДА/мин 1/[S], (моль/л)-1 1/R, ДА1 мин
3 0,00400 0,093 250 10,753
4 0,0100 0,231 100 4,329
5 0,0400 0,569 25 1,757
6 0,0800 0,758 12,5 1,319
7 0,120 0,923 8,333 1,083
8 0,160 0,995 6,25 1,005
9 0,240 1,032 4,167 0,969
10
11 Ячейка СЗ = 1/АЗ. Скопирована вниз
12 Ячейка D3 = 1/ВЗ. Скопирована вниз
13 Тангенс угла наклона (ДА'1 мин/(моль/л)-1) = 0,0395
14 Отсекаемый осью ординат отрезок = 1/Rmax = 0,737
15 Rmax(AAMHH-i)=1/D14 = 1,357
16 Кт(моль/л) = тангенс угла наклона Rmax = D13*D15 = 0,0536
17 I i
Зависимость Лайнуивера-Берка
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
263
Физический смысл Кт наглядно проиллюстрирован на рис. 22.3 (зависимо-
сти на котором аналогичны зависимостям на рис. 22.2). Когда скорость реакции
резко возрастает с увеличением концентрации субстрата, значение Кт невелико
(кривая 7). Субстрат, дающий для данного фермента наименьшее значение Кт,
зачастую (но не обязательно) является его природным субстратом, что и являет-
ся причиной резкого увеличения скорости реакции по мере увеличения концент-
рации субстрата. Малые значения Кт показывают, что фермент приходит в
насыщение при малых концентрациях субстрата. Напротив, большие значения
Кпг свидетельствуют о том, что для достижения высоких скоростей реакции тре-
буются высокие концентрации субстрата. В этом случае сложно добиться зави-
симости нулевого порядка по субстрату, а сам субстрат не будет подходящим
реагентом для определения фермента.
Специфичность ферментативных реакций
Существуют четыре типа специфичности реакций с участием ферментов:
(1) абсолютная специфичность, в случае, когда фермент катализирует одну
единственную реакцию; (2) групповая специфичность, при которой фермент
взаимодействует только с молекулами, содержащими определенные функцио-
нальные группы, например, амино-, фосфатные или метильные группы, (3) спе-
цифичность по типу связи, при которой фермент действует лишь на соединения,
имеющие определенный тип химической связи; (4) стереохимическая специ-
фичность, при которой фермент взаимодействует с определенными простран-
ственными или оптическими изомерами.
Помимо субстрата, на который они действуют, многие ферменты требуют
наличия дополнительного (второго) субстрата. Вторые субстраты могут активиро-
вать многие ферменты и являются частным случаем кофактора или кофермента
(описано выше). В качестве примера здесь можно привести никотинамидаденин-
Рис. 22.3
Иллюстрация зависимости константы
Михаэлиса от скорости реакции.
= ([S] при Ятах/2):
кривая 1 соответствует малым значениям Кт;
кривая 2 — большим значениям Кт
[S]
264
ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
динуклеотид (NAD+), который является кофактором во многих реакциях с учас-
тием дегидрогеназы, выступая в качестве акцептора водорода:
SH2 + NAD+ ~ме-нт" S + NADH + Н+
(22.15)
где SH2 — восстановленная форма субстрата, S — его окисленная (дегидриро-
ванная) форма, NADH — восстановленная форма NAD+. (NAD+ является наибо-
лее распространенным кофактором в анализах клинических лабораторий. За
течением реакции наблюдают, измеряя концентрацию NADH.)
Номенклатура ферментов
Ферменты классифицируют в соответствии со специфичностью их реакции, а
также их субстратной специфичностью. Названия большинства ферментов име-
ют окончание «аза». В зависимости от типа катализируемой реакции, ферменты
подразделяют на четыре группы: (1) те, что катализируют присоединение воды
(гидролазы) или ее удаление (гидразы). Гидролазы включают в себя эстеразы,
карбогидразы, нуклеазы и деаминазы, в то время как гидразы — угольную ан-
гидразу и фумаразу; (2) те, что катализируют реакции с участием электронных
переходов: оксидазы и дегидрогеназы; (3) те, что катализируют перенос радика-
лов, например, трансаминазы (перенос аминогрупп), трансметилазы (перенос
метильных групп) и трансфосфорилазы (перенос фосфатных групп); (4) те, что
катализируют разрыв и образование С—С-связей: десмолазы.
Например, а-глюкозидаза действует на любой а-глюкозид. Для разных
глюкозидов скорость реакции может быть различной. Тем не менее, ферменты
обычно проявляют абсолютную специфичность лишь к одному субстрату. Та-
ким образом, глюкозооксидаза катализирует аэробную реакцию окисления глю-
козы до глюконовой кислоты и пероксида водорода.
С6Н12О6 + О2 + Н2О
глюкозооксидаза
(22.16)
* ^6^12^7 + ^2^2
Данный фермент является почти полностью специфичным по отношению к
P-D-глюкозе, при этом a-D-глюкоза реагирует со скоростью 0,64 по сравнению
с P-формой, для которой скорость принимают за 100. Это объясняется тем, что в
P-форме глюкозы все атомы водорода расположены в аксиальной плоскости, а
гидроксильные группы — в экваториальной, ввиду чего ее молекула беспрепят-
ственно присоединяется к активному центру фермента с образованием фермент-
но-субстратного комплекса. Однако в a-форме расположение атомов водорода
и гидроксильных групп иное, что не дает возможности ее молекуле подойти к
активным центрам фермента вплотную. Таким образом, аэробное превращение
глюкозы (обычно на 36% состоящей из a-формы и на 64% — из P-формы) зави-
22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
265
сит от степени мутаротации a-формы в [3-форму. Равновесие мутаротации сме-
щается по мере расходования [3-формы. На этот процесс можно воздействовать с
помощью другого фермента — мутаротазы, но в нем обычно не возникает необ-
ходимости. Известно, что глюкозооксидаза действует также и на другое вещест-
во — 2-дигидрокси-/)-глюкозу. Тем не менее, относительная скорость этой
реакции на порядок меньше скорости превращения [3-глюкозы, и обычно она не
влияет на результаты определения глюкозы в крови.
Существуют тысячи природных ферментов и большинство из них проявля-
ют абсолютную специфичность.
Определение ферментов
Ферменты можно определять, измеряя количество превращенного субстрата
или продукта, полученного в результате ферментативной реакции за определен-
ный промежуток времени. Для того, чтобы скорость реакции зависела только от
концентрации фермента, субстрат должен находиться в избытке, т. е. реакция
должна иметь псевдонулевой порядок. Результаты определения ферментов вы-
ражают в международных единицах. Например, активность препарата глюкозо-
оксидазы можно определить путем манометрического или амперометрического
измерения числа микромолей кислорода, потребляемого в единицу времени.
С другой стороны, оказалось чрезвычайно полезным использование ферментов
для разработки специфичных методик определения субстратов, особенно в кли-
нической химии. В этом случае необходимо, чтобы скорость реакции была прямо
пропорциональна концентрации субстрата, потому фермент берут в заведомо из-
быточном количестве.
Определение субстратов ферментов
Для определения ферментных субстратов можно использовать две основные ме-
тодики. Во-первых, можно добиться полного превращения субстрата. С этой
целью измеряют концентрацию продукта ферментативно-каталитической реак-
ции или же расходование реагента, изначально взятого в избытке. Затем концентра-
цию определяемого вещества пересчитывают в искомую концентрацию субстрата.
Зачастую такие реакции нестехиометричны по отношению к субстрату ввиду
наличия побочных реакций или же нестабильности продуктов и реагентов. По-
мимо этого, для завершения реакции может потребоваться очень много време-
ни. В таких случаях при аналитических измерениях обычно строят специальную
градуировочную зависимость, в которой измеряемый параметр связан с извест-
ными концентрациями или численными характеристиками субстрата.
Другой подход, используемый для определения субстратов, состоит в изме-
рении скорости ферментативно-каталитической реакции, как и в случае опреде-
ления активности ферментов. Это можно сделать одним из трех способов.
Во-первых, можно измерять время, необходимое для образования в процессе ре-
акции заданного количества продукта, или же время, требуемое для расхода за-
266
ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
данного количества субстрата*. Во-вторых, можно измерять количество
израсходованного субстрата или же полученного в результате реакции продукта
в течение фиксированного промежутка времени** (см. практическую работу
№35 по определению глюкозы). Третий подход состоит в постоянном измере-
нии концентрации продукта или субстрата в зависимости от времени, с целью
определения значения тангенса угла наклона графика скорости реакции \c/\t ***.
Этот подход также известен как измерение «истинной» скорости реакции. По-
добные измерения следует проводить на ранних этапах реакции, где она имеет
псевдопервый порядок.
Измерения скорости обычно более экспрессны, чем вышеописанные мето-
ды фиксированных времен и концентраций или же методы полного превраще-
ния. С другой стороны, реакции полного превращения меньше подвержены
мешающему влиянию со стороны активаторов или ингибиторов, до тех пор,
пока для полного превращения есть достаточно времени. Различные подходы к
определению субстратов описаны также в гл. 13, где затрагиваются вопросы ис-
пользования ферментативных электродов.
Пример 22.2
Содержание этанола в крови человека определяют по ферментативной реакции
с участием NAD+ по превращению последнего в NADH под действием алкоголь-
дегидрогеназы (табл. 22.1). Скорость образования NADH измеряют при длине
волны, равной 340 нм (рис. 22.4). Для стандартного раствора, содержащего 0,1%
(масса : объем) этанола, и образца неизвестного содержания в результате про-
ведения данной реакции получены следующие значения оптической плотно-
сти:
Т, с
0
20
40
60
80
100
л
станд
0,004
0,052
0,099
0,147
0,201
0,245
л
неизв
0,003
0,036
0,070
0,098
0,132
0,165
Используя электронные таблицы, определите скорость изменения оптической
плотности и искомую концентрацию.
Так называемый метод фиксированной концентрации. —Прим, перев.
Так называемый метод фиксированного времени. —Прим, перев.
Так называемый метод тангенсов. — Прим, перев.
22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
267
Решение
А В C D Е F G
1 Т, с Атганд за вычетом фона ДА/ДТ Анеизв за вычетом фона ДА/АТ
2 0 0,004 0,003
3 20 0,052 0,048 0,00240 0,036 0,033 0,00165
4 40 0,099 0,095 0,00238 0,070 0,067 0,00168
5 60 0,147 0,143 0,00238 0,098 0,095 0,00158
6 80 0,201 0,197 0,00246 0,132 0,129 0,00161
7 100 0,245 0,241 0,00241 0,165 0,162 0,00162
8 Ср. значение 0,00241 0,00163
9 Станд.отклонение 0,00003 0,00004
10 Концентрация пробы 0,068 % (масса: объем)
11
12 Ячейка СЗ = В3-$В$2 Скопирована вниз
13 Ячейка D3 = СЗ/АЗ Скопирована вниз
14 Ячейка F3 = Е3-$Е$2 Скопирована вниз
15 Ячейка G3 := F3/A3 Скопирована вниз
16 Ячейка D8 = AVERAGE(D3:D7)
17 Ячейка G8 = AVERAGE(G3:G7)
18 Ячейка D9 = STDEV(D3:D7)
19 Ячейка G9 = STDEV(G3:G7)
20 Ячейка СЮ = 0,1*(G8/D8)
Примеры ферментативных анализов
Для определения параметров ферментативных реакций часто используют спек-
трофотометрические методы. Продукт реакции может иметь спектр поглощения,
отличный от спектра поглощения субстрата, что дает возможность ограничиться
простым измерением оптической плотности каждого из них. В других случаях
применяют реагент, дающий окрашенный продукт с продуктом или субстратом,
и измеряют изменение окраски. Зачастую хромоген присоединяется к продукту
с помощью другого фермента.
1. Реакции дегидрогеназы. Восстановленная (NADH) и окисленная (NAD+)
формы никотинамидадениндинуклеотида имеют заметные различия в ультра-
фиолетовых спектрах поглощения и поэтому широко используются при реакци-
ях с дегидрогеназой. Спектры поглощения NAD+ и NADH в УФ-области
приведены на рис. 22.4. При длине волны 340 нм светопоглощение NAD + прене-
брежимо мало, в то время как в спектре NADH при этой длине волны наблюдает-
ся максимум, что дает возможность наблюдать изменения за концентрацией
NADH.
Примером использования таких измерений может послужить определение
фермента дегидрогеназы молочной кислоты (LDH), что важно для подтверж-
268
ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Рис. 22.4
Ультрафиолетовые спектры поглощения
NAD+ и NADH (любезно предоставлено
Worthington Biochemical Corporation)
дении диагноза инфаркта миокарда. В данном случае NAD+ требуется для ката-
лизируемой ферментом LDH реакции окисления молочной кислоты в
пировиноградную:
СН3 СН3
| LDH |
СНОН + NAD+ С=О + NADH + Н+
I I
СО2Н СО2Н
молочная пировиноградная
кислота кислота
(22.17)
Эта реакция обратима и может протекать в обоих направлениях. В прямой реак-
ции к сыворотке, содержащей неизвестное количество LDH, добавляют раствор,
содержащий достаточную для насыщения фермента концентрацию молочной
кислоты и NAD, а затем измеряют увеличение оптической плотности при 340 нм
в зависимости от времени.
Помимо этого, NADH используют для сопровождения некоторых фермен-
тативных реакций без непосредственного в них участия, где он выступает в ка-
честве связывающего реагента во вторичной реакции с продуктом. Например,
сыворотка глютаминовой оксацетиновой трансаминазы (GOT) катализирует ре-
акцию с участием а-кетоглутарата и аспарата, при этом продукт восстанавли-
вается NADH в присутствии другого фермента — дегидрогеназы яблочной
кислоты (MDH):
GOT
а-Кетоглутарат + аспарат ±=? глутамат + оксалоацетат (22.18а)
MDH
Оксалоацетат + NADH малат + NAD+ (22.186)
При избытке MDH вторая реакция протекает гораздо быстрее первой, а потому
скорость уменьшения концентрации NADH прямо пропорциональна активно-
сти GOT.
2. Наиболее часто определяемые субстраты. Список некоторых субстратов,
определяемых в крови или моче, приведен в табл. 22.1. Их обсуждению посвя-
щены последующие разделы.
22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
269
Таблица 22.1
Примеры наиболее часто применяемых ферментативных реакций
для определения субстратов в клинической химии
Определяемый субстрат Фермент Реакция
Мочевина Уреаза о II NH2—С—NH, + Н2О 2NH3 + СО2
Глюкоза Г люкозооксидаза С,Н„О, + Н,0 + О, -> СлН|707 + Н,О, О 1Z О Z Z О 1Z / Z Z (глюкоза) (глюконовая кислота)
Мочевая кислота Уриказа CSH4O. -1- 2Н7О + О7 -> CJLCXN. + СО7 + Н7О7
(мочевая (аллантоин) кислота)
Галактоза Г алактозооксидаза D-галактоза + О2 —> D-галактогексодиальдсза + Н2О2
Этанол в крови Алкогольдегидрогеназа Этанол + NAD+ -> ацетальдегид + NADH + Н+
Уреаза — первый фермент, выделенный в чистом виде и полученный в кри-
сталлическом состоянии. Он количественно переводит мочевину в аммиак и ди-
оксид углерода. Количество мочевины рассчитывают исходя из количества
образовавшегося в реакции аммиака или (реже) диоксида углерода. Продукт
определяют спектрофотометрически по реакции аммиака с фотометрическим
реагентом.
Глюкозу обычно определяют по количеству пероксида водорода, получен-
ного по реакции, катализируемой глюкозооксидазой. Измерения проводят спек-
трофотометрически: реакцию связывания образующегося в реакции пероксида
водорода реагентом типа о-толуидина проводят в присутствии второго фермен-
та — пероксидазы хрена, в результате чего образуется окрашенный продукт.
Коммерческие препараты глюкозооксидазы обычно содержат примеси, реаги-
рующие с пероксидом водорода и тем самым нарушающие стехиометричность
процесса. Примесный фермент, ответственный за распад пероксида водорода,
называется каталазой. Тем не менее, процент пероксида водорода, переходяще-
го в окрашенный продукт, остается постоянным, а потому можно построить
градуировочные зависимости на основании измерений с различными кон-
центрациями глюкозы.
За ходом реакций с участием оксидазы наблюдают измерением потребляе-
мого О2 или же скорости образования Н2О2.
Существует множество веществ, способных выступать в качестве ингиби-
торов при определении глюкозы, но большинство из них встречается во второй
ферментативной реакции. Метод с применением глюкозооксидазы мог бы быть
более специфичным, если бы концентрацию пероксида водорода определяли без
использования второго фермента. Например, иодид-ионы в присутствии катали-
затора на основе молибдена(У1) быстро окисляются до свободного иода. Концен-
270
ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
трацию иода можно определять амперометрически (см. гл. 15). Другой способ
заключается в амперометрическом определении количества потребляемого кис-
лорода.
Мочевую кислоту определяют путем измерения светопоглощения в ультра-
фиолетовой области при 292 нм. Однако содержание мочевой кислоты в крови
невелико, и светопоглощение в этой части спектра неселективно. Поэтому после
измерения мочевую кислоту разрушают добавлением фермента уриказы. Затем
повторно измеряют оптическую плотность. Количество мочевой кислоты, при-
сутствующей в образце, определяют по разности полученных значений. Данный
метод является селективным, поскольку уриказа действует лишь на мочевую кис-
лоту. Похожие методики фотометрического определения мочевой кислоты со-
стоят в окислении мочевой кислоты молибдатом с образованием молибденовых
синей — соединений молибдена(У). В принципе определение мочевой кислоты
можно проводить по аналогии с определением глюкозы, но примеси в препарате
уриказы обычно быстро разлагают пероксид водорода, образующийся в очень
малом количестве.
Галактозу определяют тем же методом, что и глюкозу, окисляя хромоген
пероксидом водорода в присутствии пероксидазы. Содержание этанола в крови
определяют измерением образующегося в реакции NADH по светопоглощению
в ультрафиолетовой области.
3. Наиболее часто определяемые ферменты. В табл. 22.2 приведены основные
реакции, используемые при определении активности некоторых ферментов,
наиболее часто определяемых в клинической лаборатории. Для определения пи-
рувата, образующегося в GPT-реакции, проводят его реакцию с NADH в присут-
ствии LDH. СК катализирует перенос фосфатной группы от креатининфосфата к
нуклеотиду аденозиндифосфата (ADP) с образованием аденозинтрифосфата
(ATP). АТР реагирует с глюкозой под действием фермента гексокиназы с обра-
зованием глюкозы-6-фосфата, который может вступать в реакцию с NAD+ в при-
сутствии глюкозы-6-фосфодегидрогеназы. В настоящее время СК определяют
также методами высокоэффективной жидкостной и ион-эксклюзионной хрома-
тографии или электрофореза.
Природный фермент LDH состоит из пяти компонентов, называемых изо-
ферментами, соотношение которых зависит от источника ткани, из которой он
получен. Два наиболее электрофоретически подвижных компонента встречают-
ся в большом количестве в LDH из сердечной мышцы, и их содержание в крови
возрастает при повреждениях последней. С помощью LDH-методики определя-
ют суммарное количество изоферментов LDH, превышенное значение которых
обычно свидетельствует о повреждении сердечной мышцы. Однако две упомяну-
тые формы изоферментов более склонны катализировать реакцию восстановления
а-кетобутирата, чем менее подвижные компоненты печеночного происхождения,
которые называют активными по а-гидроксибутиратдегидрогеназе (HBD).
С помощью этой реакции можно определять HBD, что является более показате-
льным при инфарктах миокарда, чем LDH (так как они остаются в активной фор-
ме в течение долгого времени с момента инфаркта).
22.2. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ КАТАЛИЗ
271
Таблица 22.2
Примеры ферментов, наиболее часто определяемых в клиническом анализе
Фермент Обозна- чение Реакция
Г лютаминопиро- виноградная трансаминаза Глютамин- оксалоацетат- трансаминаза GPT GOT GOT а-Кетоглутарат + Z-аланин глютамат + пируват LDH Пируват + NADH + Н+ лактат + NAD+ GOT а-Кетоглутарат + аспартат глютамат + оксалоацетат MDH Оксалоацетат + NADH + Н+ малат + NAD+
Креатинин- фосфокиназа СК СК Креатининфосфат + ADP креатинин + АТР гексокиназа
АТР + глюкоза - ADP + глюкозо-6-фосфат Глюкозо-6-фосфат + NAD+ G"6PPH> 6-фосфоглюконат + NADH + Н+
Лактат- дегидрогеназа а-Гидрокси- бутират- дегидрогеназа LDH HBD LDH Z-лактат + NAD+ пируват + NADH + Н+ HBD а-Кетобутират + NADH + Н+ а-гидроксибутират + NAD+
Щелочная фосфатаза .г < жж pH 10,1 , . , Тимолфталеинмонофосфат натрия > тимолфталеин натрия + фосфат
Кислая фосфатаза Та же, что и в случае щелочной фосфатазы, но pH 6,0
Фосфатазы определяют, измеряя интенсивность голубой окраски тимол-
фталеинов в сильнощелочных растворах через определенный промежуток вре-
мени. Сильнощелочная среда останавливает ферментативные реакции.
Конечно, измерять параметры ферментативных реакций можно не только
спектрофотометрически. Существуют методики с использованием амперомет-
рических, кондуктометрических, кулонометрических и вольтамперометрических
измерений, а также с применением ионселективных электродов. Характеристики
некоторых ферментативных реакций можно определять с помощью фермента-
тивных электродов, отклик которых специфичен для определенной реакции (по-
дробное описание приведено в гл. 13 и 15).
Активаторы и ингибиторы ферментов можно определять с использовани-
ем реакций с их участием. Простейшая методика состоит в измерении соответству-
ющего увеличения или уменьшения скорости ферментативной реакции. Другой
подход заключается в «титровании» фермента ингибитором (или наоборот) и
определении количества ингибитора, требующегося для полного ингибирова-
ния реакции. Например, ингибированием или активацией ферментативных ре-
акций можно определять некоторые микроэлементы.
272
ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
Многие ферменты являются идеальным воплощением мечты аналитика об
абсолютно специфичном реагенте, но из-за наличия ингибирующих эффектов, а
также проблем, связанных с необходимостью контроля pH и ионной силы, их
следует использовать с некоторой осторожностью.
Большинство вышеописанных методик можно приспособить к системам ав-
томатического мониторинга с применением ферментативных анализов. Приме-
ры этого приведены в ссылке 7.
Что мы узнали из этой главы?
• Реакции первого порядка, их период полупревращения [основные уравне-
ния (22.3), (22.4)] — стр. 254
• Реакции второго порядка, их период полупревращения [основные уравне-
ния (22.7), (22.8)] —стр. 256
• Ферментативный катализ — константа Михаэлиса [основное уравнение
(22.14)], расчеты с использованием электронных таблиц — стр. 257, 261
• Определение субстратов (табл. 22.1), определение ферментов (табл. 22.2) —
стр. 267
Вопросы
Общая теория
1 - В чем различие между реакциями первого и второго порядка?
2. Что такое период полупревращения реакции? Сколько периодов полупрев-
ращения потребуется для полного завершения реакции?
3- Что такое реакция псевдопервого порядка?
4- Предложите способ определения принадлежности реакции между вещест-
вами А и В к реакциям первого или второго порядка.
Ферменты
5- Что такое международная единица?
6. В чем разница между конкурентным и неконкурентным ингибированием
фермента?
7, Почему ионы тяжелых металлов ядовиты для организма?
8- Что такое коферменты?
9 - Предложите способ проверки того, является ли ингибитор фермента конку-
рентным или неконкурентным.
10. Как с помощью графика Лайнуивера-Берка можно определить тип ингиби-
тора (конкурентный или неконкурентный)?
ЗАДАЧИ
273
Задачи
Кинетика
11. Если в реакции первого порядка 50%-я степень превращения достигается
за 10 мин, то сколько времени потребуется для 90%-го превращения? Для
99%-го?
12. Реакции первого порядка требуется 25 с для 30%-го превращения в продук-
ты. Каков ее период полупревращения?
13 - Реакция, протекающая в 0,1 М растворе веществ А и В, относится к реакци-
ям второго порядка. Чему равен период ее полупревращения при условии,
что за 6,75 мин она протекает на 15%? Чему будет равен период ее полу-
превращения в случае, когда концентрации А и В одинаковы и равны 0,2 М,
и сколько потребуется времени для протекания этой реакции на 15%?
14, Сахароза гидролизуется до глюкозы и фруктозы:
^12^22^11 + Н2О “> ^6^12^6 + ^6^12^6
В разбавленном водном растворе концентрацию воды можно считать прак-
тически постоянной, поэтому данная реакция имеет псевдопервый порядок
и подчиняется законам кинетики реакции первого порядка. Через какое
время количество образовавшихся глюкозы и фруктозы будет равно поло-
вине концентрации не успевшей прореагировать сахарозы, если в течение
9 ч гидролизуется 25% 0,5 М раствора сахарозы?
15- Пероксид водорода разлагается по реакции второго порядка:
~ катализатор _
2Н2О2-------> 2Н2О + О2
Сколько времени потребуется при нормальных условиях для получения
100 мл О2 из 100 мл 0,1 М раствора Н2О2, если за 8,6 мин разлагается 35%
0,1 М раствора?
Ферменты
16» Активность препарата глюкозооксидазы определяют, измеряя объем по-
требляемого кислорода в зависимости от времени. Препарат в количестве
10 мг поместили в насыщенный кислородом раствор, содержащий 0,01 М
глюкозы. Далее определили, что при нормальных условиях спустя 20 мин
было израсходовано 10,5 мл кислорода. Рассчитайте активность данного
препарата, выразив ее в ферментных единицах/мл. Если активность чисто-
го фермента равна 61,3 единицы/мл, какова чистота препарата, выраженная
в процентах?
Задача для решения при помощи электронных таблиц
17. Только что разрезанное яблоко на воздухе начинает темнеть вследствие
окисления содержащихся в нем фенолов, катализируемых ферментом
274
ГЛАВА 22. КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА
о-дифенилоксидазой. Был проведен эксперимент по определению констан-
ты Михаэлиса о-дифенилоксидазы. Для этого свежие кусочки яблока сна-
чала измельчают, затем центрифугируют, а полученную надосадочную
жидкость применяют в качестве источника фермента (см. www.ultranet.com/
~jkimball/BiologyPages/E/EnzymeKinetics.html). В качестве субстрата ис-
пользуют пирокатехин. Измеренное количество ферментного препарата
помещают в трубку, содержащую 0,3 мМ пирокатехина, и в течение несколь-
ких минут измеряют разность оптической плотности при 540 нм с интервалом
в 1 мин. Эксперимент повторяют с тремя другими трубками, содержащими
0,6, 1,2 и 4,8 мМ пирокатехина. Были получены следующие результаты
(мМ пирокатехина / АЛ/мин): 0,3/0,020; 0,60/0,035; 1,20/0,048; 4,8/0,081. Рас-
считайте значение Кт с помощью электронных таблиц.
Рекомендуемая литература
Кинетика
1. Н. Н. Bauer, G. D. Christian, and J. E. O’Reilly, eds., Instrumental Analysis. Bos-
ton: Allyn and Bacon, 1978, Chapter 18, «Kinetic Methods», by H. B. Mark, Jr.
2- R. A. Greinke and H. B. Mark, Jr., «Kinetic Aspects of Analytical Chemistry»,
Anal. CAezn., 46 (1974) 413R.
3. H. L. Pardue, «А Comprehensive Classification of Kinetic Methods of Analysis
Used in Clinical Chemistry», Clin. Chem.. 23 (1977) 2189.
4. D. Perez-Bendito and M. Silva, Kinetic Methods in Analytical Chemistry. New
York: Wiley, 1988.
5- H. A. Mottola, Kinetic Aspects of Analytical Chemistry. New York: Wiley-Inter-
science, 1988.
Ферменты
6. H. U. Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis. 3rd ed. New York: Wiley. Се-
рийное издание, включающее 12 томов, 1983-1987.
7. N. Gochman and L. J. Bowie, «Automated Rate-Monitoring Systems for Enzy-
me Analyses», Anal. Chem.. 48 (1976) 1189a.
Интернет-сайты
8. www.worthington-biochem.com — приведены ссылки на информацию о
свойствах ферментов, источниках их получения и краткое введение в био-
химию ферментов из «Руководства по ферментативным методом».
9. www.chem/qmul.ac.uk/iubmb/enzyme или www.chem.qmw/ac.uk/iubmb/
kinetics — приведена номенклатура ферментов по рекомендациям Между-
народного союза по биохимии и Международного союза по чистой и при-
кладной химии (ИЮПАК).
Глава 23
АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Если вы не знаете, как это делать,
компьютер вам не поможет,
(из книги: J. F. Ryan, Today's Chemist at Work)
По мере развития методов анализа, особенно в области контроля окружающей
среды и медицины, в распоряжении химиков-аналитиков появляются все новые
технические средства и возможности. Аналитику часто приходится анализиро-
вать большое число проб и обрабатывать большие объемы данных. Сейчас до-
ступны средства, позволяющие автоматически выполнять большинство или
даже все стадии анализа, тем самым значительно увеличивая производитель-
ность лаборатории. Для обработки данных целесообразно использовать компью-
теры; компьютеры могут также быть непосредственно связаны с аналитическими
приборами. Важный случай автоматического анализа — контроль производст-
венных процессов, который можно осуществлять в реальном времени (в режиме
online). При этом аналитическая информация непрерывно поступает в системы
контроля, поддерживающие параметры производственного процесса в пределах
заданных условий.
В этой главе мы кратко рассмотрим наиболее распространенные типы авто-
матических приборов и устройств и принципы их работы, а также обсудим их
применение для контроля производства.
23.1. Основы автоматизации
Существуют два основных типа автоматизированного оборудования. Автома-
тические устройства выполняют отдельные операции анализа, чаще всего из-
мерения. Так, автоматический титратор выполнит остановку титрования в
конечной точке (при помощи механических или электрических устройств) на
основании сигнала датчика об изменении свойств раствора. Собственно же
автоматизированные устройства контролируют и регулируют весь ход про-
цесса без вмешательства человека. Они осуществляют это при помощи механи-
ческих и электронных устройств, управляемых за счет сигналов обратных
связей, поступающих от датчиков. Автоматизированный титратор может, на-
пример, поддерживать заданное значение pH раствора, подавая в него кислоту
или основание в тех случаях, когда изменение pH регистрируется электродом.
Такое устройство называется pH-стат. Его можно использовать, в частности,
276
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
для поддержания постоянного значения pH в ходе ферментативной реакции, при
которой выделяются или поглощаются протоны. При этом скорость реакции
можно определять по скорости добавления кислоты или основания, необходи-
мой для поддержания постоянного значения pH.
Автоматизированные устройства широко применяются в системах произ-
водственного контроля, а автоматические устройства (различной степени слож-
ности) — главным образом в аналитических лабораториях для выполнения
анализов. При этом последние могут выполнять все стадии анализа, начиная от
отбора пробы и кончая измерением сигнала, обработкой и отображением резуль-
татов.
23.2. Автоматизированная аппаратура:
контроль производственных процессов
Цель производственного анализа — получение данных о ходе процесса произ-
водства или качестве продукции. Как показано на рис. 23.1, существуют различные
способы выполнения производственных анализов. Можно, например, периоди-
чески отбирать пробы и транспортировать их в лабораторию для анализов.
В этом случае можно использовать обычное лабораторное оборудование, при-
чем самое разнообразное. Однако такая процедура достаточно медленная: часто
химический производственный процесс к моменту поступления результатов ана-
лиза попросту успевает закончиться. Поэтому лабораторный анализ более удобен
для контроля качества продукции. Более высокой производительности можно
достичь, если, наоборот, аналитическое оборудование доставить на химическое
производство. Но для того, чтобы по-настоящему выполнять анализы в реаль-
ном масштабе времени, прибор должен быть напрямую связан с химическим
процессом, осуществляя автоматический пробоотбор и анализ. Еще лучше было
бы поместить датчик непосредственно в технологический поток (режим inline) и
обеспечить тем самым непрерывность измерения без использования химиче-
ской обработки. Однако число и доступность таких датчиков достаточно огра-
ничены, поскольку они должны удовлетворять множеству требований: быть
селективными по отношению к определенному аналиту, устойчивыми к хими-
ческим воздействиям, не выходить из строя и сохранять постоянство градуиро-
вочной зависимости. Самым лучшим приемом были бы измерения вообще без
вмешательства в производственный поток. Например, аналит может обладать
характерным спектром поглощения. В этом случае его можно селективно опре-
делить, просто пропуская свет через производственную систему. Естественно,
примеры подобных определений тоже достаточно редки.
Важный аспект производственного анализа в реальном времени — исполь-
зование аналитической информации для управления химическими процессами
посредством обратной информационной связи с управляющим устройством.
Последнее может, например, регулировать количества подаваемых реактивов с
тем, чтобы поддерживать параметры процесса в заданных пределах. Проведение
измерений в режиме online в сочетании с обратной связью для контроля химиче-
23.2. АВТОМАТИЗИРОВАННАЯ АППАРАТУРА: КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ПРОЦЕССОВ
277
Рис. 23.1
Способы осуществления
производственного анализа. Режимы
анализа: OFFLINE — с периодическим
отбором проб, анализ в лаборатории;
ATLINE — с периодическим отбором
проб, анализ на месте; ONLINE —
с непрерывным отбором проб, анализ
на месте; INLINE — анализ в потоке;
NONINVASIVE — бесконтактный
анализ [J. В. Callis, D. Ulman,
В. R. Kowalski, Anal. Chem., 59 (1987)
624А]. ©American Chemical Society,
1987. Воспроизведено с разрешения
INLINE
ских производств позволяет химическим компаниям экономить миллионы и
даже сотни миллионов долларов ежегодно за счет оптимизации производства:
достижения наибольших выходов реакций и количеств образующихся продук-
тов, предотвращения протекания побочных процессов, своевременного обнару-
жения загрязнений и т. д. Подобное использование аналитической химии стало
важнейшей составляющей промышленного производства. Центр производст-
венной аналитической химии Университета штата Вашингтон (Center for Process
Analytical Chemistry, СР AC) пользуется поддержкой промышленных спонсоров с
целью проведения исследований в области современной призводственной изме-
рительной технологии (см. http://www.cpac.washington.edu).
Измерительные устройства можно разделить на непрерывные и дискретные
(прерывистые). Прибор непрерывного действия постоянно измеряет некото-
рое физическое или химическое свойство пробы и выдает сигнал в виде непрерыв-
ной функции от времени. Прибор дискретного действия анализирует отдельные
или периодически поставляемые пробы и выдает информацию также только в
278
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
дискретном режиме. Однако в любом случае полученная информация учитыва-
ется контрольными и управляющими устройствами. В каждом из способов ис-
пользуются обычные измерительные процедуры химического анализа. Кроме
того, и те, и другие приборы должны быть пригодны для длительных измерений
без вмешательства оператора.
Анализаторы непрерывного действия
Приборы непрерывного действия для контроля производства могут выполнять
измерения непосредственно в технологическом потоке или реакторе периодиче-
ского действия, например в ферментаторе. В подобных случаях, как правило, не
выполняется никаких аналитических операций с пробами, поэтому следует ис-
пользовать устройства для прямых измерений типа сенсоров — таких, например,
как электроды. Если же требуется разбавление пробы, контроль температуры, до-
бавление реагентов и тому подобные действия, то можно сделать небольшое от-
ветвление от основного потока и направить его в специальный анализатор, в
котором будет происходить непрерывное добавление требуемых реагентов в ав-
томатическом режиме, а также выполняться измерения. Предварительно поток
пробы может быть пропущен через фильтр.
Устройства для управления производственными процессами работают при
помощи петли управления, состоящей из трех основных частей.
1. Сенсор (датчик) или измерительное устройство, осуществляющее непре-
рывное измерение того параметра, который следует контролировать.
2. Контроллер, осуществляющий сравнение измеренной величины с ее задан-
ным значением и передающий информацию управляющему устройству.
3. Управляющее устройство (оператор), подающий сигнал определенным
устройствам (например, клапанам) с тем, чтобы привести контролируемый
параметр к заданному значению.
Петля управления работает по принципу обратной связи (рис. 23.2). Под «про-
цессом» здесь понимается любой процесс производства того или иного продук-
та. Он имеет одну или несколько точек входа, которыми можно управлять для
получения продукта (точка выхода). Датчик осуществляет измерение величины,
подлежащей контролю (например, значения pH, температуры, концентрации ре-
агента). Полученная информация поступает на контроллер, в котором происхо-
дит сравнение измеренной и заданной величин параметра. Данные о различии
между ними поступают к оператору, регулирующему клапан (открывая или за-
крывая его) или иное соответствующее устройство с тем, чтобы установить тре-
буемое значение контролируемого параметра.
Подобные устройства характеризуются так называемым «мертвым» вре-
менем. Оно представляет собой временной интервал с момента изменения пара-
метра на входе, в течение которого не происходит изменения величины параметра,
контролируемого датчиком на выходе. Мертвое время включает в себя время
выполнения измерений (аналитическое «мертвое» время). Его можно умень-
23.2. АВТОМАТИЗИРОВАННАЯ АППАРАТУРА: КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ПРОЦЕССОВ
279
Рис. 23.2
Петля управления
с обратной связью
шить, располагая детектор как можно ближе к точке входа, а также увеличивая
скорость потока. Датчик можно поставить непосредственно на входе, впереди
процесса. В этом случае при нежелательном изменении контролируемого пара-
метра корректирующие действия можно осуществить еще до выполнения процес-
са, и последующая корректировка не требуется. Однако при этом невозможно
проследить результат корректировки на выходе. Такие системы можно назвать
системами с прямой связью, или открытыми петлями управления, в отли-
чие от закрытых петель управления в устройствах с обратной связью. Для
управления часто используются сложные алгоритмы, основанные на методах
хемометрики и многомерного анализа и реализуемые при помощи компьюте-
ров. Их рассмотрение выходит за рамки материала книги.
Дискретные анализаторы
В ходе работы дискретных анализаторов пробу периодически отбирают через
определенные интервалы времени и затем анализируют. Полученная информа-
ция точно так же поступает на контроллер и управляющее устройство. Естест-
венно, что за счет отбора проб аналитическое «мертвое» время в этом случае
больше, чем для непрерывных анализаторов, а регулируемый параметр в проме-
жутках между измерениями специально не поддерживается на заданном уровне.
Если в промежутке между измерениями происходит временный сбой, он может
быть не зафиксирован и не исправлен. С другой стороны, как раз в ходе измере-
ния может быть обнаружен сбой, который окажется временным, а ответные дей-
ствия по его устранению будут продолжаться в течение всего времени до
следующего измерения.
Дискретные измерения следует проводить в тех случаях, когда это диктует-
ся спецификой работы измерительного устройства — например, при использо-
вании хроматографов или проточно-инжекционных анализаторов (см. ниже).
280
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Оборудование для автоматизированного управления
производством
В принципе для управления производством можно использовать любые обыч-
ные измерительные приборы и методики измерений. Но лабораторные приборы,
как правило, не приспособлены для измерений в режиме online. Удовлетворяю-
щие этим требованиям приборы должны быть более устойчивыми в эксплуатации
и быть способными к работе без вмешательства оператора либо при участии
операторов достаточно низкой квалификации — ведь заводские работники, как
правило, не являются специально обученными химиками-аналитиками. В то же
время Вы, уважаемый читатель, будучи аналитиком-профессионалом, обязаны
решить, какой способ измерений следует применить, какие приборы для этого за-
купить, а также гарантировать, что полученные результаты будут правильными.
Выбор оборудования определяется его стоимостью и соответствием его
возможностей поставленным задачам. Среди методов, используемых чаще все-
го, — спектрофотометрия (измерение интенсивности окраски, поглощения в
ультрафиолетовой или инфракрасной области, мутности, толщины пленок);
электрохимические методы, в первую очередь потенциометрия (измерения pH,
активностей различных катионов или анионов); газовая и жидкостная хромато-
графия, в первую очередь — в нефтехимической промышленности, где требует-
ся контролировать состав сложных смесей в ректификационных колоннах. Изме-
рения спектрофотометрическим и другими методами часто возможно выполнить
очень быстро, используя методику проточно-инжекционного анализа.
23.3. Автоматическая аппаратура
Как отмечено ранее, автоматические приборы не являются управляющими
устройствами с обратной связью. Они предназначены лишь для автоматизации
одной или нескольких стадий анализа, как правило, — для анализа множества
проб на содержание одного или нескольких компонентов.
Автоматические приборы позволяют выполнять одно или более из следую-
щих действий.
1. Отбор пробы (например, раствора из маленькой чашечки, помещенной во
вращающуюся кассету или на движущуюся ленту).
2. Разложение проб.
3. Разбавление, добавление реагентов.
4. Инкубация проб.
5. Перенос пробы к детектирующей системе.
6. Считывание и запись показаний.
7. Обработка данных (введение поправок на сигнал контрольного опыта, не-
линейность градуировочной зависимости, расчет среднего и дисперсии,
корреляционных характеристик и т. д.).
23.3. АВТОМАТИЧЕСКАЯ АППАРАТУРА
281
Аппаратура, применяемая в клинических исследованиях, может также включать
устройства для удаления белков из пробы. Устройства, позволяющие автомати-
зировать лишь небольшое число указанных операций, главным образом выпол-
нять электронную обработку данных, часто называют полуавтоматическими.
С точки зрения терминологии, используемой для автоматизированных про-
изводственных анализаторов, все автоматические устройства являются дискретны-
ми, поскольку они позволяют анализировать лишь отдельные пробы в дискретном
режиме. В то же время для таких устройств существует и своя собственная клас-
сификация.
1. Приборы с дискретным пробоотбором. В таких устройствах каждая про-
ба претерпевает химическое превращение в отдельной кювете или камере.
Эти пробы анализируют последовательно или параллельно (см. ниже).
2. Приборы с непрерывным проточным пробоотбором. В этом случае рас-
творы проб непрерывно движутся друг за другом в потоке, заключенном в
трубку. Отдельные пробы могут быть разделены пузырьками воздуха. Они
последовательно смешиваются с реагентами в определенной точке той же
самой трубки, а затем так же последовательно проходят через детектор.
Преимущество приборов с дискретным пробоотбором состоит в меньшей веро-
ятности (или полном отсутствии) взаимного загрязнения проб. Однако проточные
приборы требуют меньше механических манипуляций и могут характеризоваться
очень высокой воспроизводимостью результатов.
Приборы дискретного типа могут быть предназначены для определения толь-
ко одного компонента в одной пробе в данное время. Они называются одноканаль-
ными анализаторами (рис. 23.3). Приборы, которые могут одновременно
анализировать несколько проб, т. е. работать с ними не последовательно, а па-
раллельно, отличаются высокой производительностью. Обычно их можно легко
перестроить для выполнения нескольких различных анализов. Дискретные ана-
Проба № Детектор № Проба № Детектор №
Проба № Детектор №
у-| Реагент^
Реагент 1 ,—.
-------
yi Реагент^
—I Реагент 1
1| Э
у» Реагент^
Параллельно Последовательно
Параллельно
б
□ Реагент 1 .—.
-------S*[U
РИС. 23.3. Принципиальные схемы дискретных анализаторов: а — одноканальных, б — многока-
нальных
282
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Проба № Детектор №
I I I I I Реагент 1 । —>
Параллельно
Детектор № Проба №
Детектор №
Реагент 1
Проба №
Реагент 2
Реагент 3
Последовательно
б
РИС. 23.4. Принципиальные схемы непрерывных проточных анализаторов: а — одноканальных;
б — многоканальных
лизаторы могут также анализировать отдельные аликвоты одной и той же пробы
(отбирая их из одной и той же чашки) параллельно на содержание нескольких
различных аналитов. В этом случае их называют многоканальными анализа-
торами.
Проточные приборы тоже могут быть одноканальными, предназначенными
для последовательного анализа большой серии проб на содержание одного ком-
понента (рис. 23.4), или многоканальными. В этом случае общий поток пробы
делится в одной или нескольких точках на отдельные потоки для определения
различных компонентов либо производится отбор нескольких аликвот пробы,
движущихся параллельно по различным потокам.
Современные приборы часто оказываются столь сложными, что приобретают
черты автоматизированных устройств вне зависимости от того, действительно
ли они выполняют анализ в автоматическом режиме. Например, они могут по-
зволить контролировать температуру реакционной камеры и, при помощи об-
ратной связи, регулировать ее, поддерживая постоянной (что бывает важным
для проведения ферментативных реакций).
23.4. Проточно-инжекционный анализ
Основы метода
Проточно-инжекционный анализ (ПИА) основан на вводе (инжекции) жидкой
пробы в непрерывный движущийся несегментированный поток жидкости под-
ходящего состава. Инжектированная проба образует зону, которая переносится
к детектору. Смешение пробы с реагентами в движущемся потоке осуществля-
23.4. ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
283
ется главным образом в режиме, контролируемом диффузией; при этом проис-
ходит химическая реакция. Детектор непрерывно регистрирует оптическую
плотность, потенциал электрода или другой физический параметр, который из-
меняется в момент прохождения пробы через проточную ячейку. Сигнал регист-
рируется в форме пика.
ПИА напоминает высокоэффективную жидкостную хроматографию, толь-
ко без колонки. Он осуществляется при низком давлении без разделения компо-
нентов.
На рис. 23.5 в качестве простейшей иллюстрации проточно-инжекционного
метода показана схема спектрофотометрического определения хлоридов в од-
ноканальной системе. Оно основано на высвобождении тиоцианат-ионов из
тиоцианата ртути(П) под действием хлоридов, последующем взаимодействии
тиоцианатов с ионами железа(Ш) и измерении интенсивности возникающей при
этом красной окраски (подробности см. в описании практической работы 37).
Пробы, содержащие хлориды в концентрации от 5 до 75 мкг/мл, инжектировали
(точка S) при помощи дозатора объемом 30 мкл в раствор носителя, который со-
держал смесь реагентов, и прокачивался со скоростью 0,8 мл/мин. На пути к де-
тектору (D) в процессе того, как зона инжектированной пробы размывалась в
потоке носителя-реагента, в смесительной спирали (длина 50 см, внутренний
диаметр 0,5 мм) образовывался тиоцианат железа(Ш). Использование смесите-
льной спирали позволяло уменьшить размывание зоны пробы вследствие возни-
кающих в спирали центробежных сил. Это привело к тому, что регистрируемые
пики получились более узкими. Проточно-инжекционный анализ выполняется
Рис. 23.5
Схема
проточно-инжекционной
системы для
спектрофотометрического
определения хлоридов (а)
и аналоговый вывод
сигнала при определении
хлоридов в диапазоне
от 5 до 75 мкг/мл
при помощи ПИА:
S — точка ввода пробы;
D — детектор; W — слив
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
очень быстро. Оптическую плотность потока носителя непрерывно измеряли
при 480 нм в миниатюрной проточной ячейке (объемом 10 мкл) и регистрирова-
ли (рис. 23.5, б). Чтобы продемонстрировать воспроизводимость аналитического
сигнала, пробу каждого состава инжектировали по четыре раза; таким образом, в
этой серии было выполнено 28 отдельных анализов проб с семью различными
концентрациями хлоридов. Это заняло 14 минут. Средняя производительность в
этом случае составила 120 проб/ч. Результаты быстрого сканирования пиков для
проб с концентрациями 75 и 30 мкг/мл (рис. 23.5, б, справа) подтверждают, что к
моменту поступления следующей пробы (S2) в проточную ячейку от предыду-
щего раствора в ней осталось менее 1%. Таким образом, при вводе проб с интер-
валом в 30 с перегрузки системы не наблюдается.
Важнейшей особенностью ПИА является то, что, поскольку все условия
анализа строго воспроизводимы, размывание (дисперсия) зон также контроли-
руемо и воспроизводимо. Иными словами, все пробы последовательно претер-
певают по мере прохождения через канал системы одни и те же процессы: то,
что происходит с одной пробой, в точности происходит и с любой другой.
Для прокачивания потоков обычно используют перистальтические насосы.
Однако для производственного анализа они мало подходят, поскольку трубки
насосов приходится часто менять. В этом случае либо нужна прочная техника,
например, поршневые насосы, либо подача жидкости должна осуществляться за
счет давления воздуха, нагнетаемого в резервуар. Инжектором может служить
петлевой дозатор того же типа, что применяется в высокоэффективной жидкост-
ной хроматографии. Наличие обходной петли позволяет потоку носителя проте-
кать через систему и в те моменты, когда инжектор находится в положении
«Загрузка». Объем вводимой пробы составляет от 1 до 200 мкл (обычно 25 мкл).
При этом на анализ одной пробы расходуется не более 0,5 мл раствора реагента.
Таким образом, ПИА является простым методом микрохимического анализа,
отличающимся большим числом проб, анализируемых в единицу времени, и ве-
сьма малыми расходами как проб, так и реагентов. Насос, детектор и инжектор
могут управляться компьютером, что позволяет выполнять анализы в автомати-
зированном режиме.
ПИА — универсальный метод анализа растворов, применимый ко множест-
ву задач, — от измерения pH или электропроводности до колориметрии или
ферментного анализа. Правильная разработка схемы проточно-инжекционной
системы определяется теми задачами, которые она призвана решать. При изме-
рении pH или электропроводности, а также в атомно-абсорбционном анализе,
где требуется определить элементный состав исходной пробы, важно лишь, что-
бы по каналам системы и в проточной ячейке перенос пробы осуществлялся без
разбавления с высокой воспроизводимостью. В других случаях, например, при
использовании спектрофотометрии, аналит следует превратить в форму, до-
ступную для измерения при помощи соответствующего детектора. При этом в
ходе движения по каналу системы в зоне пробы должно произойти смешение с
реагентами, а после этого пройти время, достаточное для образования продукта
в количествах, необходимых для детектирования.
23.4. ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
285
РИС. 23.6. Типы потокораспределительных схем в проточно-инжекционном анализе: А — однока-
нальная; В — двухканальная с одной точкой соединения потоков; С — с предварительным вводом
реагента в один из потоков; D — двухканальная с одной точкой соединения и предварительным
вводом реагента; Е — трехканальная с двумя точками соединения потоков
Помимо одноканальной (однопотоковой) системы, представленной на
рис. 23.5, можно использовать и другие разнообразные конфигурации потоков.
С их помощью ПИА можно осуществлять практически для любых химических
систем. Некоторые виды проточных систем изображены на рис. 23.6. Наиболее
распространена двухканальная схема (В), где пробу вводят в поток инертного
носителя, а затем смешивают с реагентом. В этом случае, в отличие от однокана-
льной схемы, раствор реагента все время разбавляется в одно и то же число раз, в
том числе и в момент ввода пробы. В одноканальных системах разбавлением ре-
агента при вводе пробы можно пренебречь только тогда, когда его избыток ве-
лик, а сам реагент не дает значительного фонового сигнала (величина которого
может измениться за счет разбавления). Если два реагента при смешении неу-
стойчивы, их можно смешивать в потоке (схемы С и В) либо добавлять к пробе
по очереди (схема Е). Между точками смешения потоков можно вставлять сме-
сительные спирали для обеспечения перемешивания реагентов.
Коэффициент дисперсии
Степень размывания зоны (дисперсии) или разбавления пробы в проточных сис-
темах характеризуют коэффициентом дисперсии D. Рассмотрим простейший экс-
перимент, посвященный изучению размывания зоны. Пусть раствор пробы,
содержащийся внутри полости дозатора перед инжектированием, является го-
могенным и имеет исходную концентрацию Со. Если зону с таким раствором
пропустить непосредственно через детектор, мы получим прямоугольный сиг-
нал, высота которого будет пропорциональна концентрации раствора пробы
(рис. 23.7). Однако после ввода в систему зона приходит в движение вместе с по-
током носителя и размывается, приобретая форму, зависящую от геометрии ка-
налов и скорости потока. Поэтому кривая отклика будет иметь форму пика, в
пределах которого концентрация непрерывно изменяется. Образуется концент-
286
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Рис. 23.7 . Зона гомогенной пробы (вверху слева) в ходе своего движения через трубчатый реактор
размывается (вверху в центре). При этом ее исходный прямоугольный профиль (внизу слева), ха-
рактеризующийся начальной концентрацией Со, изменяется на профиль с непрерывным концент-
рационным градиентом и максимальной концентрацией Стах, соответствующей вершине пика
рационный градиент, концентрация в любой точке которого отлична от концен-
трации в соседней точке. В то же время полезно бывает упрощенно представить
себе такой градиент в виде отдельных элементарных зон, концентрация в преде-
лах каждой из которых постоянна и равна некоторой величине С. Каждая из таких
элементарных зон может быть использована для регистрации аналитического
сигнала.
Для рациональной разработки проточно-инжекционной системы важно знать,
во-первых, насколько будет разбавлен исходный раствор пробы на пути к детек-
тору и, во-вторых, время между вводом пробы и регистрацией сигнала. С этой
целью вводят понятие коэффициент дисперсии D. Он служит мерой степени
размывания зоны пробы к моменту регистрации сигнала и определяется как от-
ношение концентраций вещества пробы до и после размывания в той элементар-
ной зоне, которая используется для регистрации аналитического сигнала:
D = ^
(23.1)
Если сигнал регистрируется в точке максимума пика, следует рассматри-
вать концентрацию в той (воображаемой) элементарной зоне, которая соответ-
ствует максимуму (Стахнарис. 23.7). Подставляя в выражение (23.1) в качестве
С величину С™ах, а в качестве Со — исходную концентрацию вещества во вво-
димой пробе С05, получаем:
2) max _ 0s
5 max
(23.2)
23.4. ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
287
Зная эту величину, можно оценить требуемые концентрации вещества в пробе
(и реагентов). Обратите внимание, что в соответствии с определением величина
коэффициента дисперсии отражает только физический процесс размывания зоны,
но не происходящие в ходе анализа химические реакции.
Типичные значения коэффициентов дисперсии в случае протекания в систе-
ме химических реакций составляют от 3 до 10. Например, если коэффициент
дисперсии равен 2, это означает, что в потоке носителя произошло разбавление
исходной пробы в соотношении 1:1. Для удобства проточно-инжекционные сис-
темы в зависимости от величины коэффициентов дисперсии классифицируют на
системы с ограниченной дисперсией (D = 1 4- 3), средней дисперсией (D = 3 4-10) и
высокой дисперсией (D > 10) и используют для решения различных аналити-
ческих задач. Системы с ограниченной дисперсией предпочтительнее в случаях,
когда требуется простой перенос пробы к детектору (например, при детектирова-
нии с применением ионселективных электродов или атомной абсорбции). Сред-
нюю дисперсию используют тогда, когда требуется смешение аналита с реагентом
и образование продукта реакции, который детектируют. Применение проточ-
но-инжекционных систем с высокой дисперсией обосновано лишь в тех случаях,
когда необходимо существенное разбавление пробы для того, чтобы ее концент-
рация попала в диапазон, доступный измерению.
Простейший способ измерения коэффициента дисперсии состоит в том, что
строго определенный объем раствора красителя вводят в поток бесцветного но-
сителя и непрерывно контролируют оптическую плотность размытой зоны краси-
теля при помощи колориметра. Величину Z>max находят по высоте пика (например,
величине оптической плотности), а затем сравнивают ее с величиной сигнала
(измеренной от базовой динии) в условиях, когда ячейка детектора заполнена
неразбавленным раствором красителя. При соблюдении закона Бера-Ламберта
отношение соответствующих оптических плотностей равно величине Z>max, ха-
рактеризующей проточно-инжекционную систему в целом (параметры потоко-
распределительной схемы, детектора и способа детектирования).
Образование пика в методе ПИА есть результат двух процессов, протекаю-
щих во времени одновременно: физического процесса размывания зоны и хими-
ческого процесса взаимодействия вещества пробы с реагентами. Для каждого
отдельного инжекционного цикла физические процессы хорошо воспроизводят-
ся. Они не приводят к полному перемешиванию растворов, а вызывает лишь раз-
мывание зоны пробы с градиентом концентрации вдоль потока носителя.
Факторы, влияющие на высоту пика
Степень размывания зоны, а следовательно, и регистрируемая высота пика, за-
висят от множества факторов, включая объем вводимой пробы, скорость потока,
форму, длину и другие геометрические параметры каналов.
1 Объем пробы. Рассмотрим одноканальную проточную систему, для которой
скорость прокачивания Q составляет 1,5 мл/мин, длина трубки L — 20 см, а внут-
ренний диаметр трубки — 0,5 мм. На рис. 23.8, а приведен обобщающий серию
288
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Рис. 23.8. Зависимости кривых отклика (а) и длины трубки L проточной системы (б) от объема
вводимой пробы, а — Высота пика растет с ростом объема пробы, вводимой в проточную систему,
до тех пор, пока не достигается значение сигнала, соответствующее стационарному состоянию.
Все кривые записаны от одной и той же точки 5, соответствующей моменту ввода пробы. Объемы
проб составляют 60,110,200,400 и 800 мкл. Заметьте, что значение D = 1 соответствует стационар-
ному состоянию, а ширина пика возрастает с ростом объема пробы, б — Объем пробы равен
60 мкл, значения L приведены в сантиметрах. Внутренний диаметр трубки равен 0,5 мм. Значение
Q во всех экспериментах составляет 1,5 мл/мин
регистрируемых кривых график, полученный для возрастающих объемов вво-
димого раствора красителя. С ростом объема высота пика возрастает и, в конце
концов, достигает предела, называемого «стационарным состоянием». С этого
момента регистрируемая оптическая плотность соответствует неразбавленному
раствору красителя с концентрацией Со, а величина коэффициента дисперсии
составляет D = 1. Восходящие участки всех кривых совпадают и имеют одну и ту
же форму независимо от объема пробы, а отношение Стах/С0 экспоненциально
зависит от объема пробы. Обозначив объем пробы как 5V, имеем:
= 1 - exp(-kSv) = 1 - ехр(-0,693и) = 1 - 2’" = —(23.3)
С 0 £>тах
Здесь п = Sv/$ у, а 5^/ — объем пробы, соответствующий величине сигнала 50%
от стационарного состояния, т. е. при D = 2. Из этого уравнения видно, что, напри-
мер, при вводе пробы объемом 2Sу концентрация пробы в максимуме составит
75%отС0, а£> = 1,33. Строго говоря, значение D= 1 не может быть достигнутое
точности. Однако при вводе объема, равного 55^/, величина/) равна 1,03, при
23.4. ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
289
вводе 7Sу — 1,008 (т. е. концентрация в максимуме равна 99,2% от Со). На
практике в проточно-инжекционном анализе никогда не работают в условиях
стационарного состояния; объем вводимой пробы не превышает 2S у в случае
ограниченной дисперсии и составляет менее Sy в остальных случаях. Начальная
часть восходящего участка пика вплоть до точки, соответствующей 50% Со
(т. е. D = 2), является почти линейной. Отсюда следует, что в условиях средней
(5V < 5^/) и высокой дисперсии высота пика прямо пропорциональна объему
вводимой пробы.
Показано, что величина Sy зависит от геометрических параметров и объе-
ма проточных каналов.
2. Длина канала и скорость потока. Микрореактор, расположенный между
точкой ввода й детектором, может иметь различную длину, диаметр и форму.
Влияние длины спирали L и внутреннего радиуса трубок R на коэффициент дис-
персии подробно изучено. Снижение диаметра трубки приводит к уменьшению
величины Sy, поскольку для пробы одного и того же объема протяженность ее
зоны (0) при этом возрастает. Таким образом, проба будет все в меньшей мере
смешиваться с окружающим раствором и, следовательно, размываться. Объем
вводимой пробы равен хК20. При уменьшении радиуса трубки R в два раза
длина зоны 0 станет в четыре раза больше, а величина S у^ — в четыре раза меньше.
Поэтому если требуется работа в области ограниченной дисперсии, объем вво-
димой пробы должен составлять, по меньшей мере, Sy, а длина и диаметр трубок
системы, соединяющих инжектор и детектор, должны быть как можно меньше.
Даже если требуется работать в области средней дисперсии, разумно исполь-
зовать узкие трубки из экономических соображений. С уменьшением диаметра
трубок расходы пробы и реагентов существенно уменьшаются, поскольку при
равных значениях линейной скорости потока и скорости прокачивания Q для
трубки с радиусом R они вчетверо меньше, чем для трубки с радиусом 2R. Опти-
мальные значения внутреннего диаметра трубок, соединяющих инжектор и де-
тектор, обычно составляют от 0,5 до 0,8 мм. При применении более узких
каналов возрастает опасность их забивания.
При разработке систем со средней дисперсией, когда требуется, чтобы про-
ба смешалась и прореагировала с компонентами потока носителя, можно снача-
ла попробовать увеличить длину трубки L с тем, чтобы продлить среднее время
пребывания пробы в системе Т. В то же время можно ожидать, что при этом воз-
растет и размывание зоны. Будет наблюдаться уширение пика, что приведет к сни-
жению как чувствительности, так и производительности анализа (см. рис. 23.8, б).
Серия кривых, полученных при возрастании длины трубки, характеризуется
уменьшением высоты пиков. Показано, что в проточно-инжекционных систе-
мах в условиях течения жидкости по узкой открытой трубке размывание зоны
возрастает пропорционально квадратному корню из среднего времени пребыва-
ния пробы в системе Т (или пройденного расстояния L).
Таким образом, хотя ширина зоны возрастает с меньшей скоростью, чем ве-
личина пройденного расстояния, после достижения некоторого предела увели-
290
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
чение времени пребывания пробы в системе Т за счет увеличения длины трубки
L (требуемого для увеличения дисперсии) становится нецелесообразным. Чтобы
пики были узкими, а производительность высокой, величина L должна быть не-
большой. Кроме того, протяженность отдельных участков проточно-инжекци-
онной системы (от инжектора до реакционной спирали, от спирали до детектора,
длина самой спирали) имеет естественные ограничения. Поэтому нужен разум-
ный компромисс. Как правило, для квалифицированно разработанных проточ-
но-инжекционных систем общая длина трубок составляет от 10 до 100 см, а
внутренний диаметр — 0,5 мм. Время пребывания пробы в системе составляет
до 20 с; его легко можно регулировать, изменяя скорость потока. (Коэффициент
дисперсии D пропорционален L2У?2.)
В целом можно сказать, что размывание зоны пробы возрастает пропорцио-
нально квадратному корню из величины пройденного пробой пути и квадрату
радиуса трубки. Обычно оно также несколько возрастает с увеличением скоро-
сти потока. Но при очень низких скоростях потока размывание тоже увеличива-
ется, поскольку в этих условиях начинают преобладать диффузионные явления.
3. Геометрия каналов. Обычно проточный микрореактор имеет не прямую, а
искривленную или спиралевидную форму. Это делается для того, чтобы увели-
чить радиальное перемешивание за счет вторичного потока, возникающего под
действием центробежных сил при протекании раствора по кривой. Радиальное
перемешивание уменьшает степень параболичности зоны в осевом направле-
нии, возникающей при вводе пробы в ламинарный поток носителя. Параболиче-
ский профиль образуется вследствие того, что в ламинарном потоке скорость
течения в центре вдвое выше средней, а вблизи стенок равна нулю. Таким обра-
зом, в условиях вторичного потока улучшается перемешивание реагентов с про-
бой и уменьшается осевое размывание зоны.
Сглаживания ламинарного профиля в радиальном направлении лучше всего
достичь созданием локальной турбулентности при резком изменении направле-
ния потока. При этом те элементарные объемы потока, которые отстают в силу
своей близости к стенкам, перемещаются к быстро движущейся центральной ча-
сти потока и наоборот. Чем чаще повторяется этот процесс, тем более симмет-
ричным получается градиент концентрации в размытой зоне пробы, и форма
пика изменится от асимметричной к симметричной (гауссовой). В результате
пики будут получаться более высокими и узкими. Для этого иногда трубки реак-
тора завязывают в один или несколько близко расположенных узлов.
Пример 23.1
При непрерывном пропускании раствора красителя через проточную спектро-
фотометрическую ячейку величина регистрируемой оптической плотности равна
0,986. Тот же раствор красителя ввели в поток носителя при помощи инжек-
ционной петли объемом 25 мкл. В этом случае величина оптической плотности в
максимуме пика составила 0,326. Чему равны коэффициент дисперсии и величи-
на^?
23.4. ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
291
Решение
шах _ ^0 _ 0,986 _
Атах 0,327
Используя уравнение (23.3), получаем
sv
1
-J—=1-2 л
max
25,0 мкл
Sy. = 42,9 мкл
Пример 23.2
Пусть для условий, приведенных в примере 23.1, объем пробы равен 25,0 мкл,
скорость потока — 1,00 мл/мин, длина спирали реактора — 50,0 см, а внутрен-
ний диаметр трубки — 0,800 мм. Каким будет коэффициент дисперсии, если:
а) объем пробы составит 50,0 мкл; б) длина спирали — 100 см, внутренний диа-
метр трубки — 0,500 мм, а скорость потока — 0,750 мл/мин?
Решение
а) Из уравнения (23.3)
—=i-io~fcS”
max
1 _ _ iq-£(25,0 мкл)
3,01“
1g 0,668 = -к (25,0 мкл)
к = 7,01 • 10-3 мкл-1
Для Sv = 50,0 мкл
1 iq-(7,°110~3 мкл-1)(50,0 мкл)
max
—— = 1-Ю-0’351 =0,554
max
£>max =1,80
292
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
б)
Отсюда
D~UR2 =kL2R2
3,01 = к (50,0 см) (0,0400 см)2
к = 266 см-2’5
Для L = 100 см и R = 0,0250 мм
D = 266 см-2’5 (100 см) (0,0250 см)2
D= 1,66
Измерения в остановленном потоке
Метод ПИА характеризуется очень высокой воспроизводимостью (относитель-
ное стандартное отклонение менее 1%) в результате того, что в непрерывном по-
токе размывание зоны пробы происходит в строго контролируемых условиях.
Этим методом можно проводить и кинетические измерения, если остановить по-
ток в строго определенный момент (под управлением компьютера), когда зона
продукта, образованного аналитом, достигает ячейки детектора. Этот момент
может соответствовать максимуму пика или другой его точке, в зависимости от
концентраций веществ. После этого в течение определенного времени регистри-
руют сигнал (например, оптическую плотность) и находят скорость реакции. Такие
измерения повторяют для различных концентраций и по угловым коэффициентам
полученных кинетических кривых строят градуировочный график, что часто ис-
пользуется в проведении ферментативноого анализа (см. гл. 22 и 24). Достоинст-
ва такого способа кинетических измерений в том, что кинетическая кривая
селективна для аналита, а в величину скорости изменения сигнала не входит сиг-
нал фона (хотя и в этом случае всегда следует проводить контрольный опыт —
для определения точки отсчета измерения сигнала относительно базовой линии
или введения поправок на фоновые ферментативные реакции).
Полное описание множества разновидностей и приложений проточно-ин-
жекционного анализа можно найти в литературе, список которой приведен в
конце главы.
Последовательный инжекционный анализ
Последовательный инжекционный анализ — одноканальный вариант инжекци-
онных методов, выполняемый под управлением компьютера. Он отличается
упрощенной потокораспределительной схемой и более устойчив в условиях ра-
боты без вмешательства оператора. Пропускание потоков осуществляется перио-
дически; при этом расходы реагентов составляют лишь несколько микролитров.
В последовательном инжекционном анализе вместо обычного инжектора для
23.4. ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
293
Носитель Шприцевой
насос
Носитель S Р
( ( | Кран
Последовательность зон
Носитель s
Р R
Детектор
Ввод зон
РИС. 23.9. Схема потокораспределительной системы в последовательном инжекционном анализе.
Символами S, Р и R обозначены проба, продукт и реагент соответственно
ввода пробы используют многоходовой кран-переключатель (рис. 23.9). Общий
вход крана (в центре) может быть подключен к любому другому входу посредст-
вом вращения барабана при помощи электрических сигналов. Он соединен с
возвратно-поступательным насосом шприцевого типа, который имеет два поло-
жения. В одном положении насос засасывает раствор носителя, в другом — по-
дает его к крану. Между насосом и краном расположена удерживающая спираль,
предохраняющая насос от попадания в него посторонних растворов. Различные
входы крана соединены с емкостями, содержащими растворы пробы, реагенты и
стандартные растворы, емкостью для слива, а также детектором. В начале рабо-
ты насос заполняется раствором носителя. Затем кран подключают к детектору,
и насос прокачивает носитель через систему до тех пор, пока он не достигнет ем-
кости для слива. После этого кран подключают к раствору пробы, несколько мик-
ролитров которого засасывают в систему при помощи насоса, включенного в
обратном направлении (перед началом анализа трубки для растворов пробы и
реагентов предварительно заполняют при помощи насоса, засасывая их в удер-
живающую спираль, а избыток этих растворов удаляют через вспомогательный
выход для слива). При переключении крана насос останавливают во избежание
перепадов давления. После ввода пробы сразу же засасывают раствор реагента.
Таким образом, растворы пробы и реагента последовательно вводятся в удержи-
вающую спираль, откуда и происходит название метода. Наконец, кран подклю-
чают ко входу детектора, поршень насоса снова меняет направление движения,
и введенные растворы прокачиваются через реакционную спираль до проточной
ячейки детектора. В результате диффузии и вторичных потоков растворы пере-
294
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
мешиваются и взаимодействуют с образованием продукта, который детектиру-
ют. При этом возникает сигнал в форме пика — такой же, как в обычном ПИА.
Для последовательного инжекционного анализа требуются только один на-
сос и кран. Весь процесс управляется компьютером, поскольку необходим точный
контроль времени. Серийные аналитические системы снабжены программным
обеспечением, позволяющим задавать последовательности операций и времена
работы насоса. При этом автоматически вычисляются площади пиков, строятся
градуировочные кривые, рассчитываются концентрации и проводится статисти-
ческая обработка результатов. Для выполнения серии различных анализов мож-
но применять различные реагенты. Чтобы заменить реагент, достаточно просто
подать с клавиатуры команду на засасывание раствора из другой емкости через
другой вход крана (а не перестраивать всю потокораспределительную схему,
как в ПИА). Можно использовать и два реагента, помещая небольшой объем
пробы между зонами двух реагентов наподобие сэндвича; к моменту достиже-
ния детектора все три зоны перекроются.
Важнейшим параметром последовательного инжекционного анализа явля-
ется степень взаимного проникновения, или перекрывания, соседних зон. Поми-
мо обычных параметров — таких, как длина и диаметр трубок, форма
реакционной спирали и им подобных характеристик — она зависит также от со-
отношения объемов. Наряду с дисперсией, степень проникновения определяет
относительную величину регистрируемого сигнала. Проникновение зон можно
охарактеризовать величиной
(23.4)
где vv0 — ширина участка перекрывания зон, измеренная на уровне базовой ли-
нии, a ws и wR — ширина зоны пробы и реагента соответственно (измеренные
также на уровне базовой линии; см. рис. 23.10). Если + wR = 2w0, зоны пере-
крываются полностью (это бывает редко). Как правило, величина р находится
Рис. 23.10
Проникновение зон в последовательном
инжекционном анализе
[Т. Gubeli, G. D. Christian, J. Ruzicka,
Anal. Chem., 63 (1991) 2407. © American
Chemical Society, 1991].
Перепечатано с разрешения
23.5. МИКРОПРОЦЕССОРЫ И КОМПЬЮТЕРЫ В ХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ
295
между 0 и 1, что соответствует частичному перекрыванию. Точка ID на рис. 23.10
называется изодисперсионной. Задача состоит в том, чтобы достичь перекрыва-
ния, достаточного для того, чтобы коэффициент дисперсии был равным, по ме-
ньшей мере, 2 (реагент берется в избытке). Обратите внимание, что на рис. 23.10
зона реагента выходит первой (при меньшем времени), хотя она была инжекти-
рована во вторую очередь (и поэтому находится ближе к крану). Зона пробы
проходит большее расстояние до детектора, в результате чего дисперсия возрас-
тает. Если необходимо уменьшить дисперсию пробы, это можно сделать, вводя
компоненты в обратном порядке. Более подробно об этом можно узнать из статьи
[ 11], а также обратившись к сайту http:// www.flowinjection.com для ознакомления
с образцами серийных проточных и последовательных инжекционных систем.
23.5. Микропроцессоры и компьютеры в химическом анализе
В зависимости от задач и располагаемых средств вы можете приобретать анали-
тические приборы различной степени сложности. На сегодняшний день почти
все из них выпускаются с современными цифровыми электронными устройства-
ми, облегчающими работу, сбор и обработку информации. Многие приборы
сопряжены с персональными компьютерами, а для управления и обработки
данных используется высокопроизводительное программное обеспечение. Не-
которые программы могут быть специфичными для данного прибора, другие же,
особенно предназначенные для сбора и обработки информации, — более уни-
версальными коммерческими продуктами. Прибор может иметь и встроенный
специализированный компьютер с использованием методов искусственного ин-
теллекта.
