Text
                    М. В.ВОЛЬКЕНШТЕИН
БИОФИЗИКА
ВТОРОЕ ИЗДАНИЕ,
ПЕРЕРАБОТАННОЕ И ДОПОЛНЕННОЕ
МОСКВА «НАУКА»
ГЛАВНАЯ РЕДАКЦИЯ
ФИЗИКО-МАТЕМАТИЧЕСКОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1 а в 8

ББК 28.071 В71 УДК 577.32(075.8) Рекомендовано Министерством высшего и среднего специального образования СССР для использования в учебном процессе студентами, специализирующимися в области биофизики и физико-химической биологии ВОЛЬКЕНШТЕИН М. В. Биофизика: Учеб, руководство, 2-е изд., по,- рераб. и доп.— М.: Наука. Гл.ред. физ.-мат. лит., 1988f—592 с., ил. ISBN 5-02-013835-5 Энциклопедический курс, излагающий основные разделы предмета — молекулярную биофизику, биофизику клетки и биофизику сложных си- стем, включая проблемы биологической эволюции. Второе издание перера- ботано по сравнению с первым, вышедшим в 1981 г., и дополнено новыми разделами (бионеорганическап химии и биофизика, топология ДНК, аку- стическая рецепция, биолюминесценция и др.). Для студентов — биологов и физиков, специализирующихся в области биофизики и физико-химической биологии. Табл. 44. Ил. 332. Библиогр. 83 назв. Рецензенты: кафедра биофизики биологического факультета ЛГУ, зав. кафедрой кандидат биологических наук А. В. Лонский, доктор химических наук Л, А. Блюменфельд „ 2001040000-034 „„ m В 053(02)-88 133-8® Издательство «Наука»» Главная редакция физико-математической литературы^ 1981; с изменениями, 1988 ISBN 5-02-013835-5
ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие ко второму изданию................................... 7 Предисловие к первому изданию.................................... 7 Глава 1. Задачи и методы биофизики . ....................... 9 § 1.1. Место биофизики в естествознании...................... 9 § 1.2. Физика и биология.....................................10 § 1.3. Живая и неживая природа...............................13 § 1.4. Биологическая индивидуальность........................14 § 1.5. Финализм и каузальность...............................15 § 1.6. Свойства открытых систем..............................16 § 1.7. Разделы и методы биофизики............................20 Глава 2. Химические основы биофизики.............................23 § 2.1. Химия и биология......................................23 | 2.2. Аминокислоты..........................................25 § 2.3. Электролиты...........................................27 § 2.4. Состав и первичная структура белков...................32 § 2.5. Нуклеиновые кислоты 36 § 2.6. Аденилаты.............................................40 § 2.7. Хиральность биологических молекул.....................42 § 2.8. Углеводы и липиды.....................................46 § 2.9. Кофакторы, витамины, гормоны..........................48 § 2.10. Основные биохимические процессы......................52 § 2.11. Сильные и слабые взаимодействия......................54 Глава 3. Физика макромолекул . . . . ..................59 § 3.1. Макромолекулы и высокоэластичность....................59 § 3.2. Внутреннее вращение и поворотная’ изомерия .... 62 § 3.3. Конформационная теория макромолекул...................67 § 3.4. Макромолекула как кооперативная система...............73 | 3.5. Клубок и глобула......................................76 § 3.6. Методы исследования макромолекул......................79 § 3.7. Полиэлектролиты . ...................................84 Глава 4. Физика белка............................................87 § 4.1. Задачи физики белка................................. 87 § 4.2. Конформации полипептидной цепи........................88 § 4.3. Водородная связь и структура воды.....................94 § 4.4. Переходы спираль — клубок ............................99 § 4.5. Белковая глобула и гидрофобные взаимодействия . . . 104 § 4.6. Связь между первичной и пространственной структурами белка ......................................................108 § 4.7. Структура и устойчивость глобулы ....... 112 § 4.8. Антитела и антигены..................................122 § 4.9. Фибриллярные белки ......................... . . . 126 1* а
Глава 5. Методы исследования структуры биополимеров . . . ,130 § 5.1. Рентгеноструктурный анализ................................130 § 5.2. Диффузное рассеиние рентгеновских лучей растворами биополимеров............................................136 § 5.3. Методы ядерпой физики.............................138 § 5.4. Электронные спектры поглощения....................1401 § 5.5. Люминесценция.....................................144 § 5.6. Естественная оптическая активность................148 § 5.7. Естественная онтическаи активность биополимеров . . . 154 § 5.8. Магнитная оптическая активность...................150 § 5.9. Колебательные спектры.............................168 § 5.10. Спектры ядерного и электронного парамагнитного резонанса 166 Глава 6. Физика ферментов.......................................... 178 § 6.-1. Химическая кинетика и катализ . . . . . 173 § 6.2. Кинетика простых ферментативных реакций,................. 177 § 6.3. Химические аспекты действия ферментов.....................182 § 6.4. Конформационные свойства ферментов . .. ... . . 180 § 6.5. Физика фермеит-субстратного взаимодействия .... 192 § 6.6. Электронно-конформациопные взаимодействия .... 195 § 6.7. Кооперативные свойства ферментов . . . 199' J 6.8. Миоглобин и гемоглобин................................... 206 § 6.9. Бионеорганическая химия и биофизика ...... 215 Глава 7. Физика нуклеиновых кислот................................. 220 § 7.1. Молекулярная биология и физика............................220 § 7.2. Структура нуклеиновых кислот............................ 222. § 7.3. Внутримолекулярные взаимодействия в двойной спирали 231 § 7.4 Термодинамика плавления двойной спирали . . . . . 233 § 7.5. Кинетика расплетания двойной спирали ;....................242 § 7.6. Взаимодействие двойной спирали с малыми молекулами и ионами . ... ................................ 246 § 7.7. Редупликация ДНК........................................ 248 § 7.8. Топология ДНК.............................................254 Глава 8. Физика биосинтеза белка.................................258 § 8.1. Проблема генетического кода ..............................258 § 8.2. Биосинтез белка . ..................< . . . . 262 § 8.3. Транскрипция и обратная транскрипция......................266 § 8.4. Транспортные РНК . . . . . . . . -.о- . . . 269* § 8.5. Трансляция . . ................... . . . . 272 § 8.6. Расшифровка генетического кода и его смысл .... 276 § 8.7. Мутации . . . . . . . . . . . . . . 282 § 8.8. Регуляция генов ..........................................287 Глава 9. Неравновесная термодинамика в биологии .... 30£ § 9.1. Информация и энтропия................... ... .. . . 301 § 9.2. Неравновесные процессы................................. 307“ § 9.3. Сопряжение потоков ......................... . . . 310 § 9.4. Сопряжение химических реакций . . . . ,. . . . 312 § 9.5. Стационарные состояния линейных систем : '. . . . 316 § 9.6. Сопряжение химических реакций с переносом вещества 322 § 9.7. Процессы, далекие от равновесия . . .'....................326 Г Л. а в а 10. Физика мембран . , ,..................................332 § 10.1. Мембраны клетки 332 § 10.2. Структура мембран........................................334 10.3. Конформационные свойства мембран • • > 337 4
§ 10.4. Пассивный мембранный транспорт.......................................................341 § 10.5. Активный мембранный транспорт . . . . . . . 345 § 10.6. Перенос заряженных частиц через мембраны'. . . . 351 § 10.7. Молекулярная рецепция.i' . 354 Глава 11. Физика нервного импульса........................................................... -359 § 11.1. Аксон и нервный импульс.........................'. . . . 359 § 11.2. Распространение нервного импульса . . . . 369 § 11.3. Генерация импульса....................•.'... 374 § 11.4. Полные каналы..........................• . . . . 378 § 11.5. Синаптическая передача............................................................. 382 Глава 12. Механохимические процессы . . . > 387 § 12.1. Термодинамика механохимических процессов . . . . . 387 § 12.2. Структура мышцы и мышечных белков ...... 392 § 12.3. Химия и физика мышцы.............................................................397 § 12.4. Теория мышечного сокращения .........................................................402 § 12.5. Кинетические свойства мышцы......................................................4(>9 § 12.6. Механохимические системы...............................411 § 12.7. Слуховая рецепция......................................416 § 12.8. Биомеханика............................................420 Глава 13. Биоэнергетика дыхательной цепи...................................................... 423 § 13.1. Биологическое окисление................................423 § 13.2. Строение и свойства митохондрий........................429 § 13.3. Хемиосмотическое сопряжение.....................432 § 13.4. Электронно-конформационные взаимодействии .... 439 § 13.5. Цитохром с.............................................444 Глава 14. Фотобиологические процессы....................... . 447 § 14.1. Фотосинтез.................447 § 14.2. Две фотохимические системы.................452 § 14.3. Хлоропласты............................. 458 § 14.4. Механизм фотосинтеза.........................460 § 14.5. Зрение.........................462 § 14.6. Молекулярный механизм фоторецепции.................470 § 14.7. Бактериородопспн.........................477 § 14.8. Биолюминесценция.................480 Глава 15. Моделирование динамических биологических процессов 483 § 15.1. Динамическая упорядоченность.................483 § 15.2. Физико- математические основы динамики нелинейных про- цессов .....................................................486 § 15.3. Модели Лотка и Вольтерра....................................494 § 15.4. Автокаталитические системы.................499 § 15.5. Фазовые переходы.................505 § 15.6. Стохастические процессы.................509 § 15.7. Динамика и регуляция.................511 Глава 16. Периодические химические и биологические процессы 514 § 16.1. Введение.........................514 § 16.2. Реакции Белоусова—Жаботинского ....... 515 § 16.3. Автоколебания при гликолизе...................522 § 16.4. Нелинейная динамика мембран...............................525 § 16.5. Автоволновые процессы в сердечной мышце.............528 Г л а в а - 17. Проблемы биологического развития................................................534 § 17.1. Происхождение жизни..................................................................534 § 17.2. Моделирование добиологической эволюции ..... 538 5
§ 17.3. Игровые модели и информационные аспекты самоорга- низации ....................................................541 § 17.4. Гиперциклы.........................................544 § 17.5. Другие модели добиологической эволюции.............548 § 17.6. Биологическая эволюция.............................553 § 17.7. Эволюция биологических макромолекул................558 § 17.8. Информационные аспекты эволюции..................561 § 17.9. Сложность и эволюция...............................568 § 17.10. Онтогенез.........................................573 § 17.11. Иммунитет.........................................578 Список рекомендуемой литературы................................583 Предметный указатель , . ...................................58Т
ПРЕДИСЛОВИЕ КО ВТОРОМУ ИЗДАНИЮ Необходимость второго, дополненного и переработанного из- дания «Биофизики» определяется несколькими причинами. В первом издании отсутствовал ряд разделов биофизики, та- ких как топология ДНК, вопросы бионеорганической химии, аку- стическая рецепция, биолюминесценция и др. Эти разделы нуж- ны в курсе, претендующем до некоторой степени на энцикло- педичность. За истекшие годы биофизические исследования значительно расширились и продвинулись вперед по ряду актуальных направ- лений. В этом издании предпринята попытка отразить достигну- тый уровень науки, в книгу включены новейшие результаты, в том числе и полученные автором и его сотрудниками. Совре- менная биофизика содержит представления, развитые в синерге- тике и в теории информации, что также нашло свое отражение в книге. И, наконец, существует очевидная потребность в учебном по- собии по биофизике — первое издание книги давно распродано. Я очень благодарен Б. Н. Белинцеву, Л. А. Блюменфельду, В. Д. Васильеву, Г. В. Турскому, В. Б. Журкину, В. И. Иванову, А. А. Константинову, В. П. Тимофееву, А. Н. Тихонову и Е. Е. Фесенко за их советы и материалы, оказавшиеся очень полезными для работы над вторым изданием. ПРЕДИСЛОВИЕ К ПЕРВОМУ ИЗДАНИЮ Задача этой книги — служить учебным пособием для студен- тов физических и биологических факультетов, специализирую- щихся в области биофизики. Книга исходит из двух монографий автора («Молекулярная биофизика», 1975 и «Общая биофизика», 1978), но написана за- ново. В основу положен курс, читаемый на протяжении многих лет студентам Московского физико-технического института. Биофизика рассматривается в книге как физика живой при- роды, а не как вспомогательный раздел биологии и физиологии. Сегодня биофизика неразрывно связана с теоретической биоло- 7
гией. Соответственно в книге уделяется внимание основным про- блемам поведения биологических систем на разных уровнях строения, начиная с молекулярного. Рассматриваются также фи- зические аспекты проблем генетики, биологии развития, эволю- ционной биологии. В книге излагаются, главным образом, теоретические основы биофизики. Одновременно уделено надлежащее внимание важ- нейшим экспериментальным фактам. Рассмотрена не только тео- рия биологических явлений, о которых идет речь, но и теория ряда применяемых в биофизике методов исследования. Несмотря на большой объем книги, в нее пе вошли многие вопросы, относящиеся к ряду областей физиологии, к инструмен- тальным . и. математическим методам прикладной биофизики. Между физиологией и биофизикой нет резкой границы. Тем не менее предпринята попытка разделить эти дисциплины, сосредо- точив главное внимание на наиболее общих вопросах. Равным образом, в книге никак не представлена радиобиология. Физика ряда физиологических процессов, радиобиология, биомеханика требуют специального изложения и выходят за пределы этого пособия. Некоторые физико-математические разделы, предназначен- ные, главным • образом, для физиков, напечатаны мелким шрифтом. Я надеюсь, что эта книга окажется полезной не только для студентов, но и для научных работников и аспирантов, биологов, физиков и химиков, знакомящихся с биофизикой. Книга написана по предложению Научного Совета по пробле- мам биологической физики Академии наук СССР. Я глубоко при- знателен Совету и, прежде всего, Г. Р. Иваницкому за постоян- ную помощь в создании книги. Я очень благодарен также Л. А. Блюменфельду и А. Б. Рубину за множество ценных заме- чаний, сделанных ими при чтении рукописи.
Глава 1 ЗАДАЧИ И МЕТОДЫ БИОФИЗИКИ § 1.1. Место биофизики в естествознании Будем исходить из определения физики как науки, изучаю- щей строение и свойства конкретных видов материи — веществ и полей — и формы существования материи — пространство и время. В этом определении нет разграничения живой и неживой природы. Приведенное определение не означает сведения всего естествознания к физике, но из него следует, что конечные тео- ретические основы любой области естествознания имеют физиче- ский характер. Эти основы уже раскрыты в химии, мы знаем сейчас, что химия изучает структуру и изменения электронных оболочек атомов и молекул при их взаимодействии. Соответствен- но теоретическая химия сегодня полностью основана на кванто- вой и статистической механике, на термодинамике и физической кинетике. Биология есть наука о живой природе, объекты которой неиз- меримо сложнее неживых. Поэтому предстоит пройти еще долгий путь, прежде чем удастся раскрыть сколько-нибудь полно глу- бинные физические основы биологических явлений и законо- мерностей. Исходя из сказанного, определим биологическую физику как физику явлений жизни, изучаемых на всех уровнях, начиная с молекул и клеток и кончая биосферой в целом. Такое определе- ние биофизики противостоит ее пониманию как вспомогательной области биологии или физиологии. Содержание биофизики не обязательно связано с применением физических приборов в био- логическом эксперименте. Медицинский термометр, электрокар- диограф, микроскоп — физические приборы, но врачи или био- логи, пользующиеся этими приборами, вовсе не занимаются био- физикой. Биофизическое исследование начинается с физической постановки задачи, относящейся к живой природе. Это означает, что такая задача формулируется, исходя из общих законов фи- вики и атомно-молекулярного строения вещества. Тем самым конечная цель биофизики состоит в обосновании теоретической биологии. Одновременно биофизика решает много- численные теоретические и практические (прикладные) пробле- мы более частного характера. Формулировка биофизической задачи возможна пока лишь в ограниченном числе случаев. Живая природа настолько сложна, что биологические знания большей частью недостаточны для реа- 9
лизации физических подходов. Однако биология стремительно развивается, с ее современным развитием неразрывно связано развитие биофизики. Биофизика — наука XX века. Из этого не следует, что ранее не решались биофизические задачи. Максвелл построил теорию цветного зрения, Гельмгольц измерил скорость распространения нервного импульса. Число примеров такого рода велико. Однако лишь в наше время биофизика перешла от изучения физических свойств организмов и физических воздействий на них (свет, звук, электричество) к фундаментальным проблемам — к исследованию наследственности и изменчивости, онтогенеза и филогенеза, ме- таболизма и биоэнергетики. Это оказалось возможным именно благодаря мощному развитию биологии и биохимии. Задачи биофизики те же, что и биологии. Они состоят в по- знании явлений жизни. Будучи частью физики, биофизика неот- делима от биологии. Биофизик должен обладать и физическими, и биологическими знаниями. Для успешной работы в области биофизики желательно общее понимание живой природы, опре- деляемое знанием основ зоологии и ботаники, физиологии и эко- логии. Физики часто относятся пренебрежительно к описатель- ным разделам биологии. Необходимость зоологии и ботаники принципиальна, без Линнея пе могло бы возникнуть учение Дарвина. Несмотря на большие трудности, современная биофизика до- стигла крупных успехов в объяснении ряда биологических явле- ний. Мы узнали многое о строении и свойствах биологически функциональных молекул, о свойствах и механизмах действия клеточных структур, таких, как мембраны, биоэнергетические органоиды, механохимические системы. Успешно разрабатыва- ются физико-математические модели биологических процессов, вплоть до онтогенеза и филогенеза. Реализованы общетеоретиче- ские подходы к явлениям жизни, основанные на термодинамике, теории информации, теории автоматического регулирования. Все эти вопросы будут с той или иной степенью детализации рас- смотрены в книге. При этом, в соответствии с пониманием био- физики как физики явлений жизни, мы будем исходить из фи- зических закономерностей, а не из физиологической классифика- ции. Так, например, рецепция внешних воздействий органами чувств рассматривается в различных разделах книги — зрение в главе, посвященной фотобиологическим явлениям, слух и ося- зание в связи с механохимическими процессами, обоняние — в связи с физикой молекулярного узнавания. § 1.2. Физика и биология Но достаточна ли современная физика для решения биологи- ческих проблем, для обоснования теоретической биологии? Не по- требуется ли биофизике новая, еще не существующая физика? В истории науки были ситуации, в которых ранее разработанная 10
теория встречалась с границами своей применимости и оказыва- лось необходимым строить принципиально новую систему пред- ставлений. Именно так возникли и теория относительности, и квантовая механика. A priori не исключено, что подлинная биофизика должна быть построена на основе еще не известной будущей физики, существенно отличной от совре- менной. Оставим в стороне концепции витализма, согласно которым биологические явления принципиально непостижимы на основе физики и химии, так как существует некая «жизненная сила», или энтелехия, или биологическое поле, не подлежащие физиче- скому истолкованию. Витализм не научен, он отрицает единство природы и, в конечном счете, приходит к теологии. В современ- ной науке неконструктивные виталистические представления уже не фигурируют. Обсуждая возможности физического истолкования явлений жизни, т. е. влияние физики на современное и последующее раз- витие биологии, не следует забывать и об обратном влиянии био- логии на физику. Закон сохранения энергии, первое начало тер- модинамики, был открыт Майером, Джоулем и Гельмгольцем. Как известно, Майер исходил из наблюдений над живыми орга- низмами, над людьми. Менее известно, что Гельмгольц также ос- новывался на биологических явлениях, руководствуясь четкой антивиталистической концепцией. Он писал: «По Шталю, силы, действующие в живом теле, суть физические и химические силы органов и веществ, но какая-то присущая телу жизненная душа или жизненная сила может связывать или освобождать их дея- тельность... Я нашел, что теория Шталя приписывает всякому живому телу свойства так называемого perpetuum mobile (веч- ного двигателя)... Таким образом я натолкнулся на вопрос, какие отношения должны существовать между различными силами природы, если принять, что perpetuum mobile вообще невозмо- жен...». Не только биофизика, но и физика в целом развивались на пути преодоления витализма. Остановимся на представлениях о соотношении физики и био- логии, разработанных физиками XX века — Бором и Шре- дингером. Бор рассматривал эту проблему на основе концепции допол- нительности, частным случаем которой является принцип неоп- ределенности квантовой механики. Бор считал дополнительными исследования живых организмов на атомно-молекулярном уровне и как целостных систем. Эти два вида исследований несовмести- мы. В то же время «ни один результат биологического исследо- вания не может быть однозначно описан иначе как на основе понятий физики и химии». Жизнь следует рассматривать «...как основной постулат биологии, не поддающийся дальнейшему ана- лизу»’, подобно кванту действия в атомной физике. Таким обра- зом, имеется дополнительность биологии, с одной стороны, и фи- зики и химии — с другой. Эта концепция не виталистична, она 11
не ставит каких-либо границ применению физики и химии в ис- следованиях живой природы. В конце жизни (1961, 1962 гг.) Бор изменил свои взгляды под влиянием успехов молекулярной биологии. Он отметил, что дополнительность в биологии имеет не принципиальный, но прак- тический характер, определяемый чрезвычайной сложностью жи- вого тела. Практическая дополнительность преодолима. Развитие молекулярной биологии привело к атомистическому истолкованию основных явлений жизни — таких как наследствен- ность и изменчивость. В последние десятилетия успешно разви- вается и физическая теория целостных биологических систем, основанная на идеях синергетики (гл. 15). В 1945 г. Шредингер написал книгу «Что такое жизнь с точ- ки зрения физики», оказавшую существенное влияние на разви- тие биофизики и молекулярной биологии. В этой книге внима- тельно рассмотрено несколько важнейших проблем. Первая из них — термодинамические основы жизни. На первый взгляд име- ется решительное противоречие между эволюцией изолирован- ной физической системы к состоянию с максимальной энтропией, т. е. неупорядоченностью (второе начало термодинамики), и био- логической эволюцией, идущей от простого к сложному. Шредин- гер говорил, что организм «питается отрицательной энтропией». Это означает, что организмы и биосфера в целом не изолирован- ные, но открытые системы, обменивающиеся с окружающей сре- дой и веществом, и энергией. Неравновесное состояние открытой системы поддерживается оттоком энтропии в окружающую сре- ду. Вторая проблема — общие структурные особенности организ- мов. По словам Шредингера, организм есть апериодический кри- сталл, т. е. высокоупорядоченная система, подобная твердому телу, но лишенная периодичности в расположении клеток, мо- лекул, атомов, Это утверждение справедливо для строения орга- низмов, клеток и биологических макромолекул (белки, нуклеи- новые кислоты). Как мы увидим, понятие об апериодическом кристалле важно для рассмотрения явлений жизни на основе теории информации. Третья проблема — соответствие биологиче- ских явлений законам квантовой механики. Обсуждая результа- ты радиобиологических исследований, проведенных Тимофеевым- Ресовским, Циммером и Дельбрюком, Шредингер отмечает, кван- товую природу радиационного мутагенеза. В то же время приме- нения квантовой механики в биологии не тривиальны, так как организмы принципиально микроскопичны. Шредингер задает во- прос: «Почему атомы малы?» Очевидно, что этот вопрос лишен смысла, если не указано, по сравнению с чем малы атомы. Они малы по сравнению с нашими мерами длины — метром, сантимет- ром. Но эти меры определяются размерами человеческого тела. Следовательно, говорит Шредингер, вопрос следует переформули- ровать: почему атомы много меньше организмов, иными словами, почему организмы построены из большого числа атомов? Дей- ствительно, число атомов в наименьшей бактериальной клетке 12
Mycoplasma laidlp.wii имеет порядок 10’. Ответ на вопрос заклю- чается в том, что необходимая для жизни упорядоченность воз- можна лишь в макроскопической системе, в противном случае порядок разрушался бы флуктуациями. Наконец, Шредингер задавался вопросом об устойчивости вещества генов, построен- ного из легких атомов С, Н, N, О, Р, на протяжении множества поколений. Ответ на этот вопрос дала позднее молекулярная био- логия, установившая двуспиральное строение дезоксирибону- клеиновой кислоты (ДНК). Мы не останавливаемся на работах некоторых физиков, в ко- торых утверждалось несоответствие биологических явлений и за- конов физики (Эльзассер, Вигнер и др.). Ошибочность этих работ была выявлена в научной литературе. Сегодня имеются все основания утверждать, что современная физика не встречается с границами своей применимости к рас- смотрению биологических явлений. Трудно думать, что такие границы обнаружатся в будущем. Напротив, развитие биофизики как части современной физики свидетельствует о ее неограни- ченных возможностях. Приходится, конечно, вводить новые фи- зические представления, но не новые принципы и законы. § 1.3. Живая и неживая природа Определим живой организм как открытую, саморегулируемую, •самовоспропзводящуюся и развивающуюся гетерогенную систе- му, важнейшими функциональными веществами которой явля- ются биополимеры — белки, и нуклеиновые кислоты. Организм — •система историческая, в том смысле, что он является результа- том филогенетического, эволюционного развития и сам проходит путь онтогенетического развития — от зиготы до старости и смерти. Обычная физика неживой природы не имеет дела с историей. Электрон, атом,, молекула характеризуются постоянными физиче- скими свойствами, независимо от своего происхождения. Конеч- но, обычная физика изучает кинетические, динамические процес- сы. При этом, однако, не рассматривается индивидуальная исто- рия физического тела. Сказанное не означает, что в физике неживой природы нет исторических проблем. Само возникновение живой природы, ее зволюционное развитие и индивидуальное развитие каждой особи есть часть развития Вселенной как целого, часть развития Сол- нечной системы, часть развития Земли. Следовательно, имеет смысл рассмотреть сходство, и различие между биофизикой, с од- ной стороны, и космологией, астрофизикой и геофизикой, с дру- гой. Такое рассмотрение поучительно, так как эти разные обла- сти физики могут обогатить друг друга едиными подходами к решению исторических задач. Согласно современным представлениям, история Вселенной начинается с малого сгустка плазмы громадной плотности. При- 13
мерно 2 • 1010 лет назад этот сгусток начал расширяться взрыв- ным образом, причем из фотонов и нейтрино возникали электро- ны и нуклоны, затем, по мере охлаждения Вселенной, легкие, а далее тяжелые атомы. По-видимому, расширение Вселенной непрерывно. Силы всемирного тяготения определили возник- новение звезд и галактик. При высоком гравитационном сжатии температура звезды повышается вплоть до возникновения термо- ядерных процессов. Эти процессы ответственны за эволюцию- звезд, за такие катастрофические события, как вспышки сверх- новых. Солнце — звезда, находящаяся на определенной стадии эволюции, образование планет является одним из следствий раз- вития Солнца. По современным данным Земля существует около- 4,5 • 10э, жизнь на Земле около 3,5 • 109 лет. В эволюции звезд и планетных систем так же, как и в биоло- гической эволюции, происходит «борьба за существование» — воз- никшие центры тяготения конкурируют друг с другом за кон- денсируемый материал. И в космологии, и в биологии мы имеем дело с созданием новой информации при возникновении новых звезд или новых видов или особей. Новая информация создается в результате запоминания случайного выбора. Эти процессы про- текают в результате неустойчивостей предшествующих состоя- ний. Они имеют характер фазовых переходов (§ 15.5 и 17.6). Таким образом, теоретические подходы, основанные на тео- рии информации и рассмотрении устойчивости динамических си- стем, в принципе являются общими для физики живой и нежи- вой природы. § 1.4. Биологическая индивидуальность Принципиальная особенность живой природы состоит в ее неограниченном многообразии. В настоящее время известно око- ло 3 • 10® видов различных живых существ. Число различных особей многоклеточных растений или беспозвоночных животных вообще не поддается оценке — оно чрезвычайно велико. Мы пока не различаем индивидуальности представителей данного штам- ма одноклеточных, но, надо думать, такие особенности суще- ствуют. Нет двух одинаковых организмов на Земле. Это объяс- няется генетической изменчивостью, реализуемой в очень широких пределах, и различиями во взаимодействиях со средой. Дарвиновская эволюция неразрывно связана с изменчивостью, с неограниченной индивидуализацией организмов. Научная био- логия не могла бы существовать без своих описательных разде- лов — зоологии и ботаники. В неживой природе ситуация иная. Число различных атомов, считая изотопы, составляет около 5000. Сегодня известно около- 102 элементарных частиц. Число различных атомов и простых мо- лекул, наблюдаемых в космосе, также имеет порядок сотен, и при исследовании эволюции звезд не приходится оперировать большим числом элементарных сущностей. Число различных 14
соединений, известных современной химии, имеет порядок 10’, ио здесь нет никаких ограничений, Существенно, однако, что атомы или молекулы данного вещества неотличимы друг от друга. Конечно, и в неживой природе имеется индивидуализация -на макроскопическом уровне. Реальные кристаллы данного минера- ла различаются, так как они вырастали в различных условиях. Нет двух совершенно одинаковых камней, обкатанных морским прибоем. Однако это многообразие не имеет принципиального значения для развития неживой природы, в которой при наличии измен- чивости отсутствует наследственность. Каковы могут быть химические, молекулярные основы безгра- ничного разнообразия живых систем? Они определяются макро- молекулярным строением генов и организмов. Полимерные цепи, макромолекулы не подчиняются основному закону химии — зако- ну постоянства состава,-Представим себе сополимер, построенный из двух сортов мономерных единиц. Если число звеньев макро- молекулярной цепи равно 100 (это совсем не длинная цепь), то число различных цепей, содержащих два типа звеньев, равно ~ юз» Таким образом, в данном макроскопическом образце сополимера может не быть двух одинаковых макромолекул. Действительно, в конечном счете биологическая изменчивость «определяется разнообразием генов, т. е. достаточно протяженных участков макромолекул ДНК, представляющих собой сополиме- ры, построенные из звеньев четырех типов. Как и физика в целом, биофизика — количественная наука, широко применяющая математический аппарат. Биология как таковая, и прежде всего популяционная генетика, также мате- матизируется. Однако имеются большие трудности при матема- тическом описании индивидуальных особенностей организмов. Такое описание может быть лишь численным, но не ана- литическим. § 1.5. Финализм и каузальность Биологическая эволюция определяется преимущественным вы- живанием популяций, более приспособленных к условиям среды. Соответственно строение организма характеризуется такой при- способленностью и адаптацией к определенной экологической нише. Поэтому в биологии естественным образом возникает фи- налистическая трактовка изучаемых явлений. Развитие зиготы во взрослый организм можно описывать, пользуясь понятием цели: целью развития является создание приспособленного орга- низма. Уже на ранних стадиях эмбриогенеза определенные груп- пы клеток предназначены для развития в определенный орган, и этим задается их функциональность на всех уровнях, вплоть до молекулярного. Организм подобен машине, построенной по плану для дости- жения определенных целей. Более того, это машина высшего 15
уровня сложности, способная целесообразно реагировать на за- ранее не запланированные события. Пример — производство ор- ганизмом высшего животного антител в ответ на практически любые антигены, в том числе и искусственные, с которыми ни- когда не приходится встречаться в природе. Финалистическое описание непосредственно следует из историчности живых орга- низмов. Оно не свойственно обычной физике и химии. Очевидна бессодержательность такого, например, утверждения: «Ионы натрия и хлора взаимодействуют друг с другом для того, чтобы построить кубический кристалл». Напротив, утверждение «...так как ионы Na+ и С1~ имеют единичные заряды и такие-то радиу- сы, ионный кристалл NaCl должен быть кубическим» имеет ясный смысл. Биологи часто задают вопрос «для чего?», физики спрашивают «почему?». Очевидно, что истинный научный смысл имеет именно второй вопрос. Физика и естествознание в целом каузальны — наука ищет причины (causa) явлений. В действительности нет противоречия между финализмом и каузальностью, и указанное различие между физикой и биоло- гией является внешним. Финализм возникает в физике всякий раз, когда мы встречаемся с проблемами устойчивости, с вариа- ционными принципами. Мы имеем в виду устойчивость в строгом математическом смысле, по Ляпунову (см. гл. 15). Устойчивое состояние динамической системы сохраняется при малых воз- мущениях — система, будучи отклонена от этого состояния, в пе- го возвращается. Финалистическая формулировка: система стре- мится сохранить свое состояние. Напротив, неустойчивое состоя- ние необратимо изменяется при малом возмущении — система стремится перейти в другое состояние. Пример — состояния рав- новесия физического маятника, устойчивое и неустойчивое. Вариационный принцип всегда финалистичен. Так, согласно» принципу наименьшего действия Гамильтона, вариация действия равна нулю, действие минимально. «Цель механической системы состоит в ее наименьшем действии». Но, как показывает класси- ческая механика, принцип Гамильтона эквивалентен уравнениям движения Лагранжа, в свою очередь следующих из второго за- кона Ньютона. Этот закон каузален, он описывает ускоренное движение как результат действия сил. Другие примеры финали- стически формулируемых законов физики: принцип Ферма в оптике, принцип Ле Шателье в термодинамике, правило Ленца в электродинамике. Вариационный финализм сводится к каузаль- ности. Число таких примеров неограниченно. § 1.6. Свойства открытых систем Как уже сказано, живые системы принципиально открыты и тем самым неравновесны. Одним из первых это понял советский биолог Бауэр, писавший, что «...неравновесное состояние живой материи и, следовательно, ее постоянно сохраняющаяся работо- способность обусловливаются... молекулярной структурой живой 16
материи, а источником работы, производимой живыми система- ми, служит в конечном счете свободная энергия, свойственная этой молекулярной структуре, этому состоянию молекул». Даль- нейшее развитие термодинамики открытых систем применитель- но к биологии связано с работами Берталанффи и, главным об- разом, Пригожина и его школы. Организм есть термодинамически открытая система, в кото- рой протекают химические реакции. Биохимические реакции на всех стадиях являются каталитическими, катализаторами служат белки — ферменты. Изменение энтропии такой системы выража- ется суммой энтропии, производимой внутри системы, dtS, и эн- тропии, поступающей извне или уходящей во внешнюю сре- ду, deS: dS = dtS + deS-, (1.1) d,S всегда положительна вследствие второго начала — если по- местить организм в изолирующую оболочку, deS = 0, и энтропия может только возрастать; dtS есть производство энтропии в ре- зультате внутренних химических реакций. Знак deS зависит от конкретной ситуации. Из уравнения (1.1) следует возможность стационарного, но неравновесного состояния открытой системы.. В стационарном состоянии термодинамические величины, харак- теризующие систему, постоянны, но не имеют равновесных зна- чений. Энтропия системы не максимальна. Имеем в стационар- ном состоянии dS = O, т. е. deS = — d,S < 0. (1.2) Иными словами, производимая энтропия полностью уходит ва внешнюю среду. Рассмотрим изолированную систему, состоящую из организ- ма и окружающей его среды. Организм получает из этой среды пищу, кислород, воду и в свою очередь выделяет в нее различ- ные вещества. Между организмом и средой осуществляется теп- лообмен. В таких условиях практически находится космонавт в космическом корабле. Организм космонавта — открытая система по отношению к кораблю, который хорошо изолирован от окру- жающего космического пространства. Общее изменение энтро- пии всей системы, согласно второму началу, положительно: dS = dSi + dS2 > 0, (1.3) где dSt и dS2 — изменения энтропии космонавта и окружающей среды. Имеем dSt = diSt + deSt. (1.4)’ Изменение энтропии dS2 происходит лишь в результате обмена среды веществом и энергией с космонавтом,— продукции энтро- пии в. среде, окружающей космонавта, практически нет. Следо- вательно, dS2 = — deSi и dS = diSj > 0. (1.5)’ 2 м. В. Волькенштейн 17
Если состояние космонавта стационарно, то d$t = 0, d'S^-d&cO, dS2 = dS = dtSl>0. (1.6)1 Таким образом, стационарное состояние космонавта поддержива- ется возрастанием энтропии в окружающей среде, определяемым оттоком в нее энтропии из организма космонавта, компенсиру- ющим продукцию энтропии в организме. В этом и состоит смысл слов Шредингера: «организм питается отрицательной энтропией». Энтропия среды возрастает, dS2 > 0, вследствие выделения тепло- ты космонавтом и вследствие того, что энтропия веществ, выделя- емых космонавтом, выше энтропии потребляемых им веществ. •Стационарное состояние космонавта будет сохраняться до тех пора, пока не истощатся питательные вещества в окружающей среде или пока необратимые процессы в организме космонавта не приведут к его изменению (старение). Стационарное состоя- ние может быть длительным, но не вечным. Его реализация определяется наличием двух шкал времени — быстрой шкалой для времени обмена энтропией с окружающей средой и относи- тельно медленной шкалой для времени исчерпания запасов пи- тательных веществ и (или) старения организма. Рассмотрим еще один пример. Имеем два больших тепловых резервуара, находящихся при температурах Т\ и Т2 и соединен- ных друг с другом тонким проводником теплоты. В проводнике устанавливается постоянный поток теплоты, любой отрезок провод- ника находится в стационарном состоянии. Оно сохранится, пока сколько-нибудь заметно не изменятся температуры 7\ и Т2, ко- торые медленно выравниваются. Время установления стационар- ного состояния много меньше времени достижения окончатель- ного равновесия, в котором ТХ = Т2. При расчете стационарного режима в быстрой временной шкале температуры 7\ и Т2 счи- таются постоянными — они изменяются в медленной шкале. Само существование биосферы можно рассматривать как ста- ционарный процесс, реализуемый на фоне грандиозного необра- тимого процесса охлаждения Солнца. Стационарное состояние открытой системы может быть близ- ким или далеким от равновесия, может быть устойчивым или не- устойчивым. В свою очередь нестационарное состояние может быть близким или далеким от стационарного. Как мы увидим (гл. 9), термодинамические подходы к анализу открытых систем, близких или далеких от равновесия, различны. При этом вводят- ся строгие количественные критерии близости или удаленности. Целый ряд фактов свидетельствует о том, что биологические си- стемы далеки от равновесия. Биологическое развитие возможно лишь в далекой от равновесия системе. Из сказанного не следует, однако, невозможность применения обычной равновесной термодинамики к рассмотрению каких бы то ни было биологических явлений. Динамические, необратимые жизненные процессы происходят внутри организованной струк- туры, которая изменяется медленно или остается практически 18
неизменной. Это справедливо для всех уровней биологического- строения, начиная с молекулярного. Соответственно, изучая структуру, мы можем исходить из условного термодинамического равновесия. Само возникновение биологической структуры можно- грубо представить двумя стадиями — биосинтезом составляющих элементов (макромолекул, клеток) и сборкой из них организо- ванной системы. Процесс сборки находится в значительной сте- пени под термодинамическим контролем, скажем, на молекуляр- ном уровне система стремится к состоянию с наименьшим хими- ческим потенциалом. Равновесная термодинамика оказывается одной из основ молекулярной биофизики. Самоорганизация и эволюция открытых биологических систем: на всех уровнях, начиная с клетки и кончая биосферой в целом, происходят вследствие оттока энтропии в окружающую среду. Земля получает энергию от Солнца в виде потока фотонов. Со- гласно обоснованным оценкам (Эбелинг), поток энергии, дости- гающий Землю, равен dE/dt = 1,2 •10” Вт. (1.7) Такое же количество энергии экспортируется вновь, но при более- низкой температуре. Общий экспорт энтропии равен dS 4 Г 1 1 1 = 4-1,2.10-Вт.^-^^-б-ЮиВт/К. . (1.8} Эта формула получена на основе статистической физики излу- чения черного тела; 5800 К—температура излучения Солнца, 260 К — средняя температура излучения Земли. Из (1.8) сле- дует, что плотность оттока энтропии в среднем составляет Js = -1 Вт/(К-м2). (1.9) Эта величина, представляющая верхний предел экспорта энтро- пии Землей, ответственна за биологическое развитие и эволюцию. В то же время очевидно, что в биологии мы встречаемся со сложным комплексом термодинамических и кинетических явле- ний. Различие термодинамики и кинетики иллюстрируется тече- нием химической реакции. Реакция принципиально возможна, лишь если она сопровождается понижением свободной энергии, AG < 0. Это необходимое, однако еще недостаточное условие для протекания реакции. Если начальное и конечное состояния си- стемы разделены высоким активационным барьером, константа к скорости реакции, зависящая экспоненциально от высоты энерге- тического барьера Еа, согласно закону Аррениуса к = A exp(—E3/RT), (1.10) где А — предэкспоненциальный множитель, R — газовая постоян- ная, Т — абсолютная температура, может быть исчезающе малой. Поэтому можно рассматривать неравновесное состояние, защи- щенное высоким барьером, как равновесное. Пример — гремучий газ, смесь Н2 и О2, взрывающаяся при активации цепной реак- 2” 19
щии пламенем спички, но устойчивая, т. е. квазиравновесная, в отсутствие .активации. Роль катализатора состоит в снижении активационного барьера Ел. Неравновесная термодинамика оказывается необходимой при трактовке динамических процессов,— прежде всего, явлений раз- вития. С термодинамикой связана и теория информации. Увеличение количества информации в системе, рассматриваемой как сообще- ние, всегда сопряжено с понижением энтропии (см. гл. 9). Ин- формационные аспекты биологии весьма поучительны. Выясня- ется, что понятие количества информации совершенно недоста- точно для рассмотрения развивающихся биологических систем. Оказывается необходимым рассматривать и рецепцию информа- ции, и создание новой информации. И то, и другое возможно лишь в условиях неравновесия, нестационарности и неустойчи- вости. В биологии важно не количество информации, ио ее ка- чество, смысл или ценность (§ 17.8). § 1.7. Разделы и методы биофизики Живая природа, живые организмы представляют собой много- уровневые сложные системы. Большие и малые молекулы, кле- точные органоиды, клетки, ткани, органы, организмы, популя- ции, биоценозы, биосфера — уровни, которыми должны занимать- ся и биология, и биофизика. Биофизика условно подразделяется на три области: молеку- лярная биофизика, биофизика клетки, биофизика сложных си- стем. Уто деление не обязательно, но удобно. Охарактеризуем содержание и методы трех областей биофизики. Молекулярная биофизика изучает строение и физико-химиче- ские свойства биологически функциональных молекул, прежде всего биополимеров — белков и нуклеиновых кислот. Задали мо- лекулярной биофизики состоят в раскрытии физических меха- низмов, ответственных за биологическую функциональность мо- лекул, например за каталитическую активность белков-фермен- тов. Молекулярная биофизика — наиболее развитая область биофизики. Она неотделима от молекулярной биологии и химии. Крупные успехи в этой области понятны — легче изучать моле- кулы (даже наиболее сложные из известных науке молекулы белков), чем клетки или организмы. Молекулярная биофизика опирается, с одной стороны, на биолого-химические дисциплины (биохимия, молекулярная биология, биоорганическая и бионеор- таническая химия), с другой, на физику малых и больших мо- лекул. Соответственно этому в гл. 2 мы рассматриваем химиче- ские основы биофизики, в гл. 3 — физику макромолекул и лишь после этого обращаемся к молекулярной биофизике. как таковой (гл. 4—8). Поскольку главные задачи молекулярной биофизики относят- ся к структуре молекул и их функциональности, как уже сказа- 20
по, мы можем рассматривать равновесные свойства молекул. Тео- ретический аппарат молекулярной биофизики — равновесная тер- модинамика, статистическая механика и, конечно, квантовая механика, поскольку речь идет о химии, о молекулах. Для экс- периментального исследования биологически функциональных молекул (будем далее называть их просто биологическими моле- кулами) применяется широкий арсенал физических методов. Это, во-первых, методы, употребляемые в физике макромолекул для определения их молекулярных масс, размеров и формы—седи- ментация в ультрацентрифуге, рассеяние света и рассеяние рентгеновских лучей растворами исследуемых веществ и т. д. Во-вторых, методы исследования структуры молекул, основанные на взаимодействии вещества со светом, начиная с рентгеновских лучей и кончая радиочастотным излучением. Методы оптики и спектроскопии, в широком смысле этих слов, включают рентге- ноструктурный анализ, у-резонансную спектроскопию (эффект Мёссбауэра), электронные и колебательные спектры, т. е. спект- ры поглощения и люминесценции в ультрафиолетовой и видимой областях, инфракрасные спектры и спектры комбинационного рассеяния. Сюда же относится спектрополяриметрия, т. е. иссле- дования естественного и магнитного вращения плоскости поля- ризации света и кругового дихроизма. Очень ценную информацию дают спектры ядерного и электронного парамагнитного резонан- сов (ЯМР и ЭПР). В случае ЭПР особенно важно применение парамагнитных спиновых меток. В-третьих, методы калоримет- рии, применяемые для изучения превращений биологических макромолекул. И, наконец, прямое изучение структуры белков и нуклеиновых кислот (а также, конечно, надмолекулярных структур, клеточных органоидов и клеток) посредством электрон- ной микроскопии. Применение ряда этих методов в биологии специфично. По- этому необходимо рассказать о них в курсе биофизики. Глава 5 посвящена краткому изложению теории методов оптики и спект- роскопии и полученных с их помощью биофизических ре- зультатов. Молекулярная биофизика естественно переходит в биофизику клетки, изучающую строение и функциональность клеточных и тканевых систем. Эта область биофизики является самой старой и традиционной. Ее главные задачи связаны сегодня с изучением физики биологических мембран и биоэнергетических процессов. Биофизика клетки включает изучение генерации и распростра- нения нервного импульса, изучение механохимических процессов (в частности, мышечного сокращения), изучение фотобиологиче- ских явлений (фотосинтез, рецепция света, зрение, биолюминес- ценция). В этой области также применяются уже перечисленные экспериментальные методы.' Биофизика клетки имеет дело с бо- лее сложными задачами и встречается с большими трудностями по сравнению с молекулярной биофизикой. Биофизике клетки посвящены гл. 10—14. 21
Биофизикой сложных систем условно называется преимуще- ственно теоретическая область биофизики, посвященная рассмотре- нию общих физико-биологических проблем и физико-математиче- скому моделированию биологических процессов. Перечислим основные современные разделы теоретической биофизики слож- ных систем. 1. Общая теория диссипативных нелинейных динамических систем — термодинамика необратимых процессов и кинетическое- моделирование. 2. Теория возбудимых сред, частью которой является теория биологических колебательных процессов. 3. Общетеоретическая трактовка биоэнергетических явлений. 4. Общая теория и моделирование процессов биологического развития — эволюции, онтогенеза, канцерогенеза, иммунитета. Этим разделам биофизики специально посвящены гл. 9, 15—17, но с теми же общими идеями мы встретимся и в осталь- ных главах. В конечном счете любой вопрос, обращенный к жи- вой природе, имеет эволюционный характер. Все разделы биофизики находят сегодня важные практиче- ские приложения, прежде всего в медицине и фармакологии^ а также в сельском хозяйстве.
