Клеточно-молекулярные механизмы фотодинамической терапии

Часть I. Фотодинамический эффект и фотодинамическая терапия
Глава 1. Основы фотодинамической терапии

1. 4. Клинические применения фотодинамической тepaпии

1. 6. Внутриклеточная локализация фотосенсибилизаторов

1. 7. Направленная доставка фотосенсибилизаторов

Глава 2. Фотодинамическое воздействие на клеточные структуры

2. 4. Аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум

2. 5. Цитоскелет: микротрубочки и актиновые филаменты

Глава 3. Реакции клеток на внешние воздействия

3. 2. Комплекс выживаемости или защиты клеток

3. 3. Комплекс клеточной смерти: апоптоз, аутофагия и некроз

Глава 4. Смерть клеток при фотодинамическом воздействии

4. 2. Роль митохондрий в фотодинамическом повреждении клеток

4. 3. Инициация апоптоза при фотосенсибилизации плазматической мембраны

4. 4. Смерть клеток при фотодинамическом воздействии на лизосомы

4. 5. Участие эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи в апоптозе, индуцированном фотодинамическим воздействием

Глава 5. Участие процессов сигнальной трансдукции в реакциях клеток на фотодинамическое воздействие

5. 4. Фосфолипазы А2 и С
5. 5. Кальмодулин и кальмодулинзависимая киназа

5. 10. Фосфатидилинозитол 3-киназа и протеинкиназа В/ Akt

5. 12. Факторы транскрипции и гены раннего ответа

6. 4. Белки теплового шока и белки, регулируемые глюкозой

Часть II. Фотодинамическое воздействие различных фотосенсибилизаторов на нервные клетки
Глава 7. Нейроны и глиальные клетки как объект фотодинамической терапии

Глава 8. Биоэлектрические реакции нейронов на фотодинамическое воздействие

8. 2. Импульсные реакции нейронов на фотодинамическое воздействие

8. 3. Концентрационные кривые и сравнение фотосенсибилизаторов

Глава 9. Фотодинамическое действие на нейрон порфириновых фотосенсибилизаторов

Глава 10. Фотодинамическое действие на нейрон хлоринов е6 и р6 и их производных

Глава 11. Фотодинамическое действие на нейрон фталоцианиновых сенсибилизаторов

Глава 12. Геперицин как фотосенсибилизатор

12. 3. Темновая токсичность геперицина и Hyp-S

Глава 13. Фотодинамическое действие на нейрон рибофлавина и других фотосенсибилизаторов

13. 3. Янус зеленый В
13. 4. Заключительные замечания

Часть III . Клеточно-молекулярные механизмы фотодинамическoго воздействия на нейроны и глиальные клетки
Глава 14. Морфологические изменения фотосенсибилизировнных нейронов и глиальных клеток

14. 2. Локализация Фотосенса в рецепторе растяжения рака и клетках глиобластомы

14. 3. Морфологические изменения фотосенсибилизированных нейронов на светооптическом уровне

14. 4. Морфологические изменения фотосенсибилизированных глиальных клеток на светооптическом ypовне. Некроз и апоптоз

14. 5. Ультраструктурные изменения фотосенсибилизированного нейрона

14. 6. Ультраструктурные изменения фотосеисибилизированных глиальных клеток

Глава 15. Участие активных форм кислорода в реакции нейpонa на фотодинамическое воздействие

Глава 16. Роль биоэнергетических процессов в реакции нейрона на фотодинамическое воздействие

Глава 17. Роль сигнальных процессов в реакциях нейронов и глии на фотодинамическое воздействие

17. 2. Са 2 + зависимые сигнальные процессы

17. 3. сАМР-зависимые сигнальные процессы

Глава 18. Poль нейроглиальных взаимодействий в фотоповреждении нейронов и глиальных клеток

18. 2. Протеолитическое «разделение» нейрона и глии

18. 3. Влияние нейротрофина NGF и эпидермального фактора роста EGF на выживаемость фотосенсибилизированных нейронов и глии

Глава 19. О механизмах реакций нейронов и глиалныx клеток на фотодинамическое воздействие

Author: Узденский А.Б.

Tags: медицина биохимия молекулярная биология клеточная биология фотодинамическая терапия

Similar

Фотобиология

Растительные ресурсы России. Том 2. Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность

Дерматовенерология. Национальное руководство

Химия синтетических красителей Т.4

Text

А. Б. Узденский
КАЕ ГОЧ НО;МОЛЕКУЛЯPH ЫЕ
МЕХАНИЗМЫ « W
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ
ТЕРАПИИ
А. Б. Узденский
КЛЕТОЧНО-МОЛЕКУЛЯРНЫЕ
МЕХАНИЗМЫ
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ
ТЕРАПИИ
ПРЕДИСЛОВИЕ
Фотодинамический эффект — повреждение светом окрашен-
ных инфузорий — был открыт О. Раабом и Г. фон Таппейнером
чуть более 100 лет назад. Такое, казалось бы, чисто академиче-
ское наблюдение легло в основу фотодинамической терапии, в
которой световое излучение разрушает патологически изменен-
ные ткани, избирательно окрашенные специальными красителя-
ми-фотосенсибилизаторами. Особенно широко этот эффект ис-
пользуется в онкологии для селективного разрушения опухолей.
Также разрабатывается его применение для лечения ряда неон-
кологических болезней, например артритов или макулярной де-
генерации сетчатки, для стерилизации крови и т. д. Фотодинами-
ческая терапия — это поистине «magic bullet» (волшебная пуля).
Этот термин или, точнее концепцию медицины будущего пред-
ложил в свое время выдающийся врач и фармаколог Пауль Эр-
лих. Основная идея этого подхода — разработка лекарственных
средств, которые сами находят пораженную ткань и избиратель-
но разрушают или излечивают ее. Фотодинамическая терапия —
это хороший пример того, как фундаментальные биофизические
исследования находят широкое применение в медицинской
практике.
Для повышения эффективности поражения злокачественных
клеток и защиты окружающих нормальных тканей необходимо
всестороннее изучение фотодинамических процессов на клеточ-
ном и молекулярном уровне. Особый интерес представляет изу-
чение протекающих при этом в клетке сигнальных процессов,
управляющих ее состоянием и направленных как на защиту
клетки, так и на реализацию программы смерти. Модуляция
этих реакций с помощью фармакологических или физиотерапев-
тических средств позволит управлять результатами воздействия.
Очень важно также учитывать взаимодействие клеток в тканях и
органах, которое также может способствовать защите соседних
клеток или их повреждению вплоть до фагоцитоза клеточных
обломков.
Поскольку в основе фотодинамического повреждения лежит
развитие в клетках окислительного стресса, то это исследование
также помогает понять общие механизмы клеточных реакций на
окислительный стресс, механизмы клеточной защиты, а также
механизмы, запускающие, реализующие или блокирующие про-
грамму клеточной смерти, осуществляющие переключение раз-
ных путей смерти клетки (аутофагия, некроз или апоптоз). Этой
работе посвящены тысячи исследований. Поиск научных статей
по запросу «photodynamic cell» в известной научной базе биоме-
дицинских данных www.pubmcd.com дал 4350 названий. Поэто-
му возникла необходимость обзора и обобщения основных све-
дений о клеточно-молекулярных механизмах фотодинамической
терапии, что и являлось основным предметом настоящей книги.
Кроме этого в нее включены результаты собственных исследо-
ваний автора и его коллег, посвященных электрофизиологиче-
скому, биофизическому, микроскопическому, биохимическому
и фармакологическому изучению механизмов фотодинамиче-
ского повреждения нервных и глиальных клеток.
Автор с благодарностью вспоминает своих учителей, в пер-
вую очередь, С. Е. Бреслера и А. Б. Когана; выражает иск-
реннюю признательность сотрудникам и коллегам, особенно
Б. М. Владимирскому, О. Ю. Кутько, О. Ю. Дергачевой, А. А. Жа -
воронковой, Д. Е. Брагину, М. С. Колосову, А. В. Лобанову,
Г. М. Федоренко, Й. Моану, А. Юзенинс, В. Иани, Л. В. Ма,
А. Я. Потапенко, Т. Й. Кару, О. Р. Колье и другим. Особую бла-
годарность автор приносит своей жене за моральную поддержку
и терпение, а также своим покойным родителям.
ЧАСТЬ I
ФОТОДИНАМИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ
И ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ
Глава 1
ОСНОВЫ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ
1. 1. Краткая история фотодинамической терапии
Фотодинамический (ФД) эффект был открыт в 1900 г. О. Ра-
абом, аспирантом известного биолога Г. фон Таппейнера. При
изучении влияния флуоресцентных красителей акридина и его
производных на инфузории и другие простейшие он обнаружил,
что при освещении окрашенные одноклеточные останавливают-
ся и погибают. После защиты диссертации Рааб, вероятно, ушел
из науки и исчез из поля зрения ученых. Но Г. фон Таппейнер
продолжил эти исследования. Он и выдвинул термин «фотоди-
намический эффект», обозначающий действие света на динами-
ку клеток, т. е. на их подвижность. Иногда этот эффект называ-
ют фотосенсибилизацисй, — придание фоточувствительности
клеткам или организмам. В 1902 г. Лсду-Лебартс показал, что
кроме красителя и света для фотодинамического повреждения
клеток нужен третий обязательный компонент — кислород. Та-
ким образом, в фотодинамическом повреждении клеток участву-
ет триада: «краситель — свет — кислород». Г. фон Таппейнер
сразу понял потенциальную терапевтическую ценность фотоди-
намического эффекта. Уже в 1903 г. он вместе с А. Джсзиони-
ком провел опыты по фотодинамической терапии заболеваний
кожи ракового, сифилитического и туберкулезного происхожде-
ния с помощью окрашивания эозином и освещения ярким сол-
нечным светом. Ему впервые удалось вылечить рак кожи. Чуть
раньше, в 1902 г. Г. Дрейер открыл бактерицидный эффект при
действии света на окрашенные бактерии. Он же показал, что
свет может повреждать окрашенную кожу человека, и обнару-
жил болевой эффект при фотоповреждении кожи. Этот и другие
побочные эффекты, а также нестабильное лечебное действие,
ограничение фотоповреждения только поверхностными слоями
патологически измененной кожи побудило первых исследовате-
лей прекратить эксперименты с использованием таких токсич-
ных и канцерогенных красителей, как акридин и эозин. Позднее,
в 1911 г. В. Хаусманн показал высокую фототоксичность гема-
топорфирина, а в 1924 г. А. Поликар обнаружил избирательное
накопление его опухолями, открывшее перспективы их флуо-
ресцентной визуализации и фототерапии рака (Moan, Peng, 2003;
Hamblin, Mroz, 2008).
С. Шварц и Р. Л. Липсон в конце 1950-х годов доказали, что
грубые, плохо очищенные препараты гематопорфирина избира-
тельно накапливаются в опухолях, и их красную флуоресцен-
цию можно видеть во время хирургической операции. В попыт-
ке очистить гематопорфирин путем последовательной обработ-
ки серной и уксусной кислотами была получена смесь
различных производных, обогащенная олигомерными порфири-
нами, названная впоследствии «производное гематопорфирина»
(HpD). Оказалось, что HpD гораздо более селективно локали-
зуется в опухолях, чем чистый гематопорфирин. Авторы показа-
ли возможность использования HpD для флуоресцентной диа-
гностики и разрушения опухолей (Schwartz et al., 1955; Lipson
et al., 1960, 1961). Точного химического состава HpD не имеет.
Оно содержит смесь различных веществ, наиболее активными
из которых являются ди- и полигематопорфириновые эфиры.
На его эффективность сильно влияет агрегация порфиринов
в воде. Агрегированные молекулы фотохимически не активны,
но более липофильны и лучше проникают в клеточные мемб-
раны, где в гидрофобном окружении они могут мономеризо-
ваться и стать активными. Степень полимеризации зависит от
способа получения препарата, который патентуется. Препара-
ты HpD, полученные в разных странах, называются Фотофрин,
Фотофрин II (США, Канада), Фотосан-3 (Германия), Фотогем
(Россия).
Широкое распространение фотодинамической терапии
(ФДТ) началось в середине 1970-х годов с работ Т. Догерти и со-
авт. Уже в первых работах они добились полной или частичной
ремиссии 111 из 113 кожных и подкожных опухолей и мета-
стазов у 25 пациентов после внутривенного введения HpD и об-
лучения красным светом ксеноновой лампы (600—700 нм в диа-
пазоне) (Dougherty et al., 1975, 1978). После этих работ началось
взрывное изучение фотодинамического эффекта и применение
фотодинамической терапии для лечения рака и ряда других
болезней. К настоящему времени опубликованы тысячи работ
и излечены десятки и сотни тысяч людей (Dougherty et al., 1998;
Calzavara-Pinton et al., 2001; Brown et al., 2004; Hamblin, Mroz,
2008).
1. 2. Фотодинамический эффект
Фотохимические превращения молекул происходят не в
основном, а в электронно-возбужденном состоянии. Поэтому
они вызываются только поглощенным светом. После поглоще-
ния кванта света молекулы сначала переходят на более высокие
энергетические уровни: сначала на короткоживущие синглетные
уровни со временем жизни порядка 10“8—10 9, а потом в про-
цессе интеркомбинационной конверсии они могут перейти в
долгоживущие триплетные состояния со значительно большим
временем жизни (10 4—10+2с) и поэтому более активные. Эти
процессы изображены на классической схеме Яблонского
(рис. 1) (Конев, Болотовский, 1974; Владимиров, Потапенко,
2006).
Возбужденные светом молекулы либо непосредственно
вступают в окислительно-восстановительные реакции с перено-
сом электронов или протонов и образованием промежуточных
радикальных продуктов, которые затем взаимодействуют с кис-
0 ____Смерть
2 клетки
Рис. 1. Энергетические уровни и переходы между ними.
Схема Яблонского. Sq, S t и S2 — синглетные уровни; Т। — триплетный уровень.
Fig. 1. Energy levels and transitions.
Yablonsky scheme. Sq, Sj и S2 — singlet levels; T[ — triplet level.
Тип 1
Тип 2
Рис. 2. Инициация перекисного окисления липидов фотодинамическими
реакциями 1-го и 2-го типов (по: Girolti, 1990).
Пояснения в тексте.
Fig. 2. Initiation of lipid peroxidation by I and 11 type photodynamic reaction
(After Girolti, 1990).
Explanations are in the text.
лородом (реакции 1 -го типа), либо сначала они реагируют с кис-
лородом, переводя его в высокоактивную синглетную форму
(*О2), которая затем окисляет широкий круг биомолекул (реак-
ции 2-го типа). В обоих случаях молекулы красителей повыша-
ют чувствительность клеток к световому повреждению. Поэто-
му их называют фотосенсибилизаторами. При этом по отдельно-
сти свет или красители могут быть нетоксичными, и только
совместное действие всех трех компонентов: света, фотосенси-
билизатора и кислорода вызывает фототоксический эффект.
При фотодинамическом эффекте 1-го типа фотовозбужден-
ные молекулы фотосенсибилизаторов переходят в триплетное
состояние и прямо реагируют с субстратом и/или с молекулами
среды, в частности с водой. При этом сначала образуются про-
межуточные радикальные продукты, которые затем взаимодей-
ствуют с кислородом и дают сложную смесь высокоактивных
продуктов, вступающих в дальнейшие окислительные реакции,
повреждающие биоструктуры (рис. 2). После поглощения фото-
на hv молекула фотосенсибилизатора возбуждается и переходит
из основного состояния 5 сначала в синглетное *5*, а затем и в
триплетное возбужденное состояние 37*. Фотодинамический
эффект 1-го типа можно представить следующими реакциями
(Girotti, 1990; Ochsner, 1997; Krasnovsky, 1998, 2007; Aveline,
2001):
5 + hv —> ’5* -> 3T*,
далее происходит перенос электронов на субстрат R:
37*+ 7? —> 5-- + Л‘+,
)T* + R^>S-+ + R-
или перенос протонов:
3Т*Н + R—> S'+ RH',
3Т* + RH —> S'H+ R'
Затем радикалы участвуют в различных реакциях, а в присутст-
вии кислорода они могут инициировать цепное перекисное
окисление, которому особенно подвержены ненасыщенные ли-
пиды в биомембранах:
r- + o2^>roo-,
ROO’ + RiH^RH+RyOO-
и образование супероксид-аниона и других активных форм кис-
лорода:
R+ О2 —> R + О2’_
О2- + Н+ -> но2-
но2- + о2-+Н+ -> Н2О2 + 02
н2о2 + о2- -> он- + он- + 02
Последняя реакция — реакция Габера-Вейса. Она плохо идет в
клетках и организме, но может резко усиливаться по фентонов-
скому механизму в присутствии ионов железа (Ochsner, 1997;
Зенков и др., 2001):
О2- + Fe(III) -> О2 + Fe(II),
Н2О2 + Fe(II) -> ОН- + ОН- + Fe(III).
Супероксид-анион О,’-, получающийся в этих реакциях, высоко-
активен. Но еще большей активностью отличается гидро-
ксил-радикал ОН' (Ochsner, 1997; Зенков и др., 2001). Эти актив-
ные формы кислорода (АФК) при взаимодействии с ненасыщен-
ными жирными кислотами образуют радикалы липидов (£’)>
алкоксильные радикалы (LO"), перекисные радикалы (LOO')
или гидроперекиси липидов (LOOH), входящие в состав био-
мембран. Полученные радикалы инициируют цепное перекис-
ное окисление липидов, повреждение биомембран и нарушение
их функций.
Некоторые классы фотосенсибилизаторов, такие как флави-
ны или кетоны, участвуют в фотодинамических реакциях 1-го
типа (Girotti, 1990). Так, флавины являются эффективными фо-
тогенераторами супероксид-аниона (Schmidt, Butler, 1976;
Schmidt, 1984).
В фотодинамических реакциях 2-го типа (рис. 2) сначала
происходит перенос энергии от фотовозбужденного красителя
на кислород. Это переводит кислород в высокоактивное синг-
летное состояние 'О2 (1 Ag), а затем синглетный кислород окисля-
ет разнообразные субстраты в клетках:
S+hv-> >S* ->37*
+O2^S+ ю2,
'O2 + RH^>ROOH
и далее запускается цепь перекисных процессов.
В отличие от других молекул, основное состояние обычного
молекулярного кислорода — триплетное (3Sg-) с локализацией
неспаренных электронов на разных ядрах. В электронно-возбуж-
денном синглетном состоянии 'Ag со спаренными электронами,
располагающимися на одной орбитали, вторая орбиталь свобод-
на и может принять пару электронов, что обусловливает высо-
кую реакционную способность 'О, (Krasnovsky, 1998, 2007; Вла-
димиров, Потапенко, 2006; Красновский, 2007). В воде время
жизни 'Оэ (тд) примерно 3 мкс, в тяжелой воде (D2O) — около
70 мкс, а в органических растворителях 10—250 мкс. В био-
системах тд значительно ниже благодаря большому количеству
тушителей, главным образом, аминокислот и белков (Krasnov-
sky, 1998; Красновский, 2007). В цитоплазме клеток тд == 170—
320 нс (Baker, Kanofsky, 1992), а в липидной фазе биомемб-
ран — 24—30 нс (Kanofsky, 1991). В модельных экспериментах
с суспензией мицелл показано, что синглетный кислород нахо-
дится преимущественно в гидрофобной фазе (Буторина и др.,
2003). По данным Й. Моана и К. Берга, в клетках, содержащих
множество тушителей, диффузионная длина 'О, не превышает
10—20 нм (Moan, 1990; Moan, Berg, 1991), что хорошо согласу-
ется с оценкой А. А. Красновского: 9 нм в цитоплазме и
4.5—13 нм в биомембранах (Krasnovsky, 1998).
Отсюда следует очень важный вывод: '02 может повреж-
дать только биоструктуры, находящиеся в непосредственной
близости от молекул фотосенсибилизаторов. Поэтому фото-
динамическое повреждение клетки во многом определяется
внутриклеточной локализацией фотосенсибилизатора.
Окислительная способность синглетного кислорода на 2 по-
рядка выше, чем обычного кислорода (Владимиров, Потапенко,
2006). Он может повреждать все основные компоненты клеток.
В нуклеиновых кислотах этот ислород атакует в основном ти-
мин и урацил (Helene, 1976). Поперечные сшивки ДНК—ДНК
или ДНК—белок в фотосенсибилизированных клетках могут по-
вреждать их, особенно в период митоза, когда разрушена ядер-
ная оболочка и фотосенсибилизатор получает доступ к ядерным
структурам (Ben-Hur et al., 1987; Ramakrishnan et al., 1988). ФД
воздействие также может вызывать однонитевые разрывы ДНК
(Ben-Hur, Rosenthal, 1985). Эти воздействия усугубляются тем,
что ферменты, рспарирующие ДНК, особенно чувствительны
к синглетному кислороду (Bocgheim et al., 1987). Однако в ин-
терфазных клетках ДНК не является первоочередной мишенью
для ФД воздействия, так как фотосснсибилизаторы обычно ло-
кализуются в цитоплазме и нс проникают в ядро. Об этом гово-
рит и отсутствие заметного мутагенного действия (Ben-Hur
et al., 1987).
В белках легче всего фотоокисляются цистеин, гистидин,
тирозин, триптофан и фенилаланин, особенно, если они распо-
ложены на поверхности глобул и доступны для фотосснсибили-
затора. Они обычно играют ключевую роль в ферментативной
активности, и поэтому белки очень чувствительны к ФД воздейст-
вию. Они теряют активность в результате нарушения структуры
активного центра, внутренних сшивок или межмолекулярных сши-
вок с другими белками, липидами, РНК и ДНК (Spikes, Straight,
1987; Ochsner, 1997; Girotti, 2001; Davies, 2003; Liu et al., 2004).
В фотодинамических реакциях 1-го типа радикальные пары,
образующиеся при переносе электронов, относительно стабиль-
ны в среде с высокой диэлектрической проницаемостью, где об-
ратный перенос электронов затруднен, т. е. в водных растворах.
Напротив, в неполярных липидных средах время жизни и рас-
творимость ’О, выше. Это предполагает, что фотодинамические
реакции 1-го типа легче протекают в цитозоле, а 2-го — в липид-
ной фазе биомембран, т. с. фотодинамические реакции с участи-
ем гидрофильных фотосенсибилизаторов должны преимущест-
венно идти по первому типу, а гидрофобных — по второму (Gi-
rotti, 1990; Ochsner, 1997). Но, даже в водных средах, реакции
2-го типа намного эффективней реакций 1-го, вследствие боль-
шего коэффициента диффузии *ОЭ и более высоких констант
скоростей реакции. Поэтому реакции 2-го типа доминируют в
повреждающем действии большинства фотосснсибилизаторов,
включая порфирины, хлорины, фталоцианины и т. д. (Ochsner,
1997; Aveline, 2001). В работе Догерти с соавт. (Dougherty et aL,
1976) впервые показано, что именно синглетный кислород явля-
ется основным цитотоксическим агентом при фотодинамиче-
ском повреждении опухолей производным гематопорфирина.
Однако реакции 1-го типа также могут вносить определенный
вклад в фотоповреждение клеток и в ряде случаев ими нельзя
пренебрегать (Henderson, Dougherty, 1992). В большинстве слу-
чаев реализуются смешанные реакции с участием механизмов
обоих типов и генерацией различных АФК. Поскольку ФД воз-
действие быстро снижает уровень кислорода в ткани, то со вре-
менем вклад реакций 2-го типа должен снижаться, а реакций
1-го типа — повышаться (Ochsner, 1997).
Кроме того, при взаимодействии ’О, с некоторыми химиче-
скими соединениями могут получаться другие АФК. Например,
недавно показана генерация гидроксил-радикала ОН’ в результа-
те взаимодействия фенольных соединений с 'О,, полученного
при фотовозбуждении гематопорфирина (Ueda et al., 2003).
Предполагается, что такие биологические восстановители, как
восстановленный глутатион или NADPH обусловливают пря-
мую конверсию ‘О, в ОН* (Nishizawa et al., 2004).
Таким образом, при ФД воздействии интенсивная генерация
радикальных активных форм кислорода (О,-’, ОН*, НО,', Н,О, и
др.) или синглетного кислорода (’О,) (Girotti, 1990; 2001; Ochs-
ner, 1997, Krasnovsky, 1998; Aveline, 2001; Красновский, 2004)
приводит окислению и повреждению белков, перекисному окис-
лению липидов клеточных мембран, нарушению клеточных
функций, развитию окислительного стресса и, в итоге, к смерти
клеток (Girotti, 1990; Владимиров и др., 1991; Dean et al., 1997;
Зенков и др., 2001; Droge, 2002).
1. 3. Фотодинамическая терапия
Процесс фотодинамической терапии (ФДТ) можно разделить
на следующие этапы (Henderson, Dougherty, 1992; Uzdensky,
1996; Dougherty et al., 1998):
А. Селективное окрашивание патологически измененных
тканей.
Б. Фотофизические процессы, ведущие к генерации актив-
ных химических продуктов.
В. Темновые фотохимические процессы, ведущие к смерти
клеток и деструкции опухоли.
Г. Очищение раны и заживление.
Д. Выведение фотосенсибилизатора из организма.
Их можно дальше подразделить на следующие стадии:
А1. Доставка красителя-фотосснсибилизатора к опухолевой
ткани. Фармакокинетика фотосснсибилизаторов зависит как от
свойств органов или тканей, например от их кровоснабжения,
так и от их физико-химических характеристик фотосенсибилиза-
торов, особенно, от их гидрофильности или липофильности.
Гидрофильные сенсибилизаторы локализуются преимуществен-
но в кровеносных сосудах, а гидрофобные — в опухолевой тка-
ни. Они лучше проникают в опухолевые клетки (Henderson, Do-
ugherty, 1992; Boyle, Dolphin, 1996; Dougherty et al., 1998). Через
определенное время после внутривенного введения, разное для
разных органов или тканей (обычно, это несколько часов), кон-
центрация фотосенсибилизатора в опухоли достигает максиму-
ма, а затем он постепенно выводится из организма. Это дает воз-
можность определить время, когда отношение концентрации
фотосенсибилизатора в опухоли к его концентрации в окружа-
ющих тканях максимально — до 10—30 к 1. В этом случае до-
стигается наибольшая селективность воздействия, позволяющая
избирательно разрушить опухоль. Определенные трудности воз-
никают с доставкой гидрофобных фотосенсибилизаторов, не
растворимых в воде. Они хорошо проникают в клетки и более
эффективны, но при внутривенном введении могут агрегировать
или связываться с белками и клетками крови и других тканей. В
крови, однако, есть естественные переносчики липофильных ве-
ществ — липопротеины, альбумины и т. д. В последнее время
разрабатываются искусственные носители для доставки фото-
сенсибилизатора в опухоль — липосомы, антитела, наночастицы
и т. п. (Jori, 1996; Konan et al., 2002).
A2. Проникновение фотосенсибилизаторов в клетки и рас-
пределение их между различными внутриклеточными компо-
нентами (плазматической мембраной, органеллами, ядром и ци-
тозолем). Этот процесс также зависит от физико-химических ха-
рактеристик фотосснсибилизаторов. В целом можно сказать, что
гидрофобные вещества локализуются в основном в различных
клеточных мембранах, а гидрофильные после пиноцитоза попа-
дают в эндосомы и лизосомы (Boyle, Dolphin, 1996; Jori, 1996).
При освещении лизосомальные мембраны разрушаются, и кра-
Рис. 3. Спектры поглощения важнейших хромофоров в клетках и тканях
(по: Moan, 2001).
I — ДНК, 2 — уроканиновая кислота, 3 — меланин, 4а — оксигемоглобин, 4Ь —
дезокепгемоглобин, 5 — вола, 6 -- жир, 7 — билирубин, 8 — каротин.
Fig. 3. Absorption spectra of main chromophores in cells and tissues (After
Moan, 2001).
1 — DNA, 2 -- urocaninc acid, 3 — melanin, 4a — oxyhemoglobin, 4b — desoxyhe-
moglobin, 5 — water, 6 — fat, 7 — bilirubin, 8 — carotin.
ситель может перераспределяться внутри клетки и неспецифи-
чески окрашивать внутриклеточные структуры (Berg, Moan,
1994, 1997; Scully et al., 1998; Sclbo et al., 2002).
Б1. Доставка света к опухоли и се облучение. В качестве ис-
точников света используются мощные лампы, лазеры, в частно-
сти, лазерные диоды, светодиоды (LED — light-emitting diode) и
светодиодные матрицы, излучающие красный или ближний ин-
фракрасный свет в области 600—800 нм. В этой спектральной
области, называемой «терапевтическим окном», собственное
поглощение тканей, обусловленное, главным образом, гемогло-
бином крови и миоглобином мышц, уменьшается, и свет глубже
проникает в ткани, нс повреждая их (рис. 3). Инфракрасное из-
лучение с длиной волны, большей 800 нм, несмотря на хорошее
проникновение в биологические ткани, оказывается неэффек-
тивным из-за неспособности низкоэнергстичсских фотонов ге-
нерировать синглетный кислород (Moan et al., 1998). В тканях
свет поглощается и рассеивается, его интенсивность падает.
Глубина проникновения света не превышает 1 см. Поэтому наи-
более эффективно повреждаются небольшие и плоские опухоли.
Однако возможно послойное разрушение более крупных опу-
холей в несколько приемов. Для повышения эффективности об-
лучения в опухолевую ткань иногда вставляют несколько свето-
водов, доставляющих лазерное излучение на большую глубину
(Тучин, 1998).
Б2. Поглощение света и первичные фотохимические реак-
ции. После поглощения световых квантов молекулы фотосенси-
билизаторов возбуждаются и переходят на верхний синглетный
уровень. В соответствии со схемой Яблонского (рис. 1), энергия
возбуждения безизлучательно расходуется в тепло, либо высве-
чивается в виде квантов флуоресценции, либо может пойти на
фотохимические реакции (Конев, Болотовский, 1974; Владими-
ров, Потапенко, 2006). Последний процесс наиболее эффективно
идет с участием долгоживущих триплетных возбужденных со-
стояний. Поэтому фотосснсибилизаторы должны отличаться вы-
соким квантовым выходом интеркомбинационной конверсии
синглетного состояния в триплетное. В результате переноса
энергии фотовозбуждения на кислород и различные биомолеку-
лы генерируются синглетный кислород, другие АФК и различ-
ные радикальные интермедиаты.
В1. Вторичные темновые реакции и повреждение клеток.
На следующем этапе в клетках происходят свободнорадикаль-
ные процессы окисления липидов, белков и других биомолекул,
вызывающие повреждение биомембран и клеточных органелл.
В клетках развиваются цитотоксические каскады, ведущие к смер-
ти клеток, — апоптозу или некрозу. Эти процессы контролиру-
ются реакциями внутриклеточной сигнальной трансдукции. Они
подробнее рассмотрены ниже.
В2. Лизис погибающих клеток. Высвобождение продуктов
распада, стимулирующих как гибель соседних клеток, так и фа-
гоцитоз клеточных обломков соседними клетками или лейкоци-
тами крови. Фагоцитоз продуктов распада больших опухолей
представляет серьезную проблему для организма, поэтому луч-
шие результаты достигаются при лечении небольших новообра-
зований.
Г. Заживление раны. В случае массивной некротической ги-
бели клеток под влиянием интенсивного ФД воздействия фор-
мируется рубцовая ткань, а при преимущественном развитии
апоптоза продукты распада клеток успевают перевариваться со-
седними клетками и макрофагами, заживление раны происходит
быстрее, рубец нс формируется и достигается лучший космети-
ческий эффект (Новиков и др., 1996).
Д. Выведение фотосенсибилизатора из организма может за-
нимать значительное время (до нескольких месяцев). При этом
человек приобретает кожную фоточувствительность, что огра-
ничивает возможность его пребывания на свету, снижает трудо-
способность и качество жизни. Поэтому одной из проблем фото-
динамической терапии является разработка быстро выводящих-
ся сенсибилизаторов.
Примером стандартного протокола фотодинамической тера-
пии может быть следующая методика (Schuitmaker et aL, 1996):
внутривенная инъекция Фотофрина в дозе 2—5 мг/кг веса (ино-
гда требуется уменьшать дозу фотосенсибилизатора до 1 мг/кг
веса и ниже) и через 24—72 ч после инъекции — облучение
красным светом (630 нм, 100—200 Дж/см2).
Механизм селективного накопления фотосснсибилизаторов
в опухолях не вполне понятен. Его связывают с рядом причин
(Moan, Berg, 1992; Dougherty et aL, 1998; Moan et al., 1998):
а) благодаря утечке из сосудов опухоли, более проницаемых,
чем сосуды нормальных тканей, в ней собирается больше фото-
сенсибилизатора;
б) слабый лимфатический дренаж ведет к задержке фотосен-
сибилизатора в опухоли;
в) макрофаги, многочисленные в опухолевой ткани, аккуму-
лируют агрегированные и связанные с белками фотосенсибили-
заторы;
г) большое межклеточное пространство в опухолях способ-
ствует накоплению гидрофильных фотосснсибилизаторов;
д) низкий pH внеклеточной жидкости в опухолях способст-
вует связыванию фотосенсибилизаторов клетками, так как при
снижении pH повышается липофильность порфиринов и облег-
чается проникновение их в клетки;
е) в опухоли много рецепторов липопротеинов низкой плот-
ности, связывающих большое количество гидрофобных молекул
фотосенсибилизаторов.
Основными мишенями фотодинамической терапии рака яв-
ляются опухолевые клетки, капиллярная сеть, периферические
нервные элементы и иммунные клетки. Оказалось, однако, что
прямое фотоповрежденис клоногенных опухолевых клеток не
вносит доминирующий вклад в разрушение опухоли. Ведь для
разрушения всех опухолевых клеток каждая из них должна по-
лучить достаточно большие дозы фотосенсибилизатора и света и
в опухоли должно быть достаточно кислорода. Но клетки неоди-
наково аккумулируют краситель, свет неравномерно распреде-
лен в гетерогенной опухолевой ткани, а концентрация кислорода
выше вблизи капилляров. Поэтому предполагают важную роль
фотодинамического повреждения сосудов и нарушения кровото-
ка, вызывающего сильную гипоксию, сохраняющуюся после
воздействия (Henderson, Dougherty, 1992; Dougherty et al., 1998;
Hasan et al., 2000).
1. 4. Клинические применения фотодинамической
терапии
Онкологические применения фотодинамической терапии
ограничены опухолями, которые возможно облучить красным
светом. Это могут быть либо поверхностные опухоли, которые
можно непосредственно облучать, например, рак кожи, головы и
шеи, либо опухоли полых внутренних органов, к которым мож-
но доставить свет с помощью волоконного световода. К таким
опухолям относятся новообразования полости рта, пищевода,
желудка, толстого кишечника, легких, молочной железы, шейки
матки, простаты и мочевого пузыря. В ряде случаев фотодина-
мическая терапия рака получила одобрение национальных орга-
низаций, контролирующих применение фармакологических пре-
паратов в ряде стран, или проходит клинические испытания (Do-
ugherty et al., 1998; Hasan et al., 2000; Moan, Peng, 2003; Brown et
al., 2004; Странадко, Иванов, 2004; MacCormack, 2006; Hamblin,
Mroz, 2008). Также проводятся экспериментально-клинические
исследования применения фотодинамической терапии для лече-
ния опухолей мозга, глаза, яичек, груди и т. д. Современное со-
стояние клинических применений различных фотосснсибилиза-
торов отражено в табл. 1.
Фотодинамическая терапия, как и другие методы лечения,
особенно эффективна на ранних стадиях онкологических забо-
леваний, в случае небольших локализованных опухолей. Ее до-
стоинствами по сравнению с другими методами лечения рака
(хирургией, радио- и химиотерапией) являются локальность и
селективность воздействия, возможность многократного повто-
рения процедур, послойной обработки опухолей, бесконтакт-
ность воздействия, возможность сочетания с другими методами
лечения, снижение метастазирования. Фотодинамическая тера-
пия — бинарное воздействие, оба компонента которого — кра-
ситель и свет — по отдельности нетоксичны и только при совме-
стном применении разрушают клетки. Это хороший пример
«магической пули» Пауля Эрлиха — лекарства направленного
действия. Фотодинамическая терапия дает высокий процент
апоптозной смерти клеток и в результате хорошее заживление
раны первичным натяжением без образования больших рубцов.
Таблица 1
Современное состояние разработок в области клинических применений фотодинамической терапии
(по: Moan, Peng, 2003)
Фотосенси- билизатор Торговая марка Производитель x, HM Современное состояние разработок
Производное гема- топорфирина (HpD) Porfimer sodium Photofrin Photofrin II Photosan-3 Photoheme Axcan Pharma (до 2000: QLT Inc) 632 Получено разрешение для лечения: — рака желудка (Япония) — рака пищевода (Франция, Канада, Великобритания, Финляндия, Япония, США, Нидерланды); — рака легких (Канада, Нидерланды, Япония, Дания, Ирландия, Франция, Германия, Финляндия, Вели- кобритания, США) — рака мочевого пузыря (Канада); — рака и дисплазии шейки метки (Япония) Также проводятся клинические испытания применения Фотофрина для лечения разных форм рака головы и шеи, мозга и т. д.
Производное бензопорфирина с монокислым кольцом А (BPD-MA) Visudine Verteporfm QLT Inc. и Novar- tis Ophthalmic 690 Разрешено в разных странах для лечения макулярной де- генерации сетчатки, патологической миопии Множественная базальноклеточная карцинома (III фаза клинических испытаний)
5-аминолевулино- вая кислота (ALA) Levulan DUSA Pharma- ceuticals, Inc. 632 375—400 Поверхностное применение: актиничный кератоз (США, ЕС) Внутрисосудистое введение: диагностика рака мочевого пузыря (I/II фаза клинических испытаний)
Метиламино-леву- нилат Тетра(метагидрок- си-фенил)хло- рин (тТНРС) Metvix Foscan PhotoCure ASA Biolitec AG
Этиопурпурин олова (SnEt2) Purlitin Miravant Medical Technologies
Тексафирин люте- ция (Lu-Tex) Lutrin Antrin Optrin Pharmacyclic Inc.
Порфирин бора BOPP Pacific Pharmaceu- tical
Моноаспартил хлорин е6 (Npe6) Talaporfin Meiji Seika Kaisha Ltd. and Sciences Corporation
Гиперицин Hypericin VIMR Pharmaceu- ticals
Сульфированный
алюмофталоциа-
нин
Порфицен
(АТМРп)
Фотосенс
НИОПИК (Россия)
Glaxo-Welcome
632
652
660
732
628
664
600—1000
675
630
Поверхностное применение, актиничный кератоз и ба-
зальноклеточная карцинома (ЕС, Австралия и Новая
Зеландия)
Рак головы и шеи (ЕС, Норвегия, Исландия)
Рак груди, поджелудочной железы, желудка и кишечни-
ка (II фаза клинических испытаний)
Вспомогательная терапия при лечении поздиих стадий
рака (I/II фаза клинических испытаний)
Макулярная дегенерация сетчатки (III фаза клинических
испытаний)
Рак кожи (II/III фаза клинических испытаний)
Рак простаты (I фаза клинических испытаний)
Рак груди, фотоангиопластика при болезнях перифери-
ческого артериального кровообращения
Рак мозга (I фаза клинических испытаний)
Рак легкого, ранние стадии (III фаза клинических испы-
таний) крупные опухоли головы, шеи, легких, прямой
кишки, простаты и др. (II фаза клинических испыта-
ний)
Глиобластома (I/II фаза клинических испытаний), анти-
вирусный агент (СПИД и др.) (I фаза клинических ис-
пытаний)
Кожная Т-клеточная лимфома Саркома Капоши, псориаз
(поверхностное применение, I фаза клинических ис-
пытаний)
Разные формы опухолей кожи, груди, легких, пищевари-
тельного тракта (Россия)
Псориаз (I/II фаза клинических испытаний)
К недостаткам этого метода относятся: трудность точной дози-
метрии воздействия, иногда недостаточная эффективность, мед-
ленное выведение красителя из организма, придающее организ-
му нежелательную фоточувствитсльность.
Области применения фотодинамической терапии не ограни-
чиваются онкологией. В последние годы показано, что этот ме-
тод перспективен для лечения макулярной дегенерации сетчат-
ки; псориаза, ревматоидного артрита, атеросклеоза, рестеноза
после балонной ангиопластики, гиперплазии простаты, бактери-
альной и грибковой инфекции, а также для стерилизации пере-
ливаемой крови или эритроцитарной массы и т. д. (Hamblin,
Mroz, 2008).
1. 5. Фотосснсибилизаторы
Производное гематопорфирина, использованное Р. Л. Лип-
соном, а позднее Т. Догерти в первых работах по фотодинамиче-
ской терапии, является эффективным сенсибилизатором и сегод-
ня использующимся в онкологической практике. HpD не имеет
строго определенного химического состава, а является смесью
множества различных порфиринов, включая гематопорфирин,
протопорфирин, дейтеропорфирины, их производные, мономе-
ры, димеры и олигомеры, их эфиры и т. д. В попытке его очис-
тить и выделить действующее начало была выделена более ак-
тивная фракция дигематопорфирина, в которой две молекулы
гематопорфирина соединены эфирной связью. В настоящее вре-
мя широко используется препарат Фотофрин (QLT Phototherape-
utics, Vancouver, Canada), представляющий собой смесь олиго-
меров гематопорфирина (число мономеров от 2 до 6 преимуще-
ственно 2—3), которая очищена от менее активных мономеров.
Это сравнительно стабильный продукт с минимальными вариа-
циями между отдельными партиями (Dougherty et al., 1998). Рос-
сийский вариант Фотогем (МИТХТ, Москва) используется в
ряде отечественных клиник (Странадко, Иванов, 2004). Однако
эти препараты обладают рядом недостатков: продолжительная
кожная фоточувствительность (до 4—6 нед), неопределенность
химического состава, слабое поглощение красного света. Это
побудило исследователей к разработке следующего поколения
фотосенсибилизаторов.
Оптимальный фотосенсибилизатор должен обладать следу-
ющими свойствами (Moan, 1990; Penning, Dubbelman, 1994; Jori,
1996):
1. Химическая чистота. Установленная химическая формула.
2. Отсутствие темновой токсичности, стимуляции клеточ-
ного деления и мутагенности.
3. Высокая молярная экстинкция в дальней красной области.
4. Высокий квантовый выход триплетных возбужденных
состояний.
5. Высокий квантовый выход фотогенерации синглетного
кислорода.
6. Отсутствие непредсказуемых фотопродуктов.
7. Стабильность в организме и при облучении.
8. Гидрофильность, а для гидрофобных фотосенсибилиза-
торов — наличие клинически безопасных носителей.
9. Быстрое и селективное накопление в опухолях.
10. Отсутствие накопления в коже, глазах, слизистых обо-
лочках и быстрое выведение из организма (за 1—2 сут).
11. Отсутствие побочных явлений.
12. Низкая цена.
13. Официальное разрешение применения.
Особенно важны такие свойства фотосенсибилизаторов, как
нетоксичность, высокое поглощение красного света, большой
квантовый выход синглетного кислорода, селективное накопление
опухолями и быстрое выведение из организма после операции.
Многие из сформулированных требований противоречат друг
другу, поэтому оптимальный фотосснсибилизатор, удовлетворя-
ющий всем требованиям, пока не создан. При создании новых
препаратов исследователям приходится идти на компромисс.
В качестве фотосенсибилизаторов уже синтезированы и ис-
пытаны многие соединения, относящиеся преимущественно к
порфириновому ряду: различные порфирины, хлорины, фтало-
цианины, феофорбиды и т. д. (рис. 4; табл. 1). К числу фотосен-
сибилизаторов, перспективных для клиники и уже прошедших II
и/или III стадию клинических испытаний, относятся: производ-
ное бензопорфирина BPD-МА (лекарственная форма вертепор-
фин или визудин), сульфированный алюмофталоцианин Фото-
сенс; л/езо-тетрагидроксифенилхлорин тТНРС (лекарственные
формы темопорфин или фоскан); моноаспартилхлорин е6; этио-
пурпурин олова SnET2 (лекарственная форма Purlytin); тексафи-
рин лютеция (лекарственная форма Lutrin) и другие (Dougherty
et al., 1998; Hasan et al., 2000; Zane et al., 2001; Moan, Peng, 2003;
Detty et al., 2004; Allison et aL, 2004; Hamblin, Mroz, 2008). Не-
смотря на наличие этих, достаточно хороших фотосенсибилиза-
торов, исследователи продолжают поиски новых, более эффек-
тивных.
Фотофрин (HpD)
Производное бензопорфирина (BPD)
соон
Этиопурпурип ш-тетрагидроксифенилхлорнн TOOKAD
олова (SnEt2) (inTHPC)
Фталоцианин Рс4
Тексафирин лютеция (Lutex)
Рис. 4. Некоторые фотосенсибилизаторы, применяющиеся при фотодина-
мической терапии.
Fig. 4. Some photosensitizers used in photodynamic therapy.
Можно отметить 5-аминолевулиновую кислоту (ALA), есте-
ственного предшественника эндогенного фотосенсибилизатора
протопорфирина IX (PpIX), вырабатывающегося в клетках для
синтеза гема. ALA и ее метильное (Metvix) производное легко
проникают через кожу. Для лечения рака кожи они наносятся в
составе мази на кожу, покрывающую опухоль. Последующее об-
лучение, производимое часто в амбулаторных условиях, полно-
стью разрушает опухоли с минимальным повреждением кожи и
хорошим косметическим эффектом. Поскольку протопорфирин
хорошо флуоресцирует, то его ALA-индуцированный синтез в
опухолевых клетках также используется для флуоресцентной
визуализации и диагностики опухолей (Juzeniene, Moan, 2007).
1. 6. Внутриклеточная локализация
фотосенсибилизаторов
Для оптимизации ФД воздействия на ткани и направленно-
го поиска наиболее эффективных фотосснсибилизаторов не-
обходимо понять механизм их действия на клеточном уровне,
выяснить, как структура фотосснсибилизаторов определяет их
физико-химические свойства, а те, в свою очередь, влияют на
фотодинамическую эффективность. Кроме чисто фотофизиче-
ских и фотохимических характеристик, таких как коэффициент
поглощения красного света или ближнего инфракрасного излу-
чения, квантовый выход триплетных состояний красителя
и квантовый выход фотогенерации 'О,, важное значение име-
ют свойства фотосенсибилизаторов, определяющие их взаимо-
действие с клеткой и механизм клеточной смерти. За свое ко-
роткое время жизни 'О, диффундирует в клетке нс более, чем
на 10—20 нанометров (Moan, 1990; Moan, Berg, 1991; Krasnov-
sky, 1998). Поэтому он должен оказывать преимущественно
локальное воздействие вблизи молекул фотосенсибилизато-
ра. Поэтому локализация сенсибилизатора играет решающую
роль в механизме фотоповреждения клетки. Она определяет
мишени, которые в первую очередь подвергаются ФД воз-
действию.
Красители могут проникать в клетку, как путем диффузии,
так и в результате эндоцитоза, когда некоторый объем внекле-
точной жидкости захватывается внутрь эндоцитозных пузырь-
ков, транспортируемых в клетку. В этом случае краситель по-
падает преимущественно в лизосомы. Эндоцитоз — активный
процесс, происходящий за счет энергии АТФ. Для того чтобы
выяснить его роль в транспорте фотосенсибилизаторов в клетку,
можно изучить накопление красителя при охлаждении клеток до
4—5 °C, когда синтез АТФ подавлен, а диффузия снижается
только незначительно.
Диффузионное проникновение фотосенсибилизатора в клет-
ку и его внутриклеточная локализация сильно зависят от разме-
ров молекул, полярности (гидрофобность или гидрофильность),
суммарного заряда и распределения заряженных групп (симмет-
ричное или асимметричное), способности к образованию водо-
родных связей, подверженности к агрегации и т. д. Кроме того,
локализация фотосенсибилизатора в клетке зависит от времени
инкубации, состава внеклеточной среды, например, от присутст-
вия в ней сыворотки крови или белков (Boyle, Dolphin, 1996;
Zane et al., 2001; Соболев и др., 2004).
Гидрофобные фотосенсибилизаторы локализуются преиму-
щественно в плазматической мембране и мембранах клеточных
органелл. Они легко проникают в липидную фазу мембран, но
выход из нее в водную среду затруднен. Такие вещества могут
далее переноситься из плазматической мембраны к внутрикле-
точным органеллам с помощью амфифильных белков цитозоля,
например шаперонов. Они могут захватывать фотосенсибилиза-
тор экспонированными гидрофобными участками, и после диф-
фузии к внутриклеточным органеллам перегружать фотосенси-
билизатор в липидные мембраны, обладающие большим сродст-
вом к гидрофобным веществам. Затем цикл может повторяться
(Uzdensky et al., 2001с). Другой механизм внутриклеточного
транспорта — перенос в составе мембран пиноцитозных пузы-
рьков. В этом случае облучение не может заставить фотосенси-
билизатор покинуть мембраны. Гидрофобные фотосенсибилиза-
торы, такие как гиперицин или гпТНРС локализуются преиму-
щественно в перинуклеарной области, богатой митохондриями,
цистернами эндоплазматического ретикулума (ЭР), комплекса-
ми Гольджи, лизосомами и многочисленными везикулами (Boy-
le, Dolphin, 1996; Wilson et al., 1997; Vandenbogacrte et al., 1998;
Melnikova et al., 1999; Fabris et al., 2001; Peng, 2001; Uzdensky et
al., 2001c; Peng et al., 2005). Их также обнаруживают в плазмати-
ческой мембране (Peng et al., 1991, 1996; Jori, 1996; Peng, 2001).
Проникновению в клетку полярных фотосснсибилизаторов
препятствует липидный бислой клеточной мембраны. Они с тру-
дом попадают в мембрану, но легко из нее выходят. Поэтому
проницаемость мембраны для них пропорциональна коэффици-
енту распределения К в системе «неполярный органический
растворитель/вода» (Геннис, 1997). Для анионных красителей
дополнительным барьером служит отрицательный заряд клеточ-
ной поверхности. Поэтому гидрофильные анионные фотосснси-
билизаторы, такие как NP<?6 (Roberts, Berns, 1989), сульфирован-
ные тетрафенилпорфины (TPPS34) (Berg et al., 1990), A1PCS34
(Peng et al., 1991) и некоторые производные порфирина (Wood-
bum et al., 1992a) попадают в цитоплазму, главным образом, пу-
тем эндоцитоза.
Амфифильные вещества с асимметричным распределением
полярных и неполярных групп в молекуле лучше проникают в
клетки и более эффективно фотосенсибилизируют их (Boyle,
Dolphin, 1996; Ball et al., 1998; Uzdensky et aL, 2001a, 2004b; Ran-
can et al., 2005). Они одновременно и водо-, и жирорастворимы.
Встретив биомембрану, они встраиваются в нее с помощью
своей липофильной части, а затем легко выходят в цитозоль,
диффундируют, а потом могут встроиться в мембраны цитоплаз-
матических органелл (Jori, 1996; Решетников и др., 1999). Более
высокое накопление клетками амфифильных фотосенсибилиза-
торов с асимметричным распределением полярных групп проде-
монстрировано in vitro (Paquette et al., 1988) и in vivo (Peng et al.,
1994).
Фталоцианины алюминия с разной степенью сульфирования,
т. е. присоединения отрицательно заряженной сульфогруппы
—SO3 , различаются гидрофильностью или гидрофобностью.
Так, анионные производные AlPcS3 и AlPcS4 локализуются пре-
имущественно в лизосомах. Для более гидрофобного AlPcS2 ха-
рактерно как гранулярное, так и диффузное распределение, а для
AlPcSj — диффузное, обусловленное связыванием красителя с
цитоплазматическими структурами, которые неразличимы в оп-
тическом микроскопе, — белками, рибонуклеопротсидами, ве-
зикулами и т. д. (Peng et al., 1991; Moan, Berg, 1992). Подобные
закономерности были обнаружены для производных гемато- и
протопорфиринов (Woodburn et al., 1992) и сульфированных ме-
зо-тстрафснилпорфинов (Berg et al., 1991).
Катионные красители, например, бензофенотиазин (Cincotta
et al., 1994) или некоторые производные порфирина селективно
локализуются в митохондриях, матрикс которых имеет высокий
отрицательный потенциал порядка 200 мВ относительно цитозо-
ля (Oscroff et al., 1986; Woodburn et al., 1992; Kessel et al., 1995b).
При этом более эффективны амфифильные катионные фотосен-
сибилизаторы, такие как родамин 123 (Oscroff et al., 1986) или
производное метиленового синего MBD (Ball et aL, 1998). За
счет липофильной части молекулы они пересекают плазматиче-
скую мембрану и проникают в цитоплазму, а затем благодаря
своему положительному заряду втягиваются в митохондрии
(Kowaltovski et al., 1999; Kandela et al., 2002). Так, у фибробла-
стов мембранный потенциал был порядка -75 мВ относительно
окружающей среды, а разность потенциалов между митохондри-
альным матриксом и цитозолем — 180 мВ. Расчет с использова-
нием уравнения Нсрнста показал, что концентрация хорошо пе-
ресекающего мембраны катионного красителя в цитозоле в 18
раз выше, чем в среде, а в митохондриях — в 1000 раз выше, чем
в цитозоле. Поскольку объем митохондрий составляет около
15 % от объема клетки, то подавляющее большинство красителя
концентрируется в митохондриях (Rugolo, Lenaz, 1987). Это зна-
чительно увеличивает фототоксичность (Wood et al., 1997).
Порфириновые фотосенсибилизаторы, такие как HpD и Фо-
тофрин, локализуются преимущественно в митохондриях, хотя
также попадают в другие органеллы и плазматическую мембра-
ну (Berns et al., 1982; Peng, 2001). Это обусловлено их специфи-
ческим связыванием с периферическими бензодиазепиновыми
рецепторами в участках слияния наружной и внутренней мито-
хондриальной мембран (Verma et al., 1987). Особый случай —
протопорфирин IX, эндогенно образующийся в клетках из
5-аминолевулиновой кислоты. Он синтезируется в митохондри-
ях и первоначально фотосенсибилизирует только эти органеллы,
но через 1—2 ч выходит из митохондрий и диффузно распреде-
ляется в цитоплазме, а затем начинает выходить из клеток и по-
является в инкубационной среде (Uzdensky et al., 2004а).
Локализация фотосенсибилизаторов в клетке также зависит
от их концентрации и времени инкубации. Например, при
10-минутной инкубации TPPS^a накапливался в плазматической
мембране, а при более длительной (> 1 ч) — в лизосомах (Berg,
Moan, 1997). Фотофрин после 3-часовой инкубации накаплива-
ется преимущественно в плазматической мембране клеток эпи-
дермоидной карциномы человека, а после 24-часовой — глав-
ным образом в аппарате Гольджи (Hsien et al., 2003).
Облучение клеток повреждает мембраны клеточных орга-
нелл, что может привести к перераспределению фотосенсибили-
заторов из мест первоначального связывания в другие компарт-
менты (Berg, Moan, 1994; 1997; Wood et al., 1997; Berg et al.,
2004). Например, производные тетрафенилпорфина гидрофоб-
ный TPPS2o и амфифильный TPPS2a после облучения диффузно
распределялись в цитоплазме, а анионный TPPS4 попадал в ядро
(Berg et al., 1991). Также наблюдалось фотоиндуцированнос пе-
рераспределение анионных производных фталоцианина цинка
из лизосом в цитоплазму и затем в клеточное ядро (Ball et al.,
1999). Это может иметь важное значение в фотоповреждении
клеток, так как клеточные ядра очень чувствительны к фотопов-
реждению, которое может происходить даже, когда флуоресцен-
ция сенсибилизатора в ядре практически не отсутствует (Собо-
лев и др., 2004).
Порфирины и их аналоги — хлорины, фталоцианины, нафта-
лоцианины и т. п. представляют широкие возможности для со-
здания разнообразных фотосенсибилизаторов с заданными свой-
ствами. Можно значительно и гибко менять их структуру, вклю-
чая строение и размер макроциклов, боковых заместителей, а
также центральные атомы металла. Так, расширение ароматиче-
ских циклов усиливает делокализацию электронных облаков и
сдвигает спектры поглощения света в дальнюю красную и инф-
ракрасную области. Меняя структуру боковых групп, можно в
широких пределах менять гидрофобность и гидрофильность мо-
лекулы, придавать им амфифильность, влиять на их способность
к агрегации, и добиваться желательной внутриклеточной ло-
кализации (Jori, 1996). Принято считать, что только мономерные
порфирины, а не их агрегаты биологически активны. Но в мемб-
ранах порфириновые агрегаты не связанные ковалентными свя-
зями могут расщепляться на более активные мономеры. Нали-
чие электрических заряженных групп или больших аксиальных
лигандов предотвращает агрегацию фотосенсибилизаторов, ко-
торая сильно снижает фотодинамический эффект (Jori, 1996).
Прижизненные красители-фотосенсибилизаторы, селектив-
но локализующиеся в определенных внутриклеточных структу-
рах, необходимы не только для фотодинамической терапии, но
и для исследовательской практики цитологов. С их помощью
можно избирательно воздействовать на определенные клеточ-
ные структуры с тем, чтобы изучить их роль в тех или иных кле-
точных функциях (Узденский, 1982; Ito, 1983). Эта задача срав-
нима с потребностью прижизненной микроскопии в красителях,
селективно выявляющих те или иные клеточные структуры. Та-
ких высокосслективных сенсибилизаторов известно немного.
К ним можно отнести гидрофильные фотосенсибилизаторы, ло-
кализующиеся в лизосомах, такие как лизилхлорин рь (Kessel
et al., 1995а); TPPS2a, который сенсибилизирует цитоплазматиче-
скую мембрану при кратковременной инкубации (Uzdensky
et al., 2004а); катионные амфифильные фотосенсибилизаторы,
такие как родамин 123 (Oseroff et al., 1986), производное метиле-
нового синего МБР (Ball et al., 1998), или MitoTracker Red (Mina-
mikawa et aL, 1999), селективно сенсибилизирующие митохонд-
рии. Высокоселективную фотосенсибилизацию можно осущест-
вить, когда, связываясь с изучаемой структурой, краситель
приобретает новые свойства. Так, янус зеленый в окисленной
форме избирательно окрашивает митохондрии за счет окисле-
ния его цитохромной системой, а в цитоплазме он восстанавли-
вается до бесцветной лейкоформы (Lazarow, Cooperstein, 1953;
Reiss, 1969). Это позволяет селективно воздействовать сфоку-
сированным лазерным лучом на отдельные митохондрии в окра-
шенной живой клетке (Baba, 1970; Salet, 1972). Таким образом,
гидрофильность/липофильность фотосенсибилизатора в значи-
тельной мере определяет его внутриклеточное распределение,
и именно локализация сенсибилизатора играет решающую роль
в фотоповреждении клетки, определяя механизм и тип ее ги-
бели.
1. 7. Направленная
доставка фотосенсибилизаторов
Процесс доставки фотосенсибилизатора к опухолевым клет-
кам и эффективного их фотоповреждения делится на два этапа:
а) доставка фотосенсибилизатора, внутривенно введенного в
кровеносное русло, к опухоли;
б) транспорт фотосенсибилизатора внутрь клетки к наиболее
чувствительным клеточным структурам.
Для эффективного переноса фотосенсибилизаторов разрабо-
таны различные носители. При внутривенном введении фото-
сенсибилизаторы связываются с белками крови, и только небо-
льшая их часть оказывается в свободном состоянии (Kongshaug,
1992; Соболев и др., 2004; Shaman et al., 2004). Молекулы кра-
сителей связываются с белками за счет электростатических, ван-
дерваальсовых, гидрофобных и водородных взаимодействий. По
данным Соболева и др. (2004), гидрофобные фотосенсибилиза-
торы: гематопорфирин, HpD, ZnPc или SnEt2 транспортируются
преимущественно липопротеинами высокой плотности (ЛВП).
Хлорины и тетрафенилпорфины (ДДаспартилхлорин е6, тТНРС,
TPPS3 или TPPS4 переносятся в основном альбумином, а хлорин
Chi е6 и ALPcS, примерно в равной степени связываются с аль-
бумином и ЛВП. Однако в других обзорах (Konan et al., 2002;
Sharman et al., 2004) большую роль в переносе таких гидро-
фобных фотосенсибилизаторов, как гематопорфирин, BPD-MA,
А1Рс или ZnPc, отводят липопротеинам низкой плотности
(ЛНП). Одна молекула ЛНП может переносить до 1000 молекул
гидрофобного фотосенсибилизатора. Они не фагоцитируются
клетками крови и длительно циркулируют в кровеносном русле.
Многие клетки имеют на своей поверхности рецепторы ЛНП, а в
опухолевых клетках их особенно много. Поэтому с их помощью
можно направленно доставлять фотосенсибилизатор в опухоль.
Для исследования этой возможности были синтезированы конъ-
югаты разных фотосенсибилизаторов с ЛНП (Sharman et al.,
2004), но пока существенных результатов не получено, за иск-
лючением одной работы, в которой показано, что конъюгат хло-
рина еь ЛНП был более фототоксичен для культивируемых фиб-
робластов или клеток ретинобластомы, чем свободный хлорин
е6 (Schmidt-Erfurth et al., 1997).
В настоящее время ведутся работы по направленной достав-
ке фотосенсибилизаторов в клетки. В качестве их носителей ис-
пользуются липосомы, полимерные наночастицы, квантовые
точки и антитела.
Липосомы — искусственные бислойные или многослойные
мембранные пузырьки, приготовленные обычно из фосфолипид-
ных молекул. Если в их состав входят белки, то они называются
протеолипосомами, представляющими собой хорошую модель
биологических мембран. Гидрофильные фотосенсибилизаторы
вводятся внутрь липосом, а гидрофобные включаются в липо-
сомную мембрану. Липосомы облегчают транспортировку гид-
рофобных фотосенсибилизаторов по кровеносным сосудам. Это
улучшает фармакокинетику и повышает их фототоксичность.
Липосомы могут связываться с липопротеинами плазмы крови,
в частности с ЛНП, и это повышает селективность доставки фо-
тосенсибилизатора в опухоль, так как трансформированные
клетки имеют больше рецепторов ЛНП, чем нормальные. Для
направленной доставки к опухолевым клеткам в липосомную
мембрану также можно включить антитела, факторы роста и
другие молекулы, которые могут распознаваться клетками-ми-
шенями. После связывания с рецепторами или антигенами на
поверхности мишени гидрофобный фотосенсибилизатор пере-
ходит из липосомной мембраны в плазматическую мембрану
клетки-мишени, а также транспортируется внутрь клетки в со-
ставе эндосомных пузырьков (Hoebeke, 1995; Rodal et al., 1998;
Ronan et al., 2002).
Интересно использование фоточувствительных липосом, у
которых мембрана содержит фотосенсибилизатор. При ее фото-
повреждении переносимое вещество: лекарство, токсин, белок
или нуклеиновая кислота контролируемым образом высвобож-
даются внутрь клетки. В этом случае нормальные ткани защи-
щены от токсического действия находящегося в липосомах ядо-
витого противоракового вещества (Hoebeke, 1995).
Другой способ доставки — присоединение фотосенсибили-
заторов к полимерным микросферам или наночастицам. Так,
хлорин е6, ковалентно присоединенный к шарикам из полисти-
рола диаметром в 1 мкм, фагоцитировался клетками карциномы
мочевого пузыря. При этом его фототоксичность была выше,
чем у свободного хлорина <?6, у которого был, однако, на порядок
больший квантовый выход фотогенерации активных форм кис-
лорода (Bachor et al., 1991). Включение фотосенсибилизаторов в
полимерные биодеградирующие наночастицы может увеличить
количество переносимого вещества. При этом, варьируя матери-
алы, можно добиться желаемых свойств носителя. Так, покры-
тие полиэтиленгликолем наночастиц из полилактата для предот-
вращения связывания ретикулоэндотелиальной системой позво-
лило повысить их доставку в опухоли (Копал et al., 2002).
Включение гиперицина в наночастицы из поливинилпирролидо-
на повысило его фототоксичность в отношении нервных клеток
(Uzdensky ct al., 2003).
Также изучается возможность направленной доставки фото-
сенсибилизаторов или лекарств путем связывания их с монокло-
нальными антителами, специфичными к антигенам на поверх-
ности раковых клеток. Было показано, что при этом почти не те-
ряются фотосенсибилизирующие свойства красителей (были
испытаны гематопорфирин, хлорин еь, BPD-МА, mTHPC, AlPcS
и другие сенсибилизаторы) и антигенная специфичность анти-
тел, а накопление фотосснсибилизаторов в опухолях и эффек-
тивность их фотодинамического воздействия повышаются (Ко-
пап et al., 2002; Соболев и др., 2004).
Альтернативой этому подходу является использование моле-
кул, способных отыскивать опухоль, благодаря наличию специ-
фических рецепторов. К ним относятся белок трансферрин, не-
которые гормоны, например, стероиды или инсулин, эпидерма-
льный фактор роста (EGF), фолиевая кислота.
Все делящиеся клетки нуждаются в большом количестве же-
леза, которое переносится железотранспортирующим белком
трансферрином. В некоторых раковых клетках особенно много
специфических рецепторов трансферрина. Так, ковалентное свя-
зывание хлорина е6 с трансферрином, сохраняющее такой же
квантовый выход 'О-,, как у свободного хлорина е6 усилило на-
копление клетками хлорина ей и повысило его фетотоксичность
в 10—40 раз (Cavanaugh, 2002).
Рецепторы стероидных гормонов находятся в цитоплазме.
После связывания гормона они перемещаются в ядро и начина-
ют регулировать экспрессию определенных генов. Исключени-
ем являются эстрогены, чьи рецепторы постоянно локализуются
внутри ядра. Поэтому, связывая стероидные гормоны, особенно
эстрогены, с фотосенсибилизаторами, можно непосредственно
воздействовать на клеточное ядро. Но проблемой является воз-
можное нарушение способности рецепторов распознавать сай-
ты, которые они контролируют. При связывынии различных фо-
тосенсибилизаторов с разными эстрадиолами повышалась эф-
фективность накопления гидрофобных конъюгатов в клетках
рака молочной железы мышей, по сравнению с гидрофильными
(Khan et aL, 2003). Но неожиданно оказалось, что не гидрофоб-
ные, а гидрофильные красители были более фототоксичны. Не-
давно были синтезированы несколько конъюгатов диметилового
эфира хлорина е6 с С17-а-алкинилэстрадиолом, которые специ-
фически связывались с рецепторами эстрадиола и позволяли эф-
фективно убивать клетки рака груди человека MCF-7, обладаю-
щие рецепторами эстрадиола, но нс клетки MDA-MB 231, кото-
рые нс имели таких рецепторов (Swamy et al., 2006).
Аналогично, конъюгаты эстрадиола и фсофорбида а позволяли
доставить фотосенсибилизатор в ядро, вызвать повреждения
ДНК и повредить клетки рака груди человека и сосудистого эн-
дотелия более эффективно, чем свободный феофорбид а (Е1-Ак-
ra et al., 2006).
Многие клетки, включая раковые, обладают также рецепто-
рами фолиевой кислоты, которая необходима для их деления.
Связывание фолата с рецептором инициирует эндоцитоз и мо-
жет усилить захват конъюгированного с фолатом фотосенсиби-
лизатора. Было показано, что конъюгаты тетрафенилпорфирина
с фолатом транспортировались в раковые клетки КВ путем ре-
цсптор-опосредованного эндоцитоза. Они отличались большей
фототоксичностью, чем свободный фотосенсибилизатор (Schne-
ider et al., 2005). Липосомы, заполненные водорастворимым фо-
тосенсибилизатором A1PcS4, с поверхностью которых было свя-
зано одно из производных фолата, эффективно доставляли
A1PcS4 к клеткам КВ и также отличались повышенной фетоток-
сичностью (Qualls, Thompson, 2001).
Факторы роста, такие как инсулин или EGF, также могут
инициировать эндоцитоз после связывания с поверхностными
рецепторами. Повышенная экспрессия их рецепторов характер-
на для ряда раковых клеток (Sharman et al., 2004). Конъюгат EGF
с алюмофталоцианином A1PcS2 отличался 8-кратной фототок-
сичностью по сравнению со свободным сенсибилизатором, а с
кобальтовым фталоцианином CoPcS,— 100-кратной (Lutsenko
et al., 1999).
В последние годы стали конструироваться более сложные
системы доставки фотосенсибилизаторов в клетки. Так, в комп-
лексе Sn(IV)Chl е(> -ЧСА-EGF, сывороточный альбумин человека
ЧСА служил носителем фотосенсибилизатора, а эпидермальный
фактор роста EGF стимулировал его поглощение клеткой Gij-
sens et al. (2000). Еще более сложные и биологически обоснован-
ные модульные конструкции созданы А. С. Соболевым и сотр.
(2004). Для доставки фотосенсибилизатора в ядро, как критиче-
ской для жизнеспособности клетки структуры, они соединили
белок-носитель (им служили бычий сывороточный альбумин,
бактериальная Р-галактозидаза, или химерный полипептид РЮ),
фотосенсибилизатор (хлорин е6), лиганд, стимулирующий эндо-
цитоз и проникновение фотосенсибилизатора в лизосомы (инсу-
лин или EGF) и специальный пептид — сигнал ядерной локали-
зации (СЯЛ), который распознается и связывается с белками,
транспортирующими этот комплекс в ядро. Авторы показали,
что такие комплексы обеспечивают доставку фотосенсибили-
затора в ядро и повышение фотодинамической эффективности
более, чем в 2000 раз по сравнению с исходным хлорином е6.
Однако они сперва попадают в эндосомы и ранние лизосомы,
из которых может выйти только небольшая часть захваченных
белков. Поэтому А. С. Соболев и соавт. использовали способ-
ность аденовирусов повреждать лизосомную мембрану и выхо-
дить в цитозоль. Они включили в фотосенсибилизирующий
комплекс ослабленный штамм сПЗ 12 аденовируса Ad5 без кан-
церогенного участка Е1А, и это еще больше повысило фотоди-
намическую эффективность. Аналогичными свойствами облада-
ет также дифтерийный токсин DTox, или кислый синтетический
пептид GALA.
Химический синтез таких сложных белковых комплексов
очень дорог и трудоемок. Поэтому авторы разработали методи-
ку получения рекомбинантных транспортировщиков, экспресси-
руемых в бактериях Е. coli. Это может в будущем значительно
упростить и удешевить их производство. Такие комплексы со-
стояли из:
1) а-мсланоцитостимулирующего гормона (МСГ), использу-
емого в качестве лиганда, который стимулирует эндоцитозную
интернализацию;
2) оптимизированного СЯЛ аденовируса;
3) носителя гемоглобиноподобного белка бактерий Е. coli
НМР;
4) белка DTox, способствующего лизису эндосом и выходу
из них белкового комплекса (комплекс с белком GALA был ме-
нее эффективен). Этот комплекс: DTox-НМР-СЯЛ-МСГ-хлорин
еь значительно лучше накапливался в клеточном ядре, чем ком-
плекс НМР-СЯЛ-МСГ-хлорин е6, не содержащий эндосомолити-
ческий пептид. При этом он был более, чем на два порядка цито-
фототоксичней (Соболев и др., 2004).
Глава 2
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ
НА КЛЕТОЧНЫЕ СТРУКТУРЫ
В механизме повреждения клеток важное значение имеет нс
только степень альтерации различных органелл, но и роль, кото-
рую они играют в жизнеспособности клетки. Например, при
кратковременной 10-минутной инкубации производное хлорина
NPe6 накапливается преимущественно в эндосомах, а наиболее
сильные повреждения отмечаются в митохондриях (Kessel, Ро-
retz, 2000). Аналогично, при фотосенсибилизации нейронов Фо-
тосенсом, представляющим собой смесь алюмофталоцианинов
A1PcS2^, обычно считающихся лизосомотропными (Moan et al.,
1994), наиболее выраженные ультраструктурные изменения на-
блюдались в митохондриях, аппарате Гольджи и примембран-
ных цистернах (Uzdensky et aL, 2002а; Fedorenko, Uzdensky,
2008). Следовательно, того небольшого количества фотосенси-
билизатора, которое попадает в митохондрии или другие орга-
неллы, достаточно, чтобы их повредить.
2.1. Плазматическая мембрана
Плазматическая мембрана — первый барьер на пути фото-
сенсибилизатора в клетку. Перед тем, как попасть в клетку,
фотосснсибилизаторы сорбируются на плазматической мемб-
ране и, надолго или нет, задерживаются в ней. Гидрофильные
фотосснсибилизаторы сильнее сенсибилизируют клеточную
поверхность, в частности, связанные с мембраной белки и гли-
копротеины, а липофильные — липидный бислой и гидро-
фобные участки интегральных или погруженных в мембрану
белков.
Биомембраны особенно чувствительны к ФД воздействию.
Фотодинамическое повреждение плазматической мембраны
происходит быстро, в первые минуты воздействия. Синглетный
кислород и другие АФК инициируют в них цепные процессы пе-
рекисного окисления липидов. Особенно легко окисляются не-
насыщенные жирные кислоты и холестерин. 'О, может присое-
диняться по месту двойных связей в липидах (L) с образованием
гидропероксидов LOOH. Кроме того, в результате перекисного
окисления липидов в клетке образуются радикальные продукты
типа L", LOO", OLOO' и OLO’ (Girotti, 1990, 2001). Долгоживу-
щие гидропероксиды скорее, чем короткоживущие радикалы
могут служить сигнальными медиаторами в окислительном
стрессе. Путем латеральной диффузии они могут транспортиро-
ваться в мембранах на большие расстояния, а их перенос между
органеллами распространяет окислительный стресс по всей
клетке (Aveline, 2001; Girotti, Kriska, 2004). Перекисное окисле-
ние повышает жесткость липидного бислоя, вызывает образова-
ние межмолекулярных липид-липидных и липид-белковых сши-
вок, что приводит к образованию локальных дефектов и пор в
липидных бислоях (рис. 5). Существует прямая корреляция меж-
ду фотоиндукцией перекисных процессов и повреждением мем-
бран (Владимиров и др.. 1991; Girotti, 1990, 2001).
Другой критической мишенью в мембранах, еще более важ-
ной для нарушения клеточных функций, являются мембранные
белки (Ehrenberg et al., 1998, Davies, 2003). На их фотоповрежде-
ние тратится до 70 % синглетного кислорода, генерируемого в
клетке, тогда как на окисление аскорбата — 17 %, а липидов —
менее 1 % (Davies, 2003). Окисление мембранных липидов и
белков вызывает появление мембранных пор, изменение текуче-
сти мембран и подвижности ионов внутри мембраны (Girotti,
1990; Valenzeno, Tarr, 1991b).
Крупные мембранные белки, такие как ионные каналы или
транспортные АТФазы, весьма чувствительны к ФД воздей-
ствию. Ионные каналы теряют селективность, а транспортные
АТФазы инактивируются. Снижение максимальной проводимо-
сти мембраны для ионов Na+ и К+ свидетельствует о поврежде-
нии натриевых и калиевых ионных каналов (Pooler, 1972; Oxford
et al., 1977; Valenzeno, Tarr, 1991). Na", K+-, Mg2'-и Ca2'-АТФазы
ингибируются (Ташмухамедов, 1973; Kondo, Kasai, 1974; Gibson
et al., 1988; Weizman et al., 2000). В результате неспецифической
утечки ионов и ингибирования их транспорта происходит паде-
ние ионных градиентов и деполяризация клеток (Бурмистров и
др., 1969; Людковская; Бурмистров, 1971; Pooler, 1972, 1987;
A
Рис. 5. Механизм повреждения биомембран при перекисном окислении
липидов (по: Girotti, 1990).
А — норма, Б — повреждение.
Fig. 5. Mechanism of biomembranc injury associated with lipid peroxidation
(After Girotti, 1990).
A — norm, Б — injury.
Gibson et al., 1988; Specht, Rogers, 1991; Valenzcno, Tarr, 1991;
Tarr, Valenzcno, 1991; Kunz, Stark, 1997; Chaloupka et al., 1999a).
Кроме того, ФД воздействие повреждает мембранные рецепто-
ры и нарушает процессы сигнальной трансдукции (Glinski et al.,
1995; Agostinis et al., 1996; Ahmad et al., 2001; Wong et al., 2003;
Liu et al., 2004), адгезии клеток (Margaron et al., 1997; Rousset et
al., 2000; Uzdensky et al., 2004a) и другие мембранные функции.
Продолжительная фотосенсибилизация вызывает повыше-
ние проницаемости плазматической мембраны для более круп-
ных молекул, таких как этидиум-бромид или пропидиум-иодид,
за которыми следуют набухание клетки, некроз и лизис (Dellin-
ger, 1997; Kessel, Luo, 1998; Grosswcincr, 1998). Ксан с соавт.
(Hsicn et al., 2003) показали, что в клетках карциномы А431, сен-
сибилизированных так, что Фотофрин сосредоточивался почти
исключительно в плазматической мембране (3-часовая инкуба-
ция) перед тем, как проникнуть во внутриклеточные органеллы,
небольшая концентрация сенсибилизатора (7 мкг/мл) вызывала
прекращение пролиферации и некроз. В этих процессах участво-
вала система внутриклеточной сигнализации. При большей кон-
центрации Фотофрина (28 мкг/мл) целостность плазматической
мембраны нарушалась сразу после фотосенсибилизации, и клет-
ки подвергались быстрому некрозу.
2. 2. Лизосомы
ФД воздействие гидрофильных фотосснсибилизаторов
AlPcS4, TPPS,a, TPPS4, LuTex или NPe6 быстро разрушает мем-
браны лизосом (Berg, Moan, 1994, 1997; Woodbum et al., 1997;
Noodt et al., 1999; Kessel et al., 2000; Reiners et aL, 2002). Накоп-
ленные в лизосомах фотосенсибилизаторы выходят в цитозоль и
перераспределяются в клетке. При этом они неспецифически
окрашивают цитоплазму и могут проникать в различные орга-
неллы и даже в клеточное ядро (Berg et al., 1991; Berg, Moan,
1994, 1997; Moan et al., 1994; Malik et al., 1997).
Такие процессы лежат в основе метода фотохимической ин-
тернализации, т. е. введения в клетку гидрофильных веществ:
белков, токсинов, лекарственных препаратов, нуклеиновых кис-
лот, которые сами не могут проникнуть в нее. Эти вещества до-
бавляются вместе с лизосомотропным фотосенсибилизатором
(TPPS4, TPPS2a или ALPcS^a). После эндоцитоза переносимое ве-
щество вместе с фотосенсибилизатором попадает в эндосомные
пузырьки и эндосомы. Последующее освещение вызывает раз-
рушение их мембран и выход данного вещества в цитозоль (Sel-
bo et al., 2002; Berg et al., 2004).
2. 3. Митохондрии
Фотосенсибилизаторы, локализующиеся в митохондриях
считаются наиболее эффективными. Митохондрии очень чувст-
вительны к ФД воздействию. К тому же они являются одной из
главных мишеней цитотоксического действия порфиринов
(Berns et al., 1982; Salet, Moreno, 1990, 1994; Riccheli et al., 1997;
Morgan, Oseroff, 2001; Hilf, 2007). Порфирины липофильны и об-
ладают большим сродством к митохондриальным мембранам
(Woodbum et al., 1992). Но кроме простой диффузии имеется
специфический механизм транспорта порфиринов в митохонд-
рии, где из протопорфирина IX синтезируется гем — кофермент
митохондриальных цитохромов и других гемсодержащих бел-
ков. Порфирины связываются с периферическими бензодиазе-
пиновыми рецепторами (PBR — peripheral benzodiazepine recep-
tor), расположенными в зоне контакта наружной и внутренней
митохондриальных мембран, и переносятся в матрикс, где они
взаимодействуют с кардиолипинами внутренних митохондриа-
льных мембран (Verma et al., 1987).
Первичная генерация синглетного кислорода и других актив-
ных форм кислорода (АФК) при фотовозбуждении порфиринов
усиливается в митохондриях вторичной генерацией «митохонд-
риальных» АФК (мАФК или mROS). Ограниченная генерация
супероксид-аниона О*2~ может происходить и в нормальных
клетках вследствие одноэлектронного восстановления молеку-
лярного кислорода электронами, утекающими из цепи электрон-
ного транспорта. Это происходит преимущественно на уровне
флавиновых соединений. Этот процесс усиливается при разоб-
щении окислительного фосфорилирования, когда кофермент Q
переносит избыточные электроны прямо на кислород, минуя
цепь цитохромов (Skulachev, 1999).
ФД воздействие резко усиливает генерацию АФК в митохон-
дриях (Atlante et al., 2000; Lam et al., 2001; Jou et al., 2004; Cher-
nyak et al., 2006). При этом происходит как перекисное окисле-
ние липидов (Chatterjee el al., 1997), так и инактивация важней-
ших митохондриальных ферментов: сукцинатдегидрогеназы
(Hilf et al., 1984; Modica-Napolitano et al.,1990; Chatterjee et al.,
1997; Uzdensky et al., 2002a); цитохромоксидазы (Gibson, Hilf,
1983; Hilf et al., 1984; Khanum, Jain, 1989; Musser, Oseroff, 1994);
ЬГ-АТР-синтетазы (Perlin et al., 1985; Glaser et al., 1988); пере-
носчиков органических кислот, участвующих в цикле Кребса:
сукцината, цитрата и оксалоацетата (Salet, Moreno, 1994); транс-
локатора адениновых нуклеотидов (ADP/ATP обменник, ANT)
(Salet, Moreno, 1994; Belzacq et al., 2001), гексокиназы (Miccoli et
al., 1998), моноаминоксидазы (Murant et al., 1987). Как считают
некоторые авторы, фотоокисление белков более важно для нару-
шения функций митохондрий, чем перекисное окисление липи-
дов митохондриальных мембран (Salet, Moreno, 1994). Среди
компонентов цепи электронного транспорта наибольшей фото-
чувствительностью отличались электронпереносящие комплек-
сы I (NADH-редуктазный) и IV (цитохромоксидазный) (Musser,
Oseroff, 1994). По другим данным, однако, цитохромоксидаза
была устойчива к фотосенсибилизации тТНРС (Teiten et al.,
2003а) или разными фталоцианинами (Vames et al., 1999; Fabris
et al., 2001).
В результате этих процессов ингибируется клеточное дыха-
ние, разобщается окислительное фосфорилирование, падает ми-
тохондриальный потенциал ДТт и снижается синтез АТФ (Сеск-
ler et al., 1986; Hilf et al., 1986; Khanum, Jain, 1989; Salet, Moreno,
1990, 1994; Klein et al., 1997; Noodt et al., 1998; Varnes et al., 1999;
Weizman et aL, 2000). Фотоповреждение митохондрий, однако,
не приводит к полному истощению запасов АТФ в клетке, так
как оно частично компенсируется гликолизом. Полное падение
внутриклеточного уровня АТФ происходит при сочетании ФД
воздействия с ингибиторами гликолиза (Hilf et al., 1986; Kirvelie-
ne et al., 1997; Noodt et al., 1998; Obcrdanner et al., 2002).
На ультраструктурном уровне фотоиндуцированные измене-
ния митохондрий отмечаются, как правило, раньше, чем измене-
ния структуры плазматической мембраны, ядра или других орга-
нелл. Митохондрии набухают, в них происходит просветление
матрикса и разрушение крист (Uzdcnsky et al., 2002а).
Сначала предполагалось, что первичной мишенью ФД воз-
действия являются биоэнергетические ферменты (Salet, Moreno,
1990, 1994). Деполяризация митохондрий, т. с. падение Д'Рт,
происходит в самом начале ФД воздействия, и это является пер-
вым признаком фотодинамического повреждения митохондрий
(Chaloupka et al.,1999а; Kessel, Luo, 1999; Oleinick ct al., 2002).
Она может происходить вследствие утечки протонов через де-
фекты в митохондриальной мембране, появляющиеся в резуль-
тате перекисного окисления липидов, либо при фотоиндуциро-
ванном открытии высокопроницаемых митохондриальных пор.
Но роль фотоповреждения митохондрий в смерти клетки оказа-
лась сложнее, чем думали ранее.
2. 4. Аппарат Гольджи
и эндоплазматический ретикулум
Гидрофобные фотосснсибилизаторы, локализующиеся в
мембранах клеточных органелл, например гиперицин (Thomas,
Pardini, 1992; Weber ct al., 1994; Vandcnbogaerte et al., 1997; Uz-
densky et al., 2001c), mTHPC (Foscan) (Melnikova ct al., 1999; Tci-
ten et al., 2003a, 2003b; Marchal ct al., 2004), фталоцианин Pc 4
(Trivedi ct aL, 2000), метиловый эфир пирофеофорбида-а
(PMME) (Matroule, Piette, 2000), фталоцианин цинка (Rodal et aL,
1998; Fabris et aL, 2001; Cristobal et aL, 2006), а также Фотофрин
(Hsicn et aL, 2003) обычно накапливаются в перинуклеарной об-
ласти, богатой мембранными органеллами, — митохондриями,
эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) и аппаратом Гольджи
(АГ), а также транспортными пузырьками. Соответственно эти
органеллы являются потенциальными мишенями для ФД воз-
действия.
По электронно-микроскопическим данным, в фотосенсиби-
лизированных нейронах наряду с изменениями митохондрий
и других внутриклеточных структур происходит набухание
цистерн ЭР и комплекса Гольджи, а затем деградация послед-
него (Uzdensky et al., 2002а; Fedorenko, Uzdensky, 2008). При фо-
тосенсибилизации культивируемых опухолевых клеток гид-
рофобным фталоцианином цинка ингибируются маркерные
ферменты митохондрий (цитохромоксидаза) и аппарата Гольд-
жи (UDP-галактозилтрансфераза), но не ЭР (NADPH-цитохром
с редуктаза) или лизосом (0-М-ацетил-П-глюкозаминидаза)
(Rodal ct al., 1998). Менсе гидрофобный фотосенсибилизатор
Фотофрин ингибировал UDP-галактозилтрансферазу (комплекс
Гольджи), но не NADPH-цитохром с редуктазу (ЭР), амфифиль-
ный TPPS,() ингибировал NADPH-цитохром с редуктазу (ЭР), но
не UDP-галактозилтрансферазу (АГ), а гидрофильный TPPS4 нс
влиял на ферменты ни ЭР, ни комплекса Гольджи. Аналогич-
ный анализ, проведенный Тэйтсном с соавт. (Teiten et al., 2003а,
2003b), показал, что гидрофобный тТНРС, локализующийся
почти исключительно в комплексе Гольджи и ЭР, вызывал фото-
ингибирование маркерных ферментов этих органелл: UDP-ra-
лактозилтрансферазы и NADPH-цитохром с редуктазы соот-
ветственно. Следовательно, ЭР и Гольджи также могут быть
мишенями для ФД воздействия на клетки. Селективность по-
вреждения клеточных органелл зависит от физико-химических
свойств фотосснсибилизаторов, которые определяют их внутри-
клеточную локализацию.
2. 5. Цитоскелет: микротрубочки
и актиновые филаменты
Микротрубочки наряду с другими элементами цитоскеле-
та — актиновыми нитями и промежуточными филаментами —
придают определенную форму клеткам, а также участвуют в ор-
ганизации цитоплазмы, подвижности внутриклеточных орга-
нелл и сегрегации хромосом в митозе. По микротрубочкам
транспортируются клеточные компоненты. Их динамичная
структура является результатом одновременной сборки и раз-
борки. ФД действие некоторых фотосенсибилизаторов (Фото-
фрин II, TPPSn, A1PcS4, BPD-МА, гипокреллин А и других) мо-
жет разрушать микротрубочки в интерфазных или делящихся
клетках (Berg et al., 1990; Spom, Foster, 1992;. Juarranz et al.,
1995, 2001; Lee, Chen, 1995; Stockert et al., 1996; Berg, Moan,
1997; Vantieghem et al., 2002; Canete et al., 2004). Эти эффекты
зависят от концентрации фотосенсибилизатора, дозы облучения
и времени после воздействия. Сублетальное ФД воздействие
либо не влияет (Uzdensky et al., 2005b), либо вызывает времен-
ную, обратимую деполимеризацию, тогда как большие, леталь-
ные дозы могут приводить к необратимому разрушению микро-
трубочек и потере жизнеспособности клетки (Sporn, Foster,
1992; Juarranz et al., 1995, 2001). Фотосенсибилизация также по-
вреждает мономерный тубулин и ингибирует сборку микротру-
бочек (Berg et al., 1992; Lee, Chen, 1995; Sakharov et al., 2003).
Поэтому предполагается, что наряду с плазматической мембра-
ной и внутриклеточными органеллами тубулин и микротрубоч-
ки являются одной из мишеней для фотодинамического воздей-
ствия. Воздействие на них в делящихся клетках предотвращает
формирование митотического веретена и приводит к наруше-
нию митоза. Фотосенсибилизированные клетки накапливаются
в метафазе, повышается митотический индекс. Не вступившие в
деление клетки затем умирают (Berg, Moan, 1997; Juarranz et al.,
1995, 2001). Другие важные следствия разрушения микротрубо-
чек — нарушение внутриклеточного везикулярного транспорта
и формы клеток (Lee, Chen, 1995; Berg, Moan, 1997).
Для объяснения фотодинамического повреждения микротру-
бочек предполагается либо их непосредственная деструкция,
либо нарушение их сборки в результате фотомодификации мо-
номерного а- и/или р-тубулина. В пользу первого предположе-
ния кроме вышеприведенных данных свидетельствуют опыты, в
которых наблюдался синергизм фотодинамического воздейст-
вия и деполимеризации микротрубочек, вызванной винкристи-
ном. В пользу второго — данные об их разрушении не сразу, а в
течение нескольких часов после прекращения воздействия (Juar-
ranz et al., 1995), а также данные об усилении фотоповреждения
при ингибировании сборки микротрубочек нокодазолом (Berg et
al., 1992). Фотодинамическое ингибирование сборки микротру-
бочек зависит от гидрофильности фотосснсибилизаторов: гидро-
фобные сенсибилизаторы не связывались с тубулином и не фо-
тосенсибилизировали микротрубочки (Berg et al., 1992). Мето-
дом Вестерн-блот показано непосредственное повреждние
а-тубулина при ФД воздействии фталоцианина цинка (Juarranz
et al., 2001). Стабилизация микротрубочек таксолом, однако, не
снижала, как можно было предположить, а повышала эффектив-
ность фотодинамического воздействия (Ma et al., 1996). Возмож-
но в основе усиления фотоповреждения клеток при добавлении
таксола лежит нарушение не самих микротрубочек, а их функ-
ций, например, внутриклеточного транспорта. На сборку и ста-
бильность микротрубочек влияло присутствие АТФ, хотя корре-
ляции между динамикой деполимеризации микротрубочек и со-
держания АТФ в клетке не было обнаружено (Spom, Foster,
1992). По предположению авторов, нарушение сборки микро-
трубочек может быть опосредовано ионами Са2Т уровень кото-
рых в цитозоле повышается при ФД воздействии.
В некоторых работах сообщается об отсутствии поврежде-
ния актиновых стресс-волокон при таком ФД воздействии Фото-
фрина, которое вызывало деполимеризацию микротрубочек
(Sporn, Foster, 1992; Lee, Chen, 1995). Но в других исследованиях
с помощью сканирующего электронного микроскопа были вы-
явлены существенные морфологические изменения клеток
HeLa: резкое снижение числа филоподий, «пузырение» (ЫеЬ-
bing) клеточной поверхности, сморщивание и округление кле-
ток. Они свидетельствуют о значительных нарушениях цитоске-
лета под влиянием больших доз фотодинамического воздейст-
вия фталоцианина цинка, приводящих к некрозу или апоптозу
(Stockcrt et al., 1996; Canetc et al., 2004). Вестерн-блот показал,
что ФД воздействие фталоцианина цинка непосредственно по-
вреждает G-актин и а-актинин (Juarranz et al., 2001).
Возможно не только непосредственное фотодинамическое
повреждение актина, но и опосредованное нарушение актиново-
го цитоскелета. После ФД воздействия с LD20 или LD60 (структу-
ра актиновых стресс-волокон менялась не сразу), а через 8 или
24 ч, когда отмечались значительные изменения клеточной мор-
фологии, связанные с нарушением цитоскелета: ретракция отро-
стков, открепление от подложки и округление. Все это вело к
апоптозу (точнее, аноикису) (Juarranz et al., 2001). О дезоргани-
зации актинового цитоскелета говорило и снижение флуорес-
ценции антител, связанных с актином (Canete et al., 2004) и а-ак-
тинином (Juarranz et al., 2001). Фотодинамически индуцирован-
ный распад актиновых стресс-волокон, свидетельствующий о
нарушении клеточной адгезии, также наблюдался через сутки
после фотосепсибилизации клеток фталоцианином алюминия
ALPcS4 (Ferreira et al., 2004).
Актиновый цитоскелет, будучи высоколабильной структу-
рой, способен перестраиваться при изменении функционального
состояния клеток, особенно, при их движении, когда постоянно
меняется форма клетки. Эти процессы находятся под контролем
разнообразных сигнальных процессов, связанных с адгезионны-
ми молекулами. Поэтому фотодинамически индуцированные пе-
рестройки актинового цитоскелета могли быть опосредованы
сигнальными процессами. Так, перераспределение актина от
стресс-волокон к клеточному кортсксу в клетках аденокарцино-
мы WiDr и распад актиновых фибриллярных структур в конусах
роста отростков клеток глиобластомы D54Mg, подвергнутых
сублетальному действию ALA-ФДТ, могли скорее быть резуль-
татом модификации сигнальных белков, которые управляют пе-
рестройкой цитоскелета (Uzdcnsky ct al., 2005b). По данным
Плюскаловой с соавт. (Pluskalova ct al., 2006), разрушение акти-
нового цитоскелета в клетках лейкемии К562 под влиянием
ALA-PDT было связано с фотоиндуцированным подавлением
белка Septin2, организующим объединение актиновых нитей в
пучки. Также повреждался белок CLP36 — адаптер протеинки-
назы LIM, которая инактивирует белок кофилин, деполимеризу-
ющий актин в клетках. Это также способствовало деполимери-
зации актина.
Промежуточные волокна намного более устойчивы к фото-
динамическому воздействию, чем актиновый и тубулиновый ци-
тоскелет (Juarranz et al., 2001).
2. 6. Ядро
ФД воздействие эффективно повреждает ДНК в растворах
(Evensen, Moan, 1982). Используя лазерный микролуч, М. Бернс
с сотрудн. облучали хромосомы, митотическое веретено, микро-
участки клетки, прилегающие к митотическому веретену, и мик-
роучастки цитоплазмы на периферии делящихся клеток РТК2 и
Нер-2, а также ядра интерфазных клеток после инкубации с
ALA. В порядке убывания чувствительности к ФД воздействию
клеточные зоны располагаются следующим образом: хромосо-
мы, участок около митотического веретена, периферическая ци-
топлазма, митотическое веретено и, наконец, интерфазное ядро
(Liang et al., 2000).
Однако фотосенсибилизаторы порфиринового ряда — про-
изводные гематопорфирина HpD и Фотофрин (Malham et al.,
1996; Rousset et al., 2000), алюмофталоцианины ChlAIPc, A1S2Pc,
A1S4PC или Pc 4 (Malham ct al., 1996; Trivedi et al., 2000), BPD
MA (Rousset ct al., 2000), mTHPC и мероцианин 540 (Yow et aL,
2000) — практически не попадают в клеточное ядро, не повреж-
дают генетический аппарат, не вызывают мутации и не являются
канцерогенами (Moan, 1986, Yow et al., 2000; Zenzen, Zankl,
2004). Например, фотосснсибилизация гексиловым эфиром ами-
нолевулиновой кислоты не повышала процент хромосомных
аберраций, нс вызывала формирование микроядср и не влияла
на характеристики спектрального кариотипирования опухоле-
вых клеток RPMI 2650 и фибробластов WS 1. Это говорит об от-
сутствии мутагенного эффекта. Но при этом фотодинамическая
обработка снижала митотический индекс и индекс деления ядер
в опухолевых клетках RPMI 2650, но нс в фибробластах WS 1,
т. с. она оказывала цитотоксическое действие на клетки опухо-
ли, но нс на нормальные фибробласты, что весьма желательно
для лечебного действия (Zcnzen, Zankl, 2004). Группой 3. Хркал
(Z. Hrkal) показано, что ингибирование деления клеток HL-60,
индуцированное фотодинамическим воздействием ALA, сопро-
вождалось уменьшением числа и исчезновением окрашиваемых
серебром частиц ядрышкового организатора. Ультраструктур-
ное исследование показало, что в апоптозных клетках происхо-
дит уменьшение числа и исчезновение фибриллярных центров,
что также отражает снижение биосинтетической активности яд-
рышек (Smetana et al., 2004).
Глава 3
РЕАКЦИИ КЛЕТОК НА ВНЕШНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ
3.1. Клетка как система, взаимодействующая
с окружающей средой
Все клетки находятся во внешнем окружении и постоянно
взаимодействуют с другими клетками и окружающей средой.
Чрезмерные или вредные внешние влияния приводят к их по-
вреждению и могут вызвать смерть этих клеток. Повреждение и
смерть клеток — сложные многостадийные процессы. Сначала
клетка активно сопротивляется, стараясь сохранить свою жизне-
способность, но по исчерпании защитного потенциала она теря-
ет свои основные функции и развиваются процессы, приводя-
щие к се смерти. Внешние воздействия сперва атакуют опреде-
ленные клеточные структуры, в которых развиваются первичные
повреждения. Затем зона повреждения расширяется и постепен-
но захватывает всю клетку. Одновременно в клетке происходят
защитные процессы, сначала локальные, а затем глобальные, во-
влекающие практически все клеточные компоненты.
Сравнительно недавно получены данные о клеточных сигна-
льных процессах, участвующих в вызванных внешними воздей-
ствиями перестройках функций, процессах адаптации, управле-
нии защитными механизмами и процессах смерти. Продукты
первичных повреждений, которыми часто являются активные
формы кислорода, активируют систему внутриклеточной сигна-
лизации. В клеточную реакцию вовлекаются не только присут-
ствующие белки, но также активируются факторы транскрип-
ции, которые запускают производство новых белков, необходи-
мых для интегрального клеточного ответа.
При анализе комплекса реакций, участвующих в реакциях
клеток на повреждающие воздействия, полезно разделить кле-
Рис. 6. Системы, управляющие реакциями клеток на внешние воздействия.
Fig. 6. System controlling cell responses to external impacts.
точные системы на четыре подсистемы или комплекса, которые:
а) выполняют специфические клеточные функции; б) осуществ-
ляют клеточное деление; в) защищают клетку и поддерживают
ее выживаемость; г) осуществляют процессы клеточной смерти,
некроза или апоптоза (рис. 6). Такое деление, характерное для
описания жизнедеятельности одиночной клетки, разумеется, нс
достаточно для характеристики реакций той же клетки в составе
организма, где се состояние контролируется другими клетками и
системами высшего уровня — тканями, органами и всем орга-
низмом. Такой контроль осуществляется с помощью химиче-
ских (гормоны, пептиды, трансмиттеры, ионы) и физических
(температура, давление, адгезия) сигналов.
При рассмотрении реакций клеток на повреждающие воздей-
ствия основной интерес представляют комплексы выживаемо-
сти и смерти клеток.
3. 2. Комплекс выживаемости или защиты клеток
В состав комплекса выживаемости можно отнести следую-
щие подсистемы, обеспечивающие жизнедеятельность и защиту
клеток (рис. 7):
1) общий метаболизм, в том числе его важнейшее звено —
комплекс биоэнергетических процессов.
Рис. 7. Клеточные системы, участвующие в реакциях клеток на повреждение.
Fig. 7. Cellular systems participating in cell responses to injury.
2) системы поддержания гомеостаза, в частности внутрикле-
точных концентраций важнейших ионов: Н+, Na+, К+ и Са2+. Они
включают ионные насосы, ионные каналы и обменники. Связы-
вание ионов биополимерами и депонирование их во внутрикле-
точных органеллах вносит вклад в эти процессы.
3) защитные механизмы, включающие подсистемы:
а) детоксикации активных форм кислорода и перекисей
липидов (антиоксиданты, каталаза, пероксидазы, супер-
оксиддисмутаза и т. п.);
Ь) ферменты детоксикации чужеродных молекул, такие
как цитохром Р-450;
с) системы репарации ДНК;
d) белки теплового шока (шапероны);
е) везикулярный транспорт, залечивающий механические
повреждения плазматической мембраны;
f) белки множественной лекарственной устойчивости
MRP (multidrug resistance proteins)
Когда эти механизмы нс справляются с защитой, клетки уми-
рают.
3. 3. Типы клеточной смерти:
апоптоз, аутофагия и некроз
С давних пор биологов интересуют повреждения и смерть
клеток: что отличает живую клетку от неживой? Как происходит
повреждение клетки, переход от живого состояния к неживому?
Возможно ли возвращение поврежденной клетки в нормальное
состояние, и где находится «точка невозврата»? Эти вопросы
имеют ключевое значение для медицины, для понимания приро-
ды различных болезней и разработки методов лечения. Начиная
от Р. Вирхова, автора «Целлюлярной патологии» (1866), многие
выдающиеся биологи, такие как Л. В. Гсйльбрупн, Д. Н. Насо-
нов, В. Я. Александров и другие, пытались решить эти пробле-
мы. Их парадигмы, разумеется, соответствовали существующе-
