/
Author: Пинаев Г.П.
Tags: биологическая техника, экспериментальные методы и оборудование в целом биология биология клетки цитология научные труды культивирование
ISBN: 5-02-026610-8
Year: 1988
Text
Методы
культивирования
клеток
АКАДЕМИЯ НАУК СССР Н
НАУЧНЫЙ СОВЕТ ПО ПРОБЛЕМАМ ЦИТОЛОГИИ
ИНСТИТУТ цитологии
Методы
культивирования
клеток
Сборник научных трудов
Ответственный редактор
Г. П. ПИНАЕВ
j МГ АН pggp j
ЛЕНИНГРАД
ЛЕНИНГРАДСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ
«НАУКА»
1988
ч
УДК. 57.086.8
Методы культивирования клеток: Сборник науч, трудов. — Л.: Наука, 1988. — 313 с.
В книге представлены современные методы культивирования клеток человека,
животных и растений, способы подготовки культуральной посуды, приготовления
и выбора необходимых питательных сред, определения контаминаций клеточных
культур, методы идентификации микоплазм н способы борьбы с ними. Детально раз-
бираются методы клеточной инженерии: получение гибридных клеток и мини-клеток,
введение чужеродной ДНК. Специальный раздел посвящен питательным средам.
Приведены типовые методы, используемые для характеристики клеточных линий.
Описаны основные приборы, используемые при культивировании и анализе клеточных
линий, выпускаемые отечественной промышленностью. Сборник рассчитан на широкий
круг специалистов, использующих в своей работе клеточные культуры. Библиогр.
702 назв. Ил. 34. Табл. 21.
Рецензенты:
Ю. Б. ВАХТИН, А. А. СОМИНИНА
2001010000-567
042(02)-88
202-87 — IV
ISBN 5-02-026610-8
© Издательство «Наука», 1988 г.
Предисловие
Клеточные культуры с каждым годом находят все большее приме-
нение в самых разнообразных областях биологии, медицины
и сельского хозяйства. Их используют при решении таких общебио,
логических проблем, как выяснение механизмов дифференцировки
и пролиферации, взаимодействия клеток со средой, адаптации,
старения, биологической подвижности, злокачественной трансформа-
ции и многих других.
Важную роль клеточные культуры играют в биотехнологии
при производстве вакцин, биологически активных веществ. Они
являются исходным материалом для создания клеток-продуцентов,
используются в целях повышения продуктивности сельскохозяйствен^
ных животных и для выведения новых сортов растений. Культуры
клеток применяются для диагностики и лечения наследственных
заболеваний, в качестве тест-объектов при испытании новых фарма-
кологических веществ, а также для сохранения генофонда исчезаю-
щих видов животных и растений.
Широкое распространение клеточных культур и постоянно возни-
кающие новые аспекты их применения обусловлены бурным прогрес-
сом техники культивирования и появлением все большего числа
клеточных линий.
В последнее время интерес к работе с культивируемыми клетками
особенно возрос у специалистов, ранее не применявших этот методи-
ческий подход для решения своих научных проблем. Одной из причин
такой заинтересованности является возникновение новых экспери-
ментальных приемов с использованием моноклональных антител,
получаемых методами гибридомной технологии. Можно сказать
без большого преувеличения, что все ведущие биологические или
медицинские научные учреждения страны стали сейчас усиленно раз-
вивать исследования, проводимые на клеточных культурах человека,
животных и растений. В связи с этим большое число научных
сотрудников разного профессионального профиля обращаются в спе-
циализированные лаборатории клеточных культур за консульта,
циями о том, как организовать работу, какое оборудование су-
ществует для этой цели и как его правильно применять, чем руко-
водствоваться при выборе питательных сред, как бороться с кле-
точными контаминациями, криоконсервировать клетки'и определять
их выживаемость. Начинающие часто пренебрегают самыми основ-
ными и необходимыми правилами ведения клеточных культур и1
расплачиваются за это крупными неудачами в своей работе.
В предлагаемой читателю книге мы пытаемся ответить на
большинство возникающих у исследователей вопросов. Несмотря
3'.
на то что методические аспекты культивирования клеток животных и
растений уже неоднократно рассматривались в зарубежных и оте-
чественных руководствах, непрерывное совершенствование техно-
логии культивирования и анализа клеток, создание новых приборов
и питательных сред приводит к необходимости пересмотра и допол-
нения методического арсенала работы с клеточными культурами.
Это особенно остро ощущается на конференциях, школах и рабочих
совещаниях по биологии клетки в культуре, где идет интенсивный
обмен методической информацией и проявляется большой интерес
к новым методам.
Специальные разделы посвящены отечественному оборудованию,
культуральной посуде и свойствам материалов, из которых она
изготавливается. Подробно рассмотрены вопросы контроля за
контаминациями клеточных культур. Особое внимание уделено
методам гибридизации, генетической трансформации и селекции
соматических клеток в культуре. Учитывая слабую цитогенетическую
подготовку большинства исследователей, работающих с клеточными
культурами, подробно разобраны все этапы хромосомного анализа
клеточных линий. Ряд статей дает представление о методических
особенностях работы с культурами клеток растений.
Книга состоит из четырех разделов. Первый посвящен вопросам
общей технологии клеточных культур, второй — методам анализа
культивируемых клеток, третий — методам клеточной и генной
инженерии и, наконец, четвертый — культивированию клеток разного
происхождения. Все статьи написаны специалистами, имеющими
большой практический опыт в соответствующих направлениях
работы с* клеточными культурами. Достоинством данного сборника
является то, что в нем учтен опыт работы в реальных условиях
с применением отечественного оборудования, материалов и пита-
тельных сред.
К сожалению, объем книги не позволил включить в нее ряд
важных методических приемов работы с клеточными культурами,
которые, как мы надеемся, будут отражены в последующих изданиях.
К ним относятся методы суспензионного культивирования клеток
в ферментерах, культивирование на микроносителях, инкапсуляция
культивируемых клеток для решения биотехнологических и медицин-
ских задач, вопросы управляемого культивирования и ряд других.
Мы надеемся, что материал данной книги будет полезен широкому
кругу читателей, в той или иной степени связанных с работой
на клеточных культурах или собирающихся приступить к ней.
Без сомнения, она найдет спрос у цитологов, генетиков, биохимиков,
молекулярных биологов, физиологов, вирусологов и биотехнологов,
а также у студентов старших курсов университетов и медицинских
институтов.
Вместе с тем мы хотим обратить внимание читателей на то обстоя-
тельство, что культивирование клеток представляет собой сложный
технологический процесс, состоящий из ряда последовательных
этапов. К ним относятся криоконсервация и хранение клеток,
мытье и стерилизация посуды, приготовление и стерилизация пи-
4
тательных сред, работа в боксе в стерильных условиях, постоянный
микробиологический контроль и периодический контроль видовой
специфичности используемых клеток, предохраняющий от часто
случающейся перекрестной контаминации клеточными линиями раз-
ного происхождения.
Многолетний опыт работы Отдела клеточных культур Института
цитологии АН СССР свидетельствует о том, что пренебрежение ка-
кими-либо из перечисленных этапов или несоблюдение мер пре-
досторожности сводит на нет всю остальную работу. Следует под-
черкнуть, что необходимо обеспечить квалифицированное мытье
посуды, ее стерилизацию, приготовление сред и контроль за куль-
турами.
Хотя в настоящее время в Советском Союзе существует Всесоюз-
ная коллекция клеточных культур, из которой можно получить
любую из имеющихся в ней клеточных линий, целесообразно и
разумно организовать в каждом институте свою небольшую кол-
лекцию рабочих штаммов. Это позволит избежать изменения харак-
теристик клеточных линий в процессе их длительного культивиро-
вания.
При организации лаборатории или группы клеточных культур
необходимо предусмотреть расположение помещений и отдельных
подразделений таким образом, чтобы потоки грязного и чистого ма-
териала не пересекались и чтобы вся используемая посуда и все
инструменты обрабатывались единообразно. В противном случае
неизбежны нежелательные осложнения с чистотой клеточных куль-
тур. Желательно контаминированные культуры уничтожать не-
медленно и без сожаления, если существует источник для их восста-
новления.
Многие из перечисленных здесь вопросов нашли отражение
в отдельных разделах настоящей книги. Остается лишь пожелать
читателям успехов в трудном и трудоемком деле работы на клеточных
культурах.
В заключение мне хочется выразить глубокую благодарность
И. И. Фридлянской за большую помощь при редактировании и
компановке данной книги и Е. И. Гончаровой за помощь при подго-
товке рукописи к печати.
Г. П. Пинаев
5
Часть 1
Общая технология
культивирования клеток
Оборудование, используемое при работе
с клеточными культурами
Н. С. Волосов
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Развитие работ с клеточными культурами предполагает создание
соответствующей технической инфраструктуры, обеспечивающей
должный уровень и единую методологическую базу проводимых
исследований.
Технические средства, предназначенные для этой цели, должны
образовывать определенную систему, т. е. быть совмещенными
по виду производимых операций и их последовательности, произ-
водительности, габаритам и эргономическим свойствам, обеспечивать
возможно полное оснащение процедур, необходимых при работах
с клеточными культурами. Полезным при подборе оборудования
является составление так называемых номенклатурных перечней.
При этом все технические средства группируются по их месту
в процессе работ с клеточными культурами, например: 1) приборы
и устройства, обеспечивающие работу с клеточными культурами;
2) приборы и устройства для культивирования клеток; 3) микро-
скопы; 4) устройства для криоконсервации и хранения клеточных
культур.
Предложенная классификация, естественно, не может охватить
все возможные способы применения приборов и виды работ, но она
дает систему для корректного подбора технических средств, нужных
при создании и оснащении лабораторий и участков, связанных
в своей деятельности с использованием клеточных культур.
Информация об особенностях и параметрах приборов и устройств
для работ с культурами клеток животных и растений, приводимая
ниже, сгруппирована по приведенному принципу.
Приборы и устройства, обеспечивающие работу
с клеточными культурами
Установки для приготовления сверхчистой и общелабораторной
воды. Качество воды, используемой для приготовления питательных
сред, для мытья культуральной посуды и в других целях, имеет важ-
ное значение. До недавнего времени такая вода приготавливалась
простой и двухкратной дистилляцией питьевой воды. Эти традицион-
6
ные способы отличаются малой производительностью, сочетающейся
с весьма большой энерго- и материалоемкостью. Изложенное послу-
жило причиной разработки и широкого применения устройств
для приготовления воды, не уступающей, а по ряду параметров
и превосходящей по качеству дистиллированную и бидистиллирован-
ную воду, путем использования физико-химических процессов
обратного осмоса, ионного обмена и мембранной фильтрации.
Водопроводная вода, используемая в качестве исходной, проходит
в этих установках через очистку обратным осмосом, далее поступает
на фильтры из активированного угля, с них — на колонки с ионооб-
менными смолами и затем на мембранные фильтры с диаметром
пор 0.22 мкм. При необходимости вода дополнительно подвергается
воздействию мощного потока УФ-облучения.
Именно к таким установкам относится выпускаемый НПО
АН СССР прибор типа ОВ-1, рассчитанный на получение из обычной
водопроводной воды (ГОСТ 2874-73) до 500 л/ч общелабораторной
или сверхчистой воды. При этом общелабораторная вода превосходит
требования ГОСТ 6709-72 на дистиллированную воду; сверхчистая
вода имеет удельное объемное сопротивление не менее 15 мОм/см
при температуре 20 °C. Частицы с размером более 0.2 мкм в воде
отсутствуют. Тяжелые металлы (железо, свинец, ртуть, кадмий и др.)
содержатся в количествах, не отражающихся на качестве питатель-
ных сред для культур клеток животных.
Установка ОВ-1 состоит из двух конструктивно самостоятельных
частей, допускающих независимое использование и поставку —
ОВ-2 и ОВ-3.
Установка ОВ-2 представляет собой систему для приготовления
общелабораторной воды (габариты 1875X700X1930 мм, масса
500 кг, производительность 220—500 л/ч) и выпускается по
ТУ 88.1Г2.950.728-86. Для обеспечения полной производительности
подаваемая на вход вода должна иметь температуру не ниже 15 °C
и давление не менее 2.5 кг/см2.
Установка ОВ-3 предназначена для получения пригодной
для приготовления питательных сред сверхчистой воды из общелабо-
раторной (от установки ОВ-2) или из дистиллированной воды
(габариты 1160X500X1430, масса 150 кг, производительность
200—500 л/ч), выпускается по ТУ 88.1Г2.950.729-86.
Установка ОВ-1 представляет собой последовательно соединен-
ные установки ОВ-2 и ОВ-3, производится по ТУ 88.1Г2.950.727-86.
Эта установка и соответственно приборы ОВ-2 и ОВ-3 подключаются
к источнику электроэнергии (220/380 В, 50 Гц), потребляемая
мощность не более 8.0 кВА, в том числе ОВ-2 — 6.0 кВА и ОВ-3 —
2.0 кВА.
Приборы и аппараты для мытья и стерилизации посуды обеспечи-
вают выполнение всех этапов этого технологического процесса:
предварительную стерилизацию посуды, поступающей из опыта,
предварительное замачивание„полоскание после замачивания, мойку,
сушку, упаковку и финишную стерилизацию.
Предварительная стерилизация, как правило, производится на-
7
сыщенным водяным паром в паровых стерилизаторах при темпера-
туре от 121 до 135 °C. Время и температура стерилизации опреде-
ляются исходя из биологической опасности обрабатываемой посуды.
В работах с клеточными культурами наиболее удобны электрические
паровые стерилизаторы вертикальной и горизонтальной конструкции
со стерилизационными камерами круглого и прямоугольного сечения.
Наиболее совершенные модели этих аппаратов имеют автомати-
ческую защиту от перегрева, защиту оператора от ожогов, авто-
матическое выполнение заданного цикла стерилизации, приборы
для регистрации текущей температуры в камере. В комплекте
с автоклавом могут поставляться специальные загрузочные корзины.
Для обеспечения быстрой и качественной мойки посуда после
предварительной стерилизации замачивается в водных растворах
химических реагентов (5 %-ном растворе гипохлорита натрия,
3 %-ном растворе перекиси водорода и т. п.). Замачивание целесооб-
разно производить в специальных сосудах (ваннах) прямоугольной
или цилиндрической формы из химически стойких материалов
(например, винипласта), снабженных крышками и сливными сифон-
ными устройствами. Если замачивание производится в метал-
лических емкостях, то их внутреннее эмалевое покрытие должно
быть без сколов и других механических повреждений. Замачивание
необходимо производить под местной вытяжной вентиляцией.
Посуду при этом целесообразно помещать в специальные корзины,
изготовленные из химически и коррозийно стойких материалов
и имеющих крышки, что не позволяет посуде всплывать при ее погру-
жении д раствор. Конструкция корзин должна обеспечивать
свободную циркуляцию раствора во внутреннем объеме и легкое
извлечение корзин из ванны, исключающее прямой контакт рук
обслуживающего персонала с раствором. Можно рекомендовать
использование корзин прямоугольной формы с размерами 270Х320Х
ХЗЗО мм, что обеспечивает их максимальное заполнение культураль-
ной посудой с оптимальной массой, не превышающей 10 кг.
После извлечения корзин с посудой жидкость из них сливается
в ванну, остатки жидкости удаляются путем помещения в аналогич-
ные ванны, но заполненные водой, которая автоматически заменяется
при помощи сифонного устройства через определенное время.
При скорости слива до 10 л/мин смена воды в сосуде емкостью
200 л происходит 1—2 раза в час.
Посуда, очищенная от остатков замачивающего раствора,
подвергается мойке, как правило, включающей в себя следующие
обязательные операции: предварительное полоскание холодной
или слегка нагретой (до 30—40 °C) водой; мытье горячим (до 96 °C)
водным раствором детергента; второе полоскание горячей или теплой
водой; финишное полоскание дистиллированной или общелаборатор-
ной водой. Необходимо заметить, что выбор температуры воды
зависит от термостойкости обрабатываемой посуды и ее способности
выдерживать «тепловой удар», т. е. резкий перепад температур
при охлаждении или нагреве.
Оптимальным является использование для мытья автоматических
8
моечных машин различной производительности, выпускаемых рядом
фирм («Gilowy», «Netzsch», «Forma Scientific», «Miele», «Hotpack-
Heinicke»).
Аналогичная машина типа РЗ-АММ, разработанная в СССР,
обеспечивает выполнение следующих технологических операций:
предварительное полоскание холодной водой, мойку водным раство-
ром детергента с температурой до 90 °C, повторное полоскание
холодной или горячей водой, финишное полоскание дистиллирован-
ной водой. Длительность каждой операции выбирается в диапазоне
от 1 до 15 мин (в зависимости от степени загрязненности посуды
или требований к качеству помывки). Машина может работать
в автоматическом и ручном режимах. В первом случае машина
сама переходит от одной технологической операции к другой.
Длительность операций, установленная заранее, выдерживается
также автоматически. В ручном режиме длительность операций
и переход от одной операции к другой контролируются и управляются
оператором. Оптимальная длительность обработки посуды (полного
цикла) примерно 15 мин, из которых финишное полоскание длится
1 мин. Техническая производительность машины в час: чашки ЧБН
(Петри) диаметром 100 мм — до 200, колбы емкостью 250 мл —
до 100, пробирки диаметром 14 мм — до 2000, пипетки мерные —
до 12 600.
Посуда перед мойкой загружается в специальные корзины
различной конфигурации, входящие в комплект поставки машины.
Тип корзин определяется видом посуды (пипетки, чашки ЧБН ит. п.).
Нагрев водного раствора детергента происходит непосредственно
в машине. Температура нагрева задается оператором и поддержи-
вается автоматически. Имеется система аварийной защиты и сигна-
лизации при перегреве или отсутствии раствора.
Дистиллированная горячая и холодная вода подается от внешних
источников, обеспечивающих давление на входе в машину для ди-
стиллированной воды не менее 0.5 кг/см2; для холодной и горячей —
4.5 кг/см2. Машина потребляет 30—40 л/мин по каждому виду воды.
Габариты машины РЗ-АММ 1090X660X1040 мм. В рабочем
положении машина устанавливается на специальную подставку,
входящую в комплект РЗ-АММ. Удобство загрузки и разгрузки
машины дополнительно обеспечивается подкатным столиком,
также прилагаемым к ней. Масса РЗ-АММ (без подставки и столика)
150 кг, электропитание от сети трехфазного переменного тока
220/380 В, потребляемая мощность— 14 кВА.
В качестве детергента могут использоваться продукты, производи-
мые в СССР (например, тринатрийфосфат). Важно, чтобы они обес-
печивали наименьшее количество пены. Необходимо следить
за полным растворением детергента в баке машины и очищать
от механических примесей подводимую к машине горячую и холодную
воду.
После окончания мойки посуда должна быть высушена. Наиболее
эффективно этот процесс происходит в сушильных шкафах с принуди-
тельной продувкой горячим воздухом.
9
Сушильные шкафы, выпускаемые в СССР, имеют рабочий объем
от 40 до 640 л. Температура сушки задается и автоматически
поддерживается в диапазоне от 40 до 120 °C. В современных
сушильных шкафах для лабораторной посуды заданная температура
поддерживается с точностью до ±3 °C, имеются задатчики времени
сушки и системы сигнализации об окончании процесса сушки
и аварийной защиты от перегрева. Воздух в полезном объеме
сушильного шкафа может рециркулировать или сообщаться с внеш-
ней средой. В последнем случае подача воздуха происходит через
фильтр.
После сушки посуда готовится к финишной стерилизации: за-
купоривается ватно-марлевыми пробками, заворачивается в бумагу
крафт, алюминиевую фольгу или помещается в специальные
металлические контейнеры, что необходимо для обеспечения мини-
мального повторного загрязнения внутренних полостей посуды
при ее выемке из финишного стерилизатора. Для укупорки рекомен-
дуется использовать фольгу пищевую гладкую мягкую из алюминия
А5 (ГОСТ 745-79) толщиной 0.014 мм, которая поставляется в ру-
лонах шириной от 54 до 420 мм. Учитывая значительную массу
рулонов, рекомендуется размещать их на специальных штативах,
обеспечивающих надежное крепление и свободное вращение рулона.
Финишная стерилизация посуды производится в паровых (опи-
саны выше) или воздушных стерилизаторах. Последние изготов-
ляются в СССР по ГОСТ 22649-83 с полезным объемом стерилиза-
ционной камеры от 1 до 1300 л. В работах с клеточными культурами
целесообразно использовать электрические воздушные стерилиза-
торы с горизонтальной прямоугольной стерилизационной камерой.
Общепринятой стандартной температурой стерилизации является
180°C±1q°C. В отдельных случаях допускается производить сте-
рилизацию при температурах 85, 120 или 160 °C. Для уменьшения
перепада температуры по полезному объему воздух в стерилизаторе
принудительно циркулирует от встроенных в прибор вентиляторов.
Современные воздушные стерилизаторы имеют цифровую индикацию
текущей температуры в полезном объеме, систему автоматической
блокировки дверей, исключающую как повреждение посуды от
теплового удара, так и ожоги обслуживающего персонала, обеспе-
чивают возможность программирования и автоматического выпол-
нения цикла стерилизации по времени и температуре и аварийную
сигнализацию.
Приборы для дозирования, разведения и пробоотбора. В практике
работ с клеточными культурами весьма часто возникает необходи-
мость массового дозирования, пробоотбора или разведения биологи-
чески активных жидкостей. Величина единичной дозы в большинстве
случаев лежит в диапазоне от 1 мкл до 10 мл. Предъявляются также
весьма жесткие требования к точности и воспроизводимости
разовой дозы. Значительно облегчает введение этой технологической
операции использование автоматических или полуавтоматических
устройств, называемых в различных источниках дозаторы-дилюторы,
автоматические пипетки и т. п.
10
Одним из технических требований к подобным приборам
является отсутствие или минимизирование контакта дозируемого
раствора с частями конструкции дозатора, что достигается
использованием шприцевых дозаторов, перистальтических насосов-
дозаторов или путем создания воздушного буфера между разливае-
мым веществом и активным элементом дозатора. Все части прибора,
имеющие контакт (потенциальный или реальный) с дозируемым
раствором, должны позволять их паровую или воздушную стерили-
зации. Очевидной является также необходимость обеспечения
хороших эргономических параметров (малая масса, удобная форма
рабочих органов и т. п.).
Перечисленные требования в основном удовлетворяются в се-
рийно производимых в СССР приборах подобного назначения.
Ниже приводится описание некоторых из них.
Полуавтоматический шприцевый дозатор «Дозатор ДВ» может
быть установлен либо на горловине сосуда с разливаемой жидкостью,
для чего имеет специальный узел крепления, либо на крышке
укладочного ящика. В последнем случае подача дозируемого ве-
щества производится по соединительной трубке, сочленяемой с за-
борным отверстием дозатора, имеющим специальный штуцер.
На воздухозаборное отверстие прибора может быть помещен
воздушный фильтр (в комплект поставки не входит). Собственно
дозирующий элемент прибора представляет собой стеклянную трубку,
в которой перемещается на определенное расстояние поршень
из силиконовой резины. Дозатор позволяет паровую стерилизацию
без разборки его на составные части. Прибор поставляется в комп-
лекте, состоящем из трех дозаторов, обеспечивающих забор и выдачу
единичных доз: от 0.4 до 2 мл (ДВ-2); от 1.0 до 5.0 мл (ДВ-5);
от 2.0 до 10.0 мл (ДВ-10). Дискретность задания величины дозы
равна 0.1 от величины нижнего значения диапазона дозирования.
Например, для дозатора ДВ-2 это будет 0.04 мл. Основная приве-
денная погрешность дозирования 1 %, сходимость дозирования
0.5 %. Диаметр каждого дозатора не более 60 мм, длина 120 мм,
масса не более 0.5 кг, при установке на укладочный ящик его габа-
риты 60X115X210 мм. Приборы выпускаются по ТУ 25-0521.117-85.
Код ОКП 42 1592 9880 01.
Автоматический шприцевый дозатор «Дозатрон-3» производит
разведение или дозирование одновременно по двум каналам. Может
работать как в автоматическом, так и в полуавтоматическом режи-
мах. При работе в автоматическом режиме оператор устанавли-
вает величину единичной дозы по каждому каналу, задает число
последовательно выдаваемых доз (циклов дозирования). После по-
дачи команды «пуск» прибор автоматически выполняет дозирова-
ние намеченное число раз. В полуавтоматическом режиме команда
«пуск», подаваемая с пульта управления или от ножной педали,
инициирует выдачу единичной дозы, после чего дозирование пре-
кращается до получения следующей команды. Величина дозы под-
держивается равной заданной. В зависимости от типа дозирую-
щего элемента номинальные объемы единичной дозы могут быть
п
установлены: от 10 до 100 мкл; от 100 до 1000 мкл; от 1000 до
10 000 мкл. Все сменные дозирующие элементы входят в комплект
поставки прибора. Величина единичной дозы задается дискретно
с шагом, равным 0.01 от наибольшего значения дозы для данного
дозирующего элемента. Максимальное значение основной приведен-
ной погрешности дозирования лежит в диапазоне 1—3 % (в зависи-
мости от величины дозы). Сходимость дозирования не более 1 %.
При автоматическом режиме работы прибор обеспечивает скорость
дозирования до 20 доз в 1 мин при величине дозы в 5000 мкл.
Прибор работает при включении в сеть 220 В, 50 Гц, потребляемая
мощность не более 75 Вт, уровень шума при работе прибора
не более 60 дБ. Дозатор рассчитан на работу с жидкостями, имею-
щими температуру не более 35 °C и вязкость, близкую к вязкости
воды. Все части прибора, контактирующие с разливаемыми жидко-
стями, могут быть подвергнуты паровой стерилизации. Прибор
состоит из двух блоков: блока управления (габариты 337X317Х
Х145 мм, масса 10 кг) и блока дозирования (габариты 290Х215Х
Х335 мм, масса 8 кг). Прибор выпускается по ТУ 25-05. (Я62.393.
016)-84, код ОКП 42 1592-9885 07.
Автоматический шприцевый дозатор «Дозатрон-4» предназна-
чается для автоматического дозирования жидкостей в иммунологи-
ческие планшеты (ТУ 64.2-278-79) с 96 микрокюветами. Объем еди-
ничной дозы в каждой микрокювете может быть установлен опе-
ратором в диапазоне от 10 до 300 мкл с дискретностью в 1 мкл.
Прибор имеет 8 дозирующих элементов с объемом в 7.2 мл каждый.
Все эти элементы позволяют паровую стерилизацию. Прибор может
работать в автоматическом и полуавтоматическом режимах. При
работе в автоматическом режиме заранее установленная опера-
тором доза подается автоматически в заданное количество рядов мик-
рокювет на планшете. Дозирование производится одновременно в
8 кювет, которые по очереди автоматически подводятся в положение
дозирования. При переходе в полуавтоматический режим работы
после заполнения заданной дозой микрокювет одного ряда прибор
останавливается. Повторный запуск и очередное перемещение кювет
производится путем подачи отдельной команды. Прибор обеспечи-
вает дозирование с максимальной основной приведенной погреш-
ностью в ± 1 % со сходимостью в 1 %. Дозирование 96 доз объемом
в 300 мкл производится за 1 мин.
«Дозатрон-4» состоит из двух блоков: блока дозирования
(габариты 208x402x433 мм, масса 10 кг) и блока управления
(габариты 337x317x145 мм, масса 7 кг). Питание дозатора про-
изводится от сети переменного тока 220 В, 50 Гц, потребляемая
мощность 75 Вт. Прибор изготовляется по ТУ 25-05. (Я 62.393.013) -84,
код ОКП 42 1592 9886 06.
Пипетки лабораторные ПЛ-01 производят полуавтоматическое
дозирование биологически активных жидкостей. Конструкция пипе-
ток исключает возможность контакта разливаемых жидкостей
с рабочим элементом пипетки. Дозируемая жидкость набирается
в специальный сменный наконечник конической формы. Пипетки
12
поставляются в наборе из трех приборов: ПЛ 01-20 (величина
дозы задается в диапазоне от 2 до 20 мкл, основная погрешность
дозирования ±0.2 мкл, сходимость дозирования ±0.4 мкл), ПЛ 01-
200 (величина дозы от 20 до 200 мкл, основная погрешность дози-
рования ±1.0 мкл, сходимость дозирования ±2.0 мкл), ПЛ 01-1000
(величина дозы от 200 до 1000 мкл, основная погрешность дозиро-
вания ±5.0 мкл, сходимость дозирования ±10.0 мкл). Конструкция
позволяет их поправочную калибровку и подстройку пользователем.
Сменные наконечники допускают паровую стерилизацию при темпе-
ратуре ПО °C и вторичное использование. В комплект поставки
входят три прибора, два вида сменных наконечников, штатив для
пипеток и подставки для наконечников. Выпускаются по ТУ 25-
11.1550-80.
Дозаторы пипеточные типа КДП-1 для полуавтоматического
дозирования биологически активных жидкостей с набором их в смен-
ные наконечники. Комплект дозаторов состоит из 8 моделей, каждая
из которых обеспечивает выдачу двух фиксированных по объему
доз (5 и 10 мкл, 20 и 25, 50 и 75, 50 и 100, 75 и 150, 200 и 300, 250 и 500,
600 и 1000 мкл). Сменные наконечники могут подвергаться паровой
стерилизации при 121 °C и повторно использоваться. Пипетки, вхо-
дящие в комплект, отличаются цветной маркировкой. Комплект
поставки состоит из восьми дозаторов, штатива и сменных нако-
нечников.
Дозаторы пипеточные П1 производят полуавтоматическое
дозирование биологически активных жидкостей с набором их в смен-
ные наконечники. Выпускается пять моделей дозаторов П1: П1-0.02,
выдает фиксированную дозу в 20 мкл; П 1-0.05, выдает фиксирован-
ную дозу в 50 мкл; П1-01, выдает фиксированную дозу в 100 мкл;
П1-0.2, выдает фиксированную дозу в 200 мкл; П1-0.5, выдает
фиксированную дозу в 500 мкл. В зависимости от величины дозы
предел допускаемых значений основной относительной погрешности
дозирования колеблется от ±3 до ±4 %. Предельное значение
среднего квадратичного отклонения случайной составляющей
основной погрешности дозирования (определяет воспроизводимость
дозирования) равно 2—3 %. Конструкция дозаторов П1 позволяет
только химическую стерилизацию путем погружения собранного
дозатора в 6 %-ный раствор перекиси водорода (ГОСТ 177-79)
с 2-часовой выдержкой при температуре 50 °C (при температуре
20 °C выдержка не менее 6 ч). Дозаторы выпускаются по ТУ 64-1-
3329-81, код ОКП 94 5244.
Все описанные выше приборы позволяют работу с жидкостями,
нагретыми до 40 °C (не более) и имеющими вязкость, близкую
к вязкости воды. Тем самым не обеспечивается дозирование
питательных сред на основе агара, которые для придания им малой
вязкости должны быть нагреты до температуры не менее 60 °C.
Для решения этой задачи разработан комплекс «Агар-1».
«Агар-1» — аппарат для разлива питательных сред, состоит
из перистальтического насоса-дозатора и разливочного аппарата.
Прибор обеспечивает автоматическое одновременное заполнение
13
16 стеклянных чашек ЧБН (Петри) с диаметром 100 мм. Простерили-
зованные чашки ЧБН устанавливаются в закрытом виде на специаль-
ный планшет, помещаемый оператором в разливочный аппарат
прибора, где чашки одновременно открываются, и автоматически
перемещающаяся разливочная головка производит их заполнение
заданным количеством среды, подающейся от перистальтического
насоса. В момент разливки среда имеет температуру от 5 до 70 °C.
Заполнение 16 чашек происходит за 1 мин. В период заливки
в разливочном аппарате поддерживаются стерильные условия
путем УФ-облучения его внутреннего объема. После заливки чашки
выдерживаются в аппарате для удаления паров воды и образования
на поверхности среды пленки (первичное схватывание), после
чего планшет извлекается оператором и перемещается на стол
(в комплект прибора не входит), где крышки чашек при помощи
специального устройства на планшете приподнимаются с целью
удаления остаточных паров среды и исключения возможности
образования конденсата на них.
В комплект поставки прибора входят 12 планшетов, что обеспе-
чивает заливку до 400 чашек в час. Перистальтический насос-дозатор
из комплекта прибора может заказываться как самостоятельное
изделие. Шланги насоса и планшеты могут быть подвергнуты па-
ровой стерилизации при температуре 121 °C в течение 30 мин. Ниже
приводятся технические данные комплекса «Агар-1».
Насос-дозатор перистальтический (габариты 400x300x300 мм,
масса 8 кг) подает питательную среду со скоростью от 0.2 до 2.5 см3/с,
шаг 0.2 см3. Величина дозы задается в диапазоне от 1 до 29 см3
с шагом Ч см3. Точность дозирования ±10 % от заданного объема.
Питание насоса от сети переменного тока 220 В, 50 Гц. Шум при
работе насоса не более 65 дБ. В насосе используются шланги
из силиконовой резины. Насос может работать в автоматическом
и полуавтоматическом режиме дозирования. В последнем случае
обеспечивается возможность дозирования в любые сосуды при авто-
номном использовании насоса. При этом управление насосом
производится от специальной кнопки на наконечнике шланга
или от ножной педали.
Аппарат разливочный (габариты 1000X600X600 мм, масса 40 кг)
имеет съемную крышку со смотровым окном, боковое отверстие
для ввода планшета, встроенные источники УФ-облучения и органы
управления, необходимые для работы. Разлив питательной среды
происходит без образования пены и капель. Аппарат поставляется
по ТУ 25-05 (Яб 1.540-004)-84, код ОКП 42 1592 9101 04.
Кроме изложенного, необходимо отметить, что в зарубежной
практике нашли широкое применение устройства малой лаборатор-
ной техники, не являющиеся по своей сути дозаторами, но значи-
тельно облегчающие этот процесс и делающие его более безопасным
для оператора. Речь идет о так называемых приборах «Pipet-Aid».
Приборы этого вида выпускаются рядом фирм («Flow», «Bellco»,
«Cole-Parmer» и др.) и предназначены для пробоотбора и выдачи
14
дозы при работе с пипетками Пастера и любыми градуированными
пипетками емкостью до 75 мл. Пипетка вставляется в специальный
держатель типа «пистолет», который соединяется с малогабаритным
вакуумным насосом, в некоторых моделях размещенным непосред-
ственно в держателе, но могущим быть и автономным устройством.
Отбор и дозирование производится созданием вакуума или избыточ-
ного давления в пипетке. Управление работой прибора производится
оператором нажатием кнопок, размещенных на держателе. Скорость
набора и выдачи дозы регулируются установкой производительности
насоса или силой нажатия соответствующих кнопок управления.
Имеется защита от попадания дозируемой жидкости в прибор
и воздушные фильтры, исключающие загрязнение дозируемой
жидкости при сливе дозы.
Устройства для приготовления питательных сред. Одним из глав-
ных требований к жидким питательным средам для клеточных
культур является их стерильность, достигаемая в том числе и так
называемой стерилизующей фильтрацией, освобождающей питатель-
ные среды от примесных частиц, бактерий и коллоидов.
Следует различать микро- и ультрафильтрацию сред. При микро-
фильтрации из жидкости удаляются частицы примесей и бактерии
размерами от 0.25 до 10 мкм. Ультрафильтрация приводит к извлече-
нию из раствора очень мелких частиц и коллоидов, а также молекул
растворенных веществ с молекулярными массами от 1 тыс. до 1 млн.
Процесс микрофильтрации осуществляется пропусканием жид-
кости через мембранные или глубинные фильтры. Ряд недостат-
ков, свойственных глубинным фильтрам, изготавливаемым из ваты,
стекловолокна, асбеста, фарфора и других материалов (возможность
роста микроорганизмов в массе фильтра, поглощение значительных
количеств фильтруемых жидкостей), делает предпочтительным
использование при очистке питательных сред мембранных фильтров,
которые имеют поры гарантированного размера и лишены других
перечисленных выше недостатков. Мембранные фильтры изготавли-
ваются из различных полимеров, в том числе позволяющих стерили-
зацию паром (фторопласт, поливинилдендифторид, эфиры целлю-
лозы) и обеспечивающих химическую стойкость к компонентам
питательных сред. Для стерилизующей фильтрации питательных
сред используются мембранные фильтры с диаметром пор 0.2—
0.22 мкм, хотя имеются фильтры с порами размером 0.1, 0.3, 0.45,
0.65, 0.8, 1.2, 3.0, 5.0 и 8.0 мкм. Фильтры с порами 0.22 мкм при пере-
паде давления на них 70 кПа (0.7 бар) обеспечивают скорость
протока воды 15—16 мл/(мин • см2).
Мембранные фильтры, пригодные для очистки питательных сред,
производятся рядом фирм («Millipore», «Sartorius», «Shleiher-
Shull» и др.). Наибольшее применение в практике нашли фильтры
фирмы «Millipore». Размеры мембранных фильтров этой фирмы
(13, 25, 47, 90, 142 и 293 мм) в какой-то мере стали стандартными.
Для фильтрации средних по объему количеств питательных сред
(25—50 л) наиболее удобны установки с мембранными фильтрами,
диаметром 90 и 142 мм. В общем случае установка для стерили-
15
зующей фильтрации состоит из системы создания избыточного
давления на фильтруемую жидкость, стерилизуемого держателя
фильтра, фильтрующей мембраны, трубопроводов и сосудов
(для размещения фильтруемой жидкости и фильтрата).
Для обеспечения движения жидкости через фильтр к ней
необходимо приложить определенное давление извне. Подобное
давление может быть создано центробежными силами, вакуумом
на выходе установки, но чаще для этой цели используется подача
нейтрального газа (например, азота) под определенным давлением
в сосуд со средой, подлежащей очистке. Величина избыточного
давления зависит от размера пор и диаметра (площади) мембраны.
Подробные указания на этот счет приводятся изготовителем мембран.
Стерилизуемый держатель фильтра обычно изготавливается
из качественной нержавеющей стали (например, 12Х18Н9Т) и сос-
тоит из двух частей тарельчатой формы, внутри которых имеется
цилиндрическая выборка для размещения мембраны. Держатель
горизонтально устанавливается на опорах, размещенных в его ниж-
ней части. Оба тарельчатых элемента имеют штуцерные вводы,
обеспечивающие соединение с трубопроводами подачи и сбора
фильтруемой жидкости. Соединение верхнего и нижнего тарельчатого
элементов производится при помощи шпилек (обычно трех),
на которые при сборке навинчиваются гайки, позволяющие ручную
стяжку. Мембрана фильтра, размещенная на опорной сетке, под ко-
торой укладывается осушительная сетка, фиксируется в цилиндри-
ческой выборке держателя кольцевыми прокладками.
После установки мембраны и сборки держателя перед началом
и после окончания фильтрации производится обязательная проверка
правильности установки и сборки, а также качества мембраны.
Для проверки используется «тест появления пузырьков» или «пузырь-
ковый тест». Так как мембрана представляет собой тело, имеющее
сеть единообразных переходов, могущих рассматриваться как одно-
родные капилляры, то естественно, что для вытеснения из них жид-
кости необходимо приложить некоторое избыточное давление, об-
ратно пропорциональное диаметру капилляров (пор). Тест заклю-
чается в создании на входе фильтра избыточного давления, при кото-
ром на выходе появляются пузырьки воздуха. Величина давления
фиксируется и сравнивается с указанным в паспорте мембранного
фильтра. Значение давления меньше паспортного показывает на
неисправность в системе фильтрации.
При подборе и расчете фильтрующей системы рекомендуется
предварительно сформулировать задачу (вид среды, подлежащей
фильтрации, ее температура, вязкость, химический состав, размер
частиц, подлежащих фильтрации, режим фильтрации — непрерыв-
ный или порционный и т. п.) и подобрать соответствующую мембрану,
держатель, а также определить величину избыточного давления,
необходимого для фильтрации.
Стерилизацию питательных сред рекомендуется проводить
в боксовых помещениях или в так называемых ламинар-боксах,
описываемых ниже.
16 ' , '' ! '
Приборы и устройства для культивирования клеток
Стерильные рабочие места. Обеспечение стерильности при работе
с клеточными культурами обычно достигается путем помещения
объекта исследования вместе с экспериментатором в так называемое
боксовое помещение в виде изолированной комнаты, имеющей
прихожую (предбоксник) и обеспеченную необходимым общим
и специальным освещением, системами приточной и вытяжной
вентиляции, горячим и холодным водоснабжением, а также подво-
дами газов и сжатого воздуха. Стены, пол и потолок подобных
помещений покрыты несорбирующими пыль и моющимися покры-
тиями.
Создание боксовых помещений, как правило, требует значитель-
ных капитальных затрат и не обеспечивает необходимой организа-
ционно-технологической гибкости при переходе к отличным от перво-
начальных методам исследований. Помещения не дают должной
стерильности. Кроме того, неизбежны прямые контакты между
объектом работы и оператором, что часто нежелательно.
Альтернативой является использование так называемых
ламинар-боксов или стерильных рабочих мест. В этом случае
в любом помещении может быть создан локальный стерильный
объем, необходимый для работы и создающий биологическую защиту
пользователей. Технически задача решается путем постоянного
обдува места проведения работ (например, стола) ламинарным
потоком воздуха, содержащего не более четырех частиц загрязнений
с размером 0.3—0.5 мкм в 1 дм3. Избыточное давление воздуха
в рабочем объеме и специальные конструктивные меры исключают
возможность попадания воздуха из помещения на место, где располо-
жен биологический материал. При работе с заведомо непатогенными
материалами поток обеспыленного воздуха из рабочей зоны выходит
непосредственно в окружающее пространство. В случае работы
с потенциально патогенным материалом воздух перед выходом
из рабочей зоны дополнительно фильтруется. Возможность обдува
оператора при этом исключена. В зависимости от устройства
ламинар-бокса поток обеспыленного воздуха в рабочей зоне может
быть горизонтальным, вертикальным или наклонным. Использование
ламинар-боксов обеспечивает оперативное переоборудование рабо-
чих помещений при реализации новых методик и не требует дорогих
и длительных монтажно-строительных работ. Ниже приводится опи-
сание отечественных приборов этого класса.
Ламинар-бокс с горизонтальным потоком обеспыленного воздуха
типа УО-БГ (установка обеспыливания биологическая с горизонталь-
ным потоком) имеет следующие параметры: габариты 1280X1120Х
Х2000 мм; размеры рабочей зоны 1140X670X700 мм, масса 250 кг.
Электропитание 220/380 В, 50 Гц, потребляемая мощность 1.1 кВА.
Установка обеспечивает очистку воздуха, подаваемого в рабочую
зону, до уровня не более четырех частиц размером больше 0.5 мкм
в 1 дм3. Очистка производится путем фильтрации на фильтрах
грубой и тонкой очистки, встроенных BfnpJWSaprfie-Mep^jjx загряз-
.«.я „
имг ДН ррм. ;
нения фильтр грубой очистки может промываться, фильтр тонкой
очистки должен заменяться на новый. Прибор имеет встроенные
источники освещения и УФ-облучения (для стерилизации рабочей
зоны в перерывах между использованием бокса), регулятор скорости
воздушного потока и столешницу с негорючим покрытием. Со стороны
оператора рабочий объем имеет подъемное прозрачное ограждение.
Шум при работе УО-БГ не превышает 65 дБ.
Ламинар-бокс с вертикальным потоком обеспыленного воздуха
типа УО-БВ (установка обеспыливания биологическая с вертикаль-
ным потоком) имеет следующие параметры: габариты 1300Х930Х
Х2570 мм, рабочая зона 1280Х800Х 1700 мм, масса 245 кг. Электро-
питание 220/380 В, 50 Гц, потребляемая мощность 1.1 кВА. Качество
очистки воздуха и правила замены фильтров, наличие источников
света и УФ-облучения, регулировка скорости потока воздуха
аналогичны боксу УО-БГ. Прибор комплектуется специальным
столом типа ЮАС, представляющим самостоятельное изделие,
помещаемое внутрь рабочей зоны установки. УО-БВ поставляется
в разобранном виде. Наибольшая транспортная единица — блок
фильтровентиляционной установки — имеет габариты 1250Х870Х
Х930 мм и массу 100 кг. Шум при работе бокса не превышает 65 дБ.
Ламинар-бокс для работ с потенциально патогенными культурами
типа БП-4 004 («Бокс-P») обеспечивает подачу в рабочую зону
ламинарного потока воздуха, содержащего не более 3—4 частиц
загрязнений размером более 0.3 мкм в 1 дм3. В приборе обеспечи-
вается так называемая рециркуляция воздушного потока, заключаю-
щаяся в том, что воздух из рабочего объема попадает на специальный
фильтр ‘Тонкой очистки, откуда часть его выходит в окружающее
пространство, а остальной поток повторно проходит через фильтр
тонкой очистки и вновь поступает в рабочий объем. Этим достигается
невозможность выноса обрабатываемого материала в помещение.
Возможность попадания выходящего воздуха на оператора
предотвращается созданием зоны подсоса на открытой стороне
рабочего объема бокса. Поток воздуха в рабочем объеме может
быть направлен сверху вниз или слева направо. Параметры уста-
новки: наружные размеры 1400X900X2375 мм, размер рабочей зоны
1150X610X700 мм, масса 480 кг, электропитание 220/380 В, 50 Гц,
потребляемая мощность 1.0 кВА. Прибор имеет встроенные источники
света и УФ-облучения, столешницу из нержавеющей стали. Передняя
часть рабочего объема закрыта прозрачным стеклом, перемещаемым
по высоте. Бокс снабжен системой регулирования скорости потока
воздуха и индикаторами загрязнения фильтра тонкой очистки.
Уровень шума, создаваемого установкой, не превышает 65 дБ.
Все перечисленные выше ламинар-боксы предназначаются
для размещения в любых производственных помещениях, имеющих
приточную вентиляцию с предварительной грубой очисткой воздуха.
Общие требования к чистоте воздуха в подобных помещениях
и ламинар-боксах изложены в ГОСТ 25991-83. В том же документе
приведены эргономические и другие требования к этим приборам.
Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны
18
отвечать ряду специальных требований: обеспечивать высокую
стабильность поддержания заданной температуры, создавать мини-
мальный градиент температуры по полезному объему, обладать
системой быстрого восстановления температуры после кратковре-
менного открывания полезного объема, внутренний объем должен
изготовляться из биологически пассивных материалов, т. е. не влияю-
щих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию
компонентов питательных сред.
Материалы и покрытия внутренних и наружных частей
конструкции термостата должны позволять деконтаминацию
водными растворами спирта ректификата и стерилизацию УФ-облу-
чением.
Современные модели этих приборов имеют полезный объем
от 20 до 1400 л. Полезный объем образуется пластинами полирован-
ной нержавеющей стали или меди (у дорогих моделей). Как правило,
термостаты имеют наружную и внутреннюю дверь, последняя изго-
тавливается из прозрачного материала, что обеспечивает обзор со-
держимого термостата без нарушения температурного режима. Мно-
гие модели подобных приборов (фирм «Forma Scientific», «Astell»
и др.) имеют секционированную внутреннюю дверь, обеспечивающую
доступ в термостат с минимальным нарушением теплового режима
в полезном объеме. Устройство термостатов, предназначенных
для работы с культурами растительных клеток, позволяет освещать
полезный объем для получения режима «день—ночь». При этом
варьируются по заданной программе как длительность включения
света и интервала между включениями, так и интенсивность
освещенности (от 500 до 12 тыс. лк). Спектр света подбирается
близким к естественному освещению. Программа регулирования
выполняется автоматически специальным блоком управления.
В подобных термостатах может задаваться и поддерживаться
относительная влажность воздуха в полезном объеме (например,
70 % при 26 °C).
Температура в рабочей камере термостатов обычно может
задаваться в диапазоне от превышающей комнатную на 5 °C до
80 °C. В некоторых моделях термостатов имеется встроенная
холодильная установка, позволяющая задание температуры в диапа-
зоне от —10 до 80 °C и поддержание ее при помещении в полезный
объем приборов, выделяющих дополнительное тепло, например
роллерных установок, встряхивателей и т. п.
Устройство быстрого (форсированного) нагрева обеспечивает
восстановление температуры в полезном объеме прибора после
его кратковременного (до 1 мин) открывания. Время восстановления
зависит от объема термостата и лежит в пределе от 2 до 10 мин.
Как правило, точность поддержания заданной температуры
гарантируется только для одного значения рабочей температуры,
обычно для 37 °C, и равняется ± 0.2 °C. При других рабочих темпера-
турах эта величина достигает ±0.5 °C. Следует иметь в виду,
что подобная точность справедлива лишь в 1—2 точках полезного
объема прибора и, естественно, будет хуже во всем остальном
2*
19
объеме термостата. Градиент температуры по полезному объему
в лучших моделях термостатов равен +0.3 °C и обеспечивается
при незагруженном приборе. Низкое значение градиента создается
принудительным перемешиванием воздуха в камере термостата
от встроенных в него вентиляторов.
Обычно термостаты поставляются с комплектом полок. Полки
изготавливаются из того же материала, что и камера прибора;
они должны обеспечивать свободную циркуляцию воздуха и иметь
достаточную механическую прочность. Шаг установки полок (от 40
до 75 мм) в термостате дает возможность их размещения на разной
высоте.
Термостаты массой более 50 кг имеют поворотные опоры качения.
Все модели этих приборов снабжаются неподвижными опорами,
позволяющими горизонтирование термостатов. Обязательным
является наличие системы аварийной сигнализации, срабатывающей
при уходе температуры от заданной на величину, выбираемую
пользователем (обычно на ±1°С). Кроме того, многие модели
термостатов имеют сигнализацию о неплотном закрытии наружной
двери.
На пульт управления прибором обязательно выводится инфор-
мация о текущей и заданной температурах в полезном объеме;
кроме того, предусматривается возможность документальной регист-
рации первого параметра.
По своей конструкции лабораторные термостаты делятся
на жидкостные и воздушные. В первых из них полезный объем
окружен емкостью, наполненной дистиллированной водой, которую
собственно и нагревают. Воздушные термостаты имеют полезный
объем, непосредственно контактирующий с электронагревательными
элементами. Жидкостные термостаты обеспечивают малые значения
температурного градиента в камере, но имеют очень большую
тепловую инерцию и поэтому очень длительное время вхождения
в рабочий режим. Масса их значительна, а эксплуатация сложна.
Воздушные термостаты, ранее уступавшие жидкостным по ряду
основных параметров (точность поддержания температуры, ее гра-
диент), теперь значительно усовершенствованы и составляют боль-
шую часть серийно производимых моделей.
СО2-инкубаторы. Необходимость поддержания постоянной вели-
чины pH в питательной среде и ее минимального испарения в период
инкубации клеток привела к разработке специальных приборов
для этой цели, так называемых углекислотных или СОг-инкубаторов.
По своей конструкции и основным параметрам эти приборы пол-
ностью соответствуют описанным выше термостатам. Главной
их отличительной чертой является наличие систем создания
и поддержания определенного состава газовой среды в полезном
объеме и высокой относительной влажности в нем.
Газовая среда в камерах СОг-инкубатора содержит повышенную
концентрацию кислорода и углекислого газа, а в большинстве
случаев только углекислого газа; величина концентрации задается
по условиям культивирования и поддерживается автоматически
20
с точностью до ±0.1 %. Современные модели этих приборов
(фирм «Heraues», «Hotpack», «Flow» и др.) позволяют регулировать
количество О2 и СО2 в диапазоне от 1 до 95 % (объемных).
В автоматических СОг-инкубаторах заданный состав газовой
среды поддерживается дозированным поступлением нужного газа
в поток очищенного от пыли внешнего воздуха, подаваемого
во внутренний объем прибора, что позволяет резко сократить
потребление кислорода или углекислого газа от внешних источников
(например, баллонов). Другой разновидностью инкубаторов
являются так называемые газопроточные инкубаторы, где подача
нужных газов производится непрерывно, а точное процентное содер-
жание их достигается изменением скорости протока. Они имеют
повышенный против автоматических моделей расход газов, но более
просты и надежны по конструкции. Воздух нагнетается в полезный
объем инкубаторов встроенными в них воздушными насосами.
При этом внутри прибора создается и поддерживается небольшое
избыточное давление, препятствующее заражению обрабатываемых
материалов из внешней атмосферы. Приборы снабжаются системой
быстрого восстановления состава газовой среды после кратковремен-
ного открывания рабочей камеры и системой аварийной сигнализации
о нарушении газового или температурного режимов. Высокая
(до 98 %) относительная влажность атмосферы в камере обеспечи-
вается постоянным прохождением подаваемой смеси газов над водя-
ным зеркалом — налитой в специальный поддон дистиллированной
водой. Лучшие модели СОг-инкубаторов имеют системы самодекон-
таминации, производимой путем нагрева стенок рабочей камеры
(при разгруженном приборе) до 98 °C, или даже стерилизации
подачей в рабочую камеру воздуха, нагретого до 180 °C.
Наибольшую сложность представляет измерение концентрации
углекислого газа в камере инкубатора, так как в применяемых
в большинстве моделей этих приборов тепловых резистивных
датчиках выходные параметры концентрации меняются в зависи-
мости от влажности анализируемой газовой смеси. В настоящее
время ряд фирм («Joan», «Ikemoto Scientific», «Hewlett-Packard»)
использует лазерные датчики, ликвидировавшие необходимость
учета и коррекции показаний в зависимости от влажности.
В некоторых моделях СОг-инкубаторов наружная дверь имеет
принудительный подогрев, что исключает или сильно уменьшает
отпотевание внутренней стеклянной двери и облегчает наблюдение
за содержимым инкубатора.
Из приборов этого вида в СССР разработан и выпускается газо-
проточный СО2-инкубатор типа ГПИ-1 со следующими парамет-
рами: объем рабочей камеры — 150 дм3, диапазон задания избыточ-
ной концентрации СО2 до 20 %, погрешность поддержания заданной
концентрации СО2±0.2 %, диапазон рабочих температур 25—70 °C,
погрешность поддержания заданной температуры ±0.15 °C при
37 °C, градиент температуры по рабочему объему ±0.3 °C при
37 °C.
Лабораторные встряхиватели. Как известно, принудительное
21
перемешивание питательных сред с помещенными в них клеточными
культурами обеспечивает лучший газообмен и, следовательно,
повышает эффективность культивирования. Во многих случаях
этот эффект возрастает при сочетании перемешивания с содержанием
в оптимальной для данной культуры температуре. Приборы, осу-
ществляющие эту операцию, называются лабораторными встряхива-
телями. Конструктивно они состоят из платформы, на которой
крепятся сосуды, заполненные суспензией, и приводного механизма,
придающего платформе вращательное или возвратно-поступательное
движение. При необходимости платформа помещается в воздушный
термостат или водяную баню. Невзирая на внешнюю принципиаль-
ную простоту эти приборы относятся к достаточно сложным
и дорогим техническим устройствам, что вытекает из ряда специаль-
ных требований к их работе, главным из которых является строгое
плоско-параллельное перемещение платформы без толчков и виб-
рации. Кроме того, при вращательном движении диаметр этого
перемещения должен быть одинаков в любой точке платформы.
Естественно, в процессе работы прибор не должен перемещаться.
Заданные режимы встряхивания (перемешивания), например радиус
вращения, должны быть стабильными во времени. Привод плат-
формы осуществляется как от электродвигателя через систему
кинематических передач, так и приложение к платформе магнитного
поля, изменяющегося во времени и пространстве по заданному
закону.
Большинство современных приборов этого вида имеет следующие
характеристики: частота возвратно-поступательного движения
платформой от 10 до 300 колебаний в 1 мин, частота вращательного
движения платформы от 40 до 400 об/мин, радиус вращения 20—
25 мм, ход возвратно-поступательного движения от 10 до 40 мм,
стабильность поддержания заданных параметров не хуже ±1 %
от заданной величины.
Большинство моделей встряхивателей позволяет перемешивание
в одном режиме — вращательном или возвратно-поступательном.
Наиболее современные модели (фирмы «Infers») являются универ-
сальными, т. е. могут работать в любом из приведенных режимов
перемешивания.
Во многих случаях встряхиватели имеют комплект сменных
платформ, обеспечивающих возможность работы с сосудами j
различных типов (колбами, пробирками, чашками Петри и т. n.).t
Сосуды на платформе могут крепиться и в наклонном положении,
что способствует газообмену за счет увеличения площади контакта
жидкость—воздух. I
Ряд моделей этих приборов снабжен реле времени для задания :
длительности цикла встряхивания и сигнализацией как об окончании
цикла перемешивания, так и об аварийных ситуациях (о внезапной
остановке, резком изменении режима встряхивания и др.).
При подборе нужной модели прибора необходимо учитывать,
что сосуды, размещаемые на платформе, заполняются не более
чем на 1 /г своего объема. При работе в водяной бане дополнительно
22
обеспечиваются невозможность попадания воды в перемещаемые
сосуды и сигнализация о снижении уровня жидкости в бане ниже
заданного уровня. Как водяные бани, так и воздушные термостаты
для встряхивателей имеют системы задания и автоматического
поддержания температуры в них.
Импортные приборы этого класса изготавливаются фирмами
«Infors», «В. Braun Melsungen», «GFL», «Luckham» и др.
Роллерные установки. Одним из общепринятых методов культи-
вирования клеток является их выращивание в цилиндрических
сосудах из боросиликатного стекла, наполненных небольшим
количеством питательной среды и вращающихся в горизонтальном
положении со скоростью до 8 об/мин, что обеспечивает постоянное
перемещение прикрепившихся клеток из питательной среды в атмо-
сферу и обратно и их интенсивный рост. Устройства, реализующие
эту процедуру, называются роллерными аппаратами. В подобных
аппаратах могут размещаться до 45 роллерных сосудов длиной
в 470 мм. Для повышения эффективности массового культивирования
установки снабжаются системой, дающей возможность заменять
питательную среду и удалять супернатант без остановки вращения.
При этом сосуды закупориваются специальными «перфузионными»
пробками, у которых центральная часть вращается независимо
от периферийной. В эту часть пробки вводятся трубки для смены
питательной среды, удаления супернатанта и введения инокулята.
В состав упомянутой системы входят также перистальтические
насосы и блок автоматики, регулирующий работу насосов во времени.
В СССР разработаны две модели подобных приборов, отличаю-
щиеся своими размерами и количеством размещаемых сосудов.
Обе модели состоят из базового блока и комплекта специальных рам.
В базовый блок входят приводной двигатель, редуктор, система
задания и стабилизации скорости вращения мотора. На базовом
блоке могут быть размещены четыре роллерных сосуда, для чего
там имеются специальные обрезиненные валики. На рамах, при-
крепляемых к базовому блоку, дополнительно размещаются
по четыре сосуда (на каждой). Вращательное движение выходного
вала мотора передается на привод валиков через систему зубчатых
ремней, что обеспечивает отсутствие скольжения и, следовательно,
постоянную скорость вращения всех сосудов. Строгая параллель-
ность поверхностей обрезиненных валиков создает невозможность
выталкивания роллерных сосудов в процессе вращения.
Роллерная установка типа А позволяет размещение до 16 сосудов
длиной 470 мм или 32 сосудов длиной 250 мм. Габариты установки
с тремя рамами 740X740X1000 мм, масса 80 кг, электропитание
установки от сети 220 В, 50 Гц, потребляемая мощность 0.06 кВА.
Установка типа Б рассчитана на использование только коротких
роллерных сосудов длиной 250 мм, позволяет размещение до 16 таких
сосудов. Базовый блок в сборе с одной рамой может быть установлен
в серийный термостат с рабочим объемом не менее 760X370X590 мм.
Обе модификации роллерной установки обеспечивают скорость
вращения сосудов (диаметром ПО мм) от 0.08 до 14 об/мин.
23
Лабораторные ферментеры — комплексы приборов и аппа-
ратов для массового суспензионного или глубинного культиви-
рования клеточных и бактериальных культур. В лабораторной
практике ферментеры применяются для ведения научно-исследо-
вательских работ или отработки технологии массового культиви-
рования.
В общем случае ферментер состоит из культивационного сосуда,
насосов и соединительных трубопроводов (для подачи питательной
среды, газов, инокулята и отбора продукта), измерительных приборов
и регуляторов, управляющих температурой среды в сосуде, ее pH,
окислительно-восстановительным потенциалом и другими парамет-
рами.
В лабораторной практике наибольшее применение находят
ферментеры с емкостью сосудов от 1 до 20 л. Для отработки техноло-
гии промышленного культивирования применяются так называемые
пилотные ферментеры с емкостью сосуда от 30 до 400 л. Во всех
случаях питательной средой заполняется не более 75 % объема
сосуда.
Части ферментеров, контактирующие с питательной средой
(сосуды, соединительные трубопроводы, насосы и т. п.), должны
изготовляться из биологически пассивных, химически стойких мате-
риалов,' позволяющих производить стерилизацию насыщенным водя-
ным паром (качественная нержавеющая сталь, фторопласт, бороси-
ликатное стекло, силиконовая резина).
Сосуды ферментеров имеют цилиндрическую (иногда кониче-
скую) форму. В них размещаются датчики температуры, pH, Ог,
а также‘Система для аэрации питательной среды, производимой бар-
ботированием газов через питательную среду или сочетанием про-
дувки газов с механическим перемешиванием среды. При использова-
нии механических мешалок их соединение с приводным двигателем
производится при помощи магнитных муфт, что снижает риск
загрязнения питательной среды. Мешалки вращаются со скоростью
от 10 до 1500 об/мин, которая автоматически поддерживается
с точностью до ±3 %. Конструкция лопастей мешалок во многом
определяет возможность работ с легко повреждаемыми клетками
животных. Иногда для повышения эффективности перемешивания
в сосуд могут дополнительно помещаться неподвижные лопасти-
отражатели, часто используемые и для подачи газов и отведения
избыточного тепла из суспензии. Особое внимание уделяется борьбе
с пеной, для чего в сосуд вводят специальный датчик ценообра-
зования. При механическом пеногашении лопасти пеногасителя
размещаются на валу мешалки. При химическом пеногашении
в крышке сосуда предусматривается специальный ввод для реагента
гашения.
Конфигурация трубопроводов должна обеспечивать отсутствие
застойных зон и мест скопления загрязнений. Газы, подаваемые в со-
суд ферментера, стерилизуются фильтрацией через фильтры, обеспе-
чивающие перехват 99.999 % частиц с размером более 0.3 мкм. Ана-
логичные меры применяются на выходе газов из сосуда в окружаю-
24
щее пространство. Специальные технические приемы обеспечивают
невозможность попадания капель питательной среды в газопроводы,
что исключает их зарастание.
Управление работой ферментера осуществляется комплексом
измерительных и управляющих приборов, включающим в себя си-
стему датчиков-преобразователей измеряемого параметра в электри-
ческий сигнал, органы задания необходимых величин этих парамет-
ров и исполнительные устройства, 'регулирующие и стабилизирую-
щие во времени заданные режимы работы.
Как правило, датчики помещаются внутри рабочего объема фер-
ментерного сосуда и находятся в прямом контакте с питательной
средой и клетками. Одним из главных специальных требований к их
конструкции является стерилизуемость. Кроме того, они должны вы-
держивать длительное воздействие различных химических реагентов,
обладать должной чувствительностью и малой инерционностью.
Удовлетворение всех перечисленных требований — сложная техниче-
ская задача. Органы управления и системы стабилизации размеща-
ются в блоке управления ферментером, выполняются на полупровод-
никовой элементной базе. Системы индикации могут быть аналого-
выми или цифровыми, т. е. использовать стрелочные или цифровые
приборы. Исполнительные устройства в ферментерах для культиви-
рования культур клеток животных обычно электрические, с приводом
от моторов постоянного тока или шаговых электродвигателей.
Измеряются и управляются следующие параметры работы фер-
ментера: pH среды в диапазоне от 2 до 12, растворенный кислород
(от 2 до 100 %), скорость подачи питательной среды и газов, темпе-
ратура в диапазоне от 0 до 60 °C, число оборотов мешалки.
Кроме изложенного, в некоторых моделях приборов измеряется
и индуцируется подача реагентов для поддержания pH и пеногаше-
ния. Наиболее сложная задача — оперативное измерение числа кле-
ток в суспензии — еще не нашла своего исчерпывающего решения.
Ряд фирм («NBC» — США, «LKB» — Швеция, «В. Braun Mel-
sungen» — ФРГ) используют для управления ферментерами микро-
процессорные комплексы с соответствующим специальным матема-
тическим обеспечением. Примером подобного прибора, производи-
мого в странах СЭВ, является комплекс ферментер—ЭВМ типа
СЛФ-20 (ЧССР). Прибор состоит из 20-литрового ферментера с бло-
ком регулирования, микро-ЭВМ типа ТНС-64 и периферийных
устройств (цифропечать, дисплей и т. п.). Микро-ЭВМ может одно-
временно управлять по заданным программам четырьмя ферменте-
рами. Ферментер имеет магнитный привод мешалки. Поток воздуха
регулируется до 15 л/мин. Измерение и регулирование pH в диапа-
зоне от 2 до 12 происходит с точностью до ±0.1. Пеногашение —
механическое и химическое. Температура суспензии регулируется
от 15 до 40 °C с точностью ±0.4 °C. Регулировка по растворенному
кислороду — от 20 до 90 %. Скорость вращения мешалки задается
в диапазоне от 60 до 1200 об/мин с точностью ±5 %. Паровая сте-
рилизация прибора происходит в автоклаве, входящем в комплект
поставки ферментера. Пакет математического обеспечения в виде
25
стандартных программ позволяет наблюдать за работой прибора,
автоматически поддерживать заданные режимы, обрабатывать и про-
водить статистический анализ полученной информации, математи-
чески моделировать процессы в ферментере. Разрабатывается
матобеспечение для автоматической оптимизации процесса фермен-
тации. При выходе ЭВМ из строя возможно управление прибором
непосредственно с панели управления ферментера.
В заключение необходимо отметить, что в настоящее время интен-
сивно разрабатываются новые методы массового культивирования
клеток животных — культивирование на полых волокнах, на носите-
лях из высокомолекулярных пластиков, на носителях с магнитной
матрицей.
Микроскопы
Необходимость оперативного получения качественной информа-
ции о состоянии культивируемых клеток породила появление спе-
циальных микроскопов для этой цели, названных инвертированными.
Принцип инвертированное™ (перевернутости) заключается в том,
что в подобных микроскопах объект наблюдения освещается сверху,
наблюдается через объективы, расположенные под объектом. Это
конструктивное новшество дало возможность наблюдения живых
клеток в культуре, т. е. непосредственно в сосудах, где происходит
процесс их роста. Микроскоп обычной оптической схемы исключал
возможность тюмещения таких сосудов между столом и объективом
из-за недостаточных размеров этого расстояния.
Инвертированные микроскопы выпускаются многими фирмами
(«Nikon» — Япония, «Leitz» — ФРГ, «Opton» — ФРГ, «Olimpus» —
Япония). В зависимости от количества реализуемых методов наблю-
дения и конструктивной сложности, а следовательно и цены, инвер-
тированные микроскопы могут быть условно разделены на микро-
скопы для общелабораторных работ, или скрининговые, и микро-
скопы для ведения научно-исследовательских работ.
К микроскопам 1 группы могут быть отнесены приборы «Телевал»
(«К- Цейсс, Йена», ГДР) и «Биолам-П» (ЛОМО, СССР). Приборы
этой категории позволяют осуществлять наблюдения методом свет-
лого и темного поля, фазового контраста с увеличением до 250—
300 крат. Тринокуляр обеспечивает возможность микрофотографи-
рования.
Инвертированные микроскопы для научно-исследовательских ра-
бот позволяют осуществлять перечисленные выше методы наблюде-
ния и, кроме того, дают возможность использовать методы фазово-
дифференциального контраста (по Номарскому), люминесценции,
поляризационный. Эти приборы имеют специальную оптику для
присоединения фото- или киноприставок и устройства автоматиче-
ской установки экспозиции. Увеличение наблюдаемого объекта лежит
в пределах от 20 до 1500 крат. Микроскопы могут снабжаться спе-
циальными камерами для термостатирования сосуда с клетками
26
и создания необходимого состава газовой атмосферы в нем. Системы
электромеханического управления положением объекта наблюдения
и фокусировкой дают возможность использовать подобные микро-
скопы в устройствах для автоматического анализа изображений.
Фотометрическая приставка обеспечивает количественный цитофото-
метрический анализ.
Независимо от класса инвертированных микроскопов им присущи
следующие, кроме описанных выше, конструктивные особенности:
наличие объективов с большим фокусным расстоянием (от 6 до 24 мм
с численной аппертурой 0.1—0.6) и устройствами коррекции на
толщину стекла сосуда; фокусировка изображения путем перемеще-
ния головки с объективами, что позволяет применять прибор с устрой-
ствами для микрохирургии, требующими, как известно, неподвижного
стола микроскопа; микроскопы имеют стол большого размера (до
220X330 мм), обеспечивающий размещение и фиксацию различных
видов культуральной посуды; осветители инвертированных микроско-
пов поставляются с конденсорами, фокусное расстояние которых
до 70—80 мм и более. Мощность и тип источников света позволяют
работать с использованием всех методов, реализуемых прибором.
Следует подчеркнуть, что инвертированные микроскопы дают
в основном качественную информацию об объекте наблюдения. Для
получения количественной информации (цитохимической и морфо-
метрической) используются другие приборы — проточные цитофлюо-
рометры (описываются ниже), автоматические анализаторы денсито-
метрических и планиметрических параметров микрообъектов и их
изображений, автоматические счетчики-анализаторы клеток в суспен-
зии. В большинстве вариантов перечисленных приборов инвертиро-
ванный микроскоп является их базовой частью — источником полу-
чения информации о микрообъектах.
Устройства для криоконсервации и хранения клеточных культур
Программные замораживатели. Основным методом длительного
хранения клеточных культур без потери их жизнеспособности, как
известно, является так называемая криоконсервация.. Препарат, по-
мещенный в ампулу, заполненную жидкостью — криопротектором,
подвергают охлаждению с заданной скоростью до температуры
— 180 °C, хранят при той же температуре. Технически эта задача
реализуется в приборах, называемых программными замораживате-
лями, где препарат в ампуле помещается в объем, продуваемый
струей паров жидкого азота. Количество паров определяет скорость
охлаждения и в свою очередь зависит от температуры нагрева испа-
рителя, помещенного в емкость с жидким азотом. Прибор имеет
рабочую камеру и систему управления для задания (ручного) и авто-
матического поддержания определенной скорости охлаждения и-ее
вариаций по определенной экспериментатором программе. За-
мороженные препараты переносятся из замораживателя в емкости
с жидким азотом, где и хранятся. Расконсервация совершается путем
нагрева препарата также с определенной скоростью в приборе-декон-
27
серваторе, представляющем собой водяную баню с системой под-
держания и задания программы нагрева.
В СССР небольшими партиями выпускается устройство для
охлаждения, программное, типа УОП со следующими параметрами:
объем одновременно замораживаемого материала 0.4 л, диапазон
рабочих температур от 20 до —180 °C, режим работы: 1) автомати-
ческое двухэтапное программное охлаждение со скоростями на пер-
вом этапе от 0.1 до 1.0 °C в 1 мин (с дискретностью задания
в 0.1 °С/мин) и от 1 до 10°С/мин (с дискретностью задания
в 1 °С/мин), на втором этапе — со скоростями 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
20, 30, 40, 50 °С/мин; 2) автоматический программный отогрев со
скоростями от 1 до 3 °С/мин; 3) стабилизация температуры биомате-
риала в диапазоне от 0 до —99 °C; 4) автоматическое управление
процессом кристаллизации биоматериала в диапазоне от 0 до
—99 °C; 5) автоматический переход охлаждения с первого на второй
этап. Расход жидкого азота не более 4.5 кг на программу, потребляе-
мая мощность не более 2.0 кВА, масса не более 120 кг.
Низкотемпературные холодильники. Сохранение биологически ак-
тивных веществ обеспечивается их содержанием в специальных хра-
нилищах при температурах, лежащих в диапазоне от 4 до —140 °C.
Одной из разновидностей подобных устройств являются так назы-
ваемые холодильники глубокого холода, к которым относятся про-
изводимые в СССР холодильники КЛГХ (компрессионный ларь глу-
бокого холода). Как следует из названия, холодильник представляет
собой ларь или сундук. Доступ в рабочий объем производится сверху,
через подъемную крышку, снабженную теплоизоляцией и запором.
Для создания низкой температуры используется холодильный агрегат
воздушного охлаждения с приводом от сети трехфазного тока
220/380 В, 50 Гц. В комплект поставки холодильника входит специ-
альная укладочная тара, позволяющая легкое и удобное обращение
с хранимыми веществами и их идентификацию. Холодильники имеют
блок управления, обеспечивающий задание и автоматическое поддер-
жание в рабочем объеме температуры от —5 до —90 °C. Заданные
температуры поддерживаются с точностью в ±1-5 °C при температу-
рах от —50 до —90 °C и с точностью ±5 °C при температурах от
—5 до —50 °C. Холодильники снабжены местной и дистанционной
аварийной сигнализацией с независимым источником электропита-
ния, которая срабатывает при изменении температуры в рабочем объ-
еме на ±15 °C от заданной. Ларь установлен на поворотные роли-
ковые опоры для легкого перемещения на месте установки. Шум при
работе холодильников не превышает 80 дБ.
Выпускаются три модели КЛГХ: КЛГХ-200 М (объем рабочей
камеры 200 дм3, габариты наружные 1360X930X1100 мм, масса
300 кг, установленная мощность не более 1.5 кВА); КЛГХ-300 М
(объем рабочей камеры 300 дм3, габариты наружные 1680Х930Х
X 1 ЮО мм, масса 340 кг, установленная мощность не более 1.5 кВА);
КЛГХ-500 (объем рабочей камеры 500 дм3, габариты наружные
2115Х930Х 1100 мм, масса 500 кг, установленная мощность не более
1.5 кВА). .
28
Аварийная система в холодильниках должна обеспечивать под-
держание низкой температуры в случае выхода из строя холодиль-
ного агрегата прибора или аварий в сети электропитания по край-
ней мере до прибытия на место обслуживающего персонала. Вы-
пускаемая в СССР система САПТ (система аварийного поддержания
температуры) работает по принципу управляемой (дозированной)
подачи в рабочий объем холодильников КЛГХ жидкой двуокиси
углерода из баллонов, расположенных в установке САПТ. Имеются
два таких баллона емкостью 40 дм3 каждый, что позволяет поддер-
живать низкую температуру длительное время (достаточное для
устранения аварии холодильника). Прибор снабжен также блоком
управления для задания и индикации температуры в холодильнике.
Питание системы САПТ производится от встроенных аккумуляторов.
Технические параметры САПТ: габариты 985X800X1560 мм, масса
150 кг с заполненными баллонами, диапазон поддержания темпе-
ратур от —5 до —50 °C с точностью в ±5 °C, длительность поддер-
жания температуры 12 ч для КЛГХ-500 при температуре —50 °C.
Включение прибора САПТ происходит автоматически, одновременно
с подачей аварийного сигнала об уходе температуры в КЛГХ в сто-
рону повышения. Баллоны для углекислоты в комплект поставки не
входят.
Холодильники КЛГХ изготавливаются по ТУ 27-52-3727-85, код
ОКП 51 5621. Система САПТ изготовляется по ТУ 27-72-115-86.
Культуральная посуда и способы ее обработки
М. И. Блинова, Л. Н. Лисенок
Институт цитологии АН СССР, Технологический институт им. Ленсовета,
Ленинград
Основная часть ассортимента специальной культуральной посуды
предназначена для роста клеток в монослое, что определяет особые
требования к свойствам поверхности и материала изделий, как из
стекла, так и из пластика. Для культивирования клеток обычно
используют флаконы Карреля, сосуды Колля, матрасы, чашки Петри,
платы, роллерные сосуды, пробирки, пипетки, флаконы для питатель-
ных сред, растворов и воды.
Хотя в последние два десятилетия очень широко применяется
пластиковая посуда одноразового использования, но посуда из
стекла не потеряла своего значения. Она обладает рядом бесспор-
ных преимуществ: хорошие адгезионные свойства поверхности, спо-
собствующие прикреплению и распластыванию клеток; многократ-
ность использования; биологическая инертность стекла ряда составов
(группа алюмоборосиликатных стекол), термостойкость и др. По
мнению некоторых исследователей [1], стеклянной посудой необхо-
димо пользоваться в экспериментах с контролируемым уровнем
кислорода, так как в пластике кислород способен растворяться.
Кроме того, из пластика могут экстрагироваться водорастворимые
органические соединения.
29
Стеклянная посуда
«Стекло — аморфный изотропный материал, получаемый пере-
охлаждением расплавов неметаллических окислов и бескислородных
соединений... Физико-химические свойства стекла зависят от его
химического состава, условий варки, формования и последующей
термической и химической обработки» ([2], с. 1027—1034).
Характеристика и свойства материала. Для стеклянной лабора-
торной и культуральной посуды на практике в основном применяются
два типа составов — многощелочное и малощелочное боросиликат-
ное стекло типа «Пирекс». Свойства стекла оцениваются обычно по
следующим критериям:
1) коэффициент линейного теплового расширения, 1/град • 107;
2) термостойкость, °C; 3) плотность, г/см3; 4) водостойкость, мг/г;
5) кислотостойкость, %; 6) щелочестойкость, мг/дм2.
Щелочесодержащие силикатные стекла готовятся из относительно
недорогих сырьевых материалов: песок, кальцинированная сода, из-
вестняк. Для специального назначения иногда вводятся добавки не-
больших количеств других веществ (осветлителей, гомогенизаторов).
Щелочесодержащее стекло имеет, как правило, высокий коэффициент
линейного теплового расширения, хорошо плавится, формуется.
Но оно имеет недостаточную термостойкость и химическую устой-
чивость к воде, кислотам и щелочам. В нем, как правило, содержится
большое (до 15 %) количество одного из оксидов щелочных метал-
лов. Из отечественных стекол к этой группе относятся такие широко
распространенные марки медицинских тарных стекол, как НС-1,
НС-2, НС-3, тарные стекла для пищевых продуктов, ряд химико-
лабораторных стекол [3—5] (табл. 1 и 2).
Боросиликатное стекло классифицируется как простое стекло
с минимальным составом, куда входят оксиды кремнезема, бора,
алюминия; по сравнению с группой щелочесодержащих стекол оно
содержит гораздо меньше (до 3—5 %) оксидов щелочных металлов
и полностью свободно от тяжелых металлов (табл. 3 и 4). Один из
нашедших большое применение в биологических лабораториях соста-
вов группы алюмоборосиликатных стекол — «Пирекс» — был разра-
ботан в 1912 г. фирмой «Corning» [6]. К группе боросиликатных
стекол относится не только «Пирекс», но и марки Corning 7740
(США), KG-33 OWENS (США), Sovirel (Франция), В-37 GTK
(Англия), Chance Brothers (Англия), Schott (ГДР), Duran-50
(ГДР), Simax (ЧССР), Termosil (ПНР) [7—9].
Боросиликатные малощелочные стекла имеют относительно низ-
кое содержание щелочи и потому являются высокоустойчивыми
к воде, в то время как щелочные стекла, изменяют pH дистиллиро-
ванной воды при автоклавировании на 2.5 единицы. «Пирекс» имеет
в своем составе примерно 80 % кремнезема, что обеспечивает его
устойчивость ко всем кислотам, за исключением плавиковой (фто-
ристоводородной) и горячей фосфорной.
Щелочные растворы (0.1—4 н.) разрушают все силикатные
стекла, однако алюмоборосиликатное стекло «Пирекс» может класси-
30
Таблица 1
Составы отечественных медицинских и химико-лабораторных стекол, находящих применение в биологических и биохимических
лабораториях [3—5]
Марка стекла Доля следующих оксидов, % от массы
SiO2 В2О3 А12О3 СаО MgO ВаО ZnO Na2O К2О другие добавки
Стекла медицинского назначения по ГОСТ 19808-74:
НС-1 73.0 4.0 4.5 7.0 1.0 — — 8.5 2.0'
НС-2 73.0 2.5 3.5 7.0 1.0 — — 11.0 2.0
НС-3 72.8 6.0 4.5 6.1 0.8 — — 8.1 1.7
АВ-1 71.5—73.0 — 3.0—3.5 7.0—10.5 2.5 — — 14.5 — SO3, 0.5
МТ тарное j _ 72.5 — 2.0 8.0 2.0 — — 15.5 — —
МТО тарное 73.0 — 1.5 8.0 2.0 — — 12.5 — Fe2O3, 0.5
ОС 73.5 — 1.5 9.0 0.5 — 15.5 —
Дополнительно введены после 1975 г.: Т-1 74.6 7.5 5.7 0.8 0.2 5.0 1.5 Fe2O3, 0.5
XT 74.0 8.0 5.0 1.0 0.2 4.8 — 5.0 2.8 SO3, 0.2
ХТ1 72.0 10.5 6.0 0.8 — 2.2 — 6.7 1.8 SO3, 0.2
Химико-лабораторные стекла для лаборатор- ной посуды (применялись до 1945—1950 гг.):
«Йенское» 65.3 15.0 3.5 — — 12.0 4.2 —
стекло для матрацев РУ 65.0 9.2 0.6 8.0 1.0 5.0 3.2 5.5 2.5 —
№ 23 68.6 2.5 3.8 8.4 0.8 — — 9.7 6.1 —
Покровные стекла ВПО «Дружная горка» 68.6 — 3.7 7.5 3.5 3.5 — 10.0 3.0 F, 0.5
№ 29 ДГ [3]
Бутылочное тарное стекло БТ-1 73.0 — 0.6 9.4 0.3 — — 15.3 1.0 Fe2O3, 0.4
Классическое сортовое (посудное) 74.4 — 0.6 4.7 4.9 — — 12.1 3.2 Fe2O3, 0.3
Примечание. Предприятия, указанные здесь и в табл. 3—4, являются стекольными.
Таблица 2
Основные свойства стекол медицинского тарного сортамента по ГОСТ 19808-74
Свойства стекол Марки стекол
НС-1 НС-2 НС-3 АВ-1
Коэффициент линейного тепло- 68—72 72—82 63—67 84—88
вого расширения 20—400 °C, 1/град • 10'
Термостойкость, °C, не меиее 150 145 150 130
Плотность, г/см3 2.435—2.445 2.450—2.460 2.420—2.430 2.460—2.470
Водостойкость, мг/г, не более 0.028 0.080 0.023 0.150
Кислотостойкость, %, не более 0.018 0.020 0.015 0.050
Щелочестойкость, мг/дм2, 85 85 100 90
не более
Таблица 2 (продолжение)
Свойства стекол Марки стекол Нормативы методов испытаний
мто ОС ОС-1
Коэффициент линейного тепло- 89—93 80—94 80—94 ГОСТ 10978-69
вого расширения 20—400 °C, 1/град • 10'
Термостойкость, °C, не менее 125 125 135 ГОСТ 7330-55
Плотность, г/см3 2.470 2.480 2.460—2.470 ГОСТ 9555-74
Водостойкость, мг/г, не более О.ЗЮ 0.400 0.400 ГОСТ 19809-74 1
Кислотостойкость, %, не более 0.060 0.050 0.050 ГОСТ 10134-62
Щелочестойкость, мг/дм2. 85 90 80 ГОСТ 19810-74 ,
не более
фицироваться как достаточно устойчивое. Большую неприятность
биологам доставляет при эксплуатации селективное коррозионное
разрушение материала, так называемое выщелачивание, т. е. посто-
янный выход из поверхностных слоев стекла и перераспределение
в них ионов щелочных металлов. При взаимодействии щелочного
стекла с водой этот процесс идет очень интенсивно: разрушается
поверхностный слой стекла, могут затрагиваться и глубинные его
слои (рис. 1 и 2). Размеры зон разрушения поверхностных слоев
тарного стекла типа НС-1 (рис. 1 и 2) были получены с помощью
современных неразрушающих методов анализа поверхности (Оже-
спектроскопия, масс-спектроскопия вторичных ионов [10]). Глубина
выщелоченного слоя составляет 20 нм при воздействии воды в тече-
ние 1 ч при 37 °C. Эти же участки обогащены (до 100 %) защитным
слоем SiO2, а глубина градиентного слоя, в котором концентрация
КагО достигает объемного содержания, гарантированного маркой
стекла, составляет от 200 до 80 нм. Глубина выщелоченного слоя
зависит от времени воздействия и температуры реагента и может
достигать до 0.6 мкм (рис. 2). Образующийся иа поверхности защит-
ный слой поликремниевых кислот при содержании в составе стекла
менее 70 %. БЮг не способен в этом случае защитить материал от
32
Таблица 3
Составы стекол группы «Пирекс», выпускаемых фирмами-изготовителями разных
стран [7—9]
Страна, фирма-изготовитель Марка Доля оксидов, % 'от массы
SiO2 В2О3 А12О3
СССР, завод им. Октябрьской «Пирекс» 80.10 12.40 1.50
революции
СССР, завод «Победа труда» 79.60 12.12 1.93
СССР, (?) (Оптический каталог) ЛК-5, ЛК-105 80.60 12.00 2.00
США, «Corning» Ругех-7740 80.50 11.90 2.10
Ругех-1710 80.50 12.00 2.20
Англия, «Chance Brothers» 7900 (Vicor) 80.60 12.20 2.70
Англия, «GTK» В-37 (Мопах) 75.50 16.00 2.60
Япония, (?) (?) 75.60 15.60 1.80
(?) 80.50 11.80 0.40
(?) 79.24 10.66 0.94
ГДР, «Schott» (?) 78.25 12.18 2.74
ФРГ, «Schott» Duran-5 79.69 10.29 3.10
ЧССР, «Simax» Simax 82.76 11.60 1.57
Франция, «Can-Goben» Sovirel 80.00 13.00 2.25
ПНР, «Termosil» Termosil 77.95 11.74 2.55
Таблица 3 (продолжение)
Страна, фирма-изготовитель Доля оксидов, % от массы
СаО MgO Na2O К2О ВаО другие добавки
СССР, завод им. Октябрьской 0.50 — 5.00 — — As2O3, 0.50
революции
СССР, завод «Победа труда» 0.43 0.17 3.68 1.74 — Fe2O3, 0.19
СССР, (?) (Оптический 0.30 0.06 4.00 1.00 — Fe2O3, 0.03
каталог)
США, «Corning» 0.40 — 4.40 0.20 — As2O3, 0.50
— — 3.80 0.40 — As2O3, 0.50
Англия, «Chance Brothers» 0.80—1.20 — 4.15
Англия, «GTK» — 3.70 1.70 — —
Япония, (?) 0.20 — 6.80 — — —
— — 4.60 — — As2O3, 0.60
0.53 2.08 6.55
ГДР, «Schott» 0-85 0.14 5.39 0.41 — —
ФРГ, «Schott» 0.77 0.87 5.20 — —
ЧССР, «Simax» 0.03 — 3.51 0.76 — —
Франция, «Сап-Goben» — — 3.50 — — Fe2O3, 0.05
ПНР, «Termosil» 1.07 0.23 3.94 0.70 1.42 —
разрушения. Внешне такая коррозия выражается в появлении на
поверхности беловатых пятен. Отсутствие в составе таких стекол, как
кварцевое, состоящее полностью из SiO2, и «Пирекс», щелочнозе-
мельных элементов или элементов из группы тяжелых металлов
обеспечивает им биологическую инертность. На рис. 3 представлены
типы разрушающихся поверхностей стекол разного состава, сведения
о которых, возможно, облегчат экспериментатору выбор материала
в проводимых исследованиях.
3 Заказ 1789
33
Таблица 4
Основные физико-химнческне свойства стекла группы «Пирекс», выпускаемого
фирмами-изготовителями в разных странах
Свойства стекла Марка стекла, фирма, страна
Pyrex- 7740, «Corning», США Ругех- 1710, «Corning», США «Chance Brot- hers», Англия «Simax», ЧССР «Пирекс», «Победа труда», О СССР
Плотность, г/см3 2.23 2.53 2.18 2.23 2.26
a-коэффициент термического рас- ширения, 1/град • 107 (термостойкость), °C X и м и ч е с Потери массы образца; мг/см1 2 в условиях: 32 42 38 32 33—37
300 кая у с 1 300 о й ч и в 300 э с т ь 250 Не менее 250 с
100 °C, 6 ч,20.4 %-ная НС1 — — — 0.002 0—0.004
' 100 °C, 3 ч, 1 н. раствор < Na2CO3+ NaOH — — — 1.4 1.5
• 100 °C, 3 ч, Н2О — — — 0.0017 —
Расход 0.01 н. HCi на титрова- ние (эквивалентно количеству извлеченной щелочи), мл/г 0.03 0—0.1
Хорошие оптические свойства боросиликатных стекол, в частности
«Пирекса», придают им еще одно достоинство при использовании
их для изготовления культуральной посуды.
Существует также группа макропористых стекол, которые не ис-
пользуются для изготовления посуды, но применяются при культиви-
ровании клеток в качестве микроносителей. Хотя это и не относится
к изделиям лабораторной посуды, но возможно, что данные о марках
и составе таких стекол представят интерес для тех, кто занимается
культивированием клеток на таких микроносителях [11].
Обработка посуды. Успех в эксперименте будет обеспечиваться не
только составом используемого стекла, но и качеством подготовки
посуды к работе. Посуда для культивирования клеток должна
быть чистой физически, химически и бактериологически. Существует
ряд общих этапов подготовки посуды для работы: обеззараживание
после контаминации микроорганизмами,1 обработка детергентом, сте-
рилизация.
В течение долгого времени, с 1943 г., существует способ под-
готовки посуды [1] с использованием горячей (120 °C) смеси серной
и азотной кислот (16 : I).2 Новую, неиспользованную, посуду необхо-
димо прежде всего замочить (а практически ополоснуть) в указанной
смеси кислот, затем прополоскать горячей проточной водой и далее
1 Обеззараживание и стерилизацию контаминированной микроорганизмами по-
суды следует по возможности производить в разных автоклавах.
2 Для мытья посуды, предназначенной для бактериологических, фармакологи-
ческих и биологических исследований, не следует использовать хромовую кислоту
из-за биологического действия ионов хрома [6].
34
Рис. 1. Распределение оксидов в поверхностном слое тарного стекла, подвергнутого
воздействию воды в течение I ч при 37 °C (по: (10]).
Состав: SiO2 — 71.95 %, А12О3 — 1.25, СаО—10.25, MgO — 2.5, Na2O — 13.43, К2О —
0.12, AI2O3 — 0.04 %. По оси абсцисс — глубина слоя, нм; по оси ординат — доля оксидов,
% от массы.
провести цикл мытья с применением детергента с серией споласки-
ваний проточной водопроводной и дистиллированной водой.
По этой методике посуду, уже использованную для культивирова-
ния клеток, необходимо предварительно проавтоклавировать, ополос-
нуть холодной водой и затем замочить на 24 ч в горячей смеси кислот,
а затем провести все последующие этапы мытья.
Посуду, зараженную химическими канцерогенами или токсич-
ными не физиологическими соединениями, предлагается замачивать
в кислоте на 48—72 ч.
Авторы метода, естественно, напоминают, что должны соблю-
даться все правила работы с кислотами (спецодежда, защитные
очки, перчатки, наличие в помещении достаточного количества
бикарбоната натрия для нейтрализации случайно разлитой кислоты).
Они указывают, что в смеси кислот должно быть исключено присут-
ствие тяжелых металлов. Необходимо применять кислоты марок
ч. д. а., тогда для посуды из стекла «Пирекс» кислоты могут исполь-
зоваться в течение длительного времени. Химический смысл указан-
ной процедуры состоит в том, что при воздействии кислоты на боро-
силикатное стекло на его поверхности создается слой биоинертных
поликремниевых кислот, обладающих сорбционной емкостью к бел-
кам сыворотки, добавляемой в питательную среду. Такой защитный
слой, обеспеченный составом боросиликатного стекла, может долго
сохраняться; для этого достаточно однократной обработки кислотой.
При таком же воздействии на многощелочное стекло, особенно с вы-
соким (до 15 %) содержанием одного оксида, например Na+, в по-
верхностных слоях стекла создается слой, частично составленный
поликремниевыми кислотами, в котором полностью удалены
ионы Na+. Указанный слой служит в качестве защитного только
ограниченное время, в пределах не более одного цикла эксплуата-
ции, так как за счет диффузии высокоподвижных катионов Na+ из
глубинных слоев стекла происходит устранение защитного слоя
3:
35
Рис. 2. Концентрационные профили
Na+ н К+ коммерческого тарного
стекла, подвергнутого воздействию
воды при 90 °C в течение 38, 68,
195, 540 ч (глубина разрушения до-
стигает 6 мкм) (по: [10]).
По оси абсцисс — глубина разрушения,
мкм; по оси ординат — доля оксидов,с
% от массы.
и появление щелочи в около-
клеточном пространстве. По-
следующая обработка посуды в автоклаве устраняет остаточные
следы поликремниевых кислот, созданных кислотной обработкой,
и обнажает стекло с высоким содержанием щелочи, контакт которого
с клеткой недопустим вследствие его биоактивности. Для такого
стекла необходимо кислотную обработку возобновлять в каждом но-
вом цикле эксплуатации. Для этого можно использовать также и 2 н.
НС) и H2SO4 в течение I—3 ч при 100 °C.
Обобщая литературные сведения и опыт, накопленный в Инсти-
туте цитологии АН СССР, можно предложить определенные рекомен-
дации по мытью стеклянной культуральной посуды: 1) обеззаражива-
ние и мытье посуды, содержащей вредные материалы, должно про-
водиться отдельно от других видов посуды; 2) культуральная посуда,
в которой клеточные культуры были контаминированы микроорганиз-
мами, должна предварительно пройти процедуру обеззараживания
методов автоклавирования в течение 30 мин при давлении 2 атм ;
3) для удаления остатков питательной среды с сывороткой и остатков
клеток культуральная посуда после использования сразу же должна
быть ополоснута холодной водой; 4) посуда должна быть вымыта
по возможности вскоре после использования, а если это невозможно
сделать, то ее следует замочить; 5) посуда после использования за-
мачивается в 3—5 %-ном растворе гипохлорита натрия,3 время за-
мачивания — не менее 1 ч, но на практике в лаборатории посуда
остается в растворе на ночь (таким же действием обладает перекись
водорода, 4—10 %-ный раствор); 6) посуда, обработанная смазкой
или какими-нибудь жирными веществами (например, вазелином,
маслом), до замачивания в гипохлорите натрия должна быть обез-
жирена слабым раствором углекислого натрия, ацетона или раство-
рителями жиров, но никогда для этой цели не используются сильные
щелочи; 7) после того как посуда извлечена из раствора гипохлорита
ее следует несколько раз ополоснуть водопроводной водой для удале-
ния остатков гипохлорита; 8) затем посуда моется горячей водой
с детергентом; 4 процесс мытья может осуществляться как ручным
3 В результате происходящей окислительной реакции от поверхности сосудов
отслаиваются остатки органических загрязнений и клеток, что позволяет не применять
механическую обработку «ершом» н кипячение посуды, а соответственно будет
меньше деформироваться поверхность изделия. Кроме того, гипохлорит натрия обла-
дает дезинфицирующим свойством.
4 Детергент должен иметь нейтральное значение pH 7.0, чтобы избежать силь-
ного коррозийного воздействия на поверхность стекла. Наиболее привлекательным
36
Селективное
выщелачивание •,
отсутствие
защитной пленки
Рис. 3. Типы разрушающихся по-
верхностных структур стекла
(по: [10]).
7—кварцевое стекло (SiOz—
100%); И— «Пирекс» (SiOz—
80%); III — стекло сложного со-
става с высоким содержанием SiOz,
AI2O3, Ьа2Оз, ZrO2 образует двой-
ную защитную пленку силикатов
(гидросиальиых) в поверхностном
слое; IV — оконное, тарное, лабора-
торное стекло (SiO2 — 70 %; KzO —
5—10 %), слой поликремииевых ки-
слот не выполняет защитных функ-
ций; V—растворяющиеся стекла
(SiO2 — 40%). 1 — раствор; 2 —
граница «раствор—стекло»; 3 — за-
щитная пленка; 4 — масса стекла.
По оси абсцисс — расстояние от
границы «раствор—стекло»; по оси
ординат — масса стекла (концен-
трация SiO2).
способом, так и в моечной машине с определенным режимом; 9) после
мытья с детергентом необходимо тщательно ополоснуть горячей про-
является использование разработанного фирмой «Flow» (Англия) специально для
мытья культуральной посуды детергента 7Х — для ручного способа или 7Х-0 (мало-
пеиящаяся модификация 7Х) для мытья в машине. Другим детергентом такого же
назначения является Calgolac производства фирмы «Calgon» (США). К сожалению,
отсутствуют отечественные детергенты специального назначения для культуральной
посуды. Взамен можно рекомендовать «Детское мыло», пасты «Ландыш» и «Триалои».
37
точной (до 10 раз при ручном способе) и проточной дистиллирован-
ной или деионизированной водой (не менее 5 раз при ручном спо-
собе); 10) вымытая посуда должна быть сразу же высушена, но при
температуре, не превышающей 120 °C; 11) вымытая и высушенная
посуда должна быть защищена от пыли и загрязнения, для чего ее
заворачивают в плотную бумагу, которая не выделяет канцероген-
ных или токсичных соединений, или в алюминиевую фольгу (в Инсти-
туте цитологии АН СССР используют мягкую алюминиевую фольгу
марки А-5 толщиной 0.014—0.016 мм) и подвергнута стерилизации.
Пипетки проходят те же процедуры обработки и мытья, что и куль-
туральная посуда, с небольшими изменениями: 1) замачивать пи-
петки в раствор гипохлорита удобно либо в высокий цилиндр, либо
в высокий полиэтиленовый сосуд, предварительно положив на дно
сосуда прокладку либо из хлопчатобумажной ваты, либо из поролона
для предотвращения деформации пипеток; 2) хранить высушенные
пипетки и стерилизовать удобно в металлических пеналах; 3) перед
стерилизацией необходимо закрыть пипетку фильтром из ваты.
Укупорку культуральных сосудов — пробки или завинчиваю-
щиеся крышки — подвергают такой же обработке, как и всю по-
суду: 5 1) укупорку на этапе мытья с детергентом и последующим
полосканием в горячей проточной воде можно подвергнуть кипяче-
нию; 2) после мытья укупорку следует рассортировать по размерам
и разложить в чашки Петри, затем завернуть чашки в бумагу или
фольгу; 3) стерилизовать (для этих изделий допустим только один
способ стерилизации) автоклавированием в течение 30 мин при тем-
пературе'*121 °C.
Пластиковая посуда одноразового использования
Начиная с 1965 г. все больше применяется пластиковая посуда
одноразового использования. Ассортимент ее все время увеличива-
ется и постоянно модифицируется. Мотивы, вызвавшие использова-
ние пластиковой посуды, вероятно, могут заключаться в следующем:
1) производство такой посуды дешевле, чем стеклянной (экономи-
чески выгоднее, что позволяет удовлетворять возросшую потребность
в связи с развитием исследований на культивируемых клетках);
2) свойства материала позволяют методом литья технологически
достаточно просто изготавливать изделия любой конфигурации;
3) возможность выпускать стерильные изделия, сразу же готовые
к использованию; 4) структура поверхности пластиковой посуды
более пригодна для некоторых клеточных линий.
Характеристика и свойства материала. Различные полимерные
материалы могут использоваться для изготовления посуды и пленок
одноразового применения при культивировании клеток [12, 13, 14].
5 Укупорка сосудов для культивирования должна изготовляться из биологи-
чески инертного материала, не выделяющего в среду никаких токсичных веществ.
Материал должен выдерживать условия автоклавирования. Наиболее подходящим
материалом для пробок и прокладок к завинчивающимся крышкам является силико-
новая резина.
38
Наиболее предпочтительным является полистирол, получаемый в ре-
зультате полимеризации стирола (табл. 5):
-СН2-СН(С6Н5)-СН2-СН(С6Н5)-
Полистирол прозрачен, прочен, имеет хорошую стабильность про-
странственной структуры, ударопрочен, высокоустойчив к водным ра-
створам.
Способы стерилизации. Как уже говорилось выше, одним из пре-
имуществ пластиковой посуды является возможность стерилизации
ее в процессе изготовления. Способы стерилизации могут быть
физической и химической природы.
Самый распространенный физический способ, применяемый в про-
мышленности, — облучение у-лучами дозой 25 кГр (2.5 Мрад [14]).
Все пластики выдерживают стерилизацию УФ-светом (не менее
30 мин) с длиной волны 254 нм. Но этот способ чаще всего приме-
няется в лабораторных условиях, а в технологии только в профилак-
тических целях для снижения инициального уровня контаминации
изделий, поступающих на сборку, а также исходных материалов. Этот
способ стерилизации с экономической точки зрения невыгоден [14].
Химическая стерилизация может быть выполнена с помощью газа
и жидкостей. Газовая стерилизация осуществляется с помощью
окиси этилена. Минимальная концентрация в стерилизационной
камере составляет 450 мг/л в течение 6—16 ч. Повышение концент-
рации до 1000 мг/л позволяет сократить время стерилизации вдвое,
но при этом стерилизация будет эффективней, если повысить темпера-
туру воздействия [14]. Можно использовать окись этилена в сочета-
нии с бромистым метилом в течение 4—6 ч, но пары эти токсичны
и приводят к деструкции материала [15]. В качестве стерилизующих
жидкостей используют этиловый спирт (70—96 %-ный раствор, 15—
20 мин), раствор пергидроля (10 %-ный, 4—6 ч), формалин (5 %-
ный раствор, 1 ч).
Способы обработки пластиковой посуды. Пластиковая посуда
производится в двух модификациях — для культивирования микро-
организмов и для культивирования клеток.
Такое разделение вызвано тем, что культивируемые клетки (речь
идет о монослойном культивировании) в отличие от бактериальных
клеток находятся в непосредственном контакте с поверхностью
сосуда, которая является для них субстратом. Клетки оседают на
этой поверхности, прикрепляются и распластываются.
Для улучшения адгезионных свойств поверхности из полистирола
ее подвергают специальной обработке, в то время как бактериоло-
гическая посуда не обрабатывается. Рабочая поверхность этих двух
типов посуды различается по силе поверхностного натяжения и сма-
чиваемости: бактериологическая — гидрофобна, культуральная —
гидрофильна. По некоторым данным [16], наиболее пригодными для
культивирования клеток могут быть поверхности, смачиваемость ко-
торых свыше 560 мкН/см, в то время как у полиамидных, полиэфир-
ных и у некоторых других поверхностей эта величина не превышает
39
Таблица 5
Свойства материалов, используемых для производства посуды
Материал Прозрачность Прочность Удельная масса Проницаемость для газов *
Флюоропластик Полиэтилен Полипропилен Полистирол Поликарбонат *** Полиэфир Полиамид Стекло Нержавеющая сталь Матовая Достаточно хорошая Высокая » Достаточно высокая То же Достаточно хорошая Высокая Никакой Низкая » Средняя Высокая » Средняя » Высокая » 2.10 0.92 0.90 1.06 1.02 1.12 1.14 2.30 7.90 130 7 2 10 20 о.ю 0.05 Никакой И » Я
Таблица Е (продолжение)
Материал Поверхностное натяжение,** мкН/см Способ стерилизации Максимальная температура обработки, °C
Флюоропластик Полиэтилен Полипропилен Полистирод Поликарбонат *** Полиэфир Полиамид Стекло Нержавеющая сталь 190 310 310 330 (?) 430 460 7000 10 000 УФ, газовый, химический, авто- клавирование УФ, у-лучи, химический УФ, газовый, химический, авто- клавирование УФ, газовый, у-лучи, химиче- ский УФ, газовый, автоклавирова- ние, химический Автоклавирование То же Автоклавирование, сухо- жаровой То же 250 80—120 135 70 135 (?) (?) >200 >200
Примечание. * — проницаемость в см3 02/1000 см2 при толщине пленки 25 мкм,
** — приводятся данные для необработанной поверхности; поверхностное натяжение воды —
720 мкН/см. *** — после автоклавирования уменьшается механическая прочность.
440 мкН/см. На необработанных чашках имеется некоторое коли-
чество отрицательных зарядов (может быть, это остатки карбоксиль-
ных групп после полимеризации). В лабораторных исследованиях
применяются различные обработки. Так, ионы марганца в простом
солевом растворе будут стимулировать как адгезию, так и распласты-
вание клеток [17]. Возможно покрытие поверхности изделий различ-
ными полимерами: polyHEMA (поли-2-гидроксиэтилметакрилатом)
[18, 19]; полиионинами (поличетвертичные полимерные амины) [20];
белковыми молекулами (коллагеном [21]; экстраклеточными комп-
лексами, синтезируемыми эндотелиальными клетками человека
[22]); полимерами полилизина, полиглютаминовой кислоты [23, 24];
40
положительно заряженными полимерами (годится практически лю-
бой такой полимер) [23].
Очень популярным является использование поли-В-лизина [23].
Нужно приготовить в дистиллированной воде раствор поли-В-лизина
(молекулярная масса 30 000—70 000) в концентрации 0.1 мг/мл,
простерилизовать через мембранный фильтр. Затем налить 0.5 мл
этого раствора на чашку Петри диаметром 60 мм. Равномерно рас-
пределить жидкость, наклоняя чашку. Через 5 мин раствор слить
и чашку прополоскать 1.5 мл стерильной воды, тщательно удалив
весь раствор, так как свободный полилизин при добавлении прямо
в культуральную среду может ингибировать рост клеток. Чашки,
обработанные таким образом, можно использовать сразу или после
некоторого срока хранения в высушенном виде. Если все операции
выполнены нестерильно, их можно затем простерилизовать под
ультрафиолетом. Таким же образом производится обработка раство-
ром коллагена.
Следует отметить, что в ряде работ имеются сведения о значении
толщины пленки покрытия. При использовании polyHEMA проверяли
толщину покрытия в диапазоне 35—0.0035 мкм. Клетки, посеянные
иа самый толстый слой (35 мкм), были наименее прикрепленными
и имели круглую форму; на более тонких слоях все клетки прикреп-
лялись и распластывались [18, 19]. Такая же зависимость отмечена
при посеве эпителиальных клеток кожи на коллагеновое покры-
тие [21]. Механизм этой реакции пока неизвестен.
Известно, что на заводах фирм, специализирующихся на произ-
водстве пластиковой посуды для культивирования клеток, эти
изделия проходят специальную обработку, вероятнее всего электри-
ческим коронным разрядом. Он может индуцировать на поверхности
пластика мягкое окисление или разрушение различных агентов,
остающихся на поверхности после литья [25].
К разряду физических способов относится и обработка плазмой
кислорода [26].
Очень хорошие результаты получаются при обработке полисти-
рола концентрированной серной кислотой. Для этого обычно
используют концентрированную кислоту (93 и 98%) [16, 27, 28].
Время обработки колеблется от 2 мин до 18 ч. Есть и некоторые другие
различия в условиях обработки; например [27], при использовании
93 %-ной холодной кислоты, которую отмывали дистиллированной
водой, посуду затем обрабатывали 10 %-ным раствором NazCCh
в течение 20 мин для нейтрализации групп H2SO4, прикрепленных
к пластику, и проводили следующее отмывание и стерилизацию
ультрафиолетом в течение 30 мин (рис. 4).
В ряде случаев [13, 28] посуду обрабатывали концентрированной
серной кислотой при 37 °C в течение 2, 10 мин и 18 ч. Результаты
были прекрасные, в то время как обработка соляной кислотой,
хлорноватой кислотой, гидролиз раствором 5 • 10~3 М КС1 или
10 М НС1 в течение 30 мин, озонирование 2 %-ным озоном при 25 °C
в течение 25 мин улучшали адгезию клеток, но не настолько, как
в случае с серной кислотой. Обработка хромовой кислотой может
41
Рис. 4. Рост клеток иа бактериологических чаш-
ках (1 и 2) и на чашках для культур клеток
(3) (по: [27]).
1—без предварительной обработки; 2—обработка
УФ и NajCOa По оси абсцисс— время после посева,
ч; по оси ординат — количество клеток иа чашку.
индуцировать на поверхности полисти-
рола гидроксильные, альдегидные или
карбоксильные группы. Все эти способы
обработки, вызывающие окислительные
реакции на поверхности полистирола,
улучшают адгезию клеток. Но пока еще
не существует полного понимания при-
роды адгезии клеток к субстрату. Одни
авторы [13, 16, 27] полагают, что в ос-
нове механизма адгезии лежат физиче-
ские силы взаимодействия субстрата
(полистирол) с клеткой, проявляю-
щиеся в величине и плотности возни-
кающего заряда. Такой вывод был сделан из экспериментальных дан-
ных по измерению знака и величины заряда на обработанных и не-
обработанных поверхностях. Количество отрицательно заряженных
групп можно измерить по связыванию их положительно заряженным
четвертичным аммониевым красителем кристаллическим фиолето-
вым. Оказалось, что чашки, предназначенные для культивирования
клеток, связывают его в 5—10 раз больше, чем бактериологические
[16, 27],
Обработка концентрированной серной кислотой — сульфониро-
вание— увеличивает адгезивность полистирола. Есть данные [16],
что необработанные бактериологические чашки имеют плотность
отрицательного заряда 0.6 на 1 нм2 при плотности заряда 2.3
(это значение соответствует полному сульфонированию поверх-
ности), после сульфонирования распластанность клеток увеличива-
ется в 5 раз. Но при дальнейшем увеличении плотности заряда
до 17.2 распластывание клеток снижается в 2.5 раза (в бессывороточ-
ной среде). Было обнаружено, однако, что клетки также хорошо
распластываются на положительно заряженном полистироле. Следо-
вательно, для адгезии будет иметь значение скорее величина плот-
ности заряда, чем его знак.
Другие исследователи полагают, что основную роль в адгезии
клеток играют физико-химические взаимодействия [26, 28]. Согласно
контактной гипотезе [28], наиболее существенными для адгезии
клеток являются межмолекулярные силы, включая не только
дипольные и электростатические, но также водородные связи и гид-
рофобные. Такое взаимодействие может быть измерено по контактному
углу смачивания разнообразными жидкостями, в частности водой.
При различных обработках полистирола на его поверхности могут
возникать химические группы, в основном гидроксильные и карбо-
ксильные. Есть мнение [28], что для некоторых клеток первостепенное
значение имеет наличие на поверхности гидроксильных групп, так как
42
их блокирование подавляло адгезию; блокирование карбоксильных
групп адгезию не подавляло, а даже могло повышать. Это наблюда-
лось как в отсутствие, так и в присутствии сыворотки.
В большинстве случаев клетки культивируют в среде с сывороткой.
Белки сыворотки адсорбируются на поверхности полистирола, и
клетки могут прикрепляться не столько к самой поверхности, сколько
к этим белкам. Следовательно, адгезия и распластывание клеток
на полистирольной поверхности в присутствии или в отсутствие
сыворотки могут иметь некоторые свои особенности.
При исследовании обработанных пластиковых поверхностей
методом фотоэлектронной спектроскопии [26] хорошую клеточную
адгезию связывают прежде всего с возникновением карбоксильных
групп в результате окислительного воздействия обработки как
физическими, так и химическими агентами. Такие данные были
получены при обработке полистирола плазмой кислорода при очень
коротких экспозициях или при обработке азотной кислотой. Контакт-
ный угол смачивания поверхности полистирола, обработанной плаз-
мой кислорода, составлял 18—38°, а для необработанного полисти-
рола он был равен примерно 90°. Первостепенную роль в этом про-
цессе приписывают карбоксильным группам [26].
Таким образом, как можно видеть во всех случаях, на сегодняш-
ний день основным критерием пригодности поверхности для культи-
вирования клеток служит величина ее смачиваемости.
В последние годы стали появляться модифицированные изделия
из пластика, предназначенные для культивирования клеток. К ним
относятся полистирольные чашки Petriperm фирмы «Heraeus»; дно
в них представляет собой газопроницаемую мембрану, которая либо
гидрофобна (для суспензионного культивирования), либо гидро-
фильна (для культивирования в монослое). Фирма «Millipore»
предлагает чашки Millicell, где рабочая поверхность представлена
газопроницаемой пористой мембраной, обеспечивающей клеткам,
в особенности эпителиальным, оптимальные условия роста и диффе-
ренцировки.
Таким образом, одним из первых условий успешного культивиро-
вания клеток является хороший субстрат, т. е. посуда, обеспечиваю-
щая максимальную адгезию, распластывание и, следовательно,
рост. Наши знания о материале и о его взаимодействии с клеткой
будут способствовать созданию наиболее оптимальных условий ее
существования вне организма.
Литература
1. Pierce F. М., Sanford К. К- Cleaning and preparation of glassware for cell
culture // Tissue Cell Assoc. Manual. 1976. Vol. 2. P. 379—382.
2. Кешишян T. H. Стекло // Химическая энциклопедия. 1965. T. 4. С. 1027—1034.
3. Стекло: Справочник / Под ред. Н. М. Павлушкина. М., 1973. 625 с.
4. Справочник по производству стекла. М., 1963. Т. 1. 368 с.
5. Евстропьев К- С., Качалов Н. Н. К. с. № 102890 (СССР). Стекло. 1936.
6. Glass. Technical data. Care and maintenance // Catalog «Corning». Stattford,
1984. P. 10—27.
7. Юрков Л. Ф., Леко В. В. Переходные стекла и спаи в электровакуумной промыш-
ленности. М., 1979. 138 с.
43
8. Вольф М. К- Стекло «Симакс» и его свойства // «Стеклоревю» (ЧССР). 1978.
Т. 33. № 10. С. 22—25.
9. Takegoshi F. Glass application and thermal tension // J. Med. Techn. 1980. Vol. 22.
P. 3—21.
10. Hench L. L., Clark D. E. Surface analysis of glass // Ind. Appl. of surface annual
Symp. 18st Meet. AM Chem. Soc. New York. 23—28 Aug. 1981. Washington,
1982. P. 203—228.
11. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии / Под ред.
Г. В. Лисичкина. М., 1986. 248 с.
12. Catalog «Kartell» plastic labware. Milano, 1981 —1982. 64 p.
13. Maroudas N. G. New methods for large-scale of anchorage-dependent cells // New
techniques in biophysics and cell biology. London, 1973. P. 67—86.
14. Шерстнев П. П. Полимеры в медицинской технике. М., 1980. 366 с.
15. Гительзон И. И., Нефедов В. П., Самойлов В. А. Культура изолированных
органов. Л., 1977. 195 с.
16. Maroudas N. G. Adhesion and spreading of cells on charged surfaces // J. Theor.
Biol. 1975. Vol. 49. P. 417—424.
17. Rabinovitch M., DeStefano M. Manganese stimulates adhesion and spreading
of mouse sarcoma 1 ascites cells // J. Cell Biol. 1973. Vol. 59. P. 165—175.
18. Folkman J., Mosckona A. Role of cell shape in growth control // Nature. 1978.
Vol. 273. P. 345—349.
19. Minnet T. W., Tighe В. I., Lydon M. I., Rees D. A. Requirements for cell spreading
on polyHEMA coated culture substrates // Cell Biol. Intern. Reps. 1984. Vol. 8.
P. 151 — 159.
20. Rembaum A., Ingram M., Stroud-Schmink F. A., Rounds D. E. Treatment of surface
to stimulate biological cell adhesion and growth // Patent USA. 1974. N 443. 751.
21. Liu S.-Ch., Eaton M. I., Karasek M. A. Growth characteristics of human epidermal
keratinocytes from newborn foreskin in primary and serial cultures // In Vitro.
1979. Vol. 15. P. 813—822.
22. Hatcher V. B., Fadi-Allan N., Levitt M. A., etal. Isolation and partial characterization
of endothelial cell extracellular complexes // J. Cell. Physiol. 1986. Vol. 128,
P. 353—361.
23. Ham R. G,, Mosckona A. Media and growth requirements // Methods in enzymology.
New York etc. 1979. P. 44—93.
24. Wahrmann G. S. Modulation of differentiation in vitro. Influence of the attachement
on myogenesis //In Vitro. 1981. Vol. 17. P. 752—763.