Компьютер представляет собой микропроцессор и периферийные устрой-
ства, собранные из электронных микросхем. Микропроцессоры предназначены
для управления работой приборов (например, установки длины волны или ско-
рости сканирования). С их помощью можно также собирать и обрабатывать дан-
ные. Многие приборы имеют встроенные программы, написанные на машинных
языках, другие же программы могут быть модифицированы оператором для вы-
полнения тех или иных специфических функций. Разработка и конструирование
микропроцессора могут стоить десятки и даже сотни тысяч долларов, но создан-
ные в результате этого электронные устройства-микрочипы могут производить-
ся в массовых количествах с небольшими затратами. В качестве примера можно
привести распространенные электронные часы, которые стоят очень дешево, об-
ладают набором встроенных функций (например, отображение даты) и в то же
время могут быть дополнительно запрограммированы пользователем (напри-
мер, на определенное время подачи сигнала будильника) или использованы для
производства вычислений.
Обмен информацией между аналитиком и прибором осуществляется по-
средством клавиатуры, воспринимающей подаваемые команды (например, по-
вторное сканирование спектра производится по нажатию специальной клавиши)
и вводимую числовую информацию (например, число повторных сканирова-
296
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
ний). Помимо графического представления данных (например, спектра), прибор
обычно позволяет представлять их и в числовом виде, а также выводить на печать.
Приборы, управляемые микропроцессорами, могут выполнять и другие раз-
нообразные функции в зависимости от типа прибора и его возможностей. На-
пример, спектроскопические приборы могут осуществлять автоматическую
коррекцию фона, получение производных спектров различных порядков, интегри-
рование или усреднение сигнала в заданном диапазоне для улучшения отношения
сигнал/шум, статистическую обработку данных (например, расчет стандартного
отклонения). К числу стандартных операций относится и построение градуиро-
вочных графиков в любых выбранных единицах. Если градуировочная зависи-
мость оказалась нелинейной, микропроцессор может сам установить алгоритм
ее обработки и ввести поправку на нелинейность (это бывает особенно важно
для атомно-абсорбционных приборов). Для автоматического введения поправок на
дрейф градуировочной зависимости может быть использовано периодическое
повторное измерение сигналов одного или нескольких стандартов. Параметры
градуировочных зависимостей можно рассчитывать методом наименьших квад-
ратов.
Приборы, предназначенные для ферментативного анализа и других видов
кинетических методов анализа, должны позволять измерять сигнал (например,
оптическую плотность) непрерывно в течение некоторого интервала времени
и рассчитывать скорость реакции. Таким путем можно определять активность
фермента или концентрацию субстрата (при условии соответствующей градуи-
ровки).
Приборы могут быть оснащены средством автоматизации — закрытой пет-
лей управления с обратной связью. Это позволяет, например, поддерживать
постоянной температуру в реакционной камере для кинетических измерений.
Автоматический титратор может «почувствовать» приближение конечной точ-
ки и для повышения точности определения ее положения уменьшить скорость
подачи титранта, — точно так же, как это делает человек, но, как правило, более
воспроизводимо. Наконец, прибор может осуществлять самопроверку своих
различных функций и в случае их нарушения прекращать работу.
Что мы узнали из этой главы?
• Управление и контроль производственных процессов: непрерывные и диск-
ретные анализаторы — стр. 276
• Автоматические приборы — стр. 280
• Проточно-инжекционный анализ — стр. 282
• Коэффициент дисперсии [основное уравнение (23.1)] — стр. 285
• Объем пробы Sу [основное уравнение (23.3)] — стр. 287
• Последовательный инжекционный анализ — стр. 292
• Микропроцессоры и компьютеры в химическом анализе — стр. 295
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
297
Вопросы
1. В чем заключается различие между автоматическими и автоматизирован-
ными приборами?
2- В чем заключается различие между дискретными и непрерывными автома-
тизированными приборами?
3- В чем заключается различие между автоматическими приборами с диск-
ретным и непрерывным пробоотбором?
4. Что такое петля обратной связи?
5. Опишите основы проточно-инжекционного анализа.
6. Опишите основы последовательного инжекционного анализа. В чем его от-
личие от обычного проточно-инжекционного анализа?
7. Кратко сформулируйте основные области применения компьютеров в ана-
литической лаборатории.
8- Перечислите основные функции микропроцессора.
Задачи
Проточно-инжекционный анализ
9- Для проточно-инжекционной системы коэффициент дисперсии составляет
4,00. Чему он будет равен при увеличении вдвое:
а) объема вводимой пробы;
б) внутреннего диаметра трубки;
в) длины трубки?
Результат задачи (а) сравните с результатом, полученным в примере 23.2.
10. Рассчитайте величину объема пробы Sy для проточно-инжекционной
системы, в которой при объеме пробы, равной 50,0 мкл, коэффициент дис-
персии равен 4,00.
Рекомендуемая литература
Общая
1. G. D. Christian, J. Е. O’Reilley, eds., Instrumental Analysis, 2nd ed. Boston: Al-
lyn and Bacon, 1986. Chapter 25, «Automation in Analytical Chemistry», by
K. S. Fletcher and N. C. Alpert. Превосходное детализированное и в то же
время краткое описание автоматических и автоматизированных приборов
различных типов и выполняемых ими операций.
298
ГЛАВА 23. АВТОМАТИЗАЦИЯ ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Проточно-инжекционный анализ
2. J. Ruzicka and Е. Н. Hansen, Flow Injection Analysis. 2nd ed. New York: Wiley,
1988.
3. M. Valcarcel and M. D. Luque de Castro, Flow Injection Analysis. Principles and
Applications. Chichester: Ellis Horwood, 1987.
4. Z. Fang, Flow Injection Separation and Preconcentration. Weinheim: VCH,
1993.
5- Z. Fang, Flow Injection Atomic Absorption Spectrometry. New York: Wiley,
1995.
6- J. L. Burguera, ed., Flow Injection Atomic Spectroscopy. New York: Marcel
Dekker, 1989.
7. M. M. Calatayud, Flow Injection Analysis of Pharmaceuticals: Automation in
the Laboratory. London: Taylor and Francis, 1997.
Последовательный инжекционный анализ
8. M. Troj anowicz, Flow Injection Analysis: Instrumentation and Applications. Ri-
ver Edge, NJ: World Scientific, 2000. Единственная книга, посвященная по-
следовательному инжекционному анализу.
9- G. D. Christian, «Sequential Injection Analysis for Electrochemical Measure-
ments and Process Analysis», Analyst. 119 (1994) 2309.
10- R. J. Baxter and G. D. Christian, «Sequential Injection Analysis: A Versatile Tech-
nique for Bioprocess Monitoring», Accounts Chem. Res.. 29 (1996) 515.
11. T. Giibeli, G. D. Christian, and J. Ruzicka, «Fundamentals of Sinusoidal Flow
Sequential Injection Spectrophotometry», Anal. Chem.. 63 (1991) 2407.
Базы данных в Интернете
12. Hansen’s FI Bibliography, www.flowinjection.com/search.html — более 8000
ссылок по проточно-инжекционному анализу.
13. Chalk's Flow Analysis Database, www.fia.unf.edu/fad.lasso — более 11000
ссылок по проточным методам.
Производственный анализ
14. G. D. Christian and Е. D. Yalvac, «Process Analytical Chemistry», in R. Kellner,
J.-M. Mermot, M. Otto, and H. M. Widner, eds. Analytical Chemistry. Weinhe-
im: Wiley-VCH, 1998.
15. J. B. Callis, D. L. Ulman, and B. R. Kowalski, «Process Analytical Chemistry»,
Anal. Chem.. 59 (1987) 624A.
16. M. T. Riebe and D. J. Eustace, «Process Analytical Chemistry. An Industrial Per-
spective», Anal. Chem.. 62 (1990) 65A.
Глава 24
КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
В предыдущих главах были рассмотрены методический и инструментальный
аппараты, общие для всех видов анализа. В данной главе, а также в двух после-
дующих главах нам предстоит разобраться с практическими аспектами анализа
некоторых конкретных типов объектов. Знания, полученные из предыдущих глав,
помогут в изучении специфических типов анализа и решении конкретных анали-
тических задач.
В настоящей главе мы остановимся на практических аспектах клинического
анализа. Будут рассмотрены имеющие особое значение в клинической химии
компоненты крови и мочи, в том числе важнейшие электролиты, белки и органи-
ческие вещества, а также перечислены некоторые аналитические параметры,
которые широко используются для проведения клинических анализов, в част-
ности, нормальный диапазон концентраций компонентов физиологических
жидкостей и условия, при которых их значения могут выпадать из этого диапа-
зона. Кроме того, мы ознакомимся с высокочувствительным методом иммуно-
анализа.
Во многих клинических методах анализа широко используется спектрофо-
тометрия. При определении физического состояния человека проводят анализ
крови, который выявляет такие общие показатели, как содержание глюкозы, хо-
лестерина, липидов, а также азота мочевины. Сложные анализы обычно осущест-
вляют с помощью автоматизированных приборов, действие которых основано
на спектрофотометрической детекции. Для разных методов анализа применяют
различные химические подходы, в частности, ферментативный или иммунохими-
ческий. Такие электролиты, как натрий или калий, можно определять с помощью
автоматизированных систем с ионселективными электродами (ИСЭ). Осущест-
вление большинства более специфических анализов требует предварительного
разделения компонентов, например, с помощью газовой или жидкостной хрома-
тографии. Обнаружить наркотические средства в организме можно с помощью
иммунологических методов, подкрепив их хроматографическими данными (на-
пример, с помощью ГХ-МС). Следующие разделы данной главы посвящены от-
бору и подготовке проб и, кроме того, различным подходам к определению
некоторых часто определяемых веществ.
300
ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
24.1. Состав крови
Цельную кровь можно разделить на отдельные компоненты: плазму, состоя-
щую из сыворотки и фибриногена, а также клеточные элементы — эритроци-
ты, лейкоциты и тромбоциты (см. гл. 1). Плазма представляет собой жидкую
фракцию циркулирующей крови; центрифугированием цельной крови от плаз-
мы отделяют клетки. При свертывании крови вместе с клетками удаляется
фибриноген и остается сыворотка. Для большей части клинических анализов
используют цельную кровь, плазму или сыворотку, причем чаще всего проводят
именно анализ сыворотки. Кроме того, часто анализируют мочу.
В табл. 24.1 приводится нормальный диапазон концентраций некоторых
компонентов крови человека, имеющих важное значение в клинических иссле-
дований. Необходимо подчеркнуть, что представленный диапазон является усред-
ненным. Содержание в крови основных электролитов (катионов и анионов)
отражено в табл. 5.3. Ниже мы обратимся к анализу некоторых наиболее часто
определяемых компонентов крови и обсудим физиологическую значимость этих
показателей.
24.2. Отбор и хранение проб
Образцы крови и мочи часто отбирают после того, как пациент воздерживался
от приема пищи на протяжении определенного времени (например, в течение
ночи); это особенно важно при определении уровня холестерина и глюкозы.
В одном исследовании было показано, что обычный завтрак не влияет на содер-
жание в крови СО2, хлоридов, натрия, калия, кальция, азота мочевины, мочевой
кислоты, креатинина, общего белка и альбумина. Количество фосфора в сыво-
ротке несколько снижается через 45 мин после приема пищи, а спустя 2 ч возвра-
щается на обычный уровень.
ВНИМАНИЕ: Отбор проб и манипуляции с кровью и другими биологиче-
скими образцами требуют особых мер предосторожности, так как через них
можно заразиться такими опасными заболеваниями, как ВИЧ (СПИД). При ра-
боте необходимо использовать резиновые перчатки, а иногда и маски. Для вы-
полнения практических работ, предложенных вам в конце книги, вам не нужно
будет брать кровь или использовать другие биологические образцы, полученные
от других людей — вы будете работать с коммерческими или синтетическими
препаратами, не представляющими опасности (например, с сухой сывороткой).
Лишь в одном эксперименте, в котором проводится анализ мочи, вы можете ис-
пользовать свою собственную мочу, но можете также исследовать мочу животно-
го или синтетический препарат. Сыворотки крови животных, например, лошади
или быка, являются коммерческими препаратами (www.sigma-aldrich.com).
Если для анализа необходима сыворотка крови, то кровь отбирают в чистые
сухие пробирки, чтобы предотвратить загрязнение и гемолиз. Гемолиз — это
разрушение красных клеток крови (эритроцитов), сопровождающееся выходом
гемоглобина и других компонентов клетки в плазму или сыворотку. При гемолизе
24.2. ОТБОР И ХРАНЕНИЕ ПРОБ
301
Таблица 24.1
Основной химический состав крови а
Компонент Образец 6 Нормальный диапазон концентрации
Азот аминокислот К 4-6 мг/дл
Азот мочевины (BUN) К до 20 мг/дл
Азот небелковый (NPN) К 25-40 мг/дл
Альбумин с 4-5 г/дл
Амилаза с до 150 мг/дл
Аммиак к 40-125 мкг/дл
Белок общий сывороточный с 6,5-8 г/дл
Билирубин, свободный с до 0,4 мг/дл
общий с до 1,0 мг/дл
Глобулины общие с 2,5-3,5 г/дл
альфа-1 0,1-0,4 г/дл
альфа-2 0,3-0,7 г/дл
бета 0,4-0,9 г/дл
гамма 0,6-1,3 г/дл
Железо сывороточное с 50-180 мкг/дл
Жирные кислоты с 200-400 мг/дл
Иод белковосвязанный (БСИ) с 3,5-8 мкг/дл
Калий с 3,8-5,6 моль экв./л
Кальций с 4,5-5,5 моль экв./л
Клиренс креатинина с 100-180 мл/мин
Креатинин с 0,7-1,7 мг/дл
Липаза с до 1,5 единиц
Липиды общие с 350-800 мг/дл
Магний с 1,5-2,5 моль экв./л
Мочевая кислота с 3-6 мг/дл
Натрий с 138-146 моль экв./л
Сахар (глюкоза) к 65-90 мг/дл
Трансаминаза (СГОТ) с до 40 единиц
Углекислый газ (СО2) с 25-32 моль экв./л
Фосфатаза кислая с до 4 единиц Гутмана
Фосфатаза щелочная с до 4 единиц Боданского
Фосфолипиды с 100-250 мг/дл
(как фосфор) 4-10 мг/дл
Фосфор неорганический с 3-4,5 мг/дл
Хлориды в сыворотке с 100-108 моль экв./л
Холестерин общий с 140-250 мг/длв
Холестерина эфиры с 50-60% от общего холестерина
a Взято из [J. S. Annino, Clinical Chemistry, 3rd ed. Boston: Little, Brown and Company, 1960].
6 C — сыворотка, К — кровь.
в Изменяется с возрастом.
ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
сыворотка приобретает красноватый цвет, в то время как в норме она имеет цвет
соломы. Концентрация некоторых веществ в клеточных элементах крови может
быть гораздо выше, чем в сыворотке или плазме. Так как при определении кон-
центрации веществ в сыворотке или плазме в результате гемолиза может быть
получено завышенное значение (это касается таких компонентов, как калий, же-
лезо, магний, цинк, мочевина, белок (из-за гемоглобина) и т. д.), то для отделения
сыворотки или плазмы от клеточных элементов необходимо проводить центрифу-
гирование сразу после взятия крови.
Если для проведения анализа требуется плазма или цельная кровь, то кровь
собирают в пробирки с антикоагулянтом. Часто для этой цели используют ге-
парин (натриевую соль). Однако действие гепарина ограничено во времени, а
кроме того, он достаточно дорог. Поэтому чаще в качестве антикоагулянта при-
меняют оксалат калия (около 1 мг на 1 мл крови). Это соединение связывает
кальций, который способствует свертыванию крови; понятно, что полученную
таким способом плазму нельзя анализировать на содержание калия и кальция.
Оксалат связывает и многие другие металлы, поэтому их содержание определя-
ют в сыворотке. Обычно для приготовления образцов цельной крови или плазмы
необходимое количество раствора оксалата помещают в пробирки, а затем высу-
шивают в печи при 110 °C; это позволяет избежать разбавления образца крови.
Например, для препарата крови объемом 10 мл необходимо взять (и высушить)
0,5 мл 2%-го раствора оксалата калия. Под действием оксалата калия эритроци-
ты сжимаются, так что внутриклеточная вода переходит в плазму, поэтому плаз-
му необходимо отделить от клеток как можно быстрее.
Если образец необходимо хранить в анаэробных условиях, как при опреде-
лении содержания СО2, в пробирку для отбора пробы добавляют минеральное
масло, которое легче крови и распределяется на поверхности образца. Пробирки
с такими образцами закрывают корковыми пробками, поскольку резиновые
пробки в минеральном масле разбухают.
Иногда к образцам вместе с антикоагулянтом добавляют консервант. Если
необходимо определить содержание глюкозы, то в качестве консерванта часто
используют фторид натрия. Это вещество является ингибитором активности
ферментов, вызывающих разложение глюкозы (гликолиз). На 1 мл крови доста-
точно добавить 1 мг фторида натрия. Поскольку фторид натрия ингибирует и
другие ферменты, в том числе уреазу, его не следует добавлять к тем образцам, в
которых предстоит определять активность ферментов или содержание мочеви-
ны с помощью уреазы.
Обычно образцы можно хранить в охлажденном виде один или два дня. Ох-
лаждение замедляет ферментативные и микробные процессы, но не останавливает
их, поэтому лучше анализировать пробы как можно быстрее после их отбора. Перед
проведением анализа образцы необходимо довести до комнатной температуры. За-
морозка позволяет сохранять образцы длительное время, поскольку останавливает
ферментативную активность в крови. Цельную кровь не следует замораживать, по-
скольку при этом разрушаются эритроциты. При заморозке образцы сыворотки и
плазмы расслаиваются, образуя участки с разным содержанием компонентов, так
что после размораживания их необходимо осторожно перемешать.
24.3. НЕКОТОРЫЕ РАСПРОСТРАНЕННЫЕ МЕТОДИКИ
303
Образец является более устойчивым, если приготавливается безбелковый
фильтрат (ББФ). Его используют для предотвращения влияния белков на резуль-
таты анализа. В соответствии с методом Фолина-Ву или методом с применением
вольфрамовой кислоты один объем крови, сыворотки или плазмы смешивают с
семью объемами воды и одним объемом 0,33 М серной кислоты и оставляют до
появления коричневой окраски. Затем добавляют один объем 1%-го (масса: объем)
раствора вольфрамата натрия Na2WO4 • 2Н2О, а спустя 2 мин смесь фильтруют
или центрифугируют, отделяя выпавший в осадок белок. В методе с применени-
ем трихлоруксусной кислоты (ТХУК) один объем крови, сыворотки или плазмы
смешивают с девятью объемами 5%-го раствора ТХУК (масса : объем), а после
осаждения белков смесь фильтруют или центрифугируют. В обоих случаях по-
лучается кислый фильтрат, но он пригоден для определения многих веществ.
Если полученные данными методами фильтраты использовать для опреде-
ления глюкозы путем ее окисления (например, с помощью тартрата меди, см.
ниже), то результаты могут быть завышены. Этой проблемы можно избежать,
если приготовить безбелковый фильтрат с помощью гидроксида бария и сульфа-
та цинка, поскольку из него будет удалено большинство мешающих восстано-
вителей (см. практическую работу 35). В данном случае безбелковый фильтрат
является практически нейтральным, поскольку образующийся Zn(OH)2 выпада-
ет в осадок:
Ва(ОН)2 + ZnSO4 -> BaSO4 + Zn(OH)2
В безбелковом фильтрате глюкоза не разлагается, поскольку гликолитические
ферменты из него удалены.
24.3. Некоторые распространенные методики
в клиническом анализе
Наиболее часто определяемые вещества в практике клинического анализа с ука-
занием методик их определения приведены в табл. 24.2. Однако следует иметь в
виду, что во многих случаях существует несколько вариантов определений, и
выбор конкретной методики определяется степенью применимости, скоростью,
чувствительностью, точностью и другими факторами.
Основные электролиты сыворотки — натрий, калий, кальций, магний,
хлориды и бикарбонат (СО2) — определить довольно легко. Металлы проще
всего определить методами пламенной спектрометрии или атомной абсорбции,
а для определения кальция и магния существуют еще и фотометрические мето-
ды. Кальций и, реже, магний, кроме того, титруют раствором ЭДТА. Для рутинно-
го определения натрия, калия и кальция применяют ионселективные электроды.
Бикарбонат определяют как манометрическим методом, так и путем обратного
титрования стандартным раствором кислоты (см. практическую работу 8). Хло-
риды часто определяют с помощью автоматического кулонометрического тит-
рования с электрогенерацией ионов серебра.
304
ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Пожалуй, наиболее часто в клинической практике определяют уровень
глюкозы и азота мочевины (BUN) в крови. В соответствии с методикой прове-
дения анализа на содержание глюкозы, приведенной в табл. 24.2, определяют
сумму всех восстанавливающих сахаров, поэтому результаты могут быть завы-
шены. Однако эти методы используются в качестве стандартных на протяжении
уже многих лет. Существует также ферментативный метод определения глюко-
зы (см. гл. 22), для проведения которого широко применяются специальные ана-
лизаторы.
Таблица 24.2 (начало)
Некоторые методы клинического анализа
Определяемое вещество Анализируемый образец0 Методика измерения Основы
Азот мочевины (BUN) К Спектрофотометрия (фермент.) ББФ (с вольфрамовой кислотой) инкубируют с уриазой при pH 6,8; образующийся NH3 определяют с реактивом Несслера
Азот небелковый (NPN) К Спектрофотометрия ББФ гидролизуют до образования NH4HSO4, добавляют иодид ртути (реактив Несслера) для связывания аммиака и измеряют поглощение при 480 нм
Барбитураты с У Ф-спектрофотометрия Барбитураты экстрагируют СНС13, затем раствором NaOH; измеряют поглощение в щелочной среде при 252 нм
Белок общий с Спектрофотометрия Тартрат меди образует комплекс с белками (биуретовая реакция); поглощение измеряют через 30 мин при 550 нм
Железо с Спектрофотометрия Железо в ББФ восстанавливают до Fe(II) и добавляют батофенантролин; поглощение измеряют при 535 нм
Иод белково- связанный (БСИ) с Спектрофотометрия (катал ит.) Белки осаждают ТХУК, озоляют или гидролизуют; через 20 мин измеряют каталитическое действие иона I- на скорость превращений Ce(IV)-As(III) по поглощению Ce(IV) при 420 нм
Калий с Пламенная фотометрия; электрод Разбавляют (1 : 50) 0,15 М NaCl и измеряют поглощение при 766 нм; К+ ИСЭ
Кальций с Атомно-абсорбционная спектроскопия Разбавляют (1 : 20) №2ЭДТА (10 000 ppm) и измеряют поглощение при 422,7 нм
24.3. НЕКОТОРЫЕ РАСПРОСТРАНЕННЫЕ МЕТОДИКИ
305
Таблица 24.2 (окончание)
Некоторые методы клинического анализа
Определяемое вещество Анализируемый образеца Методика измерения Основы
Креатинин С Спектрофотометрия ББФ (ТХУК) реагирует с щелочным пикратом; поглощение измеряют при 490 нм
Магний С Атомно-абсорбционная спектроскопия Разбавляют (1 : 20) 1% Иа2ЭДТА и измеряют поглощение при 285,2 нм
Мочевая кислота С Спектрофотометрия ББФ (с вольфрамовой кислотой); окисляют щелочным раствором фосфовольфрамата и измеряют поглощение синего продукта при 680 нм
Натрий с Пламенная фотометрия; электрод Разбавляют (1 : 50) и измеряют поглощение при 589 нм; Na+ ИСЭ
Салицилат с Спектрофотометрия Образует комплекс с нитратом железа(Ш) в кислой среде; поглощение измеряют при 535 нм
Сахар (глюкоза) К или С Спектрофотометрия БФФ (Ba(OH)2-ZnSO4); в реакции с Cu(II) образуется Си2О, который восстанавливает фосфомолибденовую кислоту с образованием молибденовой сини, определяемой при 420 нм; после проведения реакции сахаров с о-толуидином измеряют поглощение при 635 нм
Углекислый газ С Манометрия; электрод Метод Ван Слайка; электрод на СО2
Фосфатаза кислая С Спектрофотометрия Инкубируют 1 ч с глицеро- фосфатом натрия при pH 4,9; образующийся фосфат определяют, как и в случае неорганического фосфора
Фосфатаза щелочная с Спектрофотометрия Как и в случае кислой фосфатазы, но инкубируют при pH 9,6
Фосфор неорганический с Спектрофотометрия БФФ (ТХУК); при взаимодействии с Mo(IV) образуется фосфомолибденовая кислота, которую далее восстанавливают до молибденовой сини и измеряют поглощение при 660 нм
Хлориды с Волюметрия; кулонометрия Титруют с Ag+ или Hg(II)
С — сыворотка; К — кровь.
ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Более селективное определение мочевой кислоты осуществляют с помощью
ферментативной методики, отличной от указанной в табл. 24.2. В аликвоте образ-
ца мочевую кислоту разлагают с помощью фермента уриказы и измеряют погло-
щение синего продукта восстановления фосфовольфрамата. Вторая аликвота
служит в качестве раствора контрольного опыта. Кроме того, мочевую кислоту
можно определить непосредственно по поглощению в ультрафиолетовой облас-
ти при 290 нм до и после инкубации с уриказой.
Альбумин и глобулины после фракционирования высаливанием с помо-
щью сульфата или сульфита натрия можно определить тем же методом, который
используют для определения общего содержания белка. Иногда требуется более
подробная информация о содержании отдельных белковых фракций (а-, 0- и
у-глобулинов). В таком случае для их разделения может подойти электрофорез в
крахмальном геле. Для получения высокоточных результатов белки определяют
микрометодом Кьельдаля; погрешность биуретовой реакции, которая использу-
ется в клиническом анализе для определения общего содержания белка, состав-
ляет около 4%.
Кислая и щелочная фосфатазы — это ферменты, содержащиеся в крови и
проявляющие активность соответственно в кислой и щелочной среде. В качест-
ве субстрата для их определения применяют глицерофосфат. При соответствую-
щем значении pH данные ферменты гидролизуют субстрат с высвобождением
фосфата. Можно использовать и другие субстраты с фосфатными группами.
Барбитураты — это лекарственные вещества, которых в норме в крови
быть не должно. В неионизированной форме их экстрагируют из крови метилен-
хлоридом. Затем, уже в ионизированной форме, их можно реэкстрагировать
0,45 М раствором NaOH. Ионизированная форма (в отличие от неионизирован-
ной) способна поглощать свет в ультрафиолетовой области. Спектр поглощения
подтверждает наличие барбитуратов на качественном уровне. Ионизированная
форма при pH 13-14 имеет максимум поглощения между 252 и 255 нм и мини-
мум — между 234 и 237 нм; при pH 9,8-10,5 существует еще одна ионизирован-
ная форма с максимумом поглощения при 240 нм.
Некоторые из перечисленных выше тестов осуществляют и при анализе об-
разцов мочи, причем часто применяют те же самые методы. Поскольку в моче
определяемые компоненты присутствуют в других концентрациях, а также в
связи с наличием мешающих веществ, методики проведения анализа некоторым
образом модифицируют. Обычно для анализа используют мочу, собранную па-
циентом за 24 ч, поскольку общее количество выделяемых за сутки веществ го-
раздо важнее их концентрации в отдельной пробе. На рис. 24.1 проведено
сравнение состава мочи и сыворотки крови.
При необходимости получения быстрых результатов, имеет смысл выпол-
нять так называемый анализ по месту лечения. Например, при сердечном при-
ступе длительность периода от появления симптомов до начала лечения играет
решающую роль в минимизации нарушений сердечной деятельности, и работа
службы скорой помощи непосредственно зависит от результатов анализа кро-
ви, подтверждающих наличие сердечного приступа. В данном случае транс-
портировка образцов крови в лабораторию для получения результатов крайне
24.3. НЕКОТОРЫЕ РАСПРОСТРАНЕННЫЕ МЕТОДИКИ
307
Моча Плазма
моль экв./л
8001-------------
750
Не
определено
700
650
600
550
Мочевина
500
450
400
350
300
250-
200-
150-
100-
50-
200
175
150
125
100
75
50
25
Са
Мд
Н2СО
Белок
Глюкоза
Другой азот
Мочевина
SO4
Орг. кисл.
НСО.
Мд
Са
Креатинин
Н2СО3
Орг.
кисл.
Н2РО4
SO4’
Плазма крови
pH 7,4
Моча
pH 5,4
РИС. 24.1. Сравнение состава мочи и плазмы крови. Концентрация веществ, не являющихся элек-
тролитами, выражена в миллимолях по шкале, построенной в моль экв./л. Значения на шкале отно-
сятся ко всем компонентам (их сумме) [J. A. Gamble, Chemical Anatomy, Physiology, and Pathology of
Extracellular Fluid. Cambridge, MA: Harvard University Press, 1950]. Воспроизведено с разрешения
издательства
308
ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
неэффективна. Служба скорой помощи должна быть снабжена прикроватными
ферментативными анализаторами, тестирование с помощью которых требует
минимальных манипуляций: поместить образец крови, нажать кнопку и полу-
чить результат не позднее, чем через минуту.
Одним из наиболее хорошо зарекомендовавших себя биосенсорных анали-
заторов является персональный анализатор глюкозы в крови, которым пользуют-
ся больные диабетом. Пациент просто прокалывает палец стерильным ланцетом и
помещает маленькую капельку крови на тестовую полоску; глюкозооксидаза на
полоске катализирует окисление глюкозы, сопровождающееся выделением пе-
роксида водорода, концентрацию которого можно измерить электрохимиче-
ским или фотометрическим методом. Дополнительную информацию вы можете
получить на сайтах http://abbott.com/diabetes.html и www.diabeticsupply.com.
24.4. Иммуноанализ
Иммунологические методы, отличающиеся очень высокой селективностью, ис-
пользуются для определения гормонов, лекарств, витаминов и других веществ,
присутствующих в количестве нескольких нанограммов и меньше. Данные ме-
тоды основаны на взаимодействии антигенов и специфических антител, приводя-
щем к образованию комплекса или осадка. Первым аналитическим применением
иммуноанализа был радиоиммуноанализ (РИА), с помощью которого Берсон и
Ялоу продемонстрировали возможность селективного определения низких кон-
центраций инсулина [10]. Рутинным методом РИА стал лишь в конце 1960-х и на-
чале 1970-х годов — в период, когда лабораторные методы с рекордной скоростью
стали входить в клиническую практику, что было обусловлено острой необходимо-
стью. В современных клинических лабораториях иммуноанализ и родственные
методы, базирующиеся на конкурентном связывании, используются очень широ-
ко. Огромная роль данной технологии была подтверждена тем, что в 1977 г. уже
после смерти Берсона Розалин Ялоу получила Нобелевскую премию по физио-
логии за вклад в развитие метода (www.almaz.com/nobel/nobel.html).
В методе иммуноанализа обычно используют конкуренцию между определя-
емым антигеном и меченым стандартным антигеном за специфические участки
распознавания на антителе. Меткой может служить радиоактивный изотоп, фер-
мент или флуоресцентный краситель. Далее мы рассмотрим общие принципы
иммуноанализа, а от них перейдем к обсуждению деталей иммуноанализа с флу-
оресцентной и ферментативной метками.
Принципы иммуноанализа
В иммуноанализе соединились чувствительность радиохимических, флуорес-
центных или ферментативных методов анализа и специфичность иммунологии.
Иммунология изучает антигены и их реакции с антителами, т. е. защитные меха-
низмы организма, опосредованные антителами и направленные против чуже-
родных агентов (рис. 24.2). Антиген (например, гормон) представляет собой
24.4. ИММУНОАНАЛИЗ
309
Антиген ------
(чужеродная частица)
-> Образование (Ат)
Антиген
V
Комплекс антиген-антитело (Аг-Ат)
РИС. 24.2. Принципиальная схема протекания иммунологической реакции
вещество (в том числе чужеродное), способствующее образованию в организме
антител и реагирующее (связывающееся) с ними. Антитело — это белок, кото-
рый посредством стереоспецифических взаимодействий распознает чужерод-
ные для организма вещества, например, бактерии или вирусы.
Антитела представляют собой высокомолекулярные глобулины (относитель-
ная молекулярная масса около 150 000; см. рис. 24.3). Белок, обладающий актив-
ностью антитела, называют иммуноглобулином (1g). В крови человека
обнаружено пять основных типов иммуноглобулинов (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM),
из которых наиболее многочисленными являются IgG. Иммуноглобулины со-
стоят из двух легких полипептидных цепей, построенных примерно из 214 амино-
кислотных остатков, и одной тяжелой цепи, в состав которой входят примерно
430 остатков. Цепи соединены между собой дисульфидными мостиками и обра-
зуют гибкую Y-образную структуру (рис. 24.4). При обработке таких молекул
папаином образуются три фрагмента с относительной молекулярной массой
50 000, два из которых идентичны и сохраняют способность связывать антиген
(Fab-фрагменты — fragment, antigen binding). Третий фрагмент не способен са-
мостоятельно связывать антиген; этот фрагмент удалось получить в кристал-
РИС. 24.3. Пространственная модель антитела
310
ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
лическом виде, за что его назвали Fc-фрагментом (fragment, crystallizable).
Fc-фрагмент имеет практически инвариантную структуру, в то время как
Fab-фрагменты содержат участки переменного состава, придающие антителам
их специфичность. Участки, играющие основную роль в связывании, располо-
жены в концевой области Fab-фрагментов (закрашенные области на рис. 24.4);
они образуют участок связывания антигена (Fc-фрагмент также способен изги-
баться таким образом, что его конец принимает участие в связывании антигена,
но основная роль все же принадлежит Fab-фрагментам). Все антитела имеют
сходную структуру и различаются лишь вариабельными антигенсвязывающими
участками Fab-фрагментов.
Антитела специфическим образом реагируют с антигенами с образованием
комплексов антиген-антитело. Такие комплексы возникают в организме (и оста-
ются в нем некоторое время) уже после однократного воздействия чужеродного
агента (т. е. вакцинации, как спонтанной, так и искусственной). Для проведения
иммуноанализа путем введения антигенов в организм животного сначала полу-
чают антитела, для которого они являются чужеродными, а затем отбирают сы-
воротку, содержащую искомые антитела (так называемую антисыворотку).
Комплекс Аг-Ат характеризуют двумя параметрами—аффинностью (срод-
ством) и авидностью. Аффинность отражает степень специфического сродства
антитела к моновалентному антигену, характеризуемую константой связыва-
ния, а авидность — общую энергию связывания между антителами и поливалент-
ным антигеном. В общем случае реакцию связывания можно записать следующим
образом:
Ат + Аг = АтАг
Константа образования комплекса выражается как:
к= [АтАг]
[Ат][Аг]
(24.1)
(24.2)
Тяжелая
Легкая цепь
цепь
Вариа-
бельный
участок
Область
связывания
антигена
Константный
участок
Рис. 24.4
Структура антитела
24.4. ИММУНОАНАЛИЗ
311
Для таких комплексов К принимает достаточно высокие значения: обычно от
108—101 °. Связывание достигается за счет действия слабых сил (вандерваальсо-
вых, электростатических и гидрофобных), но в нем принимает участие большое
количество групп. При добавлении соли, а также при повышении pH, температу-
ры или полярности растворителя связи разрываются, что приводит к диссоциа-
ции комплекса.
Все методы иммуноанализа основаны на исходном открытии Берсона и
Ялоу, которыми было показано, что антитела к антигенному гормону инсули-
ну в низкой концентрации можно детектировать радиохимическим способом
по их способности связывать меченый инсулин (содержащий 1311). Например, в
радиоиммуноанализе (РИА) определение неизвестной концентрации антигена
базируется на том, что меченый и немеченый антиген (из образца или стандар-
тного раствора) конкурируют за участки связывания на молекулах антител
(рис. 24.5).
Сначала в реакционный сосуд помещают раствор антител (антисыворотку),
меченый антиген и образец сыворотки, в котором может находиться немеченый
(искомый) антиген. В результате инкубации образуются комплексы антиген-
антитело (Аг-Ат). Если немеченый антиген отсутствует, происходит связыва-
ние определенной доли меченого антигена (Аг*). По мере увеличения концент-
рации немеченого антигена (Аг) он постепенно вытесняет меченый антиген из
участков связывания на молекулах антител, поскольку число таких участков
ограничено. После разделения связанных и несвязанных (свободных) антигенов
с помощью прямых и косвенных методов измерения измеряют концентрацию
меченого антигена (по наличию радиоактивной или флуоресцентной метки) в
одной или обеих фракциях.
Для проведения анализа исходный раствор антител разбавляют таким обра-
зом, чтобы в отсутствие немеченого стандартного или неизвестного антигена
было связано около 50% меченого Аг*. Снижение количества связанного анти-
гена при добавлении образца указывает на наличие в нем немеченого антигена.
Используя набор растворов стандартного антигена с известными концентраци-
ями, строят градуировочную кривую в виде зависимости доли связанного ме-
ченого антигена (либо отношения связанного и свободного антигена) от
Ат
(антитело)
Аг*
(антиген с
радиоактивной
меткой)
Инкубация
-------->
Аг*-Ат
и
Аг-Ат
(связанные) Разделение
Аг*-Ат
И -L
Аг-Ат +
(связанные)
Аг* и Аг
(свободные)
(антиген
из анализируемого
или стандартного
образца)
— Аг* и Аг
(свободные)
РИС. 24.5. Принцип радиоиммуноанализа
312
ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Рис. 24.6
Типичная градуировочная кривая
в иммуноанализе
Логарифм концентрации (нг/мл)
концентрации немеченого антигена, и определяют неизвестную концентрацию
антигена.
Пример типичной градуировочной кривой представлен на рис. 24.6. Обра-
тите внимание на широкий диапазон определяемых концентраций (от 10-2 до
103 нг/мл на относительно прямолинейном участке), а также на высокую чувст-
вительность метода. Наклон градуировочной кривой и, следовательно, диапазон
измерений и чувствительность зависят от исходного разбавления раствора анти-
тел. С одной стороны, с разбавлением антител возрастает чувствительность, но с
другой стороны, при использовании более концентрированного раствора увели-
чивается охватываемый диапазон концентраций антигена. Кроме того, как уже
говорилось ранее, для достижения высокой чувствительности рекомендуют раз-
бавлять антисыворотку таким образом, чтобы связывалось примерно 50% мече-
ного антигена (при его очень низкой суммарной концентрации) в отсутствие
немеченого антигена. Смысл этого заключается в том, что снижение на 50% ис-
ходного отношения связанного и свободного антигена, равного 1,0 (т. е. при на-
чальном связывании 50% антигена), можно определить более точно, чем такое
же (в %) снижение исходного значения, равного, скажем, 10 (исходно связан
91% антигена). В первом случае доля связанного антигена снизится с 50% (свя-
занный/свободный = 1,0) до 33% (связанный/свободный = 0,5), а во втором —
с 91% (связанный/свободный = 10) до 83% (связанный/свободный = 5). Чувстви-
тельность определений в начальной части кривой можно повысить, используя
минимально возможное количество меченого антигена.
Принцип конкурентного связывания, используемый в иммунологических
методах анализа, может быть применен и в других аналитических системах.
С помощью принципа конкурентного белкового связывания, можно детекти-
ровать любое вещество, способное специфическим образом связываться с опреде-
ленной макромолекулой. В качестве специфической макромолекулы может
выступать белок сыворотки, например, тироксинсвязывающий глобулин, специ-
фический рецептор или антитело.
24.4. ИММУНОАНАЛИЗ
313
Специфичность иммуноанализа
Использующаяся для иммуноанализа антисыворотка никогда не может быть аб-
солютно специфична к определенному антигену. На специфичность анализа
оказывает влияние: а) гетерогенность антител; б) перекрестные реакции с други-
ми антигенами; в) присутствие низкомолекулярных веществ, способных влиять
на реакцию между антителами и антигенами посредством изменения условий
среды. Конкретный антиген приводит к образованию целого набора антител и
взаимодействует с ними в различной степени, в зависимости от константы рав-
новесия соответствующей реакции. Кроме того, в одном типе антител могут
встречаться антитела с различным числом и расположением участков связывания.
Проблему гетерогенности удалось уменьшить с развитием технологий очистки
антисыворотки. Кроме того, синтетические моноклональные (т. е. однотип-
ные) антитела обеспечивают очень высокую специфичность анализа.
Проблема перекрестных реакций с другими антигенами довольно сложна и
должна рассматриваться отдельно для каждого типа определяемого антигена.
Для решения этой проблемы могут потребоваться специальные методы очистки.
Среди неспецифических факторов, влияющих на скорость реакции между
антителами и антигенами, можно назвать pH, ионную силу, повышенную темпе-
ратуру, состав инкубационной среды, наличие гепарина, мочевины и высокой
концентрации билирубина. Стандартные и анализируемые образцы антигенов
необходимо разводить в не содержащей антигенов плазме, чтобы избежать раз-
личий в составе среды, а также использовать один и тот же буфер или раствор
для разведения. Если не содержащая антигенов плазма, принадлежащая орга-
низму того же вида, недоступна, можно применять плазму другого вида, исполь-
зование которой исключает возможность возникновения перекрестных реакций.
Получение антител
Естественно, что для проведения иммуноанализа требуется подходящая антисы-
воротка. Важно учитывать концентрацию антител в сыворотке (так называемый
титр антител*), но главным критерием при выборе антисыворотки является ее
специфичность и аффинность по отношению к анализируемому антигену.
Обычно для получения антител животным вводят от 0,2 до 2,0 мг чистого
антигена, смешанного с адъювантом Фрейнда (комбинация минерального мас-
ла, воска и убитых бактерий, которая усиливает и продлевает иммунный ответ).
Для получения антител используют кроликов, овец, морских свинок, коз, кур
или обезьян — в зависимости от необходимого объема антисыворотки и степени
допустимой побочной активности антигена.
Небольшие молекулы с относительной молекулярной массой 1000-5000
(небольшие полипептиды, стероиды и др.), называемые гаптенами, самостоя-
тельно не могут вызывать иммунный ответ. Поэтому перед инъекцией животным
гаптены связывают с более крупными молекулами — носителями, в качестве ко-
торых применяют белки или синтетические вещества. Часто в роли носителей
Это понятие имеет другой смысл, в отличие от титра, о котором идет речь в гл. 5.
314
ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
выступают человеческие гаммаглобулин или альбумин, синтетические пептиды
и полимеры.
Вводить антиген иммунизированному животному можно несколько раз, по-
лучая при этом разные серии сыворотки. Для большинства видов анализа, для
которых получены меченые антигены, существуют коммерческие препараты ан-
тисыворотки. Разбавленные образцы сыворотки можно хранить длительное время
в замороженном виде. После размораживания препараты хранят при 4 °C.
Длительность периода инкубации
Время до наступления равновесия в реакции между антигеном и антителом в
процессе анализа составляет от нескольких часов до нескольких суток в зависи-
мости от свойств определяемого антигена. Длительная инкубация обычно нежела-
тельна, поскольку антиген может повреждаться при продолжительном воздействии
высококонцентрированных белков плазмы, окислителей и др., так и не достиг-
нув состояния равновесия.
Разделение связанного и свободного антигена
Существуют различные методы разделения свободного и связанного антигена
после инкубации для последующего определения доли связанного антигена с
помощью метки. (Стоит отметить, что это актуально в гетерогенном типе анали-
за. При проведении анализа гомогенного типа (см. ниже) разделения не требуется.)
Иммунные комплексные соединения (комплексы антиген-антитело) представляют
собой белоксодержащие вещества, которые можно осадить (денатурировать)
добавлением большого количества соли (например, (NH4)2SO4, Na2SO4) или ор-
ганического растворителя (ацетона, этанола и др.) Осаждение используется
чаще, при этом выпавший в осадок комплекс отделяют центрифугированием
(хотя можно и фильтрацией), а затем анализируют количество метки в одной
или обеих фракциях.
Кроме того, широко применяется метод с вторичными антителами,
которые используют для осаждения комплекса, образованного антигенами и пер-
вичными антителами. Вторичные антитела получают путем введения второму жи-
вотному гаммаглобулина, образовавшегося в крови первого животного, которое
использовалось для получения первичных антител. Несмотря на то, что еще
один тип антител является дополнительным источником погрешностей, данный
метод имеет то преимущество, что может применяться практически в любом
типе иммуноанализа и сопровождается полным разделением свободного и свя-
занного антигена.
К другим методам разделения относятся электрофорез (см. гл. 21) и иммо-
билизация антигенов или антител на твердой подложке.
Иммуноанализ с флуоресцентной меткой
Если антитела или антигены помечены флуоресцентным красителем, то де-
тектирование основано на измерении флуоресценции [12]. Данный тип анализа
24.4. ИММУНОАНАЛИЗ
315
получил широкое распространение, поскольку с химическими веществами обра-
щаться гораздо проще, чем с радиоактивной меткой, и отсутствует проблема рас-
пада метки. Наиболее известными флуоресцентными красителями являются
флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ) и лиссамин родамин (RB200). Обычно для
конъюгации с красителем (мечения) используют смесь иммуноглобулинов, ко-
торые не должны содержать примеси других сывороточных белков, поскольку
альбумин и другие глобулины метятся легче, чем гаммаглобулин, в результате
чего метод теряет свою специфичность. После конъюгации непрореагировав-
ший краситель удаляют, а меченый белок очищают методом эксклюзионной
хроматографии.
Флуоресценция меченого антигена часто гасится в процессе иммунохими-
ческой реакции, причем снижение интенсивности флуоресценции можно изме-
рить без проведения физического разделения. В этом состоит отличие анализа
гомогенного типа от анализа гетерогенного типа, при котором требуется раз-
деление реакционной смеси.
Иммуноанализ с ферментативной меткой
В качестве метки используют ферменты, например, пероксидазу; количество
непрореагировавшего антигена, связанного с ферментом, определяют с помо-
щью соответствующей ферментативной реакции. Опять же здесь активность
фермента часто ингибируется в результате протекания иммунохимической ре-
акции, поэтому снижение активности можно применять как количественную
меру при проведении гомогенного иммунохимического анализа. Иммуноанализ
с ферментативной меткой в гомогенной системе часто используют для опреде-
ления низкомолекулярных веществ, таких как дигоксин, амфетамины и лекарст-
венные средства, отпускаемые по рецепту.
Распространенной разновидностью ферментативного метода иммуноана-
лиза является так называемый твердофазный иммуноферментный анализ (en-
zyme-linked immunosorbent assays — ELISA) [13]. Некоторые варианты данного
метода проиллюстрированы на рис. 24.7. В данном случае антитела или антигены
иммобилизуют на твердой поверхности, такой как стекло или пластик. Использова-
ние полипропиленовых или полистирольных пробирок или дисков, обладающих
адсорбирующей поверхностью, позволяет избежать стадию центрифугирова-
ния. Такие поверхности легко моются и адсорбируют воспроизводимое количе-
ство антигенов или антител. Обычно используют пластиковые, чаще всего
96-луночные планшеты, позволяющие одновременно анализировать множество
образцов и стандартов, причем проведение анализа можно облегчить примене-
нием автоматических пипеток и измерительных устройств.
Если ферментативная метка связана с антителом, то при взаимодействии
антитела с определяемым антигеном ферментативная активность ингибирует-
ся; в данном случае мы имеем дело с анализом, основанном на неконкурент-
ном типе связывания (см., например, [11]). В конкурентном варианте
ELISA антитела на твердой подложке иммобилизуют с помощью гидрофоб-
ных взаимодействий. В этом случае наряду с образцом немеченого антигена в
316
КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Ат — Е + Аг -» Аг — Ат — Е
Анализ основан на неконкурентном связывании фермента. Е ингибируется при связывании.
? — Ат + Аг — Е ? — Ат — Аг
+ -> +
Аг J —Ат — АгЕ
Конкурентный метод ELISA. Количество связанного Аг-Е снижается по мере роста Аг.
? — Ат + Аг -» J — Ат — Аг
J — Ат — Аг + Ат — Е —> J — Ат — Аг — Ат — Е
Неконкурентный метод «сэндвич-ELISA». Количество связанного АтЕ увеличивается пропор-
ционально количеству Аг
Рис. 24.7. Метод ELISA.
Аг — анализируемый антиген; Ат — антитело; Е — ферментативная метка
инкубационную среду добавляют известное количество меченого ферментатив-
ной меткой антигена, и они конкурируют за участки связывания на антителах,
иммобилизованных на носителе. После инкубации лунки промывают и добавля-
ют субстрат для ферментативной реакции; обычно для этого используют фер-
ментативные системы, в которых образуется окрашенный продукт. Наиболее
сильная окраска (наибольшее количество продукта ферментативной реакции)
наблюдается там, где антиген в образце отсутствовал и, следовательно, не пре-
пятствовал связыванию меченого антигена; ослабление окраски пропорциона-
льно количеству антигена в образце. Для проведения данного типа анализа
требуется довольно большое количество очищенного антигена, необходимого
для предварительного мечения.
Сэндвич-метод является неконкурентным вариантом иммуноанализа. В лун-
ки с иммобилизованными антителами добавляют образец, а после инкубации —
меченные ферментативной меткой антитела, которые связываются пропорцио-
нально количеству связавшегося антигена. Не связавшиеся меченые антитела
вымывают, а на твердой подложке остаются своеобразные «сэндвичи» — антиге-
ны, заключенные между мечеными и немечеными антителами. Окраска, развиваю-
щаяся в процессе ферментативной реакции, прямо пропорциональна количеству
антигена.
В косвенном варианте метода ELISA определяемый антиген сначала ад-
сорбируют на твердой подложке либо напрямую, либо через антитела, как опи-
сано выше. Затем добавляют немеченые первичные антитела, инкубируют и
отмывают. Наконец, добавляют вторичные меченые антитела (полученные про-
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
317
тив соответствующего класса иммуноглобулинов того вида животных, от кото-
рого взяты первичные антитела), снова инкубируют и отмывают жидкую фазу.
В данном случае ферментативная активность (и интенсивность окраски продук-
та) тоже пропорциональна количеству антигена. Преимуществом данного метода
является возможность использования «универсального» конъюгата в качестве
вторичных антител против всех первичных антител, относящихся к тому же
классу иммуноглобулинов соответствующего вида животных. Таким образом,
для определения каждого конкретного антигена нет необходимости метить пер-
вичные антитела. Косвенный метод ELISA обычно чувствительнее прямого ме-
тода анализа; это, по-видимому, объясняется тем, что с каждым первичным
антителом связывается несколько меченых вторичных антител. Кроме того, не-
конкурентные методы анализа обычно более чувствительны, чем их конкурент-
ные аналоги.
Что мы узнали из этой главы?
• Состав крови и основные измеряемые показатели (рис. 24.2, табл. 24.1 и
24.2) —стр. 300
• Принципы иммунного анализа: антигены и антитела; флуоресцентный им-
муноанализ, ферментативный иммуноанализ (ELISA) — стр. 308
Вопросы
1. Перечислите основные компоненты крови.
2. Что такое гемолиз и почему о нем нужно знать?
3. Почему к образцам крови, анализируемым на содержание глюкозы, часто
добавляют фторид натрия?
4. Почему образцы цельной крови нельзя замораживать?
5. Какие наиболее распространенные виды клинического анализа?
6. Что такое антитело?
7. Объясните принципы иммуноанализа. Какие метки используют в этом ме-
тоде? Какие возможные варианты этого метода вы знаете?
Рекомендуемая литература
Общая
1. С. A. Burtis and Е. R. Ashwood, eds., Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry,
4th ed., Washington, DC: American Association of Clinical Chemistry, 1995.
2. C. A. Burtis and E. R. Ashwood, eds., Tietz Textbook of Clinical Chemistry,
3th ed., Washington, DC: American Association of Clinical Chemistry, 1998.
318
ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
3. М. Reiner and D. Seligson, eds., Standard Methods in Clinical Chemistry. San
Diego: Academic. Многотомная серия, выходящая в свет с 1953 г.
4. D. Glick, ed., Methods of Biochemical Analysis. New York: Wiley-Interscience.
Серия томов, выпускаемых ежегодно, начиная с 1954 г.
5. D. S. Young and R. В. Friedman, Effect of Diseases on Clinical Laboratory
Tests, 4th ed., Washington, DC: American Association of Clinical Chemistry,
2001.
6. D. S. Young and R. B. Friedman, Effect of Drugs on Clinical Laboratory Tests,
5th ed., Washington, DC: American Association of Clinical Chemistry, 2000.
7. J. Wang, Electroanalytical Techniques in Clinical Chemistry and Laboratory
Medicine. New York: VCH, 1988.
Иммуноанализ
8. J. T. Wu, Quantitative Immunoassay: A Practical Guide for Assay Establish-
ment, Troubleshooting, and Clinical Applications. Washington, DC: American
Association of Clinical Chemistry, 2000.
9. С. P. Price and D. J. Newman, Principles and Practice of Immunoassay, 2nd ed.,
Basingstoke Hampshire, UK: Macmillan, 1997.
10. S. A. Berson and R. S. Yallow, «Immunoassay of Plasma Insulin», Immunoassay
of Hormones, Ciba Found. Colloq. Endocrinol., 14 (1962) 182.
11. T. A. Kelly and G. D. Christian, «Homogeneous Enzymatic Fluorescence Immu-
noassay of Serum IgG by Continuous-Flow Injection Analysis», Taianta, 29
(1982) 1109.
12. С. M. O’Donnell and S. C. Suffin, «Fluorescence Immunoassays», Anal. Chem.,
51 (1979) 33A.
13. E. Engvall and P. Perlman, «Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Quantitative Assay of Immunoglobulin G», Immunochemistry, 8 (1971) 871.
Глава 25
ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА:
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ*
Век генов начался, когда Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик раскрыли тайну строе-
ния генов: ДНК представляет собой двойную спираль. За это открытие в 1962 г.
они были удостоены Нобелевской премии. Для определения полной последова-
тельности человеческих генов (генома) понадобилось еще 40 лет, и в этом про-
цессе важнейшую роль сыграли аналитические методы и приборы. В настоящей
главе мы остановимся на принципах определения последовательности ДНК
(секвенировании) и использования секвенирования для определения последова-
тельности генома. Кроме того, мы рассмотрим методы, позволяющие опреде-
лять функции белков. Но сначала немного биологии.
25.1. Из чего мы состоим?
Белки являются основными строительными блоками нашего организма. Практи-
чески вся биологическая активность осуществляется при их участии. Наши
мышцы, зубы, печень, кожа, кровь, т. е. практически все тело, существуют лишь
постольку, поскольку существуют белки. Откуда берутся белки? Синтез белков
определяется нашими генами (ДНК); «экспрессия генов» — это по существу тот
процесс, с помощью которого гены контролируют биологические функции орга-
низма. Гены кодируют аминокислоты, из которых строятся белки. Все функции
клетки закодированы в клеточной ДНК; ДНК определяет, какая клетка будет
клеткой волоса, какого цвета будет этот волос, а также многое другое.
Гены входят в состав хромосом. Ядра почти всех 100 триллионов клеток, об-
разующих наш организм, содержат 23 пары хромосом, т. е. 46 отдельных хромосом
(рис. 25.1). Исключение составляют сперматозоиды и яйцеклетки, содержащие все-
го по 23 хромосомы. Каждый родитель передает своему ребенку 23 хромосомы.
Ребенок берет лишь часть ДНК от обоих родителей, причем случайным образом,
так что каждый малыш обладает только ему свойственным набором родительских
генов; исключением являются однояйцовые близнецы, гены которых идентичны.
Перед изучением данной главы мы рекомендуем обратиться к сайту www. oml. gov/hgmis/project/info.html
и прочесть статью «From the Genome to the Proteome».
320
ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
Два метра ДНК
46 человеческих
хромосом
Триллионы клеток
Каждая клетка
содержит:
клетка
Хромосомы
ген
.... ... ген 1
ДНК
ДНК — молекула жизни
Три миллиарда
основания
(А, Т, С и G)
Около 30 тыс. генов
кодируют белки,
осуществляющие
основные
жизненные функции
белок •
Рис. 25.1. От хромосом к белкам. С любезного разрешения Департамента энергетики США
(www.oml.gov / hgmis)
Под микроскопом хромосомы выглядят как цилиндрические структуры. На
самом деле, они состоят из набора генов, представляющих собой тесно перепле-
тенные двойные нити молекул ДНК (рис. 25.2). Две нити ДНК удерживаются
вместе за счет водородных связей между соответствующими парами нуклеоти-
дов, которые можно рассматривать как «ступеньки» в «лестнице» ДНК.
25.2. Что такое ДНК?*
Дезоксирибонуклеиновая кислота (сокращенно ДНК) представляет собой длин-
ную полимерную молекулу, составленную из нуклеотидных звеньев. Каждый
нуклеотид построен из остатка сахара, фосфатной группы и азотистого основа-
ния (соединения с основными азотсодержащими группами). Сахарофосфатный
остов молекулы ДНК неизменен, а вот азотистые основания могут меняться.
Основная структура нуклеотида представлена на рис. 25.3. Мономерные звенья
соединяются путем образования связи между 3'- и 5'-концевыми группами
(рис. 25.4). Для построения ДНК используются лишь четыре типа азотистых
До или после изучения данного раздела мы рекомендуем обратиться к сайту www.pbs.org/ wgbh/nova/
genome/dna.html и прочесть статью «Journey into DNA».
25.2. ЧТО ТАКОЕ ДНК?
321
Рис. 25.2
Структура хромосомы.
Каждая хромосома
образована скрученной
спиралью ДНК; если ее
развернуть, обнаруживается
двойная структура спирали.
(С любезного разрешения
Объединенного института
генома при Департаменте
энергетики США.
С благодарностью
Университету Калифорнии,
Национальной библиотеке
им. Лоуренса Ливермора и
Департаменту энергетики,
при поддержке которых
выполнена данная работа)
оснований: аденин (А), цитозин (С), гуанин (G) и тимин (Т), структура которых
изображена на рис. 25.5.
Азотистые основания в двух нитях ДНК образуют связи (спариваются) толь-
ко в определенных комбинациях'. А образует пару с Т, a G — с С (рис. 25.6), но
различных комбинаций этих нуклеотидов в длинной двойной спирали ДНК ока-
зывается достаточно для записи генетического
кода всего организма. Как же это возможно?
Попробуем объяснить это на примере азбуки
Морзе. Она состоит из точек (•) и тире (-), с
помощью которых создается алфавит (а = • -
b = - • • •, с = - • - • и т. д.). Далее буквы алфавита
используют для записи слов (между буквами
оставляют пробелы), слова складывают в пред-
ложения, фразы, абзацы, главы, книги, энцик-
лопедии. Как мы увидим далее, комбинации
трех различных нуклеотидов используются
для передачи информации с помощью ДНК. На
рис. 25.4 изображена цепочка из трех нуклеоти-
дов, образующая олигонуклеотид. Обратите
3'-конец
Рис. 25.3
Структура нуклеотида
322
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
Аденин (А)
ОН
1
I
I
НО — Р=О
| основание
Гуанин (G)
З'-конец
Тимин (Т)
Рис. 25.4
Олигонуклеотид
(при физиологических значениях pH
находится в виде аниона)
Рис. 25.5
Азотистые основания в составе ДНК. Между
двумя нитями ДНК образуются водородные
связи: А образует пару с Т, a G — с С
внимание, что ОН-группа остатка сахара, находящаяся в положении 3', связана с
фосфатной группой в положении 5'. В результате на одном конце фрагмента
ДНК всегда расположена 3'-группа, а на другом — 5'-группа. Если такой одно-
нитевой фрагмент ДНК образует пару с идентичным (точнее комплементарным)
однонитевым фрагментом, то они укладываются в противоположных направле-
ниях; такую структуру называют антипараллельной. Другими словами, в одной
нити остаток сахара расположен нормально, а в другой — «вверх тормашками»,
25.3. ПРОЕКТ «ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА»
323
Рис. 25.6
Двойная спираль ДНК, образованная
сахарофосфатным остовом и
удерживаемая водородными связями
в парах А-Т и G-С. Воспроизведено
с разрешения D. Leja, Национальный
Институт по исследованию генома
человека, США
так что 3' и 5'-концы обеих нитей находятся с разных сторон. Две нити уложены
таким образом, что соответствующие основания могут взаимодействовать, об-
разуя пары. Нуклеотид А всегда расположен напротив Т, a G — напротив С.
Хотя взаимодействие в каждой отдельной паре довольно слабое, но все вместе
они способны удерживать цепочку ДНК сдвоенной.
25.3. Проект «Геном человека»*
Проект «Геном человека» — это международный проект по определению полной
последовательности генов человека (www.nhgri.nih.gov/NEWS/profiles.html),
реализация которого началась в 1990 г. В рамках Проекта предстояло идентифи-
цировать все 3 млрд бит (пар оснований) ДНК, содержащих полный генетиче-
ский код человека, и расположить их в правильном порядке. В работе
принимало участие около 20 групп ученых из США, Великобритании, Франции,
О роли аналитической химии в реализации проекта «Геном человека» см. [Е. Zubritsky, How Analytical
Chemists Saved the Human Genome Project, Anal. Chem., 74 (2002) 23A].
324
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
Германии, Японии и Китая; основную часть финансирования Проекта осущест-
вляли США. Национальный институт здоровья США (NIH) и британский фонд
«Белком Траст» (Wellcome Trust of London) предоставили для реализации Про-
екта $2,5 млрд долларов. В США научная сторона Проекта осуществлялась под
руководством Национального института по исследованию генома человека и
Департамента энергетики США в рамках программы «Геном человека».
Первоначально в рамках Проекта ставилась задача закончить сборку генома
к 2003 г. Лаборатории-участницы Проекта прочитывали по одному биту за раз,
проводя методичное секвенирование каждого клона (см. ниже). В 1998 г. ком-
мерческая группа «Селера Геномике», основанная бывшим сотрудником NIH
доктором Крейгом Бентером, выдвинула альтернативный проект и заявила, что
закончит определение генома на три года раньше. Группа «Селера Геномике» и
13 других академических, некоммерческих и промышленных групп начали сек-
венирование в сентябре 1999 г., а закончили основную работу уже в октябре
2000 г.! Как им это удалось? Они действовали двумя путями. Во-первых, альтер-
нативная группа использовала данные, полученные к тому времени в рамках
основного проекта (эти данные полностью открыты для широкого доступа).
Во-вторых, они применили абсолютно новый способ секвенирования, так назы-
ваемое дробление генома (см. ниже). Кроме того, Селера использовала новое бо-
лее мощное аналитическое оборудование, основанное не на гель-электрофорезе,
а на капиллярном зонном электрофорезе (модель ABI 3700; подробности
см. ниже), разработанное компанией Applied Biosystems. Большая часть участ-
ников основного проекта переключилась на ту же технологию, а в июне 2000 г.
обе стороны объявили, что практически закончили секвенирование. В феврале
2001 г. каждая сторона опубликовала предварительные результаты своих исследо-
ваний: основная группа—в Nature, 409 (2001) 860, а Сел ера — в Science, 291 (2001)
1304. Эти публикации можно найти на сайтах www.nature.com/genomics/human и
www.sciencemagazine.org/content/voll29/issue5501. Результаты, полученные в
рамках основного проекта, открыты для широкого доступа. По соглашению с
журналом Science Селера поместила свои результаты в собственную базу дан-
ных. Этими данными может пользоваться любой желающий, но не в коммерче-
ских целях.
В реальности опубликованные «предварительные результаты» были закон-
чены лишь на 89%, а полное завершение Проекта потребовало более трех лет ра-
боты.
Каковы же основные открытия, полученные при реализации Проекта? Од-
ним из наиболее удивительных результатов оказалось то, что лишь 30-35 тыс.
генов (1% генома) кодируют белки. (В соответствии с накапливающимися дан-
ными эта цифра у приматов, возможно, окажется выше.) Это в два с лишним раза
меньше, чем ранее называвшаяся цифра 80-100 тыс. генов. Большую часть ге-
нома составляют длинные повторы некодирующих участков ДНК. Одна чет-
вертая часть генома представляет собой длинные участки, вообще не
содержащие генов. Такая сложная организация стала одной из проблем при
анализе генов.
25.4. КАК ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОВ?
325
25.4. Как осуществляется секвенирование генов? *
Секвенирование представляет собой сложный, но теперь уже рутинный про-
цесс. На рис. 25.7 и 25.8 отражены его основные стадии, которые подробнее описа-
ны ниже. Секвенируя перекрывающиеся последовательности генов, воссоздают
полную последовательность. Для этого, прежде всего, выделяют и размножают
(клонируют) большие фрагменты генов в необходимом для работы количестве.
Эти клонированные фрагменты составляют геномную библиотеку, с которой да-
лее работают те, кто осуществляет секвенирование. Длинные перекрывающиеся
фрагменты затем разбивают на более короткие участки с помощью случайного
дробления: образцы пропускают сквозь иглу шприца, где они разрушаются под
действием силы сдвига. Раньше фрагментацию ДНК осуществляли с помощью
ферментов нуклеаз, однако методом дробления удается получить случайный на-
бор фрагментов. (Нуклеазы — это ферменты, расщепляющие нуклеиновые кис-
лоты; они могут действовать как на однонитевую, так и на двунитевую ДНК.
Экзонуклеазы отщепляют нуклеотиды с конца цепи ДНК, а эндонуклеазы рас-
щепляют внутренние связи.) Фрагменты реплицируются (амплифицируются)
благодаря спариванию соответствующих комплементарных нуклеотидов. Нук-
леотиды присоединяются по одному, начиная с конца фрагмента. Обычно эту
процедуру осуществляют до тех пор, пока не будет реплицирован весь фраг-
мент. Однако амплификацию можно остановить в различных точках ДНК для
каждого из четырех нуклеотидов. Кроме того, можно определить, что за нуклео-
Геном
Нуклеаза
Крупные фрагменты ДНК Вставка в
(100 000-300 000 п. н.) -577;--►
' ' ВАС-вектор
Репликация Геномная
в бактериях библиотека
Рис. 25.7. Создание геномной библиотеки
Крупные
фрагменты
ДНК
Нуклеаза
Мелкие фрагменты
ДНК 100-300 п. н.
Репликация
плазмид
Миллиарды
копий фрагмента
ПЦР в присутствии Комплементарные
дидезоксинуклеотидов нити разной длины
_ А Упорядочение фрагментов
Электрофоретическое п0 длине; определение
разделение концевых нуклеотидов по
флуоресценции
Перекрывающиеся
фрагменты выстраивают в
ряд для получения исходной
последовательности
РИС. 25.8. Секвенирование геномной библиотеки
До или после изучения разделов, посвященных секвенированию, мы рекомендуем обратиться к сайту
www.pbs.org/wgbh/nova/genome/sequener.html и прочесть статью «Sequence for Yourself».
326
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
тид находится на конце каждого фрагмента—А, Т, G или С. Если среди миллио-
нов или миллиардов клонированных фрагментов мы получим фрагменты всех
возможных длин, и если нам удастся разделить их по длине и выстроить в ли-
нию, мы как раз получим полный упорядоченный набор нуклеотидов, соответст-
вующий исходной матрице ДНК. Представьте себе, что мы выделили набор
следующих фрагментов, заканчивающихся указанными нуклеотидами:
___________________Т
________________________А
______________________________А
____________________________________С
__________________________________________G
Это означает, что исходная матрица ДНК имела последовательность TAACG.
Далее мы обсудим, как это можно сделать.
25.5. Амплификация ДНК: полимеразная цепная реакция
ДНК обладает уникальным свойством: при нагревании она денатурирует (легче,
чем белок), причем этот процесс заключается в расхождении двух ее нитей. Это
происходит при нагревании раствора ДНК до критической температуры. Ра-
зошедшиеся нити ДНК по-прежнему комплементарны друг другу, так что при
охлаждении раствора за счет беспорядочного движения молекул они вновь сли-
паются, образуя двухцепочечную ДНК. Данный процесс называют отжигом,
или гибридизацией.
Для секвенирования и анализа ДНК необходимо получить достаточно боль-
шой участок ДНК, т. е. амплифицировать фрагменты. Воспроизвести каждую
отдельную нить ДНК можно с помощью фермента ДНК-полимеразы в присут-
ствии набора четырех нуклеотидов и праймера. Праймер — это короткий учас-
ток ДНК (олигонуклеотид, обычно состоящий из 20 пар нуклеотидов — п. н.).
Последовательность праймера комплементарна одному из концов амплифициру-
емой матрицы ДНК, так что он способен с ней слипаться. Вот пример типичного
праймера, состоящего из 20 п. н.:
5'-ATT-AAC-CCT-CAC-TAA-AGG-GA-3'.
ДНК-полимераза достраивает праймер, создавая при этом нить, комплемен-
тарную матрице ДНК, так что роль праймера заключается в инициации полиме-
разной реакции. Фермент достраивает 3'-конец праймера. Он «прочитывает»
каждое основание в однонитевой матрице ДНК и пристраивает к праймеру соот-
ветствующее комплементарное основание (например, если в матрице стоит Т, то
фермент присоединяет А, если стоит С — то G и т. д.) Фермент продвигается
вдоль матрицы и при этом создает точную комплементарную последователь-
25.6. ПЛАЗМИДЫ И ИСКУССТВЕННЫЕ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ХРОМОСОМЫ
327
ность (для нити 5'—>3' получается комплементарная нить 3'—>5'). Одновременно
то же самое происходит и со второй нитью расплетенной исходной молекулы
ДНК. Так происходит удвоение числа молекул ДНК. Процесс повторяют, мно-
гократно повышая и снижая температуру, пока не получат достаточное коли-
чество ДНК; в каждом цикле число молекул ДНК удваивается. Таким образом из
единственной копии ДНК можно получить миллиард реплик. Данный процесс
называют полимеразной цепной реакцией (ПЦР).
Существует несколько типов полимераз. Для ПЦР обычно применяют Taq-
полимеразу, которая выделена из термофильной бактерии Thermophilis aquati-
cus и стабильна при высокой температуре.
С помощью полимеразной цепной реакции можно обнаружить чрезвычайно
малые количества ДНК, причем даже в смесях, что очень удобно для проведения
судебно-медицинской экспертизы и в клинической диагностике. Например, в
деле О. Дж. Симпсона* ПЦР использовали для амплификации ДНК из следов
крови, найденных на месте преступления. ДНК, полученную методом ПЦР, да-
лее секвенируют, как описано ниже, а затем найденную последовательность
нуклеотидов сравнивают с последовательностью ДНК подозреваемого.
25.6. Плазмиды и искусственные бактериальные хромосомы
При выполнении проекта «Геном человека» библиотеки, содержащие крупные
клонированные фрагменты геномной ДНК, собирали и секвенировали. Клони-
рование основано на естественной способности ДНК к репликации. Для реплика-
ции фрагментов геномной ДНК используют разные вспомогательные молекулы
ДНК, называемые векторами. Существует два основных типа векторов — плаз-
миды и искусственные бактериальные хромосомы (bacterial artificial chromoso-
mes, ВАС).
Плазмиды
Плазмиды — это маленькие кольцевые молекулы ДНК, обнаруженные в некото-
рых бактериях. Плазмиды удается выделять в больших количествах. Выделенные
плазмиды разрезают и встраивают в них последовательность ДНК, которую
предстоит анализировать. Встроенную последовательность ДНК называют
вставкой. Плазмиды, содержащие вставку, вновь переносят в бактерии; бакте-
рии начинают реплицировать плазмиды наряду со своей собственной ДНК,
производя миллиарды копий, которые затем вновь выделяют. Обычно после-
довательность вектора известна, а вот последовательность вставки предстоит
* В середине 1990-х годов суд Лос-Анджелеса рассматривал дело знаменитого американского футболиста
О. Дж. Симпсона, обвинявшегося в убийстве своей бывшей жены и ее приятеля. Кровь жертв нашли на его
одежде, обнаруженной в доме и в машине. ДНК-экспертиза установила идентичность этих образцов и кро-
ви самого Симпсона. Однако суд не принял результаты ДНК-экпертизы как доказательство вины Симпсо-
на, поскольку в ходе следствия и экспертизы были выявлены явные ошибки. Симпсон был оправдан
криминальным судом (позднее дело передали в гражданский суд, который присудил его к выплате огром-
ной компенсации). — Прим, перев.
328
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
выяснить. Среди часто используемых плазмид можно назвать pGEM, pBR322 и
pUC18. Плазмидная ДНК имеет сравнительно небольшой размер — от 2000 до
20000 п. н.
Искусственные бактериальные хромосомы (ВАС)
ВАС (Bacterial Artificial Chromosome) используют для репликации более круп-
ных фрагментов ДНК по сравнению с теми, что можно реплицировать в плазми-
дах. Это клонирующие векторы, способные переносить очень крупные вставки
размером от 100 до 400 тыс. п. н. Подобно плазмидам, ВАС со вставками помеща-
ют в бактерии, которые растут и реплицируют ВАС, воспроизводя при этом своеоб-
разные минихромосомы. Основную часть геномной ДНК человека клонировали
именно таким путем, создавая геномные ВАС-библиотеки, которые затем пе-
редавали рабочим группам для секвенирования. Каждая такая библиотека со-
держит крупный фрагмент геномной ДНК — от 100 до 300 тыс. п. н. Библиотека
должна содержать достаточное количество различных ВАС, чтобы данный ген
находился в нескольких перекрывающихся ВАС и чтобы данный участок геном-
ной ДНК был обнаружен с 99%-й вероятностью. С помощью ВАС клонируют
целые геномы, а полученные клоны секвенируют, используя метод дробления
(shotgun sequencing).
