ФИЗИЧЕСКИЕ

МГГС"1И< ‘ГТВАНИЯ

БЕЛКОВ

И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
АКАДЕМИЯ НАУК СССР
основы
МОЛЕКУЛЯРНОЙ
БИОЛОГИИ

ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
академик В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТ

ЗАМ. ГЛАВНОГО РЕДАКТОРА
Г. А. ДЕБОРИН
научный совет по проблемам

МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

ФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ
И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

ПОД РЕДАКЦИЕЙ
профессора Ю. С. ЛАЗУРКИНА

ИЗДАТЕЛЬСТВО «НАУКА»

МОСКВА-1967
УДК 547.96.004.13

2-10-2

450-67

СОСТАВИТЕЛЬ

М. Д. ФРАНК-КАМЕНЕИКИЯ
ПРЕДИСЛОВИЕ

Стремительное развитие молекулярной биологии и те порази-
тельные успехи, которых она достигла за последние 10—15 лет,
во многом обусловлены применением современных физических
методов исследования. Эти методы непрерывно совершенствуют-
ся и обладают в настоящее время очень большими возможностя-
ми: позволяют видеть биологические макромолекулы, определять
положение в пространстве каждого атома в молекулах глобуляр-
ных белков, замечать тонкие изменения формы молекул биопо-
лимеров в растворе, разделять в центробежном поле молекулы,
лишь ничтожно отличающиеся одна от другой, и т. д.

Все большее число биологов сталкивается с применением фи-
зических методов исследования.

Часто ученые, не нуждаясь в овладении всеми деталями
метода, должны ясно представлять себе его принципиальные
основы и то, какие сведения о молекулах могут быть получены
при помощи этого метода.

Сборник «Физические методы исследования белков и нуклеи-
новых кислот» рассчитан в первую очередь не на физиков, а глав-
ным образом на биологов и химиков, интересующихся свойства-
ми биологических полимеров и желающих получить представле-
ние о. принципиальных основах и возможностях физических
методой их исследования.

'При изложении количественных физических методов исследо-
вания невозможно обойтись без основ теории как самого явле-
ния, так и метода. Тем не менее авторы сборника постарались
изложить материал по возможности популярно, прибегая к ма-
тематике лишь в тех случаях, когда это необходимо. Часть более
сложного материала в отдельных главах напечатана петитом и
может быть опущена при первом чтении. Например, в разделе
спектральных методов использовано в основном классическое
описание процессов, а квантовомеханическое, в известной мере
дублирующее, но одновременно и углубляющее рассмотрение
вопроса, выделено в разделы, набранные мелким шрифтом. Сте-
пень использования строгих математических подходов для раз-
ных глав различна. Так, глава об электронной микроскопии,
материал которой носит более наглядный характер, изложена
популярнее, чем остальные главы, в которых показано, как из
первичных результатов измерений делаются выводы о величине
и форме молекул, их взаимодействиях и превращениях. Здесь
между данными, получаемыми непосредственно из опыта (таки-
ми, как дифракционная картина, величина скорости седимента-
ции, время затухания люминесценции, вид кривой аномальной
дисперсии оптической активности и т. и.), и конечными вывода-
ми обычно существует разрыв, для преодоления которого тре-
буется приложить теорию. Конечные выводы и их надежность
зависят, таким образом, не только от качества самих опытов, но
и от степени развития и справедливости теоретических представ-
лений.

Метод исследования включает, следовательно, как экспери-
ментальную методику, так и теоретическую и расчетную часть.
В ходе развития метода обычно проверяется и совершенствуется
и теория, которая, в свою очередь, помогает усовершенствованию
и развитию в нужном направлении экспериментальной методики,
ставит задачи перед создателями новых приборов.

В сборник включены те физические методы, которые наибо-
лее полезны и нашли достаточно широкое применение, а также
некоторые менее распространенные, но достаточно разработан-
ные методы, обещающие в дальнейшем стать источником важ-
ных сведений о структуре и свойствах биополимеров. От описа-
ния некоторых методов мы вынуждены были отказаться в связи
с ограниченным объемом сборника.

Чтение книги предполагает наличие у читателя наряду с об-
щей подготовкой, даваемой биологическими и химическими ин-
ститутами и факультетами, некоторого минимума сведений о
полимерах вообще и биологических в частности1.

Не всегда возможно и нужно резко отделять методы иссле-
дования полимерных молекул от методов исследования малых

1 Сведения по этим вопросам можно найти в следующих книгах:
С. Е. Бреслер, Б. Л. Ерусалимскин. Физика и химия макромолекул.
М., 1965; М. В. Во л ькен штейн. Молекулы и жизнь. М., 1965; С. Е. Б р е с-
лер. Введение в молекулярную биологию. М., 1966; В. Н. Цветков,
В. Е. Эс к нн, С. Я. Френкель. Структура макромолекул в растворах. М.,
1964; см, также ряд книг настоящей серии.
молекул, с одной стороны, и более сложных надмолекулярных
структур, с другой. Поэтому в некоторых главах, например в
разделах электронной микроскопии или ядерного магнитного
резонанса, затронуты и эти пограничные вопросы.

Здесь следует сделать еще несколько замечаний, относящих-
ся к сборнику в целом и к некоторым особенностям физических
исследований биологических полимеров. Как известно, представ-
ления, развитые за последние ЗОлет для молекул синтетических
полимеров, полимерных электролитов и таких полимеров при-
родного происхождения, как каучук и целлюлоза, применимы и
к биологическим полимерам — нуклеиновым кислотам, белкам и
их синтетическим моделям — полинуклеотидам и полипептидам.
Но большая внутренняя упорядоченность этих молекул и су-
ществование внутримолекулярных взаимодействий различной
природы приводят к появлению новых своеобразных свойств,
наблюдаемых у синтетических полимеров лишь в зачаточном
виде. Отдельная молекула биополимера в растворе ведет себя
в некоторых отношениях как одномерный кристалл. В биополи-
мерах наблюдается внутримолекулярное плавление — коопера-
тивное явление, близкое к явлению плавления кристаллов. Все
это дает новые, дополнительные возможности исследования
структуры биополимеров, их взаимодействий и природы явлений,
происходящих в них при тех или иных воздействиях. С другой
стороны, в ряде случаев недостаточная чистота препаратов, а
также большая сложность и лабильность объектов исследования
могут явиться источником артефактов и требуют от эксперимен-
татора особо тщательного и критического подхода, в особенно-
сти если результаты опытов in vitro переносятся на поведение
тех же молекул in vivo.

Необходимы, как правило, многочисленные контроли повто-
ряемости, в частности, в ходе очистки препаратов, тщательный
анализ ошибок опыта, контроль стандартности исходных веществ
и т. п. В пределах каждого метода обычно применяются те или
иные способы исключения артефактов, например устранение рас-
сеянного света при изучении аномальной дисперсии оптической
активности в полосе поглощения или сравнение различных мето*
дов фиксации препарата при электронной микроскопии тонких
срезов.
Но характерная особенность исследований биополимеров за-
ключается в том, что один и тот же объект или явление, как пра-
вило, исследуется параллельно различными методами, дополня-
ющими и контролирующими друг друга. Именно так велось,
например, исследование явления денатурации белков и нуклеи-
новых кислот, приведшее к открытию и изучению перехода спи-
раль — клубок.

Благодаря использованию широкого набора методов и под-
ходов, таких, как спектрофотометрия, метод оптической актив-
ности, светорассеяние, электронная микроскопия, измерение вяз-
кости, седиментации, плотности молекул, и других физических и
физико-химических методов, в исследовании этого важного яв-
ления достигнут значительный прогресс.

Рассматриваемые в книге методы обладают различными воз-
можностями и дают разную по характеру информацию (об этом
более детально сказано в каждой главе). Среди них есть такие,
как рентгеноструктурный анализ или электронная микроскопия,
которые в известном смысле являются абсолютными методами,
так как могут прямо давать сведения о строении изучаемого
объекта. Другие, как, например, спектрополяриметрия, вискози-
метрия, спектрофотометрия, люминесцентный метод, дают
косвенную, усредненную информацию о молекулах, для расшиф-
ровки которой необходимо опираться на данные о структуре,
полученные другими методами. Но по сравнению с первой груп-
пой методов, использующих специально приготовленные объекты
(монокристаллы, фиксированные препараты), вторая группа
дает возможность изучать молекулы в растворе, часто даже при
столь низких концентрациях, что можно пренебречь межмолеку-
лярным взаимодействием, а также дает ценные сведения о мо-
лекулярных превращениях, позволяет исследовать термодинами-
ческие и кинетические закономерности явлений, в которых
участвуют биологические макромолекулы, а также получать до-
полнительную информацию об их структуре.

Как уже отмечено выше, в настоящий сборник невозможно
было включить все физические методы, применяемые для иссле-
дования биополимеров. С методом светорассеяния можно позна-
комиться по монографии В. Н. Цветкова и др. Применению мик-
рокалориметрии при исследовании биополимеров посвящено
несколько статей, в том числе работы П. Л. Привалова с сотруд-
8
никами и Стартеванта С применением масс-спектрометрии к
анализу первичной структуры белков можно ознакомиться по
работам, опубликованным за последние годы1 2.

За время, прошедшее с момента сдачи рукописи книги в пе-
чать, произошло дальнейшее развитие ряда физических методов
исследования биополимеров. Так, например, переход к ультра-
фиолетовой области вблизи от полосы поглощения пептидной
связи с использованием автоматического сканирующего устрой-
ства позволил резко повысить чувствительность абсорбционного
метода при седиментационном исследовании белков и перейти,
благодаря этому, к измерениям при очень малых концентрациях
белка (порядка микрограммов на миллилитр) в кювете ультра-
центрифуги3. Это существенно расширяет возможности метода
ультрацентрифугирования. Шахману удалось наблюдать при
низких концентрациях распад некоторых белков, обладающих
четвертичной структурой, на субъединицы.

Возможности метода ультрацентрифугирования расширяют-
ся и в другом направлении. Он начал применяться для количе-
ственного исследования взаимодействия больших и малых мо-
лекул—для изучения связывания белков и нуклеиновых кислот
с малыми молекулами и между собою (см., например,4).

Совсем недавно получил новое многообещающее применение
в молекулярно-биологических исследованиях метод электронно-
го парамагнитного резонанса. Это произошло благодаря тому,
что были синтезированы соединения, содержащие стабильные
свободные радикалы5, способные специфическим образом реа-

1 П. Л. Привалов, Д. Р. Монаселидзе, Г. М. М р ев л и ш в и л и,
В. А. М а г а л д а д з е. Ж. эксп. и теор. физ., 1964, 47, 2073; J. М. Sturte-
vant, Р. Geiduschek. J. Amer. Chern. Soc., 1958, 80, 2914; M. A. Rawit-
scher, P. D. Ross, J. M. Sturtevant. J. Amer. Chern. Soc., 1963, 85, 1915;
П. Л. Привалов, Г. M. Мревлишвили. Биофизика, 1967, 12, 22.

2 Е. В г 1 с a s, J. van Н е i j е п о о г t, М. Barber, W. A. Wolstenhol-
me, В. С. D a s, Е. L е d е г е г. Biochem. 1965, 4, 2254; F. W е у g а п d, А. Р г о х,
Н. Н. Fes sei, К. К. Sun. ZS. f. Naturforsch., 1965, 206, 1169; К- Bieman,
С. Cone, В. R. Webster, J. Amer. Chern. Soc., 1966, 88, 2597; M.M. Шемя-
кин, Ю. А. Овчинников, H. С. Вульфсон и др. Nature, 1966, 211, 361.

3 H. К. S ch a ch man, S. J. Edelstein. Biochem., 1966, 5, 2681.

4 I. Z. Steinberg, H. K. Schachman. Biochem., 1966, 5, N 12, 3728;
Ю. H. Косаганов, Ю. С. Лазуркин. Мол. биол., 1967, 1, № 1, 75.

5 Э. Г. Розанцев, Р. А. П ап к о. Изв. АН СССР, ОХН. 1963, № 5, 764;
Е. G. Rosantzev, М. В. Neiman. Tetrahedron, 1964, 20, 131; Е. G. R о-
s antzev, L. A. Krinitzkaya. Tetrahedron, 1965, 21, 491.
гировать с биологическими макромолекулами или связываться
с ними при помощи межмолекулярных сил. Изучая изменения в
спектре ЭПР свободного радикала, входящего в состав модели
субстрата, при ее связывании с ферментом, удалось наблюдать
кинетику ферментативной реакции, а также судить о подвижно-
сти субстрата на поверхности молекул фермента. Используя
стабильные свободные радикалы в составе моделей антигенов,
удалось получать сведения о стехиометрии связывания и о со-
стоянии антигена, связанного с антителом. Имеются и попытки
исследования этим методом, получившим название метода спи-
новой метки, конформационных переходов в биополимерах.

Эти работы (см. например ') находятся пока в начальной
стадии. Есть все основания надеяться, что метод спиновой метки
найдет и другие интересные применения в исследовании белков
и нуклеиновых кислот.

В настоящем сборнике главное внимание уделено изложению
основ методов и их возможностей. Более подробное описание
методов имеется в книгах и обзорных статьях, ссылки на кото-
рые даны в соответствующих главах.

Ю. С. Лазуркин

1 О. Н. G г i f f i t h, H. M. Me Connel. Proc. N. A. S„ 1966, 55, 8; S. Oni-
s h i, J. С. А. В о e у e n s, H. M. Me Connel. Proc. N. A. S., 1966, 56, N 3, 809;
L. J. Berliner, H. M. Connel. Proc. N. A. S., 1966, 55, N 4, 708; L. S fry-
er, О. H. G r i f f i t h. Proc. N. A. S„ 1965, 54, N 6, 1785.
Глава I

РЕНТГЕНОСТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ

/7. С. Андреева

1.	Рентгеновская структурная кристаллография белков и ви-
Русов ...................................................  12

а.	Принципы метода рентгеноструктурного анализа .

б.	Основные особенности строения кристаллов .	.

в.	Кристаллы белков и вирусов........................16

г.	Дифракция рентгеновских лучей на кристаллической
решетке. Закон Брегга — Вульфа......................21

д.	Обратная решетка кристалла и геометрические
условия дифракции...................................24

е.	Рентгенограммы белков.............................27

ж.	Дифрактометры....................................30

з.	Структурный фактор...............................3,1

и.	Определение симметрии кристалла по рентгенограм-
мам; собственная симметрия молекул белков и ви-
русных частиц.......................................33

к.	Методы определения фаз структурных амплитуд
белковых кристаллов.................................34

л.	Распределение электронной плотности в кристал-
лах. Ряды Фурье в кристаллографии ....	38

м. Распределение электронной плотности в кристал-
лах белков .......................................43

2.	Исследование строения фибриллярных структур .	.	>45

а.	Особенности структуры волокон биополимеров	.	45

б.	Дифракция рентгеновских лучей на волокнах .	.	49

в.	Экспериментальные методы получения рентгено-
грамм волокон.....................................  53

г.	Информация о структуре, получаемая на основе
анализа рентгенограмм волокон.......................54

д.	Модели конфигурации цепных молекул биополиме-
ров ................................................57

3.	Дифракция рентгеновских лучей под малыми углами на во-
локнах и растворах биополимеров ............................. 61

а.	Дискретное малоутловое рассеяние на тканях и во-
локнах биополимеров.................................61

б.	Диффузное малоугловое рассеяние рентгеновских

лучей
Литература

63

66

Плодотворное развитие ’исследований в области молекуляр-
ной биологии за последние 15 лет в большой мере обязано успе-
хам в изучении структуры биологических полимеров — белков и
нуклеиновых кислот, а также синтетических полипептидов и

И
полинуклеотидов. Значительную роль в развитии структурных
исследований биополимеров сыграл рентгеноструктурный ана-
лиз— метод, позволяющий определять пространственное распо-
ложение атомов в молекулах исследуемых соединений. В приме-
нении к изучению строения монокристаллов этот метод в извест-
ном смысле эквивалентен микроскопии очень высокой разреша-
ющей способности: на картах распределения электронной
плотности, которые строятся на основе рентгеновских экспери-
ментальных данных, видны атомы в виде отдельных ее сгустков.

В этой главе мы пытаемся дать лишь представление о некото-
рых особенностях метода рентгеноструктурного анализа и о том,
как он используется при исследовании структуры сложных моле-
кул. Обстоятельное освещение этих вопросов невозможно в рам-
ках настоящего сборника, поэтому глава в целом не может пре-
тендовать ни на полноту, ни на строгость изложения. Для более
Ьбстоятельного ознакомления с методами рентгено-структурного
анализа рекомендуется специальная литература [1—12]. Мы так-
же we ставили своей целью дать подробное описание структуры
белков и нуклеиновых кислот, установленной на основании рент-
генографических исследований. Этому вопросу посвящен ряд об-
зоров [13—22] и монография Перутца ([23]; см. также [104]).

Методы, применяемые при рентгенографических исследовани-
ях монокристаллов и волокон, различны. Совершенно особый
характер носят исследования некоторых структурных парамет-
ров макромолекул и их агрегатов методами малоуглового рас-
сеяния рентгеновских лучей. Поэтому глава разделена на три
части. Первая из них посвящена рентгеновской структурной кри-
сталлографии глобулярных белков и кристаллизующихся виру-
сов, вторая — методам исследований строения волокнистых со-
единений — фибриллярных белков, нуклеиновых кислот, синте-
тических полипептидов и полинуклеотидов; третья — краткой ха-
рактеристике некоторых возможностей применения дифракции
ренгеновских лучей под малыми углами для исследования строе-
ния биополимеров.

1. Рентгеновская структурная
кристаллография белков и вирусов

а.	Принципы метода рентгеноструктурного анализа

Чтобы легче понять принципы этого метода, рассмотрим при-
мер, хорошо известный в оптике [24]. Допустим, что у нас имеет-
ся -бйтическая система, состоящая из точечного источника света
И конденсора, преобразующего расходящийся световой пучок в
параллельный. На пути этого пучка поставим непрозрачный
экран (L) с малым отверстием произвольной формы (рис. 1).
Свет будет дифрагировать на этом отверстии. Поставив выпук-
лую линзу, проследим, как формируется оптическое изображение
светящегося объекта (в данном случае отверстия). В фокальной
плоскости линзы (Li) соберутся параллельные лучи и будет
наблюдаться так называемое дифракционное, или первичное,
изображение объекта (в данном случае дифракция Фраунгофе-
ра). Истинное или вторичное изображение объекта ’будет наблю-‘
даться не в фокальной, а в другой плоскости (Аг), находящейся
на определенном расстоянии от фокуса линзы и сопряженной с
плоскостью объекта.

Рис. 1. Схема, иллюстрирующая получение изображения объекта
при помощи выпуклой линзы

Дифракционная картина объекта в фокальной плоскости лин-
зы может быть рассчитана теоретически при помощи формул,
известных в математике как трансформация Фурье.

Производя трансформацию Фурье, мы по существу рассчи-
тываем интерференцию всех дифрагированных световых волн,
пришедших в определенную точку фокальной плоскости. К фор-
мулам Фурье-трансформации мы вернемся, когда будем рас-
сматривать наш метод детальнее.

Существует очень важная теорема, согласно которой транс-
формация Фурье, проведенная дважды, т. е. в данном случае
трансформация Фурье от дифракционной картины в фокальной
плоскости, дает изображение объекта. Таким образом, в процес-
се формирования изображения для рассмотренной оптической
системы световые лучи интерферируют по законам, соответст-
вующим проведению двух трансформаций Фурье: первой — при
переходе лучей от объекта к фокальной плоскости и второй —
при переходе от фокальной плоскости к изображению предмета.
В более общем случае можно рассматривать не плоский,
а трехмерный объект и применять к нему изложенные рассужде-
ния. Подобный подход к анализу оптических явлений составляет
основу дифракционной теории микроскопа Аббе.

К сожалению, микроскоп для рентгеновских лучей сделать
нельзя, так как их коэффициент преломления очень близок к
единице (см. стр. 39). Можно наблюдать лишь дифракцию на
объектах, сравнимых по величине с длиной волны рентгеновско-
го излучения, т. е. на молекулах и атомах. Однако явление ди-
фракции рентгеновских лучей имеет много общего с только что
рассмотренным примером из оптики. Оказывается, образование
рентгеновской дифракционной картины подчиняется тем же за-
конам, что и формирование изображения объекта в фокаль-
ной; плоскости линзы. Таким образом, мы как бы имеем пер-
вую часть рассмотренного процесса. Но чтобы увидеть атомы,
т. е. «получить изображение объекта», необходимо иметь воз-
можность реализовать вторую часть процесса, т. е. осуществить
переход от дифракционного изображения к >истинному. Никакая
оптическая система здесь уже помочь не может. На помощь при-
ходят замечательные свойства трансформаций Фурье, позволяю-
щие расчетным путем воссоздать исходную структуру «по ее
изображению в фокальной плоскости», т. е. по рентгенограмме.
Это и составляет содержание рентгеноструктурных исследова-
ний. Задача рентгеноструктурного анализа состоит в том, чтобы
найти пространственное расположение атомов в молекулах ис-
следуемого вещества по его рентгеновской дифракционной кар-
тине.

На первый взгляд она может показаться очень простой: полу-
чили рентгенограмму, измерили, провели расчеты по формулам
Фурье и определили структуру. К сожалению, все это не так.
Для вычисления трансформаций Фурье необходимо знать вели-
чины амплитуд дифрагированных лучей и их относительные
фазы; только в этом случае можно правильно рассчитать ин-
терференцию. Экспериментально измерить амплитуду дифраги-
рованного излучения никогда не удается. Приходится иметь дело
не с амплитудами, а интенсивностями, так как почернение фото-
пленки или количество квантов, считаемых счетчиками, пропор-
ционально интенсивности излучения, т. е. квадратам амплитуд.
Но по квадрату амплитуды луча мы не можем определить, какой
вклад даст этот луч в интерференционную сумму (трансформа-
цию Фурье) —положительный или отрицательный или, в общем
случае, с какой фазой следует учитывать вклад каждого из
лучей.

Основная и принципиальная трудность метода рентгенострук-
турного анализа и состоит в том, что непосредственно из экспе-
риментальных данных не удается измерить фазы дифрагирован-
ных лучей. Поэтому рентгенографическое определение структуры
14
в каждом конкретном случае не является решением стандартной
задачи, оно требует поиска метода определения фаз дифрагиро-
ванных лучей. Правда, иногда обходятся другим способом —
ограничиваются построением гипотетической модели для иско-
мой структуры. Хорошее совпадение теоретически рассчитанной
дифракционной картины для этой модели с экспериментально
наблюдаемой может служить в известной мере критерием пра-
вильности предполагаемой модели. Однако это далеко не уни-
версальный метод, и для таких сложных объектов, как кристал-
лические белки, он не применим.

Задача определения фаз дифрагированных рентгеновских
лучей может быть решена в некоторых особых случаях, когда
исследуемый объект является монокристаллом. Для кристаллов
белков разработан специальный метод ее решения. В этой главе
кратко изложены основы этого метода. Однако, прежде чем пе-
рейти к его разбору, необходимо уяснить основные особенности
строения кристаллов и познакомиться с законами дифракции
рентгеновских лучей в кристаллических структурах.

б.	Основные особенности строения кристаллов

Основная особенность структуры каждого кристалла состоит
в том, что он построен из регулярно расположенных в простран-
стве отдельных групп атомов. Такими группами, или структур-
ными единицами, кристалла могут быть, например, молекулы
или группы молекул. Располагаясь периодически в трех изме-
рениях, они образуют тем самым кристаллическую решетку. Ре-
гулярность структуры кристаллов проявляется в их характерной
внешней форме.

Трехмерную кристаллическую решетку можно представить
себе как систему одинаковых элементарных параллелепипедов.
Каждый такой параллелепипед носит, название элементарной
ячейки кристалла. Описывается элементарная ячейка при помо-
щи трех векторов, соответствующих ее пересекающимся ребрам,
и задается шестью параметрами — длинами этих векторов
(а, Ь, с) и углами между ними (а, Р, у).

В зависимости от соотношения длин векторов и значений уг-
лов между ними различают сингонии кристаллов. Так, например,
если длины одинаковы и углы прямые, сингония кубическая,
если длины различны, но углы остаются прямыми, сингония ром-
бическая, и т. д. Существует всего семь сингоний, все они пред-
ставлены в таблице.

Всякий кристалл — это замкнутый многогранник, который мо-
жет иметь определенную симметрию. Для замкнутых многогран-
ников характерны следующие элементы симметрии (рис. 2):

1)	центр симметрии, при наличии которого расположение
диаметрально противоположных ребер, граней, углов идентично;
Z-аланин

Рис. 2. Элементы симметрш

А—простая поворотная ось второго порядка; Б — винтовая ось второго порядке
При повороте вокруг этих осей /-аминокислота остается Z-амииокислото!"

2)	плоскость симметрии, при наличии которой одна половина
многогранника оказывается зеркальным отображением другой;

3)	ось симметрии, при повороте вокруг которой на определен-
ный угол многогранник совмещается сам с собой. В кристаллах
существуют оси симметрии различных порядков; порядок оси
определяется углом поворота. Так, ось симметрии второго поряд-
ка соответствует повороту на 36072=180°, третьего — на
36073=120° и т. д. Условие плотного заполнения пространства
допускает в кристаллах существование лишь осей 1, 2, 3, 4 и
6-го порядков.
кристаллических структур

В —центр симметрии; Г —плоскость скольжения; Д —зеркальная плоскость симметрии.
При отражении в этих элементах симметрии /-аминокислота переходит в d-а мм но кис лоту

Наличие таких элементов симметрии обусловливает так на-
зываемые закрытые симметрические операции, которые, в конеЧ'
ном итоге, приводят тот или иной структурный элемент к совпа-
дению с самим собой. Возможны 32 различные комбинации этих
операций, или 32 класса симметрии.

Классами симметрии определяется не только внешняя форма
кристалла. В соответствии с ними располагаются атомы и моле-
кулы в элементарных кристаллических ячейках. Для каждой
сингонии существует свой набор классов симметрии.

Однако перечисленными элементами симметрии не ограни-
чивается расположение атомов и молекул в элементарных ячей-

2 Физические методы исследования белков

17
ках, оно может Определяться и так называемыми открытыми
симметрическими операциями. Эти операции уже не применимы
к замкнутым фигурам, так как они не приводят структурную
единицу, на которую действуют, к совпадению с самой собой. Не-
обходимым элементом операций является трансляция — смеще-
ние структурной единицы вдоль определенного направления.

К подобным операциям приводят винтовые оси и плоскости
скольжения. Винтовая ось, поворачивая структурную единицу
на определенный угол, смещает ее вдоль оси на определенный
отрезок. Плоскость скольжения также смещает отраженный в
плоскости элемент определенным образом (см. рис. 2).

Существует 230 комбинаций всех элементов симметрии и раз-
личных трансляций, допустимых законами кристаллографии.
Каждая такая комбинация называется пространственной груп-
пой, для каждой сингонии и класса симметрии характерен свой
набор пространственных групп. Пространственные группы кри-
сталлов впервые были охарактеризованы нашим соотечествен-
ником Е. С. Федоровым [30]. Обозначаются они специальными
символами, отражающими набор элементов симметрии соответ-
ствующей группы [31].

Рентгеноструктурные исследования кристалла начинаются
с определения размеров и формы элементарной ячейки и уста-
новления его пространственной группы симметрии. Эти сведения
необходимы для дальнейших исследований, так как они в явном
или неявном виде входят во все последующие расчеты.

в.	Кристаллы белков и вирусов

Очень многие белки могут кристаллизоваться. Кристаллизу-
ются также и более сложные соединения, например вирусы, ко-
торые представляют собой комплексы белков с нуклеиновыми
кислотами. Образующиеся при этом кристаллы по многим своим
свойствам соответствуют тому, что принято называть кристал-
лом в классическом смысле этого понятия. Они имеют характер-
ную внешнюю огранку (рис. 3). Рентгенограммы свидетельст-
вуют о достаточной правильности их трехмерной кристалличе-
ской решетки (рис. 4).

Кристаллизуются белки и вирусы во всех известных сингони-
ях. Параметры их элементарных ячеек заключены в пределах от
нескольких десятков до нескольких сотен ангстрем (см. таблицу).

Однако для кристаллов оптически активных веществ, к ко-
торым относится большинство соединений биологической приро-
ды, возможными оказываются не любые пространственные
группы симметрии. Молекулы с определенной оптической конфи-
гурацией, например /-аминокислоты, нельзя расположить в про-
странстве так, чтобы какая-либо одна молекула стала зеркаль-
ным отображением другой (см. рис. 2). Поэтому белки и вирусы
а^Ькс

омЬмс

Сингонии

Триклинная

Моноклинная

Гжсагональная

а=Ь*с

!а

кубическая

а=Ь^с

а^б-с

--у *90°

а^Ь^с

Ь-

а = Ь^с

Таблица

Ромбическая

Ромбоэдрическая

Тетрагональная

Примеры
Вирус некроза табака, мол. вес 1 600 000; а=157 А; 6=154 А; с=147 А; а=100°; (3= =110°; 7=120°.  Пространственная группа Plj [13]
Карбоксипептидаза А, мол. вес 34 300; а=51,5А; 6=59,9 А, с=47,2 А; 3=97°30'.  Пространственная группа Р2Х [25]
Вирус полиомиэлита, мол. вес 6 000 000; а= =353 А; 6=378 А; с=320 А.  Пространственная группа Р2х2г2 [26]
Цинкинсулин, мол. вес 12 500; а=49,0 А; ос=114,8°.  Пространственная группа КЗ [13, 27]
Пепсин, мол. вес 35 000;  а=68 А; с=292 А.  Пространственная группа Р6Х22 [13]
Лизоцим, мол. вес 14 600;  а=79,1 А; с=37,9 А.  Пространственная группа Р432х2 [28]
Вирус желтой мозаики репы, мол. вес 5 000 000; а=720 А.  Пространственная группа В4Х32 [29]

не могут кристаллизоваться в тех пространственных группах, где
есть зеркальные элементы симметрии, т. е. центр и плоскости
симметрии.

Важная отличительная особенность кристаллов белков и ви-
русов состоит в том, что их элементарная ячейка 'всегда в виде
необходимого компонента содержит воду, которая может состав-
Рис. 3. Моноклинный кристалл пепсина в поляризованном свете

Рнс. 4. Рентгенограмма моноклинного кристалла
пепсина (плоскость обратной решетки, содержа-
щая узлы okl)
лять от 30 до 60% веса содержимого ячейки. Помимо воды, в
элементарной ячейке белковых кристаллов могут находиться
также ионы солей, молекулы органических растворителей, содер-
жащиеся в маточном растворе, из которого происходила кри-
сталлизация. Все эти дополнительные ингредиенты могут обра-
зовывать целые слои между молекулами белка и располагаться
в многочисленных пустотах элементарных ячеек, возникающих
за счет того, что поверхность больших макромолекул чрезвы-
чайно нерегулярна — она имеет много выступов и впадин. Эф-
фективное заполнение пространства фигурами такой сложной
формы невозможно, поэтому в сухом состоянии белковый кри-
сталл энергетически не стабилен и по мере высыхания становит-
ся все более и более дефектным.

Как правило, кристаллизация белков и вирусов происходит
при добавлении к их растворам ионов различных солей. Выса-
ливание— один из распространенных методов кристаллизации
и одновременно очистки препаратов. Уменьшение растворимости
белков при добавлении к их растворам таких солей, как
(NH4)2SO4, MgSO4, NaCl и т. д., обусловлено нарушением гид-
ратной оболочки белковых молекул и соответственно увеличе-
нием их взаимодействия. Понизить растворимость белков мож-
но также при помощи таких органических растворителей, как
спирты, ацетон и др. Эти реагенты также используются для кри-
сталлизации.

Выращивание 'больших кристаллов — размером в несколько
десятых долей миллиметра, годных для рентгеноструктурных ис-
следований,— задача достаточно сложная. Универсальных ре-
цептов для ее решения нет. Это обстоятельство в ’известной мере
предопределило ход развития структурной кристаллографии бел-
ков. Первыми объектами исследований, для которых удалось
довести до конца анализ структуры, были ие наиболее интерес-
ные в биологическом отношении ферменты, а гемобелкн, кото-
рые сравнительно легко образуют большие кристаллы.

г.	Дифракция рентгеновских лучей иа кристаллической решетке.
Закон Брегга — Вульфа

Как известно, рентгеновские лучи — это электромагнитные
волны, которые занимают область спектра между у-излучеиием
и коротким ультрафиолетом. В структурных исследованиях ис-
пользуются лучи с длинами’волн от 0,5 до 2 А. Когда на образец
попадает рентгеновский луч, под действием электромагнитной
'волны этого луча все атомы исследуемого вещества становятся
источниками вторичных рассеянных волн. Эти волны могут ин-
терферировать, так как рассеяние таких рентгеновских лучей на
атомах происходит главным образом без изменения длины вол-
ны, В то же время межатомные расстояния по своей величине
сравнимы с длиной волны используемого излучения. Интерфе-
ренционная, или, иначе, дифракционная, картина определяется
особенностями взаимного расположения атомов в исследуемом
веществе. Регулярное и симметричное взаимное расположение
атомов в кристаллических решетках обусловливает возникнове-
ние регулярной и симметричной дифракционной картины, состоя-
щей из дискретных максимумов.

Как показали Брегг и Вульф, все сложное явление дифрак-
ции рентгеновских лучей в кристалле можно представить как их
зеркальное отражение от некоторых плоскостей, которые можно
мысленно построить в кристаллической решетке. Каждому отра-
женному лучу принято приписывать определенные индексы, ко-
торые одновременно являются индексами отражающей плоско-
сти и характеризуют ориентацию отражающих плоскостей в кри-
сталле. Чтобы понять, как задается ориентация отражающих
плоскостей в кристаллической решетке, разделим каждый из
основных векторов элементарной ячейки на отрезки, соответст-
вующие делению длины ребра на небольшие целые числа, и про-
ведем через первые точки деления плоскость. Допустим, мы раз-
делили ребро, направленное вдоль оси а, на три части, вдоль
оси b — на две части и вдоль оси с — на четыре части. Припишем
плоскости, проведенной через первые точки деления, индексы
(324); они однозначно определят ее ориентацию, если известно
отношение длин осевых отрезков ячейки. Выбранные таким обра-
зом индексы носят название Миллеровских индексов плоскостей.

Один из основных законов кристаллографии состоит в том,
что внешние грани кристаллов параллельны плоскостям с не-
большими Миллеровскими индексами.

Разделив ребра элементарной ячейки на отрезки определен-
ной длины, мы можем провести через последовательные точки
деления серию последовательных плоскостей (рис. 5). Все они
окажутся параллельными друг другу и будут находиться на оди-
наковом одна от другой расстоянии. Такому семейству па-
раллельных плоскостей приписывают одни и те же индексы. Чем
больше индексы плоскости, тем на большее число частей разби-
вается каждый из осевых отрезков и тем, следовательно, меньше
межплоскостное расстояние. Таким образом, для каждого се-
мейства плоскостей с определенными индексами характерно свое
межплоскостное расстояние. Межплоскостные расстояния приня-
то обозначать dhki, где h, k, I — Миллеровские индексы семей-
ства плоскостей.

Основной закон дифракции рентгеновских лучей в кристал-
ле — закон Брегга — Вульфа — определяет зависимость угла
отражения рентгеновских лучей й от длины волны используемо-
го излучения X и межплоскостного расстояния d той системы пло-
скостей, от которой происходит отражение. Он может быть по-
лучен из простых геометрических соображений (рис. 6'). Для
Рис. 5. Следы различных систем отражающих плоскостей
в кристаллической решетке

того чтобы произошло усиление интенсивности, необходимо, что-
бы разность хода лучей (отраженных последовательными пло-
скостями) ВВ'—BD = 2 d sin -& равнялась целому числу длин
волн (иХ).

Уравнение

2dsin'& = nX	(1)

есть закон Брегга—Вульфа.

Если использовать монохроматическое излучение, то закон
Брегга — Вульфа можно записать в виде 2 din. sin'&=X. Здесь п
носит название порядка отражения. При постоянном значении %
можно наблюдать различные порядки отражения от какой-либо
системы плоскостей кристалла, изменяя определенным образом
угол Й.

В действительности дифракция рентгеновских лучей в кри-
сталле— явление сложное, обусловленное интерференциейволн,
рассеянных всеми атомами кристаллической структуры. Как по-
казывает анализ функции Лауэ [1—11], которая представляет
собой результат расчета интерференции волн, рассеянных ато-
мами периодической решетки, закон Брегга—Вульфа можно рас-
сматривать как следствие более общих уравнений.
Рис, 6. Схема вывода уравнения
Брегга — Вульфа

Уравнение Брегга—
Вульфа не дает, однако,
достаточно полного пред-
ставления о том, какой
должна быть дифракци-
онная картина кристалла.
Оно определяет лишь за-
висимости между скаляр-
ными величинами, в то
время как отраженные
кристаллом рентгеновские
лучи ориентированы со-
вершенно определенным
образом по отношению к

системе координат, свя-
занной с кристаллом. Поэтому они могут быть представлены опре-
деленными векторами. Следовательно, чтобы представлять угло-
вую ориентацию отраженных лучей, необходимо иметь уравне-
ние, связывающее основные векторные величины, характеризую-
щие явление дифракции.

Для этого очень удобно воспользоваться представлением об
обратной решетке кристалла. Как будет показано ниже, при
помощи обратной решетки удается в наиболее общей форме
выразить геометрические условия дифракции рентгеновских
лучей в кристалле, при этом существенно упрощается решение
очень многих дифракционных задач.

д.	Обратная решетка кристалла и геометрические
условия дифракции

Обратная решетка определяется следующим образом. Пусть у
нас решетка кристалла задается тремя векторами — а, Ь, с. По-
строим новую решетку на векторах а*, Ь* и с*, для которых вы-
полняются следующие условия. Во-первых, вектор а* перпендику-
лярен плоскости, где лежат два вектора прямой решетки Ь и с.
Вектор Ь* соответственно перпендикулярен векторам прямой решетки
а и с, а вектор с* — векторам а и Ь. Иными словами:

(«•&) = (а*с) = (b*a) = (»’с) = (с’а) = (с*&) = 0.	(2)

Во-вторых, длины векторов обратной решетки определяются как
обратные величины межплоскостных расстояний между гранями эле-
111

ментарной ячейки: а" =------; Ь* = ------; с*—-------. Иначе

^100	^010	^001

(аа*) = (»»’) = (сс*) = 1.	(3)

Если мы имеем дело с ортогональной решеткой, эти соотно-
шения упрощаются и длины векторов обратной решетин оказы-
24
ваются попросту равными
обратным величинам длин
соответствующих векторов
прямой решетки.

Примем какой-либо из
узлов обратной решетки за
ее начало координат и на-
правим координатные оси
вдоль направлений ее основ-
ных векторов. Пронумеруем
узлы, лежащие вдоль коор-
динатных осей; узлам, рас-
полагающимся в отрица-
тельной части координатных
осей, припишем отрицатель-
ные номера. Таким обра-
зом, мы как бы наносим оп-

Рис. 7. Геометрическое представление
закона дифракции рентгеновских лучей
в кристаллах

ределенный масштаб изме-

рения на координатные оси обратной решетки. В этом масштабе
можно определить координаты любого из узлов обратной решет-
ки, условившись вести проектирование вдоль ребер ее элемен-
тарных параллелепипедов. При таком проектировании коорди-
наты узлов обратной решетки будут всегда только целыми чис-
лами (рис. 7).

Проведем из начала координат обратной решетки вектор,
конец которого совпадает с узлом, имеющим координаты h, k, I.
Обозначим его как вектор Ньм. При помощи простых формул
аналитической геометрии можно доказать очень важную для
кристаллографии теорему. Она состоит в том, что направление
вектора Ним обратной решетки совпадает с направлением пер-
пендикуляра к плоскостям прямой решетки, имеющим Милле-
ровские индексы h, k, I, а длина вектора Ннм есть обратная ве-
личина их межплоскостного расстояния dhki.

Опираясь на эту теорему, можно дать геометрическую интер-
претацию закона дифракции рентгеновских лучей в кристалле.
Для этого рассмотрим систему параллельных плоскостей, имею-
щих Миллеровские индексы h, k, I, от которых под определенным
углом 'й отражается рентгеновский луч (рис. 8). Легко видеть,

что угол между падающим и отраженным лучом всегда равен
2'fl’. Отложим вдоль направлений падающего и отраженного лу-
чей отрезки длиной 1/Х и соединим их концы. Замыкающий от-
резок ВС будет перпендикулярен отражающим плоскостям, и,
следовательно, он должен быть параллелен вектору Н обратной
решетки с координатами hkl. Если длина замыкающего отрезка
будет также равна или кратна длине этого вектора обратной
решетки, то геометрическая зависимость между тремя вектора-
ми, на которых построен треугольник АВС, будет представлять
собой не что иное, как одно из выражений закона дифракции.
В самом деле

1A sin ft —

2

но Hhki = -г— , отсюда 2— sin ft = X.
ahkl	П

Рис. 8. Схема вывода векторного урав-
нения дифракции рентгеновских лучей
в кристаллах

В векторной форме эта зависимость может быть записана следую-
щим образом:

у-у ~пН,л„	(4)

(tlHhkl — tfnh,nk,nl —

где s0 и s — единичные векторы, направленные вдоль падающего и
отраженного лучей соответственно.

Таким образом, уравнение (4) дает возможность предсказать, как
будут ориентированы отраженные кристаллом лучи.

Практически это делается при помощи построения Эвальда
[31, 32, 1 — И], которое состоит в следующем. Проведем в про-
странстве обратной решетки сферу радиуса 1/Х так, чтобы она пе-
ресекла начало координат и чтобы радиус, проведенный из центра
сферы в начало координат, совпадал с направлением первичного луча
(см. рис. 7). Этот радиус дает нам пространственную ориентацию
вектора — . Пусть один из узлов обратной решетки попал на поверх -
кость сферы (эту сферу мы условимся в дальнейшем называть сфе-
рой отражений или сферой Эвальда). Проведем из начала координат
обратной решетки вектор, конец которого совпадает с узлом, оказав-
шимся на поверхности сферы. Пусть это будет вектор Нны- Про-
странственная ориентация двух векторов — и Hhki однозначно опре

X

деляет и ориентацию третьего вектора — . Он должен быть на-
правлен вдоль линии, соединяющей центр сферы с узлом, находя-
щимся на ее поверхности; только тогда будет выполнено основное
условие дифракции. Координаты этого узла дают нам сразу индексы
отражающей плоскости, и мы всегда можем определить простран-
ственную ориентацию отраженного луча, т. е. — .

X

Из приведенной схемы легко видеть, что только узлы, ока-
завшиеся на поверхности сферы, обеспечат выполнение геомет-
рических условий дифракции. Таким образом, рентгенограмму
кристалла можно рассматривать как своеобразную проекцию
той части узлов его обратной решетки, которые находятся на по-
верхности сферы отражений. Различные методы съемки рентге-
нограмм кристаллов и отличаются друг от друга способами
совмещения узлов обратной решетки с поверхностью этой
сферы.

е.	Рентгенограммы белков

Существуют два способа регистрации рентгеновской дифрак-
ционной картины-—фотографический и ионизационный.

Остановимся сначала на первом из них.

Параметры обратной решетки кристаллов обычных низкомо-
лекулярных соединений сравнимы по величине с радиусом сфе-
ры отражений для используемых в структурном анализе значе-
ний длин волн. При произвольной ориентации таких кристаллов
вероятность попадания узла обратной решетки на поверхность
сферы отражений очень мала. Чтобы увеличить эту вероятность,
используют полихроматическое излучение (метод Лауэ) или за-
дают кристаллу специальное движение так, чтобы определенные
узлы обратной решетки пересекли сферу отражений (метод вра-
щения или колебания кристалла).

Обратная решетка кристаллов белков и вирусов очень густо
усеяна узлами, так как параметры их элементарных ячеек ве-
лики. Наибольшая плотность узлов наблюдается в плоскостях
обратного пространства, содержащих основные векторы обрат-
ной решетки — а*, Ь* и с*, так как в прямой решетке им соот-
ветствуют максимальные межплоскостные расстояния.

При таком расположении узлов обратной решетки оказывает-
ся возможным получить довольно богатую и весьма специфиче-
скую рентгенограмму неподвижного кристалла на монохромати-
ческом излучении. Плоскости обратной решетки белкового
кристалла, густо усеянные узлами, пересекают сферу отражения
по окружностям. Отраженные лучи, соответствующие узлам, рас-
положенным на таких окружностях, направлены вдоль образую-
щих конуса с вершиной в центре сферы отражений. Такие кону-
сы отраженных лучей пересекаются с плоской фотопленкой по
кривым второго порядка — эллипсам, гиперболам, окружнос-
тям — в зависимости от того, как ориентирована по отношению к
падающему лучу соответствующая система плоскостей обратной
решетки. По таким рентгенограммам удается оценить иногда
размеры элементарных ячеек.

Однако такие рентгенограммы дают слишком мало информа-
ции о структуре белкового кристалла. Наиболее эффективными
оказываются методы, позволяющие получить на фотопленке не-
искаженные изображения расположения узлов в отдельных плос-
костях обратной решетки кристаллов. Рентгенограммы белков,
полученные этими методами, содержат по нескольку сотен ди-
фракционных максимумов, которые очень легко индицируются
(см. рис. 4). Вместе с тем по ним удобно измерять относительные
интенсивности рефлексов при помощи регистрирующих денсито-
метров, так как дифракционные пятна на таких рентгенограм-
мах расположены по линейным рядам. Снимая одну за другой
плоскости обратной решетки, можно получить данные о распре-
делении интенсивности рефлексов для всего дифракционного
поля.

Существуют различные способы получения неискаженного
изображения обратной решетки кристалла [33—35]. Основная
идея всех этих методов сводится к следующему. Если заставить
кристалл и пленку синхронно двигаться так, что во время
съемки расстояние между кристаллом и пленкой не будет ме-
няться и плоскость пленки все время будет оставаться парал-
лельной плоскости обратной решетки кристалла, можно сохра-
нить принцип подобия, и на пленке получится неискаженное изоб-
ражение расположения узлов в этой плоскости. Так как кроме
отражений, соответствующих узлам снимаемой плоскости обрат-
ной решетки, на пленку могут попасть отражения, соответствую-
щие узлам других плоскостей, используются специальные экра-
ны, вырезающие лучи, соответствующие только выбранной плос-
кости.

Разные методы фотографирования обратной решетки отли-
чаются один от другого характером движения кристалла.

Для кристаллов белков наиболее приемлем прецессионный
метод Бургера [34—35], дающий для белков по сравнению с дру-
гими методами существенное сокращение экспозиций. Суть его
состоит в следующем. Нормаль к снимаемой плоскости обратной
решетки совершает прецессионные движения вокруг направления
первичного луча с определенным углом прецессии ц. Точно такие
же движения совершает нормаль к плоскости пленки, с тем же
углом прецессии. Такое движение позволяет получить неиска-
женное изображение круговой области обратной решетки (рис. 9);
радиус этой области легко меняется изменением угла прецессии.

Последнее обстоятельство особенно существенно. Кристаллы
белков и вирусов долго облучать нельзя (не более 40—50 час. на
трубке средней мощности), так как они разрушаются. В то же
28
время в прецессионном методе Бургера экспозиции резко умень
шаются при уменьшении размеров снимаемой области. Уменьшая
размер снимаемой области белка до граничных значений d~2 А,
мы ничего не теряем, так как интенсивности рефлексов для бел-
ков и вирусов с d<2 А, как правило, очень малы и измерять их
фотометодом нет смысла. Это позволяет получить хорошие рент-
генограммы белка за 20—30 час. при съемке на наших стандарт-
ных установках типа УРС-60, если кристаллы имеют достаточные
размеры.

Рис. 9. Схема прецессионного метода Бургера.

/ — нулевая плоскость; 2 — n-я плоскость; 3 — положение,
пленки при съемке нулевой плоскости; 4 — то же, при съемке,-
n-й плоскости

Так как кристаллы белков и вирусов стабильны лишь во
влажном состоянии, все исследования ведутся на кристаллах, по-
мещенных в запаянные стеклянные капилляры, на дне которых
находится капля маточного раствора и, таким образом, сохра-
няется необходимая влажность. Стенки капилляра делаются
очень тонкими и практически никакого паразитного рассеяния
рентгеновских лучей не дают. Снимают белки обычно на СиКа-из-
лучении с длиной волны 7. = 1,54 А.

В настоящее время для измерения интенсивностей отражен-
ных кристаллом рентгеновских лучей применяются автоматиче-
ские ионизационные приборы — дифрактометры. Тем не менее-
прецессионные рентгеновские камеры продолжают широко ис-
пользоваться в белковых рентгеноструктурных лабораториях.
На этих камерах сравнительно просто могут быть получены дан-
ные, необходимые для определения третичной структуры некотог
рых белков. Так, данные для третичной структуры миоглобина,
восстановленного и окисленного гемоглобинов были получены
именно на таких камерах.

Кроме того, вся предварительная работа по отбору кристал-
лов и их производных для последующей работы проводится толь-
ко на этих камерах.

ж. Дифрактометры

Регистрация рентгеновской дифракционной картины может
быть осуществлена также ионизационными методами. Для этого
служат специальные приборы, называемые дифрактометрами.

Дифрактометры позволяют измерять положения и интенсив-
ности рентгеновских отражений при помощи гейгеровских, про-
порциональных или сцинтилляционных счетчиков, которые, дви-
гаясь синхронно вместе с кристаллом, регистрируют последова-
тельно дифракционные максимумы.

Регистрация интенсивностей при помощи счетчиков имеет
много преимуществ по сравнению с фотографическим методом.
Во-первых, при использовании автоматических дифрактометров
значительно сокращается время, требуемое для измерения интен-
сивностей рефлексов полного дифракционного поля, что весьма
существенно для соединений с большими параметрами ячеек,
таких, например, как белки. На первых стадиях исследования
гемоглобина определение фотометодом более чем 7000 значений
интенсивностей рефлексов потребовало нескольких лет работы.
В настоящее время эти данные могли быть получены при помощи
дифрактометра менее чем за месяц. Во-вторых, точность измере-
ний, определяемая длительностью регистрации максимумов,
может быть доведена до 1—2% (фотометод дает 10—15%).
Дифрактометры необходимы для измерения слабых рефлексов
дальних участков дифракционного поля, которые не могут быть
выявлены фотометодом при больших экспозициях, так как время
жизни белковых кристаллов ограничено. Результаты измерений
на дифрактометре могут быть автоматически записаны на пер-
фокарты или перфоленту, которые затем непосредственно исполь-
зуются в вычислительных машинах. Ионизационные методы
позволяют получить значения интенсивностей всех отражений
в единой шкале, которая затем может быть сведена к абсолют-
ным единицам измерения. При использовании фотографических
методов перевод интенсивностей в единую шкалу измерений
связан с определением поправочного коэффициента для каждого
из снимков, что приводит к дополнительным погрешностям.

Различные конструкции дифрактометров отличаются схемой
связи и характером движения кристалла и счетчика [33]. Для
исследования кристаллов белков были специально разработаны
два типа дифрактометров: так называемый линейный [36], кото-
30
рый в настоящее время выпускается фирмой Хильгер Уоттс в
Англии, и дифрактометр, выпускаемый американской фирмой
Дженерал Электрик Компани [37].

з.	Структурный фактор

Интенсивность отражений рентгеновских лучей от различных
плоскостей кристаллической решетки зависит от ряда факторов;
важнейший из них — взаимное расположение атомов в элемен-
тарной кристаллической ячейке. Связь между интенсивностью
рентгеновских отражений и расположением атомов в ячейке и
представляет основу для решения главной задачи рентгенострук-
турного анализа кристаллов — определения пространственного
расположения атомов в элементарных ячейках.

Дифракционная картина, обусловленная лишь атомами одной
элементарной ячейки, может быть рассчитана при помощи фор-
мул Фурье-трансформации. Она не будет содержать дискретных
максимумов, так как никакой периодичности в пределах одной
элементарной ячейки нет; мы получим лишь некоторое непре-
рывное распределение интенсивности. Однако наличие множе-
ства ячеек в кристалле и трехмерная периодичность приводят к
тому, что большая часть излучения, дифрагированного одной
элементарной ячейкой, оказывается погашенной, остаются лишь
лучи, удовлетворяющие условию Брегга — Вульфа, т. е. лучи, как
бы отраженные от системы плоскостей с индексами h, k, I или,
как говорят, соответствующие узлам обратной решетки h, k, I.
Значение Фурье-трансформации одной элементарной ячейки
для направлений, соответствующих этим лучам (hkl), и носит
название структурного фактора Fhu, или структурной амплиту-
ды. Интенсивности дифрагированных кристаллом лучей пропор-
циональны квадрату структурного фактора.

Расчет структурного фактора или Фурье-трансформации ячейки для отраже-
ний с индексами hkl производится следующим образом. Мы можем рассматри-
вать ячейку как систему дискретных центров рассеяния — атомов.

Само рассеяние происходит главным образом на электронных оболочках ато-
мов; ядра как значительно более тяжелые практически никакого вклада в общее
рассеяние не дают. Способность атома рассеивать рентгеновские лучи характери-
зуют функцией f, которая возрастает с ростом числа электронов в атоме и убы-
вает с увеличением угла рассеяния. При расчете структурного фактора опреде-
ляется вклад каждого из атомов в результирующую рассеянную волну. Он равен

f exp 2ni (hx 4- ky 4- Iz).

Здесь x, у, z — координаты атома в ' элементарной ячейке, определяемые долями
длины основных ее векторов; Л, k, I — индексы отражающей плоскости. Струк-
турный фактор это сумма вида:

phki = А ехР 2jri'	+ Zzj) + f2 exp 2ni (hx2 4- ky2 4- Zz2) 4- ...

• • • + fn exp 2nZ (fixn + kyn 4- Zz„);
f/M = 2j Ь еХР 2Ш' ^Xl + kyi +

(5)

Суммирование Проводится по всем атомам ячейки, число их равно л, — функ-
ция атомного рассеяния атома /, зависящая от структуры его электронной обо-
лочки Ху, Zy — координаты атома / в элементарной ячейке.

Если мы считаем, что распределение рассеивающего вещества в ячейке не-
прерывно, то сумму Фурье следует заменить интегралом Фурье по объему эле-
ментарной ячейки.

Fhkl

р (х, y,z) exp 2лi (hx + ky + lz) dx dy dz.

(59

О&^йстви-
тельных чисел

Рис. 10. Изображение струк-
турного фактора в виде
вектора в комплексной
плоскости

Здесь р (x,r/,z) — функция распределения рас-
сеивающего вещества — электронной плотности
(см.£ ниже).

В общем случае структурный фактор — это
комплексная величина. Она может быть пред-
ставлена формулой^ + iB. Как известно, всякое
комплексное число характеризуется модулем
и фазой; модуль —это | Fhkl | — У А2 + В2, а фа-

за—это угол	определяемый из соотношения

В

А



. Изобразив комплексное число векто-

ром в комплексной плоскости (рис. 10), мы ви-
дим, что модуль — это длина вектора, а фаза —
угол, когорый^он образует с осью абсцисс.

Координаты атомов x^y^-zj зависят от того,
где выбирается начало координат элементарной
ячейки. Легко показать, что | Fhkl | не зависит

от выбора начала координат, меняются лишь абсолютные значения фаз, однако
их разности сохраняются.

Таким образом, модули структурных амплитуд и разности их фаз — харак-
теристики определенного расположения атомов в элементарной ячейке.

На практике измеряются интенсивности отраженных кристал-
лом лучей, они пропорциональны квадрату структурного фактора,
т. е. сумме квадратов его действительной и мнимой части.

Если нам известно лишь значение А2 + В2, то тем самым нам
известна лишь длина вектора или его модуль, соответствующий
угА2 + В21 но об его угловой ориентации, которая определяет
фазу, мы ничего не знаем. Это означает, что непосредственно из
эксперимента мы получаем лишь часть информации, необходи-
мой для определения пространственного расположения атомов в
элементарных ячейках.

Как уже указывалось, основная и принципиальная трудность
метода рентгеноструктурного анализа и состоит в отсутствии
универсальных способов экспериментального определения фаз
структурных факторов. Если для какого-либо кристалла фазы
определены, то как будет показано ниже, расчет положений ато-
мов в элементарной ячейке этого кристалла не составит принци-
пиальных трудностей.
и.	Определение симметрии кристалла по рентгенограммам;
собственная симметрия молекул белков и вирусных частиц

Наличие определенных элементов симметрии в кристалличе-
ской структуре приводит к тому, что координаты некоторой груп-
пы атомов в элементарной ячейке оказываются связанными опре-
деленными соотношениями с координатами атомов другой такой
же группы. В зависимости от того, каковы эти соотношения, не-
которым отражениям будут соответствовать вполне определен-
ные значения структурного фактора. Так, например, для неко-
торых из них структурный фактор может обратиться в нуль,
некоторым отражениям могут соответствовать равные значения
структурных факторов и т. д. [1—3, 9, 10].

Подставив в формулу для структурного фактора координаты
атомов симметрически связанных групп, можно доказать следую-
щие соотношения.

Открытые симметрические операции, такие, как плоскости
симметрии и простые поворотные оси разных порядков, прояв-
ляются в виде точно таких же элементов симметрии на рентге-
новских дифракционных картинах. Эти элементы симметрии пе-
ресекаются всегда в нулевом узле обратной решетки. Винтовые
оси проявляются на рентгенограммах так же, как и простые по-
воротные оси. Кроме того, винтовые оси и плоскости скольжения
приводят к специфическим погасаниям рентгеновских отражений
с определенными индексами для каждого элемента симметрии.

Пользуясь формулой для структурного фактора, легко пока-
зать, что интенсивности отражений от плоскостей с индексами
hkl и —/г,—k,—I одинаковы. Таким образом, дифракционное
поле кристалла всегда имеет центр симметрии, если даже в крис-
талле его нет. Эта особенность дифракции рентгеновских лучей
в кристаллах носит название закона Фриделя. Если используется
излучение с длиной волны, соответствующей или близкой к обла-
сти селективного поглощения для каких-либо атомов кристалли-
ческой структуры, закон Фриделя нарушается. Это явление носит
название аномального рассеяния, иногда оно может быть исполь-
зовано для определения фаз структурных факторов. Однако из-
ложение этих вопросов выходит за рамки данной главы.

Привнесение центра симметрии в рентгеновскую дифракцион-
ную картину при наличии других элементов симметрии в крис-
таллической структуре может привести к появлению новых эле-
ментов симметрии на рентгенограммах. Так, например, комбина-
ция поворотной оси четного порядка с центром симметрии приво-
дит к появлению плоскости симметрии на рентгенограммах. По-
явление подобных элементов симметрии на снимках белковых
кристаллов есть лишь следствие общих законов дифракции
рентгеновских лучей и не отражает особенностей их истинной
структуры.

3 Физические методы исследования белков

33
По симметрии рентгенограмм белков и вирусов и специфи-
ческим погасаниям рефлексов удается иногда судить о собствен-
ной симметрии их молекул, т. е. о четвертичной структуре.

Рентгеноструктурный анализ, а в ряде случаев — электронная
микроскопия — наиболее эффективные методы определения соб-
ственной симметрии макромолекул. Определить собственную
симметрию молекул можно следующим образом. Из рентгено-
графических данных вычисляют объем элементарной ячейки.
Измерив плотность кристалла и внося поправку на содержа-
ние в нем кристаллизационной жидкости, определяют долю
веса белка, приходящегося на одну ячейку. Далее, сравнивая
полученную величину с молекулярным весом, находят число мо-
лекул в ячейке. Симметрия пространственной группы всякого
кристалла требует, чтобы его элементарная ячейка содержала
определенное число структурно идентичных элементов. Напри-
мер, если в кристалле имеется ось шестого порядка, его элемен-
тарная ячейка обязательно должна содержать 6 п идентичных
структурных единиц, где п — целое число. Допустим, что в эле-
ментарной ячейке такого кристалла содержатся всего две моле-
кулы белка. Тогда каждая из молекул должна состоять из трех
идентичных элементов. Такими элементами могут быть три оди-
наковые субъединицы или три одинаковые пары разных субъ-
единиц.

Очень интересным примером установления четвертичной
структуры из рентгенографических данных являются работы по
структуре малых кристаллизующихся вирусов. Детальные рент-
генографические исследования показали, что белковые оболочки
вирусных частиц большинства исследованных к настоящему вре-
мени препаратов имеют одну и ту же симметрию — симметрию
икосаэдра [38]. Это возможно лишь в том случае, если каждая
частица состоит из 60 п одинаковых элементов. Эти результаты
находят широкое подтверждение при изучении строения вирусов
другими методами, например электронномикроскопическими [39].
Симметрия икосаэдра обеспечивает образование эффективной
поверхности с минимальной площадью из любых неправильных
по форме элементов. По-видимому, в образовании эффективной
оболочки, защищающей нуклеиновую кислоту, и состоит назна-
чение белкового компонента вирусов [40].

к.	Методы определения фаз структурных
амплитуд белковых кристаллов

Над проблемой определения фаз структурных амплитуд крис-
таллов белков долгое время работали сотрудники Кэвендишской
лаборатории в Кембридже. В 1954 г. Перутц и сотрудники [41]
обратили внимание на то, что присоединение одного или двух
атомов ртути к молекуле белка с молекулярным весом 20000—
36 000 может заметно изменить интенсивности дифракционных
максимумов.

Изменение интенсивности рентгеновских отражений при при-
соединении к молекуле белка атомов тяжелых металлов, подоб-
ных ртути, может служить экспериментальной основой для опре-
деления фаз структурных амплитуд. И, действительно» после
того, как были получены первые производные гемоглобина со
ртутью, скоро был разработан во всех деталях эффективный ме-
тод определения фаз структурных амплитуд кристаллов белка.

Чтобы легче понять сущность этого метода, необходимо ус-
воить основной прием изображения структурных факторов в виде
векторов комплексной плоскости (см. рис. 10).

Структурный фактор — это сумма выражений вида /у ехр2ш (Лх/+
+ kyi + I?/) каждое из которых может быть представлено со-
ответствующим вектором в комплексной плоскости. Таким образом,
структурный фактор Fhki есть результирующий вектор, представляю-
щий сумму всех подобных векторов. Если к молекуле белка присо-
единен атом тяжелого металла так, что после его присоединения
положение других атомов в элементарной ячейке не изменилось,
то структурный фактор модифицированного белка F^ может быть
получен добавлением одного дополнительного вектора в сумму (5).

п

Fhki = Fhki + fn — 2

/=1

Оценивая разницу в интенсивности отражений исходного и мо
дифицированного белка и используя специальные расчетные приемы
(см. ниже), можно определить координаты тяжелого атома в эле-
ментарной ячейке Хн, Ун, гн- Зная их, можно теоретически рассчи-
тать как модуль, так и фазу вектора /и, определяющего рассея-
ние тяжелым атомом.

Рассмотрим теперь графический прием определения фаз структур-
ных амплитуд, предложенный Харкером [42] (рис. 11). Пусть из
экспериментальных данных мы определили только модули | Fhki | и
|/=Ш т. е. модули структурных факторов немодифицированного
белка и белка с тяжелым металлом для определенного отражения
с индексами hkl.

В комплексной плоскости конец вектора Fhki попадает на окруж-
ность радиуса \Fhki |. Наша задача состоит в том, чтобы найти ори-
ентацию этого вектора, определяемую углом ерш- Построим в этой
же плоскости уже известный нам заранее вектор Для удобства
отложим от начала координат не вектор /не а противоположный
ему вектор—fHt и проведем из его конца окружность радиусом [ Fhkt*\-
Для двух точек пересечения окружностей с радиусами ] Fhki | и
\Fhki | будет справедливо соотношение (6).
Одна из точек пересечения определяет истинную ориентацию
вектора Fhki, т. е. искомое решение. Чтобы сделать выбор между
двумя точками пересечения, берется другая производная белка.
Она должна содержать тяжелый атом, присоединенный уже к дру-
гому участку белковой молекулы, так, чтобы вектор f , соответ-
ствующий рассеянию тяжелым атомом во второй производной, имел
ориентацию, отличную от ориентации вектора fH1. Для второй про-

Рис. 11. Диаграмма Харкера, иллюстрирующая
метод определения фаз структурных амплитуд
в методе полиизоморфного замещения

изводной на той же диаграмме делается точно такое же построение.
Две производные должны дать одно общее пересечение с окружно-
стью радиуса \ Fhki |, соответствующее истинной ориентации Fhki для
исходного кристалла. Таким образом определяется угловая ориента-
ция вектора Fhki, т. е. фаза <р^ структурной амплитуды для кри-
сталлов исходного немодифицированного белка.

Подобный графический метод определения фаз структурных
амплитуд можно использовать, если приходится иметь дело с
небольшим числом рефлексов. Например, для расчета третичной
структуры миоглобина с разрешением 6 А был применен этот
простой графический метод [43]. Однако для более детального
анализа, в котором использовались 9600 отражений, расчет фаз
вели на вычислительных машинах [44].
Для того чтобы определить фазы структурных амплитуд бел-
ковых кристаллов этим методом, необходимо выполнение ряда
очень важных условий. Во-первых, метка должна присоединять-
ся специфично к определенной группе. Во-вторых, кристаллы
белка, содержащего атомы тяжелых металлов, должны быть
подобны кристаллам немодифицированного белка; введение тя-
желого атома в белковую молекулу не должно ее деформировать
и менять характер упаковки молекул в кристалле. Весь расчет
основан на том, что положение всех атомов белковой молекулы в
элементарной ячейке не изменяется, за исключением появления
нового дополнительного центра рассеяния. Тяжелые атомы долж-
ны играть роль так называемых изоморфных добавок.

Получение различных производных белков с изоморфными
добавками экспериментально задача очень трудная и рациональ-
ных методов ее решения пока нет. Известен один надежный
метод химической модификации белков — присоединение пара-
хлормеркурибензоата к сульфгидрильным группам. Последова-
тельная метка различных сульфгидрильных групп гемоглобина
позволила получить необходимые данные для расчета фаз струк-
турных амплитуд для кристаллов этого белка [45]. Если в белке
нет сульфгидрильных групп, для получения изоморфных добавок
используют ионы, содержащие атомы тяжелых металлов, так как
никакая другая химическая модификация белка до сих пор успе-
ха не дала *. В этом случае важно добиться специфического при-
соединения ионов к небольшому числу групп белковой молекулы,
в противном случае становится невозможным определение коор-
динат тяжелых атомов. Очень часто для получения необходимых
производных кристаллы белка, достигшие достаточных размеров,
помещают в растворы, содержащие необходимые ионы. Ионы
могут диффундировать в кристалл, не нарушая его симметрии,
и далее присоединяться к определенным группам на поверхности
белковых молекул.

В настоящее время задача получения кристаллов производ-
ных белков с изоморфными добавками — одна из наиболее труд-
ных проблем на пути полной расшифровки их структуры. Прак-
тика показывает, что двух производных оказывается недостаточ-
но для того, чтобы определить фазы с необходимой точностью.
Окружности могут пересекаться не в одной точке за счет ошибок
в измерении интенсивностей рефлексов, погрешностей в опреде-
лении координат тяжелых атомов, а также за счет неполного
изоморфизма. При использовании нескольких производных обыч-
но удается зафиксировать область, в которой могут заключаться

1 В последнее время стали успешно использовать метод присоединения тя-
желого атома к ингибиторам ферментов. Последние, присоединяясь специфично
к белку, обеспечивают тем самым жесткую фиксацию тяжелого атома на по-
верхности белковой молекулы. При выяснении положения тяжелого атома
одновременно определяют и положение активного центра фермента [103].
значения фазового угла. При этом возникает вопрос, какое зна-
чение этого угла следует использовать в последующих расчетах,
чтобы получить наиболее правильное представление о располо-
жении атомов в белковой молекуле.

Блоу и Крик разработали специальный метод определения
оптимальных значений фаз, которые вносят наименьшую общую
погрешность в функцию распределения электронной плотности
(см. ниже). При этом они показали, что следует использовать
значения модулей структурных амплитуд с некоторым поправоч-
ным коэффициентом [46].

Существуют и другие методы определения фаз структурных
амплитуд белковых кристаллов, которые, однако, могут приме-
няться лишь в специальных случаях [47—52], на них мы останав-
ливаться не будем.

л.	Распределение электронной плотности в кристаллах.
Ряды Фурье в кристаллографии

Как уже указывалось, рентгеновские лучи рассеиваются в
основном на электронных оболочках атомов. Поэтому экспери-
ментальные рентгенографические данные позволяют в принципе
судить об особенностях расположения электронов в элементар-
ных кристаллических ячейках. Это расположение принято харак-
теризовать функцией распределения электронной плотности,
которая измеряется числом электронов, приходящихся на один
кубический ангстрем. Такая функция отражает расположение
атомов в элементарных ячейках, так как каждому атому соот-
ветствует сгусток электронной плотности определенной величины.

Так как кристалл имеет правильную структуру, периодиче-
скую в трех измерениях, функция распределения электронной
плотности в кристалле тоже будет функцией, периодической в
трех измерениях. Из математики известно, что значение подоб-
ных функций в любой из точек с координатами х, у, z может быть
определено расчетным путем, а именно оно равно сумме

Q (х, у, Z) = 2 2 2 ^лРехР [ * 2я^ (тх + пУ + Р^*	(7)

т п р

Подобные суммы носят название сумм, или рядов, Фурье, а опера-
ция суммирования называется трансформацией, или синтезом, Фурье.
Суммирования проводятся по всем целочисленным значениям т, п
и р от —оо до ф-оо. Атпр—некоторая величина, называемая ам-
плитудой ряда.

Функция распределения электронной плотности в кристаллах
может быть представлена рядом Фурье следующего вида:

Р (x,y,z) = 2 2 2 —-ехр[— 2л1 (hx + ky'+lz)].	(8)

hkl V
р

Здесь V — объем элементарной ячейки, а —— — амплитуда ряда.

.Теория рентгеноструктурного анализа доказывает, что амплитудами
рядов Фурье, представляющих распределение электронной плотности
в кристаллах, являются структурные факторы отражений с индек-
сами hkl, отнесенные к единице объема элементарной ячейки
( Аптр = —~у~г Р ) • Суммирование производится по всем значе-
ниям hkl экспериментально наблюдаемых отражений. Сходимость
эяда обеспечивается тем, что по мере роста индексов hkl значения

Fhki | падают. Выражение (8) можно записать в другом виде:

Р (*>^) =

ООО

оо

+ 2 2 231Icos (2л ^hx +~

h=o k I	(9)

где &hkt — фаза структурного фактора Fhki-

Таким образом, если нам известны значения структурных
факторов, т. е. их модули и фазы, мы всегда можем рассчитать
структуру кристалла — найти функцию распределения электрон-
ной плотности и по ней определить локализацию атомов в про-
странстве.