25. A ms tein C. F„ Hartman P. A. Adaptation of plastic surfaces for tissue culture by glow
charge // J. Clin. Microbiol. 1975. Vol. 21. P. 46—54.
26. Ramsey W. S., Hertl №.. Nowlan E. D., Binkowski Y. Surface treatments and cell
attachment // In Vitro. 1984. Vol. 20. P. 802—808.
27. Martin G. R., Rubin H. Effects of cell adhesion to the substratum on the growth
of chick embryo fibroblasts // Exp. Cell Res. 1974. Vol. 85. P. 319—333.
28. Curtis A. S. G., Forrester J. V., Mclnnes C., Lawrie F. Adhesion of cells to polysterine
surfaces // J. Cell Biol. 1983. Vol. 97. P. 1500—1506.
Питательные среды <
для культивирования клеток млекопитающих
А. Д. Т артаковский
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Успешное культивирование клеток вне организма возможно лишь
при удовлетворении всех их многообразных и взаимосвязанных
потребностей в составе жидкой (питательная среда), газообразной
(смесь газов) и твердой (поверхность субстрата) фаз. Для удовлет-
ворения уже известных потребностей клеток в питательных веществах
созданы среды определенного химического состава, т. е. растворы,
каждый компонент которых имеет известную химическую структуру
44
(хотя, конечно, даже чистейшие реактивы содержат небольшое
количество примесей). Не выясненные к данному моменту потреб-
ности удовлетворяют, добавляя в среды определенного состава жид-
кости биологического происхождения (плазма и сыворотка крови,
тканевые экстракты и т. д.).
Непостоянство чрезвычайно сложного состава и ростостимули-
рующей0 активности (вплоть до цитотоксичности) биологических
жидкостей, воздействие, которое они оказывают на специализирован-
ные функции клеток, риск контаминации вирусами и микоплазмами
создают ряд проблем при культивировании. Применение бессыворо-
точных сред устраняет маскирующее влияние сыворотки и других
подобных компонентов при поиске новых клеточных регуляторов
и облегчает выделение полезных клеточных продуктов.
В предлагаемом обзоре рассматривается состав наиболее рас-
пространенных питательных сред, обсуждаются вопросы оптими-
зации сред и замены сыворотки известными веществами. В заключе-
ние описывается приготовление бессывороточной среды для культи-
вирования нормальных кератиноцитов.
Поддержание pH и осмотического давления
Даже при кратковременном культивировании одним из главных
условий сохранения жизнеспособности клеток является поддержание
в определенных пределах концентрации водородных ионов (pH)
и осмотического давления. Эту функцию выполняет лежащая в основе
питательной среды смесь солей, дополненная углеводом в качестве
источника энергии — сбалансированный солевой раствор. В табл. 1
приведен состав двух таких растворов — Эрла [1] и Хэнкса [2],
которые входят в состав многих сред. Растворы Эрла и Хэнкса,
а также фосфатно-солевой буфер Дульбекко и Фогта широко
используются и самостоятельно, в частности, для орошения и промы-
вания клеток, для приготовления различных растворов, необходимых
при культивировании клеток: трипсина, ЭДТА, некоторых веществ,
вводимых в среду, и т. д.
Осмотическое давление раствора определяется числом молей
осмотически активных частиц (ионов и неионизированных молекул)
растворенных веществ на 1 кг растворителя (осмоляльность) или
на 1 л раствора (осмолярность). В разбавленных водных растворах,
таких как питательные среды, эти величины близки. Общую осмо-
ляльность раствора (осмоль/кг) можно представить в виде суммы
2где /л,-—концентрация <-го растворенного вещества
<=1
(моль/кг), х,— количество частиц, на которое диссоциирует его мо-
лекула, п — количество веществ. Например, для раствора Эрла
(табл. 1) расчетная величина осмоляльности составит 310.6 мосмоль/
кг, а реальная, полученная из данных по определению снижения
точки замерзания, — 283 мосмоль/кг [3].
Пределы pH и осмоляльности, в которых происходит размножение
клеток, довольно узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Так,
например, для клонального роста диплоидных фибробластов чело-
45
Таблица 1
Состав сбалансированных солевых растворов
Компонент Эрла Хэнкса, г/л Дульбекко н Фогта, г/л
10“’ и г/л
NaCl 116.50 6.80 8.00 8.00
КС1 5.35 0.40 0.40 0.20
СаС12 1.80 0.20 0.14 0.10
MgSO4•7Н2О 0.83 0.20 0.20 —
MgCl2 . 6Н2О — — — 0.10
NaH2PO4 • Н2О 1.01 0.14 — —
Na2HPO4 • 12Н2О — — 0.12 * 2.90 **
КН2РО4 — — 0.06 0.20
NaHCO3 26.10 2.20 0.35 —
Глюкоза 5.56 1.00 1.00 —
Феноловый красный *** — 0.02 —
Примечания. * — соответствует 0.06 г/л Na2HPO4 • 2Н2О; ** — соответствует
1.15 г/л Na2HPO4 (безводный); *** — феноловый красный не является компонентом раствора
Эрла, но может быть добавлен к нему.
века WI-38 оптимальны pH 7.30+0.15 и осмоляльность
285 мосмоль/кг+40 мосмоль/кг, а для фибробластов из эмбриона
цыпленка — 7.12+0.18 и 300+20 соответственно [4]. С другой
стороны, культивирование эпителиальных клеток из предстательной
железы мыши лучше проводить в среде с 350 мосмоль/кг [5].
Оптимум pH для нетрансформированных клеток, как правило, слегка
сдвинут в щелочную область по сравнению с клетками соответствую-
щих пострянных линий.
В большинстве сред, как и в крови, в качестве главного компо-
нента системы, поддерживающей pH, используется бикарбонат-
ный буфер. В растворе бикарбоната осуществляется равновесие:
НСО^=СО2+ОН“. Если СО2 уходит из раствора, то равновесие
сдвигается вправо и пропорционально концентрации бикарбоната
увеличивается число гидроксильных ионов. Растворы с бикарбонат-
ным буфером можно разделить на две группы. Одни, подобно раст-
вору Хэнкса, содержат относительно малое количество бикарбоната
и предназначены для поддержания pH в плотно закрытых сосудах;
в других, так же как в растворе Эрла, значительно больше бикарбо-
ната, они используются в системах с повышенным парциальным
давлением углекислого газа.
Раствор Эрла — более емкий буфер. Однако в средах на его основе
культивирование можно вести в плотно закрытых сосудах лишь тогда,
когда в ходе метаболизма клетки продуцируют адекватное коли-
чество СО2. В противном случае (при клонировании, например)
культивирование ведут в допускающих газообмен сосудах, помещен-
ных в СО2-инкубатор, где поддерживается заданный уровень СО2
(обычно 5—10 %). Технические трудности, а также проблемы, свя-
занные со значительными изменениями pH при манипуляциях с куль-
турами вне СО2-инкубатора, стимулируют поиск альтернативных
буферных систем. Можно поддерживать pH, повышая концентрацию
аминокислот .[6], а также заменяя бикарбонат р-глицерофосфатом
46
и различными синтетическими органическими буферами, из которых
наиболее широкое распространение получил HEPES— 4-(2-окси-
этил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота. HEPES (рКо=7.31
при 37 °C, молекулярная масса 238.3) легко растворяется в воде,
не связывает двухвалентные катионы, не проявляет цитотоксичности
вплоть до концентрации 0.05 М и обычно используется в концентра-
ции 0.01—0.03 М [7]. Буферная емкость HEPES в отличие от бикар-
боната (рК=6.1) максимальна как раз в области физиологических
значений pH. Величина рКа HEPES уменьшается с ростом темпера-
туры (ДрКо/°С=—0.014), вследствие чего для получения при 37 °C
pH 7.30 необходимо при 20 °C довести pH до 7.54 с помощью NaOH,
концентрация которого составит более чем половину концентрации
HEPES.
Добавляя к стандартным средам HEPES или другие вещества,
надо учитывать их вклад в общую осмоляльность: 0.05 М HEPES
с соответствующим количеством NaOH увеличит осмоляльность
на более чем 75 мосмоль/кг. В результате может быть превышен
допустимый предел, если одновременно не снизить концентрацию
других компонентов, обычно NaHCOs или NaCl. Так, в случае введения
0.02 М HEPES используют бикарбонат в концентрации не более
0.01 М. С точки зрения сохранения осмоляльности следует также
обращать внимание на поддержание влажности в ССЪ-инкубаторе,
поскольку частичное испарение среды ведет к увеличению осмоляльт
ности. При нормальной влажности осмоляльность контрольной среды
(без клеток) остается неизменной.
Стандартные среды
В табл. 2 приведен состав некоторых наиболее распространенных
питательных сред (они производятся промышленностью) и несколь-
ких сред, оптимизированных для клеток определенного типа. Для
удобства сравнения сред концентрация компонентов выражена
в молях на литр. Информацию, необходимую для приготовления сред,
можно найти в первоисточниках, а также в ряде обзоров [8—10]
(подробнее о роли отдельных компонентов сред см. [11 —13]).
Среды Игла [14]. Среда MEM (minimal essential medium)
используется значительно чаще других. Подобно своей предшествен-
нице — среде ВМЕ (basal medium, Eagle) — она основана на тща-
тельном исследовании потребностей клеток постоянных линий,
главным образом L и HeLa, содержит минимальный набор компонен-
тов, необходимых для клеточного размножения (плюс феноловый
красный в качестве индикатора pH) и предназначена для моно-
слойного культивирования клеток различного типа в присутствии
цельной или диализованной сыворотки. В состав МЕМ входят
4 катиона, 3 аниона, 13 незаменимых аминокислот, 6 водораствори-
мых витаминов, 2 витаминоподобных соединения (холин и инозит),
выполняющие роль субстратов, а не катализаторов, и углевод.
В среде МЕМ в отличие от ВМЕ присутствует инозит и отсутствует
биотин, а концентрация аминокислот увеличена. Бикарбонат не явля-
Т а б л н ц а 2
Состав некоторых питательных сред (моль/л)
Компонент Наименование сред
МЕМ ВМЕ ОМЕ IMDM L-15 199 CMRL- 1066
Н е з а е н н м ы е
Аргинин 6.0Е-4 1.0Е-4 4.0Е-4 4.0Е-4 2.9Е-3 З.ЗЕ-4 З.ЗЕ-4
Цистеин — — — — 9.9Е-4 6.ЗЕ-7 1.5Е-3 Т
Цистин (х2) * 2.0Е-4 1.0Е-4 4.0Е-4 5.8Е-4 —. 1.7Е-4 1.7E-4.q
Глютамин 2.0Е-3 2.0Е-3 4.0Е-3 4.0Е-3 2.1 Е-3 6.8Е-4 6.8Е-4 «
Г нстидин 2.ОЕ-4 5.0Е-5 2.0Е-4 2.0Е-4 1.6Е-3 1.0Е-4 9.5Е-5 -J ,
Изолейцин 4.0Е-4 2.0Е-4 8.0Е-4 8.0Е-4 1.9Е-3 ’♦ З.ОЕ-4 *» 1.5Е-4 '
Лейцин 4.0Е-4 2.0Е-4 8.0Е-4 8.0Е-4 9.5Е-4 9.1Е-4 ** 4.6Е-4
Лизнн 4.0Е-4 2.0Е-4 8.0Е-4 8.0Е-4 5.1Е-4 3.8Е-4 3.8Е-4
Метионин 1.0Е-4 5.0Е-5 2.0Е-4 2.0Е-4 1.0Е-3 ** 2.0Е-4 ** 1.0Е-4
Фенил аланин 2.0Е-4 1.0Е-4 4.0Е-4 4.0Е-4 1.5Е-3** З.ОЕ-4 ** 1.5Е-4
Треонин 4.0Е-4 2.0Е-4 8.0Е-4 8.0Е-4 5.0Е-3 ** 5.0Е-4** 2.5Е-4
Триптофан 5.0Е-5 2.0Е-5 8.0Е-5 7.8Е-5 9.8Е-5 9.8Е-5 ** 4.9Е-5
Тирозин 2.0Е-4 1.0Е-4 4.0Е-4 4.6Е-4 1.7Е-3 2.2Е-4 2.2Е-4
Валин 4.0Е-4 2.0Е-4 8.0Е-4 8.0Е-4 1.7Е-3** 4.3Е-4 ** 2.1Е-4
Зам е н и м ые
Аланин — — — 2.8Е-4 5.1Е-3 “ 5.6Е-4 ** 2.8Е-4
Аспарагин — — — 1.9Е-4 1.9Е-3 — —
Аспартат — — — 2.2Е-4 — 4.5Е-4 ** 2.ЗЕ-4
Глютамат — — — 5.1Е-4 — 9.1Е-4 ** 5.1Е-4
Глнцнн , — — 4.0Е-4 4.0Е-4 2.7Е-3 6.7Е-4 6.7Е-4
Пролин — — — 3.5Е-4 —. 3.5Е-4 3.5Е-4
Серин — — 4.0Е-4 4.0Е-4 1.9Е-3 4.8Е-4 ** 2.4Е-4
Производные
Аминобутнрат — — — — — 3.6Е-7 __ д
Глютатнон — — — — — I.6E-7 З.ЗЕ-5 <
Окснпролии — — — — —. 7.6Е-5 7.6Е-5 5
Орнитин — — — — — — —
Путрисцнн — — — — — — —
Таурин — — — — — — —
Водораств о р и м ы е
Аскорбиновая — — — — — 2.8Е-7 2.8Е-4
кислота
Бнотни —• 1.0Е-6 — 5.3Е-8 —. 4.1Е-8 4.1Е-8
Фолиевая кислота 2.3Е-6 1.0Е-6 9.1Е-6 9.1Е-6 2.ЗЕ-6 2.ЗЕ-8 2.3Е-8
Фолиновая — — — — — —
кислота
Парааминобен- — — — — — 3.6Е-7 3.6Е-7
зойная кислота а-Липоевая
кислота
Никотиновая — — — — — 2.ОЕ-7 2.0Е-7
кислота
Никотинамид 8.2Е-6 1.0Е-6 З.ЗЕ-5 З.ЗЕ-5 8.2Е-6 2.0Е-7 2.0Е-7
НАД — — — — —. — 1.1Е-5
НАДФ — — — — — — 1.3Е-6
48
Наименование сред
NCTC- (35 мв- 752/1 Мак-Коя- 5а RPMI- (640 F-I0 F-I2Q MCDB- (05 MCDB- 153 MCDB- 202
а м и и о к ИСЛОТЫ
1.5Е-4 3.6Е-4 2.0Е-4 1.1 Е-З 1.0Е-3 1.0Е-3 1.0Е-3 1.0Е-5 З.ОЕ-4
— 5.7Е-4 2.0Е-4 — 2.0Е-4 2.ОЕ-4 5.0Е-5 2.4Е-4 2.0Е-4
8.7Е-5 1.2Е-4 — 4.2Е-4 — — — — —
9.ЗЕ-4 2.4Е-3 1.5Е-3 2.1 Е-З 1.0Е-3 1.0Е-3 2.5Е-3 6.0Е-3 1.0Е-3
1.3Е-4 7.8Е-4 1.0Е-4 9.7Е-5 1.0Е-4 1.0Е-4 1 .ОЕ-4 8.0Е-5 1 .ОЕ-4
1.4Е-4 1.9Е-4 З.ОЕ-4 3.8Е-4 2.0Е-5 З.ОЕ-5 З.ОЕ-5 1.5Е-5 1 .ОЕ-4
1.6Е-4 3.8Е-4 З.ОЕ-4 3.8 Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 5.ОЕ-4 З.ОЕ-4
2.1 Е-4 1.3Е-3 2.0Е-4 2.2Е-4 1.0Е-4 2.ОЕ-4 2.0Е-4 1.0Е-4 2.0Е-4
З.ОЕ-5 3.4Е-4 1.0Е-4 1 .ОЕ-4 З.ОЕ-5 З.ОЕ-5 З.ОЕ-5 З.ОЕ-5 З.ОЕ-5
1.0Е-4 З.ОЕ-4 1.0Е-4 9.1 Е-5 З.ОЕ-5 З.ОЕ-5 З.ОЕ-5 З.ОЕ-5 З.ОЕ-5
1.6Е-4 6.ЗЕ-4 1.5Е-4 1.7Е-4 З.ОЕ-5 •1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 З.ОЕ-4
8.6Е-5 2.0Е-4 1.5Е-5 2.4Е-5 З.ОЕ-6 1.0Е-5 1.0Е-5 1.5Е-5 З.ОЕ-5
9.1 Е-5 2.2Е-4 1.0Е-4 1.1 Е-4 1.0Е-5 З.ОЕ-5 З.ОЕ-5 1.5Е-5 5.0Е.5
2.1 Е-4 5.5Е-4 1.5Е-4 1.7Е-4 З.ОЕ-5 1.0Е-4 1.0Е-4 З.ОЕ-4 З.ОЕ-4
а м и и о к «СЛОТЫ
3.5Е-4 — 1.5Е-4 — 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4
6.1 Е-5 — З.ОЕ-4 З.ЗЕ-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-3
7.4Е-5 4.5Е-4 1.5Е-4 1.5Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 З.ОЕ-5 1.0Е-4
5.6Е-5 1.0Е-3 1.5Е-4 1.4Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4
1.8Е-4 6.7Е-4 1.0Е-4 1.3Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4
5.3Е-5 4.3Е-4 1.5Е-4 1.7Е-4 1.0Е-4 З.ОЕ-4 З.ОЕ-4 З.ОЕ-4 5.0Е-5
1.0Е-4 — 2.5Е-4 2.9Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 6.0Е-4 З.ОЕ-4
а м и и о к «слот
5.3Е-5 — — — — — — — —
З.ОЕ-5 4.9Е-5 1.6Е-6 З.ЗЕ-6 — — — — — :
3.1 Е-5 — 1.5Е-4 1.5Е-4 — — — — !
5.6Е-5 — — — — — — — —
— — — — — 1.0Е-6 1.0Е-9 1.0Е-6 I.0E-9
З.ЗЕ-5 — — — — — — — —- -
витамин ы и кофермен! ы
2.8Е-4 9.9Е-5 2.8Е-6 — — — — — — *
1.0Е-7 8.2Е-8 8.2Е-7 8.2Е-7 1.0Е-7 З.ОЕ-8 З.ОЕ-8 6.0Е-8 З.ОЕ-8 :
5.7Е-8 9.1Е-7 4.5Е-7 2.ЗЕ-6 З.ОЕ-6 З.ОЕ-6 — 1.8Е-6 — Ik
— — 1.0Е-9 — 1.0Е-8 1
1
9.1Е-7 — 7.ЗЕ-6 7 .ЗЕ-6 — — — — *
— — — — 1.0Е-6 1.0 Е-6 1.0 Е-8 1.0Е-6 1.0Е:8 <
5.1Е-7 — 4.1Е-6 — — — — у
5.1Е-7 8.2Е-6 4.1Е-6 8.2Е-6 5.0Е-6 З.ОЕ-7 5.0Е-5 З.ОЕ-7 5.0Е-5 <
1.1Е-5 — — — — — — — —
1.3Е-6 — — — — — —
4 Зак. 1789
49
Компонент Наименование сред
МЕМ ВМЕ DME 1MDM L-15 199 CMRL- 1066
Пантотеновая 4.6Е-6 1.0Е-6 1.7Е-5 1.7Е-5 4.2Е-6 4.2Е-8 4.2Е-8
кислота
Кофермент А — — — — — — З.ЗЕ-6
Пиридоксин — — — — 4.9Е-6 1.2Е-7 1.2Е-7
Пиридоксаль 6.0Е-6 1.0Е-6 2.0Е-5 2.ОЕ-5 — 1.2Е-7 1.2Е-7
Рибофлавин 2.7Е-7 1.0Е-7 1.1Е-6 1.1Е-6 — 2.7Е-8 2.7Е-8
Рибофлавин- — — — — 1.9Е-7 — —
фосфат ФАД — — 1.3Е-6
Тиамин З.ОЕ-6 1.0Е-6 1.2Е-5 1.2Е-5 — З.ОЕ-8 З.ОЕ-8
Тиамиимоно- — — — — 2.8Е-6 — —
фосфат Тиаминпиро- — 2.1Е-6
фосфат Витамин В12 — — — 9.6Е-9 — — —
Жирорастворимые
Витамин D — — — — : — 2.5Е-7
Витамин К — — — — — 5.8Е-8 — к
Витамин Е — — — — — 2.0Е-8 —
Витамин А — — — — — 3.5Е-7 —
Углевод!
Ацетат — — — — — 6.1Е-4 6.1Е-4
Дезоксирибоза — — — — — 3.7Е-6
Г алактоза — — — — 5.0Е-3
Глюкозамии — — — — — —
Глюкоза 5.6Е-3 5.0Е-3 5.6Е-3 2.5Е-2 — 5.6Е-3 5.6Е-3
Глюкуроиат — — — — — — 1.8Е-5
Глюкуроиолактои — — — — — — —
Пируват — — 1.0Е-3 L0E-3 5.0Е-3 — —
Рибоза — — — — З.ЗЕ-6 —
Производные
Аденин — — — — — 4.9Е-5
АМФ — — — — — 5.8Е-7
АТФ — — — — — 1.8Е-6 —
Дезоксиадеиозин — — — — — .. 40Е-5
Гуанин — — — — — 1.6Е-6
Дезоксигуаиозии — — — — — — 3.7Е-5
Гипоксантин — — — — — 2.2Е-6
Ксантин — — — — — 2.0Е-6
Дезоксицитидин — — — — — — 4.4Е-5
Метилцитозии — — — — —
Метилдезоксици- — — — — — — 4.1Е-7
тидии
Тимин — — — — — 2.4Е-6
Тимидин — — — — — — 4.1Е-5
Урацил — — — — — 2.7Е-6
УТФ — — — — — — 2.1Е-6
50
Таблица 2 (продолжение)
Наименование сред
NCTC- 135 МВ- 752/1 Мак-Коя- 5а RPMI- 1640 F-I0 F-I2 MCDB- 105 MCDB- 153 MCDB- 202
1.0Е-7 4.2Е-6 8.4Е-7 1.0Е-6 З.ОЕ-6 1.0Е-6 1.0Е-6 1.0Е-6 1.0Е-6
З.ЗЕ-6 — — — — — — - 0
З.ОЕ-7 4.9Е-6 2.4Е-6 4.9Е-6 1.0Е-6 З.ОЕ-7 З.ОЕ-7 З.ОЕ-7 З.ОЕ-7
3.1Е-7 — 2.5Е-6 — — — — — —
6.6Е-8 2.7Е-6 5.3Е-7 5.ЗЕ-7 1.0Е-6 1.0Е-7 З.ОЕ-7 1.0Е-7 З.ОЕ-7
— — — — — — — — —
1.3Е-6 — — — — — — — —
7.4Е-8 З.ОЕ-5 5.9Е-7 З.ОЕ-6 З.ОЕ-6 1.0Е-6 1.0Е-6 1.0Е-6 1.0Е-6
— — — — — — — —
2.1Е-6 — — — — — — — —
7.4Е-6 1.5Е-7 5.5Е-10 3.7Е-9 1.0Е-6 1.0Е-6 1.0Е-7 З.ОЕ-7 1.0Е-7
витамины
6.3Е-7 — — — — — J — — —
1.5Е-7 — — — — — — — —
4.5Е-8 — — — — — — — —
8.7Е-7 — — — — — — — —
и их производные
3.7Е-4 — — — — — 3.7Е-3 —
— — — — — — — — —
— — — — — — — — —
1.8Е-5 — — — — — — — —
5.6Е-3 2.8Е-2 1.7Е-2 1.1Е-2 6.1Е-3 I.0E-2 4.0Е-3 6.0Е-3 8.0Е-3
7.7Е-6 — — — — — —
1.0Е-5 — — — — — — — —
— — — — 1.0Е-3 1.0Е-3 1.0Е-3 5.0Е-4 5.0Е-4
— — — — — — — — —
нуклеиновых кислот
4.0Е-5
3.7Е-5
3.8Е-5
8.0Е-7
1.8Е-4
— — 1.0Е-5 1.8Е-4 1.0Е-6
— — — — —
— — — — —
— — — — —
— — — — —
— — — — —
З.ОЕ-5 З.ОЕ-5 — — —
— — — — —
— — — — —
4.1Е-5
1.8Е-6
— — — — —
— — — — —
З.ОЕ-6 З.ОЕ-6 З.ОЕ-7 З.ОЕ-6 З.ОЕ-7
— — — — —
4*
51
Компонент Наименование сред
МЕМ ВМЕ DME 1MDM L-I5 199 CMRL- 1066
Жиры
Холестерин — — — — — 5.2Е-7 5.2Е-7
Холин 8.ЗЕ-6 1.0Е-6 2.9Е-5 2.9Е-5 8.3Е-6 3.6Е-6 3.6Е-6 1
Инозит 1.1Е-5 — 3.9Е-5 4.0Е-5 1.1Е-5 2.8Е-7 2.8Е-7 (
Линолеат — — — — — — —
Важ ней ш и!
Кальций 1.8Е-3 1.0Е-3 1.8Е-3 1.5Е-3 1.3Е-3 1.8Е-3 1.8Е-3
Магний 9.8Е-4 5.0Е-4 8.1Е-4 8.1Е-4 1.8Е-3 8.1Е-4 8.1Е-4
Калий 5.4Е-3 5.0Е-3 5.4Е-3 4.4Е-3 5.8Е-3 5.4Е-3 5.4Е-3
Натрий 1.4Е-1 1.2Е-1 1.6Е-1 1.1Е-1 1.5Е-1 1.5Е-1 1.5Е-1
Хлорид 1.3Е-1 1.1Е-1 1.2Е-1 8.7Е-2 1.5Е-1 1.3Е-1 1.3Е-1 '
Нитрат — — 7.5Е-7 7.5Е-7 — 1.2Е-6 —
Фосфат 9.7Е-4 1.0Е-3 9.1Е-4 1.0Е-3 7.9Е-4 1.0Е-3 1.0Е-3
Сульфат — — 8.1Е-4 8.1Е-4 8.1Е-4 8.6Е-4 8.1Е-4
Микро
Кобальт *** — — — 9.6Е-9 — — —
Медь — — — — — — —
Железо — — 2.5Е-7 — — 4.1Е-7 —
Марганец — — — — — — —
Молибден — — — — — — —
Никель — — — — — — —
Селен — — — 1.0Е-7 — — —
Кремний *• — — — — — — —
Олово — — — — — — —
Ванадий — — — — — — —
Цинк — — — — — — —
Буфера и
Бикарбонат 2.4Е-2 2.0Е-2 4.4Е-2 3.6Е-2 — 2.6Е-2 2.6Е-2
Углекислый газ § 5 **** 10 5 **♦♦* 8 5«**«
(%)
HEPES — — — 2.5Е-2 —. — —
Феноловый 1.4Е-5 1.4Е-5 4.2Е-5 4.0Е-5 2.8Е-5 4.2Е-5 5.6Е-5
красный
Этанол
Твин 80 (мг/л)
Про
3.5Е-4
5
Примечание: Состав сред приведен, в основном, по Хэму (12]; ссылки даны в тексте;
для удобства буквой Е заменено выражение «10 в степени», например, 6.0Е-4 означает
6.0 • 10“ ; * — для удобства сравнения приведена концентрация «полуцистииа»,т. е. удвоенная
концентрация цистина; ** — отмечены DL-амииокислоты, остальные аминокислоты в L-форме;
*** — кобальт входит в среды как компонент витамина В12; •*** — первоисточник не указывает
ется необходимым компонентом для клеток многих линий, когда
достаточное его количество образуется из других компонентов мини-
52
Таблица 2 (продолжение)
Наименование сред
МВ- Мак-Коя- RPMI- Р I А Р I О MCDB- MCDB-
752/1 5а 1640 Г • 1 и Г • 1 Z 105 153
MCDB-
202
NCTC-
135
и их производные
— — — — — — — —
9.0Е-6 1.8Е-3 3.6Е-5 2.1Е-5 5.0Е-6 1.0Е-4 1.0Е-4 1.0Е-4 1 ОЕ-4
6.9Е-7 5.6Е-6 2.0Е-4 1.9Е-4 З.ОЕ-6 1.0Е-4 1.0Е-4 I .ОЕ-4 1 .ОЕ-4
— — — — — З.ОЕ-7 1.0Е-8 — 2.0Е-7
и е о р г а н и ч е с к и е ионы
1.8Е-3 8.2Е-4 1.8Е-3 4.2Е-4 З.ОЕ-4 З.ОЕ-4 1.0Е-3 З.ОЕ-5 2.0Е-3
8.3Е-4 2.0Е-3 8.1Е-4 4.1Е-4 6.2Е-4 6.0Е-4 1.0Е-3 6.ОЕ-4 1.5Е-3
5.4р-3 2.6Е-3 5.4Е-3 5.4Е-3 4.4Е-3 З.ОЕ-З З.ОЕ-З 1.5Е-3 З.ОЕ-З
1.55-1 1.3Е-1 1.4Е-1 1.4Е-1 1.4Е-1 1.5Е-1 1.3Е-1 1.5Е-1 1.4Е-1
1 .ЗЕ-1 1.1Е-1 1.2Е-1 1.1Е-1 1.3Е-1 1.4Е-1 1.2Е-1 1.3Е-1 1 .ЗЕ-1
— — — 8.4Е-4 — — — — —
1.0Е-3 2.7Е-3 1.0Е-3 5.6Е-3 1.7Е-3 I.0E-3 З.ОЕ-З 2.0Е-3 5.ОЕ-4
8.3Е-4 8.1Е-4 8.1Е-4 4.2Е-4 6.2Е-4 6.0Е-6 1.0Е-3 4.5Е-6 1.5Е-3
элементы
7.4Е-6 1.5Е-7 5.5Е-10 3.7Е-9 1.0Е-6 1.0Е-6 1.0Е-7 З.ОЕ-7 1.0Е-7
— — — — 1.0Е-8 1.0Е-8 1.0Е-9 1.1Е-8 1.0Е-9
— — — — З.ОЕ-6 З.ОЕ-6 5.0Е-6 5.0Е-6 5.0Е-6
— — — — — — 1.0Е-9 1.0Е-9 5.0Е-10
— — — — — — 7.0Е-10 7.0Е-9 7.0Е-9
— — — — — — 5.0Е-10 5.0Е-10 5.0Е-12
— — — — — — З.ОЕ-8 З.ОЕ-8 З.ОЕ-8
— — — — — — 5.0Е-7 5.0Е-7 5.0Е-7
— — — — — — 5.0Е-10 5.0Е-10 5.0Е-12
— — — — — — 5.0Е-9 5.0Е-9 5.0Е-9
— — — — 1.0Е-7 З.ОЕ-6 5.0Е-7 5.0Е-7 1.0Е-7
индикатор
2.6Е-2 2.7Е-2 2.6Е-2 2.4Е-2 1.4Е-2 1.4Е-2 — 1.4Е-2 —
10 £***« 8 5* *** 5 5 2 5 2
— — — — З.ОЕ-2 2.8Е-2 З.ОЕ-2
5.5Е-5 2.8Е-5 7.1Е-6 1.4Е-5 З.ЗЕ-6 З.ЗЕ-6 З.ЗЕ-6 З.ЗЕ-6 З.ЗЕ-6
ч и е
I 8.7Е-4
12.5
необходимую концентрацию углекислого газа, эти среды обычно используются с 5 % СО2
в воздухе или с двуокисью углерода, образуемой плотными культурами клеток в процессе
метаболизма при культивировании в закрытых сосудах; ***** — эта среда предназначена
для культивирования клеток в сосудах, допускающих газообмен с воздухом.
мальной среды. Потребность в бикарбонате (или СОг) возникает,
в частности, при низкой концентрации клеток.
53
Среда МЕМ никогда не предназначалась для использования
без сыворотки, поскольку не содержит всех необходимых веществ.
Так, например, в ней отсутствуют такие трудно отделяемые от сыво-
ротки незаменимые компоненты, как биотин, витамин В12, ионы же-
леза и другие микроэлементы. Основой сред Игла является раствор
Эрла, однако многие предприятия выпускают среды ВМЕ и МЕМ
также на основе раствора Хэнкса. В СССР под названием «среда
Игла» производится ВМЕ с солями по Эрлу. Среды Игла с солями
по Хэнксу часто применяются на начальных этапах выращивания
первичных культур.
Адгезивность клеток зависит от кальция, поэтому МЕМ без каль-
ция используют для суспензионного культивирования. Концентрацию
фосфата увеличивают при этом в 10 раз. Производятся и другие
модификации сред Игла. Так, введение янтарнокислого натрия
(100 мг/л) и янтарной кислоты (75 мг/л) позволяет стерилизовать
среды автоклавированием. Глютамин и бикарбонат при этом стерили-
зуют отдельно. Заменимые (7 из 20) аминокислоты участвуют в син-
тезе белка и могут быть синтезированы большинством клеток. Однако
это требует повышенного содержания незаменимых аминокислот
и глюкозы. Кроме того, промежуточные продукты метаболизма,
особенно серин и пируват, теряются клетками, растущими в условиях
редкого посева. В случае медленного размножения клеток в МЕМ
вводят, по рекомендации Игла, все заменимые аминокислоты
(по 1 • 10-4 М) и пируват (1 • 10-3 М). Получаемый набор компо-
нентов лежит в основе многих сред.
Среда Дульбекко обозначается DME или DMEM (Dulbecco’s
modified'Eagle’s medium) и является наиболее распространенной
модификацией среды Игла. Предложенная сначала для выращива-
ния вируса полиомы в первичных культурах из мышиных эмбрионов,
она используется при культивировании клеток самых различных
типов, в том числе нетрансформированных клеток и гибридом,
в присутствии сыворотки. В смеси с другими стандартными средами,
чаще всего с F-12, DME является основой ряда бессывороточных
сред; от среды Игла отличается наличием глицина, серина, пирувата,
а также железа. Кроме того, в DME резко увеличены концентрации
всех аминокислот и витаминов, бикарбоната, а в одном из вариан-
тов— глюкозы. Выпускаются три варианта DME: 1) стандартный,
содержащий пируват и глюкозу (см. табл. 2); 2) с повышенным
содержанием глюкозы, но без пирувата; 3) с повышенным содержа-
нием глюкозы и с пируватом. Для культивирования клеток в DME
необходим СОг-инкубатор с 10% СОг в воздухе.
Среда Пскова [15, 16] обозначается IMDM (Iscove’s modified
Dulbecco’s medium) и предназначена для бессывороточного культи-
вирования (в присутствии альбумина, трансферрина и липидов)
лимфоцитов и кроветворных клеток. Используется также в случае
постоянных линий клеток крови и гибридом. Исков дополнил наибо-
лее богатый вариант среды Дульбекко заменимыми аминокислотами,
биотином, витамином В12 и селенитом натрия. Селен необходим
большинству клеток, он является компонентом ферментной системы,
54
разрушающей образующиеся в среде перекиси. В IMDM введен
HEPES с параллельным уменьшением концентрации NaCl и NaHCO3..
Осмоляльность исходного варианта DME (350 мосмоль/кг) нахо-
дится на верхнем пределе для мышиных лимфоцитов (оптимальная —
280 мосмоль/кг). Обычно в момент приготовления к среде добавляется
сульфгидрильное соединение 2-меркаптоэтанол (5 • 10-5 М) или
а-тиоглицерин (7.5 • 10~5М).
Качественно близка по составу к IMDM среда аМЕМ; она исполь-
зовалась для культивирования в присутствии сыворотки сначала
клеток почки хомячка, а затем и других плохо растущих клеток.
В некоторых случаях при нехватке в среде фолиевой кислоты или
неспособности клеток ее использовать появляется необходимость
введения в среду источника пуринов (обычно аденина или гипоксан-
тина) и тимидина. Производятся два варианта аМЕМ — с рибо-
и дезоксирибонуклеозидами или без них.
Среда Мак-Коя 5А и серия сред RPMI. Среда Мак-Коя 5А [17]
была разработана в 1958 г. для поддержания клонального роста кле-
ток карциносаркомы Уолкера 256 в присутствии сыворотки, а затем
с успехом использована для первичных культур и различных клеточ-
ных линий, включая WI-38, ВНК/С13, ЗТЗ и др. Среда Мак-Коя 5А
производится обычно в модификации Иваката и Грейса. В этом слу-
чае она идентична среде RPMI-1629 из серии сред RPMI (Roswell
Park Memorial Institute), предназначенных для культивирования
лейкоцитов в присутствии сыворотки. Относящаяся к этой серии
среда RPMI-1640 [18] является в настоящее время одной из наиболее
распространенных и применяется, в частности, при культивировании
гибридом. В ряде случаев в средах на ее основе получали бессыворо-
точный рост клеток. Как видно из табл. 2, обе эти среды содержат
незаменимые и заменимые аминокислоты, незаменимые витамины,
включая В12, парааминобензойную кислоту и глютатион, а также
в относительно высокой концентрации глюкозу и особенно инозит.
Для культивирования клеток в этих средах требуется 5 % СОг в атмо-
сфере. Состав среды RPMI-1640 качественно проще. Принципиаль-
ным является то, что она содержит значительно меньше магния и
особенно кальция и поэтому может использоваться как для моно-
слойного, так и для суспензионного культивирования.
Среда Лейбовитца L-15. Из питательных сред, культивирование
в которых можно проводить в условиях свободного газообмена
с атмосферой, чаще всего используется среда Лейбовитца L-15 [6],
разработанная для повышения безопасности, удобства и экономич-
ности при проведении массовых вирусологических исследований.
Для уменьшения закисления среды в процессе культивирования
клеток в плотно закрытых сосудах глюкоза в качестве источника
энергии заменена на D ( + )-галактозу и пируват. С другой стороны,
защелачивание, свойственное открытым бикарбонатным системам,
устранено заменой бикарбоната в качестве буфера на основные
аминокислоты в высокой концентрации (pH среды 7.6). Чтобы избе-
жать быстрого истощения среды, концентрация всех аминокислот
увеличена до максимального, но не токсичного значения. В резуль-
55
тате быстро размножающиеся клетки (HeLa или НЕр2, например)
требуют смены среды L-15 не чаще раза в неделю, а медленно
размножающиеся (WI-38, первичные культуры) — не чаще раза
в месяц.
Среды Хэма. С использованием жесткого критерия отбора —
размножение одиночных клеток (клональный рост) — разработан
метод оптимизации состава питательных сред, позволяющий мини-
мизировать количество компонентов неопределенного состава [12].
Так были созданы широко используемые F-10 [19] и ее модификация
F-12 [20], а также набор сред MCDB, где каждый состав
«подогнан» к определенному типу клеток [21]. Клетки яичников
китайского хомячка клонируются в F-10, которую достаточно допол-
нить либо минимальным количеством сыворотки (2 %), либо фетуи-
ном и альбумином (белка менее 100 мкг/мл), и в F-12, в которую
введен селенит. Эти среды применяются также в случае культивиро-
вания плохо растущих клеток, в том числе первичных культур
дифференцированных клеток разных видов. F-12 в смеси с DME явля-
ется основой ряда бессывороточных сред.
Среды F-10 и F-12 содержат все описанные выше незаменимые
компоненты, включая микроэлементы Fe, Zn, Си, а также заменимые
аминокислоты, пируват, предшественники нуклеиновых кислот и
липоевую кислоту. F-12 отличается наличием линолевой кислоты
и путрисцина. Ненасыщенные жирные кислоты, к которым относится
линолевая, незаменимы при бессывороточном культивировании,
хотя клетки многих адаптированных постоянных линий могут размно-
жаться без них. В коммерческих препаратах F-12 линолевая кислота
часто находится в неактивной форме, так как легко окисляется;
в таких случаях ее надо добавить. Избыток жирных кислот токсичен,
поэтому их часто вводят в комплексе с сывороточным альбумином.
Путрисцин или другие полиамины необходимы клеткам СНО и спо-
собствуют размножению клеток других типов. Высокая концентрация
цинка в F-12, оптимальная для СНО, токсична для некоторых других
клеток.
Среда 199 [22] разработана в 1950 г. для культивирования
фрагментов сердца из эмбриона цыпленка. Выбор и концентрация
61 компонента, кроме фенолового красного, соответствовали извест-
ным в то время данным о составе физиологических систем; критерием
было сохранение жизнеспособности и специфической функции клеток,
но не их размножение. Вследствие этого для среды 199 характерны
широкий спектр питательных веществ и относительно невысокая
их концентрация. Некоторые свойства среды 199, например наличие
DL-аминокислот и отсутствие витамина Bi2, отражают ее солидный
возраст. В настоящее время среда 199 используется без каких-либо
добавок как поддерживающая для первичных клеток, а с сывороткой
или с заменяющими ее белками — как ростовая среда для быстро
размножающихся клеток.
Изначально основой среды 199 являлся раствор Эрла. В настоя-
щее время применяются два варианта среды 199: на растворе Эрла
или Хэнкса. В СССР производится только второй вариант. Таким
56
образом, при выборе между отечественными средами Игла и 199 сле-
дует иметь в виду, что помимо прочих различий первая из них в своей
основе имеет раствор Эрла, а вторая — Хэнкса и, следовательно,
они требуют различного содержания СОг в атмосфере.
Начиная с конца 50-х годов в качестве тест-системы для разра-
ботки новых сред использовались постоянные клеточные линии,
главным образом мышиные фибробласты линии L. В течение ряда
лет исследовательскими коллективами были созданы серии сред:
NCTC — в Национальном институте по изучению рака (США),
CMRL — в Медицинской исследовательской лаборатории в Коннауте
(Канада), среды Уэймаут — в Джексоновской лаборатории (США).
Наиболее широкое распространение получили среды NCTC-135,
CMRL-1066 и МВ-752/1. Путем постепенной адаптации клеток,
культивировавшихся ранее в сложных средах неопределенного
состава, удалось добиться их размножения в этих средах с полностью
определенным химическим составом, хотя добавление сыворотки
увеличивает скорость размножения.
Бессывороточные среды
Процесс адаптации к стандартным средам определенного химиче-
ского состава приводит к успеху обычно лишь в случае трансформи-
рованных клеток постоянных линий и включает в себя отбор. Ото-
бранные клетки могут во многом отличаться от исходной культуры.
Нормальные клетки, сохраняющие свои специфические функции,
в таких средах не размножаются. В последние годы достигнут yurtex
в разработке бессывороточных сред. С одной стороны, в лабора-
тории Хэма созданы среды, состав которых оптимизирован для под-
держания (при наличии относительно небольшого количества сыво-
ротки) клонального роста клеток нескольких типов [21, 23, 24]:
диплоидных фибробластов человека (MCDB-104 и MCDB-105),
фибробластов из эмбриона цыпленка (MCDB-202) и утки
(MCDB-501), клеток ЗТЗ и фибробластов из эмбрионов мыши
(MCDB-401), кератиноцитов человека (MCDB-151 и MCDB-153).
Хотя, как видно из табл. 2, различия между MCDB-105 и
MCDB-153 в основном количественные, эти среды являются селектив-
ными: фибробласты плохо размножаются в среде, оптимизирован-
ной для кератиноцитов, и наоборот.
С другой стороны, Сато и его последователи [25] добились
бессывороточного роста различных клеток, используя стандартные
среды и заменяя сыворотку специфичным для данного клеточного
типа набором гормонов, гормоноподобных ростовых факторов, транс-
портных белков и факторов, способствующих прикреплению и рас-
пластыванию клеток (табл. 3). При этом многие клетки сохраняли
способность к синтезу характерных для дифференцированного
состояния веществ. В качестве базовой используют разные среды,
но чаше всего смесь F-12 и DME (1:1). Это объясняется тем,
что ассортимент питательных веществ F-12 достаточен для удовлет-
ворения клеточных потребностей, а количественную нехватку незаме-
57
Таблица 3
Стимуляторы размножения клеток в бессывороточиых условиях
[251]
Группа веществ Наимеиоваиие Эффективная концентрация
Гор*моны Инсулин 0.1 —10 мкг/мл
Глюкагон 0.05—5
Фолликулотропии 0.05—0.5
Ростовой гормон 0.05—0.5
Соматомедин С 1 — 100 иг/мл
Паратирин 1 — 10
Тиреолиберин 1 — 10
Люлиберин 1 — 10
Трийодтиронин (1 — 100) • ю-12 м
Гидрокортизон (10—100 • ю9 м
Прогестерон 1 — 100 »
Тестостерон 1 — 10 »
Эстрадиол 1 — 10 »
Ростовые ЭРФ 1 — 100 нг/мл
факторы ФРФ 1 — 10 »
НРФ 1 — 10 »
Простаглан- F2a 1 — 100 нг/мл
ДИНЫ Е, 1 — 100
Транспортные Трансферрин 0.5—100 мкг/мл
белки Альбумин 0.5—2 мг/мл
Факторы при- Фибронектин 0.5—5 мкг/мл
крепления Сывороточный фактор 0.5—5 »
распластывания
Фетуин 1 мг/мл
‘Аримечание. Альбумин добавляется с линолевой кислотой
(3—5 мкг/мл).
нимых компонентов восполняет DME. В среду вводят 0.015 М HEPES
(pH 7.2) с соответствующим уменьшением концентрации бикарбо-
ната (1.2 г/л).
Наиболее универсальными добавками к базовой среде являются
пептидный гормон инсулин и сывороточный белок, переносящий
железо, — трансферрин. Стимулируют размножение клеток многих
типов стероидный гормон гидрокортизон и его синтетический аналог
дексаметазон, гормон, вырабатываемый щитовидной железой, —
трийодтиронин, а также ростовые факторы, особенно эпидермальный.
Необходимую клеткам линолевую кислоту обычно вводят в среду
в комплексе с сывороточным альбумином, предварительно очищен-
ным от связанных с ним жирных кислот. Прикрепления клеток
к субстрату добиваются либо добавляя к среде фибронёктин или
сывороточный фактор распластывания, либо покрывая поверхность
субстрата полилизином или коллагеном. При культивировании
клеток без сыворотки часто выявлялась их потребность в питательных
веществах, отсутствующих или недостающих в базовой среде.
Недавним примером [26] удачного использования стандартной
среды для бессывороточного культивирования нормальных клеток
является размножение кератиноцитов мыши в бескальциевой среде
Игла с заменимыми аминокислотами, в которую добавлены инсулин
58
(5 мкг/мл), ЭФР (5 нг/мл), трансферрин (5 мкг/мл), гидрокорти-
зон (5 • 10~7М), этаноламин и фосфоэтаноламин (по 5 • 10-5М)
и экстракт из гипофиза (180 мкг белка на 1 мл). Однако бессыворо-
точное культивирование в стандартных средах удается обычно лишь
в случае опухолевых клеток и постоянных клеточных линий.
Наиболее последовательный путь создания питательной среды
определенного состава для ранее не культивировавшихся клеток
состоит по крайней мере из трех этапов [27]. Во-первых, для прове-
дения испытания компонентов культуральной системы необходимо
найти условия, при которых клетки размножаются достаточно
хорошо. Для этого используются любые среды неопределенного
состава, включающие сыворотки или тканевые экстракты, конди-
ционированные среды, а также культивирование в присутствии
облученных клеток-фидеров. На следующем этапе, вводя в среду
необходимые клеткам низкомолекулярные вещества в концентрации,
оптимальной для размножения, шаг за шагом понижают концентра-
цию компонентов неопределенного состава. Конечным этапом явля-
ется замена оставшегося небольшого количества сыворотки и ей
подобных компонентов соответствующей смесью известных веществ
по Сато. Оптимизация базовой среды позволяет уменьшить ас-
сортимент и концентрацию добавляемых факторов.
Методические рекомендации
Обзор питательных сред целесообразно закончить описанием их
приготовления. Поскольку процедура стерилизации сред фильтрова-
нием, а также методика приготовления некоторых стандартных
сред, используемых в основном для выращивания фибробластов
и им подобных клеток, описаны в отечественной литературе [8—10],
здесь предлагается пропись среды, оптимизированной для нормаль-
ных кератиноцитов из кожи человека (MCDB-153). Близкие по со-
ставу среды применяются при культивировании различных эпите-
лиальных клеток.
Общие рекомендации. Питательные среды и все растворы, сопри-
касающиеся с клетками, следует готовить на свежей сверхчистой
воде, полученной на специальных установках. Допустимо исполь-
зование деионизованной воды, перегнанной затем трижды в стеклян-
ных дистилляторах. Повышенные требования предъявляются также
к чистоте используемых реактивов.
Растворы, содержащие компоненты сред и хранящиеся незаморо-
женными, должны быть стерилизованы.
Среда MCDB-153 [28, 29]. Сначала последовательно приготав-
ливают концентраты (табл. 4). Концентрат 1 готовят, растворяя
аминокислоты по очереди в теплой воде. В процессе приготовления
концентрата 3 следует иметь в виду, что в нейтральном и слабо-
кислом растворах фолиевая кислота образует едва различимую
взвесь, которая при стерилизации задерживается на фильтре. Двуза-
мещенный фосфат натрия создает щелочные условия, необходимые
59
H v Таблица 4 -
' >с Состав концентратов для приготовления среды MCDB-153 [28, 29] h
№, кратность н условия Компонент Концентра- Я
хранения концентрата цня, г/л н
и 1 (X 100), 4 °C — 2 мес, Аргинин- НС1 21.07
—20 °C — дольше Гистидин- НС1- Н2О 1.677
Изолейцин 0.1968 ) .»
Chi ’ Лейцин 6.56 /
Лизни- НС1 1.827 м
Метионин 0.4476 Л
Фенилаланин 0.4956 X
Треонин 1.191
Триптофан 0.306 я
Тирозин 0.2718 и
Валин 3.513
Холин 1.396
Серин 6.306 ' il
2 (X 100), 4 °C —2 мес, Биотин 0.00146 I f
—20 °C — дальше Пантотенат Са 0.0258
Ниацинамид 0.003663
Пиридоксин- НС1 0.006171 »?
Тиамин- НС! 0.03373 и
КС1 11.183
3 (Х50), 4 °C — 2 мес, Фолиевая кислота 0.0395
—20 °C — дольше Na2HPO4- 7Н2О 26.81
4а (ХЮ00), 18—22 °C СаС12- 2Н2О 4.411 >'sh4eo"<
46 (ХЮ00), 18—22 °C MgCl2- 6Н2О 122.0
4в (Х200), 18—22 °C FeSO<- 7Н2О 0.278 '
5 (Х1000), 18—22 °C Феноловый красный 1.242 °'
6а (ХЮ0), —20 °C Глютамин 14.62
66 (X 100), —20 °C Пируват Na 5.50
6в (ХЮ0), —20 °C Рибофлавин 0.003764
7 (ХЮ0), —20 °C Цистеин- НС1- Н2О 4.204 i
8 (X 100), 4 °C — 2 мес, Аспарагин 1.501
—20 °C — дольше Пролин 3.453
Путрисции 0.01611
Витамин В|2 0.0407
9 (X 100), 4 °C —2 мес, Аланин 0.891
—20 °C — дольше Аспарагиновая кислота 0.399
Глютаминовая кислота 1.471
Глицин 0.751
10 (X 100), 4 °C —2 мес, Аденин 2.432
—20 °C — дольше Инозит 1.802
Липоевая кислота 0.02063
Тимидин 0.07266
CuSO4- 5Н2О 0.000249
11 (мг/л, X 100), 18—22 °C CuSO4- 5Н2О MnSO4- 4Н2О 0.0249 0.0223
(NH4)6Mo,O24- 4Н2О 0.1236
NiCl2- 6Н2О 0.01188
H2SeO3 0.3869
Na2SiO3- 5Н2О 10.61
SnCl2- 2Н2О 0.01128 У
nh4vo3 0.05849
ZnSO4- 7Н2О 14.38
60
для полного растворения фолиевой кислоты. Будучи растворена,
она остается в растворе даже при небольшом подкислении.
Концентрат 4в готовят, растворяя соль в 2.5 мл 4 н. НС1, а затем
разбавляя водой до 1 л (при образовании оранжевого осадка не приго-
ден). Концентрат 6в (рибофлавин) необходимо защищать от света.
Концентрат 7 следует закрывать особенно плотно, чтобы предотвра-
тить окисление цистеина кислородом воздуха (при появлении осадка
не пригоден). Для приготовления концентрата 9 к воде, объем
которой немного меньше конечного, добавляют при постоянном
перемешивании 1 мл раствора фенолового красного (концентрат 5)
на 1 л, а затем аспарагиновую и глютаминовую кислоты. Их растворе-
ния добиваются, поддерживая нейтральность раствора с помощью
1 н. NaOH. После того как взвесь исчезнет и раствор приобретет
устойчивую оранжевую окраску, в нем растворяют аланин и глицин,
а затем доливают воду до конечного объема. Концентрат 10 тоже
готовят в несколько этапов. Сначала растворяют аденин в 0.6 мл 4 н.
NaOH с подогревом до 40 °C, затем раствор разбавляют водой.
Отдельно растворяют липоевую кислоту в нескольких каплях 1 н.
NaOH и раствор разбавляют водой. В смеси этих растворов легко
растворяются остальные компоненты.
Для приготовления 1 л среды к 800 мл воды добавляют с переме-
шиванием следующие концентраты: 1 и 2 (по 10 мл), 3 (20 мл),
5 (1 мл), 6а (60 мл), 66, 6в, 7, 8, 9 и 10 (по 10 мл). В этой смеси
растворяют глюкозу (1.081 г), NaCl (7.599 г), СНзСООИа (0.5 г),
HEPES (6.6 г) и подводят pH к 7.4 с помощью 4 н. NaOH. Затем
добавляют NaHCO3 (1.176 г) и воду до 983 мл. Полученную заго-
товку среды можно хранить замороженной при —20 °C до 6 мес.
Полную среду готовят в малых количествах непосредственно перед
использованием. Для этого к 98.3 мл заготовки добавляют концен-
траты 4а (0.1 мл), 46 (0.1 мл),4в (0.5 мл) и И (1 мл) и стерилизуют
фильтрованием сразу же, чтобы предотвратить потерю на фильтре
выпадающего в осадок железа. Можно также стерилизовать среду
без концентрата 4в, а его, простерилизовав фильтрованием или авто-
клавированием, добавить затем стерильно.
Дополнительные компоненты к среде MCDB-153 (1000-кратные
концентраты). Сначала готовят буфер А состава: 0.03 М HEPES
(7.149 г), 0.01 М глюкоза (1.802 г), 3» 10~3 М КС1 (0.224 г),
0.13 М NaCl (7.697 г), 1 • 10“3 М Na2HPO4 • 7Н2О (0.268 г),
3.3* 10-6 М феноловый красный (1 мл концентрата 5). Доводят
pH раствора до 7.4 с помощью 4 н. NaOH и объем водой до 1 л.
Буфер А стерилизуют фильтрованием и хранят при 4 °C.
Концентрат ЭРФ готовят (растворяя стерильный лиофилизиро-
ванный ЭРФ) в стерильном буфере А в концентрации 5 мкг/мл (для
опытов по клонированию) или 10 мкг/мл (для массового культивиро-
вания). Концентрат инсулина (5 мг/мл) готовят, растворяя его
в 0.012 М НС1, и стерилизуют фильтрованием. При нейтральном pH
инсулин выпадает в осадок из раствора такой концентрации. Концен-
трат гидрокортизона (0.5 мг/мл) готовят, растворяя его в абсолют-
ном этаноле, и стерилизуют фильтрованием. Концентраты этанол-
61
Т а бли ц а 5
Дополнительные компоненты к среде MCDB-153
для; культивирования, криокоисервации и клонирования
кератиноцитов человека
Компонент Культивиро- вание Криоконсер- вацня Клоннровй* ние
ЭРФ, нг/мл 10 10 5
Инсулин, мкг/мл 5 0 5
Гидрокортизон, 1.4 (0.5) 1.4 (0.5) 1.4 (0.5)
10_6 М (мкг/мл)
Этаноламин, 10-3 М 0.1 0 0.1
Фосфоэтаноламии, 10~3М 0.1 0 0.1
СаС1г, конечная коицен- 0.1 0.1 0.03—1.0
трация, 10-3 М
Гипофизарный экстракт, 70 700 0
мкг белка на 1 мл
ДМСО, % от объема 0 10 0
амина и фосфоэтаноламина (0.1 М) готовят, растворяя их отдельно
в буфере А и стерилизуя каждый фильтрованием. Все стерильные
концентраты дополнительных компонентов расфасовывают по 0.5 мл
в стерильные пластиковые пробирки с крышками и хранят при —20 °C.
Концентрация дополнительных компонентов к среде MCDB-153,
используемая при культивировании, криоконсервации и клонирова-
нии кератиноцитов человека, приведена в табл. 5.
Литература
1. Bryant J. С. Earle’s balanced salt solution: preparation of the saline // Tissue Cult.
Assoc. Manual. 1975. Vol. 1. P. 185—188.
2. Hanks J. H. Hanks’balanced salt solution and pH control // Tissue Cult. Assoc.
Manual. 1975. Vol. 1. P. 3—4.
3. Waymouth C. Determination of osmolality in culture media // Tissue culture. New
York, 1973, P. 703—709.
4. Ham R. G., McKeehan W. L. Nutritional requirements for clonal growth of nontrans-
formed cells // Nutritional requirements of cultured cells. Tokyo, 1978. P. 63—115.
5. Waymouth C., Ward P. F., Blake S. L. Mouse prostatic epithelial cells in defined
culture media // Growth of cells in hormonally defined media. New York, 1982,
P. 1097—1108.
6. Leibovitz A. Preparation of medium L 15//Tissue Cult. Assoc. Manual. 1977.
Vol. 3. P. 557—559.
7. Shipman C. Control of culture pH with synthetic buffers//Tissue culture. New:
York, 1973. P. 709—712.
8. Адамс P. Методы культуры клеток для биохимиков. М., 1983. 263 с.
9. Витакер А. Среды для культивирования клеток млекопитающих // Новые методы
культуры животных тканей. М., 1976. С. 7—36.
10. Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению
клеточных культур в вирусологии. Л., 1976, 223 с.
11. Оленев С. Н. Среды для культивирования//Руководство по культивированию
нервной ткани. М., 1976. С. 47—88.
12. Ham R. G., McKeehan W. L. Media and growth requirements // Methods in enzymo-
logy. New York, 1979. Vol. 58. P. 44—93. ,
13. Ham R. G. Survival and growth requirements of nontransformed cells // Handbook --
of experimental pharmacology. Berlin, 1981. Vol. 57. P. 13—88.
14. Eagle H. Media for animal cell culture // Tissue Cult. Assoc. Manual. 1977. Vol. 3.
P. 517—520,-
62
15. tscove N. N., Melchers F. Complete replacement of serum by albumin, transferrin
and soybean lipid in cultures of lipopolysaccharide reactive В lymphocytes //J. Exp.
Med. 1978. Vol. 147. P. 923—933.
16. Iscove N. N. Culture of lymphocytes and hemopoietic cells in serum-free medium //
Methods for serum-free culture of neuronal and lymphoid cells. New York, 1984.
P. 169—185.
17. Patterson M. K., Dell'orco R. T. Preparation of McCoy’s madium 5A // Tissue Cult.
Assoc. Manual. 1978. Vol. 4. P. 737—740.
18. Moore G. E., Gerner R. E., Franklin H. A. Culture of normal human leukocytes //
J. Amer. Med. Assoc. 1967. Vol. 199. P. 519—524.
19. Ham R. G. An improved nutrient solution for diploid Chinese hamster and
human cell lines // Exp. Cell Res. 1963. Vol. 29. P. 515—526.
20. Ham R. G. Clonal growth of mammalian cells in a chemically defined synthetic
medium // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1965. Vol. 53. P. 288—293.
21. Ham R. G. Selective media // Cell separation. New York, 1984. Vol. 3. P. 209—236.
22. Morton H. J., Tolnai S. Preparation of medium 199 //Tissue Cult. Assoc. Manual.
1978. Vol. 4. P. 729—736.
23. Ham R. G. Growth of normal human cells in defined media // Hormonally defined
media. Berlin, 1983. P. 16—30.
24. Ham R. G. The impotance of matching the culture milieu to the cellular model
system // Uses and standardization of vertebrate cell cultures. New York, 1984.
P. 71—79.
25. Barnes D., Sato G. Serum-free cell culture: a unifying approach // Cell. 1980.
Vol. 22. P. 649—655.
26. Bertolero F., Kaighn M. E., Camalier R. F., Saffoiotti U. Effects of serum and
serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes //
In Vitro. 1986. Vol. 22. P. 423—428.
27. Ham R. G. Impotance of the basal nutrient medium in the design of hormonally
defined media // Growth of cells in hormonally defined media. Cold Spring Harbor,
1982. P. 39—60.
28. Peehl D. M., Ham R. G. Clonal growth of human keratinocytes with small
amounts of dialyzed serum // In Vitro. 1980. Vol. 16. P. 526—540.
29. Boyce S. T., Ham R. G. Cultivation, frozen storage and clonal growth of normal
human epidermal keratinocytes in serum-free medium // J. Tissue Cult. Meth.
1985. Vol. 9. P. 83—94.
Криоконсервация
культивируемых клеток животных
А. А. Цуцаева, Т. Ф. Петренко
Институт проблем криобиологии
и криомедицины АН УССР, Харьков
Важной задачей для работающих с клеточными культурами явля-
ется длительное хранение клеток в функционально полноценном
состоянии. На сегодняшний день единственным методом, обеспе-
чивающим долгосрочное хранение клеточных линий, является кри-
оконсервирование и хранение клеточных суспензий в жидком азоте.
Благодаря интенсивным исследованиям использование низких темпе-
ратур для криоконсервации клеточных культур получило широкое
распространение [1—4]. Методы криоконсервирования имеют раз-
личные модификации [5—8].
Успех низкотемпературного консервирования зависит от целого
ряда факторов: вида и типа клеток, нх концентрации в суспензии,
состава среды консервирования, вида и концентрации криопротек-
тора, режима охлаждения и отогрева, способа реабилитации клеток
63
после отогрева [9—12]. Морфофункциональные особенности клеток
определяют их устойчивость к воздействию факторов низкотемпера-
турного консервирования, что обусловливает необходимость разра-
ботки оптимальных способов криоконсервирования для конкретных
линий клеток.
Применяемые программы охлаждения весьма разнообразны.
Для них характерны медленные скорости охлаждения, реализуемые
либо на всех этапах охлаждения, либо до определенных температур
с последующим погружением в азот. Оптимальным для целого ряда
клеток оказался 2-ступенчатый режим с температурной остановкой
[13—15]. Экспериментальные данные показали, что замораживание
клеток перевиваемых культур без криопротектора по 2-этапной
программе со скоростью 30—40 °С/мин с температурной остановкой
обеспечивало в 2 раза большую сохранность, чем замораживание
со скоростью 1—2 °С/мин. Так, при замораживании клеток Sp 2/0
по 2-этапной программе сохранялось 45—50 % клеток, а при медлен-
ном замораживании — 20—25 %.
Применение криопротекторов позволяет снизить повреждающее
действие физико-химических факторов при криоконсервировании.
Используют различные криопротекторы: сахарозу, декстран, этилен-
гликоль, поливинилпирролидон (ПВП), диметилсульфоксид
(ДМСО), полиэтиленоксиды (ПЭО) и др. [16]. По многочисленным
данным.криопротекторы оказывают токсическое действие на биологи-
ческие объекты, степень которого зависит от типа криопротектора,
концентрации, степени очистки и времени контакта с клетками [12,
16—18, 19]. Для определения токсического действия криопротек-
тора клеФки выдерживают при комнатной температуре с различными
его концентрациями в течение 30—60 мин, после чего определяют их
жизнеспособность. Степень защитного действия криопротекторов
определяют также опытным путем, для чего суспензию клеток замо-
раживают в среде, содержащей исследуемые криопротекторы в кон-
центрации, не оказывающей токсического действия. После размора-
живания определяют жизнеспособность клеток. Вид криопротектора,
концентрацию его в среде и состав криоконсерванта следует подби-
рать индивидуально для каждого типа клеток. От свойств криопро-
тектора зависит и выбор режима охлаждения.
Глицерин и диметилсульфоксид—криозащитные агенты, полу-
чившие наиболее широкое применение для криоконсервирования
клеток перевиваемых культур. Сравнительные данные по защитному
действию этих криопротекторов весьма противоречивы [20].
Проведенные исследования по эффективности криозащитного
действия этих веществ показали, что ДМСО обеспечивает не только
более высокую жизнеспособность клеток, но также и сохранение их
морфофункциональных свойств. Так, одним из показателей повреж-
дения клеток является образование на мембране клеток выпячиваний
(везикул). Количество клеток с такими морфологическими изменени-
ями и характер этих изменений зависят от применяемого криопро-
тектора. В суспензии клеток, замороженных в среде с 10 % глице-
рина, количество клеток с везикулами составляло около 12 %, в то
64
время как при замораживании в среде с 10 % ДМСО— только
1.5 %. Нарушения адгезивных свойств клеток после криоконсервиро-
вания были выражены в большей степени в случае применения
в качестве криопротектора глицерина: при замораживании клеток
в присутствии 10 % глицерина около 10 % клеток утрачивало способ-
ность к прикреплению и распластыванию; при использовании 10 %
ДМСО — только 3%. Скорость адгезии также была ниже при
использовании в качестве криопротектора глицерина.
Процесс криоконсервирования вызывает нарушения процессов
эндогенного дыхания в клетках перевиваемых культур. Степень этих
нарушений зависит от применяемого криопротектора. При использо-
вании в качестве криопротектора 10 % глицерина уровень эндоген-
ного дыхания снижался в 2—2.5 раза по сравнению с уровнем
потребления кислорода нативными клетками, а при использовании
10 % ДМСО—в 1.2—1.5 раза.
Анологичная зависимость от применяемого криопротектора отме-
чена и при определении интенсивности синтеза белков и ДНК. в клет-
ках перевиваемых культур после криоконсервирования: ингибирова-
ние биосинтеза больше при криоконсервировании с 10 % глицерина.
При использовании того или иного криопротектора следует учиты-
вать особенности взаимодействия его с молекулами воды. Так, часто
при использовании ДМСО не учитывается экзотермический характер
процесса гидратирования ДМСО, что может отрицательно повлиять
на функциональную активность клеток в случае быстрого добавления
этого криопротектора к суспензии клеток. Оптимальные результаты
получены при постепенном увеличении концентрации ДМСО в среде
замораживания от 0.01 до 10 % в течение 5—7 мин.
Кинетика проникновения криопротекторов внутрь клетки зависит
от свойств мембран биологических объектов, состава среды и темпе-
ратуры эквилибрации [13]. Установлено, что для получения криоза-
щитного эффекта в присутствии 5—10 % глицерина, ДМСО, ПВП
или ПЭО подготовка клеток к приоконсервированию завершается
в течение 5—12 мин при температуре 22—37 °C [21]. При более
длительной эквилибрации в клетках появлялись морфологические
изменения, которые были обратимы, если время контакта с криопро-
тектором не превышало 2 ч [17].
Основой любой среды консервирования является ростовая среда.
Однако модифицируя ее состав путем увеличения содержания сыво-
ротки и добавления различных веществ, можно повысить эффектив-
ность разработанного метода криоконсервирования. Хорошие резуль-
таты получены при использовании в качестве основы кондициониро-
ванной среды [18,22].
Успех криоконсервирования во многом зависит от исходного
морфофункционального состояния клеток: клетки, находящиеся
в стационарной фазе роста, менее устойчивы к повреждающему
действию низкотемпературного консервирования, чем клетки, находя-
щиеся в экспоненциальной фазе роста.
Немаловажную роль играет плотность замораживаемой клеточ-
ной суспензии [12, 20, 23]. Оптимальные результаты восстановления
5 Зак, 1789
65
были получены при замораживании клеточной суспензии плотностью
1 • 106—5 • 106 клеток в 1 мл [4, 12].
Жизнеспособность клеток в суспензии зависит от скорости ото-
грева. Установлено, что при ее увеличении количество выживших
клеток в суспензии возрастает [13, 24]. В настоящее время сущест-
вует несколько методов размораживания биологических объектов —
в водяной бане, в сверхвысокочастотном электромагнитном поле,
с использованием высокого давления. Размораживание в водяной
бане при температуре 40—41 °C является наиболее доступным и рас-
пространенным.
После криоконсервирования и хранения в жидком азоте клетки
перевиваемых культур особенно нуждаются в оптимальных условиях
культивирования, так как восстановление нелетальных повреждений,
возникающих при замораживании—оттаивании, возможно только
при благоприятных условиях. Установлено, что процессам восстанов-
ления способствует инкубирование клеток в среде, содержащей
уабаин, или в среде с пониженным содержанием кислорода; а также
в кондиционированной среде [25—27]. Стимулирующее действие на
пролиферацию клеток перевиваемых культур после криоконсерви-
рования оказывает инсулин [14].
Исследования особенностей восстановительных процессов в клет-
ках перевиваемых культур после криоконсервирования в зависимости
от условий культивирования показали, что в кондиционированной
среде все процессы протекали значительно быстрее, чем в свежей
ростовой среде. Об этом свидетельствовали стимуляция процессов
синтеза .ДНК в клетках и увеличение скорости адгезии при инкуби-
ровании клеток в кондиционированной среде. Восстановительными
свойствами обладала кондиционированная среда от клеток разных
линий.
На основании литературных данных и проведенных исследований
был разработан метод криоконсервирования клеток перевиваемых
культур [28]. Для криоконсервирования отбирают клетки в экспонен-
циальной фазе роста. Культуры, растущие в монослое, снимают
с поверхности матраса по общепринятой методике. Клетки ресуспен-
зируют в небольшом количестве кондиционированной среды, доводя
концентрацию до 1 • 107—2 • 108 клеток в 1 мл. Нужную концентра-
цию клеток, растущих в суспензиях, получают путем центрифугиро-
вания и удаления части ростовой среды. Подготовленная к крио-
консервированию суспензия клеток не должна содержать конгло-
мераты.
Рабочий раствор криопротектора ДМСО (20 %) готовят непо-
средственно перед замораживанием на свежей или на кондициониро-
ванной ростовой среде. К полученной суспензии клеток добавляют
равный объем 20 %-ного раствора криопротектора дробными пор-
циями, по каплям, постоянно перемешивая суспензию клеток, доводя"
содержание криопротектора до конечной концентрации 10 % в тече-
ние 5—7 мин. Подготовленную таким образом суспензию переносят
в ампулы и тщательно закупоривают. Оптимальное время эквилиб-
рации клеток с криопротектором при комнатной температуре не
66
должно превышать 15 мин. В случае невозможности соблюдения ука-
занного времени ампулы следует поместить в холодильник при
температуре 4 °C, в данных условиях ампулы с суспензией клеток
можно выдерживать в течение 1 ч.
Для большинства перевиваемых клеточных линий оптимальные
результаты получены при охлаждении по 2-этапной программе:
1) от 20 до —28 °C со скоростью 30—40 °С/мин, затем 15-минутная
остановка при —28 °C; 2) от —28 °C до —196 °C со скоростью
300—400 °С/мин.
При отсутствии замораживателя эту программу можно осущест-
вить, используя спиртовую баню, хотя это и менее эффективно, для
чего 0.5—1.0 л спирта помещают в термос с металлической внутрен-
ней колбой и путем медленного добавления жидкого азота при
постоянном перемешивании доводят температуру спирта до —30—
32 °C. После чего ампулы погружают в спирт на 15 мин, контролируя
при этом его температуру (она не должна быть выше —28 °C и ниже
—32 °C), затем ампулы переносят в жидкий азот.
Перевиваемые клеточные культуры можно замораживать и со
скоростью 1—2 °С/мин до —80 °C с последующим погружением
в жидкий азот, для этого пригодно большинство программных
замораживателей. В случае невозможности реализации этой про-
граммы на имеющемся замораживателе либо при его отсутствии -
ампулы помещают в пенопластовую коробку с толщиной стенок около
2.0 см и ставят в низкотемпературный холодильник с температурой
—80 °C на 2 ч; после чего: ампулы переносят в жидкий азот. При
температуре —196 °C клетки перевиваемых культур можно хранить
в течение нескольких лет без существенных, изменений их морфо-
функциональных свойств.
Отогрев замороженных образцов лучше производить в специ-
ально сконструированных водяных банях, снабженных нагреватель-
ным элементом, регулятором температуры и устройством для покачи-
вания ампул. При помощи длинного пинцета1 ампулы переносят из
жидкого азота в водяную баню с температурой 41 °C. Ампулы
объемом 1 мл при таком режиме размораживаются в течение
0.5—1.0 мин, что зависит от материала, из которого изготовлены
ампулы. При размораживании ампул следует соблюдать некоторые
предосторожности: использовать плексигласовый щиток и защитные
перчатки, так как при нарушении герметичности ампулы могут
взрываться.
После размораживания ампулы вскрывают и переносят их содер-
жимое в центрифужные пробирки, в которые вносят ростовую среду,
разбавляя суспензию клеток в 5—10 раз, среду вносят медленно,
по каплям, постоянно перемешивая, длительность этого процесса
5—7 мин. Суспензию клеток выдерживают при комнатной темпера-
туре в течение 10 мин, затем пробирки центрифугируют 5 мин при
1000 об/мин, супернатант удаляют, а к осадку клеток добавляют
порцию свежей или кондиционированной среды, ресуспензируют,
суспензию клеток доводят до посевной концентрации и высевают
в культуральные флаконы.
5*
67
Для восстановления клеток после хранения в жидком азоте
лучше использовать кондиционированную среду, которую собирают
с культуры клеток на 3—4-е сутки после посева клеток, фильтруют
через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0.22—0.45 мкм и
хранят при температуре —20 °C. При восстановлении клеток можно
использовать кондиционированную среду от любой клеточной линии,
культивируемой на той же среде, что и восстанавливаемые клетки.
После размораживания определяют концентрацию сохранивших-
ся клеток, для чего в суспензию добавляют равный объем 0.2%-ного
трипанового синего, окрашивающего мертвые клетки в синий цвет.
Окрашенную суспензию заправляют в счетную камеру Горяева.
О жизнеспособности клеток можно судить по способности образо-
вывать колонии, по скорости пролиферации, по интенсивности син-
теза ДНК.
Одним из критериев степени сохранности клеток после криокон-
сервирования может служить показатель интенсивности поглощения
кислорода в присутствии 0.01 М сукцината [29]. Если добавление
к размороженной суспензии не вызывает стимуляции дыхания в клет-
ках, то это является свидетельством сохранения целостности клеточ-
ных мембран, вследствие чего сукцинат не проникает в клетки.
Предлагаемый метод криоконсервирования по 2-этапной про-
грамме со скоростью 30—40°С/мин под защитой 10%-ного ДМСО
позволяет сохранять основные функциональные свойства клеток, что
дает возможность использовать их после криоконсервирования
в различных областях биологии, медицины и вирусологии. Однако
следует учесть, что клетки перевиваемых культур после криоконсер-
вированйя изменяют чувствительность к вирусам. Это связано с вре-
менным ингибированием синтеза интерферона, в результате чего
репродукция вируса в замороженной культуре выше, чем в нативной.
Повышенная чувствительность клеток к вирусам проявляется на про-
тяжении первых двух пассажей после криоконсервирования, впослед-
ствии чувствительность клеток к вирусам возвращается к исходному
значению.
Литература
1. Залюбовская Н. П., Киселева Р. И. Консервирование клеток культур тканей мето-
дом глубокого замораживания // Вопр. вирусологии. 197.5. № 6. С. 734—738.
2. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М., 1973. 331 с.
3. Юдина Н. С. Криоконсервирование и сохранение клеточных культур в лаборатор-
ных и производственных условиях: Автореф. дис. . . . канд. биол. наук. Покров,
1974. 19 с.
4. Coriell L., Greene А. Е., Silver R. К. Historical development of cell and tissue culture
freezing //Cryobiology. 1964. Vol. 1. P. 72—79.
5. Дьяконов Л. П., Поздняков А. А., Панков Г. E. и др. Методические указания по
криоконсервированию культур клеток животного происхождения в жидком азоте.
М„ 1978. 9 с.
6. Красиков Г. А., Наумец 3. П. А. с. № 549471 (СССР). Способ замораживания кле-
точных культур //Опубл. Открытия. Изобретения. 1977. № 9.
7. Шонов И. П., Соса Н. Н. А. с. № 23816 (НРБ). Способ глубокого замораживания
клеток ВНК и клеток почки теленка //Опубл. РЖБ. 1982. № 7. 04 А. С. 30.
8. Kendall О. S. Low-temperature storage of surface-attached living cell culture//
Cryobiology. 1981. Vol. 18. P. 251—257.
68
9. Mazur P., Schmidt J. J. Interactions of cooling velocity, temperature and warming
velocity on the survival of frozen and thawed yeast //Cryobiology. 1968. Vol. 5.
P. 1 — 17.
10. Robinson D. M. Repair of freezing injury in mammalian cells grown in serial
culture//Cryobiology. 1973. Vol. 10. P. 413—420.
11. Riidiger H. W., Wohler W., Bohmer H. V., Passarge E. Cooling velocity and cell
recovery//Nature. 1975. Vol. 254. P. 361.
12. Yasukawa M., Terasima T., Yamada M., Matsumara T. Inactivation of proliferative
capacity of cultured mammalian cells by liquid nitrogen storage procedure //
Cryobiology. 1974. Vol. 11. P. 493—499.
13. Криоконсервация клеточных суспензий / Под ред. А. А. Цу паевой. Киев, 1983.
148 с.
14. (Farrant J.) Фаррант Д. Пересмотр некоторых криобиологических концепций //
Криобиология и криомедицина. Киев, 1977. Вып. 3. С. 12—20.
15. Farrant 1. Mechanism of cell damage during freezing and thawing and its preven-
tion //Nature. 1965. Vol. 205. P. 1284—1289.
16. Пушкарь H. С., Шраго M. И., Белоус A. M., Калугин Ю. В. Криопротекторы.
Киев, 1978. 204 с.
17. Глушко Т. А. Особенности пролиферации клеточных культур после контакта
с криопротекторами: Автореф. дис. . . . канд. биол. наук. Харьков, 1983. 22 с.
18. Lovelock J. Е. The mechanism of the protective action of glycerol against haemolysis
by freezing and thawing //Biochem. biophys. acta. 1953. Vol. 11, N 1. P. 28—36.
19. Matthes G., Hackensellner H. A. Correlation between purity of dimethyl sulfoxide
and survival after freezing and thawing //Cryo-Letters. 1981. Vol. 2. P. 389—392.
20. Малахова И. В., Зорин Е. В., Новохатский А. С. Хранение и восстановление
гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к вирусным антигенам//
Молекуляр. генетика, микробиология, вирусология. 1985. № 6. С. 41—44.
21. Tsonoev L., Aleksiev N., Nicolov Ch., Tsvetkov T., Milev A. Studies equilibration
of MesSO in a platelet suspension // Cryobiology. 1979. Vol. 16. P. 601.
22. Ashwood-Smith M. J., Warby C., Connor K. W., Becker G. Low temperature
preservation of mammalian cell in tissue culture with polyvinil pyrrolidone (PVP),
dextrans and hydroxyethyl (HES) // Cryobiology. 1972. N 9. P. 441—449.
23. Maack P., Rieger P., Piidiger H. W. Recovery after freezing and thawing human
diploid fibroblasts // Cryobiology. 1982. Vol. 19. P. 10—16.
24. Farrant J., Walter C. A., Heather Lee E., McGann L. E. Use of two-step cooling
procedures to examine factors influencing cell survival following freezing and
thawing // Cryobiology. 1977. Vol. 14. P. 273—286.
25. McGann L. E., Kruuv L, Frey H. E. The repair of freezing damage in mammalian
cells//Cryobiology. 1972. Vol. 9. P. 496—501.
26. McGann L. E., Kruuv Frim J., Frey H. E. Factors affecting the repair of sublethal
freeze-thaw damage in mammalian cells. 1. Suboptimal temperature and hypoxia //
Cryobiology. 1974. Vol. 11. P. 530—539.
27. McGann L. E., Kruuv L, Frim J., Frey H. E. Factors affecting the repair of
sublethal freeze-thaw damage in mammalian cells. 2. The effect of ouabain //
Cryobiology. 1974. Vol. 11. P. 332—339.
28. Цуцаева А. А., Иткин Ю. А., Петренко T. Ф. и dp. Методические рекомендации на
технологический процесс криоконсервации перевиваемых клеточных линий. Харь-
ков, 1985. 16 с.
29. Валеева И. X., Мохова Е. Н. Полярографическим методом изучение функциональ-
ного состояния митохондрий в лимфоцитах. Регуляция энергетического обмена и
физиологическое состояние организма. М., 1978. С. 187—189.
69
Криоконсервация клеток растений
А. С. П о п о в
Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева
АН СССР, Москва
Для большинства соматических клеток всех и спермиев ряда ви-
дов животных криоконсервация давно стала рутинной процедурой.
В то же время за 18 лет, прошедших после первых попыток [1,2], и за
13 лет с начала интенсивной разработки этой проблемы для клеток
растений [3] все еще нет универсального метода, пригодного для
криосохранения клеток всех или многих видов. Более того, как пра-
вило, даже штаммы, производные от одного исходного, требуют
разных условий на некоторых важных этапах этой экстремальной
процедуры [4]. И все же во всем мире за эти годы достигнуто крио-
сохранение (при —196 °C) культур клеток примерно 30 видов расте-
ний и культур апикальных меристем еще 25 видов [5].
Причина такого сравнительно медленного продвижения связана
не только с недостаточностью внимания к этой проблеме, но прежде
всего со спецификой растительных клеток: большими размерами,-
сильной вакуолизацией, обилием воды и чрезвычайной широтой и
пластичностью их метаболизма, поскольку они находятся в значи-
тельно более изменчивых условиях, чем условия строгого гомеостаза
внутренней среды, которая окружает клетки животных. Поэтому вы-
живаемость клеток после оттаивания даже в лучших, редких случаях
не превышает 60—70 %.
Повреждения клеток при замораживании и последующем оттаи-
вании зависят, с одной стороны, от образования льда внутри их,
а с другой — от их дегидратации. Опасен рост центров кристаллиза-
ции в крупные кристаллы (более 0.1 мкм), чьи грани разрушают
эндомембраны [6]. Скорость роста кристаллов сильно возрастает при
увеличении степени переохлаждения воды. Полностью рост и пе-
рестройка кристаллов льда прекращаются в чистой воде только около
—140 °C [7]. Вот почему длительное уверенное хранение возможно
только при более низких температурах. Точка замерзания цито-
плазмы около —1 °C, проникающие криопротекторы понижают ее
в соответствии со своим —\t, например, для 10%-ного ДМСО =
=—3.5 °C [8], но клетки обычно остаются незамерзшими до
—10 —15 °C, так как до этих температур плазмалемма еще предотв-
ращает проникновение внутрь кристаллов льда, растущих во внеш-
нем растворе [7]. Следовательно, к моменту инициации кристаллиза-
ции в клетке уже существует значительное переохлаждение, что очень
неблагоприятно. Но если температура снижается достаточно мед-
ленно, то свободная вода успевает выйти из клетки, замерзая на
поверхности кристаллов в растворе [7]. Происходит значительная
дегидратация и сжатие протопласта. Возникающие повреждения
могут иметь различные механизмы [9], но ведущую роль для клеток
растений, если внутри них не образуются большие кристаллы льда,
при снижении температуры до —25 °C и ниже играет чрезмерный
70
(по степени и длительности) плазмолиз и последующая полная по-
теря осмотической реактивности в результате нарушения целостности
плазмалеммы непосредственно в сжатом состоянии [10]. Наиболее
полная сводка данных по вопросам криоповреждений, криозащиты
и криоконсервации клеток растений имеется в недавно вышедшей
книге под редакцией К. Карта [И].
Криоконсервация культур клеток и меристем растений в отличие
от клеток животных во многих случаях начинается с этапа специаль-
ной подготовки, хотя и существуют культуры, для которых он не обя-
зателен, и их достаточно просто поддерживать в очень хорошем
состоянии. Но и такие культуры следует брать для глубокого замора-
живания в начале или в середине экспоненциальной фазы роста,
когда они обогащены меристемоидными клетками в результате интен-
сивных делений. Отсюда простейший способ подготовки заключается
в частых пересадках культуры, что позволяет поддерживать ее почти
постоянно в ранней экспоненциальной фазе. Преимущество частых
пересадок известно [12], иногда их приходится делать каждые 2—
4 сут [4, 13, 14]. Еще большее обогащение меристемоидными клет-
ками достигается при синхронизации культур по митозам, что обеспе-
чивается голоданием, охлаждением или действием ингибиторов [15].
К сожалению, возможности такой синхронизации клеток растений
ограничены по сравнению с селективным сбором делящихся клеток
животных, а специальные агенты могут вызывать мутации.
Остальные способы требуют предварительного культивирования
в определенных условиях. При одном из способов в среду добавляли
маннит или сорбит в концентрации 2—6 % на период от нескольких
суток до 2—3 пассажей. Такой способ уменьшал размер клеток и, что
еще важнее, их вакуолей, значительно улучшал выживание клеток
явора, моркови, перца [16], обеспечивал криосохранение многих
штаммов, в том числе и клеток наперстянки шерстистой [ 17]. Иногда
концентрацию сорбита постепенно повышают до 1 М (18.2 %), но на
срок не более суток [4, 14].
При втором способе предкультивирования используют амино-
кислоты и среди них в первую очередь пролин, чье значение для
связывания воды в клетках растений широко известно. Его концент-
рации постепенно поднимали для ряда клеток до 1 М (11.5 %) на срок
до 4 сут [18, 19]. Но клетки других видов были очень чувствительны
к пролину даже при кратковременной (1—2 ч) инкубации. Поэтому
для клеток диоскореи мы использовали низкие концентрации (0.01 —
0.05 М) и не только пролина, но и аланина, серина и аспарагина в те-
чение 4—6 сут. Больший срок предкультивирования приводил к деге-
неративным изменениям в клетках. Наилучшие результаты были по-
лучены с аспарагином, остальные испытанные аминокислоты были
менее эффективны [20]. Показано, что вместо пролина или вместе
с ним у ряда видов растений значительную роль в осморегуляции
играют аспарагин или глицин-бетаин. Кроме названных веществ для
предварительного культивирования и криозащиты использовали
также и гамма-аминомасляную кислоту [18].
Третий способ предварительного культивирования применяли
71
вначале только для апексов побегов — плотных организованных
структур без межклетников, являющихся в сущности микроорганами
размером около 500 мкм. Проникновение во внутренние клетки апек-
сов даже легкопроникающего ДМСО и их дегидратация затруднены.
ДМСО добавляли к среде, на которой шло предкультивирование
в обычных для данных апексов условиях, в концентрации от 2.5 до
10 % (чаще 5 % на срок до 48 ч [21, 22]). Для такого культивирова-
ния удобно использовать жидкую питательную среду и мостики из
фильтровальной бумаги. Коммерческий ДМСО считается 100%-ным
и является практически стерильным вследствие своей токсичности;
растворы его можно автоклавировать. Иногда предкультивирование
с ДМСО (5%-ным, до 24 ч) проводится и с некоторыми клеточными
штаммами в суспензионных культурах, но это возможно только
с очень устойчивыми клетками [4].
Четвертый способ предварительного культивирования осущест-
вляется в условиях искусственного закаливания к холоду, он приме-
ним к зимующим растениям умеренного климата. Для клеточных,
тканевых и органных культур незимующих растений он непригоден.
В случае культур меристем целесообразно предварительно закали-
вать сами растения, из которых затем стерильно вырезают меристемы
и культивируют их на среде с ДМСО. Суть закаливания сводится
к имитации естественного осеннего процесса подготовки растений
к периоду зимнего покоя. У разных групп растений конкретные
цитофизиологические механизмы такой подготовки различны. При
работе с клеточными суспензионными или каллусными культурами
обычно цх (так же как и растения) или сразу помещают в условия
с температурой от 2 до 5 °C на срок от 1 до 6 нед, или сначала в тече-
ние нескольких суток выдерживают при температуре 8—10 °C.
Остальные условия культивирования сохраняют прежними. Более
эффективно закаливание в присутствии сахарозы. Для каллусных
культур ее добавляют до 12—15 % [1, 23]. Для суспензионных
культур женьшеня мы получили наилучшие результаты, если после
выращивания в обычных условиях в течение недели (примерно до
конца экспоненциальной фазы роста) переносили их в условия
с температурой 10 °C на 5—7 сут, добавляя сахарозу до 7 %, а затем
выдерживали 2 нед при 2 °C, увеличивая концентрацию сахарозы
сначала до 15, а через неделю до 20 % [24].
Выбор способа подготовки зависит от объекта и его особенностей.
Чаще всего используют маннит или сорбит, иногда в комбинации
с ДМСО [4].
После подготовки перед добавлением криопротекторов клеточные
суспензии концентрируют. Поскольку центрифугирование (даже
в течение 5 мин при 100 g) повреждает многие растительные клетки,
то применяют осаждение в цилиндре или прямо в колбе, которые
устанавливают в сосуд со льдом. Длительность осаждения 15—
30 мин в зависимости от размера клеток и их агрегатов. Небольшие
агрегаты с мелкими наиболее жизнеспособными и устойчивыми
клетками оседают последними. После осаждения надосадочную жид-
кость отсасывают.
72
Наиболее эффективными криопротекторами являются глицерин,
ДМСО, этиленгликоль и его производные, пролин, сахароза и глю-
коза. Кроме того, появились сообщения о криозащитном действии
и ряда других (помимо пролина) аминокислот и близких соединений
(например, глицин-бетаин, гамма-аминомасляная кислота, оксипро-
лин и аспартат). Все эти вещества используются как порознь, так и
в комбинациях, что позволяет уменьшить их токсичность. Например,
полиэтиленгликоль со средней молекулярной массой 6000 действует
именно таким образом, поскольку сам не защищает [25]. Токсичность
свежеочищенного ДМСО меньше, чем коммерческого, но способ
очистки трудоемкий [26]. Чтобы снизить токсичность и осмотический
стресс, обеспечив в то же время 5—15%-ные концентрации криопро-
текторов, заранее готовят раствор удвоенной по сравнению с конеч-
ной концентрацией, который содержит защитные вещества в желае-
мом-соотношении. Запасной раствор охлаждают и добавляют к ох-
лажденному осадку клеток в соотношении 1 : 1 не сразу, а четырьмя
порциями с интервалами по 15 мин, перемешивая. Затем клетки
в этом растворе переносят в ампулы и держат на льду 30—60 мин для
уравновешивания с раствором до переноса в камеру замораживания,
температура в которой к этому времени должна быть снижена
примерно до 0 °C. Поскольку чувствительность различных раститель-
ных клеток к химическому и плазмолизирующему действию очень
разная, то необходимы предварительные испытания допустимых
концентраций и времени действия криопротекторов. Может быть
полезна дополнительная защита, которую на клетках моркови обеспе-
чивала эмбриональная телячья сыворотка. Ею заменяли питательную
среду и затем добавляли ДМСО [27].
Хотя для наиболее мелких и устойчивых клеток (например,
моркови) допустимы скорости замораживания 1—4 °С/мин, но для
существенно более крупных и вакуолизированных, к которым отно-
сится подавляющее большинство культивируемых in vitro клеток
растений, рекомендуется скорость 0.5 °С/мин, а для самых больших
агрегатов и апексов еще меньшие скорости [8]. Аппараты программ-
ного замораживания выпускает Специальное конструкторское
технологическое бюро с опытным производством при Институте
проблем криобиологии и криомедицины АН УССР в Харькове.
Рекомендуемые скорости обеспечивает аппарат УОП-6. Предложен-
ная нами достаточно универсальная программа замораживания,
уже обеспечившая успех с 13 клеточными штаммами шести видов
растений и меристемами трех видов, отличается применением
«затравки», т. е. принудительной инициацией кристаллизации.
Затравка должна быть при температуре на 1—2 °C (не более) ниже
точки замерзания криозащитного раствора. Эта точка равняется
сумме величин —А/, характерных для каждого растворенного веще-
ства и пропорциональных его концентрации. Для очень концентриро-
ванных растворов существуют отклонения от линейной зависимости.
Для затравки мы на самое краткое время открываем камеру про-
граммного замораживателя и погружаем в жидкий азот (на 0.5—
1.0 с) либо перфорированную кассету с ампулами, либо только дно
73
нескольких ампул, закрепленных в штативе. В последнем случае, если
объектов в ампуле мало (меристемы), то помещаем их в пакетике
наверху раствора. Способ затравки был затем усовершенствован
и предложено дополнительное устройство для его осуществления,
которое позволяет не открывать камеру [28, 29].
После затравки целесообразно стабилизировать температуру на
том же уровне до кристаллизации всего раствора в ампуле. Для этого
достаточно 20 мин [8]. Далее мы снижаем температуру с той же
заданной скоростью до —30 °C, а затем со скоростью около 9 °С/мин
до —70 °C и быстро переносим ампулы в жидкий азот. Именно при
этой конечной температуре медленного замораживания получали,
по-видимому, максимальную выживаемость клеток наперстянки [17].
Но по данным ядерно-магнитного резонанса минимум жидкой воды,
являющийся критическим для выживания клеток барвинка, в среде
с 1 М сорбита и 5 % ДМСО достигается уже при —40 °C, а при
—30 °C эта величина была лишь немного выше [30]. В клетках ди-
оскореи льда не было вплоть до —27 °C (конечная температура) при
условии замораживания с затравкой со скоростью 0.7—1.0°С/мин
в присутствии 7%-ного ДМСО. Иными словами, свободная вода,
способная замерзнуть, успевала выйти из клеток и около —30 °C ее
уже почти не оставалось, так как ниже этой температуры в других
опытах было возможно резко увеличить скорость замораживания
с хорошими результатами [31]. Следовательно, конечная темпера-
тура может быть —40 °C. Если же для большей уверенности в успехе
снижать ее еще больше, то можно (и, вероятно, лучше, поскольку
длительней сильный плазмолиз губителен) увеличить скорость замо-
раживания.
Длительность хранения в жидком азоте практически не лимити-
рована при условии, что ампулы не выступают над его поверхностью,
так как температура над ней быстро повышается с высотой [32, 33].
Оттаивание должно быть как можно более быстрым. Для этого
ампулы встряхивают в воде с температурой 40, иногда даже 60 °C.
Но как только начинает исчезать последний кристаллик льда, ампулу
переносят в сосуд со льдом.
Отмывание от криопротектора применяется только в случае
веществ, токсичных для данных клеток, но для меристем оно не обя-
зательно, так как их извлекают из ампул почти без криозащитного
раствора. Содержимое ампулы разбавляют в 3—4 приема с 15-минут-
ными интервалами большим объемом холодной питательной среды
или 3—15%-ной сахарозы. Повышенная концентрация сахарозы
полезна для замедления деплазмолиза, если криопротектор вызывал
плазмолиз. Затем обычно клетки просто отстаивают, а надосадочную
жидкость заменяют питательной средой, объем которой приблизи-
тельно равен исходному объему суспензии. Наиболее чувствительные
к манипуляционным и осмотическим стрессам клетки лучше отмывать
на фильтровальной бумаге с загнутым краем диаметром 4—5 см,
помещенной с помощью подставки на поверхность холодного раст-
вора (50 мл) сахарозы в большой чашке Петри. В такой системе
достаточно 15—20 мин при 2 °C для диффузии ДМСО в раствор [34].
74
Полное отмывание достигается однократной сменой раствора.
Фильтр с клетками переносят затем для рекультивирования на
поверхность питательной среды в маленькую чашку Петри или Коха.
Наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворительный способ
оценки жизнеспособности клеток после оттаивания — окраска ви-
тальным красителем. Для этого смешивают каплю суспензии и каплю
0.1%-ного феносафранина или 0.25%-ного синего Эванса. Смотреть
под микроскопом можно сразу, окраска мертвых клеток устойчива
не менее 30 мин (живые клетки не окрашены). При использовании
флюоресцирующего красителя флюоресцеиндиацетата, наоборот,
не окрашены мертвые клетки, но в этом случае смотреть можно
только через 6 мин, окраска менее стабильна и нужен люминесцент-
ный микроскоп [35]. Так как основная масса клеток обычно сосре-
доточена в агрегатах с числом клеток более 10—15, где клетки мас-
кируют друг друга и сосчитать их невозможно или трудно, то реко-
мендуется считать агрегаты (200—500 на препарат), отмечая агрегат
живым, если половина или больше его клеток не окрашены, и мерт-
вым, если больше половины клеток окрашены [12]. Другие способы
оценки имеют свои преимущества, но требуют больше времени и не
повышают точность [36]. Окончательным критерием, разумеется,
служит четкое возобновление роста при рекультивировании после
оттаивания.
Для этого следует распределить суспензию (около 1 мл) из одной
или двух-трех ампул на поверхности агаризованной питательной
среды (5—6 мл) в чашке Петри, Коха или в небольшой колбочке.
Чашки заклеивают парафилмом, причем для лучшего газообмена
чашки Коха можно заклеивать не сплошь, а секторами. После
прилипания клеток к агару (через 2 сут) лучше отсосать избыток
жидкости. Полезно использовать также чашки с жидкой средой
и мостики из фильтровальной бумаги, на которые помещают фильтры
или целлофановые диски с клетками. Объем среды должен быть
минимальным. Жидкая среда улучшает метаболизм, ускоряет рост
и позволяет легко заменять ее не целиком, а наполовину, чтобы
сохранить факторы кондиционирования. На отдельный мостик в ту же
чашку можно посадить ткань-няньку (хорошо растущий каллус
в экспоненциальной фазе, его лучше менять на новый через каждые
4—5 сут [34]) или применять кормящий слой [13]. Если клетки
до замораживания закаливали, то мы ставили чашки на ночь в ка-
меру, где было 2 °C, утром переносили в камеру с 10 °C, на следую-
щую ночь оставляли в комнате и только потом помещали в обычные
условия (25—26 °C). Возобновление культур требует от 2 до 6 нед.
Литература
1. Туманов И. И., Бутенко Р. Г., Оголевец И. В. Применение метода изолированных
тканей для изучения процессов закаливания растительной клетки // Физиол.
растений. 1968. Т. 15. С. 749—756.
2. Quatrano R. Freeze-preservation of cultured flax cells utilizing dimethyl sulfoxide //
Plant Physiol. 1968. Vol. 43. P. 2057—2061.
3. Nag K., Street H. Carrot embryogenesis from frozen cultured cells //Nature.
1973. Vol. 245. P. 270—272.
75
4. Chen T., Kartha К., Loung N. et al. Cryopreservation of alkaloid-producing cell
, cultures of periwinkle (Catharanthus roseus) // Plant Physiol. 1984. Vol. 75.
P. 726—731.
' 5. Kartha K. Cryopreservation of plant cells and organs // IAPTC Newsletter. 1985.
й N 45. P. 2—15.
- 6. Nei T., Asada M. Changes appearing in the rewarming process of rapidly frozen
erythrocytes // Low Temperature Sci. B. 1972. Vol. 30. P. 45—64.
7. Самыгин Г. А. Причины вымерзания растений. М., 1974. 190 с.
8. Бутенко Р. Г., Попов А. С., Волкова Л. А. и др. Жизнеспособность клеток растений
. 6 при различных режимах глубокого замораживания // Цитология. 1983. Т. 25.
н С. 1191 — 1196.
9. Попов А. С. Криогенное хранение культур клеток растений // Культура клеток
растений. М., 1981. С. 150—162.
10. Steponkus Р. Role of the plasma membrane in freezing injury and cold acclimation //
Ann. Rev. Plant Physiol. 1984. Vol. 35. P. 543—584.
11. Cryopreservation of plant cells and organs / Ed. K. Kartha. Boka-Raton (Florida),
1985. 304 p.
12. Попов А. С., Бутенко P. Г., Глухова И. И. Влияние условий подготовки и глубокого
замораживания иа возобновление суспензионной культуры клеток дикой мор-
кови // Физиол. растений. 1978. Т. 25. С. 1227—1236.
13. Hauptmann R., Widholm J. Cryostorage of clonal aminoacid analog-resistant
carrot and tobacco suspension cultures // Plant Physiol. 1982. Vol. 70. P. 30—34.
14. Weber G., Roth E., Schweiger H. Storage of cell suspensions and protoplasts
of Glycine max (L) Nerr, Brassica napus (L), Datura innoxia (Mill) and Daucus
carota (L) by freezing // Intern. J. Plant Physiol. 1983. Vol. 109. P. 29—40.
15. Withers L. The freeze-preservation of synchronously dividing cultured cells of Acer
pseudoplatanus L.//Cryobiology. 1978. Vol. 15. P. 87—92.
16. Withers L., Street H. Freeze preservation of cultured plant cells. 3. The pregrowth
phase // Physiol, plant. 1977. Vol. 39. P. 171 —178.
17. Diettrich B., Popov A. S., Pfeiffer B. et al. Cryopreservation of Digitalis lanata
cell cultures // Planta med. 1982. Vol. 46. P. 82—87.
18. King P., Dhalival H., Gebhardt C. et al. Mutagenesis in plant cell cultures // Annu.
Rep. Friedrich-Miescher Inst. Basel. 1979. P. 20—22.
19. Withers t.. King P. Proline: a novel cryoprotectant for the freeze preservation
of cultured cells of Zea mays L. // Plant Physiol. 1979. Vol. 64. P. 675—678.
20. Волкова Л. А., Попов А. С., Носов A. M., Бутенко P. Г. Сохранение биосинтетиче-
ского потенциала клетками диоскореи (Dioscorea deltoidea Wall.) после криоген-
ного хранения // Докл. АН СССР. 1982. Т. 265. С. 504—506.
21. Манжулин А. В., Попов А. С., Бутенко Р. Г. Получение растеиий-регенераитов
из меристем Solanum tuberosum L. после хранения их в жидком азоте // Физиол.
растений. 1982. Т. -29. С. 787—789.
22. Kartha К., Leung N., Gamborg О. Freeze-preservation of pea meristems in liquid
nitrogen and subsequent plant regeneration // Plant Sci. Lett. 1979. Vol. 15. P. 7—15.
23. Бутенко P. Г., Баскаков Ю. А., Оголевец И. В. и др. Влияние картолина на морозо-
стойкость культуры каллусной ткани озимой пшеницы // Докл. АН СССР. 1982.
Т. 267. С. 253—256.
24. Попов А. С., Черняк Н. Д., Бутенко Р. Г. Возобновление суспензионной культуры
женьшеня Panax ginseng С. А. Меу после глубокого замораживания // Докл.
АН СССР. 1982. Т. 262. С. 765—768.
25. Ulrich J., Finkle В., Moore Р. et al. Effect of a mixture of cryoprotectants in attaining
liquid nitrogen survival of callus cultures of a tropical plant //Cryobiology. 1979.
Vol. 16. P. 550—556.
26. Matthes G., Hackensellner H. Correlations between purity of DMSO and survival
after freezing and thawing//Cryo-Lett. 1981. Vol. 2. P. 389—393.
27. Попов А. С., Бутенко P. Г., Глухова И. H. К. с. № 865245 (СССР). Способ хранения
клеток и тканей растений // Опубл, в Б. И. 1981. № 35.
28. Попов А. С., Волкова Л. А., Бутенко Р. Г. А. с. № 1144673 (СССР). Способ
консервирования живых клеток или тканей растений // Опубл, в Б. И. 1985. № 10.
29. Попов А. С., Бутенко Р. Г. К. с. № 1097875 (СССР). Устройство для заморажива-
ния живых биологических объектов в контейнерах // Опубл, в Б. И. 1984. № 22.
30. Chen Т., Kartha К., Constabel F. et al. Freezing characteristics of cultured Catha-
76
ranthus roseus (L) G. Don cells treated with DMSO and sorbitol in relation to cryo-
preservation // Plant Physiol. 1984. Vol. 75. P. 720—725.
31. ВолковаЛ. А., Попов А. С., Самыгин Г. А. Влияние аминокислот на суспензионную
культуру клеток диоскореи дельтовидной и ее возобновление после хранения
при —196 °C // Физиол. растений. 1984. Т. 31. С. 632—638.
32. Грэхем Е. Ф. Криоконсервация и биохимическая оценка спермы быков и баранов //
Физиология воспроизведения сельскохозяйственных животных. Харьков, 1977.
С. 25—51.
33. Whittingham D., Lyon М., Glenister Р. Long-term storage of mouse embryos at
—196 °C: the effect of background radiation//Genet. Res. 1977. Vol. 29.
P. 171 — 181.
34. Попов A. С., Черняк И. Д., Пауков В. H. Совершенствование рекультивирования
клеток и тканей растений после хранения в жидком азоте //Физиол. растений.
1984. Т. 31. С. 602—605.
35. Widholm J. The use of fluorescein diacetate and phenosafranine for determining
viability of cultured plant cells // Stain Technol. 1972. Vol. 47. P. 189—194.
36. Самыгин Г. А., Волкова Л. А., Попов А. С. Использование разных методов
для оценки состояния суспензионных и каллюсных культур клеток различных
растений //Физиол. растений. 1985. Т. 32. С. 813—818.
;',Ы. М '
Xld '
>н
77
Ч а с т ь 2 /
I
Методы анализа |
культивируемых клеток
Хромосомный анализ культивируемых клеток
С. Е. Мамаева
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Совершенствование методов дифференциального окрашивания
хромосом и комплексное использование этих методов для цитогене-
тического анализа привели к принципиально новым заключениям
о кариотипической уникальности каждой клеточной линии и о воз-
можности узнавания ее среди множества других линий различного
видового происхождения.
В последнее время постоянные опухолевые и лейкозные клеточные
линии стали широко использоваться в качестве объекта совместных
исследований цитогенетиков и молекулярных биологов. Было уста-
новлено, что большинство специфических перестроек хромосом совпа-
дает с местами локализации протоонкогенов [1,2], что в свою очередь
привело к пониманию ряда важных закономерностей в злокачествен-
ной трансформации клеток и одновременно явилось мощным стиму-
.лом для ’ комплексного использования различных методов цито-
генетического анализа клеток постоянных линий.
В то же время хорошо известно, что такие факторы культивирова-
ния, как нестандартность питательных сред и сывороток, вирусы
и микоплазма, могут явиться причиной дестабилизации различных
клеточных характеристик, в том числе и кариологическнх.
Еще не решена такая остро стоящая перед исследователями
проблема, как внутривидовая и межвидовая контаминация клеток
[3]. В то же время отсутствие надлежащего цитогенетического
контроля не позволяет своевременно обнаружить факт контаминации.
Все это требует применения современных методов цитогенетического
анализа как для контроля за «чистотой» данной линии, так и для
получения детальной цитогенетической характеристики.
На сегодняшний день с помощью данного метода могут успешно
решаться следующие задачи: 1) межвидовая и внутривидовая
идентификация линий; 2) кариологическая паспортизация линий;
3) контроль стабильности кариотипа или его изменчивости в процессе
длительного культивирования клеток; 4) оценка действия на клетки
различных факторов (онкогенов, вирусов, радиации, химических
агентов и др.); 5) сравнение между собой линий, обладающих важ-
ными в практическом отношении свойствами с помощью нового
приема реконструирования кариотипа; 6) выявление точек разрывов
на хромосомах и сопоставление их с локализацией онкогенов и других
78
генов, а также фрагильных сайтов, мест интеграции вирусов
и др.
Методическая литература, посвященная детальному цитогене-
тическому анализу линий, практически отсутствует, если не считать
описания отдельных методов дифференциального окрашивания
хромосом, о которых будет сказано ниже.
Применяемый в настоящее время цитогенетический анализ дает
информацию о видовой принадлежности клеток данной линии, интер-
вале изменчивости числа хромосом и модальном классе клеток,
присутствии ряда маркерных хромосом в клетках. Однако этой ин-
формации явно недостаточно, она часто носит субъективный харак-
тер и ограничивает круг задач, которые можно с успехом решать
с помощью современного цитогенетического метода.
В данной работе излагаются последовательные этапы цитогене-
тического анализа клеточных линий, разработанные на основе дан-
ных литературы и собственного многолетнего опыта, которые позво-
ляют получить полную информацию как о количественных, так
и качественных характеристиках хромосомного состава в клетках
различных линий.
Цитогенетический анализ постоянных клеточных линий включает
семь основных этапов: 1) приготовление препаратов метафазных
хромосом; 2) окрашивание хромосом; 3) количественный анализ
метафазных пластинок; 4) приготовление банка образцов нормаль-
ных хромосом; 5) кариотипирование клеток; 6); построение обобщен-
ного реконструированного кариотипа линии; 7) локализация «горячих
точек» на хромосомах.
Необходимо подчеркнуть, что последние два чрезвычайно важных
и наиболее информативных этапа цитогенетического анализа могут
быть выполнены только при условии идентификации всех маркерных
хромосом в. линии. Ниже приводим подробное описание каждого
этапа кариологического анализа.
Приготовление препаратов метафазных хромосом'
Остановка митоза на стадии метафазы. В активно растущую
культуру добавляют колхицин в концентрации 0.05—0.1 мкг/мл на 1 —
2 ч. Время введения и срок действия колхицина или колцемида
устанавливаются эмпирически. Обычно генерационное время куль-
туры варьирует от 20 до 40 ч. Чтобы получить достаточное количество
митозов, лучше использовать культуры в логарифмической фазе
роста через 48 ч после пересева.
Снятие клеток со стекла. По окончании действия цитостатика
среду культивирования в монослойных культурах осторожно
сливают в центрифужные пробирки, на дно культуральных флако-
нов наливают 2—4 мл подогретой до 37 °C смеси 0.25 %-ного
трипсина и 0.2 %-ного версена в соотношении 1 : 1 и ставят в термо-
стат при 37 °C. Через 3—10 мин в зависимости от степени адгезии
клеток содержимое центрифужных пробирок выливают в культураль-
ный флакон и встряхивают его несколько раз. Следует подчеркнуть,
79
что нельзя стремиться к полному отделению монослоя со дна фла-
кона, так как это может привести к разрушению отделившихся
в первую очередь митотических клеток и увеличению доли интерфаз-
ных клеток. Суспензию с клетками переносят в центрифужные про-
бирки и центрифугируют в течение 6 мин при 1000 об/мин.
Клетки суспензионных культур после окончания действия
цитостатика вместе с питательной средой сразу переносят
в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 6 мин
при 1000 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную
жидкость удаляют, оставляя 0.5 мл для ресуспензирования осадка
с помощью механического потряхивания.
Обработка клеток гипотоническим раствором. Данный этап
предусматривает постепенное набухание клеток, что приводит
к улучшению разброса хромосом в метафазной пластинке. Для этого
к осадку небольшими порциями, первоначально по 1—2 капли,
при постоянном встряхивании для получения равномерной суспензии
клеток добавляют гипотонический раствор либо комнатной темпера-
туры, либо подогретый до 37 °C. Объем его определяется количеством
клеточной массы и составляет обычно 6—8 мл. Для этой цели
используют 0.56 %-ный раствор хлористого калия или смесь
0.56 %-ного раствора хлористого калия и 1 %-ного раствора цитрата
натрия в соотношении 1:1.
Длительность гипотонического воздействия и сам раствор подби-
рают эмпирически. Для определения оптимального режима гипотонии
и получения достаточного количества метафазных пластинок хоро-
шего качества следует использовать несколько вариантов гипо-
тонический обработки клеток в одном опыте.
Для большей части постоянных клеточных линий человеческого
и мышиного происхождения оптимальным режимом является 20—
30-минутная обработка гипотоническим раствором второй модифика-
ции при комнатной температуре либо подогретым до 37 °C. Однако
клетки некоторых человеческих линий, таких как К-562 и RH, требуют
более длительного гипотонического воздействия (50—60 мин), на-
правленного на полное освобождение метафазных пластинок от
цитоплазмы и получение хорошего разброса хромосом.
В то же время многие линии крысиного происхождения (транс-
формированные эмбриональные фибробласты, глиомы и др.) и линии
клеток китайского и сирийского хомячка предпочтительнее обрабаты-
вать хлористым калием, изменяя время гипотонического воздействия
в зависимости от типа клеток от 15 до 50 мин.
Фиксация клеток. По окончании гипотонической обработки клетки
центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную
жидкость удаляют, осадок ресуспензируют и осторожно, по каплям,
добавляют 5—6 мл фиксатора, постоянно встряхивая клетки, чтобы
избежать образования комочков.
Через 15—20 мин фиксатор после центрифугирования заменяют
новой порцией, повторив эту процедуру 2 раза. В окончательной
порции объем фиксатора в зависимости от количества клеток состав-
ляет 1—3 мл. Рекомендуется начать приготовление препаратов сразу
80
после окончания фиксации, так как хранение клеток в последней
порции фиксатора может привести к конденсации хромосом и ухудше-
нию их морфологии.
Приготовление препаратов. Различные способы приготовления
препаратов могут отразиться на качестве метафазных пластинок.
Необходимо учитывать, что требования к качеству препаратов на от-
дельных этапах хромосомного анализа не одинаковы и зависят
от задач и целей исследования. Обычно в работе используют следую-
щие способы приготовления препаратов: 1) раскапывание клеток
(по 3 капли) с высоты 20—30 см на обезжиренное мокрое охлажден-
ное стекло и высушивание на воздухе; 2) раскапывание клеток
на сухое чистое стекло, лежащее на рельсах над водяной баней,
нагретой до 40—50 °C, и высушивание на воздухе; 3) раскапывание
клеток (по 5—6 капель) на мокрое охлажденное стекло и высушива-
ние с помощью выжигания фиксатора.
Обычно готовят 1—2 пробных препарата из различных вариантов
и в зависимости от результата выбирают наиболее адекватный
способ.
Наш опыт показал, что первые два приема способствуют лучшему
сохранению целостности метафазных пластинок и получению препа-
ратов, пригодных как для количественного, так и качественного
анализа хромосом в линиях. В то же время высушивание препаратов
выжиганием дает возможность улучшить разброс хромосом в мета-
фазных пластинках, если гипотоническое воздействие оказалось
недостаточным, а также освободить их от цитоплазмы, препятствую-
щей дифференциальному окрашиванию хромосом на G-диски.
Приготовление препаратов контролируют под микроскопом, меняя
в зависимости от полученных результатов густоту суспензии, силу
нанесения суспензии на стекло и характер высушивания. Для про-
ведения полного цитогенетического анализа обычно бывает доста-
точно 15—20 стекол. ।
4
Окрашивание хромосом {
В настоящее время цитогенетики располагают широким спектром
методов окрашивания хромосом, демонстрирующих различные сто-
роны их морфофункциональной организации. Здесь мы остановимся
на четырех основных методах, достаточно информативных как
для получения количественных и качественных кариотипических
характеристик, так и для точной идентификации структурно-
перестроенных хромосом.
Рутинная окраска. Для рутинного окрашивания необходимо ото-
брать 2—3 препарата, содержащих достаточное количество мета-
фазных пластинок с сохранившейся цитоплазмой (рис. 1, см.
вклейку). Окрашивание производят в течение 5—7 мин 1 %-ным
красителем Гимза («Merck»), приготовленным на фосфатном буфере :Л
(pH 6.8). Краску смывают проточной холодной водой, препараты и
высушивают на воздухе и заключают в канадский бальзам. Получен-
ные препараты используют для определения количественных карио-
6 Зак. 1789
81
Цитогенетические признаки,
идентисрикации постоянных
Рутинная }
Акроцентрические хромосомы :
мышь (2п =40)
бык (2п =60)
собака (2п = 78)
Тип окраски Группа А
мышь бык собака человек зеленая мартышка
С=диски Все Л/Ч Л Все ЛЛЛл Некоторые /Шл 1, 9,16, Y Все, Y
12,15,16,18,19 ШЯй ЛЛЛ ллл 13-15 21-22 м м
Рис. 4. Характер С- и Ag-окрашивания хромосом ряда видов, способствующий
.! определению видовой принадлежности клеточных линий.
типических характеристик. Исключение составляют клетки мышей,
где для получения количественных характеристик используют хромо-
сомы, окрашенные на С-диски (рис. 2, см. вклейку).