История секвенирования генов
Основы той огромной работы, которая была выполнена при определении последователь-
ности генома человека, были заложены в 1970-х годах, когда Фредерик Сенгер (Кемб-
ридж, Англия) разработал метод секвенирования ДНК с помощью электрофореза в
гелевом блоке. Процесс этот, естественно, тогда выполнялся вручную и был по сегод-
няшним меркам очень медленным, но его значение очень важно. Сенгер и его сотрудни-
ки были первыми, кто смог просеквенировать геном: сначала был прочитан геном
простого вируса, потом — митохондриальный геном, а затем они принялись за секвени-
рование бактериальных геномов. Сенгер был дважды удостоен Нобелевской премии: в
1958 г. за исследования в области структуры белков (www.almaz.com/nobel/chemistry/
1958a.html) и в 1980 г. за развитие метода секвенирования ДНК (www.almaz.com/nobel/
chemistry /1980с. html).
В 1980-х годах Мэйнард Олсон (ныне директор Геномного центра при Универси-
тете Вашингтона) разработал систему искусственного клонирования в дрожжах и ввел
некоторые маркеры для картирования, что сыграло важную роль в секвенировании ге-
нов человека. Еще одним ключевым моментом в секвенировании генома было развитие
мощного программного обеспечения, позволяющего работать с миллиардами бит ин-
формации. Коллега Олсона — доктор Филлип Грин — создал две программы, назван-
ные Phred и Phrap, которые сыграли важнейшую роль в анализе последовательностей
ДНК.
25.7. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК
329
25.7. Секвенирование ДНК
Итак, получены различные фрагменты геномной ДНК, готовые для секвениро-
вания. Эти фрагменты имеют разную длину и перекрываются. Чтобы составить
общую картину, следует просеквенировать каждый из них, а затем выстроить их
в ряд, чтобы найти перекрывающиеся области. Теперь мы знаем последователь-
ность всех 23 пар хромосом (на самом деле из-за сложной структуры генома все
несколько сложнее).
Сам процесс секвенирования имеет много общего с описанным выше мето-
дом ПЦР. Он состоит в получении реплик различных фрагментов ДНК путем
повторения циклов денатурации и отжига. Репликация (или гибридизация) осу-
ществляется в присутствии матрицы ДНК, Taq-полимеразы и праймера для ини-
циации процесса. Следует заметить, что достаточно точно удается прочитывать
последовательность, отстоящую от праймера примерно на 50 нуклеотидов. Вы-
бор праймера крайне важен, так как он должен соответствовать определенному
участку на матрице ДНК, но здесь мы не будем заострять на этом внимание.
Праймер должен располагаться на максимальном удалении от 3'-конца фраг-
мента, поскольку ДНК наращивается именно в этом направлении.
Секвенирование имеет одно важное отличие от обычного метода ПЦР. Кроме
смеси четырех нуклеотидов, необходимых для наращивания цепи, в систему до-
бавляют небольшую часть (около 5%) изомеров нуклеотидов каждого типа, у ко-
торых 3'-гидроксильная группа остатка сахара заменена атомом водорода; такие
нуклеотиды называют дидезоксинуклеотидами. Рассмотрим в качестве примера
аденин. В большинстве случаев, когда полимераза встречает в матрице ДНК Т,
она помещает в синтезируемую цепь комплементарное основание А, так что про-
цесс гибридизации продолжается. Однако в 5% случаев фермент встраивает диде-
зокси-А (ddA), присоединение следующего звена к которому невозможно, поэтому
цепь обрывается. То же происходит и с другими нуклеотидами. Еслй мы имеем
миллиарды копий матрицы ДНК, то с большой вероятностью получим варианты
всех возможных длин, заканчивающиеся на ddA, ddC, ddG и ddT. Эту смесь можно
разделить методом электрофореза и проанализировать (см. ниже). Прививая к
дидезоксинуклеотидам химическую метку, индивидуальную для каждого диде-
зоксинуклеотида и флуоресцирующую при определенной длине волны, можно
определить, каким основанием заканчивается фрагмент ДНК. В качестве метки
обычно используют флуоресцентный краситель.
Вот как мог бы выглядеть гель при визуализации только меченого ddA:
CTTAGCAGGAATA
CTTAGCAGGAA
CTTAGCAGGA
CTTAGCA
330
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
Более короткие фрагменты движутся в геле быстрее длинных и элюируются
первыми. Первый и второй фрагменты в рассмотренном примере, считая снизу,
разделены двумя другими (фрагментов соответствующей длины, заканчиваю-
щихся на А, не существует), а два верхних — еще одним.
В реальности всегда имеют дело со смесью фрагментов, заканчивающихся
на все четыре нуклеотида, среди которых обязательно находятся фрагменты лю-
бой возможной длины. После разделения и детекции каждого из них по флуорес-
ценции концевой группы можно восстановить, к примеру, следующий фрагмент
хромосомы:
CTTAGCAGGAATA
CTTAGCAGGAAT
CTTAGCAGGAA
CTTAGCAGGA
CTTAGCAGG
CTTAGCAG
cttagca
Таким образом, искомая последовательность — CTTAGCAGGAATA. Жир-
ным шрифтом выделены определенные нами основания. Далее следует отыскать
среди других фрагментов перекрывающиеся области, чтобы восстановить всю по-
следовательность. Например, можно встретить два подобных фрагмента:
CTTAGCAGGAATA
CTTAGCTAGGCCT
В области ТА фрагменты перекрываются, так что исходная последовательность
имеет вид AGGAATAGGCCT. На самом деле длины фрагментов гораздо боль-
ше, здесь мы лишь проиллюстрировали принцип данного метода анализа. По до-
говоренности все последовательности записывают в направлении от 5' к З'-концу.
Секвенирование осуществляют с помощью автоматических секвенаторов, в
которых разделение производят с помощью либо гель-электрофореза, либо ка-
пиллярного электрофореза. В таких приборах одновременно может происхо-
дить разделение 96 образцов. На рис. 25.9 представлена картинка, отражающая
расположение полос в типичном эксперименте. Ультрафиолетовый лазер скани-
рует каждую полосу в нижней части геля, а прибор фиксирует флуоресценцию
каждой полосы, разумеется, на длине волны каждого из четырех маркеров.
По мере выхода из геля и детекции каждого фрагмента (чем мельче фраг-
мент, тем быстрее он элюируется) получаемые флуоресцентные сигналы записы-
вают в виде электрофореграммы (напоминает хроматограмму). На рис. 25.10
изображена часть электрофореграммы, полученной при сканировании одной по-
лосы, от более легкого фрагмента к более тяжелому. Встроенный в систему
компьютер распознает флуоресцентный сигнал каждого маркера и автоматиче-
ски помечает каждый пик символом соответствующего нуклеотида. На данном
рисунке представлен лишь небольшой фрагмент всей электрофореграммы.
Обычно в образце удается прочесть до 700 нуклеотидов. Дальше полосы стано-
25.7. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК
331
РИС. 25.9. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК при секвенировании. Каждая вер-
тикальная линия соответствует одному образцу. В каждой линии фрагменты разделились в соот-
ветствии с их размерами: чем мельче фрагмент, тем быстрее он движется. Каждая полоса имеет
специфическое окрашивание, соответствующее концевому нуклеотиду в данном фрагменте. Пре-
доставлено Геномным центром Университета Вашингтона. Цветную иллюстрацию, отражающую
окраску маркеров четырех нуклеотидов, можно увидеть на компакт-диске
1040, 1120, 1200, 1280, 1360, 1440, 1520, 1600
_1____I___।_____I___।_____I_!_____I___।______I_1____I____I_____I_।_____I____।_____I_।____I____।______I_।___I_____I_____I_I_____I___и_
TTG GCG ТАATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTG ТТАТСС
90 100 110 120 130
РИС. 25.10. Электрофореграмма разделенных фрагментов. Каждому пику соответствует один из
четырех цветов, а над пиками тем же цветом обозначено соответствующее концевое основание.
Предоставлено Университетом Мичигана. Цветную иллюстрацию, отражающую окраску марке-
ров четырех нуклеотидов, можно увидеть на компакт-диске
вятся слишком размытыми, так что точность и чувствительность определения
снижаются.
Описанный выше метод секвенирования был применен основной группой,
выполнявшей проект по секвенированию генома человека. Национальный науч-
332
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
ный фонд и Национальный институт здоровья (США) финансировали работу по
созданию ВАС-библиотек. Лаборатории-участницы Проекта амплифицировали
библиотеки и осуществляли секвенирование, используя метод дробления.
Не углубляясь в подробности, секвенирование дроблением заключалось в
следующем: лаборатории, проводившие секвенирование, получали клоны из
ВАС-библиотеки. Каждый ВАС-клон содержал крупный (до 300 тыс. п. н.)
фрагмент геномной ДНК. Клоны содержали случайные последовательности
ДНК, поэтому любой ген вполне мог присутствовать в одной или нескольких
хромосомах, несущих перекрывающиеся последовательности. Искусственные
бактериальные хромосомы реплицировали при помощи ДНК-полимеразы. За
один прием можно просеквенировать последовательность лишь нескольких со-
тен нуклеотидов, так что большие фрагменты чаще всего подвергали дробле-
нию, используя силы сдвига, а полученные фрагменты встраивали в вектор
(обычно в плазмиду) для репликации. Амплифицированные фрагменты секве-
нировали, используя смесь четырех нуклеотидов, их дидезокси-изомеров и
праймеров, разделяли с помощью электрофореза, а затем идентифицировали
концевые нуклеотиды по флуоресценции маркера. Полученные последователь-
ности нуклеотидов записывали в направлении от 5'- к 3'-концу. Перекрывающи-
еся участки позволяли определить полную последовательность фрагмента,
содержащегося в ВАС-клоне.
Программы Phred и Phrap
В результате секвенирования ДНК получают огромное количество данных. Каждый пик
на электрофореграмме может перекрываться с другими, сдвигаться в сторону от ожидае-
мой позиции, иметь необычную форму и т. д. Тому, кто занимается секвенированием,
приходится решать две основные проблемы. Первая состоит в надежной идентификации
каждого конкретного основания, а вторая — в сборе огромного экспериментального мате-
риала и получении на его основе перекрывающихся последовательностей, позволяющих
реконструировать геном. Сотрудник Геномного центра Университета Вашингтона про-
фессор Филлип Грин создал две мощные компьютерные программы, позволяющие ре-
шать обе эти задачи. Эти программы получили названия Phred (от phragment read) и Phrap
(от phragment assembly program или Phil’s revised assembly program).
Программа Phred считывает и идентифицирует нуклеотиды, проставляют им баллы,
отражающие достоверность результата, а также записывает все эти значения в файл. При
обработке электрофоретических пиков или профилей программа использует метод Фу-
рье для определения положения центральной части пика в отсутствие факторов, сдвига-
ющих его от «истинного» положения.
Программа Phrap предназначена для сборки воедино всех прочитанных фрагментов.
Она фиксирует основания, определенные с наибольшей достоверностью в каждом варианте
прочтения, и выбрасывает повторы. Программа, как мозаику, создает непрерывную после-
довательность на основе наиболее достоверных данных с погрешностью, не превышающей
1/10 тыс. п. н. Каждому основанию приписывается фактор достоверности, позволяющий ис-
следователю при необходимости работать с последовательностью вручную.
25.9. ПОЛИМОРФИЗМ ОТДЕЛЬНЫХ НУКЛЕОТИДОВ
333
25.8. Секвенирование генома методом дробления
Участники альтернативной группы Селера предприняли несколько другой под-
ход. Они опустили стадию создания ВАС-библиотек, содержащих длинные по-
следовательности ДНК, сразу разбивая геном на фрагменты размером
2000-10000 п. н. и секвенируя каждый из них кусками по 700 нуклеотидов (мак-
симальное количество нуклеотидов, которое можно прочесть за один проход).
Поскольку в целом речь идет о трех миллиардах оснований, то после секвенирова-
ния необходимо рассортировать и расставить по местам огромное количество
фрагментов (на самом деле, лишь часть фрагментов подвергалась сортировке,
но и это число крайне велико). Для такой работы потребовались очень мощные
компьютеры.
Для более быстрой сортировки миллионов фрагментов всю процедуру вы-
полняли автоматически, осуществляя разделение с помощью капиллярного
электрофореза, разрешение которого выше, а скорость больше, чем у гель-элект-
рофореза. Детекцию проводили, пропуская луч лазера через капли на концах
множества капилляров. Основная исследовательская группа, выполнявшая Про-
ект, также в значительной степени переключилась на такой принцип работы
(с использованием анализатора ABI модель 3700).
Ученые расходятся во мнениях относительно того, какой подход обеспечи-
вает получение более точных результатов. Обе группы продолжают работу по
анализу оставшихся непрочитанными участков (вспомните, что сначала удалось
прочесть лишь 89% генома).
25.9. Полиморфизм отдельных нуклеотидов
Раскодирование человеческого генома выявило удивительное сходство генети-
ческого строения всех людей (на самом деле, наш генетический код не слишком
отличается и от кода животных). Около 99,9% генов у всех людей одинаковы, и
лишь 0,1% генов отвечают за те различия, которые между нами существуют.
Кроме того, среди этих 0,1% генов содержатся те, что ответственны за возникно-
вение болезней и нарушение функций организма. Обычно эти гены различаются
всего на одно основание. Конечно, 0,1 % от 3 миллиардов дает все же значительную
цифру — 3 миллиона генов. Однако существуют генетические маркеры, которые
сужают область поиска таких генов; это так называемые SNP (single-nucleotide poly-
morphisms, «снипы»). По оценкам специалистов около 80-90% вариаций генома
человека связано с SNP. Поиск SNP представляет собой быстро развивающуюся
область исследований в клинической и фармакогенетической практике, поско-
льку позволяет идентифицировать генетические дефекты и создать лекарства
для борьбы с ними.
Обычно SNP встречаются у всех людей в одних и тех же позициях в геноме.
Уже идентифицировано около трех миллионов таких участков, а во всей челове-
ческой популяции их, по-видимому, существует около 10 млн. Многие нуклео-
тидные замены несущественны, однако наличие SNP в некоторых определенных
334
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
участках строго коррелирует с наличием специфического заболевания. При боль-
шинстве заболеваний обнаруживаются сотни различных SNP. Лишь около
200 000 SNP встречаются относительно часто, но практически все распростра-
ненные генетические заболевания связаны с теми SNP, что входят в их число.
Обнаружить SNP позволяет секвенирование. Для быстрого анализа такого
полиморфизма применяют новые технологии, основанные на ДНК-микрочипах.
25.10. ДНК-чипы
Для быстрого и недорогого определения генетических характеристик индивида,
в частности, для обнаружения генетических маркеров специфических заболева-
ний, учеными были разработаны новые технологии. Эти технологии основаны
на использовании ДНК-микрочипов. Их применяют при анализе генетических
образцов для поиска определенных последовательностей ДНК, например, SNP.
Действие ДНК-чипов основано на том факте, что комплементарные нити
ДНК слипаются друг с другом. Однонитевые участки ДНК с известной последо-
вательностью готовят путем денатурации, а затем наносят на микроскопическую
матрицу, причем во всех точках матрицы нуклеотидные последовательности раз-
личны. Далее на каждую точку наносят исследуемый образец. Там, где анализируе-
мая последовательность встречается с комплементарной ей последовательностью,
происходит их слипание (гибридизация). В систему добавляют флуоресцентные
маркеры, которые связываются только с двунитевыми участками ДНК. По на-
личию флуоресценции этим методом можно сразу определить неизвестную
последовательность на основании той последовательности, с которой она свя-
залась.
На микроскопическую решетку размером всего несколько сантиметров мож-
но нанести сотни тысяч различных последовательностей ДНК. Такие ДНК-чипы
производятся и продаются коммерческими фирмами. Кроме того, можно приоб-
рести и ручные анализаторы, позволяющие одновременно анализировать до 100
образцов (www.nanogen.com).
Анализ SNP
Идентификация SNP, которые могут быть связаны со специфическими заболе-
ваниями, в будущем станет важным элементом медицинской диагностики, про-
филактики и лечения этих заболеваний. В подобных исследованиях ключевую
роль может сыграть использование ДНК-чипов. Для этого необходимо создать
чипы, содержащие такие варианты генов, о которых известно, что они являются
причиной заболеваний. ДНК пациента амплифицируют методом ПЦР, наносят
на чип, а затем с помощью светящейся метки определяют тот вариант гена, кото-
рым обладает пациент. Пациенту можно назначать различные лекарственные
препараты, чтобы найти среди них тот, который способен ингибировать эксп-
рессию дефектного варианта гена.
Например, ДНК-чипы можно использовать для поиска мутаций в генах
BRCA1 и BRCA2, которые в 60% случаев ответственны за возникновение на-
25.11. ЭСКИЗ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА
335
следственного рака молочных желез и яичников. При этом применяют ДНК-чипы
с фрагментами нормального гена BRCA1. Контрольную ДНК, не содержащую
мутаций, и образец ДНК из крови пациентки денатурируют, получая тем самым
однонитевую ДНК, которую затем расщепляют на более мелкие фрагменты и
метят флуоресцентными маркерами. ДНК пациентки помечают, к примеру, зе-
леным маркером, а контрольную ДНК — красным. Оба набора фрагментов на-
носят на чип и осуществляют гибридизацию с фрагментами гена BRCA1. Если
ген пациентки не содержит мутаций, он должен гибридизоваться с теми же
фрагментами BRCA1, что и контрольный образец (образец ДНК пациентки
идентифицируют по зеленому свечению, а стандартный образец — по красно-
му). Однако, если ген пациентки мутирован, фрагмент ее ДНК, несущий мута-
цию, гибридизоваться не будет.
Профиль экспрессии
Экспрессию генов анализируют по связыванию мРНК на ДНК-чипах. Это осу-
ществляется через транскрипцию последовательности гена ДНК в комплементар-
ную копию матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК). Далее с помощью
ферментов в рибосоме последовательность РНК транслируется в аминокислот-
ную последовательность, из которой строится определенный белок. Реакцию
клетки на определенные стимулы, например, на действие токсина можно оце-
нить, определяя их влияние на экспрессию генов, а именно, активируют они экс-
прессию или подавляют.
Характер (профиль) экспрессии, кроме того, используют для классифика-
ции различных видов рака и других заболеваний. Для этого сравнивают профиль
экспрессии генов у пациентов с известным типом заболевания с последователь-
ностями мРНК новых больных. В таких случаях известные последовательности
РНК, связанные с тем или иным типом заболевания, наносят на чипы в качестве
матрицы.
Анализ профиля экспрессии в дальнейшем будет играть очень важную роль
для классификации различных типов рака на основании активности генов в опу-
холевых клетках. Это поможет развитию специального лечения, направленного
против конкретного типа рака, а также позволит найти более эффективный спо-
соб терапии в каждом отдельном случае заболевания.
25.11. Эскиз генома человека
Составление «чернового варианта» генома человека осуществила группа лабо-
раторий, выполнявших секвенирование и получивших множество перекрываю-
щихся данных. Всего было определено свыше 22 млрд оснований, что в семь раз
превышает саму последовательность генома (т. е. можно сказать, что геном про-
секвенировали семь раз). В состав перекрывающихся фрагментов входит 3,9 млрд
оснований. Более 30% «чернового варианта» определено окончательно, т. е. с
высокой точностью (8-10-кратное перекрывание и точность 99,9%). В практиче-
336
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
ски полностью определенной части генома (89% целого генома) есть лишь не-
большое количество пробелов. Работы по завершению секвенирования
оставшихся частей продолжаются сейчас.
25.12. Геномика и протеомика: завершение рассказа
Основной единицей любой живой системы является клетка. Находящаяся в ядре
ДНК представляет собой инструкцию, руководящую деятельностью клетки,
главным образом, через синтез белков. Большинство жизненных функций осу-
ществляют именно белки, причем часто в виде комплексов. Для понимания фун-
кций белков, в том числе их роли в развитии различных заболеваний, и для
создания лекарств необходимо изучать экспрессию генов, приводящую к обра-
зованию белков, а также структуру и функции белков. В подобных исследовани-
ях широко применяют аналитические методы и приборы.
Геномика как наука изучает ДНК и принципы кодирования белков. Проте-
омика, в свою очередь, изучает клеточные белки — весь белковый состав клетки,
ткани или организма (протеома), а также включает анализ белковых взаимо-
действий и секвенирование белков для определения их первичной структуры.
Белки — это крупные молекулы, состоящие из 20 основных типов амино-
кислот (см. гл. 20 и 21). Последовательность нескольких связанных между со-
бой аминокислот называют полипептидом. Аминокислоты связываются друг с
другом в результате протекания реакции конденсации между карбоксильными и
О Н
аминогруппами, посредством образования пептидной || | связи. Синтез
—С—N—
белков из аминокислот закодирован в генах. Последовательность трех основа-
ний ДНК (называемая кодоном) определяет специфическую аминокислоту и
управляет процессом синтеза пептидной цепи. Например, нуклеотидная после-
довательность ATG кодирует аминокислоту метионин. Ген среднего размера со-
держит около 3000 оснований, т. е. 1000 кодонов. Следовательно, закодированный
в таком гене белок состоит из 1000 аминокислот. В этом суть генетического
кода: определенный набор кодонов управляет синтезом специфического белка.
Аминокислотная последовательность каждого белка заставляет его образовы-
вать специфическую трехмерную структуру, которая очень важна для функцио-
нирования белка в клетке (рис. 25.11).
Закодированная в генах информация передается путем образования комп-
лементарной однонитевой матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) в процес-
се, называемом транскрипцией. Молекулы мРНК выходят из ядра в цитоплазму,
где становятся матрицей для синтеза белка.
Выше мы описали подходы к изучению экспрессии генов с применением
ДНК-чипов, а также возможности использования полученной информации для
идентификации генетических мутаций, ответственных за те или иные заболева-
ния. Область протеомики распространяется еще дальше — на получение инфор-
мации о структуре белков. Существуют мощные методы, позволяющие разделять
и исследовать белки в смесях.
25.12. ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: ЗАВЕРШЕНИЕ РАССКАЗА
337
Первичная структура белка — последовательность
аминокислотных звеньев
Вторичная структура белка образуется при взаимо-
действии аминокислотных последовательностей по-
средством водородных связей
Третичная структура белка обеспечивается взаимо-
действием а-спиралей и складчатых слоев
Четвертичную структуру имеют белки, образован-
ные несколькими аминокислотными цепями
РИС. 25.11. Структура белка (воспроизведено с разрешения D. Leja, Национальный институт по
исследованию генома человека)
Двумерный гель-электрофорез
Двумерный гель-электрофорез в полиакриламидном геле (2D PAGE) — это
основной метод, применяющийся для разделения сложных белковых смесей.
Белки разделяют сначала по зарядам, а потом — по размерам. Образец помеща-
ют в верхнюю часть столбика геля для разделения с помощью изоэлектрофоку-
сирования, при котором белки движутся в электрическом поле в зависимости
от их заряда, достигая положения, соответствующего своей изоэлектрической
точке (см. гл. 21). В геле заранее создается градиент pH, что повышает эффек-
тивность разделения, подобно тому, как программирование температуры помо-
гает в проведении газовой хроматографии. После первого этапа разделения гель
помещают в верхнюю часть полиакриламидного геля, содержащего додецилсуль-
338
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
Рис. 25.12
Двумерный гель-электрофорез
(воспроизведено с разрешения
докт. Mike Dunn, Госпиталь
Харефилда, Миддлсекс,
Великобритания)
фат натрия (SDS), и подвергают белки, находящиеся в первом геле, электрофоре-
тическому разделению (SDS-PAGE). Такое двумерное разделение белков
обеспечивает очень высокое разрешение. Этим методом удается выявить до не-
скольких тысяч белков или белковых кластеров. На рис. 25.12 представлена ти-
пичная картинка разделения белковой смеси.
Масс-спектрометрия MALDI-TOF
После разделения белков встает проблема их идентификации, или обнаружения
конкретных белков. (Часто при изучении экспрессии белковые полосы, напри-
мер, из образца опухолевой ткани, сравнивают с полосами в контрольном
образце, а затем более детальному анализу подвергают лишь те, которые имеют
отличия от контрольных образцов. Для выявления различий белковые полосы
окрашивают флуоресцентными красителями.)
Идентификация белков подразумевает определение их аминокислотной по-
следовательности. Для этого из геля вырезают полосы, содержащие отдельные
белки, и расщепляют белки на пептиды. Для расщепления белков применяют
протеолитический фермент трипсин, который избирательно гидролизует только
те связи, которые образованы С-концевой группой аргинина или лизина. Затем
смесь пептидов анализируют с помощью масс-спектрометрии.
Для проведения масс-спектрометрии необходим источник ионизации и
анализатор (см. гл. 20). Наилучшим способом ионизации является лазерная де-
сорбция с использованием матрицы-мишени (matrix-assisted laser desorption
ionization— MALDI), а в качестве масс-анализатора часто применяют вре-
мя-пролетный детектор (time-of-flight — TOF). Комбинированный метод носит
название MALDI-TOF. MALDI обеспечивает «мягкую ионизацию», приводящую
лишь к весьма незначительным разрушениям высокомолекулярных веществ. Час-
то детектируют интактные (протонированные) пептиды, что облегчает идентифи-
25.12. ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: ЗАВЕРШЕНИЕ РАССКАЗА
339
кацию. Образец пептида смешивают с очень большим избытком матричного
материала, в качестве которого применяют небольшие поглощающие в УФ-диа-
пазоне органические молекулы (например, дигидроксибензойную кислоту), а
затем смесь высушивают на твердой подложке, создавая кристаллическую мат-
рицу. Матрицы поглощают свет на длине волны азотного лазера (377 нм) и пре-
вращают его в теплоту, что приводит к испарению и ионизации образца, при
которой пептид протонируется, приобретая заряд+1. Образующийся пар пода-
ется на детектор с помощью электростатических линз. Метод MALDI не толь-
ко обеспечивает возможность регистрации отдельного пика для каждого иона,
но и характеризуется высокой чувствительностью. Для получения хорошего
масс- спектра достаточно фемтомолярных (10-15) количеств образца.
Время-пролетный детектор TOF представляет собой простейший масс-ана-
лизатор. Он позволяет определить отношение m/z для ионов путем измерения
времени, необходимого ионам для преодоления фиксированного участка пути
до детектора. Все ионы, попадающие в анализатор, имеют одинаковую кинети-
ческую энергию, но скорость их движения зависит от массы, поэтому они дости-
гают детектора через разные промежутки времени.
Идентификация белков
В результате обработки трипсином белки расщепляются на смесь различных
полипептидов длиной, скажем, от 4 до 20 аминокислотных остатков. Метод
MALDI-TOF позволяет идентифицировать некоторые из них. Существуют базы
данных по белкам, в которых последовательности аминокислот содержат более
100 000 белков (см. Protein Information Resource: http://pir.georgetown.edu).
Компьютерные поисковые программы сравнивают экспериментальные резуль-
таты с пептидными последовательностями всех белков данного организма; в
каждом случае только один белок может давать наблюдаемый набор пептидов.
Достоверная идентификация белка возможна лишь в том случае, если пять или
шесть пептидов совпадают с предсказанной последовательностью. Полученные
экспериментальные данные можно сравнить с последовательностью любого че-
ловеческого белка.
Существуют и другие методы анализа белковых смесей, причем некоторые
из них еще находятся в стадии усовершенствования с целью ускорения процесса
обработки данных, поскольку быстрое развитие данной области науки требует
анализа большого количества образцов. Однако основная часть работ выполня-
ется с помощью описанных выше методов.
В данной главе мы остановились на принципах секвенирования и анализа
ДНК, а также на методах анализа сложных белковых смесей. Многие техниче-
ские детали этих методов остались вне нашего поля зрения. Для более подробного
ознакомления с биологией ДНК и белков рекомендуем обратиться к учебникам по
биохимии и молекулярной биологии, а ссылки, приведенные в тексте и в конце
главы, помогут в поиске соответствующей литературы.
340
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
Что мы узнали из этой главы?
• Структура ДНК — стр. 319
• Проект «Геном человека»: старт и финиш — стр. 323
• Секвенирование генов — полимеразная цепная реакция (ПЦР); плазмиды и
искусственные бактериальные хромосомы — стр. 325, 326, 327
• Секвенирование ДНК — разделение и идентификация нуклеотидов; гель-
электрофорез и капиллярный электрофорез — стр. 329
• Секвенирование целого генома методом дробления — стр. 333
• Полиморфизм отдельных нуклеотидов (SNP) как генетический маркер —
стр. 333
• ДНК-чипы — стр. 334
• Протеомика — разделение и идентификация белков: разделение методом
двумерного гель-электрофореза, идентификация методом масс-спектромет-
рии MALDI-TOF — стр. 336
Вопросы
1. Что такое гены и хромосомы?
2. Из чего состоит ДНК?
3. Что такое полимеразная цепная реакция?
4. Что такое плазмида и искусственная бактериальная хромосома?
5. Что такое геномная библиотека?
6. Расскажите о секвенировании ДНК дроблением.
7. Что такое SNP?
8. Что такое ДНК-чип?
9. Что такое профиль экспрессии?
10. Что изучают геномика и протеомика?
11. Каковы основные химические составляющие белка?
12. Каким образом в генах закодированы белки?
13. Что такое двумерный гель-электрофорез?
14. Что представляет собой метод MALDI-TOF?
15. Как осуществляют идентификацию белков на основании аминокислотных
последовательностей?
Задача
16. Вы провели электрофоретическое разделение нуклеотидных фрагментов
участка ДНК. Праймер имеет последовательность GATCCA. С помощью
четырех типов флуоресцентных меток были определены следующие остат-
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
341
ки: ATTGCAT. Эта последовательность перекрывается с фрагментом
CATTCCGTA, определенным с тем же праймером. Приведите последова-
тельность перекрывающихся участков.
Рекомендуемая литература
Интернет-сайты
1. www.oml.gov/hgmis — сайт Департамента энергетики США, содержащий
информацию о проекте «Геном человека». Раздел Education может послу-
жить прекрасным пособием по молекулярной генетике; он отражает карти-
рование и секвенирование генома человека, а также содержит словарь
терминов. Раздел Science behind the project представляет собой краткое
учебное пособие по основам клеточных функций — от генома до протеома.
2. www.nhgri.nih.gov — сайт Национального института по исследованию
генома человека при Национальном институте здоровья (NIH). Содержит
список генетических терминов и иллюстрации, а также информацию о про-
екте «Геном человека».
3- www.genome.washington.edu/UWGC — сайт Геномного центра Универси-
тета Вашингтона. Может служить превосходным учебным пособием, в том
числе по секвенированию методом дробления. Содержит подробную тех-
ническую информацию и списки генов.
4- http://science-education.nih.gov — разделы Snapshots of science и Medicine
содержат важные статьи, например, по ДНК-чипам.
5- http://seqcore.brcf.med.umich.edu — сайт центра по секвенированию
Университета Мичигана. Прекрасное учебное пособие по секвенированию.
6- www.ensembl.org — прекрасный сайт, посвященный структуре хромосом.
Содержит изображение каждой хромосомы. Указывая курсором на разные
участки хромосомы, вы можете получить детальную картину генов и SNP.
7- www.pbs.org/wgbh/nova/genome — хорошее наглядное пособие по ДНК и
секвенированию.
8- www.ncgr.org — сайт Национального центра генетических ресурсов.
Собрана информация по компьютерным технологиям.
Геном
9- К. Davies, Cracking the Genome: Inside the Race to Unlock Human DNA. New
York: Free Press, 2001.
Протеомы
10- S. P. Gygi, G. L. Corthals, Y. Zhang, Y. Rochan, and R. Aebersold, «Evaluation
of Two-Dimensional Gel Electrophoresis-Based Proteome Analysis Technolo-
gy», Proc. National Acad. Sci., 97 (2000) 9390.
342
ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ
11. М. Mann, R. С. Hendrickson, and A. Pandey, «Analysis of Proteins and Proteo-
mes by Mass Spectrometry», Ann. Rev. Biochem., 70 (2001) 437.
12. S. Pennington and M. J. Dunn, eds., Proteomics: From Protein Sequence to Fun-
ction. Berlin: Springer, 2001.
Биоинформатика
13. G. R. Grant and W. J. Ewens, Statistical Methods in Bioinformatics: An Introduc-
tion. Berlin: Springer, 2001.
14. S. Misener and S. A. Krawetz, eds., Bioinformatics: Methods and Protocols. To-
towa, NJ: Humana, 2000.
15. D. W. Mount, Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis. Cold Spring Har-
bor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
16. A. D. Baxevanis and B. F. Francis Ouellete, eds., Bioinformatics: A Practical
Guide to the Analysis of Genes and Proteins, 2nd ed. New York: Wiley-Liss,
2001.
Микрочипы
17. M. Schena, ed., Microarray Biochip Technology. Westborough, MA: Eaton,
2000.
18. M. Schena, ed., DNA Microarrays: A Practical Approach. Oxford: Oxford Uni-
versity Press, 1999.
19. J. B. Rampal, ed., DNA Arrays: Methods and Protocols. Totowa, NJ: Humana,
2001.
Глава 26
ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ
ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
Проблема состояния окружающей среды (качество воздуха и воды, накопление
твердых отходов, а также гигиена и безопасность труда) и его контроля постоян-
но находится в поле зрения широкой общественности. Мы, наконец, начали
осознавать, что эта сторона жизни чрезвычайно важна и сложна, и для осуществ-
ления многих замыслов многое еще предстоит сделать. Аналитическая химия
играет чрезвычайно важную роль как в анализе объектов, так и в контроле чисто-
ты окружающей среды. В данной главе мы кратко остановимся на некоторых ана-
литических методах, которые используются для отбора и анализа проб из
окружающей среды.
26.1. Получение представительных проб
Получение представительной пробы, возможно, является наиболее важным эта-
пом анализа состояния окружающей среды. В анализах подобного типа погреш-
ность при отборе пробы часто намного превосходит погрешность самого метода
анализа. Разброс данных, связанных с погрешностью аналитических измерений
геохимических образцов составляет 0,1% от общего разброса, в то время как
вклад погрешностей, вносимых отбором проб — 43%. При этом реальная вариа-
бельность геохимических характеристик составляет 53% [М. Н. Ramsey, «Ap-
propriate Precision: Matching Analytical Precision Specifications the Particular
Application», Anal. Proceed., 30 (1993) 112]. Для надежной интерпретации резу-
льтатов химического анализа суммарный разброс данных, обусловленный по-
грешностями отбора пробы и аналитических измерений, не должен превышать
20% общего разброса. Часто эта проблема связана с негомогенностью образцов.
Чтобы оценить количество образцов, необходимых для отбора пробы с приемле-
мой погрешностью, повторите разд. 3.23, посвященный этому вопросу.
Прежде, чем перейти к подробному рассмотрению методов отбора проб
воздуха, воды и твердых веществ, обратимся к некоторым общим вопросам, ка-
сающимся отбора проб.
344
ГЛАВА 26. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
Рисунок воспроизводится с любезного разрешения компании Merck KGaA
При анализе жидких и твердых образцов очень часто приходится прибегать
к экстракции, позволяющей выделять органические компоненты; для этого при-
меняют распространенные растворители. Кроме того для достижения необходи-
мой селективности иногда приходится регулировать pH, например, осуществляя
экстракцию из кислого раствора во избежание выделения основных компонен-
тов. Сейчас для твердых образцов используют такие эффективные методы, как
микроволновая экстракция или ускоренная жидкостная экстракция (см. гл. 19).
На сайте www.sampleprep.dug.edu перечислены методы ЕРА (Агентство по
охране окружающей среды США), в которых применяется микроволновая экст-
ракция. Там же перечислены кислоты, используемые для обработки образца с
целью определения того или иного элемента.
Перед проведением хроматографического разделения для выделения и кон-
центрирования анализируемого вещества часто применяют твердофазную экст-
ракцию (см. гл. 18).
26.2. Отбор и анализ проб воздуха
Ранее считалось, что после попадания какого-либо загрязняющего вещества в
атмосферу его химический состав не меняется, так что содержание этого веще-
ства отражает степень загрязнения. Однако теперь известно, что многие химиче-
ские вещества подвергаются в атмосфере фотохимическому разложению и
вступают в различные взаимодействия, в результате чего образуется целый ряд
26.2. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ВОЗДУХА
345
новых загрязняющих веществ. Ситуация усугубляется тем, что некоторые из
них могут быть более токсичными, чем исходные соединения. Например, всем
известный смог представляет собой результат взаимодействия оксидов азота,
углеводородов и солнечного света. Эти обстоятельства указывают на чрезвы-
чайную важность правильного отбора проб воздуха, для анализа которых могут
применяться самые разные методы.
Воздух состоит главным образом из N2,02 и Аг, на долю которых приходит-
ся 99,9% сухого воздуха. Кроме того, в воздухе может содержаться некоторое
количество водяных паров, следовые количества других газообразных компо-
нентов, а также аэрозолей и мелких частиц. В табл. 26.1 перечислены некоторые
наиболее важные с природоохранной точки зрения газообразные компоненты
атмосферы, а также указаны их концентрации в тропосфере. Обычно концентра-
ции газообразных веществ выражают в объемных долях (объем : объем). Напом-
ним, что концентрация вещества 1 ppm означает, что один его объем содержится
в 106 объемов воздуха. Концентрации, выраженные в объемных долях, не зави-
сят от температуры и давления. В то же время массовые концентрации, выражен-
ные в единицах масса : объем (обычно мг/м3; так принято выражать соединение в
воздухе аэрозолей и мелких частиц), зависят от температуры и давления. Поэто-
му такие величины следует приводить с указанием конкретных значений темпе-
ратуры и давления.
Таблица 26.1
Содержание в воздухе некоторых важных с природоохранной точки зрения газов
Вещество Содержание в воздухе (если присутствует), объем: объем Метод измерения
СО от 100 ppb до 20 ppm Электрохимический; ГХ
со2 345 ppm
сн4 2 ppm
CFC13 (фреон 11) 200 ppt ГХ, электронный захват
CF2C12 (фреон 12) 350 ppt ГХ, электронный захват
Углеводороды от 1 ppt до 1 ppb ИК
NO от 5 ppt до 1 ppb УФ; хемилюминесценция
no2 1-150 ppb Спектрофотометрия; хемилюминесценция
n2o 300 ppb ИК; ГХ, электронный захват
О3 1-100 ppb УФ; хемилюминесценция
so2 1-100 ppb Пламенная фотометрия; спектрофотометрия
ppb — частей на миллиард; ppm — частей на миллион; ppt — частей на триллион.
346
ГЛАВА 26. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
Общие принципы
При оценке состояния окружающей среды обычно преследуют цель определить
уровень содержания опасных веществ, установить химический состав среды,
оценить эффективность природоохранных мероприятий или выявить источник
загрязнений. Для решения этих задач, способ отбора пробы может играть весьма
важную роль. Мониторинг состава воздуха проводят во внешней среде, про-
мышленных и других выбросах газа, а для выявления специфических токсичных
веществ проверяют также состав воздуха в помещениях. Следует учитывать, что
состав воздуха во внешней среде подвержен краткосрочным и долгосрочным из-
менениям. Содержание озона в городской среде в течение суток претерпевает
циклические изменения, а в стратосфере изменяется лишь с изменением време-
ни года и, кроме того, постепенно снижается. Содержание таких газов, как диок-
сид углерода, оксид азота и метан, постепенно возрастает, примерно на 0,8%
в год.
Промышленные выбросы газа можно контролировать на выходе из выхлоп-
ных труб, где их концентрация намного превышает ту, что определяется позднее
в воздухе. Используют также методы дистанционного контроля.
1 Объем образца. Работа с газами отличается от работы с жидкостями или
твердыми веществами. Здесь приходится иметь дело с большими объемами.
В целом объем отбираемой пробы воздуха определяется концентрацией того ве-
щества, которое содержится в минимальном количестве, чувствительностью ме-
тодики анализа и требуемой точностью результата. Диапазон концентраций
веществ в пробе часто неизвестен, в таком случае объем образца устанавливают
методом «проб и ошибок». Для анализа состава воздуха в окружающей среде
могут потребоваться пробы, объем которых превышает 10м3.
2. Частота отбора проб. Максимально возможная частота отбора проб зависит
от характеристик устройства пробоотбора и определяется экспериментально.
Большинство приборов для отбора газовых проб характеризуются скоростями
потока от 0,003 до 0,03 м3/мин. Полнота отбора пробы не обязательно должна
составлять 100%, если она воспроизводится и ее значение может быть установ-
лено с помощью стандартных образцов. Тем не менее эта величина не должна
быть ниже 75%. Все устройства, предназначенные для отбора газовых проб,
имеют предел измерений, ниже которого эффективность отбора падает практи-
чески до нуля. Это значение варьируется для различных устройств, и его необхо-
димо определять в конкретных условиях анализа. Ниже приводится описание
некоторых подобных устройств.
3- Длительность отбора пробы. Время суток и длительность отбора пробы за-
висят от той информации, которую необходимо получить в результате проведе-
ния анализа. Помните, что анализ пробы, отобранной за определенный период,
позволит получить лишь усредненные данные для этого периода. Например, для
получения более значимых результатов относительно содержания СО в город-
ском воздухе отбор проб следует проводить в часы пик и между ними, на основа-
26.2. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ВОЗДУХА
347
нии чего можно реалистично оценить в среднем воздействие этого газа на
отдельного индивида. Часто для определения концентрации вредных веществ
требуется отбор серии проб через короткие интервалы. Для такого частого отбо-
ра проб требуется устройство, способное к эффективной работе при высокой
скорости потока. В подобных случаях более подходящим может оказаться не-
прерывный автоматический мониторинг с использованием высокочувствитель-
ного детектирующего устройства.
4. Хранение образцов. Сроки хранения образцов воздуха должны быть сведе-
ны к минимуму. Образцы следует защищать от нагревания и солнечного света.
Следует быть уверенным, что определяемый компонент не вступает в реакции с
другими веществами, содержащимися в смеси, или с материалом, из которого сде-
лан контейнер. Иногда образцы газа отбирают путем адсорбции на твердом носи-
теле, в таких случаях следует предотвратить десорбцию газа до проведения
анализа.
Устройства для отбора и анализа проб газов
Для периодического отбора проб газа требуются источник вакуума, устройство
для определения объема отобранного воздуха и коллектор или серия коллекто-
ров. Для контроля временного интервала между отборами проб и длительности
отбора используют таймер. Устройство для отбора проб (коллектор) раз-
мещается на входе прибора, затем расположено измерительное устройство, и,
наконец, вакуумный насос. Некоторые из наиболее часто применяемых прибо-
ров описаны ниже.
1 - Устройство для создания вакуума необходимо для пропускания образца
через коллектор. Чаще всего применяют автоматические или ручные вакуумные
насосы, аспираторы или автомобильные насосы. Если вакуумный насос затяги-
вает воздух через фильтр, на котором в процессе отбора пробы возможно паде-
ние давления (например, из-за частичного засорения фильтра), то следует
дополнительно использовать устройство, контролирующее постоянство потока
газа.
2 . Измерительное устройство. Существует два типа устройств для определе-
ния характеристик потока газа: для измерения скорости и определения объема.
Приборы первого типа невелики по размеру и недороги, но их недостаток заклю-
чается в том, что они определяют лишь мгновенные значения скорости, так что в
процессе отбора пробы их приходится неоднократно контролировать. Приборы
второго типа регистрируют общий объем проходящего сквозь них воздуха и,
следовательно, более полезны. Они, однако, громоздки и обычно стоят дороже.
Ротаметр — это прибор для измерения скорости потока, представляющий
собой градуированную трубку, в которой находится сферический поплавок
(рис. 26.1). Трубка имеет конусовидную форму, сужающуюся к низу. Газ пода-
ется в трубку через нижнее отверстие, при этом стальной поплавок занимает
определенное положение в зависимости от скорости потока газа и размера от-
348
ГЛАВА 26. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
верстия, которое изменяется с изменением диаметра трубки. Шкалу трубки калиб-
руется для каждого анализируемого газа (например, для воздуха). Существуют
графики, позволяющие вводить поправки на температуру и давление, а также
калибровать шкалу для определения скорости других газов.
Приборы для анализа сухого и влажного газа (роторные, турбинные,
диафрагменные и др.) используют для измерения объема газа. Система пласти-
ковых мехов поочередно заполняется и опустошается, перемещая стрелку через
систему рычагов; для приведения счетчика в действие требуется лишь неболь-
шое давление. Счетчик снабжен термометром и манометром для коррекции тем-
пературы и давления. Счетчик для сухого газа полезен для измерения больших
объемов, тогда как счетчик для влажного газа обычно применяют для более точ-
ных измерений малых объемов. Газ раскручивает ротор, который, в свою оче-
редь, запускает измерительное устройство. Корпус измерительного устройства
частично заполнен водой, в которой и вращается ротор. Прибор прокалиброван
в расчете на определенный уровень воды.
Насосы для отбора проб воздуха могут иметь встроенные измерительные
устройства. Насос может управляться компьютером, который задает время на-
чала и конца отбора пробы при периодическом, непрерывном или полупериодиче-
ском способе отбора. На рис. 26.2 представлено сенсорное устройство, работающее
в изотермическом режиме, при помощи которого автоматически осуществляет-
ся коррекция флуктуаций температуры (или давления). Данные автоматически
поступают в компьютер.
РИС. 26.1. Ротаметр.
Воспроизведено с разреше-
ния Fisher Scientific Со.
Рис. 26.2. Насос для отбора проб воздуха.
Воспроизведено с разрешения компании SKC
(www. skcinc. com)
26.2. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ВОЗДУХА
349
Все газовые счетчики необходимо калибровать до и после проведения ра-
бот, при этом обычно измеряют объем жидкости (воды), вытесняемой потоком
газа. Принцип такого метода калибровки проиллюстрирован на рис. 26.3. Перед
измерительным устройством помещают сатуратор (в котором воздух насыщает-
ся водой), чтобы предотвратить испарение части воды из емкости. Вытесняемую
воду взвешивают или измеряют ее объем. Определив с помощью встроенного
манометра давление, можно точно (с учетом температуры) рассчитать объем
газа в стандартных условиях.
3 - Устройства для отбора проб. Третьим элементом системы для отбора и ана-
лиза проб является коллектор. При этом пробой могут быть твердые и жидкие
аэрозоли, твердые частицы, а также газ или пар. Существуют разные типы кол-
лекторов, которые применяют для решения конкретных задач. К ним относятся
фильтры, стеклянные скрубберы и импинджеры (пылемеры). Ниже описаны эти
и другие устройства, используемые для отбора компонентов аэрозолей и газо-
вых смесей.
а) Отбор компонентов аэрозолей. Наиболее часто для отбора компонентов
аэрозолей используют фильтрацию. После сбора на фильтре аэрозоль взвеши-
вают или определяют его химический либо фракционный состав. Применяют
фильтры из волокнистых материалов (стекловолокно, древесное волокно), зер-
нистые фильтры (пористый фарфор, металл или керамика, песок), а также мемб-
ранные фильтры из эфиров целлюлозы. Фильтры последнего типа особенно
удобны для определения фракционного состава смесей. Большинство фильтров
не выдерживают высоких температур и повышенной влажности, но некоторые
стеклянные фильтры работают при температуре до 800 °C.
Вторым типом устройств для отбора проб аэрозолей являются импиндже-
ры (пылемеры), которые годятся как для твердых, так и для жидких аэрозолей.
При сухом методе улавливания частиц используют пылемеры, также называе-
мые импакторами; при этом аэрозоль проникает через поверхность, обра-
Манометр
Калибруемый
счетчик
Сатуратор
с водой
Сбор
вытесненной
воды
РИС. 26.3. Калибровка газовых счетчиков
350
ГЛАВА 26. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
Рис. 26.4
Каскадный импактор
Вход образца
Выход
образца
щенную к потоку воздуха. Каскадный импактор, схема действия которого
изображена на рис. 26.4, состоит из набора форсунок уменьшающегося размера,
расположенных под прямым углом и направляющих поток частиц на предмет-
ное стекло микроскопа. Такие импакторы эффективны для сбора частиц, размер
которых не превышает 2 мкм; их удобно использовать для микроскопического
анализа аэрозолей.
В мокром методе улавливания пыли аэрозоли проникают вглубь поверх-
ности, погруженной в жидкую среду (рис. 26.5). Стеклянная трубка с отверстием
на конце направлена к плоской поверхности, которая может являться дном кол-
лектора или стеклянной пластинкой, соединенной с трубкой. Поглощаемые час-
тицы удерживаются жидкостью в трубке, причем используемая жидкость не
должна растворять отбираемые частицы. Такие устройства позволяют отбирать
частицы размером 0,1 мкм.
Рис. 26.5
Импинджеры для мокрого улавливания пыли:
а — градуированный импинджер; б — миниатюрный
импинджер. Воспроизведено с разрешения Arthur Н. Thomas Со.
а
б
26.2. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ВОЗДУХА
351
Более сложные устройства — электростатические и термические преци-
питаторы — используют для сбора частиц размером 0,001-0,01 мкм.
б) Отбор компонентов газовых смесей. Газ и пар можно собирать путем по-
глощения жидкостью или на твердой поверхности, замораживанием или кон-
денсацией, а также с помощью вакуумного контейнера. Разница между газом и
паром состоит в том, что пар при обычных температурах и атмосферном давле-
нии можно легко сконденсировать, а газ — нет.
Газоадсорбционные трубки работают по тому же принципу, что и описан-
ные в гл. 20 термодесорбционные трубки; они используются для сбора летучих
органических веществ. Трубка может быть заполнена одним сорбентом или сме-
сью нескольких сорбентов. После сбора анализируемого вещества его необхо-
димо экстрагировать или десорбировать при повышенной температуре. Для
отбора локальных проб воздуха можно применять твердофазную микроэкстрак-
цию (см. гл. 18), выдерживая нить на воздухе до достижения равновесия. Если
нить заключена в иглу шприца, образец необходимо пропустить через иглу.
Кроме того, для отбора проб можно использовать описанные в гл. 20 приемы
анализа паров летучих веществ, а также технику очистки и улавливания при-
месей.
Мешки для сбора и хранения газовых проб используют для отбора проб газа
и пара, в которых концентрация определяемого вещества ниже уровня чувстви-
тельности анализатора (рис. 26.6; производство фирм Teflon и Tedlar). Обычно
мешки заполняют не более чем на 80%. Заполненные мешки не следует транс-
портировать воздушным путем, кроме как в герметичных кабинах, поскольку
понижение давления может привести к разрыву мешка.
Примеры насосов и коллекторов для отбора и анализа проб воздуха можно
найти на сайте www. skcinc. com. Кроме того, на этом сайте указаны стандарты
ЕРА, ASTM и государственных органов служб безопасности и гигиены труда в
США: OSHA, NIOSH.
Анализ проб воздуха
Большинство газов, представляющих интерес с точки зрения состояния окружа-
ющей среды, являются химически активными и могут быть селективно извлече-
ны из определенного объема воздуха с помощью раствора соответствующего
реагента, а затем подвергнуты химическому или физическому анализу. Газы,
молекулы которых образованы ковалентными связями, за исключением непо-
лярных двухатомных газов типа О2, N2 и С12, обычно имеют характеристичные
спектры поглощения в инфракрасной области, а также могут поглощать в
УФ-диапазоне. Газовый анализатор может селективно определять тот или иной
газ при различных длинах волн. Существуют недисперсионные инфракрасные и
ультрафиолетовые анализаторы, в которых имеются светофильтры для разных
длин волн.
Ниже описаны некоторые приемы, использующиеся для определения важ-
ных составляющих атмосферного воздуха. Для определения следовых коли-
честв веществ широко применяют газовую хроматографию.
352
ГЛАВА 26. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
Рис. 26.6. Мешок для хранения газовых проб. Воспроизведено с разрешения компании SKC
(www.skcinc.com)
Высокочувствительный метод определения диоксида азота в атмосфере
основан на поглощении этого газа раствором сульфаниловой кислоты и реаген-
та, способного образовывать азокраситель. Устойчивая розовая окраска раство-
ра развивается через 15 мин. Определяемое содержание диоксида азота в
атмосфере составляет от 0,005 до 5 ppm. Суммарное содержание оксидов азо-
та, в том числе закиси азота, в газообразных продуктах горения определяют пу-
тем отбора проб газа в находящийся под вакуумом сосуд с окислителем (перок-
сид водорода в разбавленной серной кислоте). Оксиды азота в таких условиях
превращаются в азотную кислоту. Затем образовавшиеся нитраты реагируют с
фенолдисульфокислотой, образуя желтый продукт, который определяют коло-
риметрически. Этим методом удается определить от пяти до нескольких тысяч
частей на миллион оксидов азота в пересчете на NO2. В щелочной среде диоксид
азота реагирует с люминолом, излучая фотоны при 425 нм; этим методом можно
определить порядка 30 ppt NO2.
Оксид азота(П) NO можно определять по поглощению в УФ-диапазоне.
Другой высокочувствительный и селективный метод определения основан на
реакции NO с О3, приводящей к образованию возбужденных частиц NO 2, которые
26.2. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ВОЗДУХА
353
при возвращении в основное состояние излучают в диапазоне от 590 до 2600 нм.
Закись азота N2O часто преобладает среди оксидов азота в атмосфере; этот газ
можно определить по поглощению в ИК-диапазоне или с помощью газовой хро-
матографии с детектором электронного захвата.
Озон определяют по поглощению в УФ-диапазоне. При реакции озона с
этиленом (С2Н2) образуются возбужденные частицы СН2О*, испускающие фо-
тоны при 430 нм; таким образом определяют концентрацию озона от 0,1 до
1000 ppb.
Для определения содержания в атмосфере SO2 известный объем воздуха
пропускают сквозь раствор тетрахлоромеркурата натрия. В результате реакции
образуется комплексный ион дихлоросульфитомеркурата(П) — HgCl2SO . Это
соединение не окисляется кислородом воздуха, а в кислой среде реагирует с
формальдегидом и парарозанилином, образуя окрашенную парарозанилинме-
тилсульфоновую кислоту, поглощающую при 560 нм. Данный метод высоко-
чувствителен и практически свободен от влияния мешающих веществ. Однако
определению мешают следовые количества таких металлов, как железо и маг-
ний, поэтому их следует предварительно либо удалить осаждением, либо свя-
зать с ЭДТА. Этот метод позволяет определить порядка 0,003 ppm диоксида
серы в атмосфере. Мониторинг содержания SO2 можно осуществлять методом
пламенной фотометрии с использованием воздушно-водородного пламени.
В таком пламени из SO2 образуется атомарная сера, для которой характерны ли-
нии испускания при 384,0 и 394,1 нм.
Общее содержание углеводородов в воздухе можно определить с помо-
щью ИК-спектрофотометрии. Углеводороды собирают в конденсационную
ловушку, погруженную в жидкий кислород. Поглощение углеводородов
измеряют в 3-4-микрометровом диапазоне инфракрасной области, применяя
ячейку с длиной пути 20 м. Количество углеводородов выражают как содержа-
ние гексана в частях на миллион, а аналитическое оборудование калибруют по
гексановому стандарту.
Хлорфторуглероды являются устойчивыми химическими соединениями;
их разделяют и определяют с помощью газовой хроматографии с детектором
электронного захвата.
Выхлопные газы анализируют путем установки сенсорных устройств в
поток газа. Кроме того, их можно анализировать на расстоянии спектрофото-
метрическим методом с помощью светового пучка, который пересекает зону
выхлопного газа и отражается обратно на детектор. Для отбора проб в трубе
размещают адсорбционную колонку и закачивают газ в анализатор или кол-
лектор.
В данном разделе мы коснулись лишь части многочисленных приемов, при-
меняемых для отбора проб воздуха. Кроме перечисленных газов, в воздухе опре-
деляют также ацетилен, общее содержание альдегидов, аммиак, формальдегид,
муравьиную кислоту, а также общее содержание органических кислот. Часто
анализируют различные аэрозольные фракции воздуха.
354
ГЛАВА 26. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
Пример 26.1
Содержащийся в воздухе бензол отбирали путем пропускания воздуха через ад-
сорбционную колонку в течение 10 мин со скоростью 1 л/мин при давлении
1 атм и температуре 75,0 °F. Затем бензол десорбировали, повышая температу-
ру, и определяли методом газовой хроматографии. В образце обнаружили 88 нг
бензола. Определите концентрацию бензола в воздухе в частях на миллиард
(объем : объем).
Решение
Масса бензола в 1 л воздуха составляет
881О~,Г .8,S.10-’ г/л
10,0 л воздуха
Переведем значение температуры из °F в кельвины:
75 °F -> 23,9 °C + 273,2 -> 297,1 К.
Исходя из закона Бойля, один моль паров чистого бензола занимает объем
TZ nRT 1 моль 0,08206 л • атм/(К - моль) -297,1 К _ . .
Р 1 атм
8,8-10-9 г/л воздуха-24,4л/моль -
-----------------------------= 2,75 • 10 л/л воздуха = 2,75 ppb (объем : объем)
78,11г/моль
Как калибруют газоанализаторы?
Точная калибровка газоанализирующих устройств имеет принципиальное зна-
чение. Для калибровки необходимо приготовить смесь газов известного состава
или использовать коммерческий стандартный образец. Статический способ при-
готовления смеси заключается в последовательном добавлении газообразных
компонентов в цилиндр и измерении его массы. Стандарты можно приготовить
и динамическим способом, разбавляя концентрированный стандартный газ или
смесь газов в потоке газа-носителя, например, воздуха или азота. В результате
получают поток газовой смеси с известной концентрацией газов-аналитов. Раз-
бавление можно осуществлять путем диффузии аналитов, например, NO или
SO2, из контейнера сквозь мембрану либо через капилляр. Скорость диффузии
зависит от давления паров вещества, температуры, свойств мембраны и геомет-
рических параметров устройства. Эту скорость определяют по уменьшению
массы контейнера.
26.3. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ВОДЫ
355
26.3. Отбор и анализ проб воды
Среди многих потенциальных источников загрязнения воды можно назвать та-
кие, как нефтяная промышленность, производства железа и стали, целлюлоз-
но-бумажная промышленность, добыча угля, химическая и пищевая индустрии,
а также сточные воды из жилых домов и общественных заведений. Эрозия почв
и отходы переработки руд также представляют собой важный источник загряз-
нений. Такое разнообразие источников загрязнения делает проблему монито-
ринга чистоты воды весьма сложной. Анализ воды требует определения
множества веществ и подразумевает применение самых разнообразных методов
анализа. Проблема мониторинга производственных выбросов во многих стра-
нах решается на государственном уровне.
Отбор проб воды
Для анализа воды пробы отбирают из разных источников, в том числе из поверх-
ностных слоев рек, озер и эрозийных стоков, из грунтовых и весенних сточных
вод, питьевых источников, эстуарных и соленых вод, из атмосферы (дожди, сне-
га, туманы, росы), паров и промышленных стоков. Некоторые образцы могут
иметь неоднородный состав в зависимости от места и времени отбора пробы.
Принципы отбора проб зависят от источника анализируемой воды.
Пробу воды можно брать на выходе из крана, в различных участках трубо-
проводных систем, с поверхности рек и озер, а также на разных глубинах водоемов.
Наиболее важный принцип отбора состоит в том, что частота и длительность отбо-
ра проб должны обеспечить получение представительных и воспроизводимых
данных. В некоторых случаях достаточно использование образцов, состоящих
из небольшого числа проб, отобранных через определенные промежутки вре-
мени.
Для взятия проб с разных глубин водоемов применяют специальные
устройства. Они должны иметь механизм, позволяющий открывать пробку при
погружении бутыли на заданную глубину. Такие устройства есть в продаже.
Образцы, предназначенные для транспортировки, следует помещать в бутыли,
объем которых превышает объем пробы минимум на 10-25 мл, поскольку жид-
кость в процессе транспортировки может расширяться.
Отбор проб грунтовых вод
Для мониторинга состояния грунтовых вод в грунте просверливают небольшие
скважины, обеспечивающие доступ к воде. Перед отбором пробы застоявшуюся
воду из скважины удаляют и дожидаются заполнения скважины свежей водой;
иногда необходимо промыть таким образом скважину несколько раз. Для отбора
проб используют электрические погружные, перистальтические или диафраг-
менные насосы, желонки (которые также пригодны для прочистки лунок) и диа-
лизные мембраны. Применение аспираторов и вакуумных насосов может
привести к потере летучих компонентов, но их преимуществом является то, что
они поддерживают тяжелые компоненты образца в виде суспензии. Перисталь-
356
ГЛАВА 26. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
тические насосы управляются с помощью многоваликовой вращающейся голов-
ки, которая сдавливает резиновую трубку, заставляя перемещаться находящуюся
в ней жидкость (как если бы вы сжатыми в кулак пальцами выдавливали из труб-
ки жидкость). Трубка насоса, соединенная с трубкой пробоотборника, должна
быть выполнена из медицинской силиконовой резины, в которой отсутствуют
органические перекиси, присутствующие в других сортах резины. Если в соста-
ве воды предполагается определять органические вещества, следует использо-
вать тефлоновые трубки.
Желонки удобны для отбора проб из водопонизительных скважин небольшо-
го диаметра. Недостатками такого способа отбора пробы является то, что образец
перемешивается и аэрируется, со дна скважины отбираются твердые частицы, а
летучие вещества испаряются из открытого сосуда. Желонку можно модифициро-
вать, снабдив ее клапаном нижнего отбора; ее следует погружать в воду медленно.
Для достижения большей точности результатов отобранные пробы следует
анализировать как можно быстрее. Некоторые параметры необходимо измерить
сразу в полевых условиях, поскольку по прибытии в лабораторию состав образ-
ца может измениться. К числу этих параметров относятся pH, температура, а
также содержание растворенных в воде газов: кислорода, сероводорода, диокси-
да углерода. В некоторых случаях до проведения анализа в лаборатории газы
можно связать при помощи необходимых реагентов. Следует принять меры про-
тив попадания в образец кислорода и диоксида углерода из воздуха. Контейнеры
для отбора проб должны быть чистыми, не загрязнять и не адсорбировать анали-
зируемые вещества. Тефлоновые контейнеры, хотя они и дорогие, наиболее
предпочтительны для хранения образцов, содержащих следовые количества
анализируемых веществ. Стеклянные контейнеры обязательно следует промыть
кислотой и раствором ЭДТА, чтобы свести к минимуму попадание в образец
следовых количеств металлов.
В ряде случаев анализы, которые необходимо проводить непосредственно в
месте отбора пробы (в полевых условиях), можно автоматизировать. Например,
для быстрого определения содержания кислорода применяют амперометриче-
ские датчики, которые можно поместить на любой глубине скважины в любой ее
точке. Автоматизированные устройства используют для периодического или
постоянного мониторинга. Например, проточно-инжекционная установка
(см. гл. 23), контролируемая компьютером или таймером, позволяет отбирать
пробы через определенные промежутки времени (возможно, пропуская их через
фильтр), а затем вводить их в анализатор и получать результаты. Детектирую-
щим устройством может служить простой колориметр, состоящий из неболь-
шой проточной ячейки, светоизлучающего диода и диодного детектора.
Мониторинг содержания фосфатов или нитратов осуществляют с применением
соответствующих реагентов.
Анализ образцов воды
Проблемы, возникающие при анализе проб воды, по существу не отличаются от
проблем, которые встречаются при анализе любых водных растворов. С некото-
рыми из определяемых в воде веществ, а также с соответствующими методами
26.4. ОТБОР ПРОБ ГРУНТА И ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ
357
анализа, вы можете ознакомиться, прочитав книгу [4]. К определяемым парамет-
рам относятся щелочность или кислотность раствора, биохимическое потребление
кислорода, содержание СО2, хлора, растворенного кислорода, электропровод-
ность, мутность, содержание фторидов, аммиака, фосфатов, нитратов, кремния,
сульфатов, сульфидов, сульфитов, ионов металлов и других взвешенных и рас-
творенных веществ, наличие бактерий и других микроорганизмов и т. д.
26.4. Отбор проб грунта и донных отложений
Состав донных отложений поверхностных водоемов изменяется в зависимости
от сезона в соответствии с изменением состава сточных вод, а также в зависи-
мости от глубины. В этих отложениях содержится гораздо больше органиче-
ских и неорганических веществ, чем в самой воде. Анализ состава донных
отложений важен для оценки переноса следовых элементов из отложений в
воду и обратно.
Для этого анализа обычно используют выборочную пробу, которую отбира-
ют с помощью дночерпателей, или берут буровую пробу. Выборочную пробу
легко извлечь и объем ее, как правило, велик. Недостатком такого способа отбо-
ра пробы является то, что структура образца нарушается, а мелкие частицы уно-
сятся водой. В буровой пробе мелкие частицы сохраняются, но такой способ
отбора позволяет покрыть лишь небольшую часть изучаемой площади дна, так
что количество проб сильно возрастает. Целостность слоев отложения по верти-
кали при отборе пробы сохраняется.
Для анализа часто берут смешанные образцы. Буровые пробы разделяют на
фракции и замораживают либо сначала замораживают, а перед анализом фрак-
ционируют. Образцы разделяют по размерам частиц с помощью мокрого или су-
хого просеивания (для неорганических веществ применяют полиэтиленовые
или нейлоновые сита, а для органических веществ — сита из нержавеющей ста-
ли). Образцы высушивают или при комнатной температуре, или при повышен-
ной (в зависимости от наличия летучих компонентов), а затем измельчают для
облегчения экстракции. Летучие вещества извлекают из мокрых образцов, хра-
нившихся в замороженном виде. Для определения следовых количеств металлов
образцы подвергают сухому озолению или обработке в септик-танках (подобно
тому, как поступают с биологическими образцами).
Образцы поверхности грунта часто отбирают для изучения последствий
разливов жидкостей. Если составляющие анализируемых образцов летучи или
если после разлива прошло длительное время, то может потребоваться отбор бо-
лее глубоких слоев почвы. Образцы поверхности с глубины от 15 до 30 см можно
отбирать с помощью совков, копалок или лопат. При определении органических
компонентов необходимо применять инструменты из нержавеющей стали, а для
определения неорганических веществ — из полиэтилена высокой плотности.
Для получения воспроизводимых результатов лучше использовать специальный
перфоратор (тонкостенную стальную трубку), которую погружают в грунт на
необходимую глубину.
358
ГЛАВА 26. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
Для получения образцов с глубины более 30 см может понадобиться доро-
гостоящее рытье траншей определенного профиля. Иногда используют ручные
или механические буры, а также грунтовые трубки. Образцы берут из выбурен-
ной породы. Наилучшим способом взятия пробы является бурение до необходи-
мой глубины и введение в лунку пробоотборника. Полученная таким путем
образец при извлечении полностью сохраняет свою структуру.
26.5. Пробоподготовка для определения следовых количеств
органических веществ
Для определения следовых количеств органических веществ в образцах объек-
тов окружающей среды необходимо отделить эти вещества от матрицы, что
чаще всего предполагает проведение экстракции. Обычно определяют содержа-
ние алифатических и ароматических углеводородов, альдегидов, фенолов, хлор-
содержащих растворителей, полихлорированных дифенолов, пестицидов, а
также фталатов и адипатов (попадающих в окружающую среду из производств
полимерных материалов).
Образцы воды удобно экстрагировать несмешивающимися с водой раство-
рителями, используя делительную воронку. Для выделения органических кис-
лот применяют полярные растворители, такие как этилацетат или диметиловый
эфир. Для экстракции нейтральных липидов (триглицеридов) и таких неполяр-
ных составляющих проб, как алифатические углеводороды и пестициды, подхо-
дят неполярные растворители: гексан, н-гептан, циклогексан или дихлорметан.
Разделение и концентрирование следовых количеств органических веществ из
образцов воды все чаще осуществляют твердофазной экстракцией.
Влажные образцы (грунт) обычно высушивают в вакуумных печах, а затем
измельчают. Перед проведением экстракции образцы вновь смачивают буфер-
ными растворами, что позволяет экстрагировать определяемые вещества сме-
шивающимися с водой растворителями, такими как ацетон.
Смесь твердого образца с растворителем взбалтывают или встряхивают, а
затем фильтруют или центрифугируют для осаждения балластной матрицы. Для
полного извлечения обычно необходимо провести трехкратную экстракцию с
небольшим количеством растворителя. В некоторых случаях помогает нагрева-
ние, а иногда для повышения эффективности процесса применяют ультразвук
(ультразвуковую ванну или зонд). Часто для экстракции используют метод Со-
кслета. Прибор Сокслета представляет собой круглодонную колбу, в верхней
части которой имеется пористый наконечник (экстрактор), куда помещают об-
разец. Растворитель постоянно циркулирует сквозь образец, достигая располо-
женного сверху холодильника. Образующийся в холодильнике конденсат
проникает сквозь матрицу вещества и насадку обратно в колбу. Проэкстрагиро-
ванное вещество собирается в колбе.
Экстрагированные из образцов вещества перед проведением анализа концен-
трируют, выпаривая растворитель при низкой температуре и пониженном давле-
26.7. МЕТОДИКИ ЕРА И СИСТЕМЫ ИЗМЕРЕНИЙ PBMS
359
нии. Летучие вещества в образцах донных отложений и грунтов можно отбирать и
определять напрямую методом парофазного хроматографического анализа.
После экстракции и концентрирования органических веществ можно осу-
ществить их дальнейшую очистку, например, пропуская через колонку с адсор-
бентом — оксидами кремния или алюминия. Непосредственно для анализа чаще
всего используют хроматографию. Пестициды обычно определяют методом га-
зовой хроматографии с детектором по захвату электронов или ГХ-МС. При
этом применяют неполярные капиллярные колонки для ГХ. Следовые количест-
ва полихлорированных дифенолов и полициклических ароматических углево-
дородов определяют методом ВЭЖХ с УФ-детектором.
26.6. Загрязненные участки земель - что нужно анализировать?
Одной из наиболее распространенных задач при оценке состояния окружающей
среды является определение степени загрязнения земельных участков. Для пра-
вильной оценки необходимо корректно провести отбор пробы. Разумеется, что
образцы следует брать из тех мест, где произошло загрязнение или куда загряз-
няющие вещества могли попасть. Следует проанализировать пробы поверхност-
ного грунта, буровые пробы, взятые на разной глубине, расположенные
поблизости стоки, воду рек и озер, донные отложения, а также растительность
на водной поверхности и на земле.
26.7. Методики Агенства по охране окружающей среды США
и системы измерений PBMS
Агентство по охране окружающей среды США (ЕРА) опубликовало несколько
сотен методик, официально принятых для определения содержания органиче-
ских и неорганических компонентов в воздухе, питьевой воде, сточной воде,
твердых отходах и др., а также для обнаружения пестицидов и токсичных ве-
ществ. В конце главы указаны Интернет-сайты, в которых приведены методики
ЕРА и ссылки на источники многих из них, причем некоторые доступны в режи-
ме онлайн.
Долгие годы для проведения официальных анализов требовалось примене-
ние только методик, утвержденных ЕРА, несмотря даже на то, что появлявшиеся
новые методики часто обладали более высокой чувствительностью, селектив-
ностью, скоростью выполнения анализа и меньшей стоимостью. Затем данное
правило стало менее жестким, и лаборатории получили право использовать но-
вые методики при условии, что они удовлетворяют определенным критериям.
Совет ЕРА утвердил применение системы измерений PBMS (performan-
ce-based measurement system — система измерений, основанная на показателях
эффективности), в которой строго оговорено, что следует определять, но не
предписывается, как это должно быть сделано. ЕРА описывает систему PBMS
как «набор процессов, в которых определяются требуемые данные, задачи и
360
ГЛАВА 26. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
ограничения программы или проекта и которые служат в качестве критерия для
выбора подходящих методов получения соответствующих данных с наи-
меньшими затратами» (см. www.epa.gov/sw-864/pbms.htm). Акцент делается на
результат, а не на способ, которым он будет достигнут. При этом приемлемый
уровень эффективности для каждой методики определяется с помощью таких
критериев как точность, пределы обнаружения, селективность, чувствитель-
ность и трудоемкость. Если лаборатория подтверждает, что ее методики удов-
летворяют данным критериям, то они принимаются. Более подробно процедура
такого утверждения изложена в гл. 4.
Что мы узнали из этой главы?
• Отбор образцов воздуха: порядок и устройства — стр. 344
• Некоторые примеры анализа проб воздуха — стр. 351
• Отбор проб воды из поверхностных водоемов и грунтовых вод — стр. 355
• Отбор проб грунта и донных отложений — стр. 357
• Экстрагирование следовых количеств органических веществ — стр. 358
• Методики ЕРА и системы измерений PBMS — стр. 359
Вопросы
1 - Назовите основные этапы отбора проб воздуха и использующиеся при этом
устройства.
2- В чем заключается главное назначение импинджеров и скрубберов?
3 - Какие меры предосторожности следует предпринять для сохранения образ-
цов воздуха до проведения анализа?
4- Перечислите основные вещества и параметры, определяемые в образцах
воды.
5- Какие основные параметры воды лучше определять в полевых условиях
сразу после взятия пробы?
Задачи
6. Было определено, что в 25 л воздуха содержится 2,8 ppm (объем : объем)
СО. Сколько граммов этого газа содержится в 1 л воздуха при 20 °C и дав-
лении 1 атм?