му в то время уровню знаний о строении и функциях клетки
(Браун, Можепок, 1987).
Изучение проблемы клеточной смерти получило новый им-
пульс в последние десятилетия в связи с открытием апоптоза и
развитием методов молекулярной и клеточной биологии. Со-
гласно современной классификации (Golstein, Kroemer, 2006;
Galuzzi et al., 2007; Уздснский, 2010), выделяется три основных
типа клеточной смерти: апоптоз (тип 1), аутофагия (тип 2) и не-
кроз (тип 3).
Апоптоз изучен лучше других типов смерти клеток. Апоп-
тоз — запрограммированная смерть клетки, осуществляемая по
имеющейся в клетках программе особым комплексом клеточ-
ных белков, когда клетка получает специальные сигналы, ини-
циирующие ее смерть, или длительно подвергается сравнитель-
но слабому повреждающему воздействию. Программа апоптоза
находится под контролем системы внутриклеточной сигнализа-
ции, способной, как усилить, так и затормозить или блокировать
апоптоз. В отличие от других типов клеточной смерти, при
апоптозе основные деструктивные процессы сначала протекают
в клеточном ядре при сравнительно сохранных клеточных орга-
неллах. Наиболее характерные апоптотические процессы: меж-
нуклеосомная фрагментация ДНК, конденсация хроматина, сжа-
тие и фрагментация клеточного ядра (кариопикноз и кариорек-
сис соответственно), «пузырение» поверхностной мембраны.
После этого клетки распадаются на окруженные мембраной
фрагменты — апоптозныс тельца, содержащие интактные орга-
неллы и фрагменты ядер, которые затем фагоцитируются фиб-
робластами, лейкоцитами, эпителиоцитами и другими сосед-
ними клетками. В отличие от некроза, апоптоз не приводит к
развитию воспаления и последующему формированию рубца,
что важно с медицинской точки зрения (Arends, Willie, 1992; Но-
виков и др., 1996; Haunstettcr, Izumo, 1998; Trump, Berczcsky,
1998; Skulachcv, 1999; Лушников, Абросимов, 2001; Bras et al., 2005;
Fadeel, Orrenius, 2005; Князькин, Цыган, 2007; Elmore, 2007).
Для реализации апоптоза необходимы целостность плазма-
тической мембраны и достаточный уровень АТФ. Это решаю-
щие факторы, определяющие программу клеточной смерти.
Если мембрана повреждена и/или низок уровень АТФ, то клетки
погибают от некроза, если нет — возможен апоптоз (Luo, Kes-
sel,1996; Dellinger, 1997; Lcist cl al., 1997; Nicotera, Lcist, 1997;
Nicotera et al., 1999; Tsujimoto, 1997). Кроме того, необходимы
ионы Са2^ и синтез некоторых белков.
Основным исполнительным механизмом апоптоза является
комплекс гидролитических ферментов: протеаз, нуклеаз, липаз,
осуществляющих разборку клеточных структур. Эта система за-
пускается каскадами каспаз — специальных протеиназ, расщеп-
ляющих в белках пептидную связь между аспарагиновой кис-
лотой и цистеином. Они отщепляют ингибирующий пептид
от неактивной прокаспазы, превращая се в активную каспазу.
В центре каспазного каскада стоит каспаза 3, которая активиру-
ется каспазами 8, 9, 10 или 12. В свою очередь каспаза 3 активи-
рует каспазы 6 и 7, которые «включают» исполнительные гидро-
литические белки: протеиназы, фосфолипазы и нуклеазы. К ми-
шеням этих гидролаз относятся:
— ядерпыс белки, осуществляющие мсжнуклеосомную
фрагментацию ДНК, такие как DFF (DNA fragmentation factor);
ламины, образующие клеточную оболочку, топоизомеразы I и II,
гистон Ш, поли(АОР-рибоза)-полимераза (PARP), ДНК-зависи-
мая протеинкиназа (Mdm2) и другие;
— регуляторные белки цитозоля, например, протеинкиназа
С, фокальная адгезионная киназа (FAK); протеинкиназа МЕК.К.1
и др.;
— белки цитоскелета, такие как актин, фодрин, гсльзолин;
— различные белки, участвующие в перестройках и дезин-
теграции цитоскелета, мембран, органелл, ядра, формировании
апоптотических телец и т. д. (Hounstetter, Izumo, 1998; Bras et al.,
2005; Fadeel, Orrenius, 2005, Elmore, 2007).
Активация протеолитического каспазного каскада, выполня-
ющего основные процессы апоптоза, может инициироваться как
снаружи, так и изнутри клетки (рис. 8, а). В первом случае апоп-
тоз запускается при связывании специальных «лигандов смер-
ти»: FasL (Fas-ligand), TNFa (tumor necrosis factor-alfa) или
TRAIL (TNF-rclated apoptosis-inducing ligand) с поверхностными
рецепторами плазматической мембраны: Fas, TNF1 (tumor necro-
sis factor receptor 1) и TRAIL RI/2 соответственно. Они активи-
руют каспазы 8 или 10, а те — каспазу 3 и нижележащие пути,
ведущие к апоптозу (Haunstctter, Izumo, 1998; Ashkenazi, Dixit,
1999; Faded, Orrcnius, 2005; Elmore, 2007).
Во втором случае сигналы для запуска апоптоза могут исхо-
дить из внутриклеточных органелл — митохондрий, эндоплаз-
матического ретикулума и лизосом. Митохондрии играют цент-
ральную роль в активации ферментных каскадов, ведущих к
апоптозу (рис. 8,«). При повреждении митохондрий из их меж-
мембранного пространства могут высвобождаться белки-актива-
торы апоптоза: цитохром с, AIF, SMAC/DIABLO и Omi/Htr. Ци-
тохром с вместе с цитоплазматическим белком Apaf-1 и дезокси-
адсниптрифосфатом (dATP) стимулирует каспазу 9, которая
затем активирует каспазы 3, 6 и 7 и далее исполнительные белки
апоптоза. SMAC/DIABLO и Omi ингибируют препятствующий
апоптозу белок IAP (apoptosis inhibitor protein), облегчая тем са-
мым апоптотичсскис процессы. Белок AIF активирует ядерные
нуклеазы, осуществляющие фрагментацию ДНК. Кроме этих
белков, из митохондрий может высвобождаться эндонуклеаза G,
также участвующая во фрагментации ДНК. Митохондриальный
путь апоптоза обычно индуцируется при окислительном стрессе
(Haunstetter, Izumo, 1998; Skulachev, 1999, 2000; Jiang, Wang,
2004; Bras et al., 2005; Faded, Orrcnius, 2005; Jemmcrson et al.,
2005; Elmore, 2007).
При повреждении лизосом из них могут выходить протеоли-
тические белки катепсины, которые либо непосредственно акти-
вируют каспазу 3, либо активируют белок Bid, способствующий
выходу цитохрома с из митохондрий и запуску апоптоза по ми-
тохондриальному пути. В результате повреждения цистерн эн-
доплазматического ретикулума из них может высвобождаться
Са2' , стимулирующий кальпаин, который активирует каспазы 12
и 3 и дальнейшие проапоптозные пути (Haunstetter, Izumo, 1998;
Elmore, 2007).
К «точкам невозврата» при апоптозе, после которых насту-
пают необратимые процессы и смерть неизбежна, относятся
массивная активация каспаз, исчезновение трансмембранной
A
Б
Рис. 8. Основные компоненты клетки, участвующие в апоптозе (А) и не-
крозе (Б) (по: Узденский, 2010).
А — схема основных апоптотических процессов, Б — кальпаин-катепсиновый ме-
ханизм некроза; ЭР — эндоплазматический ретикулум, Мит — митохондрия.
Остальные пояснения в тексте.
Fig. 8. Main cellular systems participating in apoptosis (A) and necrosis (5)
(after Узденский, 2010).
A — scheme of main apoptotic processes, Б — calpain-cathepsin mechanism of necro-
sis; ЭР — endoplasmic reticulum, Mum — mitochondria. Other explanations are in the
text.
разности потенциалов в митохондриях, открытие высокопрони-
цаемых митохондриальных пор и высвобождение проапоптоти-
ческих белков из межмембранного пространства митохондрий.
Апоптоз — строго регулируемый, эволюционно консерватив-
ный процесс, протекающий весьма сходно у эукариотических
организмов, стоящих далеко друг от друга на эволюционной ле-
стнице (Bras et aL, 2005; Fadeel, Orrenius, 2005; Galluzzi et al.,
2007).
Недавно описан аутофагический тип клеточной смерти
(тип 2). В нем смерть клетки связывают с аномальным накопле-
нием в цитоплазме аутофагосом, ограниченных мембранами пу-
зырьков, которые содержат крупные фрагменты цитоплазмы с
находящимися в них органеллами и их обломками. При слиянии
аутофагосом с лизосомами образуются аутофаголизосомы, в ко-
торых их содержимое переваривается. Правда, давно известная
аутофагия, т. е. «самопоедание клетки», обычно рассматривает-
ся как элемент клеточной защиты, освобождения клетки от по-
врежденных или излишних органелл. К смерти может приводить
несбалансированное, массивное формирование аутофагосом.
При этом трудно определить, что происходит: смерть, наступа-
ющая вместе с формированием аутофагосом, или смерть, воз-
никающая благодаря образованию аутофагосом. В отличие от
апоптоза, при котором происходит быстрая разборка клетки,
аутофагия — медленный процесс. Как и апоптоз, аутофагия —
тоже эволюционно-консервативный процесс. Она управляется
специальной системой сигнальных белков, кодируемых семей-
ством J/g-генов (autophagy-related genes), которые регулируются
протеинкиназой mTOR (the mammalian target of rapamycin). Поэ-
тому аутофагию, как и апоптоз, считают программируемой кле-
точной смертью (Meyer, Codogno, 2006; Levine, Kroemer, 2008).
Третий тип клеточной смерти — некроз ранее был подробно
охарактеризован как «нсспсцифическая реакция клеток на по-
вреждение» (Эйдус, 1977; Браун, Можснок, 1987). Он обычно
считается пассивным процессом, не потребляющим энергии и не
требующим синтеза новых белков. Традиционно считается, что
некроз — многоступенчатый, неуправляемый, саморазвиваю-
щийся процесс, не поддающийся фармакологической коррек-
ции. Это катастрофическая клеточная смерть, неспецифически
вызываемая интенсивными повреждающими факторами самой
разной природы. К типичным пронекротическим воздействиям
относятся осмотический лизис, активные формы кислорода и
факторы, вызывающие повышение уровня ионов Са2+ в цитозо-
ле. При некрозе изменения сначала развиваются в цитоплазме, а
затем захватывают ядро. Внутриклеточные оргапеллы и вся
клетка набухают, округляются, а затем клеточная мембрана раз-
рывается, и клетки лизируют. В отличие от апоптоза и аутофа-
гии, для некроза не найдено особых биохимических маркеров.
Наиболее падежным показателем некроза является нарушение
проницаемости, а затем и целостности плазматической мембра-
ны (Proskuryakov et al., 2003; Festjens et al., 2006; Zong, Thomp-
son, 2006; Golstcin, Crocmer, 2006; Galluzzi et al., 2007).
Основные некротические процессы включают (Узденский,
2010).
— Нарушение целостности плазматической мембраны и
мембран внутриклеточных органелл.
— Проникновение воды в клетку.
— Падение ионных градиентов, декомпартментализацию и
перераспределение низкомолекулярных соединений в клетке.
— Повышение уровня ионов кальция в цитозоле, которые
активируют кальций-зависимые фосфолипазы, протеиназы и
нуклеазы.
— Инактивацию ферментов, торможение биосинтетических
процессов и снижение общего уровня метаболизма.
— Набухание и деградацию внутриклеточных органелл. В
митохондриях — разрушение крист, падение мембранного по-
тенциала и разобщение окислительного фосфорилирования.
Временная активация гликолиза поддерживает клеточную энер-
гетику до исчерпания запасов гликогена.
— Деструкцию цитоскелета, набухание и округление клетки.
— Лизис.
Эти повреждения взаимно усиливают друг друга, они прак-
тически не репарируются и необратимы. Такой механизм эволю-
ционно консервативен, он характерен для различных эукариоти-
ческих клеток. По современным представлениям, одним из клю-
чевых факторов, инициирующих некроз, является повышение
уровня ионов кальция в цитозоле свыше 10‘4—10 3 М. Это мо-
жет быть результатом проникновения Са2+ в клетку через по-
врежденную плазматическую мембрану или открытые кальцие-
вые каналы, а также высвобождения депонированного Са2+ из
митохондрий и ЭР. Цитоплазматический кальций активирует
кальпаины — кальцийзависимыс цистеиновые протеиназы, спо-
собствующие разрушению лизосомальных мембран и мобилиза-
ции лизосомальных ферментов, в частности, неспсцифичсских
протеаз катепсинов, называемых киллерными или исполнитель-
ными протеазами. Катепсины разрушают белки цитоскелета и
клеточных мембран и тем самым нарушают их целостность. Это
кальпаин/катепсиновый механизм некроза (Yamashima, 2000;
Festjens et al., 2006; Golstein, Croemer, 2006; Zong, Thompson,
2006).
Смерть клетки — сложный и продолжительный процесс. Но
как установить границу между живой и неживой клеткой? По
современным представлениям, критическим событием клеточ-
ной смерти, приводящим к необратимой утрате жизнедеятельно-
сти, является необратимая утрата целостности плазматической
мембраны (Festjens et al., 2006; Golstein, Croemer, 2006; Zong,
Thompson, 2006; Galluzzi et al., 2007). До сих пор не вполне ясно,
как повреждаются клеточные мембраны. В принципе возможны
следующие повреждающие процессы.
— Перекисное окисление липидов под влиянием активных
форм кислорода с последующим образованием различных дефек-
тов: мембранных пор, липид-липидных и бслок-липидных сшивок.
— Повреждение мембранных белков: рецепторов, ионных
каналов, ионных насосов, переносчиков ионов и метаболитов в
результате окисления аминокислот, образования липид-белко-
вых, внутри- или межбелковых сшивок .
— Протеолитическое разрушение мембранных белков акти-
вированными протеазами, например, каспазами, катепсинами и
кальпаинами.
— Ферментативное разрушение мембранных липидов фос-
фолипазами А:, С и D (Proskuryakov et al., 2003; Festjens ct al.,
2006; Бережнов и др., 2009). Продуктом фосфолипазы cPLA2 яв-
ляется арахидоновая кислота — один из основных субстратов
липооксигепаз, которые участвуют в мобилизации и перекисном
окислении липидов (Maccarone ct al., 2001).
3. 4. Сигнальная система клетки
Одно из важнейших открытий последних десятилетий — си-
стема внутриклеточной сигнализации, состоящая из многочис-
ленных сигнальных путей, которые взаимодействуют друг с
другом и идут от рецепторов на плазматической мембране в ци-
топлазму, далее в ядро, где регулируется работа генетического
аппарата, назад в цитоплазму, к клеточной поверхности и
внеклеточной среде. Эта система состоит из межклеточных сиг-
нальных молекул (гормонов, нейромедиаторов, цитокинов, фак-
торов роста), рецепторов на клеточной поверхности, цитоплаз-
матических сигнальных каскадов, факторов транскрипции,
управляющих экспрессией генов, и исполнительных белков, ко-
торые определяют клеточный ответ. Основные ее звенья приве-
дены на рис. 9. Некоторые компоненты этой системы поддержи-
вают выживаемость клеток, другие участвуют в клеточной смер-
ти. Вследствие сложности сигнальной системы, регулирующей
работу клетки, различной экспрессии се компонентов в разных
клетках, перекрестных взаимодействий сигнальных путей, зави-
симости от функционального состояния и внешней среды труд-
но выявить конкретную последовательность событий, разверты-
вающихся в данной клетке в ответ на определенное воздействие.
Пока известны не все сигнальные пути. Поэтому современные
данные о роли системы внутриклеточной сигнализации в реак-
циях клеток на то или иное воздействие пока фрагментарны и
неполны. По современным данным, центральную роль в клетках
играют следующие сигнальные пути.
Внеклеточные сигнальные молекулы распознаются рецепто-
рами, связанными с G-белками (RCGP), или рецепторными ти-
розинкиназами (RTK). Межклеточный матрикс или соседние
клетки распознаются рецепторами адгезии (интегринами, кадге-
ринами, синдеканами и т. д.). Они инициируют несколько внут-
риклеточных сигнальных путей (Bradshaw, Dennis, 2003).
Кальциевый путь запускается входом ионов Са2+ через ион-
ные каналы в плазматической мембране или высвобождением
Са2+ из внутриклеточных депо: митохондрий и/или эндоплазма-
тического ретикулума. В последнем случае кальциевые каналы в
мембранах ЭР открываются при связывании 1,4,5-инозитолтри-
фосфата (1Р3), который появляется в цитозоле после расщепле-
ния мембранных фосфолипидов фосфолипазой С, которая в свою
очередь активируется RCGP или RTK в ответ на связывание сиг-
нальных молекул. Повышение уровня Са2+ в цитозоле ведет к ак-
тивации Са2+-зависимых сигнальных белков: протеинкиназы С,
кальмодулина, кальмодулинзависимой киназы II (СаМКП) и т. д.
В аденилатциклазном пути связывание сигнальной моле-
кулы-лиганда с RCGP активирует G-бслок. Его каталитическая
субъединица а высвобождается и активирует или ингибирует
аденилатциклазу, которая продуцирует циклический аденозин-
монофосфат (сАМР). В ответ на появление сАМР протеинкиназа
А активирует разнообразные клеточные реакции.
Рецепторные тирозинкиназы могут инициировать сигналь-
ные пути, опосредованные следующими ферментами:
а) фосфолипазой С и ионами Са2+;
б) фосфатидилинозитол 3-киназой и протеинкиназой B/Akt
(РКВ);
в) митогенактивируемыми протеинкиназами (МАРК).
Рис. 9. Схема основных сигнальных процессов в клетках.
АС — аденилатциклаза; сАМР — циклический адснозинмонофосфат; СаМ — ка-
льмодулин; СаМКП — кальмодулинзависимая киназа II; МАРК — митогенакти-
вируемая протеинкиназа; PI3K — фосфатидилинозитол 3-киназа; РКА — протеин-
киназа А; РКС —протеинкиназа С; PLC — фосфолипаза С; RCGP — рецепторы,
сопряженные с G-белкамп; RTK - рецепторные тирозинкиназы. Звездочка —
предполагаемая мишень фотодинамического воздействия.
Fig. 9. Scheme of the main signaling pathways in cells.
AC - - adenylate cyclase; cAMP - cyclic adenosine monophosphate; CaM — calmodu-
lin; CaMKII — calmodulin-dependent kinase II; МАРК — mitogen activated protein ki-
nase; PI3K — phosphatidyl inositol 3-kinase; PKA — protein kinase A; PKC — protein
kinase C; PLC — phospholipase C; RCGP — receptors coupled to protein G; RTK —
receptor tyrosine kinase. Asterisk — possible PDT target.
Известны три основные протеинкиназы, семейства МАРК:
внеклсточно регулируемая протеинкиназа (ERK), c-Jun терми-
нальная киназа — она же стрссс-активирусмая протеинкиназа
(JNK/SAPK), и протеинкиназа р38. ERK стимулируется фактора-
ми роста, цитокинами или химическими сигналами и регулирует
пролиферацию и выживаемость клеток. JNK/SAPK (далее име-
нуемая просто JNK) и р38 участвуют в реакциях клеток на
стресс, в выживании, апоптозе и делении клеток.
Фокальная адгезионная киназа (FAK) активируется при свя-
зывании интегринов, рецепторов адгезии к белкам внеклеточно-
го матрикса. Она управляет перестройками цитоскелета, прида-
ющими клеткам определенную форму, и регулирует клеточную
подвижность.
Все эти протеинкиназы фосфорилируют и тем самым регу-
лируют многочисленные исполнительные белки и факторы
транскрипции, которые определяют конкретные реакции клеток
(Bradshaw, Dennis, 2003). Каждый тип клеток имеет свой инди-
видуальный набор таких белков, которые обеспечивают специ-
фические реакции клеток на различные воздействия.
Глава 4
СМЕРТЬ КЛЕТОК
ПРИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
4.1. Какой вид смерти индуцирует фотодинамическое
воздействие: некроз или апоптоз?
ФД воздействие может индуцировать как некроз, так и апоп-
тоз в зависимости от силы и интенсивности воздействия, а также
от того, какие клеточные структуры повреждаются в первую
очередь. Один и тот же фотосепсибилизатор может вызывать не-
кроз или апоптоз в зависимости от концентрации и времени ин-
кубации. 'Гак, после кратковременной инкубации (порядка 1 ч)
Фотофрин или HpD прежде всего накапливались в плазматиче-
ской мембране и последующее освещение вызывало преимуще-
ственно некроз. После продолжительной инкубации (24 ч), ког-
да краситель распределялся по всей клетке и сосредотачивался в
митохондриях, доминировал апоптоз (Dellinger, 1997; Kessel et
al., 1997; Kessel, Luo, 1998). Предполагается, что для фотодина-
мической терапии воздействие на митохондрии оптимально,
так как оно эффективно индуцирует апоптоз, предпочтительный
с медицинской точки зрения (Kessel, Luo, 1998, 1999; Morgan,
Oseroff, 2001; Oleinick et al., 2002). В опытах in vitro ФД воздей-
ствие быстро и эффективно индуцирует апоптоз митохондриа-
льного типа у большинства клеток (Agarwal et aL, 1991; Luo,
Kessel, 1996; Noodt et aL, 1996, 1998; Krammer et aL, 1997; Dellin-
ger, 1997; Kessel, Luo, 1998, 2001; Granville et aL, 1997—2001;
Oleinick et aL, 2002; Plaetzcr et aL, 2005; Castano et aL, 2005; No-
wis et aL, 2005; Buytacrt et aL, 2007a, 2007b). Однако основной
тип клеточной гибели при фотодинамическом лечении опухо-
лей, когда для большей надежности применяют максимальные
воздействия — некроз.
4. 2. Роль митохондрий
в фотодинамическом повреждении клеток
Неабсолютная селективность внутриклеточного распределе-
ния фотосенсибилизаторов предполагает существование множе-
ства внутриклеточных мишеней для ФД воздействия. При этом
трудно выделить некое одно критическое событие, ведущее к
смерти клетки (Jori, 1996; Morgan, Oseroff, 2001). Но все же глав-
ную роль отдают фотоповреждению митохондрий. Фотосенси-
билизаторы, накапливающиеся митохондриями, особенно эф-
фективно индуцируют апоптоз (Kessel et al., 1997, Kessel, Luo,
1998, 1999; Granville ct al., 2001a; Oleinick ct al., 2002).
Фотоповрежденис митохондрий может привести к следую-
щим процессам, участвующим в некротической и апоптотичс-
ской смерти клетки:
— падение производства АТФ;
— высвобождение ионов Са2^;
— генерация АФК, в частности/супсроксид-аниона Oj”;
— высвобождение цитохрома с и запуск апоптоза.
Митохондрии играют центральную роль в инициации апоп-
тоза. Ключевым участником в этом процессе явяется цитохром
с. Он располагается в межмембранном пространстве, где связы-
вается с кардиолипином на наружной поверхности внутренней
митохондриальной мембраны. Как показано на рис. 10, повреж-
дение митохондрий вызывает усиленную генерацию в них
активных форм кислорода (мАФК или mROS), перекисное окис-
ление митохондриальных липидов, в частности, кардиолипи-
на, мобилизацию и выход из межмембранного пространства
цитохрома с и других проапоптозных белков: A1F (apotosis-indu-
cing factor), SMAC/D1ABLO, Omi и эндонуклеазы G. Цитохром с
образует комплекс с цитоплазматическим белком Apaf-1 (арор-
totic protease activating factor-1) и дезоксиадепозиитрифосфа-
том (dATP) Этот комплекс расщепляет прокаспазу 9. Получен-
ная активная каспаза 9 активирует таким же образом каспазу 3,
а та — каспазы 6 и 7, которые активируют исполнительные
гидролитические белки. Эндонуклеаза G вместе с ядерными
нуклеазами, активируемыми каспазами и AIF, осуществляет
межнуклеосомную фрагментацию ДНК, последующую конден-
сацию хроматина и другие процессы апоптоза (Skulachev, 1999,
2000; Bras et al., 2005; Fadeel, Orrcnius, 2005; Jcmmcrson et al.,
2005).
Есть две гипотезы о том, как цитохром с и другие проапоп-
тозные белки могут выходить из межмембранного пространства
Рис. 10. «Митохондриальные» пути апоптоза.
Fig. 10. “Mitochondrial” apoptotic pathways.
через наружную митохондриальную мембрану, проницаемую
лишь для молекул с молекулярной массой менее 6 кДа.
А. Открытие высокопроницаемых митохондриальных пор
(РТР, permeability transition роге). РТР — крупный белковый
комплекс, расположенный в месте слияния внутренней и наруж-
ной митохондриальных мембран. В его состав входят: 1) потен-
циалзависимый анионный канал VDAC (voltage-dependent anion
channel), встроенный в наружную митохондриальную мембрану;
2) транслокатор адениновых нуклеотидов ANT (adenine nucleoti-
de translocator), обменивающий ADP на ATP, компонент внут-
ренней митохондриальной мембраны; 3) периферический бензо-
диазепиновый рецептор PBR, взаимодействующий с VDAC на
наружной митохондриальной мембране; 4) белок митохондриа-
льного матрикса циклофилин D, взаимодействующий с ANT на
внутренней митохондриальной мембране. С РТР также взаимо-
действуют цитозольная гексокиназа и креатинкиназа митохонд-
риального матрикса (Verma et aL, 1987; Halestrap, Brenner, 2003;
Vysokikh, Brdiczka, 2003).
Открытие РТР вызывает мгновенную утечку ионов, потерю
трансмембранного потенциала АТ1П и сопряжения окисления
субстратов и фосфорилирования АДФ, подавление синтеза АТР
и генерацию активных форм кислорода в митохондриях
(мАФК). Массивный вход воды через эти поры вызывает осмо-
тическое набухание митохондриального матрикса и разрыв на-
ружной митохондриальной мембраны, чья поверхность намного
превышает поверхность внутренней мембраны. При этом меж-
мембранные белки и другие вещества, например, ионы Са2’ вы-
ходят из митохондрий в цитозоль (Bras cl al., 2005; Faded, Orre-
nius, 2005; Jemmerson et al., 2005).
В. Открытие специальных мсгаканалов в наружной митохон-
дриальной мембране, достаточно больших для прохождения
белков. Эти каналы формируются белками Вах или Вак, относя-
щимися к семейству белков Bcl-2. Вак нормально присутствует
в наружной митохондриальной мембране, тогда как Вах — ци-
тозольный белок. В цитозоле Вах связан с белком Ки70 — фак-
тором репарации ДНК. При повреждении клетки этот комплекс
диссоциирует и Вах высвобождается. Белок Вах также может ак-
тивироваться фрагментом белка Bid, так называемым tBid (tran-
cated Bid, т. с. укороченный Bid), или цитозольным белком
PUMA (рис. 10). После активации Вах перемещается в наруж-
ную митохондриальную мембрану, где он олигомеризуется и
может формировать мегаканалы.
Антиапоптозные белки Вс1-2 или Bcl-xL формируют гетеро-
полимеры с Вах или Вак и таким образом снижают долю этих
проапоптозных белков, участвующих в образовании канала. Так
называемые «ВН-3 only proteins» Bid и Bim связываются с бел-
ками Bcl-2 and Bcl-x и снижают их противоапоптозный потенци-
ал (Fadeel, Orrenius, 2005; Bras et al., 2005; Jemmerson et al.,
2005). Выход цитохрома с из митохондрий в цитозоль и после-
дующий апоптоз «митохондриального типа» продемонстриро-
ван во многих работах при фотосенсибилизации клеток различ-
ными красителями (Granville et aL, 1998а; Inanami et aL, 1999;
Kessel, Luo, 1998,1999; Varnes et al., 1999; Chiu, Oleinick 2001;
Lam et aL, 2001; Vantieghcm et aL, 2001; Chen et aL, 2002; Teitcn
et aL, 2003a; Marchal et aL, 2004; Peng et aL, 2005). Как показали
Криска с соавт. (Kriska et aL, 2005), выход цитохрома с из фото-
сенсибилизированных митохондрий происходил в результате
фотоиндуцированного перекисного окисления кардиолипина,
который удерживал его в межмембранном пространстве мито-
хондрий. Во многих случаях выход цитохрома с происходил
сразу после ФД воздействия и сопровождался одновременным
падением митохондриального мембранного потенциала А'Рт
(Kessel, Luo, 1999; Vantieghcm ct al., 2001; Tciten et al., 2003). Ho
эти процессы нс всегда тесно связаны. В некоторых работах вы-
ход цитохрома с из митохондрий не сопровождался заметными
изменениями мембранного потенциала (Carthy et al., 1999). При
высоких дозах облучения мембранный потенциал митохондрий
падал примерно с той же скоростью, что и выход цитохрома с в
цитозоль, но малые дозы вызывали только его выход, но нс па-
дение ЛЧ/т (Chiu и Oleinick, 2001).
Цитохром с, высвобождающийся из митохондрий фотопов-
режденных клеток, образует комплекс с цитоплазматическим
белком Apaf-1 и активирует каскад каспаз 9, 3, 2, 6, 7 и 8 (Gran-
ville et aL, 1997, 1998а, 1999b; Не et al., 1998; Assefa et al., 1999;
Zhuang et al., 1999; Chan et al., 2000; Gad et al., 2001). Это приво-
дит к быстрому развитию апоптоза (Kessel, Luo, 1998, 1999;
Granville et al., 1998a). ФД воздействие также вызывает выход из
митохондрий других апоптогенных белков: AIF (Granville et al.,
2001а; Furre et al., 2005) и Smac/DIABLO (Usuda ct aL, 2002).
Оба способа высвобождения цитохрома с и других проапоп-
тозных белков из митохондрий: через открытые РТР и через
Вах/Bak мегаканалы могут реализоваться в фотосснсибилизиро-
ванных клетках. При этом ФД воздействие может открывать
РТР или, непосредственно воздействуя на РТР, ингибировать их
открытие.
Порфириновые фотосснсибилизаторы связываются с пери-
ферическими бензодиазепиновыми рецепторами как раз в облас-
ти РТР, и поэтому РТР являются одной из главных мишеней для
их ФД действия (Verma et al., 1987; Bclzacq et aL, 2001; Furre et
aL, 2005). Например, фотосснсибилизация клеток лейкемии
L1210 протопорфирином IX, специфически связывающимся с
PBR, эффективно индуцировала апоптоз, в отличие от двух дру-
гих протопорфиринов, сродство которых к PBR было в 20 раз
меньше (Kessel et aL, 2001). Специфические ингибиторы РТР
циклоспорин А или бонгрековая кислота предотвращали паде-
ние АТт и последующий апоптоз в клетках разных видов, фото-
сенсибилизированных вертепорфином, Рс 4 или протопорфири-
иом IX (Bclzacq et aL, 2001; Lam et aL, 2001; Furre et aL, 2005).
Однако в других работах не наблюдалось влияния этих ингиби-
торов на фотоиндуцировапное открывание РТР (Chaloupka et aL,
1999b; Kowaltovski et aL, 1999). Таким образом, митохондриаль-
ные мишени для ФД действия порфиринов пока не определены с
достаточной точностью. Для фотосенсибилизаторов, не прояв-
ляющих особого сродства к PBR, механизм фотодинамического
повреждения митохондрий может быть иным (Oleinick et al.,
2002). Транслокатор адениновых нуклеотидов ANT, входящий в
состав РТР, оказался наиболее чувствительным среди митохонд-
риальных белков к ФД действию Фотофрина (Atlantc et al., 1989;
Salet, Moreno, 1990, 1994, Salet et al., 1997) или вертепорфина
(Belzacq et al., 2001). Этот белок составляет 9—10 % от всех бел-
ков митохондрий. Его необратимое повреждение предшествова-
ло инактивации дыхательных ферментов, потере Д*Рт, сниже-
нию производства АТФ и выходу Са2" из митохондрий (Salet,
Moreno, 1990, 1994).
В ряде других работ фотоиндуцированный выход цитохрома
с из митохондрий и последующий апоптоз происходили незави-
симо от открывания РТР и падения АТт. Эти процессы контро-
лировались белками семейства Bcl-2 (Не et al., 1996; Chaloupka
et al., 1999b; Granville et al., 1999a; Zhang et al., 1999; Vaiitieghem
et al., 2001; Xue et al., 2001). Некоторые из этих белков (Bcl-2 и
Bcl-xL) выполняют антиапоптозную роль, а другие (Вах и
Bad) — проапоптозную. Сверхэкспрессия антиапоптозных бел-
ков Вс1-2 и Bcl-xL задерживала или предотвращала фотоиндуци-
рованное высвобождение цитохрома с, активацию каспаз 3 и 6, а
также белков PAR.P и DFF/ICAD, участвующих во фрагмента-
ции ДНК (Не et al., 1996; Granville et al., 1998b, 1999a; Chaloupka
et al., 1999b; Vantieghem et al., 2001). При этом повышенная экс-
прессия белка Bcl-2 нс влияла на фотоиндуцированное падение
митохондриальной разности потенциалов ДФ в клетках (Chalo-
upka et al., 1999b; Vantieghem ct al., 2001). И наоборот, снижение
уровня Bcl-2 или трансфекция клеток антисмысловой Вс1-2 РНК
способствовали апоптозу. Уровень Вах в этих клетках не изме-
нялся (Zhang et al., 1999; Srivastava et al., 2001). Клетки НТ-29 c
повышенной экспрессией белков Bcl-2 и Hsp27 вместе с пони-
женной экспрессией Вах были устойчивы к ФД воздействию
(Shen et al., 2005).
ФД воздействие на клетки А431 или MCF10A со свсрхэксп-
рессией белка Вс1-2 неожиданно усиливало апоптоз. Но оказа-
лось, что в этих клетках экспрессия проапоптозного белка Вах
была повышена настолько, что отношение Вах/Вс1-2 увеличива-
лось. Следовательно, клеточную судьбу определяет не уровень
отдельных белков Вах и Вс1-2, а соотношение между ними (Kim
et al., 1999; Srivastava et al., 2001).
С другой стороны, сам белок Bcl-2 оказался фоточувстви-
тельным. ФД воздействие, снижало его уровень в разных клет-
ках (Kim et al., 1999; Srivastava et al., 2001; Vantieghem et al.,
2002; Xue et al., 2001, 2003, 2005; Kessel, Castelli, 2001; Kessel et
al., 2002; Grebenova et. al., 2003; Usuda et al., 2003; Crescenzi et
al., 2004). Так, в клетках лейкемии LI210, сенсибилизированных
разными митохондриальными красителями, деструкция Вс1-2
обнаруживалась сразу после ФД воздействия, еще до падения
мембранного потенциала ATm (Kessel, Castelli, 2001). В клетках,
фотосенсибилизированных фталоцианином Рс 4, наблюдалась
быстрая потеря Вс1-2, тогда как уровни других митохондриаль-
ных белков: Bcl-xL, Bad, Вах, VDAC и ANT — не изменялись
(Xue et al., 2001). ФД воздействие индуцировало сшивки Вс1-2 с
другими белками. При этом оно повреждало Вс1-2 только тогда,
когда этот белок был заякорен в мембране (Xue et al., 2001; Usu-
da et aL, 2003).
Другой антиапоптозный белок Bcl-xL также препятствовал
выходу цитохрома с в цитозоль и снижал опосредованную кас-
пазой 3 активацию белка DFF, участвующего во фрагментации
ДНК в клетках, сенсибилизированных BPD-МА (Granville et aL,
1998b). Сверхэкспрессия Bcl-xL и его укороченной формы
Bcl-xLr предотвращала апоптоз фотосенсибилизированных кле-
ток лейкемии Hut-78 (Lavie et aL, 1999). В ряде случаев ФД воз-
действие снижало уровень Bcl-xL в клетках, причем воздействие
на митохондриальную фракцию белка Bcl-xL было более эффек-
тивным, чем на цитозольную (Grebenova et aL, 2003; Xue et aL,
2003, 2005).
Противоапоптозное действие белков Bcl-2 и Bcl-xL, по-види-
мому, связано с их способностью формировать гетеродимеры с
проаноптозным белком Вах. Это снижает количество молекул
Вах, образующих мегаканалы в наружной митохондриальной
мембране (Bras et aL, 2005; Jemmerson et aL, 2005). Именно отно-
шение Bax/Bcl-2(Bcl-xL) определяет про- или антиапоптозный
потенциал клетки. В фотосенсибилизированных клетках уро-
вень Вах мог повышаться (Kim et aL, 1999; Paba et aL, 2001; Sri-
vastava et aL, 2001; Crescenzi et aL, 2004), или понижаться (Gran-
ville et aL, 1999a; Kessel, Castelli, 2001; Grebenova et aL, 2003),
или оставаться неизменным (Srivastava et aL, 2001; Xue et aL,
2001). Но апоптоз усиливался тогда, когда повышалось отноше-
ние Bax/Bcl-2 (Kim et aL, 1999; Srivastava et aL, 2001).
При ФД воздействии фталоцианина Pc 4 на клетки MCF-7c3
рака молочной железы человека белок Вах перемещался из ци-
тозоля в митохондрии и вызывал выход цитохрома с. Антисмыс-
ловые нуклеотиды к гену, кодирующему белок Вах ингибирова-
ли фотоиндуцированный апоптоз. В Вах-негативных клетках
DU-145 блокировались ключевые апоптогенные процессы: вы-
ход цитохрома с, диссипация ДТт, активация каспаз, фрагмента-
ция и конденсация хроматина. Восстановление экспрессии Вах в
этих клетках восстанавливало апоптоз, т. е. в этих клетках Вах
был единственным представителем семейства белков Вс1-2, от-
ветственным за апоптоз (Chiu et al., 2003, 2005).
Фотосенсибилизация клеток гиперицином, локализующимся
в ЭР и аппарате Гольджи, быстро инактивировала кальциевый
насос эндоплазматического ретикулума (SERCA2), что повыша-
ло уровень Са2+ в цитозоле. Дальнейшая судьба этих клеток за-
висела от присутствия Вах и Вак. Когда эти белки формировали
мегаканалы в наружной митохондриальной мембране, происхо-
дил апоптоз. Если их не было, то в этих клетках развивалась
аутофагия (Buytaert et al., 2006). Аналогично, селективное ФД
воздействие на эндоплазматический ретикулум вызывало апоп-
тотичсскую или аутофагическую смерть клеток лейкемии мыши
L1210, нормально экспрессирующих Вах, а в клетках рака про-
статы DU-145, дефицитных по белку Вах, только аутофагиче-
скую смерть (Kessel et al., 2006). В фотосенсибилизированных
клетках белок Вах способствовал выходу из митохондрий не то-
лько цитохрома с, но и других проапоптозных белков: AIF
(Granville et aL, 2001b) или Smac/DIABLO (Usuda et aL, 2002).
Фотоиндуцированное ингибирование гексокиназы может
также вносить вклад в апоптоз клеток глиомы человека, фото-
сенсибилизированных гиперицином (Miccoli et aL, 1998). Этот
эффект, возможно связан со способностью гексокиназы затруд-
нять связывание Вах с митохондриями и стимулировать опосре-
дованный ANT обмен адениновых нуклеотидов, что повышает
выживаемость клеток (Vyssokikh, Brdiczka, 2003).
4. 3. Инициация апоптоза при фотосенсибилизации
плазматической мембраны
Фотосенсибилизаторы, локализующиеся в плазматической
мембране, обычно сенсибилизируют ее фотоповреждение и ин-
дуцируют некроз (Kessel et aL, 1997; Dellinger, 1997; Kessel, Luo,
1998). Но иногда ФД воздействие с их участием может приво-
дить к апоптозу. Для изучения этого явления использовали ме-
тодику исчезающих волн (evanescent waves), проникающих в
клетку на малую глубину, для селективного возбуждения бен-
гальского розового в плазматической мембране клеток эндоте-
лия аорты быка и в субмембранном слое цитоплазмы толщиной
не более 100—150 нм. Такая локализованная фотосенсибилиза-
ция вызывала апоптоз. Он, в принципе мог быть инициирован
белком Fas, связанным с мембраной (Lin et al., 2000). Однако ав-
торы отклонили это предположение, так как ФД воздействие
скорее повреждает, чем активирует мембранные белки (Davies,
2003). Скорее всего, ФД воздействие запускало какие-то не уста-
новленные сигнальные процессы, начинавшиеся в клеточной
мембране и приводящие к апоптозу.
В клетках А431В плазматическая мембрана являлась глав-
ной мишенью ФД воздействия Фотофрина, которое быстро ини-
циировало начальные апоптотические процессы: активацию
МАР киназы JNK, затем каспазы 3 и падение митохондриаль-
ного потенциала АФ|П. Однако поздние апоптотические процес-
сы, такие как перераспределение фосфатидилсерина в клеточной
мембране и фрагментация ДНК, не происходили. Вероятно,
они перекрывались некрозом, параллельно развивающимся в ре-
зультате повреждения плазматической мембраны (Hsien et al.,
2003). В клетках разных видов, фотосенсибилизированных вер-
тепорфином (Granville et al., 2001с), бенгальским розовым (Zhu-
ang et al., 1999), Pc 4 (Ahmad et al., 2000), или гиперицином
(Schempp et al., 2001), отмечена активация каспазы 8, которая
обычно стимулируется проапоптозными поверхностными ре-
цепторами Fas и TNF (tumor necrosis factor). Наблюдаемое в не-
которых работах увеличение экспрессии и Fas, и Fas лиганда по-
сле ФД воздействия на опухоль (Yokota et aL, 2000; Chen et aL,
2002) могло быть результатом межклеточных взаимодействий в
многокомпонентной опухолевой ткани. Но в опытах in vitro, где
такие взаимодействия исключались, также были отмечены по-
добные явления. Так, фотосенсибилизация культивируемых кле-
ток А431 фталоцианином Рс 4 повышала экспрессию Fas, FasL
(Fas лиганда) и FADD (адапторной молекулы для Fas), а также
вызывала мультимеризацию Fas и связывание Fas с FADD. Все
это начальные этапы «мембранного» апоптоза, приводящие к ак-
тивации каспазы 8, которая затем активирует каспазу 3 и даль-
нейшие стадии апоптоза (Ahmad et aL, 2000). В клетках карцино-
мы человека, фотосенсибилизированных гиперицином или ги-
покреллинами А или В, начальным звеном апоптоза является
экспрессия Fas и Fas лиганда (АН ct aL, 2002а, 2002b). Впослед-
ствии активируется каспаза 8, высвобождается цитохром с, ак-
тивируется каспаза 3, происходит расщепление и активация бел-
ка PARP и фрагментация ДНК. ФД действие гиперицина в клет-
ках Jurkat активировало апоптотические пути, опосредованные
каспазами 3 и 8 (Schempp et aL, 2001).
Другой проапоптозный лиганд TRAIL участвовал в актива-
ции каспазы 8 при ФД действии хлорина ATX-SlO(Na) на кера-
тиноциты. Это сопровождалось мультимеризацией Fas и выхо-
дом из митохондрий цитохрома с и AIF (Takahashi et al., 2003).
Гранвиль с соавт. (Granville et aL, 2001с) продемонстрировали
усиление апоптоза клеток Jurkat, фотосенсибилизированных
вертепорфином в присутствии FasL и/или TRAIL.
4. 4. Смерть клеток при фотодинамическом
воздействии на лизосомы
Фотодинамическое повреждение лизосом может вызвать вы-
ход в цитоплазму гидролитических ферментов, повреждение ци-
топлазматических структур и смерть клеток (Zdolsek et al., 1990).
Но все же оно не является критическим цитотоксическим собы-
тием (Christensen et aL, 1982; Santus et aL, 1983; Berg, Moan, 1994,
1997). Возможно, лизосомные гидролазы фотоинактивируются в
лизосомах еще до их выхода в цитозоль (Berg, Moan, 1994, 1997). К
тому же, они теряют активность в цитозоле при pH = 7.0—7.2
(Alberts et aL, 2002). Поэтому локализующиеся в лизосомах гид-
рофильные фотосенсибилизаторы обычно менее эффективны,
чем гидрофобные, накапливающиеся в мембранах и диффузно
окрашивающие цитоплазму. Квантовый выход вызываемой ими
фотодинамической инактивации клеток, как правило, ниже, чем
для гидрофобных сенсибилизаторов, попадающих в митохонд-
рии. Это показано на примере гематопорфиринов (Moan et aL,
1987), тетрафенилпорфинов и сульфированных фталоцианинов
(Berg et aL, 1989; Peng et aL, 1994).
Фотосенсибилизаторы, локализующиеся в лизосомах, обыч-
но индуцируют некроз, но иногда они могут вызывать апоптоз, а
иногда — смерть клеток с комбинацией свойств некроза и апоп-
тоза (Kessel et aL, 1997, 2000). Фотоповреждение лизосом приво-
дит к высвобождению из них катепсинов, протеолитических
ферментов, способных превращать прокаспазу 3 в активную
каспазу 3 (рис. 10). Катепсины также могут активировать проа-
поптотический белок Bid, отрезая от него пептидный фрагмент.
Укороченный белок tBid способствует олигомеризации белков
Вак в наружной мембране митохондрий и формированию из них
мегаканалов, через которые могут выходить цитохром с и дру-
гие проапоптозные белки (Kessel et aL, 2000; Reiners et aL, 2002;
Caruso et aL, 2004).
4. 5. Участие эндоплазматического ретикулума
и аппарата Гольджи в апоптозе, индуцированном
фотодинамическим воздействием
Эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи играют
центральную роль в синтезе и процессинге клеточных белков, а
также в поддержании ионного гомеостаза. Они участвуют и в
процессах клеточной смерти. Гидрофобные фотосенсибилизато-
ры, такие как тТНРС или гиперицин, преимущественно локали-
зуется в этих органеллах (Uzdensky et al., 2001с; Teiten et al.,
2003b). Поэтому они являются первичными мишенями их ФД
действия. Так, ультраструктурное исследование показало высо-
кую чувствительность аппарата Гольджи в изолированных нер-
вных клетках к этому действию Фотосенса, вызывающему де-
градацию комплексов Гольджи: набухание и фрагментацию цис-
терн, а также снижение общего их числа (Fedorenko, Uzdensky,
2008)
При фотосенсибилизации клеток с помощью тТНРС наблю-
дался апоптоз, происходящий по митохондриальному пути с де-
поляризацией митохондрий и выходом из них цитохрома с. Он
происходил независимо от открытия высокопроницаемых мито-
хондриальных пор (Teiten et al., 2003b). Отсутствие прямого фо-
тодинамического влияния на митохондрии подтверждалось тем,
что фотосснсибилизация нс влияла на активность ключевых
биоэнергетических ферментов — дегидрогеназ или цитохромок-
сидазы, локализованных в комплексах I, II или IV внутренней
митохондриальной мембраны (Kirveliene et al., 1997; Teiten et al.,
2003b). Как сопряжены эти пространственно удаленные процес-
сы, происходящие в разных внутриклеточных органеллах? По
предположению авторов, из фотоповрежденных цистерн ЭР и
комплекса Гольджи высвобождаются ионы Са2+, белки Bid,
Вар31, каспаза 12 и другие молекулярные стрессовые сигналы,
которые могут воздействовать на митохондрии и запускать кас-
кады, ведущие к смерти клеток.
По данным Матруля с соавт. (Matroulc et aL, 2001), в клетках,
фотосенсибилизированных метиловым эфиром пирофеофорби-
да-а, фотодинамическое повреждение аппарата Гольджи играет
важную роль в индукции апоптоза. Исследуя этот вопрос Огата
с соавт. (Ogata ct al., 2003), сенсибилизировали клетки карцино-
мы HeLa с помощью бромида 2,4,5,7-тетрабромродамина 123,
селективно локализующегося в аппарате Гольджи. Его ФД воз-
действие вызывало апоптоз, развитие которого отличалось от
апоптоза, индуцированного воздействием на митохондрии. В
нем участвовали ионы Са2, но яс каспаза 3, обычно играющая
центральную роль в митохондриальном апоптозе. При этом
фрагментация ДНК осуществлялась ДНКазой-у. Сигнальный ка-
скад, ведущий от фотоповрежденного аппарата Гольджи к ис-
полнителям такого необычного апоптоза, еще предстоит вы-
яснить.
Недавно показано, что ФД воздействие фталоцианина цинка
ZnPc, который после 3-часовой инкубации локализуется преи-
мущественно в аппарате Гольджи клеткок А-549, немедленно
активирует каспазу 2 именно в местах расположения комплек-
сов Гольджи. Через несколько минут после этого аппарат Голь-
джи начинал разрушаться, а через 6 ч развивалась типичная кар-
тина апоптоза с фрагментацией ядра (Cristobal et al., 2006). При
фотосенсибилизации клеток А431 гиперицином, который также
локализуется в аппарате Гольджи, тоже наблюдался быстро раз-
вивающийся апоптоз митохондриального типа. При этом через
5 ч после фотодинамической обработки отмечалась значитель-
ная активация каспаз 2, 3, 6 и 9, падение митохондриального
мембранного потенциала, но уровень АТР не изменялся благо-
даря активации гликолиза (Berlanda et al., 2006). Роль каспазы 2
в процессах инициации апоптоза не очень ясна. Это высоко кон-
сервативный белок, сохраняющий черты как инициаторной, так
и исполнительной каспазы. Она необходима для инициации
апоптоза при повреждении ДНК, и часто находят связь между
активацией каспазы 2 и проапоптозного белка р53, активирую-
щегося при разрывах ДНК (Zhivotovsky, Orrenius, 2005). С дру-
гой стороны, показано, что проапоптозный ганглиозид GD3,
синтезируемый в аппарате Гольджи, способствует активации
каспазы 2 (Ferri, Kroemer, 2001). Возможно, фотодинамическое
повреждение аппарата Гольджи активирует каспазу 2, а та — ис-
полнительные каспазы 3 и 6, непосредственно или с помощью
белка р53.
Глава 5
УЧАСТИЕ ПРОЦЕССОВ СИГНАЛЬНОЙ
ТРАНСДУКЦИИ В РЕАКЦИЯХ КЛЕТОК
ИА ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ
Повреждающие воздействия, такие как окислительный
стресс, не только разрушают клеточные компоненты, но и уси-
ливают экспрессию ряда сигнальных и защитных белков (Тур-
паев, 2002). В табл. 2 приведены данные о белках, активиру-
Таблица 2
Белки, активирующиеся или экспрессирующиеся
при фотодинамическом воздействии
Белок Функция Фотоссн- сибилизатор Автор
Исполнители и регуляторы апоптоза
Каспаза 2 Протеолиз ZnPc Гиперицин Cristobal et al., 2006 Berlanda et al., 2006
Каспаза 3 » Различные Много ссылок
Каспаза 6 » » To же
Каспаза 7 » » » »
Каспаза 8 » Бенгальский ро- зовый » »
Каспаза 9 » Различные » »
Вах Митохондриаль- ные мегаканалы Рс 4; Гиперицин Kim et al., 1999; Srivastava et al., 2001
Вс1-2 Предотвраще- ние апоптоза Различные Много ссылок
Bcl-xs, Bid, Bad, Bak Индукция апоп- тоза Рс 4 Srivastava et al., 2001
Таблица 2 (продолжение)
Белок Функция Фотоссн- сибнлнзатор Автор
Smac/DIABLO Индукция апоп- тоза Рс 4 Usuda et al., 2002
ICAD Ингибитор кас- паз, активирую- щих DNa3bi Вертепорфин (BPD-MA) Granville, et al., 1998b
PARP Апоптоз Различные Много ссылок
Fas и Fas лиганд TNF-a Индукция апоп- тоза Рс 4 Рс 4; тТНРС Ahmad et al., 2000 Coutier et al., 1999
р53 То же Сигназ Фотофрин и Феофорбид-п зьные белки Fisher et al., 1999; Tong et al., 2000; Hajri et al., 2002
р38 МАР киназа Различные Много ссылок
JNK, JNK1 То же » To же
ERK1/2 » » Фотофрин Рс 4 Tong et al., 2002; Xue et al., 1999a
МРК-1 (МАРК фосфатаза 1 Дефосфорили- рование ERK1/2 Фотофрин Tong et al., 2002
FAK Фокальная адге- зионная киназа Вертепорфин (BPD-MA) Carthy et al., 1999
GAP Ras-активирую- щий белок То же Granville, et al., 1998a
Фосфолипаза PLA2 Гидролиз фос- фолипидов, про- изводство ара- хидоновой кис- лоты Различные Много ссылок
Циклооксигена- за СОХ-2 Производство простагланди- нов из арахидо- новой кислоты Фотофрин Гиперицин Hendrickx et al., 2003
Кислая сфинго- миелиназа Синтез церами- да РРМЕ Matroule et al., 1999a;
Сериипальмито- илтрансфераза То же Рс 4 Dolgachev et al., 2004
NO-синтаза Производство NO Гиперицин Ali, Olivo, 2003
Akt/PKB Выживание кле- ток Бенгальский ро- зовый Zhuang, Kochevar, 2003
Таблица 2 (продолжение)
Белок Функция Фотоссн- сибилизатор Автор
PI 3-киназа Фосфорилирова- ние Akt/PKB Бенгальский ро- зовый Zhuang, Kochevar, 2003
АР-1 Фактор транс- крипции Фотофрин Kick et al., 1995; Ryter, Gomer, 1993
c-fos Компонент АР-1 Npe6 Бенгальский ро- зовый Фотофрин Luna et al., 1994; Kick et al., 1995, 1996
c-jun c-myc erg-1 То же Фотофрин » » Luna et al., 1994; Kick et al., 1995, 1996 Luna et al., 1994 To же
NF-кВ Фактор транс- крипции Различные Много ссылок
WAFl/p21 Ингибитор цик- линзависимых киназ Рс 4 Ahmad et aL, 1998; Colussi et al., 1999
Кальмодулин Са2+-зависимый модулятор бел- ков ALA-PDT Grebenova et al., 2000
Различные тиро- Фосфорилирова- Рс 4 Xue et al., 1997;
зинкиназы ние разных бел- ков BPD-MA Granville, et aL, 1998c
Структурные белки и ферменты общего метаболизма
Гликолиз Синтез АТФ AlPcS3 Oberdanner et aL, 2002; Berlanda et aL, 2006
Вар-31 Челнок между ЭР и Гольджи Вертепорфии (BPD-MA) Granville, et aL, 1998a
DNA-PKcs DNA-зависимая протеинкиназа Вертепорфии (BPD-MA) Granville, et aL, 1997
ММР-1,-3,-8, -9 Металлопротеи- наза, а Фотофрин Ferrario et aL, 2004
EMMPRIN Гемоксигеиаза Активатор ММР Защи » тные белки Фотофрин II To же Gomer et aL, 1991b
GRP-78 GRP-80 Белки, регули- Фотофрин II Gomer et aL, 1991a
GRP-94 GRP-100 руемые глюко- зой BPD-MA Curry, Levy, 1993
Таблица 2 (продолжение)
Белок Функция Фотоссн- сибилизатор Автор
Hsp-60 Митохондриаль- ный шаперонин Фотофрип II ALA-PDT Hanlon et al., 2001; Grebenova et al., 2003
Hsp-47, Hsp-70, Hsp-72, Hsp-73, Hsp-90, Hsp-110, Hsp-70 mRNA Шапероны Хлорин Npe6 SnET2 BPD-МА; МТНРС; Гиперицин Gomer et al., 1996; Curry, Levy, 1993; Paba et al., 2001
HSF-1 Фактор теплово- го стресса Npe6 Luna et al., 2000
MnSOD (но не Cii,Zn-SOD) Детоксикация о2-- Фотофрин Golab et al., 2003; Das et al., 2000
HIF-la Субъединица фактора транс- крипции HIF-1 (hypoxia- inducible factor) » Ferrario et aL, 2000
ющихся или экспрессирующихся при ФД воздействии. К ним
относятся защитные белки (шапероны, супероксиддисмутаза,
циклооксигеназа-2), белки сигнальной трансдукции и факторы
транскрипции (р38, JNK, FAK, PI 3-киназы, Akt/PKB, АР-1,
NF-кВ), белки-исполнители апоптоза (каспазы, белки семейства
Вс1-2, нуклеазы). Эти процессы контролируются регуляторной
системой клетки с участием разных сигнальных путей (Moor,
2000; Oleinick et al., 2002; Agostinis et al., 2004; Almeida et al.,
2004; Plaetzer et al., 2005; Castano et aL, 2005; Nowis et al., 2005;
Buytaert et al., 2007b; Uzdensky, 2008).
Однако начальное звено в этой цепи процессов, распознаю-
щее окислительную угрозу при интенсивной фотодинамической
продукции АФК, пока неизвестно. Логично предположить, что в
клетках имеются специальные рецепторы или сенсоры АФК
(ROS sensor) или, если они отсутствуют, клетка реагирует на об-
щее повреждение своих структур: мембран, органелл и т. д., вы-
зывающее ионный дисбаланс, нарушения энергетического мета-
болизма и деструкцию клеточных компонент.
5. 1. Есть ли в клетке сенсоры активных форм
кислорода?
Сложная реакция клеток на окислительный стресс, включающая
участие разнообразных сигнальных путей, подразумевает наличие
них специальных сенсоров АФК. Такие сенсоры должны быть:
— очень чувствительны к АФК,
— расположены вблизи повреждаемых структур,
— способны инициировать процессы, направленные на за-
щиту клетки или выполнение программы ее смерти.
Долгоживущие АФК, такие как Н2О, и О,’“, являются побоч-
ными продуктами окислительного фосфорилирования. В не-
больших количествах они производятся в митохондриях норма-
льных клеток. Но в стрессовых ситуациях, когда нарушается
электронный транспорт, их производство значительно повыша-
ется (Skulachev, 1999).
Ненасыщенные липиды очень чувствительны к окисли-
тельному повреждению, причем некоторые из них: арахидоно-
вая кислота, диацилглицерол, или церамид являются сигнальны-
ми мессенджерами. Продукты окисления ненасыщенных липи-
дов, особенно долгоживущие гидропероксиды (LOOH) или их
короткоживущие радикальные интермедиаты (L‘, LOO’, OLOO'
или OLO') могут служить неспецифическими сигналами окисли-
тельного повреждения клетки (Girotti, 1990, 2001). LOOH может
перемещаться между внутриклеточными мембранами и тем са-
мым распространять цепь окислительных процессов по всей
клетке (Girotti, Kriska, 2004). Кроме того, описаны косвенные
механизмы, связывающие перекисное окисление липидов с сиг-
нальными процессами. Так, фосфолипаза A, (PLA,) активней ра-
ботает на пероксидах, чем на нормальных липидах клеточных
мембран (Girotti, Kriska, 2004). Описано участие фосфолипаз
PLA2 и PLC в апоптозе, вызванном ФД воздействием (Agarwal
et al., 1993). Но в клетках есть различные антиоксидантные
системы, такие как липидные антиоксиданты и ферменты, осу-
ществляющие детоксикацию АФК (глутатионпероксидаза, су-
пероксиддисмутаза, каталаза), которые предотвращают или ре-
парируют окислительные повреждения. Только, когда их анти-
окислительная активность становится недостаточной для
защиты клеток, может сработать сигнальная система и вызвать
дополнительную экспрессию антиоксидантных белков, а при бо-
лее сильном повреждении, — апоптоз.
В литературе обсуждаются потенциальные кандидаты на
роль более специфических сенсоров АФК.
• У бактерий, например у Escherichia coli, обнаружены два
сигнальных белка SoxR и OxyR, неактивных в нормальных клет-
ках. OxyR активируется низкими концентрациями Н2О2, а
SoxR — радикалами О2‘" и NO’, которые индуцируют разрыв
внутримолекулярных дисульфидных мостиков. Последние вос-
станавливаются глутаредоксином, у которого дисульфидные
связи, в свою очередь, восстанавливаются глутатионом (GSH).
SoxR содержит пару железо-серных кластеров [2Fe-2S], и пред-
полагается, что именно они являются сенсорами АФК. Акти-
вированный SoxR стимулирует транскрипцию белка SoxS, яв-
ляющегося фактором транскрипции генов, которые кодируют
защитные белки: каталазу, супероксиддисмутазу, алкилгидропе-
роксидазу, глутатионредуктазу (Hidalgo et al., 1997). Такие про-
стые и элегантные АФК сенсоры пока не найдены в эукариотах,
у которых, возможно, есть более сложные сигнальные механиз-
мы (Турпаев, 2002).
• Ферменты с тиоловыми группами в активных центрах легко
инактивируются синглетным кислородом (Moan, Vistnes, 1986).
При этом они могут напрямую связывать первичное окислитель-
ное повреждение с сигнальными процессами, направленными на
защиту клетки или на запуск процессов, ведущих к ее смерти. К
числу таких белков можно отнести тирозинфосфатазу (Gabbita
et al., 2000), малые мономерные ГТФазы, такие как Ras (Finkel,
1998), и митохондриальный переносчик адениновых нуклеоти-
дов ANT (Atlante et al., 1989,1990; Salet, Moreno, 1994).
Так, ANT оказался более чувствительным к ФД воздейст-
вию, чем другие митохондриальные белки (Atlante et al., 1989;
Salet, Moreno, 1994). Фотосенсибилизация вызывала окисление
его тиоловых групп (Atlante ct al., 1990). Поскольку ANT участ-
вует в формировании высокопроницаемых митохондриальных
пор и последующем апоптозе, то не вызывает удивления, что он
может служить сенсором АФК.
В белке Ras, который связывает рецепторные тирозинкиназы
с МАРК-каскадом, цистеин 118, находящийся в активном цент-
ре, может окисляться и влиять на обмен гуаниновых нуклеоти-
дов, т. е. на активность этого сигнального белка (Finkel, 1998).
Поэтому Ras также может служить сенсором АФК.
Тирозинфосфатазы играют важную роль во внутриклеточ-
ной сигнализации. В их активном центре обычно есть высоко
консервативный цистеин (Gabita et aL, 2000). Хинсли с соавт.
(Hensley et aL, 2000) предложили схему инактивации тирозин-
фосфатазы (ТР) перекисью водорода Н2О2, в которой напрямую
образуется интермедиат TP-SOH или с помощью глутатиона
GSH образуется интермедиат TP-S-SG. Регенерация тирозин-
фосфатазы осуществляется с помощью глутатиона или тиоре-
доксина, катализирующего восстановление экспонированных
—S—S— мостиков:
TP-SH + Н2О2 TP-SOH + Н2О,
2 GSH + Н2О2 „.рутатионпероксидаза > GSSG +
TP-SOH + GSSG -> TP-S-SG + GSH,
TP-S-SG GSH’ Тиоредоксин > TP-SH.
Подобные реакции могут участвовать в инактивации тиро-
зинфосфатазы синглетным кислородом. Это продлевает сущест-
вование фосфорилированных тирозинов и соответственно удли-
няет сигнальное действие фосфорилированных ферментов.
• Тиорсдоксин — многофункциональная редокс-чувствитель-
ная дисульфидрсдуктаза — также может служить сенсором
АФК, особенно перекиси водорода. Восстановленный тиоредок-
син образует неактивный комплекс с МАР киназой киназой ки-
назой ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase 1). После окисле-
ния перекисью водорода этот комплекс разрушается и свобод-
ная ASK1 инициирует сигнальный каскад МАРК (рис. 11),
включающий МАР киназы киназы МКК 3, 4, 6 и 7, а затем МАР
киназы рЗ8 и JNK, которые в свою очередь активируют факторы
транскрипции CREB, ATF-2, c-Jun и другие (Турпаев, 2002).
Синглетный кислород 'О,, генерируемый в фотодинамиче-
ских реакциях, сдвигает баланс окислительно-восстановитель-
ных процессов в клетке. Роль тиоредоксина и связанных с ним
сигнальных путей в реакциях клеток на ФД воздействие пока не
изучены (Kochevar, 2004). Возможно, в этом пути участвует фак-
тор транскрипции NF-кВ. Показано, что окисленный тиоредок-
син активирует, а восстановленный ингибирует NF-кВ (Leg-
rand-Poels et al., 1998; Matroule, Piette, 2000; Турпаев, 2002).
• NF-кВ сам по себе может служить сенсором АФК. Известно,
что синглетный кислород и другие АФК, произведенные в фото-
динамических реакциях, могут активировать NF-кВ, стимулируя
отделение его ингибиторной субъединицы 1кВ (Finkel, 1998;
Legrand-Poels et al., 1998; Gabbita et al., 2000; Matroule, Piette,
2000).
• Внутриклеточные сенсоры кислорода, такие как фактор
транскрипции HIF-1 (hypoxia-inducible transcription factor) (Se-
menza, 2001; Турпаев, 2002), могут регистрировать быстрое
SH
SH
ASK-1
Тиоредоксинпероксидаза Z' \—S
Н,О, (TRX
•s
NADPH
Тиоредоксинредуктаза
ASK-1 + TPAF-2
MAPKKK
ASK-1
TPAF-2
ASK-1
TPAF-2
МАРКИ
МАРК
МКК-3
МКК-6
CREB ATF2
МКК-4
МКК-7
c-Jun
Факторы транскрипции
Рис: 11. Сигнальный каскад с участием МАР киназ р38 и JNK, в котором
белок ASK.-1 может служить сенсором синглетного кислорода.
Тгх — тпорсдоксин; ASK-1 — apoptosis signal-regulating kinase 1; TRAF-2 — TNF
receptor-associated factor 2; MKK-3, -4, -6, -7 •- MAP kinase kinases 3, 4, 6, 7.
(по: Турпасв, 2002).
Fig. 11. Signaling cascade with MAP kinases p38 and JNK, in which protein
ASK-1 may serve as a sensor of singlet oxygen.
Trx — thioredoxin; ASK-1 - apoptosis signal-regulating kinase 1; TRAF-2 — TNF
receptor-associated factor 2; MKK3, 4, 6 and 7 — MAP kinase kinases 3,4,6 and 7
(After Turpaev, 2002).
падение концентрации кислорода в фотосенсибилизирован-
ной клетке (Juzeniene ct al., 2006). АФК, генерируемые в ми-
тохондриях, особенно эффективно активируют HIF-1. Состоя-
ние цистеиновых остатков, участвующих в редокс-регуляции
HIF-1, регулируется тиорсдоксином. Белок HIF-1 вместе с
фактором транскрипции АР-1 контролирует клеточный метабо-
лизм, пролиферацию и выживание (Semenza, 2001; Турпасв,
2002).
• По мнению Зорова и других исследователей, сама структура
митохондрий может являться сенсором АФК (Зоров и др., 2005).
Действительно, первые ультраструктурныс изменения в фото-
сенсибилизированных нервных клетках — набухание, разруше-
ние крист и просветление матрикса обнаруживались именно в
митохондриях (Uzdensky et al., 2002а; Fedorenko, Uzdensky,
2008).
Таким образом, несмотря на ряд потенциальных возможно-
стей, пока нет указаний на существование в клетках какого-то
одного определенного сенсора АФК. Может быть, в клетках есть
несколько таких сенсоров, чувствительных к разным уровням
окислительного повреждения и располагающихся в разных кле-
точных компартментах. Наличие в клетках специальных сенсо-
ров синглетного кислорода весьма проблематично. Короткожи-
вущий синглетный кислород 'О, очень активен и быстро по-
вреждает клеточные структуры. Но в отличие от Н2ОЭ и О/",
клетки животных практически не встречают ’О2 в своей жизни
и, видимо, не нуждаются в особых сенсорах. Возможно включе-
ние многочисленных сигнальных путей в ответ на ФД воздейст-
вие опосредовано какими-то из обсуждавшихся выше сенсоров
общего окислительного повреждения клетки.
5. 2. Церамид
Сфинголипид церамид обычно синтезируется в клетках при
стрессе и апоптозе цсрамидсинтазой или производится из сфин-
гомиелина кислой или нейтральной сфингомиелиназой (СМаза).
Церамид действует как второй мессенджер в остановке клеточ-
ного цикла и запуске апоптоза при различных патологических
состояниях. Он также вызывает изменения клеточных мембран,
влияет на их слияние и разъединение, внутриклеточный везику-
лярный транспорт, образование апоптозных телец, проницае-
мость мембран и формирование ионных пор (Blittcrswijk et al.,
2003).
Апоптогспные стимулы обычно вызывают выработку цера-
мида в клетках, а ингибиторы церамида блокируют апоптоз. В
апоптозе, опосредованном церамидами, могут участвовать ми-
тохондрии. Они содержат все ферменты, необходимые для син-
теза и гидролиза церамида, включая церамидсинтазу и СМазу.
При апоптозе уровень церамида в митохондриях повышается.
Недавно была выдвинута гипотеза о том, что церамид может об-
разовывать большие и стабильные каналы в клеточных мембра-
нах, включая наружную мембрану митохондрий (Siskind, 2005).
Через эти каналы или поры из межмембранного пространства
митохондрий могут выходить проапоптозные белки. Предпо-
лагается, что размер этих каналов может быть достаточным
для прохождения белков с молекулярной массой до 60 кДа.
Для сравнения, массы цитохрома с, эндонуклеазы G, AIF и
Smac/DIABLO составляют соответственно 12, 28, 57 и 42 кДа.
ФД воздействие вызывает быструю генерацию церамида в
разных клетках. Заметное повышение уровня церамида отмеча-
лось через 1, 10 и 30 мин после фотосенсибилизации фталоциа-
нином Рс 4 клеток лейкемии человека U937, яичника китайского
хомячка СНО, лимфомы LY-R и фибросаркомы RIF-1 мыши со-
ответственно. В первых трех клеточных линиях уже через 1 ч
начинался апоптоз. Экзогенный С2-церамид вызывал подобный
апоптоз в этих клеточных линиях. Поэтому было высказано
предположение о том, что генерация церамида является сигна-
лом для начала апоптоза. Однако в клетках RIF-1, где фотосен-
сибилизация тоже приводила к продукции церамида и утрате
клоногенности, апоптоз не возникал. Следовательно, церамид
может вызывать и неапоптозную смерть клеток (Separovic et al.,
1997, 1998).
ФД воздействие Рс 4 на лимфобласты людей, больных бо-
лезнью Ниманна-Пика, у которых была только нейтральная, но
не кислая СМаза, не вызывало продукции церамида и апоптоза,
как у нормальных лимфобластов, в которых уровень церамида
существенно повышался уже через 5 мин, а апоптоз происходил
за последующие 2 ч. Это показывает участие кислой СМазы в
фотоиндуцированном апоптозе, а также то, что этот фермент яв-
ляется одной из мишеней ФД воздействия (Separovich et aL,
1999).
В клетках А431 через 10 мин после этого воздействия Рс 4
повышался уровень церамида, а еще через 30 мин активирова-
лась каспаза 3. Однако в накоплении церамида не участвовала
кислая СМаза, так как ФД воздействие не активировало, а инги-
бировало этот фермент. Ингибирование церамидсинтазы фумо-
низином В1 предотвращало фотоиндуцированнос накопление
церамида, что указывало на его синтез de novo (Nagy et al.,
2000). СМаза также не участвовала в производстве церамида и
апоптозе фибробластов эмбриона мыши, сенсибилизированных
Рс 4 (Chiu et al., 2000). Этот фермент обычно располагается в ли-
зосомах, не являющихся мишенями для ФД воздействия Рс 4.
Напротив, в клетках НСТ-116 фотосенсибилизатор РММЕ (ру-
ropheophordide-д methyl ester), также локализующийся в лизосо-
мах, стимулировал СМазу. Производящий его церамид затем ак-
тивировал NF-kB (Matroule ct al., 1999a).
Пока не известно, на какие компоненты клетки влияет це-
рамид. Одни авторы предполагают, что он может действовать на
сигнальный путь JNK/SAPK и некоторые фосфатазы и протеин-
киназы, например на протеинкиназу РКС £ (Separovic et al.,
1998, 1999). В других работах ближний ультрафиолет (UVA)
или фотосенсибилизация клеток бенгальским розовым повыша-
ли уровень церамида и одновременно фосфорилировали проти-
воапоптозные киназы ERK1/2 и Akt, но не р38. Фотоактивация
Akt зависела от фосфатидилинозитол 3-киназы и приводила к
фосфорилированию и ингибированию противоапоптозной кина-
зы гликогенсинтетазы 3 (GSK.3). ФД воздействие также предот-
вращало активацию этих протеинкиназ, индуцированную факто-
рами роста PDGF или EGF. Было высказано предположение о
том, что фотогенерированные церамиды активируют серин/тре-
онин фосфатазы, а тс дефосфорилируют ранее фосфорилирован-
ные ERK 1/2 и Akt (Schieke et al., 2004).
5. 3. Ионы кальция
5. 3. 1. Фотодинамическое нарушение
кальциевого гомеостаза
Ионы кальция играют исключительную роль в регуляции
многочисленных клеточных процессов. Са2т является вторым
мессенджером в системе сигнальной трансдукции и интегрирует
различные сигнальные пути (рис. 12). В клетках одновременно
работают различные системы поддержания уровня ионов каль-
ция в цитозоле, [Са2+]; (рис. 13).
Внутриклеточная концентрация ионов Са2+ может повы-
шаться вследствие их проникновения в клетку через потенциал-
зависимые или рецспторуправляемые кальциевые каналы в
плазматической мембране. Кроме того, Са2+ может обменивать-
ся на внутриклеточный Na1-. Другой способ повышения уровня
Са2+ в цитозоле — высвобождение его из внутриклеточных де-
по: митохондрий и ЭР. Из ЭР Са2т выходит через каналы, обра-
зованные рецепторами 1,4,5-инозитолтрифосфата (IP3R) или
рианодина (RyR). Выход Са2+ из митохондрий происходит в ре-
зультате открытия митохондриальных пор или разрыва внутрен-
ней митохондриальной мембраны. Возможен также обмен депо-
нированного Са2+ на цитоплазматические ионы Н+ или Na+. При
этом небольшое повышение концентрации Са2+ в цитозоле мо-
жет вызвать массивный выброс Са2+ из эндоплазматического ре-
тикулума (Ca2+-induced Са2+ release, CICR) или стимулировать
открытие митохондриальных пор.
Также существует несколько путей снижения [Ca2+]j (рис. 13).
Ионы Са2+ могут выкачиваться из цитозоля кальциевым насосом
РМСА (plasma membrane Ca2+-ATPase) через плазматическую
Рис. 12. Важнейшие пути Са2+-завнсимой регуляции выживания клеток,
пролиферации и апоптоза (по: Anis, 2006, модифицировано).
Fig. 12. Main pathways of Ca2+-dependent regulation of cell survival, prolife-
ration and apoptosis (After Anis, 2006, modified).
мембрану или закачиваться в цистерны эндоплазматического ре-
тикулума с помощью другой Са2“-АТРазы SERCA (sarcoplasmic
endoplasmic reticulum calcium ATPase). Также они могут накап-
ливаться в митохондриях кальциевым унипортсром (Pozzan ct
al., 1994; Meldolessi, 2001; Vcrkhratsky, 2002).
Повышение уровня Ca2^ в цитозоле может индуцировать как
пролиферацию клеток, так и некроз или апоптоз (Trump, Веге-
zesky, 1998; Orrenius et al., 2003; Anis, 2006). Поны Ca2+ активи-
руют целый ряд гидролитических ферментов: протеиназ нукле-
аз, и фосфолипаз. Это вызывает открытие РТР и последующее
высвобождение из митохондрий цитохрома с, активирующего
каскад каспаз и эндонуклеаз, выполняющих программу апоптоза
(Granville et al., 2001а). К числу сигнальных белков, активируе-
мых ионами кальция, относятся факторы транскрипции ATF и
ELk, МАР киназа JNK, протеинфосфатаза 2В (кальцинейрин) и
тирозинкиназа ААТуК. С другой стороны, регулируемые иона-
[P3R - - рецепторы пнозптолтрифосфата, I’MCA — кальциевая ЛТРаза плазмати-
ческой мембраны, РТР — митохондриальные высокопронпцаемые поры, RAM —
быстрый транспорт ионов кальция в митохондрии, RyR — рианодиновые рецепто-
ры, SERCA — кальциевая ЛТРаза эндоплазматического ретикулума, ЭР— эндоп-
лазматический ретикулум.
Fig. 13. Maintaining of Са2* homeostasis in cells.
IP3R — inositol triphospate receptors, PMCA — the plasma membrane calcium ATPa-
se, PTP - mitochondrial permeability transition pores, RAM — rapid transport of Ca2+
in mitochondria, RyR — ryanodine receptors, SERCA — endoplasmic reticulum calci-
um ATPase, ЭР -- endoplasmic reticulum.
ми Ca24 сигнальные пути с участием NF-(B, кальмодулина и ка-
льмодулин-зависимых киназ II и IV обычно поддерживают вы-
живаемость клеток (рис. 12).
В последнее время накапливаются данные о связи между
концентрацией кальция в цитозоле и уровнем активных форм
кислорода в клетках. С одной стороны, Са2" может стимулиро-
вать образование АФК в дыхательной цепи митохондрий, с дру-
гой — генерация АФК вызывает увеличение [Ca2*]i (Гордеева и
др., 2003). АФК влияют и на кальций-зависимые процессы. Так,
DiChiara и Reinhart (1997) сообщили об ингибировании Са2+-за-
висимых К"-каиалов перекисью водорода.
ФД воздействие быстро повышает уровень Са2+ в цитозоле .
Обычно за быстрым скачком следует фаза медленного, но про-
должительного повышения [Са2+]( (Ben-Hur et al., 1991, 1993;
Yonuschot, 1991; Specht, Rogers, 1991; Tajiri et al., 1998; Ruck
et al., 2000; Granville et al., 2001a; Ding et al., 2004; Kessel et al.,
2005; Hendrickx et al., 2005). Эти процессы зависят от внутри-
клеточного распределения фотосснсибилизатора. Гидрофоб-
ные красители высвобождают Са2+ главным образом из внутри-
клеточных органелл: митохондрий и/или эндоплазматического
ретикулума (Agarwal et al, 1993; Dellinger et al., 1994; Hubmcr et
al, 1996; Morgan et aL, 1998; Granville et aL, 2001b; Ogata et aL,
2003; Mak et aL, 2004; Kessel et aL, 2005). Так, фотосенсибилиза-
ция митохондрий липофильными фотосенсибилизаторами
Zn-BC-AM (Mak et aL, 2004) или производным порфицена (Kes-
sel et aL, 2005), избирательно локализующимися в ЭР и аппарате
Гольджи вызывала выход Са2+ и апоптоз. При селективном ФД
воздействии на аппарат Гольджи, с помощью фотосснсибилиза-
тора TBR также происходил выход ионов Са2+ в цитозоль, но по-
следующий апоптоз происходил нс зависимым от каспаз путем
(Ogata et aL, 2003).
Поскольку кальциевые каналы различных видов слабо влия-
ли или совсем не влияли на фотоиндуцированнос повышение
[Ca2+]i, то предполагается, что гидрофильные сенсибилизаторы,
адсорбированные на плазматической мембране, способствуют
входу Са2+ не через кальциевые каналы, а скорее через дефекты
в плазматической мембране (Specht, Rogers, 1991; Humber et aL,
1996; Valenzeno, Tarr, 2001). Предполагается, что быстрое, но
кратковременное повышение [Ca2+]j может быть результатом
входа ионов через клеточную мембрану, а более продолжитель-
ное и стабильное — выхода Са2+ из ЭР и митохондрий (Humber
et aL, 1996; Ricchelli et aL, 1999).
Повышению [Ca2+]i также способствует фотодинамическое
повреждение кальциевых насосов с последующим нарушением
депонирования Са2+ в эндоплазматическом ретикулуме (Kondo,
Kassai, 1974; Dellinger et aL, 1994; Ricchelli et aL, 1999; Granville et aL,
2001a). Так, по данным Гранвилля с соавт. (Granville et aL, 2001b),
в клетках, фотосенсибилизированных липофильным вертепор-
фином, нарушалось нс высвобождение кальция из эндоплазма-
тического ретикулума, а его аккумуляция в цистернах ретикулума.
Наиболее чувствительной к ФД действию вертепорфина была
Са2+-АТФаза SERCA-2, нечувствительная к действию каспаз.
Активация фосфолипазы С с последующим расщеплением
мембранных фосфоинозитидов и активацией инозитолтри-
фосфат-управляемых кальциевых каналов также может привес-
ти к выбросу Са2+ из эндоплазматического ретикулума (Agarwal
et aL, 1993).
Митохондрии накапливают большое количество кальция, ко-
торый может высвобождаться при их повреждении (Pozzan et aL,
1994). Фотосснсибилизация по-разному влияет на эти процессы.
Так, ФД воздействие тТНРС ингибировало поглощение Са2+
изолированными митохондриями вследствие повреждения каль-
циевого унипортера (Klein et al., 1997). Кратковременная фото-
сенсибилизация изолированных митохондрий гематопорфири-
ном в течение 1 мин инактивировала ANT и предотвращала от-
крывание РТР, через которые может выбрасываться Са2*. Эти
митохондрии сохраняли мембранный потенциал и способ-
ность накапливать Са24 (Salet et al., 1997). Фотосенсибилизато-
ры, локализующиеся в местах, отличных от PBR, например
4,5',8-триметилпсорален, вызывали открывание РТР. Но удиви-
тельно, что это не влияло на митохондриальный транспорт элек-
тронов и окислительное фосфорилирование (Moreno et al., 2001).
Кальциевый унипортср, ответственный за поглощение кальция
митохондриями, менее чувствителен к ФД воздействию, чем
Са2т-АТФаза эндоплазматического ретикулума SERCA (Dellin-
ger et al., 1994).
5. 3. 2. Роль Са2+ в фотоиидуцировапной смерти клеток
Есть разные мнения о роли свободного Са2+ в фотосенсиби-
лизированных клетках. По некоторым данным, Са2+ участвует в
защите клеток (Penning et al., 1992; Ben-Hur, Dubbelman, 1993;
Humber et al., 1996; Zheng et al., 2006). Так, защитная роль Ca2+ в
клетках карциномы Т24 связана с активацией циклооксигеназы
и последующим высвобождением простагландина Е2 (Penning
et aL, 1993b). Другой защитный механизм, описанный в работе
Зента с соавт. (Zheng et aL, 2006) для клеток рака толстой кишки
SW480, сенсибилизированных ALA, связан с активацией ERK-
зависимого пути. Однако, по мнению большинства авторов, фо-
тоиндуцированное повышение [Са24Д влечет за собой смерть
клеток (Agarwal et aL, 1993; Dellinger et aL, 1994; Morgan ct aL,
1998; Tajiri et aL, 1998; Inanami ct aL, 1999; Ruck et aL, 2000; Va-
lenzeno, Tarr, 2001; Ogata et aL, 2003; Ding et aL, 2004; Mak et aL,
2004; Kessel ct aL, 2005; Hcndrickx et aL, 2005). Ca2+ может ин-
дуцировать как каспазозависимый (Ding et aL, 2004; Mak
et aL, 2004), так и каспазонезависимый (Ogata et aL, 2003) пути
апоптоза
В клетках HL60, подвергнутых ФД воздействию ALA, Са2+
одновременно участвовал в клеточных процессах, которые ве-
дут к смерти и в защитных процессах. В этих клетках наблюдал-
ся типичный митохондриальный апоптоз с быстрой диссипа-
цией ATm, выходом в цитозоль цитохрома с, активацией каспаз
9 и 3, расщеплением PARP и фрагментацией ДНК. Однако инги-
бирование каспаз 3 и 9, а также Са2т-зависимой протеазы каль-
паипа нс предотвращало апоптотичсской фрагментации ДНК,
что указывало на участие альтернативных проапоптозных путей.
В этих клетках синтезированный из ALA протопорфирин IX пе-
рераспределялся из митохондрий, где он вырабатывался, в ЭР и
вообще по всей клетке. В ЭР снижался уровень противоапоптоз-
ных белков Вс1-2 и Bcl-xL, Са2+-связывающих шаперонов ERp57
и ERp72, а также протеиндисульфидизомеразы р55. Это могло
приводить к снижению связывания Са2+ в ЭР и стимуляции его
выхода в цитозоль. В цитозоле повышался уровень кальмодули-
на и шапсронина Hsp60. Комплекс Са2+/кальмодулин активиро-
вал кальпаин, который затем стимулировал каспазу 3 и дальней-
шие процессы, ведущие к апоптозу. Одновременно кальций ак-
тивировал эндонуклеазу G, расщепляющую ДНК независимо от
каспазы 3 (Grebenova et al., 2003).
Эндоплазматический ретикулум также был вовлечен в апоп-
тоз клеток HeLa, фотосенсибилизированных вертепорфином.
Фотодеградация SERCA2, кальциевого насоса ЭР, приводила к
накоплению Са2+ в цитозоле. Это вызывало активацию протсин-
фосфатазы кальцинейрина, дсфосфорилированис белка Bad,
инактивацию Bcl-xL и в конце — апоптоз (Granville et al., 2001а).
Фотодинамическое повреждение SERCA2 и последующее на-
копление Са2+ в цитозоле при фотосенсибилизации клеток гипе-
рицином вызывало быстрый Вах/Вак-зависимый апоптоз с поте-
рей митохондриального потенциала выходом в цитозоль
цитохрома с, активацией каспазы 3 и расщеплением PARP.
Клетки, не имеющие белков Вах и Вак, погибали от каспазонеза-
висимой аутофагии (Buytacrt et al., 2006).
Повышение [Ca2l_]. при ФД воздействии модулирует разно-
образные клеточные функции, например нейронную активность
(см. ниже) или мышечное сокращение (Matthews, Mesler, 1983).
Интересно, что быстрая стимуляция мышечного сокращения бы-
ла опосредована фотоиндуцированным выходом Са2+ из сарко-
плазматического ретикулума (Stuart et al., 1992), а длительное
сокращение, контрактура гладкой мускулатуры кровеносных
сосудов, — повышением кальциевой проницаемости сарко-
плазматической мембраны, скорее чем выходом кальция из ре-
тикулума.
5. 4. Фосфолипазы А2 и С
Фосфолипазы осуществляют деградацию разных типов фос-
фолипидов и при этом вырабатывают различные вторые мессен-
джеры. Фосфолипаза A, (PLA,) активируется ионами Са2+, про-
теинкиназой С и МАРК. Она производит арахидоновую кисло-
ту, из которой затем получаются разнообразные паракринные
регуляторы, например простагландины или тромбоксаны (Sun
et al., 2004). Арахидоновая кислота также участвует в запуске
апоптоза. Фосфолипаза С (PLC) регулируется внеклеточными
сигналами, распознаваемыми рецепторами, связанными с G-бел-
ками или рецепторными тирозинкиназами. Расщепляя мембран-
ные фосфолипиды, фосфатидилинозитол-специфичная фосфо-
липаза С (PI-PLC) производит два вида вторых мессенджеров:
инозитолтрифосфат (1Р3), стимулирующий высвобождение Са2+
из ЭР, и диацилглицерол (DAG), активирующий протеинкиназу
С (Cockroft, 2006). Фосфолипазы также разрушают мембранные
липиды, нарушают функции плазматической мембраны, способ-
ствуют утечке ионов и в итоге приводят к некрозу.
ФД воздействие быстро активировало PI-PLC в клетках лим-
фомы мыши. В результате уже за 15—20 с повышался внутри-
клеточный уровень инозитолтрифосфата. Последующее повы-
шение [Ca2+]j достигало максимума уже через 30—60 с после на-
чала облучения. Ингибирование P1-PLC с помощью U73122
снижало высвобождение 1Р3, и повышение уровня Са2+ в цитозо-
ле. В свою очередь Са2+ активировал фосфолипазу А,, произво-
дящую арахидоновую кислоту, которая принимает участие в
апоптозе. Ингибирование PLA блокировало апоптоз (Agarval et
al., 1993; Hendrickx et al., 2005). В клетках карциномы T24, сен-
сибилизированных HpD (Penning et al., 1993b), или в дольках
поджелудочной железы, сенсибилизированных алюмофталоциа-
нином AlPcS (Al-Laith ct al., 1993), PLA, участвовала в произ-
водстве простагландина Е, из арахидоновой кислоты. Фосфоли-
пазы также участвовали в фотодинамической инактивации гена
c-foc (Luna et al., 1994).
5. 5. Кальмодулин и кальмодулинзависимая
киназа II
Кальмодулин (СаМ) и кальмодулинзависимые киназы I, II и
IV (CaMKI, СаМКИ и CaMKIV), вместе или порознь, контроли-
руют многочисленные клеточные процессы, включая метабо-
лизм циклических нуклеотидов, ионный транспорт, перестройки
цитоскелета, активацию разнообразных протсинкиназ и фосфа-
таз (рис. 12). СаМ и СаМКП — изобильные клеточные белки,
составляющие порядка 1 и 2 % от всех клеточных белков соот-
ветственно. Они «декодируют» кальциевую информацию в клет-
ках. В ответ на повышение [Са2+]юни по-разному влияют на кле-
точный метаболизм и экспрессию некоторых генов. Это особен-
но выражено в нервной системе (Colbran, 2004; Zhang et al.,
2004).
Но несмотря на значительные изменения уровня [Са2+]: и
важность для клеток этого сигнального пути, роль СаМ и СаМК
в реакциях клеток на ФД воздействие практически нс изуче-
на. Только Гребенова с соавт. (Grebenova et aL, 2003) сообщили
о повышении уровня СаМ в клетках HL60, подвергнутых
ALA-PDT, что могло указывать на защитную роль СаМ в этих
клетках. Недавно было показано, что СаМКП и CaMKIV участ-
вуют в защите клеток рака молочной железы MCf-7 от окисли-
тельного стресса, вызванного перекисью водорода, доксору-
бицином, ионизирующей радиацией или ФД воздействием (Rod-
riguez-Mora et al., 2006).
5. 6. Протеинкиназа С
Протеинкиназа С — один из центральных регуляторов в сиг-
нальной системе клетки. После активации ионами Са2+ и диа-
цилглицеролом она фосфорилирует и регулирует множество
белков, контролирующих жизнедеятельность и выживаемость
клеток, включая ферменты, факторы транскрипции, ионные ка-
налы и белки цитоскелета (Newton, Johnson, 1998; Gopalakrishna,
Jaken, 2000).
Данные литературы о роли протеинкиназы С в фотоиндуци-
рованной смерти клеток противоречивы. Возможно, это связано
с ее участием в самых разнообразных сигнальных процессах.
Так, активация протеинкиназы С форболовым эфиром ТРА спо-
собствовала в потере клоногенной активности клеток СНО, фо-
тосенсибилизированных алюмофталоцианином, тогда как ее ин-
гибитор Н7 защищал эти клетки (Rasch et al., 1997). Протеинки-
наза С также участвовала в фотоинактивации нейронов и
апоптозе глиальных клеток, но при этом защищала глиальные
клетки от некроза, вызванного ФД действием алюмофталоциа-
нина Фотосенса (Bragin et al., 2003; Uzdensky et al., 2007, cm.
17.2.2).
Защитное, антиапоптозное действие протеинкиназы С про-
демонстрировано во многих работах. Разные ее ингибиторы —
калфостин С, гиперицин, стауроспорин, тамоксифен или Н7 —
усиливали фотоиндуцированный апоптоз клеток (Luo, Kessel,
1996; Weller et al., 1997; Fox et al., 1998; Zhuang et aL, 1998; Beck
et al., 1999, Jiang et al., 2002). Некоторые из них, гиперицин и
калфостин С, были сами фоточувствительны (Bums et aL, 1991).
Они одновременно действовали как фотосенсибилизаторы и как
ингибиторы протеинкиназы С. Освещение резко усиливало их
способность ингибировать протеинкиназу С, а также антипроли-
феративную и проапоптозную активность (Gopalakrishna et aL,
1993; Utsumi et aL, 1995; Pollack, Kawccki, 1997; Weller ct aL,
1997; Fox et aL, 1998; Vantieghem et aL, 1998; Beck ct aL, 1999).
Используя эту способность гиперицина или калфостина С, уда-
лось избирательно воздействовать на злокачественные клетки
глиомы, в которых уровень протеинкиназы С был гораздо выше,
чем в нормальных глиальных клетках (Pollack, Kawecki, 1997). В
последнее время гиперицин используется для фотодинамиче-
ской терапии некоторых видов рака (Agostinis et aL, 2002; Mis-
kowsky, 2002). Апоптоз, вызванный его ФД действием, может
быть связан с фотоинактивацией протеинкиназы С и других кле-
точных мишеней. Протеинкиназа С также участвовала в предот-
вращении фотодеструкции плазматической мембраны эритроци-
тов, ведущей к некрозу; се ингибирование хлорпромазином уси-
ливало фотогемолиз (Varshney, Jain, 1998).
Главная проблема в понимании роли протеинкиназы С, как и
других сигнальных белков, в фотоповреждении клеток заключа-
ется в том, что, как правило, неизвестны все эффекторные белки,
активируемые этими протеинкиназами в разных типах клеток.
Поэтому ценны всякие сведения такого рода. Так, показано, что
протеинкиназа С фосфорилирует и активирует противоапоптоз-
ный белок Вс1-2, что может быть одним из механизмов ее проти-
воапоптозной активности (Zhuang ct aL, 1998).
Интересны двойственные эффекты регулирования РКС и
связанных с ней сигнальных процессов. Так, с одной стороны,
РКС активируется ионами Са2+, а с другой, она сама фосфорили-
рует кальциевые каналы в плазматической мембране и таким об-
разом активирует вход Са2+ в клетку (Bartschat, Rhodes, 1995).
Здесь в каналы управления клеточными процессами включены
петли обратной связи.
Фотосенсибилизация клеток фотофрином вызывает кратко-
временную экспрессию гена раннего ответа c-fos. Поскольку
этот эффект ослаблялся ингибиторами РКС стауроспорином
и Н7, но не НА-1004, ингибитором протеинкиназы А, или пен-
токсифиллином, ингибитором фосфодиэстеразы, то предполага-
лось участие РКС в активации c-fos, но не сАМР-зависимого
сигнального пути (Luna et al., 1994). В недавней работе показано
участие РКСа в фотодинамической активации фактора транс-
крипции NF-кВ и последующем повышении экспрессии цикло-
оксигеназы-2 в некоторых, но не всех раковых клетках (Volanti
et aL, 2005).
Таким образом, протеинкиназа С управляет многими важ-
ными сигнальными процессами в фотосенсибилизированных
клетках.
5. 7. сАМР-зависимый сигнальный путь
Циклический адснозинмонофосфат (сАМР) синтезируется
аденилатциклазой в ответ на связывание межклеточных молеку-
лярных сигналов (нейромедиаторов, гормонов) с рецепторами,
связанными с G-белками (RCGP). сАМР активирует протеинки-
назу А, которая в свою очередь фосфорилирует и активирует
разнообразные исполнительные белки в клетке. Этот путь обыч-
но участвует в защите клеток от повреждений, индуцированных
внешними воздействиями (Kebabyan, 1992; Michel, Agid, 1996).
Его участие в клеточных реакциях на ФД воздействие пока
не очень хорошо изучено. Как показали Псннинг с соавт. (Pen-
ning et al., 1993а), фотосенсибилизация клеток карциномы моче-
вого пузыря человека Т24 кратковременно повышала внутрикле-
точный уровень сАМР дозозависимым образом с возвращением
к исходному уровню в течение двух часов после облучения.
Простагландин Е, который стимулирует RCGP, как и активатор
аденилатциклазы форсколин или 8’-бром-сАМР, аналог сАМР,
снижали фотоцитотоксичность. Напротив, индометацин, ин-
гибитор циклооксигеназы, производящей простагландин Е из
арахидоновой кислоты, резко снижал производство сАМР и уси-
ливал ФД воздействие. Авторы предположили, что последнее
сначала повышает уровень ионов кальция в цитозоле. Кальций
стимулирует фосфолипазу А2, а та производит арахидоновую
кислоту, из которой циклооксигеназа синтезирует простаглан-
дин Е2. Последний связывается с RCGP, и G-белок стимулирует
аденилатциклазу. Произведенный сю сАМР активирует сигналь-
ный каскад, направленный на защиту клеток. Аналогично, акти-
вация аденилатциклазы форсколином предотвращала фотоинду-
цированный апоптоз клеток китайского хомячка V79, фотосен-
сибилизированных феофорбидом а и клеток меланомы В16,
фотосенсибилизированных тТНРС (Inanami et al., 1999; Thibaut
et al., 2002). Форсколин ингибировал активацию каспазы 3, но
не выход цитохрома с из митохондрий. Следовательно, сАМР
ингибировал апоптозный путь где-то между высвобождением
цитохрома с и активацией каспазы 3. По предположению авто-
ров, протеинкиназа А регулировала активацию каспазы 3 (Inana-
mi ct al., 1999).
Данные о роли адснилатциклазы, протеинкиназы А и фосфо-
диэстеразы в фотодинамической инактивации, смерти нейронов
и глиальных клеток приведены ниже (Uzdensky et al., 2005,
2007).
5. 8. Тирозинкиназы
Рецепторные тирозинкиназы, распознающие внеклеточные
сигнальные молекулы, такие как цитокины и факторы роста,
инициируют три важнейших сигнальных пути, связанных с
МАР киназами, фосфолипазой С, и фосфатидилинозитол 3-ки-
назой, которые регулируют клеточные реакции на стресс, выжи-
ваемость клеток и поддерживают целостность тканей (рис. 9).
ФД воздействие может непосредственно повреждать рецепторы
клеточной поверхности. После адсорбции на клеточной мембра-
не или растворения в липидном бислое молекулы фотосенсиби-
лизатора оказываются вблизи от рецепторных белков и могут
эффективно повлиять на них. Это ослабляет межклеточные сиг-
нальные взаимодействия.
Фотосенсибилизация клеток порфиринами или феофорби-
дом а значительно ингибировала связывание цитокинов (TNF-a,
IL-8, EGF) с рецепторами или моноклональных антител — с по-
верхностными антигенами. Этот эффект был специфичен для
разных рецепторов, цитокинов или антител. При этом оказалось,
что безметалльные тетрапирролы (гемато- мезо- и протопор-
фирин IX, феофорбид а) более фотоактивны, чем металлосо-
держащие, возможно, вследствие разной локализации в мембра-
не (Glinski et al., 1995). Фотосенсибилизация препаратов клеточ-
ных мембран гиперицином сильно и необратимо ингибировала
тирозинкиназную активность инсулиновых и EGF рецепторов,
тогда как цитозольные тирозинкиназы Lyn, Fgr, ТРК-ПВ и CSK
оставались интактными (De Witte et al., 1993; Agostinis et al.,
1996).
В фибробластах мыши NIH ЗТЗ ФД воздействие бенгальско-
го розового, который в первую очередь фотосенсибилизирует
плазматическую мембрану, ингибировало тирозинкиназную ак-
тивность рецептора PDGF (platelet-derived growth factor). При
связывании PDGF, как и обычно, формировались димеры этих
рецепторов, но их аутофосфорилирование или фосфорилирова-
ние субстратов нс происходило, возможно, из-за поперечных
сшивок в этих белках (Zhuang, Kochevar, 2003). Фотосенсибили-
зация бенгальским розовым В фибробластов человека предот-
вращала активацию сигнальных белков ERK1/2 и Akt, опосредо-
ванную EGF. Этот эффект мог быть связан не с прямым ФД воз-
действием на EGF рецептор, а скорее, с фотогенерацией
церамида, активацией Ser/Thr фосфатазы и последующим сни-
жением фосфорилирования EGF (Schicke et al., 2004).
ФД воздействие ALA или Фотофрина приводило к утрате
чувствительности клеток различных видов рака эпителия, а так-
же нормальных эпителиальных клеток к EGF и интерлейкину 6,
вероятно, вследствие деградации рецепторных и сигнальных
белков (Wong et al., 2003). В эпителиальных клетках FaDu ФД
воздействие ALA вызывало следующие эффекты:
1) структурные модификации и потерю рецепторов EGF;
2) поперечные сшивки некоторых белков, в частности STAT
(signal transducer and activator of transcription);
3) дефосфорилирование фосфотирозинов в белках;
4) ингибирование протеинфосфатаз;
5) стимуляцию сигнального пути, опосредованного JNK.
В результате терялась чувствительность этих клеток к интер-
лейкину 6 и онкостатину М (Liu et al., 2004). Фотосенсибилиза-
ция клеток с помощью фталоцианина Рс 4 снижала экспрессию
и фосфорилирование рецептора EGF и адапторного белка She
(Ahmad et al., 2001).
Таким образом, в результате ФД воздействия происходило
нарушение межклеточных взаимодействий. Клетки теряли чув-
ствительность к внеклеточным молекулярным сигналам, регули-
рующим их функции и выживаемость.
5. 9. МАР киназы
МАР киназы (mitogen-activated protein kinase, МАРК) участ-
вуют в реакциях клеток на разные физико-химические воздейст-
вия, включая гормоны, цитокины, окислительный стресс, ульт-
рафиолетовое и ионизирующее излучение. МАРК представляет
собой семейство серин/треонин протеинкиназ, регулирующих
экспрессию генов, метаболизм, подвижность, деление и смерть
клеток. Их функции и структура основных компонентов эволю-
ционно консервативны (Gobb, 2001; Kiriakis, Avruch, 2001; John-
son, Lapadat, 2002).
В состав этого семейства входят три МАР киназы ERK, JNK
и р38 (рис. 9). ERK (cxtracellularly regulated kinase) стимулируе-
мая факторами роста, цитокинами и другими химическими сиг-
налами, регулирует пролиферацию клеток и различные постми-
тотические процессы. Известны две основные изоформы этого
белка: ERK1 и ERK2. К их мишеням относятся такие протеинки-
назы, как МАРКАР-К1, MNK, или MSK и некоторые факторы
транскрипции, например Elk-1. Другие МАР киназы, JNK и р38,
активируются в ответ на стрессовые воздействия, такие как
ионизирующая радиация или окислительный стресс, а также на
факторы роста и воспалительные цитокины. Известны три изо-
формы JNK: JNK1, JNK2 и JNK3. Они фосфорилируют белок
c-Jun, который вместе с белком c-Fos образуют фактор транс-
крипции АР-1, контролирующий экспрессию многих генов, уча-
ствующих в реакциях клеток на стресс. Они контролируют и
другие факторы транскрипции, например, ATF2 или Elk-1. JNK
играет важную роль в апоптозе и канцерогенезе (Kiriakis, Av-
ruch, 2001; Johnson, Lapadat, 2002). Известны также четыре изо-
формы МАР киназы р38: р38а, р380, р38у и р385. Они также
фосфорилируют ряд факторов транскрипции (ATF-2, Elk-1,
МАХ и CREB) и протеинкиназ (MSK и МАРКАР-К2). Протеин-