Если мы имеем дело с непрерывным распределением интен-
сивности, то сумма Фурье переходит в интеграл Фурье и для
электронной плотности мы получаем выражение:

р (x,z/,z) =	Fhkl exp[—2ni(gx + т)у + £z)]d%di\ dt,.

(10)

где £, т], £—компоненты вектора И

В направлениях, соответствующих брегговским отражениям,
£, т], £ равны hkl. Сравнивая формулы (5Z) и (10), мы видим, что
это пара Фурье-трансформаций. Наличие дискретных отражений
от монокристалла позволяет заменить более общую формулу
(10) на сумму Фурье (8).

Расчет кристаллографических рядов Фурье принципиальной
сложности не представляет, однако трудоемок. Чтобы получить
точное представление о распределении электронной плотности в
кристалле, расчет ведут для большого числа точек. Обычно каж-
дое ребро элементарной ячейки делится на 30, 60 или 120 частей.
Таким образом, иногда приходится рассчитывать 603 сумм Фурье
или больше. Каждая сумма содержит столько членов, сколько
наблюдается отражений: для обычных кристалов около тысячи,
для белков десятки тысяч. Эти расчеты можно проводить только
на вычислительных машинах1.

1 Суммирование рядов Фурье для простых структур может быть прове-
дено также при помощи оптических приспособлений, не совсем правильно на-
зываемых «рентгеновскими микроскопами».
Рис. 12. Распределение электронной плотности
в дикетопиперазине при различном разрешении

Иногда используется ограниченная часть экспериментальных
данных и рассчитываются ряды Фурье с малым разрешением.
Для этого в расчет берутся отражения, соответствующие меж-
плоскостным расстояниям до какого-то определенного минималь-
ного значения. Мерой разрешения ряда Фурье в этих случаях
принято считать эту минимальную величину межплоскостного
расстояния.

Функция распределения электронной плотности изображает-
ся в виде контурных карт, на которых изолиниями соединены
точки с ее одинаковым значением. На рис. 12 представлена
функция распределения электронной плотности дикетопиперази-
на, рассчитанная для различных разрешений [18]. Однако этот
прием удобен для представления распределения электронной
плотности в одной какой-либо плоскости. Модели, построенные
на основании данных об объемном распределении электронной
плотности в некоторых белках, представлены на рис. 13, 14.

Ряд Фурье вида

Р (X, Y, Z) = -L 2 2 2 Ни cos 2 л (hX +	(11)

h k I

носит название функции Паттерсона. Эта функция широко ис-
пользуется в рентгеновской структурной кристаллографии, ее
расчет — необходимый этап при анализе структуры белков,
Рис. 13. Модели распределении электронной плотности в белках
а — модель распределения электронной плотности в миоглобине с разрешением 6А;

б — в гемоглобине с разрешением 5,5 А

Теория структурного анализа показывает, что функция Паттер-
соона отображает пространственную ориентацию всех межатомных
векторов в кристалле. Она имеет максимумы в тех точках XYZ,
которые удовлетворяют условию X = хх- — xf, Y — yt — yj’, Z — Zi —Z/,
где x^tZi и XjyjZf — координаты каких-либо двух атомов в элемен-
тарной ячейке. Величина максимума функции Паттерсона пропор-
циональна произведению атомных номеров соответствующей пары
томов.

Эта функция часто используется для определения коорди-
нат тяжелых, сильно рассеивающих рентгеновские лучи атомов
в элементарных ячейках, так как максимумы, соответствующие
расстояниям между тяжелыми атомами, обнаруживаются на ней
в первую очередь.

Для определения координат атомов тяжелых меюллов в эле-
ментарной ячейке белкового кристалла используется синтез Пат-
терсона, коэффициентами которого служат квадраты разностей

JFm/)]. а также различные модификации этих разностей1.
По комплексу векторов, соответствующих расстояниям между
тяжелыми атомами в элементарной ячейке, легко могут быть
определены координаты этих атомов при условии, что -каждая’
молекула присоединяет лишь небольшое их число.

1 Проблеме эффективного определения координат тяжелых атомов в кри-
сталлах белка посвящено очень много работ, обзор которых имеется в статье
J53); см. также [52, 54].
Рис. 14. Данные, полученные на основе анализа распределения электронной
плотности в белках

а — конфигурация аминокислотных остатков вблизи гомогруппы миоглобина; б — конфи-
гурация цепи лизоцима (цифры на схеме — номера аминокислотных остатков)
м. Распределение электронной плотности в кристаллах белков

Рентгеноструктурный анализ с расчетом функции распределе-
ния электронной плотности был проведен лишь для некоторых
белков. Изучение структуры кристаллизующихся вирусов в силу
сложности их строения ограничилось лишь определением соб-
ственной симметрии их молекул.

Впервые распределение электронной плотности в белковой
молекуле удалось наблюдать на примере миоглобина [43]. Перво-
начально функция электронной плотности многлобнна была рас-
считана при слабом разрешении 6 А. В расчете учитывались
структурные амплитуды всего лишь 400 отражений. Однако эта
функция уже позволила определить общий характер свертывания
полипептидной цепи в миоглобине, т. е. его третичную структуру.
В 1958 г. это было крупнейшим научным достижением. Как ока-
залось, все прежние теории строения белка, в которых белковая
глобула представлялась как совокупность связанных коротких
параллельных а-спиральных сегментов, оказались несостоятель-
ными. Было показано, что полипептидная цепь в белковой моле-
куле может изгибаться весьма сложным образом, обеспечивая
образование очень компактной глобулы.

К настоящему времени распределение электронной плотности
с разрешением 5—6 А рассчитано и для других белков [45,55—58].

Сравнительные данные, полученные для различных гемоглоби-
нов, послужили основой для многих очень важных выводов. Уда-
лось, например, показать, что изменение функциональных свойств
гемоглобина, наблюдаемое при переходе из обычной окси- в так
называемую восстановленную форму, является следствием увели-
чения расстояния между его Р-субъеднницами при неизменности
их третичной структуры [56].

Весьма интересным оказалось то обстоятельство, что, несмот-
ря на существенную разницу в химическом строении, третичная
структура а- и -p-субъединиц гемоглобина и глобулы миоглобина
практически одинакова [45].

Распределение электронной плотности с разрешением 5—6 А
в лизоциме [57] и химотрипсиногене [58] интерпретировать сразу
ие удалось. Эти белки содержат мало а-спиралей и поэтому в рас-
пределении их электронной плотности нет заметных сгустков, лег-
ко выявляемых при малом разрешении.

Ценнейшие результаты были получены после расчета Фурье-
синтеза для миоглобина [44] и лизоцима [59] с разрешением 2 А.
В расчетах было использовано до десятка тысяч отражений, рас-
чет производили на самых мощных вычислительных машинах.

При этом разрешении в глобуле миоглобина четко выявились
а-спирали, существование которых в глобулярных белках дол-
гое время являлось предметом спора. В молекуле миоглобина
было обнаружено 8 а-спиральных сегментов, содержащих от 7 до
24 остатков аминокислот. Было определено направление враще-
ния этих спиралей — они всюду оказались правыми.

Однако несомненно, что самым интересным явилось определе-
ние пространственной ориентации различных аминокислот и пер-
вичной структуры из рентгеновских данных [60—64]. Следует под-
черкнуть, что ко времени получения этих результатов химических
данных о первичной структуре миоглобина еще не было. Была
лишь найдена последовательность в некоторых пептидах, полу-
ченных из гидролизата миоглобина. Разрешение в 2 Л не является
достаточным, чтобы точно локализовать все атомы, тем не менее,
как показали последующие химические работы, найденная из
рентгеновских данных последовательность аминокислот в миогло-
бине в основном оказалась правильной. Эти данные в дальней-
шем помогли химикам установить чередование пептидов в моле*
куле белка.

Первичная структура лизоцима была установлена химичес-
кими методами до того, как был рассчитан для него Фурье-син-
тез с разрешением 2 А. Таким образом, на долю рентгенографи-
стов осталось определение пространственного расположения ами-
нокислот в молекуле этого фермента.

В настоящее время пространственная ориентация аминокис-
лот известна для трех белков — миоглобина, гемоглобина и ли-
зоцима. Хотя для гемоглобина данных об электронной плотности
с высоким разрешением еще не получено, тождественность тре-
тичной структуры а- и р-субъединиц гемоглобина и миоглобина,
а .также данные о первичной структуре некоторых гемоглобинов
позволили эту ориентацию определить.

При анализе пространственной ориентации боковых цепей
миоглобина и гемоглобинов обнаружена очень важная особен-
ность. Оказалось, что почти все гидрофобные боковые группы на-
ходятся внутри молекул, образуя компактное гидрофобное ядро.
В то же время полярные боковые группы расположены на поверх-
ности глобулы и образуют солеобразные или водородные связи
с молекулами воды и ионами солей, находящимися в элементар-
ных ячейках кристалла [60—64].

Важнейшим результатом исследований этих белков явилось
определение пространственной ориентации аминокислот вблизи
функциональных групп. Так было показано, какие аминокислот-
ные остатки должны наиболее сильно влиять на свойства гема.
Таким путем удалось точно охарактеризовать и объяснить ано-
малии, характерные для некоторых «молекулярных болезней»
[55, 60].

Активный центр лизоцима особенно хорошо проявился, когда
был исследован комплекс лизоцима с ингибитором. На картах
разности* распределения электронной плотности для такого ком-
плекса и чистого лизоцима четко выявились положение и контуры
ингибитора [65]. Это дало возможность идентифицировать боко-
вые группы лизоцима, находящиеся в контакте с ингибитором и,
следовательно, включающие активный центр. Рентгенографичес-
кие данные показали, что гистидин никак не может входить в
активный центр лизоцима, что являлось предметом споров L

Сейчас еще трудно оценить полученные результаты во всей их
полноте. По-видимому, они смогут служить основой для объяс-
нения многих химических и физических свойств белков.

Пространственная ориентация функциональных групп, их вза-
имодействие с другими группами в молекуле — сведения, необхо-
димые для понимания структурных основ биологической специ-
фичности ферментов. Результаты, полученные при рентгенострук-
турных исследованиях первых белков — миоглобина, гемоглобина
и лизоцима, могут служить хорошей иллюстрацией возможностей
метода рентгеновской структурной кристаллографии. Исследо-
вания в этом направлении лишь начинаются. Предстоит огромная
работа по изучению строения многочисленных ферментов и выяв-
лению общих закономерностей связей их структуры и функций.

2.	Исследование строения фибриллярных структур

а.	Особенности структуры волокон биополимеров

Биологические полимеры, молекулы которых имеют нитевид-
ную форму, образуют волокнистые, или, иначе, фибриллярные,
структуры. Подобные структуры составляют основу многих тка-
ней живого организма. Например, мышечные волокна, соедини-
тельная ткань, кожные покровы, роговые образования состоят
главным образом из фибриллярных белков.

Нитевидные молекулы ДНК и некоторых видов РНК имеют
также определенную тенденцию к образованию волокон. Такие
волокна могут быть получены искусственно из концентрирован-
ных растворов этих соединений. Легко образуют фибриллярные
структуры и высокомолекулярные синтетические полипептиды и
полинуклеотиды. Некоторые глобулярные белки могут полимери-
зоваться, при этом возникают линейные агрегаты их молекул. Та-
кие «бусы», построенные из глобулярных частиц, также образуют
волокна. Волокна могут быть получены и из концентрированных
растворов вируса табачной мозаики (ВТМ), так как частицы
этого вируса имеют высокую степень асимметрии.

Исследования строения волокон биополимеров — очень важ-
ный и интересный раздел молекулярной биологии. Именно они
привели к двум фундаментальным открытиям—-к определению

1	За последнее время удалось установить детальную структуру активного
центра лизоцима, исследовать комплексы лизоцима с ингибитором с разреше-
нием 2 А и дать подробное описание процесса каталитического расщепления
субстрата этим ферментом.
структуры а-спирали [66} и установлению структуры ДНК [67].
Как известно, эти открытия послужили основой для развития
важнейших исследований.

Прежде чем приступить к разбору методов, применяемых при
изучении структуры волокон биологических полимеров, остано-
вимся кратко на основных особенностях их строения.

Строение цепных молекул. Рассмотрим простей-
ший случай — полимерную цепочку, которая состоит из иден-
тичных мономерных единиц. Примерами такой цепочки могут
служить простые полипептиды или полинуклеотиды. При опреде-
ленных условиях такая цепь приобретает правильную регуляр-
ную конфигурацию, если не по всей длине молекулы, то по край-
ней мере па отдельных, достаточно больших ее сегментах. При
этом идентичные группы молекулы располагаются так, что в
структуре этих сегментов возникают определенная периодич-
ность и симметрия. ,

Структура изолированной цепной молекулы определяется в
конечном итоге особенностями валентных связей ее основной
цепи и теми дополнительными внутрицепными взаимодействия-
ми (вандерваальсовыми и водородными связями), которые мо-
гут при этом реализоваться. Поэтому законы симметрии упа-
ковки мономерных звеньев в полимерной цепочке качественно
отличаются от законов симметрии упаковки «свободных» моле-
кул в кристаллах. Единственно возможным элементом симмет-
рии цепной молекулы является винтовая ось (если, конечно,
сами мономерные единицы не наделены какой-либо дополни-
тельной симметрией и сшивка всех мономерных единиц при син-
тезе происходит одинаково). При этом никаких ограничений на
порядок винтовой оси не накладывается. Сама цепь «выбирает
удойную для себя ось». В цепных молекулах биополимеров мы
наблюдаем, например, винтовые оси десятого порядка или очень
часто нецелочисленные винтовые оси, такие, как ось 18/5 или
10/3 (т. е. спирали' с 18 идентичными группами в пяти оборо-
тах или с 10 — в трех оборотах). Существование таких элемен-
тов симметрии в кристаллах абсолютно исключено. Впервые на
возможность существования таких элементов симметрии в цеп-
ных молекулах полимеров указал Полинг [66].

Строго говоря, эти рассуждения касаются изолированной
цепной молекулы. Структура молекул в волокнах — это резуль-
тат как внутримолекулярных, так и межмолекулярных взаимо-
действий. Однако опыт показывает, что для многих фибрилляр-
ных биополимеров вклад, вносимый в свободную энергию меж-
молекулярными взаимодействиями, значительно меньше выигры-
ша в энергии, обусловленного образованием компактной
внутримолекулярной структуры. Это связано, по-видимому, с
тем, что поверхность цепных молекул биополимеров часто имеет
сложный рельеф и эффективная упаковка молекул с образова-
46
нием большого числа межмолекулярных связей не всегда воз-
можна. Поэтому молекулы многих биополимеров при переходе
из растворов в волокно сохраняют характерную для изолирован-
ной молекулы упорядоченную структуру.

В отличие от цепочек простых полипептидов и полинуклео-
тидов молекулы белков и нуклеиновых кислот содержат, поми-
мо идентичных периодически повторяющихся групп (фосфатно-
сахарных — в нуклеиновых кислотах и пептидных — в белках),
не регулярно чередующиеся различные боковые радикалы. Под
симметрией молекул нуклеиновых кислот и фибриллярных бел-
ков подразумевают симметрию хребта или остова их молеку-
лярных цепочек.

Известны случаи, когда молекула представляет собой спе-
цифический агрегат из нескольких цепочек (ДНК, коллаген).
При анализе симметрии таких молекул необходимо учитывать
дополнительно особенности взаимного расположения отдельных
цепочек. Цепи в таких агрегатах могут располагаться в соответ-
ствии с простыми и винтовыми осями различных порядков, па-
раллельными длине молекулы (например, ось 10/3 — коллаген),
а также с осью второго порядка, перпендикулярной длине мо-
лекул (ДНК). Симметрия цепных молекул и их агрегатов под-
робно рассмотрена в работе Б. К. Вайнштейна [68].

Особый класс структур образуют «бусы» из глобулярных
частиц— белковых глобул (актин, фибрин) — или белковых
субъединиц (ВТМ). В этих структурах «бусы» как бы навиваются
на цилиндрическую поверхность, образуя особые спирали. Так,
спираль ВТМ содержит 49 белковых субъединиц в трех оборо-
тах. Структурной единицей таких спиралей является не моно-
мерное звено цепочки, а белковая глобула как целое. Соответ-
ственно параметры таких спиралей (толщина, величина витка)
намного больше параметров простых спиралей белков и нукле-
иновых кислот.

Упаковка цепных молекул в волокнах. В силу
своей высокой анизотропии нитевидные молекулы стремятся
расположиться параллельно одна другой. При этом оказывают*
ся возможными два типа их взаимной упаковки.

Во-первых, параллельные молекулы могут быть уложены
относительно Друг друга регулярным образом так, что иден-
тичные группы всей совокупности этих молекул образуют трех-
мерную периодическую решетку (рис. 15, я). Однако возможен
и другой тип упаковки, когда 'цепи, оставаясь параллельными,
расположены одна относительно другой без какой-либо законо-
мерной корреляции (рис. 15, б). Между этими двумя крайними
случаями возможны и промежуточные, когда упаковка молекул
не настолько совершенна, чтобы возникла строгая трехмерная
периодичность в расположении идентичных групп, вместе с тем
это расположение в известной мере является упорядоченным.
Рас'Мотрим сначала особенности строения регулярных
структур иначе — «кристаллитов». С точки зрения геометриче-
ской они в некотором отношении подобны кристаллам, так как
их основу составляет трехмерная периодическая решетка, со-
стоящая из идентичных элементов. Однако в силу сравнительно
легкой деформируемости длинных цепных молекул, строгая ре-
гулярность расположения сегментов различных цепочек не мо-
жет выдерживаться в больших объемах. Поэтому кристаллиты,
возникающие в полимерных структурах, сравнительно малы по
размерам.

Рис. 15. Схема упаковки цепей в волокнах биополимеров
а — правильная кристаллическая упаковка цепей; б — неупорядоченная упаковка парал-
лельных цепей

Одно из направлений элементарной ячейки таких кристал-
литов всегда параллельно направлению молекулярной цепи.
Два других направления, лежащие в плоскости, перпендикуляр-
ной длине цепочки, могут быть ориентированы любым образом
(рис. 16). Так как макроскопические волокна состоят из мно-
жества мелких кристаллитов, практические приходится иметь
дело с непрерывным набором ориентации кристаллитов вокруг
оси волокна. Поэтому волокно в целом имеет аксиальную сим-
метрию, или, иначе, аксиальную текстуру.

Для таких биополимеров, как нуклеиновые кислоты и фиб-
риллярные белки, правильная кристаллическая структура в об-
щем случае невозможна, так как их разнородные боковые груп-
пы не чередуются регулярно вдоль цепочки. Основу решетки
этих полимеров может образовать лишь остов — хребет цепи,
боковые группы играют роль аморфной набивки ячеек. Напри-
мер, в кристаллических препаратах ДНК правильную прост-
ранственную решетку образуют лишь фосфатно-сахарные осто-
вы цепочек, не регулярно чередующиеся пары оснований, хотя
и имеют одинаковые размеры, не могут быть частью правиль-
ной кристаллической структуры.
Исключение составляют два белка — фиброин шелка и кол-
лаген, в которых обнаружена более или менее правильная
периодичность в чередовании некоторых боковых групп на от-
дельных сегментах цепей. Однако эта периодичность не являет-
ся абсолютной, поэтому кристаллиты в этих белках также де-
фектны.

Второй тин упаковки более естествен для цепных молекул
с разнородными, не регулярно чередующимися боковыми груп-
пами, расположенными на поверхности этих молекул. Расстоя-

иия между цепями в таких структу-
рах не могут быть выдержаны доста-
точно строго, скорое можно говорить
о некотором наборе-таких расстоя-
ний и характеризовать его функцией
распределения. Подобным образом
характеризуют набор межмолеку-
лярных расстояний в жидкостях.
Угловая ориентация молекул вокруг
оси, совпадающей с направлением
их длины, в таких структурах может
быть любой. Поэтому структура в
целом имеет также аксиальную сим-
метрию.

Взаимное расположение молекул
по длинам не является регулярным.
Такие структуры получили название
паракристаллов. Они возникают в
фибриллярных белках, нуклеиновых
кислотах и некоторых синтетических

Рис. 16. Схема образова-
ния аксиальной текстуры
в волокнах

биополимерах.

Структуру промежуточного типа образует вирус табачной
мозаики. Расстояния между его молекулами выдержаны доволь-
но строго. Между ними может возникнуть достаточно плотный
контакт, когда выступы одной частицы, расположенные по вин-
товой линии, попадают в пазы другой, расположенной таким
же образом. Однако в упаковке молекул существует «винтовой
беспорядок», соответствующий нерегулярной ориентации -частиц
вокруг длинной оси и, следовательно, в силу спиральности их
структуры — нерегулярным смещениям их по длине.

б.	Дифракция рентгеновских лучей на волокнах

Анализ этого явления нам легче всего начать с рассмотре-
ния особенностей дифракции рентгеновских лучей на волокнах,
которые по своему строению близки к совокупности правильных
кристаллитов, беспорядочно ориентированных вокруг оси акси-
альной текстуры.

4 Физические методы исследования белков

49
Рис. 17. Геометрическое представ-
ление условий дифракции иа со-
вокупности кристаллов, ориенти-
рованных беспорядочно вокруг
оси аксиальной текстуры

В чем состоят особенности
дифракции на каждом из.таких
кристаллитов, нам уже изве-
стно. Задача заключается в
том, чтобы проанализировать
их совокупное влияние на ди-
фракционную картину. Так как
они ориентированы беспоря-
дочно, никаких регулярных фа-
зовых соотношений между лу-
чами, рассеянными разными
кристаллитами, не возникнет.
Поэтому дифракционная кар-
тина такого волокна будет
представлять собой простое на-
ложение дифракционных кар-
тин отдельных кристаллитов.

Каким будет результат это-
го наложения, легче всего по-
нять, прибегнув к геометриче-
скому изображению условия
дифракции для рассматривае-
мой системы. Условимся счи-
тать, что ось текстуры у нас
совпадает с направлением 001
обратной решетки кристаллов
и первичный луч перпендикуля-
рен этому направлению. Непре-
рывному набору ориентации
кристаллитов соответствует не-
прерывный поворот их обрат-
ной решетки вокруг оси тексту-
ры. При этом узлы обратной
решетки будут описывать ок-

ружности с радиусами, равными их расстояниям от оси тек-

стуры.

Геометрические условия дифракции на такой совокупности
кристаллитов могут быть представлены в виде схемы, изобра-
женной на рис. 17. Точки пересечения сферы отражений подоб-
ными окружностями будут соответствовать, выполнению усло-
вий дифракции. Так как направление отраженных лучей совпа-
дает с радиусами сферы, проходящими через эти точки пересе-
чения, для каждой плоскости обратной решетки мы будем иметь
конус таких лучей с определенным углом раствора. Эти конусы
пересекутся с плоской пленкой по гиперболам, называемым
слоевыми линиями. На каждой такой гиперболе будут лежать
максимумы, соответствующие одной плоскости обратной решет-
Рис. 18. Рентгенограмма A-формы натриевой соли ДНК

ки, с одним общим индексом. Значения индекса определяют но-
мер слоевой линии. Нулевая слоевая линия рентгенограмм во-
локон иначе называется экватором; линия, перпендикулярная
ей и проходящая через центр рентгенограммы, называется ме-
ридианом.

На рис. 18 изображена рентгенограмма так называемой
A-формы натриевой соли ДНК. Это типичная рентгенограмма
волокна. Небольшой угловой разброс кристаллитов вокруг оси,
перпендикулярной оси текстуры, приводит к размытию макси-
мумов по дугам.

Далее рассмотрим влияние несовершенства упаковки цепей
на дифракционную картину волокна. Это довольно сложная и
специальная задача, поэтому мы ограничимся здесь лишь переч-
нем тех особенностей рентгенограммы, которые вызваны отли-
чиями структуры упорядоченных областей в полимерах от строе-
ния правильных кристаллитов. Более подробно см. [6].

Во-первых, рассмотрим тот случай, когда трехмерная упа*
ковка идентичных элементов разных цепей сохраняется, но яв-
ляется дефектной. Это означает, что каждый из таких элементов
слегка смещен из правильного положения в элементарной ячей-
ке и в среднем мы имеем дело со статистическим набором таких
смещений. Подобные дефекты в структуре кристаллита приво-
дят к усилению спада интенсивности отраженных лучей с ростом
угла отражения. Чем больше среднее квадратичное смещение
элементов из правильного положения, тем резче спад интенсив-
ности. Кристаллиты в волокнах биополимеров всегда дефектны,
поэтому их рентгенограммы состоят из небольшого числа ди-
фракционных максимумов, расположенных в центральной части.
Даже рентгенограммы сравнительно «упорядоченной» ДНК со-
держат значительно меньше отражений, чем следовало бы ожи-
дать для правильного кристалла. С уменьшением размеров кри-
сталлитов увеличивается размытие дифракционных максимумов,
они становятся более «диффузными».

Специфические дефекты в упаковке цепочек, такие, как их
неупорядоченный сдвиг по длине, приводят к особым дифракци-
онным эффектам {6, 69]. В этом случае па всех слоевых линиях,
кроме нулевой, исчезают дискретные максимумы и наблюдает-
ся лишь непрерывное размытие дифрагированного излучения с
образованием штрихов вдоль слоевых линий. Как правило, не-
упорядоченный сдвиг цепочек по длине связан одновременно с
расстройкой ориентации соседних молекул вокруг оси волокна.
Непрерывное размытие интенсивности вдоль слоевых линий
определится в этом случае некоторым усредненным значением
структурного фактора периодического элемента цепочки. Несо-
гласованный изгиб цепочек приведет к увеличению размытия
интенсивности с ростом угла отражения как вдоль слоевых ли-
ний, так и в поперечном направлении. Дополнительная аморф-
ная набивка ячеек вызовет увеличение фона на рентгенограм-
мах.

Обычно волокна биополимеров содержат и такие области,
где сегменты цепочек не являются параллельными один друго-
му и упаковка их неупорядочеиа. Наличие таких областей при-
водит к появлению диффузных колец.

Таким образом, па рентгенограммах волокон биополимеров
могут наблюдаться самые разнообразные дифракционные эф-
фекты. Они отражают специфику химического строения боль-
шинства биополимеров — нерегулярность чередования различ-
ных в стереохимическом отношении боковых групп и обуслов-
ленные ею дефекты в упаковке цепных молекул.
в.	Экспериментальные методы получения
рентгенограмм волокон

Методы съемки рентгенограмм волокон сравнительно прос-
ты. Как правило, волокна биополимеров снимают на излучении,
полученном от трубки с медным анодом. Так как дифракцион-
ное поле волокон сосредоточено в основном в области <0,3,
его мож1но зафиксировать почти целиком на одном снимке. Для
того чтобы получить рентгенограмму волокна типа рентгено-
граммы, изображенной на рис. 18, достаточно направить на пу-
чок волокон, перпендикулярно их длине, монохроматиче-
ский рентгеновский луч и поместить плоскую фотопленку за
образцом.

Если степень ориентации препарата высока, то, направляя
луч перпендикулярно длине волокна, мы не должны наблюдать
меридиональных отражений, так как они получаются от плос-
костей, перпендикулярных длине волокон. Обычно, однако, при-
ходится иметь дело с небольшим рассеянием текстуры — около
10—15 град. При этом такие плоскости будут отклоняться от
точной ориентации на угол, соответствующий рассеянию тек-
стуры. Поэтому обычно удается на плоской пленке фиксировать
меридиональные отражения с брегговскими углами до 15 град.
При наблюдении меридиональных отражений, которым соответ-
ствуют большие брегговские углы, необходимо волокна ориенти-
ровать по отношению к рентгеновскому лучу так, чтобы он со-
ставлял соответствующий брегговский угол с интересующей нас
плоскостью. Для фиксации дальних отражений, соответствую-
щих малым межплоскостным расстояниям (например, 1,5 А в
белках или 1,7 А в ДНК), необходимо использовать камеры с
цилиндрической кассетой.

При получении рентгенограмм малоупорядоченных объектов
возникают дополнительные сложности. Фон на рентгенограммах
таких объектов, обусловленный аморфными областями препа-
рата, может оказаться настолько сильным, что он забьет слабое
рассеяние кристаллической фазой, на долю которой будет при-
ходиться лишь небольшая часть объема облучаемого образца.
Интенсивность фона будет тем больше, чем более гетерогенным
(по длинам волн) является используемое излучение. Особенно
это относится к коротковолновым компонентам спектра. В таких
случаях монохроматизация луча при помощи никелевого фильт-
ра оказывается недостаточной и рекомендуется использовать
излучение, полученное отражением первичного луча от моно-
кристалла.

Хорошими монохроматорами для съемки волокон служат кри-
сталлы пентаэритрита [70]; удобен для работы и специальный для
них держатель конструкции Квитка [71].
В последнее время были разработаны камеры для съемки
волокон, в которых применяется особая система фокусировки
первичного луча за счет его полного внутреннего отражения от
тороидальной металлической поверхности. При этом достигает-
ся большой выигрыш в интенсивности, что дает возможность
фиксировать очень слабое рассеяние рентгеновских лучей [72].

При проведении рентгенографических исследований волокон
биополимеров очень часто основной трудностью оказывается
работа с самим объектом. Как правило, получить высокоориен-
тированные препараты очень трудно. Вытяжка нитей из кон-
центрированных растворов препарата или растяжение пленок
не всегда приводят к нужным результатам. Необходимо, чтобы
в самом растворе при его концентрировании возникла опреде-
ленная упорядоченность. Довольно часто кристалличность пре-
паратов биополимеров сохраняется лишь при высокой степени
влажности, так как они большей частью являются кристалло-
гидратами. Поэтому всю съемку приходится проводить в герме-
тических камерах, где поддерживается постоянная влажность.
Рассеяние рентгеновского луча в воздухе приводит к появлению
дополнительной вуали па снимке в той области, где часто со-
средоточены наиболее важные отражения от волокон. Поэтому
герметические камеры, где поддерживается постоянная влаж-
ность, наполняют легким газом, слабо рассеивающим рентге-
новские лучи, таким, как водород или гелий. Иногда удачно
ориентированный препарат удается получить в виде одиночной
тонкой нити диаметром в несколько десятков микрон. В этом
случае целесообразно использовать микрофокусные или остро-
фокусные рентгеновские трубки [73]. Необходимая для всего
этого аппаратура выпускается нашей отечественной промыш-
ленностью.

г.	Информация о структуре, получаемая на основе
анализа рентгенограмм волокон

Рентгеновские дифракционные данные, получаемые для во-
локнистых структур, не могут быть использованы непосредствен-
но для прямого определения расположения атомов в молекуле,
как это делается при исследовании структуры кристаллов бел-
ков. Этому мешают два обстоятельства. Во-первых, па рентгено-
граммах волокон наблюдается, как правило, слишком мало
отражений, для некоторых биополимеров их может быть не бо-
лее десятка. Ряд Фурье, содержащий так мало членов, не будет
иметь сколько-нибудь приемлемой степени разрешения для ана-
лиза положений атомов в структуре. Во-вторых, в силу аксиаль-
ной симметрии волокон может происходить наложение отраже-
ний с разными индексами. Для этого достаточно, чтобы какие-
либо плоскости обратной решетки содержали разные узлы,
54
находящиеся па одинаковом расстоянии от оси аксиальной тек-
стуры. Как правило, таких наложений бывает довольно много.
Поэтому, измеряя интенсивность какого-либо отражения, мы
имеем дело с суммарным ее значением для нескольких рефлек-
сов и определить раздельно величины \Fhkt | не можем.

Поэтому анализ структуры волокнистых соединений состоит
в построении такой модели конфигурации молекулярных цепочек
и в подборе такой их упаковки, которые согласуются с рентге-
нографическими данными.

Рассмотрим, какие конкретные параметры модели могут быть
получены из рентгенограмм.

По рентгенограммам волокон всегда можно измерить период
идентичности молекулы I вдоль оси волокна, т. е. величину про-
екции повторяющегося вдоль цепи элемента па эту ось. Расстоя-
ния между слоевыми линиями на рентгенограммах In связаны
с этой величиной простым геометрическим соотношением

hi —-	Цп —	>

sin	R

где In — расстояние n-слоевой линии от экватора; R — расстоя-
ние образен-—пленка.

По рентгенограммам волокон не всегда удается однозначно
выбрать элементарную ячейку. В некоторых случаях определе-
ние элементарной ячейки и не имеет особого смысла, так как
упаковка цепочек может быть слишком дефектной.

Как уже указывалось, биополимеры обычно характеризуются
наличием винтовых осей в структуре — их молекулы имеют
спиральную конфигурацию.

Важнейшим вкладом в развитие рентгеноструктурных ис-
следований волокон полимеров послужила работа Кокрэна,
Крика и Ванда о законах дифракции рентгеновских лучей на
цепных спиральных молекулах [74]. Опираясь на результаты
этой работы, можно, проанализировав качественно распределе-
ние интенсивности на разных слоевых линиях рентгенограммы,
определить тип спирали, образуемой полимерной молекулой,
величину ее витка и число эквивалентных групп, приходящихся
на один оборот.

Очень важно, что правило Кокрэна, Крика и Ванда можно
применять и для случая несовершенной паракристаллической
упаковки молекул, анализируя непрерывное распределение ин-
тенсивности на слоевых линиях, обусловленное независимым
рассеянием цепочек.

Положение первых максимумов на экваториальной слоевой
линии почти всегда соответствует межмолекулярным расстоя-
ниям. Для спиральных молекул довольно часто реализуется гек-
сагональная упаковка, межмолекулярные расстояния при этом
характеризуют средний диаметр молекул.

Если волокно обладает высокой степенью кристалличности и
его рентгенограммы содержат соответственно сравнительно
много дифракционных максимумов, можно рассчитать функцию
Паттерсона особого типа, характерную для структур с цилинд-
рической симметрией. Расчет подобной функции для ДНК по-
зволил выявить двуспиральный тип структуры, а также расстоя-
ние между фосфатными группами в молекуле [75]. Можно
также, используя изоморфные производные, рассчитать зиаки
структурных амплитуд для ряда рефлексов и попытаться по-
строить усредненную, в соответствии с цилиндрической симмет-
рией объекта, функцию распределения электронной плотности.

Так, например, для вируса табачной мозаики построили про-
екцию распределения электронной плотности вдоль длинной оси
вирусной частицы при слабом разрешении. При этом обнару-
жили внутреннюю полую область частицы радиусом 20 А и по-
казали, что пуклеиновая кислота расположена на расстоянии
40 А от центральной оси [76].

Последняя группа рентгенографических данных, наклады-
вающих ограничения на молекулярные модели,— это относи-
тельные интенсивности отдельных дифракционных максимумов.
Они зависят от координат атомов. Общее соответствие, опреде-
ляемое, например, типом спирали, должно быть подкреплено
соответствием относительных интенсивностей рефлексов на сло-
евых линиях для экспериментальных и расчетных данных,
полученных для конкретной модели.

Иногда изучение особенностей упаковки цепных молекул био-
полимеров является предметом специального исследования.
Основная информация об этой упаковке может быть получена
па основе анализа распределения интенсивности на экваторе
рентгенограммы. Рассчитывая при помощи специальных формул
так называемую функцию распределения радиальной плотности,
можно определить среднее число ближайших соседей молекулы,
которое и характеризует тип упаковки. Такие исследования
были проведены для некоторых кератинов [77].

Наконец, снимая рентгенограммы волокон, находящихся в
различных условиях (например, при различной влажности, тем-
пературе и пр.), можно наблюдать за изменениями их структуры.
Иногда эти изменения сводятся к увеличению или уменьшению
межмолекулярных расстояний, иногда меняется степень упоря-
доченности структуры, в ряде случаев удается наблюдать струк-
турные превращения. • Например, ДНК может существовать в
разных структурных модификациях (Л, В, С), которые реали-
зуются для разных солей при различных степенях влажности
[78, 79]. Такие исследования полезны при изучении влияния раз-
ных факторов на структуру волокон биополимеров.
д.	Модели конфигурации цепных молекул биополимеров

Как уже указывалось, несмотря на ограниченность экспери-
ментальных данных, получаемых из рентгенограмм волокон био-
полимеров, для них однозначно или почти однозначно удается
найти модель структуры молекул. Это объясняется прежде всего
тем, что основная цепь полипептидов и полинуклеотидов состоит
из жестких однородных единиц, имеющих вполне определенную
структуру. В то же время законы сочленения этих единиц остав-
ляют не слишком много вариантов для выбора моделей. Пояс-
ним это на примере: остов полипептидной цепи состоит из плос-
ких пептидных групп, поворот цепи возможен только в точках
с а-углеродным атомом; существуют несколько благоприятных
взаимных ориентаций двух соседних пептидных групп. Остов
полинуклеотидной цепи содержит жесткие сахарные кольца,
изгиб цепи осуществляется лишь в точках с С атомом фосфатно-
сахарных групп. Таким образом, при построении моделей моле-
кул биополимеров мы встречаемся с более благоприятной ситуа-
цией, чем, скажем, при изучении каучука, мономерная единица
которого может иметь целый набор разных конфигураций.

Финальный результат построения моделей — определение
координат атомов основного, периодически повторяющегося мо-
тива молекулы, в цилиндрической системе связанной с осью
молекулы. Иногда удается найти упаковку молекул в ячейках и
определить координаты атомов в системе, связанной с ячейкой,
однако в этом не всегда есть необходимость, так как многие
биополимеры — паракристаллы.

Так как периодически повторяющийся мотив цепной молеку-
лы содержит всего лишь одно или несколько мономерных звень-
ев (иногда лишь остова цепи), число определяемых неизвестных
(координат атомов) невелико. Таким образом, изучение струк-
туры волокон принципиально отличается от исследования струк-
туры молекулярных кристаллов, для которых число искомых
параметров, характеризующих положение всех атомов молеку-
лы, измеряется тысячами.

Отправные данные, используемые при построении моделей,
параметры, полученные из рентгенограмм: диаметр молекулы,
период идентичности вдоль оси, тип спирали, величина ее витка
и число групп в обороте. Очень важный параметр — ориентация
водородных связей в структуре. Информацию об ориентации
водородных связей в волокнах дают поляризованные спектры
поглощения в инфракрасной области.

При построении моделей в первую очередь учитывают, какие
ограничения на структуру молекул накладывают определенные
стереохимические параметры. Эти ограничения предусматри-
вают сохранение определенных значений межатомных расстоя-
ний, валентных углов, параметров водородных связей и вандер-
ваальсовых расстояний, а также сохранение стереохимии от-
дельных элементов цепочки, например пептидных групп, сахар-
ных колец, нуклеотидных оснований. Данные о стереохимии этих
элементов были получены иа основе анализа структуры кристал-
лов низкомолекулярных соединений, родственных белкам и
нуклеиновым кислотам.

Процесс поиска модели конфигурации полимерной молекулы
может быть осуществлен двумя путями. Во-первых, можно при-
менить расчетные приемы и, пользуясь геометрическими фор-
мулами, проанализировать различные варианты конфигурации
молекул, отобрав наиболее приемлемые. Это довольно утоми-
тельная работа. Значительно легче осуществлять поиск прн по-
мощи специальных молекулярных моделей — деревянных или
сделанных нз пластмассы, нли просто из металлических стерж-
ней, в которых допускается вращение сегментов цепей вокруг
определенных связей, в соответствии с тем, что может иметь
место в реальной структуре. Использование таких молекуляр-
ных моделей в значительной мере облегчило многие структур-
ные исследования. Вместе с тем эти модели дают очень нагляд-
ное представление об основных особенностях строения молекул.

Расчет координат атомов эквивалентных групп цепной мо-
лекулы производится геометрически. Для некоторых типов
структур разработаны специальные методы такого расчета.

В качестве примера остановимся на работе по моделирова-
нию структуры ДНК.

Известная модель структуры ДНК была найдена Уотсоном
н Криком на основе сравнительно небогатого эксперименталь-
ного материала, полученного для натриевых солен ДНК [67].
Нативная, так называемая В-форма натриевой соли ДНК обра-
зует структуру скорее паракрнсталлического, чем кристалличе-
ского типа (рис. 19). По рентгенограммам такой паракристалли-
ческой ДНК были определены параметры спирали, образуемой
молекулой (наличие 10 эквивалентных групп в одном обороте,
равном 34 А), и ее диаметр. Предположение о гексагональном
характере упаковки цилиндрических молекул и использование
данных о плотности препаратов привели к выводу о том, что
каждая молекула должна состоять из двух цепей. Далее после-
довали модельные построения, успех которых в большой мере
был определен удачной догадкой об образовании известных
нуклеотидных пар Уотсона и Крика— АТ и ГЦ. Основной струк-
турной особенностью этих пар является полная тождественность
нх суммарных размеров, необходимая для того, чтобы молекула
могла иметь постоянный диаметр. В противном случае фосфат-
но-сахарный остов, располагающийся на поверхности молекулы,
не сможет иметь правильную регулярную конфигурацию. Анти-
параллельность двух цепочек в молекуле следовала нз рентге-
нограмм.
Рис. 19. Рентгенограмма паракристаллической В-формы
натриевой соли ДНК

Поиски конфигурации молекулы производились при помощи
построения специальных моделей, в результате чего была полу-
чена известная модель, скоро завоевавшая широкую популяр-
ность, так как давала наглядное представление о возможном
механизме редупликации и соответственно передачи наслед-
ственной информации.

Однако эта модель являлась только гипотезой, согласующей-
ся с определенным кругом экспериментальных данных. «Лишь
сравнительно недавно Вилкинс и его коллеги привели убеди-
тельные аргументы в пользу этой модели [78, 79]. Они получили
препараты литиевой соли ДНК с очень высокой степенью кри-
сталличности, которые давали рентгенограммы, содержащие
более сотни отражений. Правда, Вилкинс немного изменил по-
ложение атомов в модели Уотсона и Крика, но общий характер
первоначальной модели сохранился. По полученным рентгено-
граммам был рассчитан синтез Фурье, причем фазы структур-
ных амплитуд для этого синтеза были определены по координа-
там атомов видоизмененной модели Уотсона и Крика, а интен-
сивности измерялись экспериментально. Если бы модель была
неправильной, фазы, рассчитанные по этой модели, не находи-
лись бы в соответствии с экспериментально измеренными
интенсивностями, и синтез Фурье не показал бы разумного рас-
пределения электронной плотности. Однако результаты этого
синтеза полностью подтвердили предполагаемую модель. Срав-
нительно эффективное использование синтеза Фурье в данном
случае оказалось возможным лишь потому, что рентгенограмма
ДНК содержит довольно много отражений по отношению к чис-
лу параметров (координатам атомов), которые необходимо
определять.

Другой пример поиска структуры при помощи моделей — ра-
боты Рича и Крика по структуре коллагена [80]. Этот метод
успешно применялся также при изучении строения полипепти-
дов [81].

В общем случае проверку модели производят сравнением
расчетных и экспериментальных интенсивностей всех отражений
рентгенограммы. Расчет этот часто производится вычислитель-
ными машинами. Однако при исследовании структуры волокон
широко применяют и другой прием. Он состоит в получении
дифракционной картины от системы светящихся центров при
использовании обычных световых лучей. Расположение светя-
щихся центров в таких опытах соответствует расположению
атомов в предполагаемой модели. Достигается это использова-
нием так называемых масок — специальных непрозрачных
экранов, на которые наносятся отверстия разного диаметра в
соответствии с расположением различных атомов в структуре
и их рассеивающей способностью. На экран направляется па-
раллельный пучок лучей света. Такой экран с отверстиями эк-
вивалентен плоской проекции структуры. Дифракцию получают
для разных проекций и далее картины суммируют. Если модель
правильна, оптическая дифракционная картина тождественна
рентгенограмме. При таких проверках для -белков с нерегуляр-
но чередующимися боковыми группами используют модели, в
которых каждая боковая группа представлена некоторым усред-
ненным распределением рассеивающих центров для разных
аминокислот [82].

Методы исследования строения белков с регулярным чередо-
ванием аминокислот на отдельных сегментах цепей имеют ряд
особенностей. Процесс изучения их структуры включает опреде-
ление основного закона чередования аминокислотных остатков.
Этот закон может быть установлен на основании рентгенографи-
ческих исследований модельных соединений. Однако эти вопросы
уже выходят за рамки данной главы.
3.	Дифракция рентгеновских лучей под малыми углами
на волокнах и растворах биополимеров

На рентгенограммах некоторых препаратов биополимеров в
области малых углов дифракции от 1 град и меньше наблюда-
юся специфические дифракционные эффекты. Хотя они могут
иметь и различную природу, однако во всех случаях дают по-
лезную информацию о структуре макромолекул биополимеров
и о строении сложных молекулярных агрегатов.

Для наблюдения дифракции в области малых углов применя-
ют специальную методику, позволяющую фиксировать рассея-
ние в непосредственной близости от первичного луча. Это дости-
гается использованием очень тонких первичных пучков с малой
угловой расходимостью. Для этого применяют длинные коллима-
торы с малыми входными и выходными отверстиями, которые
могут быть либо, круглыми, либо щелевыми. Щелевые диафрагмы
дают значительный выигрыш в интенсивности и поэтому исполь-
зуются чаще. Очень удобная и эффективная для работы в обла-
сти малых углов дифракции схема коллимации была предло-
жена Кратки {83]. Точечные диафрагмы применяют лишь тогда,
когда необходимо иметь высокую разрешающую способность в
двух измерениях. При работе с малыми углами применяются
также фокусирующие методы съемки.

Теории и методам малоуглового рентгеновского рассеяния
посвящена специальная монография [84].

Мы рассмотрим здесь два типа дифракционных картин био-
полимеров, наблюдаемых под малыми углами и покажем, какие
данные могут быть из них получены.

а.	Дискретное малоугловое рассеяние на тканях
и волокнах биополимеров

Волокна многих фибриллярных белков дают в области ма-
лых углов дифракции систему дискретных меридиональных ли-
нейных рефлексов, сходную с тем, что обычно наблюдается для
линейной дифракционной решетки. Подобного типа рефлексы
можно наблюдать и на различных тканях, например на нервных
волокнах 185], на мышцах [86], а также на агрегатах рибосом
[87]. Рефлексы такого же типа, но только экваториальные, дают
жидкие кристаллы многих биополимеров. Основные периоды,
измеряемые по таким рентгенограммам, имеют порядок несколь-
ких сотен ангстрем (700 А-— мышечные волокна, 200 А— агрега-
ты рибосом). Иногда число наблюдаемых порядков отражений
для основного периода довольно велико (например, 27 порядков
отражений для коллагена [88]).

Подобные дифракционные картины обусловлены наличием
больших периодов . в распределении электронной плотности
вдоль волокна. Это распределение отражает основные особенно-
сти структурообразования сложных упорядоченных молекуляр-
ных комплексов, а также специфику строения их отдельных ком-
понент. Поэтому малоугловое дискретное рассеяние может слу-
жить экспериментальной основой для построения моделей струк-
туры важнейших биологических систем (таких, как мембраны,
мышечные волокна и т. п.).

Обработка рентгенограмм с дискретным малоугловым рас-
сеянием чаще всего сводится лишь к расчету основного перио-
да, определяемого по формуле Брегга — Вульфа. Иногда анали-
зируют относительные интенсивности различных порядков отра-
жений, сопоставляя их с расчетными для определенных моделей.
Модели строятся главным образом на основании электронномик-
роскопических данных.

К настоящему времени убедительно объяснить причину появ-
ления дискретных малоугловых максимумов удалось лишь в не-
многих случаях. К этим случаям относятся исследования полиме-
ров глобулярных белков, таких, как F-актин и фибрин [89, 90].
Структурной единицей этих полимеров являются целые белковые
глобулы. Естественно, что спирали, которые образуются из поли-
мерных нитей подобного рода, имеют очень большой шаг и при-
водят к появлению на рентгенограммах слоевых линий с очень
большим периодом. Протяженность этих слоевых линий зависит
от толщин рассеивающих агрегатов цепочек. Эти толщины, опре-
деляемые размерами белковых глобул, велики, соответственно
все слоевые линии наблюдаются в меридиональной части рент-
генограммы. Существуют убедительные гипотезы, объясняющие
большие периоды в мышечных волокнах [91].

Малоугловые рефлексы, наблюдаемые на рентгенограммах
некоторых кератинов и парамиозина, удается объяснить как ре-
зультат дифракции на биспиральных структурах. Эти структуры
могут возникнуть при дополнительном закручивании спирали в
спираль с большой величиной витка. Наблюдаемые при этом
периоды близки к 200 А.

Во всех остальных случаях интерпретация малоуглового дис-
кретного рассеяния на волокнах менее обоснована. Очень часто
дискретные малоугловые рефлексы объясняют упорядоченным
расположением белковых субъединиц в волокне (коллаген, мио-
зин). Однако детального сравнения размеров субъединиц и вели-
чины периода, наблюдаемого под малыми углами, проведено
не было.

Иногда малоугловые рефлексы объясняют как результат пе-
риодического расположения аморфных и кристаллических обла-
стей в волокнах (коллаген), однако и в этом случае убедитель-
ных доказательств представлено не было.

Выяснение природы основных элементов, участвующих в
структурообразовании различных тканей и обеспечивающих вы-
сокую степень упорядоченности последних,-—очень важная для
биологии задача. Для ее решения одних рентгенографических
дифракционных данных недостаточно.

Дискретное малоугловое рассеяние дают многие жидкие
кристаллы биополимеров. Оно возникает вследствие регулярно-
го расположения молекул, находящихся в жидком кристалле на
больших расстояниях одна от другой. Последовательность на-
блюдаемых межплоскостиых расстояний позволяет оценить гео-
метрию упаковки молекул в сечении, перпендикулярном их дли-
не. Чаще всего в жидких кристаллах биополимеров (нуклеопро-
теиды, синтетические полипептиды) реализуется гексагональная
упаковка. Используя специальные формулы, можно рассчитать
линейную плотность цепных молекул, т. е. массу, приходящуюся
на единицу их длины. Для ее определения необходимо знать
расстояния между молекулами, их удельный парциальный объ-
ем, концентрацию и плотность раствора [92—94].

Однако эти расчеты правомочны, если весь препарат пред-
ставляет собой однофазную систему. В противном случае сред-
няя плотность раствора не соответствует плотности определен-
ного жидкого кристалла и расчеты массы на единицу длины ста-
новятся ошибочными [95].

б.	Диффузное малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

Диффузное рассеяние рентгеновских лучей под малыми уг-
лами наблюдается на объектах, содержащих субмикроскопиче-
ские неоднородности электронной плотности. Примером таких
объектов могут служить, например, растворы макромолекул,
имеющих электронную плотность, отличную от электронной
плотности растворителя.

Диффузное рассеяние имеет вид размытия первичного пуч-
ка с постепенным спадом интенсивности по мере роста угла рас-
сеяния. Иногда оно проявляется в виде диффузных максимумов,
сосредоточенных в области малых углов. Методика, применяе-
мая для исследования диффузного рассеяния в области малых
углов, аналогична методике, используемой при изучении ди-
скретного рассеяния, в случае, если оценка интенсивности про-
изводится фотографическим методом. В последнее время стали
применять малоугловые дифрактометры, позволяющие измерять
интенсивности при помощи счетчиков. Наиболее целесообразно
использование сцинтилляционных или пропорциональных счет-
чиков со схемой дискриминации. Помимо более высокой точ-
ности в оценке интенсивностей по сравнению с фотометодом,
дифрактометры дают возможность измерить интенсивность в
абсолютной шкале. Это позволяет оценить дополнительно неко-
торые структурные параметры молекул. При обработке дан-
ных малоуглового рассеяния очень важно правильно учитывать
влияние коллимации первичного пучка на характер кривой
рассеяния.

Диффузное рассеяние рентгеновских лучей под малыми угла-
ми имеет много общего со светорассеянием и является источни-
ком информаций о размерах и форме молекул биополимеров
[12, 84, 96]. Особенно удобными объектами для этих исследова-
ний оказываются разбавленные растворы. Известно, что раство-
рители сами по себе никакого малоуглового рассеяния не дают,
поэтому весь эффект обусловлен макромолекулами. В то же
время в разбавленных растворах межмолекулярная интерферен-
ция практически отсутствует и дифракция происходит на незави-
симых молекулах.

В этом случае интенсивность рассеяния определится как сум-
ма интенсивностей рассеяния отдельными молекулами. Пусть
амплитуда волны, рассеянной одной частицей в заданном на-
правлении, характеризуемом вектором S, определится как функ-
ция F(S). Тогда интенсивность рассеяния / такой частицей будет
пропорциональна F2(S). Так как в растворе пространственная
ориентация макромолекул беспорядочна, то, чтобы найти сред-
нюю интенсивность рассеяния, приходящуюся на одну молекулу,
необходимо усреднить F2(S) по всем пространственным ориен-
тациям молекул; получим F2(S). Интенсивность рассеяния для
гомогенного разбавленного раствора I = NF2(S), где N— число
макромолекул в облучаемом объеме.

Вся информация о строении макромолекул заключена в функции

?Ч5) - 2 3

т п

где fm и fn — рассеивающие способности атомов т и п; — pac-
с.	о s — s0 2 sin О

стояние между ними; 5 — вектор рассеяния, о =---------- =-----

X X

(см. стр. 26). Суммирование производится по всем атомам макромо-
лекулы. Набор расстояний гпт характеризует частицу. При малых S,
т. е. при малых углах рассеяния, экспонента имеет большие значения.

Один из способов обработки данных малоуглового рентгеновского
рассеяния состоит в следующем [12, 84,96]. Функцию F(S) можно
разложить по степеням S в окрестности точки S = 0 и апроксими-
ровать ее значение первыми членами разложения. Если за начало
координат принять центр «электронной» массы молекулы, то оказы-
вается, что I = A4e~1/3p2/l2, где М — суммарное число электронов в
рассеивающих молекулах; h = 2л5, а р — «электронный» радиус
инерции частицы. Центр «электронной» массы молекулы определяет-
р

ся как точка, относительно которой = 0> гДе — число

к=1

электронов в атоме k, г* — его расстояние от данной точки; сумми-
рование производится по всем р атомам молекулы. Электронный мо-
мент инерции относительно этого центра масс определяется как
р

V ZkTk', таким же моментом инерции будет обладать частица, имею-
*=i

щая Л, Z электронов и находящаяся на расстоянии р от центра элек-
*=i

тронной массы. Можно показать, что электронный радиус инерции
макромолекул эквивалентен механическому радиусу инерции относи-
тельно центра масс.

Для определения радиуса инерции частицы строится зависи-
мость In 7 от h2. В области малых углов она должна иметь вид
прямой линии. По углу наклона определяется р.

Молекулы, имеющие разную форму, могут иметь один и тот
же радиус инерции. Таким образом, кривая малоуглового рас-
сеяния не чувствительна к форме молекул, по крайней мере в
той области углов, где справедлива эта апроксимация.

Поэтому для оценки формы молекулы необходимо либо при-
влечь данные, полученные другими методами, либо проследить
за ходом кривой в большей области углов рассеяния. Знание
молекулярного веса уже достаточно для того, чтобы по радиу-
су инерции можно было бы найти форму эквивалентного эллип-
соида или цилиндра, которыми может быть апроксимирована
молекула. Иногда используются табулированные кривые рассея-
ния для частиц различной формы, с которыми сравниваются экс-
периментальные данные. Эти кривые могут строиться в различ-
ных координатах. Довольно часто для различных эллипсоидов
вращения используются координаты 1g/ и lgha* или lgI и h2.
При наложении кривых важно совпадение для больших значе-
ний h. Этот метод уже давно успешно применяется для опреде-
ления размеров и формы молекул белков и вирусов [97].

Недавно Птицын и Федоров показали, что вытянутую моле-
кулу можно отличить от сплющенной, если проследить за хо-
дом зависимости Нг2 от h [98]: для вытянутой фигуры эта зави-
симость имеет вид кривой с одним максимумом, пересекающей
ось абсцисс. По положению максимума можно рассчитать сред-
нюю толщину молекулы по формуле

d = 2’72^
4л sin ф
где d — толщина молекулы; й— угол рассеяния, соответствующий
положению этого максимума. Для диска эта кривая имеет осцилли-
рующий характер, оси абсцисс она не пересекает.

Если известна геометрическая форма молекулы, то ее размеры
легко определяются по радиусу инерции. Для шара р =	-|- R;

1 Здесь а — радиус кругового сечения эллипсоида.

5 Физические методы исследования белков
для двухосного эллипсоида вращения о эксцентриситетом е и радиу-
/2 4-е2	-• Г 6г24-Л2

—£— а; для цилиндра р = I/  12  .

Данные малоуглового рассеяния иногда позволяют- опреде-
лить объем молекулы и отношение поверхности к объему. Для
этого необходимо дополнительно измерить рассеяние в направ-
лении первичного пучка. Оно надежно измеряется при помощи
ионизационных методов, хотя иногда применяют и фотометоды,
экстраполируя значение интенсивности рассеяния при малых
углах к S = 0 и используя ее относительные величины.

Следует подчеркнуть, что методы малоуглового рассеяния
позволяют определить параметры макромолекул без учета гид-
ратной оболочки, так как рассеяние рентгеновских лучей опре-
деляется разностью электронных плотностей макромолекул и
растворителя. Это дает определенные преимущества.

В случае, если мы имеем дело с молекулами, состоящими из
жестких линейных участков, сочлененных один с другим гиб-
кими связями (к ним относятся молекулы ДНК, РНК, а также,
возможно, некоторых синтетических полинуклеотидов и полипеп-
тидов), из данных малоуглового рассеяния оказывается возмож-
ным определить толщину линейных участков. Соответствующие
формулы были выведены Птицыным и Федоровым [98, 99].
В этом случае на определенном участке кривая рассеяния ока-
жется подобной кривой для частиц удлиненной формы. Тол-
щина их определяется по положению максимума кривой, постро-
енной в координатах /Л2 от /г (см. выше).

За последние годы в Советском Союзе метод малоуглового
рассеяния рентгеновских лучей стал широко использоваться для
изучения структуры биологических макромолекул [98—102].
Можно надеяться, что эти исследования позволят получить по-
лезные данные о структуре и свойствах белков и нуклеиновых
кислот в растворах.

ЛИТЕРАТУРА

1.	Г. С. Жданов. Основы рентгеноструктурного анализа. М., Гостехиздат,
1940.

2.	А. И. Китайгородский. Рентгеноструктурный анализ. М., Гостехиз-
дат, 1950.

3.	Г. Б. Б о к и й, М. А. П о р а й - К о ш и ц. Практический курс рентгено-
структурного анализа. Изд-во МГУ, 1950.

4.	Н. В. Белов. Структурная кристаллография. М., Изд-во АН СССР, 1951.
5. М. А. П о р а й • К о ш и ц. Рентгеноструктурный анализ. Изд-во МГУ, 1960.
6. Б. К- Вайнштейн. Дифракция рентгеновых лучей на цепных моле-
кулах. М„ Изд-во АН СССР, 1963.

7.	В. Л. Б р егг. Кристаллическое состояние. М., ИЛ, 1938.

8.	Р. Джеймс. Оптические принципы дифракции рентгеновских лучей. М.,
ИЛ, 1950.
9.	Г. Л и п с о н, В. К о к р е н. Определение структуры кристаллов. М., ИЛ,
1956.

10.	М. Бургер. Рентгеновская кристаллография. М., ИЛ, 1948.

11.	А. Гинье. Рентгенография кристаллов. М., Физматгиз, 1961.

12.	А. И. Китайгородский. Рентгеноструктурный анализ мелкокристал-
лических и аморфных тел. М., Гостехиздат, 1952.

13.	Б. Л оу. В сб.: «Белки», т. II. М., ИЛ. 1956.

14.	Дж. Кендрью. В сб.: «Белки», т. Ill, М., ИЛ, 1959.

15.	R. Dickerson. В сб.: «The Proteins», v. II, 603, Acad. Press, 1964.

16.	Л. П о л и и г, P. Б. К о p e й. В сб.: «Современные проблемы биохимии». М.,
ИЛ, 1957.

17.	J. С. Kendrew, М. F. Р е г u t z. Ann. Rev. Biochem., 1957, 26, 327.

18.	A. R i c h, D. W. G r e e n. Ann. Rev. Biochem., 1961, 30, 93.

19.	D. W. Green. В сб.: «Comprehensive Biochemistry», v. 7, pt. 1, 217, Else-
vier Publ., 1962.

20.	F. M. R i c h a r d s. Ann. Rev. Biochem., 1963, 32, 269.

21.	H. С. А и д p ее в а. Усп. совр. биол., 1964, 58, 3.

22.	J. К г a u t. Ann. Rev. Biochem., 1965, 34, 247.

23.	M. E. P e r u t z. «Proteins and Nucleic Acids. Structure and Functions»,
Elsevier Publ., 1962.

24.	Г. С. Л а и д с б e p г. Оптика. M., Гостехиздат. 1947.

25.	M. L. Ludwig, J. C. Paul, G. S. Pawley, W. N. L i p s с о m b. Proc.
Nat. Acad. Sci., 1963, 50, 282.

26.	J. T. F i n c h, А. К 1 u g. Nature, 1959, 183, 1703.

27.	M. Harding, D. Hodgkin, A. Kennedy, A. Connor, R. Weizt-
m a n n. J. Mol. Biol., 1966, 16, 227.

28.	R. B. Corey, J. Donohue, K. N. Trueblood, K. J. Palmer. Acta
Cry st., 1952, 5, 701.

29.	А. К 1 u g, J. T. F i п c h. J. Mol. Biol., 1960, 2, 189.

30.	E. С. Федоров. Симметрия и структура кристаллов (основные работы),
серия «Классики науки». Л.— М., Изд-во АН СССР, 1949.

31.	«International Tables for X-ray Crystallography», The Kynoch press, Birmin-
gam, England, 1952.

32.	P. P. E w a 1 d. Zs. f. Kristallographie, 1921, 56, 129.

33.	M. M. Уманский. Аппаратура рентгеноструктурных исследований. М.,
Физматгиз, I960..

34.	М. Buerger. «The photography of reciprocal lattice», ASXRED, 1944.

35.	M. Buerger. «The Precession Method in X-Ray Crystallography». New
York, Wiley, 1964.

36.	U. W. A r n d t, D. С. P h i 11 i p s. Acta cryst., 1961, 14, 807.

37.	T. C. F u r n a s, D. H a r k e r. Rev. Sci. Instr., 1955, 26, 449.

38.	D. L. D. Caspar, A. Klug. Cold Spring Harbor Symp. on Quant. Biol.,
vol. 27, 1, 1962.

39.	Б. К. Вайнштейн, H. А.'Киселев. В сб.: «Вирусология и иммуноло-
гия». М., Изд-во «Наука», 1964.

40.	Дж. Уотсон, Ф. Крик. В сб.: «Структура вирусов». М., ИЛ, 1958.

41.	D. W. Green, V. М. Ing am, М. F. Perutz. Proc. Roy. Soc., 1954,
A225, 287.

42.	D. H a r k e r. Acta cryst., 1956, 9, 1.

43.	J. C. Kendrew, G. Bodo, H. M. D i n t z i s, R. G. Parrish, H. W.
W у с k о f f, D. С. P h i 11 i p s. Nature, 1958, 181, 662.

44.	J. C. Kendrew, R. Dickerson, В. E. Strandberg, R. G. Hart,
D. R. Davies, D. C. Phillips, V. C. Shore. Nature, 1960, 185, 422.

45.	M. F. P e r u t z, M. G. R о s s m a n n, A. C u 11 i s, H. M u i r h e a d, G. W i 11,
A. С. T. N о r t h. Nature, 1960, 185, 416.

46.	D. В 1 о w, F. H. С. C r i c k. Acta cryst., 1959, 12, 794.

47.	D. M. В 1 о w. Proc. Roy. Soc., 1958, A247, 302.

48.	D. M. В 1 о w, M. G. Rossmann. Acta cryst., 1961, 14, 1195.
49.	M. G. R о s s m a n n, D. М. В 1 о w. Acta cryst., 1962, 15, 24.

50.	M. G. Rossmann, D. M. Bio w. Acta cryst., 1963, 16, 39.

51.	A. С. T. N о r t h. Acta cryst., 1965, 18, 212.

52.	B. W. M a 11 h e w s. Acta cryst., 1966, 20, 230.

53.	R. E. Dickerson, J. C. Ken drew, В. E. Strandberg. Computing
Methods and Phase Problem in X-Ray Crystal analysis, Pergamon Press,
236, 1961.

54.	G. Kartha, R. Parthasarathy. Acta cryst., 1965, 19, 883.

55.	A. F. C u 11 i s, H. M u i r h e a d, M. F. Perutz, M. G. R о s s m a n n,
Л. С. T. N о г t h. Proc. Roy. Soc., 1962, A265, 161.

56.	H. M u i r h e a d, M. F. P e r u t z. Nature, 1963, 199, 633.

57.	С. C. F. В 1 a к e, R. H. F e n n, A. С. T. N о r t h, D. С. P h i 11 i p s, R. J. P o-
Ijak. Nature, 1965, 206, 100; D. C. Phillips. Sci. Amer., 1966, N 11.

58.	J. Kraut, L. C. Siecker, D. F. High, S. T. Freer. Proc. Nat. Acad.
Sci., 1962, 50, 282.

59.	С. C. F. В 1 a к e, D. F. К о e n i g, G. A. M a i г, A. С. T. N о r t h, D. С. P h i 1-
1 i p s, V. R. S a r m a. Nature, 1965, 206, 757.

60.	J. C. Ken drew, H. C. Watson, В. E. Strandberg, R. E. Dicker-
son. Nature, 1961, 190, 666.

61.	M. F. P e r u t z, J. С. К e n d r e w, H. C. Watson. J. Mol. Biol., 1965, 13,
669.

62.	M. F. P e r u t z. J. Mol. Biol., 1965, 13, 646.

63.	Дж. К e н д p ь io. Биофизика, 1963, 8, 273.

64.	M. Ф. П e p у т ц. Биофизика, 1964, 9, 1.

65.	L. N. Johnson, D. C. Phillips. Nature, 1965, 206, 761.

66.	L. Pauling, R. B. Corey, H. Branson. Proc. Nat. Acad. Sci., 1951. 37,
205.

67.	J. D. Watson, F. H. C. Crick. Nature, 1953, 171, 737, 964.

68.	Б. К. В а й н ш т e й и. Кристаллография, 1959, 4, 842.

69.	H. С. Андреева, В. И. Ивер оно в а. Биофизика, 1957, 2, 282.

70.	В. П. Тарасова, А. А. Звягина. Заводская лаборатория, 1967.

71.	С. С. Квитка. Кристаллография, 1956, 1, 485.

72.	А. Е 11 i о t. J. Sci. Instr., 1965, 42, 312.

73.	Б. К. Лемажихин, Л. А. Лебедев. Приборы и техн, эксп., 1960,
1, 136.

74.	W. Cochran, F. Н. С. Crick, Н. Vand. Acta cryst., 1952, 5, 582.

75.	R. E. Franklin, R. G. Gosling. Acta cryst., 1953, 6, 151.

76.	P. Франклин, К. Холмс. В сб.: «Структура вирусов». М., ИЛ, 1958.

77.	R. D. В. F г a s е г, Т. Р. MacRae. Biochim. et biophys. acta, 1958, 29, 229.

78.	В. Langridge, H. R. Wilson, C. W. Hooper, M. H. F. Wilkins,
L. D. H a m i 11 о n. J. Mol. Biol., 1960, 2, 19.

79.	M. Вилкинс. Биофизика, 1963, 8, 641.

80.	A. R i c h, F. H. С. C r i c k. Nature, 1955, 176, 915.

81.	A. E 11 i о t. В сб.: «Synthetic Polypeptides», AP, 1965.

82.	G. N. Ramachandran, G. Kartha. Proc. Indian Acad. Sci., 1955,
A42, 215.

83.	О. К r a t k y. Zeitschr. Electrochem., 1954, 58, 49.

84.	A. G u i n i e r, G. Fournet. «Small Angle X-ray Scattering». Wilev, New
York, 1955.

85.	X. Фернандес-Моран. В сб.: «Современные проблемы биофизи-
ки», т. II. М., ИЛ, 1961.

86.	R. S. В е а г. J. Amer. Chern. Soc., 1945, 67, 1625.

87.	R. Langridge, К. Holmes. J. Mol. Biol., 1962, 5, 611.

88.	R. S. Bear. J. Amer. Chern. Soc., 1944, 66, 1297.

89.	C. Cohen, J. Hanson. Biochim. et biophys. acta, 1956, 21, 177.

90.	L. S try er, C. Cohen, R. Langridge. Nature, 1963, 197, 793.

91.	H. E. H u x 1 e y. Proc. Roy. Soc., 1953, B141, 59.

92.	V. Luzzati, A. Nicolaieff, F. Masson. J. Mol. BioL, 1961, 13,
185.
93.	V. Luzzati, J. Witz, A. N i с о 1 a i e f f. J. Mol. Biol., 1961, 3, 367,
379.

94.	V. Luzzati, M. Cesari, G. S p a c h, F. Masson, J. M. Vincent.
J. Mol. Biol., 1961, 3, 556.

95.	D. A. D. P a г г у, A. E 11 i о t. Nature, 1965, 206, 616.

96.	E. А. Пор ай - Кошиц. Усп. физ. наук, 1949, 39, 600.

97.	О. К г a t к у. В сб.: «Progress in Biophysics and Molecular Biology»,
1964, 13, 105.

98.	Б. А. Федоров, T. M. Б и p ш т e й н, О. Б. Птицын. Биофизика,
1963, 8, 288.

99.	Б. А. Федоров, О. Б. Птицын. Докл. АН СССР, 1963, 153, 882.

100.	А. А. В а з и н а. Канд. дисс. Ин-т биофиз. АН СССР, 1965.

101.	Б. К. Вайнштейн, Л. А. Фейгин. Докл. АН СССР, 1965, 161, 1444.

102.	Б. А. Федоров. Канд. дисс. Ин-т высокомолек. соед. АН СССР, 1965.

103.	Р. В. S i е g 1 е г, В. A. Jeffery, В. W. Matthews, D. М. В 1 о у. J.
Mol. Biol., 1966, 15, 175.

