Валентин Иванович Грищенко — доктор медицинских наук,
профессор, академик НАН Украины. В 1951 г. окончил Харьковский
медицинский институт. Работал в Харьковском НИИ ОХМД
(1954-1956), Харьковском медицинском институте (1956 — по настоящее
время). С1983 г. — директор Института проблем криобиологии и
криомедицины НАН Украины.
Научные интересы: изучение криочувствительности и криосохранения
эмбриональных, гемопоэтических и плодовых клеток человека. Инициатор
освоения и внедрения в Украине метода оплодотворения яйцеклетки
человека вне организма, нового направления в медицине — использования
низких температур в акушерстве и гинекологии. Первым в Украине
организовал аутобанк сохранения кордовой крови. Соавтор разработки и
создания на основании криопротекторов препаратов «Дорсай», «Юпитер»,
повышающих урожай зерновых и других культур.
Автор более 1000 научных трудов, 21 монографии и 6 учебников, 143
патентов и авторских свидетельств на изобретения. Почетный
изобретатель НАН Украины, заслуженный деятель науки и техники Украины.
Лауреат Государственных премий в области науки и техники УССР, СССР,
Украины, премий им. А.А. Богомольца НАН Украины, им. В.Ф. Снегирева
АМН СССР. Подготовил 35 докторов и 119 кандидатов медицинских и
биологических наук.

Эмма Ивановна Алексеевская — биолог-генетик. В1967 г.
окончила Харьковский государственный университет им. В.Н. Каразина.
С1972 г. работает в Институте проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины. Кандидат биологических наук (1973), старший научный
сотрудник.
Научные интересы: расшифровала программу жизни здоровой,
охлажденной и криоконсервированной клетки, закодированной в ее
геноме. Создала принципиально новое направление в биологии, медицине
и сельском хозяйстве — обновление и криообновление. Предложила
способ эффективного лечения онкологических заболеваний, мужского
бесплодия, получения здорового потомства и продления его жизни,
повышения урожайности растениеводческих культур и др.
Автор 150 научных трудов, в том числе единственного в мире атласа
«Цитохимия костного мозга при криоконсервировании» (в соавторстве
с Е.Я. Панковым, 1979), 48 патентов и авторских свидетельств.
Награждена нагрудным знаком «Изобретатель СССР».

НАЦИОНАЛЬНАЯ
АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ
ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ
И КРИОМЕДИЦИНЫ

NATIONAL ACADEMY
OF SCIENCES OF UKRAINE
INSTITUTE FOR PROBLEMS
OF CRYOBIOLOGY AND CRYOMEDICINE

V.I. Grishchenko, E.I. Alekseyevskaya

Cryoregeneration,
Its Role in Preservation
of Health and Longevity
^SCIENTIFIC BOOK*
PROJECT

KIEV NAUKOVADUMKA 2009

В.И. Грищенко, Э.И. Алексеевская

Криообновление,
его роль в сохранении
здоровья и долголетия
ПРОЕКТ
«ПАУКОВА КНИГА»

КИЕВ НАУКОВА ДУМКА 2009

УДК 57.043:613

Монография посвящена принципиально новому направлению в биоло­
гии, медицине и сельском хозяйстве — изучению механизмов обновления
(программированной жизни клетки) и криообновления (программированной
жизни охлажденной и криоконсервированной клетки) по значимости сравни­
мых лишь с апоптозом (программированной гибелью клетки), так как являют­
ся его противовесом. Обосновывается основополагающая мысль о том, что в
основе здоровья и долголетия лежит сдвиг динамического взаимодействия
разнонаправленных процессов — апоптоза и криообновления в сторону
криообновления.
Для биологов, медиков, животноводов и растениеводов, интересующихся
проблемами лечения неизлечимых заболеваний и продления жизни, получе­
ния более качественного потомства во всех поколениях, мясомолочной, вин­
ной, рыбной и растениеводческой продукции улучшенного качества, элитных
«криообновленных» семян.
Монографію присвячено принципово новому напряму в біології, медици­
ні та сільському господарстві — вивченню механізмів оновлення (програмова­
ного життя клітини) і кріооновлення (програмованого життя охолодженої та
кріоконсервованої клітини), що за значущістю порівнянні лише з апоптозом
(програмованою загибеллю клітини), оскільки є його противагою. Обґрунто­
вується основоположна думка про те, що в основі здоров’я та довголіття лежить
зсув динамічної взаємодії різноспрямованих процесів — апоптоза і кріоонов­
лення у бік кріооновлення.
Для біологів, медиків, тваринників і рослинників, котрі цікавляться проб­
лемами лікування невиліковних захворювань і продовження життя, отриман­
ня якіснішого потомства в усіх поколіннях, м’ясомолочної, винної, рибної та
рослинної продукції поліпшеної якості, елітного «кріооновленого» насіння.

Рецензенты:
Ф.И. Осташко, акад. УААН
П.М. Перехрестенко, д-р мед. наук, профессор
С.А. Гусева, д-р мед. наук, профессор
К. Гуревский, д-р биол. наук, профессор
A.
Н.В. Дедух, д-р биол. наук, профессор
Н.В. Проскурин, канд. с.-х. наук, профессор
И. Вишневский, д-р биол. наук, профессор
B.
Рекомендовано к печати ученым советом
Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины

Виготовлення оригіналу-макета здійснено за державним контрактом
на випуск наукової друкованої продукції
Научно-издательский отдел медико-биологической,
химической и геологической литературы

Редактор Н.С. Колосок

ISBN 978-966-00-0932-1

© В.И. Грищенко, Э.И. Алексеевская, 2009
© НПП «Издательство “Наукова думка” НАН
Украины», дизайн, 2009

Предисловие

Вопросы повышения качества жизни, особенно в последние го­
ды, когда во всем мире возросли заболеваемость и смертность, связанные с
воздействием физико-химических факторов, являются одними из наиболее
актуальных в современной биологии и медицине.
За последние 15 лет содержание промышленных выбросов в атмосфере уве­
личилось на 20 %. Ученые отмечают повышенное содержание в воздухе углекис­
лого газа, что вызвано прежде всего промышленной деятельностью человека и
растущим количеством автомобилей, в связи с чем стремительно сократилось на­
селение страны. Рурская область Германии — одна из самых населенных в Евро­
пе. В результате сверхиндустриализации оказались до предела загрязненными ре­
ки (практически мертвые), воздух, которым трудно дышать, и земля, на которой
сложно что-либо выращивать. Не менее пессимистический прогноз по России.
Только в Вологодской обл. в последние годы довольно быстрыми темпами растет
уровень смертности, который значительно превышает уровень рождаемости. За­
болеваемость взрослых за последний год увеличилась на 11 %, детей — на 29 %. В
Череповце 75 % детей рождаются с теми или иными патологиями.
В Украине, как и в странах ближнего и дальнего зарубежья, экологичес­
кая проблема вызывает тревогу и беспокойство. Согласно данным Госкомста­
та, к концу 1990 г. в Украине проживало 51,94 млн человек, а к 2004-му —
47,28 млн. По прогнозам Института демографии и социальных исследований
НАН Украины, до 2050 г. численность населения Украины может сократиться
до 35 млн человек. Уже на сегодня Донецкая, Днепропетровская, Луганская,
Запорожская и Харьковская области относятся к поясу повышенной экологи­
ческой опасности для жизни. На неблагоприятных территориях проживает
достаточно много людей. В основном это жители густонаселенных промыш­
ленных регионов Приднестровья, Донбасса и Слобожанщины. В Приднепро­
вье и Донбассе люди не доживают до пенсии. За последний год в Донецкой
обл. не родился ни один ребенок без патологии.
По всей Украине расположено множество очагов загрязненности, в пер­
вую очередь в примыкающих к Чернобыльской зоне районах, а также в Краснограде, Александрии и даже крымском Армянске. Эта категория граждан
Украины в наибольшей степени подвержена хроническим, онкологическим и
другим заболеваниям, что в конечном итоге приводит к преждевременному
старению организма и смертности. Средняя продолжительность жизни в
Украине сегодня на 10 % ниже, чем в 1990 г. До пенсионного возраста в стране
не доживают почти половина мужчин и около 40 % женщин. В промышленно
развитых районах, таких, как Приднепровье и Донбасс, средняя продолжитель­
ность жизни не достигает даже 59 лет. Уровень онкологических заболеваний в
десятки раз превышает показатели по другим регионам.
В Украине на сегодня смертность превышает рождаемость с разницей в
400 тыс. человек. По информации Министерства здравоохранения Украины,

5

Предисловие

нормальные роды в стране составляют в среднем лишь 1/3 их общего числа.
Доля осложненных родов выросла с 58 % в 1992 г. до 67 % в 2003 г.
Ученые Государственного института проблем семьи и молодежи сделали
заключение о том, что воздействие физико-химических факторов среды на­
прямую влияет на здоровье населения и, следовательно, на уровень рождае­
мости. Чем чище регион, тем выше в нем показатель рождаемости. Более 20 %
украинских семей не имеют детей по состоянию здоровья женщин и мужчин,
и эта ситуация ухудшается с каждым днем. Экологическая проблема в стране
достигла критического барьера. По количеству инсультов и инфарктов Украи­
на занимает первые позиции в мире. Ежегодно в Украине регистрируют около
120 тыс. инсультов и 50 тыс. инфарктов. У 90—93 тыс. человек выявляют он­
кологические заболевания.
В целом за период 1987—2004 гг., по оценкам М3 Украины, умерли 504 117
человек, 6769 из которых — дети. Более того, в результате Чернобыльской ка­
тастрофы ряды пострадавших с годами пополняются новыми поколениями, а
именно теми, кто родился и еще родится от ликвидаторов аварии, от эвакуиро­
ванных из зараженной зоны. На 1 января 2005 г. в Украине проживало 2 405 890
человек, пострадавших от Чернобыльской катастрофы. Из них детей, родив­
шихся от пострадавших, — 428 045. Радиация резко повысила у детей заболе­
ваемость органов дыхания и пищеварения, глаз, кожи. Они чаще заболевают
инфекционными заболеваниями. У «чернобыльских» детей намного чаще, чем
у малышей из «чистых» регионов Украины, встречаются болезни нервной сис­
темы, психические расстройства. У подростков-чернобыльцев все чаще прог­
рессируют «взрослые» болезни: у девочек часто выявляются нарушения мен­
струального цикла, а у мальчиков (14 лет ’) заболевания простаты. Самые
страшные последствия атомной катастрофы — это прежде всего различные он­
кологические заболевания (рак щитовидной железы, лейкемия и т. д.), а также
генетические отклонения.
Проблема выживания человечества потребовала разработки механизмов
принципиально нового направления в биологии и медицине. Известно, что на
клеточном и молекулярном уровнях неизлечимые заболевания — онкологи­
ческие болезни, туберкулез, СПИД и другие, а также преждевременное старе­
ние организма являются следствием запуска реакций программированной
смерти клетки (апоптоза), развитием иммунодефицитного состояния организ­
ма. В Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины
(ИПКК) академик НАН Украины В.И. Грищенко и старший научный
сотрудник, кандидат биологических наук Э.И. Алексеевская на протяжении
последних 30 лет работают над механизмами программированной жизни клет­
ки (криообновление), которые представляют собой противовес апоптозу.
В монографии дано теоретическое обоснование способности цитохро­
ма с, антиоксидантов, цитокинов, продуктов эмбриоспецифических и других
факторов тормозить развитие неизлечимых заболеваний и преждевременное
старение организма. Особое внимание уделено вопросам повышения лечеб­
ной эффективности криоконсервированных клеток костного мозга и эмбрио­
нальной печени. Представлены основные направления развития цитохромной
терапии и показаны причины большей эффективности цитохромной терапии
с применением криобиологических технологий по сравнению с общеприня­
тыми методами. Большое внимание уделено лечению онкологических забо­
леваний и бесплодия, сокращению продолжительности коматозного состоя­
ния и пребывания больного в реанимационном отделении, получению более
жизнеспособного поколения, повышению урожайности растениеводческих
культур, мясомолочной и винной продукции улучшенного качества.

ГЛАВА 1

Апоптоз и криообновление — важнейшие
противоположно направленные
феномены в клеточной биологии

Хорошо известны изречения: «Родиться, чтобы уме­
реть», «Первый шаг человека — шаг к его смерти». Они имеют глу­
бокий философский и научный смысл. Да, природа распорядилась
так, что человек, как и все живое, с момента рождения до смерти
претерпевает борьбу между жизнью и смертью. В молодом орга­
низме побеждает программа жизни. Со временем организм мед­
ленно, но неизбежно приходит в негодность — в нем накапли­
ваются шлаки, вредные химические вещества, вследствие чего им­
мунитет слабеет, внутренние органы все чаще дают сбои. След­
ствие таких сбоев — злокачественные новообразования, инсульт,
инфаркт и т. п.
В последние годы достаточно широко обсуждается понятие
«биологический возраст». Оно характеризуется состоянием сер­
дечно-сосудистой, дыхательной, мышечной, нервно-психической
систем. Определяя разные жизненно важные параметры организ­
ма, можно установить, какому возрасту они соответствуют. На­
пример, измеряют артериальное давление, жизненную емкость
легких, парциальное давление кислорода в крови, определяют объ­
ем выполненной работы за единицу времени, проверяют зрение,
слух, быстроту движений, силу кисти руки, способность растяже­
ния сухожилий, состояние зубов, кожи, волос и измеряют биоло­
гический индекс. Это — укороченный вариант. Обычно добав­
ляют еще ряд биохимических и психологических показателей.
Генетики Харьковского национального университета В.Г. Шахбазов, Ю.Г. Шкорбатов, Л.А. Журавлева предложили принципиаль­
но новый метод определения биологического возраста человека
по биоэлектрическим свойствам клеточных ядер и по степени
компактизации хроматина. С электрическими свойствами ядра
связана интенсивность ядерно-цитоплазматического транспорта и
его генетические функции. Измеряется всего один показатель и

7

Глава 1. Апоіггоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

занимает это лишь несколько минут. Ученые считают, что измене­
ния энергетического состояния клеток соответствуют возрастным
изменениям организма в целом. Они обследовали несколько ты­
сяч человек разных возрастных групп — от роддомов до домов
престарелых, от новорожденных первых дней жизни до 90-летних
старцев. На основании этих показателей впервые была построена
среднестатистическая кривая распределения отрицательного элект­
рического заряда клеток по возрастам — от рождения до смерти.
Ученые Харьковского национального университета работали с ли­
квидаторами аварии на ЧАЭС и получили данные о том, что био­
логический возраст у молодых людей резко повышен по сравне­
нию с их паспортным: 20-летние ребята имели биологический
возраст 50—60 лет. Вместе с тем у некоторых ликвидаторов более
старшего возраста биологический возраст почти не изменился.
Не менее важное значение для определения биологического
возраста имеет изменение степени компактизации хроматина в
ядрах клеток. С позиции двух разнонаправленных процессов —
апоптоза и обновления — степень компактизации (деконденса­
ции) хроматина отражает процессы программированной гибели
клетки. Степень декомпактизации (деконденсации) хроматина ха­
рактеризует процессы программированной жизни клетки. Поэто­
му руководствуясь принципами доказательной медицины, по сос­
тоянию хроматина можно наиболее четко определить биологичес­
кий возраст человека.
Ученые выяснили, что «потенциал молодости» очень велик,
поэтому в преклонном возрасте можно выглядеть молодо. Естес­
твенные враги молодости, в первую очередь свободные радикалы,
которые образуются в результате стрессов, курения, избыточного
ультрафиолетового излучения, неблагоприятной экологии, связа­
ны с физико-химическими воздействиями, без которых, как упо­
миналось выше, нельзя обойтись. Долгое время считали, что ак­
тивные формы кислорода (АФК) — побочные продукты метабо­
лизма и их биологическое действие сводится к пероксидному
окислению липидов клеточных мембран, деструкции и поврежде­
нию белков и нуклеиновых кислот. На самом деле свободноради­
кальные формы АФК инициируют цепные реакции и повреждают
значительное количество биоэнергетических молекул. С возрас­
том концентрация АФК в организме человека увеличивается.
Из изложенного следует, что, научившись управлять програм­
мой жизни и смерти, мы научимся регулировать процессы старе­
ния и корректировать биологический возраст человека. На сегод­
ня с позиции доказательной медицины можно с уверенностью ре­

8

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

комендовать использование антиоксидантов, продуктов эмбриофеталоплацентарного комплекса, кордовой крови, цитокинов, гор­
монов и других, «запускающих» программированную жизнь клет­
ки, именуемую нами «обновление». Таким образом, качество жиз­
ни определяет характер динамического взаимодействия двух раз­
нонаправленных программ — жизни и смерти.
Процессы жизни и смерти находятся под контролем клеточно­
го генома. Гены контролируют и направляют развитие от оплодот­
воренного яйца до взрослой особи. Индивидуальное развитие уп­
равляется генами посредством ферментов, которые продуцируют­
ся этими генами. Хорошо изучена сложная система химических
процессов. Ее реакции протекают с точно уравновешенными ско­
ростями и взаимодействуют между собой определенными спосо­
бами. Никакой фермент не может начать действовать до тех пор,
пока не будет веществ, необходимых для того, чтобы он вообще
был способен действовать. Некоторые гены активны уже на ран­
них стадиях развития, действие других проявляется лишь на позд­
них стадиях.
Смерть клетки в организме может происходить двумя путя­
ми — некроза и апоптоза. Биологические признаки, а также зна­
чение некроза и апоптоза различны. Некроз (от греч. nekros —
мертвый) — омертвение, гибель клеток и тканей в живом организ­
ме под воздействием болезнетворных факторов. Этот вид гибели
клеток генетически не контролируется. Некроз вызывают слож­
ные факторы: 1) физические (огнестрельное ранение, радиация,
электричество, низкие и высокие температуры — отморожение
и ожог); 2) токсические (кислоты, щелочи, соли тяжелых метал­
лов, ферменты, лекарственные препараты, этиловый спирт и др.);
3) биологические (бактерии, вирусы, простейшие и др.); 4) аллер­
гические (эндо- и экзоантигены, например фибриноидный некроз
при инфекционно-аллергических и аутоиммунных заболеваниях,
феномен Артюса); 5) сосудистый (инфаркт — сосудистый некроз);
6) трофоневротический (пролежни, незаживающие язвы).
В зависимости от механизма действия патогенного фактора
различают прямой некроз, обусловленный непосредственным
действием фактора (травматические, токсические и биологичес­
кие некрозы), и непрямой некроз, возникающий опосредованно
через сосудистую и нервно-эндокринную системы (аллергичес­
кие, сосудистые и трофоневротические некрозы).
Изучены морфологические признаки некроза. В начальном
периоде некробиоза клетка морфологически не изменена. Должно
пройти 1—3 ч, прежде чем появятся изменения, распознаваемые

9

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

при электронной микроскопии или гистохимически, и по крайней
мере 6—8 ч, прежде чем появятся изменения, выявляемые при
световой микроскопии; еще позже развиваются макроскопичес­
кие изменения. Гистохимические изменения обусловлены прито­
ком ионов кальция в клетку, который тесно связан с ее необрати­
мым повреждением и появлением морфологических признаков
некроза. В нормальной клетке внутриклеточная концентрация
кальция составляет приблизительно 0,001 его концентрации во
внеклеточной жидкости. Этот градиент поддерживается мембра­
ной клетки, которая активно транспортирует ионы кальция из
клетки. При повреждении клеток в результате ишемии или под
воздействием различных токсических агентов накопление каль­
ция внутри клеток наблюдается только тогда, когда изменения
необратимы. Кальций активирует эндонуклеазы (гидролиз, рас­
щепление ДНК), фосфолипазы (разрушение мембран) и протеазы
(деструкция, переваривание цитоскелета). Активность окислитель­
но-восстановительных ферментов (например, СДГ) резко сни­
жается или исчезает.
Одним из важных и наглядных морфологический признаков
некроза клетки является изменение структуры ядра. Хроматин
мертвой клетки конденсируется в крупные глыбки. Ядро умень­
шается в объеме, становится сморщенным, плотным, интенсивно
базофильным, т. е. окрашивается в темно-синий цвет гематокси­
лином. Этот процесс назван «кариопикнозом» (сморщивание).
Пикнотическое ядро может затем разрываться на многочисленные
маленькие базофильные частицы (кариорексис) или подвергну­
ться лизису (растворению) в результате действия лизосомной де­
зоксирибонуклеазы (кариолизис). Тогда оно увеличивается в объ­
еме, слабо окрашивается гематоксилином, постепенно исчезают
его контуры. При быстро развивающемся некрозе ядро подвер­
гается лизису без пикнотической стадии.
Приблизительно через 6 ч после того как клетка подверглась
некрозу, ее цитоплазма становится гомогенной и выражено аци­
дофильной, т. е. интенсивно окрашивается кислыми красителями,
например в розовый цвет при окраске эозином. Это — первое из­
менение, выявляемое световой микроскопией, которое возникает
в результате коагуляции цитоплазматических белков и разруше­
ния (исчезновения) рибосом. РНК рибосом придает базофильный
оттенок нормальной цитоплазме. Специализированные органел­
лы клетки, например миофибриллы в миокардиальных клетках,
исчезают в первую очередь. Набухание митохондрий и деструкция
(разрушение) мембран органелл вызывают вакуолизацию цито­

10

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные ...

плазмы. Наконец переваривание клетки ферментами, которые
высвобождаются из собственных лизосом, приводят к лизису
клетки (аутолизу).
Программированная гибель клетки — естественный процесс,
протекающий при нормальной жизнедеятельности многоклеточ­
ного организма. Он регулирует форму и развитие организма по
определенным стадиям жизненного цикла, способствует сохране­
нию порядка и нормального функционирования биологической
системы, очищая от невостребованных, больных, закончивших
свой жизненный цикл или появившихся в результате мутаций по­
тенциально опасных клеток.
Следует отметить, что проблеме гибели клетки учеными уде­
лялось значительно меньше внимания, чем другим этапам жиз­
ненного пути. Вместе с тем первые высказывания о существова­
нии процесса гибели клеток в многоклеточном организме появи­
лись еще в конце XIX в. Однако годом признания апоптоза как
физиологического явления считается 1972 г., когда английские
исследователи L.F. Kerr, A.N. Wylie, A.R. Currie представили убе­
дительные морфологические доказательства существования этого
явления [317]. Термин «апоптоз» (от греч. apoptosis — опадание
листьев) служит для характеристики процесса, противоположного
митозу. Он обозначает совокупность реакций клеточной гибели,
регулируемых внутренней генетической программой. Согласно
биохимическому определению, апоптоз — это активная форма
клеточной смерти, являющаяся результатом реализации ее генети­
ческой программы или ответом на внешние сигналы и требующая
затрат энергии и синтеза макромолекул de novo. С точки зрения
морфологии — это форма гибели клетки, проявляющаяся в умень­
шении ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уп­
лотнении наружной и цитоплазматических мембран без выхода
содержимого клетки в окружающую среду.
Основным сигналом большинства форм апоптоза является на­
рушение регуляции нормального клеточного цикла. Апоптоз —
это такой тип гибели клеток, при котором сама клетка активно
участвует в процессе своей гибели, т. е. происходит ее самоунич­
тожение. Апоптоз, в отличие от некроза, является активным про­
цессом. После воздействия этиологических факторов запускается
генетически запрограммированный каскад реакций, сопровож­
дающийся активацией определенных генов, синтезом белков,
ферментов, приводящих к эффективному и быстрому удалению
клетки из ткани.

11

Г л а в а 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

Можно назвать несколько основных причин апоптоза:
• во время эмбриогенеза апоптоз играет важную роль в разру­
шении различных тканевых зачатков и формировании органов;
• апоптозу подвергаются стареющие клетки, закончившие
цикл своего развития, например исчерпавшие запас цитокинов
лимфоциты;
• в растущих тканях определенная часть дочерних клеток под­
вергается апоптозу; количество погибающих клеток может регули­
роваться системными и местными гормонами;
• причиной апоптоза может быть слабое воздействие повреж­
дающих факторов (гипоксии, ионизирующего излучения, токси­
нов и др.), которые при большей интенсивности могут привести к
некрозу.
Клетка подвергается апоптозу, если в ядре происходит пов­
реждение ДНК, которое не может быть исправлено системой ре­
парации. За этим процессом следит белок, кодируемый геном р53.
При невозможности устранения дефекта ДНК под действием про­
теина р53 активируется программа апоптоза. Многие клетки имеют
рецепторы, воздействие на которые вызывает активацию апопто­
за. Наиболее изучены Fas-рецептор, выявленный на лимфоцитах,
и рецептор к фактору некроза опухолей альфа (TNF-α), обнару­
женный на многих клетках. Эти рецепторы играют большую роль
в удалении аутореактивных лимфоцитов и регуляции постоянства
размера клеточной популяции по типу обратной связи. Апоптоз
клеток активируется при недостатке кислорода в тканях. Причи­
ной его активации может быть действие свободных радикалов, на­
рушение энергетически зависимых процессов репарации ДНК и
др. Апоптозу подвергаются клетки, утратившие связь с межкле­
точным матриксом, базальной мембраной или соседними клетка­
ми. Утрата данного механизма апоптоза в опухолевых клетках
приводит к появлению способности метастазировать. Некоторые
вирусные белки могут активировать апоптоз клеток после самос­
борки вируса в зараженной клетке. Поглощение апоптотических
телец соседними клетками ведет к их заражению вирусом. Вирус
СПИДа также может активировать апоптоз незараженных клеток,
имеющих на поверхности CD4-рецептор.
Для клетки, подвергающейся апоптозу, характерны такие про­
цессы:
1. Сжатие клетки. Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма
уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нор­
мальными, располагаются более компактно. Предполагается, что
форма и объем клетки нарушаются в результате активации в апоп­

12

Глава 1. Апогггоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

тотических клетках трансглютаминазы и цистеиновых протеаз
(каспаз). Первая группа ферментов вызывает образование пере­
крестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к
формированию своеобразной оболочки под клеточной мембра­
ной, подобно ороговевающим клеткам эпителия, а вторая группа
ферментов разрушает белки в цитозоле.
2. Наиболее характерное проявление апоптоза — конденсация
хроматина. ДНК расщепляется эндонуклеазами в местах, связы­
вающих отдельные нуклеосомы, что приводит к образованию боль­
шого количества фрагментов, в них число пар оснований делится
на 180—200, которые затем конденсируются под ядерной мембра­
ной. Ядро может разрываться на два или несколько фрагментов.
3. Формирование апоптотических телец. В апоптотической
клетке формируются глубокие впячивания клеточной мембраны,
что приводит к отшнуровке фрагментов клетки, т. е. формирова­
нию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из
цитоплазмы и плотно расположенных органелл с или без фраг­
ментов ядра.
4. Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляет­
ся окружающими здоровыми клетками как макрофагами, так и
паренхиматозными. Апоптотические тельца быстро разрушаются
в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делят­
ся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки прос­
транство.
При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется
в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптоти­
ческие клетки имеют округлую или овальную форму, интенсивно
эозинофильную цитоплазму с плотными фрагментами ядерного
хроматина. Сжатие клетки и формирование апоптотических телец
происходит быстро и так же быстро они фагоцитируются, распа­
даются или выбрасываются в просвет органа, поэтому на гистоло­
гических препаратах апоптоз обнаруживается в случаях его значи­
тельной выраженности. К тому же в отличие от некроза апоптоз
никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также
затрудняет его гистологическое выявление.
Значение апоптоза трудно переоценить. Он важен в эмбриоге­
незе (включая имплантацию и органогенез). Нарушение гибели
клеток в межпальцевых промежутках может привести к синдакти­
лии, а отсутствие апоптоза избыточного эпителия при слиянии
небных отростков или тканей, окружающих нервную трубку, при­
водит к нарушению слияния тканей с двух сторон, что проявляет­
ся расщеплением твердого неба и дефектом в тканях, ограничи­

13

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

вающих спинномозговой канал (spina bifida), соответственно.
Апоптоз играет важную роль в поддержании постоянства клеточ­
ного состава, особенно в гормончувствительных тканях. Замедле­
ние апоптоза приводит к гиперплазии тканей, ускорение — к ат­
рофии. Установлена значительная роль апоптоза в развитии ряда
патологических состояний организма, таких, как злокачественные
новообразования, синдром приобретенного иммунодефицита, не­
которые нейродегенеративные и аутоиммунные заболевания, ин­
фекционные процессы и др. Во всех опухолевых клетках наблю­
дается нарушение апоптоза. Эта поломка возможна на разных эта­
пах апоптоза, например может происходить мутация гена р53, что
приведет к тому, что мутантный протеин р53 будет накапливаться
в клетке в избыточном количестве, но не вызовет апоптоз, несмот­
ря на дефекты в геноме клетки. В свою очередь, это приведет к
пролиферации клеток с нарушенным геномом, причем с каждым
последующим делением нарушения в ДНК будут накапливать­
ся. Иногда в опухолевых клетках может накапливаться и нор­
мальный, или «дикий», протеин р53, если поломка в механизме
апоптоза происходит на других уровнях. При хронических лим­
фоидных лейкемиях наблюдается накопление продуктов гена
bcl-2, что приводит к патологическому удлинению срока жизни
опухолевых клеток и резистентности их к различным проапоптотическим факторам.
Итак, апоптоз играет важную роль в процессе эмбрионального
и онтогенетического развития. Он наблюдается при различных
морфологических процессах. Его нарушение в эмбриогенезе мо­
жет приводить к внутриутробной гибели плода, врожденным урод­
ствам или различным заболеваниям, в том числе и злокачествен­
ным новообразованиям. Во взрослом организме апоптоз распрос­
транен в различных типах тканей. Он встречается как в медленно
пролиферирующей популяции клеток (гепатоциты, клетки эпите­
лия коры надпочечников), так и в быстро пролиферирующих кле­
точных популяциях. В первом случае он выполняет функцию
гомеостатической регуляции оптимального объема ткани, во вто­
ром роль апоптоза в основном связана с дифференцировкой кле­
ток. При патологических состояниях в результате программиро­
ванной клеточной гибели из организма удаляются клетки, выжи­
вание которых нежелательно для организмов, например мутан­
тные клетки или клетки, зараженные вирусом. В последнем случае
этот процесс имеет важное биологическое значение, поскольку
фрагментация ДНК предупреждает перенос генетического мате­
риала в другие клетки.

14

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

Таким образом, апоптоз — широко распространенный обще­
биологический механизм, ответственный за поддержание пос­
тоянства численности клеток, формирование дефектных клеток и
их выбраковку. Механизмы регуляции апоптоза очень сложны.
Согласно исследованиям последних лет, они практически не из­
менились в процессе эволюции. Это дает основание судить о фун­
даментальной биологической роли апоптоза. Обнаружены 14 ге­
нов (cedl-14), отвечающих за регуляцию программированной ги­
бели клетки в процессе развития С. elegans, два из которых (ced-З и
ced-4) регулировали синтез индукторов апоптоза. Один ген (ced-9)
отвечал за торможение апоптоза и около 6 генов кодировали бел­
ки, участвующие в поглощении апоптозных клеток.
Недавно установлено, что процесс гибели клетки состоит из
четырех отдельных стадий: начальной, эффекторной, стадии дег­
радации и поглощения. Запуск и регуляция начальной фазы пред­
ставляют собой весьма сложный и запутанный механизм. Если
проапоптозные сигналы преобладают над антиапоптозными, то
клетка автоматически переходит в эффекторную стадию, в кото­
рой она погибает. Стадия деградации характеризуется морфологи­
ческими и биохимическими изменениями. Она неуправляема и
необратима. В конечной стадии активированные фагоциты погло­
щают апоптозные тельца. Нарушение регуляции каждой фазы, как
правило, приводит к развитию патологического процесса.
После получения сигнала к апоптозу в клетке происходит два
последовательных события: первое — немедленное, которое раз­
вивается в мембране с участием рецепторов гибели клетки; вто­
рое — в течение нескольких часов, приводящее к ее уничтожению.
Оно заключается в активации каскада внутриклеточных протеаз
(каспаз). Рецепторы гибели клетки расположены на ее поверхнос­
ти и служат сенсорами внеклеточных сигналов к апоптозу. Эти
сигналы подаются рецептор-специфическими лигандами, кото­
рые могут быть сцеплены с мембраной или находиться в раствори­
мой фазе. Рецепторами гибели являются Fas (С95, АРО-1),
TNF-R1 (tumor necrosis factor receptor 1) и соответствующие им
лиганды (Fas-лиганд и TNF-α). TNF-a представляет собой раство­
римый цитокин, активирующий В-лимфоциты и макрофаги в от­
вет на воспаление и инфекцию. После его связывания с TNF-peцепторами происходит то же самое, что и при связывании Fas-R и
Fas-L, с той разницей, что мобилизуется белок TRADD (TNF re­
ceptor-associated death domain). Это, в свою очередь, усиливает
продукцию ядерного фактора транскрипции (NF-κΒ) и активато­
ра плазминогена-1 (АР-1).

15

Глава 1. Апоптоз и криообновлеиие — важнейшие противоположно направленные...

Помимо наиболее изученых Fas- и TNF-рецепторов в настоя­
щее время обнаружен ряд других рецепторов гибели клеток: DR3
(death receptor 3), DR4, 5 и 6. Различные рецепторы гибели клетки
активируют единую для всех тканей систему «казни» клетки—кас­
кад каспаз, что в конечном итоге приводит к деградации клетки.
В настоящее время известно 13 разновидностей каспаз у млеко­
питающих, 11 из которых имеют аналоги у человека. Каспазы могут
быть объединены в несколько групп по их специфичности к суб­
страту и функциям. Первую группу представляют «начальные» фер­
менты (каспазы 8, 9, 10), необходимые для начала и распростране­
ния сигнала клеточной гибели. Вторую группу — каспазы 2, 3, 6 и 7,
являющиеся аналогами CED-3, которые вовлекаются в стремитель­
ный процесс расщепления структурных компонентов и элементов
жизнеобеспечения клетки (например PARP (поли-АДФ-рибозополимераза)), участвующих в регуляции межгенных взаимодействий,
восстановлении ДНК и ядерной мембраны. К этой группе относит­
ся ряд ферментов, участвующих в ДНК-фрагментации. Третья ка­
тегория каспаз (1, 4, 5 и 13), именуемая ICE-подобные, может быть
вовлечена в равной степени и в процесс клеточной смерти, и в про­
цесс воспаления.
Процесс клеточной пролиферации и выживания клеток под­
держивается множеством проонкогенов. Наиболее важные из них
относятся к семейству Вс1-2. Выделяют соединения, способствую­
щие выживанию клетки (Bcl-2, Bcl-xl, Bag-1, Вік) и предраспола­
гающие к ее гибели (Вах, Bak, Bad). Bcl-2 является структурным и
функциональным аналогом CED-9 и кодирует синтез мембран­
но-ассоциированного белка, расположенного на митохондриаль­
ной и перинуклеарной мембранах. Роль этого соединения заклю­
чается в поддержании процессов клеточного выживания и про­
лиферации. Транслокация гена Вс1-2, приводящая к его гипер­
экспрессии, впервые была описана при изучении В-клеточной
лимфомы и, по всей вероятности, связана с неблагоприятным прог­
нозом некоторых форм рака и резистентностью к химиотерапии.
Кроме генетически детерминированных медиаторов апоптоза,
перечисленных выше, клетка может подвергаться действию других
соединений, регулирующих этот процесс, например цитокинов (ин­
терлейкинов (ИЛ) — ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10), циркулирующих в крови
или связанных с биомембранами. Эти соединения способны запус­
кать специфические взаимодействия лиганд—рецептор (Fas-лиганд/Fas, TNF-a/TNF-Rl), определяющие динамику апоптоза.
Следует отметить, что со временем увеличивается доля пато­
логических процессов, основывающихся на усилении апоптоза,

16

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

которое вызвано действием внешних апоптогенных факторов.
Первое место среди них занимает ионизирующая радиация. В свя­
зи с тем что она индуцирует апоптоз преимущественно лимфоид­
ных клеток, эта сторона ее действия проявляется в иммунной не­
достаточности, хотя вызываемые облучением нарушения крове­
творения, по крайней мере частично, обусловлены индукцией
апоптоза клеток-предшественников. Источником апоптогенных
факторов, как неоднократно упоминалось выше, служит также
внешняя среда. Нормальное окружение человека практически не
является источником воздействий, вызывающих апоптоз, однако
такие факторы могут накапливаться во внешней среде при форми­
ровании экологического неблагополучия.
Итак, в основе молекулярных механизмов апоптоза лежит
многоэтапный процесс. Первый этап — прием сигнала, предвест­
ника гибели в виде информации, поступающей в клетку извне или
возникающей в самой клетке. Сигнал воспринимается рецепто­
ром и подвергается анализу. Далее через рецепторы или их сочета­
ния полученный сигнал последовательно передается молеку­
лам-посредникам (мессенджерам) различного порядка и в конеч­
ном итоге достигает ядра, в котором включается программа гибели
клетки путем активации летальных и/или репрессии антилетальных генов. Идентифицированы специфические гены, активирую­
щиеся в связи с апоптозом [40, 77].
В здоровом организме апоптоз является механизмом для под­
держания гомеостаза. Как гипофункция, так и гиперфункция
апоптоза ведут к нарушению гомеостаза. Применительно к клет­
кам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с
протеолитической активацией каскада каспаз — семейства эволю­
ционно-консервативных цистеиновых протеаз, которые специфи­
чески расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты.
На основе структурной гомологии каспазы подразделяются на
подсемейства: а) каспазы-1 (каспазы 1, 4, 5), б) каспазы-2 (каспа­
за 2); в) каспазы-3 (каспазы 3, 6—10). При получении сигнала на
уничтожение клетки (апоптоз) посредством активации на поверх­
ности клетки рецепторов Fas TNRF1 активируется каспаза 8, ко­
торая отщепляет N-концевой фрагмент белка Bid с образованием
усеченного (truncated) белка tBid. Последний перемещается в ми­
тохондрии, связывается с их наружной мембраной с последующим
изменением структуры митохондриальной мембраны, ее пермеабилизацией и выбросом из митохондрий цитохрома с, который
деструктирует клетку [411]. Авторы показали процесс связывания
белка tBid с наружной мембраной митохондрий с использованием

17

Рис. 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие разнонаправленные феноме­
ны в клеточной биологии. Смещение динамического взаимодействия апопто­
за и криообновления в сторону криообновления — основа конкурентоспособ­
ных технологий [70, 74, 76]

18

Глава 1. Апогггоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

метода Монте-Карло в версии Метрополиса. В качестве стартовой
использовали структуру белка tBid (конформацию 1), полученную
средствами ЯМР-спектроскопии. При этом белок был располо­
жен на расстоянии 20Е от бислойной липидной мембраны. Мето­
дом математического моделирования установили взаимодействие
белка tBid с мембраной [31].
В целом картина апоптоза у животных и человека — это про­
цессы, сопряженные с конденсацией хроматина (рис. 1) [364, 365].
Хроматин, который в норме представлен открытыми и конденси­
рованными областями (гетеро- и эухроматин), становится суперконденсированным в форме полумесяца по периферии ядра. В
этот момент начинаются фрагментация ДНК, структурные преоб­
разования нуклеиновых кислот [28], нарушение ДНК-ядерных
белковых связей, разрывы нитей ядерной ДНК и ее фрагментация
[388] с последующим распадом ядра на части. На ранних этапах
апоптоза клетка сморщивается, теряя до 1/3 объема за несколько
минут. Механизм этого явления до сих пор не изучен, но, несом­
ненно, в этот процесс должен вовлекаться транспорт ионов и во­
ды. Особенностью процесса является сморщивание цитоплазма­
тической мембраны, образование складок. Дальнейшая картина
апоптоза — это фрагментация клетки на мембранные везикулы с
внутриклеточным содержимым (апоптозные тельца), фагоцити­
рующиеся макрофагами и клетками-соседями; освобождение ци­
тохрома с из митохондрий с последующим разобщением сопряже­
ния окислительного фосфорилирования и дыхания. Процессы
апоптоза характеризуются переходом фосфатидилсерина из внут­
реннего монослоя плазматической мембраны в ее наружный мо­
нослой [93, 94, 341, 401, 403].
Индукция апоптоза связана с проапоптотическим действием,
которое регулируется белками семейства Вс1-2 (В-клеточные лим­
фоцит-лейкемия проонкогены) [283]. Важная роль в регуляции
апоптоза клеток иммунной системы принадлежит другим цитоки­
нам — интерлейкинам, интерферонам. Было обнаружено, что ин­
терлейкины являются индукторами апоптоза как в здоровых, так и
в онкологических клетках и клеточных линиях. Например, ИЛ-12
индуцирует апоптоз натуральных киллеров, ИЛ-4 и ИЛ-10 — пери­
ферических моноцитов человека, ИЛ-10 — Т-лимфоцитов. Однако
не только роль индукторов апоптоза свойственна интерлейкинам,
не менее выраженный эффект цитокинов наблюдается в предот­
вращении апоптоза. При этом один и тот же Вс1-2 и интерлейкин
может быть как индуктором апоптоза, так и открытого нами ново­
го, противоположно направленного явления — криообновления.

19

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

Пусковой механизм апоптоза — освобождение цитохрома с из
митохондрий с последующим разобщением процессов сопряже­
ния дыхания и фосфорилирования [175, 290]. Цитохром с, вышед­
ший из митохондрий, взаимодействует с цитозольным белком А
paf-Ι, что обеспечивает переход каспазы-3 в каталитически актив­
ную форму [77]. Это ведет к повреждению мембран и гибели клет­
ки. В клетках, подвергшихся индуктору апоптоза, резко снижается
мембранный потенциал (Dy) митохондрий. Падение Dy обуслов­
лено увеличением проницаемости внутренней мембраны мито­
хондрий вследствие образования гигантских пор. Факторы, вызы­
вающие раскрытие пор, весьма многообразны. К ним относятся
прежде всего АФК, каспазы и др. Образование гигантских пор —
не единственный механизм выхода межмембранных белков мито­
хондрий в цитоплазму. Предполагается, что разрыв наружной
мембраны митохондрий может быть вызван гиперполяризацией
внутренней мембраны. Возможен и альтернативный механизм,
без разрыва мембраны, — раскрытие в самой наружной мембране
гигантского белкового канала, способного пропускать цитохром с
и другие белки из межмембранного пространства. Следствием
раскрытия поры является набухание митохондриального матрик­
са, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение
растворимых белков. Среди этих белков — ряд апоптогенных фак­
торов: цитохром с, прокаспазы 2, 3 и 9 и др. Прокаспаза 3 обнару­
живается как в межмембранном объеме митохондрий, так и в ци­
топлазме.
В ряде случаев апоптоз реализуется в результате комбиниро­
ванного действия двух путей — с участием рецепторов плазмати­
ческой мембраны и митохондриального цитохрома с. При чрез­
мерном нарушении генома, когда ДНК уже не поддается репара­
ции, включаются рецепторный и цитохром с-зависимый апоптозные каскады активации каспаз.
Одним из возможных механизмов инициации программы
апоптоза является активация внутриклеточными регуляторными
сигналами специального гена «клеточного самоубийства» р53
(53 кДа), противодействующего репликации поврежденных генов
за счет блокирования перехода клетки из Gj- в S-фазу. В основе
антимитотического эффекта белка р53 лежит индукция синтеза
продуктов генов р21, р15и р16, блокирующих функцию циклинзависимых киназ (edc-белков) — ферментов, ответственных за фос­
форилирование белков, обеспечивающих реализацию митотичес­
кого процесса. Аналогично, человеческий ген Fas состоит из 325
аминокислотных остатков и относится к мембранным белкам пер­

20

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

вого типа, т. е. в его структуру входят внеклеточный, трансмем­
бранный и цитоплазматический домены. Примерно 80 аминокис­
лотных остатков образуют домен смерти (DD), который вовле­
кается в белок-белковое взаимодействие с цитоплазматическими
белками, генерируя сигнал смерти. Ген Fas у человека локализо­
ван в длинном плече хромосомы 10 и состоит из 9 экзогенов.
Апоптоз может включиться в условиях глубокого охлаждения
различных биологических объектов, в частности в паренхимальных и эндотелиальных клетках печени [360]. Авторы связывают
это с образованием свободных радикалов кислородного проис­
хождения в течение фазы отогрева. Как известно, АФК вызывают
свободнорадикальные частицы и молекулы, которые возникают
либо на пути одноэлектронного восстановления кислорода, либо
при его возбуждении, когда он переходит из основного триплет­
ного в синглетное состояние. К АФК относят супероксидный
анион-радикал, перекись водорода и другие пероксиды, а также их
радикальные формы, гидроксильный радикал, озон и ряд других
соединений. АФК обладают высокой реакционной способностью
и легко окисляют различные органические молекулы. Свободно­
радикальные формы АФК способны также инициировать цепные
реакции. Поэтому при появлении даже небольшого количества
свободных радикалов в среде, содержащей биоорганические моле­
кулы, повреждениями может быть затронута значительная часть
последних.
Накопление АФК связывают с процессами старения клеток.
Их сущность, как уже упоминалось, состоит в повышении с воз­
растом в организме человека концентрации АФК. Прежде всего
они вызывают гибель нейронов — клеток головного мозга. Элек­
троны в молекуле кислорода вследствие различных причин могут
перегруппироваться так, что превращают кислород в весьма агрес­
сивное соединение, вызывающее разрушение поверхности нейро­
нов и их компонентов. В первую очередь АФК повреждают липи­
ды поверхностной мембраны клетки, вызывают их окисление,
разрывы, изменение структуры, обезвоживание, что приводит к
образованию брешей в мембране и гибели клетки.
В настоящее время в медицинской биофизике изучены клю­
чевые аспекты нового научного направления, ассоциированные с
возникновением и развитием митохондриальных болезней [172].
В случае митохондриальных болезней клетки, как правило, подвер­
гаются сильному окислительному дисбалансу вследствие струк­
турно-функциональных нарушений в мембранах митохондрий.
Митохондриальные расстройства связаны с процессами старения.

21

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

Важную роль в возникновении митохондриальных болезней
играют процессы нарушения функционирования генома. Пос­
тоянно увеличивается число мутаций ядерных генов и митохон­
дриальной ДНК, непосредственно связанных с развитием таких
болезней.
В период открытия явления программированной гибели клет­
ки мы обсудили данные, касающиеся стимулирующего действия
цитохрома с на размороженные гемопоэтические клетки [149].
Это навело нас на мысль, что у многоклеточных организмов (жи­
вотных, растений и грибов) генетически заложена программа жиз­
ни охлажденной и криоконсервированной клетки, которую мы
назвали «криообновление». Две разнонаправленные программы
находятся в динамическом взаимодействии. Здоровье и долголе­
тие человека определяют смещение этих программ в сторону
криообновления.
На этапе активации каспаз жизнь клетки еще можно сохра­
нить. Существуют регуляторы, блокирующие разрушительное
действие каспаз, что является прерогативой процессов криооб­
новления. К ним относятся белки Вс1-2 (ингибиторы апоптоза: А1,
Bcl-2, Bcl-W, Bcl-XL, Brag-1, Mcl-1 и NR13) и Вах (промоторы
апоптоза: Bad, Bak, Вах, Bcl-XS, Bid, Вік, Віт, Нгк, Mtd). Эти бел­
ки эволюционно консервативны: гомолог Вс1-2 обнаружен даже у
губок Geodia cydomium и Suberites domuncula.
Термин «криообновление» (благоприятные изменения охлаж­
денных и криоконсервированных биологических объектов), вве­
денный нами в 1989 г., обозначает совокупность реакций, активи­
рующих жизнедеятельность клетки, с последующим переводом ее
на более высокий уровень гомеостаза.
Под термином «обновление» (от латинского novus — обнов­
лять), согласно классической терминологии, понимается распрос­
траненное исключительно в природе состояние физиологической
активации жизненно важных процессов, проявляющееся в резуль­
тате самоизменения биологического объекта. Стать «обновлен­
ным» означает: 1) приобрести другой характер; 2) приобрести дру­
гой вид; 3) стать новым по составу, пополниться включением,
внесением чего-то нового в результате каких-либо перемен, изме­
нений, преобразований.
Впервые в мировой практике нами изучены основные меха­
низмы процессов обновления (рис. 1). К ним относятся:
• экспрессия генов, контролирующих жизнеспособность
клетки;

22

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

• экспрессия антиапоптотических генов, под контролем кото­
рых находятся процессы, подавляющие апоптотические реакции;
• индукция антиапоптотических белков и антиоксидантов,
способных тормозить апоптотические реакции;
• вхождение цитохрома с в митохондриальный матрикс; попа­
дая в митохондриальный матрикс, он блокирует процессы актива­
ции каспаз, направленные на уничтожение клеток;
• активная деятельность процессов эмбриофеталоплацентарного комплекса и кордовой крови, цитокинов — интерлейкинов,
интерферонов, гормонов и др., блокирующих апоптоз.
При истощении почв в Украине и дефиците важнейших пита­
тельных элементов даже в наиболее «витаминных» продуктах —
фруктах, ягодах, овощах, рыбе, мясных и кисломолочных продук­
тах — практически единственным способом восполнить критичес­
кий дефицит важнейших компонентов рациона является исполь­
зование биологически активных добавок (БАД) к пище, активизи­
рующих реакции обновления.
Анализ успешного решения проблемы оздоровления населе­
ния в странах Западной Европы, США, Канады, Японии и других
государствах показывает, что состояние здоровья населения мо­
жет быть значительно улучшено не только реализацией дорого­
стоящих программ восстановления экологически здоровой среды
обитания, но и внедрением принципов научно обоснованного пи­
тания. Это позволяет через рационально подобранные пищевые
продукты и обогащающие их состав БАД к пище насытить орга­
низм жизненно важными компонентами.
Такой подход обеспечит мощную поддержку системам стаби­
лизации гомеостаза организма в его конфликте с внутренними и
внешними агрессивными болезнетворными факторами, а также
значительное снижение заболеваемости и смертности от систем­
ных сердечно-сосудистых заболеваний, злокачественных новооб­
разований, диабета, вирусных и бактериальных инфекций, других
опасных болезней.
В Украине системные продукты здоровья появились около
10 лет назад. В последние годы их ассортимент значительно рас­
ширился за счет продуктов как отечественного, так и зарубежного
производства. Активные компоненты таких добавок к пище — ви­
тамины, минеральные вещества, аминокислоты, растительные эк­
стракты, гликозиды, биофлавоноиды — нормализуют и стабили­
зируют важнейшие механизмы обмена веществ на основе взаимно
усиливающего (синергического) действия этих элементов в биоло­
гических комплексах.

23

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

Биоактивные комплексы не являются фармацевтическими ле­
чебными препаратами, однако они способны эффективно очищать
организм от внешних ядов, токсических метаболитов самого орга­
низма, обладают антиоксидантным действием, связывают свобод­
ные радикалы и предохраняют ткани от их повреждающего дей­
ствия. БАД к пище способны восстанавливать и нормализовывать
поврежденные звенья обменных процессов, создавая благоприят­
ные условия для регенерации клеток, восстановления их функ­
циональной активности. Это особенно важно для иммунной сис­
темы, реабилитация которой обеспечивает снижение онкологи­
ческого риска, повышение устойчивости к многочисленным иммунозависимым заболеваниям (ревматизму, диабету, псориазу,
хроническому бронхиту, бронхиальной астме и др.). Опыт много­
летнего и массового применения БАД десятками миллионов боль­
ных и здоровых людей в развитых странах показывает, что их сис­
тематическое использование способно обеспечить такой уровень
здоровья человека в современном обществе, который позволяет
ему не болеть в условиях постоянного воздействия бесчисленных
агрессивных факторов внешней и внутренней среды.
Руководствуясь принципами доказательной медицины можно
заключить, что в основе здоровья и долголетия лежит смещение
динамического взаимодействия двух разнонаправленных процес­
сов — апоптоза и обновления в сторону обновления. В общебио­
логическом плане ярким проявлением динамического взаимодей­
ствия апоптоза и обновления служит способность проапоптотических белков при определенных условиях переходить в антиапоптотические. Важная роль в регуляции процессов апоптоза и
обновления принадлежит цитокинам — интерлейкинам и интер­
феронам. Обнаружено, что они являются индукторами апоптоза и
в здоровых, и в опухолевых клетках и клеточных линиях. Напри­
мер, ИЛ-12 индуцирует апоптоз натуральных киллеров, ИЛ-4 и
ИЛ-10 — периферических моноцитов человека, ИЛ-10 — Т-лим­
фоцитов. Вместе с тем не менее выраженный эффект цитокинов
наблюдается в предотвращении апоптоза. При этом один и тот же
ИЛ может быть как индуктором апоптоза, так и его ингибитором в
зависимости от того, какая программа превалирует, — гибели ли­
бо жизни.
Аналогично молекулы класса Вс1-2 неоднозначно влияют на
апоптоз, т. е. являются либо анти-, либо проапоптозными, в зави­
симости от того, какая программа во взаимодействии апоптоз —
обновление превалирует. Изучены некоторые механизмы этого
явления. Степень влияния Вс1-2 на апоптотический процесс зави­

24

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

сит, во-первых, от комплексирования с другими молекулами этого
класса, во-вторых, от исходной локализации молекулы (на мито­
хондрии либо в цитозоле), в-третьих, от наличия в ее структуре
комплексов Bax/Bcl-2, Bax/Bcl-XL, Bax/Mck-1. Bak/Bax являются
проапоптозными, а комплекс Bad/Bcl-2/Bcl-XL прерывает Вахапоптоз. Большую роль играет, например, включенная в комплекс
фосфатаза, которая приводит к дефосфорилированию белка Bad,
обеспечивая этим его проапоптозную активность. Комплекс с бел­
ком 14-3-3 предотвращает возможность дефосфорилирования,
чем способствует ликвидированию проапоптозной активности.
Данные, полученные после криоконсервирования биологи­
ческих объектов, обсуждаются согласно приведенной выше тер­
минологии обновления и криообновления. Процессы криообнов­
ления регулируются генетической программой, которая запус­
кается внутриклеточными физиологическими факторами. Крио­
обновление альтернативно процессам криорезистентности.
Недавно представлены обзорные работы по функциональной
и пространственной организации генов холодовой адаптации
(ГХА) в геноме млекопитающих [210] и человека [320]. Описана
их локализация. Исследована структура области холодового шока
(CSD) VB-1, которая ответственна за ДНК-связанные свойства
белков. Выявлены индуцируемые ими белки холодового шока
(БХШ), в частности в лимфоцитах человека [250]. Те и другие рас­
полагаются неслучайно в геноме человека. Анализ экспрессии ге­
нов подтверждает увеличение экспрессии цикл-ассоциированных
клеточных генов и Gq-протеин-протеинкиназы С, сигнализирую­
щих в охлажденных узелках щитовидной железы [293]. Выявлена
интенсификация пролиферации клеток криоконсервированной
щитовидной железы.
Показана экспрессия генов холодового шока (ГХШ) (VEGF) в
области Y-box, играющих важную регуляторную роль в увеличе­
нии пролиферации эндотелиальных сосудистых клеток [269].
Снижение температуры в клетках Е. coli и В. substilis индуцирует
синтез основных БХШ—CS7.4 и CspB, соответственно [370].
CS7.4 является транскрипционным активатором генов. Описаны
особенности гена CspA, индуцирующего высокий выход белковой
продукции в Е. coli [359]. Сверхэкспрессия белков в Е. coli при
низкой температуре улучшает их растворимость и устойчивость.
Выявлены области эукариотических генов-регуляторов, которые
сохранены от бактерий до человека.
Обнаружены БХШ Р14 и Р20 кДа, предохраняющие мембраны
в спермиях баранов от повреждения [258]. Защитный эффект, по

25

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

мнению авторов, обусловлен их декапацитационной ролью. Дру­
гие авторы предполагают механизмы генной регуляции адаптиро­
ванных к холоду рыб Т. bemacchii [262]. Описан эффект экспрес­
сии гена Вах и антиапоптотических белков Вс1-2 в сперматогенных стволовых клетках и их локализация на внутренней митохон­
дриальной мембране [386].
Картина криообновления у человека и животных — это декон­
денсация (разрыхление) хроматина без нарушения ДНК-ядерных
связей [27, 62, 266]; экспрессия ГХА и антиапоптотических генов;
индукция БХШ [274] и антиапоптотических белков; увеличение
размера клеток в пределах допустимых физиологических колеба­
ний; вхождение цитохрома с в клетку с последующим восстанов­
лением процессов сопряжения дыхания и фосфорилирования [70,
284]; активация генов, под контролем которых находятся цито­
хром с и НАД · Н, участвующий в его транспортной функции че­
рез наружную митохондриальную мембрану [384]; повышение
концентрации цитохромов в митохондриях и гомогенатах [143];
формирование новых взаимоотношений цитохрома с с митохон­
дриальными мембранами [330]; появление митохондрий с новыми
свойствами, более устойчивых к повреждающим факторам. Под­
робнее эти и другие данные представлены в обзорных работах
[62, 63, 70].
Важное значение в запуске процессов криообновления при­
надлежит антиоксидантам. В биологических системах антиокси­
дантами называются вещества, способные ингибировать процессы
свободнорадикального окисления. Для живых клеток наибольшую
опасность представляет цепное окисление полиненасыщенных
жирных кислот, или пероксидное окисление липидов (ПОЛ). В
реакциях ПОЛ образуется большое количество липидных гидро­
пероксидов, которые обладают высокой реакционной способнос­
тью и оказывают мощное повреждающее действие на клетку.
В последнее время свободные радикалы и реакции с их учас­
тием считаются причиной возникновения старения, онкозаболе­
ваний, астмы, диабета, катаракты и многих других. Защита орга­
низма от любого рода заболеваний — основная задача антиокси­
дантной системы. Антиоксиданты предотвращают ПОЛ и не дают
свободным радикалам накапливаться в организме. Однако естест­
венная антиоксидантная система организма часто оказывается
перегруженной от чрезмерного образования свободных радика­
лов. Это состояние называется окислительным стрессом, кото­
рый обусловлен чрезвычайной продукцией АФК. Окислительный
стресс на клеточном уровне — результат многих факторов, вклю­

26

Глава 1. Апоптоз и ікриообновление — важнейшие противоположно направленные...

Рис. 2. Криообновление — универсальный феномен в биологии и медицине
[70, 74, 76]

чая экспозицию в спирте, действие медикаментов, холода, токси­
нов или радиации. Например, такие антиоксиданты, как глютатионпероксидаза 1, гемоксидаза 2 защищают от увеличения АФК
миокарда больных мерцательной аритмией [319]. Показана экс­
прессия гена как результат оксидативного стресса.
Годом признания феномена криообновления считается 1989 г.,
когда были представлены убедительные морфофункциональные
данные этого явления [62, 154 — глава «Криоконсервированные
клетки костного мозга и крови — качественно новая популяция»].
Недавно концепция криообновления получила дальнейшее разви­
тие в работах В.И. Грищенко, Э.И. Алексеевской [10, 71, 73, 74,
76, 304], а также в их совместных работах с российскими учены­
ми [66].
Примечательно, что концепция криообновления базируется
на реакциях обновления. Механизмы процессов обновления уси­
ливают механизмы криообновления, так как несмотря на некото­
рые их различия, они являются однонаправленными (рис. 2).
Открыты антиапоптотические гены и индуцируемые ими антиапоптотические белки. Антиапоптотические белки «запускают»
процессы обновления. Запуск программы криообновления обес­
печивает деконденсация хроматина, которая коррелирует с повы­
шением фертильности спермиев. Деконденсированный хроматин
ведет к экспрессии ГХА, индукции БХШ, экспрессии антиапопто-

27

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

тических белков, активизирующих программу обновления. Пос­
ледние тормозят выход цитохрома с из митохондриального мат­
рикса либо ингибируют вышедший и, таким образом, подавляют
апоптоз; блокируют активацию каспаз. С позиции концепции
криообновления в основе здоровья и долголетия лежит смещение
динамического взаимодействия двух разнонаправленных процес­
сов — апоптоза и криообновления в сторону криообновления.
Благоприятную направленность этого взаимодействия определяет
цитохром с в качестве ведущего механизма апоптоза и криообнов­
ления. Поэтому несомненный интерес представляет выяснение
его роли в механизме криообновления, что наиболее полно изло­
жено в обзорной статье [72].

1.1. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ
МЕМБРАННОГО ТРАНСПОРТА БЕЛКОВ: ПЕРЕНОС ЦИТОХРОМА c
ЧЕРЕЗ МИТОХОНДРИАЛЬНЫЕ МЕМБРАНЫ
И ЕГО РОЛЬ В МЕХАНИЗМЕ КРИООБНОВЛЕНИЯ
Одним из путей повышения жизнеспособности клеток является
восстановление их энергетического баланса за счет активации раз­
личных элементов дыхательной цепи. Особого внимания заслужи­
вают работы по восстановлению и активации биоэнергетических
процессов с помощью цитохрома с в связи с той ролью, которую
он играет в цепи биологического окисления и в механизмах об­
новления. Известно, что цитохромы в организме выполняют роль
ферментов, катализирующих реакции окисления—восстановле­
ния и служат переносчиками электронов. Из всех цитохромов ци­
тохром с единственный, полученный в кристаллическом виде. Он
выделен из сердечной мышцы и дрожжей. Это гемопротеид с мо­
лекулярной массой 13 кДа, который содержит по крайней мере
4—5 фракций. Цитохром с имеется у всех организмов, обладаю­
щих митохондриальными дыхательными цепями, — растений,
животных, микроорганизмов. Он появился более 1,5 млрд лет на­
зад. В течение всего этого периода его функция не изменилась. Об
этом свидетельствует ряд факторов:
1. Цитохром с любого вида эукариот реагирует in vitro с цитохромоксидазой (ЦХО) любого другого исследуемого к настоящему
времени вида. Цитохром с, например, из зародышей пшеницы
реагирует с ЦХО из ткани человека.
2. Близость значения окислительно-восстановительного по­
тенциала для всех молекул цитохрома с (около +0,25 В).

28

1.1. Возможные механизмы мембранного транспорта белков ...

3. Идентичность спектров поглощения молекул цитохрома с
различных видов.
Молекулы цитохрома с животных, растений и микроорганиз­
мов состоят из одной полипептидной цепи, содержащей 104 ами­
нокислотных остатка. В цитохромах всех этих видов 35 аминокис­
лотных остатков абсолютно не изменяются. Молекулы цитохрома
с лошади и дрожжей различаются между собой по 48 аминокис­
лотным остаткам, утки и курицы — только по двум остаткам, ку­
рицы, индейки, свиньи, коровы и овцы — идентичны. Многие ге­
номы млекопитающих, в том числе человека, содержат 20—30
нуклеотидных последовательностей, родственных гену цитохрома
с крысы [261].
В 1963 г. Р. Boech применил цитохром с при отравлении снот­
ворным (фенодормом). После первой инъекции у пациента, нахо­
дящегося в течение 59 ч в коматозном состоянии, прояснилось
сознание, после третьей — наступило выздоровление. Позднее
ученые установили, что этот препарат повышает энергетическую
мощность клетки, улучшает использование кислорода и повышает
устойчивость организма к травме. Руководствуясь принципами
механизмов обновления, можно предположить, что в клетках ор­
ганизма пациента фенодорм индуцирует процессы апоптоза. При­
менение цитохрома с, ведущего механизма обновления, позволи­
ло сдвинуть динамическое взаимодействие двух разнонаправлен­
ных процессов — апоптоза и обновления в сторону обновления. В
результате после трех инъекций апоптотические процессы были
подавлены и наступило выздоровление.
Согласно нашим данным, основной механизм криоповрежде­
ния ядерных клеток костного мозга и крови — потеря ими цито­
хрома с с последующим снижением интенсивности биоэнергети­
ческих реакций [149]. Через 10 лет другие авторы также пришли
к выводу о ведущей роли выхода цитохрома с из митохондрий в
уменьшении дыхательной активности дрожжей [343] и гепатоци­
тов крыс [355]. Известно, что недостаток цитохрома с в организме
вызывает ряд различных заболеваний сердечно-сосудистой систе­
мы, развитие инфаркта миокарда, опухолевых новообразований,
ишемической, гипоксической, геморрагической и постлучевой
патологий организма — основных причин сокращения продол­
жительности жизни и смертности людей.
Российские ученые изучили механизм лечебного действия ци­
тохрома с, который, как упоминалось выше, запускает процессы
обновления. Дефицит цитохрома с вызывали обработкой предва­
рительно выделенных митохондрий раствором КС1 либо подкож­

29

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

ным введением его крысам [190]. В обоих случаях в дифференци­
альных спектрах митохондрий были обнаружены однотипные из­
менения — снижение интенсивности полос поглощения в диапа­
зоне волн, специфичных для цитохрома с (520 и 550 нм). Интен­
сивность полос поглощения, характеризующих цитохромы a, a1, b,
оставались без изменений. Расчет концентраций цитохромов по
дифференциальным спектрам с помощью системы линейных
уравнений показал, что обработка интактных митохондрий рас­
твором КС1 и острая интоксикация крыс CC14 сопровождалась
снижением концентрации цитохрома с в митохондриях печени на
40 и 35 % соответственно. Потеря митохондриями цитохрома с
повлекла за собой уменьшение фосфорилирующей способности и
нарушение сопряженности процессов дыхания и фосфорилирова­
ния. Степень эстерификации неорганического фосфата митохон­
дрий после обработки их КС1 и при интоксикации крыс CC14 сни­
жалась на 75 и 70 % соответственно. Результаты высокочастотной
электроскопии митохондрий в диапазоне 1—6 МГц свидетель­
ствовали о том, что острая интоксикация организма и обработка
митохондрий раствором CC14 сопровождается исчезновением ре­
зонансных зон, характерных для цитохрома с. Сделано заключе­
ние, что дефицит цитохрома с в митохондриях печени, независи­
мо от его причин, приводит к нарушению биоэнергетических про­
цессов в печени.
Инкубирование цитохром с-дефицитных митохондрий с ци­
тохромом с и парентеральное введение его крысам с острым ток­
сическим гепатитом сопровождалось повышением интенсивности
процессов окислительного фосфорилирования и увеличением
коэффициента P/О. Изучение дифференциальных спектров пока­
зало, что и в том, и в другом случае увеличиваются полосы пог­
лощения в диапазоне волн, специфичных для цитохрома с. При
расчете концентраций цитохромов обнаружено достоверное по­
вышение содержания цитохрома с и суммы цитохромов с + c1 в ци­
тохром с-дефицитных митохондриях печени. Результаты высоко­
частотной спектроскопии свидетельствовали о том, что инкуби­
рование цитохром с-дефицитных митохондрий с цитохромом с
и его парентеральное введение крысам при интоксикации CC14
приводит к восстановлению на кривой дисперсии высокоча­
стотной электропроводности митохондриальных зон, характерных
для цитохрома с.
Аналогичные исследования были проведены на кроликах.
Установлено, что хронический токсический гепатит сопровож­
дается глубокими нарушениями процессов окислительного фос­

30

1.1. Возможные механизмы мембранного транспорта белков ...

формирования, снижением концентрации цитохромов с + c∣ и а +
+αl в митохондриях печени и повышением активности трансфераз
в крови. Парентеральное введение кроликам цитохрома с приво­
дило к нормализации процессов окислительного фосфорилиро­
вания, повышению концентрации с + c1 и a + ai, снижению ак­
тивности трансфераз, менее выраженным явлениям жировой ин­
фильтрации гепатоцитов и белковой дистрофии. Аналогично в
результате лечения животных с постгеморрагической гипоксией
цитохромом с происходила активная стимуляция процессов ткане­
вого дыхания [115]. Митохондрии отличались высоким дыхатель­
ным контролем. Достоверно возрастали скорость фосфорилирова­
ния и коэффициент АДФ/О. Все показатели окислительного фос­
форилирования достигали уровня нормы, а в отдельных опытах
превышали его.
Изучение цитохромной системы митохондрий печени кроли­
ков при геморрагическом шоке методом субстратного восстановле­
ния позволило авторам регистрировать цитохром с, встроившийся
в сопрягающую мембрану. Более прочное встраивание цитохрома с
наблюдали в случае его комплексирования с фосфолипидами, в
частности с α-токоферолом, что подтверждают данные полярогра­
фического исследования ДНФ-стимулирующего дыхания (показа­
тель дыхательного коэффициента ДНФ возрос до 6,4 против 5,4 в
группе животных, леченных только цитохромом с).
Таким образом, лечебный эффект цитохрома с связан с его
способностью проникать в клетки и взаимодействовать с мито­
хондриальными мембранами.
В 80—90-х годах прошлого столетия ученые выяснили специ­
фику передвижения цитохрома с через наружную и внутреннюю
митохондриальные мембраны. Известно, что в клеточных мембра­
нах есть системы переноса, способные ускорять прохождение
биологически важных растворенных веществ. Одна из особеннос­
тей цитохрома с состоит в легкой растворимости в воде. Системы
переноса обладают субстратной специфичностью, высоким срод­
ством, детерминированы генетически и подвержены ингибирова­
нию. Какова бы ни была природа переносчиков, сам факт их ло­
кализации в мембране не вызывает сомнения. Транспортируемые
молекулы белка имеют разные названия: транспортные системы,
переносчики, носители, транслоказы.
Механизмы вхождения цитохрома с в митохондрии интенсив­
но изучены в низших эукариотических клетках. Установлено, что
N-концевая часть добавлений функционирует как сигнал к им­
порту, и в процессе импорта происходит отщепление. Исследова­

31

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные...

ны кодирующие факторы, вовлеченные в митохондриальный им­
порт цитохрома с, например Сус-2 дрожжей [287].
Импорт цитохрома с через наружную митохондриальную мем­
брану обеспечивает белковый предшественник апоцитохром с, за­
меняющий рецепторную функцию. Он идет сравнительно простым
путем через наружную митохондриальную мембрану в интермем­
бранное пространство, вовлекая фермент цитохром-с-гемолиазу
[285, 350, 351]. Передвижение апоцитохрома с стимулируется в
присутствии 1%-го фенетилового спирта, который расстраивает
кислотные цепные участки бислоя и промоторов переноса мито­
хондриальных предшественников [315]. Импорт цитохрома с через
наружную мембрану зависит прежде всего от присутствия НАД · Н
и коферментов ФАД или ФМН [285, 351]. НАД · Н вместе с флавиннуклеотидами восстанавливает гем. В восстановленном состоя­
нии гему необходима его ковалентная привязанность к апоцито­
хрому с. Эту функцию выполняет коэнзим цитохром-с-гемолиаза
для последующего передвижения цитохрома с через наружную ми­
тохондриальную мембрану в процессе импорта.
Цитохром с активно участвует в транспортных процессах через
внутреннюю мембрану митохондрий [190]. Окисленная (ферри) и
восстановленная (ферро) формы цитохрома с способны избиратель­
но связывать различные катионы и анионы, АТФ и АДФ и регу­
лировать их транспорт в митохондриях. Ионнотранспортная фун­
кция цитохрома с имеет большое значение для поддержания фи­
зиологического — электрохимического потенциала, сопрягающей
мембраны и связанного с ним процесса образования АТФ. Поэто­
му второй процесс импорта цитохрома с осуществляется при усло­
вии «энергизованного» состояния внутренней сопрягающей мем­
браны, т. е. способности ее к энергетическому сопряжению. Сог­
ласно Mitchel (1961), дыхание и фосфорилирование связаны меж­
ду собой через электрохимический потенциал ионов водорода на
митоходриальной мембране. Сопряжение окисления и фосфори­
лирования осуществляется протонным градиентом. При переносе
электронов по дыхательной цепи на внутренней митохондриаль­
ной мембране генерируются протонный градиент и мембранный
потенциал. Недавно изучена двигательная динамика цитохрома с,
доставленного вовнутрь интермембранного пространства интакт­
ных митохондрий по механизму низкой pH-диффузии (протонзависимый транспорт [271]).
Несколько иначе вводится цитохром c1 в наружную митохон­
дриальную мембрану. Предшественник цитохрома cl после синте­
за в цитозоле специфически связывается различными участками

32

1.1. Возможные механизмы мембранного транспорта белков ...

рецепторов на митохондриальной поверхности. Последующая
вставка на наружной мембране осуществляется общим вставоч­
ным белком (GIP-медиатором) через транслокационные контакт­
ные участки в матриксе мембранозависимым способом. Отличие в
механизме, которым цитохромы с и c1 импортируются в интер­
мембранное пространство, отражается в расхождении их путей в
течение эволюции митохондрий. Возможно, главный фактор, спо­
собствующий их расхождению, — это различие в свойстве их мем­
бранной вставки.
Известна способность гибридного белка pScl-c, содержащего
двойную информацию (цитохром с + цитохром c1), импортировать­
ся таким же образом, как и цитохром с, и затем вновь возвращать­
ся в митохондриальный матрикс путем, зависимым от мембранно­
го потенциала по типу «tug-of-war» (буксирной) реакции [385].
Предполагают, что гидрофобная часть последовательностей ци­
тохрома с может служить вторичным сигналом полипептиду еще
раз импортироваться в матрикс и обратно через внутреннюю мем­
брану [296, 307].
Итак, системы транспорта цитохромов, вероятно, состоят из
двух молекулярных компонентов: специфических белков-пере­
носчиков, которые могут узнавать и связывать аминопептиды, тем
самым облегчая их движение через мембраны, и систем, обеспе­
чивающих передачу энергии молекуле-переносчику, благодаря че­
му она становится способной переносить их через митохондри­
альные мембраны.
Существуют генетически детерминированные молекулярные
механизмы доставки цитохрома с, добавленного извне, в места его
локализации. Способность фермента, проникая в клетку, восста­
навливать функциональную активность митохондриальных мем­
бран обусловливает лечебное действие цитохрома с при многих
патологических состояниях, сопровождающихся нарушением окис­
лительно-восстановительных процессов в тканях.
Какова же роль цитохрома с в механизме криообновления?
Ранее подобные вопросы были отражены на страницах книги
[151], атласа [154] и ряда статей [62, 63, 149, 155]. Однако отсут­
ствие единого взгляда криобиологов на возможность проникнове­
ния цитохрома с в митохондриальные мембраны в течение дли­
тельного времени значительно затруднило обоснование его роли в
механизме криообновления. С 1977 г. ученые ИПКиК НАН Украи­
ны придерживаются мнения, что цитохром с не способен прони­
кать через митохондриальные мембраны [26, 355]. Выход его из
поврежденных холодом мембран митохондрий расценивается как

33

Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные ...

фактор, индуцирующий процессы ПОЛ. До настоящего времени
новое направление не было предметом широкой дискуссии. Лишь
в последние годы, благодаря открытию ГХА, антифризных поли­
пептидов, БХШ и de novo — основных «китов», на которые опи­
рается концепция криообновления, появилась реальная возмож­
ность вернуться к обсуждению роли цитохрома с в механизме
криообновления.
Разногласия легко устранимы при рассмотрении двух важней­
ших феноменов в клеточной биологии — апоптоза и противовеса
ему — криообновления. Выход из поврежденных митохондрий
цитохрома с, взаимодействующего с цитозольным белком A paf-l,
обеспечивает переход каспазы 3 (остатка аспарагиновой кислоты)
в каталитически активную форму [77], что служит одним из пуско­
вых механизмов процесса апоптоза. Недавно на клетках яичника
китайского хомячка показано, что проникающая способность ми­
тохондрий играет важную роль в регуляции освобождения мито­
хондриального цитохрома с [358]. Это может быть наиболее су­
щественным моментом на пути апоптоза, который приводит к
смерти клетки.
Концепция криообновления опирается на многочисленные
результаты подобных работ, проведенных в медицинской практи­
ке с позиции процессов обновления. Способность цитохрома с
встраиваться в митохондриальные мембраны и снижать интенсив­
ность процессов ПОЛ — один из механизмов его лечебного дей­
ствия [115, 134, 144, 148, 190]. Роль цитохрома с в процессе
криообновления наиболее существенна. Его благоприятный эф­
фект обусловлен действием низких температур, которые: регули­
руют гены, под контролем которых находятся цитохром с и НАД · Н,
участвующий в его транспортной функции через наружную мито­
хондриальную мембрану [384]; повышают концентрацию цитох­
ромов [143]; усиливают митохондриогенез; лабилизируют клеточ­
ные мембраны [151]; увеличивают проницаемость гематоэнцефа­
лического барьера [16—18], облегчая тем самым прохождение мо­
лекулы цитохрома с, являющегося индуктором пиноцитоза [183],
через эти барьеры; изменяют структуру митохондрий, что обеспе­
чивает наиболее благоприятное взаимодействие с ними цитохрома
с [330].
В целом цитохром с, непосредственно включаясь во внешнюю
и внутреннюю митохондриальные мембраны и взаимодействуя с
ними, несомненно, играет ведущую роль в механизмах обновле­
ния и криообновления.

ГЛАВА 2

Криообновление —
принципиально новое направление
в биологии и медицине

С помощью низких температур и криоконсервирова­
ния можно сохранить биологические объекты в жизнеспособном
состоянии. Однако в последние годы в связи с возрастанием эко­
логических, радиационных и других опасностей их исходный уро­
вень не может быть эталоном качества. Проблема выживания че­
ловека потребовала развития принципиально нового направления
в биологии и медицине — криобиологии обновления, изучающей
механизмы необратимых благоприятных изменений охлажденных
и криоконсервированных биологических структур и функций.
Идею качественного обновления криоконсервированных био­
логических объектов горячо поддерживали и защищали д-р мед.
наук, проф. Е.Я. Панков, д-р биол. наук В.Д. Мануильский и
чл.-кор. АН УССР А.М. Утевский, которые безгранично верили в
перспективность этого научного направления. Своими работами
они проложили путь к завершению поистине величайшего от­
крытия современности, сравнимого лишь с апоптозом, — криооб­
новления. Не остались в стороне от этого направления ученые
ближнего и дальнего зарубежья. Независимые эксперты высказа­
ли свое мнение относительно концепции криообновления. Акаде­
мик РАЕН Н.Н. Ротт (Москва) считает, что полученные авторами
данные представляют собой новое явление в криобиологии. Они
могут быть использованы в медицине и сельском хозяйстве для
снижения мутагенного действия криоконсервирования. В.И. Ва­
щенко (С.-Петербург, НИЛ Центра крови и тканей ВМА им.
С.М. Кирова, Россия) подчеркнул новизну и важность открытого
особого состояния биологических объектов, приобретенных ими в
процессе криоконсервирования. Изучая состояние ссДНК «нук­
леоидов» клеток костного мозга, он обнаружил деконденсирую­
щее свойство криоконсервирования — ведущего механизма про­
цессов криообновления. Деконденсация, как известно, вызывает

35

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

включение в работу конститутивных генов и открывает возмож­
ность реализации механизмов оперонной регуляции, что лежит в
основе программированной жизни клетки. Е. Siebzexnrubl (Эрланген-Нюрнберг, Женская клиника акушерской школы, Германия)
считает, что криоконсервация оплодотворенных яйцеклеток чело­
века повышает вероятность беременности в циклах оплодотворе­
ния in vitro и при пересадке зародышей.
E.J. Kendal (Институт биотехнологии растений, Канада) раз­
витие морозоустойчивости растений яровой пшеницы связывает с
индукцией 8 уникальных полипептидов и более высоким уровнем
сахарозы. Эти результаты — экспериментальное подтверждение
жизненности механизмов криообновления. T.D. Beacham (Тихо­
океанская биологическая станция, Канада) с помощью 17 фер­
ментных систем, кодируемых 23 локусами, установил, что выжи­
ваемость эмбрионов и молоди горбуши мужских и женских линий
и их развитие при низких температурах (4 и 15 °С) не связано с ге­
терозиготностью производителей. Иными словами, температур­
ный фактор играет ведущую, генетически детерминированную
роль в процессе выживания биологических объектов. С. Guy
(Институт урожая и сельскохозяйственных исследований, США)
представил обзор данных о генетических аспектах зимостойкости
и холодовой адаптации, в основе которых лежат механизмы
криообновления. А. К. Hardacre (Институт исследования пищевых
культур, Новая Зеландия) обнаружил генетически детерминиро­
ванную изменчивость морозоустойчивых проростков кукурузы.
К. Ebine (Кардиологический центр, Токио, Япония) отмечает
большую устойчивость криоконсервированных гемопоэтических
клеток к вирусу гепатита: переливания незамороженной цельной
аллогенной крови было причиной заболеваний гепатитом в 13,7 %
случаев (49 из 357 больных), при использовании замороженно-оттаяной аллогенной крови посттрансфузионный гепатит не разви­
вался (0 %).
С.Я. Амстиславский (Институт цитологии и генетики СО РАН,
Новосибирск) считает, что концепция криообновления позволяет
объяснить многие не решенные на сегодня вопросы, например,
данные о том, что у потомства (крысят), полученного после крио­
консервирования эмбрионов гипертензивных крыс и трансплан­
тации этих эмбрионов нормотензивным реципиентам, артери­
альное давление было существенно ниже, чем у крыс исходной ги­
пертензивной популяции. Причем этот эффект сохранился в сле­
дующем поколении. М.И. Савушкина (ВНИИ пресноводного
рыбного хозяйства, пос. Рыбное Московской обл., Россия) пол­

36

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

ностью согласна с концепцией криообновления. Она установила
изменения фенотипических признаков потомства после криокон­
сервирования гамет. Так, жизнеспособность и показатели роста
молоди рыб (карпа), выращенной с использованием криоконсервированной спермы, были выше, чем у полученной традицион­
ным методом. Молодь карпа, полученная в результате оплодотво­
рения замороженной спермой, также отличалась более высоким
уровнем гематологических и биофизических параметров и повы­
шенной иммунологической реактивностью.
Таким образом, эксперты заключили, что изучение механизмов
программированной жизни клетки — перспективное направление в
биологии и медицине и является приоритетом авторов. Результаты
их иследований хорошо укладываются в концептуальную модель
обновления. Однако отсутствие единого взгляда криобиологов на
индукцию БХШ, селективное свойство криоконсервирования и
возможность проникновения цитохрома с через наружную и внут­
реннюю митохондриальные мембраны в течение длительного вре­
мени значительно затруднило обоснование роли этих процессов в
механизме криообновления, поэтому до настоящего времени новое
направление не было предметом широкой дискуссии.
Действительно, некоторые криобиологи молчаливо признава­
ли, что фактор криоконсервирования является неспецифическим,
в связи с чем появление БХШ отождествляли с так называемыми
стресс-белками. При этом отмечали одну из особенностей их син­
теза в ответ на криовоздействие. Она заключается в том, что в от­
личие от белков теплового шока интенсивность синтеза этих бел­
ков в клетках после криовоздействия можно резко снизить исполь­
зованием криозащитных веществ, т. е. при максимальном сохра­
нении исходных свойств биологических объектов.
До недавнего времени благоприятное селективное свойство
криоконсервирования связывали с отбором устойчивых элементов
за счет элиминации неустойчивых, а восстановление морфо­
функциональных свойств размороженных биологических объек­
тов вплоть до исходного уровня объясняли репаративными про­
цессами, имеющими обратимый характер. Поэтому до настоящего
времени не выдвинута какая-либо концепция, способная внести
ясность в получение более жизнеспособных клеток, тканей и ор­
ганизмов, подвергшихся охлаждению и криоконсервированию, по
сравнению с исходными. Лишь в последние годы появилась ре­
альная возможность вернуться к обсуждению основных механиз­
мов процессов криообновления, в том числе роли цитохрома с в
механизме этого процесса.