Глава 2 ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОФИЗИКИ § 2.1. Химия и биология Живая клетка, живой организм представляют собой сложные химические машины. Они существуют благодаря химическим лревращениям веществ, поступающих извне, и выделению ве- ществ в окружающую среду, благодаря метаболизму. Биология и биофизика неразрывно связаны с химией. Никакие физические методы сами по себе не были бы в со- стоянии установить структуру сложных молекул без химических исследований. Химия решает эти задачи, изучая строение ве- ществ и их превращения в химических реакциях. Химия жизни, органическая химия, поначалу была совершен- но отделена от неорганической. Она считалась надежной опорой витализма, до той поры, когда научились синтезировать органи- ческие соединения из веществ неживого происхождения (начало было положено синтезом мочевины СО(ХН2)2, проведенным Вёлером в 1828 г.). В дальнейшем органическая химия перестала быть химией живого и превратилась в синтетическую химию со- единений углерода — химию углеводородов и их производных. Почти независимо развивалась биохимия — наука о строении и •свойствах биологических молекул, о течении химических реакций в живых организмах. Биохимия достигла грандиозных успехов в расшифровке сложных сетей метаболизма. Из биохимии в союзе с физикой выросла молекулярная биология, занимающаяся физи- ко-химическим, молекулярным истолкованием основных биологи- ческих явлений, прежде всего наследственности. Одновременно органическая химия вновь обратилась к живой природе на осно- ве многолетнего опыта исследований органических соединений. Возникла биоорганическая химия, а затем и бионеорганическая химия, изучающая биологические молекулы, содержащие атомы металлов. Провести границы между перечисленными областями исследований химии жизни невозможно, да в этом и нет необ- ходимости. Отметим основные особенности химии жизни — химии биоло- гических молекул. 1. Живая система обязательно химически гетерогенна. Бес- смысленно говорить о живых молекулах — отдельно взятые био- логические молекулы не живут. 23
2. Живая природа характеризуется единством химического строения. Грандиозное многообразие биологических видов и осо- бей не означает чрезвычайного разнообразия биологических мо- лекул и биохимических реакций. Основные вещества и основные химические механизмы едины во всей живой природе. Все белки строятся из двадцати аминокислот, все нуклеиновые кислоты — из четырех нуклеотидов. Одни и те же атомные структуры фи- гурируют во всех организмах. Однотипны и фундаментальные биохимические процессы. Разнообразие организмов определяется разнообразием сочетаний одних и тех же атомных групп и их взаимодействий. 3. Строение и свойства клетки и организма в конечном счете диктуются нуклеиновыми кислотами (ДНК и РНК), обладающи- ми «законодательной» властью в том смысле, что ими задается генетическая программа синтеза белков. В свою очередь белки обладают «исполнительной» властью уже потому, что ни одна химическая реакция в клетке не идет без участия специального фермента. 4. Биохимические процессы и биологические молекулы явля- ются результатом эволюционного развития. Биологической эво- люции предшествовала химическая (гл. 17), далее они были свя- заны неразрывно. Виды и организмы характеризуются биохими- ческой, молекулярной адаптацией к условиям среды. Изучая химию жизни, необходимо постоянно иметь в виду биологическое развитие. 5. Жизнь характеризуется точной и тонкой индивидуализа- цией. Малые различия в строении молекул, например различия между метильной и этильной группами, не имеющие существен- ного значения в обычной химии, очень важны в биологии (эти- ловый спирт Н3С—СН2—ОН вызывает опьянение, метиловый спирт Н3С—ОН — слепоту). Биологические молекулы и макро- молекулы имеют строго определенные состав и строение. 6. Химические реакции в организмах строго регулируются как прямыми и обратными связями в многостадийных процессах метаболизма, так и пространственным разделением реакций вследствие компартментации, реализуемой клеточными и внутри- клеточными мембранами. Поддерживаются тонкие концентраци- онные градиенты. 7. Наконец, укажем, что биологические молекулы построены из атомов легких элементов: С, Н, О, N, Р, S. Кроме того, в ор- ганизмах универсальна функциональность ионов щелочных и щёлочноземельных металлов Na, К, Са, Mg. Важнейшую роль играют малые количества других металлов — Fe, Zn и т. д., вплоть до Мо. Человеческий организм содержит (в атомных процентах) 60,56 Н, 25,67 0, 10,68 С, 2,44 N, 0,23 Са, 0,13 Р, 0,13 S, 0,08 Na, 0,04 К, 0,03 С1, 0,01 Mg и много меньшие количества Fe, Zn, Си, Со, Se, F, I. Избыток Н и О определяется большим содержа- нием воды. 24
Далее в этой главе дается краткая характеристика наиболее важных биологических молекул и биохимических процессов. Наша задача состоит не в дублировании курсов биохимии, но в суммировании основных сведений, необходимых для изложения биофизики. § 2.2. Аминокислоты Все белки построены из 20 типов аминокислотных остатков; ряд аминокислот, не фигурирующих в белках, участвует в мета- болизме. По-видимому, аминокислоты возникали на Земле на первом этапе химической эволюции около 4 • 10’ лет назад, в ре- зультате химических реакций в архаической восстановительной атмосфере и в океане при поглощении энергии (гл. 17). Про- стейшие аминокислоты встречаются и в метеоритах. В белках фигурируют остатки а-аминокислот, имеющих строение R NHa н/Чсоон где В — радикал, углеводородный или содержащий помимо С и И и другие атомы — О, S, N. Как показывает изучение электри- ческих свойств аминокислот (§ 2.3), их строение точнее выра- жается формулой биполярного иона R N+H3 С н соо~ Образование белковой или полипептидной цепи происходит пу- тем поликонденсации аминокислот: R. R НОН I | -н8о I II । И—С—N+H3+H—С—N+H3------►H3N+—С—С—N—С—СОО~ I I III' СОО~ СОО“ В, Н R 1 з причем образуются пептидные связи —NH—СО—. В табл. 2.1 дана сводка 20 канонических аминокислотных остатков —СО—CHR—NH—, которые классифицированы по электрохимическим свойствам. Среди них есть алифатические углеводородные остатки (Ала, Вал, Гли, Иле, Лей), остатки, со- держащие гидроксил (Сер, Тре), амидную группу (Асн, Глн), карбоксильную группу (Асп, Глу), содержащие серу (Цис, Мет), содержащие ароматические л-электронные циклы (Тир, Фен, 25
Таблица 2.1. Канонические аминокислотные остатки Mi Наименование ос- татка и аминокис- лоты Обозначение Краткое обозначе- ние Радикал—R 1. Нейтральные остатки 1 Глицил Глицин Гли (Gly) G —Н 2 Аланил Аланин Ала (Ala) А —сн3 3 Валил Валин Вал (Vai) V —CH(CHS)2 4 Лейцил Лейцин Лей (Leu) L —СН2—СН(СН3)3 5 Изолейцил Изолейцпн Иле (Не) I —СН(С2Н5)СН3 6 Феиилаланил Фенилаланин Фен (Phe) F —СН2—С6Н5 7>. Пролил Пролин *) Про (Pro) Р -CH-(CH2)3-N— 1 1 сн / ч 8 Триптофанил Триптофан Трп (Тгр) W —СН-С—С С1Г и i; 1. НС С СН ^NH^CH^ 9 Серил Серин Треонил Треоиин Сер (Ser) S —СН2ОН 10 Тре (Thr) т -СН(ОН)СН3 11 Метионил Метионин Мет (Met) м —СН2—СН2—S—сн3 12 Аспарагинил Аспарагин Асн (Asn) N —CH2—CO—nh2 13 Глутаминил Глутамин Глн (Gin) Q —CH2—CH2—СО—NHt 14 Цистеинил Цистеин 2. Кисло Цис—SH(Cys—SH) г н ы е остатки с (в в и д -CH2SH е анионов) 15 Аспартил Аспарагиновая кислота Асп (Asp) D -сн2—соо- 16 Глутамил Глутаминовая кислота Глу (Glu) Е - сн2-сн2-соо- 17 Тирозил Тирозин Тир (Туг) V -СН2-С6Н4-О' *) Пролин — не амино-, а иминокислота, содержащая вместо аминогруппы NHr миногруппу NH. **) Как правило, остатки цистеина в белке соединены дисульфидной сзязью с по- терей водорода —СН2—S—S—СН2—. При этом остаток называется цистинилом и обоз- начается (Cys), краткое обозначение также С. 26
Продолжение табл. 2Л № Наименование ос- татка и аминокис- лоты Обозначение Краткое обозначе- ние Радикал—R 3. Основные остатки (в виде катионов) 48 Гистидил Гистидин Гис (His) н —СН —С=СН +Z \ H.N N хснх 19 Лизил Лизин Лиз (Lys) к —(CH2)t—N*H, 20 Аргииил Аргинин Apr (Arg) R -(СН2)з- NH-с-N+H, NH Трп, Гис). Этим обеспечивается все многообразие свойств и строения белков. Помимо 20 канонических остатков, в белках встречаются про- изводные некоторых радикалов. Среди этих минорных остатков важен оксипролил —со-сн-сн2. I ) N-CH / СН-ОН, так как он содержится в значительном количестве в одном из универсальных белков животных — в коллагене. § 2.3. Электролиты Организмы содержат множество ионов — малые органические и неорганические катионы и анионы, основные и кислотные груп- пы аминокислотных остатков в белках и нуклеотидов в нуклеи- новых кислотах. Диссоциация электролитов на ионы определя- ется их водным окружением. Теория электролитов излагается в курсах физической химии; здесь мы ограничимся краткими све- дениями, необходимыми для дальнейшего. Согласно Бренстеду кислота есть молекула, от которой отщеп- ляется протон, основание — молекула, присоединяющая протон. Вода является кислотой в реакции Н2О =*= Н* 4-ОН~ и основа- нием в реакции Н2О 4- Н* =* Н,О* (ион оксония). Вода — очень слабый электролит, ее константа диссоциации мала. При 25°С в воде [Н+] [ОН-] = К [Н2О] = 10-“ моль7л< (2.1) Так йак [Н+] = [ОН-], концентрация водородных ионов в воде составляет 10-7 моль/л. Удобно пользоваться отрицательным де- сятичным логарифмом этой величины, обозначаемым pH. Для 27
воды, т. е. для нейтральной среды, pH = 7. Соответственно для кислот pH < 7, а для оснований pH > 7. Биологические электролиты обычно слабые, т. е. они мало диссоциированы. Рассмотрим диссоциацию некоторой кислоты НА =₽* Н+ + А-. Константа диссоциации, т. е. константа равнове- сия К, этой реакции равна К- — ЯнЯа/Яна, (2.2) где ян — яА и яИА — активности соответствующих веществ в ра- створе. Активность — эффективная концентрация в реальном раство- ре, в котором молекулы взаимодействуют. Активность пропорцио- нальна молярной концентрации: я = ус; 7 — коэффициент активности. В растворах, близких к идеальным, 7 » 1, а « с. Поэтому [Н+]2 = А[НА], (2.3> и, обозначив рК = —1g К, имеем ' pH = */2(рК. — 1g [НА]). (2.4) Степень ионизации слабой кислоты в воде есть „ - —[А~] ~ iHtl = (2 5Ъ [a-J + IHA] [НА] V (НА]' Степень диссоциации или сила кислоты растет с К, т. е. убывает с ростом рК, сила основания убывает с ростом К, т. е. растет с рК. Условие [А~] = [Н+] справедливо лишь для нейтрального раство- ра. Вообще говоря, pH = pK±lg-^- (2.6) "на или (в идеальном растворе) pH = pK±lgr^t. (2.7) Знак плюс отвечает кислоте, знак минус — основанию, для ко- торого а = что соответствует обратной основание. В неидеальном растворе ций. Имеем pH = pK + lg-^-±lg “ (2.9) Уна г—а [НА] [А-] + ]НА]’ реакции А- + Н+ =₽* НА, где А- — активности отличны от концентра- 28
Неидеальность раствора электролита определяется взаимодей- ствием ионов друг с другом и с молекулами растворителя. При достаточно высокой концентрации ионов каждый из них окру- жен ионной атмосферой — ионами противоположного знака. Теория Дебая — Хюккеля, исходящая из классической статистической механики и электростатики, позволяет определить свободную энергию взаи- модействия ионов в растворе. Рассматривается система, состоящая из цент- рального иона и окружающей его атмосферы противоионов.' Свободная энер- гия взаимодействия, приходящаяся на единицу объема раствора, G = —х3кТ/12л, (2.10) где к — постоянная Больцмана, Т — температура, ах — параметр Дебая — Хюккеля, называемый радиусом ионной атмосферы, но имеющий размер- ность, обратную длине. Параметр х выражается через заряды ионов е, и их. число в единице объема пг. где е — диэлектрическая проницаемость растворителя; суммирование про- изводится по всем сортам ионов i. Коэффициент активности данного сор- та ионов находится из изменения свободной энергии при удалении иона из растдора ^ = Ф = и^ = кГ1 дп 2е 2е 1. (2.12> где |е|—абсолютное значение заряда электрона, z< — валентность 'иона.. Имеем ‘ lnyj 2 9 1 е z?x 2 ъкТ |е|У (2л)1/2 (е«/)3/2 (2.13)- Здесь I — так называемая ионная сила раствора I = 1 (2.14). Размерность I обратна размерности объема. Ионная сила харак- теризует общее число, ионных зарядов в единице объема, неза- висимо от их знаков. Ионная сила и величины pH и рК — важ- нейшие характеристики ионного раствора. Таким образом, коэффициент активности ионов данного сорта зависит от концентрации ионов всех сортов. Теория Дебая — Хюккеля справедлива для сильных электро- литов. Аминокислоты — слабые электролиты. Однако при боль- ших ионных силах коэффициенты активности аминокислот от- личны от единицы. При малых ионных силах; Дл ~ у на ~ 1 к 1.(ср- (2.9)) pH « рК ± 1g г^. (2.15)> При титровании слабой кислоты сильным основанием, скажем, ХаОН,-идет реакция НА + Na+ + ОН" -* А" + Na+ + Н2О. 29
“Следовательно, [А-]«[Na+], Степень ионизации а равна отноше- нию концентраций сильного и слабого электролитов; = [А~1 ~ tNa+] [А“]+|HA]~ 1НА1 * Определение а, pH и, следовательно, рК производится путем титрования кислоты щелочью или основания кислотой. Для гру- бых определений применяются химические индикаторы, для точ- ных — потенциометрические методы, основанные на регистрации потенциала на электроде, опущенном в раствор. Потенциал ме- няется при титровании. Для определения pH пользуются стеклян- ным электродом. Этот электрод и электрод сравнения (обычно каломельный) помещаются в раствор с известной концентрацией исследуемого вещества. Разность потенциалов при надлежащей градуировке измеряется непосредственно в единицах pH. Таблица 2.2. Электрохимические константы аминокислот Аминокислот а РК1 РК, pKs pH4 Глицин 2,35 9,78 6,1 Аланин 2,34 •9,87 6,1 Валин 2,32 9,62 6,0 Лейцин 2,36 9,60 6,0 Серии 2,21 9,15 5,7 Пролин 1,99 10,60 6,3 Триптофан 2,38 9,39 5,9 Аспарагиновая кислота 2,09 3,87(СОО~) 9,82(NH+) 3,0 Глутаминовая кис- лота 2,19 4,28(СОО~ ) 9,66(NH+) 3,2 Тирозин 2,20 9,11(NH+) 10,1(0“) 5,7 Цистеин 1,96 8,18(NH+) 10,28(S~ ) 5,1 Аргинин 2,02 9,04(NH+) 12,48(гуанидпн) 10,8 Лизин 2,18 8,95(NH+) i0,53(NH+) 9,7 Гистядин 1,77 6,10(имидазол) 9,18(NH+) 7,6 Аминокислоты — амфотерные электролиты, характеризуемые двумя значениями рК, отвечающими титрованию кислотных групп СОО~ щелочью (рК,) и титрованию основных групп N+H3 кислотой (рК3). В табл. 2.2 приведены некоторые значения рК,, рКг, рК, (для аминокислот с ионогенными радикалами), а также рН(, отвечающие изоэлектрической точке. Если амино- кислота заряжена положительно, она движется к катоду, если отрицательно — к аноду. В изоэлектрической точке молекула амфотерного электролита нейтральна и не участвует в электро- 30
проводности. Имеем для нейтральных аминокислот pHi = ‘/2(pK1 + pK2). (2.17)' Изучение электрохимических свойств аминокислот доказывает их диполярное строение (с. 25). Теплоты реакций ионизации органических кислот RCOOH ** RCOO- + Не- малы, они имеют порядок величины 4 кДж/моль. Для реакций диссоциации замещенных ионов аммония RN+H3 ** RNH2 + Н+ теплоты велики — порядка 50 кДж/моль. Аминокислоты в кис- лом растворе характеризуются теплотами ионизации от 5,5 до 8,8 кДж/моль, в щелочном — от 42 до 55 кДж/моль. Следова- тельно, идут реакции H3N+ - CHR - COO- + Н+ H3N+ - CHR - СООН, H3N+ - CHR - COO- + ОН- H2N - CHR - СОСГ + Н2О. Другими доказательствами диполярного строения аминокислот являются сильное повышение е при их растворении в воде, боль- шие плотности и высокие температуры плавления твердых ами- нокислот, что определяется сильным электростатическим взаимо- действием. При работе с биологическими веществами следует поддержи- вать постоянные значения pH. Стабилизация pH достигается с помощью буферных растворов. В присутствии нейтральных солей диссоциация слабых кислот и оснований не зависит от разбав- ления. Рассмотрим раствор слабой кислоты НА и ее натриевой соли NaA. Константа равновесия реакции ЧА^Н+ + А- равна к [н+1 [А-1 /о К = ГНА] • <218> и, так как [А-] = [Н+], [Н+] = ГА [НА]. (2.19) В присутствии соли NaA, диссоциированной гораздо сильнее кислоты, [А-] ~ [NaA], Следовательно, к °Хд| <2-°> 111'1 = К W [Н+] и, значит, pH зависят от отношения концентраций кислоты и соли, но не от степени разведения. Так, в растворе 0,1 N ук- 31
сусной кислоты и О,IN уксуснокислого натрия в воде pH = 4,628. При десятикратном разведении раствора pH = 4,670, при сто- кратном pH = 4,73. При добавлении к 1 л воды 1 см’ 0,01 N НС1 pH уменьшается с 7 до 5. При добавлении того же количества НС1 к указанному раствору pH убывает с 4,628 до 4,540. Наряду « ацетатными, применяются фосфатные и другие буферы. §' 2.4. Состав и первичная структура белков Рис. 2.1. Пептидная связь Макромолекулы белков состоят из одной или нескольких по- липептидных цепей, построенных из аминокислотных остатков. На одном', N-конце цепи находится NHi-группа, на другом, С-конце — группа СООН. Характерные молекулярные массы (м. м.) отдельных полипёп- тидных цепей в белках по- рядка 20000, что соответст- вует 150—180 остаткам (сред- няя м. м. аминокислотного остатка равна 120). Молеку- лы, содержащие менее 100 остатков, принято называть не белками,а полипептидами. Таковы некоторые гормоны. Пептидная связь —СО— —NH —, соединяющая амино- кислотные остатки в белкдх, имеет специфическое плоское строение, как зто было,уста- новлено методом рентгено- структурного анализа (По- связи лежат в одной пло- линг и Кори). Все четыре атома скости (рис. 2.1). Связь N—С укорочена по сравнению с таковой в алифатических аминах R—NH2, где ее длина равна 0,147 нм. Это укорочение, равно как и плоское расположение связей, сви- детельствует о сопряжении связей N—С и С=О, о перекрывании их электронных оболочек, сопровождаемом сдвигом электронной плотности от N к С. Это можно изобразить вкладом структуры О“ I н т. е. связь N—С частично двойная, связь С=О частично еди- ничная. Аминокислотный состав белка устанавливаете? в настоящее время автоматическими приборами. Белок расщепляется на ами- нокислоты в результате гидролиза — реакции, обратной цоликон- 32
денсации: -CHR,-NH-CO-CHR2- + H2O - -CHR.-NH, + + HOOC-CHR2— Гидролиз происходит при действии на белок щелочей, кислот, а также протеолитических ферментов (протеаз), катализирую- щих разрыв пептидных связей. Получаемый гидролизат—раствор смеси аминокислот — анализируется методами хроматографии и электрофореза. Укажем, что протеолитический гидролиз про- исходит при пищеварении — белки пищи расщепляются в пи- щеварительном тракте на аминокислоты, из которых строятся заново белки, необходимые организму. Состав белков неравномерен — различные аминокислотные ос- татки представлены в белках с разными частотами. Имеются редкие и частые остатки, подобно тому как в русском тексте имеются редкие (например, ф) и частые (например, а) буквы. К наиболее редким остаткам относятся Трп, Мет, Цис, к наибо- лее частым — Ала, Сер, Гли. Это справедливо в среднем — неко- торые специализированные белки имеют специфический состав, отличный от среднего (например, коллаген, см. § 4.9). Последовательность аминокислотных остатков в белковой цепи называется ее первичной структурой. Определение первичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с по- мощью протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь между определенными остатками. Так, трипсин «режет» лишь связи, образованные СО-группами остатков основных ами- нокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь пепти- дов — коротких фрагментов белковой цепи. Их идентификация производится посредством химических и физико-химических ме- тодов (хроматография, электрофорез). Воздействуя вторым фер- ментом, можно «разрезать» другие связи в белке и получить смесь других фрагментов (пептидов) и т. д. Широко применяемый для изучения биополимеров метод гелъ-электрофореза основан на различной подвижности макро- молекул и их фрагментов в электрическом поле. Для разделения и исследования белков гель-электрофорез производится с доде- цилсульфатом натрия (ДСН), который связывается с молекулой белка, вызывая ее денатурацию. Подвижность молекулы в геле, на который наложено электрическое поле, зависит не только от заряда, но и от размеров молекулы (диффузионный эффект). Зная строение пептидов, полученных при гидролизе различ- ными ферментами, можно установить первичную структуру бел- ка, решая задачи типа кроссвордов. В настоящее время установ- лены первичные структуры тысяч белков. Их сводки системати- чески публикуются в атласе белковых структур. На рис. 2.2 и 2.3 изображены первичные структуры рибонуклеазы быка и миогло- бина кашалота. В первом случае имеются четыре дисульфидные связи, соединяющие друг с другом остатки Цис. 3 м в. Волькенштейн 33
Рис. 2.2. Первичная структура рибонуклеазы быка 1 Ю Вал—Лей—Сер — Глу-Гли —Глу — Три-Глн—Лей-Вал— Лей — Гис-Вал — Три—Ала за 20 | Иле-Лей-Иле—Асп—Глн—Гли—Гис—Глц-Ала-Вал—Асн-Ала-Глу-Вал —Лиз I 40 . Аре—Лей—Фен—Лиз-Сер —Гис—Про—Глу—Тре—Лей—Глу—Лиз-Фен—Асп—Аре 60 50 | Асп—Глу— Сер —Ала-Лиз—Мет—Глу—Ала—Тлу —Тре—Лиз—Лей—Гис—Лиз—Фен I то Лей—Лиз — Лиз—Гис— Гли - Вал—Тре —Вал—Лей—Тре - Ала —Лей - Гли -^ла - Иле . 90 80 I Ала—Лей—Про—Лиз—Лей—Глу—Ала—Глу—Гис—Гис —Гли—Лиз—Лиз—Лиз—Лей I wo Глн—Сер —Гис—Ала—Тре—Лиз-Гис—Лиз—Иле—Про—Иле—Лиз—Тир-Лей—Глу 120 . 110 I Про—Гис—Аре—Сер —Гис—Лей—Вал—Гис—Иле —Иле—Ала —Глу—Сер—Иле—Фен I 130 Гли—Асн —Фен—Гли—Ала—Асп—Ала—Глн—Гли—Ала—Мет—Асн—Лиз—Ала—Лей 150 .140 I Гли—Лей—Глу—Лиз—Тир—Лиз—Ала—Ала—Иле—Асп—Лиз—Арз—Фен—Лей —Глу I 153 Тир-Глн-Гли Рис. 2.3. Первичная структура миоглобина кашалота 34
Первичная структура белка — своего рода текст, написанный двадцатибуквенным алфавитом. Смысл, содержание этого текста, состоит в биологическом функционировании белка, которое, в ко- нечном счете, определяется первичной структурой. В белковых текстах запечатлена биологическая эволюция — сопоставление го- мологичных белков, выполняющих одну и ту же функцию в раз- ных видах, позволяет выявить различия в текстах. Эти различия, Рис. 2.4. Эволюционное древо, построенное на основе аминокислотного со- става цитохрома с определяемые мутационными замещениями аминокислотных ос- татков, тем больше, чем дальше отстоят друг от друга биологи- ческие виды. Особенно подробно изучен в этом отношении цито- хром с — универсальный для всех организмов белок дыхательной цепи. Сопоставление первичных структур цитохромов с различ- ных видов позволяет построить эволюционное древо. Оно пока- зано на рис. 2.4. Изучены также гемоглобины и другие белки разных видов. Первичная структура белка данного вида может изменяться также в результате мутаций. Возникают «опечатки» в белковом тексте, зачастую отрицательно сказывающиеся на функции бел- 3* 35
ка. Ряд наследственных заболеваний крови связан с мутациями гемоглобина. Тяжелое заболевание — серповидноклеточная ане-' мия—вызывается замещением остатка Глу на Вал в шестом' месте (J-цепей гемоглобина. Гемоглобин человека состоит из че- тырех цепей — двух цепей а, содержащих по 141 остатку, и двух цепей р, содержащих по 146 остатков. Таким образом, замена всего лишь двух остатков из 574 приводит к весьма серьезным последствиям. В этом случае неполярные нейтральные остатки ваменяются кислотными. Сейчас известно несколько сот мутант- ных гемоглобинов человека. Далеко не все замены аминокислотных остатков приводят к ааметным изменениям строения и биологических свойств белков. Большая часть замен нейтральна и не подвержена давлению естественного отбора (см. § 17.7). § 2.5. Нуклеиновые кислоты Второй важнейший вид биополимеров — нуклеиновые кисло- ты — макромолекулы, ответственные за биосинтез белков, за сбор- ку их первичных структур. Основная цепь нуклеиновой кислоты состоит из чередующих- ся ввеньев фосфорной кислоты и сахара — углевода рибозы в ри- бонуклеиновой кислоте (РНК) и дезоксирибозы в дезоксирибо- нуклеиновой кислоте (ДНК). К каждому углеводному звену при- соединено одно из четырех азотистых оснований. ДНК и РНК — тексты, написанные четырехбуквенным алфавитом. Общая схема цепи имеет вид (Ф — фосфат) Аз. осн. Аз. осн. Аз. осн. —Углевод—Ф—Углевод—Ф—Углевод— Структурные формулы рибозы и дезоксирибозы: он он Л-2- дезоксирибоза
Они различаются лишь заменой ОН-группы на Н у второго ато- ма С. Звездочками обозначены асимметричные атомы С (см. § 2.7). Азотистые основания являются производными пиримидина и пурина, азотсодержащих гетероциклических соединений: СН >СН i ii нс? з ш РГ Пурин Пиримидин В нуклеиновых кислотах фигурируют пиримидины, цитозин (Ц) и тимин (Т) в ДНК и Ц и урацил (У) в РНК, и пурины, аде- нин (А) и гуанин (Г) в ДНЦ и РНК: nh2 I II. С сн ЦИТОЗИН он I /с\ N С-СН, I I! 3 С СН ho/NsZ Тимин ОН / 'сн I II с сн HO/'4'N'/ Урацил nh2 I ^N/4NH Аденйи Гуанин Кроме этих канонических оснований, в ДНК и различных типах РНК встречаются в гораздо меньших количествах производные, минорные оснований — 5-метилцитоэин, 5-оксиметиЛцитозин, ги- поксантин (гуанин без NH2-rpynnbi, обозначается И) и ксантин (гуанин с группой NH2, замещенной на ОН). Пиримидины и пурины обладают основными свойствами — их атомы азота могут присоединять протоны, приобретая положи- тельный заряд. Всем приведённым азотистым основаниям свойственна тауто- мерия — они могут фигурировать в нескольких формах, тауто- мерах, возникающих в результате перехода атомов водорода гид- роксильной группы ОН к атомам азота. Таутомеры урацила: ОН О ОН I II I ZG\- Zx N СН HN CH N CH I II 5ft I II 4* I II C CH C CH C CH HO^n/ O^NHZ O^NH/ 37
Динамическое равновесие таутомеров, зависящее от темпера- туры, в обычных условиях сдвинуто к кето-форме^ По-видимому, азотистые основания возникли на ранних эта- пах добиологической эволюции, причем исходным веществом могла быть синильная кислота HCN. Возможная схема первич- ного синтеза аденина: NH II + HCN CH + HCN HCN ------ | ----« CsN HZN HzN CsN CH +HCH \ I —*"- II —" C=N C HZH \ = H H2H C C + Ю , , — II ----Аденин (HCH)j N = C XNHZ Метаболическое происхождение пуринов в современных организ- мах изображено па схеме Форм.— муравьиная кислота НСООН. Первичное происхождение рибозы связано с формальдегидом Н2СО. Соединения азотистых оснований с рибозой и дезоксирибозой называются нуклеозидами — соответственно рибо- и дезоксири- бонуклеозидами. Нуклеозиды носят названия цитидипа, тими- дина, уридина, аденозина и гуанозина. Способ соединения азоти- стого основания с углеводом показан на рис. 2.5. ^Фосфорилиро- ванные в положениях 5' и 3' углевода нуклеозиды называются соответственно нуклеозид-5' (или 5')-фосфатами или нуклео- тидами. Образование нуклеиновой кислоты происходит путем поли- конденсации пуклеозидтрифосфатов ЦТФ и т. д. При включении в цепь каждого нуклеотида образуется фосфатная межнуклеотид- ная связь и выделяется молекула дифосфата — пирофосфорная кислота ЦТФ + ГТФ ЦМФ - ГМФ + НД’гО, ЗВ
(ТФ — здесь трифосфат, МФ — монофосфат). На рис. -2.5 иска- но строение цепи ДНК. Цепь РНК построена сходным образом, с тем отличием, что в ней вместо Т фигурирует У и атом Н у С-2'-рибозы заменен на ОН. Рис. 2.5. Цепь ДНК • Нуклеотидный состав ДНК подчиняется правилу Чаргаффа -г- содержание А равно содержанию Т, а содержание Ц — содер- жанию Г: А + Г Т+Ц Тем самым, количество пуринов в ДНК равно количеству пири- мидинов. Вместе с тем Т+Г . Ц|-А~ 39
т. е. количество 6—NH2-rpynn в основаниях ДНК равно количе- ству 6—С=О-групп. Однако отношение Г + Ц ~ ~ Ц А 4- Т А Т отлично от единицы. Оно варьирует в широких пределах у бак- терий (от 0,45 до 2,8) и составляет примерно 0,45 у высших жи- вотных и растений. Видовая специфичность нуклеотидного соста- ва ДНК была детально изучена Белозерским и его школой. Спе- цифичность выражается не только относительным содержанием Г + Ц, но и содержанием минорных оснований. РНК не следует правилу Чаргаффа. Отношение (Г + Ц) к (А + У) меняется в широких пределах у любых организмов. ДНК—вещество генов — содержится в хромосомах и мито- хондриях клеток, а также в бактериофагах. Молекулярные мас- сы ДНК достигают 109 — это самые большие из известных моле- кул. РНК фигурирует в различных формах, как в ядре, так и в цитоплазме клеток, а также в; вирусах и фагах. Существуют че- тыре типа РНК: высокомолекулярные РНК, а именно рибосом- ные, рРНК с м.1д. порядка 10“ и матричные, или информацион- ные, мРНК с м.м. от 30 000 и выше. Так как средняя м. м. рибо- нуклеотида равна 224, самые короткие цепи мРНК содержат примерно 150 нуклеотидов. Третий тип — транспортные тРНК с м.м. порядка 20000, содержащие около 80 нуклеотидов. Чет- вертый тип — высокомолекулярные вирусные РНК. Разработаны прекрасные ’ методы определения первичной структуры, т. е. последовательности нуклеотидов в ДНК и РНК. Эти методы охарактеризованы в § 7.8. С их помощью «прочи- таны тексты» многих генов, а также транспортных и других ви- дов РНК. Установление первичной структуры нуклеиновой кис- лоты является сейчас более простой задачей, чем установление последовательности аминокислотных остатков в белке. Ряд генов уже синтезирован—: впервые такой синтез провел Корана в 1970 г. § 2.6. Аденилаты Мономерные фосфорилированные, нуклеозиды играют важней- шую роль в метаболизме и биоэнергетике, в регуляции жизне- деятельности на молекулярном уровне. Это яркое свидетельство химического единства живой природы (с. 24), разнообразного использований кйетками одних и тех же веществ. Среди нуклео- зидов особенно существен аденозин. На рис. 2.6 изображена структура аденозин-5'-моно-, ди-: и трифосфата (АМФ, АДФ, АТФ). АТФ является главным аккумулятором химической энер- гии в клетке. Эта энергия выделяется при гидролитическом от- щеплении Y-фосфата в реакции АТФ -* АДФ + Фн (Фя — фос- форная кислота Н3РО4). Энергия АТФ расходуется на все нужды клетки: для биосинтеза белка, для активного транспорта веществ через мембраны, для производства механической и электриче- 40
ской работы и т. д. Выделяемая АТФ при отщеплении фосфата свободная энергия Д<?° = 30,7 кДж/моль. Реже используется сво- бодная энергия других нуклеозидтрифосфатов, прежде всего ГТФ. Конечно, во всех реакциях, использующих энергию АТФ, I I ОН он АМФ АДф' АТФ Рис. 2.6. Аденозинмоно-, ди- и трифосфат действует ферменты, АТФ-азы, в ряде случаев регулируемые ма- лыми ибнами. «Зарядка аккумулятора», т. е. обратная реакция АДФ + Фн АТФ, происходит в процессах гликолиза, при фото- синтезе и при дыхании (окислительное фосфорилирование)'. он он О = Р*ОН \ , I о I сн, О=р-он /• \^соннг+н+х= П1> L II II НС сн N Нинотинамад О — СНг АВенин н ’ / V^CONHj+ZH НЬ L I « НС СН %;,/ о -снг НАД. Н НАД Рис. 2.7. Никотинамидадениндинуклеотид Во всех этих процессах происходит окисление и восстановление важных, коферментов НАД и НАДФ (никотинамидадениндину- клеотйд и НАД-фосфат). НАД и НАДФ опять-таки являются аденилатами, производными аденйна. На рис. 2.7 показаны вза- имопревращения НАД и НАД.Н — реакция НАД.Н 4-Н+** 2Н+, 41
+ НАД (стрелкой указана гидроксильная группа, этерифициро- ванная фосфатом в НАДФ и НАДФ.Н). Метаболизм многих соединений требует их превращения в ак-, тивированные производные кофермента А (КоА), из которых важнейшее — ацетилкофермент А (ацетил-КоА), показанный на рис. 2.8. Ацетил-КоА служит для переноса ацетильных групп, подобно тому как АТФ — для переноса фосфатных групп. КоА близок по строению к АТФ. Тиоэфирная связь —СН2—S—СО— так же, как и крайние фосфатные связи в АТФ и АДФ, явля- ется энергетической — экзергонической, т. е. такой связью, при расщеплении которой выделяется' свободная энергия. Величина AG° для гидролиза ацетил-КоА (аце- тил-КоА + НгО уксусная кисло- та 4- KoASH) составляет —31,5 кДж/моль. Особенно важную регулятор- ную роль играет еще один адени- лат — циклический аденозинмоио- о сн3 , о о VcH-C-GHj-S-P-O-P-O-CHj Аденин UN OHCNj. ОН. ОН СН, < Л; . NLV1 j;-nh~ch2-ch2-?h н н ° О=Р-ОН он Рис. 2.9.‘., Цикличе- ский аденозинмоно- фосфат Рис. 2.8. Ацетилкофер- мент А фосфат (цАМФ), который регулирует; ферментативные реакции в клетках, запасающих сахара и жиры. С, другой стороны, цАМФ регулирует транскрипцию генов (т. е. биосинтез белка) и служит универсальным посредников при действии ряда гор- монов, в частности, адреналина (рис. 2.9). Этот аденилат присутствует в клетках в количествах, на три порядка меньших, чем АТФ; цАМФ возникает из АТФ и в свою очередь превра- щается в инертный нециклический АМФ. Эти малые количества цАМФ все же на два-три порядка больше количества гормона и обеспечивают более чем стократное усиление внешнего гормо- нального сигнала, воздействующего на клетку. § 2.7. Хиральность биологических, молекул Подавляющее большинство сколько-нибудь сложных молекул, содержащих более чем три атома, не имеет, плоскости и центра симметрии. Такие молекулы дисимметричцы, хирадьны. Термин *2
Мая Правая Рис. 2.10. Правая и левая руки ность свойственна 19 каноническим глицина H3N+ • СН2 • СОО~). На рис. 2.11 показаны правая (D) и левая (L) конфигурации ала- нина (зеркальные антиподы или энантиомеры). В химическом синтезе из ис- ходных симметричных молекул вещество всегда получается в ви- де рацемической смеси, содер- жащей по 50% правого и левого «хиральность» (от древнегреческого хейр — рука, ср. хирургия, хиромантия) означает несовпадение некоторой структуры с ее зеркальным отражением. Хиральные вещества могут фигуриро- вать в двух формах — правой и левой. Эти две конфигурации нельзя совместить друг с другом никаким поворотом системы как целого в пространстве, они отно- сятся друг к другу, как правая и левая руки (рис. 2.10). В мире молекул чаще всего прихо- дится встречаться с хиральностью, оп- ределяемой так называемым асимметри- ческим атомом углерода (обычно отме- чаемым звездочкой, см. с. 36). В насы- щенных (алифатических) органических соединениях четыре валентных связи углерода расположены под тетраэдри- ческими углами друг к другу. Если две валентности из четырех связывают одинаковые группы, как, например, в молекуле CX2YZ, то плос- кость CYZ является плоскостью симметрии и хиральность отсут- ствует. Атом углерода асимметричен, если все четыре группы, с которыми оп связан, различаются — C*XYZV. Такая молекула не имеет пи плоскости, ни центра симметрии. Тем самым хираль- аминокислотам (всем, кроме "00С соо~ L 1» С + + с* W ^NH3 HjN'V СН3 л L Рис. 2.11. Правая и левая конфи- гурации аланина антипода. Это следует из второго начала термодинамики — раце- мат отвечает максимальной энтропии смешения. Удивительным свойством живой природы является фиксация в организмах всех важнейших биологических молекул, начиная с аминокислот, в одной определенной конфигурации. Аминокис- лотные остатки в белках всегда являются «левыми», Z-формами (рис. 2.11). Правые и левые формы одинаково реагируют с симметрич- ными молекулами. Они различаются своим взаимодействием с поляризованным светом. Хиральные вещества в отличие от их рацемических смесей вращают плоскость поляризации света в разные стороны и по-разному поглощают свет, поляризованный по кругу вправо и влево (см. гл. 6). Биологические А-аминокис- лоты названы так не потому, что они вращают плоскость поля- ризации света влево, а D-аминокислоты — вправо. Среди Z-ами- 43
нокислот есть как лево-, так и правовращающие. Исходным для L-ряда органических соединений служит левовращающий глице- риновый альдегид ОСН—С*Н(ОН)—СН2ОН. Все L-соединения можно в принципе получить из него путем замещения соответ- ствующих атомов и групп, присоединенных к С*, без изменения общей конфигурации молекулы. Хиральность свойственна и белкам, и углеводам, и нуклеино- вым кислотам, и ряду низкомолекулярных соединений в клетке. Углеводы в ДНК и РНК всегда фигурируют в D-форме. Азоти- стые основания имеют плоское строение и, следовательно, лише- ны хиральности. В процессах метаболизма, происходящих без рацемизации, т. е. без превращений зеркальных антиподов друг в друга, клетка усваивает лишь те из них, которым отвечают структуры ее биологических молекул. Организм усваивает L-, но не D-аминокислоты. Попав в «антимир», в котором растения и животные содержат молекулы с противоположными конфи- гурациями, земной организм погиб бы от голода. Для организ- ма D- и L-антиподы разнятся. Известны вещества, ядовитые в одной форме и безвредные в зеркальной форме; //-аспараги- новая кислота безвкусна, ее антипод сладок. Еще Пастер уста- новил, что некоторые бактерии питаются преимущественно одним антиподом .данного вещества. Выделение чистых антиподов in vitro из рацемических смесей (асимметрический синтез) осуществляется с помощью хираль- ных веществ биологического происхождения (обычно алкалои- дов). Действуя на рацемическую смесь (D, L) соединением L', получаем (D, L)+ L' -> DL’ + LL'. Соединения DL' и LL' уже не являются зеркальными антиподами (ими были бы DL' и LD'). Поэтому физико-химические свойства DL' и LL' различаются, и можно разделить эти соединения, например, кристаллизацией. Для разделения антиподов необходимо асимметрическое воз- действие вещества или существа, знающего разницу между пра- вым и левым. Зеркальные антиподы были открыты Пастером в 1848 г. Он изучал винную кислоту и установил, что у нее имеют- ся правые и левые формы кристаллов. Сортируя их, Пастер полу- чил чистые антиподы винной кислоты. Он играл роль асимметри- ческого фактора — человек сам «хирален» и знает разницу между правым и левым. Хиральность существует в живой природе как на молекулярном, так и на более высоких уровнях организаций. Она определяется в конечном счете «хиральной» регуляцией фер- ментативных процессов. На рис. 2.12 показаны две формы рако- вины корненожки Neogloboquadrina pachyderma. Ракушки, за- крученные по часовой стрелке, образуются при температуре, меньшей 7°С, закрученные против часовой стрелки — при более высоких температурах. В природе хиральность может быть молекулярной или кри- сталлической. В первом случае она сохраняется.при плавлении или растворении вещества (например, сахар), во втором — она свойственна лишь,.кристаллическому, состоянию. Кварц построен 44
Т<7°С ТъТЪ Рис. 2.12. Две формы раковины корненожки Neogloboquadrina pachyderma из симметричных молекул SiO2, но кристаллизуется в правой или левой формах, обладающих противоположной оптической ак- тивностью. При плавлении кварца оптическая активность исче- зает. В любом месторождении число правых и левых кристаллов в среднем одинаково. Соответственно можно выделить чистый антипод кристаллизацией, поме- стив в рацемическую смесь нера- цемическую правую или левую за- травку. Возникновение и фиксация хиральности в живой природе представляют исключительный интерес. Попытки объяснить эти факты малой круговой поляриза- цией света, рассеянного земной атмосферой, или радиоактивным облучением (в связи с несохра- нением четности в ядерных процессах) не увенчались успе- хом. Следует рассматривать эти явления в свете общей теории добиологической эволюции, моделирующей возникновение поряд- ка из беспорядка, возникновением информации (гл. 17). Выбор антипода означает создание информации, равной 1 бит на мо- лекулу мономера. Есть веские основания считать, что первона- чальное возникновение хиральности было результатом флуктуа- ции. Флуктуационное отклонение от равномерного рацемического распределения может неограниченно нарастать, если система является автокаталитической, т. е. самовоспроизводящейся. Ил- люстрируем это модельным расчетом. Пусть х, и х2 — числа мо- лекул полимера (типа РНК), построенного соответственно из D- и L-мономеров, количества которых мы обозначим через znt и т2. Полимеры строят свои копии из мономеров — имеется мат- ричная авторепродукция. Кроме того, полимеры способны распа- даться. Кинетические уравнения, описывающие развитие систе- мы, имеют вид Xi = axiWi — bxi, x2 — ax2w2 — bx2, (2.22) где а и b — константы скоростей полимеризации и распада, u>i = mJ {mi + тп2), и>2 — mjfjrii + тг) (2.23) — вероятности встречи матриц 1 и 2 с мономерами mi и т2 со- ответственно. В стационарном состоянии х, = х2 — 0, откуда u>i — — w2 = Ыа и, значит, mi — т2, т. е. ivt = w2 = 0,5, a— 2b и си- стема рацемична. Нетривиальное развитие системы возможно при неравенстве т2 в результате флуктуации. Допустим, что ^ = 0,5 + a, zp2 = 0,5 —а, причем-а >0. Тогда решение системы (2.22) имеет вид Xi = х1(0)ехр[(а/2— б)£]ехр(аа£), т2 = х2 (О)ехр [(а/2 — b)t] ехр (—aat). (2.24) (2.25) 45
С течением времени популяция станет доминирующей: х х (0) ^ = ^0)exP(2aai)- (2.26) Более подробный анализ проблемы требует привлечения со- временной теории нелинейных систем (см. гл. 16). Последующая биологическая эволюция означает дальнейшее закрепление хи- ральности, так как хиральные системы имеют преимущества пе- ред рацемическими — они более специфично взаимодействуют с окружающей средой, отличая правое от левого. § 2.8. Углеводы и липиды Третий вид биополимеров — углеводы, или полисахариды, по- строенные из моносахаридных звеньев, имеющих в свободном состоянии брутто-формулу СвН12Ов. Моносахариды играют важ- нейшую роль в метаболизме растений и животных, в частности, глюкоза .ft-D-глюкоза а-D-глюкоза Каждый из пяти атомов углерода в кольце асимметричен. В клет- ках фигурируют и дисахариды СиЩгОн. Приведем в качестве примера структурную формулу сахарозы (свекловичный и трост- никовый сахар): Важнейшие полисахариды—крахмал (две формы: амилоза и амилопектин) и целлюлоза в растениях, хитин у членистоногих, гликоген в организмах животных. Целлюлоза и хитин служат веществами, образующими скелет, опорные, защитные структуры. Крахмал и гликоген являются веществами, в которых запасается углерод и химическая энергия. На рис. 2.13 изображено звено амилозы. Цепи амилопектина, в отличие от амилозы, разветвле- ны, равно как и цепи гликогена. Полисахариды не являются 46
информационными текстами, их структура монотонна. Размеры и разветвленность этих макромолекул варьируют в широких пре- делах. М. м. амилозы из картофельного крахмала около 104 (200 глюкозных звеньев), амилопектина из рисового крахмалу около 5 105 при 80—90 разветвлениях. М. м. гликогена из мышц Рис. 2.13. Схема строения амилозы 10е, из печени — 5 • 10е. Целлюлоза хлопка имеет м. м. поряд- ка 5 • 105. Полисахариды играют важную роль в наружных мембранах некоторых клеток, фигурируют в клеточных оболочках многих видов бактерий. В мембранах полисахариды находятся в комп- лексах с белками и липидами. Важнейшая роль жировых веществ — липидов состоит в их обязательном участии в построении и функционировании биоло- гических мембран. Природные жиры, относящиеся к липидам, Рис. 2.14. Схема строения липида (сфингомиелина) представляют собой триглицериды жирных кислот, т. е. их гли- цериновые эфиры, папример триглицерид стеариновой кислоты Н3С(СН2)1вСООН: СН2—О—СО—(СН2)16СН3 I СН—О—СО—(СН2)1в сн3 I СН2-О-СО-(СН2)1в сн3 47
Мы видим, что эти соединения содержат длинные «хвосты» из неполярных углеводородных остатков и сильно полярные «голо- вы» с группами —О—СО—. Функциональные липиды клеточных мембран представляют собой более сложные соединения, в состав которых могут входить и углеводные, и аминные, и алкиламин- ные группы. Ряд важных соединений относится к фосфолипидам. На рис. 2.14 изображена схема строения фосфолипида сфинго- миелина. Мембранные липиды и фосфолипиды, как правило, по- строены из сильно полярной «головы» и двух длинных неполяр- ных углеводородных «хвостов». Для их функции существенно присутствие в «хвостах» ненасыщенных двойных С=С-связей. Такие связи отсутствуют в животных жирах, но наличествуют в растительных. Функционирование липидов в мембранах описа- но в гл. 10. § 2.9. Кофакторы, витамины, гормоны Метаболизм в целом, равно как и специальные свойства био- полимеров в клетках регулируются специфическими малыми мо- лекулами, относящимися к нескольким группам органических соединений. В § 2.5 уже говорилось об аденилатах. Большая часть ферментов функционирует в комплексах с низ- комолекулярными кофакторами, коферментами. Такой фермент в целом называется холоферментом, его белковая часть — апо- ферментом. Кофакторы разнообразны. К алифатическому ряду относятся дифосфаты углеводов и их аминопроизводных, участву- ющие в реакциях переноса фосфатных групп. Среди алифатиче- ских кофакторов отметим содержащие серу липоевую кислоту и глутатион. Необходимым участником ряда окислительно-восстанов-итель- ных процессов является аскорбиновая кислота, или витамин С: СН2ОН I НОСЫ о ХС=О I I он он Витамины необходимы именно потому, что они служат кофакто- рами или преобразуются в них. Т&к как роль кофакторов ката- литическая, они нужны организму в малых количествах. В то время как основные цепи белков и нуклеиновых кислот, не говоря уже о полисахаридах, не являются цепями сопряжен- ных л-связей, большинство важнейших коферментов — л-элект- ронные сопряженные системы, содержащие ароматические цик- лы или гетероциклы. Таковы, как мы уже видели, аденилаты. Во флавиновых коферментах — во флавинмононуклеотиде ФМН и флавинадениндинуклеотиде ФАД фигурирует сопряженный 48
трехкольцевой гетероцикл — рибофлавин (витамин В2). Эти ко- ферменты окрашены в желто-оранжевый цвет, так как рибофла- вин поглощает свет в видимой области спектра. Аденин входит и в состав кобамидных коферментов, связанных с кобаламином или В12. Пиридоксальфосфат (ПАЛФ) — производное пиридина — является коферментом трансаминаз, катализирующих превраще- ния аминокислот: л-электронная система фигурирует и в тиаминфосфате / X / \ HG G || Н,С N NH* V ХЗЩСНзОРОРОН S II II О о Тиамин есть витамин Bt. Длинная линейная сопряженная система л-связей содержится в красящем веществе моркови — в ^-каротине, являющемся про- витамином А. Его модификация — ретиналъ — непосредственно участвует в первичном акте зрительного восприятия (гл. 14). Важнейшее значение для ряда жизненных процессов, начи- ная с фотосинтеза, имеют л-электронные сопряженные системы порфириновых соединений — производные порфина Н Н Н Порфириновое кольцо рольных гетероциклов. построено из четырех пятичленных пир- Как и другие сопряженные системы, пор- 4 м. в. Волькенштейн 49
фириновое кольцо — плоское. В центре кольца может распола- гаться координационно связанный атом металла. В упомянутых кобамидных ферментах фигурирует порфирин с атомом Со в центре. Хлорофиллы, ответственные за первичные акты погло- щения света при фотосинтезе, содержат порфирин с центральным атомом Mg (см. § 14.1). Простетическая группа гема — порфи- Рис. 2.15. Гем (протогем IX) рина с центральным атомом Fe — содержится в белках, участвующих в процессах дыхания — в цитохромах (см. § 13.6), в миоглобине и ге- моглобине (§ 6.7), в легге- моглобине — белке клубень- ковых бактерий, участвую- щем в фиксации атмосферно- го азота, в ряде окислитель- но-восстановительных фер- ментов. В крови оболочников (асцидий) содержится поло- винка порфирина — дипир- рольный комплекс ванадия. На рис. 2.15 показана структура гема простетиче- ской группы миоглобина и гемоглобина. Роль металлов, в частности комплексообразующих переход- ных металлов, очень велика в биологии. Около трети всех фер- ментов, известных науке, содержит ионы металлов в качестве кофакторов. Относящиеся сюда факты и проблемы, представля- ющие собой предмет бионеорганической химии, рассмотрены в § 6.9. В сложных многоклеточных организмах роль сигнальных, ре- гуляторных веществ играют гормоны. В организмах животных имеются две большие группы гормонов — белки, полипептиды и их производные и стероиды. К первой группе относится тирео- глобулин — белок щитовидной железы, содержащий иодирован- ный тироксин, инсулин, регулирующий уровень сахара в крови, окситоцин, вызывающий сокращение матки, вазопрессин, регули- рующий кровяное давление, и т. д. Гормоны синтезируются в железах внутренней секреции и осуществляют регуляцию на уровне организма. Стероиды — соединения, содержащие углерод- ный скелет циклопентанофенантрена
Важнейшие стероидные гормоны — половые гормоны — эстрон, прогестерон, тестостерон, андростерон и гормон коры надпочеч- ников — кортизон. Кроме этих двух групп, имеются и другие низкомолекуляр- ные гормоны. Укажем на адреналин, гормон надпочечников, по- вышающий артериальное давление и стимулирующий сердечную деятельность: НО \ н с—с сн / Ч I НО-С С—СН—СН2—NH—сн3 \=с/ н н Гормональная активность определяется химической функцио- нальностью немногочисленных атомных групп. Химические раз- личия тестостерона и кортизона малы, но их физиологические функции совершенно различны. Строение и свойства гормонов Таблица 2.3. Приблизительный химический состав клеток Е. coli Вещество Средняя м. м. Число моле- кул в клетке Число раз- личных видон молекул н2о 18 10-1010 1 Неорганические ионы (Na+, К+, Mg++, Са++, С1~, РО»~, СО" и др.) 40 2,5.108 20 Углеводы и их предшественники 150 2-Ю8 200 Аминокислоты и их предшественники 120 3-10’ 100 Нуклеотиды и их предшественники 300 1,2-10’ 200 Липиды и их предшественники 750 2,5-10’ 50 Другие малые молекулы 150 1,5-10’ 200 Белки 4-104 10е 2-3-10» ДНК РНК: 2,5-10» 4 1 рРНК 16 S*) 5-Ю5 3-104 1 (?) рРНК 23 S 10е 3-Ю4 1 (?) тРНК 2,5-Ю4 4-Ю4 40 мРНК 10е 103 103 *) S — сведберг (см. с. 80). демонстрируют биологическое значение индивидуальных моле- кулярных структур. Важную роль играют олигопептиды головного мозга млекопи- тающих. Вещества, содержащие небольшое число аминокислотных остатков (например, действующий подобно морфину ундекапеп- тид Н-Арг-Про-Лиз-Про-Глн-Глн-Фен-Фен-Гли-Лей-Мет-ХНг), 4* 51