104.	Б. К- Вайнштейн. Усп. физ. наук. 1966, 88, 527.
Глава II
ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

1.	Методы электронномикроскопических исследований био-
логических макромолекул. И. Л. Киселев, В. Ф. Мамиков 70

а.	Особенности электронной микроскопии биологических
объектов........................................70

б.	Пленки-подложки	для	препаратов	.....	72

в.	Методы контрастирования молекул белков, нуклеи-

новых кислот, вирусов........................... 74

г.	Исследование молекул	нуклеиновых	кислот	...	89

2.	Исследование ультратонких срезов. Ю. С. Ченцов . .	97

а.	Фиксация....................................97

б.	Заливка....................................101

в.	Изготовление ультратонких	срезов	.....	105

г.	Специальные	приемы	обработки	тканей	и	срезов	.	108

Литература..............................................110

1.	Методы электронномикроскопических исследований
биологических макромолекул1

а. Особенности электронной микроскопии
биологических объектов

Электроны, проходя через вещество объекта, изменяют свои
траектории — рассеиваются. Приближенно отношение между
числом попадающих на участок образца электронов N и числом
рассеивающихся на угол, больший 9, электронов AW можно вы-
разить следующим образом [2, 4, 6]:

N ~ А

где р—плотность исследуемого вещества; Na— число Авогад-
ро; А — атомный вес; Z —атомный номер; V — ускоряющее на-
пряжение; е — заряд электрона; t — толщина образца.

1 Читатели, интересующиеся вопросами теории электронной микроскопии
и эксплуатации приборов, могут познакомиться с ними в работах [1—8].
Таким образом, число рассеянных электронов возрастает с
увеличением плотности вещества, его атомного номера, толщины
образца и уменьшением энергии электронов.

Практика показывает, что при современных методах контра-
стирования биологических макромолекул оптимальные ускоряю-
щие напряжения для их исследования находятся в диапазоне
70—100 кв. При напряжении ниже 70 кв образец быстрее раз-
рушается под воздействием электронов. В результате потери
энергии частью электронов при прохождении через объект увели-
чивается хроматическая аберрация, уменьшается разрешение
[9, 10]. При напряжении выше 100 кв детали исследуемых струк-
тур также выявляются хуже из-за уменьшения рассеивания элек-
тронов. Повышенные ускоряющие напряжения (например, 150 кв
и более) с успехом используются в кристаллографии и металло-
физике.

Биологические объекты состоят из веществ с малым атомным
номером — из водорода, углерода, азота, фосфора и т. д. Плот-
ность для различных биологических объектов составляет от 1
до 2 г/см3. Минимальная толщина биологического объекта такой
плотности, выявляемая при ускоряющем напряжении в электрон-
ном микроскопе 50 кв, равна примерно 50 А [11]. Практически
неконтрастированные частицы небольших вирусов, расположен-
ные на поддерживающей пленке, наблюдаются в электронном
микроскопе в виде бесструктурных пятен, а отдельные неконтра-
стированные молекулы нуклеиновых кислот вообще не видны.
Между тем задача современной электронной микроскопии в био-
логии состоит в том, чтобы по возможности глубже проникнуть
в строение клетки и ее структурных компонентов, а также в стро-
ение вирусных частиц. В связи с этим биологические объекты
приходится тем или иным способом контрастировать.

Наряду с контрастированием оттенением металлами и исполь-
зованием широко распространенного метода реплик разработаны
специфические методы контрастирования, применяемые главным
образом в биологии. Широкое применение получил метод избира-
тельного «окрашивания» тканей, тонких срезов и отдельных час-
тиц и молекул солями тяжелых металлов, а также метод так на-
зываемого негативного контрастирования.

К специфическим особенностям электронной микроскопии в
биологии относится также большая вероятность возникновения
артефактов, т. е. внесенных в структуру объекта искажений его
реальной формы. Это связано, с одной стороны, с процессом фик-
сации и высушивания, с другой — с процессом контрастирования.
Для обнаружения артефактов и предотвращения их необходимы
тщательный анализ полученного изображения и сравнение полу-
ченных данных с результатами других исследований.
б.	Пленки-подложки для препаратов

Биологические макромолекулы для исследования их в элек-
тронном микроскопе размещаются на тончайших пленках-под-
ложках. В свою очередь, опорой для этих пленок служат специ-
альные сетки, изготовленные из меди электролитическим спосо-
бом или сплетенные из тонкой проволоки. Те же электроны, кото-
рые формируют изображение исследуемых объектов, взаимодей-
ствуют и с пленкой-подложкой. Поэтому, если толщина пленки
относительно велика или материал, из которого она изготовле-
на, сильно рассеивает электроны, контрастность изображения по-
мещенного на ней объекта резко ухудшается. Материал пленки
должен быть механически прочным, обладать хорошей теплопро-
водностью и стойкостью к электронной бомбардировке. Иногда
препараты, расположенные на пленке-подложке, подвергаются
специальной обработке. В этих случаях к пленке предъявляют
дополнительные требования химической стойкости.

Следует отметить еще одну важную особенность пленок-под-
ложек. При исследовании молекул биополимеров поддерживаю-
щая пленка в силу свойств своей поверхности (гидрофильность
или гидрофобность, наличие заряда) может оказывать сущест-
венное влияние на их конфигурацию. Это необходимо учитывать
при выборе подложки или трактовке результатов.

В практике электронномикроскопических исследований био-
логических макромолекул чаще всего используются коллодиевые
и углеродные пленки. Формваровые и кварцевые пленки, одно
время широко распространенные, употребляются редко. Некото-
рые свойства пленок-подложек приведены в табл. 1. В специаль-
ных случаях, например при исследовании молекул нуклеиновых
кислот, используются подложки с особыми свойствами, о кото-
рых будет сказано в дальнейшем.

Таблица 1
Некоторые свойства пленок-подложек [12]

Пленка	Прозрачность по отношению к электронам	Механическая прочность	Стойкость к электронной бомбардировке	Химическая стойкость
Коллодиевая Углеродная Кварцевая	Большая Средняя Малая	Низкая Высокая Средняя	Низкая Высокая Средняя	Низкая  Очень высокая  Высокая

Коллодиевые пленки-подложки просты в изготовлении. Что-
бы их получить, пользуются 0,5—2%-ным раствором коллодия в
амилацетате. Каплю такого раствора наносят на поверхность
воды, налитой в чашку диаметром около 20 см (рис. 1). Капля
быстро растекается, и после испарения амилацетата образуется
тонкая пленка. Уровень воды в чашке постепенно понижают, и
пленка опускается на пластинку с сеточками, помещенную на дне
сосуда. Известны и другие способы изготовления коллодиевой
пленки [10]. Пленки из формвара получить труднее, так как его
растворители (диоксан, дихлорэтан, хлороформ) не растекаются
по поверхности воды. В этом случае каплю 0,1— 0,2%-ного рас-
твора наносят на край чистой стеклянной пластинки и дают ей
возможность растечься по всей поверхности. Отделить образо-
вавшуюся пленку от стекла можно в воде [10].

Углеродные, кварцевые пленки и пленки из окиси кремния по-

лучают испарением соответствующих материалов в вакууме.
Наибольшими преимуществами
обладают углеродные пленки.

Техника изготовления проста и
имеет много общего с изготовле-
нием углеродных реплик.

Ранее мы отмечали, что каче-
ство изображения объекта зави-
сит от толщины пленки-подложки.
Уменьшение толщины пленки сни-
жает ее механическую прочность.
Слишком тонкая пленка будет
разрываться в процессе препари-
рования или под влиянием пучка
электронов. Тонкими пленками

Рис. 1. Один из способов изготов-
ления коллодиевой пленки

1 — коллодиевая пленка на поверхно-
сти воды; 2— сетка

можно пользоваться, если приме-
нять в качестве дополнительной
опоры дырчатые пленки, изготов-
ленные из коллодия и укреплен-

ные слоем углерода.

Известно несколько способов [10], получения дырчатых пле-
нок. Простейшим из них является метод Хаксли [13] в модифи-
кации В. А. Марихина и Л. П. Романовой [14]. Он основан на
том, что при быстром испарении растворителя из раствора кол-
лодия, нанесенного тонким слоем на поверхность стекла, в плен-

ке образуются мелкие сквозные отверстия, размер которых мож-
но регулировать изменением процентного содержания коллодия
в растворе. В 0,2—0,3%-ный раствор коллодия в ацетоне или
амилацетате погружают чистое стекло. Затем его вынимают
и сушат в вертикальном положении. После испарения рас-
творителя на стекле остается голубовато-белая пленка. Ее
тщательно счищают с краев и отделяют от поверхности стекла
погружением последнего в воду. Понижая уровень воды, в сосуде,
плавающую на поверхности пленку опускают на сеточки, разме-
щенные на дне сосуда. После высушивания и контроля качества
дырчатой пленки в электронном микроскопе ее укрепляют с
одной или с двух сторон слоем распыленного в вакууме углеро-
да. В некоторых лабораториях после нанесения слоя углерода
коллодий удаляют, растворяй его амилацетатом.
в.	Методы контрастирования молекул белков,
нуклеиновых кислот, вирусов

Рис. 2. Схематическое изображение
оттенения

а — распределение металла и образование
тени при использовании метода оттенения:
б — образование тени от объекта сфериче-
ской или цилиндрической формы; 1 — объ-
ект; 2 — поддерживающая пленка; 5 —
оттеняющий напыленный слой; 4— источ-
ник испаряющегося металла; h — высота
объекта; I — длина тени; t — толщина от-
теняющего слоя; 0 — угол оттенения; г —
радиус сферической частицы; R — расстоя-
ние от испарителя до поверхности

чатки, сделанные при помощи

Контрастирование оттенением. Прежде всего
производится испарение металла в вакууме. При этом атомы ме-
талла разлетаются от места испарения по прямолинейным траек-
ториям. Если под некоторым углом к направлению пучка распы-
ляемых частиц поместить исследуемый объект, то на его поверх-
ности будет осаждаться слой
металла различной толщины.
На участках, расположен-
ных перпендикулярно к на-
правлению полета частиц,
образуется наиболее толстый
слой. В тех местах, где объ-
ект будет экранировать пу-
чок частиц, возникают «те-
ни» (рис. 2). Рассеяние элек-
тронов для различных уча-
стков объекта оказывается
различным, в результате чего
контрастность изображения
возрастает. В связи со спе-
цифическим явлением обра-
зования тени, угол между
направлением распыляемых
частиц и объектом называет-
ся углом оттенения, а сам
метод — методом оттенения.

На отпечатках микрофо-
тографий оттененных объек-
тов, выполненных непосред-
ственно с негативов, «тени»
выглядят светлыми (рис.
3, а). Однако привычнее на-
блюдать тени темными. По-
этому микрофотографии та-
ких объектов обычно дела-
ются как негативные отпе-
промежуточного позитива

(см. рис. 3, б).

• Рассматриваемый метод позволяет не только увеличить кон-
трастность изображения, но и установить размеры исследуемых
объектов. Действительно, измерив длину тени I и зная угол отте-
нения 8, можно определить высоту объекта h (см. рис. 2, а)

й = I tg 0.

(1)
Рис- 3- Вирус табачной мозаики. Углеродная реплика с предварительным от-
тенением сплавом платины с палладием. Отношение длниы- теии к высоте
объекта 4:1.

а — отпечаток с негатива; б — позитив; I — длина тени; -S—ширина частицы; в — схе-
матическое изображение углеродной реплики с предварительным оттенением; частица
ВТМ просматривается вдоль оси

Заказ 648и
Для сферической или цилиндрической частицы (см. рис. 2, б)
радиус частицы г определяется по формуле

r = Ztg|.	(2)

Для небольших углов оттенения практически можно исполь-
зовать формулу

D»Ztg0,	(3)

где D — диаметр частицы. Величина угла оттенения 0 обычно вы-
ражается через tgO или дается как отношение длины тени к вы-
соте объекта, например, 5: 1 или 10:1.

Существенным недостатком метода является ограничение
разрешения деталей объекта величиной зерна напыленного ме-
талла. Атомы металла, нанесенные на подложку, агрегируют.
Величина агрегатов зависит в первую очередь от природы атомов
и поверхности подложки. По мере накопления новых атомов раз-
меры агрегатов увеличиваются, образуются кристаллы металла.
При уменьшении угла оттенения неровности слоя металла увели-
чиваются благодаря скоплению атомов в местах попадания
первых атомов [15], что на практике приводит к увеличению зер-
на. На поверхности подложки всегда имеются неровности и за-
грязнения, например, за счет попадания паров масла из диффу-
зионного насоса. Это также способствует увеличению зернисто-
сти при небольших углах оттенения. В напыленных слоях
некоторых металлов значительное увеличение зернистости (гра-
нуляции) может возникнуть под электронным пучком в процессе
просмотра образца.

Тонкие слои металла при прочих равных условиях обладают
меньшей зернистостью, но контрастность изображения при этом
снижается. Чтобы обеспечить удовлетворительную контрастность
при минимальном напыленном слое, металл должен обладать
большой рассеивающей способностью для электронов и большой
плотностью.

Чаще всего для оттенения белковых молекул [16], вирусов [17],
нуклеиновых кислот [16—27], рибосом [28] используются платина,
палладий, сплав платины с палладием, вольфрам, реже — уран.
В табл. 2 приведены некоторые данные по этим металлам.

Платина обладает большой плотностью и устойчивостью к
электронной бомбардировке. Можно получить размеры зерна
платины менее 25 А (7, 10]. Недостатком является то, что плати-
на сплавляется с вольфрамом, из которого обычно делают нагре-
ватели, поэтому ее трудно испарить. Сплав платины с палладием
(отношение платины к палладию от 3:1 до 4:1) испаряется легче,
чем платина, и также характеризуется небольшим зерном. Пал-
ладий обладает несколько меньшей, чем платина, рассеивающей
Таблица 2

Свойства материалов,
рекомендуемых для контрастирования оттенением и изготовления реплик

Материал	Назначение материала	Толщина ♦ слоя (t), А	Плотность (Р), г;см	Темпе- ратура плавле- ния, °C	Величина зерна напыленных слоев **, А		Взаимодействие с испарителем из воль- фрамовой проволоки
Платина . . .	Оттене- ние	7	21,45	1774	Менее	25	Значительное
Палладий . . .  Сплав платины	То же	10	11,4	1555	25—50		Слабое
с палладием . .	»	7-8	19,4	—	Менее	25	»
Уран		»	6	18,7	1132	То же		Значительное
Углерод . . .	Реплики	50-200	1,8-2,0	Воз- гонка 3540				

* Приведены значения толщины пленки, рекомендуемые для расчетов по формуле (7).

** Указано минимальное значение.

*** Под воздействием пучка увеличивается.

способностью, и под воздействием электронного пучка в его сло-
ях наблюдается грануляция.

Для испарения металла в вакууме чаще всего используют
нагрев при помощи нити из вольфрамовой проволоки диаметром
0,5—1 мм, которой придается V-образная форма (рис. 4, а). Та-
кая нить позволяет испарять металлы, взаимодействующие с
вольфрамом: платину, сплав платины с палладием, уран и др.
Небольшой кусок проволоки или полоску фольги испаряемого
металла изгибают в виде скобки и подвешивают в месте перегиба
нити, которая нагревается током; металл расплавляется, обра-
зуя в месте перегиба каплю, которая приближенно может рас-
сматриваться как точечный источник испарения. Для испарения
платины рекомендуют пользоваться тонкой проволокой, обматы-
вая ею нить в месте перегиба.

При использовании другого типа нагревателя — конической
спирали (см. рис. 4, б) — испаряемое вещество помещают в об-
разующуюся «корзиночку». Распыление в этом случае происхо-
дит неравномерно во все стороны, большая часть вещества рас-
пыляется вверх. Нагреватель такой формы может быть использо-
ван только для испарения металлов, не реагирующих или слабо
взаимодействующих с вольфрамом, например для испарения
хрома.

Вольфрам характеризуется большой плотностью и при испа-
рении в достаточно высоком вакууме (3—4-10-5 мм рт. ст.) дает
очень мелкое зерно. Однако практическое использование воль-
фрама для контрастирования сопряжено с некоторыми трудностя-
76
ми. Чтобы испарить вольфрам, нагревают током нить из воль-
фрамовой проволоки. Ввиду неравномерности распределения
температуры по длине нити, испарение происходит с ее централь-
ного участка. В этом месте нить утончается, изменяется ее
сопротивление и происходит перегрев. Между тем температура,
при которой происходит интенсивное испарение вольфрама,
близка к температуре его плавления. Поэтому даже незначитель-
ное повышение температуры может привести к расплавлению
нити. Для поддержания температуры испарения и предохранения

Рис. 4. Нагреватели для испарения различных материалов
а—V-образная нить; б—коническая спираль из вольфрамовой проволоки; в—графито-
вые стержни, образующие в месте контакта соединение с высоким электросопротивлением

нити от перегорания Харт [29] предложил способ автоматическо-
го регулирования нагрева нити, основанный на использовании
для регулирования нагрева нити тока термоэмиссии, возникаю-
щего при испарении металла. В простейшем случае необходимый
термоэмиссионный ток поддерживается ручной регулировкой.
Однако изменения тока происходят настолько быстро, что ручная
регулировка оказывается малоэффективной. Нами совместно с
С. Д. Поповым разработана электронная схема автоматического
регулирования, состоящая из тиратрона, реле и других элемен-
тов (рис. 5, в).

Схема работает следующим образом. Изменения тока термо-
эмиссии вызывают зажигание или гашение тиратрона. В анодную
цепь последнего включено реле (Р), которое подключает к пер-
вичной обмотке накального трансформатора (Тр2) большее или
меньшее сопротивление (7?ь jR2), изменяя тем самым нагрев ни-
ти (//). При повышении тока термоэмиссии выше установленно-
го потенциометром уровня, определяемого при помощи микро-
амперметра (мкА), зажигается тиратрон, реле срабатывает и
подключает к первичной обмотке трансформатора большее со-
противление, уменьшая нагрев нити. Следовательно, на каждое
изменение тока термоэмиссии схема реагирует таким образом,
4

a

Рис. 5. Схема установки для испарения в вакууме

а —с неподвижным столиком; б — с вращающимся столиком; в — электронная схем,
автоматического регулирования тока накала нагревателя (объяснение в тексте); / — пле-
ти; 2 колпак; 3 — столик для размещения препаратов; 4 — нагреватель для испареииг
металла; 5 —заслонка; 6— вращающийся столик с приводом от электромотора

что поддерживается некоторое постоянное значение тока, позво
ляющее избежать перегорания нити и испарить нужное количе-
ство металла.

Так как испарение вольфрама происходит довольно медленш
и для получения достаточно контрастного оттенения требу-
ется 15—20 мин., возникает опасность теплового разрушения
препарата. Чтобы избежать этого, желательно охлаждать препа-
рат или производить оттенение через диафрагму. Мы произво-
дили оттенение вольфрамом, помещая нить длиной 2 см и
диаметром 0,4 мм на расстоянии 5 см от объекта. При токе тер-
78
моэмиссии 100 мка достаточно контрастное оттенение получали
при испарении вольфрама в течение 15 мин.

Нужно сказать, чт$ способ автоматического регулирования
нагрева нити дает хорошие результаты и в тех случаях, когда
он используется в качестве нагревателя для испарения платины
и других металлов. В этом случае обеспечивается медленное и
равномерное испарение.

Оттенение производится в специальных вакуумных установ-
ках. Принципиальная схема такой установки представлена на
рис. 5, а, б. Чтобы получить удовлетворительную контрастность,
давление в момент испарения должно быть не более 5- 10~5 мм
рт. ст. При более высоком давлении увеличивается рассеивание
атомов металла на молекулах газов, частицы попадают на уча-
стки теней, что ведет к снижению контрастности.

Для удовлетворительного оттенения необходимо задать
количество испаряемого металла. Если допустить, что распыля-
емый материал распространяется равномерно во все стороны от
точечного источника, то количество металла, напыляемого на
единицу площади поверхности (W, в г!см2), наклоненной по от-
ношению к пучку распыляемых частиц на угол 0, будет равно

где Л4 — вес испаряемого металла (в г); — расстояние от испа-
рителя до поверхности (в см). С другой стороны, это количество
металла можно выразить через толщину напыленного слоя и
плотность металла

Г = /р,

(5)

где t — толщина напыленного слоя (в см)\ р— плотность метал-
ла (в г/см3).

Подставляя значение W в уравнение (4), получим формулу
для определения количества металла (в г)

sin 0

(6)

Таким образом, количество металла для испарения пропор-
ционально квадрату расстояния, увеличивается с уменьшением
угла оттенения и зависит от свойств металла.

Экспериментальное исследование показывает, что в некото-
рых случаях формула (6) дает существенную ошибку. Это связа-
но с неравномерностью распыления металла во все стороны, не-
точностью оценки толщины напыленного слоя и его плотности.
Кроме того, если испаряемый металл реагирует с вольфрамом,
часть его сплавляется с нитью. Бредли [7] рекомендует пользо-
ваться формулой (6), подставляя в правую часть равенства
коэффициент 4/з и используя значения толщины напыленных сло-
ев, приведенные в табл. 2. В этом случае формула будет выгля-
деть так:

(7)

3sin0	v 7

Формула (7) полезна для приближенной оценки навески ме-
талла в тех случаях, когда экспериментатор начинает работать
с новым, не знакомым ему оттеняющим материалом, или когда
угол оттенения меняется.

Количество металла, необходимое для оттенения, можно оп-
ределить также и экспериментально. Для этого берут навеску
металла, например, определенную по формуле (7), и производят
ее испарение. Контроль за испарением легко вести при помощи
пластинки белой керамики, помещая на нее небольшую каплю
диффузионного масла. Во время испарения слой осаждающего-
ся металла отчетливо виден на всей поверхности керамической
пластинки, за исключением масляного пятна. После контроля
качества оттенения непосредственно в электронном микроскопе
навеска испаряемого металла в случае необходимости изменяет-
ся и в процессе испарения керамика доводится до большего или
меньшего потемнения. Большинство металлов сплавляется с
вольфрамом. Влияние этого взаимодействия невозможно
учесть, поэтому контроль за оттенением по керамической
пластинке всегда остается полезным.

Большое значение имеет правильный выбор материала под-
ложки. Собственная структура подложки должна быть незна-
чительной по сравнению с размерами оттеняемых частиц. В ка-
честве подложки для препарата при оттенении обычно исполь-
зуют коллодиевые или углеродные пленки. При использовании
реплик с предварительным оттенением, о которых мы еще бу-
дем говорить, оттеняемый препарат обычно помещают на иде-
ально гладкую поверхность слюды.

При выборе угла оттенения руководствуются главным обра-
зом профилем объекта и его размерами. В случае оттенения ви-
русов, белковых кристаллов, бактерий использовать углы, для
которых tg 0<Vs нецелесообразно. Для оттенения нитевидных
молекул, в связи с их малыми поперечными размерами, tg 6
уменьшают до Vio-

Измерив длину тени и зная угол оттенения, можно без осо-
бых затруднений по формулам (1—3) определить высоту объ-
екта. Рассмотрим эту операцию на примере вируса табачной
мозаики (ВТМ). Как известно, ВТМ представляет собой ци-
линдрический полый стержень диаметром около 170 А, построен-
ный из одинаковых, расположенных по спирали белковых субъ-
единиц. На микрофотографиях этого вируса, контрастированно-
го оттенением, его частица выглядит как палочка (см. рис. 3).
Чтобы определить диаметр частицы, необходимо измерить дли-
ну тени в направлении оттенения. Для этой цели удобно исполь-
зовать частицы, ориентированные перпендикулярно направле-
нию оттенения. Замеры показывают, что длина тени (/) состав-
ляет около 700 А. Отношение длины тени к диаметру частицы
составляет в данном случае 4: 1 (tg 6 = */4). Простой расчет по-
казывает, что диаметр ВТМ равен 170 А. При оттенении проис-
ходит накопление металла на объекте. Связанное с этим иска-
жение реальных размеров оттененных частиц исследовалось при
помощи измерения ширины частиц ВТМ, ориентированных па-
раллельно оттенению. Оказалось, что их ширина увеличивается
пропорционально количеству напыленного металла [16, 30]. На
приводимой нами микрофотографии ширина таких частиц (S)
составляет около 200 А, т. е. отличается от реальных размеров
на 30—40 А. Это необходимо учитывать при определении разме-
ров небольших частиц, например «сферических» вирусов. Раз-
меры тех же частиц ВТМ, определенные по длине отбрасыва-
емой тени, как мы показали выше, практически не отличаются
от реальных размеров.

В тех случаях, когда по длине тени оценивают высоту объек-
та, важно-точно знать угол, под которым производится оттене-
ние. Для увеличения точности можно пользоваться сферически-
ми частицами латекса полистирола, наносимыми на подложку
для оттенения вместе с препаратом. Непосредственное измере-
ние на микрофотографии диаметра частиц латекса и длины те-
ни от них позволяет установить угол, под которым происходило
оттенение препарата на данном участке подложки.

Метод углеродных реплик с предварительным
оттенением. Метод реплик заключается в том, что рельеф по-
верхности объекта воспроизводится при помощи тонкой пленки,
которая затем исследуется в электронном микроскопе. Сущест-
вуют два основных способа изготовления реплик — одноступен-
чатый и двухступенчатый. При одноступенчатом способе иссле-
дуемый образец покрывают слоем вещества, передающим рель-
еф поверхности и образующим после отделения от образца реп-
лику. При двухступенчатой методике с образца первоначально
делают так называемый промежуточный отпечаток, с которого
затем снимают реплику. Последний способ используется глав-
ным образом при исследовании поверхности массивных объек-
тов в металловедении [6, 7, 12].

Одноступенчатый способ изготовления реплик получил широ-
кое распространение при исследовании биологических препара-
тов. В этом случае в качестве материала пленки, воспроизводя-
щей рельеф, используют формвар или коллодий (если не тре-
буется высокое разрешение) и напыленные в вакууме слои угле-
рода или кварца (если необходимо изготовить реплики с высо-
ким разрешением). Мы будем рассматривать так называемые

6 Физические методы исследования белков

18
углеродные реплики с предварительным оттенением, которые
просты в изготовлении и являются, по-видимому, наиболее
перспективными.

Для изготовления напыленных реплик используют те же ва-
куумные установки, что и для контрастирования оттенением.
Испарение углерода проще всего производить термическим спо-
собом, который заключается в том, что электрический ток про-
пускают через два контактирующих между собой графитовых
стержня. Одному из них придается форма острия (см. рис. 4, в).
В месте контакта происходят интенсивный нагрев и испарение
графита.

Чтобы обеспечить необходимую контрастность, реплики от-
теняют. Если металл напыляют непосредственно на исследуемый
образец, а затем наносят слой углерода, то образуется углерод-
ная реплика с предварительно оттененного препарата или, как ее
иногда называют, предварительно оттененная реплика
(см. рис. 3, в). При использовании таких реплик структура ис-
следуемого объекта передается наиболее точно, так как оттеня-
ется непосредственно его поверхность.

В данном случае термин «реплика» не совсем точен, так как
здесь углеродная пленка не служит для передачи рельефа иссле-
дуемой поверхности, а лишь несет на себе слой оттеняющего ме-
талла. После того как препарат оттенен и на него нанесен слой
углерода, состояние препарата (если последний слабо рассеи-
вает электроны) не будет сказываться на качестве изображе-
ния. Наблюдаемое в электронном микроскопе изображение
ВТМ не изменится, например, если полученная углеродно-метал-
лическая пленка будет предварительно обработана веществом,
растворяющим вирус. Таким образом, в этом отношении функ-
ции, выполняемые обычной репликой, полностью сохраняются.
Мы будем пользоваться термином «предварительно оттененная
реплика», помня о сделанных здесь замечаниях.

Негативное контрастирование. Если частицы ис-
следуемого объекта, например вирусы или отдельные белковые
молекулы, находятся на пленке-подложке в тонком слое аморф-
ного вещества высокой плотности, то на экране микроскопа они
будут выглядеть как светлые объекты на темном фоне. В этом и
заключается принцип «негативного» контрастирования.

Впервые возможность негативного контрастирования была
показана Холлом [31] и успешно использована Хаксли [32] при
исследовании строения ВТМ. Бреннер и Хорн [33] усовершенст-
вовали методику и выявили при ее помощи детали строения
бактериофага Т2. В настоящее время эта методика широко
используется для контрастирования различных вирусов [34—39],
рибосом [40—42] и крупных белковых молекул [43—46].

Выбор веществ для негативного контрастирования опреде-
ляется целым комплексом требований. Это вещество должно
иметь высокую плотность и быть стойким к воздействию
электронного пучка. После его высыхания на подложке должен
создаваться аморфный слой. Вещество ’использовать нельзя,
если при взаимодействии с ним строение исследуемого объекта
нарушается.

Наиболее распространено контрастирование 2%-ным водным
раствором фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК), доведенным
до необходимого значения pH добавлением КОН или NaOH.
Микрофотография ВТМ, контрастированного ФВК, приведена
на рис. 6. Примерно такое же контрастирующее действие ока-
зывают вольфрамат натрия и молибденовокислый аммоний.
Микрофотография вируса костра безостого, контрастированно-
го ’молибденовокислым аммонием, показана на рис. 7.

Ниже приведены некоторые вещества, используемые для не-
гативного контрастирования.

Вещество

Безводная
плотность

Аммоний молибденовокислый .................. —

Уранилацетат ............................ 2,89

Уранилнитрат ............................ 3,7

Уранилформиат............................ 3,69

Фосфорновольфрамовая кислота ............ 3,8

Вольфрамат натрия........................ 4,2

Иногда вещества, создающие негативный эффект, способны
выявлять его строение и другим способом. Так, уранилацетат
или уранилнитрат выявляют место расположения нуклеиновой
кислоты. Если в процессе препарирования ионы уранила про-
никают внутрь головки фага, то они взаимодействуют с уложен-
ной там молекулой нуклеиновой кислоты, увеличивая плотность.
Капсула вируса в этом случае выглядит не светлой, а темной.
В противовес негативному, такое контрастирование иногда на-
зывают позитивным.

Негативное контрастирование можно осуществлять, исполь-
зуя различные приемы. Чаще всего 1—2%-ный водный раствор
контрастирующего вещества, предварительно доведенный до
нужного значения pH, смешивают с суспензией исследуемых
частиц. Полученную смесь или пульверизируют на пленку-под-
ложку, или наносят пипеткой (небольшую каплю) и тут же от-
сасывают ее фильтровальной бумагой. Так как пульверизирова-
ние способствует деформации частиц .и создает худшие условия
для распределения контрастирующего вещества на подложке
[8], второй способ предпочтительнее. К тому же при пульвери-
зировании возникают дополнительные трудности, если работу
ведут с инфекционным материалом.

Другой способ —это нанесение контрастирующего вещества
на объект, который уже находится на пленке-подложке. В этом
Рис. 6. Вирус табачной мозаикн, контрастированный ФВК
а — схематическое изображение ВТМ, находящегося в слое контрастирующего
вещества; левая частица просматривается вдоль оси, правая — сбоку; б, в —
ВТМ, контрастированный ФВК
Рис. 7. Вирус костра безостого, контрастированный молибдатом
аммония
случае сокращается до минимума время взаимодействия контра-
стирующего вещества с препаратом и меньше вероятность раз-
рушения последнего.

Схематическое изображение частиц ВТМ, находящихся в
слое ФВК, показано на рис. 6, а. Видно, что изображение части-
цы на экране или микрофотографии при таком методе контра-
стирования будет зависеть от степени ее погружения в слой
плотного вещества. Частица, находящаяся в ФВК целиком, вся
принимает участие в создании изображения. В этом случае
внутренняя полость ВТМ заполняется ФВК, которая проникает
также в «пустые» частицы сферических вирусов, занимая объем,
предназначенный для нуклеиновой кислоты. Может быть и дру-
гой вариант, когда вирус погружен в ФВК неполностью. Тогда
изображение будет создавать только некоторая его часть, напри-
мер удаленная от подложки или близкая к ней. Иногда при
исследовании спиральных структур и некоторых вирусов с ико-
саэдрическими капсулами важно знать, какая сторона контра-
стируется и создает изображение. Чтобы это установить, прибе-
гают к различным приемам. Так, исследуя капсулу вируса
папилломы человека, Клуг и Финч [37] просматривали стереопа-
ры микрофотографий частиц, контрастированных с одной сторо-
ны. Просмотр показал, что слой контрастирующего вещества
(ФВК) выглядит расположенным между находящейся на перед-
нем плане подложкой и изображением вирусной частицы. Так как
препарат помещали в микроскопе подложкой в сторону источника
электронов, такая картина свидетельствовала, что изображение
возникает благодаря взаимодействию с ФВК стороны частицы,
обращенной к подложке.

Оценка характера контрастирования при помощи стереопар
носит в известной степени субъективный характер. В дальней-
шем эти же исследователи использовали [39] более надежный
прием. Они наклоняли образец на угол от 20 до 45°. В этом слу-
чае на микрофотографиях одного и того же участка до и после
наклона можно было отчетливо обнаружить изменения в изобра-
жении частиц (рис. 8). Так как исследовались белковые кап-
сулы вируса папилломы кроликов, характеризуемые икосаэдри-
ческой симметрией, то отмечалось перемещение отдельных мор-
фологических единиц (так называемых пентамеров). Зная, как
проходит ось вращения образца, можно было определить, какой
стороне капсулы эти морфологические единицы принадлежат.
Было показано, что там, где получают изображение с одной
стороны частицы, эта сторона преимущественно та, которая об-
ращена к подложке. Пропорция частиц, контрастированных с
одной стороны, составляла 1%. При этом контрастирование
осуществлялось по методике, когда каплю суспензии вирусов
наносили на тонкую углеродную пленку, затем наносили 1%-ный
раствор ФВК и жидкость отсасывали с края сетки.
Рис. 8. Частица, контрастированная негативным методом (а), и схе-
ма (6), показывающая, как изменяется на проекции сферы положе-
ние какой-либо характерной точки (отмеченной крестиком), располо-
женной на ее поверхности, в зависимости от изменения направления
(А или В) просмотра

/ — пучок электронов; 2~ подложка; 3 — контрастирующее вещество; 4 — час-
тица; 5 — фотопластинка

Чтобы иметь возможность легко определить направление оси
наклона, на противоположную сторону сетки (т. е. ближайшую
к источнику электронов) наносили ВТМ, также контрастирован-
ный негативным методом. И тот, и другой вирусы можно было
наблюдать одновременно. Ось поворота была перпендикулярна
направлению смещения изображений «верхнего» и «нижнего*
вирусов относительно друг друга.

В некоторых случаях изложение изображений различных
участков объекта, контрастированного негативным методом,
друг на друга, приводит к формированию весьма своеобразных
картин. Например, при помощи электронной микроскопии было
обнаружено, что при реполимеризации белок ВТМ в определен-
ных условиях способен создавать трехмерные кристаллы [47].
На микрофотографиях кристаллов была чаще всего видна ре-
шетка с квадратными ячейками. Кристаллы такого же характе-
ра, но с другими параметрами решетки были обнаружены и при
реполимеризации белка вируса штриховатой мозаики ячме-
ня [48] (рис. 9, а). Анализ микрофотографий позволил устано-
вить, что составными частями этих кристаллов, элементами, из
которых они построены, являются диски, образованные из мо-
лекул белка вирусов. На рис. 9, б показана схема, демонстриру-
ющая, как именно возникает видимость квадратной решетки,
Рис. 9. Трехмерный кристалл, обра-
зующийся при реполимеризацни бел-
ка вируса штриховатой мозаики ячме-
ня и схема, демонстрирующая, каким
образом создается видимость квад-
ратной решетки

Она образуется благодаря наложению друг на друга изображе-
ний белковых дисков, расположенных в объемноцентрироваииой
тетрагональной решетке.

Оценивая метод негативного контрастирования, необходимо
отметить большую его эффективность, особенно при исследова-
нии вирусов. Преимущество этого метода наглядно демонстри-
рует сравнение микрофотографий ВТМ, оттененного
(см. рис. 3, а, б) и контрастированного ФВК (см. рис. 7, б, в)
(8]. Если в первом случае детали строения капсулы обнаружить
ие удается, то негативное контрастирование выявляет в капсу-
ле внутренний канал и белковые субъединицы, из которых она
построена.
Реальность выявляемых при помощи негативного контрасти-
рования структур прекрасно подтверждается данными, получен-
ными другими методами (например, рентгеноструктурным ана-
лизом, электронной микроскопией оттененных и «окрашенных»
вирусных частиц). Из экспериментов с вирусом герпеса, адено'-
вирусом, миксовирусами видно, что они не теряют инфекцион-
ное™ после смешивания с ФВК. Электронная микроскопия виру-
са герпеса {38] показала некоторое разрушение капсулы вируса
только при очень низких значениях pH ФВК — 4,2. Извест-
но также [44], что белки, высушенные в каплях ФВК и затем сно-
ва увлажненные, в большинстве своем не деструктированы, не
нарушается их ферментативная активность. Вместе с тем влия-
ние взаимодействия ФВК с отдельными молекулами белка уста-
новлено еще недостаточно. Недавно опубликована работа, в ко-
торой спектрофотометрически и при помощи аналитического
центрифугирования исследовали взаимодействие ФВК с молеку-
лами гемоглобина [49]. Оказалось, что при pH 5—7 ФВК силь-
но взаимодействует с гемоглобином, о чем свидетельствуют
быстрое увеличение коэффициента седиментации и резкий спад
поглощения. В области pH 7—9,5 это взаимодействие меньше,
но молекулы заметно агрегируют.

Позитивное контрастирование. За последние годы
получило широкое распространение избирательное «окрашива-
ние» срезов водорастворимыми слоями тяжелых металлов с
целью выявления участков, занимаемых нуклеиновой кислотой.
Физическая сущность такого окрашивания заключается в при-
соединении ионов тяжелых, сильно рассеивающих электроны
металлов к молекулам нуклеиновой кислоты. Успехи, достигну-
тые в этой области, вызвали применение аналогичных методов
окрашивания к вирусам [13], рибосомам [40] и отдельным моле-
кулам нуклеиновой кислоты [21, 50, 51]. Как мы уже упомина-
ли, такое контрастирование иногда называют позитивным.

Рассмотрим применение позитивного контрастирования на
примере небольших «сферических» вирусов [13]. Каплю суспен-
зии вирусов помещают на покрытую углеродной пленкой сетку.
Сетку с пленкой выдерживают в течение нескольких часов в
2%-ном водном растворе уранилацетата, после чего промывают
водой. В результате такой обработки центральная часть виру-
сов, где расположена их нуклеиновая кислота, становится ви-
димой в электронном микроскопе и на микрофотографии выгля-
дит как темное пятно. Если часть уранилацетата после промы-
вании остается на пленке-подложке и окружает исследуемые
частицы, создается эффект негативного контрастирования, бла-
годаря чему выявляется и белковая капсула.

«Окрашивание» уранил ацетатом было применено для кон-
трастирования отдельных молекул ДНК [21, 50, 51]. Тем или
иным способом ДНК наносили на углеродную пленку, поддер-
живаемую сеткой. Сетку с пленкой погружали в 1—2%-ный вод-
ный раствор уранилацетата (pH 5). После выдержки в течение
различного времени сетку вынимали и промывали водой. Опи-
санная методика выглядит примитивной. Однако ее развитие
сделало возможным избирательное окрашивание отдельных
нуклеотидов. Этого вопроса мы коснемся в следующем разделе.

г. Исследование молекул нуклеиновых кислот

В связи со спецификой нуклеиновых кислот при приготовле-
нии образцов большое значение наряду с их контрастированием
приобретают способ нанесения препарата на подложку и физи-
ческие свойства этой подложки. Поэтому изложение методики
исследования нуклеиновых кислот мы выделили в отдельный
параграф.

После высушивания капли разбавленного раствора на кол-
лодиевой, формваровой или углеродной пленке нуклеиновая кис-
лота обычно образует большие агрегаты, что делает невозмож-
ным исследование отдельных ее молекул. Довольно широко
распространен способ нанесения раствора нуклеиновой кислоты
пульверизацией на поверхность только что расщепленной
пластинки слюды. Чтобы контрастировать молекулы и получить
возможность их исследовать в электронном микроскопе, приме-
няют предварительно оттененные реплики. Свежий скол слюды
имеет идеально гладкую поверхность, обеспечивающую равно-
мерный фон при оттенении молекул. Нуклеиновую кислоту,
растворенную в летучем буфере нужного состава, например аце-
татно-аммониевом, при помощи пульверизатора наносят на по-
верхность слюды (рис. 10, а). После оттенения металлом
(рис. 10, б) наносят слой углерода (рис. 10, в). Слюду с нане-
сенной на нее углеродно-металлической пленкой постепенно по-
гружают в воду, как это показано на рис. 10, г, и пленку отделя-
ют от ее поверхности. Затем уровень воды постепенно понижа-
ют, и пленка опускается на сетки, предварительно положенные
(на керамическом или металлическом диске с отверстиями) на
дно воронки.

При работе с высокополимерной ДНК по описанной методи-
ке на микрофотографиях отмечается образование участков с по-
вышенной плотностью, от которых в радиальных направлениях
расходятся жгуты и одиночные молекулы (рис. 11). Такое рас-
пределение связано с высыханием микрокапли раствора на под-
ложке [10, 21, 50].

Трактуя микрофотографии молекул нуклеиновых кислот,
контрастированных оттенением, необходимо принимать во вни-
мание направление оттенения. На этих микрофотографиях на-
правление оттенения не всегда четко видно. Это иногда созда-
ет неверное представление о поперечных размерах молекул.
б

Рис. 10. Методика приготовления
предварительно оттененных реп-
лик с препаратов типа нуклеино-
вых кислот, вирусов, фагов, рибо-
сом и т. п. с использованием в ка-
честве подложки свежего скола
слюды

а — нанесение препарата на поверхность
слюды; б— оттенение металлом; в —
нанесение слоя углерода; г—отделение
углеродно-металлической пленки от по-
верхности слюды; 1 — частицы препара-
та; 2 — выходное отверстие пульвери-
затора; 3 — пластинка слюды; 4—источ-
ник испаряющегося металла; 5 — слой
металла; 6— графитовые стержни; 7—
слой углерода; 8— сетки; 9—диск с
отверстиями; 10—воронка, заполненная
водой; 11 — трубка с зажимом

На рис. 12, а, б показаны микрофотографии молекул ДНК, от-
тененных в различных направлениях по отношению к оси мо-
лекул. На рис. 12, а направление оттенения перпендикулярно
оси. Длина тени равна примерно 200 А. Учитывая, что отноше-
ние длины тени к высоте объекта в данном случае равно 10:1,
можно рассчитать диаметр молекулы, который равен примерно
20 А. На рис. 12, б показан случай, когда направление оттенения
на большом участке длины почти совпадает с осью молекул.
В таких условиях представления о форме и размерах молекулы
получить нельзя.

Основным недостатком описанной выше методики является
то, что пульверизация может вызвать деградацию молекул иук-
Рнс. 11. ДНК из селезенки крыс. Углеродная реплика с предвари-
тельным оттенением сплавом платины с палладием. Отношение
длины тенн к высоте объекта 10:1
Рис 12. ДНК из селезенки крыс. Углеродная реплика с предваритель-
ным оттенением сплавом платины с палладием. Стрелками показано
направление оттенения. Отношение длины тени к высоте объекта 10 - 1
а — направление оттенения перпендикулярно молекуле: о — оттенение произве-
дено почти вдоль молекулы
Рис. 13. ДНК фага Сд. Использован метод извлечения молекул из раствора
при помощи заряженной пленки. Наблюдаются длинные, ориентированные
параллельно друг другу молекулы. Отношение длины тени к высоте объекта
леиновых кислот. Аналитическим центрифугированием и ис-
следованием вязкости препаратов высокополимерной рибонук-
леиновой кислоты (РНК) до и после пульверизации уста-
новлено уменьшение молекулярного веса РНК [23]. Степень де-
градации зависит от режима пульверизации и типа пульвери-
затора.

Таким образом, использование в качестве подложки поверх-
ности слюды в сочетании с нанесением препарата пульверизиро-
ванием при всех достоинствах этого метода обладает тем недо-
статком, что не позволяет наблюдать длинные молекулы (ти-
па ДНК) неразрушенными. Поэтому в настоящее время все
большее распространение получают другие, более «мягкие» ме-
тоды нанесения препарата.

Один из таких методов предложен Биром [24]. В качестве
подложки в этом случае в первоначальном варианте использо-
вали сополимер стирола и винилпиридина (40%). Предметной
сеткой, покрытой пленкой такого сополимера, проводят по по-
верхности раствора ДНК. Молекулы ДНК в растворе заряжены
отрицательно за счет ионизированных фосфатных групп. Плен-
ка сополимера заряжена положительно, и молекулы ДНК при-
липают к ее поверхности. Благодаря движению пленки возни-
кает ориентация молекул в направлении ее перемещения
(рис. 13). Оттенение в этом случае производится перпендику-
лярно направлению перемещения. Величина положительного
заряда пленки пропорциональна количеству винилпиридина в
ней и уменьшается с увеличением pH раствора, в котором нахо-
дится ДНК. При помощи такой методики удалось наблюдать
молекулы ДНК фага Т2 длиной до 50 мк [52] и ДНК фага Сд
длиной до 38 мк [26]. Тонкую пленку из сополимера получить
трудно, поэтому вместо нее в последнее время используют обыч-
ную углеродную пленку [25, 27]. При сохранении остальных
приемов в этом случае также можно получить микрофотогра-
фии длинных ориентированных молекул [53].

Методика Бира не исключает полностью возможность раз-
рушения молекул. Они в этом случае вытянуты на подложке в
одном направлении и при большом молекулярном весе дости-
гают длины нескольких десятков микрон. Чтобы получить микро-
фотографию одной такой молекулы целиком, работая даже при
сравнительно низком увеличении, приходится производить се-
рию снимков, что представляет известное неудобство.

В настоящее время большое распространение получила ме-
тодика, впервые предложенная Кляйншмидтом и Цаном [54].
Эта методика основана на взаимодействии нуклеиновой кисло-
ты с низкомолекулярными белками и способности этих белков
образовывать пленку на поверхности жидкости. Физико-химия
образования такой пленки подробно описана в работе Трурни-
та [55].
Рассмотрим два известных в настоящее время варианта ме*
тодикн на примере исследования, проведенного совместно с
Р. Б. Хесиным н М. Ф. Шемякиным [56].

Одни нз этих методических вариантов заключается в том,
что молекулы извлекают нз раствора путем нанесения на его
поверхность белковой пленки. В наших исследованиях для этих
целей использовали раствор нуклеиновой кислоты в аммоний-
ацетатном буфере (0,01 М, pH 7,0) с концентрацией 1—2 мкг!мл.
Раствор наливали в плоскую круглую кювету площадью 80 см2
и на него наслаивали 0,02%-ный раствор цитохрома с в том же

Рис. 14. Нанесение белковой пленки
/—пипетка; 2 —стеклянная палочка; 3— белковая пленка;
/ — палочка из пластмассы; 5—вода; 6 — кювета

буфере, но 0,1 /И. Белковую пленку наносили при помощи стек-
лянного столбика, по которому спускали 0,1—0,2 мл раствора
белка (рис. 14). За образованием пленки следили по движению
частиц талька, насыпанных на поверхность раствора. Пленку
выдерживали на поверхности раствора 30 мнн. Часть молекул
нуклеиновой кислоты взаимодействовала с белком и извлекалась
из раствора. Пленку переносили на сетки с угольной пленкой,
касаясь последними белковой пленки, обезвоживали абсолютным
спиртом и высушивали на фильтровальной бумаге.

При другом методическом варианте готовили смесь, содер-
жащую 0,5 мкг нуклеиновой кислоты и 0,2 мкг цитохрома с в
1 мл 2 -М аммоннй-ацетатного буфера (pH 7,0). Смесь выдер-
живали в течение 4—5 мнн. н затем наслаивали 0,3—0,4 мл на
поверхность дистиллированной воды илн 0,01 М аммоний-аце-
татного буфера. Воду илн буфер наливали в плоскую прямо-
угольную кювету площадью около 800 см2. После образования
пленки ее при помощи стеклянной палочки поджимали на л/з
Рис. 15 Фрагмент молекулы ДНК фага Т2. Обработка по методике
Кляйннг ид га с последующим оттенением вращающегося образца
Рис. 16. Фрагмент молекулы ДНК фага Т2. Обработка по методи-
ке Кляйншмидта с последующим оттенением в одном направлении.
Выявляются только участки молекул, ориентированные поперек на-
правления оттенения
площади. Перенос белковой пленки на сетки и высушивание
производили так же, как и в первом варианте.

Исследованиями установлено, что при изготовлении образ-
цов по методике Кляйншмидта ориентация молекул в белковой
пленке в каком-либо направлении практически отсутствует. Это

Рис. 17. Схематическое изображение одной и той же молеку-
лы, обработанной по методике Кляйншмидта, оттененной
с вращением образца (а) и в одном направлении (б)

заставляет использовать вращение препарата в процессе конт-
растирования молекул оттенением. Принципиальная схема уста-
новки для оттенения с вращающимся столиком объекта показа-
на на рис. 5, б. Столик вращается при помощи электромотора и
делает 2 об!сек.

На рис. 15 приведена типичная микрофотография молекулы
ДНК фага Т2. Образцы для электронномикроскопических ис-
следований подготавливали по второму варианту методики. Вид-
но, что в условиях работы с белковой пленкой можно получить
микрофотографии длинных молекул, располагающихся на срав-
нительно небольших участках площади пленки.

На рис. 16 показан тот же препарат, но контрастированный
в одном направлении. Картина оказывается совершенно другой,
благодаря тому, что участки молекул, ориентированные вдоль
направления оттенения, совершенно не выявляются. Для боль-
шей наглядности на рис. 17, а, б показано (соответственно), как
выглядит молекула при оттенении с вращением образца и как
должна выглядеть при одностороннем оттенении.
Важным обстоятельством является то, что, в отличие от мик-
рофотографий ДНК, полученных при помощи других методов, в
данном случае толщина молекул, контрастированных оттенени-
ем, составляет 50—80 А. Такое увеличение диаметра связано с
образованием комплекса нуклеиновая кислота — белок. Некото-
рое увеличение толщины молекул (на 10—20 А) может дать
круговое напыление металлом.

Схематическое изображение предполагаемой картины рас-
пределения металла при оттенении со всех сторон объекта ци-
линдрической формы показано на рис. 18. В этом случае нет

Рис. 18. Распределение металла при оттенении
со всех сторон объекта цилиндрической формы

участков, на которых отсутствовал бы слой металла, но есть
участки с пониженной толщиной этого слоя, расположенные по
сторонам цилиндрического объекта, непосредственно на котором
слой достигает наибольшей толщины.

Метод белковой пленки успешно применяли для исследова-
ния однотяжевой ДНК некоторых фагов (57]. Основная труд-
ность при этом заключается в том, что однотяжевая нуклеино-
вая кислота не обладает жесткостью, присущей двутяжной, н
в растворе имеет форму рыхлого клубка. Чтобы развернуть этот
клубок, нужно готовить препарат для электронной микроскопии
при низкой ионной силе, а также в условиях, препятствующих
ренатурацни, если речь идет о денатурированной ДНК {сильно
щелочное pH, присутствие формальдегида). На рнс. 19 пред-
ставлена микрофотография частично денатурированной ДНК
фага Т2, где наряду с двухнитевымн участками видны фрагменты
однонитевой ДНК.

Некоторые вирусы прн резком снижении ионной силы
раствора выбрасывают свою нуклеиновую кислоту. Используя
метод Кляйншмидта, это явление можно наблюдать электрон-
номикроскопически [58]. Для этого суспензию фага Т2 в 8 М
аммоннй-ацетатном буфере смешивали с цитохромом с и 0,4 мл
смеси наносили на поверхность того же буфера, но с 0,01 М.
В образовавшейся белковой пленке некоторые частицы фага
выбрасывали ДНК, которая располагалась вокруг фаговой
частицы. Аналогичного эффекта можно добиться и другим путем.
Мы наносили мелкие капли взвеси фаговых частиц в 5 Л4 аммо-
ннй-ацетатном буфере на внутреннюю поверхность колбы. За-
тем в колбу наливали воду и тщательно перемешивали. К 1 мл
Рис. 19. ДНК фага Т2. Обработка по методике Кляйншмидта с последую-
щим оттенением вращающегося образца. Молекулы частично денатуриро-
ваны. На одной из них наблюдается расхождение двухспиральной струк-
туры на полинуклеотидпые цепочки, одна из которых разорвана. На кон-
це другой молекулы виден клубок, образованный полинуклеотидам мн
цепочками


• * # »tv

Рис. 20. Фаг T2, выбросивший ДНК




взвеси частиц в воде прибавляли 0,15 мл раствора цитохрома с
(концентрация 400 мкг/мл) и 0,4 мл смеси наносили на поверх-
ность дистиллированной воды. Микрофотография частицы фага,
окруженной выброшенной ДНК, показана на рнс. 20.

До сих пор мы рассматривали контрастирование молекул
нуклеиновой кислоты оттенением. Эта методика контрастирова-
ния нуклеиновых кислот пока наиболее распространена. Вместе
с тем она имеет и свои недостатки. В силу специфики метода
выявление тонкой структуры молекул ограничивается величиной
зерна напыленного слоя металла. Между тем исследование де-
талей строения молекул нуклеиновых кислот, например их вто-
ричной структуры, доступно для электронномикроскопнческнх
исследований. Чтобы это можно было осуществить, необходимо
разработать новые методы контрастирования.

Контрастирования ДНК можно достигнуть присоединением
к ее молекулам ноиов тяжелых металлов. В рассмотренном вы-
ше исследовании [56] наряду с оттенением металлами препараты
нуклеиновых кислот, полученные методом белковой пленки,
контрастировали солями тяжелых металлов. Для этого высу-
шенные сетки с белковой пленкой помещали на поверхность
2%-ного раствора уранилацетата (pH 5,0) пленкой вниз на 10—
15 мин. После высушивания препараты иссследовалн в микро-
скопе при увеличении 25 000. Толщина молекул нативной ДНК
при этом способе контрастирования составляет 20—25 А, т. е.
соответствует истинной толщине (рнс. 21).

Контрастирование уранилацетатом пока не дает сколько-ни-
будь ощутимых преимуществ по сравнению с оттенением в от-
ношении выявления деталей строения. Никаких признаков упо-
рядоченной внутренней структуры молекул на микрофотогра-
фиях наблюдать не удается. В одрой из работ [48], проведенной
на очень высоком экспериментальном уровне, кроме уранил-
ацетата использовали н другие окрашивающие нуклеиновую
кислоту вещества. Однако и здесь получить какие-либо данные
о вторичной структуре молекул не удалось.

Контрастирование молекул присоединением к ним ионов тя-
желых металлов продолжает разрабатываться. В связи с этим
интересны работы Бнра с сотрудниками [50, 51, 59]. Ими раз-
решается задача еще более важная, чем исследование вторичной
структуры молекул нуклеиновых кислот, а именно определение
последовательности нуклеотидов, т. е. первичной структуры. До
сих пор это делается химическими методами, причем исследова-
телям приходится сталкиваться с большими трудностями. Поэто-
му значение работ группы Бира трудно преувеличить.

Интересно проследить этапы этих исследований. Прежде все-
го решалась проблема извлечения из раствора и нанесения на
подложку целой молекулы нуклеиновой кислоты. Это оказалось
сделать сравнительно просто, применив описанные выше методы.
Контрастирование осуществлялось присоединением к молекуле
ионов тяжелых металлов. Задача в данном случае осложнялась
тем. что нужно было выявить нуклеотиды только определенного
сорта, а не все. Поэтому метящие группы должны избирательно
присоединяться к определенного вида нуклеотидам, обладаю-
щим достаточной рассеивающей способностью, чтобы их можно
было различить при помощи электронного микроскопа. Вместе
с тем размеры присоединяемой группы должны быть малы по
сравнению с расстоянием между основаниями в нуклеотидах.

Как известно, молекула ДНК в подавляющем большинстве
случаев представляет собой двойную спираль. Если даже пред-
ставить себе гипотетический случай, когда соответствующие ме-
тящие группы найдены, нх нзображення будут накладываться
одно на другое. Поэтому исследовались не нативные молекулы,
а одиночные полинуклеотндные цепочки. В этом случае расстоя-
ние между нуклеотидами будет выглядеть одинаковым и равным
6 А. Появилась реальная возможность увидеть группы тяжелых
атомов, присоединенных к соседним нуклеотидам.

В настоящее время ведутся работы по разрешению наиболее
трудной задачи—-подбору избирательно присоединяющихся1 ме-
тящих групп. Для этих целен исследования проводятся с искус-
ственными полинуклеотидами [51]. Одноцепочечные нитевидные
молекулы этих полимеров наносят на углеродную пленку. На
эту же подложку наносят сферы латекса н производят оттене-
ние. После этого осуществляют окрашивание ионами тяжелых
металлов. При просмотре препаратов, благодаря оттенению,
можно обнаружить нитевидные молекулы непосредственно по
изображению на экране. Это существенно облегчает исследова-
ние. На микрофотографиях на участках, экранированных от от-
тенения сферами латекса, наблюдаются молекулы полимеров,
выявленные в результате присоединившихся к ним ионов тяже-
лых металлов. Опыты показали, что НАиС14 окрашивает полнА,
полиГ, полиЦ н не взаимодействует с полиУ [51].

Проведенные Бнром и другими исследования взаимодейст-
вия НАиСЦ с мононуклеотидами свидетельствуют о том, что
комплекс, образуемый с адениловой кислотой, состоит из одного
иона АцС14 на одну молекулу адениловой кислоты. С другой
стороны, было найдено, что уридиловая кислота с этим ионом не
взаимодействует. Это согласуется с результатами электронно-
микроскопических исследований.

Работы по избирательному окрашиванию нуклеиновых ки-
слот являются примером таких исследований, когда результа-
тов можно добиться, только работая на предельном разрешении
микроскопа первого класса. В целом же электроиномнкроско-
пическне исследования нуклеиновых кислот хорошо иллюстри-
рует многообразие подходов при изучении одного и того же
объекта методом электронной микроскопии.
Рис. 21. ДНК фага Т2. Позитивное контрастирование ураиилацета-
том препарата, обработанного по методике Кляйншмидта
Рис. 22. Общий вид ультратопкого среза плазматической клетки мыши

В расширенных полостях эндоплазматического ретикулума (<ЭР) видео накопление

аморфного

Я — ядро; М — митохондрии, КО — клеточные
Рис. 23. Хромосомы (X) в делящейся клетке культуры ткани, стадия метафазы.
Окраска уранилапетатом
г £

Рис 24 Поперечный срез хромосомы, состоящей из нитей толщиной 50—100 А


Рис 25. Участок цитоплазмы икринки вьюна, видны митохондрии (Л1), мембра-
ны аппарата Гольджи (АГ), свободно лежащие рибосомы (Р)
Рис, 26. Митохондрии (М) в мышце аксолотля; видны гранулы гликогена (Г)
в межфибриллярных пространствах. Окраска моноокисью свинца
Рис. 27. Участок цитоплазмы клетки слюнной железы мотыля. Сложно орга-
низованная система мембран эндоплазматического ретикулума, покрытых ри
босомами (Р). Окраска уранилацетатом
2. Исследование ультратонких срезов

Если в электронный микроскоп рассматривать относительно
толстые объекты, как, например, клетки бактерий, растений и
животных, то в результате наслоения проекций одних внутрикле-
точных структур на другие мы не сможем детально разобраться
во внутреннем строении таких объектов, мы сможем рассмотреть
лишь внешнюю их форму. Кроме того, проходя через толстые
объекты, электроны будут их разрушать. Для того чтобы разо-
браться во внутренних структурных особенностях различных
клеток (а иногда и крупных вирусов), необходимо изучение их
на ультратонких срезах. При таком исследовании рассматривают-
ся тонкие сечения структур, что, с одной стороны, снимает их
маскировку лежащими сверху структурами, а с другой —такие
препараты более устойчивы к бомбардировке электронами.

Судить о трехмерной структуре объекта, изучая срезы, доволь-
но трудно, но, исследуя морфологию клеток, рассеченных в раз-
ных плоскостях, или восстанавливая общую их структуру при
помощи исследования серийных срезов, можно получить полное
и точное представление об истинных размерах и форме всех ком-
понентов клетки.

Исследование ультратонких срезов биологических объектов
открыло новую страницу в биологии. За последние годы в изуче-
нии ультраструктуры клеток были достигнуты огромные успехи,
на основе которых мы теперь имеем довольно полное представле-
ние о тонком строении клеток и составляющих их частей (рис.
22—27).

Оказалось, что для успешного изучения клеток и тканей необ-
ходимо иметь срезы, толщина которых должна быть в пределах
300—600 А, т. е. в 100 раз меньше толщины срезов, которые при-
меняются в обычной световой микроскопии. В последнем случае
ткани пропитываются парафином, но из-за его мягкости и хруп-
кости из таких объектов невозможно получить ультратонкие сре-
зы. Поэтому электронная микроскопия не имела успехов до тех
пор, пока не были найдены новые заливочные материалы -
пластмассы, такие, как метакрилаты, эпоксидные смолы и т. д.

Заливке объектов в такие среды должны предшествовать про-
цессы фиксации и обезвоживания материала, чтобы эти вещества
свободно пропитали всю ткань.

Первым необходимым звеном в процессе изучения объектов
на ультратонких срезах является фиксация клеток.

а.	Фиксация

Мы пока еще не можем при помощи электронного микроскопа
проникать в структуру внутренних компонентов живых клеток,
тем более невозможно изготовить из них срезы нужной толщины.

7 Физические методы исследования белков

97
Поэтому приходится прибегать к такой химической или иной
обработке клеток, при которой они убивались бы, но при этом ие
происходило бы изменений структур, их размеров, молекулярного
строения, дислокации веществ или их потери. К сожалению, при-
меняющиеся в настоящее время химические вещества для фик-
сации, стабилизации клеток и их компонентов одновременно всем
этим требованиям не удовлетворяют. Убивая клетку, они убивают
и ее ферменты, денатурируют белки или растворяют их, вызывая
ряд изменений в клеточных структурах. Некоторые фиксаторы
сохраняют одни клеточные компоненты, но при этом изменяются
другие; иные фиксаторы, не изменяя сильно химизма одних струк-
тур клеток, приводят к изменению или даже к потере других.
Пока что не иайдеи «идеальный» фиксатор, который сохранял бы
в нативном состоянии химизм и структуру клеток.

Одиако, несмотря на такую, казалось бы, пессимистическую
предпосылку, все же были достигнуты большие успехи в ультра-
структурном изучении клеток, благодаря применению различных
химических веществ для фиксации. Сравнительный анализ ре-
зультатов воздействия разных фиксаторов и физических, обрабо-
ток на клетки позволяет говорить о принципах организации кле-
ток, которые существуют и in vivo.

Наиболее удачными фиксаторами в электронной микроскопии
оказались вещества, которые, вступая в реакцию с белками и
липидами, связывают их и стабилизируют. Самыми распростра-
ненными нз них являются четырехокись осмия, формалин и пер-
манганат калия.

Четырехокись осмия (OsO<) удачно используется в качестве
фиксатора для клеток в электронной микроскопии ие только
потому, что оиа хорошо сохраняет клеточные компоненты, ио и
потому, что, связываясь с ними, одновременно их и «окрашива-
ет». При этом осмий, осажденный на структурах, в силу своего
большого атомного веса отклоняет электроны и тем самым как
бы контрастирует структуры.

Взаимодействие четырехокиси осмия как сильного окисли-
теля с клеточными структурами очень сложно и многообразно.
Она интенсивно связывается с белками, со многими аминокисло-
тами, мало связывается с РНК и почти не реагирует с ДНК [60].
Четырехокись осмия может соединяться с аминогруппами в по-
липептидных цепочках и тем образовывать между ними связи,
что определяет прекрасную сохранность белковых структур. Но
при продолжительном воздействии из-за глубокого окисления
такие связи рвутся и белки могут быть вымыты при дальнейшей
обработке в водных средах. Было показано [61], что в результа-
те длительной фиксации в четырехокиси осмия может быть по-
теряно до 22,6% белка из тканей и еще до 12% при дальнейшем
обезвоживании. В ненасыщенных жирных кислотах четырех-
окись осмия образует прочные связи между соседними целоч-
Рис. 28. Фиксация и обезвоживание объектов. Мелкие кусочки ткани помеща-
ются в фиксирующий раствор, затем переносятся в сосуды со спиртом повы-
шающейся концентрации, после чего пропитываются в смеси метакрилатов
ками, в результате чего оии становятся устойчивыми к дальней-
шей обработке. Осмий нацело подавляет большинство фермен-
тов в клетках и поэтому как фиксатор непригоден для гистохи-
мических исследований. Одним из минусов применения осмие-
вых фиксаторов является их медленное проникновение в ткани
(0,5 мм за 1 час). Вследствие этого периферические участки
ткани фиксируются хорошо, тогда как внутренние могут подвер-
гаться аутолитическим процессам и разрушаться. Поэтому обыч-
но фиксируют мелкие (до 1 мм?) кусочки тканей в осмиевых
растворах, охлажденных до 4° (охлаждение любых фиксаторов
рекомендуется для предотвращения автолиза клеток) (рис. 28).
Время фиксации должно быть таким, чтобы четырехокись осмия
прореагировала со всеми слоями объекта (0,5—1,5 часа). Ко-
нечно, для фиксации одиночных клеток или однослойных кле-
точных культур время фиксации может быть значительно коро-
че (15—30 мин.). Хорошие результаты фиксации достигаются
при перфузии органов растворами четырехокиси осмия [62].

Мелкие объекты можно фиксировать в парах сильно летучей
четырехокиси осмия, но для большинства объектов обычно ис-
пользуют забуференные растворы этого вещества. Одним из
универсальных фиксаторов считается раствор четырехокиси
осмия в ацетатвероналовом буфере по Паладе [63], используе-
мый при pH 7,2.

Другим фиксатором, широко применяемым в электронной
микроскопии, является формалин. Он быстро проникает в клет-
ки, хорошо стабилизирует белки, образуя связи между белко-
выми цепями, хорошо сохраняет жиры и липоиды [64]. Обработ-
ка клеток формалином с последующей промывкой водой сохра-
няет в активном состоянии многие ферменты, что используется
для проведения гистохимических реакций при исследовании кле-
ток в электронном микроскопе (см. ниже). Клетки после фикса-
ции формалином не обладают такой четкой и контрастной внут-
ренней структурой, как при осмиевой фиксации [65]. Поэтому
для контрастирования компонентов клеток после фиксации фор-
малином применяется дополнительная обработка солями тяже-
лых металлов или вторичная фиксация в растворах четырехоки-
си осмия. Последняя процедура предохраняет белки, фиксиро-
ванные формалином, от коагуляции при обезвоживании клеток
в спиртах. Ткани, фиксированные в формалине, лучше всего
заключать в эпоксидные смолы.

Недавние исследования Бернетта [66] привели к находке но-
вых фиксаторов, в состав которых входят альдегиды. Глюта-
ральдегид, глиоксаль, кротональдегид, ацетальдегид и другие,
хорошо фиксируя и сохраняя структуры, не влияют на актив-
ность некоторых клеточных ферментов и могут с успехом при-
меняться в электронномикроскопической гистохимии.

Особенно хорошие результаты фиксации клеточных структур
получены с глютаральдегидом. Этот фиксатор (4—6%-ный рас-
твор глютаральдегида в фосфатном буфере при pH 7,2—7,4)
прекрасно сохраняет тонкие структуры цитоплазмы (микротру-
бочки, тонофибриллы, мембраны, хромосомы). Но структуры
клетки 'после такой фиксации обладают низким контрастом, по-
этому необходима последующая обработка объектов растворами
четырехокиси осмия.

Для выявления мембранных структур клеток, основным ком-
понентом которых являются липопротеины, с успехом применя-
ется перманганат калия [67], который плохо сохраняет грануляр-
ные и фибриллярные структуры ядра и цитоплазмы.

Несмотря на то, что различные фиксаторы по-разному дейст-
вуют на клетки, было обнаружено удивительное однообразие в
строении клеточных компонентов при разных способах фикса-
ции. Это давало основание думать, что электронная микроско-
пия имеет дело со структурами, во всяком случае близкими по
своим морфологическим свойствам к прижизненным. Еще боль-
шую уверенность в этом исследователи получили тогда, когда
для стабилизации клеточных структур был применен качествен-
но иной, физический метод фиксации. При помощи быстрого и
глубокого замораживания с последующей сушкой в высоком ва-
кууме и пропиткой заливочными средами ряду авторов удалось
показать, что при такой обработке клеток их внутренняя струк-
тура оказалась сходной с той, что мы видим после фиксации
осмиевыми растворами [68]. Если при химической фиксации в
водных растворах из тканей экстрагируется около половины
сухого вещества клеток, то при замораживании и высушивании
из клеток удаляется только вода. При этом не происходит дис-
локаций веществ внутри цитоплазмы и ядра, и химическая струк-
тура различных клеточных компонентов тоже не изменяется.
Срезы с таких лиофилизированных клеток выглядят более тем-
ными. Светлые, как бы пустые, пространства, обнаруживаемые в
полостях мембранных структур при химических фиксациях, те-
перь оказываются заполненными различными веществами, а
темные осмиофильные мембраны становятся светлыми. Струк-
тура эргастоплазмы, ядерных оболочек, митохондрий остается в
принципе очень похожей на таковую при химической фиксации.

При лиофилизации возможно проявление ряда артефактов,
связанных с образованием мелких кристаллов льда в клетках,
которые изменяют внутриклеточные компоненты. Чтобы избе-
жать этого, необходимо глубокое (до —170°) и быстрое, момен-
тальное охлаждение объектов для предотвращения роста крис-
таллов льда. Обычно для этого свежевырезанную ткань поме-
щают в охлажденный жидким азотом изопентан, обладающий
высокой теплопроводностью. После этого ткань в охлажденном
состоянии (примерно при —75°, чтобы не вызвать рекристаллиза-
ции льда) помещают в вакуумную систему, где при большом
разрежении начинают откачку паров воды. После такого обез-
воживания ткань может быть пропитана заливочной средой и из
нее можно изоготовить ультратонкие срезы.