Дифференциальное окрашивание на G-диски было впервые пред-
ложено Сибрайт [4], после чего неоднократно модифицировано
' многими авторами [5—7]. G-окрашивание хромосом является наибо-
лее распространенным и информативным из всех методов диффе-
ренциального окрашивания. С его помощью определяют гомологи
нормальных хромосом и структурно перестроенные хромосомы.
Для проведения G-окрашивания отбирают препараты, содержащие
достаточное количество метафазных пластинок без цитоплазмы
82
используемые для межвидовой
плеточных линий человека и животных
окраска
Б
Метацентрические, сувметацентрические
акроцентрические хромосомы
и
человек (2п=4б)
зеленая мартышка (2п-60)
хомячок сирийский (2п =44)
Хомячок китайский (2п =22)
макака (2п =42)
овца (2п =54)
крыса (2гг =42)
свинья (2п =38)
Группа Б
сирийский хомячок китайский хомячок макака овца крыса свинья
Х,у 10, У, Xq .ц Все, У ХМ. Ммл Мало 1, 13- 18 X Л Л
ЯШ и 1, 2,3, 4, 25 ШЛл 3, 11, 12 ЯН 8, 10 И
Рис. 4 (продолжение).
с хромосомами средней длины и параллельно лежащими хромати-
дами. Для окрашивания выполняют следующие процедуры:
1) высушивание препаратов в термостате при температуре 37 °C
в течение 1—3 сут или при температуре 60 °C в течение 2—3 ч;
2) обработка препаратов 0.25 %-ным раствором трипсина (Институт
полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва) или 0.01 %-ным
раствором трипсина («Difco»), приготовленным на PBS, время
экспозиции в трипсине и температура раствора могут быть изменены
соответственно в пределах от 15 с до 2 мин и 20—30 °C в зависимости
от качества G-окрашивания (рис. 3, см. вклейку); 3) споласкивание
в трех порциях дистиллированной воды; 4) окрашивание 1 %-ным
раствором Гимза на фосфатном буфере (pH 6.8) в течение 5—6 мин;
6»
83
5) споласкивание холодной проточной водой и высушивание на воз-
духе; 6) анализ метафазных пластинок под микроскопом (объек-
тив Х40; окуляр X 10) с целью контроля качества G-окрашивания
и внесения соответствующей коррекции в дальнейший процесс
трипсинизации; 7) отбор препаратов с хорошим качеством G-дисков
и заключение их в канадский бальзам (рис. 3, б).
Дифференциальное окрашивание на С-диски. Этот способ диф-
ференциального окрашивания впервые описан Самнером [8] и ис-
пользуется для выявления структурного гетерохроматина. Метод
является дополнительным приемом анализа структурно перестроен-
ных хромосом. В ряде случаев он способствует установлению видовой
принадлежности клеток [9] (рис. 4).
Для выявления С-дисков выполняются следующие процедуры:
1) высушивание препаратов в термостате при температуре 37 °C
в течение 1—7 сут.; 2) обработка 0.2 н. НС1 в течение 10—15 мин;
3) споласкивание в трех порциях дистиллированной воды по 1 мин
в каждой;4) обработка NaOH ' в течение 30 с; 5) споласкивание в трех
сменах раствора 2SSC;2 6) инкубирование в растворе 2SSC в течение
18—24 ч при температуре 65 °C; 7) споласкивание стекол в растворе
2SSC в течение 1 мин при комнатной температуре; 8) обезвоживание
при помощи серии спиртов повышающейся концентрации (70 и
96 %-ный) по 2—3 с в каждом; 9) окрашивание 3 %-ным красителем
Гимза на фосфатном буфере (pH 6.8) 10—20 мин; 10) промывание
в холодной проточной воде и высушивание на воздухе; 11) отбор
препаратов с удовлетворительным качеством С-дисков (рис. 2 и 5,
см. вклейку) и заключение их в канадский бальзам.
Дифференциальное окрашивание ядрышковых организаторов
(ЯО) с помощью нитрата серебра. Впервые метод был предложен
Хоуэлом с соавторами [10] и усовершенствован рядом авторов [11,
12]. Он позволяет выявить специальные участки хромосом — ядрыш-
ковые организаторы, активно синтезирующие рибосомную РНК [13].
Обнаружение серебрящихся районов в маркерных хромосомах
способствует определению их фрагментарного состава. Специфич-
ность окраски хромосом AgNOa для многих видов животных может
стать определяющей при установлении видовой принадлежности
клеток исследуемой клеточной линии [9] (см. рис. 4).
Препараты, предназначенные для серебрения ЯО, хранятся
при комнатной температуре и могут быть использованы для окраски
этим методом в течение 1—6 мес в отличие от рассмотренных выше
методов дифференциального окрашивания хромосом. Возраст препа-
ратов не играет существенной роли при Ag-окрашивании, наоборот,
серебрение ЯО на свежеприготовленных препаратах нежелательно,
так как это сопровождается ухудшением морфологии хромосом.
Порядок окрашивания хромосом следующий: 1) нанесение 4 капель
1 Приготовление раствора: NaOH — смешать 10 мл свежеприготовленного ра-
створа 0.07 н. NaOH (2.8 г/л) с 60 мл свежеприготовленного раствора 2SSC.
* 2SSC: 0.30 М NaCl (17.4 г/л) и 3.03 М трехзамещенный цитрат натрия
(8.82 г/л).
84
50 %-ного раствора AgNCh 3 и 2 капель проявителя4 на препарат,
помещенный во влажную камеру (температура 60—65 °C); равно-
мерное распределение смеси растворов по всей поверхности предмет-
ного стекла с помощью покровного стекла; 2) экспонирование препа-
рата с красящим раствором в течение 4—6 мин до появления темно-
коричневого оттенка красящего раствора; 3) споласкивание в трех
сменах дистиллированной воды; 4) окраска 1 %-ным раствором
Гимза («Merck») на фосфатном буфере (pH 6.8) в течение 20 с;
5) промывание холодной проточной водой и высушивание на воздухе;
6) заключение в канадский бальзам.
На удовлетворительно окрашенном препарате видны ядра и
хромосомы желто-коричневого цвета с темными гранулами серебра
в районе ядрышек и Ag-позитивными ЯО на хромосомах (рис. 6,
см. вклейку). Окрашенные препараты хранят в темноте при комнат-
ной температуре, длительное хранение препаратов может привести
к обесцвечиванию гранул серебра.
Количественный анализ
метафазных пластинок
Модальный класс клеток и интервал изменчивости числа хромо-
сом определяют при подсчете 100 рутинно окрашенных метафазных
пластинок, что, как доказано нами экспериментально, вполне доста-
точно для получения количественных характеристик. Проведение
этого этапа исследования требует использования метафазных пласти-
нок с сохранившейся цитоплазмой, умеренной спирализацией хромо-
сом, расположенных отдельно друг от друга, без наложений, затруд-
няющих подсчет. Не допускается использование хромосомных препа-
ратов с разбросанными единичными хромосомами, что свидетель-
ствует о нарушении целостности многих метафазных пластинок
в период гипотонического воздействия или на этапе приготовления
препаратов.
Подсчет числа хромосом выполняют непосредственно под микро-
скопом (объектив Х90—100, окуляр ХЮ—15), если по предвари-
тельной оценке число хромосом не превышает 60. При значениях
хромосомных чисел более 60, а также в случае затруднений, возни-
кающих при оценке числа некоторых перестроек хромосом в карио-
типе, точный подсчет может быть выполнен только на микрофотогра-
фиях. При подсчете модального класса исключаются полиплоидные
клетки любого класса плоидности.
Если в нормальном кариотипе присутствует большое число акро-
центрических хромосом, как, например, у мыши и быка, более
объективные результаты могут быть получены при подсчете хромосом
на С-окрашенных метафазных пластинках, морфология которых
в отличие от рутинно окрашенных позволяет легко дифференциро-
вать робертсоновские транслокации от близко расположенных акро-
центрических хромосом (см. рис. 2, вклейка).
3 2 г AgNOa растворяют в 4 мл деионизированной воды.
4 200 мг сухой желатины растворяют в 10 мл деионизированной воды с добавле-
нием 0.1 мл муравьиной кислоты.
85
Как правило, в любой линии модальный класс клеток выявляется
легко, а интервал изменчивости не превышает 3—5, реже 6—8 хромо-
сом. Однако в пределах одного модального класса, т. е. среди клеток
с одним и тем же числом хромосом, могут быть клетки с различным
кариотипом. В таком случае выделяют модальный или типич-
ный кариотип линии, т. е. кариотип доминирующей группы
клеток с идентичным набором нормальных и маркерных хромосом.
Модальное число хромосом является довольно стабильной величи-
ной в длительно ведущихся клеточных линиях, прошедших в культуре
не менее 100 пассажей. Примером такой линии является лимфо-
бластоидная линия Raji, число хромосом в клетках которой в суб-
линиях с различным кариотипом сохраняется равным 48 на протяже-
нии многих лет культивирования. В то же время в некоторых линиях
модальный класс клеток существенно меняется в процессе длитель-
ного культивирования. Ярким примером таких непрерывных измене-
ний является линия клеток HeLa, модальное число хромосом в клет-
ках различных сублиний которой меняется от 49 до 82 [14].
Долю полиплоидных клеток подсчитывают отдельно под микро-
скопом, анализируя с этой целью 1000 рутинно окрашенных метафаз-
ных пластинок на 2—3 препаратах. При этом оценивается только
: уровень плоидности без точного подсчета числа хромосом, если этого
‘ не требуют условия эксперимента. В большинстве клеточных линий
1 доля полиплоидных клеток не превышает 3—5 %, а уровень плоид-
ности — 4п, где 2п соответствует модальному классу клеток анализи-
руемой линии [15]. Наряду с этим известны линии, например линия
клеток человека Molt-4, где модальный класс клеток уже на ранних
пассажа'х представлен клетками с 92—98 хромосомами [16].
Доля полиплоидных клеток может меняться в процессе длитель-
. ного культивирования некоторых линий, приводя к замещению класса
I диплоидных клеток полиплоидными. Преобладание клеток того или
’ иного класса плоидности может также зависеть от способа пересева.
В частности, пересев клеток монослойных культур с помощью воз-
действия на них трипсина дает преимущество клеткам околодиплоид-
ной популяции, имеющим большую адгезию, в то время как пересев
клеток с помощью механического встряхивания способствует луч-
шему сохранению клеток околотриплоидного и тетраплоидного кло-
нов [17]. Все вышесказанное еще раз свидетельствует о необходи-
мости проведения регулярного цитогенетического контроля дли-
тельно культивируемых клеточных линий.
Приготовление банка образцов
нормальных хромосом
Важным подготовительным этапом, предшествующим кариотипи-
рованию клеток любой постоянной линии, является приготовление
банка образцов нормальных хромосом данного вида. Использование
такого банка является целесообразным на всех этапах кариотипиро-
вания, так как это способствует стандартизации проводимых ис-
следований, возможности сопоставления результатов различных
86
экспериментаторов и надежному определению видовой принадлеж-
ности клеток как вновь получаемых, так и длительно ведущихся линий.
Банк нормальных хромосом следует использовать для разграничения
нормальных и структурно перестроенных хромосом в кариотипе линии
путем многократного сопоставления каждой идентифицируемой нор-
мальной и маркерной хромосомы с образцами банка.
Материалом для банка образцов нормальных хромосом служат
культуры клеток крови, костного мозга, первично трипсинизирован-
ных культур тканей или органов, а также клеток диплоидных клеточ-
ных линий с ограниченным сроком жизни, полученных от человека
или животных, не имеющих наследственных или злокачественных
заболеваний. Следует подчеркнуть, что независимо от анализируе-
мого вида эффективность применения банка образцов в значительной
мере зависит от качества дифференциального G-окрашивания самих
нормальных хромосом банка, а также хромосом исследуемой линии.
В таком банке должно быть представлено не менее 20—30 образцов
фотоотпечатков каждой пары G-окрашенных хромосом, различаю-
щихся между собой по степени спирализации (рис. 7, см. вклейку).
Фотографии гомологичных хромосом располагают на листе горизон-
тальными рядами согласно общепринятой номенклатуре данного
вида.
Номенклатура G-окрашенных хромосом разработана для чело-
века [18], мыши [19], крысы [20] и таких домашних животных, как
бык, овца, свинья, лошадь, козел, кошка, кролик [21]. Для ряда био-
логических видов существуют оригинальные авторские описания,
принятые и другими исследователями.
Для проведения полного цитогенетического анализа постоянной
клеточной линии, включающего выявление структурного гетеро-
хроматина и ЯО, необходимо кроме основного банка G-окрашенных
образцов иметь дополнительные наборы образцов фотоотпечатков
нормальных хромосом соответствующего вида, окрашенных для вы-
явления С-дисков и районов ЯО. Число и тип образцов в дополни-
тельном банке нормальных хромосом определяются спецификой
конкретного вида.
Например, в нормальном кариотипе человека крупные блоки
структурного гетерохроматина присутствуют только на хромосо-
мах 1, 9 и 16-й пар и Y-хромосоме, а ядрышкообразующими являются
хромосомы групп D (13—15-я) hG (21—22-я). В нормальном карио-
типе мыши околоцентромерные блоки структурного гетерохроматина
выявляются практически на всех хромосомах, за исключением
Y-хромосомы [22], а ядрышкообразующими являются хромосомы
12, 15, 16, 18 и 19-й пар [13, 23, 24].
На хромосомах крысы структурный гетерохроматин небольшого
размера занимает прицентромерное положение [25]. Ядрышко-
образующими являются хромосомы 3, 11 и 12-й пар, причем интенсив-
ность окрашивания их ЯО нитратом серебра служит хорошим крите-
рием межлинейных отличий у инбредных крыс [26]. Что касается
таких видов, как зеленая мартышка, макака резус, бык, собака,
кошка, крыса, сирийский и китайский хомячки, то сведения о харак-
87
тере распределения структурного гетерохроматина и районов ЯО
на хромосомах этих животных даны в статье Патака и Хсю [9],
в атласе хромосом лабораторных и домашних животных [27],
а также приведены на рис. 4.
Кариотипирование клеток
Как известно, в кариотипе клеток большинства постоянных кле-
точных линий имеются как нормальные хромосомы, представленные
различным числом гомологов, так и структурно перестроенные.
Если последние обнаруживаются в анализируемой выборке клеток
не менее чем в двух клетках, их считают маркерными хромосомами
данной линии. Однократно встретившиеся структурные перестройки
относят к классу редких. Число маркерных хромосом в разных линиях
может колебаться от 1—2 до 20—30 и более [15]. С увеличением
выборки, т. е. числа кариотипированных метафазных пластинок,
число обнаруживаемых редких структурных перестроек всегда на-
растает. При этом количество маркерных хромосом остается неизмен-
ным в одних клеточных линиях, в то время как в других может
нарастать. Такие различия между линиями обусловлены разной
степенью кариотипической гетерогенности клеточного состава.
Получение кариотипа. Для повышения объективности карио-
типического анализа клеток перевиваемых линий необходимо ис-
пользовать микрофотографии. Съемку производят на пленку «Мик-
рат-300», делая по 4—5 фотоотпечатков каждой метафазной
пластинки. Изображение не должно быть излишне контрастным,
так как прй этом снижается качество G-дисков и затрудняется иденти-
фикация хромосом. Кариотипы клеток получают путем вырезания
хромосом из фотоотпечатков метафазных пластинок и наклеивания
их согласно принятой для каждого вида системе расположения
хромосом в нормальном кариотипе. В последнем, нижнем, ряду
наклеивают маркерные хромосомы и редкие структурные перестройки
(рис. 8, см. вклейку). Как правило, для определения типичного
или модального кариотипа вполне достаточно проанализировать
кариотипы 15 метафазных пластинок, окрашенных на G-диски. Эти
метафазные пластинки должны удовлетворять следующим требова-
ниям: 1) число хромосом в них не должно быть менее тех хромосом-
ных чисел, которые установлены при анализе 100 рутинно окрашен-
ных метафазных пластинок; 2) метафазные пластинки не должны
содержать наложений, затрудняющих интерпретацию структурно
перестроенных хромосом; 3) часть метафазных пластинок (не менее
трех) должна иметь хромосомы прометафазного типа, пригодные
для более точной локализации районов разрывов хромосом при об-
разовании маркеров.
Для разграничения нормальных и структурно перестроенных
хромосом следует использовать банк нормальных хромосом, сопостав-
ляя каждую хромосому с образцами банка. Это позволяет выявить
перестройки, затрагивающие небольшие фрагменты хромосом, в том
числе терминальные и интерстициальные делеции.
88
Составление рядов идентичных маркерных хромосом. С этой
целью дополнительные фотоотпечатки всех структурно измененных
хромосом, выявленных при получении кариотипов, располагают та-
ким образом, чтобы вертикальные ряды состояли из хромосом рдной
клетки, а горизонтальные включали хромосомы одного типа из раз-
ных клеток, т. е. являлись бы рядами идентичных маркерных хромо-
сом (рис. 9, см. вклейку). В процессе формирования рядов идентич-
ности происходит разграничение маркеров и редких структурных
перестроек. Порядок расположения маркеров в вертикальном ряду
следующий: сначала убывающие по размеру метацентрические
хромосомы, затем субметацентрические и субтелоцентрические,
в конце акроцентрические хромосомы. В последний горизонтальный
ряд попадают однократно встретившиеся структурные перестройки.
Составление рядов идентичности является трудоемким, но важ- ,
ным-этапом кариотипирования, при котором происходят одномомент-,
ное сопоставление большого числа одинаковых маркерных хромосом ,
из анализируемых клеток и их коррекция. Тем самым сводится '
к минимуму субъективность в интерпретации разных типов хромосом, в
что почти неизбежно вследствие различий в качестве дифференциаль-
ного окрашивания хромосом в разных метафазных пластинках.
На этом этапе формируется представление о морфологических типах
маркеров, частоте их встречаемости и фрагментарном составе 70—
80 % всех маркерных хромосом.
Необходимо также подчеркнуть, что при работе с линией клеток
нового вида, хромосомы нормального кариотипа которого недоста-
точно знакомы исследователю, в процессе составления рядов иден-
тичности желательно оперировать всеми хромосомами, включая
и нормальные. Указанный прием, а также постоянное использование
банка нормальных хромосом позволят свести к минимуму ошибоч-
ную идентификацию как нормальных, так и маркерных хромосом
в кариотипах.
Составление суммарной числовой таблицы нормальных и маркер-
ных хромосом. Для обобщения результатов кариотипирования всех
клеток составляют суммарную числовую таблицу, в которой пред-
ставлено число хромосом данной клетки, число маркеров и число
копий всех типов хромосом по всем анализируемым метафазным
пластинкам (см. таблицу). При одномоментном сопоставлении всех
хромосом по всем клеткам становится очевидным присутствие клеток,
имеющих как идентичный, так и отличающийся состав нормальных
и маркерных хромосом. С помощью такого приема кариотипирования
устанавливается степень кариотипической изменчивости и стабиль-
ности отдельных хромосом, а также число гомологов (т. е. нулли-,
моно-, ди-, трисомия и т. д.) для каждой нормальной хромосомы.
В целом таблица позволяет выявить взаимосвязь между числом
копий определенных нормальных и маркерных хромосом. Показано,
что нуллисомия нормальной хромосомы 8 всегда сочетается с нали-
чием в клетках маркера Ms. Наоборот, в тех клетках, где есть один
гомолог хромосомы 8, маркер Ms отсутствует. На основании этих
корреляций можно предположить присутствие материала хромо-
89
Фрагмент суммарной таблицы числа нормальных и маркерных хромосом
Клетки, Число хромо- сом Число марке- ров Нормальные хромосомы Маркерные хромосомы
№ 1 2 3 4 5 6 7 8 22 X Mi Мг М3 М4 М5 м„
1 46 11 1 1 1 0 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 — 1
2 46 11 1 2 2 0 1 1 3 0 1 2 1 1 — — 1 1
3 47 12 1 2 1 0 1 1 3 1 1 1 1 1 1 1 — 1
4 47 12 2 2 2 0 1 1 2 0 1 2 0 1 — — 1 1
л 15 49 13 1 2 1 0 1 1 2 0 1 1 1 1 1 1 1 1
сомы 8 в составе маркера М5. Этот вывод должен быть проверен
с помощью сопоставления характера G-исчерченности маркера М5
с таковым хромосомы 8. Другой пример — при наличии в клетках
по два гомолога хромосомы 3 и X маркеры Мз и М4 отсутствуют, в то
время как в остальных клетках, содержащих по одной копии этих
нормальных хромосом, маркеры Мз и М4 выявляются всегда.
Проведенный таким образом анализ взаимосвязанных изменений
числа копий нормальных и маркерных хромосом позволяет получить
дополнительную информацию о происхождении некоторых маркеров,
в том числе представляющих известную трудность для идентифика-
ции [28]. с
Установление происхождения маркерных хромосом. Процедуры,
описанные'в двух предыдущих разделах, входят в процесс идентифи-
кации и установления происхождения маркерных хромосом. Как уже
указывалось, на этих этапах анализируется только G-окрашенные
хромосомы. Однако несмотря на высокую разрешающую способность
метода в некоторых линиях удается установить происхождение
лишь 70—80 % маркерных хромосом. Поэтому при анализе маркеров
в линиях следует также использовать методы дифференциального
окрашивания хромосом для выявления С-дисков и активных ЯО.
С этой целью дополнительно фотографируют и анализируют 5 мета-
фазных пластинок, окрашенных на С-диски, и 10 метафазных пласти-
нок, окрашенных методом серебрения ЯО. При сопоставлении харак-
тера распределения G-, С-дисков и активных ЯО на одних и тех же
маркерных хромосомах удается установить их фрагментарный состав
и уточнить локализацию мест разрывов нормальных хромосом
при образовании маркеров. Особенно полезно использовать на этом
этапе работы хромосомы прометафазного типа, как маркерные, так
и нормальные из банка образцов.
Как показывает анализ, основным типом хромосомных перестроек
при образовании маркеров в клетках постоянных линий человека
и животных являются транслокации робертсоновского и неробертсо-
новского типа, затрагивающие две хромосомы. С меньшей частотой
встречаются терминальные делении, транслокации, затрагивающие
три хромосомы, а также интерстициальные делеции, инверсии и
90
_ t(3',S)(3q ter—cen ter
M ^.i5p
* iBt
Рис. 10. Образец записи формул трех маркерных хромосом Mi, М2 и Мз.
дупликации. Особым типом структурных изменений хромосом сле-
дует считать амплификации, о наличии которых можно судить по по-
явлению на хромосомах гомогенно или дифференциально окрашен-
ных областей, а вне хромосом — двойных микрохромосом [29].
В окончательном виде происхождение маркеров представляется
в виде формул, составленных для каждого маркера в соответствии
с принципами идентификации и обозначения маркерных хромо-
сом [18]. При написании формул происхождения маркеров приняты
следующие обозначения: q — длинное плечо, р — короткое плечо,
t — транслокация, del — делеция, inv — инверсия, 1 — изохромо-
сома, der — дериват, ter — терминальный район, сеп — центромер-
ный район, г — кольцевая хромосома.
На рис. 10 приводятся примеры записи формул маркеров при раз-
личных способах их возникновения.
Построение обобщенного
реконструированного кариотипа линии
Благодаря идентификации фрагментарного состава всех маркер-
ных хромосом в линии удается определить суммарный хромосомный
материал по каждой нормальной хромосоме в проанализированных
кариотипах. Для этого маркерные хромосомы или их фрагменты
91
располагают в соответствии с общепринятой схемой нормального
кариотипа данного вида на месте тех нормальных хромосом, из мате-
риала которых они происходят. Поскольку из хромосом, вовлеченных
в структурные перестройки, при таких построениях происходит
восстановление или реконструкция условно нормальных гомологов,
то сформированный таким образом кариотип носит название ре-
конструированного. Результаты реконструкций, выполненных на от-
дельных клетках, суммируют и на этой основе выполняют построение
обобщенного реконструированного кариотипа линии [14, 15, 28,
30, 31].
Важно подчеркнуть, что выполнение данного приема может быть
осуществлено только на основе полной идентификации всех маркер-
ных хромосом в линии и установления точной локализации мест
разрывов на хромосомах. Описанные построения не являются трудо-
емкой задачей, так как их практически проводят с помощью схема-
тических изображений хромосом, не прибегая к изготовлению
дополнительных фотоотпечатков. При этом число выполняемых ре-
конструкций, как правило, значительно меньше, чем число анализи-
руемых клеток, так как практически в любой линии имеются идентич-
ные или сходные по набору хромосом кариотипы. В качестве примера
представлены типичный и реконструированный кариотипы линии
клеток Raji (рис. 11, а и б, см. вклейку).
Использование для анализа постоянных линий обобщенных ре-
конструированных кариотипов дает возможность получить новую
цитогенетическую характеристику линии. Эта характеристика вклю-
чает информацию о возможных нехватках или приобретениях хромо-
сом или ЙХ фрагментов по отношению к нормальному диплоидному
кариотипу клеток данного вида, о характере вовлечения в пере-
стройки отдельных хромосом и о степени их изменчивости. Обобщен-
ный реконструированный кариотип (ОРК) — более стабильная цито-
генетическая характеристика клеточной линии, чем ее модальный
класс или модальный кариотип, так как в пределах одной клеточной
популяции клетки с различными кариотипами могут иметь сход-
ный ОРК, что свидетельствует о сбалансированности хромосом-
ного материала в клетках одной популяции [28, 32]. Сравнение линий
или сублиний между собой с помощью ОРК позволяет установить
сходство или различие их по суммарному хромосомному материалу,
дает возможность следить за хромосомными изменениями в линии
в процессе их длительного культивирования или селективного отбора.
Локализация «горячих точек» на хромосомах
Точки разрывов хромосом при образовании маркеров и редких
структурных перестроек («горячие точки») наносят на схему хромо-
сом соответственно тем G-дискам, по которым происходит разрыв.
Рисунок распределения «горячих точек» служит важной кариологиче-
ской характеристикой линии, отражающей нестабильность опреде-
ленных районов хромосом в анализируемых линиях (рис. 12, а и б).
92
1 2
Рис. 12. Локализация «горячих» точек, возникающих при образовании маркеров (/)
и редких структурных перестроек (2) в линии Raji (а) и M-HeLa-76 (б).
Анализ «горячих точек» на хромосомах свидетельствует о неслу-
чайном характере их распределения в зависимости от типа культиви-
руемых клеток как между отдельными хромосомами, так и по их
длине. Показано, что в линиях, возникающих из опухолевых и лейкоз-
ных клеток различного гистогенеза, распределение «горячих точек»
может существенно отличаться. Картина распределения «горячих
точек» на хромосомах является морфологическим выражением
молекулярно-биохимических процессов, связанных с численными
и структурными изменениями различных генов на хромосомах, в том
числе и онкогенов.
Ошибки, допускаемые при проведении
хромосомного анализа
Потеря митотических клеток возможна на этапе обработки моно-
слоя трипсином или версеном, когда слабо прикрепленные делящиеся
93
клетки либо сливают вместе с раствором трипсина, либо разрушают
их при длительной обработке. В итоге на препарате видны много-
численные интерфазные клетки и единичные митотические. Другой
причиной потери митотических клеток может быть чрезмерная гипо-
тоническая обработка, приводящая к набуханию, слипанию и разру-
шению клеток. Кроме того, значительная потеря митотических клеток
может быть связана с образованием клеточных комков, которые
чаще всего возникают при обработке и центрифугировании большого
количества клеток. Чтобы избежать этого, необходимо соответствую-
щее разведение клеточной массы, а также обязательное встряхивание
и осторожное пипетирование клеточного осадка, образующегося
после каждого центрифугирования.
Наличие в препаратах небольшого количества митозов, но хоро-
шего качества может быть связано с низкой пролиферативной
активностью клеток в культуре. В этом случае помогает увеличение
времени экспозиции в колхицине до 3—4 ч.
Большое количество митозов с сильно спирализованными хро-
мосомами чаще всего обусловлено либо избыточными концентра-
94
циями колхицина или колцемида в культуре, либо удлинением
срока их действия. В этом случае концентрация колхицина и
(или) время экспозиции клеток в колхицине должны быть умень-
шены.
Если в пробных препаратах митозов достаточное количество,
но большинство из них находится в цитоплазме и содержит много
наложений, то улучшение качества препаратов может быть достиг-
нуто при помощи метода выжигания фиксатора или благодаря
увеличению времени гипотонической обработки в повторном экспе-
рименте.
Если в пробном препарате встречается большое количество непол-
ных метафазных пластинок, а также отдельно лежащие хромосомы,
то для улучшения качества препаратов следует использовать более
щадящий способ их приготовления, включающий нанесение суспен-
зии фиксированных клеток на сухие стекла, помещенные над водяной
баней с температурой 40—45 °C, или уменьшение времени гипотони-
ческой обработки в повторном опыте.
Плохое качество G-дисков чаще всего может быть связано
с использованием старых (со сроком хранения больше месяца)
или недостаточно высушенных препаратов. Кроме того, качество
G-дисков резко ухудшается на хромосомах, лежащих в цитоплазме,
а также при использовании партий трипсина плохого качества.
Как уже упоминалось, в наших условиях лучше всего зарекомендовал
себя отечественный трипсин, приготовленный Институтом полиомие-
лита и вирусных энцефалитов (Москва), а также трипсин фирмы
«Difco». Однако решающим моментом для получения высококачест-
венных G-окрашенных хромосом во многих случаях следует считать
тщательный подбор оптимального режима трипсинизации (тем-
пературы раствора, времени экспозиции) для каждой партии препа-
ратов.
Чтобы свести к минимуму возможные ошибки при кариоти-
пировании клеточных линий, необходимо тщательно соблюдать
все перечисленные выше этапы цитогенетического анализа,
обращая особое внимание на использование банка образцов
нормальных хромосом и рядов идентичности маркерных хро-
мосом.
Многолетний опыт работы с большим количеством постоянных
линий человека и животных показывает, что пренебрежение даже
одним из этапов кариологического анализа может привести к непра-
вильной интерпретации полученных результатов, что затрудняет
сопоставление данных, публикуемых разными авторами. Стандарти-
зация проведения всех этапов цитогенетического анализа повысит
объективность и соответственно ценность результатов исследования
кариотипов культивируемых клеток.
95
Проведение полного кариотипического анализа постоянных кле-
точных линий — многоэтапный и трудоемкий процесс. Однако в за-
висимости от задачи исследования могут быть выполнены только
отдельные его этапы. В частности, для определения межвидовой
контаминации линий вполне достаточным является анализ рутинно
окрашенных препаратов и определение характера локализации
С-дисков и районов ЯО на хромосомах. Для внутривидовой иден-
тификации различных линий необходимо провести сравнение мор-
фологии маркеров с помощью дифференциального окрашивания
хромосом на G-диски. Анализ обобщенного реконструированного
кариотипа линии позволяет оценивать суммарный хромосомный со-
став клеток и хромосомный материал по каждой отдельной паре
хромосом. Этот прием обычно используют и для получения сравни-
тельной кариотипической характеристики различных линий и субли-
ний как в процессе их длительного культивирования различными
способами, так и при получении сублиний, отличающихся по целому
ряду биотехнологических показателей.
Обобщение результатов анализа ОРК более 40 постоянных линий
различного видового и тканевого происхождения позволило устано-
вить ряд общих закономерностей кариотипической изменчивости
клеток в культуре: сохранение ими, как правило, диплоидности
по всем аутосомам нормального набора; присутствие дополнитель-
ного хромосомного материала, различающегося в клетках различного
гистогенеза; частая утрата половых хромосом, особенно У-хромо-
сомы, в процессе длительного культивирования клеток; сбалансиро-
ванность хромосомного материала в клетках постоянных клеточных
линий.
Определение локализации горячих точек хромосом в линиях
способствует выявлению нестабильных районов хромосом, связанных
с численными и структурными изменениями в хромосомах различных
генов, в том числе и онкогенов. Перспективным, безусловно,
являются совместные исследования цитогенетиков и молекулярных
биологов, направленные на установление природы специфических
хромосомных перестроек, отражающих неопластическую прогрессию
и появляющихся при длительном культивировании различных клеточ-
ных линий.
Литература
1. Rowley J. D. Biological implications of consistent chromosome rearrangements
in leukemia and lymphoma//Cancer Res. 1984. Vol. 44. P. 3159—3168.
2. Tereba A. Chromosomal localization of protooncogenes // Intern. Rev. CytoL 1985.
Vol. 95. P. 1-43.
3. Nelson-Reese W. A. Karyological consideration and the history of cell culture //
In Vitro Monograph. Gaithesburg, 1984. N 5. P. 142—151.
4. Seabright M. The use of proteolytic enzymes for the mapping of structural
rearrangements in the chromosomes of man // Chromosoma. 1972. Vol. 36. P. 204—
210.
5. Heneen W. K. HeLa cells and their possible contamination of other cell lines:
Karyotype studies // Hereditas. 1976. Vol. 82. P. 217—248.
6. Захаров А. Ф., Бенюш В. А., Кулешов H. П., Барановская Л. И. Хромосомы
человека: Атлас. М„ 1982. 263 с.
96
7. Trent J., Crickard K., GibassZ. et al. Methodological advances in the cytogenetic
analysis of human solid tumors // Cancer Genet. Cytogenet. 1986. Vol. 19. P. 57—
66.
8. Sumner A. T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin //,
Exp. Cell Res. 1972. Vol. 75. P. 303— 306.
9. Pathak S., Hsu T. C. Cytogenetic identification of interspecies cell-line contamiriaa-
tion: procedure for non-cytogeneticists//Cytobios. 1985. . Vol. 43. P. 101 — 114.'
10. Howell IF M., Dinton T. E., Diamond J. R. Differential staining of the satellite re-
gions of human acrocentric chromosomes // Experientia. .1975. Vol. 31. P. 260—262.
11. Howell IF. M., Black D. A. Controlled silver staining of nucleolus organazer
regions with protective colloidal develdper: a 1-step method // Experientia. 1980.
Vol. 36. P. 1014.
12. Ploton D., Menager M., Jeannesson P. et al. Improvement in the staining and the
visualization of the argyrophilic protein of the nucleolar organizer region at the
optical level // Histochem. J. 1986. Vol. 18. P. 5—14t)
13. Miller 0., Miller D., Dev V. et al. Expression of human and suppression of mouse»
nucleolus organizer activitv in mouse-human somatic cell hybrids//Proc. Natd
Aqad. Sci. USA. 1976. Vol.'73. P. 4531—4535.
14. Мамаева С. E. Цитогенетика клеток в культуре«///Бйология клетки в культуре.
Л., 1984. С. 199—234.
15. Мамаева С. El,. Литвинчук Л.' Ф'., Пинаев Г. П. Закономерности кариотипической
изменчивости в перевиваемых клеточных линиях человека //Докл. АН СССР.
1983. Т. 270. С. 456—458.
16. Huang С. С., Нои Y., Woods L. К. et al. Cytogenetic study of human lymphoid
T-cell lines derived from lymphocytic leukemia //J. Nat. Cancer Inst. 1974. Vol. 53.
P. 655—660.
17. Bey E., Bernstein: R'. Chromosome studies of a human liposarcoma cell line//
Cytogenet. Cell Genet. 1979. Vol. 24. P. 143—149.
18. ISCN. An international system for human cytoggnetic nomenclature // Cytogenet.
Cell Genet. 1978. Vol. 21. P. 309—404.
19. Committee on standardized genetic nomenclature for mice: standard karyotype
of the mouse, Mus musculus//J. Hered. 1972. Vol. 63. P. 69—72.
20. Committee for a standardized karyotype of Rattus norvegicus //Cytogenet. Cell
Genet. 1973. Vol. 12. P. 199—205.
21. Proc. First Intern. Conf, for the standardization:lof ibandeddkaryotypes of domestic
animals / Eds С. E. Ford, D. L. Pollock', J.' Gustavssan // Hereditas. 1980. Vol. 92.
P. 145-162.
22. Yoshida M. C., Kodama Y. The C- and G-banding patters of chromosomes in
17 strains of mice//Cytogenet. Cell Genet. 1983. Vol. 35. P. 51—56.
23. Miller D. A.. Tantravahi R„ Newman B. et al. Karyotype of Friend virus-induced
mouse erythroleukemia cells //Cancer Genet. Cytogenet. 1979. Vol. 1. P. 103—113.
24. Dev V. G„ Tantravahi R.,.. МЯТёг'' Dj A., MiUUr 0. J. Nucleolus organizers
in Mus musealus subspeciestand the RAG cell line//Genetics. 1977. Vol. 86.
P. 389—398:
25. Unaktii W., Hsu T. C. The'CC-anddGibaaiding^patterns Rattus,norvegicus chromo-
somes//J. Nat. Cancer Inst. 1972. Vdh’49. P? 1425—1431.
26. Sasaki M., Nishida C., Kodama Y. Characterization of silverstained nucleolus
organizer regions (Ag-NORs) in 16 inbred strains of the norway rat, Rattus
norvegicus //Cytogenet. Cell Genet. 1986. Vol. 41. P. 83—88.
27. Раджабли, .0.. И., Графодатский А. С. Атлас хромосом сельскохозяйственных и.,
лабораторных млекопитающих: Новосибирск, 1988. 102 с.
28. Мамаева С. Е., Литвиннуу.’ Л. Ф., Пинаев Г. П. Характеристика кариотипа
постоянной клеточной,линии»2. Изменчивость и сбалансиррваииость хромосомного
набора клеток M-HeLia // Цитология. 1986иТ. 26.-С. .199—203.
29. Hamlin J. L., Milbrandt J. П.-, Heinti.~Nh H.', Arizkhan J. C. DNA sequence ampli-
fication in mammalian cells//Intern. Rev. Cytol. 1984. Vol. 90. P. 31—82.
30. (Мамаева. C. E., Цвиленева H.: HE). Mamaeva &.E., Tsvileneva N. N. A study
of chromosomer content 1 of, Frrendd virus inddued mouse erythroleukemia cells
(clone М2) via karyotype Teconstituctiom// Cancer Genet. Cytogenet. 1985. Vol. 16.
P. 199— 206.
31. Филатов Л. В., Мамаева С. Е. Стабильность кариотипа двух постоянных линий
7 Зак. 1789 97 .'
клеток китайского хомячка СНО-К1 и V-79 // Цитология. 1985. Т. 27. С. 1031—
1038.
32. (Савельева Л. Г., Мамаева С. Е.) Savelyeva L. G., Mamaeva S. Е. Heterogenety
and balance of chromosomes in human cell line M-HeLa-76. Analysis of 100 karyo-
types // Cancer Genet. Cytcgenet. 1987. Vol. 28. P. 311—325.
Определение видовой специфичности культивируемых
клеток с помощью изофермеитного анализа ;
Б. А. Маргулис
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Определение видовой специфичности необходимо для выявления
в культуре примесных клеток, а также для анализа процессов,
происходящих при культивировании клеток и при создании клеточных
гибридов. Эта задача может быть решена с помощью изофермент-
ного анализа [1]. По принятому сейчас определению, изоферментами
являются ферменты с одинаковой субстратной специфичностью,
которые представляют собой результат экспрессии одного или не-
скольких структурных генов, имеющихся в геноме вида. Изоферменты
могут отличаться друг от друга по своим физико-химическим пара-
метрам, например по заряду, что позволяет разделять их с помощью
электрофореза (ЭФ) в крахмальном, агарозном или полиакриламид-
ном (ПААГ) гелях [2] (подробно об ЭФ см. [3, 4]). В данном
сообщении основное внимание уделено методам ЭФ и последующего
анализа'спектра изоферментов применительно к проблемам типиро-
вания клеточных культур. Процедура состоит из следующих этапов:
1) приготовление клеточного лизата (пробы); 2) ЭФ белков на ка-
ком-либо из перечисленных выше носителей; 3) гистохимическое
выявление зон изоферментов.
Приготовление клеточных проб
Большинство ферментов, используемых для типирования клеточ-
ных линий,— гидрофильные белки, поэтому их выявление проводят
в неденатурирующих белок условиях. Клетки суспензируют в гипо-
тоническим растворе, содержащем 0.01 М Трис-НС1, pH 7.0—7.5 или
0.005—0.01 М фосфатный буфер, pH 6.8—7.4, а также 0.001—0.002 М
ЭДТА.1 Концентрацию клеток в суспензии можно варьировать в пре-
делах 5 • 106—5 107 клеток в 1 мл буферного раствора. Разрушение
клеток достигается 3-кратным замораживанием—оттаиванием, про-
пусканием через шприц или введением в пробу за полчаса до нанесе-
ния на гель неионного детергента, Тритона Х-100, в концентрации
до 1.0 % [5]. Процедура замораживания—оттаивания может при-
вести к частичной дезактивации ферментов, однако ЛДГ и Г6ФДГ
выдерживают такую обработку, и их пробы могут храниться не менее
года при —70 °C [6]. Экстракция детергентом значительно повышает
2 Приводится количество веществ на 1 л готового раствора.
98
выход белков в раствор, однако для каждой клеточной линии
желательно устанавливать неденатурирующую белок концентра-
цию Тритона. Полученные пробы центрифугируют при 8000—
10 000 об/мин, после чего в образцы вводят до 10—15 % сахарозы
для увеличения плотности при наслаивании на гель. Готовые пробы
наносятся сразу на гель или могут храниться (в расфасованном
виде) в течение нескольких недель при —20 °C или дольше при
-70 °C.
Электрофорез
Для анализа изоферментов используют ЭФ в крахмале, агарозе,
ПААГ или на целлюлозных пленках [4]. Наиболее высокой разре-
шающей способностью обладает метод ЭФ в ПААГ. Конструкция
прибора для ЭФ выбирается с учетом следующих требований: 1) про-
стота в пользовании (вертикальный блок для ПААГ, горизонталь-
ный— для крахмала или агарозы); 2) возможность охлаждения
прибора; 3) возможность точного сравнения спектров изоферментов
нескольких клеточных экстрактов на одном геле (блоке геля).
При использовании ПААГ таким требованиям удовлетворяют
вертикальный прибор, описанный нами ранее [7], и недавно выпу-
щенная модель Phast System («Pharmacia», Uppsala, Швеция).
Следует отметить, что ПААГ выгодно отличается от других пере-
численных выше носителей не только повышенной разрешающей
способностью, но и остротой зон, прозрачностью и большей механи-
ческой прочностью [4]. Применение крахмала или агарозы позво-
ляет упростить (по сравнению с ПААГ) процедуру ЭФ, но увеличи-
вает опасность появления артефактных полос вследствие электро-
эндоосмоса в геле и снижает разрешение.
Для большинства ферментов в ПААГ используют буфер 0.04 М
Трис-НС1, pH 8.9, а в электродном растворе — 0.005 М Трис,
0.0384 М глицин (или 0.025 М и 0.192 М соответственно), pH 8.3 [8].
Хорошие результаты при разделении дегидрогеназ в ПААГ дости-
гаются с использованием буферной системы: 0.05 М Трис-ЭДТА-
борат, pH 8.0, или 0.0625 М Трис-ЭДТА-борат, pH 9.0, в геле
и электродных камерах. Концентрацию акриламида и метиленбис-
акриламида можно изменять в пределах 5—7.5 % и 0.15—0.22 % со-
ответственно; оптимальными для разделения изоферментов ЛДГ
являются 5.5 и 0.18 % [8]. При использовании однородной буфер-
ной системы (один буфер в геле и электродном растворе) для
удаления продуктов полимеризации проводят преэлектрофорез
в течение 2—24 ч при слабом токе.
В работе Шоу и Прасада [9] предложено 20 буферных систем
для ЭФ в крахмальном геле с указанием изоферментов, которые
разделяются в этих системах. Ниже приводятся буферные системы,
используемые для идентификации клеточных линий при помощи
ЭФ в крахмале [6].
1. Трис-цитратный буфер (ТЦ): 0.14 М Трис, 0.043 М лимонная
кислота, pH 7.1; в катодной камере — однократный (IX) буфер,
в анодной — 0.8ХТЦ, в геле — 0.07ХТЦ.
7*
99
2. Трис-ЭДТ А-боратный буфер (ТЭБ): 0.18 М трис, 0.004 М ЭДТА,
0.1 М борная кислота, рН'38.6; в катодной камере — IXТЭБ, в анод-
ной — 0.8ХТЭБ, в геле — 0.1ХТЭБ.
Для НАДФ-дегидрогеназ в катодныйбуфер вводится 20 мг НАДФ
на 1 л раствора.
3. Трис-гистидиновый буфер (ТГс): 0.2 М трис титруется гистиди-
ном-HCl до pH 8.0; в катоднойжамере — IX ТГс, в анодной — 0.8Х
ХТГс, в геле — 0.5ХТГс.
Условия ЭФ (ток, напряжение, время) определяются ионной
силой и составом буферной системы, размерами и типом геля-но-
сителя и конструкцией ^прибора дйя ЭФ [4]. Пробы, наносимые
на дорожку геля, должны содержать белок с общей концентрацией
в пределах 0.2—0.5 мг/мл. Для привязки спектра изоферментов
исследуемых клеток к< стандартному на.крайние доршкки гелевого
блока наносятся тканевые экстракты, иол ученные» из'мышцы, сыво-
ротки крови или печени таким, же способом, как клеточные препараты.
Гистохимическое выявление изоферментов
Для определения чизоферментного гспектра используется не-
.сколько методических разработок, включая окрашивание крахмаль-
ного или агарового отпечатка с геля, в котором проходило разде-
ление, и окрашивание самого , разделяющего геля. (Остановимся
на втором способе. Смесь для 1 гистохимической реакции обычно
состоит и? буфера с оптимальным для развития реакции pH, из суб-
страта или его аналога, кофактора фермента или (если необходимо
провести двухступенчатую»реакцию) дополнительного фермента, хро-
могена, селективных, ионов >и т. д. Очевидно, «то метод окраски,
^который применяется дан крахмального или агарозного геля,
'можно использовать для ПААГ. Ниже приведен список рецептов,
”по которым приготавливаются смеси для .определения активности
ферментов в геле, указаны конечные концентрации веществ в смеси
и порядок смешивания компонентов.
Лактат дегидрогеназа
ЭФ в ПААГ [8]: гЭФ и в-системе ТЦ^Э]:
0.1 М Na-фосфатиый буфер, pH 744, *0.075 М Трис-НС1, pH 7.0,
0.1 М Ма-ла»а,т, 0.1 М Na-лактат,
0.01 М NaCl, 5 10~3 М NaCN,
5 • IO-4 М MgCl2, 0.5 мг/мл НАД,
1 мг/мл НАД, 0.3 мг/мл НБТ,
0.25 мг/мл НБТ, ...0,02 мг/мл ФМС.
0.025 мг/мл ФМС.
Инкубация г геля в растворе при 37 °C в темноте .в течение
10—20 мин, после чего на желтоватом фоне появляются синие
гполосы.
100
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеиаза
ЭФ в системе ТЭБ [6]: ЭФ в крахмальном геле [9]:
0.05 М Трис-НС1, pH 7.5, 0.11 М Трис-НС1, pH 7.1,
6 • 10-3 М №2-глюкозо-6-фосфат, 6 • 10-3 М №2-глюкозо-6-фосфат,
0.025 М MgCl2, 0.3 мг/мл НАДФ,
0.2 мг/мл НАДФ, 0.2 мг/мл НБТ,
0.1 мг/мл МТТ, 0.02 мг/мл ФМС.
0.03 мг/мл ФМС.
Инкубация при 37 °C в темноте в течение 1 ч или более до
появления темно-синих зон.
Малатдегидрогеиаза
ЭФ в системе ТЭБ [6]:
0.05 М Трис-НС1, pH 7.1,
1 мг/мл Na-малата,
0.25 мг/мл НАД,
0.1 мг/мл МТТ,
0.03 мг/мл ФМС.
ЭФ в системе ТЦ [9]:
0.075 М Трис-НС1, pH 7.1,
0.1 М Na-малат;
5 • 10~3 М NaCN,
0.5 мг/мл НАД,
0.3 мг/мл НБТ,
0.02 мг/мл ФМС.
Условия инкубации см. в рецепте для ЛДГ.
6-Фосфоглюкоиатдегидрогеназа
ЭФ в системе ТЭБ [6]:
0.075 М Трис-НС1, pH 7.0,
2 мг/мл 6-фосфоглюконата Na,
0.2 мг/мл НАДФ,
0.1 мг/мл МТТ,
0.03 мг/мл ФМС.
ЭФ в крахмальном геле [9]:
0.05 М Трис-НС1, pH 7.1,
2 мг/мл 6-фосфоглюконата Na,
0.2 мг/мл НАДФ,
0.25 мг/мл НБТ,
0.02 мг/мл ФМС.
а-Глицерофосфатдегидрогеназа
ЭФ в системе ТЦ [9]:
0.075 М Трис-НС1, pH 7.1,
1 10~4 М а-глицерофосфат Na,
5 • 10~3 М NaCN,
0.5 мг/мл НАД,
0.3 мг/мл НБТ,
0.02 мг/мл ФМС.
Алкогольдегидрогеиаза
ЭФ в системе ТЦ [9]:
0.025 М Трис-НС1, pH 7.1,
3 мл 95 %-ного этанола на 100 мл инку-
бационной смеси,
5 • 10~3 М NaCN,
0.5 мг/мл НАД,
0.3 мг/мл НБТ,
0.02 мг/мл ФМС.
Глютамат-оксалацетаттраисамииаза
ЭФ в системе ТЦ [6]:
0.02 М Na-фосфатный буфер pH 7.0,
4.4 мг/мл L-аспарагиновой кислоты,
2.4 мг/мл а-кетоглютарата,
0.01 мг/мл пиридоксаль-5-фосфата,
5 мг/мл красителя Fast Blue ВВ salt.
ЭФ в системе ТЦ [9]:
0.1 М фосфатный буфер, pH 7.0,
5.3 мг/мл L-аспарагиновой кислоты,
0.7 мг/мл а-кетоглютарата,
0.5 мг/мл пиридоксаль фосфата,
2 мг/мл красителя Fast violet В salt.
Смесь фильтруется и непосредственно перед употреблением в нее
вводится краска. Гель инкубируется при 37 °C до появления красных
или оранжевых зон и затем фиксируется в глицерине.
Ю1
Фосфоглюкомутаза
ЭФ в системе ТЦ [6];
0.075 М Трис-HCl, pH 8.0.
2 мг/мл глюкозо-1-фосфата,
2.5- 10“3 М MgCl2,
10 ед Г6ФДГ на 100 мл инкубационной
смеси,
0.1 мг/мл МТТ,
0.03 мг/мл ФМС.
ЭФ в системе ТЦ [9]: '! -
0.05 М Трис-НС1, pH 7.1, ;
2 мг/мл глюкозо-1-фосфата,
5- io-3MMgci2,
80 ед Г6ФДГ на 100 мл инкубационной
смеси, !.
0.2 мг/мл НБТ, *
0.01 мг/мл ФМС.
В смесь дополнительно входит фермент Г6ФДГ, препарат кото-1
рого должен содержать 100—250 ед/мл («Sigma» США или «Behrin-
ger» ФРГ). Гель инкубируется при 37 °C в темноте до появления
темно-синих зон.
Супероксиддисмутаза Пурии-иуклеозидфосфорилаза
ЭФ в системе ТЭБ [6]: ЭФ в системе ТЭБ [6]:
0.01 М Na-фосфатный буфер, pH 7.0, 0.01 М Na-фосфатный буфер, pH 7.0,
0.2 мг/мл НАДФ, 1 мг/мл изозима,
0.1 мг/мл МТТ, 1 мкл/мл (100 мг/мл) ксаитиноксидазы,
0.03 мг/мл ФМС. 0.1 мг/мл МТТ,
0.03 мг/мл ФМС.
После инкубации геля зоны фермента видны на просвет.
Все смеси могут быть приготовлены из концентрированных ис-
ходных растворов. Необходимо учитывать, что растворы НАД,
НАДФ, субстратов (лактата, малата, глюкозо-6-фосфата и т. д.),
НБТ могут храниться не более недели при 4 °C; раствор ФМС
должен храниться в темноте и использоваться в течение 12 ч.
Ферментативную реакцию, развивающуюся в геле, останавливают
промывкой последнего в воде. Фиксация геля чаще всего проводится
в 50 %-ном глицерине.
Ниже описывается метод, который мы используем для идентифи-
кации клеточных линий.
Клетки (5 • 106 —-10 • 10®) после промывания в фосфатно-солевом
буфере суспензируются в 0.3—0.5 мл 0.01 М Трис-НС1, pH 7.5.
После трехкратной процедуры замораживания в жидком азоте
с последующим оттаиванием и центрифугирования в пробу добав-
ляется сахароза (хч) до концентрации 10 %. Состав геля: 5 %-ный
(для ЛДГ) или 7 %-ный (для Г6ФДГ) акриламид («Serva»),
0.2 %-ный метиленбисакриламид («Serva»), 0.375 М Трис-НС1, pH
8.9. В качестве электродного буфера используется раствор: 0.025 М
Трис-HCl («Reanal»), 0.192 М глицин («Reanal»), pH 8.3—8.6.
ЭФ проводится в приборе с вертикальным блоком [7] при
начальном токе 20 мА (30—40 мин), рабочий ток 40 мА на блок.
Прибор во время опыта погружен в ледяную ванну — 0—4 °C.
После электрофореза гели помещаются для окраски в один из сле-
дующих растворов.
1. ЛДГ: 100 мл 0.1 М Трис-HCl, pH 7.0, 200 мг Na-лактата
(«Sigma», США), 20 мг НАД («Sigma» или «Reanal»), 15 мг НБТ
(«Sigma» или «Reanal»), 3 мг ФМС («Reanal»).
102
2. Г6ФДГ: 100 мл Трис-HCl, pH 8.0, 70—90 мг глюкозо-6-фосфата
(«Sigma»), 15 мг НАДФ («Reanal»), 1 10“3 М MgCU, 20 мг НБТ,
3—4 мг ФМС.
Инкубация происходит в темноте при 37 °C в течение 20—40 мин
для ЛДГ и 60—120 мин для Г6ФДГ.
Результаты по изоферментному анализу клеточных линий, полу-
ченные в разных исследовательских группах, показывают, что наибо-
лее простыми и воспроизводимыми являются методы выявления
ЛДГ, Г6ФДГ и МДГ. Способы обнаружения других активностей
сложнее и требуют внесения в схему окраски дополнительных фер-
ментов. Компания «Corning medical scientific» (Mass. 02032, США)
выпускает наборы Autentikit для определения семи ферментов: ЛДГ,
Г6ФДГ, нуклеозидфосфорилазы, пептидазы В, аспартат-аминотранс-
феразы и манноза-фосфатизомеразы. С помощью этих наборов
можно различать клетки млекопитающих, относящихся к 12 разным
видам.
Исследования, ведущиеся в настоящее время, сосредоточены
на двух направлениях: упрощение электрофоретического метода
с использованием готовых целлюлозных пленок и создание иммуно-
химических (дополнительно к гистохимическим) наборов для выяв-
ления отдельных групп ферментов.
Литература
1. Peterson W. D., Simpson W. F., Hukku В. Cell culture characterization: monitoring
for cell identification//Meth. Enzymol. 1979. Vol. 58. P. 164—178.
2. Heep M. 1., Gabriel O. Enzyme localization in gels 11 Meth. Enzymol. 1984. Vol. 104.
P. 416—439.
3. Гааль Э., Медьеши Г., Верецки Л. Электрофорез в разделении биомакромолекул.
М„ 1982. 446 с.
4. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез
и ультрацеитрифугироваиие. М., 1981. 286 с.
5. Skyring G. W., Miller R. W., Purkayastha V. Improved method for characterization
of bacterial dehydrogenases using acrylamide gel disc electrophoresis//Anal.
Biochem. 1970. Vol. 36. P. 511—520.
6. O’Brien S. J., Shannon 1. E., Gail M. H. A molecular approach to the identification
and individualization of human and animal cells in culture: isozyme and allozyme
genetic signatures //In Vitro. 1981. Vol. 16. P. 119—135.
7. Маргулис Б. А. Методы электрофореза сократительных белков //Биофизические
и биохимические методы исследования мышечных белков. Л., 1978. С. 180—197.
8. Dietz A. A., Lubrano Т. Separation and quantitation of lactic dehydrogenase
isoenzymes by disc electrophoresis // Anal. Biochem. 1967. Vol. 20. P. 246—257.
9. Shaw C. R., Prasad R. Starch gel electrophoresis of enzymes — a compilation
of recipes //Biochem. Genet. 1970. Vol. 4. P. 297 —320.
103
Контаминанты клеточных культур
Г. Г. Миллер, И. В. Раковская, В. В. Неустроева,
Н. В. Шалунов а, Т. Д. Смирнова, С. Н. Борхсениус
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Га-
малеи АМН СССР; Государственный научно-исследовательский институт стан-
дартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Тарасевича
МЗ СССР, Москва; Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Проблема контаминации распространяется практически на все
области клеточной биологии. Использование биологически чистых
систем является необходимым условием при изучении процессов
синтеза нуклеиновых кислот и белков, процессов клеточной диф-
ференцировки, трансформации, малигнизации, взаимодействия
клетки с окружающей средой, при использовании клеток-продуцен-
тов биологически активных веществ и в генетической и клеточной
инженерии, клеточной иммунологии, вакцино- и серопрофилак-
тике.
В то же время с момента появления техники однослойных
клеточных культур и открытия возможности культивирования виру-
сов in vitro проблема контаминации клеток различными микроорга-
низмами и другими видами клеток приобрела чрезвычайно широкий
размах.
Получение первичных клеточных культур из органов и тканей
различных животных, особенно тех, которые отлавливаются в при-
роде или. содержатся в неконтролируемых колониях (птиц, рыб,
насекомых и растений), приводит к частой контаминации клеток
вирусами, нередко небезопасными для человека [1—5]. Особую
опасность в этом отношении представляют культуры, полученные
из органов и тканей приматов. По данным ВОЗ, около ‘/з таких
клеток оказываются контаминированными. За последние годы от
обезьян выделено свыше 80 различных вирусов [1, 5].
С развитием новых методов исследований перечень выявляемых
микроорганизмов и в первую очередь вирусов все увеличивается.
В последние годы в различных колониях обезьян описано заболе-
вание, по клиническим проявлениям сходное с синдромом приобре-
тенного иммунодефицита человека (СПИД), этиологическим агентом
которого является ретровирус HTLV-IH/LAV из семейства лентиви-
русов. Сходный ретровирус, обладающий иммунодепрессивным свой-
ством, выделенный от обезьян, назван STLV-III [6—8]. В литературе
обсуждается вероятность подобного заболевания и у других видов
животных: мышей, кур, кошек, норок и др. [9]. В настоящее
время известно, что контаминировать клеточные культуры могут
представители большинства групп инфекционных вирусов, а также
некоторые РНК и ДНК, содержащие онкогенные вирусы, повсе-
местно распространенные в природе. Спектр клеточных изменений,
вызываемых вирусами, необычайно широк — от бессимптомного но-
сительства (персистентной инфекции) до острого цитодеструктив-
ного процесса [10—12]. Детальное описание носительства клеточ-
104
ними культурами различных агентов дано в целом ряде работ
[13—15].
Можно отметить кажущееся противоречие между сказанным
и теми общеизвестными данными, что персистентная инфекция кле-
точных культур большинством цитодеструктивных вирусов (таких
как вирусы везикулярного стоматита и осповакцины, реовирусы,
герпесвирусы, тогавирусы и др.) моделируется достаточно трудно,
лишь с помощью специальных методических приемов. Противоречия
не будет, если принять во внимание разнообразие еще не учтенных
факторов, участвующих в формировании персистентных инфекций
клеточных культур [16], а также неконтролируемые пути распростра-
нения контаминированных клеточных линий по различным лабора-
ториям. В этих случаях обнаружение в клеточных культурах
посторонних агентов оценивается уже как контаминация.
Наиболее распространенную контаминацию клеточных культур
составляют микроорганизмы класса Mollicutes, главным образом
микоплазмы и ахолеплазмы. По данным американских авторов,
60—90 % перевиваемых линий клеток контаминированы микоплаз-
мами. В первичных клеточных культурах микоплазмы наблюдаются
значительно реже [17].
Истинная распространенность микоплазменной контаминации
клеточных культур может быть еще выше, чем это публикуется,
причем в тех случаях, когда контаминацию игнорируют, она не исче-
зает сама собой, но распространяется на другие культуры. Мико-
плазменная инфекция не сопровождается видимыми изменениями
клеток, и в этом случае без специального анализа, как правило,
остается незамеченной исследователем. Однако эта же инфекция
иногда переходит в острую форму, и тогда до 25 % общего
белка в культуре клеток и до 15 % ДНК может быть микоплазменного
происхождения [18]. В этом смысле неудивительно, что микоплазмы
существенно влияют на метаболизм клетки-хозяина, вызывая
изменения аминокислотного, углеводного и нуклеинового обмена
[19—22]. В ранних работах обсуждается способность микоплазм
вызывать хромосомные абберации клеток млекопитающих [23] и
даже неопластические эффекты [24—26].
Бактериальной контаминации клеточных культур уделяется в на-
стоящее время не столь большое внимание, поскольку инфициро-
ванные бактериями культуры достаточно хорошо определяются
макроскопически и могут быть легко выбракованы. При рутинном
контроле бактериальная контаминация обнаруживается также посе-
вом культуральной среды или смеси культуральной среды с клетками
на жидкие и твердые бактериологические питательные среды. Тем
ие менее описаны случаи инфицирования клеток некоторыми видами
бактерий, которые не вызывают ни помутнения культуральной среды, и.
ни ярко выраженных цитодеструктивных изменений клеточного моно-
слоя. Среди них были выявлены коринбактерии, микрококки их
бациллы [27].
Определить источник контаминации в большинстве случаев бы-v
вает чрезвычайно трудно. Известно, что иногда контаминация яв-';
105
ляется прямым следствием использования инфицированного суб-
страта. Кроме того, источником контаминации могут явиться компо-
ненты питательных сред, прежде всего сыворотки крупного рогатого
скота, лошади, свиньи, а также трипсин и другие компоненты/
Реальным и достаточно распространенным источником контамина-
ции является внутрилабораторная передача инфекции из воздуха,
от персонала, от используемых лабораторных препаратов и от одной
культуры клеток к другим. Известно, что совместное культивиро-
вание в одном помещении контаминированных и свободных от
микоплазмы клеток уже через 1—2 пассажа приводит к инфици-
рованию последних.
Очевидным является тот факт, что формы контаминации много-
образны. Ясно, что залогом получения линий клеток, не содержащих
посторонних агентов, является проведение контрольных испытаний.
Немаловажную роль в получении чистых клеточных линий играет
система организации банков клеток. По требованиям ВОЗ [28]
клеточный банк закладывается из размноженных путем серийного
субкультивирования клеток до выбранного уровня пассажей, на ко-
тором они смешиваются для составления одного пула и хранятся
при низких температурах (—70 °C или ниже) в виде кратных
частей.
Предварительная характеристика таких банков по основным
параметрам, включая их безопасность, является основным условием
получения сравнимых результатов при работе с клеточными куль-
турами.
В упомянутой серии технических докладов ВОЗ определены
требования к диплоидным и перевиваемым линиям клеток, исполь-
зуемым в производственных целях. Однако в этих материалах
нет подробного описания методов проведения контрольных испы-
таний.
В данном разделе книги обобщен опыт отечественных и зару-
бежных исследователей по контролю клеточных культур на отсут-
ствие посторонних агентов.
Методы выявления посторонних вирусов
в клеточных культурах и сыворотке
Контролю подвергается клеточная суспензия в концентрации,
обычно используемой для посева. Клетки выращиваются при 37 °C
во флаконах, удобных для выполнения контрольных испытаний.
За культурами наблюдают не менее 14 сут, обследуя на наличие
цитопатических изменений. В конце срока наблюдения по неспеци-
фическим случайным причинам может быть исключено не более 20 %
клеточных культур.
За время культивирования клеток не должно наблюдаться при-
знаков дегенерации, вызванной вирусами. По истечении срока инку-
бации из всех испытуемых флаконов отбирают пробы культуральной
жидкости, объединяют и исследуют на клеточных культурах, лабора-
торных животных и куриных эмбрионах.
106
В некоторых странах перевиваемые клетки проходят испытания
на присутствие ретровирусов: используется специальные тесты на
наличие обратной транскриптазы, а также электронно-микроскопи-
ческие методы.
Контроль на клеточных культурах. Контролю подлежат испытуе-
мые клетки, инкубированные в течение 14 сут, которые исследуются
на наличие гемадсорбирующих, цитопатогенных и гемагглютинирую-
щих агентов. С этой целью культуральную жидкость из тестируемых
флаконов сливают, клеточный монослой отмывают раствором Хэнкса
или 0.85 %-ным раствором NaCl при температуре 20—25 °C и во фла-
коны вносят 0.25 %-ную взвесь эритроцитов морской свинки в том же
растворе так, чтобы покрыть весь клеточный монослой. После инку-
бации при 0—4 °C, а затем в течение 30 мин при 20—25 °C взвесь
эритроцитов сливают, клеточный монослой трижды отмывают раство-
ром Хэнкса при 20—25 °C и просматривают под микроскопом
на наличие гемадсорбции. В некоторых странах национальные кон-
трольные органы рекомендуют проводить испытания на гемадсорби-
рующие агенты также и с эритроцитами человека (группа крови 0),
обезьян, кур или каких-либо других птиц. Результаты реакции
регистрируются так же как в случае применения эритроцитов морской
свинки. Исключение составляет реакция с эритроцитами обезьян,
когда результат реакции регистрируют также после еще одной
дополнительной инкубации в течение 30 мин при 37°С±1 °C.
Для исследования контролируемых образцов клеток на отсутствие
цитопатогенных вирусов пробы культуральной жидкости со всех
испытуемых флаконов объединяют (сливая равные объемы) и вводят
из расчета 1 часть контролируемой смеси проб (но не менее 10 мл
на каждую клеточную культуру) и 4 части питательной среды в три
различные клеточные тест-культуры — в гомологичную культуру
другой партии клеток, в культуру клеток человека (предпочтительно
в первично-трипсинизированную или диплоидную) и в клеточную
культуру, наиболее чувствительную для выявления вирусов —
возможных контаминантов испытуемой культуры. От каждой клеточ-
ной культуры оставляют по одному незараженному флакону. Кон-
трольные и инокулированные культуры инкубируют при 37 °С±1 °C
в течение 14 сут с однократной сменой среды (в случае необходи-
мости) на 4—6-е сутки после инокуляции.
Культуры считаются прошедшими испытания, если в опытных и
контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и
гемадсорбция, а в культуральной жидкости — гемагглютинирующие
агенты. При наличии цитопатических изменений и (или) гемадсорб-
ции и гемагглютинации в контрольных флаконах опыт следует повто-
рить на клеточных культурах, полученных из других источников.
Контроль на лабораторных животных. Испытания проводятся
только на здоровых животных, не использовавшихся ранее в экспе-
рименте. Для выявления посторонних агентов в клеточных культурах
необходимо ввести внутримышечно 107 жизнеспособных клеток по-
ровну каждому животному следующих групп: мышам-сосункам двух
пометов (не менее 10 животных в каждом) не старше 24 ч, 20 мышам
107
массой 15—20 г, 5 морским свинкам массой 300—350 г, 5 кроликам
массой 2.5—3.0 кг.
За животными следует наблюдать не менее 28 сут. Все животные,
которые погибают позднее 24 ч после инокуляции или у которых
наблюдаются признаки заболевания, должны быть вскрыты и иссле-
дованы макроскопически на наличие признаков вирусной инфекции.
Из соответствующих органов готовят 10 %-ную суспензию на
0.85 %-ном растворе NaCl и вводят ее не менее чем 5 одноименным
животным в мозг и в брюшную полость. За инокулированными
животными наблюдают 14 сут.
Клеточные культуры считаются прошедшими этот вид контроля,
если на протяжении периода наблюдения остаются здоровыми не ме-
нее 80 % инокулированных животных и ни у одного из них не наблю-
дается признаков вирусного заболевания. Допускается отход живот-
ных (до 20 %) от случайных причин, не связанных с проявлениями
каких-либо инфекционных заболеваний.
Контроль на куриных эмбрионах. Контролю подвергается не ме-
нее 106 жизнеспособных клеток, которые вводят трем группам кури-
ных эмбрионов по 10 в каждой группе.
Первой группе эмбрионов 9—10-суточного возраста материал
вводят по 0.25 мл в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют
при 37°С±1°С в течение 5—6 сут. По истечении указанного
срока аллантоисную жидкость собирают индивидуально от каждого
эмбриона и проверяют в реакции гемагглютинации с эритроцитами
морской свинки и петуха. При этом в лунках агглютинационных
планшетов готовят 3—4 последовательных разведения (0.85 %-ным
раствором*Na) аллантоисной жидкости из каждого инокулирован-
ного эмбриона. Затем в лунки добавляют равные объемы 0.5 %-ной
взвеси эритроцитов (на 0.85 %-ном растворе Na). После 30—40 мин
инкубации при 20—25 °C (после оседания эритроцитов в контрольных
лунках) учитывают результаты. Материал считается прошедшим
контроль, если в течение указанного срока инкубации остаются
живыми не менее 80 % инокулированных эмбрионов и реакция
гемагглютинации во всех случаях оказывается отрицательной.
Второй группе эмбрионов 7—8-суточного возраста то же коли-
чество клеток вводят в желточный мешок (по 0.25 мл). Эмбрионы
инкубируют при 37°С±1°С в течение 10 сут. Клетки считаются
прошедшими этот вид контроля, если к концу указанного срока
инкубации остаются живыми не менее 80 % инокулированных эм-
брионов.
Третьей группе эмбрионов 10—11-суточного возраста материал
вводят по 0.2 мл на хорион-аллантоисную оболочку с боковой
поверхности эмбриона через искусственно созданную воздушную
полость. Эмбрионы инкубируют при 37 °С±1 °C в течение 5—6 сут.
По истечении указанного срока инкубации должны остаться живыми
не менее 80 % инокулированных эмбрионов при отсутствии на
хорион-аллантоисных оболочках макроскопических изменений.
Контроль сыворотки крови. Сыворотка крови, используемая для
выращивания клеточных культур, должна быть свободна от вирусной
108
контаминации. Учитывая технологию получения (сыворотки при забое
животных, следует иметь в виду возможную ее контаминацию
также различными бактериями, грибами, микоплазмами [20—32].
В СССР для выявления вирусной контаминации сыворотки круп-
ного рогатого скота контроль производят на первично-трипсинизи-
рованных культурах клеток почек и тестикул эмбрионов коров
в объеме не менее 25 мл от всего объема серии, которые вводят
в удобные для проведения контрольных испытаний флаконы так,
чтобы разведение испытуемого материала в» с-реде не превышало
1 :4 из расчета не менее 3 см2 площади клеток на 1 мл сыворотки.
Культуры инкубируют при 37 °С±1 °C в течение 14 сут. На протяже-
нии срока инкубации культуру клетою просматривают на наличие
цитодеструктивныхчизменений. По окончании этого срока клеточный
монослой разрушают однократным замораживанием и оттаиванием,
после чего 25 мл полученного материала беа предварительного
центрифугирования вносят в клеточные культуры/того же вида и
инкубируют их в течение 14 сут приг37°С±1 °C.
Культуры просматривают под микроскопом на наличие цитопати-
ческих изменений и феномена гемадсорбции по методике, описанной
в разделе контроля клеточных культур. Сыворотка считается свобод-
ной от вирусов при отсутствии дегенеративных изменений и гемад-
сорбции.
ВОЗ для этой цели рекомендует использовать первичную культуру
тестикул быка или клетки перевиваемых линий почек быка, которые
чувствительны! к вирусам крупного рогатого скота и особенно к ви-
русу диареи [£8].
Метод испытания сыворотки в культуре»первичных клеток тести*
кул быка состоит в следующем: клеточную суспензию в объеме
90 мл смешивают с 10 мл испытуемой сыворотки и высевают
в два флакона. Такое же количество клеток засевают в качестве
контроля, взявзвместо испытуемой контрольнукпоыворотку, не содер-
жащую вирусов крупного рогатого скота (по данным предваритель-
ного контроля). Опытные и контрольные культуры инкубируют при
37 °С±1 °C в течение 28 сут, проводя многочисленные микроскопиче-
ские исследования на наличие цитопатических изменений кле-
точного монослоя. По мере надобности ростовую среду можно
менять на свежую, содержащую соответствующую сыворотку.
В течение периода наблюдения проводится однократное субкуль-
тивирование клеток, выращиваемых в среде, содержащей как испы-
туемую, так и контрольную сыворотку, чтобы обеспечить рассев
клеток минимум на 6 флаконов.
В конце периода наблюдения проводят следующие испытания
(по одному флакону на каждое):
1) суперинфицирование цитопатогенным штаммом вируса диареи
крупного рогатого скота (клетки должны быть чувствительны к ви-
русу) ;
2) окраска клеток методом Мэя—Грюнвальда—Гимзы для выяв-
ления нарушения морфологии клеток;
109
3) гемадсорбция со смесью эритроцитов (по 0.2 %) кур, морских
свинок и человека (группы 0);
4) электронно-микроскопическое исследование негативно-кон-
трастированных экстрактов клеток, полученных после их разрушения
и осветления суспензии;
5) иммунофлюоресцентное исследование (прямым и непрямым
методом) на отсутствие вируса диареи крупного рогатого скота.
Сыворотка считается свободной от вирусов, если они не обнару-
живаются ни одним из перечисленных тестов.
По нашему опыту, наиболее удобным методом контроля сыво-
ротки является тестирование на индикаторных линиях перевиваемых
Клеток с последующим иммунофлюоресцентным анализом.
Электронно-микроскопический контроль. Возможны следующие
электронно-микроскопические методы контроля на наличие посторон-
них вирусов.
1. Метод негативного контрастирования. В случае формирования
в растущих культурах цитопатических изменений или других выра-
женных изменений характера роста и морфологии клеток возможно
проведение простого и быстрого контроля на наличие посторонних
агентов [33]. Для этого используется культуральная жидкость
либо непосредственно, либо вместе с клетками, механически снятыми
со стекла и подвергнутыми замораживанию и оттаиванию. После
осветления центрифугированием на низких скоростях из надосадоч-
ной жидкости готовят препараты. Наиболее широко применяется
капельный метод: на предметное стекло, покрытое парафином, поме-
щается капля исследуемой жидкости объемом 5—6 мкл; под каплю
на 30—4б*с вносится сетка, покрытая формвар-углеродной пленкой,
для адсорбции материала из жидкости, после чего она переносится
на фильтровальную бумагу, избыток жидкости впитывается, и сетка
подсушивается на воздухе.
Препарат годится для анализа в том случае, если концентрация
агента в жидкости не ниже 104 частиц в 1 мл. В противном
случае можно прибегнуть к дополнительной концентрации агента
из этой жидкости путем скоростного центрифугирования в режиме,
обеспечивающем осаждение частиц диаметром 30—40 нм (40 000 g
в течение 1.5 ч). Полученный осадок ресуспензируется вначале
в небольшом объеме буфера или дистиллированной воды, а затем
делаются кратные разведения, из которых готовятся препараты
капельным методом. При электронно-микроскопическом исследова-
нии отбираются и анализируются сетки с оптимальным распределе-
нием и окрашиванием материала.
Рекомендуются два основных контрастирующих вещества, позво-
ляющих хорошо выявлять структурные особенности изучаемых
агентов при первоначальном анализе: фосфорновольфрамовая ки-
слота и уксуснокислый уранил (уранилацетат).
Существует обширная литература по многочисленным модифи-
кациям и перспективам применения метода негативного контрасти-
рования (см. обзоры [34, 35]).
2. Метод ультратонких срезов. Самым надежным следует считать
110
метод ультратонких срезов клеток. Он наиболее приемлем в тех
случаях, когда продукция вирусов клетками либо незначительна,
либо формирующийся вирус не покидает клетку и не может по
этой причине быть обнаружен в культуральной жидкости. Ряд
агентов при выходе из клетки быстро подвергается деструктивным
изменениям или не может быть достоверно идентифицирован при
негативном окрашивании в силу своих структурных особенностей.
Кроме того, нельзя забывать, что подавляющее большинство
клеточных систем, полученных от млекопитающих и птиц, содержит
эндогенные ретровирусы. Поэтому всякий контроль должен подразу-
мевать наличие возможных ассоциаций агентов, которые могут
взаимодействовать друг с другом на уровне одной клетки культуры
ткани [15, 36].
Обычная процедура приготовления препаратов для электронно-
микроскопического исследования в ультратонких срезах по стан-
дартной методике занимает до 4 сут. Однако рядом исследователей
было показано, что это время может быть сокращено до 2—5 ч
без значительного ухудшения сохранности ультраструктурных дета-
лей клеток [37]. С незначительными модификациями, применяемыми
нами, обработка включает следующие этапы: 1) фиксация охлаж-
денным 2.5 %-ным раствором глутарового альдегида на 0.01 М
Na-какодилатном или фосфатном буфере, pH 7.2—7.4—15 мин
(если клетки обрабатываются в монослое, то их достаточно спо-
лоснуть одним из этих буферов перед осмиевой фиксацией; суспензи-
онные культуры, обрабатываемые в осадке, промывают 2—3 раза
по 2 мин); 2) фиксация в течение 45 мин оптимальным по нашим
данным хром-осмиевым фиксатором по Дальтону [38], что позволяет
одинаково сохранить субклеточные структуры как эукариотических
клеток, так и различных микроорганизмов (состав фиксатора:
4 %-ный раствор бихромата калия, pH 7.2, доводится 2.5 н. КОН;
одну часть этого раствора смешивают с одной частью 3.4 %-ного
раствора NaCl, к этой смеси прибавляют 2 %-ный раствор четырех -
окиси осмия в соотношении 1:1); 3) обезвоживание в восходящих
концентрациях этанола (50—100 %) по 5—6 мин; 4) промывание
100%-ным ацетоном (3 раза по 5 мин); 5) пропитка в смеси
100 %-ного ацетона и эпоксидной смолы (1:1) — 15—20 мин; 6) за-
ливка в чистую смолу с однократной заменой через 10—15 мин;
7) полимеризация при 95 °C в течение 1 —1.5 ч.
Таким образом, на всю процедуру уходит около 4—4.5 ч. Полу-
ченный полимер с осадком, заключенным в капсулу, готов к резке
и в тот же день может быть исследован в электронном микроскопе.
Плоскопараллельный полимер с монослоем может быть либо
расчленен на фрагменты, зажат в плоский держатель и порезан
поперечно, либо выбранные участки монтируются на блок-держа-
тель с помощью той же смолы и полимеризуются еще 1 ч при 95 °C
(или ночь при 65 °C). В дальнейшем с блока готовят ультратонкие
срезы, которые после окрашивания могут быть исследованы в элект-
ронном микроскопе.
В этом варианте обработки возможны все же некоторые арте-
111
факты — микроразрывы, частичное склеивание хроматина и тонкого
фибриллярного компонента. Однако главные структурные элементы
клеток и вирусы сохраняются удовлетворительно и препарат может
.'быть проанализирован (подрббмее см. [39—43]).
Методы выявления микоплазм в культурах клеток
Из 88 видов микоплазм, известных к настоящему времени, клетки
млекопитающих и человека, культивируемые in vitro, спонтанно
контаминируют главным образом 7 видов микоплазм: Mycoplasma
orale, М. salivarium, М. hominis, М. hyorhinis, Acholeplasma laidlawii,
, Mycoplasma arginini, M. fermentans. Авторы, проводившие соот-
вветствующие обследования на базе нескольких крупных исследова-
тельских центров Европы и Америки, отмечают, что.в разное время
и в разных лабораториях обычно преобладают 2—Зиз перечисленных
видов [18].
Назовем основные ^методы обнаружения микоплазм: микробио-
логический, электронно-микроскопический, использование индика-
торных клеточных линий с последующим их анализом, окраска
флюорохромами, авторадиография, иммунофлюоресценция, био-
химические методы, ДНК—ДНК-гибридизация.
Микробиологический контроль. Некоторые виды микоплазм-
кконтаминантов клеточных культур (A. laidlawii, М. salivarium) хо-
рошо растут на искусственных питательных средах. iB этих случаях
микробиологический метод является эффективным для обнаружения
контаминации. Для.ныделения микоплазм рекомендуется использо-
вать среду следующего состава: 0.3 %-ный агар, iприготовленный
на ферментативном (трипсин) переваре сердечной мышцы — 7 ча-
стей, 25 %-ный дрожжевой экстракт — 1 часть, нативная лошадиная
сыворотка — 2 части, причем сыворотка обязательно должна быть
предварительно проверена на отсутствие возможной микоплазменной
«бактериальной контаминации. Культуральная среда (1 мл) от 4—5-
суточных культур с образовавшимся монослоем и надосадочная
жидкость от однократно замороженных и затем оттаявших клеток,
осветленная при 800 об/мин, высевается уколом в пробирки с пита-
тельной средой (10 мл), посевы культивируют при 37 °C в течение
2 нед, результаты учитывают еженедельно. Микоплазмы вырастают
в толще агара в виде мелких единичных светлых колоний при невысо-
кой степени контаминации или в виде легкого облачка при значитель-
ной контаминации.
При микроскопическом исследовании колонии (увеличение
^ХЛ-ЗбО), извлеченной из толщи агара, видны полиморфные струк-
туры: гранулы, нити, шары различной оптической плотности. На по-
верхности 1.3 %-иой агаровой среды колонии микоплазм часто имеют
вид яичницы-глазуньи.
При отсутствии роста рекомендуется провести 3 слепых пассажа.
Отсутствие роста в пассажах свидетельствует либо о чистоте куль-
туры, либо о контаминации клеток трудно культивируемыми штам-
мами микоплазм. Для выделения таких штаммов следует внести
112
в среду L-аргинин (до конечной концентрации 2 %), глюкозу (1 %),
пептон (2 %), комплекс.витаминов для среды Игла и дифосфопири-
диннуклеотид (0.002’%,).
Для культивирования микоплазм предложены различные стан-
дартные полутвердые и жидкие среды [44]. Разные авторы обога-
щают их различными дополнительными компонентами, однако нали-
чие в среде лошадиной сыворотки и дрожжевого экстракта —
непременное условие успешного культивирования. Агар, бульон,
лошадиную сыворотку и прочие компоненты среды предварительно
проверяют на способность поддерживать рост микоплазм и на от-
сутствие токсичности. Для контроля среды рекомендуется использо-
вать музейные, трудно культивируемые штаммы (Mycoplasma
hyorhinis, М. orale, М. femnentans).
Было показано, что наилучшие результаты при первичном выделе-
нии.микоплазм из клеточных культур удается получить, культивируя
чашки в атмосфере смеси 5 % СОг и 95 % N2 [45]. Позже эти данные
были подтверждены многими исследователями.
Электронно-микроскопический контроль. Метод позволяет опреде-
лить микоплазменную контаминацию культур только в ультратонких
срезах. Техника негативного контрастирования в данном случае не-
эффективна, так как не позволяет дифференцировать полиморфные
клетки микоплазм от субклеточных структур и элементов поверх-
ности клетки-хозяин а.
Рекомендуется способ ускоренной обработки клеток в монослое
или суспензии для электронно-микроскопического исследования
в ультратонких срезах по прописи, данной в предыдущем разделе.
Клетки микоплазм чрезвычайно полиморфны. Они могут быть
шарообразными, нитевидными, ветвящимися, их размеры варьируют
в широких пределах (от 100 нм до 2 мкм в длину и диаметром от 50 нм
до 1 мкм). Клетки окружены цитоплазматической мембраной, имею-
щей асимметричный профиль. Общая толщина мембраны равняется
16—18 нм, из них 10 нм приходится на собственно мембрану и 6—
8 нм на наружный (экстрамембранный) ворсинчатый слой.
Мембрана микоплазм и тончайшая сеть нитей дезоксирибо-
нуклеопротеина являются основными морфологическими призна-
ками, позволяющими отличить микоплазмы от субклеточных струк-
тур клетки-хозяина.
Среди микоплазм иногда обнаруживается значительное коли-
чество так называемых элементарных телец — минимальных ре-
продуктивных клеток. Они представляют собой осмиофильные
образования шаровидной формы, окруженные характерной мембра-
ной. Размеры этих образований варьируют в пределах 0.2—1.5 мкм.
Их внутреннее содержимое чаще всего представлено плотным гомо-
генным материалом. В связи с этим элементарные тела микоплазм
трудно отличить от зрелых внеклеточных вирионов онкогенных РНК-
содержащих ретровирусов типа С [46]. Особенная осторожность
требуется при интерпретации данных в клеточных культурах, полу-
ченных от грызунов и птиц.
Использование индикаторных клеточных линий. Некоторые, так
8 Зак 1789 1 13
называемые «некультивируемые виды» микоплазм (например, Myco-
plasma hyorhinis) плохо растут на бесклеточных средах. Для их
выявления рекомендуется использовать индикаторные клеточные
культуры: культуры перевиваемых клеток почки обезьяны Vero, почки
хомяка ВНК-21 и эмбрионов мышей Swiss ЗТ6, свободные от мико-
плазм-контаминантов [44]. Указанные культуры клеток выращивают
в сосудах на покровных стеклах и инфицируют контролируемыми
клетками или культуральной жидкостью от них. Через 3—4 сут
культивирования, когда титр микоплазм достигает максимальной
величины, культуры клеток на стеклах подвергают последующему
цитологическому, иммунофлюоресцентному или биохимическому ис-
следованию.
Окраска флюорохромами. Метод основан на выявлении ДНК
с помощью флюорохромов. Впервые окрашивание флюорохромами
для обнаружения микоплазменной контаминации клеточных культур
было применено в сочетании с люминесцентным вариантом реакции
Фельгена [47]. Затем были использованы и другие флюорохромы,
применяемые при изучении метафазных хромосом эукариот: акри-
флавин, диамидинофенилиндол, обозначаемый обычно DAPI [48],
краситель Hoechst-33258 [48], оливомицин [49].
Для окрашивания флюорохромами клетки выращивают на по-
кровных стеклах 48—72 ч, трижды отмывают физиологическим
раствором или фосфатным буфером (pH 7.2) и фиксируют либо
в смеси метанола и ледяной уксусной кислоты (3: 1), либо в 70 или
96 %-ном этиловом спирте.
Для анализа препаратов требуется люминесцентный микроскоп.
Обычно йспользуется 1000-кратное увеличение, объективы с масля-
ной иммерсией. В контаминированных культурах микоплазмы обна-
руживаются в виде мелких (0.1—0.3 мкм диаметром) гранул, рас-
положенных вне клеток или на поверхности клеточной мембраны.
Часто наблюдаются скопления гранул. По нашим данным н данным
других исследователей [17, 50, 51], метод позволяет обнаруживать
микоплазмы даже при сравнительно низкой множественности инфек-
ции и его чувствительность может быть повышена при использовании
индикаторных клеточных линий. Однако основными преимуществами
метода окраски флюорохромами являются относительная простота
и возможность получить ответ в течение часа.
1. Окраска Hoechst-33258. Препарат фиксируют в смеси метанола
и ледяной уксусной кислоты, добавляя 3—4 капли фиксатора
в культуральную среду на 2—3 мин. Затем среду удаляют, добавляют
свежий фиксатор и фиксируют еще 5 мин. Препарат высушивают
на воздухе и наносят на 10—15 мин раствор красителя, потом дважды
промывают в дистиллированной воде и высушивают.
Основной раствор красителя готовят растворением 0.5 мг реак-
тива в 10 мл дистиллированной воды (срок хранения при 4 °C
до года). Рабочий раствор готовится в растворе Хэнкса без индика-
тора в концентрации 0.05 мкг/мл непосредственно перед употребле-
нием.
При длине волны возбуждающего света 360 им (ртутная лампа
114
высокого давления с фильтрами, обеспечивающими максимум про-
пускания в области 360—400 нм) максимумом флюоресценции краси-
теля с ДНК соответствует приблизительно 470 нм. Флюоресценцию
комплекса наиболее удобно наблюдать с фильтрами, исключающими
свечение с длинами волн ниже 460 нм. В этих условиях на препаратах
клеток, свободных от микоплазм, наблюдается изумрудно-зеленое
свечение ядра, а цитоплазма почти не светится.
2. Окраска DAPI. При этом методе можно окрашивать как
фиксированные, так и живые клетки. Краска готовится на фосфатном
буфере (pH 6.5—7.0) с концентрацией 50 мкг/мл и хранится при 4 °C
полгода. Рабочий раствор готовится непосредственно перед употреб-
лением, концентрация 0.1 мкг/мл. При окраске живых клеток в про-
бирки со стеклами вносят 3 мл красителя, пробирки инкубируют
15—30 мин при 37 °C, затем дважды отмывают фосфатным буфером
и просматривают в люминесцентном микроскопе. Для фиксации
используют 96 %-ный этиловый спирт или смесь метанола и ледяной
уксусной кислоты (3: 1). Длительность окраски такая же, как и для
живых клеток. Как и при окраске Hoechst-33258, флюоресцируют
и ядра, и микоплазмы, иногда заметно слабое свечение цитоплазмы.
3. Окраска оливомицином. Клетки фиксируют в 70 или 96 %-ном
этиловом спирте 15—20 мин. Раствор оливомицина наносят на препа-
раты в темноте при комнатной температуре на 30—60 мин. Затем
стекла дважды промывают в дистиллированной воде, высушивают и
просматривают в люминесцентном микроскопе. Рабочий раствор
оливомицина (20мкг/мл) готовят на дистиллированной воде с добав-
лением 0.02 М Mg++ (MgCh или MgSCh). При 4 °C раствор может
храниться до полугода.
4. Окраска акрилфлавином или акридиновым оранжевым не-
сколько более трудоемка, чем окраска предыдущими флюорохро-
мами, но мы все же считаем целесообразным ее привести.
Культуру клеток, выращенную на покровных стеклах, дважды
отмывают фосфатным буфером (pH 7.2), клетки фиксируют 10 мин
в 4 %-ном формальдегиде. Затем препараты дважды отмывают
в дистиллированной воде, проводят гидролиз РНК (погружение
на 10 мин в 1 н. НС1 при 60 °C), снова дважды промывают дистилли-
рованной водой и окрашивают 20 мин раствором Шиффа. После
окраски препараты дважды промывают дистиллированной водой,
погружают в 70 %-ный спирт, а затем проводят через 20-, 40- и
70 %-ный спирт и дважды (в течение 5 мин) промывают смесью
7 частей абсолютного спирта и 3 частей 1 н. НС1. Монтировать препа-
раты можно как с глицерином, так и с водой.
Реактив Шиффа готовится следующим образом: 250 мг акридино-
вого оранжевого или акрилфлавина и 500 мг метабисульфита калия
растворяют в 250 мл воды и добавляют 20 мл 1 н. НС1. Колбу с раство-
ром герметически закрывают и оставляют в темноте при 4 °C на 3 сут
(каждые 24 ч колбу рекомендуется встряхивать). Раствор можно
хранить при 4 °C в течение месяца, перед использованием его
фильтруют через стеклянный фильтр № 4 под давлением, первую
небольшую порцию выбрасывают.
8» *115
Авторадиография. В 1965 г. появилось сообщение о том, что
клетки, контаминированные микоплазмами, в значительной мере
утрачивают способность включать меченый тимидин в ядра.
На этих же препаратах почти вся метка обнаруживалась в мико-
плазмах [52]. Этот результат послужил основанием для последую-
щего использования метода авторадиографии при определении
микоплазменной контаминации клеток [20, 45, 5L],.
Клетки выращивают на покровных стеклах в течение 48 ч с после-
дующей заменой культуральной среды на свежую, содержащую
0.2 МБк/мл 3Н-тимидина и инкубируют в течение 2.5"—-Зч при 37 °C.
Затем избыток тимидина отмывают немеченым тимидином (50 мг/мл
в растворе Хэнкса) дважды по 15 мин при 37 °C. Препарат фиксируют
в жидкости Карнуа от 30 мин до 1.5 ч, проводят 2 раза по 5 мин
через 96 %-ный спирт и оставляют на ночь в 70 %-ном спирте (можно
дольше). Затем препараты проводят через абсолютный спирт,
высушивают, заключают в бальзам (клетками вверх) на предметном
стекле и выдерживают 24—48 ч до высыхания бальзама. Все
дальнейшие процедуры, связанные с покрытием препаратов фото-
чувствительной эмульсией, их экспозицией и проявлением, про-
водят при слабом желто-зеленом свете (фильтр № П7),. Качество
радиоавтографов в значительной мере определяется качеством
эмульсии. При использовании эмульсий типа «Р» и «М» вводят
растворы пластификатора и дубителя (пластификатор: 96 %-ный
спирт — 30 мл, глицерин— 12 мл, на 100 мл эмульсии — 4.2 мл
пластификатора; дубитель: 10 %-ный водный раствор ацетата
хрома — 5 мл, 4 %-ный водный раствор Na2CO3 — 5 мл, дистилли-
рованная в'ода — 5 мл, на 100 мл эмульсии 1.2 мл дубителя). Эмуль-
сию расплавляют на водяной бане (до 40 °C), вводят теплые
растворы пластификатора и дубителя, разводят бромистой водой
(10 %-ный КВг — 0.2 мл на 100 мл воды), наносят на препарат
эмульсию «Р» (1:1) или «М» (1:2) и оставляют на Г;—2 ч при ком-
натной температуре. После высыхания эмульсии препараты за-
ворачивают в черную бумагу и экспонируют при 4 °C 10—45 сут
(зависит от качества эмульсии).
Амидоловый проявитель готовят перед употреблением (амидол —
0.3 г, №гСОз — 1 г, лимонная кислота — 0.05 г, дистиллированная
вода — 100 мл) и фильтруют через слой ваты. Препараты проявляют
3 мин при комнатной температуре, промывают 1—2 мин водой, фикси-
руют в 40 %-ном растворе тиосульфита натрия 5 мин, промывают
20 мин в проточной воде и окрашивают гематоксилин-гемалауном
или гематоксилин-эозином. После окраски препарат промывают
водой, проводят через 3 смены 96 %-ного спирта и 3 смены ксилола
(по 0.5—1 мин), заключают в бальзам и, просматривают в световом
микроскопе.
Иммунофлюоресценция. Этот метод чаще всего применяется
для обнаружения трудно культивируемых микоплазм (Mycoplasma
hyorhinis, М. orale, М. fermentans), как правило, в сочетании с мето-
дом индикаторных культур [17, 53].
При «прямой иммунофлюоресценции» на препарат наносится
116
гипериммунная сыворотка, меченная флюоресцеинизотиоцианатом
(ФИТЦ), затем следует промывание в фосфатиом буфере и высуши-
вание. Препараты монтируют и просматривают в люминесцентном
микроскопе.
Для «непрямой иммунофлюоресценции» препарат обрабатывают
рабочим раствором, содержащим антикроличий глобулин, меченный
ФИТЦ, и бычий альбумин, меченный родамином.
Этот же метод в сочетании с микробиологическим используют
для идентификации микроколоний микоплазм на поверхности твердой
питательной среды. Естественно, что для применения метода иммуно-
флюоресценции необходимо иметь достаточно полный набор гипер-
иммунных антисывороток.
Биохимические методы. Методы основаны на выявлении актив-
ности ферментов, характерных для микоплазм, или на выявлении
изменений в метаболизме клеток, возникающих вследствие мико-
плазменной инфекции. Первичная диагностика, позволяющая разли-
чить микоплазмы, способные разлагать глюкозу или аргинин и
соответственно сдвигать pH среды в кислую или щелочную область,
состоит в простом добавлении к среде цветного индикатора [54].
К биохимическим методам иногда относят и авторадиографию,
описанную в предыдущем разделе, так как преимущественное
включение 3Н-тимидина микоплазмами связано с действием специ-
фически микоплазменного фермента нуклеозидфосфорилазы, пре-
вращающей тимидин в тимин, и со способностью микоплазм активно
включать тимин, в то время как все клетки млекопитающих тимин
практически не включают [55].
Наиболее распространенный из биохимических методов также
основан на выявлении действия микоплазменной нуклеозидфосфори-
лазы, катализирующей превращение уридина в урацил. При этом
микоплазма в отличие от клеток млекопитающих быстро включает
урацил в свою РНК, и количественные соотношения меченых уридина
и урацила в контаминированной культуре и культуре, свободной
от микоплазм, оказываются резко различными [56]. Удобная моди-
фикация этого метода состоит в использовании уридина и урацила,
меченных разными изотопами (3Н и 14С), с последующим дифферен-
циальным счетом радиоактивности в кислотонерастворимой фракции
РНК с помощью сцинтилляционного спектрофотометра [57].
ДНК—ДНК-гибридизация. Заражение клеточных культур мико-
плазмами может быть определено по гибридизуемости ДНК, выделен-
ной из проверяемых культур, с рекомбинантными плазмидами, содер-
жащими фрагменты ДНК микоплазм. Эти плазмиды-зонды практи-
чески не гибридизуются с ДНК эукариот. Гибридизация зондов
с ДНК микоплазм является видоспецифичной, поэтому комплект
соответствующих зондов позволяет не только обнаружить микоплазмы
в культуре клеток эукариот (или в любом другом биологическом
материале), но и определить вид микоплазмы, оценить множествен-
ность инфекции. Плазмида, содержащая фрагмент рибосомного
оперона одной из микоплазм, может служить универсальным зондом
для определения любой микоплазменной или бактериальной конта-
117
минации. Абсолютная чувствительность метода при использовании
зондов, меченных 32Р, в реакции ник-трансляции с последующей
радиоавтографией составляет около 1 нг микоплазменной ДНК, что
соответствует примерно 106 клеток микоплазмы.
Отсутствие заметной гомологии между ДНК многих микоплазм
было отмечено еще в работах конца 60-х годов [58—60]. По более
точным количественным данным перекрестной гибридизации ДНК
разных микоплазм в растворах было установлено, что гомология
по ДНК у большинства видов не превышает 2 %, и только у несколь-
ких пар сравниваемых микоплазм гомология составила от 4 до 21 %
[61—63]. В нашей работе [64] по перекрестной блот-гибридизации
ДНК ряда микоплазм показано, что при низком уровне гомологии
ДНК исследованных видов эта гомология касается отдельных протя-
женных фрагментов генома, а не коротких участков, распределенных
по всей его длине. Более того, у некоторых микоплазм единственными
гомологичными участками ДНК оказываются рибосомные гены.
На основании этих результатов мы начали использовать в ка-
честве гибридизационных зондов для обнаружения и идентификации
микоплазм тотальные препараты ДНК, полученные из микоплазм,
выращенных на специальных средах. Такие зонды оказались высоко-
эффективными и достаточно специфичными, но их нельзя рекомендо-
вать к широкому применению, так как получение чистых культур
микоплазм и их выращивание в препаративных количествах связаны
со значительными техническими трудностями. В связи с этим мы пред-
приняли клонирование случайных рестриктазных фрагментов ДНК
микоплазм в бактериальной плазмиде pBR322 и проверку рекомби-
нантных ЬлазмиД на специфичность в опытах по блот- и дот-гибриди-
зации с ДНК различных микоплазм и ДНК клеток эукариот. Был
составлен комплект плазмид-зондов, содержащих фрагменты ДНК,
видоспецифичные для каждой из взятых микоплазм. В дальнейшем
этот комплект должен быть расширен.
В комплект включены плазмиды рА132, рМа13 и pMh9, содержа-
щие специфичные фрагменты геномов трех видов микоплазм, часто
инфицирующих клеточные культуры: Acholeplasma laidlawii, Myco-
plasma arginini, M. hominis. Нами были сконструированы плазмиды
по стандартной методике [65]. Доказательства их специфичности
в качестве зондов, т. е. отсутствие перекрестной гибридизуемости
с ДНК других микоплазм и с ДНК клеток эукариот (в 1000-кратном
избытке), представлены в отдельной статье [66].
Для обнаружения и идентификации микоплазменных контамина-
ций рекомендуется следующая последовательность операций.
1. Клетки контролируемой культуры снимаем с поверхности стекла
или пластика с помощью резинового шпателя и собираем центри-
фугированием.
2. Из осадка клеток выделяем ДНК по стандартной методике.
Клетки вскрываем в 1.5 М растворе NaCl с добавлением 1 % до-
децилсульфата Na (SDS), проводим один цикл депротеинизации
хлороформом, затем переосаждение этанолом и обработку протеина-
зой К-
118
1 2 3 V 5 6
Обнаружение и идентификация микоплазм в культурах клеток методом ДНК-гибриди-
зации с последующей радиоавтографией.
Каждая из пяти полос (а—д) содержит по 6 одинаковых проб: / — 2 мкг ДНК мыши,
2— 0.02 мкг ДНК A. laidlawiiA-2 мкг ДНК мыши, 3— 0.02 мкг ДНК М argin.in.lA-2 мкг
ДНК мыши, 4 — 0.02 мкг ДНК М. hominisA-2 мкг ДНК мыши, 5 и 6 — по 2 мкг ДНК из клеток
ЗТЗ Balb и HeLa, спонтанно контаминированных микоплазмами. В качестве зондов исполь-
зованы плазмиды, меченные 32Р в реакции иик-траисляции: а — рМа!3, б — рМЬ9, а — рА132,
г — смесь плазмид (рМа I3+pMh9+pAl32), д — универсальная плазмида pMg 16. Сравнение
автографов позволяет установить, что обе культуры (5 и б) были контаминированы A. laid-
lawii.
3. ДНК в количестве, эквивалентном 103 * 5—106 исходного числа
клеток, денатурируем, смешивая с двойным объемом щелочного
раствора (0.5 М NaOH, 1.5 М NaCl), через 10 мин нейтрализуем,
добавляя 4-кратный объем буфера (1.5 М Трис-НС1, 3 М NaCl,
pH 7.4), затем разбавляем в 2 раза 20-кратным раствором SSC
(1-кратный SSC — 0.15 М NaCl и 0.015 М цитрат Na) и переносим
на нитроцеллюлозный фильтр, используя капилляр или микрово-
ронки. Фильтр промываем 2-кратным SSC, затем 70 %-ным этанолом
и фиксируем нагреванием в вакуумном шкафу до 75—80 °C 2—3 ч.
Фильтры с образцами ДНК можно использовать немедленно или
хранить.
4.’Плазмиды, несущие специфические фрагменты ДНК мико-
плазм, метим 35Р в реакции ник-трансляции по стандартной методике,
[65]. Для серии опытов достаточно 0.8 МБк одного из четырех дез-
оксинуклеотидтрифосфатов и 0.2—0.3 мкг ДНК плазмиды.
5. Гибридизацию ДНК на фильтрах с радиоактивными плазмид-
ными зондами (отжиг) проводим в запаянных полиэтиленовых
мешочках при температуре 65 °C в 6-кратном SSC с 0.5 %-ным SDS.
Фильтры после отжига промываем 6-кратным раствором SSC при
комнатной температуре, затем 2—5 ч в 6-кратном растворе SSC ,
с 0.5 %-ным SDS при 65 °C (на качалке) и в 3 10-3 М Трис-буфере,
pH 9, при комнатной температуре, затем сушим на воздухе и экспони-
руем с рентгеновской пленкой РМ-1 в течение 1 сут.
119
Результаты подобного анализа с разными плазмидами-зондами
и их смесью при соответствующих контролях показаны на рисунке.
Плазмидные зонды для выявления контаминации клеточных куль-
тур микоплазмами сконструированы уже несколькими исследова-
тельскими группами [67—71]. Применение гибридизационного ме-
тода в описанной нами модификации ограничено теми лаборато-
риями, где возможна работа с радиоактивными изотопами. Развитие
этого метода и его более широкое распространение связывают с заме-
ной радиоактивной метки на ферментную, т. е. с использованием
щелочной фосфатазы или пероксидазы хрена, которые могут быть
«пришиты» к плазмидным зондам с помощью биотин-авидиновых
комплексов.
Методы деконтаминации клеточных культур
от микоплазм
Несмотря на то что с момента обнаружения микоплазм в клеточ-
ных культурах прошло около 30 лет, проблема деконтаминации
продолжает оставаться весьма актуальной. Здесь мы обобщаем дан-
ные основных опубликованных в последние годы работ, а также
результаты собственных исследований и даем рекомендации по ис-
пользованию наиболее эффективных на наш взгляд методов де-
контаминации.
В литературе неоднократно появлялись сообщения об использова-
нии поверхностно-активных веществ для деконтаминации клеток.
Известно, что микоплазмы чувствительны к действию катионных
и анионных детергентов, однако почти все вещества весьма токсичны
для клеток. Из семи наименее токсичных для клеток неиоиных детер-
гентов Тритон WR-1339 оказался наиболее эффективным — клетки
оставались свободными от микоплазм в течение 7 мес [72]. Катион-
ные детергенты, испытанные нами, подавляли рост микоплазм
в агаре, однако при обработке ими клеток положительные результаты
были получены лишь в одном случае (клетки ЗТЗ-Balb) — при вы-
держивании суспензии клеток в растворе роккала (1 мг/мл) в течение
7—10 мин. Подобную обработку повторяли на протяжении трех
пассажей.
Уже давно был предложен метод деконтаминации клеточных
культур с помощью аитимикоплазменных гипериммунных сывороток
[73, 74]. Имеется сообщение о возможности деконтаминации кле-
точных культур с помощью неиммунных сывороток кроликов и
морской свинки, вносимых (10 %) в среду культивирования на протя-
жении 2—4 пассажей. Микоплазмоцидное действие оказывал
комплемент, действующий по альтернативному пути, поскольку после
прогревания сыворотки и нейтрализации фактора С-3 комплемента
антисывороткой нужного эффекта не наблюдали. Аналогичные дан-
ные были получены нами при экспериментальной инфекции клеток
линии К-562 при внесении в среду культивирования свежей сыворотки
человека (20%). Было установлено, что разные виды микоплазм
обладают различной чувствительностью к комплементу, что, по-види-
мому, определяется различиями в составе их цитоплазматических
мембран.
120
Оригинальный метод деконтаминации культур клеток состоит
в пассировании их на бестимусных мышах [75—77]. Механизм
деконтаминации клеток в бестимусных мышах остается пока не-
известным. Однако в организме мыши введенные контаминированные
клетки окружены большим количеством макрофагов, которые, веро-
ятно, и играют основную роль в деконтаминации. При внесении
в культуру макрофагов контаминированных клеток в соотношении
1 : 100 (клетки : макрофаги) с добавлением антибиотиков были де-
контаминированы 10 линий клеток [78]. В наших экспериментах
при использовании данного метода удалось лишь значительно сни-
зить титр микоплазм [79].
Известно, что молекулы ДНК в присутствии интеркалируюших
красителей весьма чувствительны к фотодинамическому действию
света. На этом основан еще один метод деконтаминации клеточных
культур от микоплазм [80]. В культуру контаминированных мико-
плазмами клеток вносят 5-бромурацил, который поглощается преиму-
щественно микоплазмами, а не клетками; затем — краситель
Hoechst-33258, после чего клетки облучают УФ-светом (люминесцент-
ная лампа холодного свечения), что приводит к разрывам в ДНК.
Освобождение клеток от микоплазм в наших опытах достигалось
в результате ежедневного облучения в течение 5 сут по 30 мин. Затем
клетки клонировали и проверяли на наличие микоплазм различными
методами. Для обеспечения избирательного включения 5-бромура-
цила или бромдезоксиуридина в ДНК микоплазм, а не клеток хозяина
было предложено [81] проводить обработку клеток в условиях,
тормозящих прохождение ими клеточного цикла. Для этого до внесе-
ния в среду предшественников синтеза ДНК клетки выдерживали
в среде Игла без глютамина или с добавлением бутирата натрия.
В наших экспериментах для полной деконтаминации клеток от мико-
плазм требовалось провести 2—3 цикла подобной обработки [79].
Имеется недавнее сообщение о возможности деконтаминации
клеток Hoechst-33258, который вносили в среду в концентрации
2—8 мкг/мл на 24 ч с повторением обработки через 3 сут [82].
Многолетнее использование антимикоплазменных антибиотиков
как для деконтаминации, так и для повседневного культивирования
привело к появлению штаммов микоплазм, устойчивых к этим анти-
биотикам. Так,тилозин, линкомицин, канамицин и гентамицин в на-
стоящее время уже не способны полностью освободить клетки от
микоплазм. Увеличение дозы этих антибиотиков, обработка клеток
при повышенной температуре (41 °C), применение гипотонического
шока и трицинового буфера приводят лишь к снижению степени
контаминации. Такие клеточные линии с заглушенной микоплазмен-
ной инфекцией, принимаемой за чистые, могут являться дополнитель-
ным источником контаминации чистых клеточных линий. Тем не менее
постоянно появляются сообщения о деконтаминации линий клеток
с помощью новых антибиотиков. Тиамутин (10 мкг/мл) и миноциклин
(5 мкг/мл) были успешно использованы для деконтаминации клеток
от спонтанной и экспериментальной микоплазменной инфекции.
Обработку проводили в течение 4—5 нед, затем клетки клонировали
121
и проверяли на присутствие микоплазм [83]. Клетки Vero удалось
деконтаминировать лишь при одновременном применении мино-
циклина, антимикоплазменной сыворотки и комплемента [84].
Опубликовано сообщение о деконтаминации четырех клеточных
линий в присутствии 15 мкг/мл тетрациклина и 500 мкг/мл канами-
цина с последующим клонированием. Суспензию клеток разводили до
1 клетки на лунку, среду меняли каждые 2—3 сут из-за нестабиль-
ности тетрациклина; через 2 нед клетки переводили на среду без
антибиотиков, и клоны росли еще 21—56 сут, пока становилось
возможным тестирование инфекции [85].
Взяв за основу эту методику, мы попытались деконтаминировать
клетки HeLa-M и МХ-7 клонированием на 96-луночных пластинах
в присутствии тилозина (120 мкг/мл), линкомицина (500 мкг/мл)
и канамицина (400 мкг/мл). Обработка клонов в течение 4 нед
со сменой среды каждые 2—3 сут не привела к успеху. Деконтамина-
ция удалась только с помощью антибиотиков доксициклина
(10 мкг/мл), метациклина (10 мкг/мл) и гентамицина (400 мкг/мл).
Обработку единичных клонов проводили в течение 4 нед со сменой
среды каждые 2—3 сут, затем клоны переводили на среду без анти-
биотиков, которую также меняли каждые 2—3 сут в течение 2—3 нед.
После подрастания клонов их пересевали на 24-луночные пластины
и проводили тестирование микробиологическим методом, окрашива-
нием Hoechst-33258, авторадиографией [79, 86].
Рекомендации по предупреждению контаминации
клеточных культур микоплазмами и вирусами
1. Приобретать клеточные линии, свободные от микоплазм и
вирусов, из надежных источников, гарантирующих отсутствие мико-
плазм. Проводить криоконсервацию клеток на первом пассаже.
2. Проводить регулярный контроль контаминации (не реже 1 раза
в месяц). Контаминированные линии по возможности уничтожать.
3. Применять карантинное отделение клеточных линий, не прове-
ренных на микоплазмы, и особенно для тех клеточных линий, в кото-
рых микоплазмы обнаружены. С такими культурами необходимо
работать в отдельных боксах или, если это невозможно, после работы
с чистыми линиями, в частности, не использовать один и тот же
флакон со средой для культивирования чистых и контаминированных
линий; разливать среды и сыворотки небольшими объемами, которые
можно быстро использовать.
4. По возможности использовать для культивирования клеток
питательные среды без антибиотиков.
5. Тщательно проверять на контаминацию микоплазмами все
ингредиенты сред и рабочие растворы, особенно сыворотку и трипсин.
6. При пересеве клеток сначала разлить свежую питательную
среду по чистым флаконам, а потом уже сливать культуральную
среду из флаконов с клеточными культурами. Разливать среды
и клеточную суспензию только с помощью пипеток, а не через край.
Использованные пипетки помещать в стакан с 3 %-ным раствором
122
хлорамина или карболовой кислоты; культуральную жидкость сли-
вать в стакан с дезинфицирующим раствором.
7. После работы провести тщательное дезинфицирование (раст-
ворами хлорамина, карболовой кислоты или 70 %-ным этанолом)
рабочей поверхности стола, боковых стенок бокса и всех предметов,
находящихся в боксе. Ввести строгие меры по содержанию в чистоте
соседних с боксом помещений.
Литература
1. Лилле Э. Р. Обязьяны как источник вирусных заболеваний человека / Вопр.
вирусологии. 1985. Т. 30. С. 138—144.
2. Дзагуров С. Г. Проблема безопасности профилактических препаратов // Между-
народ. симп. по стандартизации медицинских биологических препаратов. М.,
19/6. С. 1—4.
3. Новохатский А. С. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной
биологии. М., 1979. 156 с. (Итоги науки и техники. Сер. Вирусология / ВИНИТИ;
Т. 8).
4. Stones Van G. Cellular changes, probably virus induces in primary rabbit kidney
cells // Woint roho/labs Symposium on the standardization of cell substrates for
the production of virus vaccines. 1976. P. 15.
5. Welke G. Die Ververndung von Diploidzellinien als Vermehrungssubstrat fiir die
Virusimpfstoffproduction // Zbl. gesamte Hyg. 1980. Bd 26. P. 365—372.
6. Gravell M., London W., Hamilton R. et al. Transmission of simian AIDS with type
D retrovirus isolate//Lancet. 1984.-N 8372. P. 334—335.
7. Cowen R. Virus identified as possible cause of simian AIDS // Res. Resour. Rept.
1984. Vol. 8. P. 1—6.
8. Miyoshi J., Fyjistrita M., Yoshimoto Sh. et al. Transmission of monkey retrovirus
similar to human T-cell leukemia virus by blood transfusion // Jap. J. Cancer. Res.
1984. Vol. 75. P. 479—481.
9. Letvin N., Hunt R., Finberg R. Animal models of AIDS // Simian Oncol. 1984.
Vol. 11. P. 18—28.
10. Chronic infections // Symp. Royal College of Pathologists /Ed. G. Dick. London,
1972. P. 1.
11. Aderca J. Infectii cronice eu virusuri ARN in culture cellulare. Evolutie, mecanism
de persistenta // Stud, si cere, inframicrobiol. 1971. Vol. 22. P. 315—329.
12. Астахова А. В. Некоторые биологические и физико-химические свойства вируса,
выделенного из культуры клеток почек куриного эмбриона // Вопр. вирусологии.
1977. № 3. С. 345—351.
13. Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. И. Руководство по применению
клеточных культур в вирусологии. М., 1976. 314 с.
14. Гаврилов В. И., Семенов Б. Ф., Жданов В. М. Хронические вирусные инфекции
и их моделирование. М., 1974. 256 с.
15. Миллер Г. Г. Особенности морфогенеза вирусов в условиях смешанных инфекций.
М., 1980. 114 с. (Итоги науки и техники. Сер. Вирусология / ВИНИТИ; Т. 9).
16. Анджапаридзе О. Г., Богомолова Н. Н., Борискин Ю. С. Персистенция вирусов.
М„ 1984. 256 с.
17. Barite М. F. Mycoplasma infection of cell cultures // Isr. J. Med. Sci. 1981. Vol. 17.
P. 555—562.
18. McGarrity G. J., Vanaman V., Sarama J. Cytogenetic effects of mycoplasmal
infection of cell cultures: a review //In Vitro. 1984. Vol. 20. P. 1 —18.
19. Stanbridge E. Doersen C. /. Some effect that Mycoplasmas have upon their
infected host //Mycoplasma infection cell cultures. New York, 1978. P. 119—134.
20. Barile M. F. Mycoplasma — tissue cell interactions // The mycoplasmas. New York,
1979. Vol. 2. P. 465.
21. O’Brien S. J., Simonson /. M., Grabowski M. W., Barile M. F. Analysis of multiple
isoenzyme expression among twenty two species of Mycoplasma and Acholeplasma //
J. Bacteriol. 1981. Vol. 146. P. 222—232.
123
22. McGarrity G. I., Carson D. A. Adenosine phosphorylase-mediated nucleoside toxi-
city. Application toward the detection of mycoplasma inlection in mammalian cell
cultures//Exp. Cell Res. 1982. Vol. 139. P. 199—207.