37

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Недавно наиболее полно по упомянутым и другим вопросам
дана экспертная оценка ученых из различных областей биологии,
медицины и сельского хозяйства. Заслуживает внимания мнение
д-ра биол. наук А.К. Гулевского, зав. отделом криобиохимии хо­
лодовой адаптации ИПКиК НАН Украины, который стоял у исто­
ков криобиологической науки. Эксперт и его ученики подтверди­
ли один из механизмов процессов криообновления, а именно об­
наружили БХШ (мол. масса 65 кДа) при действии сверхнизких
(-196 °С) температур в личинках большого мучного хрущака (7⅛nebrio molitor). В связи с этим рецензент особо подчеркнул важ­
ность изученных авторами некоторых механизмов программиро­
ванной жизни охлажденной и криоконсервированной клеток, та­
ких, как благоприятная деконденсация хроматина, индукция ГХА,
БХШ и антиоксидантов de novo, способных подавлять апоптоз;
вхождение цитохрома с в митохондриальный матрикс с после­
дующим блокированием апоптотических процессов. Внимание
А. К. Гулевского привлекли также данные относительно выявлен­
ных авторами перспектив возможных преимуществ большей кли­
нической эффективности криоконсервированных гемопоэтичес­
ких клеток, заготовленных от эмбрионов и плодов, по сравнению
со взрослыми донорами.
Принципиально новое направление высоко оценили П.М. Перехрестенко, директор Института гематологии и трансфузиологии
АМН Украины, заслуженный деятель науки и техники Украины и
канд. мед. наук Г.Т. Глухенькая, зав. лабораторией криоконсерви­
рования гемопоэтических клеток, стоявшая вместе с С.С. Лавриком у истоков криобиологии. Эксперты считают, что до настоящего
времени в мировой практике преобладают эмпирические подходы
к изучению качества размороженных биологических объектов,
отсутствуют научно обоснованные принципы изучения нового
качества, не сформулирована теория обновления биологических
объектов. Они особо подчеркнули, что впервые в истории крио­
биологической науки авторы поставили вопрос о том, что с помо­
щью низких температур и криоконсервирования можно не толь­
ко сохранить, но и улучшить морфофункциональные свойства
биологических объектов, а также вмешиваться в мутационный
процесс. На сегодня наиболее актуальны поиски способов, которые
позволяют не только сохранить, но и улучшить качество биологи­
ческих объектов, в связи с чем это оригинальное фундаментальное
направление относится к приоритетным разработкам в отечествен­
ной и мировой литературе. Эксперты акцентировали внимание на
том, что концепция криообновления базируется на открытии авто­

38

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

рами благоприятного стимулирующего, трансформирующего (пре­
образующего) и мутагенного (с гетерозисным эффектом) свойств
криоконсервирования.
Такого же мнения придерживается и д-р мед. наук С.А. Гусе­
ва, профессор кафедры гематологии и трансфузиологии Нацио­
нальной медицинской академии последипломного образования
им. П.Л. Шупика. Она убеждена, что руководствуясь принципами
обновления и криообновления — однонаправленными и усиливаю­
щими друг друга процессами, уже сегодня существует реальная
возможность на основе цитохрома с — активатора этих механиз­
мов изготовить лекарственные средства для эффективного лече­
ния таких тяжелых заболеваний, как бесплодие, онкологические
болезни и др. Важное значение, по мнению эксперта, имеют он­
копрепараты, изготовленные на основе антиапоптотических бел­
ков, цитокинов и антиоксидантов, подавляющих апоптоз, и таким
образом способных сдвигать динамическое взаимодействие разно­
направленных процессов апоптоза и обновления в направлении
обновления. Высокая оценка дана теоретическому обоснованию
эффективности использования маркеров раннего апоптоза с це­
лью своевременного «запуска» программы обновления. Эксперт
считает, что разработка оптимальных методов криоконсервирова­
ния гемопоэтических клеток, в том числе стволовых кроветворных
клеток (СКК) и эффективности их трансплантации, предусматри­
вает использование маркеров раннего апоптоза. Его выявление
позволит своевременно включить программу обновления и крио­
обновления путем экспрессии антиапоптотических генов и ГХА,
индукции антиапоптотических белков и БХШ. Подбор программ
замораживания—оттаивания, введение цитохрома с в разморо­
женные клетки, использование антиоксидантов, цитокинов, про­
дуктов эмбриофеталоплацентарного комплекса, кордовой крови
затормозит развитие апоптотических процессов в криоконсервированных клетках. Смещение динамического взаимодействия двух
разнонаправленных процессов апоптоза и обновления либо крио­
обновления в сторону последних лежит в основе лечебной эффек­
тивности гемопоэтических клеток. В целом криообновление яв­
ляется неотъемлемой частью клеточной терапии, ее теоретической
базой и служит основой для прогресса современных технологий в
гематологии и трансфузиологии.
Феномен криообновления нашел понимание и поддержку из­
вестного в нашей стране и за рубежом Ф.И. Осташко, академика
УААН, заслуженного деятеля науки и техники Украины, лауреата
Государственной премии Украины в области науки и техники.

39

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Ученый стоял у истоков криобиологии и длительное время воз­
главлял Институт животноводства УААН. Ценность механизмов
криообновления, по его мнению, в том, что они изучены на раз­
личных уровнях организации биологических объектов — от мик­
роорганизмов и простейших до растений и человека. Некоторые
из них Ф.И. Осташко подтвердил собственными данными в сов­
местной с авторами монографии программной статье, материалы
которой были представлены на международной практической
конференции «Современные методы репродукции сельскохозяй­
ственных животных: состояние и перспективы развития». В них
дано теоретическое обоснование повышения фертильности спермиев и получения более качественного потомства с позиции двух
важнейших разнонаправленных феноменов в клеточной биоло­
гии — апоптоза и криообновления.
В Институте животноводства УААН на спермиях производи­
телей различных видов животных (быков, баранов, хряков), а так­
же на эритроцитах крупного рогатого скота (баранов), кролей и
человека выявлен защитный механизм яичного желтка при воз­
действии низкотемпературных, иммунных, осмотических, меха­
нических и других факторов. Характерно, что в состав яичного
желтка входит большое количество антиоксидантов (лецитин,
сфингомиелин, фосфатидилхолин и др.). С позиции концепции
криообновления эти антиоксиданты способны тормозить процес­
сы апоптоза и, таким образом, сдвигать динамическое взаимодей­
ствие апоптоза и криообновления в сторону криообновления. Эти
реакции лежат в основе повышения качества криоконсервированных спермиев животных. В целом Ф.И. Осташко подчеркнул, что
повышение фертильности спермиев и получение более качествен­
ного потомства обеспечивает ряд механизмов криообновления.
Основные из них: деконденсация хроматина без нарушения
ДНК-ядерных связей, экспрессия ГХА, индукция БХШ, актива­
ция антиоксидантов de novo, подавляющих апоптоз, и вхождение
цитохрома с в митохондриальный матрикс с последующим восста­
новлением процессов дыхания и фосфорилирования. Эти меха­
низмы закодированы в геноме и представляют собой новые дан­
ные о селективном свойстве криоконсервирования.
Аналогичного мнения придерживается генетик-цитолог д-р
биол. наук Н.В. Дедух, зав. лабораторией морфологии соединитель­
ной ткани Института патологии позвоночника и суставов им.
проф. М.И. Ситенко АМН Украины. Она подчеркнула, что истоки
принципиально нового направления в биологии и медицине ведут
к 1984 г., когда авторы представили новые данные о селективном

40

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

свойстве криоконсервирования [160]. Для этой цели были разра­
ботаны и использованы возможности корреляционно-регрессион­
ного анализа. Авторы заключили, что криоконсервирование кле­
ток костного мозга и крови ведет к образованию новой клеточной
популяции, обогащенной пролиферирующими клетками. Размо­
роженные гемопоэтические клетки отличаются от свежезаготовленных направленностью энергетического обмена — переходом
на гликолитический тип обмена, а также возрастанием роли ка­
тионных белков, обладающих антибактерицидной функцией. Ка­
чественно новая популяция образуется в результате селективного
действия низкой температуры как фактора отбора и изменчивости
и связана с общебиологическим свойством живого адаптироваться
к новым условиям, переходя на другой функциональный уровень.
Н.В. Дедух акцентировала внимание на данных, полученных
зарубежными авторами в результате иммунологических исследо­
ваний, в которых доказано, что иммунодефицит проявляется
только при истощении ферментных систем, главным образом
лимфоцитов и моноцитов. Применение цитохрома с — активатора
механизма обновления и криообновления, существенно повышает
эффективность лечения и нормализует иммунный статус больных
туберкулезом. Положительное действие цитохрома с на иммуноге­
нез — результат его стимулирующего влияния на синтез иммуно­
глобулинов, процессы дыхания и фосфорилирования. Подобно
туберкулезу СПИД также является следствием проявления имму­
нодефицита. Благоприятный прогноз возможной лечебной эф­
фективности цитохрома с обусловлен его способностью путем пиноцитоза проникать в клетки мозга для последующей коррекции в
них энергетического обмена, стимуляции иммуногенеза и био­
энергетических процессов. Поэтому используя методы цитохром­
ной терапии, наиболее полно представленные авторами в статье
[73], можно прогнозировать задержку развития иммунодефицита.
Эти методы наиболее эффективны при действии низких темпера­
тур. Последние разрыхляют клеточные мембраны и регулируют
активность генов, под контролем которых находится система
транспорта электронов.
Важными, по мнению Н.В. Дедух, являются недавно опубли­
кованные данные зарубежных ученых, согласно которым фракции
спермиев с высокой и низкой подвижностью, полученные с по­
мощью оксидативного стресса как фактора отбора, содержали апоптотические белки как результат активации процессов ПОЛ и об­
разования АФК. Это означает, что в ту и другую фракцию включи­
лись механизмы программированной гибели клетки. С помощью

41

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

аннексин-У-связывания и хемилюминесценции установлена так­
же более высокая индукция мембранного антиоксиданта фосфатидилсерина (de novo) в высокоподвижной популяции спермиев
человека по сравнению с низкоподвижной. Индукция антиокси­
данта (de novo) — результат активации программированной жизни
клетки. Эти данные экспериментально продемонстрировали взаи­
модействие реакций апоптоза и криообновления.
Заслуживают внимания результаты экспертной оценки прин­
ципиально нового направления д-ром биол. наук В.И. Вишнев­
ским, проф. Харьковского государственного университета инфор­
мационно-коммуникационных технологий, который стоял у исто­
ков криобиологической науки. Его интересы — криобиология,
криомедицина и сельское хозяйство, в частности животноводство.
Особое внимание он уделил предвидению авторами ведущей роли
цитохрома с в механизме программированной жизни охлажден­
ной и криоконсервированной клетки. Ученый отметил, что еще в
1976 г. авторы обнаружили, что криоконсервированныме клетки
утрачивают цитохром с с последующим снижением в них биоэнер­
гетических процессов. После добавления в размороженные клетки
цитохрома с нормализовались реакции цикла Кребса, пентозного,
системы транспорта электронов, а в некоторых случаях наблюда­
лась их активация, что наиболее полно представлено в работе
[149]. Эти данные пролили свет на существование другого не ме­
нее важного по сравнению с апоптозом явления — криообновле­
ния. Жизненность направления III тысячелетия эксперт подтвер­
дил совместными исследованиями: замораживание гранулоцитов
и эритроцитов в постоянном магнитном поле способствует значи­
тельно большему сохранению SH-rpyππ, ЦХО, сукцинатдегидро­
геназы (СДГ) и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) по
сравнению с замораживанием вне магнитных полей. При этом ге­
терогенность популяции уменьшается за счет элиминации клеток
с низким содержанием SH-групп. Появляются лейкоциты с высо­
ким их содержанием. Озвучивание клеточных суспензий в процес­
се отогрева и после него снижает активность АТФазы и увеличи­
вает в 1,2 раза активность ЦХО, играющей важную роль в «запус­
ке» механизмов криообновления. Таким образом, по мнению
В.И. Вишневского, механизмы криообновления, закодированные
в геноме, значительно активируются с помощью физических сти­
муляторов обменных процессов.
Механизмы программированной жизни охлажденной и крио­
консервированной клетки достаточно широко изучены учеными в
области растениеводства. Представляет особый интерес мнение

42

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

зав. кафедрой генетики, селекции и семеноводства Харьковского
национального аграрного университета им. В.В. Докучаева, проф.
Н.В. Проскурина. Он акцентировал внимание на открытии авто­
рами благоприятного деконденсирующего свойства криоконсер­
вирования и активацию процессов транскрипции. Деконденсированный хроматин ведет к активации генов и реализации их регу­
ляторной деятельности. Эти принципиально новые данные в
криобиологии и криомедицине навели авторов на мысль, что у
многоклеточных организмов генетически заложена программа
жизни охлажденной и криоконсервированной клетки. В 1989 г.
новому явлению В.И. Грищенко, Э.И. Алексеевской и Е.Я. Пан­
ковым была дана терминология «криообновление» (программиро­
ванная жизнь охлажденной и криоконсервированной клетки) [62,
154]. Сбылись предвидения авторов относительно роли генома в
реализации процессов криообновления. В настоящее время зару­
бежные ученые описали функциональную и пространственную
организацию ГХА в геноме рыб, млекопитающих и человека и их
локализацию. Выявлены области эукариотических генов-регуля­
торов, которые сохранены от бактерий до человека.
Внимание эксперта привлекли данные авторов о том, что с по­
мощью низких температур, цитохрома с и антиоксидантов (холинхлорида) получена в 2—3 раза большая энергия всхожести расте­
ниеводческих культур, а также криогибрид тыквы и кабачков. Эти
результаты повторились в поколениях F2, Fi, ∕,4 и F5. Благоприят­
ные изменения обусловлены деятельностью клеточного генома:
низкие температуры регулируют гены, под контролем которых на­
ходятся цитохром с и НАДН2, участвующий в транспортной функ­
ции цитохрома с через наружную митохондриальную мембрану.
Зарубежные ученые обнаружили экспрессию новых белков ози­
мой пшеницы, что с точки зрения криорезистентности связано со
способностью озимой пшеницы переносить мороз, а с позиции
криообновления — с повышением ее качества. Изученные автора­
ми механизмы криообновления открывают широкие перспективы
получения элитных семян с заданной программой повышения ка­
чества растениеводческой продукции во всех поколениях.
Н.В. Проскурин полагает, что идея направленного воздейст­
вия на биологические объекты с целью улучшения их качества яв­
ляется принципиально новой теорией управления процессами
криоконсервирования, определившей события не менее чем на
три десятилетия. Новое оригинальное фундаментальное направ­
ление, основанное на новых данных селективного свойства крио­

43

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

консервирования, относится к приоритетным разработкам в оте­
чественной и мировой науке.
Таким образом, упомянутые выше эксперты высоко оценили
ранние представления авторов о селективном свойстве криокон­
сервирования как фактора отбора и благоприятной изменчивости.
Положение о том, что у потомства, полученного после оплодотво­
рения «криообновленными» спермиями, будут отсутствовать
признаки неизлечимых заболеваний и преждевременного старе­
ния организма, обусловленные процессами апоптоза; использова­
ние мясомолочной, винной, рыбной и растениеводческой продук­
ции улучшенного качества, несомненно, позволит предупредить
развитие неизлечимых заболеваний и преждевременное старение
организма.
Ниже представлены новые данные о селективном свойстве
криоконсервирования, которые лежат в основе благоприятных из­
менений размороженных биологических объектов, направленных
на повышение качества жизни.
2.1. НОВЫЕ ДАННЫЕ О СЕЛЕКТИВНОМ СВОЙСТВЕ
КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ

Длительное время криобиологи придерживались мнения, что се­
лективное свойство криоконсервирования — это лишь отбор ус­
тойчивых элементов за счет элиминации неустойчивых. Согласно
классическому определению, «селекция» означает отбор. Однако
отбор как созидательный и творческий процесс проявляет себя
лишь тогда, когда речь идет о процессах индивидуального разви­
тия. При этом объектом действия отбора являются не отдельные
гены, а целые генотипы, реализующиеся в ходе индивидуального
развития и различающиеся по приспособительной ценности. В
данном случае отбор — это фактор, способный обеспечивать быс­
трую перестройку генетической структуры популяции.
В зависимости от результатов проявления на внутрипопуляционном уровне различают такие основные формы отбора: стаби­
лизирующую, движущую и дизруптивную (раскалывающую) [126,
127]. Стабилизирующая форма отбора — это отбор в пользу уста­
новившейся нормы при элиминации всех заметных отклонений от
этой нормы. Движущая форма отбора представляет собой отбор
некоторых отклонений от установившейся ранее нормы в резуль­
тате элиминации представителей прежней нормы. Дезруптивный отбор — это отбор, благоприятствующий более чем одному

44

2.1. Новые данные о селективном свойстве криоконсервирования

фенотипическому оптимуму, т. е. совершенно различным геноти­
пам, и действующий против промежуточных форм. Следствием
движущего и дезруптивного отбора является изменение пределов
варьирования признака и его среднего значения в дочернем поко­
лении популяции, тогда как при стабилизирующем отборе сред­
няя величина признака не изменяется и при этом сохраняется его
изменчивость. Все три формы отбора выполняют в эволюционном
процессе разные функции: стабилизирующий отбор — консерва­
тивную, а две другие — прогрессивную.
Слово «селекция», как уже указывалось, в переводе на русский
язык означает отбор, однако ее содержание этим не ограничивает­
ся. Известно, например, что криоконсервирование позволяет раз­
делить клеточную популяцию по функциональным свойствам в
отличие от фракционирования, основанного на физико-химичес­
ких и морфологических параметрах, таких, как размер клеток, их
плотность и др.
Методы фракционирования клеток костного мозга и крови,
основанные на их различиях по плотности, размерам и электрон­
ному заряду, позволяют в несколько раз повысить концентрацию
стволовых клеток в определенных фракциях костномозговой кле­
точной суспензии, а также разделить форменные элементы крови.
Выделенные таким образом клетки получены за счет устранения
из смеси других клеточных элементов и обладают свойствами,
присущими им до фракционирования.
Концентрацию стволовых и лейкозных клеток можно повы­
сить также методом замораживания и оттаивания. Однако функ­
циональные свойства размороженных клеток в отличие от клеток,
полученных методом фракционирования, существенно отличают­
ся от свежезаготовленных в связи с повреждающим действием
низких температур на клеточные мембраны и состояние фермент­
ных систем.
Впервые видный российский ученый М.Е. Лобашов [126] выс­
казал мысль о связи адаптации, отбора и мутационного процесса.
По его мнению, изменчивость и отбор — разные стороны одного
процесса (селекции), движущей силой которого является переме­
на условий. В связи с этим далее рассматриваются новые данные о
селективном свойстве криоконсервирования с позиции концеп­
ции криообновления.
Получению новых данных о селективном свойстве низких
температур и криоконсервирования предшествовал длительный
этап разработки цитохимических и цитоэнзимологических мето­
дов определения жизнеспособности клеток, а также морфологи­

45

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

чески не различимых гемопоэтических клеток-предшественни­
ков, согласно рекомендациям Р.П. Нарциссова [147] и Д.Ф. Глузмана [45, 46] с учетом факторов криоконсервирования. Цитохи­
мические реакции, разработанные Э. Пирс [167], М. Берстоном
[25] и П. Лили [123] для срезов, потребовали существенной моди­
фикации ввиду наличия в клетках цитоплазматической мембраны,
трудно проницаемой для многих субстратов. Согласно рекоменда­
циям Р.П. Нарциссова [147], большое внимание было уделено
разработке нового направления в криоцитофизиологии клетки —
изучению внутриклеточных структур и функций в их взаимосвязи,
что в полном объеме отражено в монографии «Цитохимия заморо­
женной клетки» [151], атласе «Цитохимия костного мозга при
криоконсервировании» [154] и ряде статей [62, 63, 70, 160, 161].
С помощью указанных способов оценки качества клеток и их
популяций при криоконсервировании сделан вывод о том, что се­
лекция — это сосуществование отбора (селекции) и изменчивости
биологических объектов, движущей силой которого является воз­
действие факторов криоконсервирования. Таким образом, в нас­
тоящее время имеется теоретическая база для создания новых тех­
нологических процессов, способных перевести биологические
объекты на качественно новый уровень гомеостаза. Существует
несколько приемов: 1) перенос ГХА, генов, индуцирующих гете­
розисный эффект, и генов белков-антифризов; 2) индукция крио­
мутаций и криогибридов с гетерозисным эффектом; 3) активация
энергообразующих и других систем в стационарной кинетике био­
химических реакций. Все представленные далее материалы рас­
сматриваются с позиции новых данных о селективном свойстве
криоконсервирования.
2.1.1. Перенос генов холодовой адаптации, генов, индуцирующих
гетерозисный эффект, и генов белков-антифризов

Удивительной особенностью всех основных внутриклеточных ме­
ханизмов, обеспечивающих наследственный характер развития
организмов, является их универсальность. Принципы поведения
хромосом в митозе, мейозе и оплодотворении, принципы записи
наследственной информации в ДНК хромосом и передачи этой
информации от хромосом в цитоплазму, где осуществляются про­
цессы синтеза белков, едины для всех организмов, обладающих
дифференцированным клеточным ядром, — от простейших до че­
ловека. Результаты, полученные при изучении бактерий, бакте­

46

2.1. Новые данные о селективном свойстве криоконсервирования

риофагов и других вирусов, а также плесневых грибов, могут быть
перенесены на клетки высших организмов, так как на молекуляр­
ном уровне генетические механизмы для всех живых биологичес­
ких объектов одинаковы. Исследование генетического кода поз­
волило сделать открытие, имеющее большое общебиологическое
значение: установлена известная универсальность кода. Одинако­
вые триплеты кодируют одинаковые аминокислоты в бесклеточ­
ных системах, полученных из различных организмов (бактерий,
клеток млекопитающих) [120, 137, 241]. Код оказался универсаль­
ным для вирусов, водорослей и морского ежа. Сделано предполо­
жение, что код является одним из самых старых и консервативных
филогенетических механизмов. До настоящего времени не обна­
ружено явных различий между кодом у Е. colt и млекопитающих
[146]. Гены человека представляют собой различные последова­
тельности тех же самых «четырех букв генетического алфавита»,
из которых составлены гены рыб, злаков, бактерий и дрожжей, а
именно аденозин, цитозин, гуанин и тимин. Многие геномы мле­
копитающих, и в том числе человека, содержат 20—30 нуклеотид­
ных последовательностей, родственных гену цитохрома с крысы;
последовательность субъединицы III ЦХО N. crassa характеризует­
ся значительной гомологией с соответствующими белками дрож­
жей и человека (53 и 47 %) [261].
Показано, что экспрессия ГХА осуществляется на транскрип­
ционном уровне, не стимулируется и не индуцируется тепловым
шоком, водным стрессом или ранением [342]. Экспрессия ГХА
при -4 °С скоординирована и осуществляется на транскрипцион­
ном уровне. У дрожжей Saccharamy<x,s cervisiae при использовании
метода дифференциальной гибридизации идентифицированы ге­
ны, экспрессия которых индуцируется при низкой температуре
[322]. Анализ проростков in vitro трансляции поли-(А)+РНК, выде­
ленных из разных растительных тканей, свидетельствует о транс­
специфической экспрессии генов, индуцируемых низкими темпе­
ратурами [275]. Считают, что развитие морозоустойчивости ассо­
циировано с экспрессией специфических генов, регулируемой на
транскрипционном уровне. Холодоустойчивость пшеницы, на­
пример, контролируется двумя локусами хромосомы 5А [361].
Один локус, частично контролирующий холодоустойчивость, тес­
но сцеплен с локусом, контролирующим длину листьев. Другой
локус, обусловливающий образ жизни, по мнению авторов, тесно
сцеплен с геном Vml. Этот локус может частично контролировать
розеточный тип куста. Предположили, что ген Vrn 1 зависит от тем­

47

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

пературы и, по всей вероятности, является пусковым механизмом
яровизации, холодоустойчивости и развития розеточного типа
куста. Иными словами, ген Vrπl может кодировать синтез специ­
фических к низкой температуре белков. Выделен ген устойчивос­
ти пшеницы к низким положительным температурам [406]. Он до­
минантен и локализован на коротком плече хромосомы 6D Chi­
nese spring.
В природе большинство из 40 генов белков-антифризов, выде­
ленных из семенников рыб, находится в участках ДНК длиной
7—8 пар оснований, чередующихся в виде тандемных прямых пов­
торов [374]. Каждый повтор содержит единственный ген белка-ан­
тифриза, длиной 1 тыс. пар оснований, транскрипционно ориен­
тированный так же, как и другие подобные гены. Установлено,
что гены белков-антифризов тандемно связаны и сгруппированы
в геноме камбалы. Изучение организации генома показало, что
образование антифризных полипептидов связано с семейством ге­
нов, эволюционно более поздних, чем остальной геном [377].
Обнаружена также экспрессия БХШ, кодируемая специфи­
ческими генами: у Е. coli в условиях низкотемпературного шока
увеличивается синтез 14 белков, а синтез белков теплового шока
резко снижается [397]. Субъединица А ДНК-гиразы является
БХШ и продолжает синтезироваться после переноса растущих
культур Е. coli с 37 на 10 °С [254,313]. Ген hns, расположенный на
27 мин хромосомы Е. coli, кодирующий нуклеотидный белок HNS,
размером 15,4 кДа, относится к регулятору холодового шока. При
варьировании температуры от 17 до 27 °С аутосомные аллели про­
должительности жизни взрослых особей D. melanogaster Al и Аг
проявляли главные эффекты: увеличение продолжительности
жизни с понижением температуры. Сцепленные с полом аллели
продолжительности жизни Ar1 и Х2 играют вторичную роль во
влиянии на продолжительность жизни.
Проанализированы гены устойчивости к низкой (12 °С) тем­
пературе у групп Poecilia reticulata в связи со сцепленным с полом
наследованием [297]. Предположили, что аллель устойчивости (R)
к низкой температуре доминантен по отношению к аллелю вос­
приимчивости (г); при этом ген R1, по-видимому, сцеплен с поло­
вой Л-хромосомой. Отмечено также, что уровень экспрессии гена
R2 находится под существенным средовым (физиологическим)
контролем, чем обусловливается значительная дифференцировка
его проявления у разных линий групп, подтвержденная другими
авторами: продолжительность инкубационного периода жизни
зимней камбалы связана с температурой развития и влиянием ро­

48

2.1. Новые данные о селективном свойстве криоконсервирования

дителей на 93 и 3 % соответственно [265]. Обнаружили также вы­
сокое наследование устойчивости к низким отрицательным тем­
пературам (0, -1, -8 °С) у молодых проростков риса [344] и клевера
ползучего [299]. Авторы считают, что перенос ГХА может повы­
сить морозоустойчивость и урожайность растений. Методом пере­
носа генов белков-антифризов можно активизировать программи­
рованную жизнь охлажденной и криоконсервированной клетки и,
таким образом, повысить холодоустойчивость ряда рыб.
2.1.2. Индукция криомутаций и криогибридов
с гетерозисным эффектом

В 1979 г. нами было показано, что определенные режимы крио­
консервирования гемопоэтических клеток при -196 °С позволяют
направленно изменять их морфофункциональные свойства и по­
лучать мутанты с гетерозисным эффектом [150]. Обнаружены му­
тантные формы мегакариоцитов криоконсервированного костно­
го мозга. Последние характеризуются увеличением метаболически
активной зоны, описанной М.И. Кореневской и соавт. [108], иду­
щей на построение полисахаридного компонента мембраны тром­
боцитов и интенсификации тромбоцитоотделения. Спустя 5—10
лет гетерозисный эффект, индуцируемый криоохлаждением, был
обнаружен другими авторами. Они установили, что определенные
режимы обработки сверхнизкими температурами (-180 ÷ -190 °С)
дрожжевых микроорганизмов позволяют направленно изменять
морфофункциональные свойства и получать мутанты с полезны­
ми биохимическими и технологическими свойствами [ПО]. Выде­
лен биологически активный штамм дрожжей (M-12x) с изменен­
ной морфологией и увеличенным размером клеток. Он способен
осуществлять брожение при сравнительно низких (-11 ÷ -12 °С)
температурах, улучшать качество виноматериалов за счет больше­
го числа эндогенных антиоксидантов, меньшего — альдегидов и
летучих кислот. Получен гетерозисный криогибрид между немец­
ким карпом и сазаном, который характеризуется скоростью роста
в 2 раза большей, чем у родительских форм [107]. Локализованы
гены, влияющие на гетерозисный эффект. Наиболыпиее влияние
на гетерозисный эффект (большую репродуктивную способность)
холодового мутанта штамма D. melanogaster оказала хромосома 3,
затем 2, 1 [306].
Благодаря открытию универсальности генетического кода,
аналогичные работы можно проводить на различных биологичес­
ких объектах.

49

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

2.1.3. Активация энергообразующих и других систем
в стационарной кинетике биохимических реакций

В 1976 г. мы изучили механизм криоповреждения, в котором веду­
щую роль отвели выходу цитохрома с из митохондрий и снижению
активности дыхательных ферментов [149]. Спустя 10—20 лет эти
данные подтвердили другие авторы [343, 355]. Известно, что основ­
ная часть энергии биологического окисления освобождается в ре­
зультате реакций, катализируемых цитохромной системой, и ре­
зервные возможности дыхательных ферментов очень велики. ЦХО
в физиологических условиях проявляет лишь 5 % максимальной
каталитической активности. Активация энергообразующих систем
в стационарной кинетике переноса электронов возможна благодаря
сосуществованию двух форм дыхательной цепи — активированной
и неактивированной, переходящих одна в другую, соотношение
между которыми регулируется концентрацией кислорода в среде,
либо количеством цитохрома с в клетке. Недостаток их в ранние
сроки вызывает активацию энергообразующих систем. Это состоя­
ние становится высокоустойчивым, если режим дефицита кислоро­
да, либо цитохрома с несколько раз повторяется. Молекулярной ос­
новой повышения биоэнергетической активности митохондрий яв­
ляется активация ферментов дыхательной цепи, обеспечивающая
высокую скорость транспорта электронов [215]. Возникновение ак­
тивированной формы дыхательной цепи может быть результатом
изменения ее конформации при переносе электронов. На построен­
ной кинетической модели доказано, что перенос электронов по ды­
хательной цепи сопровождается возникновением более компакт­
ной формы последней, характеризующейся повышением устойчи­
вости к литическим факторам [117]. Экспериментально показано,
что кратковременным ответом митохондрий печени крыс при хо­
лодовом воздействии (2—4 °С) является либо повышение концен­
трации цитохромов, либо ускорение их синтеза, либо замедление
распада [143]. По мере воздействия холода возрастание количества
цитохромов усиливает окислительный обмен и приводит к интен­
сификации митохондриогенеза. Через месяц холодового воздей­
ствия устойчиво повышается концентрация цитохромов и появ­
ляются митохондрии с новыми свойствами. Это обеспечивает ста­
бильное возрастание скорости потребления кислорода печенью.
Таким образом, теоретически и экспериментально доказана
возможность обновления биологических структур и функций за
счет активации энергообразующих систем в стационарной кине­
тике переноса электронов.

50

2.2. Изменение регуляции клеточного генома

2.2. ИЗМЕНЕНИЕ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОГО ГЕНОМА
Длительное время молчаливо признавали, что ядро является
своеобразным хранилищем генетической информации и в аспек­
те, не связанном с обменом нуклеиновых кислот, представляет со­
бой метаболически инертное образование. Считали, что в ядре
протекают анаэробные процессы и оно не имеет собственных
окислительно-восстановительных систем. Однако в последние го­
ды обнаружен синтез АТФ в изолированных ядрах тимоцитов,
ферментов гликолиза, пентозного цикла, цикла Кребса, в том чис­
ле и СДГ. В ядрах печени и почек крыс выявлена активность ЦХО
и НАД · Н2-ДГ. Показано, что ЦХО ядер печени крысы локализо­
вана в ядерной оболочке. Эти данные подтвердили биохимичес­
кие и электронно-микроскопические исследования на изолиро­
ванных ядрах и их оболочках. Цитохимически и гистохимически
обнаружены окислительно-восстановительные ферменты в ядрах
клеток крови человека только с использованием детергентов, раз­
рыхляющих ядерную мембрану; установлена также положитель­
ная реакция на ЦХО в некоторых участках хроматина. Присут­
ствие ферментов гликолиза, цикла Кребса и пентозного цикла в
ядрах клеток свидетельствует о том, что ядро в значительной сте­
пени (если не полностью) покрывает потребность в энергии за
счет собственных ресурсов. В ядре обнаружены также фосфолипи­
ды (10—20 % сухой массы ядра). Ядерная мембрана содержит
28—40 общих липидов. Фосфолипиды составляют более 60 % об­
щих липидов. Подробнее эти и другие данные обсуждены в рабо­
тах [151, 154].
С использованием реакции Бекера с пиридиновой экстрак­
цией мы впервые получили уникальные данные, касающиеся со­
держания фосфолипидов: лецитинов, серинфосфатидов, сфинго­
миелинов в ядрах клеток костного мозга человека и животных
(крысы) до и после криоконсервирования (рис. 3, а, б, см. вклей­
ку). После криоконсервирования клеток костного мозга с
ПЭО-400 наблюдается заметное увеличение содержания фосфо­
липидов в ядрах клеток, что связано с изменением транскрип­
ционной активности клеточного генома. Расшифровка этого явле­
ния стала возможной лишь в последние годы, благодаря опубли­
кованным данным, касающимся связи фосфолипидов с ядерными
структурами и их роли в регуляторной деятельности клеточного
генома. Показано, например, что фосфолипиды являются состав­
ной частью хроматина, могут влиять на его функциональную ак­
тивность, а связь вновь синтезированной ДНК. с ядерным матрик­

51

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

сом осуществляется через сфингомиелин [339]. Накопление сфин­
гомиелина во внутренних структурах хроматина связывают с акти­
вацией ферментов транскрипции (РНК-полимераз I и II) и пере­
ходом свободной формы РНК-полимеразы в связанное с матрик­
сом состояние [12]. Функциональная роль сфингомиелина в про­
цессе репликации, по мнению авторов, заключается в его способ­
ности дестабилизировать структуру ДНК, что может облегчить
расплетание двойной спирали расплетающими белками перед
репликативной вилкой
Суммируя изложенное, можно заключить, что установленное
нами увеличение содержания фосфолипидов в ядрах криоконсервированных клеток костного мозга и крови связано, по всей ве­
роятности, с изменениями транскрипционной активности клеточ­
ного генома, играющей важную роль в реакциях обновления и
криообновления. Выяснена природа процессов транскрипции.
Дело в том, что учеными-генетиками обнаружена способность
клетки не только продуцировать определенное вещество, когда
оно необходимо, но и предотвращать выработку вещества, если
оно не нужно. Эта регуляция осуществляется благодаря взаимо­
действию между генами трех типов: структурными генами, гена­
ми-операторами и генами-регуляторами. Структурный ген — это
ген, способный продуцировать фермент, выполняющий специфи­
ческую функцию в течение жизни и развития организма. Выра­
ботка этого фермента должна проводиться по мере необходи­
мости. Такая регуляция осуществляется генами-операторами и
генами-регуляторами. Ген-оператор, вероятно, локализуется не­
посредственно возле структурного гена и представляет собой
своеобразный пусковой механизм, работа которого находится под
контролем гена-регулятора. Если концентрация определенного
фермента в клетке достаточно высока, ген-регулятор начинает вы­
рабатывать в клетке особое вещество — ингибитор, которое через
цитоплазму оказывает влияние на ген-оператор, побуждая его
«выключить» соответствующий структурный ген с тем, чтобы ак­
тивность последнего прекратилась. В некоторых случаях действие
гена-регулятора приводит к полному удалению гена-оператора; в
иных случаях ген-оператор полностью подавляет действие струк­
турного гена или вызывает специфические мутации этого гена.
Наконец, могут происходить мутации как гена-оператора, так и
гена-регулятора.
Итак, оперон представляет собой ряд линейно расположенных
генов, структурная активность которых координируется приле­
гающим к ним функциональным геном. Считают, что по всей

52

2.2. Изменение регуляции клеточного генома

длине оперона синтезируется одна единственная лента компле­
ментарной РНК, поэтому оперон называют единицей транскрип­
ции, в понятие которой входит «переписывание» — перенос гене­
тического кода.
Известно, что процессы конденсации—деконденсации хрома­
тина (хромосом) являются важным способом регуляции клеточно­
го генома. Термин «конденсация—де конденсация» обозначает ха­
рактер изменения плотности расположения нитей ДНК, ведущих
к репрессии—депрессии генов. Конденсированный хроматин ли­
шает гены функциональной активности, деконденсированный —
ведет к включению в работу конститутивных генов и открывает
возможность реализации механизмов оперонной регуляции.
С использованием цитохимической реакции на SH-группы,
располагающиеся по ходу хроматиновой сети ядра, нами впервые
были получены уникальные данные, касающиеся характера упа­
ковки хроматина в клетках криоконсервированного костного моз­
га [149]. Расшифровка их стала возможной гораздо позже, когда
выяснилось, что деконденсация хромосом может происходить при
самых различных физиологических процессах, а также при воз­
никновении многих видов заболеваний.
По нашим наблюдениям, деконденсация хроматина в размо­
роженных клетках костного мозга сопровождалась морфофунк­
циональными изменениями: увеличением околоядерной зоны,
участвующей в образовании полисахаридного компонента мем­
браны будущих тромбоцитов, интенсификацией тромбоцитоотделения. Так, в мегакариоцитах криоконсервированного костного
мозга хорошо прослеживается четко отграниченный участок ци­
топлазмы, лежащий вблизи ядра с более интенсивной реакцией на
пероксидазу (рис. 4, а, см. вклейку). При этом отмечается более
выраженная интенсивность всех цитохимических реакций и акти­
вация отшнуровки тромбоцитов. Аналогично, при реакции на
SH-группы околоядерная структура интенсивно заполняет пери­
нуклеарную зону и распространяется почти по всему объему ци­
топлазмы мегакариоцитов (рис. 4, в, г, см. вклейку). В контроле
такая структура околоядерной зоны, описанная ранее [108], либо
не прослеживается (рис. 4, б), либо слабо выражена. Сделано
предположение, что околоядерная зона является местом для за­
вершения формирования тромбоцита при заключительном эндо­
митозе, в частности для образования полисахаридного компонен­
та мембраны тромбоцитов, ответственного за антигенную структу­
ру и отрицательный заряд. Последний обеспечивает отталкивание

53

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

тромбоцитов от мегакариоцита в процессе тромбоцитоотделения
и препятствует их агрегации в кровяном русле.
Таким образом, после криоконсервирования в мегакариоци­
тах костного мозга околоядерная структура, играющая важную
роль в активации транспорта гликогена и реконструктивных фер­
ментов к тромбоцитам, распространяется нередко по всему объе­
му цитоплазмы. Одновременно значительно интенсифицируются
процессы отложения продукта реакции и отшнуровки тромбоци­
тов. Это служит морфологическим выражением активации мета­
болизма, проявляющегося в значительном накоплении как об­
щих, так и специальных продуктов обмена. Иными словами,
криоконсервирование индуцирует в мегакариоцитах формирова­
ние дополнительных комплексов метаболизма, идущих на пос­
троение биомембран тромбоцитов, их полисахаридного компо­
нента.
Изменение процессов конденсации—деконденсации хромати­
на в криоконсервированных клетках костного мозга, выявленных
с помощью цитохимических реакций на фосфолипиды и SH-rpyπпы, подтверждено электронно-микроскопически. Отмечено про­
светление электронно-оптического материала в спермиях по срав­
нению с высококонденсированным в контроле [60], а также с
помощью вискозиметрии: после криоконсервирования клеток
костного мозга плотность суперспирализации ДНК «нуклеоидов»
снижается, что, как правило, сопровождается изменениями тран­
скрипционной активности генома клетки [27].
Изменение регуляции клеточного генома за счет конденса­
ции—деконденсации хроматина под действием холода — обще­
биологическое явление, так как распространяется и на раститель­
ные биологические объекты: под влиянием холода происходит
деспирализация ДНК в гетерохроматиновых участках метафазных
хромосом [58]. Примечательно, что деспирализация А-сегментов
метафазных хромосом при охлаждении (-12 °С) связана только с
функциональной активностью этих участков, так как редуплика­
ция их была полностью завершена еще в S-периоде. Длительное
охлаждение клонов Tradeskantia paludose при 0—1 °С ведет к сня­
тию блока гетерохроматизации, перемещению гена, вызывающего
эффект положения гена, неслучайному распределению добавоч­
ных хромосом, а также изменению окраски тычиночных нитей и
лепестков растений.
Явление конденсации—деконденсации хромосом обнаружено
и на простейших биологических объектах. Методом дисперсии
хромосом по Миллеру показано, что при подготовке инфузорий

54

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Bursaria truneatella к состоянию покоя часть хроматина соматичес­
ких ядер (макронуклеусов) преобразуется в плоские жидкие крис­
таллы гексагональной формы [184]. При более детальном изуче­
нии формирования жидких кристаллов в макронуклеусах двух ви­
дов бурсарий установлено, что начало их формирования сопро­
вождается преобразованием хромомерного хроматина в структуры
супероидно-соленоидного типа. Затем появляются наружные гра­
ни жидкокристаллических структур и происходит, по мнению ав­
торов, нарушение ядерного матрикса в зоне формирования жид­
кокристаллических структур. Сформированные гексагональные
плоскости различаются по строению. На ранних стадиях жид­
кокристаллические структуры еще прочно связаны с остальным
хроматином. По краю и внутри них видны сверхспирализованные
нити хроматина толщиной 13—40 нм, спирально закрученные в
плоскости жидкокристаллических структур. На более поздних ста­
диях в микрокристаллических структурах выявляются как ните­
видные фрагменты ДНК, так и многочисленные минирозетки и
миникольца. Вероятно, в поздних жидкокристаллических струк­
турах гексагональной формы происходит естественная декомпактизация хромосом с образованием вначале двуспиральных нитей
ДНК, а затем раскручивание их на одиночные нити.
Представленные данные свидетельствуют о том, что в природе
при подготовке биологических объектов к состоянию анабиоза
запрограммирован функциональный механизм конденсации—де­
конденсации хромосом, обеспечивающий сверхвыживаемость био­
логических объектов.
В целом после криоконсервирования различных биологичес­
ких объектов вследствие изменения процессов транскрипции и
конденсации—деконденсации хроматина — важнейших механиз­
мов программированной жизни охлажденной и криоконсервированной клетки — изменяется регуляция клеточного генома. Это
лежит в основе открытого нами благоприятного стимулирующего,
трансформирующего и мутагенного (с гетерозисным эффектом)
действия криоконсервирования.
2.3. СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ
КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ. ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ
Для изучения благоприятного стимулирующего действия крио­
консервирования (-79 °С) на выживаемость эритроцитов их пере­
ливали больным, страдающим железодефицитной анемией [192].
Незамороженные и замороженные эритроциты хранили перед

55

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 5. Криоконсервирование эритроцитов [192]

Рис. 6. Гипотермия (4 °С) клеток костного мозга новорожденных и взрослых
кроликов [128, 151, 154]

трансплантацией 11 сут при 4 °С. Общий объем эритроцитов у
каждого реципиента определяли спустя 24 или 48 я после перели­
вания, вводя небольшое количество эритроцитов, меченных Р32.
Установлено, что число выживших после криоконсервирования

56

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Рис. 7. Краниоцеребраль­
ная гипотермия взрос­
лых крыс [128, 151, 154]

клеток отличалось от контроля большим процентом выживания
(рис. 5). Как показали наши наблюдения, активация биологических
процессов имеет место после криоконсервирования гемопоэти­
ческих клеток эмбриональной печени человека. При этом наблю­
даются сдвиги в метаболических процессах: снижается активность
ферментов цикла Кребса (СДГ) и повышается — гликолитическо­
го (ЛДГ). Аналогично после гипотермии (4 °С) клеток костного
мозга новорожденных и взрослых кроликов (рис. 6) и КЦГ (рис. 7)
снижается активность СДГ, повышаются показатели КБ и
НСТ-теста. Активность НАДН2-ДГ и НАДФ-ДГ не отличается от
контрольных значений. В опытах по изучению трансплантационно­
го эффекта размороженных клеток эмбриональной печени кроликов
обнаружили повышение (в 2 раза) бактерицидной функции лейко­
цитов костного мозга кроликов, родившихся от реципиентов (f,l).
Эти данные подтвердили другие авторы биохимическими ме­
тодами: после переливания криоконсервированной крови сни­

57

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 8. Криоконсерви­
рование эритроцитной
массы [3]

жается риск заболеваемости реципиентов вирусным гепатитом,
так как в размороженных эритроцитах антиген не обнаружен (в
контроле плазма крови положительна по антигену гепатита В в
эритроцитах 1: 32, 1 : 64, 1 : 128) [3] (рис. 8). Считают, что для умень­
шения случаев посттрансфузионного гепатита следует применять
замороженно-оттаянные клетки крови (-80, -196 °С), так как
они теряют антигенность [289]. Таким образом, одна из особен­
ностей реакции реципиентов на криоконсервированный транс­
плантат состоит в повышении их устойчивости к бактерицидной
флоре.

2.3.1. Реакции реципиентов на криоконсервированный
трансплантат (иммунобиологические характеристики)
Особый интерес представляют данные о выраженном ответе лим­
фоцитов селезенки к ФГАдо замораживания и уменьшение ответа
лимфоцитов после замораживания со скоростью 1°/мин и хране­
ния при -196 °С 10 мин [291]. Восстановление клеточной популя­
ции определяли с помощью митотического ответа (включение
Н3-тимидина) на ФГА в культуре после оттаивания. Так, при ис­
пользовании различных концентраций ДМСО ФГА-стимулированные клетки селезенки характеризовались более высоким вклю­
чением Н3-тимидина, чем контрольные. При добавлении к среде
1,5%-го ДМСО среднее число включений было в 5 раз выше, чем в
контроле. Эти различия автор объясняет инактивацией заморо­
женных супрессорных клеток, присутствующих в селезенке.
Несомненный интерес представляют данные, полученные уче­
ными ИПКК НАН Украины. Отмечена более интенсивная макро­

58

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Рис. 9. Криоконсервирование аллотрансплантатов [217]

фагальная реакция на 1-е—3-й сутки в ложе криоконсервированных аллогенных лоскутов кожи по сравнению с незамороженными
[217]. На 8—10-е сутки, когда в области трансплантата формиро­
вался интенсивный инфильтрат и развивались симптомы оттор­
жения аллогенных трансплантатов, криоконсервированные алло­
трансплантаты еще сохраняли свою архитектонику и клеточная
инфильтрация прилегающих тканей была значительно менее вы­
ражена. В результате криоконсервированные аллотрансплантаты
сохранялись у реципиентов на 1—3 сут дольше (рис. 9). Продол­
жительность приживления вторичных незамороженных транс­
плантатов у реципиентов, сенсибилизированных криоконсервированным аллотрансплантатом, составила 9,5, а у животных, сен­
сибилизированных незамороженным — 5,5 сут. Важны данные об
изменении гистологии в области трансплантата: после отторжения
криоконсервированных аллогенных лоскутов формируются рубцы

59

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

с меньшей деформацией ткани (в контроле грубые деформирую­
щие рубцы).
Изучены особенности течения вторичной болезни у реци­
пиентов с трансплантатом криоконсервированного костного моз­
га [49]. В опытах были использованы мыши линии СВА и гибриды
(СВА × C57B1) Fl, 8—10-недельного возраста. Летально облучен­
ным реципиентам вводили 3⋅107 клеток незамороженного или
криоконсервированного костного мозга мышей линии СВА. По­
казано, что смертность этих животных в период с 20-х по 40-е сут­
ки составила 12,2 ± 2,9 % (рис. 10). Максимальное число мышей
(48,5 %) с признаками вторичной болезни погибло между 40-ми и
70-ми сутками, а к 100-м суткам наблюдения количество погиб­
ших реципиентов составило 64,7 ± 3,7 %. После введения криоконсервированных клеток начало гибели мышей, обусловленное
развитием вторичной болезни, отмечено в более поздние сроки.
Только к 55-м суткам процент погибших животных был приблизи­
тельно таким же, как на 4-е сутки после введения незамороженных
клеток (15,8 ± 3,9; 12,2 ± 2,9 %). К 100-м суткам после введения
криоконсервированных клеток погибло 54,3 ± 2,8 % животных,
т. е. значительно меньше, чем к этому же сроку после введения
незамороженных клеток (54,2 ± 2,8; 64,7 ± 3,7; Р< 0,05). Увеличи­
валось эндогенное колониеобразование за счет задержки появле­
ния лимфоузлов, ингибирующих рост эндогенных колоний, до
36 сут (29 сут в контроле) и снижалась ингибирующая активность
клеток лимфоузлов до 71 % (83 % в контроле). Таким образом,
вторичная болезнь у животных с трансплантатом криоконсерви­
рованного костного мозга развивается в более поздние сроки и
протекает менее активно, чем с незамороженным миелотрансплантатом [49, 50].
Изучение влияния трансплантаций незамороженной и криоконсервированной кроветворной ткани плодов на течение острой
лучевой болезни в эксперименте [189] показало, что на 120-е сутки
после введения криоконсервированных клеток выжило от 59 до
72 % животных (29 % в контроле) и отсутствовали признаки вто­
ричной болезни (рис. 11). Для изучения трансплантационной спо­
собности криоконсервированного ксеногенного костного мозга
мышам трансплантировали гетерологичный (крысиный) костный
мозг [195]. В течение 3-недельного срока проведено наблюдение
за выживаемостью облученных животных. После трансплантации
незамороженного костного мозга гибель животных начиналась на
8-е сутки. Группа летально облученных мышей, которым вводили
криоконсервированные клетки костного мозга, была более стой­

60

Рис. 10. Особенности течения вторичной болезни у реципиентов с транс­
плантатом клеток криоконсервированного костного мозга [49, 50]

61

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 11. Криоконсерви­
рование клеток костно­
го мозга плодов крыс в
эксперименте [189]

кой к воздействию ионизирующей радиации: животные погибли в
более поздние сроки (10-е сутки), чем при трансплантации неза­
мороженного костного мозга. Выживаемость животных повыси­
лась до 36 % (32 % в контроле) [196] (рис. 12).
Известно, что при трансплантации реципиенту костного моз­
га от нескольких генетически различающихся доноров терапев­
тическая эффективность смешанного трансплантата резко сни­
жается из-за инактивации СКК несингенными лимфоцитами.
Изучено влияние замораживания костного мозга, взятого от не­
сингенных доноров, на инактивацию лимфоцитами стволовых
клеток смешанного трансплантата [83]. Установлено, что замо­
роженные клетки-киллеры СВА в дозе 0,5 · 10бне дают инактиви­
рующего эффекта в отношении клеток-мишеней С57В16, взятых
в той же дозе (12,2 колоний, вместо ожидаемых 9,2, рис. 13).
Клетки незамороженного костного мозга от двух генетически
различающихся доноров дали с этими дозами клеток инактива­
цию, равную 40 % (рис. 14). Увеличение количества киллеров в
2,4 и даже 8 раз не вызвало инактивации клеток-мишеней. На­
против, количество колоний в организме смертельно облученных
реципиентов неуклонно возрастало (14,4; 20,3; 31,1 вместо 8,1;
11,2; 16,8).

62

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Рис. 12. Трансплантация
мышам гетерологичного
крысиного костного моз­
га [196]

Сделано заключение о том, что при переливании криоконсервированного костного мозга от двух генетически различающихся
доноров отменяется эффект инактивации СКК несингенными
лимфоцитами, присутствующими в смешанном трансплантате.
При этом в организме облученного реципиента увеличивается эн­
догенное колониеобразование по сравнению с трансплантацией
незамороженного костного мозга. В селезенке смертельно облу­
ченных реципиентов в изученные сроки развиваются колонии
преимущественно эритроидного ряда. Аналогично этому, соглас­
но нашим данным, после трансплантации гемопоэтических кле­
ток эмбриональной печени в 2 раза увеличивается эндогенное ко­
лониеобразование [61]. Наши данные подтвердили другие авторы,
которые исследовали влияние криоконсервирования на снижение
активности иммунокомпетентных клеток, ответственных за разви­
тие реакции трансплантат против хозяина [95]. С этой целью сус­
пензию незамороженных и замороженных клеток лимфатических
узлов, селезенки и костного мозга вводили мышам-гибридам
(СВА х C57B16) Fl через 20 ч после облучения (рис. 15). Реакцию
трансплантат против хозяина учитывали по выживаемости реци­
пиентов в течение 30 сут после трансплантации летально облучен­
ным мышам-гибридам F} незамороженных клеток лимфатических
узлов линии СВА. Отмечено развитие острой вторичной болезни с

63

Рис. 13. Трансплантация криоконсервированных клеток лимфоцитов, селе­
зенки и костного мозга [83]

64

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

характерными симптомами: уменьшение массы тела, поредение
шерсти, увеличение селезенки.
После трансплантации размороженных клеток лимфатических
узлов к 15-м суткам выживаемость животных составила 40—50 %;
к 30-м суткам — 20—40 %. Признаков вторичной болезни авторы
не обнаружили. Пересадка незамороженных клеток селезенки
вызвала развитие острой вторичной болезни с ярко выраженными

Рис. 14. Трансплантация клеток криоконсервированного костного мозга от
генетически различающихся доноров [83]

65

Рис. 15. Влияние криоконсервирования на снижение активности иммуноком­
петентных клеток, ответственных за развитие реакции трансплантат против
хозяина [95]

66

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

клиническими симптомами. Летальность животных к 8-м суткам
наблюдения составила 100 %. После пересадки размороженных
клеток селезенки у мышей-реципиентов отсутствовали клини­
ческие признаки развития вторичной болезни, выживаемость
животных к 15-м суткам наблюдения составила 82 и 57 %; к
30-м — 67 и 42 % (для доз клеток 1 ∙ 107 и 2 ∙ 107 соответственно).
При трансплантации 1-Ю7 клеток незамороженного костного
мозга к 30-м суткам наблюдения выживаемость животных соста­
вила 82 %, а при переливании размороженного костного мозга —
96 %. Морфологических признаков вторичной болезни не выяв­
лено.
Итак, характерной особенностью реакции реципиентов на
криоконсервированный трансплантат (гемопоэтические клетки
печени плодов, клетки доноров, смеси клеток костного мозга мы­
шей С57В16 с клетками костного мозга мышей СВА, смеси клеток
костного мозга мышей С57В16 и селезенки мышей СВА; клетки
лимфоузлов, селезенки) является более высокая выживаемость ле­
тально облученных животных, гибель в более поздние сроки, от­
сутствие признаков вторичной болезни либо развитие ее в более
поздние сроки с менее активным течением, отсутствие инактива­
ции несингенными лимфоцитами СКК.
Это дало основание заключить, что под влиянием криокон­
сервирования изменяются иммуннобиологические свойства кле­
ток и осуществляется переход биологических объектов в качес­
твенно новое состояние, обеспечивающее формирование рубцов с
косметическим эффектом и сверхвыживаемость.
Особенно четко появление качественно новых свойств охлаж­
денных и криоконсервированных гемопоэтических клеток проя­
вилось при использовании активаторов обменных процессов. Ру­
ководствуясь принципами доказательной медицины, очевидно,
можно предположить, что в процесс криоконсервирования «включи­
лись» механизмы криообновления, которые обеспечили качест­
венный скачок в реакции реципиентов на криоконсервированный
трансплантат.

67

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

2.3.2. Реакции криоконсервированных гемопоэтических клеток
на активаторы обменных процессов

Нами изучено стимулирующее действие лецитина, метионина и
MgCl2 в ядерных клетках донорского и посмертного костного моз­
га, заготовленного от скоропостижно умерших людей в первые
3—6 ч с момента смерти. Исследовали пробы костного мозга
(взвесь ядросодержащих клеток в растворе ЦОЛИПК-3) незамо­
роженные и после криоконсервирования. В размороженные клет­
ки добавляли активаторы ферментов — лецитин, метионин и
MgCl2. Установлено повышение активности СДГ при использова­
нии указанных добавок (рис. 16). MgCl2 и в еще большей степени
лецитин и метионин увеличили активность энзима, но не восста­
новили ее до контрольных величин. Добавление в размороженные
клетки костного мозга цитохрома с и холинхлорида позволило
увеличить активность СДГ (маркера жизнеспособности клеток)
выше исходного уровня. Другие авторы исследовали эритроциты
14—21-суточного срока хранения при 4 °С после восстановления
метаболитами углеродно-фосфорного обмена (аденин, инозин,
пируват и фосфат натрия) и подвергнутых криоконсервированию
[4]. В результате инкубации с перечисленными метаболитами
эритроцитной массы после 14 и 21 сут хранения все основные по­
казатели восстанавливались до контрольного уровня (рис. 17). Со­
держание 2,3-ДФГ достигло контрольного уровня, а АТФ и Р50
превосходило его и достигало 130 %. Содержание АТФ в восста­
новленных и криоконсервированных эритроцитах несколько пре­
высило его уровень в контроле (Р < 0,05). Таким образом, восста­
новленные эритроциты по биохимическим показателям не усту­
пают контролю, а по некоторым — превосходят его.
Особого внимания заслуживают работы по восстановлению
биоэнергетических процессов с помощью цитохрома с в связи с
той ролью, которую он играет в цепи биологического окисления, а
также в механизмах обновления и криообновления. Известно, что
цитохромы в организме выполняют роль ферментов, катализи­
рующих реакции окисления—восстановления и служат перенос­
чиками электронов. Цитохромы обнаружены во всех животных и
растительных клетках. В клетке цитохром с в виде комплекса с
фосфолипидами находится в мембранах митохондрий. Поэтому
выделение цитохрома с либо вхождение его в клетку возможно толь­
ко при условии нарушения проницаемости клеточной мембраны.
Из всех цитохромов (Ь, с, c1, a, ai) единственный полученный в
кристаллическом виде — это цитохром с. Это гемопротеид с мол.

68

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Рис. 16. Стимулирующее действие лецитина, метионина и MgCl2 в клетках
донорского и посмертного костного мозга, заготовленного от скоропостиж­
но умерших людей в первые 3-6 ч с момента смерти [151]:
1 — без добавок; 2 — лецитин; 3 — метионин; 4 — MgCl2; 5 — цитохром c; 6— цитохром
c + холинхлорид

массой 1300 Да. Доказано, что цитохром с является гетерогенным
и содержит по крайней мере 4—5 фракций.
Ранее мы установили, что после криоконсервирования кост­
ного мозга в наибольшей степени снижается активность ЦХО.

69

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 17. Криоконсервирование эритроцитной массы [4]

Активность СДГ значительно снизилась только в зрелых грануло­
цитах. На активность НАД-, НАДФ · Н2-ДГ и Г-6-ФДГ криокон­
сервирование повлияло меньше. Так как активность ЦХО отра­
жает интегральный процесс переноса электронов, угнетение реак­
ции ЦХО, по всей вероятности, можно объяснить как ингибиро­
ванием самого фермента, так и предшествующих ЦХО звеньев

70

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

электронно-транспортной цепи, а также повреждением клеточ­
ных структур. Для выявления и уточнения возможных поврежде­
ний провели количественную и качественную оценку клеток кост­
ного мозга, а также анализ предшествующих ЦХО звеньев дыха­
ния. При цитологическом исследовании миелокариоцитов грубых
изменений их структуры, приводящих к разрушению клеток, не
выявили. Анализ активности упомянутых выше энзимов также
свидетельствовал о незначительном их повреждениии. Следователь­
но, угнетение цитохромоксидазной реакции не могло быть связа­
но с повреждением клеточных структур либо с уменьшением ак­
тивности изученных энзимов.
Для дальнейшего уточнения и анализа состояния конечного
звена цитохромной цепи в среду инкубации добавляли цито­
хром с. Выявлено полное восстановление активости ЦХО, что
свидетельствует о чувствительности ее к действию криоконсер­
вирования. По-видимому, снижение активности ЦХО обусловлено
активацией апоптотических процессов, в которых ведущую роль
играет выход цитохрома с из митохондриальных мембран. Это
обусловлено тем, что вместе с цитохромом с из митохондрий вы­
ходят проапоптозные факторы и их ингибиторы, влияющие на ак­
тивацию каспаз.
Известно, что ряд патологических состояний организма (ра­
диационные поражения, гипоксия, ожоговый шок и др.) сопро­
вождается серьезным нарушением окислительного фосфорилиро­
вания и дыхания, что наиболее подробно представлено в работах
[115, 133, 134, 145, 148, 211]. Одна из возможных причин наблю­
даемого явления — потеря митохондриями цитохрома с. После до­
бавления к митохондриям облученной селезенки цитохрома с об­
наружено повышение отношения фосфор/кислород. Такое явле­
ние названо «цитохромный эффект» [396]. Дальнейшие исследо­
вания в этом направлении позволили автору сделать вывод, что
облучение вызывает в митохондриях селезенки дефицит цитохро­
ма с. Причем полученный эффект не был связан с простым отмы­
ванием цитохрома с от митохондрий. Он указывал, скорее, на
инактивирующий характер радиации, чем на ослабление связи с
липидами и простое отмывание цитохрома с в результате повыше­
ния проницаемости мембран. Стимулирующий эффект цитохрома с
заключается в следующем: в митохондриях печени облученного
организма вследствие действия проникающей радиации частично
разрушается эндогенный цитохром с, что приводит к нарушению
функциональной активности митохондрий. Добавление к облу­
ченным митохондриям цитохрома с нормализует их способность

71

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

осуществлять окислительное фосфорилирование [134]. По мне­
нию автора, экзогенный цитохром с встраивается в разрушенную
радиацией архитектонику митохондрий, причем в те места, кото­
рые ранее занимал эндогенный цитохром с. Далее он блокирует
активацию каспаз и выход из митохондриального матрикса апоп­
тотических белков.
Приведенные данные побудили нас использовать «цитохром­
ный эффект», закодированный в геноме, в качестве необходимо­
го компонета при изучении новых консервантов. Было прове­
дено две серии экспериментов. В первой серии размороженные
гемопоэтические клетки хранили при температуре 4 °С без до­
бавления цитохрома с; во второй серии к аналогичным пробам
миелокариоцитов добавляли цитохром с в концентрации 1,2 ×
х 10^9 мМ. Исследование сохранности размороженного донор­
ского и посмертного костного мозга показало, что хранение от­
таянных клеток в суспензии ПЭО-400 без добавления цитохрома
с приводит к быстрой гибели миелокариоцитов. Через 5 сут в ука­
занном растворе осталось лишь 34 % сохраненных миелоидных
клеток. Включение в консервирующий раствор цитохрома с спо­
собствовало лучшей морфологической сохранности гемопоэти­
ческих клеток. Защитный эффект цитохрома с после воздействия
низких температур связан, очевидно, с его прямым действием на
клеточные структуры миелокариоцитов и нормализацией энерге­
тики последних.
Более выраженный «цитохромный эффект» проявляется тог­
да, когда цитохром с находится во взаимосвязи с фосфолипидами,
в частности с холинхлоридом. Холин входит в состав лецитина,
участвует в процессе синтеза фосфолипидов. Как показали наши
наблюдения, восстановленные после криоконсервирования с по­
мощью цитохрома с и холинхлорида и находящиеся в условиях ги­
потермического хранения клетки костного мозга и эмбриональ­
ной печени по активности СДГ превосходят незамороженные (вы­
раженный «цитохромный эффект», рис. 18). Примечательно, что
СДГ под влиянием гипотермических температур сохраняет актив­
ность соответственно до 10—21 сут. Аналогично этому восстанов­
ленные после криоконсервирования длительных сроков хранения
(3—10 лет) с помощью цитохрома с и холинхлорида, находящиеся
в условиях гипотермии клетки костного мозга по активности
СДГ превосходят незамороженные (выраженный «цитохромный
эффект», рис. 19). При этом активность СДГ под влиянием гипо­
термии сохраняется до 15 сут (сутки в контроле), после восстанов­
ления — до 21 сут.

72

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Рис. 18. Восстановление функциональной активности размороженных клеток
костного мозга с помощью активаторов обменных процессов [154]

Помимо химических стимуляторов для восстановления функ­
циональной активности криоконсервированных клеток используют
и физические средства. Как показали наши наблюдения, заморажи­
вание гранулоцитов и эритроцитов в постоянном магнитном поле
(ПМП) способствует значительно большему сохранению SH-rpyππ,
ЦХО, СДГ и Г-6-ФДГ по сравнению с замораживанием вне магнит­
ных полей (рис. 20). При этом гетерогенность популяции уменыпае­

73

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 19. Восстановление функциональной активности размороженных клеток
костного мозга и эмбриональной печени после длительных сроков хранения
при −196 °С [10, 154]

тся вследствие элиминации клеток с низким содержанием SH-групп.
Появляются лейкоциты с высоким их содержанием.
Мы считаем, что ПМП, активируя реакции программирован­
ной жизни охлажденной и криоконсервированной клетки, сни­
жает дегидратационную способность эритроцитов и гранулоци­
тов, вызванную действием низких температур, и, таким образом,
препятствует конформационным изменениям белковых молекул,
предупреждая образование дисульфидных связей [152]. Озвучива­
ние клеточных суспензий в процессе отогрева и после него умень­
шает активность АТФазы и увеличивает в 1,2 раза активность ЦХО

74

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Рис. 20. Криоконсервирование лейкоцитов и эритроцитов в ПМП [152]

[34, 35]. Цитохимические изменения коррелируют с морфологи­
ческими и биохимическими данными, поэтому активность ЦХО
может служить маркером магнитного эффекта, а ЦХО и АТФазы — маркерами ультразвукового эффекта.
В последние годы появился ряд публикаций о стимулирую­
щем подобно ПМП действии малых доз озона на функциониро­

75

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

вание различных биологических систем. Ученые ИПКиК НАН
Украины В.Д. Зинченко, А.В. Зинченко, Н.Г. Кадникова и др.
исследовали влияние озона на динамику роста микроорганиз­
мов, а также на динамику гемолиза эритроцитов в процессе хра­
нения их при 4 °С. При этом проводили сравнительный анализ
для образцов, не подвергавшихся замораживанию и заморожен­
ных до -196 °С с последующим отогревом. Кроме того, исследо­
вали влияние озона на соотношение лигандных форм гемоглоби­
на в эритроцитах, хранившихся в гипотермических условиях при
4 °С. Полученные результаты позволяют заключить, что стиму­
лирующее действие озона на оксигенацию гемоглобина носит
четкий дозозависимый характер, и наблюдаемые эффекты дей­
ствия озона, по всей вероятности, не связаны с сильными кон­
формационными изменениями гемоглобина. В целом на примере
микроорганизмов экспериментально показано, что под влия­
нием определенных малых доз озона динамика восстановления
биологических функций после замораживания—оттаивания ус­
коряется. Установлен факт повышения под действием озона ус­
тойчивости эритроцитов к гемолизу после замораживания—от­
таивания. Обнаружено, что в эритроцитах после гипотермичес­
кого хранения обработка клеток озоном приводит к увеличению
относительного содержания оксигемоглобина. Все эффекты дей­
ствия озона носят дозозависимый характер.
Разработан озоновый стерилизатор, работающий в замкнутом
режиме с рециркуляцией газа через стерилизационную камеру, не
допускающий выхода озона в атмосферу. В стерилизаторе исполь­
зован генератор озона на барьерном разряде. Концентрация озона
в озоновоздушной смеси близка к предельно получаемой в разряд­
никах подобного типа из неосушенного атмосферного воздуха.
Стерилизатор допускает также использование чистого кислорода,
что позволяет избежать присутствия в камере оксидов азота и ор­
ганических загрязнений, которые могут попасть в нее из атмос­
ферного воздуха. Авторы считают, что предлагаемая технология
стерилизации может быть применена для обработки низкотемпе­
ратурных хранилищ большого объема и сосудов Дьюара, исполь­
зуемых для хранения криоконсервированного материала.
Известно, что существующие в настоящее время представле­
ния о механизмах дезинфицирующего действия озона в отноше­
нии бактерий, вирусов и грибов во многом строятся на основании
предположения о повреждении озоном жизненно важных белко­
вых комплексов и мембран. В этой связи перспективны исследо­
вания взаимодействия озона с биополимерами. Изучено действие

76

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

озона на сывороточный альбумин в водном растворе. Из калори­
метрических исследований следует, что в процессе озонирования
молекулярная структура альбумина разрушается. Характер зависи­
мости этого эффекта от концентрации озона весьма сходен с кон­
центрационной зависимостью эффективности инактивирующего
действия озона на микроорганизмы. По спектрам флюоресценции
можно заключить, что деструктивные изменения белка после об­
работки озоном происходят с разрушением глобулы вплоть до
уровня отдельных аминокислот.
Перевиваемая культура. Наиболее удобной моделью, отличаю­
щейся высокой чувствительностью к изменению условий сущест­
вования и действию самых разнообразных факторов химической и
физической природы, является клеточная культура. Перевиваемые
линии клеток характеризуются морфологической однотипностью
клеточных элементов, значительным сходством метаболизма и цитофизиологических показателей. Таким образом, изучение влияния
низких температур непосредственно на клетку, проводимое на куль­
туре клеток, позволяет выявить изменения клеточных и субклеточ­
ных структур, установить, каким образом ядерный аппарат реаги­
рует на условия криоконсервирования, как изменяется темп проли­
ферации, появляются аномалии митоза и т. д.
Для решения вопроса о том, какие цитохимические измене­
ния происходят в клетках после замораживания—оттаивания с
ПЭО-400 и оксиэтилированным глицерином (ОЭГ) в восстанови­
тельный период в клетках культуры перевиваемой линии почки
овцы определили активность центрального фермента цикла Креб­
са (СДГ) и гликолитических (ЛДГ, а-ГФДГ) [196].
Установлено, что через 24 ч роста для СДГ характерна умерен­
ная реакция (рис. 21, см. вклейку), СГК составляет 0,81 ± 0,02.
Два других фермента отличаются по интенсивности реакции: ЛДГ
обладает от умеренной до выраженной реакции (рис. 22, см. вклей­
ку), α-ГФДГ — от умеренной до низкой (рис. 23, см. вклейку).
СГК составил соответственно 2,01 ± 0,04 и 0,85 ± 0,03. Через 48 ч
роста активность СДГ и α-ГФДГ снизилась соответственно на 16
и 19 %, в то время как активность ЛДГ повысилась на 10 %. Через
24 ч роста клеток, криоконсервированных с ПЭО-400, активность
СДГ и α-ГФДГ уменьшалось соответственно на 19 и 15 %, актив­
ность ЛДГ увеличивалась на 36 % по сравнению с контролем (не­
замороженные клетки). Такая же тенденция отмечена и через 48 ч
роста. Активность СДГ и α-ГФДГ снизилась соответственно на 22
и 32 %; активность ЛДГ повысилась на 51 % (рис. 24, см. вклейку).
Через 24 ч роста клеток, криоконсервированных с ОЭГ, наблюда­

77

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 28. Криоконсервиро­
вание (−196 °С) с ПЭО-400
клеток перевиваемой куль­
туры (СПЭВ, почки овцы)
[151, 196]

лось уменьшение активности СДГ на 12 % (рис. 25, см. вклейку),
α-ГФДГ на 16 % и небольшое (на 7 %), но достоверное увеличение
активности ЛДГ (рис. 26, см. вклейку). Через 48 ч роста установле­
но дальнейшее снижение активности α-ГФДГ на 15 % и повыше­
ние активности ЛДГ на 56 %. Активность СДГ не претерпевала су­
щественных изменений (рис. 27, см. вклейку). Аналогичные резу­
льтаты получены при использовании криопротектора ПЭО-400
(рис. 28).
В целом при исследовании биоэнергетических процессов в
клетках перевиваемой культуры после криоконсервирования вы­
явлена компенсаторная роль гликолитического цикла.
Сперматозоиды. Считают, что изменения, происходящие в
спермиях при криоконсервировании, довольно сложны и до кон­
ца не изучены. Наиболее легко повреждающимися структурами
спермия на различных этапах криоконсервирования являются
мембрана, акросома, шейка. Мембранный аппарат представляет
собой существенный элемент структуры мужских гамет, способ­
ный осуществлять рецепцию, а также активный и пассивный пе­
ренос веществ в системе клетка—среда.
Установлено, что в процессе кроконсервирования в биоэнер­
гетике клетки происходят большие изменения. Так как в отличие
от ядра плазматическая мембрана и акросома спермиев представ­
ляют собой липопротеидные и гликопротеидные образования, со­
держащие много воды, они являются лабильными структурами и в
первую очередь подвергаются криогенным изменениям. Одной из

78

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

наиболее лабильных структур в процессе криоконсервирования
считают мембрану спермиев. Нарушение проницаемости мембран
при гипотермии и криоконсервировании спермы приводит к утеч­
ке из спермиев ряда ферментов и увеличение их активности в
спермальной плазме. Степень утечки ферментов из спермиев за­
висит от вида животных, локализации ферментов и прочности
связывания его со структурами спермиев, состава используемой
среды, криопротектора и режима замораживания. Доказано, что
действие низких температур — основной пусковой момент раз­
вития нарушений, влияющих на энергообеспечение клетки и
состав внутриклеточной среды. Процесс дыхания в спермиях в
основном не отличается от такого же процесса в других клетках
организма.
Основными компонентами, участвующими в дыхании спер­
миев, являются: ЦХО, дегидрогеназы, три цитохрома (o1, b и с) и
рибофлавин. Распад вещества при дыхании клеток, как правило,
начинается с выделением водорода. Под влиянием дегидрогеназы
он активируется, а затем с помощью флавинового фермента и ци­
тохромов водород переносится на ЦХО, которая соединяет его с
кислородом. Цитохромы и все ферменты, участвующие в дыхании
спермиев (ЦХО, дегидрогеназы, АТФаза), сосредоточены в хвос­
товой части спермия, в меньшем количестве — в средней его части
и отсутствуют в головке. Биологические и биохимические процес­
сы в спермиях до оплодотворения совершаются исключительно в
хвостовой части; процессы дыхания и гликолиза в основном про­
текают в шейке, теле и хвосте спермиев: чем продолжительнее
процесс дыхания, тем оно становится слабее и значительно зави­
сит от температуры: снижение температуры на 100 °С понижает
уровень дыхания приблизительно в 2 раза. При 0 °С дыхание спер­
миев продолжается, но крайне слабо. В значительной степени ды­
хание спермиев зависит от фермента ЦХО.
Система транспорта электронов и содержание фосфолипидов
образуют взаимосвязанный комплекс. Поэтому несомненный ин­
терес представляют работы по изучению влияния криоконсервиро­
вания на фосфолипиды спермиев. Исследованы фосфолипиды и их
жирные кислоты спермиев индюка и белого амура, которые замо­
раживали до -196 °С [84]. Показано, что под влиянием криоконсер­
вирования содержание суммарных фосфолипидов существенно
уменьшается в основном в спермиях белого амура (до 35 %). Это
коррелирует со снижением процента подвижных спермиев.
Наряду с изучением состояния фосфолипидов в криоконсер­
вированных спермиях индюка и белого амура мы исследовали

79

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

биоэнергетические процессы в спермиях человека, о которых су­
дили по изменению активности СДГ, согласно рекомендациям
[347] в нашей модификации, и влиянию на этот процесс цитохро­
ма с. При изучении характера локализации и уровня активности
фермента установлено, что в контроле продукт реакции на СДГ
выявляется в виде мелких одиночных гранул диформазана на фо­
не слабодиффузного прокрашивания цитоплазмы (рис. 29, а, см.
вклейку). Характер реакции изменяется в зависимости от клеточ­
ной дифференцировки. В незрелых формах спермиев имеет место
укрупнение гранул, сливающихся между собой, и более интенсив­
ное прокрашивание цитоплазмы (рис. 29, б, см. вклейку). Значе­
ния СГК в контрольных образцах указывали, что по мере созрева­
ния клеток активность энзима снижается. Так, в незрелых элемен­
тах активность СДГ составила 2,89 ± 0,1, в зрелых — 1,42 ± 0,04.
Обращает на себя внимание гетерогенность популяций в зависи­
мости от того или иного донора: образцы одних доноров содержат,
в основном, зрелые формы спермиев; других — почти равные ко­
личества тех и иных; третьих — почти все незрелые формы. В не­
зрелых спермиях продукт реакции на СДГ, как правило, грубый,
диффузный, часто образуются конгломераты. В незрелых и зрелых
спермиях, находящихся в соотношении 10 : 90, продукт реакции
на СДГ соответствует описанному выше. После гипотермического
хранения (8 °С) в течение суток характер и локализация продукта
реакции на СДГ существенно не изменились. Активность фермен­
та в незрелых спермиях составила 1,8 ± 0,14. По сравнению с кон­
тролем активность СДГ снизилась на 36 %. В зрелых спермиях ак­
тивность фермента не изменилась. После 2 и 3 сут гипотермичес­
кого хранения активность СДГ в незрелых и зрелых спермиях не
изменилась и составила 1,80 ± 0,02, в зрелых — 1,33 ± 0,02.
Для повышения функциональной активности спермиев быков
использовали химические и физические методы стимуляции, на­
пример препараты амилазы и каталазы [35, 101, 113, 156, 157].
Отмечено повышение оплодотворяющей способности и переживаемости спермиев, хранившихся при -4 и -196 °С, после стиму­
ляции их аденозинфосфорными соединениями и цистеином. Сог­
ласно нашим данным, полученным совместно с М.И. Крамар, ци­
тохром с, добавленный в клетки размороженного костного мозга,
до 3 сут повысил их устойчивость к гипотермическому хранению
(против суток в контроле) [113] (рис. 30 ). Эти данные послужили
основнием для использования «цитохромного эффекта», основан­
ного на активации процессов обновления и криообновления, при
гипотермии спермиев. Некоторые эякуляты (в количестве 10) хра­

80

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Рис. 30. Активность СДГ в спермиях человека, восстановленных с помощью
цитохрома с, до и после гипотермического хранения [8, 113, 245]

нились 5 сут, что, вероятно, можно объяснить большей индиви­
дуальной устойчивостью к гипотермическому хранению. К 5-м
суткам наблюдали более выраженную гетерогенность распределе­
ния продукта реакции: от слабой до сильной. Конгломераты ста­

81

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

ловились более выраженными, обширными и многочисленными
по сравнению с хранившимися 3 сут. Начиная с 1-х суток гипотер­
мического хранения происходил отбор полноценных зрелых спермиев за счет элиминации незрелых и к 5-м суткам они исчезли.
Остались зрелые спермин со слабой и умеренной реакцией на
СДГ. При добавлении цитохрома с в суспензию спермиев челове­
ка, хранившихся 5 сут, интенсифицируются реакции на СДГ от
умеренной до выраженной.
Для изучения механизма действия цитохрома с к суспензии
активно подвижных спермиев добавляли разобщитель дыхания и
фосфорилирования 2,4-динитрофенол в количестве 5 ∙ 10^3 М, ос­
тавляя при комнатной температуре [113]. Оказалось, что спустя 3
мин после добавления разобщителя движение спермиев прекра­
щалось. Предположили, что разобщение дыхания и фосфорили­
рования лежит в основе нарушения подвижности спермиев при их
длительном гипотермическом хранении. Для уточнения этих дан­
ных к суспензии спермиев добавляли разобщитель дыхания и фос­
форилирования. Через 3 мин клетки теряли способность к движе­
нию. Спермин несколько раз отмывали от разобщителя раствором
Тироде с 15%-й сывороткой и добавляли цитохром с в количестве
2,4 ∙ 10^3 М. Через 3—5 мин подвижность спермиев восстанавлива­
лась до контрольного уровня. Полученные данные позволили сде­
лать вывод о том, что при длительном гипотермическом хранении
наступает разобщение дыхания и фосфорилирования, так как при
добавлении цитохрома с подвижность клеток восстановилась так
же, как и при добавлении цитохрома с после внесения разобщите­
ля дыхания и фосфорилирования 2,4-динитрофенола.
Ткани и органы. Холод как эффективное средство облегчения
боли и лечения травм и воспалительных процессов использовали
еще древние греки. Однако широкое применение во многих об­
ластях медицины этот метод получил только в 1981 г. С помощью
криохирургии достигается деструкция ткани с последующим нек­
розом, отделением струпа, быстрой эпителизацией площади по­
верхности раны, минимальным фиброзом и рубцеванием. На об­
работанном участке отмечается полный гемолиз и быстрая им­
мобилизация всех клеток, включая клетки злокачественных опу­
холей. Наблюдается также иммунный ответ всего организма при
разрушении ткани. Согласно нашим данным, криоаппликация
создает условия для лучшего очищения ран и способствует разви­
тию грануляционной ткани. Все это указывает на различие зажив­
ления гнойных ран после криовоздействия по сравнению с контро­
лем (рис. 31) [177].