б.	Заливка

Для изготовления ультратонких срезов толщиной 300—
600 А необходимо, чтобы заливочный материал обладал нужной
твердостью, эластичностью и другими свойствами, очень важны-
ми для исследования срезов в электронном микроскопе. Чаще
всего для этих целей используются некоторые пластические мас-
сы (метакрилаты, эпоксидные смолы, полиэфирные смолы), а
также желатина. Поэтому весь процесс обработки объекта пос-
ле фиксации находится в зависимости от того вещества, в ко-
торое будет заключен материал. Чаще всего для приготовления
ультратонких срезов в качестве заливочного материала исполь-
зуют метакрилаты, которые хорошо смешиваются с большинст-
вом органических растворителей и не смешиваются с водой. Сле-
довательно, подобно гистологической заливке в парафин, снача-
ла объект необходимо обработать так, чтобы метакрилат мог
полностью его пропитать. Это обычно достигается путем дегид-
ратации тканей или клеток при помощи нескольких смен
спиртов (метилового или этилового) или ацетона возрастающей
концентрации.

Объекты не обнаруживают значительных морфологических
различий при обезвоживании в различных средах, за исключе-
нием ацетона, который хорошо экстрагирует липиды.

При обезвоживании, так же, как и при фиксации, необходи-
мо соблюдать определенные условия, чтобы исключить появле-
ние дополнительных артефактов. Нужно помнить, что в резуль-
тате этого процесса происходит сжатие объектов (до 30%),
вызываемое не только потерей воды, но и экстракцией части ма-
териала (особенно липидов в ацетоне). По данным Сильвена
[69], ткани теряют после фиксации и обезвоживания 40—60%
своего сухого веса. Поэтому обезвоживание необходимо прово-
дить как можно быстрее, с учетом способности применяемого
реактива экстрагировать те или иные клеточные компоненты.
Обезвоживание должно быть полным, так как недостаточное уда-
ление воды из объекта при заключении его в пластмассу вызы-
вает значительные повреждения в тканях и клетках из-за
неравномерной и неполной полимеризации заливочного матери-
ала. Резкая смена концентрации спиртов вызывает резкое сжа-
тие объектов. Поэтому целесообразно применять спирты с по-
степенным увеличением концентрации. Следующим этапом в
процессе обработки тканей после обезвоживания является их
пропитка и заключение в пластмассы или другие среды.

Используемые для этих целей вещества должны отвечать
следующим требованиям: иметь низкую вязкость в мономерном
состоянии для того, чтобы свободно проникать в объект; пол-
ностью смешиваться с веществом, в котором ведется дегидрата-
ция (спирт, ацетон и др.); при полимеризации не должен ме-
няться объем, занимаемый мономером; полимеризованная среда
вместе с заключенным в нее объектом должна быть годной для
изготовления ультратонких срезов; среда не должна влиять на
качество изображения объекта.

Применяемые в настоящее время среды для заливки объек-
тов, к сожалению, всеми этими качествами не обладают. Так, ме-
такрилаты могут повреждать объекты, а также сублимируют под
лучом электронов и тем самым вносят дополнительные артефак-
ты. Эпоксидные смолы наиболее пригодны для заливок, но очень
снижают контрастность изображения [70]. Полиэфиры (Весто-
пал W) дают очень твердые блоки и смешиваются только с аце-
тоном [71]. Заключение в желатин приводит к сжатию объек-
тов [72].

Самым распространенным и легкодоступным способом для
заключения объектов в электронной микроскопии является по-
мещение их в метакрилаты. Для этих целей используют н-бутил-
метакрилат и н-метилметакрилат — эфиры метакриловой кисло-
102
ты. Они хорошо смешиваются в мономерном (жидком) состоя-
нии с большинством органических растворителей [73]. Метакри-
латы легко проникают в ткани, достаточно хорошо обработан-
ные спиртом или ацетоном. Полимеризация их может быть вы-
звана действием тепла, света, ультрафиолетовым излучением или
же химическими веществами-инициаторами.

При полимеризации молекулы мономера образуют короткие
(из нескольких десятков молекул) или длинные (из нескольких
десятков и сотен тысяч молекул) цепи в зависимости от условий
реакции. При полимеризации н-бутилметакрилата образуются
мягкие блоки, а при полимеризации н-метилметакрилата—твер-
дые. Таким образом, сочетая разные количества этих двух моно-
меров, можно получить блоки желаемой твердости. Так, при до-
бавлении 10—20% н-метилметакрилата к н-бутилметакрилату
увеличивается твердость блоков и они становятся подходящими
для более твердых тканей, таких, как печень и мышцы.

В биологических исследованиях для полимеризации метакри-
латов используются главным образом дихлорные перекиси бен-
зоила как инициаторы (в литературе их чаще называют катали-
заторами) полимеризации. После добавления перекиси бензоила
полимеризация метакрилатов может происходить и при комнат-
ной температуре, однако этот процесс занимает слишком много
времени (несколько суток). Обычно реакцию полимеризации
проводят при температурах 45—60° в термостатах. Бориско [74]
нашел, что повышение температуры при полимеризации мета-
крилатов до 80° не влияет на качество препаратов, однако оп-
тимальной температурой, при которой процесс полимеризации
завершается за 12—18 час., является 60°.

Процедура заливки объектов довольно проста. После фикса-
ции и обезвоживания они пропитываются в смесях метакрила-
тов и переносятся в желатиновые капсулы, наполненные мета-
крилатами (рис. 29). Капсулы помещают в термостат, где и за-
вершается полимеризация метакрилатов, в которые заключены
объекты. Более подробно эти процессы описаны в специальных
руководствах [10, 75].

Один из существенных недостатков метакрилатов — повреж-
дение объектов в процессе полимеризации. Это выражается в
том, что часть объектов (особенно крупных) набухает и разру-
шается, особенно на периферии, тогда как в центре объекта
клетки почти не изменяются, что особенно мешает в работе с
культурами ткани. Повреждения возникают в результате нерав-
номерного и нестабильного затвердевания полимера в присутст-
вии следов воды или при повышенном содержании кислорода.
По этим же причинам другое неудобство метакрилатов — появ-
ление в блоках пузырьков, часто располагающихся непосред-
ственно на объектах. Для борьбы с полимеризационными повре-
ждениями Бориско предложил, с одной стороны, использовать
Рис. 29. Перенос кусочков ткани из смеси метакрилатов в желатиновые
капсулы для полимеризации

метакрилат, предварительно полимеризованный (предполимер)
при температуре 60—80° до сиропообразного состояния, с дру-
гой — использовать для последующей полимеризации более
высокую температуру — 60°. Дегазация мономеров метакрилата
также является мерой борьбы с полимеризационными
повреждениями. При добавлении к метакрилатам дивинилбен-
зола образуются трехмерные структуры полимера, что предот-
вращает изменение образцов при полимеризации и делает их
более устойчивыми к пучку электронов [76].

За рубежом в качестве заливочных материалов с успехом
применяют эпоксидные смолы (Аралдит, Эпон) и полиэфиры
(Вестопал W). Для увеличения контрастности изображения объ-
екты при заливке в эпоксидные смолы необходимо дополнитель-
но окрашивать (см. ниже).

Эти приемы заливки объектов страдают общим недостатком,
а именно, объекты необходимо проводить через ряд сред, экст-
рагирующих различные химические компоненты клетки. Было
бы чрезвычайно важно использовать в качестве заливочных
сред вещества, хорошо растворимые в воде, но попытки приме-
нения таких сред (желатцн, аквон) пока не увенчались боль-
шим успехом [72, 77],
в.	Изготовление ультратонких срезов

Стеклянные ножи, используемые для ультрамикротомирова-
ния, не позволяют делать больших площадей срезов из-за своей
хрупкости и небольшой поверхности лезвия, годной к резке.
С другой стороны, размеры срезов ограничиваются размером се-
ток-подложек (до 3 мм в диаметре). Кроме того, размер самой
ткани, фиксированной для электронной микроскопии, также не-
велик. И, наконец, напряжения и вибрации, возникающие при
резке объектов, залитых в твердые пластмассы, создали необхо-
димость использовать для изготовления ультратонких срезов
очень небольшие площади объектов, составляющие чаще всего
несколько десятых долей квадратного миллиметра (вполне воз-
можно получить хорошие срезы площадью 4 мм2 каждый). Чем
меньше площадь среза, тем лучше и равномернее будут срезы.
Так как наименьшая площадь среза может быть получена с вер-
шины пирамиды, то обычно объект, заключенный в пластмассу,
затачивают на пирамиду или призму (рис. 30).

Одним из самых важных моментов при получении ультра-
тонких срезов с заточенных блоков клеток и тканей является
процесс изготовления ножа для резки. За последние 10 лет
было предложено большое число методов приготовления ножей
из различных материалов (сталь, стекло, корунд, алмаз).

Рис. 30. Зажатый в держатель блок с заключенным в нем объектом
затачивается перед резкой
Рис. 31. Ножи, применяемые для изготовления ультратонких срезов
а, б — стеклянные ножи; на один из них надета специальная ванночка для жидкости,
на поверхности которой .собираются срезы; в — специальный держатель алмазного ножа;

1 — режущий край ножа; 2— алмазный нож

Стеклянные ножи, впервые введенные в практику получения уль-
тратонких срезов Латта и Хартманом [78}, нашли очень широкое
применение благодаря доступности и значительно меньшей тру-
доемкости процесса их изготовления. В качестве режущего лез-
вия стеклянного ножа служит торцевая линия (кромка) скола
стекла, произведенного под углом 45—55° (рис. 31). Для этого
на полосках или квадратах толстого (4'—6 мм) стекла делают-
ся стеклорезом диагональные насечки. Затем такие квадрати-
ки разламываются по линиям насечек. Ширина полосок или
квадратов стеклянных заготовок обычно бывает 25 мм. Уста-
новлено, что наилучшее качество лезвия получается у ножей,
изготовленных из сортов стекла с повышенным содержанием
кремния.

Для получения ультратонких срезов хорошего качества
очень важно, чтобы ножи не имели на своей режущей кромке
зазубрин или изъянов. Процент стеклянных ножей, после изготов-
ления пригодных для резки, невелик, их кромка очень хрупка и
поэтому их нельзя использовать повторно. Более долговечны и
стабильны алмазные ножи [79], имеющие к тому же большую
протяженность режущего края (см. рис. 31).

Изготовление ультратонких срезов производится при помощи
специальных приборов — ультрамикротомов (обзор конструк-
ции см. [10]). В принципе их работа заключается -в том, чтобы
в процессе резки равномерно на одинаковую величину пода-
вать объект к ножу. Так как толщина срезов должна быть все-
го лишь в несколько сот ангстрем, то и подача объекта также
должна быть равной этой величине. Такую незначительную пода-
чу можно осуществить, используя либо тепловое расширение
Рис. 32. Расположение в ультрамикротоме держателя алмазного ножа (/) и
образца (2), который движется вперед за счет теплового расширения и одно-
временно перемещается в вертикальной плоскости (показано стрелкой);

3 — сетка с пленкой-подложкой, на которую монтируются ульдратонкие срезы

металлических стержней, на которых крепится объект, либо точ-
ную микрометрическую подачу с последующей редукцией подачи
на рычагах. Соответственно этим принципам современные модели
ультрамикротомов можно разделить на два типа: с тепловой и с
механической подачей. К первому типу относится шведский
ультрамикротом Шестранда, универсальный «Ультратом-4800»
шведской фирмы LKB, модель австрийской фирмы «Рейхерт»,
японский микротом JUM-5, советские модели УМД-5, УМД-2
и др. К микротомам с механической подачей относятся ультра-
микротомы Портера — Блюма и Хаксли.

На всех этих микротомах ножи неподвижно закреплены,
а объект, опускаясь вниз, режется иа тонкие срезы только в мо-
мент соприкосновения его с режущей кромкой ножа (рис. 32).
При обратном движении объекта вверх из-за того, что после
изготовления одиночного среза зазор между ножом и образцом
очень мал, возможен «обратный захват» среза. Чтобы избежать
захвата срезов при обратном движении образца, в ряде ми-
кротомов осуществлено движение образца по кругу (микро-
том Шестранда, УМТ-2) нли по параллелограмму (микротом
Портера — Блюма, Хаксли). В ряде ультрамикротомов расхож-
дение ножа и образца при его обратном ходе осуществляется за
счет магнитострикционного сжатия стержня, несущего образец
(ультрамикротом Хаанстра [80], УМД-5), или за счет отвода
держателя ножа назад при помощи электромагнита (Ультра-
том-4800) .

Все типы ультрамикротомов очень чувствительны к механи-
ческим сотрясениям и к колебаниям температуры. Оба фактора
могут влиять на качество изготовления ультратонких срезов.

Ультратонкие срезы, если их собирать на поверхности само-
го ножа, сминаются, ломаются и прилипают к стеклу. Чтобы
избежать этого, на верхнюю часть ножа помещают ванночку или
корытце, заполненное жидкостью, на поверхность которой и по-
падают изготовленные срезы. Отсюда их легко выловить и пере-
нести на специальные сетки (см. выше).

В ряде случаев, когда собственной «окраски» клеточных
структур четырехокисью осмия недостаточно, можно проводить
дополнительное контрастирование срезов при помощи водных
растворов солей тяжелых металлов. Некоторые из таких солей от-
кладываются на любых клеточных структурах, в то время как
другие соли взаимодействуют лишь с определенными клеточ-
ными компонентами. Так, уранилацетат контрастирует все
структуры, но более быстро и прочно связывается с гранулами
рибонуклеопротеидов и с волокнами соединительной ткани [81].
Хорошо контрастирует мембранные структуры клетки фосфор-
номолибденовая кислота, но особенно четко она окрашивает
гликоген [81]. Широкое распространение при контрастировании
получили соли свинца (ацетат свинца, гидроокись и моноокись
свинца) [82]. Они хорошо контрастируют любые структуры, осо-
бенно мембранные. Контрастирование можно проводить не толь-
ко на срезах, но и на кусочках тканей до их помещения в пласт-
массы.

г.	Специальные приемы обработки тканей и срезов

Метод исследования ультратонких срезов в электронном
микроскопе можно успешно сочетать с рядом специальных мето-
дов, таких, как, например, гистохимия, радиоаутография, имму-
нохимия.

Применяя гистохимические реакции при исследовании тка-
ней в электронном микроскопе, необходимо соблюдать следую-
щие требования. Конечные продукты реакции должны отклады-
ваться в местах локализации того или иного химического ком-
понента клетки и не менять своего положения при дальнейшей
обработке объекта. Качество и количество конечного продукта
должны давать возможность определять места его локализации
в клетках или тканях,
Кроме этих двух основных требований, добавляется условие,
что проведение гистохимических реакций не должно приводить
к образованию артефактов. Это последнее определяет крайне
медленное внедрение гистохимических методов в электронную
микроскопию. Имеющиеся на сегодняшний день подобные мето-
ды и реакции, относящиеся в основном к реакциям выявления
мест активности некоторых ферментов,- еще далеки от совершен-
ства. Для выявления мест локализации ферментов в клеточных
структурах ткани необходимо фиксировать таким образом, что-
бы не разрушить их ферментов. Лучшими фиксаторами в этом
отношении являются формалин и другие альдегиды [66]. Фикси-
рованные, а затем отмытые кусочки ткани переносятся в инку-
бационные среды, где ферменты реагируют с субстратами, и на
месте их активности откладываются или тяжелые металлы
(теллур, свинец), или гистохимические реагенты (соли тетразо-
лия). Такими способами можно исследовать локализацию раз-
личных дегидрогеназ [83], фосфатаз [84], ацетилхолинэстеразы
[85] и др. После проведения инкубации ткани необходимо снова
подвергнуть фиксации, но уже в осмиевых растворах, чтобы по-
высить контрастность. Такие ткани затем заключаются в пласт-
массы и из них приготовляются срезы. Инкубирование тканей
в средах, содержащих субстраты, обычно приводит к изменению
внутриклеточных структур, хотя в ряде случаев достигнуты от-
четливые гистохимические реакции при хорошей сохранности
структур [66].

Некоторые вещества, такие, как нуклеиновые кислоты, можно
выявлять прямо на срезах при помощи окраски уранилацетатом
и солями свинца [10].

Ультратонкие срезы тканей, особенно после заливки в водо-
растворимые среды, можно подвергать воздействию различных
ферментов для определения химической природы тех или иных
структур [86].

Большие перспективы открываются перед внедрением в элек-
тронную микроскопию метода ауторадиографии. Срезы с тканей,
меченых тритием (Н3), можно покрывать тонкими пленками
фотоэмульсии и после экспозиции и проявления фотопленок, ле-
жащих на срезах, определять в электронном микроскопе места
связи изотопа со структурами клеток. Применение подобного
метода ограничивалось двумя факторами: величиной зерен бро-
мистого серебра и толщиной самой фотоэмульсии. Применение
фотоэмульсий с крупными гранулами не давало преимущества
перед обычной ауторадиографией. Толщина желатинового слоя
эмульсий резко снижала контраст и четкость изображения в
электронном микроскопе. В настоящее время используются мел-
козернистые эмульсии [87—90], что позволяет повысить разреше-
ние метода до 600—300 А. С другой стороны, контрастирование
срезов, покрытых фотоэмульсией, щелочными растворами солей
свинца, не только увеличивает четкость картин, но и растворяет
желатин, не смещая гранул восстановленного серебра. Этим спо-
собом были определены места включения тимидина, меченого
тритием, в структуры ядра [88].

Метод исследования ультратонких срезов клеток вырос в от-
дельную отрасль цитологии — цитологию на макромолекулярном
уровне со своими подходами к исследованию, критериями и тер-
минами. На современном этапе развития наших знаний о клетке
электронная микроскопия является пограничной областью между
морфологией и химией биологических структур. В последние годы
был осуществлен первый описательный этап в развитии электрон-
ной микроскопии клетки. Будущий прогресс в этой области зна-
ний не вызывает сомнения. Уже сейчас наметились некоторые
направления исследований: исследование динамики внутрикле-
точных процессов — функциональная цитология на молекуляр-
ном уровне; субмикроскопическая цито- и гистопатология,
которая необходима для расшифровки изменений клеток, хорошо
известных из классической патологии; субмикроскопическая
цитохимия, позволяющая судить о химической природе структур-
ных элементов клеток и об их обмене (сюда относятся как методы
выявления веществ в самих тканях и срезах, так и ауторадиогра-
фия с применением электронного микроскопа); прижизненное
изучение ультраструктуры клеток.

Конечно, прогресс во всех указанных направлениях может
быть обеспечен только при привлечении самых разнообразных и
совершенных методов исследования, дающих возможность изу-
чать нативные структуры.

Л ИТЕРАТУРА

1.	В. М. Кельм ан, С. Я. Явор. Электронная оптика. М., Изд-во АН
СССР, 1963.

2.	С. Е. Hal 1. Introduction to Electron Microscopy, McGraw-Hill Book
Company, 1953.

3.	S. W i s c h n i t z e r. Introduction to Electron Microscopy. Pergamon Press,
1962.

4.	3. Л e й з e г а н г. Электронная микроскопия. M., ИЛ, 1960.

5.	Р. С е т л о у, Э. П о л л а р д. Молекулярная биофизика. М., Изд-во «Мир»,
1964.

6.	Г. Томас. Электронная микроскопия металлов. М., ИЛ, 1963.

7.	Techniques for Electron Microscopy. Ed. D. Kay, Oxford, 1961.

8.	H. А. Киселев. Электронная микроскопия биологических макромоле-
кул. М., Изд-во «Наука», 1965.

9.	П. А. Стоянов, Н. М. Мосеева. Заводская лаборатория, 1964, 27,
1935.

10.	В. И. Бирюзова, В. Л. Б о р о в я г и н, В. П. Гилев, Н. А. Кисе-
лев, А. С. Тихоненко, Ю. С. Ченцов. Электронномикроскопиче-
ские методы исследования биологических объектов. М., Изд-во АН СССР,
1963.

11.	И. Г. Стоянова, А. Н. Пилянкевич. Докл. АН СССР, 1961,
141, 973.
12.	A. H. Пи л янкевич. Практика электронной микроскопии. М., Машгиз,
1960.

13.	Н. Е. Huxley, Q. Z u b а у. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1961, 11,
. 273.

14.	В. A. M a p и x и н, Л. П. Р о м а н к о в а. Заводская лаборатория, 1963,
29 975

15.	D. Е. Bradley. Brit. J. Appl. Phys., 1960, 11, 506.

16.	С. E. Hall. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1960, 7, 613.

17.	E. C. Maclean, С. E. Hall. J. Mol. Biol., 1962, 4, 173.

18.	С. E. Hall. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1956, 2, 625.

19.	С. E. H a 11. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1959, 81, № 3, 723.

20.	N. A. Kiss elev, L. P. Gavrilova, A. S. Spirin. [H. А. Киселев,
Л. П. Гаврилова, А. С. Спирин]. J. Mol. Biol., 1961, 3, 778.

21.	H. А. Киселев, H. В. Николаева. Биохимия, 1961, 26, 959.

22.	H. А. Киселев, Л. Л. Киселев. Докл. АН СССР, 1961, 141, 980.

23.	U. Z. Littauer, D, Danon, Y. Marykovsky. Biochim. et biophys.
acta, 1960, 42, 435.

24.	M. В eer. J. Mol. Biol., 1961, 3, 263.

25.	J. В e n d e t, E. S c h a c t e r, M. L a u f f e r. J. Mol. Biol., 1962, 5, 76.

26.	H. А. Киселев, T. И. Тихоненко, А. С. К а ф т а н о в а, Ф. Л- Ки-
селев. Биохимия, 1963, 28, 1965.

27.	Р. L. High ton, М. Beer. J. Mol. Biol., 1963, 7, 70.

28.	С. E. H a 11, H. S. S 1 a у t e r. J. Mol. Biol., 1959, 1, 329.

29.	R. С. H a r t. J. Appl. Phys., 1963, 34, 434.

30.	Z. Hidaka, H. Murano. J. Electron microscopy, 1957, 5, 33.

31.	С. E. Hall. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1955, 1, 1.

32.	H. E. Huxley. Proc. Stockholm. Conf. Electron Mier., 1957, 260.

33.	S. Brenner, R. W. Horne. Biochem. et Biophys. acta, 1959, 34, 103.

34.	Б. К. Вайнштейн, H. А Киселев. В сб.: «Вирусология и иммуно-
логия». М., Изд-во «Наука», 1964.

35.	J. Н. Н 11 с h b о г п, G. J. Hills. Virology, 1965, 27, 528.

36.	The Interpretation of Ultrastructure. Ed. R. J. C. Harris. Acad. Press,
1962.

37.	А. К 1 u g, J. T. F i n c h. J. Mol. Biol., 1965,- 11, 403.

38.	P. W i 1 d y, W. C. Russel, R. W. Horne. Virology, 1960, 12, 204.

39.	J. T. Finch, A. Klug. J. Mol. Biol., 1965, 13, 1—2.

40.	H. E. Huxley, G. Z u b a y. J. Mol. Biol., 1960, 2, 10.

41.	А. С. Спирин, H. А. Киселев, P. С. Ша ку л о в, А. А. Богданов.
Биохимия, 1963, 28, 920.

42.	N. A. Kiss elev, A. S. Spirin. [Н. А. Киселев, А. С. Спирин].
Proc. Third. Europ. Conf. Electron Microscopy Prague, 1964, B, 39—40.

43.	R. C. Valentine Proc. Europ. Conf. Electron Microscopy, Delft, 1960,

44.	R. С. V a 1 e n t i n e. Nature, 1959, 184, 1838.

45.	R, W. Horne, G. D. Greville. Proc. Third. Europ. Conf. Electron Mic-
roscopy Prague, 1964, B, 53—54.

4|6	. Б. К. Вайнштейн, H. А. Киселев, В. Л. Ш п и ц б e p г. Докл. АН
СССР, 1966, 187, 212.

47.	R. М а с 1 е о d, G. Т. Hills, R. М а г k h гьт. Nature, 1963, 200, 932.

48.	И. Г. Атабеков, А. С. Кафтанов а, В. К. Новиков, Н. А. Ки-
селев (в печати).

49.	А.5В. Sanya 1, Р. Ganguly, N ,N. DasGupta. Virology, 1964, 8,

50.	W. Stoeckenius. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1961, 11, 297.

51.	M. В e e r, C. R. Z 0 b e 1. J. Mol. Biol., 1961, 3, 717

52.	M. В e er. J. Roy. Mier. Soc., 1964, 83, 153—160.

53.	P. J. H i g h t о п, M. Beer. Proc. Third. Europ. Conf. Electron Microscopy
Prague, 1964, B, 49—50. Биохимия, 1966, 31, 256.
54.	A. К. Kleinschmidt, R. К. Zahn. Z. Naturforsch., 1959, 14b, 770.

55.	H. T. Tr u r n i t. J. Colloid. Sci., 1960, 15, 1—13.

56.	M. Ф. Шемякин, В. Ф. Ma н яко в, Н. А. Киселев, Р. Б. Хе с ин.
Биохимия, 1966, 31, 594.

57.	D. F г е i I е 1 d е г, А. К. Kleinschmidt, R. L. S i и s h е i m e г. Science,
1964, 146, 254.

58.	A. K. Kleinschmidt, D. Lang, D. Jacherts, R. K. Zahn. Biophys.
et biochem. acta, 1962, 61, 857.

59.	E. N. M о u d r i a n a k i s, M. Beer. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 1965.

53, 564.

60.	Q. F. В a h r. Exp. Cell Res., 1954, 7, 457.

61.	R. D. D a 11 m a n. J. Histochem. Cytochem., 1957, 4, 14.

62.	S. L. Paley, S. M. McGee-Russell, S. Gordon, M. A. Grillo.
J. Cell Biol., 1962, 12, 385.

63.	G. E. P a 1 a d e. J. Exptl Med., 1952, 95, 285.

64.	F. S. Sjostrand. J. Cellular and Compar. Physiol., 1953, 42, 15.

65.	Э. П и p с. Гистохимия. M., ИЛ, 1962.

66.	D. D. Sabatini, К. В e n s c h, R. J. В a r r n e 11. J. Cell Biol., 1963,

17, IS.

67.	J. H. Luft. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1956, 2, 799.

68.	V. H a n z о n, L. H. H e r m о d s s о n. J. Ultrastr. Res., 1960, 4, 332.

69.	B. S у 1 v e n. Symp. «Freezing and Drying». London, 1960, 160.

70.	J. H. Luft. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1961, 9, 409.

71.	E. К e 11 e n b e r g e r, W. Schwab, A. R у t e r. Experientia, 1956, 12, 421.

72.	В. П. Гилев. Усп. совр. биол., 1'957, 44, 28.

73.	S. В. Newman, Е. Borysko, Н. S w е г d 1 о w. Science, 1949, ПО, 66.

74.	E. Borysko. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1956, 2, Suppl. 3.

75.	Д. Пиз. Гистологическая техника в электронной микроскопии. М., ИЛ,
1963

76.	К. К u s h i d a. J. Electronmicr., 1961, 10, 194.

77.	J. R. Gibbons. 4th Intern. Conf. Electron Microscopy. Berlin, 1960, p. 55.

78.	H. L u 11 a, J. E. Hartman. Proc. Soc. Exptl Biol, and Med., 1950, 74,
436.

79.	H.	A. F e r n a n d e z - M о r a n.	Suppl. Cell Res., 1953,	5,	255.

80.	H.	В. H a a n s t r a. Philips Techn.	Rev., 1955, 17, 178.

81.	M.	L. W a t s о n. J. Biophys. and	Biochem. Cytol., 1958, 4,	4.

82.	M.	L. Watson. J. Biophys. and	Biochem. Cytol., 1958,	4, 727.

83.	R. J. В a r r n e 11, G. E. Palade. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1959,

8, 163.

84.	E. E s s n e r, A. B. N о v i k о f f. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1961,

9, 773.

85.	R. J. В a r r n e 11. J. Cell Biol., 1962, 12, 247.

86.	E. Leduc, W. Bernhard. J. Biophys. and Biochem. Cytol., 1961, 10,
437.

87.	L. G. Caro. J. Cell. Biol., 1962, 12, 189.

88.	J. P. Revel. E. D. Hay. Exp. Cell Res., 1961, 25, 474).

89.	B. A. Young, В. M. Kopriwa. J. Histochem. and Cytochem., 1964, 12.

438.

90.	M. M. S a 1 p e t e r, L. Bachmann. J. Cell Biol., 1964, 22, 469
Глава Ш

ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

1.	Спектрофотометрия в области электронных переходов.

М. Д. Франк-Каменецкий....................................115

а.	Молекулярные спектры..................................115

б.	Измерение спектров....................................118

в.	Изменения спектров при димеризации и полимеризации
молекул..................................................120

г.	Спектры нуклеотидов и полинуклеотидов.................125

д.	Спектры полипептидов и белков.........................128

е.	Спектрофотометрия как метод исследования биополимеров 129

2.	Инфракрасная спектроскопия. Ю. Н. Чиргадзе ....	132

а.	Получение инфракрасных спектров.......................132

б.	Интерпретация инфракрасных спектров ....	135

в.	Применение инфракрасной спектроскопии для изучения
белков и нуклеиновых кислот..............................138

3.	Спектрополяриметрия. В. И- Пермогоров.....................148

а.	Сущность явления оптической активности ....	150

б.	Методы измерения вращения плоскости поляризации .	154

в.	Дисперсия оптической активности белков и полипептидов	156

г.	Дисперсия оптической активности нуклеиновых кислот .	162

4.	Люминесценция. Л. А. Тумерман.............................166

а.	Определение и классификация явлений	люминесценции .	168

б.	Спектры излучения.....................................172

в.	Техника спектрально-флуоресцентных	исследований	.	181

г.	Энергетический и квантовый выход флуоресценции .	.	186

д.	Процессы тушения флуоресценции........................190

е.	Длительность флуоресценции............................191

ж.	Поляризация флуоресценции растворов сложных органиче-
ских молекул...................................... 201

з.	Длительное послесвечение растворов сложных органических
молекул........................................... 212

Литература.................‘..................................218

Молекулярные спектры охватывают весьма широкий диапа-
зон длин волн — от далекой ультрафиолетовой до далекой ин-
фракрасной области. В молекулярной спектроскопии принято
следующее условное деление спектра электромагнитного излуче-
ния: ниже 0,2 мк— далекая или вакуумная ультрафиолетовая
область; 0,2—0,4 — ближняя ультрафиолетовая область; 0,4—
0,8 — видимая область; 0,8—2,5 — ближняя инфракрасная об-
ласть; 2,5—50 — средняя инфракрасная область и 50—2000 мк —
далекая инфракрасная область. Длина волны света X измеряется
в мк (1 л1лс=1О—4 см), ангстремах (1 А=10-3 см), ммк1 *
(1 ммк =10 А). Частота света характеризуется следующими
величинами: частотой v = c/X, измеряемой в сек-1, круговой ча-
стотой (£> = 2лу, измеряемой в сек-1; волновым числом v=l/%,
измеряемым в см-1.

Поглощающий свет образец характеризуется оптической плот-
ностью

O=lgA,	(1)

где /0 — интенсивность падающего света; I — интенсивность
прошедшего света. Данная полоса поглощения характеризуется
частотой (или длиной волны) максимума, интенсивностью и ши-
риной. Оптическая плотность образца, молекулы которого ори-
ентированы преимущественно в определенном направлении, зави-
сит от величины угла между выделенным направлением (осью
образца) и направлением электрического поля поляризованной
световой волны. Значение угла, при котором оптическая плотность
максимальна, определяет поляризацию образца.

Поглощение света молекулой носит резонансный характер и
велико только тогда, когда частота света близка к одной из соб-
ственных частот молекулы или, говоря на квантовом языке, когда
энергия кванта света близка к разности энергий одного из воз-
бужденных и основного состояния молекулы.

Собственные частоты системы частиц имеют порядок ве-
личины

2л * m

где m — масса частицы; k — силовая постоянная, определяющая-
ся характером сил, действующих между частицами. Так как в
молекулах взаимодействие носит чисто электромагнитный харак-
тер, то

/>2

<3)
ао

где е — заряд электрона; «о—-характерное расстояние между
частицами.

Эту оценку можно получить следующим образом. Рассмотрим заряд е
массы т, вращающийся по орбите радиуса аа вокруг неподвижного заряда е.

1 Согласно международной системе единиц SI, миллимикрон следует на-

зывать нанометром (нм). Такое название, однако, еще не получило широкого

распространения.
Круговую частоту coo находим, приравнивая выражение для центростремитель-
ной силы силе кулоновского притяжения:

2	&

.
а*

Такая же оценка получается для частоты линейных колебаний частицы
массы т и заряда е вблизи неподвижного заряда е. В этом случае а0 будет
равновесным расстоянием между колеблющейся частицей и неподвижной.

Молекулы состоят из частиц двух сортов — валентных элек-
тронов и атомных остовов — ионов. Для электронов (е~5> IO*-10
CGSE; «о~Ю-8 ел; т~10-27 г) характерная частота
v«~1015 сек-1, а для ионов, которые приблизительно в 104 раз
тяжелее, v;~ 1013 сек-1. Это соответствует длинам волн /.с~0,1жк;
Х;-~10 мк. Мы видим, что электронные колебания (переходы)
должны возбуждаться ультрафиолетовым светом, а колебания
ионов — инфракрасным. На самом деле электронные и колеба-
тельные спектры занимают широкие области длин волн, но эти
области не перекрываются. Поэтому можно считать, что элек-
тронные и ионные колебания возбуждаются независимо. Соб-
ственные колебания и вращения ионного каркаса приводят лишь
к размытию линий поглощения, отвечающих переходам.

Поглотив квант света, молекула недолго находится в возбуж-
денном состоянии. Обычно не более чем через 10-9—10-8 сек
она вновь переходит в основное состояние. Судьба освободившей-
ся при этом энергии зависит от многих причин. Как правило,
часть энергии переходит в тепло (в энергию колебаний рассмат-
риваемой молекулы и молекул, ее окружающих). Остальная
энергия может быть испущена в виде кванта света с длиной вол-
ны, большей длины волны поглощенного кванта. Этот квант мо-
жет быть испущен в любом направлении, в частности под пря-
мым углом к направлению падающего света. Рассеянный свет
тоже распространяется во всех направлениях, но, в отличие от
излученного, его частота не может сильно отличаться от частоты
падающего света. Разность частот рассеянного и падающего све-
та не превышает величины порядка характерной частоты коле-
баний ионов в молекуле (комбинационное рассеяние), в то время
как частота излученного света может отличаться от частоты па-
дающего на величину порядка частоты электронных колебаний.

1. Спектрофотометрия в области электронных переходов

а. Молекулярные спектры

При слиянии атомов в молекулу валентный электрон начи-
нает испытывать влияние со стороны атомов, окружающих атом,
к которому электрон принадлежал до слияния. Это приводит к
тому, что взамен атомных орбит (энергетических уровней)
возникают молекулярные орбиты, которые могут быть в той или
иной степени делокализованы по молекуле. Находясь на одних
орбитах, электрон сильно взаимодействует лишь с одним или
двумя атомами молекулы. На других орбитах, напротив, элек-
трон взаимодействует одинаково сильно с большим числом ато-
мов или даже практически со всеми атомами молекулы. Элек-
трон, находящийся на такой орбите, является размазанным
(делокализованным) по молекуле. Делокализованные орбиты
имеются у молекул с сопряженными связями. Такие орбиты на-
зываются л-орбитами, а находящиеся на них электроны — л-элек-
тронами. л-электроны в основном (невозбужденном) состоянии
занимают нижние л-орбиты молекулы и под действием света
переходят на более высокие незанятые л*-орбиты. Такие пере-
ходы называются л-*л*-переходами. К локализованным орбитам
относятся о-орбиты, заполненные электронами, образующими
прочные межатомные связи. Для возбуждения этих электронов
необходимо затратить значительно большую энергию, чем для
возбуждения л-электронов, поэтому соответствующие переходам
о-электронов полосы лежат в значительно более коротковолно-
вой части спектра. Их мы рассматривать не будем. К другому
типу локализованных орбит относятся орбиты, занимаемые не
связывающими (т. е. не участвующими в образовании химиче-
ских связей) электронами некоторых атомов (кислорода, азота).
Такие орбиты называются n-орбитами, они всегда заполнены.
Находящиеся на них пары электронов называются неподелен-
ными парами. Под действием света n-электрон может перейти
на незанятую л*-орбиту, т. е. может произойти п—*л*-переход.
Таким образом, при образовании молекулы возникают новые
энергетические уровни и, соответственно, новые линии в спектре
поглощения системы. Колебания атомов в молекуле, а также
вращение молекулы приводят к тому, что каждый электронный
уровень расщепляется на множество близко отстоящих один от
другого уровней, образующих полосу поглощения. Колебатель-
ная структура полос для молекул, находящихся в растворе,
обычно не разрешена и на опыте измеряется огибающая полосы;
В разреженном газе колебательные уровни, как правило, ясно
разрешены; в молекулярных кристаллах этого можно добиться
понижением температуры.

Пусть монохроматический поляризованный свет проходит
сквозь слой вещества. Рассмотрим взаимодействие света с от-
дельной молекулой вещества.

Согласно классической физике, электрический вектор свето-
вой волны, действуя на молекулу, индуцирует в ней дипольный
момент, и энергия волны затрачивается на раскачку колебаний
образовавшегося диполя. Поглощение зависит от взаимной
ориентации молекулы и электрического поля. Если частота па-
дающего света находится вблизи максимума некоторой полосы
поглощения, то направление электрического вектора волны, от-
вечающее наибольшему поглощению, определяет поляризацию
электронного перехода, отвечающего данной полосе, или, выра-
жаясь классическим языком, направление колебаний осцилля-
тора, отвечающего данной полосе.

Интенсивность света изменяется при прохождении через сре-
ду, согласно закону Бугера — Ламберта — Бэра:

I = Ioe~knL,	(4)

где п-—число молекул в см3; k — коэффициент поглощения;
L — длина пути, пройденного светом в веществе.

Поскольку форма кривой поглощения определяется колеба-
тельной структурой полосы и может сильно меняться, то имеет
смысл характеризовать «силу» полосы только суммарной интен-
сивностью. В качестве такой интегральной характеристики при-
нято использовать величину

которая называется силой осциллятора, отвечающего рассматри-
ваемой полосе.

Формулу (4) обычно записывают в виде

I = 10 • 10“D_= /0 • 1(ГЕр/',	(6)

где р—концентрация, имеющая размерность моль/л; е — моляр-
ный коэффициент поглощения (экстинкции), его размерность
л • моль~{ • см~х; L измеряется в см, D — оптическая плотность,
она, очевидно, безразмерна.

Для определения силы осциллятора обычно по оси абсцисс
откладывают волновые числа v. Тогда имеет место

/=4,33-КГ9 \e(y)dv.	(7)

Квантовая теория дает возможность вычислить силу осциллятора для пере-
хода из одного состояния (0) в другое состояние (i), исходя из строения моле-
кулы:

2 т

foi ~ ^7 “zo I M'oz I2’	(8)

где т, е, h— соответственно масса, заряд электрона и постоянная Планка; <огО =
= (Е; — Е0)//г, где Ео — энергии состояния 0, а Е(.— энергия состояния I;

= (9)

Здесь тр0 и ф;. — электронные волновые функции состояний 0 и i при равио-
N

весной расположении атомов; [1 = 2 егп — оператор дипольного момента для
П=1

электронов молекулы (N — число электронов в молекуле); dr — элемент объема.
Для сил осцилляторов имеет место важное утверждение, изве-
стное как правило сумм Томаса — Куна: сумма сил осциллято-
ров для перехода из основного состояния 0 во все возбужденные
состояния равна числу электронов в молекуле:

^foi=N.	(Ю)

I

В квантовой механике каждому переходу сопоставляется не-
который вектор (9), называемый дипольным моментом перехода
(или просто моментом перехода), величина и направление кото-
рого могут быть найдены из расположения атомов в молекуле.
Направление этого вектора совпадает с линией, по которой ко-
леблется классический осциллятор. Таким образом, можно дать
два определения поляризации перехода (полосы поглощения).
Классическое определение: «Поляризация полосы поглощения —
это направление колебаний линейного осциллятора, отвечающего
этой полосе»; квантовомеханическое: «это направление вектора
дипольного момента перехода». Основное различие между этими
определениями заключается в том, что за классическим опреде-
лением нет ничего, кроме возможности эмпирического нахожде-
ния поляризации, в то время как в квантовой механике суще-
ствует принципиальная возможность вычисления поляризации,
исходя из структуры молекулы.

Переходы, для которых интеграл (9) равен нулю, называются запрещен-
ными. Это не значит, что они никак не проявляются в спектре (вследствие
колебаний атомов поглощение все же происходит), но нх интенсивность значи-
тельно меньше интенсивности разрешенных переходов. Часто удается из про-
стых соображений о симметрии молекул определить, какой переход является
запрещенным, а у многих разрешенных переходов определить поляризацию.
Однако если простых соображений оказывается недостаточно, то задача ста-
новится практически неразрешимой из-за математических трудностей, возни-
кающих при нахождении волновых функций ф0 и фл

б.	Измерение спектров

Спектры растворов биополимеров обычно измеряются в воде
или в органических растворителях1. Для измерений, как прави-
ло, достаточно иметь прибор, работающий в ближней ультрафио-
летовой области, однако в некоторых случаях (например, при
измерении поглощения пептидной связи) необходимо работать
в вакуумной ультрафиолетовой области.

На рис. 1 представлена блок-схема двухлучевого спектрофо-
тометра. Луч света от источника L проходит через монохроматор
и системой зеркал разделяется на два луча, один из которых
проходит через чистый растворитель, а другой — через исследуе-

1 Большое значение для физических исследований имеет также исследова-
ние ориентированных пленок. Мы, однако, не будем затрагивать этот вопрос.
118
мый раствор. Затем лучи вновь соединяются и регистрируются
детектором (фотоэлементом или фотоумножителем). Специаль-
ное устройство (изображенное на рис. 1 в виде двух зеркал, свя-
занных пунктирной линией) попеременно пропускает луч то через
одну, то через другую кювету. Поэтому на детектор попадает
свет переменной интенсивности. Стоящее за детектором устрой-
ство позволяет отделить сигнал, прошедший через раствор, от
сигнала, прошедшего через растворитель. Далее сигналы усили-
ваются и измеряется их отношение. Применение двухлучевой
системы позволяет избежать таких помех, как нестабильность
источника света, нестабильность приемника и т. д.

Рис. 1. Блок-схема оптического устройства современного двухлучевого
спектрофотометра

При исследовании биополимеров большое значение имеет
измерение спектров при различных температурах. Для такого
рода измерений кювету необходимо снабдить термостатирующим
устройством, позволяющим быстро менять температуру и надеж-
но ее поддерживать. При температурных измерениях появляется
ряд методических затруднений. При нагревании свежеприготов-
ленных водных растворов на рабочих стенках кюветы появляют-
ся пузырьки воздуха, которые могут существенно изменить опти-
ческую плотность, уменьшая длину пути, проходимую светом в
растворе, и увеличивая интенсивность рассеянного света. Для
предупреждения появления пузырьков кюветы следует тщатель-
но промывать перед употреблением. Определенную опасность
представляет также испарение растворителя, что приводит к уве-
личению концентрации раствора. Так как используемые обычно
прямоугольные кюветы не предназначены для герметизации,
укажем некоторые способы борьбы с испарением: на поверхность
раствора наносится тонкий слой чистого силиконового масла;
кювета плотно закрывается тефлоновой пленкой, которая при-
жимается сверху крышкой с резиновой прокладкой. Ни в коем
случае не следует пользоваться кварцевыми крышками, прила-
гаемыми к кюветам СФ-4, так как раствор затягивается в зазор
между крышкой и стенкой кюветы и при нагревании расширяю-
щийся воздух выталкивает его наружу; чтобы предотвратить это,
верхнюю часть кюветы смазывают гидрофобным силиконовым
маслом.

Особые трудности возникают при измерении спектра в ваку-
умной ультрафиолетовой области, т. е. при длинах волн, мень-
ших 200 ммк. В этой области кварц, пары воды в воздухе, кисло-
род воздуха и сама вода начинают в заметной степени поглощать
свет. Возникает также необходимость использования специаль-
ных источников света. При измерении спектров в вакуумной
ультрафиолетовой области все элементы оптической системы из-
готовляются из специального кварца («Supersil»), который имеет
значительно лучшее пропускание, чем природный кварц. Из него
же изготовляют тонкие кюветы. Весь оптический тракт продува-
ют азотом. Чтобы продвинуться несколько дальше в коротковол-
новую область, исследуемое вещество растворяют иногда в D2O,
а не в обычной воде. Однако, несмотря на все ухищрения, при
изучении водных растворов ниже ~180 ммк продвинуться не
удается из-за сильного поглощения воды.

в.	Изменения спектров при димеризации
и полимеризации молекул

При образовании полимера соседние мономерные звенья на-
чинают взаимодействовать, что приводит к определенным
спектральным изменениям, существенно зависящим от характера
возникающего взаимодействия. Если взаимодействие носит ха-
рактер химической связи, то спектр системы может измениться
радикально. Для нахождения нового спектра необходимо решать
в этом случае квантовомеханическую задачу, рассматривая
взаимодействующую систему как единое целое. Если взаимодей-
ствующие молекулы или группы, спектр которых исследуется,
остаются на достаточно большом расстоянии друг от друга, так,
что электронные облака существенно не перекрываются и не про-
исходит обмена электронами между группами, то достаточно
рассматривать взаимодействие между ними, как между скопле-
ниями зарядов. Если молекулы в целом нейтральны, то основной
вклад во взаимодействие будет давать диполь-дипольный член.

Для начала рассмотрим димер из двух взаимодействующих
диполь-дипольно осцилляторов, лежащих один под другим в па-
раллельных плоскостях и повернутых один относительно другого
на угол <р (рис. 2). Стрелки на рис. 2 означают, что при смещении
электрона осциллятора а в направлении, указанном стрелкой,
электрон осциллятора b под действием поля осциллятора а сме-
щается в направлении своей стрелки.
Димер из одинаковых осцилляторов. Пусть
осцилляторы имели до сближения одинаковые собственные ча-
стоты ио- Из-за взаимодействия полоса с частотой ы0 расщеп-
ляется на две полосы, сдвинутые па равные расстояния Ди в
длинноволновую и коротковолновую части спектра. При указан-
ном выше выборе угла <р интенсивности (силы осцилляторов)
коротковолновой и длинноволновой полос равны:

/®о+до>	COS(p),

/к-АО = у (14-COS<p),

(И)

где f0 — сила осциллятора полосы частоты ио до димеризации,
но в расчете на пару осцилляторов.

Рис. 2. Димер из двух осцилляторов, располо-
женных в параллельных плоскостях

Согласно квантовой механике, при диполь-дипольном взаимодействии произ-
вольно ориентированных молекул энергетический уровень расщепляется на два по
формуле!

I Poi I2

£дим = £мо„ ± --- _3 (еЛь) (еЛь)]:	(12)

Rab

причем моменты переходов с основного состояния (0) на два образовавшихся
уровня равны:

I Hoi I2

р±=—— <-ea±el)'	(!3)

где еа и еь — единичные векторы, направленные вдоль моментов перехода моно-
меров а и Ь; Rab —расстояние между мономерами в димере; nab = Rab/Rab. Под-
ставив из формулы (13) в (8) вместо р,0/, получим для сил осцилляторов
выражения:

f±=-^-[l±(eA)l.	(14)

Следует подчеркнуть, что то, какая из полос — «плюс» или «минус» — будет
коротковолновой, а какая длинноволновой, зависит от знака второго члена в фор-
муле (12), который меняется при изменении взаимной ориентации моментов перехода.

1 Мы всюду предполагаем, что постоянный дипольный момент у молекул от-
сутствует, т. е. ц(1о = \ Ф^М-фо dr =0.
Поэтому при одних углах «плюс»-полоса будет коротковолновой, а «минус»-по-
лоса — длинноволновой, а при других — наборот.

Если моменты перехода расположены в параллельных плоскостях, то (еае^ =
= cos<p и формулы (14) и (11) совпадают.

Пусть осцилляторы расположены один под другим в одной пло-
скости. Тогда стрелки, согласно принятому правилу и в силу ди-
поль-дипольного характера взаимодействия, будут направлены в про-
тивоположные стороны, т. е. ср = 180°. Поэтому, согласно (11),

= 0; Ам-дю = /о (табл. 1, Л). При расположении осциллято-
ров вдоль одной прямой ф = 0; /И,_Д(В = f0; fa,+ba> = 0 (табл. 1, Б)).

При расположении моментов перехода друг под другом в одной плоскости
возможны два направления моментов перехода — параллельное и антнпараллельное
(см. табл. 1, Л). В первом случае (еаеь)=1, во втором (еаеь)=—1. Поскольку
в обоих случаях (eatiab) =0, то при помощи (12) убеждаемся, что при параллель-
ных моментах коротковолновой полосе отвечает «плюс», а при антипараллельных —
«минус». Это означает, что для коротковолновой полосы в обоих случах =
= f0, а для длинноволновой дш =0. При расположении моментов перехода
вдоль одной прямой вновь нужно рассмотреть два случая (см. табл. 1, В). Легко
убедиться, что в этом случае всегда /О(|+до =0,	= /»•

И классический, и квантовомеханический расчет приводят к оди-
наковому результату: при стопкообразном расположении осцилля-
торов в димере полоса поглощения сдвигается в коротковолновую
сторону без изменения интенсивности; при расположении вдоль одной
линии полоса смещается в длинноволновую сторону. Если угол
между осцилляторами не равен 0 и 180°, то обе полосы имеют от-
личные от нуля интенсивности, но их сумма, как видно из формул
(И) и (14), равна интенсивности полосы до сближения молекул,
что находится в согласии с правилом сумм (10).

Димер из разных осцилляторов. Пусть осцилляторы а
и b имели до сближения разные собственные частоты иа и (ор.
В результате взаимодействия при димеризации полосы немного сме-
стятся, причем, коротковолновая полоса всегда сместится в коротко-
волновую сторону, а длинноволновая — в длинноволновую, независи-
мо от взаимной ориентации осцилляторов (полосы «расталкиваются»).
От ориентации зависит только величина смещения. При этом интен-
сивности полос равны

fa = /а (1 —2С05ф- Q2 ) ,

Q2 \
“(3 ~ “а '

/з = fl ( 1 — 2 cos ф

(15)

Здесь fa и fp — силы осцилляторов полос димера, a f°a и fl —
мономеров; ф — угол между осцилляторами, определенный, как в
формулах (11); Q* характеризует энергию взаимодействия между
осцилляторами и зависит от угла между ними.
Пусть молекулы а и b до соединения в димер имели разные энергии возбуж-
дения — Е°а и Eg и соответственно разные моменты перехода — j*a и jig. Обо-
F0	Еа

значим через со „ =---- и о)„ =----- частоты, отвечающие переходам из основ-

“ h р Н

ного состояния в возбужденные. В результате взаимодействия энергии возбужде-
ния изменяются согласно формулам:

А А

“ £“ + й	аЬ'

(16)

где

E ro , 2

s“ p+» «J-»;

1

Gab = — &ael) -3	<ebnab>]-

#ab

(17)

Интенсивности полос равны

f =

• a la

4

Й r.\2	_ «.ч2

G)a (Op

^a^b) Gab

(18)

*+-----r(e^)^

Вновь рассмотрим два простейших случая. Пусть соа > сор (т. е.
Ха<Хр). Тогда при стопкорбразном расположении осцилляторов,
когда <р = 180°, интенсивность полосы а увеличится при димериза-
ции, а интенсивность полосы р уменьшится (см. табл. 1). При рас-
положении осцилляторов вдоль прямой будет наблюдаться обратное.

При помощи формул (16), (17), (18) легко убедиться, что
то же самое получается при квантовомеханическом рассмот-
рении.

Увеличение интенсивности полосы поглощения называют ги-
перхромным эффектом, а уменьшение—гипохромным. Мы ви-
дим, что классическая и квантовомеханическая теории приводят
к одному заключению: при димеризации молекул, имеющих раз-
ные полосы поглощения \ длинноволновая полоса испытывает
гипохромный эффект при стопкообразном расположении осцил-
ляторов и гиперхромный эффект, когда осцилляторы располо-
жены вдоль одной прямой. При этом полная интенсивность по
обеим полосам, в соответствии с правилом сумм, не изменяется.

Мы рассмотрели простейший случай, принимая во внимание
лишь одну полосу мономера. Легко сообразить, что будет в более
сложных случаях. Один из таких случаев представлен в нижней
строке табл. 1.

1 Часто для краткости говорят: «При взаимодействии разных полос...».
	л	Б
Классическая модель	p=iSO'!	+ - + -
		<р~0°
Квантово- механическая модель	£а *  еь	еь '	
		ЯдЬ  Cq	вЬ
		
Спектр димера из одинаковых молекул	Ж	Л
	Л	
Спектр димера из разных молекул	Л ,л	А Л
	Л	Л
Димер из одина- ковых молекул, имеющих две полосы поглощения	Ах.. . AL.  Л	Л

Табл. 1. Спектральные изменения, происходящие при димеризации (схема).

1 — поглощение невзаимодействующих молекул; 2 — поглощение днмера

Описанные здесь эффекты наблюдаются при димеризации
различных молекул. Например, при димеризации плоских моле-
кул акридина оранжевого, которые, по-видимому, образуют стоп-
ки, обе полосы поглощения красителя смещаются в коротковол-
новую сторону, причем коротковолновая полоса испытывает ги-
перхромный эффект, а длинноволновая — гипохромный. При
димеризации нуклеотидов не происходит заметного смещения по-
лос, но наблюдается гипохромный эффект (около 10%) в длин-
новолновой части спектра, т. е. в районе 260 ммк. При этом ги-
перхромный эффект должны испытывать более коротковолновые
полосы. Следует, однако, подчеркнуть, что аналогичные спект-
ральные изменения могут происходить вследствие образования
124
водородных связей между молекулами. Поэтому для выяснения
природы спектральных изменений, происходящих при димериза-
ции, в каждом конкретном случае необходимо ставить вспомога-
тельные эксперименты.

При образовании полимера полоса расщепляется на множе-
ство полос, образующих в совокупности новую экситонную поло-
су. Интенсивность внутри экситонной полосы распределяется
определенным образом в зависимости от геометрии полимера.
Кроме того, происходит перекачка интенсивности из одной экси-
тонной полосы в другую. Количественно гипохромный эффект
в полимерах впервые описал Тиноко [1]. Родс [2] изучил этот во-
прос более детально. При качественном обсуждении вполне
можно ограничиться рассмотрением какого-то димера, выхвачен-
ного из полимера, так как взаимная ориентация осцилляторов
внутри димера одинакова вдоль всего полимера, а именно эта
ориентация наиболее существенна.

г.	Спектры нуклеотидов и полинуклеотидов

Исследованная часть спектров нуклеотидов и полинуклеоти-
дов полностью обусловлена поглощением азотистых оснований,
точнее л-мг*- и п->л*-переходами в них.

Спектры азотистых оснований. В пиримидинах —
цитозине, тимине урациле — имеется шесть л-орбит (рис. 3, а).
Три нижние орбиты заняты в основном состоянии шестью
л-электронами. Верхние три л*-орбиты в основном состоянии не
заняты. Кроме того, две пары несвязывающих n-электронов ато-
мов азота заполняют две n-орбиты. Поскольку незанятыми
являются только л*-орбиты, то возможны два сорта переходов:
л->л* и п —>л*. В пуринах — аденине, гуанине — имеются девять
л-орбит, из которых нижние пять заняты в основном состоянии
(см. рис. 3, б). Имеются также три заполненные п-орбиты.

В видимой части спектра нуклеотиды прозрачны. Они погло-
щают свет с длиной волны меньше ~300 ммк. При этом погло-
щение почти полностью обусловлено л->л*-переходами; п->л*-
переходы проявляются лишь в виде трудно различимых плеч.
Однако самой длинноволновой является, по-видимому, очень сла-
бая и->л*-полоса. Эти два типа переходов отличаются интенсив-
ностью и поляризацией. Полосы, отвечающие л->-л*-переходам,
значительно интенсивнее полос, за которые ответственны п->л!:-
переходы. Еще важнее то, что л->л*-переходы поляризованы в
плоскости оснований, а поляризация п->л*-переходов перпенди-
кулярна этой плоскости. Интенсивная полоса с максимумом око-
ло 260 ммк, характерная для азотистых оснований, является
смесью л->л*- и и->л*-переходов. Это было обнаружено при
изучении спектров ориентированных пленок в поляризованном
свете.
Рис. 3. Схематическое изображение лип уровней пиримидина (а), пурина (6)
и пептидной связи (в). Стрелками указаны длинноволновые л->л * и п->л *
переходы. Точками изображены неподеленные пары электронов

Спектры полинуклеотидов. При образовании из
нуклеотидов полимера между нуклеотидами возникают, конечно,
химические связи, которые образуются между фосфатными груп-
пами и рибозой, не затрагивая азотистых оснований. В то же
время спектр в ближнем ультрафиолете обусловлен именно осно-
ваниями, поэтому само по себе образование химических связей
не должно приводить к изменениям спектра в этой области. Раз-
личными опытами было показано, что спектральные изменения
не связаны с возникновением водородных связей между основа-
ниями (3, 4]. Поэтому основную роль играет взаимодействие
между основаниями вдоль цепи1. Это взаимодействие можно
считать диполь-дипольным 2.

Полинуклеотидам присущи два важнейших вида вторичной
структуры — упорядоченная спиральная и разупорядоченная
клубкообразная. Клубкообразный полимер есть промежуточная
форма между отдельными основаниями и спиральным полиме-
ром. На обеих стадиях — при образовании клубка из отдельных
нуклеотидов и затем при переходе клубок — спираль —был от-
мечен гипохромный эффект. Итак, при образовании спирального
полимера из отдельных мономеров наблюдается гипохромный
эффект, причем основная часть эффекта приходится на переход
клубок — спираль. Гипохромизм, наблюдаемый при образовании
клубкообразного полимера из мономеров, называется остаточ-
ным гипохромизмом {3].

1 Взаимодействие вдоль цепи играет основную роль также в стабилиза-
ции спиральной структуры [4, 5].

2 Поскольку расстояния между основаниями в ДНК малы, то диполь-ди-
польное приближение является весьма грубым. Однако для качественного рас-
смотрения оно вполне подходит.
Проиллюстрируем возможность гипохромного эффекта при переходе клубок —
спираль даже без изменения расстояния между осцилляторами на модели димера,
состоящего из двух разных осцилляторов. Пусть в «спиральном» состоянии мо-
номеры в димере расположены стопкообразно один под другим в одной плоскости
(см. табл. 1, А). При «плавлении» мономеры приобретают возможность вращаться
вокруг соединяющей их оси. Зависящий от угла между осцилляторами <р мно-
житель в формуле (18) будет равен (ваей) G.lft= (e,1eb)2==cos2 <р. В «спиральном» со-
стоянии угол ф=0 и cos2 ф=1. В «клубкообразном» состоянии, когда угол может при-
----------------------------- 1

нимать любые значения, cos2 <р = —. Таким образом, в нашем примере при об-
разовании «клубка» из отдельных мономеров поглощение длинноволновой полосы
уменьшается на некоторую величину, а затем при переходе «клубок — спираль»
поглощение вновь уменьшается на такую же величину.

На рис. 4 изображены кривые поглощения ДНК тимуса те-
ленка в клубкообразном (верхняя кривая) и спиральном состоя-
ниях. ДНК растворялась в D2O, чтобы продвинуться возможно

дальше в коротковолновую
область, однако спектры
полностью совпадают со
спектрами в Н2О в той об-
ласти, где удалось произве-
сти измерения в обычной
воде.

Изменение формы кривой
и ее смещение весьма незна-
чительны. Основной эф-
фект — значительное умень-
шение поглощения при пере-
ходе клубок — спираль во
всей исследованной области.
Этот гипохромный эффект
обусловлен взаимодействи-
ем наблюдаемых полос с бо-
лее коротковолновыми при
стопкообразном расположе-
нии соседних вдоль цепи ос-
нований в ДНК (см. табл. 1, Л)
вклад в поглощение дают л->:
ны в плоскости оснований, то

Рис. 4. Спектры поглощения клубкооб-
разной (верхняя кривая) и спиральной
(нижняя кривая) ДНК тимуса теленка
в D2O [11].

. Действительно, так как основной
г*-переходы, которые поляризова-
стопкообразное расположение ос-

нований означает стопкообразное расположение осцилляторов.
Более коротковолновые полосы должны при этом испытывать ги-
перхромный эффект. С другой стороны, осцилляторы, отвечаю-
щие и->л*-переходам, расположены вдоль одной прямой (парал-
лельной оси спирали), так как эти переходы поляризованы пер-
пендикулярно плоскости оснований. Поэтому длинноволновый
и->л*-переход должен испытывать при взаимодействии с более
коротковолновыми и->-л*-переходами гиперхромный эффект. Как
видно из рис. 4, слабая п—,л*-полоса в окрестности 2820 А
действительно, быть может, не участвует в общем уменьшении
интенсивности1. Так как л-»л*- и /г-*л*-полосы имеют взаимно
перпендикулярные поляризации, то их можно рассматривать не-
зависимо. Как видно из формулы (17), ортогональные полосы
не взаимодействуют между собой.

д.	Спектры полипептидов и белков

В отличие от полинуклеотидов, в полипептидах группа, даю-
щая характерную для полипептида полосу поглощения в окре-
стности 190 ммк (амидная группа), образуется при поликонден-
сации аминокислот, так как она является пептидной связью.
Поэтому полипептид можно представить в виде полимера, со-
стоящего из мономерных звеньев — амидных групп, связанных
между собой через а-углерод:

н	н	н

I	I	I

... — амид —С— амид —С— амид —С— . . .

I I ‘ I

Ri R2 R3

Длит Ролны, г-т

Рис. 5. Спектры поглощения спиральной
(/) и клубкообразной (2) поли-Ь-глута-
миновой кислоты [6]

ной группе имеются три л-орбиты, две из которых
ном состоянии, и одна — п-орбита
(см. рис. 3, в).

То, что амидные группы
связаны между собой не не-
посредственно, а через а-
углерод, позволяет считать,
что между ними нет суще-
ственного обмена электрона-
ми и взаимодействие имеет
в основном диполь-диполь-
ный характер. В случае по-
липептидов и белков речь
может идти вообще только
об изменении поглощения
при переходе клубок — спи-
раль, так как при гидролизе
рвется пептидная связь, обу-
словливающая поглощение.
Пептидная связь (см. рис. 3,
в) является плоской, так как
л-орбиты делокализованы по
трем атомам (N, С, О) и
связь N—C носит частично
двойной характер. В амид-
заняты в основ-

— локализована на кислороде

В других опытах наблюдалось увеличение интенсивности этой полосы.
л—^'-переходы поляризованы в плоскости группы, а п-*л*-
переход запрещен. Однако он, по-видимому, проявляется у по-
липептидов в окрестности 225 ммк.

В 1959 г. Имахори и Танака обнаружили у полипептидов ги-
похромный эффект в окрестности 190 ммк, который подробно
был исследован Розенхеком и Доти [6]. Спектры поглощения
клубкообразной (верхняя кривая) и спиральной поли-£-глута-
миновой кислоты изображены на рис. 5. Видно, что гипохромный
эффект весьма велик. Как и в случае полинуклеотидов, можно
предполагать, что этот гипохромный эффект обусловлен взаимо-
действием длинноволновой -полосы с более коротковолно-
вой л->л*-полосой.

е.	Спектрофотометрия как метод исследования биополимеров

Спектрофотометрия широко используется при исследовании
биополимеров. Здесь будут кратко рассмотрены лишь некоторые
ее применения.

Определение концентрации нуклеиновых
кислот. Поскольку оптическая плотность D пропорциональна
концентрации поглощающих молекул в растворе, ее измерение
часто используется для определения концентрации поглощающих
свет молекул. Так как поглощение нуклеиновой кислоты зависит
от состояния, в котором она находится (спиральном, клубкооб-
разном или в частично спирализованном), то для определения
концентрации ее необходимо предварительно привести к стан-
дартным условиям. Измеряя затем поглощение раствора, можно
определить концентрацию нуклеиновых кислот [7].

Концентрацию белков и полипептидов определяют по спек-
трам связывающихся с ними красителей [8].

Определение степени спиральности и иссле-
дование перехода спираль — клубок в полинук-
леотидах. Величина гипохромного эффекта пропорциональ-
на количеству нуклеотидов, находящихся в спиральных уча-
стках молекулы. Поэтому для нахождения зависимости степени
спиральности от какого-нибудь параметра (температуры, pH
среды и т. д.) достаточно измерить зависимость от этого пара-
метра величины гипохромного эффекта при какой-либо длине
волны: удобнее всего проводить измерения при 260 ммк, так как
при этой длине волны гипохромный эффект максимален. Обычно
по оси ординат откладывают просто оптическую плотность D.
Кривая зависимости оптической плотности от температуры
.(рис. 6) называется кривой плавления, или кривой тепловой де-
натурации. Температура, при которой гипохромный эффект ра-
вен половине своего максимального значения, называется тем-
пературой плавления Тт полинуклеотида. Кроме того, кривые
плавления биополимеров имеют конечную ширину АГ.

9 Физические методы исследования белков

129
Температура плавления нуклеиновых кислот определяется
средней энергией связи, приходящейся на пару оснований. По-
скольку разные пары А—Т (или А—У в случае РНК) и Г—Ц
имеют различные энергии связи, температура плавления зави-
сит от нуклеотидного состава. Температура плавления ДНК
линейно растет с увеличением отношения Г+Ц/А + Г + Ц + Т.
Следует отметить, что температура (и ширина интервала) плав-
ления ДНК не зависит от молекулярного веса полимера.

Кривая плавления весьма чувствительна к наличию в раство-
ре веществ, способных связываться с ДНК, например ионов во-

Рис. 6. Зависимость величины оптической плотности
от температуры для ДНК фага Т2 в 10-3 М цитрат-
ном буфере (низкая ионная сила)

дорода (т. е. pH среды), ионов металлов, молекул красителей
(акридин оранжевый, профлавин и др.), некоторых антибиоти-
ков (актиномицин), свободных нуклеотидов, РНКазы и т. д.
(см. обзор [9]). Эти вещества меняют как температуру, так,
в ряде случаев, и ширину интервала плавления.

При охлаждении образцов после нагревания величина гипо-
хромного эффекта в той или иной степени восстанавливается.
При нагревании до температуры, меньшей температуры конца
плавления, при последующем охлаждении происходит практи-
чески полное восстановление. Если образцы нагревать выше
температуры конца плавления, то гипохромный эффект восста-
навливается не полностью при охлаждении ДНК, но практически
всегда восстанавливается при охлаждении РНК.

Ренатурацией называется восстановление комплементарной
спиральной структуры нуклеиновой кислоты при снятии действия
денатурирующего агента (например, при охлаждении). Почти
полное восстановление величины гипохромного эффекта не озна-
чает, что произошла истинная ренатурация, так как образова-
ние участков с неспецифическим (некомплементарным) спарива-
нием оснований также приводит к гипохромному эффекту.
Чтобы отличить истинную ренатурацию от ложной, ДНК повтор-
но нагревают [3]. Если при этом переход спираль — клубок бу-
дет таким же резким, как и при первом нагревании, то, значит,
ренатурация была истинной; если он окажется размазанным по
большому интервалу температур, то, следовательно, имело
место неспецифическое спаривание. Быстрое охлаждение при-
водит к неспецифическому спариванию оснований, а медленное,
особенно выдержка при температурах, несколько меньших тем-
пературы начала плавления, способствует истинной ренатурации.

При помощи измерений спектров нуклеиновых кислот мож-
но определить нуклеотидный состав полимеров (10]. Это делает-
ся следующим образом. Было обнаружено, что спектр денату-
рации, т. е. разность между поглощением денатурированной и
нативной нуклеиновой кислоты как функция длины волны, ли-
нейно меняется с изменением ГЦ-состава полимера. В частно-
сти, для ДНК

Д8ь = (1— а) AeF + аАе[ц.	(19)

В этой формуле а — доля ГЦ пар в полимере; Лщт и Де(ц — не-
которые эмпирически найденные для каждой длины волны коэффи-
циенты.

При помощи формулы (19) был найден ГЦ состав ряда нуклеи-
новых кислот [10]. Было показано [12], что формула (19) справедлива
в области значений а от 0,3 до 0,7. Однако в этой же работе найдено,
что Ае^1 и Де£ц значительно отличаются от соответствующих вели-
чин для синтетических полинуклеотидов (поли ДГ: ДЦ и поли dAT :dAT).
Это означает, что зависимость Ащ (а) не является линейной, но в
определенном интервале значений а может быть при современной
точности измерения разностных спектров апроксимирована прямой
линией. Отметим, что, поскольку гипохромный эффект обусловлен
взаимодействием оснований вдоль, а не поперек цепи, формула (19)
ни в коем случае не должна быть справедлива для всех возможных
значений а. Можно показать, что при имеющейся экспериментальной
точности справедливость формулы (19) в области значений а от 0,3
до 0,7 не противоречит существующим представлениям.

Определение степени спиральности поли-
пептидов и белков спектрофотометрическим
методом. Г ипохромный эффект полипептидов и белков макси-
мален при длине волны 190 ммк. Поэтому исследования конфор-
мационных изменений этих полимеров спектрофотометрическим
методом весьма затруднительны и не получили распространения,
тем более, что имеется значительно более простой и доступный
метод дисперсии оптической активности (см. параграф 3). Одна-
ко в ряде случаев, когда метод оптической активности неприме-
ним (например, для смеси правых D- и левых L-спиралей), спек-
трофотометрический метод может оказаться весьма полезным.
Используя гипохромный эффект при 190 -:лмк, Розенхек и Доти
(6] определили степень спиральности полипептида, состоящего из
D- и L-участков, а также нашли степень спиральности различ-
ных белков. Исследование белков осложняется тем, что боковые
группы тоже поглощают в рассматриваемой области.

2.	Инфракрасная спектроскопия

Прошедшее десятилетие характеризовалось энергичным и раз-
нообразным применением инфракрасной спекроскопии для изуче-
ния различных классов биологически важных соединений: ами-
нокислот, пептидов, стероидов, витаминов, липидов, полисахари-
дов, белков, нуклеиновых кислот. Однако основная часть работ
посвящена изучению спектров полипептидов и белков, и здесь
достигнуты наибольшие успехи, чему способствовало развитие
химии синтетических полипептидов. Около 15 лет назад исследо-
вание инфракрасного дихроизма в фибриллярных белках позво-
лило высказать мысль о существовании спиральной конформации
их молекул. Это было важным вкладом в наши знания о строе-
нии белков. Приблизительно с этого времени начинается широ-
кое использование инфракрасной спетроскопии в молекулярной
биологии в основном по трем направлениям: 1) в качестве ана-
литического средства; при этом строгое соответствие спектраль-
ной кривой структурной формуле исследуемого вещества позво-
ляет однозначно различать соединения с небольшими структур-
ными особенностями; 2) для определения структурных формул
биологических соединений; 3) как метода для изучения простран-
ственной конформации биополимеров.