7- Содержание толуола в питьевой воде определяют методом ЕРА 502.2 для
летучих органических соединений (техника очистки и улавливания приме-
сей) с помощью капиллярной газовой хроматографии. Через образец воды
объемом 5 мл продувают гелий, а выделяющийся толуол адсорбируют в
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
361
пробирке с тенаксом. Пробирку нагревают и подвергают обратной продув-
ке гелием, чтобы десорбировать летучие органические вещества и перенести
их в капиллярную колонку. Для стандартного образца воды с содержанием
0,50 мкг/л толуола, подвергнутого данной процедуре, площадь хроматогра-
фического пика составляет 128, а для исследуемого образца — 97 единиц.
Какова концентрация толуола (в частях на триллион) в анализируемой пить-
евой воде?
Рекомендуемая литература
Общая
1 - D. Perez-Bendito and S. Rubio, Environmental Analytical Chemistry. Amster-
dam: Elsevier, 1998.
2. F. W. Fifield and P. J. Haines, eds., Environmental Analytical Chemistry, 2nd ed.
Oxford: Blackwell Science, 2000.
3. S. E. Manahan, Environmental Chemistry, 7th ed. Washington, DC: American
Association of Clinical Chemistry, 2000.
4- L. H. Keith, ed., Principles of Environmental Sampling, 2nd ed. Washington, DC:
American Chemical Society/Oxford, 1996.
5- J. M. Van Emon, C. L. Gerlach, and J. C. Johnson, eds., Environmental Immu-
nochemical Methods. Washington, DC: American Chemical Society, 1996.
6- W. L. Budde, Analytical Mass Spectrometry. Strategies for Environmental and
Related Applications. Washington, DC: American Chemical Society/Oxford,
2001.
7- R.-K. Smith, Handbook of Environmental Analysis, 4th ed. 1999; R. E. Wagner,
Guide to Environmental Analytical Methods, 4th ed. 1998, Amsterdam, NY: Ge-
nium. Доступны на CD-ROM вместе с печатными копиями.
Анализ воздуха
8- G. D. Wright, Fundamentals of Air Sampling. Boca Raton, FL: CRC Press, 1994.
9- K. R. Spumy, Analytical Chemistry of Aerosols. Boca Raton, FL: Lewis, 1999.
10- E. R. Kennedy, T. J. Fischbach, R. Song, P. M. Eller, and S. A. Shulman, Guideli-
nes for Air Sampling and Analytical Methods Development and Evaluation. Cin-
cinnati: NIOSH, USDHH, publication no. 95-117, 1995.
Анализ воды и грунта
11 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 20th ed. New
York: American Public Health Association, 1998.
12- L. H. Keith, Compilation of EP A’s Sampling and Analysis Methods, 2nd ed. Boca
Raton, FL: CRC Press, 1996.
362
ГЛАВА 26. ОТБОР И АНАЛИЗ ПРОБ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРВДЫ
13- Н. Giergielewicz-Mozajska, L. Dabrowski, and J. Namiesnik, «Accelerated Sol-
vent Extraction (ASE) in the Analysis of Environmental Solid Samples — Some
Aspects of Theory and Practice», CRC Critical Rev. Anal. Chem., 31 (2001) 149.
14. G. LeBlanc, «А Review of EPA Sample Preparation Techniques for Organic
Compound Analysis of Liquid and Solid Samples», LC-GC, 19(11) (2001) 1120.
Интернет-сайты
15. www.epa.gov/Standards.html — методы и директивы по анализу состояния
окружающей среды.
16. www.epa.gov/epahome/index — указатель к методам анализа, предложен-
ным ЕРА.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Теория указывает, эксперимент решает.
И. М. Колыпгоф
Я слышу — и забываю,
Я вижу — и запоминаю,
Я делаю — и понимаю.
Конфуций
Порядок приведенного в этом разделе описания практических работ соответст-
вует общему плану книги. Вступительные работы посвящены технике работы с
аналитическими весами и мерной посудой. Прежде чем приступать к экспери-
менту, еще раз прочитайте гл. 2, где рассмотрены основные инструменты анали-
тической лаборатории, а также изучите Приложение D, в котором описаны
правила лабораторной техники безопасности. Полезно также повторить гл. 3
(приемы обработки данных), в особенности разделы, касающиеся значащих
цифр и наложения (распространения) погрешностей, — тем самым вы будете
понимать, с какой точностью следует проводить те или иные измерения. Для по-
строения градуировочных графиков, расчетов концентраций и их погрешностей
вам предстоит использовать электронные таблицы. Правила работы с ними опи-
саны в гл. 3 и 16.
Техника работы
Работа 1. Техника взвешивания на аналитических весах
Прежде, чем приступать к работе, ознакомьтесь с основными принципами рабо-
ты весов и правилами взвешивания, описанными в гл. 2.
Основы
Скорее всего, вам предстоит работа либо с электронными, либо с механически-
ми одночашечными весами (если в лаборатории имеются механические двухча-
шечные весы, то с правилами работы на них вас познакомит преподаватель).
Электронные весы следует перед взвешиванием обнулить (оттарировать), нажав
на соответствующую кнопку. Для механических весов перед взвешиванием сле-
дует определить положение нулевой точки.
Реактивы и растворы
Не требуются.
364
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Методика
1 Обнуление весов либо определение положения нулевой точки. Слегка смах-
ните пыль с чашки специальной кисточкой и закройте дверцы весов.
(а) Для электронных весов. Включите весы и нажмите кнопку «нуль»
(«тара»). Должно установиться показание 0,0000 г.
(б) Для механических весов. Механические весы имеют рукоятку аррети-
ра с двумя положениями, соответствующими частичному и полному
освобождению коромысла. Освободите коромысло полностью и отрегу-
лируйте весы с помощью специальной рукоятки так, чтобы они показы-
вали нуль. Затем арретируйте весы и повторите описанные действия.
Далее на всем протяжении данной работы все операции по установле-
нию нулевой точки и точки покоя весов повторяйте дважды. В ходе по-
следующих работ достаточно однократных измерений.
Положение нулевой точки весов обычно изменяется со временем.
Это изменение может составлять несколько десятых миллиграмма за
несколько дней или даже часов. Поэтому при проведении каждой новой
серии взвешиваний положение нулевой точки следует устанавливать за-
ново. Если оно изменилось, весы необходимо вновь отъюстировать.
2. Взвешивание объектов. Определите массу трех контрольных объектов, вы-
данных преподавателем. Один из них может быть крышкой тигля, которую
предстоит взвесить также по разности (п. 3 данной работы).
(а) Для электронных весов. Проверьте, что весы по-прежнему показыва-
ют нуль. Поместите контрольный объект на чашку весов (объект следу-
ет брать пальцами непосредственно или обернув его полоской бумаги).
Закройте дверцы весов и после того, как показания установятся, считай-
те значение массы с точностью до 0,1 мг.
(б) Для механических весов. Если после последнего обнуления весов про-
шло более часа или если после этого весы использовались кем-либо
другим, положение нулевой точки следует проверить. Поместите кон-
трольный объект на чашку весов, взяв его пальцами или обернув поло-
ской бумаги (никогда ничего не кладите на чашку и не снимайте с нее,
не убедившись, что весы арретированы!). Закройте дверцы весов. Пере-
ведите рукоятку арретира в первое положение. При этом коромысло ве-
сов освобождается, но лишь частично, и при значительном отклонении
от равновесия оно снова оказывается арретированным. Это предохраня-
ет призмы от порчи в случае, если на весы помещен слишком тяжелый
предмет, а весы находятся далеко от равновесного положения. Вращая
соответствующие рукоятки, подберите нагрузку, близкую к массе объ-
екта, с точностью до 0,1 г (следите, чтобы коромысло все время было в
движении, т. е. находилось вблизи равновесия). Сначала подберите на-
грузку с точностью до 10 г, затем до 1 г и, наконец, до 0,1 г. После этого
полностью освободите коромысло и после успокоения весов считайте
значение массы с точностью до 0,1 мг при помощи нониуса или другой
цифровой шкалы. Запишите общее значение массы.
ТЕХНИКА РАБОТЫ. Работа 2
365
3- Взвешивание по разности. Возьмите тигель и крышку к нему (или любые
другие два объекта примерно такой же массы). Взвесьте крышку тигля,
как описано в п. 2, и запишите значение массы. Затем взвесьте два объекта
вместе и запишите значение суммарной массы. Снимите с весов крышку и
запишите значение массы тигля. Рассчитайте массу крышки как разность
двух последних значений масс. Эта величина не должна отличаться более,
чем на 0,5 мг, от величины, полученной посредством прямого взвешива-
ния.
4- Тарирование электронных весов. Поместите тигель на чашку весов и на-
жмите кнопку «нуль» («тара»). При этом должно установиться показание
весов, равное нулю. После этого поместите на чашку тигель вместе с крыш-
кой и считайте показание. Насколько близким оказалось полученное значе-
ние к величине массы крышки, найденной в п. 3?
Работа 2. Техника работы с пипетками, бюретками
и статистическая обработка данных
Основы
Проверка навыков в работе с пипетками осуществляется путем взвешивания ко-
личеств воды, несколько раз отобранных при помощи пипетки. Оценивается
воспроизводимость дозирования различных объемов. Аналогичные экспери-
менты можно провести и с бюретками. Полученные данные можно использовать
также для калибровки мерной посуды (при условии, что известна температура
окружающей среды, см. табл. 2.4).
Реактивы и растворы
Раствор моющего средства; дистиллированная вода.
Методика
1 Мытье стеклянной посуды. Проверьте бюретку и пипетки на чистоту, опо-
лоснув их дистиллированной водой и дав воде стечь. Если поверхность
стекла чистая, то она должна покрыться сплошной, без разрывов, пленкой
воды. В противном случае посуду следует вымыть. Для мытья бюретки ис-
пользуйте раствор моющего средства и специальный ершик. Пипетку опо-
лосните сначала теплой водой, затем теплым раствором моющего средства.
Если это не помогает, воспользуйтесь специальным моющим раствором.
После этого бюретку или пипетку несколько раз ополосните водопровод-
ной водой, а затем дистиллированной водой. В то время, когда бюретка не
используется, оставляйте ее заполненной дистиллированной водой. Перед
работой всегда проверяйте мерную посуду на чистоту и, если необходимо,
мойте ее. Если бюретку сразу после использования тщательно промыть, а
затем заполнить дистиллированной водой, то она остается чистой в течение
нескольких недель. Однако пипетки быстро загрязняются, поэтому их надо
мыть часто.
366
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
2. Отбор аликвоты при помощи пипетки. Поупражняйтесь в заполнении пи-
петки объемом 25 мл до метки до тех пор, пока это не начнет у вас хорошо
получаться. Верхнее отверстие пипетки закрывайте указательным паль-
цем; он должен быть слегка влажным. Если палец слишком мокрый, вам
будет невозможно регулировать течение жидкости.
Взвесьте чистую, сухую коническую колбу объемом 50 мл вместе с ре-
зиновой пробкой с точностью до 1 мг (0,001 г).
При помощи пипетки перенесите 25 мл воды в колбу, касаясь стенки
колбы носиком и давая воде спокойно стечь. Следите, чтобы вода не раз-
брызгивалась и чтобы капельки воды не попадали на горлышко колбы.
Важно, чтобы горлышко колбы, а также пробка оставались сухими на всем
протяжении эксперимента. Пипетку следует держать вертикально. Преж-
де, чем вынуть пипетку из колбы, необходимо выждать 10 с, чтобы вода
полностью стекла с ее стенок. Нельзя выдувать последнюю каплю. После
заполнения колбы закройте ее пробкой и взвесьте. Рассчитайте массу воды,
которая вытекла из пипетки.
Повторите описанную процедуру еще не менее двух раз. Перед каж-
дым последующим взвешиванием следует досуха протереть наружную по-
верхность колбы, включая горлышко. Рассчитайте стандартное отклонение
и разброс значений масс воды (в частях на тысячу), как описано в гл. 3.
Повторите эксперимент, используя пипетки объемом 1,5, 10 и 50 мл.
Сравните воспроизводимость результатов для разных пипеток.
3. Работа с бюреткой. Если бюретка снабжена притертым стеклянным кра-
ном, проверьте, смазан ли он и убедитесь в чистоте внутреннего канала и
носика бюретки. Заполните бюретку дистиллированной водой и закройте
ее кран. Вода должна быть комнатной температуры. Удалите все пузырьки
воздуха из носика бюретки и установите уровень жидкости вблизи нулевой
отметки. Оставьте бюретку на несколько минут для полного стекания воды
и запишите начальное значение объема с точностью до 0,01 мл по положе-
нию мениска, избегая параллакса.
Используя методику, аналогичную той, что описана для пипеток, спус-
тите из бюретки около 5 мл воды во взвешенную колбу. В конце удалите
висящую каплю, прикоснувшись кончиком бюретки к стенке колбы, и счи-
тайте значение объема с точностью до 0,01 мл. Закройте колбу пробкой и
взвесьте ее с точностью до 1 мг. Добавьте в колбу еще ~5 мл воды и снова
взвесьте ее. Продолжайте эти операции до тех пор, пока не спустите в кол-
бу полный объем бюретки, 50 мл.*
4И Калибровка мерной посуды. Если преподаватель предложит вам использо-
вать результаты этой работы для калибровки мерной посуды при помощи
данных табл. 2.4, пересчитайте значения взвешиваний на воздухе в значе-
ния объемов. Для этого следует измерить температуру вытекающей воды.
Чтобы уменьшить погрешности, связанные с испарением воды, преподаватель может предложить вам по-
сле каждого взвешивания заново заполнять бюретку до нулевого деления и спускать воду каждый раз в пу-
стую сухую колбу.
ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Работа 3
367
Табл. 2.4 в электронном виде имеется на компакт-диске. Вы можете скопи-
ровать ее в свой компьютер и ввести необходимые данные.
5- Статистическая обработка данных. Построение гистограммы распре-
деления. В ходе эксперимента выполните 20 измерений массы воды, выте-
кающей из пипетки объемом 1 мл как описано выше, последовательно
добавляя объемы воды в небольшую коническую колбу и каждый раз рас-
считывая увеличение ее массы. Не забывайте сразу же после добавления
очередной порции закрывать колбу пробкой. Постройте на миллиметровой
бумаге гистограмму частот значений масс. Рассчитайте стандартное откло-
нение полученных данных и отметьте соответствующий интервал на гис-
тограмме. Попадают ли 68% данных внутрь этого интервала?
Гравиметрический анализ
Работа 3. Гравиметрическое определение хлоридов
Основы
Хлориды, присутствующие в анализируемом растворе, определяют путем осаж-
дения хлорида серебра при помощи раствора нитрата серебра с последующим
фильтрованием, высушиванием и взвешиванием осадка. Содержание С1~ рас-
считывают по массе AgCl.
Уравнение реакции
Ag++ С1~ —> AgCl
Реактивы и растворы
1 Имеются в лаборатории. Конц. HNO3, конц. NH3, разб. НС1 (3 М).
2 . Готовят перед работой.
(а) ОД М AgNO3. Растворите ~3 г AgNO3 (не обязательно высушенного) в
-180 мл дистиллированной воды. Раствор следует хранить в посуде из
темного стекла. Следует избегать попадания раствора на кожу. При слу-
чайном попадании — немедленно смыть раствором тиосульфата на-
трия. Если раствор не удалить с кожи, то на ней в течение нескольких
часов образуется черно-коричневое пятно металлического серебра, ко-
торое не сходит 2-3 недели.
(б) Промывной раствор. К -600 мл дистиллированной воды добавьте
-2 мл конц. HNO3, не содержащей хлоридов. Заполните промывным
раствором промывалку.
Подготовка к работе
1 Получите у преподавателя анализируемую пробу.
(а) Растворы. Отдайте преподавателю чистую подписанную мерную кол-
бу объемом 250 мл, снабженную пробкой. Колбу следует вымыть и опо-
368
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
лоснуть 3—4 раза дистиллированной водой. Сушить колбу не нужно.
После получения анализируемого раствора разбавьте содержимое кол-
бы до метки дистиллированной водой и хорошо перемешайте (описание
техники работы см. в гл. 2).
(б) Твердые пробы. Получите у преподавателя пробу (растворимую в
воде), содержащую хлориды, и поместите ее в чистый бюкс для взвеши-
вания. Бюкс и крышку к нему поставьте в подписанный химический ста-
кан и закройте стакан часовым стеклом. Бюкс не следует закрывать
крышкой. Высушите пробу в сушильном шкафу при 120-160 °C в тече-
ние 1-2 ч (1 ч в вентилируемом шкафу, 2 ч — в невентилируемом). Перене-
сите бюкс и крышку в эксикатор и охладите до комнатной температуры.
Пока бюкс не охладится, закрывать его крышкой нельзя, иначе внутри
бюкса образуется разрежение.
2. Подготовьте три фильтрующих тигля, как описано ниже.
3. Приготовьте 0,1 М раствор AgNO3*
Подготовка фильтрующих тиглей
1 Стеклянные тигли с пористым дном. Подготовьте три тигля. Выберите
тигли с мелкими или средними, но не крупными порами. Отмойте каждый
тигель от поверхностных загрязнений при помощи воды и моющих средств,
промойте дистиллированной водой и вставьте в держатель колбы Бунзена,
подключенной к водоструйному насосу. Если требуется дополнительная
очистка тиглей при помощи химических реактивов, выполните процедуры,
описанные в конце работы. При малой скорости отсасывания промойте
каждый тигель несколько раз небольшими порциями дистиллированной
воды. После этого все три тигля поместите в подписанный (например, ва-
шими инициалами) химический стакан, закройте стакан часовым стеклом и
поставьте его в сушильный шкаф (120-130 °C) на 1-2 ч. Затем при помощи
чистых тигельных щипцов перенесите горячие тигли в эксикатор, охладите
в течение 30-40 мин и точно взвесьте. Повторите операции высушивания
(второй и, если потребуется, последующий раз — в течение получаса), ох-
лаждения и взвешивания тигля. Результаты последовательных взвешива-
ний не должны отличаться более, чем на 0,3-0,4 мг.
2 . Фарфоровые тигли с фильтрующими прокладками из стекловолокна (тиг-
ли Гуча). Поместите две фильтрующие прокладки на дно тигля так, чтобы
полностью его покрыть. Промойте водой, как описано выше, и высушите
до постоянной массы (расхождение в результатах не должно превышать
0,3-0,4 мг).
Скорее всего, в лаборатории имеется специальная емкость для сбора остатков веществ, содержащих сереб-
ро. Выбрасывать материалы, содержащие серебро, нецелесообразно ни с экономической, ни с экологиче-
ской точки зрения.
ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Работа 3
369
Методика
1 Подготовка пробы
(а) Растворы. Перенесите пипеткой три аликвоты объемом 50 мл в три от-
дельных химических стакана на 500 мл. К каждому раствору добавьте
по 100-150 мл дистиллированной воды и -0,5 мл конц. HNO3. Покройте
стаканы чистыми часовыми стеклами.
(б) Твердые пробы. После охлаждения пробы в эксикаторе в течение
30^10 мин точно взвесьте три навески массой по 0,2-0,3 г и перенесите в
пронумерованные стаканы объемом 400 мл. Пробы могут содержать
гигроскопичные карбонаты. В этом случае, в соответствии с рекоменда-
циями преподавателя, возьмите навески по разности. Растворите навес-
ки в дистиллированной воде и разбавьте до объема -150 мл. Добавьте
-0,5 мл конц. HNO3, не содержащей хлоридов. Если проба содержит
карбонаты, кислоту следует добавлять медленно до прекращения вспе-
нивания.
2. Осаждение. В предположении, что твердая проба представляет собой чис-
тый хлорид натрия, рассчитайте количество AgNO3 (в миллимолях), необ-
ходимое для полного осаждения хлоридов. Для медленного добавления
раствора осадителя лучше всего использовать бюретку. Хорошо промойте
бюретку сначала водопроводной водой, затем 3^4 порциями дистиллиро-
ванной воды и заполните ее раствором нитрата серебра с концентрацией
-0,1 М. Медленно, при интенсивном перемешивании добавляйте к анали-
зируемому раствору раствор осадителя до тех пор, пока добавленное коли-
чество осадителя не станет равным рассчитанному плюс 10%-й избыток.
Для коагуляции хлорида серебра раствор с осадком нагрейте почти до ки-
пения при частом или непрерывном перемешивании. Перемешивание по-
зволяет предотвратить образование пузырей, которое может привести к
потери осадка. Дайте осадку отстояться и проверьте полноту осаждения,
осторожно добавив несколько капель раствора нитрата серебра в прозрач-
ный раствор над осадком. Если при этом появляется помутнение или новые
частицы осадка, добавьте еще несколько миллилитров раствора нитрата се-
ребра, хорошо перемешайте, нагрейте, дайте осадку отстояться и снова
проверьте полноту осаждения. Так поступайте до тех пор, пока осаждение
не будет полным. После этого накройте стаканы часовыми стеклами и оста-
вьте их в месте, защищенном от света*, не менее чем на 2 ч. При необхо-
димости можно оставить стаканы до следующего дня или даже до
следующего лабораторного занятия также в темноте.
3. Фильтрование и промывание осадка. Осторожно слейте (декантируйте)
прозрачный раствор из первого стакана по стеклянной палочке через взве-
на свету AgCl разлагается по уравнению AgCl —> Ag + ^С12Т. При этом осадок окрашивается в пурпурный
цвет из-за образования частиц металлического серебра на его поверхности, а масса осадка уменьшается.
Как правило, даже при тщательной работе не удается избежать незначительного окрашивания осадка. Но
если все работы проводить в отсутствие сильного освещения (особенно солнечного), то потери осадка за
счет разложения крайне незначительны.
370
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
шейный фильтрующий тигель, помещенный в держатель колбы Бунзена.
Скорость отсасывания должна быть небольшой. После декантации всей
жидкости добавьте к осадку в стакане -25 мл промывного раствора, хоро-
шо перемешайте, дайте осадку отстояться и снова декантируйте раствор
через фильтрующий тигель. Азотная кислота, содержащаяся в промывном
растворе, замещает адсорбированный на поверхности осадка нитрат сереб-
ра. Кроме того, наличие электролита в промывном растворе необходимо
для предотвращения пептизации осадка. В процессе высушивания азотная
кислота улетучивается. Повторите промывание и декантацию четыре раза,
после чего перенесите основную массу осадка на фильтр при помощи ма-
лых порций промывного раствора. Оставшиеся твердые частицы, прилип-
шие к стенкам стакана, перенесите на фильтр при помощи резинового
наконечника палочки. Продолжайте промывание осадка в тигле порциями
промывного раствора до тех пор, пока последняя порция фильтрата не даст
отрицательной реакции на ионы серебра. Присутствие ионов серебра про-
веряют, добавив к раствору каплю разбавленной соляной кислоты. Всего
может потребоваться десять и более промываний. Отфильтруйте и промой-
те осадок из второго и третьего растворов таким же способом.
4. Высушивание и взвешивание осадка. Поместите тигли с осадками в химиче-
ский стакан, закройте его и поставьте в сушильный шкаф (120-130 °C) на
2 ч. Охладите тигли в эксикаторе и точно взвесьте. Повторяйте нагревание
в течение 1 ч до тех пор, пока последовательные результаты будут отлича-
ться не более, чем на 0,3-0,4 мг.
Очистка тиглей
По завершении анализа очистите тигли следующим образом. Сначала механиче-
ски удалите из тигля основную массу осадка, затем поместите тигли в химиче-
ский стакан, залейте в каждый тигель по 5 мл концентрированного раствора
аммиака и покройте стакан часовым стеклом. Через 10-15 мин перенесите один
из тиглей в держатель колбы Бунзена и промойте несколькими порциями дис-
тиллированной воды. Если фильтрующая пластинка тигля темная, отмойте тигель
от аммиака и обработайте его несколькими миллилитрами концентрированной
азотной кислоты описанным выше способом. В конце тщательно промойте ти-
гель дистиллированной водой.
Расчеты
1 Растворы. Рассчитайте массу хлорид-ионов (г), содержащуюся во всем ко-
личестве выданной вам пробы. Поскольку для каждого определения была
взята одна пятая часть пробы (50 мл из 250 мл), массу, рассчитанную для
каждой аликвоты, следует умножить на 5. Приведите каждый отдельный
результат, среднее и относительное стандартное отклонение.
2 . Твердые пробы. Рассчитайте массовую долю (%) ионов С1_ для каждой
порции анализируемой пробы. Приведите каждый отдельный результат,
среднее и относительное стандартное отклонение.
ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Работа 4
371
Работа 4. Гравиметрическое определение SO3
в растворимых сульфатах
Основы
Сульфаты осаждают в виде сульфата бария действием хлорида бария. Осадок
фильтруют через бумажный фильтр, фильтр озоляют и сжигают, а осадок про-
каливают до постоянной массы. Содержание SO3 рассчитывают по массе
BaSO4.
Уравнение реакции
SO^ + Ва2+-> BaSO4
Реактивы и растворы
1. Имеются в лаборатории. Разбавленный (0,1 М) раствор AgNO3, конц. HNO3,
конц. НС1.
2. Готовят перед работой. 0,25 М ВаС12. Растворите ~5,2 г ВаС12 (не обяза-
тельно высушенного) в 100 мл дистиллированной воды.
Подготовка к работе
1. Получение и высушивание образца. Получите у преподавателя пробу, со-
держащую растворимые сульфаты, и высушите ее в сушильном шкафу при
110-120 °C в течение не менее 2 ч. Затем охладите в эксикаторе (не менее
получаса).
2. Подготовка тиглей. Возьмите три чистых фарфоровых тигля и крышки к
ним. Поместите тигли на газовую горелку и прокалите при максимально
возможной температуре в течение 10-15 мин. Затем перенесите тигли в эк-
сикатор и охлаждайте, по крайней мере, 1 ч. Точно взвесьте каждый тигель
со своей крышкой. Между прокаливанием и взвешиванием тигли и крышки
следует брать только щипцами.
3. Приготовьте 0,25 М раствор ВаС12.
Методика
1. Подготовка пробы. Точно (до четырех значащих цифр) взвесьте три наве-
ски пробы массой по 0,5-0,7 г, используя прямой метод взвешивания. Пе-
ренесите каждую в стакан объемом 400 мл, растворите в 200-250 мл
дистиллированной воды и добавьте в каждый стакан по 0,5 мл конц. НС1.
2. Осаждение. Считая, что проба представляет собой чистый сульфат натрия,
рассчитайте количество хлорида бария (в миллимолях), необходимое для
полного осаждения сульфатов из самой большой навески. Регулируя пламя
горелки, максимально нагрейте растворы, разместив их на асбестовой сет-
ке, не доводя до кипения. Медленно по каплям добавляйте из бюретки
0,25 М раствор ВаС12 до тех пор, пока количество добавленного хлорида
бария не станет равным рассчитанному плюс 10%-й избыток. В ходе прибав-
ления осадителя раствор интенсивно перемешивайте. Дайте осадку отстоя-
372
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
ться, после чего проверьте полноту осаждения, добавив несколько капель
раствора сульфата бария без перемешивания. Если осадок продолжает об-
разовываться, то медленно, при перемешивании добавьте еще 5 мл раство-
ра хлорида бария, снова дайте осадку отстояться и еще раз проверьте
полноту осаждения. Повторяйте эти действия до тех пор, пока не будет до-
стигнута полнота осаждения. Оставьте стеклянную палочку для перемеши-
вания в стакане, закройте стакан часовым стеклом и оставьте его для
старения на водяной бане до тех пор, пока маточный раствор не станет про-
зрачным. Первоначально осадок состоит из очень мелких частиц. В ходе
старения частицы укрупняются; после этого осадок уже можно филь-
тровать. Для завершения старения требуется 30-60 мин, а возможно, и боль-
ше. Если объем раствора стал менее 200 мл, добавьте соответствующее ко-
личество дистиллированной воды.
3. Фильтрование и промывание осадка. Сложите три бумажных фильтра диа-
метром 11 см из мелкопористой фильтровальной бумаги (Whatman № 42
или равноценная ей). Сложенный фильтр должен плотно прилегать к по-
верхности воронки (в этом случае носик воронки будет постоянно запол-
нен жидкостью), иначе фильтрование будет очень медленным. О том, как
правильно складывать фильтр, см. в гл. 2. Растворы фильтруйте горячими.
Старайтесь не наливать в воронку слишком много жидкости, поскольку су-
льфат бария склонен «выползать» за верхний край фильтра. Смойте осадок
на фильтр горячей дистиллированной водой, перенесите на фильтр части-
цы осадка, приставшие к стенкам стакана, при помощи резинового наконеч-
ника палочки, снова обмойте внутреннюю поверхность стакана и перенесите
жидкость на фильтр. Очень тщательно проверьте, не осталось ли на стенках
стакана еще частиц осадка. Промывайте осадок и всю поверхность фильтра
горячей дистиллированной водой до отрицательной реакции фильтрата на
хлорид-ионы. Для проверки на хлорид-ионы к нескольким миллилитрам
фильтрата, слегка подкисленного концентрированной азотной кислотой,
добавьте несколько капель раствора нитрата серебра. В ходе промывания
старайтесь направлять струю воды так, чтобы максимально собрать осадок
у вершины конуса фильтра. Проверьте, не попали ли в фильтрат частицы
осадка.
4. Прокаливание и взвешивание осадка. Выньте фильтры из воронок и оставь-
те на некоторое время, чтобы они подсохли. Каждый фильтр сверните в ма-
ленький «фантик», не допуская разрывов и потери осадка, поместите в
предварительно взвешенный фарфоровый тигель и слегка придавите ко
дну тигля. Проверьте, не осталось ли на стенках воронок частиц осадка.
Если таковые обнаружатся, снимите их маленьким кусочком влажной без-
зольной фильтровальной бумаги и поместите его в соответствующий ти-
гель. Поместите каждый тигель в наклонном положении на фарфоровый
треугольник, установленный на кольцо штатива. Тигли не следует плотно
закрывать крышками. Осторожно нагревайте тигли на маленьком пламени
горелки до тех пор, пока из бумаги не испарится вся влага и не начнется
ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Работа 5
373
обугливание и выделение дыма. Отрегулируйте пламя таким образом, что-
бы бумага продолжала тлеть без возгорания. Если бумага все же загоре-
лась, накройте тигель крышкой на очень короткое время, чтобы погасить
огонь, и уменьшите пламя горелки. После того, как бумага полностью обуг-
лилась, а дым перестал выделяться, постепенно увеличьте температуру
пламени настолько, чтобы обеспечить полное выгорание угля. Допустимо,
чтобы в ходе прокаливания частицы угля раскалялись докрасна, но откры-
того возгорания не должно происходить. По окончании прокаливания оса-
док должен быть совершенно белым, без каких-либо темных вкраплений.
Дайте тиглю остыть, установите его в вертикальное положение на треуго-
льнике и смочите осадок 3-4 каплями разбавленной (1:4) серной кислоты.
После этого очень осторожно нагревайте тигель до полного удаления па-
ров кислоты. Обработка кислотой необходима для того, чтобы перевести
сульфид бария (который мог образоваться в результате восстановления
BaSO4 раскаленным углем) в сульфат. Затем закройте тигли крышками и
прокаливайте на полном пламени до темно-красного каления в течение
15 мин.
Закрытые тигли охладите в эксикаторе (не менее 1 ч) и взвесьте. Сно-
ва прокалите докрасна в течение 10-15 мин, охладите в эксикаторе и взве-
сьте повторно. Повторяйте прокаливание и взвешивание до тех пор, пока
два последовательных результата не совпадут в пределах 0,3-0,4 мг.
Расчеты
Рассчитайте массовую долю SO3 в каждой порции пробы. Приведите также
среднее значение и относительное стандартное отклонение.
Работа 5. Гравиметрическое определение никеля
с диметилглиоксимом в нихромовом сплаве
Основы
Никель образует с диметилглиоксимом (DMG) красный хелатный комплекс, ко-
торый по своим свойствам очень удобен для гравиметрического анализа. Полно-
та осаждения достигается в ацетатном буферном растворе или в аммиачной
среде. В ацетатной среде осаждение обычно ведут тогда, когда в пробе присутст-
вует Zn, Fe или Мп. В данной работе анализируемый объект представляет собой
нихромовый сплав, основными компонентами которого являются Ni (порядка
60%), Сг и Fe. Мешающее влияние Сг и Fe устраняют связыванием в комплексы
с тартрат- или цитрат-ионами. В этом случае осаждение можно вести в аммиач-
ном растворе. Содержание никеля рассчитывают из массы осадка (его формула
приведена в табл. 10.2).
Уравнение реакции
Ni2+ + 2HDMG -> Ni(DMG)2 + 2Н+
374
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Реактивы и растворы (имеются в лаборатории)
НС1 (1:1), HNO3 (1:1), NH3 (конц. и 1 : 1), 1%-й раствор DMG в этаноле, 20%-й
раствор лимонной кислоты, 30%-й раствор этанола.
Подготовка к работе
1 - Получите образец сплава у преподавателя.
2 . Подготовьте три стеклянных фильтрующих тигля. Высушите их до по-
стоянной массы (см. работу 3).
Методика
1. Растворение пробы. Точно взвесьте три навески сплава по 0,10-0,12 г. Пе-
ренесите их в отдельные пронумерованные стаканы объемом 400 мл и в
каждый добавьте по 25 мл НС1 (1 : 1) и HNO3 (1:1). Частично прикройте
стаканы часовыми стеклами и умеренно нагревайте под тягой до полного
растворения сплава и прекращения выделения бурых паров; обычно это за-
нимает 40-50 мин. (ПРИМЕЧАНИЕ. Если после растворения образца оста-
ются крупинки карбидов, необходимо поступить следующим образом. Не
допуская потерь, профильтруйте содержимое стакана через мелко- или
среднепористый фильтр (бумага Whatman № 40 или равноценная ей) в дру-
гой стакан объемом 600 мл. Несколько раз ополосните стенки первого стака-
на (на 400 мл) небольшими порциями дистиллированной воды и перенесите
жидкость через тот же фильтр во второй стакан (на 600 мл). Затем промойте
фильтр несколько раз малыми порциями воды. Наконец, выньте фильтр и
ополосните малыми порциями воды стенки и носик воронки, собирая всю
промывную жидкость во второй стакан.)
2. Осаждение. К каждому раствору пробы добавьте по 4-6 мл раствора ли-
монной кислоты и 100-150 мл воды. По каплям при перемешивании доба-
вьте конц. NH3 до образования слабощелочной среды (запах аммиака). На
это обычно идет 2-3 мл. Проверьте, что значение pH составляет около 8
(прикоснитесь концом стеклянной палочки, смоченным в растворе, к инди-
каторной бумажке, стараясь, чтобы на кончике палочки не было крупной
капли; в противном случае потеря части раствора может оказаться сущест-
венной). Если при этом выпал осадок, значит, количество добавленной ли-
монной кислоты оказалось недостаточным. В этом случае сначала растворите
осадок, добавляя по каплям разбавленную (1:1) НС1 до pH 3 (обычно на это
уходит 2-3 мл). Затем добавьте еще 1-2 мл раствора лимонной кислоты и
снова аммиак до слабощелочной среды. Если осадок больше не образуется,
добавьте НС1 (1 : 1) до получения слабокислой среды (исчезновение запаха
аммиака). Нагрейте растворы на электроплитке до 70-80°С, избегая кипе-
ния. Снимите растворы с плитки и по каплям при перемешивании добавьте
в каждый стакан 50 мл 1%-го раствора DMG. Если при этом выпал красный
осадок, добавьте НС1 (1 : 1) до его растворения. На этом этапе работы со-
держимое стакана должно представлять собой гомогенный раствор. Затем
по каплям при перемешивании добавьте разбавленный раствор аммиака (1 : 1)
до появления сильного аммиачного запаха (на это идет 3-4 мл). При этом
КИСЛОТНО-ОСНОВНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 6
375
образуется красный осадок. Важно, чтобы на этой стадии среда в растворе
была достаточно сильнощелочной, поэтому удостоверьтесь, что запах ам-
миака исходит именно из анализируемого раствора. На всякий случай може-
те проверить величину pH раствора (при помощи палочки и индикаторной
бумажки), — она должна быть выше 8,5. Во избежание потерь осадка луч-
ше это сделать после того, как основная масса осадка образовалась и осела
на дно. Закройте стаканы часовыми стеклами и оставьте стоять не менее
чем на 2 ч (лучше до следующего дня).
3. Фильтрование и промывание. Отфильтруйте осадки через предварительно
взвешенные стеклянные тигли при малой скорости отсасывания. После
того, как вы перенесете на фильтр основную массу осадка, ополосните ста-
кан слегка теплой дистиллированной водой и количественно перенесите на
фильтр остатки. Если последние частицы осадка пристали к стенкам стака-
на и не поддаются переносу при помощи резинового наконечника, раство-
рите их в нескольких каплях горячей НС1 (1 : 1) и снова осадите, добавив
несколько капель 1%-го раствора DMG и NH3 (1:1). Теперь осадок можно
легко перенести на фильтр. Промойте осадки в тиглях теплой водой не ме-
нее 3-4 раз. Наконец, промойте осадок один раз 30%-м раствором этанола —
при этом растворится весь избыток осадителя, который может находиться в
осадке.
4. Высушивание и взвешивание осадка. Поместите тигли в подписанный хи-
мический стакан и покройте его часовым стеклом. Высушите в сушильном
шкафу при 110-130 °C в течение 1-2 ч. Охладите тигли в эксикаторе
(ЗСМ10 мин) и точно взвесьте. Повторяйте высушивание в течение 1 ч до
достижения постоянного значения массы (в пределах 0,3-0,4 мг).
Расчеты
Рассчитайте массовую долю никеля (%) в каждой порции проанализированной
пробы. Приведите каждое отдельное значение, среднее и относительное стан-
дартное отклонение.
Кислотно-основное титрование
Работа 6. Определение подвижных протонов в кислотах
титрованием гидроксидом натрия
Основы
Необходимо приготовить раствор гидроксида натрия с концентрацией прибли-
зительно 0,1 М и стандартизировать его по первичному стандарту — гидрофта-
лату калия (КНР). Затем следует определить содержание подвижных протонов в
пробе, титруя его стандартизированным раствором гидроксида натрия.
376
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Уравнения реакций
if + ОН" -» f |[ + Н2О
^СС>2 ^^СОг
КНР
на-+он-->а2~ + н2о
Реактивы и растворы
1. Имеются в лаборатории. КНР, фенолфталеин (0,2%-й раствор в 90%-м
этаноле), 50%-й раствор NaOH.
2. Готовят перед работой*. NaOH, 0,1 М раствор, не содержащий карбона-
тов. Для его приготовления используют то обстоятельство, что Na2CO3,
присутствующий в таблетированном NaOH, практически нерастворим в
50%-м растворе (~19 М) NaOH. При стоянии такого раствора в течение не-
скольких дней (до недели) частицы Na2CO3 оседают на дно сосуда, и над
осадком образуется чистая прозрачная жидкость. Для приготовления рас-
твора NaOH, не содержащего карбонатов, ее следует осторожно декантиро-
вать. При растворении NaOH происходит сильное разогревание, поэтому
50%-й раствор NaOH готовят в стакане из боросиликатного стекла — на-
пример, фирмы Kimax или Pyrex. Затем раствор охлаждают и хранят в по-
лиэтиленовой посуде. 50%-й раствор NaOH, не содержащий карбонатов,
вам выдаст преподаватель.
Для этой работы будет также необходима вода, не содержащая СО2. Для ее
приготовления заполните круглую плоскодонную колбу объемом 1000 мл дис-
тиллированной водой почти по горлышко, поместите в нее стеклянные кипяти-
льники, нагрейте до кипения на газовой горелке с асбестовой сеткой и кипятите
в течение 5 мин. Затем закройте горлышко колбы перевернутым химическим
стаканом и охладите под струей воды. Приготовьте еще 800 мл воды таким же
способом.
Сосуд объемом 500 мл, снабженный резиновой пробкой, наполовину запол-
ните водой, не содержащей СО2, добавьте 2,5 мл прозрачного 50%-го раствора
NaOH, закройте пробкой и перемешайте вращательными движениями**. Ста-
райтесь по возможности избегать контакта раствора с атмосферным воздухом.
Затем добавьте воды, не содержащей СО2, почти до полного объема сосуда, за-
кройте пробкой и тщательно перемешайте.
Раствор гидроксида натрия, приготовленный описанным способом, имеет
концентрацию приблизительно 0,1 М. Его необходимо стандартизировать по
первичному стандарту — гидрофталату калия.
* Если раствор NaOH предполагается использовать и в работе 7 (для стандартизации НС1), следует пригото-
вить 1 л раствора.
Если бы исходный препарат NaOH был химически чистым, для приготовления 500 мл 0,1 М NaOH потре-
бовалось бы лишь 2 г NaOH, т. е. 2 мл 50%-го раствора. Мы рекомендуем брать 2,5 мл, чтобы компенсиро-
вать массу, приходящуюся на долю воды и Na2CO3, которые содержатся в таблетированном NaOH.
КИСЛОТНО-ОСНОВНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 6
377
Подготовка к работе
1. Получение и высушивание гидрофталата калия. Поместите в бюкс прибли-
зительно 4 г гидрофталата калия и высушите при 100-120 °C в течение
1-2 ч. Затем охладите бюкс в эксикаторе в течение ЗСМЮ мин перед взве-
шиванием.
2. Получение и высушивание пробы. Проба может представлять собой раствор
или твердое вещество. Если она твердая, получите ее накануне эксперимен-
та в бюксе и высушите при 110-120 °C в течение 2 ч. Пробу храните в экси-
каторе. Если это раствор, получите его в чистой мерной колбе объемом
250 мл, заполните колбу до метки водой, не содержащей СО2, и хорошо пе-
ремешайте.
Методика
1. Стандартизация 0,7 MNaOH по гидрофталату калия. Точно взвесьте три
навески высушенного гидрофталата калия массой 0,7-0,9 г каждая и пере-
несите их в чистые широкогорлые конические колбы объемом 250 мл.
(ПРИМЕЧАНИЕ. Указанные количества гидрофталата калия рассчитаны
на титрование с использованием бюреток объемом 50 мл. Если вы работае-
те с бюретками объемом 25 мл, преподаватель укажет вам, какие количест-
ва гидрофталата калия, а также какие пробы следует брать в этом случае.)
При взятии навесок можно применять прямой метод взвешивания с тариро-
ванием. Растворите каждую навеску в ~50 дистиллированной воды, не со-
держащей СО2. Ополосните бюретку тремя небольшими порциями 0,1 М
NaOH, затем заполните ее этим раствором и установите мениск на уровне
вблизи нулевой отметки. Запишите начальное показание бюретки с точно-
стью до 0,02 мл. К каждой порции раствора гидрофталата калия (КНР) до-
бавьте 2-3 капли раствора фенолфталеина и титруйте 0,1 М раствором
NaOH до получения бледно-розовой окраски. Окраска должна быть устой-
чивой в течение 30 с. Вблизи конечной точки добавляйте капли раствора
титранта по частям. Запишите показание бюретки с точностью до 0,02 мл.
Исходя из массы КИР, рассчитайте в каждом случае значение мольной
концентрации раствора NaOH с точностью до четырех значащих цифр (или
трех, если она окажется ниже 0,1 М). Вычислите среднее значение.
В ходе работы раствор NaOH храните в сосуде с плотно закрытой
пробкой и по возможности избегайте контакта раствора с воздухом, чтобы
уменьшить поглощение СО2. По тем же причинам старайтесь приступить к
анализу пробы как можно скорее. В любом случае стандартный раствор
NaOH необходимо использовать в течение недели после его приготовле-
ния. По истечении этого срока его концентрация может измениться, и мо-
жет потребоваться новая стандартизация*.
Если вы планируете использовать раствор NaOH для стандартизации раствора НС1 в ходе выполнения ра-
боты 7, то в соответствии с указанием преподавателя сохраните оставшийся раствор. В этом случае рас-
твор НС1 следует приготовить и стандартизировать в течение недели после стандартизации NaOH.
378
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
2. Определение подвижных протонов в образце, содержащем кислоту. Если
образец содержит слабую кислоту (например, КИР или уксусную), вам бу-
дет предложено использовать в качестве индикатора фенолфталеин (об из-
менении его окраски в конечной точке см. выше). Если же он содержит
сильную кислоту, вы можете применять и другой индикатор, например,
хлорфеноловый красный (изменение окраски с желтой до фиолетовой).
Если образец твердый, высушите его в течение 2 ч при 110 °C и охлади-
те (30 мин). Преподаватель укажет вам примерную массу навески, которую
следует взять, чтобы на титрование пошло 30-40 мл раствора NaOH. В ча-
стности, если это чистый гидрофталат калия, следует взять приблизительно
1 г. Возьмите три навески с точностью до 0,1 мг и перенесите их в пронуме-
рованный широкогорлые конические колбы объемом 250 мл. Растворите
каждую навеску в 50 мл воды, не содержащей СО2 (если необходимо — при
нагревании). Добавьте две капли раствора индикатора и титруйте 0,1 М
раствором NaOH до изменения окраски. Окраска должна быть устойчива в
течение 30 с.
Если образец представляет собой раствор, перенесите с помощью пи-
петки три аликвоты объемом 50 мл в колбы для титрования и титруйте, как
описано выше.
Расчеты
1. Твердые пробы. Рассчитайте массовую долю (%) подвижных протонов,
либо массовую долю КНР в каждой порции пробы.
2. Растворы. Рассчитайте массу (мг) подвижных протонов во всем количест-
ве пробы. Поскольку для каждого определения берется одна пятая часть
всей пробы (50 мл из 250), то массу, рассчитанную для каждой аликвоты,
следует умножить на 5.
Работа 7. Определение общей щелочности
в пробе технической соды
Основы
Перед выполнением определения необходимо стандартизировать 0,1 М раствор
НС1 по первичному стандарту — карбонату натрия. Для приближенной оценки
половины объема титранта, требуемого для титрования, используют фенолфта-
леин, а для точной индикации конечной точки — модифицированный метило-
вый оранжевый или бромкрезоловый зеленый. В последнем случае раствор
вблизи конечной точки следует прокипятить, чтобы удалить СО2 (см. рис. 8.11 и
комментарии к нему). Раствор НС1 можно стандартизировать и по стандартизи-
рованному в ходе выполнения работы 6 раствору NaOH с индикатором фенол-
фталеином. Пробу технической соды титруют раствором соляной кислоты по
второй ступени (2 моль НС1 на 1 моль Na^O^.
КИСЛОТНО-ОСНОВНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа?
379
Уравнения реакций
Реактивы и
растворы
СО^“ + 2Н+ Н2СО3
Н2СО3 Н2О + СО2Т
1. Имеются в лаборатории. 0,2%-й раствор фенолфталеина в 90%-м этаноле,
модифицированный метиловый оранжевый (смесь метилового оранжевого и
ксиленцианола FF; поставляется фирмой Eastman Kodak Со.), либо 0,1%-й
раствор бромкрезолового зеленого в 0,001 М NaON, а также первичный
стандарт — Na2CO3, либо стандартизированный раствор NaOH (0,1 М).
2 - Готовят перед работой. 0,1 М НС1. Готовится разбавлением из конц. НО с
плотностью 1,18 г/см3 и массовой долей НС1 37%. Из этого можно рассчи-
тать, что для приготовления 500 мл 0,1 М раствора следует взять около 4 мл
конц. НС1. При помощи мерного цилиндра отмерьте ~4,5 мл конц. НС1
(т. е. с избытком 0,5 мл) в сосуд объемом 500 мл с притертой пробкой, за-
полненный почти до горлышка дистиллированной водой *. Тщательно пе-
ремешайте раствор до полной однородности.
Подготовка к работе
1 - Получение и высушивание Na2CO3. Если вы будете стандартизировать НС1
по Na2CO3, получите у преподавателя бюкс, содержащий около 2 г Na2CO3
(первичный стандарт). Поместите бюкс и отдельно крышку в подписанный
стакан объемом 150 мл и высушите при 160 °C в течение 2 ч или более. Пе-
ред взвешиванием охладите в эксикаторе (не менее 30 мин).
2 . Получение и высушивание пробы. Получите у преподавателя бюкс с пробой
и высушите ее так же, как Na^C^.
Методика
Для стандартизации НС1 используйте один из двух вариантов, приведенных
ниже.
1 - Стандартизация HCl по Na2CO3. Точно (до 0,1 мг) взвесьте бюкс с высу-
шенным карбонатом натрия. Во время взвешивания бюкс должен быть за-
крыт крышкой. Перенесите без потерь около 0,2 г (в пределах 0,16-0,24 г)
карбоната натрия в чистую коническую колбу объемом 250 мл. Снова взве-
сьте бюкс и рассчитайте точную массу перенесенного Na2CO3 по разности
(взвешивание «по разности» необходимо провести из-за гигроскопичности
Na2CO3). Повторите эти процедуры со второй и третьей порциями соды.
В каждую колбу добавьте приблизительно 50 мл дистиллированной воды и
1-2 капли раствора индикатора фенолфталеина.
Если вам предстоит выполнить и работу 19 (потенциометрическое титрование образца технической соды),
приготовьте вдвое больше раствора кислоты и используйте найденное в ходе стандартизации значение
концентрации для выполнения работы 19.
380
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Сначала (с фенолфталеином) Na2CO3 титруют по первой ступени
(СОз" + Н+ —> НСО3) до исчезновения розовой окраски раствора с тем,
чтобы приблизительно оценить объем титранта, требующийся на титрова-
ние по второй ступени (с модифицированным метиловым оранжевым или
бромкрезоловым зеленым; при этом присоединяется еще один протон:
НСО3 + Н+ —> Н2СО3). Трижды ополосните бюретку малыми порциями
(приблизительно по 5 мл) 0,1 М раствора НС1, приготовленного ранее, по-
сле чего заполните бюретку приблизительно до нулевой отметки. Запиши-
те начальное значение объема с точностью до 0,02 мл. Титруйте первую
порцию карбоната натрия, добавляя титрант со скоростью не более 0,5 мл в
секунду и непрерывно перемешивая раствор, до исчезновения розовой
окраски. Требуемый для этого объем титранта составляет примерно поло-
вину конечного (в действительности — немного более). Оцените этот объ-
ем, имея в виду, что он будет немного меньше, чем удвоенное значение
объема, соответствующего первой конечной точке. Продолжайте титрова-
ние, используя одну из двух описанных ниже методик: (а) или (б).
(а) Индикатор модифицированный метиловый оранжевый. Прежде,
чем продолжить работу, еще раз обсудите с преподавателем, какой ин-
дикатор вам предстоит использовать. Добавьте 2-3 капли раствора моди-
фицированного метилового оранжевого и титруйте до изменения окраски
с зеленой на серую. Для более точной индикации конечной точки можно
сравнить окраску титруемого раствора с окраской раствора «свидете-
ля». Для его приготовления растворите 0,20 г гидрофталата калия в
100 мл дистиллированной воды и добавьте 2 капли раствора индикато-
ра; pH такого раствора составляет 4,0, что соответствует pH в конечной
точке титрования Na2CO3 в присутствии растворенного СО2. Эту же
методику используйте и для анализа пробы.
(б) Индикатор бромкрезоловый зеленый. Добавьте в колбу 2-4 капли
раствора бромкрезолового зеленого. При работе с этим индикатором бу-
дет наблюдаться переход окраски из синей через бледно-зеленую к жел-
той. Сначала титруйте раствор до тех пор, пока он не станет голубовато-
зеленым (это произойдет непосредственно перед конечной точкой).
В этот момент прервите титрование и осторожно прокипятите раствор
2-3 мин для полного удаления диоксида углерода. При этом раствор
опять станет синим. Охладите раствор до комнатной температуры и
продолжите титрование, пока раствор не приобретет бледно-зеленую
окраску. Этот момент будет соответствовать конечной точке.
Оттитруйте две другие порции тем же способом, что и первую, и по
массе каждой из навесок рассчитайте мольную концентрацию НС1. Не
забывайте, что один карбонат-ион взаимодействует с двумя протонами.
Для последующих расчетов состава пробы используйте среднее из по-
лученных значений.
КИСЛОТНО-ОСНОВНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 8
381
2. Стандартизация НС1 по предварительно стандартизированному 0,1 М
NaOH (альтернативная методика)*. Ополосните пипетку объемом 25 мл
0,1 М раствором НС1 и перенесите пипеткой 25 мл этого раствора в кониче-
скую колбу объемом 250 мл. Добавьте 2-3 капли раствора индикатора фе-
нолфталеина. Ополосните бюретку тремя небольшими порциями 0,1 М
раствора NaOH, приготовленного и стандартизированного в ходе выполне-
ния работы 6. Заполните бюретку приблизительно до нулевой отметки.
Раствор NaOH помещают в бюретку, а не в колбу, с тем, чтобы по возмож-
ности предотвратить его контакт с атмосферным СО2. Запишите начальное
показание бюретки с точностью до 0,02 мл. Титруйте раствор кислоты до
появления бледно-розовой окраски, устойчивой в течение 30 с. Повторите
титрование еще два раза. Если при первом титровании расход NaOH соста-
вит менее 25 мл, для повторных титрований берите аликвоты НС1 по 50 мл.
Рассчитайте мольную концентрацию раствора НС1.
3- Определение карбоната натрия в технической соде. Возьмите по разности
три точные навески пробы по 0,25-0,35 г, растворите каждую в ~60 мл воды
и титруйте 0,1 М раствором НС1 по той же методике (включая выбор инди-
катора и индикацию конечной точки), по какой вы стандартизировали НС1
по Na2CO3. Если вы не проводили стандартизацию по Na2CO3, методику
укажет преподаватель.
Расчеты
Рассчитайте массовую долю (%) Na2CO3 или N^O в каждой порции пробы.
Работа 8. Определение бикарбонатов в крови
при помощи обратного титрования
Основы
Порядка 95% диоксида углерода в крови человека находится в форме НСО3,
остальная часть — в виде растворенного СО2. Концентрация НСО3 во многих
случаях является диагностическим показателем. Чтобы ее определить, к пробе
добавляют избыток 0,01 М НС1 для перевода НСО3 в летучий СО2 и удаления
газа (раствор при этом необходимо тщательно перемешивать), а затем оттитро-
вывают непрореагировавшее количество НС1 0,01 М раствором NaOH. 0,01 М
растворы НС1 и NaOH готовят разбавлением соответствующих стандартизиро-
ванных 0,1 М растворов.
Уравнения реакций
НСО 3 + Н+ -> Н2О + co2t
Н+ (избыток) + ОН- —> Н2О
* Раствор гидроксида натрия является вторичным стандартом, и любые погрешности, допущенные при
его стандартизации, скажутся на результатах стандартизации соляной кислоты. Гидроксид натрия необхо-
димо использовать в течение недели после его стандартизации. Если эта работа выполняется раньше, чем
работа 6, где применяется стандартный раствор NaOH, описанную методику можно использовать для
стандартизации NaOH.
382
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории, 0,1%-й раствор фенолового красного (фенол-
сульфофталеина) в 0,003 М NaOH, 1%-й солевой раствор (NaCl) в воде, не
содержащей СО2 (см. работу 6), пеноподавитель Antifoam A (Dow Coming
Corp.).
2 . Готовят перед работой. Стандартные 0,1 М и 0,01 М растворы НС1 и
NaOH. Достаточно, чтобы значения их концентраций были определены с
тремя значащими цифрами. Если вы уже приготовили стандартные раство-
ры НС1 или NaOH при выполнении работ 6 или 7, используйте их в этой ра-
боте. Если нет, приготовьте 250 мл 0,1 М стандартного раствора NaOH, как
описано в работе 6. Поскольку значения определяемых концентраций дол-
жны быть получены с тремя значащими цифрами, для титрования можно
использовать в десять раз меньше гидрофталата калия, чем указано, а также
бюретку объемом 10 мл. В этом случае эквивалентный объем титранта со-
ставит 4,0^,5 мл. Соответственно, и для стандартизации 0,1 М НС1 можно
брать ее аликвоту объемом 5,00 мл. Соляную кислоту титруют 0,1 М рас-
твором NaOH, как описано в работе 7. В качестве индикатора можно при-
менять феноловый красный. Если у вас есть только стандартный раствор
0,1 М НС1, используйте его для стандартизации 0,1 М NaOH.
Приготовьте по 500 мл 0,01 М НС1 и 0,01 М NaOH, разбавив по 50 мл
соответствующих 0,1 М растворов до 500 мл солевым раствором. Эти рас-
творы необходимо готовить перед работой в этот же день. Наличие соли
снижает растворимость СО2 в подкисленном растворе и тем самым способ-
ствует ее улетучиванию.
Подготовка к работе
Приготовьте и стандартизируйте 0,1 М растворы НС1 и NaOH. Для этого может
потребоваться предварительное высушивание гидрофталата калия, служащего
первичным стандартом.
Методика*
1 Подготовка пробы. Для анализа можно использовать как сыворотку кро-
ви, так и плазму (стабилизированную оксалатами или гепарином). В част-
ности, это может быть препарат крови животного, взятой незадолго до
эксперимента (от вас не будет требоваться делать это самостоятельно —
образец вам предоставит преподаватель). О различиях между понятиями
«сыворотка», «плазма» и «цельная кровь» см. гл. 1. Для того, чтобы груп-
па из 30 студентов смогла выполнить по 3 параллельных определения,
достаточно 10-15 мл пробы (20-30 мл цельной крови). С целью предот-
Определение можно проводить как для макроколичеств (используя 5,00 мл кислоты и 1,00 мл пробы), так
и для микроколичеств (2,00 мл кислоты и 0,100 мл пробы). В первом случае на титрование должно пойти
около 2,4 мл 0,01 М NaOH, во втором — около 0,7 мл.
КИСЛОТНО-ОСНОВНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работав
383
вращения гликолиза (разложения глюкозы), который может вызвать изме-
нение кислотности пробы, к пробе следует добавить фториды, подавляющие
ферментативно катализируемый процесс и стабилизирующие величину
pH на период порядка 2 ч. Пробирку для сбора крови следует ополоснуть
раствором, содержащим 100 мг гепарина натрия и 4 г фторида натрия в
100 мл. Пробу необходимо хранить без доступа воздуха, плотно закрытой
во избежание контакта с атмосферным СО2. Анализ следует выполнить в
день взятия крови, поэтому все необходимые растворы нужно пригото-
вить заранее.
2 . Приготовление раствора сравнения. Приготовьте раствор «свидетеля» —
цветовой стандарт для визуального сравнения с анализируемым раствором
вблизи конечной точки титрования. Для этого внесите 6 мл 1%-го солевого
раствора в коническую колбу объемом 25 мл и добавьте 0,10 мл сыворотки
или плазмы. Затем добавьте две капли раствора фенолового красного, за-
кройте колбу пробкой и перемешайте осторожными вращательными дви-
жениями. Переход окраски индикатора (из желтой в красную) происходит
при pH 8,4-6,7. Вследствие буферных свойств крови конечная точка титро-
вания находится как раз в этом диапазоне.
3 - Титрование пробы. Перед титрованием ко всему количеству пробы сле-
дует добавить немного (на кончике стеклянной палочки) средства Antifo-
am А и хорошо размешать его. Это предотвратит чрезмерное образование
пены при перемешивании раствора. Затем внесите 0,100 мл пробы (сыво-
ротка или плазма) в коническую колбу объемом 25 мл. Добавьте 1,00 мл
0,01 М НС1 и 4 мл 1%-го солевого раствора. Интенсивно перемешайте рас-
твор в течение 1 мин или более для удаления СО2. Затем добавьте 2 капли
раствора индикатора и титруйте 0,01 М раствором NaOH, добавляя его по
каплям, но быстро, до совпадения окраски раствора, устойчивой не менее
15 с, с окраской раствора сравнения. Для более точной дозировки раствор
NaOH можно добавлять при помощи градуированной пипетки объемом
1 мл; значения объемов в этом случае можно считывать с точностью
до 0,01 мл.
В норме содержание бикарбонатов в крови составляет около 26 ммоль/л
(или ммоль экв./л) — от 25 до 32 ммоль/л. В этом случае 0,1 мл крови, взя-
той для анализа, взаимодействуют приблизительно с 0,0026 ммоль НС1,
т. е. 0,26 мл 0,1 М НС1. Таким образом, если в ходе анализа к пробе доба-
вить 1 мл 0,01 М НС1, то останется непрореагировавшими около 0,74 мл, и
на обратное титрование идет около 0,7 мл 0,01 М NaOH.
Расчеты
Рассчитайте содержание бикарботат-ионов в крови, выразив его в ммоль экв./л
(о выражении содержания электролитов в сыворотке крови в ммоль эквивален-
тов см. гл. 5).
384
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Комплексонометрическое титрование
Работа 9. Определение общей жесткости воды с ЭДТА
Основы
Жесткость воды, обусловленную наличием Са2+ и Mg2+, выражают в виде кон-
центрации СаСО3 (мг/л, ppm). Сумму Са2+ и Mg2+ находят титрованием стандар-
тным раствором ЭДТА с индикатором эриохромовым черным Т *. Стандартный
раствор ЭДТА готовят из высушенного (при температуре не выше 80 °C)
Na2H2Y • 2Н2О с чистотой не ниже 99,5%. Если проба не содержит Mg2+, к ней
добавляют комплекс Mg-ЭДТА для обеспечения резкого перехода окраски эрио-
хромового черного Т в конечной точке. Кальций с этим индикатором образует
весьма неустойчивый комплекс, и переход окраски в отсутствие магния оказы-
вается размытым (более подробно об этом см. гл. 9).
Уравнения реакций
Титрование:
Са2+ + H2Y2- -> CaY2" + 2Н+
Са2+ + MgY2- -> CaY2" + Mg2+
В конечной точке:
Mg2+ + Hln2" -> Mgln- + Н+
Mgln- + H2Y2- -> MgY2~ + Hln2" +H+
(красный) (бесцветный) (бесцветный) (голубой)
В форме свободной кислоты состав индикатора соответствует формуле Н31п, а
титранта ЭДТА — H4Y.
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. 0,5%-й (масса : объем) раствор индикатора эри-
охромового черного Т в этаноле, 0,005 М Mg-ЭДТА (готовят смешением
стехиометрических количеств 0,01 М ЭДТА и 0,01 М MgCl2). Раствор ин-
дикатора следует готовить заново каждые несколько дней, поскольку он
неустойчив. Если к порции раствора Mg-ЭДТА добавить буфер с pH 10 и
эриохромовый черный Т, он должен принять чисто фиолетовую окраску.
При этом от одной капли 0,01 М ЭДТА она должна перейти в голубую, а от
одной капли MgCl2 — в красную.
2 . Готовят перед работой.
(а) Аммонийно-аммиачный буферный раствор с pH 10. 3,2 rNH4Cl рас-
творяют в воде, добавляют 29 мл конц. NH3 и разбавляют приблизитель-
* Если требуется определить только Са2+, титрование ведут при pH 12 (в среде NaOH), где Mg2+ выпадает в
осадок в виде Mg(OH)2 и не взаимодействует с титрантом. В качестве индикатора используют гидрокси-
нафтоловый синий.
КОМПЛЕКСОНОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 9
385
но до 50 мл. Для долговременного хранения буферного раствора лучше
использовать полиэтиленовую посуду, чтобы избежать вымывания ионов
металлов из стекла.
(б) Стандартный раствор ЭДТА, 0,01 М. Около 1,5 г химически чистого
Na2H2Y • 2Н2О высушивают в бюксе при 80 °C в течение 2 ч. Затем ох-
лаждают в эксикаторе (30 мин) и точно (с точностью до 1 мг) отвешива-
ют около 1,0 г. Препарат (динатриевую соль; свободная ЭДТА в воде
практически нерастворима) переносят в мерную колбу объемом 250 мл.
Добавляют немного дистиллированной деионизированной воды и перио-
дически встряхивают или перемешивают жидкость до полного растворе-
ния. ЭДТА растворяется медленно, процесс может занять 30 мин и даже
более. Если есть возможность, перед использованием раствор лучше
оставить до следующего дня. Если, несмотря ни на что, остаются нерас-
творившиеся частички, то можно ускорить растворение, добавив три
таблетки NaOH. Однако при этом есть опасность загрязнить раствор
следами металлов. После растворения препарата раствор разбавляют до
250,0 мл и тщательно перемешивают до полной однородности. Затем
ополаскивают чистую полиэтиленовую бутыль тремя небольшими по-
рциями этого раствора и переносят в нее весь раствор для хранения.
Подготовка к работе
Высушите Na2H2Y • 2Н2О и приготовьте стандартный раствор ЭДТА.
Методика
Получите у преподавателя пробу воды. При помощи пипетки или бюретки пере-
несите аликвоту объемом 50 мл в широкогорлую коническую колбу объемом
250 мл, добавьте 2 мл буферного раствора, 0,5 мл раствора Mg-ЭДТА и пять ка-
пель раствора индикатора. Если проба содержит магний (выясните это у препо-
давателя), добавлять Mg-ЭДТА не обязательно. При работе с растворами низкой
концентрации избегайте добавления большого количества индикатора, в про-
тивном случае переход окраски будет слишком растянутым. После добавления
магния (и только после этого!) раствор должен принять винно-красную окраску.
Буфер следует добавлять раньше, чем индикатор, — в этом случае железо, ко-
торое может присутствовать в малых количествах в пробе воды, не будет взаи-
модействовать с индикатором. (ПРИМЕЧАНИЕ. Если в конечной точке
титрования окраска раствора из винно-красной изменяется не на голубую, а на
фиолетовую, это свидетельствует о высоком содержании железа в пробе. Влия-
ние железа можно устранить добавлением нескольких крупинок цианида калия.
Это следует делать с большими предосторожностями и только после соот-
ветствующего инструктажа. Добавлять цианид калия можно только к щелоч-
ному буферному раствору, поскольку в кислой среде образуется летучий и
очень токсичный HCN. После титрования к раствору необходимо добавить 1 г
FeSO4 • 7Н2О для связывания избытка цианид-ионов в нетоксичный Fe(CN)£~.)
Если можно ожидать, что в пробе содержится медь, добавьте несколько крупи-
386
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
нок гидрохлорида гидроксиламина. При этом Cu(II) восстанавливается до Cu(I),
которая не мешает определению.
Раствор титруют 0,01 М раствором ЭДТА до перехода окраски из вин-
но-красной через пурпурную в чисто голубую. Вблизи конечной точки реакция
и, соответственно, переход окраски замедляются, поэтому титрант следует до-
бавлять медленно, а раствор — интенсивно перемешивать. Можно приготовить
раствор «свидетеля» для сравнения окраски, добавив к 50 мл воды 2 мл буферно-
го раствора с pH 10, пять капель раствора индикатора, несколько капель раство-
ра Mg-ЭДТА и несколько капель раствора ЭДТА.
Выполните три параллельных титрования. Если при первом титровании
расход титранта окажется менее 10 мл, последующие титрования выполните с
вдвое большим объемом аликвоты.
Расчеты
Для каждой порции анализируемого раствора рассчитайте жесткость, выразив
ее в единицах ррш СаСО3.
Осадительное титрование
Работа 10. Определение серебра в сплаве по Фольгарду
Основы
0,1 М раствор KSCN стандартизируют по первичному стандарту AgNO3, испо-
льзуя в качестве индикатора раствор железокалиевых квасцов. Стандартизиро-
ванный раствор KSCN применяют для анализа серебрянрго^шгава..
Уравнения реакций
SCN~ + Ag+—> AgSCN
Fe3+ + SCN- -4 Fe (SCN)2+ (реакция с индикатором)
красный
Реактивы и растворы
1 Имеются в лаборатории, AgNO3 (первичный стандарт), насыщенный рас-
твор железокалиевых квасцов KFe(SO4)2 • 12Н2О (индикатор), 6 М HNO3,
не содержащая оксидов азота (раствор должен быть бесцветным). При не-
обходимости азотную кислоту, не содержащую оксидов азота, можно при-
готовить кипячением HNO3 (1 : 1) до полного удаления NO2.
2 - Готовят перед работой. 0,1 М KSCN. Взвесьте -5,0 г KSCN, перенесите в
сосуд объемом 500 мл или 1 л, растворите в воде и добавьте 500 мл дистил-
лированной воды. Хорошо перемешайте до полной однородности. Получен-
ный раствор имеет концентрацию -0,1 М. Его следует стандартизировать по
первичному стандарту AgNO3.
ОСАДИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 10
387
Подготовка к работе
Приготовьте и стандартизируйте (см. ниже) 0,1 М раствор KSCN. Для этого по-
требуется высушить и охладить препарат AgNO3.
Методика
1 Стандартизация раствора KSCN. Получите у преподавателя приблизите-
льно 3 г AgNO3 (первичный стандарт) в бюксе. Высушите его в сушильном
шкафу при 110 °C в течение 1-2 ч, но не более. Охладите в эксикаторе
(3(М10 мин). Возьмите навеску, используя прямой метод взвешивания.
Для этого поместите чистое и сухое часовое стекло на чашку весов и
взвесьте с точностью до 0,1 мг. Положите на него 0,70-0,75 г AgNO3 и сно-
ва взвесьте с точностью до 0,1 мг. Количественно перенесите навеску в чис-
тую широкогорлую коническую колбу объемом 250 мл, по возможности
предохраняя от сильного света. Возьмите еще две навески по 0,70-0,75 г и
перенесите в две другие (пронумерованные) конические колбы объемом
250 мл.
Добавьте в каждую колбу по 50 мл дистиллированной воды, 50 мл 6 М
HNO3, не содержащей оксидов азота, и 2 мл раствора индикатора — желе-
зокалиевых квасцов. Азотная кислота не должна содержать низших окси-
дов азота, поскольку они образуют с Fe3+ нитрозокомплексы, окрашенные в
красный цвет и мешающие индикации конечной точки. Заполните бюретку
' объемом 50 мл раствором KSCN, запишите начальное значение объема с
точностью до 0,01 мл и титруйте при непрерывном сильном перемешива-
нии до появления бледной красновато-коричневой окраски. Чтобы облег-
чить ее наблюдение, вблизи конечной точки можно после добавления
каждой кдпли титранта давать осадку отстояться. Можно также сравнивать
‘ окраску с окраской раствора, полученного добавлением 5 мл 6 М HNO3 и
2 мл раствора железокалиевых квасцов к 75 мл воды. Окраска не должна
исчезать даже после сильного встряхивания раствора. Две другие навески
AgNO3 титруйте точно так же. По результатам каждого титрования рассчи-
тайте мольную концентрацию KSCN иъ дальнейшем используйте среднее
значение.
2 . Определение серебра в сплаве *. Получите у преподавателя образец сереб-
ряного сплава **. Поместите его в химический стакан объемом 250 мл, до-
бавьте 20 мл разбавленной (1:1) HNO3, покройте часовым стеклом и
нагревайте на водяной бане под тягой до полного растворения сплава. Об-
мойте часовое стекло струей воды из промывалки, собирая смывные воды в
стакан, и продолжайте нагревание в открытом стакане до прекращения вы-
деления бурых паров. Раствор при этом должен стать бесцветным. Охладите
раствор до комнатной температуры и количественно перенесите в чистую
* Если проба представляет собой не сплав, а растворимый образец, содержащий AgNO3, то просто раствори-
те его в 50 мл воды и далее действуйте так, как описано выше (стандартизация KSCN).
* * В данной работе предполагается нахождение абсолютного содержания серебра в пробе. Если же целью ра-
боты будет являться определение его массовой доли, то предварительно возьмите точную навеску сплава
(0,3-0,4 г).
388
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
мерную колбу объемом 250 мл при помощи воронки и стеклянной палочки.
Несколько раз ополосните стакан дистиллированной водой, собирая смыв-
ную жидкость в колбу. Разбавьте водой до метки и тщательно перемешайте
до полной однородности.
Пипеткой перенесите две аликвоты по 50 мл в конические колбы объе-
мом 250 мл, добавьте по 2 мл раствора железокалиевых квасцов (индикатор)
и титруйте стандартным 0,1 М раствором KSCN до появления бледного
красно-коричневого окрашивания, не исчезающего даже при сильном пе-
ремешивании. Результаты двух титрований должны совпасть в пределах
0,05 мл. Если они расходятся сильнее, выполните еще два титрования. По
окончании работы соберите все материалы, содержащие серебро, в специаль-
ную емкость.
Расчеты
Рассчитайте массу серебра (г) в образце сплава.
Работа 11. Определение хлоридов в водорастворимом
образце по Фаянсу
Основы
Пробу титруют стандартным раствором AgNO3 с адсорбционным индикатором
, дихлорфлуоресцеином.
Уравнение реакции
СР + Ag+ -> AgCl
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. 0,1 %-й раствор индикатора дихлорфлуоресцеи-
на, декстрин.
2 . Готовят перед работой. Стандартный 0,1 М раствор AgNO3. Получите у
преподавателя -4,5 г нитрата серебра требуемой степени чистоты в чистом
сухом бюксе. Высушите препарат в сушильном шкафу при 110 °C в течение
1-2 ч, но не более. Охладите в эксикаторе (30-40 мин).