82

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Рис. 31. Морфофункциональные особенности гнойных ран после криовоздей­
ствия

Исследование лейкоцитов с функционально активными ка­
тионными белками (КБ) показало, что в ранах больных, подверг­
нутых криовоздействию, активность КБ была выше и раны быс­
трее очищались от микроорганизмов [177, 223]. Уже через сутки
после криовоздействия на раневую поверхность выявлено 57 %

83

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 32. Активность КБ в ранах больных (а) и экспериментальных животных
(б, в), подвергнутых криовоздействию:
а — больные; б — кролики, раны которых инфицированы золотистым стафилококком;
в — кролики, раны которых инфицированы кишечной палочкой

лейкоцитов с активными КБ, в то время как в контрольных ранах
лишь 29 % лейкоцитов содержали активные КБ (рис. 32). Через
3 сут после криовоздействия количество лейкоцитов, обладающих

84

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

антимикробной функцией, увеличилось до 79 %; в контрольной
группе за аналогичный период этот показатель составил 65 %. На
6-е сутки после криовоздействия на раневую поверхность актив­
ность КБ лейкоцитов оставалась на прежнем уровне (78 %).
Активность КБ лейкоцитов контрольной группы составила 57 %.
Итак, холодовое воздействие на раневую поверхность позво­
лило на несколько (до 3) суток ускорить активный процесс внут­
риклеточного поглощения и переваривания микроорганизмов
[177]. Одновременно после криовоздействия в ранах наблюдалось
более раннее образование грануляционной ткани. Ее островковое
расположение отметили через 3—4 сут (в контроле этот показатель
составил 5—7 сут). Очищение ран от гнойно-некротических масс в
группе с холодовым воздействием наступил через 3—8 сут, вместо
11 сут в контроле. Это позволило сократить время пребывания боль­
ного в стационаре до 4—9 койко-дней, в контрольной группе —
12,3 койко-дня.
Аналогично, под воздействием замораживания (-160 ÷ -165 °С)
стимулировались процессы регенерации тканей области надмы­
щелков плечевой кости, улучшалась микроциркуляция за счет но­
вообразованных капилляров [92]. Разработанный автором способ
лечения эпикондилитов плеча методом криовоздействия позволил
значительно сократить сроки нетрудоспособности, снизить часто­
ту рецидивов. Низкотемпературное воздействие сокращает время
послеожоговой гипертермии тканей крыс, стабилизирует сосудис­
то-тканевую циркуляцию, снижает токсичность ожогового некро­
за [96]. Лечение холодом оптимизирует уровень воспалительной
реакции в тканях и активирует процессы репарации, что умень­
шает сроки очищения ожоговых ран и существенно ускоряет их
заживление. Способ дозированного местного охлаждения в кли­
нических условиях способствует ускоренному очищению и более
быстрой эпителизации ожоговых ран, что приводит к сокращению
сроков лечения больных. Воздействие на обожженную кожу умень­
шает гипоксическое состояние тканей, о чем свидетельствует вы­
явленный в них более высокий уровень активности центрального
фермента цикла Кребса — СДГ [36]. Криовоздействие оказывает
стимулирующее влияние и на процессы восстановления других
тканей: печени, слизистой двенадцатиперстной кишки, небных
миндалин, вовлеченных в воспалительно-дегенеративный про­
цесс [178].
Как показали наши наблюдения, образование рубцово-заме­
щенной поверхности сопровождается усилением регенерации
после криоохлаждения шейки матки гинекологических больных, в

85

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

результате чего стенки сосудов утолщались и уменьшались их
просветы [59]. Наблюдалась также более активная пролиферация
клеточных элементов роговой оболочки после сочетанного дей­
ствия криоаппликации и криоконсервирования в условиях ауто- и
аллотрансплантации [30]. В криоконсервированном лоскуте мито­
тический индекс был равен 26 %, что почти в 3 раза превышало
индекс контроля. При термических ожогах роговицы уже спустя
24 ч начинается развитие коллагенолиза и активность его увели­
чивается до 11-х суток. Применение криотерапии в раннем перио­
де термического ожога роговицы предупреждает распространение
коллагенолиза. Применение криотерапии в более позднем перио­
де, когда уже разрушились коллагеновые волокна, задерживает
коллагенолитическую активность.
Показано, что криовоздействие парожидкостным обдувом или
аппликацией специальным устройством на суставной хрящ жи­
вотных (белых крыс, кроликов, собак), у которых моделировали
деструктивно-дегенеративный процесс типа деформирующего ар­
троза, приводит к изменениям структуры суставного хряща, субхондриальной зоны эпифиза и суставной капсулы, которые имеют
деструктивный и репаративный компонент [163]. Особенности
криовоздействия авторы видят в таких изменениях структуры мак­
ромолекулярной организации межклеточного матрикса, которые
создают благоприятные условия для восстановительных процес­
сов. На протяжении периода наблюдения после криовоздействия
определено преобладание репаративных процессов, которые, про­
текая в условиях функционирующего сустава, ведут к перестройке
суставного хряща с восстановлением дефектов хрящевой ткани,
перестройке субхондриальной кости с компактизацией структуры,
что обеспечивает выполнение суставом его биохимической фун­
кции. Опыт применения криовоздействия в комплексе оператив­
ного лечения больных с деформирующим артрозом III—IV степе­
ни методом реконструктивных операций с артропластикой пока­
зал аналгезирующее, противоотечное влияние криовоздействия,
возможность раннего включения функции сустава и сокращение
сроков реабилитации его структуры и функции.
Поскольку дегенеративно-дистрофические заболевания поз­
воночника часто сопровождаются нестабильностью в межпозво­
ночном сегменте, образование корпородеза (хрящевого сращения
прилегающих позвонков) является необходимым условием их ус­
пешного лечения. Обычно изучение морфологии ткани межпозво­
ночного диска проводят после воздействия таких физических и
химических факторов, как ультразвук, механическое поврежде­

86

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

ние, гидрокортизон, трипсин и др. Морфологические изменения
тканей межпозвоночного диска после криовоздействия показали,
что первичная структура дисков не востанавливается [122]. Репа­
ративная регенерация сопровождается глубокой перестройкой
тканей диска и формированием рубцового и костно-хрящевого
сращения прилегающих позвонков (корпородеза). В контроле
(механическое повреждение), в отличие от криовоздействия, раз­
виваются дистрофические процессы на ограниченном участке
тканей, морфологическая, гистохимическая и рентгенологическая
картина которых сходна с изменениями при заболевании остео­
хондрозом.
Итак, после криообработки гнойных ран, криовоздействия на
обожженную кожу и другие ткани (суставной хрящ, межпозвоноч­
ный диск) активируются процессы репарации и регенерации, умень­
шается гипоксическое состояние тканей, усиливается бактери­
цидная функция лейкоцитов раневого отделяемого, уменьшается
микроциркуляция за счет новообразованных канальцев, что ха­
рактеризует качественно новое состояние биологических объектов
после криоохлаждения. Оно обусловлено активацией процессов
программированной жизни охлажденной и криоконсервированной клетки. Об этом же свидетельствует глубокая перестройка
тканей в процессе репарации и регенерации: образуются тонково­
локнистые рубцы вместо грубых, келоидных в контроле, осущест­
вляется компактизация структуры субмитохондриальной кости и
формируется корпородез вместо развивающихся дистрофических
процессов в контроле.
В последние годы одним из направлений в клеточной терапии
является использование препаратов фетальной ткани, активирую­
щих процессы обновления и криообновления [1, 64, 65, 67, 69, 97,
120, 125, 170, 198, 199]. Проведено комплексное сравнительное
экспериментальное исследование действия низких температур на
биологические свойства фетальных препаратов (печени, мозговой
ткани, плода, хориона плода человека 10 и 24 недель гестации) и
их влияния на функциональное состояние гепатоцитов крыс в мо­
дельных системах in vitro и in vivo [198, 199]. При введении крио­
консервированных препаратов печени животным с эксперимен­
тальным гепатитом снижаются интенсивность процессов ПОЛ,
показатели цитолиза, холестаза, уменьшается накопление токси­
ческих продуктов обмена, нормализуются регуляторно-гомеоста­
тические функции. Благоприятные морфофункциональные изме­
нения при использовании фетальной ткани хорошо прослежи­

87

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

ваются и при ожоговой болезни, развивающейся на фоне обшир­
ной термической травмы (более 10 % тела) [44].
Показано, что ожоговая поверхность, обработанная биопрепа­
ратами (криоконсервированные ткани хориона, криоконсервиро­
ванная измельченная плацентарная ткань, культивированные ал­
логенные кератиноциты и фибробласты), оставалась чистой, без
выраженной плазмореи. На участках, закрытых эмбриональными
эпителиальными клетками и криоконсервированной тканью хо­
риона, заживление раны происходило значительно быстрее, чем
без него. Поверхность раны в местах глубокого поражения кожи
закрывалась равным слоем гранулезной ткани, внутри которой
просматривались участки с разрастанием терминальных петель
сосудистой сети. Сделано предположение о возможной миграции
и пролиферации стволовых клеток, содержащихся в хорионе и
плаценте, в области раны. В результате этих процессов авторы
наблюдали образование специализированной грануляционной
ткани и соединительно-тканных элементов.
Таким образом, включение терапии биологическими препа­
ратами в схему лечения ожоговой болезни позволяет стимулиро­
вать репаративные и регенеративные процессы в организме; сок­
ратить сроки и тяжесть инфекционно-воспалительного процес­
са; устранить или снизить проявления вторичных осложнений;
изменить характер заживления раны и достичь приживления
аутологичной кожи без развития аутоиммунных реакций. Все пе­
речисленные благоприятные изменения хода заживления ожого­
вых ран являются приоритетом процессов обновления и криооб­
новления.
Аналогичное действие оказывает препарат криоконсервиро­
ванной сыворотки кордовой крови «Криокорд-С», который, в час­
тности, применяют для эффективного лечения больных с синдро­
мом диабетической стопы [170]. Экспериментально изучена его
эффективность [125]. Препарат нормализует метаболические из­
менения, улучшает показатели иммунитета по сравнению с кон­
трольной группой, ускоряет регенеративные процессы, заживле­
ние ран и сроки лечения до 15 сут. Криокорд-С используют также
для иммунокорекции больных гнойно-септической патологии
[231]. Установлено выраженное иммуностимулирующее действие
препарата, его положительное влияние на ход заболевания и пос­
ледствия лечения, динамику раневого процесса. Использование
криокорда-С, активирующего процессы обновления, способству­
ет улучшению хода раневого процесса, ускоряет процессы репара­
ции и регенерации в среднем на 3—5 сут.

88

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Другой препарат «Гемонейронал» содержит криоконсервиро­
ванные клетки печени и нервной ткани эмбрионов человека [68].
Комбинированный эмбриональный клеточный препарат как на­
тивный, так и криоконсервированный обладает большей кластеро- и колониеобразующей способностью, чем соответствующий
препарат, состоящий только из эмбриональных гемопоэтических
клеток. В препарате помимо цитокинов и антиоксидантов, запус­
кающих программированную жизнь клетки, присутствуют гормо­
ны (11-ОКС), обладающие противовоспалительным действием.
Все перечисленные активаторы обменных процессов «запускают»
программы обновления и криообновления.
Показано, что изолированные зрелые гепатоциты при транс­
плантации способны длительно выживать, выполнять гепатоспецифические функции и даже делиться в организме реципиента
при условии использования адекватной иммуносупрессии [279].
Ввиду низкой иммуногенности, богатства ростовыми факторами и
высочайшего пролиферативного потенциала внимание исследова­
телей в последние годы привлекают предшественники паренхима­
тозных клеток печени [273, 368]. Проведено сравнение характера
действия криоконсервированных гепатоцитов и клеток плодовой
печени на обмен и ПОЛ при аллотрансплантации кроликам с эк­
спериментальной гиперхолестеринемией [120]. Через 4 недели
после трансплантации плодовых клеток наблюдается значитель­
ная стимуляция ферментативной системы антиоксидазной защи­
ты и улучшение состояния печеночной паренхимы реципиентов.
Основными причинами снижения жизнеспособности печени
после гипотермического хранения и последующей нормотерми­
ческой реперфузии считаются нарушения энергетического статуса
клетки и развитие свободнорадикальных повреждений, особенно
после перевода печени в физиологические условия [389]. Генера­
ция АФК наряду с угнетением работы ферментных систем ан­
тиоксидантной защиты приводит к усилению пероксидных про­
цессов и нарушению нативной структуры как плазматичекой так и
внутриклеточных мембран. Помимо этого, развитие оксидативного стресса в процессе гипотермическое хранение—нормотерми­
ческая реперфузия (ГХ—HP) активирует клетки Купфера и эндо­
телиальные клетки печеночного синусоида, что вызывает наруше­
ние цитокинового баланса в печени. В этих клетках повышается
уровень экспрессии мРНК, провоспалительных цитокинов: фак­
тора некроза опухоли α(ΦHOα), интерлейкина-1 (ИЛ-1), которые
усиливают свободнорадикальное повреждение при ГХ—HP [312].

89

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Эти данные являются результатом развития апоптотических про­
цессов при ГХ—HP.
Предварительное введение крысам эмбриоспецифических
факторов, активирующих реакции программированной жизни ох­
лажденной и криоконсервированной клетки, позволяет снизить
количество свободнорадикальных продуктов и нормализовать ак­
тивность ферментов системы антиоксидантной защиты — катала­
зы, глутатионпероксидазы и редуктазы, подавляющих процессы
апоптоза [224]. Следовательно, предобработка крыс эмбриоспецифическими факторами дает возможность сдвинуть динамическое
взаимодействие апоптоза и криообновления в сторону криообнов­
ления, что определяет перспективность применения эмбриоспе­
цифических факторов, полученных из эмбриональных тканей в
качестве гепатопротектора для сохранения функциональной ак­
тивности печени при гипотермическом хранении.
Установлено, что трансплантация криоконсервированных
клеток эмбриональной печени (КЭП) и цитозоли мягких тканей
эмбриона человека не оказывает существенного влияния на ак­
тивность ферментов в сыворотке крови экспериментальных жи­
вотных [165]. В то же время трансплантация КЭП достоверно сни­
жает интенсивность пероксидных процессов на 3-й сутки после
инъекции (CC14) в сыворотке крови крыс, а цитозоль эмбриональ­
ных тканей человека оказывает кратковременное действие и эффек­
тивен только в 1-е сутки после токсического воздействия. Реакции
ПОЛ, как известно, являются результатом активации процессов
апоптоза. Вводимые препараты содержат цитокины, подавляю­
щие апоптоз, поэтому способность упомянутых выше эмбриопре­
паратов ингибировать пероксидные процессы, по-видимому, —
результат их антиапоптотического действия как одного из меха­
низмов обновления.
Репаративная регенерация костной ткани — важная проблема
травматологии и ортопедии. Эмбриональные ткани, как показал
опыт наш и других ученых, имеют более высокий пролифератив­
ный потенциал, пластичность, низкую антигенную активность по
сравнению с тканями взрослых особей. Терапевтический эффект
от эмбриональных тканей обеспечивается содержанием в них ци­
токинов, интерлейкинов и других сигнальных молекул, которые
обладают способностью подавлять программированную гибель
клетки и, следовательно, активировать программированную жизнь
клетки, что лежит в основе их лечебной эффективности. Изучено
влияние на репаративный остеогенез эмбриональной костной
ткани человека [15]. Установлено, что в условиях использования

90

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

эмбриональной костной ткани при хилых суставах у эксперимен­
тальных животных значительно улучшаются процессы регенера­
ции костной ткани. Отмечается, в основном, первичное костное
срастание, стимулирование регенерации паренхиматозно-стро ­
мальных элементов костной ткани.
Таким образом, препараты фетальной ткани продуцируют и
содержат большое количество биологически активных веществ —
цитокины, ростовые факторы. Кроме того, они содержат специ­
фические белки, пептиды, α-фетопротеин, антиоксиданты, адаптогены (противовосполительные бактериостатические соединения),
которые стмулируют иммунокомпетентные клетки. Упомянутые
биологически активные вещества служат исходным «запуском»
процессов обновления и криообновления, что лежит в основе ле­
чебной эффективности фетальной ткани.
Не менее важным направлением в клеточной терапии являет­
ся использование экстрактов нормальной кожи, которые содержат
биологически активные вещества, активирующие реакции прог­
раммированной жизни охлажденной и криоконсервированной
клетки, например экстракт шкуры новорожденных поросят, полу­
ченный из криоконсервированных фрагментов кожи с высоким
содержанием низкомолекулярных пептидов. Последние прояв­
ляют регуляторные свойства при экспериментальных поврежде­
ниях кожи лабораторных животных. Они выражаются в более вы­
соких темпах регенерации и полноценного обновления тканевых
структур. Использование криоконсервированного экстракта кожи
новорожденных поросят при холодовых повреждениях кожи сок­
ращает сроки очищения ран, уменьшает вторичные ишемические
повреждения дермы, стимулирует регенерацию эпителиального
пласта с минимальным развитием гранулезной ткани, что харак­
терно для процесссов криообновления [233]. В контрольной груп­
пе регенерация была неполной с образованием рубца, что, вероят­
но, обусловлено противоположно направленными апоптотическими процессами.
Одним из авторов (В.И. Грищенко) выявлены патологоанато­
мические изменения в слизистой оболочке и миометрии после
криообработки полости матки (рис. 33) [59]. Отмечен крионекроз
с появлением признаков разрастания соединительной ткани; об­
разование рубцово-замещенной поверхности и усиление явлений
регенерации, в результате чего стенки сосудов были более утол­
щенными и уменьшились их просветы. Наблюдались физиологи­
ческие изменения в организме: прекращение дисфункциональных
маточных кровотечений, установление нормального физиологи­

91

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 33. Патологоанатоми­
ческие изменения в сли­
зистой оболочке и миомет­
рии после криообработки
полости матки

ческого цикла. Отмечен переход ановулярных циклов, имевших
место до криообработки матки, в овулярные. Появились овуляции
у пациентов, не поддававшихся общепринятым методам терапии.
Таким образом, после криообработки полости матки усилились
регенерационные процессы и произошли сдвиги в гипоталамо-ги­
пофизарно-яичниковой системе.
Наиболее выраженное стимулирующее действие низких и
сверхнизких температур, как уже указывалось, достигается с по­
мощью «цитохромного эффекта», который обусловлен стимули­
рующим действием цитохрома с в реакциях обновления и криооб­
новления. Особенно ярко этот феномен проявил себя при кра­
ниоцеребральной гипотермии (КЦГ) животных и человека. Глубо­
кую КЦГ животных (крыс линии Вистар) осуществляли проведе­
нием наркоза с помощью оксибутирата натрия и тиопентала нат­
рия в дозах 0,8 и 0,05 г/кг соответственно, внутрибрюшинно и ох­
лаждением головы животных в краниоцеребральном гипотерме до
температуры тела 26,0 ± 0,3 °С, головного мозга — 19,6 ± 0,5 °С.
Длительность экспозиции гипотермии — 2—6 сут с последующим
самосогреванием животных.

92

13.

Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Недостаточная информативность морфологических призна­
ков, по которым традиционно судят о влиянии гипотермии на ор­
ганизм, а также отсутствие в литературе данных о внутриклеточ­
ном обмене костного мозга при краниоцеребральной гипотермии
побудили нас к исследованию некоторых интегральных цитохи­
мических показателей (СДГ, КБ, НСТ-тест), имеющих прогнос­
тическое значение при криоконсервировании. Показано, что в
клетках костного мозга, полученного у крыс, подвергшихся гипо­
термии, активность СДГ снизилась на 10—12 % по сравнению с
контролем. При этом коэффициент вариации не выходил за пре­
делы физиологических колебаний. Содержание КБ и НСТ-теста
не претерпевало существенных изменений. Цитохимическим по­
казателям соответствовала 100%-я выживаемость животных после
суточной КЦГ. Гипотермия в течение 2 сут приводила к дальней­
шему снижению активности СДГ во всех группах клеток костного
мозга на 19—21 %. В отличие от активности СДГ содержание КБ
и показатели НСТ-теста в гранулоцитах костного мозга увеличи­
лись на 10 %. При этом выживаемость животных снизилась до
80 %, что четко коррелировало с изменением цитохимических по­
казателей.
Полученные данные свидетельствуют о том, что снижение ды­
хательной функции, о которой судили по активности центрально­
го фермента цикла Кребса — СДГ, обусловлено длительностью
пребывания животных в условиях гипотермии. Увеличение содер­
жания КБ, очевидно, связано с компенсаторной активацией антибактерицидной функции гранулоцитов. Выявленная зависимость
между выживаемостью животных и цитохимическими показателя­
ми свидетельствует о прогностическом значении последних в ус­
ловиях пролонгированной глубокой КЦГ. Для подтверждения
этого всех животных разделили на две группы. Животные 1-й
группы подвергались дальнейшей гипотермии; животным 2-й
группы ежедневно в течение гипотермии вводили цитохром с
(5 мг/кг). К 3-м суткам гипотермии наступила 100%-я гибель жи­
вотных 1-й группы, по-видимому, вследствие «включения» про­
цессов программированной гибели клетки в связи с тем, что ци­
тохром с им не вводили (рис. 34). В группе животных, которым
ежедневно вводили цитохром с, к концу 6-х суток все животные
выжили и подверглись самосогреванию. Примечательно, что в
гранулоцитах крови выживших животных обнаружено увеличение
(в 2 раза) содержания КБ и показателей НСТ-теста, что, по всей
вероятности, связано с активацией антибактериальной и фагоци­
тарной функций гранулоцитов.

93

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 34. Краниоцеребраль­
ная гипотермия животных
(крысы) и человека

Таким образом, повышение устойчивости организма к бакте­
риальной флоре свидетельствует о качественно новом состоянии
биологических объектов после КЦГ, обусловленное «запуском»
процессов программированной жизни охлажденной и криоконсервированной клетки. Способность организма переходить на но­
вый, более высокий уровень гомеостаза после КЦГ подтвердили и
клинические испытания: внутривенное введение цитохрома с при
гипотермии человека сокращает продолжительность коматозного
состояния и пребывание больного в реанимационном отделении
в среднем на 3—5 сут [128, 243].
Ухудшение экологической ситуации, высокий уровень загряз­
нения продуктов радионуклвидами, пестицидами, тяжелыми ме­
таллами и другими токсическими веществами, активизирующими
программированную гибель клетки, диктуют необходимость де­
токсикации и оздоровления населения. Улучшить его здоровье
можно за счет широкого использования так называемых пищевых
добавок, содержащих биологически активные вещества, способ­
ные активизировать программированную жизнь клетки. Ученые
ИПКиК НАН Украины показали высокую эффективность таких
добавок, как молозиво коров [43, 179—181]. В состав молозива
входят иммунные факторы, ростовые гормоны, витамины, мине­

94

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

ралы, аминокислоты, ферменты. Лиофилизированное молозиво
коров содержит антиоксиданты и лактоферин, которые, как из­
вестно, подавляют апоптоз и тем самым предупреждают развитие
процессов ПОЛ в организме. С позиции программированной жиз­
ни клетки в основе эффективного использования молозива коров
лежит смещение динамического взаимодействия апоптоза и
криообновления в сторону криообновления.
Стимулирующее действие криоконсервирования — общебио­
логическое явление, так как обнаружено у ракообразных, прос­
тейших, микроорганизмов, бактерий и растительных объектов.
Простейшие микроорганизмы. Изучено стимулирующее влия­
ние криоохлаждения (-196 °С) на скорость развития зимующих
яиц (эфинниумов), а также на скорость выхода из цист некоторых
видов инфузорий [234]. Для опытов брали 300 эфинниумов Daph­
nia pulex (de Geer) и Ceriodaphnia reticulata и помещали в жидкий
азот на 5—10 мин После охлаждения их опускали в дважды фи­
льтрованную дождевую воду при комнатной температуре. Авторы
установили, что охлаждение эфинниумов до -196 °С ускоряет вре­
мя выхода дафний. Средняя разница во времени выхода из кон­
трольных и подвергнутых охлаждению эфинниумов составила 51,7
ч, в процентах — 28,7 %. Обработка цист Colpodapatella температу­
рой жидкого азота способствует более быстрому (на 10 ч) выходу
инфузорий. Зависимость между скоростью выхода инфузорий из
цист и временем охлаждения цисты инфузорий в течение 5 и
60 мин не обнаружена. Следовательно, сохранение при глубоком
охлаждении жизнеспособности и структуры исследуемых организ­
мов без видимых нарушений подтверждает точку зрения авторов о
полном прекращении жизненных процессов при замораживании
до сверхнизких температур.
Новым и важным является установленное катализирующее
влияние глубокого охлаждения на скорость выхода из цист инфу­
зорий и скорость развития эфинниумов дафний. Положительное
действие глубокого охлаждения на указанные параметры мы свя­
зываем с активацией низкими температурами процессов програм­
мированной жизни охлажденной и криоконсервированной клет­
ки, закодированные в геноме и, как упоминалось выше, имеющих
право на жизнь.
Аналогично этому при использовании дрожжевых микроорга­
низмов установлено, что сверхнизкие температуры (−180, −196 °С)
при определенных режимах обработки позволяют направленно
изменять морфофизиологические свойства и получать мутанты с
полезными биотехническими и физиологическими свойствами

95

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 35. Криоконсервирование —
генетически активный фактор [297]

[ПО]. Выделен новый биохимически активный штамм дрожжей
Махачкалинская-12-холодостойкая (M-12x), способный осущест­
влять брожение при сравнительно низких температурах (11—12 °С),
улучшать качество виноматериалов за счет большего синтеза эн­
догенных антиоксидантов, меньшего — альдегидов и летучих кис­
лот, увеличения вязкости и поверхностного натяжения, уменьше­
ния количества опалесцирующих веществ, что подтверждалось и
сенсорной оценкой (рис. 35).

96

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

Авторы показали, что криовоздействие (-180, -196 °С) вызы­
вает некролиз микроорганизмов, уменьшает количество живых
клеток до 50 %, изменяя их морфологию: в контроле клетки оваль­
ной формы, размер (7,8—10,2) × (5,4—7,9) мкм; размеры опытных
увеличились (9,2—15,4) × (6,7—8,5) мкм и приобрели шестигран­
ную, грушевидную и сигарообразную формы диаметром 3,5 см.
Штамм сбраживает и усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу; ус­
ваивает этанол, глицерин, уксусную и лимонную кислоты и др.
Этот штамм рекомендуют для использования в производстве шам­
панских виноматериалов и столовых вин.
Несомненный интерес представляют данные о криоконсерви­
ровании (-196 °С) стрептомицетов. Стрептомицеты, или лучистые
грибки, — это своеобразные микроорганизмы, сочетающие в себе
свойства бактерий и грибов. Они являются продуцентами анти­
биотиков и других биологически активных веществ. Выращивали
их на твердых питательных средах при температуре 28 °С в течение
10—14 сут [14]. Антибиотическая активность споровых культур
стрептомицетов St. aureoverticillus 875 и St. aureofactens ТБ 633 ФУ
повышалась после криоконсервирования по оптимальной прог­
рамме и хранения при -196 °С в течение 5—6 мес. Применяемые
режимы охлаждения стрептомицетов вызывали изменения мор­
фологических свойств микроорганизмов: на 2-е сутки вместо гус­
той мицелиальной сетки наблюдались и отдельные микроколонии
с молодыми гифами.
Получено также большее, чем в контроле (без низкотемпера­
турного воздействия), накопление биомассы нитчатых культур
цианобактерий Nostoc sp. АТСС 29411 и Anabiena var. АТСС 29313
[138]. Повышение метаболической активности после криоконсер­
вирования и хранения при -196 °С наблюдали у микроорганизмов
различных систематических групп: ацетилредуктазная активность
клубеньковых бактерий Bradurhizoliu laponicum 2490 возрастала в 2 ра­
за, В. sp. hepinas — в 2,5 [182]; активность и синтез алколоида элимоклавина у гриба Clavicugs sp. ВКМ F-2609 увеличивались в 1,5
раза [187]. Активность синтеза антибиотика цефалоспорина с у
штаммов-продуцентов (грибов) Acremorium chrusogenum ВНИИА
28IA и ВНИИА 305А возрастала до 112 % в сравнении с контролем
до криоконсервирования [188].
Приведенные данные мы связываем с активной деятельнос­
тью клеточного генома, направленной на «включение» механиз­
мов программированной жизни охлажденной и криоконсервиро­
ванной клетки.

97

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 36. Влияние однократного и повторного замораживания (−196 °С) на
всхожесть семян Setaria lutescens [314]

Растительные биологические объекты. Изучено влияние одно­
кратного и повторного замораживания—оттаивания на морфоло­
гию семенной оболочки, ультраструктуру зародыша и всхожесть
семян [314]. Семена замораживали в жидком азоте, выдерживали
4 мин и затем оттаивали на воздухе при 24 °С в течение 1 ч. Пов­
торное замораживание—оттаивание провели в тех же условиях.
Установлено, что однократное замораживание—оттаивание повы­
шает всхожесть семян на 40—70 %, повторное — понижает на 30 %
до уровня, превосходящего контрольный (рис. 36).
Обнаружена экспрессия специфических ГХА, регулируемая на
транскрипционном уровне, и установлена закономерность насле­
дования холодоустойчивости [264, 342, 382]. Эти данные наглядно
демонстрируют селективное свойство сверхнизих температур,
обеспечивающее перевод растительных биологических объектов
на более высокий уровень функционирования (гомеостаза). Дру­
гие авторы обнаружили стимулирующее влияние низких темпера­
тур (−196 °С) на культуры салата, укропа, лука, томатов, прояв­

98

2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические клетки

ляющееся на этапе прорастания [203, 204]. Важно установление
факта повышения полевой всхожести семян (Pulsatilla pateus (а)
mill, Aconitum septemtrionnab coella) по сравнению с контролем и ус­
корение роста растений (Primula veris). У ряда видов (Daanthus
jische) замораживание семян способствовало ускорению перехода
растений в генеративное состояние.
Воздействие низких температур вызывает изменение в содер­
жании клеточных липидов растительных биологических объектов.
Наблюдается заметное обогащение цитоплазмы клеток липидны­
ми глобулами при температуре, близкой к нулю, как положитель­
ной, так и отрицательной, что наиболее полно освещено в моног­
рафии «Цитохимия замороженной клетки» [151]. В природе в зим­
ний период в пробах коры 15—20-летних акаций увеличиваются
общая масса мембранных компонентов и количество фосфолипи­
дов без существенных изменений в составе ненасыщенных жир­
ных кислот. Наблюдаемые изменения в химическом составе ком­
понентов мембран приводят к повышению выживаемости клеток
при низких температурах: в препаратах летнего сезона при −10,
-15 °С выживает 50 % клеток, тогда как в зимний сезон этот же
факт наблюдается при температуре ниже −196 °С. Считается, что
липиды, в частности фосфолипиды, выполняют важные функции
в восстановлении клеточных структур после холодового стресса.
Их локализация, тесный контакт с мембранами пластид, митохон­
дрий, вакуолей, ядра свидетельствует об участии липидов в восста­
новлении мембран клеточных органелл.
Характерной особенностью клеток апикальной меристемы по­
бега пшеницы после воздействия низких температур является на­
личие различного рода белковых включений [2]. Они встречаются
в виде скоплений гранулярной либо фибриллярной структуры в
гиалоплазме, а также в пластидах и митохондриях. Иногда они
представлены скоплением гранул в цитоплазме, которые, по мне­
нию автора, являются «гранулами холодового шока». Накопление
подобных гранул связывают с образованием стрессовых белков
как быстрого интегрального ответа клетки на действие неблаго­
приятных факторов. В апикальной меристеме пшеницы особенно
многочисленны гранулярные белковые включения в цитоплазме и
органеллах после оттаивания замороженных проростков, что ука­
зывает на их возможную роль в репарации поверхностных струк­
тур клеток, вызванных воздействием низких температур.
В последние годы в растительных клетках выявлены специфи­
ческие БХШ и показана их локализация. В полном объеме эти
данные представлены в главе 1.

99

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление...

2.4. ТРАНСФОРМИРУЮЩЕЕ (ПРЕОБРАЗУЮЩЕЕ)
ДЕЙСТВИЕ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ

В период формирования криобиологии как науки нами разработа­
но новое направление в физиологии клетки — изучение взаимоза­
висимости внутриклеточных структур и функций.
Живой организм характеризуется множеством физико-хими­
ческих свойств: дискретностью и иерархичностью строения, взаи­
модействием и взаимозависимостью частей — целостностью. Он
имеет молекулярную основу строения и преобразует энергию.
Именно значительная упорядоченность и высочайший уровень
организации молекул и их компонентов приводит к появлению
новой формы существования материи — так называемой жизни.
Клеточные органеллы структурно и функционально связаны меж­
ду собой. Жизнедеятельность клеток может осуществляться толь­
ко при условии скоординированной связи между ними.
В криобиологических исследованиях о качестве клеток и их
популяций судили по тому или иному показателю изолированно.
Это не давало возможности раскрыть наиболее общие свойства
внутриклеточной организации. Известно, что одно из основных
свойств внутриклеточных мембран состоит в способности образо­
вывать отсеки (компартменты), которые являются носителями ра­
зных функций (например, выработки энергетических молекул).
Вторая особенность внутриклеточных мембран связана с форми­
рованием определенных путей перемещения веществ, по которым
осуществляется сложная взаимосвязь биохимических процес­
сов — коммуникабельность.
Третья особенность, вытекающая из первой и второй, заклю­
чается в осуществлении биохимических процессов в определен­
ном порядке — синхронизации. И, наконец, все эти свойства ве­
дут к кооперативному характеру деятельности клетки как единого
целого, быстро переключающегося при тех или иных изменив­
шихся условиях. Таким образом, в связи с тем, что живая клетка
представляет собой гомеостатическую систему со сложными коор­
динационными и регуляторными взаимоотношениями, в ее струк­
турно-организованной цитоплазме одновременно протекает боль­
шое количество реакций, многие из которых взаимно связаны
[121]. В связи с этим для определения качеств клеток после крио­
консервирования необходим анализ цитохимического спектра.
Как показали наши наблюдения, проведенные с помощью корре­
ляционно-регрессионного анализа по рекомендации Р.П. Нар­
циссова [193], характерной особенностью цитохимического спек­

100

2.4. Трансформирующее (преобразующее) действие криоконсервирования

Рис. 37. Цитохимический спектр криоконсервированных (−196 °С) с ПЭО-400
клеток костного мозга [151, 154]

тра клеток костного мозга, в частности зрелых гранулоцитов, явля­
ется высокая активность ЦХО, повышенное содержание SH-rpyππ,
нейтральных жиров (НЖ) и КБ, низкая активность НАД · Н2-ДГ,
Г-6-ФДГ (рис. 37). После криоконсервирования с ПЭО-400 цито­
химический спектр зрелых гранулоцитов изменялся за счет умень­
шения содержания фосфолипидов, активности ЦХО и увеличения
активности ЛДГ.
Следовательно, криоконсервированные клетки костного моз­
га характеризуются качественно иным уровнем гомеостаза, обус­
ловленным активной деятельностью клеточного генома, направ-

101

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

ленной на активацию процессов программированной жизни клет­
ки. Это потребовало более глубокого анализа перестройки внутри­
клеточного метаболизма.
Как уже указывалось, качество клеток, определяемое их фи­
зиологическим состоянием, зависит от гармоничного взаимодей­
ствия различных ферментативных реакций и особенности отве­
чать синхронными изменениями на воздействие тех или иных
факторов.
Результаты корреляционно-регрессионного анализа, прове­
денного нами на ЭВМ БЭСМ-6, свидетельствуют, что в незрелых
и зрелых клетках костного мозга между цитохимическими показа­
телями, относящимися к различным метаболическим циклам, су­
ществуют многочисленные корреляционные зависимости. Связь
между одними внутриклеточными показателями относительно тес­
ная, другие свободны по отношению друг к другу. В зрелых грану­
лоцитах свежезаготовленного костного мозга наибольшее количест­
во связей выявлено в цикле Кребса и гликолитическом (рис. 38).
Увеличение количества связей, отличных от контроля, наблюдает­
ся после действия ПЭО-400. После замораживания —оттаивания
зрелых гранулоцитов в присутствии ПЭО-400 и без него сохра­
нились корреляционные связи НАД · Н2-ДГ с ЦХО; СДГ с Г-6-ФДГ;
СДГ с КБ; КБ с α-ГФДГ; Г-6-ФДГ с а-ЛДГ, подобные таковым в
контроле (рис. 39). Важно установление факта увеличения зависи­
мости ферментов гликолитического и пентозного циклов, а также
SH-rpyππ и КБ от других цитохимических показателей. Ферменты
цикла Кребса (СДГ) и электронно-транспортной цепи (ЦХО) от­
носительно свободны по отношению к другим (рис. 40).
Для уточнения физиологической роли изменения взаимоотно­
шения активности ферментов и содержания веществ в криоконсервированных клетках костного мозга важное значение имеет
определение коэффициента регрессии, который показывает, как
изменяется активность одних цитохимических показателей по ме­
ре изменения коррелятивно связанных с ними других (лабиль­
ность связи). Оказалось, что в незрелых клетках костного мозга
контрольных образцов с уменьшением активности, например,
ЦХО с высокой степенью достоверности снижается активность
α-ГФДГ, ФЛ, НАД · Н2-ДГ и СДГ, а в криоконсервированных
клетках — только Г-6-ФДГ. Следовательно, в размороженных кле­
тках костного мозга с изменением активности одних ферментов
изменяется активность меньшего количества других, что и обеспе­
чивает устойчивость клеток.

102

2,4. Трансформирующее (преобразующее) действие криоконсервирования

Рис. 38. Влияние криопротектора ПЭО-400 на внутриклеточные корреля­
ционные взаимоотношения клеток костного мозга [151, 154]:
а — свежезаготовленный костный мозг; б — экспозиция с криопротектором

Общепринято, что трансплантационная эффективность попу­
ляции клеток костного мозга определяется наличием в ней незре­
лых клеточных элементов, восстанавливающих нормальное кро­
ветворение. Следует уточнить, как изменяется клеточный состав
костного мозга после криоконсервирования. Анализ коррелятив­
ных связей в клетках костного мозга крыс показал, что ЦХО и
НАД · Н2-ДГ коррелируют между собой и обладают одинаковой
криочувствительностью. Поэтому основываясь на известных фак­
тах о том, что по мере созревания гемопоэтических клеток актив­
ность НАД · Н2-ДГ уменьшается, а ЦХО увеличивается, можно
принять соотношение НАД · Н,-ДГ/ЦХО как показатель диффе­

103

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 39. Влияние криоконсервирования с ПЭО-400 и без него на корреля­
ционные взаимоотношения клеток костного мозга [151, 154]

ренцированности и зрелости клеток. Более высокое числовое зна­
чение этого отношения в криоконсервированных клетках должно
указывать на преобладание в популяции клеток с более низким
уровнем дифференцированности. Нами установлено, что характе­
рной особенностью незрелых форм клеток костного мозга являет­
ся низкая активность ЦХО (СГК = 1,54 ± 0,06) и более высокая
НАД · Н2-ДГ (СГК = 1,85 ± 0,06, рис. 41). Это нормальное физио­
логическое соотношение. После криоконсервирования оно нару­
шается в направлении значительного повышения активности
НАД · Н2-ДГ (9,6 вместо 1,2 в контроле). Следовательно, популя­
ция размороженных клеток костного мозга отличается от контро­
ля большим процентом незрелых клеток.

104

2.4. Трансформирующее (преобразующее) действие криоконсервирования

В целом после действия криопротектора, замораживания без
криопротектора и в его присутствии повысилась роль гликолити­
ческого и пентозного циклов, а также содержание КБ и SH-rpyππ,
как установлено при изолированном изучении активности ферме­
нтов и содержания веществ. Вместе с тем данные корреляцион­
но-регрессионного анализа показали, что перестройка метаболиз­
ма миелокариоцитов криоконсервированного костного мозга не
сводится лишь к изменению активности ферментов, а включает и
появление новых сложносвязанных взаимоотношений фермент­
ных процессов. На это указывает факт увеличения количества свя­
зей между ферментами и другими веществами. Подобные связи
отсутствовали в контроле, что свидетельствует о повышении инте­
гральности клеток после криоконсервирования. Таким образом,
клетки после криоконсервирования цитохимически модифи­

Рис. 40. Влияние криоконсервирования (−196 °С) костного мозга на внутрик­
леточные корреляционно-регрессионные взаимоотношения. Меняется взаи­
мозависимость цитохимических показателей: СДГ и ЦХО относительно сво­
бодны по отношению к другим (светлые сектора); исключение составляет
Г-6-ФДГ (темные сектора), которая связана с ЦХО [151, 154]:
а, в — свежезаготовленный костный мозг; б, г — криоконсервированный костный мозг

105

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

Рис. 41. Соотношение ферментов в
бластных клетках костного мозга
крыс после замораживания—оттаи­
вания [151, 154]:
1 —НАД∙H2-ДГ; 2 —ЦХО; 3 — НАД∙H2ДГ/ЦХО

цируются, переходя на глико­
литический путь обмена, при
этом повышается роль КБ как
блокаторов токсических проду­
ктов обмена, в частности окис­
ления липидов.
Выявленная модификация
цитохимических реакций в ге­
мопоэтических клетках, подобно модуляции биохимических про­
цессов в клетках криоконсервированной щитовидной железы,
носит общебиологический характер. Наблюдается перестройка в
регулируемом гормонопоэзе: стимулируется включение йодида
в белки щитовидной железы, активируется моноаминоксидаза
(МАО) в срезах печени, сердца, щитовидной железы, изменяются
параметры связывания 3Н-норадреналина с рецепторами и др.
(рис. 42) [206, 207, 225]. Отмечены также, как уже упоминалось,
благоприятные сдвиги в гипоталамо-гипофизарно-яичниковой
системе после криоохлаждения шейки матки онкологических бо­
льных: переход оновулярных циклов в овулярные, появление ову­
ляций у больных, не поддававшихся лечению общепринятыми
методами терапии, прекращение дисфункциональных маточных
кровотечений, установление нормального физиологического цик­
ла (рис. 42) [59].
Прослежено благоприятное преобразование иммунологических
реакций: при переливании криоконсервированного костного мозга
от двух различающихся доноров устраняется эффект инактивации
СКК сингенными лимфоцитами, находящимися в смешанном
трансплантанте [95]. Инактивируется супрессорная активность
криоконсервированных клеток селезенки [291], моноцитов-мак­
рофагов и других лимфоидных клеток, отличных от Т-клеток
[398]. После переливания криоконсервированной крови снижается
риск заболеваемости вирусным гепатитом, так как в разморожен­
ных эритроцитах антиген не обнаружен [3]. Эти данные коррели­
руют с большей выживаемостью летально облученных животных
после трансплантации им криоконсервированных гемопоэтичес­

106

2.4. Трансформирующее (преобразующее) действие криоконсервирования

Рис. 42. Модуляция биохимических процессов в клетках криоконсервирован­
ной щитовидной железы, печени и сердца [206]

ких клеток [49, 50, 95, 189]. Все вышеперечисленное свидетель­
ствует об уменьшении иммунологических реакций в разморожен­
ных клетках и повышении их устойчивости к облучению.
Вместе с тем положительный эффект криоконсервирования
обнаружен не только в иммунокомпетентных клетках (гемопоэти­
ческих), но и ряде других: при действии рентгеновского излучения
на фибробласты яичника китайского хомячка и микроорганизмы
снижение температуры от −20 до −196 °С приводило к уменьше­
нию повреждения хромосом и увеличению выживаемости клеток
в 3,5 раза [252]. В целом при температуре −196 °С клетки млекопи­
тающих становятся более устойчивыми к облучению, чем при ком­
натной температуре (22 °С). Эти данные подтверждены и на рас­

107

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

тигельных биологических объектах: в первые часы после облуче­
ния, т. е. в фазе G2 при 34 °С возникает больше поврежденных
клеток боковых корешков конских бобов (Vicia faba), чем при
24 °С. При 4 °С клеток с аберрациями еще меньше [88].
Суммируя изложенное, можно предположить, что облучение
растительных клеток конских бобов индуцирует в них апоптотические процессы, вследствие которых возникает большое количе­
ство поврежденных клеток. Уменьшение числа таких клеток при
4 °С, по всей вероятности, обусловлено сдвигом динамического
взаимодействия двух разнонаправленных процессов — апоптоза и
криообновления в сторону криообновления.
Трансформирующее действие криоконсервирования хорошо
прослеживается на этапе репарации и регенерации: в процессе руб­
цевания раневой поверхности образовались тонковолокнистые
рубцы, обеспечивающие более благоприятный косметический эф­
фект, вместо грубых келоидных в контроле. При этом повышается
устойчивость тканей к гипоксии, развивающейся после термичес­
кого ожога кожи, снимается токсичность ожогового некроза [96,
177]. Считается, что холодовой стресс, в отличие от других видов
травм (механических, термических и др.), ведет к более благопри­
ятному протеканию биохимических реакций, что способствует за­
мещению зоны криораны собственной тканью без выраженных
рубцовых образований [22].
Репаративные процессы, по-видимому, имеют достаточно
сложный характер, подобный тому, который отмечался после крио­
воздействия (-196 °С) на суставной хрящ и межпозвоночный диск
животных: перестройка субхондриальной кости на этапах репара­
ции сопровождается компактизацией структуры и более ранним
включением функции сустава [163]. Репаративная регенерация не
восстанавливает первичную структуру межпозвоночного диска, а
сопровождается глубокой перестройкой его тканей и отличается
характерным своеобразием: формируется костно-хрящевое сра­
щение прилегающих позвонков (корпородез) [122]. Необратимая
трансформация тканей после криовоздействия — общебиологиче­
ское явление, так как проявляется на растительных биологических
объектах. Установлено, например, образование каллюса без пря­
мого роста первичной меристемы и нарушение симпластности в
пределах суспензии Acer plendoplaticus в результате замораживания
(-196 °С) [135].
Наиболее ярко трансформирующее действие криоконсервиро­
вания проявляется уже на молекулярном уровне: получены крио­
гибрид лизоцим—РНКаза [216], гибридные формы ЛДГ и глице­

108

2.5. Мутагенное действие криоконсервирования

ральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, которые различаются элек­
трофоретической подвижностью [39]. Отмечено появление БХШ
[111]. Более подробно эти и другие работы обсуждаются ниже.
Приведенные данные, затрагивающие все уровни организации био­
логического объекта, соответствуют признакам «обновления» и,
таким образом, становится очевидным, что криоконсервирование
вызывает реальные признаки обновления и криобновления.
2.5. МУТАГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ

2.5.1. Изменение морфологии и функции клеточного генома
Известно, что живые существа населяли Землю в течение сотен
миллионов лет. Самыми древними находками докембрийского пе­
риода являются водоросли и, возможно, бактерии, которые жили
более 500 млн лет назад. Позднее в морях развился богатый живот­
ный мир, а с конца силурийского периода обнаружили первые
следы наземных растений. Более 200 млн лет назад появились
хвойные растения, тогда как цветковые покрытосеменные расте­
ния развились гораздо позже, не ранее мелового периода, т. е.
примерно 100 млн лет назад. Из позвоночных рыбы известны уже
в силурийском периоде, а млекопитающие появились только в на­
чале третичного периода, т. е., примерно около 70 млн лет назад.
Человек как вид возник относительно недавно. Тем не менее орга­
ническая жизнь на Земле существовала в течение такого продол­
жительного времени, которое с человеческой точки зрения кажет­
ся невероятным. Ученые установили, что многие группы, которые
в настоящее время представлены очень слабо или же совсем вымер­
ли, процветали в предыдущие годы.
Данные генетических исследований позволяют достаточно
удовлетворительно объяснить изменения организмов в предыду­
щие геологические периоды. Они вскрыли природу биологичес­
кой изменчивости и установили различия между модификациями,
обусловленными средой, и генотипической изменчивостью. Кро­
ме того, в результате генетических исследований установлены
принципы генетической рекомбинации и показано, что даже при
относительно небольшом количестве рекомбинирующихся генов
наследованная изменчивость очень значительна.
Изменение наследственного материала клеток называют мута­
цией. Ряд более или менее ясных случаев мутаций был замечен
еще несколько сот лет назад: например, появление в 1590 г. в од­
ном из садов Гейдельберга ланцетовидной формы Chelidonium

109

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

majus или появление в конце XVII в. в Новой Англии овцы с очень
короткими ногами, ставшей родоначальницей породы анконских
овец. Однако настоящее исследование мутаций началось лишь в
1880 г. с работ Гуго Де-Фриза. Он обнаружил, что у энотеры ред­
ко, но регулярно возникают «мутанты». Причем некоторые из них
были настолько мощными и так сильно отличались от исходного
типа, что Де-Фриз принял их за начальные стадии образования
новых видов.
Мутации условно делят на морфологические, физиологичес­
кие и биохимические. Морфологические мутации чаще всего на­
зывают видимыми. Физиологические мутации вызывают измене­
ния физиологических процессов и жизнеспособности особей. К
биохимическим мутациям относят мутации, качественно изменя­
ющие синтез определенных химических веществ в организме.
Благодаря этим мутациям изменяются обмен веществ организма
и, как следствие, его химический состав и потребность в тех или
иных химических веществах. Наиболее хорошо они изучены у ми­
кроорганизмов.
По адаптивному значению мутации делят на полезные, нейт­
ральные и вредные. Снижение жизнеспособности организмов и
торможение развития вызывают мутации, которые относят к груп­
пе полулетальных или летальных. Мутации, увеличивающие жиз­
неспособность особей, расширяющие их адаптационные возмож­
ности, повышающие плодовитость, относят к числу полезных.
Примером может служить мутация, приводящая к увеличению син­
теза антибиотиков в клетках грибов-продуцентов антибиотиков,
так как она увеличивает вероятность выживания таких клеток. Од­
нако приведенная классификация условна, так как при изменении
условий внешней среды мутации из полезных могут стать вредны­
ми и наоборот. Так, описан ярко-зеленый хлорофилльный мутант
(полезная мутация) у ячменя, который давал значительно боль­
ший урожай на севере Швеции. На юге этот мутант был нейтра­
лен. Кроме того, признаки, полезные с хозяйственной точки зре­
ния, могут быть нейтральными или даже вредными биологически.
Например, чем больше антибиотика синтезирует клетка-проду­
цент, тем она хозяйственно полезнее. Однако для организма она
полезна лишь до определенного предела, а затем избыточный син­
тез антибиотика начинает угнетать клетку и может привести к ее
гибели.
Мутации классифицируются также по генотипу, а именно ген­
ные, хромосомные, цитоплазматические. Мутации генов (точко­
вые) встречаются у всех органических форм. Они возникают в от­

110

2.5. Мутагенное действие криоконсервирования

дельных клетках и проявляются скачкообразно у отдельных осо­
бей (мутантов). Аллели генов, типичные для диких форм вида, на­
зывают генами дикого типа или нормальными, а измененные —
мутантными, хотя принципиальной разницы между ними не су­
ществует. Это связано с тем, что многие гены, свойственные ди­
ким формам вида, также были когда-то мутантными, а затем бла­
гоприятные мутантные аллели в ходе эволюции вида распростра­
нились до такой концентрации, что каждая особь вида стала их
носителем. Большинство мутаций при возникновении оказывают­
ся рецессивными. Их рецессивный характер позволяет им длитель­
ное время сохраняться у особи вида в гетерозиготном состоянии
без вреда для них и проявляться в будущем при переходе в гомози­
готное состояние. Мутации гена от дикого типа к новому состоя­
нию называют прямыми, а от мутантного к дикому — обратными.
Сам процесс обратного мутирования называют реверсией гена.
К хромосомным мутациям относят хромосомные перестрой­
ки, так как их наличие в клетках связывают с изменением
свойств этих клеток или возникающих из них организмов (нехват­
ки, делеции).
Цитоплазматическими, или плазмогенными, мутациями на­
зывают изменения плазмогенов, т. е. генов, которые, как полага­
ют, локализованы в цитоплазме и приводят к изменению призна­
ков и свойств организма. Трудность их изучения связана с тем, что
до настоящего времени нет четких доказательств локализации та­
ких мутаций. Считают, что они локализованы только в пластидах
и митохондриях. Известно два типа природы цитоплазматических
мутаций. К первому относится утрата структур: например, мутант­
ные штаммы эвглены {Euglena mushili) при длительном культиви­
ровании в темноте утрачивает пластиды (пластидная мутация).
Утрата пластид необратима и приводит к изменению ряда свойств
этих жгутиковых. Ко второму типу относятся мутации, у которых
цитоплазматические структуры функционально или морфологи­
чески изменены. Известны, например, «дыхательные» мутации у
дрожжей и нейроспоры. По морфологическим признакам такие
митохондрии не отличаются от контроля, однако, как показали
специальные исследования, митохондрии мутантных штаммов
дрожжей не содержат ЦХО, о чем упоминается ниже при исполь­
зовании криобиологических технологий.
В современной литературе по генетике полиплоиды класси­
фицируются как геномная мутация, выражающаяся в изменении
числа хромосом или хромосомных наборов. Она относится к на­
следуемым изменениям. Организмы, у которых произошло умно­

111

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление ...

жение целых гаплоидных наборов, называют полиплоидами. Ор­
ганизмы, у которых число хромосом не кратно гаплоидному, на­
зывают анеуплоидами или гетероплоидами. Явление полиплоидии
изучали в трех различных областях — автополиплоидии, аллопо­
липлоидии и эндополиплоидии. В случаях автополиплоидии име­
ют дело с чисто количественным увеличением числа наборов хро­
мосом внутри вида. Аллополиплоидия связана с суммированием
наборов хромосом от разных видов. Наконец, эндополиплои­
дия — это увеличение числа хромосом в одной клетке или в клет­
ках целой ткани. В связи с автополиплоидией уместно упомянуть
о гаплоидии, т. е. об особях, у которых число хромосом вдвое ме­
ньше нормального.
Итак, полиплоидия — это геномная мутация, состоящая в уве­
личении числа хромосом, кратном гаплоидному. Клетки с разным
числом гаплоидных наборов называют Зя — триплоидные, 4и —
тетраплоидные и т. д. Организмы, развившиеся из полиплоидных
клеток, называются соответственно триплоидами, тетраплоидами,
октоплоидами и т. п.
В 60-70-е годы прошлого столетия нами были получены поли­
плоидные формы мегакариоцитов криоконсервированного кост­
ного мозга. Позднее эти данные были подтверждены и другими
авторами: в процессе криоконсервирования роговой оболочки в
зоне заднего эпителия появляются гигантские 3- и многоядерные
клетки [30]. В последние годы прослежено образование гигант­
ских многоядерных клеток (симпластов) после воздействия сверх­
низкими температурами (-196 °С) на культуры клеток ВНК-21
[132]. Недавно обнаружена экспрессия специфических ГХА, регу­
лируемая на транскрипционном уровне, и установлена закономер­
ность наследования холодоустойчивости [342]. Считают, что гены
холодоустойчивости сцеплены с половой хромосомой, и скорость
развития особей зависит в основном от низкотемпературных фак­
торов (93 % по сравнению с влиянием родителей — 3 %) [297].
Установлено, что частота количественных хромосомных аномалий
в криоконсервированных спермиях достоверно ниже (3 %) по
сравнению с контролем (5,2 %) [336].
Под морфологией клеточного генома мы понимаем исключи­
тельно изменение характера хромосомного набора. Показано, на­
пример, образование тетра- и даже октоплоидных клеток, а в не­
которых случаях и анеуплоидных хромосомных наборов в резуль­
тате холодовой обработки яиц [345] и культивируемых фиброблас­
тов человека [366]. Частота и спектр выявляемых кариологических
аномалий зависят от температуры и продолжительности обработ­

112

2.5. Мутагенное действие криоконсервирования

ки. Установлено также появление в пентаплоидной расе долгоно­
сика декаплоидного эмбриона в результате действия низкой тем­
пературы [387]. Развившиеся эмбрионы после криообработки
(−10 °С) свежеотложенных яиц Eurudeta rudosa* более устойчивы к
действию низких температур [345]. Как правило, образование по­
липлоидных форм после криовоздействия (−196 °С) повышает
криоустойчивость биологических объектов [349].
После криоконсервирования изменяются не только морфоло­
гия, но и функция клеточного генома: криостресс (−196 °С) повы­
шает процент мутантов микроорганизмов штаммов Suwarum с не­
достаточной дыхательной активностью (с отсутствием ЦХО) и
уменьшенной активностью брожения [405], индуцирует хлорофил­
льные мутации [135]. Специально подобранные режимы охлажде­
ния дрожжевых микроорганизмов индуцируют мутации с гетеро­
зисным эффектом. Выделенный новый биохимически активный
штамм дрожжей (M-12x) улучшает качество виноматериалов за
счет большего синтеза эндогенных антиоксидантов, меньшего —
альдегидов и летучих кислот, увеличения вязкости и поверхност­
ного натяжения, уменьшения количества опалесцирующих ве­
ществ [110]. Получен гетерозисный криогибрид немецкого карпа
и сазана, который характеризуется в 2 раза большей скоростью ро­
ста, чем у родительских форм [107]. Следовательно, после дейст­
вия низких температур и криоконсервирования изменяются мор­
фология и функция клеточного генома.
Представление о том, что с помощью низких температур и
криоконсервирования биологических объектов можно длительное
время сохранять их в жизнеспособном состоянии для дальнейшей
трансфузиологии и трансплантации, позволило заготовить боль­
шие запасы биоматериала, а также создать банки генетически ред­
ких видов. Несмотря на достигнутые успехи и прогресс криобио­
логии сохранения в последние годы внимание исследователей все
больше привлекает криобиология обновления. Первые шаги в
этом направлении были предприняты нами у истоков криобиоло­
гии при исследовании вопросов сохранения гемопоэтических, ре­
продуктивных и половых клеток с целью их трансфузии и транс­
плантации, а также вопросов лечения криоохлаждением (−196 °С)
инфицированных и ожоговых ран, дисфункциональных расс­
тройств у гинекологических больных.
Криобиология обновления — это настоящее и будущее крио­
биологической науки, которая базируется на активной деятельно­
сти клеточного генома в плане запуска программ обновления и
криообновления. Направленное изменение морфофункциональ­
* Название сильно искажено, вероятно, речь о клопе urydema

rugulosa.

113

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление...

ных свойств биологических объектов даст возможность получать
особи с полезными признаками, что особенно важно при работе с
репродуктивными (яйцеклетки) и половыми (спермин) клетками.
С их помощью будут получены организмы, сверхустойчивые к раз­
личного вида неблагоприятным факторам, в том числе бактериаль­
ной микрофлоре. С этой целью подбором программ заморажива­
ния-оттаивания, воздействия химическими (субстраты цикла
Кребса, электронно-транспортной цепи митохондрий) и физичес­
кими (магнитные поля, ультразвуковые колебания) стимулятора­
ми обменных процессов можно перевести криоконсервированные
биологические объекты на функционально более полноценный
уровень гомеостаза. Подбор режима замораживания—оттаивания
дает возможность увеличить антибиотическую активность, напри­
мер, стрептомицетов, используемых для лечения заболеваний бак­
териальной и вирусной этиологии в клинике, животноводстве,
птицеводстве, пчеловодстве и растениеводстве.
Развитие нового направления перспективно также для реше­
ния продовольственной проблемы. Увеличивая с помощью крио­
консервирования массу цианобактерий, можно повысить источ­
ник белков, витаминов, ферментов, биокорма в рационе сель­
скохозяйственных животных и рыб, плодородие почв, стимулиро­
вать рост высших растений, получить ряд ценных биоорганичес­
ких соединений и др. Индукцией гетерозисного эффекта в опреде­
ленных режимах криоконсервирования дрожжевых микрооргани­
змов можно улучшить качество виноматериалов. Перенос ГХА и
генов белков-антифризов, а также использование специально по­
добранных режимов криоконсервирования и активаторов обмен­
ных процессов в реабилитационном периоде повысит морозоус­
тойчивость, термоустойчивость, радиационную устойчивость и
продуктивность животных, рыб и растений.
Таким образом, можно заключить, что криоконсервирование
не ограничивается возможностями сохранения либо селекции (от­
бора) наиболее устойчивых к различным неблагоприятным факто­
рам биологических объектов, как считали ранее. Криоконсерви­
рование — это прежде всего путь к обновлению биологических
структур и функций с помощью перевода их на качественно иной
уровень гомеостаза.

ГЛАВА 3

Причинно-следственная связь
качественного обновления свойств клеток
после криоконсервирования и ее сущность

Одним из основных признаков биологических систем
является иерархия, т. е. многоуровневая организация с формиро­
ванием структуры и функции вышележащих уровней из основных
структурных и функциональных качеств нижележащих, что прин­
ципиально отражено на рис. 43.
Каждому уровню организации соответствует свой механизм об­
новления элементов, за счет которого обеспечивается гомеостаз,
т. е. относительное постоянство структурно-функциональных ка­
честв. Иерархия организации биологических систем и динамичес­
кий характер элементов ее уровней объясняют гетерогенность био­
логических систем как по структурно-функциональным качествам,
так и по адаптационно-компенсаторным возможностям.
В связи с этим при действии экстремальных факторов возмож­
но несколько исходов. Переход системы А в состояние 2, 3, 4 и 5
зависит от трех условий: исходного состояния системы А, силы
действия фактора F и условий при которых на систему А действует
фактор F. Один из существенных моментов, определяющих состо­
яние системы А, — степень соотношения новых (Н) и старых (С)
элементов в составе каждого уровня организации.
Анализ результатов действия фактора F с учетом условий и со­
отношения элементов показывает, что при С > Н система чаще
всего не имеет возможности противодействовать силе фактора Fh
погибает. При определенном соотношении С и Н, когда С < Н
или С=Н, снижается общее интегральное состояние системы А.
При этом внутри системы происходит интенсивная гибель С-элементов, но достаточное количество Н-элементов обеспечивает ее
сохранность, и через определенный промежуток времени необхо­
димое количество элементов восстанавливается, чем обеспечивает­
ся относительно стабильное существование системы А. При Н > С
возможны два последующих состояния:

115

Глава 3. Причинно-следственная связь качественного обновления ...

Рис. 43. Уровни организации биоло­
гических систем [154]:
A1 — исходное состояние системы; F — си­
ла действия экстремального фактора;
A2 — переход системы в состояние 2; A3 —
переход системы в состояние 3; A4 — пере­
ход системы в состояние 4; A5 — переход
системы в состояние 5

• несмотря на гибель С-элементов, функциональное напря­
жение Н-элементов обеспечива­
ет сохранение системы А, а че­
рез определенное время полнос­
тью восстанавливается количес­
тво Н- и С-элементов;
• когда гибель С-элементов
представляет дополнительные воз­
можности для развития Н-эле­
ментов, что существенно повы­
шает их вклад в структурно-функ­
циональную организацию сис­
темы А и позволяет ей перейти
на новый, более высокий структурно-функциональный уровень
существования. Поддержание системы А на новом уровне будет
зависеть от условий ее существования. При достаточно энергетически-пластическом обеспечении система А займет устойчивое
положение на новом структурно-функциональном уровне.
Для уточнения связи причины (воздействия криоконсервирова­
ния), условий (обменные связи живой материи) и следствия (возни­
кновение качественно новых биологических объектов) следует испо­
льзовать общие закономерности существования живой материи. Это
поможет проникнуть в сущность обнаруженного явления, которое
состоит в том, что криоконсервированные клетки и состоящие из
них популяции — качественно новые биологические объекты.
Диалектика обменных связей базируется на том, что в живой
природе существуют многочисленные и разнообразные формы взаи­
мосвязи между различными уровнями живой материи и неорганиче­
ской среды. Общие и специфические связи материальных тел сущес­
твуют не изолированно, а представляют собой сложную иерархичес­
кую систему. При этом живые организмы, в отличие от неживых, не
остаются пассивными под влиянием внешних изменяющихся воз­
действий. Они активно осуществляют процессы самораспада. Одна­
ко сочетая его с параллельно идущими восстановительными процес­

116

Глава 3. Причинно-следственная связь качественного обновления ...

сами, создают те же структуры, которые подвергаются разложению.
Непрерывное саморазрушение и самосозидание живого создают
условия для «самообновления» внутриклеточных элементов.
Согласно диалектике обменных связей, при криоконсервиро­
вании, как было показано выше, имеет место объективно сущест­
вующая противоречивость обменных процессов живой материи. С
одной стороны, нарушение и несогласованность метаболических
путей ведут к дискоординации обменных связей, с другой — ин­
тенсифицируются восстановительные, синтетические и бактери­
цидные функции клеток [161]. Таким образом, после криоконсер­
вирования существуют объективные предпосылки для интенси­
фикации самообновления внутриклеточных структур.
Живая система может изменяться определенным образом в силу
присущих ей внутренних механизмов (программ), которые включа­
ются или изменяются под влиянием внешних воздействий. Внутри­
клеточный обмен контролируется регулирующими циклами, подде­
рживающими регулируемый показатель на постоянном уровне.
Причем нарушающий фактор в одном цикле может быть регулируе­
мым показателем, в другом цикле регулятор или какой-либо иной
член цикла может выполнить совершенно новую роль. Благодаря
этому создается сложная сеть контролирующих механизмов, которая
гарантирует упорядоченность обмена веществ в клетках. Такая само­
регулирующаяся система поддерживается обратной положительной
или отрицательной связью в зависимости от того, активирует она
или ингибирует определенный фермент. Установлено, что обмен ре­
гулируется, регуляторы обмениваются [206, 207]. Сопряженные хи­
мические реакции, формирующие биологический обмен, — это пре­
вращение, казалось бы, случайных ауторегуляций в определенную
регуляцию, обеспечивающую направленность всего обмена.
Таким образом, биологический обмен обладает свойствами ауто­
регуляции, поддерживающей его общую направленность и придаю­
щий ему характер целесообразности. Свойство живых клеток само­
стоятельно поддерживать постоянство своей структуры и состояния
в целом, а также регулировать внутриклеточные параметры обобще­
но понятием «гомеостаз». Причем, как известно, оно не подразуме­
вает чего-либо застывшего и неподвижного, а обозначает состояние,
которое изменяется, оставаясь относительно постоянным.
Поэтому процесс отражения (реакция клеток на внешние фак­
торы) — это результат не воздействия, а взаимодействия, т. е. ре­
зультат процессов, идущих как бы навстречу друг другу. Один из
них — процесс влияния объекта на живую систему, другой — ак­
тивность самой системы по отношению к воздействующему объек­
ту. С этой точки зрения в процессе криоконсервирования объект в

117

Глава 3. Причинно-следственная связь качественного обновления ...

ответ на действие факторов криоконсервирования сам претерпе­
вает определенную трансформацию.
Как было показано выше, гомеостаз основан на непрерывных
процессах изменения, на постоянном динамизме. Живой орга­
низм всегда существует в условиях необходимых обменных связей
с окружающей средой, параметры которой подвержены колебани­
ям, не зависящим от живых тел. Приведение биологического объ­
екта в соответствие с этими колебаниями путем его адекватного
самоизменения представляет собой общее содержание разнообраз­
ных процессов саморегулирования на клеточном уровне. Важней­
шей его чертой является способность биологических объектов к
адекватно-целесообразному отражению тех или иных внешних
воздействий лишь в определенном диапазоне. К таким парамет­
рам относятся температура внешней среды, ионизирующая радиа­
ция и др. Интервал допустимых колебаний может расширяться с
помощью особой формы регулирования жизненных процессов —
самоперехода в состояние полного или частичного анабиоза. При
этом жизненные процессы приостанавливаются под воздействием
неблагоприятных условий внешней среды. Хотя химические реак­
ции и могут происходить, однако не осуществляется та цепь био­
химических процессов, которая образует биологический обмен.
Криоконсервирование представляет собой одну из форм ана­
биоза — искусственный анабиоз. Так как саморегулирование осу­
ществляется под влиянием клеточного генома, следует учитывать
взаимодействие генотип—среда.
Процесс развития особи из оплодотворенной яйцеклетки даже
взрослого организма происходит под непрерывным регулирующим
влиянием генома. Однако это влияние непрерывно связано с посто­
янно изменяющейся внешней средой, в которой находится биологи­
ческий объект. Генотип допускает варьирование конкретных при­
знаков и черт формирующегося биологического объекта в опреде­
ленных пределах, а внешние условия обусловливают реализацию
возможностей, заложенных в наследственной информации. Это явля­
ется специфической формой реакции живого на внешние воздейст­
вия. Поэтому образование клеток, тканей и органов происходит под
воздействием генотипа как причины и внешней среды как условий
этого процесса. На этом основании сделан вывод, что биологические
объекты способны приспосабливаться к изменяющимся факторам
среды. Отклонение от точного соответствия генотипу — фенотипиче­
ская изменчивость — означает, что клетки, ткани и органы, «выбирая» из допустимых генотипом колебаний признаков такие формы, ко­
торые наиболее соответствуют внешним условиям его существования,
осуществляют приспособительные генетические реакции.

118

Глава 3. Причинно-следственная связь качественного обновления ...

Факторы внешней среды, такие, как криоконсервирование, с
одной стороны, действуют непосредственно на генотип: уменьше­
ние длины хромосом и увеличение их объема, появление гетерохро­
матиновых сегментов [200], исчезновение микротрубочек в клеточ­
ном центре [41] и др. С другой стороны, они оказывают информаци­
онное воздействие: увеличение числа ядер, хромосомные аномалии
[287, 345], мутации по триптофану в опероне ДНК-гиразы [254].
Таким образом, при воздействии генотип—среда наблюдаются
фенотипические и генотипические изменения. Это свидетельству­
ет о том, что характерная особенность влияния на клетки крио­
консервирования состоит в целесообразном самоизменении био­
логического объекта, ведущем к появлению качественно нового
состояния живой системы. Информационные изменения биоло­
гических объектов, как известно, обусловлены внутренними про­
граммами, соответствующими их жизненным потребностям. Целе­
сообразность живого заключается не в том, чтобы стремиться к
каким-либо достижениям в будущем, а в том, чтобы действовать,
опираясь на запрограммированный тем или иным способом опыт
прошлого. При криоконсервировании, или, иными словами, ис­
кусственном холодовом анабиозе, хотя и нельзя обнаружить «сле­
ды» биологического (функционального) обмена, сохраняются
программа и механизмы его развертывания [206, 207].
Искусственный холодовой анабиоз — это «воспоминание» о
земной эволюции, о ледниковых периодах, о суточных и сезонных
колебаниях температуры и формирование соответствующих меха­
низмов адаптации. Если согласиться с мнением, что ранние этапы
эволюции биологических систем проходили при значительно бо­
лее широких диапазонах действия физических факторов (темпера­
туры, радиации, ультрафиолетового излучения, атмосферного и
водного давления), то эти факторы играли важную роль барьеров,
преодоление которых обеспечило качественные скачки в развитии
биологических систем. В этом смысле искусственное криоконсер­
вирование моделирует естественный процесс.
В целом приведенные экспериментальные данные показывают,
что наряду с известными представлениями о повреждении и сохра­
нении биологических объектов после воздействия низких темпера­
тур и криоконсервирования имеет место обновление свойств кле­
ток и их популяций вследствие изменения регуляторной деятельно­
сти клеточного генома. Эта мысль является основополагающей.
Представленная теоретическая концепция дает возможность
по-новому рассмотреть и осмыслить экспериментальные данные,
полученные после действия низких температур и криоконсерви­
рования.

ГЛАВА 4

Классификация состояний
биологических объектов

Известно, что организмы (их органы, ткани и клетки)
могут находиться в различных состояниях — от наибольшей интен­
сивности жизненных процессов при активной жизнедеятельности
(биоз), ограничения и замедления этих процессов (гипобиоз) до
их обратимого прекращения при анабиозе [48]. При этом между
гипобиозом и анабиозом существует ряд промежуточных состоя­
ний (мезабиоз). По основному признаку — наличию или отсутст­
вию сочетания ассимиляции и диссимиляции, лежащего в основе
жизнедеятельности, разграничили соответственно состояния жиз­
недеятельные (гипербиоз, биоз, гипобиоз) и нежизнедеятельные
(мезабиоз, анабиоз). В эти пределы вошли разнообразные естест­
венные и искусственно создаваемые состояния. Многие состоя­
ния организма связаны с его обезвоживанием. Поэтому выделена
новая область биологии, предметом которой должно быть рассмо­
трение организмов при содержании воды в них ниже уровня, не­
обходимого для активной жизнедеятельности. Она получила на­
звание «ксеробиология» (от греч. xeros — сухой) аналогично крио­
биологии (cryo — холод), которую определили как науку, занима­
ющуюся изучением состояний организмов при температурах ниже
оптимальных для активной жизнедеятельности.

4.1. СОСТОЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
КАК ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА КРИОБИОЛОГИИ
Теоретически устанавливается некоторая область биологических
процессов, протекающих в живых организмах при отрицательных
и низких положительных температурах, лежащих в интервале
−4 ÷ О °С. Одним из основных положений учения о состоянии ор­

120

4.1. Состояние биологических объектов как теоретическая основа криобиологии

ганизмов является представление о том, что основа процесса жиз­
недеятельности — взаимодействие жизнеспособных структур с во­
дой. Это имеет место, например, при переходе от анабиоза к жиз­
недеятельности при увлажнении (прорастание семян при набуха­
нии). Второе важное положение учения о состоянии организмов—
представление о «безводном» строении жизнеспособных структур.
На это указывает возможность глубокого высыхания многих орга­
низмов без потери их жизнеспособности, т. е. способности возвра­
титься к жизнедеятельности при повышении содержания воды до
необходимых величин и других благоприятных условиях. Напри­
мер, доказана возможность глубокой лиофильной сушки спермы
быка, в частности до содержания воды 0—7 %, с сохранением
оплодотворяющей способности спермиев соответственно в 2 из 14
и в 1 из 3 опытов искусственного осеменения. Третье положение о
состоянии организмов — представление о том, что свойство жиз­
неспособных структур изменять интенсивность их функциониро­
вания вплоть до его приостановки, т. е. переходить к анабиозу и
снова возвращаться к функционированию (жизнедеятельности)
является их первичным и неотъемлемым свойством еще со време­
ни возникновения указанных структур [129]. Иными словами,
способность к анабиозу относят к первичным свойствам жизни.
Недавно классифицировано пять особых состояний организ­
мов [208]:
1. Биоз, или активная жизнедеятельность.
2. Гипобиоз — замедленный обмен веществ и оцепенение. Ни­
жняя температурная граница активной жизнедеятельности орга­
низмов лимитируется капельно-жидкой водой, с постоянным по­
током которой поступают в клетки и ткани питающие их вещества
и вымываются недоокисленные метаболиты. За нижним темпера­
турным порогом витальной зоны организмы впадают в холодовое
оцепенение (гипобиоз), в котором они могут пребывать разное,
иногда весьма продолжительное время. В температурной зоне,
близкой к 2—5 °С, во время холодового оцепенения происходит
повышение холодоустойчивости растений и пойкилотермных жи­
вотных — так называемая холодовая закалка. Причиной ее служит
превращение некоторой части резервных сахаров (гликогена, кра­
хмала) под действием холода в моно- или дисахариды у растений
или в глицерин, сорбитол, маннитол, служащих криопротектора ­
ми, у пойкилотермных животных.
3. Криптобиоз, или скрытая жизнь. Под термином «криптоби­
оз» понимают исключительно широко распространенное в приро­

121

Глава 4. Классификация состояний биологических объектов

де состояние физиологического покоя организмов. В его основе
лежат адаптивные механизмы, способствующие переживанию се­
зонной, суточной, зональной или другой периодичности абиоти­
ческих факторов внешней среды, которые выходят за рамки вита­
льной жизни. Сигнальным фактором приближения неблагопри­
ятного сезона года обычно служит фотопериодизм как прямой
(изменение температуры), так и косвенный — через пищу. В со­
стоянии криобиоза организмы более устойчивы к экстремальным
факторам среды, а также к биологическим и химическим агентам
патогенного значения, чем особи тех же видов, находящиеся в
состоянии активной жизнедеятельности.
4. Ангидробиоз — глубокое и длительное торможение метабо­
лизма в результате дегидратации. Под термином «ангидробиоз»
имеют в виду способность некоторых микроорганизмов, растений
и беспозвоночных животных к глубокому обезвоживанию без нару­
шения жизненных структур, и их оживание после оводнения. В от­
личие от криптобиоза, ангидробиоз наступает без какой-либо фи­
зиологической подготовки при быстрой отдаче воды и столь же бы­
стром восстановлении жизнедеятельности после оводнения. Прин­
ципиальные различия между криптобиозом и ангидробиозом автор
видит в том, что после завершения криптобиоза возврат к нему не­
возможен, так как за его терминацией может следовать только про­
должение развития или смерть. Ангидробиоты, напротив, в проме­
жутках между высушиваниями могут питаться и развиваться, а за­
тем снова впадать в ангидробиоз при высыхании. Эволюционно ан­
гидробиоз направлен на сохранение жизни в пространстве и време­
ни при резко экстремальных условиях внешней среды.
5. Анабиоз — временная остановка жизни. Под термином «ана­
биоз» понимают обратимо остановленную жизнь такими физичес­
кими факторами среды, как глубокое охлаждение (криоанабиоз),
глубокое обезвоживание (ангидробиоз) или их состояния. Нахож­
дение в природных условиях Земли семян некоторых растений и
спор микроорганизмов, оживающих после многих столетий покоя,
позволили автору предположить, что состояние анабиоза более ши­
роко распространено в природе, чем предполагалось ранее. Анаби­
оз у организмов легче достигается в состоянии криптобиоза, чем во
время активной жизнедеятельности, так как в физиологическую
подготовку анабиоза входят: депонирование резервных веществ,
значительное уменьшение содержания воды в теле и образование с
понижением температуры среды органических антифризов (полио­
лов, сахаров), препятствующих кристаллизации воды и способству­
ющих сохранению целостности биологических структур жизни.

122

4.2. Состояние биологических объектов в процессе криоконсервирования

Все перечисленные состояния организмов — оцепенение,
криптобиоз, ангидробиоз и анабиоз — выполняют каждый свои
защитные функции при различных экстремальных воздействиях,
подавляющих метаболизм. Криптобиоз, например, формируется и
терминируется как сложный комплекс морфофункциональных
перестроек на различных уровнях биологического объекта: орга­
низменном, тканевом и клеточном. Оцепенение, ангидробиоз и
анабиоз являются результатом прямого торможения или останов­
ки метаболизма физическими факторами. В случае ангидробиоза
остановка метаболизма происходит под влиянием дегидратации
организма, а при анабиозе — отнятия тепла.
Таким образом, в биологии известны различные формы и ме­
ханизмы значительного снижения жизненной активности соот­
ветственно биологического обмена и его специфических функци­
ональных ответвлений как важные адаптативные приспособления
выживания в неблагоприятных условиях.
Известно, что для заготовки клеток, организмов и тканей для
последующего криоконсервирования их нужно выделить из при­
вычной среды обитания. Поэтому далее приведены данные, каса­
ющиеся состояния клетка—организм и клетка из организма.
4.2. СОСТОЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
В ПРОЦЕССЕ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ
Особого внимания заслуживает понятие состояния клетка—орга­
низм и клетка из организма, что далеко не одно и то же. Аналогич­
но этому совокупность (клон) одноклеточных организмов не рав­
нозначна совокупности клеточных элементов какой-либо ткани
организма [207]. У первых ауторегуляция биологического обмена
как бы заканчивается на клеточном уровне и становится регуляци­
ей, динамический гомеостаз которой непосредственно взаимодейс­
твует с факторами внешней среды. Вторые при извлечении из орга­
низма лишаются гомеостаза внутренней среды, кровеносных (гумо­
ральных) и нервных связей, многочисленных ауторегуляций более
высоких уровней. Для одноклеточных организмов, например, вы­
ход из анабиоза полностью соответствует «возвращению обратно в
жизнь», т. е. к деятельной активной жизни, проявляющейся, глав­
ным образом, в биологическом обмене. Считается, что клетка из
организма, подобно клеткам организма в определенных условиях
(режимах) охлаждения, криоконсервирования, хранения и размо­
раживания, сохраняет механизмы биологического функционально­
го обмена и проявляет в соответствующих условиях адекватную
функциональную активность [206, 207].

123

Глава 4. Классификация состояний биологических объектов

Как правило, биологические объекты, заготовленные для транс­
плантации в организм реципиента, на различных этапах подготовки
подвергаются разным изменениям; при этом в результате недостатка
кислорода и последующего аутолитического разрушения снижается
их жизнеспособность. Известно, что основным фактором, вызываю­
щим аутолитические изменения в клетках, является прекращение
или ограничение доставки кислорода в ткани, что приводит к нару­
шению непрерывно протекающих окислительно-восстановительных
процессов, вследствие чего уменьшается энергообеспечение ткани.
Причиной неблагоприятных изменений при гипоксии могут быть
накопление токсических недоокисленных продуктов и связанный с
этим энергетический дефицит [131].
Прекращение доступа кислорода к тканям сопровождается
быстрым снижением его концентрации в тканях почти до нуля,
что вызывает активацию гликолитических процессов, которые в
обычных условиях существования клетки выражены слабо, поско­
льку дыхательное фосфорилирование обеспечивает достаточно
высокий уровень содержания АТФ. В этой связи выключение про­
цессов аэробного фосфорилирования приводит к прогрессирую­
щему снижению концентрации макроэргов, и гликолиз становит­
ся основным компенсаторным механизмом поддержания энерге­
тического состояния клеток на определенном уровне, о чем свиде­
тельствует накопление лактата в тканях. По всей вероятности,
уменьшение фонда макроэргов и служит первопричиной развития
аноксического состояния клеточных структур, что ведет к даль­
нейшему резкому повышению проницаемости цитоплазматичес­
ких мембраны и клетки в целом.
При адаптации к гипоксии в целом развивается комплекс яв­
лений, который был назван «постгипоксическая активация». Со­
четание отрицательных и положительных метаболических сдвигов
при гипоксии передается такой формулой:
Гипоксия + Аноксия = Постгипоксическая активация.
Продолжительная адаптация изолированных митохондрий к
гипоксии предупреждает влияние на них последующей острой ги­
поксии, а также вызывает активацию анаэробных фракций ЛДГ и
цитоплазматической малатдегидрогеназы (МДГ) в печени, легких
и миокарде при тренировке животных к гипоксиии [205]. Наблю­
дение над больными с ишемической болезнью сердца свидетель­
ствует о повышении активности МДГ и ЛДГ, что расценивается
как следствие компенсаторной активности основных энергетичес­
ких процессов в тканях, направленных на сохранение гомеостаза в
клетках.

124

4.2. Состояние биологических объектов в процессе криоконсервирования

Рис. 44. Влияние гипоксии на экспрессию генов [362]:
1 — триозофосфатизомераза; 2 — гексокиназа

Итак, одним из физиологических состояний биологических
объектов, заготовленных для криоконсервирования, является ги­
поксия. Гипоксия индуцирует синтез уникальных белков с мол.
массой 38,52 и 74 кДа в человеческих эндотелиальных клетках и
лимфоцитах [250]. В лимфоцитах человека холодовой шок тесней­
шим образом связан с развитием гипоксического состояния. При
гипоксии различных тканей и органов наблюдаются изменения в
функционировании генетического аппарата: на 40 % уменьшается
экспрессия митохондриальных генов культуры клеток после 4-часовой гипоксии [362]. Избирательно повышается транскрипцион­
ная активность ядерных генов, кодирующих ферменты гликоли­
за — триозофосфатизомеразы на 163 % и гексокиназы на 273 %
(рис. 44).
Известно, что при гипоксических повреждениях гипотермия
оказывает защитное действие на структурное и функциональное
состояние биологических объектов [226]. В связи с этим гипотер­
мия широко применяется в лечебных и профилактических целях
при гипоксических, метаболических нарушениях в организме.
Особенно велико ее значение в торакальной хирургии, главным
образом при операциях на сердце, в грудной области и в после­
операционном периоде. Положительный эффект дает использова­
ние гипотермии для лечения больных с различными поражениями
ЦНС при продолжительной клинической смерти: чем быстрее
применить гипотермию, тем лучше прогноз. Значительное рас­
пространение приобрела лечебная гипотермия в случаях черепно­
мозговой травмы, при тромбозе и эмболии сосудов головного моз­
га, массивных желудочно-кишечных и маточных кровотечениях,
язвенной болезни, не поддающихся другим видам лечения, при
ожогах, перитоните, гангрене, тиреотоксикозе, тяжелом панкреа­

125

Глава 4. Классификация состояний биологических объектов

тите, различных коматозных состояниях, в том числе и при уремии.
Холодовая гипотермия дает хорошие результаты в лечебных целях
при различных инфекционных заболеваниях, в том числе при грип­
пе, дизентерии, брюшном тифе, столбняке, острых отравлениях, в
частности барбитуратами, угарным газом, люменалом, уксусной
кислотой. При изучении сочетанного действия гипоксии и гипо­
термии обнаружили повышение показателей как холодовой, так и
гипоксической устойчивости.
Лимитирующим фактором выживаемости теплокровных живот­
ных в условии глубокой гипотермии (7 °С) является содержание глю­
козы в крови. Незадолго до гибели уровень ее составляет 0,5 мг%,
тогда как у животных, находящихся в состоянии гибернации, он не
уменьшается более чем наполовину. Эндогенное введение глюкозы
или предварительное введение животным дексаметазона поддержи­
вает содержание глюкозы в крови животных, находящихся в состоя­
нии гипотермии, в физиологических процессах и увеличивает их вы­
живаемость с 20—24 ч до 3—4 сут. Причиной гибели животных явля­
ется дыхательная, а позднее и сердечная недостаточность.
Для более глубокого понимания состояния биологических
объектов при гипотермии следует различать механизмы кратков­
ременного и длительного охлаждения. Так, при изучении регуля­
торных реакций в условиях длительного (30 сут) охлаждения (5 °С)
крыс выявлен усиленный синтез катехоламинов, что имеет жиз­
ненно важное значение, так как от этого зависит выживаемость
животных. В отличие от длительного «острое» охлаждение расце­
нивают по механизму его развития как стрессорную реакцию,
включающую в себя симпатические и андроналовые гуморальные
механизмы, способствующие реакции терморегуляции [131]. Вы­
делено три типа терморегуляторных реакций на термические раз­
дражения. При коротких температурных воздействиях специфи­
ческие сдвиги сочетаются со стрессом и элементами ориентирово ­
чного и даже оборонительного рефлекса [191]. В отличие от этого
при длительных температурных воздействиях стресс значительной
роли не играет. Это хорошо продемонстрировано на примере син­
теза стрессового белка M1-71000 (Sp71) в изолированных перфузи­
руемых сердцах крыс после различных сроков холодовой ишемии
[272]. Установлено, что длительность холодового хранения не ока­
зывает заметного влияния на количество включенного 3Н-лейцина в общие белки. Включение метки Sp71 не изменилось после
30 мин и 4 ч холодовой ишемии. Однако после 17 ч ишемии отно­
шение включенного в Sp71 3Н-лейцина к включенному в общие
белки увеличилось приблизительно в 25 раз.