В связи с развитием техники измерения инфракрасных спект-
ров, в настоящее время получить их стало довольно просто. Точно
так же относительно несложно может быть извлечена из спект-
ров первичная информация. Последнее, однако, требует знания
основ теории колебаний и происхождения инфракрасных спект-
ров. Данный раздел знакомит читателей с основами теории ин-
фракрасных спектров и особенностями применения метода инфра-
красной спектроскопии к решению различных структурных и фи-
зико-химических задач молекулярной биологии.

а.	Получение инфракрасных спектров

Происхождение инфракрасных спектров обусловлено главным
образом колебаниями атомов в молекуле. Спектр, как правило,
состоит из большого числа полос, причем для молекулярного
анализа важно то, что часть полос может быть приписана коле-
баниям отдельных атомов группировок, более или менее сохра-
няющих свойства в разных молекулах.

Доступный в настоящее время для широкого круга исследо-
вателей интервал длин волн инфракрасного диапазона простира-
ется от 1 до 25 мк. В спектральных измерениях очень часто ис-
пользуется шкала волновых чисел (сл-1), пропорциональных
частоте. Волновое число — величина, обратная длине волны, вы-
раженной в см. Указанный выше интервал в шкале волновых чи-
сел (далее иногда в том же смысле употребляется термин «часто-
та») равен 10 000—400 см~1. Частоты основных колебаний много-
атомной молекулы (см. ниже) занимают область 4000—50 см~\
тогда как в близкой инфракрасной области находятся полосы по-
глощения, обусловленные обертонами и составными тонами.

Методы приготовления образцов в инфракрасной спектроско-
пии отличаются от методов, применяемых в ультрафиолетовой об-
ласти спектра. Дело в том, что практически любой растворитель
в инфракрасной области не является прозрачным, и поэтому за-
писать спектр удается только в тех относительно небольших
участках, где данный растворитель или не поглощает, или погло-
щает очень мало. Классические растворители, применяемые в
инфракрасной спектроскопии — хлороформ, четыреххлорнстый
углерод и сероуглерод, мало пригодны для изучения большинства
биологически важных соединений (за исключением стероидов и
липидов). Применение в качестве растворителя воды хотя и за-
труднительно, но в принципе возможно; при этом в области по-
глощения обычной воды используют растворы в тяжелой воде,
однако следует иметь в виду процессы дейтерообмена водород-
ных атомов некоторых групп, о чем будет сказано ниже.

В настоящее время значительно шире изучаются инфракрас-
ные спектры биологических соединений в твердом состоянии. Для
приготовления образцов из кристаллических соединений применя-
ют в основном два метода: суспензирование в подходящей среде
и метод прессованных таблеток. В первом методе в качестве им-
мерсионной среды широко используют парафиновые масла, а в
областях их поглощения — фторированные или хлорированные
углеводороды, прозрачные в указанных областях. Данный метод
с успехом применяют также в тех случаях, когда вещество быст-
ро вступает в реакцию с окружающей средой. Однако, несмотря
на сравнительную простоту, этот метод имеет ряд серьезных не-
достатков: трудно контролировать толщину слоя, потери на отра-
жение и рассеяние; запись спектра нельзя сделать при одинако-
вой толщине во всем диапазоне. Метод прессованных таблеток
свободен от перечисленных недостатков. Было показано, что га-
лоидные соли щелочных металлов, особенно бромистый и хло-
ристый калий, могут быть сплавлены в прозрачные таблетки
под давлением в несколько тысяч атмосфер в вакууме при ком-
натной температуре. Вещество растирается вместе с солью и затем
прессуется. Подобная процедура не приводит к получению истин-
ных твердых растворов. Как показало электронномикроскопиче-
ское исследование, отдельные частицы поглощающего вещества
имеют размеры больше 100 А и, следовательно, содержат несколь-
ко элементарных ячеек. Действительно, спектры приготовленных
таким способом образцов не отличаются от спектров кристалли-
ческих порошков, взвешенных в иммерсионном масле. Большое
достоинство указанного метода заключается в том, что мы име-
ем возможность записать «чистый» спектр вещества практиче-
ски в любой области. Применяя одинаковые навески, можно
проводить качественное сравнение интенсивностей полос в спект-
рах разных соединений. Однако следует учесть возможные хи-
мические и физические изменения диспергируемого вещества,
обусловленные применением высокого давления. Хорошей про-
веркой отсутствия нежелательных эффектов такого рода являет-
ся контрольная съемка спектра по первому методу, когда влия-
ние давления исключено.

При изучении полимеров обычно исследуют пленки, получен-
ные осаждением из раствора или расплава. При необходимости
их ориентируют разными способами: растяжением, прокатывани-
ем, волочением, размазыванием высыхающего раствора и т. д.
Если пленку трудно снять с подложки, на которой она была при-
готовлена, то тогда удобно использовать в качестве подложки
хлористое серебро, которое прозрачно во всей средней инфра-
красной области, причем даже прокатка полимера вместе с этой
подложкой легко осуществима. При изучении фибриллярных бел-
ков, составляющих основу волос, кожи и различных тканей, при-
готовляют тонкие срезы необходимой толщины и вдоль опреде-
ленных направлений.

Переходы в инфракрасном спектре по сравнению с электрон-
ными переходами имеют значительно меньшую интенсивность
(приблизительно в 10—100 раз). В связи с этим требуемая тол-
щина слоя вещества равняется 5—20 мк при записи полос погло-
щения, соответствующих основным нормальным колебаниям. Как
правило, обертоны имеют меньшую интенсивность, и толщина
слоя в этом случае увеличивается до 0,1—1,0 мм. В большинстве
спектрометров сечение пучка света, проходящего через образец,
составляет около 1 см2. Отсюда становятся понятными большие
трудности, которые возникают при получении поляризационных
спектров ориентированных полимерных слоев или монокристал-
лов. Относительно небольшая площадь образца, которая может
быть пригодна для получения качественного поляризационного
спектра, требует применения специальных зеркальных конденсор-
ных микроосветителей, позволяющих довести размеры рабочего
сечения пучка до величины около 100 X 500 мк. Подобные микро-
осветители дают возможность также уменьшить количество веще-
134
ства, необходимого для получения спектра до 0,01 мг по сравне-
нию с I мг при обычном сечении пучка. Наличие микроосветителя
открывает большие перспективы для использования инфракрас-
ной спектроскопии в биохимических анализах.

Следует отдельно сказать об одном специальном методе — из-
бирательном дейтерозамещении, который широко применяется
при изучении биологических соединений при помощи инфракрас-
ной спектроскопии. Группы OHhNH, встречающиеся в органиче-
ских соединениях, способны очень быстро обменивать водород на
дейтерий при взаимодействии с тяжелой водой. Полагают, что ме-
ханизм быстрого обмена связан с наличием неподеленных пар
электронов в этих группах. При изучении дейтерообмена в поли-
мерах было замечено, что не все группы замещаются одинаково
быстро, а именно, скорость обмена резко уменьшается в «кри-
сталлических» областях, где молекулы плотно упакованы и ко-
ординаты каждого атома фиксированы достаточно жестко. В от-
дельных случаях удается различать несколько типов химически
одинаковых групп (например, NH), имеющих различные скоро-
сти обмена. Применение инфракрасных спектров для контроля
за дейтерообменом очень удобно по той причине, что некоторые
частоты колебаний молекул с группами NH и ND значительно
отличаются одна от другой, а это очень удобно для анализа.
Сильное изменение частоты объясняется относительно большим
(в два раза) увеличением массы одного из атомов, принимающих
активное участие в данных колебаниях. Иногда используют так-
же реакцию обратного обмена дейтерия на водород. Наконец,
специфические сдвиги частот при дейтерозамещении являются
очень хорошим признаком, позволяющим опознать полосы по-
глощения NH- или ОН-групп в спектре неизвестного соединения
или судить о степени участия этих групп в соответствующих ко-
лебаниях сложных молекул. Метод избирательного дейтероза-
мещения позволяет получить ценную информацию об упаковке
полипептидных цепей в молекулах глобулярных белков, причем
важно то, что он применим как к твердым белкам, так и к их
растворам.

Подробнее с различными методическими вопросами инфра-
красной спектроскопии можно ознакомиться в обзорных рабо-
тах [13, 14].

б.	Интерпретация инфракрасных спектров

При поглощении света с данной частотой молекула или атом
получают соответствующий квант энергии или, как говорят, пе-
реходят на более высокий энергетический уровень. В инфракрас-
ной области поглощается свет именно тех частот, которые равны
частотам колебаний атомов в молекуле. Изучая рассеяние види-
мого света молекулой, при определенных условиях можно обна-
ружить также рассеянный свет, отличающийся по частоте от па-
дающего на частоту колебаний атомов в молекуле. Это.явление
называется комбинационным рассеянием (Раман-эффектом) и
служит вторым методом в дополнение к инфракрасной спектро-
скопии, позволяющим изучать колебания атомов в молекуле. Ин-
тенсивность линий комбинационного рассеяния зависит от свойств
поляризуемости электронных оболочек связей, тогда как интен-
сивность полосы поглощения определяется изменением диполь-
ных моментов связей при колебании. Ввиду сравнительной слож-
ности экспериментальных методов получения спектров комбина-
ционного рассеяния последние в настоящее время применяются
в молекулярной биологии крайне редко, несмотря на то, что из-
мерение водных и других растворов осуществляется иногда даже
проще, чем в инфракрасной спектроскопии. За отсутствием ин-
тересующих нас работ по спектрам комбинационного рассеяния
в дальнейшем мы будем иметь в виду только инфракрасные
спектры поглощения.

Известно, что при колебаниях атомов в молекуле их смеще-
ния из положений равновесия имеют достаточно малые амплиту-
ды по сравнению с длинами связей и равны нескольким сотым
долям ангстрема. Такие колебания могут быть описаны теорией
малых гармонических колебаний [15, 16], которая требует, чтобы
силы связи между атомами имели упругий характер. Таким обра-
зом, молекулу можно рассматривать как совокупность точечных
масс (ядер атомов), связанных между собой упругими пружин-
ками, которые и удерживают систему в пределах равновесной
конфигурации.

Согласно теории гармонических колебаний, молекула из N
атомов должна иметь 3N—6 собственных частот или нормаль-
ных колебаний. В нормальном колебании каждый из атомов мо-
лекулы движется в определенном для него направлении и все
атомы одновременно проходят положение равновесия. Для на-
хождения уравнений движения, определяющих спектр колебаний
молекулы, требуется знать геометрию молекулы, массы атомов
и потенциальную функцию, зависящую от искомых смещений ато-
мов из положений равновесия. Коэффициенты упругости связей
и валентных углов, определяющие потенциальную функцию, на-'
зываются силовыми коэффициентами. При решении задачи о дви-
жениях атомов в качестве искомых величин удобнее использовать
не смещения атомов из положения равновесия, а систему внут-
ренних колебательных координат: изменения равновесных длин
связей, расстояний между отдельными атомами, изменения ва-
лентных углов и др. Набор этих параметров, полученных в ре-
зультате решения уравнений движения, носит название формы
колебания. Форма нормального колебания дает нам возможность
представить полную картину каждого из колебательных движе-
ний молекулы. Мы узнаем, как сильно изменяются длины связей,
136
валентные углы в данном нормальном колебании, и можем срав-
нить изменения этих параметров с их изменениями в другом ко-
лебании. Зная форму колебаний, мы можем найти и смещения
атомов из положения равновесия. Форма колебаний необходима
также для определения интенсивности и поляризации колебания.
Из сказанного выше ясно, что для расчета частот и соответству-
ющих форм колебаний необходимо знать силовые коэффициенты,
чтобы составить функцию потенциальной энергии молекулы.
По ряду причин эти коэффициенты можно однозначно вычислить
из значений экспериментальных частот только для молекул с
небольшим числом атомов. В органических молекулах очень ча-
сто приходится иметь дело с ограниченным набором определен-
ных групп атомов (например, связи С—С, С—N, С = О или груп-
пы СН2, СНз), встречающихся в различных сочетаниях. Это об-
стоятельство позволяет с известным приближением использовать
отдельные элементы силового поля малых молекул при состав-
лении потенциальной функции многоатомных молекул для рас-
чета их спектра колебаний.

Расчетные методы являются основой интерпретации спектров,
и только они дают возможность с достаточной уверенностью ска-
зать, колебания каких групп молекулы ответственны за появле-
ние тех или иных полос поглощения. Итак, если известна геомет-
рическая конфигурация молекулы и можно составить потенци-
альную функцию, то теория малых колебаний позволяет
рассчитать спектр нормальных частот и определить форму
каждого из нормальных колебаний молекулы. Сравнение полу-
ченных результатов с наблюдаемым спектром дает возможность
объяснить происхождение каждой полосы поглощения, после чего
спектр может быть использован для получения различной инфор-
мации о структуре и свойствах молекулы.

Частота и форма колебания являются важными характеристи-
ками движений атомов в молекуле. Однако не каждое колебание
может проявиться в инфракрасном спектре поглощения, иными
словами, не каждое колебание активно. Так же, как в электрон-
ных спектрах, интенсивность полосы в инфракрасном спектре
пропорциональна квадрату момента перехода между двумя ко-
лебательными уровнями, а поляризация определяется направле-
нием этого момента. Расчеты и анализ интенсивностей и поля-
ризаций в инфракрасном спектре гораздо более сложны, чем рас-
четы частот и форм колебаний {16], поэтому в настоящее время
они применяются еще очень редко.

Большие возможности изучения молекул при помощи коле-
бательных спектров обусловлены тем, что почти всегда в слож-
ной молекуле имеются колебания, которые можно отнести к выде-
ленным группам атомов, хотя большая часть из них, так назы-
ваемые скелетные, характеризуют молекулу в целом. Изучение
таких характеристических колебаний имеет важное значение.
Принято называть колебания вполне характеристическим для
данной группы, если одно из нормальных колебаний молекулы
совпадает по частоте и форме с одним из нормальных колебаний
данной группы как свободной молекулы. Разумеется, это требо-
вание может быть выполнено только приближенно, так как в
силу действия закона сохранения момента количества движения
при колебании данной группы так или иначе затрагивается и
остальная часть молекулы. Тем не менее это определение харак-
теристичности оказывается очень удобно на практике при каче-
ственном анализе спектров. Условия характеристичности по по-
ляризации и особенно по интенсивности значительно более жест-
кие, чем условия характеристичности по частоте и форме, и если
они и выполняются, то для очень ограниченного числа колебаний
молекулы. Этим объясняется, в частности, большая чувствитель-
ность интенсивности полосы к различным межмолекулярным
взаимодействиям.

Понятие характеристичности колебаний является основным
при проведении структурно-группового анализа многоатомных
молекул и, особенно, полимеров при помощи колебательных спек-
тров. В большинстве случаев молекула полимера представляет
собой длинную цепь, составленную из одинаковых мономерных
единиц. Вполне характеристическое колебание (иногда употреб-
ляют термин локализованное колебание или говорят о групповых
частотах) в этом случае, как правило, характеризует группу ато-
мов, находящуюся в повторяющейся единице. Такое колебание
по частоте и форме очень близко к соответствующему колебанию
в исходной мономерной молекуле.

в.	Применение инфракрасной спектроскопии
для изучения белков и нуклеиновых кислот

Спектр нормальных колебаний молекулы, как уже говорилось
выше, занимает диапазон от 4000 до 50 см-1. Спектр органиче-
ских соединений можно разбить на отдельные интервалы, кото-
рые приближенно характеризуются следующим образом: от 4000
до 2000 см-1— валентные (с изменением длин связей при коле-
бании) колебания связей типа ХН, YH2 (X, Y = C, О, N и др.); от
2000 до 1300 см-1—колебания, обусловленные изменениями длин
связей, образуемых относительно тяжелыми, по сравнению с во-
дородом или дейтерием, атомами С, О, N с кратностью связей
больше единицы. В интервале 1300—700 см~1 проявляются ске-
летные колебания, в которых вследствие сильного взаимодей-
ствия принимают участие обычно все одинарные связи типа С—С,
С—N, С—О, а также углы типа ССН, CNH др. Спектр в этой
области очень характерен для молекулы конкретного вида и по
этой причине иногда называется «отпечатком пальца» молекулы.
Низкочастотная область (ниже 700 см-1) занята деформацион-
ними колебаниями, которые обусловлены изменениями углов,
образованных связями типа XY; частоты деформационных коле-
баний углов типа XYH и ХН2 лежат выше (1000—1600 см-1).
Следует, конечно, помнить, что приведенное описание спектра
является весьма условным, так как практически каждое колеба-
ние молекулы включает в себя одновременно изменения различ-
ных связей и углов.

Подробный анализ спектров белков и нуклеиновых кислот, а
также обсуждение проблем, стоящих перед инфракрасной спек-
троскопией биополимеров, можно найти в специальных моногра-
фиях и обзорах [17—19].

Инфракрасные спектры аминокислот, пепти-
дов, полипептидов и белков. Особенностью поглощения
аминокислот и пептидов в твердом состоянии является наличие
сильных полосв области 3000—3500 см-1 и около 1600 и 1400 см-1.
Было показано, что эта особенность обусловлена ионным дипо-
лярным состоянием молекулы: в высокочастотной области — ва-
лентными колебаниями NH* или NH3, а полосы 1600 и 1400 см1
соответствуют двум основным колебаниям карбоксильной груп-
пы — СОО-. По мере удлинения полипептидной цепи проявле-
ние концевых групп становится менее заметным (хотя возможно
обнаружение ионизированных групп боковых цепей аминокис-
лотных остатков), зато отчетливо наблюдается сильное погло-
щение пептидной (амидной) группы. В большинстве белков и

Ох /С
полипептидов эта группа имеет транс-конфигурацию	•

С/с ХН
Валентные колебания NH связи дают сильную полосу около
3300 см-1. В области ниже 2000 см~1 выделяются несколько силь-
ных полос, обозначаемых «Амид I» (около 1650 см-1), «Амид II»
(около 1550 см-1) и «Амид III» (около 1200—1300 см-1), обу-
словленных колебаниями в плоскости, и широкая полоса поглоще-
ния неплоских деформационных колебаний NH («Амид V»). Все
перечисленные колебания являются достаточно характеристиче-
скими и практически не зависят от природы боковых цепей.

Выяснению происхождения амидных полос посвящено много
работ. Хорошим показателем принадлежности полосы пептидной
группе служит уменьшение ее частоты при замещении атома во-
дорода на дейтерий. Особенно сильно, приблизительно в]/”2 раз,
в соответствии с формулой (2), уменьшается частота валентных
колебаний NH.

Другим характерным признаком амидных колебаний могут
служить сдвиги частот в сильно разбавленных растворах непо-
лярных растворителей. Этот эффект обусловлен разрывом водо-
родной связи N—Н—-О = С. Наблюдаемые изменения нетрудно
объяснить,, если представить себе пептидную группу в виде шари-
ков с пружинками: при разрыве водородной связи силовые
коэффициенты связей NH и СО увеличиваются, так как умень-
шаются длины этих связей, т. е. а0 в формуле (3), тогда как си-
ловые коэффициенты углов ОС и CNH уменьшаются. Отсюда
следует, что валентное колебание NH в пептидной группе без во-
дородной связи будет иметь более высокую частоту (около
3450 ел-1), чем с водородной связью (около 3300 слг-1). Точно
так же и полоса Амид I, обусловленная колебанием, при кото-
ром сильно изменяется длина связи СО, будет иметь соответ-
ственно более высокую частоту (на 40—50 ел-1). Наоборот, час-
тоты деформационных колебаний Амид И, Амид III и Амид V
сдвигаются при разрыве водородной связи в сторону низких час-
тот. Величина сдвига частоты характеризует силу водородной
связи. Наибольший сдвиг имеют валентное и неплоское деформа-
ционное колебания группы NH. Сильно изменяются также шири-
на полос и их интенсивность: при наличии водородной связи поло-
сы поглощения шире и приблизительно на порядок интенсивнее.
В большинстве полипептидов и белков полоса валентных коле-
баний NH-группы имеет частоту максимума в интервале 3280—
3310 см~1-, исключение составляют белки группы коллагена (час-
тота около 3330 ся-1). Такая большая стабильность частоты, не-
зависимо от конформации, объясняется, по'видимому, тем, что
основные параметры пептидной водородной связи (и главным
образом расстояние N...O) во всех этих структурах остаются при-
близительно постоянными. Частота валентного колебания остает-
ся практически неизменной даже в том случае, когда полипептид
имеет беспорядочную конформацию цепей, правда, при этом ши-
рина полосы становится заметно больше.

В настоящее время интерес исследователей сосредоточен глав-
ным образом на изучении трех амидных колебаний — v0, vi, v2
(валентное колебание NH, полосы Амид I и II соответственно).
Расчеты нормальных колебаний пептидной группы показали [17],
что из всех плоских колебаний три отмеченные наиболее локали-
зованы и могут быть описаны смещениями из положений равно-
весия лишь шести атомов самой пептидной группы (рис. 7). Мы
видим, что общепринятые названия колебания Амид I и Амид II—
«карбонильное колебание» и «деформационное колебание NH» —
довольно грубо характеризуют эти колебания, хотя и правильно
отражают их основную сущность. Действительно, поляризация
колебания vi приблизительно совпадает с направлением связи
СО, а для v2 она направлена почти перпендикулярно связи NH в
соответствии с направлением поворота этой связи при колебании.
Объясняется это тем, что интенсивность и поляризация колеба-
ний пептидной группы в самом грубом приближении могут быть
получены из рассмотрения колебаний только тех связей, которые
имеют наибольший дипольный момент и характеризуются наи-
большим изменением дипольного момента при растяжении связи.
Такими связями в пептидной группе являются связи СО и NH.
3300 см'1

1650 см'’ 1550 см'1

Рис. 7. Смещение атомов из положений равно-
весия для некоторых основных колебаний пеп-
тидной группы в транс-конфигурации. Для на-
глядности амплитуды смещений представлены
в увеличенном виде (10:1) по отношению к
размерам связей. Стрелки, заостренные с обоих
концов, показывают направление момента
перехода [17]

Их дипольные моменты должны быть равны около 2,3 и 1,3 D,
если пептидная группа имеет кетонное строение; на самом деле
они еще больше. Все остальные связи имеют дипольные моменты,
близкие к нулю, и, следовательно, в этом приближении слабо про-
являют себя в интенсивности и поляризации полос поглощения.
Поляризация основных колебаний пептидной группы, показанная
на рис. 7, была определена экспериментально при изучении ди-
хроизма инфракрасного поглощения монокристаллов, имеющих
известную структуру. Таким образом, мы располагаем достаточ-
ным количеством сведений о происхождении основных колебаний
пептидной группы. Благодаря этому стало возможным успешное
изучение структуры полипептидов и фибриллярных белков мето-
дом инфракрасной спектроскопии.

В соответствии с предложенным рентгеноструктурным крите-
рием, фибриллярные белки можно разбить на три основные груш
пы: 1) а-белки со спиральной конформацией полипептидной цепи;
2) р-белки с конформацией складчатого слоя с вытянутой цепью;
3) белки группы коллагена со сложной спиральной конформа-
цией, отличной от конформации белков а-группы.

В таблице 2 показан характерный инфракрасный дихроизм
основных пептидных полос, который может быть использован
для определения принадлежности белка к данной структурной
группе.

В таблице даны приближенные частоты и поляризации полос
поглощения (|| — параллельно оси волокна, ± — перпендикуляр-
но). Мы видим, что белки коллагеновой группы по дихроизму
полос похожи на р-белки, однако частоты основных пептидных
полос весьма специфичны (например, валентные колебания NH).

На рис. 8 изображен поляризационный спектр типичного пред-
ставителя р-белков — фиброина шелка [20]. Волокно было взято


Рис. 8. Поляризационный спектр фиброина шелка шелковичного червя (а) и поляризационный спектр
частично дейтерированного фиброина шелка (б). Образец выдерживали несколько суток в парах
тяжелой воды [20]. Сплошная линия — электрический вектор падающего излучения перпендикуля-
рен оси волокна, пунктирная — параллелен
достаточно толстое, так что на спектре хорошо видны относитель-
но слабые скелетные колебания пептидной группы и боковых
цепей в области 800—1400 см-1. Проявился перпендикулярный
дихроизм очень широкой полосы Амид V с максимумом около
710 см-1. Неплоские деформационные колебания происходят
перпендикулярно оси волокна. Это означает, что плоскость пеп-
тидной группы приблизительно параллельна оси волокна, тогда
как перпендикулярный дихроизм валентных колебаний NH гово-
рит о том, что водородные связи образованы в структуре поперек
оси волокна, т. е. полипептидные цепи вытянуты вдоль волокна.
Характерный дихроизм ^-структуры еще отчетливее проявляется
в спектре частично дейтерированного образца, выдержанного в
парах тяжелой воды в течение нескольких суток. В результате
такой обработки происходит замещение только в аморфных час-
тях волокна. При этом по дихроизму валентных колебаний видно,
что замещенная аморфная часть практически не ориентирована.

Таблица 2

Частота и поляризация
основных инфакрасных полос белков

Группа |£елков	V#	V1	V2
а 		3300 |[	1660 II	15451
3 		33oo_l	1640 ±	15301|
Коллаген			33001	16601	1550 ||

Изучение различных особенностей структуры белков и их про-
явления в инфракрасных спектрах значительно удобнее проводить
на синтетических полипептидах. В ориентированной полимерной
пленке полипептидная цепь может иметь различные конформа-
ции в зависимости от того, из какого растворителя и при каких
условиях она получена. Более того, оказывается, что даже одна и
та же конформация цепи может существовать в различных струк-
турных модификациях. Так, например, молекулы могут быть упа-
кованы как параллельно, так и антипараллельно, а при ориента-
ции располагаются как вдоль, так и поперек основного направле-
ния ориентации. Все структурные особенности находят отражение
в частотах, интенсивностях и поляризациях полос поглощения.
Конечно, это касается не только основных пептидных, но и ске-
летных колебаний, причем даже в большей степени, последние,
однако, в настоящее время не могут быть интерпретированы до-
статочно надежно.

Рассмотрим для примера подробнее картину колебания
Амид I антипараллельной кристаллической упаковки вытянутых
полипептидных цепей (рис. 9). В элементарной ячейке находятся
четыре пептидные группы, соединенные между собой попарно
v±(5r,0)

\ц(ОХ)

Рис. 9. Диаграмма Миядзява, иллюстрирующая различные
типы колебания (полоса Амид 1) антипараллельной кристал-
лической упаковки вытянутых полипептидных цепей. Стрелки
обозначают направление момента перехода при колебании.
Знак в кружочке — отклонение вектора вперед ( + ) или
за плоскость чертежа (—) [21]



посредством либо химических, либо водородных связей. Согласно
общей теории колебаний, в этом случае каждый колебательный
уровень расщепляется на четыре подуровня в соответствии с сим-
метрией ячейки, и мы имеем четыре колебательных перехода.
Картина смещений атомов из положений равновесия зависит от
различия фаз колебаний отдельных пептидных групп. Японский
физик Миядзява [21] развил теорию возмущений с учетом взаимо-
действий слабо связанных между собой и достаточно локализо-
ванных пептидных колебаний. Частота колебания v (б, б') зави-
сит как от степени взаимодействия, так и от разности фаз б между
движениями атомов пептидных групп одной цепи и разности фаз
У колебаний пептидных групп через водородную связь. Таким
образом, в нашем случае мы имеем четыре колебания: v (0, 0).
v (0, л), v (л, 0), v (л,л), причем первое в инфракрасном спек-
тре не активно. Из диаграммы на рис. 9 сразу можно определить
поляризацию любого из компонентов. Полуэмпирический расчет
частот показывает, что они различны. В частности, параллельный
компонент v (0, л) должен иметь частоту около 1690 см~1, что
позволяет обнаружить его, несмотря на малую интенсивность,
так как основной сильный компонент v (л, 0) имеет частоту
1630 см Эта особенность отчетливо видна в спектре фиброина
шелка и является прямым доказательством наличия соответству-
ющей антипараллельной упаковки полипептидных цепей в струк-
туре данного белка.

С изучением спектров глобулярных белков дело обстоит зна-
чительно сложнее. Регулярная структура полипептидной цепи в
их молекулах образуется только на небольших участках, причем
единое направление, вдоль которого могут быть ориентированы
цепи, отсутствует. Поэтому даже если и удастся получить поляри-
зационный спектр кристаллического слоя, интерпретация инфра-
красного дихроизма глобулярных белков будет гораздо сложнее,
чем фибриллярных. В то же время именно этот параметр может
оказаться наиболее чувствительным к различным типам молекул.
Расшифровка тонкой структуры основных амидных полос и ее
связи с конформацией полипептидных цепей дают основание на-
деяться, что инфракрасные спектры могут оказаться полезными
и для таких сложных молекул.

Инфракрасные спектры нуклеотидов и нук-
леиновых кислот. Подобно аминокислотам и пептидам,
нуклеотиды могут существовать в различных ионных формах.
Количество этих таутомерных форм в нуклеотидах значительно
больше, чем для многих простых аминокислот, так как в их моле-
кулах имеются разные Места, в которых возможно присоединение
протона. Практически наблюдается сравнительно мало таутомер-
ных форм из-за того, что протонизация в ряде случаев энергети-
чески невыгодна. Однако одновременное существование уже
только двух из них значительно осложняет изучение инфракрас-
ных спектров соединений этого класса. Другой трудностью явля-
ется то, что структурные формулы азотистых оснований гораздо
сложнее формул пептидной группы, поэтому в настоящее время
описание их нормальных колебаний отсутствует. Это, безусловно,
снижает достоверность выводов, полученных на основе полуэмпи-
рической интерпретации основных полос поглощения, и ограничи-
вает информацию, которая в принципе могла бы быть извлечена
из спектров. Так же, как и в случае белков, приближенная интер-
претация основных групповых частот в инфракрасных спектрах
нуклеиновых кислот была сделана на основании изучения погло-
щения отдельных атомных группировок в низкомолекулярных

Ю Физические методы исследования белков

145
Рис. 10. Поляризационный спектр пленки литиевой соли ДНК при разных
относительных влажностях

а—86%; 6—15% [22]. Сплошная и пунктирная линии имеют тот же смысл, что на рис. 8

I .

соединениях. В отличие от спектров белков, спектры нуклеино-
вых кислот характеризуются колебаниями не одной, а несколь-
ких основных групп атомов.

На рис. 10 представлен инфракрасный спектр литиевой соли
дезоксирибонуклеиновой кислоты (Li ДНК). Сильные полосы ва-
лентных колебаний NH, ОН и структурной воды находятся в об-
ласти 3500—3000 см~1. Полосы в области 1750—1550 см~1 обу-
словлены так называемыми колебаниями кратных связей СО, CN,
СС. Точная форма этих колебаний, относящихся к плоским коле-
баниям атомов колец азотистых оснований, неизвестна. Из изу-
чения спектров простых молекул следует, что в этой области на-
ходятся колебания, связанные с растяжением сопряженных свя-
зей указанного типа. Две сильные полосы с частотами
максимумов около 1240 и 1080 сл^-1 обусловлены антисимметрич-
ным’и симметричным колебаниями заряженной группы РО2, при
которых изменяются наибольшим образом длины связей РО.
Все другие колебания имеют полосы гораздо слабее по интенсив-
ности, и надежная интерпретация их сейчас отсутствует.

Поляризация основных полос поглощения в спектре ДНК
позволяет получить сведения о пространственной ориентации
плоскостей азотистых оснований и расположении фосфатных
групп. Эти данные не противоречат известной спиральной модели
молекулы, предложенной Уотсоном и Криком. Дихроизм основ-
ных полос зависит от влажности среды, в которой находится
полимерная пленка. При этом.различные характеристики полос
146
(частота, поляризация и др.) относительно стабильны в некото-
рых узких интервалах влажности, соответствующих определен-
ным формам — А, В, С. На рис 10, а образец находится в кри-
сталлической форме А, на рис. 10, б — в форме С. Из спектров
хорошо видно, что ориентация, а следовательно, и кристаллич-
ность ДНК сильно зависят от влажности среды и, как было по-
казано [11], пленка становится практически полностью дезориен-
тированной при нулевой влажности. Изучение зависимости часто-
ты и интенсивности полосы фосфатной группы от влажности
позволило также определить, что эта группа гидратируется в ин-
тервале от0 до 66% относительной влажности, тогда как гидрата-
ция азотистых оснований начинается выше 60%. При повышении
влажности частота основного максимума фосфатной полосы око-
ло 1240 см-1 увеличивается приблизительно на 20 см-1. Эти из-
менения аналогичны изменениям частоты полосы Амид I при
образовании водородной связи между карбонильной связью и
связью NH в пептидной группе. Различно поляризованные ком-
поненты фосфатной полосы в спектре ДНК имеют небольшое
(около 6 см.-1) расщепление по частоте, однако ближайшие фос-
фатные группы находятся довольно далеко одна от другой и их
взаимодействие должно быть мало. На этом основании можно
высказать мысль, что взаимодействие колебаний соседних фос-
фатных групп передается через своеобразный мостик ••Н—О—
—Н—, который образуют молекулы воды в структуре ДНК.

Значительное место в инфракрасной спектроскопии нуклеи-
новых кислот занимает изучение водных растворов в области
плоских колебаний кратных связей. Как уже говорилось выше,
различие в таутомерных формах нуклеотидов связано главным
образом с разной протонизацией атомов пуриновых и пиримиди-
новых оснований. При этом происходит перераспределение плот-
ности л-электронов на кратных связях кольца и непосредственно
примыкающих к нему карбонильных связях. Поскольку повыше-
ние кратности связи приводит к соответствующему увеличению
силовой константы этой связи и наоборот, то протонизация так
или иначе должна приводить к изменению частот полос поглоще-
ния, обусловленных колебаниями кратных связей. Определенные
значения частот этих колебаний могут проявляться и при обра-
зовании специфических пар оснований: цитозин — гуанин и аде-
нин— урацил (аденин — тимин). Действительно, было обнару-
жено, что первая пара имеет более высокую частоту 1720 см-1,
тогда как вторая пара — около 1700 см~х. При разрушении водо-
родных связей, естественно, эти частоты на 20—30 см-1 ниже.
Удобнее исследовать растворы не в обычной, а в тяжелой воде,
более прозрачной в области 1500—1800 см-1. При этом происхо-
дит замещение водородов, способных образовывать водородные
связи, на дейтерий. Косвенным образом, через участие в колеба-
ниях связей ND, частоты колебания кратных связей сдвигаются
Рис. 11. Инфракрасные спектры
натриевой соли ДНК в тяжелой
воде

действие pD среды: а: 1 — pD=5; 2 —
pD=ll; б: 1 — pD~5; 2 — после обра-
ботки дезоксирибонуклеазой в течение
2,5 часа при 37° С; pD = 5; в: 1 — pD = 5;

2 — действие температуры 100® С в те-
чение 8 мин. [23]

в низкочастотную область на
20—30 слг[. Эти наблюдения
принципиально важны не толь-
ко потому, что они дают нам
большее понимание спектраль-
ных изменений; они открывают
возможности для определения
отношения специфических пар
Ц — Г и А — Т при помощи ин-
фракрасной спектроскопии.

Теперь становится более по-
нятным, почему в спектре дена-
турированной ДНК (а также
РНК) исчезает высокочастот-
ная компонента колебаний
кратных связей около 1710 см-1
(в растворе тяжелой воды —
около 1680 см~}). Нативная вы-
сокомолекулярная ДНК из ти-
муса теленка в растворе тяже-
лой воды имеет характерный
спектр в области колебаний
кратных связей (рис. 11). Вид
спектра заметно изменяется
под действием щелочной сре-
ды, дезоксирибонуклеазы или
нагревания. Особенно хорошо
видно различие в высокоча-

стотной области (около 1680 см”1) рассматриваемого интервала
спектра. Поскольку детального объяснения этого сдвига частот
нет, можно высказать лишь общие соображения о причинах про-
исходящих спектральных изменений: так или иначе изменяется
взаимодействие специфических пар оснований; не исключено
и образование новых водородных связей типа основание —
вода.

Во всяком случае подобные наблюдения могут послужить ос-
новой для использования этой области спектра в аналитических
целях. Примером может служить довольно успешное примене-
ние такой методики при изучении различных структурных комп-
лексов синтетических полинуклеотидов.

3.	Спектрополяриметрия

Метод дисперсии оптической активности в настоящее время
стал одним из основных методов исследования структуры и кон-
формационных превращений в биополимерах. Его широкое при-
148
менение объясняется сравнительной простотой измерений, отсут-
ствием необходимости специального препарирования образцов
.в отличие от других методов (рентгеноструктурный анализ, ис-
следование инфракрасных спектров, рассеяние света и др.).
Кроме того, большое преимущество этого метода состоит в том,
что при помощи современных спектрополяриметров можно ис-
следовать очень небольшие количества вещества (малые кон-
центрации), что особенно важно при исследовании биополи-
меров.

Величина вращения плоскости поляризации при одной длине
волны (обычно .D-линии натрия — 589 ммк.) является одной из
основных характеристик веществ и содержится в любом химиче-
ском справочнике.

Однако измерение вращения плоскости поляризации при
одной длине волны несет значительно меньшую информацию,
чем измерение дисперсии оптической активности, т. е. враще-
ния плоскости поляризации вещества в зависимости от длины
волны.

То, что метод дисперсии оптической активности не применял-
ся в течение длительного времени (явление дисперсии оптической
активности было открыто в 1817 г., а развитие метода началось
приблизительно в начале 1952 г.) объясняется тем, что измере-
ние дисперсии оптической активности на визуальных приборах,
которые применялись в то время, очень затруднено и ограничено
узкой областью спектра. Несмотря на то, что метод дисперсии
оптической активности применяется лишь в последнее десятиле-
тие, интенсивная экспериментальная работа с белками, полипеп-
тидами и нуклеиновыми кислотами позволила по достоинству
оценить возможности этого метода для исследования конформа-
ции макромолекул.

Что касается теории, то в области спектрополяриметрии поло-
жение совершенно аналогично положению в спектрофотометрии.
Существует общая квантовомеханическая формула, позволяю-
щая вычислить оптическую активность, если известны волновые
функции молекулы. Поскольку точное вычисление волновых
функций невозможно, используются различные приближенные
методы. Кроме того, существуют теории, позволяющие избежать
необходимости нахождения волновых функций и выражающие
оптическую активность через спектр поглощения и геометрию
молекулы. Эти теории имеют, однако, довольно узкую область
применения. Поэтому трактовка полученных результатов пред-
ставляет значительные трудности, и к ним необходимо относиться
с известной осторожностью. Все выводы относительно конфор-
мации макромолекул, сделанные на основе спектрополяриметри-
ческих данных, необходимо проверять другими методами.
а.	Сущность явления оптической активности

Оптически активной называется среда, при прохождении
через которую плоскость поляризации света поворачивается на
некоторый угол. Для понимания причины этого явления плоско-
поляризованную волну удобно представить в виде лево- и право-
поляризованных по кругу волн, т. е. волн, в которых конец све-
тового вектора (вектора электрического поля) движется по кругу

Рис. 12. «Мгновенная фотография» световой циркулярно-
поляризованной волны, распространяющейся вдоль оси z.
Электрический вектор движется против часовой стрелки
для наблюдателя, смотрящего навстречу волне (волна
левая}

при постоянном z (ось z совпадает с направлением распростра-
нения световой волны), а при постоянном t и изменяющемся z—
описывает спираль (рис. 12).

Правая циркулярнополяризованная волна выражается фор-

мулами:	Ex = E0cos(otf — kz),  Ey = — Ео sin (со/ — kz),
левая:	Ех = Ео cos (at — kz),	j  Ey = Eo sin (at — kz).

Легко видеть, что при сложении этих двух волн получается
плоскополяризованная волна:

Ех — 2Е0 cos (at — kz),
Е^О.

(22)

Если в уравнениях (20) и (21) амплитуды не равны, то при сло-
жении получится не плоскополяризованная волна, а волна, элек-
трический вектор которой описывает при заданном z эллипс
(эллиптически поляризованная волна).

При прохождении плоскополяризованного света через опти-
чески активное вещество одна из этих волн будет распростра-
няться в веществе с большей скоростью, чем другая. Это приво-
дит к повороту плоскости поляризации света [24]. Так как ско-
рость световой волны в среде обычно характеризуют при помощи
показателя преломления, можно сказать, что оптически активная
среда имеет различные показатели преломлений — п~ и п+ соот-
ветственно для лево- и правоциркулярнополяризованного света
или, другими словами, среда проявляет «циркулярное двойное
лучепреломление». Угол поворота на единицу длины пути выра-
жается уравнением:

а = у(п_-п+),	(23)

где % — длина волны падающего света; а—-угол, размерность
которого дана в радеем. Обычно а выражают в град]дм пути.
Для этого выражение (23) надо умножить на 1800/л.

При работе с растворами обычно пользуются другими величина-
ми: удельным вращением [а]?и — величиной, постоянной для данного
вещества:

[а]ч= а//с,	(24)

где а — вращение [раствора, в град', I—длина пути света в рас-
творе в дм\ с — концентрация вещества, в г/см?\ или молярным
вращением [MR— величиной, характеризующей силу вращения дан-
ного вещества, рассчитанную на 1 моль:



(25)

где М — молекулярный вес. Эта величина имеет смысл вращения
раствора с концентрацией 1 моль] л при длине пути света 1 м.

Обе эти величины являются функциями длины волны света.

Для полимерных молекул, например белков и полипептидов,
вводят величину вращения на 1 моль мономерных звеньев (в слу-
чае белков и полипептидов на 1 моль аминокислотных остатков)

[Я]х =



(26)

где 7? — средний молекулярный вес мономерного звена. Величина
вращения плоскости поляризации зависит от показателя преломле-
ния растворителя п. Чтобы найти величину вращения плоскости
поляризации, которую имела бы молекула, помещенная в раствори-
тель с показателем преломления, равным единице (т. е. в вакуум),

экспериментально определенную величину умножают на так назы-
ваемый Лоренцев множитель Полученная величина называется
з
приведенным удельным вращением [/?'] =

В оптически активной среде обе циркулярнополяризованные
компоненты не только распространяются с разными скоростями,
но также по-разному поглощаются. После выхода из такой среды
свет будет эллиптически поляризован. О такой среде говорят,
что она проявляет циркулярный (круговой) дихроизм. Обычно
циркулярный дихроизм заметен вблизи полос поглощения опти-
чески активного вещества и носит название эффекта Коттона.
Следует иметь в виду, что любая среда, имеющая циркулярное
двойное лучепреломление, одновременно проявляет циркуляр-
ный дихроизм. Между этими факторами так же, как между по-
глощением и дисперсией в обычной оптике, существует связь, и,
измеряя на опыте одно явление, можно теоретически по форму-
лам Крамерса — Кронига вычислить другую величину [25].

Точно так же, как в обычной оптике, в области большого цир-
кулярного дихроизма (в области сильного поглощения) диспер-
сия оптической активности становится аномальной. В области,
далекой от полос поглощения, дисперсия оптической активности
изменяется плавно и называется нормальной.

В литературе очень часто аномальную дисперсию оптической
активное™ называют эффектом Коттона. Такая терминология
неправильна, поскольку эффектом Коттона называется эффект
превращения плоскополяризованной волны в эллиптически поля-
ризованную.

В параграфе 1 отмечалось, что каждой полосе поглощения
можно сопоставить линейный осциллятор. Однако он не вращает
плоскости поляризации света. -Простейшей моделью, приводящей
к вращению, служит система из двух связанных осцилляторов,
расположенных в разных плоскостях и повернутых один отно-
сительно другого на угол ф. Модель впервые предложена Куном.

Пусть осцилляторы имели одинаковые частоты до их сближе-
ния. При возникновении связи между ними полоса поглощения с
частотой wo, отвечающая изолированным осцилляторам, расще-
пится на две с частотами сщ и ст>2, как это было объяснено в па-
раграфе 1. Если расстояние между осцилляторами d и они по-
вернуты один относительного другого на угол ф, то плоскость
поляризации света круговой частоты со при прохождении слоя
вещества единичной толщины с концентрацией «куновских ди-
меров» п повернется на угол

а = mf0------- I----------------Id sin ф, (27)

т ci | (О3 — Ю3 СО3 — СО3 J

где /о — сила осциллятора; с — скорость света.

Хорошо видно, что при d или ф, равных нулю, угол а = 0. Если
система имеет плоскость или центр симметрии, то она является
оптически неактивной. Величина взаимодействия в уравнении
(27) проявляется в раздвижке частот ®i и ст>2, причем при отсут-
ствии взаимодействия между осцилляторами (а>1 = а>2 = соо) вра-
щение, как видно из формулы (27), исчезает. Формула (27) те-
ряет смысл в полосе поглощения, так как в ней не учитывается
затухание.
Рис. 13. Дисперсия оптической активности и циркулярный дихроизм двух
осцилляторов с частотой соо, расщепившейся в результате взаимодействия на
две частоты — (Oi и со2

— сильное расщепление по частоте; б — слабое расщепление по частоте

На рис. 13 изображены кривые дисперсии оптической актив-
ности [а] и кругового дихроизма [ел — е ] для куновской модели
при разных величинах расщепления частот (щ и о2. Кривые (см.
рис. 13) построены с учетом затухания. В случае системы со
многими собственными частотами со, формула (27) обобщается
естественным образом:

D
[а]и=«>22-------(28)

i

где Rc называется силой вращения i-перехода. Сумма берется по
всем полосам поглощения системы. При этом имеет место соотно-
шение:

=	(29)

i

называемое правилом сумм. Формула (27), очевидно, подчиняется
этому правилу.

Чаще всего дисперсию оптической активности измеряют в за-
висимости от длины волны X = Легко перейти в формулах (27)
ю
и (28) от со к К. Формула (28) примет вид:

= 3 7T-V- ’	(30)

где а£ = Формула (30) впервые получена Друде и носит его
имя,

б.	Методы измерения вращения плоскости
поляризации

Современные приборы являются однолучевыми, измерения
производятся нулевым методом, т. е. установкой на минимум ин-
тенсивности света, прошедшего через поляризатор, исследуемый
образец и анализатор, причем световой сигнал регистрируется
фотоэлектрическим методом.

фэу

Рис. 14. Блок-схема спектрополяриметра с ячейкой Фарадея
в качестве модулятора

1 — источник света; 2 — конденсор; 3 — монохроматор; 4 — конденсор;
5 — поляризатор; 6 — модулирующая ячейка; 7 — термостатируемый дер-
жатель образца; 8 — анализатор; 9 — фотоумножитель; 10 — усилитель-
ное устройство; 11 — генератор

Преимущества нулевого метода общеизвестны: устранение
влияния нестабильности источника света, нестабильности коэф-
фициента усиления электрической части прибора и — самое глав-
ное— устранение изменения пропускания света исследуемым
образцом. Для увеличения точности установки на минимум ис-
пользуются модуляционные устройства, обусловливающие кача-
ние плоскости поляризации около нулевого положения и являю-
щиеся, таким образом, известными аналогами полутеневых
устройств визуальных приборов. Преимущества усиления на
переменном токе также общеизвестны.

Все современные фотоэлектрические спектрополяриметры,
позволяющие производить измерение поворота плоскости поля-
ризации с точностью ~10~3 град, работают на этом принципе.
Блок-схема спектрополяриметра представлена на рис. 14. Источ-
никами света в спектральной области 180—700 ммк служат ксе-
ноновые или криптоновые лампы сверхвысокого давления. Водо-
родные лампы позволяют работать в области спектра 180—
400. ммк. В последнее время разработаны дейтериевые лампы,
дающие возможность работать в более далекой ультрафиолето-
вой области спектра (~ 160 ммк). Свет от источника фокусирует-
ся конденсором (2) на входную цель монохроматора (5). В по-
следнее время все чаще стали применять двойные монохромато-
ры с целью снизить до минимума рассеянный свет в приборе.
Как было показано [26], рассеянный свет в приборе приводит к
различным артефактам при измерении вращения плоскости по-
ляризации в области сильного поглощения света в веществе.
Поскольку именно монохроматор есть основной источник рас-
сеянного света в приборе, его выбор должен производиться осо-
бенно тщательно. Далее за монохроматором следует конденсор
(4), формирующий параллельный или близкий к параллельному
пучок света, который используется непосредственно в поляри-
метре. За конденсором расположен поляризатор (5). В настоя-
щее время в качестве поляризатора и анализатора (8) исполь-
зуются призмы различных типов и из различных материалов.
В видимой и ближней ультрафиолетовой областях спектра (до
~240 ммк) используются призмы из исландского шпата (кальци-
та). В более коротковолновой области спектра исландский шпат
сильно поглощает и призмы изготовляются из кристаллического
кварца. В последнее время стали изготовлять призмы из АДП
(кристаллы диаммониевой соли фосфорной кислоты). Этот мате-
риал обладает пропусканием до ~ 150—160 ммк. Основной его
недостаток — гигроскопичность.

Следующим элементом поляриметра является модулятор (6).
Его действие сводится к тому, что он поворачивает с определен-
ной частотой плоскость поляризации света, выходящего из поля-
ризатора, на определенный угол в ту и другую сторону (по часо-
вой стрелке и против) относительно плоскости поляризации
поляризатора. Существуют несколько типов таких устройств.

1.	Ячейка Фарадея, представляющая собой кювету с веще-
ством, помещенную в переменное магнитное поле.

2.	Механическое устройство, позволяющее помещать в пучок
света попеременно пластины из левого и правого кварца.

3.	Механическое устройство, качающее одну из призм — поля-
ризатор или анализатор.

За модулятором находится держатель образца (7). Обычно
это приспособление снабжено термостатирующим устройством.
После анализатора (8), представляющего собой также поляри-
зационную призму, свет попадает на фотоумножитель (9).

Рассмотрим работу спектрополяриметра, в котором в каче-
стве модулятора применена ячейка Фарадея. На соленоид ячей-
ки от специального генератора (11) подается синусоидальное на-
пряжение с частотой о). Плоскость поляризации света на выходе
155
колеблется с той же частотой и амплитудой

а = Я/а,

(31)

где Н— амплитуда напряженности переменного магнитного поля
в соленоиде; I — длина кюветы; а — постоянная Верде [27] веще-
ства, применяемого в модуляционной кювете. Если исследуемое
вещество поворачивает плоскость поляризации на угол ф, а приз-
мы поляризатора и анализатора скрещены под углом 90°, то на
фотоумножитель падает свет интенсивностью

I = Io sin2 (ф Ц- a sin at).

(32)

При ф и а<^1 (что обычно выполняется, так как а не превышает,
как правило, 1—3 град)

1 ~ /0 (ф + a sin at)2 = /0 ф2 -ф ц2 -]-2фа sin at —- a2 cos 2coz) .

(33)

Световой поток, следовательно, содержит постоянную слагаю-
щую и гармоники с частотами (о и 2а. Когда вращения нет или
оно скомпенсировано (ф = 0), составляющая с частотой со про-
падает. Сигнал с фотоумножителя попадает на радиотехниче-
ское устройство (10), служащее для выделения сигнала частоты
со и для регистрации его минимума. Для компенсации вращения
исследуемого образца используется компенсационное устройство,
поворачивающее плоскость поляризации на тот же угол ф, но в
обратную сторону. По нему и производится отсчет измеряемого
поворота плоскости поляризации.

Так как именно при работе с биополимерами часто приходит-
ся иметь дело с очень небольшими вращениями (до ~0,005—
—0,01°), необходимо иметь хорошее компенсирующее устрой-
ство, снабженное отсчетным устройством, позволяющим с над-
лежащей точностью измерять подобные вращения. Одним из
самых простых и одновременно наиболее точных компенсирую-
щих устройств является ячейка Фарадея, питаемая постоянным
током. В ней угол ф определяется по силе тока в катушке.

в.	Дисперсия оптической активности белков
и полипептидов

Из уравнения (30) следует, что если знать силу вращения и
длину волны каждой оптически активной полосы поглощения в
данной молекуле, то можно предсказать дисперсию оптической
активности. И, наоборот, при помощи этого уравнения можно
оценить электронные параметры соответствующих переходов из
наблюдаемой дисперсии оптической активности.

Большинство оптически активных веществ не имеет полос
поглощения в видимой части спектра: они расположены в ближ-
ней, а большинство — в далекой ультрафиолетовой области
спектра. Поэтому до тех пор, пока измерения проводятся в ви-
димой и близкой ультрафиолетовой области с не очень большой
точностью (и поскольку полосы поглощения веществ лежат до-
статочно далеко друг от друга), дисперсия оптической активности
часто подчиняется одночленному уравнению Друде

№ = —.	(34)

V —X2

Хотя самая длинноволновая полоса поглощения, т. е. самая
близкая к области, в которой ведутся измерения, дает наиболь-
ший вклад, Кс часто не совпадает со значенияем Л длинноволно-
вой полосы.

В случае отдельных аминокислот более точные измерения
показывают, что дисперсия оптической активности подчиняется
не одночленному, а двучленному уравнению Друде [28]. По-ви-
димому, при дальнейшем совершенствовании измерений диспер-
сии оптической активности и более детальном обсчете этих кри-
вых придется использовать еще больше членов уравнения Друде.
С другой стороны, из кривых дисперсии оптической активности
можно будет получить силы вращения отдельных полос.

Характерная, т. е. не зависящая от белковых групп, но суще-
ственно зависящая от конформации полипептидов составляющая
дисперсии оптического вращения возникает при взаимодействии
амидных групп, входящих в состав полипептида. В а-спирали
амидные группы ориентированы одна относительно другой впол-
не определенным образом. В результате взаимодействия между
ними длинноволновая л->л*-полоса, рассмотрением которой мы
пока ограничимся, расщепляется на две, с длинами волн Ад и
Х2, в результате чего дисперсия оптического вращения спираль-
ного полипептида должна описываться двучленным уравнением
Друде

[«•]% =

41

л2-/.2

а2

/.2

(35)

Поскольку расщепление невелико, мы можем подвергнуть формулу
(35) следующему преобразованию.

Введем среднюю длину волны Хо = и величину АХ =
= - ~ ^2. Тогда, пренебрегая величиной (АХ)2 по сравнению с АХ,
имеем:

Ki = Го 4- 2Х0АХ,

Г = г — 2Х0АХ.
Подставляя эти выражения в (35) и разлагая получающиеся при

этом выражения в ряд до членов первого порядка по

2Х0ЛХ

—2—полу-
Х2-Х2

чим

[ah = -gi+-aa„ +.2k0AL
х2 -	(z2 - х2)2

Введя обозначения

«I +	2ДХ (Я1 - а2)

--------- И оп = -------------

находим окончательно

[«К ==

х2 - х3 № - х2)2 ’

(36)

Выражение (36) называется уравнением Моффита и играет важ-
ную роль в молекулярной биологии, поскольку дисперсия опти-
ческой активности полипептидов и белков, находящихся в спи-
ральном состоянии, удовлетворяет ему в широкой области длин
волн.

Поскольку Ьо пропорционально ДХ., а для денатурированной
структуры ДХ = 0 (расщепление по частоте отсутствует), то
&о=О для клубка и отлично от нуля для спиральных участков,
причем измеряемая величина Ьо просто пропорциональна сте-
пени спиральности, т. е. доле вещества, находящегося в спираль-
ных участках. Что касается коэффициента а0, то в него дают
вклад как клубкообразная структура, так и спиральные участки
и он, следовательно, должен быть линейной функцией от сте-
пени спиральности.

Три параметра, которые входят в уравнение (36), можно вы-
числить из кривой дисперсии оптической активности. Если отло-

X2 - X3	X2

жить значения [а]д,------ в зависимости от ------’

х3	X2 —X2

случае в этих координатах экспериментальные данные не лягут
на прямую. Величина Хо подбирается таким образом, чтобы
экспериментальные точки легли на прямую, уравнение которой
запишется так:

г , Х2-%3	Vo

[ah---------= а0 Н-------.	(37)

X3	х2-х2

Из наклона прямой определяется Ьо, а из пересечения с осью ор-
динат — а0. Измерения дисперсии оптической активности в спек-
тральной области 300—600 ммк для спиральных полипептидов
дали значения Х0=212 ммк. Однако при расширении измеряемой
области спектра до ~240 ммк оказалось, что ?.о для некоторых
полипептидов отличается от 212 ммк [26].

Кополимер 5%-кого L-тирозина с L-глутаминовой кислотой в
области спектра между 240 и 280 ммк вместо Х0 = 212 ммк дал
величину fa = 216 ммк (рис. 15) [26]. Следует отметить, что в

Рис. 15. Графическое представление уравнения
Моффита при двух разных Хо для кополимера 5%
I-тирозина с /.-глутаминовой кислотой в области
спектра от 240 до 700 ммк

/ — спиральная форма Хо = 216 ммк, 2 — то же,
Хо=212 ммк; 3 — клубкообразная форма Ло = 216 ммк;

4 — то же, Ло ~ 212 ммк

формуле Моффита коэффициент Ьо сильно зависит от выбора
Хо [29]. Так, значения Ьо для кополимера 5%-ного L-тирозина с
L-глутаминовой кислотой оказались соответственно равны — 615
и —535 при значениях Хо 212 и 216 ммк. Уравнение (36) следует
рассматривать как эмпирическое с Хо = 212 ммк и Ьо = —630 для
полностью сйиральных полипептидов.

Поскольку удельное вращение [а] и дисперсия оптической
активности значительно изменяются при переходе спираль —
клубок, эти данные можно использовать для определения сте-
пени спиральности белков и полипептидов.

Если принять, что данная макромолекула содержит только
две структуры — спиральную и клубкообразную, то

[ak==(l-fa)[a]£ + fa[a]",	(38)

где [а]х и [а]х —удельные вращения чисто клубкообразной и
спиральной структур соответственно; fa—степень спираль-
ности [30].
Как уже указывалось выше, в уравнении Моффита (36) коэф-
фициент а0 есть линейная функция степени спиральности, а Ьо
прямо пропорционально степени спиральности.

Степень спиральности можно определить тремя способами:
по [a]xj, по а0 и по Ьо.

Однако определение степени спиральности макромолекул по
[а] х и по а0 менее надежно, поскольку в эти величины дает вклад
не только спиральная структура, но и отдельные асимметриче-
ские мономерные единицы (например аминокислоты), вращение
которых очень сильно зависит от окружающей среды, в част-
ности, от растворителя.

Значение степени спиральности, определенное по формуле
[н = —°'"'"5' , где &о,'наб определяется из уравнения (37) по дис-
630

Персии оптической активности для данного белка или полипеп-
тида, хорошо совпало со степенью спиральности, определенной
другими методами (методом дейтериевого обмена, методом гипо-
хромного эффекта и др.).

Уравнение (36) прекрасно описывает дисперсию оптической
активности спиральных полипептидов и фибриллярных белков.
Однако и для глобулярных белков, чья дисперсия описывается
одночленным уравнением Друде с изменяющимся от 210 до
280 ммк для разных белков, бывает очень полезно формально
применить уравнение Моффита (36). Степень спиральности гло-
булярных белков, определенная таким образом, хорошо совпала
с результатами, полученными другими методами.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в исследова-
нии конформаций макромолекул методами оптической актив-
ности, есть вопросы, которые еще очень мало изучены. Среди
них — вопрос о роли, которую играют другие вторичные и тре-
тичная структуры белков и полипептидов.

В тех случаях, когда в белках встречаются спиральные участ-
ки другого знака, метод оптической активности неприменим.

Развитие фотоэлектрических спектрополяриметров позволило
измерять аномальную дисперсию оптической активности непо-
средственно в полосах поглощения вещества. Подобные измере-
ния дают возможность непосредственно измерять точное поло-
жение оптически активных полос поглощения и их силу враще-
ния [25]. Однако эти измерения очень затруднены и могут быть
выполнены пока лишь на уникальных приборах. Измерение ано-
мальной дисперсии в полосах поглощения позволяет усовершен-
ствовать уравнения, описывающие дисперсию оптической актив-
ности в видимой и ультрафиолетовой областях. На рис. 16
представлена аномальная дисперсия оптической активности для
спиральной и клубкообразной формы поли-у-метоксиэтил-£-глу-
тамата [31]. Из рис. 16 видно, что кривая аномальной дисперсии
160
80

70

Г

60	• I

Рис. 16. Дисперсия оптической
активности в области собственно-
го поглощения синтетического по-
липептида поли-у-метоксиэтил-

Л-глутамата

1— спиральная форма; 2 — клубкооб-
разная форма

оптической активности спирального полипептида пересекает ось
абсцисс в двух точках — 225 и 193 ммк.

Основываясь на полученных результатах, Шехтер и Блоу [31]
предложили использовать двучленное уравнение Друде (35) с
М = 193 ммк и Хг = 225 ммк для описания дисперсии оптической
активности в видимой и ближ-
ней ультрафиолетовой области
спектра.

Оказалось, что для полипепти-
дов и белков определенные гра-
фически константы щ и а2 урав-
нения (35) являются линейными
функциями степени спиральности.
Степень спиральности, определен-
ная из значений этих коэффициен-
тов для различных белков и поли-
пептидов, оказалась очень хоро-
шо согласующейся со степенью
спиральности, определенной по
гипохромному эффекту и методом
рентгеноструктурного анализа.
Предложенное двучленное урав-
нение Друде, несомненно, имеет
больший физический смысл, чем
эмпирическое уравнение Моффи-
та с Хо = 212 ммк. По-видимому,
метод Шехтера и Блоу является в
настоящее время наиболее совер-
шенным.

Тем не менее правильность та-
кого подхода недостаточно обос-
нована. Дело в том, что в области
180—230 ммк спектр поглощения
полипептидов состоит из трех по-
лос: двух полос с максимумами
при 191 и 206 ммк, образовавших-
ся в результате расщепления
л->л*-полосы амидной группы, и одной га^л*-полосы (225 ммк).
Поэтому дисперсию оптической активности нужно было бы опи-
сывать трехчленным уравнением Друде.

Для выяснения вопроса о том, какие же полосы дают основ-
ной вклад в дисперсию оптической активности (дисперсия опти-
ческой активности одинаково хорошо описывается как уравне-
нием Моффита, так и уравнением (35), точно так же, как хорошо
опишется трехчленным уравнением Друде), необходимы более
тщательные экспериментальные и теоретические исследования
этого вопроса.

11 Физические методы исследования белков

161
г. Дисперсия оптической активности нуклеиновых кислот

Можно заранее сказать, что, поскольку молекулы нуклеино-
вых кислот состоят из звеньев, содержащих асимметрические
атомы, они должны обладать оптической активностью. Оказы-
вается, что пуриновые основания дают в видимой области спект-
ра отрицательное вращение, в то время как пиримидиновые ос-
нования дают близкое по величине, но положительное вращение

Рис. 17. Кривые плавления тимусной
ДНК

1 — измерена по изменению оптической плотности
при 259 ммк; 2 — измерена по изменению удельного
вращения [а]£>

плоскости поляризации. Раствор одинаковых концентраций пу-
риновых и пиримидиновых оснований оказывается почти неак-
тивным. Того же результата можно ожидать для полностью
разупорядоченной (клубковой) конформации нуклеиновых кис-
лот, что и наблюдается на опыте. Однако, как и для полипепти-
дов, вторичная структура нуклеиновых кислот дает вполне
заметное положительное вращение. Удельное вращение, изме-
ренное при длине волны 589 ммк, для ДНК из спермы лосося
равно 125°, а для РНК, выделенной из печени крысы,— 133°.

На основании различия в удельном вращении плоскости по-
ляризации нуклеиновых кислот в нативном и денатурированном
состоянии можно использовать измерение вращения плоскости
поляризации в качестве метода для определения степени спи-
ральности этих макромолекул. На рис. 17 [32] представлены
кривые плавления ДНК, полученные по гипохромному эффекту
162
в полосе поглощения 259 ммк и по измерению удельного вра-
щения.

Как видно, эти кривые плавления хорошо совпадают. С чем
связано небольшое увеличение вращения в области температур
от 50 до 80°, пока неясно. Не исключено, что в этой температур-
ной области ДНК изменяет свою структуру.

Рис. 18. Кривые дисперсии оптической активности

Л — ДНК из спермы лосося: / — нативная ДНК в 0,15 М NaCl+0,15 М KF, pH 7,0; 2 —
денатурированная ДНК в том же буфере при 90° С; 3 —то же + NaOH, pH 12,3; Б — РНК
из печени крысы: 1 — нативная РНК в 0,15 М NaCl+0,01 М фосфатного буфера, pH 7,0
при 27° С; 2 — денатурированная РНК в том же буфере прн 90° С; 3 — денатурирован-
ная РНК в том же буфере + NaOH, pH 12,3

Метод дисперсии оптической активности для нуклеиновых
кислот оказывается менее полезным, чем для белков и полипеп-
тидов. Как указывалось в начале главы, при образовании поли-
нуклеотидов не происходит заметного расщепления полос погло-
щения оснований. В соответствии с этим дисперсия оптической
активности полинуклеотидов в спиральной и клубковой конфор-
мации удовлетворяет одночленному уравнению Друде (30) в
области спектра от 300 до 600 ммк и поэтому нет такого удоб-
ного параметра в уравнении, описывающего дисперсию оптиче-
ской активности, как Ьо для полипептидов и белков.

Параметры уравнения (30) для ДНК имеют следующие зна-
чения: а = 39,0, Хс = 234 ммк — для нативной ДНК спермы лосо-
ся и а = 40,0, Хс=244 ммк — для нативной РНК печени крысы.

Исследование аномальной дисперсии оптической активности
нуклеиновых кислот позволило связать образование вторичной
структуры с положением и величиной амплитуды кривой ано-
мальной дисперсии оптической активности. На рис. 18, Л и 18, Б
{33] представлены кривые аномальной дисперсии оптической
активности для ДНК и РНК соответственно. Приведены кривые
аномальной дисперсии оптической активности, отвечающие
различным конформациям нуклеиновых кислот. Как в случае
ДНК, так и в случае РНК кривые аномальной дисперсии оптиче-
ской активности претерпевают изменения при переходе макро-
молекулы от одной конформации к другой.

Несомненный интерес представляют измерения аномальной
дисперсии оптической активности и циркулярного дихроизма в
полосе поглощения синтетических полинуклеотидов, в частности
полирибоадениловой кислоты (полиА) и коротких однонитевых
фрагментов полирибоадениловой кислоты вида АрА (две моле-
кулы аденозина соединенных фосфодиэфирной связью), которые

Рис. 19. Аномальная дисперсия опти-
ческой активности

1 — полиА при 22° С, pH 7,0; 2 — димеры
аденина АрА при 25’ С, pH 5,9; 3 — моно-
меры аденина Ар прн 25° С, pH 5,9. При
этих условиях полиА находится в состоя-
нии однонитевых спиралей

Рис. 20. Спектры циркулярного
дихроизма (/) и поглощения (2)
димеров аденина АрА

в дальнейшем для простоты мы будем называть просто димерами
аденина [34, 35]. Эти измерения можно привести как иллюстра-
цию успешного применения методов исследования оптической
активности для определения структуры биополимеров. Кривые
аномальной дисперсии для полиА и димеров аденина имеют
асимметричный вид (рис. 19) и очень напоминают схематические
кривые аномальной дисперсии оптической активности, изобра-
женные на рис. 13 на основании рассмотрения простейшей мо-
дели Куна. То же можно сказать и про кривые циркулярного
дихроизма (рис. 20). Интересно заметить, что уже димеры аде-
нине (см. рис. 19, кривая 2) обладают аномальной дисперсией
оптической активности с такой же асимметричной кривой, как
для полиА при pH 7,4.
При измерении оптической активности было установлено, что,
кроме двухнитевой спиральной структуры полиА при pH 4,5, в
стабилизации которой определенную роль играют водородные
связи, образующиеся между нитями, существует однонитевая
спиральная структура полиА, стабилизация которой при нор-
мальных pH в основном определяется вандерваальсовым вза-
имодействием соседних оснований вдоль цепи макромолекулы.

Измерение циркулярного дихроизма димеров аденина позво-
лило определить угол между осцилляторами, а, следовательно,
и угол между основаниями в димере [35].

Рис. 21. Аномальная дисперсия опти-
ческой активности комплексов ДНК
фага Т2 с акридиновым оранжевым
1—нативная ДНК в концентрации 2- 10-5 АГ,
концентрация акридинового оранжевого
1 • 10~5 М\ 2 — денатурированная ДНК в
концентрации 1,6 • 10~5 М; концентрация
акридинового оранжевого 1,2 -И)-5 М. Рас-
твор в цитратном буфере 0,001 М, pH 6,0

Рис. 22. Аномальная дисперсия опти-
ческой активности комплекса натив-
ной ДНК фага Т2 с пинацианолом.
Концентрация ДНК 1,2'10-5Л1; кон-
центрация пинацианола 3’10~e М.
На одну молекулу красителя прихо-
дятся четыре нуклеотида ДНК. Рас-
твор в цитратном буфере 0,001 М,
pH 6,0

Как видно из сказанного, наиболее интересные сведения о
структуре биополимеров можно получить при измерении кривых
аномальной дисперсии оптической активности и кривых цир-
кулярного дихроизма в ультрафиолетовой области спектра, что,
однако, связано со значительными экспериментальными трудно-
стями. В связи с этим нельзя не упомянуть о методе исследова-
ния биополимеров при помощи измерения аномальной дисперсии
оптйческой активности красителей, связанных с биополимерами.
Плоская, оптически неактивная молекула красителя, связываясь
.с.биополимером, становится оптически активной, причем величи-
на и форма кривой аномальной дисперсии отражают в той или
иной степени структуру биополимера [36].

Связываясь с нативной ДНК, молекулы акридинового оран-
жевого становятся оптически активными и показывают аномаль-
ную дисперсию оптической активности в полосе поглощения
комплекса (рис. 21, кривая 1). При связывании того же краси-
теля с денатурированной ДНК аномальная дисперсия оптиче-
ской активности этого комплекса становится совершенно другой
(рис. 21, кривая 2).

Другие красители, в частности пинацианол, связываясь с де-
натурированной ДНК, не становятся оптически активными. Свя-
зываясь с нативной ДНК, пинацианол становится оптически
активным, причем только в том случае, когда на ДНК образуют-
ся димеры пинацианола [37]. Кривая аномальной дисперсии в
этом случае имеет сильно асимметричный вид (рис. 22), точно
такой же формы, как и для димеров аденина.