23. Nichols W. W. Genetic effects Mycoplasma // Mycoplasma infection cell cultures.
New York, 1978. P. 151 —157.
24. Macpherson J. A., Russel W Transformation in hamster cells mediated by Myco-
x plasma//Nature. 1966. Vol. 210. P. 1343—1345.
25. Гаврилов В. И., Соловьева А. И., Раковская И. В. и др. Получение хронически
инфицированных культур диплоидных клеток легких эмбриона человека и дина-
мика цитопатических изменений // Вести. АМН СССР. 1969. Т. 5. С. 57—62.
26. Engelhardt J. A., Gabridge М. G. Effect of metaplasmia on infection of hamster
organ culture with Mycoplasma pneumoniae//Infect. Immun. 1977. Vol. 15.
P. 647—651.
27. McGarrity G. L, Coriell L. L. Procedures to reduce contamination of cell cultures //
In Vitro. 1971. Vol. 6. P. 257—265.
28. ВОЗ. Серия технических докладов. M., 1984. 210 с.
29. Соколов Н. Л., Саттаров И. Т., Сологуб В. К., Авилов В. С. Методы обнаружения
коронавируса и выявления к нему антител у рогатого скота // Бюлл. ВНИИ экспер.
ветеринарии. 1982. Т. 47. С. 17—19.
30. Barile М. F., Hopps Н. Е., Grabowski Н. Incidence and sources of mycoplasma
contamination: a brief review// Mycoplasma infection of cell cultures. New York,
1978. P. 35—46.
31. Benz E., Harold lr., Mozes L. Small virus-like particles detected in bovine sera
by electron microscopy//J. Nat. Cancer Inst. 1974. Vol. 52. P. 1931 —1933.
32. Calafat J., Hageman Ph., Ressang A. Virus-like particles in bovine sera for tissue
culture//.J. Gen. Virol. 1976. Vol. 33. P. 151 — 154.
33. Brenner S., Horne R. IE. A negative staining method for high resolution electron
microscopy of viruses // Biochem. biophys. acta. 1959. Vol. 34. P. 103—109.
34. Horne R. W., Wildy P. An historical ecount of the development and application
of the negative staining technique to the electron microscopy of viruses //J. Microsc.
(Gr. Brit.), 1979. Vol. 117. iP. 103—122.
35. Королев M. Б. Электронно-микроскопические методы выявления вирусов. М.,
1980. 15t8 с. (Итоги иауки и техники. Сер. Вирусология /ВИНИТИ; Т. 9).
36. Andersen N., Doane F. IE. Microscopic detection of adventitious viruses in cell
cultures //Canad. J. Microbiol. 1972. Vol. 18. P. 299—304.
37. Doane F. IE., Andersen N., Chao /., Noonan A. Two-hour embedding procedure
for intracellular detection of viruses by electron microscopy//AppL Microbiol.
1974. Vol. 27. P. 407—410.
38. Dalton A. A chrom-osmium fixative mixure for electron microscopy//Anat. Rec.
1955. Vol. 121. P. 281—286.
39. Авакян А. А., Быковский А. Ф. Атлас анатомии и онтогенеза вирусов человека
и животных. ДА., 1970. 155 с.
40. Быковский А. Ф. Морфогенез вирусов человека и животных//Общая и частная
вирусология. М., 1982. Т. ЕС. 84.
41. Быковский А. Ф., Клицунова Н. В., Миллер Г. Г. и др. Онкогенные вирусы:
Атлас. М., 1983. 283 с.
42. Клименко С. М. Структура вириона вирусов животных // Общая и частная вирусо-
логия. М., 1982. Т. I. С. 61.
43. Быковский А. Ф., Ершов Ф. И., Кармышева В. Я. и др. Атлас вирусной цитопатоло-
гии. М., 1975. 260 с.
44. Barile М. F., McGarrity G. J. Special techniques for isolation and identification
of mycoplasmas from cell cultures // Methods in mycoplasmology. New York, 1983.
P. 155—202.
45. Barile M. F. Mycoplasma contamination of cell cultures. Mycoplasma virus cell cul-
ture interaction //Contamination in tissue cultures. New York, 1973. P. 131 —172.
46. Быковский А. Ф., Миллер Г. Г. Электронно-микроскопическая индикация ретро-
вирусов: Методические рекомендации. М., 1985. 40 с.
47. Shedden IE., Cole В. Rapid method for demonstration pleuropneumoniae-like
organisms in strain of hamster kidney cells (BHK-2I) //Nature. 1966. Vol. 210.
P. 868.
48. Chen T. R. In situ detection of mycoplasma contamination in cell cultures by fluores-
cent Hoechst-33258 stain //Exp. Cell Res. 1977. Vol. 104. P. 255—262.
124
49. Михайлова Г. Р., Новохатский А. С., Родова М. Ф. Новый способ выявления
микоплазмы в перевиваемых культурах клеток // Вопр. вирусологии. 1982. Т. 6.
С. 759— 761.
50. Stanbridge Е. J. Mycoplasma detection an obligation to scientific accuracy //
Isr. J. Med. Sci. 1981 Vol. 17. P. 563— 568.
51. McGarrity G. J., Steiner Th.. Vanaman 1Л Detection of mycoplasmal infection of cell
cultures bv DNA fluorochrome staining // Methods in mycopiasmoiogy. New York;
London, 1983. Afol. 2. P. 183—190.
52. Nardone R. M., iTodd J., Gonzales P., Gaffney E. 1Л Nucleoside incorporation into
strain L-ceii: inhibition by pleuropneumonia like organisms // Science. 1965. Vol. 149.
P. 1100—HOI.
53. Barile M. F., Graboneski M. IV. Detection and identification of Mycoplasmas
in infected cell culturesby direct immunofluorescence staining // Methods in myco-
plastnology. “New York, 1983. P. 173—181.
54. Schimke R. T., Bariel M. F. Arginine breakdown in mammalian cell culture contami-
nated with pleuropneumonia-like organisms (PPLO) // Exp. Cell Res. 1963. Vol. 30.
P. 593— 596.
55. Levine E. M., Mueller S. N. Biochemical procedures for the detection of mycoplasmal
irtfection in cell cultures // Methods in mycopiasmoiogy. 1983. Vol. 2. P. 191—201.
56. Schneider E. L., Stanbridge E. J., Epstein C. J. Incorporation of 3H-uriditie and
3H-uraciI into RNA:aa:simple technique for the detection of mycoplasma contamina-
tion of cultured cells // Exp. Gdll Res. 1974. Vol. 84. P. 311—318.
57. Stanbridge>E. J., Schneider G. L. A simple biochemical method for the detection
of mycoplasmas and other microbial contaminants of cell cultures // Tissue Cult.
Assoc. Man. 1976. Vol. 2. P. 371—374.
58. Somerson N.lL., Reich P. R., Chenoch R. M., Weissman S. M. Genetic differentiation
by nucleic acidibomology. 3. Relationship among mycoplasma, L-forms and bacte-
ria//Ann. NAY. Acad. Sci. 1967. Vol. 143. P. 9—20.
59. McGee E. A., Roqul M., Witter R. G. Molecular genetic studies of relationships among
mycoplasma, L-forms and bacteria // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1967. Vol. 143. P. 21—30.
60. Neimark H. C. Division of mycoplasmas in subgroups //J. Gen. Microbiol. 1970.
Vol. 63. P. 249—263.
61. Sugino W- M., Wek R. S.,'Kingsbury D. T. Partial nucleotide sequence similarity
within species of Mycoplasma and Acholeplasma // J. Gen. Microbiol. 1980. Vol. 121.
P. 222-228.
62. Aulakh G. S.,eStephens E. B.,:Rose D. L. et al. Nucleic acid relationships among
Acholeplasma species//J. Bacteriol. 1983. Vol. 158. P. 1338—1341.
63. Stephens E. B., Aulakh G. S., Rose D. L. et al. Interspecies and intraspecies DNA
homology among established species of Acholeplasma; a review // Yale J. Biol.
Med. 1983. Vol. 56. P.1729—785.
64. Чернова О. А., Меркулова'H. А., Борхсениус С. И. Рибосомные гены — единствен-
ные гомологичные участки ДНК у некоторых микоплазм // Молекуляр. генетика,
внрусол. и микробиол. 1986. Т. 9. С. 16—22.
65. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М., 1984. 480 с.
66. Борхсениус С. Н., Чернова О ’А.,. Меркулова Н. А., Арэ А. Ф. Обнаружение и
идентификация микоплазменных заражений методом ДНК-гибридизации //
Цитология. 1987. Т. 29. С. 934—941.
67. Razin S., Antikam .D., Glaser G. Mycoplasmal ribosomal RNA genes and their
use as probes for detection and identification of molecules // Isr. J. Med. Sci. 1984.
Vol. 20. P. 758—761.
68. Razin S., Gee M., Wormse N.,'Pollack G., Glaser C. Detection of mycoplasmas infec-
tion cell cultures by DNA hybridization // In Vitro. 1984. Vol. 20. P. 404—408.
69. Gobel U. B., Stanbridge E. J. Cloned mycoplasma ribosomal RNA genes for the
detection of mycoplasma contamination in tissue cultures // Science. 1984. Vol. 226.
P. 1211 —1213.
70. Mouches C., Ccutdresse T., Gadean A. et al. Expression of the Spiroplasma citri
spiralin gene in Escherichia coli. Use of the recombinant plasmid carryning this gene
as a molecular probe // Isr. J. Med. Sci. 1984. Vol. 20. P. 773—777.
7!. McGarrity G. J., Kotani H. Detection of cell culture Mycoplasmas by genome probe //
Exp. Cell Res. 1986. Vol. 163. P. 273—278.
72. Reyndols R. K-, Hetrick F. M. Potential use of surface active agents for controlling
125
mycoplasma contamination in animal cell cultures // Appl. Microbiol. 1969. Vol. 17.
P. 405—411.
73. Pollack M., Kenny G. Mammalian cell cultures contaminated with PPLO. 3. Elimina-
tion of PPLO with specific antiserum // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1963. Vol. 112.
P. 176—181.
74. Jeans son S., Brorson J. E. Elimination of Mycoplasmas from cell cultures utiling
hyperimmune sera // Exp. Cell Res. 1985. Vol. 161. P. 181 —188.
75. Van Diggelen O., Shin P., Phillips P. Reduction in cellular tumorigenecity after
mycoplasma infection and elimination of mycoplasma from infected cultures by
passage in nude mice // Cancer Res. 1977. Vol. 37. P. 2680—2687.
76. Howell D., Machamer C., Cresswell P. Elimination of Mycoplasma from human
B-lymphoblastoid cell lines //Hum. Immunol. 1982. Vol. 5. P. 233—238.
77. Holmes D., Hinson A., Ades E. Elimination of an anaerobic mycoplasma from
a human erythroleukemic cell line, K562 //Clin. Immunol. Immunopathol. 1984.
Vol. 30. P. 165—166.
78. Schimmelpfeng L., Langenberg U., Hinrich-Peters J. Macrophages overcome myco-
plasma infections of cell in vitro//Nature. 1980. Vol. 285. P. 661—662.
79. Смирнова T. Д. Деконтаминация клеточных культур от микоплазм: сравнение трех
методов // Цитология. 1986. Т. 28. С. 1113—1116.
80. Marcus М., Lavi U., Hattenberg Н. et al. Selective killing of mycoplasmas from
contaminated mammalian cells in cell cultures // Nature. 1980. Vol. 285. P. 659—
661.
81. Пантина P. А., Третьяков A. H., Филатов M. В. Эффективный способ деконтамина-
ции от микоплазм культур клеток млекопитающих // Цитология. 1984. Т. 26.
С. 1076.
82. Hellkuhl В., Grzeschik К- Elimination of mycoplasma contamination from mamma-
lian cell cultures by the bibenzimidazole derivative Hoechst 33258//Cytogenet.
Cell Genet. 1983. Vol. 36. P. 584—585.
83. Schmidt J., Erfle V. Elimination of mycoplasmas from cell cultures and establishment
of mycoplasma free cell lines // Exp. Cell Res. 1984. Vol. 152. P. 565—570.
84. Yamamoto К Mycoplasma contamination and infection of cell cultures. Work-
shop 1. // Yale J. Biol. Med. 1983. Vol. 56. P. 783—785.
85. Gurney Ph*, Woolf M., Alplanalp L. et al. Elimination of Mycoplasma hyorhinis
infections from four cell lines // In Vitro. 1981. Vol. 17. P. 993—996.
86. Смирнова T. Д., Фридлянская И. И. Контаминация клеточных культур микоплаз-
; мами: методы обнаружения и возможные пути распространения микоплазма-
инфекции // Цитология. 1985. Т. 27. С. 276—281.
4 Прижизненная
люминесцентная микроскопия клеток
А. Д. Соркнн, Л. В. Тесленко
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Разнообразие методических подходов — характерная черта со-
временной клеточной биологии. Одним из самых популярных методов
изучения клетки является флюоресцентная микроскопия. Практи-
чески все клеточные компартменты можно изучать с помощью
флюоресцирующих молекул. Большинство работ сделано на фиксиро-
ванных клетках, особенно много данных получено методом иммуно-
флюоресценции, однако главным преимуществом люминесцентной
микроскопии является возможность исследования различных,
в том числе и количественных, характеристик многих процессов
в живой клетке. С развитием систем усиления люминесцентного
изображения клетки, позволяющих анализировать изображение
126
при значительном уменьшении интенсивности возбуждающего
света, уровень и значимость исследований на живых клетках резко
возросли и будут расти в ближайшее время. В качестве иллюстрации
возможностей прижизненной флюоресцентной микроскопии можно
привести ряд примеров использования этого метода в клеточной
биологии.
Так, для исследования мембран и липидных включений применя-
ются различные гидрофобные зонды нелипидной природы и липиды,
меченные флюорохромами. С помощью таких зондов можно не
только наблюдать распределение липидов в клетке, но и изучать
динамические характеристики липидного бислоя в различных частях
клетки [1, 2]. Существуют зонды для прижизненного измерения
количества ДНК в клетке, например Hoechst-33342. Специфическим
маркером митохондрий (только в живой клетке) является рода-
мин. 123, отсутствие аккумуляции которого в митохондриях свиде-
тельствует о гибели клетки. Синтезированы зонды, чувствительные
к величине pH (флюоресцеин и его производные), к концентрации
свободного Са2+ (квин-2, фура-2, индо-1), к величине мембранного
потенциала. Хотя данные зонды используются значительно чаще
для измерений на целых клеточных популяциях, известны работы,
где изучалось распределение ионов Са2+ и ионов Н+ (величина pH)
в отдельной клетке [3, 4]. Перспективными и все более популярными
становятся исследования процессов после инъекции в клетку флюо-
ресцентно меченных антител к какому-либо внутриклеточному
антигену, например к белкам цитоскелета [5]. Для всех случаев
существуют общие этапы в проведении экспериментов: 1) синтез
и очистка флюоресцентного зонда или флюоресцентно меченной
биомолекулы (флюоресцентного конъюгата); 2) изучение и проверка
возможного влияния на клетку зонда или меченой молекулы, сравне-
ние свойств конъюгата с немеченым аналогом; 3) изучение спектраль-
ных характеристик зонда или метки in vitro и в условиях возможного
микроокружения в клетке и выбор на основе этого оптимальных
условий и оптимальных комбинаций фильтров возбуждения и
регистрации флюоресценции; 4) введение флюоресцентной молекулы
в клетку и обеспечение физиологических условий при микроскопиче-
ском анализе; интенсивность возбуждающего света и время засветки
должны быть минимальными, чтобы сохранить интактность клеток
в течение эксперимента, регистрирующая система должна обладать
максимальной чувствительностью; 5) при интерпретации результатов
микрофотографирования или микрофотометрирования живых клеток
при слабых сигналах необходимо учитывать собственную люминес-
ценцию клеток, которая может быть различной как у разных клеток,
так и в различных участках одной и той же клетки.
Флюоресцентная микроскопия широко используется для изучения
процесса эндоцитоза в культивируемых клетках млекопитающих.
Рассмотрим методы исследования рецептор-опосредованного эндо-
цитоза (РОЭ) различных лигандов в живых клетках. Этот процесс
складывается из связывания лигандов с поверхностными рецепто-
рами, поступления лиганд-рецепторных комплексов внутрь клетки
127
через окаймленные ямки (кластеризация и интернализация) и
последующего транспорта лигандов и рецепторов в различные
внутриклеточные компартменты. Заметим, что весь процесс может
проходить за несколько минут.
Приготовление меченых лигандов
для исследования процессов эндоцитоэа
Для исследования механизма эндоцитоза" используют ряд флюо-
ресцентно меченных лигандов, например конъюгат эпидермального
фактора роста (ЭФР) с родамином, аг-макроглобулина (МГ)
с родамином и флюоресцеином, трансферрина с флюоресцеином.
ЭФР, меченный родамином по концевой ЫНг-группе, получают
следующим образом. 600 мкг ЭФР, содержащего ,251-ЭФР в следовых
количествах, растворяют в 0.61 мл 0.2 М карбонатного буфера,
pH 9.3,и добавляют 3 раза по;1!7*мкл 1 %-ного раствора тетраметил-
родаминизотиоцианата (ТРИТЩ, «Sigma») в диметилформамиде
с промежутками в 3 ч при постоянном перемешивании при комнатной
температуре. После окончания реакции материал подвергают
гель-фильтрации на сефадексе G-15, уравновешенном на воде.
Фракции, содержащие немеченный и меченный родамином ЭФР
(ЭФР-Р), собирают и подвергают анионообменной хроматографии
на ДЕ-52 целлюлозе (колонка 5X1 см) ,, уравновешенной на 0.02 М
Трис-НС1, pH 7.6. ЭФР-Р отделяется от ЭФР при элюции градиентом
NaCl (0—1 М). Молярное соотношение ЭФР и родамина в получен-
ном конъюгате, определяемое по отношению активности 1251-ЭФР
и оптическбй плотности при 545 нм, обычно составляет 1:1. Выход
конъюгата — около 10 % (подробнее см. [6])\ Возможно, что
выход конъюгата можно повысить, если вести реакцию в органиче-
ском растворителе, например в диметиясульфоксиде [7-]. Трансфер-
рин метят флюоресцеином по стандартной методике с помощью
флюоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ, «Serva») на частицах целита.
2 мг трансферрина растворяют в 2 мл карбонатного буфера (pH 9.3),
добавляют 2 мг ФИТЦ на целите и* перемешивают 30 мин при
комнатной температуре. Затем частицы целита осаждают центри-
фугированием, а супернатант ’подвергают гель-фильтрации на
сефадексе G-25 для отделения непрореагировавшего красителя.
В полученном конъюгате обычно на одну молекулу трансферрина
приходится 2—4 флюорохрома.
Для измерения pH в лизосомах интактных клеток используется
ФИТЦ-декстран, который поступает в клетку за счет пиноцитоза
и накапливается в лизосомах, не подвергаясь расщеплению. 300 мг
декстрана-40 000 («Fluka») растворяют при нагревании в 7.5 мл
диметилсульфоксида, добавляют 120 мг ФИТЦ (Изомер I, «Serva»)
и проводят реакцию в стеклянной ампуле при 60 °C в течение 2 сут.
Полученный ФИТЦ-декстран отделяют от непрореагировавшего
красителя 5-кратным осаждением в холодном ацетоне и высушивают
в течение 4 ч при 70 °C на воздухе.
Для приготовления флюоресцентного ’Производного МГ, получен-
ие
ного по стандартной методике из плазмы крови человека, 2 мл
0.1 %-ного раствора МГ в 0.2 М карбонатном буфере, pH 9.3,
смешивают с 60 мкл 1.5 %-ного раствора ФИТЦ в диметилсульфок-
сиде. Реакцию проводят в течение суток при 4 °C, после чего
непрореагировавший краситель удаляют диализом против фосфат-
ного буфера (pH 7.4) в течение 3 сут с 6-кратной сменой буфера.
Молярное соотношение МГ и ФИТЦ в полученном конъюгате, рассчи-
танное исходя из величин оптической плотности при 280 нм и 495 нм,
составляет обычно 1 : 20—1 : 30.
При синтезе конъюгата с родамином 2 мл раствора МГ (5 мг/мл)
в 0.2 М карбонатном буфере, pH 9.2, диализуют против раствора
ТРИТЦ (0.1 мг/мл) в аналогичном карбонатном буфере в течение
суток при 4 °C. Далее раствор конъюгата сутки диализуют против
0.1 М фосфатного буфера, pH 7.4, и очищают от остатков красителя
на сефадексе G-25, уравновешенном 0.1 М фосфатным буфером,
pH 7.4. Отношение оптических плотностей Е280/Е555 в полученных
препаратах обычно составляет 1.4.
Полученные конъюгаты не токсичны для клеток и сохраняют
афинность связывания с клеточными рецепторами, что позволяет
использовать их для работы с живыми клетками. Кроме вышеупомя-
нутых конъюгатов, в исследованиях, хотя и менее широко, исполь-
зуются флюоресцентные производные других лигандов, поступающих
в клетку путем РОЭ: инсулина [8], липопротеинов низкой плотности
[9], трийодотиронина [10], асиалогликопротеинов [11] и некоторых
других.
Условия эксперимента
Для исследования процесса рецептор-опосредованного эндоци-
тоза используют различные постоянные клеточные линии. Клетки
засевают в пластиковые чашки Петри, на дне которых размещают
несколько покровных стекол размером примерно 8X8 мм.
Непосредственно перед опытом стекла с монослоем клеток про-
мывают рабочей средой (PC), состоящей из среды DME, 0.1 %-ного
бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0.02 М HEPES (pH 7.4).
Для того чтобы свести к минимуму количество меченого лиганда,
используемого в опыте, дно пластиковой чашки Петри рекоменду-
ется выстлать пленкой (Parafilm «М», «Serva»), на которую капают
20 мкл инкубационной среды, состоящей из PC и соответствующего
лиганда. Для предотвращения высыхания капли в чашку Петри
помещают мокрую вату. Стекло кладут на каплю клетками вниз.
Температурный режим инкубации зависит от цели опыта. Обычно
инкубацию производят сначала при 4 °C в течение 1—2 ч для синхро-
низации эндоцитоза, а затем клетки отмывают от несвязавшегося
лиганда и переносят в теплую среду без лиганда (37 С'С). После
инкубации стекло промывают теплым раствором Хэнкса (без краси-
теля), прикрепляют к дну пластиковой чашки Петри с помощью
пасты (Apiezon М) клетками вверх и заливают раствором Хэнкса,
Чашку со стеклом помещают или иа обычный столик микроскопа,
9 Зак. 1789
129
или на термостатируемый столик CTH-IV4.2. Объектив опускают
прямо в среду к клеткам. Для быстрого просмотра препарата
применяют объектив 30X0.9, водная иммерсия (в. и.). Наилучшее
качество изображения получается при работе с объективом 60X1.0
(в. и.). Кроме этих высокоапертурных объективов можно рекомен-
довать объектив 40X0.75 (в. и.) с большим рабочим расстоянием
и недавно разработанный 63X1.2 (в. и.). В ряде случаев, когда
необходимо наблюдать и люминесцентное и фазовоконтрастное
изображение клетки, используется объектив 90X1.25, масляная
иммерсия (м. и.), модифицированный для работы в водной среде.
Необходимые приборы
При работе с флюоресцентными метками и зондами можно
использовать микроскопы ЛЮМАМ различных модификаций.
Флюоресценция возбуждается лампой постоянного тока ДРШ-250-2,
наиболее яркой из отечественных ламп. Существенным моментом
является подбор оптимальных фильтров для возбуждения флюо-
ресценции красителей при решении определенных задач экспери-
мента. Для создания наборов фильтров целесообразно пользоваться
набором оптического стекла и наборами интерференционных
фильтров отечественного производства или зарубежных фирм.
При подборе фильтров необходимо учитывать спектр свечения
ртутной лампы, спектр возбуждения флюоресцентной метки, спек-
тральные характеристики фильтров, а также спектр собственной
люминесценции клетки. В таблице представлены некоторые комбина-
ции филь'тров, «сконструированные» только из отечественных
светофильтров. Кроме того, можно рекомендовать набор № 18,
состоящий из интерференционного фильтра Кр 490 (К. Ц. Й.),
фильтров СЗС-22-2 и ЖС-17-2 для создания узкого канала пропуска-
ния с длиной волны 490 нм и высокой эффективностью пропускания.
В таблице указаны, кроме обычных светоделительных пластинок,
«Зеленая-2» и «Зеленая-З», включенные в комплект нового микроскопа
ЛЮМАМ-Р8. Отметим, что при подборе комбинаций фильтров
нельзя ограничиваться сведениями о характеристиках фильтров,
представленными в описаниях; необходимо получить кривые про-
пускания для каждого отдельного фильтра и для всего набора
фильтров.
Другим важнейшим моментом является высокоэффективная
регистрация флюоресцентного сигнала. Возможные комбинации
«запирающих» светофильтров также представлены в таблице.
Отметим, что в любом случае (если имеется возможность) лучше
идти по пути не повышения, а снижения интенсивности возбуждаю-
щего света, чем достигается уменьшение выгорания флюорохромов
и увеличение коэффициента пропускания фильтров регистрации
и чувствительности приборов, регистрирующих люминесцентное
изображение клетки. В качестве регистрирующих приборов исполь-
зуются или фотокамера, или телекамера (видикон), или фото-
электронные умножители (ФЭУ). Обычно для регистрации свечения
130
Номера комбинаций фильтров для возбуждения и регистрации флюоресценции
флюоресцеина (1—12) и родамина (13—17)
, Фильтры возбуждения Светоделительиые пластинки и запирающие фильтры
Зл Зл-2 Зл-З Зл-З и СЗС-21-2 Зл-З и И-520 Кр Кр (без КС11) и OC14-4
СС-15-6, ЖС-11-2 1 2 — —
И-450, СС-15-2, ЖС-11-2 3 4 5 6 7 — —
И-475, СС-5-2 . 8 9 10 11 — — —
И-490, СС-5-2, ЖС-16-4 — — — — 12 — . —
СЗС-22-2, ПС-7-2, ОС-11-4, СЗС-21-2 — — — — — 13
СЗС-22-6, СЗС-21-2 — — — — — 14 • 15
И-546, СЗС-22-2, СЗС-21-2 — — —7 — — 16 17
Примечание. Зл, Зл-2, Зл-З — зеленые светоделительиые пластинки со стандартной
склейкой ЖС18 и ЖЗС19; Кр — красная светоделительиая пластинка со стандартным «запи-
рающим» фильтром КС 11; И-520— интерференционный фильтр с максимумом пропускания
520 им. Назначение фильтров для флюоресцеина: I и 2 — максимальная яркость, сравнительно
высокие фон и автофлюоресцеиция клеток; 3—5 — минимальный фон, используется для микро-
фотографирования; 6 и 11 — минимальная собственная люминесценция клеток, применяется
для метода двойной люминесценции; 7 и 12 — для измерения pH; 8—10 — минимальный фон.
минимальная собственная люминесценция клеток. Назначение фильтров для родамина:
13 и 16 — выделяется линия свечения лампы с длиной волны 546 им для возбуждения
флюоресценции тетраметилродамииа, используется для метода двойной люминесцентной
метки; 14—максимальная яркость, возбуждает кроме родамина и флюоресцеии, высокая
собственная люминесценция клеток; 15 — максимальная яркость, максимальное пропускание
флюоресценции родамина, кроме родамина возбуждается и флюоресцеии, высокая собственная
люминесценция клеток; 17— высокая яркость, минимальная собственная люминесценция кле-
ток, флюоресцеии не возбуждается, фон низкий.
флюоресцеина применяется пленка РФ-3, для родамина — пленки
«Изопанхром» тип 22 или 17 и А-2. Для микрофотометрирования
применяются стандартные ФМЭЛ-1 и 1а, различные самодельные
насадки с ФЭУ или входящая в состав микроскопа ЛЮМАМ-ИУФ
насадка для фотометрии. В состав ФМЭЛ или ЛЮМАМ-ИУФ
входят различные запирающие интерференционные фильтры.
Необходимость применения высокочувствительных видиконов
(супервидиконов) с кремниевой мишенью объясняется тем, что
чувствительности пленки не хватает, чтобы быстро сфотографи-
ровать несколько раз живую клетку. В частности, можно исполь-
зовать отечественный супервидикон ЛИ-702, который устанавли-
вается в лабораторный макет промышленной телевизионной камеры,
работающей в стандартном режиме разложения. Камера сочленя-
ется с тубусом стандартной фотонасадки микроскопа, в которой
находится окуляр (гамаль, Х1.7). Для максимального использо-
вания чувствительности трубки в камере отключают схемы обратной
связи по ускоряющему электроду, что позволяет использовать
супервидикон в высокочувствительном режиме работы. В качестве
монитора может служить телевизор «Электроника-432». Фотографи-
рование производят с экрана монитора на пленку РФ-3.
Для анализа и запоминания видеосигнала можно применять
видеомагнитофон или анализатор изображения. В настоящее время
проводятся испытания возможностей отечественного цветного анали-
затора ПЛОТ-Г.
9’
131
Рис.. 1 > Схема комплексной установки для прижизненной люминесцентной микроскопии
клеток.
/ — объект; 2 — микроскоп ЛЮМАМ; 3 — фотонасадка; 4 — телекамера на базе супервиди-
кона ЛИ-702; 5 — монитор; 6 — устройство памяти и анализа; 7 — фотокамера; 8 —
ФМЭЛ-1А; 9 — усилитель; 10 — самописец; 11 — фотокамера для съемки с экрана монитора.
Общая схема комплексной установки на базе микроскопа
ЛЮМАМ для прижизненной микроскопии клеток представлена
на рис. 1. Подобные комплексы, создаваемые на базе инвертиро-
ванных микроскопов, описаны в ряде работ [12, 13].
Возможности метода
С помощью люминесцентной микроскопии можно решать ряд
задач, сохраняя клетки живыми и прикрепленными к субстрату.
Наименее 'сложной проблемой является наблюдение и микро-
фотографирование процесса эндоцитоза флюоресцентно меченного
лиганда. Если необходимо получить несколько фотографий ранних
стадий эндоцитоза, то предпочтительнее использовать видеомикро-
скоп, сокращая время и интенсивность засветки до минимума.
Сильный свет ведет к выгоранию красителя и нарушает внутри-
клеточное движение эндосом с лигандом [13]. Инкубация с одновре-
менным наблюдением ведется при температуре 37 °C с клетками,
предварительно инкубированными с меченым лигандом и затем
отмытыми от него. Ранние стадии эндоцитоза — кластеризацию
. лиганд-рецепторных комплексов и образование мелких эндосом —
практически невозможно наблюдать при использовании техники,
описанной в-этой работе. Поэтому первой видимой картинкой после
132
начала эндоцитоза является стадия образования крупных эндосом
и мультивезикулярных тел. Эта стадия легко идентифицируется
при исследовании поступления ЭФР-родамина в клетки А431 и
а2-макроглобулина, меченного и флюоресцеином, и родамином,
в клетки ЗТЗ, NRK и фибробласты человека. Пример фотографии
клеток, инкубированных с а2-макроглобулином, полученной с экрана
монитора, представлен на рис. 2, а (см. вклейку). С помощью
видеосистемы можно получить до 20 аналогичных фотографий
одной клетки без применения устройства памяти в течение несколь-
ких минут. Стадия аккумуляции лигандов, например ЭФР-Р,
в районе комплекса Гольджи легко регистрируется с помощью
микрофотографирования на пленку, чувствительную к свечению
родамина (рис. 2, б, см. вклейку).
Несколько более сложным представляется метод двойной
флюоресцентной метки [14, 15]. Клетки инкубируются с двумя
различными лигандами, один из которых конъюгирован с родамином,
а другой с флюоресцеином. Затем на определенной стадии эндоци-
тоза делаются две фотографии одного и того же участка монослоя
клеток в свете люминесценции флюоресцеина (набор фильтров
№ 6) и родамина (набор фильтров № 13 или № 16). Контролем
селективности фильтров является отсутствие красного свечения при
возбуждении зеленой люминесценции в аналогичных препаратах
клеток, инкубированных только с лигандом, меченным флюоресцен-
ном.
Важной характеристикой компартментов, участвующих в эндо-
цитозе, является величина их внутреннего pH. Измерить эту величину
можно только в живой клетке с помощью конъюгированных с флю-
оресцеином лигандов, поступающих в данные компартменты.
Спектр флюоресценции флюоресцеина сильно зависит от pH микро-
окружения в интервале от 4 до 7. Его свечение, регистрируемое
в канале с длиной волны 520 нм при возбуждении светом с длиной
волны 490 нм, возрастает в несколько раз при. изменении pH от
4 до 7, тогда как свечение при возбуждении светом длиной волны
450 нм возрастает незначительно. Таким образом, с помощью
количественной микрофотометрии живых клеток можно оценить
величину pH в любой точке клетки, где локализован флюоресцеин,
по отношению интенсивности флюоресценции, регистрируемой
с помощью наборов фильтров № 7 и № 12 (или № 18). Микро-
флюорометрический метод измерения pH в клеточных компартментах
пока используется группой американских авторов [16] ив нашей
лаборатории [15, 17].
Низкая величина pH в лизосомах и эндосомах (около 5—6)
обусловливает слабое свечение флюоресцеина, находящегося в дан-
ных органеллах. При повышении pH, например, при внесении в кле-
точную среду метиламина, хлорохина или ионофора моненсина,
возрастает не только общая интенсивность сигнала при возбуждении
светом длиной волны 490 нм, но и резко улучшается качество изобра-
жения клетки. Поэтому если лиганд находится в кислом микроокру-
жении, то это легко установить и визуально, сравнивая фотографии
133
клетки до и после снятия градиента pH аминами или моненсином.
На; рис. 2, в и г (см. вклейку) приведены две фотографии одной
И' той же клетки А431, инкубированной с ФИТЦ-декстраном —
маркером лизосом, до и после действия 0.02 М метиламина. Когда
изображения клетки получены при возбуждении светом длиной
волны 490 нм, то во втором случае (рис. 2, г) клетка светится зна-
чительно ярче. При возбуждении флюоресценции светом длиной
волны 450 нм изображения клетки до и после действия метиламина
практически неотличимы. Аналогичный метод приближенной оценки
закисления органелл был применен для определения степени за-
кисленности эндосом клеток ЗТЗ, содержащих а2-макроглобулин-
флюоресцеин [18].
Примером другой задачи, решаемой методом флюоресцентной
микроскопии, может служить определение текучести клеточных
мембран по поляризации флюоресцентных «липидных» зондов,
таких как 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен (ДФГТ). Покроъные стекла
с культурами различной плотности инкубируют в СО2!-инкубаторе
в течение 20 мин с 3 • 10~6 М раствором ДФГТ в кондиционированной
сывороточной среде при 37 °C. Затем среду с ДФГТ сливают и
в чашку добавляют 4 мл свежей среды Игла с 0.02 М HEPES
(pH 7.2, 24 °C).
Используемые соотношения концентрации ДФГТ в среде, ее
объема и количества клеток в системе не приводили к серьезным
изменениям в структуре и функционировании мембран клеток.
Ростовые характеристики культуры клеток ЗТЗ не меняются в при-
сутствии ДФГТ по крайней мере в течение недели. Концентрационной
деполяризации флюоресценции зонда (ДФГТ), связавшегося с кле-
точной мембраной, не наблюдается.
Чашки с покровными стеклами помещают на предметный столик
поляризационного микроскопа-флюориметра, собранного на основе
ЛЮМАМ-ИУФ1. Камеру с фотоумножителем заменяют на фото-
метрическую насадку с поляризационной призмой-анализатором
и двумя ФЭУ, как это описано ранее [19]. Сигналы с: ФЭУ после
усиления подаются на разные каналы накопителя Ф-36. Таким
образом, интенсивность двух составляющих поляризованного
излучения, 7и и /^регистрируется в памяти Ф-36 одновременно.
Возбуждение флюоресценции осуществляется через фильтр
УФС-6 (5—8 мм), поляризатор помещают между полевой диафраг-
мой и светоделитель ной пластинкой опак-иллюминатора. Исполь-
зуют объектив водной иммерсии 60X1.0 Флюоресценция регистри-
руется с участка поля зрения диаметром 3 мкм. Обычно осуществля-
ется сканирование выбранной зоны препарата вдоль определенной
линии длиной 150—200 мкм. Для уменьшения ошибок, связанных
с фотовыцветанием, с помощью полевой диафрагмы микроскопа
ограничивают область препарата, освещаемую возбуждающими
лучами. При необходимости размеры полевой диафрагмы и фото-
метрического зонда увеличивают.
Степень поляризации (Р) на основании данных измерения
вычисляется, по формуле
134
р_ (Л~ЛФ> ~ (/± —/±ф)
(Л — Л*) + (^± —/±ф)
где /#фи IХф— интенсивности сигнала с участков фона соответственно
при параллельном в взаимоперпендикулярном расположении анали-
затора.
На рис. 2, д и е (см. вклейку) представлена микрофотография
интактных клеток ЗТЗ в свете флюоресценции ДФГТ. Общая флю-
оресценция клеток, обработанных ДФГТ, складывается из трех
основных компонент: 1) флюоресценции липидных включений
сферической формы, размеры и число которых широко варьируют;
2) диффузной флюоресценции околоядерной зоны клетки; 3) флюо-
ресценции периферической (ламеллярной) зоны клетки. Вклад
в общее свечение клетки липидных включений весьма существен и
в ряде случаев является определяющим.
Таким образом, применение флюоресцентной микроскопии
позволяет получить данные о текучести клеточных мембран в раз-
личных компартментах интактной клетки.
Литература
1. Hillman. G., Schlessinger ]. The lateral diffusion of EGF complexed to its surface
receptors does not account for then thermal sensitivity of patch formation and
endocytosis // Biochemistry. 1982. Vol. 24. P. 1667—1671.
2. Розанов Ю. M„ Соркин А. Д., Сорокин А. Б. Исследование динамических свойств
мембран одиночных интактных клеток ЗТЗ методом поляризационной флюоресцен-
ции // Биол. мембраны. 1986. Т. 3. С. 829—837.
3. Tanasugarn L., McNeil Р„ Reynolds G. Т., Taylor D. L. Microspectrofluoro-
metry by digital image processing: measurement of cytoplasmic pH // J. Cell
Biol. 1984. Vol. 98. P. 717—724.
4. Rogers J., Hesketh T. R., Smith G. A. et al. Intracellular pH and free calcium
changes in single cells using quene 1 and quin 2 probes and fluorescence
microscopy // FEBS Lett. 1983. Vol. 161. P. 21—27.
5. Taylor D. L., Amato P. A., Luby-Phelps K., McNeil P. Fluorescent analog cyto-
chemistry // Trends Biochem. Sci. 1984. Vol. 14. P. 88—91.
6. Haigler H. T. Receptor-mediated endocytosis of epidermal growth factor // Meth
Enzymol. 1983. Vol. 98. P. 283—289.
7. Rees A. R., Gregoriou M., Hohnson P., Garland P. B. High affinity epidermal
growth factor on the surface of A431 cells have restricted lateral diffusion //
EMBO J. 1984. Vol. 3. P. 1843—1847.
8. Schechter J., Hernaez L., Schlessinger J., Cautrecasas P. Local aggregation
of hormone receptor complexes in required for activation by epidermal growth
factor // Nature. 1978. Vol. 278. P. 835—838.
9. Via D. P., Willingham M. C., Pastan I. et al. Со-clustering and internalization
of low-density lipoproteins and a2-macroglobulin in human skin fibroblasts //
Exp. Cell Res. 1982. Vol. 141. P. 15—22.
10. Cheng S. Y., Maxfield F. R., Robbins J. et al. Receptor-mediated uptake of
3,3',5-triiodo-L-thyronine by cultured fibroblasts // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.
1980. Vol. 77. P. 3425—3429.
11. Geisow M. J. Fluorescein conjugates as indicators of subcellular pH. A critical
evalution // Exp. Cell Res. 1984. Vol. 150. P. 29—35.
12. Willingham M. C., Pastan I. The visualization of fluorescent proteins in lh
ving cells by video intensification microscopy // Cell. 1978. Vol. 13. P. 501 —
507.
13. Willingham M. C., Pastan I. Image intensification techniques for detection of
protein in cultured cells // Meth. Enzymol. 1983. Vol. 98. P. 266—282.
135
14. Maxfield F. R., Schlessinger J.. Schechter Y. et al. Collection of insulin, EGF
and a2-macroglobulin in the same patches on the surface of cultured fibroblasts
and common internalization // Cell. 1978. Vol. 14. P. 805—810.
15. Соркин А. Л., Тесленко Л. В., Никольский H. Н., Трошин А. С. Общий путь
эндоцитоза эпидермального фактора роста и трансферрина в ассоциированный
с комплексом Гольджи, закисленный (pH 6.1) компартмент клеток А431 // Докл.
АН СССР. 1986. Т. 289. С. 212—215.
16. Tycko В., Maxfield F. R. Rapid acidification of endocytic vesicles containing
a2-macroglobulin // Cell. 1982. Vol. 28. P. 643—651.
17. Соркин А. Д., Богданова H. П., Никольский H. H., Сорокин А. Б. Влияние аминов
на pH в лизосомах клеток ЗТЗ // Цитология. 1985. Т/27. С. 203—208.
18. Тесленко Л. В., Звонарев О. Ф., Плахов С. А. и др. Рецептор-опосредованный
эндоцитоз аг-макроглобулина: исследование на живых клетках ЗТЗ // Цитология.
1986. Т. 2. С. 1097—1102.
19. Розанов Ю. М., Барский И. Я., Боровиков Ю. С. Двухканальный микрофлюори-
метр // Цитология. 1970. Т. 12. С. 1477—1480.
Проточная цитометрия
Ю. М. Розанов
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Проточная цитометрия (ПЦМ) — скоростной метод анализа
отдельных клеток и клеточных структурных компонентов в потоке
жидкости. Производительность анализа составляет 1000 клеток
в 1 с и более, и это является главной технологической характери-
стикой метода. Другой уникальной особенностью ПЦМ является
возможность сортировки клеток непосредственно сразу после измере-
ния и, таким образом, получения для дальнейшего морфологического,
биохимического или биотехнологического исследования фракций
клеток, обладающих определенным значением измеряемого пара-
метра. Техника ПЦМ — это главным образом техника флюоресцент-
ных измерений с применением многочисленных зондов-красителей.
Практически любой цитохимический прием, использующийся
в флюоресцентной микроскопии для окраски клеток, может служить
основой для проведения анализа методом ПЦМ.
Принцип метода и приборы
В проточных цитометрах исследуемые клетки или клеточные
фрагменты, находящиеся в суспензии, тем или иным способом
вводятся в центр узкого ламинарного потока несущей жидкости.
Благодаря тому что расход несущей жидкости устанавливается
значительно большим, чем расход суспензии с клетками, в сформиро-
ванном потоке клетки идут одна за другой, в среднем на очень
большом по сравнению с их размерами расстоянии. Скорость потока
5—10 м/с, его диаметр обычно составляет 50—150 мкм. Отрезок
пути, где происходит измерение, отдельная клетка проходит за
время от 1—2 до 30—50 мкс в зависимости от конструкции прибора.
Импульсы соответствующей длительности образуются на выходе
датчика (или датчиков, если измеряется несколько параметров
136
одной клетки) оптического излучения и поступают в электронную
систему для анализа. В результате происходит накопление информа-
ции в форме «величина параметра—число клеток».
Проточные цитометры подразделяются на цитометры-анализа-
торы, обеспечивающие лишь анализ параметров без сортировки
клеток, и цитометры-сортировщики, выполняющие, кроме аналити-
ческих, препаративные функции. В качестве источников оптического
излучения в сортировщиках, как правило, применяются лазеры.
Это в значительной степени определяет конструкцию приборов.
Лазерный луч пересекает струю с клетками в воздухе после выхода
ее из капилляра проточной камеры и перед тем, как она разбивается
на отдельные капли, содержащие клетки. В момент отрыва от
струи капли заряжаются и далее в электрическом поле происходит
их разделение. Наиболее широко используются модели цитометров-
сортировщиков EPICS фирмы «Coulter Electronics» (Франция) и
FACS фирмы «Beckton-Dickinson» (США).
Цитометры-анализаторы проще и разнообразнее по конструкции.
В качестве источника света в них используются преимущественно
ртутные газоразрядные лампы. Такие приборы, как правило,
уступают цитометрам-сортировщикам на лазерах в предельной
чувствительности, но превосходят их в точности измерения, в разре-
шающей способности при выявлении небольших изменений иссле-
дуемых параметров и, конечно, в простоте обращения с ними и
доступности. В лабораторной практике наиболее простой путь
разрешения трудностей при создании цитометров-анализаторов —
использование люминесцентных микроскопов. Блок-схема одного
из таких приборов, одноканального проточного цитометра на базе
микроскопа фирмы ЛОМО ЛЮМАМ-Й, приведена на рис. 1. В при-
боре использована проточная камера, легко изготавливаемая
в лабораторных условиях (описание аналогичной установки см. [1]).
В этой камере струя с клетками, сформированная наконечником /,
падает под углом на нижнюю поверхность покровного стекла 7,
проходит по этой поверхности 3—4 мм и самотеком убирается с по-
мощью полоски какого-либо смачивающегося материала 8. Камера
устанавливается на предметном столике микроскопа и юстируется
так, чтобы проходящие клетки, наблюдаемые как светящийся
шнур, оказались в поле зрения микрообъектива 9. Основными
деталями камеры, кроме наконечника /, являются металлический
капилляр 2, вклеенный в корпус 3, и резиновое кольцо 4, которое
плотно удерживает наконечник и служит прокладкой между корпусом
и прижимной крышкой 5. Наконечник изготавливается из стеклянной
трубки, например пипетки, вытягиванием над газовой горелкой.
Торец наконечника после откалывания можно не шлифовать.
Под микроскопом контролируют получившийся диаметр выходного
отверстия наконечника и отбирают требуемый в пределах 100—
150 мкм. Диаметр стеклянной трубки обычно выбирается равным
5—6 мм, толщина стенок 1 —1.5 мм, общая длина наконечника
30—40 мм. Металлический капилляр изготавливают из тонкой
шприцевой иглы, которая обрезается и округляется с обоих концов.
137
г
г
Суспензия с клетками подается в капилляр с помощью микрона-
соса, автоматизированного шприца или каким-либо другим способом.
Избыточное давление в камере около 0.5 атм. С выхода фотоэлектрон-
ного умножителя импульсы сигнала поступают на усилитель
(БУС-2-97) и далее в многоканальный амплитудный анализатор
(АИ-1024). Для контроля скорости анализа используется часто-
томер. Информация в форме гистограмм выводится на графо-
построитель (Н-306) и цифропечатающее устройство (УВЦ2-95).
Среди промышленных моделей проточных цитометров-анализа-
торов следует отметить модель ICP-22 фирмы «Ortho Instruments»
(США), а также Parthograph фирмы «KRATEL» (ФРГ); в последней
модели обеспечено стандартизированное определение размеров
клеток.
Исследуемые характеристики клеток
На измерении параметров флюоресценции и светорассеяния
в проточных цитометрах основан анализ самых различных характе-
ристик клеток и их фрагментов: содержания основных клеточных
компонентов и антигенов клеточной поверхности, активности неко-
торых ферментов, размеров клеток и др. Наиболее широко ПЦМ
используется в исследованиях ДНК (около 75—80 % всех исследова-
ний методом ПЦМ).
ДНК. Для количественного определения содержания ДНК
имеется довольно много флюорохромов, различающихся спектраль-
ными характеристиками и механизмами связывания с ДНК. Характе-
ристики наиболее употребляемых из них приведены в таблице.
Цитометрия ДНК проводится на обработанных детергентом или
фиксированных клетках, так как практически все красители, пригод-
ные для этой цели, не проходят через мембрану живой клетки.
Заметной проницаемостью обладает лишь Хёхст 33342, что позволяет
использовать его для анализа содержания ДНК в живых клетках
и сортировки их по этому параметру [2]. Среди методик, приведенных
в таблице, для практического применения следует рекомендовать ту,
в которой используется комбинация красителей оливомицина (или
митрамицин, или хромомицин) и бромистого этидия. Ее досто-
инствами являются высокая надежность и воспроизводимость окраски,
значительная яркость флюоресценции при использовании ртутных
ламп в качестве источников возбуждения, доступность реактивов
(пропись № 1).
Рис. 1. Блок-схема одиокаиальиого проточного цитометра на базе микроскопа
Л ЮМАМ-И.
/—иакоиечннк форсунки проточной камеры; 2—капилляр проточной камеры; 3—корпус
форсунки; 4 — резиновое кольцо; 5 — прижимная шайба; 6 — трубка для подачи несущей
жидкости; 7 — покровное стекло; 8 — полоска для сбора жидкости; 9 — микрообъектив микро-
скопа; 10— светоделительиая пластинка опак-нллюмииатора микроскопа; 11—источник
света ДРШ-250-2; 12—коллектор осветителя микроскопа; 13 — теплозащитная кювета;
14 — светофильтр для выделения возбуждающего света; 15 — линза; 16 — апертурная диа-
фрагма; 17 — лниза; 18 — полевая диафрагма; 19 — светофильтр для выделения света флюо-
ресценции; 20 — призма; 21 — окуляр; 22— диафрагма в плоскости изображения микроскопа;
23 — фотоэлектронный умножитель.
139
Характеристика наиболее распространенных флюорохромов для исследования ДНК
Краситель Класс Цвет флюоресценции Литературный источник
Бромистый этидий Интеркалятор Кирпично-красный [35]
Йодистый пропидий » 36, 37
Оливомицин Г—Ц-связывание Зелено-желтый 35, 38
Мнтромицин » 35, 38
Хромомицин » » [35, 38, 39]
Хёхст 33258 (Bisben- А—Т-связывание Голубой [35, 40]
simide Н 33258 Fluo- А
rochrome)
DAP1 (4,6-диамидино- » [35, 41]
2-фенилиидол)
Акрифлавин Реакция Фельгена Зеленый [42]
Оливомицин+ броми- Г—Ц-связыва- Кирпично-красный [43]
стыв этидий иие+интеркалятор
Синтез ДНК методом ПЦМ исследуется с помощью 5-бром-
дезоксиуридина (БДУ), аналога тимидина. БДУ, включенный
в ДНК, тестируют либо иммунофлюоресцентным методом, либо по
эффекту тушения им флюоресценции некоторых красителей. Первый
метод гораздо чувствительнее, позволяет использовать менее токсич-
ные концентрации БДУ и уменьшать период мечения примерно
до 20 мин [3]. Второй метод доступнее на практике. Чаще всего
в этом случае используют Хёхст 33258, который очень эффективно
тушится бромдезоксиуридином (пропись № 2).
РНК. Исследование содержания РНК в клетке может быть
проведенб'с помощью акридинового оранжевого (АО) после селек-
тивной денатурации двуспиральной РНК- Используются несколько
способов соответствующей цитохимической обработки клеток [4, 5].
При этом на однонитчатой денатурированной РНК АО образует
димеры, которые в отличие от мономерной формы красителя флюо-
ресцируют в красной области спектра. Мономеры АО интеркалируют
в неповрежденную биспиральную ДНК, и по интенсивности их
зеленой флюоресценции можно оценивать содержание ДНК. Таким
образом, это по существу метод двойного окрашивания и измерения
содержания РНК—ДНК по красно-зеленой флюоресценции АО.
Применяется также способ определения содержания РНК с помощью
пиронина Y [6, 7].
Белок. Для определения содержания белка чаще всего исполь-
зуют флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), тетраметилродаминизо-
тноцианат (ТРИТЦ) и флюорескамин (ФК). Флюорескамин в отли-
чие от других красителей очень быстро реагирует с аминогруппами
белков, имеет малое время жизни в водном растворе, не связанный
краситель не флюоресцирует. Он удобен для определения белков
клеточной поверхности нефиксированных клеток.
Как правило, интенсивность флюоресценции красителей на белок
поверхности клеток пропорциональна площади поверхности клетки,
а для других белковых красителей — объему клетки [8—10].
Ферменты. Активность ферментов в клетках исследуется с по-
140
мощью флюорогенных субстратов, превращающихся при фермента-
тивном расщеплении в флюоресцирующий продукт. Трудности
анализа связаны с ограничением скорости поступления субстрата
в живую клетку и диффузией продукта реакции в течение анализа
из клетки. Несколько флюорогенных субстратов, использующихся
в аналитической биохимии, адаптированы для ПЦМ и позволяют
проводить анализ кислой и щелочной фосфатаз [11, 12], эстераз
[13], дегидрогеназ [13], глюкоронидаз [12], аминопептидаз [11]
и др. Наибольшее употребление получил флюоресцеиндиацетат
(ФДА) и его аналог, характеризующийся замедленной диффузией
из живой клетки, — карбоксифлюоресцеиндиацетат (с-ФДА) [13,
14]. Одной из задач, решаемых с помощью ФДА и с-ФДА, является
выявление и определение доли в исследуемой популяции поврежден-
ных и мертвых клеток (пропись № 3).
Антигены поверхности клетки. Иммунофлюоресцентный анализ
клеточной поверхности — расширяющаяся область применения
ПЦМ. Обычно используется метод непрямой иммунофлюоресценции
как более чувствительный, исследования проводят на цитометрах,
имеющих лазерное возбуждение. Окрашивают, как правило, живые
клетки, которые затем могут быть фиксированы этанолом или пара-
формальдегидом. Анализ получающихся гистограмм распределения
клеток по интенсивности флюоресценции требует тщательности
и опыта работы, так как субпопуляции положительных и отрица-
тельных по исследуемому антигену клеток имеют широкие, чаще
всего заметно перекрывающиеся гистограммы, форма которых
в общем случае заранее не известна. Должен быть определен также
уровень неспецифического окрашивания с помощью антисыворотки
на отсутствующие в исследовании антигены [15, 16] .
Другие клеточные компоненты и характеристики. Из многочислен-
ных возможностей анализа с помощью ПЦМ следует отметить
также исследования клеточных рецепторов, их поверхностной
плотности и перераспределения [17, 18], микровязкости клеточной
мембраны и цитоплазмы [19, 20], потенциала, клеточной мембраны
[21, 22], внутриклеточного pH [23, 24], липидов [25], изменений
структуры хроматина [26, 27], а также исследования нескольких
параметров одновременно [4, 5, 9, 10, 15, 28, 29].
Исследование кинетики клеточного цикла
Одно из наиболее эффективных применений ПЦМ получила
в исследованиях по клеточной кинетике. Различают статический
и динамический ПЦМ-анализ параметров клеточного цикла. Основой
статического метода является ДНК-гистограмма (рис. 2), форма
которой определяется соотношением клеток в фазах Gi, S и G24-M
клеточного цикла. Простейший метод обработки гистограмм заклю-
чается в следующем: находят максимумы пиков Gi и G24-A4, подсчи-
тывают число клеток (площадь) в гистограмме слева от канала,
соответствующего максимуму Gi (/ii), а также число клеток справа
от канала, соответствующего максимуму G24-M (л2), определяют
доли клеток в разных фазах:
<?| =^1 100 %; S =-N -^'1. 100 %; G,+M=^ 100 %,
где N — общее число клеток в гистограмме.
Этот метод успешно применяется в случае хорошего качества
гистограмм (рис. 2, а), т. е. когда гистограммы имеют узкий и
симметричный пик Gi, отсутствует шум в виде экспоненты и «пьеде-
стала» (рис. 2, б), четко выражена фракция отсутствуют
дополнительные структуры, связанные с появлением поврежденных
клеток (рис. 2, б).
Разработан ряд более универсальных методов математической
обработки ДНК-гистограмм, позволяющих, в частности, анализи-
ровать характер распределения клеток по S-фазе [30, 31].
Динамический ПЦМ-анализ параметров клеточного цикла
рассматривает изменения во времени формы ДНК-гистограммы
либо при блокировании движения клеток по циклу в определенной
его фазе, обычно в фазе митоза, с помощью колхицина, колцемида
или винкристина (статмокинетический метод) [32, 33], либо при
блокировании (обычно путем замены тимидина на БДУ) с определен-
ного момента окраски вновь синтезируемой ДНК [34]. В результате
появляется возможность проследить динамику прохождения
клетками отдельных фаз клеточного цикла, определить их продол-
жительность в абсолютных единицах времени, а также вычленить
долю непролиферирующей субпопуляции (пропись № 6).
Приготовление материала
Для проведения ПЦМ-анализа необходимо приготовить суспен-
зию одиночных клеток или исследуемых структурных компонентов
клетки. Концентрация клеток, удобная для исследований, — 5 • 105—
1 • 106 клеток/мл. Необходимый для однократного анализа объем
суспензии и предельная концентрация зависят от типа используемого
прибора и решаемой задачи. Обычно для одномерного анализа
готовят 0.5—1.0 мл суспензии с концентрацией не более 5 • 106 кле-
ток/мд. При концентрации меньше 105 клеток/мл скорость измерений
в большинстве случаев невелика — несколько десятков клеток
в 1 с.
Если нет специальных требований, суспензию для окрашивания
и анализа приготавливают на сбалансированном буферном солевом
растворе (например, на фосфатно-солевом буфере Дальбекко без
кальция и магния, на растворе версена или растворе Хэнкса).
При изучении внутриклеточных компонентов используют фиксиро-
ванные клетки или проводят обработку клеток детергентом, чаще
всего 0.05—0.2 %-ным (в зависимости от типа клеток) раствором
Тритона Х-100. В качестве фиксатора в большинстве случаев исполь-
зуют 70—80 %-ный этанол. Фиксируют, приливая к суспензии
охлажденный 95 %-ный этанол. Перед окрашиванием клетки отмы-
вают от фиксатора. В ряде случаев (например, при проведении
цитометрии ДНК, РНК, белка) допускается отмытые от среды
142
Рис. 2. ДНК-гистограммы — распределение клеток по содержанию ДНК.
а — гистограмма без помех; б — гистограмма с помехами. / — поврежденные клетки; 2 — шум;
п} и Пз — номер канала. По оси абсцисс — содержание ДНК; по оси ординат — число клеток.
с сывороткой клетки окрашивать и анализировать непосредственно
в 25—30 %-ном этаноле на сбалансированном буфером солевом
растворе.
Приготовленная для анализа суспензия не должна содержать
больших комков и других частиц, которые могут засорить проточную
камеру. Слипшиеся клетки и осколки клеток ухудшают качество
гистограммы и затрудняют анализ. Поэтому часто требуется очистка
суспензии фильтрацией через металлическую сеточку с ячейками
до 100X100 мкм или через несколько слоев нейлоновой ткани,
а также дезагрегация комков из нескольких клеток. При работах на
цитометрах-анализаторах с диаметром выходного отверстия фор-
сунки проточной камеры 100—150 мкм и более достаточно бывает
визуального контроля суспензии и осторожной разбивки агрегатов
с помощью шприца с тонкой иглой.
Прописи методик ПЦМ-аиализа ।
Пропись № 1. Анализ содержания ДНК. К 0.8 мл клеточной>
суспензии на растворе версена (растворе Хэнкса, среде без сыво- '•
ротки) добавить последовательно 0.1 мл 1 %-ного Тритона Х-100,
0.02 мл бромистого этидия (1 мг/мл),0.04 мл оливомицина (1 мг/мл),
0.05 мл 0.3 М MgCh- Окрашивать 30—60 мин при комнатной
температуре, в холодильнике — более 1 ч, оптимально — 4—5 ч.
При окраске в холодильнике проба сохраняется до 2 сут. Если
необходим более оперативный анализ (в течение 5—10 мин),
целесообразнее использовать методы окраски с помощью Хёхст
33258 или DAPI.
Сохранность маточных водных растворов красителей в холодиль-
нике составляет для оливомицина 2—3 мес, для бромистого этидия —
до 6 мес.
Пропись № 2. Анализ синтеза ДНК. Приготавливается раствор
Хёхст 33258 в концентрации 10 мкг/мл на сбалансированном буфером
солевом растворе с 25 % этанола. Клетки, инкубированные в среде
143
с БДУ, собираются и после центрифугирования (400 g, 10 мин)
ресуспензируются в растворе красителя. Концентрация БДУ в среде,
необходимая для полного тушения флюоресценции Хёхст 33258,
зависит от партии используемой сыворотки и типа клеток. Она
может составлять до 10 мкг/мл и более, обычно 2—3 мкг/мл.
Пропись № 3. Определение доли живых и мертвых клеток.
Приготавливаются маточный раствор ФДА или с-ФДА в ацетоне
(10 мг/мл) и маточный раствор бромистого этидия в дистиллиро-
ванной воде (1 мг/мл). Для получения рабочего раствора ФДА
20 мкл маточного раствора добавляют к 5 мл сбалансированного
буфером солевого раствора. Клеточный осадок после центрифугиро-
вания (около 1.5 • 106 клеток) инкубируется в 0.5 мл раствора
ФДА 15 мин при 37 °C. Клетки отмываются в сбалансированном
буфером солевом растворе и,ресуспензируются в 1 мл этого раствора.
В суспензию с клетками добавляется 10 мкл маточного раствора
бромистого этидия. Анализ проводится через 5—10 мин.
Пропись № 4. Анализ содержания ДНК—общий белок. К 0.2 мл
фиксированной в 70—80 %-ном этаноле клеточной суспензии,
содержащей 5- 106 клеток, добавляется 4 мл раствора версена.
Приготавливается непосредственно перед использованием раствор
ФИТЦ (1 мкг/мл): ФИТЦ растворяется в абсолютном этаноле и
0.1 мл этого раствора добавляется к 10 мл раствора версена; 0.2 мл
раствора ФИТЦ на растворе версена добавляется к клеточной
суспензии. Через 5 мин 1 мл раствора бромистого этидия (46 мкг/мл)
также добавляется к клеточной суспензии. Через 2—3 мин добавля-
ется 0.2 мл раствора РНКазы (1 мг/мл на растворе версена) при
комнатной.температуре. Конечная концентрация бромистого этидия,
ФИТЦ и РНКазы — 8.5, 0.37 и 37 мкг/мл соответственно. Анализ —
через 5 мин после добавления РНКазы.
Пропись № 5. Анализ содержания ДНК—РНК [4, 5]. К 0.2 мл
клеточной суспензии (2 • 105 клеток) прибавляется 0.5 мл раствора,
содержащего 0.1 % (объем/объем) Тритона Х-100, 0.2 М сахарозы
и 10“4М ЕДТА в цитратно-фосфатном буфере (pH 3). Через 1 мин
прибавляется 1 мл раствора, содержащего 0.002 % акридинового
оранжевого (20 мкг/мл) ш 0.1 М NaCl в цитратно-фосфатном бу-
фере (pH 3.8). Время окрашивания 5 мин при комнатной температуре.
Анализ — сразу после окрашивания.
Пропись № 6. Статмокинетический метод. В среду с асинхронно
растущими клетками на стадии их логарифмического роста добавля-
ется колцемид (0.1—0.3 мкг/мл). Через определенные обычно равные
и составляющие 1—2 ч промежутки времени порции клеток (при-
мерно по 5 105 клеток) отбираются для анализа. Клетки отмываются
от среды центрифугированием (400 g, 10 мин). Окрашивание и
измерение ведется в соответствии с прописями № 1 или № 2. В резуль-
тате можно определить зависимость доли клеток в разных фазах
цикла от продолжительности инкубации с колцемидом (анализ
получающихся зависимостей см. [32, 33]).
144
Литература
1. Lindmo Т., Steen Н. В. Characteristic of a simple, high resolution flow cytometer
based on a new flow configuration // Biophys. J. 1979. Vol. 28. P. 33—44.
2. Arndt-Jovin D. Jovin T. M. Analysis and sorting of living cells according to
deoxyribonucleic acid content // J. Histochem. Cytochem. 1977. Vol. 25. P. 585—
589.
3. Dolbear F., Graizner H., Pallavichini M. G., Gray J. IF. FCM-measurement of
total DNA content and incorporated BrdUrd // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.
1983. Vol. 80. P. 5573—5577.
4. Traganos F., Darzynkiewicz Z., Sharpless T., Melamed M. R. Simultaneous
staining of ribonucleic and deoxyribonucleic acids in unfixed cells using AO in
a flow cytofluorometric system // J. Histochem. Cytochem. 1977. Vol. 25. P. 46—56.
5. Darzinkiewicz Z., Evenson D. P., Steano-Coico L. et al. Correlation between cell
cycle duration and RNA content // J. Cell. Physiol. 1979. Vol. 100. P. 425—438.
6. Pollack A., Prudhomme D., /rvin G. L. et al. Flow cytometric analysis of RNA
content per cell using pyronin-Y and methyl green // Abstr. VIII Conf, on analytical
cytology and cytometry. New Hampshire, 1981. P. 113.
7. Crissrnan H. A., Darzinkiewicz Z., Tobey R. A., Steinkamp L. A. Correlated
measurements of DNA. RNA-and protein in individual cells by flow cytometry //
Science. 1985. Vol. 228. P. 1321 — 1324.
8. Freeman D. A., Crissrnan H. A. Evaluation of six fluorescent protein stains for use
in flow microfluorometry // Stain Technol. 1975. Vol. 50. P. 279—284.
9. Stahr M., Vogt-Schaden M., Knobloch M. et al. Evaluation of eight fluorochrome
combinations for simultaneous DNA-protein flow analysis // Stain Technol. 1978.
Vol. 53. P. 205—215.
10. Hawkes S. P., Bartholomew J. C. Quantitative determination of transformed cells
in a mixed population by simultaneous fluorescence analysis of cell surface and
DNA in individual cells // Proc. Nat. Acad. Sci.USA. 1977. Vol. 74. P. 1626—1630.
11. Smith R. E., Dean P. N. A study of acid phosphatase and dipeptidyl aminopepti-
dase II in monodispersed anterior pituitary cells using flow cytometry and
electron microscopy // J. Histochem. Cytochem. 1979. Vol. 27. P. 1499 — 1504.
12. Dolbear F. A., Phares IF. Naphtol AS-BI phosphatase and naphtol AS-BI D-glucu-
ronidase in Chinese hamster ovary cells: biochemical and flow cytometric studies //
J. Histochem. Cytochem. 1979. Vol. 27. P. 120—124.
13. Dolbear F. Dynamic assay of.enzyme activities in single cells by flow cytometry /,/
J. Histochem. Cytochem. 1979. Vol. 27. P. 1644—1646.
14. Jones К H., Senft J. A. An improved method to determine cell viability by simulta-
neous staining with fluorescein diacetate — propidium iodide // J. Histochem.
Cytochem. 1985. Vol. 33. P. 77—79.
15. Loken M. R., Parks D. R., Herrenberg L. A. Two-color immunofluorescence
using fluorescence-activated cell sorter // J. Histochem. Cytochem. 1977. Vol. 25.
P. 899—907.
16. Kruth H. S., Braylan R. C., Benson N. A., Hoarse V. A. Simulteneous analysis
of DNA and cell surface immunoglobulin in human В-cell lymphomas by flow
cytometry // Cancer Res. 1981. Vol. 41. P. 4895—4899.
17. Leary J. F., Todd P. Laser eytophotometric detection of variations in spatial
distribution of concanavalin A cell surface receptors following vrral infection //
J. Histochem. Cytochem. 1977. Vol. 25. P. 908—912.
18. Kraemer P. M., Tobey R. A., VanDilla M. A. Flow microfluorometric studies
of lectin binding to mammalian cells // J. Cell. Physiol. 1973. Vol. 81. P. 305—311.
19. Udkoff R., Horman A. Polarization of fluorescein in single cells //J. Histochem.
Cytochem. 1979. Vol. 27. P. 49—55.
20. Price С. B., McCutcheon M. J., Taylor IF. B., Miller R. G. Meassurement of cytoplas-
mic fluorescence depolarization of single cells in a flow system // J. Histochem.
Cytochem. 1977. Vol. 25. P. 597—600.
21. Shapiro H. M., Hatale P. H., Kamentsky L. A. Estimation of membrane potentials
of individual lymphocyte by flow cytometry // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979.
Vol. 76. P. 5728 —5730.
22. Shapiro H. M., Strom T. B. Electrophysiology of T lymphocyte cholinergic recep-
tors // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 4317—4321.
10 Зак. 1789
145
23. Visser J. W. M., Jougeling A. A. M., Tanke H. J. Intracellular pH-determination
by fluorescence meassurements // J. Histochem. Cytochem. 1979. Vol. 27. P. 32—35.
24. Valet C., Raffael A., Moroder L. et al. East intracellular pH-determination in
single cells by cytometry // Naturwissenschaft. 1981. Bd 68. S. 265—266.
25. Тертое В. В., Орехов А. Н., Рудченко С. А. и др. Определение содержания
липидов в отдельной клетке с помощью проточной цитофлюорометрии // Докл.
АН СССР. 1984. Т. 274. С. 1238—1241.
26. Darzinkiewicz Z., Traganos F., Scharpless T., Melamed M. R. Recognition of cells
in mitosis by flow cytofluorometry //J. Histochem. Cytochem. 1977. Vol. 25.
P. 875—880.
27. Darzinkiewicz Z. Recent advance in the use of flow cytometry to study the cell
cycle // Cell Tissue Kinet. 1983. Vol. 16. P. 521—527.
28. Crissman H. A., Egmond J. V., Holdrinet R. S. et al. Simplified method for DNA
and protein staining of human hematopoietic cell samples // Cytometry. 1981. Vol. 2.
P. 59—62.
29. Latt S. A. Fluorometric detection of deoxyribonucleic acid synthesis; possibilities
for interfacing bromodeoxyuridine dye techniques with flow fluorometry //
J. Histochem. Cytochem. 1977. Vol. 25. P. 913—926.
30. Fried J., Perez A. G., Clarkson B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell
cycle distributions using propidium iodide //J. Cell Biol. 1976. Vol. 71. P. 172—181.
31. Baisch H., Beck P., Christensen 1. J. et al. A comparison of mathematical methods
for the analysis of DNA histograms obtained by flow cytometry // Cell Tissue
Kinet. 1982. Vol. 15. P. 235—241.
32. Кириллова T. В., Розанов Ю. M., Мартынова И. M. Влияние УФ-облучения на
митотический цикл клеток китайского хомячка с различной УФ-чувствительностью.
2. Временные зависимости при блокированном делении клеток // Цитология.
1985. Т. 12. С. 1380—1387.
33. Dosik G. М., Barlogie В., White R. A. et al. A rapid automated tatmokinetic
method for determination of in vitro cell cycle transit times // Cell Tissue Kinet.
1981. Vol. 14. P. 121 — 134.
34. Bohmer R. M. Flow cytometric cell cycle analysis using the quenching of 33258
Hoechst fluorescens by bromodeoxyuridine incorporation // Cell Tissue Kinet.
1979. Vok.12. P. 101 — 110.
35. Taylor W., Milthorpe В. K- An evaluation of DNA fiuorochromes, staining techni-
ques and analysis for flow cvtometry // J. Histochem. Cytochem. 1980. Vol. 28.
P. 1224—1232.
36. Krishan A. Rapid flow cytofluorometric analysis of mammalian cell cycle by
propidium iodide staining // J. Cell Biol. 1975. Vol. 66. P. 188—193.
37. Tate E. H., Wilder M. E., Gram L. S., Wharton W. A method for staining 3T3 cell
nuclei with propidium iodide in hypotonic solution // Cvtometry. 1983. Vol. 4.
P. 211—215.
38. Crissman H. A., Stewenson A. P., Orlicky D. Ktssane R. J. Detailed studies
of the application of three fluorescent antibiotics for DNA staining in flow cyto-
metry // Stain Technol. 1978. Vol. 53. P. 321—330.
39. Jensen R. H. Chromomycine A3 as a fluorescent probe for flow cytometry of human
gynecologic samples // J. Histochem. Cytochem. 1977. Vol. 25. P. 573—579.
40. Latt S. A., Georg Y. S., Gray J. W. Flow cytometric analysis of bromodeoxyuridine
substituted cells stained with 33258 Hoechst // J. Histochem. Cytochem. 1977.
Vol. 25. P. 927 —934.
41. Otto F. J., Oldiges H., Gohde W., Jain V. K. Flow cytometric measurement of nuclear
DNA content variation as a potential in vivo mutagenicity test // Cytometry.
1981. Vol. 2. P. 189—191.
42. Gill J. E., Jotz M. M. Deoxyribonucleic acid cytochemistry for automated cytology //
J. Histochem. Cytochem. 1974. Vol. 22. P. 470—476.
43. Barlogie B., Spitzer G., Hart J. S. et al. DNA histogram analysis of human hemo-
poietic cells // Blood. 1976. Vol. 48. P. 245—258.
.«st
146
Часть 3
Клеточная и генная инженерия
Получение генетически
маркированных клеточных штаммов
К. В. Сальников
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
.Генетические маркеры широко используются в современной моле-
кулярной и клеточной биологии, генетике соматических клеток для
получения микро- и полноклеточных гибридов и изучения типа насле-
дования признака, картирования хромосом, получения гибридом,
продуцирующих моноклональные антитела, для изучения различных
аспектов ДНК-трансформации. Во всех перечисленных примерах
используются свойства генетической комплементации. Варианты с из-
мененной активностью ферментов или количественно измененным
соотношением тех или иных белков сами по себе являются ценной
моделью для изучения механизмов регуляции метаболических про-
цессов. Важная задача биотехнологии — отбор клеток-продуцентов.
В настоящее время из постоянных и первичных клеточных линий
с использованием различных селективных систем выделены ауксо-
трофы и термочувствительные варианты, а также варианты, обла-
дающие устойчивостью к ядам и антибиотикам. У прокариот такие
варианты возникают, как правило, вследствие точковых мутаций
(замены или делении пар оснований), у соматических клеток in vivo
и in vitro это не всегда так. Наблюдаемые изменения возникают
вследствие целого ряда причин: это могут быть как замены или
делении пар оснований в структурном гене? так и дупликации и
амплификации этих генов, стабильные изменения экспрессии генов,
возникающие, например, вследствие хромосомных перестроек или
встраивания выше или ниже гена вирусов, вирусоподобных элементов
или мобильных генетических элементов. Изменения экспрессии генов
могут зависеть от стабильно наследуемых изменений метилирования
пар оснований. Изменения в структуру белка могут быть внесены,
наконец, на уровне стабильного изменения сплайсинга РНК или
посттрансляционной модификации самого белка. О том, что лежит
в основе явлений, контролирующих созревание иРНК или белка, пока
можно только догадываться. Известно огромное число вариантов
соматических клеток со специфическими изменениями, генетическая
природа которых не выяснена, однако многие из них используются
как генетические маркеры главным образом из-за стабильного насле-
дования этих изменений. Наиболее значительным по числу входящих
в него вариантов классом генетических маркеров является класс
10’ 147
клеток, устойчивых к ядам и антиметаболитам. Клетки этого класса
изучены более подробно и чаще используются в работах по генетике
соматических клеток (см. обзоры: [1—3]).
Селекция клеток на устойчивость к ядам
и антиметаболитам. Общие принципы
Способы селекции. Как указывалось выше, генетическая природа
используемых маркеров может быть различна. По-видимому, тип
получаемых вариантов зависит от способа селекции. Следующие
способы могут быть использованы для получения устойчивых к ядам
вариантов соматических клеток: 1) массовую культуру чувствитель-
ных клеток обрабатывают ядом в определенной концентрации, так
что большая часть клеток погибает и выживает незначительная
часть популяции с частотой 10~4—10“6; такая селекция называется
одношаговой, она не дает возможности получать высокоустой-
чивые варианты; 2) популяции клеток обрабатываются ядом в кон-
центрации, при которой погибает только некоторая часть клеток
и через несколько клеточных генераций почти все клетки становятся
устойчивыми к яду в данной концентрации; при этом способе
селекции, последовательно повышая концентрации яда и повторяя
циклы, можно получить высокоустойчивые варианты, такая селекция
называется многошаговой. Вариантом второго способа селек-
ции может быть чередование культивирования клеток на среде
с ядом и без яда. Подращивая выжившие после обработки ядом
клетки на среде без яда, можно также получать высокоустойчивые
варианты^* Изменения в геноме клеток, полученных в результате
одношаговой и многошаговой селекции, могут быть различны. Во всех
случаях очень важно, какое время вновь полученные варианты
культивируются на среде с селективным агентом.
Посев клеток для последующего отбора. Примерная схема селек-
ции устойчивых вариантов представлена на рисунке. При поста-
новке эксперимента по такой схеме можно подсчитать спонтанную
и индуцированную частоту обнаружения устойчивых вариантов.
В зависимости от задач, стоящих перед исследователем, можно
использовать отдельные элементы этой схемы.
При посеве клеток для последующего отбора следует помнить,
что два параметра существенно влияют на частоту выявления
устойчивых к ядам вариантов — концентрация селективного агента
и исходная плотность клеточной культуры. Концентрацию селектив-
ного агента следует подбирать таким образом, чтобы клоны рези-
стентных клеток обнаруживались с частотой, соответствующей мута-
ционной (10“4—10”s). Селективный агент при обработке клеток
в заданной концентрации должен убивать основную массу клеток,
не позволяя им размножаться. К агентам с таким немедленным
действием в используемых концентрациях относятся 8-азагуанин,
уабаин, пактамицин и некоторые другие. Однако ряд агентов, исполь-
зуемых в таких концентрациях, при которых клоны устойчивых
клеток обнаруживаются с мутационной частотой, не способен сразу
148
Популяция клеток
Посев для определения
эффективности клонирования
(300 клеток, 60 мм чашки
Петри, 3 повторности)
Посев для обработки
мутагеном (3*10° клеток,
100 мм чашки Петри,
3 повторности)
Посев на селекцию (2-3)* 1О^ клеток,
100 мм чашки Петри, Ю повторностей)
10-12 сут
фиксация, окраска и
подсчет клонов
2 сут
Обработка мутагеном
для определения
Посев
эффективности клониро-
вания (числа жизнеспо-
собных клеток)
(300 клеток, 60 мм
чашки Петри, 3 повтор-
ности)
Рост клеток в течение
сут, 2 пересева
7
Посев для определения
эффективности клони-
рования
14-18 сут,
смена среды каждые
4 сут
Фиксация, окраска и подсчет
клонов или, если необходимо,
выделение клонов
Посев на селекцию (2-3)* 10° кле-
ток, 100 мм чашки Петри,
10 повторностей
10-12 сут
Фиксация, окраска и
подсчет клонов
14-18 сут,
смена среды
каждые 4 сут
фиксация, окраска и подсчет
клонов. Если необходимо вы-
деление клонов
Примерная схема селекции генетических маркеров.
остановить размножение клеток. Оно на первом этапе селекции
в присутствии селективного агента сильно усложняет генетический
анализ, так как в этом случае нельзя исключить влияние селектив-
ного агента как индуктора на частоту выявления устойчивых вариан-
тов и трудно оценить число устойчивых вариантов предсуществую-
щих в исходной популяции клеток. Для определения оптимальной
концентрации селективного агента для каждой концентрации 'засе-
вают по 5 чашек Петри диаметром 60 мм, по 200 клеток в каждой,
и обрабатывают различными концентрациями агента. Например,
на одну группу из 5 чашек приходится 1 10~3 М агента, на дру-
гую— 5 • 10-3 М, на третью— 1 • 10-2 М и т. д. Такой прием
дает возможность оценить частоту выявления устойчивых вариантов
до 10~3. Для определения более низких частот порядка 10-4—10~5
клетки высевают в 100 мм чашки Петри, после прикрепления клеток
в среду добавляют селективный агент в заданной концентрации,
на одну концентрацию агента можно взять 2—3 чашки. Среду
во всех чашках меняют раз в 4 сут. Увеличение начальной плотности
посева (больше 104—105 клеток на чашку) в этом случае может
привести к изменению частоты выявления устойчивых вариантов.
Известно, например, влияние плотности клеточной культуры на спо-
собность тиогуанин-резистентных клеток образовывать клоны в при-
сутствии тиогуанин-чувствительных клеток, так называемые опыты
по реконструкции. Небольшое количество резистентных клеток (200)
смешивали с клетками дикого типа и с разной начальной плот-
ностью (103—106 клеток на чашку) высевали в 100 мм чашки Петри
для селекции. Клоны мутантных клеток не обнаруживались при
плотности'свыше 5 • 105 клеток на чашку. При изменении начальной
плотности посева от 103 до 105 не было обнаружено практически
никакой разницы в числе обнаруживаемых клонов резистентных
клеток [4]. К причинам ингибирования роста резистентных клонов
в плотной культуре могут быть отнесены высокая токсичность продук-
тов распада гибнущих клеток .и способность чувствительных клеток
метаболизировать яды, превращая их в токсические для резистентных
клеток соединения.
Частоту обнаружения устойчивых вариантов можно определить
по формуле F=C/EN, где F—частота обнаружения устойчивых
вариантов, С — общее число клонов устойчивых клеток, Е — эффек-
тивность клонирования тестируемых клеток, выраженная в долях
единицы, N — число посеянных клеток.
Обработка клеток мутагенами. При обработке клеток мутагенами
и последующем посеве для отбора следует помнить, что три
параметра существенно влияют на частоту обнаружения устойчи-
вых вариантов: 1) доза мутагена (концентрацияхвремя), 2) плот-
ность посева (для обработки мутагеном и для посева на селекцию) и
3) время проявления исследуемого признака после обработки мута-
геном (концентрация селективного агента уже выбрана и является
постоянной величиной).
1. Доза мутагена. Так как наблюдается хорошая корреляция
между мутагенной и токсической концентрацией химического соеди-
150
нения, то дозу мутагена можно подобрать путем определения эф-
фективности клонирования клеток, обработанных мутагеном в раз-
ных концентрациях. Для этого следует, например, в качестве исход-
ного взять 0.01 М мутаген, затем, разводя его, получить ряд
градуально уменьшающихся концентраций. Посеять по 200—300 кле-
ток на чашку, после прикрепления клеток добавить мутаген, на
каждую концентрацию мутагена должно приходиться по 3 чашки.
Клетки инкубировать в присутствии мутагена в течение заданного
времени (см. ниже). Выросшие клоны сосчитать и построить кривую
выживаемости на основе отношения эффективности клонирования
в процентах (логарифмическая шкала) к концентрации мутагена
(в М или мкг/мл, линейная шкала). Концентрация мутагена,
приводящая к репродуктивной гибели 30—80 % клеток, как
показывает анализ литературы, является оптимальной для индукции
мутантных вариантов. Время действия мутагена стараются подо-
брать таким образом, чтобы агент присутствовал в среде на
протяжении клеточного цикла. Такие условия подходят для
стабильных мутагенов типа этил-метансульфоната (ЭМС). Од-
нако в большинстве случаев из-за нестабильности мутагенов время
приходится уменьшать. Бессмысленно обрабатывать клетки метил-
нитрозомочевиной 16—18 ч, так как обычно она распадается за
0.5—1 ч. В присутствии сыворотки очень нестабильны такие часто
используемые мутагены,как N-метилнитронитрозогуанидин (МННГ)
и М-ацетокси-2-ацетиламинофлюорен (2-НОФ) [5]. Поэтому обра-
ботку клеток мутагенами проводят, как правило, от 0.5 до 4 ч в бес-
сывороточной среде.
2. Плотность посева и способы обработки. Обработку клеток
мутагенами можно проводить как в монослое, так и в суспензии.
Для этого клетки высевают в стеклянные или пластиковые чашки
Петри или во флаконы Карреля, начальная плотность посева (10—
15) • 103 клеток на 1 см2 (клетки следует обрабатывать тогда,
когда плотность культуры составляет примерно */з—‘/г конфлюэнт-
ной, т. е. на стадии логарифмического роста). Через 2 сут после
посева среду удаляют, клетки промывают средой без сыворотки и
добавляют ее вместе с мутагеном в определенной концентрации.
.. При краткосрочных обработках клетки мржно инкубировать с му-
тагеном в растворе Хэнкса, при более длительных сроках обработки
и в тех случаях, когда сыворотка не инактивирует мутаген, клетки
обрабатывают мутагеном в среде в присутствии сыворотки. Мута-
гены, как правило, плохо растворимы в водных растворах, поэтому
их сначала растворяют в таких растворителях, как ацетон, этиловый
спирт, ДМСО, а затем в фосфатном буфере, растворе Хэнкса или
среде без сыворотки. В контрольные чашки Петри вносят такой же
объем растворителя, как в чашки, в которых производится обра-
ботка мутагеном. Инкубация клеток с мутагеном проводится при
37 °C в обычном термостате или, если клетки посеяны в чашки Петри,
в инкубаторе с повышенным содержанием СОг. Время обработки
таким мутагеном, как ЭМС, составляет 16—18 ч (200—300 мкг/мл),
для МННГ — 3—4 ч (1.5—3 мкг/мл). После обработки мутагеном
151
среда осторожно удаляется пипеткой, клетки промывают раствором
Хэнкса или средой без сыворотки, трипсинизируют и высевают
на свежую среду с сывороткой. Часть клеточной суспензии высевают
в чашки Петри для определения эффективности клонирования
(числа жизнеспособных клеток).
При обработке клеток в суспензии их снимают с подложки
смесью растворов трипсина и версена, центрифугированием отделяют
от снимающей жидкости и промывают раствором Хенкса или средой
без сыворотки. Суспензию клеток или суспензионную культуру поме-
щают в силиконизированный стеклянный сосуд. В среду добавляют;
мутаген в определенной концентрации (так как снятые с подложки
клетки более чувствительны к повреждающему действию мутагена,
его концентрация может быть меньше, чем та, которая использова-
лась для обработки клеток в монослое, однако в любом случае
выживаемость клеток после обработки мутагеном является крите-
рием для выбора концентрации мутагена). Клетки помещают в тер-
мостат, обработка производится при мягком покачивании или встря-
хивании суспензии клеток. Такой способ позволяет обработать боль-
шое число клеток, не загрязняя при этом мутагеном чашки или
флаконы, большие количества клеток особенно нужны в тех случаях,
когда определяют время, необходимое для оптимального проявле-
ния исследуемого признака.
3. Выбор времени проявления признака зависит от фиксации
индуцированных мутагеном повреждений в ДНК и от периода
полужизни белка-фермента. Например, время полужизни ГГФРТ
составляет примерно 24 ч, это означает, что на 7-е сутки коли-
чество нормального, немутантного, продукта будет составлять
’/|28 (1 /2?) от исходного уровня. Обычно тестируют следующие
сроки: 1) клетки высевают на селекцию сразу после обработки
мутагеном (0 сут), 2) клетки высевают на 3—4-е сутки после
обработки мутагеном (раньше этого срока клетки не пересевают),
3) клетки высевают на 7—9-е сутки, в середине этого срока клетки
пересевают 1—2 раза.
Характеристика полученных вариантов. Способность клеток
расти на среде в присутствии токсических концентраций селектив-
ного агента не является свидетельством того, что полученные ва-
рианты — истинные мутанты. Для этого вновь полученные варианты
оценивают по следующим параметрам: 1) частота обнаружения
вариантов (она должна быть низкой, 10-4—10-6); 2) стабильность
наследования исследуемого признака в неселективных условиях
(признак должен стабильно сохраняться в ряду клеточных поколе-
ний в отсутствие селективного агента); 3) влияние предваритель-
ной обработки мутагенами на частоту обнаружения исследуемых
вариантов (мутагены должны повышать частоту обнаружения
устойчивых вариантов); 4) частота обнаружения ревертантов; 5) от-
сутствие или изменение активности фермента в том случае, если
селективный агент действовал непосредственно на фермент. Если
варианты удовлетворяют всем этим требованиям, то с высокой
вероятностью можно говорить о том, что речь идет об истинных
152
мутантах со стабильным фенотипом. В повседневной работе, когда
целью является получение генетически маркированного штамма,
главным является стабильность наследования признака. Для ее
оценки следует определить уровень устойчивости. Лучше всего это
сделать, используя критерий летальной дозы (LD). Например,
LD2o — это такая концентрация агента, при которой эффективность
клонирования устойчивых клеток снижается на 20 %. Используемые
значения LD могут быть разными, однако при их выборе принимают
во внимание тот факт, что кривые выживаемости имеют, как правило,
S-образную форму. Верхнее и нижнее значения этой кривой не могут
быть определены с высокой точностью, поэтому предпочтительно
работать со значениями, приходящимися на середину кривой,—
LD2o, LD50 или LD37. Устойчивые клетки сразу после их выделения
культивируют в неселективных условиях в течение 30—50 клеточных
поколений и сравнивают значения LD сразу после выделения и через
15, 30 и 50 клеточных поколений. Снижение LD по мере культиви-
рования клеток в неселективных условиях будет указывать на потерю
признака.
Примеры вариантов клеточных линий, устойчивых к ядам
Несмотря на огромное разнообразие вариантов клеточных линий
по типу устойчивости, они могут быть сведены к трем группам:
1) изменение мишени; 2) изменение проницаемости плазматической
мембраны к селективному агенту; 3) увеличение количества нормаль-
ной или измененной формы белка мишени вследствие увеличения
дозы гена, кодирующего этот белок.
Устойчивость к аналогам нуклеотидов. Цитотоксическое действие
8-азагуанина было использовано для того, чтобы получить первые
устойчивые к яду клетки в культуре [6]. Мутанты этого типа
интенсивно изучались [5, 7—10], полученные данные внесли значи-
тельный вклад в генетику соматических клеток. Сами по себе
аналоги гуанина — 8-азагуанин и 6-тиогуанин — не токсичны для
клеток до тех пор, пока фермент ГГФРТ не превратит их в токсич-
ные нуклеозиды. У клеток млекопитающих имеются две фосфорибо-
зилтрансферазы, одна специфичная для гипоксантина, гуанина и
ксантина — ГГФРТ, другая специфическая для аденина — АФРТ.
Оба фермента участвуют в синтезе пуриновых нуклеотидов de novo
и не являются жизненно необходимыми для размножения клеток
в культуре. Ген ГГФРТ локализован на Х-хромосоме клеток грызу-
нов и человека. В результате отбора клеток на яде (8-азагуанин
или 6-тиогуанин) некоторые клетки способны выживать и давать
начало колониям, так как у них отсутствует ГГФРТ и они не способны
превращать аналоги в токсичные соединения.
Мутации, затрагивающие ген, кодирующий ГГФРТ, широко
используются в генетике соматических клеток по следующим причи-
нам: 1) устойчивые клетки имеют стабильный фенотип и могут быть
получены практически из любой клеточной линии, включая первич-
ные; 2) для селекции устойчивых клеток создана специальная
153
среда ГАТ, в состав которой входят гипоксантин, аминоптерин и
тимидин. Нормальные клетки размножаются на этой среде, а клетки,
лишенные ГГФРТ, не могут из-за того, что аминоптерин ингибирует
синтез пуринов и пиримидинов de novo; 3) обработка мутагенами
значительно повышает число устойчивых вариантов; на различных
клеточных линиях были разработаны модельные системы с использо-
ванием перехода ГГФРТ+/ГГФРТ~ для количественной оценки мута-
генного действия химических соединений [11 — 12]; 4) ГГФРТ была
выделена и очищена, что сделало возможным получение антител
и более подробное исследование мутантов, учитывая не только ак-
тивность фермента, но и наличие иммунопреципитируемого белка.
Вторая фосфорибозилтрансфераза (АФРТ), ответственная за фосфо-
рибозилирование аденина, также превращает аналоги (8-азааденин
и 2,6-диаминопурин) в токсичные соединения [13, 14]. За аденозин
в клетке конкурируют два фермента — аденозинкиназа и аденозин-
деаминаза, так что концентрация аденозина в клетке зависит от ра-
боты этих двух ферментов. Изменение аденозинкиназной активности
может быть получено при селекции клеток на устойчивость к по-
вышенным концентрациям аденозина или на устойчивость к таким
агентам, как туберцидин (7-деазааденозин) или 6-метилтиопурин
[15]. Из пиримидиновых аналогов наиболее часто для селекции
используют 3-фтортимидин, 5-бромдезоксиуридин, 5-йоддезоксиури-
дин и 5-фтордезоксиуридин. Клетки, устойчивые к этим агентам,
лишены тимидинкиназы (ТК“), поэтому аналоги не фосфорили-
руются и не включаются в ДНК [16, 17] .
Мышиные ТК~-клетки широко применялись в качестве одного
из родителей при гибридизации соматических клеток и наряду
с ГГФРТ“-клетками использовались для картирования генов на хро-
мосомах человека. На ТК~-клетках была отработана методика введе-
ния в клетки чужеродной ДНК, для этого использовался ген тими-
динкиназы вирусного происхождения [18].
Устойчивость клеток к 6-азауридину и 5-фторуридину обусловли-
вается отсутствием в устойчивых клетках уридинкиназы — фермента,
фосфорилирующего уридин или его аналоги [19, 20]. Устойчивость
к 5-фторурацилу связана с изменением активности оротидилдекар-
боксилазы и оротатфосфорибозилтрансферазы [21].
Устойчивость к ингибиторам синтеза нуклеотидов de novo. Ме-
тотрексат, аналог дигидрофолиевой кислоты, прочно связывается
с ферментом ДГФР, который превращает дигидрофолат, образую-
щийся в тимидилатсинтетазной реакции, в тетрагидрофолат. В ре-
зультате прочного связывания метотрексата с ферментом количество
работающего в клетке фермента уменьшается. При селекции на
устойчивость к метотрексату могут быть получены три типа устой-
чивых клеток. Клетки 1-го типа характеризуются изменением ди-
гидрофолатредуктазы, клетки 2-го типа — измененной проницае-
мостью к агенту, клетки 3-го типа — повышенной активностью
измененного фермента, что обусловлено амплификацией дигидро-
фолатредуктазного гена [22—24]. Пять из шести ферментов син-
теза УМФ de novo находятся в двух мультиферментных комплексах.
154
Первые три фермента представляют комплекс КАД (карбомилфос-
фатсинтетаза, аспартаттранскарбамилаза и дигидрооротаза) и коди-
руются, по-видимому, одним геном. В результате селекции на устой-
чивость к N-фосфонацетил-Е-аспартату, специфическому ингибитору
аспартаттранскарбамилазы, образуются варианты клеток, продуци-
рующие избыточное количество аспартаттранскарбамилазы. Два
других фермента, входящих в комплекс КАД, также синтезируются
в избыточном количестве. Перепроизводство ферментов комплекса
КАД в устойчивых клетках объясняется амплификацией гена данного
локуса. Число копий гена может быть увеличено более чем
в 100 раз [25].
Устойчивость к ингибиторам транскрипции. Взаимодействуя
с РНК-полимеразой II, а-аманитин подавляет элонгацию мРНК.
Устойчивость клеток к этому агенту возникает благодаря измене-
нию субъединицы РНК-полимеразы II. Устойчивые клетки были полу-
чены из различных клеточных линий [26, 27].
Устойчивость к ингибиторам белкового синтеза. Устойчивость
к эметину и дифтерийному токсину — веществам, специфически по-
давляющим белковый синтез, возникает благодаря изменению
в рибосомальной 40S субъединице и в факторе элонгации-2 соответ-
ственно [28, 29]. Пактамицин, как и эметин, взаимодействует
с 40S субъединицей рибосом. Устойчивость к этому агенту обуслов-
ливается, однако, сниженным поступлением агента в клетку [30].
Устойчивость к агентам, затрагивающим митохондриальные
функции. Устойчивость к хлорамфениколу и олигомицину, подавляю-
щим соответственно белковый синтез на митохондриальных рибосо-
мах и работу митохондриальной АТФазы, наследуется как цитоплаз-
матический признак и обусловливается изменениями тех локусов
митохондриальной ДНК, которые кодируют соответствующие
гены [31, 32].
Устойчивость к агентам, затрагивающим мембранные функции.
Уабаин проявляет свое токсическое действие, подавляя работу
Na+/К+-АТФазы. Варианты, устойчивые к действию этого агента,
могут быть отобраны из культур клеток мыши, хомячка и человека
[33—35]. Во всех выше указанных случаях обнаружено изменение
субъединицы №+/К+-АТФазы. Недавно были описаны клетки СНО,
устойчивые к уабаину, в которых Na +/К+-АТФаза не изменена [36].
Клетки, устойчивые к лектинам, являются мембранными мутантами,
так как все они имеют изменения активности специфических гли-
козилтрансфераз и как следствие аномально гликозилированные
гликопротеины и гликолипиды плазматической мембраны. Мутанты
отличаются от клеток дикого тцпа по связыванию с гормонами,
токсинами, ростовыми факторами, а также по межклеточным взаимо-
действиям (подробнее см. обзор: [3]).
Варианты с неспецифически Измененной проницаемостью плазма-
тической мембраны могут быть также получены при отборе на устой-
чивость к колхицину, винбластийу, винкристину, актиномицину D,
адриамицину, бромистому этидию (БЭ), к агентам, не действующим
специфически на плазматическую мембрану и имеющим другие
155
Генетические ж биохимические характеристики некоторых генетических маркеров
Клеточные линии Селективный агент Механизм токсического действия селективного агента
L, V79, СНО.диплоидные фибробласты человека 8-азагуанин, 6-тиогуа- нин Ингибирование de novo пурино- вого биосинтеза фосфорили- рованными продуктами селек- тивного агента
L, L5178y, СНО,диплоид- ные фибробласты человека 2,6-диаминопурин, 2-фтораденин, 8-аза- аденин То же
L, L5178y Избыток тимидина, 5-бромдезоксиуридин, 3-фтортимидин Включение в ДНК, ошибки при синтезе, хроматидные разрывы
СНО, ЗТ6 Туберцидин, избыток аденина Включение в ДНК и РНК
Крысиная гепатома Дезоксикоформицин Подавление активности адено- зиндеаминазы
S-49 6-азауридин Фосфорилированный продукт подавляет активность орота- дилатдекарбоксилазы
S-49 5-фторурацил Оротатфосфорибозилтрансфе- раза превращает агент в ток- сичный продукт
СНО, L 12П0 мышиная лейкемия Метотрексат Прочное связывание с ДГФР
ЗТЗ, СНО, 3T6.USll.78y, CHL, S-180 > То же
СНО Афидиколин Ингибирование активности ДНК-полимеразы
СНО, ВККдДиплоидные фибробласты человека а-Аманитин Ингибирование активности РНК-полимеразы II
CHL, СНО Актиномицин D Ингибирование активности РНК-полимераз
СНО, L Бромистый этидий Интеркаляция между парами оснований ДНК, имеются другие мишеии в клетке
СНО Эметин Связывание с 40S рибосо- мальной субъединицей
СНО Пактамицин Ингибирование белкового син- теза, связывание с 40S рибо- сомальной субъединицей
СНО, КВ Дифтерийный токсин Ингибирование белкового син- теза. АДФ рибозилирование фактора элонгации 2
156
Биохимические изменения в устойчивых клетках Генетические харак- теристики признака Влияние изменений на жизнедеятель- ность клеток Литературный источник
Уменьшение активности фер- Рецессивный, Не влияет [5, 9]
мента ГГФРТ сцепленный с Х-хромосомой *
Уменьшение активности фер- Рецессивный, [14, 40]
мента АФРТ хромосома 16 х>
Уменьшение активности ТК Хромосома 17 » [41, 42]
Уменьшение активности АК ^Рецессивный, хромосома 10 » [15, 43]
Увеличение количества фер- — [44]
мента в клетке вследствие
амплификации гена, коди- рующего фермент
Уменьшение активности орота- — [20]
дилатдекарбоксилазы
Уменьшение активности оротат-i Хромосома 3 [20]
фосфорибозилтрансферазы
Уменьшение транспорта мето- Рецессивный [22, 45]
трексата в клетку
Увеличение количества фер- Неполный домн- Влияет [22—24]
мента в клетке вследствие нантный, хро-
амплификации гена, коди- рующего фермент мосома 5
Изменение субъединицы ДНК- Доминантный > [46]
-полимеразы. Уменьшение связывания с ингибитором
Изменение субъединицы РНК- Неполный доми- > [26, 27]
полимеразы 11. Уменьшение связывания с ингибитором нантный
Изменение проницаемости Доминантный £ [47, 48]
мембраны к яду. Амплифика- ция генов, кодирующих белки плазматической мембраны
Изменение в проницаемости — » [48, 49]
мембраны к яду
Изменение 40S рибосомальной Рецессивный, [28, 50]
субъединицы хромосома 5
Изменение проницаемости Неполный доми- [30]
к яду нантный
Специфическое изменение фак- Доминантный, [51]
тора элонгации 2 хромосома 19
157
Клеточные линии Селективный агент Механизм токсического действия селективного агента
СНО Дифтерийный токсин • Ингибирование белкового син- теза. АДФ рибозилирование фактора элонгации 2
СНО СНО, L, гепатома XXI 1а Подофиллотоксин Колхицин Ингибирование сборки микро- трубочек То же
V79 Амфотерицин В Ингибирование метаболизма холестерина
СНО, L HeLa, V79, дип- лоидные фибробласты человека Уабаин Ингибирование активности На + /К+-АТФазы
Примечание.* — указаны номера хромосом человека.
мишени в клетке. В этом случае устойчивость к антиметаболитам
обусловлена изменением проницаемости плазматической мембраны
устойчивых клеток сразу к целому ряду токсичных агентов. В устой-
чивых клетках недавно обнаружены амплификации генов, кодирую-
щих мембранный гликопротеин с молекулярной массой 170 000 и
цитозольный белок с молекулярной массой 21 000, которые, по-види-
мому, обеспечивают повышенный синтез этих белков в устойчивых
клетках [37—39].
В таблице представлены примеры вариантов клеточных линий,
устойчивых к ядам, и некоторые их характеристики. Эти характе-
ристики включают используемый селективный агент, механизмы
токсичности селективных агентов, биохимическую основу устойчи-
вости, тип наследования признака устойчивости в гибридных клетках
и локализацию на хромосомах человека, если она известна.
Примеры селекции клеток
Селекция клеток L929 на устойчивость к 8-азагуанину (культура
клеток не должна быть заражена микоплазмой): 1) определить
эффективность клонирования исходной популяции (см. рисунок);
по 300 клеток посеять в 50 мм чашки Петри (среда Игла-Н0 %-ная
сыворотка крупного рогатого скота), чашки поместить в СОг-инку-
батор; 2) посеять по 3 • 105 клеток во флаконы Карреля (5—7 фла-
конов) или по 106 клеток в 100 мм чашки Петри — 3 чашки
(3—4 флакона или 2 чашки — контроль); 3) через 36—40 ч клетки
промыть раствором Хэнкса, добавить свежей среды без сыворотки,
во флаконы Карреля по 4 мл и в чашки Петри до 8 мл; во флаконы
добавить до 10 мкл МННГ (1 мг МННГ растворить в 1 мл ДМСО)
158
Таблица (продолжение)
Биохимические изменения в устойчивых клетках Генетические харак- теристики признака Влияние изменений на жизнедеятель- ность клеток Литературный источник
Изменение связывания поверх- ностного рецептора с токси- ном Рецессивный, хромосома 5 Влияет [30, 52, 53]
Изменение тубулинов — — [54]
Изменение проницаемости мембраны к яду. Амплифика- ция генов, кодирующих белки с молекулярной массой 170000—180000 и 19000— 21000 Неполный доми- нантный Влияет [2, 37, 38, 55, 56]
Снижение количества холесте- рина в мембранах Рецессивный » [57]
Специфические изменения Ыа + /К+-АТФазы Неполный доми- нантный » [33—35, 58]
в чашки Петри по 20 мкл, можно сделать промежуточное разведе-
ние мутагена средой без сыворотки; конечная концентрация мута-
' гена 2.5 мкг/мл; 4) через 2 ч после инкубации клеток с мутагеном
при 37 °C среду удалить, промыть клетки раствором Хэнкса 2 раза,
добавить полную среду и поместить клетки в термостат на 2—3 ч;
5) среду удалить, клетки снять смесью трипсина с версеном (1 : 1),
сосчитать, часть клеток посеять для определения эффективности
клонирования (300 клеток на 50 мм чашку Петри), большую часть
клеток посеять во флаконы Карреля или чашки Петри; 6) на 3-и сутки
клетки пересеять (чашку и флакон 1:3); 7) на 6-е сутки клетки
сосчитать и посеять в 100 мм чашки Петри, 10 чашек по 2.5 • 105 кле-
ток (контроль — столько же чашек посеять с немутагенизирован-
ными клетками); после прикрепления клеток добавить 150 мкл
8-азагуанина (3000 мкг/мл) до конечной концентрации 30 мкг/мл;
8) посеять клетки на клонирование в 50 мм чашки Петри, 3—4 чашки
по 300 клеток; 9) среду с 8-азагуанином менять 2 раза в неделю;
10) через 15 сут выделить выросшие клоны с помощью стальных
колец, клетки поместить в пенициллиновые флаконы, маленькие фла-
коны Карреля, чашки Петри диаметром 30 мм; 11) размножить и
заморозить. Часть клеток оставить для проверки: 1) способности
фоста на среде ГАТ (см. приготовление растворов), 2) стабильности
сохранения признака в отсутствие селективного агента, 3) актив-
ности фермента ГГФРТ в устойчивых клетках.
Определение активности ГГФРТ в отобранных на устойчивость
к 8-азагуанину вариантах:
1) приготовить растворы: 1а) 0.5 М Трис-НС1, 0.05 М MgCU
(1.0 мл 1 М Трис-НС1, pH 7.6, 0.1 мл 1 М MgCU, 0.9 мл НгО);
16) 5 • 10~3М 5-фосфорибозилпирофосфат (сухой порошок хранить
при —20 °C; 4.05 мг растворить в 2 мл НгО); 1в) ‘^С-гипоксантин
159
стерилизуют фильтрованием. Дифтерийный токсин получают в ампу-
лах в виде стерильного раствора. Фильтровать дифтерийный токсин
не следует, так как после фильтрации он теряет свою активность.
Приготовленные растворы можно хранить замороженными (—20 °C)
или при 4 °C, за исключением растворов уабаина и дифтерийного
токсина, которые хранят только при 4 °C. Концентрированные ра-
створы ядов при соблюдении условий хранения практически не те-
ряют своей активности на протяжении 3—4 мес.
Литература '
1. Siminovitch L. On the nature of hereditable variation in cultured somatic cells//
Cell. 1976. Vol. 7. P. 1 — 17.
2. Baker R. M., Ling V. Membrane mutants of mammalian cells in culture//
Methods in membrane biology. New York, 1978. Vol. 9. P. 337—384.
3. Wright J. A., Lewis W. H., Parfett C. L. J. Somatic cell genetics: A review
of drug resistance, lectine resistance and gene transfer in mammalian cells
in culture // Canad. J. Genet. Cytol. 1980. Vol. 22. P. 443—496.
4. O’Neill P. J., Brimer P. A., Machanoff R. et al. A quantitative assay of mutation
induction at the hypoxantineguanine phosphoribosyl transferase locus in Chinese
hamster ovary cells (CHO/HGPRT system): Development and definition of the
system//Mutat. Res. 1977. Vol. 45. P. 91 — 101.
5. Jacobs L., De Mars R. Quantification of chemical mutagenesis in diploid
human fibroblasts: induction of azaguanine-resistant mutants by N-methyl-N-nitro-
N-nitros<^juanidine // Mutat. Res. 1978. Vol. 53. P. 29—53.
6. Szybalski W. Resistance to 8-azaguanine, a selective marker for human cell
line // Microbiol. Genet. Bull. 1958. Vol. 16. P. 30.
7. Sharp J. D., Capecchi N. W., Capecchi M. R. Altered enzymes in drug resistant
variants of mammalian tissue culture cells//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973.
Vol. 70t‘P. 3145—3149.
8. Shin S. Nature of mutations conferring resistance to 8-azaguanine in mouse
cell lines//J. Cell Sci. 1974. Vol. 14. P. 235—251.
9. Maher V. M., Wessel J. E. Mutation to azaguanine resistance induced in cultured
diploid human fibroblasts by the cancerogen N-acetoxy-2-acetylaminofluorene //
Mutat. Res. 1975. Vol. 28. P. 277—284.
10. Fox M., Radacic M. Adaptational origin of some purine-analogue resistant pheno-
types in cultured mammalian cells// Mutat. Res. 1978. Vol. 49. P. 275—296.
11. Bradley M. O., Bhuyan B., Francis M. C. et al. Mutagenesis by chemical agents
in V79 Chinese hamster cells: A review and analysis of the literature. A report
of the genetix programm // Mutat. Res. 1981. Vol. 87. P. 81 —142.
12. Turner N. T., Batson G. A., Clive D. Procedures for the L5178y/TK+I TK~'-
mouse lymphoma cell mutagenecity assay // Handbook of mutagenecity test
procedures / Eds. B. J. Kibey et al. Amsterdam. 1984. P. 239—268.
13. Rappaport H., De Mars R. Diamino purine-resistant mutants of cultured diploid
human fibroblasts // Genetics (USA), 1973. Vol. 75. P. 335—345.
14. Jones G. E., Sargent P. A. Mutants of cultured Chinese hamster cells deficient in
adenine phosphoribosyltransferase//Cell. 1974. Vol. 2. P. 37—41.
15. Chan T. S., Jsh K-, Long C., Green H. Purine excretion by mammalian
cells deficient in adenosine kinase//Cell. Physiol. 1973. Vol. 81. P. 315—
322.
16. Clive D., Flamm W. G., Machesko M. R., Bernhein N. I. A mutational
assay system using the thymidine kinase locus in cultured L 5178y mouse
lymphoma cells//Mutat. Res. 1972. Vol. 16. P. 77—87.
17. Kit S., Leung W. C., Trkula D. Properties of mitochondrial thymidine kinases of
parential and enzyme-deficient HeLa cells//Europ. J. Biochem. 1973. Vol. 39.
P. 43—48.
18. Wigler M., Sweet R., Sim G. K. et al. Transformation of mammalian cell with genes
from procaryotes and eucaryotes // Cell. 1979. Vol. 16. P. 777—785.
162
19. Plagemann P. G. W., Marz R., Wohlhueter R. M. Uridine transport in Novikoff rat
hepatoma cells and other cell lines and its relationship to uridine phosphorylation
and phosphorolysis //J. Cell. Physiol. 1978. Vol. 97. P. 49—72.
20. Ullman B., Levinson В. B., Ullman D. H„ Martin D. W. Isolation and characteri-
zation of cultured mouse-T-lymphoma cells deficient in uridine-cytidine kinase //
J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 8736—8739.
21. Levinson В. B., Ultman B., Martin D. W. Pyrimidine pathway variants of cultured
mouse lymphoma cells with altered levels of both orotate phosphoribosyltransferase
and orotidylate decarboxylase//J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 4396—4401.
22. Flintoff W. F., Davidson S. V., Siminovitch L. Isolation and partial characterization
of three methotrexate-resistant phenotypes from Chinese hamster ovary cells //
Somat. Cell Genet. 1976. Vol. 2. P. 245.
23. Dolnik В. I., Berenson R. I., Bertino I. R. et al. Correlation of dihydrofolate
reductase elevation with gene amplification in homogeneously staining chromosomal
region of L 5178y cells //J. Cell Biol. 1979. Vol. 83. P. 394—402.
24. Schimke R. T., Brown P. C., Kaufmen R. S. et al. Chromosomal and extrachro-
mosomal localization of amplifed dihydrofolate reductase genes in cultured mamma-
lian cells//Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1980. Vol. 65. P. 785—797.
25. Wahl G. M., Padgett R. A., Stark G. R. Gene amplification causes overproduction
of the first three enzymes of UMP synthesis in N-(phosphonacetyl)-L-aspartate
resistant hamster cells //J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 8679—8689.
26. Chan V. L., Whitmore G. F., Siminovitch L. Mammalian cells with altered forms
of RNA polymerase II // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1972. Vol. 69. P. 3119—3123.
27. Lobban P., Siminovitch L, Ingles С. J. The RNA polymerase II of an a-amanitin-
resistant Chinese hamster ovary cell line // Cell. 1976. Vol. 8. P. 65—70.
28. Gupta R. S., Siminovitch L. The molecular basis of emetin resistance in Chinese
hamster ovary cells: Alteration in the 40S ribosomal subunit // Cell. 1977. Vol. 10.
P. 61—66.
29. Gupta R. S., Siminovitch L. Diphthera toxin resistance in Chinese hamster cell:
Genetic and biochemical characteristics of the mutants affected in protein synthesis //
Somat. Cell Genet. 1980. Vol. 6. P. 361—379.
30. Gupta R. S.. Siminovitch L. Pactamycin resistance in CHO cell: Morphological
changes induced by the drug in the wild-type and mutant cells //J. Cell. Physiol.
1980. Vol. 102. P. 305—316.
31. Spolsky С. M., Eisenstadt J. M. Chloramphenicol-resistant mutants of human HeLa
cells // Febs Lett. 1972. Vol. 25. P. 319—324.
32. Lichtor T.. Getz G. S. Cytoplasmic inheritance of rutamycin resistance in mouse
fibroblasts// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. Vol. 75. P. 324 —328.
33. Baker R. M., Brunnett D. M., Mankowitz R. et al. Ouabain resistant mutants
of mouse and hamster cells in culture // Cell. 1974. Vol. 1. P. 9—21.
34. Mankowitz R. M., Buchwald M., Baker R. M. Isolation of ouabain resistant
human diploid fibroblasts // Cell. 1974. Vol. 3. P. 221—226.
35. Rosenberg H. M. Variant HeLa cells selected for their resistance to ouabain //
J. Cell. Physiol. 1975. Vol. 85. P. 135—142.
36. Chopra A., Gupta R. S. Ouabain-resistant mutants of Chinese hamster ovary
cells are not directly affected in Na+, K+-ATPase // Somat. Cell Mol. Genet. 1986.
Vol. 12. P. 367—373.
37. Roninson J. B., Abelson H. T., Housman D. E. et al. Amplification of specific
DNA sequences correlate with multidrug resistance in Chinese hamster cells //
Nature. 1984. Vol. 309. P. 626—628.
38. Riordan J. R., Deuchars K„ Kartner N. et al. Amplification of P-glycoprotein
genes in multidrug-resistant mammalian cell lines//Nature. 1985. Vol. 316.
P. 817—819.
39. Kartner N., Evernden-Porelle D., Bradley G., Ling V. Detection of P-glycoprotein
in multidrug-resistant cell lines by monoclonal antibodies // Nature. 1985. Vol. 316.
P. 820—823.
40. Steglich C., De Mars R. Mutations causing deficiency of APRT in fibroblasts
cultured from humans heterozygous for mutant APRT alleles // Somat. Cell Genet.
1982. Vol. 8. P. 115—141.
41. Clive E., Voytek P. Evidence for chemically induced structural gene mutation at the
thymidine kinase locus in cultured L 5178y mouse lymphoma cells // Mutat. Res.
1977. Vol. 44. P. 269—278.
11*
163
42. Paeratakul U., Taylor M. W. Isolation and characterization of mutants at the
APRT locus in the L-5178y TK+/TK“ mouse lymphoma cell line//Mutat. Res.
1986. Vol 160. P. 61—69.
43. Gupta R. S., Siminovitch L. Genetic and biochemical studies with the adenosine
analogs toyocamycin and tubercidin: Mutation at the adenosine kinase locus
in Chinese hamster cells // Somat. Cell Genet. 1978. Vol. 4. P. 715—736.
44. Rowland P., Chiang J., Jarrett P. J., Hojfee P. A. Chromosome anomalies
associated with amplification of the adenosine deaminase gene (ADA) in rat hepatoma
cells // Cytogenet. Cell Genet. 1986. Vol. 41. P. 136—144.
45. Sirotnak F. M., Kurita S., Hutchison D. J. On the nature of a transport
alteration determining resistance to amethopterin in the L 1210 leukemia // Cancer
Res. 1968. Vol. 28. P. 75.
46. Vishwenatha J. K-, Mishra N. C. Chinese hamster ovary cell mutants resistant
to DNA polymerase inhibitors. 1. Isolation and biochemical genetic characteri-
zation //Mol. Gen. Genet. 1985. Vol. 200. P. 393—400.