киназы JNK и р38 фосфорилируются и активируются белками
МАРКК (МЕК 3, 4, 6 и 7) и МАРККК (ASK1 и TRAF). ASK1
может также служить сенсором АФК.
5. 9. 1. ERK
Данные о роли ERK в клеточных реакциях на ФД воздейст-
вие противоречивы. Так, в кератиноцитах мыши фотосенсиби-
лизированных BPD МА (Tao ct al., 1996) или в фибробластах че-
ловека, фотосенсибилизированных бенгальским розовым (Klotz
et al., 1998) не наблюдалось изменений активности ERK. В дру-
гих работах ФД воздействие ингибировало ERK.
Как показано группой П. Агостинис (Р. Agostinis), фотосен-
сибилизация клеток гиперицином сильно и необратимо инги-
бировала ERK2 (Assefa et al., 1999; Vantieghem et al., 2002). ФД
действие бенгальского розового снижало степень фосфорилиро-
вания и активацию ERK1/2, что авторы связывают с фотогенера-
цией церамидов и последующей активацией серин/треонин про-
теинфосфатаз РР1 или РР2 (Schieke et al., 2004).
Инкубация клеток китайского хомячка СНО, но не клеток
лимфомы LY-R с фталоцианином Рс 4 вызывала слабую и крат-
ковременную активацию ERK2. При умеренном облучении
(3 кДж/см2) исходный уровень восстанавливался, но более силь-
ное воздействие (6.5 кДж/см2) вызывало полное угнетение фер-
мента. По мнению авторов, ранняя активация ERK2 в клетках
СНО, но не LY-R способствовала фотоиндуцированному апоп-
тозу (Xue et al., 1999b). Тонг с соавт. (Tong et al., 2002) сравнили
фотодинамическую активацию ERK1/2 в клетках, чувствитель-
ных (GM38A) или устойчивых (LFS087) к фотосенсибилизации
Фотофрином. В клетках GM38A активация ERK1/2 длилась все-
го 3 ч, а в клетках LFS087 — более 11 ч. Уровень белка Raf, од-
ного из компонентов сигнальной цепи между рецепторными ти-
розинкиназами и МАРК, был в этих клетках понижен, т. с. акти-
вация ERK1/2 происходила независимо от Raf. Возможно,
продолжительность активации ERK1/2 регулировалась фосфата-
зой МКР-1, дефосфорилирующей ERK. Ингибитор МЕК киназ
PD98059 подавлял фотоактивацию ERK1/2, т. е. в активации
ERK1/2 в фотосенсибилизированных клетках участвовала про-
теинкиназа МЕК. Совместное действие PD98059 и фотосенсиби-
лизации значительно усиливало фотодинамическое поврежде-
ние клеток LFS087, что предполагает защитную роль каскада
MEK/ERK. Однако неясно, каким образом ФД воздействие акти-
вирует сигнальный путь MEK/ERK. Также не установлены суб-
страты ERK в фотосенсибилизированных клетках.
5. 9, 2. JNK и р38
Во многих работах наблюдалась сильная время- и дозозави-
симая активация JNK и р38 в разных клеточных линиях, под-
вергнутых ФД воздействию различных фотосенсибилизаторов
(Tao ct al., 1996; Xue ct al., 1999b; Assefa et al., 1999, Chan ct al.,
2000; Zhuang et al., 2000; Hsien ct al., 2002; Buchczyk et al., 2001;
Tong et al., 2003). В ряде работ ФД воздействие не влияло на ис-
ходный уровень этих МАР киназ, но быстро, за 30 мин, повыша-
ло содержание их фосфорилированных (активированных) форм
(Assefa, 1999; Xue et al., 1999b; Hsien et al., 2002; Tong et al., 2003).
Активация JNK и p38 была временной. Она длилась около 30 мин.
Затем их активность возвращалась к исходному уровню за
2—3 ч в клетках NHF (Tong et al., 2003), или оставалась повы-
шенной в течение более 4 ч в клетках А431 или HL-60 (Zhuang
et al., 2000; Hsien et al., 2002), или более 7—11 ч в клетках LFS
(Tong et al., 2003), или более 24 ч в клетках HeLa (Assefa et al.,
1999).
Данные о роли JNK и р38 в фотоиндуцированной смерти
клеток также противоречивы. Некоторые авторы сообщили, что
фотоактивация JNK или р38 ведет к апоптозу (Xue et al., 1999b;
Chan et al., 2000; Zhuang ct al., 2000; Hsicn ct al., 2003). Но в дру-
гих работах эти МАР киназы играли защитную роль (Aseffa et
al., 1999; Hendrickx et aL, 2003). Тонг с соавт. (Tong et aL, 2003)
не нашли влияния p38 на фотоцитотоксичность Фотофрина.
В клетках А431, фотосенсибилизированных гидрофильным кра-
сителем бенгальским розовым, локализующимся преимущест-
венно в лизосомах, активация каспазы 3 и последующий апоптоз
происходили после быстрой активации JNK. В числе других
белков, каспаза 3 расщепляла и активировала протеинкиназу
РАК2 (р21-activated kinase 2), которая в свою очередь активиро-
вала JNK. Так получалась цепь обратной связи, поддерживаю-
щая продолжительную активацию JNK и стимулирующая апоп-
тоз (Chan et aL, 2000). В клетках HL-60 cells, фотосенсибилизи-
рованных бенгальским розовым, наблюдалась активация р38,
каспазы 3 и нижеследующих апоптотичсских процессов. Ин-
гибирование протеинкиназы р38 с помощью SB203580 подавля-
ло фотоиндуцированный апоптоз. Но каспаза 3 нс являлась суб-
стратом для р38. Ее действие было, вероятно, опосредовано ка-
кими-то промежуточными продуктами. Поскольку SB203580
также блокировал расщепление Bid, белка семейства Вс1-2, уча-
ствующего в регуляции высвобождения цитохрома с из мито-
хондрий и последующей активации каспазы 3, то авторы пред-
положили, что активация Bid могла связывать фотоиндуциро-
ванное фосфорилирование/активацию р38 с высвобождением
цитохрома с, активацией каспазы 3 и других протеаз, выполня-
ющих апоптоз (Zhuang et aL, 2000).
При небольшой концентрации (7 мкг/мл) и кратковременной
инкубации (3 ч) Фотофрин локализовался вблизи плазматиче-
ской мембраны клеток А431. Облучение клеток вызывало прекра-
щение пролиферации. Этому предшествовала быстрая генерация
АФК, активация JNK, стимуляция каспазы 3, расщепление бел-
ков PARP и р21-активируемой киназы 2, а также потеря мито-
хондриального потенциала АТт. Эго указывало на развитие апоптоза,
но морфологические изменения этих клеток были характерны для
некроза. Значит, активация JNK могла быть общим звеном не-
кроза и апоптоза. Программа апоптоза, видимо, не была выполне-
на, так как некротические процессы могли преобладать после
повреждения плазматической мембраны (Hsien et aL, 2003).
В клетках лимфомы Ly-R, конститутивно экспрессирующих
р38, фотосспсибилизация фталоцианином Рс 4 значительно ак-
тивировала JNK, но не ERK и р38. В клетках СНО, которые нс
экспрессировали р38, фотосенсибилизация вызывала активацию
всех МАРК: ERK2, р38 и JNK. При этом в обеих клеточных ли-
ниях ингибирование р38 с помощью SB202190 блокировало фо-
тоиндуцированный апоптоз. Следовательно, протеинкиназа р38
участвовала в апоптозе, вызванном ФД воздействием. При инги-
бировании р38 также ингибировались каспазы 9 и 3, т. е., р38
действовала перед этим каспазным каскадом. Протеинкиназа
JNK также участвовала в фотоиндуцированном апоптозе, осо-
бенно в клетках LY-R. По предположению авторов, ФД воздей-
ствие могло быть опосредовано церамидом, который вызывал
активацию JNK и апоптоз (Xue et al., 1999b).
В отличие от этих данных, в клетках HeLa, фотосенсибили-
зированных гиперицином, сильная и продолжительная актива-
ция JNK1 и р38, происходящая без изменения базового уровня,
играла защитную роль. При этом фотосенсибилизация индуци-
ровала апоптоз клеток с мутацией в гене JNK, или обработанных
PD169316, ингибитором р38. Повышенная экспрессия фосфата-
зы МКР-1, которая дефосфорилирует и инактивирует и JNK1, и
р38, усиливала фотоиндуцированный апоптоз этих клеток (Asse-
fa et al., 1999). Эти же авторы показали, что фотосенсибилизация
гиперицином ингибировала зависимое от белка р38 повышение
экспрессии циклооксигеназы-2 (СОХ-2) и соответственно секре-
цию PGE,. Сверхэкспрессия р38 снижала фотоиндуцированную
смерть клеток HeLa, а ингибирование р38 с помощью PD169316,
наоборот, усиливало апоптоз и предотвращало секрецию про-
стагландина PGE2 (Hendrickx et al., 2003).
Таким образом, роль МАР киназ в реакциях клеток на ФД
воздействие сильно зависела от вида клеток и использованного
фотосенсибилизатора. Так, при фотосенсибилизации клеток
гидрофобным гиперицином, локализующимся преимуществен-
но в ЭР и аппарате Гольджи, активация INK и р38 приводила к
защите клеток от фотоиндуцированного апоптоза (Assefa et al.,
1999; Hendrickx et aL, 2003). Напротив, активация этих МАРК
вызывала апоптоз в клетках, фотосенсибилизированных гидро-
фильным бенгальским розовым, который находится в плазмати-
ческой мембране и лизосомах, или Фотофрином в условиях, ког-
да его локализация была сходной (Chan et aL, 2000; Zhuang et al.
2000; Hsien et aL, 2003). Роль JNK в реакциях разных клеток на
стресс может быть двоякой в зависимости от контекста, от конк-
ретной ситуации, в которой JNK либо участвует в клеточной
смерти, либо требуется для защиты клеток (Wactzig, Herdegen,
2005).
Каким образом ’О, и другие АФК активируют INK и р38, и
какие процессы, направленные на выживание или смерть кле-
ток, активируются этими белками — пока не выяснено.
5. 10. Фосфатидилинозитол 3-киназа
и протеинкиназа B/Akt
Фосфатидилинозитол 3-киназа (PI3K) участвует в клеточных
реакциях на стрессовые воздействия и регулирует выживае-
мость клеток, их устойчивость к апоптозу путем активации про-
теинкиназы B/Akt (PKB/Akt). Однако роль этого сигнального
пути в реакциях клеток на ФД воздействие пока недостаточно
изучена (Zhuang, Kochcvar, 2003).
Было доказано участие PI3K в защите клеток карциномы
простаты от апоптоза, вызванного ФД воздействием фталоциа-
нина Рс 4. В этой работе было также показано, что повышение
экспрессии тирозинкиназы Etk, контролируемое PI3K, делало
клетки более устойчивыми к фотоиндуцированному апоптозу.
Ингибирование Р13К с помощью LY294002 устраняло актив-
ность Etk и усиливало апоптоз (Xue ct al., 1999а).
ФД воздействие бенгальского розового вызывало значитель-
ную и продолжительную активацию протеинкиназ Akt и р38 в
фибробластах мыши NIH ЗТЗ, за которой следовал апоптоз этих
клеток. В этом случае активация рЗ8 рассматривалась как сигнал
смерти, а одновременная активация Akt — как сигнал жизни.
Активация протеинкиназы Akt предотвращалась ингибиторами
PI3K. вортманнином и LY294002, которые также усиливали
смерть клеток. Это показывает участие Akt в выживаемости кле-
ток (Zhuang, Kochcvar, 2003, Schiekc ct al., 2004). Было показано,
что ’О., снижает активацию Akt, вызванную факторами роста
EGF или PDGF (Schieke et al., 2004). Можно предположить, что
Akt регулируется двумя сигнальными путями: а) активацией
PI3K и б) выработкой церамида, стимулирующего протеинфос-
фатазы РР1 и РР2, которые, могут ингибировать Akt и ERK.
Протеинкиназа Akt может фосфорилировать и тем самым инги-
бировать протеинкиназу GSK 3 (glycogen synthase kinase 3), что
необходимо для выживания клетки.
Недавно показано, что PI3K участвует в формировании ауто-
фагосом в фотосенсибилизированных гиперицином клетках с
двойным нокаутом: Вах7ВаГ, которые умирали от фотоин-
дуцированной аутофагии. Ингибирование PI3K вортманнином
подавляло образование аутофагосом и снижение процента кле-
ток, умерших от аутофагии. Оно нс влияло на число клеток,
умерших от апоптоза. Следовательно, в этом случае PI3K скорее
участвовала в аутофагической смерти клеток, чем в апопто-
зе (Buytaert et al., 2006).
5. 11. Протсинфосфатазы
Протеинкиназы, фосфорилирующие и тем самым активиру-
ющие клеточные белки выполняют только одну часть сигналь-
ного процесса. Для завершения действия молекулярного сигнала
необходимо дефосфорилировать белки, удалить с них фосфат-
ные группы. Это делают протеинфосфатазы. Их роль в реакциях
клеток на ФД воздействие изучалась только в нескольких ра-
ботах.
Значимость протеинфосфатаз в фотодинамическом процес-
се подтверждают данные протеомного анализа опухолевых и
нормальных уротелиальных клеток, фотосенсибилизированных
ALA. Через 30 мин после фотосснсибилизации фосфатаза двой-
ной специфичности DUSP1 (dual specificity phosphatase 1) оказа-
лась в числе таких стресс-активируемых белков, как суперок-
сиддисмутаза 2 или каспаза 8 среди 40 из 2800 белков, чья мРНК
была экспрессирована. Экспрессия самого белка DUSP1 наблю-
далась позднее, через 1 ч после ФД воздействия (Wild et al.,
2005). Как отмечалось выше, ФД воздействие Фотофрина вызы-
вало экспрессию МАРК фосфатазы МКР-1, регулировавшей
продолжительность активации МАР киназы ERK1/2, которая за-
щищала клетки от фотоповреждения (Tong et al., 2002). Ингиби-
рование ссрин/треонин протеинфосфатаз РР1 и РР2А каликули-
ном А ингибировало апоптоз фотосенсибилизированных клеток
лейкемии мыши (Luo, Kessel, 1996). Следовательно, эти фосфа-
тазы участвуют в фотоиндуцированном апоптозе. Однако инги-
бирование тирозинфосфатаз с помощью ортованадата натрия не
влияло на фототоксичность фталоцианина Рс 4 и скорость апоп-
тотической фрагментации ДНК в клетках лимфомы мыши. Пока
нет никакой информации о субстратах этих фосфатаз в фотосен-
сибилизированных клетках (Xue et al., 1997).
5. 12. Факторы транскрипции
и гены раннего ответа
Некоторые протеинкиназы фосфорилируют и активируют фак-
торы транскрипции, регулирующие экспрессию генов, которые
кодируют белки, осуществляющие интегральные реакции клет-
ки. К наиболее известным факторам транскрипции, участвую-
щим в реакциях клеток на стресс, относятся АР-1 и NF-kB.
5.12. 1. АР-1
Фактор транскрипции АР-1 (activating protein-1) контролиру-
ет экспрессию разных генов, участвующих в апоптозе, пролифе-
рации клеток, дифференцировке, ангиогенезе, опухолевом росте
и других клеточных функциях. Это гомо- или гетеродимср, со-
стоящий из белков семейств Fos и Jun. Их комбинации могут
управлять экспрессией различных генов. АР-1 активируется
факторами роста, цитокинами, гипоксией, ультрафиолетовой и
ионизирующей радиацией. В активации АР-1 принимают учас-
тие разные сигнальные пути, в частности, путь с участием МАР
киназы JNK (Shaulian, Karin, 2002; Young et al., 2003). AP-1 —
рсдокс-чувствительный белковый комплекс, но сенсоры кисло-
рода, активирующие АР-1, пока не обнаружено. Известно, что
сигнальные пути с участием Са2* модулируют JNK/AP-1 сигна-
лизацию. Поэтому фотоиндуцированное повышение уровня Са2+
в цитозоле может, в принципе, участвовать в активации АР-1
(Cummins, Taylor, 2005).
ФД воздействие Фотофрина вызывало быстрое и кратковре-
менное повышение уровня мРНК генов раннего ответа c-fos и
c-jun в клетках фибросаркомы мыши RIF-1. Фотосенсибилиза-
ция бенгальским розовым также индуцировала экспрессию c-fos.
Ингибирование фосфолипазы PLA, и неспецифическое ингиби-
рование протсинкиназ А или С стауроспорином способствова-
ли фотоиндуцированной экспрессии гена c-fos. В то же время,
ингибирование протеинкиназы А, фосфодиэстеразы, или каль-
модулина, не оказывало влияния. Следовательно, фотодинами-
ческая активация фактора транскрипции АР-1 и генов раннего
ответа c-fos и c-jun была в этих клетках опосредована протеин-
киназой С и фосфолипазой PLA,, но нс сАМР-зависимым сигна-
льным путем (Luna et al., 1994). В эпителиальных клетках HeLa
фотосенсибилизация Фотофрином также вызывала быструю, си-
льную и продолжительную стимуляцию c-jun и особенно c-foc, а
также связывание АР-1, но нс NF-кВ с ДНК. При этом повыша-
лась стабильность c-jun и c-foc мРНК. Это не требовало актива-
ции протеиикиназы С. Авторы также наблюдали экспрессию ци-
токинов TNF-a, IL-1 и IL-6, что поддерживало воспалительную
реакцию и противоопухолевый тканевый ответ (Kick et al., 1995,
1996).
С помощью cDNA-микрочипов показано, что фотосенсиби-
лизация клеток карциномы А431 с помощью эндогенно синтези-
руемого протопорфирина IX вызывала продолжительную эксп-
рессию c-foc и c-jun (Vcrwanger et al., 2002). ФД воздействие
ALA повышало уровень Fos мРНК в разных опухолевых и нор-
мальных клетках (Wild ct al., 2005). В то же время, фотосенсиби-
лизация клеток профлавином, интеркалирующим в ДНК (Leg-
rand-Poels, 1995), или метиленовым синим (Piret ct al., 1995),
лишь слегка активировала факторы транскрипции АР-1 и NF-kB
в лимфоцитах и моноцитах. При фотосенсибилизации кератино-
цитов мыши производным пирофсофорбида а (НРРН) повыша-
лось связывание АР-1 с ДНК. Это приводило к экспрессии ин-
терлейкина IL-10, участвующего в воспалительной реакции, и
повышению стабильности IL-10 мРНК (Gollnick et al., 2001).
5. 12. 2. NF-кВ
Фактор транскрипции NF-кВ — вездесущий член семейства
белков Rel/NF-кВ. Его структура консервативна от членисто-
ногих {Drosophila) до человека. Он служит центральным интег-
ратором сигнальных путей, направленных на поддержание
выживаемости клеток. NF-кВ контролирует более 150 генов, от-
ветственных за отдельные стадии апоптоза, пролиферацию, вос-
палительные процессы, иммунные реакции, канцерогенез, раз-
ные желудочно-кишечные, сердечно-сосудистые и нейродеге-
неративныс болезни (Lcgrand-Poels et al., 1998; Matroule, Pictte,
2000; Aggarwal et al., 2006).
NF-kB — гетеродимер из белков p50 и RelA. Он связывается
с особой консенсусной последовательностью в ДНК. В цито-
плазме NF-кВ образует неактивный комплекс с ингибиторным
белком ТкВ, который закрывает фрагмент, необходимый для
проникновения в ядро (сигнал ядерной локализации), что обу-
словливает его постоянное пребывание в цитоплазме. Ключевы-
ми шагами в управлении NF-кВ являются образование и распад
комплекса IkB/NF-kB. В клетках есть особый и очень большой
(> 700 кДа!) комплекс киназы ТкВ (IKK), состоящий из двух ки-
наз 1кВа and 1кВр, которые активны только тогда, когда они об-
разуют димер, состоящий из дополнительного белка 1кВу и бел-
ковой платформы IKAP, на которой они расположены. При сти-
муляции IKK фосфорилирует 1кВ, и комплекс IkB-NF-kB
распадается. 1кВ убиквитинируется и деградирует в протеасо-
мах. Свободный NF-кВ быстро перемещается в ядро, где он свя-
зывается с ДНК и запускает транскрипцию ряда генов. Один из
этих генов кодирует 1кВа, который входит в ядро, связывает
NF-кВ и вместе с ним выходит назад в цитозоль, где присутству-
ет в виде неактивного комплекса до следующей активации (Mat-
roule, Piette, 2000; Aggarwal et al., 2006).
Разные стимулы — гормоны, цитокины, факторы роста, жир-
ные кислоты, гипоксия, ультрафиолетовое и ионизирующее из-
лучение, фотосснсибилизация и фармакологические агенты, де-
поляризация, нейронная активность, адгезия или старение — могут
стимулировать NF-кВ (Aggarwal et al., 2006). Многие из этих
факторов генерируют АФК и вызывают окислительный стресс.
Поэтому NF-кВ известен как редокс-чувствитсльный фактор
транскрипции, играющий важную роль в реакциях клеток на ФД
воздействие (Lcgrand-Poels et al., 1998; Matroule, Piette, 2000).
Однако, сигнальные пути, ведущие от внутриклеточных мише-
ней АФК к IKK, который активирует NF-кВ, пока неизвестны.
Активация NF-кВ обычно предотвращает апоптоз. NF-kB
вызывает экспрессию противоапоптозных генов, кодирующих
Bcl-2, Bcl-xL, с-Мус, сурвивин, с!АР 1/2, XIAP, СОХ-2, MnSOD
и другие защитные белки, и одновременно подавляет синтез
про-апоптозных белков. Это элемент защитной реакции клетки
(Aggarwal, 2006).
Активация NF-кВ в клетках разных видов наблюдалась при
фотосснсибилизации красителями, локализующимися в разных
внутриклеточных компартментах: Фотофрином (Rytcr, Gomer,
1993), метиленовым синим (Pirct et al., 1995), профлавином (Lcg-
rand-Pocls ct al., 1995), аминофеофорбидом (Matroule et al.,
1999b), метиловым эфиром аминопирофеофорбида (PMME)
(Matroule et al., 1999a, 2001), вертепорфином (Granville et al.,
2000). При этом в клеточном ядре появляется гстеродимер
р50/р65, а из цитоплазмы исчезает NF-кВ. ФД воздействие так-
же усиливает связывание NF-кВ с ДНК (Ryter, Gomer, 1993).
При фотосенсибилизации клеток карциномы толстой кишки
НСТ-116 пирофсофорбидами РММЕ или АРР, которые лока-
лизуются в ЭР, аппарате Гольджи и лизосомах наблюдалась
двухфазная активация NF-кВ. В первые 30 мин после фотодина-
мической обработки происходила кратковременная .активация,
вероятно, связанная с фотоиндуцированной интернализацией
рецепторов интерлейкина IL-1 и мобилизацией сигнального
пути, инициированного IL-1. Вторая фаза продолжительной
стимуляции, продолжавшаяся от 2 до 24 ч после воздействия,
могла быть связана с генерацией церамида (Matroule et al.,
1999а, 1999b).
ФД воздействие, активировавшее NF-кВ, также запускало
апоптоз (Matroule et al., 1999b; Granville et al., 2000). Так, в клет-
ках HL-60, фотосенсибилизированных вертепорфином, актива-
ция NF-кВ была связана с понижением уровня 1кВ0 в цито-
плазме и последующей транслокацией NF-кВ в ядро. При этом
каспазы 9 и 3 инициировали апоптоз. Но деградация 1кВа осу-
ществлялась не путем его расщепления каспазами, а вследствие
фосфорилирования комплексом IKK (Granville et al., 2000). В
клетках НСТ-120 ФД воздействие РММЕ также активировало
NF-кВ и вызывало классический митохондриальный апоптоз
с высвобождением цитохрома с и активацией каскада каспаз 9
и 3. Но эти процессы были независимы. Ведь РММЕ локализует-
ся преимущественно в ЭР и аппарате Гольджи, но не в митохон-
дриях. Поэтому авторы предположили, что за первичной генера-
цией *О2 в этих органеллах следует вторичная генерация таких
АФК, как О/ - и Н,О2, которые могут диффундировать на боль-
шое расстояние и индуцировать вспышку генерации АФК в ми-
тохондриях, приводящую к апоптозу. Механизм фотоактивации
NF-кВ и апоптоза, вероятно, были разными. Первый не зависел
от генерации АФК, но требовал интернализации интерлейкина
IL-1 и участия соответствующих сигнальных каскадов, в кото-
рых IKK фосфорилирует 1кВа и запускает его деградацию. Ин-
дукция апоптоза не зависела от IL-1. Хотя предполагалась про-
тивоапоптозная роль NF-кВ, но соответствующие антиапоптоз-
ные гены, активируемые этим фактором транскрипции пока не
установлены (Matroule et al., 2001).
В эндотелиальных клетках ECV304 и НМЕ-1, фотосенсиби-
лизированных РММЕ, наблюдалась продолжительная активация
NF-кВ и экспрессия контролируемых им генов, в частности ге-
нов, кодирующих интерлейкин IL-8. В отличие от клеток
НСТ-120, активация NF-кВ зависела от фотогенерации 'О,. Хотя
этот процесс также был связан с деградацией ингибиторного
белка 1кВа, он осуществлялся не комплексом IKK, а какой-то
неидентифицированной протеинкиназой (Volanti et al., 2002).
Позднее в клетках НМЕС-1 была обнаружена фотоиндуцирован-
ная транскрипция контролируемых NF-кВ генов, кодирующих
белки адгезии ICAM-1 и VCAM-1. Но уровень этих белков в
клетках нс повышался, вероятно, в результате их посттрасляци-
онной деградации лизосомными протеазами, но не протеасома-
ми и не кальпаином (Volanti et al., 2004). В разных клеточных
линиях активация NF-кВ и последующая экспрессия СОХ-2, вы-
званные ФД воздействием, были опосредованы разными сигна-
льными путями. Так, в клетках Т24 в активации IKK и последу-
ющей стимуляции NF-кВ участвовали PI3K и протеинкиназа Са,
а в клетках HeLa активация IKK не требовала участия этих фер-
ментов (Volanti et al., 2005).
Для понимания механизма фотоиндуцированной активации
NF-кВ нужно учитывать взаимодействие этого фактора транс-
крипции с другими сигнальными путями. Например, есть дан-
ные, что NF-кВ может стимулироваться протеинкиназами А, С,
PI3K и МАРК. С другой стороны, NF-кВ регулирует экспрессию
этих и других сигнальных белков (Aggarwal et al., 2006).
5.12. 3. HIF-1
ФД воздействие сопровождается интенсивным поглощением
кислорода и быстрым его истощением в ткани. К тканевой ги-
поксии в опухолях приводит и фотосенсибилизированное по-
вреждение сосудов (Koukourakis et al., 2001; Schouwink et al.,
2003; Ji et al., 2006). Важную роль в компенсаторных реакциях
тканей на гипоксию, которые приводят к усилению анаэробного
метаболизма, гемопоэзу и ангиогенезу, играет вездесущий, име-
ющийся практически во всех тканях фактор транскрипции HIF-1
(hypoxia-inducible factor), который, возможно, выполняет функ-
цию сенсора кислорода (Cummins, Taylor, 2005). В опытах in vivo
показано, что ФД воздействие Фотофрина повышает экспрес-
сию HIF-a, одной из субъединиц HIF-1 (Ferrario et al., 2000). Ку-
каракис с соавт. (Koukourakis et al., 2001) сообщили о значительной
экспрессии HIFla и HIF2a в опухоли пищевода, подвергнутой
ФД воздействию, что сопровождалось отсутствием экспрессии
противоапоптозного белка Вс1-2. Авторы предположили, что
оценка экспрессии белков HIF и Вс1-2 поможет предсказать чув-
ствительность опухоли к фотодинамическому повреждению.
На клеточном уровне было обнаружено, что нормальные
клетки пищевода Het-IA, у которых высокая экспрессия HIF-la
индуцировалась химической гипоксией, вызванной хлоридом
кобальта, были более устойчивы к ALA-PDT, чем в нормальной
среде без СоС12. Трансфекция этих клеток анти-HIF-la, корот-
кой интерферирующей РНК, предотвращала экспрессию HIF-la
и восстанавливала фоточувствительность клеток. В клетках рака
пищевода KYSE-70 и KYSE-450 фотосснсибилизация не вы-
зывала сверхэкспрсссии HIF-la и повышения выживаемости.
Это показало, что при ФД действии ALA белок HIF-la важен
для повышения выживаемости нормальных, но не раковых кле-
ток (Ji et al., 2006). В чем причина такой разницы между норма-
льными и опухолевыми клетками — пока неизвестно.
5. 12. 4. Белок р53
Белок р53 координирует репарацию ДНК, клеточный цикл и
апоптоз, индуцированный повреждением ДНК. Он регулирует
экспрессию по меньшей мере 100 генов, участвующих в этих
процессах. Важной физиологической функцией белка р53 явля-
ется индукция апоптоза поврежденных клеток. Потеря или мута-
ции гена р53 ведут к росту опухоли.
Белок р53 играет центральную роль в клеточных реакциях на
окислительный стресс. Обычно его экспрессия поддерживается
на низком уровне благодаря быстрому протеолизу. После кле-
точного стресса и обширного повреждения ДНК, вызванного
АФК, ультрафиолетовой или ионизирующей радиацией, уровень
белка р53 возрастает. Вышележащие сигнальные пути, регу-
лирующие уровень р53, и нижележащие пути, контролируе-
мые этим белком, очень сложны (рис. 14). Пока не очень по-
нятно, как окислительный стресс индуцирует экспрессию р53 и
последующие реакции (Culmsec, Mattson, 2005; Yu, Zhang,
2005). Возможно, синтез полиАОР-рибозы на разорванных ни-
тях ДНК, осуществляемый белком PARP, может служить сен-
сором повреждения ДНК, инициирующим как репарацию
ДНК, так и апоптоз, опосредованный белком р53. Активация р53
может осуществляться по-разному: фосфорилированием или
ацетилированием некоторых аминокислотных остатков или по-
ли(АОР)рибозилированием.
При окислительном стрессе в активации р53 могут участ-
вовать самые разные сигнальные белки: a) cdk4/6 и pRb;
б) ATM; в) JNK/p38; г) р2 l,as и д) Са2+/кальпаин (рис. 14), но воз-
можно, что центральную роль играет путь с участием JNK. Сиг-
нальный путь, управляющий выживанием клеток при действии
факторов роста: фактор роста —> рецепторная тирозинки-
наза —> PI3K —> Akt/PKB, включает опосредованную протеинки-
назой Akt активацию белка MDM2, который убирает белбк р5 3 с
ДНК и переносит его в цитоплазму, где тот деградирует с помо-
АФК
Рис. 14. Схема сигнальных процессов с участием р53.
Пояснения в тексте.
Fig. 14. p53-related signalling processes.
Explanations are in the text.
щью протеасом. Мишенями белка р53 являются гены, кодирую-
щие проапоптозные белки Fas, Apaf-1, Вах, PUMA и NOXA. Его
проапоптозное действие дополняется ингибированием путей вы-
живания, в которых участвуют факторы роста и такие факторы
транскрипции, как NF-кВ и CREB. Но с другой стороны, эти
пути могут ингибировать р53. Поэтому судьба клетки зависит от
тонкого баланса между про- и противоапоптозными сигнальны-
ми путями. Вдобавок, белок р53 активирует другой белок р21,
который ингибирует переход Gl—>S в клеточном цикле и репа-
рацию ДНК (Culmsee, Mattson. 2005; Yu, Zhang, 2005).
Повреждение ДНК не характерно для ФД воздействия, так
как большинство фотосенсибилизаторов не попадает в клеточ-
ное ядро. Тем не менее, белок р53 участвует в фотодинамическом
повреждении различных клеток, сенсибилизированных разными
фотосенсибилизаторами. Данные литературы о роли этого белка
в фотоповреждении клеток противоречивы. В некоторых рабо-
тах активация р53 усиливала фотоиндуцированную потерю кло-
ногенности клеток и некроз (Fisher et al., 1997; Weller et al., 1997;
Tong et al., 2000; Lim et al., 2006). В других сообщалось об учас-
тии р53 в фотоиндуцированном апоптозе (Fisher et al., 1999;
Gupta et al., 2003; Heinzelmann-Schwarz, 2003; Barberi-Heyob et
al., 2004; Lim et al., 2006). Эти эффекты могли быть связаны с по-
вышением экспрессии р53 в фотосенсибилизированных клетках
(Tong et al., 2000; Hajri et al., 2002; Lim et al., 2006).
Необходимо помнить, что примерно в 50 % всех случаев он-
кологических заболеваний опухолевые клетки несут мутации
гена р53, что позволяет им избегать апоптоза и неконтролируе-
мо делиться (Lee et al., 2005). Соответственно многие из исполь-
зуемых в экспериментах опухолевых клеток являются мутан-
тами по гену р53. К сожалению, пока нет фармакологических
агентов, избирательно модулирующих активность белка р53.
Поэтому для выяснения его роли в клеточных ответах на ФД
воздействие большинство авторов сравнивают клеточные линии,
по-разному экспрессирующие этот белок, или клетки дикого
типа с мутантами по гену р53, или мутанты, в которых актив-
ность р53 восстановлена введением гена р53 путем аденови-
рус-опосредованной трансфекции.
Фишер с соавт. (Fisher et al., 1999) сравнивали ФД действие
Фотофрина на две линии клеток дикого типа по фенотипу р53:
чувствительные к апоптозу клетки карциномы толстой кишки
LS513 или устойчивые к апоптозу клетки рака груди MCF-7 с
ФД воздействием на клетки с нарушением функции белка р53. В
обеих клеточных линиях экспрессия р53 или нарушение его
функций не влияли на фотоиндуцированный блок фазы G1 кле-
точного цикла и утрату клоногенности. В обеих линиях дикого
типа ФД воздействие замедляло экспрессию белков р53 и р21,
но сильней в устойчивых к апоптозу клетках MCF-7. В клетках
LS513, не утративших белок р53, ФД воздействие быстро вызы-
вало апоптоз. В клетках MCF-7 апоптоз практически не наблю-
дался. Следовательно, экспрессия р53 непосредственно не влия-
ла на фоточувствительность как чувствительных к апоптозу кле-
ток LS513, так и устойчивых клеток MCF-7 (Fisher et al., 1999). В
другой работе сравнение клеток глиомы человека BMG-1 с ди-
ким типом гена р53 и клеток карциномы 4451 с мутацией в гене
р53, показало участие белка р53 в фотоиндуцированном апопто-
зе (Gupta et al., 2003). Недостатком таких экспериментов являет-
ся сравнение различных клеточных линий. Недавно Ли с соавт.
(Lee et al., 2005) сравнили влияние ФД воздействия гипер-
ицина на две изогенные линии клеток остеосаркомы U2OS и
U2OS+p53DD, различавшиеся только экспрессией р53. Авторы
не обнаружили влияния р53 на поглощение гиперицина, про-
филь ареста клеточного цикла, индукцию апоптоза и смерть кле-
ток, оцениваемую по клоногенной активности и методом МТТ.
Также сравнивалось влияние фотосенсибилизации Фотофри-
ном нормальных фибробластов человека, экспрессирующих р53
и клеток LFS, мутантных по гену р53. Клетки LFS были более
устойчивы к ФД воздействию, чем фибробласты. Перенос гена
р53 в клетки LFS с помощью аденовируса не влиял на фотодина-
мическое повреждение этих клеток. Многие клетки LFS накап-
ливались в фазе G2 клеточного цикла и умирали от апоптоза
(Tong et al., 2000). Введение гена р53 дикого типа в мутантные
клетки карциномы НТ29, не способные к апоптозу, вызывало
арест клеточного цикла в фазе G1, но не апоптоз. Однако апоп-
тоз сильно облегчался при фотосенсибилизации этих клеток
2-бутиламино-2-диметоксигипокреллином A (Zhang et al., 1999).
Восстановление дикого типа в клетках НТ29А4, мутантных по
гену р53, усиливало апоптоз, но не некроз клеток, вызванный
фотосенсибилизацией хлорином е6 (Barberi-Heyob et al., 2004).
В другой работе использование аденовируса AdCMVp53 для
доставки гена р53 позволило увеличить экспрессию р53 в клет-
ках рака шейки матки CaSki. В этих клетках ФД воздействие
ингибировало пролиферацию и вызывало апоптоз (Lim et al.,
2006).
Устойчивость некоторых мутантных вариантов клеток НТ29
к ФД воздействию Фотофрина коррелировала со снижением экс-
прессии белков р53 и Вах и с повышением уровня Вс1-2 и Hsp27
(Shen ct aL, 2005). ФД воздействие m-THPC на фибробласты эм-
брионов мыши быстро вызывало некроз большинства клеток вне
зависимости от белков р53 и ATM, который передает информа-
цию о повреждении ДНК на р53. Но доля апоптозных клеток
была меньше у фибробластов, утративших р53 и ATM. Следова-
тельно, эти белки необходимы для фотоиндуцированного апоп-
тоза, но не некроза (Heinzelmann-Schwarz, 2003).
Но все же во многих работах было показано, что при ФД воз-
действии белок р53 не является необходимым для общей (Fisher
et aL, 1999; Heinzelmann-Schwarz, 2003; Barberi-Heyob et aL,
2004; Lee cl aL, 2005) и апоптотической (Fisher et al., 1997, 1999;
Weller et al., 1997; Lee et aL, 2005) смерти клеток. Например,
хотя клетки дикого типа, экспрессирующие р53, были более чув-
ствительны к ФД воздействию Фотофрина или SnET2, чем клет-
ки с мутантным или отсутствующим геномр53, вес же оба фото-
сенсибилизатора быстро вызывали апоптоз и в тех, и в других
клетках, происходивший по пути, независимому от р53 (Fisher
et aL, 1997). Апоптоз клеток глиомы, фотосенсибилизированных
гиперицином, наступал независимо от р53, протеинкиназы С и
Bcl-2 (Weller et aL, 1997).
ФД воздействие Фотофрина или фсофорбида а повышало эк-
спрессию белка р53 в клетках НТ29, но белок р53 в этих клетках
был мутантным и неспособным индуцировать апоптоз (Hajri et
al., 2002). С другой стороны, фотосенсибилизация клеток рака
молочной железы индоцианиновым зеленым не влияла на эксп-
рессию р53 (Crescenzi et aL, 2004).
Что могло индуцировать экспрессию р53 в фотосенсибили-
зированных клетках? Возможны два пути: а) через активацию
JNK и другие сигнальные пути и б) через индукцию множест-
венных разрывов ДНК на начальных стадиях апоптоза. Акти-
вированный р53 может индуцировать транскрипцию генов, ко-
дирующих проапоптозныс белки, которые остаются неповреж-
денными. Так, может создаться цепь с положительной обратной
связью, ускоряющая фрагментацию ДНК и развитие апопто-
за. Оба механизма могли предшествовать экспрессии р53, для
которой требовалось более 6 (Tong et aL, 2000) или 24—48 ч
(Fisher ct aL, 1999).
Таким образом, имеется больше данных в пользу участия
р53 в клеточных реакциях на ФД воздействие, чем данных про-
тив.
5. 12. 5. Белок р21
Ингибитор циклинзависимой протеинкиназы p21/WAF/Cipl
(далее называемый р21) вызывает остановку клеточного цикла.
При окислительном стрессе экспрессия р21 может вызываться
как р53-зависимым, так и р53-независимым путем. В качестве
ингибитора пролиферации р21 играет важную роль в предотвра-
щении неконтролируемого деления клеток и развития опухоли.
Кроме этого, р21 ингибирует апоптоз и участвует в репарации
ДНК. Благодаря своей центральной роли, р21, как и р53, счита-
ется одним из основных регуляторов выживаемости и смерти
клеток (O'Reilly, 2005; Yu, Zhang, 2005).
ФД воздействие фталоцианина Рс 4 вызывало остановку кле-
точного цикла и апоптоз клеток карциномы А431 с мутантным
геном р53. Биохимический механизм этого процесса включает
экспрессию белка р21 и снижение синтеза циклинов D1 и Е и цик-
линзависимых киназ cdk 2 и cdk 6, что приводит к аресту клеточ-
ного цикла при переходе от фазы GO к G1 и апоптозу (Ahmad et al.,
1998). В фотосенсибилизированных клетках MCF-7 рака молоч-
ной железы наблюдалась задержанная экспрессия р21 и блок фа-
зы G1 (Fisher et al., 1999). В клетках рака груди MCF-7, фотосен-
сибилизированных индоцианином зеленым, в присутствии цисп-
латина отмечена сверхэкспрессия р21 (Cresccnzi et al., 2004).
Сверхэкспрессия р21 и быстрый апоптоз также происходили в
клетках карциномы эпителия яичника человека OVCAR-3 после
фотосенсибилизации фталоцианином Рс 4 (Colussi et al., 1999).
Таким образом, в фотосенсибилизированных клетках сверх-
экспрсссия р21 может быть связана с проапоптозными процесса-
ми скорее, чем с противоапоптозными. В отсутствие активности
р53 в раковых клетках она может быть связана с опосредован-
ной белком р21 разрегуляцией клеточного цикла. Но пока не по-
нятно, как р21 вовлекается в эти процессы (Ahmad et al., 1998).
Как указывалось выше, в клетках А431 ФД воздействие бен-
гальского розового стимулировало каскад JNK/каспаза 3 и акти-
вировало р21 -активируемую протеинкиназу (РАК2) (Chan ct al.,
2000). А та, в свою очередь, стимулировала JNK, что создавало
петлю положительной обратной связи, приводящую к быстрому
развитию апоптоза. В клетках А431, фотосенсибилизированных
Фотофрином, наблюдалась задержанная активация РАК2 вместе
с такими апоптотичсскими процессами, как активация каспазы 3
и расщепление белка PARP (Hsien et al., 2003). Напротив, в клет-
ках рака шейки матки человека CaSki, экспрессирующих повы-
шенное количество белка р53, фотосснсибилизация подавляла
активность белка р21 (Lim ct al., 2006).
В клетках рака яичника фотосенсибилизация не влияла на
белок р21 (Dabrowska et aL, 2005). Нс было изменений экспрес-
сии белка р21 и в клетках рака молочной железы MCF-7, под-
вергнутых сочетанному действию фотодинамической терапии
и противоракового препарата цисплатина (Cresccnzi et al., 2004).
5. 12. 6. Другие факторы транскрипции
Белок с-Мус контролирует экспрессию многих генов, участ-
вующих в клеточном цикле и апоптозе. ФД воздействие Фо-
тофрина или ALA вызывало быструю и кратковременную эксп-
рессию гена раннего ответа с-Мус в клетках RIF-1 или транс-
формированных фибробластах человека соответственно (Luna
et al., 1994; Verwanger et al., 1998). В нормальных фибробластах
ALA-PDT, наоборот, снижало уровень с-Мус. Кинетика измене-
ний белка с-Мус была такой же, как белка Вс1-2 в трансфор-
мированных, но не нормальных фибробластах. Через 24 ч уров-
ни с-Мус и Вс1-2 возвращались к исходному уровню (Verwanger
et aL, 1998). Таким образом, судить о роли этого белка в фотоди-
намическом повреждении клеток пока преждевременно.
Факторы транскрипции семейств pRb (retinoblastoma prote-
in) и E2F регулируют переход G1S в клеточном цикле. Ахмад с
соавт. (Ahmad ct al., 1999) продемонстрировали участие pRb-E2F
машинерии в остановке клеточного цикла и апоптозе при ФД
действии фталоцианина Рс 4. По данным этих авторов, фотоссн-
сибилнзация вызывает генерацию NO’ с последующей стимуля-
цией p21/WAFl. Это снижает уровень циклинов и циклинзави-
симых киназ, что приводит к уменьшению уровня фосфорилиро-
вания pRb и всех пяти факторов транскрипции, входящих в
семейство E2F. В результате, переход Gl—>S нс происходит и кле-
точный цикл останавливается в фазе G1, что инициирует апоп-
тоз. В работе Фишер с соавт. (Fisher et al., 1999) отмечен быст-
рый переход pRb из гипер- в гипофосфорилировапное состояние
при фотосенсибилизации клеток рака толстой кишки LS513/E6 и
рака молочной железы человека MCF-7/E6, нс экспрессирую-
щих р53. Он нс был опосредован экспрессией р53 или р21.
Повреждение эндоплазматического ретикулума приводит к
неправильному фолдингу и нарушению синтеза белков, останов-
ке роста и апоптозу. Одним из компонентов апоптоза, опосредо-
ванного повреждением ЭР, является белок СПОР (С/ЕВР homo-
logous protein), также известный как GADD153 (Oyadomari,
Mori, 2004). Фибробласты эмбрионов мышей с генотипами
CHOP +/+ и CHOP -/- подвергались ФД воздействию порфири-
на PH, который локализуется в митохондриях и ЭР, или хлорина
NPe6, локализующегося в лизосомах. Фотосснсибилизация кле-
ток вызывала экспрессию CHOP и шаперона эндоплазматиче-
ского ретикулума GRP-78, по нс цитоплазматического шаперона
HSP-70. При таком воздействии апоптоз скорее возникал в клет-
ках CHOP +/+, чем в СПОР -/-. В противоположность этому,
при ФД действии хлорина NF>e6 в клетках повышался уровень
HSP-70, по не CHOP или GRP-78, а апоптоз происходил только
в малой части клеток обеих клеточных линий: CHOP +/+ и
CHOP Следовательно, фотодинамическая активация CHOP,
GRP-78 и HSP-70 зависела от внутриклеточной локализации фо-
тосенсибилизатора, и экспрессия CHOP усиливала апоптоз толь-
ко в случае фотосснсибилизации клеток порфирином PH, лока-
лизующимся в митохондриях (Wong et al., 2004).
Важным регулятором экспрессии генов является белок STAT
(signal transducer and activator of transcription proteins). Одним из
негативных последствий ФД воздействия являются ковалентные
сшивки белка STAT3 и в меньшей степени белков STAT1 и
STAT4. Они не позволяют этим цитоплазматическим белкам
связаться с ДНК, что приводит к утрате способности клеток, пе-
реживших ФД воздействие, реагировать на интерлейкин-6 и он-
костатин М (Liu et al., 2004).
Роль других факторов транскрипции, таких, как CR.EB или
ATF, участвующих в выживаемости, апоптозе и других клеточ-
ных реакциях на стресс еще предстоит изучить.
5.13. NO и NO синтаза
Окись азота (NO) регулирует многочисленные физиологиче-
ские и патологические процессы, включая нейротрансмиссию,
вазодилатацию, реакции на стресс и т. д. Она вырабатывается из
L-аргинина ферментом NO-синтазой (NOS). NO активирует гу-
нилатциклазу, производящую циклический гуанозинмонофосфат
(cGMP), который регулирует различные биохимические и цито-
физиологичсские клеточные реакции (Реутов, 1998, Bredt, 1999).
Сублеталыюс ФД действие тТНРС усиливало производство
NO, экспрессию TNF-a и фагоцитарную активность моноцитов
U937 (Couticr et al., 1999). Продукция NO также отмечена в клет-
ках карциномы, фотосенсибилизированных Рс 4 (Gupta et al.,
1998) или в клетках носоглоточного эпителия, фотосенсибили-
зированпых гиперицином (АН, Olivo, 2003).
NO оказывает защитное действие против апоптоза, вызван-
ного различными физико-химическими факторами, включая фо-
тодинамическое воздействие (Liu, Stamlcr, 1999; Niziolek et al.,
2003a, 2003b; 2006). Было показано, что NO действует как анти-
оксидант, перехватывающий цитотоксичные свободные радика-
лы, прерывающий цепь перекисного окисления липидов и
ослабляющий фотоповреждение биомембран. Так, внешний ис-
точник NO — спермин NONOate — значительно снижал пере-
кисное окисление липидов и последующий некроз эпителиаль-
ных опухолевых клеток СОН-BRI, фотосенсибилизированных
5-аминолевулиновой кислотой (Niziolek et al., 2003а, 2003b).
Аналогичные данные были получены и на клетках, фотосенси-
билизированных мероцианином-540, первичной мишенью ФД
действия которого является плазматическая мембрана (Zareba
et al., 2005). Механизм продолжительной устойчивости клеток к
фотоокислительному стрессу, возможно, связан с быстрым
NO-индуцированным высвобождением гема и мобилизацией
свободного железа, которое, вероятно, индуцирует экспрессию
таких защитных белков, как гемоксигеназа-1 и ферритин, дейст-
вующих в течение нескольких часов и дольше. Ферритин снижа-
ет концентрацию ионов железа ниже исходного уровня, что
обеспечивает защиту клеток от последующего фотодинамиче-
ского повреждения (Niziolek et al., 2006). Пока не известно, как
NO регулирует эти процессы.
Другой механизм участия NO в защите клеток против фото-
динамического повреждения и апоптоза выявлен в работе Гоме-
ша с соавт. (Gomes et al., 2002). Субстрат NOS аргинин или экзо-
генные доноры NO (DETA NONOate, SNAP или гидроксиламин)
значительно снижали уровень апоптоза в лимфобластоидных клет-
ках CCRF-CEM, сенсибилизированных фталоцианином AlPcS,.
Защитное действие NO устранялось ингибиторами гунилат-
циклазы, производящей cGMP, или протеинкиназы G, активиру-
емой cGMP. 8-Br-cGMP, аналог cGMP, также активировал про-
теинкиназу G и оказывал такое же защитное действие, как NO.
Следовательно, сигнальный путь: гунилатциклаза-cGMP-npo-
теинкиназа G опосредовал защитное действие NO в фотосенси-
билизированных клетках. Хотя антиапоптотические механизмы,
контролируемые протсинкиназой G, пока неизвестны, ясно, что
они предшествуют каспазам 9 и 3. Другие защитные белки кле-
ток: гсмоксигеназа-1, Hsp-70 и Вс1-2 не участвовали в опосредо-
ванной NO защите клеток от фотоиндуцированного апоптоза.
В отличие от этих данных, в клетках карциномы, фотосенси-
билизированных фталоцианином Рс 4, окись азота участвовала в
фотоиндуцированном апоптозе. В этих клетках ФД воздействие
быстро, за 5 мин увеличивало активность конститутивной, но не
индуцибельной формы NOS и производство NO возрастало в те-
чение 15 мин после фотосенсибилизации. Этот эффект не на-
блюдался в клетках фибросаркомы RIF-1, в которых апоптоз
был заблокирован (Gupta et al., 1998).
Итак, пока нельзя дать определенного ответа на вопрос о
роли NO в реакциях клеток на фотодинамическое повреждение.
Глава 6
ЗАЩИТНЫЕ БЕЛКИ КЛЕТОК
ФД воздействие активирует не только белки, участвующие в
смерти клеток, но и ряд защитных белков. Рассмотрим их роль в
реакциях клеток на данное воздействие.
6. 1. Белки антиоксидантной защиты
Антиоксидантная защита клетки включает низкомолекуляр-
ные антиоксиданты (каротиноиды, глутатион, аскорбат и дру-
гие) и ферменты детоксикации АФК (супероксиддисмутаза, ка-
талаза и различные пероксидазы).
Хотя большинство фотосенсибилизаторов генерируют в
основном синглетный кислород, при ФД воздействии повышает-
ся уровень маргансцзависимой супероксиддисмутазы (MnSOD).
MnSOD локализуется в митохондриальном матриксе и, в отли-
чие от цитоплазматической конститутивной Си, Zn-SOD, явля-
ется индуцибсльной изоформой SOD. Ес основная функция —
детоксикация супероксида и других митохондриальных АФК,
интенсивно генерируемых в митохондриях во время и после ФД
воздействия.
В опытах с фотосснсибилизацисй клеток меланомы Мб ли-
посомной формой производного фталоцианина кремния HexSiPc
наблюдалось повышение активности супероксиддисмутазы. Но
при этом уровень глутатиона (GSH) в цитоплазме, а также глута-
тионпероксидазная и каталазная активность снижались (Decreau
et al., 1999). В эритроцитах человека, фотосенсибилизирован-
ных m-хлорпербензойной кислотой, сенсибилизатором I рода,
генерирующим преимущественно О'~ и ОН', активировались не
только SOD, но и каталаза, и пероксидазы, в частности глутати-
онпероксидаза (El-Missiry, Abou-Seif, 2000). Повышенная эксп-
рессия гена и апоптоз наблюдались в клетках рака шейки матки
(Das et al., 2000). При фотосснсибилизации клеток аденокарци-
номы толстой кишки С-26 Фотофрипом повышалась экспрессия
гена, кодирующего митохондриальную MnSOD, но нс цитоплаз-
матическую Cu,Zn-SOD. Ингибирование MnSOD усиливало ци-
тотоксический и противоопухолевый эффект ФД воздействия
(Golab et al., 2003). В отличие от этих данных, фотосенсибилиза-
ция клеток Jurkat или опухоли носоглотки с помощью Рс 4 или
гиперицина, соответственно, не влияла на экспрессию эндоген-
ных Мп- или Cu,Zn-SOD (Du ct al., 2003; Dolgachcv et al., 2005).
Тем нс менее, сверхэкспрессия MnSOD защищала клетки Jurkat
от апоптоза, вызываемого фотодинамическим действием фтало-
цианина Рс 4, но нс от фотоиндуцированного повышения уровня
церамида, которое, вероятно, предшествовало проапоптозным
процессам. Фотосенсибилизация вызывала и накопление цера-
мида, и апоптоз в клетках, мутантных по гену MnSOD. Эти дан-
ные предполагают участие супероксида в фотоиндуцироваином
апоптозе и, отчасти, в синтезе церамида de novo (Dolgachcv ct al.,
2005). Сигнальные механизмы, вызывающие свсрхэкспрессию
SOD в фотосенсибилизированных клетках, пока нс установлены.
6. 2. Гсмоксигсназа-1
Гем — простетичсская группа многочисленных белков, уча-
ствующих в клеточной энергетике, внутриклеточной сигнализа-
ции и защите клеток: цитохромов, гемоглобина, миоглобина, пе-
роксидаз, каталазы, гуанилатциклазы, NO-синтазы, циклоокси-
геназы и других. Свободный гем, однако, очень токсичен (Ryter,
Tyrrell, 2000; Wagener ct al., 2003). Гемоглобин, появляющийся
в плазме крови после гемолиза, вызванного ФД воздействием,
является, вероятно, основным источником внеклеточного гема.
Накопление последнего может происходить в результате нару-
шения включения его в гсмсодсржащис белки или усиленной
деградации последних. Фотодинамическое повреждение мито-
хондрий может усилить оба этих процесса. Так как гем гидро-
фобен, то он может легко входить в липидные мембраны и окис-
лять разные их компоненты (Ryter, Tyrrell, 2000; Wagener ct al.,
2003).
Гсмоксигеназа-1 (НО-1) — вездесущий фермент, также изве-
стный как шаперон Hsp32, участвует в защите клеток от окисли-
тельного стресса. Ее экспрессия усиливается при действии раз-
личных стрсссорных агентов. НО-1 разлагает гем на железо, СО
и биливердин. Последний быстро превращается в билирубин.
Оба, билирубин и биливердин, — мощные антиоксиданты.
Токсичные ионы железа, способные резко стимулировать пере-
кисное окисление липидов, быстро связываются ферритином и
удаляются из сферы реакции (Rytcr, Tyrrell, 2000; Wagener et al.,
2003; Nowis et al., 2006). НО-1 участвует во многих физиологи-
ческих и патологических процессах, включая защиту клеток от
апоптоза. Ее антиапоптознос действие опосредовано СО, про-
дуктом деструкции гема, который, возможно, активирует р38,
р21 и NF-kB (Wagener ct al., 2003). Одним из компонентов за-
щитной активности НО-1 являются экспрессия и активация су-
пероксиддисмутазы (Nowis ct al., 2006). Экспрессия гена, коди-
рующего белок НО-1, стимулируется разнообразными сигналь-
ными путями, включающими протеинкиназы А, С и G, МАР
киназы, протеинфосфатазы, факторы транскрипции NF-kB и
АР-1 (Wagener et al., 2003). Однако противоапоптозное действие
НО-1 может способствовать росту и метастазированию опухо-
лей, а поэтому раковые клетки, экспрессирующие НО-1, могут
быть устойчивыми к противоопухолевой терапии (Jozkowicz
ct al., 2007).
ФД воздействие индуцирует экспрессию НО-1 на генном
и белковом уровнях в разных клеточных линиях (Gomer ct al.,
1991b; Wang ct al., 2002; Grebenova ct al., 2003; Makowski et al.,
2003; Jalili et al., 2004; Nowis ct al., 2006). Повышенная экспрес-
сия НО-1 коррелирует с ростом устойчивости клеток к фотоди-
намическому повреждению. Индукция НО-1 гемином повышала
сопротивляемость клеток к последующей фотосенсибилизации,
тогда как ингибирование этого фермента Zn(II) протопорфи-
рином IX повышала чувствительность раковых клеток к ФД
воздействию. Это свидетельствует об участии НО-1 в защите
клеток от фотодинамического поражения (Nowis et al., 2006).
Возможно, ингибиторы НО-1 могут повысить противоопухоле-
вую эффективность фотодинамической терапии. В клетках, сен-
сибилизированных гиперицином, индукция НО-1, в которой
участвуют протеинкиназы PI3K и р38 снижает апоптоз (Косапо-
va et al., 2007).
6. 3. Циклооксигеназа-2
Простагландины, производимые циклооксигеназой (СОХ) из
арахидоновой кислоты, могут стимулировать защитные процес-
сы в клетке. Известны две изоформы СОХ: конститутивная —
СОХ-1 и индуцибельная — СОХ-2. Первая синтезирует простаг-
ландины, необходимые для нормального клеточного гомеостаза.
Произведенные СОХ-2 простагландины стимулируют аденилат-
циклазный сигнальный путь, поддерживающий выживаемость
клеток. В этом случае снижается уровень каспаз, повышается эк-
спрессия противоапоптозиых белков семейства Вс1-2, факторов
роста (FGF, PDGF) и металлопротеиназ, участвующих в пере-
стройке ткани. Простагландины также регулируют процессы
воспаления, ангиогенеза и канцерогенеза. Экспрессия СОХ-2
контролируется различными факторами транскрипции, включая
АР-1, CREB и NF-кВ. Поэтому нестероидныс противовоспали-
тельные средства, являющиеся ингибиторами СОХ-2, рассмат-
риваются как потенциальные противоопухолевые агенты (Dem-
pke et al., 2001).
Ранние исследования показали, что ФД воздействие стиму-
лирует высвобождение из клеток простагландина PGE2. Этот эф-
фект подавлялся ингибитором СОХ-2 индометацином (Hender-
son, Donovan, 1989; Penning et aL, 1993b). По данным Феррарио с
соавт. (Ferrario et al., 2001), ФД воздействие порфирина PH, ло-
кализующегося в митохондриях, или хлорина NPc6, попадающе-
го в лизосомы, вызывает в культивируемых раковых клетках си-
льную и продолжительную активацию СОХ-2, но не СОХ-1, с
последующим повышением производства PGE,. Анализ эксп-
рессии разных генов с помощью ДНК-микрочипов продемонст-
рировал фотоиндуцированную экспрессию СОХ-2 в клетках
аденокарциномы СТ-26. Повышение экспрессии СОХ-2 и крат-
ковременное высвобождение PGE? также отмечено в клетках
карциномы шейки матки HeLa или мочевого пузыря Т24, фото-
сенсибилизированных гиперицином или РММЕ (Hendrickx ct aL,
2003; Makowski ct aL, 2003; Volanti et aL, 2005). Повышение экс-
прессии MAP киназы p38 повышало устойчивость клеток к фо-
тоиндуцированному апоптозу. В случае ФД действия гиперици-
на было показано, что в активации СОХ-2 участвовали изофор-
мы р38а и р38р, но не NF-кВ (Hendrickx et aL, 2003). Однако при
ФД воздействии РММЕ, экспрессия СОХ-2 регулировалась фак-
тором транскрипции NF-кВ, а МАР киназы р38, JNK и ERK 1/2
не участвовали в этом процессе. Эти различия в реакциях раз-
ных линий клеток были удивительны, так как внутриклеточная
локализация обоих фотосснсибилизаторов была практически од-
ной и той же. Сигнальные пути, стимулирующие экспрессию
СОХ-2 также различались в разных клеточных линиях. В клет-
ках Т24 фотосенсибилизация РММЕ последовательно индуци-
ровала PI3K, протеинкиназу Са, протеинкиназный комплекс 1кВ
и активацию экспрессии СОХ-2. В клетках HcLa активация IKK.
и NF-кВ происходила независимо от протеинкиназы С и PI3K
(Volanti et al., 2005).
Ингибирование СОХ-2 с помощью NS-398 снижало секре-
цию PGE, и усиливало смерть фотосенсибилизированных рако-
вых клеток (Hendrickx et al., 2003). Другой ингибитор СОХ-2 ни-
месулид синергично усиливал ингибирование роста клеток кар-
циномы, фотосенсибилизированных ALA (Akita et al., 2004).
Использование ингибиторов СОХ-2 в комбинационной терапии
может быть перспективно для фотодинамического лечения рака.
6. 4. Белки теплового шока и белки,
регулируемые глюкозой
Белки теплового шока (Hsp — heat shock protein), или стресс-
белки, или шапероны вырабатываются в клетках в ответ на
стресс, вызванный разнообразными физико-химическими воз-
действиями. Они восстанавливают пространственную структуру
денатурированных или неправильно свернутых белков, у кото-
рых неполярные аминокислотные остатки экспонированы нару-
жу. Связываясь с таким белком, Hsp за счет энергии АТР меняет
свою конформацию и вместе с ним изменяется конформация
связанного белка. После серии конформационных изменений бе-
лок сворачивается правильным образом так, что все гидрофоб-
ные аминокислоты оказываются внутри глобулы. При апоптозе
Hsp выполняет противоапоптозную роль (Вссгс, 2004).
ФД воздействие на разные виды клеток повышало в них
экспрессию различных стрссс-белков (табл. 2): Hsp27, Hsp47,
Hsp60, Hsp70, Hsp72, Hsp73, Hsp90, Hspl 10 и белков, регулируе-
мых глюкозой (ЭР шаперонов): GRP78, Grp80, Grp94. и Grp 100
(Gomer et al., 1991a, 1996; Curry, Levy, 1993; Xue ct al., 1995;
Morgan ct al., 1998; Paba et al., 2001; Verwanger ct al., 2002; Wang
ct al., 2002; Grebenova ct aL, 2003; Mak et aL, 2004; Nonaka ct aL,
2004).
Hsp27 обычно присутствует в клетках в небольших количе-
ствах. Он участвует в защите клеток от различных стрессорных
агентов, регулируя сворачивание белков цитоскелета и белков,
участвующих в апоптозе. Он также фосфорилирует белки и ре-
гулирует метаболизм глутатиона (Весге, 2004). ФД воздействие
повышает уровень Hsp27, что способствует выживанию клеток
(Wang et aL, 2002; Jalili et aL, 2004; Kuzelova et aL, 2004; Shen et
aL, 2005). Кроме того, ФД воздействие вызывает быстрое фосфо-
рилирование Hsp27, опосредованное протеинкиназами С и G, но
не р38. В свою очередь Hsp27 фосфорилирует актин, способст-
вуя стабилизации цитоскелета, и это может вносить вклад в по-
вышение резистентности клеток к фотодинамическому повреж-
дению (Wang ct al., 2002).
Фотосснсибилизация клеток RIF-1 производным бензопор-
фина повышала экспрессию коллаген-специфичного шаперона
Hsp47 (Curry, Levy, 1991). Но ALA-PDT не влияла на экспрес-
сию Hsp47 в фибробластах мыши ЗТ6 (Shackley et al., 2002).
Митохондриальный шаперон Hsp60, участвующий в пере-
носе цитоплазматических белков в митохондрии, также защищая
их от фотоповреждения. После ФД воздействия Фотофрина в
клетках НТ29 и RIF-1 и в их устойчивых к фотосенсибилизации
вариантах НТ29-Р14 и RIF-8A существенно повышался уровень
Hsp60. Максимальное повышение достигалось через 6—8 ч пос-
ле ФД воздействия ALA, причем уровень Hsp60 был выше в обо-
их устойчивых вариантах (Hanlon et al., 2001). Повышение эксп-
рессии Hsp60 также наблюдалось в фотосенсибилизированных
промислоцитах HL60, клетках рака толстой кишки С-26 и клет-
ках остеосаркомы HOSM-1 (Grebenova et al., 2003; Jalili ct al.,
2004; Yanase et aL, 2005).
Hsp70 — самый изобильный цитозольный шаперон. Он спо-
собствует правильному сворачиванию (фолдингу) синтезиро-
ванных на рибосомах или денатурированных белков. Hsp70 ин-
гибирует активацию каспаз и связывание белка AIF, защищая
тем самым клетки от апоптоза (Веегс, 2004). ФД воздействие по-
вышало экспрессию Hsp70 в клетках R1F-1, фотосенсибилизи-
рованных BPD (Curry, Levy, 1993), клетках лимфомы U937, сен-
сибилизированных гиперицином (Paba ct al., 2001), мышиных
фибробластах (Wong ct aL, 2003), клетках остеосаркомы HOSM-1 и
карциномы КВ, сенсибилизированных ALA (Yanase et aL, 2005).
Повышение экспрессии Hsp70 в фотосенсибилизированных
клетках зависело от внутриклеточного распределения фотосен-
сибилизатора. Так, MOHO-L-аспартилхлорин <?6 или SnET2, ко-
торые локализуются в лизосомах и плазматической мембране,
но нс Фотофрин, находящийся в митохондриях, вызывали крат-
ковременную сверхэкспрессию Hsp70 через 4 ч после ФД воз-
действия. Защита клеток от фотоипдуцированного апоптоза
зависела от уровня экспрессии Hsp70. Например, при одинако-
вой летальной дозе фотосснсибилизация Фотофрином вызывала
апоптоз только у 0.4 % клеток лимфомы Raji, конститутивно эк-
спрессирующих Hsp70, и у 77 % клеток лейкемии HL60, не эксп-
рессирующих этот белок. Обе эти клеточные линии экспресси-
ровали Hsp90. Противоапоптозный эффект Hsp-70 и Hsp-90 мог
быть обусловлен их способностью связывать Apaf-1 и таким об-
разом предотвращать активацию каспазы 9 (Nonaka ct al., 2004).
В фотосенсибилизированных клетках С-26 повышалась экспрес-
сия шаперонов Hsp72/73 (Jalili et aL, 2004). Противоапоптозное
действие Hsp70 в клетках К.562 осуществлялось на уровне, пред-
шествующем активации каспаз (Kuzelova et al., 2004).
Однако другие авторы сообщили, что ФД воздействие может
не повышать, а, наоборот, понижать уровень Hsp70 в клетках.
Так, по данным Хыо с соавт. (Xue ct al., 1995) фотосснсибилиза-
ция клеток гидрофобным фотосенсибилизатором Рс 4 снижала
синтез конститутивного Hsp70 и экспрессию Hsp70 mRNA. ФД
воздействие ALA также снижало уровень Hsp70 в клетках DS
саркомы крысы (Frank et aL, 2003) и не повышало экспрессию
Hsp72 в мышиных фибробластах ЗТ6 (Shackley et aL, 2002). Фо-
тосенсибилизация клеток опухоли мыши SCCVII Фотофрином
снижала внутриклеточный уровень Hsp70, но при этом вызывала
быстрый перенос 15—25 % общего количества Hsp70 из ци-
топлазмы к наружной поверхности опухолевых клеток мыши
или эндотелиальных клеток вены человека. Шапероны Hsp60 и
Grp94, но не Grp78, также экспрессировались на поверхности
фотосенсибилизированных клеток SCCVII. Причины и механиз-
мы перераспределения шаперонов в фотосенсибилизированных
клетках пока неизвестны (Korbclick et aL, 2005). Недавно было
показано опосредованное Hsp70 осаждение белка комплемента
СЗ па поверхности фотосенсибилизированных клеток SCCVII
(Cccic, Korbclik, 2006).
ФД воздействие пурпурина-18 на клетки HL60 вызывало
окислительный стресс и апоптоз митохондриального типа (Di
Stefano et aL, 2001). Протсомпый анализ этих клеток выявил об-
разование кислых карбонильных групп в боковых аминокислот-
ных остатках некоторых белков, особенно чувствительных к
окислительному стрессу. Этими белками были шапероны Grp78,
Hsp60, Hsp71, дисульфидфосфатизомераза и кальретикулин, а
также белки цитоскелета 0-актин, тубулин-а-1 и энолаза-а. Кар-
бонилирование белков типично для окислительного стресса,
но окислительный стресс, индуцированный ФД воздействием,
почему-то действовал только на несколько шаперонов и белков
цитоскелета. Почему эти белки были так чувствительны к окис-
лительному стрессу? Общим свойством этих белков была их
АТРазная активность. Авторы предположили, что карбонилиро-
вались положительно заряженные остатки лизина и аргинина в
АТФ-связывающих сайтах этих белков, и это инактивировало
белки. Возможно, при контакте окисленных белков с шаперона-
ми, помогающими восстановить фолдинг белков, радикалы мог-
ли переноситься от окисленных белков на шапероны и инакти-
вировать их. Таким образом, карбонилирование и инактивация
шаперонов, снижающие защитный потенциал клеток, могли слу-
жить сигналом для фотоиндуцированного апоптоза (Magi et al.,
2004).
Фотосенсибилизация клеток RIF-1 вертепорфином или кле-
ток карциномы С-26 повышала также уровень другого шаперо-
на — Hsp90 (Curry, Levy, 1991; Jalili et al., 2004). Это еще один
изобильный цитозольный шаперон. Он участвует в сигнальной
трансдукции (Buchner, 1999).
Экспрессия белков теплового шока контролируется белком
HSF-1 (the heat shock factor). Он неактивен, когда связывается с
Hsp70. Стресс повышает количество неправильно свернутых
белков, которые связываются с Hsp70. Освободившийся HSF-1
мигрирует после этого в ядро и связывается с фрагментом ДНК,
называемым HSE (heat shock clement). Это стимулирует произ-
водство Hsp. Фотосенсибилизация клеток RIF-1 хлорином NPe6
приводила к связыванию HSF-1 с HSE-1 и последующей гиперп-
родукции Hsp70 (Luna et al., 2000).
Белки, регулируемые глюкозой (Grp), участвуют в реакциях
клеток на истощение глюкозы, аноксию, нарушения кальцие-
вого гомеостаза, но нс на температурный шок. Белки Grp78 и
Grp94 являются Са2+-зависимыми ЭР шаперонами. Они постоян-
но находятся в эндоплазматическом ретикулуме и связываются с
несвернутыми полипептидными цепочками, сходящими с рибо-
сомы, и с белками, транспортируемыми через мембраны ЭР.
ФД воздействие разных фотосенсибилизаторов — Фото-
фрина II, BPD МА, Рс 4; Victoria Blue ВО (VBBO), ALA или
Zn-BC-AM — на нормальные или опухолевые клетки, вызывает
повышение уровня Grp78 и Grp94 (Curry, Levy, 1993; Gomer
et al., 1991a; Xue et al., 1995; Morgan et al., 1998; Wong ct al.,
2004; Jalili et al., 2004; Magi et al., 2004; Mak et al., 2004; Korbelik
et aL, 2005). Экспрессия гена grp-78 в клетках китайского хомяч-
ка V79, фотосенсибилизированного фталоцианином Рс 4 осуще-
ствлялась как на транскрипционном, так и на трансляционном
уровнях (Xue et al., 1995). В клетках RIF-1, сенсибилизирован-
ных Фотофрином II, максимальный уровень достигался через
12 ч (Gomer et aL, 1991а). Предобработка этих клеток кальцие-
вым ионофором А23187 вызывала повышенную экспрессию
белка Grp. Эти клетки были более устойчивы к фотодинамиче-
ской терапии, чем контрольные. Это указывало на корреляцию
между уровнем этого белка и фоторсзистентностью клетки (Go-
mer et al., 1991а).
Противоположный эффект наблюдался при фотосенсибили-
зации клеток положительно заряженным красителем VBBO, ло-
кализующимся в митохондриях. В них белок Grp78 скорее уси-
ливал, чем предупреждал фотоиндуцированную смерть клеток
(Morgan et al., 1998). В клетках FaDu, происходила сверхэксп-
рессия белка Grp78, локализующегося в ЭР, но не Grp94. Каль-
циевый ионофор А23187 аналогично индуцировал Grp78. Поэто-
му авторы полагают, что свсрхэкспрсссия Grp78 была опосредо-
вана ионами Са2+, высвобождающимися из фотоповрежденных
митохондрий. Неожиданно, после предварительной обработки
А23187, которое должно было повысить уровень Grp78, эти
клетки стали более фоточувствительны, а не устойчивы (Morgan
ct al., 2001). Протеомнос исследование обнаружило в фотосен-
сибилизированных ALA клетках лейкемии HL60, сверхэкс-
прсссию дисульфидизомеразы и Са2+-связывающих шаперо-
нов эндоплазматического ретикулума ERp57 и ERp72 (Grebe-
nova et al., 2000).
ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
Таким образом, в реакциях клеток на ФД воздействие участ-
вуют практически все сигнальные пути клеток. Некоторые из
них направлены на защиту клеток, а другие участвуют в процес-
сах клеточной смерти. Пока наши знания о молекулярных меха-
низмах клеточных реакций очень фрагментарны. Нс известны
все участвующие в них сигнальные пути и основные их компо-
ненты. Не известны сенсоры активных форм кислорода и осо-
бенно синглетного кислорода в клетках разных видов. Нет дан-
ных о взаимодействии разных сигнальных систем. Еще меньше
информации о том, какие именно исполнительные белки и ка-
ким образом контролируются сигнальными системами разных
видов клеток при ФД воздействии, направленном на разные кле-
точные структуры. Нс установлено, как они участвуют в различ-
ных цитофизиологических процессах. Из-за большой сложности
сигнальной системы клетки, многочисленных взаимодействий
разных сигнальных путей между собой, разницы между разны-
ми видами клеток, зависимости от состояния окружающей сре-
ды и физиологического состояния клетки в данных условиях
трудно понять реальную цепь событий, ведущих к смерти дан-
ных клеток. Это общая проблема. Подобная ситуация сущест-
вует для других физико-химических воздействий — ультрафио-
летового и ионизирующего излучения, химических факторов
и т. д.
В последние годы разрабатываются новые технологии, осно-
ванные на методах геномики, транскриптомики и протеомики,
которые могут дать толчок в исследовании суперсложных сигна-
льных процессов в клетках. Они позволяют одновременно ис-
следовать экспрессию нс единичных белков, а сотен и тысяч
белков и генов. Эти методы, включающие двухмерный электро-
форез, масс-спектрометрию, микрочипы с антителами или оли-
гонуклеотидами, ПЦР реального времени, уже показали свою
эффективность при анализе ФД воздействия на клетки в самые
последние годы (Verwanger et al., 2002; Wild ct al., 2005; Cekaite
et aL, 2007; Ruhdorfer et al., 2007; Bhuwaneswatri ct al., 2008; Buy-
taert et al., 2008; Tsaytler et al., 2008). Например, анализ клеток
T24 рака мочевого пузыря, фотосенсибилизированных гипери-
цином, с помощью олигонуклеотидного микрочипа выявил по-
вышение экспрессии 826 генов и понижение экспрессии 653 ге-
нов, участвующих в разнообразных метаболических процессах,
аутофагии, пролиферации, воспалении, карциногенезе и клеточ-
ной смерти (Buytaert et al., 2008).
Тем не менее, несмотря на сложность и различия начальных,
инициирующих процессов, итоговое число клеточных реакций
невелико: изменение функционального состояния, деление клет-
ки, дифференцировка, выживание или смерть (некроз, апоптоз
или аутофагия). Модификация различных сигнальных путей мо-
жет модулировать интегральный ответ клетки и привести либо к
повреждению клетки, либо к ее защите. Оба эти результаты важ-
ны для медицинских приложений. При сочетании ФД и фарма-
кологического воздействия можно усилить повреждение опухо-
левых клеток и одновременно защитить соседние нормальные
клетки.
ЧАСТЬ II
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ
РАЗЛИЧНЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ
НА НЕРВНЫЕ КЛЕТКИ
Глава 7
НЕЙРОНЫ И ГЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ КАК ОБЪЕКТ
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ
7. 1. Применение фотодинамической терапии
в нейроонкологии
Новообразования мозга составляют порядка 3 % от всех ви-
дов онкологических заболеваний. Наиболее опасные опухоли
мозга имеют глиальное происхождение. Среди них наиболее
многочисленны глиомы и глиобластомы (около 70 %), а также
анапластические астроцитомы (И %). Они обычно инфильтри-
руются в окружающие нормальные ткани и практически не под-
даются излечению. Хирургические методы, как правило, не
дают хороших результатов из-за сложности визуализации опу-
холи и невозможности обширной резекции, широко захватываю-
щей нормальные ткани. Глиомы устойчивы к химио- и радиоте-
рапии. Средний срок жизни больных раком мозга составляет 8—
9 мес (Ejljamel, 2008).
В настоящее время изучаются перспективы применения фо-
тодинамической терапии в нейроонкологии для диагностики и
лечения опухолей мозга глиального происхождения. В качестве
сенсибилизаторов чаще используются ALA, производное гема-
топорфирина, Фотофрин или фоскан (mTHPC) (Kostron et al.,
1996; Popovic ct al., 1996; Goodell, Muller, 2001; Friesen et al.,
2002; Stylli, Kaye, 2006; Eljamcl et al., 2008). Случаи полного из-
лечения опухолей мозга с помощью разных методов лечения
пока редки. Поэтому увеличение продолжительности жизни до
30—61 нсд после фотодинамической терапии по сравнению с
20 нед после хирургического вмешательства, рассматривается
как серьезный успех. Особенно эффективно применение фото-
динамической терапии в комбинации с другими способами воз-
действия на опухоль. Так, ФД воздействие после хирургической
операции позволяет разрушить раковые клетки, оставшиеся в
операционном ложе. Наилучший эффект был достигнут в ком-
бинации «хирургия + ФД воздействие + химио- и радиотера-
пия»: в этом случае отмечено выживание 50 % пациентов более
2 лет у больных глиобластомой, и более 8 лет в случае астроци-
томы (Popovic et al., 1996). Не все авторы, однако, добились та-
ких впечатляющих результатов (Eljamel et al., 2004; Eljamel,
2008).
Селективное накопление некоторых фотосенсибилизаторов
раковыми клетками позволяет осуществить флуоресцентную
визуализацию опухоли, особенно ее тонких веточек, внедряю-
щихся в ткань мозга, которые, будучи незамеченными, дают по-
вторный рост опухоли. Такая фотодинамическая диагностика
позволяет более тщательно разрушить опухоль и существенно
улучшить результаты не только фотодинамической терапии, но
и оперативной хирургии.
В опытах по изучению ФД воздействия на культивируемые
опухолевые клетки (Joshi ct al., 1994; Pollack, Kawecki, 1997; De-
ininger et al., 2002; Jiang et al., 2002; Gupta ct al., 2003; Wu ct al.,
2003) или сфероиды глиомы (Terzis et al., 1997; Hirschberg et al.,
2002; Madsen et al., 2003) были обнаружены тс же закономерно-
сти, что и при фотосенсибилизации других видов раковых кле-
ток: ФД воздействие на них приводило как к некрозу, так и
к апоптозу.
В ходе фотодинамической терапии могут повреждаться нс
только опухолевые клетки, но и нейроны, и нормальные глиаль-
ные клетки, располагающиеся в очаге повреждения. Идеальный
вариант — селективное разрушение только перерожденных кле-
ток с одновременной защитой нормальных. Для того чтобы при-
близиться к решению этой задачи, необходимо всестороннее
изучение реакций нормальных клеток глии и нейронов па ФД
воздействие, а также нейроглиальных взаимодействий, осущест-
вляющихся с помощью межклеточных молекулярных сигналов.
Фотодинамическое повреждение глиальных клеток в естествен-
ном окружении, где они взаимодействуют с нейронами и сосед-
ними глиальными клетками, пока не исследовано. Необходимо
изучить как участие нейронов в повреждении и спасении клеток
глии, так и глиальных клеток в повреждении и защите нейронов,
подвергнутых действию фотоиндуцированного окислительного
стресса. Кроме того, периферические нервные элементы неиз-
бежно повреждаются при ФД воздействии на опухоли любых
других локализаций.
7. 2. Фотодинамическое воздействие на нервные
и глиальные клетки (краткий обзор)
Во второй половине XX в. только несколько групп исследо-
вателей изучали влияние фотодинамического воздействия на
нервные клетки (Erskine, 1958; Лгодковская, Каюшин, 1959; Бур-
мистров, Людковская, 1969; Людковская, Бурмистров, 1971; Po-
oler, 1972; Узденский, 1975; Wang-Bennett, 1990; Yoshida et al.,
1990; Valcnzeno, Tarr, 1991; Starkus ct al., 1993; Kress et al., 1997,
Lilge et al., 2000).
В одной из первых работ (Erskine, 1958) не было обнаружено
ФД влияния нейтрального красного на культивируемые непиг-
ментированные нейроны и глиальные клетки. Позднее Бурмист-
ров с соавт. (1969) показали, что фотосенсибилизация нейронов
речного рака метиленовым синим вызывает их деполяризацию и
активацию импульсной активности. Тот же результат был полу-
чен на гигантских аксонах сепии (Chalazonitis, Changcux, 1961).
Облучение мощным импульсом рубинового лазера нейронов
моллюска аплизии, окрашенных метиленовым синим, также вы-
зывало быструю деполяризацию и генерацию разряда потенциа-
лов действия (Arvanitaki et al., 1968).
Одной из первых мишеней ФД воздействия являются ион-
ные каналы (Pooler, 1972, 1987; Oxford et al., 1977; Specht, Ro-
gers, 1990, 1991; Valenzcno, Tarr, 1991; Tarr, Valcnzeno, 1991;
Starkus, 1993; Kress ct al., 1997) и насосы — Na+, K+- и Ca2'1’-
АТФазы клеточных мембран (Ташмухамедов, 1973; Kondo, Ka-
sai, 1974). Их повреждение, а также нсспецифичсская утечка ио-
нов через образующиеся дефекты в мембранах (Valenzcno, Tarr,
1991) вызывают падение ионных градиентов и деполяризацию,
которая приводит к стимуляции импульсной активности нейро-
нов (Людковская, Каюшин, 1959; Бурмистров, Людковская,
1969; Людковская, Бурмистров, 1971; Узденский. 1975; Specht,
Rogers, 1991; Kress et al., 1997).
Нейрональная мембрана и митохондрии оказались наиболее
чувствительными к фотосенсибилизации элементами нервной
клетки (Wang-Bennett et al., 1990). Наблюдалось набухание цис-
терн эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи в
нейронах коры головного мозга крыс, сенсибилизированной Фо-
тофрипом II. Более сильное воздействие повреждало митохонд-
рии, плазматические мембраны и ядра клеток и вызывало некроз
(Yoshida et al., 1992). При ФД воздействии на мозг крысы в зоне
облучения формировалась некротическая область, окруженная
на периферии апоптозными клетками (Lilge et al., 2000). Это
подтверждает гипотезу о том, что интенсивное ФД воздействие
вызывает некроз, а менее интенсивное — апоптоз. При фотоди-
намической терапии могут повреждаться здоровые клетки, окру-
жающие опухоль, в частности периферические нервные элемен-
ты (Ji et al., 1992). Это вызывает довольно сильную боль (Gra-
pengiesser et al., 2002), что является негативным свойством
фотодинамической терапии. Поэтому в проводимом исследова-
нии механизмов фотодинамического повреждения нейронов мы
стремились получить данные, используя которые можно было
бы не только максимально разрушать злокачественные клетки,
но и защищать здоровые.
В проделанных работах, с одной стороны, рассматривалось
непосредственное ФД воздействие на нейрональные мембраны
и изучались ионные механизмы изменений биоэлектрической
активности нервных клеток, связанные с фотоповреждением
ионных каналов. С другой стороны, получены данные о морфо-
логических изменениях в нейронах мозга, подвергнутого фото-
сенсибилизации. Но связь между этими процессами, а также
роль метаболических и сигнальных процессов в указанных
изменениях была не изучена. Необходимо было получить ин-
формацию о реакции нервной клетки как целостной системы, с
учетом важнейших ее компонентов. С этой целью мы провели
комплексное электрофизиологическое, цитохимическое, фарма-
кологическое, флуоресцентно-микроскопическое и ультраструк-
турное исследование клеточно-молекулярных механизмов ФД
воздействия на отдельные нервные клетки.
Глава 8
БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ НЕЙРОНОВ
ИА ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ
8. 1. Изолированный рецептор растяжения рака
как модельный объект
Абдоминальный рецептор растяжения речного рака (рис. 15,
А, К) — классический объект нейрофизиологии. Его электрофи-
зиология, морфология и биохимия детально описаны (Alexand-
rovicz, 1951; Wiersma et al., 1953; Florey, Florey, 1955; Eyzaguirre,
Kuffler, 1955; Kuffler, Eyzaguirre, 1955; Giacobini, 1969; Ильин-
ский, 1975; Акоев, Алексеев, 1985).
В каждом сегменте хвоста речного рака расположены по два
симметричных рецептора растяжения (рис. 15, Л), которые со-
стоят из пары рецепторных мышц, протягивающихся между со-
седними сегментами, и мсханорецепторных нейронов, дендриты
которых разветвляются среди мышечных волокон. Быстро адап-
тирующийся нейрон реагирует на резкое растяжение рецептор-
ной мышцы кратковременным импульсным разрядом. При по-
стоянном растяжении мышцы он молчит. Медленно адаптирую-
щийся нейрон длительно генерирует потенциалы действия с
частотой, пропорциональной удлинению рецепторной мышцы.
На этом стабильном фоне можно непрерывно регистрировать
динамику клеточной реакции на внешнее воздействие от начальных,
пороговых сдвигов до терминальных событий, ведущих к гибе-
ли клетки. Крупные тела мсханорецепторных нейронов (50—
100 мкм) хорошо видны под микроскопом (рис. 15, Б). Нейроны
окружены многослойной оболочкой из сателлитных глиальных
клеток, однако, не образующих миелин (Машанский и др., 1974).
Рецепторы растяжения выделялись под контролем биноку-
лярного микроскопа по методике, описанной в работе Флори с
соавт. (Florey et al., 1955). Аксон перерезали на расстоянии око-
ло 1 см от тела нейрона. Отпрепарированный рецептор помеща-
ли в плексигласовую ванночку с 2 мл физиологического раство-
ра ван Харрсвельда, оборудованную приспособлением для рас-
тяжения мышц, которое позволяет экспериментатору задавать
уровень импульсной активности (обычно 6—10 Гц; с этой часто-
той нейроны могли работать до 10—12 ч). Потенциалы действия
отводили внсклсточно от аксонов стеклянными присасывающи-
мися электродами, и после усиления регистрировали их частоту
(Uzdensky et al., 2002а).
После установки препарата в ванночку проводили контроль-
ную регистрацию частоты импульсов в течение 30 мин, а затем к
физиологическому раствору добавляли раствор фотосснсибили-
затора и после 30-минутной инкубации препараты 30 мин облу-
чали гелий-неоновым лазером ЛГН-11 1 (632.8 нм, 0.3 Вт/см2)
или полупроводниковым лазером (670 нм, 0.4 мВт/с2), продол-
жая непрерывно регистрировать импульсную активность нейрона.
Длительность облучения была достаточной для регистрации всех
фаз импульсной реакции нейрона вплоть до прекращения потен-
циалов действия. Функциональная инактивация нейрона рас-
сматривалась как индикатор и один из этапов предстоящей его
смерти, определяемой по морфологическим и биохимическим
показателям. По частотограмме определяли «время жизни» ней-
рона (Г) от начала облучения до прекращения импульсной актив-
ности. Контрольные нейроны, генерировавшие потенциалы дей-
ствия в течение такого же времени, что и подопытные, выделялись
из того же животного. В ряде опытов для повышения точности
использовали симметричные контралатеральные нейроны.
В настоящей работе описаны реакции нейронов на ФД дей-
ствие более 30 фотосснсибилизаторов как известных, так и но-
вых, синтезированных в трех ведущих российских лаборатори-
ях: профессора А. Ф. Миронова в Московской академии тонкой
химической технологии, профессора Г. В. Пономарева в Инсти-
туте биомедицинской химии РАМН и профессора Е. А. Лукьян-
ца в Научно-исследовательском институте органических полу-
продуктов и красителей (Узденский и др., 1999, 2000; Uzdensky,
1996, 1997; Uzdensky, Mironov, 1999; Uzdensky ct al., 2000b, 2001a,
2001b, 2004b).
Для изучения участия различных метаболических и сигналь-
ных процессов в реакциях нейрона на ФД воздействие Фотоссн-
са за 15—30 мин до облучения в экспериментальную ванночку
добавляли фармакологические агенты, модифицирующие изуча-
емые биохимические процессы, и изучали реакцию нейрона на
фотосенсибилизацию. Их концентрации предварительно подби-
рали так, чтобы они сами не влияли на импульсную активность
нейрона в течение 2—3 ч. Контролем служили фотосенсиби-
лизированные нейроны, не обработанные модификаторами. В
представленных опытах использовались различные ингибиторы
или активаторы свободнорадикальных, биоэнергетических и
сигнальных процессов.
Исследование ультраструктурных изменений в нейроне про-
водилось совместно с д. б. н. Г. М. Федоренко. В этой работе
препарат фиксировали на разных стадиях импульсной реакции
нейрона или после фотоиндуцированного прекращения нейрон-
ной активности. Контрольные нейроны работали эквивалентное
время до момента фиксации. Препараты фиксировали 2.5%-ным
глутаральдегидом, обрабатывали 1%-ным OsO4 по Колфилду,
контрастировали уранилацетатом, обезвоживали в спиртах и аце-
тоне и заключали в эпон. Ультратонкис срезы готовили на ульт-
рамикротоме Tesla BS 590А. Препараты просматривали и фото-
графировали на электронном микроскопе ПЭМ-100.
После фотоинактивации изолированный рецептор растяже-
ния инкубировали в ванночке, а затем флуорохромировали про-
пидиум-иодидом и Hoechst 33342. Пропидиум-иодид не прони-
кает в живые клетки и может флуорохромировать только некро-
тические клетки с поврежденной плазматической мембраной, в
которых он попадает в ядро и придает ему красную флуоресцен-
цию. Hoechst 33342 проникает в живые клетки и придает их яд-
рам сине-зеленую флуоресценцию. Это позволяет увидеть ядра
живых клеток и фрагменты ядер апоптотических клеток. После
окраски и постфиксации 0.1%-ным раствором глутаральдегида
нейроны вырезали вместе с кусочками рецепторных мышц, за-
ключали в глицерин и изучали на флуоресцентном микроскопе
ЛЮМАМ-ИЗ, оборудованном цифровой фотокамерой Nikon Со-
olpix 995. Контролем служили препараты, не подвергавшиеся
фотодинамическому воздействию.
Для оценки фотоповреждения глиальных клеток число их
ядер и процент ядер, окрашенных пропидиум-иодидом, подсчи-
тывались на стандартной площади 10 000 мкм2 вокруг тела ней-
рона или на аксоне. Фрагментированные апоптозные ядра глиа-
льных клеток, окутывающих аксоны, подсчитывались на про-
ксимальном участке аксона длиной 2 мм. Параметры линейной
регрессии в двойных логарифмических координатах при сравни-
тельном анализе фотосенсибилизаторов определяли методом
наименьших квадратов. Данные представлены как среднее зна-
чение ± стандартная ошибка (М ± т).
8. 2. Импульсные реакции нейронов
на фотодинамическое воздействие
Изолированные нейроны нс реагировали на облучение ге-
лий-неоновым лазером или на темновое действие фотосенсиби-
лизаторов в использованных концентрациях, но были очень чув-
ствительны к их сочетанному действию, т. е. фотодинамическо-
му эффекту. Часто динамика импульсного ответа нейрона была
многофазной. При разных воздействиях реакции нейронов раз-
личались последовательностью фаз возбуждения и торможения
импульсации. Разные типы клеточных ответов на ФД воздейст-
вие были классифицированы следующим образом (Uzdensky
et al., 1996; Uzdensky, Mironov, 1999): В-тип — учащение импу-
льсации, затем резкий и необратимый ее срыв; ВТВ-тип — уча-
щение, затем торможение, новое учащение и резкий необрати-
мый срыв импульсации; ТВ-тип — торможение, учащение и
резкий необратимый срыв импульсации; Т-тип — постепенное
торможение вплоть до необратимого прекращения импульса-
ции; ВТ-тип — учащение импульсации, затем постепенное тор-
можение вплоть до необратимого прекращения; ТВТ-тип — тор-
можение импульсации, затем учащение и постепенное торможе-
ние вплоть до необратимого прекращения (рис. 16).
Динамика реакции нейрона на ФД воздействие зависела от
вида фотосенсибилизатора и его концентрации. Обычно при ин-
тенсивном воздействии преобладали возбудительные реакции В
или ВТВ, в которых прекращение импульсации происходило
резко, по типу деполяризационного блока, а при сравнительно
слабых, но продолжительных воздействиях — тормозные реак-
ции: Т, ВТ или ТВТ, когда импульсация прекращалась в резуль-
тате постепенного замедления. Необратимое прекращение импу-
льсации рассматривалось нами как функциональный показатель
развивающейся смерти нейрона. Поэтому особое внимание уде-
лялось терминальной фазе реакции, ведущей к гибели клетки.
Начальная фаза реакции, указывающая на наиболее чувствите-
льные к облучению клеточные мишени, также представляла бо-
льшой интерес. Основываясь на ранее полученных данных о ре-
акциях неокрашенных нейронов на лазерное облучение в синей
области спектра, где наблюдались аналогичные фазные измене-
ния импульсной активности (чаще реакции ВТВ-типа, но в ряде
ситуаций — В- или ВТ-реакции) и где эндогенным фотоакцепто-
ром служили флавиновые соединения (Узденский, 1980, 1987;
Uzdensky, 1993), мы предположили, что при ФД воздействии
фазы учащения импульсации были также обусловлены фотопов-
Рис. 16. Примеры основных типов реакций нейронов на фотодинамиче-
ское воздействие.
А — В-тип, Б — ВТВ-тип, В — ВТ-тип, Г — Т-тип, Д— ТВ-тип, Е — ТВТ- тип.
Fig. 16. Examples of the most typical neuron responses to photodynamic im-
pact.
A — В-type, Б — BTB-type, В — ВТ-type, Г— T-type, Д — ТВ-type, E — TBT-type.
реждением клеточной мембраны и ее деполяризацией, а фазы
торможения опосредованы ионами кальция, высвобождающи-
мися из фотоповрежденных митохондрий и/или эндоплазмати-
ческого ретикулума.
8. 3. Концентрационные кривые
и сравнение фотосенсибилизаторов
Для характеристики разных фотосенсибилизаторов и сравне-
ния их ФД эффективности мы исследовали зависимости време-
ни жизни нейронов Т от их концентрации С. Зависимости Т(С)
хорошо аппроксимировались степенной функцией:
Т(С) = аСь,
линейной в двойных логарифмических координатах:
IgHO = Iga + b IgC.
Параметры а и b определялись методом наименьших квадратов.
О справедливости такой аппроксимации свидетельствуют высо-
кие значения коэффициента корреляции R (> 0.8) и коэффици-
ентов Стыодента tst и Фишера F (табл. 4, 7, 11, 14, 17). На этих
линеаризованных графиках более эффективные фотосенсибили-
заторы, которые при меньших концентрациях быстрее инакти-
вируют нейроны, располагаются в левом нижнем углу (Uzden-
sky, Mironov, 1999; Узденский и др., 2000; Uzdensky et aL, 2000b,
2001b).
Для учета того, что использованная в опытах длина волны
облучения 633 нм не соответствовала максимумам поглощения
света разными фотосенсибилизаторами, вводилась поправка
к = ет/е633, учитывающая разницу молярных экстинкций ет и е
в максимуме поглощения и на 633 нм (Uzdensky et al., 2000b).
Она показывает, насколько бы изменилась величина Г(С), если
бы длина волны облучения соответствовала красному пику по-
глощения света данным фотосенсибилизатором:
lgrm(C) = lg7’633(C) - 1g к = lgfl + 6 IgC - 1gк.
В этой формуле Т633(С) измеренные величины времени жиз-
ни нейронов, а Тт(С) — скорректированные величины для пред-
полагаемого облучения с длиной волны, соответствующей крас-
ному пику поглощения света фотосенсибилизатором Хт.
Коэффициент а определяет относительную силу воздейст-
вия. Он зависит от интенсивности светового потока, действую-
щего на клетку, т. е. от числа фотонов, поглощенных клеткой за
время облучения. Эта величина зависит как от интенсивности
облучения, так и от коэффициента поглощения света клеткой, а
последний определяется молярной экстинкцией красителя и
числом его молекул, содержащихся в клетке или, точнее, в кле-
точных мишенях, повреждение которых вызывает наблюдаю-
щийся эффект. Показатель степени b в концентрационной зави-
симости Т(С) в соответствии с законами химической кинетики
характеризует количество элементарных повреждений, ведущих
к инактивации нейрона при поглощении фотона одной молеку-
лой фотосенсибилизатора. Так, при b = 1 фотон, поглощенный
молекулой фотосенсибилизатора, приводит к одному элементар-
ному фотоповреждению, инактивирующему нейрон. При b = 1/2
поглощение фотона молекулой вызывает два элементарных по-
вреждения, а при 6 = 2 для одного фотоповреждения нужно по-
глощение фотонов двумя молекулами сенсибилизаторов.
Глава 9
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НА НЕЙРОН
ПОРФИРИНОВЫХ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ
Препараты на основе производных гематопорфирина: HpD,
Фотофрин II (Канада), Фотосан-3 (Германия), Фотогем (Россия)
показали высокую фотохимическую эффективность и получили
официальное разрешение для лечения разных форм рака. Одна-
ко, кроме очевидных достоинств, они имеют и ряд недостатков.
Все эти производные гематопорфирина не являются химически
чистыми веществами, а представляют собой смеси неустанов-
ленного и непостоянного состава, содержащие различные по-
рфирины, их моно- и диацетаты, ди-, три- и олигопорфириновые
эфиры и другие производные (рис. 17).
Разные фракции HpD по-разному локализуются в клетках и
тканях, оказывая на них различное действие, что затрудняет по-
нимание механизмов ФД действия и стандартизацию методов
лечения. Правда, в последнее время канадская фирма QLT Photo
Therapeutics (Канада) производит в контролируемых условиях
стабильный водорастворимый препарат Photofrin II, являющий-
ся очищенной формой HpD с повышенной степенью олигомери-
зации порфиринов, что улучшает их проникновение в клетки и
повышает фотодинамическую активность. Аналогичные препа-
раты Фотогем и Фотосан-3 разработаны в России и в Германии.
Кроме того, порфирины довольно слабо поглощают свет в крас-
ной области спектра (е ~ 3-103 М~1см-1) (табл. 3). Это обуслов-
ливает недостаточную глубину повреждения опухолевой ткани
(менее 1 см). Поэтому для получения удовлетворительного тера-
певтического эффекта необходимо вводить в организм сравни-
тельно большое количество препарата. Другой недостаток пре-
парата — невысокая селективность его локализации в опухолях.
Это приводит к накоплению фотосенсибилизатора в коже, ее фо-
Рис. 17. Дигематопорфириновый эфир.
Fig. 17. Dihematoporphyrin ester.
точувствительности и необходимости в длительном пребывании
послеоперационных больных в темноте (до 4—6 нед).
Нами изучено действие 10 порфириновых фотосенсибили-
заторов: протопорфирина и производных гематопорфирина и
дейтеропорфирина на изолированный нейрон рака. В их число
входили: производные гематопорфирина Фотогем (МИТХТ),
Фотосан-3 (Seehof Laboratorium, FRG), Фотофрин II и прото-
порфирин IX (Serva, FRG); производные дейтеропорфирина
(синтезированы профессором Г. В. Пономаревым и к. х. н.
А. В. Решетниковым, ИБМХ РАМН, Москва): 4-(1-метил-2-аце-
тил-3-оксобутил) дейтеропорфирин IX (4АсАс); 2,4-ди(1-метил-
2-асе1у1-3-оксобутил дейтеропорфирин IX (2,4diAcAc); 4-(1-ме-
тил-3-оксобутил) дейтеропорфирин IX (4Ас); 2,4-ди(1-метил-3-
оксобутил) дейтеропорфирин IX (2,4diAc); 4-(1-метил-3-гидро-
ксибутил) дейтеропорфирин IX (4OHbu) и 2,4-ди(1-метил-3-
гидроксибутил) дейтеропорфирин IX (2,4diOHbu) (рис. 18). Их
физико-химические характеристики представлены в табл. 3.
Таблица 3
Физико-химические свойства порфириновых
фотосенсибилизаторов