Поместите на часовое стекло точную (до 0,1 мг) навеску AgNO3 массой
-4,3 г, перенесите ее в стакан объемом 250 мл и растворите в -100 мл дис-
тиллированной воды. Осторожно перенесите раствор в мерную колбу объе-
мом 250 мл, обмойте стенки стакана несколько раз дистиллированной
водой, перенося смывную жидкость в колбу. Разбавьте водой до метки, хо-
рошо перемешайте и перенесите раствор в чистый сухой сосуд на 500 мл из
темного стекла с притертой пробкой. Еще раз перемешайте до полной од-
нородности раствора. При хранении раствора по возможности избегайте
освещения его сильным светом. Рассчитайте мольную концентрацию полу-
ченного раствора.
ОСАДИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 11
389
Подготовка к работе
1 Приготовьте 0,1 М раствор AgNO3.
2 . Получите у преподавателя пробу, содержащую хлориды, и высушите ее в
сушильном шкафу при 120 °C в течение 1 ч или более. Можно высушивать
ее до следующего дня. Перед взвешиванием пробы охладите ее в эксикато-
ре (по меньшей мере 30-40 мин).
Методика
На часовом стекле взвесьте три навески пробы массой по 0,25-0,30 г (массы мо-
гут быть различными, но каждую нужно измерить точно), перенесите в кониче-
ские колбы объемом 250 мл и растворите в ~50 мл дистиллированной воды.
Добавьте по 10 мл 1%-й суспензии декстрина (предварительно хорошо ее пере-
мешав) и 10 капель раствора индикатора дихлорфлуоресцеина. Декстрин препят-
ствует чрезмерной коагуляции осадка в конечной точке титрования. В результате
общая поверхность осадка оказывается большой, что способствует адсорбции
индикатора и делает переход его окраски более резким. Вместо суспензии декст-
рина можно взять 0,1 г твердого вещества.
Значение pH раствора должно составлять 4-10. Если среда слишком кислая
(например, за счет гидролиза ионов металлов, присутствующих в пробе), рас-
твор можно нейтрализовать добавлением твердого СаСО3 (до тех пор, пока он не
перестанет растворяться). Наличие суспензии СаСО3 не препятствует индика-
ции конечной точки. Если pH раствора менее 4, результаты получаются зани-
женными, поскольку в этих условиях индикатор склонен вытеснять хлорид-
ионы из осадка. Для повышения точности результатов можно стандартизиро-
вать раствор AgNO3 по высушенному химически чистому NaCl, титруя его в тех
же условиях, что и пробу.
Титруйте раствор 0,1 М раствором AgNO3. Чтобы переход окраски в конеч-
ной точке был резким, важно непрерывно перемешивать раствор на всем протяже-
нии титрования. Не допускайте освещения раствора прямым солнечным светом
(если вы работаете в яркий солнечный день у окна, лучше задернуть его штора-
ми). Признаком конечной точки титрования служит изменение окраски индика-
тора с бледно-желтой до отчетливой розовой. Если вы перетитровали, добавьте
в колбу немного NaCl или КС1 и сначала несколько раз потренируйтесь в наблю-
дении конечной точки, а потом уже титруйте вторую и третью порции пробы. По
окончании работы соберите все материалы, содержащие серебро, в специаль-
ную емкость.
Расчеты
Рассчитайте массовую долю (%) хлоридов для каждой оттитрованной порции
пробы.
390
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Потенциометрический анализ
Работа 12. Определение pH шампуня для волос
Основы
Для определения pH шампуней и других косметических средствах по уходу за
волосами (концентрированных и разбавленных в соотношении 1:10) использу-
ют откалиброванный стеклянный электрод в сочетании с насыщенным каломель-
ным электродом. Полученные данные могут служить основой для предположений,
у каких из исследованных средств значение pH обеспечивается наличием в их
составе буферной системы, а у каких — сильной кислоты или основания. Можно
также обсудить, какая величина pH является оптимальной для шампуня и влияет
ли pH на моющие свойства шампуня или на состояние волос.
Уравнение функции отклика электрода
„ 7 2,303ЯГ u
Е = к - —---pH
F
Реактивы и растворы
Имеются в лаборатории. Стандартные буферные растворы с pH 3,5, 7, 9 и 11
(величины ориентировочные). Кроме того, каждый студент группы приносит с
собой один или несколько образцов средств для волос, имеющихся в прода-
же, — шампуней, кондиционеров, ополаскивателей, депиляторов. В их числе
могут быть шампуни против перхоти или средства для удаления волос. Все об-
разцы распределяются между студентами группы. Для выполнения работы сту-
денту достаточно 15-20 мл каждого образца.
Методика
1 Калибровка электродов. Сначала следует откалибровать электрод по бу-
ферному раствору с pH 7 и приблизительно оценить значения pH всех об-
разцов. После этого образцы делят на пять групп в соответствии с их
величинами pH: ниже 4; 4-5,9; 6-8; 8,1-10 и выше 10. Перед работой стек-
лянный электрод необходимо вымочить в 0,1 М раствора КС1 в течение, по
меньшей мере, суток. Неиспользуемый электрод хранят в разбавленном
растворе КС1. Для каждой группы образцов проведите дополнительную ка-
либровку электрода в соответствующей области pH (около 3 — для первой
группы, около 11 — для последней), руководствуясь указаниями препода-
вателя. В частности, преподаватель может предложить вам провести калиб-
ровку всего по трем буферным растворам — например, с pH 4, 7 и 9 — для
всей области pH. Калибровка электрода так или иначе сводится к установке
показаний pH-метра, равных значению pH раствора, в который погружены
электроды, при комнатной температуре. После калибровки промойте элек-
троды дистиллированной водой и промокните фильтровальной бумагой.
Электроды не следует протирать, так как это может привести к появлению
на их поверхности статических зарядов. Не забывайте отключать электро-
ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Работа 12
391
ды (переводить pH-метр в нейтральный режим), когда вынимаете их из рас-
твора. Если для калибровки используется лишь небольшой объем буферного
раствора, то его потом лучше вылить, чем подвергать опасности загрязне-
ния остальной раствор.
2 . Измерения pH проб. Приготовьте разбавленный (1:10) раствор каждого об-
разца, смешав в стакане объемом 100 мл 5,00 мл образца и 45,0 мл дистилли-
рованной воды (отмерив ее из бюретки объемом 50 мл). Измерьте величины
pH первого разбавленного, а затем концентрированного образца. В послед-
нем случае если для измерения используется стаканчик малого объема (на-
пример, 25 мл), то достаточно 5 мл пробы (ее количество должно быть
таким, чтобы полностью покрыть шарик стеклянного электрода). Можно
применять и комбинированный электрод (стеклянный электрод и электрод
сравнения в одном корпусе). В этом случае пробу можно поместить в про-
бирку и погрузить в нее электрод. Следует иметь в виду, что у комбиниро-
ванных электродов солевой контакт электрода сравнения находится выше
шарика стеклянного pH-электрода. Поэтому корпус электрода должен быть
погружен в раствор достаточно глубоко, чтобы обеспечить электролитиче-
ский контакт. Комбинированный электрод соединяется с pH-метром при
помощи двух проводов — по одному от каждого отдельного электрода.
Погрузите электроды в анализируемый раствор и перемешайте его не-
сколько секунд. Дождитесь установления показаний и запишите значение
pH с точностью до 0,01 ед. Между измерениями тщательно промывайте
электроды и удаляйте с них капли воды фильтровальной бумагой. Измере-
ния pH лучше проводить в определенном порядке — возрастания или убы-
вания. Если при анализе какого-то образца показания pH-метра выходят за
пределы 4-10, электрод следует заново откалибровать по буферу с ближай-
шим к измеренному значением pH. В частности, для депиляторов величины
pH часто превышают 10, и следует использовать буфер с pH 11.
Отчет о работе
Сгруппируйте пробы, разделив их на шампуни (и кондиционеры) и ополаскива-
тели. В отдельную группу выделите депиляторы. В пределах каждой группы
распределите образцы в порядке возрастания pH концентрированных растворов.
Можете сравнить с преподавателем ваше значение со средним значением соот-
ветствующей группы. На основании изменения pH при разбавлении укажите, в
каких образцах, по вашему мнению, величина pH поддерживается при помощи
буферных систем, а в каких — при помощи сильной кислоты или основания. Ис-
пользуйте данные работы [J. J. Griffin, R. F. Corcoran, К. К. Akana, J. Chem. Ed.,
54 (1977) 553] и включите в отчет результаты обсуждения вопроса о влиянии pH
на моющие и кондиционирующие свойства шампуней, упомянув также о вреде
для волос неправильно подобранного pH. Предложите возможные механизмы
такого влияния. На чем основано действие депиляторов? В каком диапазоне дол-
жны находиться значения pH детских шампуней?
392
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Работа 13. Потенциометрическое определение фторидов
в питьевой воде при помощи фторид-селекгивного электрода*
Основы
В пробе воды фториды определяют при помощи комбинированного (т. е. со
встроенным электродом сравнения) фторид-селективного электрода. Сначала
следует установить, является ли электродная функция нернстовской в широком
диапазоне концентраций. Затем определяют содержание фторидов в пробе по
результатам измерений в узком диапазоне, охватывающем неизвестную концен-
трацию. По результатам измерений строят градуировочную зависимость.
Уравнения
„ 7 2,303А Г 7, 2,ЗОЗАГ г___ z
п, = К--------lg 6Z = /с —------IgLJr J (при постоянной ионнои силе)
F F
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. Раствор TISAB (total ionic-strength adjustment buf-
fer — буфер полного состава для поддержания ионной силы). Для его при-
готовления растворяют 57 мл ледяной уксусной кислоты, 58 г хлорида
натрия и 4 г ЦДТА (циклогексилендинитрилотетрауксусной кислоты) в
-500 мл воды, устанавливают pH в пределах 5,0-5,5 при помощи 5 М NaOH
и разбавляют до 1 л. Перед измерением потенциала все пробы смешивают с
этим раствором в соотношении 1:1. Роль TISAB состоит в следующем.
(а) Во всех растворах создается одна и та же ионная сила, независимо от
возможных различий в ионной силе для исходных проб.
(б) Величина pH раствора устанавливается в пределах 5-6. В слишком кис-
лых средах определение pH невозможно из-за образования HF. В ще-
лочных средах начинают мешать ионы ОН-.
(в) ЦДТА связывает многозарядные катионы (например, Sn4+, А13+ или
Fe3+), которые, в случае их присутствия в пробе, образуют комплексы с
F“ и тем самым снижают их концентрацию.
2- Готовят студенты.
(а) Исходный стандартный раствор фторидов с концентрацией ОД М.
Высушите около 1 г NaF при 110 °C в течение 1 ч и охладите в эксикато-
ре (30 мин). Возьмите навеску высушенного NaF массой 0,45-0,50 г
(с точностью до 1 мг), перенесите в мерную колбу объемом 100 мл, рас-
творите и разбавьте до метки дистиллированной водой, тщательно переме-
шайте и перенесите в полиэтиленовую бутыль (предварительно ополоснув
ее несколькими небольшими порциями раствора). Растворы фторидов
хранят в пластмассовой посуде, поскольку фторид-ионы склонны адсор-
Методика подходит и для определения NaF или SnF2 в зубной пасте. В этом случае следует приготовить
суспензию пасты в воде и для анализа отобрать пипеткой маточный раствор. Можно анализировать также
детские таблетки или капли, содержащие фториды. См. [T. Light, С. Cappucino, J. Chem. Ed., 52 (1975) 247].
ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. Работа 13
393
бироваться на поверхности стекла. Внимание: ФТОРИДЫ ЯДОВИТЫ!
ОБРАЩАТЬСЯ С ОСТОРОЖНОСТЬЮ! Для выполнения работы можно
использовать и имеющиеся в продаже стандартные растворы фторидов.
(б) Стандартные растворы для проверки линейности электродной функ-
ции. Последовательным разбавлением исходного раствора дистиллиро-
ванной деионизированной водой (не засасывайте растворы в пипетку
ртом!) приготовьте серию растворов с концентрациями фторида при-
близительно 1 • 10-2,1 • 10-3, 1 • 10-4, 1 • 10-5 и 1 • 10-6 М. Например, три
первых раствора можно приготовить разбавлением исходного в соотно-
шениях 10 : 100, 1 : 100 и 1 : 1000 мл, а три последних — разбавлением
полученного раствора 1 • 10-4 М в соотношениях 10 : 100 и 1 : 100 мл.
Рассчитайте точные концентрации растворов. Перенесите растворы в
полиэтиленовые бутыли. Растворы следует готовить в день выполнения
работы.
(в) Стандартные растворы для градуировки. Содержание фторидов в
пробе находится в диапазоне от 1 • 10-3 до 1 • 10-2 М. В этом же диапазо-
не следует строить градуировочную зависимость. Приготовьте еще два
раствора с концентрациями приблизительно 2 • 10-3 и 4 • 10-3 Ми рассчи-
тайте их точные концентрации. Растворы следует готовить в день вы-
полнения работы.
Подготовка к эксперименту
Приготовьте исходные растворы NaF. Для этого вам потребуется высушить NaF.
Методика
1 - Определение диапазона отклика электрода и диапазона линейности элек-
тродной функции. Присоедините электроды к потенциометру (если он рабо-
тает в режиме pH-метра, то установите полный диапазон pH). При помощи
пипетки поместите в полиэтиленовый стаканчик 10 мл стандартного рас-
твора с концентрацией 1 • 10-6 М и 10 мл раствора TISAB. Погрузите элект-
роды в раствор. Во время измерений перемешивайте раствор магнитной
мешалкой. Если шкала прибора отградуирована только в единицах pH, счи-
тывайте показания pH, переводя их в условные величины потенциалов
(примите, что pH 0 соответствует 0 мВ; при 25 °C одна единица pH соответ-
ствует 59,2 мВ). Если шкала отградуирована в милливольтах, считывайте
непосредственно значения потенциалов. Значения записывайте после того,
как они установятся. Занесите данные в электронную таблицу и постройте
график зависимости потенциала от десятичного логарифма концентрации
фторида. Рассчитайте тангенс угла наклона зависимости (мВ/pF), величину
отсекаемого осью отрезка и величину г2. Укажите диапазон линейности
электродной функции.
2. Построение градуировочной зависимости. Измерьте и запишите значения
потенциалов, соответствующих стандартным растворам в диапазоне кон-
центраций от 1 • 10-3 М до 1 • 10-2 М, и постройте градуировочную зависи-
394
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
мость в этом диапазоне. В одну из ячеек таблицы введите формулу для
расчета концентрации в анализируемом растворе по величине потенциала,
тангенсу угла наклона и отсекаемого осью отрезка градуировочной зависи-
мости.
3. Анализ пробы. После построения градуировочной зависимости получите у
преподавателя пробу. Если это специально приготовленный раствор, он бу-
дет находиться в мерной колбе объемом 250 мл. Сразу же разбавьте его до
метки дистиллированной деионизированной водой и перенесите в поли-
этиленовый сосуд. В пластмассовый стаканчик пипеткой перенесите 10 мл
анализируемого раствора и 10 мл раствора TISAB. Запишите значение по-
тенциала. Проведите не менее трех параллельных определений с новыми
порциями раствора. (ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ должен быть проведен сразу
же после построения градуировочной зависимости. Между этими действи-
ями не следует корректировать показания прибора. Если это все же при-
шлось сделать, постройте градуировочную зависимость заново.)
Расчеты
Из градуировочной зависимости определите концентрацию фторидов в анали-
зируемом растворе (ppm). Укажите также стандартное отклонение для серии из
трех результатов.
Окислительно-восстановительное титрование
Работа 14. Определение железа в сплаве или руде
дихроматометрическим титрованием
Основы
Образец железного сплава или руды растворяют в НО и восстанавливают Fe(III)
до Fe(II) при помощи SnCl2. Избыток SnCl2 окисляют действием HgCl2. При
этом образуется малорастворимое соединение — каломель (Hg2Cl2), которое не
взаимодействует с титрантом с заметной скоростью. Fe(II) титруют стандарт-
ным раствором К2Сг2О7 с индикатором дифенил аминосульфонатом.
Уравнения реакций
Восстановление Fe3+:
2Fe3+ + Sn2+ (небольшой избыток) —> 2Fe2+ + Sn4+ + Sn2+ (непрореагировавшее количество)
Окисление Sn2+:
Sn2+ + 2Hg2+ + 2C1“ —> Sn4+ + Hg 2CI2 (белый осадок)
Если добавлено слишком много Sn2+, то идет реакция
Sn2+ + Hg2Cl2 -» Sn4+ + 2Hg° + 2C1-
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 14
395
Если образовалась металлическая ртуть (черный осадок), то индикация конеч-
ной точки невозможна. С такой пробой дальше работать нельзя, поскольку Hg°
способна взаимодействовать с Сг2О7”.
Титрование:
6Fe2+ + Cr2O^ + 14Н+ -» 6Fe3+ + 2Сг3+ + 7Н2О
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. 0,28%-й (масса : объем) раствор индикатора —
и-дифениламинсульфоната натрия, 0,5 М SnCl2 в 3,5 М НС1 (для стабилиза-
ции в раствор добавляют гранулированное олово, предотвращающее окис-
ление Sn2+ до Sn4+ кислородом воздуха: Sn4+ + Sn° -» 2Sn2+), насыщенный
раствор HgCl2, конц. НС1, 6 М НС1, смесь Н3РО4 и H2SO4 (по 15 мл конц.
Н3РО4 и H2SO4 добавляют к 600 мл воды и охлаждают до комнатной темпе-
ратуры), 0,1 М FeCl3 в 6 М НС1.
2 . Готовят студенты*. Стандартный раствор К2Сг2О7 с концентрацией
1/60 М (-0,017 М). Высушите в бюксе около 3 г К2Сг2О7 (первичный стан-
дарт) при 120 °C в течение 2 ч или более. Высушивание можно проводить
даже до следующего занятия. Охладите бюкс в эксикаторе в течение
30—40 мин. Поместите навеску массой около 1,3 г на часовое стекло (с точ-
ностью до 1 мг) и количественно перенесите ее в стакан объемом 200 мл.
Растворите в небольшом объеме воды и снова количественно перенесите в
мерную колбу объемом 250 мл. Разбавьте раствор до метки и тщательно пе-
ремешайте. Ополосните чистую бутыль объемом 1 л тремя небольшими
порциями раствора и перенесите в нее остальной раствор для хранения. Рас-
считайте мольную концентрацию полученного раствора. Можно приготовить
раствор К2Сг2О7 приблизительной концентрации, а затем стандартизировать
его по первичному стандарту, электролитическому железу, используя ту
же методику, что и для анализа железного сплава (см. ниже).
Подготовка к эксперименту
1 - Высушите требуемое количество К2Сг2О7.
2 . Получите и растворите (либо высушите) пробу.
(а) Проба сплава. Преподаватель даст вам три отдельных предварительно
взвешенных образца сплава (например, в виде проволоки), каждый из
которых следует поместить в отдельную подписанную коническую кол-
бу объемом 500 мл, содержащую 10 мл конц. НС1. Покройте каждую
колбу перевернутым химическим стаканом объемом 100 мл и оставьте
на своем рабочем месте до следующего дня или более. Образцы можно
растворить и в день эксперимента. Для этого их следует поместить в ста-
Если вы предполагаете использовать раствор К2Сг2О7 также для выполнения работы 15 и (или) 25, приго-
товьте 500 мл раствора. В этом случае следует растворить точную навеску массой около 2,5 г в
200 мл воды, перенести в мерную колбу объемом 500 мл и разбавить водой до метки. Следует оставить не
менее 150 мл раствора для работы 15 и не менее 100 мл — для работы 25. Для данной работы вполне хватит
250 мл, если работать аккуратно и без потерь.
396
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
каны объемом 400 мл, добавить кислоты, покрыть часовыми стеклами и
для ускорения растворения нагревать на электроплитке или водяной
бане под тягой. По окончании растворения смойте в стакан жидкость с
часового стекла и стенок. Для смыва используйте как можно меньше
воды: конечный объем раствора не должен превышать 50 мл.
(б) Проба руды. Получите образец у преподавателя. Высушите в сушиль-
ном шкафу при 110-120 °C или более высокой температуре (длительное
высушивание опасности не представляет).
Методика
1 - Восстановление железа и пробное титрование. Перед титрованием анали-
зируемого образца рекомендуется провести 1-2 пробных титрования. Это
можно сделать во время растворения образца руды. В стакан объемом
600 мл поместите приблизительно 10 мл 0,1 М раствора FeCl3 в 6 М НС1 и
добавьте около 50 мл воды. При этом раствор разбавляется настолько, что
после полного восстановления Fe3+ он станет практически бесцветным.
Если не добиваться такого разбавления, а использовать более концентриро-
ванный раствор, то будет наблюдаться бледно-зеленая окраска Fe2+, что за-
труднит проверку полноты восстановления. Закройте стакан часовым стеклом
и нагревайте раствор на электроплитке под тягой почти до кипения. Темпе-
ратура раствора должна быть как ближе к точке кипения. Он может даже
слегка закипать, но не слишком интенсивно, поскольку при этом возможны
потери. По стенке стакана добавляйте по каплям 0,5 М раствор SnCl2 до тех
пор, пока раствор не начнет заметно бледнеть. С этого момента каждую
каплю раствора SnCl2 добавляйте при интенсивном перемешивании только
после того, как полностью прореагирует предыдущая порция. Добавляйте
SnCl2 до полного обесцвечивания или, по крайней мере, полного исчезно-
вения даже бледно-желтой окраски. Может случиться, что раствор не обес-
цветится полностью, а приобретет бледно-зеленую окраску, присущую
ионам Fe2+ (это зависит от содержания железа в пробе). Но в любом случае
в момент исчезновения желтой окраски прекратите добавлять SnCl2 и оста-
вьте раствор нагреваться еще две минуты. Если при этом вновь появится
желтая окраска, добавьте еще несколько капель раствора SnCl2 до ее исчез-
новения (и повторяйте эти действия до тех пор, пока желтая окраска не ис-
чезнет окончательно). Затем добавьте еще две капли раствора SnCl2, но не
более. Если вы все же добавили слишком много SnCl2, окислите его избы-
ток, добавив несколько капель раствора перманганата калия, а затем повто-
рите процесс восстановления железа. Снимите стакан с плитки, смойте в
него жидкость с часового стекла и стенок и быстро охладите до комнатной
температуры под струей воды. Если, несмотря ни на что, какой-либо из рас-
творов опять приобрел желтую окраску, его следует снова нагреть, доба-
вить по каплям раствор SnCl2 до ее исчезновения и еще две капли раствора
дополнительно. Описанные действия можно проводить с двумя или тремя
пробами одновременно. Однако все дальнейшее следует производить с каж-
дой пробой по отдельности, без пауз вплоть до окончания титрования.
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 14
397
Заполните бюретку объемом 50 мл стандартным раствором К2Сг2О7 и
подготовьте ее для титрования.
К одному из титруемых растворов (он должен иметь комнатную тем-
пературу) добавьте 100 мл воды и затем быстро — предварительно отмерен-
ные 15 мл насыщенного раствора HgCl2, сразу же интенсивно перемешивая
раствор. При этом должно образоваться немного белого осадка. Если оса-
док окрашен в серый или черный цвет (за счет металлической ртути) либо
не образовался вообще, это означает, что количество добавленного SnCl2
оказалось, соответственно, слишком велико либо слишком мало (недоста-
точно для полного восстановления Fe3+). И в том, и в другом случае с этой
пробой работать дальше нельзя. Перемешайте раствор в течение 2 мин, за-
тем добавьте 100 мл смеси Н3РО4 и H2SO4 и 6-8 капель раствора индикато-
ра — дифениламиносульфоната. Сразу же после этого титруйте раствором
К2Сг2О7 при непрерывном перемешивании до перехода окраски из зеленой
в пурпурную или сине-фиолетовую, не исчезающую в течение по меньшей
мере 1 мин. Смесь кислот добавляют для поддержания постоянной высо-
кой кислотности среды и связывания продукта реакции — Fe3+ — в практи-
чески бесцветный фосфатный комплекс. Благодаря этому переход окраски
в конечной точке становится более отчетливым.*
2 . Анализ сплава. После полного растворения пробы разбавьте раствор дис-
тиллированной водой до 40-60 мл. Нагрейте почти до кипения и выполните
все те же действия, что и в ходе пробного титрования, начиная с добавле-
ния SnCl2. Вплоть до добавления хлорида ртути все три пробы можно обраба-
тывать одновременно. Все последующие операции до окончания титрования
надо проводить с каждой пробой отдельно.
3 - Анализ руд. После охлаждения в эксикаторе высушенной пробы (30-40 мин)
возьмите три ее навески по разности (железная руда может быть гигроско-
пичной). Относительно массы навесок посоветуйтесь с преподавателем.
Перенесите каждую навеску в стакан объемом 600 мл, добавьте 10 мл воды
и тщательно перемешайте до полного смачивания и образования суспен-
зии. Прикройте стаканы часовыми стеклами и по стенке добавьте 10 мл
конц. НС1. Нагревайте под тягой на электроплитке до полного растворения
руды и образования прозрачного красно-коричневого раствора. При рас-
творении некоторых проб может оставаться нерастворимый, похожий на
песок остаток, состоящий из кремнезема или сульфидов (при наличии в
нем черных частиц). Дальнейшему ходу анализа его присутствие не меша-
ет. Раствор должен находиться почти при температуре кипения. Однако ин-
тенсивного кипения следует избегать, поскольку это может привести к
потерям пробы и чрезмерному испарению кислоты. При необходимости
добавляйте 6 М НС1, чтобы объем раствора все время составлял около
20 мл. После перехода всего железа из пробы в раствор нерастворимый
Фосфорная кислота играет здесь еще одну и, пожалуй, самую важную роль. Связывая Fe3+ в комплекс, она
предотвращает возможность окисления индикатора ионами Fe3+ и тем самым — сильного недотитровыва-
ния пробы. — Прим, перев.
398
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
остаток (если он есть) должен быть серым или белым, а после добавления
хлорида олова не содержать черных или красноватых частиц. Когда рас-
твор станет прозрачным, добавьте дистиллированной воды до объема при-
близительно 50 мл и далее действуйте точно так же, как при пробном
титровании, начиная с добавления хлорида олова к горячему раствору.
Вплоть до добавления хлорида ртути все три пробы можно обрабатывать
одновременно. Все последующие операции до окончания титрования надо
проводить с каждой пробой отдельно.
Расчеты
1 - Анализ сплава. Рассчитайте массу (мг) железа в каждой проанализирован-
ной порции образца, среднее значение и охарактеризуйте воспроизводи-
мость результатов.
2 . Анализ руды. Рассчитайте массовую долю (%) железа в каждой проанализи-
рованной порции образца, среднее значение и охарактеризуйте воспроиз-
водимость результатов.
Работа 15. Анализ растворов, содержащих
гипохлориты натрия или пероксиды водорода,
йодометрическим титрованием
Основы
Содержание NaOCl или Н2О2, определяющее окислительную способность рас-
твора, находят иодометрически по реакции в уксуснокислой среде с иодид-иона-
ми, взятыми в избытке, и оттитровывании выделившегося иода (в форме 13 в
присутствии избытка иодидов) стандартным раствором тиосульфата натрия.
Раствор тиосульфата натрия стандартизируют по первичному стандарту — йода-
ту калия, используя крахмал в качестве индикатора.
Уравнения реакций
Стандартизация Na2S2O3:
10 3 + 81- + 6Н+ -» 31 з + ЗН2О
1з+2S2O^->3I- + S4O6~
Анализ пробы:
СЮ" + 31- + 2Н+ -» Cl- +13 + Н2О
или
Н2О2 + 31- + 2Н+ - -М?(-°- -> 2Н2О +13
х х катализатор z J
Затем I3 титруют 820з” (см. выше).
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 15
399
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. 6 М НС1, KI, КЮ3 (первичный стандарт), ледяная
уксусная кислота, 3%-й раствор молибдата аммония (для определения пе-
роксидов), Na2CO3, разбавленная H2SO4 (1 : 4).
2 . Готовят перед работой.
(а) Раствор крахмала. Для приготовления 1%-го раствора смешивают
0,5 г растворимого крахмала с 2-3 мл дистиллированной воды и добав-
ляют на кончике шпателя немного Hgl2. Полученную смесь выливают
при перемешивании в 50 мл кипящей дистиллированной воды и нагре-
вают 2-3 мин до тех пор, пока раствор не станет прозрачным или лишь
слегка опалесцирующим. Раствор охлаждают до комнатной температу-
ры. Hgl2 стабилизирует крахмал на долгое время. Если готовить раствор
без добавления Hgl2, его следует использовать в день приготовления.
ПРИМЕЧАНИЕ. Вместо приготовленного раствора крахмала можно
использовать имеющийся в продаже препарат Thiodene (-0,4 г).
(б) Стандартный раствор КЮ3. Нужен для стандартизации раствора
Na2S2O3. (ПРИМЕЧАНИЕ. Если вы приготовили стандартный 1/60 М
раствор К2Сг2О7 в ходе выполнения работы 14, то его можно использо-
вать вместо КЮ3 для стандартизации Na2S2O3. На титрование берут
аликвоты по 50 мл раствора К2Сг2О7. Более подробные указания полу-
чите у преподавателя.) Для стандартизации Na2S2O3 по КЮ3 вместо от-
дельных навесок первичного стандарта берут аликвоты его раствора.
Причина состоит в том, что КЮ3 имеет достаточно низкую эквивалент-
ную массу, и масса каждой отдельной навески составила бы всего около
0,1 г. Поэтому способ с титрованием аликвот более точный. Однако в
этом случае готовят лишь один раствор, поэтому при его приготовлении
требуется повышенная аккуратность в работе.
Высушите около 1,5 г КЮ3 при 120 °C в течение 1-2 ч и охладите в
эксикаторе (30-40 мин). Взвесьте 1,0-1,4 г с точностью до 0,1 мг и рас-
творите в небольшом количестве дистиллированной воды в стакане
объемом 200 мл. Количественно перенесите раствор, ополаскивая стен-
ки посуды, в мерную колбу объемом 500 мл по стеклянной палочке че-
рез воронку. Разбавьте водой до метки.
Рассчитайте мольную концентрацию раствора.
(в) ОД М раствор Na2S2O3. Растворы тиосульфата натрия подвержены воз-
действию бактерий, в результате чего их концентрация со временем мо-
жет изменяться. Поэтому воду и стеклянную посуду, используемые для
приготовления и хранения таких растворов, следует стерилизовать. Если
раствор мутнеет, в нем появляются микроорганизмы или плесень, он
становится непригодным. Весьма желательно удалить из воды и СО2,
поскольку в нейтральной среде растворы тиосульфатов более устойчи-
вы, чем в слабокислой.
Прокипятите -1200 мл дистиллированной воды в течение 5-10 мин
для стерилизации и удаления диоксида углерода. Охладите до комнат-
400
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
ной температуры. Также простерилизуйте горячей (почти кипящей) ди-
стиллированной водой стенки сосуда объемом 0,5 л, а затем ополосните
их холодной кипяченой дистиллированной водой. На технических весах
на часовом стекле взвесьте -12,5 г кристаллогидрата тиосульфата на-
трия Na2S2O3 • 5Н2О. Перенесите в стерилизованную посуду, добавьте
500 мл свежепрокипяченной, охлажденной дистиллированной воды,
0,05 г карбоната натрия и тщательно перемешайте до полной однород-
ности раствора. Небольшое количество карбоната натрия добавляют
для того, чтобы среда была нейтральной или слабощелочной. Это предот-
вращает разложение тиосульфат-ионов с образованием элементной
серы. Если есть возможность, храните раствор в холодильнике, но перед
использованием дайте ему нагреться до комнатной температуры.
Подготовка к эксперименту
1 Высушите требуемое количество КЮ3 (первичный стандарт).
2 . Приготовьте 0,1 Мраствор Na2S2O3. Раствор можно приготовить и в день
эксперимента. Но лучше это сделать хотя бы накануне стандартизации.
Растворы тиосульфата натрия склонны изменять свой титр вскоре после их
приготовления.
Методика
1 - Стандартизация раствора Na2S2O3. Растворы следует стандартизовать в
день выполнения работы. Спросите у преподавателя, будете ли вы для
стандартизации использовать раствор К2Сг2О7, приготовленный для вы-
полнения работы 14. Если нет, поступайте следующим образом.
Несколько раз ополосните бюретку объемом 50 мл небольшими по-
рциями раствора Na^C^ и заполните ее этим раствором. Установите ме-
ниск вблизи нулевой отметки и запишите начальное значение объема с
точностью до 0,02 мл. Пипеткой перенесите аликвоту 50,00 мл раствора
йодата калия в чистую широкогорлую коническую колбу объемом 250 мл.
Добавьте около 2 г твердого иодида калия и перемешайте до растворения.
Затем при интенсивном перемешивании добавьте 5 мл разбавленной H2SO4.
Сразу же после этого титруйте раствором тиосульфата натрия. В си-
льнокислой среде иодид-ионы, присутствующие в титруемом растворе в
избытке, быстро окисляются кислородом воздуха до IJ, поэтому титрова-
ние следует проводить быстро. В ходе титрования важно все время интен-
сивно перемешивать раствор: недопустимо, чтобы в кислом растворе
тиосульфаты скапливались в отдельных местах, потому что в этом случае
они могут разлагаться на H2SO3 и серу. Титруйте до почти полного исчез-
новения желтой окраски, обусловленной присутствием ионов 13 (раствор
должен быть бледно-желтым). Добавьте 2-3 мл раствора крахмала и про-
должайте титрование до исчезновения синей окраски. При правильной
работе на это должно пойти не более 0,5 мл раствора титранта после до-
бавления крахмала.
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 15
401
Титрование следует повторять до тех пор, пока не будет достигнута
сходимость результатов в пределах 0,1% (например, ±0,03 мл, если эквива-
лентный объем титранта составляет порядка 30 мл). Рассчитайте мольную
концентрацию раствора Na^Oj.
2 . Определение гипохлоритов или пероксидов в образце.*
(а) Взвешивание и разбавление пробы. Ориентировочно откалибруйте
бюкс, налив в него около 12 мл воды и заметив ее уровень. Затем опо-
рожните, тщательно высушите и взвесьте бюкс с точностью до 1 мг.
Анализируемые растворы гипохлоритов или пероксидов находятся в
фабричной упаковке — сосудах, снабженных сифонными трубками.
Очистите кончик трубки от твердых загрязнений и спустите несколько
капель раствора. Отберите около 12 мл раствора в откалиброванный и
взвешенный бюкс. Раствор не должен попадать на верхнюю часть бюк-
са, в особенности шлиф. Взвесьте бюкс без крышки с точностью до 1 мг.
Через воронку перенесите содержимое бюкса в мерную колбу объемом
250 мл, уже содержащую -100 мл воды. Смойте раствор со стенок бюкса
и воронки струей воды из промывалки в колбу. Разбавьте раствор до
метки и тщательно перемешайте. Пипеткой перенесите три аликвоты
раствора объемом 50 мл в конические колбы объемом 250 мл, в которые
налито около 50 мл воды. Аккуратно смойте капли раствора со стенок
колбы таким образом, чтобы над раствором образовался слой чистой
воды. С этого момента и до конца процесса с каждой пробой следует ра-
ботать отдельно.
(б) Титрование. Заполните бюретку стандартным 0,1 М раствором тиосу-
льфата натрия. Заранее отмерьте и поставьте на рабочее место 10 мл ле-
дяной уксусной кислоты, 2 г иодида калия и, если образец содержит
пероксиды, капельницу с 3%-м раствором молибдата аммония, служа-
щего катализатором. При определении гипохлоритов катализатор не
требуется. Когда все подготовлено для титрования, добавьте в анализи-
руемый раствор ледяную уксусную кислоту, иодид калия и, при опреде-
лении пероксидов, три капли раствора катализатора. Сразу же после
этого начните титрование, непрерывно перемешивая раствор. Когда
раствор станет бледно-желтым, добавьте около 2 мл раствора крахмала
и продолжайте добавлять титрант отдельными каплями до полного
обесцвечивания раствора. Проделайте то же самое с другими пробами.
Расчеты
Рассчитайте массовую долю NaClO или Н2О2 в анализируемом растворе и вели-
чину относительного стандартного отклонения. (ПРИМЕЧАНИЕ. Отбеливаю-
щие растворы, которые имеются в продаже, должны содержать не менее 5,25%
NaClO. При меньшем содержании называть их «отбеливающими» нельзя!)
* Эту работу, включая расчеты и оформление, все студенты группы должны выполнить в один и тот же день.
Как гипохлориты, так и пероксиды быстро разлагаются, и их концентрация изменяется со временем. Для
оценки (в качестве «истинного» значения) преподаватель может взять средний из результатов, получен-
ных студентами, либо выполнить анализ самостоятельно.
402
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Работа 16. Йодометрическое определение меди
Основы
Образец, содержащий металлическую медь, растворяют в азотной кислоте; при
этом медь превращается в Cu(II). Из раствора удаляют оксиды азота упаривани-
ем с H2SO4 до появления дыма SO3. Затем раствор нейтрализуют аммиаком и
слегка подкисляют фосфорной кислотой. Фосфорная кислота также связывает в
комплексы ионы Fe3+, которые могут присутствовать в растворе пробы, и тем са-
мым предотвращает окисление ими иодидов. После этого к раствору добавляют
избыток KL В результате образуется осадок Cui и выделяется эквивалентное ко-
личество ионов Ц, которые титруют стандартным раствором Na2S2O3 с индика-
тором крахмалом. Вблизи конечной точки к титруемому раствору добавляют
KSCN для вытеснения 12, адсорбирующегося на поверхности Cui (при этом об-
разуется поверхностный слой CuSCN). Для повышения точности результатов
Na2S2O3 стандартизируют по металлической меди (в виде проволоки) высокой
чистоты.
Уравнения реакций
2Cu2+ + 5I--»2CuI + I3
1з +2S2O|"-»3r + S4O|’
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. 6 М HNO3, конц. H2SO4,3 М H2SO4, конц. Н3РО4,
6 М NH3, KSCN.
2 . Готовят перед работой.
(а) Раствор крахмала. Готовят в день выполнения эксперимента, как опи-
сано в работе 15, либо используют индикатор Thiodene.
(б) 0,1 М раствор Na2S2O3. Приготовление описано в работе 15.
Подготовка к работе
Приготовьте 0,1 М раствор Na2S2O3. Раствор можно приготовить и в день экспе-
римента. Но лучше это сделать хотя бы накануне стандартизации. Растворы тио-
сульфата натрия склонны изменять свой титр вскоре после их приготовления.
Методика
1 - Стандартизация 0,1 Мраствора Na2S2O3. Для этого используют ту же ме-
тодику, что и для последующего анализа образца. Взвесьте три порции по
0,20-0,25 г фольги из чистой электролитической меди и перенесите их в
конические колбы объемом 250 мл. Под тягой растворите их в 10 мл
6 М HNO3 (если необходимо — при нагревании на водяной бане). Добавьте
10 мл конц. H2SO4 и выпаривайте до появления обильного белого дыма
SO3. Охладите раствор и осторожно добавьте 20 мл воды. Прокипятите рас-
твор в течение 1-2 мин и снова охладите. По каплям при перемешивании
добавьте 6 М NH3 до появления темно-синей окраски аммиачных комплек-
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 17
403
сов меди. Затем добавьте 3 М H2SO4 до исчезновения синей окраски, а после
этого — 2,0 мл конц. Н3РО4. Охладите раствор до комнатной температуры.
С этого момента каждую пробу нужно обрабатывать отдельно. Раство-
рите около 2 г KI в 10 мл воды и добавьте в одну из колб. Сразу же титруйте
раствором Na2S2O3 до почти полного исчезновения желтой окраски 13. До-
бавьте 2-3 мл раствора крахмала или около 0,4 г индикатора Thiodene и
продолжайте титрование до начала ослабления синей окраски (на это дол-
жно пойти не более 0,5 мл титранта). После этого добавьте 2 г KSCN и на
этот раз продолжайте титрование до полного исчезновения синей окраски.
Повторите титрование с двумя другими растворами. Рассчитайте моль-
ную концентрацию Na2S2O3.
2 - Определение меди в образце. В каждую из трех чистых конических колб
объемом 250 мл поместите 10 мл 6 М HNO3 и отдайте колбы преподавате-
лю. Он поместит туда анализируемые образцы. В частности, это может
быть медная фольга, использованная для стандартизации Na2S2O3. Раство-
рите и титруйте образцы, как описано выше (стандартизация Na^O^.
(ПРИМЕЧАНИЕ. Для связывания железа и одновременно для создания не-
обходимой кислотности раствора вместо Н3РО4 можно взять приблизитель-
но 2 г бифторида аммония NH4HF2, или NH4F • HF. По описанной методике
можно также определять медь в латуни — брать навеску около 0,3 г.)
Расчеты
Рассчитайте массу меди (г) в каждой пробе и относительное стандартное откло-
нение. При анализе навески латуни рассчитайте массовую долю меди (%).
Работа 17. Определение сурьмы титрованием
раствором иода
Основы
Сурьму(Ш) титруют раствором иода, окисляющим ее до сурьмы(У), в нейтраль-
ной или слабощелочной среде с индикатором крахмалом. Раствор иода стандар-
тизируют по первичному стандарту — оксиду мышьяка(Ш). К анализируемому
раствору добавляют винную кислоту для связывания ионов сурьмы в комплексы
и предотвращения их гидролиза с образованием малорастворимых основных со-
лей (SbOCl, SbO2Cl и им подобных) в нейтральных или слабокислых средах.
Уравнения реакций
Стандартизация:
H2As€>3 + IJ + Н2О -> HAsO4~ + 31- + ЗН+ (pH 8)
Титрование пробы:
8ЬО2С4Н4Об +13 + Н2О -> SbO2C4H4O; + 31- + 2Н+
404
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. As2O3 (первичный стандарт), 1 М NaOH, Na2CO3,
NaHCO3, KI, винная кислота, 1 М НО. Для анализа сурьмяных руд: КС1,
0,1%-й (масса : объем) раствор индикатора метилового красного в 60%-м
этаноле, конц. НС1, 6 М НС1, 6 М NaOH.
2 . Готовят перед работой.
(а) Раствор крахмала. Приготовьте, как описано в работе 15, или исполь-
зуйте индикатор Thiodene.
(б) 0,05 М раствор иода. Взвесьте 6,5 г кристаллического иода и 20 г иоди-
да калия. Разотрите иод в ступке, периодически добавляя небольшие
порции KI и воды и сливая раствор в стеклянный сосуд с притертой
пробкой, до полного растворения твердых веществ. Не допускайте, что-
бы в сосуд попадали нерастворившиеся частицы иода. 12 малорастворим в
воде, но в присутствии избытка KI образует растворимый комплекс К13.
Разбавьте раствор до объема приблизительно 500 мл и тщательно
перемешайте. Проверьте, нет ли в сосуде нерастворившихся частиц
иода. Чтобы гарантировать полное растворение иода, лучше перед стан-
дартизацией оставить раствор до следующего дня. Кроме того, прежде,
чем разбавлять раствор, можно добавить в него еще KI для облегчения
растворения иода.
Подготовка к работе
1. Получение и высушивание пробы. Получите у преподавателя пробу для ана-
лиза в бюксе и высушите ее при 110-120 °C по меньшей мере в течение
1-2 ч. Перед взвешиванием охладите (30-40 мин или более).
2. Высушивание As2O3. Получите и высушите ~1 г As2O3 (первичный стан-
дарт) при 110-120 °C в течение 1-2 ч. Перед взвешиванием охладите в эк-
сикаторе (30-40 мин или более).
3 - Приготовление 0,05 Мраствора 12. Если проба представляет собой сурьмя-
ную руду, то, в отличие от водорастворимой специально приготовленной
смеси, на ее растворение потребуется определенное время. Поэтому в этом
случае желательно стандартизировать раствор иода (методика описана ниже)
накануне выполнения анализа, чтобы иметь достаточный запас времени.
Методика
1 - Стандартизация раствора иода. Используя прямой метод взвешивания,
возьмите три точные навески высушенного As2O3 (первичный стандарт)
массой 0,15-0,20 г. Перенесите их в конические колбы объемом 250 мл и
растворите в 10-20 мл 1 М NaOH (для ускорения — при нагревании). В рас-
творах не должно оставаться нерастворившихся частиц. Охладите и доба-
вьте 1 М НС1 до кислой реакции по лакмусовой бумажке. Добавьте 3—4 г
твердого NaHCO3. При добавлении последней порции не должно наблюдаться
выделения СО2, в противном случае добавьте еще NaHCO3 — pH раствора
должен составлять 7-8. Смойте раствор со стенок колбы и добавьте 50 мл
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 17
405
воды и 3 мл раствора крахмала или 0,4 г индикатора Thiodene. Титруйте
раствором иода до появления синей окраски, не исчезающей в течение 30 с.
По результатам трех титрований рассчитайте мольную концентрацию рас-
твора иода. В дальнейшем используйте среднее значение.
2 . Определение сурьмы в пробе.
(а) Водорастворимая искусственная смесь. Выясните у преподавателя,
пробу какой массы следует взять, чтобы она содержала порядка 2 ммоль
сурьмы. Возьмите три навески высушенного образца и растворите каж-
дую в 50 мл воды в конической колбе объемом 500 мл. В 100 мл воды
растворите 4 г NaHCO3 и 2 г винной кислоты и добавьте этот раствор к
анализируемому. На этом этапе раствор должен быть прозрачным, не
содержащим основных хлоридов сурьмы. Добавьте 3 мл раствора крах-
мала и титруйте до появления синей окраски, устойчивой в течение 30 с.
(б) Сурьмяная руда антимонит (нерастворима в воде). Выясните у пре-
подавателя, пробу какой массы следует взять, чтобы она содержала по-
рядка 2 ммоль сурьмы. В сухие химические стаканы объемом 250 мл
поместите три точные навески сурьмяной руды. Добавьте около 0,3 г
тонкорастертого хлорида натрия, прикройте стакан часовым стеклом
почти полностью и осторожно, по стенке добавьте 10 мл конц. НС1. Пе-
ред добавлением винной кислоты необходимо создать в растворе высокую
концентрацию хлоридов, чтобы предотвратить гидролиз ионов сурьмы
(при высокой концентрации хлоридов сурьма будет находиться в форме
SbCl3). Нагревайте под тягой (не до кипения) до полного разложения
пробы: раствор не должен более издавать запаха сероводорода, а нерас-
творимый остаток (кремнезем) должен быть белым или лишь слегка се-
роватым. Сурьмяная руда (антимонит) состоит из сульфида сурьмы
Sb2S3, кремнезема и примесей других веществ. Когда вся сурьма перей-
дет в раствор, выделение сероводорода прекратится. Не допускайте вы-
паривания раствора досуха, поскольку при этом возможны потери
SbCl3; при необходимости добавляйте еще НС1. По окончании разложе-
ния добавьте 3 гтонкорастертой винной кислоты и продолжайте нагрева-
ние 10-15 мин. Затем добавьте воды порциями по 5 мл при сильном
перемешивании до общего объема порядка 100 мл. Раствор следует раз-
бавлять медленно, поскольку в противном случае возможен гидролиз су-
рьмы из-за наличия локальных избытков воды. Если в ходе разложения
образуется красно-оранжевый осадок (Sb2S3), приостановите разбавле-
ние и осторожно нагрейте раствор до растворения осадка. Если же обра-
зуется белый осадок основных солей, с раствором дальше работать нель-
зя. По окончании разбавления прокипятите раствор в течение 1 мин.
Смойте раствор с часового стекла в стакан, добавьте несколько ка-
пель раствора индикатора метилового красного и осторожно нейтрали-
зуйте раствор 6 М раствором гидроксида натрия. Затем добавьте по
каплям 6 М НС1 до кислой реакции среды, тщательно избегая избытка
кислоты.
406
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
В конических колбах объемом 500 мл приготовьте растворы, содер-
жащие 4 г бикарбоната натрия в 200 мл воды. Перелейте анализируемые
растворы в растворы бикарбоната натрия, избегая потерь вследствие
вспенивания. Смойте несколько раз струей воды из промывалки жид-
кость со стенок стакана в колбу. Добавьте 3 мл раствора крахмала или
0,4 г индикатора Thiodene и титруйте стандартным раствором иода до
первого появления устойчивой синей окраски. Постепенное ослабление
окраски или нечеткий цветовой переход свидетельствует о том, что со-
держание бикарбонатов в растворе недостаточно для поглощения кис-
лоты, выделяющейся в ходе реакции. В этом случае добавьте еще 1 г
NaHCO3 и продолжайте титрование до появления устойчивой синей
окраски.
Расчеты
Рассчитайте массовую долю (%) Sb2O3 в каждой порции пробы. Приведите так-
же среднее значение и охарактеризуйте воспроизводимость результатов.
Работа 18. Количественный микроанализ воды на жесткость
методом косвенного перманганатометрического
окислительно-восстановительного титрования *
Основы
В пробе жесткой воды кальций осаждают в аммиачной среде в виде оксалата,
осадок количественно отфильтровывают, промывают и растворяют в разбавлен-
ной серной кислоте. Выделившуюся щавелевую кислоту титруют стандартным
раствором перманганата калия.
Примечание. Эта работа может служить моделью для выполнения в варианте
микроанализа и некоторых других работ, описанных в книге. Статистическое срав-
нение результатов микроанализов с результатами обычных макроанализов (с испо-
льзованием бюретки объемом 50 мл) показало сопоставимые характеристики по
воспроизводимости*. Но в варианте микроанализа наблюдается небольшая от-
рицательная систематическая погрешность, составляющая в среднем 50 ppm для
проб с содержанием аналита порядка 500 ppm и обусловленная, возможно, меха-
ническими потерями осадка при использовании больших воронок. Для уменьше-
ния этих потерь проф. Ричардсон предложил работать с микроворонками. Более
подробно о титровании в варианте микроанализа см. [М. М. Singh, С. В. McGown,
Z. Szafran, R. М. Pike, J. Chem. Educ., 77 (2000) 625].
Уравнения реакций
Ca2+ + C2O^“ -> CaC2O4
CaC2O4 + 2H+ -> Ca2+ + H2C2O4
5H2C2O4 + 2MnO; + 6H+ -> 10CO2 + 2Mn2+ + 8H2O
С любезного разрешения профессора Ричардсона (J. N. Richardson, Shippensburg University). О деталях ста-
тистического анализа экспериментальных данных см. [J. Chem. Educ., 2002].
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 18
407
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. Конц. H2SO4, конц. НС1, конц. HN03, Na2C2O4
(первичный стандарт, высушенный при 120 °C в течение 1 ч), 0,35 М
(NH4)2C2O4, ОДОМ AgNO3, разбавленный (1:10)раствор аммиака, метило-
вый красный (0,02%-й раствор в 60%-м этаноле; для растворения сначала
добавить чистый этанол). Концентрированные кислоты и раствор AgNO3
находятся в капельницах.
2. Раствор КМпО4, приблизительно 0,02 М. Одного литра раствора достаточ-
но для 30 студентов. Раствор готовят в соответствии с тем, как описано в
разд. 14.6. Для большего числа студентов можно соответственно пригото-
вить больше раствора. Рассчитайте массу перманганата калия для приго-
товления 1 л 0,02 М раствора. Взвесьте на часовом стекле навеску с массой
на 0,05 г больше рассчитанной. Перенесите ее в два химических стакана
объемом по 600 мл (приблизительно половину в каждый), добавьте по
500 мл дистиллированной воды, закройте часовыми стеклами, нагрейте до
кипения и осторожно кипятите в течение 1-2 мин, не дольше. Более долгое
кипячение — 1-2 ч — было бы желательно, но это может привести к испа-
рению раствора и изменению его концентрации. Если же раствор поддер-
живать при температуре чуть ниже температуры кипения, то его можно
нагревать дольше. После нагревания оставьте растворы на сутки или более
прежде, чем приступать к дальнейшим действиям. Стаканы храните, по-
крыв часовыми стеклами, во избежание попадания в растворы пыли и па-
ров химикатов, а также испарения.
Поместите стеклянный фильтрующий тигель в колбу Бунзена и профи-
льтруйте раствор перманганата. Раствор не следует перемешивать или
взбалтывать, иначе осадок, скопившийся на дне стакана, забьет поры филь-
тра, и фильтрование резко замедлится. По этой же причине не фильтруйте
последние несколько миллилитров из каждого стакана. Колбу Бунзена под-
соедините к водоструйному насосу через ловушку: если водопроводная
вода попадет в фильтрат, это приведет к загрязнению раствора. Профиль-
трованный раствор перенесите в чистую бутыль из темного стекла с при-
тертой пробкой и перемешайте до полной однородности. Раствор ни в коем
случае не должен контактировать с какими-либо органическими материа-
лами, включая корковую пробку или резину.
3. Проба, имитирующая жесткую воду. Ее готовят растворением приблизи-
тельно 20 г высушенного СаСО3 в минимальном объеме 1 М НС1. К получен-
ному раствору добавляют несколько капель раствора индикатора метилового
красного, а затем по каплям 1 М NaOH до перехода окраски из красной в
желтую. Раствор количественно переносят в мерную колбу объемом 2,000 л,
разбавляют до метки и тщательно перемешивают. Каждому студенту мож-
но выдавать порцию этого раствора (при помощи бюретки) в личную мер-
ную колбу объемом 100,00 мл. Типичный объем аликвоты составляет
10,00-20,00 мл, что после разбавления соответствует содержанию Са2+ от
400 до 800 ppm.
408
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Микробюретка
Состоит из градуированной пипетки объемом 2,000 мл, силиконовой трубочки
длиной 2 см, пластмассового шприца объемом 10 мл и носика для автоматиче-
ской подачи раствора. Детальное изображение микробюретки и описание ее
сборки см. в работе [М. М. Singh, С. В. McGown, Z. Szafran, R. М. Pike, J. Chem.
Educ., 75 (1998) 371].
Методика
1 - Стандартизация раствора KMnO4. Студенты, работающие за одним сто-
лом, готовят 200 мл разбавленной (1 :20 по объему) серной кислоты из конц.
H2SO4. (Внимание! КИСЛОТУ СЛЕДУЕТ МЕДЛЕННО ДОБАВЛЯТЬ К
ВОДЕ ПРИ ПЕРЕМЕШИВАНИИ.) Прокипятите раствор в течение 5-10 мин
для удаления из него растворенных газов, опустив в раствор стеклянную
палочку для предотвращения интенсивного вспенивания. Охладите рас-
твор до комнатной температуры на ледяной бане и храните его в плотно за-
крытой подписанной полипропиленовой посуде. Этим раствором будут
пользоваться все, кто работает за одним столом (обычно 3—4 студента).
К дальнейшей работе можно приступать только в том случае, если стан-
дартизация будет выполнена в этот же день.
Студенты, работающие за одним столом, готовят также один на всех рас-
твор первичного стандарта — Na^C^. Для этого в мерную колбу объемом
100,00 мл помещают 0,5000 г Na^O^ растворяют в заранее приготовленной
разбавленной H2SO4, разбавляют до метки и тщательно перемешивают. Далее
каждый студент работает индивидуально.
Ополосните микробюретку объемом 2 мл раствором первичного стан-
дарта, а затем заполните ее этим раствором. Перенесите 1,500-2,000 мл
раствора в чистый стаканчик объемом 30 мл и запишите точное значение
объема. Разбавьте раствор до общего объема ~5 мл разбавленной H2SO4.
Приготовьте таким способом еще три раствора, каждый раз с другим объе-
мом Na^C^.
Промойте микробюретку водой, ополосните, а затем заполните 0,02 М
раствором КМпО4. Рассчитайте приближенное значение объема этого рас-
твора, эквивалентное порции первичного стандарта самого маленького
объема. Быстро добавьте из бюретки объем, на 0,2 мл меньший этой вели-
чины, при осторожном, но непрерывном перемешивании раствора стеклян-
ной палочкой. Оставьте раствор до тех пор, пока он не обесцветится (это
может занять 1-2 мин). Нагрейте раствор до 55-60 °C и продолжайте титро-
вать до конца при этой температуре. Контролировать температуру можно
термометром или визуально (по образованию легкого пара). В горячий рас-
твор титрант добавляйте по каплям — каждую последующую только после
того, как полностью прореагирует предыдущая порция. Титрование закан-
чивайте при первом появлении розовой окраски, не исчезающей по мень-
шей мере 30 с. Повторите эту процедуру для каждой из оставшихся порций
Na2C2O4. По результатам каждого титрования рассчитайте мольную кон-
центрацию КМпО4, среднее значение и стандартное отклонение.
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 18
409
2 - Анализ пробы жесткой воды. Каждый студент получит мерную колбу объ-
емом 100,00 мл, в которой находится проба жесткой воды. Разбавьте ее
дистиллированной водой до метки и хорошо перемешайте. При помощи
микробюретки перенесите аликвоту объемом около 1 мл (запишите это
значение объема с максимально высокой точностью) в чистый стаканчик
объемом 30 мл. Добавьте 10 мл дистиллированной воды, 7 капель конц.
НС1 и 1-2 капли индикатора метилового красного. Нагрейте раствор почти
до кипения и добавьте 1 мл 0,35 М (NH4)2C2O4. (ПРИМЕЧАНИЕ. Как пра-
вило, этот раствор отмеряют обычной макробюреткой или даже мерным
цилиндром, поскольку высокая точность дозировки здесь не требуется —
важно только, чтобы оксалат-ионы находились в избытке.)
Подготовьте и заполните микробюретку разбавленным (1 : 10 по объе-
му) раствором аммиака. Добавляйте его по каплям к анализируемому рас-
твору. При этом раствор мутнеет, так как образуется осадок СаС2О4.
Продолжайте добавлять аммиак до изменения окраски индикатора из розо-
вой в бледно-желтую. Избытка аммиака следует избегать. Покройте ста-
канчик пленкой Parafilm и оставьте осадок стариться до следующего дня.
Если после этого раствор снова примет розовую окраску, добавьте еще NH3
до изменения ее в желтую. Повторите все описанные действия с двумя дру-
гими пробами жесткой воды, каждый раз отмеряя ее аликвоту несколько
другого объема.
Осадок СаС2О4, полученный из каждой порции пробы, отфильтруйте
через среднепористый бумажный фильтр (бумага Whatman № 1 или равно-
ценная ей) диаметром 42,5 мм, вставленный в воронку с длинным
носиком.* Следите за тем, чтобы перенести осадок количественно. Для это-
го осадок на фильтре промывайте холодной дистиллированной водой до
тех пор, пока фильтрат после добавления смеси HNO3 и AgNO3 не переста-
нет мутнеть. Это проверяют так: собирают несколько капель фильтрата в
пробирку и добавляют к нему 1-2 капли азотной кислоты, а затем 1-2 капли
AgNO3.
Выньте фильтр из воронки и поместите его в чистый стаканчик объе-
мом 30 мл. Добавьте приблизительно 3 мл разбавленной серной кислоты
(1 : 10 по объему, предварительно прокипяченной — см. п.1). Перемеши-
вайте смесь до тех пор, пока СаС2О4 не растворится, а бумага не превратит-
ся в кашицу. Добавьте около 10 мл дистиллированной воды и нагрейте почти
до кипения. Титруйте смесь стандартизированным раствором КМпО4 следу-
ющим образом. Сначала добавьте 0,10 мл раствора титранта и оставьте сто-
ять до полного обесцвечивания. После этого продолжайте титрование как
обычно до появления розовой окраски. Температура раствора на всем про-
тяжении титрования должна быть выше 55 °C. Повторите описанные дей-
ствия со всеми остальными порциями пробы.
Можно достичь более высокой правильности результатов, если использовать воронку меньшего размера,
соответствующего размеру фильтра.
410
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Расчеты
Из полученных данных в соответствии со стехиометрией реакций рассчитайте
концентрацию кальция (в ppm) для каждой порции пробы. Рассчитайте среднее
значение и стандартное отклонение.
Потенциометрическое титрование
Работа 19. Потенциометрическое титрование образца
технической соды
Основы
Образец технической соды титруют стандартным раствором НС1 с потенцио-
метрической индикацией, используя pH-метр и стеклянный pH-электрод в соче-
тании с насыщенным каломельным электродом сравнения. Положения скачков
на кривой титрования сопоставляют с интервалами перехода окраски индикато-
ров.
Уравнения реакций
СО з + Н+ —> НСО з (по фенолфталеину)
НСО з + Н+ Н2О + СО2 (по метиловому пурпурному)
Обратите внимание, что между первой и второй точками эквивалентности умень-
шение pH происходит постепенно ввиду буферных свойств системы НСОз/СО2.
На практике в ходе потенциометрического определения карбонатов применяют
индикатор метиловый пурпурный. После перехода окраски этого индикатора
раствор осторожно кипятят для удаления СО2 (в растворе остается только НСО 3),
а затем дотитровывают (более подробно см. гл. 8).
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. 0,2%-й раствор фенолфталеина в 95%-м этаноле,
0,1%-й раствор метилового пурпурного в воде, Na2CO3 (первичный стан-
дарт), стандартный буферный раствор с pH 7.
2 . Готовят перед работой. 0,1 М стандартный раствор НС1. Используйте
раствор, приготовленный для выполнения работы 7, или приготовьте и
стандартизируйте его, как описано в этой работе. Раствор кислоты можно
стандартизировать также по первичному стандарту Na2CO3 потенциомет-
рическим титрованием, применяя ту же методику, что и для анализа техни-
ческой соды (см. ниже).
Подготовка к работе
Приготовьте и стандартизируйте раствор НС1. Для этого надо предваритель-
но высушить Na2CO3, служащий первичным стандартом.
ПОТЕНЦИОМЕТРИЧЕСКОЕ ТИТРОВАНИЕ. Работа 19
411
Получите у преподавателя образец технической соды и высушите его при
160 °C в течение не менее 2 ч. Перед взвешиванием охладите в эксикаторе (не
менее 30 мин).
Методика
Стеклянный электрод необходимо вымочить в 0,1 М КС1 в течение, по крайней
мере, суток перед работой. Его также следует хранить в растворе КС1 всегда,
когда им не пользуются. При помощи стандартного буферного раствора с pH 7
откалибруйте стеклянный электрод в соответствии с указаниями преподавателя.
Калибровка электрода состоит в установке показаний pH-метра, равных 7,00,
при погружении электродов в буферный раствор. Если для калибровки исполь-
зуется лишь небольшой объем буферного раствора, то его потом лучше вылить,
чем подвергать опасности загрязнения остальной раствор.
1 - Ориентировочное титрование. Его выполняют для того, чтобы быстро
оценить приближенное положение двух точек эквивалентности. Возьмите
по разности точную навеску (0,2-0,3 г) анализируемой технической соды и
поместите ее в стакан объемом 400 мл, снабженный магнитной мешалкой.
Добавьте приблизительно 50 мл воды и несколько капель раствора индика-
тора фенолфталеина. Индикатор добавляют затем, чтобы сравнить положения
скачка потенциала и интервала перехода окраски индикатора. Поместите ста-
кан на столик магнитной мешалки, погрузите электроды в раствор и включите
мешалку, не допуская, чтобы она касалась электродов. Титруйте стандартным
раствором НС1, записывая значения pH через каждые 2 мл. После исчезно-
вения розовой окраски фенолфталеина добавьте несколько капель метило-
вого пурпурного и продолжайте добавлять титрант с интервалом 2 мл до
достижения второй конечной точки. После этого добавьте еще несколько
порций титранта. Для точного определения положения второй конечной
точки можно сравнить окраску титруемого раствора с окраской раствора
«свидетеля», содержащего несколько капель раствора индикатора и 0,20 г
гидрофталата калия в 100 мл воды. Подготовьте электронную таблицу для
построения кривой титрования в виде зависимости pH (ордината) от объе-
ма раствора НС1 (абсцисса), а также первой производной этой зависимости.
Приближенно оцените положения точек эквивалентности. О построении
производных кривых титрования см. гл. 14 и компакт-диск.
2 . Точное титрование. Возьмите еще одну точную навеску анализируемого
образца и титруйте ее, как описано выше. Вне областей ±3 мл от точек экви-
валентности титрант добавляйте порциями по 5 мл, внутри этих областей —
по 0,5-1 мл. В непосредственной близости от второй точки эквивалентности
считывайте показания как можно быстрее, поскольку значения pH могут
«ползти» из-за улетучивания СО2 из раствора. Сравните положения ко-
нечных точек, найденные потенциометрически и визуально (по изменению
окраски индикатора). Используйте ранее созданную электронную таблицу
для построения кривой точного титрования и ее первой производной. Рас-
печатайте кривую титрования и отметьте на ней области изменения окраски
412
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
индикаторов. Определите положение второй конечной точки по перегибу
кривой. Повторите титрование с двумя другими порциями пробы, не забы-
вая ополаскивать электроды между титрованиями.
Расчеты
Рассчитайте массовую долю (%) Na2CO3 и Na2O для каждой порции проанали-
зированной пробы. В отчет о работе включите кривые титрования. Рассчитай-
те среднее значение содержания и охарактеризуйте воспроизводимость ре-
зультатов.
Работа 20. Потенциометрическое титрование смеси
хлоридов и иодидов
Основы
Анализируемый образец титруют стандартным раствором нитрата серебра с по-
тенциометрической индикацией, используя pH-метр, металлический серебря-
ный и мембранный стеклянный pH-электроды. Поскольку в ходе титрования
величина pH раствора остается практически постоянной, постоянным будет и
потенциал стеклянного электрода, который в этом случае можно применять в
качестве электрода сравнения. Это позволяет исключить необходимость испо-
льзования специального солевого мостика, не содержащего хлоридов, в случае
работы с традиционным электродом сравнения. Сначала осаждается Agl
(Ks = 1 * 10-16), поскольку он менее растворим, чем AgCl (Ks = 1 • IO-10). AgCl
начинает осаждаться только в непосредственной близости точки эквивалент-
ности, соответствующей оттитровыванию иодидов (при достижении условия
[Ag+][C1“] = 1 • 1О-10; в точке эквивалентности для I" [Ag+] = V110-16 = 1 • 10-8 М).
На участке кривой, соответствующей оттитровыванию иодидов, потенциал
электрода (и величина рХ) возрастают, а в момент начала выпадения AgCl, т. е.
вблизи точки эквивалентности для I-, прекращают рост. Затем следует характер-
ный S-образный участок кривой потенциометрического титрования, соответ-
ствующий оттитровыванию хлоридов. Если за конечную точку титрования
иодидов принять момент прекращения роста потенциала, то погрешность инди-
кации будет невелика. Отметим, что иодиды и хлориды в их смеси возможно от-
титровать по отдельности, тогда как бромиды в смеси как с хлоридами, так и с
иодидами — нельзя, поскольку при этом образуются смешанные кристаллы
(см. гл. 10, изоморфное замещение).
Уравнения реакций
I- + Ag+ Agl
С1- +Ag+-> AgCl
ПОТЕНЦИОМЕГРИЧЕСКОЕТИТРОВАНИЕ. Работа 20
413
Реактивы и растворы
0,1 М стандартный раствор AgNO3 Приготовление описано в работе 11.
Подготовка к работе
Высушите AgNO3 (первичный стандарт) при 110-120 °C в течение 1-2 ч, но не
дольше. Перед взвешиванием охладите в эксикаторе.
Получите и высушите анализируемый образец при 120 °C в течение 1-2 ч.
Перед взвешиванием охладите в эксикаторе.
Методика
Используя прямой метод взвешивания, возьмите три навески высушенной про-
бы (0,5-0,6 г) и перенесите их в химические стаканы объемом 400 мл. Растворите
одну порцию в 150 мл дистиллированной воды, поместите в стакан магнитную
мешалку и поставьте стакан на столик мешалки. Растворяйте и титруйте по од-
ной навеске, чтобы свести к минимуму окисление иодидов кислородом воздуха.
Погрузите электроды в раствор, не допуская, чтобы их задевала мешалка. При-
соедините серебряный электрод к гнезду электрода сравнения pH-метра, а стек-
лянный электрод — к гнезду индикаторного электрода*. Включите мешалку и
титруйте раствор стандартным раствором AgNO3. Записывайте показания при-
бора (по любой шкале, например, шкале pH) через каждые 2 мл титранта до тех
пор, пока изменения потенциала не достигнут 0,4 единиц pH или 25 мВ. После
этого добавляйте титрант по 0,2 мл. После прохождения первой конечной точки
вновь увеличьте порции титранта до 2 мл, а вблизи второй точки снова умень-
шите до 0,2 мл. При помощи электронных таблиц постройте зависимость потен-
циала от объема AgNO3 и определите положения конечных точек титрования
иодидов и хлоридов (во втором случае — как точки перегиба). Ориентируясь на
эти значения, оттитруйте две другие порции. Титрант можно добавлять быстро
вплоть до объемов 2-3 мл до конечной точки. Не забывайте ополаскивать элект-
роды между титрованиями.
Расчеты
Рассчитайте массовые доли (%) иодидов (по величине объема титранта, соответ-
ствующей первой конечной точке) и хлоридов (по величине объема титранта
между первой и второй конечными точками) для каждой порции пробы. Вклю-
чите в отчет о работе кривые титрования.
Рассчитайте средние значения и охарактеризуйте воспроизводимость резуль-
татов.
На самом деле серебряный электрод играет роль индикаторного, а стеклянный — электрода сравнения.
Однако большинство стеклянных электродов снабжены специальным контактом, который не подходит к
гнезду для электродов сравнения. Предлагаемое соединение электродов означает лишь, что измеренное
значение разности потенциалов будет иметь знак, противоположный действительному, а изменение по-
тенциала происходить в противоположном направлении.
414
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Методы молекулярной спектрометрии
Работа 21. Спектрофотометрическое определение железа
Основы
Для определения железа его переводят в комплекс Fe(II) с 1,10-фенантролином
Fe (С12Н8К2)з+ и измеряют оптическую плотность его раствора при помощи
спектрофотометра. Максимум светопоглощения находят из спектра поглоще-
ния. Для восстановления Fe3+ до Fe2+ и предотвращения его обратного окисления
добавляют гидроксиламин (в виде гидрохлорида для увеличения растворимости).
Уравнения реакций
1,10-фенантролин трис( 1,10-фенантролинат) железа(П)
Реактивы и растворы
1 - Стандартный раствор железа^}. Для приготовления стандартного раствора
железа взвесьте 0,0176 г сульфата железа(П)-аммония Fe(NH4)2(SO4)2 • 6Н2О,
количественно перенесите навеску в мерную колбу объемом 250 мл и рас-
творите в достаточном количестве воды. Затем добавьте 0,7 мл концентри-
рованной серной кислоты, разбавьте до метки дистиллированной водой и
тщательно перемешайте. Полученный раствор содержит 10,0 мг/л (10 ppm)
железа. Если масса навески отличалась от указанной, рассчитайте соответ-
ствующее значение концентрации.
2. Раствор 1,10-фенантролина. Растворите 25 мг моногидрата 1,10-фенант-
ролина в 25 мл воды. Раствор хранят в пластмассовой посуде.
3. Раствор гидрохлорида гидроксиламина. Растворите 10 г вещества в 100 мл
воды.
4. Раствор ацетата натрия. Растворите 10 г ацетата натрия в 100 мл воды.
Методика
В мерные колбы объемом 100 мл внесите пипеткой 1,00,2,00,5,00,10,00 и 25,00 мл
стандартного раствора железа. В еще одну такую же колбу поместите 50 мл воды
для приготовления раствора сравнения. В мерной колбе объемом 100 мл нахо-
дится и анализируемый раствор. В каждую колбу (включая колбу с анализируе-
мым раствором) добавьте 1,0 мл раствора гидрохлорида гидроксиламина и
5,0 мл раствора 1,10-фенантролина. Для установления необходимого значения
pH в каждую колбу добавьте 8,0 мл раствора ацетата натрия; при этом возникает
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ. Работа 22
415
красная окраска комплекса железа(П) с 1,10-фенантролином. (Комплекс образу-
ется в диапазоне pH 2-9. При добавлении ацетата натрия нейтрализуется кислота,
присутствующая в растворе, и значение pH устанавливается в нужном диапазоне.)
После добавления всех реагентов оставьте растворы на 15 мин или более для
полного развития окраски (развившись, окраска устойчива в течение несколь-
ких часов). Разбавьте каждый раствор точно до объема 100 мл. После разбавле-
ния концентрации железа в стандартных растворах составят 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и
2,5 ppm соответственно.
Для раствора с концентрацией 2,5 ppm запишите спектр поглощения в диа-
пазоне 400-700 нм (или близком к нему, в соответствии с возможностями прибо-
ра). Измерения проводите с шагом 25 нм, а вблизи максимума поглощения —
5 или 10 нм. Конкретные указания по работе на спектрофотометре вы получите у
преподавателя. В качестве раствора сравнения используйте раствор контрольно-
го опыта. Постройте зависимость оптической плотности от длины волны (для
этого можно воспользоваться электронными таблицами). Зная значения моль-
ной концентрации железа в растворе и длины кюветы, можно рассчитать моляр-
ный коэффициент поглощения комплекса железа(П) с фенантролином при длине
волны максимального поглощения.