47. Sobel J. S., Albrecht A. M., Riehm H.. Bieldler J. L. Hybridization of actinomycin
D and amethopterin-resistant Chinese hamster cells in vitro//Cancer Res. 1971.
Vol. 31. P. 297—307.
.48 . Ефимова E. В., Игнатова T. H., Гриниук T. M., Зенин В. В., Розанов Ю. М.,
Третьяков А. В. Получение и генетическая характеристика клеток китайского
хомячка, устойчивых к колхицину, актиномицину Д и бромистому этидию//
Докл. АН СССР. 1984. Т. 274. С. 431—434.
49. Сальников К- В. Генотипические и фенотипические особенности клеток линии L,
устойчивых к бромистому этидию//Цитология. 1986. Т. 28. С. 615—621.
50. Gupta R. S., Siminovitch L. An in vitro analysis of the dominance of emetine
sensitivity in CHO cell hybrids//J. Biol. Chem. 1978. Vol. 253. P. 3978—3982.
51. Kaneda Y., Yoshida M. C., Kohno K- et al. Chromosomal assignment of the gene for
human elongation factor 2 // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 3158—
3162.
52. Creagan R. P., Chen S., Ruddle F. H. Genetic analysis of the cell surface:
association of human chromosome 5 with sensitivity to diphtheria toxin in mouse-hu-
man somatic cell hybrids // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1975. Vol. 72. P. 2237—
2239. '•
53. Kohno K-, Uchida T., Mekada E., Okada J. Characterization of Diptheria-Toxin-
resistant mutants lacking receptor function or containing nonribosylatable elonga-
tion factor 2 // Somat. Cell Mol. Genet. 1985. Vol. 11. P. 421—431.
•54. Gupta R. S. Podophyllotoxin resistance: a codominant selection system for quantita-
tive mutagenesis studies in mammalian cells // Mutat. Res. 1981. Vol. 83.
P. 261—270.
55. Копни/н.Б. П., Ставровская А. А. Генетический анализ резистентности сома-
тических клеток мыши к колхицину // Генетика. 1978. Т. 14. С. 1625—1633.
56. Горностаев В. С., Игнатова Т. И. Различная степень стабильности устойчивых
к колхицину клонов мышиной гепатомы XXII // Цитология. 1984. Т. 26.
С. 594—598.
57. Hidaka К-, Akiyama S. J., Kuwano M. Amphotericin В resistance is recessive
in Chinese hamster hybrid cells//J. Cell. Physiol. 1981. Vol. 106. P. 41—47.
58. Lankas G. R. Effect of cell growth rate and dose fraction on chemically induced
ouabain-resistant mutations in Chinese hamster V-79 cell//Mutat. Res. 1979.
Vol. 60. P. 189—196.
Методы получения
и культивирования протопластов
'И. Н. Смоленская, А. В. Носов
’Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР, Москва
Развитие метода культивирования клеток растений открыло ши-
рокие возможности для изучения биологии клетки, ее биосинтети-
164
ческого потенциала, а также генетических основ стабильности и
изменчивости клеток. В ряде случаев для этого необходимо уметь
культивировать одиночные клетки. Одним из методов их получения
является изолирование протопластов. В определенных условиях
клетки, лишенные клеточной стенки, регенерируют ее заново и,
возвращенные к нормальным условиям существования, начинают
проявлять все характерные свойства культивируемых клеток, такие
как деление и тотипотентность. Изолированные протопласты более
доступны для введения в них экзогенных факторов, что позволяет
также изучать влияние биологически активных соединений на жизне-
деятельность клеток растений.
В настоящее время исследователи рассматривают протопласты
как модель, с помощью которой можно изучать целый ряд проблем
как на клеточном, так и на молекулярном уровне, имеющих большое
значение при решении практических задач биотехнологии и сельского
хозяйства.
Методы выделения протопластов были успешно разработаны
в целом ряде лабораторий.
Существуют два метода выделения протопластов. Один состоит
в механическом удалении клеточной стенки в среде, содержащей
осмотический стабилизатор. В этом случае получается незначитель-
ное число протопластов, и в основном источником их служат вакуоли-
зированные клетки паренхимного типа. Этот метод сейчас использу-
ется редко. Другой метод связан с энзиматическим удалением
клеточной стенки. При правильно подобранных условиях изолиро-
вания и культивирования можно получить большое число прото-
пластов, которые длительное время сохраняют жизнеспособность.
Именно этот метод является общепринятым в настоящее время [2].
Материал для выделения протопластов
Сущность метода изолирования протопласта состоит в удалении
клеточной стенки таким образом, чтобы в нем не возникало необрати-
мых изменений. Для этого наружное и внутреннее осмотическое
давление на мембрану должно быть таким, чтобы клетки не разру-
шались и не наблюдалось лизиса протопластов. В настоящее
время протопласты получают из однодольных и двудольных растений.
Используют листья, проростки, клубни, лепестки, плоды, клубеньки
бобовых растений, опухолевые клетки различного происхождения,
ткани и клетки, культивируемые in vitro. Протопласты могут быть
получены из микроспор, взятых на стадии тетрад, или одноклеточной
пыльцы.
Для выделения протопластов обычно используют молодое расте-
ние, еще не начавшее цветение. Имеют значение также и условия
его выращивания: интенсивность освещения, фотопериод, влажность
и температура. Большое число протопластов удается получить из ра-
стений, выращенных в стерильных условиях.
Протопласты выделяют и из культуры тканей. Преимуществом
является то, что ткань растет в стерильных условиях и не требует
165
специальной асептической обработки. Подбор сред для культивиро-
вания облегчается, поскольку за основу может быть взята среда,
на которой выращивалась ткань. Успешное получение протопластов
в этом случае также зависит от ряда факторов. Во-первых, от
возраста исходной ткани в цикле выращивания: по данным многих
авторов, лучше брать ткань, находящуюся на стадии раннего экспо-
ненциального роста, когда в популяции имеется значительное число
клеток, способных начать деление. Во-вторых, от особенностей роста
ткани: каллусная ткань многих видов растений образует на агаризо-
ванной среде плотную массу, состоящую как из меристемоидных
клеток, находящихся в фазе растяжения, так и из клеток паренхим-
ного типа и трахеидных элементов. Все это осложняет работу,
требует специальных методов очистки при выделении протопластов
и дает небольшой их выход по сравнению с количеством взятой
ткани.
Наиболее пригодна для выделения протопластов рыхлая, не диф-
ференцированная ткань, образующая небольшие агрегаты клеток
при переводе в жидкую среду. При добавлении ферментов агрегаты
легко распадаются на отдельные клетки. Чаще для выделения
протопластов применяют суспензионные культуры клеток. Обычно
они имеют небольшое число клеток с уплотненными стенками, не раз-
рушающимися при действии целлюлитических ферментов, и их легко
удалить фильтрованием. Кроме того, суспензии удобны для разных
манипуляций: фракционирования клеток, введения изотопов, полу-
чения синхронных популяций.
Выделение протопластов
В общем виде способ получения протопластов представлен на
рисунке. Однако для каждой системы тканей этот способ требует
корректировки. В некоторых случаях бывает необходима предвари-
тельная подготовка материала. Так, чтобы получить жизнеспособные
протопласты из листьев гаплоидного растения табака, ткань выдер-
живают в темноте в течение нескольких часов в растворе 0.4 М саха-
розы, а побеги и листья бобов помещают на 1 ч в смесь 0.5 М сорбита
и 5 • 10-3 М СаСК, чтобы вызвать предварительный плазмолиз и
сократить время инкубации в ферменте. Иногда перед выделением
протопластов растение на некоторое время помещают в темноту
либо на короткое время на яркий свет.
Все работы по изолированию протопластов проводятся в стериль-
ных условиях. Ткани, взятые от целого растения, выращенного в поле
или теплице, тщательно стерилизуют растворами 70 %-ного спирта,
0.1 %-ного диацида или 2—5 %-ного гипохлорита. Затем их не-
сколько раз промывают стерильной водой. С листьев, там где это
возможно, снимают эпидермис стерильными инструментами,и неболь-
шие кусочки ткани помещают в раствор фермента.
Культура клеток не требует дополнительной стерилизации. Для
выделения протопластов используют 2- и 3-суточные суспензии
клеток. Однако оптимальный для получения протопластов возраст
166
Стерилизация
Выделение протопластов
Фильтрация через
нейлоновый фильтр (поры 60 мкм)
Протопласты
Добавление среды
Отмывание
о о о о о о о J
Инкубирование
фермента
Первое
деление
Регенерация
клеточной стенки
Схема, иллюстрирующая этапы получения и культивировании протопластов из клеток
растений.
167
ткани зависит от конкретных особенностей цикла ее роста. Определе-
ние параметров роста суспензии клеток в цикле выращивания,
ее морфологические характеристики, а также специальная подго-
товка являются необходимыми этапами в работе. Несомненно,
существуют различия в строении клеточных стенок тканей разного
происхождения. Изменяя условия культивирования ткани, из которой
собираются выделять протопласты, можно добиться большей гомо-
генности популяции по этому признаку. Это достигается изменением
соотношения гормональных факторов, состава макро- и микросолей,
содержания СаС12, аминокислот и сахаров.
В некоторых случаях каллусные и суспензионные культуры пред-
инкубируют в растворе плазмолитиков. Подбор конкретных соедине-
ний и их концентраций для выделения протопластов также зависит
от вида ткани и условий, в которых она растет. Одним из методов
установления концентраций этих агентов служит прямое наблюдение
за клетками под микроскопом при инкубации их в растворах с повы-
шающимся уровнем осмотического потенциала. При этом плазмолиз
может быть полным, когда клеточная оболочка целиком отошла от
протопласта и под микроскопом видно, что округленная клетка лежит
в центре полости, ограниченной оболочкой. Возможен частичный
плазмолиз, когда клеточная стенка отошла от протопласта с одной
стороны, но на значительном ее протяжении, и пристеночный пла-
змолиз, при котором наблюдается отхождение клеточной оболочки
от протопласта лишь в некоторых местах.
В качестве осмотически активных веществ обычно используют
различны^ сахара:, глюкозу, сахарозу, маннит и сорбит. Маннит
применяют чаще, чем сорбит, так как он обладает слабой прони-
кающей способностью в клетки, проникновение в клетки сорбита
сопровождается и проникновением ферментов. Применяется также
смесь сорбита и маннита. Использование в ферментных системах
растворов глюкозы и сахарозы создает условия, близкие к условиям
культивирования клеток, хотя эти сахара активно проникают через
мембрану. Для некоторых видов тканей применение сахаров не дает
хороших результатов. В этом случае используют в качестве осмоти-
ческих стабилизаторов солевые растворы, хотя известно, что соли
обладают большей проникающей способностью, чем сахара, и сни-
жают активность некоторых гидролитических ферментов. Растворы
макро- и микросолей часто берут за основу, к которой добавляют
другие осмотически активные вещества. Это смягчает процесс выде-
ления протопластов, особенно если он длителен, и приближает
его к условиям культивирования ткани в суспензии. Неправильный
выбор осмотического агента может привести к разрыву плазмалеммы
либо вызвать спонтанное слияние протопластов и образование много-
ядерных клеток; оптимальными для выделения протопластов
являются 0.3 до 0.7 М растворы.
Состояние протопластов и дальнейшая их судьба во многом
зависят от состава, концентрации и времени действия ферментов.
Выбор их основан на структуре и строении клеточной стенки.
Основными компонентами ферментной системы должны быть соеди-
168
нения, разрушающие целлюлозу, гемицеллюлозу и пектиновые ве-
щества. Для этой цели подходят ферментные препараты, полученные
из микроорганизмов и грибов.
Целлюлазный препарат Onozuka R-10 («Kinki Yakult», Япония),
выделенный из Thrichoderma viride, является сложным комплексом
целлюлаз, разрушающим сначала нативную и кристаллическую
целлюлозу, а затем и аморфную. В состав этого фермента входят
также целлобиоза, ксиланаза, пектиназа, липаза, а также различные
нуклеазы. Целлюлазной активностью обладает также целлюлизин
(«Calbiochem», Швейцария), а гемицеллюлазной — дрейселаза
(«Kyowa, Hakko, Kogyo», Япония), полученная из актиномицетов,
и целлюлаза из Aspergillus niger («Sigma», США), а также оте-
чественные препараты ксиланазы, полученной из того же гриба,
и ксиланигрина (Московский завод ферментных препаратов).
Применяют различные пектиназы — пектиназу («Sigma», США),
пектиназу-500 и 1500 (Московский завод ферментных препаратов),
а также мацерозим, полученный из Rhizopus («Kinki Yakult», Япо-
ния) и мацеразу («Calbiochem», Швейцария). Если применяемые
ферменты не разрушают полностью компоненты клеточной стенки,
то в качестве добавки используют препарат из пищеварительного
сока улитки Helix pomatia. Коммерческий препарат называется
геликазой («Ind. Biol. Framjaise», Франция) и содержит более 30 ин-
дивидуальных целлюлитических энзимов.
Подбор ферментной системы производится на основании знаний
об особенностях тканей и данных, имеющихся в литературе для
тканей подобного типа данного или близкого вида.
Время выделения протопластов зависит от концентрации фер-
мента. При больших концентрациях продолжительность инкубации
составляет 1—4 ч, при невысоких—12—20 ч, оптимальные усло-
вия — pH 5—6, температура 23—26 °C. Иногда требуется слабое
покачивание в течение периода инкубации с ферментом.
В результате обработки ткани ферментными препаратами полу-
чается смесь, содержащая протопласты, обломки тканей, разрушен-
ные и целые клетки. Чтобы отделить протопласты от этих примесей,
суспензию фильтруют через нейлоновый фильтр, а затем центрифуги-
руют в мягких условиях.
Культивирование протопластов
Методы культивирования протопластов соответствуют тем, кото-
рые применяются для выращивания клеток. Протопласты высевают
как на жидкие (табл. 1 и 2), так и на агаризованные среды того же
состава с различными концентрациями агара. В табл. 1 и 2 приводятся
наиболее часто используемые среды. Основное требование к применя-
емым средам состоит в том, чтобы в процессе культивирования
не происходило разрушения протопластов и среда была оптимальна
для образования клетками колоний. До тех пор пока протопласты
не образовали клеточную стенку, они представляют собой очень
нежные структуры и работу с ними нужно проводить в мягких
условиях.
169
Таблица 1
Состав (мг/л) сред, наиболее употребимых для культивирования протопластов
Состав Гамборг и Эвелейт [8] Мурасиге и Скуг [9] Нагате и Такебе [10] Шейк и Хиль дебраидт [ 11
Макрос ОЛИ
NaH2PO4 150 — — • 300
KNO3 3000 1900 950 2500
(NH4)2SO4 134 — —' —
MgSO4- 7Н2О 500 370 1233 500
СаС12- 2Н2О 150 440 220 200
FeSO4- 7Н2О 27.25 27.85 27.8 27.85
Na2-EDTA 37.25 37.25 37.3 37.3
NH4NO3 — 1650 825 —
КН2РО4 — 170 680 —
Микросоли
MnSO4- Н2О 10 22.3 22.3 10
НзВОз 3 6.2 6.2 5
ZnSO4- 7Н2О 2 8.6 8.6 1
Na2MoO4- 2Н2О 0.25 0.25 0.25 0.1
CuSO4- 5Н2О 0.025 0.025 0.025 0.2
СоС12- 6Н2О 0.025 0.025 0.03 0.1
KI 0.75 0.83 0.83 1
Са-пантотеийт
Никотиновая кислота
Тиамин
Пиридоксин
Инозит
Кинетин
НУ К
2,4-Д
Сахароза
Маннит
Витамины
1 1 10 1 100 1 1 1 100 1 100 ' 5 5 5 0.5 100
Гормоны
— 5 — 0.1
—- 1 3 ——
2 — 1
Сахар а
20 000 30 000 10 000 30 000
— 0.7 М —
Величин а pH
5.5 5.5 5.8 5.6
Условия, в которых культивируют протопласты, в основном соот-
ветствуют тем, которые применяются для выращивания в культуре
клеток растений. Состав минеральных солей может быть несколько
170
Таблица 2
Состав среды Као и Михайлюка [7J
Вещество мг/л Вещество мг/л
Макросоли Микросоли
NH4NO3 600 Н3ВО3 3.00
KNO3 1900 KJ 0.75
MgSO4- 7Н2О 300 MnSO4- Н2О 10.00
КС1 300 Na2MoO4- 2Н2О 0.25
FeSO4- 7Н2О 28.75 CuSO4- 5Н2О 0.025
Na2-EDTA 37.3 СоСЬ* 6Н2О 0.025
Сахара Витамины
Глюкоза 68 400 Никотинамид 1
Сахароза 125 Аскорбиновая кислота 1
Фруктоза 125 Пиридоксин- НС1 1
Ксилоза 125 Витамин А 0.005
Манноза 125 Тиамин- НС1 10
Рамноза 125 Витамин Дз 0.005
Целлобиоза 125 Са-пантотеиат 0.5
Сорбит 125 Фолиевая кислота 0.2
Маннит 125 р-Аминобензойная кислота 001
Рибоза 125 Биотин 0.005
Холинхлорид 0.5
Органические ки СЛОТЫ Рибофлавин 0.1
Пируват Лимонная кислота 5 10 Инозит Витамин Bi2 100 0.01
Яблочная » 10 Гормоны
Фумаровая » 10 2,4-Д 0.2
Гидролизат казеина 125 Зеатин 0.5
Кокосовое молоко 10 НУК 1
изменен. Как правило, среда должна состоять из осмотического
стабилизатора, неорганических соединений, источников углерода,
витаминов, источников органического азота и фитогормонов. Маннит,
сорбит и их комбинации могут быть использованы в качестве
осмотических стабилизаторов. За основу берется состав минеральных
солей в средах для культивирования клеток растений. Можно менять
соотношение аммонийного и нитратного азота в зависимости от
потребности в них клеток, увеличивать концентрацию СаСЬ для
стабилизации образующейся клеточной стенки. После того как обра-
зовались и начали делиться клетки, они могут быть помещены
в условия культивирования, применяемые обычно для клеток
растений.
В качестве источников углерода используют глюкозу, сахарозу,
их смеси. Сахароза! не всегда может быть подходящим компонентом
среды для протопластов. В некоторых случаях добавляют рибозу,
ксилозу, фруктозу, маннозу и другие сахара.
В состав витаминов при культивировании протопластов должны
входить тиамин, пиридоксин и никотиновая кислота. При небольшой
плотности высева требуется добавление и других витаминов.
171
В качестве источников органического азота добавляют одну или
больше аминокислот. Обычно используют гидролизат казеина, пред-
ставляющий собой смесь аминокислот, и добавляют его в том случае,
если в среде недостаточное содержание неорганического азота,
а его концентрацию уже нельзя увеличить.
Ауксины и цитокинины требуются для клеточного деления и
дальнейшего развития растительных клеток; обычно используют 2,4-
дихлорфеноксиуксусную (2,4-Д) и нафтилуксусную (НУК) кислоты
(ауксины), кинетин, бензиладенин, зеатин (цитокинины) и др.
Оптимальные концентрации варьируют, и их подбирают в каждом
отдельном случае.
Большое значение при культивировании протопластов имеют и
другие условия. Так, pH среды должен составлять от 5.4 до 5.8,
температура — от 22 до 28 °C. Иногда требуется слабое освещение,
не более 2000 лк. Жизнеспособность протопластов зависит от началь-
ной плотности высева, обычно их культивируют при плотности
высева от 104 до 106 на 1 мл среды. Иногда для повышения
числа делящихся протопластов в среду добавляют различное коли-
чество кондиционированной среды, на которой некоторое время росли
клетки, или же используют так. называемый кормящий слой, состоя-
щий из облученных клеток, — такие клетки не делятся, но остаются
метаболически активными, т. е. продукты жизнедеятельности инакти-
вированных клеток восполняют необходимые компоненты среды.
Обычно эти методы применяют в том случае, если протопласты
высевают с небольшой плотностью.
Единичные протопласты можно культивировать в небольших
количествах среды в пластмассовых или стеклянных чашках Купрака
либо в микрокамерах. Это бывает необходимо для получения колонии
нз одной клетки и наблюдения за ее развитием. В дальнейшем
при перенесении таких колоний на агаризованную среду определен-
ного состава можно получить каллус, а затем и целое расте-
ние.
В 1-е сутки культивирования некоторое число протопластов
погибает, что может быть связано с гетерогенностью популяции
по отношению к действию осмотиков. Оставшиеся уже через не-
сколько часов начинают синтезировать клеточную стенку. Пол-
ностью этот процесс завершается при правильно подобранных
условиях выделения и культивирования через 1—4 сут. При этом
протопласты теряют сферическую форму, клетки удлиняются. Ско-
рость регенерации клеточной стенки зависит от вида растения и
ткани, из которой получены протопласты, а также от степени ее
дифференцировки.
При неблагоприятных условиях выделения и культивирования
протопластов образуется клеточная стенка не по всей их поверхности.
В местах разрывов часть цитоплазмы выходит, оставаясь окруженной
плазмалеммой. В ней могут находиться вакуоли. Это так называемые
почки. «Почкование» происходит при повышенной концентрации
осмотически активного вещества в присутствии неподходящего для
данной культуры сахара, при низком содержании СаСЬ и др.
172
При правильно подобранных условиях выделения и культивиро-
вания к 3—4-м суткам с момента высева наблюдаются первые
деления протопластов. В большинстве случаев затем образуются
многоклеточные агрегаты, развивающиеся в дальнейшем в каллус,
способный регенерировать целое растение. Растения-регенеранты
из протопластов получены для люцерны, табака, моркови, томата
и целого ряда других.
Процедура выделения
и культивирования протопластов
Работа с протопластами требует стерильных условий;и следую-
щего оборудования: Г) стерильная комната — бокс или* ламинар-
бокс; 2) инвертированный микроскоп; 3) центрифуга, способная
давать небольшое число оборотов; 4) аппарат для стерилизации
растворов, имеющий фильтр с размерами пор 0.2—0.45 мкм, задер-
живающий бактерии; 5) автоклав; 6) газ или спиртовая горелка;
7) пинцеты глазные и хирургические; 8) скальпели; 9) пипетки
на 1, 2 и 5 мл, градуированные; 10) чашки Петри» диаметром
50—60 мм; 11) стерильные колбы Эрленмейера на 50 и 100 мл;
12) центрифужные пробирки; 13) центрифужные стаканы со вклады-
шами; 14) матрас из крафта с вложенными в него листами филь-
тровальной бумаги; 15) стеклянные воронки с вложенными в них
нейлоновыми фильтрами, размер пор 60 мкм; 16) качалка с контро-
лируемыми параметрами качания; 17) колбы на 1 л для стерилизации
воды; 18) стаканы (3 шт.) на 500—800 мл для стерилизации и
промывания водой листьев растений; 19) парафилм; 20) карандаш
или фломастер по стеклу; 21) штатив для пробирок; 22) камера
Фукса—Розенталя; 23) вата; 24) спирт 70 и 96 %-ный.
Протопласты из листьев растений. Для выделения протопластов
из мезофилла листа берут растения определенного возраста, напри-
мер при получении протопластов из листьев табака — 50—60-суточ-
ные растения, из листьев бобов — 14—18-суточные. Важно, чтобы все
работы проводились в стерильных условиях. Ферментные растворы
готовятся непосредственно перед использованием и стерилизуются
через бактериальный фильтр. Посуда стерилизуется сухим жаром
при 180 °C в течение 1 ч. Матрас автоклавируют при 2 атм в те-
чение 1 ч, так же стерилизуется и дистиллированная вода. Инстру-
менты можно стерилизовать при 120 °C или прожигать несколько
раз над горелкой, предварительно помещая их в 96 %-ный спирт.
Стол и вся стеклянная посуда предварительно протирается 70 %-ным
спиртом. Все растворы дважды стерилизуются в автоклаве при
0.7—0.8 атм в течение 15 мин.
Процедура получения протопластов: 1) листья табака промывают
проточной водой, затем споласкивают дистиллированной; 2) поме-
щают их в стакан с 70 %-ным спиртом на 0.5—1 мин; 3) затем
на 3—5 мин помещают в раствор 0.1 %-ного диацида (666 мг цетил-
пиридиний хлорида, 333 мг этанолмеркурий хлорида и 1 л дистилли-
рованной воды); 4) трижды по 10 мин промывают стерильной дистил-
173
лированной водой, разлитой в стаканы емкостью 500—800 мл; 5) по-
мещают в матрас на фильтровальную бумагу нижним эпидермисом
вверх; осторожно с помощью скальпеля и глазного пинцета снимают
эпидермис, разрезают на небольшие кусочки шириной 5—10 мм и
помещают в раствор фермента (0.5 М маннит+0.5 %-ная целлюлаза
(Onozuka R-10), pH 5.5—5.7), разлитый по 10 мл в 100 мл колбы Эр-
ленмейера (стерильные) так, чтобы ткань плавала на поверхности
фермента и не тонула; при этом та часть листа, с которой удален
f эпидермис, должна контактировать с ферментным раствором; 6) кол-
+( бы закрывают резиновыми пробками и ставят в темноте при 25 °C
/ на 13—15 ч во влажную камеру; 7) по истечении этого времени
под инвертированным микроскопом оценивают качество и общее
количество выделившихся протопластов; 8) начинают отмывать
от фермента, если выделилось достаточное число протопластов и они
имеют правильную сферическую форму с равномерно расположен-
ными в них хлоропластами; 9) с помощью пипетки пропускают
суспензию через нейлоновый фильтр в стеклянные колбочки или
сразу же в центрифужные пробирки; 10) закрывают пробирки
стерильными пробками и центрифугируют при 100 g в течение 3 мин,
протопласты садятся на дно пробирки; 11) осторожно отбирают
пипеткой надосадочную жидкость и добавляют 7—8 мл 0.4 М ман-
нита; 12) затем центрифугируют в тех же условиях, операцию
отмывки протопластов повторяют дважды; 13) пипеткой отбирают
раствор маннита и добавляют 1—2 мл среды, на которой впоследствии
будут культивировать протопласты; 14) в чистую стерильную про-
бирку набивают 0.9 мл среды и 0.1 мл получившейся суспензии
протопластов; 15) в камере Фукса—Розенталя определяют число
протопластов в мл; 16) на предметном стекле с помощью 0.01 %-ного
раствора синьки Эванса или 0.1 %-ного эозина, приготовленных на
соответствующем осмотически активном веществе, определяют про-
цент живых протопластов и делают поправку к тому, что было
просчитано в камере Фукса—Розенталя; 17) в стерильной пробирке
исходную суспензию разводят средой так, чтобы конечное число
клеток составляло (1—4) • 104 на 1 мл, и по 2 мл разливают
в чашки Петри диаметром 50—60 мл; 18) заклеивают чашки пара-
филмом и культивируют в темноте при 25 °C, наблюдая под инверти-
рованным микроскопом за развитием протопластов каждые сутки.
Протопласты из суспензионной культуры клеток сахарной свеклы.
1) В 250 мл круглодонные колбы помещают 10 мл 3-недельной
суспензии клеток и ставят на качалку со скоростью 60 качаний в мин
и амплитудой 7—8 см при температуре 28 °C; 2) через 48 ч в колбу
с суспензией добавляют 10 мл раствора фермента (макро- и микро-
соли по Шенку и Хильдебрандту (табл. 1) +0.56 М сорбит, 0.4 %-ная
целлюлаза Onozuka R-10, 0.2 %-ный целлюлизин, 0.2 %-ный маце-
розим, 0.8 %-ная дрейселаза, pH 5.5—5.7); фермент этого состава
смешивают с суспензией в отношении 1 : 1; 3) колбы стерильно закры-
вают фольгой и ставят на качалку (условия те же, что описаны
выше) на 18—20 ч в темноту при 22—23 °C; 4) дальнейшие операции
с суспензией протопластов проводят так же, как и с листьями табака
174
(раствор для отмывания фермента: макро- и микросоли по Шенку
и Хильдебрандту + 0.36 М сорбит, pH 5.5—5.7); 5) число прото-
пластов подсчитывают, определяют процент живых и рассеивают
в чашки Петри (60 мм) при плотности высева 5 • 104—105 клеток
на 1 мл; 6) протопласты помещают во влажную камеру при темпе-
ратуре 25 °C в темноту.
Цитологическое наблюдение
Протопласты табака (см. рисунок), помещенные на среду Мура-
сиге и Скуга, через 24 ч образуют клеточную стенку и через
2—3 сут наблюдается в них первое деление. Второе деление происхо-
дит на 7—8-е сутки, затем образуются 8-клеточные колонии, и к 21 —
30-м суткам культивирования формируются многоклеточные
колонии.
При перенесении их на агаризованную среду образуется каллус,
из которого при определенных условиях культивирования и состава
среды может быть получено целое растение.
Протопласты, изолированные из суспензионной культуры сахар-
ной свеклы, в течение 1-х суток культивирования формируют клеточ-
ную стенку на среде Щенка и Хильдебрандта или Као и Михайлюка.
Первое деление происходит на 2—3-и сутки. В течение 7—10 сут
образуются колонии из 4—8 клеток. Через 2 нед при перенесении
образовавшихся клеток на среду Шенка и Хильдебрандта, содержа-
щую 3 % сахарозы, колонии увеличиваются в размерах. Из них
можно возобновить суспензию через 30—40 сут после получения
протопластов.
Литература
1. Глеба Ю. Ю., Ситник К- М. Слияние протопластов и генетическое конструирование
высших растений. Киев, 1982. 102 с. .
2. Cocking Е. С. Fusion and somatic hybridization of higher plant protoplasts // Micro-
bial and plant protoplasts. London, 1976. P. 189.
3. Butenko R. G. Cultivation of isolated protoplasts and hybridization of somatic
plant cells // Intern. Rev. CytoL 1979. Vol. 59. P. 323.
4. Dudits D. The effect of selective conditions on the products of plant protoplasts
fusion // Cell genetics in higher plants. Budapest, 1976. P. 153.
5. Eriksson T., Glimelius K, Wallin A. Protoplast isolation, cultivation and develop-
ment//Frontiers of plant tissue culture. Calgary (Canad;), 1978. P. 131.
6. Gamborg O. L., Shyluk J. P., Shanin E. A. Nutrition, media and characteristics of
plant cell and tissue cultures//Plant tissue culture: Methods and application in
agriculture / Ed. T. A. Thorpe. London, 1981. P. 115.
7. Kao R. N., Michayluk M. R. A method for high-frequency intergenetic fusion of
plant protoplasts//Planta. 1974. Vol. 115. P. 355.
8. Gamborg O. L., Eveleigh D. E. Culture methods and detection of glucanases in cultu-
res of wheat and barley // Canad. J. Biochem. 1968. Vol. 46, N 5. P. 417.
9. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid and bioassays with tobacco
tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, N 3. P. 473.
10. Nagata T., Takebe 1. A. Cell wall regeneration and division in isolated tobacco
mesophyl protoplasts//Planta. 1970. Vol. 92, N 3. P. 301.
11. Schenk R. U., Hildebrandt A. Medium and techniques for induction and growth of
monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Canad. J. Bot. 1972.
Vol. 50, N 1. P. 199.
175
Гибридизация клеток животных
И. А. П рудо веки й, С. И. Сухарев
Институт молекулярной биологии АН СССР,
Институт электрохимии им. Фрумкина АН СССР, Москва
Гибридизация клеток — экспериментальный подход, нашедший
широкое применение в биологии за последние 20 лет. Создание
клеточных гибридов дает исследователю возможность обнаруживать
существование внутриклеточной регуляции различных процессов.
Сливая клетки, различающиеся по каким-то временным характери-
стикам (например, по фазе цикла) или по постоянным признакам
(по способности или неспособности образовывать опухоли, наличию
или отсутствию черт специфической дифференцировки), в гибридах
нередко удается наблюдать исчезновение характеристик одной
из клеток и «навязывание» ей свойств ее партнера по гибридизации.
Так, были обнаружены реактивация синтеза ДНК при слиянии
непролиферирующих клеток с пролиферирующими fl], преждевре-
менная конденсация хромосом при слиянии интерфазных клеток
с митотическими [2], исчезновение злокачественного фенотипа при
слиянии опухолевых клеток с нормальными [3].
Гибридизация создает возможность картирования хромосом [4],
что достигается благодаря избирательной потере клеточными гибри-
дами хромосом одного из партнеров. Сопоставление фенотипических
признаков клеточных гибридов с утерей хромосом того партнера,
чей хромосомный набор подвергается постепенной элиминации,
позволяет,выяснить, в какой хромосоме расположен ген, определяю-
щий интересующий нас признак. По-видимому, картирование хромо-
сом удастся сильно упростить, используя ,гдля слияния в качестве
одного из партнеров не целые клетки, а искусственно созданные
микроклетки, несущие отдельные хромосомы [5].
В результате гибридизации удается получать гибриды клеток
с хозяйственно ценными свойствами. Пока практически единственный
пример таких гибридов — это гибридомы, продуцирующие монокло-
нальные антитела [6]. Однако можно ожидать создание линий
гибридных клеток, обладающих способностью продуцировать другие
ценные биологические вещества. Получение таких линий может быть
достигнуто путем слияния дифференцированных клеток-продуцентов
ценных веществ с опухолевыми клетками, имеющими такое же
происхождение, что и клетки-продуценты.
Методы слияния клеток
Слияние клеток — процесс, в некоторых случаях происходящий
в естественных условиях (слияние отдельных амебоидных клеток
и образование синцития у миксомицетов, образование многоядерных
мышечных клеток и остеокластов у позвоночных). Спонтанное
слияние клеток в культуре [7] происходит с низкой частотой и не
может быть использовано в опытах по гибридизации клеток.
176
Эффективным является метод слияния клеток с помощью инакти-
вированного вируса Сендай [8]. Господство этого метода в области
гибридизации клеток пришлось на вторую половину 60-х и первую
половину 70-х годов. Преимущества вируса Сендай как сливающего
агента заключаются в практически полном отсутствии цитотоксиче-
ского эффекта, недостатки — в необходимости наращивать, титро-
вать, концентрировать и инактивировать вирус, а также в непри-
менимости данного метода слияния к клеткам растений и грибов,
которые не имеют рецепторов к вирусу Сендай.
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) был впервые применен как сливающий
агент к растительным клеткам [9]. Вскоре было показано, что поли-
этиленгликоли с молекулярной массой 1000—6000 успешно сливают
клетки животных [10]. Главный недостаток ПЭГ — высокая токсич-
ность. В связи с этим время контакта клеток с ним стараются ограни-
чить 1 мин. Предложен способ слияния, заключающийся в мно-
гократных очень коротких (по 1 с) обработках клеток 50 %-ным
раствором ПЭГ с последующим переводом клеток в 25 %-ный
раствор, затем в культуральную среду и снова в 50 %-ный раствор
ПЭГ [11]. Клетки, находящиеся на покровных стеклах, переносятся
таким образом из 50 %-ного раствора ПЭГ в культуральную среду
и обратно 5—10 раз. В результате удается повысить частоту слияния
клеток в 3—5 раз и резко уменьшить токсический эффект ПЭГ
по сравнению с обычно применяемым способом (1 мин в 50 %-ном
растворе ПЭГ). Жизнеспособность клеток, очевидно, увеличивается
за счет снижения времени их контакта с 50 %-ным раствором ПЭГ.
ПЭГ производится многими иностранными фирмами («Merck»,
«Loba», «Sigma», «Koch-Light», «Baker», «Serva» и др.). По нашему
опыту, наилучшим для слияния является ПЭГ фирмы «Loba» (Авст-
рия) с молекулярной массой 1500 и 2000. Исследователь, начинаю-
щий работать с новыми, ранее не испытанными партиями ПЭГ,
должен предварительно провести проверку на токсичность и на сли-
вающую способность. ПЭГ с одной и той же молекулярной массой
может варьировать по этим показателям.
Повышение pH раствора ПЭГ до 7.8—8.0 повышает частоту
слияния клеток [12]. Для снижения токсичности в раствор в некото-
рых случаях добавляют 10 %-ный диметилсульфоксид и снижают
при этом концентрацию ПЭГ до 35 % f[ 13]. Предложен еще один путь
снижения токсичности ПЭГ — использование для слияния бескаль-
циевой среды [14]. При слиянии клеток в суспензии перед обработкой
ПЭГ проводят их агглютинацию. Для этой цели используют расти-
тельные лектины — ФГА [15] или поликатионы, например полиарги-
нин [16]. Наш опыт работы с ФГА показал, что использование этого
лектина в данных условиях может приводить к резкому увеличению
числа многоядерных клеток, которые характеризуются низкой
жизнеспособностью.
В некоторых работах при слиянии клеток со сниженной адгезив-
ностью возникает необходимость их перевода в монослой. Это
относится к слиянию интерфазных клеток со слабо прикрепляю-
щимися метафазными. Для изучения происходящей при таком слия-
12 Заказ {789
177
нии преждевременной конденсации хромосом желательно, чтобы
гибридные клетки вскоре после слияния прикреплялись к стеклу или
к пластику [17]. Осаждение центрифугированием интерфазных
и метафазных клеток на пластик, покрытый конканавалином А [17],
заставляет клетки прикрепляться к субстрату, и их слияние в моно-
слое с помощью ПЭГ становится возможным.
«Эпоха ПЭГ» в гибридизации клеток началась с середины 70-х го-
дов и продолжается до сих пор. Однако в последние годы начинает
распространяться метод слияния клеток с помощью электрошока
(подробно см. [18]). Здесь мы остановимся лишь на основах метода
и на новинках, появившихся в нем в последние годы.
Метод электрослияния основан на электропробое мембран двух
контактирующих клеток в месте их контакта. Для этого контактирую-
щие клетки подвергаются действию электрических импульсов
высокого напряжения (0.5—6 кВ/см) продолжительностью 1 —
50 мкс [18]. Предварительное сближение клеток может быть достиг-
нуто многими способами: 1) механически, с помощью микроигл;
2) путем совместной посадки клеток-партнеров в виде плотного
смешанного монослоя; 3) соосаждением в центрифужной пробирке;
4) путем агглютинации клеток лектинами, поликатионами или
растворами ПЭГ в низкой концентрации; 5) с помощью диэлектро-
фореза (клетки образуют цепочки).
Первоначально особенно популярным был последний метод
приведения клеток в контакт. Однако в последнее время многие
исследователи отказались от него, так как большинство клеток,
образующихся в результате слияния «диэлектрофорезных цепочек»,
оказывается многоядерными.
Клетки суспензионных культур предпочитают приводить в кон-
такт, осаждая их центрифугированием. Хорошо прикрепляющиеся
к твердому субстрату клетки достаточно легко сливать в монослое.
Существуют два способа. В первом случае силовые линии электриче-
ского поля направлены параллельно поверхности пластиковой или
стеклянной подложки с клетками, во втором случае силовые линии
проходят через специальную электропроводящую'подложку, на кото-
рой растут клетки. Жизнеспособность клеток, слитых методом
электрошока, повышается, если их затем в течение 30—60 мин
инкубировать в бескальциевой среде. Само слияние (пробой) также
должно проводиться в среде, не содержащей ионов кальция. Пока-
зано, что кратковременный гипотонический шок после электропробоя
заметно ускоряет слияние клеток.
Имеются сведения о том, что предобработка клеток протеолити-
ческими ферментами — диспазой, проназой, трипсином [19] —за-
метно улучшает эффективность электрослияния. Аналогичные сведе-
ния получены и при слиянии клеток при помощи ПЭГ. Наибольшая
эффективность слияния монослойных клеток отмечается через
несколько часов после обработки их трипсином для пересева [14].
По-видимому, протеазы снимают какие-то поверхностные белки,
препятствующие слиянию клеток. Однако нами было обнаружено, что
178
обработка клеток протеазами не всегда хорошо влияет на слияние
с помощью электрошока.
Методом электрошока удается слить разные клетки. В последнее
время этот метод был успешно применен для слияния клеток эмбрио-
нов ранних стадий развития [20], а также для получения гибридом
[21, 22]. Заметным преимуществом метода электрослияния перед
методами с использованием вируса Сендай и ПЭГ является возмож-
ность четкого разделения стадий агглютинации клеток и собственно
их слияния. Этим преимуществом воспользовались для создания
очень изящного способа получения гибридом [21]. На первом этапе
специфический антиген, связанный с биотином, инкубируют с суспен-
зией лимфоцитов, полученных из селезенки мыши, иммунизированной
данным антигеном. Одновременно осуществляют прижизненную
химическую пришивку авидина к клеткам миеломы. На втором этапе
проводят совместную инкубацию лимфоцитов и клеток миеломы.
За счет специфического взаимодействия биотин—авидин происходит
агглютинация клеток миеломы и иммунокомпетентных лимфоцитов,
несущих на поверхности антитела к специфическому антигену.
На третьем этапе клетки подвергаются электрошоку. Гибриды клеток
отбирают на среде ГАТ. Практически все клоны гибридных клеток
продуцируют антитела против нужного антигена, что упрощает
задачу идентификации и отбора клонов-продуцентов специфических
моноклональных антител.
Эффективность существующих в настоящее время методов слия-
ния клеток достаточно высока. Так, с помощью электрошока удается
слить до 80 % клеток в препарате. Однако необходимо иметь в виду
разрешение двух задач при электрослиянии: преимущественное
получение двуядерных гибридов и снижение гибели клеток при
слиянии. Ниже приведены некоторые методы слияния клеток,
рекомендуемые нами читателям. Мы сочли нужным поместить среди
них методы слияния клеток с помощью вируса Сендай, несмотря
на их трудоемкость, связанную с необходимостью наращивания
и титрования вируса (соответствующие методики также приве-
дены) — пока эти методы отличаются наибольшей мягкостью, что
делает их особенно ценными в цитологических исследованиях, где
важно сохранение высокой жизнеспособности и хорошей морфологии
клеток. Приведенные нами методы слияния клеток с помощью ПЭГ
не включают использования ДМСО, бескальциевой среды и агглюти-
нирующих лектинов. Мы полагаем, что эти усовершенствования
в ряде случаев могут быть полезны, но их следует применять
лишь при необходимости, так как приходится подбирать условия
к каждому конкретному типу клеток. Приведенные методы электриче-
ского слияния различаются способом сближения клеток: с помощью
диэлектрофореза, центрифугирования, совместной посадки клеток
на подложку.
В заключение следует указать, что для цитологических работ,
когда предполагается исследование гетерокарионов, оптимальным
является слияние клеток в монослое. В остальных случаях, когда
необходимо получить клоны гибридных клеток, лучше использовать
12*
179
методы слияния клеток в суспензии, позволяющие сливать очень
большие количества клеток-партнеров (десятки и сотни миллионов).
1.1. Получение вируса Сендай. Небольшие количества вируса
Сендай для последующего размножения можно получить в Инсти-
туте вирусологии АМН СССР, Москва (обычно титр вируса в предо-
ставляемых образцах составляет 2500—5000); 1) приготавливают
10 мл 1000-кратного разведения вируса на растворе Хэнкса с пени-
циллином и стрептомицином (по 1000 ед/мл); 2) яйца с 9-суточными
куриными эмбрионами обжигают с тупого конца «спиртовым факе-
лом» (намотанная на стеклянную палочку горящая вата, пропитан-
ная спиртом); 3) стерильным шильцем проверчивают маленькие
отверстия (диаметром 1 мм) в тупых концах яиц, следят, чтобы
при этом не образовывались трещины в скорлупе; 4) вводят в каждый
эмбрион с помощью шприца по 0.2 мл раствора Хэнкса с вирусом,
заливают отверстия в скорлупе каплей расплавленного парафина;
5) эмбрионы ставят на инкубацию (на 3 сут при 39 °C), при этом идет
размножение вируса и его накопление в аллантоисной жидкости;
6) на ночь эмбрионы помещают в холодильник, это необходимо для
того, чтобы сосуды эмбрионов спались и при получении аллантоисной
жидкости она не оказалась засоренной эритроцитами; 7) прожигают
яйца спиртовым факелом и ножницами срезают с тупых концов
скорлупу; 8) отсасывают аллантоисную жидкость пастеровской
пипеткой или шприцем емкостью 5—10 мл с широкой иглой; жид-
кость не должна содержать кровь и желток, она должна быть
опалесцирующей, что свидетельствует о накоплении в ней вируса;
образцы t аллантоисной жидкости с максимальной опалесценцией
отбирают*в отдельные емкости (с эмбриона обычно получают 5—
10 мл аллантоисной жидкости); 9) центрифугируют аллантоисную
жидкость 20 мин при 3000 g («осветление»), это необходимо для
очистки жидкости от клеток и клеточного детрита; аллантоисную
жидкость можно непосредственно использовать для слияния, если
титр вируса в ней не менее 1000, хранить ее следует в замороженном
виде небольшими порциями, каждая для одного слияния.
1.2. Титрование и концентрирование вируса Сендай: 1) срезают
скорлупу с тупого конца яйца, содержащего 9—13-суточный куриный
эмбрион; 2) перерезают ножницами крупные кровеносные сосуды,
питающие эмбрион, собирают пастеровской пипеткой или шприцем
аллантоисную жидкость с вытекшей в нее кровью; 3) разбавляют
аллантоисную жидкость раствором Хэнкса в 5—10 раз и центрифу-
гируют 5 мин при 700 g; 4) сливают супернатант, ресуспензируют
осадок эритроцитов в 10 мл раствора Хэнкса без индикатора феноло-
вого красного; 5) вносят автоматической пипеткой в круглодонные
ячейки 96-ячеечной пластиковой платы для титрования (Ленинград-
ский завод медицинских полимеров) суспензию эритроцитов; в пер-
вые ячейки каждого ряда вносят по 90 мкл суспензии, в остальные —
по 50 мкл (имеются в виду длинные ряды, по 12 ячеек в каждом);
6) добавляют в первые ячейки рядов по 10 мкл тестируемых образцов
вируса, в два ряда добавляют раствор Хэнкса (контроль); ресуспен-
зируют эритроциты, переносят в следующую ячейку ряда 50 мкл
180
суспензии, пипетируют; затем 50 мкл переносят из второй ячейки
в третью и так далее до конца каждого ряда, один образец аллан-
тоисной жидкости следует тестировать в двух рядах; 7) после того как
плата простояла 45—60 мин при комнатной температуре в контроль-
ных рядах, куда вирус не был внесен, осадок эритроцитов имеет вид
ровной круглой бляшки. Там, где был внесен вирус и произошла
гемагглютинация, осадок имеет «размытый» вид. Максимальное
разведение, при котором все еще происходит гемагглютинация,
соответствует титру вируса в тестируемом образце.
В том случае, если титр вируса в аллантоисной жидкости менее
1000, вирус следует сконцентрировать. Аллантоисную жидкость
центрифугируют 30 мин при 50 000 g. Супернатант сливают. Осадок
вирусных частиц ресуспензируют в малом объеме растворы Хэнкса.
Объем подбирают так, чтобы титр концентрированного виру-
са был 5000—10 000. Концентрированный вирус разделяют на не-
большие порции, достаточные для одного слияния, и заморажи-
вают.
1.3. Слияние клеток вирусом Сеидай в моиослое: 1) Клетки А
(обычно это те партнеры по слиянию, которые лучше прикрепляются-
к стеклу и распластываются на нем) высевают в концентрации
100 тыс. клеток / мл в 2 мл культуральной среды, содержащей 10 %
сыворотки, в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами,
инкубация при 37 °C продолжается 2—4 ч; 2) инактивация вируса
Сендай: 1—2 мл жидкости, содержащей вирус, наносят на чашку
Петри диаметром 90 мм, покачивая чашку, дают жидкости разлиться
по всей ее поверхности, выставляют чашки на 5 мин на расстоянии
15 см от включенной ультрафиолетовой лампы БУВ-30-2, при этом
происходит инактивация вируса — он теряет способность к размно-
жению, но сохраняет способность сливать клетки; жидкость, содер-
жащую инактивированный вирус, собирают с чашек Петри пипеткой;
3) из флаконов, содержащих покровные стекла, на которых растут
клетки А, сливают культуральную среду и промывают стекла холод-
ным раствором Хэнкса; 4) на покровные стекла наносят по 0.3 мл
охлажденной жидкости, содержащей инактивированный вирус;
затем флаконы выдерживают 10 мин при 4 °C для сорбции вирусных
частиц на поверхности клеток А; 5) вносят во флаконы по 0.2 мл
холодного раствора Хэнкса, содержащего клетки Б, количество
клеток Б нужно подбирать опытным путем; чем хуже клетки Б
прикрепляются и чем меньше их размеры, тем больше следует
их брать; в случае, если клетки Б — фибробласты или клетки
фибробластоидной линии, достаточно вносить во флаконы 300—
400 тыс. клеток, если это лимфоциты, то их количество должно
составлять от 500 тыс. до 2 млн., для куриных эритроцитов или
кариопластов (ядерные фрагменты клеток, получаемые при энуклеа-
ции) — 2—10 млн.; после внесения клеток Б во флаконы их выдержи-
вают 20 мин при 4 °C, в это время происходит агглютинация клеток
А и Б; 6) флаконы переносят в водяную баню при 37 °C и инкубируют
45 мин (слияние заметно усиливается при резком повышении темпе-
ратуры) ; 7) флаконы промывают теплым раствором Хэнкса. Затем
181
в них добавляют культуральную среду с 10—20 % сыворотки и инку-
бируют при 37 °C.
1.4. Слияние клеток вирусом Сендай в суспензии: 1) клетки А
и Б культивируют в монослое, обрабатывают трипсином и снимают
с культуральных флаконов средой, содержащей 10 % сыворотки
(присутствие сыворотки необходимо для предотвращения образова-
ния клеточных комков при снятии); 2) клетки А и Б по отдельности
центрифугируют 5 мин при 700 g, сливают супернатанты, ресуспензи-
руют в 1 —10 мл (в зависимости от массы осадка) раствора Хэнкса,
подсчитывают количество клеток в камере Горяева; 3) смешивают
клетки А и Б; если клетки имеют одинаковые размеры и одинаковую
способность к прикреплению, то их численное соотношение должно
быть примерно равно 1; в остальных случаях следует брать избыток
более мелких и хуже прикрепляющихся клеток (см. метод 1.3,
п. 5); доводят объем смешанной суспензии клеток до 50—100 мл
раствором Хэнкса, центрифугируют 5 мин при 4 °C и 700 g; 4) сли-
вают супернатант, ресуспензируют клетки в холодном растворе,
содержащем инактивированный вирус Сендай (содержание клеток
в жидкости должно составлять 2—5 млн./мл), переносят суспензию
в пробирку емкостью 10 мл, инкубируют 30 мин при 4 °C; 5) добав-
ляют в пробирку нагретую до 37 °C культуральную среду без сыво-
ротки в объеме, равном объему суспензии клеток, переносят пробирку
в водяную баню и инкубируют 45 мин при 37 °C; 6) переносят суспен-
зию в пробирку емкостью 100 мл, разводят в 10 раз теплым раствором
Хэнкса, центрифугируют 5 мин при 700 g и комнатной температуре;
7) сливают супернатант, ресуспензируют клетки в теплой культураль-
ной среде'с 10—20 % сыворотки (содержание клеток в среде должно
составлять 150—200 тыс./мл в пересчете на наиболее крупные
и хорошо прикрепляющиеся клетки-партнеры), переносят суспензию
клеток в культуральную посуду и инкубируют при 37 °C.
2.1. Слияние клеток с помощью ПЭГ в монослое [11] : 1) клетки А
и Б (по 100 тыс./мл) в 2 мл культуральной среды с 10 % сыворотки
высаживают на покровные стекла, находящиеся в пенициллиновых
флаконах, и инкубируют 4 ч при 37 °C; 2) приготовляют 8 мл
50 %-ного раствора ПЭГ с молекулярной массой 1000—6000; для
этого 4 г ПЭГ переносят в закрытую ватно-марлевой пробкой про-
бирку и нагревают в кипящей водяной бане в течение 1 ч (стерилиза-
ция ПЭГ); в случае, если гибридные клетки должны будут расти
более 1 нед, навеску ПЭГ автоклавируют 1 ч при 1 атм (к расплав-
ленному ПЭГ прибавляют 4 мл культуральной среды без сыворотки
и перемешивают, pH ПЭГ доводят до 7.8—8.0 примерно 0.05 мл 1 н.
NaOH, затем pH 50 %-ного раствора ПЭГ проверяют по индика-
торной бумаге Lachema, ЧССР, или Whatman, США); 3) к поверхно-
сти проточной металлической кюветы с ячейками с помощью пласти-
лина прикрепляют, вырезанный из пластиковой 24-ячеечной платы
ТС24 производства «Flow» (Великобритания) 4-ячеечный блок (один
ряд), который предварительно стерилизуют, выдерживая 1 ч
в 70 %-ном спирте и 2—3 ч под УФ-светом на расстоянии 15 см
от лампы БУВ-30-2; металлическая кювета присоединена к ультра-
182
термостату, отрегулированному на 41 °C (при этом температура воды
в ячейках кюветы равна 38—39 °C); в одну из ячеек кюветы, напол-
ненную водой, помещается пробирка или стаканчик емкостью 25—
100 мл с культуральной средой, остальные ячейки содержат неболь-
шое количество воды — здесь будут стоять во время слияния фла-
коны с клетками; 4) одну из пластиковых ячеек блока заполняют
50 %-ным раствором ПЭГ, в соседней пластиковой ячейке приготов-
ляют 25 %-ный раствор (культуральной средой вдвое разводят
50 %-ный раствор); 5) флаконы с клетками переносят в ячейки
проточной кюветы и глазным пинцетом извлекают покровное стекло
с клетками; стекло промывают в теплой культуральной среде, дают
среде стечь и переносят стекло на 1 с в пластиковую ячейку
с 50 %-ным раствором ПЭГ, затем — на 1 с в 25 %-ный раствор ПЭГ
и далее промывают в культуральной среде. Переносы «среда ->
-> 50 %-ный ПЭГ -> 25 %-ный ПЭГ -> среда» повторяют 5—10 раз;
затем стекло с клетками возвращают во флакон с полной культураль-
ной средой, который во время переносов находился в ячейке проточ-
ной кюветы при 37 °C. По окончании слияния все флаконы с клетками
переставляют в термостат при 37 °C.
2.2. Слияние клеток с помощью ПЭГ в суспензии. Слияние прово-
дят в водяной бане при 37 °C — используют заполненные водой
ячейки проточной кюветы ультратермостата (о численном соотноше-
нии клеток А и Б при слиянии см. метод 1.4, п. 3 и 1.3, п. 5). Следует
заметить, что в суспензии с помощью ПЭГ сливают лимфоциты
селезенки и клетки миеломы при получении гибридом. Соотношение
лимфоцитов и клеток миеломы от 5 : 1 до 10 : 1. При слиянии с по-
мощью ПЭГ в суспензии в общей сложности берут несколько
десятков или сотен миллионов клеток: 1) суспензии клеток А и Б
смешивают в нужном соотношении и центрифугируют 5 мин при
700 g; 2) надосадочную жидкость тщательно отсасывают пипеткой,
добавляют в пробирку по каплям 1 мл 50 %-ного теплого раствора
ПЭГ (о приготовлении этого раствора см. метод 2.1, п. 2); ресуспензи-
рование осадка следует проводить мягко с помощью пипетки емко-
стью 5 или 10 мл, имеющей достаточно широкое выходное отверстие;
3) через 1 мин после добавления ПЭГ в пробирку вносят 1 мл теплой
культуральной среды без сыворотки, перемешивают ПЭГ со средой,
покачивая пробирку; 4) через 1 мин добавляют еще 2 мл культураль-
ной среды и перемешивают; 5) через 1 мин культуральной средой
доводят объем суспензии клеток до 10 мл, инкубируют при 37 °C еще
10 мин; 6) центрифугируют 5 мин при 700 g и комнатной температуре,
ресуспензируют клетки в культуральной среде с 20 % сыворотки.
Желательно, чтобы 1 /з—1 /2 культуральной среды была кондициони-
рована А или Б клетками-партнерами (например, в случае получения
гибридом — клетками миеломы). Кондиционированная среда предва-
рительно должна быть очищена от открепившихся клеток и клеточ-
ного детрита центрифугированием в течение 10 мин при 3000 g.
Оптимальное время кондиционирования среды при исходной плот-
ности посадки клеток 100 тыс./мл составляет 2—3 сут (о содержании
клеток в среде при их посадке после слияния см. в методе 1.4, п. 7).
183
3.1. Электростимулируемое слия ние клеток. Далее мы рассмотрим
некоторые наиболее универсальные методики электрослияния, при-
менимые к культурам животных клеток. В них использованы различ-
ные способы приведения клеток в контакт. Выбор оптимального спо-
соба зависит от типа клеток, морфологии и свойств поверхности.
Важен также учет некоторых факторов (воздействие переменного
поля, пребывание в среде с низкой ионной силой при диэлектрофо-
резе) , способных повредить особо чувствительные клетки. Поскольку
электрический пробой приводит к резкому, хотя и временному,
неспецифическому увеличению проницаемости плазматических мем-
бран, жизнеспособность клеток сильно зависит от состава среды,
в которой проводится электрообработка. Чтобы сохранить в норме
ионный состав внутри клетки, ее осуществляют предпочтительно
в бескальциевой среде, содержащей калий в качестве основного
катиона. Лишь в некоторых случаях [22] в среду добавляют не более
10~4 М Са2+. Содержащиеся в среде электрообработки 0.1—0.3 М
сахара (сахароза, маннит или инозит) уменьшают ее электропровод-
ность (и соответственно выделение тепла при протекании тока —
закон Джоуля—Ленца), а также предотвращают коллоидно-осмоти-
ческий лизис клеток после пробоя [23].
Предложенные модификации метода можно разделить на микро-
и макроспособы в зависимости от того, с каким количеством клеток
оперирует исследователь: микроспособы предполагают работу с оди-
ночными или несколькими парами клеток, в то время как макроспо-
собы не имеют принципиальных ограничений числа клеток и дают
возможность обрабатывать до 108 клеток одновременно. Изложенные
далее процедуры электрослияния приведены в достаточно общем
виде, так что указаны не конкретные параметры электрообработки:
число импульсов, напряжение (V), напряженность поля между
электродами (£), длительность импульса (1 или т), частота перемен-
ного поля (f), а лишь диапазоны, в которых следует отыскивать
оптимальные параметры. Отметим, что для разных клеточных линий
эти параметры могут варьировать в широких пределах.
3.2. Электрослияние с применением диэлектрофореза в неодно-
родном переменном электрическом поле: микроспособ [24]. При нало-
жении неоднородного переменного поля на клетки, находящиеся
в среде с низкой ионной силой, последние втягиваются в область
максимальной напряженности поля (диэлектрофорез) и формируют
характерные цепочки (см. рисунок, а). Наложение одиночных
электрических импульсов на цепочки плотно контактирующих клеток
непосредственно в ходе диэлектрофореза вызывает их слияние.
Установка, схема которой приведена на рисунке (б), состоит
из генератора Л (ГЗ-7А или аналогичного), подающего синусои-
дальные колебания с частотой f=10 кГцЧ-2 МГц, амплитудой £пнк
до 30 В, подключаемого через реле генератора Г2 (Г5-54 или Г5-28),
подающего прямоугольные импульсы Г=04-70 В, 1—14-100 мкс, и
осциллографа (О) для контроля напряжения на электродах ячей-
ки (Я). Микроячейка для диэлектрофореза (см. рисунок, в) монтиру-
ется на предметном стекле (<?) при помощи водостойкого клея и со-
184
Схема электростимулируемого слияния клеток и необходимое оборудование.
а — схема, иллюстрирующая диэлектрофорез клеток в неоднородном переменном электри-
ческом поле, создаваемом двумя цилиндрическими электродами; б—блок-схема установки
для диэлектрофореза и слияния клеток; в — конструкция микроячейки для слияния клеток
по Циммерману; е — схема простого формирователя экспоненциально затухающих импуль-
сов; д — схема формирователя квазипрямоугольиых импульсов; е — ячейки для слияния
клеток в осадке после центрифугирования: / — тефлоновая ячейка, сужающаяся киизу и
имеющая там небольшую (диаметром 3—4 мм) цилиндрическую полость, 2 — ячейка, изготов-
ленная из кюветы от спектрофотометра. Пояснение см. в тексте.
стоит из спейсера (2) (плексиглас) и двух проволочных электро-
дов (платина, никель или нержавеющая сталь) диаметром 0.2—
0.4 мм (2). Расстояние между электродами в рабочей части состав-
185
ляет 0.1—0.2 мм. Ячейку можно стерилизовать этанолом с последую-
щим высушиванием под УФ-лампой, а в ходе эксперимента накрывать
покровным стеклом.
Оба этапа, как диэлектрофорез клеток, так и слияние, контроли-
руют под микроскопом: 1) клетки А и Б, взятые для слияния,
перемешивают в соотношении 1:1, промывают 1 раз раствором
Хэнкса и затем после двукратной промывки переводят в среду
с низкой ионной силой следующего состава: 0.28 М инозит, 1 • 10~3М
фосфатный буфер (К2НРО4/КН2РО4), 5 • 10“4М Mg(CH3COO)2,
1 • 10 4М Са(СН3СОО)2, в простейшем случае данная среда может
быть заменена на незабуференный 0.3 М маннит или сахарозу;
2) 50—100 мкл суспензии, содержащие 103—104 клеток, переносят
186
в ячейку и включают переменное поле с амплитудой Епи1=0.24-
4-0.8 кВ/см и частотой /=0.54-1 МГц (заметим, что при ширине
межэлектродного зазора 0.1 мм напряжение V, необходимое для
достижения данной величины поля, равно 2—8 В; за 0.5—3 мин
клетки концентрируются в зазоре между электродами и формируют
характерные цепочки); подбором плотности клеточной суспензии
и напряженности переменного поля можно добиться образования
значительного числа цепочек, состоящих только из двух клеток,
некоторая доля таких клеточных пар будет представлять искомую
комбинацию А-f-Б; 3) в ходе диэлектрофореза, длящегося 0.5—5 мин,
на цепочки накладывают несколько (1—5) последовательных
импульсов (/=54-50 мкс, £=2.54-5 кВ/см) и затем для поддержания
целостности цепочек еще в течение минуты переменное поле остав-
ляют включенным; 4) переменное поле выключают, и через 2—5 мин
в ячейку осторожно добавляют 100—200 мкл среды следующего
состава: 0.132 М NaCl, 8- 10-3 М КС1, 0.01 М буфера (ЫагНРСЬ/
NaH2PO4), 5- ИГ4 М Mg(CH3COO)2 и 1- 10“4 М Са(СН3СОО)2,
в которой в течение 20—30 мин происходит собственно процесс
слияния клеток; 5) при помощи пипетки или микрошприца все
содержимое ячейки переносят в питательную среду с 10—15 % сыво-
ротки для дальнейшего культивирования. За один цикл таким
образом можно получить 10—100 гибридных клеток.
Возможные модификации: 1) для удобства наблюдения клетки
типа А и типа Б предварительно могут быть окрашены витальными
красителями, например нейтральным красным (0.24 мг/мл, 30 мин)
или янусом зеленым (0.12 мг/мл, 30 мин) [19]; 2) после процедуры
диэлектрофореза часть клеток оказывается плотно адгезированной
на поверхности электродов; чтобы избежать этого, диэлектрофорез
клеток проводят на поверхности стекла между двумя плотно прижа-
тыми к нему электродами в среде следующего состава: 0.3 М маннит,
1- 103MMgCl2, 1- 10“4 М СаС12, 5- 10~3 М Трис-НС1 (pH 7—7.4)
[25]; в этом случае клетки практически не соприкасаются с электро-
дами, легче получить и хорошее микроскопическое изображение;
3) для увеличения эффективности слияния в среду электрообработки
можно добавлять ферменты, частично удаляющие гликокаликс:
проназу Е («Serva», 50—100 мкг/мл), диспазу («Boehringer», 10—
20 мкг/мл) или нейраминидазу («Koch-Light», 10 мкг/мл); 4) исполь-
зование спиральной ячейки специальной конструкции [26] позволяет
превратить описанный микроспособ в макроспособ и обрабатывать
до 106 клеток одновременно.
3.3. Электрослияние с применением диэлектрофореза в однород-
ном электрическом поле: макрофособ [27]. Находясь в однородном
переменном электрическом поле, клетки подвергаются взаимному
диэлектрофорезу, т. е. благодаря возникновению наведенных диполей
они притягиваются и приходят в плотный контакт. Приложенный
в этот момент импульс высокой амплитуды вызывает слияние клеток.
Метод предполагает обработку достаточно больших объемов
клеточной суспензии (0.1 — 1 мл), поэтому для достижения достаточ-
ной для слияния напряженности электрического поля (2—5 кВ/см)
187
при не слишком узком межэлектродном зазоре (0.5 мм и более)
удобно иметь генератор высоковольтных импульсов.
Схема наиболее простого устройства, позволяющего формировать
экспоненциально затухающие импульсы, приведена на рисунке (г)
[26]. Накопительный конденсатор (С), заряженный от источника
высокого напряжения (/), разряжается через ячейку (Я). Разряд
достигается включением коммутирующего элемента, в качестве кото-
рого может быть использован высоковольтный теристор (Т) или ти-
ратрон. Пиковая амплитуда импульса определяется напряжением,
до которого заряжен конденсатор. Длительность импульса, т. е.
характерное время т, за которое напряжение спадает в е раз, опреде-
ляется по формуле т=/?С, где С — емкость накопительного конденса-
тора, R — сопротивление ячейки. Таким образом, длительность т
можно подбирать, изменяя либо емкость, либо ионную силу и соответ-
ственно проводимость раствора в ячейке.
Блок-схема формирователя квазипрямоугольных импульсов
от источника высокого напряжения (/) приведена на рисунке (д).
Включением теристора Т\ формируется передний фронт импульса;
последующее шунтирование цепи теристором Т2, включаемым
с некоторой задержкой t, формирует задний фронт импульса. Таким
образом, импульс состоит из двух экспонент: сначала медленно
спадающей, а затем быстро спадающей. Подбором величин емкости
С (2—10 мкФ) и шунтирующего сопротивления /?ш (0.5—1 Ом)
можно добиться практически прямоугольной формы импульса.
Источником высокого напряжения (/) в обеих схемах может
послужить любой лабораторный источник, используемый для гель-
электрофбреза, коммутирующими элементами — теристоры ТЧ-100
или ТЧИ-100, а в качестве блока задержки в схеме формирователя
можно использовать генератор Г5-54. Необходимо помнить, что все
элементы высоковольтной цепи должны быть смонтированы с учетом
правил электробезопасности! Блок-схема установки для диэлектро-
фореза и электрослияния в однородном поле аналогична изображен-
ной на рисунке (б). В качестве генератора Г, используется генератор
ГЗ-7А, снабженный ВЧ-трансформатором, повышающим напряже-
ние вдвое (до 60 В). В качестве генератора Г2 — один из описанных
выше формирователей.
Ячейка представляет собой две чисто обработанные пластины
из нержавеющей стали диаметром 40—50 мм, между которыми вло-
жено изолирующее тефлоновое кольцо толщиной 0.5 мм с внутренним
диаметром 30 мм. Пространство, заключенное между пластинами
внутри кольца, образует рабочий объем ячейки. При необходимости
ячейку можно стерилизовать любым способом и далее все операции
выполнять, поместив ее и подводящие кабели в ламинарный шкаф.
Для слияния берут клетки, находящиеся по возможности в лога-
рифмической фазе роста: 1) клетки А и Б смешивают в необходимой
пропорции и, дважды промывая, переводят в 0.3 М раствор сахарозы,
для увеличения индекса слияния клетки предварительно могут быть
обработаны ферментами (см. метод 3.2) 3—10 мин при 37 °C;
2) каплю суспензии (50—100 мкл), содержащую 3- 106 клеток,
188
помещают на нижний электрод ячейки в центр кольца и накрывают
верхним электродом (необходимо убедиться, что капля смачивает
оба электрода); 3) диэлектрофорез клеток проводят в переменном
поле: Епик=0.84- 1.2 кВ/см, /=14-2 МГц в течение 20—30 с; 4) непо-
средственно в ходе диэлектрофореза накладывают 1—2 импульса,
£=34-5 кВ/см, /=34-20 мкс, после чего продолжают диэлектрофорез
еще в течение 10 с; 5) поле отключают и через 10 мин клетки перено-
сят в питательную среду для культивирования.
При производстве мышиной гибридомы данным методом сплено-
циты и миеломные клетки смешивают в соотношении 2:1. Обработке
проназой (0.5 мг/мл, 0.5 мин, 37 °C) подвергают только миеломные
клетки, затем их промывают 0.3 М сахарозой и после этого добавляют
спленоциты [27]. Могут быть использованы следующие параметры
диэлектрофореза: £пик=1.2 кВ/см, f—2 МГц с последующим прило-
жением одиночного импульса £=4.2 кВ/см, /=3 мкс.
3.4. Электрослияние клеток в осадке после центрифугирования
[28, 29]. Установка для слияния состоит из формирователя импуль-
сов и ячейки (см. рисунок, е). В простейшем случае ячейка может
быть изготовлена из стеклянной или пластиковой кюветы от спектро-
фотометра шириной 5—10 мм, на противоположные стенки которой
приклеены электроды из алюминиевой фольги. Далее мы опишем
процедуру слияния применительно к получению мышиных гибридом
[29]: 1) клетки миеломы (1 • 107—3 • 107) и спленоциты (108)
смешивают, дважды промывают буфером с 0.28 М инозитом (см. ме-
тод 3.2, п. 1) и ресуспензируют в 4 мл того же буфера; 2) 0.4 мл
суспензии помещают в кювету с приклеенными электродами; затем
в качестве агглютинирующего агента добавляют ПЭГ (молекулярная
масса 6000, «Serva») в концентрации 2—4 %; 3) кювету закрывают
стерильной крышкой и центрифугируют при 200 g в течение 10 мин;
таким образом, формируется тонкий клеточный осадок на дне кюветы;
4) подсоединив электроды к генератору, прикладывают 1—3 им-
пульса; £=2.54-5 кВ/см, /=54-100 мкс; 5) после электрообработки
кювету помещают на 15 мин в термостат (37 °C), затем
в кювету вводят 1.5 мл фосфатного буфера, содержащего 0.132 М
NaCl (см. метод 3.2, п. 4) и далее инкубируют при той же температуре
еще 10 мин; 6) клетки суспензируют в 10 мл среды МЕМ, содержа-
щей 10 % эмбриональной сыворотки, и затем разливают по 12 лункам
24-луночной культуральной платы.
3.5. Электрослияние клеток в монослое [30, 31]. В данном спо-
собе использовано свойство многих типов клеток (фибробластов,
эпителиальных) образовывать монослой из плотно контактирующих
клеток, спонтанно формирующиеся межклеточные контакты обеспе-
чивают достаточно тесное сближение мембран и соответственно
высокий индекс слияния: 1) исходные клетки А и Б смешивают
в соотношении 1 : 1 и высевают в 35 мм чашки Петри («Falcon») или
на покровные стекла, концентрацию клеток подбирают такой, чтобы
на следующие сутки образовался смешанный субконфлюэнтный
(70 %) монослой; 2) после формирования монослоя среду в чашке
189
заменяют на раствор следующего состава: 0.25 М сахароза, 0.01 М
фосфатный буфер (К2НРО4/КН2РО4) и 1 • 10~3 М MgCl2; 3) в чашку
Петри помещают два электрода (пластины из нержавеющей стали
длиной 10—20 мм, скрепленные параллельно на расстоянии 4—10 мм
друг от друга) и плотно прижимают их ко дну чашки; участок клеточ-
ного монослоя между электродами обрабатывают 3—5 импульсами,
Е= 14-1.5 кВ/см, 1=30-4-100 мкс; 4) чашку помещают в термостат
(37 °C) на 10—20 мин, после чего среду электрообработки заменяют
на полноценную ростовую среду с 15—20 % сыворотки и далее
инкубируют в термостате в течение 3—5 ч; 5) появившиеся гетеро-
и поликарионы можно наблюдать в фазовом контрасте или после
фиксации и окрашивания клеток непосредственно в чашке Петри
(или на стекле) через 3 ч после индукции слияния.
Методы селекции клеточных гибридов
В 60—70-х годах был предложен ряд систем селекции гибридных
клеток, основанных на использовании для слиянйя линий клеток,
имеющих генетические дефекты. Наибольшее распространение полу-
чила система с использованием среды ГАТ. В настоящее время
система ГАТ используется в подавляющем большинстве работ
по получению клонов гибридных клеток. В связи с необходимостью
получения гибридов из первичных клеток большую важность при-
обретает разработка систем селекции клеточных гибридов, которые
позволили бы обходиться без линий с генетическими маркерами
[33, 34].
Мы приводим два новых метода селекции, не требующих ис-
пользования линий клеток с генетическими маркерами. Один из них
базируется на предварительном введении в клетки-партнеры антител
к двум различным токсинам и на последующем выживании гибридов
на среде с этими токсинами, так как они несут антитела против них
обоих [13]. Второй метод основан на защите гибридных клеток
от вируса (выступающего в качестве селективного агента) с помощью
видоспецифических интерферонов [35].
Селекция методом «токсин—антитоксин» [13]. Метод основан
на предварительном введении в клетки А антител против рицина,
а в клетки Б — антител против дифтерийного токсина. После слияния
клетки инкубируют в среде с рицином и дифтерийным токсином,
в результате чего выживают только клеточные гибриды, защищенные
антителами обоих видов. Метод разработан на диплоидных фибро-
бластах человека.
1. Клетки обрабатывают трипсином, снимают с матрасов средой
с 10 % сыворотки, подсчитывают число клеток в камере Горяева,
затем клетки осаждают центрифугированием (5 мин, 700 g),
ресуспензируют в среде без сыворотки, вновь осаждают, сливают
супернатант и центрифугируют еще раз (2 мин, 700 g), после этого
тщательно отсасывают пипеткой остатки жидкости из пробирки.
2. Ресуспензируют 107 клеток в 0.2 мл бессывороточной культу-
ральной среды, содержащей сахарозу (0.5 М, гипертонический раст-
190
вор) и ПЭГ-1000 (10 %), а также антитела против рицина (для кле-
ток А) или против дифтерийного токсина (для клеток Б); могут быть
использованы как моноклональные мышиные, так и поликлональные
кроличьи антитела. Предварительно АТ осаждают 50 %-ным раство-
ром сульфата аммония, диализируют против 6 • 10~3М натрий-
фосфатного буфера (pH 7.2), стерильно фильтруют и лиофилизируют,
после чего растворяют в малом объеме гипертонического раствора.
Концентрация антител в гипертоническом растворе должна быть
по крайней мере в 15—20 раз выше, чем в исходной сыворотке
(для поликлональных антител) или в культуральной среде (для моно-
клональных антител). Для получения антител к рицину животных
следует иммунизировать рицином, обработанным формальдегидом.
Клетки инкубируют в гипертоническом растворе с антителами в тече-
ние 10 мин. В это время клетки пиноцитируют раствор.
3. . Добавляют 10 мл теплой смеси бессывороточной среды и ди-
стиллированной воды (6 : 4). В результате гипотонического шока пи-
ноцитозные пузырьки, содержащие раствор антител, разрываются
и их содержимое поступает в цитоплазму. Инкубация клеток в гипо-
тоническом растворе продолжается 2 мин при 37 °C. Далее клетки
осаждают центрифугированием (5 мин, 700 g) и ресуспензируют
в 10 мл теплой изотонической культуральной среды, инкубируют
10 мин при 37 °C.
4. Смешивают клетки А и Б (по 107 клеток) и осаждают центри-
фугированием (5 мин, 700 g), сливают супернатант. Центрифугируют
еще 2 мин при 700 g. Отсасывают остатки жидкости.
5. Ресуспензируют клетки в 0.2 мл бессывороточной культураль-
ной среды, содержащей 35 % ПЭГ-1000 и 10 % диметилсульфоксида.
Инкубируют 45 с.
6. Добавляют 10 мл культуральной среды с 10 % сыворотки
эмбрионов коров. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре.
Центрифугируют 5 мин при 700 g. Ресуспензируют в полной культу-
ральной среде (с 20 % сыворотки эмбрионов коров), содержащей
рицин и дифтерийный токсин в заранее подобранных концентрациях.
Высаживают в культуральную посуду с плотностью не более
(25—50) • 103 клеток на 1 см2. Для диплоидных фибробластов кон-
центрации рицина и дифтерийного токсина в селективной среде
составляли 3 нг/мл. Для предварительного подбора концентраций
токсинов некоторое количество клеток А, в которые были инъециро-
ваны антитела к рицину, и клеток Б с антителами к дифтерийному
токсину инкубируют в течение 20 ч с соответствующими токсинами
в различных концентрациях, а затем 3 сут без токсинов. Одновре-
менно в аналогичных условиях проводят инкубацию клеток, не под-
вергавшихся инъекциям. Подбирают такие концентрации токсинов,
при которых погибают все неинъецированные клетки и выживает
максимальное количество клеток, подвергавшихся инъекции антител.
Для подбора используют концентрации токсинов в диапазоне от 0.03
до 30 нг/мл.
7. Через 15—20 ч переводят клетки в полную культуральную
среду без токсинов.
191
Данная система селекции не годится для клеток мышевидных
грызунов, которые резистентны к дифтерийному токсину. Работая
с этими клетками, можно заменить дифтерийный токсин другим
ядом — абрином, и соответственно инъецировать в клетки перед
слиянием антитела к абрину.
Селекция методом «интерферон—вирус». Метод разработан
на человеческих клетках J-96 и на мышиных клетках L929 [35]:
1) по 107 клеток человека и мыши сливают в суспензии с помощью
полиэтиленгликоля (см. метод 2.2); 2) высевают клетки во флаконы
или в чашки Петри из расчета 3 • 105 клеток в 1 мл в культуральной
среде с 20 % сыворотки крупного рогатого скота; через 24 ч заменяют
культуральную среду на свежую того же состава; 3) через 18 ч произ-
водят замену на среду с 2 % сыворотки эмбрионов коров с добавле-
нием мышиного сывороточного интерферона, 50 ед/мл; 4) через 6 ч
вводят в среду вирус везикулярного стоматита (штамм Индиана)
в дозе 104 ТПД50/мл; 5) через 18 ч после гибели одноядерных клеток
человека и гомокарионов, образовавшихся в результате слияния кле-
ток человека друг с другом (эти клетки не имеют рецепторов для
мышиного интерферона и, следовательно, не могут быть им защи-
щены от вируса), клетки отмывают от вируса раствором Хэнкса;
добавляют среду с 20 % сыворотки эмбрионов коров и лейкоцитар-
ным человеческим интерфероном (80 МЕ/мл); 6) через 6 ч вводят ви-
рус везикулярного стоматита в дозе 104 ТПД50/мл; 7) через 18 ч,
когда произошла гибель клеток мыши, не имеющих рецепторов
для человеческого интерферона, отмывают клетки от вируса раство-
ром Хэнкса и добавляют среду с 20 % сыворотки эмбрионов коров
с удвоенном содержанием глютамина.
Колонии гибридных клеток появляются через 2 нед.
Литература
1. Harris Н. Behaviour о! differentiated nuclei in heterokayons of animal cells from
different species // Nature. 1965. Vol. 206. P. 583—588.
2. Saksela E., Aula P., Cantell K- Chromosomal damage of human cells induced by Sen-
dai virus //Annu. Med. Exp. Biol, Fenn. 1965. Vol. 43. P. 132—136.
11 3. Howell A. N., Sager R. Tumorogenicity and its suppression in cybrids of mouse
and Chinese hamster cell lines // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. Vol. 75.
P. 2358—2362.
4. Рингерц P., Сэвидж P. Гибридные клетки. M., 1979. 326 с.
5. Dhar И„ Searle В. М., Athwal R. S. Transfer of Chinese hamster chromosome 1
to mouse cells and regional assignment of 7 genes: a combination of gene transfer
and microcell fusion // Somat. Cell Mol. Genet. 1984. Vol. 10. P. 547—559.
6. Campbell A. M. Monoclonal antibody technology. Amsterdam, 1985. 326 c.
7. Barski G.. Sorieul S., Cornefert F. «Hybrid» type celis in combined cultures of two
mammalian cell strains//J. Nat. Cancer Inst. 1961. Vol. 26. P. 1269—1291.
8. Okada I., Murayama F. Multinucleated giant cell formation by fusion between
cells of two different strains//Exp. Cell Res. 1965. Vol. 40. P. 154—158.
9. Constable F., Kao K- N. Agglutination and fusion of plant protoplasts by polyethylene
glycol // Canad. J. Bot. 1974. Vol. 52. P. 1603—1606.
10. Pontecorvo G. Production of indefinitely multiplying mammalian somatic cell hybrids
by polyethylene glycol (PEG) treatment // Somat. Cell Genet. 1976. Vol. 1. P. 397—
400.
11. Егоров E. E., Прудовский И. А., Зеленин А. В. Синтез ДНК в гибридах макрофагов
и клеток с различной пролиферативной активностью // Докл. АН СССР. 1984.
Т. 276. С. 961-965.
192
12. Vaughan L., Hansen D.. Stadler J. Parameters of polyethylene glycol-induced cell
fusion and hybridization in Ivmphoid cell lines // Somat. Cell Genet. 1976. Vol. 2
P. 537—544.
13. Wright W. E. Toxin-antitoxin selection for isolating somatic cell fusion products
between any cell types // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 7822—7826.
14. Мерсер В., Басерга P. Методы снижения токсического действия полиэтиленглико-
ля //Методы генетики соматических клеток. М., 1985. Т. 1. С. 35—48.
15. Mercer W. Е., Schlegel R. A. Phytohemagglutinin enhancement of cell fusion reduces
polyethylene glycol cytotoxicity//Exp. Cell Res. 1979. Vol. 120. P. 417—421.
16. Ytaka M., Yamane 1. Cell hybridization and cell agglutination. 2. Enhancement of cell
hybridization by polycations//J. Cell Sci. 1985. Vol. 78. P. 273—282.
17' , Hanks S. K-, Brawn D. B., Rao P. N. The fusion of metaphase and interphase cells //
Exp. Cell Res. 1982. Vol. 138. P. 215-220.
18. Зеленин А. В., Бандрина И. H. Ранние этапы слияния клеток // Биофизика мем-
бран. М., 1984. С. 218—242. (Итоги науки и техники. Сер. Биология / ВИНИТИ;
Т. 3).
19. Ohno-Shosaku Т., Hama-Inada Н., Okada У. Somatic hybridization between human
and mouse lymphoblast cells produced by an electric pulse-induced fusion techni-
que//Cell Struct. Funct. 1984. Vol. 9. P. 193—196.
20. Kubiak J. Z., Tarkows-ki A. K. Electrofusion of mouse blastomeres // Exp. Cel! Res.
1985. Vol. 157. P. 561—566.
21. La M. S., Tsang T. Y., Conrad M. K. et al. Monoclonal antibody production by recep-
tor-mediated electrically induced cell fusion // Nature. 1984. Vol. 310. P. 792—794.
22. Vienken J., Zimmermann U. An improved electrofusion technique for production
of mouse hybridoma cells // FEBS Lett. 1985. Vol. 182. P. 278—280.
23. Kinosita K., Tsong T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human
erythorocytes // Biochem. biophys. acta. 1977. Vol. 471. P. 227—242.
24. Zimmermann U. Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena //
Biochem. biophys. acta. 1982. Vol. 694. P. 227—277.
25. Ohno-Shosaku T., Okada Y. Facilitation of electrofusion of mouse lymphoma cells
by the proteolytic action of proteases // Biochim. Biophys. Res. Communs. 1984.
Vol. 120. P. 138—143.
26. .Zimmermann U. Electrofusion of cells: principles and industrial potential // Trends
Biotechnol. 1983. Vol. 1. P. 149—155.
277 Karsten U., Papsdorf G., Roloff G. et al. Monoclonal anti-cytokeratin antibody from
a hybridoma clone generated by electrofusion // Europ. J. Cancer Clin. Oncol. 1985.
Vol. 21. P. 733—740.
28. Neumann E., Gerisch G., Opatz K. Cell fusion induced by high electric impulses
applied to Dictyostelium//Naturwissenschaft. 1980. Bd 67. S. 414—415.
29. Ruker F., Mattanovich, Liegel W., Katinger H. A simple and efficient procedure
for electrofusion of animal cells //Stud. Biophys. 1987. Vol. 119. P. 81—84.
30. Teissie J., Knutson V. P., Tsong T. Y., Lane M. Electric pulse-induced fusion of 3T3
cells in monolayer culture//Science. 1982. Vol. 216. P. 537—538.
31. Finaz C., Lefevre A., Teissie J. A new, highly efficient technique for generating
samatic cell hybrids // Exp. Cell Res. 1984. Vol. 150. P. 477—481.
32. Чой В., Гопалакришнан III., Литлфилд Дж. Методы селекции с использованием
среды ГАТ в генетике соматических клеток // Методы генетики соматических кле-
ток. М„ 1985. Т. 1. С. 22—34.
33. Ионгкинд И., Веркерк А. Неселективное выделение гетерокарионов, гибридов и
цибридов между фибробластами методом сортировки в потоке // Методы генетики
соматических клеток. М., 1985. Т. 1. С. 101 —121.
34. Райт В. Отбор гетерокарионов и клеточных гибридов с помощью метаболических
ингибиторов — йодацетамида и диэтилпнрокарбоната//Методы генетики сома-
тических клеток. М., 1985. Т. 1. С. 62—85.
35. Наровлянский А. Н., Амченкова А. М., Щегловитова О. Н., Хесин Я. Е. Выделение
гибридов соматических клеток с помощью специфического интерферон-внрусного
метода селекции // Вопр. вирусологии. 1985. Т. 30. С. 244—250.
13 Заказ 1789
193
Получение моноклональных антител
(гибридомная технология)
И. И. Фридлянская
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
В процессе фундаментальных исследований механизмов синтеза
иммуноглобулинов, проводимых с применением клеточных культур и
гибридологического анализа, выявились закономерности, практиче-
ское применение которых произвело революцию в иммунологии [I].
Был найден подход, позволяющий получать практически в неограни-
ченных количествах моноклональные антитела (МонАТ) с известной
специфичностью. Суть новой технологии состоит в получении гибри-
дов между клетками миеломы и нормальными В-лимфоцитами от до-
норов, иммунизированных определенными антителами. В таких ги-
бридах (гибридомах), которые при культивировании «бессмертны»,
продуцируются гомогенные антитела против индивидуальных эпито-
пов антигена.
МонАТ являются новым поколением иммунодиагностических и
иммунотерапевтических препаратов. Благодаря им иммунологиче-
ские методы стали шире использоваться в различных отраслях
науки, даже в тех, где ранее применение иммунологических подходов
было ограничено или они вовсе не использовались. Это определило
интерес к гибридомной технологии многих исследователей, занимаю-
щихся решением научных и прикладных задач. Принципы метода,
а также возможности применения МонАТ описаны в ряде обзоров
[2-4].
Для получения МонАТ используют различные клеточные системы.
Особое внимание уделяется получению гибридом человеческого
происхождения, поскольку МонАТ, полученные на их основе, имеют
первостепенное значение для клинического применения. В этом на-
правлении имеются некоторые успехи [5]. Однако в настоящее время
основной клеточной системой в гибридомной технологии являются
клетки мышиного происхождения, поэтому подробное описание
метода, которое будет дано ниже, касается только мышиных МонАТ.
Процедура получения МонАТ включает следующие этапы:
1) иммунизация; 2) слияние нормальных клеток от иммунизирован-
ных доноров с клетками миеломы, селекция гибридов (гибридом);
3) скрининг гибридом на продукцию специфичных МонАТ; 4) получе-
ние стабильных л и ний-продуцентов (клонирование); 5) характе-
ристика МонАТ; 6) наработка МонАТ — культивирование in vivo
и (или) in vitro; 7) криоконсервация клеток; 8) очистка антител.
Методы, используемые разными авторами на каждом из этапов,
в деталях почти всегда несколько отличаются. Здесь будет описан
вариант гибридомной технологии получения моноклональных анти-
тел, успешно применяемый в нашей лаборатории. Учитывая, что
публикуемый сборник посвящен методам культивирования клеток,
основное внимание будет уделено этапам работы, связанным
с культивированием клеток. Подробно с методами, относящимися
194
к характеристике антител, а также к очистке антител, можно ознако-
миться в ряде обзоров [2, 3,6].
Иммунизация
Цель иммунизации — индукция клонов В-лимфоцитов, продуци-
рующих антитела к определенному антигену. Для некоторых анти-
генов получение гибридом возможно без целенаправленной иммуни-
зации, однако такая ситуация чрезвычайно редка.
Считается, что при образовании гибридом с клетками миеломы
сливаются преимущественно делящиеся В-лимфоциты. Выход гибри-
дом, продуцирующих специфические антитела, наибольший, если
для слияния берутся клетки на 3—5-е сутки после бустерной иммуни-
зации (в период активной антиген-индуцированной пролиферации
В-лимфоцитов). Поэтому в подавляющем большинстве конечным
этайом иммунизации является бустирование и забор клеток на 3—
5-е сутки после него [7]. Бустерные инъекции наиболее эффективны
при внутривенном или внутрибрюшинном введении антигена.
Общее время иммунизации варьирует от нескольких суток
(иммуноген—клетки) до нескольких месяцев (иммуноген—гаптены).
При использовании в качестве антигенов растворимых белков при
первичных иммунизациях применяются стимуляторы иммунного от-
вета (например, полный адъювант Фрейнда). Для иммунизации
можно использовать мышей разных штаммов. Однако поскольку
до сих пор основным методом получения МонАТ остается выделение
их из асцитной жидкости, работают, как правило, с животными,
сингенными в отношении миеломных клеток.
Ниже приводится схема иммунизации, которая может быть приме-
нена для растворимых белков (неслабых иммуногенов).
Сутки до слияния Доза антигена (мкг на мышь), способ
введения
15.................. 100 подкожно с полным адъювантом
Фрейнда
8..................50 внутрибрюшинно с полным адъюван-
том Фрейнда
4..................50 внутрибрюшинно
3..................50 внутрибрюшинно, 50 внутривенно
2..................То же
1..................Антиген не вводится
0..................Слияние
В последние годы большое внимание уделено методам иммуниза-
ции in vitro, особенно в связи с получением моноклональных антител
на основе клеток человека (см. обзор: [8]). Для практического
применения можно порекомендовать метод, основанный на использо-
вании кондиционированной среды от клеток тимомы EL-4, стимулиро-
ванных в течение 2 сут форболмеристатацетатом, 10 нг/мл. В такой
среде содержатся интерлейкин-2, дифференцировочный В-клеточный
фактор, а также ростовой В-клеточный фактор. Клетки селезенки,
взятые от мышей, которым предварительно, за 2 нед, вводили внутри-
13*
195
брюшинно по 50 мкг антигена, культивируют в течение 4 сут в среде,
содержащей 10 % кондиционированной среды и 100 мкг/мл анти-
гена [9], после чего проводят слияние.
В процессе иммунизации у животных определяют титр антител
к данному антигену. Для этого из орбитального синуса делают забор
крови. Для бустирования и дальнейшего слияния отбирают живот-
ных с максимальным титром антител.
Слияние
Источником В-лимфоцитов служит, как правило, селезенка
иммунизированных животных. В редких случаях их выделяют из
лимфатических узлов.
Получение спленоцитов: 1) животное забить, покровы про-
стерилизовать спиртом; 2) в стерильных условиях извлечь селезенку,
поместить в чашку Петри; 3) в шприц набрать среду без сыворотки
(RPMI-1640) и многократным укалыванием в разные точки селезенки
вымыть из нее клетки; общий объем среды — 10 мл; 4) суспензию
клеток перенести в центрифужные пробирки и центрифугировать
7—10 мин при 700 g; 5) осадок суспензировать в новой порции среды
без сыворотки (5 мл); 6) подсчитать концентрацию клеток и их
жизнеспособность (с помощью витальных красителей). Выход клеток
составляет (ГО—15) • 107, жизнеспособность близка к 100 %.
Подготовка миеломных клеток. В гибридомной технологии ис-
пользуют различные миеломные линии (см. обзор: [10]). Все они
имеют генетические маркеры, позволяющие работать с ними в селек-
тивных условиях. Наиболее распространены в настоящее время две
линии — Sp 2/0 AgI4 и X63Ag8 6.5.3. Эти клеточные линии имеются
во Всесоюзной : коллекции клеточных культур. Обе они являются
производными линии РЗК, полученной из миеломы мышей BALB/c
МОРС-21. Преимуществом этих клеток является вторичная утрата
ими способности синтезировать собственные иммуноглобулины.
Клетки дефектны по ферменту гипоксантин-гуанинфосфорибозил-
трансфераза, благодаря чему устойчивы к 8-азагуанину и чувстви-
тельны к среде ГАТ (см. ниже). Реверсии в этих клетках являются
чрезвычайно редким событием, тем не менее рекомендуют каждые
3—6 мес эти клетки культивировать в течение 2—3 пассажей на среде
с 8-азагуанином (2- 10-5М).
Миеломные клетки культивируют на среде Игла в модификации
Дальбекко (DME) или на среде RPMI-1640 с добавлением 10 % эм-
бринальной сыворотки коров. Плотность насыщения для этих кле-
ток— (1.0—1.5) • Ю6 клеток на I мл. Растут они, частично при-
крепляясь к подложке, частично в суспензии. Для слияния исполь-
зуют клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста.
Процедура подготовки клеток для слияния следующая: 1) пере-
нести клетки из культуральных сосудов в центрифужные пробирки;
прикрепившиеся к подложке клетки снимают энергичным встряхива-
нием; 2) центрифугировать 5—7 мин при 700 g; 3) осадок суспензиро-
вать в 5 мл среды без сыворотки; 4) подсчитать концентрацию
196
клеток. Для слияния обычно используют (10—12) • 10б кле-
ток.
Приготовление раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) (стерилизуют
автоклавированием при 120 °C в течение 15 мин): 1) стерильный ПЭГ
расплавить в водяной бане; 2) 3 мл среды без сыворотки (RPMI-1640
или DME) нагреть в водяной бане до 50—60 °C; 3) добавить к 3 мл
нагретой среды равный объем (3 мл) расплавленного ПЭГ, пипеткой
тщательно перемешать; 4) к полученной смеси добавить 0.6 мл
ДМСО. Такой раствор можно хранить несколько недель при комнат-
ной температуре или в холодильнике. Непосредственно перед слия-
нием раствор ПЭГ нагревают до 37 °C. Разные авторы используют
ПЭГ с различной молекулярной массой (1000, 1500, 4000).
Процедура слияния: I) клетки миеломы и спленоциты смешать
в соотношении от 1 : 3 до 1 : 1.5— (10-12)- 10б клеток миеломы
и (3.0—60)- 10б спленоцитов; 2) центрифугировать 7—10 мин
при 700 g; 3) осадок осторожно встряхнуть; 4) добавить к осадку 1 мл
ПЭГ, осторожно встряхнуть, инкубировать 1 мин; 5) медленно
(1—2) мин, по каплям, каждый раз осторожно встряхивая, добавить
9 мл среды без сыворотки; 6) центрифугировать 7—10 мин при 700 g;
7) осадок суспензировать в 50—60 мл полной ростовой среды.
Среды для роста гибридом. Основной средой является среда DME
(с повышенным содержанием глюкозы — 4.5 г/л). Б нее вводят анти-
биотики (50 мкг/мл гентамицина) и глютамин (2 • 10-3М). по-
скольку последний является термолабильным компонентом. Выхс/д
гибридом повышается при добавлении к среде 5 • 10“5 М 2-меркапто-
этанола. Сыворотка (в большинстве случаев работают с эмбриональ-
ной сывороткой коров) используется в концентрации 10—20 %. Рост
гибридных клеток зависит от качества сыворотки. Рекомендуется
предварительно тестировать ростовые качества сыворотки (напри-
мер, по эффективности клонирования родительских миеломных кле-
ток), чтобы для получения гибридом выбрать наилучшую.
«Питающие» клетки. Размножение медленно растущих гибридных
клеток стимулируется добавлением к высеваемой суспензии не-
размножающихся клеток, называемых «питающими». Источники
их различны; тимоциты, спленоциты, макрофаги. Предпочтительнее
использовать перитонеальные клетки. Значительную долю последних
составляют макрофаги, секретирующие ростстимулирующие факторы
для гибридом. Кроме того, макрофаги выполняют еще одну важную
функцию: они фагоцитируют погибающие в ходе селекции неслив-
шиеся миеломные клетки. Последние при гибели выделяют в среду
токсины, ингибирующие рост гибридных клеток.
Перитонеальные клетки получают от мышей разных штаммов:
сингенность животных не является обязательным требованием при
выборе донора «питающих» клеток. Не рекомендуется брать клетки
от животных, стимулированных к продукции макрофагов: активиро-
ванные макрофаги могут фагоцитировать гибридомные клетки.
Получение перитонеальных клеток: 1) забить мышь, положить
спинкой вниз на подставку, облить тушку спиртом для стерилизации;
2) осторожно, чтобы не повредить стенку брюшины, сделать продоль-
197
ный разрез кожи, верхние и нижние поперечные разрезы, растянуть
кожу в противоположных направлениях, при этом обнажается брюш-
•Н^я полость; 3) шприцем ввести в брюшную полость 5 мл полной
ростовой среды; 4) массировать брюшную полость 2—3 мин;
5) собрать шприцем суспензию клеток из брюшной полости; 6) под-
считать концентрацию клеток. От одной мыши получают (3—5) • 106
клеток. Их используют из расчета (0.5—1) • 104 клеток на 1 ячейку
планшета с 96 лунками. «Питающие» клетки рассеивают на планшеты
за 2—3 сут до слияния либо их добавляют к суспензии клеток мие-
ломы и спленоцитов в момент рассева после слияния.
Рассев клеток после слияния. Суспензию клеток в полной ростовой
среде разливают по 100 мкл в каждую ячейку 96-луночных планше-
тов. В одном эксперименте мы используем 5—6 планшетов. В одну
ячейку при этом попадает (0.5—1) • 105 клеток. Через 24 ч после
посева гибридизированных клеток в каждую ячейку добавляют
по 100 мкл селективной среды ГАТ (двойной концентрации). Таким
образом, объем среды в каждой ячейке становится равным 200 мкл,
а концентрация среды ГАТ уменьшается в 2 раза. Клетки инкубируют
при 37 °C в атмосфере с 5 % СО2.
Приготовление 100-кратного раствора среды ГАТ (маточные
растворы компонентов этой среды хранят при —20 °C).
Аминоптерин (молекулярная масса 440.4): 1) добавить к 1.76 мг
аминоптерина 90 мл деионизированной воды; 2) добавить по каплям
1 н. NaOH до полного растворения аминоптерина; 3) нейтрализовать
раствор 1 н. НС1 до pH 7.5; 4) довести объем до 100 мл; 5) раствор
простерилизовать через фильтр с порами 0.22 мкм; 6) разлить по 5 мл.
Хранить‘"при —20 °C. Конечная концентрация аминоптерина —
4 • 10~7М. Потенциальный канцероген! Работать в перчатках!
Гипоксантин (молекулярная масса 136.1): 1) добавить 136 мг
гипоксантина к 90 мл деионизированной воды; 2) добавить по каплям
1 н. NaOH до полного растворения гипоксантина; 3) нейтрализовать
раствор 1 н. НС1 до pH 7.5; 4) довести объем до 100 мл; 5) раствор
простерилизовать через фильтр с порами 0.22 мкм; 6) разлить по 5 мл.
Хранить при —20 °C. Конечная концентрация гипоксантина —
1 10“4 М.
Тимидин (молекулярная масса 242.2): 1) добавить 38.7 мг тими-
дина к 100 мл деионизированной воды; 2) раствор простерилизовать
через фильтр с порами 0.22 мкм; 3) разлить по 5 мл. Хранить
при —20 °C. Конечная концентрация тимидина— 1.6 • 10-5М.
Определение специфических антител,
продуцируемых гибридомами
Через 5—7 сут после слияния, если оно прошло успешно, колонии
растущих гибридных клеток становятся микроскопически видимыми.
Для роста гибридных клеток в низкой (клональной) плотности
существенное значение имеет кондиционирование среды, поэтому
первую смену среды осуществляют при увеличении числа клеток
в колонии примерно до 100. При смене среды ГАТ аминоптерин,
198
присутствующий в клеточном пуле, может тормозить синтез пуринов
и пиримидинов в клетке. Для обеспечения клеток экзогенными
предшественниками синтеза ДНК при первой смене среды ГАТ
замещается на среду ГТ (содержащую гипоксантин и тимидин
в тех же концентрациях, что и среда ГАТ). При последующих сменах
среды, которые осуществляются с интервалом 2 сут (плотность
культуры увеличивается), добавляется среда без добавок для селек-
тивных сред.
При достижении в ячейках плотности клеток 30 % и более можно
проводить тестирование гибридных клеток на продукцию специфиче-
ских антител. Способ тестирования определяется свойствами иммуно-
гена, а также целью эксперимента — будущей аппликацией антител.
Наиболее распространенными методами являются иммунофлюо-
ресценция, твердофазный радиоиммунологический анализ (ТРИА)
и твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА). Ввиду большей
биологической безопасности последнего по сравнению с ТРИА он
получил в последние годы самое широкое распространение.
Для проведения ТИФА используют специальные плоскодонные
96-луночные планшеты. На них наносят антиген (растворимые
белки, клетки), который благодаря определенным свойствам пластика
сорбируется на нем. Следует, однако, подчеркнуть, что сорбция
растворимых антигенов имеет место только в том случае, если они
являются заряженными или полярными молекулами и поэтому опре-
деленным образом связываются с модифицированой поверхностью
пластика в Na-карбонатном буфере, pH 9.5. Если антигеном являются
клетки, то фиксация их к пластику осуществляется с помощью
поли-Ь-лизина (10 мкг/мл) или глютаральдегида (0.25—1.50 %).
Процедура ТИФА для растворимых белков: 1) раствор антигена
(1 мкг/мл) готовят в 0.2 М Na-карбонатном буфере, pH 9.5; приготов-
ление буфера: 13 мл 0.2 М Na2CO3 (2.12 г Na2CO3 растворить
в 100 мл дистиллированной воды)+37 мл 0.2 М NaHCO3 (1.68 г
NaHCO3 растворить в 100 мл дистиллированной воды); 2) добавить
70 мкл раствора антигена в лунки планшета (через ряд, вертикально),
инкубировать 1 ч при 37 °C или более 2 ч при комнатной температуре;
3) встряхнуть, промыть водопроводной водой, затем PBS1 с 0.05 %
твина-20; 4) во все ячейки нанести блокирующий раствор (0.5—
1.0 %-ного овальбумина, бычьего сывороточного альбумина или
0.1—0.2 %-ной желатины в PBS), инкубировать 1 ч при 37 °C
(в блокирующем растворе пластины можно хранить в холодильнике
несколько суток); 5) после инкубации встряхнуть; в первые две
вертикальные дорожки нанести по 70 мкл ростовой среды, в осталь-
ные — по 70 мкл культуральной среды от тестируемых гибридом;
среду от каждой гибридомы нанести в 2 ячейки (с антигеном и
с блокирующим раствором); инкубировать 1 ч при комнатной
температуре; 6) встряхнуть, промыть водопроводной водой, потом
PBS с 0.05 % твина-20; 7) во все ячейки добавить по 70 мкл конъю-
1 Раствор Дульбекко и Фогта без солей кальция и магния см. в статье А. Д. Тарта-
ковского (наст, сб.), табл. 1.
199
гата антимышиных иммуноглобулинов с пероксидазой в соот-
ветствующем разведении в растворе блокирующего агента с 0.05 %
твина-20, инкубировать 1 ч при комнатной температуре; 8) встрях-
нуть, промыть водопроводной водой, затем PBS с 0.05 % твина-20;
9) приготовить раствор субстрата-хромогена (5 мг о-фениленди-
амина растворить в 10 мл 0.1 М натрий-цитратного буфера, pH 4.5),
добавить 3—5 мкл 30 %-ной Н2О2, быстро нанести по 70 мкл во все
ячейки планшетов, инкубировать в темноте 10—60 мин; реакцию
можно остановить добавлением в каждую ячейку 5 мкл 2 М H2SO4
(приготовление 0.1 М натрий-цитратного буфера: смешать 89 мл
0.1 М лимонной кислоты и 111 мл 0.1 М цитрата натрия, довести pH
до 4.5); 10) оценить результаты: качественно — ячейки с желтым
раствором позитивные; количественно — с помощью спектрофото-
метрии при 492 нм. Первые две вертикальные дорожки — контроль.
В этих ячейках раствор должен быть прозрачным.
Культуральная среда от каждой гибридомы тестируется парал-
лельно на двух ячейках. В одной их них присутствует антиген, в дру-
гой только блокирующий раствор. При первичном тестировании
такой подход кажется обязательным, поскольку при слиянии часто
образуются гибридомы, продуцирующие антитела, обладающие
высоким сродством к разным антигенам. Они выявляются как
позитивные и на иммуногене, и на блокирующем белке и не могут
рассматриваться как специфичные к иммуногену. Причина появления
таких гибридом и природа иммуноглобулинов, синтезируемых ими,
неизвестны.
Анализ позитивных клонов повторяется дважды для большей
достоверности результатов. Позитивные клоны клонируют и размно-
жают для криоконсервации. Первым этапом в размножении является
перенос клеток из 96-луночных планшетов в 24-луночные из одной
ячейки на одну (при условии наличия в 24-луночных планшетах
питающих клеток). На этом этапе небольшие количества гибридом-
ных клеток могут быть криоконсервированы.
Клонирование
Исходные гибридные клетки могут иметь неклональное происхож-
дение, особенно если гибридные колонии растут в большинстве ячеек.
Они могут представлять собой смесь клонов-продуцентов и непроду-
центов, а также смесь разных клонов-продуцентов. Для получения
моноклональных антител необходимо, чтобы производящие их клетки
были потомками единичных клеток. Достигается это последователь-
ными этапами клонирования, которое осуществляется 2—3, а иногда
и более раз.
Наиболее распространенным способом клонирования является
метод лимитирующего разведения в жидкой фазе: 1) засеять 96-
луночные планшеты перитонеальными клетками (1 • 104—2 • 104
клеток в 100 мкл ростовой среды на лунку), инкубировать I—2 сут
при 37 °C в атмосфере с 5 % СО2; 2) подсчитать концентрацию клеток
в ячейках с растущими гибридами; для клонирования выбираются
200
ячейки с жизнеспособными клетками, находящимися в логарифмиче-
ской фазе роста; 3) путем разведения приготовить 10 мл суспензии
клеток в ростовой среде, содержащей 1—3 клетки на 1 мл; 4) рассеять
суспензию гибридных клеток на планшеты с питающими клетками
по 100 мкл на ячейку.
Колонии растущих клеток становятся микроскопически видимыми
через 5—7 сут. Рост клеток в таких условиях подчиняется распределе-
нию Пуассона [3]: f (0) = е~\ где f(0) — фракция ячеек, в которых
отсутствует рост, X — среднее число колоний в одной ячейке. Если
Х=1, то /:(0) = 0.37. Это значит, что при отсутствии роста в 37 %
ячеек в остальных ячейках с растущими клетками колонии происхо-
дят из единичных клеток. Однако такая ситуация может оказаться
ложной из-за неоднородности ячеек (токсичности).
Тестирование проводят на 10—14-е сутки после клонирования.
В течение этого периода смена среды не обязательна. Для анализа
выбираются ячейки, содержащие единичные колонии, различимые
микроскопически. Как правило, выборка из 20—30 клонов оказы-
вается достаточной для тестирования.
При первом клонировании гибридом-продуцентов наблюдается
расщепление клонов по способности продуцировать специфические
антитела. Причины нестабильности гибридом широко обсуждаются
(см., например, [4]). Одной из основных причин нестабильности
гибридом считают элиминацию хромосом, несущих иммуноглобули-
новые гены. Однако возможны и иные механизмы (как генотипиче-
ские, так и фенотипические), в силу которых гибридные клетки
перестают синтезировать иммуноглобулины.
Отбираются позитивные клоны, которые подвергаются реклониро-
ванию. При выборе клонов-продуцентов для дальнейшего клонирова-
ния могут возникать тактические трудности. Они становятся очевид-
ными, если популяция тестированных клонов составляет большинство
проанализированных клонов. Поэтому параллельно с клонированием
некоторых позитивных гибридом (высокопродуктивных, активно
пролиферирующих) все позитивные клоны следует поддерживать
культивированием в течение 10—14 сут, после чего их повторно про-
анализировать на продукцию антител. При повторном тестировании
количество позитивных клонов может уменьшиться за счет выявления
менее стабильных клонов. Позитивные клоны клонируют повторно
(условия клонирования те же).
При таком подходе при втором клонировании число позитивных
клонов оказывается близким к 100 %. Если нет, то процедура и
тактика повторяются. На всех этапах клонирования гибридные
клетки параллельно размножаются в небольших количествах
на пластинах с 24 ячейками и криоконсервируются.
Массовая продукция антител
После получения гибридомного клона, стабильно продуцирую-
щего специфические антитела, следующим этапом является на-
работка их в большом количестве. Это достигается культивированием
клеток либо in vitro, либо in vivo.
201
Культивирование гибридом in vitro. Продукция антител при ру-
тинных способах культивирования in vitro является низкой (еди-
ницы—десятки микрограммов на 1 мл). Преимуществом этого метода
является упрощение процедуры очистки антител. Кроме того, низкая
концентрация антител, присутствующих в культуральной среде,
оказывается достаточной для проведения некоторых тестов с ис-
пользованием моноклональных антител.
При длительном пассировании гибридом в культуре следует иметь
в виду их высокую чувствительность к условиям культивирования.
К ним относятся качество посуды, состав среды, pH, плотность
культуры и др. Лимитирующей размножение является как высокая,
так и низкая плотность культуры. В переросших культурах накапли-
ваются токсические вещества и клетки быстро погибают. Существен-
ное значение в контроле размножения имеет pH среды. При повыше-
нии pH деление клеток прекращается. При восстановлении pH
до оптимальных значений (pH 7.5—7.6) происходит восстановление
клеточной пролиферации, однако время этого восстановительного
периода является функцией времени, в течение которого клетки
находились в среде с щелочными pH: 5 сут после 24-часового пре-
бывания при pH 8.3 и 11 сут после 72 ч [4].
" Клетки культивируют на среде с сывороткой (5—10 %) или без
нее. В последние годы бурно развивается технология культивирова-
ния клеток на бессывороточных средах. Преимущества ее очевидны:
1) стандартизируются условия культивирования (сыворотка —
биологическая жидкость, состав которой сильно варьирует);
2) облегчается очистка антител, поскольку упрощается белко-
вый состав среды и уменьшается концентрация белка; 3) отсут-
ствуют экзогенные иммуноглобулины, что упрощает исследование
многих параметров иммуноглобулинов (изотипа, концентрации
и Др.)•
Основными компонентами заменителей сыворотки являются
транспортные белки, липиды, гормоны, агенты, стимулирующие
секрецию антител, и др. Эти компоненты добавляются к среде опреде-
ленного химического состава. В нашей лаборатории для культивиро-
вания гибридом применяется среда, предложенная Мураками и
соавторами [11]. В качестве базовой среды используется смесь
среды F-12 и DME (1:1). К ним добавляются инсулин (5 мкг/мл),
трансферрин (35 мкг/мл), этаноламин (0.02 М), селенит
(2.5 • 10~3М), HEPES (15 • 10-3М). На такой среде гибридомы
поддерживаются in vitro в течение многих пассажей и сохраняют
продукцию антител.
Для увеличения концентрации антител в культуральной среде
разрабатываются подходы культивирования клеток на полых волок-
нах, микрокапсулах и др. [12].
Культивирование гибридом in vivo. Другим подходом к накопле-
нию антител является культивирование гибридом in vivo. При при-
вивке сингенным мышам гибридомные клетки образуют опухоли.
Опухолевые клетки растут частично в солидной, частично в асцитной
форме. Концентрация антител в асцитной жидкости возрастает
202
по сравнению с культуральной средой на 2—3 порядка и составляет
единицы—десятки миллиграммов на 1 мл.
Образованию асцита способствует предварительная инъекция
животным пристана или вазелинового масла. Их инъецируют
за 7—14 сут до введения клеток по 0.5 мл на 1 мышь, внутрибрю-
шинно. Суспензию гибридомных клеток в PBS, (1—2) • 106 клеток
(0.5 мл) на 1 мышь, также инъецируют внутрибрюшинно.
Опухоли образуются через 2—3 нед после прививки. Асцитную
жидкость (2—3 порции) забирают через' 2—3-суточные интервалы
у живых мышей, вводя им в брюшную полость иглу. Для получения
последней порции животных забивают, открывают брюшную полость,
иглой собирают асцитную жидкость.
Асцитные жидкости центрифугируют 5—7 мин при 200 g. Снимают
с поверхности минеральное масло. Надосадочную жидкость перено-
сят в новый сосуд. Хранят при 4 °C. Для консервации добавляют
0.1 % азида натрия. При таком подходе от одного животного удается
получить около 15 мл асцита.
Осадок клеток используют для инъекции новой группе животных,
которым также вводят вазелиновое масло или пристан. Многие
гибридомные штаммы стабильны в течение многих перевивок in vivo.
Возрастает и объем асцитной жидкости на животное.
Обычно асцитные опухоли получают у мышей линии BALB/c,
поскольку для иммунизации в основном используют этих животных.
Для накопления большого количества антител требуются большие
партии животных. Иногда это может являться проблемой. В таких
случаях индукцию опухолей можно проводить на р! (tf BALB/c X
Х$ беспородных мышей). Объем асцита при этом увеличивается
(до 30 мл от одного животного), но несколько задерживается время
образования опухолей [13].
Криоконсервация гибридом
Процесс получения клеточных линий, стабильно продуцирующих
моноклональные антитела, является длительным и трудоемким. Одно-
временно в работе оказываются сотни культур, отличающихся
по жизнеспособности, скорости пролиферации и, следовательно, тре-
бующих для поддержания индивидуального подхода. Кроме того,
при длительном культивировании возникает опасность заражения
клеток.
Страхование клеточного материала осуществляют с помощью
криоконсервации. На всех этапах гибридомной технологии (тестиро-
вания, клонирования) клетки дополнительно размножают и замора-
живают в жидком азоте.
На начальных этапах работы длительно размножать клетки
не следует, поскольку гибридомы могут быть нестабильны. Для крио-
консервации могут быть использованы клетки, растущие в 24-луноч-
ных планшетах. Выбираются ячейки с жизнеспособными клетками
при плотности 70—80 %.
Процедура замораживания: 1) за 24 ч сменить среду; добавить
203
1.5 мл свежей ростовой среды в каждую ячейку; 2) для криоконсерва-
ции суспензировать клетки в среде, в которой они росли, часть клеток
адгезивна, поэтому пипетировать нужно многократно, но осторожно,
чтобы не повредить клетки; 3) из лунки отобрать 1 мл суспензии,
к оставшимся клеткам добавить свежую ростовую среду; 4) пригото-
вить криопротектор: 20 %-ный ДМСО в сыворотке; 5) к клеточной
суспензии медленно, по каплям, добавить равный объем 20 %-ного
ДМСО; таким образом, среда для криоконсервации оказывается
следующего состава: 45 % кондиционированной среды, 45 % сыво-
ротки, 10 % ДМСО; 6) подготовленную суспензию разлить по ампу-
лам.
Режимы замораживания гибридомных клеток не отличаются
от принятых для других типов клеток (подробнее см. статью А. А. Ду-
наевой и Т. Ф. Петренко, наст. сб.).
При оттаивании: 1) содержимое ампулы перенести в центрифуж-
ную пробирку, медленно, по каплям, перемешивая, добавить 10-крат-
ный объем среды; 2) центрифугировать 5—7 мин при 700 g;
3) к осадку добавить 1 мл свежей среды; 4) суспензию клеток пере-
нести в 1 ячейку 24-луночного планшета с питающими клетками.