Фотосснси- билизатор Молярная эк- стинкция при 633 нм £633 10“3. л/еммоль Поправка на поглощение в максимуме lg А = 1g (е1пе6зз) Коэффициент распреде- ления, Липофиль- ность, Rf
Фотофрин II 3.1 0.04 — —
Фотогем 3.0 0.06 1.5* —
4АсАс 5.2* 0 28* 0.54*
4OHbu 4.1* 0 28* 0.27*
2,4diAc 3.0* 0.14 10* 0.48*
4Ас 4.2* 0.01 9* 0.56*
2,4diAcAc 2.2* 0.08 19* 0.45*
2,4diOHbu 3.7* 0 17* 0.05*
Примечание. * — по измерениям А. В. Решетникова.
Фотогем проявлял фототоксичность при концентрациях от
0.005 до ЮмкМ (табл. 4, рис. 19). При концентрациях 0.2—
10 мкМ наиболее типичными были реакции В- или ВТВ-типов
(по 43 %). Это указывает на преимущественное фотоповрежде-
ние плазматической мембраны. Но при концентрациях от 5 до
200 нМ наблюдались в основном реакции Т- или ТВТ-типов, что
может указывать на большую роль фотоповреждения митохонд-
рий в этом режиме. При таких низких концентрациях Фотогема
в 2/3 экспериментов импульсная реакция нейрона заканчивалась
постепенным торможением. Зависимость Т(С) для Фотогема хо-
рошо аппроксимировалась степенной функцией (коэффициент
корреляции R = -0.851, табл. 4). Показатель степени b = -0.51
был близок к 1/2 (табл. 4), что может указывать на участие од-
ной молекулы сенсибилизатора в двух актах фотоповреждения,
приводящих к нарушению импульсной активности нейрона.
Фотофрин II был менее эффективен в наших экспериментах.
График его концентрационной зависимости Г(С) лежал на
рис. 19 выше и правее соответствующего графика для Фотогема.
Поскольку наклон линий регрессии b не слишком различался
(-0.40 и -0.51 соответственно, табл. 4), то меньшая эффектив-
ность этого сенсибилизатора была, очевидно, связана с большим
коэффициентом а (1.25 против 0.91, табл. 4), характеризующим
интенсивность светового воздействия на клетку. Так как моляр-
ные экстинкции обоих фотосенсибилизаторов были примерно
COO R' COO R'
4-АсАс-ДП-1Х
R‘= -H’,AS
(AS‘— остаток аминосахара)
4-ОНбу-ДП-1Х
2.4-ди-АсАс-ДП-)Х
2.4-ди-Ас-ДП-1Х
2.4-ОНбу-ДП-!Х
Рис. 18. Структура изученных производных дейтеропорфирина IX (по
данным А. В. Решетникова).
Fig. 18. Structures of studied deuteroporphyrin IX derivatives (According to
A.V. Reshetnikov's data).
одинаковы (табл. 4), то поглощение света клетками определя-
лось, главным образом, концентрацией в них красителей. Поэто-
му наши данные могут свидетельствовать о большем накопле-
нии в нейронах Фотогема по сравнению с Фотофрином II.
Фотосан-3 действовал на нейрон только при концентрациях
от 0.5 до 30 мкМ (табл. 4). Для него коэффициент а = 1.84 был
заметно больше, чем для Фотогема или Фотофрина II, что могло
бы быть связано с меньшим его накоплением в нейроне. В отли-
чие от Фотогема или Фотофрина II, для Фотосана-3 коэффи-
циент b = -0.93 был близок к единице, т. е. поглощение одного
фотона молекулой этого сенсибилизатора вело к одному элемен-
тарному повреждению, вызывающему фотоинактивацию ней-
рона.
Протопорфирин IX — естественный предшественник гема, —
высокоэффективный эндогенный фотосенсибилизатор (Pottier,
Kennedy, 1996). Он синтезируется в митохондриях, но затем
диффузно распределяется в цитоплазме (Krammer, Uberriegler,
1996; Wilson et al., 1997; Uzdensky et al., 2004a). Однако в наших
опытах экзогенный протопорфирин IX был наименее эффектив-
Статистические параметры, характеризующие зависимость
времени жизни нейрона от концентрации порфириновых
фотосенсибилизаторов
Таблица 4
Фотосснси- билизатор Концентрация, М Число опытов Коэффициент корреляции, R Коэффициенты регрессии Коэффициент Стьюдснта, Gt Коэффициент Фишера, F
1g а Ь
Фотофрин II КГ8—3.4 IO’5 21 -0.912 + 1.25 -0.40 9.67 93.6
Фотогем 5 10~9—1.6 КГ5 16 -0.851 +0.91 -0.51 6.07 36.8
Фотосан-3 5 10~7—3 КГ5 18 -0.830 +1.84 -0.93 6.10 37.2
Протопорфирин IX 10-6—3.5 IO’5 18 -0.827 +2.18 -0.86 5.89 34.7
4АсАс ю-‘2—ю-5 30 -0.798 +0.17 -0.27 7.01 49.2
4OHbu 5 IO”13—IO"5 31 -0.822 +0.54 -0.22 7.77 60.4
2,4diAc ю-11—КГ5 26 -0.659 +0.77 -0.22 4.29 18.4
4Ас 5 10-11—10"5 26 -0.756 +0.72 -0.25 5.67 32.1
2,4diAcAc 5 Ю’10— КГ5 21 -0.711 +0.66 -0.30 4.40 19.4
2,4diOHbu ю-1—io-5 23 -0.723 +0.84 -0.46 4.80 23.0
Рис. 19. Зависимость времени жизни нейрона Т от концентрации С порфи-
риновых фотосенсибилизаторов.
/ — 4АсАс, 2 — 4OHbu, 3 — 2,4diAc, 4 — 4Ас, 5 — 2,4diAcAc, 6 — 2,4diOHbu,
7 — Фотогем, 8 — Фотофрин II.
Fig. 19. Concentration dependencies of neuron lifetime T for different photo-
sensitizers.
1 — 4AcAc, 2 — 4OHbu, 3 — 2,4diAc, 4 — 4Ac; 5 — 2,4diAcAc, 6 — 2,4diOHbu,
7 — Photohem, 8 — Photofrin II.
ным фотосенсибилизатором из изученных порфиринов (Uzden-
sky, Mironov, 1999; Узденский и др., 2000). Он действовал на
нейрон только при концентрациях: от 1 до 35 мкМ (табл. 4). Ко-
эффициент а в зависимости Г(С), был еще большим, чем у Фото-
сана-3: а = 2.18 (табл. 4). Это могло быть результатом высокой
липофильности протопорфирина IX, агрегации при переводе в
водную фазу и слабого накопления в нейроне. В 94 % реакций
нейронов на ФД действие экзогенного протопорфирина IX пер-
вой фазой было временное снижение частоты импульсов. Это
указывает на митохондрии как на первоочередную мишень для
ФД действия протопорфирина IX.
Производные дейтеропорфирина IX. Г. В. Пономарев и А. В. Ре-
шетников (ИБМХ РАМН) синтезировали ряд 4-монозамещен-
ных и 2,4-дизамещснных производных дейтеропорфирина IX с
боковыми заместителями, придающими разную липофильность
и амфифильность (Решетников и др., 1999). Изучение их ФД
действия на модельные системы показало их перспективность
для фотодинамической терапии (Иванов и др. 1998). Нами изу-
чены реакции изолированных нейронов на ФД действие шести
производных дейтсропорфирина IX (рис. 18): 4АсАс; 4OHbu;
2,4diAc; 4Ас; 2,4diAcAc и 2,4diOHbu (Uzdensky et al., 2001b).
Как и у производных гематопорфирина, их молярные экс-
тинкции в красной области спектра были невелики: от 2.2
до 5.2-103 л-М_|см_| (табл. 3). По данным А. В. Решетникова
Распределение порфириновых фотосенсибилизаторов по физико-химическим свойствам
и фотобиологической эффективности
Таблица 5
Параметр Распределение фотосенсибилизаторов (величина параметра)
Экстинкция при 633 нм: е633 1 0~3, л/см-моль 1g к = 1g (em/e363) 2,4diAcAc < 2,4,diAc = PhH = PII < 2,4diOHbu < 4OHbu S 4Ac < AcAc (2.2) (3.0) (3.0) (3.1) (3.7) (4.1) (4.2) (5.2) (0.08) (0.14) (0.06) (0.04) (0) (0) (0.01) (0)
Коэффициент распределения Кр PhH « 4Ac s 2,4diAc < 2,4diOHbu = 2,4diAcAc < 4AcAc = 4OHbu (1.5) (9) (10) (17) (19) (28) (28)
Липофильность R{* 2,4diOHbu < 4OHbu < 2,4diAcAc s 2,4diAc < 4AcAc = 4Ac (0.05) (0.27) (0.45) (0.48) (0.54) (0.56)
Время жизни нейрона (к = 633 пт) Время жизни, скорректированное на к = ет / е633 Процент импульсных реакций нейронов с начальны- ми возбудительными фазами (В+ВТ+ВТВ — реак- ции) на низкоинтенсивное ФД воздействие Процент импульсных реакций нейронов с конечны- ми возбудительными фазами (В+ТВ+ВТВ — реак- ции) на низкоинтенсивное ФД воздействие PII < PhH = 2.4diOHbu < 2,4diAcAc < 4Ac = 2,4diAc < 4OHbu < 4AcAc PII < PhH = 2.4diOHbu < 2,4diAcAc S 4Ac < 2,4diAc 4OHbu < 4AcAc 2,4diOHbu < 2,4diAc < PhH 2 PII < 2,4diAcAc < 4AcAc = 4OHbu = 4Ac (33) (40) (44) (46) (54) (63) (64) (64) PII < 2,4diAc 2 2,4diAcAc = 2,4diOHbu < PhH 2 4OHbu < 4AcAc < 4Ac (0) (20) (23) (25) (33) (36) (58) (65)
Примечание. * Показатель хроматографической подвижности Яг, характеризующий гидрофобность фотосснсибилизаторов, определялся
А. В. Решетниковым методом тонкослойной хроматографии. Элюентом служила смесь хлороформ-этанол-ацстон (89:1:10). Их гидрофоб-
ность/гидрофнльность/амфифильность также оценивалась А. В. Решетниковым по коэффициенту распределения Кр в системе л-октанол/фосфат-
ный буфер, pH 7.4. Для смесей определялись главные значения. В скобках приведены численные значения.
(табл. 3), наименее гидрофобным из них был 2,4diOHbu. Его
хроматографическая подвижность Rp характеризующая липо-
фильность1, составляла всего 0.05. Другие производные дейте-
ропорфиринов были значительно более липофильными (7?f =
= 0.27—0.56). По коэффициенту распределения Кр в системе
л-октанол—вода, характеризующем и амфифильность, и липо-
фильность, распределение производных дейтеропорфирина IX
несколько отличалось от распределения по 7?г Их можно было
разделить на три группы: 4Ас и 2,4diAc (К = 9.1 и 10.0, соответ-
ственно); 2,4diOHbu и 2,4diAcAc (К = 1₽7.0 и 19.4); 4АсАс и
4OHbu (Хр = 28.0). Для сравнения, у Фотогема Кр = 1.5.
Неокрашенные нейроны были нечувствительны к темновому
действию производных дейтеропорфирина IX, но весьма чувст-
вительны к их ФД действию (Uzdensky et al., 2001b). Все изу-
ченные производные дейтеропорфирина IX, за исключением
2,4diOHbu, были намного эффективней производных гематопор-
фирина, и действовали при субнаномолярных концентрациях
(табл. 4, рис. 19).
При концентрациях производных дейтеропорфирина IX бо-
лее 10“7—10-6М первой фазой импульсной реакции 70—100 %
нейронов на ФД воздействие было учащение импульсации (ре-
акции В-, ВТ- или ВТВ-типов). При этом, вероятно, преобладало
прямое ФД воздействие на нейрональную мембрану, а тормоз-
ные процессы не успевали развиваться. Такой механизм преоб-
ладал и при фотодинамическом действии низких концентраций
(менее 10-7—10’9М) 4-монозамещенных производных: 4АсАс,
4Ас и 4OHbu, когда начальная активация импульсной активно-
сти наблюдалась у 60—70 % клеток (табл. 5). Эти сенсибилиза-
торы отличались липофильностью и высоким коэффициентом
распределения Кр (табл. 3 и 5). Возможно, они накапливались в
плазматической мембране, удерживались в ней и медленно про-
никали во внутриклеточные органеллы. Это приводило к пре-
имущественному фотоповреждению нейрональной мембраны,
деполяризации и учащению импульсной активности. В 60—
70 % опытов начальной фазой ФД действия низких концент-
раций двухзамещенных производных дейтеропорфирина IX:
2,4diAc и 2,4diOHbu было торможение импульсации. Эти сен-
сибилизаторы были более амфифильны (Хр = 10 и 17 соответст-
венно, табл. 3). По-видимому, они легче проникали внутрь клет-
ки и сенсибилизировали органеллы: митохондрии и/или эн-
доплазматический ретикулум. 2,4diAc и 2,4diAcAc примерно в
равной степени вызывали и возбудительные, и тормозные про-
цессы на начальной стадии реакции нейрона.
Что касается терминальных процессов, то ФД воздействие
4-замещенных производных дейтеропорфирина IX: 4АсАс и 4Ас
приводило к деполяризационному блоку импульсации 58—65 %
нейронов (табл. 5). Остальные сенсибилизаторы вызывали по-
степенное торможение и прекращение импульсации нейрона
у 64—100 % нейронов, что мы связываем с фотоповрежденисм
внутриклеточных органелл. Вероятно, лазерное облучение уси-
ливало проникновение фотосенсибилизаторов в клетку и их
внутриклеточное перераспределение.
Тем не менее, четкой корреляции между типом изменений
импульсной активности на начальных и конечных стадиях реак-
ции нейрона и такими свойствами фотосснсибилизаторов, как
амфифильность и гидрофобность не выявлено. Видимо, тут су-
щественны не только эти, но и другие их характеристики.
Как и в случае производных гематопорфирина, концентраци-
онные зависимости Т(С) для производных дейтеропорфирина IX
в первом приближении хорошо аппроксимировались степенны-
ми функциями, параметры которых а и h приведены в табл. 4. По
этим данным, фотодинамическая эффективность изученных по-
рфириновых фотосснсибилизаторов возрастает в следующем
ряду (табл. 4, 5):
Протопорфирин IX < Фотосан-3 < Фотофрин II < Фотогем ~
~ 2,4diOHbu < 2,4diAcAc < 2,4diAc ~ 4Ас < 4OHbu < 4АсАс,
а в предположении, что облучение будет проводиться в макси-
муме для каждого ФС:
Протопорфирии IX < Фотосан-3 < Фотофрин II < Фотогем ~
~ 2,4diOHbu < 2,4diAcAc = 4Ас < 2,4diAc < 4OHbu < 4АсАс.
По концентрационным зависимостям, приведенным на рис. 19
и в табл. 4, изученные порфириновые фотосснсибилизаторы
можно разделить на следующие группы: 1) 4АсАс и 401 Ibu, дей-
ствовавшие при концентрациях С > 10'12 М; 2) 2,4diAc, работав-
ший при С > 10_|,М; 3) 4Ас, действовавший при С > 10-10 М;
4) 2,4diAcAc — при С > 10 9 М и 5) 2,4diOHbu, Фотогсм и Фото-
фрин П, эффективные при С > 10 8 М. В целом среди изученных
веществ 4-монозамещенные производные дейтеропорфирина IX
были эффективней 2,4-дизамсщснных. АсАс- производные были
эффективней гидроксибутильных, а Ас-производныс занимали
промежуточное положение. Изученные производные дейтеро-
порфирина IX были намного эффективней производных гемато-
порфирина: Фотофрина II, Фотогема или Фотосана-3.
Различия в их молярной экстинкции были небольшими
(табл. 5). Их большая эффективность была, скорее, связана с
лучшей способностью проникать в клетку и сенсибилизировать
ее структуры. Распределение изученных сенсибилизаторов по
фотодинамической эффективности лучше коррелировало с рас-
пределением по коэффициенту распределения Кр, чем по хрома-
тографической подвижности 7?г (табл. 5). Поскольку коэффи-
циент распределения Кр отражает не только липофильность, но
и амфифильность фотосснсибилизаторов, то амфифильность
должна иметь большое значение для фотодинамической эффек-
тивности красителя. Для хорошего накопления в клетке, а зна-
чит для большей эффективности, краситель должен отличаться
амфифильностью, позволяющей нс только входить в клеточные
мембраны, но и выходить из них. Это позволяет ему пересекать
плазматическую мембрану и попадать в разные внутриклеточ-
ные органеллы. Как показали наши опыты, коэффициент Кр не
должен быть, однако, слишком высоким: оптимальны значения
порядка 10—30. При Кр < 5 краситель недостаточно липофилен
и не может достаточно хорошо и быстро входить в мембраны,
а при .Кр > 50 — с трудом выходит из них. Например, 4АсАс
имел такой же коэффициент липофильности R? как и 4Ас, и их
экстинкции не сильно отличались (5200 и 4200 л/ем моль соот-
ветственно). Следовательно, его большая эффективность могла
быть связана с большим коэффициентом распределения Кр (28 и
9 соответственно, табл. 3 и 5), т. е. с меньшей амфифильностью
и более длительной задержкой в мембранах. Сенсибилизатор
2,4diOHbu с умеренными значениями е и Кр был наименее эф-
фективен, возможно, из-за на порядок меньшей липофильности
7?г по сравнению с другими производными дейтеропорфирина
IX, нс позволяющей ему хорошо проникать в клеточные мембра-
ны. Тем не менее, полной корреляции между химическим соста-
вом, липофильностью, амфифильностью и фотодинамической
эффективностью данных веществ не наблюдалось (табл. 5). Кро-
ме этих свойств, эффективность фотосснсибилизаторов, очевид-
но, зависит и от других характеристик: способности к образова-
нию водородных связей, спектральных свойств, квантового вы-
хода синглетного кислорода и т. д.
Для повреждения клеток при малых концентрациях фотосен-
сибилизаторов важна слабая зависимость фотодинамического
эффекта от концентрации Т(С) (Ь < 0.5). При более крутой зави-
симости, когда b > 1, малые концентрации сенсибилизаторов
оказываются неэффективными и не приводят к гибели нейрона
за «разумное время», не превышающее 0.5—1 ч. Для изученных
производных дейтеропорфирина IX (кроме 2,4diOHbu) b = 0.2—
0.3. Это указывает на то, что одна молекула сенсибилизатора,
поглотившая квант света, вызывала 3-—5 вторичных поврежде-
ний клетки, сказывавшихся на импульсной активности, возмож-
но, инициируя несколько цепочек свободнорадикального по-
вреждения клеточных мембран.
Таким образом, исследованные производные дейтеро порфи-
рина отличались высокой фотодинамической эффективностью.
Они вызывали необратимое прекращение импульсации нервных
клеток при пикомолярных концентрациях (> 10“12—10"10М),
тогда как Фотогем и Фотосенс, используемые в фотодинамиче-
ской терапии были эффективны при наномолярных концентра-
циях (> 10-9—10-8 М). Наиболее эффективными были 4OHbu и
4АсАс. Их высокая фотодинамическая эффективность слабо за-
висела от концентрации сенсибилизатора, которая может сви-
детельствовать об инициации 3—5 вторичных процессов при
поглощении фотона одной молекулой красителя. Для фотодина-
мической эффективности важна определенная амфифильность
фотосенсибилизатора, характеризующаяся коэффициентом рас-
пределения Кр порядка 20—30 (Uzdensky et al., 2001b).
Глава 10
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НА НЕЙРОН
ХЛОРИНОВ е6 и р6 И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ
Хлорины — перспективный класс фотосенсибилизаторов
второго поколения. Они обладают интенсивной полосой погло-
щения света в красной области спектра 640—670 нм (Q-полоса)
и высоким квантовым выходом фотогенерации синглетного кис-
лорода. Они нетоксичны, селективно накапливаются в опухолях
и быстро выводятся из организма после инъекции. Хлорин е6 —
исторически первый фотосенсибилизатор хлоринового ряда, ис-
пытанный для фотодинамической терапии (Spikes, 1990). Его
молярная экстинкция в красной полосе поглощения света равна
5104 М-1см-1, а время жизни триплетного состояния достигает
760 мкс, что обусловливает высокий квантовый выход синглет-
ного кислорода, равный 0.7. Сходными фотофизическими и фо-
тохимическими параметрами характеризуется хлорин р6 (Zen-
kevich et aL, 1996). На основе хлоринов е6 и р6 синтезирован ряд
новых фотосенсибилизаторов с заданными свойствами. Так,
глюкаминовые производные хлорина е6 амфифильны и быстро,
в течение недели, а иногда и 1—2 сут, выводятся из организма
(Reshetnikov et aL, 2001). Замена винильной группировки в моле-
куле хлорина р6 на формильную смещает спектр поглощения
света к 690 нм (Grishine et aL, 2001), а циклоимидные производ-
ные поглощают еще более длинноволновый свет с максимумом
около 710 нм (Feofanov et aL, 2002, 2004).
Исследование ФД действия хлоринов е6 и р6 и ряда их произ-
водных (рис. 20 и 21), а также мезо-[тетракис-(т-гидроксифе-
нил)]-хлорина (тТНРС) на нейронную активность рецептора
растяжения рака позволило сравнить эти фотосенсибилизаторы
и изучить связь между их строением, физико-химическими
свойствами и фотодинамической эффективностью (Узденский
A
IV R = CH(OMe)Me,
V R = CH(OEt)Me,
VI R = CH(Me)CHAc2,
VII R = CH(Me)CH,Ac,
VIII R = CH(Me)CH7CH(OH)Me
IV R1 =C7H18NO5
v r‘ = c7h18no5
VI r'=c7h]8no5
vii r' = c7h18no5
VIII R1 =C,H1RNO,
/10 J
и др., 1999, 2000; Uzdensky et al., 2004b). Нами изучены следую-
щие хлориновые фотосенсибилизаторы:
— натриевая соль хлорина <?6, (Chi <?6) и его производные
(синтезированы Г. В. Пономаревым и А. В. Решетниковым):
ди-А-метил-£>-глюкаминовый комплекс хлорина <?6 (GA-Chl е6);
Радахлорин (смесь 80 % хлорина e(i, 15% пурпурина 5 и 5%
хлорина рь в форме ионного комплекса с А-мстил-Р-глюками-
ном производства фирмы Рада-Фарма, Москва); 2-девинил-2-
(1-метоксиэтил)хлорин е6, ди-А-метил-£)-глюкаминовый комп-
лекс (DVME-Chl е6); 2-девинил-2-(1-этоксиэтил)хлорин е6, ди-А-
метил-£>-глюкаминовый комплекс (DVEE-Chl е6 или Фотохлорин П);
2-девинил-2-(1-метил-2-ацстил-3-оксо)бутилхлорин е6, ди-А-ме-
тил-£)-гл1окаминовый комплекс (DVMAOB-Chl е(.) или Фото-
хлорин III; 2-девинил-2-(1-метил-3-оксо)бутилхлорин е6, ди-А-
метил-£>-глюкаминовый комплекс (DVMOB-Chl <?6); 2-дсвинил-
2-(1-метил-3-гидрооксн) бутилхлорин <?6, ди-А-метил-£)-глюка-
миновый комплекс (DVMIIB-Chl е6); Фотодитазин (смесь 60 %
ди-А-метил-£>-глюкамипового комплекса Chi <?ft, ди-А-метил-D-
глюкаминового комплекса хлорина рь и пурпуринов 7 и 18).
— производные хлорина р6 (синтезированы под руководст-
вом А. Ф. Миронова, МИТХТ, Москва): хлорин рв, натриевая
соль (СМ р6); З-формил-З-девииилхлорин р6, натриевая соль
(FDV-Chl р6); 13', 15'- М-(3-гидрокси-пропилциклоимид)хлорин
pb (HPCI-Chl /?ft), а также:
— мезо-[тетракис-(т-гидроксифенил)]-хлорин (тТНРС).
При pH 7,4 хлорины е(} и рв имели интенсивный пик поглоще-
ния света при 656 нм (табл. 6). Q-полосы поглощения света про-
изводных хлорина е(} (кроме DVME-Chl е6) были сдвинуты в си-
нюю область спектра до 646—655 им (табл. 6), а производных
хлорина р6, FDV-Chl рь и HPCI-Chl рь — наоборот, в красную
область до 690 и 711 нм соответственно. Молярные экстинкции
тТНРС, хлорина рь и его производных были ниже, чем у хлори-
нов е6 (табл. 6).
Присутствие трех карбоксильных групп у хлоринов е6 и р6
делает их амфифильными соединениями, способными раство-
Рис. 20. Глюкаминовые производные хлорофилла а, модифицированные
на периферии (Л). Основные компоненты радахлорина: хлорин еь ([), хло-
рин рь (/Г) и пурпурин 5 (///) (А) (по: А. В. Решетников, 1999).
A
Б
Рис. 21. Структура производных хлорина р6: FChl р6 (Л), НРС1 СЫ р6 (Б)
(по данным А. Ф. Миронов).
Fig. 21. Structure of chlorine pb derivatives: FChl p6 (A), HPCI Chi pb (B)
(After A. V. Mironov).
ряться как в воде, так и в липидных слоях биологических мемб-
ран. Глюкаминовые производные хлорина е(у имеют с одной сто-
роны молекулы гидрофильную углеводную группу /?*, ас дру-
гой — гидрофобный хвост R (рис. 20). Такое асимметричное
распределение полярных и неполярных групп в разных частях
молекулы придаст им существенную амфифильность. Хроматог-
рафическая подвижность R( производных хлорина е6 (кроме
DVMHB-Chl е6) мало различалась: от 0.47 до 0.62 (табл. 6). Си-
льней варьировали коэффициенты распределения сенсибилиза-
торов Кр между водой и л-октанолом. По данным табл. 6, к ам-
фифильным фотосенсибилизаторам с коэффициентом распреде-
ления К порядка единицы, можно отнести GA-Chl е6, DVEE-Chl
е6, DVME-Chl е6, и Радахлорин. К умеренно амфифильным с Кр
порядка 10—20 — DVMHB-Chl е6 и DVMOB-Chl еь, а к липофи-
льным (X > 50) — DVMAOB-Chl е6.
Мы не имели данных о коэффициентах Кр и 7?f для хлорина
р6 и его производных, но известна амфифильность хлорина р6 и
FDV-Chl р6 (Grishine et al., 2001), а также высокая гидрофоб-
ность HPCI-Chlр6 (Feofanov et al., 2002) и mTHPC (Ma et al., 1994).
Исследованные фотосенсибилизаторы практически не из-
меняли импульсную активность нейронов в темноте, как ми-
Т аблица 6
Физико-химические свойства хлоринов е6 и р6 и их производных
№ Фотосенси- билизатор Брутго-формула; Мол. масса, Да Q-полоса: \n- нм (em10-3, M_,cm'1) ®633> М-'см-1 Ещ^бЗЗ V R?>6
1 СЫ е6 C42H54N4O5 Na, 710 656 (50.0)“ 39.0 0.11 Амфифильный 0.62
2 GA-Chl е6 C48H66N6O16, 987 655 (28.3)r 18.7 0.18 1.4±0.3 0.62
3 Радахлорин смесь, среднее: -929 654 (28.3)r 2.4 1.07 1.4±0.3 0.62
4 DVME-Chl е6 C49H74N6Oi7, 1019 647 (53.1)д 16.9 0.50 1.8±0.3 0.58
5 DVEE-Chl е6 CsotyjNjOp, 1033 646 (28.5)д 4.3 0.82 2.4±0.4 0.60
6 DVMAOB-Chle6 СззН78^О18, 1087 648 (30.7)д 18.3 0.23 53±2 0.47
7 DVMOB-Chle6 c51h76n6o17, 1045 652 (38.5)д 30.3 0.10 13.6±1.1 0.49
8 DVMHB-Chl е6 С51Н77^О17, 1047 651 (25.5)д 13.5 0.27 14.1±3.2 0.22
9 Фотодитазин смесь, среднее: -980 657 (30)д 16.4 0.26 1.4±0.3 0.45—0.65
10 Chlp6 Cj3H3iN4O6 Na3, 648 656(11.1)“ 2.3 0.68 Амфифильный 0.59
11 FDV-Chl р6 CJ2H29N4O7 N&3, 650 690 (12.1)е 3.8 0.49 Амфифильный (Grishine et al., 2001)
12 HPCI-Chl р6 Сз7Н42К4О5, 635 711 (90)* н. д. н. д. Гидрофобный (Feofanov et al., 2002)
13 тТНРС С44Нз0Н4О4, 678 655 (18.8)" 3.6 0.72 Гидрофобный
Примечание, а — по измерениям А. В. Решетникова; б — метиловый эфир в хлороформ-этанол-ацетоне, 99:1:10, Kieselgel (Merck); камера
100x50x100 мм, длина разгонки 85 мм; в — в фосфатном буфере, pH 7.4; г— в 0.01 М боратном буфере, pH 7.2; д — в растворе Ван Харревель-
да, pH 7.3; е — в воде (Grishine et al., 2001); ж — в 5%-нон эмульсин кремафора CrEL (Feofanov ct al., 2002); н. д — данные отсутствуют.
Таблица 7
Статистические параметры, описывающие зависимости времени
жизни нейрона Т(С) от концентраций С различных хлориновых
фотосенсибилизаторов
№ Фотосснси- билизатор Концентра- ция, pM n Коэф- фици- СНТ корре- ляции, R Коэффициенты регрессии Коэф- фици- СНТ Стыо- дента, 'st Коэф- фици- ент Фи- шера, F
lg« l>
1 Chi еь 0.03—0.5 24 -0.796 -0.02 -1.83 6.30 39.8
2 GA-Chl е6 0.01 --5 21 0.828 +0.49 -0.77 6.44 41.4
3 Радахлорин 0.001—2 23 -0.830 +0.59 -0.46 6.83 46.5
4 DVME-Chl е6 0.05—10 18 -0.838 + 1.20 -1.16 6.15 37.8
5 DVEE-Chl е6 0.1 — 10 19 -0.710 + 1.57 -0.82 4.16 17.3
6 DVMAOB-Chle6 0.1 — 10 13 -0.923 +0.90 -1.31 8.37 70.0
7 DVMOB-Chle6 0.005—10 22 -0.823 -<-0.97 -0.46 6.47 41.9
8 DVMHB-Chl ел 0.005—5 22 0.589 + 1.10 -0.36 3.34 11.1
9 Фотодитазип 0.01 — 10 20 -0.706 + 1.45 -0.43 4.35 18.9
10 Chi ph 0.005—6 41 -0.712 +0.69 -0.58 6.33 40.0
11 FDV-Chl pb 0.05—10 18 -0.861 +0.91 -0.77 6.78 46.0
12 HPCI-Chl pb 0.1- 20 10 -0.816 + 1.28 -0.65 4.00 16.0
13 inTHPC 0.001- 1 23 -0.756 +0.82 0.36 5.30 28.0
нимум, в течение 2—3 ч при концентрациях, использованных
в наших экспериментах (табл. 7). Как и для других фотосен-
сибилизаторов, при относительно высоких концентрациях
большинства производных Chi eft и р6 (> 0.05—1 цМ), т. е. при
интенсивных ФД воздействиях, преобладали процессы стимуля-
ции нейронной активности, а при низких — процессы тормо-
жения.
Вероятно, разнообразие реакций нейронов на ФД действие
изученных хлоринов было связано с различиями в динамике их
накопления в разных мембранных системах клетки —- плазма-
лемме и мембранах внутриклеточных органелл. Как показано на
примере FDV-Chlрьи HPCI-Chlph (Grishine ct al., 2001; Feofanov
et al., 2001), красители проникают в клетку преимущественно
путем эндоцитоза. Затем они либо с помощью везикулярного
механизма попадают в аппарат Гольджи и эндоплазматический
ретикулум, либо благодаря своей амфифильности выходят в ци-
тозоль, диффузно окрашивают различные клеточные структуры
и проникают в митохондрии. Сравнительно небольшие вариа-
ции гидрофобности—гидрофильности—амфифильности краси-
A
Рис. 22. Концентрационные зависимости для времени реакции нейрона
(«время жизни») на фотодинамическое действие разных хлориновых фо-
тосенсибилизаторов:
/ — Chi е6, 2 — GA-Chl е6, 3 - - Фотохлорин, 4 — DVME-Chl е6, 5 — DVEE-Chl <?6,
6 — DVMAOB-Chl е6, 7 — DVMOB-Chl е6, 8 — DVMHB-Chl е6, 9 — Фотодита-
зин, 10 — Chi р6, 11 — FDV-Chl р6, 12 — HPCI-Chl р6, 13 — тТНРС (А, Б).
Fig. 22. Concentration dependecies of neuron lifetime for photodynamic effects
of different chlorine photosensitizers:
/ — Chi e6; 2 — GA-Chl e6; 3 — Photochlorin; 4 — DVME-Chl e6; 5 — DVEE-Chl e6;
6— DVMAOB-Chl e6; 7 — DVMOB-Chl e6; 8 — DVMHB-Chl e6; 9 — Photoditazin;
10 — Chi p6; 11 — FDV-Chl p6; 12 — HPCI-Chl p6; 13 — тТНРС.
телей могут привести к преимущественной локализации их в тех
или иных мембранных системах в начале или в конце клеточной
реакции. В большинстве случаев, когда концентрации фотосен-
сибилизаторов были невелики, на начальных этапах ФД воздей-
ствия красители сильней сенсибилизировали плазматическую
мембрану и вызывали учащение импульсации нейрона. На за-
ключительных стадиях клеточной реакции они могли проникать
внутрь клетки, связываться с органеллами и вызывать преиму-
щественно тормозные изменения импульсной активности.
В своем большинстве хлориновые фотосенсибилизаторы
оказались весьма эффективными. Они инактивировали нейроны
при наномолярных концентрациях. Анализ концентрационных
зависимостей Т(С) (рис. 22, табл. 7) показал, что по фотодина-
мической эффективности в нано- и микромолярном диапазонах
концентраций от 10“9 до 10-5 М хлориновые сенсибилизаторы
располагаются в следующем ряду:
DVEE-Chl eb < HPCI-Chl р6 < DVME-Chl еь <
< DVMAOB-Chl е6 < Chi е6 < Фотодитазин « FDV-Chl рь <
< GA-Chl е, < DVMHB-Chl е. < DVMOB-Chl е, « Chi р. <
6 6 6 “6
< Радахлорин ~ тТНРС.
При использовании Chi ей, GA-Chl е6, DVMHB-Chl е6, Chi рь
и FDV-Chl р6 возбудительные фазы преобладали не только на
начальных, но и на заключительных этапах реакции нейрона
(Uzdensky et al., 2004b). Следовательно, основной мишенью
для их ФД действия могла быть плазматическая мембрана.
Локализация хлорина еь в мембранах была действительно про-
демонстрирована белорусскими фотобиологами (Гуринович
и др., 1989; Frolov et al., 1990). GA-Chl e6, DVMHB-Chl e6, Chi p6
и FDV-Chl p6 амфифильны и заметная их доля могла локали-
зоваться как в плазмалемме, так и в мембранах внутрикле-
точных органелл. О присутствии FDV-Chl р6 в плазматической
мембране, митохондриях и аппарате Гольджи сообщалось в ра-
боте (Grishine et al., 2001). При фотосенсибилизации ней-
рона DVEE-Chl е6 или тТНРС в большинстве опытов как на
начальных, так и на заключительных стадиях реакции наблю-
дались тормозные изменения импульсации (Uzdensky et al.,
2004b), свидетельствующие о преимущественном ФД воздейст-
вием на Са24"-депонирующие органеллы — митохондрии и эн-
доплазматический ретикулум. В. Мельниковой и соавт. показа-
но, что гидрофобный тТНРС локализуется в перинуклеарной
области, богатой митохондриями, диктиосомами и эндоплаз-
матическим ретикулумом (Melnikova et al., 1999). Тормозные
процессы преобладали и в реакциях нейронов на ФД действие
амфифильных DVEE-Chl е6, DVME-Chl е6 и Радахлорина. Воз-
можно, митохондрии и эндоплазматический ретикулум, запа-
сающие Са2+, также были основными мишенями для ФД дейст-
вия этих фотосенсибилизаторов. Для небольших концентраций
остальных фотосенсибилизаторов характерно было преобла-
дание возбудительных фаз в начале реакции и тормозных — в
конце.
Для оценки максимальной фотодинамической эффективно-
сти хлориновых фотосенсибилизаторов в предположении, что
облучение будет проводится не при 633 нм, как в наших опытах,
а в максимумах поглощения сенсибилизаторов, можно ввести
поправку на разницу экстинкций на этих длинах волн. Тогда ряд
хлориновых фотосснсибилизаторов в порядке максимальной фо-
тодинамической эффективности будет таким:
DVMAOB-Chl е6 ~ DVME-Chl е6 < DVEE-Chl е6 < Chi е6 <
< Фотодитазин < FDV-Chl р6 ~
~ GA-Chl е6 < DVMOB-Chl е6 < DVMHB-Chl е6 <
< Chi р6 < тТНРС < Радахлорин.
По концентрационным зависимостям (рис. 21) все хлорино-
вые фотосенсибилизаторы можно было разделить на следующие
группы:
а) тТНРС и Радахлорин были наиболее эффективными. Они
инактивировали нейроны быстрее, чем за 1.5—2 ч, при концент-
рациях С > 10-9 М;
б) Фотодитазин, DVMOB-Chl е6, DVMHB-Chl е6, GA-Chl е6,
Chi р6 оказывали ФД действие при концентрациях С > 10-8 М;
в) СЫ е6, DVME-Chl е6, DVEE-Chl е6, DVMAOB-Chl е6,
FDV-Chl р6, HPCI-Chl рв — были эффективны при С > 10~7 М.
Наиболее эффективным был широко известный фотосенси-
билизатор тТНРС, хорошо зарекомендовавший себя в клинике
(Ma et al., 1994). Изученные производные хлоринов еь и р6 бы-
ли менее эффективны. Только Радахлорин приближался по эф-
фективности к тТНРС (рис. 22, А). Можно спрогнозировать,
что при облучении в максимуме спектра поглощения (654 нм) он
может оказаться заметно эффективней (рис. 22, В).
Производные хлорина pb: FDV-Chl р6 и HPCI-Chl рь, отлича-
ющиеся значительным длинноволновым сдвигом Q-полосы по-
глощения света (табл. 6), были высоко эффективны в опытах на
культивируемых раковых клетках (Grishine et aL, 2001; Feofanov
et al., 2002). Однако, па нашем объекте они были менее эффек-
тивны, чем хлорин рв или многие его производные.
Умеренно амфифильные DVMHB-Chl еь и DVMOB-Chl еь с
К ~ 14, были в наших опытах эффективней как более амфи-
фильных GA-Chl е6, DVEE-Chl еь и DVME-Chl еь с К~1— 2,
так и более гидрофобного DVMAOB-Chl еь с К? = 53 (рис. 22;
табл.7). Вероятно, такие уровни амфифильности оптимально
обеспечивают проникновение фотосенсибилизатора в клеточ-
ные мембраны и достаточно длительную задержку в них. Кроме
того, локализация сенсибилизаторов в тех или иных клеточных
структурах, определяется не только такими интегральными ха-
рактеристиками молекул, как липофильность и амфифильность,
но и конкретной геометрией полярных и неполярных групп. На-
пример, гидрофобный хвост определенной длины позволяет
фиксировать полярную часть молекулы вблизи мембраны и
даже погружать ее в мембрану на определенную глубину. Ко-
роткие хвостики GA-Chl еь, DVEE-Chl еь и DVME-Chl е6, делали
это, видимо, менее эффективно, чем более длинные хвосты
DVMHB-Chl еь и DVMOB-Chl еь.
Фотодинамическая эффективность сенсибилизаторов при
низких концентрациях во многом связана с пологой концентра-
ционной зависимостью Г(С) = аСь. Более эффективными были
фотосенсибилизаторы с низкими величинами показателя степе-
ни Ь, соответствующими множественным вторичным процес-
сам, например цепочкам перекисного окисления липидов, разви-
вающимся после поглощения фотона одной из элементарных
мишеней в нервной клетке. По величине b хлориновые фотосен-
сибилизаторы можно было разделить на группы; представлен-
ные в табл. 8.
Такое распределение примерно отражает распределение
хлориновых фотосенсибилизаторов по фотодинамической эф-
фективности и характеризует механизм фотоповреждения. Так,
Таблица 8
Группы хлориновых фотосенсибилизаторов
Группа b Фотосснсибилизатор
I 0.36—0.46 тТНРС, Радахлорин, Фотодитазин, DVMOB-Chl е6, DVMHB-Chl еь
II 0.58—0.82 Chi рй, FDV-Chl рй, HPCI-Chl pb, GA-Chl ей, DVEE-Chl е6
III 1.16—1.31 DVME-Chl е6, DVMAOB-Chl е6
VI 1.83 Chi е6
наиболее эффективные фотосенсибилизаторы из группы I харак-
теризовались низкими величинами b от 0.36 до 0.46, свидетель-
ствующими об участии одной молекулы фотосенсибилизатора в
2—3 вторичных повреждениях, инактивирующих нейрон. Наи-
менее эффективными оказались DVME-Chl е6, DVMAOB-Chl е6
со значениями Ь, близкими к 1, и СЫ еь с 6=1.8. Квадратичная
концентрационная зависимость (6 == 2), характерная для хлорина
е6, наблюдалась также при фотосенсибилизации гемолиза эрит-
роцитов хлорином е6 (Frolov, Gurinovich, 1992). Известно, что
линейная или квадратичная концентрационная зависимость со-
ответствует тому, что для данного биологического эффекта тре-
буется фотовозбуждение одной или двух (для СЫ е6) молекул
фотосснсибилизатора соответственно. Мы пока не можем отве-
тить на вопрос, почему хлориновые соединения столь заметно
различаются по величинам Ь, в отличие от фталоцианиновых со-
единений или дейтеропорфиринов.
Необходимо подчеркнуть, что применение малых концент-
раций выгодно для уменьшения темновой токсичности фото-
сенсибилизаторов и быстрого их выведения из организма после
фотодинамической терапии. Однако, когда требуется быстро и
надежно повредить клетки, лучше использовать большие кон-
центрации фотосенсибилизаторов с крутой зависимостью Т(С),
как у хлорина е6. Исследованный нами набор хлориновых произ-
водных достаточно разнообразен и позволяет выбрать фотосен-
сибилизаторы, пригодные для решения как первой (тТНРС, Ра-
дахлорин, DVMOB-Chl е6, DVMHB-Chl е6), так и второй задачи
(хлорин е6).
Глава 11
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ НА НЕЙРОН
ФТАЛОЦИАНИНОВЫХ СЕНСИБИЛИЗАТОРОВ
Физико-химические свойства фталоцианинов, в частности,
высокое поглощение света в красной области спектра с мак-
симумом около 670 нм, большое время жизни триплетных со-
стояний и высокий квантовый выход синглетного кислорода,
хорошая стабильность при хранении и фотостабильность, воз-
можность синтеза многочисленных производных с заданными
свойствами весьма привлекательны для фотодинамической те-
рапии (van Lier, Spikes, 1989, Rosenthal, 1991). Однако фталоциа-
нины гидрофобны и имеют тенденцию агрегировать при раство-
рении в водной среде. Это резко снижает их фотодинамическую
активность и затрудняет использование. Для придания водораст-
воримости фталоцианины сульфируют. Образование комплек-
сов с металлами (AL, Zn и др.) увеличивает их способность ге-
нерировать синглетный кислород при фотовозбуждении. Не-
которые из них положительно зарекомендовали в клинике, а
сульфированный алюмофталоцианин Фотосснс после клиниче-
ских испытаний зарегистрирован в качестве лекарственного
средства для лечения разных видов рака и разрешен к медицин-
скому применению (Соколов и др., 1995; Лагода и др., 2000,
Странадко, Иванов, 2004).
Фотосенс — смесь натриевых солей алюмофталоцианина
(AlPcSn) с разной степенью сульфирования: AlPcS,, AlPcS3 и
A1PcS4 в соотношении 15:50:35, так что среднее значение
п = 3.1. Причем, AlPcS, гидрофобен, a A1PcS4 гидрофилен, что
позволяет сенсибилизировать разные клеточные структуры. Фо-
тосенс фотостабилен, а его растворы стабильны при хранении,
что обеспечивает устойчивый фотодинамический эффект. Фото-
сене малотоксичен. При концентрации 10“5 М Фотосенс инак-
тивировал нейроны в темноте в среднем за 5 ч, а при 10-7 М —
не влиял на нейронную активность. Это согласуется с данными
литературы о низкой темновой токсичности фталоцианинов
(BenHur, Rosental, 1985).
Нами изучено влияние на нейрон трех алюмофталоциани-
нов и трех фталоцианинов цинка, синтезированных в НИОПИК
(Москва) под руководством профессора Е. А. Лукьянца:
1) Фотосенса;
2) окта(оксиэтоксифосфинилметилфталоцианина) алюминия
(PAlPc);
3) окта-4,5-карбоксифталоцианина оксиалюминия (окта-А1);
4) натриевой соли дисульфированного фталоцианина цинка,
ZnPcS2, представляющий собой смесь производных с разной
степенью сульфирования со средним значением п = 2.1;
5) натриевой соли трисульфированного фталоцианина цин-
ка, ZnPcS3, (среднее п = 3.1);
6) натриевой соли тетрасульфированного фталоцианина цин-
ка, ZnPcS4, (среднее п = 3.7). Структура некоторых из них при-
ведена на рис. 23.
В водной среде сульфированные фталоцианины алюминия
и цинка имеют высокие коэффициенты экстинкции (1.27—
2.14105 М"'см_1) в красном диапазоне (660—676) (табл. 9).
Спектры поглощения света алюмофталоцианинами PAlPc и
окта-А1 сдвинуты в длинноволновую область: 686—691 нм
(табл. 9). Спектры поглощения, возбуждения и флуоресценции
Таблица 9
Состав и спектральные характеристики
изученных фталоцианинов
Фталоцианин Сред- нсс п Состав, % max» nm Enux IO5, М_1 см"1 *=Е max /с633 (1g к)
п = 1 и = 2 « = 3 п = 4
AlPcSn 3.1 15 50 35 676* 2.00 6.5 (0.81)
(Фотосенс) ZnPcS2 2.1 6 74 13 7 630— 2.14 1.0 (0.00)
ZnPcS3 3.1 — 22 51 27 675* 660* 1.69 1.3 (0.11)
ZnPcS4 3.7 — 1.5 23 75.5 668* 1.59 3.6 (0.56)
Окта-Al PAlPc AlOPc(COONa)8 HOAlPc СН2РО(ОС2Н5)ОН]8 686* 691* н. д. 1.27 8.2 (0.91) 4.5 (0.65)
Примечание. * — в растворе ван Харрсвсльда; * — в фосфатном буфере.
Рис. 23. Химические формулы некоторых изученных фталоцианинов: су-
льфированные производные фталоцианина цинка ZnPcSn (сверху), алюми-
ния AlPcSn (внизу слева) и фосфонового производного алюмофталоциани-
на PAlPc (внизу справа).
Fig. 23. Chemical formulae of studied sulphonated derivatives of zinc (ZnPcSn)
and aluminum (AlPcSn) phthalocyanines and phosphonated aluminum phthalo-
cyanine PAlPc (top; bottom, left and bottom, right, respectively).
Фотосенса, фотодинамическое действие которого изучалось
наиболее детально, приведены на рис. 23. Фотосенс обладал уз-
кой и интенсивной полосой поглощения света при 673 нм с
молярной экстинкцией е= 1.9105 М“'см ’. Кроме нее, наблюда-
лись еще два менее интенсивных пика при 348 и 605 нм соответ-
ственно. Спектр возбуждения флуоресценции Фотосенса был
сходен со спектром поглощения (рис. 24).
По данным Маргарона с соавт. (Margaron et al., 1996), суль-
фированные фталоцианины алюминия и цинка гидрофильны:
их коэффициенты распределения в системе л-октанол/вода, Кр,
меньше единицы. Они уменьшались при увеличении степени
сульфирования фталоцианинов, отражая увеличение гидрофиль-
ности (табл. 10).
При лазерном облучении (633 нм, 0.3 Вт/см2) сульфирован-
ные фталоцианины алюминия и цинка инактивировали механо-
2е+5
А
Длина волны к, нм
Рис. 24. Спектры поглощения (Л), флуоресценции (Б, сплошная линия) и
возбуждения (Б, пунктир) Фотосенса в растворе ван Харревельда.
Fig. 24. Absorption (Л), fluorescence (Б, solid line) и возбуждения (Б, dashed
line) spectra of Photosens in van Harreveld’s saline.
рецепторные нейроны рака в широком диапазоне концентраций
от 1 нМ до 10 мкМ и выше. Окта-Al и PAlPc в наших опытах
были менее эффективны; они инактивировали нейроны при кон-
центрациях более 10—40 нМ. Возможно, это было связано со
сдвигом длинноволновой полосы поглощения света до 686—
690 нм и значительно меньшим поглощением на волне 633 нм,
на которой проводилось облучение (табл. 9).
Сравнительно высокие концентрации изученных фталоциа-
нинов (более 10~7 М) вызывали возбудительные ответы В- или
ВТВ-типов в 72—100 % экспериментов. При меньших концент-
рациях увеличивался вклад тормозных процессов в реакции
Табл и ца 10
Коэффициенты распределения фталоцианинов
в системе л-октанол/вода (Кр)
Фотосснси- бнлнзатор V К И лр
AlPcS2adj& 0.069 —
AlPcS2oppe 0.034 —
AlPcSj 0.004 —
A1PcS4 <0.001 —
ZnPcS2 0.016 0.048
ZnPcSj 0.006 0.014
ZnPcS4 <0.001 0.0003
Примечание. & и £ соседнее и противоположное распо-
ложение сульфогрупп соответственно; * — по: Allen ct al.,
1995; # — по: Margaron ct al., 1996.
нейронов. Видимо, в последнем случае большую роль играет вы-
свобождение Са2+ из фотоповрежденных внутриклеточных орга-
нелл (Uzdensky et al., 2000b). В состав Фотосенса входят как гид-
рофильный A1PcS4, так и более гидрофобные AlPcS, и AlPcS3.
Разные компоненты Фотосенса могут обеспечивать фотопов-
реждение разных клеточных мишеней. Суммарная реакция клет-
ки при этом зависит от относительной степени их повреждения.
Для сравнения фталоцианиновых фотосенсибилизаторов
нами исследованы концентрационные зависимости времени
жизни нейронов Т(С) в диапазоне концентраций, вызывающих
инактивацию нейрона за практически значимое время: от 1 до
100 мин. Линейная аппроксимация зависимости Т(С) в двойных
логарифмических координатах (рис. 25) показала, что для всех
исследованных фталоцианинов коэффициент регрессии b был
примерно одинаковым: от -0.318 до -0.364 (табл. И). Поэтому
их фотодинамическая эффективность практически полностью
определялась величиной а. В соответствии с рис. 25, где графи-
ки Т(С) более эффективных фотосенсибилизаторов располага-
ются в левом нижнем углу, исследованные фталоцианины рас-
полагаются по фотодинамической эффективности в следующем
порядке:
ZnPcS2 > ZnPcS3 > Фотосенс > ZnPcS4 > PAlPc,
т. е. при облучении с длиной волны 633 нм фталоцианины цин-
ка были эффективней фталоцианинов алюминия. Кроме того,
Рис. 25. Зависимости времени жизни нейрона Т (мин) от концентраций
фталоцианиновых фотосенсибилизаторов С (мкМ).
1 н Г — PalPc, 2 и 2' — ZnPcS4, 3 и 3’ — Фотосенс, 4 и 4‘ — ZnPcSj, 5 и 5’ —
ZnPcS2. Гипотетические штриховые линии вычислены в предположении, что ней-
роны облучаются в максимуме поглощения фотосенсибилизаторов.
Fig. 25. Concentration dependencies of neuron lifetime for different phthalocy-
anines photosensitizers.
1 and /’ — PalPc, 2 and 2’ — ZnPcS4, 3 and 3’ — Фотосенс, 4 and 4' — ZnPcS3, 5 and
5' — ZnPcS2. Hypothetical dashed lines are calculated from suggestion that neurons are
irradiated with a wavelength corresponding to absorption maxima of photosensitizers.
T аблица 11
Статистические параметры, характеризующие зависимость
времени жизни нейрона от концентраций флавиновых
фотосснсибилизаторов ЩС)!
Фотосснси- билизатор Концент- рация, мкМ Число опы- тов Коэф- фициент корре- ляции, R Коэффициенты регрессии Коэф- фициент Стью- дента, 's< Коэф- фициент Фишера, F
lg «(1g д') Ь
Фотосенс 0.001 — 12 27 0.636 0.83 (0.02) -0.325 4.13 17.0
PAlPc 0.01—50 27 0.847 1.13(0.48) 0.350 7.96 63.4
Окта-Al 0.04--40 18 0.830 1.66 (0.75) 0.318 6.15 37.8
ZnPcS2 0.001—10 24 0.579 0.44 (0.44) 0.355 3.33 11.1
ZnPcS3 0.001 — 10 30 0.587 0.69 (0.58) 0.364 3.84 14.7
ZnPcS4 0.001—50 16 0.771 0.89 (0.33) 0.342 4.54 20.6
Примечание. # — для концентраций, измеренных в мкМ; величины а и Ь, как в
табл. 4.
более гидрофобный ZnPcS, оказался более эффективным, чем
ZnPcS3 и тем более, чем гидрофильный ZnPcS4, что согласуется
с данными литературы (Berg et al., 1989; Margaron et al., 1996).
Но если учесть разницу в поглощении света на длине волны
633 нм и в максимумах поглощения и ввести поправку, как дела-
лось в других сериях опытов, то при облучении нейронов светом
с длиной волны Хт (табл. 11) Фотосенс должен оказаться эффек-
тивней фталоцианинов цинка, a ZnPcS4 — эффективней ZnPcS3
(рис. 25):
Фотосенс > ZnPcS. > ZnPcS, == PAlPc > ZnPcS,.
Для высокой фотодинамической эффективности сенсибили-
заторов важна слабая концентрационная зависимость ДС), т. с.
небольшая величина показателя степени Ь. Наблюдавшиеся зна-
чения Ь от 0.318 до 0.364, т. е. примерно равные 1/3 (табл. 11)
свидетельствовали о том, что одна фотовозбужденная молекула
фталоцианина могла индуцировать в среднем три вторичных по-
вреждения, ведущих к инактивации нейрона. Ими могли быть
три цепочки перекисного окисления липидов, повреждающие
клеточные мембраны. Такие значения b были характерны имен-
но для фталоцианинов. Другие классы фотосснсибилизаторов
характеризовались другими величинами Ь. Например, для про-
изводных дейтеропорфирина IX были характерны значения от
0.22 до 0.30.
Итак, изученные фталоцианины алюминия и цинка оказа-
лись весьма эффективными сенсибилизаторами. Они изменяли
импульсную активность нейрона и вызывали ее необратимое
прекращение при наномолярных концентрациях на 2—3 поряд-
ка меньших, чем концентрации фотосенсибилизаторов, приме-
няемые в фотодинамической терапии.
Глава 12
ГИПЕРИЦИН КАК ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР
Гиперицин (Нур) — природный полициклический хинон
(рис. 26), выделенный из зверобоя продырявленного (Hypericum
perforatum) (Falk, 1999). Он оказался эффективным антидепрес-
сантом и анксиолитиком (Muldner, Zoller, 1984; Vandenbogaer-
dc et al., 2000), а также противовирусным агентом (Lavie et al.,
1995; Miskovsky, 2002). Высокий коэффициент экстинкции
вблизи 600 нм, высокий квантовый выход 'О, (порядка 0.7), низ-
кая темновая токсичность, фотостабильность, селективное на-
копление в опухолях, делают гиперицин перспективным сенси-
билизатором для фотодинамической терапии рака (Lavie et al.,
1995; Falk, 1999; Agostinis ct aL, 2002; Miskovsky, 2002). Яркая
флуоресценция, избирательное накопление опухолевыми тка-
нями и фотостабильность гиперицина позволяют использовать
его для визуализации опухолей как в ходе хирургической опе-
Рис. 26. Структура гиперицина.
Fig. 26. Hypericin structure.
рации, так и для ранней диагностики рака (D’Hallewin et aL,
2000).
Гиперицин гидрофобен и быстро агрегирует в водных рас-
творах, что ограничивает его медицинское применение. Для пре-
одоления этих трудностей недавно разработан водораствори-
мый препарат Hyp-S (Loew, Kubin, 2001), в котором гиперицин
связан водородными связями с линейными цепями поливинил-
пирролидона (рис. 27). Нанокластеры поливинилпирролидона
с молекулярной массой порядка 10—40 кДа служат водораство-
римыми носителями гиперицина. В Hyp-S сочетаются раствори-
мость в воде и высокое сродство к клеточным мембранам.
12.1 . Спектральные свойства и фотостабильность
гиперицина в растворе и в клетках
В водных растворах гиперицин агрегирует и выпадает в оса-
док. Его спектр поглощения в фосфатном буфере (pH 7.2) имеет
полосы 409, 556 и 596 нм (табл. 12). Растворение 1 цМ гипери-
цина в фосфатном буфере (pH 7.2), содержащем 1.5 цМ чело-
веческого сывороточного альбумина (ЧСА), предотвращало
Таблица 12
Характерные пики спектра поглощения гиперицина
в разных средах
Среда Длитель- ность об- лучения", мин Длина волны Х/Ах;А*
Фосфатный буфер3 0 — — 409/0.3 556/2.0 596
ЧСА6 0 280/2.2 330/1.4 380—500/0.7 559/0.8 599
95 ~280*/4.0 ~330*/1.4 400—480/1.1 559/0.9 599
ЧСА/Не° 0 ~280*/3.7 ~330*/2.1 370—500/0.9 558/0.9 599
95 ~280*/3.8 ~330*/2.2 370—500/1.2 565/1.0 603
4CA/D20' 0 286/2.1 323/1.4 370—500/0.6 556/0.8 596
95 ~280*/6.8 323/2.1 380—500/0.9 556/0.8 597
Примечание. а — фосфатный буфер, pH 7.2; б — 0.01%-ный (1.5 рМ) раствор
сывороточного альбумина человека (ЧСА) в фосфатном буфере с pH 7.2; в — раствор
ЧСА, через который 30 мин пропускали гелий; г — раствор ЧСА, приготовленный
на фосфатном буфере, содержащем D20 вместо воды; д — оранжевый свет (Хмакс =
= 600 нм, 100 мВт/см2); # — Asl — амплитуда пика около 600 нм, взятого за стандарт,
А^ — амплитуда пика на данной длине волны Л; * — плечо.
Рис. 28. Спектр поглощения света 1 мкМ гиперицина, растворенного в
1.5 мкМ растворе HSA в фосфатном буфере (pH 7.2).
Спектры зарегистрированы до и после облучения оранжевым светом (\nax =
600 нм; 100 мВт/см2) от 5 до 95 мин с дозами от 30 до 570 Дж/см2 соответственно.
Fig. 28. Absorption spectrum of Hypericin dissolved in 1.5 цМ HSA solution
in phosphate buffer (pH 7.2).
Spectra were registered before and after orange light irradiation (Xmax = 600 nm;
100 mW/ctn2; irradiation exposure varied from 5 to 95 min (corresponding doses were
from 30 to 570 J/cm2).
агрегацию. При этом изменялись его спектральные свойства
(Uzdensky et al., 20026). В спектре поглощения наблюдались по-
лосы 280 (белковая полоса), 330, 559, 599 нм и широкое плато
между 380 и 500 нм. Пик 599 нм становился основным и сущест-
венно превышал остальные (рис. 28; табл. 12). Эти спектральные
сдвиги отражали изменения состояния гиперицина — он ста-
новился мономерным и приобретал белковое микроокруже-
ние. Подобные спектры поглощения мономерного гиперицина
были зарегистрированы в этаноле (Senthil et al., 1992; Lenci et al.,
1995), диметилсульфоксиде (Kapinus et aL, 1999) и липосомах
(Lenci et aL, 1995).
Интересно разобраться в происходящих изменениях, а также
выяснить, что происходит с гиперицином при действии света.
Большинство фотосенсибилизаторов не отличаются фотостаби-
льностыо. Они разрушаются под действием света, и это препят-
ствует их применению в фотодинамической терапии. Вообще,
проблема фотостабильности красителей очень важна во многих
A
Рис. 29. Кинетика фотовыцветания гиперицина и аккумуляции фотопро-
дукта в разных экспериментальных условиях.
Индексы Фл и Воз относятся к спектрам флуоресценции и возбуждения; последу-
ющие числа — длины волн флуоресценции и возбуждения. ЧСА — 1 мкМ гипери-
цина растворен в 1.5 мкМ растворе ЧСА в фосфатном буфере (pH 7.2);
4CA/D2O — такой же раствор, но с D2O вместо Н?О; ЧСА/Не — такой же раствор
после продувания гелием; клетка — клетки WiDr после 1-часовой инкубации с
1 мкМ гиперицина в фосфатном буфере. А—В — падение поглощения света при
599 нм, флуоресценции при 600 нм и возбуждения флуоресценции гиперицина (за-
регистрированном по флуоресценции на 650 нм при возбуждении на длинах волн
592—598 нм) до и после облучения;. Г — кинетика накопления продукта фото-
трансформации гиперицина, зарегистрированная по флуоресценции при 524, 530
или 560 нм.
в
1.0
Возб 650/596ЧСЛ
Возб 648/5924CA/D2O
-А- Возб бООЧСА/Не
Возб 651/598клстка
о -Аг ПрВозб560/480ЧСА/Не
ь ПрВозб530/473клетка
S -ф- ПрВозб530/223клетка
0.1 -------1------------—J--------1-------1
0 20 40 60 80 100
Длительность облучения, мин
Fig. 29. Kinetics of hypericin photobleaching and accumulation of photopro-
ducts in various experimental conditions.
Indices Фл and Воз indicate excitation and emission spectra; following numbers — flu-
orescence and excitation wavelengths. ЧСА: 1 pM hypericin is dissolved in 1.5 pM
HSA solution in phosphate buffer (pH 7.2); 4CA/D2O — the same solution but contai-
ning D2O instead of H2O; 4CA/He — the same solution saturated with He; клетки —
WiDr cells after 1-hour incubation with 1 pM hypericin dissolved in 1.5 pM HSA solu-
tion in phosphate buffer (pH 7.2). A—В — fall of light absorption at 599 nm, fluorescen-
ce at 600 nm and excitation spectra after irradiation; Г— kinetics of accumulation of
products of hypericin phototransformation registered at fluorescence maxima 524, 530
and 560 nm.
Рис. 30. Спектры флуоресценции гиперицина (1 мкМ) в растворе ЧСЛ
(1.5 мкМ) в фосфатном буфере (Хвоз6 = 476 нм) до (сплошные линии) и по-
сле (прерывистые линии) освещения (Хмакс = 600 нм, 100 мВт/см2,
5—95 мин); справа — те же спектры, нормированные на амплитуду пика
при 600 нм.
Fig. 30. Fluorescence spectra of hypericin (1 pM) in HSA (1.5 pM) in phosp-
hate buffer saline (Xex = 476 nm) before (solid lines) and after (dashed lines)
light exposure (7max = 600 nm, 100mW/cm2, 5—95 min). The same spect-
ra but normalized by the amplitude of 600 nm peak arc shown on the right
panel.
областях от флуоресцентной микроскопии до живописи или тек-
стильной промышленности. Многие красители выцветают под
действием света, т. е. претерпевают фототрансформацию, струк-
турные изменения, приводящие к утрате их хромофорных
свойств.
Освещение гиперицина в растворе ЧСА оранжевым све-
том (Хмакс = 600 нм; 100 мВт/см2) не сдвигало полосы 559 и
599 нм, но постепенно снижало поглощение во всем спектре
(рис. 28). Кинетика фотовыцветания гиперицина представлена на
рис. 29, A (Uzdensky et al., 2002b).
Спектры флуоресценции гиперицина в растворе ЧСА содер-
жали полосы при 608 и 648 нм (рис. 30). Освещение снижало
оба пика и сдвигало основную полосу от 608 до 602 нм. При
этом в области 470—580 нм появлялась широкая полоса с
максимумом около 524 нм. Она лучше видна на рис. 30, В, где
все спектры нормированы на величину основного пика при
600 нм. Эта полоса соответствовала накоплению продуктов фо-
тотрансформации гиперицина с кинетикой, представленной на
рис. 29, Г.
Изучение спектров возбуждения флуоресценции даст инфор-
мацию о продуктах, ответственных за спектральные изменения
в фототрансформированном красителе. Облучение оранжевым
светом снижало все полосы возбуждения (рис. 31, Л; 29, В), заре-
гистрированные для основной полосы флуоресценции ги-
перицина: = 650 нм. Это соответствует убыли основной мас-
сы гиперицина при фотовыцветании. Но ситуация становилась
противоположной при регистрации спектров возбуждения на
длине волны 560 нм, соответствующей спектру флуоресценции
фотопродукта. Флуоресценция продуктов перестройки гипери-
цина не регистрировалась, если препарат не облучали. Но после
освещения оранжевым светом появлялся спектр с максимумами
при 243, 339, 387 и 477 им (рис. 31, В; 29, Г), в целом похожий
на спектры поглощения и возбуждения гиперицина. Видимо, фо-
топродукт не слишком отличается от гиперицина по своему
строению.
Для исследования участия кислорода в фототрансформации
гиперицина и образовании фотопродукта мы изучили этот про-
цесс в гипоксических условиях после получасового продувания
гелия через кювету с раствором гиперицина. Отсутствие сдвигов
в спектрах поглощения, возбуждения и флуоресценции указыва-
ло на то, что кислород не участвует в фотовыцветании гипери-
цина, связанного с ЧСА. Этот процесс также не был фотосенси-
билизированным и происходил без участия синглетного кисло-
рода: он не усиливался в растворе, где Н,0 была заменена на
D.,0, в которой время жизни ’О, увеличивается на порядок и со-
ответственно усиливаются все процессы, связанные с синглет-
ным кислородом (Gorman, Rodgers, 1989).
Каково состояние гиперицина в клетках? После инкубации
клеток аденокарциномы человека WiDr с гиперицином основ-
ной пик его флуоресценции был сдвинут в синюю область до
602 нм по сравнению с 608.5 нм в растворе ЧСА. Отношение ам-
плитуды этого пика к амплитуде следующего: (АМ2/А651 = 3.2)
было выше, чем в растворе ЧСА (1.9) (рис. 32). Облучение кле-
ток оранжевым светом вызывало появление широких полос
флуоресценции при 470—580 и 615—635 нм (рис. 32). Послед-
A
Гиперицин/ЧСА
о
Длина волны, нм
Рис. 31. Спектры возбуждения флуоресценции гиперицина (1 мкМ) в рас-
творе ЧСА (1.5 мкМ) в фосфатном буфере (Хвоз6 = 476 нм) до (сплошные
линии) и после (прерывистые линии) освещения (Хмакс = 600 нм,
100 мВт/см2, 5—95 мни). А — А.фП = 650 нм, Б — Х(|,„ =560 нм.
Fig. 31. Fluorescence excitalion spectra of hypericin (1 pM) in HSA (1.5 pM)
solution in phosphate buffer saline before (solid lines) and after (dashed lines)
light exposure (imax = 600 nm; 100 mW/cm2, 5—95 min). A — Xcm = 650 nm,
Б — Km =560 nm.
няя полоса не наблюдалась в органических растворителях или в
растворе с ЧСА. Вероятно, она была обусловлена фототранс-
формацией гиперицина в липидном микроокружении клеточных
мембран. Спектры возбуждения гиперицина в клетках WiDr при
регистрации флуоресценции на волне 651 нм аналогичны поло-
сам гиперицина в растворе HSA, за исключением красного сдви-
га полос 282 и 333 нм на 7—10 нм (рис. 33, А). Облучение не
Рис. 32. Спектры флуоресценции гиперицина (1 мкМ) в клетках WiDr до
(сплошные линии) и после (прерывистые линии) освещения (Хмакс =
600 нм, 100 мВт/см2, 5—95 мни); справа — те же спектры, нормирован-
ные на амплитуду пика при 600 нм.
Fig. 32. Fluorescence spectra of hypericin (1 цМ) in suspension of WiDr cells
before (solid lines) and after (dashed lines) light exposure (Xmax = 600 nm,
100 mW/cm2, 5—95 min). The same spectra but normalized by the amplitude
of 600 nm peak are shown on the right panel.
сдвигало, но снижало полосы, что отражало фотовыцветание
красителя (рис. 33, Л). В клетках оно происходило медленнее,
чем в растворе (рис. 29). Спектры возбуждения, зарегистриро-
ванные при Хфп= 530 им (рис. 33, б), соответствовали появлению
фотопродукта (рис. 31,5’). Облучение клеток усиливало полосы
в широком диапазоне от 220 до 360 нм и индуцировало появле-
ние новой полосы при 430—500 нм с максимумом при 470 нм.
Эти отличия от спектров гиперицина в растворе ЧСА указывают
на то, что в клетках фототрансформация гиперицина протекает
несколько иначе, чем в комплексе с этим белком (Uzdensky et al.,
2002b). О чем говорят эти спектральные данные? Положение
основной полосы флуоресценции гиперицина около 600 нм, в
отличие от полос поглощения света и возбуждения флуоресцен-
Длина волны, нм
Рис. 33. Спектры возбуждения флуоресценции гиперицина (1 мкМ) в
клетках WiDr до {сплошные линии) и после (прерывистые линии) освеще-
ния (Хмакс = 600 нм, 100 мВт/см2, 5—95 мин), зарегистрированные на дли-
нах волн 651 нм (Л) и 530 нм (Б).
Fig. 33. Fluorescence excitation spectra of hypericin (1 цМ) in suspension of
WiDr cells before (solid lines) and after (dashed lines) light exposure (^max =
600 nm, 100 mW/cm2, 5—95 min) registered at 651 (A) and 530 nm (Б).
ции, было чувствительно к микроокружению и фотовоздейст-
вию. Она сдвигалась от 595 нм в метаноле до 598 нм в DMSO
(Das et al., 1999), 600 нм в липосомах (Lenci et al., 1995), 602 нм
в клеточных мембранах и 608.5 нм в растворах ЧСА. Красный
спектральный сдвиг обычно происходит при повышении вязко-
сти микроокружения хромофора, когда подвижность молекул
ограничена и больше энергии расходуется на реорганизацию
среды вокруг возбужденной молекулы хромофора. По данным
Даса с соавт. (Das et al., 1999), гиперицин образует водородную
связь между карбонильным кислородом и группой N(-H трипто-
фана W214 в ЧСА. Эта жесткая связь ограничивает конформа-
ционные изменения молекулы. В клетках гиперицин локализу-
ется преимущественно в гидрофобном липидном микроокруже-
нии внутри мембран, где он сравнительно подвижен. Еще выше
подвижность молекул гиперицина в DMSO и метаноле, где на-
блюдается более коротковолновая флуоресценция.
При фоторазрушении органических красителей обычно об-
разуются фрагменты, не поглощающие видимый свет, т. е. про-
исходит фотовыцветание (Bonnett et al., 1999). Фотовыцветание
сенсибилизаторов ослабляет фотоинактивацию клеток и разру-
шение опухолей в ходе фотодинамической терапии (Moan, 1986;
Bonnet et al., 1999). Фальк (Falk, 1999) описывает следующие
возможные фототрансформации гиперицина, которые могут
повлиять на его спектральные свойства: фототаутомеризация с
внутримолекулярной миграцией протона между гидроксильной
и карбонильной группами; дспротонирование; конформацион-
ные переходы типа «пропеллер-бабочка»; изменение микроок-
ружения, например, конформационные изменения альбумина
или фотоокисление мембранных липидов, влекущие за собой из-
менения связывания гиперицина. Существующие данные не по-
зволяют выбрать какой-то из этих механизмов фотообесцвечи-
вания гиперицина, а также идентифицировать продукт его фото-
трансформации (Uzdensky et al., 2002b).
Согласно нашим данным, гиперицин весьма фотостаби-
лен. Он обесцвечивается при дозах облучения, значительно
превышающих дозы фотовыцветания порфиринов и хлоринов
и сопоставимых с дозами фотообесцвечивания фталоцианинов
(табл. 13). Дозы BD50, обесцвечивающие сенсибилизаторы на
50 %, можно ранжировать следующим образом (Uzdensky et al.,
2002b):
тТНРС < Фотофрин II < Н2Рс = Zn Рс < AlPcCl <
< гиперицин < AlPcS.
Таблица 13
Дозы света (BD50), обесцвечивающие фотосепсибилизаторы
па 50 % (по: Uzdensky et al., 2002b)
Фотосеисибилизатор Среда Вид спектра BD5(), Дж/см2
Гиперицин Раствор HSA Поглощение 200
Раствор HSA Флуоресценция ~70
HSA + D2O 54
HSA + Не 66
Клетки WiDr 100
Кожа мыши 140
HSA То же 60
HSA + D,0 50
HSA + Не 60
Клетки WiDr НО
Фотофрин II Клетки Поглощение 3
NHIK 3025 Флуоресценция 0.3—2
Опухоль мыши То же 115—135
тТНРС Клетки V79 1'о же 0.1—0.2
Кожа мыши 0.2—0.1
Н2Рс Раствор BSA Поглощение 5
ZnPc 5
AlPcCl 36
AlPcS >220
Начальные спектральные сдвиги гиперицина происходят
при дозах порядка 30 Дж/см2, намного больших доз, убивающих
90 % клеток (около 4 Дж/см2) (Uzdensky et al., 2001с).
12. 2. Локализация гиперицина в клетках
Для выяснения возможных мишеней фотодинамического
действия гиперицина мы сравнили его внутриклеточное распре-
деление с локализацией известных флуоресцентных зондов: Mi-
toTracker Green, селективно флуорохромирующего митохонд-
рии, LysoTracker, который выявляет лизосомы, и ERTracker, ло-
кализующийся в мембранах эндоплазматического ретикулума и
аппарата Гольджи. Изучались три вида опухолевых клеток чело-
века с разной морфологией и способностью образовывать коло-
нии: аденокарциномы толстой кишки WiDr, карциномы матки
NHIK и глиобластомы D54Mg (Uzdensky et al., 2001c). Флуорес-
центные и фазово-контрастные изображения клеток приведены
на рис. 34 и 35 соответственно. Также изучено распределение
гиперицина и Hyp-S в более сложном препарате — изоли-
рованном рецепторе растяжения рака, состоящем из двух типов
клеток — сенсорных нейронов и окружающих глиальных клеток
(рис. 36).
Лизосомы, флуорохромированные зондом LysoTracker, были
представлены в виде разбросанных в цитоплазме гранул разного
размера. В различных клетках митохондрии имели разную ве-
личину и форму. Они выглядели как гранулы в клетках WiDr,
гранулы и фибриллы в клетках NHIK и длинные фибриллы в
клетках D54Mg. Фибриллярная морфология в клетках NHIK и
D54Mg, вероятно, отражает присутствие в них митохондриона, а
гранулярная соответствует дискретным органеллам. Распределе-
ние ERTracker в клетках выявляло две компоненты: (а) относи-
тельно слабо флуоресцирующее кольцо вокруг ядра, меньшее,
чем область, занимаемая лизосомами и митохондриями; (б) ярко
флуоресцирующая область с одной стороны ядра, обычно иден-
тифицируемая как область локализации комплекса Гольджи
(Malik et aL, 1997).
Клетки, окрашенные гиперицином, обладали яркой красной
флуоресценцией. Она была фотостабильной и выцветала под
возбуждающим светом гораздо медленней, чем флуоресценция
других красителей и фотосснсибилизаторов. Распределение
флуоресценции гиперицина более походило на распределение
флуоресценции ERTracker (рис. 34), что свидетельствовало о его
преимущественной локализации в мембранах эндоплазматиче-
ского ретикулума и аппарата Гольджи. Это соответствует дан-
ным других исследователей (Thomas, Pardini, 1992; Weber et aL,
1994; Vandcnbogaerte ct aL, 1997). Гиперицин не окрашивал
плазматические мембраны, но аккумулировался в межклеточ-
ном пространстве между тесно контактирующими клетками
WiDr внутри колоний, вероятно, задерживаясь в гликокаликсе.
Распределение гиперицина в клетках WiDr, окрашенных при
температуре 4 °C, когда энергозависимый эндоцитоз был подав-
лен, было таким же, как и при 25 °C. Следовательно, гиперицин
проникает в клетки скорее за счет диффузии, чем эндоцитоза.
В работе Thomas, Pardini (1992) поглощение гиперицина не по-
давлялось при ингибировании синтеза АТФ, что также свидете-
льствовало о большей роли диффузии, чем пиноцитоза в про-
никновении гиперицина в клетку.
WiDr
Lyso
Tracker
Mito
Tracker
NIHK
D54Mg
Рис. 34. Локализация LysoTracker, MitoTracker Green, ERTracker и гиперицина в клетках WiDr, NIHK 3025 и D54Mg.
Об. 40х ВИ (по: Uzdensky et al., 2001с).
Fig. 34. Localization of LysoTracker, MitoTracker Green, ERTracker and hypericin in WiDr, NIHK. 3025 and D54Mg cells.
Objective 40x WI (Uzdensky et al., 2001c).
NIIIK
WiDr
Lyso
Tracker
Mito
Tracker
D54Mg
Рис. 35. Фазово-контрастные изображения тех же клеток, что и на рис. 33.
Об. 40х ВИ (по: Uzdensky et al., 2001с).
Fig. 35. Phase contrast images of the same cells as in fig. 33.
Objective 40x W1 (Uzdensky et al., 2001c).
Культивируемые клетки, лежащие изолировано, легко до-
ступны для красителя. В реальных тканях, состоящих из раз-
ных типов клеток распределение красителей намного сложней.
Так, в рецепторе растяжения рака, инкубировавшемся 30 мин с
2—5 цМ гиперицина или Hyp-S, красно-оранжевая флуоресцен-
ция обнаруживалась преимущественно в глиальной оболочке
вокруг механорецепторного нейрона (рис. 36, А, Е, соответст-
венно). Это свидетельствует о возможности избирательной фо-
тодинамической деструкции глиальной ткани и, в частности,
при лечении глиом — опухолей мозга глиального происхожде-
ния. Близлежащие нейроны при этом могут повреждаться зна-
чительно меньше. Это, разумеется, необходимо проверить как
на экспериментальных животных, так и в клинике. Яркая и ста-
бильная флуоресценция гиперицина, который хорошо проника-
ет в клетки глиобластомы может быть весьма полезной для
флуоресцентной визуализации глиом при нейрохирургических
операциях.
12. 3. Темновая токсичность и фототоксичность
гиперицина и Hyp-S
При концентрации до 10 мкМ гиперицин не влиял на выжи-
ваемость клеток WiDr в темноте, и только при 31 мкМ выживае-
мость клеток падала примерно на 27 % (рис. 37, A) (Uzdensky
et al., 2001с). В опытах на нейронах рецепторов растяжения реч-
ного рака гиперицин в концентрации более 20 мкМ постепенно
тормозил импульсную активность нейрона вплоть до полного ее
прекращения в течение первого часа действия. Меньшие кон-
центрации гиперицина не инактивировали нейрон. Концентра-
ции гиперицина менее 4—6 мкМ не влияли на импульсацию
МРН. Это свидетельствует о его низкой токсичности (Uzdensky
et al., 2003). Hyp-S сильнее действовал на нейроны, чем гипери-
цин: при концентрации 10 или 20 мкМ импульсная активность
прекращалась в среднем через 40 и 20 мин соответственно. Но
при концентрациях менее 4 цМ он не нарушал импульсную ак-
тивность в течение 2—4 ч и более. Его большая цитотоксич-
ность может объясняться лучшей его доставкой к нейронам (Uz-
densky et al., 2003). В целом чувствительность нейронов к темно-
вому действию Нур или Hyp-S была того же порядка, что и у
раковых клеток.
В концентрации 1 мкМ гиперицин эффективней убивал клет-
ки WiDr при освещении их оранжево-красным светом (560—
A
Доза облучения, Дж/см2
Рис. 37. Выживаемость клеток WiDr при действии гиперицина.
А — в темноте, Б — при действии оранжевого света (560—680 нм, 6 мВт/см2). Для
сравнения приведены кривые выживаемости клеток, фотосенсибилизированных
Фотофрином И и тТНРС (по: Uzdensky et al., 2001с).
Fig. 37. Survival of WiDr cells incubated with Hypericin.
A — in the darkness, Б — under orange light exposure (560—580 nm, 6 mW/ст2). For
comparison, cells photosensitized with Photofrin II and тТНРС are also shown (Uzden-
sky et al., 2001c).
680 нм, 600 нм; 6 мВт/см2), выделенным светофильтрами
из спектра галогеновой лампы, чем известные фотосенсибилиза-
торы Фотофрин II и тТНРС (рис. 37, Б). LD50 для гиперицина
составляла примерно 1.8 Дж/см2.
ФД воздействие гиперицина (от 0.1 до 20 мкМ) или Hyp-S (от
0.2 до 4 мкМ) вызывало необратимое прекращение импульсной
активности механорецепторного нейрона рака (Uzdensky et al.,
2003). В 64 % опытов с гиперицином и в 47 % опытов с Hyp-S
Рис. 38. Зависимость времени жизни нейрона от концентрации гипери-
цинов.
/ — гиперицин, 2 — Hyp-S.
Fig. 38. Concentration dependencies of neuron lifetime for hypericins (1) and
Hyp-S (2).
/ — hypericin, 2 — Hyp-S.
первой фазой реакции нейронов было учащение импульсации.
Следовательно, первой мишенью для фотодинамического дейст-
вия гиперицина в большей части опытов могла служить плазма-
тическая мембрана, а для Hyp-S — как плазматическая мембра-
на, так и цитоплазматические органеллы, возможно, вследствие
лучшей доставки гиперицина внутрь нейрона. Инглишь с соавт.
(English et al., 1999) также показали, что фотовозбуждение гипе-
рицина необратимо повреждает нейрональную мембрану. Пре-
кращение нейронной активности после постепенного торможе-
ния наблюдалось в 57 и 80 % опытов соответственно (Uzdensky
et al., 2003). Это свидетельствует о перераспределении гипери-
цина в облученной клетке и проникновении его во внутрикле-
Т аблнца 14
Статистические параметры, характеризующие зависимости
времени жизни нейронов от концентраций гиперицина и Hyp-S
Фотосснси- билиэатор Концент- рация, цМ Число опы- тов Коэф- 1 фициент! коррс- |— ЛЯЦИИ, | V-R 1 Соэффициснты регрессии Коэф- фициент Стыодсн- та, fSl Коэф- фициент Фишера, Г
1g а ь
Гиперицин 0.1—20 14 0.86 1.77 -0.42 5.88 34.7
Hyp-S 0.2-Л 15 0.90 1.58 -0.69 7.28 53.0
Примечание. Величины а и Ь, как в табл. 4.
точные органеллы. Этот процесс был более выражен для Hyp-S
по сравнению с гиперицином. Судя по концентрационным зави-
симостям (рис. 38, табл. 14), Hyp-S был эффективней гиперици-
на при концентрациях более 0.5 мкМ. При меньших концентра-
циях оба сенсибилизатора были неэффективными и практически
нс инактивировали нейрон. В обоих случаях показатель степени
b не сильно отличался от 0.5 (-0.42 или -0.69 соответственно,
табл. 14), т. с. поглощение фотона молекулой гиперицина могло
инициировать в среднем два вторичных повреждения, ведущих
к инактивации нейрона.
Таким образом, гиперицин и Hyp-S действовали в микромо-
лярном диапазоне концентраций. Это было, вероятно, связано с
их затрудненной доставкой к нейрону. Макромолекулы ЧСА
или наночастицы ПВП, несущие молекулы гиперицина, могли
задерживаться в узком межклеточном пространстве среди глиа-
льных оболочек и медленнее проникать в нейрон. Время инкуба-
ции нейронов с гиперицином в наших опытах, не превышающее
1 ч и достаточное для их сенсибилизации другими красителями,
было, видимо, недостаточным для существенной аккумуляции
гиперицина в теле нейрона, и поэтому он концентрировался пре-
имущественно в глиальных оболочках. Этот факт, однако, дает
надежду на селективное повреждение опухолей мозга глиально-
го происхождения с относительным сохранением нейронов при
фотодинамической терапии с использованием гиперицина или
его растворимых форм типа Hyp-S.
Глава 13
ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ
НА НЕЙРОН РИБОФЛАВИНА И ДРУГИХ
ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ
13. 1. Рибофлавина
Как известно, синий свет наболее активен по сравнению с
другими частями видимого спектра. Спектр действия фотоин-
дуцированного изменения нейронной активности имел «фла-
виновый» максимум при 460 нм (Uzdensky, 1993; Uzdensky, Sav-
ransky, 1997). Такое воздействие сильней всего повреждает
внутренние мембраны митохондрий, в которые встроены бел-
ки-переносчики электронов, несущие хромофорные группы —
флавины, гемы и железо-серные центры (Федоренко, Узденский,
1986). Синее лазерное изучение (442 нм) эффективно инактиви-
ровало флавопротеин сукцинатдегидрогеназу, что позволило
предположить, что в непигментированных нейронах именно
флавиновые соединения служат эндогенными фотосенсибилиза-
торами (Узденский, 1987; Uzdensky, 1993; Uzdensky, Savransky,
1997). Поэтому представляло интерес выяснить реакции нер-
вных клеток на фотосснсибилизацию экзогенными флавинами.
В отличие от выше изученных сенсибилизаторов, рибофлавин
известен как фотосенсибилизатор первого типа, генерирующий
при освещении супероксид-анион (О/“) (Schmidt, Butler, 1976).
Поэтому такое исследование позволяло сравнить фотодинамиче-
скую эффективность рибофлавина и сенсибилизаторов II типа.
Экзогенный рибофлавин (10~4 М) сам по себе ускорял инак-
тивацию изолированных нейронов в темноте. Если неокрашен-
ные нейроны после изоляции генерировали импульсы в темноте
10—12 ч, то в присутствии рибофлавина — только 4—5 ч, а за-
тем их активность тормозилась и прекращалась (табл. 15). При
Таблица 15
Фотодинамическая инактивация нейрона рибофлавином
№ Условия эксперимента Число опытов Время жизни, МИИ
1 Голубой свет, 0.25 Вт/см2 6 162±28
2 Рибофлавин, 10"4 М рибофлавина 5 288±36
3 Рибофлавин, 10-5 М + голубой свет 6 122±21
4 Рибофлавин, Ю^1 М + голубой свет 23 37±3**|.2,з
Примечание. ** — Достоверные отличия от вариантов 1,2 и 3; р>0.01.
освещении нейронов голубым светом (400—550 нм, 0.25 Вт/см2)
в отсутствие рибофлавина нейронная активность прекращалась
в среднем через 2.7 ч (табл. 15), что могло быть обусловлено
сенсибилизацией нейрона эндогенными флавинами.
В опытах по фотосенсибилизации рибофлавином заметная
инактивация нейрона отмечалась только при концентрации бо-
лее 10 5 М. При этой концентрации импульсная активность пре-
кращалась после продолжительного торможения в среднем за
122 мин, а при 10’4 М — 37 мин (табл. 15) (Дергачева и др.,
2005). К моменту прекращения нейронной активности, вызван-
ного фотосснсибилизацией рибофлавином (10‘4 М), как и спустя
4 ч, примерно у половины нейронов была повреждена цитоплаз-
матическая мембрана, что позволяло пропидиум-иодиду прони-
кать в клетку и флуорохромировать ядро, что свидетельствовало
о развитии некротического процесса (табл. 16). В этот момент,
однако, активность сукцинатдегидрогеназы в теле нейрона не
отличалась от контрольной. Только спустя 4 ч активность этого
фермента снижалась вдвое (табл. 16), что свидетельствует о сни-
жении производства АТФ в клетке. При этом существенных
Таблица 16
Влияние фотодинамического действия 1(М М рибофлавина
на некроз нейронов и активность в нем сукципатдегидрогеназы
Время после
фотосснсибилизации, ч
Некроз
нейронов, %
Активность
сукцииатдсгидрогеназы,
отн. ед.
Контроль
0
4
10 ± 7 (19)
55 ± 11 **(22)
50 ± 19* (8)
0.34 ± 0.04(16)
0.36 ± 0.04(12)
0.18 ± 0.01** (7)
Примечание. В скобках приведено число опытов. * —р < 0.05, ** —р<0.01.
изменений размеров и морфологии ядер нейронов, в частности
характерных для апоптоза пикноза и фрагментации ядер, не
наблюдалось. Аналогичное замедленное падение активности сук-
цинатдегидрогеназы наблюдалось и при фотосенсибилизации
нейрона Фотосснсом (Uzdensky et al., 2002а).
Таким образом, фотосенсибилизация нейронов экзогенным
рибофлавином может изменять их импульсную активность и за-
тем приводить к некрозу. Известно, что при взаимодействии
фотовозбужденных молекул флавинов с кислородом в присут-
ствии доноров электронов, например, цитохромов, образуется
супероксид-анион и перекись водорода (Schmidt, Butler, 1976).
Супсроксид-анион считается основным цитотоксическим аген-
том при фотосенсибилизации клеток рибофлавином (Ortel et al.,
1990).
Фотосенсибилизирующая способность рибофлавина оказа-
лась существенно меньшей, чем у изученными нами сенсиби-
лизаторов второго типа: фталоцианинов, порфиринов или хло-
ринов (Uzdensky et al., 2000b; 2001b, 2004в). Для фотоинактива-
ции нейронов рибофлавином требовались концентрации более
10-5-—Ю'4 М, тогда как упомянутые ФС были эффективны при
концентрациях, меньших на 3 и более порядков. Интенсивность
голубого света в наших экспериментах (0.25 Вт/см2) была при-
мерно такой же, что и интенсивность красного света (0.3 Вт/см2)
в опытах с сенсибилизаторами второго типа, а молярная экс-
тинкция рибофлавина в растворе ван Харревельда (pH 7.4)
при X = 443 нм была того же порядка или всего на один поря-
док ниже экстинкции других фотосснсибилизаторов: (около
12 500 М_|см~'; Брагин, Узденский, неопубликованные данные).
Поэтому меньшая эффективность рибофлавина может быть свя-
зана не с поглощением меньшего количества фотонов, а с мень-
шей цитотоксичностью О,' - по сравнению с 1О?.
Через 4 ч после прекращения облучения доля некротических
нейронов с поврежденной плазматической мембраной была та-
кой же, как и сразу после ФД воздействия (табл. 16). Значит, по-
вреждение плазмалеммы при фотосснсибилизации рибофлави-
ном происходило только во время облучения, а не после него,
как, например, при ФД действии Фотосенса (Uzdensky et al.,
2002а). В последнем случае, вероятно, инициировалась цепочка
вторичных темновых реакций, продолжавшихся после прекра-
щения облучения, а при фотосенсибилизации рибофлавином —
нет. В этом, вероятно, была еще одна причина меньшей фотоди-
намической эффективности рибофлавина по сравнению с фото-
сенсибилизаторами второго типа.
Итак, ФД воздействие рибофлавина инактивирует нейрон,
повреждает его цитоплазматической мембрану и вызывает раз-
витие некротических процессов. Существенное нарушение био-
энергетических процессов в нейроне обнаруживается через 4 ч
после фотоиндуцированного прекращения импульсации.
13. 2. Метиленовый синий
Метиленовый синий давно известен как эффективный фото-
генератор 'О2 (Nilsson et al., 1972). В последнее время он привле-
кает внимание как перспективный сенсибилизатор для фотоди-
намической терапии рака (Klccmann,1990) и как бактерицидный
агент (Zeina ct al., 2001). В наших экспериментах метиленовый
синий показал себя как весьма эффективный фотосенсибилиза-
тор (Uzdensky, Mironov, 1999; Узденский и др., 2000). Во всех
опытах он вызывал импульсные реакции нейрона В-типа, в
основе которых, вероятно, лежали нарушение ионной прони-
цаемости нейрональной мембраны, деполяризация, учащение
импульсации и последующий деполяризационный блок. Стой-
кая деполяризация нейронов ракообразных и млекопитающих
и активация их импульсной активности при фотосенсибили-
зации метиленовым синим была описана ранее (Бурмистров
и др., 1969, Kress et al., 1997). Причинами этого были замедление
инактивации натриевых каналов и блокирование калиевых кана-
лов (Kress et al., 1997). Концентрационная зависимость времени
жизни нейрона Т(С) была близка к квадратичной (Ь =-1.82)
(табл. 17), т. е., для блокирования нейронной активности нужно
было фотовозбуждение двух молекул метиленового синего.
Таблица 17
Статистические параметры, характеризующие зависимость
время жизни нейрона (7) от концентраций метиленового синего
и януса зеленого В
Фотосснси- билизатор Концснт- кисло Коэф- фициент корре- ляции, R Коэффициенты регрессии Коэф- фициент Стъю- дента, fst Коэф- фициент Фишера, F
рация, мкМ опы- тов 1g а b
Метиленовый синий 0.05—0.5 и -0.864 -0.47 -1.87 5.14 26.4
Янус зеленый В 0.1—10 12 -0.530 + 1.46 -0.25 1.98 3.9
Примечание. # — величины а и Ь, как в табл. 4.
13. 3. Янус зеленый В
Янус зеленый В селективно окрашивает митохондрии в жи-
вых клетках (Lazarov, Cooperstein, 1953). Фотосенсибилизация
клеток янусом зеленым позволила селективно повреждать мито-
хондрии сфокусированным лазерным микролучом (Baba, 1970).
В наших опытах янус зеленый был менее эффективен, чем
другие фотосенсибилизаторы. Он действовал при концентраци-
ях 0.1—ЮмкМ. Время фотоинактивации нейрона превышало
15 мин даже при наибольшей изученной концентрации януса зе-
леного (10 мкМ) (Uzdensky, Mironov, 1999).
ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ
В результате сравнительного изучения фотодинамического
действия 34 фотосенсибилизаторов (трех производных гема-
топорфирина, протопорфирина IX, шести производных дей-
теропорфирина IX; двенадцати производных хлоринов ей и р6;
тТРНС, шести фталоцианинов А1 и Zn; гиперицина и его водо-
растворимого комплекса, метиленового синего, януса зеленого и
рибофлавина) на импульсную активность механорецепторных
нейронов рака можно сделать следующие заключения:
— Механорецепторные нейроны рака весьма чувствительны
к ФД воздействию: нано- и в ряде случаев пикомолярными
концентрации фотосенсибилизаторов вызывали изменения их им-
пульсной активности и необратимую инактивацию. Их функцио-
нальная инактивация может служить индикатором фотоповреж-
дения клетки. Изолированные нейроны рецептора растяжения
рака могут служить модельными объектами для изучения кле-
точных механизмов фотодинамического эффекта на клеточном уров-
не, тестирования и сравнения новых фотосенсибилизаторов.
— Фотосенсибилизация нейрона вызывала фазные измене-
ния импульсной активности и в итоге — необратимое прекраще-
ние импульсации. При интенсивном фотодинамическом воздей-
ствии преобладали возбудительные реакции нейронов с учаще-
нием импульсации и последующим резким и необратимым ее
прекращением по типу деполяризационного блока. При слабом,
но продолжительном воздействии — тормозные реакции, когда
нейронная активность прекращалась в результате постепенного
торможения.
Такие разнонаправленные изменения нейронной активно-
сти могли быть обусловлены воздействием на разные клеточные
Т абл и ца 18
Величины параметра b в концентрационных
зависимостях Т(С) = а-106 для разных классов
фотосенсибилизаторов
Класс фотосснсибилизаторов b
Производные гематопорфиринов 0.40—0.93
Производные дейтеропорфиринов 0.22—0.30“
Производные хлорина еь 0.43—1.86
Производные хлорина р6 0.58—0.77
Сульфированные фталоцианины 0.318—0.364
Гиперицины 0.42—0.69
Метиленовый синий 1.87
Янус зеленый В 0.25
Примечание, а — кроме 2,4diOHbu (b = 0.46).
мишени — плазматическую мембрану и кальцийдепонирующие
органеллы: митохондрии и/или эндоплазматический ретикулум.
Поэтому по направлению изменений импульсной активности в
начале или в конце импульсной реакции нейрона можно предва-
рительно судить о том, какие мишени более чувствительны к
ФД воздействию, и повреждение каких из них ответственно за
инактивацию нейрона.
— Концентрационные зависимости продолжительности
импульсной реакции нейрона на ФД воздействие Г(С) можно
было аппроксимировать степенной функцией Т(С) = а- 10ь, в ко-
торой показатель степени b характеризовал число молекул сен-
сибилизатора, участвующих в элементарном акте, приводящем
к инактивации нейрона. Оказалось, что разные классы фотосен-
сибилизаторов характеризуются определенными величинами b
(табл. 18). Довольно узкие интервалы b для сенсибилизаторов
разных классов свидетельствовали об общих механизмах их ФД
действия. Так, для производных дейтсропорфирина IX были
характерны значения b от 0.22 до 0.30 или примерно 1/3—1/5,
для фталоцианинов — от 0.32 до 0.36 или примерно 1/3, для
производных хлорина рь — от 0.58 до 0.77 или от 1/2 до 1, для
гиперицинов -— 0.42 или 0.69. Это указывало на участие одной
молекулы фотосенсибилизатора в 3—5, 3, 1—2 или 2 элементар-
ных актах фотоинактивации нейронов, соответственно. Для про-
изводных хлорина е6 был характерен значительно больший раз-
брос значений Ь: от 0.43 до 1.87, что указывало на большее раз-
нообразие механизмов их ФД действия. Фотосенсибилизаторы с
малыми значениями Ь, были более эффективными в диапазоне
малых концентраций.
Эти зависимости позволяют сравнивать фотодинамическую
эффективность фотосенсибилизаторов. С помощью такого под-
хода мы выявили наиболее эффективные сенсибилизаторы в
каждом классе. Этот метод может быть использован при отборе
новых фотосенсибилизаторов, перспективных для фотодинами-
ческой терапии.
— Фотодинамическая эффективность фотосенсибилизато-
ров зависит от их физико-химических свойств, особенно, моляр-
ной экстинкции и амфифильности. По нашим оценкам, наиболее
эффективны амфифильные фотосенсибилизаторы, у которых
гидрофобные и гидрофильные группы расположены в разных
частях молекулы. Они могут пересекать мембраны и проникать
в клетку благодаря внедрению гидрофобной части молекулы
в мембрану и последующему выходу из нее в водную среду с
помощью гидрофильной части. Коэффициент распределения
фотосенсибилизатора между неполярной и полярной средой,
например, между л-октанолом и водой /С , характеризующий ам-
фифильность фотосенсибилизатора, должен быть не слишком
малым, чтобы липофильные красители проникали в мембраны,
но и не слишком большим, чтобы они там не задерживались на-
долго, пересекали их и проникали в глубь клетки. По нашим
данным, оптимальны значения К в пределах 10—30 (Uzdensky
et al., 2000b, 2001b, 2004).
ЧАСТЬ III
КЛЕТОЧНО-МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ
ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
НА НЕЙРОНЫ И ГЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ
При фотодинамической терапии опухолей мозга возможно
поражение не только опухолевых, но и нормальных нервных
и глиальных клеток. В отличие от других тканей, повреждение
отдельных нейронов мозга может иметь критическое значение
для всего организма. Кроме того, при ФД воздействии на любые
соматические опухоли всегда оказывается попутное воздействие
на периферические нервные элементы в окружающих тканях.
Фотоповреждение нервов вызывает болевой эффект и другие
побочные явления. Но неврологическим проявлениям фото-
динамической терапии, оказывалось недостаточное внимание.
Поэтому мы исследовали феноменологию и механизмы фото-
повреждения нормальных нервных и глиальных клеток. Особое
внимание уделялось изучению процессов межклеточной и внут-
риклеточной сигнализации, управляющих реакциями нейронов
и глии на фотодинамическое воздействие. В качестве фотосен-
сибилизатора был выбран сульфированный алюмофталоциа-
нин — Фотосенс, показавший хорошие результаты при фотоди-
намической терапии опухолей (Странадко, Иванов, 2004).
Глава 14
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ
ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ НЕЙРОНОВ
И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
14. 1. Импульсные реакции нейрона
на фотодинамическое воздействие Фотосенса
Основные типы импульсных реакций нейронов на ФД воз-
действие Фотосенса, как и других фотосенсибилизаторов, пред-
ставлены на рис. 16 (Uzdensky, Mironov, 1999; Узденский и др.,
A
Рис. 39. Импульсные реакции нейрона на фотодинамическое действие
10-5 (А) и 10~7М (Б) Фотосенса.
Левая стрелка указывает момент добавления Фотосенса, правая — начало облучения.
Fig. 39. Impulse responses to photodynamic effect of 10-5 (A) and 10-7 M (Б)
Photosens.
Left arrow indicates the moment of Photosens application, right — irradiation start.
2000). Мы изучали реакции нейронов на интенсивное (10-5 М)
или сравнительно слабое (10-7 М) ФД воздействие Фотосенса1
(рис. 39). В первом случае преобладали реакции В-типа, в ко-
торых после фазы резкой активации импульсная активность
1 Интенсивность фотодинамического воздействия определяется количе-
ством квантов, поглощенных клеткой в единицу времени. Оно может быть
обусловлено как световым потоком, так и числом поглощающих молекул в
клетке, которое зависит от наружной концентрации фотосенсибилизатора.
Строго говоря, связь внутриклеточной и наружной концентрации красителя
может отличаться от линейной, но очевидно, что увеличение наружной кон-
центрации вызывает повышение внутриклеточной концентрации. Так как ин-
тенсивность лазерного излучения была одинакова во всех опытах, то говоря о
более или менее интенсивном фотодинамическом воздействии, мы подразу-
меваем разные концентрации сенсибилизаторов.
Рис. 15. Схема эксперимента по изучению ФД воздействия на МРН и ГК.
AI...брюшная нервная цепочка рака; А2 — рецептор растяжения; АЗ - вырезае-
мые кусочки панциря, на которых крепится рецептор растяжения; Ы — мсханорс-
цепторная мышца; Б2 — мсханорсцспторный нейрон; БЗ — аксон; Б4 — глиальная
оболочка; В! кювета; В2 — подопытный рецептор; ВЗ контрольный рецеп-
тор; В4 — регулятор растяжения рецепторной мышцы; В5 — присасывающиеся
электроды; В6 — добавление фотосснсибилизатора или модификатора; В7 — ла-
зер; Г! усилитель; Г2 импульсная активность подопытного нейрона; ГЗ —
частотограмма подопытного нейрона; Г4 — импульсная активность контрольного
нейрона; Г5 — частотограмма контрольного нейрона (по: Лобанов, 2007).
Fig. 15. The scheme of experiments for study of PDT effect on crayfish mecha-
noreceptor neuron and surrounding glial cells.
Al ..abdominal nerve cord; A2 - stretch receptor; A3 - carapace pieces with attac-
hed receptor muscles; Б1 — mechanorcccptor muscle; Б2 — mcchanorcccptor neuron;
БЗ — axon; Б4 — glial envelope; Bl — cuvette; B2 — experimental receptor; B3 —
control receptor; B4 device for receptor muscle extension; B5 - sucking electrodes;
B6 — adding of photosensitizer and modifier; B7— laser; /7 — amplifier; Г2 — activi-
ty of the treated neuron; ГЗ — firing frequency of the treated neuron; Г4 — activity of
the control neuron; Г5 firing frequency of the control untreated neuron (After: Loba-
nov, 2007).
A
Связи линейных цепей с лактамовыми группами PVP
Рис. 27. Молекулярная модель (//), демонстрирующая одну из возможных
трехмерных конфигураций надмолекулярного комплекса «гипери-
цин—поливинилпирролидон (PVP)» и схема предполагаемых водород-
ных связей (прерывистые красные линии) между гиперицином и лактамо-
выми группами поливинилпирролидоновой матрицы (Б) (по: Uzdensky
et al., 2003).
Fig. 27. Molecular model (A) showing a hypothetic 3D configuration of the su-
permolacular complex “hypericin-polyvinylpyrrolidon” (PVP)”. Red dashed li-
nes on (Б) indicate possible location of hydrogen bonds between hypericin and
lactam groups of poluvinylpyrrolidon matrix (no: Uzdensky et al., 2003).
Рис. 36. Локализация Hyp-S (3 мкМ; А, Б) и гиперицина (2 мкМ; В, Г) в
изолированном рецепторе растяжения рака после 30-минутной инкуба-
ции.
А и В — флуоресцентные изображения; Бп Г— фотографии тех же препаратов в
проходящем свете. Зеленая флуоресценция на А и В — собственная флуоресцен-
ция нейрона. Об. бОх; водная иммерсия (по: Uzdensky et al., 2003).
Fig. 36. Localization of Hyp-S (3 pM; А, Б) and hypericin (2 pM; В, Г) in iso-
lated crayfish stretch receptor after 30-min incubation.
A and В — fluorescence; Б and Г— brightfield images of the same preparations. Green
fluorescence on A and В — neuron autofluorescence. Objective 60xWI (Uzdensky et al.,
2003).
.4
Рис. 40. Локализация Фотосенса (10~5 М) в механорецепторном органе
речного рака.
А и В — область тела нейрона; Б и Г— область аксона. А и В — флуоресценция. Б
и Г проходящий свет. Масштаб: 50 мкм. Об. бОх (но: Uzdensky et al., 2005).
Fig. 40. Localization of 10~5 M Photosens in the crayfish mechanoreceptor or-
gan.
A and В — region around neuron body; Б and Г— axon region. A and В — fluorescence.
Б and Г brightficld illumination. Scale bar 50 pm. Objective 60xWI (no: Uzdensky
ct al., 2005).
Рис. 42. Ядра глиальных клеток в рецепторе растяжения речного рака.
А и В — контрольные препараты; Б н Г— препараты, сенсибилизированные Фо-
тосснсом (10 7 М) и сфотографированные через 8 ч после ФДТ. Двойное флуорох-