обладают различными функциями — среди них имеются аналь- гетики, стимуляторы памяти и сна. К веществам полипептидной природы относится ряд нейро- токсинов, содержащихся в ядах змей, скорпионов и т. д. Эти вещества блокируют синаптическую передачу нервного импульса „(см. § 11.5). Табл. 2.3 характеризует разнообразие веществ, функциони- рующих в бактериальной клетке Escherichia coli (кишечной палочке). § 2.10. Основные биохимические процессы Все кратко охарактеризованные выше вещества участвуют в процессах жизнедеятельности различных организмов, выработан- ных в ходе биологической эволюции. Большие и малые биологи- ческие молекулы обеспечивают биосинтез, метаболизм и био- энергетику. Как уже сказано, нуклеиновые кислоты ответственны за био- синтез белков. В этом и состоит их единственная «законодатель- ная» функция. В свою очередь «исполнители» — белки — являют- ся необходимыми участниками всех биохимических процессов в качестве катализаторов — ферментов. Для реализации биосинтеза и метаболизма необходима энер- гия, запасаемая в клетках в химической форме, главным образом в экзергонических третьей и второй фосфатной связи АТФ. Со- ответственно метаболические биоэнергетические процессы имеют своим результатом «зарядку аккумулятора» — синтез АТФ из АДФ и неорганического фосфата. Это происходит в процессах дыхания и фотосинтеза. Современные организмы несут память об эволюции, начавшейся около 3,5 10’ лет назад. Имеются веские основания считать, что жизнь на Земле возникла в от- сутствие свободного кислорода (см. § 17.2). Метаболические процессы, протекающие при участии кислорода (прежде всего окислительное фосфорилирование при дыхании), относительно немногочисленны и эволюционно являются более поздними, чем анаэробные процессы. В отсутствие кислорода невозможно пол- ное сгорание (окисление) органических молекул пищевых ве- ществ. Тем не менее, как это показывают свойства ныне суще- ствующих анаэробных клеток, и в них необходимая для жизни энергия получается в ходе окислительно-восстановительных про- цессов. В аэробных системах конечным акцептором (т. е. окисли- телем) водорода служит О2, в анаэробных — другие вещества. Окисление без О2 реализуется в двух путях брожения — в гли- колизе и в спиртовом брожении. Гликолиз состоит в многоста- дийном расщеплении гексоз (например, глюкозы) вплоть до двух молекул пирувата (пировиноградной кислоты), содержащих по три атома углерода. На этом, пути две молекулы НАД восстанав- ливаются до НАД.Н и две молекулы АДФ фосфорилируются — получаются две молекулы АТФ. Вследствие обратной реакции 52
НАД.Н -> НАД + Н из пирувата получается лактат (молочная кислота). При спиртовом брожении из пирувата получается эти- ловый спирт. Попутно выделяется СО2. Суммарные реакции: СвН12Ов + 4НАД + 2АДФ +2Ф-> 2Н3С-СО-СООН + пируват + 4НАД.Н +2 АТФ. 2Н3С-СО-СООН4-4НАД.Н->2Н3С-СН (OH).QOOH + 4НАД,. 2Н3С- СО СООН + 4НАД.Н -> 2С2Н5ОН + 2СО2 + 4НАД. . Побочной стадией гликолитического и спиртового брожения яв- ляется так называемый пентозофосфатный путь, на котором про- исходит расщепление воды и также выделение СО2. Благодаря присутствию во внешней среде СО2 оказался воз- можным фотосинтез. Бактериальный фотосинтез, а затем и фото- синтез зеленых растений развивались примерно 3—2 • 10® лет на- зад. Фотосинтез состоит в поглощении света и преобразовании его энергии в химическую энергию биологических молекул. Для этого потребовались поглощающие свет соединения, в частности, содержащие порфириновые циклы — хлорофилл и цитохромы. В результате поглощения квантов света в хлорофилле электроны системы переходят на более высокие уровни энергии. Далее ра- ботает цепь переноса электронов, главными участниками которой являются окислительно-восстановительные ферменты — цитохро- мы. Запасенная первоначально в хлорофилле энергия выделяется в биологически полезной форме — в АТФ и НАДФ. Происходит фотофосфорилирование. По-видимому, на более поздней стадии эволюции возникло фотосинтетическое восстановление СО2 до углеводов. При этом источником Н у прокариот (бактериальный фотосинтез) служат разные молекулы, а у зеленых растений Н2О. В окружающую среду выделяется кислород. Его накопление в атмосфере явля- ется результатом фотосинтеза. Суммарная реакция: 6СО2 + 1?Н2О -> С6Н12О6 + 6Н2О + 6О2. Примерно 1,5—2 10’ лет назад парциальное давление О2 в атмосфере достигло 0,02—0,20% современного уровня. При этом начал возникать аэробный метаболизм, дыхание. При клеточном дыхании происходит ряд взаимосвязанных процессов синтеза био- логических молекул, необходимых для жизни, и «зарядка» АТФ (окислительное фосфорилирование). Молекулы пищевых веществ «сгорают», окисляются до СО2 и Н2О, причем О2 служит конеч- ным акцептором водорода. Освобождение химической энергии из пищи происходит, грубо говоря, в трех фазах. Первая состоит в расщеплении макромолекул и молекул жиров. Из белков полу- чаются аминокислоты, из углеводов (крахмал, гликоген)—гексо- зы, из жиров — глицерин и жирные кислоты. Из этих веществ 53
во второй стадии образуются ацетилкофермент А (с. 42), а-ке- тоглутарат и оксалоацетат. В третьей фазе реализуется цикл Кребса, представленный на с. 424. Цикл Кребса начинается реак- цией оксалоацетата с ацетил-КоА и тот же оксалоацетат регенери- руется при обороте по циклу. Определенные реакции цикла, выпол- няющего каталитическую функцию, сопровождаются переносом атомов Н на НАД или флавопротеид. На каждые два электрона, перенесенные с НАД.Н на О2, синтезируются три молекулы АТФ (окислительное фосфорилирование). Этот перенос, электронов осуществляется в дыхательной цепи. При переходе от первой фазы ко второй выделяется СО2, при переносе электронов с НАД Н на О2 образуется Н2О. Общий баланс процесса аэробного дыхания СвН12Ов + 6Н2О + 6О2 + 36АДФ + 36Ф -*• 6СО2 + 12Н2О + 36АТФ. Дыхание много эффективнее гликолиза. При гликолизе измене- ние свободной энергии на моль глюкозы составляет — 197 кДж, при дыханиии — 2880 кДж. Сложные процессы метаболизма, запасания и расходования энергии пространственно локализованы в клетках. Дыхание реа- лизуется в мембранах митохондрий, фотосинтез — в мембранах хлоропластов. Биохимические процессы эволюционно адаптиро- ваны. Так, у животных пустынь и у птиц главным источником метаболической энергии является жир, а не гликоген. В пустыне надо обеспечивать не только максимальный выход энергии, но и максимум образования воды — при окислении жира производит- ся вдвое больше воды, чем при окислении гликогена. Для птиц существенна меньшая масса жира. Масса гликогена и связанной с ним воды в 8 раз больше, чем масса жира, дающая при окис- лении то же количество энергии. Подробное рассмотрение и схемы всех метаболических путей содержатся в руководствах по биохимии. Мы вернемся к дыха- нию и фотосинтезу в гл. 13, посвященной биоэнергетике, и в гл. 14, посвященной фотобиологическим процессам. § 2.11. Сильные и слабые взаимодействия Взаимодействия атомов в биологических молекулах, равно как й в молекулах синтетических органических соединений,— это прежде всего химические ковалентные связи, которые мы назо- вем сильными. Энергия, необходимая для разрыва С—С-связп, равна 348,6 кДж/моль, энергия С—N-связи 336 кДж/моль и т. д. Сильные взаимодействия определяют цепное строение биополи- меров, соединение друг с другом соответствующих мономеров — аминокислотных остатков, нуклеотидов, гексоз. Сильные связи образуются внешними электронами атомов; теория ковалентных связей может быть основана только на квантовой механике. Со- ответствующая область физики или теоретической химии имену- ется квантовой химией. 54
В ходе биохимических реакций, катализируемых ферментами, происходит перестройка химических связей, перестройка элект- ронных оболочек. Однако биологические молекулы не могли бы функциониро- вать и жизнь в известных нам формах не существовала бы, если бы помимо сильных взаимодействий внутри биологических моле- кул и между ними не действовали бы невалентные, нехимиче- ские, слабые силы. Клетки и их органоиды — гетерогенные систе- мы, существование и функционирование которых определяются межмолекулярными взаимодействиями невалентного характера. Исполнители почти всех молекулярных функций в клетках — белки — взаимодействуют с липидами и углеводами, с нуклеино- выми кислотами и с малыми молекулами. Взаимодействия эти преимущественно слабые, так как сильные взаимодействия со- здавали бы слишком жесткие и устойчивые структуры, лишен- ные молекулярной подвижности, необходимой для выполнения биологическими молекулами их разнообразных задач, включаю- щих тонкую регуляцию химических реакций, компартментацию, установление градиентов концентрации. Перечислим виды сла- бых взаимодействий в биологических системах и охарактери- зуем их. 1. Ионные связи. Силы взаимодействия между ионами, описы- ваемые законом Кулона. Энергия взаимодействия двух ионов с зарядами е, и ег равна е с ^ион = -^, (2.27) где г — расстояние между ионами, е — диэлектрическая прони- цаемость среды. Разноименные заряды притягиваются, 77ИОН < О, одноименные отталкиваются, ияоя > 0. Ионные связи образуются, в частности, между ионогенными группами в белках (например, Глу~, Лиз+), между такими группами и малыми противоионами, между фосфатными группами в нуклеиновых кислотах и катио- нами т. д. 2. Ион-дипольные взаимодействия между ионами и полярны- ми группами молекул. Они определяются зарядом иона и диполь- ным моментом взаимодействующей с ним атомной группы. 3. Ориентационные силы. Электростатические взаимодействия между диполями. Дипольный момент р малой молекулы или атомной группы равен по порядку величины произведению за- ряда электрона (4,8 • 10~10 ед. СГСЭ) на длину химической связи (~10-8 см). Единица дипольного момента, равная 10“18 ед. СГСЭ, называется дебаем (D). Диполи стремятся установиться антипа- раллельно или «в хвост» друг к другу. Энергия ориентационного взаимодействия Двух диполей обратно пропорциональна кубу расстояния между ними: г 3(Р1Г)(Р2Г)) /9 9Я, Гор — ~ {PiPa а----} • (2.28) г ( г' ) 55
Если два диполя установлены «в хвост» друг к другу, т. е. вс© три вектора р„ р2 и г коллинеарны, то С7„р = -Зр.рг/г3, (2.29) Если дипольные молекулы находятся в состоянии теплового дви- жения в газе или в жидкости, то выражение (2.28) следует усреднить по всем взаимным ориентациям диполей с учетом больцманова фактора ехр(—U/кТ). При достаточно высокой тем- пературе, когда U << кТ, усреднение дает £4р~~'з^Л* (2-30> 4. Индукционные силы. Постоянный диполь молекулы или атомной группы индуцирует в другой молекуле или группе ато- мов дипольный момент, с которым он взаимодействует. Диполь- ный момент, индуцированный электрическим полем с напряжен- ностью Е, равен р = оЕ, (2.31) где а — поляризуемость, характеризующая способность электрон- ной оболочки смещаться под действием электрического поля. По- ляризуемость имеет размерность объема, порядок величины по- ляризуемости атомов и малых молекул тот же, что их объемов, т. е. 10~2‘ см3. В нашем случае напряженность электрического поля диполя в молекуле, отстоящей от него на расстояние г, есть Е = 2р/т3 (если р и г параллельны), и энергия индукцион- ного взаимодействия равна илал = —>/,,аЕ2=^-^2ар2/тя. (2.32) Подобно Uov, энергия индукционного взаимодействия обратно! пропорциональна шестой степени расстояния, но от температуры не зависит. Формулы (2.28) — (2.32) справедливы лишь для точечных ди- полей, т. е. при условии р < ег, где е — заряд электрона. Если это условие не выполнено, то необходимо проводить расчет вза- имодействия точечных зарядов, монополей. Перечисленные взаимодействия являются электростатически- ми, энергия притяжения или отталкивания вычисляется на осно- ве классической электростатики. Квантовые эффекты практиче- ски не существенны. 5. Дисперсионные силы. Взаимодействие валентно насыщен- ных электронных оболочек атомов и молекул. Это силы, не зави- сящие от наличия зарядов, дипольных моментов, квадрупольных моментов и т. д. Таковы, например, силы, действующие между молекулами N2, О2, СО2, благородных газов в их смеси (воздух) и порознь. Эти силы определяют неидеальное поведение безди- польных газов, их сжижение. Дисперсионные силы ответственны за существование молекулярных кристаллов, в частности, кри- сталлов углеводородов. Дисперсионные силы имеют квантовоме- 56
ханическую природу, в рамках классической физики нельзя объяснить их существование. Элементарный расчет энергии дисперсионного взаимодействия исходит из представления электронов гармоническими осцилля- торами. Между двумя одинаковыми осцилляторами реализуется мгновенное диполь-дипольное взаимодействие, вследствие чего вместо первоначального колебания с частотой со, возникают два нормальных колебания с частотами, которые отличаются от сов тем больше, чем сильнее взаимодействие. Соответственно изме- няется и нулевая энергия колебаний. В отсутствие взаимодей- ствия она равна #2 = 6^-, (2.33) Ъ — постоянная Планка. Множитель 6 получается потому, что каждый электрон-осциллятор предполагается имеющим три сте- пени свободы. При взаимодействии нулевая энергия колебаний равна 1 f Гf \г/2 ( r2W2l <Г0 = |йю02 —) + I--,) + 41 I L \ Jr ' ' fr / J / 2^2\1/2 / %>2W21 +(14v) )’ (2-34> где е — заряд электрона, / — коэффициент упругости осциллято- ра, г — расстояние между осцилляторами. При eV/r3 < 1 ч е* ^о«ЗЙЮо-|й«о^ (2.35) м, следовательно, энергия взаимодействия равна С дисп — Й’о ^2 — Ч р* 4" (2.36) Поместим электрон-осциллятор в электрическое поле Е. Сила еЕ, действующая на электрон, уравновешивается упругой силой jr. Следовательно, индуцированный дипольный момент равен р = ег = уЕ = яЕ, (2.37) где а — поляризуемость осциллятора, равная 2 2 € € » = 7 = ™- (2.3S) (т — масса осциллятора). Подставляя а в выражение (2.36), по- лучаем • о 2 £7дисн=-4 (2.39) 57
Энергия дисперсионного взаимодействия также обратно пропор- циональна шестой степени расстояния между взаимодействующи- ми системами. Наличие множителя Й в выражении (2.39) сви- детельствует о квантовомеханической природе дисперсионных сил, впервые раскрытой Лондоном. Дисперсионные силы имеют универсальное значение для внут- ри- и межмолекулярных взаимодействий атомных групп и мо- лекул с насыщенными валентными связями. Силы 3, 4, 5 принято называть ван-дер-ваальсовыми, так как в сумме они определяют межмолекулярпое притяжение, ответ- ственное за поправку на давление в уравнении Ван-дер-Ваальса для реальных газов. Поправка на объем определяется взаимным отталкиванием молекул на малых расстояниях, природа которого также квантовомеханическая. Порядок величины энергии ван-дер-ваальсовых взаимодей- ствий соответствует теплоте испарения жидкости. Она имеет по- рядок величины 10 кДж/моль. 6. Водородные связи. Специфические донорно-акцепторпыо взаимодействия, создаваемые атомом Н в группах О—Н, N — Н„ F—Н, С1—Н, иногда в S—Н. Водород связывает эти группы с валентно насыщенными атомами О, N, F, например, в воде: ’''''И ;..о—Н--.-О-н---. Водородные связи определяют строение и свойства воды, они иг- рают очень важную роль в формировании структур биополимеров: и в их взаимодействиях с малыми молекулами. Энергии водород- ных связей имеют порядок 4—29 кДж/моль. Подробнее о них рассказано в § 4.3. 7. Гидрофобные взаимодействия. Биополимеры — белки и ну- клеиновые кислоты — функционируют главным образом в водном окружении. Гидрофобные силы — силы специфического отталки- вания между неполярными атомными группами и молекулами во- ды. Это энтропийный эффект, определяемый особенностями струк- туры воды как конденсированной системы. Гидрофобные взаимо- действия играют важнейшую роль в формировании структуры белков, надмолекулярных систем (мембраны) и т. д. О гидрофобных взаимодействиях рассказано в § 4.5. Слабые взаимодействия ответственны за молекулярную гиб- кость, т. е. конформационные свойства биополимеров и малых молекул (см. гл. 3). Имп определяется молекулярное узнавание,, реализуемое в ферментативном катализе (гл. 6), в биосинтезе (гл. 8) и в целом ряде биологических процессов, происходящих на молекулярном уровне. 58
Глава 3 ФИЗИКА МАКРОМОЛЕКУЛ § ЗЛ. Макромолекулы и высокоэластичность Биологические макромолекулы — белки и нуклеиновые кисло- ты — очень сложны. Их свойства в живых системах определяют- ся всеми особенностями строения, в частности, тем, что эти мак- ромолекулы являются информационными, они представляют со- бой «тексты». Важно установить, что в поведении биополимеров связано с самим фактом их цепочечного строения, независимо от конкретных атомных групп, входящих в состав макромолекулы. Простые неинформационные цепи синтетических полимеров слу- жат моделями для исследования этой проблемы. Как уже сказано, физика макромолекул — одна из основ мо- лекулярной биофизики. Полимеры синтезируются химическими методами или добы- ваются из растений (каучук, целлюлоза) главным образом ради их ценных физических свойств. В технике полимеры применя- ются как пластмассы, изоляторы, волокна и высокоэластичные материалы — природный и синтетический каучуки. Простейший синтетический полимер — полиэтилен Х/СН2Х/СН2Х/СН2Х сн2 сн2 сн2 получаемый полимеризацией этилена Н2С=СН2, идущей путем раскрытия двойных связей. Сходным образом получается аналог природного каучука — синтетический ^нс-полпизопрен -Н2С-СН2Ч /СН2-СН2. /СН2- 2у=с/ >с=с/ Н3Сг \ц H3CZ хн в результате полимеризации изопрена Н2С=С(СН3)—СН=СН2. Ряд полимеров, в частности, найлон и ему подобные, синтезиру- ются путем поликонденсации, идущей с выделением какого-либо вещества. Как мы видели, полипептидная цепь получается путем поликонденсации аминокислот, идущей с выделением воды, поли- нуклеотидная — путем поликонденсации нуклеозидтрифосфатов с выделением пирофосфата. Специфическим свойством полимеров, наиболее важным для биофизики, является высокоэластичность — способность блочного 59
каучукоподобного полимера испытывать большие упругие дефор- мации, достигающие сотен процентов, при малом модуле упру- гости. Каучук, подобно другим упругим телам, подчиняется при малых деформациях закону Гука — напряжение пропорциональ- но относительной деформации: L — L о = е—у—(3.1) О Здесь а — напряжение, L, Lo — длины растянутого и нерастяну- того образцов, е — модуль упругости. Для стали е » 200000 МПа, для резин е ~ 0,2—8 МПа (в зависимости от степени вулканиза- ции каучука). В этом смысле каучук похож на идеальный газ. Идеальный газ следует закону Клапейрона pV = RT. (3.2) Сожмем газ, находящийся в цилиндре с поршнем, при постоян- ной температуре, увеличив давление на dp. Объем уменьшится на dV. Из (3.2) следует /IV — L dp^-p^p-t--, (3.3) о где La — начальное, L — конечное положение поршня. Уравнение (3.3) аналогично (3.1), роль модуля упругости е играет давле- ние р. Атмосферному давлению отвечает е = 100 кПа — величина того же порядка, что и модуль упругости каучука. Идеальный газ нагревается при адиабатическом сжатии. Аналогичным обра- зом резина нагревается при адиабатическом растяжении. Это означает, что в обоих случаях при деформации происходит умень- шение энтропии. Работа при растяжении каучука на длину dL силой / равна jdL = dF = dE — T dS, (3.4) где F — свободная энергия, Е — внутренняя энергия, S — энтро- пия. Каучук практически несжимаем. Упругая сила при изотер- мическом растяжении каучука равна j — (дЕ\ _r(dS\ /ч • \dL — \dL}т 1 (йГ]т' Опыт показывает, что для каучука сила / пропорциональна Т, причем прямая /(Т) проходит вблизи начала координат. Иными словами, Подобно тому как внутренняя энергия идеального газа не зави- сит от объема (^)г=®. <3-7> 60
внутренняя энергия каучука не зависит от длины. Упругая сила и в том, и в другом случае определяется изменением не внутрен- ней энергии, а энтропии. Для каучука (3.8) В этом и состоит принципиальное отличие высокозластич- ности полимера от упругости твердого тела (скажем, стальной пружины), определяемой изменением внутренней энергии. Почему же каучук похож на идеальный газ? Энтропийный характер упругости идеального газа означает, что при уменьше- нии объема газа возрастает число ударов молекул о стенки — упругая сила определяется тепловым движением молекул. Сжатие газа уменьшает его энтропию, так как газ переходит из более вероятного разреженного состояния в менее вероятное — сжатое. Поэтому модуль упругости идеального газа пропорционален абсо- лютной температуре: „__Л т Р ~ у Т. Пропорциональность модуля упругости каучука абсолютной тем- пературе, следующая из (3.8), также свидетельствует об энтро- пийной природе высокоэластичности, о том, что каучук состоит из большого числа независимых элементов, подверженных тепло- вому движению. Переход от более вероятного расположения этих элементов к менее вероятному происходит при растяжении кау- чука. Аналогия между свойствами каучука и идеального газа может состоять только в сказанном. Йо что зто за элементы? Что в каучуке играет роль молекул газа? Отличие макромолекул от малых молекул определяется преж- де всего большим числом однотипных звеньев, связанных в ли- нейную цепь. Как правило, макромолекулы содержат единичные о-связи С—С, С—N, С—О и др. Вокруг этих связей возможны повороты атомных групп. В результате поворотов вокруг еди- ничных связей возникают различные конформации цепи. Макро- молекула обладает конформационной лабильностью, той или иной степенью гибкости. Роль независимо движущихся элементов иг- рают участки цепи, совершающие независимые повороты. Как мы увидим, конформационные свойства биологических молекул очень важны. Знакомство с этими свойствами нужно начинать с изучения каучука. Следуя таким путем, мы, в конечном счете, придем к пониманию природы ферментативной активности. Ландау говорил, что задача физики состоит в установлении новых связей между далекими друг от друга явлениями. Мы уже установили, что связывает каучук с идеальным газом. Далее мы увидим, что связывает фермент с каучуком. 61
§ 3.2. Внутреннее вращение и поворотная изомерия Классическая органическая химия считала свободным вра- щение атомных групп вокруг единичных связей. Любые конфор- мации, например, этана Н3С—СН3, возникающие в результате внутренних поворотов, имеют одинаковую энергию; изменение Рис. 3.1. Расположение С — 11- связей этана в транс- (а) и цис- (б) конформациях. Проек- ции на плоскость, перпенди- кулярную С — С-связи угла поворота не требует затраты энергии. Некоторые из кон- формаций этана изображены на рис. 3.1. Однако исследования термодинамических свойств этана и дру- гих соединений с единичными связями, а также структурные исследования, проведенные методами спектроскопии, ЯМР и т. д., показали, что внутреннее вращение почти всегда несвободно. Молекула этана имеет минимум энергии в транс-, или скрещен- U Рис. 3.2. Зависимость потенциаль- ной энергии внутреннего враще- ния в этапе от угла поворота О !20' . ZW° 360" ? ной, конформации (рис. 3.1, а) и максимум в цис-, или затенен- ной, конформации. Для поворота вокруг С—С-связи на 120°, т. е. для перехода из одной транс-конформации в другую, ей тождественную, нужно преодолеть энергетический барьер, рав- ный 12 200 Дж/моль. Для этана, а также для других молекул е осевой симметрией С3 зависимость потенциальной энергии мо- лекулы от угла поворота <р можно приближенно представить формулой Cf^VJMl-cosScp), (3.9) где Ua— высота потенциального барьера (рис. 3.2). Значение Ua возрастает при замене атомов Н в этане на более объемистые атомы и группы и уменьшается при удлинении оси вращения (ср. Н3С—СН3, Н3С—SiH3, H3Si—SiH3). Некоторые эксперимен- тальные значения Uo приведены в табл. 3.1. Потенциальная энергия внутреннего вращения определяется слабыми взаимодействиями валентно несвязанных атомов и групп 62
(в этане это взаимодействие атомов Н одной группы СН3 с ато- мами Н другой группы СН3). Строгий квантовомеханический расчет величины Uo затруднителен, так как она много меньше суммарной энергии химических связей в молекуле и определя- ется как малая разность двух больших величин — полных энер- гий молекулы в цис- и транс-конформациях. Барьер возникает вследствие отталкивания валентно несвязанных атомов и взаимо- действия связей, примыкающих к оси вращения (эффект ориен- Таблица 3.1. Высоты энергетических барьеров внутреннего вращения Молекула кДж моль ккал моль Молекула кДж моль ккал моль н3с—сн3 12,2 2,9 Н3С-ОН 4,6 1,1 Н3С—СН2СН3 14,3 3,4 Н3С—осн3 11,3 2,7 Н3С—СН(СН3)2 16,4 3,9 Н3С—SH 5,5 1,3 Н3С—С(СН3)3 18,5 4,4 П3С—сп=сп2 8,4 2,0 н3с—ch2f 13,9 3,3 Н3С—SiH3 7,1 1,7 Н3С—СН2С1 15,5 3,7 n3Si—SiH3 4,2 1,0 Н3С—СН2Вг 15,1 3,6 Н3С—С=С—сн3 0 0 тации связей). И то, и другое делает более устойчивой транс- конформацию (принцип скрещенных связей). Межатомное оттал- кивание можно оценить, зная характерные зависимости энергии межмолекулярного взаимодействия от расстояний между моле- кулами для модельных веществ (см. с. 64). Труднее определить эффект ориентации связей. Грубую оценку можно получить, счи- тая, что в этане из-за малого ван-дер-ваальсова радиуса атома водорода U(<р) целиком определяется эффектом ориентации и что у производных этана этот эффект тот же. Тогда получаем для производных этана U (<р) = ’/г^этО — cos 3<р) +2 U (ги); (З.Ю) i.J [/(г,,)—энергия ван-дер-ваальсовых взаимодействий валентно не- связанных атомов i и /, находящихся на расстоянии друг от друга. Ясно, что г(,- зависит от <р. Если связи не полярны, то V (rtj) слагается из энергии дис- персионных сил (с. 56) и энергии отталкивания. Если взаимодействуют полярные молекулы или группы, обла- дающие дипольными моментами, то кроме дисперсионных сил действуют электростатические — ориентационные и индукцион- ные (с. 55, 56). Все три вида сил одинаковым образом зависят от расстояния — соответствующие энергии обратно пропорциональны г*. Энергии ван-дер-ваальсова отталкивания еще сильнее зависят от расстоя- ния, так как отталкивание существенно больше на малых рас- стояниях. Приближенно можно считать, что энергия отталкива- 63
ния обратно пропорциональна гВ * * * 12. Полную энергию ван-дер-ва- альсовых взаимодействий атомов, молекул или групп можно представить формулой = (З.и) U(г)—потенциал «6—12» Леннард-Джонса. На рис. 3.3 пока- зана форма соответствующей кривой. Энергия взаимодействия минимальна и равна — ВЧАА на расстоянии г0 = (2А/В)1,<‘. По- тенциал (3.11) является эмпирическим. Предложены и другие Рис. 3.3. Зависимость по- тенциальной энергии ван-дер-ваальсова взаи- модействия от межмо- лекулярного расстояния потенциалы, в частности, отталкивание можно представить экспо- нентой А ехр (—аг). Этим вводится еще один эмпирический параметр. В табл. 3.2 представлены константы потенциала Леннард- Джонса для некоторых пар атомов. Таблица 3.2. Константы потенциала Леннард-Джонса Атомы В10‘, кДж А-1012, кДж г0, нм Атомы в-ю“, кДж А-1012, кДж го- ™ МОЛЬ’НМ® 12 МОЛЬ*НМ моль*нм* 12 МОЛЬ*НМ НН 197,4 18,9 0,24 CN 1537,2 907,2 0,32 сс 1554,0 1201,2 0,34 СН 537,6 159,6 0,29 NN 1524,6 676,2 0,31 NO 1533,0 642,6 0,31 оо 1541,4 609,0 0,30 НО 520,8 105,0 0,27 со 1541,4 861,0 0,32 NH 525,0 113,4 0,28 В основе вычислений энергии внутреннего вращения лежит предположение о том, что внутримолекулярные невалентные вза- имодействия имеют тот же характер, что и межмолекулярные. В частности, Китайгородский развил для этих целей метод атом — атом потенциалов, ранее разработанный им же для расче- та энергий молекулярных кристаллов. В качестве эмпирических параметров используются равновесные расстояния между валент- но несвязанными атомами г0. Кроме того, учитывается, что в мо- лекулах потенциалы не имеют сферической симметрии — так, равновесный радиус одновалентного атома зависит от угла, обра- 64
зуемого этим радиусом и валентной связью. Этим вводится еще один эмпирический параметр. Лучшие результаты, однако, дает учет не атом-ятомных, а связь-связевых взаимодействий. Мы вер- немся к рассмотрению конформаций молекул в следующей главе. Рис 3.4. Зависимость потен- циальной энергии внутреннего вращения в и-бутапе от угла поворота Если молекула, в отличие от этана, не имеет аксиальной сим- метрии, кривая U (ф) уже не может быть описана формулой типа (3.9). Так, например, для молекулы и-бутана Н3СЧ /Н И—С—С—Н НХ ЧСН3 кривая зависимости внутренней энергии от угла поворота ф во- круг центральной связи С—С имеет форму, показанную на рис. 3.4. Имеются три минимума энергии: первый наиболее глу- бокий (при 0 и 360°) отвечает траис-конформации, два других 'Одинаковой глубины — конформациям, получаемым поворотом из трдис-положения одной группы С2Н5 относительно другой груп- пы С2Н5 на 120 и —120°. Эти конформации называются сверну- тыми или гош-конформациями. Очевидно, что молекулы, характеризуемые несколькими не- эквивалентными минимумами энергии £7(ф), существуют именно в этих состояниях, переходя из одной конформации в другую со скоростью, определяемой высотой барьера, разделяющего мини- мумы. Равновесные числа молекул w-бутана в Tpanc-(Nt) и свер- нутых вправо и влево на 120° конформациях (Nd и Nt) легко вычисляются по закону распределения Больцмана: лт = ту ________1________ /V = АГ = 7V ехр (~ ^E/RT'I f 1 + 2 ехр (— EE/RT) ’ d 1 1 4- 2 exp (— EE/RT) ’ (3.12) тде NE—разность энергии минимумов (рис. 3.4). Очевидно, что Nt + Nd + Nt = N — полное число молекул. Вещество представляет собой динамическую смесь конформаций, которые называют по- разному: -поворотными изомерами, ротамерами, конформерами. Состав термодинамически равновесной смеси определяется' раз- ностью энергий ротамеров \Е и температурой. При Т °° число 5 м. В. Волькеиштейн 65
молекул Nt = Nt = Nt = NJ3; при понижении T до температуры плавления вещество кристаллизуется в форме одного наиболее устойчивого ротамера и формулы (3.12) становятся неприме- нимыми. При высотах барьеров порядка десяти кДж/моль время пово- ротной изомеризации, т. е. время превращения одного ротамера в другой, имеет порядок 10~10 с. К такой оценке приводит расчет на основе теории абсолютных скоростей реакций (см. § 6.1). Следовательно, ротамеры нельзя разделить. Их наличие и доля устанавливаются путем изучения физических и химических свойств смеси ротамеров. Пространственное строение ротамеров- различно, соответственно различаются и их колебательные спект- ры. За время жизни ротамера происходят сотни и тысячи коле- баний (с частотами порядка 1012—1013 с-1)—ротамер успевает «выдать» свой спектр. Действительно, существование поворотной изомерии было впервые установлено Кольраушем с помощью спектров комбинационного рассеяния. Отношение интенсивностей спектральных линий, отвечающих различным ротамерам, зависит от их содержания в смеси в соответствии с формулами (3.12). Следовательно, ЛЕ можно определить по температурному ходу интенсивностей спектральных линий. Так, для н-бутана найдено АЕ « 2,5 кДж/моль. Информацию о ротамерии получают также с помощью радио- частотной спектроскопии, ЯМР, электронографии, измерения ди- польных моментов и т. д. Теоретический расчет величин ЛЕ про- водится, естественно, теми же методами, что и расчет барьеров (с. 93). Если энергия системы зависит от нескольких углов (в случае н-бутана от углов <р(-НгС9-СН2-) и <|>|=<р2(Н3С^-СНг-)), то вычисляется уже не кривая типа рис. 3.4, а многомерная энер- гетическая поверхность 17 (<р, <plt фг, .-)—своего рода геодезиче- ская карта. Мы познакомимся с такими поверхностями при рас- смотрении конформаций белков. Подчеркнем принципиальное различие между конформациями и конфигурациями молекул. Переход из одной конформации в другую происходит в результате внутренних поворотов вокруг единичных связей. Конфигурация при этом не меняется. Напро- тив, для изменения конфигурации необходимы разрывы ковалент- йых связей и новое их образование. Пример различных кон- фигураций— зеркальные антиподы хиральных молекул (см. рис. 2.10). Изучение поворотной изомерии и изомеризации, т. е. конфор- маций и конформационных превращений, приобрело большое зна- чение в органической и биоорганической химии. Главные особен- ности физического поведения синтетических и биологических макромолекул связаны с их конформационными свойствами. 66
§ 3.3. Конформационная теория макромолекул В цепи полиэтилена (с. 59), состоящей из единичных связей С—С, внутренние повороты происходят в каждом звене цепи. Именно внутренним вращением, т. е. конформационными пере- ходами, и определяется гибкость цепи, ответственная за высоко- эластичность полимера. Построим максимально упрощенную модель макромолекулы в виде шарнирно соединенных стержней одинаковой длины Ъ (рис. 3.5). Каждый стержень свободно поворачивается по отношению к соседним. Тем самым набор конформаций, возника- ? / тощих при поворотах вокруг данного ато- / / ма цепи — шарнира, непрерывен в интер- fix вале углов от 0 до 4л и энергия при по- воротах не меняется. Цепь можно ока- <-< Т рактеризовать вектором h, проведенным ‘ • J \ I от первого атома цепи к последнему I \ А (рис. 3.5). Очевидно, что среднее по всем , °---® конформациям значение вектора h равно " Y \/ нулю: h = 0, так как при тепловом дви- fi---------- \ жении все его направления равновероят- / 1 ны. Нужно установить, как при этом рас- а пределены вероятности реализации тех ° пли иных численных значений h = Ih|, ко- рис. з.5. Схема свободно торые могут меняться от нуля до макси- сочлененной цепи мальной длины вытянутой цепи Zb (Z — число звеньев, Ь — длина звепа). Ре- шение этой задачи аналогично решению задачи теории броунов- ского движения — нахождению вероятности перемещения части- цы на расстояние h в результате Z шагов, каждый из которых имеет длину b и произвольное направление. Распределение ве- роятностей оказывается гауссовым — вероятность того, что рас- стояние между концами цепи лежит в интервале от h до h + dh, равна W(h\dh =(JL_|3/24nfc2expf-^-')&. (3.13) ' ' \2nZb4 \ 2Zft2- / Если закрепить один конец цепи в точке 0, а другой располо- жить в элементе объема на расстоянии h от точки 0, то число конфигураций цепи будет пропорционально элементу объема и плотности вероятности w(h) этого элемента. Имеем / 3 \з/2 ( 37г2 \ п>(/0= ----;) ехр-------5 . (3.14) ’ \2лгьу \ 2Z&8/ Средний квадрат длины цепи равен оо /7 « J (h) dh = (3.15) 9 5* 67
т. е. цепь сильно скручена. Формула (3.15) справедлива ирге 1, когда верхний предел Zb может быть заменен на бесконеч- ность. Таким образом, тепловое движение свертывает макромолекулу в клубок. Вероятность такого состояния много больше, чем вы- тянутого, так как вытянутая конформация цепи может осущест- вляться одним способом, а свернутая — множеством способов.. Клубкообразная форма макромолекул в растворе доказана пря- мыми опытами (§ 3.6). Энтропийная природа высокоэластичности каучука непосред- ственно следует из сказанного. В нерастянутом состоянии цепи свернуты в клубки, чему соответствует максимальная энтропия. При растяжении клубка энтропия уменьшается. Энтропия растя- нутой цепи согласно (3.14) равна (к — постоянная Больцмана) S = Klnw(h) = C--^ (3.16> 2Zb и; согласно (3.8), упругая сила, возникающая при растяжении: цепи, равна ЪкТ (3.17) Закон Гука справедлив, модуль упругости пропорционален абсо- лютной температуре. Мы изложили кинетическую теорию упру- гости каучука, предложенную Куном. В реальных макромолекулах валентные углы между связями, фиксированы и повороты не свободны. Зададим положение двух Рис. 3.6 Цепь с фиксированными валентными уг- лами соседних звеньев цепи полиэтилена (рис. 3.6).. Третье звено может занимать различные по- ложения на поверхности конуса с раствором 2й (л — —валентный угол между связями. С—С, близкий к тетраэдрическому 109°28').. Этим различным положениям, характеризуе- мым углом поворота <р вокруг второй связи: С—С, отвечают разные энергии [7(<р). Поло- жение четвертой связи по отношению к первым двум менее определенно, так как она лежит на конусе, описанном вокруг каждого из поло- жений третьей связи, и т. д. Достаточно уда- ленная связь располагается по отношению к первой связи практически произвольным обра- зом. Поэтому длинная цепь свертывается в клу- бок. Макромолекулу можно мысленно разбить на сегменты, положения которых уже не коррелированы друг с другом. Формулы (3.13)—(3.17) сохраняются, но Z и b озна- чают число и длину свободно сочлененных сегментов, а не ре- альных звеньев. Можно, однако, построить молекулярную теорию цепи, выра- зив длину цепи через число реальных звеньев N, длину звена I 68
и угол й. Вектор h есть сумма векторов звеньев h = 2 Ц. (3.18) Следовательно, _____________________ N N ________ N N г-1 ____ 2 2 М>=2 *1 + 22 2 «Л- (3.19) г=1 j=l г=1 г=2 j=l В реальной цепи средние значения скалярных произведений 1J, зависят от углов й и <р. Для цепи с симметричными привесками типа полиэтилена строгий расчет дает формулу Ока (при ZV»1) Г* = Nli 14-cosfl l + n 3 0) где т) — средний косинус угла ср внутреннего вращения 2 Я. J cos ф-ехр (— V (<р)/кТ) йф J] = еоГ^= 2—^-----------------------. (3.21) ехр (— U (<{>)1кТ) йф о Величина h2, вычисленная по (3.20), больше, чем для свободно- сочлененной цепи (2W2), так как корреляция, определяемая отсут- ствием свободы вращения и валентными углами, удлиняет цепь. Величина h2 есть мера термодинамической гибкости — чем мень- ше h2 при заданных N и I, тем_больше скручена цепь, тем боль- ше ее гибкость. Вычисление h2 сводится к вычислению ц, что требует знания потенциальной энергии £7(<р). Эту трудность, од- нако, можно обойти. Теория размеров, формы, электрических и оптических свойств макромолекул в растворе должна исходить из физического СН3 СН3 СН3 сн, О 1 Z з Рис. 3.7. Ротамеры «-бутана механизма их гибкости. Этот механизм раскрывается поворотно- изомерной, или конформационной, теорией (Волькенштейн, 1951— 1958). -Как мы видели, лишенные аксиальной симметрии малые молекулы образуют вследствие поворотов вокруг единичных связей различные поворотные изомеры (ротамеры). На рис. 3.7 пока- 69
ваны ротамеры н-бутана (ср. рис. 3.4), на рис. 3.8 — подобные им ротамеры полиэтилена, получающиеся в результате поворота вокруг любой связи С—С в цепи. Различие состоит лишь в том, что в полиэтилене вместо СН3-групп фигурируют группы СН2, присоединенные к продолжающейся цепи, что изображено знаком ~. Отсюда следует, что можно рассматривать макромолекулу как Рис. 3.8. Ротамеры полиэтилена равновесную смесь поворотных изомеров, а внутреннее вращение в цепи — как поворотную изомеризацию, т. е. как переходы из одной конформации в другую. Это значит, что вместо непрерыв- ной кривой U(ф) достаточно рассматривать состояния цени, от- вечающие ротамерам с дискретными, фиксированными значения- ми ф. Интегрирование в (3.21) заменяется суммированием по ротамерам. Так, для полиэтилена, имеющего три ротамера 1, 2, 3 (рис. 3.8), Для полиэтилена Ег — Е, = Es — Et -= АЕ, ф4 = 0°, ф2=120°, ф3 = = —120° (ср. рис. 3.4) и _ 1 — ехр(— ЬЕ/кТ) 1 + 2 ехр (—Д£/«Т) ’ p.zo; При АЕ = 2500 Дж/моль (с. 66) и Т = 273 К величина т)=0,37. Находим по формуле Ока (3.20) при cos й = cos(n — 109°28') = = —*/3 величину /г2 = 1,1А/2. Термодинамическая гибкость тем больше, чем меньше ц, т. е. чем меньше \Е. Конечно, в действительности происходят флуктуации — кру- тильные колебания около значений ф, отвечающих поворотным изомерам. Однако их можно не учитывать, так как эти колеба- ния, будучи случайными, в среднем компенсируют друг друга и не влияют на усредненные свойства цепей. Поворотно-изомерная теория хорошо обоснована для тех слу- чаев, когда минимумы энергии U (ф) разделены барьерами, су- щественно превышающими кТ. Если барьеры малы, поворотно- 70
изомерная теория сохраняет значение приближенного математи- ческого метода, заменяющего интегрирование суммированием. Реальное существование ротамеров у макромолекул установ- лено рядом методов, прежде всего методом инфракрасной спектро- скопии, при изучении термомеханических свойств и растяжения полимеров. Поворотно-изомерная теория лежит в основе стати- стической физики макромолекул. Она позволяет вычислять не только размеры макромолекулярных клубков, но и их дипольные моменты и поляризуемости, ответственные за электрические и оптические свойства. Расчет гибкости основывается на химическом строении макро- молекул. Мы все время говорили о полиэтилене. Однако многие макромолекулы содержат в своих звеньях массивные привески, например, полистирол (— С.Н2—CHR—)„, где R есть С6Н5. В этих случаях конформации определяются преимущественно взаимодей- ствиями привесков. Сведения о конформациях цепи можно полу- чить методом рентгеноструктурного анализа — если полимер кри- сталлизуется. При кристаллизации фиксируются определенные ро- тамеры для всех звеньев цепи и возникает дальний порядок: зная положение атомов в данном мономерном звене, мы знаем их для сколь угодно удаленных звеньев, так как расположение атомов строго периодично. Вместе с тем, в кристалле имеется, конечно, в ближний порядок — определенное расположение соседних звень- ев. Кристаллический ближний порядок сохраняется при плавлении и растворении полимера, так как кристаллическая структура по- лимера отвечает минимуму потенциальной энергии. Можно пред- положить, что ближний одномерный порядок в свободной макро- молекуле, образующей статистический клубок, аналогичен даль- нему одномерному порядку в кристалле. Эта идея получила под- тверждение в расчетах конформаций и в результатах эксперимен- тальных исследований. Повороты в соседних звеньях не независимы друг от друга — имеется корреляция, удлиняющая цепь. У полиэтилена устойчи- вы конформации соседних звеньев (0°, 0°), т. е. (t, t); (0°, 120°) и (0°, -120°) (t, s); (120°, 0°), (-120°, 0°) (s, Z); (120°, 120°) и (—120°, —120°) (s, s). Конформации (120°, —120°) и (—120°, 120°), т. е. (s+, s~) и (s~, s+), энергетически невыгодны. Средняя квадратичная длина цепи, вычисленная с учетом корреляции, оказывается равной не 1,1 N12, а 1,6 N12. Для несимметричной цепи (— СН2—CHR—)п повороты по часовой стрелке и против нее не эквивалентны и формула (3.20) несправедлива. В этом случае в выражение для h2 наряду с cos <р будет входить и sin ср; в симметричном случае sin<p = 0. Поворотно-изомерная теория дает количественное истолкова- ние физических свойств макромолекул в растворе в хорошем согласии с опытом. Она раскрывает физический механизм растя- жения. каучука, состоящий в поворотной изомеризации, в конфор- мационных превращениях. Сказанное можно пояснить одномерной моделью макромолекулы. Представим каждое звено стрелкой дли- 71
ны I, которая направлена вправо или влево. Одному ротамеру (обозначаемому Z), отвечают две соседние стрелки, смотрящие в одну сторону, другому (s)—смотрящие в разные стороны. Общая длина цепи выражается векторной суммой длин всех стрелок. На рис. 3.9, а изображена цепь, состоящая из 10 звеньев. Из них 5 смотрят вправо, 5 — влево, следовательно, общая длина цепи h = 0. В цепи пять t- и пять s-ротамеров (чтобы общее число а. —*—*-——-----»-—— —---t-----—-е— g---------------------------------- 8 —-------,---,--,--->------,----------- Рис. 3.9. Одномерная модель, иллюстрирующая растяжение цепи ротамеров равнялось числу звеньев, т. е. 10, добавлено еще «ну- левое» звено, смотрящее вправо,— оно показано пунктиром). Бу- дем растягивать цепь силой, поворачивающей стрелки вправо. На рис. 3.9, б показано одно из вытянутых состояний цепи с длиной h = (7 — 3)/ = 41. При этом числа ротамеров остались прежними — по пяти. Цепь удлинилась до 41 в результате пере- распределения ротамеров без изменения их относительного содер- жания. Произошел переход ttsststsst tttsstssts, не сопровожда- емый изменением энергии. Однако путем перераспределения ро- тамеров без изменения их количеств нельзя достичь полного растяжения цепи. Полностью растянутая цепь (рис. 3.9, е) со- стоит из 10 Еротамеров. В этом случае превращение сопровожда- ется изменением и энтропии, и энергии: 10Е, =/= 5Е, + 5Е„. Дейст- вительно, независимость внутренней энергии каучука от растя- жения (формула (3.6)) выполняется не вполне строго. Наряду с энтропийным имеется некоторый энергетический вклад в вы- сокоэластичность, поскольку разность энергий ротамеров ДЕ от- лична от нуля. Тем самым (dE/dh)T 0. Это подтверждается опытом. Исследования термомеханических свойств каучуков не только подтвердили наличие небольшой энергетической упругости, но позволили нши из опыта значения ДЕ в хорошем согласии с теоретическими. Прямое исследование растяжения полимеров методом инфракрасной спектроскопии показало, что при растя- жении действительно изменяется относительное содержание ро- тамеров. Если гибкость макромолекулы мала (т. е. велики значения ДЕ), то может реализоваться механизм скручивания цепи в клу- бок, отличный от поворотно-изомерного. Происходит не ротамери- зация, но крутильные колебания около единственного значения ср. Возникает весьма рыхлый клубок. К таким жестким макромоле- кулам относятся двойные спирали ДНК. Жесткую цепь, в кото- рой происходят крутильные колебания, можно рассматривать как упругий стержень (см. § 3.5) . 72
Мы все время говорим о термодинамической, равновесной гибкости макромолекул, определяемой величиной ДЕ. Кинетиче- ская гибкость, характеризующая поведение макромолекулы . во времени, т. е. скорость конформационного превращения, зависит главным образом не от ДЕ, а от высоты энергетического барьера, разделяющего различающиеся конформации. И термодинамиче- ская, и кинетическая гибкости варьируют в широких пределах. Макромолекулы, построенные из сопряженных л-связей или из сопряженных ароматических колец, являются жесткими — они лишены конформационной подвижности. В отличие от макромо- лекул с о-связями (полиэтилен, каучук), сопряженные цепи яв- ляются своего рода л-электронными полупроводниками. С этим связано поглощение света в длинноволновой области — соответ- ствующие полимеры практически черны. Гибкость и полупровод- никовые свойства макромолекул не совместимы. § 3.4. Макромолекула как кооперативная система Как уже сказано и как это видно из рис. 3.9, состояние (кон- формация) данного звена макромолекулы зависит от состояний соседних звеньев. Система, состояния элементов которой зависят друг от друга, называется кооперативной. Впервые понятие о кооперативности было введено Фаулером при изучении фазовых переходов. Эти важнейшие явления нельзя понять без учета взаимодействия элементов системы. Так, переход газ—жидкость есть кооперативный переход. Уравнение, связывающее газообраз- ное и жидкое состояния,— уравнение Ван-дер-Ваальса (p + p)(V-b) = ET, (3.24) где а, Ь, R — константы. Сожмем газ при температуре ниже критической. Уменьшение объема V увеличивает взаимное притяжение молекул a/V2, что в свою очередь вызывает уменьшение объема, и т. д. Кооперация большого числа частиц приводит к резкому переходу, идущему по принципу «все или ничего». В статистической механике развиты методы для расчета свойств коо- перативных систем — вычисления статистической суммы, с помощью кото- рой находятся все термодинамические характеристики системы. Учет взаи- мосвязи конформаций в одномерной кооперативной системе, в макромоле- куле, приводит к тому, что выражение потенциальной энергии содержит члены, зависящие от конформаций по крайней мере двух соседних звеньев: Л' Q2, .... »n) = 2 ^(Qi-V Ъ), (3.25) i=l где Qi — конформация г-го звена, представленная соответствующими угла- ми поворота, N — число звеньев. Приводим расчет, основанный на одномерной модели Изйнга и выпол- няемый с помощью матричного метода, предложенного Крамерсом и Ваянье. 73