Исследование оптической активности комплексов красителей
с биополимерами в видимой области спектра позволяет, во-пер-
вых, получить некоторые сведения о механизме связывания кра-
сителей, в том числе биологически активных, с биополимерами,
что может оказаться важным для понимания их биологического
действия; во-вторых, узнать структуру самих биополимеров;
в-третьих, получить дополнительную информацию о свойствах
красителей.

4.	Люминесценция

Наряду с другими методами получения физической инфор-
мации о биологических структурах и процессах, в биологии и
биохимии в последние годы все шире применяются методы, осно-
ванные на изучении люминесценции биологически важных ве-
ществ. При этом наблюдается и качественное расширение того
круга задач, в решении которых эти методы оказываются полез-
ными. Если еще сравнительно недавно область применения лю-
минесцентных методов в биологии была практически ограничена
задачами люминесцентного анализа, т. е. качественной иденти-
фикации или количественного определения тех или иных биоло-
гически важных веществ, то сейчас эти методы все шире начи-
нают применяться для решения двух важнейших задач физико-
химической биологии: выяснения физических механизмов
фундаментальных биологических процессов и расширения наших
знаний о структуре компонентов клетки и биополимеров >.

Сознательное применение люминесцентных методов к реше-
нию этих новых, более сложных задач предъявляет к исследова-

1	Сказанное в полной мере относится и к специфической области люминес-
центной микроскопии, которой мы в настоящей статье совершенно не касаемся,
166
телям требование более глубокого знакомства с физикой явле-
ний люминесценции, нежели то, каким обладает большинство
биологов и биохимиков. Цель настоящей статьи — по возмож-
ности восполнить этот пробел и познакомить читателей, не яв-
ляющихся специалистами в области физики, с главными
физическими закономерностями и особенностями явлений люми-
несценции и с основными физическими характеристиками люми-
несцентного излучения.

Конечно, сделать это сколько-нибудь полно и глубоко в сжа-
тых рамках статьи невозможно, и читатель, желающий приме-
нять люминесцентные методы на современном уровне, должен
будет обратиться к специальной монографической и журнальной
литературе. К сожалению, однако, монографии о люминесценции,
написанной со специальным учетом требований и потребностей
биологии и биохимии, нет ни на русском языке, ни на иностран-
ных, а имеющиеся немногочисленные и частично устаревшие
монографии, написанные физиками для физиков, содержат много
материала, трудно доступного биологам и зачастую не представ-
ляющего для них непосредственного интереса.

Для общего ознакомления с вопросом можно рекомендовать
популярную книжку С. И. Вавилова [38] и две его обзорные
статьи [39]. Из монографий более специального характера наибо-
лее подходящими для биологов и биохимиков являются книги
Б. И. Степанова [40] и Форстера [41], хотя и эти книги во многом
могут показаться читателю-нефизику слишком трудными и спе-
циальными. Другая монография Б. И. Степанова [42] рассчитана
на читателя с довольно высоким уровнем подготовки в области
теоретической физики. По специальному, но очень важному воп-
росу о поляризации'люминесцентного излучения на русском язы-
ке есть монография П. П. Феофилова [43]. Эта книга освещает
ряд вопросов, не представляющих непосредственного интереса
для биологических проблем, однако- она дает возможность ясно
понять факторы, определяющие состояние поляризации люми-
несценции, и уяснить перспективы применения изучения поля-
ризационных характеристик для решения интересующих нас
проблем.

Две очень большие по объему монографии П. Прингсгейма
[44] и В. Л. Левшина [45] несколько устарели и содержат столь
большое количество данных, не представляющих непосредствен-
ного интереса для биологии, что их можно рекомендовать скорее
для справок, чем для систематического изучения.

В настоящей статье не сделано никаких попыток дать сведе-
ния о люминесцентных характеристиках отдельных классов био-
логически важных веществ. Наиболее полный обзор таких дан-
ных и обширные библиографические указания можно найти в
книге С. Юденфренда [46]. Ряд полезных сведений по этим воп-
росам имеется также в сборнике [47]. Обзор данных о люмине-
сценции белков см. в книгах Ю. А. Владимирова [48], С. В. Ко-
нева [49] и Баренбойма и др. [49а].

Приведенные в статье немногочисленные примеры конкрет-
ного применения люминесцентных методов в различных пробле-
мах молекулярной биологии носят выборочный и чисто иллю-
стративный характер. Они ни в какой мере не претендуют на
полноту обзора всех существующих достижений. Именно поэто-
му мы взяли примеры в основном из практики работы нашей ла-
боратории, считая, что в таком плане материал «из первых рук»
может представлять больший интерес, чем изложение чужих
результатов.

а. Определение и классификация явлений люминесценции

Определение люминесценции. Термин «люминес-
ценция» был введен в 1888 г. Видеманом для того, чтобы под-
черкнуть различие между равновесными («тепловыми») и
неравновесными процессами излучения. Всякое тело, находяще-
еся в тепловом равновесии с окружающей средой, т. е. могу-
щее характеризоваться определенной температурой, является
источником излучения, которое называют «тепловым», или «тем-
пературным». При обычных температурах это излучение лежит
в инфракрасной области, и лишь при температуре свыше 800° в
его составе появляются с заметной интенсивностью видимые
(красные) лучи. Только за счет теплового излучения никакое
тело при обычных температурах не могло бы испускать види-
мые и тем более ультрафиолетовые лучи с измеримой интенсив-
ностью. Между тем на практике мы часто встречаемся со слу-
чаями довольно сильного видимого или ультрафиолетового
свечения различных тел не только при комнатной температуре,
но и при сильном охлаждении. Такое свечение, например, сопро-
вождает ряд химических реакций, в том числе и реакций, проте-
кающих в живых организмах. Многие тела становятся источни-
ками видимого и ультрафиолетового излучения под действием
различных внешних факторов (рентгеновское или ультрафио-
летовое облучение, удары быстрых электронов и др.). Во всех
этих случаях,-очевидно, на равновесное излучение, свойственное
этим телам, как и всяким другим, накладывается излучение,
обусловленное какими-то иными, неравновесными процессами.
Именно для этих неравновесных процессов Видеман и предло-
жил термин «люминесценция».

Чрезвычайно важное и плодотворное уточнение понятия о
люминесценции было дано С. И. Вавиловым [50], который пока-
зал, что наиболее характерная особенность явлений люминес-
ценции— это конечная длительность излучения (или, что то же,
конечная длительность жизни возбужденных молекул), сущест-
венно превышающая период световых колебаний. По предельно
сжатому и точному определению Вавилова [51], «люминесцен-
цией тела в данной спектральной области называют избыток
излучения над температурным при условии, что это избыточное
излучение обладает конечной длительностью, превышающей пе-
риод световых колебаний».

Во избежание недоразумений заметим, что различие между
люминесценцией и другими процессами излучения заключается
не в природе элементарного акта излучения. Этот акт всегда
связан с переходом возбужденной молекулы с более высокого
энергетического уровня на более низкий. Но в случае теплового
излучения населенность различных уровней соответствует теп-
ловому равновесию; в случае неравновесных процессов на том
или ином уровне образуется избыток возбужденных молекул
над равновесным распределением. Различие между телами, лю-
минесцирующими под действием внешних факторов (например,
под облучением), и телами, не люминесцирующими, заключает-
ся в том, что в первых возбужденное состояние молекулы со-
храняется в течение некоторого более или менее значительного
(по атомным масштабам) промежутка времени, на протяжении
которого энергия может быть излучена или использована иным
способом, тогда как во вторых энергия возбуждения молекулы
чрезвычайно быстро, «мгновенно», разменивается по внут-
ренним степеням свободы и превращается, как правило, в
тепло.

Введение критерия длительности как основной характеристи-
ки явлений люминесценции прежде всего позволило четко отгра-
ничить эти явления от ряда других физически совершенно от-
личных процессов неравновесного излучения (комбинационное
рассеяние света, эффект Вавилова—Черенкова и др.). Однако,
по Вавилову, конечная длительность есть не простой классифи-
кационный признак. По существу это очень важный стержень, на
который нанизываются основные явления люминесценции. Этот
признак во многом определяет главные свойства люминесцен-
ции, доступные прямому наблюдению, а именно, спектр, яркость,
выход, поляризацию. При практическом применении люминес-
центных методов, в частности в проблемах молекулярной биоло-
гии, также очень важное значение имеет не только изучение
указанных экспериментальных характеристик, зависящих от
длительности возбужденных состояний косвенно, но и прямое
измерение этой величины.

Классификация явлений люминесценции. Весь-
ма многообразные по своей природе и характеристикам явления
люминесценции можно классифицировать по различным при-
знакам. Очень часто их классифицируют по признаку природы
того физического агента, который вызывает свечение. Разли-
чают фотолюминесценцию — свечение, возбуждаемое ультра-
фиолетовым или видимым излучением, хемилюминесценцию —
свечение, сопровождающее ряд химических реакций (частным
случаем является биолюминесценция — свечение организмов,
связанное с их жизнедеятельностью), рентгено- и радиолюми-
несценцию — свечение, вызываемое действием рентгеновских
лучей или других ионизирующих излучений, катодолюминесцен-
цию, вызываемую ударами быстрых электронов (телевизи-
онные экраны) и т. п.

С другой стороны, иногда классифицируют явления по ха-
рактерным особенностям люминесцирующих тел. Различают,
например, люминесценцию паров и газов, люминесценцию рас-
творов, кристаллов и т. п. Эти два способа классификации, оче-
видно, перекрываются, так как одно и то же тело может люмине-
сцировать под действием разных агентов и один и тот же агент
может вызывать люминесценцию разных тел. Во всяком случае
обе эти системы классификации преследуют только цели практи-
ческого удобства и не претендуют на более глубокий физический
смысл.

Разделение явлений люминесценции на явления флуоресцен-
ции и фосфоресценции было широко распространено в физике
еще несколько десятилетий назад и бытует и сейчас среди лиц,
более далеких от физики. Первоначально под флуоресценцией
разумели свечение «мгновенное», т. е. исчезающее «сразу» после
прекращения возбуждения, а под фосфоресценцией — свечение,
продолжающееся еще некоторое более или менее длительное вре-
мя после прекращения возбуждения. Этому различию приписы-
вали определенный физический смысл. Однако после того, как
было показано, что люминесценция всегда характеризуется неко-
торой конечной и измеримой длительностью свечения и этот факт
лег в основу самого определения явления, термины «флуоресцен-
ция» и «фосфоресценция» в их первоначальном определении по-
теряли строгий смысл. Их можно, конечно, употреблять и сейчас
для грубой качественной характеристики явления, но только в
таком же условном и относительном смысле, в каком мы гово-
рим о «горячих» и «холодных» телах.

Нужно отметить, что и практическая грань между явлениями
«флуоресценции» и «фосфоресценции» в указанном смысле все
больше стирается. С одной стороны, сейчас существует ряд син-
тетических типичных фосфоров с длительностью послесвечения
до 10-7 сек. С другой стороны, типичные «флуоресцирующие»
вещества (растворы сложных органических молекул) в опреде-
ленных условиях обладают послесвечением с длительностью в
десятки секунд.

Наиболее глубокая физическая классификация явлений лю-
минесценции была дана С. И. Вавиловым [51], который различал
три типа люминесцентного излучения.

1.	Излучение, возникающее при спонтанном (не зависящем
от внешних условий) переходе молекулы из состояния с большей
в состояние с меньшей энергией. К этому классу явлений, кото-
рые целесообразно называть флуоресценцией, относится свече-
ние растворов многих органических веществ, представляющее
для нас наибольший интерес. Длительность этих процессов све-
чения обычно лежит в пределах от 10 8 до 10-10 сек.

2.	Излучение, в процессе которого происходит переход моле-
кулы на промежуточный метастабильный (долгоживущий)
уровень, куда молекула попадает и откуда она может выйти
только вынужденным путем, например, при соударениях. Дли-
тельность этих процессов свечения имеет обычно значения от
1СН сек до десятков секунд. Примером явления такого рода мо-
жет служить длительное послесвечение органических соединений
в твердых средах, замороженных и вязких растворах. Вавилов
предложил для этих явлений наименование «длительное после-
свечение». Некоторые авторы говорят в этих случаях о «длитель-
ной флуоресценции», хотя против этого термина есть известные
возражения. Мне представляется наиболее удачным термин «ме-
тастабильная», или «триплетная», флуоресценция. Во всяком
случае не следует называть эти явления «фосфоресценцией», хотя
такое наименование встречается, к сожалению, довольно часто.

3.	Рекомбинационное свечение, при котором первичным ре-
зультатом действия возбуждающего свечение агента является
не переход молекулы в возбужденное состояние, а отрыв элек-
трона от люминесцирующего центра с последующей рекомбина-
цией электронов и ионизированных центров свечения. Именно
для этих явлений целесообразно сохранить термин «фосфорес-
ценция», так как именно здесь, в различии механизмов первич-
ного акта поглощения света, можно провести строгую границу
между терминами «флуоресценция» и «фосфоресценция». По-
следняя в указанном строгом смысле слова имеет место преиму-
щественно в обширном классе кристаллических веществ (фос-
форов или точнее кристаллофосфбров). В- биологии эти явления
пока не получили применения, и мы на них останавливаться
не будем.

Предпосылки для применения флуоресценции
к изучению биологических структур и функ-
ций. В рамках настоящей статьи мы ограничимся только озна-
комлением с основными характеристиками флуоресценции рас-
творов сложных органических молекул. Особое значение имен-
но этого круга явлений люминесценции для биологии и биохи-
мии обусловлено тем, что из всех сложных органических молекул
способностью люминесцировать (в растворах и в парах) обла-
дают только молекулы с более или менее развитыми система-
ми сопряженных связей, т. е. молекулы ароматические или ге-
тероциклические, а также полиены. Особенностью электронно-
го строения этого класса молекул является наличие у них систе-
мы коллективизированных л-электронов, которые не связаны с
отдельными атомами, а принадлежат молекуле как целому. Воз-
бужденные уровни этой системы л-электронов обладают той от-
носительной стабильностью, которая, как мы видели, необхо-
дима для того, чтобы молекула могла флуоресцировать. Эти
же л-электроны в первую очередь определяют и все наиболее
существенные химические и физико-химические свойства моле-
кул этого класса. Причина этого в том, что л-электроны сла-
бее связаны с молекулой, чем не коллективизированные сг-элек-
троны, определяющие жесткий скелет молекулы, в рамках ко-
торого разыгрываются события в л-электронном облаке.

С другой стороны, очень важно то, что именно к этому клас-
су веществ с сопряженными связями (л-электронами) относит-
ся большинство соединений, играющих основную роль в биохи-
мических процессах и входящих в состав основных структур, от-
ветственных за важнейшие явления жизнедеятельности. Доста-
точно указать на то, что к этому классу веществ относятся все
четыре азотистые основания, из которых построены нуклеино-
вые кислоты, три важнейшие аминокислоты, входящие в состав
всех функционально важных белков, все коферменты, многие
витамины и гормоны, наконец пигменты, участвующие в преоб-
разованиях световой энергии (хлорофилл и зрительные пигмен-
ты) . Внутренняя связь между этой важной биологической ролью
соединений с сопряженными связями и относительной стабиль-
ностью их возбужденных состояний сейчас еще не вполне ясна.
Быть может, в известной мере она связана с тем, что важную
роль в биологической активности этих соединений играет их спо-
собность легко отдавать и принимать электроны, т. е. выступать
в качестве трансмиттеров (доноров и акцепторов) электронов.

Причиной того, что среди различных физических методов ис-
следования структуры биополимеров и изучения механизмов
основных биологических функций все большую роль начинают
играть методы, основанные на изучении характеристик люмине-
сценции, является, с одной стороны, способность многих био-
логически важных соединений флуоресцировать как in vitro,
так и in vivo, а с другой — тот факт, что белки и нуклеиновые
кислоты легко образуют комплексы с флуоресцирующими мо-
лекулами. Изучение люминесцентных свойств таких комплексов
часто позволяет выяснить вторичную структуру и молекуляр-
ную морфологию этих биополимеров.

б. Спектры излучения

Уровни энергии сложных молекул. В случае про-
стых молекул колебательные подуровни каждого электронного
уровня дискретны, т. е. отделены один от другого конечным ин-
тервалом. Поэтому в так называемых полосатых спектрах по-
глощения и излучения таких молекул каждая электронная поло-
172
Рис. 23. Схема электронно-колебательных
уровней энергии сложных молекул. Жир-
ные линии — уровни электронной энергии,
частоты переходов между которыми обозна-
чены van. Тонкие линии — подуровни коле-
бательной энергии, сливающиеся в слож-
ных молекулах в непрерывную полосу. Рас-
пределение молекул по запасам колебатель-
ной энергии показано справа. Стрелки
вверх — различные переходы в спектре по-
глощения; стрелки вниз — некоторые из пе-
реходов в спектре флуоресценции

са распадается на ряд отдельных узких полосок или линий,
соответствующих переходам между разными колебательными
подуровнями соответствующих электронных состояний. Изучая
разности частот этих линий, мы можем определить разность
энергий соответствующих подуровней и тем самым проанализи-
ровать характер возможных колебаний атомов в данной моле-
куле.

В случае сложных молекул положение иное. Уровней коле-
бательной энергии здесь так много и они настолько близки один
к другому, что сливаются в одну непрерывную полосу (рис. 23).
Поэтому и спектры поглощения и флуоресценции этих моле-
кул имеют вид широких непрерывных полос без всякой опреде-
ленной структуры или, в некоторых случаях, со слабо выражен-
ной структурой. Обычно спектр поглощения состоит из ряда
таких частично перекрывающихся полос. Спектр флуоресцен-
ции, как правило, состоит только из одной полосы, соответ-
ствующей переходу с первого возбужденного уровня на основной
уровень. В пределах каждой полосы коэффициент экстинкции
или спектральная интенсивность излучения достигают макси-
мума при некоторых определенных значениях длины волны
^макс и Хмакс, а в обе стороны от максимума значения этих вели-
чин плавно падают до нуля.

Спектры поглощения и излучения сложных молекул не об-
наруживают структуры не только в растворах, но и в парах
этих соединений. Из этого ясно, что причиной бесструктурности
этих спектров и соответствующих систем энергетических уров-
ней являются не взаимодействия молекул с растворителем, а
особенности их внутренней структуры, наличие большого чис-
ла тесно связанных один с другим типов колебаний атомов
в молекуле.

В большинстве случаев тонкая структура спектров поглоще-
ния и люминесценции не выявляется даже при очень значитель-
ном охлаждении растворов. Именно такого рода молекулы
можно в строгом смысле слова считать «сложными». Наряду с
этим известен ряд случаев, когда структура, отсутствовавшая
при комнатной или более высокой температуре, начинает выяв-
ляться при низкой температуре. Такие молекулы называют «по-
лу сложными».

Особый интерес здесь представляют некоторые конденси-
рованные ароматические углеводороды, типичным представи-
телем которых является известное благодаря своему силь-
ному канцерогенному действию соединение 3,4-бензпирен. При
охлаждении растворов веществ этой группы в некоторых неполяр-
ных растворителях до очень низкой температуры спектр их рас-
падается на ряд очень тонких полосок, почти «линий», дающих
возможность проводить вибрационный анализ структуры таких
соединений. Это явление, открытое Э. В. Шпольским и потому
часто называемое «эффектом Шпольского», несомненно, пред-
ставляет очень большой интерес для анализа структуры ряда
важных биоорганических соединений. Мы не имеем возможно-
сти остановиться на этом подробнее и вынуждены отослать чи-
тателей к обзорной статье Шпольского [52].

Следует подчеркнуть, что предлагаемая классификация мо-
лекул (разделение их на «сложные», «полусложные» и «про-
стые») основана только на указанных спектроскопических раз-
личиях и ни в какой мере не характеризует их химической
сложности или простоты. В самом деле, с химической точки зре-
ния, нет оснований считать «полусложную» молекулу бензпире-
на или дибромметилат-9,9-биакридила более простой, чем
«сложные» молекулы таких красителей, как флуоресцеин или
акридиновый оранжевый.

Универсальность формы спектров поглоще-
ния и флуоресценции сложных молекул. Еще в
1922 г. С. И. Вавилов [53] обратил внимание на то, что форма
длинноволновой полосы поглощения сложных молекул имеет
универсальный характер и лишь в очень малой степени зависит
от индивидуальных особенностей строения молекулы. Если для
различных по своему составу и строению молекул построить
спектры поглощения, искусственно совместив их максимумы и
откладывая по оси абсцисс значения разности Хмакс — К то
спектры эти практически совпадают. Как видно из рис. 24, то же
справедливо и относительно формы полосы флуоресценции.

Эта универсальность формы полос поглощения и флуорес-
ценции представляет очень большой интерес как с точки зре-
Рис. 24. Универсальность формы полосы флуоресценции
1 — данные для химотрипсина (Л>макс =330 ммк; 2 —для
восстановленного ТПН (А-максв442 ммк); 3 — для люми-
нола (А,макс= 435 ммк); 4 — для акридинового оранжевого
(^макс “* 530 ммк)

ния физики процесса флуоресценции сложных молекул, так и с
точки зрения оценки практического значения спектральных ме-
тодов в интересующих нас проблемах молекулярной биоло-
гии. Теоретическое объяснение этой универсальности было да-
но Б. И. Степановым [42], который вывел общую формулу, оп-
ределяющую форму этих спектральных полос.

С точки зрения практической следует отметить, что универ-
сальность формы полос поглощения и флуоресценции очень
сильно ограничивает объем полезной информации, извлекаемой
из изучения этих спектров, и снижает ценность изолированны'
спектральных методов в органической химии и молекулярное
биологии. Действительно, по существу единственный индиви-
дуальный параметр, который можно получить из изучения
спектров поглощения и флуоресценции интересующих нас моле-
кул,— это значение длин волн, соответствующих максимумам
отдельных полос в этих спектрах. Этот параметр, однако, нельзя
однозначно связать с какими-нибудь определенными особенно-
стями состава и строения соответствующих молекул. Очень
часто молекулы, сильно различающиеся по составу и строению,
имеют весьма близкие максимумы поглощения и флуоресцен-
ции, а молекулы, сходные по строению, флуоресцируют и погло-
щают в различных областях спектра.

Эти обстоятельства сильно ограничивают даже возможности
спектрального (абсорбционного и люминесцентного) анализа
сложных органических соединений. В отличие от атомарного
спектрального анализа, где каждая линия прямо говорит о на-
личии в веществе того или иного атома, здесь идентификация
того или иного вещества по его спектру возможна лишь в огра-
ниченном числе случаев и всегда требует очень тщательного
анализа всей химической и физической ситуации.

Рис. 25. Спектр поглощения (7) и спектр флуо-
ресценции (2) щелочного раствора флуоресцеи-
на [45]

В еще большей мере это касается применения спектральных
методов для решения более сложных структурных и функцио-
нальных задач физико-химической биологии. В этих задачах
имеет обычно значение не спектр поглощения или флуоресцен-
ции сам по себе, а изменения этого спектра в результате той или
иной реакции или при протекании определенного биологического
процесса. Однако эти изменения носят лишь характер «сигнала
тревоги», свидетельствующего о том, что в системе произошли
изменения. Расшифровка характера и природы этих изменений
требует очень тщательного анализа всей обстановки и всех фак-
торов процесса. Как правило, она невозможна на основе одних
лишь спектральных данных, а требует комплексного изучения
всех параметров флуоресценции (ее выхода, длительности, поля-
ризации и т. д.).

Взаимное расположение и симметрия полос
поглощения и флуоресценции. Взаимное расположение
полос поглощения и флуоресценции растворов флуоресцеина,
изображенное на рис. 25, является типичным для всех флуорес-
цирующих органических молекул. Для него характерны две осо-
бенности.
1.	Полоса флуоресценции в целом и ее максимум смещены в
длинноволновую сторону относительно полосы поглощения и ее
максимума (правило Ломмеля).

2.	Полосы поглощения и флуоресценции частично перекры-
ваются (отрезок ab на рис. 25).

Из рис. 25 видно также, что по крайней мере качественно по-
лосы поглощения и флуоресценции зеркально симметричны: в
полосе поглощения интенсивность спадает от максимума более
круто в длинноволновую («красную») сторону и более полого —
в коротковолновую («синюю»); интенсивность флуоресценции,
напротив, круто спадает в синюю сторону и более полого — в
красную.

Рис. 26. Зеркальная симметрия спектров
поглощения (/ и Г) и излучения (2 и 2')
раствора родамина 6Ж [45]

В. Л. Левшин {54] показал, что для многих молекул эта зер-
кальная симметричность приобретает строго количественный ха-
рактер, если спектры строить не в шкале длин волн, а в шкале
частот и спектральную интенсивность флуоресценции выражать
числом квантов, излучаемых в соответствующей частоте, т. е. от-
кладывать по оси ординат величину — . Масштабы для обоих

V

сравниваемых спектров надлежит выбрать так, чтобы ординаты
максимумов этих спектров были равны (рис. 26).

Зеркальная симметрия спектров поглощения и излучения
имеет место не только для растворов, но и для паров сложных
молекул (Непорент {55]). Это показывает, что она не являет-
ся результатом взаимодействия флуоресцирующей молекулы с
растворителем, а связана с внутренними свойствами самой мо-
лекулы.

Зеркальная симметрия наблюдается также для ряда полу-
сложных молекул, в том числе и таких, в спектрах которых име-
ется колебательная структура. Однако в то время, как для типич-
ных сложных молекул она сохраняется и при понижении темпе-

\2 Физические методы исследования белков

177
ратуры, в случае полусложных молекул эта симметрия при
низких температурах нарушается. Таким образом, степень зер-
кальности всегда увеличивается по мере усложнения молекул и
точное ее выполнение является лишь предельным случаем. Ко-
нечно, здесь имеется в виду «сложность» молекулы в указанном
выше спектроскопическом, а не химическом смысле.

Теоретически вопрос о тех особенностях внутреннего строения
молекул, которыми обусловлена зеркальная симметрия спектров
поглощения и излучения, был рассмотрен В. Л. Левшиным [45].
Строгое обоснование правила зеркальной симметрии на основе
общих представлений квантовой теории дал Д. И. Блохинцев [56].
Соотношения зеркальной симметрии вытекают также из общей
формулы Б. И. Степанова для формы спектров абсорбции и
люминесценции сложных молекул. Вся эта совокупность вопро-
сов представляет очень большой интерес с точки зрения теории
спектров сложных молекул, но не имеет особенно существенного
значения для практических применений люминесценции в про-
блемах биохимии и молекулярной биологии. Поэтому мы не бу-
дем останавливаться на них подробно. Читатель может обратить-
ся к монографиям [41] и [42], в которых найдет ссылки на соот-
ветствующие оригинальные работы.

Независимость спектра флуоресценции от
длины волны возбуждающего света. В отличие от ато-
мов и простых молекул, спектр излучения которых зависит от
способа возбуждения, профиль полосы флуоресценции сложных
органических молекул не зависит ни от длины волны возбуждаю-
щего света, ни даже от того, возбуждается ли флуоресценция све-
том, ударом электронов или каким-нибудь иным способом. Толь-
ко при возбуждении светом большой длины волны (малой часто-
ты), лежащим в области перекрытия спектров поглощения и
флуоресценции (отрезок ab на рис. 25), наблюдаются некоторые
незначительные изменения формы полосы излучения.

Физический смысл этой фундаментальной закономерности
легко понять из рассмотрения схемы энергетических уровней
молекулы (см. рис. 23). В результате поглощения света различ-
ной частоты как простые молекулы или атомы, так и сложные мо-
лекулы могут оказаться в одном из возбужденных состояний Si,
S2, S3. В случае атомов или простых молекул мы наблюдаем в
спектре излучения свет с частотами, соответствующими перехо-
дам с высшего достигнутого возбужденного уровня на различные
другие нижележащие уровни. Если, например, молекула была
возбуждена до уровня 53, то в спектре могут наблюдаться линии,
соответствующие переходам S3-*S2, S3-*Sb S3->S0, а также «кас-
кадным» переходам S2-*Si, S2-*S0 и Si->S0. Если молекула бы-
ла возбуждена только до уровня S2, то, очевидно, первые три ли-
нии в спектре излучения возникнуть не могут. Таким образом,
спектр излучения зависит от характера возбуждения.
Напротив, в случае сложных молекул мы всегда, независимо
от того, на каком уровне находилась молекула непосредственно
после поглощения света, наблюдаем только флуоресценцию, со-
ответствующую переходам из самого нижнего возбужденного со-
стояния Si в основное состояние 50. Это означает, что очень бы-
стро, т. е. за время, много меньшее, чем длительность флуорес-
центного состояния 51, все молекулы, находящиеся на более
высоких уровнях, переходят на уровень Sj, причем эти переходы
не сопровождаются излучением и избыток энергии переходит в
тепло. Этот процесс часто называют процессом внутренней кон-
версии энергии электронного возбуждения в тепло. Наличие вну-
тренней конверсии и составляет основную отличительную особен-
ность «сложных» (в спектроскопическом смысле) молекул.

Спектр флуоресценции этих молекул не зависит также и от
того, на каком из колебательных подуровней флуоресцентного
состояния 51 оказываются молекулы после поглощения света или
после конверсии энергии более высоких возбужденных состояний.
Это означает, что за время, много меньшее, чем длительность
возбужденного состояния 51, успевает установиться некоторое
постоянное распределение молекул по колебательным подуров-
ням этого состояния. Наблюдаемая флуоресценция всегда исхо-
дит из этого уже установившегося распределения. В случае рас-
творов это может объясняться тем, что вероятность обмена коле-
бательной энергией со средой для сложных молекул очень велика
и значительно превосходит вероятность переходов между раз-
личными уровнями. Но независимость спектров флуоресценции
от длины волны возбуждающего света наблюдается и в случае
паров сложных молекул. Стало быть, объяснение подобного яв-
ления следует искать в особенностях самих молекул.

Практически указанная выше закономерность весьма важна,
так как она дает возможность контролировать флуоресцентную
чистоту исследуемых веществ. Только в том случае, если для все-
го спектра поглощения показана независимость спектра флуо-
ресценции от длины волны возбуждающего света, мы можем быть
уверены в отсутствии примесей или, по крайней мере, флуоресци-
рующих примесей. Этот способ контроля чрезвычайно чувствите-
лен, и каждое люминесцентное исследование можно рекомендо-
вать начинать с его применения.

Правило Стокса. Стоксовская и антистоксов-
ская флуоресценция. В большинстве случаев, с которыми
приходится встречаться на практике, вся полоса флуоресценции
лежит в области больших длин волн (или меньших частот), чем
возбуждающее излучение. Так, например, обычно красная флуо-
ресценция возбуждается зелеными, синими или ультрафиолето-
выми лучами, зеленая — только синими и ультрафиолетовыми.
Обобщая такого рода наблюдения, Стокс в 1852 г. сформулиро-
вал свое знаменитое правило о том, что частота света флуорес-
пенции всегда меньше частоты возбуждающего света. В такой
жесткой формулировке, однако, это правило неверно и должно
быть заменено более мягким «правилом Ломмеля» (стр. 177).

Мы говорили уже о том, что спектр флуоресценции всегда
сдвинут в длинноволновую сторону по отношению к спектру аб-
сорбции, но на некотором участке длин волн (см. отрезок ab на
рис. 25) оба эти спектра перекрываются. Ясно, что пока мы изби-
раем возбуждающий свет в той части спектра поглощения, кото-

650	600	550

Л, ими

Рис. 27. Спектральное распределение
интенсивности флуоресценции рас-
твора родамина Б в пропиловом спир-
те при стоксовской возбуждении (/)
и при антистоксовском возбуждении
линией натрия 589 ммк (2) [57]

рая лежит влево (в сторону
меньших длин волн или боль-
ших частот) от границы
спектра флуоресценции, пра-
вило Стокса, очевидно, име-
ет силу. Но когда возбужде-
ние производится длинами
волн, лежащими в области
перекрытия спектров (меж-
ду точками а и Ь), то пра-
вило Стокса могло бы со-
хранять силу лишь в том
случае, если бы спектр флуо-
ресценции резко изменялся
и в нем отсекалась бы вся та
часть, которая соответствует
длинам волн, меньшим (или
частотам — большим), чем у
возбуждающего света. Одна-
ко этого, как мы видели вы-
ше, нет. Изменения спектра
флуоресценции при возбуж-

дении малыми частотами, лежащими в области перекрытия
спектров, очень незначительны (рис. 27), и в спектре флуоресцен-
ции всегда имеется более или менее значительный участок длин

волн, меньших, чем длина волны возбуждающего света. Таким

образом, при возбуждении флуоресценции светом, лежащим в
области перекрытия спектров поглощения и флуоресценции, пра-
вило Стокса нарушается. Эта часть спектра поглощения назы-
вается поэтому «антистоксовской», в отличие от более коротко-
волновой, «стоксовской» области. Равным образом, часто гово-
рят о «стоксовской» и «антистоксовской» части спектра флуорес-

ценции в зависимости от того, соответствует ли она длинам волн,
большим или меньшим, чем длина волны возбуждающего флуо-
ресценцию излучения. На антистоксовскую часть спектра может
приходиться весьма значительная доля всей мощности флуорес-
ценции. В примере на рис. 27 при возбуждении флуоресценции
раствора родамина Б в пропиловом спирте линией натрия с дли-
ной волны 589 ммк заштрихованная площадь антистоксовской
части спектра флуоресценции составляет около 40% всей площа-
ди под спектральной кривой.

В рамках классической физики правило Стокса не могло быть
объяснено и рассматривалось как чисто эмпирическая и довольно
загадочная закономерность. Однако уже в первых работах Эйн-
штейна по квантовой (фотонной) теории излучения оно получило
вполне естественное толкование. Действительно, так как энергия
фотона (поглощаемого или излучаемого кванта) пропорциональ-
на частоте излучения (£=/iv), то смысл правила Стокса заклю-
чается в том, что величина излучаемого кванта обычно меньше,
чем величина кванта поглощенного, т. е. процесс превращения
частоты излучения обычно идет с потерями энергии электронно-
го возбуждения, частично превращающейся в тепло. В случаях
нарушения правила Стокса излучается квант больший, чем по-
глощенный, т. е. величина кванта возрастает за счет тепловой
энергии системы. Это вполне может иметь место, например, тогда,
когда происходит переход с некоторого колебательного подуров-
ня верхнего электронного состояния на более низкий колебатель-
ный подуровень основного состояния по сравнению с исходным
(см. рис. 23).

в. Техника спектрально-флуоресцентных исследований

В рамках настоящей статьи мы не можем остановиться под-
робно на описании различных установок и приборов, применяе-
мых для изучения спектрального распределения мощности излу-
чения. Отметим лишь несколько принципиальных моментов.

Построение кривых спектрального распре-
деления интенсивности излучения в шкале
длин волн и в шкале частот. Спектры флуоресценции
принято графически представлять в виде кривых, изображающих
зависимость «спектральной интенсивности» излучения от длины

волны (X) или частоты (v=—) соответствующих монохроматиче-
%

ских излучений (с — скорость света). Примеры такого рода гра-
фиков, которые часто называют также «профилями» спектраль-
ной полосы излучения, были даны выше на рис. 24—27. Чрезвы-
чайно важно уточнить физический смысл величин, которые мы
называем «спектральной интенсивностью» (в шкале длин волн
или в шкале частот) и значения которых мы откладываем по
оси ординат на наших графиках. Это необходимо как для пере-
хода от результатов непосредственного измерения мощности из-
лучения к истинным значениям спектральной интенсивности,
так и для того, чтобы, зная распределение в одной из шкал (на-
пример, в шкале длин волн), можно было вычислить распреде-
ление в другой шкале (в частотах).
При спектральных исследованиях мы всегда выделяем при
помощи того или иного прибора — монохроматора — сравни-
тельно узкую полоску спектра, ограниченную близкими длинами
волн Л] и /.2 (или соответствующими частотами vi=-£- и N2=-~),
Л1	Л-2

и измеряем мощность излучения с длинами волн (частотами),
лежащими в этом интервале.

Разность длин волн ДХ=Хг—М, ограничивающих выделя-
емую прибором спектральную полосу (или соответствующую
разность частот Av=vi—V2), называют оптической шириной вы-
ходной щели данного прибора. Эта величина всегда конечна.
Она может измеряться десятками миллимикрон при применении
светофильтров, ангстремами или их долями — в хороших обыч-
ных приборах, или тысячными долями ангстрема — в специаль-
ных приборах высокой разрешающей силы, но никогда не мо-
жет быть равна нулю.

Измеряемая нами мощность излучения, выходящего из
монохроматора, очевидно, при прочих равных условиях тем
больше, чем больше «оптическая ширина» щели прибора. При
достаточно малых значениях этой ширины можно считать, что
измеряемая мощность Wk пропорциональна значениям Лк или
Av:

Wk= 1кЛк = -1чЛч.	(3)

Знак минус во втором равенстве обусловлен тем, что положи-
тельным значениям Лк (Хг>М) соответствуют отрицательные
значения Av (v2<vi).

Множители пропорциональности 1к и Iv и представляют собой
те величины, которые называют «спектральной интенсивностью»
излучения в шкале длин волн или в шкале частот соответствен-
но. Легко видеть, что эти величины существенно различны не
только по своему численному значению, но и по физическому
смыслу (размерности).

Спектральная интенсивность в шкале длин волн 1к есть мощ-
ность излучения вблизи данной длины волны, отнесенная к еди-
ничному интервалу длин волн. Если мощность измерять, напри-
мер, в ваттах, а длины волн — в миллимикронах (ммк), то раз-
мерность величины 1к есть ватт/ммк.

Спектральная интенсивность в шкале частот есть мощ-
ность излучения вблизи данной частоты, отнесенная к единич-
ному интервалу частот. Она имеет размерность ватт•сек, если
мощность измеряется в ваттах, а частота — в обратных секун-
дах.

Из формулы (39) вытекают два важных практических след-
ствия.

Во-первых, только в том случае, если конструкция монохро-
матора обеспечивает постоянство значений АЛ, или Av во всем
182
исследуемом спектральном интервале, можно откладывать на
соответствующих графиках в нужном масштабе прямо измерен-
ные значения мощности излучения W. Вообще же при построении
«профилей» полосы излучения нужно учитывать изменения оп-
тической ширины щелей (в соответствующей шкале длин волн
или частот) и делить измеренные значения W на значения АХ
или Av.

Во-вторых, при переходе от спектрального распределения в
шкале длин волн к распределению в шкале частот или наобо-
рот нужно исходить из соотношения

При достаточно малых АХ и Av можно считать, что
Av	dv	с	v2	....

---=-----=-------=----- (41)

АХ	dX	X2	с	V ’

откуда следует

Л = А,-^=дЛ; /v = /%—(42)

X2 с	с v2

Таким образом, чтобы от распределения в длинах волн перейти
к распределению в частотах, нужно каждое значение Л. умножить

X2 /	Q \

на — или на — | и отнести его к соответствующему значению
С \	V2/

v= “. Чтобы от распределения в частотах перейти к распределе-
нию в длинах волн1, нужно проделать обратные операции.

Величины АХ и Av, как мы видели, не пропорциональны одна
другой. Поэтому «профили» спектральных полос излучения, построен-
ные в разных шкалах, не только отличаются по форме, но и имеют
максимумы в различных местах. Если в шкале длин волн максимум
интенсивности соответствует некоторому значению Хмакс, то частота
vMaKC, соответствующая максимуму интенсивности в шкале частот,
не равна -т-^— (рис. 28).

^макс

В любой шкале общая площадь под кривой профиля полосы
ОО	со

h.d'K или Ivdv\ изображает в некотором масштабе суммарную
о	о	'

мощность излучения. Если мы выделим на графике полоску, соот-

1 Очень часто вместо распределения мощности излучения в частотах дают
- 1

распределение ее в так называемых волновых числах: v = —. Эго распределение
X

отличается от распределения в частотах только постоянным множителем с, кото-
рый не имеет существенного значения, так как кривые спектрального распределе -
ния всегда строятся в произвольно выбранном масштабе.
ветствующую двум каким-нибудь значениям длин волн — Ах и А2
(или двум значениям частоты vx и v2), то площадь этой полоски
изображает в принятом масштабе мощность излучения в полосе между
Ах и А2 (или соответственно между vx и v2).

Монохроматоры. В настоящее время в практике спектраль-
ных исследований применяются монохроматоры двух типов: в одних
из них диспергирующим (разлагающим излучение в спектр) элемен-
том является дифракционная решетка, в других — призма из стекла

у-Ю'ксен~’

Рис. 28. Профиль полосы флуоресценции раство-
ра акридинового оранжевого в шкале длин волн
(1^, кривая 1\ ось абсцисс внизу) и в шкале час-
тот (Iv, кривая 2, ось абсцисс наверху)

или кварца. В монохроматорах первого типа дисперсия линейна, т. е.
длина волны выделяемого излучения практически прямо пропорцио-
нальна углу поворота решетки. В силу этого оптическая ширина
щели прибора в шкале длин волн ДА остается постоянной при всех
длинах волн. В призменных монохроматорах с уменьшением длины
волны дисперсия растет, и оптическая ширина щели ДА соответст-
венно уменьшается. С достаточным приближением можно считать
1

что ДА ~ — .

А2

Из этого ясно, что в монохроматорах с дифракционной решеткой
мощность измеряемого излучения пропорциональна спектральной ин-
тенсивности в шкале длин волн: Ж~Л.- Чтобы получить относи-
тельные значения Iv, нужно измеренные значения мощности умно-

А»2

жить на — (41). При применении призменных монохроматоров для
с

получения относительных значений нужно измеренные значения
мощности Wk умножить на X2, а чтобы получить относительные
значения Iv, нужно умножить Wk на X4.

Монохроматоры с дифракционной решеткой имеют в при-
кладных, в частности люминесцентных, исследованиях ряд весь-
ма существенных преимуществ. Важнейшим из них является
линейность дисперсии и вытекающее из нее постоянство шири-
ны оптической щели по всему спектру (в шкале длин волн).
Это существенно облегчает построение регистрирующих устано-
вок с автоматической записью кривых спектрального распреде-
ления на самописце и дает возможность работать с достаточно
широкими щелями и в длинноволновой (красной) области спект-
ра. К сожалению, однако, все монохроматоры, выпускаемые оте-
чественной промышленностью (типы УМ-2, ЗМР-З и ДМР-4),
являются призменными.

Приемникщ излучения и калибровка устано-
вок. При работе в видимой и ультрафиолетовой областях в ка-
честве приемников излучения сейчас применяют почти исключи-
тельно фотоэлектронные умножители (ФЭУ). Эти приемники
являются селективными, т. е. чувствительность их к излучени-
ям различных длин волн неодинакова. Кроме того, и пропуска-
ние света всей спектральной установкой также селективно.
Поэтому измеряемый фототок отнюдь не пропорционален мощ-
ности излучения, выделяемого монохроматором из состава дан-
ного излучения. Если обозначить функцию спектральной чув-
ствительности ФЭУ через S (X), пропускание прибора — через
Т(Х) и измеренный фототок — /(X), то истинная мощность дан-
ного потока излучения

W (X) =	— .	(43)

v ’ S (X) Г (X)

Поэтому для измерения мощности Ж(Х) и вычисления зна-
чений .спектральной интенсивности 1к или Iv спектральную
установку следует калибровать, т. е. получить систему множи-
телей К(Х)= -	, на которые нужно умножить показа-

ния измерительного прибора для получения истинных относи-
тельных значений W(K). Проще всего это осуществляется при
помощи эталонных ламп, т. е.'источников света с точно извест-
ным спектральным расределением мощности. Поместив такую
лампу в то место, где при нормальной работе находится кювета
с флуоресцирующим раствором, снимают на данной установке
спектр лампы. Сравнив полученную кривую с точно известной
для эталонной лампы ‘кривой, получают искомую систему по-
правочных коэффициентов К(Х). Калибровку следует повто-
рять не реже раза в год и производить ее заново при смене ФЭУ
даже в том случае, когда новый ФЭУ принадлежит к тому же
типу и марке, что и старый.

Нормировка спектральных кривых. На практике
измерения абсолютного значения мощности излучения, выде-
ляемого монохроматором, производятся очень редко. Обычно из-
меряют относительные значения величин 7% или Iv, принимая
за единицу их значения при определенной длине волны. Чаще
всего за единицу принимают значения или Л> в максимуме
(или в одном из максимумов) спектральной полосы флуоресцен-
ции. Такой способ дает возможность наглядно судить о форме
или профиле этой полосы.

Такой же способ нормировки применяется обычно для срав-
нения спектров различных веществ или спектров, снятых при
разных условиях. Каждый спектр при этом нормируется по сво-
ему максимуму. В некоторых случаях, особенно тогда, когда
сравниваемые спектры существенно отличаются по ширине,
предпочтительнее нормировать их по площади, т. е. так выби-
рать масштабы для сравниваемых спектров, чтобы площади под
всеми кривыми были равны. Наконец, иногда- бывает полезно
нормировать спектры так, чтобы площади кривых под ними
оказались пропорциональными значениями квантовых выходов
соответствующих растворов.

г.	Энергетический и квантовый выход флуоресценции

Определение. В биологических (и вообще прикладных)
исследованиях очень часто сопоставляют значения интенсивно-
сти (мощности) флуоресцентного излучения в разных объектах
и при разных условиях. Следует подчеркнуть, что эта величина,
даже измеренная при постоянной интенсивности возбуждающе-
го света, т. е. отнесенная к единице мощности возбуждающего
излучения, не имеет определенного физического смысла и не
может служить характеристикой изучаемой системы. Информа-
ционная ценность ее чрезвычайно ограничена. (В самом деле,
если в том или другом случае мы наблюдаем изменение интен-
сивности флуоресценции, то без контроля сопутствующих изме-
нений поглощения ничего не можем сказать об изменении эф-
фективности самого процесса флуоресценции.

Эффективность процессов преобразования поглощенной мо-
лекулой энергии в излучаемую характеризуется значениями
энергетического или квантового выхода флуоресценции. Стро-
гие определения этих величин следующие.

1.	Энергетическим выходом флуоресценции называют отношение
энергии, излученной веществом за некоторое время, к энергии, погло-
186
поглощения,

(44)

в стационар-
поглощением

щенной им за это же время. Иными словами, если ТГИзл есть мощ-
ность (интенсивность) излучения, a IFno™ — мощность
то энергетический выход флуоресценции

W

„	ИЗЛ

1] =------.

W
" пог л

При этом предполагается, что наблюдения ведутся
ном режиме, когда уже достигнуто равновесие между

и излучением, и величины 1^ИЗл и Ц7ПОгЛ имеют постоянные значения.
Практически в интересующих нас случаях требование стационар-
ности не накладывает дополнительных экспериментальных ограниче-
ний, так как стационарный режим флуоресценции устанавливается
за очень короткое время — порядка 10-8—10-9 сек.

2.	Квантовым выходом флуоресценции называют отношение числа
квантов, излучаемых системой в стационарном режиме за единицу
времени (гсИзл), к числу квантов возбуждающего излучения, поглощен-
ных системой за то же время (плогл),

п

„	ИЗЛ	/лг-\

Р = ------•	(45)

лпогл

Эта величина представляет собой, очевидно, вероятность того, что
молекула, поглотившая квант возбуждающего света, испустит квант
излучения флуоресценции.

Если мы определим среднее значение частоты излучения (<Ч')ИЗЛ)
и среднее значение частоты поглощенного кванта возбуждающего
излучения (<v>no™) при помощи соотношений

Пизлк ("V }изл = №изЛ; ^погл^ (V^norJi —= й^погл,
то связь между значениями 'квантового и энергетического
да флуоресценции, очевидно, определится соотношением

(46)

выхо-

(47)

мэж-

4 у/погл
Закон Вавилова. Фундаментальное соотношение
ду выходом флуоресценции и длиной волны (частотой) возбуж-

1	Зная спектральное распределение интенсивности флуоресценции по час-
тотам (/v), которое при стоксовском возбуждении не зависит от частоты воз-
буждения, можно вычислить среднюю частоту излучения из соотношения

<^>изл = vlydv!^ I,dv.

Среднюю частоту поглощенного кванта <т>Поглтакже можно вычислить,
если известны спектр возбуждающего излучения н спектр поглощения данного
вещества.
Рис. 29. Зависимость энергетического
выхода флуоресценции от длины вол-
ны возбуждающего света [581

Рис. 30. Проверка закона Вавилова для большой группы
флуоресцирующих веществ [59]. Относительный кванто-
вый выход люминесценции в зависимости от длины вол-
ны возбуждающего света

/ — родамин; 2 —эскулин; 3 — урановое стекло; 4 — роза бен-
гальская; 5 — нафтол; 6 — родамин кислый; 7 — сульфорода-
мин; 8 — хннин бисульфат; Р — бензофлавин; 10— эозин;
И — трнпафлавнн; 12 — флуоресцеин; 13 — акридин; 14 — эри-
трозин
дающего света, установленное С. И. Вавиловым [57] и носящее
поэтому его имя, гласит: в стоксовской части спектра поглоще-
ния квантовый выход флуоресценции не зависит от длины воз-
буждающего света; в антистоксовской части спектра он быстро
спадает с увеличением длины волны (уменьшением частоты)
возбуждающего света1.

Так как при стоксовской возбуждении спектр излучения и,
стало быть, значение средней частоты излучения <т>изл не
зависят от длины волны возбуждающего света, то из постоянст-
ва квантового выхода и соотношения (47) следует, что в этой
области энергетический выход
флуоресценции линейно падает
с увеличением частоты (умень-
шением длины волны) возбуж-
дающего света (рис. 29).

Сформулированная выше
закономерность, установленная
Вавиловым на примере раство-
ров флуоресцеина, носит уни-
версальный характер. Она бы-
ла проверена и подтверждена
для большого числа веществ
различной природы (рис. 30).

Закон спадания квантового
выхода флуоресценции в анти-
стоксовской области и влияние
на него температуры более де-
тально исследованы в работе
[58]. Было показано, что этот
закон имеет экспоненциальный
характер (рис. 31). Эти резуль-
таты были недавно проверены
и подтверждены в работе [60].

Постоянство квантового выхода во всей стоксовской области
возбуждения имеет ту же физическую причину, что и независи-
мость формы спектра флуоресценции от длины волны возбуж-
дающего света. Она заключается в том, что за время, очень ма-
лое по сравнению с длительностью возбужденного состояния,
успевает установиться постоянное распределение возбужденных
молекул по нижним колебательным подуровням первого воз-
бужденного (флуоресцентного) состояния. К моменту излучения

Lg/»

0,0

КО

Флуоресцеин
в воде

Флуоресцеин
в глицерине

Флуоресцеин
 В спирте

t-ПО'

t-20°

t-20'

t-90'
t-2O’

500

550 V

Рис. 31. Зависимость квантового вы-
хода флуоресценции растворов флуо-
ресцеина в воде, глицерине и спирте
от длины волны возбуждающего све-
та и температуры [57]

1 Строго говоря, квантовый выход флуоресценции остается постоянным ие
только в стоксовской, но и в несколько более широкой области спектра, вплоть
до некоторой частоты возбуждающего света v0, которая примерно соответ-
ствует частоте чисто электронного перехода между основным и первым воз-
бужденным уровнем.
молекула «успевает забыть» о том, в каком состоянии она нахо-
дилась непосредственно после возбуждения. Причины падения
выхода при антистоксовской возбуждении описаны в литерату-
ре (40, 42, 61].

д.	Процессы тушения флуоресценции

Квантовый выход флуоресценции, в отличие от ее спектра,
не есть некоторая постоянная величина, характеризующая дан-
ную молекулу как таковую. Напротив, его значения очень силь-
но зависят от различных внешних факторов: природы и свойств
растворителя, температуры, концентрации флуоресцирующего
вещества, наличия в растворе тех или иных посторонних ве-
ществ и т. п. Хотя в некоторых случаях значения квантового вы-
хода могут быть очень велики (например, для водных и спирто-
вых растворов флуоресцеина р=0,75), значения р всегда мень-
ше единицы и изменяются в очень широких пределах, что ука-
зывает на то, что наряду с так называемыми радиационными
переходами молекулы из возбужденного состояния в основное,
т. е. переходами, при которых избыток энергии излучается в
виде кванта флуоресценции, существуют и различные другие,
конкурирующие с флуоресценцией процессы нерадиационных
переходов, (при которых избыток энергии либо переходит в иную
форму, либо передается другой молекуле. Все (процессы такого
рода, уменьшающие в той или иной степени квантовый выход
флуоресценции, можно назвать процессами ее тушения.

Физические механизмы этих процессов весьма разнообраз-
ны. Они могут быть связаны как с внутримолекулярными, так и
с межмолекулярными процессами, т. е. с процессами взаимодей-
ствия возбужденной молекулы флуоресцирующего вещества с
молекулами растворителя или с некоторыми молекулами, нахо-
дящимися в растворе.

В первом случае речь идет о так называемом процессе
внутренней конверсии энергии электронного возбуждения, т. е.
о размене этой энергии по тепловым степеням (Свободы молеку-
лы. В результате этого мы получаем молекулу, находящуюся в
основном электронном состоянии, но обладающую большим за-
пасом колебательной энергии. Такая «горячая» молекула очень
быстро отдает свой избыток тепловой энергии в окружающую
среду и приходит в тепловое равновесие с ней.

Среди процессов межмолекулярного тушения некоторые
осуществляются в результате соударения возбужденной моле-
кулы с какими-то другими молекулами, находящимися в рас-
творе. Эти процессы обусловлены диффузией молекул за время
их пребывания в возбужденном состоянии, и эффективность их
зависит от вязкости и температуры среды. В других случаях
может иметь место передача энергии возбуждения от данной
молекулы к некоторой другой без прямого соударения их — в
результате так называемой индуктивной, или резонансной, миг-
рации возбуждения [61—64].

Общая классификация весьма разнообразных процессов ту-
шения была установлена С. И. Вавиловым [65]. По Вавилову,
следует различать процессы тушения «мгновенные», т. е. проис-
ходящие за время, значительно меньшее, чем длительность воз-
бужденного состояния, и 'процессы, при которых конкуренция
между флуоресценцией и тушащим процессом имеет место во
все время пребывания молекулы в возбужденном состоянии.
Эти процессы принято называть соответственно «тушением пер-
вого рода» и «тушением второго рода».

Когда мы имеем дело с тушением первого рода, то в рас-
творе молекулы находятся в двух различных формах или состоя-
ниях: одни из них гаснут «мгновенно», т. е. являются нефлуо-
ресцирующими, а на другие данный тушащий процесс не влия-
ет. Наблюдаемое нами в этих случаях изменение квантового
выхода флуоресценции обусловлено сдвигом в ту или иную сто-
рону равновесия между молекулами, находящимися в флуорес-
цирующем и нефлуоресцирующем состоянии или форме. Это
частный случай сдвига равновесия между различными формами
или состояниями данной молекулы, каждая из которых харак-
теризуется своим значением квантового выхода. При тушении
первого рода для одной из этих форм р = 0.

В случае процессов второго рода во все время пребывания
молекулы в возбужденном состоянии существует определенная
вероятность (р) того, что возбужденная молекула испустит
квант излучения, и определенная вероятность (<?) того, что она
за это время растратит свой запас электронной энергии безиз-
лучательным путем. Наблюдаемое в том или ином процессе из-
менение квантового выхода отражает изменение вероятности
последнего процесса, т. е. величины q.

Экспериментальным критерием для различия процессов
первого и второго рода является сопоставление изменений вы-
хода и длительности флуоресценции. Это будет показано в сле-
дующем разделе статьи. Там же мы постараемся на нескольких
примерах показать, какое большое значение имеет классифика-
ция Вавилова для исследования ряда проблем молекулярной
биологии.

е.	Длительность флуоресценции

Закон затухания флуоресценции. Флуоресценция
есть процесс спонтанного (самопроизвольного) излучения. Это
означает, что для каждой возбужденной молекулы существует
определенная вероятность pdt того, что за время dt она произ-
вольно перейдет в основное состояние (или на более низкий
энергетический уровень), излучив избыток энергии в виде кван-
та флуоресценции. Интенсивность флуоресценции (мощность
излучения), очевидно, пропорциональна числу таких переходов
за единицу времени. Если в некоторый момент времени t име-
лось п возбужденных молекул, то убыль их за время dt в ре-
зультате радиационных переходов будет равна

dn = — pndt,	(48)

интенсивность (мощность) флуоресценции

/ = Л(у>ИЗлРп,	(49)

где <'’>изл —среднее значение частоты излучения.

Предположим сначала, что квантовый выход флуоресцен-
ции р=1, т. е. что возможны только радиационные переходы из
возбужденного состояния в основное и отсутствуют какие бы то
ни было конкурирующие с ними процессы тушения флуоресцен-
ции. В этом случае из формулы (48) следует, что закон убыва-
ния числа возбужденных атомов сходен с законом радиоактив-
ного распада и выражается простой экспоненциальной зави-
симостью

__t__

п = noe~pi = пое ,	(50)

где п0 — число возбужденных молекул в начальный момент
(^ = 0). Такой же вид будет иметь и закон затухания флуорес-
ценции:
______________________________________

f = foe~pt = foe \	(51)

Величина То, которую мы определили при помощи соотноше-
ния То = —’ представляет собой, очевидно, длительность того про-
межутка времени, в течение которого первоначальная интенсив-
ность флуоресценции уменьшается в е раз (2,72 раза). Нетруд-
но показать, что этот интервал времени есть средняя длитель-
ность пребывания молекул в возбужденном состоянии, или, как
говорят, средняя длительность жизни возбужденных молекул
(/). Действительно, вычисляя t по формуле

ОО
tdn

7 = -----,	(52)

о
мы легко убеждаемся в том, что

т0 7.	(53)
Нужно отметить, что величина р (а стало быть, и величина
1

То=—) представляет собой молекулярную характеристику дан-
ного вещества. Она определяется только электронной структу-
рой молекулы и не зависит от внешних условий, если они не ме-
няют этой структуры. Поэтому величину то называют естествен-
ной средней длительностью жизни возбужденных молекул.

Рассмотрим теперь чрезвычайно важный вопрос о влиянии
процессов тушения на закон затухания и длительность флуорес-
ценции. При этом мы должны строго различать процессы туше-
ния первого и второго рода.

Процессы тушения первого рода не влияют ни на закон за-
тухания флуоресценции, ни на значение ее средней длительно-
сти, так как по самому своему определению они разыгрываются
за время, много меньшее, чем т0. За это время некоторая доля
возбужденных молекул — мы обозначим ее через а — будет по-
тушена и квантовый выход флуоресценции будет равен не еди-
нице, а 1—а, но те молекулы, которые не испытывают тушения
за это время, будут затухать по тому же закону и с тем же значе-
нием постоянной затухания т0, что и при отсутствии этих туша-
щих процессов. Таким образом, изменение квантового выхода
флуоресценции, не сопровождающееся изменением ее длитель-
ности и закона затухания, свидетельствует о наличии только
процессов тушения первого рода. Эти процессы, как было ска-
зано, всегда отражают сдвиг равновесия между флуоресцирую-
щей и нефлуоресцирующей формами или состояниями данного
вещества.

С такого рода случаем мы сталкиваемся, например, при изу-
чении флуоресценции хлорофилла в смесях спирта с водой. Так
как хлорофилл нерастворим в воде, то по мере увеличения со-
держания последней в растворителе прогрессирующая доля мо-
лекул пигмента переходит из флуоресцирующего молекулярно-
дисперсного состояния в нефлуоресцирующую форму агрегатов
или мицелл. Соответственно квантовый выход наблюдаемой флу-
оресценции падает от 30% в чистом спирте почти до нуля
при содержании спирта 30—40%. Однако, как видно из рис. 32, А,
длительность флуоресценции при этом не меняется.

Существенно иная картина наблюдается при наличии про-
цессов тушения второго рода. Если вероятность этих процессов
остается во все время пребывания молекулы в возбужденном
состоянии неизменной, то закон затухания флуоресценции со-
храняет экспоненциальную форму (51), но длительность ее со-
кращается пропорционально уменьшению р.

Действительно, если постоянную вероятность того, что за
время dt молекула будет потушена, мы обозначим через qdt, то
убыль числа молекул за это время как в результате радиацион-
ных переходов, так и в результате рассматриваемых процессов

13 Физические методы исследования белков

193
тушения будет равна:

dn = — pndt — qndt = — (р ф- q) ndt.	(54)

Отсюда можно получить закон убывания числа возбужден-
ных молекул:

п = noe-(₽+9)/ = noe~tlx,	(55)

и так как f~pn, то закон затухания флуоресценции имеет вид:

f = /oe-<P+,)Z = /o^/'t-	(56)

Таким образом, при наличии тушащего процесса второго
1	1

рода т= ------, а при его отсутствии —	.

р + я	р

С другой стороны, нетрудно видеть, что в рассматриваемом
случае доля общего числа возбужденных молекул, которые не
испытывают тушения, а перейдут в основное состояние с испус-
канием кванта флуоресценции, равна —-—. Иными словами,

Р + я

если выход флуоресценции при наличии тушения второго рода
равен р, а при его отсутствии ро, то

— — — или — = — = const.	(57)

Ро То Р Ро

Таким образом, при всех изменениях величин р и т, происхо-
дящих в результате процессов тушения второго рода с постоян-
ной вероятностью q, должна сохраняться строгая пропорцио-
нальность между значениями этих величин.

Как видно из рис. 32, Б, это имеет место, например, в очень
важном практически случае тушения флуоресценции растворов
посторонними примесями.

В случаях, когда вероятность тушения сама изменяется за
время пребывания молекулы в возбужденном состоянии [q=f(t)],
закон затухания принимает более сложный вид и строгая про-
порциональность между значениями величин ри t не имеет ме-
ста. Однако и в этом случае уменьшение выхода флуоресцен-
ции всегда сопровождается параллельным, хотя и не строго
пропорциональным сокращением ее длительности. Такой случай
обнаружил Галанин [62] при изучении концентрационного туше-
ния флуоресценции ряда красителей в вязких растворах (см.
рис. 32, В).

Мы видим, что сопоставление величин р и г дает возмож-
ность судить не только о характере конкурирующих с флуорес-
ценцией процессов, в частности процессов использования энер-
гии возбуждения в том или ином фотобиологическом процессе,
но и о том, остается ли постоянной вероятность этих тушащих
194
процессов за время пребывания молекулы в возбуждённом со-
стоянии.

Ясное и отчетливое понимание этих фундаментальных соот-
ношений абсолютно необходимо для успешного и целенаправ-
ленного применения люминесцентных методов к решению проб-
лем физико-химической биологии.

Рис. 32. Соотношения между квантовым выходом и
длительностью флуоресценции для различных случаев
тушения

Л — для флуоресценции хлорофилла в водио-спиртовых сме-
сях (тушение водой) [66]; Б — для тушения флуоресценции
раствора хлорофилла в ацетоне хиноном (/) и раствора
уранила в воде йодистым калием (2) [67]; В —для концент-
рационного тушения флуоресценции растворов флуоресцеина
в глицерине [62]

Экспериментальные методы измерения вели-
чины т. Как было указано выше, длительность возбужденного
состояния флуоресцирующих молекул (т) имеет очень малые по
обычным масштабам значения — порядка миллиардных долей се-
кунды. Измерение столь малых интервалов времени и исследова-
ние кинетики столь быстро затухающих процессов представляет
значительные экспериментальные трудности и требует примене-
ния специальных приборов, которые в русской литературе полу-
чили название флуорометров. В настоящее время для этой цели
применяются почти исключительно так называемые фазовые
Рис. 33. Принципиальная
схема фазового флуоро-
метра

на две части: одна (около

флуорометры, принципиальная идея которых была предложена
автором этой статьи в 1941 г. [68].

Принципиальная схема такого прибора показана на рис. 33.
Возбуждающий пучок света пропускается через то или иное мо-
дулирующее устройство М воздействующее на пучок так, что
мощность его после прохождения через модулятор периодически
изменяется с частотой 10 000 000—20 000 000 периодов в 1 сек.
Не нарушая общности рассуждения, можно считать, что эти из-
менения происходят по простому си-
нусоидальному закону, т. ё. мощ-
ность прошедшего через модулятор
света изменяется по закону:

1 = Io (14- т cos ы1).	(58)

Здесь w — циклическая частота мо-
дуляции, имеющая значение око-
ло 108 гц (w = 2jtf, где f — частота
модуляции), а т — коэффициент
глубины модуляции (отношение
амплитуды переменной составляю-
щей потока к постоянной составляю-
щей) .

Этот модулированный поток све-
та делится прозрачной пластинкой D
8%) отражается от пластинки и дей-

ствует на фотоэлектрический приемник ФЭУ-2 (фотоэлектронный
умножитель), в котором возникает электрический ток, изменяю-
щийся по закону (58). Другая, большая часть света возбуждает
флуоресценцию исследуемого вещества в кювете К, и свет флуо-
ресценции воздействует на другой приемник — ФЭУ-1.

Нетрудно понять, что при возбуждении модулированным
(периодически изменяющимся) пучком свет флуоресценции так-
же будет промодулирован с той же частотой. Но так как свет за-
держивается в флуоресцирующем веществе на некоторое сред-
нее время т, то фаза модуляции света флуоресценции будет
отставать от фазы возбуждающего света на некоторый угол ф.
Расчет показывает, что при этом и глубина модуляции флуорес-
ценции несколько уменьшится. Таким образом, закон изменения
интенсивности света флуоресценции и тока в приемнике ФЭУ-2
имеет вид:

f — fo 11 + ma cos	— ф)1,	(59)

где а<1.

При экспоненциальном законе затухания флуоресценции (561
связь между сдвигом фазы ф, множителем а и величиной т очень
проста:

1§ф = сот; а = совф.

(60)
Таким образом, для измерения величины т оказывается доста-
точным измерить сдвиг фазы между токами, возникающими в
приемниках ФЭУ-1 и ФЭУ-2. Это осуществляется при помощи хо-
рошо разработанных в современной радиотехнике фазоизмери-
тельных устройств (ФИ на рис. 33).

. Реализация этой принципиальной схемы — осуществление вы-
сокочастотной модуляции, усиление слабых фототоков высокой
частоты и точное измерение сдвига фазы между ними — требует
применения довольно сложных электронных и оптических уст-
ройств [69—73].

Примеры применения флуорометрических из-
мерений в проблемах молекулярной биологии.
Из того, что было сказано выше о связи между длительностью и
выходом флуоресценции при наличии процессов тушения второ-
го рода, следует, что биологическими процессами, в изучении ко-
торых применение люминесцентных методов представляется наи-
более перспективным, являются процессы фотобиологические, в
первую очередь процессы фотосинтеза. Поскольку во всех про-
цессах этого рода большая или меньшая часть поглощенной све-
товой энергии должна быть израсходована на осуществление той
или иной фотохимической реакции и аккумулирована в ее первич-
ных продуктах, то по отношению к флуоресценции все первичные
акты этих процессов носят характер специфического тушения, до-
полнительного к тем процессам тушения, какие имеют место
in vitro (в растворах).

Поэтому все эти процессы должны привести к уменьшению
квантового выхода флуоресценции, а в тех случаях, когда они
являются процессами второго рода,— и к сокращению ее дли-
тельности.

Так, например, уже сравнительно давно известно, что флуо-
ресценция' хлорофилла in vivo, т. е. в клетках фотосинтезирую-
щих организмов, значительно слабее, чем в растворах этого пиг-
мента в спирте, эфире, ацетоне и в других растворителях. Если в
растворах квантовый выход флуоресценции достигает 25—30%,
то в клетках он примерно раз в 10 меньше 174]. В 1957 г. в трех
лабораториях независимо друг от друга были впервые произве-
дены измерения длительности флуоресценции хлорофилла in vitro
и in vivo [75—77].

Оказалось, что и величина т для клеток значительно меньше,
чем для растворов, хотя строгой пропорциональности между зна-
чениями ри г нет. Если для растворов величина т имеет значение
5—6 наносекунд (10-9 сек), то для фотосинтезирующих клеток
значения т лежат около 1 наносекунды. Это указывает на то, что
конкуренция за энергию возбуждения молекулы пигмента между
первичным фотосинтетическим актом и флуоресценцией проис-
ходит во все время пребывания молекулы в возбужденном со-
стоянии, но вероятность этого первичного акта не остается в тече-
ние этого времени постоянной. По-видимому, это можно объяс-
нить так же, как и аналогичные соотношения в случае концент-
рационного тушения в вязкой среде [62].

В клетке конкуренция между фотосинтезом и флуоресценци-
ей складывается решительно в пользу первичного фотосинтети-
ческого акта. Сокращение выхода в 10 раз указывает на то, что
примерно 90% возбужденных молекул дезактивируются не путем
флуоресценции или внутренней конверсии, а через первичную фо-
тохимическую реакцию. Этим, естественно, объясняется высокий
квантовый выход реакции, в которой для фотосинтеза использу-
ется не только энергия, затрачиваемая в растворе на флуоресцен-
цию, но и значительная доля энергии, обычно превращающей-
ся в тепло.

С этой точки зрения можно было бы ожидать, что все факто-
ры, вызывающие уменьшение эффективности первичного фото-
синтетического акта, будут приводить к возрастанию выхода и
длительности флуоресценции хлорофилла и, наоборот, всякое
возрастание эффективности первичных фотосинтетических про-
цессов должно сопровождаться уменьшением значений р и т. Ис-
следователям [66] удалось показать, что при действии различных
ингибиторов фотосинтеза величины риг возрастают, достигая
тех значений, какие они имеют в растворах. Напротив, по мере
формирования фотосинтетического аппарата при освещении эти-
олированных (выращенных в темнотеУ листьев значения риг
падают. Все эти данные позволяют рассматривать значения ве-
личины т как очень удобную меру степени эффективности первич-
ного фотосинтетического акта.

При помощи этого критерия можно было показать [78], что
этот первичный акт, который, согласно современным представ-
лениям о механизме фотосинтеза, нужно представлять себе как
процесс передачи электрона от возбужденной молекулы хлоро-
филла к первичному акцептору (ферредоксину), является в ши-
роком температурном интервале темпёратуронезависимым, т. е.
что он представляет собой не обычную химическую реакцию, кон-
тролируемую температурой и диффузией, а электронный, фото-
физический процесс, связанный, вероятно, с образованием так
называемых комплексов с переносом заряда (charge transfer
complex). Этот же критерий дал возможность довольно деталь-
но проследить за процессом фотохимического превращения про-
тохлорофилла в хлорофилл в процессе зеленения этиолирован-
ных листьев [79].