Постройте градуировочную зависимость, измерив оптические плотности
всех стандартных растворов в максимуме поглощения. В тех же условиях изме-
рьте оптическую плотность анализируемого раствора. При помощи электрон-
ных таблиц постройте градуировочный график в виде зависимости оптической
плотности от концентрации стандартного раствора (ppm). По этому графику из
оптической плотности анализируемого раствора рассчитайте концентрацию же-
леза в нем. Для нахождения этой величины введите в одну из ячеек таблицы фор-
мулу расчета концентрации по величине оптической плотности, тангенсу угла
наклона и отсекаемого осью отрезка градуировочной зависимости (см. гл. 3
и 16). В отчете приведите общее содержание железа в образце (мкг), молярный
коэффициент поглощения комплекса и спектр комплекса железа(П) с фенант-
ролином.
Работа 22. Определение нитратного азота в воде *
Основы
Нитрат-ионы (NOj) взаимодействуют с фенолдисульфокислотой с образовани-
ем продукта, окрашенного в желтый цвет (максимум поглощения при 410 нм).
Мешающее влияние хлоридов устраняют их осаждением. Присутствие нитрит-
ионов (NO 2) является причиной положительных погрешностей при их содер-
жании выше 0,2 мг/л, но в поверхностных водах такие концентрации нитритов
встречаются редко.
Нитраты можно также определять флуориметрически по реакции с флуоресцеином в конц. H2SO4 по умень-
шению его флуоресценции вследствие тушения — см. [J. Chem. Ed., 51 (1974) 682].
416
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Реактивы и растворы
1. Имеются в лаборатории. 1 М раствор NaOH, конц. NH3, раствор реагента
фенолдисульфокислоты. Последний готовят растворением 25 г фенола в
150 мл конц. H2SO4, затем добавляют 75 мл олеума с 15%-м содержанием
свободного SO3, хорошо перемешивают и 2 ч нагревают на кипящей водя-
ной бане.
2. Готовят перед работой.
(а) Раствор сульфата серебра (не требуется, если для анализа берется спе-
циально приготовленный раствор, не содержащий хлоридов). 0,44 г
Ag2SO4, не содержащего нитратов, растворяют в 100 мл дистиллирован-
ной воды. Один миллилитр этого раствора эквивалентен 1 мг хлоридов.
(б) Раствор ЭДТА. К суспензии 50 г Иа2ЭДТА • 2Н2О в 20 мл воды добав-
ляют 60 мл конц. NH3 и хорошо перемешивают до растворения.
(в) Исходный раствор нитратов, 100 мг/л N. Растворяют 0,722 г безвод-
ного KNO3 в воде и разбавляют до 1 л.
(г) Стандартный раствор нитратов, 100 мкг/мл N (44 мкг/мл NO3).
50 мл исходного раствора разбавляют дистиллированной водой до 500 мл.
Методика
1 - Устранение мешающего влияния хлоридов. Если вы анализируете специа-
льно приготовленный на дистиллированной воде раствор, не содержащий
хлоридов, эту стадию можно опустить.
Малые количества хлоридов вызывают отрицательные погрешности.
При содержании хлоридов выше 10 мг/л их нужно отделять (примерное со-
держание хлоридов в пробе укажет преподаватель). К 100 мл пробы добавь-
те эквивалентное количество раствора сульфата серебра и отделите осадок
хлорида серебра центрифугированием или фильтрованием. При необходи-
мости предварительно скоагулируйте осадок нагреванием или оставьте
раствор до следующего дня в темном месте (последнее допустимо только в
том случае, если проба не содержит нитрифицирующих микроорганиз-
мов — см. ниже).
2 . Определение нитратов. Анализируемый раствор не должен быть заметно
окрашен. Чтобы предотвратить изменения в азотном балансе вследствие
биологических процессов, природную воду следует анализировать сразу
же после отбора ее пробы. Можно также хранить пробу в холодильнике при
температуре чуть выше температуры замерзания, добавив 0,8 мл H2SO4 на
литр пробы в качестве консерванта. Непосредственно перед анализом под-
кисленные пробы необходимо нейтрализовывать.
Пробу, освобожденную от хлоридов (или 100 мл исходной пробы, если
она не содержит хлоридов), нейтрализуйте разбавленным раствором NaOH
до pH около 7. Перенесите ее в чашку и выпарьте досуха. К остатку добавь-
те 2,0 мл раствора реагента фенолдисульфокислоты и перемешайте стек-
лянной палочкой для ускорения растворения твердых веществ; при
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ. Работа 23
417
необходимости нагрейте на водяной бане. Добавьте 20 мл дистиллирован-
ной воды, а затем 6-7 мл аммиака до максимального развития окраски.
Если при этом образуется хлопьевидный осадок гидроксидов, растворите
его, добавляя раствор ЭДТА по каплям при перемешивании (или профиль-
труйте раствор). Перенесите прозрачный раствор в мерную колбу объемом
50 мл и разбавьте его до метки дистиллированной водой.
Приготовьте таким же образом серию стандартных растворов с теми
же объемами реагентов, выпаривая 10, 25 и 50 мл стандартного раствора
нитратов (при этом содержание азота будет составлять 0,10, 0,25 и 0,50 мг
соответственно). Стадию удаления хлоридов опустите. Приготовьте рас-
твор контрольного опыта с теми же самыми количествами реагентов.
Измерьте оптические плотности всех растворов при 410 нм относите-
льно раствора контрольного опыта, постройте градуировочный график и
рассчитайте концентрацию нитратного азота в пробе (мг/л).
Этим способом можно обнаружить до 1 мкг нитратного азота, что со-
ответствует концентрации 0,01 мг/л при объеме пробы 100 мл. В питьевой
воде концентрация нитратов обычно составляет ниже 10 мг/л. В случае бо-
лее высоких содержаний можно поднять верхнюю границу диапазона опре-
деляемых концентраций в шесть раз, измеряя оптическую плотность при
480 нм, либо вдвое, если брать для анализа не 100, а 50 мл пробы.
Работа 23. Экстракционно-спектрофотометрическое
определение свинца в листьях *
Основы
Свинец растворяют с поверхности листьев, встряхивая пробу с разбавленной
азотной кислотой. Затем свинец экстрагируют метиленхлоридом в виде комп-
лекса с дитизоном при pH выше 9. Содержание свинца находят из оптической
плотности экстракта по градуировочному графику, построенному по стандарт-
ным растворам свинца, которые подвергнуты такой же обработке. Мешающее
влияние большинства металлов можно устранить добавлением маскирующих
реагентов — цианидов и сульфитов.
Уравнение реакции
(зеленый) (красный)
Методика этой работы включает использование растворов, содержащих цианиды. Они служат маскирую-
щим реагентом для некоторых ионов металлов. Без разрешения преподавателя с такими растворами ра-
ботать не разрешается. Для безопасности можно вообще отказаться от работы с цианидами и считать,
что наблюдаемый аналитический сигнал обусловлен лишь наличием свинца.
418
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Реактивы и растворы
1. Имеются в лаборатории. 1 М HNO3, 0,1 М HNO3, 0,1 %-й водный раствор
индикатора тимолового синего, 2 М раствор аммиака, аммиачно-цианид-
но-сульфитный раствор (смешивают 350 мл конц. NH3, 30 мл 10%-го рас-
твора NaCN и 1,5 г Na2SO3 и разбавляют до 1 л; pH такого раствора
составляет около 11).
2. Готовят перед работой.
(а) Исходный раствор свинца с концентрацией 1000 ррш. Растворяют
0,160 г Pb(NO3)2 в воде и разбавляют в мерной колбе до 100 мл.
(б) Стандартный рабочий раствор свинца с концентрацией 10 ррш.
В день проведения эксперимента разбавляют 1 мл исходного раствора в
мерной колбе до 100 мл.
(в) Раствор дитизона. Растворяют 7,5 мг дитизона в 300 мл метиленхлори-
да. Раствор следует готовить непосредственно перед использованием.
Внимание. Запрещается выливать в раковину какие-либо растворы, использо-
ванные в этой работе. Водные растворы могут содержать цианиды. Их следует
собирать в специальную емкость, содержащую FeSO4 (для превращения CN- в
Fe(CN) б~). Запрещается выливать в эту емкость кислые растворы! Всю испо-
льзованную посуду необходимо ополоснуть щелочным раствором и слить его в
эту же емкость. Растворы в метиленхлориде следует собирать в отдельную ем-
кость.
Подготовка к работе
Соберите образцы листьев. Это могут быть листья деревьев, растущих вблизи
шоссе и, для сравнения, в удалении от них. С каждого дерева возьмите, по край-
ней мере, два больших листа, поместите их в чистый пластмассовый контейнер и
закройте его. Листья выбранные для анализа, должны по возможности не содер-
жать пыли и других видимых загрязнений. Запишите местоположение сбора
каждого листа. Число деревьев, с которых следует брать листья, вам укажет пре-
подаватель.
Методика
1. Построение градуировочного графика. Градуировочный график следует
построить непосредственно в день выполнения анализа. Реакцию комплек-
сообразования и экстракцию проводят в закрытых пластмассовых сосудах
объемом 200 мл. Пометьте каждый из шести сосудов, перенесите в них пи-
петкой 0 (раствор сравнения), 2,4, 6 и 8 мл стандартного раствора свинца с
концентрацией 10 ppm и добавьте воды до объема 20 мл. Затем при помощи
мерного цилиндра добавьте по 60 мл аммиачно-цианидно-сульфитного
раствора (только по указанию преподавателя!) и пипеткой — по 25 мл рас-
твора дитизона в СН2С12 (не засасывать ртом!). Закройте сосуды и непре-
рывно встряхивайте их в течение 1 мин. Пипеткой отберите основную часть
более тяжелой фазы метиленхлорида и профильтруйте через фильтр из
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ. Работа 24
419
среднепористой фильтровальной бумаги (Whatman № 40 или равноценной)
в измерительную кювету (либо отцентрифугируйте раствор перед измере-
нием). Вместе со стандартными растворами необходимо приготовить и
раствор пробы, чтобы их можно было анализировать совместно.
Для одного из стандартных растворов измерьте оптические плотности
в диапазоне 400-600 нм с шагом 20 нм и определите длину волны макси-
мального поглощения. При этой длине волны измерьте оптические плотно-
сти всех стандартных растворов относительно раствора контрольного опыта.
При помощи электронных таблиц (см. гл. 3 и 16) постройте градуировочный
график зависимости оптической плотности от массы свинца (мкг).
2. Определение свинца в листьях. В каждый контейнер, содержащий пробы
листьев, залейте 20 мл 0,1 М HNO3, нагретой до ~70 °C, закройте крышкой
и непрерывно встряхивайте его около 2 мин. Вылейте жидкость в чистый
стакан объемом 100 мл. Добавьте одну каплю раствора индикатора тимоло-
вого синего, затем по каплям 2 М NH3 до завершения перехода окраски
(в синюю), а затем еще несколько капель. Раствор должен издавать запах
аммиака. Затем добавьте (только если получите соответствующее указа-
ние} 60 мл аммиачно-цианидно-сульфитного раствора и выполните экст-
ракцию и измерения так же, как для стандартных растворов.
Расчеты
Промокните каждый лист досуха, положите его на лист бумаги, обведите по
контуру. Вырежьте бумажный контур листа и взвесьте его на аналитических ве-
сах с точностью до трех значащих цифр. Из такой же бумаги вырежьте квадрат
10x10 см (площадью 100 см2) и тоже взвесьте. Рассчитайте площадь поверхно-
сти листа в см2.
По результатам измерения оптической плотности для каждой пробы при по-
мощи градуировочного графика рассчитайте общую массу свинца (мкг) на по-
верхности каждого листа и удельную массу (мкг/100 см2) на единицу площади.
Наблюдается ли корреляция между содержанием свинца и степенью близости
дерева к шоссе?
Работа 24. Спектрофотометрическое определение
неорганического фосфора в сыворотке крови *
Основы
Неорганический фосфор, содержащийся в безбелковом фильтрате сыворотки
крови, взаимодействует с Mo(VI) (в форме молибдата аммония), образуя молиб-
дофосфат аммония. Последний при восстановлении мягкими восстановителями
образует молибденовую синь — гетерополикислоту, содержащую Mo(V). Сво-
В качестве пробы можно использовать искусственную сыворотку крови (сноска в работе 30) и добавить к
ней 60 г альбумина (например, бычьего сывороточного) в качестве белка. Сыворотка содержит порядка
6% белка по массе. Анализируемый раствор будет содержать -0,41 мг/дл фосфора (конкретное значение
может изменяться от образца к образцу).
420
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
бодные молибдаты в условиях анализа не восстанавливаются. Интенсивность
синей окраски раствора измеряют спектрофотометрическим методом.
Уравнения реакций
7Н3РО4~ + 12(NH4)6Mo7O24 + 51Н+ -> 7(NH4)3PO4 • 12МоО3 + 51NH4 + 36Н2О
(NH4)3PO4 • 12МоО4 + мягкий восстановитель -> вещество, содержащее Mo(V) (синее)
Хотя существует и нормальный молибдат аммония (NH4)2MoO4, наиболее рас-
пространена форма (NH4)6Mo7O24 • 4Н2О или, условно, 3(NH4)2O • 7МоО3 • 4Н2О.
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. 5%-й (масса : объем) раствор трихлоруксусной
кислоты, 5 М H2SO4, раствор восстановителя — аминонафтолсульфокис-
лоты. Последний готовят следующим образом. В сосуд из темного стекла с
притертой пробкой помещают 195 мл раствора бисульфита натрия (15 г
NaHSO3 в 100 мл), добавляют 0,50 г 1,2,4-аминонафтолсульфокислоты и
5,0 мл раствора сульфита натрия (20 г безводного Na2SO3 в 100 мл). Сосуд
закрывают пробкой и перемешивают до растворения твердого вещества.
Если растворения достичь не удается, добавляют еще раствор сульфита на-
трия порциями по 1 мл при непрерывном встряхивании до полного раство-
рения. Избытка сульфита натрия следует избегать. Раствор хранят в
холодильнике. Он устойчив в течение 1 месяца.
2 . Готовят перед работой.
(а) Исходный стандартный раствор фосфора (100 мг/дл Р). Растворите
0,439 г КН2РО4 в воде и разбавьте в мерной колбе до 100 мл.
(б) Рабочие стандартные растворы фосфора. Пипеткой внесите 1 мл ис-
ходного раствора в мерную колбу объемом 100 мл и доведите до метки
5%-й раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУК). (ВНИМАНИЕ. Три-
хлоруксусная кислота — очень едкое вещество. Избегайте попадания ее
на кожу. Растворы ТХУК нельзя засасывать ртом.) Полученный рас-
твор, содержащий 1 мг/дл фосфора, используют для приготовления серии
стандартных растворов. Перенесите пипеткой 2 и 5 мл этого раствора в
мерные колбы объемом 10 мл и разбавьте до метки 5%-м раствором
ТХУК. Таким образом, приготовлены стандартные растворы с содержа-
нием фосфора 0,2, 0,5 и 1 мг/дл. Они соответствуют концентрациям
фосфора в сыворотке крови, равным 2, 5 и 10 мг/дл, поскольку в ходе
анализа пробу разбавляют в десять раз.
(в) Раствор молибдата аммония. Растворите 0,62 г молибдата аммония
(NH4)6Mo7O24 • 4Н2О в 2,0 мл воды и добавьте 8 мл 5 М H2SO4. Раствор
устойчив неограниченное время. Однако если раствор контрольного
опыта окажется окрашенным в синий цвет, пользоваться раствором мо-
либдата аммония нельзя.
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ. Работа 25
421
Методика
Анализ сыворотки крови. Выполните два параллельных определения. Помести-
те 9,50 мл 5%-го раствора ТХУК в пробирку для центрифугирования объемом
12 мл. Добавьте 0,500 мл сыворотки, хорошо перемешайте и оставьте на 5 мин.
Затем отцентрифугируйте при скорости вращения 1500 об/мин до тех пор, пока
маточный раствор не станет прозрачным (около 5 мин). При отсутствии центри-
фуги профильтруйте раствор через мелкопористый фильтр (бумага Whatman
№ 42 или равноценная ей) в сухой стаканчик. Поскольку фильтровальная бумага
может содержать восстановители, раствор контрольного опыта, содержащий
5%-й раствор ТХУК, также следует профильтровать.
Перенесите 5,00 мл чистого маточного раствора в пробирку размерами
15x150 мм. Приготовьте раствор контрольного опыта и стандартные растворы,
отбирая пипеткой по 5,00 мл в четыре отдельные пробирки, соответственно,
5%-го раствора ТХУК и растворов с содержанием фосфора 0,2, 0,5 и 1,0 мг/дл.
Во все пробирки добавьте по 1,00 мл раствора молибдата аммония и хорошо
перемешайте. Наконец, добавьте по 0,40 мл раствора аминонафтолдисульфокис-
лоты и еще раз хорошо перемешайте. Растворы оставьте стоять на 5-10 мин или
более, а затем измерьте их оптические плотности при 690 нм относительно дис-
тиллированной воды. Из результата измерения каждого стандартного раствора
вычтите оптическую плотность раствора контрольного опыта.
Постройте градуировочный график зависимости чистой оптической плот-
ности (т. е. за вычетом раствора контрольного опыта) от концентрации фосфора,
пользуясь электронными таблицами (см. гл. 3 и 16). При помощи этого графика
по величине чистой оптической плотности анализируемого раствора определите
концентрацию фосфора в фильтрате сыворотки, не содержащем белков. Умножь-
те полученную величину на 20, чтобы получить концентрацию в исходной сыво-
ротке. В норме содержание фосфора в сыворотке крови составляет 3,0-4,5 мг/дл
для взрослых и 4,5-6,5 мг/дл для детей.
Работа 25. Спектрофотометрическое определение
марганца и хрома в их смеси
Основы
Концентрации марганца и хрома можно определить одновременно, измеряя оп-
тические плотности при двух длинах волн после окисления ионов этих металлов
до Сг2О у" и МпО 4. Показано, что для этих ионов закон Бера хорошо соблюдает-
ся в сернокислотных растворах с концентрацией H2SO4 не менее 0,5 М. Сг2О
имеет максимум поглощения при 440 нм, а МпО4 — при 545 нм. Еще один и не-
сколько более интенсивный максимум для МпО4 находится при 525 нм, но при
545 нм Сг2О мешает меньше. Для нахождения двух концентраций по резуль-
татам измерений при двух длинах волн решают систему уравнений, аналогичных
(16.16) и (16.17). Необходимые для этого значения четырех коэффициентов А:
(равных произведению гЪ) определяют по результатам измерений оптических
плотностей растворов чистых компонентов в известных концентрациях при со-
422
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
ответствующих длинах волн. При каждой длине волны строят градуировочный
график (зависимость А от с) как для Сг2О 7", так и для МпО 4, и по тангенсам уг-
лов наклона находят средние значения к.
Уравнения реакций
Исходная проба содержит Сг и Мп в форме Сг3+ и Мп2+. Сг3+ окисляют до Сг2О 7"
пероксодисульфатами (персульфатами) при нагревании в присутствии катализа-
тора Ag+:
2Сг3+ + 3S2O^“ + 7Н2ОСг2О2- + 6SO^ + 14Н+
Ион Мп2+ частично также окисляется пероксодисульфатами, а также перйодатами:
2Мп2+ + 5S2O8” + 8Н2О^4 2МпО; + lOSO^’ + 16Н+
2Мп2+ + 510 4 + ЗН2О--------------> 2MnO4 + 510 3 + 6Н+
Для смеси Сг2О 7” и Мп2+ справедливы соотношения
^440 = ^Cr,44oQr + ^Мп,440^Мп
^545 = ^Cr,545^Cr + ^Мп,545^Мп
Величины к находят из угловых коэффициентов градуировочных зависимостей,
построенных для растворов чистых компонентов:
^Сг,440 = ^44(/Qr ^Сг,545 = ^545^Сг
^Мп,440 = ^440^Мп ^Мп,545 = ^545^Мп
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. 18 М H2SO4, K2S2O8, КЮ4, AgNO3.
2 - Готовят перед работой.
(а) Стандартный раствор 0,002 М MnSO4. Высушите приблизительно 1 г
MnSO4 при 110 °C в течение 1 ч, охладите (30 мин) и возьмите навеску
массой около 0,08 г с точностью до 0,1 мг. Перенесите навеску в мерную
колбу объемом 250 мл, растворите и разбавьте до метки. Рассчитайте
мольную концентрацию раствора и концентрацию Мп в мг/л (ppm).
(б) Стандартный раствор 0,0178 М К2Сг2О7. Используйте раствор, при-
готовленный для работы 14, или приготовьте 100 мл этого раствора в со-
ответствии с описанием этой работы (навеску можно брать с точностью
до 1 мг). Рассчитайте мольную концентрацию раствора и концентрацию
Сг в мг/л (не забывайте, что на одну частицу К2Сг2О7 приходятся два
атома Сг).
(в) 0,1 М раствор AgNO3. Растворите приблизительно 0,2 г AgNO3 в
~12 мл воды.
Подготовка к работе
Приготовьте стандартные растворы MnSO4 и К2Сг2О7. Для этого потребуется
высушить эти вещества.
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ. Работа 25
423
Методика
1. Градуировка (определение величин к). ПРИМЕЧАНИЕ. Оптические плот-
ности растворов для градуировки и анализируемого раствора следует изме-
рить в один и тот же день. Поэтому прежде, чем проводить измерения,
приготовьте все растворы. Они достаточно устойчивы, и при необходимо-
сти их можно оставить до следующего занятия. Но лучше этого не делать.
(а) Раствор марганца. Перенесите пипетками 10, 15 и 25 мл стандартного
раствора MnSO4 в три отдельные конические колбы объемом 250 мл.
Добавьте дистиллированной воды до 50 мл. В каждую колбу добавьте
10 мл конц. H2SO4 (с осторожностью, мерным цилиндром) и 0,5 г твер-
дого К1О4 (в форме перйодата или метапериодата калия, в зависимости
от изготовителя). Прокипятите каждый раствор 10 мин, охладите, коли-
чественно перенесите в мерные колбы объемом 250 мл и разбавьте до
метки дистиллированной водой. Измерьте оптическую плотность каж-
дого раствора при 440 и 545 нм относительно 0,5 М H2SO4. Растворы
перманганата, содержащие перйодаты, устойчивы. При 440 нм величи-
ны оптической плотности окажутся меньше 0,1, поэтому относительная
погрешность их измерения будет большой (см. рис. 16.27). Однако в
данном случае это вполне допустимо (а малые значения оптических
плотностей — даже желательны), поскольку это означает, что поправки
на поглощение марганца при этой длине волны будут небольшими. Та-
ким образом, достаточно большая относительная погрешность в опре-
делении малой поправочной величины приведет лишь к небольшой
погрешности результата.
(б) Растворы хрома. Поместите аликвоты стандартного раствора К2Сг2О7
объемом 10,15 и 25 мл в мерные колбы на 250 мл, добавьте приблизитель-
но 100 мл воды и 10 мл конц. H2SO4, тщательно перемешайте и разбавь-
те до метки дистиллированной водой. Измерьте оптическую плотность
каждого раствора при 440 и 545 нм относительно 0,5 М H2SO4. В этом
случае оптические плотности будут малыми (< 0,1) при 545 нм.
(в) Определение значений к. Пользуясь электронными таблицами, по-
стройте графики зависимостей оптической плотности от концентрации
(мг/л) для обеих серий растворов при каждой длине волны. Методом
наименьших квадратов проведите через каждый набор точек прямую
линию. Прямые должны проходить через начало координат; для этого
установите в меню Диаграмма (Chart) программы Excel соответству-
ющую опцию. Тангенсы улов наклона этих прямых есть искомые вели-
чины к = А/с, используемые для определения хрома и марганца в пробе.
Эти величины характеризуют взаимосвязь между концентрациями и
значениями оптических плотностей только применительно к конкрет-
ным инструментальным параметрам. Поэтому для всех измерений в
данной работе следует использовать один и тот же прибор, одни и те
же кюветы, одно и то же их расположение, а также одинаковые объемы
растворов.
424
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
2. Анализ пробы. Получите раствор смеси Мп2+ и Сг3+ (или Сг^О?-) в мерной
колбе объемом 250 мл и разбавьте его до метки. Перенесите пипеткой три
аликвоты объемом 50 мл в конические колбы на 250 мл. На этом этапе вы-
полнение работы можно прервать. Но после добавления пероксодисульфа-
та окисление необходимо довести до конца.
В каждую колбу добавьте по 5 мл конц. H2SO4 (ОСТОРОЖНО!) и хо-
рошо перемешайте. Затем добавьте 1-2 мл 0,1 М AgNO3 и 1,0 г твердого пе-
роксодисульфата калия K2S2O8. БУДЬТЕ ОСТОРОЖНЫ! Пероксоди-
сулъфат — сильный окислитель, способный реагировать с восстановителя-
ми очень бурно! Используйте вещество строго по назначению и не просы-
пайте. Растворите пероксодисульфат калия, нагрейте раствор до кипения и
осторожно прокипятите 5 мин. Охладите раствор, добавьте 0,5 г КЮ4 и
снова прокипятите 5 мин.
Все растворы охладите до комнатной температуры, количественно пе-
ренесите в мерные колбы объемом 250 мл и разбавьте до метки. С этого
момента (и даже ранее — до разбавления) растворы устойчивы. При необ-
ходимости их можно оставить до следующего занятия. В этом случае оста-
вьте и стандартные растворы, поскольку градуировку и анализ пробы надо
провести в один день.
По величинам оптических плотностей анализируемого раствора рас-
считайте концентрации (ррш) Сг и Мп в пробе, используя закон Бера для
смесей (закон аддитивности оптических плотностей) и найденные величи-
ны коэффициентов к. Для расчетов воспользуйтесь электронной таблицей,
аналогичной приведенной в гл. 16 и на компакт-диске. Результаты расчетов
будут выражены в тех же единицах, что и рассчитанные коэффициенты. Не
забывайте учитывать разбавление растворов. Приведите результаты для
каждой проанализированной порции пробы.
Работа 26. Экстракционно-спектрофотометрическое
определение аспирина, фенацетина и кофеина
в таблетках ARC в УФ-области спектра
Основы
Таблетки АРС (aspirin, phenacetin, caffeine) представляют собой смесь аспирина,
фенацетина и кофеина*. Каждое из этих веществ имеет характерный спектр по-
глощения в УФ-области, главные максимумы которых приходятся на 277 нм для
аспирина, 275 нм для кофеина и 250 нм для фенацетина. В ходе работы измель-
ченную таблетку растворяют в метиленхлориде и отделяют аспирин от фенаце-
тина и кофеина экстракцией водным раствором бикарбоната натрия. Затем
аспирин реэкстрагируют в метиленхлорид из подкисленного водного раствора и
определяют спектрофотометрически при 277 нм. Фенацетин и кофеин, оставши-
еся в исходном растворе в СН2С12, определяют методом анализа двухкомпонент-
ных смесей, как описано в гл. 16 [см. уравнения (16.16) и (16.17)].
В России применяются таблетки аналогичного состава под названием «аскофен» — Прим, перев.
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ. Работа 26
425
Формулы и уравнения реакций
NHCOCH3
СО2Н
ОСОСНз
ос2н5
аспирин
(А, ацетил-
салициловая
кислота)
фенацетин кофеин
(Р, ацетофенетидин) (С, теин,
1,3,7-триметилксантин)
СН2С12
А—gr2-» А (277 нм)
Р (250 нм)
+
С (275 нм)
Реактивы и растворы
1. Имеются в лаборатории. СН2С12, 4%-й (масса : объем) раствор NaHCO3
(охлажденный), конц. НС1, 1 М H2SO4.
2. Готовят перед работой.*
Стандартные растворы. Приготовьте стандартные растворы с концентра-
циями приблизительно 250, 20 и 10 мг/л каждого из индивидуальных ве-
ществ — аспирина, фенацетина и кофеина — в метиленхлориде следующим
образом. Возьмите навеску каждого вещества массой ~25 мг (с точностью
до 0,1 мг), перенесите в мерную колбу объемом 100 мл, растворите и раз-
бавьте до метки метиленхлоридом. Для приготовления растворов с концент-
рациями 20 и 10 мг/л разбавьте, соответственно, по 2 и 1 мл приготовленных
растворов в мерных колбах объемом 25 мл до метки.
Методика**
Точно взвесьте одну таблетку и запишите ее массу. В таблетке содержится около
220 мг аспирина, 160 мг фенацетина и 30 мг кофеина. Чтобы уменьшить расход
растворителя на разбавление, разделите таблетку на четыре части, взвесьте и ис-
пользуйте для анализа одну четвертую часть. Перенесите пробу в химический
стакан и тонко измельчите ее. При перемешивании добавьте 20 мл метиленхло-
рида и количественно перенесите смесь в делительную воронку объемом 60 мл,
смывая все твердые частицы небольшими дополнительными порциями мети-
ленхлорида. Проэкстрагируйте аспирин из раствора в метиленхлориде двумя
порциями по 10 мл охлажденного 4%-го водного раствора бикарбоната натрия, к
которому добавлены две капли соляной кислоты, а затем одной порцией воды
Кофеин и фенацетин можно приобрести у фирмы «Sigma-Aldrich».
Аспирин в растворах склонен к разложению, поэтому анализ его растворов необходимо проводить по воз-
можности сразу после их приготовления.
426
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
5 мл. Объединенные водные экстракты промойте тремя порциями метиленхло-
рида по 10 мл и присоедините органическую фазу к исходному раствору в мети-
ленхлориде. Водную фазу оставьте в делительной воронке. Для удаления следов
воды профильтруйте органическую фазу через бумажный фильтр, предварите-
льно смоченный метиленхлоридом, в мерную колбу объемом 50 мл и разбавьте
метиленхлоридом до метки. Аликвоту 1 мл этого раствора разбавьте метилен-
хлоридом в мерной колбе объемом 50 мл до метки.
Бикарбонатный раствор (водную фазу), находящуюся в делительной ворон-
ке, подкислите 6 мл 1 М H2SO4. Эту операцию надо провести сразу же во избежа-
ние гидролиза аспирина. Кислоту следует добавлять медленно, маленькими
порциями. По окончании выделения большей части диоксида углерода хорошо
перемешайте раствор. На этом этапе pH раствора должен быть в пределах 1-2
(проверьте по универсальной индикаторной бумажке). Проэкстрагируйте под-
кисленный раствор восемью отдельными порциями метиленхлорида по 10 мл и
профильтруйте экстракт в мерную колбу объемом 100 мл через бумажный
фильтр, смоченный метиленхлоридом. Разбавьте раствор до метки. Аликвоту
5 мл этого раствора разбавьте метиленхлоридом в мерной колбе объемом 25 мл
до метки.
Для стандартных и анализируемого растворов запишите спектры поглощения
в диапазоне 200^300 нм. Если в лаборатории нет регистрирующего УФ-спектрофо-
тометра, эту операцию можно опустить. Считаете ли вы, что для определения ас-
пирина наиболее удобна длина волны 277 нм, а для анализа смеси фенацетина и
кофеина — 250 и 275 нм? Почему вы так думаете?
По величинам оптических плотностей стандартных и анализируемого рас-
творов аспирина при 277 нм рассчитайте массовую долю (%) аспирина в препара-
те АРС и общую массу аспирина (мг) в одной таблетке. Не забывайте учитывать
разбавление растворов.
Чтобы найти содержание фенацетина и кофеина, необходимо измерить оп-
тические плотности всех стандартных растворов этих веществ, а также экстракта
пробы, содержащего эти вещества, как при 250, так и при 275 нм. Из полученных
результатов рассчитайте массовые доли (%) и абсолютные содержания (мг) фе-
нацетина и кофеина в одной таблетке. Руководствуйтесь материалом гл. 16 по
спектрофотометрическому анализу смесей. Для расчетов используйте электрон-
ную таблицу, подобную приведенной в гл. 16 и на компакт-диске.
Работа 27. Анализ смеси изомерных ксилолов
методом И К-спектрометрии
Основы
Мета- и ияря-ксилол определяют в их смеси, используя о/?то-ксилол в качестве
внутреннего стандарта для того, чтобы скомпенсировать эффекты, связанные с
возможными изменениями длины оптического пути кюветы от измерения к из-
мерению. После записи ИК-спектров методом базовой линии рассчитывают от-
носительные высоты пиков определяемых компонентов в анализируемой смеси
и стандартных смесях.
МЕТОДЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ. Работа 28
427
Реактивы и растворы
1 - Имеются в лаборатории. Орто-, мета- и «яря-ксилол.
2 . Готовят перед работой. Стандартные смеси мета- и «яря-ксилола. Отме-
рьте при помощи бюреток и смешайте необходимые объемы о-, м- и «-кси-
лола так, чтобы содержание о-ксилола (внутреннего стандарта) в каждой
смеси составляло 30% по объему, аж-ксилола — 25, 35 и 45%. Содержание
«-ксилола при этом составит 45, 35 и 25% (об.) соответственно.
Методика
Порядок работы на приборе вам объяснит преподаватель. Обращайтесь с кюве-
той для ИК-спектрометрии осторожно, не берите ее пальцами и не допускайте
контакта ее с водой. Заполните кювету чистым л/-ксилолом и запишите его
спектр в диапазоне 2-15 мкм (убедитесь, что зарегистрирован последний пик перед
значением длины волны 15 мкм, соответствующий волновому числу 692 см-1).
Перед каждой записью спектра устанавливайте 0% пропускания, перекрыв не-
прозрачной заглушкой световой поток, падающий на пробу. Затем опорожните
кювету, промойте ее, заполните ее «-ксилолом и запишите его спектр. Точно так
же запишите спектр о-ксилола и всех стандартных смесей. По спектрам чистых
компонентов выберите по одному пику для определения каждого из них. Для
каждого вещества рассчитайте величину lg(P0/P), используя метод базовой ли-
нии (см. рис. 16.11). Для мета- и «яря-изомеров постройте градуировочные гра-
фики в виде зависимостей lg(P>0/P>)Ckpmo и lg(P0/P)„apa / ^Р0/Р)орто
от концентрации соответствующего (мета- или пара-) изомера. О создании
электронных таблиц для построения градуировочных графиков с использовани-
ем внутреннего стандарта см. гл. 20 и компакт-диск.
Получите у преподавателя смесь мета- и «яря-изомеров ксилола для анали-
за. Смешайте ее с о-ксилолом в соотношении 70 : 30 по объему. Запишите спектр
смеси и, используя ранее выбранные пики, методом базовой линии рассчитайте
величины \g(PJP)l\g(PJP)opmo для каждого из определяемых компонентов. При
помощи градуировочных графиков определите объемную долю (%) м- и «-кси-
лола. Найденные величины разделите на 0,7, чтобы перейти к содержаниям в ис-
ходной смеси.
Работа 28. Флуориметрическое определение рибофлавина
(витамина В2)
Основы
Рибофлавин обладает сильной флуоресценцией в среде 5%-й уксусной кислоты.
Для нахождения оптимальных длин волн возбуждения и регистрации флуорес-
ценции записывают соответствующие спектры (возбуждения и испускания флуо-
ресценции). Содержание рибофлавина находят по градуировочной зависимости.
Реактивы и растворы
Стандартные растворы рибофлавина. Приготовьте исходный раствор рибофла-
вина с концентрацией 100 ррш. Для этого возьмите точную навеску вещества
428
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
массой около 50 мг, перенесите ее в мерную колбу объемом 500 мл, растворите и
разбавьте до метки 5%-м (по объему) раствором уксусной кислоты. Раствор сле-
дует хранить в холодном темном месте. Непосредственно в день эксперимента
приготовьте рабочий стандартный раствор с концентрацией 10 ppm, разбавив
аликвоту исходного раствора в соотношении 1:10. Затем разбавьте аликвоты
рабочего раствора 5%-й уксусной кислотой таким образом, чтобы получить
стандартные растворы с концентрацией рибофлавина 0 (раствор контрольного
опыта), 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 ppm.
Методика
Для раствора с концентрацией рибофлавина 0,6 ppm запишите спектры возбуж-
дения и испускания флуоресценции, чтобы определить оптимальные длины
волн возбуждения и регистрации свечения. Если возможности прибора не по-
зволяют это сделать (в случаях, когда флуориметр снабжен лишь набором свето-
фильтров), измерьте интенсивности флуоресценции с различными первичными
(входными) и вторичными (выходными) светофильтрами и найдите комбина-
цию, обеспечивающую максимальный сигнал. В найденных условиях измерьте
интенсивность флуоресценции раствора с концентрацией 1 ppm и примите ее за
100%. Измерьте интенсивности флуоресценции остальных стандартных раство-
ров и постройте градуировочный график. Получите анализируемый раствор в
мерной колбе объемом 50 мл, разбавьте его до метки 5% уксусной кислотой и из-
мерьте интенсивность его флуоресценции. По градуировочной зависимости рас-
считайте общее содержание рибофлавина (мкг) в пробе. Для расчетов используйте
электронные таблицы.
Методы атомной спектрометрии
Работа 29. Определение кальция методом
атомно-абсорбционной спектрометрии
Основы
В ходе работы предстоит изучить влияние инструментальных параметров, а так-
же фосфатов и алюминия на величину оптической плотности атомного пара каль-
ция (см., например, [W. Hoskins et al., J. Chem. Ed., 54 (1977) 128]). Содержание
кальция в искусственной пробе или сыворотке крови определяют по градуиро-
вочной зависимости.
Реактивы и растворы
Растворы Са (50 ppm), SrCl2 (4%-й), NaCl (2000 ppm), фосфатов (100 ppm), эта-
нол.
1 - Имеются в лаборатории', этанол, 4%-й (масса : объем) раствор SrCl2, ис-
ходный раствор, содержащий 140 ммоль экв./л Na и 4,1 ммоль экв./л К —
см. сноску на стр. 431.
МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ. Работа 29
429
2 . Готовят перед работой.
(а) Исходный раствор Са, 500 ppm. Растворяют точную навеску 1,834 г
СаС12 • 2Н2О в воде и разбавляют до 1 л в мерной колбе. Разбавлением
полученного раствора в соотношении 1:10 готовят раствор с концент-
рацией 50 ррш. Из последнего готовят все остальные необходимые в
работе растворы кальция (см. ниже). В качестве исходного можно ис-
пользовать также имеющийся в продаже стандартный раствор Са2+ с
концентрацией 1000 ppm.
(б) Исходный раствор Na, 2000 ppm. Растворяют 0,51 г NaCl в 1 л воды,
(в) Раствор фосфатов, 100 ppm. Растворяют 0,15 г Na2HPO4 в 1 л воды,
(г) Исходный раствор А1,100 ppm.
Растворяют 0,18 г A12(SO4)3 • K2SO4 • 24Н2О в 100 мл воды. Можно ис-
пользовать и А1С13, но при добавлении к нему воды будьте осторожны.
Изучение влияния инструментальных параметров
При работе с прибором следуйте указаниям преподавателя. Для однолучевых
приборов лампу с полым катодом перед измерениями необходимо прогреть
30 мин. При использовании двухлучевого прибора достаточно несколько минут.
Для работы необходимо воздушно-ацетиленовое пламя и горелка с камерой
предварительного смешения.
1. Влияние высоты пламени. Отрегулируйте потоки горючего газа и воздуха
так, чтобы пламя имело почти стехиометрический состав (бледно-желтый
оттенок). Затем увеличьте подачу так, чтобы пламя стало ярко-желтым (та-
кое пламя называется обогащенным). Это свечение обусловлено наличием
частиц углерода — продуктов неполного сгорания. Если же пламя образу-
ется при избытке воздуха (обедненное), то оно имеет голубой цвет. Приго-
товьте раствор кальция с концентрацией 5 ррш и распылите его в пламя,
установив длину волны монохроматора 422,67 нм. Затем точно отрегули-
руйте длину волны монохроматора так, чтобы добиться максимального
значения оптической плотности. Установите горелку так, чтобы луч света
проходил через самое основание пламени. Распылите в пламя дистиллиро-
ванную воду и установите показание оптической плотности, равное нулю.
Затем распылите раствор кальция (5 ppm) и измерьте величину оптической
плотности. Последовательно 6-8 раз опускайте горелку и измеряйте опти-
ческую плотность в каждом положении.
Постройте зависимость оптической плотности от высоты наблюдения
в пламени и выберите оптимальную высоту.
2. Влияние соотношения горючий газ : воздух. При постоянном расходе воз-
духа пошагово изменяйте расход горючего газа, начиная от самого большого
(сильно обогащенное пламя) до самого маленького (обедненное). Запишите
величины оптической плотности для раствора Са (5 ppm) при каждом зна-
чении расхода газа.
Выберите и установите оптимальный расход горючего газа и изменяй-
те расход воздуха таким же способом. Постройте зависимости оптической
плотности от расхода как горючего газа, так и воздуха (при постоянном
430
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
расходе другого компонента). Выберите оптимальные значения расходов
горючего газа и воздуха. Является ли такое пламя обогащенным, стехио-
метрическим или обедненным?
Изучение мешающего влияния посторонних компонентов
1 - Влияние фосфатов. Приготовьте раствор, содержащий 5 ppm Са и 10 ppm
фосфатов. В оптимальных условиях, найденных ранее, измерьте и запиши-
те величину оптической плотности и сравните ее с оптической плотностью
для чистого раствора Са 5 ppm. Объясните полученные результаты.
Приготовьте раствор, содержащий 5 ppm Са, 10 ppm фосфатов и
1% SrCl2. Приготовьте также раствор, содержащий только 5 ppm Са и
1% SrCl2. Измерьте и запишите оптические плотности для этих растворов.
Сравните эти величины с полученными ранее. Объясните результаты.
2 - Влияние натрия. Приготовьте раствор, содержащий 5 ppm Са и 1 000 ppm Na.
Измерьте величину оптической плотности и сравните ее с величиной для
чистого раствора Са 5 ppm. Объясните причину различия.
3. Влияние алюминия. Приготовьте раствор, содержащий 5 ppm Са и 10 ppm Al.
Измерьте величину оптической плотности и сравните ее с величиной для
чистого раствора Са 5 ppm. Приведите возможное уравнение реакции, по-
зволяющее объяснить полученные результаты.
Определение концентрации кальция в пробе
Вместо методики, описанной далее, можно использовать методику, основанную
на способе добавок.
1 - Анализ искусственного раствора. Получите у преподавателя раствор для
анализа и разбавьте его так, чтобы концентрация Са в нем составляла
5-15 ppm. Из раствора кальция с концентрацией 50 ppm приготовьте серию
стандартных растворов с концентрациями 0, 2,5, 5, 7,5, 10 и 15 ppm. Если
проба содержит фосфаты, к пробе и ко всем стандартным растворам доба-
вьте SrCl2 в таком количестве, чтобы его конечная концентрация составила
1%. Запишите значения оптических плотностей (либо величин пропускания
или поглощения, которые затем следует пересчитать в оптические плотно-
сти) для этих растворов и постройте градуировочный график в виде зависи-
мости оптической плотности от концентрации. Определите концентрацию
кальция в пробе, пользуясь стандартными приемами.
2 . Анализ сыворотки крови. В настоящей или искусственной сыворотке крови
(приготовление последней описано в сноске на стр. 432) кальций определя-
ют после разбавления пробы 1%-м раствором SrCl2 в соотношении 1 : 20.
В норме содержание кальция в сыворотке составляет около 100 ppm, таким
образом разбавленный раствор будет содержать около 5 ppm Са. К стандар-
тным растворам необходимо добавить натрий и калий в таких количествах,
чтобы их концентрации примерно совпадали с концентрациями в пробе.
Поместите 0,5 мл настоящей или искусственной сыворотки крови в
мерную колбу объемом 10 мл и разбавьте до метки 1%-м раствором SrCl2.
МЕТОДЫ АТОМНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ. Работа 29
431
Если вместо обычной градуировки или для сравнения с ней используется
метод добавок, то 2,5 мл пробы разбавьте 1%-м раствором SrCl2 до 50 мл.
Приготовьте стандартные растворы с концентрациями Са, равными 0, 3, 4,
5,6 и 8 ppm, каждый из которых содержит также 1% SrCl2,6,9 ммоль экв./л Na
и 0,21 ммоль экв./л К *. По величинам оптических плотностей, измеренных
для стандартных растворов, постройте градуировочный график и при его
помощи определите концентрацию кальция в пробе. Пользуйтесь элект-
ронными таблицами.
Метод добавок
Для анализа пробы можно использовать данную методику вместо предыдущей.
Она иллюстрирует целесообразность применения метода добавок для устране-
ния матричных эффектов. Разбавьте пробу, как описано выше, дистиллирован-
ной водой, чтобы получить раствор с концентрацией Са приблизительно 5 ppm
(для сыворотки крови это разбавление составит 1 : 20; например, можно разба-
вить 2,5 мл до 50 мл). Аликвоты разбавленной пробы объемом 10,0 мл перенесите
пипеткой в три отдельные чистые и сухие пробирки или колбы. Затем добавьте в
них, соответственно, 50,0, 100 и 150 мкл стандартного раствора Са с концентра-
цией 500 ppm (или 25,0, 50,0 и 75,0 мкл раствора Са с концентрацией 1000 ppm,
если имеется). При этом концентрация кальция в разбавленной пробе увеличи-
вается, соответственно, на 2,5, 5,0 и 7,5 ppm (или около того, в зависимости от
точного значения концентрации стандартного раствора; в диапазоне этих вели-
чин находится и само значение концентрации кальция в пробе). Изменением
объема раствора можно пренебречь. Для дозировки стандартного раствора ис-
пользуйте подходящую шприцевую пипетку (например, пипетку Eppendorf или
Finn на 50 мкл) либо градуированную пипетку объемом 0,1 мл. Для большей точ-
ности пипетку следует откалибровать (см. гл. 2).
Установите нулевое показание прибора по дистиллированной воде, а за-
тем распылите разбавленный раствор пробы и растворы с добавками. При этом
величины оптических плотностей будут возрастать в соответствии с возрастани-
ем концентрации кальция. При помощи электронных таблиц постройте зависи-
мость оптической плотности от концентрации добавленного кальция (начиная с
нулевой, т. е. с чистой пробы). По отсекаемому осью абсцисс отрезку найдите
концентрацию кальция в разбавленной пробе. О построении градуировочных
зависимостей по методу добавок и расчете концентрации аналита в пробе
см. гл. 17. Рассчитайте концентрацию кальция в исходной пробе. За счет чего
применение метода добавок позволяет скомпенсировать мешающее влияние
фосфатов?
Для этого можно приготовить исходный (в 20 раз более концентрированный) раствор, содержащий
140 ммоль экв./л Na и 4,1 ммоль экв./л К, растворив 8,1г NaCl и 0,21 г КС1 в 1 л воды. Концентрации Na и К
соответствуют их нормальному содержанию в сыворотке крови и при анализе позволяют скомпенсировать
эффекты, обусловленные ионизацией. В ходе приготовления стандартных растворов разбавьте этот раствор
в 20 раз.
432
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Работа 30. Определение натрия методом
атомно-эмиссионной спектрометрии в пламени
Основы
Измеряют интенсивность испускания атомов натрия в пламени при 589,0 нм и
сравнивают ее с интенсивностями испускания для стандартных растворов. Если
прибор позволяет выполнять измерения методом внутреннего стандарта, исполь-
зуют отношения интенсивностей испускания натрия и лития.
Реактивы и растворы
1. Исходный стандартный раствор NaCl {1000ppm Na). Высушите около 1 г
NaCl при 120 °C в течение 1 ч и охладите (30 мин). Взвесьте 0,254 г NaCl,
растворите в воде и разбавьте до 1 л. Следует принимать меры предосто-
рожности против загрязнения растворов натрием извне — особенно из
воды и посуды. Для внесения поправки на содержание натрия в воде необ-
ходимо провести контрольный опыт.
2. Раствор внутреннего стандарта LiNO3 {1000ppm Li).,Нужен только при
выполнении измерений методом внутреннего стандарта. При измерениях
абсолютным методом этот раствор не требуется. Растворите 0,99 г LiNO3 в
воде и разбавьте до 100 мл.
3. Рабочие стандартные растворы .*
(а) Измерения абсолютных интенсивностей. Приготовьте стандартные
растворы Na с концентрациями 0, 10, 20, 30, 40 и 50 ppm разбавлением,
соответственно, 0, 5, 10, 15, 20 и 25 мл исходного раствора NaCl до
50 мл. Для некоторых приборов целесообразнее использовать растворы с
концентрациями в пять раз меньшими, разбавляя 0,1,2,3,4 и 5 мл исход-
ного раствора, — в этом случае градуировочный график может получить-
ся ближе к линейному. Руководствуйтесь указаниями преподавателя.
(б) Измерения относительных интенсивностей (метод внутреннего стан-
дарта). Приготовьте серию стандартных растворов натрия, как описано
выше, но в каждый раствор перед разбавлением добавьте по 5 мл исход-
ного раствора лития. В этом случае концентрация лития во всех раство-
рах составит 100 ppm. Для разных приборов оптимальная концентрация
Объектом анализа может служить простой раствор NaCl либо сыворотка крови. В последнем случае стан-
дартные растворы следует готовить в более узком концентрационном диапазоне, непосредственно охваты-
вающем содержание натрия в пробе. Концентрация натрия в сыворотке крови составляет около
140 ммоль экв./л или 3200 ppm. Для анализа пробу достаточно просто разбавить в 100 (например, 0,1 мл до
10 мл) или 500 раз в зависимости от чувствительности прибора. Можно приготовить искусственную сыво-
ротку крови, растворив в воде следующие вещества в указанных количествах (г) и разбавив раствор до 1 л:
NaCl 8,072
КС1 0,21
КН2РО4 0,18
СаС12 • 2Н2О 0,37
MgSO4 • 7Н2О 0,25
Этот раствор содержит 138,1 ммоль экв./л Na (его содержание можно несколько изменять от пробы к про-
бе). В качестве источника белка к раствору можно добавить 60 г бычьего сывороточного альбумина (сыво-
ротка содержит около 6% по массе белков).
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. Работа 31
433
лития может быть различной, поэтому преподаватель может предло-
жить вам добавить другое количество лития.
Подготовка к работе
Высушите NaCl при 120 °C в течение 1 ч и охладите в эксикаторе.
Методика
Получите у преподавателя мерную колбу объемом 100 мл, содержащую анали-
зируемый раствор.
1. Измерения абсолютных интенсивностей. Разбавьте анализируемый раствор
водой до метки. При работе на приборе следуйте указаниям преподавателя.
Иногда для работы можно использовать атомно-абсорбционный спектро-
метр, поскольку некоторые из них позволяют измерять интенсивность испу-
скания света. Распылите в пламя горелки дистиллированную воду (раствор
контрольного опыта) и установите нулевое показание прибора. Затем распы-
лите стандартные растворы и измерьте для них интенсивности испускания.
Для некоторых приборов требуется установить 100%-ное значение интен-
сивности по самому концентрированному стандартному раствору.
Пользуясь электронными таблицами, постройте зависимость интен-
сивности испускания от концентрации натрия в стандартных растворах и
найдите концентрацию натрия в пробе по градуировочному графику. Из
полученного значения рассчитайте общее содержание (мкг) натрия в пробе
(при анализе воды) или концентрацию его в исходной пробе в ppm или
ммоль экв./л (при анализе сыворотки крови; см. сноску на стр. 432 стр.).
2. Измерения методом внутреннего стандарта. Добавьте к пробе то же ко-
личество раствора лития, что и к стандартным растворам, и разбавьте во-
дой до метки. При работе на приборе следуйте указаниям преподавателя.
Линия испускания лития наблюдается при 670,8 нм. Постройте градуиро-
вочный график в виде зависимости отношения интенсивностей линий ис-
пускания Na и Li от концентрации натрия. Определите концентрацию
натрия в анализируемом растворе и рассчитайте общее содержание (мкг)
натрия в пробе (при анализе воды) или концентрацию его в исходной пробе
в ppm или ммоль экв./л (при анализе сыворотки крови; см. сноску на
стр. 432). При расчетах пользуйтесь электронными таблицами (см. гл. 20:
построение градуировочного графика методом внутреннего стандарта и
соответствующие расчеты).
Хроматографические методы
Работа 31. Разделение аминокислот
при помощи тонкослойной хроматографии
Основы
Аминокислоты разделяют на пластинке для тонкослойной хроматографии
(ТСХ) — например, с силикагелем, — используя одну из двух подвижных фаз на
выбор. В качестве проявляющего реагента применяют нингидрин.
434
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Реактивы и растворы
Имеются в лаборатории
(а) Подвижные фазы: № 1, смесь бутанола, уксусной кислоты и воды
(80 : 20:20 по объему); № 2, смесь пропанола и воды (7 : 3 по объему).
(б) Проявляющий реагент: 0,3%-й раствор нингидрина (1,2,3-грикето-
гидринден, Eastman № 2495) в бутаноле, содержащем 3% ледяной ук-
сусной кислоты.
Хроматографическое оборудование
Пластинки для ТСХ из комплекта Fisher Scientific TLC Kit A (http://www.
fisheredu.com) или аналогичные, распылитель (для опрыскивания раствором
проявляющего реагента), хроматографическая камера (например, из комплек-
та Fisher Scientific TLC Kit А или аналогичная).
Методика
Получите у преподавателя для анализа раствор смеси аминокислот, содержащий
приблизительно 1 мг каждой аминокислоты в 1 мл 0,5 М спиртового раствора
НС1 (см. комментарии ниже). Нанесите ~1 мкл этого раствора в виде пятнышка
на хроматографическую пластинку на расстоянии около 2 см от нижнего края.
Предварительная обработка пластинки не требуется. Аминокислоты, содержа-
щиеся в пробе, по крайней мере для одной из предлагаемых подвижных фаз зна-
чительно различаются по величинам параметра Rp поэтому их легко можно будет
разделить. Чтобы отличить аминокислоты, содержащиеся в пробе, от других с
близкими значениями Rp одновременно с пробой проведите хроматографирова-
ние некоторых растворов чистых аминокислот (преподаватель укажет вам, ка-
ких именно). После нанесения пробы оставьте пластинку сушиться в течение
15-20 мин до полного удаления паров НС1.
Выберите одну из двух подвижных фаз и выполните хроматографирование
пробы на пластинке так, чтобы фронт подвижной фазы прошел расстояние око-
ло 10 см (это должно занять около 90 мин). При выборе подвижной фазы руко-
водствуйтесь приведенными ниже в таблице величинами R^ аминокислот и
указаниями преподавателя. Высушите хроматографическую пластинку, опрыс-
ните ее раствором нингидрина и осторожно подогрейте несколько минут до от-
четливого проявления отдельных хроматографических зон.
Идентификация аминокислот
Ниже приведена таблица с приблизительными значениями R^ 13 различных ами-
нокислот для двух подвижных фаз. Пользуясь этой таблицей и принимая во внима-
ние результаты хроматографирования индивидуальных аминокислот, установите,
какие аминокислоты содержатся в анализируемой смеси.
Комментарии
Ввиду ограниченной растворимости многих аминокислот в спирте приготовле-
нию анализируемой смеси следует уделить особое внимание. В работе рекомен-
дуется использовать растворы в 0,5 М спиртовом растворе НО. Однако для
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. Работа 31
435
растворения некоторых аминокислот может потребоваться добавление к этому
раствору значительных количеств воды. В этом случае особенно важно, чтобы
пятно раствора пробы, наносимое на пластинку, было как можно меньше. Кроме
того, между нанесением пятна и хроматографированием необходимо выждать
достаточно времени, чтобы растворитель полностью испарился.
Чтобы улучшить разрешение хроматографических зон, можно использо-
вать технику двумерной хроматографии. Для этого пятно пробы наносят вблизи
левого нижнего угла пластинки (при размерах пластинки 20x20 см — на рассто-
янии 2 см от нижнего и левого краев). Сначала пробу хроматографируют как
обычно, затем пластинку вынимают и высушивают, а после этого поворачивают
на 90° против часовой стрелки и для разделения плохо разделившихся компо-
нентов еще раз хроматографируют, применяя другую подвижную фазу.
Экспериментальные значения Rf аминокислот зависят от множества факто-
ров, включая концентрации как самих аминокислот, так и других компонентов,
присутствующих в пробе. По этой причине используемые для сравнения раство-
ры, содержащие индивидуальные аминокислоты, должны быть по всем пара-
метрам максимально подобны раствору пробы.
При проявлении хроматографических зон нингидрином предел обнаруже-
ния составляет 0,01-0,5 мкг в зависимости от природы аминокислоты, а также от
конкретного способа разделения. Окраску, образующуюся при действии ни-
нгидрина, можно стабилизировать. Для этого проявленную пластинку следует
дополнительно опрыскать раствором, полученным смешением 1 мл насыщенно-
го водного раствора нитрата меди, 0,2 мл 10%-й азотной кислоты и 100 мл
95%-го этанола. После этого пластинку выдерживают над парами аммиака до
появления красной окраски медных комплексов. Окраска устойчива только в от-
сутствие кислот.
Аминокислота Приблизительное значение
подвижная фаза № 1 подвижная фаза № 2
Аланин 0,29 0,50
Аргинин (моногидрохлорид) 0,15 0,15
Аспарагин 0,20 0,43
Валин 0,40 0,60
Глицин 0,22 0,39
Глутаминовая кислота 0,33 0,40
Лейцин 0,57 0,69
Лизин 0,10 0,20
Метионин 0,47 0,63
Серин 0,25 0,45
Тирозин 0,52 0,69
Триптофан 0,55 0,71
Цистин 0,12 0,22
436
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Работа 32. Газохроматографический анализ
тройной смеси углеводородов
Основы
Смесь пентана, гексана и гептана разделяют методом газовой хроматографии.
При этом можно использовать разнообразные колонки различных типов. Для
детектирования подойдет простейший детектор по теплопроводности (катаро-
метр, «горячая спираль»). Для каждого вещества проводят градуировку по стан-
дартной смеси определяемых компонентов. Установление последовательности
хроматографических пиков осуществляют хроматографированием индивидуаль-
ных веществ.
Другой вариант работы предусматривает анализ двухкомпонентной смеси
«-гексана и «-гептана. В этом случае «-пентан применяют как внутренний стан-
дарт.
Реактивы и растворы
1. Имеются в лаборатории. Ацетон.
2. Готовят перед работой. Стандартная смесь определяемых компонентов —
«-пентана (5,00 мл), «-гексана (10,00 мл) и «-гептана (15,00 мл). Все смеси
следует готовить непосредственно перед работой и хранить в закрытых со-
судах с пластмассовыми пробками. Можно приготовить смесь с заданным
соотношением масс (взвешивая отдельные компоненты или рассчитывая
их массы по величинам объемов и плотностей). В этом случае результаты
анализа следует представить в виде массовых долей.
Внимание. При работе с микрошприцами будьте очень осторожны. Не
повредите их. Правильные результаты можно получить лишь при правиль-
ном уходе за шприцами. Каждый раз после использования шприца выньте
поршень, тщательно промойте шприц ацетоном и оставьте до полного вы-
сыхания. Промывание можно сделать при помощи другого шприца, запол-
нив его ацетоном, вставив в отверстие стеклянной трубки использованного
шприца и пропуская ацетон до полной очистки внутренней поверхности
шприца. Для высушивания пропустите через трубку шприца ток воздуха.
После полного высыхания внутренняя поверхность шприца будет казаться
шероховатой.
Методика
Получите у преподавателя смесь для анализа. Строго следуйте всем инструкци-
ям по работе на приборе и указаниям преподавателя. Не производите никаких
изменений температурного режима. Пользуясь подходящим шприцом, получи-
те хроматограммы каждого отдельного компонента смеси, три хроматограммы
стандартной смеси и три хроматограммы анализируемой смеси.
По окончании работы выключите прибор в соответствии с указаниями пре-
подавателя. Особенно важно при этом соблюдать правильный режим уменьше-
ния потока газа-носителя и порядок перевода детектора в «ждущий» режим.
Вымойте, ополосните ацетоном и высушите все шприцы и посуду.
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. Работа 33
437
Обработка данных
Для вычисления площади хроматографического пика достаточно умножить его
высоту на ширину на половине высоты *. Необходимые для этого измерения вы-
полните с помощью миллиметровой линейки. Если прибор позволяет автоматиче-
ски определять площади пиков и выводить их на печать, используйте эти значения.
Компоненты смеси идентифицируют по их положениям на хроматограмме
(временам удерживания).
Стандартную смесь используют для количественной градуировки. Отклик
детектора к разным веществам неодинаков, поэтому для каждого компонента
необходимо определить коэффициент относительной чувствительности. Проще
всего это можно сделать путем непосредственного сравнения абсолютных пло-
щадей пиков** с относительными долями соответствующих компонентов в стан-
дартной смеси. Так, если пик компонента А с содержанием 25% имеет площадь,
равную 40, то площадь того же компонента, равная 80, соответствует 50% содер-
жанию. Конечно, более точным было бы построение для каждого компонента гра-
дуировочной зависимости площади пика от содержания. В этом случае оказывается
учтенным возможное изменение общего объема при смешении веществ.
По средним значениям площадей пиков рассчитайте для каждого компо-
нента среднее значение его содержания (% об.) в анализируемой смеси.
Градуировка методом внутреннего стандарта
Преподаватель может выдать вам для анализа двухкомпонентную смесь «-гекса-
на и «-гептана и предложить добавить во все растворы «-пентан в качестве внут-
реннего стандарта. В этом случае стандартную смесь приготовьте, как описано
выше, а к 25,00 мл пробы добавьте 5,00 мл «-пентана. Для градуировки исполь-
зуйте отношения площадей пиков определяемых компонентов к площади пика
«-пентана. Подробнее о методе внутреннего стандарта см. в гл. 20.
Работа 33. Качественный и количественный анализ
фруктовых напитков на витамин С методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии***
Основы
Несколько проб соков непосредственно хроматографируют на колонке с силь-
ноосновным анионобменником, используя УФ-детектор при 254 нм. Наличие
Вместо расчетного способа определения площадей пиков можно использовать несколько более точный
способ, основанный на взвешивании бумаги. Сделайте бумажную копию хроматограммы. Из исходной
хроматограммы аккуратно вырежьте по контуру каждый пик. Взвесьте вырезанные пики на аналитиче-
ских весах и возьмите в расчет значения масс в качестве меры площади. В этом случае приложите «вырез-
ки» к отчету о работе. Можно определять площади пиков и электронным интегрированием.
Лучше использовать не абсолютные, а относительные значения площадей (по отношению к сумме площадей
всех пиков). При этом устраняется возможная погрешность, связанная с дозировкой пробы. — Прим, перев.
Продукт окисления аскорбиновой кислоты — дегидроаскорбиновая кислота — не поглощает в УФ-облас-
ти и не обнаруживается описанным методом. Для получения долее точных результатов пробу следует
предварительно обработать восстановителем, например H2S [Roe et al., J. Biol. Chem., 174 (1984) 201], для
восстановления дегидроаскорбиновой кислоты.
438
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
либо отсутствие витамина С устанавливают, сравнивая времена удерживания
пиков для пробы и чистого раствора витамина С (/-аскорбиновой кислоты). Ко-
личественно содержание витамина С (в тех пробах, где он присутствует) нахо-
дят по величинам площадей пиков.
Реактивы и растворы
1. Имеются в лаборатории. Подвижная фаза (раствор 1,36 г/л КН2РО4, при-
готовленный на дистиллированной деионизированной воде), /-аскорбино-
вая кислота.
2. Готовят перед работой. Стандартный раствор витамина С. Взвесьте 50 мг
/-аскорбиновой кислоты с точностью до 0,1 мг, перенесите в мерную колбу
объемом 50 мл, растворите и разбавьте до метки дистиллированной деио-
низированной водой. Раствор следует готовить в день выполнения работы.
Концентрация раствора составляет 0,1%. Из него разбавлением приготовь-
те 0,05% и 0,02% стандартные растворы.
Методика
1. Градуировка. Руководствуйтесь указаниями преподавателя о порядке рабо-
ты на приборе, включая необходимую настройку. В состав прибора входит
колонка с сильноосновной анионообменной смолой. Для типичного давле-
ния 1000 фунт/дюйм2 (около 70 атм) скорость потока составляет около
0,5 мл/мин.
При помощи шприца объемом 10 или 25 мкл введите аликвоту 10 мкл
0,02%-го стандартного раствора витамина С и снимите хроматограмму.
Сделайте то же самое с 0,05%-м и 0,1 %-м стандартными растворами. Изме-
рьте времена удерживания и площади пиков. Площадь пика можно найти
расчетным путем (как произведение высоты на ширину на половине высо-
ты), по взвешиванию бумаги (вырезав пик по контуру) или электронным
интегрированием (если прибор позволяет это делать и выводить результа-
ты на печать). Пользуясь электронными таблицами, постройте градуиро-
вочный график в виде зависимости площади пика от концентрации.
2. Анализ проб. Преподаватель предоставит вам три или более проб. Это мо-
гут быть, в частности, напитки с повышенным содержанием витамина С,
виноградный напиток, апельсиновый сок и т. д. Введите в хроматограф по
10 мкл каждой пробы и получите хроматограммы. Каждая из них может со-
держать несколько пиков. Если позволяет время, снимите не менее двух
хроматограмм каждой пробы. По величинам времен удерживания устано-
вите, в каких из проб содержится витамин С. Измерьте площади пиков ви-
тамина С и по градуировочному графику найдите его концентрации в
соответствующих пробах. Если вы выполнили хроматографирование два
или более раз, рассчитайте средние значения и (если повторных хроматог-
рамм более двух) стандартные отклонения. Пики витамина С могут частич-
но перекрываться с соседними. В таких случаях экстраполируйте пик до
базовой линии и измеряйте площади от базовой линии.
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. Работа 34
439
Работа 34. Анализ анальгетиков методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии
Основы
Качественный состав анальгетиков (Bufferin, Anacin, Empirin, таблетки аспири-
на под разными торговыми названиями и т. д.) устанавливают посредством
сравнения их хроматограмм с хроматограммами чистых растворов аспирина,
фенацетина и кофеина. Количественно содержание аспирина в каждой пробе на-
ходят путем сравнения площадей пиков для проб и стандартных растворов. Раз-
деление проводят на колонке с сильноосновным анионообменником, используя
УФ-детектор.
Реактивы и растворы
1. Имеются в лаборатории *. Аспирин (ацетилсалициловая кислота), фенаце-
тин (ацетофенетидин), кофеин (теин, 1,3,7-триметилксантин), метанол, по-
движная фаза (раствор 0,01 М бората натрия + 0,005 М нитрата аммония).
Структурные формулы аспирина, фенацетина и кофеина приведены в опи-
сании работы 26.
2. Готовят перед работой**
(а) Исходные растворы аспирина, фенацетина и кофеина. Возьмите на-
вески фенацетина и кофеина по 50 мг с точностью до 1 мг и перенесите
их в подписанные мерные колбы объемом 50 мл. Растворите вещества в
метаноле и разбавьте им растворы до метки. Возьмите навеску аспирина
массой 150 мг с точностью до 1 мг, перенесите в подписанную мерную
колбу объемом 50 мл, растворите в метаноле и разбавьте им до метки.
Растворы следует готовить в день выполнения работы.
(б) Рабочие стандартные растворы аспирина. Из исходного раствора ас-
пирина с концентрацией 300 мг/дл путем разбавления метанолом пригото-
вьте стандартные растворы с концентрациями около 200, 100 и 50 мг/дл.
Методика
1. Градуировка. Руководствуйтесь указаниями преподавателя о порядке рабо-
ты на приборе, включая необходимую настройку для каждой пробы. В со-
став прибора входит колонка с сильноосновной анионообменной смолой.
Для типичного давления 1000 фунтов на квадратный дюйм (~70 атм) ско-
рость потока составляет около 0,5 мл/мин.
При помощи шприца объемом 5 или 10 мкл введите аликвоты 5 мкл
каждого из стандартных растворов аспирина, фенацетина и кофеина с кон-
центрацией 100 мг/дл и получите соответствующие хроматограммы. Таким
же образом снимите хроматограммы для остальных стандартных раство-
ров аспирина (если позволит время, то по несколько повторных).
Кофеин и фенацетин можно приобрести у фирмы Sigma-Aldrich.
** Аспирин в растворах склонен к разложению, поэтому анализ его растворов нужно выполнять по возмож-
ности сразу после их приготовления.
440
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Измерьте времена удерживания веществ, а для аспирина — также пло-
щади пиков. Площадь пика можно найти расчетным путем (как произведе-
ние высоты на ширину на половине высоты), по взвешиванию бумаги
(вырезав пик по контуру) или электронным интегрированием (если прибор
позволяет это делать и выводить результаты на печать). Пользуясь элект-
ронными таблицами, постройте градуировочный график в виде зависимо-
сти площади пика от концентрации.
2. Анализ проб. Преподаватель предоставит вам 5-6 таблеток: Bufferin, Апа-
cin, Empirin, аспирин от фирмы Bayer и 1-2 таблетки аспирина других про-
изводителей. Приготовьте раствор каждого препарата в метаноле. Для
этого измельчите таблетку пестиком в ступке, возьмите навеску около
175 мг с точностью до 0,1 мг, перенесите в мерную колбу объемом 50 мл,
растворите в метаноле и разбавьте до метки. Хорошо перемешайте раство-
ры и, если присутствует нерастворившийся остаток, дайте ему осесть в те-
чение 10 мин. Затем снимите хроматограммы, как описано выше, вводя
аликвоты объемом 5 мкл. Если позволяет время, получите по две хроматог-
раммы каждого образца (запись каждой хроматограммы длится 10-15 мин).
По временам удерживания идентифицируйте компоненты каждого
анальгетика. Измерьте площади пиков аспирина и определите его содержа-
ние в каждой таблетке при помощи градуировочного графика. Если пик ас-
пирина перекрывается с другим пиком, экстраполируйте его до базовой
линии и измеряйте площадь пика от базовой линии. Для образцов, для кото-
рых было записано по две хроматограммы, рассчитайте средние значения.
Кинетические методы анализа
Работа 35. Ферментативное определение глюкозы в крови *
Основы
Проба объемом 0,5 мкл представляет собой фильтрат цельной крови, сыворотки
или плазмы, освобожденный от белков осаждением гидроксидом цинка. Глюко-
за, содержащаяся в аликвоте пробы, взаимодействует со смесью ферментов глю-
козооксидазы и пероксидазы хрена. Выделяющийся при этом пероксид водорода
взаимодействует с о-дианизидином, образуя окрашенный продукт с максиму-
мом поглощения при 540 нм.
Уравнения реакций
т- I Г\ 1 тт глюкозооксидаза
Глюкоза + О2 + Н2О-----------> глюконовая кислота + Н2О2
тт ~ , пероксидаза хрена
Н2О2 + о-дианизидин-----------> окрашенный продукт
(максимум поглощения при 540 нм)
Об искусственных пробах см. первую сноску на стр. 442.
КИНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА. Работа 35
441
Реактивы и растворы*
1. Имеются в лаборатории.
(а) 2,2%-й раствор сульфата цинка ZnSO4 • 7Н2О; 3 М H2SO4.
(б) Раствор гидроксида бария, насыщенный. Добавьте приблизительно
80 г Ва(ОН)2 • 8Н2О к 1 л кипящей воды. Затем прекратите нагревание,
закройте сосуд пробкой с хлоркальциевой трубкой, заполненной на-
тронной известью, тщательно перемешайте раствор и оставьте его на
несколько дней до полного оседания осадка. При 25 °C концентрация
раствора составляет около 0,22 М.
(в) Раствор гидроксида бария, 0,06 М. Разбавьте 270 мл насыщенного
раствора гидроксида бария до 1 л водой, не содержащей СО2 (прокипя-
ченной и охлажденной). На нейтрализацию 10,00 мл раствора сульфата
цинка должно пойти 9,00 ± 0,10 мл этого раствора. Проверьте это, поме-
стив 10,00 мл раствора сульфата цинка в коническую колбу объемом
100 мл, добавив 25 мл воды и 2 капли 0,2%-го спиртового раствора фе-
нолфталеина и титруя раствором гидроксида бария до появления устой-
чивого бледно-розового окрашивания. При необходимости разбавьте
один или другой раствор так, чтобы достичь требуемого соотношения
эквивалентных объемов.
2. Готовят перед работой.
(а) Глицериновый буферный раствор с pH 7,0. Растворите 0,35 г Na^PC^
и 0,21 г КН2РО4 в 60 мл воды и добавьте 40 мл химически чистого глице-
рина.
(б) Ферментный реактив. В чистой сухой ступке разотрите 250 мг глюко-
зооксидазы и 5 мг пероксидазы хрена с 1 мл глицеринового буферного
раствора. Смойте кашицу глицериновым буферным раствором в мер-
ный цилиндр объемом 100 мл и доведите буферным раствором до
100 мл. Профильтруйте содержимое цилиндра в чистую сухую колбу.
Для ускорения процесса фильтруйте через воронку Бюхнера при слабом
отсасывании.
Растворите 10 мг о-дианизидина в 1,0 мл абсолютного метанола
при периодическом встряхивании. Перенесите раствор в сосуд из тем-
ного стекла и добавьте профильтрованный раствор ферментов. Пер-
вую порцию раствора прибавляйте быстро, чтобы избежать выпадения
о-дианизидина в осадок. При хранении в холодильнике раствор устой-
чив 3 недели.
Можно использовать имеющиеся в продаже растворы реактивов. В этом случае необходимость пригото-
вления соответствующих растворов отпадает.