ромирование с помощью Hoechst 33342 и проиидиум-иодидом позволяет выявить
ядра живых глиальных клеток голубого цвета со структурированной кариоплаз-
мой. нпкнотичсские сморщенные ядра со сконденсированным хроматином, ядра
некрот ических клеток с поврежденной нлазмалеммой и фрагментированные апои-
тозпыс ядра. А и Б— область тела нейрона; Ди/’— участок аксона. Об. 40х; мас-
штабно мкм (но: Uzdensky ct al.. 2005).
Fig. 42. Glial nuclei in the crayfish stretch receptor.
A and В — control preparations; Б and Г— preparations photosensitized with 10 7 M
Photosens and photographed 8 h after the treatment. Double fluorochroming with Ho-
echst 33342 and propidium iodide reveals blue nuclei of alive cells with structured kary-
oplasm, shrinked piknotic nuclei with condensed chromatin, red nuclei of necrotic cells
with injured plasma membrane, through which propidium penetrates into the cell, and
fragmented nuclei of apoptotic cells. (A and Б) the region around neuron body; (5 and
Г) — the initial axon of axon. Objective 40xWI. Seale bar 40 pm (no: Uzdensky ct al.,
2005).
Рис. 66. Смерть нейронов и сателлитных глиальных клеток после локаль-
ной инактивации тела нейрона сфокусированным лазерным лучом.
.4 — контрольный препарат. В центре ядро нейрона, окруженное более мелкими
ядрами глиальных клеток. Б — локальный некроз клеточных ядер (в круге), вы-
званный сфокусированным лазерным микрооблучснием. Микрофотография сде-
лана через 3 мин после лазерного воздействия. В — препарат, подвергнутый до-
полнительному общему лазерному облучению 7-часовой инкубации при комнат-
ной температуре. Некроз нейрона и большинства глиальных клеток (красные
ядра). На вставке показаны ядра глиальных клеток, окружающие проксимальный
фрагмент аксона. Некоторые из них фрагментированы (стрелки), что отражает
апоптоз этих клеток. Масштаб: 50 мкм; об. 60х ВИ (по: Uzdensky et al., 2005).
Fig. 66. Death of satellite glial cells after local inactivation of the neuron body
by the focused laser beam.
A — control preparation. Big neuron nucleus in the center is surrounded by numerous
small glial nuclei. Б — local cell necrosis (in the circle) caused by focused laser microir-
radiation. The preparation was photographed 3 min after laser microiradiation. В — the
microirradiated preparation additionally subjected to total laser irradiation with lower
intensity during 30 min and following 7-hour incubation in the darkness. Necrosis of ne-
urons and the most of glial cells (red nuclei). Inset: nuclei of glial cells around proximal
axon fragment. Some of them are fragmented (arrows) that indicates apoptosis. Scale
bar 50 pm. Objective 60xWI (no: Uzdensky et al., 2005).
Рис. 71. Схема сигнальных механизмов, участвующих в фотоиндуциро-
ванной инактивации и смерти нейрона.
Красные стрелки обозначают активацию, синие линии — ингибирование указан-
ных процессов, установленное в проведенных опытах. Черные стрелки соответс т-
вуют данным литературы. Красные молнии обозначают клеточные мишени фото-
динамического действия. Желтые прямоугольники — изученные компоненты сиг-
нальных путей, зеленые — клеточные процессы.
Fig. 71. Signaling pathways involved in photoinduced inactivation and death of
neurons.
Red arrows indicate activation and blue lines inhibition of these processes, which has
been determined in the experiments described above. Black arrows correspond to litera-
ture data. Red lightnings — possible cellular targets of photodynamic effect. Yellow rec-
tangles - studied components of signaling pathways, green rectangles — studied cellu-
lar processes.
Рис. 72. Схема сигнальных механизмов, участвующих в фотоиндуциро-
ванной пролиферации и смерти глиальных клеток.
Обозначения, как на рис. 71.
Fig. 72. Signaling pathways involved in photoinduced proliferation and death
of glial cells.
Notations arc the same as in fig. 71.
внезапно прекращалась (как при деполяризационном блоке), в
среднем за 2.5 мин. Менее интенсивное воздействие (10“7М)
приводило к постепенному торможению и необратимому пре-
кращению импульсации (Т-реакция), в среднем за 21 мин (Уз-
денский и др., 2000).
Мы рассматривали необратимое прекращение импульсации
нейрона, т. е. его функциональную инактивацию, как предвест-
ник предстоящей смерти. Активация импульсации нейрона
была, вероятно, связана с нарушением проницаемости плазмати-
ческой мембраны и деполяризацией нейрона. Механизмы тор-
мозных процессов, преобладавшие при низких концентрациях
фотосенсибилизатора (<10“7 М) и последующей смерти нейро-
на, были не ясны. Поэтому они были более подробно изучены.
В качестве рабочей гипотезы предполагалось, что торможение
импульсации обусловлено повреждением внутриклеточных ор-
ганелл и нарушением кальциевого гомеостаза (Uzdensky et al.,
2000, 2002).
14. 2. Локализация Фотосенса в рецепторе растяжения
рака и клетках глиобластомы
После 30-минутной инкубации Фотосенс (10“5 М) локали-
зовался преимущественно в глиальной оболочке, окружающей
нейрон, и, вероятно, в нейрональной мембране (Kolosov et al.,
2003; Uzdensky et al., 2005). При 10“7 M флуоресценция Фотосен-
са была слишком слаба для регистрации. Распределение красной
флуоресценции Фотосенса было диффузным (рис. 40), в отличие
от гранулярного распределения в культивируемых клетках гли-
областомы D54Mg (рис. 41), обусловленного локализацией во-
дорастворимых алюмофталоцианинов в лизосомах (Berg, Moan,
1994). Детали внутриклеточного распределения Фотосенса в ци-
топлазме глиальных клеток, формирующих многослойную обо-
лочку вокруг нейрона нельзя было рассмотреть из-за их особой
рулетоподобной морфологии. В теле нейрона красная флуорес-
ценция Фотосенса была слабее, чем в глие. Она перекрывалась
зелено-голубой аутофлуоресценцией пиридиннуклеотидов и
флавинов митохондрий (рис. 40). Слабая диффузная флуорес-
ценция цитоплазмы свидетельствует о меньшей концентрации
Фотосенса внутри клетки. Но и этого количества хватало, чтобы
придать нейронам и глие высокую фоточувствительность.
По данным Берга с соавт. (Berg et al., 1989а), ди-, три- и тет-
расульфированные алюмофталоцианины, входящие в состав Фо-
Рис. 41. Локализация Фотосенса (10"6 М, 30-минутная инкубация) в куль-
тивируемых клетках глиобластомы D54Mg,
А — флуоресценция Фотосенса, Б — фазово-контрастное изображение того же
препарата. Об.бЗх. Масштаб: 50 мкм.
Fig. 41. Localization of Photosens (IO 6 M, 30-min incubation) in cultured gli-
oblastoma D54Mg cells.
A — fluorescence, Б — phase contrast image of the same preparation. Objective 60xWI.
Scale bar 50 pm.
тосенса, аккумулируются в клетках пропорционально степени
гидрофобности. Внутрь клетки попадает больше гидрофобного
AlPcS? и меньше гидрофильного AIPcS4. Последний попадает в
клетку с эндоцитозом и локализуется, главным образом, в эндо-
сомах и лизосомах, но в ходе облучения может диффузно пере-
распределяться в цитоплазме (Moan et al., 1994; Ruck ct al.,
1996). При этом его флуоресценция возрастает вследствие мо-
номеризации при связывании с клеточными белками и мембра-
нами, тогда как в кислой водной среде внутри лизосом он нахо-
дился в фотохимически неактивном агрегированном состоянии
(Moan ct al., 1994).
14. 3. Морфологические изменения
фотосенсибилизированных нейронов
на светооптическом уровне
В контрольных препаратах краситель Hoechst 33342, спе-
цифически флуорохромирующий ядерный хроматин, выявлял
крупные ядра нейронов, круглые или овальные, с равномерно
распределенными мелкими глыбками хроматина, четкой грани-
цей и круглым ядрышком (рис. 42, А). ФД воздействие вызывало
сжатие тел и ядер нейронов (рис. 42, Б). Этот процесс оцени-
Таблица 19
Влияние фотодинамического воздействия Фотосенса
на площадь тела и ядра нейрона, оцениваемого с помощью
флуорохромирования Hoechst 33342 или выявления
сукцинатдегидрогеназы (СДГ)
Концентрация Фотосенса, М Время после фотодина- мического, воздействия, ч Площадь ядра нейрона (Hoechst), мкм2 Площадь ядра нейрона (СДГ), мкм2 Площадь тела нейрона (СДГ), мкм2
0 — 730±50 730±30 3000±270
10~7 0 — 740±90 2800±310
1—2 680±30 — —
3—6 520±30*1,3 530±30*' 1900±230*1,2
>10 460±20*1,3,9 — —
10“5 0 — 1130±180*' 2000±460
1—2 600±40 — —
3—6 510±50*' 715±210 1800±270*'
>10 600±30 — —
Примечание. * — достоверные отличия (р < 0.05) от вариантов, обозначенных
цифрами.
вался как с помощью флуорохромирования ядер красителем
Hoechst 33342, так и путем измерения площади ядер и тел нейро-
нов на препаратах, окрашенных для гистохимического выявле-
ния сукцинатдегидрогеназы. В последнем случае окрашивалась
богатая митохондриями перинуклеарная область тела нейрона, а
ядра оставались неокрашенными (Uzdensky et al., 2002а). Эти из-
мерения, сделанные в разное время после ФД воздействия, до-
полняли друг друга. Динамика данного процесса зависела от ин-
тенсивности этого воздействия. В контроле средняя площадь
ядер и тел нейронов составляла 730 и 3000 мкм2 соответственно
(табл. 19). Интенсивное ФД воздействие (10-5 М Фотосенса) сра-
зу после инактивации нейрона (0 ч) вызывало сжатие перинук-
леарной области тел нейронов до 2000 мкм2, но одновременно
приводило к увеличению площади ядер почти на 60 %. Набу-
хание ядер характерно для некроза и не наблюдается при апоп-
тозе. Через 1—2 ч после ФД воздействия площади ядер сни-
жались до контрольного уровня, а через 3—6 ч становились ни-
же его (табл. 19).
При меньшей концентрации Фотосенса (10“7 М) в первые
1—2 ч после инактивации нейрона средние площади тела и ядра
8
*** I
** 2
I 2 3
Рис. 43. Среднее время повреждения плазматической мембраны после фо-
тодинамического воздействия Фотосенса.
1 — контроль, 2 — 10-7 М, 3 — 10‘ 5 М, ** — р < 0.01,*** — р < 0.001.
Fig. 43. Mean time required for neuronal membrane lesion after photosensitiza-
tion with Photosens.
1 — Control, 2 — 10-7 M, 3 —10-5 м, ** — pcO.Ol,*** — p< 0.001.
нейрона не отличались от контроля. Но через 3—6 ч после
прекращения импульсации происходило их сжатие (табл. 19).
При этом исчезало ядрышко, увеличивались хроматиновые гра-
нулы, и усиливалась их флуоресценция, что свидетельствовало о
более плотной упаковке ДНК.
При интенсивном ФД воздействии (Фотосенс, 10“5 М) крас-
ная флуоресценция пропидиум-иодида наблюдалось в ядрах
нейронов сразу после прекращения импульсной активности, т. е.
мембрана повреждалась еще во время облучения. При слабом
воздействии (10“7 М) ядра нейронов начинали флуоресцировать
в среднем через 1.7 ч после инактивации нейрона (рис. 43). Ве-
роятно, основной мишенью ФД воздействия 10-5М Фотосенса
была плазматическая мембрана, и нейроны погибали от некроза.
При меньшей концентрации Фотосенса (10-7М) более сущест-
венным могло быть ФД воздействие на другие клеточные струк-
туры, вызывающее торможение нейронной активности. Потеря
целостности цитоплазматической мембраны и развитие некроза
с 1.7-часовой задержкой могли быть опосредованы какими-то
внутриклеточными процессами, возможно, перекисным окис-
лением липидов и/или активацией фосфолипаз (Uzdensky et al.,
2002а).
Мы ни разу не наблюдали характерной для апоптоза фраг-
ментации нейрональных ядер или группирования хроматина в
большие плотные массы, хотя апоптоз глиальных клеток наблю-
дался довольно часто (Uzdensky ct al., 2002а, 2005, 2007). Воз-
можно, в мсханорецепторных нейронах рака, важных для управ-
ления движениями, а, следовательно, и выживания животного,
апоптоз внутренне заблокирован.
14. 4. Морфологические изменения
фотосенсибилизированных глиальных клеток
на светооптическом уровне. Некроз и апоптоз
Изучение глиальных клеток затруднено их особой морфоло-
гией: они формируют многослойную оболочку вокруг нейрона,
но не плотную, как в миелине. Поэтому с помощью световой
микроскопии невозможно рассмотреть детали строения их цито-
плазмы. Ядра нормальных глиальных клеток, окружающих тела
нейронов, были округлыми, а вокруг аксонов — вытянутыми
(рис. 42). Внутри они содержали 2—3 десятка гранул сконденси-
рованного хроматина ярко флуоресцирующих голубым цветом.
В некротических клетках, иногда наблюдавшихся в контроль-
ных препаратах, пропидиум-иодид проникал в клетку через
поврежденную плазматическую мембрану и придавал ядрам
красную флуоресценцию. В апоптозных глиальных клетках ядра
частично фрагментировались, и ядро оказывалось окруженным
более мелкими круглыми фрагментами. Иногда наблюдалась
полная фрагментация глиальных ядер (рис. 42, Г). Так мож-
но было различить ядра живых, некротических и апоптозных
клеток.
Глиальные клетки оказались весьма чувствительными к ФД
воздействию (Kolosov et al., 2003; Uzdensky et al., 2005). В конт-
рольных препаратах обычно встречалось около 10 % некроти-
ческих глиальных клеток, у которых ядра флуорохромирова-
лись пропидиум-иодидом (рис. 42, А, В; 44, А). Возможно эти
клетки повреждались в ходе выделения рецептора растяжения.
ФД воздействие прогрессивно увеличивало количество некроти-
ческих клеток до 30 % через 0.5 ч и до 51 % через 8 ч после воз-
действия (рис. 44, А). В контрольных препаратах практически
не наблюдались апоптозпые глиальные клетки с фрагменти-
рованными ядрами (рис. 42, А В; 44, В). Но число апоптозных
клеток резко увеличивалось через 8 ч после ФД воздействия
(рис. 44, В). К этому моменту также достоверно повышалась
численность глиальных клеток вокруг тел нейронов (рис. 42, В;
44, В). Это явление напоминало реактивный глиоз, т. е. пролифе-
рацию глии в поврежденных нервах (McMillan ct al., 1994; Bruce
et al., 2000).
Апоптоз глиальных клеток,
Численность ядер глин, отн. ед. отн. ед. Некроз глиальных клеток, %
70
60
50
40
30
20
10
0
40
30
20
10
0
50
40
30
20
10
0
А
। I без воздействия
***
14. 5. Ультраструктурные изменения
фотосенсибилизированного нейрона
Электронно-микроскопическое исследование, проведенное
совместно с д. б. н. Г. М. Федоренко (Федоренко и др., 2002; Uz-
densky et al., 2002а; Fedorenko, Uzdensky, 2008), выявило измене-
ния ультраструктуры на разных фазах реакции нейронов на ФД
воздействие 10-7 М Фотосенса. Фотосенсибилизированные ней-
роны изучались через 5 мин после начала облучения, когда их
импульсная активность только начинала изменяться (группа 2);
сразу после 30-минутного ФД воздействия, которое вызвало
прекращение импульсной активности нейрона (группа 3) и че-
рез 1 ч после ФД воздействия (группа 4). Структура этих ней-
ронов сравнивалась со структурой контрольных нейронов, ре-
гулярно генерировавщих импульсы с частотой порядка 10 Гц в
течение примерно 2 ч и не подвергавшихся воздействию (груп-
па 1).
В ядрах контрольных нейронов (рис. 45, А) наблюдались
дисперсно-распределенные небольшие глыбки умеренно скон-
денсированного хроматина и извилистая кариолемма с неболь-
шими выпячиваниями. Цитоплазма изобиловала полисомами и
цистернами гранулярного эндоплазматического ретикулума, что
свидетельствовало об интенсивном белковом синтезе. В перика-
рионе содержались многочисленные округлые митохондрии с
умеренно плотным матриксом и хорошо развитыми кристами.
Часто наблюдались агрегаты из 10 и более контактирующих ми-
тохондрий с повышенной электронной плотностью в участках
контакта (рис. 45, А—Г). В теле нейрона были рассеяны скопле-
ния зерен гликогена, являющегося значительным источником
энергии. Гладкий эндоплазматический ретикулум в перикарионе
был представлен небольшими (50—100 нм) округлыми или вы-
тянутыми цистернами неправильной формы. Диктиосомы обыч-
Рис. 44. Морфологические изменения глиальных клеток после фотодина-
мического воздействия Фотосенса (10-7М).
А — динамика фотоиндуцировапного некроза глиальных клеток; Б — динамика
развития апоптоза глии; В —динамика численности глиальных клеток на площади
100x100 мкм2 вокруг тела нейрона; * —р < 0.05, ** —р < 0.01, *** —р < 0.001.
Fig. 44. Morphological changes in glial cells after photodynamic effect of
10~7 M Photosens.
A — dynamics of necrosis development in glial cells; Б — dynamics of apoptosis deve-
lopment in.glial cells; В — dynamics of glia density at the 100x100 pm2 area around ne-
uronal body. Significant difference: * —p < 0.05, ** —p < 0.01, *** — p < 0.001.
Рис. 45. Ультраструктура контрольного нейрона.
А — центральная часть тела клетки, х28000; Б и В — перикарион, х40000; Г— пе-
риферический участок сомы, х35000; ga - аппарат Гольджи, ger - гранулярный
эндоплазматический ретикулум, gl — гранулы гликогена, L — лизосомы, пи --
микротрубочки, п - ядро, р — полисомы, рт — плазматическая мембрана.
Fig. 45. Ultrastructure of the control neuron.
A — Central part of a neuronal body, x28000; Б and B a perkaryon, x40000; Г — pe-
riphery of a soma, x35000; ga — Golgi apparastus, ger — granular endoplasmic reticu-
lum, gl — glycogen granules, L — lysosome, mt — mictotubule, n — nucleus, p — poly-
some, pm — plasma membrane.
ио представляли собой стопки, состоящие из 3—5 плоских цис-
терн и округлых пузырьков (рис. 45, А, Б). Иногда встречались
округлые диктиосомы (рис. 45, В), находящиеся, возможно, в
неактивном, ждущем состоянии. Аксон, дендриты и перифери-
ческая часть сомы были заполнены пучками многочисленных
регулярно расположенных микротрубочек. Рядом с плазмалем-
мой в цитоплазме располагались многочисленные митохондрии
и скопления гликогеновых гранул (рис. 45, Г).
Уже через 5 мин после начала ФД воздействия, когда им-
пульсная активность нейрона только начинала изменяться, на-
блюдались явные ультраструктурные изменения. Отмечались
разрежения ядерного хроматина, сконденсированный хроматин
практически отсутствовал, а в кариоплазме отмечались неболь-
шие электронно-прозрачные участки размером 50—200 нм
(рис. 46, А). В цитоплазме появлялись крупные вакуоли (порядка
1 мкм) нерегулярной формы с извилистыми краями (рис. 46, А).
Они могли происходить из периферических областей цистерн
аппарата Гольджи (рис. 46, Б). Иа этой стадии реакции нейро-
на наблюдались многочисленные диктиосомы. Некоторые из
цистерн были сжаты, а остальные — набухли (рис. 46, Б, Г).
Часто диктиосомы выглядели как скопление пузырьков
(рис. 46, В,Д), что могло отражать их разборку (Shorter, Warren,
2002). Многочисленные лизосомы были разбросаны в цитоплаз-
ме (рис. 46, А—Д). Иногда митохондрии были окружены элект-
ронно-плотной оболочкой (рис. 46, С, стрелка), что, возможно,
отражало формирование аутофагосом (рис. 46, г). Гранулярный
эндоплазматический ретикулум и полисомы наблюдались реже,
чем в контроле. Ультраструктура митохондрий варьировала.
Некоторые из них не отличались от контрольных. Другие содер-
жали как электронно-прозрачные участки с разрушенными кри-
стами, так и участки с нормальной структурой (рис. 46, Г). Мно-
гие митохондрии были удлиненными и образовывали агрега-
ты (рис. 46, А, Г). В целом ультраструктурные изменения на
этой стадии были, скорее, функциональными, чем патологиче-
скими.
30-минутное ФД воздействие инактивировало нейрон (им-
пульсация прекращалась за 20—30 мин) и вызывало более зна-
чительные нарушения ультраструктуры цитоплазмы по срав-
нению с 5-минутным воздействием. При этом существенных
структурных изменений в ядре не отмечено (рис. 47, А). Но в ци-
топлазме сразу после воздействия наблюдалось множество ваку-
олей неправильной формы, размером 0.2—1 мкм. Они могли
происходить из фотоповрежденных митохондрий, цистерн аппа-
рата Гольджи, эндоплазматического ретикулума или субмемб-
ранных цистерн. Митохондрии были весьма гетерогенными. На
одной и той же микрофотографии (рис. 47, Б) наблюдались ми-
тохондрии с нормальной ультраструктурой, с полностью разру-
шенными матриксом и кристами, а также, что очень необычно,
митохондрии с локальной деструкцией матрикса и крист в одной
Рис. 46. Ультраструктура нейрона, зафиксированного через 5 мин после
начала фотодинамического воздействия 10-7М Фотосенса.
А — ядро и псрикарпон, звездочка — поврежденный участок митохондрии, мале-
нькая стрелка — электронно-прозрачный участок ядра, х28000; Б — образование
вакуоли на периферии аппарата Гольджи; # — вакуоль неправильной формы,
х40000; В и Г— участки цитоплазмы, х50000 и х35000 соответственно. Большая
стрелка на /’указывает на митохондрию, обернутую дополнительными мембрана-
ми, из которых может сформироваться аутофагосома (ар на В); Д — перифериче-
ский участок, х50000; ga -• аппарат Гольджи, ger.гранулярный эндоплазмати-
ческий ретикулум, gl — гранулы гликогена, L — лизосомы, mt — микротрубочки,
п - ядро, р - - полисомы, рт — плазматическая мембрана.
Fig. 46. Ultrastructure of the neuron fixed after 5-min photosensitization with
IO? у Photosens.
A — nucleus and perikaryon, asterisk — the injured mitochondria part, small arrow —
an electron-transparent region in the nucleus, x28000; Б — vacuole formation at Golgi
periphery, respectively; il - - the irregular shape vacuole, x40000: В and Г— cytoplasm
половине (звездочки) и нормальной ультраструктурой — в дру-
гой половине той же органеллы. Причем никакой видимой гра-
ницы между разрушенной и нормальной половиной этих мито-
хондрий не наблюдалось (рис. 47, Б). Некоторые митохондрии
содержали внутри электронно-плотный материал (рис. 47, Б, Г,Д).
Они, возможно, поглощались многочисленными лизосомами.
Митохондриальные агрегаты, наблюдавшиеся в контрольных
препаратах, распадались на меньшие группы или отдельные ми-
тохондрии (рис. 47, А—Д). Диктиосомы встречались значитель-
но реже, чем в контрольных клетках. Некоторые их цистерны
сильно набухали, а другие — сжимались (рис. 47, В). Гранулы
гликогена, полисомы и гранулярный эндоплазматический рети-
кулум практически исчезали (рис. 47, Б—Д). Многослойные
аутофагосомы наблюдались преимущественно на периферии тел
нейронов (рис. 47, Г). Разрывов плазматической мембраны не
наблюдалось. Через 1 ч после ФД воздействия отмечены даль-
нейшие изменения ультраструктуры нейрона. В ядре наблюда-
лись как электронно-плотные гранулы, размером 50—200 нм,
так и электронно-прозрачные участки (рис. 48, А). Ядерная обо-
лочка сохраняла целостность, но становилась более извилистой
по сравнению с предыдущей стадией. Это коррелировало со
сжатием ядра, наблюдавшимся во флуоресцентно-микроскопи-
ческом исследовании (Uzdensky et al., 2002а). Практически все
митохондрии набухли до 2—3 мкм и стали круглыми или оваль-
ными. Их матрикс стал электронно-прозрачным, а кристы —
фрагментированными. Цистерны эндоплазматического ретику-
лума набухли. Гранулярный эндоплазматический ретикулум,
полисомы, аппарат Гольджи, гранулы гликогена отсутствовали
(рис. 48). В цитоплазме наблюдалось множество маленьких
электронно-плотных гранул, являвшихся, видимо, деградирую-
щими митохондриями или вторичными лизосомами. На этой
стадии, в отличие от предыдущих, отмечены разрывы плазмати-
ческой мембраны (рис. 48, Б). В целом изменения ультраструк-
туры цитоплазмы были более однородны и типичны для умира-
ющей некротической клетки.
Таким образом, в реакции нейрона на ФД воздействие вовле-
кались практически все клеточные структуры. Структурные из-
менения внутриклеточных органелл проявлялись уже в первые
regions, х50000 and х35000. Big arrow at Г indicates mitochondria enveloped by addi-
tional membranes — formation of an autophagosome (ар); Д — peripheral region,
x50000; ga — Golgi apparatus, ger — granular endoplasmic reticulum, gl — glycogen
granules, L — lysosome, mt — mictotubule, n — nucleus, p — polysome, pm — plasma
membrane.
Рис. 47. Ультраструктура нейрона, фиксированного после 30-минутного
фотодинамического воздействия 10-7 М Фотосенса.
А — ядро и перикарион, х 18000; £и В — перикарион, х35000; Г иД— перифери-
ческие участки, х50000 и Х24000 соответственно. Звездочки на Б — участки дест-
рукции внутри митохондрий, ga — аппарат Гольджи, L — лизосомы, sc — субмем-
бранные цистерны, х — электронно-плотный материал внутри митохондрий.
Стрелки на Г показывают аутофагосомы.
Fig. 47. Ultrastructure of the neuron fixed after 30-min photosensitization with
1О-7 M Photosens.
A — nucleus and perikaryon, xl 8000; Б and В — perikaryon, x35000; Г and Д — perip-
heral regions, x50000 and x24000, respectively. Asterisks on Б indicate destructed regi-
ons inside mitochondria; ga — Golgi apparatus, L — lysosome, sc — submembrane cis-
tern, x intramitochondrial electron-dense material. Arrows at /’indicate mitochondria
autophagosomes.
Рис. 48. Ультраструктура нейрона, зафиксированного через 1 ч после фо-
тодинамического воздействия 10-7 М Фотосенса.
А — ядро и перикарион, х28000; Б — периферический участок, х50000. Малые
стрелки на А указывают на электронно-прозрачные участки в ядре, стрелки на
5 — разрывы плазматической мембраны.
Fig. 48. Ultrastructure of the neuron fixed 1 hour after 30-min photosensitizati-
on with 10"7 M Photosens.
A — nucleus and perikaryon, X28000; 5— peripheral region, x50000. Small arrows at
A indicate electron-transparent regions in the nucleus; arrows on 5 indicate ruptures of
the plasma membrane.
минуты воздействия, когда импульсная активность еще только
начинала изменяться. Уже через 5 мин после начала облучения
нарушалась структура отдельных митохондрий. Появление вы-
тянутых митохондрий и их агрегация могли отражать процессы
оптимизации энергетического метаболизма. Некоторое набуха-
ние цистерн эндоплазматического ретикулума, вероятно, было
направлено на поддержание ионного баланса в клетке. Эти сдви-
ги можно считать адаптационными.
Более длительное, 30-минутнос воздействие вызывало силь-
ные повреждения цитоплазматических органелл изолированных
механорецепторных нейронов рака, особенно митохондрий и ап-
парата Гольджи. Оно также истощало запасы гликогена и пре-
кращало белковый синтез в клетке. Известно, что первичными
мишенями ФД воздействия являются места локализации фото-
сенсибилизатора (Moan, 1990). Однако, несмотря на инфор-
мацию ряда исследователей о преимущественном накоплении
алюмофталоцианинов в лизосомах (Peng ct al., 1991, 1996; Berg,
Moan, 1994, 1997; Malham et al., 1996), наши результаты свиде-
тельствуют о том, что в митохондриях и аппарате Гольджи на-
капливалось достаточно фотосенсибилизатора, чтобы вызвать
разрушение их мембран. Эти органеллы, а также эндоплазмати-
ческий ретикулум являются первичными мишенями для фотоди-
намического действия малых концентраций Фотосенса. Обраща-
ла на себя внимание локальность виутримитохондриальных из-
менений — разрушение крист и просветление матрикса в одной
части митохондрии и отсутствие видимых изменений в другой.
Возможно, это было связано с неравномерным накоплением в
них фотосенсибилизатора. Вероятным следствием фотоповреж-
дения этих органелл может являться высвобождение депони-
рованного Са2"", который вызывает торможение импульсной ак-
тивности (Uzdensky ct al., 2000а, 2002а) и активирует гидроли-
тические ферменты — фосфолипазы, протеиназы и нуклеазы,
осуществляющие как некроз, так и апоптоз (Nicotera et al., 1990;
Trump, Berezesky, 1992).
По нашим данным, не только митохондрии, но и аппарат
Гольджи весьма чувствителен к ФД воздействию. Это согласу-
ется с накапливающимися сведениями о его повреждении при
фотосенсибилизации клеток гидрофобными красителями: ZnPC
(Fabris ct al., 2001), метиловым эфиром феофорбида a (Matroule
et al., 2001), производными хлорина рь (Feofanov ct al., 2002); фо-
тофрином (Hsien et aL, 2003), mTHPC (Teitcn et aL, 2003b), или
бромидом 2,4,5,7-тетрабромродамина 123 (Ogata et aL, 2003).
Фотоиндуцированная дисфункция аппарата Гольджи может
привести к апоптозу (Matroule ct al., 2001; Ogata et al., 2003). На-
бухание его цистерн было одной из причин вакуолизации цито-
плазмы. Но осталось неясным, почему многие вакуоли были не
круглыми, а имели сложную неправильную форму.
Еще одно ультраструктурнос проявление фотодинамическо-
го повреждения нейронов — появление аутофагосом уже на ран-
них стадиях реакции. Возможно, процесс аутофагии играл за-
щитную роль, способствуя деструкции и устранению повреж-
денных органелл (Kessel et al., 2006). На более поздних стадиях
реакции доминировали некротические процессы, связанные с
повреждением плазматической мембраны и истощением энерге-
тических запасов. Через 1 ч после ФД воздействия ультраструк-
турные изменения приобретали патологический характер. Силь-
ная вакуолизация эндоплазматического ретикулума, набухание
митохондрий и разрушение их внутренней мембраны, разрывы
плазматической мембраны свидетельствовали о некрозе нейро-
на. Действительно, при развитии апоптоза изменения сначала
происходят в клеточном ядре при сохранных органеллах, а затем
распространяются на цитоплазму. Но при ФД воздействии более
выраженные сдвиги наблюдались в цитоплазме. Развитие этих
изменений продолжалось не только во время, но и после него.
Динамику изменений ультраструктуры изолированных меха-
норсцспторных нейронов можно сравнить с развитием ульт-
раструктурпых сдвигов в коре мозга крыс после фотосенсибили-
зации Фотофрином II: через 1 ч после ФД воздействия сначала
наблюдалось набухание и некроз астроцитов, а затем поврежда-
лись нейроны. Через 4 ч в фотоповрежденных нейронах первы-
ми, как и в нашей работе, набухали цистерны гранулярного ЭР и
аппарата Гольджи, а также снижалось число полисом, свидете-
льствующее об угнетении синтеза белка. Через 18—24 ч проис-
ходил кариопикноз, появлялись десятки гранул сконденсирован-
ного хроматина, утрачивались нейрофиламенты и микротрубоч-
ки, нарушалась целостность плазматической мембраны (Yoshida
ct al., 1992).
14. 6. Ультраструктурные изменения
фотосенсибилизированных глиальных клеток
В рецепторе растяжения рака глиальные клетки образуют во-
круг нейрона оболочку из 20—30 тонких слоев, толщиной 0.2—
1 мкм, но не такую плотную, как миелин. В контрольных препа-
ратах цитоплазма глиальных клеток содержала немногочислен-
Рис. 49. Ультраструктура глиальных клеток в изолированном рецепторе
растяжения рака, не подвергавшемся фотодинамическому воздействию,
Х35000.
Fig. 49. Ultrastructure of glial cells in isolated untreated stretch receptor,
X35000.
Рис. 50. Ультраструктура глиальных клеток рецептора растяжения рака
сразу после прекращения импульсной активности нейрона, вызванного
фотодинамическим воздействием 10-7М Фотосенса, х35000.
Fig. 50. Ultrastructure of glial cells in isolated stretch receptor just after PDT-induccd
abolition of neuronal activity, x35000.
Рис. 51. Ультраструктура глиальных клеток в рецепторе растяжения рака
через 1 ч после прекращения импульсной активности нейрона, вызванно-
го фотодинамическим воздействием 10 7М Фотосенса, х35000.
Fig. 51. Ultrastructure of glial cells in isolated stretch receptor 1 hour after
PDT-induced abolition of neuronal activity, x35000.
ныс небольшие митохондрии, пузырьки, цистерны эндоплазма-
тического ретикулума, рибосомы, микротрубочки. В крупных
глиальных ядрах овальной формы скопления сконденсированно-
го хроматина, имевшего зернистую структуру, располагались
вдоль ядерной оболочки (рис. 49).
Сразу после инактивации нейрона и прекращения облучения
наблюдалось сжатие глиальных ядер. Значительную часть их
площади занимал сильно сконденсированный хроматин, тонкая
структура которого нс просматривалась. Глиальные слои были
сильно уплотнены, но некоторые — расширены (рис. 50).
Через 1 ч после прекращения облучения отмечены пикно-
тические глиальные ядра со сконденсированным хроматином,
представляющим собой одну большую глыбку овальной формы
с нарушенной ядерной оболочкой. Вероятно, это были апоптоз-
ные клетки. Цитоплазматические органеллы в них были практи-
чески разрушены (рис. 51).
Таким образом, изменения в глиальных клетках усиливались
параллельно изменениям ультраструктуры нейрона, но в отли-
чие от нейронов, в глиальных клетках наблюдалось характерное
для апоптоза формирование больших скоплений электрон-
но-плотного хроматина.
Глава 15
УЧАСТИЕ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА
В РЕАКЦИИ НЕЙРОНА НА ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ
ВОЗДЕЙСТВИЕ
Для исследования роли некоторых активных форм кислоро-
да в реакции нейрона на ФД воздействие 10-7 М Фотосенса ис-
пользовались различные анти- и прооксиданты: перехватчики
синглетного кислорода и ОН'-радикалов 1,4-диазабицикло-
[2,2,2]-октан (DABCO) и гомокарнозин (Кения и др., 1993; Бол-
дырев и др., 1995); антиоксидант аскорбат натрия (Кения и др.,
1993); прооксидант FeSO4 (Владимиров и др., 1991), а также
прооксидантная смесь РеБО4/аскорбат (10/800 мкМ) (Панасенко
и др., 1996). Они добавлялись в экспериментальную ванночку за
5—15 мин до облучения.
Оба перехватчика синглетного кислорода, DABCO (1 мМ), и
гомокарнозин (100 мкМ) достоверно увеличивали время жизни
нейрона на 80 и 60 % соответственно (рис. 52, табл. 20). Следова-
тельно, 'Оэ и, возможно, ОН’ участвуют в фотоиндуцированном тор-
можении импульсной активности нейрона (Uzdensky et al., 2000а).
Аскорбат натрия (0.8 мМ) не влиял на импульсную реакцию
нейронов на ФД воздействие (рис. 52). Но известно, что он мо-
жет, как усиливать, так и ослаблять фотодинамическое повреж-
дение клеток (Bachowski et al., 1988), т. е. служить как анти-, так
и прооксидантом, особенно в больших концентрациях, или в
присутствии небольших количеств ионов с переменной валент-
ностью, Fc2* или Си+ (Кения и др., 1993). Возможно, использо-
ванная нами концентрация аскорбата занимала промежуточное
место между про- и антиоксидантной и не влияла на чувствите-
льность нейрона к ФД воздействию.
Ионы Fe2+ известны как мощный катализатор генерации сво-
бодных радикалов и перекисного окисления липидов в клетках
Рис, 52. Модификация реакции нейрона на ФД воздействие 10-7 М Фото-
сенса некоторыми про- и антиоксидантами.
* — р < 0.05, ***р< 0.001,
Fig. 52. Modification of neuron response to PD effect of IO'7 M Photosens with
various pro- and antioxidants.
Significant difference: * - p < 0.05, ***p < 0.001.
(Владимиров и др., 1991; Зенков и др., 2001). Воздействие 0.5—
1 мМ FeSO4 в темноте приводило к необратимому прекращению
импульсации нейрона. Но в концентрации 10 мкМ FeSO4 не вли-
ял на импульсную активность фотосенсибилизированных нейро-
нов (рис. 52) (Uzdensky ct al., 2000а). Как известно, при концент-
рациях ниже 10—-30 мкМ Fc2" может служить не про-, а антиок-
сидантом (Владимиров и др., 1991; Погосян и др., 1996).
Использованная концентрация FeSO4 (ЮмкМ) попадала в этот
диапазон и может быть поэтому была нетоксичной.
Смесь 10 мкМ FeSO( и 800 мкМ аскорбата (Ре2+/аскорбат,
10/800 мкМ) — более мощный прооксидапт, чем Fe2+. В ней Fe2+
быстро окисляется растворенным кислородом до Fe3+, а аскор-
бат вновь восстанавливает Fc3+ до Fe2+ и этим сильно стимулиру-
ет свободно-радикальные процессы (Панасенко и др., 1996; Зен-
ков и др., 2001). В 5 из 19 наших экспериментов нейроны были
очень чувствительны к прооксидантному действию Ре2+/аскор-
бата. Их импульсация ускорялась сразу после добавления этой
смеси и через 15—25 мин резко блокировалась. В других
14 опытах смесь Ре2+/аскорбат не сильно возмущала активность
нейрона в течение 25—60 мин перед облучением. Но она усили-
Таблица 20
Влияние различных фармакологических агентов па время жизни
нейронов фотосенсибилизированных 10'7 М Фотосенса
Модулируе- мые процес- сы Фармакологиче- ские агенты Концент- рация, С Число опытов Опыт Контроль (без моду- ляторов) Р
Активные формы кис- FeSO4/acKop6aT 10/800 мкМ 10 10.5±2.2 23.0±3.0 <0.001
лорода DABCO 1 мМ 7 25.0±7.1 13.7±1.0 <0.05
Гомокарнозин 0.1 мМ 16 44.0±7.6 26.7±2.7 <0.05
[Ca2+]i 3-кратная [Са2+]0 40 мМ 12 27.2±7.8 39.5±8.0 <0.05
CdCl2 0.1 мМ 9 47.7±4.0 26.7±1.9 <0.01
Дантролен 20 мкМ 16 30.1±4.1 14.2±1.7 <0.01
Кофеин 0.5 мМ 15 13.6±1.5 21.7±3.7 <0.05
Иономицин 1 мкМ 8 8.1 ±0.9 16.4±1.3 <0.001
Тапсигаргин 1 мкМ 7 14.0±1.1 21.9±1.8 <0.01
Биоэнерге- Глюкоза 10 мМ 21 38.9±6.3 20.4±2.8 <0.05
тика Сукцинат 5 мМ 9 49.6±7.2 21.Н2.0 <0.01
Пируват+Малат 2.5+2.5 мМ 9 27.7±1.4 17.6±2.2 <0.01
Малонат 5 мМ 8 8.8±2.0 22.0±2.7 <0.05
Иодоацетат 0.2 мМ 18 20.0+2.7 29.2±2.8 <0.05
2,4-Динитро- фенол 0.2 мМ 18 16.7±2.3 21,8±1.5 <0.05
Ротенон 250 нМ 11 12.8±1.5 21.5±1.3 <0.01
Амитал 2.5 мМ 8 13.9±1.1 26.6±1.5 <0.01
Антимицин А 10 нМ 6 12.8±1.0 18.8±0.8 <0.01
Азид 1 мМ 24 20.9±2.1 28.9±2.7 <0.05
Винбластин 5 мкМ 15 19.4±2.5 16.6±2.1 >0.05
вала фотоиндуцированное торможение импульсации и сокраща-
ла время жизни нейрона с 22 до 12 мин (рис. 52, табл. 20). Со-
гласно Батовскому с соавт. (Bachowski et aL, 1988,1991), синг-
летный кислород в присутствии аскорбата и ионов железа может
рождать другие активные формы кислорода: НЭО2, О2*“, ОН* и
резко активировать перекисное окисление липидов. При этом
происходит переключение механизма ФД действия со 2-го типа
на 1-й. Полученные результаты коррелируют с данными Келли с
соавт. (Kelley et al., 1997) об усилении генерации свободных ра-
дикалов и Повышении фототоксичности Фотофрина в присутст-
вии смеси Бе2+/аскорбат. Этот эффект можно использовать для
повышения эффективности фотодинамической терапии.
Алюмофталоцианины — известные фотосснсибилизаторы
2-го типа, генерирующие при фотовозбуждении l0, (Rosenthal,
1991). Но фотодинамические реакции 1-го типа также могут
вносить вклад в фотоповреждение клеток (Moan et al., 1987; Ro-
senthal, 1991). Наши данные о защите нейронов с помощью та-
ких перехватчиков ’02, как DABCO и гомокарнозин, и усилении
фотоповреждения в присутствии прооксидантной смеси Fc/ac-
корбат указывают на преимущественную роль фотодинамиче-
ских реакций 2-го типа в фотоинактивации нейрона (Uzdensky ct
al., 2001а), тем более, что фотосенсибилизация нейронов рибоф-
лавином, индуцирующим фотодинамические процессы I типа,
была значительно менее эффективной (Дергачева и др., 2005).
Глава 16
РОЛЬ БИОЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
В РЕАКЦИИ НЕЙРОНА НА ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ
ВОЗДЕЙСТВИЕ
Приведенные выше ультраструктурные данные о том, что
митохондрии — важнейшая мишень для ФД воздействия в клет-
ках согласуются с данными других исследователей (Berns et aL,
1982; Gibson, Hilf, 1983; Hilf et al., 1984, 1986; Murant et aL, 1987;
Salet, Moreno, 1990, 1994; Morgan, Oseroff, 2001; Hilf, 2007).
Один из ключевых ферментов клеточной биоэнергетики — сук-
цинатдегидрогеназа (СДГ), локализующаяся на внутренней мем-
бране митохондрий (Кондрашова, 1987). По фотоиндуцированным
изменениям ее активности можно судить об участии митохонд-
рий в процессе фотоинактивации нейрона (Узденский, 1987).
Цитохимическое определение активности СДГ, основанное
на восстановлении нитротетразолевого синего в фиолетовый
пигмент формазан, проводили по методу Лойда с соавт. (1982),
адаптированному для рецептора растяжения (Узденский, 1987).
Общую активность внутриклеточных дегидрогеназ в нейроне
оценивали с помощью МТТ-теста (Mosmann, 1983). СДГ локали-
зовалась преимущественно в богатой митохондриями перинук-
леарной области нейрона и в дендритных окончаниях, разветв-
ляющихся среди волокон рецепторных мышц (рис. 53, Л), но не
в аксоне и окружающих глиальных клетках (Узденский, 1987;
Uzdensky et aL, 2002).
Окрашивание рецептора растяжения рака Фотосенсом в тем-
новых условиях в концентрации 10-7М нс влияло на среднюю
активность СДГ в теле нейрона, но 10-5 М Фотосенса снижало ее
активность на 18 % (рис. 53, Б).
При ФД воздействии 10-7М Фотосенса средняя активность
СДГ в теле нейрона не отличалась от контрольной сразу после
A
Б
Контроль
Активность СДГ
после ФД воздействия, отн. ед.
1 2 3 4 5 6 7
В
Фотосенсибилизация
Рис. 53. Фотодинамическое действие 10'7 М Фотосенса на дегидрогеназ-
ную активность в механорецепторном нейроне рака.
А — контрольный нейрон с высокой активностью сукцинатдегидрогеназы в его
теле (сверху), резкое снижение активности сукцинатдегидрогеназы в перинуклеар-
ной области фотосенсибилизированного нейрона (снизу)', Б — фотоиндуцирован-
ные изменения активности сукцинатдегидрогеназы, усредненной по перинуклеар-
ной области нейрона: 1 — контроль; 2 — слабое, окраска; 3 — слабое, ФД, 0 ч;
4 - слабое, ФД, 4 ч; 5 - интенсивная окраска; 6 —- интенсивное ФД, 0 ч; 7 — ин-
тенсивное ФД, 4 ч; В — фотоипдуцпрованные изменения общей дегидрогеназной
активности (МТТ-тест) в теле нейрона: 1 — контроль; 2 - слабое. О ч; 3 - слабое,
4 ч; 4 — интенсивное, 0 ч; 5 — интенсивное, 4 ч; * - р < 0.05, ** —р < 0.01, *** —
р < 0.001.
Fig. 53. Photodynamic effect of 10“ 7 M Photosens on dehydrogenase activity in
the crayfish mechanoreceptor neuron.
A — Top: control neuron with high succinate dehydrogenase activity in soma. Bottom:
the succinate dehydrogenase activity is significantly reduced after photosensitization.
Б — photoinduced decrease in the average succinate dehydrogenase activity in the neu-
ron perikaryon. В — photoinduced changes in general dehydrogenase activity
(MTT-tcst) in neuronal soma. Significant difference: * — p < 0.05, ** — p < 0.01,
*** p < 0.001.
прекращения импульсной активности, но через 4 ч она уменьша-
лась на 41 % (рис. 53, Б). Болес интенсивная фотосснсибилиза-
ция (10 5 М Фотосенса) намного сильней инактивировала СДГ.
Она снижала ее среднюю активность на 35 % сразу после пре-
кращения импульсации и на 68 % через 4 ч (рис. 53, Б). Общая
активность клеточных дегидрогеназ изменялась сходным обра-
зом, но сильней, чем активность СДГ (рис. 53, В). Такое замед-
ленное подавление биоэнергетических процессов, как и наруше-
ние целостности плазматической мембраны, наблюдавшееся не
сразу, а через 1.7 ч, было, очевидно, не прямым результатом ФД
воздействия, а представляло собой вторичный процесс (Uzdens-
ky et al., 2002). К моменту прекращения ФД воздействия на-
блюдались ультраструктурные изменения многих, но не всех
митохондрий. Возможно, сохранившиеся митохондрии компен-
сировали функции поврежденных, и поэтому активность дегид-
рогеназ существенно не понижалась. Но уже через 1 ч после фо-
тосенсибилизации нарушалась ультраструктура всех митохонд-
рий, и изменения были столь существенны, что указывали на
серьезные нарушения биоэнергетических процессов. Но даже
при сильном нарушении ультраструктуры митохондрий и дезор-
ганизации крист, наблюдающихся уже через 1 ч после фотосен-
сибилизации, клеточные дегидрогеназы до определенной степе-
ни сохраняли способность переносить электроны на МТТ или
нитротетразолиевый синий. Даже через 4 ч она была на уровне
20—30 %. При этом синтез АТФ, вероятно, нарушался сильнее,
вследствие неминуемого разобщения окислительного фосфори-
лирования при повреждении митохондриальных мембран.
Для изучения участия отдельных звеньев энергетического
метаболизма в реакции нейрона на фотодинамическое действие
10-7М Фотосенса в экспериментальную ванночку добавлялись
субстраты или ингибиторы гликолиза, цикла трикарбоновых
кислот, окислительного фосфорилирования и электронного
транспорта (Uzdensky et al., 2001а).
Субстрат гликолиза глюкоза (10 мМ) не влияла на нейрон-
ную активность в темноте, но замедляла инактивацию фотосен-
сибилизированных нейронов и увеличивала продолжительность
их импульсного ответа в среднем на 90 % (рис. 54). Ингибиторы
гликолиза иодоацетат натрия (0.2 мМ), или 2-дсзокси-В-глюкоза
(0.5 мМ) достоверно сокращали среднее время жизни фотосен-
сибилизированных нейронов примерно на 30 % по сравнению с
контролем (рис. 54).
Субстраты цикла Кребса, сукцинат натрия (5 мМ) или смесь
пирувата и малата натрия (по 2.5 мМ), защищали нейроны от
фотодинамической инактивации. Особенно эффективным был
сукцинат, увеличивавший среднее время жизни нейрона почти
в 2.5 раза по сравнению с контролем. Напротив, ингибирова-
ние цикла Кребса малонатом натрия (5 мМ) сокращало время
Рис. 54. Время жизни нейрона при фотодинамическом действии 10~7М
Фотосенса в присутствии субстратов или ингибиторов биоэнергетических
процессов.
Опытные варианты, в отличие от контрольных, заштрихованы; * —р < 0.05, ** —
р < 0.01.
Fig. 54. Effect of different substrates or inhibitors of bioenergetic processes on
neuron lifetime.
Experimental but not control bars are hatched. Significant difference:* — p < 0.05,
**—/?< 0.01.
жизни фотосенсибилизированного нейрона в среднем на 60 %
(рис. 54).
Все ингибиторы разных звеньев цепи электронного транс-
порта: азид натрия (0.5—1 мМ), амитал натрия (2.5 мМ), ан-
тимиции А (10 нМ) и ротенон (250 нМ), а также разобщитель
окислительного фосфорилирования 2,4-динитрофснол (0.2 мМ)
(Досон и др., 1991) усиливали инактивацию фотосенсибилизи-
рованпых нейронов и достоверно сокращали их время жизни на
23- 4S % (рис. 54). Наиболее эффективным был амитал натрия.
1 In гсресно, что добавление 1 мМ АТФ в среду приводило не
к увеличению, а к снижению времени жизни нейрона почти
вдвое по сравнению с контролем (рис. 54). Возможно, внекле-
точный АТФ действовал не как источник энергии, а как медиа-
тор, активирующий пуринэргические рецепторы (Зиганшин, Зи-
ганшин, 1999).
Таким образом, субстраты разных звеньев энергетического
метаболизма — глюкоза, сукцинат натрия или смесь пирувата и
малата натрия — замедляли фотоиндуцированное торможение
импульсации, защищая нейрон от фотодинамического повреж-
дения. В наших экспериментах наиболее эффективным нейро-
протектором был сукцинат (Uzdensky et al., 2001а). Это быстро
утилизируемый субстрат с большим выходом АТФ, играющий
особую роль в энергетическом метаболизме клетки при различ-
ных стрессовых ситуациях (Кондрашова, 1987). Другие энерге-
тические субстраты пируват и малат также известны, как ней-
ропротекторы, причем пируват действует не только как энерге-
тический субстрат, но и как перехватчик перекиси водорода
(Dcsagher et al., 1997). Но их действие в использованных концен-
трациях было менее эффективным.
Напротив, все ингибиторы разных звеньев биоэнергетиче-
ского процесса -— гликолиза (иодоацетат натрия или 2-дезок-
си-О-глюкоза); цикла Кребса (малонат натрия); электронного
транспорта (ротенон, антимицин А, амитал натрия или азид на-
трия) или же разобщитель окислительного фосфорилирования
2,4-динитрофенол — ускоряли фотоиндуцированное торможе-
ние и прекращение нейронной активности. Аналогичное усиле-
ние фотоповреждения клеток при ингибировании энергетиче-
ского метаболизма 2-дсзокси D-глюкозой, иодоацстатом, олиго-
мицином, цианидом калия и т. д. наблюдалось и другими
исследователями (Hilf et al., 1986; Khanum, Jain, 1989, 1994; Kir-
veliene et al., 1997).
Поскольку все эти процессы являются разными звеньями
процесса синтеза АТФ в клетке, то именно недостаток АТФ сле-
дует признать одной из причин фотоиндуцированной инактива-
ции нейрона.
Глава 17
РОЛЬ СИГНАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В РЕАКЦИЯХ
НЕЙРОНОВ И ГЛИИ НА ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ
ВОЗДЕЙСТВИЕ
Процессы внутриклеточной сигнализации управляют состоя-
нием клетки, определяют пролиферацию, дифференцировку, вы-
живаемость или смерть клеток (Gompertz et al., 2002; Зинченко,
Долгачева, 2003; Bradshaw, Dennis, 2003). При внешних воз-
действиях в клетках запускаются цепи сигнальных реакций, на-
правленных как на их защиту, так и на реализацию программы
смерти. Выше рассмотрены сигнальные процессы, развертываю-
щиеся при ФД воздействии в разных, преимущественно культи-
вируемых опухолевых клетках (см. также обзоры: Moor, 2000;
Oleinick ct al., 2002; Almeida et al., 2004, Agostinis et al., .2004;
Castano et al., 2005, Nowis ct al., 2005; Buytaert et al., 2007a; Uz-
densky, 2008). В организме не существует клеточной монокуль-
туры, а клетки разных типов взаимодействуют не только друг с
другом, но и с клетками других типов. Межклеточные взаимо-
действия обеспечивают интеграцию тканей, их взаимодействие
и устойчивость к действию внешних факторов. Они играют важ-
ную роль в поддержании выживаемости клеток и управлении их
функциональным состоянием. К числу межклеточных сигналь-
ных молекул относятся гормоны, простагландины, цитокины,
нейропептиды, нейромедиаторы и факторы роста. Они воспри-
нимаются рецепторами, связанными с G-белками, или рецептор-
ными тирозинкиназами, и запускают внутриклеточные сигналь-
ные пути, формирующие целостную реакцию клетки.
Изолированный рецептор растяжения рака предоставляет
уникальную возможность для изучения как внутриклеточных
сигнальных процессов в двух типах клеток, нервных и глиаль-
ных, так и межклеточных нейроглиальных взаимодействий, про-
исходящих под влиянием ФД воздействия. В этом простом объ-
екте нейроны получают молекулярные сигналы только от глиа-
льных клеток, а те — от соседних глиальных клеток и нейронов.
Для получения информации об участии разных путей внут-
риклеточной и межклеточной сигнализации мы модифициро-
вали их различные компоненты с помощью фармакологических
агентов.
17. 1. Ионы Са2+
Каким образом первичное фотоповреждение митохондрий,
аппарата Гольджи и/или эндоплазматического ретикулума мо-
жет вызвать торможение импульсной активности, функциональ-
ную инактивацию и последующую гибель нейрона? Логично
предположить существование мобильных низкомолекулярных
посредников, способных высвобождаться из фотоповрежденных
органелл, мигрировать к нейрональной мембране и изменять
биоэлектрические процессы. Таким посредником могут служить
ионы Са2+. Они играют важнейшую роль во внутриклеточ-
ной сигнализации и управлении многочисленными клеточными
функциями: от регуляции функциональной активности и синап-
тических процессов в нервных клетках до инициации процессов
некроза и апоптоза. Поэтому концентрация ионов кальция в ци-
тозоле разных видов клеток поддерживается на очень низком
уровне: 10"7—10“8 М. При повреждении клеток [Ca2+]j резко воз-
растает, и это может запускать некроз или апоптоз (Nicotera et
а!., 1990; Trump, Berezesky, 1992, 1998).
В наших экспериментах, факторы, ведущие к повышению
внутриклеточного уровня Са2+, усиливали фотодинамическое
торможение импульсной активности нейрона, а понижающие
[Ca2+]i замедляли фототорможение и защищали нейрон (Uzdens-
ky et al., 2000а, 2001а, 2002а; Bragin et al., 2003). Действительно,
замена стандартного физиологического раствора Харревельда,
содержащего 13.5 мМ СаС17, на раствор с 3-кратной внеклеточ-
ной концентрацией Са2+ (40 мМ), при которой увеличивался
вход кальция и повышалась [Са2+]р ускоряла фототорможение
импульсации и инактивацию нейрона (рис. 55, табл. 20).
Ионы Cd2+ (0.1 мМ), блокирующие кальциевые каналы всех
типов (Llinas, 1988), при добавлении в ванночку за 20—30 мин
до облучения оказывали противоположное действие и увеличи-
вали время жизни фотосенсибилизированного нейрона (рис. 55,
табл. 20). Их защитный эффект, возможно, связан с тем, что про-
должительное предотвращение поступления Са2+ в клетку из
Рис. 55. Влияние модуляторов концентрации ионов кальция в цитозоле
[Са2+] на время жизни нейрона при фотодинамическом действии 10~7 М
Фотосенса.
* — р < 0.05, ** - р < 0.01, *** — р < 0.001.
Fig. 55. Effect of modulators of cytosolic Ca2+ level, [Ca2+]j, on lifetime of a
photosensitized neuron. Significant difference: * —p < 0.05, ** — p < 0.01.
среды могло приводить к истощению кальциевых депо, и после-
дующее фотоповреждение Са21--депонирующих органелл (ЭР,
митохондрий) уже не приводило к такому повышению [Са24^,
как в несенсибилизированном нейроне. Верапамил (2—10 мкМ),
блокирующий кальциевые каналы L-типа (Llinas, 1988), был не-
эффективен (рис. 55). Возможно, Са2+ проникал в клетку через
другие каналы.
С другой стороны, усиление входа С а24 в клетку с помощью
Са2+-ионофора иономицина повышало эффективность ФД воз-
действия. Добавление 1 мкМ иономицина вдвое снижало время
жизни фотосснсибилизированного нейрона (рис. 55, табл. 20),
что указывает на важную роль повышенной внутриклеточной
концентрации Са2+ в фототорможении и последующем прекра-
щении импульсной активности.
Внутриклеточный уровень Са2+ может повышаться нс только
в результате входа через плазматическую мембрану, но и вслед-
ствие высвобождения из внутриклеточных депо: митохондрий
и/или эндоплазматического ретикулума. Кальций, запасенный в
ретикулуме, может выходить в цитозоль через каналы, управля-
емые 1,4,5-инозитолтрифосфатом (IP3), рианодином или агони-
стами их рецепторов. Рианодиновые рецепторы участвуют в ка-
льций-индуцированном высвобождении кальция (Pozzan et al.,
1994; Meldolessi, 2001; Verkhratsky, 2002). В наших эксперимен-
тах, однако, рианодин в концентрации 1—2 мкМ не изменял
время жизни фотосенсибилизированного нейрона (рис. 56). Воз-
можно, выбор этих концентраций был не совсем удачен, так как
известно, что рианодин стимулирует выход Са2+ из эндоплазма-
тического ретикулума при концентрации ниже 1 мкМ, а при
концентрациях, превышающих 1 мкМ, он может ингибировать
его (Taylor, Broad, 1998).
Кофеин (0.5 мМ) — агонист рианодиновых рецепторов, ко-
торый высвобождает Са2+ из ЭР (Taylor, Broad, 1998), достовер-
но уменьшал время жизни нейрона с 22 до 13 мин при его добав-
лении за 5 мин до облучения (рис. 55, табл. 20). Но при добавле-
нии кофеина, или его аналога теофиллина, за 30—90 мин до
лазерного облучения время жизни нейрона значительно увели-
чивалось (рис. 57) (Uzdensky et al., 2000а, 2001а). Возможно, в
отличие от кратковременного действия кофеина, приводящего к
повышению [Са2*]р продолжительное воздействие кофеина или
теофиллина опустошало кальциевые депо и предотвращало до-
полнительный выход Са2+, ведущий к торможению импульсации
при последующем облучении нейрона (Uzdensky et al., 2000а).
Дантролен (20 цМ) — блокатор рианодиновых рецепторов,
предотвращающий выход С а2' из ЭР в цитозоль (Frandsen, Scho-
usboe, 1991), защищал нейроны от фотодинамического повреж-
дения и достоверно увеличивал их время жизни более, чем вдвое
(рис. 55, табл. 20) (Uzdensky et aL, 2000а). Возможно, рианоди-
новые рецепторы на мембранах ЭР и управляемые ими кальцие-
вые депо служили мишенями для ФД воздействия Фотосенса, а
их блокирование дантроленом нс позволяло депонированному
кальцию высвобождаться в цитозоль при облучении.
Тапсигаргин, ингибитор Са2+-АТФазы эндоплазматического
ретикулума (SERCA), закачивающей кальций из цитозоля в ЭР,
вызывает длительное повышение [Са2Д( (Taylor, Broad, 1998).
При концентрации 1 мкМ он существенно ускорял торможение
импульсации и достоверно снижал время жизни фотосенсибили-
зированного нейрона в среднем на 36 % (рис. 56, табл. 20). Сле-
довательно, фотоиндуцированное высвобождение ионов каль-
ция из ЭР в цитозоль могло приводить к повышению [Са2+]( и
последующему торможению импульсной активности.
Непосредственное фотодинамическое повреждение Са2+-АТ-
Фаз плазматической мембраны или эндоплазматического рети-
кулума (Kondo, Kasai, 1974; Ricchelli et al., 1999; Granville et al.,
2001b) также должно приводить к повышению уровня Са2+ в ци-
A
Рис. 56. Действие 1 мкМ флюфеназина и фотодинамического воздействия
10~7 М Фотосенса на механорецепторный нейрон рака (Л) и сателлитные
глиальные клетки (£).
/ — контроль, 2 — воздействие флюфеназина в темноте, 3 — фотодинамическое
воздействие, 4 — фотодинамическое воздействие в присутствии флюфеназина;.
* — р < 0.05, ** — р < 0.01, *** — р < 0.001.
Fig. 56. Effect of 1 jiM fluphenazine and PD effect of 10-7 M Photosens on
crayfish mechanoreceptor neuron (J) and satellite glial cells (Б).
1 — control, 2 — action of fluphenazine in the darkness, 3 — PD effect, 4 — PD effect
in the presence of fluphenazine. Significant difference: * — p < 0.05, ** — p < 0.01,
*** — p < 0.001.
тозоле. Так, ФД воздействие вертепорфина вызывало быструю
деградацию Са2+-АТФазы и опустошение кальциевых депо в ЭР
и митохондриях. Это, а не вход кальция через плазматическую
мембрану, являлось основной причиной повышения [Са2+](
(Granville et al., 2001b). Поглощение кальция эндоплазматиче-
ским ретикулумом, осуществляемое SERCA в изолированных
микросомах печени крыс, было более чувствительным к фотоди-
намическому повреждению, чем поглощение Са2+ изолирован-
ными митохондриями (Ricchelli et al., 1999).
Нельзя недооценивать и возможную роль митохондрий в
поддержании кальциевого гомеостаза. Митохондрии обладают
большой Са2+-связывающсй емкостью. Они быстро связывают
избыточный цитозольный кальций, поступающий в клетку извне
или высвобождающийся из эндоплазматического ретикулума.
При этом активируются митохондриальные дегидрогеназы и
стимулируется производство АТФ. Таким образом, митохонд-
рии являются сенсорами кальциевых сигналов о предстоящем
выполнении энергоемкой функции или о повреждении клетки.
При слишком большом подъеме [Ca2l’]j открываются высокопро-
ницаемые митохондриальные поры, кальций выходит из мито-
хондрий, что дополнительно повышает [Са2*]р и стимулирует
некротические и апоптозные процессы (Duchen, 2000).
Наблюдавшееся в электронно-микроскопическом исследова-
нии набухание митохондрий с разрывами их мембран свидетель-
ствует о непосредственном выходе ионов из фотоповрежденных
органелл. Показано, что митохондрии, фотосенсибилизирован-
ные тТНРС, вместе с падением их мембранного потенциала те-
ряют способность поглощать Са2* (Klein et aL, 1997).
Итак, разные пути повышения уровня ионов кальция в цито-
золе, -— повышение концентрации Са2+ в среде, кальциевый
ионофор иономицин, кофеин, высвобождающий депонирован-
ный Са2+, или тапсигаргин, блокирующий Са2+-АТФазу, усили-
вали фотоиндуцированнос торможение импульсации и ускоряли
фотоинактивацию нейрона. Напротив, ионы Cd2+, блокирующие
Са2+-каналы; дантролен, который ингибировал высвобождение
Са2~ из ЭР; продолжительное действие кофеина или теофиллина,
опустошающее Са2+-депо, защищали нейроны, увеличивая их
время жизни. Вероятно, ионы Са2+, появляющиеся в цитозоле
при фотодинамическом повреждении плазматической мембраны
или Са2~-депонирующих органелл, участвовали в фотодинами-
ческом торможении импульсации и инактивации нейрона. Са2+,
как известно, может активировать Са2+-зависимые К+-каналы
плазматической мембраны. Выходящий калиевый ток ионов мог
гипсрполяризовать мембрану и вызывать торможение нейрон-
ной активности (Sah, Faber, 2002). Резкое возрастание [Са2+]1 при
повреждении клетки запускает и некроз, и апоптоз (Nikotera et
al., 1990, 1994; Trump, Berezesky, 1992, 1998).
Фармакологическая модуляция процессов высвобождения
Са2+ или его депонирования может повысить фотодинамическое
повреждение клеток или, наоборот, защитить нейроны.
17. 2. Са' -зависимые сигнальные процессы
17. 2. 1. Кальмодулин
и кальмодулинзависимая киназа 11
Ионы кальция инициируют несколько важных сигнальных
путей с участием протеинкиназы С, кальмодулина, кальмоду-
линзависимой киназы II и других белков, играющих централь-
ную роль в регуляции клеточных процессов (рис. 9,12). Они
очень важны для реакций нейронов и глии на ФД воздействие.
Регулирующая роль ионов кальция в значительной мере реа-
лизуется с помощью кальмодулина, который после связывания
Са2+ приобретает способность активировать многие клеточные
белки (Sola ct al., 1999). Но о роли таких важнейших компонен-
тов кальциевого сигнального пути, как кальмодулин и кальмоду-
линзависимая киназа II (СаМКП) в фотодинамическом повреж-
дении клеток практически не было информации. В нашей работе
ингибирование кальмодулина 1 мкМ флюфеназином не вызыва-
ло достоверных изменений нейронной активности в темноте или
при ФД воздействии (Uzdensky et al., 2007). Однако флюфеназин
защищал нейроны и глиальные клетки от фотоиидуцированного
некроза: в его присутствии процент некротических нейронов и
глиальных клеток снижался с 74—77 % до 29—41 % (рис. 56).
Он нс влиял на уровень апоптоза и изменение численности глиа-
льных клеток, вызванных ФД воздействием. Эти данные указы-
вают на участие кальмодулина в некрозе нейронов и глии, но не
в апоптозе или повышении численности глиальных клеток (гли-
озе), индуцированных этим воздействием.
Одним из важнейших субстратов кальмодулина является ка-
льмодулинзависимая киназа II, которая регулирует множество
клеточных процессов, включая пролиферацию и смерть (Takano
et al., 2003). Ингибирование СаМКП с помощью 2 мкМ KN-93
не влияло на нейроны и глиальные клетки в темноте (рис. 57).
KN-93 также не влиял на нейронную активность и уровень апоп-
A
Рис. 57. Действие 2 мкМ KN-93 и фотодинамического воздействия 10-7 М
Фотосенса на механорецепторный нейрон рака (А) и сателлитные глиаль-
ные клетки (5).
1 — контроль, 2 — воздействие KN-93 в темноте, 3 — фотодинамическое воздей-
ствие, 4 — фотодинамическое воздействие в присутствии KN-93. ** —р < 0.01,
***—/?< 0.001.
Fig. 57. Effect of 2 цМ KN-93 and PD effect of 10-7 M Photosens on crayfish
mechanoreceptor neuron (Л) and satellite glial cells (5).
1 — control, 2 — action of KN-93 in the darkness, 3 — PD effect, 4 — PD effect in the
presence of KN-93. Significant difference: ** — p < 0.01; *** — p < 0.001.
тоза фотосенсибилизированных глиальных клеток. Но он досто-
верно снижал процент некроза нейронов и глии, а также предот-
вращал фотоиндуцированный глиоз (рис. 57). Следовательно,
СаМКП, действуя в одной цепи с ионами кальция и кальмодули-
ном, способствовала фотоповреждению плазматической мемб-
раны и развитию некроза нейронов и глиальных клеток, а ее ин-
гибирование ослабляло эти процессы. СаМКП, вероятно, также
участвовала в механизмах управления клеточным делением, ак-
тивируемых ФД воздействием. Так как флюфеназин не влиял
на фотоиндуцированное повышение численности глиальных
клеток, то можно предположить, что СаМКП участвовала в этих
процессах независимо от кальмодулина (Uzdensky et al., 2007).
17. 2. 2. Протеинкиназа С
Протеинкиназа С, управляемая ионами Са21- и диацилглице-
ролом, управляет многими клеточными функциями. Она активи-
рует ионные каналы, запускает экспрессию различных генов, ре-
гулирует клеточный метаболизм, состояние цитоскелета и т. д.
(Newton, Johnson, 1998). Для изучения ее роли в реакциях нейро-
нов рака на ФД воздействие мы использовали форболовый эфир
ТРА (I2-0-tetradecanoylphorbol 13-acetate), действующий анало-
гично природному активатору диацилглицеролу, или ингибито-
ры — гиперицин, стауроспорин и челеритрин А.
В концентрации 50—250 нМ ТРА вдвое повышал скорость
фотодинамического торможения импульсации и сокращал сред-
нее время жизни нейрона с 26 до 15.5 мин (табл. 21). Усиление
Таблица 21
Влияние модуляторов протеинкиназы С на время жизни
и морфологию ядра нейрона при фотодинамическом действии
IO-7 М Фотосенса
Модулятор Концентрация Время жизни нейрона, мин
ФД ФД + модулятор
ТРА 50—250 нМ 26.3±2.9 (20) 15.5±1.0 (39)***
Гиперицин 1 мкМ 19.0±1.2 (11) 36.0±2.6 (11)**
Стауроспорин 1 нМ 17.5±1.7 (12) 26.0±2.0 (14)**
Челеритрин А 1 мкМ 15.4±0.7 (11) 18.7±1.0 (15)*
Примечание. В скобках указано число опытов; * — р < 0.05, ** — р < 0.01, ***
р <0.001.
A
Рис. 58. Действие 1 нМ стауроспорина и фотодинамического воздействия
10-7 М Фотосенса на механорецепторный нейрон рака (А) и сателлитные
глиальные клетки (Б).
1 — контроль, 2 — воздействие стауроспорина в темноте, 3 — фотодинамическое
воздействие, 4 — фотодинамическое воздействие в присутствии стауроспорина;.
* — р < 0.05, ** — р < 0.01, *** — р < 0.001.
Fig. 58. Effect of 1 nM staurosporine and PD effect of 10-7 M Photosens on
crayfish mechanoreceptor neuron (Л) and satellite glial cells (£).
1 — control, 2 — action of staurosporine in the darkness, 3 — PD effect, 4 — PD effect
in the presence of staurosporine. Significant difference: * — p < 0.05, ** — p < 0.01,
***—/,<0.001.
фототорможения нейрона в присутствии ТРА могло быть связа-
но с фосфорилированием Са2+-каналов протеинкиназой С и уве-
личением притока ионов Са2т в цитозоль (Bragin et al., 2003).
В отличие от ТРА, ингибиторы протеинкиназы С стауро-
спорин (1 нМ), гиперицин (1 мкМ) и челеритрин А (500 нМ)
повышали время жизни фотосенсибилизированных нейронов
(табл. 21, рис. 58). Гиперицин был наиболее эффективен. Инги-
бирование протеинкиназы С стауроспорином (1 нМ) достовер-
но, хотя и немного снижало процент некроза глиальных клеток,
вызванного ФД воздействием. В нейронах наблюдалась проти-
воположная картина (рис. 58) Так что роль протеинкиназы С в
некротических процессах в нейронах и глие может быть различ-
ной. Стауроспорин также достоверно повышал уровень апоптоза
глиальных клеток как в темноте, так и при ФД воздействии. Сле-
довательно, в глиальных клетках протеинкиназа С участвовала в
защите глиальных клеток от спонтанного и фотоиндуцированно-
го апоптоза. Кроме того, стауроспорин снижал численность гли-
альных клеток вокруг тела нейрона как в темноте, так и при фо-
тосенсибилизации (рис. 58), что указывает на участие протеин-
киназы С в поддержании числа глиальных клеток (Uzdensky et
al., 2007).
Как отмечено выше, данные литературы о роли протеинки-
назы С в фотоиндуцированной гибели клеток противоречивы.
Она может, как ослаблять, так и усиливать этот процесс, благо-
даря разнообразию управляемых ей сигнальных путей (Oleinick
et al., 2002; Almeida et al., 2004; Uzdensky, 2008).
17. 2. 3. Фосфолипаза C
Са2+-зависимая фосфолипаза С расщепляет мембранные ли-
пиды. Ее активация может быть одним из механизмов разруше-
ния мембран при некрозе. Фосфатидилинозитол-специфическая
фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат
с образованием двух вторичных мессенджеров диацилглицерола
и 1,4,5-инозитолтрифосфата (1Р3). 1Р3 затем стимулирует вы-
свобождение Са2+ из эндоплазматического ретикулума, а диа-
цилглицерол активирует протеинкиназу С. Фосфатидилхолин-
специфическая изоформа гидролизует фосфатидилхолин с обра-
зованием диацилглицерола. Она прямо не участвует в высво-
бождении Са2+ из эндоплазматического ретикулума.
Добавление ЕТ-18 (20 мкМ) специфического ингибитора
фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С не влияло
Некроз нейронов, %
Апоптоз глии, отн. ед.
Рис. 59. Влияние 20 мкМ ЕТ-18, ингибитора фосфатидилинозитол-специ-
фичной фосфолипазы С, и фотодинамического воздействия 10~7 М Фото-
сенса на время жизни (А) и некроз (Я) механорецепторного нейрона рака,
некроз (В) и апоптоз (?) сателлитных глиальных клеток.
1 — контроль, 2 — воздействие ЕТ-18 10 мкМ в темноте, 3 — воздействие ЕТ-18
20 мкМ в темноте, 4 — фотодинамическое воздействие, 5 — фотодинамическое
воздействие в присутствии ЕТ-18; * — р < 0.05, ** — р < 0.01, *** — р < 0.001.
Fig. 59. Effect of 20 цМ ЕТ-18 and PD effect of IO-7 M Photosens on crayfish
mechanoreceptor neuron (/1) and satellite glial cells (5).
/ — control, 2 — action of ET-18 10 jiM in the darkness, 3 — action of ET-18 20 pM in
the darkness, 4 — PD effect, 5 — PD effect in the presence of ET-18. Significant diffe-
rence: * — p < 0.05, ** — p < 0.01, *** — p < 0.001.
на время жизни и некроз фотосенсибилизированных нейронов,
но снижало фотоиндуцированные некроз и апоптоз глиальных
клеток (рис. 59). Ингибирование фосфатидилхолин-специфиче-
ской изоформы фосфолипазы С с помощью 7.5 мкМ D-609 не
оказывало достоверного влияния на фотоиндуцированный не-
кроз нейронов и глиальных клеток, импульсные реакции нейро-
нов и апоптоз глиальных клеток (Uzdensky et al., 2007). Следова-
тельно, именно фосфатидилинозитол-специфическая изоформа
фосфолипазы С участвовала в фотоиндуцированном некрозе и
апоптозе глиальных клеток. По всей вероятности, ее действие
реализовалось путем высвобождения из эндоплазматического
ретикулума ионов Са2", опосредованного инозитолтрифосфа-
том. Этот фермент может активироваться рецепторными тиро-
зинкиназами в ответ на стимуляцию нейротрофическими факто-
рами, или рецепторами, связанными с G-белками. Это предпола-
гает возможное участие межклеточных молекулярных сигналов,
нейротрофинов или нейромедиаторов, в реакциях глиальных
клеток на фотодинамическое воздействие.
17. 3. сАМР-зависимые сигнальные процессы
Циклический аденозинмонофосфат, производимый адени-
латциклазой в ответ на активацию рецепторов, связанных с
G-белками, стимулирует протеинкиназу А, управляющую мно-
жеством исполнительных белков и факторов транскрипции.
Их совокупность определяет интегральный ответ клетки, на-
правленный преимущественно на повышение ее выживаемости
(Michel, Agid, 1996; Кузнецова, 2002, Зинченко, Долгачева,
2003).
Нейрон
Нейрон
Время жизни нейрона, мин
Глия
Отн. ед.
Форсколин
Рис. 60. Влияние модуляторов аденилатциклазы: активатора форсколина
(10 мкМ) (А и Б) или ингибитора MDL-12330A (50 нМ) (5 и Г) на время
жизни и некроз механорецепторного нейрона (А и В), некроз, апоптоз и
численность сателлитных глиальных клеток (Б и /”) в рецепторе растяже-
ния речного рака, подвергнутом фотодинамическому воздействию 10-7 М
Фотосенса.
1 — контроль, 2 — воздействие модуляторов в темноте, 3 — фотодинамическое
воздействие, 4 — фотодинамическое воздействие в присутствии модулятора; * —
р < 0.05, ** — р < 0.01, *** — р < 0.01.
Fig. 60. Effect of adenylate cyclase modulators: activator forskolin (10 pM) (A
and Б) or inhibitor MDL-12330A (50 nM) (В и Г) on lifetime and necrosis of
neurons (A and 5), necrosis, apoptosis and number of glial cells (Б and Г) in
crayfish stretch receptors photosensitized with 10-7 M Photosens.
1 — control, 2 — action of modulators in the darkness, 3 — PD effect, 4 — PD effect in
the presence of modulators. Significant difference: * —p < 0.05, ** —p < 0.01, *** —
p < 0.01.
Наши эксперименты выявили значительную роль аденилат-
циклазного пути в реакциях нейронов и глиальных клеток на ФД
воздействие (Uzdensky et al., 2005, 2007). Эти процессы изуча-
лись с помощью модуляторов его разных звеньев: форсколина
(ЮмкМ), активатора аденилатциклазы; MDL-1233OA (50 нМ),
ее ингибитора и Н89 (1 мкМ), ингибитора протеинкиназы А.
Стимуляция аденилатциклазы форсколином замедляла фото-
индуцированное торможение импульсации нейронов и продле-
вала время их импульсной реакции (рис. 60, А), а ее ингибирова-
ние с помощью MDL-12330A, наоборот, ускоряло фотоинак-
тивацию нейронов (рис. 60, 5). Следовательно, производимый
аденилатциклазой сАМР препятствовал фотодинамической
инактивации нейрона. Его действие, вероятно, реализовалось че-
рез сАМР-активируемую протеинкиназу А, ингибирование ко-
торой с помощью Н89 так же, как и ингибирование аденилат-
циклазы, сокращало время жизни нейрона (рис. 61, А). Возмож-
но, этот фермент противодействовал повышению уровня Са2+ в
цитозоле, ведущему к торможению нейронной активности (Uz-
densky et al., 2000).
Ингибирование аденилатциклазы снижало уровень фотоин-
дуцированного некроза нейронов и глиальных клеток (рис. 60, В
и Г). Это могло бы указывать на участие сАМР в некротических
процессах, но в опытах с форсколином не наблюдалось влияния
активации аденилатциклазы на некротические процессы в этих
клетках. Более того, ингибирование протеинкиназы А в нейро-
нах с помощью Н89 усиливало некроз нейронов и не влияло на
A
Рис. 61. Влияние 1 мкМ Н89, ингибитора протеинкиназы А, и фотодина-
мического воздействия 10-7 М Фотосенса на время жизни и некроз меха-
норецепторного нейрона рака (/1), некроз, апоптоз и численность сател-
литных глиальных клеток (Б).
1 — контроль, 2 — воздействие Н89 в темноте, 3 — фотодинамическое воздейст-
вие, 4 — фотодинамическое воздействие в присутствии Н89; * — р < 0.05, ** —
р < 0.01, *** — р < 0.001.
Fig. 61. Effect of 1 цМ H89 and PD effect of 10-7 M Photosens on lifetime and
necrosis of crayfish mechanoreceptor neurons (A), necrosis, apoptosis and
number of glial cells (Б).
1 — control, 2 — action of H89 in the darkness, 3 — PD effect, 4 — PD effect in the
'presence of H89. Significant difference: * —p < 0.05, ** — p < 0.01, *** —p < 0.01.
фотоиндуцированный некроз глиальных клеток (рис. 61), т. е. в
нейронах протеинкиназа А играла противонекротическую роль,
а в глие не влияла на некротические процессы. Механизм учас-
тия сАМР-зависимого сигнального пути в фотоиндуцированном
некрозе нейронов и глии пока не выяснен.
Более определенно можно сказать о противоапоптозной роли
аденилатциклазного пути в глиальных клетках. В них активация
аденилатциклазы форсколином предотвращала фотоиндуциро-
ванный апоптоз (рис. 60, Б), а ингибирование протеинкиназы А
усиливало этот процесс (рис. 61, Г), т. е., протеинкиназа А, как и
аденилатциклаза, препятствовала фотоиндуцированному апоп-
тозу. Вероятно, оба фермента последовательно участвовали в
одном и том же противоапоптозном процессе: активация адени-
латциклазы повышала уровень сАМР, а тот активировал проте-
инкиназу А и управляемые ею белки, реализующие защитный
эффект.
Согласно рис. 60, Б и Г, форсколин проявлял тенденцию к
увеличению числа сателлитных глиальных клеток вокруг тела
фотосенсибилизированного нейрона, a MDL-12330A — к сниже-
нию. Эти различия становились значимыми при сравнении этих
опытов между собой. Это указывает на возможное участие аде-
нилатциклазы в фотоиндуцированном глиозе, который мог слу-
жить одним из элементов защиты нейронов от окислительного
повреждения и компенсации утраченных глиальных клеток (Uz-
densky et al., 2005). Протеинкиназа А в этом процессе не участ-
вовала (рис. 61).
Как инициируется сигнальный аденилатциклазный путь при
фотоокислительном повреждении клеток, пока не ясно. Возмож-
на внешняя и внутренняя его активация. В первом случае его
инициатором мог служить, например, нейромедиатор глутамат,
появляющийся в межклеточной жидкости рака после секреции
аксонами дипептида NAAG (У-ацетиласпартатглутамат), его
расщепления и распознавания метаботропными глутаматными
рецепторами, связанными с G-белками (Urazaev et al., 2001). Из-
вестно, что активация G-белков, ведущая к синтезу сАМР, повы-
шает уровень глутатиона в нейронах, защищая их от окислите-
льного стресса (Lewerenz et al., 2003). О реальности этого меха-
низма в рецепторе растяжения рака свидетельствуют данные о
снижении фотоиндуцированного апоптоза глиальных клеток в
присутствии экзогенного глутамата и NAAG (Романенко, Узден-
ский, 2008).
Другой альтернативой является внутриклеточная стимуля-
ция аденилатциклазы Са2+/кальмодулином. Хорошо известно,
что аденилатциклазная система тесно связана с системой регуля-
ции кальциевого гомеостаза. С одной стороны, Са2+-каналы мо-
гут активироваться протеинкиназой А, а с другой — Са2+ влияет
на внутриклеточный уровень сАМР, так как комплекс Са2+/каль-
модулин регулирует активность как аденилатциклазы, произ-
водящей сАМР, так и фосфодиэстеразы, расщепляющей его
(Zaccolo, Pozzan, 2003). Среди белков, активируемых протеинки-
назой А, следует отметить фактор транскрипции CREB, деятель-
ность которого направлена на повышение выживаемости клеток
(Lonze, Ginty, 2002). Показано, что сенсорные нейроны живот-
ных, утратившие CREB, подвергаются апоптозу и отмирают
(Lonze et aL, 2002).
17. 4. Фосфотирозиновые сигнальные пути
Важнейшие компоненты межклеточной сигнализации — ре-
цепторные тирозинкиназы. Они распознают цитокины и факто-
ры роста, имеющие критическое значение для выживаемости
клеток, и инициируют три основных внутриклеточных сигналь-
ных пути: кальциевый, начинающийся с фосфолипазы С , фос-
фатидилинозитол 3-киназный и MAP-киназный. Нейрогли-
альные взаимодействия в нервной системе осуществляются ней-
ротрофическими факторами, распознаваемыми рецепторными
тирозинкиназами (Chao et al., 2006; Reichardt, 2006). Противопо-
ложную роль играют тирозиновые протеинфосфатазы, которые
дефосфорилируют белки и тем самым прерывают сигнальное
действие фосфотирозинов (Gomperts et al., 2002, Зинченко, Дол-
гачева, 2003; Bradshaw, Dennis, 2003).
Для исследования роли фосфотирозиновой сигнализации
в реакциях нейронов и глиальных клеток на ФД воздействие
были использованы ингибитор тирозинкиназ генистеин и инги-
битор тирозинфосфатаз ортованадат натрия (Uzdensky et al.,
2005). В концентрации 50 цМ генистеин ускорял фотоиндуциро-
ванное торможение импульсации и сокращал время жизни ней-
ронов (рис. 62, А), а ингибирование тирозинфосфатаз ортована-
датом натрия (500 мкМ), которое должно продлевать существо-
вание фосфотирозинов, действовало противоположным образом
(рис. 63, Б). Следовательно, фосфорилирование тирозинов в не-
которых клеточных сигнальных белках препятствовало фотоин-
дуцированному торможению импульсации. Известно, что фос-
форилирование тирозинов участвует в регулировании Са2+ и
К+-каналов в нейронной мембране (Pafford et al., 1995). Возмож-
A
Время жизни, мин Некроз, %
Рис. 62. Влияние 50 мкМ ингибитора тирозинкиназ генистеина и фотоди-
намического воздействия 10-7 М Фотосенса на время жизни и некроз ме-
ханорецепторного нейрона рака (Я); некроз и апоптоз сателлитных глиа-
льных клеток (Б).
1 — контроль, 2 — воздействие генистеина в темноте, 3 — фотодинамическое
воздействие, 4 — фотодинамическое воздействие в присутствии генистеина; * —
р < 0.05, ** — р < 0.01.
Fig. 62. Effect of 50 цМ genistein and PD effect of 10-7 M Photosens on lifeti-
me and necrosis of crayfish mechanoreceptor neurons (J), necrosis and apopto-
sis of glial cells (5).
/ — control, 2 — action of genistein in the darkness, 3 — PD effect, 4 — PD effect in
the presence of genistein. Significant difference: * — p < 0.05, ** — p < 0.01.
A
Рис. 63. Влияние 500 мкМ ортованадата натрия, ингибитора тирозинфос-
фатаз, и фотодинамического воздействия 10-7 М Фотосенса на время жиз-
ни и некроз механорсцспторного нейрона рака (Л), некроз, апоптоз и чис-
ленность сателлитных глиальных клеток (Б).
1 — контроль, 2 — воздействие ортованадата в темноте, 3 — фотодинамическое
воздействие, 4 — фотодинамическое воздействие в присутствии ортованадата;
* — р < 0.05, ** — р < 0.01, *** — р < 0.001.
Fig. 63. Effect of 500 рМ sodium orthovanadate and PD effect of 10~7 M Pho-
tosens on lifetime and necrosis of crayfish mechanoreceptor neurons (A), ne-
crosis, apoptosis and number of glial cells (Б).
I — control, 2 — action of sodium ortho vanadate in the darkness, 3 — PD effect, 4 —
PD effect in the presence of sodium orthovanadate. Significant difference: * — p < 0.05,
** — p < 0.01, *** — p < 0.001.
но, какие-то нейротрофические факторы, поставляемые окружа-
ющими глиальными клетками, регулируют ионный баланс и им-
пульсный ответ нейрона на ФД воздействие.
Гснистеин также снижал некроз нейронов с 47 до 17%
(рис. 62, А). Ортованадат, однако, не влиял на некротические
процессы в нейронах, но снижал некроз глиальных клеток
(рис. 63, Д), на который не действовал генистсин, т. е., в нейро-
нах фосфорилирование тирозинов участвовало в некрозе, а в
глие, наоборот, играло противонекротичсскую роль.
Механизм участия фосфотирозинов в фотоповреждении
плазматической мембраны, приводящему к некрозу, пока нея-
сен. Известно, что ортованадат, который в наших опытах замед-
лял функциональную инактивацию нейронов и ослаблял фото-
индуцированный некроз глии, также защищал нейроны млеко-
питающих от других вредных воздействий, например от ишемии
мозга (Kawano et al., 2001). Его нейропротскторное действие мо-
жет реализоваться через повышение эффективности сигнально-
го действия нейротрофинов (Lu et al., 2002).
Отсутствие влияния обоих ингибиторов на уровень апоптоза
фотосенсибилизированных глиальных клеток и их численность
(рис. 62, Б; 63, Б) свидетельствуют о том, что тирозинкиназ-
ный/тирозинфосфатазный сигнальный путь не участвует в про-
цессах апоптоза и пролиферации глиальных клеток рецептора
растяжения рака при ФД воздействии (Uzdensky et aL, 2005). Как
и у нас, оба, генистсин и ортованадат, не влияли па фотоиндуци-
рованный апоптоз (Xue et al., 1997). В работе Гранвилля с соавт.
(Granville et al., 1998) фосфорилирование тирозиновых остатков
в белках клеток, сенсибилизированных вертенорфином, также
не участвовало в апоптозе. Однако Лю с соавт. (Luo et al., 1996)
сообщили, что и гснистеин, и ванадат оказывали проапоптозное
действие на фотосенсибилизированные клетки лейкемии мыши.
Возможно, в силу разнообразия процессов, управляемых тиро-
зинкиназами, их участие в клеточных реакциях различается в
разных конкретных условиях (разные клетки, разные фотосенси-
билизаторы, дозы воздействия и т. д).
17. 5. МАР киназы: JNK и р38
Как рассмотрено выше, внешние воздействия инициируют в
клетках сигнальные пути, ведущие к активации трех основных
МАР киназ: ERK, JNK и р38. Если ERK активируется в основ-
ном сигнальными молекулами (цитокинами, факторами роста),
вырабатываемыми другими клетками организма, то JNK. и
р38 — стрессовыми воздействиями (Gobb, 2001; Gompertz et al.,
2002; Bradshaw, Dennis, 2003). Эти сигнальные пути консерва-
тивны и имеются у разных видов клеток. В нервных клетках
JNK и рЗ8 регулируют выживаемость и смерть (Horstmann et al.,
1998; Wang et al, 2003b).
В наших экспериментах ингибирование JNK с помощью 10
мкМ SP600125 несколько ускоряло спонтанную инактивацию и
вызывало некроз 15 % механорецепторных нейронов рака в тем-
ноте, но не влияло на некроз и апоптоз глиальных клеток
(рис. 64). При ФД воздействии SP600125 не влиял на импуль-
сную активность нейронов и некроз нейронов и глиальных кле-
ток (рис. 64, А—В). Однако, он несколько повышал уровень фо-
тоиндуцированного апоптоза глии (рис. 64, Г), что выявлялось
при сравнении симметричных нейронов с помощью парного
Z-критерия Стыодента (Bibov et al, 2007). Это указывает на про-
тивоапоптозную роль JNK в глиальных клетках.
SB202190 — ингибитор другой МАР киназы, р38, достовер-
но снижал среднее время жизни фотосенсибилизированных ней-
ронов (рис. 65, А), а также уровень некроза глиальных клеток
(рис. 65, В), но не нейронов. Он также не влиял на апоптоз глии.
Это указывает на участие р38 в поддержании уровня импуль-
сной активности нейронов и в защите глии, но не нейронов от
некроза.
Такая существенная разница во влиянии ингибиторов JNK и
р38 на реакции фотосенсибилизированных нейронов и глиаль-
ных клеток говорит о различии сигнальных путей в этих клет-
ках. Как описано выше, ФД воздействие быстро активирует JNK
и р38 в разных клеточных линиях (Tao et al, 1996; Klotz et al,
1998; Assefa et al, 1999; Xue et al, 1999; Chan et al, 2000; Tong et
al, 2000; Zhuang et al, 2000; Hsien et al, 2002). Но при этом они
могли либо играть защитную роль, либо усиливать смерть фото-
сенсибилизированных клеток. Обсуждая противоречивые дан-
ные о роли JNK в нейронах, Вайтциг и Хердеген (Waetzig, Нег-
degen, 2005) указали на контекст-специфичные функции JNK.
Зависимость его роли от конкретной ситуации в разных типах
клеток может быть связана, например, с присутствием в них раз-
ных изоформ этого белка или с разными наборами исполни-
тельных белков, характерными для разных видов клеток. То же
может быть сказано и о роли р38. Можно предположить, что эти
белки участвуют в разных каскадах межклеточной нейротро-
фической сигнализации между нейронами и глиальными клет-
ками.
A
500
400
300
200
100
80
60
40
20
0
Время жизни, мин
Рис. 64. Влияние 10 мкМ SP600125, ингибитора JNK, и фотодинамическо-
го воздействия 10"7 М Фотосенса на время жизни и некроз мсханорецеп-
торного нейрона рака (Л), некроз, апоптоз и численность сателлитных
глиальных клеток (5).
/ — контроль, 2 — воздействие SP600125 в темноте, 3 — фотодинамическое воз-
действие, 4 — фотодинамическое воздействие в присутствии SP600125; * — р <
0.05, ** — р < 0.01, *** — р < 0.001.
Fig. 64. Effect of 10 цМ SP600125 and PD effect of IO-7 M Photosens on life-
time and necrosis of crayfish mechanoreceptor neurons (Я), necrosis, apoptosis
and number of glial cells (5).
1 — control, 2 — action of SP600125 in the darkness, 3 — PD effect, 4 — PD effect in
the presence ofSP600125. Significant difference: *—p < 0.05, **—p<0.01, *** —
p < 0.001.
A
Рис. 65. Влияние 5 мкМ SB202190, ингибитора р38, и фотодинамического
воздействия 10~7 М Фотосенса на время жизни и некроз механорецептор-
ного нейрона рака (Л), некроз, апоптоз и численность сателлитных глиа-
льных клеток (Б).
1 — контроль, 2 — воздействие SB202190 в темноте, 3 — фотодинамическое воз-
действие, 4 — фотодинамическое воздействие в присутствии SB202I90; * —р <
0.05, **—/?< 0.01, *** -- р < 0.001.
Fig. 65. Effect of 5 цМ SB202190 and PD effect of 10~7 M Photosens on lifeti-
me and necrosis of crayfish mcchanoreceptor neurons (Л), necrosis, apoptosis
and number of glial cells (Б).
J —.control, 2 — action of SB202190 in the darkness, 3 — PD effect, 4 — PD effect in
the presence of SB202190. Significant difference: * — p < 0.05, **—/?< 0.01, ** —
p < 0.001.
17. 6. Фосфатидилинозитол 3-киназа
Еще один важный путь внутриклеточной сигнализации
включает в себя фосфатидилинозитол 3-кипазу, которая регули-
рует клеточные ответы на стрессовые воздействия, выживае-
мость клетки и устойчивость к апоптозу посредством активации
протеинкиназы В (Akt/PKB) (Skaper et al., 1998). Для исследова-
ния ее роли в реакции нейрона на ФД воздействие мы использо-
вали два ингибитора: вортманнин и LY294002 (Bragin et al.,
2003).
Ингибирование фосфатидилинозитол 3-киназы вортманни-
ном (100 нМ) или LY294002 (20 мкМ) защищало нейроны от фо-
тодинамической инактивации и существенно увеличивало их
время жизни (табл. 22). Мы нс наблюдали качественных измене-
ний динамики импульсных реакций нейронов: как правило, их
инактивация происходила в результате торможения имнульса-
ции. Через 4 ч после фотоинактивации вортманнин, но не LY
294002, также увеличивал среднюю площадь ядер нейронов с
530 до 930 мкм2 (табл. 22), что согласовывалось с данными об их
некротической смерти.
Если фотоиндуцированное прекращение импульсации ней-
рона связано с повышением цитоплазматического уровня Са2*
(Uzdensky ct al., 2000а), то можно предположить, что участие
фосфатидилинозитол 3-киназы в фотоинактивации нейрона мог-
ло быть связано с ее влиянием па уровень свободного Са2+ в
клетке (Hsu ct aL, 2000). Действительно, продукт фосфатидили-
нозитол 3-киназы фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат стиму-
лирует вход Са2+ в разных типах клеток (Barker et aL, 1999; Hsu
et al., 2000), а фосфатидилинозитол 3-киназа активирует фосфо-
Таблица 22
Влияние фосфатидилинозитол 3-киназы на время жизни
и морфологию ядра нейрона при фотодинамическом
действии 10 7 М Фотосенса
Ингибитор Время жизни нейрона, мин Площадь ядра, мкм2
ФД ФД + ингибитор ФД ФД + ингибитор
Вортманнин (100 нМ) LY 294002 (20 мкМ) 19.0±1.9 (6) 2.4±2.9 (8) 33.2±2.5 (9)** 36.3±3.3 (9)** 540±50(14) 540±50(14) 930±110 (12)* 540±30(13)
Примечание. В скобках указано число опытов; * — р < 0.05, ** — р < 0.01.
липазу С, стимулирующую повышение [Са2+]г В свою очередь
комплекс Са2+/кальмодулин может активировать фосфатидили-
нозитол 3-киназу (Hsu et al., 2000). Эти данные свидетельствуют
о сложной взаимосвязи Са2+-зависимой и фосфатидилинозитол
3-киназной сигнальных систем и их совместной роли в реакции
клетки на стрессовые воздействия (Bragin et al., 2003).
Глава 18
РОЛЬ НЕЙРОГЛИАЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
В ФОТОПОВРЕЖДЕНИИ НЕЙРОНОВ
И ГЛИАЛЬНЫЙ КЛЕТОК
Межклеточные взаимодействия играют важнейшую роль в
интеграции тканей и органов, их реакциях на внешние воздейст-
вия (Пальцев и др., 2003). В последнее время большое внимание
уделяется изучению нейроглиальных взаимодействий при раз-
ных физиологических и патологических процессах, при дейст-
вии повреждающих факторов: травмы и аксотомии (Корр et al.,
1997; Raivich et al., 1999), ишемии (Largo et al., 1996), лише-
нии трофических факторов (Largo et aL, 1996) и т. д. Показано,
что все типы глиальных клеток — астроциты, микроглиоциты,
олигодендроциты и шванновские клетки — участвуют в реакци-
ях нейронов на повреждение. Они удаляют продукты распада
умирающих клеток, регулируют состав межклеточной среды,
секретируют факторы роста, поддерживая выживаемость ней-
ронов, репаративные и регенеративные процессы в них (Muller,
Stoll, 1998; Raivich et aL, 1999, Barres, Barde, 2000; Николлс
и др., 2003). При внешних повреждающих воздействиях одно-
временно с гибелью глиальных клеток может происходить и
их пролиферация — реактивный глиоз, направленный на заме-
щение утраченных клеток и защиту поврежденных нейронов
(Guenard et aL, 1996; Bruce et aL, 2000; Baumann, Pham-Dinh,
2001).
18.1. Защита нейроном сателлитных глиальных
клеток
Достоинством рецептора растяжения рака как объекта для
изучения нейроглиальных взаимодействий по сравнению с цент-
ральной нервной системой является его. простота: мы точно зна-
ем, какие глиальные клетки окружают данный нейрон. Для вы-
Экспериментальные группы
Рис. 67. Некроз (Я) и апоптоз (Б) глиальных клеток (ГК) после фотодина-
мического воздействия.
1 — контроль, 2 — общее фотодинамическое воздействие, 3 — локальное облуче-
ние тела нейрона + общее фотодинамическое воздействие.
Fig. 67. Necrosis (Я) and apoptosis (Б) of glial cells after photodynamic effect.
/ — control, 2 — total irradiation, 3 — local irradiation of neuron body + total irradiation.
яснения роли медленно адаптирующегося механорецепторного
нейрона в поддержании выживаемости глиальных клеток, под-
вергнутых фотоокислительному стрессу, был проведен следую-
щий эксперимент: после 30-минутной инкубации рецептора рас-
тяжения с 10“7 М Фотосенса нейрон подвергали интенсивному
локальному облучению лазерным лучом (200 Вт/см2, диаметр
луча 90 мкм), сфокусированным на его тело. Это вызывало бы-
строе учащение импульсной активности, а затем ее резкое и не-
обратимое блокирование в среднем за 3 мин. При этом в облу-
ченной области быстро развивался некроз нейрона и окружаю-
щих глиальных клеток (эта область обведена кружком на
рис. 66, Б). Затем весь препарат, как обычно, подвергали общему
лазерному облучению в течение 30 мин с интенсивностью
0.3 Вт/см2, а через 6—7 ч определяли число глиальных клеток
и типы их смерти. Оказалось, что предварительная инактива-
ция нейрона не влияла на некроз, но достоверно повышала уро-
вень апоптоза глиальных клеток, окутывающих аксон, с 0.5±0.4
до 3.9±1.4 отн.ед. (рис. 66, 67). Следовательно, тело нейрона ка-
ким-то образом предотвращало апоптоз глиальных клеток, окру-
жающих его удаленные участки (Kolosov, Uzdensky, 2006).
Можно предположить, что нейрон секретирует какие-то сиг-
нальные молекулы, влияющие на устойчивость глиальных кле-
ток к фотоиндуцированному апоптозу. Ими могут быть, напри-
мер, нейротрофипы или нейрегулины, которые у позвоночных
животных выделяются из поврежденных аксонов и поддержива-
ют выживаемость окружающих глиальных клеток (Grinspan et