126

4.2. Состояние биологических объектов в процессе криоконсервирования

Поскольку функционирование центральных механизмов тер­
морегуляции осуществляется при участии норадренергических,
серотинэргических и холинэргических нейромедиаторных систем
и во многом зависит от соотношения концентраций норадренали­
на и серотонина, вопрос о взаимоотношении регуляторных сис­
тем, обеспечивающих «запуск» механизмов терморегуляции, явля­
ется одним из важных. Результаты, полученные при изучении сек­
реции и обратного захвата 3Р-норадреналина, серотонина и входа
в синатопсоны ионов Ca2+, могут свидетельствовать о том, что на
уровне температуры тела 32 °С создается качественно новое состо­
яние симпатических процессов, призванных, очевидно, активно
влиять на интеграцию и регуляцию вегетативных, обменных и эн­
докринных функций [16—18]. Считают, что генез сверхмедленных
колебаний секундного диапазона при КЦГ связан с нейрохимиче­
скими процессами норадренергической симпатической передачи,
и усиление сверхмедленных процессов может указывать на повы­
шенную реактивность адренергической функциональной системы
в ответ на охлаждение. Физиологическая сущность активации и
последующего угнетения активности ЦНС под влиянием КЦГ за­
ключается в выработке механизма приспособления обменных
процессов в тканях организма к изменившимся условиям, лабилизации неспецифических и специфических защитных реакций.
Выполняя функцию регуляторов, система медиаторов оперативно
реагирует на изменившиеся требования, включая более или менее
интенсивное функционирование мозга и всего организма в целом.
Следовательно, при адаптации биологически активные вещества
вызывают перестройку регуляторных реакций на новый уровень
функционирования.
Согласно нашим данным, при гипотермии наряду с обновле­
нием биологического обмена (повышение терморегуляции) имеет
место и его перестройка: содержание КБ в гранулоцитах костного
мозга крыс в условиях КЦГ в течение 1-х суток не изменилось по
сравнению с контролем (нормотермия+физиологический раствор)
[128]. На 2-е сутки гипотермии содержание КБ увеличилось. При
этом коэффициент вариации не выходил за пределы физиологи­
ческих колебаний (1—10 %). Увеличение содержания КБ коррели­
ровало с повышением выживаемости животных.
Таким образом, одним из состояний организма являются ги­
поксия и гипотермия, в ответ на воздействие которых активирую­
тся общие (энергетические, регуляторные) и специализированные
(синтетические, антибактериальные) функции, осуществляется

127

Глава 4. Классификация состояний биологических объектов

перестройка метаболизма на гликолитический тип обмена, обес­
печивающий сверхвыживаемость биологических объектов.
Помимо гипоксии и гипотермии, как уже указывалось, извест­
ны различные другие формы и механизмы значительного сниже­
ния жизненной активности как способ выживания в неблагоприя­
тных условиях. Примером могут служить явления гибернации (зи­
мней спячки), оцепенения, которое характерно для некоторых
представителей фауны пустынной (аридной) зоны, и т. д. В этих
случаях, как и при гипотермии, несомненно, организмы сохраня­
ют некоторый необходимый обмен и функции жизнедеятельнос­
ти, хотя и в очень ограниченном масштабе. Поэтому для более
глубокого понимания состояния биологических объектов при
криоконсервировании следует подробнее остановиться на приро­
дном явлении гибернации и протекающих при нем процессах.
Известно, что в гибернацию, характеризующуюся значительным
и длительным снижением температуры тела и метаболизма, впадают
животные разных филогенетических групп. В состоянии спячки тем­
пература тела млекопитающих понижается до 3—5 °С, а пойкило­
термных позвоночных — до 0 или -2 °С. Во время холодового оцепе­
нения у зимоспящих животных резко снижается электрическая ак­
тивность мозга, уменьшаются потребление кислорода нервной тка­
нью [238], содержание РНК и белков [158]. Обеднение мозга РНК и
белками в определенной мере обусловлено общим угнетением био­
синтетической активности и снижением уровня энергетического
обеспечения в результате понижения температуры животных до
5—6 °С. Имеет место также длительное и генерализованное тормо­
жение функциональной активности мозга, которое в момент пробу­
ждения сменяется резкой активацией. Установлено, что пробужде­
ние крапчатых сусликов Citellus suslicus сопровождается резкой акти­
вацией РНК в мозге: если за 2 ч после введения 3Н-уридина живот­
ные разогревались и просыпались, то включение РНК за это время
возрастало от 1 до 7 % активности пула [56]. Следовательно, увеличе­
ние включения 3Н-уридина в РНК в момент пробуждения сусликов
отражает истинное возрастание синтеза РНК.
Изучено влияние холодового оцепенения и возбуждения в мо­
мент пробуждения от зимней спячки на включение 3Н-уридина в
нуклеотидный пул и РНК в мозге сусликов [56]. Авторы показали,
что во время спячки активность нуклеотидного пула уменьшается
вдвое, а интенсивность синтеза — в 10 раз по сравнению с актив­
ными животными. Через 2 ч после пробуждения от спячки объем
нуклеотидного пула не увеличился, а синтез РНК возрос в 6 раз.

128

4.2. Состояние биологических объектов в процессе криоконсервирования

По мнению авторов, важную роль в регуляции синтеза РНК игра­
ют энергетические факторы и функциональная активность мозга.
Синтез белка изучен также в зимний период у пробуждающихся
сусликов и крыс изотопным методом с использованием 3Н-лейцина
[89—91]. Показано, что активация синтеза белков у зимоспящих
происходит уже на начальных этапах пробуждения еще при низкой
температуре тела грызунов. Это позволило автору предположить на­
личие у гибернаторов специального механизма стимуляции процесса
синтеза белков, который может реализоваться уже на значительных
этапах разогрева животных. При этом в период зимней спячки прои­
сходят циклические изменения синтетической активности клеток, а
также периодическое обновление белков мембран в процессе спон­
танных пробуждений гетеротермных животных. Предложен возмож­
ный механизм перестройки цитоплазматических мембран клеток сер­
дца сусликов в цикле гибернация—пробуждение путем замены мем­
бранного материала на бислой цитоплазматических везикул, содер­
жащих вновь синтезированные белки. Таким образом, в состоянии
гибернации в природе снижение температуры тела животных пред­
полагает наличие механизма, ответственного за обновление и интен­
сификацию процесса синтеза белков.
Актуальность проблемы поиска фармакологических средств,
ускоряющих процессы реабилитации, обусловлена развитием па­
тологических реакций, снижающих резистентность организма при
самосогревании после глубокой гипотермии. В этой связи изучено
влияние фармакологических веществ различного класса соедине­
ний на процессы восстановления после глубокой гипотермии, вы­
зываемой острым охлаждением [130]. Установлено, что психости­
муляторы сиднокарб и феномин снижают выживаемость живот­
ных при самосогревании. Декстран, глюкоза в различных дозах не
влияют на скорость разогревания и устойчивость животных в этот
период, а при температуре 19 °С даже ускоряют их гибель. Наибо­
лее положительное действие на выживаемость животных оказыва­
ют полиэтиленгликоли (ПЭГ), которые достоверно повышают
резистентность и ускоряют восстановление температурного го­
меостаза после глубокой гипотермии. На фоне действия ПЭГ сни­
жается концентрация малонового альдегида, холестерина и били­
рубина, предотвращается рост активности аминотрансфераз в сы­
воротке крови. Нормализуются осмотичность плазмы, ионный
(Na, К, Cl, Cu2+) и белковый составы. Авторы полагают, что эффе­
ктивность ПЭГ обусловлена их ингибирующим влиянием на про­
цессы ПОЛ, мембранностабилизирующую и антиагрегатную акти­
вность этих соединений. Учитывая влияние ПЭГ на дезинтокси­

129

Глава 4. Классификация состояний биологических объектов

кацию, реологические характеристики крови, проницаемость Саканалов, авторы допускают, что изменения в организме в период
восстановления после интенсивного охлаждения обусловлены на­
рушением теплового гомеостаза, гомеостаза ионов Ca2+ и опосре­
дуемой ими патологии мембран.
Изучена реакция системы, ответственной за генерацию NO,
на комбинацию факторов (гипоксия, гиперкапния, темнота и низ­
кая температура), создающих условия для развития природного
гипометаболизма у животного, способного впадать в зимнюю спя­
чку (хомяк) по сравнению с животным (крыса), у которого такая
способность отсутствует [232]. Сочетанное действие нарастающей
гипоксии и гиперкапнии на фоне охлаждения, по мнению авто­
ров, затрагивая одни и те же 2-аргининовые NO-пути, не приво­
дит к серьезным нарушениям обмена NO у гибернизирующих и
негибернизирующих животных. Отмеченные изменения носят,
вероятно, адаптивный характер, в основном нивелируются уже че­
рез 2 ч и окончательно — через 24 ч после возвращения животных
в нормальные условия. Исключение составляет сниженный уро­
вень нитрита в крови у животных, способных к гибернации.
В целом все виды гибернации — это «воспоминание о земной
(наземной) эволюции, о ледниковых периодах, о суточных и се­
зонных колебаниях температуры и формирование соответствую­
щих механизмов адаптации» [48]. Качественно иное явление на­
блюдается в биологических объектах, к которым не применимо
понятие «жизнедеятельность», а только понятие и термин «жизне­
способность», т. е. способность при определенных условиях ста­
новиться жизнедеятельными. Примером служат семена, споры, а
также организмы, впадающие в анабиоз.
Итак, перечисленные выше состояния биологических объек­
тов, такие, как гипоксия и гипотермия, предшествующие криокон­
сервированию, гипотермия как самостоятельный вид охлаждения,
гибернация и анабиоз являются составными частями криобиоло­
гической науки.
Считали, что интенсификация обменных процессов при холо­
довых воздействиях связана с адаптационными реакциями, направ­
ленными лишь на сохранение постоянства внутренней среды (го­
меостаз) или функциональных характеристик биосистемы. Поэто­
му до настоящего времени не акцентировали внимания на том, что
адаптация может быть срочной и долговременной. Между тем, по
мнению ряда физиологов, это очень принципиальный вопрос, так
как механизмы обоих типов реакций различны, несмотря на нали­

130

4.2. Состояние биологических объектов в процессе криоконсервирования

чиє общих элементов [141, 159]. Так, наиболее изученные острые
механизмы адаптации связаны с изменениями взаимоотношений
внутри функциональной системы уже «имеющимися» средствами,
например изменение ферментативных реакций синтеза белка с це­
лью сохранения и поддержания постоянства гомеостаза.
Долговременные механизмы адаптации, в отличие от срочных,
связаны с увеличением массы активно функционирующих струк­
тур, переходом организма на новый уровень гомеостаза. Это под­
тверждает открытое недавно явление раннего «всплеска» в струк­
турных компонентах клетки [140]. Оно заключается в том, что при
действии на клетки повреждающих факторов мгновенно включа­
ются системы, направленные на поддержание гомеостаза и подго­
товку к переходу на новый режим работы, адекватный возникшим
новым условиям. Эта реакция крайне кратковременна и быстро
заменяется стабильным режимом адаптации, при котором функ­
ционирование происходит на более высоком уровне по сравнению
с контролем. Она обеспечивается не отдельными органами, а сис­
темой, специфически реагирующей на данный раздражитель, и
стресс-реализующими системами, например адренергической и
гипофизарно-адреналовой, неспецифически реагирующими на
самые различные изменения в среде обитания. В дальнейшем, по
мнению авторов, повышенный запрос на функцию приводит к
формированию структурного «следа» адаптации, который пред­
ставляет собой комплекс структурных изменений, обеспечиваю­
щий расширение звена, лимитирующего функцию клеток, и тем
самым увеличивающий физиологическую мощность функциона­
льной системы, ответственной за адаптацию. В клетках доминиру­
ющей функциональной системы увеличенная физиологическая
функция активизирует генетический аппарат, усиливается синтез
нуклеиновых кислот и белков. При повторном (многократном)
действии чрезвычайного раздражителя структурный «след» закре­
пляется. В биологии известны и другие способы формирования
физиологической мощности функциональной системы, отражен­
ные, например, в явлении гетерозиса [197]. Показано, что длите­
льный отбор на жизнеспособность в линии, несущей полулетальный ген в гомозиготном состоянии, приводит к значительным ге­
нетическим перестройкам ее. Из резервов генотипа популяции
шелкопряда образуется новая форма, отличительной особеннос­
тью которой служит появление мощного компенсационного ком­
плекса из генов, контролирующих жизнеспособность.
В криобиологии, к сожалению, долгое время молчаливо при­
знавали, что факторы криоконсервирования являются генетичес­

131

Глава 4. Классификация состояний биологических объектов

ки инертными и что отсутствие ГХА не позволяет повысить уро­
жайность растениеводческих культур. Вместе с тем известно, что
к наследуемым изменениям, вызываемым гипотермическими и
сверхнизкими температурами, относят полиплоидию, которая в
современной генетике классифицируется как геномная мутация,
выражающаяся в изменении числа хромосом или хромосомных
наборов. В настоящее время уже получены холодочувствительные
доминантные летальные мутации на дрожжах и дрозофиле в хро­
мосомах 2 и 3 (в зависимости от вида мутаций) и гетерозисные
криогибриды на летальной основе.
Известно, что для эволюции и закрепления полезных организ­
му признаков большое значение имеет фиксация этой полезной
информации в генетическом аппарате клеток. Генетические про­
граммы реализуются через синтез специфических белков. Это мо­
жет изменять интенсивность и направленность метаболизма кле­
ток, а также функций органов, что, несомненно, сказывается на
приспособляемости индивидуумов. Особи, относящиеся к различ­
ным типам и видам, имеют разные физиологические и метаболи­
ческие особенности, поэтому пути к приспособлению к одним и
тем же условиям могут быть разными. В последние годы представ­
лены данные сравнительного изучения реакции белоксинтезирующего аппарата пойкилотермных и зимнеспящих животных при
их приспособлении к различным температурам. Показано, что как
пойкилотермные животные, так и зимнеспящие млекопитающие,
приспосабливаясь к различным температурам, используют выра­
ботанные в процессе длительной эволюции генетические механи­
змы адаптации, реализуемые через дифференциальную экспрес­
сию генов и синтез белков [91]. В связи с этим данные механизмы
приспособления специфичны для различных животных, органов и
тканей, а также зависят от температурных условий приспособле­
ния. Известно, что интенсивность и направленность метаболизма
определяются степенью активности, качественным и количест­
венным составом ферментов в клетке, а их необходимая концент­
рация регулируется изменением скорости их синтеза и распада.
Поэтому обнаруженные авторами при адаптации явления пери­
одического частичного обновления белкового состава у пойкило­
термных и зимнеспящих животных можно рассматривать как при­
способительный полифункциональный ответ клеток на необходи­
мость изменения функциональной активности органов.
Таким образом, появляется все больше данных о гипотермии и
криоконсервировании как о генетически активных факторах, улуч­
шающих свойство биологических объектов. Приведенные данные о

132

4.2. Состояние биологических объектов в процессе криоконсервирования

формировании структурного «следа» адаптации и появлении гете­
розисного эффекта, что ведет к физиологической мощности, суще­
ственно изменяют представления о состоянии организмов (их орга­
нов, тканей и клеток) после криоконсервирования.
Переход на новый уровень функционирования (гомеостаза)
предполагает не только изменение промежуточных величин, но и
области допустимых колебаний жизненно важных характеристик
гомеостатических систем. В этой связи к понятию «норма» авторы
относят не только среднестатистические показатели, но и учиты­
вают конкретные условия окружающей среды [141, 159]. Наряду с
этим, создавая определенные условия, можно целенаправленно
регулировать протекающие процессы и моделировать заданное
состояние клеток, тканей и организма, например более устойчи­
вое к гипоксии, гипотермии либо криоконсервированию.
Представление о показателе «норма» (исходное) в настоящее
время меняется. Обычно состояние биологических объектов до
криоконсервирования считали «нормой» и с этим «эталоном» срав­
нивали данные, полученные после криоконсервирования. Все по­
казатели со знаком (-) оценивали как тенденцию к снижению
морфофункциональных свойств, со знаком (+) — как их актива­
цию, направленную на осуществление репаративных процессов и
сохранение гомеостаза. Согласно этому, фиксировали лишь два
состояния биологических объектов после криоконсервирования —
сохранение и повреждение, в основу которого было положено
представление о том, что «норма» — это среднестатистические по­
казатели и любое отклонение от «нормы» — патология. Основное
внимание исследователи направляли на изучение механизмов
криоповреждения, главным образом, клеточных мембран, исполь­
зуя преимущественно биохимические методы.
Отсутствие цитохимических данных в этом направлении было
связано с необходимостью модификации гистохимических мето­
дов, разработанных для срезов [25, 123, 167], и использовании де­
тергентов для обнаружения «маскированных» ядерных структур.
Поэтому одновременно с решением криобиологических вопросов
мы уделяли большое внимание разработке цитохимических мето­
дов в зависимости от вида клеток и факторов криоконсервирова­
ния. Основные положения отражены в работах [151, 154].
Мы уделили внимание вопросам состояния организмов как
теоретической основы криобиологии и криомедицины, в которой
существенная роль отводится криопротекторам. В этой связи
представляется целесообразным рассмотреть особенности криоп­
ротекторов и их токсикофармакологические свойства.

ГЛАВА 5

Криопротекторы.
Классификация и механизм
действия

С давних пор человечество мечтало о могучем здоро­
вье и вечной жизни. Люди открывали целебные свойства трав, хи­
мические и физические вещества, создавали легенды о бессмер­
тии. Эта проблема занимала и умы ученых. В конце XIX — первой
половине XX в. были открыты особенности представителей раз­
ных видов растений и животных переносить снижение температу­
ры тела ниже 150 °С: семенных растений — 1887 г., бактерий —
1899 г., грибов — 1900 г., червей и членистоногих — 1919 г., папо­
ротниковых — 1930 г., водорослей — 1936 г. Каковы же причины
выживаемости представителей флоры и фауны при столь низких
температурах?
Оказалось, что природа создала специальные химические ве­
щества, которые защищают морозоустойчивые виды от вредного
действия холода. Это глицерин, углеводы — сахара, глюкоза и др.
Известно, например, что в зимний период в ткани личинок аркти­
ческих насекомых, обитающих на островах северного побережья
Канады, накапливается глицерин, чего не бывает летом. Природ­
ные химические соединения, защищающие насекомых и рыб от
переохлаждения, назвали биологическими антифризами. Они
представляют собой биополимеры, в состав молекул которых вхо­
дит полярный кислород, способный взаимодействовать водород­
ными связями. Благодаря упомянутым защитным веществам внут­
реннего замерзания не происходит и, таким образом, кристаллы
льда не разрушают ткани. Американские ученые установили, что у
лягушек, способных переносить низкие температуры от -3 до
−8 °С, в момент появления кристаллов льда в конечностях интен­
сивно образуется глицерин или глюкоза в зависимости от вида
животных. Замороженные животные переходят на бескислород­
ное дыхание (гликолиз). В сердечной мышце накапливается спе­

134

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

циальное вещество — лактат. У более высокоорганизованных жи­
вотных, таких, как якутская лошадь, в зимний период при 50 °С
накапливается гликоген. Более того, увеличиваются размеры ми­
тохондрий, которые представляют собой энергетическое депо кле­
тки, и лизосомального аппарата печени, ответственного за про­
цессы внутриклеточного пищеварения, защиты клеток от вредных
воздействий, самоочищения и др., что не наблюдается при 20 °С.
Таким образом, природа мудро позаботилась о создании защит­
ных химических веществ и «инструкций» выживания охлажден­
ных и замороженных животных.
Для искусственного сохранения в жизнеспособном состоянии
клеток, тканей и организмов потребовалось создание аналогич­
ных веществ, так называемых криопротекторов. Из известных
100 химических соединений, обладающих криозащитными свой­
ствами, активными криопротекторами оказались единичные пред­
ставители различных классов веществ (многоатомные спирты,
оксиды, амины и др.). В конце 40-х годов прошлого века благода­
ря таким ученым, как П.И. Бахметьев, Л.К. Лозина-Лозинский,
С. Polge и др., подобные исследования выделились в самостояте­
льную науку — криобиологию. До недавнего времени основу этой
науки составляли исследования состояния функционирования и
адаптации (приспособления) живых организмов к низкой темпе­
ратуре. Благодаря открытию нами явления программированной
жизни охлажденной и криоконсервированной клетки возможнос­
ти и значимость криобиологических исследований значительно
расширились.
Из изложенного выше следует, что в настоящее время для ха­
рактеристики клеток и тканей применяют крайне ограниченное
количество криопротекторов. Это связано, в основном, со слож­
ным комплексом требований, предъявляемых различными авто­
рами к указанной группе соединений. Прежде всего они должны
легко проникать в клетки, быстро связывать воду, хорошо раст­
воряться в водных растворах электролитов, способствовать об­
разованию низкоплавных электрических смесей, обеспечивать
мелкую однородную кристаллизацию льда, иметь низкую моле­
кулярную массу, обладать малой токсичностью в больших конце­
нтрациях и др.
Считают, что высокую растворимость в воде следует признать
одним из необходимых критериев, предъявляемых к криопротек­
торам [340]. К такому выводу авторы пришли после выяснения
причин различий в криозащитной эффективности ДМСО и диме­
тилсульфоне — близких по химической структуре веществ. Авто­

135

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

ры исследовали фазовое поведение их водных растворов при замо­
раживании суспензии лимфоцитов человека. При низких концен­
трациях точки замерзания растоворов ДМСО и диметилсульфона
были близки к расчетным для идеальных растворов. Эксперимен­
тальная кривая ДМСО отклонялась от идеальной с повышением
осмотического коэффициента. Кривая для диметилсульфона со­
ответствовала идеальной до концентрации 10 %, затем точка заме­
рзания оставалась постоянной (−1,6 °С) до концентрации 20 %.
Авторы связывают наличие данного плато с пределом растворимо­
сти диметилсульфона в воде. При замораживании—оттаивании с
повышением концентрации ДМСО возрастал процент выживае­
мости клеток. Результаты опытов с диметилсульфоном показали
обратную зависимость, что, по мнению авторов, обусловлено вы­
падением диметилсульфона в осадок при низких температурах как
во вне-, так и внутриклеточной среде. Поэтому наряду с другими
перечисленными признаками растворимости криопротекторов
отводится важная роль для их дальнейшего использования в крио­
биологических целях.
По характеру взаимодействия с клетками все криопротекторы
могут быть разделены на две группы: так называемые эндоцеллю­
лярные, свободно проникающие внутрь клетки, — глицерин,
ДМСО, глюкоза и др., экзоцеллюлярные, не проникающие в клет­
ку, — ПВП, декстран и другие полимеры. В отличие от эндоцеллюлярных последние не требуют удаления из клеток после размо­
раживания перед введением их в организм реципиента. Способ­
ность проникать в клетки у ПЭО зависит от их молекулярной массы
[237]. Другие авторы все криопротекторы делят на четыре группы:
спирты, сахара, смешанные соединения и полимеры [256]. Всем
криопротекторам присуще токсическое действие, ослабляющее
эффект криозащиты и связанное, по мнению автора, скорее всего
с их осмотическим действием. Имеются данные, свидетельствую­
щие о химической природе токсичности криопротекторов. Токси­
чность криопротекторов зависит от их концентрации, температу­
ры и времени инкубации клеток в них. Считалось, что для прояв­
ления защитного действия криопротекторы должны проникать в
клетки. Однако это положение не доказано. Защитный эффект бо­
льшинства криопротекторов связан со снижением температуры
кристаллизации воды и увеличением количества жидкой фазы
клеток при температурах выше точки эвтектики. Ряд криопротек­
торов (ДМСО, глицерин) проявляет множественное биологичес­
кое действие: радиозащитное, активирующее генетический ап­
парат клетки, мебранотропное [256].

136

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

Криопротекторы для растительных клеток предлагают класси­
фицировать следующим образом [390]:
1) проникающие и сквозь клеточную стенку, и сквозь плазмалемму (глицерин, ДМСО);
2) проникающие сквозь клеточную стенку, но не плазмалемму
(олигосахариды, аминокислоты, полимеры с низкой молекуляр­
ной массой);
3) непроникающие.
Криопротекторы первой группы вначале индуцируют времен­
ный плазмолиз, снижают адгезию протопласта к клеточной стен­
ке, затем клетка возвращается к исходному объему. Криопротек­
торы второй группы защищают протопласт от сверхдегидратации
и действия солей, индуцируют плазмолиз до замораживания. При
замораживании они концентрируются между клеточной стенкой и
плазмалеммой и образуют буферный слой. Криопротекторы тре­
тьей группы концентрируются перед фронтом кристаллообразова­
ния и снижают его скорость.
В опытах на срезах почки кролика, инкубированных в 40%-м
растворе ДМСО или ацетамида с 300 мМ манитола, изучена при­
рода токсичности криопротекторов. Установлено, что полупериод
для пассивного транспорта воды составляет 0,8 мин, ацетамида —
5 мин. Такие высокие скорости диффузии позволили автору пред­
положить отсутствие выраженного осмотического стресса во вре­
мя насыщения органа раствором криопротектора или отмывки от
него. Сокращение времени насыщения—отмывки с 300 до
230 мин привело к увеличению жизнеспособности срезов почки.
Это, по мнению автора, подтверждает биохимическую природу
токсичности криопротекторов.
Другие авторы показали, что уже в подготовительный период
холодового анабиоза животных клеток (эритроцитов) их метабо­
лическое состояние существенно изменяется, что, в основном,
обусловлено торможением криопротекторами транспорта амино­
кислот, нуклеозидов, катионов. При этом затрагиваются все ос­
новные виды транспорта веществ через плазматические мембраны:
диффузия, пассивный транспорт, работа ионных насосов. Непро­
никающие криопротекторы тормозят поступление метаболитов и
ионов в клетки при более низких концентрациях в криозащитной
среде, чем проникающие криопротекторы. Степень торможения
транспорта веществ также зависит от вида биологического объекта
и чувствительности транспортного процесса к тому или иному
криопротектору. Нарушение транспортного процесса связано с
изменением физико-химических условий среды: повышением вяз­

137

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

кости раствора, уменьшением диэлектрической постоянной сре­
ды, увеличением осмотической силы растворов, что затрудняет
взаимодействие мембраны и переносчиков с субстратами и созда­
ет неблагоприятные условия для переноса веществ в клетки. В
случае использования проникающих криопротекторов торможе­
ние метаболизма аминокислот дополняется непосредственным
ингибированием криопротекторами компонентов трансляции, а
при использовании непроникающих криопротекторов торможе­
ние метаболизма аминокислот и нуклеозидов дополнительно уси­
ливается осмотической дегидратацией.
Методом 31Р-ЯМР изучены некоторые аспекты физико-хими­
ческих основ метаболических процессов в эритроцитах человека,
влияние криопротекторов на энергетическое состояние клеток
[103]. Приведена классификация проникающих и непроникаю­
щих криопротекторов. Так, криопротекторы гомологического ря­
да полиэтиленгликолей — ПЭГ, ЭГ, ДЭГ, ТЭГ оказались прони­
кающими, ПЭО-400 — непроникающими, а ПЭГ-200 и ПЭГ-300
заняли промежуточное положение, причем их проникающая спо­
собность была различной при температурах в диапазоне 20—40 °С.
Авторы показали, что в случае полностью оксигенированных эри­
троцитов при добавлении непроникающего криопротектора знак
pH на мембране изменяется. Получены также новые эксперимен­
тальные доказательства увеличения под воздействием ДМСО раз­
меров мембранных пор эритроцитов при повышении температуры
до 40 °С. Исследована энергетическая стабильность эритроцитов в
присутствии как проникающих, так и непроникающих криопро­
текторов. Установлено, что при использовании непроникающего
соединения ПЭО-400 макроэрги в клетке в процессе их инкуба­
ции при 30 °С в отсутствие глюкозы расходуются быстрее, чем в
случае проникающего глицерина. Этот эффект также может быть
обусловлен изменением кислотно-основного равновесия под вли­
янием непроникающих соединений. В результате проведенного
кинетического анализа энергетической стабильности эритроцитов
в ходе криоконсервирования с 1,2-ПД выявлена стадия криокон­
сервирования, при которой резко снижается уровень макроэргов.
Возможны и другие типы влияния криопротекторов на метабо­
лизм клеток, например за счет резкого повышения концентрации
криопротекторов при замораживании [328].
К наиболее известным эндоцеллюлярным криопротекторам в
первую очередь относят глицерин [119, 236, 237]. Сделано предпо­
ложение, что глицерин понижает распределение фронта кристал­
лизации, способствует переохлаждению среды и обусловливает

138

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

мелкокристаллическое замерзание растворов. Поскольку глице­
рин не кристаллизуется одновременно с водой, то он разбавляет
солевые растворы, не допуская их сильной концентрации, т.е.
действует как противосолевой буфер; перемещая границу эвтекти­
ки в зону низких температур, он способствует образованию стек­
ловидных структур. Место приложения защитных свойств глице­
рина — ионы металлов, находящиеся в клетке и необходимые для
биологической активности многих ее компонентов. Изучено вли­
яние глицерола на каталитическую активность Са2+-насоса и асим­
метричное распределение фосфатидилсерина в мембранах эрит­
роцитов человека, оцененное методом проточной цитометрии по
связыванию аннексина V-FITC с эритроцитами [93]. Показано,
что достаточно продолжительный контакт клеток с криопротекто ­
ром не влияет заметно на экспонирование фосфатидилсерина на
внешнюю поверхность мембраны. Это свидетельствует о том, что
повышение уровня Са2+АТФазы под влиянием глицерола не ока­
зывает негативного действия на структуру липидного бислоя.
Защитное действие эндоцеллюлярных криопротекторов слага­
ется из ряда факторов: являясь хорошими растворителями, они
снижают концентрацию солей и электролитов до безопасного
уровня и, тем самым, смягчают их денатурирующее действие на
белковые структуры компонентов клетки; способствуя переохлаж­
дению растворов, обусловливают мелкокристаллическое их замер­
зание; обладая небольшой молекулярной массой, легко проника­
ют в клетки, замещая и связывая воду, а также понижая точку эв­
тектики, препятствуют развитию в клетках процессов кристалли­
зации и обусловливают мелкокристаллическое замерзание.
Преимущество ДМСО перед глицерином состоит в быстром
достижении осмотического равновесия через клеточную мембра­
ну. Несмотря на различную химическую структуру, по механизму
защитного действия при замораживании глицерин и ДМСО очень
близки. Последние, проникая в клетку, понижают точку замерза­
ния растворов и точку начала кристаллизации, а также предотвра­
щают гиперконцентрацию электролитов, так как обладают спосо­
бностью растворять соли и другие органические и неорганические
соединения. Обладая мембранотропным действием, ДМСО может
не только стабилизировать клеточные мембраны, но и вызывать в
предишемическом периоде перестройку клеточного метаболизма,
направленную на активирование неспецифических адаптацион­
ных процессов. Показана экспрессия шим-гена в сальмонелле под
действием ДМСО [346].

139

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

Поиски новых эффективных криопротекторов привели к соз­
данию отечественных криопротектров — ПЭО, обладающих струк­
турирующим действием на воду. Препараты были синтезированы
в Харьковском химико-фармацевтическом институте [236, 237].
Их способность увеличивать количество связанной воды опреде­
ляется химической структурой этих соединений. Методом рентге­
ноструктурного анализа и низкотемпературной кристаллографии
установлено, что ПЭО-400 в значительно меньшем количестве,
чем глицерин, проникает в клетку; основная же его масса локали­
зуется экстрацеллюлярно. Эти данные свидетельствуют о принци­
пиальном отличии механизма защитного действия ПЭО от дейст­
вия глицерина. ПЭО — криопротекторы широкого диапазона за­
щитного действия в отношении различных биологических объек­
тов (ядросодержащих клеток крови и костного мозга, эритроцитов
человека, спермы ценных пород рыб, микроорганизмов, штаммов
опухолей, роговой оболочки, кожи, эндокринных желез и других
биологических объектов).
В настоящее время изучаются возможности применения ПЭО
при криоконсервировании органов. Эффект криозащиты клеток и
тканей зависит от природы, физико-химических свойств и моле­
кулярной массы полимера. Так, ПЭО-100, ПЭО-ЗОО проникают в
клетки и по характеру криозащиты близки к эндоцеллюлярным
криопротекторам. Наиболее широко защитные свойства отечест­
венного препарата ПЭО-100 исследованы при замораживании
спермы быков [156,157]. ПЭО-400 обладает свойствами эндо- и
экзоцеллюлярного криопротектора. Он обеспечивает высокую
криозащиту клеток крови и костного мозга, сохраняя высокий
уровень жизнеспособных клеток. При изучении механизма дейст­
вия ПЭО-400 нами установлено отсутствие значимых различий по
способности клеток костного мозга к синтезу ДНК после удале­
ния криопротектора. После отмывания ПЭО-400 показатели ак­
тивности НАД · Н2-ДГ и Г-6-ФДГ у всех групп клеток достигли
контрольного уровня. Сходную картину наблюдали и в отноше­
нии потребления О2 клетками лейкоконцентрата. Предваритель­
ное торможение ПЭО-400 важнейших метаболических процессов,
возможно, уменьшает повреждающее действие холода в процессе
замораживания. Получены данные о гипотензивном действии
ПЭО-400, ПЭО-1500 и ПЭО-4000 на внутриглазное давление [21].
Определены оптимальные дозы ПЭО различных молекулярных
масс, вызывающие при внутривенном и пероральном введении в
дозе 1,5—2,0 г чистого вещества на 1 кг массы тела снижение внут­
риглазного давления у опытных животных. Установлено, что в ос­

140

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

нове снижения внутриглазного давления с помощью ПЭО-400 ле­
жит дегидратация стекловидного тела вследствие изменения осмо­
тического градиента крови. ПЭО-400 как гипотензивное средство
рекомендован при лечении больных глаукомой и подготовке к
оперативным вмешательствам с повышенным риском.
ПЭО более высокой молекулярной массы (1500, 4000) оказы­
вает высокий защитный эффект при замораживании эритроцитов
человека. Механизм защитного действия ПЭО обусловлен способ­
ностью этого соединения связывать воду и этим затруднять крис­
таллизацию воды [237]. При использовании высокомолекулярно­
го ПЭО-8000 были получены высокие показатели сохранности,
выхода жизнеспособных клеток и метаболической активности
КЭП человека после криоконсервирования [166]. При культиви­
ровании КЭП человека, криоконсервированных в присутствии
ПЭО-8000 в полутвердых метилцеллюлезных средах, наблюдается
значительная задержка в формировании колоний, что, по мнению
авторов, может свидетельствовать о перспективности использова­
ния ПЭО для регуляции пролиферации СКК.
В последние годы показано, что наилучшее защитное действие
при консервировании эритроцитов оказывает 10%-й ПЭО-1500.
При этом сохраняется 99 +0,07 % клеток, незначительно изменяю­
тся показатель СОЭ, содержание внутриклеточного калия, уро­
вень 2,3-дифосфоглицериновой кислоты и характер кривых дис­
социации оксигемоглобина.
Криопротекторные свойства ПВП заключаются в следующем:
• ПВП действует исключительно как экстрацеллюлярное за­
щитное вещество;
• прочно связывает внеклеточную воду и часть воды, извле­
ченной из клеток, замедляя рост кристаллов льда;
• обволакивает клетки, что не только защищает их от непос­
редственного воздействия уже образовавшихся кристаллов льда,
но при быстром замораживании препятствует образованию кон­
центрированных растворов солей внутри и вне клетки, поскольку
при таком быстром образовании мелких кристаллов соли замерза­
ют вместе с водой.
На основании многочисленных работ, проведенных в ИПКК
НАН Украины, при сравнении свойств различных криопротекто ­
ров установлено, что при замораживании костного мозга макси­
мальными защитными свойствами обладает ПЭО-400. По крио­
протекторным свойствам он не уступает стандартному криопроте­
ктору — глицерину и превосходит ПВП, обеспечивая максималь­
ную выживаемость элементов костного мозга после оттаивания.

141

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

ПЭО-400 выгодно отличается от глицерина тем, что он не токси­
чен и не нуждается в удалении из клеток костного мозга перед вве­
дением их в организм реципиента. Тем самым значительно упро­
щается техника трансплантации и трансфузиологии и исключает­
ся потеря клеток во время отмывания.
Для подтверждения этого токсикологические свойства ПЭО-400
изучены на разных видах животных (белых мышах, крысах, кроли­
ках, собаках) [151]. Летальная доза (ЛД) при внутрибрюшинном
введении белым крысам составила 8,5—12,3 г/кг массы животно­
го. Это дало основание для заключения, что по такому важному
интегральному показателю токсичности, как смертность при ост­
ром отравлении, ПЭО относится к сравнительно нетоксичным со­
единениям. В подострых опытах при ежедневном внутрибрюшин­
ном введении ПЭО в течение 15 сут в дозах 1,5 ЛД-50 каких-либо
изменений внутренних органов не обнаружено.
В проведенных нами цитохимических исследованиях активно­
сти пероксидазы (рис. 45, см. вклейку), ЦХО (рис. 46, см. вклей­
ку), СДГ (рис. 47, см. вклейку), НАДФ · Н2.-ДГ (рис. 48, см. вклей­
ку), Г-6-ФДГ (рис. 49, см. вклейку) и других в клетках костного
мозга не выявлены какие-либо изменения, свидетельствующие о
неблагоприятном влиянии криопротектора ПЭО-400 на изучае­
мые показатели. Такие же результаты получены в опытах на соба­
ках. Внутривенное введение ПЭО-400 в дозе 5 г/кг не оказывает
угнетающего действия на кроветворение, свертывающую систему
крови, не вызывает нарушений функциональной деятельности и
морфологической структуры внутренних органов собак.
Проведено патоморфологическое исследование характера дейст­
вия криопротектора ПЭО-1500 на крысах и кроликах [82]. В ост­
рых опытах кроликам однократно внутрибрюшинно вводили 10- и
50%-е растворы в смертельных дозах. ЛД-50 для ПЭО-1500 соста­
вила 8 г/кг. Крысам троекратно через сутки в дозах 1/2 ЛД-50 вво­
дили 15- и 50%-е растворы криопротекторов. ЛД-50 для крыс-са­
мок составила 11,5 г/кг. В подострых опытах многократно (через 2
и 3 сут) в течение месяца кроликам внутривенно, крысам внутри­
брюшинно вводили 1/10, 1/20 и 1/30 ЛД-50 10, 15 и в части опы­
тов — 2%-е растворы ПЭО-1500. Контрольным группам животных
ввели соответствующие объемы 0,9%-го раствора NaCl или дис­
тиллированной воды. Установлено, что в больших дозах
ПЭО-1500 вызывает изменение сосудисто-тканевой проницаемо­
сти, способствует развитию дистрофических процессов в большей
(печень, почки) или меньшей (сердце, легкие, селезенка) степени,
нарушению углеводного, белкового и липидного обменов.

142

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

Многократные инъекции животным растворов ПЭО-1500 в
дозах 1/10, 1/20, 1/30 ЛД-50 не вызывали существенных измене­
ний массы внутренних органов и структурных отклонений, харак­
теризующих токсическое и раздражающее действие веществ. По­
лученные результаты позволили отнести ПЭО-1500 к малотоксич­
ным веществам.
В связи с отсутствием цитохимических данных о токсикологи­
ческих свойствах ПЭО-1500 мы провели исследование активности
ЦХО в клетках костного мозга кроликов и крыс в условиях остро­
го и подострого экспериментов. В контрольных препаратах про­
дукт реакции на ЦХО выявляется в виде мелких гранул диформазана различной величины (рис. 50, см. вклейку). При однократном
введении кроликам 10- и 50%-х растворов ПЭО-1500 (ЛД-50 —
8 г/кг) резко изменился характер распределения продукта реак­
ции, маркирующего места ферментативной активности. Образо­
вались крупные полиморфные гранулы и изменился характер их
распределения в цитоплазме клеток костного мозга кроликов по
сравнению с контролем (рис. 51, см. вклейку). Другая часть клеток
характеризовалась низким уровнем продукта реакции либо по­
лным его отсутствием, что расценили как инактивацию фермента.
В условиях подострого эксперимента (внутривенное введение
кроликам и внутрибрюшинное крысам в течение месяца 1/30
ЛД-50) выявлена высокая активность ЦХО. При этом отсутствова­
ли какие-либо качественные изменения характера распределения
продукта реакции, как было обнаружено в остром опыте. В усло­
виях подострого опыта (внутривенное введение кроликам и внут­
рибрюшинное крысам ПЭО-1500 1/20 ЛД-50), в отличие от преды­
дущего опыта, выявлена умеренная активность ЦХО. Качественных
изменений не обнаружено. На основании цитоэнзимологических
исследований в условиях острого опыта выявлены существенные
изменения в цепи переноса электронов, вплоть до инактивации
активности ЦХО. В условиях подострого эксперимента введение
животным ПЭО-1500 1/30 ЛД-50 не влияло на активность ЦХО.
Более высокая концентрация криопротектора (1/20 ЛД-50) также
не вызвала каких-либо грубых изменений в активности фермента,
что позволило говорить о малой токсичности ПЭО-1500.
В ИПКиК НАН Украины синтезированы и исследованы окси­
этилированные пентаэритриты различной молекулярной массы
(636, 532, 386, 892, 281, 466, 1126) и степени полимеризации (11,4;
9; 5; 17,2; 3,3; 7,5; 22,5), которые могут использоваться в качестве
криопротекторов при криоконсервировании клеток крови и кост­
ного мозга [195].

143

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

Изучены токсикологические свойства ОЭП 450—500. Сделано
заключение, что ОЭП в дозах 0,97 и 1,95 г/кг относится к малоток­
сичным веществам [236]. ОЭП вызывает кратковременное сниже­
ние артериального давления, изменяет дыхание (увеличивает его
амплитуду и частоту), ведет к повышению количества лимфоци­
тов, сегментоядерных клеток и эозинофилов. С увеличением дозы
действие препарата усиливается. Для уточнения и углубления ток­
сикологических свойств ОЭП в острых опытах кроликам однокра­
тно вводили 10- и 50%-е растворы в смертельных дозах. ЛД-50 со­
ставила для ОЭП 14,5 г/кг. Крысам криопротектор вводили троек­
ратно (через сутки) в дозах 12 ЛД-50 15- и 50%-е растворы. ЛД-50
для крыс-самок составила 20,94 г/кг. В подострых опытах многок­
ратно (через 1, 2 и 3 сут) в течение месяца кроликам внутривенно,
крысам внутрибрюшинно вводили 1/10, 1/20 и 1/30 ЛД-50 10,
15%-х и в части опытов — 20%-х растворов ОЭП. Контрольным
группам животных вводили соответствующие объемы 0,9%-го рас­
твора NaCl или дистиллированной воды.
Показано, что у животных, выживших после введения летальных
доз ОЭП, почти полностью восстанавливается структура тканей и
органов в отдаленные (3 мес) сроки. Многократные инъекции живот­
ным растворов ОЭП в дозах 1/10, 1/20 и 1/30 ЛД-50 не вызывали су­
щественных изменений массы внутренних органов и структурных
отклонений, характеризующих токсическое и раздражающее дейст­
вие веществ. Как показали наши наблюдения, активность ЦХО, пе­
роксидазы, ЛДГ, α-ГФДГ в аналогичных условиях эксперимента в
контрольных препаратах выявляется в цитоплазме гемопоэтических
клеток в виде мелких гранул диформазана, располагающихся в пери­
нуклеарной зоне и в цитоплазме, чередуясь с диффузным их отложе­
нием. Уровень ферментативной активности был ниже в недифферен­
цированных и зрелых элементах гемопоэза. По мере созревания кле­
ток активность фермента увеличивается. После внутривенного вве­
дения 1/20 ЛД-50—10%-го раствора ОЭП — не выявлено каких-либо
качественных изменений в локализации продукта реакции (рис. 52,
см. вклейку). Между тем изучение СГК в клетках костного мозга
кроликов свидетельствует о достоверном снижении активности
ЦХО. В отличие от цитохромоксидазной активности активность
ЛДГ, α-ГФДГ и пероксидазы существенно не изменилась по сравне­
нию с контролем. После внутривенного введения 1/10 ЛД-50—
10%-го раствора ОЭП — незначительно снизилась активность ЦХО,
α-ГФДГ и пероксидазы (рис. 53, см. вклейку).
Известно, что активность ферментов и других веществ зависит
от функционального состояния клеток. В стареющих легко повреж­

144

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

дающихся клетках активность ферментов и других веществ умень­
шается. Кроме того, различные воздействия вызывают дополните­
льные изменения в клетках, что, естественно, влечет за собой даль­
нейшее снижение активности ферментов и содержания веществ.
Существенная разнородность клеточной популяции, по данным
цитохимических показателей, хорошо оценивается коэффициен­
том вариации (V) [193]. В норме Vколеблется в пределах 5—10 %.
Увеличение последнего свидетельствует о функциональной разно­
родности (разнокачественности) клеток. Проведенный нами ана­
лиз средних показателей активности ЦХО, α-ГФДГ и пероксидазы
показал, что во всех вариантах опытов Vнаходится в пределах фи­
зиологических колебаний. Иными словами, снижение активности
цитохимических и цитоэнзимологических показателей при токси­
кологических исследованиях ОЭП не связано с появлением функ­
ционально неполноценных клеток. Полученные данные дают ос­
нование для заключения о нетоксичности ОЭП, а также для реко­
мендации применять активность ЦХО в качестве чувствительного
теста при изучении токсичности криопротекторов.
Одновременно с изучением криопротекторных свойств ОЭП
велись поиски способов направленного изменения физико-хими­
ческих и биологических свойств глицерина его оксиэтилировани­
ем для криопротекции клеток при замораживании [105,106]. По
мере повышения степени полимеризации осмотическое давление
растворов ОЭГ снижается [236]. Включение пяти и более оксиэтильных звеньев несколько уменьшает его. Замена растворов ОЭГ на
изоосмотическую среду не вызывает разрушения клеток.
Итак, способом оксиэтилирования из глицерина и морфина
были получены соответственно соединения ОЭГл 3 и оксиэтилгептан (оксиэтилен) морфолинл 8, не обладающие цитотоксичностью
и проявляющие высокие криозащитные свойства в отношении пе­
ревиваемых линий культур клеток почки овцы (ПО-2) и эмбриона
свиньи (СПЭВ). Уровень восстановленных клеток после криокон­
сервирования составил 92 и 100 %. Выполнение 100 % монослоя с
нормальным морфологическим статусом наблюдалось после 3 сут
культивирования размороженных клеток. Их митотическая актив­
ность в 1-е сутки составила 33,3 %; на 2-е — 39,0; на 3-й — 43,0 %.
Синтезированные криопротекторы не требуют удаления из размо­
роженной суспензии перед культивированием.
Для изучения токсикологических характеристик ОЭГ в острых
опытах кроликам однократно вводили 10- и 50%-е растворы в сме­
ртельных дозах. ЛД-50 составила 13 г/кг. Крысам троекратно в до­
зах 1/2 ЛД-50 вводили 15- и 50%-е растворы. ЛД-50 для крыс сос­

145

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

тавила 17,27 г/кг. В подострых опытах многократно в течение ме­
сяца вводили 10- и 15%-е растворы ОЭГ в виде 1/10, 1/20 и 1/30
ЛД-50. Установлено, что в больших дозах ОЭГ вызывает развитие
дистрофических процессов, нарушение углеводного и белкового
обменов. В условиях подострого опыта не выявили существенных
изменений массовых коэффициентов внутренних органов и струк­
турных отклонений, характеризующих токсическое и раздражаю­
щее действие веществ. Так, многократное внутрибрюшинное вве­
дение 10%-го ОЭГ п-30 в дозе 1/20 ЛД-50 не нарушает функции
почек. Многократное внутрибрюшинное введение ОЭГ п-30 в той
же дозе, но в 20%-й концентрации может вызвать кратковремен­
ное нарушение канальцевой реабсорбции натрия.
Согласно нашим данным, в клетках костного мозга интактных
кроликов продукт реакции на ЦХО выявляется в виде мелких гра­
нул диформазана, равномерно заполняющих цитоплазму клеток.
СГК составляет 1,93 ± 0,05 в незрелых элементах, 2,36 ± 0,08 в
зрелых гранулоцитах [153]. Коэффициент вариации находится в
пределах физиологических колебаний. В условиях острого опыта
(введение 10- и 15%-го растворов ОЭГ в смертельных дозах) выяв­
лены грубые изменения в локализации продукта реакции: образо­
вание крупных полиморфных гранул диформазана и их перерасп­
ределение. Электронно-микроскопические исследования показа­
ли делокализацию митохондриальных ферментов, появление их в
саркоплазматическом ретикулуме при замораживании—оттаива­
нии скелетных мышц. Поэтому можно предположить, что обнару­
женные нами изменения в локализации продукта реакции связа­
ны с повреждением митохондрий. Качественные изменения энзи­
матической активности коррелируют с количественными. Так, в
условиях острого эксперимента СГК составил лишь 0,53 ± 0,03
(Р < 0,01) в незрелых элементах и 0,81 ± 0,07 (Р < 0,01) в зрелых
гранулоцитах костного мозга по сравнению с контролем. В незре­
лых формах и зрелых гранулоцитах V резко увеличился и составил
соответственно 58,6 и 69,5. Это свидетельствует о появлении боль­
шого количества функционально неполноценных клеток.
В условиях подострого эксперимента (введение 1/20 ЛД-50
10%-го раствора ОЭГ) при исследовании активности ЦХО в клет­
ках костного мозга сразу после введения криопротектора отклоне­
ний в локализации фермента не обнаружено. Отмечено лишь не­
которое снижение его активности: в незрелых элементах и зрелых
гранулоцитах. СГК составил соответственно 1,80 ± 0,04 (Р < 0,01)
и 2,12 ± 0,06 (Р < 0,05). Vнаходился в пределах физиологических
колебаний в незрелых и зрелых клетках костного мозга.

146

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

После повышения концентрации ОЭГ до 15 % существенных
качественных изменений в локализации фермента не обнаружено.
При исследовании активности ЦХО выявлено статистически зна­
чимое уменьшение активности энзима в данных условиях экспе­
римента. СГК составил в незрелых элементах и зрелых гранулоци­
тах соответственно 1,73 ± 0,04 и 1,98 ± 0,07 (Р < 0,05). Vне выхо­
дил за пределы физиологических колебаний.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том,
что в условиях острого опыта (введение 10- и 15%-го растворов
ОЭГ в смертельных дозах) ингибируется активность ЦХО, что со­
провождается качественными изменениями ферментной реак­
ции — образование грубых полиморфных гранул продукта реак­
ции и перераспределение их в цитоплазме незрелых и зрелых эле­
ментов костного мозга.
Многократное внутривенное введение 10%-го ОЭГ в дозе 1/20
ЛД-50 умеренно снижает активность ЦХО. С повышением концен­
трации ОЭГ до 15 % его влияние на ферментативную активность ко­
стного мозга кроликов усиливается. Вместе с тем при анализе стати­
стических данных отмечена незначительная дисперсия средней ак­
тивности ЦХО (5—10 %). Иными словами, снижение активности
ЦХО в клетках костного мозга кроликов в условиях хронического
эксперимента обратимо, так как не связано с физиологическими из­
менениями внутриклеточных процессов.
Таким образом, цитоэнзимологические исследования актив­
ности ЦХО в клетках костного мозга кроликов и крыс свидетель­
ствуют о малой токсичности ОЭГ.
Существенный интерес для криобиологов представляет 1,2-ПД.
Испытания 1,2-ПД при криоконсервировании клеток крови пока­
зали, что это соединение может быть перспективным криопротек­
торным веществом. 1,2-ПД обладает свойствами, необходимыми
для проявления криопротекторного эффекта: легко проникает в
клетки, эффективно связывает воду, имеет низкую токсичность и
низкую эвтектическую температуру. Стабильность аморфного со­
стояния его водных растворов намного выше, чем у других крио­
протекторов. Присутствие 1,2-ПД нарушает стабильность аморф­
ного состояния других водных систем. 7%-й раствор 1,2-ПД, ис­
пользованный, например, при замораживании спермы быков, ба­
ранов и индюков, в смеси с буферными растворами позволил сох­
ранить жизнеспособность клеток на более высоком уровне, чем
ДМСО и глицерин. Но особенно эффективен криопротектор при
замораживании эритроцитов человека.

147

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

Перспективы развития криобиологии и криомедицины обус­
ловливают необходимость более глубокого изучения процессов
взаимодействия низкотемпературных факторов с биологическими
системами различных уровней организации, включая организм
человека и животных. Проблема криопротекции является ключе­
вой и до настоящего времени интерес к ней не снижается. В миро­
вой практике преобладают эмпирические подходы к изучению
криопротекторов, не сформированы научно обоснованные прин­
ципы их создания, не сформулирована теория криозащиты биоло­
гических объектов.
В ИПКиК НАН Украины созданию новых криопротекторов с
заданными свойствами, изучению взаимосвязи между их химичес­
кой структурой, физико-химическими, токсикологическими
свойствами и криозащитной активностью уделяется особое вни­
мание, поскольку это оригинальное научное направление фунда­
ментальных исследований в области криобиологии относится к
приоритетным разработкам в отечественной и мировой науке.
Впервые с помощью корреляционно-регрессионного анали­
за цитохимических показателей при вычислении коэффициента
корреляции нами выявлена прямая связь между активностью
НАД Н2-ДГ и СДГ; СДГ и Г-6-ФДГ; Г-6-ФДГ и ЛДГ; СДГ и КБ
(см. рис. 38). Установлена также связь между циклом Кребса и си­
стемой переноса электронов (НАД · Н2-ДГ и ЦХО), системой ци­
тохромов и гликолизом (ЦХО и ЛДГ); фосфолипиды и КБ связа­
ны обратной связью с α-ГФДГ, а НЖ и SH-группы — только меж­
ду собой.
После экспозиции костного мозга с ПЭО-400 в зрелых грану­
лоцитах появилось большое количество связей между цитохими­
ческими параметрами, отличных от исходного костного мозга, а
именно уменьшение связей в цикле Кребса и увеличение их в гли­
колитическом между α-ГФДГ и ЦХО; а-ГФДГ и ЛДГ; а-ГФДГ и
СДГ; ЛДГ и КБ. Это свидетельствует о дискоординации активнос­
ти ферментов и содержания веществ в клетках костного мозга до­
норов после экспозиции их с криопротектором. Возросла также
роль КБ как блокаторов токсических продуктов обмена.
Известно, что в клетках костного мозга и крови сосуществуют
два процесса, дающих энергию, — дыхание и гликолиз, и при уме­
ньшении интенсивности одного из них другой может выполнять
компенсаторную роль. Поэтому можно предположить, что во вну­
триклеточной корреляции цитохимических параметров заключен
один из механизмов компенсации. Однако расшифровка компен­
саторных процессов представляется весьма сложной и предстоит

148

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

еще многое сделать: проанализировать коррелятивные связи кост­
ного мозга в условиях целого организма, установить корреляцию
цитохимических параметров с приживляемостью криоконсерви­
рованного костного мозга и т. д.
Сохранение типичных связей между цитохимическими пара­
метрами после экспозиции с ПЭО-400 отражает роль последнего
как адаптогена за счет блокирования биохимических процессов,
которые могли бы приводить к деструктивным изменениям. По­
явление связей, отсутствующих в контроле, и повышение роли КБ
связано, по всей вероятности, с переходом биологических объек­
тов после действия криопротекторов на качественно новый уро­
вень функционирования.
Таким образом, на основании данных корреляционно-регрес­
сионного анализа можно утверждать, что криопротекторы, несом­
ненно, сохраняют биологические объекты, в частности клетки ко­
стного мозга, в жизнеспособном состоянии. Важен факт перевода
их на качественно иной уровень гомеостаза: криопротекторы пе­
реключают окислительный тип обмена на гликолитический и по­
вышают роль КБ, обеспечивающих устойчивость биологических
объектов к бактериальной микрофлоре.
При сопоставлении состояния анабиоза в природе с криокон­
сервированием биологических объектов выделяют некоторые об­
щие черты и различия. Различия определяются в разных темпера­
турных границах. В условиях Земли живые биологические объек­
ты не подвергаются воздействию таких низких температур, как те­
мпературы сжиженных газов — азота, кислорода, гелия, которые
применяются при криоконсервировании. В природе явление ана­
биоза наблюдается у особей, находящихся на разных уровнях
биологической организации. Различия касаются только глубины
понижения жизнедеятельности и степени восстановления. В ис­
кусственных условиях глубокого холода удается сохранить жизне­
деятельность изолированных клеток, образующих суспензии, и
некоторых тканей (кожи, роговицы и др.).
К общим чертам относят накопление глицерина и углеводов.
У некоторых видов рыб, живущих в антарктических морях и адап­
тированных к холоду, отмечено понижение температуры замерза­
ния сыворотки крови [280]. Установлено, что субстанцией, пони­
жающей температуру замерзания сыворотки, является гликопро­
теин, содержащий две аминокислоты, — аланин и треонин [281].
Таким образом, наряду с изученными криопротекторами, при­
меняемыми для криозащиты биологических объектов при криокон­
сервировании, выявлены химические соединения биологического

149

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

происхождения, участвующие в реализации холодового анабиоза в
природе под общим названием «биологические антифризы» [286].
Поэтому все известные криозащитные вещества делят на три
группы: 1) криопротекторы — синтетические полимерные соеди­
нения, чуждые организмам, получившие применение в криокон­
сервировании (ПВП, декстран, ПЭО и др.); 2) соединения, встре­
чающиеся в природе у морозоустойчивых видов и используемые
в искусственных условиях хранения в замороженном состоя­
нии; к ним относят глицерин, углеводы — сахара, глюкозу и др.;
3) биологические антифризы — гликопротеины, представляющие
собой биополимеры, в состав молекулы которых входит полярный
кислород, способный взаимодействовать водородными связями.
Особенности криозащитных веществ, относящихся к первой
группе, довольно подробно описаны выше. Соединения, встреча­
ющиеся в природе у морозоустойчивых видов и относящиеся ко
второй группе криозащитных вещестй, хорошо продемонстриро­
ваны на примерах арктических насекомых, лягушек и др.
Известно, например, что арктические насекомые Gynaephora
groenlandica, обитающие на островах северного побережья Кана­
ды, в отличие от других видов, переносят замораживание не толь­
ко в зимний период, но и в летнее время [375]. Температурный
предел выживания личинок составляет зимой -7 °С, а летом
-15 °С. В период зимней акклиматизации отмечено накопление в
ткани личинки глицерина; летом это не обнаружено. Накопление
глицерина начиналось после снижения температуры ниже 5 °С.
С помощью ЯМР-спектроскопии с использованием 13С-глюкозы установлено, что глицерин из 13С-глюкозы синтезируется
как зимой, так и летом. При температуре ниже 5 °С также выявле­
но снижение потребления О2 и электронно-микроскопические
признаки повреждения мембран митохондрий. Авторы считают,
что вследствие нарушения процессов окислительного фосфорили­
рования при гипотермии происходит торможение окислительно­
го метаболизма 13С-глюкозы и усиление синтеза глицерина из
|3С-глюкозы, что и обеспечивает повышенную криорезистент­
ность. Глицерин из глюкозы синтезируется в жировом теле (экви­
валент печени у насекомых).
Катаболизм глюкозы у зимующих E. solidaginis изучали, чтобы
определить значение гликолиза и пентозофосфатного пути в син­
тезе многоатомных спиртов — криопротекторов при разных тем­
пературах [392]. Авторы определили скорости образования и лока­
лизации 14CO2 после инъекций 1-['4C ]-глюкозы, 6-[l4C]-глюкозы
и 3,4 [l4C]-глюкозы. Фиксировали также включение маркера из

150

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

каждого вида меченой глюкозы в сорбитол и глицерин. Респиро­
метрия показала увеличение пентозофосфатной активности при
5—10 °С. При 10 °С глицерин синтезируется с максимальной ско­
ростью. Скорость синтеза сорбитола начинает заметно возрастать
только при температуре ниже 5 °С.
Как только кожа лягушки вступает в контакт со льдом, в печени
начинается интенсивный распад гликогена до глюкозы, уровень
которой в крови повышается с 4—5 до 550 мкМ [412]. У одного ви­
да лягушек возрастает концентрация не глюкозы, а глицерина.
Сделано предположение, что эта реакция запускается гормональ­
ным сигналом, поскольку перерезка нервных путей не предотв­
ращает увеличение концентрации глюкозы при замораживании
лягушки.
Аналогично этому лягушек Rana sylvatica подвергали троекрат­
ному замораживанию до −2 ÷ −4 °С с последующим согреванием
до 3 °С и исследовали изменение концентрации гликогена, глюко­
зы, лактата, аланина и 2,6-фрукгозодифосфата в различных орга­
нах [383]. Обнаружены распад гликогена до глюкозы в органах при
замораживании и активация ресинтеза гликогена после отогрева.
Распределение концентраций гликогена и глюкозы по органам во
время замораживания позволило автору сделать вывод о перифе­
рической вазоконстрикции в этот период с максимальным сохра­
нением кровообращения во внутренних органах (в первую очередь
в мозге, сердце и печени). Во время замораживания в тканях во­
зрастала концентрация лактата и аланина, и повышенная кон­
центрация этих метаболитов в ряде органов (сердце, мозг и почки)
сохранялась и после отогрева. При исследовании изменений
2,6-фруктозодифосфата в печени и мышцах конечности обнару­
жено нарастание его количества в мышцах и снижение в печени
при каждом цикле замораживания и обратные изменения при
отогреве. Таким образом, авторы выявили органно-специфичес ­
кий метаболизм при замораживании—оттаивании у лягушек, устой­
чивых к замораживанию.
К третьей группе криозащитных веществ относят биологичес­
кие антифризы. У активно живущих в зимнее время насекомых
(Boreus westwoodi и Bolyphautes index) в гемолимфе содержатся ан­
тифризы, предотвращающие образование кристаллов льда в тка­
невой жидкости при температурах ниже 0 °С. Из-за присутствия
этих веществ в гемолимфе температура образования льда в ткане­
вой жидкости изученных насекомых понижается до −6, −7 °С. Ан­
тифризные свойства гемолимфы теряются при нагревании ее до
80 °С.

151

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

Белки-антифризы полярных рыб снижают точку замерзания
растворов без изменения температуры плавления [294]. Установ­
лено, что низкотемпературные соединения, например хлористый
натрий, оказывают большое коллигативное влияние на кривые за­
мораживания и плавления растворов. Ход полученных кривых и
большой диапазон значений солевых растворов может быть обус­
ловлен агрегацией при замораживании. Участки с высокой концен­
трацией соли плавятся при низких температурах, а с более низкой
концентрацией — при температурах, близких к точке плавления
льда. В растворах синтетического полипептида точка замерзания
снижается в большей степени, чем можно было бы ожидать от вы­
сокомолекулярного соединения, обладающего коллигативным
действием. Однако температурный гистерезис при этом не наблю­
дался, а кривая плавления была аналогична таковой солевого рас­
твора. Несмотря на то, что препараты синтетического полипепти­
да несколько снижают точку замерзания раствора, они не имеют
функционального сходства с антифризными белками, существую­
щими в природных моделях.
Многие насекомые и другие членистоногие, переносящие зи­
му, чувствительны к замораживанию, поэтому сезонные образова­
ния у них антифризов имеют большое значение. В основном это
низкомолекулярные антифризы, такие, как полиолы и сахара
[286]. Они могут снижать точку переохлаждения насекомых почти
вдвое больше, чем точку плавления. Такие белки, как антифризы
насекомых, скорпионов и пауков, подобно белкам-антифризам и
гликопротеинам полярных рыб формируют феномен температур­
ного гистерезиса. У некоторых видов эти белки — единственные
антифризы, у других образуются также полиолы. Температура и
фотопериод являются наиболее важными факторами окружающей
среды, которые влияют на образование и потерю белков темпера­
турного гистерезиса. В физиологическом временном процессе,
контролирующем уровень антифризов, участвует циркадная сис­
тема насекомых. Некоторые белки температурного гистерезиса
удалось выделить и проанализировать их состав. Установлено, что
белки температурного гистерезиса содержат большое количество
гидрофобных аминокислот и меньшее — аланина, чем аналогич­
ные белки рыб.
Итак, под влиянием криопротекторов происходит сложная
метаболическая перестройка жизненно важных органов в виде
увеличения интеграции обмена, повышения роли КБ как блокато­
ров токсических продуктов обмена, снижения активности имму­
нологических реакций, повышения устойчивости к экстремальным

152

5.1. Криопротекторы — генетически активный фактор

факторам, активации ДНК-синтезирующей активности клеток,
отражающих формирование структурного «следа» адаптации, что
моделирует переключение организма на новый уровень гомео­
стаза. Обнаруженные некоторые новые признаки криоконсервированных биологических объектов обусловлены, по-видимому,
изменениями, происходящими в генетическом аппарате клеток. По­
этому ниже приводятся данные, касающиеся влияния криопроте­
кторов на генетический аппарат биологических объектов различ­
ных уровней организации, уточняющие обнаруженное явление
качественного обновления их после действия криопротекторов.
5.1. КРИОПРОТЕКТОРЫ —
ГЕНЕТИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ФАКТОР
Изучено влияние некоторых криопротекторов, взятых в 5- и
10 %-х концентрациях, на митотический режим культуры клеток
китайского хомячка [47]. После отмывания клеток от криопротек­
торов митотический индекс достоверно снижался в первые часы
роста культуры с одновременным увеличением количества пато­
логических форм митоза. Наряду с этим отмечены цитопатические изменения. Через 24 ч в клетках восстанавливались характер­
ные для них морфологические особенности митотического режима.
Изменение митотического режима клеточных культур, по мнению
авторов, могут служить критерием для оценки влияния степени
определенных дозировок различных криопротекторов на проли­
феративную способность клеток еще до замораживания.
Исследованы особенности статмокинетического действия
глицерина и ПЭО-400 при контакте с клеточными культурами
лейкоцитов периферической крови человека и монослойной пере­
виваемой культурой клеток китайского хомячка (клон 237) [162].
Определен митотический индекс, соотношение фаз митоза и ко­
личество К-митозов в процентах от соответствующих митотичес­
ких индексов. Добавление глицерина и ПЭО-400 в среду культи­
вирования клеток крови достоверно снижало их митотический
индекс. При этом отмечено уменьшение в процентных соотноше­
ниях отдельных фаз митоза. В культурах фибробластоподобных
клеток также наблюдали тенденцию к снижению митотического
индекса. Установлено, что глицерин и ПЭО-400 в концентрациях,
широко используемых для замораживания различных биологичес­
ких объектов, при длительном контакте с культивируемыми клет­
ками оказывает статмокинетическое действие, носящее обрати­
мый характер и связанное с общими для криопротекторов дегид­

153

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

ратационными свойствами, степень проявления которых зависит
от проникающей способности.
На растительных и животных клетках изучено явление гибри­
дизации и влияние криопротекторов на нее. Известно, что процесс
слияния характерен не только для половых клеток. Он может прои­
сходить и между соматическими клетками. Как и в половых клет­
ках, хромосомы при этом могут соединяться, образуя единый на­
бор. При некоторых условиях иногда образуются настоящие «клет­
ки-гибриды» с измененным хромосомным материалом, вследствие
чего изменяется и характер метаболизма. Под влиянием такой пе­
рестройки некоторые клетки погибают (элиминируются). Для дру­
гих клеток такое изменение метаболизма оказывается полезным и
они становятся более активными: размножаются более интенсив­
но, чем клетки, оставшиеся нормальными, неизмененными. При
определенных условиях среды в культуре ткани именно неизменен­
ные клетки постепенно элиминируются в процессе борьбы за су­
ществование. Возникают клоны гибридных клеток.
Еще совсем недавно метод изолированных протопластов выс­
ших растений считался лишь потенциально пригодным для полу­
чения неполовых (соматических, парасексуальных) гибридов рас­
тений. Получение гибридных растений неполовым путем зависит
от эффективных методик индукции слияния протопластов и полу­
чения гибридных клеток способных, в отличие от животных кле­
ток, в дальнейшем реализовать свою генетическую тотипотент­
ность, т. е. давать начало целым гибридным растениям. Таким уни­
версальным индуктором оказался ПЭГ.
Изучены изменения, происходящие при слиянии протоплас­
тов высших растений и клеток человека под влиянием ПЭГ [186].
В качестве исходного материала авторы использовали изолиро­
ванные протопласты мезофилла табака Nicotina tabacum L., его
пластомного хлорофиллдефектного мутанта типа W- W- Wкаллюсной ткани арабидопсиса Arabidopsis thaliana (L. Neynky) и лимфоци­
ты человека. Электронно-микроскопическое исследование пока­
зало, что при воздействии ПЭГ на смешанную суспензию мезофи­
льных протопластов происходит агглютинация различных прото­
пластов табака и образуются первичные продукты их слияния.
При действии ПЭГ на смешанную суспензию протопластов мезо­
филла табака и каллюсной ткани арабидопсиса также происходит
агглютинация протопластов и образуются межсемейственные
продукты слияния. При этом обнаруживались протопласты с од­
ним ядром, содержащие как лейкопласты, так и хлоропласты.
Обработка ПЭГ смешанной суспензии клеток человека и прото­
пластов растений вызывала слияние как клеток человека с протопла­

154

5.1. Криопротекторы — генетически активный фактор

стами, так и лимфоцитов и протопластов между собой. Как правило,
в цитоплазме протопластов ядра лимфоцитов были окружены узким
слоем собственной цитоплазмы. Ни в одном из межцарственных
продуктов слияния авторам не удалось обнаружить слияние ядер,
несмотря на их физическую близость. Полученные результаты пока­
зали, что ПЭГ действительно является удобным химическим агентом
и универсальным индуктором слияния при гибридизации клеток и
растений, и животных. К настоящему времени уже получен ряд меж­
видовых гетерокарионов (гетерокариоцитов), способных к дальней­
шему размножению [295]. Считается, что слияние ядер и образова­
ние истинных гибридных клеток растений могут происходить до ми­
тоза и во время митоза. Некоторые авторы полагают, что для слия­
ния ядер до митоза необходима координация клеточных циклов. О
дальнейшей судьбе плазматической мембраны, окружающей клетку,
достаточно убедительных данных не накоплено.
Сделано предположение, что ПЭГ, как и другие экзогенные
химические стимуляторы слияния, могут вызывать нарушение
структурной организации мембран: увеличивать текучесть жидко­
кристаллической мембраны, что приводит к слиянию контактиру­
ющих липидных слоев и агрегации внутримембранных протеино­
вых частиц [186]. Возможно, слиянию предшествует материальное
перераспределение большинства протеинов мембран, в результате
чего взаимодействуют лишь билипидные мембраны, лишенные
внутримембранных белков. По мнению авторов, стрессовое состо­
яние клеточной мембраны, а также ее локальные повреждения
под воздействием определенных химических веществ носят до не­
которой степени обратимый характер. После снятия стрессового
фактора происходит репарация наружной клеточной мембраны,
причем этот процесс может способствовать слиянию мембран. Ав­
торы пришли к выводу, что при воздействии ПЭГ на протопласты
растений и клетки животных действительно происходит слияние
клеток в любых комбинациях.
Как показали наши наблюдения, проведенные с помощью ре­
акции на СДГ, криопротектор ПЭО-400 индуцирует увеличение
плоидности ядра мегакариоцитов костного мозга человека и жи­
вотных (рис. 54). При этом ядерно-цитоплазматическое отноше­
ние изменяется в пользу ядра, которое нередко занимает почти все
поле зрения микроскопа. Увеличение плоидности ядер после воз­
действия криопротекторов сопровождается изменением процес­
сов конденсации—деконденсации хроматина — важного способа
регуляции клеточного генома. Нами установлено, что после экс­
позиции клеток костного мозга с ПЭО-400 хроматин ядра характе­

155

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

ризуется мелкогранулярной, нитчатой и диффузной структурой,
что, согласно классификации В.Д. Дышлового и соавт. [87], харак­
терно для деконденсированных, активных в молекулярно-биологи­
ческом и генетическом плане клеток (рис. 55). В контроле глыбки
различной формы и величины, что характерно для конденсирован­
ных структур хроматина, т. е. неактивной его формы (рис. 55, б).
В культуре ткани зарубежные исследователи обнаружили экс­
прессию генов при действии ДМСО. Установлено, что длитель­
ность экспозиции ДМСО (34—48 ч) в концентрации около 1—2 %
вызывает генную активацию, фрагментацию, повреждение клеточ­
ного ядра и другие изменения [253, 255]. Индукция обмена сест­
ринских хроматид и увеличение количества микроядер как резуль­
тат повреждения хромосом обнаружены в культуре ткани при экс­
позиции ее с 0,6%-м ДМСО. Автор советует учитывать эти дан­
ные, т. е. активацию генома и его возможную повреждаемость при
использовании криопротектора ДМСО для человеческих эмбрио­
нов в процессе их замораживания—оттаивания.
ДМСО проявляет генотипическую активность в ити С, в кото­
ром определяется индукция β-галактозы, структурный ген кото­
рой находится под контролем SOS — индуцитального промотора
гена ити С. Максимальная активность β-галактозы (превышение в
3,5 раза уровня фона) наблюдается при 10 %-й концентрации
ДМСО в культуральной среде. Минимально действующая концен­
трация ДМСО (превышение фона в 2 раза) составляет примерно
5 %. Токсичность ДМСО довольно низка и более 50 % бактериаль­
ных клеток выживает при концентрации ДМСО до 15 %. В неток­
сичных дозах ДМСО не индуцирует экспрессию гена ити С.
Аналогично этому геномную ДНК выделяли из семенников
камбалы и обрабатывали рестриктазами [374]. Фрагменты подвер­
гали электрофорезу и наносили на нитроцеллюлозу. По результа­
там клонирования составили рестрикционные карты геномных
клонов. Показано, что большинство из 40 генов белков-антифри­
зов находится в участках ДНК длиной 7—8 тыс. пар оснований,
чередующихся в виде тандемных прямых повторов. Каждый по­
втор содержит единственный ген белка-антифриза длиной 1 тыс.
пар оснований, транскрипционно ориентированный так же, как и
другие подобные гены. Несмотря на высокую гомологию повто­
ров, обнаружен некоторый полиморфизм в отношении участков и
длины рестрикции. После обработки рестрикционными эндонук­
леазами, не затрагивающими повторы, большинство генов бел­
ков-антифризов находились во фрагментах длиной не менее
40 тыс. пар оснований, представляющих собой группы из пяти и

156

5.1. Криопротекторы — генетически активный фактор

Рис. 54. Увеличение плоид­
ности ядра мегакариоцита
костного мозга доноров (а)
и животных (б). Ядерноцитоплазматическое отно­
шение изменяется в пользу
ядра (видны отшнуровав­
шиеся тромбоциты); ×1000
[150, 151, 154]

более тандемных повторов. После обработки рестриктазами Xba I
и Xho I эти гены находились во фрагментах исключительно боль­
шой молекулярной массы, что позволило авторам предположить

157

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия

Рис. 55. Изменение процессов конденсации—деконденсации хроматина в
клетках костного мозга доноров после действия ПЭО-400; ×1000 [150, 151,
154]. При реакции на SH-группы структура хроматина ядра мелкогрануляр­
ная, нитчатая, диффузная (а). В контроле — глыбки различной формы и
величины (б)

158

5.1. Криопротекторы — генетически активный фактор

объединение нескольких групп. Таким образом, установлено, что
гены белков-антифризов тандемно связаны и сгруппированы в ге­
номе камбалы [374].
Определены также сезонные изменения содержания антифри­
зных компонентов в сыворотке камбалы и колебания температуры
кристаллизации сыворотки [377]. Показано, что с апреля по сен­
тябрь антифризные полипептиды в сыворотке практически не
определялись, в то время как с сентября по март их концентрация
колебалась от 6 до 10 мг/мл. Температура замерзания сыворотки в
этот период снижалась на 0,4 °С. Изменения содержания анти­
фризных полипептидов обусловлены эндогенными причинами и
связаны с изменением фотопериода и температуры окружающей
среды, которые вызывали изменение функции гипофиза. Изуче­
ние организации генома показало, что образование антифризных
полипептидов связано с семейством генов, эволюционно более
поздних, чем остальной геном. Считают, что методом переноса ге­
нов антифризных полипептидов можно повысить холодоустойчи­
вость ряда рыб.
Итак, из рассмотренного материала следует, что криопротек­
торы являются генетически активными факторами. Они не только
повышают адаптационно-приспособительные реакции с целью
сохранения биологических объектов в процессе криоконсервиро ­
вания, как считалось ранее, но и обеспечивают качественный
«скачок», а также формирование структурного «следа» адаптации,
переводя биологические объекты на качественно новый уровень
гомеостаза.

ГЛАВА 6

Апоптоз и криообновление
как основа эффективного
использования криобиологических
технологий в гематологии
и трансфузиологии

В последние годы установлено, что часть живых кле­
ток, в том числе гемопоэтических, при криоконсервировании по­
вреждается и гибнет по типу апоптоза [28, 66]. СКК неустойчивы
при замораживании и легко разрушаются на всех этапах криокон­
сервирования, особенно в зоне —10 ÷ -40 °С [209]. Это сопровож­
дается изменением направления дифференцировки и созревания,
что отражается на качественных характеристиках защитного поте­
нциала гемопоэтической ткани [51, 52, 218]. Проведена сравните­
льная аттестация состояния кроветворных предшественников ко­
стного мозга по некоторым структурным и функциональным ха­
рактеристикам до и после криоконсервирования [55]. На основа­
нии полученных результатов и теоретических предпосылок авторы
смоделировали возможные варианты изменения внутреннего сос­
тояния, а также феноменологии поведения СКК после действия
факторов криоконсервирования. Сделано заключение, что крио­
консервирование — это фактор, оказывающий выраженное влия­
ние на структурно-функциональное состояние СКК. Точкой при­
ложения физико-химических факторов криоконсервирования яв­
ляются, по мнению авторов, разные этапы каскадного процесса
реализации гемопоэтической функции этих клеток: от рассеяния в
микроокружении до формирования колоний, и лишь определен­
ная часть СКК подвергается отрицательному влиянию криоконсе­
рвирования. Характерно, что в одних и тех же СКК каждая из фу­
нкций, а именно расселение, пролиферация, наработка структур
гликокаликса изменяется по-разному в аналогичных условиях
криоконсервирования. Авторы подтверждают тезис значимости
исходного состояния биологического объекта в определении его
криолабильности и криостабильности.

160

6.1. Апоптоз: конденсация хроматина, потеря митохондриальными мембранами ...

Может ли холод вызвать генетически детерминированные бла­
гоприятные изменения в криоконсервированных гемопоэтичес­
ких клетках? В литературе эти вопросы почти не обсуждались. Тем
не менее актуальность их при современном состоянии экологии,
возрастании количества заболеваний и смертности вполне очевид­
на. Наиболее четко осветить эту проблему представляется возмож­
ным, по нашему мнению, с позиции двух разнонаправленных ва­
жнейших феноменов в клеточной биологии — апоптоза и криооб­
новления.
6.1. АПОПТОЗ: КОНДЕНСАЦИЯ ХРОМАТИНА, ПОТЕРЯ
МИТОХОНДРИАЛЬНЫМИ МЕМБРАНАМИ АПОПТОТИЧЕСКИХ
БЕЛКОВ И ЦИТОХРОМА c, АКТИВАЦИЯ КАСПАЗ

Известно, что апоптоз у животных и человека, как правило, свя­
зан с протеолитической активацией каспаз, которые специфичес­
ки расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты. На
основе структурной гомологии каспазы подразделяются на подсе­
мейства: 1) каспазы-1 (каспазы 1, 4 и 5); 2) каспазы-2 (каспаза-2);
3) каспазы-3 (каспазы 3, 6—10). В клетках, подвергшихся воздейс­
твию индуктора апоптоза, резко снижается мембранный потенци­
ал митохондрий. Падение мембранного потенциала обусловлено
увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий
в результате образования гигантских пор. Следствием раскрытия
поры являются набухание митохондриального матрикса, разрыв
наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых
белков — индукторов апоптоза, в частности цитохрома с, прокас­
пазы 2, 3 и 9. Разрыв наружной мембраны митохондрий может
быть вызван также гиперполяризацией внутренней мембраны ли­
бо раскрытием гигантского белкового канала в самой наружной
мембране, способного пропускать цитохром с и другие белки из
межмембранного пространства [175].
В нормальном организме апоптоз — естественный этап в жиз­
недеятельности клеток. Он служит одним из компенсаторных про­
цессов, обеспечивающих гомеостаз внутренней среды организма.
Эволюционно программа клеточной смерти возникла у прокариот
как механизм противовирусной защиты популяций и была закре­
плена у одноклеточных эукариот. В дальнейшем, с появлением
многоклеточных организмов, она совершенствовалась и была
приспособлена для реализации важных жизненных функций: ди­
фференцировки клеток и тканей в эмбриогенезе и постэмбрио­

161

Глава 6. Апоптиз и криообновление как основа эффективного использования...

нальном развитии, элиминирования клеток иммунной системы,
невостребованных, состарившихся клеток либо подвергшихся фи­
зико-химическому воздействию и мутагенных факторов. Как гипо-,
так и гиперфункция апоптоза ведут к нарушению гомеостаза. Про­
тиводействовать этому, по всей вероятности, возможно «включени­
ем» противоположно направленных программ, т. е. обновления и
криообновления. В основу криообновления положены новые дан­
ные о селективном свойстве криоконсервирования.
6.2. КРИООБНОВЛЕНИЕ: ДЕКОВДЕНСАЦИЯ ХРОМАТИНА,
АКТИВАЦИЯ ПРОЦЕССОВ ТРАНСКРИПЦИИ, БЛАГОПРИЯТНОЕ
СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ЦИТОХРОМА c
В 1976 г. нами был обнаружен ведущий механизм апоптоза: потеря
криоконсервированными клетками костного мозга цитохрома с с
последующим снижением в них активности биоэнергетических
процессов. После добавления в размороженные клетки цитохрома с
нормализовались реакции цикла Кребса, пентозного, системы
транспорта электронов, а в некоторых случаях наблюдалась их ак­
тивация. Аналогичные результаты были получены российскими
учеными: лучшей морфологической и функциональной сохраннос­
ти размороженных клеток костного мозга способствовало включе­
ние в консервирующий раствор цитохрома с [98]. На этапе форми­
рования криобиологии как науки эти данные представляли собой
новое явление, которое нуждалось в расшифровке и объяснении.
Сопоставление данных корреляционно-регрессионного ана­
лиза цитохимических показателей клеток костного мозга с декон­
денсацией хроматина и активацией процессов транскрипции по­
зволило сделать заключение о том, что отбор и изменчивость —
это две стороны одного процесса (селекции), движущей силой ко­
торого является действие низких температур. В 1984 г. мы обосно­
вали новые данные о селективном свойстве криоконсервирования
[160], которые легли в основу создания концепции генетически
детерминированных благоприятных изменений криоконсервированных биологических объектов (криообновление). В 1989 г. мы
обсудили ее [62, 154]. Недавно концепция криообновления полу­
чила дальнейшее развитие в наших [70, 71,73], а также в совмест­
ных работах с российскими учеными [66]. В клетках криоконсервированного костного мозга установлена корректировка структур­
ной активности топоизомераз II класса, которая необходима для

162

6.3. Динамическое взаимодействие апоптоза и криообновления ...

репликации, рекомбинации и транскрипции, а также для митоти­
ческой конденсации хромосом и их сегрегации. В переливаемом
больному компоненте образуется трансформированная (преобра­
зованная, обновленная) популяция стволовых клеток: устойчи­
вость ее к облучению в летальных дозах при -196 °С в 3,45, а у
предшественников гранулоцитарно-макрофагальных клеток — в
3,04 раза выше, чем при нормотермии [329].
Важная роль в запуске реакций криообновления принадлежит
антиоксидантам. Последние задерживают апоптоз: предотвраща­
ют реакции ПОЛ, не дают свободным радикалам накапливаться в
организме и образовывать АФК. По нашим наблюдениям, после
добавления в размороженные клетки костного мозга лецитина,
прочно связанного с цитохромом с, и вытяжки из него — холинхлорида существенно увеличились активность ключевых фермен­
тов цикла Кребса, гликолитического и пентозного, а также содер­
жание сульфгидрильных групп [151].
Приведенные данные служат экспериментальным подтверж­
дением открытого нами принципиально нового явления в клеточ­
ной биологии — криообновления. Вхождение цитохрома с в мито­
хондриальный матрикс и использование антиоксидантов, подав­
ляющих апоптоз, и, следовательно, активирующих механизмы
программированной жизни охлажденной и криоконсервированной клетки, способствуют сдвигу динамического взаимодействия
апоптоза и криообновления в сторону криообновления. Это лежит
в основе повышения трансплантационной активности разморо­
женных гемопоэтических клеток.

6.3. ДИНАМИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АПОПТОЗА
И КРИООБНОВЛЕНИЯ: ЭКСПРЕССИЯ АНТИАПОПТОТИЧЕСКИХ
ГЕНОВ И ГХА; ИНДУКЦИЯ АНТИАПОПТОТИЧЕСКИХ БЕЛКОВ И БХШ
К настоящему времени установлено, что апоптоз могут вызывать
как внутриклеточные, так и внешние сигналы, опосредующие
свое действие через рецепторные системы. Известна группа физи­
ологических активаторов и ингибиторов апоптоза. Последние иг­
рают существенную роль в механизмах криообновления. Важны­
ми физиологическими регуляторами апоптоза являются цитоки­
ны. Они представляют собой обширную группу белков, которые
регулируют пролиферацию и дифференцировку клеток при свя­
зывании со специфическими рецепторами на клетках-мишенях.
Цитокины объединены в три группы в зависимости от структуры и

163

Глава 6. Апоптиз и криообновление как основа эффективного использования ...