Многие флуоресцирующие красители образуют прочные комп-
лексы с белками и нуклеиновыми кислотами. Изучение люминес-
ценции таких комплексов может быть источником ценной инфор-
мации о вторичной структуре и молекулярной морфологии этих
биополимеров. Для иллюстрации возможностей этих методов мы
остановимся вкратце лишь на люминесцентном методе изучения
198
вторичной структуры нуклеиновых кислот, разработанном в на*
шей лаборатории.

Детальное изучение всех характеристик люминесценции ком-
плексов красителя акридина оранжевого (АО) с нативной двух-
нитевой и (денатурированной) однонитевой ДНК [80] показало,
что в первом случае, по крайней мере при не слишком высокой
концентрации красителя, молекулы его, связанные с ДНК, сохра-
няют свою мономерную форму, тогда как при комплексировании
с однотяжевыми структурами происходит в большей или мень-
шей мере димеризация этих молекул. Люминесценция мономеров

Рис. 34. Спектры флуоресценции комплексов акридинового оран-
жевого с нативной (А) и денатурированной (5) ДНК

САО= 5- 10—’ М; с ДНК = °’ 5’	мкг1мл Для кривых 1, 2, 3, 4 соответ-

ственно. Кривые 4' и 4" — разложение спектра комплексов с денатури-
рованной ДНК на мономерную и димерную составляющие [80]

и димеров, связанных с ДНК, существенно различается по всем
своим основным характеристикам, которые отличны и от харак-
теристик люминесценции свободных молекул в растворе.

Спектр люминесценции комплексов АО с нативной ДНК от-
личается от спектра люминесценции свободных молекул в вод-
ном (солевом) растворе лишь некоторым сужением полосы, обу-
словленным более крутым спаданием интенсивности в длинно-
волновой части спектра. Максимум спектральной полосы в
обоих случаях лежит в зеленой части спектра — около 530 ммк
(рис. 34, А). Спектр флуоресценции связанных с ДНК димеров
этого красителя сильно смещен в-красную сторону: максимум его
лежит около 640 ммк (см. рис. 54, Б). Квантовый выход й дли-
тельность флуоресценции связанных мономеров примерно в 2,5
раза больше, чем для свободных мономеров в растворе: для сво-
бодных мономеров р= 0,35, т=2'10~9 сек, для связанных мономе-
ров р =С,9, t = 5'10-9 сек (флуоресценция димеров в растворе
пренебрежимо слаба).

Когда мы наблюдаем флуоресценцию через зеленый свето-
фильтр, пропускающий практически только излучение мономер-
ных молекул АО (свободных и связанных), то вклад в наблюдае-
мое свечение будут давать молекулы двух различных сортов,
каждый из которых характеризуется своим значением величин
и т. При наблюдении через красный светофильтр основной вклад
в люминесценцию дают связанные димеры, но в большей или
меньшей степени будут давать вклад и мономеры. Таким обра-

Рис. 35. Зависимость значений
г для зеленой и красной обла-
сти спектра, т3 (/) и тк (2—4)
от содержания денатурирован-
ной ДНК в смеси с нативной

Общая концентрация ДНК

12 мкг!мл.

Кривые 2, 3, 4 сняты со светофиль-
трами КС-10, КС-13 и КС-17 соот-

зом, в этом случае мы имеем дело
со смесью люминесцирующих обра-
зований трех различных типов. Во
всех этих случаях понятие о средней
длительности флуоресценции или
средней длительности жизни воз-
бужденных молекул теряет опреде-
ленность и ясный физический смысл.
Однако измеряемый на флуорометре
сдвиг фазы ср между первичным
модулированным потоком возбуж-
дающего излучения и вторичным по-
током люминесценции или величина
7=^,
w

которую можно назвать «флуоромет-
рическим т», представляет собой
очень чувствительный индикатор на
соотношение молекул различных ти-
пов в изучаемом объекте. Поскольку
димеризация происходит, как было
сказано, только на однотяжевых
структурах, то эта величина яв-
ляется чувствительным индикатором

ветственно	на соотношение двухтяжевых и од-

нотяжевых участков в исследуемой
нуклеиновой кислоте [81].

О чувствительности этого индикатора дает представление
рис. 35, изображающий в графической форме зависимость отно-
сительных значений изменения величины тКр (индексом «кр» от-
мечаются значения величины т, измеренные при наблюдениях
через красный светофильтр) от процентного содержания денату-
рированной ДНК в смесях с нативной. Как видно из рис. 35, в
благоприятных условиях этот метод позволяет обнаружить при-
месь денатурированной ДНК в количестве 1—3%.

Этот метод был применен прежде всего для определения сте-
центрации нуклеиновой кислоты

пени спиральности транспортной (низкомолекулярной) РНК
(тРНК), т. е. доли ее оснований, входящих в Уотсон-Криковские
комплементарные пары и ответственных за образование спирали-
зованных участков [82]. На рис. 36 показана зависимость вели-
чины ткр от концентрации тРНК в растворе для нативной ДНК
(кривая 1), для денатурированной ДНК (кривая 3) и для тРНК
(кривая 2). Интерполяция дает для последней степень спирали-
зации около 0,8, что хорошо совпадает с рядом прежних данных,
полученных другими методами.

Тем же методом удалось по-
казать, что при инкубации
тРНК с рибонуклеазой под-
желудочной железы атака ри-
бонуклеазы, по крайней мере в
наших условиях (при избытке
ионов Mg), направлена в пер-
вую очередь на однотяжевые
участки и не затрагивает двух-
тяжевых [83]. В сочетании с по-
ляризационными измерениями,
о которых будет сказано ^иже,
этот факт дал возможйость
однозначного установления
вторичной структуры тРНК-

Этот метод был также при-
менен для изучения изменений
структуры ДНК фагов при УФ-
облучении [84, 85]. Существен-
но то, что высокая чувствитель-
ность метода позволила про-
вести детальное изучение этих
изменений (образование дена-
турированных участков и тими-
диновых «сшивок») при очень
малых дозах облучения, близких к биологическим. Это дало воз-
можность установить известные корреляции между этими изме-
нениями структуры ДНК и биологическими последствиями облу-
чения.

ж.	Поляризация флуоресценции растворов сложных
органических молекул

Причины частичной поляризации флуорес-
ценции. Тот факт, что излучение флуоресценции растворов
сложных органических молекул (красителей) является всегда в
большей или меньшей мере частично поляризованным, был впер-
вые обнаружен в 1920 г. Вейгертом. Уже через три года после
этого в обстоятельной статье С. И. Вавилова и В. Л. Левшина
[86] эти явления были объяснены с точки зрения осцилляторной
модели. В дальнейшем эта теория была развита и детализована
во. многих работах [87—91].

На первый взгляд частичная поляризация излучения раство-
ров представляется весьма загадочной, так как молекулы флуо-
ресцирующего вещества распределены в среде хаотически и сра-
зу неясно, откуда возникает анизотропия в распределении излу-
чающих молекул (диполей), которая могла бы объяснить частич-
ную поляризацию излучения. Нетрудно, однако, видеть, что эта
анизотропия создается самим возбуждающим пучком света, в
котором колебания происходят всегда перпендикулярно к направ-
лению распространения света (лучу), и обусловлена тем, что
вероятность возбуждения той или иной молекулы зависит от угла
между осью осциллятора поглощения и направлением электриче-
ского вектора возбуждающей световой волны.

Представим себе для простоты, что возбуждение производится

светом, распространяющимся в направлении оси х и поляризован-
ным по оси z, а наблюдение флуоресценции ведется в направле-
нии оси у (рис. 37) (такая схема наблюдения применяется при
изучении поляризации флуоресценции почти всегда). Каждую
молекулу мы заменяем в нашей модели линейным осциллятором.
При этом следует различать осциллятор, ответственный за погло-
щение света молекулой, и осциллятор, ответственный за испус-

кание ею света. Ориентация этих

изме-
излу-

Рис. 37. Схема наблюдения при
рениях степени поляризации

чения

осцилляторов относительно
осей, жестко связанных с
молекулой, определяется ее
структурой. Эти осциллято-
ры могут в зависимости от
длины волны возбуждаю-
щего света либо совпадать
по направлению, либо обра-
зовывать между собой тот
или иной угол а. Положим
сначала, что направления ос-
цилляторов поглощения и
излучения совпадают (а = 0),
и сделаем еще два заведомо
неверных упрощающих пред-
положения, от которых мы
позже освободимся.

Предположим, во-пер-
вых, что поглощают свет.
только те молекулы, у кото-
рых в данный момент ось

осциллятора поглощения
совпадает с направлением электри-
ческого вектора возбуждающего
света (£), и, во-вторых, что среда
является настолько жесткой, что за
время возбужденного состояния мо-
лекула не успевает сколько-нибудь
заметно повернуться, так что на-
правление всех излучающих осцил-
ляторов совпадает с направлением
поглощающих, т. е. с вектором Е.

Так как каждый излучающий
осциллятор дает излучение линейно
поляризованное (рис. 38), а в наше*м
случае все молекулы имели бы па-
раллельно ориентированные осцил-
ляторы излучения, то наблюдаемое
нами флуоресцентное излучение
было бы также линейно поляризо-

Рис. 38. Поле излучения линей-
ного осциллятора (электриче-
ского диполя)

ванным. В схеме опыта на рис. 37 свет флуоресценции был бы
поляризован так же, как возбуждающий, т. е. его электрический
вектор был бы направлен параллельно оси z.

Частично поляризованное излучение можно рассматривать как смесь (су-
перпозицию) естественного света с интенсивностью 1п и линейно поляризован-
ного с интенсивностью I . Степенью поляризации называют долю поляризован-
ного света в общей, суммарной интенсивности света, т. е. отношение

Р =

(62)

Нетрудно привести последнее выражение к другому, более удобному виду.
Если пропустить пучок частично поляризованного света через анализатор (устрой-
ство, пропускающее свет с колебаниями только в одной определенной плоскости)
и поворачивать анализатор’ вокруг луча, то при некоторой определенной ориен-
тации анализатора интенсивность прошедшего через него света будет иметь мак-
симальное значение/макс, а при (повороте анализатора на 90° она будет иметь ми-

нимальное значение /миним- Очевидно, в первом случае поляризованная компонента
проходит через анализатор полностью, а естественная ослабляется вдвое, т. е.

/накс = 1р + ~~ • При повороте анализатора на 90® интенсивность естественной

компоненты не меняется, а поляризованная компонента вовсе не проходит через
анализатор: /миннм = • Таким образом, Ip = /макс Iьганим и 1р + 1п = /макс +

+ Лпшим- Подставляя эти выражения в формулу (62), получаем:
макс Лшним

р —----------------.

^макс + ^МИНИМ

(63)

Если учесть, что поглощать свет могут частично и молекулы,
расположенные под углом к вектору Е, то соответствующий
расчет показывает, что для случая, когда оси диполей поглоще-
ния и излучения совпадают, предельная поляризация флуорес-
ценции р, т. е. та степень поляризации, которая имела бы место
при полной жесткости среды и невозможности поворота моле-
кулы в целом за время т, имела бы значение ро = О,5.

Это предельное значение степени поляризации зависит от
угла а между осями осцилляторов поглощения и излучения. Если
бы этот угол был равен 90°, то поляризация была бы отрицатель-
на, т. е. в схеме рис. 37 направление колебаний света флуоресцен-
ции было бы параллельно оси х, т. е. перпендикулярно к на-
правлению колебаний вектора Е возбуждающего света; при
полной жесткости среды степень поляризации имела бы значе-
ние р0 = — 73.

Эти рассуждения показывают, что действительно излучение
флуоресценции всегда должно быть в большей или меньшей мере
поляризовано, причем степень поляризации может иметь любые
значения, лежащие между + '/2 и —7з- Эксперимент полностью
подтверждает этот вывод.

Заметим, что для простоты мы рассматривали случай возбуж-
дения флуоресценции поляризованным светом. Это, однако, не
обязательно. Флуоресценция будет частично линейно поляризо-
вана и при возбуждении естественным светом, хотя степень поля-
ризации в этом случае будет меньше. Анизотропия излучающих
молекул (диполей) создается теперь тем, что возбуждаются пре-
имущественно молекулы, у которых оси осцилляторов поглоще-
ния образуют небольшой угол с плоскостью, перпендикулярной
к направлению возбуждающего луча (плоскостью zy на рис. 37).
Расчет показывает, что если обозначить через р значение степе-
ни поляризации флуоресценции при возбуждении поляризован-
ным светом, а через рп ту же величину при возбуждении естест-
венным светом, то при прочих равных условиях эти величины свя-
заны соотношением

(64)

2-Рр

Практически это важно потому, что в случаях, когда интен-
сивность флуоресценции мала, а степень ее поляризации доста-
точно велика, можно вести измерения наблюдения при возбужде-
нии естественным светом, т. е. более чем вдвое увеличить интен-
сивность возбуждения и флуоресценции.

Экспериментальные методы измерения степе-
ни поляризации флуоресценции. Не будем останав-
ливаться на визуальных и фотографических методах измерения
величины (поляриметры Корню, Савара и др.), потому что в на-
стоящее время эти методы практически полностью вытеснены
фотоэлектрическими методами и применяются чрезвычайно ред-
204
ко. Описание этих методов можно найти в книге П. П. ФеофилО-

ва [43] или в подробных классических курсах оптики.

Обычная схема опыта при измерениях поляризации соответст-

вует рис. 37. Интенсивность флуоресценции измеряют фотоэле-
ментом или фотоэлектронным умножителем, перед которым по-
мещен анализатор (поляроид или поляризационная призма).
Поворачивая этот анализатор вокруг оси пучка, определяют мак-
симальное и минимальное значения силы фототока и вычисляют

степень поляризации по формуле (63).

Этот простой статический метод достаточно точен, когда степень

поляризации р велика, но для малых степеней поляризации он мало-
пригоден. Легко видеть, что если разность /макс — /МИним, входящая
в числитель формулы (63), мала, то относительная ошибка в опреде-
лении р будет значительно больше, чем относительная ошибка в из-

мерении каждой из величин /макс и /Мииим- Практически этот метод
непригоден, если измеряемая величина р становится сравнимой
6/

с относительной погрешностью измерения —.

От этого недостатка свободен предложенный автором этой статьи
[91] дифференциальный, или динамический, метод, заключающийся
в том, что анализатор, находящийся перед фотоэлектрическим при-
емником света флуоресценции, равномерно вращают с некоторой
постоянной частотой f. Простой расчет показывает, что при этом
в фототоке имеются постоянная составляющая, пропорциональная
/макс + /миним, И переменная, синусоидальная, составляющая частоты
2/, амплитуда которой пропорциональна /макс— /Миним- Таким образом,
задача измерения степени поляризации излучения сводится к измере-
нию отношения амплитуды переменной составляющей фототока
к постоянной составляющей, т. е. к задаче измерения глубины моду-
ляции фототока. Относительная погрешность измерения величины р
при этом не зависит от значения этой величины.

В установке, описанной в работе [91], переменная состав-

ляющая тока компенсировалась поворотом стопы плоских пла-
стинок, помещенной перед анализатором. В настоящее время в
нашей лаборатории измеряют отдельно постоянную составляю-
щую и амплитуду переменной составляющей фототока, которая
усиливается резонансным усилителем и затем детектируется.
Нетрудно и автоматизировать это измерение при помощи схемы,
прямо измеряющей отношение двух токов или напряжений.
Калибровочный множитель, на который необходимо умножить
измеренное отношение двух токов для вычисления р, определяют,
помещая перед анализатором поляризатор и определяя то отно-
шение токов, которое соответствует значению р = 1,0.

Во всех измерительных установках, где плоскость поляриза-
ции действующего на приемник света' поворачивается, необходи-
мо учитывать, что чувствительность фотоэлектрических приемни-
ков, особенно приемников с массивными, а не полупрозрачными
катодами довольно заметно зависит от ориентации плоскости
поляризации относительно катода. Для устранения этого иска-
жающего измерения и трудно контролируемого фактора необхо-
димо помещать между анализатором и приемником деполяриза-
тор, превращающий частично поляризованный свет в деполяри-
зованный. В описанной установке [91] в качестве такого деполяри-
затора применялась пластинка из молочного стекла, сильно
ослаблявшая интенсивность действующего на приемник света.
В настоящее время мы применяем псевдодеполяризатор —вра-
щающуюся вместе с анализатором клиновидную пластинку из
кварца или исландского шпата. Такая пластинка не дает истинно
деполяризованного света, но создает такую смесь различных
форм поляризации, которая практически не отличается от депо-
ляризованного света (о других псевдодеполяризаторах см. в кни-
ге Шерклиффа [92]).

Для устранения указанного осложняющего обстоятельства
было предложено [93] вращать не анализатор,- а бикварц, т. е.
круглую пластину, состоящую из двух склеенных по диаметру
пластин из право- и левовращающего кварца, сохраняя перед
приемником неподвижный анализатор. Такая же установка была
использована [94] с применением неподвижного анализатора и
вращающейся пластинки, создающей сдвиг фазы Х/2 между
право- и левоциркулярнополяризованными компонентами. Недо-
статок всех этих схем — их сильная хроматичность, т. е. зави-
симость угла поворота плоскости поляризации (в случае би-
кварца) или сдвига фаз (в случае пластинки) от длины волны
света.

Факторы, определяющие степень поляриза-
ции флуоресценции. Как ясно из сказанного, степень по-
ляризации флуоресценции определяется двумя различными по
своей природе группами факторов: 1) углом между направле-
ниями осей поглощающего и излучающего осциллятора, который
зависит от строения молекулы, и 2) поворотом молекулы за
время т, который определяется, с одной стороны, условиями
внешней среды (ее температурой и вязкостью), а с другой —
объемом самой молекулы (вместе с ее сольватационной оболоч-
кой) и степенью ее асимметрии. Последний фактор имеет особое
значение при изучении высокополимерных молекул, в частности
белков и нуклеиновых кислот.

Влияние первого фактора проявляется в том, что предельная
поляризация флуоресценции (или вообще поляризация при неиз-
менных внешних условиях) зависит от длины волны возбужда-
ющего света. На рис. 39 приведены примеры таких «поляриза-
ционных спектров», т. е. кривых, изображающих зависимость ве-
личины р от Авозб> для ряда красителей. Как видно из рисунка,
при переходе от одной полосы поглощения к другой может ме-
няться не только величина, но и знак степени поляризации.
Объяснение этого Явления заключается в том, Что осциллято-
ры, характеризующие различные полосы поглощения (различные
электронные переходы),по-разному ориентированы относительно
осей молекулы и образуют различные углы с диполем излучения.
Этим же объясняется и то, что предельная поляризация различ-
ных веществ может иметь резко различные значения. Так, напри-
мер, по измерениям Феофилова [43], величина р0, равная для
акридина 17,1%, закономерно изменяется в ряду его производ-
ных, достигая значения 40% для 3,6-диаминоакридина.

Рис. 39. Поляризационные спектры люминесценции красителей
(Вавилов)

1 — родамин Б; 2 — магдановый красный; 3 — эскулин; 4 — флоуресценн

Вопрос о поляризационных спектрах и их связи со структурой
молекул рассмотрен Феофиловым [43]. Не останавливаясь на
этом подробно, отметим, что возможности применения поляриза-
ционных спектров для изучения строения и симметрии сложных
органических молекул, продемонстрированные Феофиловым на
примере ряда красителей, почти не использованы в биохимии и
химии биологически важных соединений. Это, несомненно, «золо-
тоносная жила», еще ожидающая своих первооткрывателей.

Шире, хотя и в недостаточной мере, используются в биохимии
и молекулярной биологии методы, связанные с изучением враща-
тельной деполяризации флуоресценции, т. е. с изучением влияния
второй группы факторов, уменьшающих степень поляризации
флуоресценции в тех или иных условиях по сравнению с предель-
ным значением этой величины, определяемым только строением
молекулы и длиной волны возбуждающего света.

Представим себе, что в некоторый момент времени возбужда-
ющее излучение создало анизотропию возбужденных молекул,
т. е. что в растворе существует определённая группа молекул, у
которых оси излучающих диполей ориентированы параллельно
или имеют одно и то же преимущественное направление. Если
мы предоставим эту группу молекул самой себе, то в результате
случайного броуновского вращения, испытываемого каждой мо-
лекулой, эта анизотропия будет постепенно «рассасываться» и
через некоторое время практически исчезнет. Это время мы будем
называть «временем релаксации» для броуновского вращательно-
го движения молекул. Наблюдаемая степень поляризации флуо-
ресценции определяется тем, в какой мере эта анизотропия еще
сохранится к моменту излучения флуоресценции. Иными слова-
ми, степень поляризации флуоресценции должна зависеть от соот-
ношения между длительностью возбужденного состояния т и вре-
менем релаксации оптической анизотропии 0. Если т<О, как это,
например, имеет место при очень низкой температуре или
очень высокой вязкости раствора, то броуновское вращение
практически не успеет нарушить первоначальную анизотропию
возбужденных молекул, и степень поляризации будет иметь пре-
дельное значение р0. Напротив, при т, сравнимом с 0, что имеет
место для растворов малой вязкости и при комнатной температу-
ре, анизотропия рассосется за время т почти полностью, и степень
поляризации будет очень низка.

Расчет показывает, что в общем случае степень поляризации
определяется соотношением

----1_ fJ-— 1W1+ —V	(65)

Р з ~ \ Ро 3 А 0 )

Для частиц сферической формы время релаксации

0 =

ЗцУ
RT ’

(66)

где V—объем частицы (вместе с ее сольватационной оболоч-
кой); т] — вязкость раствора; Т — его абсолютная температура;
R — газовая постоянная. Подставляя это выражение в формулу
(65), получаем известную формулу Перрена — Вавилова для
степени поляризации сферических частиц

Р 3	\ ро 3 J \ Уц /

(67)

из которой следует, что величина — должна линейно зависеть от
отношения абсолютной температуры раствора к его вязкости j .
Рис. 40 показывает, насколько хорошо оправдывается этот вывод
в эксперименте.
1	т

Из наклона прямой на графиках, дающих зависимость — от —,
Р	П

можно вычислить объем частицы, если ее можно считать сфериче-
ской. Определения такого рода для молекул красителей хорошо
совпали с другими данными.

При изучении макромолекул биополимеров уже нельзя всегда
считать, что частица имеет сферическую форму. Напротив, во многих

случаях мы имеем дело с частицами, резко асимметричными, палоч-
кообразными. Апроксимируя такие частицы в виде эллипсоидов,

9ЭЛ =---------------

1/61 + 1/02

(68) Рис. 40. Зависимость 1/Р от
7’/т] для раствора флуорес-

цеина в глицерине

Так как величины и 02 пропорциональны отношению ц/Т, то и

1
в этом случае должна сохраняться линейная зависимость между —

Р
Т

и — , что также подтверждено экспериментом [89].

Ч

Из формул Вебера можно вычислить для заданного отношения
осей эллипсоида вращения (а/b) отношение времени релаксации 0ЭЛ
к тому значению этой величины 0О, которое имела бы сферическая
частица того же объема при данных условиях. Такая теоретически
В

рассчитанная зависимость отношения — от — показана на рис. 41.
00

Пользуясь этой кривой или рассчитанными, по Веберу, кривыми
1/р — 1/я	Т	и.

зависимости отношения —----— от — для разных значении а о,

i/Po-'/a	Оо

можно, как будет+оказано ниже, оценивать асимметрию макромоле-
кул и устанавливать форму частиц биополимеров.

Примеры применения поляризационных изме-
рений к проблемам молекулярной биологии. Из
сказанного выше следует, что резких изменений в степени поля-
ризации флуоресценции можно ожидать (при постоянстве т)

14 -Физические методы исследования белков

209
1,01—I-----1----1----1----L.

14 в 1Z 16 20
a/L

Рис. 41. Теоретическая за-
висимость отношения 0/0о от
а/в

тогда, когда существенно меняется либо объем молекулы, либо
степень ее асимметрии. Первый случай имеет место при распаде
макромолекулы на более мелкие части (субъединицы) или при
образовании комплекса флуоресцирующей молекулы с другой
молекулой.

В качестве примера можно указать на работу [96], в которой
изучался распад молекулы фермента аспартатглутаматтрансами-
назы (КФ: 6.2.1.1) на две субъединицы при разбавлении вод-
ного раствора этого фермента. Резкое падение степени поляриза-
ции флуоресценции как самого фермен-
та (точнее, его кофермента), так и
связанного с ферментом ковалентными
связями красителя (изотиоцианата
флуоресцеина) показывает, что при
определенном разведении фермент
действительно распадается на две
субъединицы (рис. 42, кривые 1, 2).
В случае рибонуклеазы (кривая 3) та-
кое падение поляризации отсутствует,
что вполне естественно, так как рибо-
нуклеаза — одноцепочечный, сравни-

тельно низкомолекулярный белок. Интересно отметить, что ката-
литическая активность (сродство к субстрату) оказалось у субъ-
единиц фермента значительно выше, чем у агрегированной
(димерной) формы. Это позволяет думать, что, возможно, рас-
пад на субъединицы и агрегирование фермента есть один из
механизмов регуляции его активности в клетке.

Пример возрастания поляризации флуоресценции при ком-
плексообразовании можно найти в работе [97]. При добавлении
к раствору красителя акридинового оранжевого возрастающих
количеств аденина или аденозинтрифосфата поляризация флуоре-
сценции красителя резко возрастает. Напротив, прй добавлении
пиримидиновых оснований или нуклеотидов такое возрастание по-
ляризации флуоресценции не имеет места (рис. 43). Это свиде-
тельствует о том, что данный краситель комплексируется с пури-
новыми основаниями и не комплексируется с пиримидиновыми.

Тем же методом Массей, Харрингтон и Хартли [98] исследова-
ли ферменты — химотрипсин и химотрипсиноген, обнаружив по-
лимеризацию этих ферментов при увеличении концентрации, и
определили число мономеров в полимере. Оказалось, что это чи-
сло равно 4—8 для химотрипсина и 2 для химотрипсиногена, при-
чем в последнем случае субъединицы соединяются «встык», обра-
зуя цепочку. В работе [99] изучение поляризации флуоресценции
позволило выяснить влияние pH среды на взаимодействие акри-
динового оранжевого с ДНК.

Последовательное применение развитой Вебером теории вра-
щательной деполяризации для молекул, которые можно апрокси-
210
мировать в виде эллипсоидов, позволяет решать не только та
кие относительно простые задачи, но и более сложные, связанные
с.определением формы макромолекул. Так, Вебер [89] показал,
что молекулы овальбумина имеют форму, близкую к сфериче-
ской, тогда как молекулы сывороточного альбумина представ-
ляют собой эллипсоиды с отношением осей 4:1.

В нашей работе [100] сочетанием флуорометрических и поля-
ризационных измерений удалось показать, что для транспортной
РНК как до, так и после гидролиза ее рибонуклеазой время вра-
щательной релаксации 0 значительно больше, чем можно было
бы ожидать для сферической
частицы того же объема. При
комнатной температуре, напри-
мер, 6 = 4,4-10-8 сек для натив-
ной РНК и 3,7-10~8 сек для
гидролизованной, тогда как для

Рис. 43. Зависимость вели-
чины 0 для раствора акри-
динового оранжевого от
концентрации добавленного
аденина (/) или тимина (2)
[97]

Рис. 42. Изменение степени поляризации ко-
фермента глутаматаспартаттрансаминазы (пи-
ридоксаля) (/) и скомплексированного с фер-
ментом красителя изоцианата флуоресцеина
(2) от концентрации фермента; 3 — то же, для
рибонуклеазы, окрашенной тем же красителем

сферической частицы время 0 должно было бы быть равно
2,4-10-8 сек. Это расхождение указывает на значительную асим-
метрию молекулы тРНК- Сопоставление экспериментальных
данных с расчетными (рис. 44) показало, что отношение осей для
этих молекул имеет значения около 4,5: 1. Это позволило одно-
значно установить форму такой макромолекулы. В последнее
время таким же путем удалось детально изучить вторичную
структуру высокомолекулярной рибосомальной РНК [101].

Особенно перспективно применение этих методов в пробле-
мах иммунохимии. Здесь уже давно применяется предложенный
Кунсом [102] метод нанесения флуоресцирующей метки на анти-
тела для изучения под микроскопом образования их комплексов
с антигенами. Однако применение уточненных методов, основан
ных на изучении поляризации и длительности флуоресценции,
может дать в этой области значительно более богатые и важные
результаты. Как указывают Дэндликер и другие [ЮЗ], эти ме-
тоды, с одной стороны, могут стать средством для изучения тер-

антиген — антитело, а с дру-

модинамики и кинетики реакции

мости

Р 3
отношения г----- от

1	1

То/0о, рас-

Ро 3
считанные по Веберу (сплошные линии),
и экспериментальные данные (кружки
и точки) для тРНК до и после обработ-
ки рибонуклеазой

гой — могут оказаться по-
лезными в решении ряда
практических проблем,
среди которых эти авторы
отмечают: 1) обнаруже-
ние иммунологических со-
бытий в тех случаях, где
отсутствие вторичных яв-
лений делает классиче-
ские методы непримени-
мыми (например, для ви-
русных агентов, гаптенов
и непреципитирующих ан-
тител) ; 2) изучение гипер-
сенситизации in vitro;
3) измерение тонких раз-
личий в действии антиге-
нов на организм хозяина
в случае хронических за-
болеваний; 4) исследова-
ние количества и качества
антител на протяжении
курса иммунизации орга-

низма.

В указанной работе имеется много ценных теоретических рас-
четов и интересных экспериментальных данных, но она представ-
ляет собой, конечно, только первый шаг в этом весьма перспек-
тивном направлении.

з.	Длительное послесвечение растворов сложных
органических молекул

Условия возникновения длительного .после-
свечения. При обычных условиях, т. е. в растворах малой
вязкости (вода, спирт) и при комнатной температуре, флуорес-
ценция органических молекул характеризуется, как мы видели,
весьма малыми значениями длительности возбужденного состоя-
ния, измеряющимися миллиардными долями секунды. Однако
еще с конца прошлого века (Видеман, 1887) было известно, что
при помещении исследуемого вещества в твердые стеклообраз-
ные среды (сахарные леденцы, расплавы борной кислоты и т. п.),
а также при охлаждении растворов до низкой температуры
наблюдается длительное послесвечение, которое в благоприят-
ных случаях можно наблюдать в течение нескольких секунд
после прекращения возбуждения хотя обычно длительность
этого послесвечения меньше и не превышает долей секунды.
Закон затухания этого свечения экспоненциальный, но константа
его всегда на много порядков превышает значения т для обыч-
ной флуоресценции.

Особое внимание к этим явлениям было привлечено в 20-х го-
дах нашего века после работ Вавилова, Левшина, Прингсгейма
и др. Сейчас явления, связанные с наличием длительного после-

свечения, стоят в центре внима-
ния как физиков, изучающих
явления люминесценции, так и
биологов, старающихся выяс-
нить роль возбужденных со-
стояний ароматических соеди-
нений в важнейших процессах
жизнедеятельности.

При интерпретации этих яв-
лений нужно иметь в виду
прежде всего то, что длитель-
ное послесвечение не представ-
ляет собой просто процесса
«удлинения» или «растяжки во
времени» обычной флуоресцен-
ции, а является отдельным, са-
мостоятельным процессом, на-
кладывающимся на обычную
флуоресценцию и сосуществу-
ющим с ней. Это следует из
того, что при изучении образ-
цов, обладающих длительным
послесвечением, можно при по-
мощи высокочастотного фазо-
вого флуорометра, описанного

Iph

1,0

0,5

О

Iph
1,0

0,5

О

А. ммк

500	500	700 А, ммк

Рис. 45. Спектры суммарного свече-
ния (/), а-полосы (2) и (3-полосы (3)
[69]

А— раствор трипофлавина в смеси глице-
рина с глюкозой, t “ —35° С; Б — раствор
акридинового оранжевого с оргстекле,
t------------------50° С

выше, легко выделить в свечении компоненту со значениями т
порядка 10~9 сек. Это было бы невозможно, если бы мы имели
дело с одной полосой свечения, затухающей как целое с констан-
той порядка долей секунды или целых секунд.

Другой важный факт, обнаруженный впервые Вавиловым и
Прингсгеймом [105], заключается в том, что следует различать два
вида длительного послесвечения, отличных и по своим кинети-
ческим характеристикам, и по спектрам. При сравнительно высо-

1 Недавно было показано, что длительное послесвечение можно наблюдать
и при комнатной температуре в растворах малой вязкости, если их очень тща-
тельно обезгазить и удалить последние следы газов и примесей [104].
кой (комнатной) температуре спектр длительного послесвечения
совпадает или почти совпадает со спектром флуоресценции. По
мере понижения температуры наряду с этой полосой начинает
развиваться вторая, смещенная в длинноволновую (красную)
сторону (рис. 45). Следуя Льюису, мы будем называть первую по-
лосу, совпадающую с флуоресценцией, a-полосой длительного
послесвечения, а вторую — p-полосой. Иногда просто говорят об
а- и р-свечении

Объяснение длительного послесвечения.
Синглетная и триплетная система уровней.
Объяснение явления длительного послесвечения и указанных
выше характерных особенностей этого явления было дано в
1933—1935 г. Яблонским [107], который предположил, что, поми-
мо той системы энергетических уровней, которую мы рассматри-
вали выше (стр. 173), молекулы имеют еще некоторый метаста-
бильный, т. е. долгоживущий уровень Т, лежащий несколько ниже
первого возбужденного (флуоресцентного) уровня S' (рис. 46).

Метастабильность уровня означает, что вероятность перехо-
да Т —>5 на много порядков меньше, чем вероятность перехода
SZ^S. Если допустить существование такого уровня энергии, то
явление длительного а- и р-свечения получает простое объясне-
ние. Молекула, оказавшаяся в результате поглощения фотона на
уровне S', имеет некоторую конечную вероятность (г) перейти
без испускания излучения на уровень Т. Эта вероятность срав-
нима с вероятностью флуоресценции р, т. е. вероятностью пере-
хода Sz->S(p) и вероятностью теплового тушения на уровне
S/(<?1). Молекула, оказавшаяся на метастабильном уровне, мо-
жет либо перейти на уровень S с испусканием кванта света
меньшей энергии (большей длины волны), чем свет флуоресцен-
ции, либо испытать тушение — внутреннюю конверсию энергии
возбуждения в тепло, либо, наконец, за счет тепловых флуктуа-
ций снова вернуться на уровень S'. Вероятности этих трех про-
цессов мы будем обозначать соответственно через л, q2 и р, как
это указано на рис. 46.

При сравнительно высокой температуре вероятность тушения
на уровне Т много больше, чем вероятность излучения р, и мы
практически наблюдаем только свечение, соответствующее пере-
ходам S'->S, т. е. флуоресценцию и a-полосу длительного после-
свечения. Последняя может наблюдаться только в том случае, ес-
ли за время возбужденного состояния более или менее значитель-
ная доля возбужденных молекул успеет побывать в состоянии Т
и вернуться обратно на уровень S'. Для этого необходимо, чтобы

1 Длительное послесвечение органических молекул часто называют их фос-
форесценцией. Неправомерность и нелогичность такой терминологии была вы-
яснена выше (стр. 171). К сожалению, однако, этот термин можно довольно
часто встретить не только в биологических и химических, но и В некоторых
физических работах.
вероятность г была достаточно велика по сравнению с суммой
р + 71, вероятность р достаточно велика по сравнению с a + q2.
Условия для этого создаются жесткостью среды.

Вероятность р зависит от температуры и резко уменьшается
при значительном ее понижении. Вместе с тем при этом умень-
шается и вероятность тушения на уровне Т (величина q2),
тогда как вероятность излучения л остается неизменной. В силу
этого при низкой температуре более или менее значительное коли-
чество молекул, попавших на уровень Т, успевает совершить ра-
диационный переход на основной уровень S прежде, чем они бу-
дут потушены. Так возникает длинноволновая p-полоса длитель-
ного послесвечения, соответствующая переходам T—>-S.

Рис. 46. Схема Яблонского для объяснения
длительного послесвечения

Было показано [106], как по экспериментальным данным мож-
но определить в функции от температуры все шесть вероятностей
р, q, г, л, 72 Р, определяющих соотношение между флуоресцен-
цией, длительным послесвечением и тепловым тушением возбуж-
денных молекул.

Метастабильный уровень Т был постулирован Яблонским для
объяснения экспериментальных фактов. Физическая природа это-
го уровня была выяснена Терениным 1108] в 1943 г. Годом позже
к его мнению присоединились Льюис и Каша [109].

Квантовомеханический расчет электронного строения арома-
тических молекул показывает, что они должны обладать двумя
системами возбужденных уровней: синглетной и триплетной. Раз-
личие между ними заключается в следующем. Из принципа
Паули следует, что на каждом возможном электронном уровне
молекулы может находиться не более двух электронов. При этом
спины двух электронов, находящихся на одном уровне, должны
быть противоположными. Когда один из электронов переходит на
более высокий уровень, то возможны два случая: либо спины
двух разделившихся электронов остаются противоположно на-
правленными, либо они оказываются параллельными. Та система
уровней, которая соответствует первому случаю, называется
синглетной, а система, соответствующая второму случаю,— три-
плетной. Таким образом, полная система уровней интересующих
нас молекул имеет вид, схематически изображенный на рис. 47,
дополняющем ранее данную неполную схему (рис. 23).

Согласно спектроскопическим «правилам отбора», радиацион-
ные (сопровождающиеся излучением) переходы возможны с
большой вероятностью только между различными уровнями
одной и той же системы. Переходы между уровнями различных
систем, например переход T^Sq, запрещены. В реальных усло-

Рис. 47. Схема синглетных и триплетных энер-
гетических уровней ароматических молекул

виях в силу возмущающего влияния среды этот запрет не яв-
ляется абсолютным, но вероятность триплет-синглетных перехо-
дов, в частности перехода Tj-*S, на много порядков меньше, чем
вероятности переходов между уровнями одной и той же системы,
например перехода S]->S.

Предложенная Терениным интерпретация явлений длительно-
го послесвечения заключается в том, что гипотетический мета-
стабильный уровень Яблонского Т он трактует как реальный низ-
ший уровень триплетной системы 7\. Эта интерпретация полно-
стью подтверждена не только теоретическими расчетами системы
уровней для бензола и ряда других ароматических соединений,
но и прямыми экспериментами. Освещая образец, дающий после-
свечение, сильной импульсной вспышкой, можно создать доволь-
но высокую населенность триплетного уровня. После этого в
течение короткого времени, пока эта высокая населенность сохра-
няется, можно обнаружить в спектре поглощения ряд новых по-
лос, соответствующих переходам между различными уровнями
триплетной системы (Л —*Т2,	и т. д.). С другой стороны,

при освещении такого образца он должен приобрести магнитный
момент, так как спины находящихся на триплетном уровне элект-
ронов уже не компенсируют друг друга, а складываются. Суще-
ствование такого фотоиндуцированного магнитного момента
обнаружили в 1945 г. Льюис и Калвин [ПО]. Модифицируя эти
опыты, Ивенс [111] показал, что по мере затухания длительного
послесвечения окрашенного флуоресцеином сахарного леденца,
т. е. по мере убывания количества молекул красителя на уровне
Tj, магнитный момент убывает. Затухание свечения и убывание
магнитного момента идут параллельно и по одному и тому же
закону.

Подробнее эти чрезвычайно важные и интересные явления опи-
саны в обзорных статьях Теренина и других авторов [112—114].

Возможная роль триплетных состояний в
биологических процессах. Из общих соображений
можно было бы ожидать, что переход молекул в триплетное сос-
тояние играет важную роль в различных фотохимических, фото-
биологических и даже темновых биологических процессах. Эта
возможная роль триплетных состояний обусловлена двумя фак-
торами. Во-первых, большая длительность пребывания молекул
на триплетном уровне благоприятствует возможности использо-
вания запаса энергии молекулы для осуществления той или иной
химической реакции или биологического процесса. Во-вторых,
молекула, имеющая два электрона с параллельными спинами, с
химической точки зрения представляет собой бирадикал и долж-
на обладать повышенной реакционной способностью. Наконец,
если предположить, что и в темновых биологических процессах
возможно образование возбужденных состояний участвующих в
них молекул за счет энергии экзоэргических, например окисли-
тельных реакций, то вероятен переход этих молекул на первый
триплетный уровень, лежащий ниже соответствующего возбуж-
денного синглетного уровня.

Участие триплетных состояний во многих фотохимических
реакциях in vitro доказано (см. например, [115]). Однако участие
их в биологических процессах, даже в процессах, связанных с
действием света, все еще остается гипотезой.

Особенно убежденным сторонником представлений о важной
роли триплетных состояний в различных биологических процес-
сах был Сент-Дьердьи, посвятивший этому вопросу, свою изве-
стную книжку «Биоэнергетика» [116]. Он опирался на экспери-
ментально установленный факт, что при замораживании водных
растворов очень многих флуоресцирующих соединений свечение
исчезает, а при более глубоком охлаждении этих растворов вновь
разгорается, причем полоса низкотемпературного свечения сме-
щена в длинноволновую сторону. Эту «красную» полосу Сент-
Дьердьи считал полосой, соответствующей переходу с триплетно-
го уровня. Он обратил внимание на ряд действительно очень ин-
тересных корреляций между биологической активностью различ-
ных веществ и их влиянием на указанные люминесцентные
явления, а также пытался интерпретировать важные биологиче-
ские процессы с точки зрения гипотезы об участии в них триплет-
ных состояний молекул.

Однако в работе [117] мы показали, что явления, наблюдав-
шиеся Сент-Дьердьи, не имеют отношения к триплетным сос-
тояниям, а обусловлены димеризацией молекул при кристаллиза-
ции раствора. Таким образом, экспериментальные обоснования
гипотезы Сент-Дьердьи отпали. Он сам согласился с этим (лич-
ное сообщение) и в дальнейших своих работах к этой концепции
не возвращался.

Точно так же не получили до сих пор подтверждения и выска-
зывавшиеся разными авторами предположения о роли триплет-
ных состояний в первичных процессах фотосинтеза. Напротив,
полученные в последнее время данные о конкуренции между фо-
тосинтетическим использованием световой энергии и флуоресцен-
цией говорят против такого предположения.

Мы считаем, что в настоящее время вопрос о роли триплетных
состояний в биологических процессах остается открытым. Несом-
ненно, что его решение в ту или иную сторону, как и выяснение
вопроса о том, могут ли возбужденные состояния молекул участ-
вовать в темновых биохимических реакциях и биологических про-
цессах, имеет первостепенное значение и служит предпосылкой
для понимания физических механизмов этих процессов.

ЛИТЕРАТУРА

1.	I. Tinoco. J. Amer. Chern. Soc., 1960, 82, 4785.

2.	W. R h о d e s. J. Amer. Chern. Soc., 1961, 83, 3609.

3.	А. С. Спирин, Л. П. Гаврилова, A. H. Белозерский. Биохи-
мия, 1959, 24, 600.

4.	G. D. Fasman, G. L i n d b 1 о w, L. G г о s s m a n. Biochemistry, 3,
1015 (1964).

5.	D. M. Crothers, В. H. Zimm. J. Mol. Biol., 1964, 9, 1.

6.	K. Rosenheck, P. Doty. Proc. Nat. Acad. Sci., 1961. 47, 1775.

7.	А. С. С п и p и и. Биохимия, 1958, 23, 656.

8.	О. H. L о w г у et al. J. Biol. Chem., 1951, 193, 256.

9.	J. Marmur, R. Rownd, C. L. Schildkraut. In: «Progress in Nuc-
leic Acid Research», v. 1., J. N. Davidson, W. E. Cohn (eds.). Acad. Press,
1963, p. 232.

10.	J. R. Fresco, L. C. Klotz, E. G. Richards. Cold Spring Harbor
Syrup., v. 28, 1963.

11.	M. Falk. J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 1226.

12.	H. R. Mahler, B. Kline, B. D. Mehrotra. J. Mol. Biol., 1964, 9, 801.

13.	P. Фрезер. В кн.: «Аналитические методы белковой химии». М., ИЛ,
1963/
14.	Н. Джонс, К. С а н д о р ф и. В кн.: «Применение спектроскопии в хи-
мии». М., ИЛ, 1959.

15.	М. А. Ельяшевич. Атомная и молекулярная спектроскопия. М.,
Физматгиз, 1963.

16.	Л. А. Г р и б о в. Теория интенсивностей в инфракрасных спектрах мно
гоатомных молекул. М., Изд-во АН СССР, 1963.

17.	Ю. Н. Ч и р г а д з е. Инфракрасные спектры и структура полипептидов
и белков. М„ изд-во «Наука», 1965.

18.	Т. Shimanouchi, М. Tsuboi, Y. Kyogoku. Infrared spectra of
nucleic acids and related compounds. Advances in Chem. Phys., 1964, v. 7,
435.

19.	M. Tsuboi. Some problems in the infrared spectra of polypeptides and
polynucleotides. Biopolymers symposia № 1, 1964, 527.

20.	M. Beer, G. Sutherland, K. N. Tanner, D. L. Wood. Proc. Roy.
IQ^Q A94Q 14-7

21.	T.Miya’zawa. J. Chern. Phys., 1960, 32, 1647.

22.	E. M. В r a d b u r y, W. C. Price, G. R. Wilkinson. J. Mol. Biol., 1961,
3, 301.

23.	E. R. В 1 о u t, H. L e n о r m a n t. Biochim. et biophys. acta, 1955, 17, 325.

24.	К. Джерасси. Дисперсия оптического вращения. M., ИЛ, 1962.

25.	А. Мошкович. В кн.: К. Джерасси. «Дисперсия оптического вра-
щения». М., ИЛ, 1962.

26.	Р. U г п е s, Р. Doty. Advances in Protein Chemistry, v. 16, 401, 1961.

27.	Г. С. Л а н д с б e p г. Оптика ГИТТЛ, 1952.

28.	L. S. К a t z i n, E. Gulyas. J. Amer. Chem. Soc., 1964, 86, 1655.

29.	D. Ridgewa y. Biophys. J., 1963, 3, 167.

30.	П. Доти. Современные проблемы биофизики, т. I. М., Физматгиз, 1961.

31.	Е. Shechter, Е. R. В 1 о u t. Proc. Nat. Acad. Sci., 1964, 51, 695, 794.

32.	J. R. Fresco. Tetrahedron, 1961, 13, 185.

33.	T. S amej ima, J. T. Yang. Biochemistry, 1964, 3, 613.

34.	D. N. H о 1 с о m b, J. T i n о c o. Biopolymers, 1965, 3, 121.

35.	К. E. Van H о 1 d e, J. Brahms, A. M. Michelson. J. Mol. Biol., 1965,
12, 726.

36.	В. И. Пермогоров, Ю. С. Л а з у p к и н, С. 3. Шмурак. Докл. АН
СССР, 1964, 155, 1440.

37.	В. И. П е р м о г о р о в, Ю. С. Л а з у р к и н. Высокомолекулярные соеди-
нения, 1966, 8, 1124.

38.	С. И. Вавилов. О «теплом» и «холодном» свете. Соч., т. IV (первое
изд. 1949 г.).

39.	С. И. Вавилов. Изв. АН СССР, серия физ., 1945, 9, 283.

40.	Б. И. Степанов. Люминесценция сложных молекул. Минск, Изд-во
АН БССР, 1955.

41.	Th. Forster. Fluoreszenz organischer Verbindungen. Gottingen, 1951.

42.	Б. И. Степанов. Введение в теорию люминесценции. Минск, Изд-во
АН БССР, 1957.

43.	П. П. Феофилов. Поляризованная люминесценция атомов, молекул и
кристаллов. М., Физматгиз, 1959.

44.	П. Прпнгсгейм. Флуоресценция и фосфоресценция. М., ИЛ, 1951.

45.	В. Л. Левшин. Фотолюминесценция жидких и твердых тел. М., Физ-
матгиз, 1951.

46.	С. Юденфренд. Люминесцентный анализ в биологии и медицине. М.,
изд-во «Мир», 1966.

47.	Люминесцентный анализ. Под ред. М. А. Константиновой-Шлезингер. М.,
Физматгиз, 1961.

48.	Ю. А. Владимиров. Фотохимия и люминесценция белков. М., изд-во
'«Наука», 1965.

49.	С. В. Конев. Люминесценция белков. М., изд-во «Наука», 1964.
49а. Г. М. Б а р е н б о й м, А. Н. Д о м а н с к н й, К. Т у р о в е р о в, Люминес-
ценция биополимеров и клеток. М., изд-во «Наука», 1966.

50.	С. И. Вавилов. Предисловие к книге Прингсгейма (см. [44]).

51.	С. И. Вавилов. Примечание к книге Прингсгейма (см. [44]).

52.	Э. В. Ш польский. Усп. физ. наук, 1960, 71, 215.

53.	С. И. В а в и л о в. Zs. f. Phys., 1922, 43, 307.

54.	В. Л. Левшин. Ж. физ. хим., 1931, 2, 641.

55.	Б. С. Н е п о р е н т. Ж. эксп. теорет. физ., 1951, 21, 172.,

56.	Д. И. Блохинцев. Ж. эксп. теорет. физ., 1939, 9, 459.

57.	С. И. В авилов. Zs. f. Phys., 1927, 42, 311.

58.	Л. А. Тумерман. Труды Физ. ин-та АН СССР, 1938, 1, вып. 4, 77.

59.	С. С. Соломин. Докл. АН СССР, 1941, 31, 741.

60.	А. В u d о, I. Ketskemety. Acta Physica Polonica, 1964, XXVI, 385.

61.	С. И. Вавилов. Микроструктура света, соч., т. II. М., 1952.

62.	М. Д. Галанин. Докт. дисс. Труды Физ. ин-та АН СССР, 12, 1957.

63.	Th. Forster. In: Comparative Effects of Radiation. M. Burton, J. S. Kir-
by-Smith, J. L. Magee (eds.). N. Y., 1960, p. 300.

64.	H. Kal Im an. Ibid., p. 342.

65.	С. И. Вавилов. Acta Physica Polonica, 1936, 5, 417.

66.	Л. А. Тумерман, О. Ф. Борисова, А. Б. Рубин Биофизика, 1961,
4, 645.

67.	Л. А. Тумерман. Проблемы фотосинтеза. М., Изд-во АН СССР, 1959.

68.	Л. А. Тумерман. Ж. эксп. теорет. физ., 1941, 11, 515.

69.	Л. А. Т у м е р м а н. Усп. физ. наук, 1947. 33, 218.

70.	А. М. Бонч-Бруевич. Изв. АН СССР, серия физ., 1956, 20, 591.

71.	А. М. Бонч-Бруевич, В. А. Молчанов, В. И. Широков. Изв
АН СССР, серия физ., 1956, 20, 596.

72.	А. Ю. Борисов, Л. А. Тумерман. Изв. АН СССР, серия физ., 1959,
33, 1.

73.	А. Ю. Б о р и с о в. Канд. дисс. Гос. опт. ин-т, Л., 1963.

74.	Р. Latimer, Т. Т. Bannister, Е. Rabinovitch. Science, 1955,
124, 585.

75.	S. S. В г о d у, Е. R a b i п о v i t с h. Science, 1957, 125, 555.

76.	О. Д. Дмитриевский, В. Л. Ермолаев, А. Н. Теренин. Докл.
АН СССР, 1952, 114, 761.

77.	Л. А. Тумерман. Докл. АН СССР, 1957, 117, 605.

78.	Л. А. Тумерман, А. Б. Рубин. Докл. АН СССР, 1962, 145, 202.

79.	А. Б. Рубин, Л. Е. Минченко в а, А. А. Красновский, Л. А. Ту-
мерман. Биофизика, 1962, 7, 571.

80.	О. Ф. Борисова, Л. А. Тумерман. Биофизика, 1957, 2, 537.

81.	О. Ф. Борисова, Л. А. Тумерман. Биофизика, 1965, 10, 32.

82.	О. Ф. Борисова, Л. Л. Киселев, Л. А. Тумерман Докл АН
СССР, 1963, 152, 1001.

83.	Л. Л. Киселев, Л. Ю. Фролова, О. Ф. Борисова, М. К. Ку-
хан о в а. Биохимия, 1964, 29, 116.

84.	Г. Б. 3 а в и л ь г е л ь с к и й, О. Ф. Борисова, Л. Е. М и н ч е и к о в а,
Э. Е. М и н я т. Биохимия, 1964, 29, 508.

85.	Г. Б. 3 а в и л ь г е л ь с к и й, Л. Е. М и н ч е н к о в а, Э. Е. М и н я т,
А. П. С а в ич. Биохимия, 1965', 30, 652.

86.	С. И. Вавилов, В. Л. Левшин. Zs. f. Phys., 1923, 16, 136.

87.	В. Л. Левшин. Zs. f. Phys., 1924 26, 274.

88.	F. Perrin. J. Phys. Radium., 1926, 7, 390.

89.	G. Weber. Biochem. J., 1952, 51, 141,5, 155.

90.	A. Jablonski. Acta Physica Polonica, 1964, 26, 427.

91.	Л. A. T у м e p м a h. Докл. АН СССР 1947, 58, 1945.

92.	А. Шерклифф. Поляризованный свет. M., изд-во «Мир», 1965

93.	Л. А. С п е к т р о в. Докл. АН СССР, 1949. 65. 485.

94.	В. И. Грибков, К. Д. Ж е в а н д р о в. Докл. АН СССР. 1954, 98, 565.
95.	H. Wi 11 е. Optik, 1952, 9, 84.

96.	О. Л. Пол яновский, В. И. Ивсков. Биохимия, 1964, 29, 728.

97.	Л. Е. М и н ч е н к о в а, Л. А. Т у м е р м а н. Биофизика, 1965, 10, 696.

98.	V. М a s s е у, W. F. Н а г г i п g t о п, В. S. Н a 11 е у. Disc. Farad. Soc., 1955,
20, 24.

99.	Е. В. А и у ф р и е в а, М. В. В о л ь к е н ш т е й н, Т. В. Ш е в е л е в а. В сб.:
«Молекулярная биофизика». М., изд-во «Наука», 1965.

100.	О. Ф. Борисова, Л. Л. Киселев, А. И. Суровая, Л. А. Тумер-
ман, Л. Ю. Фролова. Докл. АН СССР, 1964, 159, 1154.

101.	О. Ф. Борисова, Л. Л. Киселев, А. И. Суровая, Л. Е. Минят.
Биофизика (в печати).

102.	A. Coons, Н. Creech, R. Jones, D. Berliner. J. Immunol., 1942,
45 159

103.	W. B. D a n d 1 i k e r et al. Immunochemistry, 1964, 1, 165.

104.	С. A. P a r k e r, C. G. H a t c h a r d. Trans. Farad. Soc., 1961, 57, 1894.

105.	S. I. Vavilov, P. Prinshgeim. [С. И. Вавилов, П. Принте-
гейм.] Zs. Phys., 1926, 37, 705.

106.	Ю. В. Морозов. Биофизика, 1963, 8, 165.

107.	A. J a b 1 о n s k i. Nature, 1933, 131, 839.

108.	A. N. T erenin. [A. H. Теренин]. Acta Physicochimica URSS, 1943, 18,
210.

109.	G. L e w i s, M. К a s h a. J. Amer. Chem. Soc., 1944, 67, 1232.

110.	G. L e w i s, M. С a 1 v i n. J. Amer. Chem. Soc., 1945, 67, 1232.

111.	D. F. E v a n s. Nature, 1955, 176, 777.

112.	A. N. TereninfA. H. Теренин]. Trans. Farad. Soc., 1956, 52, 1042.

113.	G. P о r t e r, F. R. S. W 11 k i n s о n. Proc. Roy. Soc., 1961, A264, 1.

114.	В. Л. E p м о л a e в. УФН, 1965, 80, 3.

115.	A. H. Теренин. Фотохимия красителей. M., Изд-во АН СССР, 1960.

116.	А. Сент-Дьердьи. Биоэнергетика. М., Физматгиз, 1960.

117.	Л. А. Т у м е р м а н, Ю. В. Морозов, Ю. И. Наберухин. Биофизика,
1961, 6, 556.
Глава IV

ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Ю. Н. Косаганов, Э. Н. Трифонов

1.	Вискозиметрия ............................................223

а.	Основные понятия..................................223

б.	Жесткие не взаимодействующие между собой частицы	225

в.	Характеристическая вязкость полимерных молекул .	227

г.	Измерение вязкости................................231

д.	Вязкость растворов биополимеров...................234

2.	Метод ультрацентрифугирования.............................238

а.	Краткие сведения об аналитических ультрацентрифугах240

б.	Метод скорости седиментации.......................251

в.	Определение степени полидисперсности ....	260

г.	Седиментация в градиенте плотности................262

д.	Метод седиментационного равновесия и приближения
к седиментационному равновесию.......................264

е.	Равновесная седиментация в установившемся градиен-
те плотности.........................................269

3.	Двойное лучепреломление в потоке..........................274

а.	Механизм ДЛП......................................274

б.	ДЛП в потоке..................................... 276

в.	Жесткие эллипсоидальные частицы...................279

г.	ДЛП цепных молекул................................283

д.	ДЛП растворов биополимеров .	 285

Литература...................................................287

Гидродинамические методы исследования полимеров — ви-
скозиметрия, ультрацентрифугирование, метод двойного луче-
преломления в потоке — широко применяются для измерения
молекулярных весов и исследования конформации и структур-
ных превращений макромолекул в растворе. Исследуемые макро-
молекулы могут находиться при этом в условиях, приближаю-
щихся по ряду параметров к условиям их существования in vivo.

Такие свойства, как вязкость растворов, скорость осаждения
макромолекул при ультрацентрифугировании, оптическая ани-
зотропия текущих растворов, тесно связаны с гидродинамически-
ми характеристиками молекул и, следовательно, с их формой,
размерами, молекулярным весом, деформируемостью. Основное
применение вискозиметрического метода и метода ультрацентри-
фугирования — определение молекулярных весов полимеров.
При этом ультрацентрифугирование является одним из немно-
гих абсолютных методов определения молекулярного веса.
Очень большие значения молекулярных весов, свойственные
большинству белков и нуклеиновых кислот (105—108), исключают
применение обычных способов определения молекулярного веса
(криоскопию, осмометрию и др.). Метод светорассеяния в дан-
ном случае также неэффективен вследствие трудностей измере-
ний при малых углах, где очень велика доля света, рассеиваемо-
го взвешенными в растворе частицами пыли.

Вискозиметрия и ультрацентрифугирование позволяют, кро-
ме того, обнаружить и количественно охарактеризовать асим-
метрию недеформируемых частиц, жесткость цепных клубкооб-
разных молекул, наблюдать различные конформационные пре-
вращения. Для исследования этих свойств удобно также
пользоваться методом двойного лучепреломления в потоке, на-
ходящим все большее распространение и далеко еще не исчер-
павшим свои возможности. В частности, этот метод позволяет
судить не только о макромолекуле в целом, но и о составляющих
ее звеньях.

L Вискозиметрия

Определение свойств молекул вещества по вязкости его ра-
створов в ряду других методов изучения макромолекул занимает
очень важное место. Прежде всего это связано' с технической
доступностью метода и относительной простотой интерпретации
результатов вискозиметрического исследования. Вискозиметрия
позволяет определить важнейшую характеристику полимера —
его характеристическую вязкость, связанную с размерами, фор-
мой и жесткостью молекул. Этот параметр, в частности, широко
используется для определения молекулярного веса нуклеиновых
кислот. Вискозиметрический метод определения молекулярных
весов, однако, не является независимым, требуя градуировки при
помощи абсолютных методов (светорассеяние, электронная
микроскопия, авторадиография и др.).	।

а.	Основные понятия

В потоке жидкости молекулы, движущиеся в разных слоях с
разными скоростями, взаимодействуют между собой, создавая
препятствие свободному течению. Внешне это выражается в
большей или меньшей скорости истечения жидкости, в большем
или меньшем сопротивлении жидкостей движущимся в них
телам.

В потоке, движущемся около стенки сосуда (рис. 1), вслед-
ствие взаимодействия молекул жидкости с неподвижной стенкой
и между собой скорость течения различных слоев жидкости,
параллельных стенке сосуда, неодинакова. Здесь имеет место
зависимость

u = gy,

где и скорость движения жидкости в слое, находящемся на
расстоянии у от плоской стенки. Величина g называется гради-
ентом скорости. В более общем случае градиент скорости g
определяется выражением

Рис. 1. Течение жидкости около
стенки сосуда

г:=т-

dy

и сам может являться функцией
координаты у, направленной нор-
мально к движущемуся слою. Как
известно, сила трения f между
соседними слоями жидкости, от-
несенная к единице площади, про-
порциональна градиенту скоро-
сти:

f = №	(1)

Коэффициент пропорционально-
сти т] в этом соотношении называется вязкостью и является ин-
дивидуальной характеристикой данной жидкости. Так, при 20°
вязкость воды равна 0,01 пуаз, глицерина— 14,95 пуаз (1 пуаз =
= 1 г!см • сек).

Вязкость раствора может значительно отличаться от вязко-
сти чистого растворителя. По величине этого различия можно
судить о свойствах молекул растворенного вещества. Если т]о —
вязкость растворителя, т] — вязкость раствора, то величина

Пуд.= 11^==	(2)

По По

называемая удельной вязкостью, показывает, какая часть вяз-
кости раствора обусловлена присутствием в нем растворенного
вещества. Эта величина, естественно, зависит от концентрации
раствора. В частности, для раствора жестких не взаимодей-
ствующих между собой частиц Цуд пропорциональна их концен-
трации. Коэффициент пропорциональности

hl =	(3)

с

называется характеристической вязкостью растворенного веще-
ства. В этом частном случае [q] зависит только от свойств жест-
ких частиц в данном растворителе и является константой в ши-
роком интервале концентраций. Единицей характеристической
вязкости служит см?[г или дл/а= 100 см?)г.
При исследовании полимерных молёкул Межмблёкулярйым
взаимодействием пренебрегать нельзя. Это взаимодействие тем
сильнее, чем больше концентрация макромолекул в растворе.

Т]

Поэтому величина — неодинакова при разных концентрациях
с

вещества и имеет смысл характеристической константы только
при очень малых с. Точнее,

[т|] = lim .	(4)

с->0 \ с J

С другой стероны, цепная молекула в потоке жидкости подвер-
гается деформации вследствие неравенства скоростей слоев
жидкости, между которыми находится молекула. Эта деформа-
ция отсутствует только при весьма малых градиентах скорости
потока. Величина [т}] зависит при этом от градиента скорости,
приближаясь к своему предельному значению при g->0.

Выражение (3), как легко видеть, есть частный случай об-
щего определения (4), когда зависимость _ от концентрации
с

исследуемого вещества отсутствует. Остановимся на этом случае
подробнее.

б.	Жесткие не взаимодействующие между собой частицы

Предположим для простоты и наглядности, что частицы,
суспендированные в жидкости и движущиеся с ней, имеют фор-
му прямоугольных пластинок с толщиной h и площадью S. До-
пустим также, что все пластинки ориентированы параллельно
движущимся слоям и не изменяют ориентации (рис. 2). Пусть
скорость в потоке жидкости изменяется линейно с координатой
у и градиент скорости равен g. Присутствие частиц в жидкости
уменьшает это изменение, так как в пространстве, занимаемом
частицами, изменение скорости, очевидно, отсутствует. Умень-
шение скорости потока в суспензии по сравнению со скоростью
в чистой жидкости легко рассчитать по среднему числу пересе-
чений диаграммы скорости ОА с частицами в плоскости ху, па-
раллельной направлению потока и перпендикулярной движу-
щимся слоям жидкости. Как легко убедиться, число частиц, пе-
ресекаемых ломаной линией ОА, равно произведению NSL, где
N— число частиц в единице объема. Скорость уменьшается, сле-
довательно, на величину gNSLh, т. е.

ux = gL — gNSLh = g (1— Nv) L = gxL,

где v=Sh— объем частицы. Величина gi — средний фактиче-
ский градиент скорости течения суспензии. Поскольку сила, вы-
зывающая течение жидкости, остается прежней, в соответствии

15 Физические методы исследования белков

225
Рис. 2. Градиент скорости потока в суспензии жестких частиц

с (1) имеем

£Ло= £1Л = £(1~

откуда, выразив ц через т]о, находим

_ Т] — Ло _

УД т]о 1— Nv

Пренебрегая величиной Nv по сравнению с единицей (малая
концентрация частиц), получаем

ЦуД Nv.	(5)

Такой расчет совершенно аналогично может быть выполнен для
частиц произвольной формы и ориентации, так что приближен-
ное соотношение (5) имеет общий смысл — пропорциональность
удельной вязкости доле объема, занимаемой суспендированны-
ми частицами.

Для сферических жестких частиц Эйнштейн [1] получил точ-
ное соотношение:

Пуд =2,5 ЛД.	(6)

<w.

Отсюда, поскольку N = ----, где М — молекулярный вес, с — кон-
центрация растворенных частиц в г/<жч, ДГд — число Авогадро,
получаем

[ill =2,5Л/Л.	(7)

м

Аналогичная формула предложена Симха [2] для эллипсоидальных
частиц (см. также [3]):

[п] = ь№\МЛ	(8)

\а2 ) М

где v — объем частицы, b ( — ) — некоторая возрастающая функция
отношения длин и а2 главных осей эллипсоидальной частицы,
полученная Симха в аналитическом виде и известная также в виде

таблиц [4]. Если известна величина Na — (удельный объем части-
М

цы), то измерение [т]] позволяет в данном случае определить коэф-

фициент b | — ) в выражении (8), а значит, и отношение — главных
\Ч2 1	а2

осей эллипсоидальной частицы, что однозначно определяет ее форму.
Запишем формулу Симха в несколько ином виде:

[И] = 2,5Ад

1

i \д2 J

М 2,5

(9)

v= 2,5^-^,
М

т. е. по величине гидродинамического взаимодействия со средой
эллипсоидальные частицы эквивалентны сферическим частицам с той
же массой М и с эффективным объемом v3 = — b ( — ), тем боль-
2,5 у /

шим, чем больше форма эллипсоидальных частиц отличается от сфе-
рической. При аг = я2 имеем b [ —) = 2,5, v3 = v, и (9) перехо-
дит в формулу Эйнштейна (7). Соотношение (9) справедливо для
жестких частиц любой формы. При этом каждой форме отвечает
собственная величина v3, имеющая смысл объема, занимаемого ча-
стицей вместе с жидкостью, вовлеченной частицей в движение.

в.	Характеристическая вязкость полимерных молекул

- Особый интерес представляет изучение вискозиметрическим
методом, цепных полимерных молекул, принимающих в растворе
всевозможные сложные конформации. В соответствии с теорией,
описывающей поведение и свойства таких молекул [5], гибкая
цепная макромолекула, находящаяся в растворе, имеет форму
случайным образом свернутого клубка (гауссов клубок). В сред-
нем это асимметричный клубок (рис. 3), который можно
Рис. 3. Клубкообразная
молекула

апроксимировать эллипсоидом вращения с отношением главных
осей, равным 2.

При вращении такой клубкообразной молекулы в потоке
жидкости часть жидкости, пропитывающей клубок, вовлекает-
ся в движение вместе с ним, составляя с клубком как бы одно
целое. Это делает макромолекулу частично непротекаемой для
молекул растворителя. Предположим, что клубкообразная моле-
кула непротекаема полностью. Тогда ее можно рассматривать
как жесткую частицу и для определения
характеристической вязкости воспользо-
ваться формулой Симха (8), в которой
п = ^(Я)3—объем эллипсоида, апрокси-
мирующего макромолекулу, Н — длина
главной оси эллипсоида;

b = Ь(2) =2,91.
\<h J

Получаем

[П1=0,38ЛГл-^.	(Ю)

м

Из теории статистических клубков известно, что величина Н
связана с молекулярным весом М гибкого полимера зави-
симостью /7~ЛГ/2. Учитывая это, из формулы (10) получим

[П] = К =	(11)

м

где К — некоторый постоянный коэффициент. Мы пришли, та-
ким образом, к зависимости, однозначно связывающей характе-
ристическую вязкость непротекаемой клубкообразной молекулы
с ее молекулярным весом, т. е. со степенью полимеризации.

Эмпирические соотношения вида

[t)] = W,	(12)

относящиеся к полимерам одного гомологического ряда в дан-
ном растворителе, широко применяются для определения моле-
кулярного веса полимеров. Зависимость (12) можно записать
также в виде:

In [т]] = 1п/С + а 1пМ,	(13)

что является уравнением прямой в координатах In М, 1п{т]]. Из-
мерив характеристическую вязкость нескольких стандартных
препаратов с известными молекулярными весами, определенны-
228
Рис. 4. Зависимость характеристи-
ческой вязкости от молекулярного
веса фрагментов коллагена

ми каким-либо абсолютным методом (светорассеяние, электрон-
ная микроскопия, ультрацентрифугирование и др.) и разме-
стив соответствующие точки в координатах In М, 1ш[г]], мы
убеждаемся прежде всего в справедливости выражения (13)
для данного случая. Если нанесенные на график точки действи-
тельно лежат на одной прямой, то длина отрезка, отсекаемого
этой прямой на оси In i[v)], и тангенс угла наклона прямой дают
соответственно величины In К и а
в формуле (13). Теперь не состав-
ляет труда вычислить или опреде-
лить непосредственно на графике
неизвестный молекулярный вес
фракции полимера, для которой
измерена характеристическая вяз-
кость |[Т)].

Показатель а в выражении
(12) может принимать различные
значения — обычно от 0 до 1,8 — и
зависит от формы молекулы поли-
мера, от протекаемости молеку-
лы, от степени набухания. Так,
а = 0 для сплошных шарообраз-
ных частиц. Действительно, в вы-

ражении (7) v~M и ![т|] не зависит от М. Для эллипсоидальных
жестких частиц зависимость от М определяется зависимостью

от М коэффициента b (— . Очевидно, если молекулярный вес
\ С^2'

и размеры эллипсоидальной частицы возрастают без изменения

ее формы, т. е. b —I =const, то показатель а в уравнении (12)

также равен нулю. Наоборот, если при возрастании массы эл-
липсоидальной частицы происходит ее удлинение при сохранении
поперечного размера, показатель а становится равным 1,7. По-
добная зависимость [ц] от М наблюдается, например, для фрак-
ций коллагена, полученных ультразвуковым дроблением исход-
ного высокомолекулярного препарата (рис. 4). Это означает, что
молекулы коллагена представляют собой жесткие палочки. Чем
сильнее при возрастании М меняется асимметрия частицы, тем
больше показатель а в уравнении (12) для этих частиц.