al., 1996; Корр et al., 1997; Carratt ct al., 2000).
18. 2. Протеолитическое «разделение» нейрона и глии
В другом эксперименте предпринята попытка протеолитиче-
ского «разделения» нейрона и глии, т. с. разрушения белков,
участвующих в межклеточных взаимодействиях, с тем, чтобы
проанализировать по отдельности реакции нейронов и глии на
фотодинамическое воздействие. Для этого рецептор растяжения
в течение часа предварительно обрабатывался протеолитиче-
скими ферментами коллагеназой (0.02 %) или проназой (0.01 —
0.025 %), чтобы разрушить белки межклеточного матрикса
(преимущественно коллаген) и поверхностные белки, участву-
ющие в межклеточных взаимодействиях, а потом препарат,
как обычно, подвергался ФД воздействию (Lobanov, Uzdensky,
2005).
Время жизни нейрона, Мйн
Обработка коллагеназой в темноте не влияла на фоновый
уровень некроза нейронов и глии и апоптоза глиальных клеток
(рис. 68), но проназа достоверно усиливала спонтанный некроз
нейронов и глии и вызывала апоптоз глии (рис. 69).
Предобработка рецептора растяжения рака коллагеназой
ускоряла их инактивацию и вызывала достоверное снижение вре-
мени жизни фотосенсибилизированных нейронов (рис. 68, А).
При обработке проназой отмечалась та же тенденция (рис. 69,
А). Это могло быть обусловлено повреждением внеклеточных
частей транспортных белков, ионных каналов и насосов, а также
нарушением клеточного гомеостаза.
Обработка рецептора растяжения коллагеназой не влияла на
фотоиндуцированный некроз нейронов и глии (рис. 68, В, Г).
Проназа также не изменяла уровень некроза нейронов, но досто-
верно усиливала фотоиндуцированный некроз глиальных клеток
(рис. 69, Г).
Особенно интересно, что и коллагеназа, и проназа практиче-
ски предотвращали фотоиндуцированный апоптоз глиальных
клеток (рис. 68, Г; 69, Г). Это, с одной стороны, могло быть ре-
зультатом нарушения проницаемости плазматической мембра-
ны вследствие протеолиза некоторых мембранных белков, кото-
рое усиливало некротические процессы, а с другой стороны —
препятствовало апоптозу. Возможно, какие-то белки на поверх-
ности глиальных клеток, такие как «смертельные» рецепторы
нейротрофических факторов типа p75NGF, способствуют фотоин-
дуцированному апоптозу глии. Их разрушение экзогенными
протеазами могло защитить клетки от апоптоза, но не некроза.
(Lobanov, Uzdensky, 2005, 2007).
Рис. 68. Фотодинамическое воздействие 10-7 М Фотосенса на механоре-
цепторные нейроны и глию после 1-часовой обработки 0.02%-ной колла-
геназой.
А — время жизни нейрона; Б — некроз нейронов; В — некроз глиальных клеток;
Г — апоптоз глиальных клеток через 6—7 ч после прекращения импульсной ак-
тивности; * - р < 0.05, ** — р < 0.01, *** — р < 0.001.
Fig. 68. Photodynamic effect of IO-7 M Photosens on mechanoreceptor neurons
and glial cells after 1-hour treatment with 0.02% collagenase.
A — neuron lifetime; Б — neuron necrosis: В — necrosis of glial cells; Г— apoptosis of
glial cells in 6—7 hours after firing abolition. Significant difference: * — p < 0.05,
** — p < 0.01, *** — p < 0.001.
Апоптоз глии, отн. сд.
18. 3. Влияние нейротрофина NGF
и эпидермального фактора роста EGF на выживаемость
фотосенсибилизированных нейронов и глии
Известно, что нервные и глиальные клетки могут поддержи-
вать выживаемость друг друга с помощью нсйротрофинов и ней-
регулинов, выделяемых ими в межклеточное пространство. В
изолированном рецепторе растяжения сенсорные нейроны мо-
гут получать межклеточные молекулярные сигналы от окружа-
ющей глии, а глиальные клетки — от нейронов или соседних
глиальных клеток. Для выяснения молекулярной природы сиг-
нальных молекул, осуществляющих нейроглиальные взаимодей-
ствия в фотосенсибилизированном рецепторе растяжения рака,
мы изучили влияние фактора роста нервов NGF (nerve growth
factor) и эпидермального фактора роста EGF на реакции нейро-
нов и глиальных клеток на ФД воздействие.
NGF — наиболее изученный нейротрофический фактор. Он
состоит из 5 субъединиц: 2а, 10 и 2у. Из них активной является
субъединица 0. NGF распознается рецепторной тирозинкиназой
ТгкА, инициирующей рост нейритов и способствующей выжи-
ваемости нейронов, или рецептором р75, который инициирует
апоптоз (Sofronicw et al., 2001; Chao et al., 2006; Reichardt, 2006).
Оба вида рецепторов найдены на поверхности и в цитоплазме
нейронов и глиальных клеток (Pannesse, Procacci, 2002).
mNGF 7S — полная пятисубъединичная молекула фактора
роста нервов мыши. В темноте mNGF 7S (100 нг/мл) не влиял на
импульсную активность (рис. 70, Л) и процент некротических
нейронов (рис. 70, Б), а также на фоновый уровень некроза и
апоптоза глиальных клеток (рис. 70, В, Г). Также не наблюда-
лось влияния mNGF 7S на импульсную реакцию нейронов на
Рис. 69. Фотодинамическое воздействие 10-7 М Фотосенса на механоре-
цепторные нейроны (Л, Б) и глиальные клетки (В, Г) после 1-часовой об-
работки 0.01—0.025%-ной проназой.
А — время жизни нейрона; Б — некроз нейронов; В — некроз глиальных клеток;
Г — апоптоз глиальных клеток через 6—7 ч после прекращения импульсной ак-
тивности; * — р < 0.05, ** — р < 0.01, *** — р < 0.001.
Fig. 69. Photodynamic effect of 10-7M Photosens on mechanoreceptor neu-
rons and glial cells after 1-hour treatment with 0.01—0.025% pronase.
A — neuron lifetime; Б — neuron necrosis; В — necrosis of glial cells; Г— apoptosis of
glial cells in 6—7 hours after firing abolition. Significant difference: * — p < 0.05,
** — p < 0.01, *** — p < 0.001.
09
ФД воздействие, а также на фотоиндуцированный некроз ней-
ронов (рис. 70, А—В). Однако фотоиндуцированный некроз
(рис. 70, В) и апоптоз (рис. 70, Г) глиальных клеток существенно
снижался в присутствии mNGF 7S. Аналогичные данные полу-
чены в присутствии 50 нг/мл активной Р-субъединицы этого
нейротрофина mNGF 2,5S (данные не показаны). Эти защитные
эффекты указывают на возможное присутствие в клетках сател-
литной глии рецептора растяжения рака аналогов рецепторов
фактора роста нервов ТгкА, способных распознавать как сам
фактор роста нервов мыши mNGF 7S mNGF, так и его активную
Р-субъединицу mNGF 2.5S (Лобанов, Узденский, 2007; Лобанов
и др., 2007).
Чтобы убедиться, что действие NGF на глиальные клетки не
является неспецифичным, мы изучили действие эпидермального
фактора роста человека EGF (Sigma-Aldrich) в концентрации
100 нг/мл на фотосенсибилизированные нейроны и глию рака.
Он действительно не влиял на импульсную реакцию нейрона на
фотодинамическое действие 10 7 М Фотосенса, а также на фото-
индуцированный некроз нейронов и глии и на апоптоз глиаль-
ных клеток.
Эти данные указывают на возможность межклеточной ней-
ротрофической сигнализации в рецепторе растяжения рака в на-
правлении «нейрон глия» с помощью нейротрофина, анало-
гичного NGF млекопитающих, который способствует выживае-
мости глиальных клеток, но не нейронов. Возможно, глиальные
клетки речного рака имеют рецепторы, аналогичные ТгкА, спо-
собные распознать NGF, а нейроны выделяют аналоги mNGF,
защищающие глиальные клетки от некроза и апоптоза.
Рис. 70. Фотодинамическое воздействие 10-7М Фотосенса на механоре-
цепторные нейроны и глиальные клетки в присутствии 100 нг/мл
mNGF 7S.
А — время жизни нейрона; Б — некроз нейронов; В - некроз глиальных клеток;
Г— апоптоз глиальных клеток; 1 - контроль, 2 — действие mNGF 7S в темноте,
3 — фотодинамическое воздействие, 4 — фотодинамическое воздействие в при-
сутствии mNGF 7S. Внутри столбиков указано число опытов; * — р < 0.05, ** —
р < 0.01, *** — р < 0.001.
Fig. 70. Photodynamic effect of 10-7 M Photosens on crayfish mechanorccep-
tor neurons and glial cells in the presence of mNGF 7S (100 ng/ml).
A — neuron lifetime; Б— necrosis of neurons; В — necrosis of glial cells; Г — apopto-
sis of glial cells; 1 — control, 2 — effect of mNGF 7S in the darkness, 3 — photodyna-
mic Effect, 4 — photodynamic effect in the presence of mNGF 7S. The numbers of ex-
periments are shown inside bars. Significant difference: * — p < 0.0, ** — p < 0.01,
*** — p < 0.001.
Изучение данной проблемы осложняет то, что пока не изве-
стно, есть ли вообще у ракообразных нейротрофическая сигна-
лизация. Не известно, сходны ли их нейротрофические факторы
с нейротрофинами позвоночных животных, есть ли у ракообраз-
ных рецепторы, способные распознавать нейротрофины млеко-
питающих? Пока получены только первые свидетельства в поль-
зу этих предположений. Но эти вопросы придают новое важное
звучание данному исследованию.
Внутриклеточные сигнальные пути обычно высоко консер-
вативны. Это древние механизмы управления функциональным
состоянием, дифференцировкой и делением клеток, их реакция-
ми на внешние воздействия. Однако межклеточные взаимо-
действия, как более позднее эволюционное приобретение, более
разнообразны. Тщательные поиски нейротрофинов у беспозво-
ночных, включая анализ геномов, привели к заключению об их
отсутствии у нематод С. elegans и мух D. melanogaster. Была вы-
двинута гипотеза о том, что эволюционное развитие сложной
центральной нервной системы, зачатки которой появляются у
моллюсков, связано с появлением нейротрофической сигнализа-
ции (McKay et al., 1999; Jarro ct al., 2001). Но пока не выяснено,
на каком этапе эволюции появляются аналоги нейротрофинов.
Поэтому важны данные о влиянии нейротрофинов позвоночных
животных на нейроны и глию беспозвоночных. Так, обнаружено
влияние NGF на кальциевые токи, синаптические процессы,
рост и ветвление аксонов моллюсков Lymnaea stagnalis (Ridgway
et al., 1991; Wildering et al., 1995) и кальмара Loligopeallei (More-
no et al., 1998). В этом аспекте важны полученные данные о вли-
янии ряда нейротрофинов млекопитающих на реакции нейронов
и глиальных клеток речного рака на фотоокислительный стресс,
которые свидетельствуют о возможном наличии нейротрофиче-
ской сигнализации у ракообразных.
Глава 19
О МЕХАНИЗМАХ РЕАКЦИЙ НЕЙРОНОВ
И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК НА ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ
ВОЗДЕЙСТВИЕ
В зависимости от физико-химических свойств и концент-
рации сенсибилизаторов ФД воздействие может повреждать
разные мишени и индуцировать разные клеточные реакции.
Они проявляются как в разных биоэлектрических ответах, так и
в развертывании различных метаболических и сигнальных це-
пей, вызывающих разные типы клеточной смерти. Так, ФД воз-
действие Фотосенса в концентрации 10“5 М вызывало резкое
учащение импульсной активности, оканчивающееся необрати-
мым ее блокированием. При меньшей концентрации (10-7 М) не-
обратимое прекращение нейронной активности происходило по-
сле постепенного торможения импульсации (Uzdensky et al.,
2002а).
В первом случае картина фотоповреждения нейрона была
достаточно ясна и типична для острого некротического процес-
са, обусловленного быстрым повреждением плазматической
мембраны и падением уровня биоэнергетических процессов.
Интенсивная генерация синглетного кислорода при высокой
концентрации фотосснсибилизатора приводит к перекисному
окислению липидов и фотоповреждению мембранных белков. В
результате развивается утечка ионов (Valenzeno, Tarr, 1991); по-
вреждаются ионные каналы (Pooler, 1972; Specht, Rogers, 1990,
1991; Valenzeno, Tarr, 1991; Starkus, 1993; Kress et al., 1997), ин-
гибируются ионные насосы (Ташмухамсдов, 1973; Kondo, Kasai,
1974). Это вызывает деполяризацию (Бурмистров и др., 1969;
Specht, Rogers, 1991; Kress et al., 1997), активацию и деполяриза-
ционный блок нейронной активности (Людковская, Бурмистров,
1971; Ходоров, 1975).
В наших опытах при воздействии 10“5 М Фотосенса ядра
нейронов флуорохромировались пропидиум-йодидом уже в
ходе фотосенсибилизации (Uzdensky et al., 2002а), что свидете-
льствовало о нарушении проницаемости плазматической мемб-
раны. В это же время ингибировались клеточные дегидрогеназы
(Uzdensky et al., 2002а), что указывало на нарушение синтеза
АТФ. Это служило дополнительной причиной деполяризации.
Нарушение биоэнергетических процессов и повреждение плаз-
матической мембраны — факторы, ведущие к некрозу (Luo, Kes-
sel, 1996; Dellinger, 1997; Nicotera, Leist, 1997). Таким образом
ФД воздействие 10“5 М Фотосенса, вызывающее свободно-ради-
кальное повреждение мембран, нарушение их проницаемости и
ингибирование биоэнергетических процессов, быстро индуци-
ровало некроз нейрона (Uzdensky et al. 2001а, 2002а).
При меньшей концентрации фотосенсибилизатора (10’7 М)
наблюдались в основном тормозные ответы нейронов, характе-
ризующиеся постепенным замедлением, а затем прекращением
нейронной активности. При этом целостность плазматической
мембраны нарушалась только через 1.7 ч, а ингибирование биоэ-
нергетических процессов выявлялись только через 4 ч после
функциональной инактивации нейрона. Затем наблюдалось сжа-
тие ядер нейронов, но их фрагментации, характерной для апоп-
тоза, не выявлялось (Uzdensky et al., 2002а). Механизмы фото-
повреждения нейронов и глиальных клеток в этом случае были
изучены подробнее.
Какие процессы лежат в основе фотоиндуцированного тор-
можения импульсной активности? По ультраструктурным дан-
ным, на ранних стадиях реакции нейрона, когда только начина-
ли выявляться сдвиги импульсной активности, уже наблюдались
структурные изменения митохондрий и ЭР: набухание, нару-
шения мембран. Эти органеллы являются кальциевыми депо, и
их повреждение приводит к выходу Са2+ в цитозоль. Са2+ спо-
собен вызывать гиперполяризацию клетки вследствие актива-
ции Са2+-зависимых К’ каналов (Vergara et al., 1998; Sah, Faber,
2002) и, как следствие, торможение и прекращение нейрон-
ной активности. Это предположение подтвердилось в экспери-
ментах по фармакологической модуляции процессов, приво-
дящих к повышению или понижению уровня Са2+ в цитозоле.
Оказалось, что агенты, вызывающие повышение [Са2"]р уси-
ливали фототорможение и прекращение импульсной активно-
сти, а вещества, снижающие уровень Са2’’’ в цитозоле, замедля-
ли этот процесс. Резкое возрастание [Са2+]: при повреждении
клетки может, как известно, запускать как некроз, так и апоптоз
(Nicotera et al., 1990; Trump, Berezesky, 1992, 1998; Fadeel, Orre-
nius, 2005).
Фотоинактивация нейрона была связана с нарушением энер-
гетического метаболизма. Добавление в среду биоэнергетиче-
ских субстратов защищало нейроны от фотоинактивации, а ин-
гибиторы разных биоэнергетических процессов (гликолиза, цик-
ла Кребса, электронного транспорта или окислительного
фосфорилирования) увеличивали фоточувствительность нейро-
на и сокращали время его жизни. Поэтому, снижение производ-
ства и истощение запасов АТФ, необходимого для поддержания
ионного баланса и противодействия процессам фотоповрежде-
ния, могло быть одной из причин фототорможения и инактива-
ции нейрона.
Значительную роль в реакциях нейронов и глиальных клеток
на фотоповреждение играли процессы внутри- и межклеточной
сигнализации. Применяя ингибиторы или активаторы различ-
ных сигнальных ферментов, нам удалось показать их участие в
тех или иных реакциях нейронов на ФД воздействие: функцио-
нальной инактивации, некрозе, апоптозе или пролиферации. Эти
данные суммированы в табл. 23 и 24. По ним построены схемы
сигнальных процессов, участвующих в реакциях нейронов и
глиальных клеток на ФД воздействие 10“7 М Фотосенса (рис. 71
и 72).
Согласно этим данным, фотоиндуцированное торможение
импульсации замедлялось при ингибировании белков, участву-
ющих в различных сигнальных путях: фосфолипазы С, протеин-
киназы С, фосфатидилинозитол 3-киназы и тирозинфосфатазы.
Следовательно, эти белки участвуют в фотодинамической инак-
тивации нейрона. Так как фосфолипаза С участвует в мобилиза-
ции Са2+ из ЭР, а протеинкиназа С активирует кальциевые кана-
лы в плазматической мембране и тем самым также способствует
повышению [Са2+], то понятно их участие в фототорможении
импульсной активности. Участие других ферментов в данном
эффекте, видимо, опосредовано более сложными механизмами.
Напротив, ферменты аденилатциклазного пути — аденилатцик-
лаза и протеинкиназа А, а также тирозинкиназы противодейст-
вовали фотоиндуцированному торможению нейронной активно-
сти. Возможно в основе этих эффектов также лежала модуляция
внутриклеточного уровня кальция.
Каков был механизм смерти нейронов при слабом ФД воз-
действии (10-7 М Фотосенса), вызывавшем постепенное тормо-
жение нейронной активности и сравнительно медленную его
инактивацию. Известно, что интенсивные воздействия вызыва-
Таблица 23
Суммарные данные о влиянии ингибиторов или активаторов
сигнальных ферментов и нейротрофических факторов
на время жизни и некроз нейронов, а также на некроз, апоптоз
и численность глиальных клеток при фотодинамическом
воздействии 10-7 М Фотосенса
Фермент Ингибитор Время жизни Некроз нейро- нов Нек- роз глни Апоп- тоз глии Числен- ность глин
PI-фосфолипаза С ( ЕТ-18 За2+ 1 1
PC-фосфолипаза С D-609 — — — — —
Кальмодулин Флюфеназин — 1 1 — —
СаМКП KN-93 — 1 1 — 1
Протеинкиназа С Стауроспорин 1 — 1 t 1
сАМР
Аденилатциклаза MDL-1233OA Форсколин* 1 1 1 1 1 1
Протеинкиназа А Н-89 1 t — 1
МАРК
JNK/SAPK SP-600125 — 1 — - 1 1 —
р38 МАРК SB-202190 1 1 ! - 1
Фосфотирозины
Тирозинкиназы Гснистеин 1 1 — — —
Тирозинфосфатазы Ортованадат t — 1 — —
Нейротрофические факторы
NGF 7S 1 1 —
EGF — — —
Примечание. * — Активатор; достоверные изменения (р < 0.05) обозначены
стрелками: 1 — усиление эффекта, | — ослабление эффекта,------отсутствие влия-
ния.
ют некроз, а слабые, но продолжительные — апоптоз (Новиков,
1996; Лушников, Абросимов, 2001). ФД воздействие, имеющее
первичной мишенью митохондрии, чаще индуцирует апоптоз,
а воздействие, направленное на плазматическую мембрану и ли-
зосомы, — некроз (Kessel et al., 1997; Kessel, Luo, 1998; Oleinick
et al., 2002). Отличительной особенностью апоптоза является
первоначальное развитие изменений в клеточном ядре при
Таблица 24
Участие ферментов и нейротрофических факторов
на время жизни и некроз нейронов, а также на некроз, апоптоз
и численность глиальных клеток при фотодинамическом
воздействии 10-7 М Фотосенса
Нейрон Глня
Торможение импульсации Некроз Некроз Апоптоз Глиоз
Усиление/ участие 1 PLC РКС PI3K ТРР HRGl-pi СаМ, СаМКП АС ТК PLC СаМ СаМКП РКС АС ТРР р38 PLC СаМКП РКС АС р38
Снижение / Предотвра- щение 1 АС, РКА ТК РКА NGF NGF GDNF G1U РКС АС РКА JNK
сохранной структуре цитоплазмы. В фотосенсибилизирован-
ных нейронах, в отличие от глиальных клеток, не наблюдалось
характерной для апоптоза фрагментации нейрональных ядер
или группирования хроматина в крупные массы. Наиболее выра-
женными были изменения цитоплазматических органелл: ми-
тохондрий, ЭР, аппарата Гольджи, наблюдавшиеся уже в начале
ФД воздействия. Исчерпание запасов гликогена к концу облуче-
ния свидетельствовало об истощении энергетических ресур-
сов для производства АТФ. Хотя активность дегидрогеназ
еще сохранялась, но нарушения структуры митохондриальных
мембран свидетельствовали о разобщении окислительного
фосфорилирования и падении производства АТФ. Через 2—4 ч
после ФД воздействия становились явными такие признаки не-
кроза, как истощение запасов гликогена, инактивация дегидро-
геназ и нарушение проницаемости плазматической мембраны,
ультраструктурные изменения митохондрий и эндоплазмати-
ческого ретикулума (Uzdensky et al., 2002а, 2007). Возможно,
во время ФД воздействия могли срабатывать некоторые элемен-
ты апоптозной программы, например, выход цитохрома с из
поврежденных митохондрий. Но они, вероятно, перекрывались
некротическими реакциями. Поэтому, летальные события, при-
водящие к гибели нейрона при низкоинтенсивном ФД воздейст-
вии, мы определили как замедленный некроз (Uzdensky et al.,
2002а).
Мы не наблюдали апоптотическую фрагментацию ядер ме-
ханорецепторных нейронов рака не только при фотосенсибили-
зации, но и при действии различных фармакологических индук-
торов апоптоза например, стауроспорина или иономицина. Воз-
можно, программа апоптоза изначально заблокирована в этих
нейронах, уникальных в нервной системе рака и необходимых
для управления его движениями, что способствует выживанию
животного. Может быть, это вообще справедливо для нейронов
членистоногих, функции которых не дублируются (Цвиленева,
1970). Недавно показано, что программа апоптоза заблокирова-
на у многих нейронов взрослых млекопитающих. Если в раннем
развитии апоптоз широко используется для формирования нер-
вных сетей, то в нейронах взрослых животных блокируются раз-
ные стадии апоптоза от нарушения передачи сигнала от Fas ре-
цепторов внутрь клетки до нарушения механизма апоптоза
(Benn, Woolf, 2004).
Медленное развитие некроза нейронов в течение 2 ч после
ФД воздействия и его модуляция различными сигнальными про-
цессами свидетельствуют о том, что некроз — не пассивный, не-
контролируемый процесс катастрофической гибели клеток, а
комплекс управляемых клеточных реакций. Это согласуется с
аналогичными представлениями о механизме некроза как «про-
граммированной смерти клеток некротического типа» (Proskury-
akov et al., 2003; Krantic et aL, 2005; Festjens, 2006; Golstein, Kroe-
mer, 2006; Zong, Thompson, 2006; Galluzzi et aL, 2007; Узден-
ский, 2010). Данные о том, что некроз может контролироваться
различными внутриклеточными сигнальными процессами и
реализоваться по определенной программе накапливаются в по-
следние годы. В доказательство того, что некроз можно рассмат-
ривать, как одну из форм программированной клеточной смер-
ти, приводится ряд аргументов.
— Некротическая смерть клеток может происходить не толь-
ко при патогенных воздействиях, но и при осуществлении раз-
личных физиологических функций. Например, хондроциты, ре-
гулирующие рост костей млекопитающих в раннем онтогенезе,
отмирают путем некроза (Roach, Clarke, 2000).
— Некроз может запускаться при связывании некоторых ли-
гандов (например, фактора некроза опухолей TNFa) с поверхно-
стными рецепторами и последующей инициации соответствую-
щих внутриклеточных сигнальных путей (Proskuryakov et aL,
2003; Festjens, 2006; Golstein, Kroemer, 2006).
— Чувствительность клеток к некрозу может регулироваться
генетическими и эпигенетическими факторами. Например, про-
цесс некроза нейронов мышей мозга при ишемии зависит от воз-
раста и различается в разных отделах мозга (Mattson, Magnus,
2006).
— Ингибирование некоторых ферментов, например, кальпа-
инов, катепсинов, циклофилина D, поли(АВР-рибоза)полимера-
зы или киназы RIP1 (receptor-activating protein 1) может предот-
вратить некроз, т. е. эти ферменты играют решающую роль в ле-
тальном процессе (Proskuryakov et aL, 2003; Festjens, 2006;
Golstein, Kroemer, 2006).
В наших экспериментах сравнительно интенсивное ФД воз-
действие (10-5 М Фотосенса) вызывало некроз нейронов и глиа-
льных клеток в процессе облучения в течение 2—3 мин, а при
менее интенсивном воздействии (10-7М Фотосенса) — через
1.7 ч после завершения облучения. Этот процесс модулировался
ингибиторами различных сигнальных путей, т. е., в отличие от
сильных воздействий, вызывающих немедленное повреждение
клеточной мембраны, и быстрое, неконтролируемое развитие
некротических изменений, возможно сравнительно медленное и
управляемое развитие некроза. По всей вероятности, нужно раз-
личать не одну, а три возможности.
А) Быстрое неуправляемое развитие некроза при интенсив-
ных воздействиях, особенно, если они непосредственно повреж-
дают наружную мембрану клетки. Это, собственно, некроз в его
классическом понимании.
Б) При умеренных воздействиях на клетку возможно осуще-
ствление определенной программы, последовательности собы-
тий, приводящих к некрозу. Такой программированный некроз
является хорошо организованным комплексом молекулярных
процессов, взаимодействующих между собой на различных
уровнях (Festjens et aL, 2006).
В) (промежуточный вариант). Отдельные стадии некроза мо-
гут регулироваться некоторыми сигнальными белками. В этом
случае можно говорить о сигнальном контроле некротических
процессов, осуществляющихся «по умолчанию», но в опреде-
ленной степени регулируемых. Эти варианты нелегко разделить
и можно говорить лишь о преимущественной тенденции.
По всей вероятности, при внешнем воздействии в клетке мо-
гут одновременно запускаться все программы смерти — апоп-
тоз, аутофагия и некроз, а также защитные процессы. В зависи-
мости от характера, силы и продолжительности воздействия, а
также от типа клеток, их биохимического и физиологического
статуса, те или иные процессы начинают преобладать и приво-
дят в конечном итоге к выживанию клетки или к тому или иному
типу ее смерти. Если повреждения слабы и клетка успешно их
репарирует, она выживает. При более сильных повреждениях,
не затрагивающих клеточную мембрану и производство АТФ,
развивается апоптоз. Аутофагия, играющая поначалу защитную
роль, при блокировании апоптоза может стать преобладающим
типом смерти. Еще более интенсивное повреждение может при-
вести к программируемому некрозу, перекрывающему защит-
ные и апоптотические процессы. Очень сильное воздействие,
при котором не успевают срабатывать защитные и сигнальные
процессы, приводит к катастрофическому развитию некроза. Та-
кая схема смерти клеток приведена на рис. 73. Она отличается от
классической парадигмы, постулирующей, что интенсивные
воздействия вызывают некроз, а слабые, но продолжительные —
апоптоз. Кроме общих закономерностей, в разных ситуациях мо-
гут срабатывать специальные механизмы, направленные на за-
щиту клеток или реализацию того или иного типа ее смерти. В
тканях чувствительность разных клеток неодинакова, и поэтому
при одном и том же воздействии одни из них могут умирать от
апоптоза, в других будет развиваться некроз, а третьи могут вы-
жить. Это надо иметь ввиду при разработке лечебных методик,
направленных на разрушение патологических клеток с помо-
щью радиационного, химического или ФД воздействия. Иногда
наблюдаются смешанные варианты клеточной смерти с чертами
как апоптоза, так и некроза или аутофагии. Это характерно для
нервной системы (Nicotera, Leist, 1997). В таких случаях некото-
рые авторы говорят о «континууме дегенеративных событий»
(Proskuryakov et al., 2003).
Надо отметить, что проблема сигнального контроля некроти-
ческого процесса и его фармакологической модуляции очень
важна, так как некроз — основной механизм смерти клеток при
таких важных и сложных патологиях, как окислительное по-
вреждение мозга, вызванное фокальной ишемией (Dimagi et al.,
1999). Ингибирование ранних этапов некроза могло бы защи-
тить мозг от повреждения. Но хотя некроз был известен задолго
до апоптоза, механизмы, управляющие этим процессом, оказа-
лись менее изученными. В литературе практически мало инфор-
мации о сигнальных процессах, контролирующих разрушение
или, наоборот, защиту некротических нейронов и глии (Syntic-
haki, Tavemarakis, 2003; Krantic et al., 2005).
Повреждение клетки, стресс
Рис. 73. Участие сигнальной системы в основных механизмах смерти
клетки.
Fig. 73. Involvement of signaling processes in main mechanisms of cell death.
Фотоиндуцированное повышение численности глиальных
ядер вокруг тел нейронов напоминало реактивный глиоз — про-
лиферацию глиальных клеток вокруг поврежденных нейронов с
целью заменить умирающие глиальные клетки и, в конечном
итоге, спасти поврежденный нейрон (McMillan et al., 1994; Bruce
et al., 2000). Возможно, это было связано с пролиферацией кле-
ток-предшественников глиоцитов, готовых быстро разделиться,
спасая поврежденные нейроны от внезапного повреждения (Bar-
res, Bardc, 2000; Baumann, Pham-Dinh, 2001). Метаболиты, необ-
ходимые для новых клеток могли браться из материнских кле-
ток, а частично — из погибших и разрушенных соседних. На-
блюдавшееся уменьшение размеров клеток, в частности, сжатие
их ядер могло отражать этот процесс. Реактивный глиоз, проис-
ходящий одновременно с гибелью глиальных клеток под влия-
нием внешнего воздействия, играет важную роль в сохранении
жизнеспособности и функциональной активности нервной тка-
ни. Этот процесс контролируется различными сигнальными пу-
тями. По нашим данным, белки-компоненты различных сигналь-
ных путей: кальмодулинзависимая киназа II, протеинкиназа С,
аденилатциклаза и МАР киназа р38 были необходимы для фото-
индуцированного увеличения численности ядер глиальных кле-
ток (табл. 22, 23), и ни один из изученных сигнальных путей не
противодействовал ему.
Все эти данные свидетельствуют о сложной взаимосвязи раз-
личных сигнальных систем, участвующих в реакциях клеток на
стрессовые воздействия. Центральным и связующим звеном раз-
личных сигнальных путей, управляющих клеточными реакция-
ми могут быть ионы Са2+.
В ткани или органе, состоящем из разных типов клеток, важ-
ную роль играет межклеточное взаимодействие, интегрирующее
и согласующее реакции отдельных клеток на внешние воздейст-
вия. В нервной ткани — это нейроглиальные взаимодействия.
Нейроны и глия взаимно поддерживают функционирование и
выживание друг друга. Особенно важна их роль в эмбриональ-
ном и постнатальном развитии, а также при повреждении нер-
вной системы. Нами изучена возможная роль двух типов межк-
леточных молекулярных сигналов, потенциально способных
участвовать в нейроглиальных взаимодействиях в рецепторе
растяжения рака: нейротрофических факторов и нейромедиато-
ра глутамата. Наши опыты показали, что в фотосенсибилизиро-
ванном рецепторе растяжения рака оба этих фактора оказывают
защитное антиапоптозное действие на глиальные клетки.
Интересно, что они защищали от фотодинамического по-
вреждения только глиальные клетки, но не нейроны. Это указы-
вает на наличие соответствующих рецепторов в глиальных клет-
ках, но не в нейронах. По данным группы Е. М. Либермана
(Е. М. Lieberman), аксоны рака могут выделять NAAG, при рас-
щеплении которого в межклеточной жидкости получается глу-
тамат. Глутамат воздействует на метаботропные NMDA-pe-
цепторы (Уразаев и др., 2001; Gafurov et al., 2001) и это может
приводить к гиперполяризации глиальных клеток. Возможно,
эта гиперполяризация и соответствующее смещение ионного
баланса лежали в основе антиапоптозного действия глутамата.
Они могли влиять на антиапоптозные сигнальные каскады
(рис. 72).
Другой вид межклеточных молекулярных сигналов, предпо-
ложительно участвующих в нейроглиальных взаимодействиях в
фотосенсибилизированном рецепторе растяжения рака, — ней-
ротрофические факторы. В наших опытах NGF млекопитающих
(мыши) защищал только глиальные клетки. Это свидетельствует
о возможном присутствии в этих клетках рецепторов, способ-
ных распознавать NGF и инициировать защитные внутриклеточ-
ные каскады.
В отличие от глутаматного сигнального пути, древнего и
консервативного, нейротрофическая сигнализация — сравните-
льно недавнее эволюционное приобретение. В последние годы,
когда были проанализированы геномы многих животных, стало
известно, что у некоторых беспозвоночных, например, у немато-
ды Caenorabditis elegans или мухи Drosophila melanogaster, от-
сутствуют нейротрофические факторы, аналогичные нейротро-
финам позвоночных (Jarro et al., 2001; Hidalgo et al., 2006). У
других, таких как земляной червь Eisenia foetida (Davoli et al.,
2002) или моллюск Lymnaea stagnalis (Fainzilber et al., 1996; van
Kcsteren et al., 1998), были обнаружены аналоги нейротрофинов
и/или их рецепторов. Была выдвинута гипотеза о том, что эво-
люционное развитие сложной центральной нервной системы, за-
чатки которой появляются у моллюсков и головоногих, связано
с появлением нейротрофической сигнализации, с помощью ко-
торой включаются дополнительные механизмы обеспечения вы-
живаемости нервных клеток, улучшается их взаимодействие с
окружающей глией, повышается сложность и эффективность
межклеточных взаимодействий (McKay et al., 1999; Jarro et aL,
2001). В свете этого предположения, представляются важными
данные о влиянии нейротрофинов позвоночных животных на
нейроны беспозвоночных. К таким фактам относятся данные о
влиянии NGF или BDNF на кальциевые токи, синаптические
процессы, рост и ветвление аксонов бабочки шелкопряда Вот-
byx niori (Kim et al., 2005); моллюсков Lymnaea stagnalis (Ridg-
way et aL, 1991; Wildering et aL, 1995; Syed et aL, 1996) и Aplysia
californica (Purcell et aL, 2003), кальмара Loligopeallei (Moreno et
aL, 1998), а также результаты наших экспериментов. Но пока не
выяснено, на каком этапе эволюции появляются аналоги нейрот-
рофинов. Поэтому вопрос о возможном участии нейротрофинов
в механизмах нейроглиальных взаимодействий и клеточных ре-
акций рецептора растяжения рака на фотоокислительный стресс
имеет значение не только для этого вопроса, но и для более гло-
бальной проблемы —- эволюции нервной системы у беспозво-
ночных животных.
В заключение можно отмстить, что ФД воздействие, успеш-
но применяющееся для разрушения опухолевой ткани и имею-
щее определенную перспективу в нейроонкологии, весьма эф-
фективно повреждает нервные и глиальные клетки. Оно вызыва-
ет функциональную инактивацию и некроз нейронов, а также
некроз, апоптоз и увеличение плотности распределения гли-
альных клеток. Эффективность ФД воздействия сильно зависит
от физико-химических характеристик красителя-фотосенсиби-
лизатора — его способности поглощать свет в красной части
спектра, генерировать синглетный кислород, а также от его
внутриклеточной локализации, определяющей мишени, на кото-
рых сосредоточено световое воздействие. Распределение фото-
сенсибилизатора внутри клетки в значительной мере зависит от
его гидрофобности/гидрофильности, которые в конечном счете
определяются химической структурой. Наши опыты подтверди-
ли представления о том, что наиболее эффективны амфифиль-
ные вещества.
Степень и механизм повреждения нейронов и глиальных
клеток зависит от интенсивности ФД воздействия, которая в на-
ших опытах определялась концентрацией фотосенсибилизатора.
Интенсивное воздействие немедленно вызывало некроз, а более
слабое приводило к замедленному развитию некроза уже после
того, как облучение было прекращено. В последнем случае раз-
витие некроза контролировалось разнообразными сигнальными
процессами, различающимися в нейронах и глиальных клетках.
Оказалось, что повреждение нейрона усиливает апоптоз окружа-
ющих глиальных клеток, т. е. интактный нейрон, во всей вероят-
ности, защищает глию от апоптоза. Это возможно с помощью
выделения нейроном каких-то сигнальных молекул, иницииру-
ющих внутриклеточные сигнальные пути, направленные на по-
вышение выживаемости глиальных клеток. Наши опыты показа-
ли, что этот эффект может быть опосредован фактором роста
нервов NGF. На основании этих данных можно надеяться, что
ингибиторы или активаторы некоторых сигнальных путей, ней-
ротрофические факторы и, может быть, другие, пока неизвест-
ные молекулы смогут либо усилить фотодинамическое повреж-
дение опухолевой ткани, либо ослабить вредное влияние фото-
сенсибилизации на нормальные нейроны и глиальные клетки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Эксперименты, проведенные на нервных и глиальных клет-
ках рака, которые использовались нами в качестве модельного
объекта для изучения механизмов фотодинамического повреж-
дения животных клеток, показали, что механорецепторные ней-
роны рака весьма чувствительны к ФД воздействию различных
фотосенсибилизаторов, включая производные различных по-
рфиринов, хлоринов, фталоцианинов и гиперицина. Наномоляр-
ные, а в ряде случаев даже пикомолярные концентрации фото-
сенсибилизаторов необратимо инактивировали нейроны и вызы-
вали их некроз.
ФД воздействие сравнительно больших концентраций сенси-
билизаторов (более 1 мкМ) приводило к учащению и резкому
блокированию нейронной активности, быстрому нарушению це-
лостности плазматической мембраны, ингибированию клеточных
дегидрогеназ и некрозу, развивающемуся уже в ходе воздейст-
вия. Более слабые, но продолжительные воздействия небольших
концентраций фотосенсибилизаторов (менее 0.1 мкМ) вызывали
торможение и необратимое прекращение импульсации. В этом
случае явные признаки некроза (нарушение целостности плазма-
тической мембраны и падение активности клеточных дегидроге-
наз) наблюдались только через 2—4 ч после воздействия. Харак-
терные признаки апоптоза, такие как фрагментация ядра, наблю-
дались только в глиальных клетках, но не в нейронах.
Концентрационные зависимости продолжительности импу-
льсной реакции нейронов позволяют сравнить фотодинамиче-
скую эффективность разных фотосенсибилизаторов. Последняя
зависит от строения и физико-химических свойств сенсибилиза-
торов, особенно, от молярной экстинкции и амфифильности.
Амфифильные сенсибилизаторы, характеризующиеся величи-
ной коэффициента распределения в системе и-октанол/вода (Кр)
порядка 10—30, наиболее эффективны.
Основными мишенями ФД воздействия Фотосенса в нейро-
нах являются плазматическая мембрана, повреждение которой
вызывает учащение импульсации, и внутриклеточные органел-
лы — митохондрии, эндоплазматический ретикулум и аппарат
Гольджи. Фотоповреждение этих органелл ведет к выходу ионов
кальция в цитозоль и торможению нейронной активности.
В фотодинамической инактивации и некрозе нейронов важ-
ную роль играют процессы внутриклеточной сигнализации.
Фосфолипаза С, протеинкиназа С, фосфатидилинозитол 3-кина-
за и протеинфосфатазы, но не кальмодулин и СаМКП, способст-
вовали фотоиндуцированному торможению и прекращению им-
пульсации нейрона, а аденилатциклаза, протеинкиназа А и тиро-
зинкиназы препятствовали им.
Среди важнейших сигнальных ферментов, участвующих в
фотоиндуцированном некрозе нейронов и глиальных клеток, от-
метим аденилатциклазу, кальмодулин и кальмодулинзависимую
киназу II. В некрозе глиальных клеток также участвовали фос-
фолипаза С, протеинкиназа С, киназа р38 и тирозинфосфатаза.
Только протеинкиназа А препятствовала некрозу фотосенси-
билизированных нейронов. Эти данные показывают, что нек-
роз — это не пассивная, неуправляемая смерть клеток. Как и
апоптоз, он может регулироваться различными сигнальными
процессами.
В апоптозе глиальных клеток, с одной стороны участвует
фосфолипаза С, с другой — экзогенный глутамат, нейротроф
NGF, а такие сигнальные белки: МАР киназа JNK, аденилатцик-
лаза, протеинкиназы А и С играют противоапоптозную, защит-
ную роль.
Важную роль в выживании фотосенсибилизированных ней-
ронов и глиальных клеток играют межклеточные нейроглиаль-
ные взаимодействия. Нейрон защищает глиальные клетки от фо-
тоиндуцированного апоптоза. В межклеточных нейроглиальных
взаимодействиях в фотосенсибилизированном рецепторе растя-
жения рака могут участвовать нейромедиаторы и нейротро-
фины. Нами показано, что такие межклеточные медиаторы, как
глутамат и факторы роста нервов NGF, могут участвовать в ней-
роглиальных взаимодействиях у ракообразных, защищая гли-
альные клетки, но не нейроны, от фотоиндуцированного апопто-
за, a NGF — также от некроза.
С помощью фармакологических модуляторов сигнальных
белков можно селективно усилить фотоповреждение или, наобо-
рот, защитить от него нейроны и глиальные клетки. Это дает
основание для разработки методов усиления фотоповреждения
патологически измененных клеток и защиты окружающих нор-
мальных клеток.
Наблюдавшееся увеличение численности глиальных клеток
вокруг тела нейрона после ФД воздействия было, вероятно, на-
правлено на компенсацию функций утраченных глиальных кле-
ток и повышение жизнеспособности нейронов.
Изученные нами нейроны и глиальные клетки рака не имеют
специальных пигментов для восприятия светового излучения.
Поэтому многие полученные результаты могут быть обобщены
на другие непигментированные клетки животных. Конечно, это
необходимо делать с оговорками, так как сигнальные механиз-
мы в разных типах клеток могут различаться, да и межвидовые
различия, особенно, между клетками беспозвоночных и позво-
ночных животных могут быть довольно значительными. Но бо-
льшинство механизмов, относящихся к общему метаболизму и
консервативным сигнальным путям, должно быть общим.
ФД воздействие представляет собой один из видов воздейст-
вий, индуцирующих в клетках интенсивный окислительный
стресс. Изучение механизмов реакций клеток на ФД воздействие
сходны с механизмами реакций на другие окислительные по-
вреждения, вызывающие в клетках окислительный стресс. Это
также придает общебиологическое значение полученным дан-
ным.
Другой важный момент, затронутый в настоящей работе, —
необходимость учета межклеточных взаимодействий при изуче-
нии реакций клеток на внешнее воздействие. Значение влияния
клеток друг на друга в тканях и организме невозможно преуме-
ньшить. Необходимо тщательно изучать его механизмы и спосо-
бы модуляции. Это очень важно для нервной системы, где ней-
роглиальные взаимодействия играют особенно важную роль как
в информационных процессах, так и в поддержании жизнеспо-
собности мозга. Проблема окислительного повреждения мозга,
как это ни печально, является одной из центральных медицин-
ских проблем.
Как достигнуть большего прогресса в понимании процессов,
происходящих в клетках при фотоокислительных и других по-
вреждениях? Ясно, что изучение отдельных ферментов и даже
целых ферментных каскадов, описанное в настоящей моногра-
фии, не дает полного понимания происходящих в клетке процес-
сов. Кроме того, клетка не статична, а динамична. Все процессы
в ней развертываются во времени. К сожалению, большинство
современных методов позволяют изучить только отдельные про-
цессы в какие-то произвольно выбранные моменты времени. Не-
обходим интегральный взгляд на динамику клеточного ответа. К
счастью, в последние годы найдены пути к более полному и все-
стороннему исследованию клеток. Методы геномики, протеоми-
ки и транскриптомики позволяют одновременно исследовать
множество клеточных процессов и получить сведения об эксп-
рессии сотен и тысяч генов и белков в клетке. Эти методы пока
дороги и применение их еще редко, но в будущем они будут ши-
роко использоваться для анализа реакций клеток на различные
воздействия и патологические процессы в организме.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АФК — активные формы кислорода
мАФК — митохондриальные активные формы кислорода
ПМ — плазматическая мембрана
СДГ — сукцинатдегидрогеназа
ЭР — эндоплазматический ретикулум
АА — арахидоновая кислота
АС — аденилатциклаза
AIF (apoptosis-inducing factor) — апоптоз-индуцирующий фактор
ALA — 8-аминолевулиновая кислот
ANT (adenine nucleotide translocator) — переносчик адениновых нуклео-
тидов
АР-1 (activating protein-1) — активирующий белок-1
Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1) — апоптотический фактор ак-
тивации протеаз-1
ASK1 (apoptosis signal-regulating kinase-1) — апоптозная сигнал-регулиру-
ющая киназа-1
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) — нейротрофический фактор
• мозга
BPD-МА (Verteporphin) — производное бензопорфирина
СаМ — кальмодулин
СаМКП (Ca27calinodulin-depcndent kinase II) — кальмодулинзависмая ки-
наза II
EGF (epidermal growth factor) — эпидермальный фактор роста
ERK (extracellularly regulated kinase) — внеклеточно регулируемая киназа
FasL — Fas лиганд
GDNF (glia cell line-derived neurotrophic factor) — глиальный нейротрофи-
ческий фактор
GSH — глутатион
HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1) — гипоксия-индуцирующий фактор-1
IAP (apoptosis inhibitor protein) — белок-ингибитор апоптоза
IP3 — инозитолтрифосфат
JNK/SAPK. (c-Jun terminal kinase/ stress-activated protein kinase) —
c-Jun-терминальная киназа / стресс-активируемая киназа
МАРК (mitogen-activation protein kinase) митоген-активируемая протеин-
киназа
Mdm2 — ДНК-зависимая протеинкиназа 2
тТНРС (m-tetrahydrophenyl chlorin, Foscan) — т-тетрагидрофенилхлорин
NGF (nerve growth factor) •— фактор роста нервов
'О2 — синглетный кислород
PBR (peripheral benzodiazepine receptor) — периферический бензодиазепи-
новый рецептор
Рс 4 (silicon phthalocyanine) — фталоцианин кремния
PI3K (phosphatydilinositol 3-kinase) — фосфатидилинозитол 3-киназа
РКА — протеинкиназа А
РКВ — протеинкиназа В
РКС — протеинкиназа С
PLA? — фосфолипаза А2
PLC — фосфолипаза С
РМСА (plasma membrane Ca2+-ATPase) — Са2+-АТФаза плазматической
мембраны
РТР (permeability transition pore ) — высокопроницаемые митохондриаль-
ные пора
RCGP (receptors coupled with G-protein) — рецептор, сопряженный с
G-белком
RTK — рецепторная тирозинкиназа
SERCA (ER Ca2+-ATPase) — Са2+-АТФаза эндоплазматического ретику-
лума
SOD (superoxide dismutase) — супероксиддисмутаза
VDAC (voltage dependent anion channel) — потенциалзависимый анион-
ный канал
ЛИТЕРАТУРА
Акоев Г. Н., Алексеев Н. П. Функциональная организация механоре-
цепторов. Л.: Наука, 1985. 146 с.
Бережное А. В., Федотова Е. И., Ненов М. Н. и др. Токсикологи-
ческие эффекты жирных кислот. Роль фосфолипаз // Рецепция и внут-
риклеточная сигнализация / Под ред. В. П. Зинченко, С. С. Колесникова,
А. В. Бережнова. Пущино, 2009. С. 15—19.
Болдырев А. А., Волынская Е. А., Курелла Е. Г, Тюлина О. В.
Устойчивость к окислению 1Ча+,К+-АТФ-азы мозга // Физико-химические
принципы функционирования белков и их комплексов / Под ред. В. Г. Ар-
тюхова. Воронеж: Изд-во ВГУ, 1995. С. 27—29.
Браун А. Д., Моженок Т. П. Неспецифический адаптационный синд-
ром клеточной системы. Л.: Наука, 1987. 232 с.
Бурмистров Ю. М., Людковская Р. Г., Шуранова Ж. П. Электриче-
ская активность нейронов речного рака при витальной окраске метилено-
вым синим И Биофизика. 1969. Т. 14. С. 495—501.
Буторина Д. Н., Красповский А. А., Приезжее А. В. Исследование
кинетических параметров синглетного молекулярного кислорода в во-
дных растворах порфиринов. Влияние детергентов и тушителя — азида
натрия И Биофизика. 2003. Т. 48. С. 201—209.
Владимиров Ю. А., Азизова О. А., Деев А. И. и др. Свободные ради-
калы в живых системах. М.: ВИНИТИ, 1991. 249 с.
Владимиров Ю. А., Потапенко А. Я. Физико-химические основы
фотобиологических процессов. М.: Дрофа, 2006. 285 с.
Теннис Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. М.:
Мир, 1997. 624 с.
Гомазков О. А. Нейротрофическая регуляция и стволовые клетки
мозга. М.: ИКАР, 2006. 332 с.
Гордеева А. В., Звягильская Р. А., Лабас Ю. А. Взаимосвязь между
активными формами кислорода и кальцием в живых клетках // Биохимия.
2003. Т. 68. С. 1318—1322.
Гуринович Г. П., Зорина Т. Е., Аркатов IO. М. и др. Люминесцент-
но-спектроскопическое изучение распределения хлорина е6 и его произ-
водных в клетках HeLa И Цитология. 1989. Т. 31. С. 1058—1075.
Дергачева О. Ю., Колосов М. С., Узденский А. Б. Фотосенсибили-
зация изолированного механорецепторного нейрона рака и сателлитных
глиальных клеток экзогенным рибофлавином // Журн. эвол. биохим. фи-
зиол. 2005. Т. 41 С. 259—265.
Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джойс К. Справочник биохимика.
М.: Мир, 1991. 543 с.
Зенков Н. К., Лапкин В. 3., Меньшикова Е. Б. Окислительный
стресс. М.: МАНК «Наука/Интерпериодика», 2001. 343 с.
Зиганшин А. У., Зиганшин Л. Е. Фармакология рецепторов АТФ.
М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. 209 с.
Зинченко В. П., Долгачева Л. П. Внутриклеточная сигнализация.
Пущино: Аналитическая микроскопия, 2003. 84 с.
Иванов А. В., Решетников А. В., Дмитриев А. А. и др. Структур-
но-функциональные зависимости для некоторых порфириновых фотосен-
сибилизаторов // II Всерос. съезд фотобиологов. Пущино, 1998. С. 362—
364.
Ильинский О. Б. Физиология сенсорных систем. Часть III. Физиоло-
гия механорецепторов. Л.: Наука, 1975. 560 с.
Карнаухов В. Н. Спектральные методы исследования энергетики и
регуляции в живой клетке // Биофизика живой клетки. Пущино, 1972,
вып. 3. С. 100—117.
Кения М, В., Лукаш А. И., Гуськов Е. П. Роль низкомолекулярных
антиоксидантов в окислительном стрессе // Усп. совр. биол. 1993. Т. 3.
С. 456—470.
Князькин И. В., Цыган В. Н. Апоптоз в онкоурологии. СПб.: Наука,
2007. 240 с.
Кондрашова М. И. Молекулярные механизмы и регуляция энергети-
ческого метаболизма / Под ред. Ю. Г. Каминского, Т. С. Азарашвили. Пу-
щино: НЦБИ АН СССР, 1987. С. 140—154.
Конев С. В., Волотовский И. Д. Фотобиология. Минск: Изд. БГУ,
1974. 348 с.
Красновский А. А. Фотодинамическое действие и синглетный кисло-
род И Биофизика. 2004. Т. 49. С. 305—321.
Кузнецова Л. А. Регуляторные свойства изоформ аденилатциклаз //
Ж. эвол. биохим. физиол. 2002. Т. 38. С. 289—305.
Лагода Т. С., Каплан М. А., Кривошеев Я. В. и др. Оптимизация
фотодинамической терапии саркомы Ml с использованием Фотосенса //
Вопр. Онкол. 2000. Т. 46. С. 327—331.
Лобанов А. В. Роль нейроглиальных взаимодействий и кальциевой
сигнальной системы в реакциях нейронов и глиальных клеток речного
рака на фотодинамическое воздействие // Дис. ... канд. биол. наук. Рос-
тов-на-Дону, 2007.
Лобанов А. В., Петин Я. О., Узденский А. Б. Участие нейротрофи-
ческих факторов в реакции нейронов и глиальных клеток рецептора растя-
жения речного рака на фотодинамическое воздействие И Рецепция и внут-
риклеточная сигнализация. Мат. Междунар. конф. / Под ред. В. П. Зинчен-
ко и др. Пущино, 2007. С. 91—93.
Лобанов А. В., Узденский А. Б. Нейротрофин NGF защищает глиаль-
ные клетки, но не нейроны рецептора растяжения рака Astacus astacus
от фотоокислительного стресса // Ж. эвол. биохим. физиол. 2007. Т. 43.
С. 448—449.
Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. М.: Мир,
1982. С. 211—215.
Лушников Е. Ф., Абросимов А. Ю. Гибель клетки (апоптоз). М.: Ме-
дицина, 2001. 192 с.
Людковская Р. Г., Бурмистров Ю. М. Фотобиоэлектрические про-
цессы в возбудимых клетках // Биофизика живой клетки. Пущино, 1971.
С. 50—67.
Людковская Р. Г., Каюшип Л. П. Действие света на электрическую
активность гигантского аксона кальмара и миелинового аксона лягушки //
Биофизика. 1959. Т. 4. С. 404—413.
Машанский В. Ф., Загускин С. Л., Федоренко Г. М. Гистохимиче-
ское и электронно-микроскопическое изучение нейронно-глиальных от-
ношений в рецепторе растяжения речного рака // Цитология. 1974. Т. 16.
С. 770—773.
Николлс Д. Г., Мартин А. Р., Валлас Б. Д., Фукс П. А. Ог нейрона к
мозгу. М.: Едиториал УРСС, 2003. 672 с.
Новиков В. С. (ред.). Программированная клеточная гибель. СПб.:
Наука, 1996. 275 с.
Новожилова А. П., Плужников II. II., Новиков В. С. Механизмы
клеточной смерти: проблемы и перспективы И Программированная кле-
точная гибель / Под ред. В. С. Новикова. СПб.: Наука, 1996. С. 9—29.
Однпак М. М., Цыган Н. В. Факторы роста нервной ткани в цент-
ральной нервной системе. СПб.: Наука, 2005. 157 с.
Пальцев М. А., Иванов А. А., Северин С. Е. Межклеточные взаимо-
действия. М.: Медицина, 2003. 288 с.
Панасенко Ю., Ариольд IO., Арнольд К. п др. Перекисное окисле-
ние фосфолипидных липосом, индуцированное гипохлоритом. Сравнение
с перекисным окислением в системе. Ге2+/аскорбат И Биофизика, 1996.
Т. 41. С. 334—341.
Погосян Г. А., Дремина Е. С., Шаров В. С. и др. Кинетика Ее2+-ин-
дуцированного перекисного окисления липидов в суспензиях митохонд-
риальных и ядерных мембран // Биофизика, 1996. Т. 41. С. 342—347.
Решетников А. В., Швец В. И., Пономарев Г. И. Водорастворимые
тетрапиррольные фотосснсибилизаторы для фотодинамической терапии
рака И Успехи химии порфиринов. Т. 2 / Под ред. О. А. Голубчикова.
СПб.: Изд. СПбГУ, 1999. С. 34—^46.
Реутов В. П., Сорокина Е. Г., Охотип В. Е., Косицын Н. С. Цикли-
ческие превращения оксида азота в организме млекопитающих. М.: Нау-
ка, 1998. 159 с.
Романенко II., Узденский А. Противоапоптозное действие глутамата
при фотодинамическом повреждении глиальных клеток И V съезд Рос-
сийск. фотобиологического об-ва. Программа / Тез. докл. Пущино, 8—
13 июня 2008 г. НИА-Природа, М., 2008. С. 176.
Соболев А. С., Розенкранц А. А., Гилязова В. II. Подходы к направ-
ленной доставке фотосенсибилизаторов для повышения их эффектив-
ности и клеточной специфичности // Биофизика. 2004. Т. 49. С. 337—
363.
Соколов В. В., Странадко Е. Ф., Жаркова II. И. и др. Фотодинами-
ческая терапия злокачественных опухолей с препаратами Фотогем и Фо-
тосенс (результаты трехлетних наблюдений) // Вопр. онкол. 1995. Т. 41.
С. 134—138.
Странадко Е. Ф., Иванов А. В. Современное состояние проблемы
фотодинамической терапии рака и неопухолевых заболеваний // Биофизи-
ка. 2004. Т. 49. С. 380—383.
Ташмуха.медов Б. А. Активный транспорт ионов в биологических
мембранах животных клеток // Биология мембран / Под ред. П. В. Сергее-
ва. М.: Медицина, 1973. С. 67—74.
Турпаев К. Т. Активные формы кислорода и регуляция экспрессии
генов // Биохимия. 2002. Т. 67. С. 281—-292.
Тучин В. В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследо-
ваниях. Саратов: Изд-во Саратовского у-та, 1998. 384 с.
Узденский А. Б. Действие лазерного излучения на рецептор растяже-
ния рака // Науч. Докл. Высш, школы. Биол. науки. 1975. № 5. С. 45—48.
Узденский А. Б. Влияние лазерного микрооблучения на изолирован-
ный механорецепторный нейрон рака // Науч. докл. высш, школы. Биол.
Науки. 1980. № 3. С. 20—28.
Узденский А. Б. О селективности и локальности лазерного микрооб-
лучения клеток И Цитология. 1982. Т. 24. С. 1119—1132.
Узденский А. Б. Инактивация сукцинатдегидрогеназы в изолирован-
ном механорецепторном нейроне рака сфокусированным синим лазерным
излучением И Цитология. 1987. Т. 29. С. 1392—1397.
Узденский А. Б. Управляющий некроз // Биол. мембр. 2010. Т. 27.
С. 1 — 11.
Узденский А. Б., Жаворонкова А. А., Миронов А. Ф., Кузьмин С. Г.
Исследование фотодинамического действия новых фотосснсибилизаторов
на изолированную нервную клетку И Изв. РАН, сер. биол. 2000. № 2.
С. 230—238
Узденский А. Б, Миронов А. Ф., Лосев А. П. Фотодинамическое
действие хлоринов еб и рб на изолированную нервную клетку, индуциро-
ванное лазерным излучением //Журн. Прикл. Спектр. 1999. Т. 66. С. 250—
255.
Федоренко Г. М., Брагин Д. Е., Колосов М. С. и др. Динамика ульт-
раструктурных изменений в изолированном механорецепторном нейроне
при фотоиндуцированном окислительном стрессе // Проблемы нейроки-
бернетики. Т. 2. / Под ред. Б. М. Владимирского. Ростов-на-Дону, 2002.
С. 287—290.
Федоренко Г. М., Узденский А. Б. Ультраструктурныс изменения в
изолированном механорецепторном нейроне, вызванные микрооблучени-
см гелий-кадмиевым лазером // Цитология. 1986. Т. 28. С. 512—518.
Цвиленева В. А. К эволюции туловищного мозга членистоногих. Л.:
Наука, 1970. 199 с.
Ходоров Б. И. Общая физиология возбудимых мембран. М.: Наука,
1975. 406 с.
Эйдус Л. X. Неспецифическая реакция клеток и радиочувствитель-
ность. М.: Атомиздат, 1977. 151с.
Agarwal М. L., Clay М. Е., Harvey Е. J. et al. Photodynamic therapy in-
duces rapid cell death by apoptosis in L5178Y mouse lymphoma cells // Cancer
Res. 1991. Vol. 51. P. 5993—5996.
Agarwal M. L., Larkin H. E., Zaidi S. I. et al. Phospholipase activation
triggers apoptosis in photosensitized mouse lymphoma cells // Cancer Res.
1993. Vol. 53. P. 5897—5902.
Aggarwal В. B., Sethi G., Nair A., Ichikawa H. Nuclear factor-?B: a holy
grail in cancer prevention and therapy // Curr. Sign. Transduct. Therapy. 2006.
Vol. 1. P. 25—52.
Agostinis P., Buytaert E., Breyssens H., Hendrickx N. Regulatory path-
ways in photodynamic therapy induced apoptosis // Photochem. Photobiol. Sci.
2004. Vol. 3. P. 721—729.
Agostinis P., Donella-Deana A., Cuveele J. et al. A comparative analysis
of the photosensitized inhibition of growth factor regulated protein kinases by
hypericin-derivatives // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1996. Vol. 220.
P. 613—617.
Agostinis P., Vantieghem A., Merlevede W., Witte de, P. A. M. Hyperi-
cin in cancer treatment: more light on the way // hit. J. Biochem. Cell Biol.
2002. Vol. 34. P. 221—241.
Ahmad N., Feycs D. K., Agarwal R., Mukhtar H. Photodynamic therapy
results in induction of WAF1/CIP1/P21 leading to cell cycle arrest and apopto-
sis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. Vol. 95. P. 6977—6982.
Ahmad N., Gupta S., Feyes D. K., Mukhtar H. Involvement of Fas
(APO—1/CD—95) during photodynamic-therapy-mediated apoptosis in hu-
man epidermoid carcinoma A431cells // J. Invest. Dermatol. 2000. Vol. 115.
P. 1041—1046.
Ahmad N., Gupta S., Mukhtar H. Involvement of retinoblastoma (hb)
and E 2F transcription factors during photodynamic therapy of human epider-
moid carcinoma cells A431 // Oncogene. 1999. Vol. 18. P. 1891—1896.
Ahmad N., Kalka K., Mukhtar H. In vitro and in vivo inhibition of epi-
dermal growth factor receptor-tyrosine kinase pathway by photodynamic thera-
py // Oncogene. 2001. Vol. 20. P. 2314—2317.
Airaksinen M. S., Sarma M. The GDNF family: signaling, biological fun-
ctions and therapeutical value // Nature Rev. Neurosci. 2002. Vol. 3. P. 383—
394.
Akita G., Kozaki K., Nakagawa A. et al. Cyclooxygenase-2 is a possible
target of treatment approach in conjunction with photodynamic therapy for va-
rious disorders in skin and oral cavity // Br. J. Dermatol. 2004. Vol. 151.
P. 472—480.
Alberts B., Johnson A., Lewis J. et al. Molecular Biology of The Cell.
New York: Garland Science, 2002. 1463 p.
Alexandrovicz J. C. Muscle receptor organs in the abdomen of Homarus
vulgaris and Palinurus vulgaris // Quart. J. Mier. Sci. 1951. Vol. 92. P. 163—
199.
Ali S. M., Chee S. K., Yuen G. Y., Olivo M. Photodynamic therapy indu-
ced Fas-mediated apoptosis in human carcinoma cells // Int. J. Mol. Med.
2002a. Vol. 9. P. 257—270.
Ali S. M., Chee S. K., Yuen G. Y., Olivo M. Hypericin induced death re-
ceptor-mediated apoptosis in photoactivated tumor cells // Int. J. Mol. Med.
2002b. Vol. 9. P. 601—616.
Ali S. M., Olivo M. Nitric oxide mediated photo-induced cell death in hu-
man malignant cells // Int. J. Oncol. 2003. Vol. 22. P. 751—756.
Al-Laith M., Matthews E. К., Cui Z. J. Photodynamic drug action on iso-
lated rat pancreatic acini. Mobilization of arachidonic acid and prostaglandin
production // Biochem. Pharmacol. 1993. Vol. 46. P. 567—573.
Allison R. R., Downie G. H., Cuenca R. et al. Photosensitizers in clinical
PDT // Photodiagn. Photodynam. Ther. 2004. Vol. 1. P. 27—42.
Almeida R. D., Manadas B. J., Carvalho A. P., Duarte С. B. Intracellu-
lar signaling mechanisms in photodynamic therapy // Biochim. Biophys. Acta.
2004. Vol. 1704. P. 59—86
Anis Y. Involvement of Ca2+ in the apoptotic process — „Friends or
Foes” II Pathways. 2006. No 2. P. 1—7.
Arends M. J., Willie A. H. Apoptosis: mechanisms and role in patholo-
gy // Int. Rev. Exp. Pathol. 1992. Vol. 32. P. 223—254.
Arvanitaki A., Romey G., Chalazonitis N. Photopotentiel primaire et ef-
fete secondaires par photoactivation de la neuromembrane a haute resolution
spatiale et temporelle (emission laser)(neurones d'Helix et d'Aplysia) // Comp.
Rend. Soc. Biol. 1968. Vol. 162. P. 153—160.
Ashkenazi A., Dixit V. M. Apoptosis control by death and decoy recep-
tors // Curr. Opin. Cell Biology. 1999. Vol. 11. P. 255—260
Assefa Z., Vantieghem A., Declercq W. et al. The activation of the c-Jun
N-terminal kinase and p38 mitogenactivated protein kinase signaling pathways
protects HeLa cells from apoptosis following photodynamic therapy with hype-
ricin // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 8788—8796.
Atlantc A., Calissano P., Bobba A. et al. Cytochrome C is released from
mitochondria in a reactive oxygen species (ROS)-dependent fashion and can
operate as a respiratory substrate in cerebellar neurons undergoing cytotoxic
death // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 37159—37166.
Atlante A., Pasarella S., Quagliariello S. et al. Haematoporhyrin deriva-
tive (Photofrin II) photosensitization of isolated mitochondria: inhibition of
ADP/ATP translocator//J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1989. Vol. 4. P. 35—46.
Atlante A., Pasarella S., Quagliariello S. et al. Carrier thiols are targets
of Photofrin II photosensitization of isolated rat liver mitochondria // J. Photo-
chem. Photobiol. B. Biol. 1990. Vol. 7. P. 21—-32.
Aveline В. M. Primary processes in photosensitization mechanisms // Pho-
todynamic therapy and fluorescence diagnosis in dermatology / Eds P. Calzava-
ra-Pinton, P. M. Szeimies, B. Ortel. Amsterdam: Elsevier, 2001. P. 17—37.
Baba K. Selective injury of mitochondria with janus green В and ruby la-
ser light. Enzyme, morphological and ultrastructural study // Acta pathol. Jap.
1970. Vol. 20. P. 59—78.
Bachor R., Shea G. R., Cities R., Hasan T. Photosensitized destruction of
human bladder carcinoma cells. Photosensitized destruction of of human blad-
der carcinoma cells treated with chlorine e6-conjugated microspheres // PNAS.
1991. Vol. 88. P. 1589—1584.
Bachowski G. J., Morehouse К. M., Girotti A. W. Pophyrin-sentitized
photoreactions in the presence of ascorbate: oxidation of cell membrane lipids
and hydrogen radical traps // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1988. Vol. 47.
P. 635—645.
Baker A., Kanofsky J. R. Quenching of singlet oxygen by biomolecules
from L1210 leukemia cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1992. Vol. 55.
P. 523—528.
Ball D. J„ Luo Y., Kessel D. et al. The induction of apoptosis by a positi-
vely charged methylene blue derivative II J. Photochcm. Photobiol. B. Biol.
1998. Vol. 42. P. 159—163.
Ball D. J., Mayhew S., Wood S. R. ct al. A comparative study of the cel-
lular uptake and photodynamic efficacy of three novel zinc phthalocyanines of
differing charge // J. Photochcm. Photobiol. B. Biol. 1999. Vol. 69. P. 390—396.
Barberi-Heyob M., Vedrine I’. O., Merlin J. L. et al. Wild-type p53 gene
transfer into mutated p53 HT29 cells improves sensitivity to photodynamic thera-
py via induction of apoptosis // Int. J. Oncol. 2004. Vol. 24 P. 951—958.
Barker S. A., Lujan D., Wilson B. S. Multiple roles for PI 3-kinase in the
regulation ofPLC-? activity and Ca2+ mobilization in antigen-stimulated mast
cells // J. Leukoe. Biol. 1999. Vol. 65. P. 321—329.
Barres B. A., Barde Y. A. Neuronal and glial cell biology // Curr. Opin.
Neurobiol. 2000. Vol. 10. P. 642--648.
Bartschat D. K., Rhodes T. E. PK.C modulates Ca channels in isolated
presynaptic nerve terminals of rat hippocampus // J. Ncurochem. 1995. Vol. 64.
P. 2064—2072.
Baumann N., Pham-Dinh D. Biology of oligodendrocytes in the mamma-
lian central nervous system // Physiol. Rev. 2001. Vol. 81. P. 871—927.
Beck T. P., Kirsh E. J., Chmura S. J. et al. In vitro evaluation of calphos-
tin C as a novel agent for photodynamic therapy of bladder cancer // Urology.
1999. Vol. 54. P. 573—577.
Beere H. M. „The stress of dying”: the role of heat shock proteins in the re-
gulation of apoptosis // J. Cell Sci. 2004. Vol. 117. P. 2641—2651.
Belzacq A. S., Jacotot E., Vieira II. L. et al. Apoptosis induction by
the photosensitizer verteporfin: identifeation of mitochondrial adenine nucle-
otide translocator as a critical target // Cancer Res. 2001. Vol. 61. P. 1260—
1264.
Ben-Hur E., Dubbelmann T. M. A. R., Steveninck van, J. Phthalocy-
anine-induced photodynamic changes of cytoplasmic free calcium in Chine-
se hamster cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1991. Vol. 54. P. 163—
166.
Ben-Hur E., Dubbelmann T. M. Cytoplasmic free calcium as a trigger
mechanism in the response of cells to photosensitization // J. Photochem. Pholo-
biol. B. Biol. 1993. Vol. 58. P. 890—894.
Ben-Hur E., Fijihara T., Suzuki F., Elkind M. M. Genetic toxicology of
the photosensitization of Chinese hamster cells by phthalocyanines // J. Photoc-
hem. Photobiol. B. Biol. 1987. Vol. 45. P. 227—230.
Ben-Hur E., Rosenthal I. Factors affecting photokilling of cultured Chi-
nese hamster cells by phthalocyanines // Radiat. Res. 1985. Vol. 103. P. 403—
409.
Benn S. C., Woolf C. J. Adult neuron survival stratcgies-slamming on the
brakes // Nat. Rev. Neurosci. 2004. Vol. 5. P. 686—700.
Berg K., Bommer J. C., Moan J. Evaluation of sulfonated aluminum
phthalocyanines for use in photochcmotherapy. Cell uptake studies // Cancer
Lett. 1989. Vol. 44. P. 7—15.
Berg K., Madslien K., Bommer J. C. et al. Light induced relocalization
of sulfonated meso-tetraphenylporphines in N1HK 3025 cells and effect of dose
fractionation//J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1991. Vol. 53. P. 203—210.
Berg К., Moan J. Lysosomes as photochemical targets // Int. J. Cancer.
1994. Vol. 59. P. 814—822.
Berg K., Moan J. Lysosomes and microtubules as targets for photochemothe-
rapy of cancer // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1997. Vol. 65. P. 403—409.
Berg K., Moan J., Bommer J. C., Winkelman J. W. Cellular inhibition
of microtubule assembly by photoactivated sulphonated meso-tctraphcnylporp-
hincs // Int. J. Radiat. Biol. 1990. Vol. 58. P. 475-Л87.
. Berg K., Selbo P. K., Prasmickaite L., Hogset A. Photochemical drug
and gene delivery // Curr. Opin. Mol. Therapeut. 2004. Vol. 6. P. 279—287.
Bcrlanda J., Kiesslich T., Obcrdanner С. B. et al. Characterization of
apoptosis induced by photodynamic treatment with hypericin in A431 human
epidermoid carcinoma cells // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 2006. Vol. 25.
P. 173—188.
Berns M. W., Dahlman A., Joahnson F. et a). In vitro cellular effects of
hematoporphyrin derivative // Cancer Res. 1982. Vol. 42. P. 2325—2359.
Bhuvaneswari R., Gan Y. Y., Lucky S. S. ct al. Molecular profiling of
angiogenesis in hypericin mediated photodynamic therapy // Mol. Cancer.
2008. Vol. 7. P. 56.
Bibov M. Yu., Petin Ya. O., Uzdensky A. B. The involvement of MAP
kinases JNK and p38 in photodynamic injury of crayfish neurons and glial
cells // Proc. SPIE. 2007. Vol. 6535, N 64. 6 p.
Binder D. K., Scharfman H. E. Brain-derived neurotrophic factor //
Growth Factors. 2004. Vol. 22. P. 123—131.
Blitterswijk van , W. J., Luit van der, A. II., Veldman R. J. et al. Cera-
mide: second messenger or modulator of membrane structure and dynamics? //
Biochem. J. 2003. Vol. 369. P. 199—211.
Boegheim J. R., Scholte II., Dubbelman T. M. et al. Photodynamic ef-
fect of hematoporphyrin derivative on enzyme activities of murine L929 fibrob-
lasts // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1987. Vol. 1. P. 61—-73.
Bonnett R., Djelal B. D., Hamilton P. A. et al. Photobleaching of 5,10,
15,20-telrakis(m-hydroxyphenyl)porphyrin (m-THPP), and corresponding
chlorin (m-THPC) and bacteriochlorin (m-THPBC). A comparative study //
J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1999. Vol. 53. P. 136—143.
Boyle R. W., Dolphin D. Structure and biodistribution relationships of
photodynamic sensitizers // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1996. Vol. 64.
P. 469—485.
Bradshaw R. A., Dennis E. A. (Eds). Handbook of Cell Signaling // CD:
Academic Press, 2003.
Bragin D. E., Kolosov M. S., Uzdensky A. B. Photodynamic inactivation
of isolated crayfish neuron requires protein kinase C, PI 3-kinase and Ca"+ //
J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2003. Vol. 70. P. 99—105.
Bras M., Quecnan B., Susin S. A. Programmed cell death via mitochond-
ria: different models of dying // Biochemistry (Moscow). 2005. Vol. 70.
P. 231—239.
Bredt D. S. Endogenous nitric oxide synthesis: biological functions and
pathophysiology // Free Radio Res. 1999. Vol. 31. P. 577—596.
Brown S. B., Brown E. A., Walker I. The present and future role of pho-
todynamic therapy in cancer treatment // The Lancet. Oncology. 2004. Vol. 5.
P. 497—508.
Bruce J. H., Norenberg M. D., Kraydieh S. et al. Schwannosis: role of
gliosis and proteoglycan in human spinal cord injury // J. Neurotrauma. 2000.
Vol. 17. P. 781—788.
Buchczyk D. P., Klotz L. O., Lang K. et al. High efficiency of 5-aminole-
vulinate-photodynamic treatment using UVA irradiation // Carciogenesis. 2001.
Vol. 22. P. 879—883.
Buchner J. Hsp90 & Co — a holding for folding // Trends Biochem. Sci.
1999. Vol. 24. P. 136—141.
Burns R. F., Miller F. D., Merriman R. L. et al. Inhibition of protein ki-
nase C by calphostin is light-dependent // Biochem. Biophys. Res. Communs.
1991. Vol. 176. P. 288—293.
Buytaert E. P., Callewaert G., Hendrickx N. et al. Role of endoplasmic
reticulum depletion and multidomain proapoptotic Bax and Bak proteins in sha-
ping cell death after hypericin-mediated photodynamic therapy // FASEB J.
2006. Vol. 20. P. 756—758.
Buytaert E., Dewaele M., Agostinis P. Molecular effectors of multiple
cell death pathways initiated by photodynamic therapy // Biochim. Biophys.
Acta. 2007a. Vol. 1776. P. 86—107.
Buytaert E., Dewaele M., Agostinis P. Molecular pathways in cell death
following photodynamic therapy // Photodynamic therapy at the cellular level I
Ed. A. B. Uzdensky. Trivandrum; Research Signpost, 2007b. P. 63—96.
Buytaert E., Matroule J. Y., Durinck S. et al. Molecular effectors and
modulators of hypericin-mediated cell death in bladder cancer cells // Oncoge-
ne. 2008. Vol. 27. P. 1916—1929.
Calzavara-Pinton P., Szeimies P. M., Ortel B. (Eds). Photodynamic the-
rapy and fluorescence diagnosis in dermatology. Amsterdam: Elsevier, 2001.
392 p.
Canete M., Ortega C., Gavalda A. et al. Necrotic cell death induced by
photodynamic treatment of human lung adenocarcinoma A-549 cells with pal-
ladium(II)-tetraphenylporphycene // Int. J. Oncol. 2004. Vol. 24. P. 1221—
1228.
Carratt A. N., Britsch S., Birchmeier C. Neuregulin, a factor with many
functions in the life of a Schwann cell // BioEssays. 2000. Vol. 22. P. 987—996.
Carthy С. M., Granville D. J., Jiang H. et al. Early release of mitochond-
rial cytochrome c and expression of mitochondrial epitope 7A6 with a porphy-
rin-derived photosensitizer: Bcl-2 and Bcl-xL overexpression do not prevent
early mitochondrial events but still depress caspase activity // Lab. Invest. 1999.
Vol. 79 P. 953—965.
Caruso J. A., Mathieu P. A., Joiakim A. et al. Differential susceptibiliti-
es of murine hepatoma lclc7 and Tao cells to the Lysosomal photosensitizer
NPe6: Influence of aryl hydrocarbon receptor on Lysosomal fragility and prote-
ase contents II Mol. Pharmacol. 2004. Vol. 65. P. 1018—1028.
Castano A. P., Demidova T. N., Hamblin M. R. Mechanisms in photody-
namic therapy: part two — cellular signaling, cell metabolism and modes of
cell death // Photodiagn. Photodyn. Ther. 2005. Vol. 2. P. 1—23.
Castillo C., Malave C., Martinez J. C. et al. Neuregulin-l isoform
induces mitogenesis, KCa and Ca2+ currents in PC 12 cells. A comparison
with sciatic nerve conditioned medium // Brain Res. 2006. Vol. 1110. P. 64—
75.
Cavanaugh P. G. Synthesis of chlorin еб-transferrin and demonstration of
its light-dependent in vitro breast cancer cell killing ability // Breast Cancer Res.
Treat. 2002. Vol. 72. P. 117—130.
Cede I., Korbelik M. Deposition of complement proteins on cells treated
by photodynamic therapy in vitro // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 2006.
Vol. 25. P. 189—204.
Ceckler T. L., Bryant R. G., Penney D. P. et al. 31P-NMR spectroscopy
demonstrates decreased ЛТР levels in vivo as an early response to photodyna-
mic therapy // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1986. Vol. 140. P. 273—
279.
Cekaite L., Peng Q., Reiner A. et al. Mapping of oxidative stress respon-
ses of human tumor cells following photodynamic therapy using hexaminolevu-
linate И BMC. Genomics. 2007. Vol. 8. P. 273.
Chae K. S., Dryer S. E. Regulation of neuronal K(Ca) channels by be-
ta-neuregulin-1 does not require activation of Ras-MEK-extracellular signal-re-
gulated kinase signaling cascades // Neuroscience. 2005. Vol. 135. P. 1013—
1016.
Chalazonitis N., Changeux R. Photopotentials of the Sepia giant axons
sensitized to light // Bull. Inst. Oceanogr. 1961. Vol. 1223. P. 1—20.
Chaloupka R., Obsil T., Plasek J., Sureau F. The effect of hypericin and
hypocrellin-A on lipid membranes and membrane potential of 3T3 fibroblasts//
Biochim. Biophys. Acta. 1999a. Vol. 1418. P. 39—47.
Chaloupka R., Petit P. X., Israel N., Sureau F. Over-expression of Bcl-2
does not protect cells from hypericin photo-induced mitochondrial membrane
depolarization, but delays subsequent events in the apoptotic pathway // FEBS
Lett. 1999b. Vol. 462. P. 295—301.
Chan W. H., Yu J. S., Yang S. D. Apoptotic signalling cascade in photo-
sensitized human epidermal carcinoma A431 cells: involvement of singlet oxy-
gen, c-Jun N-terminal kinase, caspase-3 and p21-activated kinase 2 // Biochem.
J. 2000. Vol. 351. P. 221—232.
Chao M. V., Rajagopal R., Lee F. S. Neurotrophin signalling in health
and disease // Clin Sci. (Lond.). 2006. Vol. 110. P. 167—173.
Chatterjee S. R., Srivastava T. S., Kamat J. P, Devasagayam T. P. Li-
pid peroxidation induced by a novel porphyrin plus light in isolated mitochond-
ria: possible implications in photodynamic therapy // Mol. Cell Biochem. 1997.
Vol. 166. P. 25—33.
Chen B., Roskams T., Xu Y. et al. Photodynamic therapy with hypericin
induces vascular damage and apoptosis in the RIF-1 mouse tumor model // Int.
J. Cancer. 2002. Vol. 98. P. 284—290.
Chernyak В. V., Izyumov D. S., Lyamzaev K. G. et al. Production of re-
active oxygen species in mitochondria of HeLa cells under oxidative stress //
Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol. 1757. P. 525—534.
Chiu S. M., Davis T. W., Meyers M. et al. Phthalocyanine 4-photodyna-
mic therapy induces ceramides generation and apoptosis in acid sphingomyeli-
nase-deficient mouse embryonic fibroblasts // Int. J. Oncol. 2000. Vol. 16.
P. 423-^127,
Chiu S.-М., Oleinick N. L. Dissociation of mitochondrial depolarization
from cytochrome c release during apoptosis induced by photodynamic thera-
py // Br. J. Cancer. 2001. Vol. 84. P. 1099—1106.
Chiu S.-М., Xue L.-Y., Azizuddin K., Oleinick N. L. Photodynamic the-
rapy-induced death of HCT 116 cells: apoptosis with or without Bax expressi-
on // Apoptosis. 2005. Vol. 10. P. 135.
Chiu S.-М., Xue L.-Y., Usuda J. et al. Bax is essential for mito-
chondrionOmcdiatcd apoptosis but not for cell death caused by photodynamic
therapy // Br. J. Cancer. 2003. Vol. 89. P. 1590—1597.
Christensen T., Volden G., Moan J., Sandquist T. Release of lysosomal
enzymes and lactate dehydrogenase due to hematoporphyrin derivative and
light irradiation of NHIK 3025 cells in vitro // Annals Clin. Res. 1982. Vol. 14.
P. 46—52.
Cincotta L., Foley J. W., Mac Eachern T. et al. Novel photodynamic ef-
fect of a benzophenothiazine on two different murine sarcomas // Cancer Res.
1994. Vol. 54. P. 1249—1258.
Cockcroft S. The latesl phospholipase C, PLCeta, is implicated in neuro-
nal function // Trends Biochem. Sci. 2006. Vol. 31. P. 4—7.
Colbran R. J. Targeting of calcium/calmodulin-dcpendent protein kina-
se II // Biochem. J. 2004. Vol. 378 (Pt 1). P. 1 — 16.
Colussi V. C., Feycs D. K., Mulvihill J. W. et al. Phthalocyanine 4 (Pc 4)
photodynamic therapy of human OVCAR-3 tumor xenografts // J. Photochem.
Photobiol. B. Biol. 1999. Vol. 69. P. 236—241.
Coutier S., Bezdetnaya L., Marchal S. et al. Foscan (mTHPC) photosen-
sitized macrophage activation: enhancement of phagocytosis, nitric oxide relea-
se and tumour necrosis factor-alpha-mediated cytolytic activity // Br. J. Cancer.
1999. Vol. 81. P. 37— 42.
Crescenzi E., Varrialc L., lovino M. ct al. Photodynamic therapy with
indocyanine green complements and enhances low-dose cisplatin cytotoxici-
ty in MCF-7 breast cancer cells // Mol. Cancer. Ther. 2004. Vol. 3. P. 537—
544.
Cristobal J., Stockcrt J. C., Villanueva A. et al. Caspase-2: a possible
trigger of apoptosis induced in A-549 tumor cells by ZnPc photodynamic treat-
ment // Int. J. Oncol. 2006. Vol. 28. P. 1057—1063.
Culmsee C., Mattson M. P. p53 in neuronal apoptosis // Biochem. Biop-
hys. Res. Communs. 2005. Vol. 331. P. 761—777.
Cummins E. P., Taylor С. T. Hypoxia-responsive transcription factors //
Pflugers Arch. 2005. Vol. 450. P. 363—371.
Curry P. M., Levy J. G. Stress protein expression in murine tumor cells
following photodynamic therapy with benzoporphyrin derivative // J. Photoc-
hem. Photobiol. B. Biol. 1993. Vol. 58. P. 374—379.
Dabrowska A., Gos M., Janik P. „Bystander effect” induced by photody-
namically or heat-injured ovarian carcinoma cells (OVP10) in vitro // Med. Sci.
Monit. 2005. Vol. 11. P. 316—324.
Das IL, Koizumi T., Sugimoto T. et al. Induction of apoptosis and man-
ganese superoxide dismutase gene by photodynamic therapy in cervical carci-
noma cell lines // Int. J. Clin. Oncol. 2000. Vol. 5. P. 97—103.
Das K., Smirnov A. V., Wen J. et al. Photophysics of hypericin and hy-
pocrellin A in complex with subcellular components: interaction with human
serum albumin // Photochem. Photobiol. 1999. Vol. 69. P. 633—645.
Davies M. J. Singlet oxygen-mediated damage to proteins and its consequ-
ences // Biochem. Biophys. Res. Communs. 2003. Vol. 305. P. 761—770.
Davoli C., Marconi A. ct al. Expression of nerve growth factor-like poly-
peptides and immunoreactivity related to the two types of neurotrophin recep-
tors in earthworm tissues // Cell Mol. Life Sci. 2002. Vol. 59. P. 527—539.
Dean R. T., Fu A., Stocker R., Davies M. J. Biochemistry and pathology
of radical-mediated protein oxidation// Biochem. J. 1997. Vol. 324. P. 1—18.
Decreau R., Richard M. J., Verrando P. et al. Photodynamic activities
of silicon phthalocyanines against achromic M6 melanoma cells and healthy
human melanocytes and kcratinocytes // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
1999. Vol. 48. P. 48—56.
Deininger M. H., Weinschenk T., Morgalla M. H. et al. Release of re-
gulators of angiogenesis following Hypocrellin-Л and -B photodynamic thera-
py of human brain tumor cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002.
Vol. 298. P. 520—530.
Dellinger M. Apoptosis or necrosis following Photofrin photosensitizati-
on: intluence of the incubation protocol // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
1997. Vol. 66. P. 479^183.
Dellinger M., Ricchelli F., Moreno G., Salct C. Hematoporphyrin deriva-
tive (Photofrin) photodynamic action on Ca2+ transport in monkey kidney cells
(CV-1) // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1994. Vol. 60. P. 368—372.
Deinpke W., Rie C., Grothey A., Schmoll H. J. CycIooxygenas-2: a no-
vel target forcancer chemotherapy? // J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2001.
Vol. 127. P. 411—417.
Desagher S., Glowinski J., Premont J. Pyruvate protects neurons against
hydrogen peroxide-induced toxicity//J. Neurosci. 1997. Vol. 17. P. 9060—9067.
Detty M. R., Gibson S. L., Wagner S. J. Current clinical and preclinical
photosensitizers for use in photodynamic therapy // J. Med. Chem. 2004.
Vol. 47. P. 3897—3915.
D'Hallewin M. A., de Witte P. A., Waelkens E. et al. Fluorescence de-
tection of flat bladder carcinoma in situ after intravesical instillation of hyperi-
cin // Urol. 2000. Vol. 164. P. 349—351.
DiChiara T. J., Reinhart P. II. Redox modulation of hslo Ca2'-activated
K+-conductance // J. Neurosci. 1997. Vol. 17. P. 4942—4955.
Ding X., Xu Q., Liu F. et al. Hematoporphyrin monomethyl ether photo-
dynamic damage on HcLa cells by means of reactive oxygen species production
and cytosolic free calcium concentration elevation // Cancer Lett. 2004.
Vol. 216. P. 43—54.
Dirnagl U., ladecola C., Moskowitz M. A. Pathology of ischaemic stroke:
an integrated view // Trends Neurosci. 1999. Vol. 22. P. 391—397.
Dolgachcv V., Farooqui M. S., Kulaeva О. I. et al. De novo ceramide accu-
mulation due to inhibition of its conversion to complex sphingolipids in apopto-
tic photosensitized cells // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 23 238—23 249.
Dolgachcv V., Nagy B., Taffe B. et al. Reactive oxygen species generati-
on is independent of de novo sphingolipids in apoptotic photosensitized cells //
Exp. Cell Res. 2003. Vol. 288. P. 425-Л36.
Dolgachcv V., Oberley L. W., Huang T. T. et al. A role for manganese
superoxide dismutase in apoptosis after photosensitization // Biochem. Biophys.
Res. Communs. 2005. Vol. 332. P. 411—417.
Dougherty T., Gomer C. J., Henderson B. W. et al. Photodynamic thera-
py // J. Natl. Cancer Inst. 1998. Vol. 90. P. 889—903.
Dougherty T. J., Gomer C. J., Weishaupt K. R. Energetics and efficien-
cy of photoinactivation of murine tumor cells containing hematoporphyrin //
Cancer Res. 1976. Vol. 36. P. 2330—2333.
Dougherty T., Grindey G. B., Fiel R. et al. Photoradiation therapy. II.
Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light // J. Natl. Cancer Inst.
1975. Vol. 55. P. 115—121.
Dougherty T., Kaufman J. E., Goldfarb A. et al. Photoradiation therapy
for treatment of malignant tumors // Cancer Res. 1978. Vol. 38. P. 2628—2635.
Droge W. Free radicals in physiological control of cell functions // Physiol.
Rev. 2002. Vol. 82. P. 47—95.
Du H. Y., Olivo M., Tan В. K., Bay В. H. Hypcricin-mediated photody-
namic therapy induces lipid peroxidation and necrosis in nasopharyngeal can-
cer // Int. J. Oncol. 2003. Vol. 23. P. 1401—1405.
Duchen M. R. Mitochondria and calcium: from cell signalling to cell de-
ath II J. Physiol. 2000. Vol. 529. P. 57—68.
Ehrenberg B., Anderson J. L., Foote C. S. Kinetics and yield of singlet
oxygen photosensitized by hypericin in organic and biologic media // J. Photoc-
hem. Photobiol. B. Biol. 1998. Vol. 68. P. 135—140.
El-Akra N., Noirot A., Faye J. C., Souchard J. P. Synthesis of estradi-
ol-pheophorbide a conjugates: evidence of nuclear targeting, DNA damage and
improved photodynamic activity in human breast cancer and vascular endothe-
lial cells // Photochem. Photobiol. Sci. 2006. Vol. 5. P. 996—999.
Eljamel M. S. Brain PD and PDT unlocking the mystery of malignant glio-
mas // Photodiagn. Photodyn. Ther. 2004. Vol. 1. P. 303—310.
Eljamel M. S. Brain photodiagnosis (PD), fluoresceme-guided resection
(FGR) and photodynamic therapy (PDT): past, present and future // Photody-
agn. Photodyn. Ther. 2008. Vol. 5. P. 29—35.
El-Missiry M. A., Abou-Seif M. Photosensitization induced reactive oxy-
gen species and oxidative damage in human erythrocytes // Cancer Lett. 2000.
Vol. 158. P. 155—163.
Elmore S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death // Toxicol. Pat-
hol. 2007. Vol. 35. P. 495—516.
English D. S., Doyle R. T., Petrich J. W., Haydon P. G. Subcellular dist-
ribution and excited-state processes of hypericin in neurons // J. Photochem.
Photobiol. B. Biol. 1999. Vol. 69. P. 301—305.
Erskine C. A. Reaction of photosensitized glia cells and neurons in tissue
culture to incondensced light and electronic flash // Irish. Med. Sci. 1958.
Vol. 395. P. 525—526.
Evensen J. F., Moan J. Photodynamic action and chromosomal damage: a
comparison of haematoporphyrin derivative (HpD) and light with x-irradiati-
on // Br. J. Cancer. 1982. Vol. 45. P. 456—465.
Eyzaguirre C., Kuffler S. W. Further study of soma, dendrites and axon
excitation in single neuron // J. Gen. Physiol. 1955. Vol. 39. P. 121—153.
Fabris C., Valduga G., Miotto G. et al. Photosensitization with zinc(II)
phthalocyanine as a switch in the decision between apoptosis and necrosis //
Cancer Res. 2001. Vol. 61. P. 7495—7500.
Fadeel B., Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wi-
de-ranging implications in human disease// J. Intern. Medicine. 2005. Vol. 258.
P. 479—517.
Fainzilber M., Smit A. В. et al. CRNF, a molluscan neurotrophic factor
that interacts with the p75 neurotrophin receptor // Science. 1996. Vol. 274.
P. 1540—1543.
Falk H. From the photosensitizer hypericin to the photoreceptor stentorin.
The chemistry of phenanthroperylene quinines // Angew. Chem. Int. 1999.
Vol. 38. P. 3116—3136.
Fedorenko G. M., Uzdensky A. B. Dynamics of ultrastructural changes in
the isolated crayfish mechanoreceptor neuron under photodynamic impact // J.
Neurosci. Res. 2008. Vol. 86. P. 1409—1416.
Feofanov A., Grichine A., Karmakova T. ct al. Near-infrared photosen-
sitizer based on a cycloimide derivative of chlorin p6: 13,15-N-(3'-hydroxypro-
pyl)cycloimide chlorin p6 // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2002. Vol. 75.
P. 633—643.
Feofanov A., Grishine A., Karmakova T. et al. Comparative study of
photodynamic properties of 13,15-N-cycloimide derivatives of chlorine p // J.
Photochem. Photobiol. B. Biol. 2004. Vol. 79. P. 172—188.
Feofanov A., Sharonov G., Grishine A. et al. Influence of the substitution
of 3-vinyl by 3-formyl group on the photodynamic properties of chlorine p6:
molecular, cellular and in vivo studies // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
2001. Vol. 73. P. 267—277.
Ferrario A., Chantrain C. F., Tiehl von K. et al. The matrix metallopro-
teinase inhibitor prinomastat enhances photodynamic therapy responsiveness in
a mouse tumor model // Cancer Res. 2004. Vol. 64. P. 2328—2332.
Ferrario A., Tiehl von, K. F., Rucker N. et al. Antiangiogenic treatment
enhances photodynamic therapy responsiveness in a mouse mammary carcino-
ma // Cancer Res. 2000. Vol. 60. P. 4066—4069.
Ferrario A., Tiehl K. F., Wong S. et al. Cyclooxygenase inhibitor treat-
ment enhances photodynamic therapy-induced tumor response // Cancer Res.
2001. Vol. 62. P. 3956—3961.
Ferreira S. D., Tedesco A. C., Sousa G. et al. Analysis of mitochondria,
endoplasmic reticulum and actin filaments after PDT with AlPcS(4) // Lasers
Med. Sci. 2004. Vol. 18. P. 207—212.
Ferri K. F., Kroemer G. Organelle-specific initiation of cell death path-
ways // Nat. Cell Biol. 2001. Vol. 3. E 255—263.
Festjens N., Vanden Berghe T., Vandenabeelc P. Necrosis, a well-orc-
hestrated form of cell demise: Signalling cascades, important mediators and
concomitant immune response // Biochim. Biophys. Acta. 2006. Vol. 1757.
P. 1371 — 1387.
Finkel T. Oxygen radicals and signaling // Curr. Opin. Cell Biol. 1998.
Vol. 10. P. 248—253.
Fisher A. M., Danenbcrg K., Banerjee D. et al. Increased photosensitivi-
ty in HL60 cells expressing wild-type p53 // Photochem. Photobiol. 1997.
Vol. 66. P. 265—270.
Fisher A. M., Ferrario A., Rucker N. et al. Photodynamic therapy sensi-
tivity is not altered in human tumor cells after abrogation of p53 function //
Cancer Res. 1999. Vol. 59. P. 331—335.
Florey E., Florey E. Microanatomy of the abdominal stretch receptors of
the crayfiish (Astacus fluviatilis, leptodactylis) // J. Gen. Physiol. 1955. Vol. 39.
P. 69—85.
Fox F. E., Niu Z., Tobia A., Rook A. H. Photoaclivated hypericin is an
anti-proliferative agent that induces a high rate of apoptotic death of normal,
transformed, and malignant T lymphocytes: implications for the treatment of
cutaneous lymphoproliferative and inflammatory disorders // J. Invest. Derma-
tol. 1998. Vol. Ill P. 327—332.
Frandsen A., Schousboe A. Dantrolene prevents glutamate cytotoxicity
and Ca2+ release from intracellular stores in cultured cerebral cortical neu-
rons II J. Neurochem. 1991. Vol. 56. P. 1075—1078.
Frank J., Lambert C., Biesalski H. K. et al. Intensified oxidative and nit-
rosative stress following combined ALA-based photodynamic therapy and local
hyperthermia in rat tumors // Int. J. Cancer. 2003. Vol. 107. P. 941—948.
Freas W., Hart J. L., Golightly D. et al. Vascular interactions of calcium
and reactive oxygen intermediates produced following photoirradiation // J.
Cardiovasc. Pharmacol. 1991. Vol. 17. P. 27—35.
Friesen S. A., Hjortland G. O., Madsen S. J. et al. 5-Aminolevulinic
acid-based photodynamic detection and therapy of brain tumors (review) // Int.
J. Oncol. 2002. Vol. 21. P. 577—582.
Frolov A. A., Gurinovich G. P. The laws of delayed photohaemolysis sen-
sitized by chlorin e6 // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1992. Vol. 13. P. 39.
Frolov A. A., Zenkevich E. I., Gurinovich G. P. et al. Chlorin e6-liposo-
me interaction. Investigation by the methods of fluorescence spectroscopy and
inductive resonance energy transfer // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1990.
Vol. 7. P. 43—56.
Furre I. E., Shahzidi S., Luksiene Z. et al. Targeting PBR by hexamino-
levulinate-mediated photodynamic therapy induces apoptosis through translo-
cation of apoptosis-inducing factor in human leukemia cells // Cancer Res.
2005. Vol. 65. P. 11051—11060.
Gabbita S. P., Robinson K. A., Stewart C. A. et al. Redox regulatory
mechanisms of cellular signal transduction // Arch. Biochem. Biophys. 2000.
Vol. 376. P. 1—13.
Gad F., Viau G., Boushira M. et al. Photodynamic therapy with 5-amino-
levulinic acid induces apoptosis and caspase activation in malignant t cells // J.
Cutan. Med. Surg. 2001. Vol. 5. P. 8—13.
Gafurov B., Urazacv A. K., Grossfeld A. M., Lieberman E. M. N-acety-
laspartylglutamate (NAAG) is the probable mediator of axon-glia signaling in
the crayfish medial giant nerve fiber// Neuroscience. 2001. Vol. 106. P. 227—
235.
Gai F., Fehr M. J., Petrich J. W. Observation of excited-state tautomeri-
zation in the antiviral agent hypericin and identification of its fluorescent speci-
es // J. Phys. Chem. 1994. Vol. 98. P. 5784—5795.
Galluzzi L., Maiuri M. C., Vitale I. et al. Cell death modalities: classifi-
cation and pathophysiological implications // Cell Death Differ. 2007. Vol. 14.
P. 1237—1243.
Giacobini E. E. Chemical Studies of Individual Neurons // Neurosci.
Res. Vol. II. Invertebrate nerve cell. New York: Acad. Press, 1969. P. Ill—
202.
Gibson S. L., Hilf R. Photosensitization of mitochondrial cytochrome C
oxidase by hematoporphyrin derivative and related porphyrins in Vitro and in
Vivo // Cancer Res. 1983. Vol. 43. P. 4191^4197.
Gibson S. L., Murant R. S., Hilf R. Photosensitizing effect of hematopor-
phyrin derivative and Photofrin II on the plasma memebrane enzymes 5’-nucle-
otidase, Na+, K.+-ATPase and Mg2+-ATPase in R3230AC rat mammary ade-
nocarcinomas // Cancer Res. 1988. Vol. 48. P. 3360—3366.
Gijsens A., Missiaen L., Merleved W., Witte de P. Epidermal growth
factor-mediated targeting of chlorin e6 selectively potentiates its photodynamic
therapy // Cancer Res. 2000. Vol. 6. P. 2197— 2202.
Girotti A. Photodynamic lipid peroxidation in biological systems // J. Pho-
tochem. Photobiol. B. Biol. 1990. Vol. 51. P. 497—509.
Girotti A. Photosensitized oxidation of membrane lipids: reaction pathwa-