функции: 1) ростовые факторы (колониестимулирующие факто­
ры, эпидермальный фактор роста, инсулиноподобный фактор ро­
ста и др.); 2) семейство фактора некроза опухоли и 3) спиральные
цитокины (интерлейкины, интерфероны).
Процессы криообновления запускают ингибиторы каспаз и
антиапоптотические сигналы. Кордовая кровь содержит набор
специфических плацентарных белков, гормонов, ростовых факто­
ров, цитокинов, гемопоэтических факторов, интерлейкинов и т.
д., а также репродуктивных иммуномодуляторов, запускающих
программу криообновления [78]. Антиапоптотические стимулято­
ры защищают нейтрофилы от стрессиндуцированного апоптоза,
активируя гранулоцито-макрофагальные колониестимулирующие
факторы [300]. Защита происходит, начиная с регистрации умень­
шения мембранного потенциала и увеличения освобождения
цитохрома с из митохондриальных мембран. Поэтому на этапе ак­
тивации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохра­
нить, включив регуляторы, которые блокируют или, при необхо­
димости, усиливают разрушительное действие каспаз. К ним от­
носятся белки Bcl-2 (ингибиторы апоптоза: AL, Bcl-2, Bel W,
Всі-XL, Brag-1, Ncl-1, NR13) и Вах (промоторы апоптоза): Nad,
Bak, Nax, Bcl-XS, Bid, Вік, Віт, Hrk, Mtd). Всг-АЬІ предотвращает
апоптоз, ингибируя цитохром с, вышедший из мембран, а также
тормозит активацию каспазы после высвобождения цитохрома с
[410]. Установлен локус антиапоптотического действия Всг-АЫ,
который тормозит активацию каспазы и высвобождение цитохро­
ма с из мембран в лейкемических клетках, микроинъектируя его в
интактные клетки [284], что является прерогативой процессов
криообновления.
Апоптоз через В-клеточный антиген-рецептор требует Вахтранслокацию, сопровождающуюся митохондриальной деполяри­
зацией, высвобождением цитохрома с и активацией каспаз-9
[290]. Эти же авторы показали, что активация каспазы-3 зависит
от активации CD95- и BCR-связанного апоптоза, а также от акти­
вации Вах и вышедшего из митохондриальных мембран цитохро­
ма с. Недавно установлено, что экспрессия антиапоптотических
белков Bcl-2 и Bcl-X была более выражена в СД34+-, чем в мононуклеарных клетках [409]. В противоположность этому, уровень
Вах повысился в связи с апоптозом мононуклеарных клеток.
Показана возможность использования продуктов эмбриофеталоплацентарного комплекса, активирующих процессы обновле­
ния, как корректора апоптотических процессов при аутоиммун­
ных заболеваниях [53, 54]. Данные электрофоретического анализа

164

6.3. Динамическое взаимодействие апоптоза и криообновления ...

фрагментации ДНК и количественного учета Xecτ+- и Bcl-2+-κπeток у больных ревматоидным артритом свидетельствуют о выра­
женном угнетении апоптотической активности иммуннокомпе­
тентных клеток в тимусе, региональных лимфоцитах, а также в
перитонеальной области. Выявлена отрицательная корреляция
между интенсивностью воспалительных реакций и изменением
выраженности апоптоза. Таким образом, используя продукты эмбриофеталоплацентарного комплекса, представляется возможным
сместить динамическое взаимодействие апоптоза и криообновле­
ния в сторону обновления.
Такое же действие оказывает и кордовая кровь (плацентарная,
пуповинная, фетальная), являясь богатым источником стволовых
клеток и их предшественников. Препараты, полученные из ее
компонентов, используют для лечения различных патологий. На­
пример, препарат гемокорд представляет собой суспензию кровет­
ворных иммуннокомпетентных, дендритных и других клеток в
аутологической плазме [219—221]. Противовирусное действие
плазмы кордовой крови авторы объясняют присутствием в ней
интерферона, который, как известно, является ингибитором апоптотических процессов и, следовательно, активатором процессов
обновления и криообновления [220]. Известно, что Z-селекция в
CD34+-κπeτκax играет важную роль в восстановлении гемопоэза
после трансплантации стволовых клеток периферической крови.
Показаны изменения Ζ,-селективной экспрессии в CD34+-κπeτκax
криоконсервированных трансплантатов [278]. Выявлен различ­
ный уровень селекции в апоптотических и неапоптотических замороженно-оттаянных лимфоцитах и гранулоцитах. CD34+-κneτки кордовой крови коровы также можно использовать для созда­
ния банков стволовых клеток и их предшественников [331].
Сделано заключение о том, что на функциональном уровне
состояние «стволовости» стволовых клеток, т. е. недифференцированности определяется повышенной чувствительностью их к
внешним агентам. Поддержание СКК в недифференцированном
состоянии длительное время возможно с помощью различных ци­
токинов, таких, как LIF (Leukemia inhibitory factor) из семейства
IL-6, CDF-3 (Growth-differentiation factor-3), FGF-4 (Fibroblast
growth factor) и др. Изучено влияние LIF и SCF (Stem cell factor) на
функциональную активность мышиных эмбриональных стволо­
вых клеток линии ESRI [24]. Показаны изменения их функциона­
льной активности по содержанию АТФ — основного «аккумулято­
ра» энергии, позволяющего судить о функциональных сдвигах,
происходящих в клетках в ответ на митотический стимул. Полу­

165

Глава 6. Апоптиз и криообновление как основа эффективного использования ...

ценные данные свидетельствуют о масштабных изменениях функ­
циональной активности эмбриональных стволовых клеток при
комплексировании с регуляторными ростовыми факторами. Это
имеет важное значение для поддержания пролиферативного поте­
нциала клеток и выбора методов направленного регулирования их
развития в культуре.
Обработка цитокиназой, активирующей реакции обновления
и криообновления, защищает от апоптоза криоконсервированные
мононуклеарные клетки периферической крови после их оттаива­
ния [369]. Установлено участие ингибитора каспаз z-VAD в криоконсервированно-индуцируемом CD-4+-aπoπτo3e Т-клеток, кото­
рый способен тормозить как дезорганизацию митохондриальной
мембраны, так и апоптоз. Лечение цитокинами IL-2, IL-4, IL-7 и
их комбинацией значительно ингибировало апоптозиндуцированную смерть клетки и обеспечивало выживаемость CD-4+-T-κπeτoκ
в криоконсервированных мононуклеарных клетках периферичес­
кой крови. Другие авторы предполагают, что каспаза 3 включи­
лась в апоптоз предшественников CD34+-κπeτoκ кордовой крови
коровы во время экспрессии in vitro и наиболее эффективный ци­
токинез SCF b FL мог сохранять гемопоэтические стволовые клет­
ки и подавлять апоптоз [332].
Изучено действие криоконсервирования мононуклеарных
клеток крови на экспрессию различных цитокинов (IFN-g, IL-4,
IL-5, IL-9, IL-10 и IL-13) [324]. Процесс криоконсервирования и
оттаивания влияет на экспрессию цитокинов на уровне мРНК.
Исследование цитокинной секреции до и после замораживания
гемопоэтических клеток позволит выработать тактику для каждого
цитокина, способную затормозить развитие апоптотических про­
цессов и, следовательно, сместить взаимодействие двух разнонап­
равленных процессов — апоптоза и криообновления — в сторону
криообновления.
Апоптоз в ответ на развивающийся раздражитель и стресс,
стимулируемый каспазами, регулируется белковым семейством
Bcl-2 [335]. Для лейкоцитов необходима каждая из каспаз. Кроме
того, лимфоциты чувствительны к различным апоптотическим
стимуляторам. Снижение активности каспаз-2 и -9 лимфоцитов
обусловлено сложным каспазозависимым апоптозом, включая вы­
ход цитохрома с из митохондрий. Замораживание—оттаивание
мононуклеарных клеток костного мозга человека ведет к повреж­
дению белков, включенных в сигнализацию апоптотических кле­
ток [371]. Этот эффект был полностью заблокирован введением в
среду замораживания широкого спектра ингибиторов протеаз и

166

6.3. Динамическое взаимодействие апоптоза и криообновления ...

вследствие оттаивания клеток на льду. Это хорошо демонстрирует
процессы взаимодействия апоптоза и криообновления.
Недавно представлены обзорные работы о функциональной и
пространственной организации ГХА в геноме млекопитающих
[210] и человека [320]. Описана их локализация. Исследована
структура области холодового шока (CSD) YB-1, которая ответст­
венна за ДНК-связанные свойства белков. Выявлены индуцируе­
мые ими БХШ [267, 274], в частности в лимфоцитах человека в
условиях гипоксии [250]. Те и другие располагаются в человечес­
ком геноме неслучайно. Показаны экспрессия гена как результат
окислительного стресса [319] и необходимость использования ан­
тиоксидантов как блокаторов апоптотических реакций. Не менее
важна в реализации механизмов криообновления экспрессия в
клетках крови человека антиапоптотических генов, таких, как А1,
Mcl, Rho А и hHR23B [308]. Последние могут вызвать устойчивость
к апоптозу у больных судорожной почечной гемоглобинурией и
обеспечить общий компенсаторный механизм после повреждения
клеток костного мозга, что способствует выживанию и росту оста­
вшихся гемопоэтических стволовых клеток.
Таким образом, запуск реакций криообновления ведет к бла­
гоприятным внутриклеточным перестройкам на генном уровне за
счет включения в работу ГХА и БХШ. Сдвинуть динамическое
взаимодействие апоптоза и криообновления в сторону криообнов­
ления возможно с помощью антиапоптотических генов, антиок­
сидазной системы, направленной на торможение апоптоза, а
также ингибиторов апоптоза, цитокинов, гормонов, ростовых фак­
торов, интерлейкинов, интерферонов. Аналогичное действие ока­
зывают репродуктивные иммуномодуляторы, продукты эмбриофеталоплацентарного комплекса и кордовой крови, выступающие
в роли ингибиторов апоптоза и, следовательно, активаторов крио­
обновления.
Нарушение апоптоза в эмбриогенезе может приводить к внут­
риутробной гибели плода, врожденным уродствам или различным
заболеваниям, включая злокачественные новообразования. Разра­
ботка оптимальных методов криоконсервирования гемопоэтичес­
ких клеток и повышения эффективности клеточной терапии тес­
нейшим образом связана с использованием «маркеров» раннего
апоптоза. Один из них — определение активности фосфатидилсерина (ФС) (антиоксиданта) с помощью аннексин-У-окрашивания
и хемилюминесценции [257]. Признаки раннего апоптоза регист­
рируются в том случае, когда ФС переходит из внутреннего моно­
слой плазматической мембраны в ее наружный монослой [298].

167

Глава 6. Апоптиз и криообновление как основа эффективного использования ...

Эти данные наглядно демонстрируют процессы апоптоза, которые
вытесняют реакции криообновления. Поэтому своевременное
введение в гемопоэтические клетки антиоксидантов позволит на
ранних этапах затормозить процессы апоптоза.
Наиболее существенным «маркером» раннего апоптоза, поми­
мо указанного, является выход из митохондриальных мембран ци­
тохрома с. Освобожденный цитохром с индуцирует процессы апо­
птоза в криоконсервированных гемопоэтических клетках, что
может привести к развитию непредсказуемых последствий после
использования их в лечебной практике. Введение цитохрома с в
криоконсервированные клетки решит вопросы успешной клеточ­
ной терапии.
Таким образом, выявление раннего апоптоза позволит своев­
ременно «включить» программу криообновления, вызвав эксп­
рессию антиапоптотических генов и генов ГХА, индукцию антиапоптотических белков и БХШ. В данном случае антиапоптотические гены и индуцируемые ими апоптотические белки, являясь
активаторами программы обновления, усиливают реакции крио­
обновления.
Современные проблемы криоконсервирования и трансплан­
тации гемопоэтических клеток теснейшим образом связаны с изу­
чением двух важнейших разнонаправленных феноменов в клеточ­
ной биологии — апоптоза и криообновления. Смещение динами­
ческого взаимодействия апоптоза и криообновления в сторону
криообновления — один из важнейших механизмов перевода раз­
мороженных клеток на более высокий уровень гомеостаза.
Даны практические рекомендации использования маркеров
раннего апоптоза. Своевременный «запуск» программы криооб­
новления путем подбора программ замораживания—оттаивания,
введения цитохрома с в клетки, использования антиоксидантов,
цитокинов, продуктов эмбриофеталоплацентарного комплекса,
кордовой крови, активирующих программу обновления, затормо­
зит развитие апоптотических процессов в криоконсервированных
клетках и обеспечит высокую лечебную эффективность криокон­
сервированных гемопоэтических клеток в том числе СКК. Новое
направление является неотъемлемой частью клеточной терапии,
ее теоретической базой и служит основой для прогресса современ­
ных технологий в гематологии и трансфузиологии. В последние
годы оно находит все большее понимание и поддержку ученых
ближнего и дальнего зарубежья.

168

6.4. Перспективы возможных преимуществ большей клинической эффективности ...

6.4. ПЕРСПЕКТИВЫ ВОЗМОЖНЫХ ПРЕИМУЩЕСТВ БОЛЬШЕЙ
КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК,
ЗАГОТОВЛЕННЫХ ОТ ЭМБРИОНОВ И ПЛОДОВ, ПО СРАВНЕНИЮ
СО ВЗРОСЛЫМИ ДОНОРАМИ
Концепция криообновления предполагает решение проблем, свя­
занных с длительным поддержанием кроветворения у реципиен­
тов трансплантированного костного мозга. Методом селезеноч­
ных колоний, предложенным J.E. Till и Е.А. McCullok в 1961 г., за­
рубежными учеными изучено кроветворение СКК и их обновле­
ние [338]. Сделано заключение о том, что трансплантация боль­
шого числа кроветворных клеток и, главным образом, их качество
имеют решающее значение для выживаемости реципиентов.
С позиции концепции криообновления нами разработаны но­
вые технологии, защищенные патентами РФ и Украины. Они по­
зволили повысить трансплантационную активность криоконсервированных клеток костного мозга и эмбриональной печени: ак­
тивность СДГ клеток костного мозга, заготовленного от взрослых
доноров, сохраняется до 10 сут (сутки в контроле), от эмбрионов —
до 21 сут (2 сут в контроле). По нашим наблюдениям, после замо­
раживания — оттаивания клеток, выделенных из эмбриональной
печени человека, эффективность колониеобразования превышала
исходный уровень более чем в 2 раза [61] Изменилось также соот­
ношение клеток в сторону увеличения клеток-предшественников
эритроидного (на 20 %) и миелоидного (на 32 %) ряда. Интенсив­
ность реакции на внутриклеточный гемоглобин и катионные бел­
ки, обладающие антибактериальной функцией, увеличилась соот­
ветственно на 36 и 45 %. Таким образом, криоконсервированные
клетки, заготовленные от эмбрионов и плодов, надо полагать, об­
ладают более высокой жизнеспособностью и антибактерицидной
функцией по сравнению с клетками взрослых доноров.
Поэтому мы считали целесообразным изучить морфофункци­
ональные особенности клеток эмбриональной печени различной
гестации плода до и после криоконсервирования.

6.4.1. Криоконсервирование стволовых клеток

Известно, что стволовые клетки — универсальный строительный
материал, из которого произрастет все, что угодно (нужное орга­
низму), от нейтронов мозга до клеток тканей, выстилающих ки­
шечник. Они представляют собой универсальный строительный
материал. Различают два типа их классификации: по источнику

169

Глава 6. Апоптиз и криообновление как основа эффективного использования...

происхождения или получения (эмбриональные или из тканей
взрослого типа) и по способности к дифференцировке (тотипоте­
нтные, плюрипотентные, мультипотентные и унипотентные). На
самых ранних стадиях развития эмбриона клетки не специализи­
рованы. Они получили название стволовых. Стволовые клетки
есть у детей и у взрослых. Когда в организме исчерпан пул стволо­
вых клеток, наблюдается выпадение зубов, волос, появляются мо­
рщины, утрачивается половая функция. Стволовые клетки тканей
взрослого организма рассеяны по всем тканям. Их мало (костный
мозг, печень). Основная функция эмбриональных стволовых кле­
ток, примитивных клеток, возникающих в эмбрионе млекопитаю­
щих на разных стадиях эмбрионального развития, — многократ­
ное деление, перенос генетической информации. Роль стволовых
клеток — обеспечение целостности, построение и сохранение
организма. Их используют для лечения травм и заболеваний,
преодоления старения организма, а также в косметологии для по­
лучения более быстрого эффекта регенерации тканей. Поэтому
перспективы использования стволовых клеток для лечения травм,
заболеваний и, по всей вероятности, преодоления старения неис­
черпаемы. Успешная разработка методов длительного культиви­
рования стволовых клеток, выделенных из эмбрионов, плодов и
взрослых органов, создали предпосылки для заместительной кле­
точной и тканевой терапии.
В связи с тем что клетки получают у донора, проверка отсутст­
вия вирусной и бактериальной контаминации является неотъем­
лемой частью допуска материала к работе. Известно также, что
при длительном культивировании клетки могут преодолевать зна­
чительные фено- и генотипические изменения. В организме мута­
нтные клетки элиминируются иммунной системой. Однако в
культуре этого не происходит. Кроме того, согласно данным по­
следних лет, небезопасны апоптотические изменения, происходя­
щие в клетках, заготовленных для последующей терапии, в том
числе на этапе их культивирования. Использование в клинике
клеток, подвергшихся апоптозу, может привести к непредсказуе­
мым последствиям. Полный анализ пригодности стволовых кле­
ток для применения в клинике занимает несколько дней, поэтому
для поддержания клеток в жизнеспособном состоянии использу­
ют метод криоконсервирования. Он позволяет сохранить морфо­
функциональную активность криоконсервированных клеток нео­
граниченно длительное время, а также их способность дать начало
новой культуре клеток после оттаивания.

170

6.4. Перспективы возможных преимуществ большей клинической эффективности ...

Следует отметить, что сверхнизкие температуры могут быть
причиной возникновения мутаций. Более того, культивирование
и криоконсервирование могут привести к возникновению спон­
танных мутаций в клетках. Поэтому основная цель доклинических
исследований — идентификация используемых препаратов и их
безопасность. Изучен иммунофенотип криоконсервированных
клеток эмбриональной печени человека (ЭПЧ) до и после культи­
вирования, а также их колониеобразующая активность [201]. Ста­
тистический анализ позволил обнаружить положительную кор­
реляцию между содержанием АС 133-клеток и количеством коло­
ниеобразующих единиц. Фенотипический анализ показал, что в
криоконсервированной суспензии ЭПЧ содержится достаточно
большое количество жизнеспособных примитивных предшествен­
ников гемопоэтических клеток. Данные о колониеобразующей ак­
тивности ЭПЧ свидетельствуют об их высоком пролиферативном
потенциале и способности к мультинаправленной дифференциро­
вке после криоконсервирования.
В Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН
Украины проведен анализ структурных и функциональных харак­
теристик, входящих в компартменты стволовых элементов. Пока­
зана способность клеток стромы костного мозга дифференциро­
ваться in vitro в нервные клетки, которые успешно используются в
клинической практике [75]. Выявлены также особенности ответа
клеток стромы костного мозга и гемопоэтических предшественни­
ков на факторы криоконсервирования в зависимости от условия
дифференцировки. Сделан вывод о том, что варьирование усло­
вий криоконсервирования определяет характер роста стволовых
клеток in vivo и in vitro.
Впервые для идентификации морфологически не различимых
клеток-предшественников эритропоэза мы использовали моди­
фицированную нами цитохимическую реакцию на внутриклеточ­
ный гемоглобин [244]. В основу ее положены особенности перок­
сидазного действия оксигемоглобина, т. е. устойчивость к дейст­
вию спиртов и высоких концентраций перекиси водорода [270].
Мы модифицировали метод Э.Н. Барковой [20], заменив основ­
ной бензидин о-дианизидином, что позволило четче идентифици­
ровать эритроидные предшественники ввиду нетоксичности по­
следнего [244]. Согласно нашему методу, эритроциты и оксифиль­
ные нормобласты окрашиваются в желто-оранжевый цвет, полих­
роматофильные нормобласты — в ярко-зеленый. В базофильных
представителях эритроидного ряда на фоне интенсивно-синей ци­
топлазмы видны участки зеленого цвета, соответствующие лока­

171

Глава 6. Апоптиз и криообновление как основа эффективного использования...

лизации гемоглобина. Цитоплазма негативных к пероксидазной
реакции лимфоцитов, эритробластов и проэритробластов сохра­
няет базофилию.
Установлено, что наибольшее количество КЭП 3—5—6-недельной гестации плода принадлежит к эритроидному ростку крове­
творения: примитивных эритробластов — 45 ± 3,3 %; дефинитив­
ных — 14 ± 1,26 % (рис. 56, см. вклейку). Моноциты, макрофаги
представлены в умеренном количенстве, соответственно 7 ± 0,13 %
и 15 ± 1,68 %. Небольшой процент в популяции КЭП занимают
мегакариоциты и гранулоциты — по 0,2 ± 04 %. Экспозиция с
ДМСО существенно не влияет на клеточный состав эмбриональ­
ной печени. Различия отсутствуют либо недостоверны. После за­
мораживания-оттаивания количество недифференцируемых бла­
стных клеток, лимфоцитоподобных и примитивных эритроблас­
тов увеличивается соответственно на 31,89 и 28 %. Уменьшается
количество представителей дефинитивных эритробластов (23 %) и
моноцитарно-макрофагального ряда (41—70 %). Мегакариоциты,
лимфоциты и гранулоциты отсутствуют.
Эмбриональная печень 7—8-недельной гестации характеризу­
ется аналогичным составом недифференцируемых бластных (14 ±
± 0,91) и лимфоцитоподобных (6 ± 0,65) клеток (рис. 57, см.
вклейку). Количество примитивных эритробластов снижается до
32 ± 1,56; дефинитивных — увеличивается до 21 ± 1,82. Предста­
вители моноцитарно-макрофагального ряда составляют соответс­
твенно 7 ± 1,43 и 16 ± 0,72. Мегакариоциты и гранулоциты зани­
мают небольшой процент, соответственно, 0,8 ± 0,24 и 1 ± 0,13.
Экспозиция с ДМСО не изменила клеточный состав 7—8-недельной эмбриональной печени. После замораживания —оттаивания
количество недифференцируемых бластных клеток, лимфоцито­
подобных и примитивных эритробластов увеличилось соответст­
венно на 40, 70 и 26 %. Количество дефинитивных эритробластов
не изменилось, моноцитарно-макрофагального ряда снизилось до
48—81 %. Мегакариоциты, лимфоциты и гранулоциты отсутствуют.
Эмбриональная печень 9—10-недельной гестации характери­
зуется меньшим количеством недифференцируемых бластных
клеток и лимфоцитоподобных, соответственно 6 ± 1,05 и 3 ± 0,03 %.
Количество примитивных эритробластов составляет 29 ± 3,96, в то
время как дефинитивных увеличивается до 51 ± 1,77. Представи­
телей моноцитарно-макрофагального ряда — небольшое количес­
тво, соответственно 3 ± 0,72 и 0,5 ± 0,18. Мегакариоциты и грану­
лоциты единичные. После экспозиции с ДМСО клеточный состав
существенно не изменился. После замораживания —оттаивания

172

6.4. Перспективы возможных преимуществ большей клинической эффективности ...

количество недифференцируемых бластных клеток и лимфоцито­
подобных увеличилось соответственно на 50 и 67 %, примитивных
и дефинитивных эритробластов — на 59 и 30 %. Число представи­
телей моноцитарно-макрофагального ряда снизилось на 50 %.
Эмбриональная печень 11 — 12-недельного развития по срав­
нению с 9—10-недельным характеризуется аналогичным количес­
твом недифференцируемых бластных клеток (6 ± 0,63), лимфоци­
топодобных (2 ± 0,21) и эритробластов: примитивных (30 + 1,68),
дефинитивных — 52 ± 5,04 (рис. 58, см. вклейку). Моноциты и ма­
крофаги составляют соответственно 2 ± 042 и 6 ± 1,68. Мегакари­
оциты и гранулоциты находятся в незначительном количестве, со­
ответственно 0,8 + 0,42 и 1,2 ± 0,42. Появляются лимфоциты —
1,2 ± 0,24 и миелобласты — 0,6 ± 0,21. После экспозиции с ДМСО
клеточный состав существенно не изменился. После заморажива­
ния-оттаивания количество недифференцируемых бластных кле­
ток увеличилось на 16 %, лимфоцитоподобных — в 2 раза,
примитивных эритробластов — на 40 %. Количество дефинитив­
ных эритробластов уменьшилось на 17 %. Количество клеток мо­
ноцитарно-макрофагального ряда снизилось на 65—68 %. Мегака­
риоциты, миелобласты и гранулоциты отсутствуют. Количество
лимфоцитов увеличилось до 1,3 ± 0,84. На рис. 59 (см. вклейку)
показана реакция на внутриклеточный гемоглобин в клетках эмб­
риональной печени человека (смесь 6, 8, 12-недельной гестации)
до и после замораживания—оттаивания. Примечательно, что по­
сле замораживания—оттаивания с криопротекторами (ДМСО,
ТЭГ) гемоглобин в ядре отсутствует.
Известно, что основная часть гемоглобина синтезируется в
цитоплазме. Методами авторадиографии с радиоактивным желе­
зом и цитофотометрии по пероксидазной реакции гемоглобин
обнаружен в изолированных ядрах [104]. В ядро гемоглобин мо­
жет проникать из цитоплазмы, участвуя в процессах регуляции
пролиферативной активности эритроидных клеток. Попав в яд­
ро, гемоглобин репрессирует матричную активность ДНК, конт­
ролирующую синтез гемоглобина. Факторы криоконсервирова­
ния, лабилизируя ядерную мембрану, создают условия для обрат­
ного транспорта гемоглобина из ядра в цитоплазму. С помощью
о-дианизидиновой реакции на внутриклеточный гемоглобин мо­
жно видеть азурофильные (пероксидазотрицательные) ядра криоконсервированных клеток костного мозга [154] и эмбриональной
печени. Более гемоглобинизированная их цитоплазма по сравне­
нию с клетками свежезаготовленного костного мозга и эмбрио­
нальной печени характеризует новое состояние криоконсервиро­

173

Глава 6. Апогггиз и криообновление как основа эффективного использования ...

ванных эритроидных клеток, ответственных за кислородпереносящую функцию.
В основе преимущества эмбриональных и плодовых клеток по
сравнению с клетками взрослого типа лежат их морфофункциона­
льные особенности:
1. Слабая выраженность иммуногенных структур и проявле­
ния реакции иммунореактивности [49, 50, 95, 189, 217]. Вследст­
вие этого при введении в гистонесовместимый организм гемопоэ­
тических клеток, заготовленных от эмбрионов и плодов, вторич­
ная болезнь либо не наступает, либо развивается в более поздние
сроки и протекает менее активно по сравнению с гемопоэтичес­
кими клетками, заготовленными от взрослых доноров.
2. Миелограмма эмбриональных и плодовых клеток отличает­
ся от миелограммы взрослых доноров большим количеством СКК
и клеток-предшественников — 20—25 % [61], вместо 3—5 % для
взрослых доноров [99], что обеспечивает более интенсивную про­
лиферативную активность эмбриональных и плодовых гемопоэти­
ческих клеток по сравнению со зрелыми формами.
3. Преобладание в миелограмме клеток эритроидного ряда (до
90 %), обладающих гликолитическим типом обмена, более устой­
чивого к охлаждению по сравнению с окислительным, характер­
ным для взрослых доноров [104].
4. Продукция гемоглобина фетального типа (гемоглобин F),
отличающегося от гемоглобина взрослого типа (гемоглобин А) бо­
лее высоким сродством к кислороду и способностью более эффек­
тивно его связывать (рис. 60, см. вклейку) [151, 357]. Это уменьша­
ет образование недоокисленных продуктов в клетках, заготовлен­
ных от эмбрионов и плодов, и задерживает некроз.
5. Наличие мегалобластического ростка кроветворения, харак­
терной особенностью которого является накопление гемогло­
бина F.
6. Наличие островков Бессиса (скопление эритроидных кле­
ток вокруг макрофага, рис. 61, см. вклейку). В нормальном крове­
творении макрофаги активируют ген эритропоэтина (Еро) [399].
Последний резко повышает выход СКК и задерживает апоптоз пу­
тем репарации и синтеза ДНК [323].
Таким образом, вырисовываются перспективы возможных
преимуществ большей клинической эффективности криоконсервированных гемопоэтических клеток, заготовленных от эмбрио­
нов и плодов, по сравнению со взрослыми донорами, что может
быть обусловлено их морфофункциональными отличиями.

174

6.5. Маркеры раннего апоптоза гемопоэтических клеток ...

6.5. МАРКЕРЫ РАННЕГО АПОПТОЗА
ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ТРЕБУЮТ
ВКЛЮЧЕНИЯ ПРОГРАММЫ КРИООБНОВЛЕНИЯ:
РЕАЛЬНОСТЬ И ПЕРСПЕКТИВЫ
В 1976 г. мы обсудили благоприятное стимулирующее действие ци­
тохрома с в клетках криоконсервированного костного мозга [149].
Представленные данные предопределили открытие ведущего меха­
низма концепции криообновления. Поэтому существенная роль в
запуске реакций криообновления принадлежит цитохрому с.
Разработка оптимальных методов криоконсервирования гемо­
поэтических клеток и эффективности клеточной терапии тесней­
шим образом связана также с использованием маркеров програм­
мированной гибели клетки (рис. 62). Один из них — определение
активности ФС с помощью аннексин-У-связывания и хемилюми­
несценции [257]. Признаки раннего апоптоза регистрируются в том
случае, когда ФС (фосфолипид), участвующий в реакциях криооб­
новления, переходит из внутреннего монослоя плазматической
мембраны в ее наружный монослой [298]. Эти данные наглядно де­
монстрируют процессы апоптоза, которые вытесняют реакции крио­
обновления. Поэтому своевременное введение в гемопоэтические
клетки антиапоптотических белков и антиоксидантов, подавляю­
щих апоптоз, позволит на ранних этапах затормозить процессы
апоптоза. После замораживания—оттаивания клеток кордовой кро­
ви лучшим способом обнаружения раннего апоптоза СКК считают
витальное окрашивание SytoR16, аннексии V, 7-AAD (7-аминоак­
тиномицин), комбинацию SytoR16 и 7-AAD [373, 409]. При окра­
шивании трипановым синим ранний апоптоз не обнаружен.
Известно, что мембрана эритроцитов структурно и функциона­
льно асимметрична. Существует выраженная асимметрия располо­
жения фосфолипидов: фосфатидилхолин и сфингомиелин преиму­
щественно локализованы во внешнем монослое, а фосфатидилэта­
ноламин и ФС располагаются во внутреннем. Потеря асимметрии,
особенно появление ФС на клеточной поверхности, может быть
связано с различными физиологическими и патологическими сос­
тояниями [334], что характерно для апоптотических процессов.
Показано, что предобработка эритроцитов криопротектором
ПЭО-1500 приводит к увеличению числа аннексин-У-связанных
клеток, что связано со структурными перестройками, вызванными
действием криопротектора на клетку [94]. Примечательно, что об­
работка эритроцитов ПЭО-1500 при комнатной температуре при­
водит к более выраженному аннексин-У-связыванию клеток с
ФС, чем при холодовой обработке (0,3 и 13 % соответственно).

175

Глава 6. Апоптиз и криообновление как основа эффективного использования ...

Рис. 62. Маркеры раннего апоптоза и криообновления гемопоэтических
клеток [11, 74]

176

6.5. Маркеры раннего апоптоза гемопоэтических клеток ...

Это, по мнению авторов, может свидетельствовать о большей сте­
пени нарушения асимметрии мембраны в случае обработки при
комнатной температуре и указывать на возможное повышение
устойчивости эритроцитов на этапе замораживания в случае «хо­
лодовой» обработки клеток, где наблюдается меньшее нарушение
асимметрии. Определение аннексин-V-связывания в эритроцитах
кордовой крови после размораживания показало, что процент
клеток с экспонированым на внешней мембране ФС практически
не отличается от такого соответствующих групп до криоконсерви­
рования. Следовательно, можно сделать предположение о возмо­
жном включении в размороженных клетках программы криообно­
вления как корректора апоптотических процессов.
Наиболее существенным маркером раннего апоптоза, помимо
указанных, является потеря митохондриальными мембранами цито­
хрома с [401, 403, 410]. Освобожденный цитохром с индуцирует про­
цессы программированной гибели криоконсервированных гемопоэ­
тических клеток, что может привести к развитию непредсказуемых
последствий после использования их в лечебной практике. Введение
цитохрома с в криоконсервированные гемопоэтические клетки, а та­
кже использование антиапоптотических белков, способных тормо­
зить выход цитохрома с из митохондриального матрикса либо унич­
тожить его в цитозоле [284,410], существенно повысит лечебную эф­
фективность гемопоэтических клеток, в том числе СКК.
Таким образом, выявление раннего апоптоза позволит своевре­
менно включить программу криообновления, вызвав экспрессию
ГХА и БХШ. Сдвинуть динамическое взаимодействие апоптоза и
криообновления в сторону криообновления возможно с помощью ан­
тиапоптотических белков, ангиоксидазной системы, а также ингибито­
ров апоптоза, цитокинов, гормонов, ростовых факторов, интерлейки­
нов, интерферонов. Аналогичное действие оказывают репродуктивные
иммуномодуляторы, продукты эмбриофеталоплацентарного комплекса
и кордовой крови, выступающие в роли ингибиторов апоптоза и, сле­
довательно, активаторов процессов обновления и криообновления.
В настоящее время зарубежные ученые разрабатывают лекарс­
твенные средства, основанные на принципах программированной
жизни клетки. Они используют антиапоптотические белки, анти­
оксиданты и цитохром с для лечения лейкемии [326, 414], наслед­
ственных болезней [283], мужского бесплодия [401, 403] и других
заболеваний. В 2004 г. [71] мы представили на обсуждение теоре­
тическое обоснование эффективности использования цитохрома с
в медицинской практике с позиции двух разнонаправленных про­
цессов — апоптоза и криообновления.

ГЛАВА 7

Апоптоз и криообновление —
современные проблемы
цитохромной терапии

В середине XX в. в медицинской науке произошли со­
бытия, предопределившие главные направления развития цито­
хромной терапии на нынешнее и будущее столетия. Был теорети­
чески обоснован лечебный эффект цитохрома с, основанный на
его способности проникать в клетки и взаимодействовать с мито­
хондриальными мембранами [134], раскрыт и обоснован молеку­
лярный механизм, согласно которому система переноса цитохро­
ма с состоит из двух процессов. Один из них — перенос полипеп­
тида, который «входит» в наружную митохондриальную мембрану
с помощью апоцитохрома с, заменяющего рецепторную функцию
[350]. Он зависит, прежде всего, от присутствия НАД · Н и кофер­
ментов ФАД или ФМН. НАД · Н совместно с флавиннуклеотидами восстанавливает гем, которому в восстановленном состоянии
необходима ковалентная связь с апоцитохромом с. Эту функцию
выполняет энзим цитохром с-гемолиаза для последующего пере­
движения цитохрома с через наружную митохондриальную мем­
брану. Второй процесс импорта цитохрома с осуществляется при
условии «энергизованного» состояния внутренней сопрягающей
мембраны, т. е. способности ее к энергетическому сопряжению.
Эти открытия стали основанием для широкого применения ци­
тохрома с в медицинской практике.
7.1. КРАТКИЙ ОЧЕРК РАЗВИТИЯ ЦИТОХРОМНОЙ ТЕРАПИИ

В 1957 г. D.V. van Bekkum [396] обнаружил повышение коэффи­
циента P/О после добавления цитохрома с к митохондриям облу­
ченной селезенки. Через час этот эффект усилился. Через 4 ч Р/О
был в 2 раза выше исходного значения, хотя и не достиг нормы.
Это явление было названо «цитохромный эффект». Автор пришел

178

7.1. Краткий очерк развития цитохромной терапии

к выводу, что облучение вызывает в митохондриях селезенки де­
фицит цитохрома с и показал инактивирующий характер радиа­
ции, а не простое отмывание цитохрома с от митохондрий.
На основании изучения двух разнонаправленных феноме­
нов — апоптоза и обновления целесообразно предположить, что
облучение селезенки индуцирует в ее митохондриях апоптотические процессы. Это ведет к разобщению окислительного фосфори­
лирования и дыхания. Вхождение цитохрома с (ведущего меха­
низма обновления) в митохондриальный матрикс способствует
восстановлению указанных процессов. Одновременно цитохром с
активирует программу обновления. В результате динамическое вза­
имодействие апоптоза и обновления сдвигается в сторону обнов­
ления и повышается коэффициент Р/О.
Несколько позже российские ученые [211] изучили влияние
цитохрома с на окислительное фосфорилирование в некоторых
органах животных при экспериментальном опухолевом росте и
лучевой болезни, что предопределило дальнейшее направление
подобных работ в онкологии и радиационной медицине.
В целом препарат цитохрома с применяют в тех случаях, когда
в тканях организма нарушены окислительные процессы, т. е. при
гипоксии различного происхождения. Механизм лечебного дей­
ствия цитохрома с заключается в его ингибирующем влиянии на
ПОЛ, что проявилось в уменьшении содержания конъюгатов, ма­
лонового альдегида и стимуляции синтеза ингибиторов протеоли­
за [148]. Цитохром с стабилизирует мембраны лизосом и обеспе­
чивает сохранение кислых фосфатаз и ДНК в основном в связан­
ном со структурами органелл состоянии.
Способность препарата снижать интенсивность процессов
ПОЛ — один из механизмов его лечебного действия при остром
вирусном гепатите [145]. Цитохром с оказывает стимулирующее
влияние на синтез иммуноглобулинов, в связи с чем его исполь­
зуют, например, в комплексном лечении больных тифо-парати­
фозными заболеваниями [144]. Установлено, что уровень IgG в
группе больных, леченных цитохромом с, был на 17 % выше по
сравнению с лечением традиционным методом. При этом уровень
lg М и А также превышал, но менее интенсивно. Благодаря стиму­
ляции иммуногенеза на 5—10-е сутки лечения прекратилось бак­
териовыделение. Положительное влияние цитохрома с на имму­
ногенез является результатом его стимулирующего действия на
процессы окислительного фосфорилирования и дыхания.
В акушерстве и гинекологии среди причин перинатальной
смертности гипоксия внутриутробного плода стоит на первом

179

Глава 7. Апоптоз и криообновление — современные проблемы цитохромной терапии

месте. При патологическом течении беременности (токсикозах,
невынашивании и др.) плацентарная ткань перерождается, нару­
шаются маточно-плацентарное кровообращение и функция пла­
центы, прекращается поступление лактата и пирувата через пла­
центу и пуповину, что приводит к развитию хронической гипок­
сии [169]. Плацента содержит 6—8 мг цитохрома с/кг сухого остат­
ка. При тяжелых токсикозах беременности активность цитохрома
с и ЦХО снижается. После внутривенного введения цитохрома с
при родах сердечная деятельность плода существенно улучшается,
что связано с благоприятными изменениями функции плаценты,
а также с непосредственным действием препарата на миокард
плода.
В хирургии показаны преимущества парентерального введе­
ния цитохрома с в сочетании с гипербарической оксигенацией
(ГБО) при лечении гнойно-воспалительного процесса челюстно­
лицевой области по сравнению с традиционными методами лече­
ния. Сочетанное применение цитохрома с и ГБО усиливает лейко­
цитарную местную реакцию, ускоряет отторжение секвестров и
активирует рост сосудов и нервных окончаний [19].
Обосновано применение цитохрома с для лечения сердечной
мышцы при ее недостаточности [222]. Показана положительная
динамика показателей энцефалограммы, а также ряда психофи­
зиологических тестов при лечении этим препаратом. У больных с
церебро-кардиальными синдромами введение препарата вызыва­
ло улучшение как церебральных проявлений заболевания, так и
показателей сердечной деятельности. Цитохром с рекомендован в
качестве компонента комплексной терапии сосудистой патологии
мозга.
Дано клинико-цитохимическое обоснование использования
цитохрома с в метаболической коррекции при осложненной фор­
ме острой пневмонии у детей раннего (1 мес — 2 года) возраста
[42]. Хорошие результаты получены у детей с сердечно-сосудистой
недостаточностью, гипотрофией, рахитом, анемией, а также после
родовой травмы и асфиксии. Показанием к применению считает­
ся снижение активности СДГ, НАД- и НАДФ · Н-дегидрогеназ в
нейтрофилах крови. Действие препарата направлено на восста­
новление ферментного статуса этих клеток, в которых цитохром с
нормализует нарушенные окислительные процессы фосфорили­
рования и энергообеспечения.
Таким образом, метод цитохромной терапии завоевал право на
жизнь при лечении ряда патологических состояний организма.
Криобиологические технологии повышают эффективность цито­

180

7.2. Роль цитохрома

с в механизмах апоптоза и криообновления

хромной терапии. Впервые описанные нами феномены обновле­
ния и криообновления в сопоставлении с апоптозом пролили свет
на актуальность и важность цитохромной терапии в медицинской
практике.
Руководствуясь принципами доказательной медицины, можно
заключить, что любой патологический процесс в организме обус­
ловлен индукцией апоптотических реакций, таких, как активация
каскада каспаз и процессов ПОЛ, образованием свободных ради­
калов и АФК, повреждающих клетку и организм в целом. Вхожде­
ние цитохрома с в митохондриальный матрикс блокирует актива­
цию каспаз, препятствует образованию АФК, выходу проапоптотических белков из клеток. В результате этих реакций происходит
сдвиг динамического взаимодействия двух разнонаправленных
процессов: с одной стороны, апоптоза, с другой — обновления и
криообновления в сторону последних. Это обеспечивает высокую
эффективность цитохромной терапии.
Ниже представлены данные, касающиеся роли цитохрома с в
запуске процессов апопоза и криообновления.
7.2. РОЛЬ ЦИТОХРОМА c
В МЕХАНИЗМАХ АПОПТОЗА И КРИООБНОВЛЕНИЯ
Недавно на клетках яичника китайского хомячка показано, что
проникающая способность митохондрий играет важную роль в ре­
гуляции высвобождения из митохондрий цитохрома с [276]. Это
может быть наиболее существенным моментом на пути апоптоза.
Одним из пусковых механизмов процесса апоптоза является вы­
ход из поврежденных митохондрий цитохрома с, взаимодействую­
щего с цитозольным белком A paf-l, что обеспечивает переход
каспазы 3 (остатка аспарагиновой кислоты) в каталитически ак­
тивную форму [77]. Один из пусковых механизмов криообновле­
ния — повышение концентрации цитохромов в митохондриях и
гомогенатах печени крыс и появление митохондрий с новыми
свойствами, более устойчивыми к повреждающим факторам. Уси­
ление митохондриогенеза коррелирует с морфологическими изме­
нениями этих структур, вследствие чего формируются новые взаи­
моотношения цитохрома с с митохондриальными мембранами.
Благоприятные изменения в системе транспорта электронов обес­
печивают низкие температуры, благодаря их способности регули­
ровать гены, под контролем которых находятся цитохром с и
НАД · Н, участвующий в его транспортной функции через наруж­

181

Глава 7. Апоптоз и криообновление — современные проблемы цитохромной терапии

ную митохондриальную мембрану [384]. В настоящее время выяв­
лены и локализованы гены, участвующие в процессах криообнов­
ления, о чем упоминалось выше.
Концепция криообновления служит теоретическим обоснова­
нием эффективности криобиологических технологий в цитохром­
ной терапии. В результате лечения цитохромом с и гипотермией
больных с острым отравлением (алкоголь, наркотики) у них сок­
ратились продолжительность коматозного состояния и сроки пре­
бывания в реанимационном отделении в среднем на 3—5 сут [243].
После 1—2 инъекций цитохрома с больные с ишемической и ге­
моррагической патологией вышли из коматозного состояния,
включая и тех, кто не поддавался методам традиционной гипотер­
мии. На протяжении ряда лет успешно проводится транспланта­
ция размороженных клеток костного мозга и эмбриональной пе­
чени, обогащенных цитохромом с [242]. Благодаря использованию
цитохрома с и гипотермии удалось активизировать подвижность и
жизнеспособность спермиев человека на 30—32 %, что дало воз­
можность повысить фертильность мужских гамет и способствова­
ло увеличению частоты наступления беременности [245]. Приме­
чательно, что у всех новорожденных, полученных от этих мужчин,
отсутствовали признаки асфиксии, гемолитической желтухи и
статуса недоношенности, что нередко встречается при использо­
вании традиционных методов. Наблюдения последних лет свиде­
тельствуют о том, что «криообновленные» дети, полученные с по­
мощью цитохрома с, практически не болеют инфекционными и
другими заболеваниями. Недавно с помощью подбора программ
замораживания—оттаивания, согласно патенту [246], представле­
ны аналогичные данные на животных (собаках). Потомство от яй­
цеклетки, оплодотворенной криоконсервированными спермиями,
характеризовалось высокой жизнеспособностью, отсутствовали
признаки анемии, что нередко встречается при использовании
традиционных методов оплодотворения.
Положительный эффект сочетания низких температур и ци­
тохрома с при лечении бесплодия мы связываем с открытым нами
ранее деконденсирующим свойством криоконсервирования и
активацией процессов транскрипции. Гораздо позже подобную
мысль высказали зарубежные авторы, которые показали положи­
тельную корреляцию между деконденсацией хроматина в спермиях человека и животных (свиньи) и их оплодотворяющей спо­
собностью [266]. Потерю оплодотворяющей способности у муж­
чин связывают с чрезвычайной конденсацией хроматина [364,
365]. Конденсированный хроматин лишает гены функциональной

182

7.2. Роль цитохрома

с в механизмах апоптоза и криообновления

активности, деконденсированный (разрыхленный) ведет к вклю­
чению в работу генов и открывает возможность реализации их ре­
гуляторной деятельности.
Суммируя приведенные данные, можно предположить, что
низкие температуры, активно воздействуя на гены, под контролем
которых находится цитохром с, активируют систему транспорта
электронов [143, 330] и тем самым в значительной степени спо­
собствуют интенсификации подвижности спермиев и их фертиль­
ности. Теоретические предпосылки подтверждены эксперимен­
тально: при осеменении икры осетра и карпа размороженными
спермиями значительно увеличились процент выклева личинок и
их средняя масса [173, 174]. Молодь этих рыб также отличалась
большей средней массой тела и более высоким уровнем гематоло­
гических биохимических и иммунологических параметров. Недав­
но в клетках человека идентифицированы БХШ (CIRP) [274]. В
результате их функционирования повышается выживаемость че­
ловека и животных. Поэтому, согласно универсальности кода,
можно прогнозировать получение более жизнеспособного потом­
ства во всех поколениях.
В настоящее время в клинической практике для лечения кома­
тозных, гипоксических, постлучевых состояний, а также при на­
рушении гемопоэза и бесплодия все чаще используют криобиоло­
гические технологии. В основе высокой эффективности цито­
хромной терапии с использованием низких температур лежит ряд
генетически обусловленных факторов:
• деконденсация хроматина и активация процессов тран­
скрипции;
• экспрессия ГХА, синтез БХШ и de novo;
• интенсификация системы транспорта электронов;
• лабилизация клеточных мембран;
• индукция с помощью цитохрома с процессов пиноцитоза
[183];
• повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера
[18];
• корректировка динамического равновесия между уровнем и
состоянием топоизомераз I и II типа [66] и многие другие.
Согласно данным зарубежных авторов, радиактивно-индуцируемый апоптоз вызывает высвобождение цитохрома с из мито­
хондрий [379]. Вышедший из митохондрий цитохром с стимули­
рует процессы апоптоза, активируя каспазу 9. Он индуцирует апоп­
тоз в раковых клетках [292]. Цитохром с, введенный в организм,

183

Глава 7. Апоптоз и криообновление — современные проблемы цитохромной терапии

стимулирует процессы криообновления и тем самым оказывает
благоприятное действие на течение пострадиационных осложне­
ний и опухолевой болезни. Высокая терапевтическая эффектив­
ность обусловлена способностью препарата тормозить рост опухо­
ли, предотвращать снижение активности биоэнергетических про­
цессов в митохондриях.
В иммунологических исследованиях доказано, что иммуноде­
фицит проявляется только при истощении ферментных систем,
главным образом, лимфоцитов и моноцитов. Применение цито­
хрома с существенно повышает эффективность лечения и норма­
лизует иммунный статус больных туберкулезом. Положительный
эффект цитохрома с на иммуногенез обусловлен его стимулирую­
щим действием на синтез иммуноглобулинов, процессы дыхания
и фосфорилирования. Подобно туберкулезу СПИД также являет­
ся следствием проявления иммунодефицита. Лечебная эффектив­
ность цитохрома с обусловлена его способностью проникать в
клетки мозга для последующей коррекции в них энергетического
обмена, стимуляции иммуногенеза и биоэнергетических процес­
сов. Поэтому цитохромная терапия дает возможность прогнозиро­
вать задержку развития иммунодефицита и, следовательно,
СПИДа.
Итак, на основании теоретических предпосылок и собствен­
ных экспериментальных данных, полученных за последние 35 лет,
нами разработаны технологии, способные активно бороться с
неизлечимыми заболеваниями и преждевременным старением ор­
ганизма. Теоретически обоснована эффективность использования
цитохрома с в экспериментальной и клинической медицине, в ос­
нову чего положено динамическое взаимодействие разнонаправ­
ленных процессов: с одной стороны, апоптоза, с другой — обнов­
ления и криообновления.
Далее мы более подробно остановимся на одной из важней­
ших проблем современности — лечения бесплодия путем исполь­
зования механизмов программированной жизни охлажденной и
криоконсервированной клетки.

ГЛАВА 8

Криообновление как основа
эффективного лечения
мужского бесплодия

Проблема бесплодия волнует все человечество. Дан­
ные органов юстиции свидетельствуют о том, что смертность в
Украине продолжает превышать рождаемость. В 2005 г. по сравне­
нию с соответствующим периодом 2004 г. количество новорож­
денных в Украине сократилось на 7,4 тыс. (2,3 %). Как сообщает
Государственный комитет статистики, уровень рождаемости за
этот период составил 9 человек на 1000 жителей. В 2007 г. в Украи­
не органами регистрации актов гражданского состояния было за­
регистрировано 92,355 тыс. рождений, 163,598 тыс. смертей.
В сравнении с 1980 г. уровень смертности населения в Луган­
ской обл. вырос в 1,8 раза. За последние 15 лет численность насе­
ления уменьшилась на 389 тыс. человек. Среди первоклассников
только 5—9 % практически здоровых детей. В дошкольных учреж­
дениях 10 % детей имеют группу по инвалидности.
Наиболее низкий общий коэффициент рождаемости (от 6,9 до
7,6 на тысячу жителей в пересчете на год против 8,7 по Украине в
целом) зафиксирован в Луганской, Сумской, Донецкой, Чернигов­
ской, Полтавской, Черкасской и Харьковской областях. Младен­
ческая смертность в 2004 г. составляла 10 детей на тысячу, перина­
тальная смертность — 8. Луганские медики констатируют значи­
тельное увеличение новорожденных с патологиями. По данным уп­
равления здравоохранения Донецкой облгосадминистрации, за год
в области рождается около 40 % младенцев с пороком сердца и око­
ло 20 % — с патологиями желудочно-кишечного тракта, конечнос­
тей и прочими отклонениями. С 1991 г. население Днепропетров­
ской обл. сократилось на 200 тыс. человек, снизился уровень рож­
даемости и продолжительность жизни. Увеличивалось число инва­
лидов и людей, страдающих экологозависимыми болезнями.
В 2009 г. в Украине зафиксирован резкий спад смертности по
сравнению с аналогичными периодами 2007 и 2008 гг. Количество
зарегистрированных смертей уменьшилось на 21—23 %. Показатель

185

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

рождаемости также снизился на 6—10,5 %. Вместе с тем в последние
годы наблюдается тенденция к превышению смертности над рож­
даемостью в среднем в соотношении 1,6 : 1. Наиболее неблагоприя­
тное соотношение смертности и рождаемости зафиксировано орга­
нами юстиции в Донецкой, Луганской, Черниговской и Полтавской
обл. Исключение составляют Волынская, Закарпатская, Ривненская
обл. и г. Киев, где с начала 2009 г. количество рожденных превышает
количество умерших. В целом с начала 2009 г. в Украине умерли
391 952 жителя. Показатель смертности младенцев (детей до 1 года) в
Украине в 2009 г. составляет 11,35 ребенка на 1 тыс. новорожденных.
Одна из причин этого — неблагоприятная экологическая кар­
та Украины. Большая часть населения ныне живет в экологически
опасных регионах. Уровень загрязнения почвы, воды и воздуха в
них настолько велик, что специалисты уже слабо представляют се­
бе молодое поколение из этих областей, которое не страдало бы от
болезней, вызванных загрязненной окружающей средой. Как ука­
зывалось выше, одна лишь авария на ЧАЭС отравила более 5 млн
гектаров украинских земель, что по территории равно нескольким
областям. 1,5 млн гектаров лесов также стали непригодными для
отдыха на природе и сбора грибов. Около 1,5 млн людей сегодня
живут, работают и рожают детей на территории, где радиоактив­
ный фон в десятки раз превышает допустимый (Киевская, Жито­
мирская, Винницкая, Ивано-Франковская, Черниговская, Чер­
касская, Ривненская и другие области). Воды Днепровского бас­
сейна до сих пор загрязнены радионуклидами, концентрация ко­
торых местами в сотни раз превышает норму.
В Донбасско-Приднепровском регионе, где сконцентрированы
самые грязные с экологической точки зрения производства, ситуа­
ция еще хуже. Там практически не осталось водоемов, пригодных
для купания. В водах р. Северский Донец присутствуют нефтепро­
дукты и тяжелые металлы. По данным Луганского национального
педагогического университета им. Т. Шевченко, над этим регионом
уже много десятилетий существует своеобразная кислородная во­
ронка. В Луганской обл. хранится почти 532 т непригодных и зап­
рещенных химических средств защиты растений — пестицидов.
Эти яды десятки лет губительно действуют на всю цепочку экосис­
темы. Они отрицательно влияют на репродуктивную функцию че­
ловека и животных, поражают печень, вызывают заболевания нер­
вной, сердечно-сосудистой и дыхательной систем. Плотность выб­
росов пыли и газов в атмосферу составляет около 70 км2, что в 6 раз
больше, чем в среднем по Украине. В структуре вредных выбросов
преобладает оксид углерода, на долю которого приходится почти

186

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

Рис. 63. Основные механизмы процессов апоптоза в спермиях человека

28,8 % всех выбросов, сернистый ангидрид (диоксид серы) — 21,3,
пыль — 15, легкие органические соединения — 13 %.
На клеточном уровне вредные физико-химические факторы «за­
пускают» программу гибели клетки и организма в целом. Выход из
этой тяжелой ситуации возможен за счет включения противополож­
но направленных механизмов обновления и криообновления.
Современные проблемы эффективного лечения мужского бес­
плодия теснейшим образом связаны с изучением двух важнейших
разнонаправленных феноменов в клеточной биологии — апоптоза
и криообновления. Активация апоптоза еще в сперматогенезе мо­
жет приводить к потере их оплодотворяющей способности. Поэ­
тому наиболее четко раскрыть механизм благоприятного действия
цитохрома с и низких температур для лечения мужского беспло­
дия возможно с позиции вышеупомянутых феноменов.
Апоптоз в спермиях человека и животных служит для элими­
нирования поврежденных клеток. Гиперфункция ведет к потере
оплодотворяющей способности. Пусковой механизм апоптоза —
конденсация и агрегация хроматина (рис. 63). Потерю оплодотво­

187

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

ряющей способности у мужчин связывают с чрезвычайной кон­
денсацией хроматина [364, 365], что влечет за собой нарушение
ДНК-ядерных белковых связей, разрывы нитей ядерной ДНК. В
результате этих процессов ядро подвергается фрагментации, рас­
падается на части. Ведущий механизм апоптоза — высвобождение
цитохрома с митохондриальных мембран. Вышедший из митохон­
дриального матрикса цитохром с активирует каспазы в митохон­
дриях, в результате чего повреждается ядерная ДНК, а также ката­
лизирует процессы ПОЛ. В результате активации ПОЛ в клетке
образуются АФК, вызывающие повреждение мембран [401]. По
сравнению с нормальными донорами больные с мужским факто­
ром бесплодия отличались высоким уровнем экспрессии АФК, ас­
социированной с увеличением апоптоза, ведущего к повреждению
ДНК, насыщением цитохромом с межмембранного пространства,
активацией каспазы 3 и 9. У бесплодных мужчин наблюдалась
уменьшенная спермальная вариабельность (подвижность, кон­
центрация и морфология), которая отрицательно коррелировала с
цитохромом с, каспазой 3 и 9.
В клетках, подвергшихся воздействию индуктора апоптоза,
резко снижается мембранный потенциал митохондрий. Более вы­
сокий уровень цитохрома с в межмембранном пространстве у бес­
плодных пациентов по сравнению с контролем зарубежные авторы
объясняют снижением трансмембранного потенциала, изменени­
ем проницаемости митохондриальной мембраны, высвобождени­
ем цитохрома с, ведущим к повреждению электронного транспор­
та, что характерно для многих апоптотических клеток [403].
Запуск процессов криообновления в спермиях человека и жи­
вотных — это деконденсация (разрыхление) хроматина без нару­
шения ДНК-ядерных связей. Показана положительная корреля­
ция между деконденсацией хроматина в спермиях человека и жи­
вотных (свиней) и их оплодотворяющей способностью [266]. Де­
конденсация хроматина выявлена при нормо- и патоспермии в ус­
ловиях действия высоких скоростей охлаждения.
Процессы криообновления находятся под контролем клеточ­
ного генома. Выявлены БХШ Р14 и Р20 кДа, предохраняющие
мембраны в спермиях животных (бараны) от повреждения [258].
Защитный эффект, по мнению авторов, обусловлен их декапацитационной ролью. Выявлен ген spe-5, ассоциированный с холодо­
чувствительным фенотипом спермиев [333]. Описан эффект эк­
спрессии гена Вах и антиапоптотических белков Bcl-2 в спермато­
генных стволовых клетках и их локализация на внутренней мито­

188

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

хондриальной мембране [327]. Антиапоптотические белки блоки­
руют выход цитохрома с из митохондриального матрикса, а также
уничтожают вышедший в межмембранное пространство и, таким
образом, тормозят апоптотические процессы.
Ведущий механизм криообновления — генетически детерми­
нированное, благоприятное стимулирующее действие цитохро­
ма с. Попадая в митохондриальный матрикс, цитохром с блоки­
рует процессы активации каспаз и подавляет реакции апоптоза,
направленные на уничтожение клеток.
Важная роль в осуществлении процессов криообновления
принадлежит антиоксидантам. Они подавляют апоптоз, предуп­
реждают повреждение ДНК и улучшают качество спермы: предот­
вращают реакции ПОЛ, не дают свободным радикалам накапли­
ваться в организме и образовывать АФК. Согласно нашим наблю­
дениям, наибольшая жизнеспособность спермиев достигается с
помощью цитохрома с в концентрации 1,2 ∙ 10^3 мМ и а-токоферола в концентрации 0,5 мМ [245]. После их совместного действия
жизнеспособность охлажденных спермиев человека повысилась
на 18 % (Р< 0,01). Антиоксидантная функция токоферолов, в част­
ности α-токоферола, определяется их способностью связывать
появляющиеся в клетках активные свободные феноксидные ради­
калы (участки ПОЛ) в относительно устойчивые и поэтому не
способные к продолжению цепи.
После действия холинхлорида, вытяжки из лецитина (природ­
ного антиоксиданта) в концентрации 0,2 % и α-токоферола в кон­
центрации 0,3 мМ активность СДГ в охлажденных спермиях по­
высилась соответственно на 14 и 15 % (Р< 0,01) [7]. Согласно дан­
ным зарубежных авторов, хранение спермы баранов при 5 °С в
присутствии антиоксидантов (супероксиддисмутазы, каталазы,
цитохрома с, глютатионпероксидазы) улучшало подвижность, акросомальную целостность, оплодотворяющую способность и по­
казатели беременности [337].
В Институте животноводства УААН, как уже указывалось, на
спермиях производителей различных видов животных (быков, ба­
ранов, хряков), а также на эритроцитах крупного рогатого скота
(баранов), кролей и человека выявлен защитный механизм яичного
желтка при воздействии низкотемпературных, иммунных, осмоти­
ческих, механических и других факторов. В состав яичного желтка
входит большое количество антиоксидантов (лецитин, сфингомие­
лин, фосфатидилхолин и др.). С позиции концепции криообновле­
ния эти антиоксиданты способны тормозить процессы апоптоза,
сдвигая тем самым динамическое взаимодействие апоптоза и

189

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

криообновления в сторону криообновления. Этот процесс лежит в
основе повышения качества охлажденных спермиев животных.
Защитное действие яичного желтка, по всей вероятности, свя­
зано с образованием на поверхности плазматической мембраны
клеток дополнительных структур за счет адсорбции содержащихся
в нем липидов или протеинов [156]. Действительно, содержащий­
ся лецитин желтка, имея сродство с липопротеидным покровом
клеток, наслаивается на их поверхности и образует липидную фа­
зу. Кроме того, при наслоении лецитина значительно увеличи­
вается толщина клеточной оболочки. Поэтому для проявления хо­
лодового удара у обработанных желтком клеток необходимо соз­
дать в несколько раз больший, чем у необработанных, осмотичес­
кий градиент на границе оболочка клетки—окружающая среда.
На основе теории фортификации в Институте животноводства
УААН разработаны способ консервирования спермы животных и
среда для ее криоконсервирования [156, 157]. Суть механизма фор­
тификации сводится к взаимной адсорбции липидов окружающей
клетку среды с компонентами цитоплазматической мембраны за
счет сил полярных и гидрофобных взаимодействий. При этом на
поверхности клетки образуется структура, сообщающая плазмати­
ческой мембране дополнительную механическую прочность и изо­
лирующая ее от соприкосновения с вредоносными агентами.
Создан также способ фортификации мембран спермиев мо­
ноэтанол амином. Моноэтанол амин является фрагментом молеку­
лы фосфолипидов, участвующих в фортификации мембранного
аппарата. Установлено, что введение в разбавитель для спермы
быков моноэтаноламинхлорида способствует уменьшению интен­
сивности разрушения мембранного аппарата спермиев. При этом
удалось предотвратить снижение активности спермиев на 0,1—0,2
балла и сохранить на 10—12 % больше спермиев с неповрежден­
ной акросомой после замораживания. Оплодотворяющая способ­
ность замороженной спермы быков с использованием антиокси­
данта моноэтаноламина оказалась на 18,4—10,9 % выше контроль­
ной, замороженной без моноэтаноламинхлорида.
Разработка методов эффективного гипотермического хране­
ния спермиев предусматривает использование маркеров раннего
апоптоза (рис. 64). Один из них — определение активности ФС с
помощью аннексин-У-связывания и хемилюминесценции. Приз­
наки раннего апоптоза регистрируются в том случае, когда фосфо­
липид, в норме присутствующий на внутренней цитоплазматичес­
кой мембране здоровых клеток, передвигается в ее наружный мо­
нослой. При этом молекула фосфолипида претерпевает структур­

190

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

Рис. 64. Маркеры раннего апоптоза и криообновления в спермиях человека

ные изменения. Аннексин-У-связывание было обнаружено во
фракциях с высокой и низкой спермальной подвижностью до и
после замораживания. Очищенная высокоподвижная «криообновленная» популяция спермиев характеризуется значительно более
высокой индукцией мембранного ФС (антиоксиданта de novo),
подавляющего апоптоз [341]. В течение раннего апоптоза клетка
изменяет свою мембранную асимметрию [348]. Следовательно, в
основе фертильности спермиев лежит существование отбора (се­
лекции) и изменчивости [73]. Эти процессы находятся под кон­
тролем клеточного генома: частота количественных хромосомных
аномалий в криоконсервированных спермиях достоверно ниже
(3 %) по сравнению с контролем (5,2 %) [336].
Характерными признаками раннего обновления и криообнов­
ления являются конформационные изменения мембранных струк­
тур без повреждения молекулы цитохрома с [142] и его транспорт­
ной функции через митохондриальные мембраны. Как следует из
вышеупомянутых обзорных работ, импорт цитохрома с через на­

191

Г л а в а 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

ружную митохондриальную мембрану зависит прежде всего от
присутствия НАД · Н и коферментов ФАД или ФМН. НАД · Н
совместно с флавиннуклеотидами восстанавливает гем, которому
в восстановленном состоянии необходима его ковалентная привя­
занность к апоцитохрому с. Эту функцию выполняет коэнзим цитохром-с-гемолиаза для последующего передвижения цитохрома с
через наружную митохондриальную мембрану. Ионно-транспорт­
ная функция цитохрома с имеет существенное значение для под­
держания электрохимического потенциала сопрягающей мембра­
ны и связанного с ним процесса образования АТФ. Окисленная
(ферри) и восстановленная (ферро) формы цитохрома с способны
избирательно связывать различные катионы и анионы, АТФ и
АДФ, регулировать их транспорт в митохондриях. Поэтому про­
цесс импорта цитохрома с через внутреннюю мембрану митохон­
дрий в реакциях обновления и криообновления осуществляется
при условии ее «энергизованного» состояния, т. е. способности
внутренней мембраны к энергетическому сопряжению. Повыше­
ние мембранного потенциала как маркера раннего криообновле­
ния сопровождается усилением митохондриогенеза, образованием
более компактной структуры транспорта электронов, появлением
митохондрий, более устойчивых к охлаждению.
Приведенные данные наглядно демонстрируют динамическое
взаимодействие апоптоза и криообновления и экспериментально
подтверждают наши ранние представления о низкотемпературной
селекции как факторе отбора и благоприятной изменчивости.
Именно такая трактовка селекции лежит в основе программиро­
ванной жизни охлажденной и криоконсервированной клетки.
Итак, маркерами раннего апоптоза служат определение ФС с
помощью аннексин-У-связывания, уменьшение мембранного по­
тенциала и потеря мембранами митохондрий цитохрома с. Осво­
божденный цитохром с индуцирует процессы апоптоза в охлаж­
денных спермиях, что может привести к потере их оплодотворяю­
щей способности. Стимуляция цитохромом с спермиев человека,
подвергшихся гипотермическому хранению, обеспечивает «за­
пуск» процессов криообновления, направленных на лечение муж­
ского бесплодия.
Таким образом, маркеры раннего апоптоза и криообновления
могут служить прогностическим тестом для разработки тактики
успешного лечения мужского бесплодия. Выявление раннего
апоптоза позволит своевременно «включить» программу криооб­
новления, вызвав экспрессию ГХА и БХШ. Введение цитохрома с
и других антиоксидантов (α-токоферола, холинхлорида), а также

192

8.1. Активность сукцинатдегидрогеназы в спермиях человека ...

антиапоптотических белков, активирующих процессы програм­
мированной жизни клетки, уменьшит развитие апоптотических
процессов в охлажденных спермиях человека. Это даст возмож­
ность сместить динамическое взаимодействие двух разнонаправ­
ленных процессов — апоптоза и криообновления в сторону крио­
обновления, что лежит в основе эффективности лечения мужско­
го бесплодия.

8.1. АКТИВНОСТЬ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В СПЕРМИЯХ
ЧЕЛОВЕКА, ХРАНИВШИХСЯ В УСЛОВИЯХ ГИПОТЕРМИИ
В наши дни организм человека подвергается мощному воздействию
различных факторов загрязнения внешней среды, отрицательно
влияющих на здоровье человека, в том числе и на репродуктивную
функцию [109, 240, 241]. По данным ВОЗ, за последние 50 лет кон­
центрация спермиев в эякуляте здоровых мужчин снизилась на
40—50 %. Количество бесплодных супружеских пар увеличилось с 15
до 30 %. Около 50 % из них приходится на долю мужского беспло­
дия, вызванного разными причинами: гормональной недостаточнос­
тью, воздействием эндогенных или экзогенных факторов, которые в
сочетании значительно затрудняют коррекцию вызванных наруше­
ний [240]. Для повышения подвижности и жизнеспособности спер­
миев применяли различные физические и химические методы, в
частности ультразвуковые колебания, лазерное излучение, ПМП, а
также некоторые фармакологические, химические и биологические
вещества. Традиционные методы лечения бесплодия не всегда при­
водят к восстановлению функции сперматогенеза. В таких случаях
приходится использовать новые репродуктивные технологии (ΓVF,
ICSI, ИСМ, донорство гамет и эмбрионов), включающие кратковре­
менное или долгосрочное хранение репродуктивных клеток, что
можно достичь криоконсервированием или гипотермией.
Интегральным показателем внутриклеточного метаболизма
является активность СДГ. Это объясняется тем, что данный фер­
мент занимает центральное место в цикле Кребса и находится в
тесной коррелятивной зависимости от других ключевых фермен­
тов. Второе важное свойство СДГ — принадлежность к высокоактивируемым ферментам [121].
Известно, что при бесплодии, вызванном как воспалительны­
ми процессами в репродуктивном тракте, так и андрогенной не­
достаточностью, характерно снижение активности СДГ [240]. С
изменением активности этого фермента изменяется физиологи­
ческое состояние клеток, что может служить диагностическим и

193

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

прогностическим тестом для определения жизнеспособности спермиев человека на этапах криоконсервирования и гипотермии.
Изучена активность СДГ в спермиях человека до и после ги­
потермического хранения (8 °С), а также при добавлении в среду
отогрева цитохрома с. Для определения СДГ нами был модифици­
рован метод, применяемый для тканевых срезов [347]. При оценке
мазков установлено, что по мере созревания клеток активность
энзима в контрольных образцах снижается. Отмечена выраженная
реакция в юных клетках, умеренная — в зрелых. СГК соответ­
ственно составлял: в юных формах — 2,89 ± 0,1, в зрелых спер­
миях — 1,42 ± 0,04 (Р< 0,05, рис. 65, см. вклейку). После суток ги­
потермического хранения характер и локализация гранул диформазана в зрелых спермиях существенно не изменялись по сравне­
нию с контролем, хотя активность фермента в юных спермиях
снизилась на 36 %, СГК составлял 1,87 ± 0,14. После 2 сут СГК в
юных и зрелых гаметах составлял соответственно 1,80 ± 0,02 и
1,33 ± 0,02 (P≤ 0,05). Активность СДГ в мазках при оценке отло­
жения продукта реакции варьировала от слабой до умеренной. В
обездвиженных, патологически измененных клетках, по-видимому, нарушилась проницаемость мембраны, что сопровождалось
появлением аномальных количеств субстрата в различных учас­
тках клетки и образованием крупных конгломератов.
После 3 сут гипотермического хранения кинетическая актив­
ность спермиев резко снизилась. Поэтому была проведена стиму­
ляция их подвижности с помощью цитохрома с. После добавления
цитохрома с в образцы суспензии спермиев, хранившихся в усло­
виях гипотермии в течение 2 или 3 сут, активность СДГ в юных и
зрелых клетках повысилась по сравнению с контролем соответ­
ственно на 30 и 32 % (выраженный «цитохромный эффект»). В
контрольных образцах (без добавления цитохрома с) преобладаю­
щее количество спермиев было с низкой активностью фермента.
Полученные данные свидетельствуют о том, что применение
цитохрома с с целью повышения биологической активности спер­
миев человека как нативных, так и хранившихся в условиях гипо­
термии, обусловлено участием этого фермента в энергетическом
обмене клеток, его способностью активировать СДГ и дыхание и
тем самым опосредовано способствовать повышению оплодотво­
ряющей способности спермиев человека.
Итак, цитохром с способствует увеличению подвижности спер­
миев и активности СДГ на этапе реабилитации после гипотермии
и, следовательно, может быть использован для улучшения качест­
ва спермы при подготовке ее к инсеминации.

194

8.2. Влияние цитохрома с на подвижность и фертильность спермиев человека ...

8.2. ВЛИЯНИЕ ЦИТОХРОМА c НА ПОДВИЖНОСТЬ
И ФЕРТИЛЬНОСТЬ СПЕРМИЕВ ЧЕЛОВЕКА, ХРАНИВШИХСЯ
В УСЛОВИЯХ ГИПОТЕРМИИ ПРИ −196 °С

Кратковременного или долгосрочного хранения спермиев для да­
льнейшего использования их в программах «Экстракорпоральное
оплодотворение», «Искусственная инсеминация» и «Донорство»
можно достичь с помощью криоконсервирования или гипотермии
[114, 413]. При олигозооспермии для сохранения семейного гено­
фонда используют криоконсервированную сперму мужа, предва­
рительно накапливая достаточное количество доз для последую­
щей инсеминации. Известно, что для реабилитации гамет после
гипотермии и криоконсервирования применяют различные био­
логические и лекарственные препараты [85, 113]. Об эффектив­
ности восстановления морфофункциональных свойств гамет пос­
ле охлаждения—отогрева судят, как правило, по их кинетической
активности и оплодотворяющей способности.
Изучено влияние стимулятора активности клеток—цитохро­
ма с на подвижность и пенетрационную способность спермиев
после гипотермического и низкотемпературного хранения. Пока­
зано, что при добавлении цитохрома с в концентрации 2,4 ×
х 10^6 мМ подвижность спермиев к 12 ч после гипотермии была
наиболее высокой и превышала показатели контрольных образцов.
Для исследования пенетрационного теста, который опреде­
ляет выживаемость спермиев и их оплодотворяющую способ­
ность, было отобрано 18 супружеских пар с положительным тестконтактом. Цервикальную слизь приводили в соприкосновение
со спермой, хранившейся в гипотермических условиях 1, 2 и 3 сут.
Согласно нашим данным, при добавлении цитохрома с к спермиям, хранившимся в условиях гипотермии в течение суток, их
пенетрационная способность становилась выше, чем в контроле.
В криоконсервированных образцах мы также наблюдали увеличе­
ние кинетической активности спермиев после добавления цито­
хрома с по отношению к контролю.
Установлено, что применять этот препарат более рационально
непосредственно перед использованием спермиев. Цитохром с
позволяет получить высокие показатели кинетической активности
спермиев человека и может быть рекомендован как препарат для
стимуляции фертильности половых клеток человека после гипо­
термического и низкотемпературного хранения. Ранее было пока­
зано, что при гипокинезии, под которой понимали снижение под­
вижности, скорости, фертильности, активность СДГ — признан­

195

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

ного теста на жизнеспособность спермиев — в незрелых и зрелых
спермиях человека составляет соответственно 1,59 ± 0,05 и 1,88 ±
± 0,05 (при нормоспермии активность СДГ в незрелых и зрелых
формах составляет соответственно 2,99 ± 0,07 и 2,3 ± 0,04). После
1 ч гипотермического хранения спермиев (+8 °С) при гипокинезии
активность энзима в незрелых и зрелых формах составила соответ­
ственно 1,04 ± 0,01 и 0,49 ± 0,02, что значительно меньше по срав­
нению с нормоспермией и с данными, полученными сразу после
воздействия гипотермических температур. Дальнейшее снижение
активности СДГ наблюдалось на всех сроках (3—5 ч) гипотерми­
ческого хранения. Следовательно, активность СДГ в патологичес­
ких спермиях значительно снижена по сравнению с нормоспер­
мией. После воздействия цитохрома с в концентрации 2,6 ∙ 10^6 М
активность СДГ повышалась при пато- и нормоспермии, наибо­
лее выраженно при патоспермии. Аналогично, согласно работам
зарубежных авторов, параметры сперматограммы при внутрима­
точном осеменении женщин, мужья которых страдали патоспер­
мией (олигоастеноспермией), были в 1,6—3,5 раза выше в размо­
роженных спермиях, чем эти же параметры для свежезаготовленных [247].
Из приведенных данных следует, что методом гипотермии
можно улучшить качество патологических спермиев, а с помощью
активности СДГ осуществить прогноз. Наиболее четко осветить
механизм благоприятного действия гипотермии на жизнеспособ­
ность спермиев человека, по нашему мнению, возможно с пози­
ции двух разнонаправленных феноменов в клеточной биологии —
апоптоза и криообновления.

8.3. ДИНАМИЧЕСКОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АПОПТОЗА
И КРИООБНОВЛЕНИЯ И СДВИГ ЕГО В СТОРОНУ
КРИООБНОВЛЕНИЯ — ОСНОВА ПОЛУЧЕНИЯ
ЗДОРОВОГО ПОТОМСТВА

В нормальном организме апоптоз — естественный этап в жизне­
деятельности клеток. Он служит одним из компенсаторных про­
цессов, обеспечивающих гомеостаз внутренней среды организма.
При охлаждении и криоконсервировании апоптоз участвует в эли­
минации поврежденных клеток. Как гипо-, так и гиперфункция
апоптоза ведет к нарушению гомеостаза. Противодействовать это­
му можно включением противоположно направленной програм­
мы, т. е. криообновления.

196

8.3. Динамическое взаимодействие апоптоза и криообновления ...

8.3.1. Апоптоз: конденсация хроматина, нарушение ДНК-ядерных
белковых связей, потеря митохондриальными мембранами цитохрома c,
активация каспаз, снижение мембранного потенциала

Как неоднократно упоминалось выше, пусковой механизм апоп­
тоза — конденсация и агрегация хроматина. Потерю оплодотво­
ряющей способности у мужчин связывают с чрезвычайной кон­
денсацией хроматина [364, 365], что влечет за собой нарушение
ДНК-ядерных белковых связей, разрывы нитей ядерной ДНК. В
результате этих процессов ядро подвергается фрагментации, рас­
падается на части. Апоптоз, обусловленный фрагментацией ДНК,
в отличие от мертвых некротических клеток эякулята, элимини­
рующихся из ткани [403], не связан с откликом на воспаление.
Ведущий механизм апоптоза — высвобождение митохондри­
альными мембранами цитохрома с. Вышедший из митохондриаль­
ных мембран цитохром с катализирует в этих клетках процессы
ПОЛ, образование АФК, активацию каспаз 9 и 3 [403]. Окислите­
льный стресс, обусловленный чрезмерной продукцией АФК, по всей
вероятности, участвует в нарушении нормального эмбрионального
развития и получения здорового потомства. По сравнению с нормаль­
ными донорами больные с мужским фактором бесплодия отлича­
лись высоким уровнем экспрессии АФК, ассоциированной с увели­
чением апоптоза, ведущего к повреждению ДНК, насыщением ци­
тохрома с межмембранного пространства, активацией каспазы 9 и 3.
Бесплодные мужчины имели уменьшенную спермальную вариабе­
льность (подвижность, концентрация и морфология), которая отри­
цательно коррелировала с содержанием цитохрома с, каспазой 9 и 3.
Другие исследователи апоптотические повреждения, ведущие к
смерти клеток, связывают с параметрами спермы [310].
Апоптотический уровень спермиев с помощью метки аннексин-V обнаружен в спермальных фракциях как с высокой, так и с
низкой подвижностью, а также в спермиях с нормальной морфо­
логией [309]. В клетках, подвергшихся воздействию индуктора
апоптоза, резко снижается мембранный потенциал митохондрий.
Более высокий уровень цитохрома с у бесплодных пациентов
по сравнению с контролем зарубежные авторы объясняют сниже­
нием трансмембранного потенциала, изменением проницаемости
митохондриальной мембраны, высвобождением цитохрома с, ве­
дущим к повреждению электронного транспорта, что характерно
для многих апоптотических клеток [403]. Падение мембранного
потенциала обусловлено увеличением проницаемости внутренней
мембраны митохондрий в результате образования гигантских пор.

197

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

После раскрытия поры набухает митохондриальный матрикс, раз­
рывается наружная мембрана митохондрий и высвобождаются
растворимые белки, являющиеся индукторами апоптоза, в част­
ности цитохрома с, прокаспазы 2, 3 и 9. Фазовые переходы липи­
дов в мембранах криоконсервированных спермиев могут быть
связаны с потерей стабильности липидного слоя [408]. Это ведет к
уменьшению активности антиоксиданта супероксиддисмутазы
вследствие утечки его из митохондриальных мембран в результате
замораживания—оттаивания [325]. Аналогично этому, заморо­
женная сперма ассоциирована с уменьшением содержания фос­
фолипидов, потерей ФС и фосфодиэтилэтаноламина [251]. Раз­
рыв наружной мембраны митохондрий может быть вызван также
гиперполяризацией внутренней мембраны либо раскрытием в са­
мой наружной мембране гигантского белкового канала, способно­
го пропускать цитохром с и другие белки из межмембранного
пространства [175].

8.3.2. Криообновление: деконденсация хроматина, индукция ГХА, БХШ,
вхождение в митохондриальный матрикс цитохрома c

Как уже указывалось, запуск процессов криообновления у челове­
ка и животных — это деконденсация (разрыхление) хроматина без
нарушения ДНК-ядерных связей. Недавно деконденсация хрома­
тина выявлена в охлажденных спермиях человека [85]. Зарубеж­
ные авторы показали положительную корреляцию между декон­
денсацией хроматина в спермиях человека и животных (свиней) и
их оплодотворяющей способностью [265]. Деконденсация хрома­
тина ведет к экспрессии ГХА и индукции БХШ.
Зарубежными авторами выявлены БХШ Р14 и Р20 кДа, предо­
храняющие мембраны в спермиях баранов от повреждения [258].
Защитный эффект, по мнению авторов, обусловлен их декапацитационной ролью. Другие авторы предполагают механизмы ген­
ной регуляции адаптированных к холоду рыб T. bernacchii [262].
Описан эффект экспрессии гена Вах и антиапоптотических бел­
ков Bcl-2 в сперматогенных стволовых клетках и их локализация
на внутренней митохондриальной мембране [327, 386].
Ведущий механизм криообновления — генетически детерми­
нированное, благоприятное стимулирующее действие цитохро­
ма с: низкие температуры регулируют гены, под контролем кото­
рых находятся цитохром с и НАД · Н, участвующий в его тран­
спортной функции через наружную митохондриальную мембрану
[384]. Цитохром с, попадая в митохондриальный матрикс, блоки­

198

8.3. Динамическое взаимодействие апоптоза и криообновления ...