Конформационная статистическая сумма для макромолекулы в отсут- ствие внешних сил имеет вид *-22-24-а”))- <3-28’ Cj й2 Йу Суммирование производится по г ротамерам каждого звена. Если справед- ливо выражение (3.25), то z = (3-27> Cj &; qn i=i где ( U (Q. ,, Я.)\ g (Qj-p Я.) = ехр--------------------. (3.28) \ к/ / Считая, что цепь состоит из повторяющихся одинаковых единиц, можно рассматривать величины у(Я,_!, Я<) как элементы матрицы /g (Я(1), Q(1)) ... у (Q(1), g = I : : г (3-29) \у(Я(г), Q(1)) ...g(fi(r>, Q(r>)/ Обозначим i g(^, = (3.30) Статистическая сумма (3.27) переписывается в виде 2 = 2 5 • • • 2 G^G^, • • • Gaу_1йу (3-31) »! й2 йу 01 1 ' и по правилу перемножения матриц находим Z=2G^-‘ (3-32) йу 0 Вводя условие цикличности Qo = Qw (при W 1 это условие не играет роли), получаем Z в виде следа Sp Gv, т. е. суммы диагональных членов матрицы G, взятой в степени JV: z = sp Gn = xf + . + Ь*. (3.33) где Хп — собственные числа матрицы G. Все элементы матрицы положи- тельны. Отсюда следует, что она имеет максимальное собственное число Xlt вещественное, положительное и невырожденное (теорема Фробениуса). При N » 1 Z ® Af. (3.34) Таким образом, вычисление ротамерной статистической суммы сводится к нахождению максимального корня матрицы Хь Зная Z, мы можем вы- числить равновесные характеристики макромолекул. В частности, этим ме- тодом находится средняя квадратичная длина клубка h2 (см. формулу (3.20) и формулы, учитывающие корреляцию ротамеров). Рассмотрим с помощью этого метода растяжение одномерной коопера- тивной модели рис. 3.9 внешней силой /. Пусть энергия t-ротамера, т. е. энергия двух соседних параллельных звеньев, равна —Е, энергия s-ротаме- ра, т. е. двух соседних антипараллельных звеньев; равна Е. Следовательно, разность энергий ротамеров равна Д£ = 2Е. (3.35) 74
Запишем это условие в форме ЕесЛИ i = ' + 1' (3.36) 4 ( 0, если i =/= j -J- 1. Здесь а, = 1, если звено (стрелка) смотрит вправо, и с< = —1, — если вле- во; i и / — номера звеньев. Энергия Ец — О, если звенья расположены не рядом — корреляция распространяется только на соседние стрелки. Если действует внешняя сила /, ориентирующая стрелки вправо, то иаждое зве- но длиной I приобретает дополнительную энергию Е/ = —If cos ср = —If аз, (3.37) где ср — угол между направлением звена и внешней силой. Так как каждая стрелка может находиться лишь в двух положениях, то матрица G имеет порядок \= 2. Согласно (3.28) находим s ai+i) = ехР (J? aj°i+i + ai) <3-38’ н матрица и —1: G получается при подстановке значений аз и Oj+i, равных +1 с /gd, 1) ^(1,-1) \ vr = L (э.эУ) 1) g(-l, -1)/ Обозначив а = E/кТ, Ъ = 1ЦкТ, имеем G = /exp(«+b) ехр(—а + Ь)\ \ехр (— а—Ь) ехр(а—Ь) ] Собственпь ie числа находим из уравнения I ехр (а + Ь) — % ехр(—а-(-Ь) 1 = 0. (3.41) |ехр(— а— Ъ) ехр(а—Ь)—XI Они равны Xt,2 = е“ ch b ± (е2“ sh2 Ъ -|- е-20)7’. (3.42) Так как %i > Хг, то, согласно (3.34), Z « = [еа ch Ъ + (е2а sh2 Ъ + е-2а)!/2]\ (3.43) Мы получили простое аналитическое выражение для статистической сум- мы. Пользуясь им, вычислим среднюю длину цепи: — д In Z д In sh Ь h=KT ~df~ = NkT df = Nl (sh2 b + e-4«)i/2- (3>44) Мерой кооперативности здесь является величина а, т. е. ДЕ/кГ. В отсут- ствие кооперативности, т. е. при а = О, - Ч h = Nl th Ъ = Nl th (3.45) При свободной ориентации стрелок длина цепи тем больше, чем большо сгла и чем ниже температура. При малых силах, т. е. при fl С кТ Л « NPffKT (3.46) или кТ - f^-2k, (3.47) т е. длина цепи пропорциональна растягивающей силе (закон Гука), при- чем модуль упругости пропорционален абсолютной температуре. Если, 75
напротив, а_Э> 1, т. е. ДЕ кТ, то можно пренебречь в (3.44) величи-/ ной и h = iVl независимо от силы. Цепь жесткая, и потому она вытис- нута. Тот же результат получается при больших силах, т. е. при fl кТ. Здесь также sh2 b 3> е~*а — большая сила полностью растягивает цепь. ; Средняя квадратичная длина ротамерной одномерной цепи, в отсут- ствие внешней силы, вычисляется непосредственно по формуле (ср. (3.19)): N г—1 / N л\ + <ЗЛ8> г=2 ;=1 1 где t]—средний косинус утла между соседними стрелками. В рассматривае- мом случае cos 0° • exp (E/кТ) + cos 180° • ехр (— E/кТ) Е 11 = ехр (Е/кГ) + ехр (— Е/ кТ) = th (ЗЛ9> и при N > 1 /г2 = №ехр (2Е/«Г). Корреляция, определяемая выгодой параллельного расположения стрелок, удлиняет цепь. Конформационные превращения макромолекул как при плав- лении кристаллического полимера, так и при растяжении цепи кооперативны. § 3.5, Клубок и глобула Макромолекулы и системы, состоящие из них, характеризу- ются взаимодействиями, резко разнящимися по энергии. Сильные, ковалентные связи с энергиями порядка 400 кДж/моль связей определяют последовательность звеньев, которая не меняется благодаря тепловым флуктуациям. Остальные силы, ответствен- ные за конформационные свойства цепи и взаимодействия ее звеньев друг с другом и со звеньями соседних молекул, имеют много меньшие энергии и существенным образом зависят от тем-' пературы. Таким образом, цепь находится в состоянии парциаль- ного равновесия с фиксированной линейной памятью (Лифшиц). Этим определяются важные особенности макромолекул. Полимерный клубок, возникающий вследствие тепловых флуктуаций — поворотов вокруг единичных связей, является рых- лым образованием. На рис. 3.10 показана полученная в модель- ном эксперименте на ЭВМ типичная конформация клубка из 626 звеньев (Балабаев). Клубок как флуктуирующая система характеризуется корреляцией плотности, т. е. связью изменения плотности в одной области пространства, занятой клубком, с из- менением плотности в другой его области. Оказывается, что ра- диус корреляции того же порядка, что и размер клубка. Причиной этого является именно линейная память цепи. Тем самым плот- ность клубка не является его термодинамической характеристи- кой, она не имеет достоверного постоянного значения. Клубок флуктуирует и его флуктуации микроскопичны. Имеет смысл лишь средняя плотность клубка: 76
Гибкость макромолекулы выражается в размерах клубка — ’чем больше эти размеры при том же числе звеньев, тем более жесткой является макромолекула. Существенной характеристикой (гибкости служит персистентная ; Допустим, что цепь состоит ^цое, образующих друг с другом углы (рь ф2, ..., ф1т. Косинус угла между i-м и i + j-м звень- ями равен cos ф(, i+j = 1J.+/Z2 = (cos ф) J, (3.50) где cos ф — среднее значение cos ф. При малых ф cos ф4, i+J« (1 — <pV2) J‘ « ~ехр(—/ф72), (3.51) cos ф1, к+1 « ехр(—^ф^/2) = = ехр(—L/d), (3.52) длина цепи d. из N + 1 звеньев длиною I каж- Рис. 3.10. Конформация клубка где L — контурная длина цепи. Персистентная длина <2, равная d = 21/ц2, (3.53)’ характеризует потерю корреляции между звеньями при движении вдоль цепи. Смысл d следующий: участок цепи, более короткий чем d, можно рассматривать как твердый стержень. Сегменты с длинами d свободно сочленены. Теория выражает значение средней квадратичной длины цёпи через L и d: ТГ = 2d2 (L/d—1 +e~L/d). (3.54) При L « d получим h2 « L2 — цепь вытянута, при L > d имеем h2 « 2Ld — она свернута в клубок со статистическим сегментом длиною 2d, так как L = 2nd (п — число сегментов) и h2 « 4nd2. Даже очень жесткая цепь сворачивается в клубок, если она до- статочно длинна. Далекие друг от друга по цепи звенья могут сближаться в клубке. При этом возникают объемные эффекты (Флори). Взаимодействия звеньев в клубке сходны со взаимодей- ствиями молекул в реальном газе: сильное отталкивание на ма- лых расстояниях и тем самым невозможность нахождения двух мономеров в одном и том же месте и слабое притяжение на боль- ших расстояниях. Приведенные расчеты размеров клубка этих эффектов не учитывают. Тем не менее эти расчеты можно срав- нивать с опытом в так называемой 6-точке. 0 — температура, при которой в Дайном растворителе сйлы притяжения компенсируются силами отталкивания и объемные эффекты отсутствуют. 0-точка 77
подобна точке Бойля реального газа. При Т > 0 доминирует от- талкивание (хороший растворитель), при Т < 6—притяжение^ (плохой растворитель). Клубок раздувается или сжимается. Тео-) рия Флори усовершенствована Хохловым, рассматривавшим клум- бой как облако не мономеров, а квазимономеров, характеризую^- щих коллективные свойства всех мономеров цепи. i Если между звеньями цепи реализуется сильное притяжение при Т < 0 или на клубок действует внешнее сжимающее поле, то он «схлопывается» в ком- пактную структуру — в гло- булу. Этот процесс до неко- торой степени сходен с кон- денсацией газа в жидкость. В отличие от клубка, в глобуле макромолекула име- ет термодинамически досто- — верную структуру. В глобуле флуктуации локальной кон- центрации звеньев малы по сравнению с самой концен- трацией, а радиус корреля- ции флуктуаций концентра- ции много меньше размеров макромолекулы (Лнфшиц). На рис. 3.11 показана типич- ная глобулярная конформа- ция свободно сочлененной с длиной звена 1. Рис. 3.11 сле- Рис. 3.11. Конформация глобулы цепи, состоящей из 626 звеньев дует сравнить с рис. 3.10. Теория перехода клубок—глобула развита Лифшицем, Грос- бергом и Хохловым. Этот переход и состояние глобулы зависят от свойств цепи. Если цепь длинная и ее гибкость мала, т. е. р3»г3, где р2 — среднее квадратичное расстояние между моно- мерами, соседствующими в клубке, а г—величина порядка ра- диуса взаимодействия между звеньями, то при Т < 0 переход по- добен фазовому переходу первого рода со скачком плотности. Если цепь гибкая, т. е. р3 « г3, получается плавный переход вто- рого рода с постепенным разбуханием глобулы до размеров клуб- ка. При р3 » г3 сама глобула является двухфазной системой, со- стоящей из плотного ядра и флуктуирующей «опушки», плотность которой постепенно убывает до нуля. Ядро глобулы сходно о кристаллом, а не с жидкостью. При достаточно низкой темпера- туре короткая цепь образует глобулу без «опушки». Большинство белков в нативном состоянии глобулярно. Изла- гаемая здесь теория существенна для понимания структуры и свойств белков и, в частности, природы их денатурации (см. гл. 4). Гросберг и Шахнович исследовали особенности поведения сопо- лимеров — макромолекул, состоящих из двух и большего числа различных звеньев. 78
§ 3.6. Методы исследования макромолекул При любом химическом строении макромолекулы характеризу- ется определенной молекулярной массой (м. м.) или распреде- лением молекулярных масс и, будучи клубками или глобулами,— размерами и формой. Остановимся на способах эксперименталь- ного определения этих характеристик. \ Среди методов определения м. м. в физике полимеров имеют значение осмометрия, вискозиметрия и седиментация в центри- фуге. Последний метод особенно широко применяется для изуче- ния биополимеров. Осмометрия основана на измерении осмотического давления potM раствора полимера. Согласно закону Вант-Гоффа p„,Jc = RT/M, (3.55) где с — концентрация раствора (в г/см3), М — м. м. (для поли- дисперсных полимеров М — среднечисленная м. м.). Уравнение (3.55) справедливо для идеальных растворов. Для неидеальных растворов (растворы полимеров всегда неидеальиы) Роем ~ ^-c + Bc^ + Cc^ .... (3.56) где В, С и т. д.— второй, третий и т. д. вириалъные коэффициенты. Для разбавленных растворов можно пренебречь третьим и по- следующими членами. График зависимости pacJc от с линеен и позволяет найти М и В. Характеристическая вязкость раствора полимера и — [ц] = Jim -1—\ (3.57) С—*0 Ч0С где ц — вязкость раствора, т|9 — вязкость чистого растворителя. Величина [ц] зависит от М. Оказывается, что для раствора по- лимерных клубков [ц] = Л/И1’, (3.58) причем 0,5 sS а 1,0 в зависимости от проницаемости клубка для растворителя. Для полностью проницаемого клубка а = 1,0, для непроницаемого а = 0,5. Для жестких сфер а = 0, для длинных жестких стержней а = 1,7. Формулой (3.58) можно воспользовать- ся для нахождения м. м., если константы Лиа определены из независимых данных. Седиментационный метод состоит в осаждении макромолекул под действием центробежной силы в ультрацентрифуге, ротор ко- торой вращается со скоростью до 104—105 об/мин. Центробежное ускорение много больше ускорения свободного падения g — в сов- ременных ультрацентрифугах оно доходит до 350000 g (70 000 об/мин). Кювета с раствором полимера, представляющая собой цилиндр с прозрачными окнами из кристаллического квар- 79
ца, помещается в ротор — наблюдение ведется оптическими ме- тодами. Если скорость седиментации значительно превосходит скорость диффузии макромолекул, то они осаждаются. В кювете образу- ются две .области — чистый растворитель и раствор полимера. Между ними находится переходная зона, в которой концентра- ция растворенного полимера с меняется от нулевого до пекото/ ррго максимального значения. По мере седиментации эта зона и ее граница перемещаются. Измеряется скорость движения гра- ницы по направлению к дну кюветы, т. е. от оси. вращения ротора. , На макромолекулу действует центробежная сила Иирмсо2гг где V„ — объем макромолекулы, рм — ее плотность, ы — угловая скорость вращения ротора, х—расстояние от оси вращения. Но в растворе на макромолекулу действует архимедова сила, и эф- фективная центробежная сила равна Им(рм —ро)^2^, где р0 — плотность растворителя. Эта сила уравновешивается силой трения при поступательном перемещении udx/dt (х — коэффициент тре- ния). В расчете на 1 моль получаем ^дГмрм (1 - УмРо) <о2г = х % (3.59} где Л^а — постоянная Авогадро, Ум = Рм* — удельный парциальныГг объем макромолекулы. Но, с другой стороны, АаГмРм = ЛЛ (3.60) Для разбавленных растворов % выражается через коэффициент диффузии D по формуле Эйнштейна k=RT/D. Из (3.59) — (3.6j|) следует формула Сведберга (3.61) (3.62) (3.63) где s — коэффициент седиментации: 1 dx 1 din х С - — —— - ______ w2xdt ш2 dt Размерность s — секунда, обычно коэффициент седиментации из- меряется в сведбергах (S), 1S = 10~13 с. Последовательные во времени положения седиментирующей границы фотографируются в ультрафиолетовом свете. Измерив- s, D, рм и р0, можно определить М. Величина s зависит от кон- центрации раствора вследствие гидродинамического взаимодей- ствия молекул. Значение s, экстраполированное к нулевой кон- центрации, s0 = lim (3.64) C->0 80
называется константой седиментации. Она тем выще,.;чем больше- \М. Так, значения s0 для миоглобина 2,0 S, для гемоглобина 4,5 S, для фикоэритрина 12,0 S. Соответствующие значения м. м. 17 600, 68 000, 290000. При меньших скоростях вращения ультрацентрифуги может установиться равенство встречных седиментационного и диффу- зионного потоков. При достаточно больших коэффициентах диф- фузии равновесие устанавливается быстро и наблюдается равно- весное распределение вещества. Если с — концентрация растворенного полимера на расстоянии х от оси вращения, то число молекул, седиментирующих за вре- мя dt через единицу поверхности, перпендикулярной оси х, равно dx -1л Cdtdt’ (3.65) где dx/dt—скорость седиментации на расстоянии х. За то же время dt количество диффундирующего через то же сечение раст- воренного вещества равно D(dc/dx)dt. В равновесии dx _ de > ' С — = D -г. dt dx Но, согласно (3.62) и (3.63), dx 2 М(1-Ёмр) 2 — = SC02X = -------------------—БТр--- D«>2x. at ni Подставляя (3.66) в (3.65), получаем второе уравнение га, уже не содержащее коэффициента диффузии D: М =______—______—е (1-ЁмР0)Л dx • Интегрируя это уравнение в интервале между xt и х2, находим м. 2RT In (с2/сг) О-^мРо)*02 *2-*i ’ В методе Арчибальда, требующем меньших затрат вещества и времени, исследуется не само равновесие, а приближение к нему. Потоки вещества через мениск и дно кюветы нулевые, незави- симо от достижения равновесия. Из (3.65) и (3.66) следует 1 1 / dc\ 11/jc\ so2 — % Wo ~ ' Индекс m относится к мениску, 0 — к дну кюветы. Из, (3.69) и (3.66) получаем м _ RT (dc/dx)m (1-ЁмР>2 * м = {dc/dx}° (1-^мРо)“2 Vo ‘ Для гомогенного полимера эти два значения М совпадают. 6 М. В. Волькенштейн 81 (3.66> Сведбер- (3.67} (3.68) (3.69) (3.70)
Для биофизики важен метод седиментации в градиенте плот- пости. В концентрированном растворе низкомолекулярного ве- щества (в CsCl, в сахарозе и т. д.) при ультрацентрифугирова- нии устанавливается градиент концентрации, т. е. градиент плот- ности растворителя макромолекул dp0/dx. В таком растворе макро- молекулы будут располагаться в той части кюветы, в которой s = 0, т. е. согласно (3.66), Гмро = 1 или р0 = рм. Иными словами, макромолекулы локализуются в той области кюветы, где плот- ность концентрированного раствора совпадает с плотностью макромолекул (рм измеряется непосредственно). Гетерогенная смесь макромолекул разделяется и наблюдается спектр плотно- стей. Этот метод с большой эффективностью применяется при изучении нуклеиновых кислот. Диффузия описывается уравнением Фика <3-71> С помощью (3.71) находится D. Градиент концентрации и ско- рость ее изменения определяются оптическими методами. В спе- циальной кювете осторожно наслаивают чистый растворитель на раствор и исследуют преломление или интерференцию света. Для реальных растворов достаточно высокой концентрации вместо формулы Эйнштейна (3.61) справедливо выражение (ср. (3.56)). D =^(НТ+ 2ВМс + ЗСМс2+ ...),. (3.72) т. е. D зависит от концентрации. Коэффициент трения х зависит от формы макромолекулы и ее проницаемости для растворителя. Для твердых сфер радиуса г справедлив закон Стокса хсф = блцог. (3.73)' Для несферических частиц коэффициенты трения различны для направлений движения, совпадающих с продольной и поперечной осями частицы. Средний коэффициент трения для эллипсоида больше, чем для сферы того же объема. Для длинных стержнеоб- разных молекул коэффициент трения и вязкость особенно велики. Информацию о м. м. и форме макромолекул дают оптические методы исследования. Интенсивность света, рассеянного раство- ром полимера, зависит от М. Вследствие рассеяния интенсивность света, проходящего через раствор, ослабляется по закону Z = Zo ехр(—%Z), (3.74)' где Zo — интенсивность падающего света, I — путь, проходимый лучом света в растворе, %—коэффициент мутности. Теория рас- сеяния света дает Х = (3.75) 82
где 4л2п2 / J \2 я =—. (3.76> Здесь Иц и и — показатели преломления растворителя и раствора, к — длина волны света, NA — постоянная Авогадро. Значение ЛГ находится из измерения коэффициента мутности. При рассеянии света макромолекулами, размеры которых со- измеримы с длиной волны света, наблюдается эффект Ми — спе- цифическая угловая зависимость интенсивности рассеянного све- та: большая интенсивность света, рассеянного вперед, чем назад. Эффект Ми определяется интерференцией световых волн, которые рассеиваются разными частями молекулы с различающимися фазами. С эффектом Ми связан забавный эпизод в истории биофизики. В спектре крови не удавалось наблюдать некоторые полосы по- глощения, свойственные гемоглобину в растворе. На этом осно- вании утверждалось, что гемоглобин в эритроцитах находится в измененном состоянии. В дальнейшем выяснилось, что поглоще- ние света гемоглобином маскировалось эффектом Ми — усилен- ным рассеянием света вперед эритроцитами. Дебай вычислил функцию рассеяния Р($), т. е. отношение интенсивности света, рассеянного под углом Ф, к интенсивности падающего света: P(ft) = 7*/Z0, (3.77) для макромолекул различной формы — для сфер, эллипсоидов, стержней. Измерение функции рассеяния дает возможность оп- ределить форму макромолекулы. Метод Зимма позволяет одно- временно измерять м. м. и размеры макромолекул. Весьма ценную информацию о биополимерах дает изучение- рассеяния рентгеновских лучей их растворами (см. гл. 5). Для определения формы макромолекул (а также их анизо-, тропной поляризуемости) пользуются и двойным лучепреломле- нием в потоке (динамооптический эффект Максвелла). Динамо- оптиметр представляет собой два коаксиальных цилиндра, между стенками которых находится исследуемая жидкость — раствор полимера. Внутренний цилиндр — ротор — вращается вокруг об- щей оси, увлекая за собой жидкость. В ней устанавливается гра- диент скорости — слой, примыкающий к стенке ротора, движется с наибольшей скоростью, слой, примыкающий к стенке непод- вижного цилиндра, неподвижен. В результате макромолекулы ориентируются в растворе и подвергаются растягивающему уси- лию. Жидкость становится анизотропной, подобной двухосному кристаллу. Двойное лучепреломление наблюдается в направле- нии, параллельном оси динамооптиметра. Его измерение дает ука- занные сведения. 6* 83
Напротив, метод двойного лучепреломления в электрическом юле (эффект Керра) мало перспективен в случае биополимеров. Биополимеры являются полиэлектролитами — макромолекулы не- сут на себе заряды и поэтому не только ориентируются, но И перемещаются в электрическом поле. § 3.7. Полиэлектролиты Многие макромолекулы, в том числе белки и нуклеиновые кислоты, в водном растворе являются макроионами, несут мно- жество заряженных групп. Такова, например, полиметакриловая кислота Г_С(СН3)-СН-] I COO" Jn являющаяся полианионом. Биополимеры представляют собой по- лиамфолиты, т. е. Они содержат и анионные, и катионные груп- пы. В белках фигурируют кислотные (Глу, Асп, Тир) и основ- ные (Apr, Гис, Лиз) остатки (см. с. 25), в нуклеиновых кисло- тах наличествуют кислотные фосфатные группы и основные груп- пы Ns®, HN=, H2N— азотистых оснований. Существуют как твердые макроионы (глобулярные белки и др.), так и гибкие полиэлектролитные цепи. Очевидно, что свой- ства таких макромолекул существенно зависят от взаимодейст- вия содержащихся в них зарядов. Величины этих зарядов опре- деляются степенями диссоциации ионогенных групп и окружаю- щей их ионной атмосферой. Конформация гибкой полиэлектролитной цепи определяется условием минимума для суммы конформационной и электрической свободной энергий. Естественно, что наличие одноименных заря- дов в цепи означает их взаимное отталкивание, которое приводит к развертыванию клубка, к увеличению его размеров. Электро- статическая свободная энергия клубка вычисляется с учетом ионной атмосферы. Флори построил теорию размеров цепей поли- электролитов, сходную с предложенной им же теорией объемных эффектов (с. 77). Предполагается, что клубок вместе с иммоби- лизованным им растворителем в целом электрически нейтрален. Расчет показывает, что электростатические взаимодействия не могут превратить клубок в вытянутую цепь — происходит лишь раздувание клубка. Это согласуется с экспериментальными дан- ными— с зависимостью характеристической вязкости [ц] от м. м. В более строгой статистической теории заряженных макромоле- кул учитывается, что из-за экранирования противоионами заря1- женные группы макромолекулы, расположенные далеко друг от друга по цепи, взаимодействуют лишь при случайном их сбли- жении в результате флуктуаций. Из этой теории следует, что конформационные свойства заряженных макромолекул занимают «4
промежуточное положение между свойствами ненабухших ста- тистических клубков и жестких стержней. Для полиэлектролитов 7? М43 и [ц] ~ (ср. с. 79). Эти результаты согласуются с опытом (в частности, для денатурированной ДНК). Квадрат .коэффициента линейного набухания пропорционален 7-2/3 (Z — ионная сила, с. 29). Наибольшая степень развертывания макромолекулы поли- электролита достигается при низкой ионной силе. На рис. 3.12 Рпс. ЗЛ2. Зависимость радиуса инерции моле- кул метакриловой кис- лоты от степени диссо- циации карбоксильных групп показано влияние заряда на радиус инерции макромолекулы полиметакриловой кислоты. Эти данные получены методом све- торассеяния для растворов, не содержащих солей. Степень диссо- циации поликислоты регулируется добавлением основания. При этом, конечно, ионная сила не остается постоянной. Набухание клубка увеличивается с разбавлением раствора, так как уменьшение концентрации полиэлектролита при постоян- ной степени диссоциации означает уменьшение ионной силы. Для получения информации о структуре и свойствах макромолекул яолиэлектролитов в растворах пользуются изоионным разбавле- нием: раствор полиэлектролита разбавляется раствором соли с ионной силой, равной ионной силе наиболее концентрированного раствора полиэлектролита, с тем, чтобы сохранить постоянной общую концентрацию противоионов. В этих условиях (ц — Цо)/т]оС линейно зависит от с. Противоионы могут связываться заряженными группами поли- электролита специфически — такое связывание зависит от хими- ческой природы и макроиона, и малого иона. Следует отличать это специфическое связывание, сводящееся к образованию солевых связей в фиксированных точках макромолекулы, от неспецифи- ческого связывания — образования ионной атмосферы. В солевой связи противоион находится на значительно меньшем расстоянии от заряженной группы полииона, чем расстояние между этой группой и подвижными противоионами. Специфическое связыва- ние противоионов определяет ионообменные свойства полиэлект- ролитов, имеющие важные практические применения. Сшитые по- перечными связями нерастворимые полиэлектролиты, набухающие в воде или в других жидких средах, применяются в качестве ионообменных смол или ионитов. Иониты способны сорбировать определенные ионы из растворов, что находит применение при 85
очистке и разделении различных электролитов и при очистке неэлектролитов от ионных примесей. В полиамфолитах и, следовательно, в биополимерах возможно образование солевых связей между катионными и анионными группами в одной цепи или в разных цепях. Исследования строе- ния и свойств биополимеров обязательно должны учитывать их полиамфолитную природу, а, значит, pH и ионную силу среды. Структура нативных (т. е. биологически функциональных) моле- кул белков и нуклеиновых кислот в значительной мере опреде- ляется электростатическими, ионными, взаимодействиями. Не менее важны взаимодействия с малыми ионами окружающей среды. Взаимодействие белков с ионами К+, Na+, Са++, Mg++ оп- ределяет важнейшие биологические явления, в частности, генера- цию и распространение нервного импульса и мышечное сокра- щение. Функциональная структура нуклеиновых кислот и их участие в биосинтезе белка также связаны с катионами щелоч- ных и щелочноземельных металлов. Свойства полиэлектролитов позволяют моделировать механо- химические процессы, в частности, мышечное сокращение (см. гл. 12). Полиэлектролитными свойствами белков определяется воз- можность их разделения и исследования методом электрофореза.
Глава 4 ФИЗИКА БЕЛКА § 4.1. Задачи физики белка Белки — непременные участники всех процессов жизнедея- тельности. Белки-ферменты катализируют все химические, электрохимические и механохимические процессы в клетках и в организмах. Важнейшей функцией белков можно считать фер- ментативную. Специализированные ферменты служат катализа- торами всех метаболических реакций, репликации ДНК, тран- скрипции текста ДНК в текст мРНК, трансляции этого текста при биосинтезе белка. Белки являются и регуляторами генети- ческих функций нуклеиновых кислот. Регуляторные ферменты, называемые аллостерическими (гл. 6), обеспечивают обратные связи в метаболических цепях. Движение клеток и организмов, выполнение ими механиче- ской работы (например, мышечной) производятся особыми со- кратительными белками, служащими рабочими веществами этих процессов. Сократительные белки выполняют ферментативную, АТФ-азную функцию, реализуют превращение химической энер- гии (запасенной в АТФ, с. 40) в механическую работу. «Зарядка аккумулятора», т. е. окислительное фосфорилирование, происхо- дит в мембранах митохондрий при непременном участии фер- ментов дыхательной цепи. Окислительно-восстановительные фер- ментативные процессы происходят и при фотосинтезе. Другие мембранные белки ответственны за активный транспорт молекул и ионов сквозь мембраны и, тем самым, за генерацию и распрост- ранение нервного импульса. Белки определяют все метаболиче- ские и биоэнергетические процессы. В организмах животных некоторые специальные белки выпол- няют особые функции. Белки служат для запасания (миоглобин) и переноса (гемоглобин, гемоцианин) кислорода. Некоторые низкомолекулярные белки, точнее, полипептиды, являются гор- монами (с. 50). Гамма-глобулины высших организмов защищают их от чужеродных биополимеров, функционируя в качестве анти- тел — в иммунных процессах. Наконец, белки, входящие в состав соединительной ткани, хрящей и сухожилий, а также белки ко- жи, волос и перьев выполняют опорную функцию, обеспечивая надежную и в то же время подвижную взаимосвязь органов, це- лостность организма и его защиту от внешних воздействий. 87
Можно сказать, что белки являются обязательными участни- ками запасания, передачи, трансформации и рецепции химиче- ских сигналов — макромолекул, молекул и ионов — в живых си- стемах. Во многих случаях сигналами, их рецепторами и пре- образователями служат сами белки. Белки, входящие в состав, рецепторных систем организма, перекодируют внешние сигналы на химический и электрохимическим язык. Молекулы белков — самые сложные из известных науке. Их: биологически функциональная пространственная структура, а так- же структура надмолекулярных систем, содержащих белки (мем- браны и др.), определяются как химическими связями в белковых цепях, так и целой гаммой слабых взаимодействий. Нативные белки никогда не являются статистическими клубками. Белковые глобулы — апериодические кристаллы сложной структуры. Это не статистические, но динамические системы, своего рода машины,, поведение которых зависит от положения и свойств всех их эле- ментов. Наряду с глобулярными существуют фибриллярные бел- ки — сократительные и опорные. Денатурация белка, т. е. утрата им биологической функцио- нальности при нагревании, воздействии кислот, оснований и дру- гих веществ, состоит в разрушении слабых взаимодействий и в конечном счете в превращении конденсированного тела (глобу- лы или фибриллы) в статистический клубок. Определим основные задачи физики белка. 1. Теоретическое и экспериментальное исследование струк- туры белковых молекул и содержащих такие молекулы надмо- лекулярных систем. 2. Исследование динамического поведения белковых молекул и белковых кристаллов. Изучение денатурации белков. 3. Установление связи между первичной и высшими струк- турами белков в их нативном состоянии. 4. Изучение физических аспектов возникновения и измене- ний, белков в ходе биологической эволюции. 5. Изучение взаимодействий белков с нуклеиновыми кисло- тами как факторов, определяющих регуляцию генов. 6. Изучение физических механизмов, лежащих в . основе раз*- личных биологических функций белков, прежде всего фермента- тивной активности. 7. Изучение физических аспектов белковой инженерии — ме- тодов получения белков с заданными свойствами. Решение этих задач будет означать раскрытие сущности био- логических явлений на молекулярной основе. § 4.2. Конформации полипептндной цепи Для понимания структуры белка необходимо рассмотреть воз- можные конформации полипептндной цепи. Они определяются, прежде всего, плоским строением пептидной связи —СО—NH—• (с. 32). Структурные параметры пептидных единиц, установлен- 88
аые в результате рентгенографического исследования пептидов м родственных им соединений, приведены в табл. 4.1. Смысл обозначений С“ и С9 ясен из рис. 4.1; X и Y — атомы, -с которыми связан С“ как в основной цепи, так и в привеске R. Полностью вытянутая цепь (без деформации валентных углов Таблица 4.1. Структурные параметры пептидных единиц: длины связей и углы между ними Связи Длины, нм Углы, град Связи Длины, нм Углы, град •С“-С 0,153 C“CN 114 N—Н 0,100 CNH 123 <С—N 0,132 OCN 125 с“—с₽ 0,154 HNCa 114 N—С“ с=о 0,147 0,124 С“СО CNC“ 121 123 с“-н 0,107 XC“Y 109,5 и изменений длин связей) имеет транс-конформацию с нулевыми значениями углов поворота 0, ф и и (рис. 4.1). Однако' такая конформация не является наиболее стабильной. Атомы Н иминных групп N—Н образуют водородные связи с ато- мами О карбонильных групп: \С=О----Н— (см. § 4.3). Нахождение наиболее устойчивой- конформации полипептид- ной цепи требует минимизации ее полной энергии, включая энер- гию внутримолекулярных водородных связей. Полинг и Кори определили наиболее устойчивые конформации полипептидной цепи, основываясь на данных рентгеноструктур- ных исследований и на рассмотрении плотной упаковки цепей с максимальным числом водородных связей. Таких конформаций три. Это, во-первых, а-спираль, показанная на рис. 4.2. Она ха- рактеризуется поворотом вокруг оси на 100° и перемещением вдоль оси на 0,15 нм на каждое пептидное звено. Соответственно на один полный виток спирали приходится 3,6 пептидной еди- ницы и смещение вдоль оси на 0,54 нм. Водородные связи обра- зованы между С=О-группой данной единицы и Н—N-группой четвертой предшествующей единицы. Такие связи реализуются между всеми аминокислотными остатками, за исключением про- лила (Про), не содержащего N—Н-группы. а-Спираль может быть правой и левой. В первом случае Ф — 132°, ф = 123°, во вто- ром — Ф = 228°, ф = 237° (углы отсчитываются от плоской транс- конформации цепи). Конформация а-спирали определяется, в част- ности, плоским расположением атомов —СО—NH—. Вторая и третья конформации с максимальным насыщением водородных связей — параллельная и антипараллелъная ^-фор- мы — показаны на рис. 4.3 и 4.4. Это конформации уже не от- 89
дельной цепи, но совокупности цепей, образующих слоистую структуру. Цепи в ^-формах не имеют плоского, тракс-строения (рис. 4.5). В параллельной ^-форме Ф — 61°, ф = 239°, в анти- параллельной Ф = 380°, ф = 325°. Очень важна возможность образования [J-формы и в отдельной полипептидной цепи в результате ее систематических изгибов. Схематическое изображение такой кросс-^-формы показано на рис. 4.6. В местах изгибов углы поворотов име- ют значения, отличные от свойствен- ных упорядоченным участкам. Таким образом, водородные связи стабилизуют выделенные конформации полипептидной (белковой) цепи в ра- створе. Выделенную конформацию при- нято называть вторичной структурой цепи. Наличие вторичной структуры, имеющей периодичность, означает сход- ство цепи с кристаллом: а-спираль по- добна одномерному, а. ^-форма — дву- мерному кристаллу. а- и fl-формы не единственные. В частности, фибриллярные белки (§ 4.9) обладают другими конформациями. Рассмотрим теперь зависимости энер- гий полипептидной цепи от углов внут- реннего вращения Ф и ф — так на- Рис. 4.2. Схема a-спи- рали Рис. 4.1. Фрагмент бел- ковой цепи зываемые стерические карты, подобные геодезическим. Конформационная энергия цепи определяется слабыми взаимо- действиями валентно несвязанных атомов. Вследствие плоского строения пептидной группы углы поворота Ф^ ф( i-ro звена прак- тически не зависят от углов 0i+i, ф<+1 соседнего звена. Если углы Ф{, ф, варьируют в области значений, не запрещенных перекры- ванием атомов пептидных групп, соединенных связями i-ro и (i+ 1)-го звеньев, и если одновременно варьируют углы Ф,+1, ф1+1, то не существует такой комбинации этих четырёх углов, при которой возможно стерическое взаимодействие i-ro звена с (i+2)-M. Тем самым полипептидная цепь имеет ограниченную 90
кооперативность, ближние взаимодействия в ней ограничены бли- жайшими соседями. Это позволяет рассматривать порознь кон- формационные энергии для отдельных аминокислотных остатков. Стерическая карта для данного остатка существенно зависит от Рис. 4.3. Схема параллельной f-формы. Слева — отдельная цепь Рис. 4.4. Схема антипараллельиой f-формы. Слева — отдельная цепь природы его радикала R. Можно считать, что взаимодействия в данной паре пептидных групп характеризуют аминокислотный остаток, соединяющий эти группы. Рамачандран исследовал ди- 91
пептид глицил-£-аланин и получил конформационную (стериче- скую) карту для аланина. Расчет проводился на основе простей- шего предположения об атомах как твердых сферах, имеющих ван-дер-ваальсовы радиусы, определяемые из данных по меж- атомным расстояниям в молекулярных кристаллах. В табл. 4.2: Рис. 4.5. Структура полипептидной цепи в fj-форме Рис. 4.6. Схема кросс-$- формы приведены эти расстояния, чаще всего наблюдаемые в кристал- лах, и минимальные расстояния, наблюдаемые лишь в немногих случаях. Пользуясь потенциалом твердых сфер, можно, очевидно, по- лучить только разрешенные и запрещенные области значений Ф Таблица 4.2. Контактные расстояния между атомами в полипептидах Пара атомов Обычное рас- стояние, нм Минимальное расстояние, нм Пара атомов Обычное рас- стояние, нм /Минимальное 1 расстояние, нм с с 0,32 0,30 О N 0,27 0,26 С О 0,28 0,27 О Н 0,24 0,22 С N 0,29 0,28 N N 0,27 ' 0,26 С н 0,24 0,22 N Н 0,24 0,22 О О 0,28 0,27 Н Н 0,20 0,19 и ф. На рис. 4.7 показана такая карта для аланипа. Сплошными линиями обведены области, разрешенные при обычных межатом- ных расстояниях, пунктирными — при минимальных расстояниях. На карте указаны значения Ф и ф для правой и левой «-спира- лей (aD и aL), параллельной и антипараллельной p-форм (рпирап} и для фибриллярного белка — коллагена (К). Аналогичные кар- ты были получены для других остатков. Естественно, что с уве- личением размера радикала R область разрешенных значений Ф и ф уменьшается. 92
Более строгие расчеты проводились с помощью потенциала (ср. с. 63) U (0.,, ф) = l/2U# (1 — cos 30) + 1/2U<^ (1 — cos Зф) + 2 U (ri}j +UK. • (4.1} Потенциал U (г„) можно взять в форме «6—12» Леппард- Джонса или «6— ехр» (с. 64); UK характеризует кулоновское. Рис. 4.7. Стерическая карта для Л-аланина (Рамачандран) электростатическое взаимодействие между соседними парами пептидных групп, определяемое их большими дипольными мо- ментами, достигающими 3,7 D. Барьеры и 6% находят из данных, полученных при ис- следовании модельных малых молекул. По-видимому, 2,1 < U& < <5,5 кДж/моль (2,1 — барьер для Н3С—СО—ОН; 5,5 — для? Н3С—СО—С1); U$ < 6,3 кДж/моль. Эти барьеры малы, заметно меньше, чем для углеводородов. Константы для потенциала «б-ж-12» представлены в табл. 3.2 (с. 64). Расчет UK затруднен тем, что неизвестно значение ди- электрической проницаемости е, фигурирующей в законе Кулона: ei е • (4.2> где е„ е, — заряды на атомах i и j. Если между взаимодействую- щими атомами нет других атомов или молекул растворителя (во- ды), то е « 3. Это значение соответствует углеводородному, орга- ническому окружению. Для атомов О и N, соединенных водородной связью, можно воспользоваться функцией Е7ВС. = Un + UK, определяемой из зна- 93
'чений энергии водородной связи, и равновесными расстояниями О-Н—N. Выражение (4.1) не учитывает искажений длин связей и ва- лентных углов, которые, по-видимому, малы. Оно характеризует изолированную полипептидную цепь. При наличии водного окру- жения следует учитывать изменение свободной энергии молекул Рис. 4.8. Стерическая карта для Лалашша (Флори) Н2О, удаляемых’из сольватной оболочки при контакте между атомами. Строго говоря, нужно минимизировать сумму внутри- молекулярной потенциальной энергии и свободной энергии раст- ворителя. На рис. 4.8 показана стерическая карта для аланина. Цифры у кривых указывают значение (в ккал/моль) энергии U (4.1). Проведены геодезические линии, отвечающие энергиям от 4 до 20 кДж/моль. Крестиком отмечен минимум энергии. Поучительно сравнить карты рис. 4.8 и 4.7. ’ § 4.3. Водородная связь и структура воды Итак, вторичные структуры белковых цепей стабилизованы водородными связями, играющими также большую роль в кон- формационном строении нуклеиновых кислот и углеводов. Биополимеры функционируют в водном окружении. Особые свойства воды, благодаря которым она является незаменимой компонентой клеток и организмов, также определяются водород- ными связями. Остановимся на природе и свойствах водородной связи (см. с. 58). 94
Наличие водородных связей сильно сказывается на физиче- ских и физико-химических свойствах веществ. Межмолекулярные водородные связи определяют ассоциацию молекул. Ассоцииро- ванные вещества характеризуются сравнительно .большими т§п- лотами испарения, высокими температурами плавления и кипе- ния и большими их разностями. Сравним четыре вещества (табл. 4.3), состоящие из изоэлектронных молекул. Метан — не- ассоциированное вещество, остальные ассоциированы водородны- ми связями. Таблица 4.3. Свойства изоэлектронных веществ Вещество Гпл. К ^КИП’ К Молярная теплота испа- рения, кДж/моль Молярный объем, см3/моль Фтористый водород HF 181 292 30,2 20,2 Вода Н2О 273 373 40,8 18,0 Аммиак H3N 195 240 23,4 20,8 Мотан Н4С 89 112 9,3 34,0 Сравним свойства двух изомерных веществ: этанола и ди- метилэфира (табл. 4.4). В этанол входит группа ОН, образующая водородную связь. В диметилэфире таких связей нет. Вещества, ассоциированные водородными связями, имеют боль- шие значения диэлектрических проницаемостей е. Так, при 20°С Таблица 4.4. Свойства этанола и диметилэфира Вещество ^ПЛ’ К ^КИП» К Молярная теплота ис- парения, кДж/моль Этанол С2НБОН Диметилэфир (СН3)20 161 135 351 249 42,8 18,7 е воды — 80, HCN — 95, формамида HCONH2 — 84, NH3 — 15,5. В то же время е для диэтилэфира (С2Н5)2О равна 4,3. Структурные исследования кристаллов, содержащих водород- ные связи, показывают, что при связывании атомом водорода двух электроотрицательных атомов А и В (О, N, F, С1) расстояние между ними гАВ меньше суммы ван-дер-ваальсовых радиусов. Суммы этих радиусов равны: 00 — 0,28, ON — 0,30, NN — 0,33 нм. При наличии водородных связей расстояние уменьшено в О—Н—О до 0,255, в O-H--- N до 0,280, в N-H - 0 до 0,288, в N—H --N до 0,310 нм. Водородная связь ярко проявляется в оптических спектрах и в спектрах ЯМР. Характеристические частоты колебаний групп, содержащих атом Н, например, О—Н-, N—Н-групп, понижаются, 95
если водород образует водородную связь. Так, в мономерной му- равьиной кислоте Н—СО—ОН частота колебаний группы О—Н равна 3682 см-1, а в димере, стабилизованном водородными сви- лями, Н-С уО....Н-О\ \О—Н....О/ С-Н сна равна 3080 см-1. Меняются и другие частоты мономера. Инфракрасные полосы поглощения О—Н-групп сильно расширя- ются при образовании водородной связи, их интенсивности сильно возрастают,. Водородная связь влияет на электронные спектры, сдвигая тгл*-переходы (ср. с. 142) в коротковолновую сторону. В спектрах протонного магнитного резонанса (ПМР) наблюда- ются химические сдвиги, вызванные водородной связью. Спектро- скопия ПМР — наилучший метод изучения водородных связей. Энергия водородных связей определяется из термодинамичес- ких свойств соответствующих веществ, из спектров и т. д. Термо- динамические функции выражаются через константу равновесия гг________Активность соединения____[ А—Н- • • В) ,, ,,, Произведение активностей реагентов ~ [АН] [В] ' \ ’ Квадратные скобки обозначают концентрации. Свободная энер- гия образования водородной связи AG = АЯ-Т А5 = -ЯТ1п A, (4.4)" где ДЯ — энтальпия, Д5 — энтропия образования связи. Из (4.4) следует ДЯ = ЯГ . (4.5) \ дТ /р ' ' Значения ДЯ порядка 12—30 кДж/моль: для воды 11,8, для льда 25,6, для аммиака 15,5—18,5, для HF 28,1—29,4 кДж/моль. Водородная связь с углеродом образуется лишь в немногих случаях (HCN, хлороформ СНС13 в смеси с пиридином C5H;,N и др.). Водородная связь всегда соединяет два электроотрицательных атома. Атом Н не обобществляется полностью атомами А и В; обозначение А—Н- • • В, в котором сплошная черта означает ко- валентную связь, а пунктир — водородную, имеет реальный смысл. Рентгенография не позволяет непосредственно определить положенпе атома Н (см. с. 132), но оно устанавливается методом нейтронографии (с. 139). В системе О—Н-•• О, например, кова- лентная связь существенно короче и, значит, прочнее водородной. В системе происходят переходы О—Н- • • 0^0- • и—о. Кривая зависимости энергии от положения атома водорода в си- стеме О—Н- • • О (скажем, в димере муравьиной кислоты) имеет два симметричных минимума, разделенных барьером. Квантовая механика нозволяет рассмотреть водородную связь количествен- «6
но, вычислить ее энергию и длину в разумном согласии с опы- том. Водородная связь имеет сложный характер, в ее энергию вносят вклады и электростатические, и дисперсионные, и кван- товомеханические (определяемые делокализацией протона .и электронов) взаимодействия. Структура воды и льда определяется водородными связями, образовать четыре водородных Каждая молекула воды может связи с соседними молекулами (рис. 4.9), расположение этих связей тетраэдрическое. Обыч- ный лед (лед I) имеет гексаго- нальную кристаллическую ре- шетку, каждый атом кислорода в решетке расположен в цент- ре тетраэдра, в вершинах кото- рого находятся соседние ато- мы О. Расстояния О-•••О рав- ны 0,276 нм. В элементарную ячейку входят четыре молеку- лы. Молекулярная решетка льда очень рыхлая, с больши- ми пустотами, так как ее координационное число мало. Именно поэтому лед легче во- ды. Это свойство льда не уни- кально, им обладают также кристаллы алмаза, кремния н Рис. 4.9. Схема структуры воды германия, имеющие сходное строение. Льдоподобная структура сохраняется и в жидкой воде, но с тем большими нарушениями, чем выше температура. Говоря о структуре воды, следует иметь в виду масштаб времени, в ко- тором эта структура регистрируется. В кристалле льда молекулы Н2О испытывают колебания, повороты и редкие трансляционные перемещения. На мгновенном снимке с временем экспозиции т, много меньшим периода колебаний ткол ~ 2 10~13 с, получается мгновенная, или М-, структура, показанная на рис. 4.10, а. За время т, много большее ткол, но значительно меньшее времени вращательной диффузии тдяф ~ 10-5 с, колебания усредняются и мы увидим на снимке регулярно расположенные, но случайным образом ориентированные молекулы—К-структуру (рис. 4.10,6). Наконец, при т > тДиф, т. е. в обычном опыте, получится диффу- зионно усредненная К-структура (Д-структура) (рис. 4.10, в). В жидкой воде М- и К-структуры подобны кристаллическим, но Д-структура размыта перемещениями молекул. Если мысленно поместить фотокамеру на молекулу Н2О и регистрировать окру- жающие молекулы во время движения данной, то получится Д-структура жидкости, являющаяся усреднением ее К-структур. Применяя различные методы исследования с разными време- нами опыта т, мы будем получать сведения о различных типах 7 м. в. Волькенштейн ОТ
структуры (рис. 4.11). Термодинамические свойства характери- зуют, естественно, Д-структуру жидкости. Укажем, что наибольшие времена релаксации в воде имеют порядок 10~5 с (тдиф для льда). Иногда публикуемые утвержде- ния о том, что вода якобы «запоминает», что с ней делали — Рис. 4.10. Мгновенная (а), колебательно-усредненная (б) и диффузионно- усредненная (в) структуры воды нагревали или замораживали, «омагничивали» или «диспергиро- вали» (т. е. усиленно взбалтывали),— основаны на плохих опы- тах и не имеют отношения к науке, равно как и сообщения о «живой» и «мертвой» воде, получаемой посредством электролиза. Д-структура К-структура М-структура Рентген Тернодиястика , Рассеяние сВета {м3О’) 2 -4 -6 Ч---1--1—4----Н— (бода’0") -Ю -12 -/4 -16 . —I---1--4—4----4—4---1--1 Диэлектрическая релаксация Поглощение ультразвука Неупругое рассеяние нейтронов НолеЗателбные спектры Рис, 4.11. Временные интервалы 1g т (т — в с), соответствующие различным методам исследования структуры воды и льда К выдумкам относятся и особые свойства талой воды или воды, «термически активированной». Рентгенография воды дает функцию радиального распределе- ния, т. е. относительное содержание молекул, находящихся на тех или иных расстояниях друг от друга. При температурах от 4 до 120 °C главный максимум этой функции постепенно смеща- 98
стся от 0,282 до 0,294 нм. Координационное число в этом интер- вале равно в среднем 4,4 (укажем, что в жидком Ne это число равно 8,6, в Аг—10,5). Таким образом, вода квазикристаллична, каждая молекула имеет в среднем четыре соседа. Предложен ряд теоретических моделей структуры воды, согласующихся с этими данными, но однозначный выбор структуры пока затруднителен. Однако можно считать установленной интерпретацию важнейших физических свойств воды и. прежде всего, зависимость удельного объема от температуры. Минимум удельного объема при 4“С объясняется конкуренцией двух процессов. Первый — разрушение упорядоченной льдоподобной структуры с малым координацион- ным числом (4), сопровождающееся уменьшением объема. Это — продолжение плавления. В одной модели уменьшение объема свя- зано с заполнением полостей рыхлой решетки мономерными мо- лекулами Н2О, в другой — изгибание водородных связей приводит к сближению соседних молекул, т. е. к уменьшению объема. Вто- рой процесс, превалирующий при Т > 4°С,— термическое расши- рение жидкости вследствие возрастания амплитуд ангармониче- ских межмолекулярных колебаний. § 4.4. Переходы спираль — клубок Конформации полипептидных цепей, стабилизованные водо- родными связями, устойчивы лишь в определенных условиях. Изменения температуры, растворителя, pH среды приводят к переходам порядок — беспорядок, к превращению регулярной конформации цепи в статистический клубок. Эти процессы удоб- но изучать на модельных гомополимерах — синтетических поли- аминокислот ах. Многие полиаминокислоты, в частности полиглутаминовая кислота (ПГК) и ее производное поли-у-бензилглутамат (ПБГ) СО—СН—NH— 1 I сн —сн —со—о—сн —с н л Л й и о п фигурируют в растворах в форме а-спиралей, что доказывается их гидродинамическими и оптическими свойствами. Доти уста- новил, что переходы спираль — клубок весьма резки, сходны с фазовыми переходами — происходит своего рода плавление а-спи- ралей, одномерных кристаллов. На рис. 4.12 показана зависимость степени иош^ации, характеристической вязкости [ц] и удельного оптического вращения <руд ПГК от pH среды. Вблизи pH 6 про- исходит резкое падение [ц] и <руд и возрастание степени иониза- ции. При pH 6 ПГК — спираль, при pH 6 — клубок. В отличие от ПГК, ПБГ растворяется в органических растворителях. В дихлор- этане, хлороформе, формамиде ПБГ образует жесткие стержни — а-спир‘али. Напротив, в растворителях, молекулы которых обра- зуют с ПБГ водородные связи,— в трихлоруксусной кислоте и др.— ПБГ находится в форме клубков. При постепенном изме- 7* 99