Метод криоконсервации клеток в 96-луночиых планшетах [14]:
1) сменить среду за сутки до консервации; 2) добавить в каждую
ячейку по 100 мкл сыворотки с 10 % ДМСО; 3) обернуть пластину
клейкой лентой, затем пластиковой пленкой, поместить на тающий
лед; 4) поместить в холодильник при —43 °C; 5) через сутки быстро
перенести в пары жидкого азота.
При оттаивании: 1) из жидкого азота планшеты быстро перенести
в культуральное рабочее помещение; 2) добавить в каждую ячейку
по 0.2 мл среды без сыворотки, прогретой до 40 °C; 3) поместить
планшеты в инкубатор при 37 °C на 3 мин; 4) удалить среду, добавить
свежую ростовую среду.
После получения стабильных линий, продуцирующих МонАТ,
клетки могут быть криоконсервированы большими партиями (см.
статью А. А. Цуцаевой и Т. Ф. Петренко, наст. сб.).
Возможные трудности в получении гибридом
Многие проблемы уже были упомянуты при описании отдельных
этапов гибридомной технологии (подбор оптимальной среды, условий
культивирования, тестирования и др.). Осложняет работу с гибридо-
мами возможность инфекций. Поскольку в культуральную среду при
получении и культивировании добавляют гентамицин (50 мкг/мл),
то бактериальное заражение наблюдается чрезвычайно редко. Основ-
ную трудность представляет заражение плесневыми грибами, ис-
точником которого являются некоторые типы СОг-инкубаторов. Неко-
торые авторы используют противогрибковые антибиотики, например
фунгизон. Однако они являются высокотоксичными.
Как правило, плесневая инфекция в первую очередь появляется
в краевых лунках и может быстро распространиться. В ячейку, где
обнаружено заражение, можно добавить 1 каплю 1 %-ного мертио-
лата. Через 5 мин содержимое ячейки отсосать, снова добавить
204
1 каплю мертиолата, снова отсосать. Попадание мертиолата в сосед-
ние ячейки вызывает гибель клеток в них.
Очень часто неудачи в получении гибридом при слиянии связаны
с микоплазменной инфекцией. Клетки, зараженные микоплазмой,
не растут на среде ГАТ. Перед слиянием миеломные клетки должны
быть проконтролированы на отсутствие микоплазм (см. статью
Г. Г Миллер и др. в наст. сб.). Микробиологический контроль
периодически должен осуществляться и при длительном пассирова-
нии гибридом. Микоплазменная инфекция может угнетать рост
клеток вплоть до их полной дегенерации.
Литература
1. Kohler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of pre-
defined specificity//Nature. 1975. Vol. 256. P. 495—497.
2. ' Моноклональные антитела / Под ред. Р. Кеннетта и др. М., 1983. 416 с.
3. Goding J. Antibody production by hybridoma // J. Immunol. Meth. 1980. Vol. 39.
P. 285—308.
4. Westerwoudt K- Improved fusion methods. 4. Technical aspects // J. Immunol.
Meth. 1985. Vol. 77. P. 181 — 196.
5. Croce C., Linnenbach A., Dolby T., Koprowski H. The use of mouse-human hybrido-
mas in human genetics and immunology // Somatic cell genetics. New York; Lon-
don, 1982. P. 55—68.
6. Келер Г. Метод получения гибридом // Методы исследования в иммунологии.
М„ 1983. С. 402—406.
7. Stahli С., Staeheli Т., Miggiano V. et al. High frequency of antigen-specific
hybridoma: dependence of immunization parameters and prediction of spleen cell
analysis // J. Immunol. Meth. 1980. Vol. 32. P. 297—309.
8. Reading C. Theory and methods for immunization in culture and monoclonal anti-
body production //J. Immunol. Meth. 1982. Vol. 53. P. 261—291.
9. Wu S., Ma M. In vitro immunization with EL-4 conditioned medium for hybridoma
production //J. Tissue Cult. Meth. 1985. Vol. 9. P. 147—149.
10. Фридлянская И. И. Постоянные клеточные линии, дифференцирующиеся in vitro //
Биология клетки в культуре. Л., 1984. С. 50—100.
11. Murakami Н., Masui Н., Sato G. et al. Growthnof hybridoma cells in serum-free
medium: ethanolamine is essential component // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982.
Vol. 79. P. 1158—1162.
12. Boss M. Large scale production of monoclonal antibodies//Biotechnology. 1985.
Vol. 2. P. 179—188.
13. Brodeur B., Tsang T. High yield monoclonal antibody production in ascites //
J. Immunol. Meth. 1986. Vol. 86. P. 239—241.
14. Price P. A simple, rapid method for freezing hybridomas //J. Tissue Cult. Meth.
1985. Vol. 9. P. 167—169.
Генетическая трансформация
соматических клеток
О. К. Глебов
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Способы введения в соматические клетки векторных ДНК, несу-
щих клонированные последовательности, и методы выявления клеток,
содержащих определенные рекомбинантные молекулы ДКК, пред-
ставляют собой наряду с методами клонирования в бактериальных
клетках нужных последовательностей эукариотных ДНК основные
205
элементы генной инженерии эукариот — методологии, революциони-
зировавшей в последнее десятилетие исследования не только в гене-
тике соматических клеток, но и в молекулярной клеточной биологии.
Попытки введения в соматические клетки чужеродной ДНК с целью
выявления наследуемых изменений признаков, обусловленных экс-
прессией чужеродных генов (т. е. с целью генетической трансформа-
ции соматических клеток), неоднократно предпринимались с момента
установления генетики соматических клеток как самостоятельной
дисциплины [1—4], но доказательство того, что измененный фенотип
действительно определяется экспрессией чужеродного гена, было
получено только в 1973 г. [5]. В 1977 г. появился ряд сообщений
о трансформации соматических клеток мыши и человека фрагмен-
тами ДНК ВПГ1, содержащими ген ТК [6—8]. Успех этих работ
был связан с использованием для трансформации кальцийфосфат-
ного преципитата ДНК. Этот метод, как было показано ранее,
существенно повышает инфекционность ДНК аденовируса при транс-
фекции соматических клеток [9]. В первых экспериментах по введе-
нию клонированного гена ТК ВПГ1 в соматические клетки было
обнаружено, что спустя 24—72 ч после введения этот ген экспресси-
руется в значительной части клеток, доля которых с течением вре-
мени, однако, быстро падает [10, 11]. Стратегия экспериментов,
в которых активность чужеродных генов изучается спустя короткое
время (36—72 ч) после их введения в соматические клетки, получила
затем широкое распространение; этот подход был назван методом
временной экспрессии чужеродных генов (см. обзоры: [12, 13]). Ме-
тоды введения генов в соматические животные клетки в культуре
и собственно метод генетической трансформации соматических
клеток за короткий срок стали обязательными в лабораториях,
' занимающихся решением как фундаментальных проблем (связанных,
например, с анализом функциональной роли тех или иных последова-
тельностей эукариотной ДНК, изучением рекомбинации ДНК и мута-
генеза и т. д.), так и прикладных задач, в частности выделения
и идентификации генов эукариот и создания клеток-продуцентов
полезных белков (см. обзор: [14]). Это обусловлено разработкой
более эффективных методов введения генов в клетки и более чувстви-
тельных методов определения продуктов активности генов.
Несмотря на высокую частоту генетической трансформации сома-
тических клеток (например, с помощью микроинъекций [15, 16] или
при инфицировании клеток рекомбинантными ретровирусами [17]),
до сих пор не описано ни одного случая, когда клоны генетически
трансформированных клеток были бы выделены без использования
специальных селективных сред. Возможно, это связано с тем, что
установление трансформантного фенотипа клеток, обусловливаю-
щего их способность переживать на селективной среде, происходит
(по неизвестным причинам) только при культивировании на селек-
тивной среде (на 3—6-е сутки после микроинъекции [18]).
Принципиальным было открытие того, что последовательности
ДНК, ковалентно не связанные с геном, придающим клеткам селек-
тивный фенотип (селективным геном), переносятся (при обработке
206
клеток смесью ДНК) и обнаруживаются совместно с ним в клетках
трансформантиых клонов — это явление получило название котранс-
формации [10]. Возможность котрансформации означает, что при
наличии соответствующих клеток-реципиентов и селективного гена
в клетки можно ввести любые иные векторные ДНК, отбирая гене-
тически трансформированные клетки по способности (обусловленной
экспрессией селективного геиа) расти на селективной среде и иденти-
фицируя среди них котрансформированные клоны.
Для введения ДНК в соматические клетки обычно применяются
методы с использованием химических агентов, защищающих ДНК
от вне- и внутриклеточных нуклеаз и облегчающих проникновение
ДНК в клетки, — фосфата кальция и ДЭАЭ-декстрана. При смеши-
вании раствора ДНК с растворами, содержащими ионы кальция
и фосфата, молекулы ДНК включаются в образующиеся микро-
кристаллы фосфата кальция; ДНК в таком комплексе значительно
более устойчива к действию нуклеаз [19]. Комплекс кальцийфос-
фат—ДНК сорбируется на поверхности клеток и затем в основном
фагоцитируется. По характеру реакции на ингибиторы дыхания
и агенты, разрушающие микротрубочки, фагоцитоз кальцийфосфат-
иого преципитата ДНК напоминает так называемый опосредованный
рецепторами фагоцитоз [19, 20]. Если в эндоцитозе преципитата
участвуют специфические рецепторы, то получает естественное объяс-
нение жесткая зависимость эффективности проникновения комплекса
в клетки от условий его формирования (pH раствора, концентрация
ДНК), поскольку структура микрокристаллов фосфата кальция
должна, очевидно, зависеть от условий их образования. В то же
время зависимость проникновения кальцийфосфатного преципитата
ДНК от узнавания его специфическими рецепторами клеточной
поверхности указывает на необходимость индивидуального подбора
условий образования этого комплекса, поскольку набор рецепторов
и их свойств может изменяться от одной линии клеток к другой
[21, 22].
Обработка клеток ДНК в присутствии ДЭАЭ-декстрана столь же,
а иногда и более эффективна, как и обработка кальцийфосфатным
преципитатом ДНК в случае временной экспрессии чужеродных
генов, но по неизвестным причинам выход генетически трансформи-
рованных клеток существенно ниже в первом случае [1'1, 13]. Пока-
зано, что ДЭАЭ-декстран связывается с ДНК,нейтрализуя ее заряд
и изменяя конформацию молекулы ДНК, что делает последнюю
устойчивой к ДНКазам и нагреванию, и, кроме того, взаимодействует
с мембраной клеток, стимулируя эндоцитоз, причем сам ДЭАЭ-
декстран не проникает в клетки [23, 24]. Оптимальные концентрации
векторной ДНК и ДЭАЭ-декстрана различаются для клеток разных
линий. Как и при введении ДНК в комплексе с фосфатом кальция,
обработка клеток мембранотропными агентами (ДМСО, глицерином
или ПЭГ [25]) или изменение иных условий (например, обработка
клеток в суспензии, а не в монослое [13, 26] или культивирование их
в атмосфере с 2 %, а не с 5—10 % СОг [27]) может повысить эффек-
тивность введения чужеродных генов в соматические клетки.
207
Довольно часто для введения клонированных фрагментов ДНК
используют метод слияния под действием ПЭГ соматических клеток
с протопластами бактерий, несущих соответствующие векторные
ДНК [28—32]. Метод не требует выделения и очистки векторной
ДНК, что может быть существенным при введении в соматические
клетки интронированных генов большого размера. Кроме того,
использование данного метода облегчает анализ клонотек кДНК
эукариотных генов в экспрессируемых в соматических клетках векто-
рах. Сообщалось, что в оптимальных условиях частота генетической
трансформации клеток первичных эксплантатов человека может быть
даже в 10—20 раз выше при слиянии с протопластами Escherichia
coli, чем при обработке клеток кальцийфосфатным преципитатом
ДНК [33]. Механизмы слияния протопластов бактерий с соматиче-
скими клетками (очевидно, аналогичные таковым при слиянии под
действием ПЭГ клеток и микроклеток), как и возможные эффекты и
роль встраивающейся в мембрану клеток бактериальной мембраны и
проникающей в клетки бактериальной ДНК, детально не исследо-
ваны.
Требования к клеточным культурам
Безусловным требованием является отсутствие микоплазменной
контаминации, не говоря уже о загрязнении культур другими микро-
организмами. В таблице представлены полученные нами данные по
генетической трансформации соматических клеток различной видо-
вой принадлежности. Все указанные линии клеток могут быть полу-
чены из Всесоюзной коллекции клеточных культур. Условия культиви-
рования должны быть наиболее благоприятными. В частности, для
генетической трансформации и селекции генетически трансформиро-
ванных клеток используют, как правило, ростовую среду с СЭК,
хотя в своей работе мы трансформировали и отбирали на среде
МКГАТ генетически трансформированные клетки человека линии
HeLa, культивируя их и на среде с СКРС. Ростовые среды могут быть,
по-видимому, использованы любые; однако следует избегать сред, со-
держащих большое количество СаСЬ (например, RPMI).
Целесообразно заморозить достаточно большое количество некон-
таминированных клеток и культивировать их после размораживания
только в течение времени, необходимого для эксперимента. Клетки
китайского хомячка линии DUX11 чувствительны к версену, поэтому
их рассевают, обрабатывая 0.25 %-ным раствором трипсина (на
PBS); клетки остальных указанных в таблице линий можно рассе-
вать, используя смесь 0.25 %-ного раствора трипсина и 0.2 %-ного
раствора (на RBS) версена (в отношении 1:1). ТК~-клетки линий
А238 и LMtk~ следует периодически культивировать на ростовой
среде, содержащей 50 мкг/мл БДУ; клетки линий HeLa и Vero до
трансформации геном Ч^ГФРТ мы культивируем на среде ГАТ.
К ростовой среде мы обычно добавляем неосновные аминокислоты
(НОА).1
' Здесь, если это специально не оговаривается, любая ростовая среда содержит
НОА.
208
14 Заказ 1789
Частота трансформации клеток разных линий клонированными генами
Клетки-реципиенты Ростовая среда (с 10 % СЭК) Генетический маркер клеток Селективный ген Селективная среда * ДНК- носи- тель ** Частота трансформации
Человек: линия HeLa-p а-Модификация среды Игла — а-МЕМ Отсутствует КГФРТ (под конт- ролем промотора ранних генов ОВ40) МКГАТ + 9.9 • 10"4 1.0 • 10“4
Зеленая мар- тышка: линия Vero *** Среда Игла в моди- фикации Даль- бекко — ДМЕМ » То же » + 1.2 • 10“4 1.3 • io-5
Китайский хомячок:
линия А238 Среда Хэма F-10 Отсутствие актив- ности тк ТК ВПП ГАТ 4- 6.8 • 10“5 0.9 • 10~5
линия DUX 11 То Же Отсутствие актив- ности ДГФР ДГФР (кДНК гена ДГФР мыши под контролем промо- тора поздних генов аденовируса) Среда без нук- леотидов с 10 % диализованной СЭК + 3.0 • 10“3 3.3 • 10~4
Мышь:
линия LMtk~ ДМЕМ Отсутствие актив- ности тк ТК ВПП ГАТ + 9.9 - 10 -5 1.1 • ю-5
линия LMtk~ » То же АГФТ (под контро- лем промотора ранних генов ОВ40) Антибиотик G-418 (генетицин) + 1.0 • 10~3 8.8 • IO”5
линия С 127 **** Неспособность клеток к многослойному росту 0.69Т ВПКРС-1 Отбор фокусов роста + 1.0 • 10~4 1.0 • 10“5
Примечание. * —прописи селективных сред см. ниже; ** клетки трансформировали кальцнйфосфатным преципитатом ДНК
в отсутствие или в присутствии ДНК-носителя из спермы лосося; - - аналогичные результаты получены с клетками зеленой мартышки линии
CV-1; **** — аналогичные результаты получены с клетками мыши линии N1H3T3. При обработке клеток линий HeLa-p, Vero, CV-1, DUX11, LMtk-
и C127 кальцннфосфатиым преципитатом ДНК-носителя в отсутствие векторных ДНК с селективными генами и селекции клеток на указанных
g средах мы не получили колоний клеток. Частота спонтанных н индуцированных преципитатом ДНК-носителя реверсий клеток клона А238
S к ТК+-фенотнпу составляет (0.5—2.0) • 10—6, это учтено в таблице.
100-кратный раствор НОА (в мг):2 аланин — 890, глицин — 750,
аспарагиновая кислота — 1330, глютаминовая кислота — 1470, про-
лин — 1150, серин — 1050, аспарагин-гидрат — 1500. Аминокислоты
растворить в указанной последовательности при легком нагревании,
за исключением аспарагин-гидрата, который следует растворить в по-
следнюю очередь после охлаждения раствора до комнатной темпе-
ратуры. Стерилизовать фильтрованием через мембранный фильтр
с диаметром пор 0.22 мкм (далее в тексте эта операция обозначается
как стерилизация фильтрованием). Хранить (по 5 мл) при —20 °C.
Раствор стабилен в этих условиях в течение года и более. На 500 мл
ростовой среды добавлять 5 мл 100-кратного раствора НОА.
Для селекции генетически трансформированных клеток мы
используем обычно чашки Петри диаметром 9 см (Ленинградский
завод пластмасс), хотя качество подложки их неудовлетворительно
(клетки садятся неравномерно, часто образуются скопления с высо-
кой плотностью); качество подложки можно повысить, обработав
чашки (дно) концентрированной H2SO4 (несколько часов) с после-
дующим промыванием дистиллированной и деионизированной
Н2О (далее — просто Н2О) и стерилизацией (замачиванием в 96 %-
ном этаноле на ночь).
, I,
Обработка клеток
кальцийфосфатным преципитатом ДНК
Составы растворов, используемых при введении в клетки ДНК,
приводятся ниже [8, 9, 34].
10-кратный буфер А (в г): HEPES — 50, NaCl — 80, КС1 —
3.7, Na2HPO4 • 2НгО—1.25, D-глюкоза — 10. Растворить компо-
ненты в 800 мл НгО, довести pH до 7.05 1 М раствором NaOH (около
35 мл), добавить НгО до объема 1 л, простерилизовать фильтрова-
нием, хранить при 4 °C. Раствор стабилен в течение года.
2-кратный буфер А: 40 мл 10-кратного буфера А довести НгО до
180 мл, довести pH до 7.05 1 М раствором NaOH (около 0.5 мл),
добавить НгО до объема 200 мл, простерилизовать фильтрованием.
Хотя раствор стабилен при 4 °C в течение года, лучше готовить его
непосредственно перед использованием.
Буфер Б (в мг): Трис—121, ЭДТА • NH4 (хелаплекс) —33.
Растворить компоненты в 800 мл НгО, проверить pH — он должен
быть равен 9.0, в противном случае довести pH 9.0 растворами NaOH
или НС1, добавить НгО до 1 л, простерилизовать фильтрованием.
Раствор стабилен при 4 °C.
10 %-ный раствор CaCh (0.9 М): используется стерильный ком-
мерческий фармацевтический раствор для инъекций.
15 %-ный (масса/объем) раствор глицерина: к 15 г глицерина
(по массе) прибавить 85 мл ростовой среды (без сыворотки). Взве-
шенный глицерин стерилизуют автоклавированием (1 атм, 30 мин);
после охлаждения стерильно добавляют ростовую среду. Раствор
2 Приводится количество веществ на 1 л готового раствора.
210
стабилен в течение нескольких недель при 4 °C, но лучше его готовить
незадолго до использования.
15 %-ный раствор ДМСО: к 15 мл ДМСО прибавить 85 мл росто-
вой среды (без сыворотки). Компоненты стерильно смешивают
непосредственно перед употреблением.
Раствор ДНК-носителя (1 мг/мл): 10 мг ДНК из спермы лосося
растворить в 5 мл буфера Б (в течение ночи при 4 °C); пропустить
раствор ДНК через иглу шприца диаметром 0.2 мм (или озвучить
раствор ДНК); добавить 0.1 объема 3 М раствора СНзСООЫа и
2 объема охлажденного этанола, инкубировать при —20 °C; осадить
ДНК центрифугированием (3000 g, 15 мин); промыть (суспензируя
осадок и вновь осаждая ДНК центрифугированием) 70 %-ным и
96 %-ным этанолом (пробирка должна быть полностью заполнена
спиртом); оставить на ночь осадок ДНК под этанолом для стерилиза-
ции; этанол слить в стерильных условиях, подсушить осадок ДНК
и растворить ДНК в 5—7 мл стерильного буфера Б; определить
концентрацию ДНК; довести концентрацию ДНК буфером Б до
1 мг/мл и разлить по стерильным пластиковым пробиркам. Можно
хранить при —20 °C в течение года. Раствор стабилен и при 4 °C.
Раствор векторной ДНК: от 5 до 50 мкг плазмидной ДНК в раст-
воре поместить в пластиковые пробирки и осадить этанолом (см.
выше); оставить на ночь осадок ДНК под 96 %-ным этанолом для
стерилизации (пробирки должны быть полностью заполнены спир-
том); растворить в стерильных условиях подсушенный осадок ДНК
в соответствующем количестве буфера Б. Обычно мы работаем
с раствором векторной ДНК в концентрации 0.2 мкг/мкл.
Процедура введения ДНК может быть представлена в виде ряда
последовательных этапов.
1. За 18 ч до трансформации рассеять клетки так, чтобы к моменту
обработки кальцийфосфатным преципитатом ДНК они достигли 30—
50 % насыщающей плотности. Для этого мы рассеваем 1 полностью
заросший флакон диаметром 8 см либо на 2 флакона (клетки чело-
века линии HeLa, клетки зеленой мартышки линий Vero и CV1 и
клетки мыши линии LMtk~), либо на 3 флакона (клетки китайского
хомячка линий А238 и DUX11, а также клетки мыши линий С127 и
NIH3T3). Ростовая среда на этом этапе не должна содержать анти-
биотиков (поскольку они образуют агрегаты с кальцийфосфатным
преципитатом ДНК).
2. За 1 ч до трансформации клеток приготовить кальцийфосфат-
ный преципитат ДНК. Для этого к раствору ДНК в буфере Б доба-
вить 10 %-ный (0.9 М) раствор СаС12 до конечной концентрации
0.25 М (конечная концентрация ДНК — 40 мкг/мл). При использо-
вании малых количеств векторной ДНК добавить в раствор ДНК-
носитель. На 1 флакон с клетками диаметром 8 см мы используем
1.5 мл кальцийфосфатного преципитата ДНК, поэтому готовим
0.75 мл раствора ДНК в 0.25 М растворе СаС12.
а) Вариант без ДНК-носителя (в мкл): раствор векторной ДНК
(с концентрацией 0.2 мкг/мкл) — 150, Н2О — 390, 10 %-ный раствор
СаС12 — 210.,
14*
211
б) Вариант с ДНК-носителем (в мкл): раствор векторной ДНК
(с концентрацией 0.2 мкг/мкл) — 25, раствор ДНК-носителя (с кон-
центрацией 1 мг/мл) —25, НгО — 490, 10 %-ный раствор СаОг •—
210.
После приготовления раствор ДНК в 0.25 М растворе СаС1г по
каплям и при перемешивании добавить к равному объему (750 мкл)
2-кратного буфера А. Инкубировать 40—60 мин при 4 °C (в сосуде со
льдом) для формирования преципитата.
3. Тщательно слить среду из флакона с клетками и прилить каль-
цийфосфатный преципитат ДНК- Инкубировать 40—60 мин при 37 °C.
Добавить около 7 объемов (по отношению к объему преципитата)
ростовой среды с 2 % СЭК (10 мл на флакон с 1.5 мл преципитата).
4. Спустя 4—10 ч заменить среду на ростовую среду с 10 % СЭК.
В этот момент клетки могут быть обработаны для повышения эффек-
тивности трансформации 15 %-ными растворами глицерина или
ДМСО: слить среду с 2 % СЭК, промыть ростовой средой без сыво-
ротки и прилить 10 мл раствора глицерина или ДМСО. Инкубиро-
вать от 30 с до нескольких минут при комнатной температуре (в зави-
симости от линии клеток). Слить раствор глицерина (или ДМСО),
промыть клетки 2 раза ростовой средой по 10 мл, добавить ростовую
среду с 10 % СЭК-
5. На следующие сутки рассеять клетки на чашки Петри (по
1 • 106—2 • 106 клеток на чашку диаметром 9 см для большинства
систем «ген—селективная среда») на ростовую среду с 10 % СЭК.
6. Спустя 5—6 ч после рассева или на следующие сутки сменить
ростову^ среду на селективную.
Хотя для трансформации клеток кальцийфосфатным преципита-
том ДНК мы с успехом использовали векторные (плазмидные)
ДНК, выделенные из клеток Е. coll как щелочным методом (после 2—
3 переосаждений этанолом), так и методом осветленного лизата с по-
следующим центрифугированием в равновесном градиенте CsCh
с бромистым этидием (методы выделения векторных ДНК — см.
[35]), последний способ предпочтительней. При использовании неко-
торых препаратов плазмидных ДНК, полученных щелочным мето-
дом, клетки могут открепляться от подложки и сползать в среду
в момент обработки кальцийфосфатным преципитатом ДНК- В этом
случае клетки после обработки преципитатом следует осадить, про-
мыть ростовой средой (без антибиотиков) и, ресуспензировав в ро-
стовой среде с СЭК, поместить во флакон, где они, как правило,
хорошо вновь прикрепляются к подложке. Если задача эксперимента
заключается в получении количественных данных о частоте и эффек-
тивности генетической трансформации клеток, необходимо использо-
вать плазмидные ДНК, дважды отцентрифугированные в градиенте
CsCb с бромистым этидием. При этом необходимо проконтролиро-
вать, каково: содержание суперкольцевых молекул ДНК в получен-
ных препаратах и, если оно различается, линеаризовать плазмидные
ДНК с помощью соответствующих рестриктаз (эффективность
трансформации с линейными молекулами плазмидной ДНК в 2—
10 раз выше, чем с суперкольцевыми молекулами ДНК).
212
При трансформации клеток китайского хомячка клона А238 мы
культивируем клетки в течение 2—3 пассажей на ростовой среде,
содержащей 500 мкг/мл линкомицина, 200 мкг/мл канамицина и
100 мкг/мл тилоцина, рассеивая их за 18 ч до трансформации на
среду без антибиотиков [21, 36]. Такая предобработка повышает
частоту трансформации клеток клона А238 геном ТК ВПП в 10 раз.
Сообщалось о повышении частоты трансформации клеток после ана-
логичной предобработки антибиотиками полиэнового ряда — амфо-
терицином В, нистатином к др. [37].
Время обработки клеток глицерином (или ДМСО) существенно
различается для клеток разных линий (в частности, для клеток
линии HeLa оптимальное время обработки 15 %-ным раствором гли-
церина составляет 30 с, а для клеток мыши линий С127 и NIH3T3 —
120 с.) Кроме того, частота и эффективность генетической трансфор-
мации клеток китайского хомячка линий А238 и DUX11 и клеток
мыши некоторых линий не повышается, а даже понижается при
обработке клеток указанными агентами. Обработка клеток зеленой
мартышки линии Vero 15 %-ным раствором глицерина приводит
к отслоению клеток от подложки и гибели; в то же время предобра-
ботка этих клеток глицерином (до введения ДНК) повышает эффек-
тивность проникновения ДНК в клетки [38].
Обработка клеток ДНК
в присутствии ДЭАЭ-декстрана
Составы растворов, используемых при введении в клетки комп-
лекса ДНК—ДЭАЭ-декстрана,приводятся ниже ([34] с модификаци-
ями).
Буфер Д (в г на 1 л готового раствора): NaCl — 8, КС1 — 0.4,
Na2HPO4 • 2Н2О —0.125, Трис — 3, СаС12 — 0.1, MgCl2 • 6Н2О—
0.1, D-глюкоза— 1. Растворить в 800 мл Н2О, проверить pH — он
должен быть равен 7.4, в противном случае довести pH до 7.4 (NaOH
или НС1), стерилизовать фильтрованием. Раствор стабилен в течение
года при 4 °C.
1-ый раствор ДЭАЭ-декстрана (100 мг/мл, запасной): 2 г ДЭАЭ-
декстрана растворить в 20 мл буфера Д (в течение ночи при 4 °C),
простерилизовать фильтрованием. Раствор стабилен при 4 °C в тече-
ние года.
2-ой раствор ДЭАЭ-декстрана (0.5 мг/мл, рабочий): стерильно
слить 0.5 мл 1-го раствора ДЭАЭ-декстрана (100 мг/мл) и 9.5 мл бу-
фера Д. Раствор стабилен при 4 °C, но предпочтительней использо-
вать свежеприготовленный раствор.
Раствор векторной ДНК (с концентрацией 1—2 мкг/мл): стериль-
ный раствор векторной ДНК в буфере Б (см. выше) разбавить
стерильным буфером Д до нужной концентрации (концентрация
векторной ДНК в буфере Б не должна быть ниже 100 мкг/мл).
Процедура введения ДНК: 1) клетки рассеять за 18 ч до обра-
ботки ДНК на чашки Петри диаметром 6 см (1 • 105—1 • 106 клеток
'. на чашку); 2) отсосать ростовую среду и промыть чашки 1 раз с 5 мл
213
буфера Д; 3) добавить по 1 мл 2-го раствора ДЭАЭ-декстрана
(500 мкг/мл) на чашку; инкубировать 30 мин при комнатной темпера-
туре (или при 37 °C); 4) отсосать раствор ДЭАЭ-декстрана и доба-
вить 0.2 мл раствора векторной ДНК в буфере Д; инкубировать чаш-
ки 30 мин при комнатной температуре (или при 37 °C); 5) отсосать
раствор ДНК, промыть чашки 2 раза по 5 мл буфера Д, в этот момент
клетки можно обработать 15 %-ными растворами глицерина, ДМСО
(см. выше) или 48 %-ным раствором ПЭГ (см. ниже); после обра-
ботки (15—90 с) клетки промыть ростовой средой без сыворотки,
добавить ростовую среду с 10 % СЭК; 6) на следующие сутки сме-
нить среду; спустя еще 1—2 сут протестировать клетки на времен-
ную экспрессию чужеродного гена. При необходимости клетки могут
быть рассеяны.
Слияние клеток
с бактериальными протопластами
Составы растворов, которые используются при введении ДНК
в клетки с помощью слияния с протопластами, содержащими вектор-
ные ДНК с клонированными генами, приводятся ниже (по: [39, 40]
с модификациями).
Среда LB (в г): бакто-пептон—10, дрожжевой экстракт — 5,
NaCl — 10. Растворить в 800 мл Н2О, довести pH до 7.5 2 М раство-
ром NaOH (около 2.5 мл), довести объем до 1 л, автоклавировать
(1 атм, 30 мин). Хранить при 4 °C.
Хлорамфеникол (25 мг/мл): 25 мг хлорамфеникола растворить
в 1 мл 96 2^-ного (или абсолютного) этанола. Хранить при —20 °C.
Лизоцим (10 мг/мл): 10 мг лизоцима растворить в 1 мл буфера В,
используется свежеприготовленный раствор.
Буфер В: сахароза — 200 г, 10-кратный буфер А — 100 мл, Н2О
до общего объема 800 мл, довести pH к 7.05 1 М раствором NaOH
(около 2 мл), добавить Н2О до 1 л, стерилизовать фильтрованием.
Раствор стабилен при 4 °C в течение нескольких недель.
Буфер Г: сахароза — 90 г, 10-кратный буфер А— 100 мл.
0.25 М раствор ЭДТА • Na2 (pH 7.0): ЭДТА • Na2 — 93 г, раст-
ворить в 800 мл Н2О, добавляя 30 %-ный раствор NaOH до pH 7.0, до-
вести объем до 1 л, простерилизовать фильтрованием. Раствор
стабилен при комнатной температуре.
1.25 М раствор СаС12: СаС12 • 2Н2О— 184 г на 1 л. Стерилизо-
вать фильтрованием. Стабилен при 4 °C.
48 %-ный раствор ПЭГ (с молекулярной массой 1000). Взвесить
24 г ПЭГ. Автоклавировать 15 мин при 1 атм. Охладить приблизи-
тельно до 60 °C. Добавить 25 мл подогретой 2-кратной ростовой среды
(без сыворотки) и 1 мл Н2О. Интенсивно перемешать. Раствор
должен быть стабильным при комнатной температуре, не расслаи-
ваться; если осадок образуется в первые после перемешивания
минуты, подогреть на водяной бане (65—75 °C) до растворения ПЭГ.
Хранить при 4 °C не более 2 нед; при —20 °C раствор стабилен в те-
чение года.
Очистка ПЭГ. Если имеются подозрения на токсичность ПЭГ,
214
раствор может быть приготовлен следующим образом. 300—500 мл
расплавленного при 45 °C ПЭГ поместить в водяную баню; довести
pH до 7.4 с концентрированной НС1 (измеряя pH по индикаторной
бумаге). Добавить и хорошо размешать 10 г смешанного анионо-
катионообменника (AG501-X8(D)—фирма «Bio-Rad», США) или
смесь амберлитов IRA и IR («Serva», ФРГ), инкубировать с периоди-
ческим перемешиванием несколько часов при 45 °C. Собрать ионо-
обменник фильтрованием через фильтровальную бумагу, покрытую
слоем свежего ионообменника (10 г): фильтровать в вакуумную
колбу с отсосом, воронку и колбу можно подогреть до 60—80 °C.
Взвесить профильтрованный ПЭГ, добавить 2-кратную ростовую
среду и НгО до получения 48 %-ного раствора ПЭГ. Стерилизовать
фильтрованием. Условия хранения и стабильность см. выше.
Процедура слияния может быть представлена в виде следующих
этапов.
1. За 1 сут до слияния клеток с протопластами инокулировать
в 50 мл среды LB 4 мл ночной культуры соответствующего штамма
Е. coli.
2. Спустя 2—4 ч при 37 °C при достижении оптической плотности
Абоо=О.7-=-О.8 (3 • 108—5 • 108 клеток/мл) добавить 50 мкл раст-
вора хлорамфеникола (25 мг/мл), инкубировать со встряхиванием
18—20 ч при 37 °C.
3. Осадить бактериальные клетки центрифугированием (5000 об/
мин, 10 мин при 4 °C), осадок ресуспензировать в буфере В так, чтобы
количество клеток составляло около 1 • 10’° в 1 мл (обычно 2 мл).
4. На 2 мл суспензии клеток добавить 0.4 мл раствбра лизоцима
в буфере В (10 мг/мл), инкубировать от 10 до 45 мин при комнатной
температуре до превращения 85—90 % клеток в сферопласты (за
удалением клеточной стенки необходимо проследить под фазово-
контрастным микроскопом, поскольку для разных штаммов Е. coll
оптимальное время обработки лизоцимом, особенно в указанных
субоптимальных по значению pH условиях, может существенно раз-
личаться; при этом чрезмерная обработка лизоцимом может повре-
дить протопласты); эта стадия — получение сферопластов —
является ключевой.
5. Охладить суспензию, поместив ее в сосуд со льдом (4 °C);
добавить 1.25 М раствор СаСЬ (0.25 мл на 2 мл исходной суспензии
клеток) и 0.25 М раствор ЭДТА • Na2 (0.8 мл на 2 мл исходной сус-
пензии клеток); разбавить суспензию, осторожно и при перемешива-
нии добавляя 4 объема буфера Г (т. е. 8 мл буфера Г на 2 мл исходной
суспензии); в полученной суспензии содержится обычно 5- 108—
1 • 109 протопластов в 1 мл.
6. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре, 1 мл суспен-
зии (около 109 протопластов) добавить на 1 чашку диаметром 50 мм
с клетками, клетки необходимо посеять за 18 ч до эксперимента,
оптимальным является рассев 1 • 105—2 • 105 клеток на чашку
диаметром 50 мм.
7. Осадить протопласты на клетки, центрифугируя чашки в тече-
ние 3—5 мин (при комнатной температуре); мы используем для этой
215
цели пластиковые контейнеры цилиндрической формы со съемным
дном и крышкой, устанавливаемые непосредственно в подстакан-
ники buckett-роторов центрифуг К23 или К70 («Janezki», ГДР) с по-
мещенными в них чашками Петри.
8. Тщательно отсосать супернатант (поставив дно чашки на бок,
дать стечь остаткам среды и вновь отсосать среду); добавить на
чашку 1 мл 4гё %-ного раствора ПЭГ, и, наклоняя чашку, добиться
равномерного распределения раствора по поверхности чашки.
9. Инкубировать 45—90 с при комнатной температуре, отсосать
раствор ПЭГ и быстро промыть чашки 3—4 раза ростовой средой
(по 5 мл) без сыворотки с 200 мкг/мл гентамицина и 100 мкг/мл
пенициллина и стрептомицина.
10. Добавить по 5 мл ростовой среды е 10 % СЭК и 200 мкг/мл
гентамицина на чашку; в течение следующих 3 ч трижды сменить
среду.
11. На следующие сутки поменять среду на селективную; при
необходимости рассеять клетки на новые чашки Петри и спустя 5—
6 ч сменить среду на селективную; в течение следующих 3 сут
ежедневно менять селективную среду, селекцию проводить в присут-
ствии гентамицина (200 мкг/мл) по крайней мере в течение первых
6 суток.
Селекция
генетически трансформированных клеток
Среда ГАТ. В присутствии ингибитора эндогенного синтеза de
novo пурийовых и пиримидиновых нуклеотидов — аминоптерина
(аналога фолиевой кислоты) соматические клетки ауксотрофны по
гипоксантину и тимидину и их выживаемость зависит от наличия
ферментов реутилизации пуриновых и пиримидиновых оснований —
ГФРТ и ТК соответственно [3, 41]. ТК“-клетки (устойчивые к БДУ)
и ГФРТ'-клетки (устойчивые к ТГ) трансформируют генами ТК и
ГФРТ (КГФРТ) соответственно и генетически трансформированные
клетки отбирают на среде ГАТ.
1000-к,ратный раствор аминоптерина (1 мг/мл): 20 мг аминопте-
рина растворить в 1 мл 2 М раствора NaOH, добавить 18 мл Н2О,
простерилизовать фильтрованием; хранить при —20 °C. После оттаи-
вания для растворения аминоптерина раствор можно кратковременно
нагреть в пламени спиртовки.
100-кратный раствор гипоксантина и тимидина: 150 мг гипоксан-
тина растворить в 2 мл 2 М раствора NaOH, добавить 48 мл Н2О,
отдельно растворить 50 мг тимидина в 50 мл Н2О, растворы слить
вместе, простерилизовать фильтрованием, хранить при —20 °C (по
5 мл).
Для приготовления среды ГАТ к 440 мл ростовой среды добавить
5 мл 100-кратного раствора гипоксантина и тимидина, 0.5 мл
1000-кратного раствора аминоптерина и 50 мл СЭК. При селекции
клеток среда ГАТ меняется вначале 1 раз в 3—4 сут.
Среда МК.ГАТ (МКГАС). Микофенольная кислота ингибирует
216
инозинмонофосфатдегидрогеназу, блокируя тем самым превращение
ИМФ в ксантинмонофосфат (КМФ), непосредственный предшествен-
ник ГМФ. В этих условиях даже при наличии ГФРТ клетки неспо-
собны при отсутствии в среде гуанина синтезировать ГМФ. КГФРТ
Е. coll в отличие от ГФРТ соматических клеток способна узнавать
ксантин и превращать его в КМФ; поэтому клетки, экспрессирующие
ген КГФРТ, способны выживать на среде, содержащей микофеноль-
ную кислоту и ксантин. Добавление ингибиторов биосинтеза нуклео-
тидов de novo — аминоптерина или азасерина (более специфично
ингибирующего биосинтез пуриновых нуклеотидов, но не пиримиди-
новых) — приводит к более полной остановке роста клеток и более
быстрому откреплению не экспрессирующих ген КГФРТ клеток от
субстрата [42, 43, 44].
Раствор микофенольной кислоты: 50 мг микофенольной кислоты
растворить в 1 мл 2 М раствора NaOH, добавить 24 мл Н2О, про- ’
стерилизовать фильтрованием, хранить при —20 °C.
1000-кратный раствор азасерина: 80 мг азасерина растворить
в 1 мл 2 М раствора NaOH, добавить 19 мл Н2О простерилизовать
фильтрованием, хранить при —20 °C.
500-кратный раствор ксантина: 5 г ксантина растворить в мини-
мальном объеме 30%-ного раствора NaOH при легком нагревании,
довести НгО объем до 10 мл, простерилизовать фильтрованием,
хранить при комнатной температуре.
Для приготовления среды МКГАТ к 435 мл ростовой среды
добавить 5 мл 100-кратного раствора гипоксантина и тимидина,
0.5 мл 1000-кратного раствора аминоптерина, 1' мл 500-кратного
раствора ксантина, 1—5 мл раствора микофенольной кислоты (в за-
висимости от линии клеток-реципиентов, так, для клеток китайского
хомячка и человека селективной является концентрация микофеноль-
ной кислоты 4 мкг/мл, тогда как для клеток зеленой мартышки
необходимо добавлять в среду микофенольную кислоту в концентра-
ции не ниже 20 мкг/мл) и 50 мл СЭК. Для доведения pH среды до
7.2—7.4 добавить стерильно 1—3 капли концентрированной
НС1.
Для приготовления среды МКГАС в среду не добавляется тими-
дин, а вместо аминоптерина добавляется 0.5 мл 1000-кратного раст-
вора азасерина. Среда МКГАС предложена Графом с соавторами
[44]. Поданным авторов (и по нашим неопубликованным наблюде-
ниям), скорость роста и максимально достижимая плотность в моно-
слое клеток трансформантных клонов, экспрессирующих ген КГФРТ
и отобранных на среде МКГАТ, на этой среде существенно ниже,
чем эти же характеристики клеток-реципиентов на неселективной
среде. Ростовые характеристики клеток трансформантных клонов не
изменяются и при удалении из среды микофенольной кислоты и ксан-
тина по крайней мере на протяжении 5—10 клеточных поколений —
срока, необходимого для размножения клеток клонов с целью их
замораживания. Все это затрудняет работу с клетками на среде
МКГАТ. По мнению авторов, среда МКГАС свободна от указанных
недостатков; нами, однако, она не использовалась.
217
При селекции клеток среда МКГАТ (МКГАС) меняется 1 раз
в 3—4 сут.
Среда для селекции клеток, трансформированных геном ДГФР.
В дефектных по ДГФР (ключевому ферменту одноуглеродного мета-
болизма) клетках не осуществляется биосинтез пуриновых и пири-
мидиновых нуклеотидов de novo (поэтому ДГФР“-клетки культиви-
руют в присутствии гипоксантина и тимидина). При отсутствии
в среде нуклеотидов и оснований (гипоксантина и тимидина) могут
выжить только клетки, экспрессирующие чужеродный ген ДГФР (или
ДГФР+-клетки-ревертанты). В присутствии в среде метотрексата
(аналога фолиевой кислоты), стехиометрически и необратимо связы-
вающегося с ДГФР, из популяции ДГФР+-клеток генетически транс-
формированных клонов могут быть отобраны клетки с увеличенным
числом копий гена ДГФР (и увеличенным числом копий котранс-
формированных генов) [45—48].
Селективная среда состоит из ростовой среды без нуклеотидов
и оснований нуклеотидов, в которую добавлено 10 % диализованной
СЭК.
Диализованная СЭК: 1) поместить СЭК в водяную баню для
тепловой инактивации (45 мин при 56 °C); 2) диализные трубки
прокипятить в 5 %-ном растворе бикарбоната натрия, содержащего
0.1 % версена, промыть Н2О; 3) налить охлажденную СЭК (500 мл)
в диализный мешок, диализовать против 20 л 0.85 %-ного раствора
NaCl при 4 °C с перемешиванием; первые две смены 0.85 %-ного
раствора NaCl — через 4 ч каждая, затем на ночь, на следующие
сутки сменить 0.85 %-ный раствор NaCl и спустя 4 ч прекратить
диализ; 4) п'ростерилизовать СЭК фильтрованием, разлить по 50 мл
и хранить при —20 °C. При селекции среда с диализованной СЭК
меняется 1 раз в 3—4 сут.
Среда с антибиотиком G418. Антибиотик G418 (генетицин) сходен
по структуре с гентамицином, неомицином и канамицином, но в отли-
чие от них блокирует в клетках эукариот синтез белка, связываясь,
по-видимому, с SOS-рибосомами [49]. Введение в клетки гена АГФТ
(прокариотного происхождения, из транспозона Тп5) делает их
устойчивыми к генетицину [50, 51, 52, 53].
100-кратный раствор генетицина: 500 мг генетицина растворить
в 10 мл H2O, стерилизовать фильтрованием, хранить при —20 °C.
К ростовой среде с 10 % СЭК добавить 5 мл 100-кратного ра-
створа генетицина. Среда при селекции меняется 1 раз в 3—5 сут;
с появлением видимых колоний на чашках среда заменяется на среду
без генетицина; выросшие колонии выделяются (с помощью титано-
вых цилиндров) и размножаются до 1 • 106—10 • 106 клеток в среде
без генетицина, поскольку по неизвестным причинам клетки в кло-
нальной плотности более чем в 200 раз чувствительней к генети-
цину.
Селекция клеток на фокусы роста или в среде с полужидким
агаром, применяемая для отбора клеток, трансформированных вирус-
ными или клеточными onc-генами, описана Т. В. Поспеловой (см.
наст. сб.).
218
Литература
1. Подгаецкая Д. Я., Бреслер В. М., Оленов Ю. М. Действие нуклеопротеинов,
выделенных из сарколизинустойчивых опухолей, на сарколизинчувствительиые
опухоли // Цитология. 1962. Т. 4. № 1. С. 59—61.
2. Подгаецкая Д. Я-, Бреслер В. М., Оленов Ю. М. Биологическая активность нуклео-
протеидов, выделенных из клеток сарколизинустойчивого штамма саркомы 45 //
Тез. докл. VIII Международ, противоракового конгр. М., 1962. С. 126.
3. Szybalska Е. Н., Szybalski Е. Genetics of human cell lines. 4. DNA-mediated here
ditable transformation of a biochemical trait//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1962.
Vol. 48. P. 2026— 2034.
4. Szybalski IV., Szybalska E. H., Ragni G. Genetic studies with human cell lines //
Nat. Cancer Inst. Monogr. 1962. Vol. 7. P. 75—89.
5. McBride О. IV., Ozer H. L. Transfer of genetic information by purified metaphase
chromosomes//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1973. Vol. 70. P. 1258—1262.
6. Bacchetti S., Graham F. L. Transfer of the gene for thymidine kinase-deficient
human cells by purified herpes simplex viral DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.
1977. Vol. 74. P. 1590—1594.
7. 'Maitland N. J., McDougall J. K. Biochemical transformation of mouse cells by frag-
ments of herpes simplex virus DNA // Cell. 1977. Vol. 11. P. 233—241.
8. Wigler M., Silverstein S., Lee L.-S. et al. Transfer of purified herpes simplex virus
thymidine kinase gene to cultured mouse cells//Cell. 1977. Vol. 11. P. 223—232.
9. Graham F. L., van der Eb A. J. A new technique for the assay of infectivity of human
adenovirus 5 DNA //Virology. 1937. Vol. 52. P. 456—467.
10. Pellicer A., Robins D., Wold B. et al. Altering genotype and phenotype by DNA-
mediated gene transfer // Science. 1980. Vol. 209. P. 1414—1422.
11. Milman G., Herzberg M. Efficient DNA transfection and rapid assay for thymidine
kinase activity and viral antigenic determinants // Somat. Cell Genet. 1981. Vol. 7.
P. 161-170.
12. Banerji J., Schaffner IV. Trancient expression of cloned genes in mammalian
cells // Genetic engineering: principles and methods. New York, 1983. Vol. 5. P. 19—
32.
13. Gorman C. High efficiency gene transfer into mammalian cells//DNA cloning:
a practical approach. Oxford, 1985. Vol. 2. P. 143—190.
14. Томилин H. В., Глебов О. К. Генетическая трансформация клеток млекопитаю-
щих//Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л., 1986. С. 62—82.
15. Anderson IV. F., Killos L., Sanders-Haigh L. et al. Replication and expression of
thymidine kinase and human globin genes microinjected into mouse fibroblasts //
Proc. Nat. Acad. Sci.USA. 1980. Vol. 77. P. 5399—5403.
16. Capecchi M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into
cultured mammalian cells // Cell. 1980. Vol. 22. P. 479—488.
17. Nelson D. L., Weis J. H., Przyborski M. J. et al. Metaphase chromosome transfer
of introduced selectable markers //J. Mol. Appl. Genet. 1984. Vol. 2. P. 563—577.
18. Yamaizuml M., Howich A. L., Ruddle F. H. Expression and stabilization of microin-
jected plasmids containing the herpes simplex virus thymidine kinase gene and
polyoma virus DNA in mouse cells//Mol. Cell Biol. 1983. Vol. 3. P. 511—522.
19. Loyter A., Scangos G. A., Ruddle F. Mechanisms of DNA uptake by mammalian
cells: fate of exogenously added DNA monitored by the use of fluorescent dyes //
Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. Vol. 79. P. 422—426.
20. Loyter A., Scangos G. A., Juricek D., Ruddle F. H. Mechanisms of DNA entry into
mammalian cells. 2. Phagocytosis of calcium phosphate DNA co-precipitate visua-
lized by electron microscopy // Exp. Cell Res. 1982. Vol. 139. P. 223—234.
21. Глебов О. K-, Абрамян Д. С., Томилин Н. В. Генетическая трансформация сомати-
ческих клеток. 1. Клон клеток китайского хомячка, дефектных по тнмидинкиназе,
отличающийся высокой эффективностью трансформации // Цитология. 1985.
Т. 27. № 4. С. 467—475.
22. Moore Н.-Р. Н.. Walker М. D., Lee F., Kelly R. В. Expressing a human preproin-
sulin cDNA in a mouse ACTH-secreting cell. Intracellular storage, proteolytic
processing and secretion on stimulation // Cell. 1983. Vol. 35. P. 531—538.
23. Graham F. L. Biological activity of tumor virus DNA // Adv. Cancer Res. 1977.
Vol. 25. P. 1—57.
219
24. Hasmain S. E., Ganesan K-, Upadhyaya К. C. Mechanism of enhancement of DNA-
uptake by polykations: effect of polvkations on DNA, DNAase, and plasma membra-
nes//Indian J. Exp. Biol. 1980. Vol. 18. P. 1230—1232.
25. Shen Y.M., Hirschhorn R. R., Mercer IT. E. et al. Gene transfer: DNA microinjection
compared with'D'NA transfection with a very high efficiency// Mol. Cell Biol. 1982.
Vol. 2. P. 1145—1154.
26. Chu G., Sharp P. A. SV40 DNA transfection of cells in suspension: analysis of the
efficiency of transcription and translation T-antigen // Gene. 1981. Vol. 13. P. 197—
202.
27. Sussman D. J., Milman G. Short-term high-efficiency expression of transfected
DNA//Mol. Cell Biol. 1984. Vol. 4. P. 1641—1643.
28. Schaffner W. Direct transfer of cloned genes from bacteria to mammalian cells //
Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 2163—2167.
29. De Saint-Vincent B. R., Delbriick S., Eckhart IV et al. The cloning and reintroduction
into animal cells of a functional CAD gene, a dominant amplifiable genetic marker //
Gdl. 1981. Vol. 27. P. 267—277.
30. De Saint-Vincent B. R., Wahl G. M. Homologous recombination in mammalian
cells mediates, formation of a functional gene from two overlapping gene frag-
ments // Proc. Nat. Acad. Sci.USA. 1983. Vol. 80. P. 2002—2006.
31. Sandri-Goldin R. M., Goldin A. M„ Levin M., Gloriozo J. C. Highfrequency
transfer of cloned herpes simplex virus type 1 sequences to mammalian cells by
protoplast fusiffln//Mol. Cell Biol. 1981. Vol. 1. P. 743 — 752.
32. Wahl G. M., Allen V., Delbriick S. et al. Analysis of CAD gene amplification using
a combined approach of molecular genetics and cytogenetics // Eukaryotic cell
cultures: basis and applications. New York; London, 1984. P. 319—349.
33. Rassoulzadegan M., Binetruy B., Cusin F. High frequency of gene transfer after
fusion between bacteria and eukaryotic cells // Nature. 1982. Vol. 295. P. 257—259.
34. Crowe R., Ozer H., Rifkin D. Experiments with norma! and transformed cells.
A laboratory manual for working with cells in culture. New York, 1978. 175 p.
35. Маниатис T., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., 1984. 479 с.
36. Глебов О. К., Титомиров А. В., Пинаев Г. П., Томилин Н. В. Трансформация клеток
китайского хомячка плазмидой pBR325::tk::NS3 и влияние на стабильность транс-
формантов опухолевого промотора ТРА // Докл. АН СССР. 1982. Т. 267. № 6.
С. 1496—1198.
37. Hidaka К-, Siminovitch L. Enhancement effect of amphotericin В on the DNA
mediated gene transfer //Gann. Jap. J. Cancer Res. 1984. N 237. P. 228.
38. Yelle J., Dion M., Hamelin C. Efficient transfection of mammalian cells with viral
DNA in optimal culture conditions//J. Virol. Meth. 1983. Vol. 7. P. 321—326.
39. Reeves R., Gorman С. M., Howard В. H. Construction and transfer into mammalian
-cells of a vector containing insect histone genes // Genetic engineering in eukaryo-
tes. New York; London, 1983. P. 73—88.
40. Yoakum G. H., Korba В. E., Lechner J. F. et al. Highfrequency transfection and
cytopathology of the hepatitis В virus core antigen gene in human cells // Science.
1983. Vol. 222. P. 385—389.
41. Littlefield J. IV. Selection of hybrids from mathings of fibroblasts in vitro and their
presumed .recombinants//Science. 1964. Vol. 145. P. 709—710.
42. Mulligan R. C., Berg P. Selection for animal cells that express the Escherichia
colt gene coding xanthine-quanine phosphoribosyltransferase // Proc. Nat. Acad.
Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 2072—2076.
43. Mulligan R. C., Berg P. Factor govering the expression of a bacterial gene in mamma-
lian cells //Mol. Cell Biol. 1981. Vol. 1. P. 449—459.
44. Graf L. N., Kqplan P., Silagi S. Efficient DNA-mediated transfer of selectable
genes and unselected sequences into differentiated and undifferentiated mouse
melanoma clones //Somat. Cell Mol. Genet. 1984. Vol. 10. P. 139—151.
45. Ringold G. M., Dieckman B., Lee F. Coexpression and amplification of dihydrofolate
reductase cDNA and the Escherichia coli XGPRT gene in Chinese hamster ovary
cells//.J. Mol. Appl. Genet. 1981. Vol. 1. P. 165—175.
46. Kaufman R. J., Latt S. A., Sharp P. A. Expression and amplification of DNA introdu-
ced into mammalian cells//Gene amplification. New York, 1982. P. 245—250.
47. Kaufman R. J., Sharp ,P. A. Construction of a modular dihydrofolate reductase
cDNA gene: analysis of signals utilized for efficient expression //Mol. Cell Biol.
1982. Vol. 2. P-. 1304—1319.
220
48. Kaufman R. J., Sharp P. A. Amplification and expression of sequences contransfected
with a modular dihydrofolate reductase complementary DNA gene//J. Mol. Biol.
1982. Vol. 159. P. 601—622.
49. Jimenez A., Davies J. Expression of a transposable antibiotic resistance element
in Saccharomyces //Nature. 1980. Vol. 287. P. 869—871.
50. Colbere-Garapin F., Horodniceanu F., Kourilsky P., Garapin A.-C. A new dominant
hybrid selective marker for higher eukaryotic cells //J. Mol. Biol. 1981. Vol. 150
P. 1 — 14.
51. Colbere-Garapin F., Horodniceanu F., Kourilsky P., Garapin A.-C. Construction of
a dominant selective marker useful! for gene transfer studies in animal cells //
Develop. Biol. Stand. 1982. Vol. 50. P. 323—326.
52. Southern P. J., Berg P. Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance
with a bacterial gene under control of the SV40 early region promotor //J. Mol.
Appl. Genet. 1982. Vol. 1. P. 327—341.
.53, Southern P. J., Berg P. Mammalian cell transformation with SV40 hybrid plasmid
vector // Eukaryotic virus vectors. New York, 1982. P. 41 — 45.
Трансформация нормальных клеток
онкогенными последовательностями ДНК
Т. В. Поспелова
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
В начале 80-х годов было высказано предположение, что в клетке
должны существовать последовательности ДНК, ответственные за
превращение нормальных клеток в опухолевые. Данные Мак-Канна и
Эймса [1] однозначно указывали на тесную корреляцию мутагенного
и канцерогенного действия агентов различного происхождения и
позволяли предполагать, что именно на уровне молекул ДНК разво-
рачиваются центральные события канцерогенеза. Однако прямых
доказательств существования последовательностей ДНК, ответ-
ственных за превращение нормальных клеток в опухолевые, не было.
Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза был
связан с изучением онкогенных ретровирусов и обнаружением у них
специальных трансформирующих последовательностей, которые
были названы вирусными онкогенами (v-onc), а также с открытием
в клетках различных видов позвоночных и Metazoa существования
сходных с ретровирусными высококонсервативных последователь-
ностей, которые получили название клеточных онкогенов (с-опс) [2].
Принципиально новые возможности для изучения онкогенов и их
роли в процессе канцерогенеза появились в связи с разработкой мето-
дов переноса генов с помощью кальцийфосфатного преципитата ДНК
[3]. Присутствие онкогенных последовательностей в ДНК опреде-
лялось по морфологической трансформации, которая выражалась
в появлении «фокусов» роста или, как говорят, «фокусов» морфоло-
гической трансформации. «Фокусы» представляют собой очаги мно-
гослойного роста на монослое клеток, которые исходно имеют признак
контактного торможения пролиферации в монослое, т. е. пролифери-
ровать на монослое способны только трансформированные онкоге-
нами клетки. Индукция таких «фокусов» препаратами ДНК из опухо-
левых клеток указывает на то, что в них присутствуют доминантно
221
действующие последовательности ДНК, способные трансформиро-
вать нормальные клетки на уровне морфологии.
Наиболее широко в опытах по тестированию ДНК на присутствие
в них онкогенных последовательностей используются минимально
трансформированные линии грызунов, СЗНЮТ’/г, Rat-2, С-127,
REF-108, REF52, FR3T3. Наиболее часто используется линия мыши-
ных фибробластов NIH3T3, у которой хорошо выражен признак
контактного ингибирования клеточной пролиферации в монослое [4].
При использовании клеток NIH3T3 и препаратов ДНК, полученных
из опухолей человека и млекопитающих, было показано, что по крите-
рию образования «фокусов» трансформирующей способностью обла-
дают препараты ДНК из карцином мочевого пузыря, гортани,
поджелудочной железы, кожи, толстого кишечника, а также рабдоми-
осаркомы и различные гемопоэтические неоплазии [5]. Трансформи-
рующие последовательности можно проводить через серии переносов
и таким образом обогащать популяцию клеток последовательностями
ДНК, которые отвечают за морфологическую трансформацию. При
тестировании ДНК из опухолей и опухолевых постоянных клеточных
линий было обнаружено, что в большей части случаев индукция
«фокусов» связана с присутствием активированной формы прото-
онкогенов семейства ras, когда же переносили ДНК из опухолей,
в которых были активированы другие типы протоонкогенов, в част-
ности «ядерного типа», морфологическая трансформация обнаружи-
валась не во всех случаях. В среднем при тестировании ДНК из опу-
холей человека по способности вызывать «фокусы» морфологической
трансформации на клетках NIH3T3, только у 20 % опухолей обнару-
живаются .трансформирующие последовательности ДНК. По-види-
мому, появление «фокусов» морфологической трансформации при
тестировании ДНК из опухолевых клеток зависит не только от при-
сутствия в них онкогенных последовательностей, но и от других
причин. В частности, действие онкогенов может иметь рецессивный
характер, и в таких случаях трудно ожидать проявления свойств
трансформации на морфологическом уровне. Не исключена также
тканеспецифичность в проявлении онкогенов при трансформации
ДНК- Несмотря на указанные сложности, в связи с простотой и
существенной информативностью метод индукции «фокусов» морфо-
логической трансформации на клетках NIH3T3 относится к числу
наиболее широко применяемых при анализе ДНК на присутствие
в них онкогенных последовательностей.
Индукция «фокусов» морфологической трансформации
в клетках линии NIH3T3 препаратами тотальной ДНК
из опухолей и постоянных клеточных линий
Морфологическую трансформацию NIH3T3 клеток осуществляют
с помощью различных модификаций кальцийфосфатного метода
[6, 7]. Этот метод дает хорошие результаты при использовании пере-
носа генов для большинства монослойных и некоторых суспензионных
культур. Для проведения морфологической трансформации NIH3T3
222
клеток препаратами тотальной ДНК с помощью кальцийфосфатного
преципитата необходимо выполнять несколько основных требований:
1) клетки должны быть посеяны не более чем за 16—18 ч до проведе-
ния трансформации; 2) необходимо тщательно контролировать pH
используемых буферных растворов; 3) клетки не должны быть конта-
минированы микоплазмой.
Культивирование клеток NIH3T3 и приготовление растворов для
трансфекции. Клетки линии NIH3T3 культивируют на среде Игла
в модификации Дальбекко с 10 % эмбриональной сыворотки коров
«Gibco». За 16—18 ч до трансформации клетки снимают смесью
0.25 %-ного трипсина с 0.02 %-ным версеном в отношении 1 : 1 и рас-
севают на 60 мм пластиковые чашки по 3 • 104 клеток/см2 и культи-
вируют в СОг-инкубаторе до эксперимента. Среды, содержащие
в составе СаС12, не могут использоваться для кальцийфосфатного
переноса ДНК, так как избыток кальция вызывает уплотнение
преципитата и приводит к увеличению размера гранул. Плотность
клеток в момент проведения обработки их кальцийфосфатным преци-
питатом ДНК является важным моментом. Если используемая плот-
ность существенно ниже указанной, клетки после обработки преципи-
татом могут погибать или открепляться от подложки. Если плотность
клеток существенно выше указанной, эффективность трансформации
снижается. Для получения кальцийфосфатного преципитата ДНК
готовятся два буферных раствора и раствор СаС12, предпочтительно
на деионизованной или Super-Q воде.
10-кратнып HEPES-буфер (Буфер А), pH 7.05: HEPES — 0.21 М,
NaCI— 1.36М, КС1 — 0.05 М, Na2HPO4 • 2Н2О — 7.5 • 10“3М,
декстроза (D-глюкоза) — 0.055 М. Раствор стерилизуется фильтро-
ванием через мембранный фильтр («Millipore») тип GS с диаметром
пор 0.22 мкм, доводится до значений pH 7.05 1 н. NaOH, разливается
по 10 мл в стерильные флаконы и может храниться при 4 °C в течение
года. Непосредственно перед экспериментом готовится 2-кратный А
буфер, pH которого вновь доводится до 7.05 перед стерилизацией
раствора через мембранный фильтр.
Буфер Б, pH 9.0, для растворения ДНК: Трис-НС1 — 1 • 10~3 М,
Na-ЭДТА — 1 • 10"4 М.
Раствор СаС12: готовится 2 М раствор СаС12, который стерилизу-
ется фильтрованием и хранится при 4 °C.
Растворы для проведения шока: для проведения шока после
кальцийфосфатного переноса ДНК можно использовать либо 10—
15 % глицерин в HEPES-буфере, pH 7.05, пропись которого приве-
дена выше, либо 10 %-ный диметилсульфоксид на бессывороточной
среде Дальбекко. Растворы готовятся непосредственно перед экспе-
риментом и стерилизуются через мембранные фильтры («Millipore»)
с диаметром пор 0.22 мкм.
Приготовление кальцийфосфатного преципитата ДНК. ДНК, вы-
деленная из опухолей или опухолевых клеток постоянных клеточных
линий,растворяется в буфере Б в концентрации от 10 до 1000 мкг/мл
(в зависимости от объема и задач эксперимента) и фрагментируется
гидродинамическим способом при 2-кратном пропускании через
223
шприц с диаметром иглы, равным (0.2 мм. После этого ДНК осажда-
ется двумя объемами этилового спирта в присутствии 0.1 М ацетата
натрия в течение ночи при температуре —20 °C. Осадок ДНК полу-
чают центрифугированием при 12 000 g. Надосадочную жидкость
тщательно удаляют, и осадок ДНК вновь растворяется в буфере Б.
Для морфологической трансформации используется 10—20 мкг ДНК
на 60 мм чашку, в которой находится (2—5) • 105 клеток. Общее
количество преципитата готовится из расчета 0.5 мл на 60 мм чашку.
Для формирования преципитата в (буфер Б, где растворена ДНК, до-
бавляется 2 М раствор СаСЬ до> конечной концентрации 0.25 М
(можно использовать фармацевтический стерильный раствор СаСЬ,
который применяется для внутривенных инъекций). К равному
объему 2-кратного буфера А осторожно, по каплям, добавляется
ДНК в 0.25 М растворе СаСЬ (пробирка постоянно встряхивается).
Преципитат начинает формироваться bi течение нескольких секунд,
по мере введения ДНК раствор все более опалесцирует. Если значе-
ния pH используемых растворов точно соблюдены, то образуются
кальцийфосфатные гранулы очень мелкого размера. Если значение
pH сдвинуто в щелочную сторону, то образуются конгломераты круп-
ного размера, которыми трудно трансформировать клетки. При более
кислых значениях pH кальцийфосфатный преципитат не образуется
и трансформация клеток не идет.
Трансформация клеток. Питательную среду с клеток тщательно
удаляют пастеровской пипеткой и на клеточный монослой наносится
ДНК в составе кальцийфосфатного» преципитата. После этого клетки
сразу же помещают в ССЬ-инкубатор, для того чтобы избежать коле-
баний рН‘,'и выдерживают в течение 1 ч. Для повышения эффектив-
ности трансфекции через 1 ч проводят либо глицериновый шок —
15 %-ным раствором глицерина в течение 2 мин при температуре
37 °C, либо 10—20 %-ным раствором ДМСО на среде Дальбекко
без сыворотки в течение 2—4 мин при комнатной температуре.
На 60 мм чашку добавляется по 1 мл среды с указанными агентами.
После шока клетки 2—3 раза промывают бессывороточной средой,
заливают среду Дальбекко с 2—5 % эмбриональной сыворотки коров
и культивируют еще в течение 16—18 ч в СОг-инкубаторе. Затем
клетки снимают смесью трипсина с версеном (1:1) и рассевают
по 105 клеток на 60 мм пластиковые чашки в среде Дальбекко
с 5 или 10 % эмбриональной сыворотки коров «Gibco». Смену среды
на свежую проводят каждые 3 сут.
«Фокусы» морфологической трансформации на клетках NIH3T3
при трансформации препаратами тотальной ДНК начинают форми-
роваться через 18—20 сут. Выглядят они как зоны многослойного
роста на монослое нетрансформированных клеток. В центре «фокуса»
клетки растут с очень большой плотностью и имеют округлую
форму, по краям можно видеть хорошо распластанные радиально
ориентированные клетки. «Фокусы» могут образовываться с разной
скоростью, варьировать в размерах и по морфологии. Число фокусов
на чашке подсчитывается после фиксации смесью метилового спирта
с уксусной кислотой (3:1) и окрашивания клеток кристаллвиолетом
224
или 1 %-ным водным раствором метиленовой сини. Выделение фоку-
сов проводится с помощью титановых колец или цилиндров из нержа,
веющей стали с внутренним диаметром от 3 до 10 мм. Ростовая
среда тщательно удаляется с чашек Петри, и цилиндры с помощью
силиконового клея (стерилизуется автоклавированием при 0.5 атм
в течение 30 мин) приклеиваются на дно чашки так, чтобы «фокус»
оказался внутри цилиндра. Затем с помощью пастеровской пипетки
в цилиндр наливается смесь трипсина с версеном (1 : 1). Клетки из
цилиндра после открепления пастеровской пипеткой переносятся
в чашку Петри диаметром 30 мм или ячейку 24-ячеечной платы.
Эффективность трансформации оценивают по частоте появления «фо-
кусов» морфологической трансформации, возникающих при обра-
ботке 106 клеток 1 мкг ДНК- Эта частота может варьировать
от 10“4 до 10 5, однако описаны случаи значительно более низкой
частоты «фокусов» морфологической трансформации при переносе
онкогенных последовательностей препаратами тотальной ДНК [8].
Учитывая частоту возникновения «фокусов» морфологической транс-
формации, можно рекомендовать в экспериментах по тестированию-
трансформирующей способности тотальной ДНК из опухолевых кле-
ток обрабатывать кальцийфосфатным преципитатом ДНК не менее
(3—4) • 106 клеток. Для анализа трансформантов лучше брать «фо-
кусы» независимого происхождения, из разных чашек.
К числу наиболее интересных результатов, которые получены при
трансформации клеток NIH3T3 препаратами тотальной ДНК из опу-
холей различного происхождения, можно отнести те, которые позво-
лили обнаружить в клетках трансформирующие последовательности,
не имеющие гомологии с ретровирусными трансформирующими по-
следовательностями. Среди открытых методом ДНК-переноса онкоге-
нов можно назвать B-lymI [9], T-lymI [10], пей [11] и met [12],
которые были не только идентифицированы методом переноса препа-
ратами тотальной ДНК, но позднее выделены методами молекуляр-
ного клонирования.
Можно также отметить, что тотальная ДНК, которая использу-
ется для тестирования в ней трансформирующих последователь-
ностей, должна иметь определенные размеры — порядка нескольких
десятков тысяч пар оснований. Деградация ДНК до 5000 пар основа-
ний приводит к тому, что трансформирующей способностью начинают
обладать ДНК, выделенные из нормальных клеток, при этом, воз-
можно, происходит активация онкогенных последовательностей, ко-
торые не активны в интактной высокополимерной ДНК [13].
Трансформация клеток NIH3T3
и первичных эмбриональных фибробластов крысы
клонированными онкогенными последовательностями
Кроме переноса клеточных онкогенов препаратами тотальной
ДНК, в настоящее время широко используется метод генетической
трансформации клонированными последовательностями онкогенов,
которые включены в состав различных плазмидных векторов. Исполь-
15 Заказ 1789
225
зование этого метода позволяет осуществить принципиально новые
подходы в изучении процесса канцерогенеза и его отдельных этапов.
В настоящее время созданы конструкции с регулируемыми промото-
рами [14], с тканеспецифическими усилителями транскрипции,
в частности с энхансерами иммуноглобулиновых генов [15], что поз-
воляет решать вопросы связи отдельных признаков трансформации
с количеством онкогенных продуктов и вопросы тканеспецифической
экспрессии онкогенов. Введение одного онкогена в минимально
трансформированные клетки грызунов (линий СЗНЮТ’/г, С-127,
Rat-2, FR3T3, REF52 и др.) может приводить к образованию «фоку-
сов» морфологической трансформации, однако это происходит не во
всех случаях. В тех случаях, когда не удается индуцировать образо-
вание «фокусов», онкоген вводят вместе с каким-либо доминантным
маркером устойчивости (см. ниже) и отбирают среди устойчивых
клонов те, в которых гибридизацией по методу Саузерна опреде-
ляется присутствие онкогенных последовательностей.
На основании результатов экспериментов по введению онкогенов
в составе плазмидных векторов в первичные эмбриональные фибро-
бласты крысы было впервые сформулировано представление о том,
что для полной морфологической трансформации нормальных кле-
ток требуется кооперация онкогенов по крайней мере двух типов.
Один из них должен принадлежать к онкогенам «ядерного» типа,
т. е. к онкогенам, продукт которых локализован в ядре и взаимодейст-
вует либо с ДНК ядра, либо с ядерным матриксом. К онкогенам
«ядерного» типа относятся с-тус, c-myb, c-m.il, имеющие аналоги
среди ретровирусных трансформирующих последовательностей, и бе-
лок р-53 клеточного происхождения, аналогов которого у ретрови-
русов нет. В группу онкогенов «неядерного» типа попадает большой
класс онкогенов, кодирующих тирозинзависимые протеинкиназы —
c-sarc, c-fes, c-fgr, c-yes, c-ros, c-abl; группа онкогенов, кодирую-
щая рецепторы для ростовых факторов (c-erb-B, c-fms), и сами
ростовые факторы (c-sis, B-lymI); онкогены семейства c-ras, коди-
рующие ГТФ-связывающие белки. Выделяют также группу онкоге-
нов, которые к настоящему времени слабо охарактеризованы —
c-sci, T-lymI, c-rel.
В специальную группу можно также выделить нуклеотидные
последовательности ранних и других районов аденовирусов, папова-
вирусов и герпесвирусов, которые клонированы в составе различных
плазмидных векторов и обладают трансформирующим действием.
Эти гены способны заменять по своему функциональному действию
онкогены как «ядерного», так и «неядерного» типа при тестировании
их трансформирующей способности по комплементации с клеточ-
ными онкогенами при котрансформации нормальных клеток.
При введении в первичные эмбриональные фибробласты крысы
онкогенов, принадлежащих к тому или другому классу, «фокусы»
морфологической трансформации получить не удается. Однако введе-
ние различных онкогенов методом котрансформации с доминантными
маркерами устойчивости позволяет определить, какие признаки
привносятся в нормальную клетку тем или иным онкогеном. Так,
226
введением онкогенов «ядерного типа» в первичные эмбриональные
фибробласты крысы, по-видимому, инициируются события, обеспе-
чивающие способность клеток к неограниченной пролиферации in
vitro. При введении «неядерных» онкогенов, в частности семейства
ras, у нормальных клеток сразу же появляется свойство, обеспечи-
вающее им способность клонироваться в агаре и слабо прививаться
«пцг/г»-мышам. Однако такие клетки не обладают способностью
длительно культивироваться in vitro и не могут давать опухоли,
которые убивают животное. Лишь совместное введение онкогенов
обоих типов приводит к образованию «фокусов» морфологической
трансформации и вызывает в нормальных клетках полное проявле-
ние признаков, характерных для опухолевых клеток, в том числе
способности неограниченно расти in vitro, клонироваться в агаре,
расти на среде с низким содержанием факторов роста, прививаться
сингенным животным и образовывать опухоли, которые убивают
животное.
Приготовление культуры клеток из эмбрионов крысы. Культура
эмбриональных фибробластов готовится из эмбрионов 12—14-суточ-
ной стадии беременности по модифицированному методу [16]. Для
получения клеточной суспензии эмбрионы декапитируют, удаляют
внутренности, тушки измельчают ножницами в чашке Петри на ку-
сочки размером 2—3 мм, переносят в колбу с раствором трипсина
и версена (1:1) и ставят на магнитную мешалку. Раствор должен
быть подогрет до 37 °C. Клетки, отделившиеся от кусочков тканей,
переходят в раствор, который сливают, и вновь наливают свежую
порцию трипсина с версеном. Процедуру повторяют 5—6 раз. Полу-
ченные таким образом клетки осаждают центрифугированием в сте-
рильных центрифужных флаконах при 2000 об/мин в течение
10 мин. Клетки разбавляют до оптимальной концентрации таким об-
разом, чтобы на 100 мм чашку получалось 1.2 • Ю6 клеток в объеме
8 мл среды Дальбекко с 10 % эмбриональной сыворотки коров. Куль-
тивирование в СОг-инкубаторе проводят до образования хорошего
монослоя. В течение этого периода среду на свежую лучше не
менять. Затем клетки рассевают для экспериментов по трансформа-
ции на 60 мм пластиковые чашки по 3 • Ю5 клеток. Так же как и
в случае МНЗТЗ-клеток, эксперимент должен проводиться через 16—
18 ч после посева клеток.
Приготовление кальцийфосфатного преципитата плазмидной
ДНК. Растворы, используемые для формирования кальцийфосфат-
ного преципитата с плазмидной ДНК, те же, что описаны выше.
Можно отметить, что для полного растворения плазмидной ДНК
в буфере Б требуется значительно меньше времени, чем для раство-
рения тотальной. Трансформацию можно проводить как одной плаз-
мидной ДНК, так и с носителем. В качестве носителя часто приме-
няется коммерческий препарат ДНК из спермы лосося, ДНК из
клеток той же линии, на которой проводится трансформация, или
ДНК из печени животных того же вида. Важно, чтобы использова-
лись препараты полимерной ДНК с размером фрагментов не менее
нескольких десятков тысяч пар оснований.
1.5'
227
Трансформация эмбриональных фибробластов крысы одним онко-
геном. Поскольку уже показано, что одним онкогеном получить
морфологическую трансформацию практически не удается и отбор
трансформантов по «фокусам» невозможен, применяется метод одно-
временного введения онкогенной последовательности с каким-либо
доминантным селективным маркером. Такой способ введения ДНК
получил название котрансформации [16, 17]. Было показано, что
при 10-кратном и более избытке неселектируемого гена наблюдается
котрансформация двух независимых генов в составе разных плазмид-
ных векторов, т. е. в одну клетку попадают оба гена. В экспери-
ментах такого рода наиболее часто используется плазмида с геном,
обеспечивающим устойчивость к микофеноловой кислоте (Ecogpt).
Это бактериальный ген, кодирующий фермент ксантин-гуанинфосфо-
рибозилтрансферазу [18, 19]. Для полного подавления синтеза пури-
новых нуклеотидов de novo используют микофеноловую кислоту и
аминоптерин. Микофеноловая кислота ингибирует синтез пуриновых
нуклеотидов, действуя на инозинмонофосфатдегидрогеназу и таким
образом блокируя образование ксантинмонофосфата и гуанинмоно-
фосфата. После введения в клетки эукариот гена Ecogpt клетки спо-
собны жить и пролиферировать на ксантине как единственном
источнике образования гуаниновых нуклеотидов и на селективной
среде, содержащей ингибиторы синтеза пуриновых нуклеотидов
de novo. Кроме микофеноловой кислоты в селективную среду добав-
ляется аминоптерин, блокирующий синтез инозинмонофосфата из
аминокислот, поэтому для синтеза аденинов в селективную среду
в качеств^ предшественника добавляется гипоксантин или можно
сразу вводить экзогенный аденин.
Для проведения котрансформации 3 • 105 первичных эмбриональ-
ных фибробластов крысы, на 60 мм чашку можно использовать
от 0.1 до 2 мкг ДНК плазмиды, несущей ген устойчивости к микофено-
ловой кислоте с добавлением 10-кратного избытка ДНК плазмиды,
несущей онкогенные последовательности, так чтобы в сумме общее
количество ДНК на чашку не превышало 20 мкг.
Селекция котрансформантов с онкогенными последовательно-
стями и геном устойчивости к микофеноловой кислоте. После обра-
ботки клеток плазмидной ДНК в составе кальцийфосфатного преци-
питата клетки культивируют в течение 3 сут на среде Дальбекко
с 5 % эмбриональной сыворотки коров. После инкубации клетки
снимают смесью трипсина с версеном (1 : 1) и рассевают по 105 кле-
ток на 60 мм чашки на селективную среду, содержащую 25 мкг/мл
микофеноловой кислоты, 2 мкг/мл аминоптерина, 250 мкг/мл ксан-
тина, 15 мкг/мл гипоксантина и 10 мкг/мл тимидина (подробно о при-
готовлении среды ГАТ и микофеноловой кислоты см. ст. О. Л. Глебова,
наст, сб.). Селективная среда также готовится на среде Дальбекко
с 10 % эмбриональной сыворотки коров. Кормление клеток свежей
средой с селективными агентами проводится каждые 4 сут. Устой-
чивые клоны можно видеть через 7—10 сут, а выделение их с по-
мощью титановых цилиндров проводится через 14 сут на селектив-
ную среду. Клоны размножают, выделяют ДНК и гибридизацией
228
г
по методу Саузерна идентифицируют те из них, в которых находятся
онкогенные последовательности, попавшие вместе с геном устойчи-
вости к микофеноловой кислоте. Частота трансформации в этих экспе-
риментах составляет (1.5—2)- 104. После проверки стабильности
Ecogpt через 30 и 75 пассажей ведения на чистой среде показано,
что они могут терять признак устойчивости.
Селекция котрансформантов, устойчивых к антибиотику генети-
цину G-418. Котрансформации клеток онкогенными последователь-
ностями и геном устойчивости к генетицину проводится таким же
образом, как и с геном устойчивости к микофеноловой кислоте.
Ген, обеспечивающий эукариотическим клеткам устойчивость к анти-
биотику генетицину, выделен из бактериального транспозона Тп-5 и
кодирует фермент аминогликозид — З-О-фосфотрансферазу типа 2
(АГФТ) [19]. Антибиотик весьма токсичен для клеток, однако он
используется в концентрации 200—500 мкг/мл, при которой в конт-
роле стабильные устойчивые варианты не образуются. Селективная
среда готовится на среде Дальбекко с 10 % эмбриональной сыворотки
коров. Время селекции на этом антибиотике зависит от плотности
клеточных культур. При плотном посеве время гибели чувствитель-
ных клеток в контроле может быть более 3 нед, тогда как при опти-
мальной плотности посева порядка 5 • 103 клеток/см2 в опыте устой-
чивые клоны можно видеть уже через неделю, а выделять через 14 сут.
Для анализа трансформантов на присутствие в них онкогенных
последовательностей также лучше проводить выделение клонов на се-
лективную среду, но при этом концентрацию антибиотика можно
понизить до 100 мкг/мл.
Селекция трансформантов в агаре. К числу признаков, которые
могут быть селективными при введении в клетки онкогенных последо-
вательностей, относится признак независимого от субстрата размно-
жения. В связи с этим после переноса онкогенов, через 36 ч, первич-
ные эмбриональные фибробласты снимают смесью версена с трипси-
ном и клонируют в полужидком агаре.
Приготовление полужидких агаровых сред для выявления транс-
формантов по признаку не зависимого от субстрата размножения. Го-
товится 1.2 %-ный агар фирмы «Difco», лучше типа Noble на деиони-
зированной воде. Навеску агара оставляют на ночь в воде для набу-
хания. Автоклавирование производится в течение 1 ч при 1 атм.
В горячем виде агар разливается по 25 мл в стерильные 50 мл фла-
коны, в которых готовится 0.6 %-ный агар для нижнего (питатель-
ный слой) и верхнего 0.3 %-ного агарового слоя, в котором собст-
венно культивируют клетки. Нижний слой готовится из 1.2 %-ного
агара (разогретого в кипящей водяной бане и затем охлажденного
в ультратермостате до 44 °C) добавлением 20 см3 2-кратной среды
Дальбекко и 5 См3 фетальной сыворотки. Нижний слой формируется
из 0.6 %-ного агара по 5 мл на 60 мм чашку Петри, после чего чашки
ставятся в ССЬ-инкубатор до затвердевания агара. После того как
нижний слой приготовлен, клетки снимают смесью трипсина с версе-
ном и подсчитывают в камере Горяева. Для получения верхнего
слоя из 0.3 %-ного агара необходимый объем культуральной среды
229
с 10 % фетальной сыворотки и клетками смешивается в соотношении
1:1с 0.6 %-ным агаром, так чтобы общее число клеток на чашку
составляло 104—105, а объем верхнего слоя был равен 1.5 мл. Види-
мые глазом колонии появляются через 14—18 сут после посева. В те-
чение этого срока культивирования можно добавлять по 0.5—1 мл
ростовой среды с 10 % сыворотки. Колонии из агара выделяют
с помощью пастеровских пипеток и помещают в ростовую среду либо
на 24-ячеечную плату, либо на 30 мм чашки Петри. После размноже-
ния клеток доказывается наличие в них онкогенных последовательно-
стей, которыми была проведена трансформация, затем клоны исполь-
зуются для экспериментальной работы.
Трансформация эмбриональных фибробластов крысы двумя онко-
генами. При введении двух онкогенов в первичные эмбриональные
фибробласты крысы возможен отбор трансформантов по «фокусам»
морфологической трансформации без введения доминантных марке-
ров устойчивости. Процедура получения морфологических трансфор-
мантов при обработке клеток кальцийфосфатным преципитатом ДНК
такая же, как описано выше. Смесь двух плазмид, которыми
трансформируют первичные эмбриональные фибробласты, раство-
ряют в буфере Б и формируют преципитат, которым обрабатывают
клетки. Суммарное количество ДНК на 60 мм чашку, в которой
находится 3 • 105 клеток, не должно превышать 20 мкг. Через сутки
клетки рассевают и, меняя каждые 3 сут среду, ожидают появление
«фокусов» морфологической трансформации, которые формируются
через 18—21 сут после обработки клеток преципитатом плазмидной
ДНК- Затем «фокусы» выделяют с помощью титановых цилиндров
и после размножения клеток определяют гибридизацией по Саузерну
присутствие двух онкогенных последовательностей, вводимых в со-
ставе различных плазмидных векторов. Выделенные трансформант-
ные клоны можно использовать для изучения различных аспектов
канцерогенеза (in vitro и in vivo).
Литература
i. McCann J., Ames B. N. Detection of carcinogens as mutagenes in Salmonella / mi-
crosome tests: Assays of 300 chemicals // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1976. Vol. 73.
P. 950—954.
2. Bischop M. Cellular transforming genes // Annu. Rev. Biochem. 1983. Vol. 52.
P. 301—354.
3. Graham F. L., van der Eb A. J. A new technique for the assay of inefectivity of
human arienovirus 5 DNA // Virology. 1973. Vol. 52. P. 456—471.
4. Jainchill J. L., Aaronson S. A., Todaro G. J. Murine sarcoma leukemia viruses: assay
using clonal lines of contact inhibited mouse cells //J. Virol. 1969. Vol. 4. P. 549—
553.
5. Land FL, Parada L. F., Weinberg R. A. Cellular oncogenes and multistep carcinoge-
nesis // Nature. 1983. Vol. 222. P. 771—778.
6. Г левое О. К., Абрамян Д. С., Томилин Н. В. Генетическая трансформация сомати-
ческих клеток. 1. Клон клеток китайского хомячка, дефектных по тимидиикииазе,
отличающийся высокой эффективностью трансформации // Цитология. 1985. Т. 27.
№ 4. С. 467—475.
7. Gorman С. High efficiency gene transfer into mammalian cells. DNA cloning ,//
1RL Press Limited. 1985. Vol. 2. P. 143—165.
8. Takahashi M., Ritz J., Cooper G. M. Activation of a novel human transforming gene,
ret, by DNA rearrangement // Cell. 1985. Vol. 42, P. 581—588.
230
9. Diamond A., Cooper G. M., Ritz J., Lane A. Identification and molecular cloning
of the human B-lym transforming gene activated in Burkitt’s lymphomas // Nature.
1983. Vol. 305. P. 112—116.
10. Lane M. A., Sainten A., Doherty K. M„ Cooper G. M. Isolation and'characterization
of a stage specific transforming gene T-lym 1 from T-cells lymphomas // Proc. Nat.
Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 2227—2231.
11. Schechter A. L., Stern D. F., Vaidyanatan L. et al. The new oncogene: an erb-
B-related gene encoding a 185 000-Mr tumor antigen // Nature. 1984. Vol. 312.
P. 513—516.
12. Cooper C. S., Park M., Blair D. G. et al., Molecular cloning of a new transforming
gene from a chemically transformed human cell line // Nature. 1984. Vol. 311. P. 29—
33.
13. Cooper G. M. Cellular transforming genes // Science. 1982. Vol. 217. P. 801—806.
14. Armelin H. A., Armelin M. C. S., Kelley K. et al. Functional role for c-myc in mytoge-
nic response to platelet-derived growth factor // Nature. 1984. Vol. 310. P. 655—660.
15. Adams I. M., Harris A. W., Pinkert C. A. et al. The c-myc oncogen driver by immuno-
globuline enchancers induces lymphoid malignancy in transgenic mice//Nature.
1985. Vol. 318. P. 533—538.
16. Голубев Д. Б., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению
клеточных культур в вирусологии. М., 1976. 221 с.
17. Perucho М., Hanachau D., Wigler М. Genetic and physical linkage of exogenous
sequences in transformed cells // Cell. 1980. Vol. 22. P. 309—317.
18. Mulligan R. C., Berg P. Selection for animal cell that express the Escherichia
coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase // Proc. Nat. Acad.
Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 2072—2076.
19. Southern P. J., Berg P. Transformation of mammalian cells to antibiotic resistance
with a bacterial gene under control of the SV-40 early region promotor // J. Moi.
Appl. Genet. 1982. Vol. 1. P. 327—341.
231
Ч а с т ь 4
Культивирование клеток »
разного происхождения (
Культивирование каллусных тканей
на твердых питательных средах
В. В. Урманцева
Институт физиологии растений им. К. А. Тимирязева АН СССР, Москва
Культура изолированных органов, тканей и клеток растений в на-
стоящее время находит все большее применение в биологических
исследованиях. Такие методы, как клональное микроразмножение ра-
стений, оздоровление от вирусной инфекции с помощью культуры
апикальных меристем, регенерация растений из каллусных культур,
находят сейчас практическое применение. Существенную помощь ме-
тоды культивирования in vitro могут оказать генетикам и селекционе-
рам в получении новых форм растений. Используя гаплоиды, незре-
лые или нежизнеспособные зародыши гибридов, сомаклональные
варианты растений-регенерантов, биотехнологи вместе с селекционе-
рами ускоряют и облегчают селекционный процесс. Более сложная
техника манипулирования с клетками растений необходима для полу-
чения соматических гибридов слиянием протопластов или для генети-
ческой трансформации клеток и растений.
Для большинства названных исследований необходимым звеном
является получение и культивирование каллусных тканей на твердых
питательных средах. В отечественной литературе этой теме посвящен
ряд книг и методических пособий [1—3]. Наша задача более узкая —
рассмотреть применяемые в настоящее время приемы, методы и тех-
нологии, в том числе и относящиеся к рациональной организации
лаборатории.
Самым важным обстоятельством при получении и выращивании
клеточных культур является необходимость асептики. В соответствии
с этим мы выделяем особо все методы асептического получения
исходных эксплантатов и дальнейших манипуляций с ними в усло-
виях, обеспечивающих стерильность.
Технологическая линия
Наиболее рациональным является отделение лабораторных поме-
щений для работы со стерильными культурами от тех, в которых
проводится обычная аналитическая работа с тканями. При наличии
большого объема работ необходимо предусмотреть хорошую увязку
всех помещений, входящих в технологическую цепочку: мытье и
сушка посуды-*приготовление среды-*-автоклавирование и стерили-
232
зация материалов сухим жаром->-пересадка растительного мате-
риала->выращивание культур. Рекомендуется иметь тележки для
транспортировки материалов из одного помещения в другое.
/Мытье и сушку посуды проводят в моечной комнате, оборудован-
ной глубокими кислотоупорными раковинами для мытья посуды,
моечными машинами, дистилляторами, сушильными шкафами. Над
раковинами необходимо поставить вытяжки. Грязную посуду осво-
бождают от остатков агаровой среды, тщательно отмывают водой
с помощью ершика, затем моют с применением детергента или
хромовой смеси, ополаскивают 10—15 раз водопроводной и 1—2 раза
дистиллированной водой. Сушить посуду следует 1—2 ч в сушильных
шкафах при 120—140 °C. При наличии в средах инфекции микроорга-
низмы убивают автоклавированием.
Рекомендуется иметь отдельную комнату для приготовления пита-
тельных сред, оборудованную шкафами для чистой посуды и реакти-
вов, столами с большой рабочей поверхностью, холодильниками для
хранения концентратов сред, морозильниками для хранения при
—20 °C и ниже, техническими и аналитическими весами, рН-метрами,
электроплитками, водяными банями.
Стерилизацию питательных сред и материалов проводят в спе-
циальной комнате, оснащенной автоклавами и сухожарными стерили-
заторами или сушильными шкафами с контактными термометрами.
Питательные среды автоклавируются при давлении 0.7—0.8 атм
(117 °C) в течение 15—30 мин в зависимости от объема среды. Пу-
стые колбы, закрытые пробками или фольгой, дистиллированная вода
в колбах, вата, марля, пачки бумаги стерилизуются 1 ч при давлении
2 атм (121 °C). Металлические инструменты, колбы, стаканы, чашки
Петри, завернутые в плотную бумагу, стерилизуются сухим жаром
при 140 °C — 2 ч, при 180 °C — 30 мин.
Все работы, связанные с асептическим переносом растительного
материала, проводятся в стерильных боксах. В боксах устанавлива-
ются бактерицидные лампы БУФ-15 или БУФ-30, которые включа-
ются на 30 мин за 1 ч до работы. Кроме того, рекомендуется ночью
проводить автоматическое облучение боксов в течение 2 ч. В послед-
ние годы получили широкое распространение ламинарные боксы —
установки обеспыливания с горизонтальным или вертикальным пото-
ками воздуха (УО-БГ, УО-БВ, Ужгород). При наличии нескольких
установок их рекомендуется поместить в отдельной комнате, где необ-
ходимо поддерживать чистоту, еженедельно проводить влажную
уборку дезинфицирующими растворами и облучать помещение ночью
ультрафиолетовыми лампами.
Выращивание каллусных культур проводится в темноте при тем-
пературе 26 °С± 1 °C и влажности воздуха 70 %. Для выращивания
используют кондиционированные комнаты, оборудованные стелла-
жами, шкафы или климатические камеры (КВ-1Р или КВ-1Л, Ужго-_
род).
Представленный вариант оснащения лаборатории рекомендуется
при большом объеме работ. При более узких задачах можно совме-
щать работы и сокращать число специализированных помещений.
233
Таблица I
Состав наиболее употребимых питательных сред для выращивания каллусных тканей
растений
Компоненты среды Основная среда, мг/л
Гамборга и Эвелега В5 [4] Мураснге и Скуга [5] Нича и Нич [6] Шенка и Хильде- брандта (Л Уайта [8]
Макросоли
nh4no3 1650 720
(NH4)2SO4 134 — — —
nh4h2po4 — —. — 300 —
KNO3 2500 1900 950 2500 80
KH2PO4 170 68
KC1 — — — — 65. |
Ca(NO3)2 безвод- ный — — — — 208.50
СаС12 • 2H2O 150 440 166 200 !
MgSO4 • 7H2O 250 370 185 400 360 ;
Na2SO4 — — — 200
NaH2PO4 . 2H2O 169.6 — — — 18.7 !
M и к p о э л е ленты
MnSO4•4H2O 13.2 22.3 25.0 13.2 7.0 ‘
H3BO3 3.0 6.2 10.0 5.0 1.5 >
ZnSO4•7H2O 2.0 8.6 10.0 1.0 3.0 ,
KI 0.75 0.83 — 1.0 0.75
CuSO4 • 5H2O 0.025 0.025 0.025 0.2 0.001 J
Na2MoO4 • 2H2O 0.25 0.25 0.25 0.1 0.0025 '
CoC12 • 6H2O 0.025 0.025 — 0.1 — 1
Железо
FeSO4 • 7Н2О 28.0 27.8 27.8 15.0
На2-ЭДТА •'2Н2О 37.3 37.3 37.3 20.0
Fe2(SO4)3 j— — — — 2.5
Органические добавки
Мезоииозит 100.0 100.0 100.0 1000.0
Фолиевая кислота — — 0.5
Никотиновая 1.0 0.50 5.0 5.0 0.5
кислота Тиамин НС1 10.0 0.10 0.5 5.0 0.1
Пиридоксин НС1 1.0 0.5 0.5 0.5 0.1
Глицин — 2.0 2.0 3.0
Бнотин — — 0.05 — — (
2.4Д 2.0 Фитогорл 1 О н ы 0.5 м
И УК — 2.0 0.1 0.1
Кинетин 1 0.2 — — — i
234
Таблица 1 (продолжение)
Компоненты среды Основная среда, мг/л
Г амборга и Эвелега В5 [4] Мурасиге и Скуга [5] Ннча н Ннч [6] Шенка и Хильде- брандта [7] Уайта [8]
Сахароза 20 000 У г л е в о 30 000 Д Ь1 20 000 30 000 20 000
Агар-агар | 7000 С у б с т р | 8000 а т 7000 | 6000 | 7000
Приготовление питательной среды
Составление питательной среды [4—8] начинают с приготовления
концентрированных растворов (табл. 1). Макросоли взвешивают на
технических весах, растворяют по отдельности в небольшом коли-
честве бидистиллята и доводят в цилиндре до объема, в 10 раз мень-
шего, чем требуется по прописи среды (хранят при 4 °C до 1 мес),
т. е. на 1 л общего объема питательной среды берут 100 мл раствора
макросолей. Навески микроэлементов растворяют так, чтобы конеч-
ная концентрация соответствовала 1 мл раствора на 1 л среды.
Навески микросолей для хелатного железа взвешивают, растворяют
по отдельности, смешивают и доводят до объема с конечной концент-
рацией 5 мл/л (хранят при 4 °C несколько месяцев). Раствор должен
получиться ярко-желтого цвета, pH 8.0. Неправильное приготовле-
ние хелатного железа может привести к выпадению в осадок после
автоклавирования фосфатов кальция или магния.
Концентрированные растворы витаминов готовят также с расче-
том добавления 1 мл на 1 л среды, они должны быть разлиты по
10 мл и заморожены при —20 °C. Фитогормоны приготавливают
в небольших количествах (10—20 мл) и хранят при 4 °C.
Ауксины (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота — 2,4-Д, индолил-
уксусная кислота — ИУК, 1-нафтилуксусная кислота, индолилмасля-
ная кислота и др.) и цитокинины (6-бензиламинопурин, кинетин,
зеатин, 2-изопентенил-аденин) обычно используются в концентрации
10~7—10-5 М. Эти фитогормоны растворяют в нескольких каплях
водного этанола или 1 н. NaOH и далее доводят до нужного объема
бидистиллятом. Гиббереллин (GA3) легко растворим в воде.
Агар-агар пластинчатый моют несколько часов в проточной
водопроводной воде, ополаскивают 2—3 раза дистиллированной во-
дой, отжимают в марле и высушивают под вентилятором.
Для приготовления 1 л твердой питательной среды взвешивают
7 г агара и растворяют его при подогревании в 500 мл бидистиллята.
Если агар-агар загрязнен механическими примесями, его фильтруют
через двойной слой марли.
С помощью цилиндра и пипеток отбирают концентрированные
растворы макросолей, микроэлементов, хелатного железа, витаминов,
235
фитогормонов и помещают их в химический стакан на 1 л. Добавляют
к смеси навески мезоинозита, сахарозы и других сухих органических
компонентов (желательно растворить их по отдельности в бидистил-
ляте). Бидистиллированной водой объем доводят до 500 мл. Осадок
можно растворить, перемешивая раствор на магнитной мешалке или
слегка подогревая его на плитке. Далее следует довести pH до
оптимума, зависящего от особенностей культуры (5.4—6.2), добав-
ляя по каплям 1 н. NaOH или НС1 (обычно после автоклавирования
pH среды несколько понижается). Добавляют расплавленный агар,
доводят в цилиндре объем до 1 л, хорошо перемешивают и быстро
разливают в чистые пробирки или колбы (можно использовать авто-
матические дозаторы, осуществляющие подогрев и перемешивание
среды). Колбы закрывают ватными пробками, кладут этикетку, на-
крывают целлофаном и затягивают пробку резинкой. Можно закрыть
колбы вместо пробок плотной фольгой. Колбы со средой стерилизуют
15 мин в автоклаве при 0.7—0.8 атм с предварительным прогревом
под давлением 0.7 атм при открытом кране в течение 15 мин. Время
стерилизации определяется объемом среды в колбе: 20—150 мл —
не менее 15 мин, 200—500 мл — 25 мин.
Автоклавированную среду, содержащую ауксины, лучше исполь-
зовать сразу; если среду необходимо хранить продолжительное
время, ее помещают в холодильник при 2—4 °C.
Большинство каллусных культур хорошо растет на полностью
синтетических средах. Однако некоторые культуры растут лучше
в присутствии гидролизата казеина, дрожжевого экстракта, кокосо-
вого молока или экстрактов растений. Кокосовое молоко или экст-
ракты пло'дов, отфильтрованные через бумажный фильтр, разливают
в ампулы и автоклавируют, затем ампулы запаивают и хранят при
—20 °C. Добавляют к среде 10—15 % от объема.
Некоторые фитогормоны, например гибберелловая кислота и зеа-
тин, а также активные вещества иного рода (аминокислоты) термо-
лабильны и их нельзя автоклавировать. В таких случаях готовят
среду без этих веществ, автоклавируют ее, охлаждают до 50 °C, до-
бавляют в стерильных условиях термолабильный компонент, просте-
рилизованный через бактерицидный фильтр (размер пор 0.45 мкм)
и быстро разливают по пробиркам или колбам.
При выращивании без агара каллусные культуры можно высажи-
вать на мостики из фильтровальной бумаги, которые при пересадке
погружаются в жидкую питательную среду после автоклавирования
либо в колбы на диски из пенополиуретана (поролона). Предвари-
тельно диски отмывают мылом, хорошо промывают водой, автоклави-
руют в дистиллированной воде, отжимают и затем, погрузив в пита-
тельную среду, вновь автоклавируют. Диски можно использовать
многократно. Можно использовать также пластмассовые шарики,
стеклянные бусы, ПААГ.
Стерилизация исходного материала
Каллусные культуры могут быть получены из разных органов и
тканей растений (листьев, стеблей, корней, цветоносов, частей
236
Цветка) и даже таких специализированных тканей растений, как
эндосперм семян или микроспоры, изолированные из пыльников. Спо-
собность к инициации каллуса в условиях in vitro у молодых, юве-
нильных, растений выше, чем у зрелых. В случае специализированных
тканей, например эндосперма, образование и рост каллуса зависят
от возраста семени. Как правило, каллус с трудом образуется на
эксплантатах старше 8—11 сут после опыления. Отрезки стеблей дре-
весных растений обычно являются плохими эксплантатами. Иногда
используют такой прием: срезают боковую ветвь, давая возможность
образоваться раневому каллусу прямо на растении, затем каллус
изолируют, стерилизуют и помещают на стерильную питательную
среду.
Следует заметить, что для успешной инициации первичного кал-
луса в питательную среду часто необходимо вводить антиоксиданты
(глютатион — 5 мг/л, диэтилдитиокарбамат — 5, цистеин — 5,
аскорбиновую кислоту — 10, поливинилпирролидон — 250—500 мг/л
и др.), которые будут ингибировать ферменты, окисляющие фенолы.
Продукты окисления фенолов токсичны и подавляют деление клеток
эксплантата.
Наиболее трудной задачей является получение стерильного
растительного материала. Вид стерилизующего агента, его концен-
трацию и время действия, зависящие от особенностей тканей исход-
ных растений, необходимо подобрать таким образом, чтобы убить
микроорганизмы и не повредить ткани эксплантата. Для поверхност-
ной стерилизации растительных объектов применяют химические
соединения, содержащие активный хлор (гипохлорит натрия — Г—-
1.4 %, гипохлорит кальция — 7—10 %, хлорамин — 2—10%) или
ртуть (сулема 0.1 %, диацид), перекись водорода (2—10 %), этило-
вый спирт (96 или 70 %) и др. Эффективность стерилизации повы-
шается при добавлении на 1 л стерилизующего агента 5—6 капель
Твин-80 или Твин-20.
Начиная работу с новым растительным объектом, необходимо
предварительно найти удовлетворительные условия для его стерили-
зации.
Рекомендуется испробовать несколько вариантов, значительно
различающихся между собой по времени стерилизации, а затем, су-
жая эти интервалы, найти условия, оптимальные для данного объекта
(табл. 2).
В тех случаях, когда инфицирование культуры связано с нали-
чием спор грибов или бактерий во внутренних полостях ткани,
эксплантаты высаживают на среду, содержащую антибиотик широ-
кого спектра действия (тетрациклин, доксициллин и др.) в концентра-
ции 0.1—0.01 мг/л.
Техника стерилизации растительного материала. Перед стерили-
зацией объекты должны быть тщательно вымыты теплой водой с мы-
лом и промыты дистиллированной водой. Сильно загрязненные
корнеплоды после мытья рекомендуется выдерживать в слабом
(розовом) растворе KMnCh. Сегменты корней, стеблей, побегов, клуб-
ней опускают на несколько секунд в спирт, затем в стерилизующий
237
g.:
• f :
Таблица 2
Время стерилизации различных растительных объектов
Орган растения Время стерилизации, мин
гипохлорит натрия нли кальция сулема
Семена 20 10—20
Стебли древесных растений 15—30 20—30
Стебли травянистых растений 10—15 8—10
Мясистые корни, клубни 20—25 15—20
Корневища 20—30 20
Листовые пластинки 3—5 5
Верхушечные и пазушные почки 10—15 3—15
Ткани репродуктивных органов 3—5 1—5
раствор. Через 20—25 мин сегменты переносят в стакан со стериль-
ной дистиллированной водой, выдерживают 10 мин, затем меняют
воду еще 2 раза, выдерживая в каждой порции по 15—20 мин.
В стерильных чашках Петри или на листах стерильной бумаги обре-
зают стерильным скальпелем концы сегментов исходного материала,
где клетки могут быть повреждены, и из средних зон нарезают
кусочки тканей, которые высаживают на инициальную среду для об-
разования каллусов. Из стеблевой паренхимы табака или корнепло-
дов после обрезания кончиков сегментов стерильным пробкобуром
выделяют цилиндрики ткани, которые затем нарезают скальпелем на
диски и помещают на агаризованную среду.
При стерилизации мелких объектов (семян, почек и др.) их поме-
щают в марлевые мешочки, затянутые длинной ниткой, и в них прово-
дят последовательно через операции стерилизации и промывки сте-
рильной водой. При стерилизации отрезков стебля или верхушечных
почек в растворах сулемы или гипохлорита рекомендуется парафини-
ровать срезы, чтобы стерилизатор не проник в сосуды, что может
привести к интоксикации ткани.
Семена до набухания стерилизуют для снятия эпифитной и
субэпидермальной микрофлоры одним из стерилизующих агентов,
трижды промывают стерильной водой и оставляют для набухания
в стерильной чашке Петри. Затем семена стерилизуют второй раз,
отмывают 3 раза стерильной водой и с помощью стерильных инстру-
ментов вычленяют зародыш или его структуры, которые помещают на
питательные среды для роста зародыша или индукции каллусов,
кроме того, стерильные семена можно использовать для получения
каллуса из семян, помещенных на агаризованную среду, содержа-
щую фитогормоны, а также для получения проростков из семян на
агаризованной среде без фитогормонов, с последующим использова-
нием стерильных корней, побегов, листьев в качестве эксплантатов
для получения каллусных культур. При помещении кусочков или
дисков стебля на питательную среду требуется соблюдать условия
физиологической полярности, т. е. помещать их апикальным концом
в среду. У фрагментов пластинок листа надсекают в нескольких
местах жилки и помещают их нижней стороной пластинки на среду.
238
Эксплантаты приводят в плотный контакт со средой, но не погру-
жают.
Все операции по стерилизации исходного растительного мате-
риала проводятся в стерильном боксе или ламинар-боксе. ,
Культивирование каллусных тканей -г
Каллусной тканью или штаммом культуры изолированных клеток
высшего растения называется ткань, возникшая путем неорганизо-
ванной пролиферации из эксплантатов органов растений после пер-
вого субкультивирования [9]. Как правило, исходный эксплантат
гетерогенен по морфологическому, физиологическому и цитогенетиче-
скому состоянию, и неизвестно, какие именно клетки, дедифференцн-
руясь, дают начало культуре, т. е. возникновение штамма с индиви-
дуальными признаками носит вероятностный характер. В дальней-
шем, после возникновения штамма, происходит его становление,
приводящее к формированию популяции клеток, приспособленных
к росту в условиях in vitro. Продолжительность этого периода у раз-
ных культур неодинакова и приблизительно составляет 100—200 сут,
в течение которых происходит 8—10 циклов роста. Затем, наступает
период относительной стабилизации штамма на определенном физи-
олого-биохимическом и цитологическом уровнях. Однако и в этот
период сформированного штамма у большинства изученных-объектов
наблюдается изменчивость культивируемых клеток, характеризую-
щаяся в цитогенетическом отношении увеличением числа хромосом
и хромосомных аберраций. Этим объясняют и уменьшение с возра-
стом культуры ее морфогенетической способности.
Изменчивость растительного генома in vitro зависит от тканевого
происхождения исходного эксплантата, состава питательной среды и
других условий выращивания, однако определяющим моментом
является генетическая конституция вида [10]. Сохранение видовых
свойств проявляется прежде всего в биосинтезах специфических
вторичных соединений. Значительно менее ясно, в какой мере сохра-
няются в культуре особенности основного обмена исходного растения,
поскольку клетки in vitro обладают большой метаболической подвиж-
ностью и способны использовать альтернативные пути метаболизма,
т. е. может реализоваться самая разная степень соответствия изу-
чаемых признаков особенностям исходного растения. Довольно часто
обнаруживается сохранение определенных физиолого-биохимических
характеристик исходных тканей в качественном отношении при изме-
нении их количественного выражения. Сохранение исследуемого при-
знака на уровне исходного и в количественном отношении наблю-
дается редко, по-видимому, из-за отсутствия коррелятивных связей
целого растения, что значительно меняет обмен в клетках. Кроме
того, в ряде случаев отмечалась радикальная перестройка метабо-
лизма, определяемая по активности ферментов превращения энергии
и азотного обмена, ряда гидролитических ферментов, а также по син-
тезу и накоплению запасных продуктов. Формирование индивидуаль-
ного штамма является зачастую невоспроизводимым процессом,
239
зависящим от многих факторов, связанных с особенностями исход-
ного материала и условиями культивирования клеток.
Техника культивирования каллусных тканей. Большинство экс-
плантатов образуют первичный каллус, который можно субкультиви-
ровать, через 6—8 нед. В асептических условиях каллус следует
перенести пинцетом в стерильные чашки Петри, скальпелем отделить
каллусную ткань от исходного эксплантата или некротических
участков в центре и на нижней стороне каллуса и, разделив каллус
на несколько кусочков (5X5 мм), перенести на свежую питательную
среду. (Рекомендуется положить кусочек срезанной поверхностью
на агар и осторожно прижать его к среде. Использованные пин-
цеты и скальпели опускаются в 96 %-ный спирт и в процессе работы
обжигаются в пламени спиртовки и остужаются между листами
стерильной бумаги.
Обычно каллусную ткань субкультивируют через каждые 4 нед.
Визуальные наблюдения за состоянием культур необходимо прово-
дить не реже 1 раза в неделю. В случае интенсивного роста каллусы
надо пересадить раньше (через 3 нед), не допуская обезвоживания
и потемнения ткани.
Если при пересадках выявляется инфекция, необходимо тща-
тельно проанализировать все этапы работы. По наличию отдельных
очагов грибковой инфекции на поверхности среды можно судить
о неблагополучии со стерилизацией помещения или ламинар-бокса,
поскольку такая инфекция заносится воздушным путем. Если выявля-
ется бактериальная инфекция вокруг эксплантата или каллуса в пи-
тательной среде, то инфекция могла быть занесена с клетками и
такой растительный материал должен быть отбракован. Такого же
рода инфекция может быть занесена плохо простерилизованными
инструментами или чашками Петри. Наличие бактериальной инфек-
ции внутри среды может говорить о плохой стерилизации питатель-
ной среды при автоклавировании.
Литература
1. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза расте-
ний. М., 1964. 272 с.
2. Катаева Н. В., Бутенко Р. Г. Клональное микроразмножение растений. М., 1983.
96 с.
3. Шамина 3. Б. Методические указания по клеточной селекции (ВАСХНИЛ). М.,
1984. 36 с.
4. Gamborg О. L., Eveleigh D. Е. Culture methods and detection of glucanases in
cultures of wheat and baHey // Canad. J. Biochem. 1968. Vol. 46, N 5. 417—421.
5. Murashlge T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. Vol. 15, N 13. P. 473—497.
6. Nitch J. P., Nitch C. Haploid plants from pollen grains // Science. 1969. Vol. 163,
N 3862. P. 85—87.
7. Schenk R. U., Hildebrandt A. Medium and techniques for induction and growth of
monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Canad. J. Bot. 1972.
Vol. 50. P. 199—204.
8. White Ph. R. The cultivation of animal and plant cells. New York, 1954. 239 p.
9. Чайлахян M. X., Бутенко P. Г., Кулаева О. H. и др. Терминология роста и развития
высших растений. М., 1982. 54 с.
240
10. Фролова Л. В. Цитогенетическая изменчивость и автоселекция растительных кле-
ток в условиях in vitro // Биотехнология. М., 1984. С. 272—277.
Культивирование клеток
и тканей беспозвоночных
В. Т. Какпаков
Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова
АН СССР, Москва
В настоящее время известно около 120 пересеваемых линий клеток
беспозвоночных; наибольшее число клеточных линий получены из
насекомых [1]. Проблемы культивирования клеток и тканей беспо-
звоночных обсуждались на нескольких международных конферен-
циях и на III Международном конгрессе по культуре клеток в г. Сен-
дай (Япония) [2—5]. Однако культивирование клеток насекомых
таит целый ряд нерешенных проблем. Интерес к культурам клеток и
тканей насекомых связан с чрезвычайным разнообразием и ориги-
нальностью роста и метаморфоза, которые могут быть прекрасным
объектом для изучения основных процессов клеточной дифференци-
ровки и регуляции активности генов в клетках высших организмов.
Получение первичной и в особенности пересеваемой культуры клеток
насекомых представляется сейчас чрезвычайно нелегким делом
[6-13].
Среды для культивирования
Среды для культивирования клеток и тканей насекомых, предла-
гаемые разными авторами даже для одного вида, сильно варьируют
по составу [14—18]. При составлении питательных сред часто руко-
водствуются данными по составу гемолимфы. Однако ее состав часто
изменчив у разных видов насекомых. В настоящее время предложено
около 50 вариантов питательных сред для культивирования клеток
беспозвоночных [18]. Все эти среды отличаются от сред для клеток и
тканей млекопитающих наличием органических кислот, повышенным
содержанием аминокислот и более высоким осмотическим давлением.
Ни одна из этих сред не пригодна для получения культур клеток
всех видов беспозвоночных [19, 20].
Фирма «GIBCO» (США) поставляет среды Чиу и Блэка [21] и
Маркса М-14 и М-20 [22] для клеток клопов и кузнечиков; Грейса
[23] и Лейбовипа L-15 [24] для клеток шелкопрядов и комаров; Мит-
сухаси [25] для клеток бабочек; Шнейдер [15] для клеток дрозо-
филы.
Нами предложена среда КШ-10 [26] для выращивания существу-
ющих линий клеток насекомых разных видов. Она приготавливается
на дважды или трижды дистиллированной или деионизированной
воде. Трудно растворимые компоненты среды, например тирозин и
16 Заказ 1789
241
триптофан, следует растворять отдельно. Соли магния и кальция
добавляют в последнюю очередь, когда остальные компоненты уже
растворены в основном объеме среды, после чего pH доводят до 6.8—
7.2. Приготовленную среду фильтруют через миллипоровый фильтр
GS с диаметром пор 0.2 мкм, автоклавированный при 1 атм в течение
30 мин. Готовую среду можно хранить при 4 °C в течение года
и больше. Очень часто среду обогащают добавлением эмбрио-
нальной сыворотки коров (2—10%), которую иногда можно пол-
ностью исключить [27].
Получение стерильных тканей насекомых
Стерильные внутренние органы достаточно крупных насекомых
(например, бабочки) можно получить, если обработать их поверх-
ность 70 %-ным спиртом в течение 10—15 мин и извлечь ткани в сте-
рильных условиях [28]. Личинки и куколки насекомых, тщательно от-
мытые водой, стерилизуют 95 %-ным этанолом 10—15 мин. Однако
при работе с мелкими насекомыми (например, дрозофила, домашняя
муха или комар) сложно извлечь органы при сохранении их стериль-
ности: приходится содержать насекомых в стерильных условиях. Ме-
тоды получения стерильных культур насекомых различны и подробно
описаны в ряде работ [19, 29, 30].