рует процессы активации каспаз и уменьшает реакции апоптоза,
направленные на уничтожение клеток.
Важная роль в осуществлении процессов криообновления
принадлежит антиоксидантам. Последние подавляют апоптоз,
предупреждают повреждение ДНК и улучшают качество спермы
(см. с. 189).
Технологии, базирующиеся на основе концепции криообнов­
ления, способны перевести организм человека и животных на бо­
лее высокий уровень гомеостаза. В Институте проблем криобио­
логии и криомедицины НАН Украины установлено, что при хра­
нении криоконсервированной спермы петухов в течение полугода
и 9 лет оплодотворяемость яиц увеличилась соответственно на 6 и
3 % [124]. Выводимость яиц также повысилась на 8 и 10 % и прак­
тически равнялась значениям, полученным при осеменении све­
жей спермой. Аналогично этому, охлаждение (4 °С) и эквилибра­
ция спермы карпа с охлажденным криопротектором (10%-м ДМСО)
значительно изменяет скорость течения эмбриогенеза [202]. Вы­
лупление личинок происходит на 2,3 ч раньше, чем в контроле.
Согласно данным российских ученых, жизнеспособность раз­
мороженных спермиев сибирского осетра и карпа составила
10—40 % в отличие от свежезаготовленных (90—100 %) [173, 174].
Однако при осеменении икры размороженными спермиями зна­
чительно увеличились процент выклева личинок икры и их сред­
няя масса. Молодь осетров и карпа отличалась большей средней
массой тела и более высоким уровнем гематологических, биохи­
мических и иммунологических параметров. У потомства (крысят),
полученного после криоконсервирования эмбрионов гипертен­
зивных крыс и трансплантации этих эмбрионов нормотензивным
реципиентам, артериальное давление было существенно ниже,
чем у крыс исходной гипертензивной популяции [13, 239]. При­
чем этот эффект повторился в следующем поколении. Данные,
полученные в Университете им. Гумбольда (Германия), свидетель­
ствуют о том, что при использовании спермы генофондных пету­
хов оплодотворяемость составила 87,5—97,2 % [372]. По этим пока­
зателям криоконсервированная сперма не только не уступала, но
даже несколько превосходила свежую сперму петухов тех же гено­
типических линий. Считают, что криоконсервирование оплодотво­
ренных яйцеклеток человека полезно для повышения частоты ве­
роятности беременности in vitro и пересадки зародышей [378].
Трансплантация клеток и тканей на сегодня — один из альтер­
нативных методов лечения патологий, связанных с нарушением
функционирования различных систем организма. Проведено ис­

199

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

следование морфологических и функциональных характеристик
ксенотрансплантатов нативных и криоконсервированных органо­
типических культур семенников новорожденных поросят [164].
На препаратах нативных культур семенников наблюдается масси­
рованная воспалительная инфильтрация, особенно на границе
трансплантата и почечной паренхимы. В центре фрагментов фик­
сируются некроз и замещение тестикулярной ткани соединитель­
нотканными элементами, которые характерны для органотипи­
ческой культуры. Ксенотрансплантаты криоконсервированной и
рекультивированной органотипической культуры семенников но­
ворожденных поросят практически не были инфильтрованы лей­
коцитами, сохранялись элементы интерстициальной ткани. Наб­
людались обширные зоны замещения соединительной тканью. На
29—30-е сутки нативный трансплантат находился в стадии про­
дуктивного воспаления, которое в конечном итоге завершилось
формированием рубца и снижением уровня гормона в связи с дес­
трукцией гормонпродуцирующих элементов.
Нарушение продукции половых гормонов, изменение прооксидантно-антиоксидантного равновесия в организме развиваются
после перенесенных воспалительных заболеваний половых орга­
нов. Кроме того, воздействие неблагоприятных факторов окру­
жающей среды или производства отрицательно влияет на сперма­
тогенез [67] в результате активации программированной гибели
клетки. Это сопровождается уменьшением подвижности и опло­
дотворяющей способности спермиев человека. Положительное
влияние трансплантации криоконсервированной плацентарной
ткани на сперматогенез у мужчин с олигоастенозооспермией
обусловлено содержанием в ней цитокинов и антиоксидантов, ак­
тивирующих процессы программированной жизни клетки.
Эффективность рассмотренных технологий, по всей вероят­
ности, обусловлена тем, что спермин — легко активируемые поло­
вые клетки. Активаторами могут служить физические (низкие
температуры, ПМП, УЗ) и химические (яичный желток, кофеин,
пентоксифиллин, цитохром с, сыворотка кордовой крови, фолли­
кулярная жидкость и др.) факторы. Ранее нами было высказано
предположение о том, что ПМП снижает дегидратационную спо­
собность клеток, в частности эритроцитов и лейкоцитов, вызван­
ную действием низких температур [152]. Таким образом, он пре­
пятствует конформационным изменениям белковых макромоле­
кул. Это способствует сохранению каталитических свойств фер­
ментов и реакционно способных SH-rpyππ. Другой физический
фактор — УЗ также оказывает стимулирующее влияние на показа­

200

8.3. Динамическое взаимодействие апоптоза и криообновления ...

тели жизнеспособности спермиев животных [35] и человека [113].
Увеличение подвижности криоконсервированных спермиев чело­
века, очевидно, связано с возникновением акустических микро­
потоков, которые вызывают перемещение частиц вещества из
слоев жидкости на границе раздела фаз. Это ведет к активации
энергетических процессов и изменению характера скоростей дви­
жения спермиев человека и животных.
Аналогично физическим стимуляторам обменных процессов,
на спермин влияют химические агенты. После сверхбыстрого за­
мораживания-оттаивания спермиев человека добавление произ­
водных метилксантина увеличивает их подвижность и способ­
ствует оплодотворяющей способности гамет [118]. Предваритель­
ная обработка препаратом яичного желтка модифицирует липид­
ный состав мембран криоконсервированных спермиев и повы­
шает в них содержание холестерина и лицетина [156, 157].
В последние годы в животноводстве и медицине возрос интерес
к использованию для этих целей цитохрома с. По нашим наблюде­
ниям, после 2—3-суточного гипотермического хранения спермиев
человека с цитохромом с жизнеспособность в незрелых и зрелых
формах повысилась соответственно на 30 и 32 %. Один из механиз­
мов стимулирующего действия цитохрома с мы связываем с его
способностью к «цитохромному эффекту», т. е. к восстановлению
сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования. Спо­
собность криоконсервированных спермиев к повышению жизне­
способности обусловлена генетически: частота количественных
хромосомных аномалий в криоконсервированных спермиях досто­
верно ниже (3 %), чем в контроле (5,2 %) [336]. Параметры сперматограммы при внутриматочном осеменении женщин, мужья кото­
рых страдали патоспермией (олигоастеноспермией), были в
1,5—1,6 раза выше в размороженных спермиях, чем эти же пара­
метры в свежезаготовленных [347]. Частота беременностей в расче­
те на один цикл составила 5,8—12,3 % (против 4,1 % в контроле).
Полагают, что более высокая частота беременности при использо­
вании эмбрионов, полученных из криоконсервированных донор­
ских ооцитов, связана с их высоким качеством и большей рецептивностью эндометрия в циклах переноса эмбрионов [282].
Считают, что холодовое воздействие в ранние сроки беремен­
ности положительно влияет на репродуктивную функцию, рост и
развитие потомства животных (крысят) после рождения [139]. По
нашим наблюдениям, у новорожденных, полученных после опло­
дотворения ооцитов размороженными спермиями, обогащенны­
ми цитохромом с, отсутствовали признаки асфиксии, гемолити­

201

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия

ческой желтухи и статуса недоношенности, что нередко имеет
место при использовании традиционных методов.
Недавно установлено, что процесс криоконсервирования спермиев человека приводит к деконденсации ядерного хроматина
[85]. Степень деконденсации хроматина хорошо коррелирует с по­
вышением жизнеспособности спермиев человека [266]. Потеря
оплодотворяющей способности у мужчин связана, по-видимому, с
чрезвычайной конденсацией хроматина, хотя их спермин облада­
ли достаточной резистентностью (высокой подвижностью) [364].
С целью прогнозирования положительного действия низких
температур и криоконсервирования на оплодотворяющую способ­
ность спермиев человека и судьбу будущего поколения необходи­
мо иметь информацию о маркерных реакциях раннего апоптоза.
Это позволит своевременно осуществить запуск противоположно
направленной программы — криообновления и, таким образом,
сместить динамическое взаимодействие апоптоза и криообновле­
ния в сторону криообновления. Наиболее перспективно в этом
направлении использование фетоплацентарных тканей. Согласно
данным, полученным в ИПКиК НАН Украины, трансплантация
криоконсервированной фетотестикулярной ткани человека сти­
мулирует сперматогенную функцию яичек у лиц с номогонадотропной олигозооспермией Π—III степени [65].

8.3.3. Маркеры раннего апоптоза спермиев человека
требуют включения программы криообновления
Современные проблемы гипотермического хранения спермиев че­
ловека с целью лечения бесплодия теснейшим образом связаны с
изучением двух важнейших разнонаправленных феноменов в кле­
точной биологии — апоптоза и криообновления. Активация апоп­
тоза в сперматогенезе может приводить к потере оплодотворяю­
щей способности.
Разработка методов эффективного гипотермического хране­
ния спермиев предусматривает использование маркеров раннего
апоптоза. Один из них — определение активности ФС с помощью
аннексин-У-связывания и хемилюминесценции. Признаки ран­
него апоптоза регистрируются в том случае, когда фосфолипид
переходит из внутреннего монослоя плазматической мембраны в
ее наружный монослой. Аннексин-V-связывание обнаружено во
фракциях с высокой и низкой спермальной подвижностью до и
после замораживания. Очищенная высокоподвижная популяция
спермиев характеризуется значительно высокой индукцией мем­

202

8.3. Динамическое взаимодействие апоптоза и криообновления ...

бранных ФС (de novo) [341]. В течение раннего апоптоза клетка
меняет свою мембранную асимметрию [336, 348]. ФС, в норме
присутствующий на внутренней цитоплазматической мембране
здоровых клеток, передвигается на внешнюю мембрану. При этом
молекула фосфолипида претерпевает структурные изменения. Эти
данные наглядно демонстрируют динамическое взаимодействие
апоптоза и криообновления и экспериментальными данными
подтверждают наши ранние представления о низкотемпературной
селекции как факторе отбора и благоприятной изменчивости.
Именно такая трактовка селекции лежит в основе программиро­
ванной жизни клетки.
Маркером раннего апоптоза, как уже указывалось, служит
уменьшение мембранного потенциала, что ведет к повышению
проницаемости митохондриальной мембраны с последующим выс­
вобождением цитохрома с. Вышедший из митохондрий цитохром с
индуцирует процессы апоптоза в охлажденных спермиях, что мо­
жет привести к потере их оплодотворяющей способности. Введение
цитохрома с в спермин, подвергшиеся гипотермическому хране­
нию, предполагает запуск программированной жизни клетки.
Таким образом, маркеры раннего апоптоза и криообновления
могут служить прогностическим тестом для разработки тактики
успешного лечения мужского бесплодия с использованием гипо­
термических температур. Выявление раннего апоптоза позволит
своевременно включить программу криообновления, вызвав эк­
спрессию ГХА и БХШ. Введение цитохрома с и других антиокси­
дантов (α-токоферола, холинхлорида), а также антиапоптотичес­
ких белков, активирующих программу обновления и криообнов­
ления, уменьшит развитие апоптотических процессов в охлажден­
ных спермиях человека. Это позволит сместить динамическое
взаимодействие двух разнонаправленных процессов — апоптоза и
криообновления в сторону криообновления, что обеспечит ус­
пешное лечение мужского бесплодия.

ГЛАВА 9

Апоптоз и криообновление
как основа эффективного
лечения онкологических заболеваний

В последние годы во всем мире возросла заболевае­
мость и смертность, связанная с воздействием физико-химичес­
ких факторов. Ежегодно у 90—93 тыс. человек выявляют онколо­
гические заболевания, что в конечном итоге приводит к прежде­
временному старению организма и смертности. В результате ава­
рии на Чернобыльской АЭС за период с 1989 по 2004 г. в Украине
прооперировано 3400 молодых людей, страдающих раком щито­
видной железы, которые в 1986 г. были детьми или подростками.
Поэтому особенно актуально изыскание новых способов и лекар­
ственных средств в борьбе с онкологическими заболеваниями.
Еще в 1975—1977 гг. мы провели исследования стернальных
пунктатов костного мозга больных раком молочной железы II—III
степени, у которых в процессе химио- и лучевой терапии имели
место нарушения гемопоэза [136, 151]. В процессе лечения наряду
с гемостимулирующей терапией больным трансплантировали
криоконсервированный аллогенный костный мозг. Установлено,
что в процессе химио- и лучевой терапии при наличии в перифе­
рической крови признаков гипоплазии гемопоэза значительно
снижаются активность ЦХО, содержание SH-rpyππ и фосфолипи­
дов. Это свидетельствует о нарушении обменных процессов в
клетках костного мозга больных. Повторные взятия стернальных
пунктатов проводились на 21-е сутки после трансплантации крио­
консервированного костного мозга. Установлено значительное
увеличение активности ЦХО, содержания SH-групп и ФЛ по
сравнению с их содержанием в клетках костного мозга в период
выраженной гипоплазии гемопоэза, что существенно повысило
качество жизни онкологических больных.
Возможной причиной наблюдаемого явления может быть вы­
ход из митохондриального матрикса цитохрома с с последующей
активацией апоптотических реакций. По нашим наблюдениям,

204

Глава 9. Апоптоз и криообновление как основа эффективного лечения...

хранение размороженных клеток донорского и посмертного кост­
ного мозга без добавления цитохрома с приводит к быстрой их ги­
бели [136, 151]. При включении в консервирующий раствор цито­
хрома с наблюдалась лучшая морфологическая и функциональ­
ная сохранность размороженных миелоидных клеток. Российские
ученые дали теоретическое обоснование лечебного действия ци­
тохрома с, которое основано на его способности проникать в клет­
ки и взаимодействовать с митохондриальными мембранами. Это
послужило широкому использованию цитохрома с в медицинской
практике. С 1984 г. препарат разрешен к применению бывшим М3
СССР.
Какова роль цитохрома с в лечении онкологических заболева­
ний?
Еще в 1926 г. О. Warburg экспериментально доказал наличие в
опухолевой клетке извращенного процесса биологического окис­
ления. Одной из особенностей раковой клетки, по мнению автора,
является наличие в ней неполноценного энергетического обмена,
в результате чего нормальные клетки перерождаются в опухоле­
вые. Российские ученые предположили, что в организме живот­
ных, пораженных опухолевой болезнью, имеет место дефицит ци­
тохромов [134, 211]. Поэтому введение цитохрома с животным —
носителям опухоли может в той или иной степени восполнить его
дефицит и, таким образом, нормализовать биоэнергетические
процессы, что, в свою очередь, окажет тормозящее влияние на
рост опухоли. Эти предположения подтверждены эксперименталь­
но. Гибель всех нелеченных животных произошла до 25-х суток. У
леченных к 54-м суткам погибли 38 животных, 10 остались жить. У
некоторых из них опухоль полностью рассосалась. Одновременно
отмечено повышение митохондриями печени скорости поглоще­
ния кислорода — 83,3 % (без лечения — 63—53 %) и фосфорили­
рования 68,5 % (без лечения — 43,2 %).
Эти же авторы изучили действие цитохрома с, каталазы и ури­
динтрифосфата на рост перевиваемых опухолей (крысиных сар­
ком) [133]. При введении цитохрома с торможение роста саркомы
к 18-м суткам составило 38 %, уридинтрифосфата и галактозы —
соответственно 29 и 26 %. Следовательно, введение цитохрома с
животным — носителям опухоли тормозит ее рост и предотвра­
щает в митохондриях печени снижение интенсивности биоэнерге­
тических процессов. Именно этим авторы объясняют благоприят­
ное действие цитохрома с на течение опухолевой болезни.
Современные проблемы эффективного лечения онкологичес­
ких заболеваний теснейшим образом связаны с изучением двух

205

Глава 9. Апоптоз и криообновление как основа эффективного лечения...

важнейших разнонаправленных феноменов в клеточной биоло­
гии — апоптоза и криообновления.
Недавно зарубежные ученые раскрыли некоторые механизмы
программированной гибели клетки. Они показали, что под воз­
действием неблагоприятных факторов среды в ядрах клеток уп­
лотняются нити хроматина, на которых расположены гены. Гены
становятся неактивными, мертвыми. Контролировать жизненно
важные процессы в клетках они уже не могут. Из поврежденных
митохондрий выходит цитохром с, который запускает программу
гибели клетки: катализирует каспазы, процессы ПОЛ, образова­
ние свободных радикалов, АФК, ведущих к повреждению клеток
и организма в целом. Активированные процессы апоптоза инду­
цируют злокачественные новообразования [292].
Можно ли остановить ничем не уравновешенный запуск апоп­
тоза и, таким образом, притормозить либо подавить рост онколо­
гических заболеваний?
Ученые Института проблем криобиологии и криомедицины
НАН Украины академик В.И. Грищенко и ст. науч, сотр., канд.
биол. наук Э.И. Алексеевская предлагают свое видение этой проб­
лемы в свете доказательной медицины. Термин «медицина, кото­
рая базируется на доказательствах» был предложен в 1990 г. канад­
скими учеными. В настоящее время во всем мире доказательная
медицина уже сформировалась как самостоятельная область ме­
дицинских знаний и является общепризнанной. Руководствуясь
принципами доказательной медицины, на протяжении последних
25 лет авторы работают над изучением механизмов обновления и
криообновления, что наиболее полно отражено в работе [70]. У
истоков этого направления стояли д-р мед. наук, проф. Е.Я. Пан­
ков, д-р биол. наук В.Д. Мануильский и чл.-кор. АН УССР
А.М. Утевский. Своими работами они проложили путь к дальней­
шему завершению поистине величайшего открытия современнос­
ти — криообновления.
Примечательно, что концепция криообновления, базирую­
щаяся на действии низких температур, оказалась универсальной.
Недавно зарубежные ученые открыли ГХА [268], которые при дей­
ствии низких температур индуцируют БХШ, повышающие устой­
чивость организма к холоду [267, 320]. Обнаружены антиапоптотические гены и индуцируемые ими антиапоптотические белки,
подавляющие апоптоз [409]. Согласно нашим данным, антиапоп­
тотические гены и индуцируемые ими антиапоптотические белки
служат ведущими механизмами программированной жизни клет­

206

Глава 9. Апоптоз и криообновление как основа эффективного лечения ...

ки и существенно усиливают реакции криообновления. Таким об­
разом, феномен криообновления представляет собой общебиоло­
гическое явление.
Руководствуясь принципами доказательной медицины, можно
заключить, что развитие онкологических заболеваний обусловле­
но активацией апоптотических процессов. Реакции апоптоза за­
пускают выход цитохрома с из митохондриального матрикса.
Цитохром с, вышедший из митохондрий, как уже указывалось,
способствует активации каспаз и процессов ПОЛ, образованию
свободных радикалов и АФК, повреждающих клетки и организм в
целом. Лечение цитохромом с обусловлено вхождением его в те
места электронно-транспортной цепи митохондрий, которые ра­
нее занимал эндогенный цитохром с. Попадая в митохондриа­
льный матрикс, он блокирует активацию каспаз, выход проапоптотических белков из клетки. В результате динамическое взаимо­
действие апоптоза, обновления и криообновления сдвигается в
сторону обновления и криообновления. Эти процессы обеспечи­
вают высокую терапевтическую эффективность цитохрома с при
лечении онкологических заболеваний.
В последние годы сравнительно хорошо изученным механиз­
мом подавления апоптоза, индуцированного физико-химически­
ми воздействиями, является повышение экспрессии ростовых
факторов и рецепторов к ним, возникающей в опухолевых клетках
вследствие активации онкогенов, что имеет место при хроническом
миелолейкозе. При активации онкогена в результате транслока­
ции образуется химерный ген bcr-abl, продуктом которого являет­
ся измененный онкобелок, обладающий повышенной тирозинки­
назной активностью и служащий важным звеном в передаче сиг­
налов, блокирующих апоптоз клетки [212]. Другой механизм нару­
шения апоптоза в опухолевых клетках — мутация в генах Ьсг-2,
контролирующих программированную клеточную гибель. Онко­
генная трансформация клетки часто сопровождается мутацией ге­
на р53, превращающей его из индуктора в ингибитор апоптоза.
Исследования последних лет показали, что патогенез многих
заболеваний человека, в том числе онкологических, аутоиммун­
ных, а также вирусных инфекций связан с неспособностью клеток
подвергаться апоптозу [40, 213, 214]. Снижение способности к
апоптозу опухолевых клеток играет большую роль в развитии мно­
гих опухолей. Поэтому очень важно изготовление лекарственных
средств, вызывающих апоптоз в лейкемических клетках человека
посредством высвобождения цитохрома с и активации каспаз 9, 3
и 2 [414].

207

Глава 9. Апоптоз и криообновление как основа эффективного лечения ...

Особый интерес для понимания трансформации функций
апоптоза при развитии опухолевого процесса представляет промиелоцитарная острая лейкемия. В ходе экспериментов установ­
лено, что при образовании опухоли происходит слияние PML-reна (хромосома 15) с рецепторами ретиновой кислоты (хромосома
17), в результате образуется химерный ген PML-RARA, являющий­
ся маркером заболевания. Предполагают, что избирательная чув­
ствительность опухолевых клеток промиелоцитарного острого
лейкоза связана с активацией гена р53 в этих клетках. Исследова­
на роль белков Bcl-2 и Вах в моноцитоиндуцированном апопто­
зе в человеческой лейкемической линии [326]. Сделано заключе­
ние, что в человеческой лейкемической клеточной линии имеется
связь между двумя экспрессирующими белками Bcl-2, Вах и
апоптозом.
При действии различных неблагоприятных факторов среды
антиапоптотические белки тормозят выход цитохрома с из мито­
хондриального матрикса либо уничтожают вышедший и, таким
образом, препятствуют развитию апоптоза, который ведет к воз­
никновению злокачественных новообразований [284]. Антиокси­
данты, цитокины и другие вещества также подавляют апоптоз и
тем самым препятствуют дальнейшему развитию онкологических
заболеваний [369].
В последние годы все большее внимание ученых привлекают
рекомбинантные цитокины (интерфероны, интерлейкины ИЛ).
Цитокин рекомбинантный — рИЛ-2 используют в качестве про­
тивоопухолевого агента. Как ключевой иммунорегулятор он обес­
печивает адаптивный иммунитет, влияя на дифференцировку и
активацию Т- и В-лимфоцитов, макрофагов, а также способствует
элиминации патогенных микроорганизмов и инфицированных
клеток. Комплексное применение флударабинсодержащих режи­
мов химиотерапии и рИЛ-2 позволило значительно улучшить ре­
зультаты терапии и повысить качество жизни больных хроничес­
кими лимфопролиферативными заболеваниями [57]. Аналогично,
проведение иммунохимиотерапии и рИЛ-2 больным острыми
миелобластными лейкемиями сопровождалось нормализацией
субпопуляционного состава Т-лимфоцитов и усилением фагоци­
тарной реакции [79]. Получены положительные результаты ис­
пользования α-интерферона и рекомбинантного эритропоэтина
(рЭПО), обладающих высокой противоопухолевой активностью,
для лечения больных с опухолевыми заболеваниями системы кро­
ветворения [80, 137]. Известно, что при множественной миеломе
часть миеломных клеток имеют на своей мембране гликопротеин,

208

Глава 9. Апоптоз и криообновление как основа эффективного лечения...

являющийся продуктом гена MDR-1, который получил название
Р-гликопротеин (р-170) [363]. Он препятствует входу цитостати­
ческих препаратов в клетку и способствует выбросу из миелоид­
ных клеток многих попавших в нее химиопрепаратов. Кроме того,
множественная лекарственная резистентность обусловлена также
повышенной экспрессией гена bcl-2, ингибирующего апоптоз
опухолевых клеток [301, 376, 393].
Новый нецитотоксический препарат талидомид, синтезиро­
ванный в Германии еще в 1957 г., является эффективным сред­
ством терапии множественной миеломы как при первичной реф­
рактерности, так и при рецидивах заболевания [81]. Препарат бло­
кирует ангиогенез в опухоли, обладает иммуномоделирующими
свойствами, вызывает супрессию а-ФНО [394] и коррекцию ба­
ланса интерлейкинов. Талидомид также способствует росту сти­
мулированных анти-CDЗT-лимфоцитов, которые могут повышать
уровень цитокинов (α-интерферона или ИЛ-12) и киллерных лим­
фоцитов, ингибирующих рост миеломных клеток [277].
В настоящее время в онкологии большое внимание уделяется
поискам возможностей создания противоопухолевых вакцин, ко­
торые наряду с использованием традиционных противоопухолевых
методов могли бы улучшить результаты лечения онкологических
больных. В сравнительном аспекте изучено противоопухолевое
действие гликопептидной вакцины и полученной из заморожен­
ных опухолей («криовакцины») [116]. Результаты исследования
противоопухолевого действия гликопептидных и модифициро­
ванных низкими температурами вакцин указывают на более выра­
женный эффект с использованием «криовакцины». Мы считаем,
что криобиологические технологии включили механизмы криооб­
новления, направленные на подавление апоптотических реакций,
возникающих в опухолевых клетках.
Одной из наиболее важных проблем химиотерапии при лече­
нии злокачественных новообразований является природная и
приобретенная резистентность к химиопрепаратам. Формирова­
ние лекарственной резистентности обусловлено уменьшением
чувствительности опухолевых клеток к действию препаратов. Этот
феномен связан с блокированием функций проапоптотических
белков и усилением функциональной активности антиапоптотических белков. Ключевая роль в индукции сигнальных каскадов,
обусловленных внутриклеточными и внеклеточными веществами,
отводится киназам суперсемейства митогенактивированных про­
теинкиназ (МАРК) и протеинкиназе В (PKB/Akt). Известно, что
активация этих сигнальных каскадов обусловливает чувствите­

209

Глава 9. Апоптоз и криообновление как основа эффективного лечения...

льность либо резистентность клеток к действию противоопухоле­
вых препаратов, в частности цисплатина, этопозида, таксола, це­
рамида, винбластина, в то время как роль, например, протеинки­
назы D (RKD) при развитии резистентности к химиопрепаратам
не выяснена. На сегодня молекулярные механизмы, лежащие в ос­
нове индукции апоптоза химиопрепаратами, и формирование ре­
зистентности при онкогематологических заболеваниях изучены
недостаточно.
Поэтому представляют интерес полученные авторами данные,
касающиеся установления доминантных сигнальных каскадов,
которые определяют чувствительность клеток к действию доксо­
рубицина [235]. Это поможет объяснить потерю опухолевыми
клетками чувствительности к действию химиопрепарата и разви­
тию ими резистентности к апоптотическому сигналу. Результаты
исследований показали, что активация JNK и р38 МАРК-сигналь­
ных каскадов, с одной стороны, обусловливает чувствительность
опухолевых клеток к действию доксорубицина, тогда как с дру­
гой — доля этих клеток не зависит от ERK- и RKD-сигнального
каскада. Баланс между Akt/RKB и МАРК-сигнальными каскада­
ми — важный фактор при выборе пути, который будет определять
резистентность либо чувствительность клеточных линий после их
взаимодействия с доксорубицином.
Среди рецепторов, регулирующих судьбу гемопоэтических
клеток, наряду с рецепторами ростовых факторов и цитокинов, а
также антигенузнаваемых рецепторов Е- и В-клеток важное мес­
то занимают рецепторы нового семейства CD 150. Установлено,
что CD 150-рецептор понижает экспрессию проапоптотических
генов и существенно повышает экспрессию генов, контролирую­
щих выживание клеток [185]. С позиции концепции обновления
и криообновления CD 150-рецептор может принимать участие в
патогенезе СО150+-лейкозов и лимфом благодаря активации сиг­
нальных путей, способствующих пролиферации и подавлению
апоптоза.
Недавно установлено, что значительное число генов, контро­
лирующих апоптоз, расположено на 17-й хромосоме, имеющей ге­
ны топоизомеразы II. Поэтому расширились исследования по
выяснению роли топоизомераз и их ингибиторов в многоэтапном
процессе программированной клеточной гибели [302]. Зарубеж­
ные ученые показали взаимосвязь топологических преобразова­
ний ссДНК с изменением многочисленных функций высокоорга­
низованных организмов. Основным элементом топологии ДНК
является ее суперспирализация [400, 402]. Контроль за внутрикле­

210

Глава 9. Апоптоз и криообновление как основа эффективного лечения ...

точной суперспирализацией ДНК осуществляет особая высоко­
специализированная группа ферментов под общим названием
топоизомеразы [407]. Они необходимы для правильного функ­
ционирования ДНК-носителя генной информации и участвуют в
процессах индуцированной гибели клетки. Топоизомеразы игра­
ют существенную роль в структурной организации хромосом и
их преобразованиях: конденсации—деконденсации и сегрегации
[353, 391].
В 60-е годы XX в. было обнаружено, что ингибиторы топоизо­
мераз I и II можно применять в качестве лечебных онкопрепара­
тов [356]. Перспективность их применения связана с тем, что ко­
личественное содержание топоизомераз в опухолевых и здоровых
клетках человека различно. Некоторые особенности топоизомераз
подробно рассмотрены в обзоре [29]. Представлены структурные
формулы основных ингибиторов топоизомераз, в том числе их ле­
карственных форм, используемых при лечении онкопатологий
широкого профиля.
Важное значение в коррекции лечения онкологических забо­
леваний имеют иммуноцитохимические методы, которые позво­
ляют диагностировать ряд форм хронических лимфолейкозов и
неходжкинских злокачественных лимфом в фазе лейкемизации,
сопровождающейся очагово-диффузной инфильтрацией костного
мозга патологическими клетками [46]. На основе специально
отобранных маркерных признаков очаги инфильтрации клетками
лимфом в костном мозге могут выявляться на ранних стадиях про­
цесса лейкемизации.
В последние годы для лечения онкологических заболеваний
хорошие результаты получены при использовании криоконсервированных клеток пуповинной крови как богатого источника ство­
ловых клеток [97]. В лечебных целях применяют как цельную кор­
довую кровь, так и ее отдельные компоненты [1]. Эритроциты
кордовой крови имеют ряд структурно-функциональных особен­
ностей, которые позволяют использовать их в клинической прак­
тике, что связано с высоким содержанием в кордовой крови фе­
тального гемоглобина (HbF), характеризующегося повышенным
сродством к кислороду [357]. Это свойство эритроцитов кордовой
крови, которое способствует нормализации газообмена в тканях,
может быть использовано для трансфузии пациентам с различны­
ми легочными патологиями, гипоксическими состояниями [1].
Эритроциты кордовой крови играют неоценимую роль в повыше­
нии качества криобиологических технологий. В последние годы,
как уже указывалось, все большее признание получает криокон­

211

Глава 9. Апоптоз и криообновление как основа эффективного лечения...

сервированный лейкоконцентрат кордовой крови человека для
лечения онкологических больных и больных с различными фор­
мами анемии.
Терапевтический эффект клеток кордовой крови значительно
выше по сравнению с аналогичным, полученным от компонентов
донорской крови в подобной ситуации. Интерферон, γ-глобулин,
присутствующие в плазме размороженных клеток пуповинной
крови, являясь ингибиторами апоптоза, в значительной степени
повышают их лечебную ценность.
Таким образом, эффективность лечения онкологических бо­
льных обусловлена взаимодействием апоптоза и криообновления.
Эти два разнонаправленных процесса служат теоретической осно­
вой для изготовления лекарственных онкопрепаратов. Неоцени­
мую роль в эффективности лечения онкологических заболеваний
играет цитохром с. С одной стороны, он обладает способностью
запускать апоптоз для уничтожения опухолевых клеток, в которых
он подавлен, с другой — запускать программу криообновления,
тормозящую развитие онкологических заболеваний. Важное зна­
чение имеют онкопрепараты, изготовленные на основе антиапоп­
тотических белков, цитокинов и антиоксидантов, подавляющих
апоптоз, а также лекарственные средства, блокирующие топоизо­
меразы.

ГЛАВА 10

Апоптоз и криообновление
как основа эффективного
использования низких температур
для повышения урожайности
растениеводческих культур

Проблема изучения холодоустойчивости и повышения
продуктивности растениеводческих культур стоит перед учеными
давно. Еще в конце XIX в., как упоминалось выше, были открыты
способности представителей разных видов растений переносить
снижение температуры ниже -150 °С: семенных растений — 1987 г.,
папоротниковых — 1930 г., водорослей — 1936 г. В последние годы
открыт феномен увеличения жизнеспособности различных расте­
ниеводческих и плодовых культур, семян и пыльцы, хранившихся в
условиях сверхнизких (-183 °С) [32] температур.
Каковы причины выживаемости представителей флоры при
столь низких температурах? Повышение жизнеспособности ох­
лажденных растений объясняли селекцией (отбором) наиболее ус­
тойчивых форм. Их модификацию считали обратимой и связыва­
ли с осуществлением репаративных процессов. Вместе с тем дан­
ные, полученные нами в период формирования криобиологии как
науки (60—70-е годы прошлого века), не укладывались в обще­
принятые представления о сохранении либо повреждении криоконсервированных биологических объектов. Скорее они указыва­
ли на качественно новое их состояние.
Теоретическое обоснование эффективного использования низ­
ких температур для повышения урожайности растений базируется
на новых явлениях в клеточной биологии — апоптоза и криооб­
новления.
Изменения морфологии клеток растений, подвергшихся прог­
раммированной гибели, сходны с таковыми при апоптозе у живот­
ных. Также наблюдается конденсация и дробление ядра на фраг­
менты, съеживание протопласта и складчатость цитоплазматичес­
кой мембраны. В клетку устремляется поток Ca2+. В наружном мо­
нослое плазматической мембраны появляется ФС. Происходит

213

Глава 10. Апоптоз и криообновление как основа эффективного использования ...

олигонуклеосомная фрагментация ядерной ДНК. Наблюдается
разрыв плазмодесм — мембранных каналов, соединяющих про­
топласты соседних клеток, чтобы инфекция не распространялась
из зараженной клетки в соседние. Благодаря плазмодесмам обра­
зуется единая внутриклеточная система — симпласт. При этом
клеточные стенки и межклеточный матрикс образуют единую
внеклеточную систему — апопласт. Сжатие протопласта приводит
к отделению его от клеточной стенки. В конечном итоге прото­
пласт дробится на отдельные везикулы, аналогичные апоптозным
тельцам. Апоптозные везикулы, образующиеся при дроблении
протопласта, у растений, в отличие от животных, выявляются не
всегда. У животных апоптозные везикулы in vivo поглощаются со­
седними или специализированными клетками. У растений таких
специализированных клеток нет, поэтому у них нет особой необ­
ходимости в образовании апоптозных везикул, поскольку отсут­
ствуют специализированные клетки-фагоциты. Кроме того, фаго­
цитозу препятствует наличие клеточной стенки. Апоптозные вези­
кулы у растений в дальнейшем разрушаются. Такая деградация
может стимулироваться ферментами, секретируемыми соседними
клетками, что отмечается, например, при отмирании листьев.
Итоговая картина апоптоза в значительной мере зависит от вида
тканей. Вместо самоуничтожения на основе погибших клеток час­
то создаются конструкции, жизненно важные для растений.
Ключевая роль в инициации определенных видов апоптоза
принадлежит митохондриям: как и у животных, индуцированный
выход из митохондрий цитохрома с и других белковых факторов
«запускает» апоптоз в растительных клетках [381]. Например, об­
работка протопластов табака менадионом ведет к выходу из мито­
хондрий цитохрома с [176].
Следует отметить, что определенная часть повреждений при
действии низких температур обусловлена влиянием АФК, обра­
зующихся во время низкотемпературного воздействия как резуль­
тат активации процессов ПОЛ, вызывающих повреждение мем­
бран и фотосистем. Как правило, АФК служат триггерными моле­
кулами апоптоза у растений, а антиоксиданты подавляют его.
Проапоптотические белки семейства Вах индуцируют процессы
апоптоза в растительных клетках. Напротив, антиапоптозные бел­
ки семейства Bcl-2 придают растению устойчивость к неблаго­
приятным факторам среды [175,176].

214

10.1. Конденсация — деконденсация хроматина — важный способ регуляции ...

10.1. КОНДЕНСАЦИЯ-ДЕКОНДЕНСАЦИЯ ХРОМАТИНА —
ВАЖНЫЙ СПОСОБ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОГО ГЕНОМА

Известно, что процессы конденсации—деконденсации хроматина
являются важным способом регуляции клеточного генома. Терми­
ном «конденсация—деконденсация» обозначают характер измене­
ния плотности расположения нитей ДНК, ведущих к репрес­
сии-депрессии генов [87]. Конденсированный хроматин лишает
гены функциональной активности, деконденсированный — при­
водит к включению активной работы генов и открывает возмож­
ность реализации механизмов их регуляторной деятельности. В
ходе замораживания—оттаивания, как считают авторы, нару­
шаются химические связи различных структурных компонентов,
которыми осуществляется компактная укладка суперспиральной
ДНК (ссДНК) в нуклеоиде [27]. Вероятным результатом таких на­
рушений будет локальная релаксация супервитков в доменах
ссДНК, что, как правило, сопровождается изменениями тран­
скрипционной активности генома клетки [379].
Другие авторы также показали, что под влиянием холода
происходит деспирализация (декомпактизация) ДНК в гетерохро­
матиновых участках метафазных хромосом [58]. Полагают, что де­
конденсация хроматина обусловлена транскрипционной актив­
ностью, направленной на синтез дополнительных веществ, необ­
ходимых для поддержания жизнедеятельности клетки в таких эк­
стремальных условиях. Деспирализация h-сегментов метафазных
хромосом при охлаждении (−12 °С) связана только с функциональ­
ной активностью этих участков, так как их редупликация была
полностью завершена еще в S-периоде. Поэтому криообновление
мы рассматриваем как альтернативный механизм реакции клетки
на репарируемые повреждения холодом структуры ДНК и ДНКядерных белковых связей.
Изучены процессы конденсации—деконденсации хромосом в
растительных клетках, индуцируемые низкой температурой. С по­
мощью предобработки низкими положительными температурами
у Л/-хромосомы клеток меристемы корня Vicia faba получена ста­
бильная картина дифференциальной исчерченности, подобная
G/A-сегментации хромосом животных клеток [23]. Действие низ­
кой (4 °С) температуры на корешки проросших семян Festuca
pratensis и Lolium perenne L. также индуцирует G∕A-подобный рису­
нок дифференциальной исчерченности профазных хромосом, ко­
торый выявляется при окрашивании ацетокармином и флуорох­

215

Глава 10. Апоптоз и криообновление как основа эффективного использования ...

ромами хехстом 33258, оливомицином и акридиновым оранжевым
[171]. Высказано предположение, что этот тип исчерченности хро­
мосом растений — следствие неодинаковой реакции хроматина Gи 7?-блоков на деконденсирующее действие холода.
Основными этапами процесса криообновления являются эк­
спрессия специфических ГХА, индукция БХШ и de novo.
10.2. ЭКСПРЕССИЯ ГХА, ИНДУКЦИЯ БХШ И DE NOVO

Представлен обзор по изучению структурных и морфологических
изменений при холодовой адаптации растений [249]. Авторами
получены новые полипептиды с криопротекторными свойствами
и отмечено уменьшение количества других полипептидов, изме­
нение липидов (особенно полярных), увеличение количества не­
насыщенных жирных кислот, что влияет на текучесть и свойства
мембран, а также накопление углеводов, аминокислот и других ве­
ществ. Выдержанные при 2 °С проростки гороха приобретают
способность переживать низкие (-6 °С) температуры [404]. Увели­
чение морозоустойчивости коррелирует с возрастанием массы
клеточной стенки и изменением в содержании ее компонентов —
арабинозильных остатков (на 100 %), других гликозильных остат­
ков и целлюлозы (на 20 %), а также оксипролина (на 80 %). Увели­
чение содержания арабинозы и оксипролина указывает на возрас­
тание количества экстенсина — главного гликопротеина клеточ­
ной стенки.
С помощью гибридизации авторы выявили более чем тройное
увеличение количества мРНК экстенсина. Идентифицированы 7
экстенсиновых транскриптов. Обнаружено, что 3 из них более ин­
тенсивно накапливаются при адаптации к низким температурам.
Показана индукция нескольких новых мРНК в закаленных про­
ростках пшеницы [354]. Наиболее важным авторы считают изме­
нение индукции и более выраженный синтез 4 пептидов — одного
высокомолекулярного с молекулярной массой 200 кДа и трех ме­
ньших — 58, 48 и 48 кДа в морозоустойчивом сорте Норпстар. Эти
специфические компоненты отсутствовали в морозочувствитель­
ном сорте Глеили. Индукция и экспрессия новых белков, по мне­
нию авторов, связана со способностью озимой пшеницы перено­
сить мороз. На основании результатов, полученных in vivo и in
vitro в клетках озимой пшеницы, сделан вывод о том, что измене­
ния в экспрессии генов во время яровизации, скорее всего, проис­
ходят на уровне транскрипции и обусловлены процессами прог­

216

10.2. Экспрессия ГХА, индукция БХШ и de novo

раммированной жизни охлажденной и криоконсервированной
клетки [259].
Таким образом, авторы вышеупомянутых работ заключили,
что при действии низких температур имеют место количественные
и качественные параметры растений, причем преобладают качес­
твенные. Поэтому для дальнейшего исследования процессов холо­
довой адаптации необходима идентификация генов, включаю­
щихся при действии низких температур, ответственных за измене­
ния метаболизма растений и экспрессию белков de novo. В этой
связи несомненный интерес представляют дальнейшие исследова­
ния изменений в экспрессии генов при пониженных температу­
рах. Анализ продуктов in vitro трансляции поли (A)+-PHK показал,
что в листьях проростков холодоустойчивого сорта риса (Somewaке) через 24 ч после снижения температуры до 5 °С наблюдается
синтез нескольких новых полипептидов, которые отсутствовали у
сорта риса с менее выраженной холодоустойчивостью [321]. Экс­
прессия ГХА была изучена также методом скрининга библиотеки
кДНК, полученной из поли(А)+-РНК проростков, выносливого к
вымораживанию сорта люцерны (Anik) [342]. Установлено, что эк­
спрессия ГХА скоординирована и осуществляется на транскрип­
ционном уровне, не стимулируется и не индуцируется тепловым
шоком, водным стрессом или ранением.
Анализ проростков in vitro трансляции поли(А)+-РНК позво­
лил установить, что при закаливании в тканях листа озимой пше­
ницы индуцируется синтез двух групп мРНК [275]. Первая группа
из 23 мРНК, кодирующая белки с молекулярной массой от 16 до
200 кДа, индуцируется и экспрессируется на высоком уровне при
понижении температуры у морозоустойчивых сортов по сравне­
нию с яровыми. Считают, что развитие морозоустойчивости ассо­
циировано с экспрессией специфических генов, регулируемой на
транскрипционном уровне.
Проведено молекулярное клонирование генов, регулируемых
холодовой обработкой, у ячменя [264]. Выделено 5 клонов кДНК,
гомологичных мРНК ячменя. Гибридизационный анализ показал,
что уровень транскрипции зависит от процесса закаливания. Гиб­
ридизация с мРНК, выделенными из различных растительных
тканей, свидетельствует о трансспецифичной экспрессии генов,
индуцируемых низкой температурой. Кодируемые генами белки
содержат области, обогащенные аргинином. Недавно установлено,
что конец экспрессии CBF∖, который является транскрипцион­
ным активатором и предполагаемым COR-генным регулятором,
индуцирует COR-генную экспрессию и повышает устойчивость

217

Глава 10. Апоптоз и криообновление как основа эффективного использования ...

растений к замораживанию [382]. Активное действие низких темпе­
ратур на функционирование клеточного генома вполне очевидно.
Согласно нашим данным, в результате предпосевной обработ­
ки семян сои, свеклы, моркови, тыквы, кабачков и фасоли охлаж­
дением (4 °С), цитохромом с и холинхлоридом энергия прораста­
ния увеличилась в 3—4 раза по сравнению с контролем (без пред­
обработки, рис. 66, см. вклейку). Получены криогибриды тыквен­
ных культур в 2 раза превышающие скорость роста (рис. 67, 68, см.
вклейку). Повышение урожайности тыквенных и бобовых культур
проявилось в F2-, F3-, F4- и в /^-поколениях (рис. 69, см. вклейку).
На рис. 70 (см. вклейку) показана высокая урожайность растение­
водческих культур (фасоль, тыква, кабачки, свекла, морковь), об­
работанных низкими (4 °С) температурами, цитохромом с и хо­
линхлоридом, выращенных в неблагоприятных агротехнических
условиях (затемненный садовый участок, засушливое лето). В са­
мом деле, положительное свойство охлаждения, цитохрома с гене­
тически детерминировано: низкие температуры регулируют гены,
под контролем которых находится цитохром с и НАД · Н, учас­
твующий в его транспортной функции через наружную митохон­
дриальную мембрану [384]. Другие авторы также обнаружили вы­
сокую наследуемость морозоустойчивости у клевера ползучего
[299] и у молодых проростков риса [344]. Предполагается контроль
устойчивости к низким температурам рецессивными генами ком­
плементарной природы.
В целом деконденсация хроматина, активация процессов транс­
крипции, экспрессия ГХА, индукция БХШ и de novo в раститель­
ных клетках лежат в основе стимулирующего, трансформирующе­
го и мутагенного (с гетерозисным эффектом) действия низких
температур и криоконсервирования.
10.3. СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР

Ch. Guy, открывший в 1985 г. экспрессию ГХА, подчеркнул важ­
ность обнаруженного нами стимулирующего действия низких
температур. По его наблюдениям, без стимуляции низкими темпе­
ратурами некоторые растения вообще не идут в рост. Рост при по­
ниженной температуре или охлаждение растений приводит к сти­
муляции дыхания листьев и увеличению числа и размеров мито­
хондрий в растительных клетках [100]. Существует положительная
корреляция между изменениями интенсивности дыхания листьев
и концентрации митохондрий в клетках мезофилла, вызванными

218

10.3. Стимулирующее действие низких температур

достаточно длительным воздействием холода. После действия по­
ниженной (8 °С) температуры энергия прорастания и всхожесть
семян сои сорта Соер 2-95 повышались под влиянием 7 %-го про­
пандиола и 15%-го ПЭО-400 [229].
Изучено влияние криоконсервирования (-10, -196 °С) семян
9 видов дикорастущих травянистых растений Р. campanula (35 пп)
на их всхожесть [203, 204]. Показано, что длительное хранение се­
мян в жидком азоте способствует повышению всхожести. При
подборе оптимальных условий обработки семян сои криопротек­
торами можно не только сохранить исходные биологические ка­
чества семян, но и увеличить показатели энергии прорастания и
всхожести [194,230]. Это зависит от условий охлаждения и обра­
ботки криопротекторами и свидетельствует о возможности повы­
шения адаптационного потенциала культуры сои.
В последние годы исследовано влияние низких положите­
льных (10 °С) температур на поглощение кислорода тканями, на­
ходящимися на различных стадиях развития [112]. Установлена
генетически детерминированная активация цитохромного пути
транспорта электронов в клетках сформировавшихся тканей кор­
ней кукурузы. Примечательно, что закаливание увеличивает спо­
собность тканей озимых растений (Brassica napus) синтезировать
лецитин, с которым цитохром с находится в теснейшей взаимо­
связи, и модифицирует биохимические пути его синтеза в направ­
лении меньшей чувствительности к промораживанию [311]. Холо­
довое закаливание растений шелковицы Morus bombucis при тем­
пературе 5 °С в течение 3 недель значительно улучшает норма­
льное образование стеблей после замораживания их до -196 °С
[352]. Низкие температуры вызывают многократное увеличение
концентрации токоферола в тканях эвглены [367]. Содержание то­
коферолов в зерне яровой пшеницы увеличивается после воздей­
ствия весенних заморозков на 25 %, осенних — на 32 % [33]. В
клетках корня кукурузы в условиях гипотермии также возрастает
активность пероксидазы [5].
Таким образом, накопление различных антиоксидантов, по­
вышение устойчивости растениеводческих культур к сверхнизким
температурам и благоприятные качественные изменения во мно­
гом определяются стимулирующим действием низких температур,
которое обусловлено активацией процессов программированной
жизни охлажденной и криоконсервированной клетки.
Аналогично стимулирующему действию низких температур
важную роль в механизмах криообновления играет их благоприят­
ное трансформирующее свойство.

219

Глава 10. Апоптоз и криообновление как основа эффективного использования ...

10.4. ТРАНСФОРМИРУЮЩЕЕ (ПРЕОБРАЗУЮЩЕЕ) ДЕЙСТВИЕ
НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР И КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ

Открытое нами ранее трансформирующее действие криоконсер­
вирования хорошо продемонстрировано на животных клетках и
тканях. Показана компактизация структуры и более раннее вклю­
чение функции сустава после криовоздействия на этапе репара­
ции [163]. Отмечена глубокая перестройка тканей диска после
криовоздействия: формирование рубцово-хрящевого сращения
прилегающих позвонков (корпородез) вместо развивающихся
дистрофических процессов, сходных с изменениями при заболе­
вании остеохондрозом [122].
Согласно универсальности кода, благоприятное трансформи­
рующее действие низких температур прослежено и на раститель­
ных культурах. Так, для сохранения генофонда растений после
криоконсервирования важна возможность образования каллюса
(молодой мозолистой ткани) на значительном количестве выжив­
ших после глубокого замораживания апексах [135]. Причины это­
го явления связывают как с нарушением симпластности в преде­
лах объекта, что приводит к смещению гормональных градиентов
или даже деструкции источников эндогенных гомонов, так и с об­
разованием веществ с гормональноподобной активностью в резуль­
тате цитолиза, что также может привести к неорганизованному
росту. Для подтверждения этих данных эксплантат, содержащий
первичную меристему побега, отсекали от интактных посевов то­
матов после замораживания (-196 °С). Выжившие эксплантаты
дали побеги за счет роста меристемы при культивировании в при­
сутствии гиббереллиновой кислоты. Без нее все выжившие экс­
плантаты образовывали ткань каллюса и последующие адвенти­
циальные побеги без прямого роста первичной меристемы. Неза­
мороженные образцы давали побеги без гиббереллиновой кисло­
ты [305]. Автор работы подтвердил, что гормональная регуляция
организованного роста за счет побегов меристемы изменяется в
процессе замораживания—оттаивания.
Исследование механизма холодовой акклиматизации пророст­
ков ржи [395] показало, что изменения криоповреждения плазма­
тической мембраны во время осмотического сокращения в резу­
льтате замораживания являются начальным этапом в процессе хо­
лодовой акклиматизации и причинно связаны с перестройками в
составе фосфолипидов плазматической мембраны.
Обнаружены биохимические изменения мембран озимой пше­
ницы при низкой температуре за счет появления добавочных ак­

220

10.5. Генетические основы селективного свойства низких температур ...

цепторов на разных уровнях структурной организации растений
[102]. Благоприятные качественные изменения растений под дей­
ствием низких температур закодированы в геноме. Установлено,
что в первые часы после облучения, т. е. в фазе G2 при 34 °С воз­
никает больше поврежденных клеток боковых корешков конских
бобов (Vicia faba), чем при 24 °С. При 4 °С выживаемость клеток
была в 3 раза выше, чем при 24 °С [88].
Таким образом, стимулирующее и трансформирующее свойство
низких температур и криоконсервирования как результат активной
деятельности клеточного генома в реализации программы криооб­
новления лежит в основе перевода охлажденных растениеводческих
культур на более высокий уровень гомеостаза. Понятие «гомеостаз»
подразумевает свойство живых клеток самостоятельно поддерживать
постоянство своей структуры и состояние в целом, а также регулиро­
вать клеточные параметры. Причем, как известно, оно не подразу­
мевает чего-либо застывшего и неподвижного, а обозначает состоя­
ние, которое изменяется, оставаясь относительно постоянным. Поэ­
тому к понятию «норма», по мнению авторов, следует относиться не
как к среднему статистическому показателю, а учитывая конкретные
условия окружающей среды [141]. Переход на новый уровень го­
меостаза с учетом этого обусловлен явлением раннего «всплеска» в
структурных компонентах клетки и формированием структурного
«следа» адаптации [140,141]. Эти феномены состоят в кратковремен­
ной реакции животных, растительных, микробных клеток и одно­
клеточных организмов на воздействие повреждающих факторов, ко­
торое проявляется в раннем и бурном повышении функциональной
активности и снижении ее в процессе жизнедеятельности до уровня,
превышающего «норму». Экспериментальным подтверждением пе­
рехода охлажденных растений на более высокий уровень гомеостаза
служат данные о том, что однократное замораживание (-196 °С) се­
мян ведет к увеличению («всплеску») их всхожести на 40—70 % выше
контроля (без криообработки). Каждое из восьми повторных замо­
раживаний понижает всхожесть на 30 % до уровня, превосходящего
контрольный [314].
10.5. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СЕЛЕКТИВНОГО СВОЙСТВА
НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР И КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ

До недавнего времени селективное свойство низких температур и
криоконсервирования криобиологи связывали со свойством низ­
ких температур повышать урожайность растений за счет сохране­
ния устойчивых форм и элиминации неустойчивых, поэтому мно­

221

Глава 10. Апоптоз и криообновление как основа эффективного использования ...

гие вопросы не находили объяснения. Например, чем объяснить
более высокую репаративную способность и скорость роста у гиб­
ридов гетерозисных проростков кукурузы после воздействия сверх­
низких (-196 °С) температур, которые повышенной холодоустой­
чивостью не отличались [227], и появление в морозоустойчивом
сорте озимой пшеницы новых белков с большой молекулярной
массой через 48 ч после начала обработки холодом, т. е. задолго до
проявления максимальной устойчивости к морозу [248]?
Для обсуждения приведенных результатов следует обратить
внимание на данные, полученные нами ранее. На основании кор­
реляционно-регрессионного анализа цитохимических показате­
лей ключевых ферментов цикла Кребса, гликолитического, пен­
тозного, системы транспорта электронов, SH-rpyππ и фосфолипи­
дов в клетках костного мозга мы пришли к выводу, что в разморо­
женных клетках сосуществуют отбор устойчивых форм и измене­
ние морфофункциональных свойств биологических объектов.
Отбор и изменчивость — две стороны одного процесса (селекции),
движущей силой которого является перемена условий существо­
вания. В 1984 г. мы обосновали новые данные о селективном
свойстве криоконсервирования [160].
Открытие генетической программы криообновления позволило
пересмотреть существующее ранее мнение о селективном свойстве
низких температур и криоконсервирования в отношении раститель­
ных клеток. Качественно новое состояние растительных биологи­
ческих объектов можно получить, повысив потенциал статистичес­
кой морозоустойчивости, так как в естественных условиях либо при
использовании агротехнических факторов он не реализуется [168].
Важнейшее явление закодировано в геноме. Проанализировав
гены устойчивости к низкой (12 °С) температуре у групп Poecilia
reticulata в связи со сцепленным с полом наследованием [297], пред­
положили, что аллель устойчивости (7?) к низкой температуре доми­
нантен по отношению к аллелю восприимчивости (г). При этом ген
R1, по-видимому, сцеплен с половой X-хромосомой. Таким образом,
ГХА в животных клетках сцеплены с половой хромосомой и скорость
развития особей зависит, в основном, от низкотемпературных фак­
торов (93 %) по сравнению с влиянием родителей (3 %) [265].
Согласно универсальности кода, выявлен ген устойчивости
пшеницы к низким положительным температурам [406]. Ген до­
минантен и локализован на коротком плече хромосомы 6D Chinase
spring. Холодоустойчивость озимой пшеницы контролируется дву­
мя локусами хромосомы 5А [361]. Один локус, частично контро­
лирующий холодоустойчивость, тесно сцеплен с локусом, контро­

222

10.5. Генетические основы селективного свойства низких температур ...

лирующим длину листьев. Другой локус, по мнению авторов, тес­
но сцеплен с геном Vrnl, обусловливающим образ жизни. Этот ло­
кус может частично контролировать розеточный тип куста. Пред­
положили, что ген Vrnl зависит от температуры и отчасти является
пусковым механизмом яровизации, холодоустойчивости и разви­
тия розеточного типа куста.
Изучена структура митохондрий и эндоплазматического рети­
кулума колеоптиля растений Triticum destivum bar. Lutescens 329;
Agropyron glaucutn; Triticum x Agropyron 56 — хромосомного гибрида,
несовершенного амфидиплоида, содержащего 42 хромосомы ржи
и 14 хромосом из В или X генома пырея (ТАГ) после экспозиции
при 0 и 4 °С от 10 мин, до 4 сут [318]. Установлено, что низкотем­
пературная обработка по-разному действует на функциональную
активность митохондрий злаков. У пырея и ТАГ 822 биохимичес­
кая активность в начале обработки возрастает, что приводит к зна­
чительному и необратимому разрушению митохондрий. Сделано
предположение, что зимостойкие растения хорошо адаптируются
к холоду. Это связано с быстрой защитной реакцией клеточных
митохондрий и эндоплазматического ретикулума. Адаптация реа­
лизуется непосредственно ядерными генами ТАГ и имеет различ­
ные клеточные митохондрии. В случае присутствия в геноме гиб­
рида X генома из пырея митохондрии становятся более устойчи­
выми к низкотемпературной обработке.
Исследованы также молекулярные механизмы холодоустойчи­
вости у риса [260]. Проростки устойчивого сорта Nippoubare (Japoпса) и чувствительного IR36 (Indica) были подвергнуты длительно­
му охлаждению при температуре 6 °С. Контрольные растения со­
держались при 25 °С. После 7 сут опыта все растения IR36 погибли,
a Nippoubare — не имели заметных повреждений. У опытных расте­
ний устойчивой формы по сравнению с контролем впервые было
обнаружено 4 белка, либо количество их продуктов резко увеличи­
лось. Накопление транскриптов, гомологичных отобранным кло­
нам, при охлаждении было тканеспецифичным. Анализ нуклеотид­
ного и аминокислотного состава трех клонов (рВС 121, рВС 422 и
рВС 591) по сравнению с генными базами данных EMBL и LASD
не выявил гомологии. Белки клонов рВС 121, рВС 422 были богаты
лейцином и серином, а рВС 591 содержал домены, богатые аргини­
ном. Сделано предположение, что выделенные гены представляют
собой новую группу генов, ответственных за холодоустойчивость.
Для изучения механизмов криоселекции растения яровой
пшеницы со значительно повышенной морозоустойчивостью бы­
ли регенерированы из каллюса, подвергнутого низкотемператур­

223

Глава 10. Апоптоз и криообновление как основа эффективного использования...

ному воздействию [316]. Кусочки каллюса охлаждали до -35 °С со
скоростями в пределах 0,1—30 °С/мин, затем переносили на 1 ч в
жидкий азот. После этого каллюс быстро оттаивали при 40 °С ли­
бо медленно на воздухе и сразу сажали на твердую среду. По дан­
ным биохимического анализа криоконсервированного каллюса,
обнаружены по крайней мере 8 уникальных полипептидов как ре­
зультат действия одного из ведущих механизмов криообновления
и значительно более высокий уровень сахарозы.
Важнейшему открытию ведущей роли низких температур и
криоконсервирования во взаимосвязанных отношениях генотип —
среда способствовали, прежде всего, исследования российского
ученого М.Е. Лобашова [126,127]. В природе растения, выросшие
в условиях Севера, претерпевают качественные и количественные
изменения функциональных систем. Например, пероксидазы из
тканей северных растений имеют максимальную активность при
температурах, которые значительно ниже температурного оптиму­
ма для ферментов растений из других регионов. Количественные
изменения в совокупности с качественными затрагивают струк­
турные перестройки молекулы белка, определяют повышение
функциональной активности системы, в которой участвуют пе­
роксидазы. У растений Севера наблюдаются изменения в содер­
жании и активности хроматина и рибосом, хлоропластов и других
функциональных систем [6].
Комплекс качественных и количественных изменений фун­
кциональных систем растений позволил авторам предположить,
что адаптация растений к условиям среды основана на усилении
мощи функциональных систем в экстремальных условиях среды.
В этом комплексе ведущую роль играют качественные изменения
функциональных систем, обусловленные «включением» механиз­
мов программированной жизни охлажденной и криоконсервированной клетки, закодированные в геноме.
Таким образом, концепция криообновления служит теорети­
ческим обоснованием эффективности использования низких и
сверхнизких температур для повышения продуктивности растение­
водческих культур. Благоприятное стимулирующее, трансформи­
рующее и мутагенное (с гетерозисным эффектом) действие низких
и сверхнизких температур обусловлено деконденсацией хроматина,
активацией процессов транскрипции, экспрессией ГХА, синтезом
БХШ и de novo, основных механизмов программированной жизни
клетки. В основу конкурентоспособных технологий положено ди­
намическое взаимодействие двух разнонаправленных процессов —
апоптоза и криообновления и сдвиг его в сторону криообновления.

Заключение

В криобиологической науке считалось общеприня­
тым, что с помощью низких температур и криоконсервирования
можно сохранить биологические объекты в жизнеспособном сос­
тоянии относительно длительное время для дальнейшей терапии и
трансплантации. Это позволило заготовить большие запасы био­
материала, а также создать банки генетически редких исчезающих
видов. Вместе с тем сохранение биологических объектов до исход­
ного уровня на сегодня не может быть эталоном их качества. Бо­
лее того, серьезную основу демографического неблагополучия как
на ближайшую, так и, что особенно опасно, на отдаленную пер­
спективу составляет угрожающе низкий уровень здоровья детей и
молодежи. По результатам выборочных медицинских обследова­
ний в 1995 г. лишь 13,5 % детей и подростков в Украине имели
удовлетворительный статус по основным физиологическим пока­
зателям, причем в последние годы отмечается тенденция к их даль­
нейшему ухудшению.
Важнейшими факторами, негативно влияющими на здоровье
населения Украины, являются:
• загрязнение среды обитания ксенобиотиками, техногенными
ядами, радионуклидами, канцерогенами и т.п.;
• усиление биологической агрессивности окружающей среды;
• появление и распространение некоторых новых разновид­
ностей вирусов, микоплазм, хламидий;
• повышение вирулентности возбудителей бактериальных и
грибковых инфекций, глистных инвазий;
• массовое распространение биоценотического дисбаланса —
синдрома дисбактериоза и др.
• снижение доступности высококвалифицированной медицин­
ской помощи и санаторно-курортного лечения;

225

Заключение

• низкий уровень общей медицинской и санитарной культуры
населения, практически полная неинформированность его об ос­
новных принципах современного здорового образа жизни;
• несоблюдение принципов рационального питания значитель­
ными группами населения, а также широкое применение в пище­
вой, мясной и молочной промышленности консервантов, краси­
телей, ароматизаторов, загустителей; расширение потребления ра­
финированных и глубоко переработанных продуктов;
• истощение почв с устойчивым дефицитом и дисбалансом со­
держания витаминов и микроэлементов в зерновых продуктах,
фруктах и овощах;
• природная недостаточность в почве и водных ресурсах ряда
регионов Украины важных микроэлементов — селена, фтора, йо­
да, хрома, меди и некоторых других;
• резкое увеличение информационных, интеллектуальных и
психоэмоциональных нагрузок, особенно у детей;
• широкое использование медикаментозных средств, рост час­
тоты проявлений побочных неблагоприятных эффектов лекарств
и др.
Воздействие перечисленных факторов привело к тому, что уже
в возрасте 30—35 лет организм многих людей в условиях Украины
утрачивает способность адекватной адаптации к внешним и внут­
ренним воздействиям, т. е. развивается синдром дисадаптации,
ведущий к болезням.
Учитывая это, еще в 70—80-х годах прошлого столетия на ос­
новании собственных экспериментальных данных и литературы,
мы обращали внимание исследователей на то, что с помощью низ­
ких температур и криоконсервирования можно улучшить качест­
во жизни. Мы также акцентировали внимание ученых на том,
что криоконсервирование — это генетически активный фактор:
стрессовые режимы замораживания —оттаивания могут вызвать
опасность получения мутантов с пониженной жизнеспособнос­
тью, подобно хлорофилльным, либо мутаций с недостаточной
«дыхательной» активностью. Оптимальные режимы заморажива­
ния-оттаивания не вызывают изменений генетического аппарата.
С помощью специально подобранных режимов криоконсервиро­
вания можно получить полезные физиологические и биохимичес­
кие мутации с гетерозисным эффектом — увеличенной жизнеспо­
собностью клеток и особей, повышенной плодовитостью, улуч­
шенными технологическими и биохимическими свойствами. Мы
понимали, что на тот момент не все наши доводы получили экспе­

226

Заключение

риментальное подтверждение. Вместе с тем большим количеством
наших дискуссионных статей мы пытались привлечь внимание
интересующихся этой проблемой и получить новые данные для
проведения соответствующих исследований.
Итак, в связи с экологическими, радиационными, инфек­
ционными и другими ранее указанными проблемами исходный
уровень биологических объектов не может быть эталоном их ка­
чества. Проблема выживания человека в этих условиях потребова­
ла развития принципиально нового направления в биологии, ме­
дицине и сельском хозяйстве — криобиологии обновления, изу­
чающей механизмы благоприятных изменений биологических
структур и функций с помощью низких температур и криоконсер­
вирования. В основу криобиологии обновления положены новые
данные о селективном свойстве криоконсервирования, представ­
ленные нами в 1984 г. [160].
Следует отметить, что до недавнего времени благоприятное
селективное свойство криоконсервирования связывали с отбором
устойчивых элементов за счет элиминации неустойчивых. Восста­
новление морфофункциональных свойств размороженных биоло­
гических объектов вплоть до исходного уровня объясняли репара­
тивными процессами, имеющими обратимый характер. Поэтому
до настоящего времени отсутствует какая-либо концепция, спо­
собная внести ясность в получение более жизнеспособных клеток,
тканей и организмов, подвергшихся действию низких температур
и криоконсервирования, по сравнению с исходными.
В самом деле, согласно классическому определению, слово
«селекция» обозначает отбор. Однако отбор как созидательный и
творческий процесс проявляет себя лишь тогда, когда речь идет о
процессах индивидуального развития. При этом объектом дей­
ствия отбора являются не отдельные гены, а целые генотипы,
реализующиеся в ходе индивидуального развития и различаю­
щиеся по своей приспособительной ценности. Отбор является
тем фактором, который сохраняет наиболее приспособительные
генотипы, объединяет их в целостные генетические системы,
обеспечивая быструю перестройку генетической структуры по­
пуляции [126]. В этой связи, когда речь идет о популяционных
процессах, отбор — действительно созидательный и творческий
процесс.
При криоконсервировании дело обстоит иначе. Подобно по­
пуляционным процессам, отбор может способствовать переводу
охлажденных и криоконсервированных биологических объектов
на качественно иной уровень гомеостаза лишь тогда, когда он на­

227

Заключение

ходится во взаимосвязи с благоприятной изменчивостью биологи­
ческих структур и функций.
Следует упомянуть, что еще в 70-х годах известный россий­
ский ученый-генетик М.Ф. Лобашов впервые представил убеди­
тельные данные, согласно которым селекция — это сосуществова­
ние отбора (селекции) и изменчивости, движущей силой которого
является перемена условий существования [126,127].
Недавно показано, что оксидативный стрес как фактор отбора
позволил выделить фракции спермиев с высокой и низкой под­
вижностью [403]. Обе фракции содержат апоптотические клетки и
характеризуются активацией процессов ПОЛ и образованием
АФК. Это означает, что и в той, и в другой фракции имеет место
«запуск» программированной гибели клетки. Отбор высокопод­
вижных спермиев за счет элиминации неустойчивых может, оче­
видно, в какой-то мере повысить их оплодотворяющую способ­
ность. Однако остается неясным характер дальнейшего влияния
апоптотических изменений на полученное потомство. Другое де­
ло, когда отбор сопровождается благоприятной изменчивостью.
Эти же авторы с помощью аннексин-У-связывания и хемилю­
минесценции показали, что очищенная высокоподвижная попу­
ляция спермиев человека характеризуется значительно более вы­
сокой индукцией мембранного ФС (антиоксидант de novo) [341].
Характерно, что в инфертильных спермиях человека, подобно
другим животным и растительным клеткам, антиоксиданты по­
давляют апоптоз [403]. Подавляя процессы апоптоза, они, несом­
ненно, сдвигают динамическое взаимоотношение двух противо­
положно направленных процессов в сторону программированной
жизни клетки.
Таким образом, в настоящее время теоретически и экспери­
ментально доказано, что взаимосвязь отбора и благоприятной из­
менчивости лежит в основе повышения оплодотворяющей спо­
собности криоконсервированных спермиев человека. В последние
годы появилось большое количество работ, свидетельствующих в
пользу новых данных о селективном свойстве криоконсервирова­
ния как процессе отбора и изменчивости.
Так, согласно нашим данным и сведениям других авторов,
размороженные биологические объекты отличаются от свежезаготовленных направленностью энергетического обмена — перехо­
дом на гликолитический тип обмена, а также возрастанием ро­
ли КБ, обладающих антибактерицидной функцией, и SH-rpyππ,
участвующих в клеточной дифференцировке. После криообработ­
ки гнойных ран, криовоздействия на обожженную кожу и другие

228

Заключение

ткани (суставной хрящ, межпозвоночный диск) активируются
процессы репарации и регенерации, уменьшается гипоксическое
состояние тканей, усиливается бактерицидная функция лейкоци­
тов раневого отделяемого, уменьшается микроциркуляция за счет
новообразованных канальцев, что характеризует качественно но­
вое состояние биологических объектов после криоохлаждения. Об
этом же свидетельствует глубокая перестройка тканей в процессе
репарации и регенерации: образуются тонковолокнистые рубцы
вместо грубых, келоидных в контроле, компактизуются структуры
субмитохондриальной кости и формируется корпородез вместо
развивающихся дистрофических процессов в контроле.
Аналогично этому низкотемпературное воздействие (-196 °С)
на кожные лоскуты доноров мышей-самцов линии C57B16y вызы­
вает пролонгацию (на 4 сут) сроков выживания их у реципиентов
самок этой же линии [228]. Признаки несовместимости у реци­
пиентов и плазмоцитарная реакция в регионарных лимфоцитах
развиваются позже, чем при пересадке нативных кожных лоску­
тов. На 120-е сутки нативные трансплантаты щитовидной железы
(контроль) претерпевали деструктивно-некротические изменения
[38]. В отличие от контроля, криоконсервированные транспланта­
ты сохраняли небольшое количество клеток, однако их гисто­
структура свидетельствовала о функциональной активности без
патологических изменений. Трансплантация рекультивированной
органной культуры щитовидной железы более выражение влияла
(42 %) на процесс восстановления содержания тиреоидных гормо­
нов в крови животных по сравнению с нативной культурой [37].
Сосуществование отбора и изменчивости как фактора, спо­
собного перевести криоконсервированные структуры и функции
на более высокий уровень гомеостаза, — общебиологическое яв­
ление, так как распространяется и на растительные биологические
объекты.
Установлено, что низкие температуры играют существенную
роль в повышении потенциала статистической морозоустойчивос­
ти, поскольку в естественных условиях либо при использовании
агротехнических факторов он не реализуется [168]. Кинетические
исследования показали, что в морозоустойчивом сорте озимой
пшеницы новые белки с большой молекулярной массой обнару­
живались через 48 ч после начала обработки холодом, т. е. задолго
до проявления максимальной устойчивости к морозу [248]. Иссле­
дованные гибриды не обладали повышенной холодоустойчивос­
тью. Однако уцелевшие ткани гибрида гетерозисных проростков
кукурузы отличались повышенной репарационной способностью

229

Заключение

и скоростью роста после охлаждения их до -196 °С по сравнению с
родительскими формами [227].
Итак, в основе повышения жизнеспособности охлажденных и
криоконсервированных биологических объектов выше исходного
уровня лежит взаимосвязь отбора и изменчивости. Углубленное
изучение этих процессов позволило М.Ф. Лобашову в 70-х годах
видвинуть концепцию, согласно которой в основе появления но­
вого качества лежит связь адаптации, отбора и мутационного про­
цесса [126,127].
Почти одновременно, в 1976 г., мы представили данные о том,
что определенные режимы криоконсервирования гемопоэтичес­
ких клеток позволяют направленно изменять морфофункциональ­
ные свойства и получать мутанты с гетерозисным эффектом [149].
Мутантные формы мегакариоцитов криоконсервированного кост­
ного мозга характеризуются увеличением метаболически актив­
ной зоны, идущей на построение полисахаридного компонента
мембраны тромбоцитов [108], и интенсификацией тромбоцитоотделения.
Аналогично нашим данным, специально подобранные режи­
мы охлаждения дрожжевых микроорганизмов индуцируют мута­
ции с гетерозисным эффектом. Выделенный новый биохимически
активный штамм дрожжей (M-12x) улучшает качество виноматери­
алов за счет большего синтеза эндогенных антиоксидантов, мень­
шего — альдегидов и летучих кислот, увеличения вязкости и поверх­
ностного натяжения, уменьшения количества опалесцирующих ве­
ществ [НО]. Получен гетерозисный криогибрид между немецким
карпом и сазаном, который характеризуется скоростью роста в 2 ра­
за большей, чем у родительских форм [107]. Подобно низким тем­
пературам, как показали наши наблюдения, криопротекторы, в
частности ПЭО-400, индуцируют генные мутации, выражающиеся
в увеличение плоидности ядра мегакариоцитов человека и живот­
ных, что сопровождается изменением процессов конденсации—де­
конденсации хроматина. Поэтому криопротекторы также являются
генетически активным фактором: при воздействии ПЭГ на прото­
пласты растений и клетки животных происходит слияние клеток в
любых комбинациях [186].
Качественно новая популяция образуется в результате селек­
тивного действия низкой температуры и связана с общебиологи­
ческим свойством живого адаптироваться к новым условиям, пе­
реходя на другой функциональный уровень. Селективное свой­
ство криоконсервирования закодировано в геноме: продолжитель­
ность инкубационного периода жизни зимней камбалы связана

230

Заключение

с температурой развития и влиянием родителей соответственно на
93 и 3 % [265].
Впервые представленные нами новые данные о селективном
свойстве криоконсервирования послужили открытию благоприят­
ного стимулирующего, трансформирующего и мутагенного (с ге­
терозисным эффектом) свойства криоконсервирования.
Итак, новые данные о селективном свойстве криоконсервиро­
вания как факторе отбора, благоприятной изменчивости и полез­
ных криомутаций легли в основу разработки механизмов програм­
мированной жизни охлажденной и криоконсервированной клет­
ки, которые представляют собой противовес механизмам ее прог­
раммированной гибели.
Первые высказывания о существовании процесса гибели кле­
ток в многоклеточном организме появились еще в конце XIX в.
Однако годом признания апоптоза как физиологического явле­
ния считается 1972 г., когда английские исследователи J.F. Kerr,
A.N. Wylie и A.R. Currie [317] представили убедительные морфоло­
гические доказательства существования этого явления. В норма­
льном организме апоптоз служит механизмом для поддержания
гомеостаза. Как гипо-, так и гиперфункция апоптоза ведет к нару­
шению гомеостаза. Основные механизмы апоптоза — это процес­
сы, сопряженные с конденсацией хроматина [364, 365], структур­
ными преобразованиями нуклеиновых кислот [28], нарушением
ДНК-ядерных белковых связей [364], разрывами нитей ядерной
ДНК и ее фрагментацией [388] с последующим распадом ядра на
части. Апоптоз, как правило, сопровождается уменьшением объе­
ма клетки, сморщиванием цитоплазматической мембраны, обра­
зованием складок; фрагментацией клетки на мембранные везику­
лы с внутриклеточным содержимым (апоптозные тельца), фагоци­
тирующиеся макрофагами и клетками-соседями. Индукция апоп­
тоза связана с проапоптотическим действием, которое регулирует­
ся белками семейства Bcl-2 (В-клеточные лимфоцит-лейкемия
проонкогены) [283].
Пусковой механизм апоптоза — высвобождение цитохрома с
из митохондрий с последующим разобщением процессов сопря­
жения дыхания и фосфорилирования [175, 290]. Цитохром с, вы­
шедший из митохондрий, взаимодействует с цитозольным белком
A paf-l, что обеспечивает переход каспазы 3 в каталитически ак­
тивную форму [77]. Это приводит к повреждению мембран и гибе­
ли клетки.
Реакции программированной гибели клетки контролируются
клеточным геномом. Так, в условиях глубокого охлаждения апоп­

231

Заключение

тоз может включиться в паренхимальные и эндотелиальные клет­
ки печени [360], а также в СКК [28, 65], которые неустойчивы при
замораживании и легко разрушаются на всех этапах криоконсер­
вирования, особенно в зоне -10 ÷-40 °С [209]. Это сопровождается
изменением направления дифференцировки и созревания.
Программированная гибель клетки, получившая право на
жизнь в 1972 г., до недавнего времени была одним из важнейших
феноменов в клеточной биологии. Несколько позже, в 1976 г., мы
представили принципиально новые данные, свидетельствующие о
благоприятном стимулирующем и трансформирующем действии
цитохрома с на жизнеспособность размороженных гемопоэтичес­
ких клеток [149]. Эти сообщения пролили свет на существование
другого явления, по своей значимости не уступающего апоптозу,
так как является его противовесом.
Примечательно, что еще в 1963 г. видный английский биолог
Одре Смит установила большую выживаемость эритроцитов, ме­
ченных 32P, в организме больных, страдающих железодефицитной
анемией, по сравнению со свежезаготовленными [192]. Несколько
позже, в 70-х годах, были получены благоприятные изменения в
гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системе [59], регулируемом
гормонопоэзе [206, 207], реакции реципиентов на криоконсерви­
рованный трансплантат [49, 50, 83, 95, 189, 216—218], ходе зажив­
ления гнойных и ожоговых ран [36, 92, 96, 177, 178, 223]. В резу­
льтате повысилась устойчивость биологических объектов к низ­
ким температурам, бактериальной микрофлоре, радиации и дру­
гим неблагоприятным факторам.
Особого внимания заслуживают качественные изменения:
после криоохлаждения шейки матки гинекологических больных
утолщаются стенки сосудов, уменьшаются их просветы; прекра­
щаются дисфункциональные маточные кровотечения, устанавли­
вается нормальный физиологический цикл [59]. В результате
криоорошения гнойных ран усиливается бактерицидная функция
лейкоцитов [177], образуются тонковолокнистые рубцы с косме­
тическим эффектом вместо грубых, келоидных в контроле; фор­
мируется корпородез вместо развивающихся дистрофических
процессов [122]; снижается токсичность ожогового некроза [36].
Вторичная болезнь у животных с трансплантатом криоконсерви­
рованного костного мозга развивается в более поздние сроки с ме­
нее активным ее течением, чем с незамороженным миелотранс­
плантатом [49, 50, 195, 217]; отменяется эффект инактивации
СКК несингенными лимфоцитами [83] и др.

232

Заключение

Годом признания феномена криообновления считается 1989 г.,
когда нами были представлены и обсуждены убедительные мор­
фофункциональные данные этого явления [62, 154].
В настоящее время достаточно широко изучены основные ме­
ханизмы обновления и криообновления. Это, прежде всего, декон­
денсация (разрыхление) хроматина без нарушения ДНК-ядерных
связей [28, 85, 86, 150, 151, 171]; экспрессия ГХАи антиапоптоти­
ческих генов; индукция БХШ и de novo [250, 274, 370] и антиапопто­
тических [327, 410]; вхождение цитохрома с в митохондриальный
матрикс с последующим восстановлением процессов сопряжения
дыхания и фосфорилирования [151, 154, 284]. Важное значение в
«запуске» процессов обновления и криообновления принадлежит
антиоксидантам и цитокинам, подавляющим апоптоз.
Ведущий механизм указанных феноменов обеспечивает тран­
спортная функция цитохрома с в митохондриальные мембраны,
широко описанная в работах [70, 72, 151, 154]. Однако отсутствие
единого взгляда криобиологов на возможность проникновения
цитохрома с в митохондриальные мембраны в течение длительно­
го времени значительно затруднило обоснование его роли в меха­
низме криообновления.
С 1977 г. ученые Института проблем криобиологии и криоме­
дицины НАН Украины придерживаются мнения, что цитохром с
ввиду большой молекулярной массы (13 кДа) не способен прони­
кать через митохондриальные мембраны [26, 355]. Выход его из
поврежденных холодом мембран митохондрий расценивали как
фактор, индуцирующий процессы ПОЛ, что характерно для реак­
ций атоптоза. Поэтому до настоящего времени новое направление
не было предметом широкой дискуссии. Лишь в последние годы
благодаря открытию ГХА, антифризных полипептидов, БХШ и
(de novo) — основных «китов», на которые опирается концепция
криообновления, появилась реальная возможность вернуться к
обсуждению роли цитохрома с в механизме криообновления.
Между тем еще в 70—80-х годах в многочисленных работах за­
рубежных ученых было показано, что системы переноса цитохро­
мов состоят, по крайней мере, из двух молекулярных компонентов
[190, 285, 287, 315, 350, 351]. Один из них — специфический бе­
лок-переносчик, который может узнавать полипептиды с помо­
щью рецепторной функции и тем самым облегчать их движение
через мембраны. Другая система обеспечивает передачу энергии
молекуле-переносчику, благодаря чему она способна переносить
полипептиды через митохондриальные мембраны. Цитохром с,
попадая в митохондриальный матрикс, блокирует активацию кас­

233

Заключение

паз, выход из митохондрий проапоптотических белков, восстанав­
ливает процессы сопряжения дыхания и фосфорилирования. Под­
робнее эти данные представлены в статье [72]. Недавно они ста­
ли достоянием мировой научной общественности на страницах
«Международного медицинского журнала» [71], «Abstract Jomal»
[304] и в материалах «CryoBiomol-2003» [303].
Благоприятное стимулирующее действие цитохрома с в меха­
низме криообновления обусловлено способностью низких темпе­
ратур регулировать гены, контролирующие деятельность цитохро­
ма с и НАД · Н, участвующего в его транспортной функции через
наружную митохондриальную мембрану [384], а также модифици­
ровать структуру и функцию митохондрий в направлении благо­
приятного взаимодействия с ними цитохрома с [330]; повышать
концентрацию цитохромов в митохондриях и гомогенатах [143],
что приводит к появлению митохондрий с новыми свойствами,
более устойчивых к повреждающим факторам.
Недавно обнаружены гены, участвующие в процессах криооб­
новления. Изучена функциональная и пространственная органи­
зации ГХА в геноме млекопитающих [210] и человека [320]. Опи­
сана их локализация. Исследована структура области холодового
шока (CSD) YB-1, которая ответственна за ДНК-связанные свой­
ства белков. Выявлены индуцируемые ими БХШ, в частности в
лимфоцитах человека [250]. Увеличение экспрессии цикл-ассоциированных клеточных генов и Gq-протеин-протеинкиназы С,
сигнализирующих в охлажденных узелках щитовидной железы,
коррелирует с интенсификацией пролиферации клеток [293].
Снижение температуры в клетках Е. coli и В. subtilis индуцирует
синтез основных БХШ CS7.4 и CspB соответственно [370]. Выяв­
лены области эукариотических генов-регуляторов, которые сохра­
нены от бактерий до человека.
На сегодня в спермиях баранов идентифицированы БХШ Р14
и Р20 кДа, предохраняющие мембраны от повреждения [258]. За­
щитный эффект, по мнению авторов, обусловлен их декапацита­
ционной ролью. Другие авторы предполагают механизмы генной
регуляции адаптированных к холоду рыб Т. bemacchii [262]. Опи­
сан эффект экспрессии гена Вах и антиапоптотических белков
Bcl-2 в сперматогенных стволовых клетках и их локализация на
внутренней митохондриальной мембране [327].
Примечательно, что концепция криообновления, ранее бази­
рующаяся на действии низких температур, оказалась универса­
льной. Процессы криообновления существенно усиливают реак­
ции обновления. Открыты антиапоптотические гены и индуци­

234

Заключение

руемые ими антиапоптотические белки, которые тормозят выход
цитохрома с из митохондриального матрикса либо уничтожают
вышедший и, таким образом, подавляют апоптоз [410]. Антиокси­
данты, цитокины, интерлейкины также задерживают процессы
программированной гибели клетки, что наиболее полно представ­
лено в обзорных работах [73, 74, 175, 337, 401].
Динамическое взаимодействие двух противоположно направ­
ленных процессов — апоптоза и криообновления и смещение его
в сторону криообновления лежит в основе здоровья и долголетия.
С помощью маркерных реакций [72—74] эти процессы можно
регулировать. После замораживания—оттаивания гемопоэтичес­
ких клеток лучшим способом обнаружения раннего апоптоза
СКК считают аннексин-У-связывание, витальное окрашивание
SytoR16, 7ADD (7-аминоактиномицин), комбинацию SytoR16 и
7ADD [94, 373]. Обнаружить ранний апоптоз с помощью трипанового синего не представляется возможным.
Наиболее существенный маркер раннего апоптоза СКК и кле­
ток-предшественников — потеря митохондриальными мембрана­
ми цитохрома с. Освобожденный цитохром с индуцирует процес­
сы апоптоза, что может привести к развитию непредсказуемых
последствий после использования их в лечебной практике. Акти­
визировать программу криообновления представляется возмож­
ным такими способами: 1) введением цитохрома с в разморожен­
ные гемопоэтические клетки в случае его дефицита; 2) использо­
ванием БХШ и антиапоптотических, способных тормозить выход
цитохрома с из митохондриального матрикса либо уничтожить его
в цитозоле; 3) с помощью антиоксидантов, цитокинов, продуктов
эмбриофетоплацентарного комплекса, кордовой крови и т. д. Все
перечисленное лежит в основе лечебной эффективности криоконсервированных гемопоэтических клеток, в том числе СКК.
Подобно гемопоэтическим клеткам и СКК, маркер раннего
апоптоза в спермиях человека — аннексин-У-связывание — поз­
волил обнаружить один из механизмов криообновления — высо­
кую индукцию мембранных антиоксидантов (de novo) [341].
Антиоксиданты способны задерживать либо подавлять апоптоз и,
следовательно, активировать процессы криообновления, что наш­
ло экспериментальное подтверждение.
Используя цитохром с и гипотермию, совместно с М.И. Кра­
мар нам удалось активировать подвижность и жизнеспособность
спермиев человека на 30—32 %, что дало возможность повысить
фертильность мужских гамет и способствовало увеличению часто­
ты наступления беременности [7—9, 113]. Примечательно, что у

235

Заключение

всех новорожденных, полученных от этих мужчин, отсутствовали
признаки асфиксии, гемолитической желтухи и статуса недоно­
шенности, что нередко встречается при использовании тради­
ционных методов. Аналогично этому, при хранении криоконсер­
вированной спермы петухов в течение полугода и 9 лет оплодотво­
ряемось яиц увеличилась соответственно на 6 и 3 % [124]. Выво­
димость яиц также повысилась на 8 и 10 %. Согласно данным
российских ученых, жизнеспособность размороженных спермиев
сибирского осетра и карпа составила 10—40 % в отличие от свеже­
заготовленных (90—100 % ) [174]. Однако при осеменении икры
размороженными спермиями значительно возросли процент вык­
лева личинок икры и их средняя масса. Молодь осетров и карпа
отличалась большей средней массой тела и более высоким уров­
нем гематологических, биохимических и иммунологических пара­
метров. У потомства (крысят), полученного после криоконсерви­
рования эмбрионов гипертензивных крыс и трансплантации этих
эмбрионов нормотензивным реципиентам, артериальное давле­
ние было существенно ниже, чем у крыс исходной гипертензив­
ной популяции [13, 239]. Причем этот эффект повторился в сле­
дующем поколении.
Данные, полученные в Университете им. Гумбольда, свидете­
льствуют о том, что при использовании спермы генофондных пе­
тухов криоконсервированная сперма не только не уступала, но да­
же несколько превосходила свежую сперму петухов тех же геноти­
пических линий [372]. Считают, что криоконсервирование опло­
дотворенных яйцеклеток человека повышает частоту вероятности
беременности in vitro [378]. С каждым годом подобных работ ста­
новится все больше. Недавно аналогичные данные получены в
ИПКиК НАН Украины на животных (собаках). Потомство, полу­
ченное после оплодотворения яйцеклетки криоконсервированными спермиями, согласно патенту [246], характеризовалось высо­
кой жизнеспособностью с отсутствием признаков анемии, что
имеет место при использовании традиционных методов.
На основании наших данных и данных зарубежных авторов
можно заключить, что эффективность лечения мужского беспло­
дия обусловлена активацией процессов обновления и криообнов­
ления: деконденсацией хроматина, экспрессией ГХА и антиапоптотических, индукцией БХШ, антиапоптотических и de novo.
Процессы обновления и криообновления направлены на по­
вышение лечебной эффективности онкологических больных и бо­
льных лейкозом, у которых гемопоэз частично или полностью ин­
гибирован в результате интенсивной химио- и радиотерапии.