нении состава растворителя, например, бинарной смеси СНС13 и СН2С1СООН, в некоторой узкой области (при 80% СНС13), спи- раль превращается в клубок. Резкость перехода, S-образность соответствующих кривых (например, кривая <руд на рис. 4.12) свидетельствуют о коопера- тивном характере превращения. Причина кооперативности очевид- Руд [?] Рис. 4.12. Графики зави- симости степени иони- зации, [ц] и фуд от pH среды в области перехо- да спираль — клубок в ПГК на из рассмотрения строения а-спирали. Конформации пептид- ных звеньев цепи взаимозависимы, так как водородная связь между группой С=О i-й единицы и группой N—Н (i —4)-й еди- ницы фиксирует конформации (i—1)-й, (i —2)-й и (i — 3)-й еди- ниц. Для освобождения пептидной единицы, дающего выигрыш энтропии, необходимо разорвать не менее трех водородных свя- зей кряду, что требует затраты энергии. Для того чтобы свобод- ная энергия G уменьшалась, необходимо освобождение многих единиц, т. е. кооперативность. Термодинамическое условие плавления кристалла состоит в равенстве свободных энергий кристалла и расплава — в нашем случае а-спирали и клубка. Имеем Ga — На — TaaSa = //нл — ТПЛ8КЛ = С„л (4.6)- или AG = Скл - Ga = MI - ТПЛМ = 0. (4.7) Изменение энтальпии компенсируется изменением энтропии. Из (4.7) следует T^MI/bS. (4.7а) Статистическая теория (излагаемая далее) показывает, что доля спирализованных звеньев такой кооперативной системы выража- ется формулой где 1<л<Я (7V—число звеньев а-спирали); s = ехр(—&G/RT) (4.9) имеет смысл константы равновесия для образования водородной связи в звене, следующем за уже связанным звеном. Формула (4.8) описывает кооперативное плавление а-спирали, если п > 1. 100
В этом случае при s = 1 происходит резкий переход: 0 «0 прй 5<1, 0 = 0,5 при s=l (т. е. при AG = 0) и 0=1 при s > 1. Таким образом, формула (4.8) согласуется с термодинамическим условием плавления (4.7), т. е. с плавлением при определенной температуре. При каких же условиях п » 1? Кооперативность велика, если велика свободная энергия, необходимая для возникновения одного разрыва в последовательности во- дородных связей, т. е. если мала константа равновесия о для тако- го процесса: о = ехр (—Gpa3p/RT). (4.10) Расчет показывает, что п«1/Уо. (4.11) Переход тем более резок, чем меньше параметр кооперативно- сти о. Кооперативность максималь- на, если Gpa3p -* °° и о —* 0. При этом п->- N. Напротив, коопера- тивность полностью отсутствует, если Сразр 0 и а (4.8) получаем Рис. 4..13. Теоретические кривые 0(s) при разных значениях а 1. В этом случае 0 = s/(l +s); -*1 и вместо формулы (4.12); п 0 изменяется плавно, без перегиба — плавления нет. На рис. 4.18 показаны теоретические кривые 0(s) при разных значениях а. Дадим статистико-механический вывод этих соотношений, оспованный на модели Изинга и матричном методе (с. 73). Каждое звено полипептид- ной цепи может находиться в несвязанном состоянии (символ р. = 0) ив состоянии, связанном водородными связями (р, = 1). Свободная энергия цепи зависит от набора значений р.,, причем взаимозависимы конформации четырех последовательных звеньев. Поэтому свободная энергия цепи равна N G {pj = G (рр р2, ..., pff) = 2 G (р._3, р{_2, р,--!, pj. (4.13) 1=1 Как и ранее (с. 74), считаем цепь весьма длинной, TV > 1, и пренебре- гаем концевыми эффектами. Очевидно, что свободная энергия, требуемая для освобождения одного или двух звеньев, заключенных между связанны- ми звеньями, должна быть очень большой, так как на самом деле освобож- дения в этом случае нет, звенья остаются в спирали. Энтальпия затрачи- вается без выигрыша в энтропии. Можно положить, что G(p._3, 1, 0, 1) оо, G(l, 0, 0, 1) -* <ю. (4.14) Эти состояния практически ие участвуют в статистической сумме, равной Z-= 2 ехр(-б{рД/ЯГ). (4.15) 101
Отвлекаясь от этих состояний, можем ограничиться рассмотрением лишь двух соседних звеньев и упростить выражение (4.13): С{М = С(Нр Н2. .... Ы==2 Hi). (4.16) 7 — 1 Мы имеем дело лишь с четырьмя значениями G: G(0, 0), G{0, 1), G(l, 0), G (1, 1). Считаем, что свободная энергия звена в свободном состоянии (ц, = =« 0) равна нулю — звено расплавилось. Имеем GCBOe = G(0, 0) = G(l, 0) = 0. (4.17) Для звена в связанном состоянии (ц, = 1) Севяз = ?(1, 1) =AG. (4.18) И, наконец, для состояния i = 0, ц; = 1 G(0, 1) = ^СВЯЗ + ^раэр* (4.19) Если принять, что при вращении свободного звена вокруг каждой связи возможны три поворотных изомера, то Gpaap — 4RT In 3 « 10,5 кДж/моль. (4.20) Эти величины входят в Z в виде экспонент: GCB06 дает множитель 1, GCBB3 — множитель s (формула (4.9)) и Gpa3p — множитель о (формула (4.10)). Имеем (ср. с. 74) N г = J П = sP (pN) = xf + к*. (4.2i) W 1-1 Матрица Р имеет вид - Ее характеристическое уравнение (1 — X)(s — X) = as. (4.23) Собственные числа матрицы Х>,2 = 7з(1 + S) ± [71(1 + S)2 + *о]'л. х (4.24) При максимальной кооперативности а = 0 и Xi = 1, Хг = s. Имеем Z = 1 + s* (4.25) Если кооперативнсть отсутствует, то Gpa3p = 0 и о = 1. При этом Xi = 1 + s, Хг = 0 и получаем формулу (4.12). В промежуточных случаях, когда 0 < а < 1, получаем формулу (4.8). Обозначим sn = s. Эта величина имеет смысл константы равновесия для мономолекулярной реакции, в кото- рой участвует п звеньев, т. е. эффективное изменение энтальпии ДЯэф = п &h, 102
где Д/г — изменение энтальпии при освобождении одного звена. При N 1 можно ограничиться в (4.21) большим корнем (4.24) Имеем 1 3 1nZ ~ 9 Ink, _ К, — 1 N dins ~ 31ns 2/.,— 1—s’ Приравняв это выражение выражению (4.8), причем п ~ ( А77чФ ^А^эф \ s = s= exp 1 —-------кт------j, находим s = (Xi — l)/(Xi — s) и dins dins dins dins АЯэф = — dtt/RT) = — d(l/RT) dins = A/1 dins’ Расчет дает d In s s 2 (X, 1) (X, s) + a (1 *) d In s ~ (X, — 1) (\ — s) 2kj — 1 — s и в области перехода, в которой s и 1, dins 2s 1 d In s ~ 2k, — 1 — s ~ у Следовательно, да АЯэф ~ у- • т. е. 1 п . у0 (4.28) (4.29) (4.30) (4.31) (4.32) (4.33) (4.34) (4.35) (4.36) Величину ДЯэф можно найти по наклону кривой зависимости 9 от ijRT в области перехода, где s « 1: d(i/RT) = ~ din 7 АЯэф = - (! +7)2 АЯэф ~ - V4АЯэф- <4-37) Оптические методы позволяют определить 9 (Г) и, тем самым, ДА/Уо. Для нахождения величин ДА и п порознь можно воспользоваться зависимостью Гпл от степени полимеризации N (Зимм и Брэгг). Опыт дает для ПБГ о = 2-10-4 и изменение энтальпии при освобожде- нии одного звена ДА около 4 кДж/моль. Те же значения о свойственны ПГК и поли-£-лизину. Одвако ДА в этих двух случаях отрицательно и мало — около —0,29 кДж/моль. Если ДА > 0, спиральное состояние менее выгодно, чем клубкообразное, и переход спираль — клубок происходит не при повы- шении, а при понижении температуры. Теория переходов, вызванных изменением растворителя или pH среды, строится на тех же основах. В первом случае необходимо учесть, что каж- дое звено может находиться уже не в двух, а в трех состояниях: в свобод- ном, в связанном внутримолекулярной водородной связью и в связанном водородной связью с молекулой растворителя. Зависимость перехода от pH определяется полиэлектролитиой природой таких полипептидов, как ПГК. Каждое звено может находиться в одном из четырех состояний, так как оно может быть свободным и связанным, заряженным и незаряженным. Дли полиамфолитов форма кривой 9 (pH) зависит от последовательности ка- 103
тиоииых и анионных звеньев. Теоретические расчеты переходов согласу- ются с опытом. Переходы [5-форма — клубок имеют несколько иной характер, так как [5-форма двумерна. Теория этих переходов была развита Бирштейн. Являются ли эти кооперативные переходы фазовыми? Вопрос этот не тривиален. Согласно теореме Ландау и Лифшица, фазо- вый переход в одномерной системе невозможен, так как в ней не существуют фазовые равновесия. Две фазы перемешиваются, пока не разделятся на малые конечные отрезки. Между тем а- спираль одномерна. Фазовые переходы и фазы строго определены в статистической физике лишь для систем с N Самые длинные а-спирали содержат лишь десятки и сотни звеньев. Плавление а-спирали происходит в заметном интервале температур АТ, определяемом лишь параметром кооперативности о. В отличие от истинного фазового перехода, ДТ не стремится к нулю при N Тем са- мым плавление а-спирали есть нефазовый кооперативный кон- формационный переход. Сказанное справедливо и для двумерных р-систем. § 4.5. Белковая глобула и гидрофобные взаимодействия В отличие от монотонной полиаминокислоты, белок содержит разнообразные остатки, в том числе и Про, которые не могут образовать водородных связен. Вторичные структуры — а-спирали и [}-формы — представлены в белке лишь частично, они переме- жаются неупорядоченными участками, в которых белковая цепь обладает значительной гибкостью. В результате белковая макро- молекула сворачивается в глобулу, приобретая определенную пространственную, третичную, структуру. Именно эта структура биологически функциональна. (О фибриллярных белках мы бу- дем говорить в § 4.9.) В ряде случаев белок обладает четвертичной структурой — молекула белка или надмолекулярная белковая система состоит из некоторого числа глобул. Примеры: молекула гемоглобина со- держит 4 глобулы двух сортов, белковая оболочка вируса табач- ной мозаики состоит из 2000 идентичных глобул. Белок — много- уровневая система. Характер структуры на каждом уровне организации опреде- ляется геометрическими свойствами структур предыдущего уров- ня, силами взаимодействия их элементов и взаимодействием с окружающей средой. Возникновение «высшей» структуры проис- ходит как бы автоматически в результате самосборки системы. Решение проблем самосборки означало бы, например, возмож- ность предсказания макроскопической структуры мышцы по дан- ным о химическом строении ее белков. Объяснение строения молекулярных кристаллов на основе знания строения образующих эти кристаллы молекул решает проблемы самосборки в гораздо более простом случае. 104
Мы уже говорили об отличии полимерной глобулы от ста- тистического клубка (с. 78). В белке вследствие полифункцио- нальности аминокислотных остатков в образовании глобулы участвуют разнообразные силы. Разнородность звеньев и взаимо- действии определяет строение глобулы—«апериодичность кри- сталла». Единственные сильные взаимодействия в белковой глобуле — это химические дисульфидные связи Цис—S—S—Цис. Наличие нескольких дисульфидных «сшивок» между звеньями одной или нескольких цепей (например, инсулин) накладывает ограничения на возможные конформации. Однако нельзя было бы говорить о глобуле, если бы взаимодействия сводились к серным мостикам. В этом случае белковая цепь походила бы на цепь каучука в резине, вулканизированной серой. Каучук в резине сохраняет свойства статистического клубка. Глобула формируется слабыми силами — электростатическими, ван-дер-ваальсовыми, водородны- ми связями и, прежде всего, гидрофобными взаимодействиями. Глобулярные белки функционируют в водном окружении, в большой степени определяющем высшие уровни их структуры. Влияние воды обязательно должно учитываться в физике белка. Вода влияет на водородные связи. Однако выигрыш свободной энергии при образовании внутримолекулярных водородных связей по сравнению с такими связями с молекулами Н2О незначителен. Роль воды в стабилизации глобулы иная. Гидрофобный эффект есть единственная организующая сила, основанная на отталкивании растворителя, а не на взаимном при- тяжении элементов системы. Вода отталкивает неполярные моле- кулы, в частности, углеводороды — керосин или масло не смеши- ваются с водой. В равновесном растворе или смеси химические потенциалы компонент равны. Для любых двух окружений а и b молекул данного вещества Н<«) = Ись> (4.38) или Р(а) + Т771 In ^Г(а) = Р(Ь) 7? Г In^(b), (4.39) где xw и х(Ь} — молярные доли вещества в средах а и Ь, находя- щегося в равновесии, RT In х характеризует энтропию смешения, р° — унитарный химический потенциал, включающий свободную энергию всех молекулярных движений изолированного вещества и энергию специфических взаимодействий с окружающими моле- кулами. Представим себе систему, состоящую из неполярной жид- кости, скажем, СС14, и воды. Так как СС14 не смешивается с во- дой, система расслаивается. Вводим в систему неполярное ве- щество, например, углеводород. Оно растворяется преимуществен- но в неполярном растворителе. В равновесии из (4.39) следует для углеводорода Рссц — Ртцо = 7771 In < 0, (4.40) 105
так как a?cci4 ^що- Действительно, для углеводородов разности унитарных химических потенциалов (4.40) отрицательны и со- ставляют примерно 3570 Дж/моль СН2-групп и 8400 Дж/моль СНа-групп. Гидрофобный эффект определяется свойствами во- ды — гидрофобные вещества безразличны к неполярным органи- ческим растворителям. Молекулы, содержащие как полярные, так и неполярные груп- пы, располагаются таким образом, что первые группы контакти- руют с водой, а вторые удаляются из водного окружения. Ленг- мюр показал, что так построены мономолекулярные слои жирных кислот на поверхности воды — полярные карбоксильные группы молекул погружены в воду, а неполярные углеводородные ради- калы обращены наружу. Та же ситуация определяет структуру мицелл в водных коллоидных растворах мыл: гидрофобные груп- пы располагаются внутри мицеллы, гидрофильные — на ее по- верхности. Физическая природа гидрофобных взаимодействий своеобразна. Плохая растворимость углеводородов в воде связана не с повы- шением энтальпии системы, а с уменьшением ее энтропии. Со- ответственно растворимость углеводорода в воде уменьшается, а не растет при нагревании. Энтальпия понижается также, но в общем балансе свободной энергии этот эффект перекрывается энтропийным. Так, при растворении бутана С4Ню в воде при 298 К энтропия понижается на 96,6 Дж/(моль-К), а энталь- пия — на 4200 Дж/моль. В результате свободная энергия воз- растает на д G = ДЯ _ т \S = -4200 + 298 • 97 « 33000 Дж/моль. (4.41)’ Растворение углеводорода в воде можно трактовать как внед- рение неполярных молекул в структурированные (льдоподобные) области воды и в более плотные неструктурированные области. В первом случае неполярные молекулы размещаются в пустотах рыхлой структуры, образуя клатраты, причем дополнительные контакты молекул с водой приводят к уменьшению энергии. Во втором случае увеличение числа контактов углеводород — вода приводит к уменьшению числа контактов вода — вода, которым отвечает более низкая энергия. В результате энтальпия увеличи- вается. Углеводороды лучше растворяются в структурированных областях и равновесие сдвигается в сторону увеличения структу- рированности (образование «айсбергов»), что означает пониже- ние энтропии. Это — качественная картина. В целом «антипатия» углеводородов и воды определяется большим выигрышем свобод- ной энергии при контактах вода—вода, чем при контактах угле- водород — вода. Свободные энергии образования контактов двух жидкостей равны: октана с водой и октана с октаном 0,042 Дж/м2, воды с водой 0,144 Дж/м2. Среди аминокислотных остатков белка имеются как Поляр- ные, так и неполярные, как гидрофобные, так и гидрофильные. Поскольку белковая цепь обладает некоторой гибкостью (благо- 106
даря наличию неупорядоченных участков), она может свернуться в глобулу так, чтобы гидрофобные остатки преимущественно кон- тактировали друг с другом, а не с водой. Иными словами, цент- ральная область глобулы, ее сердцевина должна быть гидрофоб- ной («жирной»), а внешняя поверхность — гидрофильной («мыльной»). Действительно, глобулярные белки денатурируются, т. е. пере- ходят в неупорядоченное клубкообразное состояние, под дейст- вием слабополярных органических растворителей, образующих водородные связи хуже, чем вода. Действие этих растворителей определяется контактами с неполярными аминокислотными остат- ками белка и, тем самым, нарушением гидрофобных взаимодей- ствий. Денатурирующее действие спиртов на белки возрастает с увеличением размеров алифатического радикала. Сильное денату- рирующее действие мочевины также объясняется ослаблением гидрофобных взаимодействий. Именно потому, что гидрофобные остатки «заталкиваются» внутрь глобулы, вода, окружающая белок, не подвергается доба- вочному структурированию. Конечно, молекулы Н2О взаимодей- ствуют с полярными остатками на поверхности глобулы, но это взаимодействие имеет характер обычной сольватации. Фишер дал грубую оценку влияния гидрофобных остатков на форму глобулы. Он разбил все аминокислотные остатки на две группы: полярные и гидрофильные (Apr, Асп, Гис, Глу, Лиз, Сер, Тир, Тре) и гидрофобные (остальные двенадцать). Считая, что все остатки имеют примерно одинаковые объемы и зная про- центное содержание обоих типов остатков, можно найти форму глобулы. При заданном объеме наименьшую поверхность имеет сфера. Если число гидрофильных остатков достаточно для того, чтобы покрыть поверхность сферического гидрофобного ядра, то глобула имеет сферическую форму. Если это число больше, то глобула приобретает форму эллипсоида. Наконец, если гидро- фильных остатков не хватает и они не могут закрыть ядро гло- булы, то остаются незащищенные гидрофобные участки. При этом глобулы должны слипаться, образуя четвертичную структуру. Эти представления находятся в грубом соответствии с опытом. Однако действительность, конечно, гораздо сложнее. Нельзя заменить 20 типов остатков, с их индивидуальными свойствами, всего лишь двумя типами. Следует говорить о степени гидрофоб- ности остатка и ввести ее количественную меру. В качестве тако- вой Танфорд предложил изменение свободной энергии, AG, при- ходящееся на боковую группу (радикал R) свободной аминокис- лоты, при переносе ее из этанола в воду. В табл. 4.5 приведены относительные значения AG, экспериментально определенные Танфордом, причем AG для Гли принято за нуль, так как Гли не содержит бокового привеска. Первые 10 остатков можно условно считать гидрофобными, вторые -т- гидрофильными. Эта классификация не совпадает с классификацией по полярности, т. е. по дипольным моментам. 107
Сильно полярный Apr имеет ту же гидрофобность, что и непо- лярный Ала, благодаря наличию большого углеводородного остатка. Степени гидрофобности аминокислотных остатков дают инфор- мацию о стабилизации глобулы в водном окружении. Однако необходимо учитывать, что гидрофобные остатки могут фигури- ровать и на поверхности глобулы, если в цепи они соседствуют с Таблица 4.5. Гидрофобности аминокислотных остатков Остаток AG, Дж/моль | Остаток AG, Дж/моль Остаток AG, Дж/моль 1. Трп 12 600 8. Лиз 6300 15. Асп 2270 2. Иле. 12 500 9. Гис 5900 16. Тре 1850 3. Тир 12 100 10. Мет 5500 17. Сер 170 4. Фен И 100 И. Ала 3070 18. Гли 0 5. Про : 10 900 12. Apr 3070 19. Асн —40 6. Лей 10 200 13. Цис 2700 20. Глн —420 7. Вал 7 100 14. Глу 2300 гидрофильными. Необходимо рассматривать реальную структуру глобулы и весь баланс имеющихся в ней взаимодействий. Гидрофобные взаимодействия имеют определяющее значение для структуры и свойств биологических Мембран и мембранных белков (гл. 10). § 4.6. Связь между первичной и пространственной структурами белка Построение биологических молекулярных и надмолекулярных структур всегда происходит в два этапа: биосинтез соответствую- щих больших и малых молекул и самосборка структуры. И био- синтез, и самосборка основаны на молекулярном узнавании, осу- ществляемом благодаря слабым взаимодействиям. Применительно к белкам проблема самосборки является кар- динальной. Генетически кодируется биосинтез (гл. 8), т. е. фор- мирование первичной структуры белка. Однако биологически функциональна нативная пространственная структура белковой молекулы, возникающая в результате самосборки. Естественный отбор белков идет по пространственным — третичным и четвер- тичным — структурам. Молекулярная биология, молекулярная генетика не имели бы смысла, если бы между генетически пред- определенной первичной структурой белка и его пространствен- ным строением не было однозначного или вырожденного соот- ветствия (см. § 7.1). Наличие такого соответствия следует непосредственно из опы- тов по' ренатурации белков (Анфинсен). В ряде случаев удалось наблюдать восстановление нативной структуры и функциональ- 108
ности денатурированного белка. При медленном «отжиге» белкового клубка происходит самосборка организованной глобулы. Белковая цепь может иметь громадное число конформаций. Нахождение уникальной конформации, отвечающей абсолютному минимуму свободной энергии, путем перебора всех возможных конформаций невозможно. Эта задача, по-видимому, обходится и природой, так как такой перебор потребовал бы очень большого времени, а самосборка белковой глобулы происходит за время порядка 1 с. Основная идея современных работ, посвященных предсказанию структуры глобулы, исходя из знания первичной структуры цепи, состоит в том, что нативная глобула есть конеч- ный результат самосборки, не обязательно отвечающий абсолют- ному минимуму свободной энергии. При нахождении нативной глобулы надо исходить из определенной иерархии структур. Бе- лок может быть разделен на спиральные или вытянутые струк- турные сегменты, соединенные разнообразными изгибами или петлями. Два или три соседних по цепи структурных сегмента образуют элементарные комплексы: «шпильки» из антипарал- лельных а-спиралей, антипараллельные ^-шпильки и параллель- ные ^-шпильки, прикрытые а-спиралыо. Далее возникает домен, т. е. компактная структура, построенная из нескольких соседних элементарных комплексов и структурных сегментов. Глобулы малых белков состоят из одного домена, больших — из несколь- ких. Эта иерархия структур показана схематически на рис. 4.14. Таким образом, предполагается блочный механизм сворачивания белка — более простые структуры нижнего иерархического уров- ня служат блоками для формирования высших структур (Пти- цын). Проблема самосборки есть проблема физической динамики. Вторичная структура может служить блоком в самосборке, если, во-первых, она формируется значительно быстрее, чем третичная, во-вторых, если она существует достаточно долго и, в-третьих, если она достаточно велика и гидрофобия, чтобы включиться в сильное гидрофобное взаимодействие. И а-спирали, и ji-формы удовлетворяют этим требованиям. Для расчета вторичной струк- туры необходимы параметры равновесия (величины s, с. 100) между различными возможными структурами для всех остатков. Соответствующий математический аппарат, использующий модель Изинга (с. 101), развит в работах Птицына и Финкельштейна. Гидрофобные остатки стабилизуют а- и (J-формы, короткие гидро- фильные, а также Гли и Про—дестабилизуют. Удается найти пространственную структуру ряда белков. Расхождение между вычисленным и наблюдаемым распределениями а- и ^-участков не превышает 20% (рис. 4.15). Самосборка глобулы происходит двумя путями: формирование плоской ^-структуры с последую- щим прилипанием к ней а-спирали и формирование ^-шпильки или пары а-спиралей с последующим изломом. Распределение гидрофобных групп, благоприятствующее формированию а- или 109
0-участков, одновременно обеспечивает их способность встраи- ваться в глобулу. Рассматривая корреляцию первичной и пространственной структуры белка, мы встречаемся с важной проблемой молеку- лярной биологии. В сущности речь идет о двух корреляциях — Аминокислотная последовательность Структурные сегменты Домены Глобулярные белки Элементарные комплексы Рис. 4.14. Иерархия структур белка наряду с указанной имеется соответствие пространственной структуры белка и его биологической функции. Ряд данных свидетельствует о вырожденности обеих корре- ляций. Белки с разной первичной структурой могут иметь сход- ное пространственное строение, сходные или различные биологи- ческие функции. Это было показано, в частности, для глобинов — белков, содержащих группы гема, запасающих и переносящих молекулярный кислород. Первичные структуры глобинов значи- тельно разнятся, но их пространственное строение весьма сход- но — глобины, среди которых имеются миоглобины позвоночных 110
и леггемоглобин клубеньковых бактерий, содержат практически совпадающие а-спиральные участки и «карманы», в которые погружены группы гема (Леек и Чотиа). Птицын показал, что белковая глобула может рассматриваться как ^отредактированный статистический сополимер». Усреднение Рис. 4.15. Теоретическая модель миоглобина (а) и его действительное строение (б) по первичным структурам белков практически не дает статисти- чески достоверных отличий от случайного распределения для Рис. 4.16. Теоретические кривые (штриховые линии) и гистограммы, пред- ставляющие зависимость числа а-спиралей и [5-форм от их длины в белках (Птицыи) аминокислотных остатков и их групп вдоль цепи. Это положение справедливо и для вторичной структуры. На рис. 4.16 показаны гистограммы для распределения длин а-спиралей и ^-структур в 62 белках. Прерывистые кривые показывают распределения 111
длин неполярных кластеров в беспорядочных последовательно- стях, состоящих из равных чисел полярных и неполярных остат- ков, с непрерывными гидрофобными поверхностями в a-спираль- ных и ^-структурных состояниях соответственно. Такое же хо- рошее согласие получается для а-, и ^а^-кластеров. «Редактирование», происходящее в процессе эволюции, затра- гивает биологически функциональную часть глобулы, ее актив- ный центр. Активный центр белка-фермента включен в каркас, обладающий некоторой конформационной подвижностью. Точная структура каркаса не играет определяющей роли. Поэтому струк- тура белка как целого мало связана с его функцией. Это создает важные возможности для белковой инженерии, для искусствен- ного построения белков, применимых в биоэлектронике. Первые шаги в этом направлении уже сделаны. Так, синтезирован Felix — искусственный белок, содержащий четыре а-спирали (Four helices). Приведенные факты имеют непосредственное отношение к биологической эволюции на молекулярном уровне, о которой пойдет речь в § 17.7. Забегая вперед, укажем, что вырождение соответствия первичной и пространственной структуры, равна как только что указанная статистичность, являются вескими свиде- тельствами в пользу нейтралистской теории молекулярной эво- люции, развитой Кимурой. § 4.7. Структура и устойчивость глобулы Пространственное строение и динамические свойства белковых глобул изучаются теоретически и при помощи ряда эксперимен- тальных методов. Наиболее детальную информацию дает рент- геноструктурный анализ. Более простые методы оптики, оптиче- ской спектроскопии, спектроскопии ЯМР и ЭПР, а также у- спектроскопии дают сведения о долях остатков, находящихся в а- и ^-структурах, о внутриглобулярной подвижности и т. д. Эти методы охарактеризованы в следующей главе. Косвенная информация о подвижности в глобуле может быть получена путем изучения дейтерообмена (обмена атомов Н белка в тяжелой воде на атомы D). Более подвижные и менее прочно соединенные водородными связями атомы Н легче обмениваются. Поведение белка при денатурации, а также в ходе протеолиза определяется устойчивостью глобулы. Изучение денатурации про- водится с помощью оптических и калориметрических методов. Микрокалориметрия — метод исследования суммарных свойств вещества, в частности, температурного хода теплоемкости. Интересные сведения о структуре и динамических свойствах белков дает изучение скорости распространения ультразвука и его поглощения в водных растворах белков, а также белков в твердом состоянии. Применяется широкий диапазон частот — от 0,1 до 100 кГц. Такого рода исследования позволяют определять модули упругости глобулы (модуль Юнга имеет значение 112
2—9 ГН -м-2), изучать межмолекулярные взаимодействия, гидра- тацию и денатурацию глобулы. Акустические методы с успехом применяются и при изучении нуклеиновых кислот. В качестве примеров глобулярных белков рассмотрим миогло- бин (Mb) и гемоглобин (НЬ). Структура этих белков была де- тально исследована методами рентгенографии (Mb — Кендрью, Рис. 4.17. Структура миоглобина НЬ — Перутц). На рис. 4.17 изображено строение Mb. Молекула, содержащая простетическую группу гема (указана стрелкой, ср. с. 50, 111), построена из восьми а-спиральных участков, преры- ваемых неупорядоченными. Примерно 75% общего числа 153 остатков принадлежит этим участкам, обозначаемым буквами от А до Н (считая от N-конца цепи); внутри каждого а-спирального участка остатки нумеруются от 1 до п. Межспиральные, неупоря- доченные участки обозначаются АВ, CD и т. д., концевые участ- ки— NA и НС—. В отличие от Mb, молекула НЬ имеет четвер- тичную структуру: она состоит из четырех свернутых в глобулы цепей — двух цепей, обозначаемых а, и двух цепей (3. Структура а- и (3-глобул сходна, но не совпадает со структурой Mb. Детальный анализ структуры Mb и НЬ показывает, что «серд- цевины» их глобул действительно заполнены плотно упакованны- ми неполярными боковыми привесками R аминокислотных остат- ков. Число внутренних остатков в каждой из четырех субъединиц НЬ равно 36. Многие остатки Гли и Ала, будучи слабо гидро- 8 м. В. Волькенштейн 118
фобными, располагаются на поверхности молекулы. Некоторые объемистые неполярные боковые цепи, не находящиеся внутри глобулы, спрятаны в выемке вблизи поверхности, что сводит к минимуму их контакты с водой. Все привески, ионизуемые при нейтральном pH, находятся на поверхности глобулы. То же спра- ведливо для других полярных боковых цепей, за исключением связанных с гемом Гис и Тре С4, которые соединены водородной связью. В целом в Mb из 77 полярных групп только 5—6 распо- ложены внутри глобулы, остальные находятся на ее поверхности. Изучение гемоглобинов различных видов позвоночных и миогло- бинов кашалота и человека показало, что при замещениях 33 внутренних остатков сохраняется их неполярный характер. На поверхности глобулы имеется лишь 10 инвариантно н^йолярных остатков. Анализ а-спиральных участков А, В, Е, G, Н свидетель- ствует о периодическом расположении в них неполярных остат- ков. На одной стороне а-спирали расположены гидрофобные Рис. 4.18. Структура фосфоглицераткиназы остатки, на другой — преимущественно гидрофильные. Гидрофоб- ная сторона ориентирована к ядру глобулы. Наиболее важная роль в эволюции принадлежит всего лишь пяти остаткам в нативном центре НЬ. Именно замены этих остат- ков имеют эволюционное значение (Перутц). Таким образом, гидрофобные взаимодействия особенно сущест- венны при самосборке глобулы. Вторичная структура также опре- деляется этими взаимодействиями. Миоглобин и другие глобины не содержат раздельных об- ластей — доменов — в глобуле. Многие белки имеют доменную структуру. На рис. 4.18 показано строение фермента фосфогли- цераткиназы. Глобула состоит из двух доменов. Цилиндры I—XII — а-спирали, стрелы А — L — ^-участки. 114
Взаимное расположение а-спиралей и [1-лент в белковых гло- булах имеет ограниченные топологические возможности. Левитт и Чотиа выделяют четыре основных типа. Во-первых, а-белки, »//* 12 ' Рис. 4.19. Схемы строения белков состоящие из а-спиралей, содержащие обычно два слоя таких элементов (глобины, гемэритрин). Во-вторых, [1-белки, лишенные а-спиралей, содержащие обычно два [1-слоя (рубредоксин, химо- 8* И5
трипсин и др.) . В-третьих, а + [1-белки, в которых а- и [1-участки перемешаны (рибонуклеаза, термолизин). Эти белки также обыч- но двухслойные. И в-четвертых, а/^-белки, в которых а- и [1-уча- стки отделены друг от друга. Чаще всего они имеют сэндвичевую сфа-структуру. На рис. 4.19 показаны схемы строения различных п Д) 6 7 8 3 Рис. 4.20. Топология 0-форм в белках белков, отвечающие перечисленным вариантам (а-спирали пока- заны кружками, [1-цепи — квадратами). Оси а-спиралей не обяза- тельно параллельны друг другу. На рис. 4.20 показаны элемен- ты [1-структур: а—«шпилька», б—«параллельная шпилька», а также топологически различные их комбинации в глобулах (в). Ричардсон показала, что соответствующие геометрические моти- вы подобны орнаментам на античных вазах. Не только гидрофобные, но и электростатические солевые связи в белках стабилизуются водным окружением, так как при их образовании освобождаются ориентированные молекулы воды, окружающие заряженные группы. Тем самым возникновение солевой связи сопровождается увеличением энтропии воды. Этот выигрыш в свободной энергии более значителен, чем определяе- мый электростатическим притяжением зарядов. Однако воздей- ствие воды на солевую связь отлично от гидрофобного — солевые связи усиливаются, а гидрофобные ослабляются при добавлении неводных растворителей. Кажущаяся плотность белков в воде выше, чем их сухая плот- ность в органических растворителях. Это возрастание плотности вызывается электрострикцией связанной воды. Молекулы воды связываются на поверхности глобулы, а также внутри нее — меж- ду доменами химотрипсина, например, или между субъедини- цами белка, обладающего четвертичной структурой. Количество связанной воды, в которую не могут проникать электролиты, со- ставляет около 0,3 г на 1 г белка, т. е. примерно 100 молекул Н2О на белок с м. м. 6000. Непроникновение электролитов в свя- занную воду определяется электростатическими эффектами. Рас- смотрим заряд е, погруженный в растворитель с высокой диэлект- 116
ер. В этом рической проницаемостью е0, под которым расположен слой ве- щества с малой диэлектрической проницаемостью ~ слое возникает индуцированный заряд, равный 80 8Р е' — е-------:----. 8о + 8р (4.42) неполярного соответственно энергия заряда е на расстоянии г от слоя равна (4.43) ионы не не- Е — ее' ~ ео 8р g2 2еог 8о+8р2вог‘ Если е0 == 81, ер ~ 5, то Е = кТ при г = 0,3 нм, т. е. гут проникнуть в слой воды толщиною примерно в одну моле- кулу, находящийся на белке. Разрушение нативной глобулы — денатурация белка — от- личцр от. перехода глобула — клубок, описанного в § 3.5. Гетеро- полимерный статистический клубок является лишь конечным, отдаленным результатом денатурации. Белковая цепь сравни- тельно коротка, глобула не имеет флуктуирующей «опушки». Превращение такой глобулы в клубок должно быть фазовым пе- реходом второго рода. Однако при термической денатурации бел- ка наблюдаются разрывы, энтальпии и энтропии — ДЯ и Д5. Характерные значения для разностей ДЯ и T&S порядка 400 кДж/моль. Наблюдаемый с помощью сканирующей микрокалориметрии фазовый переход первого рода при денатурации является не пере- ходом глобула— клубок (подобным переходу жидкость — газ), а переходом от нативной к «расплавленной» глобуле (подобным Рис. 4.21. Схема «плавления» белковой глобулы: слева — плотно упакован- ная глобула, справа — расплавленная глобула переходу кристалл — жидкость). Схема такого перехода показана на рис. 4.21. Слабые связи разрушены, но глобула в целом сохра- няется (Привалов, Птицын). На -рис. 4.22 показаны результаты спектроскопического изу- чения термической денатурации химотрипсиногена. При переходе 117
происходит изменение коэффициента поглощения света при 293 нм. Процесс обратим, кривые являются равновесными. Интервал перехода порядка 10°С. Энтальпия и температура денатурации белка сильно зависят от pH среды, что свидетельствует о существенной роли электро- статических эффектов. Так, например, миоглобин при pH 12 Рис. 4.22. Зависимость ко- эффициента экстинкции прн 293 нм раствора химо- трипсиногена от темпера- туры. Кривые сняты при различных pH. Нижняя штриховая кривая отвечает нативной форме, верхняя — денатурированной имеет Тпл = 50°С и ДЯ = 300 кДж/моль; при pH 10,7 7’ПЛ = 78°С и ДЯ = 710 кДж/моль. Денатурация белка кислотой или щелочью определяется дву- мя факторами. Во-первых, свободная энергия сферического поли- электролита пропорциональна квадрату суммарного заряда по- верхности, так что стабильность глобулы убывает в обе стороны от изоэлектрической точки. Во-вторых, изменение pH может при- водить к ионизации групп, погребенных в неполярном ядре гло- булы. Будучи ионизованными, эти группы притягивают гидрат- ные оболочки, что вызывает сдвиг равновесия к расплавленной форме. Сканирующая микрокалориметрия выявляет в ряде случаев последовательность пиков теплоемкости при плавлении глобулы. На рис. 4.23 приведена кривая плавления Лиз-плазминогена (Привалов и сотрудники). Ясно видны три пика теплоемкости. Это может свидетельствовать о раздельном плавлении доменов в глобуле или об отщеплении ионов Н+, происходящем при разных температурах в разных участках. В сочетании с рентгенографией и другими методами микрокалориметрия дает полезную инфор- мацию. Остановимся на методе определения AG по денатурации в растворе мочевины (Танфорд). Имеем для этого процесса - bGv = RT In Ки = RT In (4.44) где [D] и [N] — концентрации денатурированного и нативного белков. Нас интересуют значения ДСн3о для водного раствора. 118
Воспользуемся циклом Нативный белок Лснго Денатурированный в воде *" белок в воде Нативный AGu Денатурированный белок белок в растворе в растворе мочевины мочевины Тогда 6AG = AGO— AGHjO = AGd — AGn. (4.45) Величину SAG можно представить в виде 6AG= S^iAGi, (4.46) где nt — число групп типа i в белке, \Gt — их вклад в свободную энергию перехода, у, — численный параметр, зависящий от сте- пени доступности для растворителя групп данного типа в натив- ной конформации. Согласие с опытом получается, если принять Рис. 4.23. Кривая плав- ления Лиз-плазминоге- на. По вертикальной оси — дифференциаль- ная теплоемкость для полярных групп у{ = 0,25, для гидрофобных уг = 0,75, для пептидных связей yt = 0,50. Величины AG( находят из данных о растворимости аминокислот в воде и в растворе мочевины данной концентрации. Пусть Сц — концентрация мочевины, при которой [D] = [N], т. е. точка полуденатурации. Тогда, согласно (4.44), AGn = 0 и AGH2q = - (SAG) » = - 2 yini (AGt) .. (4.47) CU г CU Это удобный способ определения конформационной стабильности белка. Свободная энергия денатурации должна быть суммой многих вкладов. Можно написать AG = AGa + AGH + AGHn + AG„ + AGHa6 + AGP + ..., (4.48) где AGa определяется переходами a-спираль — клубок, AGH — разрывами водородных связей между белковыми цепями соседних макромолекул, AGBn (нп — неполярные)—изменением гидрофоб- 119
ных взаимодействий, ДСе — изменением электростатических взаи- модействий, ДСнав — набуханием образовавшегося клубка, ДСР — разрывом слабых связей между участками вторичной структуры. Имеем ДСа = (А-4)ДЯа-(А-1)ТД5а, (4.49) где N — число звеньев в а-спирали, Д//а и Д5а — изменения эн- тальпии и энтропии йа звено цепи с N» 1 при переходе спи- раль — клубок. Цепь из N звеньев имеет в а-спиральной форме N — 4 водородных связей, ограничивающих подвижность N — 1 звеньев. По имеющейся оценке ДЯа = 6,3 кДж/моль, Д5а — = 17,6 Дж/(моль-К). Если учесть лишь Дба и ДСнав, то темпе- ратура перехода находится из условия ДО = Дба + ДСнав = 0, т. е. _(2У-4)ДЯа+ДЯнаб ПЛ (N-l)bSa + bSaa6 (4.50) причем величиной Д//„аб можно пренебречь; Д5ааб пропорцио- нально N — чем длиннее цепь, тем больше число поперечных связей. Оценка ДСНП дает 2,1 кДж/моль, значения ДСН и АС, того же порядка. Строгое теоретическое определение всех вкладов в ДО затруднительно. Доля денатурированного материала может быть представлена формулой ехр (—&G/RT) 1 + ехр (— &G/RT)' (4.51) В точке перехода ДО = 0 и х = 0,5. Острота перехода характери- зуется производной dx\ dT lT /1 пл ДЯ (4.52) Насонов и Александров (1940) предположили, что функциони- рование белков связано с их «частичной денатурацией». Позднее Александров установил корреляции между температурой тела ор- ганизма и температурой денатурации его белков. Это иллюстри- руется, в частности, табл. 4.6, в которой сопоставлены соответст- вующие характеристики двух родственных видов лягушек — более северной травяной лягушки (Rana temporaria L.) и более южной озерной лягушки (Rana ridibunda Pall.). Температура денатурации белков значительно превосходит температуру тела. Александров объяснил эту корреляцию тем, что функционирование белка требует определенного уровня под- вижности, внутренней гибкости глобулярной или фибриллярной белковой молекулы (о значении этой подвижности для фермента- тивного катализа см. в гл. 6). Чем ниже температура тела, тем 120
слабее должны быть внутримолекулярные взаимодействия, от- ветственные за жесткость молекулы, и тем ниже должна быть температура денатурации. Возможно, что здесь особенно важную роль играют междоменные взаимодействия в глобуле. По-види- мому, существенны и электростатические взаимодействия — соля- ные мостики. Показательны свойства малого белка — ферредокси- на, содержащего около 60 аминокислотных остатков и два класте- ра Fe4St. Ферредоксин из бактерий Clostridium pasterianum пол- ностью инактивируется при нагревании до 70°С в течение двух Таблица 4.6. Теплолюбивость лягушек (по Александрову) Характеристика Травяная лягушка Озерная лягушка Граница ареала: северная 70° с. ш. 60° с. ш. южная 43° с. ш. 40° с. ш. верхняя 3048 м 2438 м Температура тела в природе (°C) 6,0—26 11,0—29,5 Выбираемая температура 13—26 18-28 Температура потери рефлекторной возбудимости организма 30—32 35-36 Температура потери подвижности сперматозоидов 39,2 41,4 Температура потери способности к развитию яйцеклетки 36,6 38,5 Температура полной инактивации АТФ-азной активности мышечных гомогенатов 40—42 46-50 Температура 50%-ной денатурации гемоглобина 60 64 Температура 50%-ного сокращения коллагена сухожилий 51,5 57,6 Температура 50%-ной денатурации тропоколлагена кожи 25,5 32,0 Температура начала коагуляции сы- вороточного альбумина 68,0 75,0 часов, ферредоксин из С. acidiurici сохраняет при этом 20% ак- тивности, из С. tartarivorum — 50%, из С. thermosaccharolyti- сит — 90%. Выяснилось, что повышенная теплостойкость белка из термофильных организмов определяется добавочными соляны- ми мостиками. Один такой мостик может увеличить свободную энергию стабилизации до 12—16 кДж/моль. С денатурацией хорошо коррелирует протеолиз, т. е. гидроли- тическое расщепление белка с помощью протеолитических фер- ментов (Линдерштрем-Ланг). Чем выше термостабильность бел- ка, тем' труднее он расщепляется. Это важно, в частности, для лягушек — протеолиз коллагена коллагеназой происходит при утрате головастиком его хвоста. 121
§ 4.8. Антитела и антигены Защита организма от чужеродных биополимеров и, тем самым,, от инфекционных микроорганизмов осуществляется посредством клеточного и гуморального иммунитета (см. § 17.9). Во втором случае иммунитет определяется взаимодействием антител (АТ) — особых белков, производимых лимфатическими клетками,— с чу- жеродными биополимерами, именуемыми в этом случае антиге- нами (АГ). Иммунный ответ, т. е. появление антител в организ- ме, есть результат узнавания антигенов определенными популя- циями лимфоцитов. Процесс развивается на уровне организма, в нем участвуют различные клеточные узнающие системы, явля- ющиеся «обучающимися», так как они приобретают память об однажды введенном антигене и отвечают на его вторичное вве- дение усиленной выработкой антител. Рис. 4.24. Схема строения антитела IgG АТ — это белки, относящиеся к иммуноглобулинам. У чело- века имеется пять основных классов иммуноглобулинов, обозна- чаемых IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. В качестве AT функционируют IgG. Их м. м. примерно 150 000, константа седиментации 7S. Им- муноглобулины IgM являются пентамерами IgG. Строение многих IgG изучено. На рис. 4.24 показана схема IgG кролика. Молекула состоит из двух тяжелых цепей с м. м. 53 500 ±4000 (~450 ос- татков), обозначаемых 7, и двух легких — с м. м. 23 800 ±1000 (~220 остатков), обозначаемых х или X. Цепи связаны дисуль- фидными мостиками. АТ к самым различным АГ имеют сходное строение, несмотря на различия в первичной структуре, локализованные в вариа- бельной, V-области молекулы, лежащей вблизи N-концов легких и тяжелых цепей. По-видимому, АТ имеют доменную структуру, состоящую из нескольких глобул, соединенных друг с другом (рис. 4.25). V-области ответственны за взаимодействие АТ — АГ, поскольку специфичность АТ определяется особенностями пер- вичной структуры. Активный центр АТ содержит V-область. В каждой молекуле АТ таких центров два. 122
АГ — прежде всего белки и полисахариды. Ландштейнер (1919) разработал метод получения искусственных АГ, основан- ный на соединении диазотированных ароматических веществ с Тир белка: I NH НО-< Z-CH -CH+R-< \-n+=NX“ \ / * । \----------/ ТиР с=о NH ч I но-< >-сн-сн ___ —7 2 |_ R-7 5" “° Рис. 4.25. Схема доменной струк- туры IgG по Эдельману Таким образом, можно ввести в белок любой радикал R. R-фе- нилазобелок можно использовать в качестве АГ и стимулировать выработку соответствующих АТ. Установлено, что фактором, определяющим антигенную спе- цифичность, является именно радикал R, а белок играет второ- степенную роль: АТ, полученное в ответ на R—Б (Б — белок), реагирует с R—Б' (Б' — другой белок), но не с R'—Б. Антиген R—Б дает с соответствующим АТ труднорастворимый осадок. Если добавить к системе R—АГ, АТ малые молекулы, содержа- щие ту же самую группу R, то реакция АГ с АТ тормозится, а цри дальнейшем повышении концентрации прекращается. Ма- лые молекулы не создают АТ в организме и не являются АГ. Однако они взаимодействуют с ранее возникшими АТ, образуя растворимые соединения. Это—так называемое гаптеновое дей- ствие, а указанные малые молекулы называются гаптенами. Гап- тены конкурируют с АГ, взаимодействуя с теми же активными областями АТ. Реакция АТ с гаптеном или с АГ осуществляется посредством слабых взаимодействий, но подчиняется закону дей- ствия масс. Природные АГ поливалентны, т. е. они содержат несколько детерминантных (гаптеновых) групп. Для иммуноло- гических процессов существенно пространственное строение де- терминантной группы. Наличие реактивных групп (активных центров) в АТ дока- зывается красивыми опытами Прессмана и Штернберга (1951). Кролик иммунизировался искусственными АГ, содержащими в качестве детерминантных групп остаток n-азобензойной кислоты НООС—7 N=N—Белок 123
или n-азофени л арсиновой кислоты HaO3As—N=N—Белок. Полученные АТ подвергались йодированию, чем полностью по- давлялась их иммунологическая активность. Однако если йоди- рование проводилось в присутствии гаптенов, то активность со- хранялась. Очевидно, что введение йода в активную область АТ уничтожает ее активность, а гаптен защищает эту область от йода. Сказанное изображено на рис. 4.26. Между активной об- ластью АТ, с одной стороны, и гаптеном или детерминантной группой АГ, с другой, имеется структурное соответствие. Методом электронной микроскопии была изучена структура комплекса АТ с соответствующим бифункциональным динйтрофе- нильным гаптеном (ДНФ) На рис. 4.27 показана электронная микрофотография комплекса АТ с ДНФ, а на рис. 4.28 — схема ее интерпретации. Двухвалент- ные АТ, взаимодействуя с двухвалентными же молекулами ДНФ, образуют тройные циклы. Выступы у вершин треугольников яв- ляются частями АТ, не содержащими вариабельных участков. 124
При предварительной обработке АТ пепсином эти части отщеп- ляются (рис. 4.27, б). Константы равновесия реакции АТ с АГ или гаптеном (Г) оп- ределяются в опытах in vitro: „ [АТ—Г] „ [ bff—TbS К “ [АТ] [Г] еХр( RT (4.53) По зависимости К от ИТ определяются ЛЯ и AS. Изменения эн- тальпии порядка десятка кДж/моль (слабые взаимодействия), Рис. 4.27. Электронные микрофотографии комплекса АГ с АТ (а) и этого же комплекса, обработанного пепсином (6) изменения AS, как правило, положительны, что можно объяснить освобождением гидратирующих молекул воды при образовании комплексов. Исследования зависимости констант равновесия (связывания) от структуры Г или соответствующей детерминантной группы АГ были проведены Полингом и Прессманом (1944—1957). В част- ности, были получены АТ к ионам орто-, мета- и пара-азобензол- арсоната. Антитела к каждой из этих групп действуют так, как если бы они вступали в структурное соответствие с ван-дер-ваальсовой по- верхностью детерминантной группы. Зависимость взаимодействия от струк- туры проявляется очень ярко. Так, например, АТ к орто-азобензолар- сонату хорошо связывает другие орто- замещенные (с радикалами ОН, NO2, Cl, CHS, NH2 вместо AsO3H_), слабее .иега-замещенные и хуже всего пара- замещенные. Весьма важно относитель- Рис. 4.28. Схема комплекса АГ с АТ. «Гантели»—мо- лекулы ДНФ ное расположение частей гаптеновой группы. Для АТ к пара—N=N— —С6Н4—AsOsH“ относительные кон- станты связывания гаптенов OAsO3H~, HjCAsO3H~, H5CeAsO3H~ и Н5СвСНгА8О3Н_ равны соответственно О, 0, 1, 0. Удаление бензольного кольца (необходимого для связы- вания) от арсоната на одну группу СН2 уничтожает связывание. Связывание сильно зависит от природы заряженной группы. Так, 125