Стерилизацию эмбрионов (например, дрозофилы) проводят сле-
дующим образом. Яйца дрозофилы, отложенные в течение 1 —12 ч,
собирают на лотках с кормом, содержащим убитые дрожжи. Смытые
с корма яйца переносят в капроновый мешочек, тщательно промы-
вают водопроводной водой. Собранные яйца переносят в стакан,
содержащий 30 %-ный раствор сахарозы, и оставляют на 1—24 ч
в холодильнике. Плавающие эмбрионы осторожно переносят (пере-
ливают) в цилиндр с металлической сеткой (диаметр ячейки не
более 500 мкм), через который проходят эмбрионы и мелкие частицы,
а крупные кусочки корма и возможные личинки остаются. Затем эти
эмбрионы переливают в другой цилиндр, содержащий металлическую
сетку с диаметром пор не более 100 мкм, где задерживаются эм-
брионы, а дрожжи и мелкие частицы смывают, пропуская через
сетку около 0.5 л холодной водопроводной воды. Тщательно отмытые
эмбрионы можно стерилизовать 70 %-ным этанолом 5—10 мин и
95 %-ным этанолом 10—20 мин. После отмывания эмбрионов сте-
рильным солевым раствором или средой можно получить массу кле-
ток для первичного культивирования и выделения пересеваемых
линий клеток [31, 32]. Если перенести такие стерильные эмбрионы на
i стерильный корм, то можно получить безмикробные (аксеНные)
-культуры насекомых [19].
Для более надежной стерилизации эмбрионов и облегчения про-
ницаемости удаляют хорионовую оболочку яйца. Наиболее быстрый
метод состоит в обработке яиц 3—5 %-ным раствором гипохлорита
натрия в течение 2—3 мин с последующей тщательной отмывкой
стерильной дистиллированной водой. Выживаемость дехорионизиро-
ванных эмбрионов снижается до 40—60 %. Гипохлорит натрия
242
(NaClO) можно получить по следующей прописи [33]: берут 25 г
Са(С1О)2, растворяют в 42 мл водопроводной воды; 17.5 г Na2CO3
(натрий углекислый) растворяют в 42 мл водопроводной воды. Полу-
ченные растворы смешивают (смесь сначала загустевает, затем вновь
разжижается). Полученную смесь фильтруют через полотняный
фильтр. Светлый желтоватый раствор (около 67 мл) содержит
примерно 6—10 % NaClO. Дехорионизация яиц осуществляется
в 3—5 %-ном растворе на 48 %-ном этаноле в течение 2—5 мин, когда
полностью растворяется хорионовая оболочка эмбриона. Отмытые
яйца помещают в пробирки с автоклавированным при 0.7 атм 20 мин
• кормом следующего состава: СаС12 — 0.54 г, манка — 126 г, свежие
дрожжи — 220 г, агар — 8.9 г, вода — до 1000 мл [34]. Вылупив-
шихся мух стерильно переносят в новые пробирки с автоклавиро-
ванным кормом. Таким способом в течение нескольких лет удается
содержать безмикробные культуры дрозофилы, дающие стерильные
ткани на любых стадиях развития насекомого.
Культивирование целых эмбрионов,
нмагииальных дисков и органов насекомых
Эмбрионы с удаленной или просветленной оболочкой (хорионом)
используются для изучения начальных стадий развития насекомых
[35].
Имагинальные диски. Имагинальные диски — зачатки органов
взрослого насекомого — широко используются для исследования
процессов дифференцировки in vitro [10, 14, 15, 36—42]. При этом
обычно используют метод висячей капли объемом 0.005—0.008 мл
[15]. Например, имагинальные диски дрозофилы изолируют из сте-
рильных личинок третьего возраста, которые различаются по разви-
тию дыхательного бугорка и по окраске ротового аппарата личинок
[41, 43]. Личинок, снятых со стенок пробирки, отмывают многократ-
ным погружением в автоклавированную дистиллированную воду
в чашке Петри. Затем отмытые личинки пинцетом переносят в чашку
Петри диаметром 40—60 мм, содержащую 2—4 мл стерильной среды.
Придерживая личинку препаровальной иглой, отсекают переднюю
часть тела в области первых четырех сегментов с помощью тонкой
вольфрамовой иглы, заточенной путем электролиза. Затем из перед-
ней отсеченной части осторожно выдавливают имагинальные диски
в комплексе с головным и брюшным ганглиями и переносят их
пинцетом в другую чашку Петри со свежей питательной средой,
где комплексы освобождают от трахей. Имагинальные диски 3 раза
отмывают, перенося их из одной капли среды в другую, после чего их
помещают в сосуд для культивирования, выбор которого зависит от
массы взятой ткани и объема среды. Обычно берут 10—20 имагиналь-
ных дисков вместе с головным и брюшным ганглиями в объеме
0.2 мл среды и инкубируют при 28 °C [41].
Пересеваемая линия клеток имагинальных дисков. Лин и Обер-
ландер [42, 44] впервые описали получение пересеваемой линии из
крыловых имагинальных дисков Lepidoptera. Исходные культуры со-
16»
243
держали 20—40 крыловых имагинальных дисков. Ткани культивиро-
вались в стоячей капле (объем 0.2 мл) модифицированной среды
Грейса [23], содержащей 8% гретой эмбриональной сыворотки
коров, в 35 мм чашках Петри, герметически закрытых парафильмом,
и инкубировали при 26 °C и 95 %-ной: относительной влажности.
После 48 ч в каплю добавляли еще 1 мл питательной среды. Через
5—10-суточные интервалы вплоть до пересева среду на 50 % заме-
няли свежей. Первый пассаж проводили через 9 нед: содержимое
чашки Петри переносили в 25 см5 флаконы («Costar»), содержащие
3 мл свежей среды. Первичные культуры и первые три пассажа
проводили в среде, содержащей 50 мг/л гентамицина. После этого
периода антибиотики не использовали. Последующие пассажи прово-
дили с недельным интервалом: культуры центрифугировали (120 g,
5 мин) и клетки ресуспензировали в свежей среде в разведении 1 : 2 и
1 : 4. Линии клеток бабочек Spodoptera frugiperda и Plodia interpun-
ctella имели различный характер роста. Клетки S. frugiperda (IAL-
SFD1) растут в виде многоклеточных шаров и реагируют морфологи-
чески и биохимически на гормон насекомого (экдистерон). Напротив,
клетки Р. interpunctella растут в виде монослоя мелких веретеновид-
ных клеток и не реагируют на гормон, хотя скорость их роста замед-
ляется.
Дифференцировка целых имагинальных дисков в культуре зави-
сит от многих факторов. В частности, необходимо присутствие в среде
головных ганглиев [15] или гормона роста и дифференцировки —
экдизона [38, 40, 41].
Слюнные железы. Культивирование слюнных желез Diptera пред-
ставляет большой интерес для изучения, например, процессов пуффи-
рования в политенных хромосомах [45—48]. Описаны простой метод
и питательная среда С-50 химически определенного состава для
культивирования слюнных желез дрозофилы [48].
Культивирование клеток насекомых
Первичные культуры. Для получения культур клеток яичников
шелкопряда [23] их стерильно извлекают из гусениц, куколок
или имаго, измельчают и диссоциируют на клетки с помощью
0.25 %-ного раствора трипсина «Difco», приготовленного на солевом
растворе Грейса, в течение 15 мин при комнатной температуре. Полу-
ченную взвесь клеток суспензируют в питательной среде Грейса и ин-
кубируют при 27—29 °C. После 48 ч инкубации большая часть клеток
оседает на стекло. В течение первых 7 мес среду меняют через
7—14 сут, а после того как клетки начинают активно размно-
жаться — через 4—5 сут.
Для получения культур клеток насекомых часто берут эмбрио-
нальные клетки [10, 17, 49, 50]. В качестве примера можно привести
методику получения первичной культуры эмбриональных клеток дро-
зофилы. Дехорионизированные гипохлоритом натрия или обработан-
ные спиртом, а затем тщательно отмытые (см. выше) стерильные
244
яйца дрозофилы переносят в стерильных условиях в стеклянный ци-
линдр, содержащий крупноперистый стеклянный фильтр, где их
3 раза отмывают средой без сыворотки. Затем яйца переносят в сте-
клянный гомогенизатор и мягко гомогенизируют в питательной среде
без сыворотки с помощью неплотно пригнанного пестика [17]. Разоб-
щение эмбрионов на одиночные клетки лучше производить механи-
ческим способом, поскольку протеолитические ферменты не дейст-
вуют на вителлиновую оболочку целого яйца [ 19]. Гомогенат эмбрио-
нов фильтруют через стеклянный фильтр № 2 в приемник. Из 3—
120 тыс. эмбрионов 6—20-часового возраста можно получить
(2—16) • 107 клеток [10, 16]. Суспензию клеток осаждают центрифу-
гированием первый раз в среде без сыворотки при 1500 об/мин —
5 мин, второй раз — в среде с 5—15 % эмбриональной сыворотки
коров при 1000 об/мин — 5 мин, и осадок клеток суспензируют в све-
жей питательной среде с сывороткой из расчета (1—3) • 106 кле-
ток/мл. Полученную суспензию клеток разливают в культуральные
сосуды и инкубируют при 25—28 °C.
Для получения культур клеток из кусочков 20—24-часовых эм-
брионов дрозофилы [51] их обрабатывают 0.2 %-ным раствором
трипсина, приготовленного в солевом растворе Ринальдини [52] сле-
дующего состава (в мг на 100 мл дистиллированной воды): NaCl —
800, КС1 — 20, NaH2PO4- Н2О — 5, NaHCO3 — 100, глюкоза — 100,
цитрат натрия — 68 и трипсин («Difco»), 1 : 250.
Была предложена камера для первичных культур эмбриональных
клеток [53]. Они представляют собой склеенные силиконовой рези-
ной два предметных стекла, верхнее стекло имеет отверстие диамет-
ром 15 мм. Эту камеру силиконизируют и тщательно отмывают перед
использованием. С помощью стеклянной палочки смазывают края
лунки вазелином. Каплю суспензии клеток помещают в центр лунки,
сверху покрывают покровным стеклом, предварительно тщательно от-
мытым от следов грязи смесью этанола и эфира (1 : 1). Вазелин
герметично закрывает камеру, для этого осторожно надавливают на
покровное стекло; когда капля коснется покровного стекла, она обра-
зует колонку среды в центре камеры. Камеру тут же поворачивают
покровным стеклом вниз, оставляют в течение 40 мин, пока клетки не
сядут и не прикрепятся к покровному стеклу. Когда же камеру пере-
ворачивают вновь, то неприкрепившиеся клетки и осколки клеток
оседают на дно камеры, а прикрепившиеся клетки остаются на по-
кровном стекле и продолжают свое эмбриональное развитие. Такая
камера экономна и удобна для изучения деления и дифференцировки
индивидуальных клеток при большом увеличении микроскопа и обра-
ботки их малым количеством биологически активных соединений и
радиоактивной меткой.
При культивировании клеток крови насекомых (гемоцитов) [6,
54] гемолимфу получают из личинок или куколок насекомых, выра-
щиваемых в стерильных условиях. Личинки помещают в культураль-
ную среду и осторожно прокалывают под микроскопом их кожные по-
кровы, в результате чего кровь выходит в среду. Клеточную взвесь
(концентрация 500—1000 клеток в 1 мл) разливают в пробирки и
245
культивируют в роллере при 1 об/мин 5 мин. Гемоциты прикрепля-
ются к внутренней поверхности пробирку и начинают размножаться.
С помощью методов первичного культивирования клеток удается
исследовать дифференцировку и метаболизм клеток беспозвоночных
в культуре [10, 11, 55]. Первичные культуры служат источником
для получения длительно пересеваемых линий клеток беспозвоноч-
ных.
Линии клеток беспозвоночных. После длительного периода адап-
тации клеток к условиям культивирования удается проводить пересев
клеток. Обычно период адаптации занимает 3—10 мес от момента
эксплантации клеток в первичную культуру. В настоящее время полу-
чен целый ряд пересеваемых линий клеток из различных тканей,
взятых на разных стадиях развития беспозвоночных животных
(см. обзор: [1]).
Пассирование клеток детально описано на примере линии эмбрио-
нальных клеток дрозофилы [56]. В наших условиях ведения линий
клеток дрозофилы Drosophila melanogaster, D. virilis, комаров Aedes
aegypti, A. albopictus, тутового Bombyx mori и дубового Antheraea
pernyi шелкопрядов и непарного шелкопряда Lymanthria dispar ак-
тивный рост клеток всех линий отмечен на среде КШ-10 с добавле-
нием сыворотки или без нее при 25—28 °C. Пересев клеток произво-
дят с интервалом 7 сут в разведении от 1 : 5 до 1 : 40 в зависимости
от активности их роста. Для этого засевают в пластмассовые 40 мм
чашки Петри однократного пользования (Ленинградский завод меди-
цинских полимеров, ТУ-64-2-19-79) суспензию клеток в объеме 2 мл
среды КШ-10, содержащей 0—15 % эмбриональной сыворотки
коров, концентрация клеток (0.5—1) • 106 на 1 мл. Предварительную
обработку трипсином никогда не проводили, а для снятия клеток
с поверхности сосуда достаточно осторожно суспензировать клетки
в старой питательной среде и перенести их в свежую среду (например,
1 каплю суспензии переносят в чашку с 2 мл питательной среды, чтобы
получить разведение 1 : 40; 2 капли — на 2 мл, 1 : 20 и т. д.). Посеян-
ные клетки осторожно суспензируют и инкубируют в СОг-инкубаторе,
содержащем 5 % СОг и 95 % воздуха. Таким путем нам удалось
непрерывно пересевать диплоидную линию эмбриональных клеток
дрозофилы 67j25D в течение 19 лет, что равно примерно 950 пассажам
или 3800 клеточным поколениям.
При пересевах линий клеток яичника шелкопряда пользуются
0.1 %-ным раствором трипсина «Difco», приготовленного на солевом
растворе среды Грейса [23]. Старую среду сливают, к монослою кле-
ток добавляют раствор трипсина, инкубируют при 25 °C и, как только
клетки начинают отслаиваться от стекла, в сосуд добавляют свежую
полную питательную среду и осторожно пипетируют, чтобы
освободить клетки от субстрата. После центрифугирования при
1000 об/мин в течение 2 мин надосадок отбрасывают, а клетки ресус-
пензируют в свежей питательной среде из расчета 5 • 104—1 • 105
клеток/мл.
Время генерации пересеваемых линий клеток насекомых занимает
от 18—24 [50, 56] до 72 ч [21]. В наших условиях культивирования
246
при посеве (1 —1.5)- 10ь клеток/мл линии 67j25D в пластмассовые
плато («Nunc», Дания) размером 24X24 см в 100 мл среды КШ-10+
4-2 % эмбриональной сыворотки коров фирмы («Gibco», США), на
7-е сутки урожай клеток достигал (10—15) • 106 клеток/мл, т. е.
около 1 млрд, клеток.
Замораживание клеток насекомых
1-й способ. Клетки, росшие в 4 мл среды в течение 4—7 сут, осво-
бождают от старой среды, суспензируют в среде для замораживания
(75 % среды, 15 % сыворотки и 10 % ДМСО), доводя концентрацию
клеток до 2 • 106 клеток/мл. Эту суспензию разливают в 4 полиэтиле-
новые пробирки по 1 —1.2 мл. На маркирование ампул и размеще-
ние их в пенопластовой коробке с ячейками для пробирок идет около
8 мин. Готовый пакет ампул помещают в рефрижератор при —70 °C,
через 2 ч или более ампулы переносят в сосуд Дюара с жидким азо-
том (—196 °C).
При оттаивании ампулу быстро переносят (около 30 с) в сосуд
с водой 37 °C. Вскоре, как только исчезают последние кристаллы
льда, ампулу открывают, обжигают края и содержимое переносят
пастеровской пипеткой в предварительно охлажденную пробирку
с холодной средой в объеме 5 мл. Центрифугируют 2—3 мин при
2000 об/мин, среду выбрасывают, клетки ресуспензируют в среде ком-
натной температуры, разливают в 4 флакона Карреля, где концентра-
ция клеток не превышает 0.8 • 106 клеток/мл.
2-й способ. (2—5) • -Ю6 клеток/мл в среде КШ-10 (75 %), содер-
жащей эмбриональную сыворотку коров (15%) и глицерин (10 %),
разливают по полиэтиленовым ампулам по 1 —1.2 мл. Ампулы поме-
щают в металлический стакан и держат 1 ч в холодильнике при 4 °C.
После этого стакан подвешивают над сосудом Дюара цилиндриче-
ской формы, на '/г заполненным жидким азотом (15 мин), затем
стакан опускают в цилиндр вровень с краем и оставляют на 15 мин,
далее стакан опускают до касания с жидким азотом и тут же подни-
мают на 1 см, оставляют на 20 мин, потом стакан медленно погру-
жают в жидкий азот. Такой режим заморозки примерно соответствует
скорости 1 °C в 1 мин. При размораживании ампулы помещают в воду
(при 29—32 °C) для быстрого оттаивания (1—2 мин). Клетки дрозо-
филы, хранящиеся при 4 °C, не теряют способности к активному
росту по крайней мере в течение 1 мес.
В заключение надо отметить, что культуры клеток беспозвоноч-
ных представляют огромный интерес для изучения молекулярных ме-
ханизмов взаимодействия хозяин—паразит [57, 58], роли мобильных
генетических элементов в адаптации беспозвоночных к стрессовым
условиям окружающей среды [59], регуляции действия генов в клет-
ках высших организмов [27, 60, 61] и клеточных механизмов диффе-
ренцировки и трансдетерминации в процессе метаморфоза [38, 53],
а также специфической генетической реакции (пуффинг) гигантских
политенных хромосом слюнных желез Diptera, культивируемых в хи-
мически определенной среде, содержащей известные биологически
активные соединения [46—48].
247
Литература
1. Hink W. F. The 1979 compilation of invertebrate cell lines and culture media //
Invertebrate systems in vitro / Eds. E. Kurstak, K- Maramorosch. Amsterdam
etc., 1980. P. 553 -578
2. Invertebrate tissue culture I Ed. C. Vago. New York; London, 1972. Vol. 2. P. 426.
3. Tissue culture methods and applications / Eds P. F. Kruse Ir., M. K. Patterson Ir.
New York; London. 1973. 868 p.
4. Invertebrate systems in vitro / Eds. E. Kurstak, K- Maramorosch, A. Diibendorfer.
Amsterdam, 1980. 398 p.
5. Advances in cell culture / Ed. K. Maramorosch. New York, 1981. Vol. 1. 340 p.
6. Милосердова В. Д. Культивирование клеток насекомых вне организма // Цитоло-
гия и генетика. 1967. Т. 1. С. 78—89.
7. Echalier G. In vitro established lines of Drosophila cells and application in
physiological genetics // Invertebrate tissue culture: Application in medicine, biology
and agriculture / Eds E. Kurstak, K. Maramorosch. New York; London, 1976
P. 131 — 150.
8. Echalier G. Necessity of radically new insect cell culture methods // Invertebrate
system in vitro / Eds. E. Kurstak, K. Maramorosch, A. Diibendorfer. Amsterdam etc.,
1980. P. 589—592.
9. Bernhard H. P., Lienhard S., Regenass U. Isolation and characterization of mutant
Drosophila cell lines // Invertebrate systems in vitro / Eds. E. Kurstak, K. Maramo-
rosch, A. Diibendorfer. Amsterdam etc., 1980. P. 13—26.
10. Sang J. H. Drosophila cells and cell lines // Advances in cell culture / Ed. K. Mara-
morosch. New York, 1981. Vol. 1. P. 125—182.
И. Гвоздев В. А., Полукарова Л. Г., Какпаков В. Т. Культивирование органов,
тканей и клеток дрозофилы in vitro // Биохимическая генетика дрозофилы. Ново-
сибирск, 1981. С. 126—156.
12. Lynn D. Е. Development of a cell line from the coleopteran insec:, Diabrotica
undecimpunctata // In Vitro. 1983. Vol. 19, N 3. P. 262.
13. Simcox A. A., Sobeih M. M., Shearn A. Establishment and characterization of
continuous cell lines derived from temperaturesensitive mutants о Drosophila
melanogasfh // Somat. Cell Mol. Genet. 1985. Vol. 11, N 1. P. 63—70.
14. Kuroda Y. Tissue culture of eye discs of Drosophila melanogas:er // Droso-
phila Inform. Serv. 1954. Vol. 28. P. 127.
15. Schneider I. Differentiation of larval Drosophila eye-antennal discs in vitro//J.
Exp. ZooL 1964. Vol. 156. P. 91 — 104.
16. Landureau J. C. Cultures in vitro de cellules embryonnaires de blates (Insectes
Dictyopteres). 2. Obtention de lignees cellulaires a multiplication conlinue//Exp.
Cell Res. 1968. Vol. 50. P. 323—337.
17. Гвоздев В. А., Какпаков В. T. Культура эмбриональных клеток Drosophila
melanogaster in vitro // Генетика. 1968. T. 4. С. 129—142.
18. Mitsuhashi J. Media for insect cell cultures // Advances in cell cultures / Ed.
K. Maramorosch. New York, 1982. Vol. 2. P. 133—196.
19. Какпаков В. T., Гвоздев В. А. Культивирование клеток и тканей насекомых//
Методы биологии развития. М., 1974. С. 290—298.
20. Goadwin R. Н. Comparative culture of insect cells from the Lepidoptera,
Coleoptera and Orthoptera in various media // In Vitro. 1983. Vol. 19. P.
262.
21. Chiu R., Black L. №. Monolayer cultures of insect cell lines and then inoculation
with a plant virus // Nature. 1967. Vol. 215. P. 1076—1078.
22. Marks E. P., Holman G., Leloup A. N. Cockroach tissue in vitro: A system for the
study of insect cell biology // In Vitro. 1968. Vol. 3. P. 85—95.
23. Grace T. D. C. Establishment of four strains of cells from irsect tissues
grown in vitro // Nature. 1962. Vol. 195. P. 788.
24. Leibovitz A. A medium for the growth and maintenance of tissue cell cultures
in free gas exchange with the atmosphere // Amer. J. Hyg. 19(3. Vol. 78.
P. 173—180.
25. Mitsuhashi J. Establishment of an insect cell strain persistently ilfected with
an insect virus // Nature. 1967. Vol. 215. P. 863—864.
26. (Брауде-Золотарева T. Я., Какпаков В. T., Шуппе Н. Г.). Bnudo-Zolota-
248
reva T. Ya., Kakpakov В. T., Schuppe N. G. Male diploid embryonic cell line
of Drosophila virilis // In Vitro. 1986. Vol. 222. P. 481—484.
27. Какпаков В. T., Шуппе Н. Г. Соматические клетки дрозофилы в культуре
как модель для исследований по молекулярной генетике высших организмов //
Молекулярные механизмы генетических процессов. М., 1982. С. 37—48.
28. Пол Д. Культура клеток и тканей. М., 1963. 243 с.
29. Sang J. Н. The quantitative nutritional requirements of Drosophila melano-
gaster //J. Exp. Biol. 1956. Vol. 33. P. 45—72.
30. Какпаков В. T. Питательная среда для дрозофилы // Проблемы генетики
в исследованиях на дрозофиле. Новосибирск, 1977. С. 225—230.
31. Какпаков В. Т., Полукарова Л. Г., Черданцева Е. М.) Kakpakov V. Т.,
Polukarova L. G., Cherdanzeva Е. М. Some new embryonic cell lines in
Drosophila melanogaster //Drosophila Inform. Serv., 1977. Vol. 52. P. 110.
32. Брауде-Золотарева T. Я., Какпаков В. T., Никошков А. Б. Получение и
описание новой линии эмбриональных клеток Drosophila virilis Sturt. //
IV съезд Всесоюз. о-ва генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова.
Кишинев, 1982. С. 38—39.
33. Карякин Ю. В., Ангелов И. И. Чистые химические вещества. М., 1974.
С. 285—286.
34. Molner Kiss I. An easy method for rearing axenic Drosophila lines // Droso-
phila Inform. Serv. 1980. Vol. 55. P. 163—164.
35. Counce S. J. The causal analysis of insect embryogenesis // Developmental
systems: insects / Eds S. Counce, С. H. Waddington. New York, 1972. Vol. 2.
P. 1 — 156.
36. Goltschewski G. Morphogenetische Untersuchungen au in vitro waschsenden
Augenanlagen von Drosophila melanogaster//Wilhelm Roux Arch. I960.
Vol. 152. P. 204—229.
37. Marks E. P. The action of hormones in insect cell and organ cultures // Gen.
Comp. Endocrinol. 1970. Vol. 15. P. 289—302.
38. Fristrom J. W. The developmental biology of Drosophila // Annu. Rev. Genet.
1970. P. 325—346.
39. Dolfini S. Cell culture of Diptera // Invertebrate tissue culture / Ed. C. Vago,
1971. Vol. I. P. 247—265.
40. Mandoron P. Sur le mecanisme de I’evagination des disques imaginaux chez la
Drosophile//Develop. Biol. 1971. Vol. 25. P. 581—605.
41. МуховатоваЛ. M., Какпаков В. T. Влияние альфа- н бета-экдизона на дифферен-
цировку имагинальных дисков Drosophila melanogaster, культивируемых in
vitro//Онтогенез. 1975. Т. 6, № I. С. 80—87.
42. Lynn D. Е., Miller S. G., Oberlander Н. Establishment of a cell line from lepidopteran
wing imaginal discs: induction of newly synthesized proteins by 20-hydoxyecdy-
sone//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. Vol. 79. P. 2589—2593.
43. Bodenstein D. The postembryonic development of Drosophila // Biology of Dro-
sophila / Ed. M. Demerec. New York; London, 1950. P. 275—367.
44. Lynn D. E., Oberlander H. The establishment of cell lines from imaginal wing
discs of Spodoptera frugiperda and Plodia interpunctella//J. Insect Physiol.
1983. Vol. 29. P. 591—596.
45. Cannon G. Culture of insect salivary glands in a chemically defined medium //
Science. 1964. Vol. 146. P. 1063.
46. Asciiburner M. Induction of- puffs in politene chromosomes of in vitro cultured
salivary glands of Drosophila melanogaster by ecdysone and ecdysone analo-
gues//Nature. 1971. Vol. 230. P. 222.
47. Pickards G. Ecdysteroids and puffing in Drosophila melanogaster // Progress
in ecdysone research. Amsterdam, 1980. P. 363—378.
48. Полуэктова E. В., Митрофанов В. Г., Какпаков В. Т. Действие гормонов насеко-
мых на пуффииг хромосом слюнных желез Drosophila virilis Sturt, культивируемых
in vitro. !. Изменение пуффинга при культивировании желез в среде С-50 // Онто-
генез. 1980. Т. 11. С. 175—180.
49. Horikawa М., Fox Allen S. Culture of embryonic cells of Drosophila melanogaster
in vitro // Science. 1964. Vol. 145. P. 1437—1439.
50. Echalier G., Ohanessian A. In vitro culture of Drosophila melanogaster embryonic
cells// In Vitro. 1970. Vol. 6. P. 162—172.
249
51. Schneider I. Cell lines derived from late embryonic stadies of Drosophila melano-
gaster // J. Embryol. Exp. Morphol. 1972. Vol. 27. P. 353—365.
52. Rinaldini L. M. К quantitative method for growing animal cells in vitro //
Nature. 1954. Vol. 173. P. 1134—1135.
53. Diibendorfer A., Eichenberger-Glinz S. Development and metamorphosis of
larval and adult tissues of Drosophila melanogaster in vitro//Invertebrate
systems in vitro / Eds. E. Kurstak, K. Maramorosch, A. Diibendorfer. Amsterdam
etc., 1980. P. 169—185.
54. Horikawa M., Kuroda Y. In vitro cultivation of blood cells of Drosophila
melanogaster in a synthetic medium // Nature. 1959. Vol. 184. P. 2017—2018.
55. Brooks M. A., Kurtti T. J. Insect cell and tissue culture // Annu. Rev. Entomol.
1971. Vol. 16. P. 27—52.
56. Какпаков В. T., Гвоздев В. А., Платова Т. П., Полукарова Л. Г. Линии эмбрио-
нальных клеток Drosophila melanogaster, пересеваемые in vitro // Генетика.
1969. Т. 5. С. 67—75.
57. Plus N. Endogenous viruses of Drosophila melanogaster cell lines: their
frequency, identification and origin // In Vitro. 1978. Vol. 14. P. 1015—1021.
58. Maramorosch K. Application of invertebrate tissue culture to the health and
economy of developing nations // Invertebrate systems in vitro / Eds. E. Kurs-
tak, K. Maramorosch, A. Diibendorfer. Amsterdam etc., 1980. P. 579—585.
59. Strand D. McDonald J. F. Copia is transcriptionally responsive to environ-
mental stress // Nucl. Acids Res. 1985. Vol. 13. P. 4401—4410.
60. Barigozzi C. Invertebrate cell culture in genetic research // Invertebrate tissue
culture/Ed. C. Vago. 1972. Vol. 11. P. 163—180.
61. Ильин Ю. В., Шуппе H. Г., Архипова И. Р. и др. Организация и транспозиция
мобильных диспергированных генов дрозофилы // Молекулярные механизмы
генетических процессов. М., 1985. С. 20—27.
Культивирование фибробластов человека
для диагностики наследственных болезней
К- Н. Гранберг, В. И. К у х а р е н к о, В. Н. Ляшко,
С. М. Терехов, Е. М. Пичугина, М. И. Фрейдии, В. Г. Черников
Институт медицинской генетики АМН СССР, Москва
В настоящее время практически любые клетки человека могут
быть введены в культуру и тем самым служить средством и объектом
во многих медико-биологических исследованиях. Однако поскольку
наибольший опыт накоплен в отношении фибробластов, в данном
разделе речь будет идти только об этом типе клеток.
Широкое использование фибробластов для изучения патогенеза и
диагностики наследственных болезней обусловлено не только лег-
костью их культивирования, но и тем, что соединительная ткань,
главным клеточным элементом которой являются фибробласты,
составляет весьма значительную часть массы тела. Кроме того,
фибробласты, составляя строму многих органов, являются важными
участниками их морфогенеза и создают условия микроокружения,
необходимые для дифференцировки и функционирования специали-
зированных клеток. Важно отметить, что фибробласты представляют
in vitro не только самих себя и соединительную ткань, но и клеточные
системы иной специализации, в частности нервные клетки. Так,
в фибробластах имеется фермент моноаминооксидаза, изменения
активности которого характерны для некоторых нервных и психиче-
ских заболеваний, в фибробластах имеются рецепторы к глюкокор-
250
тикоидным гормонам, инсулину, к некоторым нейромедиаторам.
В связи с этим фибробласты используются для изучения клеточных,
биохимических и молекулярных аспектов патогенеза ряда болезней,
в том числе и связанных с наследственными дефектами нервной
системы [1, 2].
Появление новых диагностических приемов возможно только
в результате глубокого изучения патогенеза заболевания. Разра-
ботка диагностики с применением культивируемых клеток возможна
только после изучения клеточных аспектов патогенеза. Именно
таким образом были разработаны методы биохимической диагно-
стики, в частности методы пренатальной диагностики [3—5],
раскрыта природа генетической гетерогенности ряда наследственных
болезней [6, 7].
Использование культивируемых клеток вне организма для диагно-
стики наследственных болезней является логическим продолжением
метода биопсии, при котором изъятый из организма фрагмент ткани
подвергается немедленному (преимущественно морфологическому)
исследованию. Однако благодаря культивированию возможности
исследования и диагностики расширяются практически беспредельно,
так как имеется возможность оценки не только морфологических
и биохимических изменений, но и изменений в поведении клеток,
их реакций на различные агенты, в том числе на лекарственные
воздействия. Воспроизведение культивируемыми клетками в ряду
поколений какого-либо дефекта или изменения, свойственного клет-
кам in vivo, свидетельствует о наследственной природе этого
дефекта или изменения. Именно это обстоятельство делает культи-
вируемые фибробласты ценным объектом физиологической генетики
[8]. Благодаря методу культивирования клеток патология человека
и антропология становятся экспериментальными науками.
Вопрос о возможности и пределах экстраполяции данных, полу-
ченных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo уже
разбирался одним из авторов [9]. Было показаног что по целому
ряду важнейших свойств фибробласты in vitro неотличимы от фибро-
бластов in vivo. Недавно этот же вопрос кратко и убедительно
разобран одним из пионеров широкого использования культуры
фибробластов для диагностики наследственных болезней [10]:
1) фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные
этим клеткам в организме; более того, они сохраняют онтогенети-
ческие и индивидуально-генотипические свойства организма-донора;
2) не существует другого типа клеток, который в полной мере мог бы
представлять свойства клеток организма; 3) изменения, которые
возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко
контролировать и свести к минимуму путем создания соответствую-
щих условий.
Источники получения фибробластов. Рост фибробластов (или
фибробластоподобных клеток) может быть получен из многих тканей
и органов. На практике используются фибробласты дермального
слоя кожи (биопсия и некропсия), фибробласты кожно-мышечного
и легочного происхождения (материал медицинских и спонтанных
251
абортов). Преобладающий рост фибробластов наблюдается при
культивировании некоторых образцов амниотических клеток (клеток
околоплодной жидкости) и мочи.
Взятие биопсии. Поскольку имеются данные о том, что биоло-
гические особенности фибробластов варьируют в зависимости от
мест взятия эксплантата, необходимо придерживаться стандартного
метода взятия биопсии. Наиболее удобным местом является внутрен-
няя сторона предплечья левой руки (нижняя треть). Кожу дезинфи-
цируют 70 %-ным этиловым спиртом. Не рекомендуется употреблять
другие дезинфицирующие растворы (например, настойку йода),
так как в случае проникновения их в биоптат они могут оказать
токсическое действие. При взятии биопсии у детей необходимо
фиксировать руку в локтевом сгибе и в запястье. После дезинфекции
кожу захватывают глазным хирургическим пинцетом, оттягивают,
насколько это возможно, и отсекают кусочек кожи непосредственно
под браншами пинцета. Не следует стремиться брать глубокие
слои кожи.
При правильно взятой биопсии, захватывающей эпидермис и
сосочковый слой дермы, кровотечение минимально. Наш многолетний
опыт свидетельствует о том, что в обезболивании нет никакой
необходимости. Отсечение кожи лучше всего производить половинкой
лезвия безопасной бритвы. Пинцет и бритва стерилизуются путем
погружения в этиловый спирт с последующим поджиганием. Отсечен-
ный кусочек немедленно погружается в заранее подготовленный
пенициллиновый флакон с питательной средой. Флакон герметически
закрывают,, пробкой и немедленно надписывают (фамилию пациента,
его кодовый номер или номер истории болезни). На рану наклады-
вают бактерицидный пластырь, детям, кроме того, накладывают
повязку. При соблюдении правил асептики и антисептики ранка
быстро заживает. Осложнений в виде нагноения мы никогда не
наблюдали. Повязка может быть удалена через 3 сут.
Фрагмент кожи в питательной среде может сохраняться при
4 °C в течение 3—4 сут без утраты фибробластами способности
к росту. Образцы можно пересылать железнодорожным или авиа-
транспортом. По нашим наблюдениям, биоптаты не теряют жизне-
способности после транспортировки при комнатной температуре
в течение 1—2 сут.
Кожа для культивирования может быть взята у трупа (некроп-
сия) при хранении в надлежащих условиях даже спустя 24 ч после
смерти.
Получение эксплантата. В стерильную чашку Петри с каплей
трипсина (0.25 %-ный раствор) или питательной среды (предо-
храняет от высыхания) помещают фрагмент кожи. Придерживая
фрагмент пинцетом, нарезают его на мелкие кусочки величиной
с булавочную головку и меньше стерильным лезвием безопасной
бритвы, зажатой в зажим Кохера или Пеана. При помощи изогнутой
препаровальной иглы кусочки извлекают из капли и помещают на
покровное стекло, находящееся в пенициллиновом флаконе или
в пробирке Лейтона. Уложенные кусочки накрывают другим покров-
252
ным стеклом, слегка прижимая его препаровальной иглой. Наливают
в культуральный сосуд питательную среду так, чтобы она покрыла
верхнее стекло. Покровные стекла с зажатыми между ними кусочками
кожи при помощи пинцета кладут на боковую сторону пенициллино-
вого флакона. Флаконы устанавливают на специальной подставке
под углом примерно в 30 °. В случае использования пробирок
Лейтона необходимость в этом отпадает. Флаконы плотно закры-
вают пробкой. Культуры инкубируют в термостате при
37 °C.
В течение недели следят только за цветом среды. Изменение
цвета индикатора к желто-оранжевому свидетельствует о хорошем
состоянии эксплантата. Спустя неделю начинают периодически
(через сутки) просматривать культуру под микроскопом. Можно
использовать как инвертированный микроскоп, так и обычный.
В последнем случае следует осторожно повернуть флакон, при
этом стекла с культурой прилипают к боковой стороне флакона
и могут быть исследованы при малом увеличении. Вокруг кусочков
появляются вначале единичные фибробласты, которые заметны
в виде длинных веретеновидных клеток, либо появляется слой эпите-
лия, окружающего фрагмент в виде «кружевного» ореола. При
появлении зоны выроста клеток следует сменить среду. Когда клетки
займут все пространство между кусочками (это видно невооружен-
ным глазом или при помощи лупы), клетки пересевают. Указать
точные сроки наступления момента пересева не представляется
возможным, поскольку скорость выроста клеток варьирует от инди-
видуума к индивидууму, сильно зависит от возраста донора (чем
старше донор, тем медленнее происходит миграция клеток из
эксплантата), от качества питательной среды.
Пересев клеток. Удаляют питательную среду из сосуда и наливают
2—3 мл заранее подогретого раствора трипсина (0.25 %-ного)
или смесь версен—трипсин. Через 2 мин удаляют трипсин, оставив
его только между стеклами. Инкубируют 15—20 мин в термостате
при 37 °C. Срок инкубации может сильно варьировать в зависимости
от качества трипсина. Ход трипсинизации можно контролировать,
просматривая культуры под микроскопом. По окончании трипсиниза-
ции при помощи препаровальной иглы отделяют одно стекло от дру-
гого и при помощи тонко оттянутой пипетки смывают клетки неболь-
шим (1 мл) количеством среды. При этом тщательно пипетируют
(несколько раз пропускают через пипетку) суспензию клеток и
кусочки. Суспензию клеток переносят в небольшой флакон Карреля
(или сосуд Коля) или в пенициллиновый флакон и добавляют среду
до 2—3 мл. Оставшиеся в прежнем сосуде кусочки снова укладывают
между двух покровных стекол и заливают средой.
От этих вторично культивируемых эксплантатов может быть
получен второй «урожай» клеток. Флакон Карреля с растущими
фибробластами просматривают ежесуточно под микроскопом. Когда
образуется слившийся слой клеток, производят второй, пересев
(обычно через 4—7 сут). Для пересева удаляют среду, вносят в сосуд
2—3 мл раствора версена, слегка покачивая сосуд, смачивают
253
этим раствором слой клеток. Удаляют раствор версена и вносят
2—3 мл раствора трипсина, который удаляют в течение 1 мин, оставив
слой клеток, смоченный трипсином. Инкубируют флакон в термостате
в течение 15—20 мин. Клетки смывают струей питательной среды,
несколько раз пропустив суспензию через пипетку. Пересев произво-
дят в отношении 1 : 2, т. е. из одного сосуда клетки распределяют
в два или в один, но большего объема. Пересевы производят
1 раз в неделю (частота пересевов зависит от скорости образования
слившегося слоя, которая значительно варьирует и в зависимости
от возраста донора). Пересевы производят до получения количества
клеток, достаточного для цитогенетического или биохимического
исследования и для криоконсервации.
Клеточный штамм считают установившимся, если после пасси-
рования в течение первых 5 пассажей прирост клеток спустя 3—4 сут
после пересева превосходит количество посеянных минимум вдвое,
что и позволяет пересевать такие клетки в отношении 1 : 2.
Имеются существенные различия по целому ряду характери-
стик, в том числе и по скорости роста, между клеточными штаммами
эмбрионального и постнатального происхождения, а также между
индивидуальными штаммами. По мере увеличения числа пассажей,
после некоторого периода, начинается снижение пролиферативного
потенциала клеток, что проявляется в увеличении времени, необходи-
мого для достижения прироста, обеспечивающего пересев 1 : 2.
При дальнейшем увеличении числа пересевов прирост вовсе прекра-
щается, и в конце концов штамм дегенерирует. Следует подчеркнуть,
что, вопреки распространенному мнению, не существует какого-то
определенного числа пассажей, ограничивающего продолжитель-
ность жизни штамма фибробластов в культуре. Это число сильно
варьирует в зависимости от качества и состава питательных сред,
от посуды, частоты пересевов. Важнейшим фактором, как уже
указывалось, является межштаммовая изменчивость пролифератив-
ного потенциала, являющаяся генетической характеристикой. Однако
существует общее правило, которое можно считать твердо установ-
ленным, — фибробласты, полученные от эмбрионов, способны
претерпеть большее количество пассажей, чем фибробласты, получен-
ные от взрослых индивидуумов. Однако при исследовании большого
количества штаммов можно обнаружить эмбриональные штаммы
с низким пролиферативным потенциалом и постнатальные — с высо-
ким.
Основываясь на опыте получения более чем 1000 штаммов фибро-
бластов человека, мы можем рекомендовать вести установившиеся
штаммы при следующих посевных концентрациях клеток: в матрас
емкостью 100 мл вносят 1 млн. клеток и 20 мл среды, 250 мл — 2—
2.5 млн. клеток и 40 мл среды, 1000 мл — 10 млн. клеток и 150—200 мл
среды. При таких концентрациях клеток сплошной слой образуется
на 3—7-е сутки культивирования.
Контроль штаммов. Существует много методов для осуществ-
ления контроля качества клеток. В этом разделе мы укажем лишь
на самые простые приемы, которые могут и должны использо-
ваться в ходе рутинного размножения клеток. Необходим ежеднев-
254
ный просмотр культуральных сосудов для оценки цвета среды и ее
5 прозрачности. Резкое изменение цвета и появление мути может
свидетельствовать о бактериальном или грибковом заражении.
Если цвет индикатора среды не изменяется после пересева или
сдвигается в сторону малинового, то это может быть связано
с отсутствием размножения клеток, с недостаточным их количеством
для данного объема или с их гибелью.
При помощи инвертированного микроскопа необходимо 1—2 раза
в неделю просматривать культуры, оценивая морфологию клеток и
слоя в целом. Фибробласты в норме обладают ориентированным
ростом и поэтому образуют характерный рисунок на субстрате.
В нормальных условиях фибробласты — веретенообразные вытяну-
тые клетки с прозрачной цитоплазмой. Отсутствие рисунка, распла-
станность клеток, появление зернистости в цитоплазме, пустые
места в слое клеток свидетельствуют об их дегенерации вследствие
токсических или иных вредных влияний. Необходимо после каждого
пересева отливать в стерильный пенициллиновый флакон небольшое
количество среды и сыворотки для проверки отдельных компонентов
питательной среды на стерильность. При подозрении на бактериаль-
ный пророст следует производить посев питательной среды и ее
компонентов на агар. Во избежание потери штамма в результате
бактериальной или иной инфекции не следует пересевать сразу все
культуральные сосуды (оставить небольшое количество культуры
для «подстраховки»).
Криоконсервация. В случае успешного культивирования выве-
денные клеточные штаммы подвергают криоконсервации (глубо-
кому замораживанию) на ранних пассажах. Запас замороженных
клеток дает возможность проводить дополнительные исследования
на тех же самых штаммах практически в любое удобное для
исследователя время и избавляет от больших потерь времени и
средств для поддержания жизни штаммов.
За сутки до криоконсервации меняют среду в культуральном
сосуде. Клетки снимают с субстрата при помощи трипсина, как
было описано выше. В подготовленную для замораживания кле-
точную суспензию (1.5—2.0 млн./мл) вводят диметилсульфоксид
в количестве 5—10 % от общего объема суспензии или стерильный
глицерин (до 10%), тщательно перемешивая. Полученную смесь
разливают по 1 мл в пластмассовые ампулы. Верхнюю часть ампулы
с плотно притертой крышкой заклеивают лейкопластырем, на котором
надписывают номер штамма и пассаж. Ампулы помещают в програм-
мный аппарат для замораживания клеток, в котором клеточная
суспензия охлаждается со скоростью 1 °С/мин до —70 °C. После
этого ампулы переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом.
При отсутствии аппарата для замораживания снижение температуры
до указанной можно производить вручную при помощи охлаждающей
смеси — любой этиловый спирт или ацетон, в который добавляют
небольшими порциями твердую углекислоту (сухой лед), следя за
показаниями термометра. Размораживают клетки быстрым извлече-
255
нием ампул из жидкого азота с последующим помещением их
в водяную баню с температурой воды 41 °C (на 2 мин). Клеточную
суспензию из одной ампулы переносят в небольшой флакон Карреля
с добавлением около 5 мл питательной среды. Успешность деконсер-
вации определяют на 2-е сутки, когда на дне сосуда под малым
увеличением микроскопа видны живые распластанные клетки.
Питательные среды. Для культивирования фибробластов исполь-
зуют среду Игла в различных модификациях и сыворотку (крупного
рогатого скота, теленка, эмбриона коровы). Вообще фибробласты
успешно культивируют и на других средах, однако во всем мире
принято для диагностических целей использовать только среду
Игла. Мы рекомендуем следующий состав питательной среды:
1) среда Игла (Институт полиомиэлита и вирусных энцефалитов
АМН СССР) — 90—85 %; 2) сыворотка крупного рогатого скота
(Московский мясокомбинат им. А. И. Микояна) — 5—10 %; 3) пупо-
винная сыворотка человека — 5 %; 4) глютамин — 150 мг на 500 мл
готовой среды. Готовую питательную среду и ее компоненты следует
хранить при 4 °C.
Приготовление пуповинной сыворотки. Кровь собирают в ро-
дильном отделении. Заранее приготовленные стерильные флаконы
из-под среды подставляют под отрезанный конец пуповины (до
рождения плаценты). Собранную кровь хранят в холодильнике.
После образования сгустка сыворотку сливают в центрифужные
стаканы и центрифугируют при 500 g 2 раза по 20 мин. Затем
сыворотку осветляют путем фильтрации через мембранные фильтры
(«Сынпор», «Millipore») с диаметром пор 0.85 мкм, затем 0.4, 0.3 и
0.22 мкм. ‘Последняя фильтрация — стерилизующая, производится
в стерильных условиях. Полученную сыворотку проверяют на
стерильность посевом на агар.
При ведении штаммов антибиотики применять не рекомендуется.
Их необходимо использовать при культивировании эксплантатов
(канамицин 40—60 мкг на 1 мл среды), а также добавлять в среду
с биоптатом.
Культуральная посуда и оборудование: пипетки мерные от 1 до
10 мл; пипетки Пастера; сосуды Карреля (сосуды Коля) всех
размеров; пенициллиновые флаконы; пробирки Лейтона; мерные
флаконы от среды разных объемов; пробки резиновые № 10, 12.5,
14.5, 24; стекла покровные для микроскопии, предварительно наре-
занные для помещения их в пенициллиновые флаконы или в пробирки
Лейтона; пинцеты глазные анатомические и хурургические; зажим
Кохера; бритва безопасная, препаровальная игла из нержавеющей
стали (может использоваться зубоврачебный зонд); резиновая
груша с надетой на нее резиновой трубкой для работы с пипетками;
микроскоп инвертированный; ламинар-бокс или стерильный бокс;
термостат с водяной рубашкой и термостат с углекислым газом
(газопроточный инкубатор ГПИ-01 или самодельные устройства);
центрифуга для больших объемов жидкости; ампулы пластмассовые
объемом 1.5 см3; ампулы перед употреблением сутки вымачивают
в теплой мыльной воде, моют ершиком, сутки промывают проточной
256
водой, затем ополаскивают дистиллированной водой, закрывают
крышками и заворачивают в пакетики по 6г-8 штук;, стерилизация
производится облучением в 30 кГр. Обработка культуральной
посуды (мытье и стерилизация) производится согласно общим
правилам культуральной работы.
Причины неудач при культивировании фибробластов человека.
Наиболее частой причиной неудач являются бактериальные и гриб-
ковые проросты и поражение микоплазмой. Необходимо иметь мини-
мальную микробиологическую службу в каждой культуральной
лаборатории (питательный агар и б'ульон, красители для идентифи-
кации микробов). Соблюдение правил стерильной работы предот-
вращает возможность инфицирования. По нашим наблюдениям,
наиболее часто культуры утрачиваются после снятия клеток с покров-
ных стекол, что связано либо с неполным снятием клеток, с прежде-
временным их снятием, а также с тем, что клетки сразу помещаются
в слишком большой объем среды. Важно помнить, что нормальные
(нетрансформированные) фибробласты плохо размножаются в усло-
виях редкого посева. Начинающему исследователю лучше упраж-
няться в культивировании, используя абортивный материал.
Литература
1. Breakfield X. О., Pintar J Е. The use of cell culture to analyze the genetic
basis of human neurologic disease//Genetic research strategies in psychobio-
logy and psychiatry. Amsterdam, 1981. P. 407 —414..
2. Neurofibromatosis (von Recklinghausen disease): Genet’, cell biology and bioche-
mistry//Adv. Neurol, New York, 1981. Vol. 29. 304 p.
3. Neufeld E. F. Contribution of ceil culture to studies of. lysosomal enzymes//
Excerpta medica. Intern. Congr. Ser. (Mexico). 1976. N 397. P., 14!
4. Dowson G., Matalon R;,. Dorfman A. Glycosohingolipids in cultured human
skin fibroblasts//J. Biol. Chem. 1972. Vol 247.'P. 5951—5958.
5. Nadler H. L. Antenatal detection of hereditary disorders // Pediatrics. 1968.
Vol. 42. P. 912—918.
6. Bearn A. Cell culture in inherited disease with some notes- on genetic hetero-
geneity // New Engl. J. Med. 1972. Vol. 286. P. 764—767.
7. Horwitz A. L. Genetic complementation studies of multiple sulfatase deficiency//
Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 71. P. 6496^-6499.
8. McKusick V. The growth and- development of' Human genetics as a clinical
discipline//Amer. J. Hum. Genet. 1975. Vol. 27, N 3. P. 261—273.
9. Гринберг К. H. Цитологические проявления хромосомного дисбаланса у чело-
века // Прогресс в медицинской генетике. М., 1978. С. 151—186.
10. Shannon Danes В. The humble fibroblast—a curiosity or a cell model for
humart genetic research //Clin. Genet 1985. Vol. 28, N 6, P. 563—566.
Клонирование стромальных клеток-предшественников
А. Я. Фриде н,инт.е й н
Институт эпидемиологии
и. микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР. Москва
Культуральный тест на клоногенные стромальные клетки кро-
ветворной ткани разработан в ПЭМ им. Н. Ф. Гамалеи АМН
СССР в 1970 г. и проводится в монослойншк культурах костного
17 Заказ 1789
257
мозга и лимфоидных органов. При низкой эксплантационной плот-
ности в таких культурах образуются стромальные колонии, которые
растут на поверхности культуральных сосудов. Колонии состоят
из фибробластов, синтезирующих интерстициальные коллагены
I и III типов и фибронектин и лишенных антигена VIII фактора и
Fc- и С-рецепторов. Все эти признаки отличают клетки стромальных
колоний от других адгезивных клеток костного мозга и лимфоидных
органов, в частности, от клеток эндотелия и от макрофагов [1—4].
По количеству колоний можно судить о численности стромаль-
ных колониеобразующих единиц (КОЕф, CFUf) или, что то же,
о численности стромальных клоногенных клеток (КОКф, FCFC),
так как стромальные колонии являются клеточными клонами [2,
4—6]. КОКф имеют высокие пролиферативные потенции, но in situ
они практически не пролиферируют. После эксплантации КОКф и
их потомки вступают в пролиферацию и проделывают в культурах
более 25 клеточных удвоений, сохраняя диплоидный набор хромо-
сом. В результате могут быть получены диплоидные стромальные
штаммы фибробластов — поликлональные, когда штаммы состоят
из потомков нескольких КОКф, и клонированные, которые полу-
чают пассированием индивидуальных стромальных колоний [7, 8].
Дифференцировочные потенции КОКф и их роль в кроветворении
и лимфопоэзе выявились в экспериментах по обратной трансплан-
тации в организм стромальных штаммов, предварительно выра-
щенные в культурах. И поликлональные, и клонированные стромаль-
ные штаммы образуйте при гетеротопной трансплантации все типы
механоцитов, которые характерны для того кроветворного органа,
из которого были выделены исходные КОКф. Так, при трансплан-
тации в организм стромальных штаммов, предварительно выра-
щенных в культурах. И поликлональные, и клонированные стромаль-
щевые клетки, а поликлональные штаммы селезеночных фибро-
бластов — только ретикулярные клетки [9, 10]. Трансплантация
стромальных штаммов в открытых для клеток системах приводит
к формированию гетеротопных кроветворных органов, строму ко-
торых образуют пересаженные фибробласты. Такие органы путем
репопуляции заселяются гемопоэтическими или лимфоидными
клетками, и в результате в случае трансплантации культуральных
потомков костномозговых КОКф формируются костные органы
с медуллярной полостью, заселенной костным мозгом, а при транс-
плантации культуральных потомков селезеночных КОКф — лимфо-
идные органы, заселенные лимфоцитами [11, 12]. Эти результаты
доказывают, что КОКф являются стволовыми стромальными клет-
ками — переносчиками гемопоэтических микроокружений и что
костномозговые КОКф одновременно служат стволовыми остеоген-
ными клетками [10].
Культуральный тест на КОКф используется прежде всего для
подсчета стромальных колоний. Отношение количества колоний
к числу эксплантированных клеток характеризует эффективность
колониеобразования (ЭКОф). По ЭКОф можно судить о числен-
ности КОКф в кроветворных органах, в том числе в условиях
258
патологии у человека, о свойствах КОКф, например, о спектре их
антигенов и рецепторов, о чувствительности КОКф к облучению,
действию цитостатиков и т. д. В последнем случае проводится
сравнение ЭКОф при эксплантации исходных клеточных суспензий
и тех же суспензий, обработанных антителами, лигандами, цито-
статиками или подвергнутых облучению. Тест на КОКф исполь-
зуется также для изучения свойств культуральных потомков ство-
ловых стромальных клеток.
Условия, в которых проводится тест, могут влиять как на ЭКОф,
так и на клеточный состав стромальных колоний. Ниже на примере
костномозговых КОКф описываются последовательные этапы прове-
дения теста и разбирается, как каждый из этих этапов может
влиять на получаемые результаты. Те же приемы культивирования
применяются и для выявления КОКф лимфоидных органов — селе-
зенки, лимфатических узлов и тимуса.
Приготовление клеточных суспензий. КОКф принадлежат к рети-
кулярной строме кроветворных и лимфоидных органов. Все ли ее
клетки связаны между собой одинаковыми по прочности межклеточ-
ными контактами, остается неизвестным. Поэтому разные способы
дезагрегации клеток при приготовлении суспензии могут высво-
бождать из кроветворной ткани различные субпопуляции ее стро-
мальных клеток. Для проведения теста на КОКф используются
два способа получения клеточных суспензий — механическая или
энзиматическая дезагрегация клеток. Механическая дезагрегация
ткани костного мозга проводится в фосфатном буфере путем повтор-
ного пропускания тканевых фрагментов через пастеровскую пипетку,
а затем через шприц с иглами уменьшающегося диаметра. Про-
пускание через шприц должно производиться медленно, чтобы
давление внутри шприца было небольшим. Энзиматическая дезагре-
гация заключается в обработке фрагментов костномозговой ткани
иа магнитной мешалке 0.25 %-ным раствором трипсина с виаказой
или ДНКазой. Трипсинизация продолжается 30 мин при комнатной
температуре, после чего полученную взвесь пропускают несколько
раз через шприц с иглами уменьшающегося диаметра. Обязательный
заключительный этап при приготовлении клеточных суспензий
состоит в их фильтрации через 4-слойный капроновый фильтр для
удаления оставшихся стромальных агрегатов. Контроль за полнотой
дезагрегации проводится путем пробной адгезии. Для этого профиль-
трованные клетки помещают в культуральные матрасы, поверх-
ность которых покрыта полилизином. На 1 см2 поверхности помещают
по 4 • 1 СР клеток, и через 30 мин, когда все клетки успевают
прикрепиться, матрасы фиксируют 80 %-ным этанолом, окрашивают
азур-эозином и определяют, сколько в них находится стромальных
клеточных агрегатов. В правильно приготовленной суспензии их
должно быть не более трех на каждые 106 костномозговых клеток.
Перед эксплантацией костномозговые клетки осаждают центрифуги-
рованием и ресуспензируют в культуральной среде с 2 % сыворотки.
Подсчет клеток в гемоцитометре производится дважды — после
фильтрования и после ресуспензирования в среде с сывороткой.
17*
259
Все манипуляции с момента выделения костного мозга проводятся
при 4 °C, за исключением трипсинизации.
Культуральная среда. Для культивирования используется син-
тетическая среда с добавлением 1(0—20 % сыворотки. Тип культу-
ральной среды может сильно влиять на ЭКОф, и поэтому для каждой
клеточной популяции синтетическую среду следует подбирать и
апробировать. Это в равной степени относится и к сыворотке.
Лучшие результаты получаются пр>и использовании свежеразведен-
ных синтетических сред и сывороток, которые до употребления
хранятся в замороженном состоянии. Тест на КОКф человека,
морских свинок и кроликов может проводиться на среде 199; на
КОКф крыс и мышей — на среде RPMI-1640. Наилучшие результаты
получаются, однако, при использовании свежеприготовленной
среды а-МЕМ. Для КОКф мышей, морских свинок, крыс и кроликов
следует применять эмбриональную сыворотку коров, а для КОКф
человека — человеческую сыворотку IV группы. Сыворотки перед
употреблением не 'подогревают, и очень желательно использовать
специально отобранные партии сывороток, которые обеспечивают
высокую ЭКОф.
Посуда. Для культивирования пригодны стеклянные и пласти-
ковые матрасы, чашки Петри и пластиковые 24-луночные плейты.
КОКф и их культуральные потомки — это высокоадгезивные клетки,
и качество субстрата, к которому они прикрепляются, сильно
влияет на рост колоний. Использование выщелоченной стеклянной
посуды и пластика низкого качества может снижать ЭКОф и неблаго-
приятно рлиять на клеточный состав колоний. При оценке пригод-
ности среды'и посуды для постановки теста ка КОКф следует исхо-
дить из того, что костномозговые клетки, полученные путем меха-
нической дезагрегации, имеют ЭКОф не ниже 3 • 10-5.
Эксплантационная плотность. Фидерные клетки. Правильный
выбор эксплантационной плотности составляет ключевой момент
проведения теста на КОКф. Следует исходить из количества костно-
мозговых клеток, приходящихся на единицу поверхности культу-
рального сосуда, и учитывать при этом два главных момента. Тест
на КОКф основан на том, что концентрация КОКф среди костномоз-
говых клеток не превышает обычно 10”4 в клеточных суспензиях,
полученных путем трипсинизации, и 10~5 в суспензиях механически
дезагрегированных клеток. Поэтому при эксплантации с небольшой
исходной плотностью КОКф оказываются достаточно разобщенными
друг от друга и на 10—12-е сутки, когда стромальные колонии
имеют в своем составе до 104 фибробластов, эти колонии располага-
ются на достаточно большом расстоянии друг от друга, чтобы их
можно было учесть как дискретные очаги фибробластического
роста. В связи'С этим эксплантационная плотность костномозговых
клеток не должна превышать 104 и 103 соответственно для меха-
нически дезагрегированных и трипсинизированных костномозговых
клеток на 1 см2 поверхности культурального сосуда.
В то же время эксплантационная плотность не должна быть
слишком малой, так жак нестромальные костномозговые клетки
260
оказывают на КОКф и их потомков фидерное действие, от которого
зависит ЭКОф [13]. Для КОКф морских свинок, мышей и человека
фидерное действие нестромальных костномозговых клеток выра-
жается в увеличении ЭКОф. Это проявляется в том, что при
повышении эксплантационной плотности ЭКОф возрастает. Мак-
симальная ЭКОф достигается при эксплантационной плотности
порядка 4 • 105 клеток на 1 ем2 для механически дезагрегирован-
ных и трипсинизированных костномозговых клеток. Однако при
этом колонии сливаются между собой, поэтому столь высокая плот-
ность не может применяться для теста на КОКф- Для достижения
нужного фидерного эффекта приходится прибегать к эксплантации
небольшого количества интактных костномозговых клеток, добавляя
в культуру в качестве дополнительного фидера облученные костно-
мозговые клетки, в которых КОКф инактивированы. Клетки облучен-
ного фидера создают, таким образом, нужный эффект плотности и
оказывают фидерное действие на КОКф, находящиеся среди интакт-
ных костномозговых клеток. Инактивация КОКф фидерных клеток
достигается рентгеновским облучением в дозе 60 Гр, которое
сохраняет фидерную активность и ингибирует пролиферацию КОКф-
Фидерные клетки не обязательно должны быть гомологичны
эксплантируемому интактному костному мозгу. Так, для КОКф
человека могут быть использованы облученные костномозговые
клетки крысы и кролика, а для КОКф мышей и морских свинок —
облученные костномозговые клетки морской свинки [13, 14]. Добав-
ление фидерных клеток повышает разрешающую способность теста
на КОКф и стабилизирует его результаты. В присутствии дополни-
тельного фидера обеспечивается четкая линейная зависимость
количества колоний от числа эксплантируемых интактных костно-
мозговых клеток и достигается возможность проводить тест на
КОКф при эксплантации небольших количеств тестируемых клеток.
Для механически дезагрегированных костномозговых клеток доста-
точно эксплантировать не более 3 • 105 костномозговых клеток
на матрас независимо от его площади или не более 3 • 104 клеток
трипсинизированного костного мозга. Количество добавляемых
фидерных клеток определяется площадью культурального сосуда
и должно составлять около 4 • 105 на 1 см2 поверхности сосуда.1
Еще одно важное преимущество дополнительного фидера связано
с тем, что в тех случаях, когда ЭКОф оказывается измененной,
может возникнуть вопрос, зависит ли это от уменьшения количества
КОКф в эксплантированной клеточной популяции или от изменения
ее фидерной активности. В условиях добавления дополнительного
фидера этот вопрос может быть снят. Для этого эксплантацию
следует проводить в два этапа, как это будет указано ниже.
Эксплантация. Для определения ЭКОф исследуемую клеточную
суспензию эксплантируют поровну в три одинаковых культуральных
1 В последнее время было показано, что вместо облученных костномозговых
клеток в качестве дополнительного фидера может быть использовано двадцатикратное
количество облученных тромбоцитов, выделенных из периферической крови человека,
кролика или морской свинки £15}.
261
сосуда. Меньшие колебания в числе колоний между отдельными
культурами получаются, когда клетки, рассчитанные на все матрасы,
разводят во всем объеме полной культуральной среды и затем эту
среду вместе с клетками разливают по матрасам. Матрасы затем
заполняют воздухом с добавлением 5 % СОг и помещают в термостат
на 2 ч. За это время КОКф успевают прочно прикрепиться к поверх-
ности культуральных сосудов. Затем неприкрепившиеся клетки сли-
вают, сосуды промывают культуральной средой без сыворотки и
добавляют нужное количество фидерных клеток в свежей полной
среде. Дальнейшее культивирование проводят при 37 °C в течение
10—12 сут без смены среды. Через 8 сут от начала культивирования
культуры следует проконтролировать в инвертированном микроскопе
и в случае, если колонии достигли больших размеров, что может при
дальнейшем культивировании привести к их слиянию или отделению
от поверхности сосуда, культивирование следует закончить. За
исключением указанного просмотра, перемещать (и в особенности
переворачивать) сосуды в течение срока культивирования не реко-
мендуется.
Подсчет колоний. Для подсчета колоний культуры фиксируют,
предварительно слив среду и промыв матрасы физиологическим
раствором при комнатной температуре. Может быть использован
любой гистологический фиксатор, например 80 %-ный этанол или
формалин. Зафиксированные культуры могут быть окрашены
любыми красителями (включая анилиновые и гематоксилин) или
использованы для проведения гистохимических реакций. Следует
иметь в ‘виду) что для подсчета колоний удобнее заканчивать
культивирование в момент, когда колонии еще не сливаются между
собой, но имеют достаточную клеточную плотность и по возможности
большие размеры. В качестве колонии учитываются все скопления
фибробластов, имеющие в своем составе 50 и более клеток.
Подсчет колоний проводится после окраски с использованием
бинокулярной лупы и обычно не вызывает затруднений. Исключе-
ние могут представлять культуры костного мозга мышей, в которых
может наблюдаться пролиферация макрофагов и миелоидных клеток,
контаминирующих колонии фибробластов. Трудности возникают
из-за сходства, которое макрофаги и фибробласты приобретают
в фиксированных культурах. Для точной их идентификации следует
использовать гистохимическую реакцию на неспецифическую эсте-
разу, ингибируемую фторидом натрия (положительная у макрофагов
и отрицательная у фибробластов) или определение внутриклеточного
коллагена I и III типов с помощью соответствующих антисывороток
(I и III типы коллагена синтезируют фибробласты), а также выявле-
ние Fc- и С-рецепторов (имеются на поверхности макрофагов)
с помощью реакции розеткообразования с эритроцитами, тониро-
ванными иммуноглобулином [3, 4].
Определение концентрации КОКф в клеточных суспензиях и
в исходных гемопоэтических органах по результатам культураль-
ного теста на КОКф. При правильной постановке культуральный
тест на КОКф должен обеспечивать высокую эффективность клони-
262
рования, т. е. должен выявлять в виде образующихся колоний
основную массу эксплантированных КОКф- Проверить, действи-
тельно ли ЭКОф в избранных условиях проведения теста является
стабильной, можно следующим образом. После 2-часовой инкубации
первично эксплантированных костномозговых клеток среда сли-
вается, культуры промываются физраствором и заливаются на 3 мин
0.25 %-ным раствором трипсина. Затем трипсин сливается так,
чтобы дно матраса оставалось влажным, и матрасы инкубируются
при комнатной температуре в течение 20 мин. После этого матрасы
заполняются культуральной средой без сыворотки, энергично встря-
хиваются, и среда вместе с открепившимися клетками переносится
в свежий культуральный сосуд, добавляется до 20 % сыворотки и
культуры инкубируются в термостате в течение 2 ч, после чего в них
добавляется фидер. Культивирование таких матрасов продолжается
в течение того же срока, что и матрасов, в которые была помещена
та же исходная клеточная взвесь, но которые культивировались
обычным способом, т. е. без трипсинизации и переноса клеток в новые
культуральные сосуды. Сравнивая ЭКОф в таких контрольных
культурах и в культурах клеток, открепленных и перенесенных
в новые матрасы, можно судить о стабильности, с которой экспланти-
рованные КОКф формируют колонии фибробластов в избранных
условиях проведения теста.
ЭКОф, установленная в результате проведения культурального
теста, дает возможность оценить, сколько КОКф содержалось
в эксплантированной клеточной суспензии, и отсюда пересчитать,
сколько их находится в кроветворном органе, клетки которого
были подвергнуты эксплантации. Для этого нужно знать, какую
часть содержащихся в соответствующем органе клеток использовали
для культивирования (величина ЭКОф обратна концентрации
КОКф).
Как правило, ЭКОф для трипсинизированных клеток костного
мозга мышей и морских свинок примерно в 10 раз выше, чем для
механически дезагрегированных клеток (для клеток человека и кро-
лика аналогичных данных нет), поскольку при трипсинизации кост-
ного мозга данных животных высвобождаются дополнительные
КОКф. которые при механической дезагрегации повреждаются или
остаются в составе клеточных агрегатов [16]. В связи с этим, оцени-
вая содержание КОКф в костном мозге морских свинок и мышей,
следует отдельно учитывать ЭКОф для трипсинизированных и меха-
нически дезагрегированных клеток.
Пассирование культуральных потомков КОКФ- Для получения
поликлональных и клонированных штаммов костномозговых фибро-
бластов используется пассирование фибробластов из первичных
культур. Поликлональные штаммы получают путем пассирования
всех колоний, выросших в первичной культуре, а клонированные
штаммы — пассированием индивидуальных колоний. При пассиро-
вании определяют количество колоний, выросших в параллельных
матрасах, которые для этого фиксируют и окрашивают. Пассирова-
нию подвергаются клетки, снимаемые трипсином. Нефиксированные
263
матрасы промываются физиологическим раствором для удаления
сыворотки и обрабатываются трипсином в течение 20 мин. Затем
матрасы заполняют культуральной средой без сыворотки, фибро-
бласты отделяют от поверхности культуральных сосудов энергичным
покачиванием, подвергают пипетированию, подсчитывают число сня-
тых клеток и, добавив в среду сыворотку (10—20%), переносят
в свежие матрасы для дальнейшего культивирования. В дальнейшем
такие культуры ведут как обычные диплоидные штаммы фибробла-
стов. Клонированные штаммы получают, пассируя колонии фибро-
бластов по одной. Для этого используют исходные культуры, в кото-
рых колонии фибробластов располагаются на значительном расстоя-
нии друг от друга. Обработку трипсином проводят в течение 5 мин,
затем отдельные колонии снимают желатиновыми губками и губки
вместе с клетками по одной переносят в новый культуральный сосуд,
содержащий свежую культуральную среду с сывороткой. Клетки
из губок вымывают пипетированием, после чего губки удаляют
и проводят культивирование вымытых фибробластов.
Клетки первых двух пассажей могут иметь незначительную конта-
минацию макрофагами, но затем примесь макрофагов практически
отсутствует. Успешному пассированию могут быть подвергнуты
стромальные фибробласты людей, морских свинок и кроликов, но не
мышей.
Проведение теста на КОКф может быть осуществлено с исполь-
зованием сред отечественного производства, а также эмбриональ-
ной сыворотки коров, выпускаемой ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи.
В качестве культуральных сосудов морут использоваться чашки
Карреля и стеклянные матрасы отечественного производства. При-
менение чашек Петри и плейтов требует культивирования в СОг-
инкубаторе. При культивировании в сосудах, закрываемых гермети-
чески, тест проводится в обычном термостате.
Литература
1. (Фриденштейн А. Я., Чайлахян Р. К-, Лалыкина К- С.) Fridenshtein А. 1а.,
Chailachan R. К-, Lalikina К- S. Development of fibroblast colonies in monolayer
cultures of guinea pig bone marrow and spleen cells // Cell Tissue Kinet. 1970.
Vol. 3. P. 393—403.
2. (Фриденштейн А. Я-, Дериглазова Ю. Ф., Кулагина H. H. и др.) Friden-
shtein A. la., Deriglasova Ju. F., Kulagina N. N. et al. Precursors for
fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by in
vitro colony assay method // Exp. Hematol. 1974. Vol. 2. P. 83—92.
3. (Фриденштейн А. Я-, Лациник H. В., Грошева А. Г., Горская Ю. Ф.)
Fridenshtein A. la., Latsinik N. V., Grosheva A. G., Gorskaya Ju. F. Marrow
microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated
and cultured cells in porous sponges // Exp. Hematol. 1982. Vol. 10. P. 217—227.
4. Лациник H. В., Горская Ю. Ф., Грошева А. Г. и др. Содержание стромальных
колониеобразующих клеток (КОКф) в костном мозге мышей и клональная
природа образуемых ими колоний фибробластов//Онтогенез. 1986. Т. 17,
№ 1. С. 27—36.
5. Кейлис-Борок И. В., Лациник Н. В., Епихина С. Ю., Фриденштейн А. Я.
Динамика формирования колоний фибробластов в монослойиых культурах
костного мозга по данным включения Н3-тимидина // Цитология. 1971. Т. 13,
№ 11. С. Г402—1409.
264
6. (Фриденштейн А. Я.) Fridenshtein A. Ja. Precursor cells of mechanocytes //
Intern. Rev. Cytol. 1976i Vol. 47. P. 327—359.
7. Чайлахян P. К., Герасимов Ю. В., Фриденштейн А. Я- Содержание в костном
мозге остеогенных клеток-предшественников и их размножение в культурах //
Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1984. Т. 98, № 11. С. 605—608.
8. Герасимов Ю. В., Фриденштейн А. Я., Чайлахян Р. К-, Шишкова В. В. Дифферен-
цировочные потенции клональных штаммов костномозговых фибробластов // Бюл.
эксперим. биологии и медицины. 1986. Т. 101, № 6. С. 717—719.
9. Owen. М. Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system //
Bone Mineral Res. 1985. Vol. 3. P. 1—25.
10. Фриденштейн А. Я-, Лурия E. А. Клеточные основы кроветворного микроокруже-
ния. М., 1980. 214 с.
11. (Фриденштейн А. Я., Чайлахян Р. К-, Лациник Н. В. и др.) Fridenshtein A. Ja.,
Chailachan R. К-, Latsinik N. V. et al. Stromal cells responsible for transferring
the microenvironment of the hemopoietic tissues // Transplantation. 1974. Vol. 17.
P. 331-340.
12. Фриденштейн А. Я., Чайлахян P. K-, Лациник H. В. и др. Стромальные клетки,
ответственные за перенос микроокружения в кроветворной и лимфоидной
ткани//Проблемы гематол. перелив, крови. 1973. № 10. С. 14—23.
13. (Фриденштейн А. Я-, Горская Ю. Ф., Кулагина Н. Н.) Fridenshtein A. Ja.,
Gorskaya Ju. F., Kulagina N. N. Fibroblast precursors in normal and irradiated
mouse hemopoietic organs // Exp. Hematol. 1976. Vol. 4. P. 267—274.
14. Кулагина H. H., Лурия E. А., Астахова В. С., Генкина Е. U. K методике клониро-
вания стромальных клеток костного мозга человека // Пробл. гематологии и пере-
ливания крови. 1981. № 11. С. 39—41.
15. Лациник Н. В., Горская Ю. Ф., Павленко Р. Г., Фриденштейн А. Я. Содержание
стромальных клоногенных клеток в костном мозге мышей//Бюл. эксперим.
биологии и медицины. 1986. Т. 101, № 4. С. 468—471.
16. Лациник Н. В., Сидорович С. Ю., Фриденштейн А. Я. Влияние трипсинизации
костного мозга на эффективность образования колоний фибробластов в моно-
слойных культурах//Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1981. Т. 91, № 9.
С. 356—358.
Поддержание кроветворения и лимфопоэза
в культурах на стромальных подложках
С. А. Кузнецов
- Институт эпидемиологии и микробиологии
им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР,
Институт химической физики АН СССР, Москва ,
Последнее десятилетие ознаменовалось значительным прогрессом
в области культивирования кроветворной и лимфоидной ткани.
Культивирование гемопоэтической ткани развивалось в нескольких
направлениях. В культурах стромального компонента кроветворных
и лимфоидных органов были изучены свойства клеток, создающих
кроветворное микроокружение [1]. В полутвердых культуральных
средах (агаровый и метилцеллюлозный гели и плазменный сгусток)
удалось клонировать практически все существующие в кроветворной
ткани коммитированные клетки-предшественники гемо- и лимфопоэза
(см. [2]). При добавлении лимфокина из культур лимфоцитов,
стимулированных митогенами, в полутвердом геле были получены ко-
лонии, образуемые непосредственно полипотентными стволовыми
кроветворными клетками — СКК [3], а в суспензионных культу-
рах — длительно пассируемые линии диплоидных Т-лимфоцитов [4].
265
Каждая из этих культуральных систем имеет свои преимущества,
однако клеточные компоненты кроветворной либо лимфоидной ткани
представлены в них порознь, а из всего многоступенчатого процесса
кроветворения осуществляются, как правило, один или несколько
этапов. Наиболее полного приближения к естественному ходу гемо-
поэза позволяют достичь культуры кроветворных и лимфоидных
клеток на стромальной подложке.
Впервые такая культуральная система была разработана
Е. А. Лурия с соавторами в ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи (Москва):
в органных культурах фрагментов печени мышиных эмбрионов
размножение СКК и миелоидное кроветворение поддерживаются
около 10 нед и находятся в тесной зависимости от состояния
стромальной ткани — печеночного эпителия (см. [5]). Перспектив-
ной представляется система культивирования клеточных суспензий
кроветворных органов в коллагеновом геле, где развиваются колонии
стромальных фибробластов [6], тесно связанные с областями актив-
ного гемопоэза [7]. Однако наиболее разработанной и открывающей
самые широкие возможности для всестороннего изучения гемопоэза
является в настоящее время система, предложенная Декстером [8]
для культивирования костного мозга мыши, а позднее приспособлен-
ная для костного мозга тупайи и человека. Особенностью этой си-
стемы является ее двухфазность, благодаря которой кроветворные
и лимфоидные элементы становятся доступными для использования
в клинических целях и всестороннего исследования без какого-либо
повреждения стромальной подложки.
В последние годы на основе декстеровских культур разработана
система культивирования, позволяющая в присутствии стромального
подслоя получить длительную пролиферацию и дифференцировку
лимфоидных клеток мыши.
< •>
Приготовление декстеровских культур
Декстеровские культуры костното мозга мыши. В своем «клас-
сическом» виде методика состоит из, двух этапов: получения адгезив-
ного слоя и вторичной подсадки костномозговых клеток. Пригодны
мыши почти всех линий, исключению составляют животные генотипа
Н-2К (линии СЗН и в ряде случаев СВА), костномозговые клетки
которых образуют адгезивный сло1й, но не годятся для вторичной
подсадки [8—10]. Пол мышей, по-вадимому, не играет существенной
роли; предпочтительно брать костный мозг молодых и здоровых
животных.
Первоначально для культивирования употребляли плоскодонные
стеклянные сосуды, затем было доказано, что вполне пригодны
стандартные пластиковые матрасы ((«Falcon», «Corning» и др.) с пло-
щадью дна 25 см2. Такие матрасы, как правило, являются одноразо-
выми; в случае повторного использювания их стерилизуют у-облуче-
нием.
266
г
Для установления адгезивного слоя в культуральный сосуд, со-
держащий 10 мл (можно 7—8 мл) среды, выдувают содержимое
одной бедренной кости. Кость только что убитого животного очищают
от мышц, отрезают оба эпифиза и в медуллярную полость вставляют
надетую на шприц (5 мл) иглу, по своему диаметру соответствующую
костномозговому каналу. Средой, содержащейся в шприце, костный
мозг выдувают прямо в матрас. Этот момент — один из самых прин-
ципиальных, поскольку костный мозг следует выдуть таким образом,
чтобы он имел вид мелких фрагментов. Авторы методики не указы-
вают, каким образом им удалось стандартизировать процедуру выду-
вания. Мы добивались нужного результата одним из двух приемов:
можно научиться обрезать противоположный игле эпифиз так, что
остается тонкая пластинка губчатой кости, служащая как бы реше-
том, либо (что проще), вставив иглу, сначала набрать часть костного
мозга в шприц, а затем выдуть все содержимое шприца через костно-
мозговую полость в матрас.
Показано, что при выдувании костного мозга в виде мелких фраг-
ментов установление адгезивного слоя и последующее кроветворение
на нем протекают успешнее, чем в культурах, куда эксплантируют
суспензию дезагрегированных костномозговых клеток [8, 11, 12].
Однако удовлетворительные культуры получают и в тех случаях,
когда в матрас помещают клеточную суспензию костного мозга
в количестве 1 • 107 клеток, что приблизительно соответствует содер-
жимому одной бедренной кости [13—15], либо 5 • 106—5 • 107 кле-
ток [10, 16]. Нам удавалось получить образование адгезивного слоя,
поддерживающего кроветворение, при эксплантации суспензии кле-
ток, полученной путем обработки костного мозга 0.25 %-иым раство-
ром трипсина (30 мин на магнитной мешалке в силиконизированной
посуде при комнатной температуре). После ферментативного воздей-
ствия в сосуд добавляли 2 % сыворотки, ресуспензировали клетки
при 4 °C многократным пипетированием пастеровской пипеткой,
фильтровали через 4-слойный капроновый фильтр (для удаления
клеточных агрегатов), центрифугировали (10 мин, 900 об/мин), оса-
док ресуспензировали в свежей среде и помешали по 1 • 107 ядерных
клеток в матрас.
При любом из этих способов эксплантации показателем успеш-
ного культивирования служит образование многослойного пласта
адгезивных клеток, покрывающего дно сосуда (следует подчеркнуть,
что наблюдение за развитием адгезивной подложки желательно вести
с помощью инвертированного микроскопа, не переворачивая матрас).
По-видимому, независимо от способа эксплантации, необходимо
прежде всего образование сплошного адгезивного слоя: при низкой
плотности клеток в слое гемопоэз осуществляется хуже [10].
Через 3 иед, когда все дно матраса оказывается покрытым адге-
зивным слоем, а количество неприкрепляющихся клеток и СКК
сильно падает, среду с плавающими клетками удаляют и на ее место
поверх адгезивного слоя помешают в 10 мл свежей среды суспензию
клеток сингенного свежеизолированного костного мозга (по 1 • 107
клеток на матрас). В дальнейшем 1 /2 среды меняют еженедельно, как
267
и в течение первых 3 нед, предшествующих вторичной подсадке.
Процедуру вторичной подсадки и смены среды следует производить
с осторожностью, чтобы не вызвать открепления адгезивного слоя.
Поскольку декстеровские культуры являются весьма длительными,
особое внимание должно быть уделено стерильности, чтобы из-
бежать грибкового или бактериального заражения культур. С этой
целью необходимо обеспечить горизонтальное положение матра-
сов в термостате, что позволяет сохранять сухими горлышко и
пробку.
В некоторых случаях продолжительное кроветворение удается
получить, осуществляя вторичную подсадку (3—5) • 10б костномоз-
говых клеток уже через 1 нед после первичной эксплантации. Эти
клетки не обязательно должны быть сингенны адгезивному слою:
размножаться могут и аллогенные [8—10], но не ксеногенные [17]
гемопоэтические клетки. Адгезивный костномозговой слой поддержи-
вает пролиферацию эмбриональных мышиных кроветворных клеток,
полученных из печени либо желточного мешка [9]. Наконец, дли-
тельное кроветворение может протекать вообще без вторичной под-
садки: при этом количество клеток неадгезивной фракции первона-
чально резко падает, а с 3-й недели снова начинает возрастать.
Вероятно, при некоторых условиях культивирования часть первона-
чально введенных СКК может доживать до того периода, когда уста-
навливается адекватная стромальная подложка, и давать начало
последующему кроветворению.
Смену среды (на 1 /г) можно осуществлять дважды в неделю, что
не сказывается на продолжительности кроветворения; более частые
смены отрицательно влияют на гемопоэз, приводя к истощению попу-
ляции СКК [14]. Даже если среду еженедельно менять полностью,
удаляя все неприкрепляющиеся клетки, СКК образуются и поддер-
живаются в течение нескольких месяцев [18].
Рассмотрим другие параметры декстеровской системы. Культу-
ральная среда содержит 20—25 % сыворотки и антибиотики (как
правило, пенициллин и стрептомицин — по 100 ед/мл). Тип применя-
емой среды не является критическим. Помимо среды Фишера, исполь-
зуемой в большей части работ, успешно применяются среда Игла
в модификации Дальбекко (ДМЕМ) [10, 16] и альфа-модификации,
среда Мак-Коя 5А [7]. Для разведения сухих сред следует пользо-
ваться тридистиллированной водой; сразу после разведения среду
стерилизуют фильтрацией через миллипоровый фильтр с диаметром
пор 0.45 мкм или (лучше) 0.22 мкм. Напротив, тип сыворотки играет
решающую роль. Первоначально было показано, что длительный
гемопоэз происходит только при использовании некоторых партий
лошадиной сыворотки («Flow»); все прочие сыворотки оказываются
неспособными к поддержанию кроветворения in vitro [11, 14, 15,
19]. Однако в дальнейшем оказалось, что добавление в культуры
Ю-10—КГ6 М гидрокортизона (гемисукцинат натрия) приводит
к тому, что 12 из 16 «неэффективных» партий лошадиной сыворотки,
а также часть партий эмбриональной сыворотки коров и коз при-
обретают способность длительно поддерживать гемопоэз. Некоторые
268
другие кортикостероиды и минералкортикоиды также эффективны
в этом отношении [19].
Наш собственный опыт в отношении сыворотки состоит в том, что
ни одна из доступных лошадиных сывороток (в том, числе и после
разрушения комплемента нагреванием'при 56 °C) не-способствовала
развитию адекватной адгезивной подложки и поддержанию гемо-
поэза. Напротив, часть партий эмбриональной сыворотки коров (про-
изводства ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи) при условии добавления в куль-
туры 10-7 М гидрокортизона оказалась вполне удовлетвори-
тельной.
Газовая фаза декстеровских культур состоит из смеси воздуха
с 5 % (или 7.5 %) СО2. Оптимальная температура не 37 °C (темпера-
тура, обычно применяемая для культивирования тканей теплокров-
ных животных), а 33 °C — при этой температуре плотность культур
и количество СКК в несколько раз выше, а адгезивный слой разви-
вается лучше [14, 19]. При 37 °C также удается воспроизвести си-
стему с длительным поддержанием кроветворения [10].
При соблюдении рассмотренных выше условий в культурах дли-
тельно, в течение 9—18 нед, поддерживаются линия СКК и морфо-
логически различимый гемопоэз [9, 12, 14, 17, 18, 20].
Декстеровские культуры костного мозга человека. Получение
декстеровских культур костного мозга человека сопряжено с боль-
шими трудностями, чем для мышиного костного мозга, хотя принципы
культивирования остаются по существу теми же. Костный мозг
получают путем пункции или биопсии подвздошной кости [17, 21 —
23], либо хирургически из ребер нормальных доноров [21,22, 24, 25].
Эксплантируют либо фрагменты, не разбивая их до состояния кле-
точной суспензии [18, 23, 26], либо суспензию дезагрегированных
костномозговых клеток в количестве 5j • 106—2 • 107 клеток на стан-
дартный матрас [24, 25]. Существуют данные, что при эксплантации
суспензий культуры развиваются успешнее [21]. После образования
адгезивного слоя на него подсаживают 1 • 107 клеток сингенного
[17, 23] или (0.5—1) • 1 О’ клеток аллогенного костного мозга [24,
25], либо клетки костного мозга вообще не добавляют [21, 26].
Используют культуральные среды разного состава: среду Фишера
с 20 % лошадиной сыворотки [17, 24—26], среду Игла в альфа-
модификации с той же сывороткой [23], среду Фишера с эмбриональ-
ной сывороткой коров [24, 25], среду Мак-Коя 5А с 12.5 % лоша-
диной и 12.5 % эмбриональной сыворотки коров [21, 22]. Как и
в мышиных культурах, весьма положительный эффект оказывает
добавление Ю 6—10-7 М гидрокортизона [21, 24—26]. Для культур
костного мозга человека температура 37 °C предпочтительнее,,чем
33 °C [17, 23, 26], либо разницы между культурами при обеих темпе-
ратурах не обнаруживается [25].
В растущих культурах поддерживаются линия коммитированных
клеток — предшественников гранулоцитов и макрофагов — КОЕ-К
(т. е., вероятно, и линия полипотентных СКК) и морфологически
различимый гемопоэз. Сроки поддержания кроветворения лишь в не-
которых работах приближаются к 20 нед [21, 22], а в большинстве
269
случаев ограничиваются 7—9 не/д [17, 23—26], что существенно
уступает продолжительности гехиопоэза в мышиных культурах.
Причину этого связывают с тем, ч!то в значительной части культур
клеток человека наблюдается преждевременное сокращение и откреп-
ление адгезивной подложки, причем гемопоэз падает пропорцио-
нально степени ее потери [17, 23, 25]. Величина открепления обратно
пропорциональна концентрации гидрокортизона (в пределах 10-8—
10-5 М), но высокие его дозы шнгибируют образование КОЕ-К
[24].
I Характеристики кроветвореиия и лимфопоэза
: в декстеровских культурах
Декстеровские культуры имеют чрезвычайно выразительную мор-
фологию: в жидкой фазе плаваю'Т большие компактные «облака»
кроветворных клеток, рыхло связанных с подложкой. Тесно располо-
женные созревающие кроветворные клетки, лежащие на поверхности
подслоя, образуют имеющие четкие: контуры территории, напоминаю-
щие булыжную мостовую.
Стромальная подложка абсолютно необходима для длительного
гемопоэза; при ее отсутствии кроветворение быстро (за 1—3 нед)
угасает [И, 12, 14, 15, 20]. Слои адгезивных клеток некостномозго-
вого происхождения неспособны поддерживать длительный гемопоэз
(см. [27]). Таким образом, костномюзговая подложка функционирует
в декстеровских культурах как крсоветворное микроокружение.
Стромальная подложка, выстилающая все дно культурального
сосуда, является многослойной структурой, гетерогенной по своему
составу [12, 13, 17, 18, 21, 23, 25]. Она образуется адгезивными
клетками костного мозга, к которым относят стромальные механо-
циты (фибробласты, ретикулярные клетки), макрофаги, клетки эндо-
телия и жировые клетки; какой жменно из этих клеточных типов
реально обеспечивает поддержание гемопоэза in vitro, окончательно
не установлено [10, 11, 13, 14, 16„ 20, 21, 25, 26, 28]. В мышиных
культурах подавляющее большинстгво морфологически гетерогенных
клеток подложки обладает важнейшими маркерными признаками
фибробластов и лишено маркерныхс признаков макрофагов и эндоте-
лия (синтезирует коллаген I и ПП типов и фибронектин, не несет
рецепторов к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, не окрашивается на
коллагены IV и V типов и ламинин) [28]. Входящие в состав под-
ложки жировые клетки, которым ряд авторов отводят первостепен-
ную роль в поддержании гемопоэза [12—14, 19, 21, 26], также,
по-видимому, являются видоизмененными фибробластами (см. [27]).
В адгезивном слое декстеровскиж культур присутствуют клетки,
обладающие остеогенными свойствами [29]. Все эти факты позво-
ляют предположить, что основным! клеточным типом, поддержива-
ющим гемопоэз в декстеровских культурах, являются костномозговые
фибробласты. Окончательно прояснить этот вопрос позволило бы
использование в качестве подложки декстеровских культур чистых
(предпочтительно клонированных) штаммов диплоидных стромаль-
270
них клеток строго определенных типов: остеогенных и неостеогенных
фибробластов и эндотелия. По предварительным данным клониро-
ванные штаммы костномозговых фибробластов человека длительно
поддерживают гемопоэз in vitro [30].
Кроветворение в декстеровских культурах протекает как в суспен-
зии, так и в адгезивном слое, который является главным местом обра-
зования СКК [11]- Количество плавающих клеток в культурах
костного мозга мыши поддерживается на уровне 10—60 %, СКК —
10—50 %, КОЕ-К— 15—25 % от первоначального [14, 28]. СКК
декстеровских культур функционально нормальны и сохраняют высо-
кие дифференцировочные потенции: защищают летально облученных
мышей, образуют при трансплантации все типы селезеночных коло-
ний [8, 11, 14, 18], продуцируют нормальные В-лимфоциты и раз-
личные субпопуляции Т-лимфоцитов. Непосредственно в декстеров-
ских культурах СКК в течение многих недель образуют весь спектр
коммитированных предшественников гемо- и лимфопоэза (см. [27]).
Однако не все типы предшественников созревают. Уже после 1-й не-
дели в мышиных культурах не остается ни морфологически различи-
мых эритроидных клеток, ни лимфоцитов [8, 12, 17, 18]; гемопоэтиче-
ская дифференцировка приводит к образованию нейтрофильных гра-
нулоцитов, макрофагов и мегакариоцитов [И, 12, 17, 18].
Особенностью культур костного мозга человека является длитель-
ный лимфопоэз и морфологически различимый эритропоэз, идущий
до 3 нед в отсутствие экзогенного эритропоэтина [17, 23, 25].
Регуляция пролиферации и дифференцировки кроветворных кле-
ток осуществляется в декстеровских культурах как путем локальных
взаимодействий с клетками адгезивной подложки [11, 12, 21], так и
посредством синтезируемых стромальными клетками гуморальных
факторов: белков, регулирующих пролиферацию СКК (NBME-1V
и RBME-III), мукополисахаридов, возможно— колониестимулирую-
щего фактора (см. [27]).
Фактически декстеровскне культуры — едва ли не первая мно-
гокомпонентная тканевая система in vitro, в которой длительно
осуществляются морфогенетические межклеточные взаимодействия,
обеспечивающие полную клеточную дифференцировку и поддержа-
ние популяции пролиферирующих клеток в равновесном состоянии.
Поскольку иммунокомпетентные клетки исчезают из человеческих
культур раньше, чем затухает кроветворение, кажется вполне реаль-
ным, что клетки из поздних культур могут восстанавливать гемопоэз
у облученных людей, не вызывая реакции «трансплантат против
хозяина». В длительных декстеровских культурах возможно отделить
лейкозные стволовые клетки от нормальных СКК и затем произвести
аутотрансплантацию последних облученному больному [9]. Взаимо-
действие со стромальным подслоем декстеровских культур человека
вызывает дифференцировку некоторых лейкозных клеточных линий
(см. [27]).
Описана злокачественная трансформация декстеровских культур,
как спонтанная, так и индуцированная введением лейкемогенов
и вирусов, что делает систему перспективной для вирусологических
271
и онкологических исследований. Гемопоэз в декстеровских культурах
весьма чувствителен к экзогенным факторам различной природы
(см. [27]); это позволяет использовать культуры для тестирования
биологически активных веществ, в частности лекарственных препа-
ратов. Перспективным представляется использование адгезивных
слоев декстеровских культур для наработки гуморальных регулято-
ров кроветворения. Очевидно, что перечисленные проблемы далеко
не исчерпывают круг задач, для решения которых декстеровские
культуры могут найти применение.
Лимфопоэз в культурах иа стромальной подложке \
Система, позволяющая получить in vitro длительную пролифера-
цию и дифференцировку В-лимфоцитов, по ряду параметров сущест-
венно отличается от декстеровской системы культивирования. Для
эксплантации используют костный мозг мышей.многих линий (наи-
лучшие культуры получены с линией BALB/c) 3—4-недельного воз-
раста; использование более взрослых мышей дает неудовлетвори-
тельные результаты. Бедренные кости выделяют немедленно после
умерщвления животного; все последующие операции проводят строго
на холоду [31 ]. 1-Костный мозг выдувают из медуллярной полости
в среду RPMI-1640 с 5 % эмбриональной сыворотки коров [32], раз-
бивают осторожным пипетированием стеклянной пипеткой, осаждают
центрифугированием и ресуспензируют в полной среде, доводя
концентрацию до 1 • 106 ядерных клеток в 1 мл. Полученную суспен-
зию не фильтруют, оставляя часть клеток в маленьких агрегатах
[31]. ‘
Для культивирования используют различные пластиковые сосуды
(чашки Петри,?-матрасы, плэйты с колодцами); плотность эксплан-
тации клеток для всех сосудов с площадью дна 20 см2 и более соблю-
дается постоянной: (2.5—2.6) 105 клеток на 1 см2 Культуральная
среда имеет следующий состав: RPMI-1640 с 5 % эмбриональной
сыворотки коров, 5 • 1О'“2 М 2-меркаптоэтанола, 50 ед/мл пеницил-
лина и 50 мкг/мл стрептомицина [31] . При более высоких концентра-
циях сыворотки в составе адгезивного слоя разрастаются категории
стромальных клеток, в дальнейшем не способствующие поддержанию
лимфопоэза. То же может произойти, если вместо RPMI-1640 исполь-
зовать среду ДМЕМ (хотя для более поздних этапов культивирова-
ния она вполне пригодна). Партию эмбриональной сыворотки коров,
благоприятную для развития адгезивного слоя и последующего
лимфопоэза, необходимо подобрать заранее. Культивирование осу-
ществляют в СО2-инкубаторе (6 % СО2 в воздухе) при температуре
37 °C. Подкормку культур производят дважды в неделю: каждые 3—
4-е сутки добавляют небольшую порцию (2/5 от общего количества)
свежей среды, каждые 7-е сутки отбирают большую часть (около
75 %) старой среды, замещая ее таким количеством свежей, чтобы
восстановить исходный объем.
Поставленные таким образом культуры проходят 4 последова-
тельные фазу развития. В течение 1-й фазы (1—3 нед культивирова-
272
ния) на дне сосуда возникает и разрастается адгезивная подложка:
к концу 2-й недели она состоит из стромальных очагов, которые,
разрастаясь, к исходу 3-й недели сливаются, образуя конфлюэнтный
подслой. Какая категория адгезивных клеток ответственна за после-
дующее поддержание лимфопоэза, остается .неизвестным. Во всяком
случае, эту роль играют не жировые клетки, которых в адгезивном
слое мало [31]; повышенное их количество указывает лишь на
высокую концентрацию в сыворотке кортикостероидов, ингибирую-
щих рост и дифференцировку лимфоцитов и стимулирующих размно-
жение гранулоцитов и макрофагов [31., 33]. Непригодными (в отли-
чие от декстеровской системы) являются и такие культуры, в которых
адгезивные очаги, соприкасаясь, не прекращают свой рост, а фор-
мируют многослойные пласты. Количество неадгезивных клеток в те-
чение 1-й недели падает и в конце ее стабилизируется на уровне
(1 —*-2) • 105 клеток/мл. Миелопоэз затухает к концу 3-й недели куль-
тивирования, когда более 50 % плавающих клеток имеет мсффологию
лимфоцитов.
В течение 2-й фазы (3—6 нед после эксплантации) количество
неадгезивных клеток падает почти до нулевых значений. Затем (на-
чало 3-й фазы) на поверхности адгезивного слоя появляются малень-
кие фокусы круглых клеток, легко уходящих в среду при покачивании
и имеющих на мазке морфологию лимфоцитов. Число круглых клеток
(как плавающих, так и связанных с подложкой) быстро растет
и через 2—3 нед достигает концентрации (1—3) • 10° клеток/мл;
на этом уровне оно сохраняется в течение нескольких месяцев культи-
вирования. В ранних (до 10 нед) культурах 70—80 % круглых
клеток проявляет положительную реакцию на цитоплазматические
иммуноглобулины, но не несет поверхностных иммуноглобулинов,
т. е. является пре-В-лимфоцитами. Позднее доля клеток, несущих
мембранные IgM, увеличивается, достигая 80—100 %, чго иллюстри-
рует созревание В-лимфоцитов; еще позднее преобладающими ста-
новятся В-лимфониты, несущие также мембранные IgD [31]. Попу-
ляция синтезируемых В-лимфоцитами тяжелых и легких цепей имму-
ноглобулинов является гетерогенной; это означает, что в культурах
образуются предшественники В-клеток, несущие неперестроенные
гены иммуноглобулинов (лимфоидные стволовые клетки) [31, 33].
Другое доказательство наличия в культурах ранних, недифференци-
рованных, предшественников линии В-лимфоцитов состоит в том, что
клетки из таких культур могут репопулировать дефектный В-клеточ-
ный компартмент у CBA/N иммунодефицитных мышей [32]. Клетки,
секретирующие иммуноглобулины, в культурах отсутствуют. Не обна-
ружены также клетки, несущие поверхностные антигены Thy-'l или
А1ас-1, и клетки, способные к образованию колоний в селезенке
облученных мышей, т. е. СКК [32]. В культурах содержатся лимфо-
циты, которые могут быть трансформированы -вирусом мышиной
лейкемии Абельсона; в результате образуются автономные клональ-
ные клеточные линии, удобные для биохимического анализа [31,
33, 34].
Через 6 и более месяцев культивирования может наступить
18 Заказ 1789 273
4-я фаза. В некоторых культурах количество неадгезивных клеток
резко увеличивается (до 1 • 10' клеток/мл), они быстро пролифери-
руют и могут вызывать развитие опухолей у животных. Иммуно-
глобулины, синтезируемые в 4-й фазе, существенно менее гетерогенны
и часто являются моноклональными.
В описанных культурах присутствие адгезивной подложки необ-
ходимо для пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов. Адге-
зивный слой длительно сохраняется неизменным, однако через 14—
16 нед часто теряет способность к поддержанию В-лимфоцитов.
Продлить лимфопоэз можно, если перенести лимфоциты на свежий
адгезивный слой; клетки костного мозга для его выращивания экс-
плантируют с меньшей исходной плотностью— (0.75—1) • 105 кле-
ток иа 1 см2 поверхности сосуда. Полученные таким способом куль-
туры к концу 3-й недели конфлюэнтны на 30—50 %, свободны от
собственных лимфоидных клеток и пригодны для добавления В-лим-
фоцитов. Последние (в 1—2 мл среды) извлекают из исходной куль-
туры, осторожно пипетируют и добавляют в кондиционированную
среду поверх свежего адгезивного слоя. Плотность клеток в новых
культурах достигает исходных значений за 2—3 нед при первом
переносе и за 4—7 сут при более поздних переносах [31]. В случае
переноса плавающих клеток в сосуд, лишенный адгезивной под-
ложки, лимфоциты прекращают пролиферацию и гибнут в течение
нескольких суток [33]. Адгезивный слой можно неоднократно пасси-
ровать (при помощи коллагеназы) с сохранением способности к под-
держанию лимфопоэза [31]. Наконец, лимфоциты, выделенные из
культур, могут быть клонированы методом лимитирующих разведе-
ний в колодцах с предварительно выращенной адгезивной подлож-
кой. Полученные клональные линии пре-В- и В-клеток синтезируют
один вид тяжелых цепей и (в случае В-клонов) один вид легких
цепей иммуноглобулинов [31, 34].
Адгезивные слои костномозговых клеток способны поддерживать
пролиферацию и дифференцировку эмбриональных В-лимфоцитов.
Суспензию клеток печени 14—17-суточных мышиных эмбрионов при-
готовляют описанным выше методом и в концентрации 1 • 106 кле-
ток/мл наслаивают на заранее выращенный адгезивный слой костно-
мозгового происхождения. Через 3—4 сут добавляют порцию свежей
среды, через 7 сут переносят все неадгезивные клетки на новую
костномозговую подложку; дальнейшее культивирование ведут по
стандартной схеме. Существенно, что адгезивный слой, установлен- „
ный клетками самой эмбриональной печени, неспособен поддержи-
вать длительный рост лимфоидных клеток. Более того, необходимость
переноса на свежую подложку, по-видимому, означает, что адгезив-
ные клетки эмбриональной печени ингибируют лимфопоэз. Как и
в культурах костного мозга, в культурах эмбриональной печени
количество пре-В-лимфоцитов начинает расти после 4—6-й недели
культивирования. Напротив, клетки, несущие поверхностные иммуно-
глобулины, на всех стадиях весьма малочисленны. Следовательно,
в культурах эмбриональной печени преобладают лимфоциты, находя-
щиеся на более ранней стадии В-клеточиой дифференцировки, чем
274
в культурах костного мозга; такие незрелые лимфоциты могут
сохраняться in vitro в течение 3 мес и дольше [32].
Рассмотренная система культивирования позволяет получать
очищенные (в том числе клональные) В-клеточные популяции. Она
весьма перспективна для анализа ряда вопросов клеточной иммуно-
логии, в частности ранних этапов В-лимфоцитарной дифференци-
ровки, развития В-лимфоцитов в отсутствие Т-клеточных влияний,
молекулярных процессов, вовлеченных в созревание В-клеток, вирус-
ной трансформации, антигенной и митогенной активации лимфоцитов
[31, 32, 34], а также вопросов стромально-лимфоцитарных взаимо-
действий и выявления категорий стромальных клеток, необходимых
для поддержания лимфопоэза.
Литература
1. Фриденштейн А. Я-. Лурия Е. А. Клеточные основы кроветворного микро-
окружения. М., 1980. 214 с.
2. Metcalf D. The granulocyte-macrophage colony stimulating factors//Cell. 1985.
Vol. 43. P. 5—6.
3. Messner H. A., Fauser A. A., Lepine J., Martin M. Properties of human pluripotent
hemopoietic progenitors // Blood Cells. 1980. Vol. 6. P. 595—603.
4. Cheever M. A., Greenberg P. D., Fefer A., Gillis S. Augmentation of the anti-tumor
therapeutic efficacy of long-term cultured T lymphocytes by in vivo administration
of purified interleukin 2//J. Exp. Med. 1982. Vol. 155. P. 968—980.
5. Лурия E. А. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах. М., 1972. 176 с.
6. Кузнецов С. А. Образование колоний фибробластов в культурах клеток костного
мозга и селезенки в трехмерном коллагеновом геле // Докл. АН СССР. 1976. Т. 230.
№ 5. С. 1214—1217.
7. Lannote М., Schor S., Dexter Т. М. Collagen gels as a matrix for haemopoiesis //
J. Cell. Physiol. 1981. Vol. 106. P. 269—277.
8. Dexter T. M., Allen T. D., Lajtha L. G. Conditions controlling the proliferation of
haemopoietic stem cells in vitro//J. Cell. Physiol. 1977. Vol. 91. P. 335—344.
9. Moore M. A. S., Dexter T. M. Stem cell regulation in continuous hematopoietic
cell culture//Transplant. Proc. 1978. Vol. 10. P. 83—90.
10. Reimann J., Burger H. In vitro proliferation of haemopoietic cells in the presence
of adherent cell layers. 1. Culture conditions and strain dependence // Exp. Hematol.
1979. Vol. 7. P. 45—51.
11. Dexter T. M. Haemopoiesis in long-term bone marrow cultures. A review// Acta
haematol. 1979. Vol. 62. P. 299—305.
12. Dexter T. M. Cell interactions in vitro // Clin. Haematol. 1979. Vol. 8. P. 453—468.
13. Allen T. D., Dexter T. M. Cellular interrelationships during in vitro hematopoiesis //
Differentiation. 1976. Vol. 6. P. 191—194.
14. Dexter T. M„ Moore M. A. S., Sheridan A. P. C. Maintenance of hemopoetic cells
and production of differentated progeny in allogenic and semiallogenic bone marrow
chimeras in vitro//J. Exp. Med. (USA). 1977. Vol. 145. P. 1612—1616.
15. Dexter T. M„ Allen T. D., Lajtha L. G. Factors controlling the proliferation of
haemopoietic stem cells in vitro // Molecular control of proliferation and differen-
tiation. New York etc., 1978. P. 149—160.
16. Wictor-Jedrzejczak IF., Ahmed A., Szczylik C. Conditions of adherent cell growth in
murine bone marrow liquid cultures and partial characterization of functions //
Exp. Hematol. 1981. Vol. 9. P. 835—848.
17. Moore M. A. S., Sheridan A. P. Pluripotential stem cell replication in continuous
human, prosimian and murine bone marrow culture//Blood Cells. 1979. Vol. 5.
P. 297—311.
18. MooreM. A. S., Sheridan A. P. C., Allen T. D., Dexter T. M. Prolonged hematopoiesis
in a primate bone marrow culture system: characteristics of stem cell production
and the hematopoietic microenvironment // Blood. 1979. Vol. 54. P. 775—793.
19. Greenberger J. S. Sensitivity of corticosteroid-dependent insulin-resistant lipogenesis
18* 275
ih’marrow preadipocytes of obese-diabetic (db/db) mice // Nature. 1978. Vol. 275.
P. 752—754.
20. Dexter T. M., Moore M. A. S. In vitro duplication and «cure» of haemopoietic
defects in genetically anaemic mice//Nature.. 1977. Vol. 269. P. 411—414.
21. Gartner S., Kaplan H. S. Long-term culture of human bone marrow cells // Proc.
Nat. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 4756—4759.
22. Greenberg H. M., Newburger P. E., Parker L. M. et ah Human granulocytes
generated in continuous bone marrow culture are physiologically normal // Blood.
1981. Vol. 58. P. 724—732.
23. Hocking W. Gl,. Golde D. W. Long-term human bone marrow cultures // Blood.
1980. Vol. 56. P. 118—124.
24. Suda T., Dexter T. M. Effect of hydrocortisone on long-term human marrow cultu-
res//Brit. J. Haematol. 1981. Vol. 48. P. 661—664.
25. Toogood I. R. G., Dexter T. M., Allen T. D. et al. The development of a liquid cultures
for the growth of human bone marrow // Leykemia Res. 1980. Vol. 4. P. 449—460.
26. Greenberger J. S. Corticosteroid-dependent differentiation of human marrow pre-
adipocytes in vitro//In Vitro. 1979. Vol. 15. P. 823—828.
27. Кузнецов С. А., Фриденштейн А. Я. Кроветворение в культурах // Успехи соврем,
бнол. 1984. Т. 97. С. 252—267.
28. Bentley S. A., Foidart J.-M. Some properties of marrow derived adherent cells in
tissue culture//Blbod. 1980. Vol. 56. P. 1006—1012.
29. (Фриденштейн А. Я-, Лациник H. В., Г рошева.А. Г., Г орская Ю. Ф.) Fridenshtein
A. Ya., Latsinik N. V., Grosheva A. G., Gorskaya Yu. F. Marrow microenvironment
transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in
porous sponges // Exp. Hematol. 1982. Vol. 10. P. 217—227.
30. Lannote M., Dexter T. M. Isolation of a human marrow stromal cell line characte-
rised by an inducible differentiation into adipocytes in vitro // Paterson Lab. Annu.
Reps. 1979/ 1980. P. 127—128.
31. Whitlock C. A., Robertson D., Witte O. N. Murine В cell lymphopoiesis in long term
culture //J' Immunol. Meth. 1984. Vol. 67. P. 353—369.
32. Denis K. A., Treiman L. J., St Claire J. J., Witte O. N. Long-term cultures of murine
fetal livep retain very early B-lymphoid phenotype // J. Exp. Med. 1984. Vol. 160.
P. 1087—1101.
33. Whitlock C. A., Witte O. N. Long-term culture of В lymphocytes and their precursors
from murine bone marrow // Proc. Nat. Acad.. Ssi.. USA. 1982. Vol. 79. P. 3608—
3612.
34. Whitlock C. A., Ziegler S. F., Treiman L. J. et all Differentiation of cloned population
of immature В cells after transformation with Abelson murine leukemia virus //
Cell. 1983. Vol. 32. P. 903—911.
Культивирование и дифференцировка костномозговых
остеогенных клеток-предшественников
Е. А. Л у р и я, С. А. Кузнецов, Е. Н. Генкина
Институт эпидемиологии
и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР,
Институт химической физики АН СССР, Москва
Стволовые остеогенные клетки являются компонентом стромы
костного мозга [1—3]; в монослойных культурах костномозговых
клеток они образуют колонии — клоны фибробластов [4—6]. При
пассировании колонии дают начало диплоидным штаммам костно-
мозговых фибробластов [7], которые в монослойных культурах кости
не образуют. Об их остеогенных свойствах можно судить по результа-
там обратной аутотрансплантации таких штаммов в организм [8],
276
где они формируют как костную, так и хрящевую ткань. Обычные
методы культивирования непригодны для изучения дифференциро-
вочных потенций стволовых остеогенных клеток. Поэтому до послед-
него времени не удавалось применить методы культуры in vitro для
анализа факторов, регулирующих дифференцировку стволовых остео-
генных клеток, и для оценки костеобразовательного потенциала
костного мозга. Такую возможность особенно важно иметь для кост-
ного мозга человека, для которого аутотрансплантация как метод
анализа, естественно, неприменима.
Культуральная система, позволяющая получать полную диффе-
ренцировку костной ткани в эксплантатах костного мозга, была со-
здана в ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР в 1985 г. [9] на ос-
нове ранее разработанного приема культивирования костного мозга
методом множественных органных культур [10]. Система дает воз-
можность получать костеобразование при культивировании как
фрагментов костного мозга, так и суспензий костномозговых клеток.
Ниже эта система излагается применительно к костному мозгу
мышей; она применима и для костного мозга человека.
Культуральная система. Культивирование фрагментов костного
мозга и суспензий костномозговых клеток проводится по методу
множественных органных культур на миллипоровых фильтрах HAWP
(диаметр пор 0.45 мкм) и AUFS (диаметр пор 1.2 мкм) площадью
64 мм2, помещенных на разделе двух фаз — жидкой питательной
среды и газовой фазы. В периферическую часть чашки Конвея поме-
щается пластмассовая платформа в форме кольца: наружный диа-
метр 50 мм, толщина 2 мм, на ножках высотой 2 мм. Платформа
содержит 12 сквозных отверстий, имеющих форму усеченного конуса.
В центральную часть чашки Конве% отделенную стеклянным борти-
ком, наливается раствор Хэнкса, в периферическую часть — пита-
тельная среда, после чего миллипоровые фильтры раскладываются
над отверстиями таким образом, чтобы нижняя их поверхность смачи-
валась средой. После эксплантации ткани и заполнения чашки Кон-
вея газовой смесью она герметически закрывается стеклянной крыш-
кой, которая приклеивается замазкой (смесь вазелина с 10 % воска).
Культуральная среда. Используется следующая пропись пита-
тельной среды, которая является наиболее благоприятной для об-
разования минерализованной кости в культурах костного мозга мыши
и человека: а-МЕМ — 80 %, сыворотка — 20 %, витамин С —
0.15 мг/мл, глюкоза — 4 мг/мл, L-глютамин — 0.5 мг/мл, Na-fJ-гли-
церофосфат — 3 мг/мл (0.01 М), антибиотики пенициллин и стрепто-
мицин — по 60 ед/мл. Витамин С и глюкоза применяются в виде раст-
воров, выпускаемых отечественной медицинской промышленностью.
Растворы L-глютамина и глицерофосфата готовятся из порошков на
тридистиллированной воде и стерилизуются фильтрацией через мил-
липоровый фильтр GS (диаметр пор 0.22 мкм).
При подборе компонентов питательной среды оказалось, что
судьба эксплантатов во многом определяется качеством применяемой
сыворотки. Для культивирования костного мозга мыши используют
те серии эмбриональной сыворотки коров, которые обеспечивают
высокую эффективность клонирования стромальных фибробластов
в монослойных культурах костномозговых клеток [11], а для культи-
вирования костного мозга человека — свежеприготовленную сыво-
ротку крови IV группы. Синтетическая питательная среда разводится
перед употреблением на тридистиллированной воде и стерилизуется
фильтрацией через фильтр GS. Высокая концентрация витамина С не-
обходима для осуществления остеогенеза в культурах: интенсивность
остеогенеза усиливается с повышением содержания витамина С до
0.20 мг/мл, дальнейшее увеличение дозы на костеобразование не
влияет [12]. Стимулирующее влияние на остеогенез in vitro оказы-
вает также введение в состав питательной среды L-глютамина и глю-
козы. Однако перечисленных компонентов еще недостаточно для за-
вершенного остеогенеза в культурах костного мозга. Решающая роль
при образовании минерализованной кости в культурах принадлежит
Na-p-глицерофосфату. В малых концентрациях он входил в питатель-
ную среду культур костных зачатков, которые выращивались на по-
верхности плазменного сгустка [13]. В культурах костного мозга 6Х
X 10~4М Na-0-глицерофосфат не обеспечивает образования минера-
лизованной кости; для этого требуются более высокие концентрации
(5. Ю-3— !• 10~2М).
Газовая фаза. Состав газовой фазы имеет большое значение для
роста органных культур, которые с ней непосредственно контакти-
руют. Хотя костная ткань in situ всегда хорошо васкуляризирована,
повышение содержания кислорода в газовой фазе по сравнению
с содержанием его в воздухе не приводит к усилению костеобразо-
вания в культурах, а оказывает даже отрицательное влияние на
остеогенез'in vitro. В связи с этим газовая фаза органных культур
костного мозга должна состоять из смеси воздуха с 5—10 % СОг и
быть насыщена парами воды; это достигается герметизацией чашек
Конвея после заполнения их газовой фазой либо использованием
СОг-инкубатора.
Эксплантация. Фрагменты ткани костного мозга, извлеченные из
медуллярной полости бедренной кости мыши либо из ребер и отрост-
ков позвонков человека (удаленных при хирургических операциях),
помещаются в чашку Петри в синтетическую среду и острой бритвой
разрезаются на кусочки объемом около 4 мм3. По одному такому
фрагменту помещают (при помощи пастеровской пипетки) на поверх-
ность миллипорового фильтра, лежащего над лункой в платформе.