236

Заключение

Эффективность лечения онкологических заболеваний обусловле­
на тем, что цитохром с, с одной стороны, обладает способностью
запускать апоптоз для уничтожения опухолевых клеток, в которых
он подавлен, а с другой — запускать программу обновления и
криообновления, тормозящих развитие онкологических заболева­
ний. Важное значение имеют онкопрепараты, изготовленные на
основе антиапоптотических белков, цитокинов и антиоксидантов,
подавляющих апоптоз, а также лекарственные средства, блоки­
рующие топоизомеразы. Наиболее полно эти и другие данные
представлены в работе [76].
Руководствуясь принципами программированной жизни клет­
ки, представляется возможным объяснить высочайшую лечебную
эффективность эмбриофетоплацентарных препаратов, источни­
ков клеток-предшественников и СКК, и пищевых добавок (моло­
зиво), за которыми будущее криобиологической науки. Они со­
держат антиоксиданты, цитокины, интерлейкины, интерфероны,
гормоны, ростовые факторы и другие биологически активные ве­
щества и рецепторы, активирующие программированную жизнь
клетки. Кордовая кровь содержит фетальный гемоглобин (HbF),
характеризующийся повышенным сродством к кислороду [357].
Это свойство эритроцитов кордовой крови может быть полезным
для лечения гипоксических состояний организма.
Процессы криообновления направлены на лечение больных с
врожденными и приобретенными иммунодефицитными состоя­
ниями; сокращение продолжительности коматозного состояния и
пребывания больного в реанимационном отделении; предотвра­
щение преждевременного старения организма; получение более
жизнеспособного поколения, когда традиционные методы бесси­
льны, повышение урожайности растениеводческих культур, мя­
сомолочной и винной продукции улучшенного качества.
До настоящего времени в мировой практике преобладают эм­
пирические подходы к изучению качества размороженных биоло­
гических объектов, отсутствуют научно обоснованные принципы
получения нового качества, не сформулирована теория обновле­
ния биологических объектов. Поэтому данное оригинальное фун­
даментальное направление относится к приоритетным разработ­
кам в отечественной и мировой науке.
Впервые в истории криобиологической науки было выдвинуто
предположение, что с помощью криоконсервирования можно не
только сохранить, но и улучшить морфофункциональные свой­
ства биологических объектов; с помощью факторов криоконсер­
вирования можно вмешиваться в мутационный процесс. В этой

237

Заключение

связи возникла идея направленного воздействия на криоконсер­
вированные биологические объекты с целью улучшения их качест­
ва и получения более жизнеспособного потомства во всех поко­
лениях. Концепция программированной жизни клетки является
принципиально новой теорией направленного управления процес­
сами криоконсервирования, опередившей события не менее чем
на три десятилетия. Правда, гипотеза вначале не была достаточно
обоснована экспериментально, но предполагала огромные пер­
спективы исследования в области криобиологии и криомедицины.
Возможность такого научного предвидения во многом опреде­
лялась принципиально новыми подходами к изучению селектив­
ного свойства криоконсервирования как взаимосвязи отбора,
изменчивости и мутационного процесса; изучению жизнеспособ­
ности клетки как единого целого с использованием метода мате­
матического моделирования (корреляционно-регрессионный ана­
лиз); исследованию морфологически не различимых гемопоэти­
ческих клеток-предшественников с помощью цитохимических
маркеров; изучению процессов конденсации—деконденсации хро­
мосом с помощью модифицированных цитохимических реакций
на фосфолипиды и SH-группы, а также направленным получе­
нием полезных мутаций с помощью подбора программ заморажи­
вания-оттаивания .
Итак, с 70—80-х годов прошлого столетия впервые в отечес­
твенной и мировой науке мы поставили перед собой задачу — раз­
работать такое направление в биологии, медицине и сельском хо­
зяйстве, которое отвечало бы запросам всего человечества — быть
здоровыми и жить долго. Этим требованиям, по нашему мнению,
отвечают механизмы процессов обновления и криообновления,
по своей значимости сравнимые лишь с противоположно направ­
ленным явлением — апоптозом.
К сожалению, этому направлению не суждено было получить
статус открытия в науке. К моменту оформления соответствущих
документов Комитет по делам открытий и изобретений бывшего
Советского Союза распался, а альтернативу ему до настоящего
времени не создали. Он был единственным учреждением, благода­
ря которому ученые могли получить официальное признание
своих идей. По мере получения знаний механизмы обновления и
криообновления, подобно механизмам апоптоза, важнейшим фе­
номенам в клеточной биологии, постоянно уточняются и совер­
шенствуются. На сегодня нами изучены следующие механизмы
программированной жизни охлажденной и криоконсервирован­
ной клетки:

238

Заключение

• экспрессия ГХА;
• индукция БХШ и de novo, подавляющих апоптоз;
• деконденсация (разрыхление) хроматина без нарушения
ДНК-ядерных связей;
• вхождение цитохрома с в митохондриальный матрикс, где он
блокирует активацию каспаз и выход проапоптотических белков,
направленных на уничтожение клеток, и восстанавливает сопря­
жение дыхания и окислительного фосфорилирования;
• индукция антиоксидантов de novo. Антиоксиданты (напри­
мер, лецитин и холинхлорид), находясь в теснейшей связи с ци­
тохромом с, подавляют реакции апоптоза и, таким образом, сдви­
гают динамическое взаимодействие двух разнонаправленных про­
цессов — апоптоза и криообновления в сторону криообновления.
Механизмы программированной жизни клетки — это прежде
всего:
• экспрессия генов, контролирующих жизнеспособность клет­
ки;
• деконденсация хроматина; деконденсированный хроматин
приводит к включению в работу конститутивных генов и откры­
вает возможность реализации механизмов оперонной регуляции;
• вхождение цитохрома с в митохондриальный матрикс с пос­
ледующим восстановлением сопряжения дыхания и фосфорили­
рования;
• экспрессия антиапоптотических белков, которые блокируют
выход цитохрома с из митохондриального матрикса либо уничто­
жают вышедший в цитозоль и, таким образом, предотвращают
развитие апоптотических реакций;
• индукция антиоксидантов, подавляющих апоптоз, что обес­
печивает сдвиг динамического взаимодействия апоптоза и обнов­
ления в сторону обновления;
• продукты эмбриофетоплацентарного комплекса, кордовой
крови, цитокины (интерлейкины, интерфероны), ростовые фак­
торы, гормоны и др. способны тормозить реакции апоптоза и, та­
ким образом, подобно антиапоптотическим белкам и антиокси­
дантам усиливать реакции обновления.
В целом смещение динамического взаимодействия, апоптоза,
обновления и криообновления в сторону обновления и криооб­
новления — залог здоровья и долголетия.
В заключение отметим, что концепция обновления и криооб­
новления — важнейшее достижение отечественной и мировой
науки, направленное на оздоровление общества. Активизировать

239

Заключение

программу обновления и криообновления и, таким образом,
продлить полноценную жизнь и снизить биологический возраст
возможно рядом мероприятий:
1. Ведение здорового образа жизни.
2. Отказ от вредных привычек.
3. Проведение оздоровительных профилактических меропри­
ятий.
4. Внедрение принципов научно обоснованного питания пу­
тем использования БАД к пище, насыщение организма наиболее
важными биоактивными компонентами, такими, как витамины,
минеральные вещества, аминокислоты, растительные экстракты,
гликозиды и др.
5. Применение в лечебной практике криобиологических тех­
нологий, положительный эффект которых проявляется уже на
генном уровне путем экспрессии ГХА и индуцируемых ими БХШ
и de novo, антиоксидантов de novo, повышающих устойчивость
организма к неблагоприятным факторам среды и качество жизни.
6. Широкое использование антиоксидантов (например, леци­
тина, токоферола, холинхлорида и др.), которые предотвращают
развитие антиапоптотических процессов, тормозя реакции ПОЛ,
образование АФК, повреждающих клетки и организм в целом.
Они способствуют лечению жировой дистрофии печени различ­
ного происхождения, острого гепатита в стадии реабилитации,
хронического гепатита, токсикоза беременных, токсических пов­
реждений печени, которые обусловлены диабетом или алкоголиз­
мом, ишемического инсульта, послеинсультного состояния с це­
лью повышения двигательных и психических функций, атеро­
склероза, хронической дыхательной недостаточности, хроничес­
кой пневмонии, бронхиальной астмы, туберкулеза.
Значение антиоксидантов в жизнедеятельности организма
трудно переоценить. Например, у животных, лишенных токофе­
рола, обнаружены дегенеративные изменения в скелетных мыш­
цах и мышцах сердца, повышение проницаемости и ломкости ка­
пилляров, перерождение эпителия семенных канальцев яичек. У
эмбрионов возникают кровоизлияния, наступает их внутриутроб­
ная гибель. С дефицитом токоферола связана гемолитическая
желтуха новорожденных.
7. Внедрение в лечебную практику цитохромной терапии, наи­
более эффективной при использовании криобиологических тех­
нологий. Дело в том, что любые патологические процессы в орга­
низме обусловлены дефицитом цитохрома с. Недостаток цитохро­
ма с в клетке приводит к нарушению сопряжения дыхания и окис­

240

Заключение

лительного фосфорилирования. В результате накапливаются недоокисленные продукты, которые повреждают мембрану клетки и
организм в целом.
Руководствуясь принципами доказательной медицины, можно
констатировать, что лечение цитохромом с неизлечимых заболева­
ний — онкологических болезней, бесплодия, туберкулеза и др. — мо­
жет в значительной степени повысить качество жизни. Это объя­
сняется тем, что цитохром с, добавленный извне, встраивается в те
места электронно-транспортной цепи митохондрий, которые ра­
нее занимал эндогенный, и восстанавливает нарушенные процес­
сы дыхания и фосфорилирования. Важным моментом является
блокирование цитохромом с активации каспаз и проапоптотических белков, образование АФК, активирующих процессы апоптоза,
который индуцирует перечисленные заболевания.
8. Использование в лечебной практике продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса, кордовой крови, богатых стволовы­
ми клетками и антиоксидантами, цитокинов (интерлейкинов, ин­
терферонов), ростовых факторов и других веществ, защищающих
организм от инфекции и повышающих иммунитет. Положитель­
ное действие указанных активаторов процессов обновления ши­
роко представлено на страницах монографии.
9. Использование в лечебной практике стволовых клеток. Уче­
ные допускают, что технологией использования стволовых клеток
владели древние греки, и Моисей, живший по преданиям 800 лет,
вполне возможно, именно столько и прожил. На сегодня ухудше­
ние состояния больных после применения лекарств на основе
стволовых клеток либо генетических «поломок» не зафиксирова­
но. Вместе с тем, несмотря на огромнейшее позитивное значение
использования стволовых клеток в медицинской практике, сле­
дует помнить, что в целях омоложения, главным образом кожи,
нужно быть весьма осторожными. Кожа, как известно, старится в
первую очередь. В коже, обработанной стволовыми клетками, в
которых запущена программа апоптоза, признаки старения насту­
пают очень быстро. Она становится дряблой ввиду проявления
морфологических признаков: сморщивания клеток, уменьшения
их в размерах, образования борозд.
10. Внедрение в сельское хозяйство криобиологических тех­
нологий позволит повысить качество мясомолочной, рыбной,
винной и растениеводческой продукции за счет синтеза эндоген­
ных антиоксидантов, белков de novo и других полезных веществ.
Употребление такой пищи значительно снизит биологический
возраст.

241

Заключение

11. Использование в лечебной практике лекарственных расте­
ний, богатых антиоксидантами, белками и витаминами. Они спо­
собствуют улучшению обмена веществ, увеличению физических и
умственных способностей и сопротивляемости организма к раз­
личным заболеваниям, в том числе вирусным инфекциям, укреп­
лению иммунной системы, улучшению памяти и стимуляции ум­
ственной деятельности, замедлению процесса старения организ­
ма, снижению усталости, стрессовых состояний, эмоциональных
напряжений и раздражительности, повышению потенции у муж­
чин, снижению преждевременной эякуляции, нормализации мен­
струального цикла у женщин, повышению тонуса.
12. Размещение в жилых и нежилых помещениях озонаторов
для обогащения их кислородом, очищения и освежения воздуха.
Озонаторы оказывают бактерицидное действие, уничтожают ви­
русы, грибки, в том числе плесневые, расщепляют молекулы не­
приятных запахов (гноя, дыма, косметики), нейтрализуют небла­
гоприятное влияние электрических и антенных сигналов, свето­
вых вибраций.
13. Использование озона в лечебной практике. Озонотерапия
оказывает противовоспалительное, общеукрепляющее действие
на органы дыхания: убивает патогенную зону, обогащает ткани
легких и бронхов кислородом, предотвращает развитие признаков
бронхиальной астмы, астматического состояния, облегчает тече­
ние приступа бронхиальной астмы, который уже развился, уме­
ньшает застойные явления в легких, ускоряет заживление ушибов,
ран, травм, швов и рубцов (послеоперационных, ожоговых), улуч­
шает обмен веществ, предотвращает развитие онкологических за­
болеваний, нормализует состояние сосудов при варикозном рас­
ширении вен, снижает чувствительность к перепадам атмосфер­
ного давления, погодных фронтов и т. д.
На примере микроорганизмов экспериментально показано,
что под влиянием определенных малых доз озона динамика вос­
становления биологических функций после замораживания—от­
таивания ускоряется, повышается устойчивость эритроцитов к ге­
молизу.
14. Использование в лечебной практике магнитотерапии.
Причиной подавляющего числа болезней или усугубляющим их
фактором является нарушение обмена веществ в организме, кото­
рое во все большей степени становится следствием стресса, сидя­
чего образа жизни и вредных воздействий окружающей среды.
Эти нарушения вызывают в организме нехватку кислорода. Лече­
ние магнитотерапией восстанавливает энергетический уровень и

242

Заключение

частоту колебания «больных» клеток. При лечении магнитотера­
пией уменьшаются и в ряде случаев исчезают симптомы заболева­
ния органов пищеварения, язвы желудка и двенадцатиперстной
кишки. Особенно хорошие результаты наблюдаются в области
профилактики лечения камней в почках и желчном пузыре и про­
чих проблем, связанных с органами выделения. Благоприятный
прогноз обеспечивает лечение магнитотерапией ревматических
заболеваний, артритов, миозитов, невритов, остеохондроза, остео­
пороза, нарушения кровообращения, сужения сосудов, высокого
кровяного давления, сахарного диабета.
15. Криосауна предназначена для гипотермического стимули­
рования и тренировки системы терморегуляции, периферического
кровообращения и эндокринной системы. Как показали исследо­
вания харьковских ученых, лечебный холод показан при заболева­
ниях, связанных с иммунодефицитом, а также при хронической
усталости, для общего оздоровления и борьбы с избыточной мас­
сой тела. На генном уровне охлажденный воздух смещает динами­
ческое взаимодействие апоптоза и криообновления в сторону
криообновления.
Таким образом, руководствуясь принципами программиро­
ванной жизни клетки, представляется возможным активировать
программу обновления и криообновления уже на этапах спермо- и
эмбриогенеза, внутриутробной жизни плода и далее на протяже­
нии всей жизни человека. Это позволит ему жить до 100—120 лет и
более практически без болезней.

Рис. 3. Содержание фосфолипидов в ядрах криоконсервированных клеток
костного мозга животных (крысы) до и после замораживания с ПЭО-400;
×1000 [151, 154]. Умеренное содержание фосфолипидов в ядрах гранулоцитов
до замораживания (а) и выраженное (б) — после замораживания—оттаивания

Рис. 4. Деконденсация хроматина в размороженных клетках костного мозга;
×1000 [149, 151]. Четко отграниченный участок цитоплазмы, лежащий вбли­
зи ядра с более интенсивной реакцией на пероксидазу (а). При реакции на

SH-группы околоядерная структура интенсивно заполняет перинуклеарную
зону и распространяется почти по всему объему цитоплазмы мегакариоцитов
(в, г). В контроле такая структура околоядерной зоны не прослеживается (б)

Рис. 21. Активность СДГ в клетках перевиваемой культуры через 24 ч роста;
×1000. Продукт реакции в виде гранул диформазана различной формы и ве­
личины, располагающихся в цитоплазме клеток

Рис. 22. Активность ЛДГ в клетках перевиваемой культуры после 48 ч роста;
×1000. Выраженная реакция на ЛДГ

Рис. 23. Активность ФДГ в клетках криоконсервированной с ПЭО-400 пе­
ревиваемой культуры после 24 ч роста; ×1000. Умеренная реакция на α-ГФДГ

Рис. 24. Активность ЛДГ в клетках перевиваемой культуры, криоконсер­
вированной с ПЭО-400, после 48 ч роста; ×1000. Выраженная реакция на ЛДГ

Рис. 25. Активность СДГ в клетках криоконсервированной с ОЭГ перевивае­
мой культуры после 24 ч роста; ×1000. Низкая реакция с образованием кон­
гломератов

Рис. 26. Активность ЛДГ в клетках криоконсервированной с ОЭГ перевивае­
мой культуры после 24 ч роста; ×1000. Реакция на ЛДГ от умеренной до вы­
раженной

Рис. 27. Активность СДГ в клетках криоконсервированной с ПЭО-400 пере­
виваемой культуры после 48 ч роста; ×1000. Выраженная реакция на СДГ

Рис. 29. Характер локализации продукта реакции на СДГ в спермиях челове­
ка; ×1000 [7, 113]. Мелкие одиночные гранулы диформазана на фоне слабо­
диффузного прокрашивания цитоплазмы (а). Реакция на СДГ варьирует в за­
висимости от клеточной дифференцировки: в незрелых формах спермиев
гранулы более крупные по сравнению со зрелыми спермиями, часто слива­
ются между собой (б)

Рис. 45. Влияние ПЭО-400 на активность пероксидазы в клетках костного
мозга доноров. Интенсивная реакция в эозинофильных гранулоцитах и отсут­
ствие ее в нейтрофильных; ×1000 [151, 154]. В исходном костном мозге про­
дукт реакции на пероксидазу в виде мелких гранул равномерно заполняет ци­
топлазму гранулоцитов костного мозга человека (а); после действия ПЭО-400
продукт реакции на пероксидазу не отличается от исходного уровня (б)

Рис. 46. Влияние ПЭО-400 на активность ЦХО в клетках костного мозга кро­
ликов; ×1000 [151, 154]. В исходном костном мозге продукт реакции на ЦХО
в виде гранул диформазана средней величины локализуется в цитоплазме
гранулоцитов и миелоцитов (а); после действия ПЭО-400 характер и распреде­
ление гранул продукта реакции не изменились по сравнению с контролем (б)

Рис. 47. Влияние ПЭО-400 на активность СДГ в клетках костного мозга до­
норов; ×1000 [151, 154]. В клетках исходного костного мозга показана умерен­
ная реакция в гранулоцитах (а) и выраженная — в миелоцитах и тромбоцитах
(б); после действия ПЭО-400 реакция на СДГ не отличается от контроля (в)

Рис. 48. Влияние ПЭО-400 на активность НАД- и НАДФ·H2-ДГ в клетках
костного мозга доноров; ×1000 [151, 154]. В гранулоцитах, миелоцитах, тром­
боцитах и в мегакариоците (видны отшнуровавшиеся тромбоциты) исходно­
го костного мозга реакция на дегидрогеназы колеблется от умеренной до вы­
раженной (а, б); после действия ПЭО-400 характер и интенсивность реакции
на дегидрогеназы в гранулоците (сверху вниз), нормобласте, миелоците и
тромбоцитах не отличаются от контрольных проб (в)

Рис. 49. Влияние ПЭО-400 на активность Г-6-ФДГ в клетках костного моз­
га доноров; ×1000 [151, 154]. Реакция на активность энзима в гранулоцитах,
миелоцитах и тромбоцитах усиливается по мере созревания клеток (а); после
действия криопротектора характер и локализация продукта реакции в грану­
лоцитах и тромбоцитах не отличаются от контрольных величин (б)

Рис. 50. Активность ЦХО в клетках исходного костного мозга кроликов;
×1000 [153]. Продукт реакции на ЦХО в виде мелких гранул диформазана
равномерно заполняет цитоплазму гранулоцитов, моноцитов и нормобластов

Рис. 51. Активность ЦХО в клетках костного мозга кроликов при однократ­
ном введении 10- и 15%-х растворов ПЭО-1500; ×1000 [153]. Характер рас­
пределения продукта реакции резко изменился по сравнению с контролем;
крупные гранулы нестандартой величины (внизу) либо почти полное их от­
сутствие (вверху)

Рис. 52. Активность ЦХО в
клетках костного мозга кро­
ликов после внутривенного
введения 1/20 ЛД-50 10%-го
раствора ОЭП; ×1000 [153].
Распределение продукта реак­
ции на ЦХО в гранулоцитах
(а) и миелоцитах (б) не отли­
чается от контроля (рис. 50)

Рис. 53. Активность ЦХО и α-ГФДГ в клетках костного мозга кроликов по­
сле внутривенного введения 1/10 ЛД-50 10%-го раствора ОЭП; ×1000 [153].
Умеренная реакция на ЦХО (а) и α-ГФДГ (б) в миелоцитах и нормобластах
костного мозга кроликов

о

Рис. 56. Клеточный состав ЭПЧ 3—5—6-недельной гестации плода до и по­
сле замораживания с ДМСО; окраска по Романовскому; ×1000 [61, 154].
В клетках ЭПЧ 5-недельного развития двуядерный мегалобласт, базофиль­
ные и ортохромные мегалобласты (а), островки Бэссиса (б). При реакции на
внутриклеточный гемоглобин клеток ЭПЧ 3-недельной гестации хорошо
прослеживаются моноцитарный предшественник, ортохромные мегалоциты
(в), макрофаг, ортохромные мегалобласты (г), примитивный эритробласт,
ортохромные мегалобласты (д, е). После замораживания—оттаивания клеток
ЭПЧ 6-недельной гестации повышается проницаемость ядерных мембран (е)

Рис. 57. Клеточный состав ЭПЧ 7—8-недельной гестации; окраска по МайГрюнвальду; ×1000 [61, 154]. Уменьшается количество примитивных эритро­
бластов 7- (а) и 8- (б) недельного развития, увеличивается количество дефи­
нитивных; представители моноцитарно-макрофагального ряда составляют
небольшой процент (в)

Рис. 58. Внутриклеточный гемоглобин клеток ЭПЧ 11-недельного развития;
×1000 [61, 154]. Ортохромные мегалобласты и мегалоциты (а). После экспо­
зиции с ДМСО клеточный состав, включая клетки-предшественники, суще­
ственно не изменился (б)

Рис. 59. Реакция на внутриклеточный гемоглобин в клетках ЭПЧ (смесь 6, 8,
12 недель); ×1000 [61, 154]. В исходных клетках ЭПЧ показан эритробласт,
мегалобласты (а), макрофаг, поглотивший мегалобласты (б). После заморажи­
вания-оттаивания с ТЭГ видны гемоцитобластоподобные клетки-предше­
ственники гемопоэза (в), мегакариоциты (г). Гемоглобин в ядре отсутствует

Рис. 60. Клетки ЭПЧ 5—7-недельной гестации; ×1000 [61, 154]. Наличие фе­
тального гемоглобина в цитоплазме клеток 5- (а) и 7- (б) недельного разви­
тия. Реакция на внутриклеточный гемоглобин

Рис. 61. Клетки ЭПЧ 5, 7, 11-недельной гестации; ×1000 [61, 154]. Видны ос­
тровки Бэссиса (скопление эритроидных клеток вокруг макрофага) в клетках
ЭПЧ 5- (а), 7- (б) и 11- (в) недельного развития. Реакция та же

Рис. 65. Локализация продукта реакции на СДГ в спермиях человека; ×1000
[9, 114]. Умеренная реакция на СДГ в зрелых спермиях, выраженная — в нез­
релых формах (а). После суток гипотермического хранения характер реакции
на СДГ в спермиях человека существенно не изменился (б)

Рис. 66. Предпосевная обра­
ботка семян фасоли охлажде­
нием (4 °С), цитохромом c и
холинхлоридом. Несмотря на
неблагоприятные агротехни­
ческие условия (затемненный
садовый участок, густо заса­
женный плодовыми деревья­
ми), урожайность бобовых су­
щественно увеличилась (а).
На каждой ветке — по 20—25
стручков (б), в контроле их от
10 до 15

Рис. 67. Предпосевная обработка семян тыквы и кабачков охлаждением
(4 °С), цитохромом c и холинхлоридом [70]. Агротехнические условия те же,
что на рис. 66. Получен криогибрид тыквы и кабачков (F1), в 2 раза превы­
шающий скорость роста (а) по сравнению с контролем (б), без предпосевной
обработки

Рис. 68. Предпосевная об­
работка семян тыквы ох­
лаждением (4 °С), цитохро­
мом c и холинхлоридом.
Агротехнические условия
те же, что на рис. 66. Уро­
жайность опытных образ­
цов тыквы (слева) значи­
тельно превалирует над
контролем (справа)

Рис. 69. Предпосевная об­
работка семян тыквы ох­
лаждением (4 °С), цитохро­
мом c и холинхлоридом.
Агротехнические условия
те же, что на рис. 66. Ско­
рость роста образцов тык­
вы F2 (а), F3 (б), F4 (в) и F5
(г) не отличается от тако­
вой F1 (рис. 67, а) [70]

Рис. 70. Предпосевная обработка растениеводческих культур (фасоли, тыквы,
кабачков, свеклы, моркови) охлаждением (4 °С), цитохромом c и холинхло­
ридом, несмотря на неблагоприятные агротехнические условия (см. рис. 66),
дала высокую урожайность растениеводческих культур [70]

Определение некоторых терминов

Еще в 1975—1976 гг. криоконсервирование биологических
объектов вышло за рамки научного поиска и вступило в фазу широкого
внедрения в практику. В итоге результаты криобиологических исследова­
ний получили широкое применение в различных областях медицины, ме­
дицинской, пищевой и биологической промышленности, животновод­
ства (искусственное осеменение), растениеводства и других отраслях.
Отсутствие унифицированных определений ряда понятий в криобио­
логии затрудняет сопоставление и анализ результатов исследований, по­
лученных в различных лабораториях и научных центрах, что тормозит
дальнейшее развитие всей проблемы криоконсервирования.
В настоящее время по результатам совещаний на различных уровнях,
включая международные конгрессы холода, выработаны общие принци­
пы систематизации технических средств криоконсервирования и терми­
нология, которые соответствуют современным положениям криобиоло­
гии, необходимым для описания результатов криобиологических иссле­

дований.
Криобиология как наука возникла на стыке биологии, медицины,
физики, биофизики, химии, математики, криогенного машиностроения,
поэтому используются термины и специальные, и механически перене­
сенные из этих наук без учета особенностей и представлений, сложив­
шихся в новой дисциплине. Поскольку механизмы программированной
жизни клетки закодированы в геноме, возникла необходимость допол­
нить терминологию генетическими и другими терминами, которыми руко­
водствуются ученые из различных областей биологии, медицины и сель­
ского хозяйства.
Предлагаем следующие формулировки понятий, применяемых в
криобиологии, криомедицине, животноводстве и растениеводстве.
Аберрация — измененная структура хромосомы или хроматиды, воз­
никающая в результате разрыва, за которым обычно следует соединение
разорванных концов в новых сочетаниях.

244

Определение некоторых терминов
Абсолютный нуль — теоретически обоснованная температура, при ко­
торой полностью прекращается молекулярная активность.
Адаптация — энергетически устойчивое состояние заданной живой
системы, выработанное в процессе эволюции, обеспечивающее организ­
му способность поддерживать гомеостаз в экстремальных условиях среды.
Аллель — любой локус хромосомы может в разных случаях иметь раз­
ную структуру, поэтому в нем располагаются разные гены, которые назы­
вают аллельными. Если число таких аллелей больше двух, то они обра­
зуют систему множественных аллелей. Каждая хромосома содержит то­
лько один из аллелей. Однако любая особь может содержать несколько
(обычно два) аллелей, поскольку она имеет две или несколько гомологич­
ных хромосом, каждая из которых несет данный локус.
Аллополиплоид (аллоплоид) — полиплоидный организм, содержащий
хромосомные комплексы двух или большего числа исходных видов.
Анабиоз — состояние временного прекращения или торможения ме­
таболических процессов в биологической системе.
Анабиоз холодовый — анабиоз, вызванный снижением температуры.
Анафаза — стадия митоза и мейоза, в течение которой хроматиды или
хромосомы, до этого соединенные в пары, расходятся к разным полюсам.
Ангидробиоз — глубокое и длительное торможение метаболизма в ре­
зультате дегидратации. Под термином «ангидробиоз» имеют в виду спо­
собность некоторых микроорганизмов, растений и беспозвоночных жи­
вотных к глубокому обезвоживанию без нарушения жизненных структур
и их оживание после оводнения.
Анеуплоид — организм, у которого число хромосом не кратно основ­
ному числу.
Анеуплоидия (ан + эуплоидия; син.: гетероплоидия) — отсутствие отде­
льных хромосом или их избыточное количество в геноме; лежит в основе
ряда хромосомных болезней.
Антифризы — вещества, понижающие температуру замерзания жид­
кости.
Антифризы биологические — вещества, накапливающиеся в организме
арктических рыб и некоторых других биологических объектов, которые
обеспечивают понижение температуры замерзания крови и лимфы.
Апомиксис — размножение семенами, осуществляемое не обычным
половым путем, а каким-либо иным способом.
Апоптоз (явление) — программированная гибель клетки.
Апоптоз (терминология) (от греч. «apoptosis» — опадание листьев)
служит для характеристики процесса, противоположного митозу. Обозна­
чает совокупность реакций клеточной гибели, регулируемых внутренней
генетической программой. Согласно биохимическому способу определе­
ния, апоптоз — активная форма клеточной смерти, являющаяся результа­
том реализации ее генетической программы или ответом на внешние сиг­
налы и требующая затрат энергии и синтеза макромолекул de novo. Сог­
ласно морфологическому способу определения, апоптоз — форма гибели
клетки, проявляющаяся в уменьшении ее размера, конденсации и фраг­

245

Определение некоторых терминов
ментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматических мем­
бран без выхода содержимого клетки в окружающую среду.
Биоз — активная жизнедеятельность.
Биологический объект — система живой материи, имеющая морфоло­
гическую и функциональную самостоятельность. Подразумеваются сис­
темы, находящиеся на любых уровнях биологической организации.
Биологический температурный нуль — температура, при которой пол­
ностью прекращается обмен веществ.
Веретено — компонент клетки, имеющий волокнистую структуру;
функционирует в течение мета- и анафазы митоза и мейоза и принимает
участие в движении хромосом к экватору и полюсам.
Вещество-рецептор — вещество, находящееся в определенных учас­
тках клеточной стенки бактерии и делающее возможным заражение тем
или иным специфическим бактериофагом.
Витрификация — затвердевание жидкости без изменения степени
упорядоченности структуры.
Выживание при низких температурах — способность (обычно выра­
жается во времени) клетки, ткани или организма сохраняться при воздей­
ствии низких температур.
Вымерзание растений — гибель растений или их частей в результате обра­
зования льда в тканях при соответствующем понижении температуры тела.
Выражение гена — внешний эффект гена, который может изменяться
в зависимости от различных внешних влияний или разного генного окру­
жения, а иногда совсем отсутствует.
Гамета — половая клетка.
Гаплоид (организм) — организм, клетки которого содержат лишь
один геном.
Гаплоид (термин) — используется для того, чтобы подчеркнуть, что
гаметы (у диплоидных видов) содержат только по одной хромосоме каж­
дого типа.
Гаплофаза — стадия развития у разных организмов, на которой ядра
клеток содержат такое же число хромосом, как и гаметы. Это число вдвое
меньше того, которое имеется в диплофазе. Как правило, каждый тип
хромосом представлен в гаплофазе одним экземпляром.
Гемопоэтическая стволовая клетка — стволовая клетка, способная
развиваться во все клеточные элементы крови (эритроциты, тромбоциты
и лимфоциты).
Ген — маленький участок хромосомы, обладающий определенной
биохимической функцией и оказывающий специфическое влияние на
свойства особи.
Геном — хромосомный набор; совокупность качественно различных
хромосом, образующих единое целое. В гаметах диплоидных видов имеет­
ся один такой геном, в соматических клетках — по два генома. Клетки по­
липлоидных видов содержат по нескольку геномов.
Генотип — сумма всех генов организма — наследственная конститу­
ция. Представляет собой сумму хроматина и плазматина и включает в се­

246

Определение некоторых терминов
бя генетическую конституцию всех клеточных органоидов, обладающих
генетической функцией.
Ген-оператор — ген, функционирующий как пусковой механизм. Под
влиянием гена-регулятора он включает или прерывает синтез определен­
ных ферментов.
Ген-репрессор — ген, блокирующий действие функционирующего гена-оперона, что приводит к снижению уровня синтеза белков. При свя­
зывании репрессора метаболитами-эффекторами синтез белков вновь ак­
тивизируется.
Ген-супрессор — ген, который подавляет активность другого гена,
присутствующего в гомозиготном состоянии. При активации гена-суп­
рессора наблюдается как бы обратная мутация из рецессивного состояния
в доминантное.
Гены-регуляторы — гены, контролирующие действие структурных ге­
нов.
Гены структурные — гены, выполняющие роль матриц, на которых
синтезируется информационная РНК. Ген-репрессор (подавление) — ве­
щество, вырабатываемое генами-регуляторами. Блокирует действие фун­
кционирующего гена — оперона, что приводит к снижению уровня син­
теза белков.
Гетерозигота — особь, дающая несколько типов генетически различ­
ных половых клеток. Это обусловлено тем, что соответствующие локусы
ее гомологичных хромосом содержат разные аллели.
Гетерозис — увеличение размеров и мощности гибридов по сравне­
нию с родительскими формами (гибридная мощность).
Гетерохроматин (конденсированный хроматин), эухроматин (деконденсированный хроматин) — вещества хромосом, которые в покоящемся
ядре не окрашиваются либо окрашиваются слабо. В митозе и мейозе они
могут окрашиваться сильно. Определенные участки хромосом, которые
называются гетерохроматическими, отличаются по окрашиваемости от
эухроматических участков и ясно видны в стадии покоя. В эухроматине
преимущественно расположены активные гены, тогда как функция гете­
рохроматина не совсем ясна.
Гибрид (от лат. hibrida — помесь) — организм (клетка), полученный в
результате объединения генетического материала генотипически различ­
ных организмов (клеток), т.е. гибридизации.
Гибридизация — слияние различных соматических клеток (например,
в тканевых культурах) с образованием одной, сочетающей в себе генети­
ческую информацию исходных родительских клеток.
Гипотермические температуры — диапазон положительных температур
ниже тех, к которым биологические объекты адаптированы.
Гипотермия общая; гибернация (искусственная) — состояние организ­
мов теплокровных животных и человека, характеризующееся пониже­
нием температуры тела, вызванном угнетением центров терморегуляции в
результате переохлаждения, некоторых патологических состояний и дей­
ствия лекарственных веществ.

247

Определение некоторых терминов
Гомологичная область — участки сходной последовательности амино­
кислотных остатков в тяжелых и легких цепях иммуноглобулинов. Каж­
дая гомологичная особь насчитывает 105—115 остатков и стягивается
внутрицепьевым дисульфидным мостиком, образуя глобулярный домен,
подобный по форме соседним доменам.
Делеция — утрата одного из внутренних (неполовых) участков хро­
мосом.
Диапазоны температур — от 0 °С и выше — зона температурного опти­
мума биологической активности (различная для ряда биологических объ­
ектов); от 0 до -10 °С — зона перехода клеток в состояние неполного ана­
биоза; от -10 до -80 °С — зона кристаллизации охлажденной и переохлаж­
денной окружающей и внутриклеточной воды и перехода клеток в состоя­
ние анабиоза; от -80 до -130 °С — зона кристаллизации связанной и ад­
сорбционной воды и рекристаллизационных процессов; от -130 до
-273 °С — зона отсутствия кристаллизационных и рекристаллизационных
процессов.
Диплоид — организм с двумя гомологичными наборами хромосом в
соматических клетках. Термин используется также для обозначения того,
что особь имеет удвоенное число хромосом (2 л), образовавшихся в резуль­
тате оплодотворения, в отличие от гаплоидного числа (и), содержащегося
в гаметах.
Добавочная хромосома (В-хромосома) — сверхкомплектная хромосо­
ма, которая не гомологична ни одной из обычных хромосом и отсутствие
которой не снижает жизнеспособности особи.
Долголетие — социально-биологическое явление, характеризующееся
доживаемостью человека до высоких возрастных рубежей. Согласно ре­
шению, принятому на Всесоюзном симпозиуме геронтологов в Ленин­
граде (1962) и на Европейском семинаре ВОЗ в г. Киеве (1963), отсчет
долгожительства ведется с 90 лет, а в некоторых статистических и герон­
тологических исследованиях — со 100 лет.
Домен (domain) — стереотипное проявление третичной структуры
(пространственной укладки) белков. Глобулярное образование, включаю­
щее участок цепи длиной до 150 аминокислотных остатков, последовате­
льность которых иногда может быть близка (гомологична) последовате­
льности участка, образующего соседний домен.
Дупликация — структурное изменение хромосомы, при котором один
из участков представлен в хромосомном наборе более одного раза.
Жизнеспособность — комплекс морфологических и функциональных
свойств, характеризующих состояние основных жизненных процессов,
присущих данному биологическому объекту.
Жизнеспособность клетки — клетка является живой системой, спо­
собной создавать заново и поддерживать в высокоупорядоченном рабо­
тоспособном состоянии свои внутренние структуры и осуществлять мно­
гочисленные химические превращения, в том числе процессы синтеза
белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов.

248

Определение некоторых терминов
Закаливание — повышение резистентности биологических объектов к
различным неблагоприятным условиям посредством воздействия низких
температур.
Замораживание биологического объекта — фазовый переход вода—лед
в биологическом объекте.
Зигота — клетка, образующаяся при слиянии двух гамет (половых
клеток).
Зимостойкость (растений) — способность растений к переживанию и
сохранению своего жизненного цикла в условиях сезонного понижения
температуры окружающей среды.
Иммунитет — термин, впервые употребленный в 1901 г. И.П. Меч­
никовым для обозначения системы защиты организма от внешнего ин­
фекционного агента. Иммунитетом называют способность иммунной
системы к отторжению чужеродных тел.
Иммуноглобулины — глобулины человека и животных, выполняющие
функции антител.
Инверсия — изменение в положении хромосомного участка, при ко­
тором он поворачивается на 180° (например, последовательность генов
1-2-3-4 превращается в последовательность 1-3-2-4).
Интерфаза — стадия покоя между первым и вторым делением мейоза
или между двумя митозами.
Интерфероны (спиральные цитокины) — белки, подавляющие репли­
кацию вирусов в клетках. Видоспецифичны, но вирусонеспецифичны.
Различают типы: Z-интерферон (лейкоцитарный), F-интерферон (фиб­
робластный) и /-интерферон (иммунный) и т. д.
Информационная РНК (РНК-посредник, мРНК) — РНК, переносящая
информацию от генов к рибосомам, в которых происходит синтез белка.
Канцерогенный — вызывающий злокачественный рост.
Кариотип — совокупность особенностей хромосомного комплекса,
касающихся числа и формы хромосом.
Каспазы — эволюционно-консервативные цистеиновые протеазы.
Клетка — элементарная структурная и функциональная единица рас­
тительных и животных организмов, способная к самовоспроизведению и
развитию. Термин «клетка» впервые введен в 1665 г. английским ученым
Р. Гуком, который, рассматривая под микроскопом тонкие срезы мертвой
пробковой ткани растений, заметил, что она состоит из мелких ячеек, на­
подобие пчелиных сот, отделенных друг от друга перегородками. Эти эле­
ментарные ячейки Р. Гук и назвал клетками.
Клетка-мишень (target cell) — аномальная красная клетка крови (эрит­
роцит), внутри которой при окрашивании образца крови наблюдаются
сменяющие друг друга темные и светлые кольца. Существование кле­
ток-мишеней в крови наблюдается при некоторых видах анемий, в том
числе при железодефицитной анемии, заболеваниях печени и наруше­
ниях в структуре гемоглобина. Мишенями для препаратов микробного

249

Определение некоторых терминов
происхождения являются фагоциты, моноциты и макрофаги. Клетка-ми­
шень очищает организм от токсинов.
Клеточная культура (перевиваемая культура) — выращивание клеток
in vitro в искусственной среде для экспериментальных исследований.
Клеточная линия — последовательные поколения клеток, развиваю­
щиеся из определенного исходного органа и генотипически приспосабли­
вающиеся к жизни в культуре ткани. Клеточные линии обычно малигнизируются, приобретая свойства злокачественных клеток.
Клон — совокупность всех потомков, полученных от одной исход­
ной особи способом вегетативного размножения или апомиктического
образования семян. Применительно к животным клеткам клон — линия
клеток, которая генетически идентична исходной клетке-предшествен­
нице. Как правило, этой клеткой-предшественницей является стволовая
клетка.
Клонирование генов — выделение и размножение специфических
фрагментов чужеродных ДНК в плазмидных или фаговых векторах, реп­
лицирующихся в культурах бактерий или дрожжей. Центральный метод
технологии рекомбинантных ДНК, разработанный в 1972—1973 гг. в ла­
бораториях Бойера, Коэна и Берга в Стапфорде и Сан-Франциско.
Кодон — группа оснований нуклеотидов, кодирующая определенную
аминокислоту.
Коммитированная клетка — клетка, способная к самообновлению, но
еще не выполняющая специфической функции. Является ранним потом­
ком стволовой клетки.
Консервирование биологических объектов; консервация — сохранение
определенных свойств биологического объекта в искусственных усло­
виях.
Криоаппликация — контактное замораживание ткани.
Криобиологическая система — комплекс, состоящий из биологическо­
го объекта, физических, химических и других средств защиты, подготов­
ленных к криоконсервированию.
Криобиология — раздел биологии, изучающий состояние биологичес­
ких объектов в диапазоне температур ниже тех, к которым они адаптиро­
ваны.
Криовоздействие — местное применение низких температур с лечеб­
ной целью.
Криогибрид — организм (клетка), полученный в результате объедине­
ния генетического материала генотипически различных организмов (кле­
ток) под влиянием диапазона температур ниже тех, к которым они адап­
тированы.
Криозащита — комплекс воздействий, предохраняющий биологичес­
кий объект от криоповреждения, независимо от температур, при которых
оно возникло, включая и температуры ниже 120 К.
Криокоагуляция — свертывание (каогуляция) ткани при местном при­
менении низких температур.

250

Определение некоторых терминов
Криоконсервирование биологических объектов; криоконсервация —
комплекс мероприятий, обеспечивающий хранение биологического объ­
екта при низких температурах в жизнеспособном состоянии. Состоит из
ряда этапов: подготовка к замораживанию, хранение, размораживание и
восстановление.
Криолабильные биологические структуры, криолабильность — биологи­
ческие структуры, теряющие жизнеспособность при понижении темпера­
туры.
Криомедицина — отрасль знаний, изучающая действие низких темпе­
ратур в различных областях медицины.
Крионекроз — разрушение клеток, тканей и органов при криовоздей­
ствии.
Криообновление (явление) — программированная жизнь охлажденной
и криоконсервированной клетки, обозначает совокупность реакций, ак­
тивирующих жизнедеятельность охлажденной и криоконсервирован­
ной клетки с последующим переводом ее на более высокий уровень го­
меостаза.
Криообновление (терминология) — изменения охлажденных и крио­
консервированных биологических объектов в диапазоне температур ниже
тех, к которым они адаптированы.
Криообъект — биологический объект для криоконсервирования.
Криоповреждение — изменения, наступающие при понижении темпе­
ратуры ниже уровня, к которому адаптирован биологический объект, в
том числе и наблюдающиеся в процессе криоконсервирования.
Криопротекторный агент, криопротектор, криозащитный агент — ве­
щество, предупреждающее криоповреждение. В соответствии с характе­
ром взаимодействия с клеткой может быть экзоцеллюлярным или эндоцелл юлярным.
Криораспылитель — криохирургический инструмент для охлаждения
поверхности открытой струей хладагента.
Криорезекция — удаление части органа или (при промораживании)
линии разреза.
Криорезистентность — способность биологических объектов или от­
дельных биологических структур сохранять жизнеспособность после по­
нижения температуры вплоть до криогенных.
Криостабильные биологические структуры, криостабильность — биоло­
гические структуры, сохраняющие жизнеспособность при понижении
температуры.
Криотемпература — температура ниже 120 К.
Криптобиоз — скрытая жизнь. Исключительно широко распростра­
ненное в природе состояние физиологического покоя организмов.
Летальный ген — ген, наличие которого (особенно в гомозиготном
состоянии) приводит организм к гибели.
Лизис — растворение бактериальной клетки после проникновения в
нее фаговой частицы и образование в ней новых фагов.
Локус — место в хромосоме, в котором расположен ген.

251

Определение некоторых терминов
Макрофаг, или фагоцит (от греч. ρhagien — есть, поедать, пожирать).
И.И. Мечников первый связал фагоцитоз с защитной функцией иммун­
ной системы. Именно с открытия фагоцитоза началась клеточная имму­
нология.
Матрикс — вещество, которое, очевидно, накапливается вокруг хро­
мосом в течение последних стадий профазы. Делает хромосому более тол­
стой и скрывает ее спиральную структуру.
Метафаза — стадия митоза и мейоза, в которой хромосомы соби­
раются на экваторе веретена, образуя так называемую хромосомную, или
метафазную, пластинку.
Метод ИКСИ (ICSI) (от англ. Intra Cytoplasmic Sperm Injection — вве­
дение сперматозоида в цитоплазму ооцита). Используется в программе
ЭКО. Является одним из вариантов процедуры оплодотворения in vitro.
Если для проведения программы ЭКО требуется большое количество ка­
чественных сперматозоидов, то для ИКСИ достаточно одного. Таким об­
разом, качество спермы почти не влияет на частоту наступления беремен­
ности.
Митоз — деление ядра, приводящее к образованию двух дочерних
ядер. В течение этого процесса каждая хромосома удваивается. Удвоение
хромосом происходит до деления ядра, и уже в профазе можно видеть, что
каждая хромосома является двойной и состоит из двух хроматид. В анафа­
зе эти хромосомы отходят к разным полюсам.
Митохондрии — тельца разной формы, содержащиеся в цитоплазме; в
них сосредоточены энергетические процессы клетки. Митохондрии обыч­
но очень многочисленны.
Модификация — фенотипическое изменение, вызванное влиянием
окружающих условий.
Мутаген — фактор, вызывающий мутации.
Мутант — организм, отличающийся от первоначального типа инди­
видуальным отклонением, возникающим в результате мутации.
Мутация — изменение наследственного материала клеток. Виды му­
таций: изменение кариотипа, хромосомные аберрации и генные мутации.
Изменение кариотипа может быть связано с отклонением числа хромо­
сом в ядре от типичного диплоидного (гашюидность, полиплоидность,
анеуплоидность). Хромосомные аберрации сопровождаются необратимы­
ми структурными изменениями хромосом, видимыми в световом микро­
скопе (нехватки или делеции, дупликации, инверсии, транслокации и
разрывы хромосом).
Нейроны — клетки головного мозга.
Некроз (от греч. necros — мертвый) — гибель клеток и тканей в живом
организме под воздействием болезнетворных факторов. Этот вид клеток
генетически не контролируется.
Низкие температуры — интервал температур от 0 до -15 °С
(273-120 К).
Нормоспермия (син.: нормозооспермия). Характеризует состояние ор­
ганизма, при котором все показатели спермограммы находятся в пределах

252

Определение некоторых терминов

нормальных величин. Содержание в эякуляте сперматозоидов у здорового
мужчины зрелого возраста составляет 60—150 млн/мл, из них подвиж­
ных — не менее 70 %. Нормоспермия свидетельствует о нормальном про­
цессе сперматогенеза и высокой жизнеспособности сперматозоидов.
Обновление (от лат. novus — обновлять). Согласно классической тер­
минологии, под термином «обновление» понимается распространенное
исключительно в природе состояние физиологической активации жиз­
ненно важных процессов, проявляющееся в результате самоизменения
биологического объекта. Стать «обновленным» означает: 1) приобрести
другой характер; 2) приобрести другой вид; 3) стать новым по составу, по­
полниться включением, внесением чего-то нового в результате каких-ли­
бо перемен, изменений, преобразований.
Овоцит — клетка, из которой у животных образуется яйцеклетка.
Октоплоид — организм, клетки которого содержат 8 геномов.
Олигоастеноспермия — уменьшение количества и подвижности спер­
миев.
Оперон — ряд линейно расположенных генов, структурная активность
которых координируется прилегающим к ним функциональным геном.
Считают, что по всей длине оперона синтезируется одна-единственная
лента комплементарной РНК. Поэтому оперон называют единицей транс­
крипции, в понятие которой входит «переписывание», перенос генетичес­
кого кода.
Оперонная регуляция (регуляция на уровне транскрипции) — основ­
ной механизм регуляции активности генов у прокариот и бактериофагов.
Оперон может состоять из одного, двух и более тесно сцепленных струк­
турных генов, кодирующих белки (ферменты), осуществляющие последо­
вательные этапы биосинтеза какого-либо метаболизма. Кроме того, каж­
дый оперон содержит регуляторные элементы: промотор (участок начала
транскрипции) и оператор (с которым связывается репрессор), располо­
женные в начале оперона, а также терминатор (сигнал к прекращению
транскрипции) — в конце оперона.
Оплодотворение искусственное вне организма матери (in vitro fertiliza­
tion, IVF) — оплодотворение яйцеклетки вне организма; осуществляется
выращиванием зиготы до стадии бластоцисты и ее дальнейшей импланта­
цией в матку.
Отогрев — процесс повышения температуры биологического объекта
в результате подвода тепла.
Охлаждение — удаление (отвод) тепла. Снижение температуры ниже
пределов, к которым адаптирован биологический объект.
Пентаплоид — организм, клетки которого содержат 5 геномов.
Плазмоген — ген, который, как полагают, локализован в цитоплазме.
В некоторых случаях оказалось, что плазмогены имеют вирусную приро­
ду. Однако провести четкую границу между вирусом и настоящей цито­
плазматической частицей не всегда возможно.
Полиплоидия — наличие в пределах вида форм с различным числом
хромосом, кратным одному основному числу.

253

Определение некоторых терминов
Программированное (программное) замораживание биологических
объектов — охлаждение биологического объекта с поддержанием пара­
метров на заранее запланированных условиях.
Программированное (программное) оттаивание (отогрев) биологичес­
ких объектов — отогрев биологического объекта с поддержанием пара­
метров на заранее запланированных условиях.
Пролиферация — увеличение популяции клеток непрерывным деле­
нием отдельных клеток на две идентичные дочерние клетки.
Промотор — короткая последовательность нескольких участков нук­
леотидов ДНК, с которой специфически связывается фермент РНК-по­
лимераза, осуществляющая транскрипцию ДНК. В случае положите­
льной регуляции необходимо присоединение к промотору активатора. В
результате связывания оператора с репрессором РНК-полимераза не мо­
жет двигаться вдоль оперона и транскрипция структурных генов не про­
исходит.
Проницаемость клеточной мембраны — специфическое свойство кле­
точной мембраны и мембран внутриклеточных структур «впускать» в
клетку (или ее органеллы) необходимые для жизнедеятельности вещества
(аминокислоты, сахара, жирные кислоты, ионы и т. д.) и «выпускать» ве­
щества, подлежащие удалению.
Протеазы — ферменты, расщепляющие белки.
Профаза — стадия митоза или мейоза, охватывающая преобразование
клеточного ядра в период до растворения ядерной оболочки.
Размораживание—оттаивание, дефростация — повышение температу­
ры биологических объектов, сопровождающееся фазовым переходом льда
в жидкое состояние.
Рекомбинация — перегруппировка генов при образовании гамет у гиб­
рида, ведущая к новым сочетаниям признаков у потомства.
Рекристаллизация — процесс образования крупных кристаллов из бо­
лее мелких.
Репликация — «копирование», самовоспроизведение молекул ДНК
редупликацией (удвоением их количества).
Репрессия — подавление.
Рецептор (лиганд) — вещество, изменяющееся в определенных учас­
тках оболочки бактерий и допускающее ее заражение бактериофагом оп­
ределенного типа.
Рибосома — клеточная частица, в которой происходит синтез белка.
Рибосомная РНК (гРНК) — РНК, находящаяся в рибосомах и обра­
зующая основную массу РНК клетки.
Скорость охлаждения — скорость понижения температуры объекта.
Предлагается следующая классификация скоростей охлаждения в данной
точке биологического объекта: а) сверхбыстрое —103—104оС/мин; б) очень
быстрое — 102—103 °С/мин; в) быстрое — 10—102 °С/мин; г) медленное —
1—10 °С/мин; д) очень медленное — менее 1 °С/мин.
Сперма — (от. греч. sperma, син.: семенная жидкость). Жидкость, вы­
деляемая при эякуляции, представляющая собой взвесь сперматозоидов в

254

Определение некоторых терминов
смеси секретов придатков яичка, предстательной, бульбоуретральной и
других желез.
Сперматограмма (спермато + греч. gramma — запись; син.: спермограмма) — совокупность результатов качественного и количественного
исследования эякулята (данные о физических свойствах, химическом и
клеточном составе).
Сперматиды (spermatida) — мужская половая клетка, образующаяся из
сперматоцита II порядка в результате второго деления, созревания и обла­
дающая гаплоидным набором хромосом.
Сперматогонии (spermatogonium; спермато + греч. gone — поколение,
порождение) — клетка сперматогенного эпителия, из которого разви­
ваются мужские половые клетки.
Сперматоцит (spermatocytus; спермато + гистологическое cytus —
клетка) — незрелая мужская половая клетка, образующаяся из сперматогония и превращающаяся при втором делении созревания в сперматиду.
Спячка — состояние временного обратимого торможения физиологи­
ческой активности.
Стволовая клетка — неспециализированная клетка, которая способ­
на делиться (самореплицироваться) в течение неопределенного периода
времени либо всю жизнь организма способна к самовозобновлению. При
определенных условиях, принимая специфические сигналы, стволовые
клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток, из которых
состоит организм.
Стволовые клетки костного мозга — включают в себя два типа мультипатентных стволовых клеток: гемопоэтические стволовые клетки и мезен­
химальные стволовые клетки. Мезенхимальная стволовая клетка — ство­
ловые клетки мезенхимы. В паренхиматозных органах из стволовых кле­
ток мезенхимы формируется соединительнотканный каркас органов, а
также сеть артерий, капилляров, вен, лимфатических сосудов. Из мезен­
химальных стволовых клеток формируется костно-мышечная система,
хрящ, жир, а также клетки миокарда.
Структурный ген — ген, который в сотрудничестве с геном-операто­
ром и геном-регулятором способен продуцировать специфический фер­
мент или пептид.
Температурный шок — повреждение или гибель биологических объек­
тов при резком изменении температуры от 37 до О °С.
Тетраплоид — организм, клетки которого содержат 4 генома.
Транскрипция («переписывание») — биосинтез молекул РНК на соот­
ветствующих участка ДНК. Первый этап реализации генетической ин­
формации в живых клетках осуществляется ферментом — ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Промотор (участок ДНК) присоединяется к не­
му, расплетает двойную спираль ДНК и копирует, начиная с этого места,
одну из ее цепей, перемещаясь вдоль ДНК и последовательно присоеди­
няя мономерные звенья (нуклеотиды) к образующейся РНК в соответ­
ствии с принципом комплементарности.

255

Определение некоторых терминов
Транслокации (перемещение) — взаимный обмен частями негомоло­
гичных хромосом или прикрепление участка хромосомы из одной пары к
хромосоме из другой. Такие перестройки приводят к нарушению групп
сцепления. Вновь возникшие транслокации сопровождаются летальным
эффектом в гомозиготном состоянии и влияют на развитие тех или иных
признаков.
Транспортная РНК (РНК-переносчик, растворимая РНК, sPHK) —
РНК, которая переносит соответствующие аминокислоты к определен­
ным участкам информационной РНК, служащей матрицей.
Триплоид — организм, клетки которого содержат 3 генома.
Фагоцитоз — пожирание и разрушение чужеродных тел макрофагами
и лейкоцитами.
Фактор некроза опухоли (ФНО) — название связано с цитотоксичнос­
тью этих молекул, т.е. с их способностью убивать клетки-мишени, в том
числе опухолевые клетки.
Фенотип — сумма свойств какой-либо особи на определенной стадии
развития. Представляет собой результат взаимодействия между геноти­
пом и окружающей средой.
Фертильность — плодовитость.
Фрагментация — разрыв хромосом на два или большее число
участков.
Холодостойкость (растений) — способность растений переносить тем­
пературы от 1 до 10 °С.
Хромосома — тельце, находящееся в клеточном ядре и видимое во
время митоза или мейоза. Имеет определенную форму, дифференцирова­
на по своей длине в отношении химической структуры и обычно содер­
жит большое количество генов, обладающих способностью к самовос­
произведению.
Цитокины (кинины) — молекулы, основное назначение которых —
перенос сигналов от клетки к клетке.
Цитоплазма — содержимое живой клетки, за исключением ядра. Час­
то цитоплазмой называют только кажущееся гомогенным основное ве­
щество.
Экспрессия — активность.
Эмбриональные стволовые клетки — примитивные (недифференциро­
ванные) культивированные клетки эмбриона, которые обладают потен­
циалом становиться разнообразными специализированными типами кле­
ток, т.е. являются плюрипотентными. Их получают из внутренней массы
клеток бластоцисты.
Эндополиплоидия — наличие в клетках организма ядер, имеющих раз­
ную плоидность.
Эффект положения гена — изменение действия гена, который в резу­
льтате хромосомной перестройки изменил свое положение в хромосоме.
Эякулят (ejaculatum; от лат. ejaculor, ejaculatus sum — выбрасывать, из­
вергать) — семенная жидкость, выделенная при эякуляции.

256

Определение некоторых терминов

Ядрышко — округлое тельце (одно или несколько) в покоящемся яд­
ре, растворяющееся при переходе от профазы к метафазе. Под влиянием
специальных участков определенных хромосом, обычно несущих спутни­
ки, ядрышки образуются снова при переходе ядра в состояние интерфазы.
Химический состав ядрышка отличается от такового хромосом. Ядрыш­
ко — центр синтеза рибосомной РНК.
β-лимфоцит — лимфоцит, происходящий из костного мозга (bone
marrow) у млекопитающих или из фабрициевой сумки (bursa) у птиц, не
прошедший созревания в тимусе. Центральная клетка гуморального им­
мунного ответа.
— первое поколение, полученное от скрещивания двух родитель­
ских типов. Следующие поколения обозначают F2, F3 и т. д.
11-1, 11-2, 11-3, 11-4, 11-5, 11-6 (Interleukin) — идентифицированные,
структурно и химически охарактеризованные цитокины (в том числе лимфокины и монокины), осуществляющие взаимодействие между клетками
иммунной системы и участвующие в регуляции лимфо- и миелопоэза.
Белки с молекулярной массой от 14 до 60 кДа. Факторы антигеннеспецифических и межклеточных дистантных взаимодействий.
X-хромосома — хромосома, определяющая развитие женского пола у
видов с мужской гетерогаметностью или определяющая пол в гаплофазе.
Y-хромосома — половая хромосома, которая встречается только у осо­
бей мужского пола; в случае, если самец гетерогаметен, У-хромосома оп­
ределяет также пол в гаплофазе.

Summary

The monograph is dedicated to absolutely new trend in bi­
ology, medicine and agriculture — study of mechanisms of
regeneration (programmed cell life) and cryoregeneration
(programmed life of cooled and cryopreserved cell) com­
parable, as to their significance, only with apoptosis (pro­
grammed cell death) since they are its counterpoise. A
main principle is substantiated that health and long life are
based on the shift of dynamic interrelation of opposite pro­
cesses — apoptosis and cryoregeneration towards cryore­
generation.
For biologists, medical specialists, animal-breeders
and plant growers interested in the problems of healing in­
curable diseases and life prolongation, in obtaining more
high-quality progeny in all generations, in perfected meat-and-milk, wine-making, fish-farming and plant-grow­
ing production, elite cryoregenerated seeds.

Список сокращений, принятых в тексте

АДФ — аденозинфосфат
АМФ — аденозинмонофосфат
АТФ — аденозинтрифосфорная
кислота
АФК — активные формы кисло­
рода
α-ГФДГ — α-глицерофосфатдегид­
рогеназа
БАД — биологически активные
добавки
БХШ — белки холодового шока
Г-6-ФДГ — глюкозо-6-фосфатде­
гидрогеназа
ГХА — гены холодовой адаптации
ГХШ — гены холодового шока
ДМСО — диметилсульфоксид
ДНФ — динитрофенол
2,3-ДФГ — дифосфоглицерин
ДЭГ — диэтиленгликоль
ИЛ
— интерлейкин
КБ
— катионные белки
КОЕ — колониеобразующие клет­
ки
КЦГ — краниоцеребральная гипо­
термия
КЭП — клетки эмбриональной
печени
ЛД
— летальная доза
ЛДГ — лакгатдегидрогеназа
МАО — моноаминоксидаза
МДГ — малатдегидрогеназа
МП
— магнитное поле
НАД — никотинамиддинуклеотид
НАД∙H2-ДГ — НАД∙H2-дегидро­
геназа

НАДФ — никотинамиддинуклеотид­
фосфат
НАДФ∙H2-ДГ - НАДФ∙H2-дегид­
рогеназа
НЖ
— нейтральные жиры
НСТ — нитросиний тетразолий
НСТ-тест — тест с нитросиним тетра­
золием
ОЭГ — оксиэтилированный глицерин
ПВП — поливинилпирролидон
ПД
— пропандиол
ПМП — постоянное магнитное поле
ПОЛ — пероксидное окисление ли­
пидов
ПЭГ — полиэтиленгликоль
ПЭО — полиэтиленоксид
СГК — средний гистохимический
коэффициент
СДГ — сукцинатдегидрогеназа
СКК — стволовые кроветворные
клетки
СОЭ — скорость оседания эритро­
цитов
ссДНК — суперспиральная ДНК
ТЭГ — триэтиленгликоль
УЗ
— ультразвуковые колебания
ФМС — феназинметасульфат
ФНО — фактор некроза опухали
ФС
— фосфатидилсерин
ЦХО — цитохромоксидаза
ЭГ
— этиленгликоль
ЭПЧ — эмбриональная печень че­
ловека
п-ФДА — п-фенилендиамин
V
— коэффициент вариации

259

Список литературы

1. Абдулкадыров К.М., Романенко НА. Заготовка плацентарной крови.
Особенности ее клеточного состава и гемопоэтического потенциала // Транс­
фузиология. — 2003. — 4, № 1. — С. 15—33.
2. Аветисова Л. В. Ультраструктура ядра в клетках апикальной меристемы
побега пшеницы при низких положительных температурах // Структура и
функция клеточного ядра: Тез. докл. 8-го Всесоюз. симп., Пущино, 15—18 мая
1984 г. — Пущино, 1984. — С. 3—4.
3. Агроненко В.А., Мелкикян НА., Щербакова Л.Н. Криоконсервирование
эритроцитной массы, восстановленной после длительных сроков хранения //
Пробл. гематологии. — 1977. — № 5. — С. 45—49.
4. Агроненко В.А., Голосова Г.В., Полякова Л.П. и др. Влияние криоконсер­
вирования на снижение риска посттрансфузионных осложнений, связанных с
переносом вирусного гепатита и бактериальным загрязнениям крови // Там
же. - 1977. - № 7. - С. 36-39.
5. Акимова Г.П., Родченко О.П. Изменение активности пероксидазы в
клетках корня кукурузы в условиях низкой температуры // Физиология устой­
чивости растений к низким температурам и заморозкам / Под ред. Р.К. Саляева. — Иркутск, 1976. — С. 4—5.
6. Алексеева В. Г. Динамические аспекты адаптации растений к условиям
севера // 2 Съезд Всесоюз. об-ва физиологов растений: Тез. докл. — Минск,
24—27 сент. 1990. — Минск, 1992. — С. 10.
7. Алексеевская Э.И., Чуб Н.Н., Юрченко Г. Г. и др. Стимулирующее дей­
ствие цитохрома С и холинхлорида на активность сукцинатдегидрогеназы в
спермиях человека, хранившихся в условиях гипотермии // Пробл. криобио­
логии. — 2001. — № 3. — С. 14—15.
8. Алексеевская Э.И., Чуб Н.Н., Крамар М.И. Влияние цитохрома С на под­
вижность и фертильность спермиев человека, хранившихся в условиях гипо­
термии и при -196 °С // Там же. — 2002. — № 2. — С. 59—61.
9. Алексеевская Э.И., Крамар М.И., Чуб Н.Н. и др. Активность сукцинатдегидрогеназы в спермиях человека, хранившихся в условиях гипотермии // Там
же. - 2002. - № 4. - С. 98-102.
10. Алексеевская Э.И., Грищенко В.И. Перспективы возможных преиму­
ществ большей клинической эффективности гемопоэтических клеток, заго­
товленных от эмбрионов и плодов по сравнению со взрослыми донорами //
Укр. журн. гематології та трансфузіології. — 2005. — № 4(5). — С. 121—122.

260

Список литературы

11. Алексеевская Э.И., Грищенко В.И. «Маркеры» раннего апоптоза гемо­
поэтических клеток требуют включения программы криообновления: реа­
льность и перспективы // Пробл. криобиологии. — 2005. — 15, № 3. —
С. 526-528.
12. Алесенко А.В. Фосфолипиды как структурные элементы ядерного мат­
рикса в образовании комплекса ДНК-матрикс в процессе репликации // Инф.
бюл. Науч, совета АН СССР по проблемам радиобиологии. — 1983. — 28. —
С. 46-47.
13. Амстиславский С.Я. Эмбриотехн©логические подходы к сохранению
исчезающих видов млекопитающих: Автореф. дис.... д-ра биол. наук. — Ново­
сибирск, 2006. — 36 с.
14. Ананьина А. В. Влияние криоконсервирования на стрептомицеты —
продуценты антибиотиков: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Харьков,
1991. - 15 с.
15. Андросов С. Г, Гамрецький А. А., Андросова О. С. Спосіб стимуляції репа­
ративного остеогенезу в умовах застосування фетальної кісткової тканини в
експерименті // Пробл. криобиологии. — 2005. — 15, № 3. — С. 372—374.
16. Бабийчук ГА. Механизмы нейрохимических и патофизиологических
процессов в организме животных при краниоцеребральной гипотермии:
Дис. ... д-ра биол. наук. — Харьков, 1986. — 280 с.
17. Бабийчук Н.А. Реакция организма на краниоцеребральную гипотер­
мию // Криобиология. — 1988. — № 2. — С. 3—8.
18. Бабийчук ГА., Грищенко В.И. Проснутся ли «замороженные»? // Хи­
мия и жизнь. — 2001. — № 5. — С. 8—13.
19. Балин В.Н., ЛотовинА.П. Применение цитохрома С и оксигенобаротерапии в гнойной хирургии челюстно-лицевой области // Цитохром с и его
клиническое применение: Сб. науч. тр. НИИ гематологии и переливания кро­
ви. - Л., 1990. - С. 65—68.
20. Баркова Э.Н. Сравнительная характеристика цитохимических методов
выявления внутриклеточного гемоглобина // Лаб. дело. — 1974. — № 7. —
С. 437-438.
21. Бездетко П.А. Влияние полиэтиленоксида на внутриглазное давление
(экспериментально-клиническое исследование): Автореф. дис. ... канд. мед.
наук. — Харьков, 1982. — 14 с.
22. Белоус А.М. Проблемы регенерации тканей при местном криовоздей­
ствии // Пробл. криобиологии. — 1992. — № 1. — С. 14—18.
23. Беляев А.А. G/A-подобная дифференциальная исчерченность М-хро­
мосомы конских бобов Faba // Цитология. — 1992. — 34, № 10. — С. 65—68.
24. Белянович Л.М., Лавруневич Г.В., Лобанок Е.С. Влияние цитокинов LIF
и SCF на функциональную активность мышиных эмбриональных стволовых
клеток линии R1 / Сб. тр. междунар. науч. конф. «Молекулярные, мембран­
ные и клеточные основы функционирования биосистем». VII съезд БОО ФиБ,
21-23 июня, 2006 г. - Минск, 2006. - Т. 1. - С. 193-195.
25. Берстон М. Гистохимия ферментов. — М.: Мир, 1965. — 349 с.
26. Бондаренко В.А. Перекисное окисление липидов в мембранах мито­
хондрий под влиянием низких температур: Автореф. дис. ... канд. биол.
наук. — Харьков, 1977. — 30 с.
27. Ващенко Т.Н., Ващенко Т.И., Петренко Г И. и др. Влияние криокон­
сервирования на топологические переходы суперспиральной ДНК «нуклеои-

261

Список литературы

дов» клеток костного мозга человека // Криобиология. — 1986. — № 1. —
С. 34-38.
28. Ващенко В. И. Сверхспиральная ДНК человека и животных при экстре­
мальных воздействиях: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — СПб: Воен.-мед.
академия и Центр, науч.-исслед. рентгенорадиол. ин-т М3 РФ, 2000. — 44 с.
29. Ващенко В.И. Ингибиторы топоизомераз как лекарственные средства,
механизм их действия // Обзоры по клин, фармакологии и лекарств, тера­
пии. - 2003. - 2, № 4. - С. 2-14.
30. Веселовская 3. Ф. Роль заднего эпителия в процессе приживления на­
тивной и криоконсервированной роговой оболочки при кератопластике:
Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Одесса, 1989. — 22 с.
31. Вересов В. Г. Моделирование связывания проапоптозного белка tBidC
наружной мембраной митохондрий // Сб. междунар. науч. конф. «Молекуляр­
ные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем». VII
съезд БОО ФиБ, Минск, 21—23 июня, 2006 г. — Минск, 2006. — 1. —
С. 199-201.
32. Вержук В.Г., Тихонова Н.Г., Жестков А. С. Жизнеспособность пыльцы
плодовых культур после низкотемпературного хранения и криоконсервации //
Пробл. криобиологии. — 2005. — 15, № 3. — С. 302—305.
33. Винтер А.К. Содержание стеринов, жирных кислот и токоферолов в
зерне яровой пшеницы в зависимости от действия заморозков в ранние фазы
онтогенеза // Физиология устойчивости растений к низким температурам и
заморозкам / Под ред. Р.К. Саляева, О.П. Родченко. — Иркутск, 1980. —
С. 142-147.
34. Вишневский В.И., Скорняков Б.А. Изменение скорости распределения
ультразвуковых колебаний в сперме после быстрого охлаждения // Мо­
лоч.-мясн. скотоводство. — 1973. — 31, № 1. — С. 58—63.
35. Вишневский В.И., Марюшенко А.В. Стимуляция переживаемости спер­
мы быков ультразвуковыми колебаниями // Физико-химические основы дей­
ствия физических факторов на живой организм и его антиокислительные сис­
темы. - М.: Б.и., 1974. - С. 34-37.
36. Волина В.В. Деструктивные и восстановительные процессы после дей­
ствия низких температур в нормальной и обожженной коже: Автореф. дис. ...
канд. биол. наук. — Харьков, 1982. — 23 с.
37. Волкова Н.А., Божок Г.А., Алабедалькарим и др. Влияние ксенотран­
сплантации криоконсервированной органной культуры щитовидной железы
на физиологические параметры экспериментальных животных // Пробл.
криобиологии. — 2003. — № 1. — С. 16—19.
38. Волкова Н.О. Кріоконсервовані органні культури щитовидної залози
при ало- та ксенотрансплантації: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. — Харків,
2004. - 20 с.
39. Воловельская Е.Л. Действие замораживания-оттаивания на структур­
но-функциональные свойства ферментов с четвертичной структурой (лактат­
дегидрогеназа и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа): Автореф. дис. ...
канд. биол. наук. — Харьков, 1986. — 21 с.
40. Волянский Ю.Л., Колотова Т.Ю., Васильев Н.В. Молекулярные меха­
низмы программируемой клеточной гибели // Успехи соврем, биологии. —
1994. - 114, № 6. - С. 693-704.

262

Список литературы
41. Воробьев И.А., Ченцов Ю.С. Динамика восстановления микротрубочек
вокруг клеточного центра в культивируемых клетках после их охлаждения //
Цитология. — 1982. — 24, № 11. — С. 1286—1289.
42. Гаджиев А.А., Нарциссов Р.П., Гасанов С.Ш., Гашимова Р.А. Клини­
ко-цитохимическое обоснование эффективности цитохрома С в метаболичес­
кой коррекции при осложненной форме острой пневмонии у детей раннего
возраста // Педиатрия. — 1990. — № 1. — С. 111—112.
43. Гальченко К. С. Вплив заморожування і сублімаційного висушування на
збереження молозива корів: Автореф. дис. ... канд. біол. наук. — Харків,
2003. - 20 с.
44. Гладких Ю.В., Лобынцева Г.С., Ельская А.В. и др. Клеточные и тканевые
препараты в регенерационной медицине // Пробл. криобиологии. — 2005. —
15, № 3. - С. 409.
45. Глузман Д.Ф. Диагностическая цитохимия гемобластозов. — Киев:
Наук, думка, 1978. — 215 с.
46. Глузман Д.Ф., Скляренко Л.М., Надгорная В.А. и др. Иммуноцитохими­
ческая диагностика опухолей из зрелых (периферических) В-Т-лимфоцитов и
естественных клеток-киллеров в стадии лейкемизации // Укр. журн. гематоло­
гії та трансфузіології. — 2005. — 5, № 4. — С. 33—34.
47. Глушко Г.А., Аспис М.Е., Болтовская М.Н. Влияние криопротекторов
на митотический режим культуры клеток китайского хомячка // Редкол. журн.
Бюл. эксперим. биологии и медицины АМН СССР. — М., 1980. — Деп. в
ВИНИТИ, 1980, № 429-80.
48. Голдовский А.М. Основы учения о состоянии организмов. — Л.: Наука,
1977. - 116. - С. 146.
49. Гольцев А.Н. Сравнительное изучение морфофункциональных свойств
деконденсированных и нативных миелокариоцитов в организме облученных
реципиентов: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Харьков, 1978. — 21 с.
50. Гольцев А.Н., Цуцаева А.А. Особенности течения вторичной болезни у
реципиентов с трансплантатом костного мозга // Криобиология и криомеди­
цина. — 1984. — № 15. — С. 60—65.
51. Гольцев А.Н., Дубрава Г.Г, Цуцаева А.А. Сравнительное изучение
криоустойчивости KOEc и KOEκ, находящихся в различном функциональном
состоянии // Криобиология. — 1987. — № 1. — С. 11—17.
52. Гольцев А.Н. Влияние факторов криоконсервирования на иммунологи­
ческие свойства кроветворных клеток костного мозга: Автореф. дис. ... д-ра
мед. наук. — Харьков, 1988. — 35 с.
53. Гольцев А.Н, Калиниченко Т.А. Пуповинная кордовая кровь человека
как источник гемопоэтических клеток для клинического применения. Часть 1.
Характеристика гемопоэтического потенциала // Пробл. криобиологии. —
1998. - № 1. - С. 3-24.
54. Гольцев А.Н., Грищенко В.И., Рассоха И.В., Останков М.В. Возможнос­
ть использования продуктов эмбриофеталоплацентарного комплекса как кор­
ректора апоптотических процессов при аутоиммунных заболеваниях // Там
же. - 2003. - № 1. - С. 41-48.
55. Гольцев А.Н., Дубрава Г.Г., Бабенко НН. и др. Модификация структур­
но-функциональной организации стволовых кроветворных клеток костного
мозга после действия факторов низкотемпературного консервирования //Там
же. - 2005. - 15, № 3. - С. 362-366.

263

Список литературы

56. Гордон Р.Я., Бочарова Л. С. Архипов В,И. Синтез РНК в мозге зимоспя­
щих // Криобиология. — 1986. — № 3. — С. 20—22.
57. Гартовская И.Р., Гусева С.А., Лебега О.А. Профилактика нарушений
иммунологической реактивности организма больных В-клеточными лимфо­
цитарными лимфомами на фоне применения флударабина-содержащих режи­
мов химиотерапии с помощью рекомбинантного интерлейкина // Укр. журн.
гематології та трансфузіології. — 2005. — 5, № 4. — С. 30—31.
58. Гриф В.Г, Волович Е.М. К вопросу о механизмах выявления гетерохро­
матиновых сегментов хромосом холодом // Цитология. — 1977. — 19, № 2. —
С. 141-146.
59. Грищенко В. И. Гипотермия и криохирургия в акушерстве и гинеколо­
гии. — М.: Медицина, 1974. — 280 с.
60. Грищенко В.И., Паращук Ю.С., Капрелъянц А. С. Ультраструктура спер­
матозоидов человека после криоконсервации // Криобиология и криомедици­
на. - 1984. - № 14. - С. 50-54.
61. Грищенко В.И., Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И.), Лобынцева ГС. и др.
Клеточный состав и KOEκ эмбриональной печени человека до и после крио­
воздействия // Научно-технический прогресс в медицине и фундаментальные
проблемы биологии. — Харьков, 1987. — С. 35—37.
62. Грищенко В.И., Панков Е.Я., Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И.). Качес­
твенное обновление свойств клеток после криоконсервирования // Успехи
соврем, биологии. — 1989. — 108, № 2. — С. 299—309.
63. Грищенко В.И., Обозная-Печенежская Э.И. (Алексеевская Э.И.), Панков
Е.Я. Обновление биологических структур и функций с помощью низких тем­
ператур и криоконсервирования — новое направление в биологии и медици­
не // Пробл. криобиологии. — 1995. — № 4. — С. 3—10.
64. Грищенко В.И., Прокопюк О. С. Перспективы и возможности использо­
вания плацентарной крови // Мед. вести. — 1997. - № 4. - С. 26—27.
65. Грищенко В.И., Керос В.А. Влияние трансплантации криоконсервированной фетотестикулярной ткани человека на функциональное состояние
репродуктивной системы при некоторых формах мужского бесплодия //
Пробл. криобиологии. — 1999. — № 4. — С. 73—76.
66. Грищенко В.И., Алексеевская Э.И., Ващенко В.И. и др. Криообновление
костного мозга и апоптоз: гипотезы и реальность // Там же. — 2001. — № 3. —
С. 22-23.
67. Грищенко В.И., Геродес А.Г, Алепова Е.К. и др. Трансплантация криоконсервированной плацентарной ткани при нарушениях сперматогенеза у
мужчин Ц Там же. — С. 91—92.
68. Грищенко В.И., Демин Ю.А., Гончарук Е.И. и др. Характеристика эм­
брионального препарата «Гемонейронал» // Там же. — С. 38.
69. Грищенко В.И., Гольцев А.Н. Трансплантация продуктов эмбриофета­
лоплацентарного комплекса. От понимания механизма действия к повыше­
нию эффективности применения // Там же. — 2002. — № 1. — С. 54—84.
70. Грищенко В.И., Алексеевская Э.И. Криообновление — основа для прог­
ресса современных технологий в биологии и медицине // Успехи соврем, био­
логии. - 2003. - 123, № 5. - С. 435-444.
71. Грищенко В.И., Алексеевская Э.И. Апоптоз и криообновление как осно­
ва современной цитохромной терапии // Междунар. мед. журн. — 2004. — 10,
№ 4. — С. 115-118.

264

Список литературы

72. Грищенко В.И., Алексеевская Э.И. Возможные механизмы мембранного
транспорта белков: перенос цитохрома С через митохондриальные мембраны
и его роль в механизме криообновления // Пробл. криобиологии. — 2005. —
№ 1. - С. 42-49.
73. Грищенко В.И., Алексеевская Э.И. Криообновление как основа эффек­
тивного лечения мужского бесплодия И Междунар. мед. журн. — 2005. —
№ 4. - С. 68-71.
74. Грищенко В.И., Алексеевская Э.И. Апоптоз и криообновление — совре­
менные проблемы криоконсервирования гемопоэтических клеток // Укр.
журн. гематології та трансфузіології. — 2005. — 5, № 5. — С. 9—15.
75. Грищенко В.И., Гольцев А. Н., Щегелъская Е.А. и др. Криоконсервирова­
ние стволовых клеток // Досягнення біології та медицини. — 2006. — 7,
№ 1. - С. 4-9.
76. Грищенко В.И., Алексеевская Э.И. Апоптоз и криообновление как осно­
ва эффективного лечения онкологических заболеваний // Укр. журн. гемато­
логії та трансфузіології. — 2006. — № 4. — С. 52—56.
ΊΊ. Губский Ю.И. Токсическая гибель клетки: свободно-радикальное пов­
реждение ДНК и апоптоз // Лікування та діагностика. — 2001. — № 4. —
С. 8-13.
78. Гулевсъкий О.К., Грищенко В.І. Нікольченко А. М., Моісєєва Н.М. Власти­
вості і перспектива використання кордової крові в клінічній практиці // Укр.
журн. гематології та трансфузіології. — 2004. — 1, № 5. — С. 5—14.
79. Гусєва С.А., Гартовская И.Р., Стельмах Е.А., Лебега О.А. Влияние ре­
комбинантного интерлейкина-2 (Ронколейкина) на иммунологическую реак­
тивность больных острыми миелобластными лейкемиями // Там же. —
2005. - 5, № 4. - С. 40-42.
80. Гусева С.А., Манило В.М., Романюк Н.М. и др. Дозозависимая эффек­
тивность рекомбинантного эритропоэтина при лечении анемии у больных со
злокачественными заболеваниями системы крови // Там же. — С. 82—83.
81. Гусева С.А. Талидомид: перспективы использования при множествен­
ной миеломе Ц Там же. — 2006. — 6, № 1. — С. 43—48.
82. Гучок В.М. Исследование токсичности 1,2-пропандиола и глицерина
для крыс в постнатальном онтогенезе // Криобиология. — 1986. — № 4. —
С. 16-21.
83. Данилова Л.А., Игнаїиева Л.П., Федотёнков А.Г. Влияние заморажива­
ния на пролиферативную активность и дифференцировку стволовых клеток
смешанного трансплантата костного мозга // Криобиология и криомедици­
на. - 1983. - № 11. - С. 51-53.
84. Дрокин СИ, Забелинский С.А., Копейка Е.Ф. Влияние низкотемпера­
турной консервации на фосфолипиды и их жирные кислоты сперматозоидов
рыбы белого амура Ctenopharungodon idella и индюка Meleagris gallopuvo ∕∕
Журн. эволюц. биохимии и физиологии. — 1985. — № 1. — С. 79—82.
85. Дунаевская А.В. Влияние спермальной плазмы, кордовой крови сыво­
ротки человека в среде криоконсервирования на сохранность криоконсерви­
рованных спермиев // Пробл. криобиологии. — 2000. — № 3. — С. 44—45.
86. Дунаевская А. В. Влияние высоких скоростей охлаждения на морфо­
функциональные особенности спермиев человека при нормо- и олигоспер­
мии: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — 2001. — 19 с.