ys, cytotoxic effects, and cytoprotective mechanisms // J. Photochem. Photobi-
ol. B. Biol. 2001. Vol. 63. P. 103—113.
Girotti A. W., Kriska T. Role of lipid hydroperoxides in photooxidative
stress signaling // Antioxidants Redox Signal. 2004. Vol. 6. P. 301—310.
Glaser E., Cadens E., Andell S., Ernster L. Inhibition of the mitochond-
rial Fl-ATPase by Rose Bengal mediated photooxidation. Interaction of the
Fe2* chelate of bathophenanthroline with the sensitizer // Acta Chem. Scand.
1988. Vol. B42. P. 175—182.
Glinski J. A., David E., Warren T. C. et al. Inactivation of cell surface
receptors by pheophorbide a, a green pigment isolated from Psichotria acumi-
nata // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1995. Vol. 62. P. 144—150.
Gobb M. H. MAP kinase pathways. Progr. Biophys // Mol. Biol. 2001.
Vol. 71. P. 479—500.
Golab J., Nowis D., Skrzycki M. ct al. Antitumor effects of photodyna-
mic therapy are potentiated by 2-methoxyestradiol. A superoxide dismutase in-
hibitor // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278. P. 407—414.
Gollnick S. O., Lee B. Y., Vaughan L. et al. Activation of the IL-10 gene
promoter following photodynamic therapy of murine keratinocytes // J. Photo-
chem Photobiol. B. Biol. 2001. Vol. 73. P. 170—177.
Gomer C. J., Ferrario A., Rucker N. et al. Glucose regulated protein in-
duction and cellular resistance to oxidative stress mediated by porphyrin photo-
sensitization // Cancer Res. 1991a. Vol. 51. P. 6574—6579.
Gomer C. J., Luna M., Ferrario A., Rucker N. Increased transcription
and translation of heme oxygenase in Chinese hamster fibroblasts following
photodynamic stress or Photofrin 11 incubation // J. Photochem. Photobiol. B.
Biol. 1991b. Vol. 53. P. 275—279.
Gomes E. R., Almeida R. D., Carvalho A. P., Duarte С. B. Nitric oxide
modulates tumor cell death induced by photodynamic therapy through a
cGMP-dependent mechanism // Photochem. Photobiol. 2002. Vol. 76. P. 423—
430.
Gompcrtz B., Kramer I., Tatham P. Signal Transduction. New York:
Academic Press, 2002. 424 p.
Goodell T. T., Muller P. J. Photodynamic therapy: a novel treatment for
primary brain malignancy // J. Neurosci. Nurs. 2001. Vol. 33; P. 296—300.
Gopalakrishna R., Chen Z., Gundimcda U. Light and dark reactions of
calphostin C and hypericin induce irreversible inactivation of protein kinase C
by site-specific oxidations // Free Rad. Biol. Med. 1993. Vol. 15. P. 530—537.
Gopalakrishna R., Jaken S. Protein kinase C signaling and oxidative
stress // Free Rad. Biol. Med. 2000. Vol. 28. P. 1349—1361.
Gorman A. A., Rodgers M. A. J. Singlet oxygen // Handbook of Organic
Photochemistry Vol. II I Ed. J. C. Sciano. Boca Raton: CRC Press, 1989.
P. 229—247.
Granville D. J., Carthy С. M., Jiang H. et al. Rapid cytochrome c re-
lease, activation of caspases 3, 6, 7 and 8 followed by Bap31 cleavage in HeLa
cells treated with photodynamic therapy // FEBS Lett. 1998a. Vol. 437. P. 5—
10.
Granville D. J., Carthy С. M., Jiang H. et al. Nuclear factor-kappaB ac-
tivation by the photochemotherapeutic agent verteporfin // Blood. 2000.
Vol. 95. P. 256—262.
Granville D. J., Cassidy B. A., Ruehlmann D. O. et al. Mitochondrial re-
lease of apoptosis-inducing factor and cytochrome c during smooth muscle cell
apoptosis // Am. J. Pathol. 2001a. Vol. 159. P. 305—311.
Granville D. J., Jiang H., An M. T. et al. Overexpression of Bcl-X(L)
prevents caspase-3-mediated activation of DNA fragmentation factor (DFF)
produced by treatment with the photochemotherapeutic agent BPD-MA // FEBS
Lett. 1998b. Vol. 422. P. 151—154.
Granville D. J., Jiang H., An M. T. et al. Bcl-2 overexpression blocks
caspase activation and downstream apoptotic events instigated by photodyna-
mic therapy // Br. J. Cancer. 1999a. Vol. 79. P. 95—100.
Granville D. J., Jiang H., McManus В. M., Hunt D. W. Fas ligand
and TRAIL augment the effect of photodynamic therapy on the induction of
apoptosis in JURKAT cells// Int. Immunopharmacol. 2001c. Vol. 1. P. 1831—
1880.
Granville D. J., Levy J. G., Hunt D. W. C. Photodynamic therapy indu-
ces caspase—3 activation in HL-60 cells // Cell Death Differ. 1997. Vol. 4.
P. 623—628.
Granville D. J., Levy J. G., Hunt D. W. Photodynamic treatment with
benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phospho-
rylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells // J. Photochem.
Photobiol. B. Biol. 1998c. Vol. 67. P. 358—362.
Granville D. J., Ruehlmann D. O., Choy J. C. et al. Bcl-2 increases emp-
tying of endoplasmic reticulum Ca2+ stores during photodynamic therapy-in-
duced apoptosis // Cell Calcium. 2001b. Vol. 30. P. 343—350.
Granville D. J., Shaw J. R., Leong S. ct al. Release of cytochrome c,
Bax migration, Bid cleavage, and activation of caspases 2, 3, 6, 7, 8, and 9 du-
ring endothelial cell apoptosis//Am. J. Pathol. 1999b. Vol. 155. P. 1021 —1025.
Grapengiesser S., Ericson M. Pain caused by photodynamic therapy of
skin cancer // Clin. Exp. Dermatol. 2002. Vol. 27. P. 493—497.
Grebenova D., Halada P., Stulik J. et al. Protein changes in HL60 leuke-
mia cells associated with 5-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy.
Early effects on endoplasmic reticulum chaperones // J. Photochem. Photo-
biol. B. Biol. 2000. Vol. 72. P. 16—22.
Grebenova D., Kuzelova K., Smetana K. et al. Mitochondrial and endop-
lasmic reticulum stress-induced apoptotic pathways are activated by 5-aminole-
vulinic acid-based photodynamic therapy in HL60 leukemia cells // J. Photo-
chem. Photobiol. B. Biol. 2003. Vol. 69. P. 71— 85.
Grinspan J. B., Marchionni M. A., Reeves M. et al. Axonal interactions
regulate Schwann cell apoptosis in developing peripheral nerve: neuregulin re-
ceptors and the role of neuregulins // J. Neurosci. 1996. Vol. 16. P. 6107—
6118.
Grishine A., Feofanov A., Karmakova T. et al. Influence of the substitu-
tion of 3-vinyl by 3-fomiyl group on the photodynamic properties of chlorine
p6: molecular, cellular and in vivo studies // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
2001. Vol. 73. P. 267—277.
Grossweiner L. I. Photosensitization of Red Blood Cell Hemolysis: A Bri-
ef Review. http://www. photobiology, com/reviews/5/index. htm 16 Sep. 1998.
Guenard V., Frisch G., Wood P. M. Effects of axonal injury on astrocyte
proliferation and morphology in vitro: implications for astrogliosis // Exp. Neu-
rol. 1996. Vol. 137. P. 175—190.
Gupta S., Ahmad N., Mukhtar H. Involvement of nitric oxide during
phthalocyanine (Pc4) photodynamic therapy-mediated apoptosis // Cancer Res.
1998. Vol. 58. P. 1785—1788.
Gupta S., Dwarakanath B. S., Muralidhar K., Jain V. Cellular uptake,
localization and photodynamic effects of haematoporphyrin derivative in hu-
man glioma and squamous carcinoma cell lines // J. Photochem. Photobiol. B.
Biol. 2003. Vol. 69. P. 107—120.
Hajri A., Wack S., Meyer C. et al. In vitro and in vivo efficacy of Pho-
tofrin and pheophorbide a, a bacteriochlorin, in photodynamic therapy of colo-
nic cancer cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2002. Vol. 75. P. 140—
148.
Halestrap A. P., Brenner C. The adenine nucleotide translocase: a central
component of the mitochondrial permeability transition pore and key player in
cell death // Curr. Med. Chem. 2003. Vol. 10. P. 1507—1525.
Hamblin M. R., Mroz P. (Eds). Advances in Photodynamic therapy. Bos-
ton: Artech House, 2008. 559 p.
Hanlon J. G., Adams K., Rainbow A. J. et al. Induction of Hsp60 by
Photofrin-mediated photodynamic therapy // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
2001. Vol. 64. P. 55—61.
Hasan T., Moor A., Ortell B. Photodynamic therapy of cancer // Cancer
Medicine / Eds J. F. Holland et al. В. C. Decker. Inc. 2000. P. 489—502.
Haunstetter A., Izumo S. Apoptosis: basic mechanisms and implications
for cardiovascular disease // Circ. Res. 1998. Vol. 82. P. 1111—1129.
He J., Agarwal M. L., Larkin H. E. et al. The induction of partial resis-
tance to photodynamic therapy by the protooncogene BCL-2 // J. Photochem.
Photobiol. B. Biol. 1996. Vol. 64. P. 845—852.
He J., Whitacre С. M., Xue L. Y. et al. Protease activation and cleavage
of poly(ADP-ribose) polymerase: an integral part of apoptosis in response to
photodynamic treatment // Cancer Res. 1998. Vol. 58. P. 940—946.
Heinzelmann-Schwarz V., Fedier A., Hornung R. et al. Role of p53 and
ATM in photodynamic therapy-induced apoptosis // Lasers Surg. Med. 2003.
Vol. 33. P. 182—189.
Helene C. Photosensitized cross-linking of proteins to nucleic acids // Age-
ing, carcinogenesis, and radiation biology / Ed. К. C. Smith. New York: Ple-
num Press. 1976. P. 149—163.
Henderson B. W., Donovan J. M. Release of prostaglandin E2 from cells
by photodynamic treatment in vitro // Cancer Res. 1989. Vol. 49. P. 6896—
6900.
Henderson В. W., Dougherty T. J. How does photodynamic therapy
work? // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1992. Vol. 55. P. 145—157.
Hendrickx N., Dewaele M., Buytaert E. et al. Targeted inhibition of
p38alpha МАРК suppresses tumor-associated endothelial cell migration in res-
ponse to hypericin-based photodynamic therapy // Biochem. Biophys. Res.
Commun. 2005. Vol. 337. P. 928—935.
Hendrickx N., Volanti C., Moens U. et al. Up-regulation of cyclooxyge-
nase-2 and apoptosis resistance by p38 МАРК in hypericin mediated photody-
namic therapy of human cancer cells // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278.
P. 52231—52239.
Hensley K., Robinson K. A., Gabbia P. et al. Reactive oxygen species,
cell signaling and cell injury // Free Rad. Biol. Med. 2000. Vol. 28. P. 1456—
1462.
Hidalgo E., Ding H., Demple B. Redox signal transduction via iron-sulfur
clusters in the SoxR transcription activator // Trends Biochem. Sci. 1997.
Vol. 22. P. 207—210.
Hidalgo A., Learte A. R., Me Quilton P. et al. Neurotrophic and Gliat-
rophic Contexts in Drosophila // Brain Behav. Evol. 2006. Vol. 68. P. 173—
180.
Hilf R. Mitochondria are targets for photodynamic therapy // J. Bioenerg.
Biomembr. 2007. Vol. 39. P. 85—89.
Hilf R., Murant R. S., Narayanan U., Gibson S. L. Relationship of mi-
tochondrial function and cellular adenosine triphosphate levels to hematoporp-
hyrin derivative-induced photosensitization in R3230AC mammary tumors //
Cancer Res. 1986. Vol. 46. P. 211—217.
Hilf R., Smail D. B., Murant R. S. et al. Hematoporphyrin derivative-in-
duced photosensitivity of mitochondrial succinate dehydrogenase and selected
cytosolic enzymes of R3230AC mammary adenocarcinomas of rats // Cancer
Res. 1984. Vol. 44. P. 1483—1488.
Hirschberg H., Sun С. II., Tromberg B. J., Madsen S. J. ALA- and
ALA-ester-mediated photodynamic therapy of human glioma spheroids// J. Ne-
urooncol. 2002. Vol. 57. P. 1—7.
Hoebcke M. The importance of liposomes as models and tools in the un-
derstanding of photosensitization mechanisms // J. Photocem. Photobiol. B.
Biol. 1995. Vol. 28. P. 189—196.
Horstmann S., Kahle P. J., Borasio G. D. Inhibitors of p38 mitogen-acti-
vates protein kinase promote neuronal survival in vitro // J. Ncurosei. Res.
1998. Vol. 52. P. 483—490.
Hsien Y.-J., Wu C.-С., Chang C.-J., Yu J.-S. Subccllular localization of
Photofrin determines the death phenotype of human epidermoid carcinoma
A431 cells triggered by photodynamic therapy: when plasma membranes are
the main targets // J. Cell Physiol. 2003. Vol. 194. P. 363—375.
Hsu A. L., Ching T. T., Sen G., Bondada et al. Novel function of phosp-
hoinositide 3-kinase in T cell Ca2+ signalling. A phosphatidylinositol
3,4,5-trisphospate-mediatcd Ca24 entry mechanism // J. Biol. Chem. 2000.
Vol. 275. P. 16242—16250.
Hubmer A., Hermann A., Uberriegler K., Krammer B. Role of calcium
in photodynamically induced cell damage of human fibroblasts // J. Photochem.
Photobiol. B. Biol. 1996. Vol. 64. P. 211 —215.
Inanami О., Yoshito A., Takahashi K. et al. Effects of BAPTA-AM and
forskolin on apoptosis and cytochrome c release in photosensitized Chinese hams-
ter V79 cells// J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1999. Vol. 70. P. 650—655.
Ito T. Photodynamic agents as tools for cell biology // Photochem. Photo-
biological Rev. 1983. Vol. 7. P. 141 —186.
Jalili A., Makowski M., Switaj T. et al. Effective photoimmunotherapy of
murine colon carcinoma induced by the combination of photodynamic therapy
and dendritic cells // Clin Cancer Res. 2004. Vol. 10. P. 4498—4508.
Jarro II., Beck G., Conticcllo S. G., Fainzilber M. Evolving better bra-
ins: a need for neurotrophins? // TiNS. 2001. Vol. 24. P. 79—85.
Jemmerson R., Dubinsky J. M., Brustovetsky N. Cytochrome c release
from mitochondria and potential of clinical intervention in apoptosis-mediated
CNS diseases // Antioxidants Redox Signal. 2005. Vol. 7. P. 1158—1172.
Ji Y. D., Walstad J. T., Brown S. K. Power interstitial photoradiation in-
jury of normal brain // Lasers Surg. Med. 1992. Vol. 12. P. 425—431.
Ji Z., Yang G., Shahzidi S., Tkacz-Stachowska K. et al. Induction of hy-
poxia-inducible factor—1 alpha overexpression by cobalt chloride enhances cel-
lular resistance to photodynamic therapy // Cancer Lett. 2006. Vol. 244.
P. 182—189.
Jiang F., Cho К. K., Mikkelse T. et al. Tamoxifen increases photodyna-
mic therapeutic response of U87 and U251n human glioma cells // J. Neuroon-
col. 2002. Vol. 56. P. 51—58.
Jiang X., Wang X. Cytochrome c-mediated apoptosis // Annu. Rev. Bioc-
hem. 2004. Vol. 73. P. 87—106.
Johnson G. L., Lapadat R. Mitogen-activated protein kinase pathways
mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases // Science. 2002. Vol. 298.
P. 1911 — 1913.
Jori G. Tumour photosensitizers: approaches to enhance the selectivity
and efficience of photodynamic therapy // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
1996. Vol. 36. P. 87.
Joshi P. G., Josni K., Mishra S., Joshi N. B. Ca“" influx induced by pho-
todynamic action in human cerebral glioma (U87 MG) cells: possible involve-
ment of a calcium channel // Photochem. Photobiol. 1994. Vol. 60. P. 244—248.
Jou M. J., Peng T. 1., Chang C. J. et al. Mitochondrial reactive oxygen
species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes //
Ann. N. Y. Acad. Sci. 2004. Vol. 1011. P. 45—56.
Jozkowicz A., Was H., Dulak J. Heme oxygenase-1 in tumors: is it a false
friend? // Antioxid Redox Signal. 2007. Vol. 9. P. 2099—2117.
Juarranz A., Espada J., Stockert J. C. et a). Photodamagc induced by
Zinc(II)-phthalocyaninc to microtubules, actin, alpha-actinin and keratin of
HeLa cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2001. Vol. 73. P. 283—289.
Juzcniene A., Moan J. The principles of 5-aminolevulinic acid Photody-
namic therapy // Photodynamic therapy at the cellular level I Ed. A. B. Uzdens-
ky. Trivandrum: Research Signpost, 2007. P. 115—141.
Juzeniene A., Nielsen К. P., Moan J. Biophysical aspects of photodyna-
mic therapy // J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 2006. Vol. 25. P. 7—28.
Juarranz A., Villanueva A., Diaz V., Canete M. Photodynamic effects of
the cationic porphyrin, mesotetra (4N-methylpyridyl) porphine, on microtubu-
les of HeLa cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1995. Vol. 27. P. 47—53.
Kandela К., Bartlett J. A., Indig G. L. Effect of molecular structure on
the selective phototoxicity of triarylmelhane dyes towards tumor cells // Photoc-
hem. Photobiol. Sci. 2002. Vol. 1. P. 309—314.
Kapinus E. I., Falk H., Tran H. T. N. Spectroscopic investigation of the
molecular structure of hypericin and its salts // Monat. Chem. 1999. Vol. 130.
P. 623—635.
Kawano T., Fukunaga K., Takeuchi Y. et al. Neuroprotective effect of
sodium orthovanadate on delayed neuronal death after transient forebrain ische-
mia in gerbil hippocampus // J. Cereb. Blood Flow Metab. 2001. Vol. 21.
P. 1268—1280.
Kebabian J. W. The cyclic AMP cascade: a signal transduction system //
Neurotransmission. 1992. Vol. 8. P. 1—4.
Kelley E. E., Domann F. E., Buettner G. R. et al. Increased efficacy of in
vitro Photofrin photosensilization of human oral squamous cell carcinoma by iron
and ascorbate// J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1997. Vol. 40. P. 273—277.
Kessel D., Castelli M. Evidence that Bcl-2 is the target of three photosen-
sitizers that induce a rapid apoptotic response // J. Photochem. Photobiol. B.
Biol. 2001. Vol. 74. P. 318—322.
Kessel D., Castelli M., Reiners J. J. Jr. Apoptotic response to photodyna-
mic therapy versus the Bcl-2 antagonist HA14-1 // J. Photochem. Photobiol. B.
Biol. 2002. Vol. 76. P. 314— 319.
Kessel D., Castelli M., Reiners J. J. Ruthenium red-mediated suppression
of Bcl-2 loss and Ca2+ release initialed by photodamage to the endoplasmic reti-
culum: scavenging of reactive oxygen species // Cell Death Differ. 2005.
Vol. 12. P. 502—51 1.
Kessel D., Luo Y. Mitochondrial photodamage and PDT-induced apopto-
sis II J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1998. Vol. 42. P. 89—95.
Kessel D., Luo Y. Photodynamic therapy: a mitochondrial inducer of
apoptosis // Cell Death Differ. 1999. Vol. 6. P. 28—35.
Kessel D., Luo Y. Intracellular sites of photodamage as a factort in apopto-
tic cell death // J. Porphyrin Phthalocyenines. 2001. Vol. 5. P. 181 —184.
Kessel D., Luo Y., Deng Y., Chang С. K. The role of subccllular localiza-
tion in initiation of apoptosis by photodynamic therapy // J. Photochem. Photo-
biol. B. Biol. 1997. Vol. 65. P. 422^126.
Kessel D., Luo Y., Mathieu P., Reiners J. J. Determinants of the apopto-
tic response to lysosomal photodamage // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
2000. Vol. 71. P. 196—200.
Kessel D., Poretz R. D. Sites of photodamage induced by photodynamic
therapy with a chlorin eetriaceloxymethyl ester (CAME) // J. Photochim. Photo-
biol. B. Biol. 2000. Vol. 71. P. 94—96.
Kessel D., Woodburn K., Gomer C. J. et a). Photosensitization with deri-
vatives of chlorin p6 // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1995a. Vol. 28.
P. 13—18.
Kessel D., Woodburn K., Henderson B. W., Chang С. K. Sites of photo-
damage in vivo and in vitro by a cationic porphyrin // J. Photochem. Photobiol.
B. Biol. 1995b. Vol. 62. P. 875—881.
Kessel D., Vicente M. G. H., Reiners J. J. Initiation of apoptosis and
autophagy by photodynamiv therapy // Lasers Surg. Med. 2006. Vol. 38.
P. 482^186.
Kestercn, van R. E., Fainzilber M. et al. Early evolutionary origin of the
neurotrophin receptor family // EMBO J. 1998. Vol. 17. P. 2534—-2542.
Khan E. H., Ali H., Tian H. et al. Synthesis and biological activities of
phthalocyanine — estradiol conjugates // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003.
Vol. 13. P. 1287—1290.
Khanum F., Jain V. Effects of hematoporphyrin derivative on the cellular
energy metabolism in the absence and presence of light // J. Photochem. Photo-
biol. B. Biol. 1989. Vol. 50. P. 647—651.
Khanum F., Jain V. Effects of 2-deoxy-D-glucose on the photosensitizati-
on-induced bioenergetic changes in Saccharomyces cerevisiae as observed by
in vivo NMR spectroscopy // Indian J. Biochem. Biophys. 1994. Vol. 31.
P. 36—42.
Kick G., Messer G., Goetz A. et al. Photodynamic therapy induces exp-
ression of interleukin 6 by activation of AP-1 but not NF-kappa В DNA bin-
ding // Cancer Res. 1995. Vol. 55. P. 2373—2379.
Kick G., Messer G., Piewig G. et al. Strong and prolonged induction of
c-jun and c-fos proto-oncogenes by photodynamic therapy // Br. J. Cancer.
1996. Vol. 74. P. 30—36.
Kim H. R., Luo Y., Li G., Kessel D. Enhanced apoptotic response to pho-
todynamic therapy after bcl-2 transfection // Cancer Res. 1999. Vol. 59.
P. 3429—3432.
Kim J. H., Sung D. K. et al. Brain-derived neurotrophic factor pro-
motes neurite growth and survival of antennal lobe neurons in brain from
the silk moth, Bombyx mori in vitro // Zoolog Sci. 2005. Vol. 22. P. 333—
342.
Kiriakis J. M., Avruch J. Mammalian mitogen-activated protein kinase
signal transduction pathways activated by stress and inflammation // Physiol.
Rev. 2001. Vol. 81. P. 807—869.
Kirvelicne V., Prasmickaite L., Kadziauskas J. et al. Post-exposure pro-
cesses in Temoporfin-photosensitized cells in vitro: reliance on energy metabo-
lism // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1997. Vol. 41. P. 173—180.
Kleemann D. Experimental studies for photodynamic therapy of malignant
tumors of the mouth cavity, larynx, and pharynx with the photosensitizer met-
hylene blue // Laryngorhynootologie. 1990. Vol. 69. P. 437.
Klein S. D., Walt H., Richter C. Photosensitization of isolated rat liver
mitohondria by tetra(m-hydroxyphenyl)chlorin // Arch. Biochem. Biophys.
1997. Vol. 348. P. 313—319.
Klotz L. O., Fritsch C., Briviba K. et al. Activation of JNK and p38 but
not ERK MAP kinases in human skin cells by 5-aminolevulinate photodynamic
therapy // Cancer Res. 1998. Vol. 58. P. 4297— 4300.
Kocanova S., Buytaert E., Matroule J.-Y. et al. Induction of heme-oxy-
genase 1 requires the p38MAPK and P13K pathways and suppresses apoptotic
cell death following hypericin-mediated photodynamic therapy // Apoptosis.
2007. Vol. 12. P. 731—741.
Kochcvar I. E. Singlet oxygen signaling: from intimate to global // Sci.
STKE. 2004. Feb. 17; 2004 (221). P. 7.
Kolosov M. S., Bragin D. E., Kohany A. S., Uzdensky A. B. Photodyna-
mic injury of isolated neuron and satellite glial cells: morphological study //
IEEE J. Select. Topics in Quantum Electronics. 2003. Vol. 9. P. 337—342.
Kolosov M., Uzdensky A. Crayfish mechanoreceptor neuron prevents
photoinduced apoptosis of satellite glial cells // Brain Res. Bull. 2006. Vol. 69.
495—500.
Konan Y. N. Gurny R., Allemann E. State of art in the delivery of photo-
sensitizers for photodynamic therapy H J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2002.
Vol. 66. P. 89—106.
Kondo M. Kasai M. Photodynamic inactivation of sarcoplasmic reticulum
vesicule membranes by xanthene dyes // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
1974. Vol. 19. P. 35^11.
Kongshaug M. Distribution of tetrapyrrole photosensitizers among human
plasma membrane proteins // Int. J. Biochem. 1992. Vol. 24. P. 1239—1265.
Kopp D. M., Trachtenberg J. T., Thompson W. J. Glial growth factor
rescues Schwann cells of mechanoreceptors from denervation-induced apopto-
sis // J. Neurosci. 1997. Vol. 17. P. 6697—6706.
Korbelik M., Sun J., Cecic 1. Photodynamic therapy-induced cell surface
expression and release of heat shock proteins: relevance for tumor response //
Cancer Res. 2005. Vol. 65. P. 1018—1026.
Kostron H., Obwegesert A., Jakober R. Photodynamic therapy in neuro-
surgery // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1996. Vol. 36. P. 157—168.
Koukourakis M. I., Giatromanolaki A., Skarlatos J. ct al. Hypoxia in-
ducible factor (HiF-1? and HIF-2?) expression in early esophageal cancer and
response to photodynamic therapy and radiotherapy // Cancer Res. 2001.
Vol. 61. P. 1830—1832.
Kowaltowski A. J., Turin J., Indig G. L., Vercesi A. E. Mitochondrial
effects off triarylmethane dyes // J. Bioenerg. Biomembr. 1999. Vol. 31.
P. 581—590.
Krammer B., Uberriegler K. In vitro investigation of ALA-induced pro-
toporphyrin IX //J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1996. Vol. 36. P. 121 —126.
Krammer B., Verwanger T., Schnitzhofer G. Photodynamically induced
cell cycle and gene expression changes: precursors of apoptosis introduction? //
Proc. SPIE. 1997. Vol. 3191. P. 96.
Krantic S., Mechawar N., Reix S., Quirion R. Molecular basis of pro-
grammed cell death involved in neurodegeneration // Trends Neurosci. 2005.
Vol. 28. P. 670—676.
Krasnovsky A. A. Singlet molecular oxygen in photochemical systems: IR
phosphorescence studies // Membr. Cell Biol. 1998. Vol. 12. P. 665—690.
Krasnovsky A. A. Singlet oxygen and primary mechanisms of photo-
dynamic therapy and photodynamic diseases // Photodynamic therapy at the cel-
lular level / Ed. Л. B. Uzdensky. Trivandrum: Research Signpost, 2007.
P. 17—62.
Krauss G. Biochemistry of signal transduction and regulation. Hoboken:
John Wiley & Sons, 2003. 558 p.
Kress M., Petersen M., Reech P. W. Methylene blue induces ongoing ac-
tivity in rat cutaneous primary affcrents and depolarization of DRG neurons via
photosensitive mechanism // Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 1997.
Vol. 356. P. 619.
Kriska T., Korytowski W., Girotti A. W. Role of mitochondrial cardioli-
pin peroxidation in apoptotic photokilling of 5-aminolevuliniv-treated tumor
cells // Arch. Biochem. Biophys. 2005. Vol. 433. P. 435—446.
KufПег S. W., Eyzaguirre C. Synaptic inhibition in an isolated nerve
cell // J. Gen. Physiol. 1955. Vol. 39. P. 155—184.
Kunz L., Stark G. Photodynamic membrane damage at the level of single
ion channel // Biochim. Biophys. Acta. 1997. Vol. 1327. P. 1—4.
Kuzelova K., Grebenova D., Pluskalova M. et al. Early apoptotic featu-
res of K.562 cell death induced by 5-aminolevuliniv acid-based photodynamic
therapy // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2004. Vol. 73. P. 67—78.
Lam M., Oleinick N. L., Nieminen A. L. Photodynamic therapy-induced
apoptosis in epidermoid carcinoma cells: reactive oxygen species and mitoc-
hondrial inner membrane permeabilization // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276.
P. 47379^17386.
Largo C., Cuevas P., Herreras O. Is glia disfunction the initial cause of
neuronal death in ischemic penumbra? И Neurol. Res. 1996. Vol. 18. P. 445—
448.
Lavie G., Kaplinsky C., Toren A. et al. A photodynamic pathway to
apoptosis and necrosis induced by dimethyc tetrahydroxyhelianthrope and hy-
pericin inleukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy // Br. J.
Cancer. 1999. Vol. 79. P. 423-^132.
Lavie G., Mazur ¥., Lavie D., Meruelo D. The chemical and biological
properties of hypericin — a compound with a broad spectrum of biological acti-
vities // Med. Res. Rev. 1995. Vol. 15. P. 111 — 119.
Lazarow A., Cooperstein S. J. Studies on the enzymatic basis for the
Janus staining reaction//J. Histochem. Cytochem. 1953. Vol. I. P. 234—241.
Legrand-Poels S., Bours V., Piret B. et al. Transcription factor NF-kappa
В is activated by photosensitization generating oxidative DNA damages // J.
Biol. Chem. 1995.' Vol. 270. P. 6925—6934.
Legrand-Poels S., Schoonbroodt S., Matroule J. ¥., Piette J. NF-кВ: an
important transcription factor in photobiology // J. Photochem. Photobiol. B.
Biol. 1998. Vol. 45. P. 1—8.
Lee C., Chen L. B. Photosensitization by 3,3'-dihexyloxacarbocyanine
iodide: specific disruption of microtubules and inactivation of organellemotili-
ty // Cancer Res. 1995. Vol. 55. P. 2063—2069.
Lee H. B., Ho A. S., Teo S. H. p53 Status does not affect photodynamic
cell killing induced by hypericin // Cancer Chcmother. Pharmacol. 2005.
Vol. 58. P. 1—8.
Lcist M., Single B., Castoldi A. F. et al. Intracellular adenosine triphosp-
hate (ATP) concentration: A switch in the descision between apoptosis and ne-
crosis // J. Exp. Med. 1997. Vol. 185. P. 1481 — 1486.
Lenci F., Angelini N., Ghetti F. et al. Spectroscopic and photoacoustic
studies of hypericin embed in liposomes as a photoreceptor model // J. Photoc-
hem. Photobiol. B. Biol. 1995. Vol. 62. P. 199—204.
Levine B., Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease // Cell.
2008. Vol. 132. P. 27-^12.
Lewerenz J., Letz J., Methner A. Activation of stimulatory hetcrotrime-
ric G proteins increases glutathione and protects neuronal cells against oxidati-
ve stress // J. Neurochem. 2003. Vol. 87. P. 522—531.
Liang H., Do T., Kasravi S. et al. Chromosomes are target sites for photo-
dynamic therapy as demonstrated by subcellular laser microirradiation // J. Pho-
tochem. Photobiol. B. Biol. 2000. Vol. 54. P. 175—184.
Lier van, J., Spikes J. D. The chemistry, photophysics, and photosensiti-
zing properties of phthalocyanynes // Ciba Foundation Symposium. 1989.
Vol. 146. P. 17—32.
Lilge L., Portnoy M., Wilson В. C. Apoptosis induced in vivo by photo-
dynamic therapy in normal brain and intracranial tumour tissue // Br. J. Cancer.
2000. Vol. 83. P. 1110—1117.
Lim D. S., Bae S. M., Kwak S. Y. et al. Adenovirus-Mediated p53 Treat-
ment Enhances Photodynamic Antitumor Response // Hum. Gene Ther. 2006.
Vol. 17. P. 347—352.
Lin С. P., Lynch M. C., Kochevar I. E. Reactive oxidizing species pro-
duced near the plasma membrane induce apoptosis in bovine aorta endothelial
cells II Exp. Cell Res. 2000. Vol. 259. P. 351—359.
Lipson R. L., Blades E. J. The photodynamic properties of a particular he-
matoporphyrin derivative // Arch. Dermatol. 1960. Vol. 82. P. 508—516.
Lipson R. L., Blades E. J., Olsen A. M. Hematoporphyrin derivative: a
new aid of endoscopic detection of malignant disease // J. Thorac. Cardiovasc.
Surg. 1961. Vol. 42. P. 623—629.
Liu W., Oseroff A. R., Baumann H. Photodynamic therapy causes
cross-linking of signal transducer and activator of transcription proteins and at-
tenuation of interleukin-6 cytokine responsiveness in epithelial cells // Cancer
Res. 2004. Vol. 64. P. 6579—6587.
Liu L., Stamler J. S. NO: an inhibitor of cell death // Cell Death Differ.
1999. Vol. 6. P. 937—942.
Llinas R. R. The intrinsic electrophysiological properties of mammalian
neurons: Insights into central nervous system function // Science. 1988.
Vol. 242. P. 1654—1664.
Lobanov A. V., Uzdensky A. B. PDT-induced death of sensory neurons
and glial cells in the isolated crayfish stretch receptor after proteolytic treat-
ment // J. Neurosci. Res. 2005. Vol. 82. P. 866—874.
Loew H. G., Kubin A. // Patentapplication PCT/AT01/001596, 2001.
Lonze В. E., Ginty D. D. Function and regulation of CREB family transc-
ription factors in the nervous system // Neuron. 2002. Vol. 35. P. 605—623.
Lonze В. E., Riccio A., Cohen S., Ginty D. D. Apoptosis, axonal growth
defects, and degeneration of peripheral neurons in mice lacking CREB // Neu-
ron. 2002. Vol. 34. P. 371—385.
Lu X., Maysinger D., Hagg T. Tyrosine phosphatase inhibition enhances
neurotrophin potency and rescues nigrostriatal neurons in adult rats // Exp. Neu-
rol. 2002. Vol. 178. P. 259—267.
Luna M. C., Ferrario A. et al. Photodynamic therapy mediated oxidative
stress as a molecular switch for the temporal expression of genes ligated to the
human heat shock promoter // Cancer Res. 2000. Vol. 60. P. 1637—1644.
Luna M. C., Wong S., Gomer C. J. Photodynamic therapy mediated in-
duction of early response genes//Cancer Res. 1994. Vol. 54. P. 1374—1380.
Luo Y., Kessel D. Initiation of apoptosis versus necrosis by photodynamic
therapy with chloroaluminum phthalocyanine // J. Photochem. Photobiol. B.
Biol. 1996. Vol. 66. P. 479—483.
Lutsenko S. V., Feldman N. B., Finakova G. V. et al. Targeting phthalo-
cyanines to tumor cells using epidermal growth factor conjugates // Tumour
Biol. 1999. Vol. 20. P. 218—224.
Ma L.. W., Berg K., Danielsen H. E. et al. Enhanced antitumour effect of
photodynamic therapy by microtubule inhibitors // Cancer Lett. 1996. Vol. 109.
P. 129—39.
Ma L., Moan J., Berg K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tet-
ra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its
photobiological properties with those of two other photosensitizers // Int. J.
Cancer. 1994. Vol. 57. P. 883—888.
MacCormack M. A. Photodynamic therapy // Adv. Dermatol. 2006.
Vol. 22. P. 219—258.
Madsen S. J., Sun С. H., Tromberg B. J., Hirschberg H. Repetitive
5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on human glioma sphe-
roids II J. Neurooncol, 2003. Vol. 623. P. 243—250.
Magi B., Ettorre A., Liberatori S. et al. Selectivity of protein carbonyla-
tion in the apoptotic response to oxidative stress associated with photodynamic
therapy: a cell biochemical and proteomic investigation // Cell Death Differ.
2004. Vol. 11. P. 842—852.
Mak N. K., Li К. M., Leung W. N. et al. Involvement of both endoplas-
mic reticulum and mitochondria in photokilling of nasopharyngeal carcinoma
cells by the photosensitizer Zn-BC-AM // Biochem. Pharmacol. 2004. Vol. 68.
P. 2387—2396.
Makowski M., Grzela T., Niderla J. et al. Inhibition of cyclooxygenase-2
indirectly potentiates antitumor effects of photodynamic therapy on mice // Clin
Cancer Res. 2003. Vol. 9. P. 5417—5422.
Malham G. M., Thomsen R. J., Finlay G. J., Baguley В. C. Subcellular
distribution and photocytotoxicity of aluminium phthalocyanines and haemato-
porphyrin derivative in cultured human melanoma cells // Br. J. Neurosurg.
1996. Vol. 10. P. 51—57.
Malik Z., Amit 1., Rothmann C. Subcellular localization of sulfonated
tetraphenyl porphines in colon carcinoma cells by spectrally resolved imaging //
J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1997. Vol. 65. P. 389—396.
Marchal S., Bezdetnaya L., Guillemin F. Modality of cell death induced
by Foscan-based photodynamic treatment in human colon adenocarcinoma cell
line HT29 // Biochemistry (Moscow). 2004. Vol. 69. P. 45—49.
Margaron P, Gregorie M. J., Scasnar V. et al. Structure-Photodynamic
activity relationship of a scries of 4-substitutcd zinc phthalocyanines // J. Pho-
tochem. Photobiol. B. Biol. 1996. Vol. 63. P. 217—223.
Margaron P., Sorrenti R., Levy J. G. Photodynamic therapy inhibits cell
adhesion without altering integrin expression // Biophys. Biochem. Acta. 1997.
Vol. 1359. P. 200—210.
Matroule J. Y., Bonizzi G., Morliere P. et al. Pyropheophorbide-a met-
hyl ester-mediated photosensitization activates transcription factor NF-kappaB
through the interleukin-1 receptor-dependent signaling pathway // J. Biol.
Chcm. 1999a. Vol. 274. P. 2988—3000.
Matroule J. Y., Carthy С. M., Granville D. J. et al. Mechanism of colon
cancer cell apoptosis mediated by pyropheophorbide-a methylcster photosensi-
tization // Oncogene. 2001. Vol. 20. P. 4070—4084.
Matroule J. Y., Hellin A. C., Morliere P. et al. Role of nuclear factor-
kappa В in colon cancer cell apoptosis mediated by aminopyropheophorbide
photosensitization // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1999b. Vol. 70. P. 540—548.
Matroule J. Y., Piette J. Photosensitization and redox signaling // Antioxi-
dants Redox Signal. 2000. Vol. 2. P. 301—315.
Mattson M. P., Magnus T. Ageing and neuron vulnerability // Nat. Rev.
Neurosci. 2006. Vol. 7. P. 278—294.
Matthews E. K, Mesler D. E. Photodynamic effect of erythosine on the
smooth muscle cells of guinea-pig taenia coli // Br. J. Pharmacol. 1984. Vol. 83.
P.'555—566.
McKay S., Purcell A. L., Carew T. J. Regulation of synaptic function by
neurotrophic factors in vertebrates and invertebrates: implications for develop-
ment and learning // Learn. Memor. 1999. Vol. 6. P. 193—215.
McMillan M. K., Thai L., Hong J. S. et al. Brain injury in a dish: a model
for reactive gliosis // Trends Neurosci. 1994. Vol. 17. P. 138—142.
Meijer A. J., Codogno P. Regulation and role of autophagy in mammalian
cells // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2004. Vol. 36. P. 2445—2462.
Meldolessi J. Rapidly exchanging Ca2+ stores in neurons: molecular, struc-
tural and functional properties// Progr. Neurobiol. 2001. Vol. 65. P. 309—338.
Melnikova V. O., Bezdetnaya L. N., Bour C. et al. Subcellular localizati-
on of meta-tetra (hydroxyphenyl) chlorin in human tumour cells subjected to
photodynamic treatment // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1999. Vol. 49.
P. 96—103.
Miccoli L., Beurdeley-Thomas A., De Pinieux G. et al. Light-induced
photoactivation of hypericin affects the energy metabolism of human glioma
cells by inhibiting hexokinase bound to mitochondria // Cancer Res. 1998.
Vol. 58. P. 5777—5786.
Michel P. P., Agid Y. Chronic activation of the cyclic AMP signaling pat-
hway promotes development and long-term survival of mesencephalic dopami-
nergic neurons // J. Neurochem. 1996. Vol. 67. P. 1633—1642.
Minamikawa T., Sriratana, A., Williams D. A. et al. Chloromethyl-
X-rosamine (MitoTracker Red) photosensitises mitochondria and induces apop-
tosis in intact human cells // J. Cell Sci. 1999. Vol. 112. P. 2419—2430.
Miskovsky P. Hypericin — a new antiviral and antitumor photosensitizer:
mechanism of action and interaction with biological macromolecules // Curr.
Drug. Targets. 2002. Vol. 3. P. 55—84.
Moan J. Porphyrin photosensitization and phototherapy // J. Photochem.
Photobiol. B. Biol. 1986. Vol. 43. P. 681—690.
Moan J. On the diffusion length of singlet oxygen in cells and tissues // J.
Photochem. Photobiol. B. Biol. 1990. Vol. 6. P. 343—347.
Moan J., Berg K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used
to estimate the lifetime of singlet oxygen // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
1991. Vol. 53. P. 549—553.
Moan J., Berg K. Photochemotherapy of cancer: experimental research //
J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1992. Vol. 55. P. 931—948.
Moan J., Berg K., Anholt IL, Madslien K. Sulfonated aluminium phtha-
locyanines as sensitizers for photochemotherapy. Effects of small light doses on
localization, dye fluorescence and photosensitivity in V79 cells // Int. J. Cancer.
1994. Vol. 58. P. 865—870.
Moan J., Johanessen J. V., Christensen T. et al. Porphyrin-sensitized
photoinactivation of human cells in vitro // Am. J. Pathol. 1985. Vol. 109.
P. 184—192.
Moan J., Peng Q. An outline of the hudred-yaer history of PDT// Antican-
cer Res. 2003. Vol. 23. P. 3591—3600.
Moan J. Peng Q., Evensen J. F. et al. Photosensing efficiencies, tumour
and cellular uptake of different photosensitizing drugs relevant to photodyna-
mic therapy of cancer // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1987. Vol. 46.
P. 713—721.
Moan J., Peng Q., Sorensen R. et al. The biophysical foundations of pho-
todynamic therapy // Endoscopy. 1998. Vol. 30. P. 387—391.
Moan J., Vistnes A. 1. Porphyrin photosensitization of proteins in cell
membranes as atudied by spin-labelling and by quantification of DTNB-re-
active SH-groups // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1986. Vol. 44. P. 15—
19.
Modika-Napolitano J. S., Jogal J. L., Ara G. et al. Mitochondrial toxici-
ty of cationic photosensitizers for photochemotherapy // J. Photohem. Photobi-
ol. B. Biol. 1990. Vol. 51. P. 497—509.
Monagham D. T., Bridges R. J., Cotman C. W. The excitatory amino
acid receptors: their classes, pharmacology, and distinct properties in the functi-
on of the central nervous system // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1989.
Vol. 29. P. 365^102.
Moor A. С. E. Signalling pathways in cell death and survival after photo-
dynamic therapy//J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2000. Vol. 57. P. 1—13.
Moreno G., Poussin K., Ricchelli F., Salet C. The effect of singlet oxy-
gen produced by photodynamic action on the mitochondrial permeability transi-
tion differ in accordance with the localization of the sensitizer // Arvh. Bioc-
hem. Biophys. 2001. Vol. 386. P. 243—250.
Moreno II., Nadal M., Leznik E. et al. Nerve growth factor acutely redu-
ces chemical transmission by means of postsynaptic TrkA-like receptors in squ-
id giant synapse // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998. Vol. 95. P. 14997—15002.
Morgan J., Oseroff A. R. Mitochondria-based photodynamic anti-cancer
therapy // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2001. Vol. 49. P. 71—86.
Morgan J., Whitaker J. E., Oseroff A. R. GRP78 induction by calcium
ionophore potentiates photodynamic therapy using the mitochondrial targeting
dye victoria blue // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1998. Vol. 67.
P. 155—164.
Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:
application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Methods.
1983. Vol. 65. P. 55—63.
Muldner V. H., Zoller M. Antidepressive effect of a hypericin extract
standartized to the active hypericin complex // Arzneimittelforschung. 1984.
Vol. 34. P. 918—920.
Muller H. W., Stoll G. Nerve injury and regeneration: Basic insights and
therapeutic interventions // Curr. Opin. Neurol. 1998. Vol. 11. P. 557—562.
Murant R. S., Gibson S. L., Hilf R. Photosensitizing effect of Photofrin II
on the site-selected mitochondrial enzymes monoamine oxidase and adenylate
cyclase // Cancer Res. 1987. Vol. 47. P. 4323—4328.
Musser D. A., Oseroff A. R. The use of tetrazolium salts to determine si-
tes of damage to the mitochondrial electron transport chain in intact cells follo-
wing in vitro photodynamic therapy with Photofrin II // J. Photochem. Photobi-
ol. B. Biol. 1994. Vol. 5. P. 621—626.
Nagy S. M., Chiu S. M., Separovic D. Fumonisin Bl does not prevent
apoptosis in A431 human epidermoid carcinoma cells after photosensitization
with a silicon phthalocyanine // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2000.
Vol. 57. P. 132—141.
Nakanishi S., Nakajima Y. et al. Glutamate receptors: brain function and
signal transduction // Brain Res. Rev. 1998. Vol. 26. P. 230—235.
Newton A. C., Johnson J. E. Protein kinase C: a paradigm for regulation
of protein function by two membrane-targeting modules // Biochim. Biophys.
Acta. 1998. Vol. 1376. P. 155—172.
Nicotera P., Bellomo G., Orrenius S. The role of calcium in cell killing //
Chem. Res. Toxicol. 1990. Vol. 3. P. 484—494.
Nicotera P., Leist M. Energy supply and the shape of death in neurons and
lymphoid cell // Cell Death Differ. 1997. Vol. 4. P. 435—442.
Nicotera P., Leist M., Single B., Volbracht C. Execution of apoptosis,
converging or differing pathways? // Biol. Chem. 1999. Vol. 380. P. 1035—
1040.
Nilsson R., Merkel P. B., Kearns D. R. Unambiguous evidence for the
participation of singlet oxygen (1Д) in photodynamic oxidation of amino
acids // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1972. Vol. 16. P. 117—123.
Nishizawa C., Takeshita K., Ueda J. et al. Hydroxyl radical generation
caused by the reaction of singlet oxygen with a spin trap, DMPO, increases sig-
nificantly in the presence of biological reductants // Free Radic. Res. 2004.
Vol. 38. P. 385—392.
Niziolek M., Korytowski W., Girotti A. W. Chain-breaking antioxidant
and cytoprotective action of nitric oxide on photodynamically stressed tumor
cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2003a. Vol. 78. P. 262—270.
Niziolek M., Korytowski W., Girotti A. W. Nitric oxide inhibiyion of
free radical-mediated lipid peroxidation in photodynamically treated membra-
nes and cells // Free Radic. Biol. Med. 2003b. Vol. 34. P. 997—1005.
Niziolek M., Korytowski W., Girotti A. W. Nitric oxide-induced resis-
tance to lethal photooxidative damage in a breast tumor cell line // Free Radic.
Biol. Med. 2006. A. Vol. 40. P. 1323—1331.
Nohl H., Gille L., Staniek K. Intracellular generation of reactive oxygen
species by mitochondria // Biochem. Pharmacol. 2005. Vol. 69. P. 719—723.
Nonaka M., Ikeda H., Inokuchi T. Inhibitory effect of heat shock protein
70 on apoptosis induced by photodynamic therapy in vitro // J. Photochem. Pho-
tobiol. B. Biol. 2000. Vol. 79. P. 94—98.
Noodt В. B., Berg K., Stokke T. et al. Apoptosis and necrosis induced
with light and 5-aminolaevulinic acid-derived protoporphyrin IX // Br. J. Can-
cer. 1996. Vol. 74. P. 22—29.
Noodt В. B., Berg K., Stokke T. et al. Different apoptotic pathways arc
induced from various intracellular sites by tetraphenylporphyrins and light // Br.
J. Cancer. 1999. Vol. 79. P. 72—81.
Noodt В. B., Rodal G. H., Wainwright M. et al. Apoptosis induction by
different pathways with methylene blue derivative and light from mitochondrial
sites in V79 cells // Int. J. Cancer. 1998. Vol. 75. P. 941—948.
Nowis D., Legat M., Grzela T. et al. Heme oxygenase-1 protects tumor
cells against photodynamic therapy-mediated cytotoxicity // Oncogene. 2006.
Vol. 25. P. 3365—3374.
Nowis D., Makowski M., Stoklosa T. et al. Direct tumor damage mecha-
nisms of photodynamic therapy // Acta Biochim. Pol. 2005. Vol. 52. P. 339—
352.
Oberdanner С. B, Kiesslich T., Krammer B. et al. Glucose is required to
maintain high ЛТР-levels for the energy-utilizing steps during PDT-induced
apoptosis // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2002. Vol. 76. P. 695—703.
Ochsner M. Photophysical and photobiological processes in the photody-
namic therapy of tumors // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1997. Vol. 39.
P. 1—18.
Ogata M., Inanami O., Nakajima M. et al. Ca2’-dcpendent and caspa-
se-3-independent apoptosis caused by damage in Golgi apparatus due to
2,4,5,7-tetrabromorhodamine 123 bromide-induced photodynamic effects //
Photochem. Photobiol. 2003. Vol. 78. 241—247.
Oleinick N. L., Morris R. L., Belichenko I. The role of apoptosis in res-
ponse to photodynamic therapy: what, where, why, and how // Photochem. Pho-
tobiol. Sci. 2002. Vol. 1. P. 1—21.
O’Reilly M. A. Redox activation of p21Cipl/WAFl/Sdil: a multifunctio-
nal regulator of cell survival and death // Antioxid. Redox Signal. 2005. Vol. 7.
P. 108—118.
Orrenius S., Zhivotovsky B., Nicotera P. Regulation of cell death: the
calcium-apoptosis link // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. Vol. 4. P. 552—565.
Ortel B., Gange R. W., Hasan T. Investigations of a manganese-contai-
ning mimic of superoxide dismutase in riboflavin phototoxicity in human cells
in vitro // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1990. Vol. 7. P. 261—276.
Oseroff A. R., Ohuoha D., Ara G. et al. Intramitochondrial dyes allow se-
lective in vitro photolysis of carcinoma cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
1986. Vol. 83. P. 9729—9733.
Oxford G. S., Pooler J. P., Narahashi T. Internal and external application
of photodynamic sensitizers on squid giant axons // J. Membr. Biol. 1977.
Vol. 36. P. 159—173.
Oyadomari S., Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reti-
culum stress // Cell Death Differ. 2004. Vol. 11. P. 381—389.
Paba V., Quarto M., Varriale L. et al. Photo-activation of hypericin with
low doses of light promotes apparent photo-resistance inJiuman'Tiistiocytic
lymphoma U937 cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2001. Vol. 60.
P. 87—96.
Pafford С. M., Simples J. E., Strong J. A. Effects of the protein tyrosine
phosphatase inhibitor phenylarsine oxide on excision-activated calcium chan-
nels in Lymnaea neurons // Cell Calcium. 1995. Vol. 18. P. 400—410.
Pannesse E., Procacci P. Ultrastructural localization of NGF receptors in
satellite cells of the rat spinal ganglia // J. Neurocytol. 2002. Vol. 31. P. 755—-763.
Paquette B., Ali H., Langois R., Lier van J. E. Biological activities of
phthalocyanines. VIII. Cellular distribution in V-79 Chinese hamstrer cells and
phototoxicity of selectively sulfonated aluminium phthalocyanines // J. Photoc-
hem. Photobiol. B. Biol. 1988. Vol. 47. P. 215—220.
Peng Q. Correlation of intracellular and intratumoral photosensitizer distri-
bution with photodynamic effect // Photodynamic therapy and fluorescence di-
agnosis in dermatology / Eds P. Calzavara-Pinton, P. M. Szeimies, B. Ortel.
Amsterdam: Elsevier, 2001. P. 55—64.
Peng Q., Farrants G. W., Madslien K. et al. Subcellular localization, re-
distribution and photobleaching of sulfonated aluminum phthalocyanines in a
human melanoma cell line // Int. J. Cancer. 1991. Vol. 49. P. 290—295.
Peng Q., Ma L.-W., Berg K., Moan J. Effect of sulfonation on the photo-
sensitizing efficiency of aluminium phthalocyanine and meso-tetraphenylporp-
hine in photodynamic therapy of cancer // Proc. SPIE. 1994. Vol. 2078.
P. 258—267.
Peng Q., Nesland J. M., Madslien K. et al. Subcellular photodynamic ac-
tion sites of sulfonated aluminum phthalocyanines in a human melanoma cell
line // Proc. SPIE. 1996. Vol. 2628. P. 102—113.
Peng T. I., Chang C. J., Guo M. J. et al. Mitochondria-targeted photosen-
sitizer enhances the photodynamic effect-induced mitochondrial disfunction
and apoptosis // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005. Vol. 1042. P. 419—428.
Penning L. C., Dubbelman T. M. A. R. Fundamentals of photodynamic
therapy: cellular and biochemical therapy // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
1994. Vol. 5. P. 139—146.
Penning L. C., Dubbelman T. M., Van Steveninck J. HPD-induced pho-
todynamic changes in intracellular cyclic AMP levels in human bladder transiti-
onal carcinoma cells, clone T24 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993a.
Vol. 194. P. 1084—1089.
Penning L. C., Keirse M. J., Steveninck van J., Dubbelman T. M.
Ca2+-mediated prostaglandin E2 induction reduces haematoporphyrin-derivati-
ve-induced cytotoxicity of T24 human bladder transitional carcinoma cells in
vitro // Biochem. J. 1993b. Vol. 292. P. 237—240.
Penning L. C., Rash M. H., Ben-Hur E. et al. A role for the transient inc-
rease of cytoplasmic free calcium in cell rescue after photodynamic treatment //
Biochim. Biophys. Acta, 1992. Vol. 1107. P. 255—260.
Perlin D. S., Murant R. S., Gibson S. L, Hilf R. Effect of photosensitiza-
tion by hematoporphyrin derivative on mitochondrial adenosine triphospha-
te-mediated proton transport and membrane integrity of R3230AC mammary
adenocarcinomas // Cancer Res. 1985. Vol. 45. P. 653—658.
Piret B., Legrand-Poels S., Sappey C., Piette J. NF-kappa В transcription
factor and human immunodeficiency virus type 1 (HIV—1) activation by methy-
lene blue photosensitization // Eur. J. Biochem. 1995. Vol. 228. P. 447—455.
Plaetzer K., Kiesslich T., Oberdanner С. B., Krammer B. Apoptosis
following photodynamic tumor therapy: Induction, mechanisms and detection //
Curr. Pharm. Design. 2005. Vol. 11. P. 1151 —1165.
Pluskalova M., Peslova G., Grebenova D. et al. Photodynamic treatment
(ALA-PDT) suppresses the expression of the oncogenic Bcr-Abl kinase and af-
fects the cytoskeleton organization in K.562 cells // J. Photochem. Photobiol. B.
Biol. 2006. Vol. 83. P. 205—212.
Pollack I F., Kawecki S. The effect of calphostin C, a potent photodepen-
dent protein kinase C inhibitor, on the proliferation of glioma cells in vitro // J.
Neurooncol. 1997. Vol. 31. P. 255—266.
Pooler J. P. Photodynamic alteration of sodium current in lobster axon //
Gen. Physiol. 1972. Vol. 60. P. 367—387.
Pooler J. P. Photodynamic modification of excitable cell function //
Light-activated pesticides / Ed. J. R. Heir. ACS symposium series. Vol. 309.
American Chemical Society. Washington, 1987. P. 109—121.
Popovic E. A., Kaye A. H., Hill J. S. Photodynamic therapy of brain tu-
mors // J. Clin. Laser. Med. Surg. 1996. Vol. 14. P. 251- 261.
Pottier R., Kennedy J. C. Photodynamic therapy with 5-aminolevuli-
nic acid: Basic principles and applications // Proc. SPIE. 1996. Vol. 2625.
P. 2—10.
Pozzan T., Ruzutto R., Volpe P., Meldolessi J. Molecular and cellular
physiology of intracellular calcium stores // Physiol. Rev. 1994. Vol. 74.
P. 595—636.
Proskuryakov S. Ya., Konoplyannikov A. G., Gabai V. L. Necrosis: a
specific form of programmed cell death? // Exp. Cell Res. 2003. Vol. 283.
P. 1—16.
Purcell A. L., Carew T. J. Tyrosine kinases, synaptic plasticity and me-
mory: insights from vertebrates and invertebrates // Trends Neurosci. 2003.
Vol. 26. P. 625—630
Qualls M. M., Thompson D. H. Chloroaluminum phthalocyanine tetrasul-
fonate delivered via Acid-labile diplasmenylcholine-folate liposomes: intracel-
lular Localization and synergistic phototoxicity // Int. J. Cancer. 2001. Vol. 93.
P. 384—392.
Raivich G., Bohatschek M., Kloss C. U. A. et al. Neuroglial activation
repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and
cues to physiological function // Brain Res. Rev. 1999. Vol. 30. P. 77—105.
Ramakrishnan N., Clay M. E., Xue L.-Y. et al. Induction of DNA-prote-
in cross-links in Chinese hamster cells by the photodynamic action of chloroa-
luminum phthalocyanine and visible light // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
1988. Vol. 48. P. 297—303.
Rancan F., Wiehe A., Nobel M. et al. Influence of dubstitutions on asym-
metric dihydroxychlorins with regard to intracellular uptake, subcellular locali-
zation and photosensitization of Jurkat cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
2005. Vol. 78. P. 17—28.
Rasch M. H., Tijssen K., Lagrberg J. W. et al. The role of PKC activity
in the killing of Chinese hamster ovary cells by ionizing radiation and photody-
namic treatment//J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1997. Vol. 66. P. 209—213.
Reichardt L. F. Ncurotrophin-regulated signalling pathways // Philos.
Trans. R. Soc. B. Biol. Sci. 2006. Vol. 361. P. 1545—1564.
Reiners J. J., Caruso J. A., Mathieu P. et al. Release of cytochrome C
and activation of pro-caspase-9 following lysosomal photodamage involves bid
cleavage // Cell Death Differ. 2002. Vol. 9. P. 934—944.
Reiss F. Lebendfurbung von Mitochondrien mit Janusgrun В // Mikrokos-
mos. 1969. Vol. 58. P. 38^11.
Reshetnikov A. V., Zalevsky I. D., Kemov Yu. V. Photosensitizer, and
process therefore. RF patent No. 2183956 (priority date 30. 03. 2001). Assig-
nee: RADA-PHARMA Co. Ltd., Russia. PCT application WO 02/078694 Л12
published 10. 10. 2002 (international priority of 04. 10. 2001).
Ricchelli F., Barbato P., Milani M. et al. Photodynamic action of porphy-
rin on Ca"+ influx in endoplasmic reticulum: a comparison with mitochondria //
Biochem. J. 1999. Vol. 338. P. 221—227.
Ricchelli F., Salet C., Moreno G. Distribution properties of photosensiti-
zers in biological membranes // Trends Photochem. Photobiol. 1997. Vol. 4.
P. 285—289.
Ridgway R. L., Syed N. I., Lukowiak K., Bulloch A. G. Nerve growth
factor (NGF) induces sprouting of specific neurons of the snail, Lymnaea stag-
nalis // J. Neurobiol. 1991. Vol. 22. P. 377—390.
Rizzuto R., Bernardi P., Pozzan T. Mitochondria as all-round players of
the calcium game // J. Physiol. 2000. Vol. 529. P. 37—47.
Roberts W. G., Berns M. W. In vitro photosensitization. 1. Cellular upta-
ke and subcellular localization of mono-L-aspartyl chlorin et,, chloroaluminum
sulfonated phthalocyanine, and Photofrin II // Lasers Surg. Med. 1989. Vol. 9.
P. 90—101.
Rodal G. H., Rodal S. K., Moan J., Berg K. Liposome-boudn
Zn(II)-phthalocyanine. Mechanism of cellular uptake // J. Photocem. Photobiol.
B. Biol. 1998. Vol. 45. P. 150—159.
Rodriguez-Mora O. G., Lahair M. M., Evans M. J. et al. Inhibition of
the CaM-kinases augments cell death in response to oxygen radicals and oxy-
gen radical inducing cancer therapies in MCF-7 human breast cancer cells //
Cancer Biol. Ther. 2006. Vol. 5. P. 1022—1030.
Rosenthal I. Phthalocyanines as photodynamic photosensitizers // J. Photo-
cem. Photobiol. B. Biol. 1991. Vol. 53. P. 859—870.
Rousset N., Vonarx V., Eleouet S. et al. Cellular distribution and phototo-
xicity of benzoporphyrin derivative and Photofrin // Res. Exp. Med. (Berl).
2000. Vol. 199. P. 341—357.
Ruck A., Beck G., Bachor R. et al. Dynamic fluorescence changes of
hydrophilic and lipophic phthalocyanine during PDT in vivo and in vitro //
Proc. SPIE. 1996. Vol. 2625. P. 124—137.
Ruck A., Heckelsmiller K., Kaufmann R. et al. Light-induced apoptosis
involves a defined sequence of cytoplasmic and nuclear calcium release in
AlPcS4-photosensitized rat bladder RR 1022 epithelial cells // J. Photochem.
Photobiol. B. Biol. 2000. Vol. 72. P. 210—216.
Rugolo M., Lenaz G. Monitoring of the mitochondrial and plasma memb-
rane potentials in human fibroblasts by tetraphenylphosphonium ion distributi-
on // J. Bioenerg. Biomembr. 1987. Vol. 19. P. 705—718.
Ruhdorfer S., Sanovic R., Sander V. et al. Gene expression profiling of
the human carcinoma cell line A—431 after 5-aminolevulinic acid-based pho-
todynamic treatment // Int. J. Oncol. 2007. Vol. 30. P. 1253—1262.
Ryter S. W., Gomer C. J. Nuclear factor kappa В binding activity in mou-
se L1210 cells following photofrin Il-mediated photosensitization // J. Photoc-
hem. Photobiol. B. Biol. 1993. Vol. 58. P. 753—756.
Ryter S. W., Tyrrell R. M. The heme synthesis and degradation pathways:
role in oxidant sensitivity. Heme oxygenase has both pro- and antioxidant pro-
perties // Free Rad. Biol. Med. 2000. Vol. 28. P. 289—309.
Sah P., Faber E. S. L. Channels underlying neuronal calcium-activated
potassium currents // Progr. Neurobiol. 2002. Vol. 66. P. 345—353.
Sakharov D. V., Bunschoten A., Weelden van H., Wirtz K. W. Photo-
dynamic treatment and H2O2-induced oxidative stress result in different pat-
terns of cellular protein oxidation // Eur. J. Biochem. 2003. Vol. 270. P. 4859—
4865.
Salet C. A study of beating frequency of a single myocardial cell. I.
Q-switched laser microirradiation of mitochondria // Exper. Cell Res. 1972.
Vol. 73. P. 360—366.
Salet C., Moreno G. Photosensitization of mitochondria. Molecular
and cellular aspects // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1990. Vol. 5. P. 133—
150.
Salet C., Moreno G. Primary effects of photo-induced singlet oxygen on
mitochondrial bioenergetics // Trends Photochem. Photobiol. 1994. Vol. 3.
P. 169—174.
Salet C., Moreno G., Ricchelli F., Bernardi P. Singlet oxygen produced
by photodynamic action causes inactivation of the mitochondrial permeability
transition pore // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 21938—21943.
Santus R., Kohen C., Kohen Ё. et al. Permeation of lysosomal membra-
nes in the course of photosensitization with methylene blue and hematoporphy-
rin: study by cellular microspectrofluorometry // J. Photochem. Photobiol. B.
Biol. 1996. Vol. 38. P. 71—77.
Schempp С. M., Simon-Haarhaus B., Termeer С. C. et al. Hypericin
photo-induced apoptosis involves the tumor necrosis factor-related apopto-
sis-inducing ligand (TRAIL) and activation of caspase-8 // FEBS Lett. 2001.
Vol. 493. P. 26—30.
Schieke S. M., VonMontfort C., Buchczyk P. et al. Singlet oxygen-indu-
ced attenuation of growth factor signaling: Possible role of ceramides // Free
Rad. Res. 2004. Vol. 38. P. 729—737.
Schmidt W. The study of basic photochemical and photophysical properti-
es of membrane-bound flavins: the indispensible prerequisite for the elucidati-
on of primary physiological blue light action // Blue Light Effects in Biological
Systems / Ed. H. Senger. Berlin, 1984. P. 81—94.
Schmidt W., Butler W. L. Flavin-mediated photorcactions in artificial
systems: a possible model for the blue-light photoreceptor pigment in the living
systems // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1976. Vol. 24. P. 71—75.
Schmidt-Erfurth U., Diddens H., Birngruber R., Hasan T. Photodyna-
mic targeting of human retinoblastoma cells using covalent low-density lipop-
rotein conjugates // Br. J. Cancer. 1997. Vol. 75. P. 54—61.
Schneider R., Schmitt F., Frochot C. et al. Design, synthesis, and biolo-
gical evaluation of folic acid targeted tetraphcnylporphyrin as novel photosen-
sitizers for selective photodynamic therapy // Bioorg. Med. Chem. 2005.
Vol. 13. P. 2799—2808.
Schouwink H., Oppelaar H., Ruevekamp M. et al. Oxygen depletion du-
ring and after mTHPC-mcdiated photodynamic therapy in RIF1 and H-MESO1
tumors II Radial. Res. 2003. Vol. 159. P. 190—198.
Schuitmaker J. J., Baas L., Leengoed van H. L. et al. Photodynamic the-
rapy: a promising new modality for the treatment of cancer // J. Photochem.
Photobiol. B. Biol. 1996. Vol. 34. P. 3—12.
Schwartz S., Absolon K., Vermund H. Some relationships of porphyrin,
X-rays and tumors // Med. Bull. 1955. Vol. 27. P. 7—13.
Scully A D., Ostler R. B., MacRobert A. J. et al. Laser line-scanning
confocal fluorescence imaging of the photodynamic action of aluminum and
zinc phthalocyanines in V79-4 Chinese hamster fibroblasts // J. Photochem.
Photobiol. B. Biol. 1998. Vol. 8. P. 199—204.
Selbo P. K., Hogset A., Prasmickaite L., Berg K. Photochemical interna-
lization: a novel drug delivery system // Tumor Biology. 2002. Vol. 23.
P. 103—112.
Semenza G. L. HIF-1, 02, and the 3 PHDs: how animal cells signal hypo-
xia to the nucleus // Cell. 2001. Vol. 107. P. 1—3.
Senthil V., Longworth J. W., Ghiron C. A., Grossweiner L. I. Photosen-
sitization of aqueous model systems by hypericin // Biochim. Biophys. Acta.
1992. Vol. 1115. P. 192—200.
Separovic D., He J., Oleinick N. L. Ceramide generation in response to
photodynamic treatment of L5178Y mouse lymphoma cells // Cancer Res.
1997. Vol. 57. P. 1717— 1721.
Separovic D., Mann K. J., Oleinick N. L. Association of ceramides accu-
mulation with photodynamic treatment-induced cell death // J. Photochem. Pho-
tobiol. B. Biol. 1998. Vol. 68. P. 101—109.
Separovic D., Pink J. J., Oleinick N. L. et al. Niemann — Pick human
lymphoblasts arc resistant to phthalocyanine 4-photodynamic therapy-indu-
ced apoptosis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol. 258. P. 506—
512.
Shackley D. C., Hayiett A., Whitehurst C. et al. Comparison of the cellu-
lar molecular stress responses after treatments used in bladder cancer // Brit. J.
Urol. 2002. Vol. 90. P. 924—932.
Sharman W. M., Liera van J. E., Allen С. M. Targeted photodynamic
therapy via receptor mediated delivery systems // Advanced Drug Delivery Rev.
2004. Vol. 56. P. 53—76.
Shaulian E., Karin M. ЛР-1 as a regulator of cell life and death // Nat.
Cell Biol. 2002. Vol. 4. P. E131—136.
Shen X. Y., Zacal N., Singh G., Rainbow A. J. Alterations in mitochond-
rial and apoptosis-regulating gene expression in photodynamic therapy-resis-
tant variants of HT29 colon carcinoma cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
2005. Vol. 81. P. 306—313.
Shorter J., Warren G. Golgi architecture and inheritance // Annu Rev.
Cell Dev. Biol. 2002. Vol. 18. P. 379-^20.
Siskind L. J. Mitochondrial ceramide and the induction of apoptosis // J
Bioenerg. Biomemb. 2005. Vol. 37. P. 143—153.
Skaper S. D., Floreani M., Negro A. et al. Neurotrophins rescue cerebel-
lar granule neurons from oxidative stress-mediated apoptotic death: involve-
ment of phosphatidylinositol 3-kinase and the mitogen-activated protein kinase
pathway // J. Ncurochem. 1998. Vol. 70. P. 1859—1868.
Skulachev V. P. Mitochondrial physiology and pathology; concepts of
programmed death of organelles, cells, and organisms // Mol. Aspect. Med.
1999. Vol. 20. P. 139—184.
Skulachev V. P. Mitochondria in the programmed death phenomena; a
principle of biology: „it is better to die than to be wrong” // 1UBMB Life. 2000.
Vol. 49. P. 365—373.
Smetana K., Cajthamlova H., Grebenova D., Hrkal Z. The 5-amino-
laevulinic acid-based photodynamic effects on nuclei and nucleoli of HL-60 leuke-
mic granulocytic precursors // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2000. Vol. 59. P. 80-—
86.
Smetana K., Grebenova D., Jiraskuva 1. et al. A note on the decreased
number and loss of fibrillar centres in nucleoli of apoptotic HL-60 leukaemic
granulocytic precursors produced by 5-aminolaevulinic acid-based photodyna-
mic treatment // Folia Biol. 2004. Vol. 50. P. 15—20.
Sofroniew M. V., Howe C. L., Mobley W. C. Nerve growth factor signa-
ling, neuroprotection, and neural repair // Annu. Rev. Neurosci. 2001. Vol. 24.
P. 1217—1281.
Sola C., Barron S., Tusell J. M., Serratosa J. The Ca27calmodulin signa-
ling system in the neural response to excitability. Involvement of neuronal and
glial cells // Progr. Ncurobiol. 1999. Vol. 58. P. 207—232.
Specht K. G., Rogers M. A. Depolarization of mouse myeloma cell mem-
branes during photodynamic action // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1990.
Vol. 5. P. 319—324.
Specht K. G., Rogers M. A. Plasma membrane depolarization and calcium
influx during cell injury by photodynamic action // Biochem. Biophys. Acta.
1991. Vol. 1070. P. 60—68.
Spikes J. D. Chlorins as photosensitizers in biology and medicine // J. Pho-
tochem. Photobiol. B. Biol. 1990. Vol. 6. P. 259—274.
Spikes J. D., Straight R. C. Biochemistry of photodynamic action //
Light-activated pesticides / Eds J. R. Heitz, K.. R. Downum. Washington, Amer.
Chem. Soc. 1987. P. 98—108.
Sporn L. A., Foster T. H. Photofrin and light induces microtubule depoly-
merization in cultured human endothelial cells // Cancer Res. 1992. Vol. 52.
P. 3443—3448.
Srivastava M., Ahmad N'., Gupta S., Mukhtar H. Involvement of Bcl-2
and Bax in photodynamic therapy-mediated apoptosis. Antisense Bcl-2 oligo-
nucleotide sensitizes R1F1 cells to photodynamic therapy apoptosis // J. Biol.
Chem. 2001. Vol. 76. P. 15 481 —15 488.
Starkus J. G., Rayner M. D., Fleig A., Ruben P. C. Fast and slow inacti-
vation of sodium channels: effects of photodynamic modification by methylene
blue // Biophys. J. 1993. Vol. 65. P. 715—726.
Stefano di A., Ettore A., Sbrana S. et al. Purpurin-18 in combination with
light leads to apoptosis or necrosis in HL60 leukemia cells // J. Photochem. Pho-
tobiol. B. Biol. 2001. Vol. 73. P. 290—296.
Stockert J. C., Juarranz A., Villanueva A., Canete M. Photodynamic
damage to HcLa cell microtubules induced by thiazine dyes // Cancer Chcmot-
her. Pharmacol. 1996. Vol. 39. P. 167—169.
Straight R. C., Spikes J. D. Photosensitized oxidation of biomolecules //
Singlet 02. Vol. IV. Polymers and biomolecules I Ed. A. A. Frimer. Boca Rato:
CRC Press, 1976. P. 92—143.
Stuart J., Pessah I., Favero T. G., Abramson J. J. Photooxidation of ske-
letal muscle sarcoplasmic reticulum induces rapid calcium release // Arch. Bi-
ochem. Biophys. 1992. Vol. 292. P. 512—520.
Stylli S. S., Kaye A. H. Photodynamic therapy of cerebral glioma — a
review. Part 1. A biological basis // J. Clin. Neurosci. 2006. Vol. 13. P. 615—
625.
Sun G. Y., Xu J., Jensen M. D., Simonyi A. Phospholipase A2 in the
central nervous system: implications for neurodegenerative diseases // J. Lipid.
Res. 2004. Vol. 45. P. 205—213.
Swamy N., Purohit A., Fernandez-Gacio A. et al. Nuclear estrogen re-
ceptor targeted photodynamic therapy: selective uptake and killing of MCF-7
breast cancer cells by a C17alpha-alkynylestradiol-porphyrin conjugate // J.
Cell Biochem. 2006. Vol. 99. P. 966—977.
Syed N., Richardson P., Bulloch A. Ciliary neurotrophic factor, unlike
nerve growth factor, supports neurite outgrowth but not synapse formation by
adult Lymnaea neurons // J. Neurobiol. 1996. Vol. 29. P. 293—303.
Syntichaki P., Tavernarakis N. The biochemistry of neuronal necrosis:
Rogue biology? // Nat. Rev. Neurosci. 2003. Vol. 4. P. 672—684.
Tajiri H., Hayakawa A., Matsumoto Y. et al. Changes in intracellular
Ca2+ concentrations related to PDT-induced apoptosis in photosensitized hu-
man cancer cells // Cancer Lett. 1998. Vol. 128. P. 205—210.
Takahashi H., Itoh Y., Miyauchi Y. et al. Activation of two caspase cas-
cades, caspase 8/3/6 and caspase 9/3/6, during photodynamic therapy using a
novel photosensitizer, ATX-SlO(Na), in normal human keratinocytes // Arch.
Dermatol. Res. 2003. Vol. 295. P. 242—248.
Takano II., Fukushi H. et al. Calmodulin and calmodulin-dependent ki-
nase II mediate neuronal cell death induced by depolarization // Brain Res.
2003. Vol. 962. P. 41—47.
Tao J., Sanghcra J. S., Pelech S. L. et al. Stimulation of strcss-activated
protein kinase and p38 HOG1 kinase in murine keratinocytes following photo-
dynamic therapy with benzoporphyrin derivative // J. Biol. Chem. 1996.
Vol. 271. P. 27107— 27115.
Tarr M., Valenzeno D. P. Modification of cardiac ionic currents by photo-
sensitizer-generated reactive oxygen // Mol. Cell Cardiol. 1991. Vol. 53.
P. 195—201.
Taylor C. W., Broad L. M. Pharmacological analysis of intracellular Ca2+
signalling: problems and pitfalls // Trends Pharmacol. Sci. 1998. Vol. 19.
P. 370—375.
Teiten M. H., Bezdetnaya L., Morliere P. et al. Endoplasmic reticulum
and Golgi apparatus are the preferential sites of Foscan localisation in cultured
tumour cells // Br. J. Cancer. 2003b. Vol. 88. P. 146—152.
Teiten M. H., Marchal S., D'Hallewin M. A. et al. Primary photodamage
sites and mitochondrial events after Foscan photosensitization of MCF-7 hu-
man breast cancer cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2003a. Vol. 78.
P. 9—14.
Terzis A. J., Dietze A., Bjerkvig R., Arnold H. Effects of photodynamic
therapy on glioma spheroids // Br. J. Neurosurg. 1997. Vol. 11. P. 196—205.
Thibaut S., Bourre L,. Hernot D. et a). Effects of BAPTA-AM, Forsko-
lin, DSF and Z. VAD. fmk on PDT-induced apoptosis and m-THPC phototoxi-
city on B16 cells // Apoptosis. 2002. Vol. 7. P. 99—106.
Thomas C., Pardini R. Oxygen dependence of hypericin-induced phototo-
xicity to EMT6 mouse mammary carcinoma cells // J. Photochem. Photobiol. B.
Biol. 1992. Vol. 55. P. 831—837.
Tong Z., Singh G., Rainbow A. J. The role of the p53 tumor suppressor in
the response of human cells to photofrin-mediated photodynamic therapy // J.
Photochem. Photobiol. B. Biol. 2000. Vol. 71. P. 201—210.
Tong Z., Singh G., Rainbow A. J. Sustained activation of the extracellu-
lar signal regulated kinase pathway protects cells from photofrin-mediated pho-
todynamic therapy // Cancer Res. 2002. Vol. 62. P. 5528— 5535.
Tong Z., Singh G., Valerie K., Rainbow A. J. Activation of the stress-ac-
tivated JNK and p38 МАРК kinases in human cells by Photofrin-mediated pho-
todynamic therapy//J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2003. Vol. 71. P. 77—85.
Trivedi N. S., Wang H. W., Nieminen A. L. et al. Quantitative analysis of
Pc 4 localization in mouse lymphoma (LY-R) cells via double-label confocal
fluorescence microscopy // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2000. Vol. 71.
P. 634—639.
Trump B. F., Berezesky I. K. The role of cytosolic calcium in cell injury,
necrosis and apoptosis // Curr. Opin. Cell. Biol. 1992. Vol. 4. P. 227—232.
Trump B. F., Berezesky I. K. The reactions of cells to lethal injury: onco-
sis and necrosis — the role of calcium // In When cells die. A comprehensive
evaluation of apoptosis and programmed cell death / Eds R. A. Lockshin, Z. Za-
keri, J. L. Tilly. Willey-Liss. New York, 1998. P. 57—96.
Tsaytler P. A., O'Flaherty M, Sakharov D. V. et al. Immediate Protein
Targets of Photodynamic Treatment in Carcinoma Cells // J. Proteome Res.
2008. Vol. 7. P. 3868—3878.
Tsujimoto Y. Apoptosis and necrosis: intracellular ATP level as a determi-
nant for cell death modes // Cell Death Differ. 1997. Vol. 4. P. 429—434.
Ueda J., Takeshita K., Matsumoto S. et al. Singlet oxygen-mediated
hydroxyl radical production in the presence of phenols: whether DMPO-*OH
formation really indicates production of *OH? // J. Photochem. Photobiol. B.
Biol. 2003. Vol. 77. P. 165—170.
Urazaev A. K., Grossfeld R. M., Fletcher P. L. et al. Synthesis and relea-
se of n-acetylaspartylglutamate (naag) by crayfish nerve fibers: implications for
axon-glia signaling // Neuroscience. 2001. Vol. 106. P. 237—247.
Usuda J., Chiu S. M., Azizuddin K. et al. Promotion of photodyna-
mic therapy-induced apoptosis by the mitochondrial protein Smac/DIABLO:
dependence on Bax Hi. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2002. Vol. 76. P. 217—
223.
Usuda J., Chiu S. M., Murphy E. S. et al. Domain dependent photodamage
to Bcl-2. A membrane anchorage region is needed to form the target of phthalo-
cyanine photosensitization. И J. Biol. Chem. 2003. Vol. 28. P. 2021—2029.
Utsumi T., Okuma M., Utsumi T. et al. Light-dependent inhibition of
protein kinase C and superoxide generation of neutrophils by hypericin, an anti-
retroviral agent // Arch. Biochem. Biophys. 1995. Vol. 316. P. 493—497.
Uzdensky A. B. Laser microirradiation of single nerve cell // Proc. SPIE.
1993. Vol. 1882. P. 254—26. 7.
Uzdensky A. B. Bioelectric changes in single neuron under photodynamic
effect: comparison of different photosensitizers // IEEE J. Select. Top. Quant.
Electron. 1996. Vol. 2. P. 984—987.
Uzdensky A. B. Photodynamic nerve cell killing: dynamics of electrophy-
siological responses and photosensitizers comparison // Proc. SPIE. 1997.
Vol. 3191. P. 130—139.
Uzdensky A. B. Signal Transduction and Photodynamic Therapy И Curr.
Signal Transd. Therapy. 2008. Vol. 3. P. 55—74.
Uzdensky A. B., Bragin D. E., Kolosov M. S., Zhavoronkova A. A. PDT
effect of different photosensitizers on a single nerve cell: Electrophysiological
and Pharmacological Study // IEEE J. Select. Top. Quant. Electron. 2001a.
Vol. 7. P. 989—995.
Uzdensky A., Bragin D., Kolosov M. et al. Photodynamic inactivation of
isolated crayfish mechanoreceptor neuron // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
2002a. Vol. 76. P. 431^137.
Uzdensky A. В., Bragin D. E., Kolosov M. S. et al. Photodynamic effect of
hypericin and a water-soluble derivative on isolated crayfish neuron and surro-
unding glial cells // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2003. Vol. 72. P. 27—33.
Uzdensky A. B., Derkacheva V. M., Dergacheva O. Yu., Zhavoronkova
A. A. A single neuron response to photodynamic effects of various aluminum
and zinc phthalocyanines // Life Sciences. 2000b. Vol. 68. P. 547—555.
Uzdensky A. B., Dergacheva O. Yu., Zhavoronkova A. A. et al. Photo-
dynamic effect of deuteroporphyrin IX and hematoporphyrin derivatives on sin-
gle neuron // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001b. Vol. 281.
P. 1194—1199.
Uzdensky A. B., Dergacheva O. Y., Zhavoronkova A. A. et al. Photody-
namic effect of novel chlorin e6 derivatives on a single nerve cell // Life Scien-
ces. 2004b. Vol. 74. P. 2185—2197.
Uzdensky A., Juzeniene A., Ma L.-W., Moan J. Photodynamic inhibition
of enzymatic detachment of human cancer cells from a substratum // Biochim.
Biophys. Acta. 2004. Vol. 1670. P. 1—11.
Uzdensky A. B., lani V., Ma L.-W., Moan J. Photobleaching of hypericin
bound to human scrum albumin, cultured adenocarcinoma cells and nude mice
skin // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2002b. Vol. 76. P. 320—328.
Uzdensky A., Kolosov M., Bragin D. et al. Involvement of adenylate cyc-
lase and tyrosine kinase signaling pathways in response of crayfish stretch re-
ceptor neuron and satellite glia cell to photodynamic treatment // Glia. 2005.
Vol. 49. P. 339—348.
Uzdensky A., Kolpakova E., Juzeniene A. et al. The effect of sub-lethal
ALA-PDT on the cytoskeleton and adhesion of cultured human cancer cells //
Biochim. Biophys. Acta. 2005b. Vol. 1722. P. 43—50.
Uzdensky A., Lobanov A., Bibov M. et al. Involvement of Ca'4 - and cyc-
lic adenosine monophosphate-mediated signaling pathways in photodynamic
injury of isolated crayfish neuron and satellite glial cells // J. Neurosci. Res.
2007. Vol. 85. P. 4860—4870.
Uzdensky A. B., Ma L.-W., lani V. et al. Intracellular localization of hy-
pericin in human glioblastoma and carcinoma cell lines // Laser Med. Sci.
2001c. Vol. 16. P. 276—283.
Uzdensky A. B., Mironov A. F. Photodynamic inactivation of the single
crayfish nerve cell: dynamics of electrophysiological responses and comparison
of photosensitizers // Lasers Med. Sci. 1999. Vol. 14. P. 185—195.
Uzdensky A. B., Savransky V. V. Single neuron response to pulse-perio-
dic laser microirradiation. Action spectra and two-photon effect // J. Photoc-
hem. Photobiol. B. Biol. 1997. Vol. 39. P. 224—228.
Uzdensky A. B., Zhavoronkova A. A., Dergacheva O. Y. Firing inhibiti-
on processes in the response dynamics of isolated crayfish nerve cell to the pho-
todynamic effect of sulphonated aluminum phthalocyanine: participation of
free radicals and Ca2* // Lasers Med. Sci. 2000a. Vol. 15. P. 123—130.
Valenzeno D. P., Tarr M. Membrane photomodification and its use to stu-
dy reactive oxygen effects // Photochemistry and Photophysics. Vol. VIII / Ed.
J.F. Rabck. Boca Raton: CRC Press. 1991. P. 137—191.
Vandenbogaerte A. L., Cuveele J. F., Proot P. et al. Differential cytoto-
xic effects induced after photosensitization by hypericin // J. Photochem. Photo-
biol. B. Biol. 1997. Vol. 38. P. 136—142.
Vanderbogaerte A. L., Delaey E., Vantieghem A. M. Cytotoxicity and
antiproliferative effect of hypericin and derivatives after photosensitization // J.
Photochem. Photobiol. B. Biol. 1998. Vol. 67. P. 119—125.
Vandenbogaerde A., Zanoli P., Puia G. et al. Evidence that total extract
of Hypericum perforatum affects exploratory behavior and exerts anxyolitic ef-
fects in rats // Pharmacol. Biochem. Behav. 2000. Vol. 65. P. 627—633.
Vantieghem A., Assefa Z., Vandenabeele P. et al. Hypericin-induced
photosensitization of HeLa cells leads to apoptosis or necrosis. Involvement of
cytochrome c and procaspase-3 activation in the mechanism of apoptosis //
FEBS Lett. 1998. Vol. 440. P. 19—24.
Vantieghem, Xu Y., Assefa Z., Piette J. et al. Phosphorylation of Bcl-2 in
G2/M phasc-arrcsted cells following photodynamic therapy with hypericin in-
volves a CDK 1-mediated signal and delays the onset of apoptosis // J. Biol.
Chem. 2002. Vol. 277. P. 37718—37731.
Vantieghem A., Xu Y., Declercq W. et a). Different pathways mediate
cytochrome c release after photodynamic therapy with hypericin // J. Photoc-
hcm. Photobiol. B. Biol. 2001. Vol. 74. P. 133—142.
Varnes M. E., Chiu S. M., Xue L. Y., Oleinick N. L. Photodynamic the-
rapy-induced apoptosis in lymphoma cells: translocation of cytochrome C cau-
ses inhibition of respiration as well as caspase activation // Biochem. Biophys.
Res. Commons. 1999. Vol. 255. P. 673—679.
Varshney R., Jain V. Effects of calcium on phthalocyanine sensitized
photohemolysis // Indian. J. Exp. Biol. 1998. Vol. 36. P. 152—156.
Vergara C., Latorre R., Marrion N. V., Adelman J. P. Calcium-acti-
vated potassium channels//Curr. Opin. Neurobiol. 1998. Vol. 8. P. 321—329.
Verkhratskv A. The endoplasmic reticulum and neuronal calcium signa-
ling // Cell Calcium. 2002. Vol. 32. P. 393—404.
Verma A., Nye J., Synder S. H. Porphyrins are endogenous ligands for
mitochondrial (peripheral type) benzodiazepine receptor // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 1987. Vol. 84. P. 2256—2261.
Venvanger T., Sanovic R., Aberger F. et al. Gene expression pattern fol-
lowing photodynamic threatment of carcinoma cell line A43 1 analysizcd by
cDNA arrays // Int. J. Oncol. 2002. Vol. 21. P. 1353—1359.
Verwanger T., Schhitzhofcr G., Krammer B. Expression kinetics of the
(proto)oncogcncs c-myc and bcl-2 following photodynamic treatment of nor-
mal and transformed human fibroblasts with 5-aminolaevulinic acid-stimulated
endogenous protoporphyrin IX // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1998.
Vol. 45. P. 131 — 135.
Volanti C., Gloire G., Vanderplasschen A. et al. Downregulation of
1CAM-1 and VCAM-1 expression in endothelial cells treated by photodynamic
therapy // Oncogene. 2004. Vol. 23. P. 8649—8658.
Volanti J. Y., Hendrickx N., Van Lint J. et al. Distinct transduction mec-
hanisms of cyclooxygenase 2 gene activation in tumour cells after photodyna-
mic therapy // Oncogene. 2005. Vol. 24. P. 2981—2991.
Volanti C., Matroule J. Y., Piette J. Involvement of oxidative stress in
NFkB activation in endothelial cells treated by photodynamic therapy // J. Pho-
tochem. Photobiol. B. Biol. 2002. Vol. 75. P. 36—45.
Vyssokikh M. Y., Brdiczka D. The function of complexes between the
outer mitochondrial membrane pore (VDAC) and the adenine nuvleotide trans-
locase in regulation of energy metabolism and apoptosis // Acta Biochim. Po-
lon. 2003. Vol. 50. P. 389—404.
Waetzig V., Herdegen T. Context-specific inhibition of JNKs: overco-
ming the dilemma of protection and damage // Trends Pharmacol. Sci. 2005.
Vol. 26. P. 455—461.
Wagener F., Volk H. D., Willis D. et al. Different faces of the heme-heme
oxigenase system in inflammation // Pharmacol. Rev. 2003. Vol. 55.
P. 551—571.
Wang H. P., Hanlon J. G., Rainbow A. J. et al. Up-regulation of Hsp27
plays a role in resistance of human colon carcinoma HT29 cells to photooxidati-
ve stress // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2002. Vol. 76. P. 98—104.
Wang W., Hou X. Y., Gao C. et al. Regulation of c-Jun N-terminal kinase
activation in hydrogen peroxide induced neurotoxicity // J. Neurocytol. 2003.
Vol. 32. P. 143—151.
Wang-Bennett L. T., Liebl D. J., Bennett G. N. Targeted neuronal lesi-
on induced by photosensitizing dyes // Brain Res. 1990. Vol. 534. P. 122—
128.
Weber N. D., Murray В. K., North J. A., Wood S. G. The antiviral agent
hypericin has in vitro activity against HSV—1 through non-specific association
with viral and cellular membranes // Antiviral Chem. Chemothcr. 1994. Vol. 5.
P. 83—90.
Weizman E., Rothmann C., Greenbaum L. et al. Mitochondrial localiza-
tion and photodamage during photodynamic therapy with tetraphenylporphi-
nes // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 2000. Vol. 59. P. 92—102.
Weller M., Trepel M., Grimmel C. et a). Hypericin-induced apoptosis of
human malignant glioma cells is light-dependent, independent of bcl-2 expres-
sion, and does not require wild-type p53 // Neurol. Res. 1997. Vol. 19.
P. 459—470.
Wiersma C. A. G., Furshpan E., Florey E. Physiological and pharmaco-
logical observations on muscle organ of the crayfish, Cambarus clarkii Girard //
J. Exp. Biol. 1953. Vol. 30. P. 136—151.
Wild P. J., Krieg R. C., Seidl J. et al. RNA expression profiling of normal
and tumor cells following photodynamic therapy with 5-aminolcvulinic acid-in-
duced protoporphyrin IX in vitro // Mol. Cancer Ther. 2005. Vol. 4. P. 516—
528.
Wildering W. C., Lodder J. C., Kits K. S., Bulloch A. G. Nerve growth
factor (NGF) acutely enhances high-voltage-activated calcium currents in mol-
luscan neurons // J. Neurophysiol. 1995. Vol. 74. P. 2778—2781.
Wilson В. C., Olivo M., Singh G. Subcellular localization of Photofrin
and aminolevulinic acid and photodynamic cross-resistance in vitro in radiati-
on-induced fibrosarcoma cells sensitive or resistant to Photofrin-mediated pho-
todynamicv therapy // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1997. Vol. 6.
P. 166—176.
Wispriyono, Schmelz E., Pelayo H. et al. A role for the de novo sphingo-
lipids in apoptosis of photosensitized cells // Exp. Cell Res. 2002. Vol. 279.
P. 153—165.
Witte de P., Agostinis P., Lint van J. et al. Inhibition of epidermal growth
factor receptor tyrosine kinase activity by hypericin // Biochem. Pharmacol.
1993. Vol. 46. P. 1929—1936.
Wong S., Luna M., Ferrario A., Gomer C. J. CHOP activation by photo-
dynamic therapy increases treatment induced photosensitization // Lasers Surg.
Med. 2004. Vol. 35. P. 36—41.
Wong T. W., Tracy E., Oseroff A. R., Baumann H. Photodynamic thera-
py mediates immediate loss of cellular responsiveness to cytokines and growth
factors // Cancer Res. 2003. Vol. 63. P. 3812—3818.
Wood S. R., Holroyd J. A., Brown S. B. The subcellular localization of
Zn(II) phthalocyanines and their redistribution on exposure to light // J. Photoc-
hem. Photobiol. B. Biol. 1997. Vol. 65. P. 397-^102.
Woodburn K. W., Vardaxis N. J., Hill J. S. et al. Subcellular localization
of porphyrins using confocal laser scanning microscopy // J. Photochem. Photo-
biol. B. Biol. 1992a. Vol. 54. P. 725—732.
Woodburn K. W., Fan Q., Miles D. R. et al. Localization and efficacy
analysis of the phototherapeutic lutetium texaphyrin (PCI-0123) in the murine
EMT6 sarcoma model // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1997. Vol. 65.
P. 410—415.
Wu S. M., Ren Q. G., Zhou M. O. et al. Protoporphyrin IX production
and its photodynamic effects on glioma cells, neuroblastoma cells and normal
cerebellar granule cells in vitro with 5-aminolevulinic acid and its hexylester //
Cancer Lett. 2003. Vol. 200. P. 123—131.
Xue L.-Y., Agarwal M. L., Varnes M. E. Elevation of GRP-78 and loss
of Hsp70 following photodynamic treatment of V79 cclls:scnsitization by nige-
ricin // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1995. Vol. 62. P. 135—143.
Xue L.-Y., He J., Oleinick N. L. Rapid tyrosine phosphorylation of HS1
in the response of mouse lymphoma L5178Y-R cells to photodynamic treat-
ment sensitized by the phthalocyanine Pc4 // J. Photochem. Photobiol. B. Biol.
1997. Vol. 66. P. 105—113.
Xue L.-Y., Qiu Y., He J. et al. Etk/Bmx, a PH-domain containing tyrosine
kinase, protects prostate cancer cells from apoptosis induced by photodynamic
therapy or thapsigargin // Oncogene. 1999a. Vol. 18. P. 3391—3398.
Xue L., He J., Oleinick N. L. Promotion of photodynamic therapy induced
apoptosis by stress kinases // Cell Death Differ. 1999b. Vol. 6. P. 855—864.
Xue L.-Y., Chiu S. M., Oleinick N. L. Photochemical destruction of the
Bcl-2 oncoprotein during photodynamic therapy with the phthalocyanine pho-
tosensitizer Pc 4 // Oncogene. 2001. Vol. 20. P. 3420—3427.
Xue L.-Y., Chiu S. M., Fiebig A. et al. Photodamage to multiple Bcl-xL
isoforms by photodynamic therapy with the phthalocyanine photosensitizer Pc
4 // Oncogene. 2003. Vol. 22. P. 9197— 9204.
Xue L.-Y., Chiu S. M., Oleinick N. L. Differential responses of Mcl-1 in
photosensitized epithelial vs lymphoid-derived human cancer cells // Oncogene.
2005. Vol. 24. P. 6987—6992.
Yanase S., Nomura J., Matsumura Y. et al. Enhancement of the effect of
5-aminolevulinic acid-based photodynamic therapy by simultaneous hyperther-
mia // Int. J. Oncol. 2005. Vol. 27. P. 193—201.
Yokota T., Ikeda IL, Inokuchi T. et al. Enhanced cell death in NR-S1 tu-
mor by photodynamic therapy: possible involvement of Fas and Fas ligand sys-
tem // Lasers Surg. Med. 2000. Vol. 26. P. 449—460.
YoshidaY., Dereski M. O., Garcia J. H. et al. Neuronal injury after pho-
toactivation of Photofrin II // Am. J. Pathol. 1992. Vol. 141. P. 989—997.
Young M. R., Yang H. S., Colburn N. H. Promising molecular targets for
cancer prevention: AP—1, NF-?B, and Pdcd4//Trends Mol. Med. 2003. Vol. 9.
P. 36^11.
Younuschot G. Early increase in intracellular calcium during photodyna-
mic pcrmeabilization // Free Rad. Biol. Med. 1991. Vol. 11. P. 307—317.
Yow С. M., Mak N. K., Szeto S. et al. Photocytotoxic and DNA damaging
effect of temoporfin (mTHPC) and merocyanine 540 (MC540) on nasopharyn-
geal carcinoma cell // Toxicol. Lett. 2000. Vol. 115. P. 3—61.
Yu J., Zhang L. The transcriptional targets of p53 in apoptosis control //
Biochem. Biophys. Res. Common. 2005. Vol. 331. P. 851—858.
Zaccolo IM., Pozzan T. cAMP and Ca2* interplay: a matter of oscillation
patterns // Trends Neurosci. 2003. Vol. 26. P. 53—55.
Zane C., Panfilis de G., Calzavara-Pinton P. Photosensitizers — syste-
mic sensitization // Photodynamic therapy and fluorescence diagnosis in derma-
tology / Eds P. Calzavara-Pinton, P. M. Szeimies, B. OrteL Amsterdam: Elsevi-
er, 2001. P. 103—114.
Zareba M., Niziolek M., Korytowski W., Girotti A. W. Merocyanine
540-scnsitized photokilling of leukemia cells: role of post-irradiation chain pe-
roxidation of plasma membrane lipids as revealed by nitric oxide protection //
Biochim. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1722. P. 51—59.
Zdolsek J. M., Olsson G. M., Brunk U. T. Photooxidsativc damage to ly-
sosomes of cultured macrophages by acridine orange // J. Photochem. Photobi-
ol. B. Biol. 1990. Vol. 51. P. 67—76.
Zeina B., Greenman J., Purcell W. M., Das B. Killing of cutaneous mic-
robial species by photodynamic therapy // Br. J. Dermatol. 2001. Vol. 144.
P. 274—278.
Zenkevich E., Sagun E., Knyukshto V. et al. Photophysical and photoc-
hemical properties of potential porphyrin and chlorine photosensitizers for
PDT // J. Photocem. Photobiol. B. Biol. 1996. Vol. 33. P. 171 — 180.
Zenzen V., ZankI H. In vitro evaluation of the cytotoxic and mutagenic
potential of the 5-aminolevulinic acid hcxylcster-mediated photodynamic the-
rapy // Mutat. Res. 2004. Vol. 561. P. 91 —100.
Zhang W. G., Ma L. P., Wang S. W. et al. Antisense Bcl-2 retrovirus
vector increases the sensitivity of a human gastric adenocarcinoma cell line to
photodynamic therapy // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1999. Vol. 69.
P. 582—586.
Zhang T., Miyamoto S., Brown J. II. Cardiomyocyte calcium and calci-
um/calmodulin-dependcnt protein kinase II: friends or foes? // Recent Prog.
Horm. Res. 2004. Vol. 59. P. 141 —168.
Zheng J. H., Shi D., Zhao Y., Chen Z. L. Role of calcium signal in apop-
tosis and protective mechanism of colon cancer cell line SW480 in response to
5-aminolevulinic acid-photodynamic therapy // Ai Zheng. 2006. Vol. 25.
P. 683—688.
Zhivotovsky B., Orrenius S. Caspase-2 function in response to DNA da-
mage // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. Vol. 331. P. 859—867.
Zhuang S., Demirs J. T., Kochevar 1. E. p38 Mitogen-activated protein
kinase mediates Bid cleavage, mitochondrial dysfunction, and caspase-3 activa-
tion during apoptosis induced by singlet oxygen but not by hydrogen peroxide //
J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 25939—25948.
Zhuang S., Kochevar 1. E. Singlet oxygen-induced activation of Akt/pro-
tein kinase В is independent of growth factor receptors // J. Photochem. Photo-
biol. B. Biol. 2003. Vol. 78. P. 361—371.
Zhuang S., Lynch M. C., Kochevar 1. E. Activation of protein kinase C is
required for protection of cells against apoptosis induced by singlet oxygen //
FEBS Lett. 1998. Vol. 437. P. 158—162.
Zhuang S., Lynch M. C., Kochevar 1. E. Caspase-8 mediates caspasc-3
activation and cytochrome c release during singlet oxygen-induced apoptosis of
HL-60 cells // Exp. Cell Res. 1999. Vol. 250. P. 203—212.
Zhuang S, Ouedraogo G. D., Kochevar 1. E. Downregulation of epider-
mal growth factor receptor signaling by singlet oxygen through activation of
caspase-3 and protein phosphatases // Oncogene. 2003. Vol. 22. P. 4413—4424.
Zong W.-X., Thompson С. B. Necrotic death as a cell fate // Genes Dev.
2006. Vol. 20. P. 1—15.
Zorov D. B., Bannikova S. Y., Belousov V. V. et al. Reactive oxygen
and nitrogen species: friends or foes? // Biochemistry (Mose). 2005. Vol. 70.
P. 215—221.