442
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
(в) Стандартные растворы глюкозы. Приготовьте исходный 1%-й рас-
твор, растворив в воде точную навеску химически чистой глюкозы
(предварительно высушенной в сушильном шкафу при 110 °C в течение
1 ч) и разбавив до метки в мерной колбе объемом 100 мл 0,25%-м рас-
твором бензойной кислоты, используемой как консервант.
Приготовьте рабочие стандартные растворы с содержанием 100,
200, 300 и 400 мг глюкозы в 100 мл, разбавляя исходный раствор
0,25%-м раствором бензойной кислоты (например, можно разбавить
5,0, 10,0, 15,0 и 20,0 мл до 50 мл).
Подготовка к работе
Высушите глюкозу при 100 °C в течение 1 ч и охладите в эксикаторе.
Методика
Перенесите пипеткой 0,5 мл образца крови, сыворотки или плазмы крови* в ко-
ническую колбу объемом 50 мл и добавьте 4,5 мл 0,06 М раствора гидроксида
бария. Перемешайте раствор и медленно добавьте 5,00 мл 2,2%-го раствора су-
льфата цинка. Тщательно перемешайте и оставьте смесь на 5 мин. Профильтруй-
те раствор в сухую колбу или отцентрифугируйте осадок в сухой пробирке.
Таким же образом приготовьте фильтраты для раствора контрольного опы-
та и стандартных растворов, используя аликвоты воды и соответствующих стан-
дартных растворов объемом 0,5 мл.
Перенесите пипеткой аликвоту 0,2 мл каждого фильтрата в чистую сухую
пробирку и с интервалами в 30 с добавьте к ним по 1,00 мл раствора ферментно-
го реактива. Сразу же после добавления реактива поместите пробирку в водя-
ную баню с температурой 37 °C (можно проводить реакцию и при комнатной
температуре в течение 45 мин, но чувствительность при этом будет несколько
ниже). Для анализируемой пробы возьмите две аликвоты. Ровно через 30 мин
выньте каждую пробирку в том же порядке (также с интервалами 30 с) и добавь-
те 50 мл 3 М H2SO4 .** Серная кислота эффективно тормозит протекание фермен-
тативной реакции.
Не ранее, чем через 5 мин, но не позже, чем через 1 ч, измерьте оптические
плотности растворов при 540 нм относительно раствора контрольного опыта.
При помощи электронных таблиц постройте градуировочный график и найдите
концентрацию глюкозы (мг/дл) в пробе.
Можно использовать имеющиеся в продаже стандартные препараты сыворотки крови (например, Versa-
tol). Существуют и препараты с «аномальным» содержанием глюкозы — от 90 мг/дл (норма) до 300 мг/дл и
выше.
Альтернативой могут быть водные растворы глюкозы. В этом случае стадию осаждения белков опускают,
а вместо растворов гидроксида бария и сульфата цинка добавляют 9,5 мл воды.
При низких концентрациях глюкозы реакция имеет псевдопервый порядок, но при высоких концентраци-
ях реакция замедляется. Поэтому в области высоких концентраций зависимость оптической плотности от
времени инкубирования может быть нелинейной.
ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ. Работа 36
443
Проточно-инжекционный анализ
Работа 36. Определение физических параметров
аналитической проточно-инжекционной системы
Носитель
мл/мин
Проба (0,002%-й БТС)
1,2
Маркировка: две
620
Реагент
(0,01 М раствор буры)
1,2
Маркировка: две
оранжевые полоски
->~Слив
0,01 М раствор буры
Носитель
Основы
Цель данной работы — приобрести навыки в работе на проточно-инжекционной
установке и оценить: (а) скорости потоков носителя и реагента; (б) объемы пет-
ли инжектора и проточных каналов; (в) коэффициент дисперсии Z)max зоны пробы
в максимуме пика (для одноканальной и двухканальной схем); (г) максимальную
частоту ввода проб. Все эксперименты выполняются по двухканальной схеме,
кроме эксперимента по определению коэффициента дисперсии для одноканаль-
ной схемы.
Уравнения
D = C®IC = H®IH
2)max — QQ/Qmax — yyO/yymax
/7° — сигнал детектора, соответствующий стационарному состоянию (чистый
раствор пробы), а //тах — сигнал в максимуме пика инжектированной пробы.
Реактивы и
растворы
1. Имеются в лаборатории. Исходный 0,1 М раствор буры (Na2B4O7), исход-
ный 0,4%-й (масса : объем) раствор бромтимолового синего (БТС; 0,4 г ве-
щества растворяют в 25 мл 96%-го этанола и разбавляют до 100 мл 0,01 М
раствором буры). ВНИМАНИЕ! Бромтимоловый синий нельзя инжекти-
ровать в кислые растворы, поскольку этот индикатор в кислотной форме
адсорбируется на стенках пластмассовых трубок.
2. Готовят перед работой. Разбавьте 100 мл 0,1 М раствора буры до 1 л для
приготовления 0,01 М раствора. Разбавьте 1 мл 0,4%-го раствора бромти-
молового синего до 200 мл 0,01 М этим раствором буры. Полученный
0,002%-й раствор БТС будет служить в качестве рабочего. Оптическая
плотность этого раствора в кювете толщиной 1 см составляет около 1,2.
444
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Сборка установки
Соедините между собой трубки перистальтического насоса, инжектор, реактор
и детектор в соответствии с описанием прибора или указаниями преподавателя.
Установка включает три трубки перистальтического насоса — для потоков но-
сителя, реагента и пробы, все с внутренним диаметром 0,89 мм (маркировка —
две оранжевые полоски).
Присоедините трубку для отбора пробы ко входу петли инжектора, а трубку
для транспортировки пробы — к выходу петли. Раствор пробы подается в петлю
при помощи перистальтического насоса.
Методика
1. Общая проверка системы. Включите детектор и записывающее устройст-
во и дайте им прогреться. Заполните сосуды для носителя и реагента 0,01 М
раствором тетрабората натрия, а маленький стаканчик примерно наполови-
ну наполните 0,002%-м раствором бромтимолового синего. Опустите в сосу-
ды соответствующие трубки. Установите инжектор в положение «Загрузка»
и включите перистальтический насос. Каналы начнут заполняться, а рас-
твор — поступать в емкость для слива. Синий раствор пробы начнет запол-
нять петлю инжектора. Прокачивайте растворы до полного удаления пузырей
воздуха. (ПРИМЕЧАНИЕ. Иногда пузырь воздуха может застрять в детек-
торе, что приведет к его «зашкаливанию». Самый простой способ вытеснить
его оттуда — ввести в поток носителя большую порцию воздуха, резко вы-
нув соответствующую трубку из раствора, а затем погрузив ее обратно.)
Настройте детектор на длину волны 620 нм. Инжектированная проба
должна давать пик с оптической плотностью в максимуме около 0,15 (при
длине оптического пути кюветы 1 см). Настройте записывающее устройст-
во (компьютер или самописец) на соответствующий диапазон значений. При
использовании самописца установите скорость движения ленты 0,5 см/с.
При непрерывном прокачивании носителя переведите инжектор в положе-
ние «Ввод» и пронаблюдайте, как синяя зона пробы движется по каналам.
Если инжектор устроен так, что проба и в положении «Ввод» продолжает
засасываться (и, таким образом, расходуется зря), выньте трубочку для вво-
да пробы из раствора (инжектор будет прокачивать воздух). При достижении
зоной пробы детектора должен наблюдаться пик с последующим возвращени-
ем сигнала до уровня базовой линии. При необходимости отрегулируйте
чувствительность записывающего устройства так, чтобы высота пика со-
ставляла около 2/3 всей шкалы. После того, как зона пробы выйдет из детекто-
ра, переключите инжектор в положение «Загрузка», чтобы вновь заполнить
петлю. Заполнение продолжайте до тех пор, пока раствор пробы не достиг-
нет конца трубки для слива инжектора. Это гарантирует хорошее промыва-
ние петли инжектора новой порцией пробы. После этого введите пробу и
снова зафиксируйте пик. Повторите эти действия несколько раз до тех пор,
пока не убедитесь, что система работает нормально, дрейф показаний де-
тектора отсутствует, а пики хорошо воспроизводятся. После этого можно
приступить непосредственно к выполнению эксперимента.
ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ. Работа 36
445
2. Определение скоростей потоков. Заполните мерный цилиндр объемом
10 мл дистиллированной водой, запишите начальное значение объема и по-
грузите в цилиндр трубку для потока носителя. Одновременно включите
насос и секундомер (или заметьте время по часам). Прокачивайте раствор в
течение 5 мин, выньте трубку и выключите насос. Запишите объем воды,
оставшейся в цилиндре. Рассчитайте скорость потока в мл/мин.
Точно так же определите скорости потока реагента, а затем пробы (ин-
жектор в положении «Загрузка»).
Наконец, измерьте скорость потока на выходе из детектора, собирая
слив в течение 5 мин.
Если для всех каналов используются трубки одинакового внутреннего
диаметра, то скорости всех потоков должны быть близки. Скорость потока
на выходе из детектора должна быть равна сумме скоростей потоков носи-
теля и реагента.
Заметьте, что объемная скорость потока прямо пропорциональна
квадрату внутреннего радиуса трубки R (т. е. площади сечения tiR2). Поэ-
тому скорости потоков можно изменять, выбирая трубки подходящего
диаметра.
3. Оценка объема петли инжектора. При включенном насосе переведите ин-
жектор в положение «Загрузка» и выньте трубку для ввода пробы из рас-
твора. При этом инжектор заполнится воздухом. Затем погрузите трубку в
раствор пробы и секундомером измерьте время от начала поступления
пробы в петлю инжектора до ее выхода из петли. Повторите измерения
несколько раз и рассчитайте среднее значение. Зная скорость потока (из-
меренную ранее) и время заполнения петли, рассчитайте объем петли
в мкл. (ПРИМЕЧАНИЕ. Эта величина является оценочной. Она не включа-
ет в себя «мертвый» объем отверстий в роторе инжектора, примыкающих к
петле.)
4. Оценка объема проточной системы. Заполните петлю инжектора возду-
хом и введите его в поток носителя. Измерьте время движения пузыря до
точки соединения потоков носителя и реагента. Из этой величины и скоро-
сти потока носителя, найденной ранее, рассчитайте объем системы (мкл)
между инжектором и точкой соединения потоков. Подобным образом из-
мерьте время движения воздуха от точки соединения потоков до детектора.
Из этой величины и суммы скоростей потоков носителя и реагента, опреде-
ленных ранее, рассчитайте объем системы (мкл) от блока реактора до де-
тектора.
5. Определение общего «мертвого» времени. При включенном записываю-
щем устройстве одновременно введите пробу и включите секундомер. Из-
мерьте время, необходимое для достижения пробой детектора, т. е. до
начала отклонения самописца. Эта величина представляет собой «мертвое»
время от момента инжекции до начала регистрации.
6- Время для промывания блока ввода пробы. При введении множества проб
важно, чтобы трубка для ввода пробы и петля инжектора были полностью
446
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
отмыты от предыдущей пробы. Заполните трубку для ввода пробы и петлю
инжектора воздухом, а затем, при включенном насосе, погрузите трубку в
раствор пробы и измерьте время, необходимое для заполнения всей петли.
В ходе всех последующих экспериментов прокачивайте пробу через петлю
дозатора в течение времени, как минимум втрое превышающего измерен-
ное. Это необходимо для того, чтобы петля была как следует промыта но-
вым раствором.
По величине скорости потока пробы рассчитайте также объем раство-
ра, требуемый для промывания.
7. Определение коэффициента дисперсии: двухканалъная система. Отрегу-
лируйте чувствительность записывающего устройства так, чтобы в пике
инжектированной пробы сигнал составлял около 1/5 всей шкалы. Введите
пробу несколько раз и рассчитайте среднюю высоту пика (77тах). Выклю-
чите насос и погрузите трубки для носителя и реагента в раствор пробы.
Включите насос и регистрируйте сигнал до тех пор, пока не будет достиг-
нуто стационарное состояние. Соответствующее ему значение сигнала рав-
но /7°. (ПРИМЕЧАНИЕ. Величину 77° можно определить и иначе, погрузив
в раствор пробы трубку для слива и включив перистальтический насос в об-
ратном направлении.) Рассчитайте коэффициент дисперсии для максимума
пика Z)max. (ПРИМЕЧАНИЕ. Если прибор регистрирует не оптическую
плотность, а пропускание, то для вычисления D тах величины пропускания
следует пересчитать в оптические плотности.)
8. Определение коэффициента дисперсии: одноканальная система. Описан-
ным способом определите коэффициент дисперсии для одноканальной си-
стемы. Чтобы превратить систему в одноканальную, зажмите трубку для
реагента и выньте ее из насоса. Сравните коэффициенты дисперсии для од-
ноканальной и двухканальной систем.
9. Определение максимальной частоты ввода проб. Увеличьте скорость ре-
гистрации сигнала в десять раз. Введите пробу и зафиксируйте профиль
пика от начала до конца. Измерьте расстояние между точками начала от-
клонения от базовой линии и возвращения к базовой линии и переведите
его в единицы времени (с). Полученная величина соответствует минималь-
ному времени между вводами проб. Из нее рассчитайте максимальную час-
тоту ввода проб (число проб в час).
По завершении работы тщательно промойте систему, несколько минут
прокачивая дистиллированную воду. Не забудьте промыть также трубку
для ввода пробы и петлю инжектора. Затем освободите трубки из крепле-
ния перистальтического насоса. Если установку длительное время не будут
использовать, полностью освободите систему от жидкости (согласно ука-
заниям преподавателя).
В отчете о работе перечислите все инструментальные параметры и ха-
рактеристики использованных растворов.
ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ. Работа 37
447
Работа 37. Одноканальный проточно-инжекционный анализ:
спектрофотометрическое определение хлоридов
мл/мин
0,002 М Hg(SCN)2 0,125 М Fe3+ 1,2 Инжектор — ПТ) - -у ) Слив Маркировка: М-И ▼ ▼ ▼ \НМ/ две оранжевые полоски
0,125 MHNO3 насос
Основы
В основе методики лежат следующие реакции:
Hg(SCN)2 + 2С1- -» HgCl2 + 2SCN-
2SCN- + Fe3+ Fe(SCN>2
Раствор носителя содержит Hg(SCN)2 и Fe(III). Хлориды, вводимые с пробой,
взаимодействуют с Hg(SCN)2, высвобождая ионы SCN". Они, в свою очередь,
взаимодействуют с Fe(III) с образованием комплексного иона Fe(SCN)2, окра-
шенного в красный цвет. Его детектируют спектрофотометрически при 480 нм.
Высота пика оптической плотности пропорциональна концентрации хлоридов в
пробе. Помимо Fe(SCN)2, могут образовываться и другие (высшие) тиоцианат-
ные комплексы Fe(III). В результате этого при высоких концентрациях градуи-
ровочная зависимость может быть нелинейной.
Чтобы научиться пользоваться проточной системой и охарактеризовать ее
параметры, предварительно выполните работу 36 (или, по крайней мере, внима-
тельно изучите ее описание).
Реактивы и растворы
1. Раствор реагента. Раствор реагента, вводимый в поток носителя, готовят
растворением в воде 0,157 г тиоцианата ртути(П), 7,6 г нитрата железа(Ш),
0,8 мл концентрированной азотной кислоты и 40 мл метанола с последую-
щим разбавлением до 250 мл.
2. Стандартные растворы. Стандартный растворы с концентрацией С1_ в
диапазоне от 5 до 75 ppm готовят соответствующим разбавлением исходно-
го раствора с концентрацией 1000 ppm С1~ (0,165 г NaCl в 100 мл).
Методика
Соберите проточно-инжекционную установку по одноканальной схеме в соот-
ветствии с описанием или указаниями преподавателя. Для потока носителя и
ввода пробы используйте трубки с внутренним диаметром 0,89 мм (маркиров-
ка — две оранжевые полоски). В этом случае скорость потока составит порядка
1,15 мл/мин при скорости вращения перистальтического насоса 25 об/мин.
Включите детектор и дайте ему прогреться несколько минут до стабилиза-
ции показаний. Если в составе установки имеется монохроматор, настройте его
на 480 нм. Однако поскольку образование окрашенного продукта специфично
для аналита, можно использовать и обычный источник белого света без моно-
448
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
хроматора. При непрерывном пропускании раствора реагента-носителя введите
несколько раз стандартный раствор самой высокой концентрации и установите
чувствительность записывающего устройства так, чтобы высота пика составля-
ла около 75% от всей шкалы. При использовании самописца установите ско-
рость ленты около 0,5 см/с. Каждый раз при заполнении петли инжектора новым
раствором нужно перед вводом аликвоты промыть ее объемом пробы, по край-
ней мере втрое превышающим объем петли. Так, петлю объемом 25 мкл следует
промыть примерно 100 мкл пробы.
При непрерывном пропускании раствора реагента-носителя трижды вве-
дите каждый стандартный раствор хлоридов и запишите серии пиков. Чтобы
охарактеризовать воспроизводимость методики, введите один из растворов
(с концентрацией в середине диапазона) 10 раз. Рассчитайте относительное
стандартное отклонение.
Получите у преподавателя пробу для анализа. Введите ее не менее трех раз
и рассчитайте среднюю высоту пика.
По высотам пиков стандартных растворов постройте градуировочный гра-
фик и рассчитайте концентрацию хлоридов в пробе.
По завершении работы тщательно промойте систему, несколько минут про-
качивая дистиллированную воду. Не забудьте промыть также трубку для ввода
пробы и петлю инжектора. Затем освободите крепления перистальтического на-
соса. Если установку длительное время не будут использовать, полностью осво-
бодите систему от жидкости (согласно указаниям преподавателя).
В отчете о работе перечислите все инструментальные параметры и характе-
ристики использованных растворов.
Работа 38. Трехканальный проточно-инжекционный анализ:
спектрофотометрическое определение фосфатов
мл/мин
Носитель
Н^О
0,0025 M(NH4)2Mo7O24
0,2 MHNO3
0,25%-ная (масса : объем)
аскорбиновая кислота
Маркировка: Инжектор
две оранжевые полоски
Маркировка:
оранжево-белая
Маркировка:
оранжево-белая
Слив
Насос
Основы
В основе методики лежат следующие реакции:
7Н3РО4 + 12(NH4)6Mo7O24 + 51Н+ -> 7[(NH4)3PO4 12МоО3] + 51NH4 + 36Н2О
(желтый комплекс Mo(VI))
желтый комплекс Mo(VI) + аскорбиновая кислота —> синий комплекс Mo(V)
ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ. Работа 38
449
Работа представляет собой автоматизированный вариант методики, описанной в
работе 24. Носителем служит дистиллированная вода. Реагент 1 представляет со-
бой 0,0025 М раствор гептамолибдата аммония, реагент 2 — 5%-й (масса: объем)
раствор аскорбиновой кислоты в 10%-м водном растворе глицерина. Глицерин
предотвращает адсорбцию окрашенного продукта реакции на стенках проточ-
ной ячейки детектора. Раствор пробы последовательно смешивается с растворами
реагентов, а затем проходит через реакционную спираль. Фосфаты, содержащие-
ся в пробе, взаимодействуют с гексамолибдат-ионами с образованием комплек-
са, окрашенного в желтый цвет. Далее этот желтый комплекс взаимодействует с
аскорбиновой кислотой, которая восстанавливает Mo(VI) до Mo(V). Продукт ре-
акции обладает интенсивной синей окраской. Его определяют спектрофотомет-
рически при 660 нм. Высота пика пропорциональна концентрации фосфатов.
Степень близости градуировочной зависимости к линейной и ее наклон зависят
от полноты протекания реакции. В проточно-инжекционном анализе величина
сигнала часто зависит от кинетических факторов. Для медленных реакций рав-
новесие может не достигаться, и количество продукта реакции составляет лишь
некоторую долю от равновесного. Глубина протекания реакции зависит от конк-
ретных параметров проточной системы. Восстановление желтого комплекса аскор-
биновой кислотой можно ускорить, добавляя сурьму(Ш) в качестве катализатора.
Чтобы научиться пользоваться проточной системой и охарактеризовать ее
параметры, предварительно выполните работу 36 (или, по крайней мере, внима-
тельно изучите ее описание).
Реактивы и растворы
Реагент 1. В мерную колбу объемом 100 мл поместите около 50 мл дистил-
лированной воды и осторожно добавьте 1,3 мл концентрированной азотной кис-
лоты. Затем добавьте 0,309 г гептамолибдата аммония (NH4)6Mo7O24 • 4Н2О,
растворите и разбавьте до метки дистиллированной водой. Полученный раствор
имеет концентрацию 0,2 М по азотной кислоте и 0,0025 М по гексамолибдату.
Реагент 2. В мерную колбу объемом 100 мл поместите 5 г аскорбиновой
кислоты, приблизительно 50 мл дистиллированной воды и 10 мл глицерина.
Тщательно перемешайте и разбавьте до метки дистиллированной водой. Кон-
центрация полученного раствора по аскорбиновой кислоте составляет 5%
(масса: объем).
Стандартные растворы. Стандартные растворы фосфатов с концентра-
цией фосфора в диапазоне 10-100 ррш готовят соответствующим разбавлением
исходного раствора с концентрацией фосфора 100 ppm (0,440 г безводного
КН2РО4 в 1 л).
Методика
Соедините инжектор, реактор и детектор в соответствии с описанием прибора
или указаниями преподавателя. Для потоков реагентов 1 и 2 используются труб-
ки с внутренним диаметром 0,64 мм (оранжево-белая маркировка), а для пото-
ков носителя и пробы — 0,89 мм (оранжево-оранжевая маркировка). Объем
инжектируемой пробы должен составлять приблизительно 25 мкл. При внутрен-
450
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
нем диаметре трубки петли инжектора 0,5 мм (Micro-line) это соответствует дли-
не петли приблизительно 13 см. Каждый раз при заполнении петли инжектора
новым раствором нужно перед вводом аликвоты промыть ее объемом пробы, по
крайней мере втрое превышающим объем петли. Так, петлю объемом 25 мкл
следует промыть примерно 100 мкл пробы.
Включите детектор и дайте ему прогреться несколько минут до стабилиза-
ции показаний. Если в составе установки имеется монохроматор, настройте его
на 660 нм. Однако поскольку образование окрашенного продукта специфично
для аналита, то годится и обычный источник белого света без монохроматора.
При использовании самописца установите скорость ленты около 0,5 см/с. При
непрерывном пропускании носителя (воды) и обоих реагентов введите стандар-
тный раствор самой высокой концентрации и установите чувствительность за-
писывающего устройства так, чтобы высота пика составляла около 75% от всей
шкалы.
Трижды введите каждый стандартный раствор хлоридов и запишите серии
пиков. Чтобы охарактеризовать воспроизводимость методики, введите раствор с
концентрацией 50 ppm 10 раз. Рассчитайте относительное стандартное отклоне-
ние.
Получите у преподавателя пробу для анализа. Введите ее не менее трех раз
и рассчитайте среднюю высоту пика. Пользуясь электронными таблицами, по
высотам пиков стандартных растворов постройте градуировочный график и рас-
считайте концентрацию фосфатов в пробе.
В отчете о работе перечислите все инструментальные параметры и характе-
ристики использованных растворов.
Проведение реакции в каталитическом варианте
Чувствительность методики можно увеличить при использовании катализатора
или техники остановленного потока. Реакцию восстановления молибденового
комплекса катализирует сурьма(Ш). В ее присутствии можно определять фос-
фор в диапазоне концентраций 1-10 ppm, не прибегая к повышению темпера-
туры для ускорения реакции. В отсутствие катализатора реакция протекает
достаточно медленно: на ее завершение требуется около 10 мин. Для проведе-
ния каталитической реакции необходимо приготовить исходный раствор сурь-
мы(1П), растворив 1,10 г тартрата калия-антимонила KSbOC4H4O6 ^Н2О в
воде в мерной колбе объемом 100 мл и разбавив раствор до метки. Концентра-
ция этого раствора по Sb(III) составляет 0,033 М, или 4000 ppm. В ходе приго-
товления раствора реагента 2 (перед доведением до метки) к нему добавляют
2,5 мл раствора Sb(III). Полученный раствор имеет концентрацию 5% по ас-
корбиновой кислоте и 100 ppm по Sb(III). Серию стандартных растворов готовят
в диапазоне концентраций 1-10 ppm по фосфору соответствующим разбав-
лением исходного раствора с концентрацией 100 ppm. Определение проводят,
как описано выше, используя новый (содержащий сурьму) раствор аскорбино-
вой кислоты и новую серию стандартных растворов фосфатов. Чувствитель-
ность записывающего устройства устанавливают по стандартному раствору с
концентрацией 100 ppm.
ГРУППОВЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ. Работа 39
451
Выключение установки
По завершении работы тщательно промойте все каналы системы, несколько ми-
нут прокачивая дистиллированную воду. Затем освободите крепления периста-
льтического насоса и выньте трубки из гнезд. Если установку длительное время
не будут использовать, полностью освободите систему от жидкости (согласно
указаниям преподавателя).
Сравнение с обычной спектрофотометрической методикой
В ходе этой работы вы выполнили по три параллельных измерения для каждого
стандартного раствора и пробы. Сколько всего времени (с момента приготовле-
ния всех растворов) для этого потребовалось? Исходя из вашего опыта работы в
области обычного спектрофотометрического анализа, попробуйте оценить время,
которое в этом случае потребовалось бы для выполнения такого же количества
измерений (включая время, необходимое для промывания кювет перед каждой
сменой раствора). Сколько реактивов потребовалось бы для одного обычного
спектрофотометрического измерения и для одного измерения в этой работе?
Групповые эксперименты
Работа 39. Изучение процедур поверки методики
и контроля качества
Основы
Конкретную практическую работу для выполнения группами с целью изучить
процедуру поверки методики выберет ваш преподаватель. Это может быть, на-
пример, работа 32 по газовой хроматографии, но с одним веществом. Удачным
вариантом может служить и задача по проточно-инжекционному анализу, на-
пример, работа 37, поскольку в этом методе можно быстро выполнить несколько
повторных измерений. В ходе работы группа студентов должна охарактеризо-
вать методику с точки зрения линейности градуировочной зависимости, прави-
льности, воспроизводимости, чувствительности, рабочего диапазона, предела
обнаружения, нижней границы определяемых концентраций и устойчивости.
Кроме того, предстоит составить контрольную карту, отражающую результаты
по крайней мере одного лабораторного занятия. Выполнение этой работы в пол-
ном объеме требует двух занятий. Результатом работы является составление от-
чета о методике. Прежде, чем приступать к эксперименту, следует повторить
теорию (разд. «Поверка методик») из гл. 4.
Основное уравнение
Фактор отклика (RF) = (Аналитический сигнал — Фоновый сигнал) / Концентрация
Подготовка к работе
Приготовьте все необходимые для выполнения эксперимента растворы. Вам бу-
дет необходим ряд стандартных растворов с известными концентрациями ана-
452
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
лита. Частично их можно будет приготовить непосредственно в ходе выполнения
работы.
Методика
Рабочая группа состоит из четырех человек, разбитых на пары. Каждая пара выпол-
няет определенную часть работы. Группа А строит градуировочную зависимость и
оценивает ее линейность, а также правильность и устойчивость методики. Она
также занимается построением контрольной карты. Группа В оценивает вос-
производимость, чувствительность, границы рабочего диапазона, предел об-
наружения и нижнюю границу определяемых концентраций. По согласованию
между студентами и преподавателем характер этих заданий может быть несколь-
ко изменен. Вся группа готовит отчет о работе, подписывает и датирует его.
Оценка выставляется группе на основании того, насколько тщательно и аккурат-
но будет проведена как сама работа, так и составлен отчет. Это задание может
служить хорошим упражнением по развитию навыков коллективной работы.
Группа А
Построение градуировочной зависимости. Для каждого стандартного раство-
ра рекомендуется проводить по три повторных измерения и откладывать на градуи-
ровочном графике среднее значение. Можно вычислить стандартное отклонение и
выше и ниже каждой точки откладывать отрезок с полушириной, равной стан-
дартному отклонению, либо изобразить весь диапазон параллельных значений.
С помощью электронных таблиц следует построить аппроксимирующую дан-
ные линию регрессии и найти ее параметры (тангенс угла наклона и отсекаемый
осью отрезок).
Линейность градуировочной зависимости. Для линии регрессии рассчитайте
величину г2 и выразите величину отсекаемого осью отрезка в процентах от вели-
чины сигнала для концентрации в середине изучаемого диапазона. Для каждой
экспериментальной точки рассчитайте значение фактора отклика (RF) и при по-
мощи Excel постройте зависимость RF от концентрации. По тангенсу угла на-
клона этой зависимости рассчитайте изменение RF в пределах исследуемого
концентрационного диапазона и выразите эту величину в процентах от среднего
значения RF.
Правильность. Получите у преподавателя образец для анализа. Концентрация
в нем вам будет не известна до того момента, пока вы ее не определите и не сооб-
щите преподавателю. Измерьте концентрацию аналита в образце семь раз, рассчи-
тайте среднее и стандартное отклонение. Сообщите результаты преподавателю и
получите у него известное значение концентрации и его стандартное отклоне-
ние, если оно известно.
Устойчивость. Для оценки устойчивости методики выполните ряд параллель-
ных анализов одного и того же образца, каждый раз незначительно изменяя один
или несколько параметров эксперимента, которые по идее не должны непосред-
ственно влиять на результат. Это может быть концентрация реагента, величина
ГРУППОВЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ. Работа 39
453
pH, время проведения реакции, размер анализируемой пробы (например, в ходе
хроматографического анализа можно увеличить объем вводимой пробы на 10%,
сделав при расчетах соответствующую поправку на величину аналитического
сигнала).
Контрольная карта. Ее целесообразно строить на втором занятии, после того,
как методика будет полностью отработана. В вашем распоряжении будет конт-
рольный образец неизвестного состава. Измеряйте концентрацию аналита в нем
через каждые 20 минут на протяжении всего занятия, чередуя с другими образца-
ми, анализируемыми группой. Контрольный образец необходимо проанализиро-
вать не менее 8 раз. Постройте зависимость найденного значения концентрации
от времени. После того, как вы построите эту зависимость и покажете ее препо-
давателю, он сообщит вам известное значение концентрации аналита в контро-
льном образце. На вашей карте проведите горизонтальную прямую при этом
значении. Возьмите у группы В, занимающейся изучением воспроизводимости
методики, величину стандартного отклонения (для концентрации в середине
изучаемого диапазона) и проведите на карте нижние и верхние контрольные гра-
ницы на расстоянии 2 и 2,5 стандартных отклонений параллельно средней линии.
Находятся ли ваши значения внутри этих контрольных границ? Наблюдается ли
закономерный дрейф результатов в одном направлении?
Группа В
Воспроизводимость. Возьмите стандартные растворы с самым низким, сред-
ним и самым высоким значениями концентрации. Проанализируйте каждый из
них по семь раз и рассчитайте стандартное отклонение концентрации.
Чувствительность. Выберите два стандартных раствора в средней области кон-
центрационного диапазона, концентрации которых различаются на величину
порядка удвоенного стандартного отклонения. Проанализируйте каждый из них
по три раза и рассчитайте средние значения концентраций и стандартные откло-
нения. Позволяет ли методика различить концентрации этих растворов? Сколь-
ко значащих цифр следует указать для найденных значений?
Рабочий диапазон. Задайте значение воспроизводимости, которое можно счи-
тать приемлемым для данной методики. Пусть оно соответствует удвоенному
относительному стандартному отклонению, найденному для концентрации в
средней части концентрационной области. Сравните эту величину с относитель-
ным стандартным отклонением, найденным вами для образцов с самой низкой и
самой высокой концентрациями. Можно ли считать, что методика в выбранном
диапазоне работоспособна? Если да, то выполните еще ряд измерений, посте-
пенно уменьшая концентрацию и каждый раз рассчитывая относительное стан-
дартное отклонение с тем, чтобы оценить положение нижней границы рабочего
диапазона.
Предел обнаружения. Измерьте фоновый сигнал семь раз. Рассчитайте его аб-
солютное стандартное отклонение. Рассчитайте предел обнаружения как кон-
центрацию, для которой сигнал превышает фоновое значение на величину,
равную трем стандартным отклонениям фонового сигнала.
454
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ
Нижняя граница определяемых концентраций. Оцените эту величину двумя
способами. За одну оценку примите концентрацию, для которой сигнал превы-
шает фоновое значение на величину в 10 раз большую, чем стандартное откло-
нение фона. В качестве второй оценки примите значение концентрации, для
которой относительное стандартное отклонение составляет 15% (это значение
можно оценить из данных по изучению воспроизводимости).
Отчет. Составьте отчет о поверке методики и контроле качества результатов
анализа (при помощи контрольной карты). Отчет должен быть документально
подтвержден всеми исходными данными (это могут быть копии записей или
распечаток показаний приборов, распечатки Excel, расчеты, ссылки на литера-
турные источники и т. д.). Сделайте необходимые выводы относительно харак-
теристик и работоспособности методики.
Работа 40. Тест на качество работы:
расчет нормированных z-величин из массива результатов
индивидуальных экспериментов
Основы
Рассчитать нормированные величины z для всего массива данных, полученных
группой студентов по результатам одного или нескольких экспериментов, и
сравнить свое собственное значение z с остальными. Перед выполнением рабо-
ты повторите разд. «Квалификационные испытания» (см. гл. 4).
Основное уравнение _
X: -X
z = —----
S
Xi — среднее из результатов, полученных z-м студентом; X — известное
значение (или общее среднее для всей группы); s — стандартное отклонение
величины X. Если в качестве X используется среднее для всей группы, рассчи-
тайте значение 5 самостоятельно.
Методика
Каждый студент группы выполняет анализ одного и того же образца. Препода-
ватель предоставляет вам (под условными кодами) массив данных, полученных
всеми студентами, а также известное значение концентрации определяемого
компонента X и его стандартное отклонение s. Если эти величины неизвестны,
рассчитайте их самостоятельно как среднее и стандартное отклонение для всего
массива данных.
Расчеты
Для каждого кодированного результата рассчитайте величину z. Расположите
эти величины в порядке убывания от самой положительной до самой отрицатель-
ной. При помощи Excel изобразите массив значений z в форме, подобной
рис. 4.4. Отметьте на рисунке свое значение z и передайте рисунок преподавате-
лю. Можно ли считать результат, полученный вами, правильным?
Приложение А
ЛИТЕРАТУРА ПО АНАЛИТИЧЕСКОМ ХИМИИ
Повторное изобретение колеса
есть пустая трата времени и таланта.
Мудрость
Одни из первых шагов, которые аналитик делает при постановке новой зада-
чи, — это чтение научной литературы и поиск ответа на вопрос: была ли уже ре-
шена данная проблема приемлемым способом? Для этого существует много
справочников по различным разделам аналитической химии, содержащих как наи-
более общеупотребительные методики (прописи), так и малораспространенные,
применимые в той или иной специальной сфере химического анализа. Как пра-
вило, в таких справочниках имеются ссылки на оригинальные статьи в химиче-
ских журналах. Для решения многих рутинных и специальных аналитических
задач различными профессиональными сообществами приняты и предписаны
стандартные методики.
Если справочники не помогают в решении проблемы, можно обратиться к
научным журналам. Начать поиск целесообразно с реферативного журнала Che-
mical Abstracts. Этот журнал помещает рефераты всех статей, публикуемых в
основных химических журналах мира, и снабжен годовыми сводными указате-
лями. Чтобы получить представление об имеющихся методиках, поиск можно
произвести по определяемому элементу или соединению либо типу анализируе-
мого образца. Существуют также авторские указатели. Возможно, ваша библио-
тека подписана на SciFinder Scholar — систему онлайнового доступа к данным
Chemical Abstracts. С ее помощью можно произвести поиск по химическому сое-
динению, теме, автору, названию фирмы, а также получить доступ к реферируе-
мому журналу. При просмотре какой-либо статьи вы можете перейти по
ссылкам к цитируемым в ней статьям.
Много ссылок на источники, касающиеся определенных задач, можно най-
ти также при помощи поисковых средств Интернета. Ряд таких ссылок, посвя-
щенных вопросам аналитической химии, приведены в конце каждой главы.
456
ПРИЛОЖЕНИЕ A
А. 1. Журналы*
1- Aznerican Laboratory
2. Лиа/ytical Biochemistry
3. ^4z?6zZytical Chimica Acta
4- Лиа/ytical Abstracts
5- Лиа/ytical Chemistry**
6- Лиа/ytical/ns/rwnentation
7- Лиа/ytical Letters
8. Analyst, The
9- Applied Spectroscopy
10- Clinica Chimica Acta
11 - C/mical Chemistry
12- Electroanalysis
13 - Journal of А О A C International
14- Journal of Chromatographic Science
15- Journal of Chromatography
16- Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry
17- Microchemical Journal
18- Spectrochimica Acta
19- Taianta (главный редактор — Г. Д. Кристиан, посмотрите хотя бы по этой
причине!)
20- Zeitschrift fur ana/ytische Chemie
к.2. Литература общего характера
Некоторые ссылки на литературу общего характера, включая энциклопедии, приве-
дены в гл. 1. Ссылки на узкоспециализированные источники, в том числе Интер-
нет-сайты, приведены в конце каждой главы. Источники, указанные ниже, можно
считать классическими. Они посвящены как общим вопросам аналитической хи-
мии, так и проблемам анализа отдельных веществ и содержат много полезной для
аналитиков информации. Эти источники доступны во многих библиотеках.
1 - Annual Book ofASTMBook of Standards, 75 vols. Philadelphia: American Soci-
ety for Testing and Materials, 2000.
В названии каждого журнала курсивом выделена та его часть, которая представляет собой сокращенное
название, используемое в Chemical Abstracts.
Каждый апрельский выпуск этого журнала содержит обзор литературы за прошлый год, посвященной раз-
личным методам аналитической химии и их применению.
ЛИТЕРАТУРА ПО АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ
457
2. R. Belcher and L. Gordon, eds., International Series of Monographs on Analyti-
cal chemistry. New York: Pergamon. Многотомная серия.
3. N. H. Furman and F. J. Welcher, eds., Scott's Standard Methods of Chemical
Analysis, 6th ed., 5 vols. New York: Van Nostrand, 1962-1966.
4. I.M. Kolthoff and P.J. Elving, eds., Treatise on Analytical Chemistry. New York:
Interscience. Многотомная серия.
5. I. M. Kolthoff, E. B. Sandell, E. J. Meehan, and S. Bruckenstein, Quantitative
Chemical Analysis, 4th ed. London: Macmillan, 1969.
6- L. Meites, ed., Handbook of Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill,
1963.
7- C. N. Reilly, ed. Advances in Analytical Chemistry and Instrumentation. New
York: Interscience. Многотомная серия.
8. A. I. Vogel, A Textbook of Quantitative Inorganic Analysis, Including Elementa-
ry Instrumental Analysis, 3rd ed. London: Longman, 1972.
9- C. L. Wilson andD. W. Wilson, Comprehensive Analytical Chemistry. G. Sveha,
ed. New York: Elsevier. Многотомная серия.
10- Official Methods of Analysis of AOAC International, 17th ed., W. Horwitz, ed.
Gaithersburg, MD: AOAC International, 2000. Доступно на компакт-диске.
A.3. Анализ неорганических веществ
1 - ASTM Methods for Chemical Analysis of Metals. Philadelphia: American Socie-
ty for Testing and Materials, 1956.
2. F. E. Beamish and J. C. Van Loon, Analysis of Noble Metals. New York: Acade-
mic, 1977.
3. T. R. Crompton, Determination of Anions: A Guide for the Analytical Chemist.
Berlin: Springer, 1996.
A.4. Анализ органических веществ
1 - J. S. Fritz and G. S. Hammond, Quantitative Organic Analysis. New York: Wi-
ley, 1957.
2 . T. S. Ma and R. C. Rittner, Modern Organic Elemental Analysis. New York:
Marcel Dekker, 1979.
3 . J. Mitchell, Jr., I. M. Kolthoff, E. S. Proskauer, and A. W. Weissberger, eds., Or-
ganic Analysis, 4 vols. New York: Interscience, 1953-1960.
4 - S. Siggia, Jr., and J. G. Hanna, Quantitative Organic Analysis via Functional
Group Analysis, 4th ed. New York: Wiley, 1979.
5 - A. Steyermarch, Quantitative Organic Microanalysis, 2nd ed. New York: Acade-
mic, 1961.
458
ПРИЛОЖЕНИЕ A
А.5. Анализ биологических проб и клинический анализ
1 J. S. Annino, Clinical Chemistry. Principles and Procedures. 2nd ed. Boston: Lit-
tle, Brown, 1960.
2. G. D. Christian and F. J. Feldman, Atomic Absorption Spectroscopy. Applicati-
ons in Agriculture. Biology, and Medicine. New York: Wiley-Interscience, 1970.
3- D. Glick, ed., Methods of Biochemical Analysis. New York: Interscience. Мно-
готомная серия.
4- R. J. Henry, D. C. Cannon, and J. W. Winkelman, eds., Clinical Chemistry. Prin-
ciples and Techniques. 2nd ed. Hagerstown, MD: Harper & Row, 1974.
5- M. Reiner and D. Seligson, eds., Standard Methods of Clinical Chemistry. New
York: Academic. Многотомная серия, издаваемая с 1953 г.
6- N. W. Tiets, ed., Fundamentals of Clinical Chemistry. 2nd ed. Philadelphia:
W. B. Saunders, 1976.
A.6. Анализ газов
1 - C. J. Cooper and A. J. DeRose, The Analysis of Gases by Gas Chromatography.
New York: Pergamon, 1983.
A.7. Анализ вод и определение загрязнителей воды и воздуха
1 - Quality Assurance Handbook for Air Pollution Measurement Systems.
U.S.E.P.A., Office of Research and Development, Environmental Monitoring
and Support Laboratory, Research Triangle, NC 27711. Vol. I, Principles. Vol. II,
Ambient Air Specific Methods.
2 . Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. New York:
American Public Health Association.
A.8. Производственная гигиена и техника безопасности
1 - National Institute of Occupational Health and Safety (NIOSH), P. F. O’Connor,
ed., Manual of Analytical Methods. 4th ed. Washington, DC: DHHS (NIOSH)
Publication No. 94-113 (August 1994).
Приложение В
ОБЗОР МАТЕМАТИЧЕСКИХ ОПЕРАЦИЙ:
ЭКСПОНЕНЦИАЛЬНАЯ И ЛОГАРИФМИЧЕСКАЯ
ФУНКЦИИ, РЕШЕНИЕ КВАДРАТНОГО УРАВНЕНИЯ
В.1. Возведение в степень и показательная функция
При выполнении математических операций, в том числе при работе с логариф-
мами, бывает удобно выражать числа в полуэкспоненциальной форме. Ниже
приведена сводка математических действий с показателями степени.
№ЩЬ - tfa+b
Nb
(Na)b = Nab
Nb = yyfe/o
например, 102 • 105 = 107
105 m3
например,----= 10
102
например, (102)5 = IO10
например, V106 = 106/2 = 103
V107 = 109/3 = 103
Десятичные числа удобно записывать в полуэкспоненциальной форме. Для
этого десятичную запятую смещают так, чтобы получилось число в пределах от
1 до 10, и умножают его на 10 в соответствующей целой степени. Показатель
степени равен числу позиций, на которое потребовалось сместить запятую. Если
запятая была смещена вправо (исходное число меньше 1), то показатель степени
отрицательный, если вправо (для чисел, больших или равных 10) — положитель-
ный. Вот некоторые примеры.
Число в исходной записи
0,00267
0,48
52
6027
Число в полуэкспоненциальной записи
2,67 • IO’3
4,8 • 10-1
5,2 • 101
6,027 • 103
460
ПРИЛОЖЕНИЕ В
Поскольку любое число, возведенное в нулевую степень, равно единице, то
10° = 1 и, например, число 2,3 в полуэкспоненциальной форме записывается как
2,3 • 10° (для чисел в пределах от 1 до 10 при записи в полуэкспоненциальной
форме сдвигать запятую не требуется).
В.2. Вычисление логарифмов
Полуэкспоненциальная форма записи удобна, в частности, для вычисления ло-
гарифмов или для нахождения числа по его логарифму. Для логарифмической
функции справедливы следующие соотношения:
N = ba
\%bN=a
или, в частности,
N = 10а
lgio^=a
Например:
lgl02 = 2
1g 10-3 =—3
Справедлива также формула
lg (ab) = 1g а + 1g b
Например:
1g (2,3 • Ю-3) = 1g 2,3 + lg 10"3 = 0,36 - 3 = -2,64
lg (5,67 • 107) = lg 5,67 + lg 107 = 0,754 + 7 = 7,754
Целый показатель десятичной степени называется характеристикой логариф-
ма, а логарифм числа, заключенного между 1 и 10, — мантиссой логарифма.
Так, в приведенном предпоследнем примере вычисления -3 есть характеристи-
ка, а 0,36 — мантисса.
В.З. Нахождение числа по его логарифму
Нахождение числа по его логарифму основано на следующих соотношениях:
1ёю^ = а
7V = ю а = antilg а
ОБЗОР МАТЕМАТИЧЕСКИХ ОПЕРАЦИЙ
461
Например:
lg#= 0,371
N= 10 0,371 = antilg 0,371 = 2,35
Чтобы в общем случае найти число по его логарифму, необходимо отделить це-
лую часть логарифма (это характеристика с) от дробной (мантисса т). При этом
мантисса всегда должна быть положительной. Затем следует взять антилога-
рифм от мантиссы т и умножить на 10 в степени, равной характеристике с, полу-
чив тем самым запись искомого числа в полуэкспоненциальной форме:
lg10 N = тс
N= 10mc= 10m • 10е
N= (antilg m) • 10е
Например:
lgtf= 2,671
N= Ю2’671 = IO0-671 • 102 = 4,69 • 102 = 469
lgW= 0,326
№ 10°>326 = 2,12
lg#=-0,326
N = Ю-0.326 = юо,б74. ю-l = 4 72 . ю-l = 0,472
Еще раз обратим внимание, что если логарифм представляет собой отрицатель-
ное число, то его следует разбить на целую характеристику, которая отрицатель-
на, и дробную (меньше 1) мантиссу, которая положительна (см. последний
пример). Их сумма должна быть равна исходному логарифму числа (в данном
случае -0,326). Вот еще один подобный пример:
lg N =-4,723
#= ю-4,723 = 100,277 . iq-5= 1^9 . ю~5 = 0,0000189
В.4. Извлечение корней при помощи логарифмов
При помощи логарифмов операция извлечения корней выполняется очень про-
сто. Например, требуется извлечь кубический корень из 325. Представим резу-
льтат в следующем виде:
W=325^
462
ПРИЛОЖЕНИЕ В
Возьмем логарифмы от обеих частей этого равенства:
lg#=lg 325 >
Вынесем показатель степени | перед знаком логарифма:
lg N= | lg 325 = 1 (2,512) = 0,837
N= 10 0.837 = antilg 0,837 = 6,87
B.5. Решение квадратного уравнения
Корни квадратного уравнения, записанного в общей форме
ах2 + Ьх + с = 0
можно найти по следующей формуле:
—Ь ± д/б2 — 4яс
х =--------------
2а
Необходимость решения квадратного уравнения часто возникает при расчете
равновесных концентраций частиц с использованием констант ионных равнове-
сий. Примером может служить уравнение для расчета pH раствора кислоты
(х — концентрация иона Н+, М; 1,0 • 10-3 — концентрация кислоты, М; 8,0 • 10 ~4
— константа кислотности):
г2
----------= 8,0 10“4
1,0-IO’3 -X
или, в другой форме записи,
х2 = 8,0- IO"7 - 8,0 • 10"4х
Перегруппировав члены этого уравнения в соответствии с общей формой запи-
си, получаем:
х2 + 8,0- 10-4х-8,0* IO"7 = 0
то есть
а=1 6 = 8,0- 10"4 с = -8,0- 10-7
ОБЗОР МАТЕМАТИЧЕСКИХ ОПЕРАЦИЙ
463
Отсюда
_ -8,0• 10^ ±7(8,010-4)2 -41(-8,0-10’7)
_ -8,0 • 10"* ± 7о,64-1О“6+3,2о1О"6 _ -8,0 10-4 ± 7з,84-10'6
2 2
_ -8,0 • 10"* ± 1,9 6 • 10"3 _ Ц6 • 10’3
2 2
х = 5,80 10-4
Так как х есть величина концентрации, которая может быть только положитель-
ной, поэтому отрицательный корень не имеет смысла.
Для решения квадратных уравнений можно использовать программу Excel
Поиск решения (см. гл. 6).
Приложение С
ТАБЛИЦЫ КОНСТАНТ
Таблица С. 1
Константы основной диссоциации
Название Формула Константы диссоциации при 25 °C
Kb2
Аммиак NH3 1,75 • 10-5
Анилин CfiH,NH9 0 J Z 4,0 • IO-10
1-Бутиламин CH3(CH2)2CH2NH2 4,1 • 10-4
Гидразин h2nnh2 1,3 • 10-6
Гидроксид цинка Zn(OH)2 4,4 • IO’5
Г идроксиламин honh2 9,1 • 10-9
Глицин hoocch2nh2 2,3 • 10~12
Диметиламин (ch3)2nh 5,9 • 10-4
Диэтиламин (CH3CH2)2NH 8,5 • 10-4
Метиламин ch3nh2 4,8 • 10-4
Пиридин c5h5n 1,7 • 10~9
Пиперидин C5HnN 1,3 • io-3
Триметиламин (CH3)3N 6,3 • IO"5
Трис(гидроксиметил)аминометан (HOCH2)3CNH2 1,2 • 10-6
Триэтиламин (CH3CH3)3N 5,3 • 10-4
Этаноламин hoc2h4nh2 3,2 • IO’5
Этил амин ch3ch2nh2 4,3 • 10-4
Этилендиамин nh2c2h4nh2 8,5 • IO’5 7,1 • IO’8
Таблица С.2.
Константы кислотной диссоциации
Название Формула
Азотистая hno2
Аланин CH3CH(NH2)COOH а
Бензойная С6Н5СООН
Борная н3во3
Глицин H2NCH2COOHb
Иодная ню3
Лейцин (CH3)2CHCH2CH(NH2)COOH ь
Лимонная НООС(ОН)С(СН2СООН)2
Малеиновая i/uc-HOOCCH : СНСООН
Молочная сн3снонсоон
Муравьиная нсоон
Мышьяковая H3AsO4
Мышьяковистая H3AsO3
Пикриновая (NO2)3C6H5OH
Пропионовая СН3СН2СООН
Салициловая С6Н4(ОН)СООН
Серная H2so4
Сернистая H2SO3
Константы диссоциации при 25 °C
К . al Ка2 /С, аЗ К, а4
5,1 • 10^*
4,5 • 10“3 1,3 • 1О-10
6,3 • IO’5
6,4 • 1О“10
4,5 • 10-3 1,7 • IO’10
2 • IO’1
4,7 • 10~3 1,8 • IO’10
7,4 • КН 1,7 • 10"5 4,0 • 10~7
1,5 • IO"2 2,6 • IO"7
1,4 • 10^
1,76 • 1(Н
6,0 • ю-3 1,0 • 10-7 3,0 • ю-12
6,0 • 1О~10 3,0 • 10“14
4,2 • 10“'
1,3 • 10"5
1,0 • 10-3
»1 1,2 • IO’2
1,3 • 10-2 5- 10-6
Таблица с.2, (окончание)
Название Формула Константы диссоциации при 25 °C
К 1 al К. а2 аЗ а4
Сероводородная H2S 9,1 • 10“8 1,2 • IO’15
Сульфаминовая nh2so3h 1,0 - 10-1
Трихлоруксусная С13СООН 1,29 • 10-1
Угольная Н2СО3 4,3 • 10-7 4,8 • 10-”
Уксусная сн3соон 1,75 • КГ5
Фенол с6н5он 1,1 • ю-10
Фосфорная Н3РО4 1,1 • ю-2 7,5 • 10-8 4,8 • 10-13
Фосфористая Н3РО3 5- 10-2 2,6 • 10“7
о-Фталевая С6Н4(СООН)2 1,2 • IO’3 3,9 • 10-6
Фтористоводородная HF 6,7 • КУ4
Хлорноватистая НОС1 1,1 • ю-8
Хлоруксусная С1СН2СООН 1,51 • 10-3
Цианистоводородная HCN 7,2 • КУ10
Щавелевая нооссоон 6,5 • КГ2 6,1 • ю-5
Этилендиаминтетрауксусная (CO2)2NH+CH2CH2NH+(CO2)2a 1,0 • ю-2 2,2 • 10-3 6,9 • 10“7 5,5 • IO’11
Яблочная ноосснонсн2соон 4,0 • 10-4 8,9 • 10-6
а Кислота является шестиосновной. Легче всего диссоциируют протоны двух карбоксильных групп [значения Ад (1,0 и 0,032) в таблице не приведены]. Труд-
нее всего диссоциируют те протоны, которые связаны с атомами азота, обладающими основными свойствами (Каз и Ка4).
6 Ка\ и Ка2 соответствуют ступенчатой диссоциации протонированной формы R—СН—СО2Н .
nh;
ТАБЛИЦЫ КОНСТАНТ
467
Таблица С.З.
Произведения растворимости
Вещество Формула Ks
Алюминия гидроксид А1(0Н)3 2 • IO-32
Бария иодат Ва(Ю3)2 1,5 • 10~9
Бария карбонат ВаСО3 8,1 • IO’9
Бария манганат ВаМпО4 2,5 • IO"10
Бария оксалат ВаС2О4 2,3 • IO-8
Бария сульфат BaSO4 1,0 • io-10
Бария фторид BaF2 1,7 • IO-6
Бария хромат BaCrO4 2,4 • 10-10
Бериллия гидроксид Ве(ОН)2 7 • IO’22
Висмута сульфид Bi2S3 1 • IO-97
Висмутила гидроксид BiOOH 4 • IO’10
Висмутила хлорид ВЮС1 7 • 10~9
Железа(И) гидроксид Fe(OH)2 8 • IO-16
Железа(Ш) гидроксид Fe(OH)3 4 • IO-38
Кадмия карбонат CdCO3 2,5 • IO-14
Кадмия оксалат CdC2O4 1,5 • 10-8
Кадмия сульфид CdS 1 • IO"28
Кальция гидроксид Ca(OH)2 5,5 • 10-6
Кальция карбонат CaCO3 8,7 • IO’9
Кальция оксалат CaC2O4 2,6 • IO"9
Кальция сульфат CaSO4 1,9 • 10-4
Кальция фторид CaF2 4,0 10-u
Лантана иодат La(IO3)3 6 • 10-10
Магния гидроксид Mg(OH)2 1,2- 10-11
Магния карбонат MgCO3 1 • io-5
Магния оксалат MgC2O4 9 • IO-5
Магния-аммония фосфат MgNH2PO4 2,5 • 10*13
Марганца(И) гидроксид Mn(OH)2 4 • 10-14
Марганца(П) сульфид MnS 1,4 • 10-15
Меди(1) бромид CuBr 5,2 • IO’9
Меди(П) гидроксид Cu(OH)2 1,6 • IO-19
Меди(1) иодид Cui 5,1 • IO-12
Меди(П) сульфид CuS 9 • IO"36
Меди(1) тиоцианат CuSCN 4,8 • IO-15
Меди(1) хлорид CuCl 1,2 • IO-6
Ртути(1) бромид Hg2Br2 5,8 • IO"23
Ртути(1) иодид Hg2I2 4,5 • 10-29
468
ПРИЛОЖЕНИЕ С
Таблица С.& (окончание)
Вещество Формула Ks
Ртути(П) сульфид HgS 4- 10“53
Ртути(1) хлорид Hg2Cl2 1,3 • io-18
Свинца иодид Pbl2 7,1 * IO-9
Свинца оксалат PbC2O4 4,8- 10~10
Свинца сульфат PbSO4 1,6* IO-8
Свинца сульфид PbS 8- 10~28
Свинца хлорид PbC12 1,6- 10-5
Свинца хромат РЬСгО4 1,8* 10~14
Серебра арсенат Ag3AsO4 i,o- IO-22
Серебра бромид AgBr 4- 10~13
Серебра иодат AgIO3 3,1 • 10-8
Серебра иодид Agl 1 • 10-!6
Серебра карбонат Ag2CO3 8,2- 10-12
Серебра сульфид Ag2S 2- 10-t9
Серебра тиоцианат AgSCN i,o- 10-12
Серебра фосфат Ag3PO4 1,3 • IO-20
Серебра хлорид AgCl 1,0- 10-Ю
Серебра хромат Ag2CrO4 1,1 • 10-12
Серебра цианид Ag[Ag(CN)2] 5,0- 10-12
Стронция оксалат SrC2O4 1,6- 10~7
Стронция сульфат SrSO4 3,8- 10~7
Таллия(1) сульфид T12S 5 • 10-22
Таллия(1) хлорид T1C1 2- 104
Цинка оксалат ZnC2O4 2,8- 10-8
Цинка сульфид ZnS 1 • 10-21
Цинка ферроцианид Zn2Fe(CN)6 4,1 • 10-16
Таблица С.4.
Константы устойчивости комплексов некоторых ионов металлов с ЭДТА
(Мп+ + Y4- MYn - 4)
Элемент Формула Kf
Алюминий A1Y- 1,35 • 1016
Барий BaY2- 5,75 • 107
Ванадий (V2+) VY2- 5,01 • 1012
(v3+) VY- 8,0 • 1025
(VO2+) VOY2- 1,23 • 1018
ТАБЛИЦЫ КОНСТАНТ
469
Таблица С.4, (окончание)
Элемент Формула Kf
Висмут BiY- 1 • 1023
Галлий GaY- 1,86 • IO20
Железо (Fe2+) FeY2- 2,14 • 1014
(Fe3+) FeY" 1,3 • 1025
Индий InY- 8,91 • 1024
Иттрий YY- 1,23 • 1018
Кадмий CdY2- 2,88 • 1016
Кальций CaY2* 5,01 • IO10
Кобальт (Со2+) CoY2- 2,04 • 1016
(Со3+) CoY- 1 • 1036
Магний MgY2" 4,90 • 108
Марганец MnY2- 1,10- 1014
Медь CuY2- 6,30 • 1018
Никель NiY2- 4,16- 1018
Ртуть HgY2- 6,30 • 1021
Свинец PbY2- 1,10- 1018
Серебро AgY3~ 2,09 • 107
Скандий ScY- 1,3 • 1023
Стронций SrY2" 4,26 • 108
Титан (Ti3+) TiY- 2,0 • 1021
(TiO2+) TiOY2- 2,0 • 1017
Торий ThY 1,6- 1023
Цинк ZnY2- 3,16- 1016
Таблица С.5.
Некоторые стандартные и формальные окислительно-восстановительные потенциалы
Полуреакция E°, В Формальный потенциал, В
F2 + 2H+ + 2e- = 2HF 3,06
O3 + 2H+ + 2e" = O2 + H2O S2O|" + 2e- = 2SO^- 2,07 2,01
Co3+ + e~ = Co2+ 1,842
H2O2 + 2H+ + 2e- = 2H2O 1,77
MnO; + 4H+ + 3e" = MnO2 + 2H2O 1,695
470
ПРИЛОЖЕНИЕ С
Таблица С.5, (продолжение)
Полуреакция E°,B Формальный потенциал, В
Се4+ + е- = Се3+ 1,70 (1 M HCIO4); 1,61 (1 М HNO3); 1,44 (1 М H2SO4)
нею + Н+ + е- = 1С12 + Н2О 1,63
Н5Ю6 + Н+ + 2е- = Ю з + ЗН2О 1,6
ВгОз + 6Н+ + 5е- = |Вг2 + ЗН2О 1,52
МпО; + 8Н+ + 5е" = Мп2+ + 4Н2О 1,51
Мп3+ + е~ = Мп2+ 1,51 (8 М H2SO4)
СЮз + 6Н+ + 5е- = 1С12 + ЗН2О 1,47
РЬО2 + 4Н+ + 2е~ = РЬ2+ + 2Н2О 1,455
С12 + 2е- = 2С1" 1,359
Сг2О^“ + 14Н+ + бе- = 2Сг3+ + 7Н2О 1,33
Т13+ + 2е- = Т1+ 1,25 0,77 (1 М НС1)
IO3 + 2СГ + 6Н+ + 4е~ = IC12 + ЗН2О 1,24
МпО2 + 4Н+ + 2е- = Мп2+ + 2Н2О 1,23
О2 + 4Н+ + 4е- = 2Н2О 1,229
2Юз + 12Н+ + 1 Ое- = 12 + 6Н2О 1,20
SeO^- + 4Н+ + 2е- = H2SeO3 + Н2О 1,15
Вг2(водн) + 2е_ = 2Вг 1,087*
Вг2(ж) + 2е~ = 2Вг 1,065*
1С12+е- = |12 + 2С1- 1,06
VO£ + 2Н+ + е- = VO2+ + Н2О 1,000
HN02 + Н++ е-= NO + Н2О 1,00
Pd2+ + 2e- = Pd 0,987
NO3 + ЗН+ + 2е- = HNO2 + Н2О 0,94
2Hg2+ + 2е- = Hg^+ 0,920
Н2О2 + 2е- = 2ОН- 0,88
Cu2+ + I- + e- = CuI 0,86
Hg2+ + 2e- = Hg 0,854
Ag+ + е- = Ag 0,799 0,228 (1 М НС1); 0,792 (1 М НС1О4)
Hg2++2e_ = 2Hg 0,789 0,274 (1 М НС1)
Fe3+ + e- = Fe2+ 0,771
H2SeO3 + 4H+ + 4e- = Se + 3H2O 0,740
ТАБЛИЦЫ КОНСТАНТ
471
Таблица С.5, (продолжение)
Полуреакция £°,В Формальный потенциал, В
PtCl^ + 2е- = Pt + 4СГ 0,73
С6Н4О2 (хинон) + 2Н+ + 2е- = С6Н4(ОН)2 0,699 0,696 (1 М НС1, H2SO4, НС1О4)
О2 + 2Н++ 2е_ = Н2О2 0,682
PtCl^ + 2е- = PtCl^- + 2СГ 0,68
12(водн) + 2е~ = 2Г 0,6197б
Hg2SO4 + 2е- = 2Hg + SO^~ 0,615
Sb2O5 + 6Н+ + 4е- = 2SbO+ + ЗН2О 0,581
M11O4 + е = МпО4" 0,564
H3AsO4 + 2Н+ + 2е- = H3AsO3 + Н2О 0,559 0,577 (1 М НС1, НС1О4)
1з+2е- = 31~ 0,5355
12(тв) + 2е" = 21- 0,5345б
Мо6+ + е~ = Мо5+ 0,53 (2МНС1)
Си+ + е~ = Си 0,521
H2SO3 + 4Н+ + 4е- = S + ЗН2О 0,45
Ag2CrO4 + 2е~ = 2Ag + СгО4~ 0,446
VO2+ + 2Н+ + е- = V3+ + Н2О 0,361
Fe(CN)|’ + e- = Fe(CN)£' 0,36 0,72 (1 М НС1О4, H2SO4)
Си2+ + 2е- = Си 0,337
UOf+ + 4Н+ + 2е- = U4+ + 2Н2О 0,334
BiO+ + 2Н+ + Зе- = Bi + Н2О 0,32
Hg2Cl2(TB) + 2е" = 2Hg + 2С1' 0,268 0,242 (насыщ. КС1—SCE); 0,282 (1 М КС1)
AgCl + е- = Ag + СГ 0,222 0,228 (1 М КС1)
SO2~ + 4Н+ + 2е- = H2SO3 + Н2О 0,17
BiCi;+3e- = Bi + 4Cl- 0,16
Sn4++ 2е~ = Sn2+ 0,154 0,14(1 МНС1)
Си2+ + е- = Си+ 0,153
S + 2Н+ + 2е- = H2S 0,141
TiO2+ + 2Н+ + е- = Ti3+ + Н2О од
Мо4+ + е~ = Мо3+ 0,1 (4 М H2SO4)
S4Og-+ 2е_ = 2S2O3” 0,08
AgBr + е_ = Ag + Br 0,071
472
ПРИЛОЖЕНИЕ С
Таблица С.5, (окончание)
Полуреакция E°,B Формальный потенциал, В
Ag(S2O3) + е~ = Ag + 2S20j‘ 0,01
2Н+ + 2е- = Н2 0,000
РЬ2+ + 2е- = РЬ -0,126
СгО4~ + 4Н2О + Зе- = Сг(ОН)3 + 5ОН" -0,13
Sn2+ + 2е~ = Sn -0,136
Agl + е~ = Ag + Г -0,151
Cui + е_ = Си + Г -0,185
N2 + 5Н+ + 4е- = N2H£ -0,23
Ni2+ + 2e- = Ni -0,250
V3+ + е- = V2+ -0,255
Со2+ + 2е~ = Со -0,277
Ag(CN)2 + е" = Ag + 2CN" -0,31
Т1+ + е- = Т1 -0,336 -0,551 (1 MHC1)
PbSO4 + 2е- = Pb + SO^“ -0,356
Ti3+ + е- = Ti2+ -0,37
Cd2+ + 2e- = Cd -0,403
Cr3+ + e- = Cr2+ -0,41
Fe2+ + 2e~ = Fe -0,440
2CO2(r) + 2H+ + 2e- = H2C2O4 -0,49
Cr3+ + 3e- = Cr -0,74
Zn2+ + 2e~ = Zn -0,763
2H2O + 2e- = H2 + 2OH- -0,828
Mn2+ + 2e~ = Mn -1,18
Al3+ + 3e- = Al -1,66
Mg2+ + 2e~= Mg -2,37
Na+ + e- = Na -2,714
Ca2+ + 2e- = Ca -2,87
Ba' + 2e~ = Ba -2,90
K+ + e- = К -2,925
Li+ + e- = Li -3,045
а Значение Е° для Вгг(ж) следует использовать для насыщенных растворов Вг2, значение Е° для Выводи) —
для ненасыщенных.
6 Значение Е° для 1г(тв) следует использовать для насыщенных растворов I2, значение Е° для 12(водн) — для
ненасыщенных.
Приложение D
ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ В ЛАБОРАТОРИИ
Общие правила безопасности
Даже соблюдение простых правил ведения домашнего хозяйства может обеспе-
чить достаточно безопасные условия в лаборатории. Всегда вытирайте проли-
тые растворы и немедленно выбрасывайте осколки разбитой посуды. Убирайте
с рабочего места все сосуды с химикатами и приборы, с которыми вы уже не
работаете. Пролитую кислоту нейтрализуйте бикарбонатом натрия, пролитую
щелочь — борной кислотой. Капли пролитой ртути необходимо собирать отса-
сыванием в вакуумированный сосуд либо засыпать порошком серы. Это необхо-
димо делать очень тщательно, так как даже мельчайшие капельки ртути
выделяют пары, которые очень ядовиты.
В некоторых странах требование находиться в очках по время проведения
лабораторной работы утверждено законодательно. Но даже при отсутствии та-
кого документа делать это стоит в любом случае. В лаборатории должны быть
четко указаны места расположения огнетушителей, пожарных кранов, одеял,
пожарных выходов, фонтанчиков для промывания глаз. При возникновении лю-
бой опасной или потенциально опасной ситуации следует немедленно сообщить
об этом преподавателю или лаборанту.
Разрешается выполнять только те эксперименты, к которым вы допущены.
Нельзя работать в одиночестве. В лаборатории запрещается есть и пить. Работы
с летучими веществами, органическими растворителями и нагревание растворов
кислот следует проводить только в вытяжном шкафу, а потенциально опасные
операции — при опущенном защитном экране. Особенно осторожно нужно об-
ращаться с органическими растворителями: многие из них огнеопасны, часто
канцерогенны, могут вызвать острое или хроническое отравление. Если это воз-
можно, следует пользоваться защитными перчатками и всегда избегать вдыха-
ния паров.
Приложение Е
ПЕРИОДИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ЭЛЕМЕНТОВ В ИНТЕРНЕТЕ
Атомные массы и атомные номера элементов, перечисленных в алфавитном
порядке, приведены на внутреннем развороте обложки книги и наилучшим об-
разом согласуются с величинами, указанными в самых различных периодиче-
ских таблицах в Интернете. Имеющиеся в Интернете таблицы часто содержат
разнообразную дополнительную информацию о каждом элементе. В большин-
стве случаев достаточно щелкнуть кнопкой мыши на символе или названии
элемента, чтобы вывести на экран значения атомной массы, атомного номера и
другую информацию — об изотопах, физических свойствах, историю откры-
тия элемента. Ниже приведено лишь несколько таких ссылок на периодиче-
ские таблицы.
1 - http://chemlab.pc.maricopa.edu/periodic/periodic.html—Иллюстрированная
периодическая система. Возможен поиск элементов по различным пара-
метрам — атомной массе, атомному радиусу, температуре кипения и т. д.
Страница содержит ссылки на периодические таблицы другой формы —
менделеевской или спиральной. Приведены даже стихи к книге Тома Лере-
ра «Элементы».
2. http://periodic.lanl.gov/default.html — Таблица представлена Отделением
химии Лос-Аламосской национальной лаборатории. В 2001 г. она была от-
мечена на сайте журнала Scientific American (http://scientificamerican.com) в
числе лучших Интернет-ресурсов такого рода.
3. http://www.chem.qmul.ac.uk/periodic/iupac/AtWt/table.html — В основе
этого варианта периодической системы лежат рекомендации комиссии по
номенклатуре в неорганической химии ИЮПАК. Она опубликована в изда-
нии IUPAC Nomenclature of Inorganic Chemistry, Recommendations 1990.
Атомные массы приведены с пятью значащими цифрами. Имеются ссылки
и на более точные данные ИЮПАК.
4- http://www.chemsoc.org — На этом сайте химических обществ содержится
ссылка на «Виртуальную периодическую систему элементов». Ее можно
скачать и загрузить на компьютер в качестве экранной заставки.
ПЕРИОДИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ЭЛЕМЕНТОВ В ИНТЕРНЕТЕ
475
5. http://www.stanford.edu/~glassman/shem/index.html — Этот сайт, помимо
интерактивной периодической таблицы, содержит много других полезных
страниц, позволяющих, в частности, выполнять расчеты концентраций в
различных единицах, переводить одни единицы измерения в другие, под-
бирать коэффициенты в уравнениях реакций. Имеются также ссылки на
другие химические сайты.
Приложение F
ОТВЕТЫ К ЗАДАЧАМ С ЧЕТНЫМИ НОМЕРАМИ
Глава 2
16* Т^25 °C = 25,071 мл; = 24,041 мл
18. 0,05138 М
Глава 3
4. (а) 5; (б) 4; (в) 3
6. 68,9466
8. 162,2
10. До ближайшего значения, кратного 0,01 г; три значащие цифры.
12. (а) 128,0 г; (б) 128,1 г; (в) 1,9 г
14. (а) абсолютное стандартное отклонение 0,052%, относительное стандарт-
ное отклонение 0,16%; (б) абсолютное стандартное отклонение 0,0021%,
относительное стандартное отклонение 8,8%.
16. (а) 0,052%; (б) 0,026%; (в) 0,027%
18. (а) 0,014 ± 0,0003; (б) 1,34 + 0,03; (в) 11,990 ±40
20. 0,5024-0,5030 М
22. +3,9 ррш
24. 0,1064-0,1072 М
26. t = 0,87, /табл = 2,365. Таким образом, с высокой вероятностью обе методики
дают одинаковые результаты.
28. F = 2,79, FTa6jI = 4,88. Нет значимого различия.
30. t = 3,6 (>^табл), нельзя (с вероятностью не менее 95%).
32. Zn: Q = 0,70, 2табл = 0,970. Промахи отсутствуют. Sn: Q = 0,75, (7табл = 0,970.
Промахи отсутствуют.
34. 0,44 ррш
36. 139,0-140,2; 138,4-140,8
ОТВЕТЫ К ЗАДАЧАМ С ЧЕТНЫМИ НОМЕРАМИ
477
38. 3,05 ppm
40. 0,915
42. t = 1,86, Ттабл = 2,262 при 95%-й доверительной вероятности. Значимое раз-
личие отсутствует, г = 0,999, г2 = 0,998. Степень корреляции высокая.
44. 1,6 г
Глава 4
20. 16%
Глава 5
10. (а) 5,23%; (б) 55,0%; (в) 1,82%
12. (а) 1,98; (б) 4,20; (в) 1,28; (г) 3,65; (д) 2,24; (е) 1,31
14. (а) 5,84 • 104 мг; (б) 3,42 • 104 мг; (в) 1,71 • 103 мг; (г) 284 мг;
(д) 7,01 • 103 мг; (е) 2,25 • 103 мг
16. 0,0333; 0,100; 0,001; 0,0333 ммоль/мл Mn2+, NOj, К+, SO^~
18. (а) 0,408 М; (б) 0,300 М; (в) 0,147 М
20. (а) 1,40 г; (б) 8,08 г; (в) 4,00 г
22. (а) 11,6 М; (б) 15,4 М; (в) 14,6 М; (г) 17,4 М; (д) 14,8 М
24. 1,06 • 103 мг/л
26. (а) 10,0 ppm; (б) 27,8 ppm; (в) 15,8 ppm; (г) 16,3 ppm; (д) 13,7 ppm; (е) 29,8 ppm
28. (а) 0,123%; (б) 1,23%о; (в) 1,23 • 103 ppm
30. 156 мл
32. 5,00 М
34. 100 мл
36. 0,172%
38. 390 мг
40. 9,25 мг/дл
42. 15,3%
44. 7,53 мл
46. 22,7 мл
48. 84,4%
50. 47,1%
52. 1,52 мг
54. 20,0 мг Ре2О3/мл КМпО4
56. (а) 36,46 г/моль экв.; (б) 85,67 г/моль экв.; (в) 389,91 г/моль экв.;
(г) 41,04 г/моль экв.; (д) 60,05 г/моль экв.