265

Список литературы
87. Дышловой В.Д., Качура В.С., Харченко Т.И. К вопросу о классификации
конденсированных структур хроматина интерфазного ядра // Цитология и ге­
нетика. — 1975. — 9, № 2. — С. 166—175.
88. Елисеенко Н.Н., Максимова М.В. Влияние температуры на возникнове­
ние и репарацию индуцированных радиацией повреждений у V. faba и клеток
китайского хомячка // Там же. — 1975. — 2, № 3. — С. 237—242.
89. Жегунов Г.Ф., Микулинский Ю.Е. Периодическое обновление белков
мембран кардиомицетов сусликов в цикле гибернация-пробуждение // Крио­
биология. — 1988. — № 4. — С. 17—23.
90. Жегунов Г.Ф. Биохимические и ультраструктурные основы функцио­
нальной активности сердца зимоспящих животных: Автореф. дис. ... д-ра
биол. наук. — Харьков, 1990. — 35 с.
91. Жегунов Г. Ф. Дифференциальная экспрессия генов при гипотермии и
адаптации // Пробл. криобиологии. — 2001. — № 3. — С. 9.
92. Жигун А.И. Лечение апикондилитов плеча методом криовоздействия:
Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Харьков, 1984. — 17 с.
93. Землянских В.И., Кофанова О.А., Бабийчук Л.А. Влияние глицерола на
активность Са2+-АТФазы и асимметричное распределение липидов в мембра­
не эритроцитов человека // Сб. тр. междунар. науч. конф. «Молекулярные,
мембранные и клеточные основы функционирования биосистем». VII съезд
БОО ФиБ, Минск, 21—23 июня, 2006 г. — Минск, 2006. — 1. — С. 244—246.
94. Зубов П.М., Зубова О.Л. Криоконсервирование эритроцитов кордовой
крови: влияние на структурно-функциональные показатели клеток // Нове в
гематології та трансфузіології: Міжнар. наук.-практ. зб., що рецензується. —
К., 2006. - Вып. 5. - С. 38-42.
95. Ненашева Л.П., Федотенков А.Г., Данилова Л.А. Снижение реакции
трансплантата против хозяина при трансплантации аллогенной кроветворной
ткани // Пробл. гематологии. — 1982. — № 10. — С. 34—38.
96. Исаев Ю.И. Дозированное местное охлаждение термических ожогов:
Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Харьков, 1980. — 25 с.
97. Калиниченко Т.О., Глухенька Г.Т., Гащук Г.П., Алгазинова М.К Гарантія
якості кріоконсервованих ядерних клітин пуповинної крові як компонентного
гемотрансфузійного середовища для клінічного застосування // Укр. журн. ге­
матології та трансфузіології. — 2005. — 5, № 4. — С. 130—131.
98. Каргин В.Д., Медведев П.М., Мамышева Т.К. Изыскание консервирую­
щих растворов для хранения размороженного костного мозга: Крат. тез. доки,
к науч. сес. по вопр. трансфузиологии. — Л., 1973. — С. 76—77.
99. Кассирский И. А., Алексеев ГА. Клиническая гематология. — М.: Меди­
цина, 1980. — 800 с.
100. Кислюк И.М., Мирославов Е.А., Палеева Т.В. Охлаждение стимулирует
дыхание листьев, деление и рост митохондрий в их клетках // Съезд Всерос.
об-ва физиологов растений: Тез. докл. — СПб., 1993. — С. 125.
101. Кичев Г, Йонов А., Захариев 3. и др. Испытание действието на някои
субстанции въерху биологичните качества на сперматозоидите // Междунар.
симп. по регуляции и интенсификации процесса размножения. — София:
Б.и., 1980. - С. 162-166.
102. Климов С.В., Астахова Н.В., Трунов Т.И. Структурно-функциона­
льная адаптация фотосинтетического аппарата озимой пшеницы к низким
температурам // Журн. общ. биологии. — 1993. — 54, № 1. — С. 30—44.

266

Список литературы

103. Клубовец Г.Л., Зинченко В.Д., Сибелъдина Л.А. 31Р-ЯМР исследование
влияния криопротекторов на метаболизм эритроцитов человека // Тез. докл.
междунар. конгр. «Достижения и перспективы развития криобиологии и
криомедицины». — Харьков, 10—12 февр. — Харьков, 1988. — С. 18.
104. Козинец Г.И., Гольдберг ЕД. Кинетические аспекты гемопоэза. —
Томск: Том. ун-т, 1982. — 308 с.
105. Козлова В.Ф. Морфологические аспекты реакции клеток, тканей и
органов на введение оксиэтилированного глицерина (ОЭГ) в организм живот­
ных // Криобиология и криомедицина. — 1980. — № 6. — С. 29—34.
106. Козлова В.Ф. Морфофункциональная характеристика действия
криопротекторов ряда полиолов и их оксиэтилированных производных на
биологические системы: Дис. ... д-ра биол. наук. — Харьков, 1989. — 258 с.
107. Копейка Е.Ф., Черепанов В.В., Аюшин Б.Н., Рачек У.И. Использование
криоконсервированной спермы карпов при получении товарных гибридов на
теплых водах Приморской ГРЭС // 4 Всесоюз. совещ. «Рыбнохозяйственное
использование теплых вод»: Тез. докл. — Курчатов, 1990. — С. 145—146.
108. Кореневская М.И., Дульцина С.М., Козинец Г.И. Особенности внутри­
клеточного обмена в клетках мегакариоцитарного ряда здоровых людей //
Пробл. гематологии. — 1982. — № 11. — С. 29—41.
109. Корякин М., Акопян А. Мужское бесплодие. — Киев, 1990. — 463 с.
ПО. Котенко О.Ц., Мануев А. М., Власова О.К, Абрамов Ш.Х. Влияние сверх­
низких температур на морфологические и биохимические свойства дрожжей //
2 Всесоюз. конф. «Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических
объектов»: Тез. докл., Харьков, 9—11 окт. — Харьков, 1984. — С. 155.
111. Котляров А. С. Влияние криоконсервирования на синтез белка в мик­
роорганизмах перевиваемых клеточных культур: Автореф. дис. ... канд. мед.
наук. — Харьков, 1980. — 20 с.
112. Кравец В.В. Влияние низких температур на направление потоков
электронов в митохондриях растений // Пробл. криобиологии. — 1999. —
№ 2. - С. 34-36.
113. Крамар М.И. Влияние гипотермии на морфологические и функцио­
нальные свойства спермиев человека: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Харь­
ков, 1990. — 40 с.
114. Крамар М.И. Влияние гипотермии на морфологические и функцио­
нальные характеристики спермиев человека при олигоастеноспермии // Сек­
сология и андрология. — 2000. — № 5. — С. 80—81.
115. Кривцова И.М., Алексеева Н.Н. Цитохром С — фосфолипидный ком­
плекс (получение и изучение в эксперименте) // Цитохром С и его клиничес­
кое применение: Сб. науч. тр. НИИ гематологии и переливания крови. — Л.,
1990. - С. 74-78.
116. Кузьменко О.П., Мазур О.В. Вплив традиційної та модифікованої ни­
зькими температурами глікопептидних вакцин на пухлинний процес в експе­
рименті // Пробл. криобиологии. — 2005. — 15, № 3. — С. 519—522.
117. Куприянов В.В., Сакс В.Я., Лузиков В.Н. Проявление активности ды­
хательной цепи в стационарной кинетике переноса электронов // Митохон­
дрии (Регуляция процессов окисления и сопряжения), 1974. — С. 21—26.
118. Кучков И.Н. Функциональные и биохимические характеристики
спермиев человека при криоконсервировании в условиях сверхбыстрого ох­
лаждения: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Харьков, 2000. — 17 с.

267

Список литературы

119. Лаврик С.С. Консервирование костного мозга. — Киев: Здоров’я,
1975. - 126 с.
120. Лебединский А.С., Волкова Н.А., Черкашина Д.В., Петренко А.Ю.
Влияние аллогенной трансплантации криоконсервированных гепатоцитов и
клеток плодовой печени на течение экспериментальной гиперхолестеринемии
кроликов // Пробл. криобиологии. — 2005. — 15, № 3. — С. 357—361.
121. Ленинджер А. Биохимия: Молекулярные основы структуры и функ­
ции клетки. — М.: Мир, 1974. — 957 с.
122. ЛиЛ.Н. Морфологические изменения межпозвоночных дисков после
криовоздействия: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Харьков, 1980. — 20 с.
123. Лилли Р. Патологическая техника и практическая гистохимия. — М.:
Мир, 1969. - 645 с.
124. Линник Т.П., Грищенко В.И., Артёменко А.Б., Терещенко А.В. Влияние
длительного низкотемпературного хранения спермы петухов на ее оплодотво­
ряющую способность // Пробл. криобиологии. — 2000. — № 3. — С. 64—71.
125. Ліпіна О.В., Прокопюк О. С., Оченашко О.В., Прокопюк В.Ю. До пи­
тання створення препарату «Кріокорд С» // Трансплантологія. — 2003. — 4,
№ 1. - С. 36-38.
126. Лобашов М.Е., Инге-Вечтомова С.Г. Физиологическая генетика. — Л.:
Медицина, 1976. — С. 471.
127. Лобашов М.Е., Ватти К.В., Тихомирова М.М. Генетика с основами се­
лекции. — М.: Просвещение, 1979. — 304 с.
128. Логинов С.И., Обозная Э.И. Функциональная активность клеток кос­
тного мозга крыс в условиях холодового гипобиоза. Экспериментальный ана­
биоз: Тез. докл. II Всесоюз. конф, по анабиозу. — Рига, 1984. — С. 79—80.
129. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. — Л.: Наука,
1982. - 278 с.
130. Мазалов В.К., Овсянников С.Е., Коваленко Г.В. Влияние криопротек­
торов и фармакологических веществ на период восстановления организма
млекопитающих после кратковременного холодового воздействия // Пробл.
криобиологии. — 2001. — № 3. — С. 15.
131. Майстрах Е.В. Патологическая физиология человека. — Л.: Медици­
на, 1975. - 216 с.
132. Манин Б.Л. Кариофагоцитарный механизм образования симпластов в
культуре клеток — ВНК-21 после воздействия глубокого холода ∕∕ II Междунар. конф. «Успехи современной биологии»: Тез. докл., Харьков, 21—25 апр.
1992. — Харьков, 1992. — С. 110—111.
133. Манойлов С.Е., Нестерова Л.А., Орлова Н.А. и др. Действие цитохрома
С, галактозы и уридинтрифосфата на рост перевиваемых опухолей // Вопр.
онкологии. — 1973. — 19, № 7. — С. 62—65.
134. Манойлов С.Е. Теоретическое обоснование использования цитохрома
С в медицине // Лечебные препараты из крови и тканей: Сб. науч. тр. НИИ ге­
матологии и переливания крови. — Л., 1974. — С. 122—124.
135. Мануильский В.Д. Проблемы консервации генетических ресурсов рас­
тений // Криобиология. — 1987. — № 2. — С. 11 — 15.
136. Маркова О.П., Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И.), Бабийчук Г.А. Мор­
фологические и цитохимические исследования стернальных пунктатов бо­
льных с гипоплазией гемопоэза до и после трансплантации криоконсервиро­

268

Список литературы

ванного (-196 °С) костного мозга Ц Криобиология и криомедицина. —
1977. - № 3. - С. 90-91.
137. Масляк З.В., Лукавецъкий Л.М., Котлярчук К.Б. та ін. Результата зас­
тосування препаратів интерферону-альфа у хворих на pH-позитивну хронічну
мієлоїдну лейкемію // Укр. журн. гематології та трансфузіології. — 2005. — 5,
№ 4. - С. 51-53.
138. Марценюк В.Ф. Охлаждение некоторых видов цианобактерий с раз­
личной скоростью Ц Влияние охлаждения на биологические объекты. — Ха­
рьков: Б.и., 1990. - С. 159-161.
139. Махмудов Э.С., Алимухамедов А.А., Бабаева Р.Н., Абдуранманова Н.Ш.
Реакция беременной самки и родившихся крысят на изменение внешней тем­
пературы и уровня гемолиза в крови // Физиол. журн. — 1992. — 78, № 6. —
С. 91-96.
140. Машанский В.Ф., Матиенко-Максимова Е.Б., Жилина З.А. и др. Явле­
ние раннего «всплеска» в структурных компонентах клетки // Изв. АН
МСССР. сер. Биологии и химии. — 1981. — № 4. — С. 5—16.
141. Меерсон Ф.З., Пшенникова М.Г. Адаптация к стрессорным ситуациям
и физическим нагрузкам. — М.: Медицина, 1988. — 256 с.
142. Моисеев В.А., Розанова Е.Д. Влияние замораживания—оттаивания на
функциональные характеристики цитохрома С и цитохромоксидазы // Крио­
биология и криомедицина. — 1981. — № 8. — С. 4—6.
143. Мохова С.Н., Жигачева И. В. Концентрация цитохромов в митохон­
дриях гомогената печени при адаптации к холоду // Митохондрии. Аккумуля­
ция энергии и регуляция ферментативных процессов. — М.: Наука, 1977. —
С. 138-143.
144. Мусабаев И.К., Мецкан Т.И., Хамитов М.Х. Применение цитохрома С
в комплексном лечении больных тифо-паратифозными заболеваниями // Ма­
териалы IV съезда гигиенистов, сан. врачей, эпидемиологов, микробиологов и
инфекционистов Узбекистана, Ташкент, 25—29 авг. 1980 г. — Ташкент: Меди­
цина УзССР, 1980. - С. 29-30.
145. Мхитарян Л.М. Механизм лечебного действия цитохрома С при ос­
тром вирусном гепатите «В» // Эксперим. и клин, медицина. — 1987. — 27,
№ 6. - С. 585-589.
146. Мюнтцинг А. Генетика. Общая и прикладная. — М., 1967. — 495 с.
147. Нарциссов Р.П. К методике цитохимического определения некоторых
дегидрогеназ клеток крови человека // Цитология. — 1968. — 10, № 7. —
С. 909-913.
148. Новиков В.С. Применение цитохрома С для нормализации наруше­
ния резистентности // Цитохром С и его клиническое применение: Сб. науч,
тр. НИИ гематологии и переливания крови. — Л., 1990. — С. 52—55.
149. Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И.), Маркова О.П. Некоторые пути вос­
становления биоэнергетики клеток криоконсервированного костного мозга //
Пробл. гематологии и переливания крови. — 1976. — № 9. — С. 6—10.
150. Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И.), Маркова О.П. Цитохимический
анализ содержания сульфгидрильных групп в клетках криоконсервированного
костного мозга // Там же. — 1979. - № 3. - С. 21—25.
151. Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И.), Пушкарь Н.С., Маркова О.П., Пан­
ков Е.Я. Цитохимия замороженной клетки. — Киев: Наук, думка, 1981. —
С. 176.

269

Список литературы

152. Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И.), Вишневский В.И., Секорняков В.А. и
др. Механизм действия магнитного поля на некоторые показатели внутрикле­
точного метаболизма // Криобиология и криомедицина. — 1982. — № 10. —
С. 40-43.
153. Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И.), Гучок В.М. Активность цитохро­
моксидазы в клетках костного мозга кроликов после внутривенного введения
оксиэтилированного глицерина // Гематология и трансфузиология. — 1986. —
№ 10. - С. 33-35.
154. Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И.), Панков Е.Я. Цитохимия костного
мозга при криоконсервировании. Атлас. — Киев: Наук, думка, 1989. — 265 с.
155. Обозная-Печенежская Э.И. (Алексеевская Э.И.), Грищенко В.И., Пан­
ков Е.Я. Криобиология обновления: факты и перспективы // Пробл. криобио­
логии. — 1993. — № 4. — С. 11—20.
156. Осташко Ф.И. Разработка вопросов теории и практики глубокого ох­
лаждения и длительного хранения спермы производителей: Автореф. дис. ...
д-ра биол. наук. — Харьков, 1968. — 32 с.
157. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спер­
мы производителей. — Киев: Урожай, 1968. — 248 с.
158. Палладии А.В. Вопросы биохимии нервной системы. — Киев: Наук,
думка, 1965. — 184 с.
159. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса. — Новосибирск:
Наука, 1983. - 233 с.
160. Панков Е.Я., Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И.). Селективное свойство
низкотемпературного консервирования // Гематология и трансфузиология. —
1984. - № 9. - С. 32-36.
161. Панков Е.Я., Обозная Э.И. (Алексеевская Э.И). Методические особен­
ности и возможности анализа цитоэнзимологических показателей клеточных
суспензий в связи с проблемами их криоконсервирования ∕∕ VI Совещ. по
пробл. автомат, анализа изображений микроструктур. — Пущино, 1984. —
С. 28-31.
162. Панков Е.Я., Глушко Т.А. Статмокинетический эффект криопротекто­
ра // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1985. — 99,№3. — С. 340—342.
163. Панков Е.Я., Тарасенко В.И. Экспериментально-клиническое обос­
нование использования криовоздействия при деструктивных поражениях сус­
тавов // Междунар. конф. «Достижения и перспективы развития биологии и
медицины»: Тез. докл., Харьков, 10—12 февр., 1988 г. — Харьков, 1988. —
С. 117.
164. Пахомов А.В., Божок Г.А., Легач Е.И. и др. Морфофункциональные
характеристики криоконсервированной органотипической культуры семен­
ников новорожденных поросят после ксенотрансплантации // Пробл. крио­
биологии. — 2005. — 15, № 3. — С. 433—434.
165. Петренко А.Ю., Оченашко О.В. Влияние препаратов эмбриональных
тканей человека на интенсивность перекисного окисления липидов при ос­
тром токсическом гепатите у крыс // Там же. — 2001. — № 2. — С. 66—71.
166. Петренко Ю.А., Горохова Н.А., Петренко А.Ю. Влияние высокомоле­
кулярных соединений на жизнеспособность и функциональную активность
клеток эмбриональной печени человека до и после криоконсервирования //
Там же. - 2005. - 15, № 3. - С. 375-379.

270

Список литературы

167. Пирс Э. Гистохимия. — М.: Изд-во иностр, лит., 1962. — 771 с.
168. Полтарев Е.М., Борисенко Л.Р., Рябчук Н.И. // Итоги н/и работы по
селекции, семеноводству и интенсификации, технологии возделывания ози­
мой пшеницы за 1986—1990 гг. и важнейшие задачи на ближайшую перспек­
тиву. — Мироновка: ВАСХН, 1991. — С. 109—110.
169. Поляк А.Я. Применение цитохрома С для профилактики и лечения
гипоксии внутриутробного плода // Физиология и патология беременности и
дети. — Рига, 1973. — С. 136—140.
170. Попович Я. О. Препарат кріоконсервованої сироватки кордової крові
«Кріокорд» в лікуванні синдрому діабетичної стопи // Пробл. криобиоло­
гии. - 2005. - 15, № 1. - С. 63-70.
171. Раскина О.М., Радионов А.В. G/R-подобная дифференциальная исчерченность митотических хромосом освяницы луговой Festuca pratensis и
райграса пастбищного Lolium perenne, индуцируемая низкой температурой //
Цитология. — 1992. — 34, № 10. — С. 59—64.
172. Рууге Э.К., Свиряева И.В. Митохондриальная болезнь и окислите­
льный стресс // Сб. тр. междунар. науч. конф. «Молекулярные, мембранные и
клеточные основы функционирования биосистем». VII съезд БОО ФиБ, Минск,
21—23 июня 2006 г. — Минск, 2006. — 1. — С. 19.
173. Савушкина С.И., Цветкова Л.И. Рост молоди карпа, полученной с
применением криоконсервированной спермы в условиях водоема охладителя
ГРЭС // Рыб. хоз-во. Сер. «Аквакультура». — 1994. — № 1. — С. 17—18.
174. Савушкина С.И. Качество молоди сибирского осетра, полученного с
использованием дифростированной спермы Ц Консервация генетических ре­
сурсов: Материалы раб. совещ., Пущино, 13—15 окт. 1998 г. — Пущино,
1998. - С. 101-103.
175. Самуилов В.Д., Олескин А.В., Лагунова Е.М. Программируемая кле­
точная смерть // Биохимия. — 2000. — 65, № 8. — С. 1029—1046.
176. Самуилов В.Д. Программируемая клеточная смерть у растений //
СОЖ. - 2001. - № 10. - С. 12-17.
177. Сандомирский Б.П., Панков Е.Я., Шенберг М.Г. и др. Особенности за­
живления гнойных ран после криовоздействия // Вопросы криоконсервиро­
вания биологических объектов. — Киев: Наук, думка, 1979. — С. 92—86.
178. Сандомирский Б.П., Волкова Н.Ф. Журавлев А. С. и др. Механизмы
криостимуляции, регенерации поврежденных тканей // Криобиология. —
1985. - № 2. - С. 92-96.
179. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Гальченко Е.С. Влияние замора­
живания и лиофилизации на антиоксидантные свойства лактоферина из мо­
лозива коров // Тр. науч, конф., посвящ. 100-летию со дня рождения академи­
ка Буланкина. — Харьков, 2001. — С. 70.
180. Сандомирський Б.П., Гальченко С.Е., Гальченко К.С. Антиоксидантні
властивості лактоферину з нативного, замороженого та ліофілізованого моло­
зива корів // Пробл. криобиологии. — 2002. — № 1. — С. 45—49.
181. Сандомирский Б.П., Гальченко С.Е., Гальченко Е.С. Влияние лактофе­
рина из молозива коров на интенсивность перекисных процессов в фрагмен­
тах печени при гипотермическом хранении // Там же. — 2002. — № 3. —
С. 42-47.
182. Сафронова В.И., Новиков Н.И., Сидякина Т.М., Гюнсьева Л.М. Сравне­
ние методов криоконсервирования и лиофилизации как способов длительно­

271

Список литературы

го хранения клубеньковых бактерий // Микробиология. — 1991. — 60, № 2. —
С. 368-375.
183. Серавин Л.Н. О различиях механизмов пиноцитоза и фагоцитоза (на
примере A. Proteus) // Цитология. — 1968. — 10, № 4. — С. 506—526.
184. Сергеева Г. И., Бобылева НИ. Образование в ядре жидкокристалли­
ческих структур при подготовке клеток к состоянию анабиоза // Структура и
функция клеточного ядра. 9 Всесоюз. симп., Черноголовка, 25—27 мая,
1987 г.: Тез. докл. — Черноголовка, 1987. — С. 33.
185. Сидоренко СП., Міхалан С.В., Юрченко О.В. CD150 рецептор — новий
маркер клітин гемопоетичної системи И Укр. журн. гематології та трансфузіології. Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання. —
2005. - 5, № 4. - С. 67-69.
186. Сидоров А.В., Глеба Ю.Ю. Слияние клеток высших организмов под
действием этиленгликоля // Цитология. — 1979. — № 4. — С. 441—446.
187. Сидякина Т.М., Сатуевич Н.И., Елисеев В.А., Калахудский Л.В. Опти­
мизация условий консервации штамма — продуцента-элимоклавина Clavecijas
sp. BKMF-2609 Ц Прикл. биохимия и микробиология. — 1990. — 26, № 5. —
С. 709-713.
188. Сидякина Т.М., Устюжанина С.В., Новиков Н.Д и др. Исследование
оптимальных режимов консервации культуры гриба Acremonium chryso­
genum — продукта цефалоспорина с // Антибиотики и химиотерапия. —
1990. - 35, № 1. - С. 11-14.
189. Симонова Л.И. Биологическая характеристика и эффективность пере­
садки консервированной (-196 °С) гемопоэтической ткани плодов при острой
лучевой болезни в эксперименте: Автореф. дис.... канд. мед. наук. — Харьков,
1969. - 19 с.
190. Слепнева Л.В., Манойлов Ю.С., Криворучко Л.И. Исследование меха­
низма лечебного действия цитохрома С // Лечебные препараты из крови и
тканей: Сб. науч. тр. НИИ гематологии и переливания крови. — Л., 1974. —
С. 131-133.
191. Слоним АД. О физических механизмах природных адаптаций живот­
ных и человека. — М.; Л., 1964. — 130 с.
192. Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлажде­
ния. — М.: Изд-во иностр, лит., 1963. — 505 с.
193. Соколов В.В., Нарциссов Р.П., Иванова Л.А. Цитохимия ферментов в
профпатологии. — М.: Медицина, 1975. — 118 с.
194. Стрибуль Т.Ф., Лесив Е.К. Влияние криовоздействий на семена //
Криобиология. — 1990. - № 2. - С. 39—46.
195. Строна В.И. Использование оксиэтилированного пентаэритрита для
низкотемпературного (-196 °С) консервирования клеток костного мозга:
Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Л., 1978. — 20 с.
196. Строна В.И., Обозная Э.И., Глушко Г.А. Влияние холодового анабиоза
на функциональную активность перевиваемой культуры клеток // Экспери­
ментальный анабиоз. Тез докл. II Всесоюз. конф, по анабиозу. — Рига, 1984. —
С. 98-99.
197. Струнников В.А. Новая гипотеза гетерозиса: ее научное и практичес­
кое значение // Вестн. с.-х. науки. — 1983. — № 1. — С. 34—40.
198. Субота Н.П. Клітинно-тканинні препарата в лікуванні печінкової
патології в експерименті // П робл. криобиологии. — 2005. — 15, № 3. —
С. 331-332.

272

Список литературы

199. Субота Н.П., Щербак І. М. Екстракт хорідону — відновлювач біохіміч­
них показників крові щурів з експериментальною опіковою хворобою // Там
же. - 2005. - 15, № 2. - С. 219-220.
200. Сушков Ф.В., Смирнова Е.Б., Савчик З.Ф. Влияние температуры на
продолжительность митоза клеток млекопитающих, культивированных вне
организма // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. — 1978. — № 2. —
С. 80-85.
201. Тарасов А.И., Джонс Р.Е., Грищенко В.И., Петренко А.Ю. Фенотип и
колониеобразующая активность криоконсервированных клеток эмбриона­
льной печени человека // Пробл. криобиологии. — 2001. — № 3. — С. 47—48.
202. Творовский С.В., Черепанов В.В. Влияние эквилибрации спермы кар­
па (Cyprinus Carpio L) с криопротекторами на скорость эмбрионального раз­
вития // Там же. — 1999. — № 4. — С. 53—56.
203. Тихонова В.Л., Викторов В.П., Макеева И.Ю., Яшина С.Г. Влияние
низких и сверхнизких температур на лабораторную всхожесть семян дикорас­
тущих травянистых растений // Там же. — 1991. — № 1. — С. 43—50.
204. Тихонова В.Л., Яшина С. Г, Шабаева Э.В. Влияние замораживания се­
мян на рост и развитие дикорастущих травянистых растений // Успехи сов­
рем. криобиологии: Тез. докл. II Междунар. конф., Харьков, 21—25 апр.,
1992 г. - Харьков, 1992. - С. 180-181.
205. Травкин А.Г. Оценка жизнеспособности и некоторых механизмов ау­
толиза роговицы в процессе ее переживания и консервации: Автореф. дис. ...
канд. мед. наук. — М., 1974. — 23 с.
206. Утевский А.М., Чуйко В.А., Беркало Л.В., Македонская В.А. Захват и
организация иодидов после замораживания щитовидной железы с димексидом // Криобиология. — 1986. — № 4. — С. 16—18.
207. Утевский А.М. Биология и криобиология обратимой остановки жиз­
недеятельности: Регуляция и функциональный обмен // Там же. — 1986. —
N 1. - С. 5-11.
208. Ушатинская Р.С. Скрытая жизнь и анабиоз. — М.: Наука. Сиб.
отд-ние, 1990. — 230 с.
209. Федоров А. Г. Криоконсервирование костного мозга// Пробл. гемато­
логии и переливания крови. — 1981. — № 4. — С. 45—52.
210. Фуллер Б., Грин К., Грищенко В.И. Охлаждение, криоконсервирование
и экспрессия генов в клетках млекопитающих // Пробл. криобиологии. —
2004. - № 3. - С. 58-71.
211. Хансон К.П., Манойлов СЕ., Полосова П.Г. Влияние экзогенного ци­
тохрома С на окислительное фосфорилирование в некоторых органах живот­
ных при экспериментальном опухолевом росте и лучевой болезни // Мито­
хондрии. — М.: Наука, 1967. — С. 68—71.
212. Хансон К.П. Программированная клеточная гибель (апоптоз): моле­
кулярные механизмы и роль в биологии и медицине // Вопр. мед. химии. —
1977. - 43, № 5. - С. 402-415.
213. Хансон К.П. Апоптоз: современное состояние проблемы // Изв.
АН СССР. Сер. биол. - 1998. - № 2. - С. 134-141.
214. Хансон К.П. Роль апоптоза в старении и возрастной патологии //
Успехи геронтологии. — 1999. — № 3. — С. 103—111.
215. Хватова Е.М., Шумакова Е.Н., Воропаева И. С. Дефицит кислорода
как фактор регуляции функционального состояния митохондрий // Митохон­

273

Список литературы

дрии (Аккумуляция энергии и регуляция ферментативных процессов). — М.:
Наука, 1977. - С. 32-37.
216. Хенокс М.А., Першина В.П. Образование гибридных ферментов под
влиянием глубокого охлаждения // Криобиология и криомедицина. — 1980. —
№ 7. - С. 98-101.
217. Цуцаева А. А., Юрченко Г.Г., Лобасенко Н.П. и др. Трансплантацион­
ный иммунитет. — Киев: Наук, думка, 1978. — 208 с.
218. Цуцаева А.А., Гольцев А.Н. «Химинг» и пролиферация кроветворных
клеток (КОЕ) криоконсервированного костного мозга в селезенке и костном
мозге реципиентов Ц Криобиология. — 1987. — № 4. — С. 9—15.
219. Цуцаева А.О., Грищенко B.I., Кудакоцева О.В. та ін. Заготівля, кріо­
консервування та клінічне застосування гемопоетичних клітин кордової крові
людини. — Харків, 1999. — 15 с.
220. Цуцаева А. О., Глушко Т.О., Лобасенко Н.П. та ін. Гемокорд — препа­
рат комплексної терапії // Трансплантологія. — 2003. — № 4. — С. 46—48.
221. Цуцаева А.А., Бровко Е.В., Желтякова И.А. и др. Лейкоконцентрат
кордовой крови «Гемокорд». Морфофункциональные свойства препарата до и
после криоконсервирования // Нове в гематології та трансфузіології: Міжнар.
наук.-прак. збірник, що рецензується. — Київ, 2006. — 5. — С. 99—102.
222. Чазов Е.И., Николаева Л.Ф. Пути воздействия на некоторые метабо­
лические процессы в сердечной мышце при ее недостаточности // Арх. анато­
мии. — 1976. — № 9. — С. 3—8.
223. Чеканов В.П. Применение холода для лечения гнойных ран: Автореф.
дис. ...канд. мед. наук. — Харьков, 1984. — С. 15.
224. Черкашина Д.В., Петренко А.Ю. Влияние предобработки крыс эм­
бриоспецифическими факторами на состояние антиоксидазной системы пе­
чени при гипотермическом хранении и нормотермической реперфузии Ц
Пробл. криобиологии. — 2003. — № 4. — С. 49—56.
225. Чуйко В.А., Утевский А.М. Биохимия криоконсервированной щито­
видной железы. — Киев: Наук, думка, 1985. — 216 с.
226. Шапиро Н.А. Гистоферментохимические исследования секционного
материала // Арх. патологии. — 1976. — 38, № 6. — С. 69—73.
227. Шахбазов В.Г, Данилина В.В., Кононенко Л.С. и др. Гетерозис и холо­
доустойчивость // Цитология и генетика. — 1973. — 7, № 4. — С. 356—360.
228. Шахбазов В. Г, Медведева Г. Г, Калмыков К. К, Вороновская А.И.
Секс-антиген мышей в условиях действия низких температур Ц Актуальные
вопросы криобиологии и криомедицины: Материалы симп., Харьков, 1974. —
Киев: Наук, думка, 1974. — С. 99—101.
229. Шевченко НО., Жмурко В.В., Стрибуль Т.Ф., Кобизева Л.М. Вплив
зниженої температури і кріопротекторів на схожість та енергію проростання і
всхожість насіння сої Ц Пробл. криобиологии. — 2002. — № 4. — С. 86—91.
230. Шевченко Н.О., Стрибуль Т.Ф., Жмурко В.В., Кобизева Л.М. Вплив за­
морожування насіння сої за дії кріопротекторів на енергію проростання і схо­
жість // Там же. — 2003. — № 3. — С. 92—98.
231. Шидловський В. О., Дейкало І.М., Чепіль І.В. та ін. Імунокорегуюча те­
рапія в комплексному лікуванні хворих на важку гнійну патологію в хірургії //
Там же. - 2005. - 15. - № 1. - С. 79-84.
232. Шило А.В., Ломако В.В., Бондарь Т.Н., Бабийчук ГА. Конечные про­
дукты метаболизма оксида азота при искусственном гипометаболизме у крыс
и хомяков // Там же. — 2005. — 15, № 1. — С. 3—13.

274

Список литературы

233. Шкодовська Н.Ю. Вплив режимів кріоконсервування шкіри на склад
водно-сольових екстрактів та їх ефективність при різних ураженнях шкіри:
Автореф. дис. ... канд. біол. наук. — Харків, 2006. — 20 с.
234. Шкорбатов Г.Л., Васенко А.Г. Новые данные об анабиозе у ракообраз­
ных и простейших // Вести. Харьк. ун-та. — 1984. — 105. — С. 79—81.
235. Шлапацька Л.М., Бердова Г.Г., Ковалєвська Л.М. и др. Молекулярні
механізми чутливості та резистентності до дії доксорубіцину клітинних ліній,
що походять з лімфоми Беркітта // Укр. журн. гематології та трансфузіоло­
гії. - 2005. - 5, № 4. - С. 76-77.
236. Шраго М.И., Калугин Ю.В., Кочуровский Г.Г. и др. Влияние оксиэтили­
рования на некоторые физико-химические и биологические характеристики
глицерина Ц Криобиология и криомедицина. — 1976. — № 2. — С. 31—33.
237. Шраго М.И. Биологические антифризы и криопротекторы // Там
же. - 1977. - № 3. - С. 81-83.
238. Штарк М.Б. Мозг зимнеспящих. — Новосибирск: Наука, 1970. —
130 с.
239. Штейн Н.А., Амстиславский С.Я., Максимовский Л. Ф. Эффекты крио­
консервации и пересадки эмбрионов на величину артериального давления у
крыс линии Нисар с наследственно обусловленной артериальной гипертен­
зией // Физиол. журн. — 1993. — № 12. — С. 51—56.
240. Юнда И.Ф., Петрунь Н.М., Горпинченко И.И. Энзимологические осо­
бенности эякулята при различных формах мужского бесплодия // Эндокрино­
логия мужского бесплодия: Сб. науч, тр.— Тбилиси, 1980. — С. 118—123.
241. Юнда И.Ф. Болезни мужских половых органов. — Киев, 1981. —
246 с.
242. Пат. № 1441504 РФ, МКИ A 01N1/02. Способ подготовки заморо­
женных клеток костного мозга к использованию / Э.И. Обозная (Э.И. Алек­
сеевская), А.Б. Савчик; Заявл. 08.10.84; Опубл. 14.05.93, Бюл. № 21.
243. Пат. № 1822761 РФ, МКИ A61F7/00. Способ лечения экзотоксических ком / С.И. Логинов, Э.И. Обозная (Э.И. Алексеевская); Заявл. 20.02.85;
Опубл. 23.06.93, Бюл. № 21.
244. Пат№ 14058.Україна. G01N1/28. Спосіб визначення життєздатності
еритроцитів / Е.І. Обозна; Заявл. 13.03.85; Оприл. 25.04.97, Бюл. № 2.
245. Пат. № 38000А Украйна. МКИ CR N 5/08. Способ повышения жиз­
неспособности охлажденных спермиев человека / В.И. Грищенко, Э.И. Алек­
сеевская, М.И. Крамар; Заявл. 15.05.2000; Опубл. 15.05.2000, Бюл. № 4.
246. Пат. № 8590 (Україна) МПК 19 AO1N 1/02. Середовище Єгорова для
кріоконсервування сперматозоїдів собаки / М.І. Єгоров, Β.ί. Грищенко,
Т.П. Ліннікта ін.; Заявл. 10.01.2005; Опубл. 15.08. 2005, Бюл. № 8.
247. Aboulghar M.A., Sattor М.A., Mansour N.T. et al. Cryopreservation of the
occasionally improved semen samples for intrauterine insemination: a new approach
in the treatment of idiopathic male infertility ∕∕ Fertil, Steril. — 1991. — 56. —
P. 1115-1155.
248. Abromait M., Askman P., Samighansen E., Dorfling K. Accumulation of
hight-molecular weight proteins in response to cold hardening and abscisic acid
treatment in two winter wheat varienties with different frost tolerance ∕∕ Plant
Phisiol. - 1992. - 140, N 5. - P. 617-622.
249. Alberdi M., Corcuera L. Cold acclimation in plants ∕∕ Phytochemistry. —
1991. - 30, N 10. - P. 3177-3184.

275

Список литературы

250. Aldashev A.A., Agibetov К. A., Yugai A.A., Shamshiev A.T. Specific proteins
synthesized in human lymphocytes during hypoxia ∕∕ Amer. J. Physiol. — 1991. —
26, (suppl 4). - P. 92-96.
251. Alvazer L.G., Storey B.T. Evidence for increased lipid peroxidative damage
and loss of superoxide dismutase activity as a mode for sublethal cryodamage to hu­
man sperm during cryopreservation ∕∕ J. Androl. — 1992. — 13. — P. 232—241.
252. Ashwood-Smith MJ, Fridmann W.B. Lethal and chromosomal effects of
freezing, thawing, storage time and X-irradiation on mammalian cells preserved at
196 oC in dimethyl sulfoxide ∕∕ Cryobiology. — 1979. — 16, N 2. — P. 132—140.
253. Ashwood-Smith MJ. Mechanizm of dehydration injuri in bacteria ∕∕ Int.
J.Refrig. - 1980. - P. 205-212.
254. Ashwood-Smith MJ., Zin P. Mutation induction in Escherichia coli by de­
siccation and freeze-dusing ∕∕ Cryobiology. — 1983. — 20, N 6. — P. 715.
255. Ashwood-Smith MJ. Genetic damage is not produced by normal cryopre­
servation procedures involving either glucerol or dimethyl sulfoxide: A cautionary
note, however, on possible effects of dimethyl sulfoxide ∕∕ Cryobiology. — 1985. —
N 22. - P. 427-433.
256. Ashwood-Smith MJ. Mechanism of cryprotectant action ∕∕ Temp, and
Anim Cells: Proc. Meet, Durhan, 10—12 Sept. 1986. — Cambrige, 1987. —
P. 395-406.
257. Augereau O., Rossignol R., DeGiorgi F. et al. Apoptotic-like mitochondrial
events associated to phosphatidylserine exposure in blood platelets induced by local
anaesthetics ∕∕ Thromb. Haemost. — 2004. — 92, N 1. — P. 104—113.
258. Barrios B., Fernandez-Juan M., Muino-Blanco T., Cebrian-Perez J.A.
Immunocytochemical localization and biochemical characterization of two seminal
plasma proteins that protect ram spermatozoa against cold shock ∕∕ Andrologia. —
2005. - 26, N 4. - P. 539-549.
259. Bin Lu, Ke-Hui, Tan, et al. Z hiwu shengli xuevao ∕∕ Acta phytophysiol.
Sin. - 1992. -18, N 2. - P. 113-120.
260. Bing de Tran, Oono Kluoham. Molecular cloning and characterization of
genes related to chilling tolerance in rice ∕∕ Plant Physiol. — 1992. — 99, N 2. —
P. 1146-1150.
261. Brown G.G., Simpson M.V. Novel features of animal mtDNA evolution as
shown by sequences of two rat cytochrome oxidase subunit genes ∕∕ Proc. Natl.
Acad. Sci USA . Biol. Sci. - 1982. - 79, N 10. - P. 3246-3250.
262. Buckley B.A., Place S.P, Hofmann G.E. Regulation of heat shock genes in
isolated hepatocytes from an Antarctic fish, Trematomus bemacchii ∕∕ J. Exp.
Biol. - 2004. - 207, pt 2. - P. 3649-3656.
263. Cao X., Hengst L. Complexity of nucleus-encoded genes of mammalian
cytochrome oxidase: Struct. Funct. and Physiopathol. — New York, 1988. —
P. 337-347.
264. Cattivelli L., Bartels D. Molecular cloning of cold-regulated genes in bar­
ley ∕∕ Physiol. Plant. - 1990. - 79, N 2. - P. 46-52.
265. Chambers R., Christopher L., William C. Paranteral influence on early live
history trains of winter flounder (Psendoplen ronectes americanus abstract) [Pap]
3-rd 1 ces symp. Early Life Hist Fish. — Bergen, 3—5 oct. — 1988 ∕∕ Rapp et proc,
Verb, reun (Cons. int. explor. Mer). — 1989. — 191. — P. 477—479.
266. Chan P.I., Fredway D.R. Association of human sperm nuclear deconden­
sation and in vitro penetration ability ∕∕ Andrologia. — 1992. — 24, N 2. —
P. 77-81.

276

Список литературы

267. Chuang D.S., Nishiyama H., Higashitsuji H. et al. Increased transcript level
of BM member of the glycine-rich RNA-binding protein family, in human cell in re­
sponse to cold stress ∕∕ Biochem. and Biophys. Res. Communs. — 1997. — 236,
N 3. - P. 804-807.
268. Chuang J.H., Li H. Functional bias and spatial organization of genes in
mutational hot and cold regions in the human genome ∕∕ PLoS Biol. — 2004. — 2,
N 2. - P. 17-29.
269. Coles L., Bartley M., Bert A. et al. A multi-protein complex containing cold
shock domain (Y-box) and polypyrimidine tract binding proteins forms on the vascu­
lar endothelial growth factor mRNA. Potential role in mRNA stabilization ∕∕ Eur J.
Biochem. - 2004. - 271, N 3. - P. 648-660.
270. Cornelius R., Trotter S. Cytochemical and radioautographic identification
of cells induced of synthesized haemoglobin ∕∕ Blood. — 1974. — 43, N 6. —
P. 885-898.
271. Cortese J.D. Motional dynamics of functional cytochrome C delivered by
low pH fusion into the intermembrane space of intract mitochondria ∕∕ Biochim. et
biophys. acta. - 1993. - 5, N 1142 (1/2). - P. 194-202.
272. Currie R. W. Synthesis of stress protein MR-71000 in isolated and perfused
rat hearts after cold ischemia ∕∕ J. Cell Biol. — 1985. — 101, N 5. — P. 2—19.
273. Dabera M.D., Petco P.M., Sandhy J. et al. Proliferation of fetal liver epithe­
lial progenitor cells after transplantation into adult rat liver Ц Amer. J. Pathol. —
2000. - 156, N 6. - P. 2017-2031.
274. Danno S., Nishiyama H., Higashitsuji H. et al. Increased transcript level of
RBM3, a member of the glycine-rich RNA binding protein family in human cell in
response to cold stress ∕∕ Biochem. and Biophys. Res. Communs. — 1997. — 236,
N 3. - P. 804 - 807.
275. Danyluk J., Sarhan F. Differential mRNA transcription during the induc­
tion of freezing tolerance in spring and winter wheat ∕∕ Plant and Cell Physiol. —
1990. - 31, N 5. - P. 609-619.
276. Darul E., LatinderS., Diane L., Steven P. Cyclosporin A inhibits chromium
(YI)-induced apoptosis and mitochondrial cytochrome C release and restores
clonogenic survival in CHO cells ∕∕ Carcinogenesis. — 2000. — 21, N 11. —
P. 2027-2033.
277. Davies F.F., Raje N., Hideshima T. et al. Thalidomide and immunomodula­
tory derivatives augment natural killer cell cytotoxicity in multiple myeloma ∕∕
Blood. - 2001. - N 98. - P. 210-216.
278. De Boer F., Drager A. M., Van der Wall E. et al. Changes in I-selection ex­
pression on CD34-positive cells upon cryopreservation of peripheral blood stem cell
transplants ∕∕ Bone marrow transplant. — 2002. — 29, N 3. — P. 249—255.
279. De Roos W.R., von Geusau B.A., Bouwman E., et al. Monitoring engraft ment of transplanted hepatocytes in recipient liver with 5—bromo-2'-deoxyuridine ∕∕
Transplantation. - 1997. - 27, N 64(4). - P. 513-518.
280. De Vries A.L., Woheschlag D.E. Freezing resistance in some antarctic
fishes Ц Science. - 1969. - N 163. - P. 469-471.
281. De Vries A.L. Antifreezes in cold-water fishes ∕∕ Oceanus. — 1976. — 19,
N4.-P. 23-31.
282. De Ziegler D., Frydman R. Different implantation rates after transfers of
cryopreserved embryos originating from donated oocytes or from regular in vivo fer­
tilization ∕∕ Fert., Steril. - 1990. - 54, N 4. - P. 682-688.

277

Список литературы

283. Degli E.M. Mitochondria in apoptosis: past, present and future ∕∕ Biochem.
Soc. Trans. - 2004. - 32, N 3. - P. 493-495.
284. Deming P.B., Schafer Z.T., TashkerJ.S. et al. Bcr-Abl-mediated protection
from apoptosis downstream of mitochondrial cytochrome C release ∕∕ Mol. Cell
Biol. - 2004. - N 24(23). - P. 10289-10299.
285. Donald Ж, Nikolson D.B.i Walter N. Import of apocytochrome C into mi­
tochondria. Reaction of heme mediated by NAD.H and flavin nucleotides, is obliga­
tory for its covalent linkage to apocytochrome C ∕∕ Proc. Nat. Acad. Sci. USA. —
1989. - 186, N 12. - P. 4340-4344.
286. Duman J.G., Horwarth K.L., TomchaneyA., Patterson J.L. Antifreeze agents
of terrestrial arthropods ∕∕ Comp. Biochem. and Physiol. — 1982. — A73, N 4. —
P. 545-555.
287. Dumont M.E., Chlichter I. V., Cardillo T. S. et al. Cyc 2 encodes a factor in­
volved in mitochondrial import of yeast cytochrome C ∕∕ Mol. Cell. Biol. — 1993. —
10, N 13. - P. 6442-6451.
288. Ebine K. Nihon reito kyokai ronbunshu ∕∕ Trans. Assoc. Jap. Refrig. —
1993. - 10, N 2. - P. 283-289.
289. Eckert G. Die Konservierung von vollblut und Zellulazen Blutbestandteilen ∕∕ Kronhenhausarrt. — 1974. — 47, N 8. — P. 410—414.
290. Eldering E., Mackus W.J., Derks I.A.i et al. Apoptosis via the В cell antigen
receptor requires Bax translocation and involves mitochondrial depolarization,
cytochrome C release, and caspase-9 activation ∕∕ Eur J. Immunol. — 2004. — 34,
N 7. - P. 1950-1960.
291. Einer G. G. Freezing of rat lymphocytes. I. Effects of DMSO and freezing in
the phytohemoagglutinin and pokeweed nitrogen responding lymphocytes subpopylations ∕I Cryobiology. — 1972. — 13, N 2. — P. 34—41.
292. Erika M.G., Elizabeth S., Nell H., Jacylyn V. Epidermal growth factor pro­
tects epithell-derived cells from tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing
ligand-induced apoptosis by inhibiting cytochrome C release ∕∕ Cancer Res. —
2002. - N 62. - P. 488-496.
293. Eszlinger M., Krohn K.. Lauter G., et al. Gene expression analysis reveals
evidence for increased expression of cell cycle-associated genes and Gq-protein-protein kinase C signaling in cold thyroid nodules ∕∕ J.Clin. Endocrinol. Metab. —
2005. - 90, N 2. - P. 1163-1170.
294. Fletcher W., New L., Joshi S., et al. Isolation and characterization of anti­
freeze glycoproteins from the frostfish microgadus tomcod ∕∕ Can. J. Zool. —
1982. - 60. - N 3. - P. 348-355.
295. Fowhe L.C., Rennie P.L., Kirkpatrick J. W. Ultrastructure of fusion products
from soybean cell culture and sweat clover leaf protoplasts ∕∕ Plants. — 1976. —
130. - P. 39-45.
296. Franz-Urich Y., Schmidt B., Wachter E.i et al. Transport into mitochondrial
sorting of the Fe/S. Protein of ubiquinol-cytochrome C reductase ∕∕ Cell. — 1986. —
47. - P. 939-951.
297. Fujio Y., Nagahuma Y. Detection of a low temperature-resistant gene in the
guppy (Poecilia reticulates) with reference to sex-linked inheritance ∕∕ J. Genet. —
1990. - 65, N 4. - P. 201-207.
298. Gao D.Y., Neff K., Xiao H.Y. et al. Development of optimal techniques for
cryopreservation of human platelets. I Platelet activation during cold storage (at 22
and 8 degress) and cryopreservation ∕∕ Cryobiology. — 1999. — 38, N 3. —
P. 225-235.

278

Список литературы

299. Garagus J.R., Machay A.S.i Bosch J. et al. Heritability of frost tolerance in
white clover (Trifolium repens) ∕∕ J. Agr. Sci. — 1990. — 114, N 2. — P. 151 — 155.
300. Gardai S.J., Whitlok B.B., Xiao Y.O. et al. Oxidants inhibit ERK/MARK
and prevent its ability to delay neutrophil apoptosis downstream of mitochondrial
changes and at the level of HIAP ∕∕ J. Biol. Chem. — 2004. — 22, N 279 (43). —
P. 4465-4703.
301. Garitt T. C., et al. Bcl-2 over expression is assotiated with dexamethasone,
but not melphalan, in multiple myeloma cells ∕∕ Int. J. Oncol. — 1998. — 13. —
P. 397-405.
302. Gattoa B., Capranico G., Palumbo M. Drugs acting in DNA topoisomera­
ses: recent advances and future perspectives ∕∕ Curr. Pharm. Des. — 1999. — 5,
N 3. - P. 195-215.
303. Grischenko V.I., Alekseyevskaya E.I. Cryorenewal is the Base for the Prog­
ress of Current Cryobiological Technologies ∕∕ Low Temperature Biology. From the
Low-Temperature Physics and Chemistry of Biological Molecules to Life in Extreme
Low Temperature Conditions: Abstr. 14—18 Sept. — Coimbra, Portugal: CryoBiomol,
2003. - P. 131.
304. Grischenko VI., Alekseyevskaya E.I. Possible mechanisms of membrane
transport of proteins: cytochrome c transfer through mitochondrial membranes and
its role in cryorenewal mechanism ∕∕ Abst. J., Ser. Biophys. — 2005. — N 12.
305. Grount B.W.W., Westcoff R.J., Henshaw G.G. Survival of shoot meristems
of tomato seedlings frozen in liquid nitrogen ∕∕ Cryobiology. — 1978. — 15, N 4. —
P. 478-483.
306. Guerra D., Cavicchi S. Chromosomal and autoplasmic control of the adap­
tation to temperature in Drosophila melanogaster ∕∕ Atti Assoc. Genet Ital. —
1984. - 30. - P. 115-116.
307. Hartl F., Schmidt B., Wachter E. et al. Transport into mitochondria and
intramitochondria sorting of the Fe/S protein of ubiquinol-cytochrome C reducta­
se I∕ Cell. - 1986. - 47, N 6. - P. 939-951.
308. Heeney M.M., Ormsbee S.M.i Moody M.A. et al. Increased expression of
anti-apoptosis genes in peripheral blood cells from patients with paroxysmal noctur­
nal hemoglobinuria ∕∕ Mol. Genet. Metabol. — 2003. — N 7. — P. 291—294.
309. Host E.i Linderbeng S., Smidt-Lensen. The role of DNA strand breaks in
human spermatozoa used for LVF and ICSI. Acta obstet. et gynecol. scand ∕∕
2000. - N 79. - P. 559-563.
310. Irvine D.S., TwiggJ.P., Gordon E.L. et al. DNA in tegrity in human sper­
matozoa: relationships with semen quality ∕∕ J. Androl. — 2000. — N 21. —
P. 33-34.
311. Itzhaki H., Pauis K., Borochov A. Effects of cold hardening on microsomal
membrane properties and phosphatidylcholine biosynthesis in canole (Brassica napus) leaves Ц Plant. Physiol. - 1991. - 138, N 1. - P. 75-79.
312. Jaeschke Y. Preservation injury: mechanisms, prevention and conse­
quences ∕∕ J. Hepatol. — 1996. — 25. — P. 774—780.
313. Jones P.G., Krah R., Tafuri S., Wolffe A.P. DNA gyrase C57.4 and the cold
shock response in Escherichia coli ∕∕ J. Bacteriol. — 1992. — 174, N 16. —
P. 5798-5802.
314. Jordan J., Jordan 5., Jordan C. Effects of freezing to -196 0C and thawing
on Seteris lutescens seeds ∕∕ Cryobiology. — 1982. — 19, N 4. — P. 435—442.

279

Список литературы

315. Jordi W. Phenethyl alcohol disorders phospholipid acyl chains and pro­
motes translocation of the mitochondrial precursor protein apocytochrome C across
a lipid bilayer Ц FEBS Lett. - 1990. - 12, N 26(1). - P. 55-58.
316. Kendall E., Qureshi J., Kartha K. et al. Cryoselection: an in vitro technique
for isolating freezing tolerant plants ∕∕ Physiol. Plant. — 1990. — 79, N 2, pt 2. —
P. 104-112.
317. Kerr L.F., Wylie A.N., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenome­
non with wide-rending implications in tissue kinetics ∕∕ Brit. J. Cancer. — 1972. —
26. - P. 239-257.
318. Khristolyubova N.B., Khvostova V.V.f Safonova V.T., Usova T.C. Studies of
the functional activity of mitochondria and cell ultrastructure of the coleoptile in
wheat, Agropuron and their hybrid (Lucomplete amplidiploids) during decreasing
temperature ∕∕ Theor. Appl. Genet. — 1974. — 44. — P. 255—261.
319. Kim Y.H.f Lim Do S.f Shim W.J. et al. Gene expression profiling of oxida­
tive stress in atrialfιbrillation in humans ∕∕ Exp. Mol. Med. — 2003. — 31, N 5. —
P. 336-349.
320. Kloks C.P., Spronk C.A., Lasonder E. et al. The solution structure and
DNA-binding properties of the cold-shock domain of the human Y-box protein
YB-1 ∕∕ J. Mol. Biol. - 2002. - 15, N 316 (2). - P. 317-326.
321. Koda-Ban Yasunori, A.mc Misaco, Kitagava Yoshichika. Alteration in gene
exppression during cold treatment of rice plant ∕∕ Plant and Cell Physiol. — 1991. —
32, N 6. - P. 901-905.
322. Kondo K., Inouye M. Tipi a cold shok — inducible gene of Saccharamyces
cerevisiac ∕∕ Biol. Chem. - 1991. - 266, N 26. - P. 17537-17544.
323. Konry M., Bondarant M.S. Erythropoietic retards DNA breakdown and
prevents programmed death in erythroid progenitor cells ∕∕ Science. — 1990. — 248,
N 4953. - P. 378-381.
324. Kvamstrom M., Jenmalm M.C., Ekerfelt C. Effect of cryopreservation on
expression of Thl and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with
different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of
interleukin-4 ∕∕ Cryobiology. — 2004. — 49, N 2. — P. 157—168.
325. Lasso J.L. Noiles E.E., Alvarez LG., Storey B.T. Mechanism of superoxide
dismutase loss from human sperm cells during cryopreservation ∕∕ J. Androl. —
1994. - 15. - P. 255-265.
326. Legdeur M.C., Bontje P.M., Ossenkoppele G.J. et al. The role of BCL-2 bax
protein in monocyte-mediated apoptosis in human leukemic cell lines ∕∕ Exp.
Hematol. - 1996. - 24, N 13. - P. 1530-1539.
327. Li H., Dong Q., Yang Y. et al. Effect of vasostomy on expression of Bcl-2
and Bax gene in rat spermatogenic cells ∕∕ Xi Yi Ke Da Xue Bao. — 2000. — 31,
N 3. - P. 353-355.
328. Linsdell H., Douglas M.S., Maryman H.T. Cryoprotectant toxicity and cry­
oprotectant toxicity reduction: in search of molecular mechanism ∕∕ Cryobiology. —
1990. - 27, N 3. - P. 247-268.
329. Liu Z., Wei H., Xing G. Фанше исюэ юйфанху ∕∕ J.Radiol. Med. and
Prot. - 1989. - 8, N 6. - P. 400 - 402.
330. Loncar D., Bedrika L., Mayer J. et al. The effect of intermittant cold treat­
ment of the adipose tissue of the cat. Apparent transformation from white to brown
adipose tissue ∕∕ Ultrastract. and Mol. Stract. Res. — 1986 ∕ 1987. — N 3. —
P. 119-129.

280

Список литературы

331. Lu L., Li Z.H., Broxmeyer HE. Recovery and characterization of CD34+
cord blood cells after cryopreservation ∕∕ In Vivo. — 1996. — N 10 (2). —
P. 229-232.
332. Ma Y.P., Zou P., Xiao J., Huang S.A. Expression of caspase-3 in CD34+
cord blood cells and its significance ∕∕ Zhonguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. —
2002. - N 10 (5). - P. 387-390.
333. Machaca K., L ’Hemault S. W. The Caenorhabditis elegans spe-5 gene is re­
quired for morphogenesis of a sperm-specific organelle and is associated with an in­
herent cold-sensitive phenotype ∕∕ Genetics. — 1997. — 146, N 2. — P. 567—581.
334. Manno S., Takakywa Y., Mohandas N. Identification of a functional role
for lipid asymmetry in biological membranes ∕∕ PNAS. — 2002. — 99, N 4. —
P. 1943-1948.
335. Marsden V.S., Ekert P.G., Van D.M. et al. Bcl-2—regulated apoptosis and
cytochrome C release can occur independently of both caspase-2 and caspase-9 ∕∕
J. Cell Biol. - 2004. - 21, N 165(6). - P. 775-780.
336. Martin R.Y., Chemos J.I., Rademaker A.W. Effect of cryopreservation on
the frequency of chromosomal abnormalities and sex ratio in human sperm ∕∕ Mol.
Reprod. and Dev. — 1991. — 30, N 2. — P. 34—41.
337. Maxwell W.M., Stojanov T. Liquid storage of ram semen in the absence or
presence of some antioxidants ∕∕ Reprod Fertil. Dev. — 1996. — N 8(6). —
P. 1013-1020.
338. Mauch P., Ferraza J., Helman S. Stem cell self renual considerations in
bone marrow transplantation ∕∕ Bone Marrow Transplant. — 1989. — 4, N 6. —
P. 601-607.
339. Mauroli F.A., Capitanis M.G. Role of chromatin phospholipids on template
availability and ultrastructure of isolated nuclei ∕∕ Adv. Enzyme Reg. — 1982. —
20. - P. 247-262.
340. McGann L.E., Walterson M.L. Cryoprotection by dimethyl sulfoxide and
dimethyl sulfone ∕∕ Cryobiology. — 1987. — 24, N 1. — P. 11 — 16.
341. McLaughlin E.A., Ford W.C.L., Hull M.G.R. Motility characteristics and
membrane integrity of cryopreserved human spermatozoa ∕∕ J.Reprod. Fertil. —
1992. - N 95. - P. 527-534.
342. Mohapatra S.S., Wolfrain L.i Poole R. J., Dhindsa R.S. Molecular cloning
and relationship to freezing tolerance of cold-acclimation — specific genes of al­
falfa U Plant Physiol. - 1989. - 89, N 1. - P. 375-380.
343. Mon Yoki, Suzuki Hiroко, Nei Токіо. Freezing ingury in the yeast respira­
tory system ∕∕ Cryobiology. — 1986. — 23, N.I. — P. 64—71.
344. Morishima H. Inheritanse of low temperature resistance of the young seed­
ling stage in rice ∕∕ Annu Rept (Nat. Inst. Genet. Jap). — 1991. — N 2. —
P. 103-104.
345. Muramoto Naato. Notes on chromosome abnormalities and poliploidies in­
duced by low temperature in Eurydema rudosa (Heteroptera) ∕∕ Chromosomo. —
1983. - N 30/31. - P. 931-934.
346. Nacamure Sci-ichi, Oda Joshimitsu, Ugava Masahiro. Induction of umu
gene expression in Salmonella typhimurium TA /535 ∕pSk 1002 by dimethyl
sulfoxide (DMSO) Ц Mutat Res. - 1990. - 229, N 1. - P. 11-15.
347. Nachlas M.M., Tsou K., Souza E. Cytochemical demonstration of succinic
dehydrogenase by the use of a new p-nitrophenyl substituted ditetrazole ∕∕ J. Histochem. & Cytochem. - 1957. - 5, N 9. - P. 103-107.

281

Список литературы

348. Duги N.K., Morchedi M., Schufner A. Cryopreservation-thawing of frac­
tionated human spermatozoa and plasma membrane translocation of phosphatidylse­
rine ∕∕ Fertil, Streril. - 2001. - 75, N 2. - P. 263-268.
349. Necas O., Kuncova 5., Slaideikova A. Some observations on the mechanism
of cell injury due to deep freezing ∕∕ Studia biophys. — 1986. — 112, N 1. —
P. 77-82.
350. Nicholson D. Wr., Kohler H., Neupert Ж Import of cytochrome C into mito­
chondria: cytochrome C heme lyase ∕∕ Eur. J. Biochem. — 1987. — 164. —
P. 147-157.
351. Nicholson D.W., Neupert W. Import of cytochrome C into mitochondria:
reduction of heme metiated by NADH and flayin nucleotides , is obligatory for its
covalent lineage to apocytochrome C ∕∕ Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1989. — 86,
N 1. - P. 4340-4344.
352. Niino T., Sakai A., Akira E. et al. Cryopreservation of in vitro-grown shoot
tips of mulberry by vitrification ∕∕ Cryo-Lett. — 1992. — 13, N 5. — P. 303—312.
353. Null A.P., Hudson J., Gorbsky G.L. Both alpha and beta isoform of mam­
malian DNA topoisomerase II associate with chromosomes in mitosis ∕∕ Cell
Growth Differ. - 2002. - 13, N 7. - P. 325-333.
354. Perras M., Sarhan F. Polysome metabolism during cold acclimation in
wheat ∕∕ Plant and Cell Physiol. - 1990. - 31, N 8. - P. 1083-1089.
355. Petrenko A.Yu., Subbota N.P. Inhibition of the activity of mitochondrial
electron transport chain by low temperature: losses of cytochrome C ∕∕ Cryo-Lett. —
1986. - N 7. - P. 395-402.
356. Pommier Y. DNA topoisomerase I and II in cancer chemotherapy: update
and perspectives ∕∕ Cancer Chemother. Pharmacol. — 1993. — 32, N 2. —
P. 103-108.
357. Pranke P., Failace R., Allebrandt И< et al. Hematologic and immunophenotypic characterization of human umbilical cord blood ∕∕ Acta haematol. —
2001. - 105, N 4. - P. 251-256.
358. Pritchard D., Singh J., Carlisle D., Patierno S. Cyclosporin A inhibits chro­
mium (YI)-induced apoptosis and mitochondrial cytochrome C release and restores
clonogenic survival in CHO cells ∕∕ Carcinogenesis. — 2000. — 21, N 11. —
P. 2027-2033.
359. Qing G., Ma L., Khorchid A. et al. Cold-shok induced high-yield protein pro­
duction in Escherichia coli ∕∕ Nat Biotechnol. — 2004. — N 22 (7). — P. 826—827.
360. Rauen U., Polzar B.i Stephen H. et al. Cold-induced apoptosis in cultured
hepatocytes and liver endothelial cells: mediation by reactive oxygen species ∕∕
FASEB.J. - 1999. - 13. - P. 155-168.
361. Roberts D. W. Identification of loci on chromosome 5 A of wheat involved
in control of cold hardiness, vernalization, leaft length, rozette growth habit, and
height of hardened plants ∕∕ Genome. — 1990. — 33, N 2. — P. 247—259.
362. Robin E.D. The impact of hypoxia on gene expression ∕∕ ACP: Appl.
Cardiopulm. Pathophysiol. — 1987. — N 1. — P. 161—164.
363. Ross D.D. Novel mechanisms of drug resistance in leucemia ∕∕ Leuce­
mia. - 2000. - 14. - P. 467-473.
364. Roure D.i Hamamah S., Nikolle C., Lansac J. Influence de letal de la chro­
matine sur la perte du pouvoir fecondant des spermatozoides apres congelation ∕∕
Contracept. Fertil. Sex. — 1989. — 17, N 7/8. — P. 643—644.

282

Список литературы

365. Roure D., Hamamah S., Nicolle J.C., Lansac J. Chromatin alterations in­
duced by freeze-thawing influence the fertilising ability of human sperm ∕∕ J.
Androl. - 1991. - 14, N 5. - P. 328-335.
366. Rudd N.J., Hoar D. V., Williams S.E., Henning U.G. Genotype and the cryo­
preservation process affect the levels of aneuplody and chromosome breakage in cul­
tured human fibroblasts ∕∕ Genome. — 1989. — 32, N 2. — P. 196—202.
367. Ruggeri B., Gray R., Watkins T., Tomlins R. Effects of low-temperature ac­
climation and oxygen stress on tocopherol production in euglena gracilis Z. ∕∕ Appl.
and Environ. Microbiol. — 1985. — 50. — P. 1404—1408.
368. Sandhu J.S., Petkov P.M., Dabeva M.D., Shafriz D.A. Stem cell properties
and repopulation of the rat liver by fetal liver epithelial progenitor cells ∕∕ Amer. J.
Pathol. - 2001. - 159, N 4. - P. 1323-1334.
369. Sarkar S., Kalia V, Montelaro R.C. Caspase-mediated apoptosis and cell
death of rhesus macaque CD4-T-cells due to cryopreservation of peripheral blood
mononuclear cells can be rescued by cytokine treatment after thawing ∕∕
Cryobiology. - 2003. - N 47 (1). - P. 44-58.
370. Schindelin H., Marahiel M., Heinemann U. Universal nucleic acid-binding
domain revealed by crystal structure of the B. subtilis major cold-shock protein ∕∕
Nature. - 1993. - 364, N 6433. - P. 164-168.
371. Schmidt-Mende J., Hellstrom-Lindberg E., Joseph B., Zhivotovsky B. Free­
zing induces artificial cleavage of apoptosis-related proteins in human bone marrov
cells ∕I J. Immunol. Methods. - 2000. - 1, N 245 (1/2). - P. 91-94.
372. Schramm W.P. Die Tieftemperatur Konservierung von Hahnensperma in
Hiublick auf die Reproduction von Genreserve populationen und den intemationalen Spermasustausch ∕∕ Arch. Weflugelk. — 1991. — 55, N 6. — P. 258—260.
373. Schuurhuis GJ., Muijen M.M., Obering J.W. et al. Large populations of
non-clonogenic early apoptotic CD34-positive cells are present in frozen-thawed pe­
ripheral blood stem cell transplants ∕∕ Bone Marrow Transplant. — 2001. — 27,
N 5. - P. 487-498.
374. Scott G., Ned C., Davies P. Antifreeze protein genes are tandemly linked
and clustered in the genome of the winter founder ∕∕ Proc. Nat. Acad. Sci USA. —
1985. - 82, N 9. - P. 2613-2617.
375. Seltzer R. NMR hrodes freeze tolerance in arctic insect ∕∕ Chem. and Eng.
News. - 1987. - 65, N 20. - P. 28-31.
376. Shain K., Alsina M. Mechanisms of Drug Resistance and Therapeutic Im­
plications. Myltiple Mueloma ∕ Eds P.G. Richardson, K.C. Anderson. — London:
NW1 3ND, 2004. - P. 25-26.
377. Shidio Song, Hew C.L., Sixu Van. Сятэнь дасюэ сюзбао изытань кэсю
эбань ∕∕ J. Xiamen Univ. Nat. Sci. — 1987. — 26, N 2. — P. 254—259.
378. Siebzehnrubl E., Spitzer M., Woltering U., Todorov S. Klinische Aspecte der
Tiefgefrickonservierung menschlicher Pronuclens-Eizellen nach in vitro Fertilisa­
tion Ц ZKM: Z. Klin. Med. - 1992. - 47, N 2. - P. 76-77.
379. Smith G.R. DNA supercoiling: another level for regulating gene expres­
sion ∕∕ Cell. - 1981. - 24, N 3. - P. 599-600.
380. Sonia R., Martia S., Scott W. et al. Protein kinase c inhibitor and irradia­
tion-induced apoptosis: relevance of the cytochrome c-mediated caspase-9 death
pathway ∕∕ Cell Growth Differentiation. — 2000. — N 11. — P. 491—499.
381. Stein G., Hansen G. Mannose induces an endonuclease responsible for
DNA laddering in plant cells ∕∕ Plant Physiol. — 1999. — N 2. — P. 71—79.

283

Список литературы

382. Steponkus P.L., Uemura M. Resolution of the individual contribution of
membrane lipid alteration sugar accumulation, and the C0R15a Gene to the freezing
tolerance of arabidopsisthaliana ∕∕ Cryo-98, 35th Ann. Meet. Soc. for Cryobiol.,
11—16 July, 1998. — Pittsburg, Pennsulvania, USA, 1998. — P. 2.
383. Storey K.B. Organ specific metabolism during freezing and thawing in a
freeze-tolerant frog ∕∕ Amer. J. Physiol. — 1987. — 253, N 2. — P. 292—297.
384. Storey K.B. Freeze-induced gene expression in vertebrates ∕ Cryo—98, 35‘
Annu. Meet. Soc. Cryobiol., 11 — 16 July 1998. — Pittsburgh, Pennsylvania, USA,
1998. - P. 167.
385. Stuart R.A., Donald Ж, Nicolson D. Hz., Walter N. Early steps in mitochon­
drial protein import receptor functions can be substituted by the membrane inseption
activity of apocytochrome C ∕∕ Cell. — 1990. — 120, N 60(1). — P. 31—43.
386. Sugiyama N., Obinata M., Matsui Y. Bcl-2 inhibits apoptosis of spermato­
gonia and growth of spermatogonial stem cells in a cell-intrinsic manner ∕∕ Mol.
Reprod Dev. - 2001. - N 58(1). - P. 1-3.
387. Takenoushi Yasuski. The occurrence of a decaploid embryo in the pentaploid parathenogenetic weevils race as a result of low-temperature treatment ∕∕
Cromosomo. - 1983. - N 30/31. - P. 935-936.
388. Tamer M., Uwe P., Hans-Juergen G., Ashok A. Role of caspases in male in­
fertility ∕∕ Human Reprod. Update. — 2004. — 10, N 1. — P. 39—51.
389. Taneja C., Prescott L., Konery B. Critical preservation injury in rat fatty
liver is to hepatocytes, not sinusoidal lining cells ∕∕ Transplantation. — 1998. — 66,
N 2. - P. 167-172.
390. Tao Dali, Li Poul. Classification of plant cell cryoprotectant ∕∕ J. Theor.
Biol. - 1981. - 123, N 3. - P. 305-310.
391. Tateno H., Kamiguchi Y. Abnormal chromosome migration and chromo­
some aberrations in mouse oocytes during meiosis II in the presence of topoisomera­
se II inhibitor ICRF-193 ∕∕ Mut. Res. - 2002. - 502, N 1/2. - P. 1-9.
392. Tsumuki H., Rojas P., Storey K. The fale of ["C] glucose during cold harden­
ing in Eurosta solidaginis ∕∕ Cryobiology. — 1987. — 24, N 6. — P. 563—564.
393. Ти К, Xu F.N., Liu et al. Unregulated expression of Bcl-2 in multiple mye­
loma cells induced by exposure to doxorubicin, etoposide, and hydrogen peroxide ∕∕
Blood. - 1996. - N 88. - P. 1805-1812.
394. Turk B.E., Jiang H., Liu G. O. Rinding of thalidomide to LI-acid glycopro­
tein may be involved in its inhibition of tumor necrosis factor-b-production ∕∕ Proc.
Nat. Acad. Sci. USA. - 1996. - 93. - P. 7552-7556.
395. Uemura M., Cahoon E., Lunch D., Steponkus P. Temporal aspects of alte­
rations in the cryobehavior and lipid composition of the plasma membrane during
cold acclimation of winter rye ∕∕ Cryobiology. — 1989. — 26, N 6. — P. 585—586.
396. Van Bekkum D. V. Oxidative phosphorylation in irradiated tissues ∕∕ Chem.
Weekbl. - 1957. - N 53. - P. 233-238.
397. Van Bogelen R. V., Olsen E.R., Nridhardt F.C. Irregularities in the transla­
tion process might be signalling the heat and cold shock responses ∕∕ Int. Conf. «Transe-Appar». Berlin. Oct. 3 Ist-Nov Sth. 1992: Abstr. Book. — Berlin, 1992. — P. 34.
398. Ven Kataraman M., Westerman M.P. Effects of cryopreservation on the
mononuclear cells of patients with lung cancer and normal controls ∕∕ Cryobiolo­
gy. - 1987. - 24, N 2. - P. 103-111.
399. Vogt Ch., Penz S., Rick I. A role of the macrophage in normal hemopoiesis:
III in vitro and in vivo erythropoietin gene expressision in macrophages detected by
in situ hybridization ∕∕ Exp. Hematol. — 1989. — 17, N 5. — P. 391—397.

284

Список литературы

400. Wang J. С. DNA topoisomerases ∕∕ Annu. Rev. Biochem. — 1996. — 65. —
P. 635-692.
401. WangX., Sharma R.K., Ranganathan P. et al. Oxidative stress and increased
levels of apoptosis (cytochrome C, caspase 3 and 9) in patients with male factor infer­
tility Ц Fertil, Steril. - 2001. - 76. - P. 195.
402. Wang J.S. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspec­
tive Ц Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2002. - 3, N 6. - P. 430-440.
403. WangX., Sharma R.K., Sikka S.C. et al. Oxidative stress is associated with
increased apoptosis leading to spermatozoa DNA damage in patients with male fac­
tor infertility ∕∕ Fertil. Steril. — 2003. — N 80(3). — P. 531—535.
404. Weiser R.L., Wallner S.J., Waddell J.W. Cell wall and extensive mRNK
changes during cold acclimation of pea seedlings // Plant Physiol. — 1990. — 93,
N 3. - P. 1021-1026.
405. Welman A.M., Stewad G. G. Storage of breeding yeasts by liquid nitrogen re­
frigeration ∕∕ Appl. Microbiol. — 1973. — 26, N 4. — P. 577—583.
406. Whelan E. Differental response to chilling injury of the group 6 chromo­
somes of ev. Chinese spring wheat ∕∕ Genome. — 1991. — 34, N 1. — P. 144—150.
407. Wigley D.B. Structure and mechanism of DNA topoisomerases ∕∕ Ann.
Rev. Biophys. Biamol. Struct. — 1995. — N 24. — P. 185—208.
408. Woelders H. Fundamentals and recent development in cryopreservation of
bull and boar semen ∕∕ Vet Q. - 1997. - 19. - P. 135-138.
409. Xiao Mi Dooley D. C. Assessment of cell viability and apoptosis in human
umbilical cord blood following storage ∕∕ J. Hematother. Stem Cell Res. — 2003. —
N 12 (1). - P. 115 - 122.
410. Yang J.i Liu X, Bhalla K. et al. Prevention of apoptosis by Cl-2: release of
cytochrome C from mitochondria blocked Ц Science. — 1997. — 275. —
P. 1129-1132.
411. Yin X.~M. Bid. A BH3 — only multi-functional molecule, is at the cross
road of life and death ∕∕ Gene. — 2006. — 369. — P. 7—19.
412. Young S. A glimpse of immortality ∕∕ New Sci. — 1988. — 119, N 16303. —
P. 44-48.
413. Zavos P.M., Goodpasture J.S., Zaneveld B.J. Motility and enzyme activity of
human spermatozoa stored for hours at 5 oC and -196 0C Ц Fertil. Steril. — 1980. —
14, N 5/6. - P. 691-695.
414. Zhong W.B., Wang C. Y., Ho K.J., et al. Magnolol induced apoptosis in hu­
man leukemia cells via cytochrome C release and caspase activation ∕∕ Anticancer
Drugs. - 2003. - 14, N 3. - P. 211-217.

Оглавление

Предисловие................................................................................................................................. 5
Глава 1. Апоптоз и криообновление — важнейшие противоположно направленные
феномены в клеточной биологии.............................................................................................. 7

1.1. Возможные механизмы мембранного транспорта белков: перенос
цитохрома c через митохондриальные мембраны и его роль в механизме
криообновления

28

Глава 2. Криообновление — принципиально новое направление
в биологии и медицине

35

2.1. Новые данные о селективном свойстве криоконсервирования................... 44
2.1.1. Перенос генов холодовой адаптации, генов, индуцирующих
гетерозисный эффект, и генов белков-антифризов
46
2.1.2. Индукция криомутаций и криогибридов с гетерозисным эффектом
2.1.3. Активация энергообразующих и других систем в стационарной
кинетике биохимических реакций
50
2.2. Изменение регуляции клеточного генома............................................................. 51
2.3. Стимулирующее действие криоконсервирования. Гемопоэтические
клетки
55
2.3.1. Реакции реципиентов на криоконсервированный трансплантат
(иммунобиологические характеристики)
58
2.3.2. Реакции криоконсервированных гемопоэтических клеток на
активаторы обменных процессов
68
2.4. Трансформирующее (преобразующее) действие криоконсервирования
100
2.5. Мутагенное действие криоконсервирования..................................................109
2.5.1. Изменение морфологии и функции клеточного генома........................... 109

Глава 3. Причинно-следственная связь качественного обновления свойств
клеток после криоконсервирования и ее сущность............................................................... 115
Глава 4. Классификация состояний биологических объектов..................................... 120
4.1. Состояние биологических объектов как теоретическая основа криобио­
логии............................................................................................................................................... 120
4.2. Состояние биологических объектов в процессе криоконсервирования
123

Глава 5. Криопротекторы. Классификация и механизм действия................................ 134

5.1. Криопротекторы — генетически активный фактор........................................ 153
Глава 6. Апоптоз и криообновление как основа эффективного использования
криобиологических технологий в гематологии и трансфузиологии................................160
6.1. Апоптоз: конденсация хроматина, потеря митохондриальными
мембранами апоптотических белков и цитохрома c, активация каспаз
6.2. Криообновление: деконденсация хроматина, активация процессов
транскрипции, благоприятное стимулирующее действие цитохрома c

286

161

Оглавление
6.3. Динамическое взаимодействие апоптоза и криообновления: экспрессия
антиапоптотических генов и ГХА; индукция антиапоптотических белков
и БХШ
163
6.4. Перспективы возможных преимуществ большей клинической
эффективности гемопоэтических клеток, заготовленных от эмбрионов
и плодов, по сравнению со взрослыми донорами
169
6.4.1. Криоконсервирование стволовых клеток.........................................................169
6.5. Маркеры раннего апоптоза гемопоэтических клеток требуют вклю­
чения программы криообновления: реальность и перспективы........................ 175

Глава 7. Апоптоз и криообновление — современные проблемы цитохромной
терапии........................................................................................................................................... 178
7.1. Краткий очерк развития цитохромной терапии................................................ 178
7.2. Роль цитохрома c в механизмах апоптоза и криообновления................ 181

Глава 8. Криообновление как основа эффективного лечения мужского бесплодия
8.1. Активность сукцинатдегидрогеназы в спермиях человека, хранивших­
ся в условиях гипотермии......................................................................................................193
8.2. Влияние цитохрома c на подвижность и фертильность спермиев
человека, хранившихся в условиях гипотермии при −196 °С
195
8.3. Динамическое взаимодействие апоптоза и криообновления и сдвиг
его в сторону криообновления — основа получения здорового потомства
8.3.1. Апоптоз: конденсация хроматина, нарушение ДНК-ядерных белко­
вых связей, потеря митохондриальными мембранами цитохрома c, акти­
вация каспаз, снижение мембранного потенциала
197
8.3.2. Криообновление: деконденсация хроматина, индукция ГХА,
БХШ, вхождение в митохондриальный матрикс цитохрома c
198
8.3.3. Маркеры раннего апоптоза спермиев человека требуют включе­
ния программы криообновления................................................................................... 202

Глава 9. Апоптоз и криообновление как основа эффективного лечения
онкологических заболеваний..................................................................................................... 204
Глава 10. Апоптоз и криообновление как основа эффективного использования
низких температур для повышения урожайности растениеводческих культур 213
10.1. Конденсация—деконденсация хроматина — важный способ регу­
ляции клеточного генома.................................................................................................... 215
10.2. Экспрессия ГХА, индукция БХШ и de novo.......................................................216
10.3. Стимулирующее действие низких температур................................................ 218
10.4. Трансформирующее (преобразующее) действие низких темпера­
тур и криоконсервирования............................................................................................... 220
10.5. Генетические основы селективного свойства низких температур
и криоконсервирования
221
Заключение................................................................................................................................. 225

Определение некоторых терминов................................................................................. 244
Summary.....................................................................................................................................258
Список сокращений, принятых в тексте...................................................................... 259
Список литературы............................................................................................................... 260

185

Наукове видання

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

ГРИЩЕНКО Валентин Іванович
АЛЄКСЄЄВСЬКА Емма Іванівна

КРІООНОВЛЕННЯ, ЙОГО РОЛЬ
У ЗБЕРЕЖЕННІ ЗДОРОВ’Я
ТА ДОВГОЛІТТЯ
Російською мовою
Київ, Науково-виробниче підприємство
«Видавництво “Наукова думка” НАН України», 2009

Художнє оформлення М.В. Соловйова
Художній редактор І.П. Савицька
Технічний редактор Т.С. Березяк
Коректор Л.Г. Бузіашвілі
Оператори О.О. Іщенко, В.Г. Каменькович, О.М. Кузьменко
Комп’ютерна верстка О.І. Фуженко

Підп. до друку 10.09.2009. Формат 60×90/16.
Папір офс. №1. Гарн. Таймс. Друк офс.
Фіз. друк. арк. 18,0 + 2 арк. вкл. на крейд, пап.
Ум. друк. арк. 20,0. Ум. фарбо-відб. 28,5.
Обл.-вид. арк. 21,22. Тираж 300 прим. Зам. №9-1098

НВП «Видавництво “Наукова думка” НАН України»
Свідоцтво про внесення суб’єкта видавничої справи
до Державного реєстру видавців, виготівників
і розповсюджувачів видавничої продукції —
серія ДК №2440 від 15.03.2006
01601 Київ 1, вул. Терещенківська, 3
ЗАТ “Віпол”
03151 Київ 151, вул. Волинська, 60
Свідоцтво про внесення до Державного реєстру
серія ДК №752 від 27.12.2001