те же АТ одинаково сильно связывают CeH5AsO3H_ и СвН5РО3Н_, но не связывают C6H5SO^, С6Н.СО-Г и C6H5SbO5H7. Важны раз- меры иона. Эти и другие данные свидетельствуют о комплементарное™, о структурном соответствии активного участка АТ и детерми- нантной (или гаптеновой) группы АГ. Изучение взаимодействия АТ к поли-Л-аланину с олигопептидами аланина позволило оце- нить размеры активного участка АТ: 2,5 X 1,1 X 0,2 нм3. Анти- тела — глобулярные белки. При денатурации АТ их способность к специфическому связыванию АГ или Г исчезает. В некоторых случаях удается осуществить ренатурацию антител с восстанов- лением их активности. Присутствие гаптена способствует рена- турации. Молекулы АТ обладают некоторой гибкостью, т. е. способ- ностью к конформационным превращениям. С помощью поляри- зованной люминесценции комплексов IgG с люминесцирующими красителями были установлены времена вращательной релакса- ции т, оказавшиеся порядка 50 нс (см. § 5.5). Эти значения со- ответствуют броуновскому вращательному движению не всей мо- лекулы белка, но малых ее участков, т. е. указывают на гибкость молекулы белка. По-видимому, домены обладают подвижностью. Взаимодействие гаптена с АТ приводит к заметному увеличению т, что указывает на изменение конформации АТ. Было установ- лено, что при образовании комплекса АТ—АГ конформация АГ также меняется. Данные оптических измерений подтверждаются исследованиями спектров электронного парамагнитного резонанса антител, содержащих парамагнитные метки. Когда в организм вводится АГ, в нем производится множест- во различных АТ. Каждое АТ синтезируется лишь одной опре- деленной группой лимфоцитов и их производных — плазматиче- ских клеток (см. § 17.10). Милстейн и Келер (1975) разработали так называемую гибридомную технику, позволяющую выделять клон идентичных клеток, производящих определенные монокло- нальные АТ. Метод состоит в слиянии клеток миеломы — злока- чественной опухоли иммунной системы с лимфоцитами, иммуни- зованными определенными АГ. Гибридные клетки — гибридо- мы — размножаются. Таким способом удается получать большие количества моноклональных АТ, широко применяемых в иссле- дованиях, для диагностики, а также в терапии. Модельная теория иммунитета изложена в § 17.10. § 4.9. Фибриллярные белки В заключение этой главы остановимся на строении и свой- ствах фибриллярных белков — структурных и сократительных. Первые играют роль опорных и защитных компонент, входя в со- став сухожилий, хрящей, костей, связок и т. д. (коллагены), а также кожи, волос, шерсти, рогов и т. д. (кератины). Вторые 126
являются рабочими веществами сократительных систем, в част- ности, мышц (миозин, актин и другие). В отличие от большинства глобулярных белков, фибрилляр- ные белки функционируют не в растворе, но образуют надмоле- кулярные системы. Они обладают свойствами жидких кристаллов. Если соединительную ткань экстрагировать холодными раст- ворами нейтральных солей при физиологическом значении ион- ной силы, то часть коллагена растворяется. Другая часть, именуе- мая проколлагеном, растворяется в лимонной или уксусной кислоте при pH 3,8. Коллагеновые волокна (фибриллы) образуются при агрегации цепей проколлагена. Эти фибриллы играют роль центров кри- сталлизации при остеогенезе, росте костей. Коллагеновые волокна нерастворимы в воде, но при длитель- ном нагревании с водой в результате деструкции длинных белковых цепей коллаген превращается в растворимую же- латину. Аминокислотный состав коллагена своеобразен: 33% всех аминокислотных остатков составляет Гли, 12% — Про и 10% — неканонический остаток оксипролил (Опро). Этот остаток, а так- же оксилизил (Олиз), содержащийся в количестве от 0,3 до 1,2%, встречаются главным образом в коллагенах. Коллаген содержит также до 10% Ала и значительно меньшие количества других аминокислот, причем содержание Тир, Гис, Цис, Мет, Вал, Фен особенно мало — менее чем по 1%. Таким образом, до 73 остат- ков составляют Гли, Про, Опро и Ала. Последовательность остат- ков в цепи коллагена можно представить в виде (Гли — X — Х)„, где X — любой остаток. Чаще всего встречаются последователь- ности Гли — Про — Опро, Гли — Про — Ала, Гли — Ала — Опро. Строение коллагена установлено в рентгенографических ис- следованиях Рамачандрана, Рича и Крика. Молекула коллагена в растворе, именуемая тропоколлагеном, построена в виде трой- ной спирали с м. м. около 360 000, каждая из трех цепей содер- жит около 1000 аминокислотных остатков. Длина молекулы 290 нм, диаметр 1,5 нм. Теоретический расчет структуры тропоколлагена исходит из минимизации конформационной энергии и учитывает стабили- зующую роль молекул воды (Туманян). Этот расчет дает ре- зультаты, согласующиеся с опытом. Тропоколлаген испытывает тепловой переход — денатурацию — в растворе. В зависимости от вида позвоночного температура денатурации Т„ меняется от 20 до 40°С, энтальпия денатурации — от 3150 до 6300 Дж/моль, энтропия—от 10,9 до 21 Дж/(моль -К) (калориметрические данные). Температура Тд, &Н и AS возрастают, с увеличением содержания иминокислотных остатков Про, Опро, которые не образуют внутримолекулярных водородных связей С = О--- ••••Н—N., По-видимому, тропоколлаген действительно стабилизу- ется соседними молекулами воды, образующими водородные свя- зи с иминными атомами азота: N ---H—О. Удаление воды при- 127
водит к разрушению структуры коллагена, а ее последующее до- бавление эту структуру восстанавливает. Нельзя считать до конца решенной проблему связи свойств коллагена с его строением. Работа в этой области необходима — коллаген является одним из важнейших белков и, обладая про- стым составом и строением, служит ценной моделью для изуче- ния белков в целом. Обратимся к кератину. Макроскопические свойства волос, шерсти и т. д. указывают на его высокую стабильность и нераст- воримость. Эти особенности определяются прежде всего большим числом поперечных дисульфидных связей между полипептидны- ми цепями. Кератин волос человека и кератин шерсти содержат 11—12% Цис, т. е. 3% серы. Длина волокон кератина существенно зависит от содержания в них воды (на этом основан волосяной гигрометр). Эти волокна эластичны и поддаются растяжению. Первыми работами по рент- генографии белков были работы Астбюри, исследовавшего струк- туру кератина шерсти (1943). Для кератина нерастянутого во- локна характерна периодичность 0,51 нм (а-кератин), при рас- тяжении происходит переход в ^-кератин с периодом вдоль оси волокна 0,33 нм и с поперечными периодами 0,47 и 0,97 нм. Аст- бюри считал, что а-кератину свойственны регулярные изгибы це- пей, которые выпрямляются при растяжении. В дальнейшем бы- ло показано, что а-кератин состоит в значительной степени из а-спиралей, а р-кератин имеет каноническую р-форму. Кератин — сложный белок. При разрыве дисульфидных свя- зей в результате окисления или восстановления получается раст- воримое вещество, из которого можно выделить две фракции — бедную и богатую серой. Первая состоит из фибриллярных, вто- рая — из глобулярных молекул. Вероятно, глобулярные молеку- лы служат сшивками в кератиновых волокнах. Структурная еди- ница волокна есть цилиндрическая микрофибрилла диаметром около 7,5 нм, построенная из белков с малым содержанием серы. На рис. 4.29 показана гипотетическая модель волокна а-керати- на. Регулярно уложенные участки являются а-спиралями, скру- ченными попарно. Белок гетерогенен и состоит из двух главных компонент в отношении 2 : 1. Отдельные молекулы могут распо- лагаться либо последовательно (рис. 4.29,6, в), либо параллель- ло друг другу (рис. 4.29, г). Опыт дает большие периоды вдоль волокна, равные 20 нм, что согласуется с моделями рис. 4,29, в иг, ло не 4.29, б. Микрофибрилла в целом состоит из 11 таких протофибрилл — двойных (а, может быть, и тройных) спиралей, причем две из них расположены в центре микрофибриллы, а девять — на ее пе- риферии (рис. 4.29, д). Это отношение 9 : 2 характерно для ряда биологических фибриллярных структур (см. § 12.6). Микрофибрилла имеет однородное строение. Длины спираль- ных участков, образующих протофибриллы, близки для разных видов, но состав неспиральных участков сильно варьирует. Раз- 128
личия в кератинах позвоночных определяются способом упаков- ки мпкрофибрилл и составом богатой серой глобулярной компо- ненты. Белок ^-кератин изучен значительно хуже. Упомянем еще об одном фибриллярном белке — о фиброине шелка. Оп.содержит главным образом Гли (более 40%), а также Рис. 4.29. Гипотетиче- ская схема молекуляр- ной организации а-кера- типа: а—отдельные мо- лекулы двух основных компонентов (они за- чернены и заштрихова- ны; последние — белки с низким содержанием серы); б, в, г — прото- фибриллы : <> - микро- фибрилла Ала, Сер, Тир. Цис и Мет в его составе отсутствуют, осталь- ные аминокислоты присутствуют в малых количествах. Рентгено- граммы фиброина сходны с рентгенограммами ^-кератина, основ- ная конформация — [S-форма. Шелк Bombyx mori образован по- липептидом (Гли — Ала)„, шелк Lyssax— полиаланином. О сократительных белках рассказано в гл. 12. 9 М. В. Волькенштайн
Глава 5 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОПОЛИМЕРОВ § 5.1. Рентгеноструктурный анализ Рис. 5.1. Дифракция рентгенов- ских лучей Прежде чем продолжить рассмотрение белков, остановимся на методах исследования структуры биополимеров. Естествознание пользуется двумя главными способами для изучения строения атомов и молекул. Эти способы — химия и оптика в широком смысле слова, т. е. изучение взаимодействия вещества со светом во всем диапазоне длин волн — от рентгенов- ских лучей до радиоволн. Химия расшифровывает первичную структуру биополимеров, струк- туру функциональных центров белковых глобул и т. д. Однако ХИМИЯ КаК ТаКОВаЯ Нс МоЖсТ ус- тановить пространственное стро- енпе белка или нуклеиновой кис- лоты. Рентгенография дает прямую информацию о расположении ато- мов в молекулах и кристаллах. Рентгеновские лучи, т. е. элек- тромагнитные волны с длиной порядка 0,1 нм, рассеиваются па электронных оболочках атомов. Интерференция волн, рассеянных веществом, приводит к возникновению дифракционной картины. При рассеянии па кристалле можно рассматривать дифракцию как отражение рентгеновских лучей плоскостями кристалличе- ской решетки (рис. 5.1). Дифракция наблюдается, если рассеян- ные волны находятся в фазе, т. е. разность хода равна целому числу п волн. Если расстояние между кристаллическими плоско- стями равно d, то условие дифракции (отражения) дается фор- мулой Брэгга — Вульфа пк = 2d sin б1, (5.1) где А — длина волны, б — угол между направлением падающего луча и кристаллической плоскостью. Вывод формулы ясен из рис. 5.1. Дифракция определяется тем, что межатомные расстояния d в решетке (0,1—0,4 нм) имеют тот же порядок, что и длины волн 130
(часто пользуются Яа-излучением Си с X = 0,154 нм). Основная идея рентгеноструктурного анализа состоит в определении рас- стояний d на основании дифракционной картины, получаемой для лучей с известной длиной волны. Подробные сведения о строении вещества можно получить только при исследовании кристаллов, в которых атомы расположены периодично. При этом, конечно, Рис. 5.2. Сечения отражающих плоскостей в ортогональной кристалличе- ской решетке элементарная формула (5.1) недостаточна. Кристаллическая ре- шетка характеризуется не одним, а тремя периодами и в кри- сталле имеется набор различных кристаллических плоскостей, от которых «отражаются» рентгеновские лучи. Эти плоскости можно охарактеризовать целыми числами (Миллеровские индек- сы) и межплоскостные расстояния d различны для разных ин- дексов. На рис. 5.2 показаны сечения различных отражающих плоскостей в ортогональной кристаллической решетке. Соответ- ственно на рентгенограмме (лауэграмме), полученной при моно- хроматическом излучении, наблюдается множество дифракцион- ных максимумов. Их число особенно велико для кристаллов бел- ка, что связано с относительно большими периодами кристалли- ческой решетки. На рис. 5.3 показана рентгенограмма кристал- лического миоглобина кашалота. Рентгенограмма получается на фотопленке, но ионизационные методы регистрации значительно более точны и чувствительны. Дифракционные максимумы обладают различными интенсив- ностями. Их анализ позволяет найти распределение электронной плотности в кристалле. Эта плотность выражается через так на- зываемые структурные амплитуды, зависящие от числа электро- нов в атоме и от направления рассеяния. Структурные амплиту- ды — величины комплексные, они характеризуются модулями и фазами. Не зная фаз, нельзя установить структуру объекта. Ме- тод определения фаз, развитый Перутцом применительно к 9* 131
белкам, состоит в том, что к молекулам, образующим кристалл, присоединяют тяжелые атомы, например, атомы ртути. Тяжелый атом, имеющий много электронов и сильно рассеивающий рентге- новские лучи, вызывает заметные изменения интенсивности ди- фракционных пятен. По разности амплитуд в присутствии и в от- сутствие тяжелого атома можно определить фазу. Применение производных белка, содержа- щих несколько, тяжелых ато- мов, позволяет решить пробле- му фаз однозначно. Необходи- мым условием при этом явля- ется полное сохранение струк- туры белкового кристалла при введении тяжелых атомов. Ме- тод Перутца есть метод изо- морфного замещения — ртут- ные производные белка кри- сталлизуются изоморфно с не- замещенным белком. Найденное по измеренным интенсивностям распределе- ние электронной плотности р(х, у, z) изображается своего Рис. 5.3. Рентгенограмма миоглоби- рода «геодезическими карта- на кашалота ми», на которых линии соеди- няют точки с одинаковыми вначениями р. Ввиду малости структурного фактора атомы водо- рода непосредственно не видны на карте электронной плотности. Их положение можно установить по искривлениям изолиний. Пространственное распределение плотности можно сделать видимым, например, наложением друг на друга контурных карт, вычерченных на листах прозрачного пластика. Соответствующая картина для миоглобина показана на рис. 5.4. Окончательным результатом исследования является пространственная модель мо- лекулы белка, в которой определены положения всех его атомов (см. с. 113, 185). До сороковых годов рентгенография сравнительно простых низкомолекулярных соединений подтверждала их структуру, уста- новленную химическими методами, и давала количественные све- дения о межатомных расстояниях. В 1944 г. Ходжкин расшиф- ровала структуру пенициллина, которую химикам не удавалось определить. Молекула пенициллина содержит 23 атома кроме атомов водорода. Далее Ходжкин установила структуру вита- мина В12, определив координаты уже 93 атомов. Вслед за этим рентгенографию стали применять в исследованиях наиболее сложных молекулярных белков. Основоположником этого направ- ления молекулярной биофизики был Бернал, крупнейшие дости- жения в изучении биополимеров принадлежат кембриджской на- учной школе (Брэгг, Кендрыо, Перутц). В 1957 г. Кендрью ус- 132
та нови л пространственное строение первого белка — миоглобина (с. ИЗ), определив положения 2500 его атомов. Необходимые для рентгеноструктурного анализа кристаллы белка далеко не всегда возможно вырастить. Они представляют собой молекулярные решетки, в узлах которых расположены гло- булярные макромолекулы. Установлено, что денатурация этих молекул (переходы глобула — клубок) может предшествовать Рис. 5.4. Пространственное распределение электронной плотности в мио- глобине плавлению кристалла (Есипова и Макаров). Кристаллы белка со- держат большое количество воды, и их исследуют в маточном растворе. Бернал и Ходжкин впервые воспользовались этим ме- тодом и получили десятки тысяч четких рефлексов на рентгено- граммах. Их число может доходить и до сотен тысяч. Расшифров- ка столь сложных рентгенограмм — очень трудная и длительная работа, которую можно провести, лишь пользуясь ЭВМ. Для точ- ного определения фазы, соответствующей каждому рефлексу, не- обходимо измерить несколько раз его интенсивность при дифрак- ции как от чистого белка, так и от его производных, содержащих тяжелые атомы. В расчетах фигурируют десятки миллионов чисел. В настоящее время рентгенография высокого разрешения (вплоть до 0,25 и даже 0,20 нм, для Mb — до 0,14 нм) проведена примерно для 200 глобулярных белков. Укажем, в частности, на расшифровку структур пепсина, леггемоглобина и аспартат- иминотрансферазы (Андреева, Вайнштейн и Борисов). Исследо- ван ряд ферментов, причем в некоторых случаях определено и 133
строение комплексов, образуемых ферментами о ингибиторами и с аналогами субстратов (см. гл. 6).- • ••'Принципиальная проблема, с которой встречается рентгено- графия белков, состоит в следующем: в какой мере структура* белковой молекулы в кристалле совпадает! с ее биологически' функциональной структурой в водном растворе? Если” бы белковая глобула предетавляла-еебей-не—апериодиче- ский кристалл, а сильно флуктуирующее образование, то можно было бы думать, что кристалли- Ррс. 5,5. Рентгенограмма. Na-соли ДНК вформе А зация означает отбор одной или нескольких конформаций из боль- шого их числа в- растворе. Но глобула имеет фиксированное строение. Кристаллические бел- ки, как уже сказано, содержат большое количество воды, и их изучают в маточном растворе. Результаты рентгенографическо- го исследования кристалла белка и данные оптических измерений того же белка в растворе, как правило, согласуются друг с дру- гом. В частности, совпадают сте- пени спиральности, определен- ные оббими методами. Более то- го, установлено, что ферментатив- ная активность ряда белков со- храняется в:.сильно оводненном кристалле. В целом ответ па по- ставленный вопрос положителен (см., впрочем, следующий параграф). Напротив, белки, подверг- нутые лиофильной сушке, изменяют свое строение — рентгено- граммы высушенных кристаллов белка очень бедны рефлексами. Недавно с помощью особенно точной и тонкой методики уда- лось изучить температурную зависимость дифракции рентгенов- ских лучей на кристаллах белков (метмиоглобин, мищлобин, ли- зоцим) и определить подвижность аминокислотных остатков. Это важно для физики ферментов (см. § G.4). Метод сводится к прецизионным измерениям интенсивности и ширины рефлек- сов, которая непосредственно связана с конформационной под-ь вижностью аминокислотных остатков в белках и ее зависимостью от температуры. Это — метод рентгенодинамического анализа, обещающий очень многое. Рентгенограммы фибриллярных биополимеров (коллаген, ДНК), образующих системы, периодические в одном измерении, характеризуются специфическими особенностями,- На рис. 5.5 при- ведена рентгенограмма натриевой соли ДНК в так называемой 4-форме (см. § 7,2). Для фибриллярной системы характерно рас- тяжение дифракционных пятен в .так называемые слоевые линии 134
и преимущественное их расположение вблизи меридиана или эк- ватора рентгенограммы. Наблюдаемая картина представляет .так •называемую осевую текстуру одномерно упорядоченной системы, •в которой одни оси молекулы приблизительно параллельны -вы- деленному направлению, а другие оси ориентированы произволь- но. Текстура имеет одну ось . симметрии бесконечного по- рядка: : • г ' . Для ряда биополимеров, в частности для ДНК, характерно спиральное строение. В этом случае на рентгенограмме текстуры наблюдается преимущественное расположение дифракционных пятен вдоль двух прямых,- образующих косой (андреевский) крест (см. рис. 5.5). Не следует, однако, думать, что для рас- шифровки спиральной структуры достаточно простого обозрения рентгенограммы и констатации косого креста. Исследуемый объ- ект представляет собой агрегат цепных молекул, обладающий го- раздо меньшей упорядоченностью, чём трехмерный кристалл. Соответственно дифракционная картина бедна рефлексами. Раз- работан ряд приемов для ее расшифровку. Применяется метод .«.проб и ошибок»: ла основании структурно-физических представ- лений и анализа атомных моделей строится пробная модель си- стемы, для которой (и вычисляется распределение интенсивностей рефлексов. Совпадение с наблюдаемым распределением доказы- вает истинность модели. Далее можно вычислить фазы и нац- Рис, 5.6. Дебаеграмма коллагена вает истинность модели. Далее ти распределение электронной плотности биополимера. Имен- но таким способом .была, ус- тановлена знаменитая двойная спираль ДНК (см. § 7-2). Агрегаты цепных молекул существуют в различных сте- пенях упорядоченности, начи- ная. с истинного кристалла и кончая аморфным полимером, в котором цепи разупорядоче- ,ны. Строгая теория позволяет судить по дифракционной кар- тине о нарушениях порядка, вызываемых сдвигами, изгиба- ми, отклонениями от парал- лельной упаковки макромоле- кулярных цепей. Полимерные структуры в ряде случаев образуют паракристаллы — системы, лишенные истинного трехмерного порядка, но состоящие йу ценных молекул, сдвинутых и.. повернутых параллельно друг другу. Для ряда фибриллярных белков (кератин, коллаген), для целлюлозы и некоторых других волокнистых веществ характер- на нарушения упорядоченности с сохранением примерной па- раллельности осей молекул. Такие системы обладают свойствами э^идких кристаллов- 485
Синтетические аморфные полимеры (например, каучук) да- ют, подобно жидкостям, дифракционные картины в виде сово- купности концентрических колец (диаграммы Дебая — Шерера, рис. 5.6). Для такой картины, несравненно более бедной, чем лауэграмма кристалла, характерно наличие размытого кольца — аморфного гало, диаметр которого определяется преимуществен- ными расстояниями между рассеивающими центрами. При рас- тяжении аморфного полимера возникает текстура и вместо рав- номерных по интенсивности колец, как мы видим, наблюдаются более или менее протяженные дуги вблизи меридиана или эква- тора кольца. Сходные картины дают фибриллярные белки, а так- же надмолекулярные структуры типа мышечных волокон. § 5.2. Диффузное рассеяние рентгеновских лучей растворами биополимеров Диффузное рассеяние рентгеновских лучей растворами макро- молекул дает прямую информацию о распределении рассеиваю- щих объектов. Диффузное рассеяние есть суммарное рассеяние на беспорядочно расположенных отдельных макромолекулах, тем самым в нем усредняются интенсивности рассеянного света по всевозможным ориентациям макромолекулы. Чем больше углы рассеяния, тем меньше размеры деталей структуры, на которых происходит дифракция рентгеновских лучей. Под малыми угля- ми рассеянии изучается общее строение макромолекул в раство- ре, а под средними и большими — особенности их внутреннего строения. Теория малоутловой дифракции исходит из представлений, близких к применяемым в теории рассеяния света растворами макромолекул (с. 82). Теория позволяет связать наблюдаемую под теми или иными углами интенсивность рассеяния, т. е. его индикатрису с расстояниями между рассеивающими частицами. Для определения формы макромолекулы приходится задаться некоторыми о ней предположениями — представить макромоле- кулу в виде шара, эллипсоида или вытянутого цилиндра. Для таких, а также для других простых тел вычисляется индикатри- са рассеяния как функция геометрических параметров макромо- лекулы. Так, для шара определяется электронный радиус инер- ции (электронный, так как рентгеновские лучи рассеиваются электронами). Для миоглобина этот радиус оказался равным 1,6 нм, что хорошо согласуется с размерами, определенными ме- тодом рентгеноструктурного анализа кристаллического миогло- бина. Если рассеивающая система вытянута, то определяется электронный радиус инерции ее поперечного сечения. По инди- катрисам рассеяния определены размеры, форма и молекулярные массы ряда биополимеров. Так, лизоцим представляется эквива- лентным эллипсоидом вращения с размерами 2,8 X 2,8 X 5,0 нм*. Более детальная информация о форме однородных частиц полу- чается из анализа кривых рассеяния под большими углами (от 136
нескольких градусов до ~25° для Си Ка-рентгеновских лучей). Рассеяние под большими углами характеризует детали размером от 4 до 0,5 нм. На рис. 5.7 показаны теоретические индикатрисы рассеяния, вычисленные для различных моделей ,уС1-иммуноглобулина, и экспериментальные точки, которые ложатся на теоретическую Рис. 5.7. Теоретические индикатрисы рассеяния для различных моделей иммуноглобулина (1—4) и экспериментальные точки (5) кривую, отвечающую Т-образной модели расположения доменов (см. с. 123). Эта модель получила в дальнейшем полное под- тверждение в кристаллографических исследованиях. При расчете рассеяния необходимо учитывать влияние раст- ворителей на вид индикатрисы. Это влияние не специфично и растворитель может быть заменен на однородный и бесструктур- ный континуум, характеризуемый лишь одним параметром — эф- фективной электронной плотностью. Метод состоит в сравнении экспериментальной индикатрисы с теоретической, вычисленной на основе кристаллографических данных. Не обнаружено заметных различий между структурами в кристалле и растворе (в области расстояний > 1 нм) для ри- бонуклеазы и для комплексов рибонуклеазы и лизоцима с их ингибиторами. Однако экспериментальная кривая для лизоцима без ингибитора слегка отличается от теоретической в интервале расстояний ~ 2 нм. Это различие можно интерпретировать как флуктуационное расширение зазора между двумя доменами бел- ка. Заметные различия обнаружены на кривых для миоглобина, что, по-видимому, объясняется флуктуационными смещениями ее GH-шпильки относительно других частей молекулы. Установле- ны также существенные различия в структурных данных для кристаллического и растворенного лизоцима фага Т4 и для дру- гих белков. Таким образом, по крайней мере некоторые белки в растворе характеризуются смещениями доменов, из которых по- строены глобулы. 137
§ 5.3. : Методы ядерной физик» В качестве побочных выходов современной ядерной физики, пользующейся, мощными пучками элементарных частиц — элект- ронов, нейтронов и т. д., надо указать на рентгенографию, при7. меняющую синхротронное излучение, и па нейтронографию кри- сталлических и растворенных биополимеров. Магнитно-тормозное, или синхротронное, излучение (СИ) воз- никает при движении заряженных частиц, в частности, электро- нов в циклических ускорителях. В СИ: происходит потеря энер- гии, затрачиваемой па ускорение частиц. СИ в рентгеновской области спектра имеет интенсивность на два порядка боль- ше, чем современная рентгеновская трубка мощностью в 2 кВт. Применение специальной монохроматизации' и коллимаций позволяет повысить интенсивность рентгеновского СИ еще : на два порядка, дальнейшее увеличение на 2—3 порядка достигает- ся с помощью специальных накопителей. СИ характеризуется^ малой расходимостью пучка. Эти особенности позволяют восполь- зоваться СИ для рентгенографии быстро изменяющихся объектов. Синхротронное излучение является весьма перспективным ме- тодом для исследования биологических процессов, связанных с конформационными и другими структурными превращениями на молекулярном и надмолекулярном уровнях. Синхротронное излучение обеспечивает важные возможности рентгеновской спектроскопии. Рентгеновские кванты имеют энер- гию, как раз достаточную для ионизаций внутренних электродов в-'атомах. На краю поглощения рентгеновских лучей наблюдается топкая структура полосы поглощения. Эта структура есть резуль- тат отражения сферической волны, испускаемой первичным по- глотителем (скажем,тяжелым атомом, расположенным в цептре молекулы), от окружающих атомов и интерференции с рассеян- ными ими волнами. С помощью такого метода, именуемого EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure), удалось, на- пример, получить ценную информацию • о- структуре нитрогена- зы — белка,' содержащего атомы молибдена. Микрочастицы испытывают дифракцию, если: длина де-брой- левской волны 1 ' X = h/mv, (5.2) где h — постоянная Планка, m — масса частицы и и — ее ско- рость, имеет тот же порядок величины, что и расстояние между деталями объекта. Разнообразные применения нашла нейтронография. Пучок нейтронов из атомного реактора подвергается монохро- матизации отражением от кристаллической пластинки (напри- мер, CaF2). Дифрагирующие нейтроны регистрируются счетчи- ками. Нейтроны рассеиваются не электронной оболочкой атома, но его ядром, и атомный фактор рассеяния определяется протон- по-пейтронпой структурой ядра, а не атомным номером. Поэто- му атомные факторы изотонов существенно различаются. Атом- 138
пый фактор для водорода, т. е. для протона, далеко не минимален. Поэтому, в отличие от. рентгенографии, нейтронография позволя- ет надежно локализовать атомы водорода. Так, например, « по- мощью нейтронографии была установлена детальная структура льда — показано, что каждый атом Н, образующий ковалентную и водородную связи ОН- О может иметь два положения—указанное и такое: О--Н-О. Иными словами, протон может находиться как у «своего», так и у «чужого» кислорода. Водородная связь в воде характеризуется перескоками протонов между двумя эквивалентными минимума- ми. Нейтронография успешно применялась в исследованиях био- полимеров. Что касается диффузного рассеяния нейтронов. раст- ворами биополимеров, то оно дает результаты, существенно дополняющие получаемые при рассеянии рентгеновских лучей. Меняя долю тяжелой воды в водном растворе биологического объекта, можно варьировать суммарную амплйтуду рассеяния нейтронов. При этом выявляется избирательное рассеяние раз- личных функциональных групп. Удалось, в частности, исследо- вать природу комплексообразования белка и ДНК в хроматине. Специфическим методом структурных исследований биополи- меров является ^-резонансная спектроскопия, основанная на эф- фекте Мёссбауэра. Эффект состоит в резонансном поглощении атомным ядром монохроматического "f-излучения, испускаемого радиоактивным атомом. Во всех природных соединениях железа содержится 2,2% изотопа ”Fe. Это дает возможность изучать Fe-содержащие белки (гемоглобин, миоглобин, цитохромы и т. д.) методом "f-резонанса. Образец подвергается действию у-лучец, испускаемых радиоактивным 5,Fe (получаемым из 57Со). Если сообщить источнику небольшую скорость движения относи- . телыю поглотителя, т. е. исследуемого образца, вдоль оси, соеди- няющей источник и образец, то частота 7-кваита немного изме- нится вследствие эффекта Доплера. При некотором значении собственной частоты ядра 5,Fe образца будут поглощать ^-кван- ты резонансно, переходя из основного в возбужденное состояние. Резонансная частота ядра ”Fe в геме и в других Fe-содержащих группах весьма .чувствительна к воздействию соседних атомов и групп. Это позволяет получать информацию об электронной структуре Fe-содержащих атомных групп в различных их состо- яниях в белках. Эффект может быть усилен обогащением биопо- .лимера изотопом ”Fe. Для этой цели увеличивается содержание этого изотопа в пище подопытных животных, являющихся источ- ником соответствующих веществ. Наряду с гемсодержащимп белками методом у-резонансной спектроскопии эффективно изу- чаются железосерные белки (ферредоксин, рубредоксин и т. д.), ,а также механизмы химических, реакций с участием железосо- 139
держащих биополимеров. Можно использовать для структурных определений у-излучающие изотопы в качестве меченых атомов и эффект Мёссбауэра как анализатор. Наряду с абсорбционными у-резонансными спектрами изуча- ются и эмиссионные. В этом случае источник содержит атомные ядра, материнские по отношению к мёссбауэровским. Эмиссион- ным методом изучено строение ряда порфириновых соединений кобальта — витамин В,2 и др. Чувствительность эмиссионного метода очень велика, с его помощью удается следить за быстро- текущими биологическими процессами. Изучение белков, меченых 57Fe, посредством этого метода по- казало, что подвижность их составных частей отлична от подвиж- ности молекул в обычных кристаллах и жидкостях. О том же свидетельствуют исследования рэлеевского рассеяния мёссбауэ- ровского излучения (Гольданский). Конформационная подвиж- ность в белках сохраняется и при низких температурах. Перспективы применения у-резонанской спектроскопии свя- заны, во-первых, с созданием «мёссбауэрографии», т. е. рентге- нографии на излучении мёссбауэровских ядер. Во-вторых, нача- лась разработка у-лазеров, что в принципе обещает возможность голографии на молекулярном уровне. § 5.4. Электронные спектры поглощения В конечном счете все оптические и спектроскопические свой- ства молекул, дающие важнейшую информацию об их строении, определяются расстояниями между энергетическими уровнями молекулы и вероятностями перехода между ними. Эти уровни отвечают различным электронным, колебательным и вращатель- ным состояниям молекул. Электронные переходы полипептидных и полинуклеотидных цепей и, тем самым, белков и нуклеиновых кислот расположены в ультрафиолетовой области спектра. Полосы поглощения пеп- тидной связи —СО—NH— лежат в области 185—240 нм, здесь же и в более коротковолновой области расположены полосы алифати- ческих боковых цепей аминокислотных остатков. Ароматические остатки Трп, Фен, Тир имеют полосы поглощения в области 280 нм. Азотистые основания в нуклеиновых кислотах поглоща- ют свет в области 260 нм. Таким образом, белки и нуклеиновые кислоты бесцветны, они не поглощают видимый свет. Это вполне согласуется с диэлектрической природой биополи- меров и делает мало правдоподобными утверждения об их элек- тронной проводимости. Мы уже говорили о том, что для свобод- ного перемещения электронов вдоль полимерной цепи она должна быть жесткой сопряженной системой, состоящей из че- редующихся двойных и единичных связей или из сопряженных ароматических циклов. Гибкость цепи несовместима с ее элек- тропроводностью. Короткие сопряженные цепи окрашены (каро- тин — красный, см. с. 49), а достаточно длинные поглощают весь 140
видимый свет, т. е. они черные или даже металлоподобные. Так, недавно был получен полимер ацетилена НС^СН Н Н Н С С С \^\^\^\ С С С н н н обладающий металлическим блеском. Квантовомеханические рас- четы действительно показывают, что для возбуждения электронов проводимости в белках необходима затрата очень большой энер- гии, не менее 3,5 эВ (т. е. 340 кДж/моль). Некоторые кристаллические полупроводники бесцветны, но это не дает оснований считать биополимеры полупроводниками. По-видимому, малая электропроводность биополимеров объясня- ется присутствием трудно отделяемых ионов металлов и биоло- гического значения не имеет. Мономер белковой цепи подобен молекуле амида R,—СО— —NH—В2. В результате изучения электронных спектров про- стых амидов (формамид, метилацетамид, миристамид) установ- лены электронные переходы в амидной группе (рис. 5.8). Схема электронных переходов основана на квантовомеханических рас- четах. На рис. 5.9 показаны волновые функции амидной группы, Рис. 5.8. Электронные переходы в амидной группе Рис. 5.9. Волновые функ- ции амидной группы соответствующие ее наиболее подвижным электронам. На рис. 5.8 уровень л2 отвечает связывающей, уровень л* — несвязывающей орбиталям С=О, уровень л, — несвязывающей орбитали азота, уровень п — состоянию неподеленной пары электронов атома кислорода. Переход по* — атомный электронный переход в кис- лороде. Согласно закону Бугера — Ламберта — Бэра, интенсивность света, прошедшего через слой поглощающего вещества толщины I, равна 7 = 70 ехр(—ecZ), (5.3)' где 70 — интенсивность падающего света, с — концентрация по- глощающего вещества (в моль/л), е — молярный коэффициент 141
. поглощения (в л/(моль • см)). Поглощение в данной полосе, от- вечающей переходу с начального уровня 0 на возбужденный уро- вень /, выражается так называемой силой осциллятора /ад, опре- деляемой интенсивностью полосы поглощения: foj = 4,32-10~9 $eojdv. (5.4) Здесь v — волновое число, т. е. частота световой волны, деленная . на скорость света; интегрирование проводится по всей полосе поглощения. Теория дает , _ 2те 2 /г п Joi--7Т ^ojPoP \a-af где е и те — заряд и масса электрона, &>Oj — круговая частота, соответствующая переходу =(£, - Ео)/Ъ, (5.6) Ео, Ej — энергии основного и возбужденного состояний. Наконец, Ро> — матричный элемент дипольного момента, отвечающий пере- ходу 0 /, или переходный дипольный момент-. (5.7) Величина называется дипольной силой перехода. Сила ос- циллятора есть величина безразмерная, ее значения для разных полос меняются от очень малых величин до порядка 0,1 —1,0. Формула (5.7) показывает, что Poj и сила осциллятора тем боль- ше, чем сильнее перекрываются волновые функции начального и конечного состояний и ф,. Переход пл* в амидной группе имеет малую дипольную силу, так как электронные облака п- и л*-состояний почти перпендикулярны друг другу и слабо пере- крываются (рис. 5.9). Теоретические расчеты дают следующие длины волн соот- ветствующие переходам: пл* 234, л,л* 160, л2л* 135 нм. В спект- ре миристамида наблюдаются полосы 220 (пл*), 190 (л,л*) и 165 нм (л2л*). Переходный дипольный момент л,л* лежит в пло- скости HNCO под углом 9° к линии, соединяющей атомы О и N, а момент перехода пл* перпендикулярен к этой плоскости. Спектры амидных групп в полимерной цепи изменяются вследствие электронного взаимодействия этих групп друг с дру- гом. В частности, энергетические уровни для концевых групп це- пи отличаются от уровней для внутренних групп. Наибольший интерес для биофизики представляют спектральные эффекты, воз- никающие вследствие эксптонного резонансного взаимодействия, а именно давыдовское расщепление и гипохромизм. Исследуя оптические свойства молекулярных кристаллов. Да- выдов показал, что в регулярной совокупности тождественных хромофорных (светопоглощающих) групп между их возбужден- ными энергетическими уровнями может происходить резонансная .142
передача энергии возбуждения. В регулярной системе может рас- пространяться волна возбуждения—экситон (Френкель). В ре- зультате резонансного взаимодействия энергетические уровни расщепляются, образуя широкую зону. Правила отбора разреша- ют переходы при поглощении и испускании света не на любые, Гис. 5.10. Уровни энер- гии для системы парал- лельных (а) и коллине- арных (б) дипольных моментов перехода но па строго определенные уровни зоны, причем поляризация по- лос поглощения определяется симметрией регулярной системы как целого. Резонансное взаимодействие возможно уже в димере, и в нем оно приводит к расщеплению исходного уровня на два. На рис. 5.10 показана схема такого расщепления для случаев па- раллельного и коллинеарного расположения переходных диполей. Сплошные стрелки указывают разрешенные переходы, прерыви- стые — запрещенные. Моффит провел теоретический расчет эк- ситонного расщепления для перехода Л1Л* 190 нм в а-спирали. Согласно теории Давыдова, эта полоса расщепляется на две, при- чем одна из полос поляризована вдоль оси спирали, а вторая — перпендикулярно к ней. Разность частот двух полос составляет 2700 см-1 (или ~ 10 нм в шкале длин волн). Резонансное взаимодействие приводит к перераспределению интенсивностей спектральных полос. В случае двух коллинеар- ных переходных диполей полоса с мепыпей частотой (с большей длиной волны) увеличивает свою интенсивность за счет интен- сивности коротковолновой полосы. Возникает гиперхромизм в длинноволновой полосе. Напротив, в случае параллельных ди- польных моментов понижается интенсивность длинноволновой по- лосы и увеличивается интенсивность коротковолновой. Возникает гипохромизм длинноволновой полосы. Именно гипохромизм на- блюдается в спектрах а-спиральных полипептидов и белков, а так- же двуспиральных нуклеиновых кислот. Если дипольные момен- ты перпендикулярны друг другу, то перераспределения интен- сивности нет. На рис. 5.11 показаны экспериментальные результаты, полу- ченные для полиглутаминовой кислоты (НГК). При pH 4,9 по- лимер находится в форме а-спирали, при pH 8,0 — в форме клуб- 14.3
ка. Хорошо наблюдаются две полосы, возникшие в результате Давыдовского расщепления, и сильный гипохромизм. Сила осциллятора длинноволновой полосы а-спирали пони- жена на 30%. В форме клубка длинноволновые полосы ПГК и полилизина характеризуются силой осциллятора 0,110, в а- спиральной форме — 0,075. Гипохромный эффект был детально изучен и эксперимен- тально, и. теоретически. Иссле- дована зависимость эффекта от окружающей среды, от pH и ионной силы. Очевидно, что Исчезновение гипохромизма при переходе спираль — клубок может дать количественную меру а-спи- ральности белка. Ввиду труд- ностей, с которыми сопряже- ны спектрофотометрические измерения в далекой ультра- фиолетовой области вблизи 200 нм, этот метод малоупотре- и эффективен бителен при изучении белков. Напротив, он прост для нуклеиновых кислот, длинноволновые полосы которых лежат вблизи 260 нм. § 5.5. Люминесценция Подобно спектрам поглощения, спектры люминесценции (флуоресценции) сложных молекул размыты и лишены тонких деталей. Информативными оказываются не столько длины волн максимумов полос» сколько интенсивность, поляризация и дли- тельность свечения. Допустим, что в момент t = 0 имеется н(0) возбужденных молекул. Если вероятность перехода за 1 с из возбужденного со- стояния в невозбужденное с излучением кванта света есть /, а вероятность безызлучательного перехода, в котором энергия возбуждения превращается в тепло, есть g, то dn — — (/ + g)ndt п (t) = п(0) exp [- (/ + g) i]. (5.8) (5.9) Средняя длительность возбужденного состояния (5.10) 144
Интенсивность флуоресценции убывает экспоненциально. В боль- шинстве случаев т равно по порядку величины 10““ — 10-8 с, но может быть и гораздо больше. Квантовый выход выражается долей переходов с излучением^ Y = //(/ + g). (5.11) В растворе равновесное распределение молекул по их запасам колебательной энергии не зависит от избытка этой энергии, по- лученной при возбуждении и, следовательно, от длины волны А.возб возбуждающего света. Значит, т и у также не зависят от Хвоаб (закон Вавилова). Флуоресцентное излучение сложных молекул (в частности красителей) поляризовано даже при естественном падающем све- те. Теория поляризации люминесценции разработана Вавиловым и Феофиловым. Возбуждающий свет поглощается молекулами, определенным образом ориентированными по отношению к элек- трическому вектору световой волны. После поглощения энергия излучается в результате другого электронного перехода, которо- му отвечает, вообще говоря, иная поляризация в молекуле, т. е. иное направление переходного диполя. Если время жизни воз- бужденного состояния, т. е. время передачи энергии, мало па сравнению с временем переориентации молекулы, то люминес- ценция поляризована. Степень поляризации выражается вели- чиной (512> где Ди/, — интенсивности излучения с составляющими элект- рического вектора вдоль осей z и х при направлении падающего света вдоль оси у (рис. 5.12). Расчет показывает, что предель- ное значение Р при естественном падающем свете для непод- вижных произвольно ориентированных молекул равно 73. Вра- щательное движение молекул или атомных групп деполяризует свечение. Теория дает формулу Левшина — Перрена Р V Н, ' 3 /Гц (5.13) Здесь Р — наблюдаемая степень поляризации; — ее предель- ное значение в отсутствие деполяризации, т. е. при Т -*• 0, или при вязкости среды ц -*• V — объем молекулы, т — время жиз- ни возбужденного состояния. Степень поляризации убывает с уве- личением подвижности излучающей молекулы и может служить мерой подвижности. Безызлучательные переходы, благодаря которым квантовый выход 7 меньше 1, сводятся к превращению световой энергии в тепло. Молекула, возбужденная фотоном Й(оа до некоторого син- глетного уровня ЕВ1, может с вероятностью / излучить квант йсй/; в ней может произойти внутренняя конверсия энергии в колеба- ния с сопутствующей деградацией в тепло; молекула может пе- 10 м в. Волькенштейн 145
рейти без излучения на метастабильный триплетный уровень Его, растрачивая часть энергии возбуждения. В дальнейшем энер- гия Ето может выделиться в виде фотона фосфоресценции или деградировать в тепло. Все эти процессы представлены на рис. 5.13. Другая важная причина уменьшения квантового выхода — тушение люминесценции. Оно может вызываться посторонними веществами или мигра- цией энергии возбуж- дения от молекулы к Рис. 5.13. Схема энергетических перехо- дов при люминесценции ясняющая поляризацию люминесценции молекуле (концентрационное тушение). Речь идет не об излуче- нии с последующей реабсорбцией света, но о прямой передаче энергии возбуждения вследствие резонансного взаимодействия молекул, которое растет с уменьшением расстояний между мо- лекулами, т. е. с увеличением концентрации. Условием такого взаимодействия является сильное перекрывание полос поглоще- ния и испускания молекул. Различие между резонансным и экситонным (с. 143) взаимо- действиями количественное. Резонансная миграция энергии про- исходит, если энергия взаимодействия велика, т. е. сильно пре- вышает ширину электронно-колебательной зоны. В этом случае передача энергии происходит быстро и можно не учитывать вли- яния колебаний. В отличие от экситонных спектров, возникаю- щих при слабом взаимодействии (энергия которого значительно меньше ширины зоны), в спектрах резонансно взаимодействую- щих молекул не наблюдается колебательной структуры. Миграция энергии вызывает деполяризацию люминесценции. Молекула, поглощающая квант, как-то ориентирована в про- странстве. Если бы та же молекула излучала свет, то он обла- дал бы некоторым значением степени поляризации Р. Однако эа время т, протекающее между поглощением и излучением, воз- можны многократные акты передачи энергии другим молекулам с несколько отличными ориентациями. По прошествии опреде- ленного времени все возбужденные молекулы теряют первона- чальную ориентацию и излучение оказывается деполяризованным. 146
Нужно подчеркнуть, что миграция энергии возможна как между тождественными, так и между разными молекулами при условии перекрывания полосы поглощения молекул одного сор- та и полосы флуоресценции молекул другого сорта. Изучение особенностей люминесценции, связанных с мигра- цией энергии, важно для биофизики. Передача энергии с одного Таблица 5.1. Спектральные свойства ароматических аминокислот Аминокислота ^тах, нм (поглощение) е, моль 1-л-*1 Мпах’ нм (флуоресценция) V Фенилаланин 257 200 282 0,04 Тирозин 257 1300 303—304 0,21 Триптофан 280 5600 353 0,21 люминесцирующего участка биополимера на другой позволяет оценить их относительное расположение. Изучение поляриз<^ван- ной люминесценции дает информацию о конформационной струк- туре и ее динамике — о подвижности макромолекулы и отдель- ных ее групп. Люминофорами часто являются циклические л-элек- тронные системы. Так, светятся ароматические аминокислотные остатки в белках. Спектральные свойства соответствующих аминокислот указаны в табл. 5.1. Флуоресценция Фен практически не видна. Свечение Тир и Трп существенно зависит от pH и полярности среды, от протони- зации соседних групп. В нативных белках у для Тир значитель- но меньше 0,21; напротив, у. для Трп может увеличиваться до 0,32. Денатурация мочевиной делает равными значения у Тир и Трп — их квантовые выходы конформационно чувствительны. Дело в том, что тушение люминесценции Тир и Трп зависит от окружения, в частности, от его гидрофобности. Свечение остат- ков, переходящих при конформационных изменениях из ядра глобулы на ее поверхность, легче тушится и посторонними туши- телями. Изучение люминесценции белков (ароматических остат- ков) дало ценные сведения об их конформационных свойствах и взаимодействиях с другими молекулами и ионами. Не менее ценные результаты дает применение люминесцент- ных меток. Конформационная структура и динамика комплек- сов нуклеиновых кислот с люминофорами — с акридиновыми красителями — успешно изучаются с помощью поляризованной люминесценции. С люминесценцией прямо или косвенно связаны три' направ- ления биофизических исследований, о которых необходимо сде- лать книтические замечания. 1. Представления о миграции энергии, возникшие в результа- те изучения люминесценции, легли в основу попыток объяснения ряда биологических процессов. Многие из этих процессов проте- кают быстро, по принципу «все или ничего». Истинное объясне- 10* 147