Суспензию костномозговых клеток приготовляют путем механиче-
ской или ферментативной обработки. В первом случае костномозго-
вую ткань в небольшом объеме среды многократно пропускают
через шприц с иглами уменьшающегося диаметра, во втором —
помещают в раствор трипсина (0.25 %) с виаказой на магнитную
мешалку на 30 мин при комнатной температуре, а затем также
пропускают через шприц. В обоих случаях полученную взвесь
фильтруют затем через 4-слойный капроновый фильтр, центрифуги-
руют в течение 10 мин при 800—900 об/мин, клеточный осадок ресус-
пензируют в среде а-МЕМ, доводя концентрацию до 1 • 108 ядерных
клеток на 1 мл. Эксплантацию полученных суспензий производят
278
с использованием пористых желатиновых губок, которые служат кар-
касом для эксплантированных клеток. Кровеостанавливающие жела-
тиновые губки нарезают на пластинки толщиной 1 мм и площадью
30—40 мм2 и помещают на влажную поверхность миллипоровых
фильтров HAWP, предварительно разложенных над средой. Клеточ-
ную суспензию осторожно наносят на поверхность губки при помощи
стеклянного капилляра или автоматической микропипетки. В одну
губку помещают 5 • 106—1 • 107 костномозговых клеток.
Эксплантацию клеточных суспензий костного мозга можно прово-
дить и без желатиновых губок. В этом случае суспензия наносится
непосредственно на поверхность миллипорового фильтра HAWP,
который затем накрывается фильтром AUFS; последний, являясь
крупнопористым и проницаемым для клеток (как и губка), представ-
ляет собой хороший каркас для образования кости врастающими
в него клетками.
Культивирование проводится при температуре 37 °C и pH 6.8—7.4.
Питательная среда и газовая фаза обновляются 2 раза в неделю.
Если не происходит сильного закисления среды, ее меняют не пол-
ностью, а на 2/з.
Фиксация и обработка культур. В последовательные сроки куль-
тивирования при смене среды производится фиксация части культур.
Фильтр с растущей на нем тканью промывают средой 199 и фикси-
руют 80% этанолом (а для электронно-микроскопического исследо-
вания — глютаровым альдегидом). Затем часть культур используют
для приготовления препаратов: окрашивают гематоксилином либо
проводят на них гистохимические реакции. После этого фильтр цели-
ком обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают
в канадский бальзам. Однако основной метод обработки органных
культур заключается в приготовлении из них после гистологической
обработки серийных срезов, на которых можно ставить гистохимиче-
ские реакции и проводить окраску любыми гистологическими краси-
телями.
Для изучения остеогенеза в культурах применяются две основ-
ные гистохимические реакции, дающие возможность охарактеризо-
вать новообразованную кость и остеогенную ткань. Реакция ван
Косса выявляет нерастворимые соли кальция и позволяет изучать
морфологию минерализации кости. Реакция на щелочную фосфатазу
по Гомори дает возможность судить о морфологии ранних стадий
остеогенеза и необходима для характеристики остеогенной ткани на
протяжении всего периода культивирования. Контроль к реакции
Гомори позволяет определить локализацию ионов РО2“ в составе
гидроксилапатита костной ткаии. Реакция на щелочную фосфатазу
по Гомори на срезах, предварительно декальцинированных ацетат-
ным буфером, выявляет локализацию фермента вне зависимости от
отложения солей кальция. Все эти реакции ставятся на серийных
срезах, которые в совокупности дают достаточно полную информацию
о ходе остеогенетического процесса.
Важно иметь в виду, что при всех перечисленных способах
обработки культуры не отделяются от миллипоровых фильтров, кото-
279
рые не мешают приготовлению срезов и проведению гистохимических
реакций. Красители, которые сорбируются на фильтре (например,
азур-эозин), непригодны для окраски тотальных препаратов.
Следует подчеркнуть, что приготовление парафиновых срезов
из культур, в которых остеогенная дифференцировка привела к обра-
зованию хорошо развитой минерализованной костной ткани, пред-
ставляет существенные трудности. Чтобы избежать выкрашивания
кости, богатой нерастворимыми солями кальция, культуры прихо-
дится предварительно декальцинировать, что в дальнейшем не позво-
ляет производить на срезах реакцию ван Косса.
Обработка культур для электронно-микроскопического исследо-
вания проводится по общепринятым методам.
Последовательные стадии костеобразования в культуре. При экс-
плантации в органные культуры фрагментов костного мозга, выде-
ленных из медуллярной полости бедренной кости мыши, за 20—25 сут
культивирования может происходить полная дифференцировка стро-
мальной ткани — образование кости. Новообразованная кость распо-
лагается в виде плоской пластины, которая занимает центральные
участки эксплантата и часть примыкающей к ним зоны роста. Мор-
фологическое изучение культур последовательных сроков позволяет
судить о динамике костеобразования in vitro. В культурах костного
мозга мыши очаги остеогенеза появляются'на 16—20-е сутки в центре
эксплантата и участках с наибольшей клеточной плотностью. Здесь
обнаруживаются тонкие костные балки, ориентированные вдоль мил-
липорового фильтра. Лежащие на их поверхности остеобласты npffi-
являют высокую активность щелочной фосфатазы и имеют морфоло-
гию, характерную для остеобластов in situ. По мере культивиро-
вания происходит разрастание костной ткани (утолщение кости) и
к 26—30-м суткам слияние костных балок в единую пластину с заму-
рованными остеоцитами. В присутствии глицерофосфата происходит
минерализация основного вещества новообразованной костной
ткани.
Структура миллипорового фильтра, который является поддержи-
вающим субстратом для культур, тво многом определяет морфологию
новообразованной кости. Так, в отличие от культур, растущих на
фильтрах HAWP, при эксплантации костного мозга на фильтры
AUFS, проницаемые для клеток, образующаяся кость и окружающая
ее ткань встраивается в толщу фильтра.
Остеогенез в культурах разобщенных костномозговых клеток
проходит в общем те же этапы, что и в культурах фрагментов
костного мозга, однако все стадии несколько отодвинуты по времени.
В культурах костного мозга человека остеогенез начинается
с конца 4-й недели после эксплантации и продолжается в течение
2 мес. В культурах фрагментов костного мозга человека помимо
остеоцитов и остеобластов явственно выявляются также многоядер-
ные остеокласты, прилегающие к поверхности новообразованной
кости и резорбирующие ее основное вещество.
Na-p-глицерофосфат может быть введен в состав питательной
среды в любой момент культивирования на различные по продолжи-
280
тельности периоды времени. Это создает интересные возможности для
изучения кальцификации костной ткани и позволяет анализировать
ряд механизмов остеогенеза, которые с трудом поддаются изучению
in vivo. Так, введение и последующее исключение глицерофосфата
позволяет судить о том, на какой стадии формирования костный
матрикс подвергается минерализации. При его введении в среду
16-суточных культур костного мозга мыши через 3 сут происходит
формирование тонкой кальцифицированной костной пластины, кото-
рая вся минерализуется. Отложение кальция происходит также
в толще фильтра под костными балками на глубину проникающих
в фильтр цитоплазматических отростков остеобластов. При исключе-
нии глицерофосфата из состава среды новообразованные слои кости
не минерализуются, но в утолщенной костной пластине через 3—7 сут
после отмены глицерофосфата отложения кальция сохраняются. Вве-
дение глицерофосфата на 3 сут в состав среды 19-суточных культур
позволяет наблюдать минерализацию основного вещества кости в но-
вообразующихся, но не в ранее образованных слоях костной пла-
стины. Кальцификации подвергается не вся образованная in vitro
кость, а те ее участки, которые строятся в присутствии глицерофос-
фата. Однако самый свежий слой основного вещества, непосредст-
венно над которым располагаются остеобласты, не минерализуется.
Такая система позволяет оценивать остеогенез in vitro по не-
скольким количественным показателям: 1) по срокам начала остеоге-
неза; 2) по срокам начала минерализации; 3) по количеству костной
ткани, образованной в культуре или подвергшейся минерализации
за определенный период (последняя оценка может быть выполнена
по включению радиоактивного кальция). Система дает возможность
сравнивать остеогенные потенции костного мозга в норме и при ряде
экспериментальных воздействий, а у человека — при различных пато-
логиях, таких, например, как системные дефекты остеогенеза, пони-
женная способность костной ткани к регенерации, нарушения остео-
генеза, связанные с гормональными расстройствами. В условиях
культуры может быть осуществлен подбор лекарственных препаратов
для лечения системных поражений остеогенеза. Становится также воз-
можным определение роли отдельных категорий костномозговых кле-
ток в процессе костеобразования и в его регуляции: эта задача может
быть выполнена при эксплантации суспензий фракционированных
костномозговых клеток. На модели остеогенеза в культурах костного
мозга доступны для изучения факторы, влияющие на образование
кости, на депонирование в ней кальция или стронция и на высвобож-
дение этих веществ из костного депо. К числу факторов, которые
могут стать объектом анализа в органных культурах костного мозга,
относятся ростстимулирующие вещества (включая PDGF), гормоны,
а также физические факторы, например гравитационная нагрузка,
которая, как известно, оказывает решающее воздействие на процесс
остеогенеза.
281
Литература
1. Фриденштейн А. Я., Чайлахян Р. К., Герасимов Ю. В. Стволовые стромальные
клетки костного мозга // Стволовые клетки и опухолевый рост. Киев, 1985.
С. 80—87.
2. Фриденштейн А. Я-, Чайлахян Р. К-, Герасимов Ю. В. Пролиферативные и диф-
ференцировочные потенции скелетогенных костномозговых колониеобразующих
1 клеток (КОКф) // Цитология. 1986. Т. 28. № 3. С. 457—464.
3. Owen М. Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system //
’ Bone Mineral Res. 1985. Vol. 3. P. 1—25.
4. (Фриденштейн А. Я-, Чайлахян P. К., Лампкина К. C.) Fridenshtein A. la.,
Chailachan R. K., Lalikina K. S. The development of fibroblast colonies in monolayer
cultures of guinea pig bone marrow and spleen cells //Cell Tissue Kinet. 1970.
Vol. 3. P. 393—403.
5. (Фриденштейн А. Я.) Fridenshtein A. Ja. Stromal mechanocytes of bone marrow:
cloning in vitro and retransplantation in vivo//Immunobiology of bone marrow-
transplantation. Berlin, 1980. P. 19—29.
6. Фриденштейн А. Я., Лурия E. А. Клеточные основы кроветворного микроокруже-
ния. М„ 1980. 214 с.
7. (Фриденштейн А. Я.) Fridenshtein A. Ja. Precursor cells of mechanocytes //
Intern. Rev. Cytol. 1976. Vol. 47. P. 327—359.
8. (Фриденштейн А. Я-, Чайлахян P. К., Лациник H. В. и dp.) Fridenshtein A. Ja.,
Chailachan R. K-, Latsinik N. V. et al. Stromal mechanocytes responsible for
transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and
* retransplantation in vivo // Transplantation. 1974. Vol. 17. P. 331—340.
9. Лурия E. А., Оуэн M., Фриденштейн А. Я., Кузнецов С. А., Генкина E. H., Гo-
,. стева В. В. Образование кости в органных культурах костного мозга // Бюл. экспе-
рим. биологии и медицины. 1986. Т. 101. С. 481—484.
10. Лурия Е. А. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах. М., 1972. 176 с.
11. (Фриденштейн А. Я-, Лациник Н. В., Грошева А. Г., Горская Ю. Ф.) Friden-
shtein A. Ja., Latsinik N. V., Grosheva A. G., Gorskaya Ju. F. Marrow microenviron-
ment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells
in porous, sponges//Exp. Hematol. 1982. Vol. 10. P. 217—227.
12. Reynolds J. J. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain
in electron microscopy//J. Cell Biol. 1963. Vol. 17. P. 208—212.
13. Fell H. B., Mellanby E. The effect of hypervitaminosis A on embryonic limb-
bones cultivated in vitro//J. Physiol. 1952. Vol. 116. P. 320—329.
Культивирование скелетно-мышечных клеток
T. А. Крылова, И. И. Фридлянская
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Клетки диссоциированной скелетной мышцы, введенные в куль-
туру, претерпевают ряд превращений, сходных с развитием скелет-
ной мышцы в онтогенезе. Процесс начинается с прикрепления
недифференцированных одноядерных скелетно-мышечных клеток
(миобластов) к субстрату. Такие клетки делятся и при достижении
высокой плотности в культуре начинают сливаться с образованием
многоядерных миотуб, в которых синтезируются специфические со-
кратительные белки, формируется организованный миофибрилляр-
ный аппарат, происходит изменение изозимного спектра ферментов
энергетического обмена, увеличение активности ацетилхолинэсте-
разы и холинорецепторов на мембране. Зрелые миотубы способны
к ритмическому сокращению.
282
Таким образом, миогенные клетки, культивируемые in vitro, фор-
мируют высокодифференцированные структуры, которые морфологи-
чески, биохимически и функционально сходны с мышечными волок-
нами. Благодаря этому они широко используются для изучения
закономерностей миогенеза (см. обзор: [1]).
Нормальные скелетно-мышечные клетки дифференцируются
только в первичных культурах. При пересевах они могут сохранять
пролиферативные потенции, но способность образовывать зрелые
скелетно-мышечные структуры (миотубы) утрачивается. Поэтому
были предприняты попытки получить постоянные культуры диффе-
ренцирующихся скелетно-мышечных клеток (см. обзор: [2]).
Наибольшее распространение в исследованиях закономерностей
миогенеза получили крысиные клеточные линии Le, Ls [3]. Они были
получены из бедренной мышцы новорожденных крыс. Хотя процедура
получения подробно описана [4], воспроизвести ее довольно трудно.
Это объясняется, по-видимому, как индивидуальными особенностями
животных-доноров, так и относительной стандартностью условий
культивирования. Клеточные линии Le, Le и некоторые другие диф-
ференцируются с образование миотуб, причем в основном этот про-
цесс протекает сходно с миогенезом в первичных культурах. Преиму-
ществом постоянных клеточных линий является их однородность
(в первичных культурах стартовой точкой каждый раз является
новое животное-донор), а также возможность различных генетиче-
ских манипуляций.
Следует, однако, подчеркнуть, что постоянные клеточные линии
способны к неограниченному размножению in vitro и, следовательно,
трансформированы. Дифференцирующиеся миогенные клеточные ли-
нии являются минимально трансформированными, поскольку по мно-
гим признакам они сохраняют сходство с нормальными клетками
(нетуморогенны, не растут в мягком агаре и др.).
Источники миогенных клеток
Источниками миогенных клеток могут служить разнообразные
животные: птицы, млекопитающие, насекомые. Но чаще работают на
миогенных клетках птиц и млекопитающих.
Скелетные мышцы птиц. В качестве исходного материала для
получения первичной культуры из скелетных мышц птиц берут
бедренную мышцу задних конечностей и грудную мышцу 10—12-
суточных эмбрионов (обычно кур и перепелок). Именно в эти сроки
удается получить наибольший выход одноядерных миобластов, обра-
зующих многоядерные миотубы при последующем развитии. Число
миобластов несколько выше в бедренной мышце, чем в грудной
того же возраста [5]. С эмбрионами, взятыми в более ранние сроки,
трудно работать из-за их небольшого размера. В более поздние сроки
пул предшественников миобластов уменьшается, преобладают много-
ядерные миотубы.
1. Бедренная мышца (работают с жизнеспособными, хорошо
283
развитыми эмбрионами): 1) перед работой яйца тщательно протереть
70 %-ным этанолом; 2) тупым концом пинцета разбить поверхность
яйца так, чтобы не повредить белую оболочку; 3) стерильным пинце-
том удалить белую оболочку, при этом обнажается вителлиновая
оболочка со множеством кровеносных сосудов; 4) осторожно погру-
зить пинцет внутрь вителлиновой оболочки, достать эмбрион и пере-
нести его в стерильную чашку Петри (для накопления эмбрионов
процедуру извлечения повторить); 5) вырезать бедро с помощью
стерильных инструментов, удалить кожу, хрящи. Все операции сле-
дует делать так, чтобы не повредить нежную ткань куриного
эмбриона.
2. Грудная мышца: 1) повторить процедуру 1 (1—4); 2) удалить
конечности, обезглавить куриный эмбрион; 3) снять кожу, удалить
внутренние органы; 4) отсечь грудную мьгцшу, отделить прилега-
ющую соединительную ткань; грудную мышцу поместить в стериль-
ную чашку Петри.
Скелетные мышцы млекопитающих. Культуры скелетных мышц
млекопитающих (обычно крыс или мышей) могут быть приготовлены
из задних конечностей эмбриональных или неонатальных животных;
оптимальный возраст — сутки после рождения. У более взрослых жи-
вотных пропорция одноядерных клеток быстро снижается в резуль-
тате слияния их в многоядерные миотубы. Считают, что наиболее
высокий выход миобластов дают крысы Wistar.
Крысиные мышечные клетки обладают некоторым преимуществом
перед куриными миобластами: процесс формирования мышечного
волокна более синхронный.
Подготовка материала: 1) смещением шейных позвонков убить
животное; зафиксировать на парафиновой пластинке; 2) промыть
тушку 70 %-ным этанолом; 3) снять кожу с задних конечностей,
отделить скелетную мышцу с помощью стерильных инструментов;
4) прополоскать выделенную мышцу 2—3 раза в растворе фосфат-
ного буфера (PBS) с антибиотиками (100 ед/мл пеницилина,
100 мкг/мл стрептомицина); 5) удалить из мышцы хрящи и кости;
измельчить до частиц величиной 2—3 мм.
Дезагрегация ткани
Кусочки мышечной ткани могут быть диссоциированы с помощью
ферментов или механическим способом. При механическом способе
получения клеточных суспензий клетки повреждаются меньше, чем
при использовании ферментов. Однако выход клеток, полученных
механическим путем, ниже. Механическую диссоциацию применяют
главным образом для куриных и перепелиных эмбрионов. Фермен-
тативную дезагрегацию используют для млекопитающих.
Механическая дезагрегация: 1) выделенные грудные или бедрен-
ные мышцы поместить в стерильную колбу с магнитом; 2) в колбу
налить 10-кратный объем раствора PBS (по отношению.к осадку);
3) поставить колбу на магнитную мешалку на 15—20 мин при ком-
натной температуре; 4) слить надосадочную жидкость, добавить но-
284
вую порцию буфера PBS (дробную дезагрегацию можно проводить
до полной диссоциации ткани); 5) суспензию клеток профильтровать
через капрон; 6) суспензию одиночных клеток центрифугировать
при 700 g 5 мин; 7) осадок промыть раствором PBS 1—2 раза, надоса-
дочную жидкость слить; 8) добавить небольшой-объем питательной
среды, подсчитать концентрацию клеток в камере Горяева; 9) клетки
суспензировать в полной ростовой среде; на чашку диаметром 50—
60 мм посеять 5 мл клеточной суспензии в концентрации (4—(6)Х
X Ю5 клеток/мл.
Ферментативная дезагрегация. Для дезагрегации кусочков мы-
шечной ткани чаще всего используют раствор трипсина (0.05—
0.25 %-ный) или раствор коллагеназы (0.05—0.1 %-ный). Иногда
используют смесь равных объемов раствора трипсина (0.25 %) и
версена (0.02%).
Дезагрегация: 1) измельченную ткань поместить в стерильную
колбу с магнитом; 2) в колбу налить раствор трипсина или коллаге-
назы; 3) поставить колбу на магнитную мешалку на 5 мин, слить
и отбросить суспензию клеток; 4) добавить новую порцию фермента,
диссоциировать 15 мин, 'недиссоциированным фрагментам дать
осесть, суспензию слить; 5s) профильтровать суспензию клеток терез
капроновый фильтр, предварительно фильтр смочить раствором PBS
(2—3 мл), добавить сыворотку до конечной концентрации 10 % (для
ингибирования трипсина), процедуры 4—5 можно повторить;
6) центрифугировать суспензию при 700 g5 мин; 7) осадок промыть
раствором PBS 1—2 раза; ;8) суспензировать осадок в небольшом
количестве среды, подсчитать в камере Горяева концентрацию кле-
ток; 9) добавить полную ростовую среду, клетки рассеять в 5 мл
среды в чашки Петри диаметром 50—60 мм с концентрацией клеток
(4—6)- 105 клеток/мл.
Среда для культивирования
Стандартная ростовая среда включает в себя смесь питательной
среды постоянного состава (синтетическая среда) и сыворотки.
Среди синтетических сред чаще применяются среда Игла, минималь-
ная среда Игла (МЕМ), -треда Игла в модификации Дальбекко
(ДМЕ), среды F-10, F-T2 и L-15.
Используют следующие виды сыворотки: коровью (эмбриональ-
ную, постнатальную), лошадиную, человеческую плацентарную. Кон-
центрация сыворотки ва,ръирует от 0.5 до 15 %. Сыворотка играет
большую роль в прикреплении, пролиферации и дифференцировке
миобластов. Многие авторы отдают предпочтение лошадиной сыво-
ротке, однако удовлетворительные результаты при получении диффе-
ренцирующихся миобластов получены и с эмбриональной сыворот-
кой коров. Партии сывороток варьируют, поэтому при работе
с миогенными дифференцирующимися клетками требуется тщатель-
ный отбор партий, которые эффективно влияют на миогенез.
Кроме синтетической среды и сыворотки в состав питательной
среды могут входить другие компоненты, влияющие на рост и диф-
285
кислоте центрифугировала IS—2 ч, 2000 g при 4 °C; 8) супернатант
(раствор коллагена) снова центрифугировали», при 3000 g 1—2 ч
при 4 °C; 9) раствор коллагена разлить па> Г—2 мл и хранить при
—10 °C или ниже.
Обработка, поверхности культуральных сосудов раствором
коллагена: 1)' на чашку Петри диаметром 60 мм нанести 0:5 мл
коллагена и 0.1 мл 6 %-ного раствора №14С1; 2) смешать вместе и
распределить по поверхности чашки Efenpn;- 3) добавить 3 мл сте-
рильной дистиллированной воды на 1—2 мин (для удаления'соли);
4) добавить 3 мл стерильного изотонического раствора на /10 мин;
5) удалить изотонический раствор, посеять клетки ? полной росто-
вой среде. 1
Вместо коллагена [16] многие используют очищенную жела-
тину (денатурированный коллаген}:. 11), к 1. г желатины добавить
40 мл дистиллированной воды, оставить на. 2—3 ч для набухания;
2)) слегка нагреть набухший гель на водяной бане до полного
растворения; 3) полученный раствор простерилизовать на кипящей
водяной бане 30 мин; 4) разлить полученный раствор по 0.3—0.5 мл
на чашки Петри диаметром 50—60 мм;, после высыхания раствора
образуется тонкая желатиновая пленка; 5)> перед внесением клеток
добавить 2’—3 мл PBS, инкубировать 2—3 ч при 37 °C, затем
слить.
Следует отметить перспективность выращивания скелетно-
мышечных клеток на декстрановых микроносителях. Одноядерные
миогенные клетки не только прикрепляются и растут, но и диффе-
ренцируются на такой поверхности. Система микроносителей позво-
ляет увеличить общую поверхность клеточного прикрепления. Удоб-
ство системы также и в том, что в любой нужный момент можно
стерильно отобрать необходимое кол ичествя: материал а для биохими-
ческих, электронно-микроскопических или других исследований [17].
Дифференцировка
в шюгенных клеточных- культурах
Первичные культуры. Одноядерные миобласты прикрепляются
к субстрату и начинают делиться. При достижении высокой плотности
в культуре ©ни сливаются в миотубы. Процессы дифференцировки
и пролиферации скелетно-мышечных клеток, находятся в обратной
зависимости. Усилению миогенеза способствует применение ингиби-
торов синтеза ДНК. В основном используют цитозинарабинозид
в концентрации 1 мкг/мл. Такой же эффект достигается понижением
концентрации сыворотки до 1—2 %. Ингибиторы пролиферации до-
бавляют в культуры с высокой плотностью клеток.
Суспензию клеток, обогащенную миобластами, высевают на
чашки Петри;, покрытые коллагеном или желатиной, в концентра-
ции 2 • 105 клеток/мл в ростовой среде с ГО’ % сыворотки. Через 24 ч
среду сменяют (удаляют неприкрепившиеся, нежизнеспособные
клетки). Еще через сутки среду меняют на содержащую 2 % сыво-
ротки.
288
К статье С. Е. Мамаевой, рис-ки 1—3; 5—9; 11, стр. 78
Рис. 1. Метафазная пластинка, окрашенная рутинным способом, с сохранив-
шейся цитоплазмой на препаратах, предназначенных для количественного ана-
лиза.
Рис. 2. Метафазная пластинка с окрашенными на С-диски хромосомами клеточ-
ной линии мыши LS.
Стрелками отмечены маркерные хромосомы.
Рис. 3. Фрагменты метафазных пластинок, окрашенных на G-диски,
Воздействие трипсина на хромосомы: а — недостаточное, б — удовлетворительное, в — ашзпг
«ом сильное.
I
Рис. 5. Метафазная пластинка с окрашенными на С-диски хромосомами клеточ-
ной линии Namalva (лимфома Баркита).
Стрелками указаны хромосомы 1, 9 и 16 с крупными С-блоками и маркерная хромосома
с двойным С-диском (дериват хромосомы 1).
Рис. 6. Метафазная пластинка постоянной линии Daudi (лимфома Баркита)
с девятью Ап позитивными хромосомами (отмечены стрелками}.
Рис. 7. Фрагмент банка образцов нормальных хромосом человека, имеющих
разную степень спирализации.
Рис. 7 (продолжение).
Рис. 8. Кариотип клетки постоянной линии Namalva, 2п=47Х.
В нижнем ряду — 12 маркерных хромосом.
Мар керы Метшразы
1 2 3 4 5 8 7 яблоки
•Хл» г I 1 < Г g
м* “1Х -ж- 1- —J— —T—
м5 t л i ( > /\
мв J j 1 1 gw 1 i 1
м7 1 J'-” 0 -J- J
М8 — Ж— > W , -i- f —— i
( 1 ‘ 1 Й 1 Г» J 1 WWhbmt 1 1 L. t -r „l-t I b 1
• ( W1*» J t 1 T зЖ>Х ! 1 -i- N I
Ц 1 1 t —
~А~ "Ж Д 1“ •» •» !
Рис. 9. Фрагмент рядов идентичных маркерных хромосом из семи клеток линии
M-HeLa.
a
12 3 5
IM н—>, J 1 <
13 ft 15 « . 11 10
В® ЖИВ ♦ ' iBi
19 20 21 22
Маркеры
Рис. 11. Кариотип клетки Raji, 2n=48.
a — маркерных хромосом; б — обобщенный реконструированный кариотип. Сплошной
линией обведены нормальные хромосомы или их фрагменты, восстановленные из маркеров.
Рис. 11 (продолжение).
НК
К статье А. Д. Соркина, Л. В. Тесленко, стр. 126
Рис. 2. Микрофотографии живых клеток, полученные с экрана монитора
(а, в, г) и непосредственно на пленку с микроскопа {б, д, е).
•в —клетки ЗТЗ-, инкубированные 15 мин с МГ-Ф при 37° С; б — клетки'А 4311, инкубирован-
ные 30 мин с ЭФР-Р при 37° С; в и г — одна и та же клетка А431, инкубированная сутки
-с ФИТЦ-декстраном, до (в) и после (г) действия метиламина (использовался набор филь-
тров № 12); ди е — клетка ЗТЗ, инкубированная 20 мин с ДФГТ при 37° С, в свете
флюоресценции ДФГТ (S) и в фазовом контрасте (е).
К статье А, Б. Борисова, стр. 290
<i — свежеизолированная мышечная клетка из желудочка сердца взрослой крысы; б — кар-
диомиоцит 2-недельной крысы на 3 сутки культивирования, в областях вставочных дисков
формируются отростки; в — 5-суточная культура клеток желудочков сердца 2-недельной
крысы, мышечные клетки (в центре) легко отличимы от фибробластов (внизу и вверху), поясне-
ния см. в тексте; а—в — фазовый контраст; г и д — Р AS-реакция — цитохимический маркер
кардиомиоцитов, 3Н-тпмидиновые автографы клеточных культур из желудочков сердца
-6-месячного эмбриона человека (г) и предсердий 2-недельной крысы (д), стрелки — меченые
ядра PAS-негативных фибробластов; инкубация с 3Н-тимидином (74 кБк/мл) в течение 24 ч.
К статье В. 3. Агрба, В. В. Тиманозской, рис-ки 1—9, стр. 299
Рис. 1. Взаимосвязь лимфоидных элементов с фибробластоподобной клеткой ли-
нии КМПГ-1. Окраска по Романовскому—Гимза, Х500.
Рис. 2. Фибробластоподобная клетка, служащая «подкормкой» для лимфоидных
клеток КМПГ-1 в культуре. Окраска по Романовскому—Гимза, Х900.
Рис. 3. Общий вид спонтанно трансформированной культуры СПГ-2, Х160.
Рис. 4. Морфология клеток лимфоидной линии павиана гамадрила СПГ-2. Ок-
раска по Романовскому—Гимза, Х500.
Рис. 5. Ультраструктура клеток лимфоидной линии павиана КМПГ-1. Ультра-
тонкий срез, X 15 000.
Рис. 6. Морфология клеток лимфоидной культуры человека ЧСЛ-1. Окраска по
Романовскому—Гимза, х800.
Рис. 7. Многоядерная клетка лимфоидной линии ЧСЛ-1, полученной от боль-
ного лимфогранулематозом (64-й пассаж). Окраска по Романовскому—Гимзаг
Рис. 8. Лимфоциты павиана гамадрила до трансформации, Х160.
Рис. 9. Лимфоциты павиана гамадрила после трансформации лимфотропным
герпесвирусом павианов, Х160.
Через 3—4 сут происходит массовое слияние миобластов в мио-
тубы. Сокращение в миотубах наблюдается через 4—5 сут после экс-
плантации.
Миогенез в культурах скелетно-мышечных клеток можно оценить
количественно. Определяют количество ядер в миотубах относительно
общего количества ядер в поле зрения (при подсчете не менее
500 ядер для одной культуры). Миотубами считаются многоядерные
структуры, содержащие не менее трех ядер. Подсчет производят
в различных полях зрения (не менее 10).
Постоянные миогенные клеточные линии. Основные этапы миоге-
неза в миогенных клеточных линиях (L6, L8) протекают так же, как
в первичных культурах скелетно-мышечных клеток. Однако процесс
слияния в постоянных клеточных линиях не является таким массо-
вым, как в первичных культурах. Даже при благоприятных условиях
определенная часть миобластов остается неслившейся. Дифференци-
ровка в постоянных клеточных линиях не всегда сопровождается
спонтанным сокращением миотуб. Клеточные линии поддерживаются
таким образом, чтобы плотность клеток в них была бы низкой. В про-
тивоположном случае клетки будут сливаться в миотубы. Будет
происходить селекция низкодифференцированных, пролифериру-
ющих клеток. При длительном культивировании может наблюдаться
утрата способности клеток к дифференцировке. В этом случае с по-
мощью клонирования можно отобрать из исходной популяции клон
клеток, сохраняющий способность к миогенезу.
Среди многочисленных вариантов сред для культивирования этих
клеток часто встречается среда DME с 10 % лошадиной или эмбрио-
нальной сыворотки коров. В качестве добавки используют 2—3 %
эмбрионального экстракта птиц.
Процедура запуска дифференцировки: 1) культуру, достигшую
плотности 60—70 %, обработать смесью трипсина (0.25 %) с версе-
ном (0.02 %), 1 : 1, в течение 2—3 мин, смесь слить; 2) стряхнуть
клетки, добавить 2—3 мм среды, суспензировать клетки, подсчитать
в камере Горяева их концентрацию; 3) на чашке Петри диаметром
50—60 мм посеять 5 мл суспензии с концентрацией 2 • 105 клеток/мл
(чашки предварительно покрыть раствором коллагена или жела-
тина); 4) через 48 ч сменить среду на среду DME с 2 % лошадиной
или эмбриональной сыворотки коров; варьируя условия культиви-
рования, можно работать либо с пролиферирующими клетками
либо с дифференцирующимися.
Через 3—4 сут наблюдается массовое слияние миобластов, на
5—6-е сутки — спонтанное сокращение зрелых миотуб. Количествен-
ная оценка миогенеза осуществляется так же, как и в первичных
культурах.
Миогенез в постоянных клеточных линиях успешно реализуется
при использовании бессывороточных сред. Среду с 10 % сыворотки
при достижении монослоя заменяют на среду ММ-1 [18]. Она состоит
из базовой среды F-12, фетуина (10~5 М), инсулина (10-6 М),
дексаметазона (10-7 М).
19 Заказ 1789
289
Литература
1. Фридлянская И. И. Использование клеточных культур для изучения миогенеза //
Проблемы миогенеза. Л., 1981. С. 188—208.
2. Фридлянская И. И. Постоянные клеточные линии, дифференцирующиеся in vitro // •
Биология клетки в культуре. Л., 1984. С. 50—94.
3. Yaffe D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of
myogenic cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1968. Vol. 61. P. 477—483.
4. Richter C., Yaffe D. The in vitro cultivating and differentiation capacities of
myogenic cell lines // Develop. Biol. 1970. Vol. 23. P. 1—22.
5. Turner D. C. Differentiation in cultures derived from embryonic chicken muscle //
Differentiation. 1978. Vol. 10. P. 81—93.
6. Shainberg A., Yagil G., Yaffe D. Alteration of enzymatic activities during muscle
differentiation in vitro // Develop. Biol. 1971. Vol. 25. P. 1—29.
7. Konigsberg I. R. Diffusion-mediated control of myoblast fusion // Develop. Biol.
1971. Vol. 26. P. 133—152.
8. Linkhart T. A., Hauschka S. D. Clonal analysis of vertebrate myogenesis //
Develop. Biol. 1979. Vol. 69. P. 529—548.
9. Dallenmeir P., Turner D. C., Eppenberger H. M. Proliferation and differentiation
of chick skeletal muscle cell cultured in a chemically defined medium // Exp.
Cell.Res. 1981. Vol. 135. P. 47—61.
10. Pinset Ch., Whalen R. Control of cell proliferation and differentiation in the cell
line L6 by manipulation of culture conditions // Hormonally defined media, a tool
in cell biology: First Europ. Conf, on serum-free cell culture. 1982. P. 396—399.
11. Hauschka S. D., Konigsberg I. R. The influence of collagen on the development
of muscle colonies // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1966. Vol. 55. P. 119—126.
12. Yaffe D. Cellular aspects of muscle differentiation in vitro // Cur. Top. Develop.
Biol. 1969. Vol. 4. P. 37—75.
13. Fambrough D., Rash J. E. Development of acetylcholine sensitivity during myogene-
sis//Develop. Biol. 1971. Vol. 26. P. 55—68.
14. Puri E. C., Turner D. C. Serum-free medium allows chicken, myogenic cell to be
cultivated in suspension and separated from attached fibroblasts // Exp. Cell Res.
1978. Vol. 115. P. 159—173.
15. Price P. J. Preparation and use of rat-tail collagen // Tissue Cult. Assoc. Manual.
1975. Vol. 1, N 1. P. 43—44.
16. Hauschka S. D. Cultivating of muscle tissue // Growth, nutrition and metabolism
of cells in culture. New York; London, 1972. Vol. 2. P. 131 —170.
17. Pawlowski R., Szigeti V. Primary culture of chick embryoskeletal muscle on dextran
microcarries // Europ. J. Cell Biol. 1984. Vol. 35. P. 296—303.
18. Florini J. R., 'Roberts S. B. Serum-free medium for the growth of muscle cells
in culture // In Vitro. 1979. Vol. 15. P. 983—992.
Культивирование клеток сердца
А. Б. Борисов
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Культивируемые клетки сердца являются удобным объектом
исследования клеточных и молекулярных аспектов функции миокарда
(о возможностях и перспективах их использования см.: [1, 2]).
За последние годы значительно р<асширилось применение клеточных
культур сердца в фармакологии [3], физиологии клеточных мембран
[4] и цитологии кардиомиогенеза [5]. В то время как культуры кле-
ток скелетной мускулатуры давно 'стали традиционным объектом изу-
чения функциональной регуляции мышечной ткани, а методы их полу-
290
чения из различных источников приводятся в практических руковод-
ствах, культивирование высокодифференцированных миоцитов серд-
ца до недавнего времени оставалось малодоступным: ввиду боль-
шой прочности межклеточных контактов вплоть до начала 70-х годов
не удавалось изолировать неповрежденные мышечные клетки. Крат-
кий исторический очерк культивирования клеток сердца можно найти
в работе Волленбергера [6].
Получение изолированных клеток сердца
Основным методом диссоциации ткани миокардаявляется повтор-
ная щадящая обработка растворами протеолитических ферментов,
проводимая в бескальциевой среде. Механическая дезагрегация
сердца и использование хелатирующих агентов менее результативны
и ввиду незначительного выхода жизнеспособных клеток практи-
чески не используются при получении материала для культивиро-
вания.
Спецификой этого этапа, отличающей его от аналогичной
процедуры при работе с другими ^типами клеток, является необходи-
мость предотвращения гибели кардиомиоцитов вследствие необра-
тимой контрактуры и нарушения автоматизма их сокращений при
возвращении в среды с физиологической концентрацией кальция
даже после кратковременного пребывания в бескальциевой среде.
Это явление, описанное ранее на уровне целого органа и развива-
ющееся в мышечных клетках сердца, получило название «кальцие-
вого парадокса» (см. обзоры: [7, 8]). Кардиомиоциты эмбрионов
и в меньшей степени новорожденных животных легче переносят
изменения концентрации внеклеточного кальция, однако уже в тече-
ние первой постнатальной недели чувствительность клеток к Са2+
резко возрастает.
В последние годы интенсивно разрабатывались методы получения
жизнеспособных мышечных клеток, толерантных к Са2+. Максималь-
но возможное уменьшение контакта с бескальциевой средой [9, 10],
введение в среду ДМСО, таурина [11] или трипсина на конечных
этапах диссоциации ткани [12] увеличивают выживаемость кардио-
миоцитов. Важным фактором в процессе изоляции клеток является
температура. В большинстве указанных работ диссоциация ткани
проводилась при 37 °C, что оптимально для активности используемых
протеолитических ферментов, однако эта процедура осуществима и
при комнатной температуре [10, 13].
Преинкубация ткани в бескальциевой среде в течение 1 ч при
22 °C до ее трипсинизации увеличивает устойчивость клеток
к Са2+, а охлаждение уже изолированных клеток до 0 °C и перевод их
в среду, содержащую Са2+, при 15 °C также значительно увеличи-
вают выживаемость [13].
Ткань сердца диссоциируют перфузией органа 0.1—0.2 %-ным
раствором коллагеназы, часто с добавлением гиалуронидазы, или
обработкой протеиназами кусочков измельченной ткани без предва-
рительной перфузии. Преимуществами перфузии являются свобод-
19*
291
ный доступ кислорода, что важно для крайне чувствительных к гипо-
ксии клеток сердца, и большой выход свободных клеток (до 60—70 %
сырой массы ткани), недостатком — довольно большой расход дефи-
цитных протеолитических ферментов. Сердце легко перфузируется
ввиду малочисленности крупных кровеносных сосудов введением
в аорту канюли, через которую подается раствор ферментов (схемы
сборки перфузионного аппарата см.: [5, 14, 15]). Диссоциация про-
теиназами кусочков ткани сердца без предварительной перфузии
[16—18] выполняется по обычным для получения первичных культур
схемам, однако при этом повышаются потери клеток вследствие
их гибели.
Оптимальной, на наш взгляд, схемой получения устойчивых
к Са2+ дифференцированных клеток сердца является разработка
Нага и соавторов [19], учитывающая преимущества более ранних
методик. Извлеченное сердце гепаринизированной перед забоем
(1000 ед гепарина на 1 кг массы) крысы (200—300 г) помещают
в 10 мл охлажденного до 0 °C бескальциевого физиологического
раствора Кребса—Рингера (РКР) на фосфатном буфере, pH 7.4,
содержащем 5 • 10~3 М глюкозы и 1 % бычьего сывороточного аль-
бумина. Перфузионный аппарат наполняют 50 мл бескальциевого
РКР, предварительно оксигенированного продуванием смесью 95 %
О2 и 5 % СО2. Через аорту (извлекая сердце, сохраняют ее участок
длиной около 5 мм) вводят канюлю и промывают сердце РКР в те-
чение 15 мин при 37 °C (на эту процедуру обычно расходуется
около 25 мл физиологического раствора); при этом сердце часто
сохраняет.сократительную активность. Перфузию продолжают окси-
генированным РКР, содержащим 0.1 % коллагеназы,1 0.1 % гиалу-
ронидазы и 1 % бычьего сывороточного альбумина (к этому времени
сокращения миокарда прекращаются). После окончания перфузии
размягченную и потерявшую упругость ткань разрезают на 4 ку-
сочка, удалив предсердия и крупные сосуды, затем повторно по 10—
15 мин до 3—4 раз инкубируют в растворе ферментов в РКР, отделяя
клетки легким встряхиванием. Полученные фракции объединяют и
отмывают центрифугированием (3—5 мин при 37 °C, 800 об/мин)
на настольной центрифуге. Сходная методика получения изолирован-
ных клеток для культивирования описана Клэйкомом и Лэнсо-
ном [14].
Для диссоциации ткани сердца наиболее пригодны препараты
коллагеназы, обладающие трипсиноподобной активностью [10].
В наибольшей мере этому требованию отвечают ферменты, выпуска-
емые фирмами «Sigma» (коллагеназа, тип 1) и «Worthington»
(коллагеназа, тип 1 и 2).
Жизнеспособность миоцитов оценивадот по окрашиванию погиб-
ших клеток трипановым синим (0.4 %-ный раствор) либо биохими-
чески [20] по их дыхательной активности и выходу в среду клеточных
белков.
1 В оригинальной методике использовали 0.05 и 0.5 %-ные растворы коллагеназы,
однако указанная концентрация оказывается вполне достаточной.
292
Идентификация мышечных клеток и очистка их
от сопутствующих клеточных типов
Сердце — гетерогенный по клеточному составу орган: в миокарде
взрослых крыс на долю миоцитов приходится лишь около 20 % от
общей численности клеток [21], поэтому, как и при работе с гете-
рогенными клеточными популяциями, полученными из других орга-
нов (печени, поджелудочной железы, почки, скелетной и гладкой му-
скулатуры), возникает необходимость типирования клеток, в первую
очередь мышечных. Большинство немышечных клеток составляют
фибробласты, клетки выстилок сердца и эндотелий сосудов. Свеже-
выделенные дифференцированные кардиомиоциты легко идентифици-
руются по характерной палочковидной форме и поперечной исчер-
ченности (см. рисунок, а и б, вклейка), выявляемым при фазово-
контрастном микроскопировании.
Очищенные фракции мышечных клеток можно получить центри-
фугированием в градиенте плотности фиколла или перколла («Phar-
macia»). Градиенты плотности этих химически инертных агентов,
обычно использующиеся для очистки лимфоцитов из препаратов
цельной крови, позволяют получать фракции, состоящие на 90 % и
более из неповрежденных мышечных клеток. Метод разделения мы-
шечных и немышечных клеток в градиенте плотности фиколла
предложен и затем усовершенствован Кутилеттой с соавторами
[22, 23]. Суспензию свежеизолированных клеток центрифугируют
3 мин в физиологическом растворе при 50 g. Супернатант сохраняют
для выделения немышечных клеток; осадок, содержащий в основном
миоциты, промывают в изотоничном фосфатном буфере, pH 7.4, и
суспензируют в 5 мл этого буфера. Полученную суспензию наслаи-
вают на 5 мл 3 %-ного (масса/объем) раствора фиколла в том же
буфере и дважды центрифугируют при 67 g 3 мин. Оба супернатанта
объединяют и центрифугируют при 800 g в течение 10 мин, получая
таким образом фракцию немышечных клеток. Полученные фракции
мышечных и немышечных клеток дважды промывают от фи-
колла. Во фракции мышечных клеток миоциты составляют более
90 %.
В другой (сходной) схеме изоляции миоцитов из суспензий
клеток миокарда в градиенте фиколла [24] был использован 2 %-ный
фиколл и все процедуры с клетками выполнялись в растворе Хэикса.
Этот метод хорошо воспроизводится и позволяет получать довольно
чистые фракции кардиомиоцитов.
Для получения толерантных к Са2+ кардиомиоцитов в градиенте
плотности перколла2 [20] свежеизолированные клетки инкубировали
в течение 20 мин при 37 °C в среде Джоклика (модификация
среды МЕМ), не содержащей СаСЬ. За это время миоциты прекра-
щают спонтанные сокращения. Затем суспензию наслаивают на 12 мл
50 %-ного (объем/объем) раствора перколла, содержащего
11.3 мг/мл среды Джоклика, 2 мг/мл NаНСОз и 2 • 10~3 М CaCh.
2 Следует учитывать гипоосмотичность перколла.
293
После центрифугирования при 2000 g и 25 °C в течение 45 мин живые
клетки концентрируются в области с плотностью 1.08 г/мл. Клетки
собирают и промывают от перколла центрифугированием дважды
при 37 g, полученный осадок миоцитов ресуспензируют в среде Джок-
лика, содержащей 1 % бычьего сывороточного альбумина и
2 • 10-3 М СаСЬ- Было показано [20], что при центрифугировании
в градиенте перколла удаляется значительная часть погибших кле-
ток, при этом до 90 % клеток полученной фракции жизнеспособны
и имеют палочковидную форму.
Приведенные выше методики, несмотря на их высокую эффектив-
ность, требуют тщательного отмывания от среды градиента, что
увеличивает продолжительность опыта и неизбежно ведет к потерям
клеток. Однако они представляют собой важное методическое усовер-
шенствование для работ по метаболизму клеток миокарда, так как
биохимические исследования кардиомиоцитов практически целиком
выполняются на тотальных гомогенатах ткани сердца.
Численность немышечных и погибших клеток в препарате зна-
чительно уменьшается после 15 мин отстаивания пробирки с суспен-
зией при 1 g за счет более быстрого оседания мышечных клеток
на дно, что позволяет избежать центрифугирования, снижающего
выживаемость клеток [14, 25].
Мышечные и немышечные клетки можно разделять уже после
посева смешанной клеточной суспензии на основании различий в ско-
рости их прикрепления к стеклу. Методика раздельного прикрепления
(differential attachment technique) подробно описана [26] для куль-
тур миокарда новорожденных крыс. Она заключается в перенесении
среды, содержащей медленно прикрепляющиеся к стеклу мышечные
клетки, в другую посуду через 1—4 ч после посева смешанной суспен-
зии (время, достаточное для адгезии на стекле фибробластов и эндо-
телия). Аналогичная процедура для клеток, культивируемых в запол-
ненных средой камерах, проводится переворачиванием камеры после
прикрепления немышечных клеток [26]. Преимущество этого метода
состоит в его физиологичности, отсутствии контакта клеток с какими-
либо химическими агентами, что обусловливает его частую применя-
емость.
Рост фибробластов резко задерживается, а кардиомиоциты хо-
рошо сохраняют функциональную активность (как показано для
клеток эмбрионов курицы) при культивировании в среде без глю-
тамина [27].
При необходимости длительного культивирования клеток даже
минимальное попадание в культуру фибробластов, обладающих
очень высокой пролиферативной активностью, приводит к быстрому
ее зарастанию немышечными клетками. Эффективное удаление немы-
шечных клеток достигается обработкой культур цитостатиками;
при этом вышедшие из митотического цикла дифференцированные
кардиомиоциты сохраняют жизнеспособность, тогда как немышечные
клетки погибают. В этом отношении наиболее пригодны ингиби-
торы синтеза ДНК ввиду минимального их влияния на метабо-
294
лизм покоящихся мышечных клеток. Практически полная очистка
культуры миокарда крысы от немышечных клеток достигается дву-
кратной обработкой цитозинарабинозидом: 14 мкг на 1 мл среды
в 1-е сутки после посева и 3 мкг на 1 мл на 4-е сутки с удалением
ингибитора на 8-е сутки культивирования [28]. Меньшая концентра-
ция цитостатика (2.8 мкг/мл) при такой же схеме введения также
приводит к удалению более чем 99 % немышечных клеток [14].
Вполне удовлетворительный эффект, по нашим наблюдениям, дает
4-суточная обработка культуры цитозинарабинозидом в концентра-
ции 3 мкг на 1 мл среды. Рост немышечных клеток тормозится при
ингибировании в течение 3—4 сут синтеза ДНК 2.5 • 10 3М тимиди-
ном, являющимся в отличие от цитозинарабинозида естественным
метаболитом клетки.
Кардиомиоциты в культуре отчетливо идентифицируются в фазо-
вом контрасте по типу распластывания, характерной форме, малым
размерам ядра (содержащего, как правило, единственное ядрышко),
плотной цитоплазме с включениями гликогена и крупным отросткам,
часто раздвоенным на концах (см. рисунок, в, вклейка) - Так как
в процессе распластывания сократительный аппарат перераспреде-
ляется по объему клетки (в отличие от строго продольной его укладки
в свежеизолированных клетках), поперечная исчерченность обнару-
живается лишь в отдельных участках цитоплазмы.
На постоянных препаратах кардиомиоциты выявляются любой
цитохимической реакцией на гликоген, например PAS-реакцией,
для проведения которой [29] клетки промывают в холодном физио-
логическом растворе и фиксируют в смеси спирта с нейтральным
формалином (9:1) в течение 24 ч при 4 °C, после чего отмывают
от фиксатора в 95 %-ном спирте и проводят через серию спиртов
в воду. В течение 30 мин обрабатывают 1 %-ным водным раствором
йодной кислоты, промывают в воде и окрашивают в реактиве Шиффа
10 мин, затем трижды по 2 мин промывают водой и высушивают
на воздухе. Цитоплазма мышечных клеток при этом окрашивается
в розово-красный цвет, тогда как немышечные клетки PAS-нега-
тивны (см. рисунок, гид, вклейка).
Культивирование клеток
Большинство работ по культивированию клеток сердца выполнено
на кардиомиоцитах крыс, что обусловлено доступностью и удобством
экспериментов с этими животными. В меньшей степени используются
эмбриональные клетки курицы [30], мыши [31] и редко, ввиду
трудности культивирования, эмбрионов человека (см. [32]). Значи-
тельным методическим достижением является успешное культивиро-
вание кардиомиоцитов взрослых людей [32]. За последние годы воз-
рос интерес к получению культур мышечных клеток из различных
отделов сердца, в первую очередь миоцитов предсердий, обладающих
двойственной, сократительной и секреторной, функцией. Были полу-
чены первичные культуры миоцитов предсердий обезьяны [33], крысы
[34, 35], синоатриального узла крысы [36] и собаки [37] и интраму-
рального ганглия сердца морской свинки [38, 39]. Все названные
295
типы клеток сохраняют in vitro присущие им функционально-морфо-
логические особенности.
Культуры кардиомиоцитов поддерживают в обычных для культи-
вирования клеток средах: Игла, часто в модификации Дульбекко
(DMEM) или Игла (ЕМЕМ), а также в более богатых средах F-10 и
F-12 с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки коров. Вместо
эмбриональной можно использовать отдельные партии сыворотки
крови лошади [5] и, по нашим наблюдениям, предварительно отсе-
лектированные серии сыворотки крупного рогатого скота. Выжива-
ние клеток и эффективность посева значительно увеличиваются
в минимальной среде Игла, кондиционированной клетками роговицы
кролика и содержащей наряду с сывороткой дополнительные ами-
нокислоты, витамины и следовые количества неорганических микро-
элементов [14]. Показана возможность культивирования клеток мио-
карда в бессывороточных средах фиксированного химического со-
става [40, 41]. Прикрепление миоцитов к стеклу ускоряется на
поверхностях, покрытых коллагеном, причем наиболее предпочтите-
лен коллаген типа IV, а также другие белки, улучшающие распла-
стывание,— ламинин и в меньшей степени фибронектин [14, 15].
При распластывании форма клеток изменяется от округлой или
палочковидной до полигонально-звездчатой (см. рисунок, бив,
вклейка). Кардиомиоциты сохраняют жизнеспособность и сократи-
тельную активность до 2 мес [19, 26]. При пассировании клеточных
культур миокарда выживают главным образом немышечные клетки,
что, по-видимому, связано с прочным прикреплением миоцитов к под-
ложке, необходимым при сократительной функции. Попытки полу-
чения постоянных клеточных линий сердца [42—44] привели к выде-
лению пассируемых штаммов, не обладающих, однако, морфологи-
ческими и физиологическими свойствами кардиомиоцитов.
Таким образом, обобщая вышеизложенное, можно выделить две
методические схемы получения первичных культур мышечных клеток
сердца.
Клеточные культуры развивающегося миокарда. Ткань миокарда
(эмбрионы крысы — 14—20-суточные, курицы — 7—11-суточные, че-
ловека— 7—16-недельные) отмывают от крови в бескальциевом
растворе Хэнкса и, измельчив, инкубируют в 0.15 %-ном растворе
трипсина, содержащем 0,05 % коллагеназы, в течение 20 мин при
37 °C. После удаления протеолитических ферментов ткань промы-
вают дважды в питательной среде с 10 % сыворотки и суспен-
зируют клетки встряхиванием флакона или пипетированием (5—8 раз
пипеткой на 10 мл с широким отверстием); 15—20-минутные циклы
трипсинизации повторяют до полной диссоциации ткани и перехода
в суспензию свободных клеток (обычно 3—4 раза). Процедура диссо-
циации проводится в бескальциевой среде. Клетки высевают либо
сразу, либо после центрифугирования (1000 об/мин в настольной
центрифуге в течение 7—10 мин), позволяющего удалить часть
погибших клеток. Мышечная фракция очищается методом раздель-
ного прикрепления или культивированием в среде без глютамина.
Применение для эмбриональных культур цитостатиков нецелесо-
296
образно ввиду гибели части пролиферирующих миогенных клеток.
Среду сменяют на 2—3-е сутки для удаления погибших и неприкре-
пившихся клеток, а затем через каждые 3—4 сут в процессе куль-
тивирования.
Культуры дифференцированных кардиомиоцитов. После перфу-
зии сердца раствором коллагеназы ткань диссоциируют и получают
суспензию свободных клеток (см. выше). Для отделения клеток
флаконы слегка встряхивают; пипетировать не следует ввиду зна-
чительного повреждения миоцитов. После посева клеток среду ме-
няют на 5—6-е сутки. Для элиминации немышечных клеток в момент
посева в культуры вводят ингибиторы репликации ДНК, которые
затем удаляют при первой смене среды 2—3-разовым ополаскива-
нием средой без сыворотки, либо используют методику раздельного
прикрепления.
Литература
1. Morvinsky R. The cultured myocardial cells as a model in cardiac research"//
Biomed. biochim. acta. 1986. Vol. 45. P. 237—240.
2. Jacobson S. L., Piper И. M. Cell cultures of adult cardiomyocytes as models of the
myocardium // J. Mol. Cell. Cardiol. 1986. Vol. 18. P. 661—678.
3. Harvey A. L. Cardiac muscle // The pharmacology of nerve and muscle in tissue
culture. London; Canberra, 1984. P. 125—158.
4. Lieberman M., Horres C. R., Shigeto N. et al. Cardiac muscle with controlled
geometry. Application to electrophysiological and ion transport studies // Excitable
cells in tissue culture / Eds P. G. Nelson, M. Lieberman. New York, 1981. P. 379—408.
5. Claycomb IV. C., Palazzo M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac
muscle cell: a light and scanning electron microscope study // Develop. Biol.
1980. Vol. 80. P. 466—482.
6. Wollenberger A. Isolated heart cells as a model of the myocardium // Basic Res.
Cardiol. 1985. Vol. 80. SuppL 2. P. 9—14.
7. Grinwald P. M., Nayler IV. G. Calcium entry in the calcium paradox // J. Mol. Cell.
Cardiol. 1981. Vol. 13. P. 867—880.
8. Ganote С. E., Nayler IV. G. Contracture and the calcium paradox // J. MoL Cell.
Cardiol. 1985. Vol. 17. P. 733—746.
9. Farmer В. B„ Mancina M., Williams E. S., Watanabe M. Isolation of calcium
tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description
of a method // Life Sci. 1983. Vol. 33. P. 1 — 18.
10. Wittenberg B. A., Robinson T. F. Oxygen requirements, morphology, cell coat
and membrane permeability of calcium tolerant myocytes from hearts of adult rats //
Cell Tissue Res. 1981. Vol. 216. P. 231—251.
11. Clark M. G., Gannon B. J., Bodkin N. et al. An improved procedure for the
high-yield preparation of intact beating heart cells from the adult rat, biochemical
and morphological study // J. Mol. Cell. Cardiol. 1978. Vol. 10. P. 1101 —1121.
12. Haworth R. A., Hunter D. R„ Berkoff H. A. The isolation of Ca2+-resistant
myocytes from the adult rat // J. Mol. Cell. Cardiol. 1980. Vol. 12.
P. 715—723.
13. Frangakis C. J., Baht J. J., McDaniel H., Bressler R. Tolerance to physiological
calcium by isolated myocytes from the adult rat heart; an improved cellular
preparation // Life Sci. 1980. Vol. 27. P. 815—825.
14. Claycomb W. C., Lanson N. Isolation and culture of terminally differentiated
adult mammalian ventricular cardiac muscle cell // In Vitro. 1984. Vol. 20. P. 647—
651.
15. Lundgren E., Borg T., Mardh S. Isolation, characterization and adhesion of calcium-
tolerant myocytes from the adult rat heart // J. Mol. Cell. Cardiol. 1984. Vol. 16.
P. 355-362.
297
16. Hume J. R., Giles W. Active and passive electrical properties
of single bullfrog atrial cells // J. Gen. Physiol. 1981. Vol. 78. P. 19—42.
17. Tarr M., Trank 1. W., Leiffer P. Characteristics of sarcomere shortening in single
frog atrial cardiac cells during lightly loaded contractions // Circ.Res. 1981. Vol. 48.
P. 189—200.
18. Isenberg G., Klockner V. Calcium tolerant ventricular myocytes delivered by preincu-
bation in KB-medium // Pfluegers Arch.1982. Bd 395. S. 6—18.
19. Nag A. C., Cheng M., Fischman D. A., Zak R. Long-term cell culture of adult
mammalian cardiac myocytes: electron microscopic and immunofluorescent analyses
of myofibrillar structure // J. Mol. Cell. Cardiol. 1983. Vol. 15. P. 301—317.
20. Onorato J. J., Rudolph S. A. Regulation of protein phosphorilation
by inotropic agents in isolated rat myocardial celfs //J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256.
P. 10697—10703.
21. Claycomb W. C. Cardiac muscle cell proliferation and cell differen-
tiation in vivo and in vitro // Adv. Exp. Med. Biol. 1983. Vol. 161. P. 249—265.
22. Cutiletta A. F., Aumont M. C., Nag A. C., Zak R. Separation of muscle and
non-muscle cells from adult rat myocardium: an application to the study of RNA
polymerase //J. Mol. Cell. Cardiol. 1977. Vol. 9. P. 399—407.
23. Aumont M. C., Swingheadauw B., Nag A. C., Cutiletta A. F., Zak R. Separation
of muscle and non-muscle cells from adult rat myocardium // Biol. Cell. 1980.
Vol. 37. P. 119—120.
24. Clubb F. J., Bishop S. P. Formation of binucleated myocardial cells in the neonatal
rat // Lab. Invest. 1984. Vol. 50. P. 571—577.
25. Claycomb W. C. DNA synthesis and DNA enzymes in terminally differentiated
cardiac muscle cells // Exp. Cell Res. 1979. Vol. 118. P. Ill —114.
26. Kasten F. H. Functional capacity of neonatal mammalian myocardial cells during
ageing in tissue culture // Cell impairment in ageing and development // Eds
V. J. Cristophalo, E. Holeckova. New York, 1975. P. 72—81.
27. Clark W. A. Selective control of fibroblast proliferation and its effect on cardiac
muscle differentiation in vitro // Develop. Biol. 1976. Vol. 52. P. 263—282.
28. Claycomb W. C., Bradshaw H. D. Acquisition of multiple nuclei and the activity
of DNA‘polymerase a and reinitiation of DNA replication in terminally differen-
tiated adult cardiac muscle cells in culture // Develop. Biol. 1983. Vol. 99. P. 331 —
337.
29. Nag A. C., Cheng M. DNA synthesis in mammalian heart cells: comparative
studies of monolayer and aggregate cultures // Cell. Mol. Biol. 1983. Vol. 29.
P. 451—459.
30. Clark W. A., Fischman D. A. Analysis of population cytokinetics of chick myocardial
cells in tissue culture // Develop. Biol. 1983. Vol. 97. P. 1—9.
31. Kaneko H., Goshima K- Selective killing of libroblast-like cells in cultures of mouse
heart cells by treatment with a Ca ionophore, A 23187 // Exp. Cell Res. 1982.
Vol. 142. P. 407—416.
32. Jacobson S. L., Banfalvi R., Schwarzfeld T. A. Long-term primary cultures of
adult human and rat cardiomyocytes // Basic Res. Cardiol. 1985. Vol. 80. Suppl. I.
P. 79—82.
33. Claycomb W. C., Moses R. L. Culture of atrial and ventricular cardiac muscle
cells from the adult squirrel monkey Saimiri sciureus // Exp. Cell Res. 1985.
Vol. 161. P. 95—100.
34. Cantin M. Successful culture of newborn (2—3 day-old) and adult (300 day-old)
rat atrial cardiocytes //J. Mol. Cell. Cardiol. 1980. Vol. 12. Suppl. 1. P. 25.
35. Moses R. L., Claycomb W. C. infrastructure of cultured atrial muscle cells
from adult rats // Amer. J. Anat. 1984. Vol. 171. P. 191—206.
36. Marvin IF. J., Chittick V. L., Rosenthal J. К et al. The isolated sinoatrial node
cell in primary culture from the newborn rat // Circ. Res. 1984. Vol. 55. P. 253—
260.
37. Woods W. T., Bubien J. K. Selective isolation and culture of the canine cardiac
pacemaker cell // J. Mol. Cell. Cardiol. 1986. Vol. 18. Suppl. 1. Abstr. 86.
38. Kobayashi Y., Hassal C. J. S., Burnstock G. Culture of intramural cardiac
ganglia of the newborn guinea-pig. 1. Neuronal elements// Cell Tissue Res. 1986.
Vol. 244. P. 595—604.
39. Kobayashi Y., Hassal C. J. S., Burnstock G. Culture of intramural cardiac ganglia
298
of the newborn guinea-pig. 2. Non-neuronal elements // Cell Tissue Res. 1986.
Vol. 244. P. 605—612.
40. Mohamed S. N. W., Holmes R., Hartzell C. R. A serum-free, chemically defined
medium for function and growth of primary neonatal rat heart cell cultures //
In Vitro. 1983. Vol. 19. P. 471—478.
41. Kessler-Icekson G., Sperling O., Rotem C., Wasserman L. Cardiomyocytes cultured
in serum-free medium. Growth and creatine kinase activity // Exp. Cell Res.
1984. Vol. 155. P. 113—120.
42. Rimes B. W., Brandt B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart //
Exp. Cell Res. 1976. Vol. 98. P. 367—381.
43. Molstad P., Bohmer T:, Hovig T. Carnitine-induced uptake of L-ca-nitine into cells
from an established cell line from human heart (CCL 27) // Bwchim. biophys.
acta. 1978. Vol. 512. P. 557—565.
44. Witkowsky J. A. Alexis Carrel and the mysticism of tissue culture // Med. Histol.
1979. Vol. 23. P. 279—296.
Методы получения и культивирования лимфоидных
суспензионных линий клеток приматов
В. 3. Агрба, В. В. Тимановская
Научно-исследовательский институт —
экспериментальной патологии и терапии АМН СССР,
Сухуми
Лимфоидные клеточные линии могут быть источником лимфотроп-
ных вирусов и применяются для изучения биологических свойств
этих вирусов (герпесвирусов, ретровирусов). Они неоценимы в ис-
следованиях по онкологии, гематологии, иммунологии, генетике
и клеточной биологии. Первые клеточные линии были получены
в 1964 г. независимо друг от друга двумя группами исследователей,
Пульвертафтом и Эпстайн в соавторстве с Барр (см. по: [1]), из био-
псированных материалов людей, больных лимфомой Баркитта. До
этого времени многочисленные попытки культивировать нормальные
и злокачественные гематопоэтические ткани in vitro кончались не-
удачей. Позднее появились многочисленные сообщения об успешном
культивировании и установлении постоянных клеточных линий от
больных лейкозами и лимфомами [1—5]. Попытки получения по-
стоянных клеточных линий от здоровых людей оставались неудач-
ными. До 1967 г. было широко распространено мнение, что все
клеточные линии, полученные из гематопоэтических тканей, про-
исходят из опухолевой клеточной популяции. В 1967 г. Мур с соавто-
рами (см. по: [1]) описал получение лимфоидной клеточной линии
от здорового индивидуума. Эти результаты вскоре были подтверж-
дены в других лабораториях. Стало известно, что лимфоидные кле-
точные линии относительно легко могут быть получены из клеток
периферической крови больных инфекционным мононуклеозом.
Клеточные линии получаются спонтанно при культивировании
периферической крови и лимфоидных тканей больных лимфомами
и лейкозами, а также клинически здоровых людей и обезьян, имею-
щих антитела к лимфотропным вирусам герпеса, вирусу Эпстайн-
Барр (ВЭБ) человека и лимфотропному герпесвирусу павианов
(ГВП) [5—11]. Успешное получение лимфоидных клеточных линий
299
от взрослых серопозитивных людей и обезьян — это скорее вопрос
техники культивирования, так как к настоящему времени от любого
серопозитивного индивидуума можно получить лимфоидную клеточ-
ную линию. Большинство таких линий имеет В-, а часть — Т-клеточ-
ную природу; кроме того, некоторые из них не относятся ни к той, ни
к другой.
Открытие в 1976 г. Морганом фактора роста Т-лимфоци-
тов (TCGF), который позднее был идентифицирован как интерлей-
кин-2 (ИЛ-2), сделало возможным культивирование зрелых чело-
веческих Т-клеток нормального и неопластического происхождения,
результатом которого явилось становление постоянных клеточных
линий. ИЛ-2, являющийся компонентом кондиционированной среды
из митоген-стимулированных лимфоцитов, способен поддерживать in
vitro клоны активированных специфическим антигеном Т-клеток
и дает возможность пролиферировать in vitro различным Т-клеткам
(хелперам, супрессорам, цитотоксическим Т-лимфоцитам), а также
НК-клеткам. В части случаев полученные с помощью ИЛ-2
культуры в дальнейшем не требуют этого фактора, а в других слу-
чаях полученные культуры остаются факторзависимыми.
В НИИЭПиТ АМН СССР имеется коллекция выведенных в лабо-
ратории экспериментальной онкологии клеточных суспензионных
постоянных лимфоидных линий, полученных от больных опухолевыми
заболеваниями и клинически здоровых людей и обезьян [6, 11 —15].
Все они имеют В-клеточное происхождение, так как продуцируют
поверхностные и цитоплазматические иммуноглобулины и не обра-
зуют розетки с эритроцитами барана [16—18]. В некоторых клеточ-
ных линиях обезьян происходит репликация лимфотропного герпес-
вируса павианов (ГВП), а в человеческих — лимфотропного герпес-
вируса человека.
Культивирование
Асептически взятые кроветворные ткани (кровь, селезенка, кост-
ный мозг, лимфатические узлы), а при наличии опухоли ее кусочки
тотчас подвергают обработке. Селезенку, лимфатические узлы
и опухоль после контакта с антибиотиками тщательно измельчают
ножницами и суспензируют в питательной среде. При необходимости
суспензию фильтруют через марлевый фильтр для удаления крупных
комочков ткани. Кровь берут в гепарин (40—50 ед гепарина на
10 мл крови). Гепарин предварительно разводят и хранят при 4 °C
под ватно-марлевой пробкой для испарения консерванта. Гепарини-
зированную кровь центрифугируют 5 мин при 500—800 об/мин. Над-
осадочную жидкость, представляющую собой плазму с лейкоци-
тами, отсасывают пастеровской пипеткой и ресуспензируют в пита-
тельной среде. Костный мозг отсасывают пастеровской пипеткой из
трубчатых костей и суспензируют тотчас в питательной среде. Хоро-
шие результаты дает культивирование мононуклеарной фракции
крови, выделяемой низкоскоростным центрифугированием в гради-
енте фиколл-верографина.
300
Выделение мононуклеаров крови, селезенки и костного мозга про-
водят по уже описанной и модифицированной в лаборатории экспери-
ментальной онкологии НИИЭПиТ АМН СССР методике [19]. Гра-
диент готовят следующим способом: к 20 мл 76 %-ного раствора
верографина («Spofa») добавляют 25 мл дистиллированной воды,
после чего к 40 частям этого раствора прибавляют 96 частей 9 %-ного
раствора фиколла-400 («Pharmacia»), приготовленного на дистилли-
рованной воде. Компоненты тщательно перемешивают, стерилизуют
фильтрованием через мембранные фильтры «Millipore» (HAWP,
0.45 мкм) и хранят при 4 °C. Три объема крови, разведенной пи-
тательной средой (без сыворотки) 1 : 4, или суспензию органа,
содержащую (3—5) • 106 клеток/мл, наслаивают на градиент и цент-
рифугируют на холоду (4 °C) в течение 30 мин при 1200 об/мин. Мо-
нонуклеарную фракцию, состоящую в основном из лимфоцитов, со-
средоточенных в интерфазе, отсасывают пастеровской пипеткой,
дважды отмывают питательной средой от градиента, подсчитывают
и ресуспензируют в питательной смеси, состоящей из питательной
среды RPMI-1640 в сочетании с 15 % эмбриональной сыворотки ко-
ров, инактивированной прогреванием в течение 30 мин при 56 °C,
L-глютамина (300 мг/мл), пенициллина (100 мг/мл) и стрептоми-
цина (50 мг/мл). Инкубирование осуществляют в стационарном со-
стоянии в термостате при 37 °C в атмосфере 5 % СОг и 95 % воздуха.
Первичная посевная концентрация клеток лимфатических узлов,
селезенки и костного мозга составляла (3—5) • 106 клеток/мл,
а клеток крови (1—3) • 106 клеток/мл.
Микроскопирование культур проводят ежедневно, а смену среды
в начале культивирования через 1—2 сут по 1 /з—1 /5 объема, затем
раз в неделю, а после становления культуры — по мере закисления.
Подсчет количества живых клеток осуществляют с помощью
0.2 %-ного раствора трепанового синего, который в равном объеме
соединяют с клеточной суспензией.
Время удвоения клеточной массы в логарифмическую фазу роста
рассчитывают по формуле
Т =
3.3 1g х/х° ’
где Т — интервал времени в часах, х° — начальная клеточная кон-
центрация, х — конечная концентрация клеток, t — время культи-
вирования.
Морфологическое изучение клеток проводят на препаратах, окра-
шенных по Гимза—Романовскому. При нарастании клеточной массы
и достижении клетками плотности 1 • 106 клеток/мл и выше необхо-
димо культуру пассировать и поддерживать ее на уровне (3—4)Х
ХЮ5 клеток/мл.
Как правило, лимфоидные культуры клеток хорошо переносят
криоконсервацию. Чаще всего в качестве криопротектора пользу-
ются ДМСО, лучше отечественным или производства фирмы «Wel-
come».
Время экспозиции криопротектора с замораживаемым материа-
301
лом составляет 15—20 мин. Деконсервацию культур проводят в водя-
ной бане при 37 °C. Клетки отмывают от криопротектора и культиви-
руют обычным способом.
г Методы получения лимфоидных суспензионных
f постоянных клеточных линий
Получение лимфоидных суспензионных культур клеток из гемато-
поэтических тканей осуществляется различными методами: культиви-
рование всей клеточной массы органа; совместное культивирование
мононуклеарной клеточной фракции органа с летально (при 6000 Р)
облученными клетками культур, продуцирующих трансформирующие
вирусы (лимфотропные герпесвирусы, ретровирусы); трансформа-
ция мононуклеарной клеточной фракции гематопоэтических тка-
ней клинически здоровых индивидуумов после инфицирования клеток
вирусами, обладающими трансформирующей активностью; культи-
вирование стимулированных митогеном (ФГА) лимфоцитов.
Культивирование всей клеточной массы органа. При этом способе
культивирования гематопоэтических тканей, как правило, уже через
1—2 сут отмечается активное прикрепление клеток к твердому суб-
страту. В случае культивирования костного мозга монослой фибро-
бластоподобных клеток может образоваться уже через 7 сут, а при
культивировании селезенок — несколько позднее, монослой может
и не образоваться. При культивировании лимфатических узлов фиб-
робластоподобные клетки бывают единичными, но могут образовы-
вать и мо^ослой. В случае культивирования лейкоцитов, содержа-
щихся в надосадочной плазме гепаринизированной крови, центрифу-
гированной 5 мин при 800—1000 об/мин, фибробластоподобные клетки
также присутствовали в культуральных флаконах.
Лимфоидные элементы округлой формы располагаются на поверх-
ности фибробластоподобных клеток и в жидкой фазе. На первых
этапах культивирования ростовые преимущества имеют фибро-
бластоподобные элементы, которые, активно пролиферируя, метабо-
лизируют среду культивирования. Затем по мере культивирования
ростовые потенции фибробластоподобных клеток уменьшаются,
а лимфоидных элементов нарастают (рис. 1 и 2, см. вклейку).
Успех культивирования в какой-то степени зависит от интенсив-
ности роста фибробластоподобных клеток, которые кондиционируют
среду культивирования для лимфоцитов. Лимфоидные элементы,
плотно или рыхло прикрепленные к фибробластоподобным клеткам,
позднее отрываются от них, плавают в суспензии, образуя конгло-
мераты разных размеров, видимые невооруженным глазом. Среда
культивирования при этом становится интенсивно желтой и мутной.
Через 20—60 сут от начала культивирования и лимфоидные элементы
могут образовать суспензионную культуру, а фибробластоподобные
элиминироваться совсем. Лимфоидные клетки при этом полностью
теряют адгезивную способность и после перенесения в свежие фла-
коны размножаются там в жидкой фазе без признаков прикрепления
к стеклу. Пролиферативная активность этих клеток, определяемая
302
по времени удвоения клеточной массы в единице объема, обычно
составляет 18—72 ч. Количество живых клеток колеблется в пределах
80—95 %. Плотность клеточной массы в уже сформированной суспен-
зионной линии может достигать (2—3) • 106 клеток/мл к 7-м суткам
культивирования (рис. 3—7, см. вклейку).
В табл. 1, составленной по нашим материалам, представлена
частота получения лимфоидных суспензионных линий клеток чело-
века в зависимости от формы заболевания; Видно, что? наиболее
часто (75 %) спонтанное становление лимфоидной линии происходит
при культивировании лейкоцитов больных миелолейкозами, (острым
и хроническим). В табл. 2 и 3 дана характеристика входящих
в нашу коллекцию клеточных линий человека и обезьян.
Получение лимфоидных линий клеток при культивировании
мононуклеарной клеточной фракции. В процессе культивирования
мононуклеарных клеток, выделенных из кроветворных тканей, отме-
чаются резкие колебания в проценте живых клеток в зависимости
от времени культивирования. В течение первых двух недель количе-
ство живых клеток постепенно снижается, достигая 40—45 % к концу
2-й или к середине 3-й недели. Для поддержания первоначальной
концентрации клеток, т. е. (1—2) • 106 клеток/мл, содержимое раз-
личных флаконов можно объединять, убирая избыток среды куль-
тивирования. Через 3—4 нед начинает медленно нарастать за-
кисление среды культивирования. Одновременно появляются и уве-
личиваются в количестве конгломераты клеток, плавающие в суспен-
зии и видимые невооруженным глазом. Уже сформированная таким
образом культура не отличается от других и культивируется обычным
способом (рис. 8 и 9, см. вклейку).
Суспензионные линии клеток, полученные методом сокультивиро-
вания. Совместное культивирование мононуклеарной клеточной
фракции (выделенной из крови, селезенки, костного мозга, лимфати-
ческих узлов) с летально (при 6000 Р) облученными клетками; куль-
тур, продуцирующих трансформирующие герпесвирусы и ретрови-
русы, обычно занимает длительное время, в процессе которого про-
изводят смену лишь половины среды культивирования регулярно
один раз в 4—7 сут. Через 45—60 сут культивирования во флаконах,
в которых клетки претерпели трансформацию, среда культивирования
закисляется, увеличивается клеточная масса, образовываются кон-
гломераты клеток разной формы и величины. Методически сокуль-
тивирование осуществляют следующим образом. Выделенные при
центрифугировании в градиенте фиколл-верографина мононуклеары
отмывают в ростовой среде дважды и затем культивируют в кон-
центрации 5 • 106 клеток/мл в объеме 4 мл 24 ч при 37 °C в атмосфере
5 % СОг и 95 % воздуха. Затем к этим клеткам в объеме I мл добав-
ляют 1 • 106 летально облученных клеток вируспродуцирующей ли-
нии. Дальнейшее культивирование продолжают уже в обычной
атмосфере без добавления СО2. Лимфоидные линии клеток, полу-
ченные таким способом, имели В-клеточную характеристику.
В литературе последнее время описаны лимфоидные клеточные
линии, полученные методом сокультивирования, которые могут иметь
303
Таблица 1
Характеристика материалов, полученных от больных опухолевыми
заболеваниями людей [1,4]
Характер заболевания Количество мате- риалов, исполь- зованных для культивирования Культивируемая ткань 4)1 Число j н получен- ных линий г.,1
Миелолейкоз (острый и хронический) 7 Лейкоциты крови 5 4
Лимфогранулематоз 3 7 Селезенка Лимфатиче- ский узел 2 1
Лейкемоидная реак- ция миелоидного типа у больного раком легких 1 Лейкоциты крови 1
Лимфолейкоз (хрони- ческий) 4 Лейкоциты крови 1
различную иммунологическую характеристику. Так, при сокультиви-
ровании гематопоэтических клеток павиана, больного лимфомой,
с летально облученными клетками, продуцирующими HVA (герпес-
вирус ateles), были получены лимфоидные постоянные клеточные
линии павианов, продуцирующие герпесвирус павианов [20]. Суще-
ствуют и другого иммунологического типа клеточные линии, по-
лученные таким способом: JM6 [21], МТ-2 [22], Si-1-З [23, 24]
и др.
Линия‘МТ-2 [21] была получена сокультивированием перифери-
ческих лимфоцитов женщины, больной острым Т-клеточным лейко-
зом, с лимфоцитами пупочного канатика ребенка мужского пола.
Полученная в результате сокультивирования линия имела кариотип
мужчины и Т-клеточную характеристику. Сокультивированием были
получены лимфоидные линии обезьян, обозначенные Si-1, Si-3
[23, 24] и др. В ряде случаев трансформированные линии теряют
свои ростовые потенции, которые могут быть восстановлены допол-
нительным введением TCGF.
Получение лимфоидных линий клеток путем трансформации лим-
фоцитов крови здоровых прнматов лимфотропиыми вирусами гер-
песа. Метод основан на способности лимфотропных вирусов герпеса
трансформировать лимфоциты приматов, что приводит к появлению
перевиваемых лимфобластоидных линий. Таким способом легко могут
быть получены клеточные линии, и чем меньше возраст донора
и выше титр трансформирующего вируса, тем быстрее. Эти линии
имели характеристики, типичные для суспензионных лимфоидных ли-
ний, т. е. пролиферировали в жидкой фазе без признаков прикреп-
ления к твердому субстрату, образовывали конгломераты клеток
обычно крупных размеров, интенсивно метаболизировали среду куль-
тивирования. Методы культивирования этих линий не отличались осо-
бенностью, а способ получения был простым. Для получения таких
линий клеток мононуклеары, отмытые от фиколл-верографина, ре-
304
Таблица 2
Характеристика клеточных лимфоидных суспензиоиных линий людей и обезьян
Название линии Диагноз Культивируемая ткаиь Период становле- ния, сут Литературный источник
ЧСЛ-1 Лимфогранулематоз Человек Лимфатический узел 40 [1—4, 20]
ЧСЛ-2 Острый миелолейкоз Периферическая 68 Тот же
чсл-з Рак легкого (лейке- кровь То же 61
ЧСЛ-4 * моидиая реакция миелоидного типа) Острый миелолейкоз 44
ЧСЛ-5 * То же 39
ЧСЛ-6 * Хронический лимфо- 42
ЧСЛ-7 * лейкоз Острый миелолейкоз 46
ЧСЛ-8 * Лимфогранулематоз Селезенка 70
ЧСЛ-9 * То же То же 24
ЧСЛ-10* Острый миелолейкоз Периферическая 46 » J
КМПГ-1 П Злокачественная кровь авиан гамадри Костный мозг Л 40 [6, 7]
СПГ-1 ** лимфома То же Селезенка ; 25 [8]
СПГ-2 То же 25 [9]
спг-з ** 25 [Ю]
СПГ-4 ** 20 [2]
ЛУПГ-1 Лимфатический 20 [Н]
ЛУПГ-2 узел То же 40 [П]
ЛУГ-4 Г и б р Злокачественная ид (п а ви а н • гел1 Лимфатический а д а) 60 [13]
МАЛ-1 лимфома Клинически здоров узел Макака бурая Периферическая 60 [Ю]
; кровь
Примечание. * — заморожены после 20-го пассажа; ** — через 6 мес культивирова-
ния погибли в результате активации пенящегося вируса обезьян.
суспензировали в среде культивирования в количестве 1 • 106 кле-
ток/мл, центрифугировали. К осадку клеток на 18 ч добавляли 0.2—
0.5 мл вируссодержащей культуральной жидкости, освобожденной от
клеток фильтрованием через фильтр фирмы «Millipore» с размером
пор 0.45 мкм. Инкубирование проводили в термостате без СОг.
На следующие сутки вирус убирали, добавляли среду и культиви-
ровали обычным способом, меняя среду один раз в неделю. Через
3—4 нед, в редких случаях позже, формировались суспензионные
культуры. Подробно эти культуры нами описаны [12, 15].
20 Заказ 1789 305
Таблица 3
Характеристика суспензионных культур, полученных
при культивировании мононуклеаров крови павианов с лимфой
Название линии Культивируемая ткаиь Период становления
ЛУПГ-3 Лимфатический узел 25
ЛПГ-1 Кровь 30
КМПГ-2 Костный мозг 42
Таблица 4
Эффективность культивирования митоген-стимулированных лимфоцитов
периферической крови обезьян
Состояние животных Число животных, лимфоциты кото- рых культиви- ровали Число без культур ФГА Число культур с ФГА Эффективность культивирования, %
Обезьяны после введения цикло- спорина А 10 0 5 50
Обезьяны, полу- чившие иммуно- депрессанты (преднизолон и иммуран) 24 0 9 37.5
Павианы гамад- рилы с диагно- зом предлимфомы 18 о 9 50
Культивирование митоген-стимулированных лимфоцитов. В на-
стоящее время накапливается все больше сведений о получении
< длительно пролиферирующих лимфоидных линий Т-лимфоцитов. Ме-
тодика получения Т-лимфоцитов из мононуклеарной фракции крови
' и стимуляция их роста с помощью ИЛ-2 описаны в отечественных
i и зарубежных работах.
В настоящее время имеется целый ряд ИЛ-2-зависимых лим-
- фоидных линий, например HUT-102 и ее сублинии CTCL-3,
CTCL-16, В-5 и др.
? В части случаев полученные с помощью ИЛ-2 линии затем ста-
i новились независимыми от этого фактора, например HUT-102.
Нами в течение года при культивировании ФГА-стимулированных
лимфоцитов периферической крови 53 обезьян получено 24 (45.3 %)
’ лимфоидных суспензионных линий, имеющих В-клеточную характе-
‘ ристику (табл. 4). Методически культивирование проводили следую-
щим образом: из гепаринизированной крови выделяются мононукле-
• арные клетки, разводятся питательной средой в концентрации (1.5—
2)- 106 клеток/мл и культивируются в объеме 5 мл в трех парал-
лельных пробирках. В одну из пробирок добавляют ФГА 2—5 мкг/мл
на 24—72 ч, после чего клетки отмывают от ФГА и разводят в ро-
стовой среде. Через 24, 48, 72 ч последовательно часть культураль-
ной жидкости (1—2 мл) из ФГА-стимулированной культуры пере-
306
носится в одну из пробирок с нестимулированными лимфоцитами,
другая такая же пробирка представляет контроль. Через 6—7 сут
культивирования подсчитывают клетки и меняют среду таким обра-
зом, чтобы первоначальная концентрация клеток сохранялась, т. е.
объем среды постепенно уменьшается. Полная смена среды осущест-
вляется 1 раз в неделю. Обычно через 3 нед культивирования объем
среды уменьшается в 5 раз. К концу 4-й недели культивирования
среда в пробирках, в которые трижды добавляли культуральную
жидкость от ФГА-стимулированных лимфоцитов, а в части случаев
и культуральная жидкость самих ФГА-стимулированных лимфоци-
тов, постепенно метаболизировалась, а количество живых клеток
в них постепенно нарастало. В контрольных пробирках, куда не вно-
сили культуральную жидкость митоген-стимулированных лимфоци-
тов, становления линий не происходило. Следует упомянуть, однако,
что при культивировании мононуклеарных клеток обезьян со злока-
чественной лимфомой или людей, имеющих антитела к ВЭБ,
лимфобластоидная трансформация может произойти приблизи-
тельно в эти же сроки.
Таким образом, при получении лимфоидных постоянных линий
клеток из гемопоэтических органов больных опухолевыми заболе-
ваниямй кроветворной ткани людей и обезьян можно выделить три
основных направления.
Первым из них является «спонтанное» становление лимфоидной
линии, очевидно, связанное с культивированием in vitro непосред-
ственнб опухолевых клеток или клеток, содержащих геном лимфо-
пролиферативных вирусов.
В основе второго направления лежит известное свойство лимфо-
тропных вирусов вызывать трансформацию лимфоцитов в перевива-
емые лимфобластоидные линии.
Получение лимфоидных линий методом сокультивирования также
является результатом трансформации. Вообще использование транс-
формации является очень результативным методом и обеспечивает
в чувствительной системе высокий процент получения трансформиро-
ванных клеточных линий.
Третье направление — культивирование стимулированных лим-
фоцитов в присутствии факторов роста и получение факторзависи-
мых или фактор-независимых линий.
Основным клеточным элементом всех лимфоидных линий является
лимфойдная клетка, имеющая морфологические параметры лимфо-
бласта.
Процесс становления лимфоидных суспензионных линий клеток
обезьян не отличается существенно от такового при культивирова-
нии опухолевых материалов людей, однако клеточный полиморфизм
выражен в них больше. Как правило, клетки всех лимфоидных линий
пролиферируют в суспензии без признаков прикрепления к твердому
субстрату и образуют разной формы и величины конгломераты.
Несмотря на морфологическое сходство клеток лимфоидных линий,
имеется существенная разница в их иммунологических и функцио-
20*
307
нальных характеристиках. Изучение биологических, культуральных,
электрокинетических свойств клеточных лимфоидных линий
обезьян позволило нам разработать критерии, лежащие в основе
их классификации [13, 25], аналогичные имеющимся для культур
человеческих клеток [26].
Таким образом, используя описанные методы, нами получено зна-
чительное количество лимфоидных постоянных суспензионных клеточ-
ных линий людей и обезьян, составляющих коллекцию НИИЭПиТ
АМН СССР.
Литература
1. (Агрба В. 3., Дьяченко А. Г., Лапин Б. А. и др.) Agrba V. Z., Diatchenko A. G.,
Lapin В. A. et al. Isolation of Epstein-Barr virus from cultured cells of a patient
with Hodgkin’s disease // Exp. Pathol. 1977. Vol. 13. P. 289—295.
2. Агрба В. 3., Яковлева Л. А., Лапин Б. А. и др. Выделение вируса Эпстайн-
Барр в суспензионных линиях клеток, полученных от людей, больных различными
формами гемобластоза // Вопр. онкологии. 1978. Т. 24, № 9. С. 33—40.
3. Яковлева Л. А., Агрба В. 3., Букаева И. А. и др. Характеристика аутологичных
лимфобластоидных культур, полученных из клеток обезьян и людей, больных
гемобластозом//Моделирование патологических состояний человека. М., 1977.
Т. 1. С. 5—14.
4. (Агрба В. 3., Лапин Б. А., Лебедев В. Н и др.) Agrba V. Z., Lapin В. A., Lebe-
dev V. N. et al. The establishment of the suspension Epstein-Barr virus produsing
cell lines from patients with tumoral diseases // Exp. Pathol. 1979. Vol. 17. P. 228—
236.
5. The Epstein-Barr virus / Eds M. A. Epstein, B. G. Achong. Berlin etc., 1979. 459 p.
6. Агрба В. 3., Лапин Б. А., Яковлева Л. А и др. Вирус герпеса в культурах клеток
кроветворных органов павианов гамадрилов, страдающих гемобластозом //
Вопр. онкологии. 1976. Т. 22, № 2. С. 44—50.
7. Лапин Б. А., Агрба В. 3., Яковлева Л. А. и др. Получение суспензионных лимфо-
бластондных культур клеток, содержащих герпесоподобный вирус, нз кроветвор-
ных органов павианов гамадрилов, больных гематосаркомой //Докл. АН СССР.
1975. Т. 222, № 1. С. 244—246.
8. Лапин Б. А., Яковлева Л. А., Агрба В. 3. и др. Гемобластозы приматов. М.,
1979. 167 с.
9. Тимановская В. В., Яковлева Л. А., Агрба В. 3. и др. Характеристика лимфоидной
линии ЛУГ-4, полученной культивированием клеток лимфоматозного лимфати-
ческого узла обезьяны гибрида (павиаи-геллада) // Злокачественные лимфомы н
ассоциированные с ними лнмфотропные вирусы. М., 1986. С. 155—160.
10. Тимановская В. В., Яковлева Л. А., Инджия Л. В. и др. Культура лнмфондных
клеток обезьяны Масаса arctoides МАЛЛ, продуцирующая лимфотропный вирус
герпеса (ГВМА) // Злокачественные лимфомы и ассоциированные с ними лнмфо-
тропные вирусы. М., 1986. С. 149—154.
11. (Агрба В. 3., Яковлева Л. А., Лапин Б. А. и др.) Agrba V. Z., Yakovleva L. А.,
Lapin В. A. et al. The establishment of continuous lymphoblastoid cell cultures
from hematopoietic organs of baboon (Papio hamadryas) with malignant lym-
phoma // Exp. Pathol. 1975. Vol. 10. P. 318—332.
12. Агрба В. 3. Изучение трансформирующей активности герпесного вируса павиа-
нов (ГВП)//Моделирование патологических состояний человека. М., 1977.
Т. Г. С. 15—19.
13. Агрба В. 3., Онищук Ф. Д., Бубеник Я- и др. Изучение некоторых биологических
характеристик лимфоидных линий клеток, продуцирующих лнмфотропные вирусы
герпеса приматов//Вопр. вирусологии. 1983. № 1. С. 85—90.
14. Агрба В. 3., Яковлева Л. А., Сангулия И. А. и др. Получение и изучение долго-
живущих внруспродуцирующих культур нз кроветворных органов больных
лейкозом обезьян // Вирусы рака н лейкоза. М., 1974. С. 83—85.
15. (Агрба В. 3., Лапин Б. А., Тимановская В. В. и др.) Agrba V. Z., Lapin В. А.,
Timanovskaya V. V. et al. Isolation of lymphotropic baboon herpesvirus (HVP)
308
from oral swabs of hamadryas baboons of the Sukhumi monkey colony 11 Exp.
Pathol. 1980. Vol. 18. P. 269—274.
16. Лапин Б. А., Кокоша Л. В., Агрба В. 3. и др. Иммунологическое изучение
суспензионных культур, полученных из клеток кроветворных органов больных
лимфомой павианов // Вопр. вирусологии. 1976. № 2. С. 141 —145.
17. Маркова Т. П., Чувиров Г. Н., Агрба В. 3. Изучение субпопуляций В-лимфо-
цитов обезьян, трансформированных вирусом герпеса павианов in vivo и в ткане-
вых культурах // Вопр. вирусологии. 1985. № 5. С. 549—552.
18. (Кокоша Л. В., Агрба В. 3., Лапин Б. А. и др.) Kokosha L. V., Agrba V. Z.,
Lapin В. A. et al. Continuous lymphoblastoid suspension cultures from cells
of haematopoietic organs of baboons with malignant lymphoma. 3. Immunolo-
gical study // Exp. Pathol. 1977. Vol. 13. P. 247—254.
19. Лапин Б. А., Агрба В. 3., Дьяченко А. Г. и др. Выделение из клеток суспензи-
онной лимфобластоидной культуры, полученной от больного лимфогранулемато-
зом, вируса Эпстайн-Барр //Докл. АН СССР. 1976. Т. 227, № 6. С. 1496—1499.
20. Falk L., Deinhardt F., Nonoyama M. et al. Properties of a baboon lymphotropic
Herpesvirus related to Epstein-Barr virus // Intern. J. Cancer. 1976. Vol. 18. P. 798—
807.
21. Hinuma У., Nagata K-, Hanaoka M. et al. Adulte T-cell leukemia: Antigen in an
ATL cell line and detection to the antigen in human sera // Proc. Nat. Acad.
Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 6476—6480.
22. Miyoshi I., Kubonishi I., Yoshimoto S. et al. A T-cell line derived from normal
cord leukocytes by coculturing with human leukemic T-cells // Gann. 1981. Vol. 72.
P. 978—981.
23. Miyoshi I., Taguchi H., Fujishita M. et al. Transformation of monkey lymphocytes
with adult T-cell leukemia virus // Lancet. 1982. Vol. i. P. 10—16.
24. Miyoshi I., Yoshimoto S., Fujishita M. et al. Isolation in culture of a type C virus from
a Japanese monkey seropositive to adult T-cell leukemia-associated antigens //
Gann. 1983. Vol. 74. P. 323—326.
25. Агрба В. 3., Онищук Ф. Д., Бубеник Я. и др. Подходы к классификации
лимфоидных суспензионных линий клеток павианов гамадрилов // Злокачествен-
ные лимфомы и ассоциированные с ними лнмфотропные вирусы. М., 1986. С. 145—
148.
26. Nilsson К., Ponten J. Classification and biological nature of established human
hematopoietic cell lines // Intern. J. Cancer. 1975. Vol. 15. P. 321—341.
• ИМЧгИ'
309
Список принятых сокращений
А — раствор аминоптерина
АК — аденозинкиназа
АГФТ — аминогликозидфосфотрансфераза
АО — акридиновый оранжевый
АФРТ — аденинфосфорибозилтрансфераза
БДУ-5 — 5-бромдезоксиуридин
БСА —бычий сывороточный альбумин
БЭ — бромистый этидий
в. и. — водная иммерсия
ВПП — вирус простого гепеса тип 1
ВПКРС1 — вирус папилломы крупного рогатого скота тип I
ВЭБ — вирус Эпштейн—Барр
ГАТ — селективная среда, содержащая аминоптерин, тимидин, гипоксантин
ГВП — герпес-вирус павиана
ГМФ — гуанинмонофосфат
ГТФ —гуанинтрифосфат
Г6ФДГ — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
ГФРТ — гипоксантинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ)
ДГФР — дигидрофолатредуктаза
ДФГТ — 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен
ДМСО — «иметилсульфоксид
ДСН — додецилсульфат натрия
ДЭАЭ- — диэтиламиноэтил-декстран
декстран
ИМФ — инозиимонофосфат
ИУК — индолилуксусная кислота
КАД — карбомилфосфатсинтетаза
КГФРТ — ксантин-гуанинфосфорибозилтрансфёраза
КОЕ-к — коммитированные клетки-предшественники гранулоцитов и макррфагов
КОК — стромальные клоногенные клетки
КМФ — ксантинмонофосфат
ЛДГ — лактатдегидрогеназа
МГ — аг-макроглобулин
МДГ — малатдегидрогеназа
м. и. — масляная иммерсия
МКГАС — среда, содержащая микофеноловую кислоту, гипоксантин и азасерин
МКГАТ — селективная среда ГАТ с добавкой микофеноловой кислоты
МННГ — N-метилнитронитрозогуанидин
Мон АТ — моноклональные антитела
МТТ —р-йоднитротетразолнй фиолетовый , „ и.
НАД —никотинадениндинуклеотид .'яй s V
НАДФ — никотинадениндинуклеотидфосфат
НБТ — тетразолий нитросиний ,
НОА —неосновные аминокислоты .Д,.:
2-НОФ — М-ацетокси-2-ацетиламинофлюорен ’
НУК —нафтилуксусная кислота
ОВ40 —обезьяний вирус 40 . Y
ПААГ — полиакриламидный гель
ПВП — поливинилпирролидон
ПЦМ — проточная цитометрия
310
ПЭГ пэо — полиэтиленгликоль — полиэтиленоксид
РОЭ PC скк СКРС СЭК тг ТГс ТИФА тк ТРИА ТРИТЦ тц ТЭБ УМФ ФГА — рецептор-опосредованный эндоцитоз — рабочая среда — стволовые кроветворные клетки — сыворотка крупного рогатого скота — сыворотка эмбрионов коров — тиогуанин — трис-гистидиновый буфер — твердофазный иммуноферментный анализ — тимидинкиназа — твердофазный радиоиммуноаналнз — тетраметилродаминизотиоционат — трис-боратный буфер — трис-ЭДтА-боратный буфер — уридинмонофосфат — фитогемагглютинин внтиммекэт RSt:
ФДА — флюоресцеиндиацетат имнюн .'niH>.»or.yquo<) «оз(
ФИТЦ ФК ФМС ФРПФ ФЭУ ЭДТА ЭМС . ЭКОф ЭРФ ЭФ ЯО РОРОР РРО SDS — флюоресцеинизотиоционат . я/ — флюорескамин и/zzi о । ч П„ Н — феназин метасульфат — 5-фосфорибодилпирофосфат П ,й н г. — фотоэлектронный умножитель — этилендиаминтетрауксусная кислота ; < ф — этил-метансульфонат , . — эффективность колониеобразования — эпидермальный ростовой фактор — электрофорез "*м* — ядрышковый организатор е — 1,4-бис-2,5-фенилоксазолилбензол '* г — 2,5-дифенилоксазол — додецилсульфат натрия
.'I О X И S г, э я Г
R»(J fl Ч
f f. ХкНН' и £ ИНГ -- . . .mFHTOW’ “V! > о 5 ч - {ЛОИ. НДОТЭМ .8 0 . 9 * янцегг днцдн! в •> q а Ь ;H'fi ‘-.SHOIUKMIOM ‘ > л! WHJIU iiibRqoi- <хэжи1п я •'i
Л -• хг ’ . ' Г. 4 '1 . B.H НХНП НПД .вЯ ВО’ <|0»Ф л
чидэцн-*5 Xktiwi’.fc • WHfcBOq- 11 "> г. н
а Я •. .ил ’ВОЦИ .0 >
п
Оглавление =« и
<ГГ
Предисловие...................................................J.‘, . . 3
Часть 1. Общая технология культивирования клеток
Н. С. Волосов. Оборудование, используемое при работе с клеточными
культурами......................................................... 6
М. И. Блинова, Л. Н. Л ы с е и о к. Культуральная посуда и способы ее
обработки......................................................... 29
А. Д. Тартаковский. Питательные среды для культивирования клеток
млекопитающих..................................................... 44
А. А. Цуцаева, Т. Ф. Петренко. Криокоисервация культивируемых
клеток животных................................................... 63
А. С. П о п о в. Криоконсервация клеток растений.................... 70
Часть 2. Методы анализа культивируемых клеток
С. Е. Мамаева. Хромосомный анализ культивируемых клеток .... 78
Б. А. Маргулис. Определение видовой специфичности культивируемых
клеток с помощью изофермеитиого анализа........................... 98
Г. Г. М и^1 л е р, И. В. Р а к о в с к а я, В. В. Н е у с т р о е в а, Н. В. Ш а л у-
иова, Т. Д. Смирнова, С. Н. Борхсеииус. Коитамниаиты
клеточных культур................................................. Ю4
А. Д. С о р к и н, Л. В. Тесленко. Прижизненная люминесцентная
микроскопия клеток ... .......................................... 126
Ю. М. Розанов. Проточная цитометрия................................ 136
Часть 3. Клеточная н генная инженерия
К. В. Сальников. Получение генетически маркированных клеточных
штаммов.......................................................... 147
И. Н. Смоленская, А. В. Носов. Методы получения и культивиро-
вания протопластов............................................... 164
И. А. Прудовский, С. И. Сухарев. Гибридизация клеток животных 176
И. И. Фридлянская. Получение моноклональных антител (гибридом-
иая технология).................................................. 194
О. К. Г л е б о в. Генетическая трансформация соматических клеток .... 205
Т. В. Поспелова. Трансформация нормальных клеток онкогенными
последовательностями ДНК......................................... 221
Часть 4. Культивирование клеток разного происхождения
В. В. У р м а и ц е в а. Культивирование каллусиых тканей на твердых
питательных средах................................................. 232
В. Т. Какпаков. Культивирование клеток и тканей беспозвоночных 241
К. НГринберг, В. И. Кухареико, В. Н. Ляшко, С. М. Терехов,
Е. М. Пичугина, М. И. Ф р е й д и и, В. Г. Черников. Культиви-
рование фибробластов человека для диагностики наследственных болез-
ней ............................................................... 250
А. Я. Фриденштейн. Клонирование стромальных клеток-предшествен-
ников ............................................................. 257
С. А. Кузнецов. Поддержание кроветворения н лимфопоэза в культу-
рах иа стромальных подложках....................................... 265
312
Е. А. Лурия, С. А. Кузнецов, Е. И. Г е и к и н а. Культивирование
и дифференцировка костномозговых остеогенных клеток-предшествен-
ников ......................................................... 276
Т. А. Крылова, И. И. Фридлянская. Культивирование скелетио -
мышечных клеток................................................. 282
А. Б. Б о р и с о в. Культивирование клеток сердца.................290
В. 3. Агрба, В. В. Т и м а н о в с к а я. Методы получения и культивиро-
вания лимфоидных суспензионных линий клеток приматов................299
Список принятых сокращений..............................................ЗЮ
Рефераты..........................;....................................315
А
•'’чг, 1 (Ik ,1s.. ft-
313
н
• fti-l
Методы
культивирования
клеток
Утверждено к печати
Научным советом по проблемам
цитологии и Институтом цитологии
Академии наук СССР
Редактор издательства Л. С. Е в с т-и г н ее в а
Художник Яценко Л. А.
Технический редактор М. Э. Карлайтис
Корректоры Г. Д. А д е й к и н а, Н. Г. К ац енко,
И. А. Корзинина и В. В. Крайнева
И Б № 33029
Сдано в набор 17.08.87. Подписано к печати 5.03.88.
М-36067. Формат 60Х901/<б. Бумага офсетная № 1.
Гарнитура литературная. Печать офсетная. Фотонабор.
Усл. леч. л. 204-1 п. л. вкл. Усл. кр.-отт. 21. Уч.-изд. л. 26.15.
Тираж 3400. Тип. зак. 1789. Цена 3 р.
Ордена Трудового Красного Знамени
издательство «Наука». Ленинградское отделение. >
199034, Ленинград, В-34, Менделеевская линия, 1.
Ордена Трудового Красного Знамени /
Первая типография издательства «Наука».
199034, Ленинград, В-34, 9 линия, 12. !
>' И р 1 1
" ’ '-’•УН
УДК 576.086.8
Волосов Н. С. Оборудование, используемое при работе с клеточными культурами //
Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 6—29.
Освещаются вопросы технического обеспечения работ с клеточными культурами, под-
черкивается необходимость комплексного методического подхода при выборе подобного обо-
рудования. Особое внимание уделяется приборам и оборудованию, производимым в СССР.
УДК 57.086.832.6
Блинова М. И., Лисенок Л. Н. Культуральная посуда и способы ее обработки //Ме-
тоды культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 29—44.
Изложены сведения о стеклянной и пластиковой (одноразового использования) писуде,
применяемой для культивирования клеток, о физико-химических свойствах стекла разных со-
ставов. Рассмотрены существующие гипотезы о механизме адгезивности полистирола для
культивируемых клеток. Подробно описаны способы мытья стеклянной посуды с учетом свойств
материала и различные варианты обработки пластиковой посуды для повышения ее адгезион-
ных свойств. Библиогр. 28 назв. Ил. 4. Табл. 5.
УДК 57.086.83
Тартаковский А. Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопита-
ющих // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 44—63.
Рассматривается состав наиболее распространенных питательных сред, обсуждаются во-
просы оптимизации сред н замены сыворотки известными веществами. Описывается приго-
товление бессывороточной среды для культивирования нормальных кератиноцитов человека.
Библиогр. 29 назв. Табл. 5.
УДК 57.042:57.085.23 '
Цуцаева А. А., Петренко Т. Ф. Крнокоисервация культивируемых клеток живот-
ных //Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 63—69.
Описываются условия криоконсервирования культивируемых клеток животных: выбор
криопротектора, режим охлаждения и отогрева, оценка жизнеспособности клеток. Библиогр.
29 назв.
УДК 581.1.083
Попов А. С. Криоконсервация клеток растений // Методы культивирования клеток. Л.:
Наука, 1987. С. 70—77.
Описаны особенности криоконсервации растительных клеток: специальное предваритель-
ное культивирование, выбор криопротектора, скорости замораживания, условия оттаивания,
оценка жизнеспособности. Библиогр. 36 назв.
315
УДК 576.312.3 : 578.085.23
Мамаева С. Е. Хромосомный анализ культивируемых клеток // Методы культивиро-
вания клеток. Л.: Наука, 1987. С. 78—98.
Дано описание последовательных этапов! цитогенетического анализа постоянных клеточ-
ных линий, позволяющего установить происхождение всех маркерных хромосом в любой линии
и получить новую объективную характеристику клеточной линии — обобщенный реконструи-
рованный кариотип. Библиогр. 32 назв. Ил. 12. Табл. 1.
УДК 577.158
Маргулис Б. А. Определение видовюй специфичности культивируемых клеток с по-
мощью изоферментного анализа // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 98—
103.
Приведена характеристика методов определения видовой специфичности клеточных линий
с помощью изоферментного анализа, разобраны варианты методов нативного электрофореза
клеточных белков; особое внимание уделено электрофорезу в акриламидном геле. Дано
описание процедур для гистохимического выявления зон изоферментов в геле с подробными
рецептами всех необходимых растворов. Биб'Лиогр. 9 назв.
УДК 579.887.111 : 579.252
Миллер Г. Г., Раковская И. В.., Неустроева В. В., Шалунова Н. В.,
Смирнова Т. Д., Борхсениус С. Н- Контаминанты клеточных культур // Методы
культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С- 104—126.
При изучении клеток эукариот, культивируемых вне организма, важно использовать
биологически чистые системы. Прежде всего исследуемые клетки или клетки, используемые
в биотехнологии, не должны содержать неконтролируемых вирусов и микоплазм. В статье
описаны наиболее часто встречающиеся контаминанты, методики их выявления и даны
рекомендации по предупреждению заражения клеточных культур микоплазмами. Библиогр.
86 назв. Ил, 1.
УДК 576.35 : 578.085.23
Сор кн и А. Д., Тесленко Л. В. Прижизненная люминесцентная микроскопия
клеток//Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 126—136.
На примере исследования процесса эндоцитоза и динамических свойств клеточных мем-
бран представлено описание условий эксперимента, приборов, используемых для прижизненной
люминесцентной микроскопии клеток, и методик приготовления флюоресцентно меченных
молекул. Библиогр. 19 назв. Ил. 2. Табл. 1.
УДК 57.086.835 : 616.073.524
Розанов Ю. М. Проточная цитометрия // Методы культивирования клеток. Л.: Наука,
1987. С. 136—146.
Дается описание принципов измерения, техники и областей применения проточной цито-
метрии. Приводятся прописи методик для анализа различных характеристик клеток. Библиогр.
43 назв. Ил. 2. Табл. 1.
УДК 575.155
Сальников К- В. Получение генетически маркированных клеточных штаммов //
Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 147—164.
Рассматриваются принципы селекции соматических клеток млекопитающих на устойчи-
вость к ядам и антиметаболитам. Даны практические рекомендации получения генетических
маркеров. На основе анализа современных литературных данных рассматриваются свойства
наиболее известных генетически маркированных линий. Библиогр. 51 иазв. Ил. 1. Табл. 1.
316
УДК 57.085.23 : 581.1
Смоленская И. Н., Носов А. В. Методы получения н культивирования прото-
пластов //Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 164—175.
Описаны источники для выделения протопластов, способы их получения, условия их
последующего культивирования. Дана пропись сред, используемых для культивирования
протопластов. Бнблиогр. 11 назв. Ил. 1. Табл. 2.
УДК 575.155
Прудовскнй И. А., Сухарев С. Н. Гибридизация клеток животных//Методы
культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 176—193.
Рассмотрены методы слияния клеток под влиянием разных стимулирующих агентов,
а также различные системы селекции гибридных клеток. Библиогр. 35 назв. Ил. 1.
УДК 576.532
Фрндлянская И. И. Получение моноклональных антител (гнбрндомная техноло*
гня) // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 194—205.
Описаны все этапы гибрндомной технологии для получения моноклональных антител
мышиного происхождения. Особое внимание уделено этапам, связанным с культивированием
клеток. Библиогр. 14 назв.
УДК 575.1
Глебов О. К. Генетическая трансформация соматических клеток// Методы культиви-
рования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 205—221.
Рассмотрены методы введения генов с помощью обработки соматических клеток каль-
цийфосфатным преципитатом ДНК и путем слияния клеток с протопластами бактерий.
Обсуждаются наиболее употребительные системы селекции генетически трансформированных
клеток животных. Библиогр. 56 назв. Табл. I.
УДК 576.16 : 575.224.46 : 57.086.835
Поспелова Т. В. Трансформация нормальных клеток онкогенными последователь-
ностями ДНК//Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 221—231.
Опнсаи кальцийфосфатный метод переноса онкогенных последовательностей в составе
плазмидной и тотальной ДНК из опухолевых клеток. Описан способ получения «фокусов»
морфологической трансформации на NLH3B клетках и эмбриональных фибробластах крысы,
а также введение онкогенных последовательностей котрансфекцией с доминантными марке-
рами устойчивости. Библиогр. 19 назв.
УДК 57.086.835 J 8
Урманцева В. В. Культивирование каллусных тканей на твердых питательных сре-
дах//Методы культивирования клеток. Л/. Наука, 1987. С. 232—241.
Рассмотрены приемы, методы и технология (в том числе рвциональиая организация
лаборатории) получения и культивирования каллусиых тканей на твердых питательных
средах. Библиогр. 10 назв. Табл. 2.
УДК 592 : 57.085.23
Какпаков В. Т. Культивирование клеток и тканей беспозвоночных//Методы куль-
тивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 241—250.
Описаны среды для культивирования клеток беспозвоночных, способы стерильного извле-
чения исходных тканей, культивирование целых эмбрионов или органов, получение клеточ-
ных культур (первичных и постоянных). Библиогр. 61 назв.
317
УДК 57.085.23 : 575.1
Гринберг К. Н., Кухаренко В. И., Ляшко В. Н., Терехов С. М., Пичу-
ги и а Е. М„ Ф р е й д и н М. И., Ч ер н и ков В. Г. Культивирование фибробластов человека
для диагностики наследственных болезней // Методы культивирования клеток. Л.: Наука,
1987. С. 250—257.
Человеческие фибробласты in vitro сохраняют онтогенетические и генотипические
свойства донора, в связи с чем широко используются для диагностики многих наследственных
болезней. В обзоре описаны источники для получения культур, взятие биопснн, получение
эксплантата, культивирование клеток, способы пересевов, криоконсервация клеток. Библиогр.
10 назв.
УДК 591.
Фриденштейн А. Я» Клонирование стромальных клеток-предшественников // Ме-
тоды культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 257—265.
Описан метод, позволяющий in vitro получать количественные н качественные характери-
стики стволовых стромальных клеток кроветворных н лимфоидных органов (КОКф). КОКф
обеспечивают создание гемопоэтического и иммунологического микроокружения, а КОКф
костного мозга служат стволовыми остеогенными клетками. Подробно разбираются этапы
клонирования КОКф н пассирования нх потомков в культурах. Приведены способы определе-
ния по результатам клонирования, т. е. по количеству колоний фибробластов, истинной
концентрации КОКф в клеточных суспензиях и исходных гемопоэтических органах; обсуж-
даются значение и перспективы применения культурального теста на КОКф- Библиогр.
16 назв.
УДК 591.
Кузнецов С. А. Поддержание кроветворения и лимфопоэза в культурах на стро-
мальных подложках // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1987. С. 265—276.
Работа содержит обзор и критический анализ современных методов культивирования
кроветворных н лимфоидных клеток на стромальных подложках. Подробно разобраны спо-
собы приготовления декстеровских культур и культур, обеспечивающих поддержание
длительного лимфопоэза; особое внимание уделено сложным, критическим, моментам методик.
Коротко рассматриваются параметры гемо- и лимфопоэза на стромальных подложках in vitro,
а также перспективы применения описанных культуральных систем. Библиогр. 34 назв.
УДК 591.
Лурия Е. А., Кузнецов С. А., Генкина Е. Н. Культивирование и дифференци-
ровка остеогенных костномозговых клеток-предшественников // Методы культивирования
клеток. Л.: Наука, 1987. С. 276—282.
Изложен метод органного культивирования фрагментов и клеточных суспензий костного
мозга взрослых животных и человека, позволяющий получить in vitro образование зрелой,
минерализованной, костной ткани. Описаны способы эксплантации, параметры культивирова-
ния н методы обработки культур, дан сравнительный морфологический анализ полученных
результатов в зависимости от особенностей культивирования. Рассмотрены некоторые пути
применения этой культуральной системы. Библиогр. 13 назв.
УДК 576.536 : 591.473
Крылова Т. А., Фрндлянская И. И. Культивирование скелетно-мышечных кле-
ток //Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 198-7. С. 282—290.
Описаны источники миогенных клеток, способы получения первичных культур, условия
культивирования скелетно-мышечных клеток. Особое внимание уделено методам запуска
экспрессии дифференцировки в первичных культурах и клеточных линиях миогенного проис-
хождения, дифференцирующихся in vitro. Библиогр. 18 назв.
318
УДК 547.963.32 : 591.413 : 576.3
Борисов А. Б. Культивирование клеток сердца//Методы культивирования клеток
Л.: Наука, 1987. С. 290—299.
Описаны методы культивирования эмбриональных и дифференцированных клеток сердца,
их идентификации от сопутствующих клеточных типов и получения популяций кардиомиоци-
тов, свободных от примесей фибробластов и эндотелия. Рассмотрены успехи культивирования
мышечных клеток предсердий, желудочков и проводящей системы сердца теплокровных
животных и человека и возможности их использования в исследованиях клеточных и молеку-
лярных аспектов функции миокарда. Библиогр. 44 назв. Ил. 1.
УДК 57.086.835 С
Агрба В. 3., Т и м а и о в с к ая В. В. Методы получения и культивирования лимфоид-
ных суспензионных линий клеток приматов // Методы культивирования клеток. Л.: Наука,
1987. С. 299—309.
В научно-исследовательском институте экспериментальной патологии и терапии АМН
СССР имеется коллекция постоянных лимфоидных линий, полученных от больных опухоле-
выми заболеваниями и клинически здоровых людей и обезьян. Эти линии имеют В-клеточиое
происхождение. В части линий обезьян происходит репликация лимфотропиого герпесвируса
павианов (ГВП), а в человеческих линиях — лимфотропиого герпесвируса человека (ВЭБ).
В обзоре изложены методические приемы для получения таких клеточных линий. Библиогр.
26 иазв. Ил. 9.
ОП -- & г-
1ЮП -- ГГ.
41
.ид
. VOR . О'-* 'I '
. (*Й0'1 '-..I -- ИНН
• '<ЙО
•; ! ч |«
319