58. (а) 128,1 г/моль экв.; (б) 64,05 г/моль экв.
478
ПРИЛОЖЕНИЕF
60- (а) 151,91 г/моль экв.; (б) 17,04 г/моль экв.; (в) 17,00 г/моль экв.;
(г) 17,00 г/моль экв.
62. 0,608 моль экв./л
64. 0,180 моль экв./л
66. 0,474 г КНС2О4 • Н2С2О4/г Na^C^
68. 84,5 ммоль экв./л
70. 8,76 г/л
72. (а) 0,1328 г; (б) 1,310 г
Глава 6
2. [А] = 4,3 • 10-7 М, [В] = 0,30 М, [С] = 0,80 М
4. 0,085%
5. 1,1 • 10~22
8. (а) 3[Bi3+] + [Н+]=2[S2“] + [HS-] + [ОН ]; (б) [Na+] + [Н+] = 2[S2 ] + [HS~] + [ОН-]
12. 2[Ва2+] = 3([РО^’] + [НРО^] + [Н2РО4] + [Н3РО4])
14. (а) 0,30; (б) 0,90; (в) 0,90; (г) 3,3
16. 0,965
18. 0,0019 М
Глава 7
6. (а) pH = 1,70; рОН = 12,30; (б) pH = 3,89; рОН = 10,11; (в) pH = -0,08;
рОН = 14,08; (г) pH = рОН = 7,00; (д) pH = 6,55; рОН = 7,45
8. (а) 3,8 • IO”10 М; (б) 5,0 • 10~14 М; (в) 1,0 • 10~7 М; (г) 5,3 • 10“15 М
10. pH = 12,70; рОН= 1,30
12. 2,3 • 10"7 М; 6,64 pH
14. 3,2%
16. 182 г/моль
18. 8,80
20. 0,0145 М
22. 11,54
24. В четыре раза
26. 10,57
28. 2,92
30. 8,72
32. 7,00
34. 2,54
ОТВЕТЫ К ЗАДАЧАМ С ЧЕТНЫМИ НОМЕРАМИ
479
36. 4,16
38. 12,96
40. 10,98
42. 4,05
44. 5,12
46. 9,24
48. 7,3 г
50. 2,62
52. 2,0 • 10-3 М НРО4~; 9,6 • IO"4 М Н2РО;
54. 0,868 М НОАс и ОАс~
56. 0,24 мл Н3РО4; 5,4 г КН2РО4
во. кь =ц//вн./он.
62. pH = 3,88; [ОАс~] = 10“3>88 М
66. В сильнокислой среде [Н2А]« СН2д = 1 • 10-3 М; lg[HA~] = -6,40 + pH; в об-
ласти pH < рЛ?а1 угловой коэффициент равен +1; в сильнощелочной среде
[А2-] и Сд2- = 1 • 10-3 М; 1g[НА-] = 2,05 - pH; в области pH > р/Са2 угловой
коэффициент равен -1.
Глава 8
14. 0,1025 М
16. 0,1174 М
18. 0 мл: 13,00; 10,0 мл: 12,70; 25,0 мл: 7,00; 30,0 мл: 1,90
20. 0 мл: 11,12; 10,0 мл: 9,84; 25,0 мл: 9,24; 50,0 мл: 5,27; 60,0 мл: 2,04
22. 0%: 9,72; 25%: 7,60; 50%: 7,12; 75%: 6,64; 100%: 4,54; 150%: 1,96
24. 35,5 мл
26. 62,8%
28. 0,0200 М Н3РО4, 0,0300 М НС1
30. 403 мг Na2CO3, 110 мг NaOH
32. 3,00 ммоль Na2CO3, 1,50 ммоль NaOH
34. 25,2%
Глава 9
4. 0,0033 М
6. 2,0 • IO-5 М
8. (а) 2,78 • 107; (б) 3,90 • 1017
Ю. 1,26. Да.
12. 0,10398М
480
ПРИЛОЖЕНИЕF
14. 10,01 (мг СаСО3/л Н2О)/мл ЭДТА
16. 9,93 мг/дл; 4,95 ммоль экв./л
18. 3,04 ppm
Глава 10
10. 16,2 г
12. 0,2138; 1,902; 0,1314; 0,6474
14. 98,68%
16. 1,071%
18. 26 мл
20. 24,74 г
22. 42,5% Ва, 37,5% Са
24. 0,846 г AgCl; 1,154 г AgBr
26. 8,20 • 10-19
28. 1,9-10-8 М
30. 5,1 • 10~7 М; 1,0- 10~9М
32. 1,6- 10^ г
34. АВ: 5 = 2- 10~9 М; АС2 : 1 • Ю^М
36. Необходим избыток F- 0,33 М. Подходит.
38. 2,0 • 10-5 М
Глава 11
4. 6,1 • 10-3 М CaF2; 1,20 • 10~2 М HF; 8,0! • 10“5 М F-
6. 8,4 • IO-3 М AgCl; 1,20 • 10~8 М Ag+; 5,96 • 10-5 М Ag(en)+;
8,4 • 10-3 М Ag(en)2
8. 2,7 • 10-5 М
10. 5,434 г/л
Глава 12
10. Ni, H2S, Sn2+, V3+, Г, Ag, C1-, Co2+, HF
12. (a) Pt/Fe2+, Fe3+//Cr2O7-, Cr3+, H+/Pt; (6) Pt/Г, I2//IO3,12, H7Pt;
(в) Zn/Zn2+//Cu2+/Cu; (r) Pt/H2SeO3, SeO^, H+//C12, СГ/Pt
14. 1,34 В
16. 0,65 В
18. PtCl + 2V2+ = PtCl+ 2V3+ + 2CГ; 0,94 В
20. 2VO2 + U4+ = 2VO2+ + UO2+, 0,67 В
ОТВЕТЫ К ЗАДАЧАМ С ЧЕТНЫМИ НОМЕРАМИ
481
Глава 13
8. 5,4 • 10-13
10, (а) -0,028 В; (б) 0,639 В; (в) 0,84 В
12. (а) 0,845 В; (б) -0,020 В; (в) -0,497 В
14. (а) 1 • 10^%; (б) 0,084 В; (в) 0,261 В
16. -0,505 В
18. (а) 5,78; (б) 10,14; (в) 12,32; (г) 13,89
20. 11,2
22. 0,015 М
24. 4,8- 10-4 М
26. 0,020
28. 1,07 • 104
Глава 14
6. (а) 10 з + 5Г + 6Н+ = 312 + ЗН2О; (б) 2Se2Cl2 + ЗН2О = H2SeO3 + 3Se+4С1-+4Н+;
(в) Н3РО3 + 2HgCl2 + Н2О = Н3РО4 + Hg2Cl2 + 2Н+ + 2С1"
8. 1,127В
10. 10,0 мл: 0,715 В; 50,0 мл: 0,771 В; 100 мл: 1,36 В; 200 мл: 1,46 В
12. Е = [(1) Е°е* Fe2+ + (2) Е°п^ Sn2+]/[(l) + (2)]
14. (а) 0,319 В; -0,780 В; 1,6 • 1012; (б) 0,691 В; -0,154 В; 2,6 • 1022
16. 4,96 ммоль экв./л
18. 1,47 мл
Глава 15
10. [Fe3+]/[Fe2+] = 5 : 1
Глава 16
30. 0,25 мкм, 250 нм
32. 20 000 — 150 000 А; 5000 — 670 см-1
34. А = 0,70; А = 0,10; %Т= 0,56; %Т= 0,10
36. 4,25 • 103 см-1 моль-1 л
38. 5,15 • 104 см-1 моль-1 л
40. 0,528 г
42. (а) 0,193 г/день; (б) 4,91 ммоль/л; (в) 0,25
44. 0,405 ppm
46. 2,61 мг/л
482
ПРИЛОЖЕНИЕ F
Глава 17
20. 13%
22. 190 ppm
24. 84 ppm
Глава 18
12. D = KD(l + 2ЗДНВг])в/{1 +
14. 48%
16. 10 миллилитрами экстрагируется 96,2%. Двумя порциями по 5 мл экстраги-
руется 99,45%.
Глава 19
8. 1,06 103см
10. Rs = 0,96. Разрешение недостаточно.
Глава 20
16. Д/и = 0,12
18. 20,9 ppm
Глава 21
26. 270 ммоль/л
28. (а) НС1; (б) H2SO4; (в) НСЮ4; (г) H2SO4
Глава 22
12. 48,5 с
14. 12,7 ч
16. 3,82%
Глава 23
10. 133 мкл
Глава 25
16. ATTCGATTCCGTA
Глава 26
6. 3,3 • 10-6 г/л воздуха
Предметный указатель*
ААС см. Атомно-абсорбционная спектроско-
пия
Автокаталитическое разложение 581(1)
Автоматизированное устройство 275(2)
Автоматические устройства 275(2), 280(2)
с дискретным пробоотбором 281(2)
с непрерывным проточным пробоотбором
281(2)
Автоматические титраторы 598(1)
Автоматический аминокислотный анализатор
229(2)
Автопротолиз 315(1)
Адсорбционная ВЭЖХ 212(2)
Адсорбционная хроматография 136(2)
Азот мочевины, определение 304(2)
Азотное правило 184(2)
Азотно-фосфорный детектор в ГХ 172(2)
Активированный комплекс 258(2)
Активность 300(1)
Аликвота 61(1)
Альбумин, определение 306(2)
Аминокислоты, ионообменное разделение 229(2)
Амперометрический электрод 610(1)
Амплификация ДНК 326(2)
Амфолит 229(2)
Анализ газовых проб
приборы для анализа сухого и влажного
газа 348(2)
устройства для отбора проб 347(2)
загрязненных участков земель 358(2)
качественный 19(1)
количественный 19(1)
мезо- 36(1)
микро- 36(1)
микро- 36(1)
образцов воды 356(2)
паров летучих веществ 179(2)
по месту лечения 306(2)
полный 36(1)
полу микро- 36(1)
проб воздуха 351(2)
размерностей 214(1)
стадии 24(1)
вычисление результатов и составление
отчета 34(1)
подготовка пробы к анализу 28(1)
получение представительной пробы
26(1)
постановка задачи 23(1)
ультра- 36(1)
частичный 36(1)
Анализаторы
дискретные 279(2)
многоканальные 282(2)
непрерывного действия 270(2)
одноканальные 281(2)
электротермический 101(2)
Аналит 25(1), 36(1)
определение 36(1)
Аналитическая наука 17(1)
Аналитическая химия 17(1)
зарождение 20(1)
Аналитические весы 49(1)
нулевая точка 53(1)
дрейф 54(1)
одночашечные механические 51(1)
полумикро- и микровесы 53(1)
точка покоя 53(1)
электронные 49(1)
Аналитический сигнал, измерение 30(1)
Анод 487(1)
Анодный ток 606(1)
В скобках указан том (1-й или 2-й).
484
ПРВДМЕГНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Антиген 308(2)
немеченый 311(2)
Антикоагулянт 27(1), 302(2)
Антисыворотка 310(2)
Антитело 309(2)
моноклональные 313(2)
получение 313(2)
титр 313(2)
Аргоно-ионизационный детектор 172(2)
Аскарит 93(1)
Атомная спектроскопия 89(2)
Атомно-абсорбционная спектроскопия 92(2)
мешающие влияния 97(2)
влияние ионизации 98(2)
образование термически устойчивых
соединений 99(2)
спектральные помехи 97(2)
физические факторы 99(2)
пределы обнаружения 101(2)
приготовление образца 100(2)
основы 93(2)
оборудование 93(2)
горелки 95(2)
источники 94(2)
пламена 96(2)
чувствительность 100(2)
Атомы, основное и возбужденное состояние 91(2)
Ауксохром 15(2)
Базы данных
по масс-спектрам 194(2)
спектральные 25(2)
Барбитураты, определение 306(2)
Батохромный сдвиг 15(2)
Безбелковый фильтрат 29(1), 99(1), 303(2)
Безиндикаторное титрование 572(1)
Безопасность в лаборатории 100(1)
Белки, идентификация 339(2)
Ближняя инфракрасная область 9(2), 22(2)
спектрометр 63(2)
Бром в качестве окислителя 586(1)
Буферный раствор 330(1)
для биологических и клинических измере-
ний 355(1)
емкость 334(1)
механизм 334(1)
физиологический 353(1)
Буферный участок кривой титрования 385(1)
Бюксы весовые 57(1)
Вектор 327(2)
Вес 49(1), 54(1)
Взвешивание
жидкостей 59(1)
источники погрешностей 57(1)
правила 57(1)
прямое 58(1)
твердых веществ 57(1)
точность 59(1)
Видимая область 40(2)
Внутренний стандарт, использование в ГХ
177(2)
Вода
анализ проб 355(2)
отбор проб 355(2)
Возбужденное состояние 11(2)
Воздух
анализ 351(2)
длительность отбора 346(2)
компоненты аэрозолей 349(2)
объем образца 346(2)
отбор проб 344(2)
хранение образцов 346(2)
частота отбора 346(2)
Волновое число 6(2)
Волоконно-оптический сенсор 79(2)
миниатюрный 80(2)
Вольтамперограмма 603(1)
Вольтамперометрия 603(1)
вольтамперные кривые 604(1)
электрохимическая ячейка 603(1)
вспомогательный электрод 603(1)
потенциостат 603(1)
рабочий микроэлектрод 603(1)
электрод сравнения 603(1)
Восстановители 584(1)
Восстановление
необратимое 608(1)
ступенчатое 606(1)
Вращательные переходы 9(2), 10(2)
Время протекания реакции 257(2)
Время удерживания 148(2), 158(2)
Вставка 327(2)
Выбор колонки в ВЭЖХ 215(2)
Выбор растворителя в ВЭЖХ 213(2)
Высокоэффективная жидкостная хроматогра-
фия см. ВЭЖХ
Высокоэффективная тонкослойная хромато-
графия см. ВЭТСХ
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
485
ВЭЖХ 146(2), 198(2)
выбор колонки 215(2)
выбор растворителя 213 (2)
высокотемпературная 220(2)
высокоскоростная 216(2)
градиентное элюирование 215(2)
колонки с узкими каналами 218(2)
неподвижные фазы 200(2) см, также
неподвижные фазы в ВЭЖХ
области применения 224(2)
противодавление 204(2)
теоретические основы 199(2)
ВЭТСХ 237(2)
ВЭТТ см. Теоретическая тарелка, эквивалент-
ная высота
Газ-носитель 158(2)
Газоадсорбционные трубки 3 51 (2)
Газоанализаторы, калибровка 354(2)
Г азовая хроматография 15 6(2)
адсорбционная 156(2)
выбор рабочей температуры 174(2)
газ-носитель 157(2)
с разделенными компонентами 158(2)
количественные измерения 175(2)
определяемые соединения 159(2)
программирование температурного режи-
ма 175(2)
распределительная 156(2)
скоростная 181(2)
чистый газ-носитель 158(2)
Газовая хроматография в сочетании с масс-
спектрометрией 159(2), 182(2), 191(2)
Газовый хроматограф 157(2)
Газожидкостная хроматография см. Газовая
хроматография, распределительная
Газо-твердофазная хроматография см. Газовая
хроматография, адсорбционная
Гальванический элемент 487(1)
полуреакции 490(1)
с жидкостным соединением 512(1)
Гаптен 313(2)
Гель-проникающая хроматография 224(2)
Гель-фильтрационная хроматография 224(2)
Гемолиз 300(2)
Генетический код 336(2)
Геномика 336(2)
Геномные В АС-библиотеки 328(2)
Гибридизация 326(2)
Гидролиз иона соли 326(1)
константа гидролиза 326(1)
Гидростатические инъекции 242(2)
Г иперхромный эффект 16(2)
Гипохромный эффект 16(2)
Гипсохромный сдвиг 15 (2)
Гликолиз 302(2)
Глобулины, определение 306(2)
Глюкоза, определение 304(2)
Горелка Бойлинга 95(2)
Горелки
с камерой предварительного смешения 95(2)
с ламинарным потоком 95(2)
Гравиметрический анализ, прокаливание
осадка 87(1)
Гравиметрический метод 30(1)
Гравиметрический фактор 262(1), 443(1)
Гравиметрия 433(1)
методики 448(1)
расчеты 443(1)
этапы 434(1)
высушивание или прокаливание осадка
443(1)
осаждение 435(1)
подготовка раствора 434(1)
промывание осадка 442(1)
старение осадка 438(1)
фильтрование 442(1)
Градиентное элюирование 215 (2)
время удерживания 215(2)
Градуировка 33(1)
по способу стандартных добавок 104(2)
использование электронных таблиц
105(2)
Градуировочная кривая 33(1)
Грамм-атомная масса 209(1)
Грамм-молекулярная масса 210(1)
Грамм-формульная масса 210(1)
График Грана 593(1)
Грунтовые воды, отбор пробы 355(2)
ГФ см. Газовая хроматография
Дальняя инфракрасная область 9(2), 10(2)
Дальтон 210(1)
Двумерный гель-электрофорез 337(2)
в полиакриламидном геле 337(2)
Двухжильный кабель 78(2)
Дегидрит 93(1)
Дегидрогеназа молочной кислоты 267(2)
486
ПРВДМЕГНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Дегидрогеназы реакции 267(2)
Дезоксирибонуклеиновая кислота 320(2)
Делительная воронка 114(2)
Деполяризатор 606(1)
Детекторы
Р-излучения 172(2)
азотно-фосфорный 172(2)
аргоно-ионизационный 172(2)
атомно-эмиссионный 174(2)
в газовой хроматографии 170(2)
деструктивные 174(2)
концентрационно-чувствительные
174(2)
недеструктивные 174(2)
пламенно-ионизационный 170(2)
пламенно-термоионный 172(2)
по теплопроводности 170(2)
электронного захвата 173(2)
Дзета-потенциал 240(2)
Дидезоксинуклеотиды 329(2)
Диоксид азота, определение 352(2)
Диоксид серы
в качестве восстановителя 584(1)
определение 353(2)
Диспергирующие приборы 61(2)
Дисперсия 287(2)
ограниченная 289(2)
средняя 289(2)
линейная 44(2)
нелинейная 44(2)
Диффузионный слой 605(1)
Дихромат калия в качестве титранта 582(1)
Длина волны 6(2)
номинальная 54(2)
соответствие с цветом 6(2)
Длительность периода инкубации 314(2)
ДНК 320(2)
ДНК-микрочип 334(2)
ДНК-полимераза 326(2)
Дополнительный цвет 6(2), 9(2)
Дробовый шум 65(2)
Единицы выражения следовых концентраций,
соотношения 225(1)
Железо в качестве титранта 583(1)
Жесткость воды общая 423(1)
Жидкостная хроматография в сочетании с
масс-спектрометрией 220(2)
ионизация частиц направленным лучом
221(2)
использование сорбентов с низкими поте-
рями неподвижной фазы 204(2)
квадрупольный масс-фильтр 223(2)
применение узких колонок 218(2)
термическая ионизация 222(2)
химическая ионизация при атмосферном
давлении 223(2)
электронная ионизация 222(2)
Жидкостная экстракция
ионных ассоциатов 118(2)
ионов металлов 117(2)
хелатов металлов 118(2)
ускоренная 120(2)
в микроволновом поле 120(2)
Жидкостно-жидкостная ВЭЖХ 212(2)
Жидкостно-твердофазная ВЭЖХ 212(2)
Закись азота, определение 353(2)
Загрязнение осадка 440(1)
изоморфное замещение 441 (1)
инклюзия 440(1)
окклюзия 440(1)
поверхностная адсорбция 441(1)
последующее замещение 442(1)
Закон Архимеда 54(1)
Закон Бера 27(2)
отклонения 65(2)
Закон распределения
нормальный 110(1), 175(1)
Пауссона 175(1)
Закон сохранения заряда 292(1)
Зародыши, образование осадка 435(1)
Золь 440(1)
Зонный электрофорез 238(2)
Измерительное устройство
дискретного действия 277(2)
непрерывного действия 277(2)
Изобестическая точка 66(2)
Изопотенциальная точка 533(1)
Изодисперсионная точка 295(2)
Изоферменты 270(2)
Изоэлектрическая точка 229(2), 239(2)
Изоэлектрофокусирование 337(2)
ИК-детекторы 52(2)
болометр 53(2)
термопара 53(2)
ПРВДМЕГНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
487
терморезистор 53(2)
термоэлектрическая батарея 53(2)
ИК-спектрометрия, применение 21(2), 24(2)
Иммуноанализ
гетерогенного типа 315(2)
гомогенного типа 315(2)
принципы 308(2)
с ферментативной меткой 315(2)
конкурентный вариант ELISA 315(2)
косвенный вариант метода ELISA 316(2)
неконкурентный вариант ELISA 315(2)
твердофазный (ELISA) 315(2)
с флуоресцентной меткой 314(2)
Иммуноглобулин 309(2)
Ингибирование субстрата 261(2)
Ингибиторы и активаторы ферментов 260(2)
определение 271(2)
Индексы удерживания Ковача 166(2), 169(2)
Индикаторы 233(1), 379(1)
окислительно-восстановительные 572(1)
Индикаторный электрод 567(1)
Индикаторы в осадительном титровании 478(1)
адсорбционные 480(1), 482(1)
взаимодействующие с титрантом 478(1)
Индифферентный электролит 607(1)
Инжекторы в ВЭЖХ 208(2)
Инструкция 190(1)
Интеркомбинационная конверсия 70(2)
Интерферограмма 61(2)
Инфракрасное излучение
ИК-спектры 21(2)
источники 41(2)
поглощение 20(2)
Иодиметрия 574(1)
Иодометрия 577(1)
Ионгидрония 315(1)
Ионизация
в растворах 324(1)
термическая 222(2)
химическая 223(2)
электронная 222(2)
электронным ударом 222(2)
Ионизованная молекула 185(2)
Ионная пара 118(2)
Ионная сила 300(1)
Ионная хроматография 226(2)
разделение катионов металлов 230(2)
Ионообменная и эксклюзионная хроматогра-
фия 136(2)
Ионообменные смолы
анионообменные 228(2)
в ВЭТСХ 237(2)
катионообменные 227(2)
Ионселективные полевые транзисторы 554(1)
Ионселективные электроды 588(1)
Ионселективный электрод 536(1)
особенности применения 553(1)
чувствительность измерений 551(1)
Искусственные бактериальные хромосомы 328(2)
Источник излучения 94(2)
Источник химической ионизации 187(2)
Капиллярная электрохроматография 248(2)
Капиллярные колонки
заполненные модифицированными носи-
телями 165(2)
производство 185(2)
с модифицированными внутренними
стенками 164(2)
с пористым слоем 165(2)
Капиллярный гель-электрофорез 249(2)
Капиллярный электрофорез 239(2)
ввод пробы 242(2)
детекторы 243(2)
капиллярная электрохроматография 248(2)
капиллярный гель-электрофорез 249(2)
механизм 240(2)
пределы обнаружения 240(2)
разделение ионов малого размера 247(2)
разделение нейтральных молекул 248(2)
сила электроосмотического потока 240(2)
число теоретических тарелок 245(2)
электроосмотический поток 240(2)
эффективность разделения 244(2)
Каталитический электрод 612(1)
Каталитическое число 258(2)
Катарометр 170(2)
Катод 487(1)
Катодный ток 606(1)
Квантовый выход 73(2)
Кинетический закон 255(2)
дифференциальная форма 255(2)
интегральная форма 255(2)
Кислотно-основное титрование 587(1)
Клеточные элементы 300(2)
Коагуляция 439(1)
Кодон 336(2)
Колебательная релаксация 70(2)
488
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Колебательные переходы 9(2), 11(2)
Коллектор 347(2)
Коллоидный раствор 438(1)
гидрофильный 440(1)
гидрофобный 440(1)
Колонки в газовой хроматографии 161(2)
капиллярные с модифицированными
внутренними стенками 164(2)
капиллярные с пористым слоем 165(2)
капиллярные, заполненные модифициро-
ванными носителями 165(2)
набивные 161(2)
открытые капиллярные 162(2)
производство 185(2)
Комбинационный переход 23(2)
Комплекснометрическое титрование 412(1)
Комплексы антиген-антитело 310(2)
авидность 310(2)
аффинность 310(2)
Компоненты пробы
главные 36(1)
следовые 36(1)
сопутствующие 36(1)
ультраследовые 36(1)
Конечная точка титрования 233(1), 373(1), 378(1)
визуальное обнаружение 571(1)
использование графиков Грана 592(1)
Конкурентное ингибирование 260(2)
Константа
автопрополиза термодинамическая 316(1)
диссоциации 410(1)
кислотности термодинамическая 315(1)
Михаэлиса 261(2)
нестойкости 410(1)
равновесия 315(1), 563(1)
реальная 305(1)
термодинамическая 305(1)
распределения 114(2)
скорости 255(2), 273(1)
устойчивости условная 417(1)
Константы Мак-Рейнольдса 169(2)
Константы Роршнайдера 169(2)
Контроль качества 17(1)
Контроль производственных процессов 276(2)
Контрольная карта качества 139(1), 199(1)
Контрольный опыт 29(1)
Концентрационно-логарифмические диаграм-
мы 359(1)
Концентрация
аналитическая 219(1), 281(1)
единицы измерения 213(1)
равновесная 219(1), 281(1)
Коррекция фонового поглощения 98(2)
Кофактор 263(2)
Кофермент 261(2), 263(2)
Коэффициент
активности 300(1)
дисперсии 286(2)
емкости см. Фактор удерживания
поглощения 29(2)
распределения 114(2), 134(2)
селективности см. Фактор разделения
Краун-эфир 541(1)
Крахмал в качестве индикатора 572(1)
Кривая титрования 373(1)
расчет рХ 475(1)
первая производная 589(1)
вторая производная 589(1)
точка максимального наклона 587(1)
буферный участок 385(1)
Критическая концентрация мицеллообразова-
ния 248(2)
Кровь
плазма 27(1)
сгусток 27(1)
сыворотка 27(1)
отбор пробы 78(1)
значение pH 322(1)
Кругооборотное число 258(2)
Лабораторные материалы и реагенты 45(1)
Лабораторный журнал 42(1)
рекомендации по ведению 45(1)
Ламинарный поток 242(2)
Лампы с полым катодом 94(2)
Летучесть анализируемых соединений 169(2)
Летучие производные веществ 175(2)
Линейка фотодиодов 50(2)
Линейка фотодиодов в качестве детектора в
ВЭЖХ 211(2)
Масса 49(1)
Масс-анализатор 189(2)
время-пролетный анализатор 190(2)
квадрупольный масс-фильтр 189(2)
Масс-спектрометрия
варианты работы 192(2)
единичное разрешение 184(2)
ПРВДМЕГНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
489
ионизованная молекула 185(2)
ионные источники 185(2)
основной пик 186(2)
принципы 183(2)
разрешение 184(2)
родственный ион 185(2)
Масс-спектрометрия в сочетании с газовой
хроматографией 159(2), 191(2)
ионселективный вариант работы
масс-спектрометра 192(2)
масс-спектр 192(2)
общий поток ионов 192(2)
Масс-спектрометрия MALDI-TOF 339(2)
Маточный раствор 438(1)
Мерная посуда 60(1)
бюретки 67(1)
вакуумированные пробирки 79(1)
выбор 76(1)
вытяжные шкафы 81(1)
калибровка 71(1)
техника 74(1)
колба Кьельдаля 99(1)
ламинарные камеры 81(1)
мерные колбы 60(1)
печи 80(1)
муфельные 80(1)
пипетки
градуированные 61(1)
мерные 61(1)
шприцевые 63(1)
промывалки 82(1)
работа и уход 67(1)
сушильные шкафы 80(1)
точность и допустимые погрешности
объема 70(1)
фильтры 83(1)
тигель Гуча 83(1)
стеклянный фильтрующий тигель 83(1)
фарфоровый фильтрующий тигель 83(1)
держатели 83(1)
беззольные бумажные 83(1)
центрифуги 83(1)
шприцы 78(1)
эксикаторы 79(1)
вакуумные 79(1)
Мертвое время 278(2)
Металлы в качестве восстановителей 585(1)
Метод 190(1)
базовой линии 39(2)
внутреннего стандарта 103(2)
дробления 328(2), 333(2)
Кьельдаля 95(1), 400(1)
микроанализ 403(1)
наименьших квадратов 157(1)
отношений см. Метод базовой линии
последовательных приближений 282(1)
стандартных добавок 33(1), 595(1),
175(2)
Методика 190(1)
стандартная 190(1)
Методики клинического анализа 303(2)
Методы анализа
абсолютные 31(1)
инструментальные 30(1)
относительные 31(1)
сравнение 32(1)
Метрическая система единиц 223(1)
Механизм реакции 254(2)
Миграционный ток 607(1)
Микроволновая область 10(2)
Микроколоночная скоростная ГХ 181 (2)
Микропроцессоры и компьютеры в химиче-
ском анализе 295(2)
Мицеллярная элекгрокинетическая хромато-
графия 248(2)
Многоосновные кислоты 339(1)
диссоциация 341(1)
доля диссоциирующих частиц 342(1)
соли 348(1)
Модифицированный метиловый оранжевый
392(1)
Мокрое сожжение 29(1), 94(1)
Молекулярные сита 224(2)
Молекулярный ион 185(2)
Моль 211(1)
Молярная константа равновесия 273(1),
316(1)
Молярная концентрация 316(1)
Молярная масса 210(1) см. также
Грамм-атомная, Грамм-молекулярная,
Грамм-формульная массы
Молярность 213(1) см. также Формаль-
ность
Молярный коэффициент поглощения 29(2)
Монолитные колонки 205(2)
Монохроматор 42(2)
голографическая решетка 46(2)
дифракционная решетка 44(2)
490
ПРВДМЕГНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
реплика 45(2)
оптический фильтр 46(2)
призма 42(2)
Мочевая кислота 306(2)
Мультиплетность состояния 70(2)
Набивные колонки в ГХ 161(2)
Недеструктивные детекторы 174(2)
Недеструктивный анализ 22(2)
Неконкурентное ингибирование 261(2)
Неподвижные фазы
в ГФ 165(2)
индексы удерживания 166(2)
Карбоваксы 166(2)
в ВЭЖХ
гибридные частицы на основе кремне-
зема со слоем полимера 206(2)
микропористые частицы 202(2)
монолиты из кремнезема 205(2)
непористые наполнители 204(2)
перфузионные наполнители с транс-
портными макропорами 204(2)
пористые частицы оксида циркония
206(2)
сверхчистый оксид кремния 200(2)
Номенклатура ферментов 264(2)
Нормальность 215(1), 236(1), 250(1)
Нормально-фазовая хроматография 136(2),
213(2) см. также Распределительная хро-
матография
Нуклеация 435(1)
Нуклеотидные звенья 320(2)
Обертон 23(2)
Область видимого излучения 9(2)
детектор 50(2)
источник излучения 40(2)
кювета для образца 47(2)
Область инфракрасного излучения 9(2)
Область отпечатков пальцев 21(2)
Обменная емкость 227(2)
Оборудование для ВЭЖХ 207(2)
детектор 210(2)
дифференциальный рефрактометр
210(2)
ультрафиолетовый детектор 210(2)
линейка фотодиодов в качестве детек-
тора в ВЭЖХ 211(2)
флуоресцентный детекторы 211 (2)
амперометрический детектор 211(2)
колонка 209(2)
система для ввода пробы 208(2)
система для подачи подвижной фазы 207(2)
Обработка данных
воспроизводимость 108(1), 119(1)
дисперсия 143(1)
доверительный интервал 140(1)
границы 140(1)
доверительная вероятность 140(1)
использование электронных таблиц 124(1)
см. также Электронные таблицы
контрольная карта качества 139(1), 199(1)
границы 139(1)
коэффициент корреляции Пирсона 162(1)
коэффициент детерминации 163(1)
логарифмирование 117(1)
малые массивы данных 154(1)
коэффициент отклонения 155(1)
медиана 154(1)
размах 154(1)
пакеты статистических программ 169(1)
погрешности
абсолютная 118(1)
детерминированные 109(1)
наложение 130(1), 138(1)
недетерминированные 110(1)
относительная 118(1)
средняя 118(1)
правильность 107(1)
мера 118(1)
способы выражения 118(1)
правила округления 118(1)
программа ЛИНЕЙН 168(1)
сложение и вычитание 115(1), 131(1)
стандартная погрешность 122(1)
стандартное отклонение 119(1), 160(1)
коэффициент вариации 122(1)
относительное 122(1)
оценка 119(1)
средневзвешенное 147(1)
статистика пробоотбора 172(1)
константа пробоотбора Ингамелла
173(1)
контрольный опыт 110(1)
степень свободы 121(1)
тесты значимости
F-тест 143(1)
Z-тест Стьюдента 145(1)
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
491
парный 149(1)
сравнение данных с известной
величиной 146(1)
сравнение серий данных 147(1)
2-тест 151(1)
умножение и деление 113(1), 133(1)
число значащих цифр 111(1)
Обратная связь 278(2)
Обращенно-фазовая хроматография 136(2),
213(2) см. также Распределительная хро-
матография
модификаторы 213(2)
Одноименный ион, влияние на растворимость
452(1)
Озон, определение 353(2)
Окисление
необратимое 608(1)
ступенчатое 606(1)
Окислители 586(1)
Окислительно-восстановительная реакция 486(1)
направление 491(1)
Окислительно-восстановительное титрование
приготовление раствора 584(1)
расчет кривых 566(1)
Окислительно-восстановительные индикато-
ры 572(1)
Оксид азота(2), определение 352(2)
Оксиды азота, суммарное содержание 352(2)
Олигонуклеотид 321(2)
Омическое падение напряжения 603(1)
Оптическая плотность 28(2)
Оптические волокна 76(2)
Опыт контрольный 110(1)
Осадители органические 448(1), 450(1)
Осадительное титрование 587(1)
Осадок, загрязнение 440(1)
Осаждение
оптимальные условия 436(1)
органические осадители 448(1), 450(1)
стадии 435(1)
Основное состояние 10(2)
Основной пик 186(2)
Оствальдовское созревание 438(1)
Осушители 80(1)
Отбор и хранение проб крови и мочи 300(2)
Отбор проб грунта и донных отложений 357(2)
Отжиг 326(2)
Открытые капиллярные колонки 162(2)
Очистка и улавливание примесей 180(2)
Параметр 234(2)
Параметр размера иона 302(1)
Парофазный анализ 179(2)
Пептизация 440(1), 442(1)
Первичный адсорбционный слой 439(1), 480(1)
Первичный стандарт 234(1)
Перенапряжение 608(1)
Переосаждение осадка 440(1)
Пересыщение 435(1)
абсолютная степень 436(1)
относительное 436(1)
Период полупревращения 255(2)
Перманганат в качестве окислителя 586(1)
Перманганат калия в качестве титранта 581(1)
Пероксид водорода в качестве окислителя
586(1)
Персульфат калия в качестве окислителя 586(1)
Петля управления 278(2)
ПИА см. Проточно-инжекционный анализ
Плазма крови 27(1), 300(2)
содержание основных ионов 230(1)
Плазмида 327(2)
Пламенная эмиссионная спектроскопия 90(2)
пределы обнаружения 101(2)
Пламенно-ионизационный детектор 170(2)
Пламенно-термоионный детектор 172(2)
Платиновый электрод в окислительно-восста-
новительном титровании 588(1)
Плотность 217(1)
Поверка методики анализа 34(1), 189(1)
аттестация методики 191(1)
воспроизводимость 195(1)
линейность градуировочной зависимо-
сти 191(1)
нижняя граница определяемых содер-
жаний 197(1)
правильность 193(1)
предел обнаружения 196(1)
рабочий диапазон 196(1)
селективность 191(1)
устойчивость 197(1)
чувствительность 196(1)
иерархия понятий 190(1)
инструкция 190(1)
метод 190(1)
методика 190(1)
пропись 190(1)
межлабораторная воспроизводимость
198(1), 200(1)
492
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Подавляющая ионообменная колонка 230(2)
регенерация 231(2)
Поиск решения см. Электронные таблицы
Полимеразная цепная реакция 327(2)
Полипептид 336(2)
Полоса излучения 53(2)
Полуавтоматические устройства 281(2)
Полуреакция 562(1)
Получение представительных образцов 343(2)
Поляризующий электрод 606(1)
Полярография 609(1)
Поперечная сшивка в полимерах 228(2)
Порядок реакции 255(2)
Последовательный инжекционный анализ
292(2)
Постороннее излучение 68(2)
Потенциал
асимметрии 523(1)
восстановительный 489(1)
выделения 605(1)
граничный 527(1)
диффузионный 527(1)
жидкостного соединения 512(1)
неэлиминированный 521(1)
снижение 512(1)
измерение 514(1)
ограничения использования 501(1)
полуволны 606(1)
потенциальный 499(1)
равновесный 496(1)
стандартный 494(1)
смешанный 522(1)
формальный 499(1)
влияние комплексообразования 500(1)
зависимость от pH 500(1)
электродный 488(1)
Потенциометр 518(1)
Потенциометрическое титрование 586(1)
Праймер 320(2)
Предел обнаружения 170(1)
Предел эксклюзии 224(2)
Предельный ток 605(1)
Предколонка 210(2)
Преобразование Фурье 62(2)
Принцип конкурентного белкового связыва-
ния 312(2)
Принцип Ле Шателье 276(1)
Проба 88(1)
анализ 36(1)
анализируемая 26(1), 88(1)
безбелковый фильтрат 99(1)
высушивание 91(1)
техника работы 99(1)
генеральная 26(1), 88(1)
измерение аналитического сигнала 30(1)
компоненты 36(1)
лабораторная 26(1)
микроволновая подготовка 96(1)
конструкция печи 97(1)
кислотное разложение в печи 97(1)
минимальное число порций 174(1)
минимальный размер 173(1)
обработка и хранение 27(1)
операции разделения 30(1)
отбор 88(1)
твердых веществ 89(1)
жидкостей 89(1)
газов 90(1)
разложение органических веществ
мокрое сожжение 94(1)
сухое озоление 92(1), 93(1)
размер 36(1), 173(1)
растворение 91(1)
техника работы 99(1)
сплавление с плавнями 92(1)
Пробы, параллельные 27(1)
Программирование температурного режима
175(2)
Продольная (осевая) или молекулярная диф-
фузия 143(2)
Проект «Геном человека» 323(2)
Произведение растворимости 451(1)
термодинамическое 457(1)
условное 468(1), 474(1)
Производственный химический анализ
автоматизация 275(2)
оборудование 280(2)
Пропись 190(1)
Пропускание 27(2)
Протеомика 336(2)
Противодавление в ВЭЖХ 204(2)
Проточно-инжекционный анализ 282(2)
геометрия каналов 290(2)
длина канала и скорость потока 289(2)
измерения в остановленном потоке 292(2)
коэффициент дисперсии 286(2)
объем пробы 287(2)
Прямая связь 279(2)
ПРВДМЕГНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
493
Пустоты в хроматографической колонке 148(2)
ПЦР см. Полимеразная цепная реакция
Равновесие
влияние давления 277(1)
влияние катализатора 278(1)
влияние концентрации 277(1), 289(1)
влияние температуры 277(1)
осадок-раствор 449(1)
сложное, расчет с использованием мате-
риального баланса 469(1)
Радиоиммуноанализ 308(2)
Разделение связанного и свободного антигена
314(2)
денатурация 314(2)
метод с вторичными антителами 314(2)
Разновесы 51(1)
Разрыхляющие орбитали 14(2)
Распределительная ВЭЖХ 212(2)
Распределительная хроматография 136(2) см.
также Обращенно-фазовая хроматография
нормально-фазовая хроматография 13 6(2)
обращенно-фазовая хроматография 136(2)
Распыление 95(2)
Раствор
коллоидный 438(1)
маточный 438(1)
насыщенный 451(1)
Растворимость
влияние кислотности среды 459(1), 466(1)
влияние комплексообразования 473(1)
влияние одноименного иона 452(1)
влияние посторонних ионов 457(1)
зависимость от стехиометрии осадка 453(1)
малорастворимые вещества 449(1)
произведение растворимости 451(1)
Растворители для ВЭЖХ 207(2)
Растворы
кислые 320(1)
нейтральные 320(1)
щелочные 320(1)
Реагирующие единицы 215(1)
расчеты с их применением 256(1)
Реакция
второго порядка 256(2)
первого порядка 254(2)
порядок 254(2)
псевдопервого порядка 257(2), 259(2)
скорость 254(2)
необратимая 501(1)
Резонансная линия 95(2)
Рибонуклеиновая кислота матричная 335(2)
Родственный ион 185(2)
Ротаметр 347(2)
Ртутный капающий электрод 609(1)
СВЭ см. Стандартный водородный потенциал
Секвенирование ДНК 329(2)
Селективный 21(1)
Серебрянный электрод в осадительном титро-
вании 587(1)
Синглетное состояние 69(2)
Системная точка 362(1)
Скорость реакции 254(2)
Следовые количества органических веществ,
пробоподготовка для определения 358(2)
Слой противоионов 439(1), 480(1)
Смесь Циммермана-Рейнгардта 581(1)
Смешанные кристаллы 441(1)
Снип 333(2) см. также SNP
Солевой мостик 489(1)
Солевой эффект 459(1)
Сопротивление массопереносу между фазами
143(2)
Сопряженная пара 312(1)
Сорбция см. Твердофазная экстракция
Состав крови 300(2)
Спектр с временной разверткой см. Интерфе-
рограмма
Спектральная ширина полосы 54(2)
Спектральная ширина щели 54(2)
Спектральные базы данных 25(2)
Спектрометр с электротермическим анализа-
тором 102(2)
Спектрометр 40(2)
двухлучевой 58(2)
детектор 50(2)
для ближней ИК-области 63(2)
ИК-фурье-спектрометр 61(2)
источник излучения 40(2)
кювета для образца 47(2)
монохроматор 42(2)
однолучевой 55(2)
с диодными массивами 59(2)
Спектрометрия
вычисления 27(2)
для анализа смесей 32(2)
номенклатура 30(2)
494
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
погрешности анализа 64(2)
растворители 25(2)
Спектрофлуориметр 74(2)
Спектрофотометр 40(2), 52(2)
калибровка 55(2)
Спектрофотометрия 52(2)
определение ионов металлов 426(1)
Спектры высших порядков 45(2)
Специфичность
иммуноанализа 313(2)
ферментативных реакций 263(2)
абсолютная специфичность 263(2)
групповая специфичность 263(2)
специфичность по типу связи 263(2)
стереохимическая специфичность 263(2)
Специфичный 21(1)
Средняя инфракрасная область 9(2)
Стандартизация раствора 234(1), 241(1)
Стандартное отклонение значения концентра-
ции 37(2)
Стандартный водородный потенциал 489(1)
Стандартный раствор 232(1)
первичный 234(1)
приготовление
растворы кислот 76(1), 77(1),
растворы щелочей 76(1)
Стандартный буферный раствор 530(1)
Старение осадка см. Оствальдовское созревание
Степень извлечения 116(2)
Стехиометричность реакции 233(1)
Стехиометрия 209(1)
Ступенчатая константа устойчивости 409(1)
Субстраты 257(2), 263(2)
определение 265(2)
по полному превращению 265(2)
по скорости реакции 265(2)
часто определяемые 268(2)
Сульфаты, определение с Ва2+ 482(1)
Сульфид натрия в качестве восстановителя 585(1)
Сухое озоление 29(1), 93(1)
низкотемпературное 93(1)
в токе кислорода 93(1)
Сыворотка 27(1), 300(2)
электролиты, определение 303(2)
Твердофазная микроэкстракция 127(2)
Твердофазная экстракция 121(2)
96-луночные планшеты 125(2)
двойные фазы 126(2)
диски 124(2)
микро- 127(2)
наконечники для пипеток 123(2)
патрончики 122(2)
полимерные фазы 126(2)
сорбенты 121(2), 126(2)
Темновой ток 57(2)
Температура
детектора 175(2)
колонки 174(2)
устройства для ввода пробы 174(2)
Теоретическая тарелка 138(2)
приведенная высота 145(2)
число теоретических тарелок 139(2)
эквивалентная высота 13 8(2)
эффективное число 140(2)
Теория
Аррениуса 311(1)
Бренстеда-Лоури 312(1)
Льюиса 313(1)
сольвосистем 312(1)
Тепловой шум 65(2)
Термическая десорбция 179(2)
Тиосульфат в качестве титранта 583(1)
Титан в качестве титранта 583(1)
Титр раствора 260(1)
Титрант 232(1), 581(1)
Титриметрические методы 30(1)
классификация 235(1)
Титрование 30(1), 67(1), 232(1)
обратное 247(1)
по Фольгарду 479(1)
хелеметрическое 412(1)
кислотно-основное 587(1)
конечная точка 67(1)
окислительно-восстановительное 562(1)
осадительное 475(1), 587(1)
индикаторы 478(1)
основные правила проведения 68(1)
потенциометрическое 586(1)
Тонкослойная хроматография 233(2)
высокоэффективная 237(2)
количественные измерения 237(2)
неподвижные фазы 236(2)
адсорбенты 236(2)
жидкие неподвижные фазы 236(2)
ионообменные смолы 236(2)
эксклюзионные тонкослойные мате-
риалы 236(2)
ПРВДМЕГНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
495
обнаружение пятен 235(2)
подвижные фазы 237(2)
получение хроматограмы 234(2)
Точка эквивалентности 233(1), 374(1)
Трансдьютер 611(1)
Транскрипция 336(2)
Триплетное состояние 70(2)
Углеводороды, определение 353(2)
Удельный вес 217(1)
Улавливание пыли, мокрый метод 350(2)
Ультрамикроэлектрод 613(1)
Уравнение
Ван Деемтера 141(2)
Гендерсона-Хасселъбаха 331(1)
Голея 146(2)
Дебая-Хюккеля 302(1)
Дэвиса 304(1)
Лайнуивера-Берка 261(2)
свободный член 261(2)
тангенс угла наклона 261(2)
Максвелла-Больцмана 91(2)
материального баланса 290(1)
Нернста 494(1)
Никольского 545(1), 550(1)
Нокса 147(2)
Пурнелла 150(2)
электронейтральности 290(1)
Ускоренная жидкостная экстракция 120(2)
Устройства
для создания вакуума 347(2)
для отбора проб газов 349(2)
газоадсорбционные трубки 351(2)
импакторы 349(2)
импинджеры 349(2)
фильтры 349(2)
электростатические и термические
преципитаторы 351(2)
Ультрафиолетовая область
ближняя ультрафиолетовая область 8(2)
детектор 50(2)
источник излучения 41(2)
кювета для образца 47(2)
область вакуумного ультрафиолета 9(2)
область кварцевого ультрафиолета 8(2)
Фактор разделения 149(2)
методы оценки 547(1)
Фактор удерживания 148(2)
Ферментативная кинетика 257(2)
Ферментативный катализ 257(2)
Ферментный электрод 611(1)
Ферменты 257(2)
активность 260(2)
ингибиторы и активаторы 260(2), 271(2)
концентрация 260(2)
международные единицы измерения
260(2)
молекулярная активность 260(2)
номенклатура 264(2)
определение 265(2)
свойства 259(2)
удельная активность 260(2)
фосфатазы 270(2)
часто определяемые 270(2)
Фибрин 27(1)
Фибриноген 27(1)
Фильтрование, техника 84(1)
Флуоресцентная спектрометрия 42(2)
Флуоресцентный анализ, оборудование 74(2)
Флуоресценция 70(2)
взаимосвязь с концентрацией 73(2)
взаимосвязь со строением молекулы 72(2)
диапазон определяемых концентраций
75(2)
интенсивность 73(2)
скорректированные спектры 76(2)
тушение 73(2)
Флуориметрия 69(2)
Фон Веймарна отношение 436(1)
Фоновое поглощение 98(2)
Формальность 217(1)
Фосфатазы кислая и щелочная, определение
306(2)
Фосфоресценция 70(2)
Фотон 8(2)
Фотоэлектроумножитель 50(2)
с солнечной блендой 50(2)
Фотоэлемент 50(2)
Фу/?ье-спектрометр 62(2)
ФЭУ см. Фотоэлектроумножитель
Хелат 412(1), 449(1)
Хелатный эффект 413(1)
Хелатообразующий
компонент 235(1)
лиганд 412(1)
реагент 449(1)
496
ПРВДМЕГНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
Химическая кинетика 254(2)
Химически модифицированный электрод
611(1)
Химически селективный слой 611(1)
Хлор в качестве окислителя 586(1)
Хлорид олова в качестве восстановителя
584(1)
Хлориды
определение по Мору 478(1)
определение по Фаянсу 481(1)
Хлорная кислота в качестве окислителя 586(1)
Хлорфторуглероды, суммарное содержание
353(2)
Хорошая лабораторная практика 188(1)
аккредитация лабораторий 201(1)
обеспечение качества результатов анализа
199(1)
организации 204(1)
система обеспечения качества 188(1),
199(1)
стандартные рабочие процедуры 188(1)
электронная документация 202(1)
электронные подписи 202(1)
Хранение образцов воздуха 346(2)
Хром в качестве титранта 583(1)
Хроматограф газовый 157(2)
Хроматография 132(2)
базы данных 152(2)
высокоэффективная жидкостная 198(2)
гель-проникающая 224(2)
гель-фильтрационная 224(2)
зарождение 133(2)
ионная 226(2)
классификация методов 13 5 (2)
номенклатура и терминология 137(2)
нормально-фазовая 213(2)
обращенно-фазовая 213(2)
основы разделения 133(2)
программное обеспечение 152(2)
разрешение 149(2)
теория эффективности колонок 138(2)
эксклюзионная 224(2)
Хромато-масс-спектрометрия 182(2)
Хромоген 15(2)
Хромофор 15(2)
поглощение излучения 16(2)
Цвиттер-ион 399(1), 229(2), 239(2)
Церий в качестве титранта 582(1)
Частота волны 6(2)
Часть на миллиард 225(1)
Часть на миллион 224(1)
Часть на триллион 225(1)
Часть на тысячу 224(1)
Число каталитических циклов 258(2)
Число миллимолей эквивалента 229(1), 250(1)
Число тарелок 139(2) см. также Теоретиче-
ская тарелка
эффективное 140(2)
Шум Джонсона 65(2)
ЭГТА 425(1)
ЭДС ячейки 492(1)
ЭДТА 412(1)
приготовление 424(1)
Эквивалент 215(1)
Эквивалентная масса 215(1), 236(1), 251(1)
Эксклюзионная хроматография 224(2)
в тонкослойной хроматографии 237(2)
Экстракция 426(1)
в микроволновом поле 120(2)
Электрод 488(1)
сравнения 567(1)
Электродвижущая сила см. ЭДС
Электродный потенциал 488(1)
Электролитическая ячейка 487(1)
без жидкостного соединения 511(1)
Электромагнитное излучение
взаимодействие с веществом 6(2)
поглощенное 11(2)
Электромагнитный спектр 6(2)
Электрометр 518(1)
Электромиграция 243(2)
Электрод
водородный 509(1)
для измерения pH 526(1)
индикаторный 511(1)
ионселективный 536(1)
каломельный 507(1)
коэффициент селективности 545(1)
методы оценки 547(1)
на основе ионофора 540(1)
с жидкой мембраной 539(1)
с твердой мембраной 538(1)
со стеклянными мембранами 537(1)
сравнения 505(1), 511(1)
насыщенный каломельный 516(1)
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ
497
стеклянный 522(1)
ферментные 542(1)
Электроды металлические 504(1)
окислительно-восстановительные 508(1)
Электронные переходы 9(2), 10(2)
типы 14(2)
Электронные таблицы 124( 1)
градуировка по внутреннему стандарту
177(2)
градуировка по способу нескольких
добавок 105(2)
калибровка мерной посуды 72(1)
определение массовой доли 460(1)
определение растворимости 460(1)
поиск решения 284(1)
построение градуировочного графика 164(1)
построение графика зависимостей долей
диссоциирующих частиц от pH 345(1)
построение концентрационно-логарифми-
ческой диаграммы 364(1)
построение кривых титрования 377(1),
387(1)
построение производных кривых титро-
вания 592(1)
программа ЛИНЕЙН 168(1)
расчет неизвестной концентрации по гра-
дуировочному графику 36(2)
расчет состава смеси 35(2)
решение квадратного уравнения 283(1)
статистические функции 129(1)
Электронный удар 185(2)
Электроосмотический поток 240(2)
Электрофорез 238(2)
Электрофоретическая подвижность 240(2)
Электрохимический сенсор 611(1)
Элементный анализ 93(1)
Эмиссионные газы, определение 353(2)
Энергия Гиббса свободная 275(1)
Энтальпия 275(1)
Энтропия 275(1)
Эриохромовый черный Т 422(1)
Этилендиаминтетрауксусная кислота
см. ЭДТА
Эффект Вентури 95(2)
Эффект внутреннего фильтра 73(2)
ВАС см. Искусственные бактериальные хро-
мосомы
Bio-Gel 226(2)
ЕРА, методики 359(2)
Excel см. Электронные таблицы
PBMS, системы измерений 359(2)
pH 317(1)
измерение 526(1)
кислотная погрешность 529(1)
точность 531(1)
щелочная погрешность 528(1)
крови, измерение 535(1)
рН-метр 518(1)
принцип измерения 532(1)
pH-электрод в кислотно-основном титровании
587(1)
Phrap 332(2)
Phred 332(2)
рМ, измерение 588(1)
ppb см. Часть на миллиард
ppm см. Часть на миллион
ppt см. Часть на тысячу, часть на триллион
Sephadex 225(2)
SNP 333(2)
анализ 334(2)
Styragel 226(2)
Оглавление
Глава 16
Методы молекулярной спектрометрии 5
16.1. Взаимодействие электромагнитного излучения с веществом............6
16.2. Электронные спектры и молекулярная структура.....................13
16.3. Поглощение в области инфракрасного излучения и молекулярная структура... 20
16.4. Инфракрасная спектрометрия в ближней области — недеструктивный
метод анализа..........................................................22
16.5. Спектральные базы данных: идентификация новых соединений.........25
16.6. Растворители для спектрометрии...................................25
16.7. Вычисления в количественном анализе..............................27
16.8. Оборудование для проведения спектрометрических исследований......40
16.9. Типы спектральных приборов.......................................55
16.10. Спектрометры с диодными массивами — регистрация всего спектра.....59
16.11. Инфракрасные фурье-спектрометры................................. 61
16.12. Спектрометры для ближней ИК-области...............................63
16.13. Погрешности спектрометрических методов анализа....................64
16.14. Отклонения от закона Бера.........................................65
16.15. Флуориметрия......................................................69
16.16. Оптические сенсоры: волоконная оптика.............................76
Что мы узнали из этой главы? 80
Вопросы 81
Задачи 83
Рекомендуемая литература 86
Глава 17
Методы атомной спектроскопии 89
17.1. Пламенная эмиссионная спектроскопия..............................90
17.2. Распределение между основным и возбужденным состояниями:
большинство атомов находится в основном состоянии......................91
17.3. Атомно-абсорбционная спектроскопия...............................92
17.4. Градуировка по методам внутреннего стандарта и стандартных добавок .... 103
Что мы узнали из этой главы? 109
Вопросы 109
Задачи 110
Рекомендуемая литература 112
ОГЛАВЛЕНИЕ 499
Глава 18
Пробоподготовка: жидкостная и твердофазная экстракция 113
18.1. Константа распределения..........................................113
18.2. Коэффициент распределения........................................114
18.3. Степень извлечения...............................................116
18.4. Жидкостная экстракция ионов металлов.............................117
18.5. Ускоренная экстракция и экстракция в микроволновом поле..........120
18.6. Твердофазная экстракция (сорбция)................................121
Что мы узнали из этой главы? 128
Вопросы 129
Задачи 129
Рекомендуемая литература 130
Глава 19
Хроматография: принципы и теория 132
19.1. Теоретические основы хроматографического разделения..............133
19.2. Классификация хроматографических методов.........................135
19.3. Теория эффективности хроматографических колонок..................138
19.4. Программное обеспечение для моделирования хроматографических
процессов..............................................................152
19.5. Коммерческие базы данных для хроматографии.......................152
Что мы узнали из этой главы 152
Вопросы 153
Задачи 153
Рекомендуемая литература 154
Глава 20
Газовая хроматография 156
20.1. Осуществление газохроматографического разделения.................156
20.2. Колонки для газовой хроматографии................................161
20.3. Детекторы в газовой хроматографии................................170
20.4. Выбор рабочей температуры........................................174
20.5. Количественные хроматографические измерения......................175
20.6. Анализ паров летучих веществ.....................................179
20.7. Термодесорбция...................................................179
20.8. Очистка и улавливание примесей...................................180
20.9. Микроколоночная скоростная газовая хроматография.................181
20.10. Сочетание газовой хроматографии с масс-спектрометрией.............182
Что мы узнали из этой главы? 194
Вопросы 195
Задачи 196
Рекомендуемая литература 196
500
ОГЛАВЛЕНИЕ
Глава 21
Жидкостная хроматография 198
21.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография......................199
21.2. Эксклюзионная хроматография.....................................224
21.3. Ионообменная хроматография......................................226
21.4. Ионная хроматография............................................230
21.5. Тонкослойная хроматография......................................233
21.6. Электрофорез....................................................238
21.7. Капиллярный электрофорез........................................239
Что мы узнали из этой главы? 249
Вопросы 250
Задачи 251
Рекомендуемая литература 251
Глава 22
Кинетические методы анализа 254
22.1. Основы химической кинетики......................................254
22.2. Ферментативный катализ..........................................257
Что мы узнали из этой главы? 272
Вопросы 272
Задачи 273
Рекомендуемая литература 274
Глава 23
Автоматизация химического анализа 275
23.1. Основы автоматизации............................................275
23.2. Автоматизированная аппаратура: контроль производственных процессов... 276
23.3. Автоматическая аппаратура.......................................280
23.4. Проточно-инжекционный анализ....................................282
23.5. Микропроцессоры и компьютеры в химическом анализе...............295
Что мы узнали из этой главы? 296
Вопросы 297
Задачи 297
Рекомендуемая литература 297
Глава 24
Клиническая химия 299
24.1. Состав крови....................................................300
24.2. Отбор и хранение проб...........................................300
ОГЛАВЛЕНИЕ 501
24.3. Некоторые распространенные методики в клиническом анализе.......303
24.4. Иммуноанализ....................................................308
Что мы узнали из этой главы? 317
Вопросы 317
Рекомендуемая литература 317
Глава 25
Век генов - геномика и протеомика: секвенирование ДНК и анализ белков 319
25.1. Из чего мы состоим?.............................................319
25.2. Что такое ДНК?..................................................320
25.3. Проект «Геном человека».........................................323
25.4. Как осуществляется секвенирование генов?........................325
25.5. Амплификация ДНК: полимеразная цепная реакция...................326
25.6. Плазмиды и искусственные бактериальные хромосомы................327
25.7. Секвенирование ДНК..............................................329
25.8. Секвенирование генома методом дробления.........................333
25.9. Полиморфизм отдельных нуклеотидов...............................333
25.10. ДНК-чипы.........................................................334
25.11. Эскиз генома человека............................................335
25.12. Геномика и протеомика: завершение рассказа.......................336
Что мы узнали из этой главы? 340
Вопросы 340
Задача 340
Рекомендуемая литература 341
Глава 26
Отбор и анализ проб объектов окружающей среды 343
26.1. Получение представительных проб.................................343
26.2. Отбор и анализ проб воздуха.....................................344
26.3. Отбор и анализ проб воды...................................... 355-
26.4. Отбор проб грунта и донных отложений............................357
26.5. Пробоподготовка для определения следовых количеств органических
веществ................................................................358
26.6. Загрязненные участки земель — что нужно анализировать?..........359
26.7. Методики Агенства по охране окружающей среды США
и системы измерений PBMS...............................................359
Что мы узнали из этой главы? 360
Вопросы 360
Задачи 360
Рекомендуемая литература 361
502
ОГЛАВЛЕНИЕ
Практические работы 363
Техника работы
Работа 1. Техника взвешивания на аналитических весах.....................363
Работа 2. Техника работы с пипетками, бюретками и статистическая обработка
данных...................................................................365
Гравиметрический анализ
Работа 3. Гравиметрическое определение хлоридов.................367
Работа 4. Гравиметрическое определение SO3 в растворимых сульфатах.......371
Работа 5. Гравиметрическое определение никеля с диметилглиоксимом в нихромовом
сплаве...................................................................373
Кислотно-основное титрование
Работа 6. Определение подвижных протонов в кислотах титрованием гидроксидом
натрия...................................................................375
Работа 7. Определение общей щелочности в пробе технической соды..........378
Работа 8. Определение бикарбонатов в крови при помощи обратного титрования ... 381
Комплексонометрическое титрование
Работа 9. Определение жесткости воды с ЭДТА..............................384
Осадительное титрование
Работа 10. Определение серебра в сплаве по Фольгарду.....................386
Работа 11. Определение хлоридов в водорастворимом образце по Фаянсу......388
Потенциометрический анализ
Работа 12. Определение pH шампуня для волос..............................390
Работа 13. Потенциометрическое определение фторидов в питьевой воде
при помощи фторид-селективного электрода................................392
Окислительно-восстановительное титрование
Работа 14. Определение железа в сплаве или руде дихроматометрическим
титрованием.............................................................394
Работа 15. Анализ растворов, содержащих гипохлориты натрия или пероксиды
водорода, йодометрическим титрованием...................................398
Работа 16. Йодометрическое определение меди..............................402
Работа 17. Определение сурьмы титрованием раствором иода.................403
Работа 18. Количественный микроанализ воды на жесткость методом
косвенного перманганатометрического
окислительно-восстановительного титрования..............................406
Потенциометрическое титрование
Работа 19. Потенциометрическое титрование образца технической соды.......410
Работа 20. Потенциометрическое титрование смеси хлоридов и иодидов.......412
Методы молекулярной спектрометрии
Работа 21. Спектрофотометрическое определение железа.....................414
ОГЛАВЛЕНИЕ
503
Работа 22. Определение нитратного азота в воде..........................415
Работа 23. Экстракционно-спектрофотометрическое определение свинца
в листьях.....................................................417
Работа 24. Спектрофотометрическое определение неорганического фосфора
в сыворотке крови.............................................419
Работа 25. Спектрофотометрическое определение марганца и хрома в их смеси .... 421
Работа 26. Экстракционно-спектрофотометрическое определение аспирина,
фенацетина и кофеина в таблетках АРС в УФ-области спектра..............424
Работа 27. Анализ смеси изомерных ксилолов методом ИК-спектрометрии.....426
Работа 28. Флуориметрическое определение рибофлавина (витамина В2)......427
Методы атомной спектрометрии
Работа 29. Определение кальция методом атомно-абсорбционной спектрометрии.. . 428
Работа 30. Определение натрия методом атомно-эмиссионной спектрометрии
в пламени..............................................................432
Хроматографические методы
Работа 31. Разделение аминокислот при помощи тонкослойной хроматографии .... 433
Работа 32. Газохроматографический анализ тройной смеси углеводородов....436
Работа 33. Качественный и количественный анализ фруктовых напитков на витамин С
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.....................437
Работа 34. Анализ анальгетиков методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии..........................................................439
Кинетические методы анализа
Работа 35. Ферментативное определение глюкозы в крови...................440
Проточно-инжекционный анализ
Работа 36. Определение физических параметров аналитической
проточно-инжекционной системы..........................................443
Работа 37. Одноканальный проточно-инжекционный анализ:
спектрофотометрическое определение хлоридов............................447
Работа 38. Трехканальный проточно-инжекционный анализ:
спектрофотометрическое определение фосфатов............................448
Групповые эксперименты
Работа 39. Изучение процедур поверки методики и контроля качества.......451
Работа 40. Тест на качество работы: расчет нормированных z-величин
из массива результатов индивидуальных экспериментов....................454
Приложение А
Литература по аналитической химии 455
Приложение В
Обзор математических операций: экспоненциальная и логарифмическая функции,
решениеквадратногоуравнения 459
504
ОГЛАВЛЕНИЕ
Приложение С
Таблицы констант 464
Таблица С.1. Константы основной диссоциации..............................464
Таблица С.2. Константы кислотной диссоциации.............................465
Таблица С.З. Произведения растворимости..................................467
Таблица С.4. Константы устойчивости комплексов некоторых ионов металлов
с ЭДТА (М«+ + Y4- MY"-4)....................................468
Таблица С.5. Некоторые стандартные и формальные окислительно-восстановительные
потенциалы...............................................................469
Приложение D
Техника безопасности в лаборатории 473
Приложение Е
Периодическая система элементов в Интернете 474-
Приложение F
Ответы к задачам с четными номерами 476
Предметный указатель 483
Относительные молекулярные массы
AgBr 187,78 CuO 79,54
AgCl 143,32 Cu2O 143,08
Ag2CrO4 331,73 CuSO4 159,60
Agl 243,77 Fe(NH4)2(SO4)2 • 6H2O 392,14
AgNO3 169,87 FeO 71,85
AgSCN 165,95 Fe2°3 159,69
Ag2SO4 311,80 Fe3O4 231,54
A1(C9H6ON)3(AIOx3) 459,46 HBr 80,92
ai2o3 101,96 HC2H3O2 (уксусная кислота) 60,05
A12(SO4)3 342,14 HC1 36,46
As2O3 197,85 HC1O4 100,46
BaCO3 197,35 H2C2O4 90,04
BaCl2 208,25 H2C2O4 • 2H2O 126,07
BaCl2 • 2H2O 244,27 H5IO6 227,94
BaCrO4 253,33 HNO3 63,01
BaO 153,34 H2O 18,015
BaSO4 233,40 H2O2 34,01
Bi2O3 466,0 H3PO4 98,00
C6H12O6 (глюкоза) 180,16 H2S 34,08
co2 44,01 H2SO3 82,08
CaCl2 110,99 H2so4 98,08
CaCO3 100,09 HSO3NH2 (сульфаминовая кислота) 97,09
CaC2O4 128,10 HgO 216,59
CaF2 78,08 Hg2Cl2 472,09
CaO 56,08 HgCl2 271,50
CaSO4 136,14 Hg(NO3)2 324,61
CeO2 172,12 KBr 119,01
Ce(SO4)2 332,25 KBrO3 167,01
(NH4)2Ce(NO3)6 548,23 K(C6H5)4B 358,31
(NH4)4Ce(SO4)4 • 2H2O 632,6 KC1 74,56
Cr2O3 151,99 KC1O3 122,55
KCN 65,12 NaCl 58,44
K^CrO, 194,20 NaClO 74,44
iqcro7 294,19 NaCN 49,01
кнс2о4 128,13 Иа^Оз 105,99
кнс2о4 • н2с2о4 218,16 NaHCO3 84,01
КНС8Н2О4(КНР) 204,23 Na^EDTA • 2H2O 372,23
КН(Ю3)2 389,92 NaOH 40,00
K^HPCZ, 174,18 NaSCN 81,07
кн2РО4 136,09 Na2SO4 142,04
KHSO4 136,17 Na2S2O3 • 5H2O 248,18
KI 166,01 Ni(C4H7O2N2)2(Ni-DMG2) 288,94
KIO3 214,00 NH3 17,03
К1О4 230,00 NH4C1 53,49
KMnO4 158,04 (HOCH2)3CNH2(THAM; Tris) 121,14
KNO3 101,11 NH2CONH2 (мочевина) 60,06
KOH 56,11 (NH4)2C2O4 • H2O 142,11
KSCN 97,18 nh4no3 80,04
174,27 (NH4)2SO4 132,14
MgCl2 95,22 (NH4)2s2o8 228,18
Mg(C9H6ON)2(MgOx2) 312,60 nh2so3h 97,09
MgNH4PO4 137,35 PbCrO4 323,18
MgO 40,31 PbSO4 303,25
Mg2P2O7 222,57 p2o5 141,94
MgSO4 120,37 Sb2O3 291,50
MnO2 86,94 SiO2 60,08
Mn2O3 157,88 SnCl2 189,60
Mn3O4 228,81 SnO2 150,69
MnSO4 151,00 SrSO4 183,68
Na2B4O7 • 10H2O 381,37 so2 64,06
NaBr 102,90 so3 80,06
Na(C6H5)4B 342,20 TiO2 79,90
NaC2H3O2 82,03 v2o5 181,88
Na2C2°4 134,00 Zn2P2O7 304,68
Международные величины атомных масс* (12С = 12)
Элемент Символ Атомный номер Атомная масса
Азот N 7 14,0067
Актиний Ас 89 (227)
Алюминий А1 13 26,9815
Америций Ат 95 (243)
Аргон Аг 18 39,948
Астат At 85 (210)
Барий Ва 56 137,33
Бериллий Be 4 9,0122
Берклий Bk 97 (247)
Бор В 5 10,811
Борий Bh 107 (264)
Бром Br 35 79,904
Ванадий V 23 50,9415
Висмут Bi 83 208,980
Водород H 1 1,00794
Вольфрам W 74 183,85
Гадолиний Gd 64 157,25
Галлий Ga 31 69,72
Гафний Hf 72 178,49
Гелий He 2 4,0026
Германий Ge 32 72,61
Гольмий Ho 67 164,930
Диспрозий Dy 66 162,50
Дубний Db 105 (262)
Европий Eu 63 151,96
Железо Fe 26 55,845
Золото Au 79 196,967
Индий In 49 114,82
Иод I 53 126,9045
Иридий Ir 77 192,2
Иттербий Yb 70 173,04
Иттрий Y 39 88,905
Кадмий Cd 48 112,41
Калий К 19 39,098
Калифорний Cf 98 (251)
Кальций Ca 20 40,08
Кислород 0 8 15,9994
Кобальт Co 27 58,9332
Кремний Si 14 28,086
Криптон Kr 36 83,80
Ксенон Xe 54 131,30
Кюрий Cm 96 (247)
Лантан La 57 138,91
Литий Li 3 6,9417
Лоуренсий Lr 103 (262)
Лютеций Lu 71 174,967
Магний Mg 12 24,312
Марганец Mn 25 54,9380
Медь Cu 29 63,546
Мейтнерий Mt 109 (268)
Менделевий Md 101 (258)
Молибден Mo 42 95,94
Мышьяк As 33 74,9216
Натрий Na 11 22,9898
Неодим Nd 60 144,24
Элемент Символ Атомный номер Атомная масса
Неон Ne 10 20,180
Нептуний Np 93 (237)
Никель Ni 28 58,69
Ниобий Nb 41 92,906
Нобелий No 102 (259)
Олово Sn 50 118,71
Осмий Os 76 190,2
Палладий Pd 46 106,4
Платина Pt 78 195,08
Плутоний Pu 94 (244)
Полоний Po 84 (209)
Празеодим Pr 59 140,907
Прометий Pm 61 (145)
Протактиний Pa 91 (231)
Радий Ra 88 (266) .
Радон Rn 86 (222)
Резерфордий Rf 104 (261)
Рений Re 75 186,2
Родий Rh 45 102,905
Ртуть Hg 80 200,59
Рубидий Rb 37 85,47
Рутений Ru 44 101,07
Самарий Sm 62 150,35
Свинец Pb 82 207,2
Селен Se 34 78,96
Сера S 16 32,066
Серебро Ag 47 107,870
Сиборгий Sg 106 (266)
Скандий Sc 21 44,956
Стронций Sr 38 87,62
Сурьма Sb 51 121,76
Таллий T1 81 204,38
Тантал Ta 73 180,948
Теллур Те 52 127,60
Тербий Tb 65 158,925
Технеций Tc 43 (98)
Титан Ti 22 47,87
Торий Th 90 232,038
Тулий Tm 69 163,934
Углерод C 6 12,011
Уран U 92 238,03
Фермий Fm 100 (257)
Фосфор P 15 30,9738
Франций Fr 87 (223)
Фтор F 9 18,9984
Хассий Hs 108 (265)
Хлор Cl 17 35,453
Хром Cr 24 51,996
Цезий Cs 55 132,905
Церий Ce 58 140,12
Цинк Zn 30 65,37
Цирконий Zr 40 91,22
Эйнштейний Es 99 (252)
Эрбий Er 68 167,26
* Числа в скобках означают массу наиболее устойчивого из известных изотопов. Данные об элементах 110,
111, 112, 114, 116 и 118 см. в периодических системах, упомянутых в Приложении Е.
Задача аналитической химии - охарактеризовать состав мате-
риального мира, то есть ответить на два важных вопроса: «что?»
(качественный анализ) и «сколько?» (количественный анализ).
Знание химического состава веществ необходимо в повседнев-
ной жизни.
В этой книге наряду с традиционными методиками приведены
методики клинического и экологического анализа.