иие таких явлении должно, по-видимому, исходить из их коопе- ративной природы. Применительно ко многим задачам такое объ- яснение получено. Однако в литературе фигурируют соображе- ния о миграции энергии в биополимере или в окружающей его якобы «структурированной» воде. На этой основе пытались, на- пример, истолковать мышечное сокращение. «Миграционные» представления в «темновой» биологии не имеют оснований. 2. В 1923 г. Гурвич сообщил об открытии митогенетических лучей, испускаемых клетками при их митотическом делении и, в свою очередь, стимулирующих митозы. Продолжавшиеся в те- чение ряда лет попытки обнаружить это излучение точными фи- зическими методами не привели к успеху. Существование мито- генетических лучей не подтвердилось, их изучение поэтому дав- но оставлено. Равным образом ложны сообщения об ультрафио- летовых излучениях при гибели клеток и при иных биологиче- ских процессах. 3. Клетки и ткани растений и животных обладают зачастую на воздухе слабым свечением, которому приписывалось биологи- ческое значение. Однако это свечение — хемилюминесценция, оп- ределяемая, в основном, окислением липидов. Многие органиче- ские соединения светятся при окислении. Биологического значе- ния это свечение, по-видимому, не имеет. Оно может использо- ваться Как индикатор окислительных процессов. § 5.6. Естественная оптическая активность Как уже говорилось, биополимеры хиральны и, следователь- но, обладают естественной оптической активностью, т. е. враща- ют плоскость поляризации света, и круговым дихроизмом (см. далее). Оптическая активность — способность хиральной среды пово- рачивать плоскость поляризации проходящего света — была от- Рис. 5.14. Разложение плоско- поляризованной волны на волны, поляризованные по кругу вправо и влево (а), и поворот плоскости поляризации в результате круго- вого двулучепреломлепия (б) крыта Араго в 1811 г. Как показал Френель (1820 г.), оптиче- ская активность есть результат кругового двулучепреломления, т. е. разных скоростей распространения в среде света, поляризо- ванного по кругу вправо и влево. В правой волне вектор напря- 148
женности электрического поля в луче, идущем в глаз наблюда- теля, вращается по часовой стрелке, в левой — против часовой стрелки. Линейно поляризованную волну можно разложить на правую и левую волны, поляризованные по кругу — электриче- ский вектор, колеблющийся вдоль одного направления, есть сум- ма двух векторов, вращающихся по кругу по и против часовой стрелки (рис. 5.14, а). Если одна из этих волн распространяется быстрее другой, то суммарный вектор поворачивается на угол, тем больший, чем больше разность скоростей (рис. 5.14, б), т. е. показателей преломления. При прохождении луча через слой вещества толщиной I плоскость поляризации поворачивается на угол ф = у- (nL — nD) I, (5.14) A тде X — длина волны света, nL и nD — показатели преломления для левой и правой волн. Удельным вращением раствора, содержащего с (г/см3) опти- чески активного вещества, называется величина <рУд = ф//с. (5.15) Если I измеряется в дм, а ф — в радианах, то 180 10 <р —1 —1 о /г* л фуд = — — -у-рад-дм -г -см3. (5.16) Для чистого вещества вместо с надо подставить плотность. Мо- лекулярным вращением называется величина „ М 18 М ,е фуд — Ф -Z7 —Г», (5.17) 100 ' л с! ' ' где М — м. м. оптически активного вещества. Любое вещество и преломляет, и поглощает свет. В области собственного поглощения света веществом показатель преломле- ния есть комплексная величина п = п — ix, (5.18) где х — показатель поглощения, связанный с молекулярным ко- эффициентом поглощения е (см. (5.3)) соотношением где М — молекулярная тгасса, а с выражено в г/см’. Часто поль- зуются законом Бугера — Ламберта — Бэра в форме / = /о.10"Е'с''. (5.20) Здесь с' выражено в моль - л-1, а е' = 0,4343е. Если вещество обладает круговым двулучепреломлением, то оно по-разному поглощает свет, поляризованный по кругу влево и вправо, т. е. обладает и круговым дихроизмом. Угол поворота 1й9
плоскости поляризации — также комплексная величина Ф = -у (nL — nD) l = -^-(nL — nD)l— у-d) I- (5_21> Л Л Л В области собственного поглощения линейно поляризованный свет- превращается в эллиптически поляризованный. Мерой эллиптич- ности служит величина 0 = 4(xl-xd). ' ' (5.22) Л Молекулярная эллиптичность определяется как 0мол = 9 4 4 = 2,303 • (e'L - e'D) 3300 (e'L - eD). (5.23) Теория должна объяснить происхождение разностей nL — nD п xL — xD (т. е. El — eD) и установить связь этих величин со строе- нием вещества. В обычной оптике — в теории преломления и дис- персии света — размеры молекул считаются бесконечно малыми по сравнению с длиной волны света А. Иными словами, не учи- тываются различия в фазах световой волны в разных точках молекулы. В действительности для малых молекул отношение их размеров к длине волны видимого света имеет порядок величины 10_3, которым в теории оптической активности нельзя пренебре- гать — весь эффект определяется именно разностями фаз свето- вой волны в пределах молекулы. Спектрополяриметрия есть сво- его рода молекулярная интерферометрия, чем и объясняется высокая чувствительность оптической активности к изменениям молекулярной структуры. Таким образом, нельзя пренебрегать расстояниями между электронами молекулы, на которые действует световая волна. Необходимо также учитывать взаимодействие этих электронов — в отсутствие такового нет и оптической активности. И; наконец, молекула или кристалл должны быть хпральными, т. е. не иметь ни плоскости, ни центра симметрии. В строгой квантовомеханическбй теории оптической активно- сти (Розенфельд) поворот плоскости поляризации выражается через электрические и магнитные переходные диполи (ср. с. 142). Для изотропной среды, содержащей Nt хиральных молекул в 1 см3, получается где п -- показатель преломления, a fJ — константа, характеризую- щая оптическую активность. Показатель преломления связан с поляризуемостью а формулой Лорентц — Лоренца (5.25) (Поляризуемость а, определяющая преломление света, и констан- та р, определяющая круговое двулучепреломление, выражаются 150
-сходным образом: о <5'27» Эти формулы справедливы для молекул в основном, электронно невозбужденном состоянии 0, вдали от полос поглощения с час- тотами ю, 553 (Ooj- Здесь со — круговая частота падающего света, с — скорость света, п = h/2n, h — постоянная Планка, р0) — элек- трический дипольный момент перехода (см. с. 142), mj0—маг- нитный дипольный момент перехода. Символ Im показывает, что в входят лишь мнимые части комплексных произведений pojmj(). Суммирование производится по всем переходам 0 /. Как мы видели (с. 142), величина p2Uj = Dj, именуемая дипольной‘силой, непосредственно связана с интенсивностью поглощения света. Сумма дипольных сил по всем переходам 0 -> / есть константа, пропорциональная числу электронов в молекуле. Величина Rj = Im {p0jmJ0} (.5.28) •называется вращательной силой перехода 0 -+ j. В отличие от суммы дипольных сил, сумма вращательных сил по всем / равна нулю. Это легко доказывается: ^5 Rj = У. 1111 { %P'P*(/'r J = 3 3 = !m { % (Pm) ~ = °’ (5-29) так как диагональные матричные элементы <0|pm|0>, <0]р10> и <0|т|0> .вещественны; т.' е. их мнимые части равны пулю. Вращательная сила Rj обращается в нуль при наличии у молекулы плоскости или центра симметрии. Электрический и магнитный сомножители не могут в отсутствие хиральности одновременно отличаться от нуля. В этих случаях все состояния молекулы делятся па четные и нечетные, в .зависимости от того, сохраняет ли волновая функция знак или меняет его при отражении соответственно в центре пли в плоскости. Операторы момен- тов р и m в декартовых координатах имеют вид р = e(ix + jj/ + kz), е\ ( [ d д \ Id д \ 7 б б VI m = — г -п--- iI и~.— — z + i z— — х -у- 4- k| х^—— ит- }, (5.30) мщс ( (' oz dy I 1 J ( их dz J ' \dy ' бх))’ ' ' где е и те — заряд и масса электрона, й = Л/2л. Л — постоянная Планка, с — скорость света, i, j, k — единичные векторы вдоль осей координат. До- пустим, что молекула имеет центр симметрии. При отражении в центре р меняет знак, a m — сохраняет. Поэтому <0|р|/> пе равно нулю только при переходах от нечетных к четным состояниям и наоборот. Напротив, </|ш|0> отлично от нуля лишь для переходов между состояниями одинаковой четно- сти. Следовательно, скалярное произведение этих матричных элементов равно нулю для любых переходов. 'Аналогичным образом доказывается ра- венство нулю Rj для молекул с плоскостью симметрии. 151
При переходе от правого антипода к левому знак R}, знак вращения, меняется. По порядку величины R, равно произведе- нию электрического и магнитного моментов молекулы. Переход- ной момент Ро, имеет порядок ID = 10-18 ед. СГСЭ, магнитный момент электрона 0,93 • 10-20 эрг Гс~*. Следовательно, порядок величины Rj есть 10-38 ед. СГСЭ. Удобно пользоваться значени- ем приведенной вращательной силы, выражаемым числом поряд- ка единицы: где Цб — магнетон Бора, ря — 1 D. В области полосы поглощения с частотой необходимо учесть затухание. Тогда мы получаем комплексное выражение для [?. о 2с »} _ 2с Л}Н-<о2) 2ic ЭК Ш?-Ш2+г<01\ ЗЦ%?_^)2+(О2Г2 За(ш2_ш2^+(О2Г2- (5.31} Величина Гд характеризует полуширину полосы поглощения в шкале частот. Первый член в (5.31) описывает вращение пло- Лебо Рис. 5.15. Графики АДОВ и КД. Ввер- ху— кривые для правовращающего ве- щества, внизу — для левовращающего скости поляризации, вто- рой — круговой дихроизм (с. 150). Аналогичным обра- зом вблизи полосы поглоще- ния получается комплексное выражение для поляризуе- мости, в котором веществен- ный член описывает пре- ломление, а мнимый — по- глощение света. Вблизи полосы поглоще- ния наблюдается аномаль- ная дисперсия оптического вращения (АДОВ) и одно- временно круговой дихроизм (КД). Модельные кривые для право- и левовращаю- щего вещества показаны на рис. 5.15. Соответствующие кривые для преломления и поглощения аналогичны кри- вым АДОВ и КД для право- вращающего вещества. АДОВ принято называть эффектом Коттона, хотя Коттон от- крыл именно КД. Вращательную силу можно определить как из АДОВ, так и из КД. Соответственно, можно перейти от одного эффекта к другому расчетом. Это частный случай соотношений Кронига—Крамерса, устанавливающих 152
связь между вещественной и мнимой частями реакции линейной системы на внешнее воздействие. Вычисление вращения из эллиптичности и наобо- рот (и аналогичные вычисления для преломления и поглощения) произво- дятся по формулам , . 2ы2 f 0(<о') ,, ф («) = -Z- —77-72---27 . (5-32> Я J <0 ((О — (О ) о 2(о5 С Ф ((о ) —J ^-<0*) о На практике для определения Rj при исследованиях биополи- меров удобнее пользоваться КД, нем АДОВ. Можно показать, что в КД значительно больше отношение сигнала к шуму. Теоретические расчеты £ являются приближенными, так как практически невозможно знать весь набор энергетических уров- ней молекул и соответствующих волновых функций для прямых вычислений по формуле (5.27). Молекулу можно мысленно разбить на атомные группы, меж- ду которыми нет обмена электронами. Тогда £ предста- вится суммой Р = р, + р2 + р3 + р4, (5.34)' где — вклады отдельных групп, равные нулю, если группы не хиральны (например, группы СН3), — «одноэлектронные» чле- ны, появляющиеся в результате электрических и магнит- ных дипольных переходов в данной группе, находящейся в асимметричном поле остальных групп. Член j33 возникает вслед- ствие взаимодействия mj(, одной группы с poj другой. Нако- нец, определяется одновременным электрическим дипольным возбуждением различных групп. Наиболее существенны вклады (J2 и ft4. Вклад р4 является результатом электростатического ди- польного взаимодействия анизотропно поляризующихся групп в молекуле. Этот вклад определяется поляризуемостями атомных групп и непосредственно зависит от их взаимного геометриче- ского расположения, т. е. от конфигурации и конформации мо- лекулы, и обращается в нуль при наличии плоскости или центра симметрии. Простейшая модель хиральной молекулы, предложенная Ку- ном, состоит из двух линейных групп, 1 и 2, отстоящих друг от друга на расстояние г и поляризующихся только вдоль своих осей, угол между которыми равен 7 (рис. 5.16). В этом случае ?4 = '/,м2 sin 7 cos 7/r3, (5.35) где at и а2 — поляризуемости групп 1 и 2. Как мы видели (с. 151), поляризуемость определяется значениями р0„ т. е. ин- тенсивностями соответствующих полос поглощения. Чем интен- сивнее полоса, тем больше ее вклад в Но вращательная сила 155
определяется произведением р.оЩЦо, При больших значениях р,-г величины тЛ обычно малы, и наоборот. В оптической активно- сти могут быть существенны слабые полосы с малыми: poj, но с- большими mj0. Такие полосы не вносят заметного вклада в по- ляризуемость, не учитывает роли слабых полос. Вклад р2 приближенно оценивается с помощью так называе- мой одноэлектронной модели. Применяется формула (5.27), но Рис. 5.16. стейшая оптически пой Про- модель актив- молекулы (Куп) рассматриваются лишь электроны хромофор- ных групп, ответственных за длинноволновое поглощение. Хромофорная группа (напри- мер, пептидная связь — NH—СО— и т. д.) обычно плоская и оптической активности не имеет. Но, находясь в асимметричном поле со- седних атомов хиральной молекулы, группа дает вклад в Одноэлектронная модель дей- ствительно позволяет хорошо описать диспер- сию оптической активности и, в осооенностгц АДОВ и КД в полосе поглощения хромофора. На основе этой модели удается с хорошей точ- ностью вычислять вращательные силы для электронных переходов в хромофорных груп- пах. Изменение конформации молекулы меняет р2. Теория с успехом была применена для конформационного анализа терпенов, стероидов и т. п. Современное развитие спектрополярпметрии непосредственно* связано с исследованиями структуры природных соединений — с биоорганической химией и молекулярной биологией. В разви- тии спектрополярпметрии было три этапа. В свое, время для характеристики молекул и кристаллов ограничивались значения- ми фуд при одной длине волны света. Это давало очень скудную информацию. В дальнейшем обратились к измерению дисперсии вне области поглощения. Наконец, в последнее время измеряются эффект Коттона (АДОВ) и КД в полосах поглощения вещества. Это наиболее информативно, но требует высокой чувствительно- сти аппаратуры (измерение вращения с точностью до 10~4 град) и возможности измерений в широком интервале длин волн (для; белков вплоть до 180—230 нм). § 5.7. Естественная оптическая активность биополимеров Применительно к полимерам рационально выражать оптиче- ское вращение и КД в величинах, отнесенных к одному мономе- ру. Среднее вращение мономера определяется как , мп m ~ ДОО ^П’ (5.36): где М„ — средняя м. м. мономера. Грубый учет влияния раство- рителя состоит во введении поправки Лорентца. Вместо ш' при- 154
меняется приведенное среднее вращение мономера: 3 , 3 М т =—>------т -----------ждфуд, (5.37) п + 2 п + 2 100 , уи’ 4 . 7 где п — показатель преломления среды. Для воды при 20°С мно- житель Лорентца 3/(п2 + 2) меняется от 0,7945 при 600 нм до 0,7306 при 185 нм. Биополимеры в ряде случаев обладают двоякой. хираль7 постью — хиральностью мономерных звеньев и хиральностью «-спиралей белков и полипептидов или двуспиральпых участков нуклеиновых кислот. При полной денатурации, т. е. при перехо- дах спираль — клубок, сохраняется лишь хиральность мономеров. Соответственно эти переходы сопровождаются резкими изменения- ми вращения и КД. Эти характеристики очень чувствительны к изменениям конформаций. С помощью АДОВ и КД удается полу- чать ценные сведения о конформациях биополимеров и их изме- нениях. > Вдали от области собственного поглощения для любой моле- кулярной системы можно выразить приведенное вращение моно- мера в виде суммы одночленных формул Друде (ср. (5.27)) т' = У (5.38) Здесь к — длина волны падающего света, Xj и щ — константы. Приближенно уравнение (5.38) заменяется одночленной фор- мулой т' = (5.39) Эта формула хорошо описывает оптическое вращение полиамино- кислот в состоянии клубка, если z.n = 268 нм. Для cs-спиралп мож- гю пользоваться формулой Моффита «По №~ЧУ' (5.40) где а'Д'1 и — константы. Второй члеп характеризует вклад «вто- рой хиральности». Формулу (5.40) следует считать эмпирической. Согласие формулы (5.40) с опытом для а-спирали получается при = 212 нм и &оа) = —630, а(0а>==630—650. Для частично спира- лизованного белка а0 = а, + хаа\, (’К) < тде а0 характеризует вращение, обусловленное аминокислотны- ми остатками, — доля спирализованпых остатков. Получаем г2 ( ?2 \ 4“’ ТСДТ + i>™ FTzW <5Л1> A А^ \ A Aq IА Ад/ / 155
Разлагая первый член в ряд по (V — %о) 1 и ограничиваясь вто- рым членом разложения, получаем л2 4 / л 4 П,’ _ „<ак> ЛД I Ь<а«) Ло I г I „«*> I Ь<«> ° ° х2-^+ ° (ка-х2)г + лЧ х2-хГн^(х2-^ (5.42> Обычно боЯК) мало и лежит в пределах ± 50. Величина а[ак) на- ходится из данных по дисперсии вращения для денатурирован- ных белков. Для нахождения ха строится зависимость т (Л2/Л2 — — 1) от (Л2/Ло—1)-1. Получается прямая с наклонома:аЬ(0а); отре- зок, отсекаемый на оси ординат, равен апзк) + х^а^,. Таким обра- зом, значение ха определяется двумя независимыми способами. Следует отметить, что присутствие ароматических остатков за- метно влияет на значения констант в уравнении Моффита. Сте- пень спиральности ха, определенная таким образом для Рис. 5.17. Кривые АДОВ (сплошные линии) и КД (штриховые) для неэкситонного и экситонного вкладов ряда белков, хорошо согла- суется с результатами других поляриметриче- ских определений (с по- мощью одночленной или двучленной формул Дру- де). Эта величина согла- суется также с данными рентгеноструктурного ана- лиза. Строгая квантовомеха- ническая теория оптиче- ской активности гомопо- лимера рассматривает ре- зонансное расщепление электронных энергетических уровней мономеров в зону — экси- тонное расщепление (см. с. 143). Расчет вращательных сил за- висит от того, является ли рассматриваемый переход 0 -» J «силь- ным» оптическим переходом с большим р0>, но малым mj0 или «слабым» переходом с малым poj, но большим niJ(l. Для «сильных» переходов можно выделить экситонный вклад, обусловленный взаимодействием возбужденных уровней в разных мономерах. Сумма экситонных вращательных сил по всем мономерам равна нулю — эти вклады «консервативны». Неэкситонные вклады, оп- ределяемые взаимодействием уровня / с другими уровнями, на которые разрешены переходы, условию консервативности не удов- летворяют. На рис. 5.17 показаны типичные кривые АДОВ и КД экситонного и неэкситонного взаимодействий для консервативного- и неконсервативного вкладов. Для а-спирали неэкситонные вклады значительно меньше экситонных: теоретическая кривая КД для а-спирали длиной в 20 звеньев имеет три экстремума в области 156
пл*-переходов (см. с. 142)’ с экситонными вкладами в R (в 10~40 эрг-смь), равными —221, 321, —100 (их сумма равна нулю) и неэкситонными соответственно 3,8, —8,6 и —17,1. Другая регулярная форма полипептидной цепи — 0-форма — в принципе также описывается формулой Моффита, но с малым значением Ьа. Опыт и расчет дают Ь'^1 = — 30. Подробный анализ КД в области лл*-перехода показывает, что и у параллельной,. 190 гш гзо too ао гзо 190 а о гзо л, нм Рис. 5.18. Кривые АДОВ и КД для /.-полипептидов и у антипараллельной0-формы доминирует неэкситонный вклад- На рис. 5.18 показаны кривые АДОВ и КД для А-полипептидов в различных конформациях. Для понимания оптической активности нуклеиновых кислот необходимо рассмотреть явление индуцированной оптической ак- тивности (ИОА). Симметричные, т. е. лишенные хиральности, молекулы красителей, будучи присоединены к а-спиральным полипептидам, обнаруживают АДОВ и КД в областях собствен- ного поглощения. Этот эффект исчезает при денатурации комп- лекса ct-спирали с красителем. Эффект объясняется взаимодей- ствием молекулы красителя с пептидным остатком вблизи асимметричного центра. О том же свидетельствует ИОА просте- тических групп и коферментов. АДОВ и КД в области поглощения пиридоксалъфосфата — кофермента аспартатаминотрансферазы- >(с. 184) послужили источником информации о структуре актив- ного центра этого фермента. На рис. 5.19 показаны кривые АДОВ дезоксигемоглобина, оксигемоглобина и карбоксигемоглобина в областях поглощения простетической группы гема, которая сама по себе симметрична (см. с. 50). Под влиянием хиральности биополимера возникает оптическая асимметрия электронной оболочки хромофора. В строгой теории ИОА необходимо рас- смотрение колебаний атомных ядер, решение электронно-колеба- тельной задачи. 15Г
Оптическая активность нуклеозидов, нуклеотидов, ДНК и РНК характеризуется АДОВ и КД в областях поглощения около 260 нм — в полосах поглощения азотистых оснований. Эти осно- вания плоские и хиральности не имеют, АДОВ и КД возникают Рис. 5.19. Кривые АДОВ дезоксигсмоглобипа (7), оксигемоглобина (2) и карбоксигемоглобина (,?) вследствие присоединения оснований к хпральным сахарам. Сле- довательно, эти эффекты определяются индуцированной оптиче- ской активностью. Действительно, замена ^-рибозы или ^-дезокси- рибозы на соответствующие a-соединения меняет знак эффекта. Вращательная сила R, (5.28) есть тензорная, а не скалярная величина, опа имеет разные значения по разным направлениям в молекуле. В обычных условиях в жидкости измеряется значение Rj, усредненное по всем направлениям. В дальнейшем были из- Рис. 5.20. Кривые Лец и Ae_i_ для комплекса ДНК — профлавин мерены анизотропные значения R, для комплексов ДНК с краси- телями и антибиогиками. Метод состоит в ориентации молекул ДНК в потоке через оптическую ячейку, представляющую собой набор капилляров. КД измеряет- ся дважды — без ориентации, когда Де = ’/з(Аец + 2Де±), (5.43) и при ориентации молекул ДНК, когда Деор=(1 - д)Де + q Де„. (5.44) Здесь Ае и Деор— измеряемые амплитуды КД, Дбц и Де±—зна- чения КД вдоль и поперек оси двойной спирали, q — степень ори- ентации, определяемая по линейному дихроизму ДНК. На рис. 5.20 показаны кривые Дe1t и Де± для комплекса ДНК — профлавин. Примечательно, что эти величины имеют разные знаки и, следо- вательно, измеряемое значение Де является малой разностью двух больших величин. Изучение анизотропии вращательной силы дает ценную информацию о структуре биополимеров и их комплексов. 158
В ориентированной системе условия симметрии особые — воз- можна оптическая активность и у молекул, имеющих плоскости симметрии, но лишенных центра симметрии. Эта «скрытая» опти- ческая активность, проявляющаяся лишь при ориентации, была открыта при изучении комплексов ДНК и РНК (Макаров, и По- летаев). Установлено, что молекулы красителя в комплексах пер- пендикулярны к оси двойной спирали нуклеиновой кислоты. § 5.8. Магнитная оптическая активность В 1845 г. Фарадей записал в своем дневнике «...в конце кон- цов мне удалось намагнитить и наэлектризовать луч света и осветить магнитную силовую линию». Речь шла об открытии магнитного вращения плоскости поляризации света, распростра- няющегося вдоль направления магнитного поля. Это явление получило название эффекта Фарадея. Приведенные слова имеют лишь фигуральный смысл — магнитное поле действует не на свет, а на вещество, которое обретает в поле круговое двулуче- преломленпе. Сравнительно недавно эффект Фарадея — магнит- ное оптическое вращение (МОВ) и магнитный круговой дихро- изм (МКД)—нашли важные применения в молекулярной био- физике. Угол вращения <р, выраженный формулой (5.14), пропорцио- нален напряженности магнитного поля Н (формула Беккереля)-. Ч> = (n-L — nD) I = III, (5.45) Т — константа магнитного вращения (постоянная Верде). В классической электронной теории эффект Фарадея сводится к эффекту Зеемана. Электрой, рассматриваемый как гармониче- ский осциллятор, колеблется в отсутствие магнитного поля с кру- говой частотой Ио- В магнитном поле, направленном вдоль луча света, спектральная линия с частотой и0 расщепляется на две, поляризованные по кругу влево и вправо. Величина расщепле- ния равна 2|ин|, где — круговая частота ларморовой пре- цессии ин = — еШ (2шес) (5.4G) (е, те—заряд и масса электрона, с — скорость света). Круговое двулучепреломление выражается величиной \n = nL-nD--= [—} .2|ин| = ^У к иШ)н=0 11 тес (5.47) или \ 'д- 2лтес~ ’ где Л — длина волны света. Следовательно, еН л [ дп \ 1 (Р — -----г* A Т7Т- • I (5.48) 2т ес1 \вЪ J н=о (5.49) 159
и F __ еХ f дп \ 2тес* \ / н=о * (5.50) Мы получили формулу Беккереля (5.45). Она грубо согласуется <с опытом в области, далекой от полос поглощения, для диамаг- нитных веществ. Подлинная теория эффекта может быть только квантовомеха- нической. Под влиянием магнитного поля происходит несколько явлений. Во-первых, расщепляется основной энергетический уро- вень электронной системы — вместо ы0 имеем соь = <оо — 7оЯ и <oD = (Оо+ 7оЯ, где 7о = <Он/Я. Во-вторых, у правой и левой волн возникают различные вероятности перехода, т. е. коэффициенты поглощения еь = е(Д + ЬН) и ео = е(1 — ЬН). В-третьих, рас- щепляются и возбужденные уровни: coL = соо — 7еЯ, = соо + 4- 7еЯ. Если молекулы парамагнитны, то поле Н изменяет насе- ленности подуровней основного уровня — различие в населенно- стях дает множители 1 и 1 — 2*(»Н/кТ. Получаем (/{.г} — функ- ция от х) 8t = е(1 + bH)f {со — (7, + 7е)Я), (5.51) eD = е(1 — 5Я)/{со + (7о + 7«)Я}(1 — 270Я/к7') и, разлагая Ле в ряд по Я и ограничиваясь линейными членами, находим .Де = 2еЯ {- (То + Те)^+ (б + ^)/ («)}= Ао + Ае + В + С/кТ. (5.52) Возникновение МОВ и МКД иллюстрируется рис. 5.21. В отсут- ствие магнитного поля (рис. 5.21, а) имеются два электронных перехода с невырожденного основного уровня £0 на дважды вы- рожденный возбужденный уровень Е„. Частоты переходов, отве- чающие правой и левой волнам, и соответствующие показатели преломления и поглощения совпадают и nL(a>) = reD(co) и еь(со) = — eD(co). (Кривые reD(co) и eD(co) для удобства показаны с об- ратным знаком.) Рис. 5.21, б объясняет возникновение эффекта типа Ае, являющегося результатом расщепления возбужденного уровня Ее. Кривые nL(co) и nD(co) (и, соответственно, eL(co) и еп(со)) симметрично смещаются, возникает симметричная кривая Дге(со) в МОВ и асимметричная кривая Ле (со) в МКД. Наконец, эффект типа С (рис. 5.21, в) появляется в результате вырожде- ния основного состояния Ео, снятия вырождения магнитным по- лем и появления разности населенности подуровней в соответ- ствии с законом Больцмана. Эффекты типа С асимметричны в МОВ и симметричны в МКД. Л 60
Рис. 5.21. Схемы, пояс- няющие возникновение МОВ и МКД: отсутствие поля (а), эффект типа А (б), эффект типа С (в) 11 М. В. Волькенштейя 161
Строгая квантовомеханическая теория дает в области собственного по- глощения удельное вращение 4лЛГ, [ 2Ш;ы2 [(<>?- со2)2 — <о2Г?] л , I Я[(<о?-«а)2 + <о2Г?]2 3 со2 (со? — со2) (со? - со2)2 + со2Г? (В • + Су/КТ) Н, (5.53) Рис. 5.22. Спектры поглощения окисленного (штриховые кривые) и кривые АДМВ восстановленно- го (сплошные) цитохрома с где <о> г сооь Nt — число молекул в единице объема и (для изотропной среды) ^ = ,/6(^-%о)1т(РоЛо)> в) =1/2 Im te роА*+ 2 PoAol (5-54> ci = Ve^oo Im (PojPio)- Формула (5.53) переходит в выражение для вклада перехода 0 -* j во вра- щение вдали от области поглощения, если положить в ней = 0. МКД описывается удельной эллиптич- ностью е (о -> /) == _ 4лЛгг 4соусо3 (со? — со2^2Г [Я [(со?- со2)2-)- со2Г?]^4' <о3^ 1 V 1 ~ ! 1 j ' (5.55) Эффект Фарадея никак не связан с естественной оптиче- ской активностью — он наблю- дается в веществах, построен- ных как из хиральных, так и нехиральных молекул. При вторичном прохождении луча света, отраженного от зеркала, через оптически активное ве- щество вращение компенсиру- ется и исчезает, а радея удваивается. Экспериментальное наблю- дение аномальной дисперсии магнитного вращения (АДМВ) и МКД с успехом проводится на системах с сильным магнитным вращением при относительно малом поглощении. Таковы, в частности, порфириновые соедине- ния — гемсодержащие белки, хлорофилл и т. д. Эффект пропор- эффект 162
ционален Я, поэтому он особенно велик в магнитных полях, соз- даваемых сверхпроводниками и достигающих 50 000 Гс и более. В обычных условиях удается получать поля до 20—30 тыс. Гс. Относительные значения МКД различных органических сое- динений характеризуются следующими величинами: для порфи- ринов ~100, аннуленов ~3, пуринов ~0,2, циклогексанона ~0,00002. Эффект Фарадея для гемсодержащих белков сильно зависит от электронных состояний гема и конформаций белка. На рис. 5.22 показаны кривые АДМВ и спектры поглощения натив- ного окисленного (ферри-) и восстановленного (ферро-) цитохро- ма с. Хорошо видна тонкая структура МОВ феррицитохрома с. В спектре поглощения ее нет. Высокая чувствительность АДМВ и МКД позволяет изучать различные цитохромы во взвесях суб- митохондриальных частиц (см. § 13.2). Спектры поглощения та- кой возможности не дают. При очень низких температурах уда- ется наблюдать неравновесные возбужденные конформации таких белков (Шаронов). См. также § 6.7. § 5.9. Колебательные спектры Частоты, интенсивности и поляризации линий и полос в коле- бательных спектрах дают информацию о строении молекул. Коле- бательные спектры наблюдаются либо в поглощении в инфра- красной области (ИК), либо в рассеянии — спектры комбинаци- онного рассеяния (КР). Комбинационное рассеяние было откры- то в 1928 г. (Раман, Мандельштам и Ландсберг). Возможность- изучать колебания молекул с помощью спектроскопии в видимой области обещала многое, но применительно к полимерам и био- полимерам спектры КР оказались вначале бесплодными ввиду невозможности получения растворов в оптически чистом виде, без паразитного рассеяния. На протяжении ряда лет колебатель- ные спектры биополимеров изучались лишь как ИК-спектры по- глощения, и лишь в последнее время благодаря развитию лазер- ной техники ИК-спектроскопия вытесняется КР. Теория колебательных спектров молекул Детально разработа- на (Волькенштейн, Ельяшевич, Степанов, Грибов). Она осповапа на возможности раздельного рассмотрения медленных колебаний атомных ядер и быстрых электронных переходов, доказываемой теоремой Ворна и Оппенгеймера. Задача о частотах колебаний ядер является классической. Она /решается при непосредственном учете симметрии молекулы. Теория интенсивностей и поляриза- ций в ИК-спектрах и спектрах КР исходит из валентно-оптиче- ской схемы, согласно которой каждой ковалентной связи можно приписать свои дипольный момент и поляризуемость. Дипольный момент молекулы является векторной суммой дипольных момен- тов связей, а поляризуемость молекулы — тензорной суммой по- ляризуемостей связей. Интенсивность данной полосы в ИК-спект- ре определяется изменением дипольного момента молекулы при 41* 163
данном нормальном колебании, в спектре КР — изменением по- ляризуемости. Молекула, состоящая из N атомов, имеет 3N — 6 нормальных колебаний (линейная молекула — ЗА— 5). Так как атомы в мо- лекуле связаны друг с другом, все они участвуют в каждом из этих колебаний. Возможны ситуации, в которых доля участия в данном колебании определенной ковалентной связи, атома или группы атомов значительно больше, чем остальных связей и ато- мов. Такое колебание характеристично для данной атомной груп- пы, его частота и интенсивность ИК-полосы или линии в спект- ре КР мало зависят от остальных атомов в молекуле. Тем самым наличие характеристической спектральной полосы или линии свидетельствует о присутствии в молекуле соответствующей группы. В ИК-спектрах белков и полипептидов наблюдаются полосы амидной группы, т. е. пептидной связи — СО—NH—. Исследова- ние низкомолекулярных амидов, в частности, метилацетамида НЭС—СО—NH—СН, и родственных веществ, и теоретические расчеты позволили получить колебательные характеристики амид- ной группы (табл. 5.2). Таблица 5.2. Характеристики колебаний амидных групп Полоса Частота, см-1 Характер колебания Участие групп, в долях единицы Амид А 33001 N-H(v) Амид В 3100/ Амид I 1597—1672 C=O(v) С—O(v) 0,8, С—N(v) 0 1 —NH(6) 0,1 Амид II 1480—1575 —Nil (5) в плоскости, С—N(v) —NH(6) 0,6, С—N(v) 0,4 Амид III 1229—1301 С—N(v), —NH(6) в плоскости C=O(v) 0,1 C—N(v) 0,3 N—H(v) 0,3 O=C—N(fi) 0,1 Амид IV 625—767 О=С—N(6) в плоскости O=C—N(6) 0,4 остальные 0,6 Амид V 640-800 —NH(6), неплоское ко- лебание Амид VI 537—606 —СО (6), неплоское ко- лебание Амид VII 200 Крутильное колебание вокруг С—N-связи v — обозначает валентное колебание, т. е. растяжение связей, б — деформационное колебание, при котором меняется валентный угол. Формы перечисленных колебаний показаны на рис. 5.23. ИК- полосы А, В, I и II чувствительны к водородным связям, наличие которых вызывает значительное понижение частот и расшире- ние полос. 164
При рассмотрении спектров полимеров необходимо учесть взаимодействие колебаний в отдельных мономерных звеньях. Упорядоченный полимер подобен в этом смысле молекулярному кристаллу, в спектре которого наблюдаются лишь те колебания, Рис. 5.23. Формы нормальных колебаний амидной группы в N-метилацета- миде (М — метильная группа) которые происходят в фазе во всех элементарных ячейках. По- лосы амидной группы, в частности, амид I и амид И, оказыва- ются характеристическими для а-спирали, fJ-формы и неупорядо- ченной формы полипептидной цепи. Это показано в табл. 5.3. Спектры растворов или неориентированных пленок не дают информации о поляризации колебаний. Напротив, при исследова- нии белков или полипептидов в анизотропных средах (в ориен- тированных пленках и волокнах) с помощью поляризованного ИК-излучения поляризация колебаний наблюдается непосред- ственно. Измеряется инфракрасный дихроизм, характеризуемый отношением коэффициентов поглощения, измеренных для излу- чения с направлением электрического вектора световой волны, параллельным и перпендикулярным выделенному направлению. Таким образом, ИК-спектры могут быть применены для оп- ределения вторичной структуры белка, для изучения ионизации аминокислотных остатков и, что особенно важно, для изучения кинетики дейтерообмена. ИК-спектроскопия нуклеиновых кислот менее информативна и практически не используется. В последнее время значение ИК-спектроскопии в физике бел- ков заметно уменьшилось. Для определения вторичной структуры другие методы (прежде всего КД) оказываются более эффек- 165
тивными. Напротив, лазерная спектроскопия КР позволяет по- С лучать весьма детальную информацию о строении белков и дру- гих биологически функциональных веществ. Получаются пре- красные спектры КР растворов, кристаллических и аморфных Таблица 5.3. Характеристики полос амид I и амид II Конформация Обозначения коле- баний Частота, см 1 амид I амид 11 Неупорядоченная То 1658 1520 Антипараллельная vll 1658 (сл.) 1530 (с.) 3-форма VJb .1632 (с.) 1510 (сл.)' VJb 1668 (о. сл.) 1550 (сл.) Параллельная vll 1648 (сл.) 1530 (с.) fi-форма 1632 (о. сл.) 1530 (сл.) а-спираль vll 1650 (с.) 1516 (сл.) VJb 1646 (сл.) 1546 (с.) с.— сильная, сл.— слабая, о. сл.— очень слабая полосы в ИК-спектре, || ид — полосы, отвечающие колебаниям дипольного момента, параллельным и перпендикуляр- ным к полимерной цепи. веществ, а также веществ в газовой' фазе. Наиболее интересные результаты получаются с помощью резонансного комбинацион- ного рассеяния (РКР). В этом случае длина волны рассеиваемо- го лазерного света попадает в область собственного поглощения хромофора биологической молекулы. Интенсивности РКР очень велики, что позволяет изучать биологические молекулы даже при очень малых концентрациях. Методом РКР изучены гемсодержа- щие белки, хлорофилл, фермент-субстратные комплексы и т. д. Если молекула не содержит хромофора, необходимого для на- блюдения РКР, то. хромофор в качестве метки может быть вве- ден посредством химического или нехимического связывания. В последнее время проведены расчеты форм и частот нормаль- ных конформационных, т. е. крутильных, колебаний для ряда белков. Исследованы колебания доменов относительно друг дру- га (Левитт). Участки с различной вторичной структурой харак- теризуются разными областями частот: а-спирали 50—110 см-1, 3-слои 5—30 см-1, неупорядоченные поворотные участки 5—75 см-1. Колебательные линии в этих низкочастотных обла- стях действительно удается наблюдать в спектрах КР белков. Соответствующие движения имеют коллективный характер. § 5.10. Спектры ядерного и электронного , парамагнитного резонанса Спектры ядерного и электронного парамагнитного резонанса (ЯМР и ЭЦР) широко применяются в биофизике. Рассмотрим сущность парамагнитного резонанса. 166
частицу Схема Рис. 5.24. нитного резонанса: класси- ческая (а) и квантовоме- ханическая (б) модели парамаг- Внесем частицу с магнитным моментом ц в постоянное маг- нитное поле напряженностью Яо. Магнитный момент будет пре- цессировать вокруг направления поля (рис. 5.24, с) с частотой, пропорциональной Н„ (ср. (5.46)): соо=уЯо=-^Яо, (5.56) где р — механический момент количества движения частицы (на- пример, спин электрона). Подвергнем действию слабого переменного поля Ht, направленного перпендикулярно Яо. Линейно поляризованное поле Ht мож- но разложить на две круговых компо- ненты (с. 148). Одна из этих компо- нент совпадает по направлению с прецессией. Если частота колебаний Hi совпадает с соо, то возникает резо- нанс, сильное поглощение волны Ht. Это явление было открыто в 1945 г. Завойским. Таково элементарное классическое описание эффекта. Квантовая механи- ка показывает, что уровни энергии частицы, обладающей магнитным мо- ментом, расщепляются в магнитном поле. Начнем с ЯМР. Атом- ные ядра, у которых нечетно хотя бы одно из двух чисел — мас- са илй порядковый номер,— имеют ядерный спин и, тем самым, ядерный магнитный момент. Ядерный спин равен нулю у 12С, 16fA „ тт „ TJ ТА 13Г» 19Т71 _ _ 17 Н 1< д. н пс раосп Л У j 1Ш у 11, г и т. д. Если 7 — ядерное спиновое число, то соответствующий маг- нитный момент равен [7(7 + 1)]1/2уй, где уй = gp0— гиромагнит- ное отношение, g — фактор расщепления, а ц0 — ядерный магне- тон. В магнитном поле Но вследствие зеемановского расщепления (см. с. 159) возникает 27+1 уровней с энергиями E = — \hHom (m = J, 7 — 1, ..., —7). (5.57) Расстояние между соседними уровнями равно ^Hoh. Для прото- на 7 = */2 и в поле Нц возникают два уровня, соответствующие параллельному и антипараллельному направлениям спина (рис. 5.24, б). Резонанс происходит при йсо0 = \Ъ,Но = g^oHo, (5.58) где Ро = 2^“ = 5’05’10-24 эрг/Рс, (5.59) е — заряд протона, тр — его масса. Фактор g для протона равен 5,58. Если Но = 10 000 Гс, то резонансная частота для протонов равна 42,6 МГц, что соответствует диапазону метровых радио- волн. 167
При данной температуре Т число протонов на нижнем уровне несколько больше, чем на верхнем. Отношение населенностей верхнего и нижнего уровней в равновесии выражается фактором Больцмана (см. с. 160) ехр(—йсоо/кГ) = ехр(—^ЦоЯо/кГ) « 1 — ^ЦоТ/о/кГ. (5.60) Экспонента заменяется двумя первыми членами разложения в ряд, так как £ц0Я0 < кТ при Т = 300 К и обычных значениях Но. При Но = 104 Гс фактор Больцмана равен (1—14) • 10-6. При включении радиочастотного поля Н, происходят перехо- ды с нижнего уровня на верхний (поглощение) и обратно (ис- пускание). Если вероятности обоих процессов одинаковы, то должно возникнуть быстрое насыщение уровней — их населенно- сти выравняются и поглощение прекратится. Это, однако, не на- блюдается, так как ядерные спины способны отдавать свою энер- гию и без излучения. Происходит релаксационный процесс, не- прерывно возвращающий, систему спинов в равновесное состоя- ние, которому отвечает распределение Больцмана. Он возникает вследствие взаимодействия ядерных спинов с решеткой, т. е. с другими ядрами, находящимися в состоянии теплового движения. При выключении поля Н, выделяющаяся энергия превращается в тепловую энергию решетки. Изменение населенности уровней после выключения поля Ht описывается уравнением &n(t) = Д«(0)ехр(—t/h), (5.61) где &n(t)—избыток протонов в момент времени t на верхнем уровне по сравнению с равновесной населенностью, Дгс(0)—то же в момент выключения ноля t = 0, Т,— время спии решеточ ной релаксации. Время Т, зависит от концентрации магнитных ядер в веществе, от подвижности молекул и от температуры. В кристаллах 7\ порядка минут, в газах и жидкостях порядка се- кунд и меньше. Присутствие парамагнитных примесей может сократить Г, до 10~4 с. Ширина спектральной линии ЯМР тем больше, чем меньше время жизни ядра на данном энергетиче- ском уровне. Спин-решеточная релаксация вносит вклад в шири- ну линии порядка Т^1. Имеется и второй процесс — спин-спиновое взаимодействие магнитных ядер. На каждый спин действует кроме поля Но ло- кальное поле, создаваемое соседними ядрами и равное Ялок =t(3cos20 - 1), (5.62) Г где г — расстояние ядра до данной точки, 0 — угол между ц и г. Условие резонанса поэтому имеет вид ®о = Т(Яо + Ялок), (5.63) а не (5.56), справедливый для изолированного спина. Порядок величины Яяок — несколько гаусс. Спин-спиновое взаимодействие 168
также дает вклад в ширину линии, как вследствие неоднородно- сти поля, так и благодаря определяемому этим взаимодействием обмену энергией между протонами. Время спин-спиновой релак- сации Т2 в твердых телах много меньше 7\ и ширина линии определяется только Т2. В невязких жидкостях Т2 того же поряд- ка, что и 7\, и ширина линии составляет доли герца. Спектры ЯМР жидкостей и растворов содержат ряд сравни- тельно узких линий, отвечающих структурно неэквивалентным протонам. Так, в спектре 1,1,2-трихлорэтана С1Н2С—СНС12 при невысоком разрешении наблюдаются две линии, отвечающие про- тонам групп СН2 и СН с отношениями интенсивностей 2 : 1. Это происходит благодаря экранирующему воздействию электронного окружения ядра на его спин. Электроны прецессируют в направ- лении, противоположном прецессии ядер, и создают вторичное поле Н' = — оН0. На ядро действует эффективное поле Н эф = Н9 + 11' = (1 —о)Я0; (5.64) о — постоянная экранирования. Ее значение различно вдоль раз- личных направлений в молекуле, т. е. о — величина анизотроп- ная. В жидкости она усредняется. Положение спектральной линии ЯМР относительно некоторой эталонной линии называется химическим сдвигом. Обычный эта- лон для протонного резонанса органических соединений — тетра- метилсилан (CH3)4Si, для водных растворов биополимеров — ДСС (2,2-диметил-2-силанпентан-5-сульфоновая кислота). Химический сдвиг выражается отношением сдвига частоты (поля) к эталон- ному значению, умноженным на 106: б = —-10е = ^Д-10в. (5.65) У биополимеров б для алифатических протонов варьирует от —0,5 до —2,0, ароматических — от —6,0 до —8,5 и т. д. При высоком разрешении наблюдается сверхтонкая (мульти- плетная) структура линий ЯМР. Она возникает вследствие маг- нитного взаимодействия между ядрами, передаваемого через электроны связи, т. е. непрямого спин-спинового взаимодействия. Так, в С1Н2С—СНС12 протон группы СН может находиться в двух состояниях — со спином +‘/2 и —*/2. Поэтому линия протонов со- седней группы СН2 расщепляется на две. В группе СН2 возмож- ны три неэквивалентных состояния пары протонов: +*/», +‘/2; -Ь‘/2, —*/2 (—*/2, +‘/2); —*/2, — 72. Линия протона СН испытыва- ет триплетное расщепление (рис. 5.25). На рис. 5.26 показаны спектры ядерного магнитного резонан- са ядер 13С для карбоангидразы В крупного рогатого скота при различных значениях pH. Спектры отражают конформационные изменения и взаимодействия атомов. . Изучение химических сдвигов и сверхтонкой структуры дает количественную информацию о расположении и взаимодействиях атомных ядер. Пользуясь приборами высокого разрешения 169
8,0 5,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 О Рис. 5.25. Спектр протонного резонанса ClHjC—СИСЬ. Сверхтонкая струк- тура Рис, 5.26. Спектры ЯЦР ядер ,3С карбоангидразы В рогатого скота: / — на- тивная форма pH 5,2; 2— pH 3,8; 3— pH 2,1; 4 — денатурированный белок < (Липмаа и соавторы) • , 5 17G
"(сильные сверхпроводниковые магниты, частоты порядка 300 МГц), удается разделить множество перекрывающихся линий протонного резонанса в белках. Здесь существенно и селективное дейтерирование белка. Методы ЯМР были эффективно применены к исследованиям конформационных свойств биополимеров, вза- имодействий белков с фармакологическими веществами, взаимо- действий фермент — лиганд, антиген — антитело и т. д. Возмож- ности спектроскопии ЯМР в молекулярной биофизике неогра- ниченны. Методы ЯМР непрерывно совершенствуются. Не имея воз- можности здесь о них рассказать, укажем лишь, что в стацио- нарном случае эффективным оказывается двойной резонанс, существенно упрощающий спектр. На образец подаются сразу два сигнала, разнящихся по частоте соответственно разности хи- мических сдвигов или двух взаимодействующих ядер. Эта так называемая двумерная ЯМР-спектроскопия особенно информа- тивна. Двойной резонанс может сопровождаться так называемым эффектом Оверхаузера. Как уже сказано, в настоящее время применяются и импульсные методы. ЯМР на 31Р и 13С эффективно применяется и к изучению жи- вых клеток и тканей. С помощью методов фурье-преобразования возможно отделить слабые сигналы от фона. При этом пользу- ются мощным радиочастотным импульсом, возбуждающим одно- временно целый резонансный спектр, отдельные частоты которо- го отсортировываются с помощью компьютера. Так были изучены явления в живой мышце — изменения концентрации АТФ и кре- атин-фосфата при сокращении мышцы (см. § 12.3). Положение пика 31Р неорганического фосфата в сердечной мышце зависит от pH и поэтому смещается при кислородной недостаточности. Это открывает принципиальные возможности для применения ЯМР в кардиологии. Обратимся теперь к ЭПР. Электрон имеет спин s = ‘/2, его энергетический уровень в поле Яо расщепляется на два с рас- стоянием между ними, отвечающим условию резонанса (ср. (5.58)) Ййо = ё^вНо, (5.66) где Цб — магнетон Бора, превышающий ядерный магнетон в 1836 раз: Ив = ?>~. = 0,93-Ю-20 эрг/ГС(! (5.67) тпе — масса электрона. Для свободного электрона # = 2,0023. В поле На = 104 Гс резонансная частота ve = 2,8 • 10*° с~* (vP = 4,26 -10’с"1). В подавляющем большинстве органических соединений спи- ны электронов скомпенсированы и ЭПР отсутствует. ЭПР наблю- дается jr свободных радикалов и у молекул с нечетным числом 171
электронов. Здесь ЭПР дает важнейшую информацию об элект- ронном строении системы. Линии ЭПР испытывают сверхтонкое расщепление вследствие локального поля, создаваемого магнитными моментами ядер. Так, ядро “N имеет J = 1, и, следовательно, проекции ядерного спина на направление поля На отвечают значениям магнитного квантового числа т = 1, 0, —1. Локальное поле, действующее на электрон свободного радикала, находящегося вблизи ядра “N, имеет три значения и пик ЭПР расщепляется в триплет. Так называемая тонкая структура возникает в кристаллах вследствие анизотропии g-фактора. Вместо одной линии наблю- дается группа линий, положения и интенсивности которых зави- сят от ориентации поля Н„ относительно кристаллических осей. В жидкости тонкая структура не наблюдается. Ширина линий в спектре ЭПР определяется, как и в ЯМР, спин-сниновой и спин-решеточной релаксацией. Времена Tt и Т2 зависят от подвижности частиц с ненулевыми спинами (Т2) и от подвижности окружающих молекул (21!). Время спин-спиновой релаксации Т2 почти не зависит от температуры и определяется концентрацией парамагнитных частиц. Время Т\ возрастает при понижении температуры. ЭПР эффективно применяется к решению многих проблем биологии и биофизики. Свободные радикалы образуются в ряде ферментативных окислительно-восстановительных процессов, при воздействии радиации и т. д. ЭПР дает весьма ценную информа- цию об этих процессах. ЭПР очень важен для изучения белков, содержащих в качестве кофакторов атомы металла с нескомпен- сированным спином (гемопротеины, см. § 6.8 и т. д.). Широко развиты исследования ЭПР биополимеров, основан- ные на методе спиновой метки. К биополимеру присоединяют ус- тойчивый свободный радикал, содержащий неспаренный элект- рон. Особенно удобны нитроксильные радикалы, как, например, нзс снз R—/ ^N->0 н3с сн3 Спин-метка чувствительна к своему окружению, ее спектр ЭПР зависит от конформационного состояния биополимера. Подвиж- ность метки связана с локальной подвижностью биополимера и подвижностью его молекулы как целого. С помощью спин-меток установлены важные особенности строения и динамики белковых молекул. Эти методы весьма эффективны и при изучении био- логических мембран. Зондирование молекулярной или надмолекулярной биологи- ческой системы с помощью спин-меток родственно применению люминесцентных меток (с. 147). Зачастую целесообразно соче- тать оба метода.
Глава 6 ФИЗИКА ФЕРМЕНТОВ § 6.1. Химическая кинетика и катализ Важнейшая функция белков — ферментативная. Ферменты служат катализаторами всех биохимических реакций. Катализа- тор ускоряет реакцию, но в реакции не расходуется. Скорости химических реакций обычно сильно зависят от тем- пературы. Эмпирически эта зависимость выражается формулой Аррениуса для константы скорости реакции (см. с. 19) к = Аехр(— E+/RT}, (6.1) где Е+— энергия активации — характеризует энергетический барьер, который должна преодолеть система для осуществления реакции. Зависимость к от Е+/НТ следует из распределения Больцмана по энергиям, экспонента указывает на долю молекул, обладающих достаточной для реакции энергией Е+. Константы k, к определяют скорости реакций. В обратимой реакции В *—1 скорости ([А], [В] — концентрации) v = kl [A], v = [В]. (6.2) В равновесии v = v и константа равновесия Индекс eq означает равновесную концентрацию. Разность сво- бодных энергий продуктов реакции и исходных реагентов равна AG = -RT\п.К = \Н- T\S, (6.4) где А// — разность энтальпий, AS — разность энтропий. Реак- ция возможна, лишь если AG < 0, т. е. если свободная энергия понижается. Однако это условие необходимо, но еще недостаточ- но для реакции. Энергия активации Е+ может быть настолько 173
большой, что константа скорости исчезающе мала и реакция не идет. Катализатор служит для понижения активационного барьера. Смысл формулы Аррениуса раскрывается в теории абсолютных скоро- стей реакций (теория переходного состояния или активированного комплек- са), предложенной Эйрингом. Рис. 6.1. Профиль свободной энер- гии для химиче- ской реакции Предполагается, что течение реакции не нарушает больцмаповского распределения молекул по состояни- ям с различной энергией. Прохождение реакции тре- бует преодоления энергетического барьера. На рис. 6.1 показан профиль свободной энергии для некоторого процесса: AG = Gi — G2 — разность свободных энергий + начального состояния 1 и конечного состояния 2, G+ — свободная энергия активации в процессе 1 -> 2. Най- дем число систем, находящихся в некотором интерва- ле б реакционной координаты £ на вершине барьера. Скорость реакции есть число систем, преодолевающих барьер в единицу времени. Средняя скорость движе- ния системы равна СО о П= - - ти^/2кТ) do ___________= 1кТ \1/2 \2лт / ту/2кТ) do (6.5) Мы воспользовались распределением Максвелла — Больцмана по кинетиче- ским энергиям то212. Скорость реакции, т. е. число переходов через барьер в единицу времени, равна с' - _е'{ кТ V/2 б б \ 2лт] * (6.6) где с' — число систем в единице объема, находящихся в пределах отрезка б. Вместе с тем v = АгсдСв .. , (6.7) где сд, св, ...— концентрации реагентов. Из (6.6) и (6.7) следует, что с' сАсв • кТ \ 1/2 1 2 nm J б кТ \1/2 1 2лтJ б ’ (6.8) Здесь К' — константа равновесия для перехода реагентов А, В, ... в акти- вированное состояние. Константа равновесия выражается через статистиче- ские суммы z = 2 ех₽ (— £1/кГ)> (6.9) где Е{ — энергия 1-го состояния всем состояниям. В вашем случае системы. Суммирование проводится по К za„ ZAZB (6.10) где Za к, Za, Zb, ... — статистические суммы для активированного комплекса (состояния) и реагентов А, В, ... соответственно. Для поступательного дви- жения частицы набор состояний непрерывен, сумма (6.9) заменяется инте- 174
гралом, который равен Znocr = б3(2лтк77/г2)3'2, (6.11) где h — постоянная Планка, т — масса частицы. Мы приняли объем, зани- маемый частицей, равным б3, ZnocT — статистическая сумма по трем степе- ням свободы поступательного движения. Но так как система имеет лишь «дну такую степень свободы — вдоль направления реакции, мы получаем za к = «•К /2ло1к7'\1/2 (6.12) где Za к— статястическая сумма для активированного комплекса по всем степеням свободы, кроме поступательной. Из (6.8), (6.10) и (6.12) получаем = (6.13) h Z.ZH ... А В Условная длина б сократилась. Статистические величины непосредственно связаны с термодинамическими. Имеем Z = exp (-G/RT), (6.14) и, следовательно, кТ exp(—G'/RT) кТ f ~ gA — бв ~ \ k~~ h exp (— Ga/RT) exp (—GB’RT} h exp\ RT J / +\ g+ -hex\-RT)‘ (615) + Здесь G+ — избыток свободной энергии активированного комплекса по сравнению с суммарной свободной энергией реагентов, т. е. свободная энер- гия активации. При выводе выражения (6.15) предполагается, что достигнув активационного барьера, система обязательно претерпевает хи- мическое превращение. Этого может и не быть. Вводя добавоч- ный множитель — трансмиссионный коэффициент и<1, полу- чаем окончательное выражение для константы скорости гомоген- ной газовой реакции — формулу Эйринга: k = x^exp(s+/2?)exp (— H+/Rt); (6.16) <S’+ — энтропия, Н+ — энтальпия активации. Значение х = 1 от- вечает адиабатическому течению реакции, т. е. процессу, в кото- ром параметры механической системы изменяются медленно. В химической реакции такими параметрами являются положе- ния атомных ядер. При каждой конфигурации ядер электроны движутся так, как если бы ядра оставались неподвижными. Если процесс неадиабатический, х С 1 и может принимать значения порядка 10-5. Наблюдаемые в газовых реакциях значения х большей частью близки к 1, т. е. эти реакции идут адиабатиче- ски. Множитель кТ/h при обычных температурах имеет порядок 1013 с-1. 175
Сравним формулу Эйринга (6.16) с формулой Аррениуса (6.1). Если отождествить энтальпию и энергию активации, то предэкспоненциальный множитель будет равен А = ехр [s+/r], (6.17) Значения параметров активации определяют по температурной зависимости к. Имеем при х = 1 + (6.18) Второе слагаемое зависит от Т слабо, им можно пренебречь. Получаем линейную зависимость In к от 1/Г. По наклону прямой + + находим Н+, по отрезку, отсекаемому на оси ординат, — 5+. Не- линейность зависимости In к от Т~1 свидетельствует об усложне- нии процесса, в частности, о его кооперативности. В таком про- цессе свободная энергия активации не постоянна, но зависит от числа уже прореагировавших систем и тем самым от Т. Пред- ставим себе процесс выхода из переполненного автобуса. В на- чале выйти трудно, для этого нужна большая энергия актива- ции. По мере освобождения автобуса эта энергия убывает. На- глядный пример кооперативной кинетики. Надо подчеркнуть, что нельзя трактовать h/кТ как время су- ществования активированного комплекса. Такая трактовка при- водит к противоречию — за 10~13—10"“ с не может установиться статистическое равновесие. В действительности время существо- вания системы в состоянии, отвечающем значениям реакционной координаты от £ до £ + б, пропорционально б. Это время долж- но трактоваться так же, как время существования состояний, рассматриваемых в теории Максвелла — Больцмана. Из малости h/кТ нельзя делать вывод о невозможности установления равно- весия между активированным комплексом и реагентами. Термин «активированный комплекс» относится к состояниям атомной системы, испытывающей превращения, и не означает существо- вания метастабильного комплекса, который можно изучать хи- мическими и физическими методами; Теория Эйринга применима к реакциям в газах, но не в жид- кой фазе. Общий метод качественного рассмотрения на основе этой теории пригоден для различных кинетических процессов (вязкое течение, диффузия, ср. § 12.4). В ряде случаев реакция идет без преодоления активацион- ного барьера посредством туннельного эффекта, квантовомехани- ческого «просачивания» сквозь барьер. Это имеет место, в част- ности, в реакциях переноса электрона или протона (ср. § 13.4). В этом случае скорость реакции практически не зависит от тем- пературы. 176
Обратимся к катализу. Как уже сказано, роль катализатора состоит в снижении свободной энергии активации, и, следова- тельно, в увеличении константы скорости реакции. Нужно разли- чать гетерогенный и гомогенный катализ. В первом случае ката- лизатор образует отдельную фазу, и реакция протекает на поверх- ности раздела фаз. Процесс начинается с адсорбции реагентов на этой поверхности, скажем, на поверхности твердого катализатора, ускоряющего реакцию в газе или в жидкости. Адсорбция сопро- вождается изменением электронной структуры реагентов и пони- жением свободной энергии активации. После прохождения реак- ции продукты десорбируются с поверхности. При гомогенном ка- тализе катализатор и реагенты находятся в одной фазе, напри- мер в растворе. Катализатор образует промежуточное соединение с реагентами, далее распадающееся на катализатор и продукты реакции. Ферменты функционируют либо в растворах, либо в надмоле- кулярных структурах. Сорбция реагентов, именуемых субстрата- ми, и реакция протекают на некоторой поверхности большой мо- лекулы белка. В этом смысле ферментативный катализ сходен с гетерогенным. Однако белок-фермент и малые молекулы субстра- тов находятся в одной фазе в растворе. Имеется строгая стехио- метрия взаимодействия — как правило, одна белковая глобула взаимодействует с одной молекулой субстрата или другого лиган- да. При взаимодействии образуется фермент-субстратный комп- лекс (ФСК), строение и свойства которого изучаются физически- ми и химическими методами. Ферментативный катализ в раст- воре — гомогенный катализ. Можно рассматривать фермент как «черный ящик», преобра- зующий входной сигнал — молекулу субстрата в выходной сиг- нал — молекулу продукта. Имеются два способа для исследова- ния устройства и механизма работы «черного ящика»: изучение молекулярной структуры фермента и ФСК и изучение кинетики ферментативных реакций. § 6.2. Кинетика простых ферментативных реакций Рассмотрим простейшую ферментативную реакцию превра- щения субстрата в продукт в одностадийном процессе Ь Ь- Fe + S^F1T^F0 + P. Здесь Fo — свободный фермент, S — субстрат, Ft — ФСК, Р — продукт. У стрелок указаны константы скорости реакций. Поло- жим, для простоты, что можно пренебречь к-г — обратной реак- цией. Кинетические уравнения имеют вид (здесь Ft, S, Р — кон- центрации) 5 = - ktFaS + k-,Ft, Ft =ktFaS— (k_t + k2)Ft, (6.19) P = - 5 = k2Ft. i2 M В. Волькенштейн 177
Общая концентрация фермента постоянна Fo + F , — Е = const. (6.20) Исключая из второго уравнения (6.19) Fo с помощью (6.20), по- лучим /’1 = *1£S-(fc_) + fc2 + A:1S)F). (6.21) Система находится в стационарном состоянии, если имеется боль- шой избыток субстрата, S > Е. Пока сохраняется стационарное состояние, Л=0 (и, конечно, А = 0). Поясним это наглядным примером. Нужно завязать ботинки. Это можно быстрее сделать, поставив ногу на стул, который тем самым играет роль катализа- тора. Субстрат — незавязанный ботинок, продукт — завязанный, свободный фермент — свободный стул, ФСК — нога; поставленная на стул. Если завязать ботинки нужно большому числу людей (скажем, матросам по тревоге), а число стульев невелико, то число стульев, на которые поставлены ноги, будет в течение не- которого времени постоянным. Итак, в стационарном состоянии Д = 0 и из (6.21) получаем ^-ks‘ (6.22) Из (6.19) следует, что = (6-23> v — скорость реакции. Поделив числитель и знаменатель на klt получаем уравнение Михаэлиса — Ментен: где константа Михаэлиса *м = Ц±-Х (6-25) Прежде чем рассмотреть это уравнение, докажем, что стационарное состояние действительно реализуется при S Е. Проинтегрируем уравне- ние (6.21), считая S практически постоянным, т. е. рассматривая S как медленно изменяющийся параметр. В момент 1 = 0 добавления фермента к субстрату fi(0) =0 (весь фермент свободен). Получаем kES )’ (6-26) тде т = (fc-i 4- кг + klS)~'1. ФСК Ft релаксирует к стационарному значению, отвечающему Fi = 0, с вре- менной постоянной т тем быстрее, чем больше концентрация субстрата S. Из (6.26) следует, что А = kiES ехр (—1/т) -> 0. (6.27) Подставляя значении Fi (6.26) и Fi (6.27) в периое уравнение (6.19), 178
находим S = — k±ES exp \kJES Г / t >1 fc_x + + kxS p — ex₽ (— T J J’ <6'28) т. e. при t -* oo величина S действительно стремится к стационарному зна- чению (6.23). Это связано с исходным предположением о медлепном изме- нении S. Относительная скорость изменения 8 действительно мала при 8 Е. Величина S монотонно убывает во времени, ее максимальное зна- чение отвечает начальному моменту t = 0: S{0) = —kiES. Максимальной мерой изменения 8 поэтому является к ES AS at 8 (0) т = — + /t2 4- кг8' Легко видеть, что при Е 8 IД5| < 8. Вместе с тем АЛ яа Ft(0)т » — AS и М\/Е > |AS|/S. (6.29) Вернемся к уравнению Михаэлиса — Ментен (6.24). Зависи- мость v (S) подобна изотерме Ленгмюра (рис. 6.2). Кривая не имеет особенностей, скорость ре- акции асимптотически стремится к своему наибольшему значению при S -> °о; FmaI = k2E. (6.30) Следовательно, (6.31) Рис. 6.2. Кривая Михаэлиса — При v = 0,5 Ртах имеем 5 = лм, Ментен т. е. константа Михаэлиса есть концентрация субстрата, при которой скорость половине максимальной. Уравнение (6.31) удобно преобразовать по Бэрку: 1 , Км 1 । 1 v wmax $ l’max реакции равна Лайнуиверу и (6.32) Строя график зависимости 1/п от 1/5, находим 1/ртах по точке пересечения прямой с осью ординат и Км по наклону прямой. Константу Михаэлиса можно представить в виде Км = k2/kt + Кв, где Кв = k-Jki. Все три константы скорости можно определить, представив (6.32) с помощью (6.30) в виде ~ l’max __ 1 _ Е S । ртах v 1 — S ' kjES' (6.33) 12* 179
При данном значении S зависимость vm№/v — 1 от rmax изобража- ется прямой линией, отсекающей на оси ординат отрезок Ka/S, а на оси абсцисс отрезок — i/ktES. Из прямых, полученных при № гг —*~ъ*р к-т V /-з ^г. а Рис. 6.3. Схемы процессов с конкурентным (а) и некон- курентным (б) ингибирова- нием разных значениях S и Е, можно найти к3, k-t, к2. Рассмотрим теперь такую же реакцию при наличии модификато- ра — вещества, вызывающего изме- нение скорости реакции. Если мо- дификатор замедляет реакцию, то он называется ингибитором, в про- тивном случае — активатором.. Обо- значим концентрацию ингибитора через I. На рис. 6.3 представ- лены графические схемы (графы) для двух простейших случаев ин- гибирования. При конкурентном ин- гибировании фермент, наряду с ФСК, образует неактивный комплекс с /, обозначаемый Ег. Ингибитор конкурирует с субстратом, связыва- ясь с активным центром фермента. При неконкурентном ингибировании комплекс Е2 образуется при взаимодействии ФСК с I. Уравнения стационарной кинетики при S Е, I» Е в пер- вом случае имеют вид' Л = - (ktS + kJ) F„ + (fc_, + k2)Ft + k_3F2 = 0, Ft — ktSF3 — (k-t + k2)Ft =0, (6.34)' Л = k3IFo —k-3F2 = 0, E = F„ + Ft + F2, v = k2F,. Их решение имеет вид и, следовательно, kSE v = ^4-^ F°= km + s + k№k1f (6-35) где Ki = k3/k-3. Максимальная скорость umaI = кгЕ не меняется, но скорость при малых S убывает. При неконкурентном ингибировании Fa = — kjSFi) + (k-t + k2)Ft = 0, Ft = ktSF3 — (k-t + k2 + k3I)Ft + k-3F3 — 0, Л = k3IFt - k-3F2 = 0, (6-36) E = F3 + Ft + F2, v --= k2Ft. 180
Решение имеет вид к^Е K^+s+K^r (6.37) При этом уменьшается максимальная скорость ^тах •— кгЕ 1 + (6.38) На практике зачастую ситуация более сложна. В нестационарных системах решение даже простых кинети- ческих задач требует применения ЭВМ. Числовые решения дают Рис. 6.4. Кривая свободной энер- гии для реакции Ф« М (фума- рат з=е малат). ФЕ, ME — ком- плексы с ферментами. Числа — энергия G в кДж/моль более богатую информацию о константах скорости, необходимую в сложных случаях. В действительности даже в простых случаях превращение субстрата в продукт протекает в несколько стадий: Сорбция Превращение Десорбция Е + S < " ' " ES\-------- ---------> ЕР \......* Е + Р. Десорбция Обратное превращение Сорбция Здесь Е есть Fo, ES =** ЕР мы ранее обозначили через F4. Иссле- дование зависимости констант скорости от температуры позво- ляет определять эффективные значения свободной энергии, эн- тальпии и энтропии активации. Реакция имеет сложный профиль для этих величин (рис. 6.4). Они были определены для многих процессов, причем выяснилась большая роль энтропийного вклада. Для G+ ферментативных реакций характерны величины порядка 40—80 кДж/моль, для Н+ — того же порядка, для 5+ — 40— 160 Дж/(моль К). Напомним, что при 300 К 140 Дж/(моль К) дают вклад в свободную энергию, равный 42 кДж/мсль. Установ- лен так называемый компенсационный эффект. Изменения эн- тальпии ДЯ в процессах, протекающих в водных растворах, зача- стую пропорциональны изменениям энтропии AS. То же отно- сится к активационным параметрам: Я+ пропорционально S+. Ламри предположил, что этот эффект определяется свойствами воды: изменение конформации белка, сопровождаемое вытесне- нием воды из активной полости глобулы, вызывает перестройку 181
окружающей водной структуры. Компенсационный эффект мо- жет быть важен для теплокровных организмов. Малость изме- нений AG и G+ вследствие компенсации означает малую чув- ствительность ферментативных процессов к температурным из- менениям в окружающей среде. + + + Однако значения G+, Н+ и S+ для ферментативных реакций условны. Кинетические измерения можно вести лишь в узком температурном интервале. Активационные параметры сильно зависят от ионного состава среды, от pH и т. д. При этом урав- нение Аррениуса может не выполняться, так как глобула испы- тывает структурные перестройки, зависящие от температуры. Указанная интерпретация компенсационного эффекта может оказаться иллюзорной. Эти вопросы остаются пока открытыми. Существенная зависимость ферментативной активности от pH среды определяется полиэлектролитной природой фермента. Ферментативная активность, характеризуемая, в частности, кон- стантой к2, зависит от pH колоколообразно — к2 имеет максимум при некотором значении pH и убывает при уменьшении или уве- личении pH. Предложен ряд теоретических моделей, объясняю- щих в общих чертах такую зависимость. Подлинная теория тре- бует, однако, более подробных сведений о ферментах, чем нам пока известные. § 6.3. Химические аспекты действия ферментов Характерные особенности ферментативного катализа — боль- шая активность и строгая специфичность по отношению к суб- страту или группе субстратов. Молекулярной активностью или числом оборотов фермента называется число молей субстрата, превращаемых в одну мину- ту одним молем фермента при значительном избытке субстрата, 5 > Е. Свойства ферментов изучаются in vitro. Многие ферменты получены в кристаллической форме. Субстраты — малые молекулы или малые группы больших молекул. Напротив, фермент макромолекулярен. Следовательно, субстрат непосредственно взаимодействует с определенным ма- лым участком молекулы фермента — с ее активным центром. Природа активного центра, т. е. совокупность и расположение аминокислотных остатков, а также кофакторов (см. с. 48), входя- щих в его состав, установлена для ряда ферментов. Мы уже упо- минали о фермент-субстратном узнавании (с. 58). Изменения активности, возникающие в результате химической модификации белка, позволяют выявить функциональные группы активного центра. Сведения о его структуре дают оптические и спектраль- ные методы, а также рентгеноструктурный анализ комплексов фермента с конкурентными ингибиторами, строение которых близко к строению субстратов. 182
Разнообразие аминокислотных остатков фермента и атомных групп кофактора определяет полифункциональность активного центра — его способность связывать субстрат и каталитическую активность. Ферментативная реакция многостадийна, протекает через ряд химических превращений. Так, у эстераз в активном центре присутствует Сер, подвергающийся ацилированию па Рис. 6.5. Схема действия креатинкиназы. Переходные состояния промежуточной стадии процесса. На субстрат действуют согласо- ванно различные группы активного центра. Приведем пример креатинкиназы, катализирующей реакцию АТФ4- + креатин АДФ3- + фосфокреатин2- + Н+. На рис. 6.5 изображена схема переходного состояния для этой реакции. Кофактором служит ион Mg2+. Особенно важную роль в активном центре играет SH-группа. Фермент инактивируется йодацетамидом и йодацетатом. В присутствии Mg2+ и обоих суб- стратов SH-группа защищена от действия блокирующих агентов. По-видимому, SH-группа соединена водородной связью с одной из основных групп фермента. Благодаря легкому переходу про- тона в системе кислота — основание, соединенных водородной связью, такая система обладает высокой каталитической актив- ностью. На рис. 6.5 показаны сдвиги электронов в субстратах и группах активного центра. При образовании ФСК существенна точная взаимная ориен- тация функциональных групп фермента и субстрата или моди- фикатора. Активный центр, естественно, хирален и, тем самым, стереоспецифичен. С помощью меченых атомов установлено, что реакции молекул типа CAABD происходят на поверхности фер- мента асимметрично. Это относится, например, к превращению аминомалоновой кислоты в глицин С*ООН С*ООН I I Н N-C-H -> H„N—С—Н А А I I соон н 183
Здесь С* — меченый атом углерода. В реакцию вступает только одна группа СООН, химически и геометрически неотличимая от другой. Это объясняется асимметрией активного центра. Так как группы фермента, связывающиеся с карбоксилами, различны, то неодинаковы и реакции карбоксилов. Ферменты хорошо разли- чают стереоизомеры, и оптический антипод данного субстрата субстратом уже не является. Прямое рентгенографическое исследование комплексов лизо- цима с ингибирующими аналогами субстратов — полисахари- дов — показало, что лиганд внедряется в полость, существующую в глобуле лизоцима, и контактирует с несколькими функциональ- ными группами фермента (Филлипс). Структура такого комплек- са показана на рис. 6.6. Внедрение субстрата установлено и для других систем. Для ряда ферментов подробно изучена последова- тельность химических превращений, т. е. стадий реакции, про- текающей в активном центре ФСК. Так, Браунштейн и его сотрудники исследовали химию аспартат-аминотра.нсферазы, (ААТ). Этот фермент содержит пиридоксалъфосфат (ПАЛФ) в качестве кофермента. ПАЛФ, присоединенный к белку, реагиру- ет с субстратом — аминокислотой — химически, образуя алъди- мин (шиффово основание) Н НО СН, н НО СН г1а \ / 3 а \ / ’ I — HgO | --\ в C-NH„4-O=CH—С =5=^ В,—С—N=CH—< I / I / СООН Н„СОРО„Н„—Белок СООН НоС0Р0„Н,-Белок 2 о 2 2 о А Атом Па легко диссоциирует в альдимине. При реакциях переами- нирования альдимин таутомеризуется в кетимин НО сн3 R1\c=n—СН — XN hoocz /===z Н2СОРО3Н2—Белок который гидролизуется водой с образованием кетокислоты НО^ сн3 R1\c=o+h,n—СН— HOOCZ 2 Н2СОРО3Н2—Белок Возникает пиридоксаминная форма фермента, реагирующая с другой кетокислотой, содержащей R2 вместо Ri, причем регене- рируется исходный фермент и получается новая аминокислота R2CH(COOH)NH2. Такова схема реакции трансаминирования — переноса аминогруппы. Практически все реакции, катализируемые ферментами, мо- гут протекать и без ферментов, но с гораздо меньшей скоростью. 184
QO сл
Поэтому можно моделировать стадии ферментативного процесса в низкомолекулярных «конгруэнтных системах». Такая модель для реакции, катализируемой ААТ, была по- строена Ивановым и Карпейским. Первая стадия процесса состо- ит в слабом связывании аминокислоты активным центром. Вторая стадия — нуклеофильное присоединение аминогруппы субстрата к связи N=C\ альдимина. Акцептором протона М12-группы здесь является отрицательно заряженная фенольная группа ко- фермента. Таким образом, неионизованная нуклеофильная амино- группа оказывается рядом с высокореактивной катионной формой кофермента. С помощью пространственных молекулярных моде- лей построена структура альдиминной формы ФСК. Далее про- исходят уже указанные превращения, причем в некоторых стадиях реализуются конформационные движения — повороты кофер- ментного цикла. Схема последовательных событий в активном центре ААТ показана на рис. 6.7, повороты кофермента от- мечены круговой стрелкой. Многоточечное связывание в актив- ном центре является причиной стабилизации активной электрон- ной конфигурации, термодинамически невыгодной в растворе, и причиной надлежащей ориентации взаимодействующих групп. В каждой стадии процесса происходит структурная перестройка, обеспечивающая оптимальность последующей стадии. На языке термодинамики это означает, что в активном центре происходит выравнивание уровней свободной энергии промежуточных сое- динений. Действительно, в спектре поглощения ФСК содержатся полосы поглощения всех важнейших промежуточных соединений реакции, в то время как в соответствующей конгруэнтной систе- ме наблюдается лишь одна полоса 330 нм. Мы остановились на этих примерах, чтобы показать возмож- ности расшифровки взаимодействий между активным центром фермента и лигандами. Химия выявляет поведение функциональ- ных групп фермента и кофакторов. Однако этого недостаточно для количественного объяснения ферментативной активности, характеризуемой понижением энергии активации. Для фермента- тивного катализа необходима вся белковая глобула. Нельзя от- резать часть белковой цепи без ущерба для активности фермента. Химия не отвечает на вопрос о роли глобулярной структуры, опи- сывая лишь события в активном центре. Эти задачи стоят перед физикой. Суммируя результаты химических исследований ферментов, Браунштейн указал качественные факторы, ответственные за их действие. 1. Большое сродство фермента и субстрата, т. е. большая веро- ятность образования ФСК, эквивалентная резкому увеличению концентрации реагентов (эффект сближения). 2. Строгая взаимная ориентация реагентов, кофакторов и ак- тивного центра (эффект ориентации). В обычных гомогенных 186
Рис. 6.7. Схема последовательных событий в активном центре ААТ HZ HZ
реакциях вероятность строгой взаимной ориентации трех или большего числа взаимодействующих молекул очень мала. 3. Воздействие на субстрат нуклеофильных и электрофиль- ных групп активного центра (эффект синхронного кислотно-ос- новного катализа). Поясним этот эффект на модели. Оксипири- дин катализирует мутаротацию глюкозы, разрывая ее шестичлен- ное кольцо и испытывая таутомерное превращение: Такая же реакция с участием смеси пиридина и фенола НО протекает в 7000 раз медленнее. Кооперация кислотных и основ- ных групп, их совместное действие резко ускоряют реакцию. Таблица 6.1. Сравнение скоростей ферментативных реакций со скоростями неферментативных аналогов Фермент Неферментативный аналог Скорость фер- ментативного процесса v, с-1 Скорость нефер- ментативного процесса t^, с~1 V V , Лизоцим Гидролиз ацета- ля, основный ка- тализ 5-10-1 3-10-» 2-108 Химотрипсин Гидролиз амида, основный катализ 4-10-2 1-Ю-4 5 * 4-103 Р-амнлаза Гидролиз ацета- ля, основный Ка- тализ 1-Ю3 310-» 3-10ц Фумараза Гидрирование ал- кена, кислотный и основный ката- лиз 5-102 3-10-’ 2-10U Скорости неферментативных реакций умножены здесь на коэффициент, отвечающий эффекту сближения. Для двух молекул, имеющих размеры молекулы HSO, этот множи- тель равен 55, т. е. равен молярной концентрации воды. 4. Активация субстрата путем перераспределения электронной плотности под действием активных групп фермента (эффект по- ляризации) . 5. Изменение конформаций белка и субстрата в ФСК (эффект индуцированного контакта). 188
Физика должна рассмотреть эту картину количественно, вы- явив попутно, в какой мере возможно разделение указанных эф- фектов. Приведем в заключение данные, характеризующие скорости ферментативных и аналогичных неферментативных процессов (табл. 6.1). § 6.4. Конформационные свойства ферментов Для понимания ферментативной активности необходимо рас- смотреть конформационное поведение макромолекулы белка. Конформационная лабильность белка обеспечивает возможность его специфического взаимодействия с субстратами и другими лигандами. В некоторых конформациях белок более эффективно связывает субстрат. Одновременно происходит отбор конформа- ций субстрата. В ФСК отбираются те конформации белка и суб- страта, которые находятся в структурном соответствии друг с другом, обеспечивающем оптимальное значение свободной энер- гии взаимодействия. При образовании ФСК происходит взаим- ная «подгонка» конформаций белка и субстрата, т. е. их специ- фический отбор. Посредством конформационных превращений реализуется структурное соответствие фермента и субстрата. Конформационные эффекты определяют значительные изме- нения энтропии при образовании ФСК. Понижение энтропии при отборе определенной конформации может компенсироваться понижением энтальпии. Физический анализ событий такого ти- па требует учета явлений, в окружающей водной среде. В свое время Фишер предложил модель «ключ — замок» для рассмотрения фермент-субстратного взаимодействия. Фермент и субстрат обладают жесткими структурами, причем фермент «по- догнан» к субстрату как замок к ключу. Ряд фактов противо- речит такой модели — взаимодействие фермента с субстратом имеет, по-видимому, не статический, а динамический характер. Кошланд предложил модельную теорию индуцированного струк- турного соответствия фермента и субстрата. Перечислим исход- ные положения этой теории, задачи которой состояли прежде всего в объяснении специфичности ферментов, катализирующих реакции переноса связи B-X + Y^B-Y + X. 1. Субстрат вызывает изменение геометрии фермента при своем проникновении в активный центр. 2. Для ферментативного действия необходима надлежащая взаимная ориентация каталитических групп. 3. Субстрат индуцирует такую ориентацию изменениями, ко- торые он вызывает в геометрии фермента. Конечно, эта теория охватывает и те случаи, в которых из- меняется конформация субстрата, а не фермента, или изменя- ются конформации и того, и другого. Основная идея теории со- 189
стоит в определяющей роли конформационной лабильности взаи- модействующих молекул для ферментативного катализа. Ряд фактов действительно свидетельствует о конформацион- ных превращениях ферментов при их взаимодействиях с суб- стратами. В присутствии субстратов некоторые ферменты ста- новятся более жесткими, другие, напротив, более лабильными — легче денатурируются при нагревании. Субстраты индуцируют диссоциацию глутаматдегидрогеназы и гексокиназы на субъеди- ницы. Под действием субстрата изменяется реакционная способ- ность аминокислотных остатков фермента. Спектр поглощения химотрипсина меняется при его взаимодействии с субстратом и эти изменения могут быть интерпретированы как вызванные из- менением конформации. Изменения конформаций проявляются и в спектрах люминесценции как ароматических аминокислот- ных остатков, так и сорбированных на белке красителей. Мето- дами спектрополяриметрии установлены изменения a-спирально- сти, . возникающие при взаимодействиях ферментов с субстрата- ми, коферментами и другими лигандами. Сведения о конформа- ционных изменениях в ФСК дают также спектры ЭПР фермен- тов, содержащих парамагнитные метки, спектры ЯМР и т. д. Рентгенография фермент-субстратных комплексов дает пря- мую информацию о конформационных превращениях. При вхож- дении субстрата в полость лизоцима (с. 185) полость сужается и более плотно «зажимает» субстрат. Смещения аминокислот- ных остатков белка невелики, но заметны — остаток Трп 62 смещается на 0,075 нм. Одно- временно происходит измене- ние конформации аналога суб- страта — небольшой поворот уг- леводных колец вокруг глико- зидной связи. Наличие предуготовленной для субстрата полости обнару- жено рентгенографически и у других ферментов. При этом выявляются группы активного Рис. 6.8. Схема активного центра карбоксипептидазы центра. Прямое подтверждение идеи об индуцированном струк- турном соответствии получено при исследовании карбоксипептидазы. В присутствии аналога субстрата глицилтирозина расположение остатков существен- но меняется. Активный центр представляет собой глубокую полость, подобную «рту паука» со «щупальцами», готовыми на- править субстрат к кофактору — к атому Zn. Одно «щупальце», содержащее Тир 248, направляется к NH-группе субстрата, Apr 145 другого взаимодействует с карбоксилом субстрата, Глу 270 третьего — с конечной аминогруппой (рис. 6.8). 190
Как уже указывалось (с. 134), рентгеноструктурный анализ позволил недавно определить относительную подвижность (кон- формационную и колебательную) различных аминокислотных остатков в белках. Исследования метмиоглобина и лизоцима по- казали, что остатки, расположенные внутри глобулы, имеют зна- чительно меньшую подвижность, чем расположенные на ее по- верхности. Методы рентгенодинамического анализа, мёссбауэровской спектроскопии, рэлеевского рассеяния мёссбауэровского излуче- ния (§ 5.1, 5.3) и другие показывают, что конформационная Рис. 6.9. Атомная модель молекулы рибонуклеазы Сг из Aspergillus clavatus О по данным рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,55 А. Различной штриховкой показаны атомы, имеющие различную подвижность — средние- квадратичные смещения <u>: 1 — <и> < 0,5 А; 2— 0,5 А < <и> < 0,6: А; 3 — со о 0,6 А <<в> < 0,7 А; 4 — <и> > 0,7 А. Значения <и> для атомов, входящих в а-спирали и [J-формы, заметно ниже, чем для атомов в нерегулярных участках подвижность сохраняется в белках и при низких температурах. Происходят ли эти движения вблизи положения равновесия или конформационная структура глобулы неравновесна, «застекло- вана»? По-видимому, возможны оба случая. В отличие от.,стек- лообразных полимеров, высота и положение пика теплоемкости на кривой плавления белка большей частью не зависят от скорости нагревания, что свидетельствует в пользу равнове- сия. Известны, однако, и противоположные случаи. На рис. 6.9 показана рентгенодинамическая картина, полу- ченная Поляковым в Институте кристаллографии АН СССР для рибонуклеазы. 191
Итак, в ФСК достигается структурное соответствие, реали- зуемое в полости молекулы фермента. Как показывает сопо- ставление всех изученных рентгенографически структур, их об- щая особенность состоит в том, что внутренняя поверхность по- лости образована преимущественно неполярными остатками. Вследствие гидрофобных взаимодействий полярные остатки вы- ведены наружу. Неполярное «нутро» белковой молекулы имеет малую диэлектрическую проницаемость, что облегчает электри- ческие взаимодействия. Фермент является не только специфиче- ским реагентом, но и средой реакции. Перутц писал: «Мы можем спросить себя, почему химические реакции, нормально требую- щие мощных органических растворителей или сильных кислот и оснований, могут протекать в водном растворе вблизи ней- трального pH в присутствии ферментных катализаторов. Орга- нические растворители имеют преимущества по сравнению с во- дой, обеспечивая среду с низкой диэлектрической проницае- мостью, в которой могут иметь место сильные электрические взаимодействия между реагентами. Неполярные внутренние об- ласти ферментов обеспечивают живую клетку эквивалентами ор- ганических растворителей, применяемых химиками». Все эти представления имеют модельный, качественный ха- рактер и сами по себе не означают построения физической тео- рии ферментативного катализа. Пути, ведущие к такой, еще не созданной теории, описаны далее. § 6.5. Физика фермент-субстратного взаимодействия Физическое своеобразие ферментативного катализа определя- ется прежде всего ролью глобулы, размеры которой на поря- док больше размеров субстрата. Естественно возникает вопрос о причинах большой эффективности именно такой системы при осуществлении химического превращения в водной среде, при нормальном давлении и физиологической температуре. При сорбции активным центром молекула субстрата перехо- дит из водного окружения в окружение, созданное аминокислот- ными остатками. Субстрат оказывается в окружении с малой диэлектрической проницаемостью, в котором могут осуществить- ся сильные электрические взаимодействия между реагентами и полярными группами фермента. Развивая идею «фермент — ра- створитель», Перутц приходит к заключению о том, что электро- статические взаимодействия дают главный вклад в энергетику ферментативного катализа, т. е. в понижение энергии активации, вызываемое ферментом. Отличие фермента от водного раствора состоит в том, что в активном цеПтре фермента располагаются диполи с фиксированной ориентацией по отношению к заряжен- ным группам субстрата, даже если поле этих зарядов мало. Вследствие такой ориентации ферменты могут стабилизировать пары ионов и другие распределения зарядов значительно боль- лпе, чем вода. В водных растворах электростатическое притяже- 192
ние невелико, так как любая сила, создаваемая сближением про- тивоположных зарядов, уравновешивается переориентацией ди- полей растворителя. В ферментах такая переориентация невоз- можна. Проведенные на этой основе количественные расчеты- для лизоцима позволили оценить снижение энергии активации катализируемой реакции в согласии с опытом (Варшел). Белковая глобула представляет собой динамическую систему. Имеется ряд заслуживающих внимания попыток физического истолкования поведения такой системы при ее взаимодействии с субстратом. Очевидно, что энергия, которую фермент может израсходо- вать на ускорение реакции (т. е. на эффективное понижение активационного барьера), может иметь единственное происхож- дение — это часть свободной энергии, выделяемой при сорбции субстрата на ферменте. Предположение о накоплении тепловой энергии окружающей среды в ферменте и ее использовании в реакции означало бы вечный двигатель второго рода. Итак, энер- гия выделяется при сорбции субстрата. Была предложена гипо- теза, согласно которой эта энергия трансформируется в энергию упругих колебаний глобулы, ведущей себя подобно капле жид- кости. Частоты таких колебаний попадают в гиперзвуковую об- ласть — до 1013 с-1. Стоячие волны в капле могут образовать пучность в области активного центра и энергия упругих коле- баний может активировать молекулу субстрата. Количественные оценки, основанные на этой идее, показали, что энергия упру- гих колебаний глобулы действительно может достигать 20— 40 кДж/моль и обеспечивать значительное понижение эффек- тивного активационного барьера. Гипотеза эта привлекательна, но пока не имеет доказательств. Остается неясным также, с какой скоростью упругая энергия глобулы диссипирует в окружающую среду. Приведем все же простую оценку ускорения реакции, осно- ванную на предположении о трансформации энергии сорбции в энергию ФСК. Предположим, что структурное соответствие фермент — субстрат в ФСК приводит и белок, и малую молеку- лу в напряженное состояние («дыба»). Пусть длина нерастяну- той молекулы субстрата равна Zo, длина полости фермента, в ко- торую вошел субстрат, I. Изменения длины молекул субстрата и фермента равны соответственно х в у. Тогда х + у—1 — и условие равенства упругих сил имеет вид ksx = kty, (6.39) где ks и кЕ — коэффициенты упругости субстрата и фермента. Находим I — 1 fc4 l — lл х = tttV. У = г ; . . ", - (6.40) Упругая энергия субстрата, определяющая понижение энергии 43 м. В. Волькенштейн 193
активации, равна A£ = V2^ = 1Ms(rT^). (6.41> Порядок кЕ отвечает произведению линейного размера глобулы на модуль упругости Le. Для белка L ~ 5 нм, е ~ 103 Дж • см-3. Следовательно, кЕ « 5 • 10~2 Н/см. Наибольшая энергия упругой деформации сосредоточивается в наиболее слабом месте моле- кулы субстрата. Деформация валентных углов происходит зна- чительно легче, чем валентных связей. Вместе с тем энергия,, запасенная на угловых степенях свободы молекулы, может пе- рейти на валентную связь и уменьшить энергию активации ее разрыва. Коэффициент упругости ks, отвечающий низкочастот- ным деформационным колебаниям (у ~ 1013 с-’), равен пример- но 0,15 Н/см. Допустим, что \Е = 31,5 кДж/моль (при умень- шении энергий активации на такую величину скорость реакции увеличивается в 105 раз). Тогда х ~ 0,08 нм, у ~ 0,23 нм, упру- гая энергия фермента 1/гкЕуг ~ 88 кДж/моль. Значит, суммарная энергия, расходуемая при сорбции на упругую деформацию, со- ставляет 171 кДж/моль. Эта величина не чрезмерна, если учесть, что сорбция происходит за счет многоточечного связывания,, т. е. образования многих химических и слабых связей между ферментом и субстратом. Наблюдаемая энергия сорбции пред- ставляет собой разность истинной энергии сорбции и энергии упругой деформации фермента и субстрата. Рассмотренная модель «дыбы» — статическая. Если предпо- ложить, что упругая система динамическая и возникает резо- нанс колебаний молекул субстрата и фермента, то для такого- же ускорения реакции потребуется средняя упругая энергия,, в четыре раза меньшая, чем в статическом случае, так как бие- ния периодически удваивают амплитуду колебаний. В этой наглядной модели рассматриваются колебания атом- ных ядер, возникающие в результате образования ФСК, т. е. взаимодействия фермента с субстратом. При этом взаимодействии изменяются состояния электронных оболочек субстрата и атом- ных групп активного центра. Электронные оболочки испытыва- ют возмущение вследствие взаимодействий в ФСК. Превраще- ние субстратов в продукт есть химический процесс, т. е. изме- нение состояния электронных оболочек молекул. Как и в любой иной химической реакции, при этом происходят перемещен