- Для клубкообразных полимерных молекул, сквозь которые
растворитель свободно не протекает, показатель а равен 0,5
(см. выражение (11)). Однако в действительности это справед-
ливо только для растворов в так называемых идеальных раство-
рителях, в которых отсутствует набухание молекул. В реальных
растворах непротекаемых молекул показатель а обычно прини-
мает значения от 0,5 до 0,8. Для клубкообразных, полностью
протекаемых молекул теория предсказывает зависимость харак-
теристической вязкости от молекулярного веса с показателем,
равным единице. Полимеры с такой зависимостью (ц](Л1) суще-
ствуют, но близость показателя а к единице во всех известных
случаях объясняется не протекаемостью молекул, а жесткостью
их полимерных цепей (см. ниже). Показатель а для таких поли-
меров имеет промежуточные значения от 0,5 до 1,8. В табл. 1
приведены значения Киа для некоторых природных и синтетиче-
ских полимеров.

Таблица 1

Величины Киа для некоторых природных и синтетических полимеров

Полимер	Растворитель	Темпе- ратура, оС-	К, дл/г	а	Литера- турный источ- ник	Структура
Полиизобутилен	1 Бензол 		24	1,07 • 10“?	0,5	[6]	Гауссов клубок
Амилаза  ДНК денатури- рованная	0,ЗЗМ КС1 . . Стандартный солевой раствор *	25	11,3-102	0,5	[7]	То же
Поливиниловый	(0,195М Na+) . .  Вода 		20	4,9-10'4	0,55	[81	» »
спирт  Каучук нату-	Толуол 		25	14-Ю2	0,6	[9]	» »
ральный		25	5-IO-2	0,67	[Ю]	» »
Полимет илмета- крилат	Бензол 		20	4,68-10-5	0,77	[И]	» »
Желатина  ДНК нативная	Вода 	  Стандартный	35	1,66-10-®	0,885	[12]	» »
(М>2-10в)	солевой раствор *	20	6,9-10-5	0,7	[8]	Полужесткие клубкообраз- ныемолекулы
ДНК денатури- рованная	0,013М Na+ . . .	20	3,1-Ю’б	0,91	[8]	То же
Нитроцеллюлоза ДНК нативная	Ацетон 	  Стандартный	20	2,8-10-5	1,0	[13]	» »
(М=0,3-  -2,0-10е)	солевой раствор *	2D	1,05-10 7	1,32	[8]	» »
Коллаген	Вода 		20	1,23-10-»	1,8	[14]	Жесткие палочко- образные молекулы

* См. стр. 237.

Заметим, что задача определения М. часто осложняется из-за
полидисперности препаратов, т. е. из-за присутствия в препара-
тах молекул у различными массами. Определение М по харак-
теристической вязкости обычным способом приводит в этом слу-
чае к так называемому средневязкостному значению молекуляр-
ного веса, несколько отличному от среднечисленного и
средневесового значений М* 1 * * *. Для получения стандартной пря-
мой (13), очевидно, следует пользоваться как можно более уз-
кими фракциями.

Величина [ц] даже в том случае, когда одной характеристи-
ческой вязкости недостаточно для суждения о форме молекул
или о молекулярном весе, является сама по себе очень ценной
характеристикой макромолекул. В сочетании с методом седи-
ментации измерение характеристической вязкости позволяет
определить молекулярный вес из соотношения Манделькерна —
Флори (см. стр. 258). Существует связь между [ц] и характери-
стическим двойным лучепреломлением, облегчающая определе-
ние анизотропии поляризуемостей молекул (см. стр. 282). В свя-
зи с этим естественны высокие требования к корректности опре-
деления величины характеристической вязкости.

г.	Измерение вязкости

В лабораторной практике для измерения вязкости в диапа-
зоне 0,01—0,1 пуаз, обычном при вискозиметрическом исследо-
вании биополимеров, используются два основных типа виско-
зиметров: капиллярные и ротационные. Измерение вязкости при
помощи капиллярных вискозиметров основано на известном за-
коне Пуазейля (см., например, [15]), согласно которому объем
жидкости V, протекающей через капилляр в единицу времени,
связан с разностью давлений Др в жидкости на концах капил-
ляра и вязкостью Т) жидкости соотношением

V = ^,	(14)

8ц/

где г—радиус капилляра; I — его длина. В наиболее распро-
страненном капиллярном вискозиметре типа Оствальда (рис. 5)
жидкость протекает по капилляру 1 из резервуара-шарика 2 в
приемный резервуар 3. Разность давлений создается столбиком
жидкости, находящейся в капилляре. Измеряется время т исте-
чения жидкости из шарика, объем которого* Ро известен. Оче-
видно,

т _ _ V° - 8V"

	I'	р

1 Если тс — молярная концентрация е-го компонента с молекулярным весом

то среднечисленным молекулярным весом называется величина Мп = ——  .

Средневесовой молекулярный вес Mw = ----, где cf = miMl— весовая концент-

рация i-го компонента.
так как Ap=p/go, где р—плотность жидкости; go — ускорение
силы тяжести. Плотность исследуемого раствора при малых
концентрациях практически не отличается от плотности раство-
рителя, поэтому отношение времени истечения раствора к вре-
мени истечения растворителя равно относительной вязкости, ко-
торая и измеряется на капиллярном приборе.

/Л 7

Рис. 5. Вискозиметр
Оствальда

вид сбоку

Рис. 6. Вискозиметр Эйгнера

Так называемые многошариковые вискозиметры имеют не-
сколько шариков, расположенных на разной высоте, для созда-
ния различных перепадов давления. Это приводит соответственно
к разным скоростям истечения при различных средних гра-
диентах скорости. Последнее особенно важно в случаях, когда
необходимо получить значения вязкости при нескольких гра-
диентах для последующей экстраполяции к g=0. Один из таких
приборов (вискозиметр Эйгнера) изображен на рис. 6. Следует
заметить, однако, что капиллярные вискозиметры недостаточно
удобны для этой цели, поскольку градиент скорости потока ка-
пилляра непостоянен и меняется от некоторого максимального
значения около стенок капилляра до нуля на его оси. В связи с
этим вязкость т), входящая в выражения (14) и (15), не являет-
ся истинной, во всяком случае для жидкостей или растворов, в
которых имеется сильная зависимость вязкости от градиента
скорости потока, и это обстоятельство при точных измерениях
необходимо учитывать (см., например, [16]). Другой серьезный
недостаток капиллярных вискозиметров — обилие источников
ошибок при измерении. Основными из них являются ошибки
измерения момента начала и конца истечения, ошибки, вызыва-
емые действием капиллярных сил, и так называемый кинетиче-
ский эффект, состоящий в том, что потенциальная энергия жид-
кости, находящейся в шарике, в основном расходуемая на рабо-
ту против сил трения, частично' переходит в кинетическую
энергию движущейся по капилляру жидкости, что усложняет
зависимость времени истечения от вязкости '[17]. Точность изме-
рений вязкости в капиллярных вискозиметрах зависит также
от полноты опорожнения капилляра, присутствия частиц пыли
в растворе, установки вискозиметра (строго вертикально) и от
других причин. Имеется, однако, множество различных вариан-
тов капиллярных вискозиметров и приспособлений к ним [17],
применение которых позволяет значительно уменьшить все ука-
занные ошибки.

Минимальный градиент скорости, получаемый при помощи
капиллярных вискозиметров,— единицы сек-1 [18]. Исследова-
ние многих полимеров, в частности ДНК, требует еще меньших
величин. Для удовлетворительной экстраполяции к §’ = 0 в слу-
чае ДНК необходимы градиенты, равные 0,2—0,1 сек-1. Такие
градиенты скорости потока могут быть получены при помощи
ротационных вискозиметров (Куэтта, Эйзенберга [19], Зимма
[20] и др.). Все они состоят из коаксиальных цилиндров или ко-
нусов, в зазоре между которыми помещена исследуемая жид-
кость. Один из цилиндров (конусов) вращается, другой, вовле-
каемый в движение потоком жидкости, поворачивается на неко-
торый угол, либо закручивая упругую нить подвеса (Куэтт),
либо сдвигая пластины электростатической системы (Эйзенберг).
В обоих случаях противодействующий момент при данной ско-
рости вращения ведущего цилиндра пропорционален вязкости
исследуемой жидкости. Прост и оригинален ротационный вис-
козиметр Зимма [20], изображенный на рис. 7. Здесь в движение
приводится только один цилиндр — внутренний — при помощи
встроенного в него железного диска и внешнего вращаю-
щегося магнита. Подвижный цилиндр свободно плавает в ис-
следуемой жидкости, заполняющей зазор между цилиндрами.
При этом верхний край подвижного цилиндра отшлифован и
Рис. 7. Вискозиметр Зимма

1— термостатируемая рубашка;

2 —мениск; 3—подвижный цилиндр;

4 — неподвижный цилиндр; 5 —же-
лезный диск в наполнителе;

6 — магнит; 7 — к оси двигателя
магнитной мешалки

совпадает с мениском, чем обеспечи-
вается автоматическое центрирова-
ние цилиндра при вращении. Ско-
рость вращения внутреннего цилинд-
ра при данной скорости ведущего
магнита обратно пропорциональна
вязкости жидкости, помещенной в
зазор между цилиндрами. Ротаци-
онные вискозиметры мало распро-
странены, вероятно, из-за трудно-
стей их изготовления. Однако, при-
боры такого типа совершенно неза-
менимы для получения очень малых
постоянных градиентов скорости.
Так, вискозиметр Зимма позволяет
работать вплоть до £" = 0,01 сект1.

Как ротационные, так и капил-
лярные приборы позволяют изме-
рять только относительную вяз-
кость по величине отношения време-
ни истечения, угла поворота или
скорости вращения для исследуемо-
го раствора к таковым для раство-
рителя. Для абсолютных измерений
вязкости каждый вискозиметр обыч-
но градуируется при помощи набора
жидкостей с известными абсолют-
ными значениями вязкости, охваты-
вающими необходимый диапазон.
Таким набором могут служить, на-

пример, чистая вода при различных
температурах или водные растворы
глицерина [21].

Поскольку вязкость большинства жидкостей сильно зависит
от температуры, для достижения необходимой точности измере-

ний следует тщательно термостатировать как вискозиметр, так
и приготовленные для измерений жидкости (растворы).

д.	Вязкость растворов биополимеров

Так как мономерные звенья, составляющие молекулярную
цепь белка (аминокислоты), неодинаковы, различные белки
нельзя рассматривать как члены одного гомологического ряда.
Следовательно, уравнение вязкости типа (12) для белков, стро-
го говоря, неприменимо. Глобулярные белки, молекулы кото-
рых представляют собой компактно уложенную полипептидную
цепь, частично спирализованную, с фиксированной конформа-
Рис. 8. Зависимость характеристи-
ческой вязкости от молекулярно-
го веса глобулярных белков —
нативных (/) и с разрушенной тре-
тичной структурой (2)

цией, несмотря на многообразие конформаций и размеров мо-
лекул обладают примерно одинаковой характеристической вяз-
костью ( — 0,04 сЬг/г), т. е. молекулы различных глобулярных
белков ведут себя как жесткие
сплошные частицы с разными
размерами и молекулярным ве-
сом, но с примерно одинаковой
асимметрией. Если разрушить
третичную структуру глобулярно-
го белка, иными словами, разор-
вать связи, организующие поли-
пептидную цепь в глобулу, то мо-
лекула приобретает форму, близ-
кую к палочкообразной, и же-
сткость, свойственные а-спирали
Полинга — Кори. Пренебрегая в
данном случае различиями меж-
ду мономерными звеньями, мы
получаем гомологичное семейство
палочкообразных молекул, для
которого должно существовать
уравнение вязкости типа (12) с
показателем а, близким к 1,8.

Действительно, характеристическая вязкость четырех глобуляр-
ных белков [22]— рибонуклеазы (Л4=14 000), трипсина (Л4 =
= 24 000), яичного альбумина (34 = 44 000) и сывороточного аль-
бумина человека (.44 = 69 000)—подчиняется уравнению вязко-
сти с показателем а=1,5—1,8 (рис. 8, кривая 2\ нативному со-
стоянию отвечает прямая /). Белок с совершенной палочкообраз-
ной структурой — коллаген, построенный из тройной полипептид-
ной спирали. Показатель а для фрагментов коллагена равен 1,8
(см. рис. 4).

При полной денатурации белков в результате разрушения
и третичной, и вторичной (спиральной) структуры их молекулы
могут приобрести клубкообразную форму. Зависимость харак-
теристической вязкости от молекулярного веса в этом случае
приближенно описывается уравнением (12) с показателем, рав-
ным 0,7, что соответствует гибким полимерным цепям, сверну-
тым в плохо протекаемый гауссов клубок. Некоторые заключе-
ния о структуре белковой молекулы можно сделать, наблюдая
характер изменения вязкости белкового раствора при денату-
рационных воздействиях. Утрата вторичной и третичной струк-
туры белка неизменно приводит к значительному увеличению
вязкости раствора одновременно с падением оптической актив-
ности.

Таким образом, вискозиметрическое исследование белковых
растворов приводит в основном только к качественным резуль-
тэтам. Для определения молекулярного веса белка необходимо
пользоваться каким-либо иным методом (например, светорас-
сеяние. седиментационный анализ).

Исследование молекул нуклеиновых кислот в растворе тре-
бует к себе особого внимания. Прежде всего это связано с боль-
шим молекулярным весом нуклеиновых кислот, особенно ДНК

TiygHn^	(Ю7--108). В растворах с такими

°	большими молекулами весьма

0£\—।—।—।—।—।—।—।—।—।—।—
0 2 4 6 8 10 12 /4 16 18 20 д

Рис. 9. Зависимость удельной
вязкости раствора нативной
ДНК от градиента скорости
потока

велико межмолекулярное взаимо-
действие. Кроме того, молекулы
нуклеиновых кислот легко под-
вержены деформациям даже при
относительно небольших градиен-
тах скорости потока.

В этом случае для определе-
ния характеристической вязкости
приходится работать с раствора-
ми весьма малых концентраций
и с предельно малыми градиента-
ми скоростей. Замечательный
пример определения удельной
вязкости раствора ДНК — изме-
рения, выполненные Эйзенбергом
'[23], результат которых приведен
на рис. 9. Из рисунка видно, что
пренебрежение очень малыми гра-

диентами при экстраполяции к
g = Q может привести к неверной оценке величины (цуд)й = о и,
соответственно,— к неправильному представлению о структуре
ДНК в растворе. Кривая, приведенная на рис. 9, убедитель-
но доказывает, что только при g, меньших 1,0 сек-1, молекулы
ДНК в растворе можно считать практически недеформирован-

ными, а величину — — не зависящей от градиента скорости

потока.

Клубкообразная молекула нативной ДНК, как об этом сви-
детельствуют данные по светорассеянию, обладает большими
размерами, чем обычный гауссов клубок, образованный гибкой
полимерной цепью той же длины. Это является следствием от-
носительной жесткости двойной молекулярной цепи ДНК, не
допускающей крутых и частых изгибов. Вместе с тем достаточ-
но длинные отрезки двухнитевой спиральной цепи ДНК обла-
дают гибкостью, что позволяет молекуле ДНК приобрести клуб-
кообразную форму. Такие цепные молекулы называются полу-
жесткими. Показатель а в уравнении характеристической вяз-
кости для таких молекул должен иметь промежуточное значе-
ние между а = 0,5 (гибкие цепные молекулы) и а =1,8 (жесткие
палочкообразные молекулы).

Как отмечено Эйгнером и Доти [8], показатель а для ДНК с
различными молекулярными весами (от 0,3-106 до 130-106) дей-
ствительно изменяется в этих пределах (рис. 10). При малых
значениях М (0,3• 106—2-Ю6) форма молекул ДНК близка к

Рис. 10. Зависимость характеристической вязкости нативной
ДНК от молекулярного веса ДНК

палочкообразной (а=1,32; К= 1,05 • 10 7). Напротив, при до-
статочно больших Л4 (от 2-Ю6) молекулы ДНК приближаются
по форме к гауссовым клубкам (п = 0,7; К=6,9- 10~5). Для ДНК
в промежуточной области (М = 0,5 • 106 = 3 • 106) можно пользо-
ваться приближенной формулой, предложенной ранее Доти
(а=1,12; К= 1,45-10-6 дл/г [24]) Ч

При денатурации ДНК, когда разрушается ее вторичная
структура и происходит разъединение полинуклеотидных цепей,

1 Все указанные зависимости справедливы для ДНК в стандартном солевом
растворе, содержащем 0,15 М NaCI, 0,015 М цитрата Na, pH 7,0.
составляющих двойную спираль ДНК, характеристическая
вязкость претерпевает существенное изменение, зависящее от
молекулярного веса ДНК и от ионной силы. Так, для денатури-
рованной ДНК Escherichia coli в стандартном солевом растворе
в уравнении для характеристической вязкости коэффициент К
(4,9 • 10“4) и показатель а (0,55) значительно отличаются от
таковых для нативной ДНК в том же диапазоне молекулярных
весов (1,45- 10“6 и 1,12, соответственно {18, 24]). Следовательно,
одноиитевая полимерная цепь денатурированной ДНК не обла-
дает той жесткостью, которая свойственна нативной структуре,
и молекула ДНК после денатурации приобретает свойства гаус-
сова клубка с гибкой полимерной цепью. Однако, при уменьше-
нии ионной силы полинуклеотидная цепь денатурированной
ДНК вновь приобретает некоторую жесткость за счет электро-
статического отталкивания отрицательно заряженных фосфат-
ных групп, которое при большой ионной силе экранируется про-
тивоионами. Об этом свидетельствует, например, увеличение
показателя в уравнении характеристической вязкости денатури-
рованной ДНК от <2 = 0,55 (см. выше) до> а = 0,91 при уменьше-
нии ионной силы примерно в 15 раз {8].

Этот последний пример показывает, что при изучении раство-
ров нуклеиновых кислот нельзя не учитывать, что эти биополи-
меры являются полиэлектролитами (то же относится и к бел-
кам). Вследствие наличия большого количества заряженных
групп в молекулах белков и особенно нуклеиновых кислот необ-
ходимо при всех измерениях сохранять одинаковыми ионные
условия, точнее, ионную силу раствора. Только в этом случае
можно быть уверенным, что конфигурация молекул при измере-
ниях остается неизменной. В серии измерений с уменьшающи-
мися концентрациями полиэлектролита для определения [ц]
недостаточно сохранять постоянным содержание солей в рас-
творе, так как уменьшение концентрации полиэлектролита ведет
к понижению ионной силы — той ее доли, которая создается
заряженными группами. Эффективная ионная сила в данном
случае остается постоянной при так называемом изоионном раз-
бавлении [25], когда, уменьшая концентрацию полиэлектролита,
одновременно увеличивают на некоторую рассчитанную величи-
ну концентрацию солей.

2. Метод ультрацентрифугирования

Одним из самых [распространенных и плодотворных методов
изучения природных и синтетических полимеров является метод
ультрацентрифугирования. Он заключается в юоздаиии больших
центробежных ускорений, превышающих ускорение земного при-
тяжения в 104—105 раз в роторах, вращающихся со скоростями
238
до 60 000 об!мин. Под действием таких сильных центробежных
полей происходит осаждение (седиментация) молекул раство-
ренного полимера, аналогично осаждению крупных частиц сус-
пензии под действием поля тяготения Земли. При низких уско-
рениях осаждение частиц молекулярных размеров невозможно
вследствие хаотического теплового движения, влияние которого
тем больше, чем меньше размер частиц.

В случае, когда скорость диффузии за счет теплового дви-
жения частиц значительно меньше скорости осаждения под дей-
ствием центробежного поля, можно непосредственно измерять
скорость седиментации частиц. При этом в растворе, первона-
чально гомогенном, вследствие осаждения частиц образуются
две области: область чистого растворителя и область раст-
вора, содержащего исследуемые частицы (для биополимеров
растворителями обычно служат солевые и буферные водные
растворы). Между этими областями имеется переходная зона
(граница), в которой концентрация полимера плавно изменяет-
ся от нуля до некоторого максимального значения. Наблюдение
скорости '.перемещения этой границы лежит в основе метода ско-
рости седиментации. В реально наблюдаемой переходной зоне
концентрация никогда не изменяется резко и зона имеет конеч-
ную ширину. Она размывается, во-первых, вследствие диффузии
осаждаемых частиц, во-вторых, за счет полидисперсности препа-
ратов по молекулярному весу в результате осаждения разных
частиц с разными скоростями. В этом случае по величине раз-
мытия границы возможна оценка степени пол1идисперсности ис-
следуемого образца. Важной разновидностью метода скорости
седиментации является метод осаждения в градиенте плотности.

При относительно небольших центробежных ускорениях по-
ток седиментирующего вещества оказывается сравнимым по ве-
личине с потоком вещества в противоположную сторону, выз-
ванным диффузией, так что граница между раствором и раст-
ворителем не образуется, а происходит лишь некоторое перерас-
пределение концентрации в кювете. Очевидно, концентрация
исследуемого вещества в верхней, обращенной к оси вращения
части кюветы меньше, чем концентрация в исходном растворе.
Ближе ко дну кюветы концентрация, наоборот, возрастает, пре-
вышая исходную. При достаточно длительном времени центри-
фугирования устанавливается равновесие потоков вещества в
каждой точке и образуется равновесное распределение веще-
ства по длине кюветы. По форме установившегося распределения
можно судить о свойствах исследуемых частиц, в частности об
их молекулярном весе [26, 27].

Те же самые сведения, но с несколько меньшей точностью,
можно получить, анализируя распределение концентрации в кю-
вете в начальной стадии установления равновесия. Этот метод,
называемый методом приближения к равновесию (метод Арчи-
бальда {28]), широко применяется в практике. К методу седимен-
тационного равновесия можно также отнести метод равновес-
ного ультрацентрифугирования в градиенте плотности. При дли-
тельном ультрацентрифугировании концентрированных раство-
ров низкомолекулярных солей (таких, как CsCl, CS2SO4, ацетат
цезия, RbBr, КВг и др.) возникает градиент плотности за счет
перераспределения концентрации солевого раствора. Макромо-
лекулы, находящиеся в таком растворе, через некоторое время
располагаются в узкой зоне, где локальная плотность раство-
рителя соответствует плотности этих макромолекул. Этот метод
позволяет проводить фракционирование макромолекул по их
плотности, оценить гетерогенность изучаемого образца по плот-
ности, а также его молекулярный вес [29].

Уже это краткое перечисление хорошо демонстрирует гиб-
кость метода ультрацентрифугирования и его широкие возмож-
ности в исследовании макромолекул.

а. Краткие сведения об аналитических ультрацентрифугах

Центробежные ускорения, создаваемые в современных ульт-
рацентрифугах, достигают 300 000 g, где g — величина ускоре-
ния силы тяжести. Роторы, способные выдержать такие ускоре-
ния, делаются из особо прочных сплавов алюминия или титана
и имеют специальную форму.

Вращение ротора может осуществляться либо масляной тур-
бинкой [26], либо воздушной (современные ультрацентрифуги;
Five, ФРГ; Г-120, Венгрия), либо электромотором (например,
модели «Spinco», США; UCA, Япония; УЦА-4, СССР). Послед-
нему типу привода в настоящее время отдают предпочтение
ввиду его явных преимуществ — малогабаритности, отсутствия
громоздких вспомогательных узлов, поэтому приводимые ниже
характеристики будут относиться к ультрацентрифугам подоб-
ного типа, т. е. «Spinco», UCA и УЦА-4. Передача вращения ро-
тору в ультрацентрифугах с электрическим приводом осуществ-
ляется через гибкий вал-струну, на которой подвешивается ро-
тор. Такая подвеска ротора обеспечивает самобалансирование
его при вращении и допускает менее тщательное уравновеши-
вание при заполнении кювет или пробирок. Ротор вращается в
камере с глубоким вакуумом (10-3—10“4 мм рт. ст.), что необ-
ходимо для предотвращения разогрева ротора из-за трения в
воздушной среде, так как при проведении аналитических опытов
предъявляются очень жесткие требования к стабильности тем-
пературы. Вакуумная камера окружена броневой защитой на
случай разрыва ротора. Стабильность вращения ротора при низ-
ких скоростях (2000—2500 об/мин) в ультрацентрифугах типа
Spinco Е, UCA составляет 0,5-^0,3% от заданной скорости, а при
максимальной скорости достигает 0,1 %.
Г- процессе 1 ы температура ротора измеряется и под-
держивается постоянной. Ее измерение производится либо при
помощи термопары, расположенной в вакуумной камере вблизи
ротора, либо при помощи термомагнитных колец, расположен-
ных на роторе (ультрацентрифуга UCA, Япония), или запрессо-
ванным в тело ротора термистором — по изменению его сопро-
тивления (наиболее современный метод). Термистор является
составной частью электронной схемы, автоматически поддер-
живающей заданную температуру посредством постоянно
действующего холодильника, укрепленного на внутренней стей-
ке вакуумной камеры, и расположенного под ротором электри-
ческого нагревателя, включаемого автоматически по мере надоб-
ности. Контакт термистора с устройством, обеспечивающим ав-
томатическое включение нагревателя, осуществляется через
иглу, укрепленную по оси внизу ротора и погруженную в непод-
вижную чашечку с ртутью. Рабочий диапазон температур в уль-
трацентрифугах обычно составляет 0—35°, а при наличии спе-
циальной приставки—до 120\ Температура поддерживается
с точностью ~0,1° и измеряется с точностью ^0,02°.

Ультрацентрифуги снабжаются разнообразными роторами,
отличающимися размерами, количеством и емкостью пробирок
и максимально допустимой для данного ротора скоростью вра-
щения. Имеются три основных типа роторов: угловой для про-
ведения препаративных работ, ротор с откидными стаканами
для проведения аналитических и препаративных работ и анали-
тический ротор. Препаративные угловые роторы выпускаются
в очень широком ассортименте, перечислять который здесь нет
надобности. Роторы с откидными стаканами в иностранной ли-
тературе называются bucket-rotor, или swing-out-rotor. Стака-
ны имеют специальные герметизирующие пробки, предотвра-
щающие испарение раствора из пробирок в вакуумной камере.
В настоящее время доступны роторы с откидными стаканами
для пробирок емкостью 5 мл, рассчитанные на максимальную
скорость — 65 000 об.] мин (максимальное ускорение - - 350 000 g),
и с пробирками емкостью 34 и 60 мл — максимальная скорость
25 000 об!мин (максимальное ускорение 90 000 g). Такие роторы
изготовляются как иностранными фирмами (США, Япония), так
и в СССР (СКВ БФЭМ),

Аналитический ротор имеет обычно два отверстия-гнезда для
аналитической кюветы и ее противовеса диаметром ^2,5 см.
Расстояние от оси вращения до центра кюветы, как правило,
равно 6,5 jcm. Противовесом является дюралюминиевый цилиндр
с осевой резьбой и сменными винтами, подбором которых про-
изводится уравновешивание кюветы. В противовесе имеются
два отверстия, расположенные на известных расстояниях от цент-
ра ротора, которые в регистрирующих системах ультрацентри-
фуг используются как отсчетные расстояния для нахождения

16 Физические методы исследования белков

241
Рис. 11. Основные типы роторов

а — угловой ротор с пробирками; б — ротор с откидными стаканами (swing-out
или bucket-rotor); а — аналитический ротор

истинных положений точек рабочей части кюветы относительно
оси вращения. Аналогичное отверстие имеется в теле ротора на
случай, если вместо противовеса используется вторая аналитиче-
ская кювета. Основные типы роторов изображены на рис. 11.

Аналитическая кювета состоит из дюралюминиевого корпу-
са, вкладыша, имеющего сквозной секториальный резервуар, и
кварцевых окошек. Высота вкладыша варьирует от 2 до 30 мм.
Вкладыш кюветы делается из дюралюминия или из химически
стойкой пластмассы. Кювета герметизируется при помощи колец
с резьбой, прижимающих кварцевые окошкн к вкладышу кюве-
ты через полиэтиленовые прокладки. Вкладыш имеет отверстие
Рис. 12. Схема аналитической кюветы и ее элементов
f — кварцевое окошко; 2 — упдотайтельиая прокладка; 3 —дер-
жатель кварцевого окошка; 4 — шпонка; 5 — корпус; б — боко-
вой винт; 7 — прокладка: 8— вкладыш: 9— резьбовое кольцо

для заливки раствора в кювету, которое уплотняется через по-
лиэтиленовую прокладку нарезным штифтом, ввинчиваемым в
корпус кюветы. Таким образом, рабочее пространство кюветы
ограничено секториальным резервуаром и кварцевыми окошка-
ми. Плоскости боковых стенок резервуара пересекаются на оси
вращения ротора (рис. 12). Такая форма резервуара обеспе-
чивает прямолинейность траектории седиментирующих частиц
в любой точке рабочего пространства.
Кроме описанной кюветы существует ряд разновидностей,
широко применяющихся в практике (подробно см. обзор Шах-
мана [27]). Рассмотрим две наиболее важные конструкции.

1.	Двухсекторная кювета имеет во вкладыше два независи-
мых резервуара, в один из которых заливается исследуемый
раствор, в другой — чистый растворитель (рис. 13). При оптиче-
ской регистрации результатов аналитического опыта, выполняе-
мого с односекторной ячейкой, часто бывает трудно определить
положение отсчетной линии (см. рис. 15), отвечающей чистому
растворителю, поскольку она бывает искривленной вследствие

Рис. 13. Вкладыш двух-
сскторнон кюветы

Рис. 14. Вкладыш кюветы
для создания искусствен-
ной границы наслоением

перераспределения концентрации солей в растворе. Одновремен-
ная регистрация кривых, соответствующих чистому раствори-
телю и раствору, содержащему исследуемое вещество, как это
может быть сделано с двухсекторной кюветой, устраняет эту
трудность. Применение двухсекторной кюветы позволяет также
обнаружить небольшие примеси, сопровождающие основной
компонент исследуемого раствора (см. рис. 16), и повышает точ-
ность отсчета результатов.

2.	Кювета с искусственной границей состоит нз двух сооб-
щающихся через капилляры резервуаров — рабочего и вспомо-
гательного. Кюветы этого типа позволяют получить узкую гра-
тицу между исследуемым раствором и чистым буферным раство-
ром посредством наслоения буфера на исследуемый раствор и,
наоборот, подслоением раствора под буфер в зависимости от
конструкции кюветы. На рис. 14 приведено схематическое изо-
бражение вкладыша кюветы с наслоением. Последнее проис-
ходит при скорости ротора 7000—8000 об]шн по капиллярам,
которыми служат риски на торце вкладыша. Кюветы с искус-
ственной границей используются для определения коэффициента
седиментации низкомолекулярных веществ, коэффициента диф-
фузии, при изучении взаимодействующих компонент и т.'д.
нН

Рис. 15. Седиментационная диаграмма для определения истин-
ного положения базовой линии раствора сывороточного альбу-
мина в 2,0 М NaCl- слева — обычная кювета, справа — двухсек-
торная. Искривление базовой линии обусловлено перераспре-
делением концентрации NaCl в растворе [27]

Рис. 16. Седиментационная диаграмма для раствора сыворотрч-
ного альбумина, слева — обычная кювета, справа — двухсек-
торная. Четко видно наличие примеси с правой стороны седи-
ментационной кривой [27]
Для определения скорости перемещения границы или пере-
распределения вещества в кювете необходимо регистрировать
изменение концентрации раствора в различных частях кюветы.
Существует однозначная связь концентрации вещества с показа-
телем преломления раствора и его оптической плотностью. Этим
определяется выбор соответствующих оптических методов реги-
страции при аналитическом ультрацентрифугировании.

Метод Фильпота — Свенссона (метод шлирен-диафрагмы)

[5]. Этот метод позволяет регистрировать производную — коэффици-
ент

ента преломления п, которая пропорциональна производной концен-
dc
трации —.

dx

Рис. 17. Оптическая схема регистрации производной показателя преломления
dnfdx раствора (метод Фильпота — Свенссона) [5]

Принципиальная схема метода приведена на рис. 17.

Источником света является ярко освещенная горизонтальная щель
А. Параллельный пучок света, создаваемый коллимирующей линзой
проходит через кювету Д; линза Ь2 формирует изображение щели
А в плоскости А4, где помещена наклонная щель В. Если жидкость
в кювете оптически однородна, то изображение щели А на экране
М получится в виде узкой горизонтальной полосы Ло с координатой
d,c

xf = 0. При наличии градиента — на некотором уровне кюветы пу-
dx

чок света отклонится на угол — h (h — толщина кюветы) в сторону
dx

увеличения коэффициента преломления света, т. е. изображение щели
сместится на расстояние х' (вверх или вниз), равное//i—, где I—

расстояние от линзы L2 до экрана. При наличии широкой области
изменения показателя преломления п в кювете Д возникает набор
смещенных изображений щели. Наклонная щель В выделяет только
одну точку смещенного изображения щели А' на экране Л4, тем
больше смещенную в направлении у', чем больше градиент —. Это
dx
смещение равно

у'=х' ctgO — hl — -ctgО,

dx

где О — угол наклона щели В,

Между объективом О и фотопластинкой 2V, на которую проекти-
руется изображение кюветы Д', помещается цилиндрическая линза
R. Линзы R и О проектируют на фотопластинку также изображение
наклонной щели. Если в кювете К раствор однороден, эта щель
изобразится в виде тонкой вертикальной прямой. Неоднородность
приводит к смещению изображения источника света на экране М и
к горизонтальному отклонению на фотопластинке М, равному

Y — koRy'>

где koR — коэффициент увеличения линз О и R. Учитывая выраже-
ние для у', получаем1:

Y = koRlhrtg'® —.
dx

Так как цилиндрическая линза в вертикальной плоскости не пре-
ломляет, по оси X увеличение равно

X = g0LX,

где goL — коэффициент увеличения линз О и L2-

Область кюветы, где — = 0, дает так называемую базовую
dx
„	dn

линию, от которой ведется отсчет —.

dx

На рис. 15 и 16 представлены типичные седиментационные
диаграммы, полученные методом Фильпота — Свенссона в
обычной (левый снимок) и двухсекторной кюветах (правый
снимок) для сывороточного альбумина. Вертикальные черные
линии являются изображениями отверстий в противовесе.

Применение метода Фильпота — Свенссона позволяет также
использовать одновременно две кюветы, одна из которых уста-
навливается вместо противовеса и имеет клиновидное кварцевое
окошко, приводящее к сдвигу между двумя седиментограммами.

1	Для того чтобы перейти от — к —, необходимо знать инкремент пока-
dx dx

dn

зателя преломления изучаемого раствора — — р, который в интервале концентра-
те

ций растворов, применяемых при ультрацеитрифугировании, постоянен. В этом
de i dn

случае — —------.

dx р dx
В результате наблюдаются сразу два различных профиля — ,
смещенные один относительно другого, отвечающие двум раз-
ным кюветам.

В современных модификациях системы Фильпота — Свенс-
сона вместо наклонной щели устанавливается фазоконтрастная
пластинка, при помощи которой и происходит соответствующее
преобразование отклонений лучей света [5, 30]. Описанный метод

Рис. 18. Схема интерферометра по
Релею, применяемая в ультрацен-
трифуге Spinco Е

регистрации получил очень боль*
шое распространение в ультра-
центрифугах, ввиду его точности
и наглядности, и является основ-
ным при работе с природными
синтетическими полимерами.

Интерференционный
метод. Этот метод позволяет
определить показатель преломле-
ния раствора в любой точке кюве-
ты. Он более чувствителен- и то-
чен, чем метод Фильпота — Свенс-
сона [30, 31]. Для регистрации,
при ультрацентрифугировании мо-
гут 'применяться различные ин-
терференционные схемы, но обыч-
но применяют интерференцион-
ную схему по Релею. При этом
используются все элементы опти-
ки Фильпота — Свенссона за
исключением наклонной диафраг-

мы. Щель источника света в этом случае устанавливается па-
раллельно оси цилиндрической линзы. Интерференционный ме-
тод требует применения специальной двухсекторной кюветы с
узкими щелями перед резервуарами. В один нз резервуаров по-
мещается раствор, в другой — растворитель. Интерференционная
схема регистрации схематически изображена на рис. 18.

Измерения производятся в монохроматическом свете, для
чего перед источником света (/) устанавливается светофильтр
(13). Через кювету (4) проходят два параллельных пучка све-
та от источника (/), которые формируются коллимирующей
линзой (2), параллельными щелями (5) и (5) кюветы (4) и дву-
мя неподвижными апертурными щелями (6). Параллельные пуч-
ки поворачиваются зеркалом (<?) и сводятся линзой (7) в плос-
кости шлирен-диафрагмы (9), образуя ‘Систему интерференцион-
ных полос. Эта система увеличивается объективом (10) и цилин-
дрической линзой (11), так что на снимке (12) получается ряд
полос одинаковой интенсивности. Полосы параллельны оси

Раствор	Граница	Растворитель

Рис. 19. Схематическое изображение интерференционной картины
седиментирующей границы

1—18 — номера полос

цилиндрической линзы при отсутствии градиента показателя
преломления раствора в кювете и искривлены в областях, где
градиент отличен от нуля. Смещение полосы относительно ли-
НИИ, для которой — = 0(оазовая линия), характеризует изме-
нение показателя преломления раствора. Приращение показате-
ля преломления на расстоянии х от оси вращения ротора опре-
деляется по числу полос, пересеченных продолжением базовой
линии до точки х (рис. 19), и равно

Мк

h

где к— длина волны монохроматического света (в см); 1г — путь
луча в кювете (в см); N— число полос, пересеченных продолже-
нием базовой линии до точки х.

Число полос в лучшем случае может быть отсчитано с точно-
стью до 0,04 полосы, что дает более высокую точность определе-
ния концентрации, чем метод Фильпота — Свенссона. Среди
других интерференционных схем заслуживает внимания приме-
ненный Цветковым [5] поляризационный интерферометр, значи-
тельно повышающий чувствительность метода.

Абсорбционный метод. Для коэффициентов седимен-
тации биополимеров, особенно нуклеиновых кислот, характерна
сильная концентрационная зависимость, что вызывает необходи-
мость проведения исследований при предельно низких концент-
Рис. 20. Седиментационная диаграмма, полученная с примене-
нием абсорбционной оптики в ультрафиолетовом свете для рас-
твора 0-лактоглобулина

а — фотография седиментирующей границы; б — результат фотометрирова-
ния снимка [27]

Цифры О--5 относятся к снимку и седнментох'рамме, полученным в разные
последовательные моменты седиментации.

рациях. Такое же требование возникает при работе с препара-
тами, недоступными в больших количествах. В этом случае при-
меняется абсорбционный метод, в котором для измерения кон-
центраций используется поглощение (абсорбция) света иссле-
дуемыми веществами в той или иной области спектра. Большин-
ство веществ биологического происхождения обладает полосами
поглощения в близкой ультрафиолетовой области. Поэтому
ультрацентрифуги с абсорбционной регистрацией оборудуются
кварцевой оптикой и источником ультрафиолетового излучения,
которым является ртутная лампа низкого давления. Хлор
бромиый светофильтр, помещенный перед лампой, отсекает
видимую часть спектра лампы и пропускает линии излуче-
ния лампы (248, 254 и 265 ммк). Абсорбционная оптика выде-
ляется в отдельный канал и состоит из коллимирующей и конден-
сорной линз и фотоаппарата. Поскольку оптическая плотность
растворенного вещества прямо пропорциональна его концентра-
ции, метод абсорбцив является самым прямым способом наблю-
дения за перераспределением вещества «и движением границ в
кювете при центрифугировании. Растворитель выбирают не-
поглощающим. Тогда на снимке области раствора и растворите-
ля отличаются различной степенью потемнения негатива
(рис. 20, а). При этом возможное перераспределение непоглоща-
ющих компонент растворителя на фотоснимках Никак не отра-
жается.

При выборе концентрации исследуемого вещества и време-
ни экспозиции необходимо, чтобы степень потемнения негатива
была пропорциональна концентрации вещества. Тогда для ее
определения достаточно произвести фотометрирование снимка
(см. рис. 20, б). Абсорбционный метод позволяет работать с ми-
нимальным количеством нуклеиновых кислот — до 0,01 мг!мл,
в то время как методы, описанные выше, требуют для измерений
не менее 0,5—1 мг/мл. Точность определения концентрации этим
методом относительно невелика. Это связано с многочисленны-
ми погрешностями фотографического процесса, а также с неста-
бильностью работы ртутной лампы,

В последнее время выпускаются приставки для прямой за-
писи кривых поглощения на самопишущем приборе при помощи
фотоумножителя, что значительно облегчает процесс обработки
данных [32]. Возможно также применение монохроматора, что
позволяет проводить эксперименты трн различных длинах волн
[33]. Это расширяет область применения метода, позволяя рабо-
тать с веществами, поглощающими в других областях спектра,
а также наблюдать за ходом седиментации отдельных компо-
нент сложных растворов.

б. Метод скорости седиментации

Метод скорости седиментации и его разновидности широко
применяются как для исследования свойств 'макромолекул в
растворе, так и для разделения веществ. Основной измеряемой
величиной в этом методе является коэффициент седиментации,
который зависит от формы макромолекулы в данном растворе и
от молекулярного веса.

Движение макромолекулы в центробежном поле происходит под
действием ряда сил. На нее действует; с одной стороны, центробеж-
ная сила	где У —объем молекулы; рлг — ее плотность;

со — угловая скорость ротора1; х — расстояние до осн вращения.
С другой стороны, на иее действует архимедова сила выталкивания
из раствора, которая равна 7рр<д2х, где рр — плотность растворителя.
Таким образом, результирующая этих двух сил равна У (рл;—рр)<о2х.

пп

о = —, где п — число оборотов ротора в мин.
В расчете на 1 моль эта сила равна NAV (р« — РР) где МА —
число Авогадро1.

В центробежном поле частицы движутся со скоростью

dx
dt ’

при

этом результирующая сила N AV (pAj — рр) «2 *х уравновешивается си-
лой поступательного трения f — , где f — молярный коэффициент
dt

трения:

ЛгдКрм(1-Крр)Л = ^,	(16а)

at

где V — удельный парциальный объем молекулы, равный обрат-
ной величине плотности молекулы.

Так как произведение Ад V Рм равно молекулярному весу Лф
получаем

M(l-VPp)(o2x = f	(166)

Для разбавленных растворов коэффициент трения f связан
с коэффициентом диффузии D соотношением Эйнштейна:

/ = —,	(17)

D

где R — газовая постоянная (8,314- 107——--), Т—абсолют-

моль • град

ная температура (в °К); D—коэффициент диффузии (в слД/сек).

Комбинируя выражения (17) и (166), получаем первую фор-
мулу Сведберга для определения молекулярного веса:

М(1--Крр)Л=-^ ~	(18)

или

dx 1

RT —----—

М =_____—____ ,	(19)

(l-Vpp)D (l-Vpp)D

где s— коэффициент седиментации. При выводе этой Формулы
не делалось никаких предположений о форме молекулы 2, поэ-
тому такой метод определения молекулярного веса является аб-
солютным наряду с методами светорассеяния и осмотического

1 В центробежном поле частица может не только осаждаться, но и дви-
гаться против поля, т. е. всплывать, если плотность растворителя больше плот-
ности молекулы.

2 В неявном виде зависимость коэффициента седиментации от формы вхо-

дит в коэффициент трения f или коэффициент диффузии D.
давления. Коэффициент диффузии D определяется независимым
способом; при некоторых условиях, однако, его можно опреде-
лить и из. седиментационного опыта.

 Рассмотрим последовательно все параметры, входящие в
уравнение (19).

Коэффициент седиментации, как уже указывалось (выраже-
ние (19)),— отношение скорости седиментирующей границы —
к центробежному ускорению ©2х:

s =-----------

<О3Л"

(20)

Это выражение может быть записано по-иному:

„	, ,	см г

Размерность коэффициента седиментации —• — или сек.

Единицей коэффициента седиментации является сведберг
(1 св = 1013 сек).

О—-

Рис. 21. Схема, объясняющая эффект радиаль-
ного разбавления

При-измерении коэффициента седиментации фиксируется по-
ложение седиментационной границы в определенные моменты
времени. Так 'как граница седиментирующего вещества имеет
конечную ширину, в качестве границы должна приниматься
точка, концентрация в которой составляет половину величины
концентрации на плато [26, 34]. Концентрация раствора ct в об-
ласти плато со временем уменьшается (см. рис. 20). Этот эф-
фект, носящий название радиального разбавления, связан с сек-
ториальной формой ячейки и линейным увеличением центробеж-
ного -поля с расстоянием.

Рассмотрим малый элемент объема dVi=hq>xdx (рис. 21), занятого раство-
ром (Л — постоянная толщина кюветы в направлении, перпендикулярном
плоскости чертежа) в момент времени t. В следующий момент t + dt молекулы’
займут другой объем — dVz, который по сравнению с начальным несколько
расширяется по радиусу за счет увеличения скорости молекул вследствие не-
однородности центробежного поля (см. уравнение (166)), а дуги этого эле-
мента также увеличатся за счет секториальной формы ячейки. Общее число
молекул полимера в слое, естественно, не изменяется. При этих условиях

/ X \ $

Ct = с0 I — ) = c0e-2“'sZ,
\xt J

'где ct — концентрация молекул полимера в момент времени t в области плато;
со — начальная концентрация; хм — расстояние мениска от оси вращения; xt —
расстояние границы седиментации от оси вращения.

Граница седиментации определяется положением слоя с концентрацией

Для экспериментального определения коэффициента седи-
ментации s строится график зависимости 1пх от времени. Коэф-
фициент седиментации, согласно уравнению (20а), равен отно-
шению тангенса угла наклона соответствующей прямой к со2.

Отступления от линейности наблюдаются в двух случаях: при
сильной зависимости коэффициента седиментации от концентра-
ции и тогда, когда растворитель ведет себя как сжимаемая жид-
кость. Первое выражается в увеличении коэффициента седимен-
тации со временем, так как в силу векториального разбавления
раствора концентрация, а следовательно, вязкость и коэффициент
трения f уменьшаются. Во втором случае эффект носит противо-
положный характер ввиду того, что со временем граница продви-
гается в область все большей плотности и все большей вязкости
растворителя. В обоих случаях для вычисления коэффициента
седиментации необходимо применять специальные экстраполя-
ционные приемы для приведения In х к нулевому моменту време-
ни [27]. Обычно при малых концентрациях зависимость In х от с
линейна и применение особых методов экстраполяции не
требуется.

При измерении молекулярного веса необходимо, чтобы все вели
чины, входящие в выражение (19), были измерены при одной и той
же температуре. Если, однако, коэффициент седиментации измерен
при некоторой температуре, отличной от температуры, при которой
определен, например, коэффициент диффузии D, то он может быть
приведен к этой температуре. Кроме того, так как коэффициент
седиментации (точнее, константа седиментации, см. ниже) является
характеристикой индивидуального вещества, необходимо приведение
этой величины к некоторым стандартным условиям с определенными
температурой, плотностью и вязкостью растворителя. В качестве
стандартных условий принимается температура 20°, а плотность и
вязкость растворителя — соответствующие этой температуре. Как
видно из уравнения (166), коэффициент седиментации s обратно про-
порционален коэффициенту трения f. Если изменения температуры
невелики, то коэффициент трения f пропорционален вязкости раство-
рителя т], которая в свою очередь обратно пропорциональна темпе-
ратуре растворителя. Таким образом, приведение к заданной темпе-
ратуре производится умножением s< на —, где индекс t относится
По

к условиям опыта, а индекс 0 — к заданным условиям. С другой
стороны, коэффициент седиментации s пропорционален (1—Vpp),
т. е. с увеличением температуры s увеличивается, так как умень-
шается плотность среды рр. Увеличение коэффициента седиментации
за счет плотности до некоторой степени компенсируется изменением
удельного парциального объема V, который увеличивается с темпе-
ратурой для большинства полимеров на 5-10“4 см3/г-град. Следова-
тельно, поправка на плотность вводится множителем -—2?Р|)- и
1 - Pt
приведенное значение коэффициента седиментации равно:

Ht 1 — VqPq

По 1 — Vt Pt '

(21)

Значения вязкости гр и т|о> плотности р0 и Р/ могут быть либо
взяты из таблиц, либо определяются опытным путем. Парциальный
объем V при заданной температуре определяется экспериментально,
а переход к стандартным условиям производится с учетом приведен-
ного выше коэффициента. Основной вклад в выражение (21) вносит
nt	„	,

сомножитель —, второй сомножитель в большинстве случаев значи-
ло
nt	,

тельно меньше —. и часто может быть заменен единицей.

Ло

При работе с водными буферными системами коэффициент
седиментации приводят к 20° и к вязкости воды аналогичным
способом:

$20, W

__„	1 ^20Р20

Ло 1— VtPt

Вследствие гидродинаМ'И.ческргоБзаимодействиямакромоле-
кул коэффициент седиментации зависит от концентрации седи-
ментирующего материала. Эта зависимость для различных ве-
ществ выражена в различной мере, и, следовательно, величинаф,
измеренная при какой-то одной концентрации, не может служить
однозначной характеристикой размеров и формы макромолекул.
Для исключения взаимодействия макромолекул коэффициент се-
диментации экстраполируют к бесконечному разбавлению. Полу-
ченное таким образом значение называется константой седимен-
тации__&Д, которая" характеризуёт индивидуальную молекулу.

В табл. 2 приведены значения констант седиментации и молеку-
лярных весов некоторых белков [35]. Часто пользуются так назы-
Таблица

Константы седиментации и молекулярный вес для некоторых белков [35]

Белок	Моле- куляр- ный Еес	Кон- станта седи- мента- ции, св	Белок	Моле- кул яр- ный вес	Кон- станта седи- мента- ции, св
Цитохром С	  Рибонуклеаза . . . . Лизоцим куриного яйца	  Лактальбумин . . . Миоглобин кашалота Белок вируса табачной мозаики	  Трипсиноген 	  Трипсин 	  Папаин 	  Карбангидраза . . . . Карбоксипептидаза . . Пепсин 	  Р-лактоглобулин . . . Пероксидаза	  Яичный альбумин . . Зеин 	  Пирофосфатаза . . . Сывороточный альбу- мин крупного рогатого скота 	  Сывороточный альбу- мин человека . . . . Енолаза	  Гемоглобин крупного рогатого скота . . .  Гемоглобин лошади  »	человека	12 400  13 700  14 100  17 400  17 600  17 500  23 700  23 800  27 000'  30 000  34 000  35 000  35 000  40 000  44 000  50 000  63 000-  67 000  65 000  64 000  67 000  68 000  68 000	2,5  1,64  1,9  1,9  2,04  4,0  2,5  - 2,5  2,4  2,8  3,1  3,3  3,2  3,5  3,6  1,9  4,4  4,4  4,3  5,6  4,6  4,6  4,5	Сывороточный альбу- мин лошади	  Дифтерийный токсин Тропомиозин . . . . Гексокиназа	. . . .  Г лицеральдегидфосфат- дегидрогеназа мышц кролика 	  3-амилаза картофеля Дифтерийный антиток- син 	  у-глобулин кролика Альдолаза из мышц кро- лика  у-глобул ин лошади --глобулин человека Фумараза	  Каталаза	  Фикоэритрин . . . . Фосфорилаза из мышц кролика 	  Фибриноген крупного рогатого скота . . . То же, человека . . . Миозин кролика . . . У реаза	  Тироглобулин свиньи Актомиозин кролика Гемоцианин из Helix pomatia 		70 000  72 000  93 000  96 600  122 000 152 000  160 000 160 000  180 000 180 000  185 000  204 000 240 000  290 000  360 000  330 000 450 000  470 000 480 000  630 000 5-10е  9-10е	4,5  4,6  2,55  3,1  7,0  8,9  7,0  7,0  8,27  6,9  7,4  8,5  11,0  12,0  13,7  7,9  9,0  6,1  18,6  19,2  35,0  103,0

ваемой характеристической константой седиментации [s], равной

[s]	= —- = Л2к_,	(22)

1-	V?p f

где М — молекулярный вес образца; f — молярный коэффициент
поступательного трения; ц0—вязкость растворителя.

Так как величина f пропорциональна вязкости т]о, то кон-
станта [s] от вязкости не зависит. Характеристическая константа
седиментации зависит только от формы и размеров частицы и
является величиной, удобной для исследования влияния внешних
условий на конформацию молекулы. Как указано выше, фор-
мула (19) справедлива при малых концентрациях исследуемого
вещества, т. е. когда s~s° и	где D° — предельное значе-

ние коэффициента диффузии, получаемое при экстраполяции D
к нулевой концентрации исследуемого вещества.

Коэффициент диффузии, входящий в выражения (17) и (19),
содержит в неявном виде информацию о форме молекул иссле-
дуемого вещества. Уже само по себе изучение диффузии в комби-
нации с другими гидродинамическими данными является мето-
дом исследования размеров и формы частиц 15]. Явление диффу-
зии заключается в переходе растворенного вещества из области
с высокой концентрацией в область с более низкой концентра-
цией. При этом, согласно первому закону Фика, количество ве-
щества, прошедшего за единицу времени через площадку единич-
ного сечения, перпендикулярную к направлению распростране-
ния вещества, пропорционально градиенту концентрации в этом
направлении. Коэффициент пропорциональности носит название
коэффициента диффузии:

г?/»

L=—D—,	(23)

dx	' ’

где L — поток вещества за единицу времени через площадку
1 см2; ---- градиент концентрации; D — коэффициент диффузии.

Размерность коэффициента диффузии — см21сек. Отрицатель-
ный знак в выражении (23) указывает на то, что диффузия
идет в сторону уменьшающейся концентрации. Пользуясь пер-
вым законом Фика, можно определить величину коэффициента
диффузии. Чаще для определения D используют уравнение диф-
фузии:

д:   д Ср дс

Щ	дх \ дх

Величину D находят, решая это уравнение для конкретных
условий опыта.

Измерение коэффициента диффузии производится на специ-
альных приборах по скорости размывания искусственно создан-
ной резкой границы между раствором исследуемого вещества и
чистым растворителем (подробнее см. 15]). Возможно также опре-
деление коэффициента диффузии и из ширины границы седимен-
тации. При этом в любом случае требуется высокая степень го-
могенности исследуемого вещества.

Если коэффициент диффузии необходимо привести к стан-
дартным условиям, то, учитывая выражение (17), аналогично

’7 Физические методы исследования белков	257
выводу уравнения (21) можно получить выражение для приве-
денного коэффициента диффузии:

273+ /0

273+ t

Ло

где индекс t относится к условиям опыта, а индекс 0 — к стан-
дартным условиям; t— температура, в °C.

Для измерения молекулярных весов необходимо определение
величины (1 — Vpp) в выражении (19). Значение парциального
удельного объема V для белков лежит между 0,70—0,75 мл!г,
а плотность растворителя (водный буферный раствор) близка к
единице. Таким образом, точность определения молекулярного
веса в значительной мере зависит от точности определения пар-
циального удельного объема V. Стандартный метод определения
V заключается в измерении пикнометрическим способом (взве-
шивание фиксированных объемов растворителя и раствора)
плотности растворителя рр и плотности раствора р с концентра-
цией растворенного вещества, равной с г/мл. Удельный пар-
циальный объем определяется из выражения:

У = —	1

Рр с\ Рр /'

Для белка или полипептида, аминокислотный состав которых
известен, парциальный объем может быть вычислен на основании
парциальных объемов аминокислот 136, 37].

Для некоторых веществ выражение (19), при помощи кото-
рого определяются молекулярные веса белков и синтетических
полимеров, не может быть использовано для этой цели ввиду не-
возможности определения коэффициента диффузии (вещество
нестабильно и разлагается за время диффузионного опыта или
имеет очень малый коэффициент диффузии). К таким веществам
относятся нуклеиновые кислоты. В этом случае молекулярный
вес можно определить по формуле Манделькерна — Флори:

.3(1 — vpp) .

где [г|] — характеристическая вязкость; s° — константа седимента-
ции; Mw —средневесовой молекулярный вес; Na—число Авогад-
ро; т|о — вязкость растворителя; рр—плотность растворителя;
р— параметр, определяющий степень доступности объема, заня-
того макромолекулой, для молекул растворителя.

Таким образом, применение этой формулы требует определе-
ния трех основных величин: характеристической вязкости [т|],
константы седиментации s° и параметра р, который может также
зависеть от молекулярного веса. Для большого класса линейных
цепных макромолекул параметр р постоянен в широком диапазо-
не молекулярных весов и в среднем близок к величине 2,5 • 106.
В настоящее время накоплен и "обобщен большой материал для
установления зависимости характеристической вязкости [г|] и кон-
станты седиментации s° от молекулярного веса ДНК различного
происхождения [8]. Молекулярный вес ДНК определялся либо мето-
дом светорассеяния (до Л4=3-106), либо (для более высоких Л4)-ауто-
радио графи чески при помощи электронного микроскопа. На рис.
22 приведена зависимость от средневесового молекулярного
веса Mw при концентрации NaCl в растворе от 1 до 0,1 М

(см. также рис. 10.) Используя общую зависимость s^^,1 нативной
ДНК от молекулярного веса (рис. 22), можно оценить молекулярный
вес исследуемой ДНК непосредственно из кривой. Кроме того, возмож-
но использование эмпирических выражений, полученных из этой кривой:
s-2o ,w = 0,116Л40,325 (для молекулярного веса от 0,3 до 3 млн.);

S2o, w = 0,034Л10’405 (для молекулярного веса свыше 3 млн.).

Коэффициент р, определенный по данным, приведенным на рис. 10
и 22 (М, [ц] и «2о,а>) и из выражения (24), слабо зависит от моле-
кулярного веса, совпадает с теоретически вычисленной зависимостью
для полужесткой щепной молекулы и лежит в интервале значений
'от 2,70-10® до 2,2; 106 при среднем значении 2,5-106.

1 Константа седиментации w :,!Ожет быть заменена коэффициентом се-
диментации s, если он определен при концентрации раствора не более

2 • 10~2 мг]мл ДНК. Отличие от константы седиментации составляет в этом
случае не более нескольких процентов.
Аналогичный подход возможен для определения молекуляр-
ного веса денатурированной ДНК, РНК и синтетических поли-
нуклеотидов.

в. Определение степени полидисперсности

Из седиментационных диаграмм можно получить сведения
чистоте препарата и его полидисперсности. Наличие нескольких
границ свидетельствует о полидисперсности анализируемого рас-
твора. При наличии примесей с близкими седиментационными
свойствами граница единственна, но асимметрична (см. рис. 16).
Полный анализ формы и ширины границы седиментации может
дать сведения о форме распределения молекул полидисперсного
препарата.по молекулярным весам.

Расширение границы гомогенного препарата обусловлено
только диффузией. Форма границы описывается сложным анали-
тическим выражением 127], которое, однако, упрощается при
условии w2s/<g;l. Это дает возможность получить простое выра-
жение для так называемого «кажущегося» коэффициента диф-
фузии:

ааж =	(4-V1-	(25>

4л/ I de I
\ dx /

где ct — концентрация исследуемого вещества в области плато;
de

— —максимальная величина градиента концентрации в пере-
dx

ходной зоне (граница седиментации); t — время, в сек; ю — угло-
вая скорость, в сек-1, s — коэффициент седиментации1.

Прямое указание на наличие полидисперсности образца мож-
но получить, сравнивая «кажущийся» коэффициент диффузии,
вычисленный из результатов седиментационного опыта, с истин-
ным коэффициентом диффузии. Совпадение этих величин свиде-
тельствует об отсутствии полидисперсности. В противном случае
величина «кажущегося» коэффициента диффузии будет больше
истинного. При этом из-за различной скорости седиментации мо-
лекул с разными молекулярными весами происходит расширение
границы. В случае сильной концентрационной зависимости коэф-

1 При определении Окаж желательно применять двухсекторпую ячейку для

повышения точности

de

определения ct и — .

При использовании оптики Филь-

пота — Свенссона величина

de

— пропорциональна максимальной ординате диа-
dx

граммы седиментации, а с — площади, ограниченной базовой линией и гради-
ентной кривой. Коэффициентами пропорциональности являются факторы уве-
личения оптической системы (см. стр. 247).
фициента седиментации наблюдается, напротив, сужение гра-
ницы, обусловленное тем, что в переходной области с уменьше-
нием концентрации и вязкости раствора происходит увеличение
скорости седиментации отставших молекул. При исследовании
границы концентрация анализируемого вещества в растворе
должна быть достаточна мала, чтобы этим можно было прене-
бречь. Исследование формы границы в общем случае весьма
сложно, поэтому ограничимся описанием одного из методов
оценки полидисперсности. Предположим, что с0 — весовая кон-
центрация вещества в растворе и что часть вещества dcQ обла-
дает коэффициентом седиментации, лежащим в пределах от s до
s + ds. Тогда функция g(s) распределения вещества по коэффи-
циентам седиментации может быть найдена из опыта при по-
мощи следующего выражения:

de

g(s) = — ^ = — ( — ГхюЧ	(26)

с0 ds с0 V хм )

de

где ——весовая доля вещества, обладающего коэффициентом
Со

седиментации, лежащим в пределе от s до s + ds, равная g(s)ds\
х — расстояние от оси вращения до заданной точки на седимен-
тационной кривой; хм — расстояние от оси вращения до мениска.

В формулу (26) входят величины, которые определяются из
седиментационной диаграммы, но это выражение справедливо
при отсутствии диффузии (или для вещества с очень малым ко-
эффициентом диффузии). В том случае, когда расширение грани-
цы происходит как за счет диффузии, так и за счет полидисперс-
ности, величину g(s) определяют для ряда моментов времени
после начала седиментации. Расширение границы за счет поли-
дисперсности прямо пропорционально длительности опыта t, так
как каждая фракция движется со своей постоянной скоростью
(20), вызывая размытие границы. Напротив, размытие границы
за счет диффузии пропорционально Уt. т. е. через достаточно
большое время седиментации расширение границы вызвано
в основном полидисперсностью, и, следовательно, экстраполяция
функции g(s) к этому моменту времени исключает влияние
диффузии. Полученное таким образом значение g(s) является
функцией распределения образца по коэффициентам седимента-
ции. Показано [38], что при условии w2s^<l для получения такого
распределения необходима экстраполяция g(s) к нулевому зна-

1

чению величины ____, где х — положение границы седиментации.

x2t

На рис. 23 представлены данные Шумейкера и Шахмана [39]
для распределений по коэффициентам седиментации g(s), полу-
ченных в различные моменты времени после начала седимента-
ции (ДНК тимуса теленка). Полученные распределения совпа-
261
Рис. 23. Распределение по коэффи-
циентам седиментации ДНК тимуса
теленка. Концентрация ДНК 40 мг]мл
[39]

дают, что указывает на отсут-
ствие вклада диффузии в рас-
ширение границы, которое, сле-
довательно, связано только с
полидисперсностью образца.

г.	Седиментация в градиенте
плотности

В последнее время широкое
распространение получил ме-
тод седиментации в градиенте
плотности [40]. Этим методом
производятся очистка, выделе-
ние биополимеров и разделе-
ние компонент смеси биополи-
меров. Центрифугирование вы-
полняется обычно с помощью.

препаративных ультрацентри-'
фуг в роторах с откидными стаканами. При этом осаждение мо-
лекул происходит в заранее созданном устойчивом градиенте
плотности инертной среды; чаще всего для этой цели используют
раствор сахарозы, обладающий значительной вязкостью. В даль-
нейшем под градиентом плотности мы будем подразумевать
именно градиент плотности сахарозы, который создается измене-
нием концентрации сахарозы по высоте пробирки, с наибольшей
концентрацией у дна пробирки. Такое распределение концентра-
ции обеспечивает устойчивость градиента плотности, а следова-

тельно, и вязкости, вследствие чего граница седиментации также
является устойчивой. После окончания центрифугирования и
при манипуляциях с пробиркой при анализе полученная граница

не искажается.

Распределение концентрации по высоте пробирки, как прави-
ло, линейно, но может быть и экспоненциальным, S-образным.
Формирование градиента в пробирке производится специальным
устройством, схема которого приведена на рис. 24. Устройство
состоит из двух шприцев, соединенных общей выводной трубкой.
Один из шприцев заполняется концентрированным раствором
сахарозы в соответствующем буферном растворителе, другой —
чистым растворителем. Перемешивание растворов происходит в
выводной трубке. При постоянной скорости движения поршней
концентрация сахарозы в растворе, вытекающем из устройства,
изменяется линейно со временем. Соответственно в пробирке^
образуется линейное распределение плотности сахарозы по высо-
те пробирки. Для получения других форм распределения плотно-
сти по высоте скорости движения поршней изменяются по любому
заданному закону при помощи кулачков различной формы. Усло-
вия седиментации в градиенте плотности отличны от описанных
выше.^При седиментации в градиенте плотности раствор, содер-
жащий смесь исследуемых макромолекул, осторожно наслаивает-
ся на мениск раствора сахарозы и молекулы седиментируют из
верхнего слоя в раствор сахарозы, так что со временем наступает
полное разделение седиментирующих компонент (рис. 25).

Рис. 24. Схематическое изобра-
жение устройства для создания
градиента сахарозы

Рис. 25. Разделение веществ при седимен-
тации в градиенте плотности

а — начало опыта (смесь двух веществ наслоена
на мениск раствора сахарозы); б — частичное раз-
деление веществ спустя некоторое время; в —мо-
мент времени, соответствующий разделению ве-
ществ на зоны

При разделении веществ обычным способом, без градиента
плотности и наслоения, возможно соосаждение компонент, имею-
щих различную скорость седиментации. Так, в роторе, дно про-
бирки которого отстоит от оси вращения приблизительно на
двойном расстоянии по сравнению с мениском раствора, быстро
осевшие компоненты будут иметь в виде примеси около 40%
вещества, седиментирующего втрое медленнее, и около 13% ве-
щества, имеющего в 10 раз меньшую скорость седиментации [41],
в то время как в градиенте плотности достигается полное разде-
ление. Кроме обычных факторов разделения, действующих при
седиментации,— молекулярного веса компоненты и формы моле-
кулы, в условиях градиента плотности при разделении играет
роль также плотность молекул. Это означает, что компонента с
плотностью, близкой или равной плотности раствора сахарозы,
будет двигаться'медленнее или вообще не будет седиментировать
в отличие от молекул такого же молекулярного веса и формы, но
с большей плотностью. Ченгом и Шахманом [42] показано, что
если средняя разность между плотностью частиц и плотностью
растворителя составляет 0,052 г/мл, то различие в плотностях
частиц на 0,01% изменяет скорость седиментации также только
на 0,01%. Если средняя разница между плотностью растворителя
и плотностью молекул составляет 0,001 г/мл, а разница в плотно-
стях молекул по-прежнему равна 0,01%, то скорости седимента-
ции отличаются уже на 10%.

После разделения седиментирующего материала на зоны
(см. рис. 25, в) центрифугирование прекращают и содержимое
пробирки фракционируют, либо разрезая ее специальным устрой-
ством на слои, либо сливая по каплям, через дно пробирки, про-
колотое иглой шприца (наличие градиента на объем капель прак-
тически не влияет). Последующий анализ радиоактивности фрак-
ций, оптической плотности или ферментативной активности дает
возможность установить распределение зон по высоте пробирки,
и так как путь, пройденный частицей в линейном градиенте плот-
ности, пропорционален времени центрифугирования, то можно
также определить коэффициент седиментации с точностью ~3%
[40, 43]. Соответствующий расчет несложен, но громоздок, тре-
бует графического интегрирования и поэтому здесь не приводит-
ся. Однако заметим, что если в исследуемом растворе имеется
одна компонента с известным коэффициентом седиментации, то
его можно определить и для других компонент, пользуясь соот-
ношением

Li _ S20,

$20, W2

где Li — путь, пройденный частицей с неизвестным коэффициен-
том седиментации	— то же, для частицы с известным

коэффициентом седиментации х2о,ш2.

Аналогично можно оценить молекулярный вес частиц с близ-
кой конфигурацией:

S20, Wi   / Mi
$20, W2	\ ^2

в соответствии с выражением (24).

Метод седиментации в градиенте плотности широко распро-
странен в практике биохимических исследований ввиду его хоро-
шей разделяющей способности. Он позволяет разделять нуклеи-
новые кислоты, фракционировать белки, а также некоторые суб-
клеточные структуры.

д.	Метод седиментационного равновесия и приближения
к седиментационному равновесию

Предыдущее рассмотрение процессов седиментации относи-
лось к центробежным полям, которые были столь велики, что вы-
зывали седиментацию и разделение молекул, нарушаемые диф-
фузией лишь в относительно небольшой степени. При меньших
значениях центробежного поля, когда перенос вещества под дею
264
ствием центробежного ускорения сравним с диффузионным по-
током вещества, происходит перераспределение концентрации
по кювете, характер которого зависит от молекулярного веса
исследуемого вещества. При достаточно длительном центрифуги-
ровании устанавливается равенство седиментационного и диф-
фузного потоков, направленных навстречу друг другу (седимента-

Рис. 26. К выводу уравнения седиментационного
равновесия

цнонное равновесие). Такое равновесное распределение концент-
рации по кювете позволяет определить молекулярный вес об-
разца [26, 27].

Метод седиментационного равновесия широко применяется
для изучения белков, полипептидов и веществ с большими
коэффициентами диффузии. Для биополимеров с малым коэф-
фициентом диффузии, например для нативной высокополимерной
ДНК, этот метод непригоден из-за очень большого времени уста-
новления равновесия.

Для вывода уравнения, описывающего равновесное распреде-
ление вещества по кювете, воспользуемся схематическим изобра-
жением кювета (рис. 26), имеющей высоту h и уголь сектора Ф,
вращающейся с угловой скоростью со. Поток вещества за единицу
времени через любое сечение кюветы, расположенное на рас-
стоянии х от оси вращения и имеющее, следовательно, пло-
щадь хФЛ, равняется:

xh— = cOx2/isco2,
dt	dt

dx
где s — константа седиментации; — •—скорость седиментации
dt

вещества; с — концентрация.

С другой стороны, встречный диффузионный поток в соответ-
ствии с первым законом Фика (23) равен

dm гл	г!

—^ = —Фх/iD —.

dt	dx
Исходя из условия седиментационного равновесия

находим

s _	11 de

D оАг с dx

(28)

Исключая из выражения (28) величину при помощи урав-
нения (19), получаем второе уравнение Сведберга:

RT '	_ dc_

(l-VpD) с dx '
Г*

(29)

которое также дает абсолютный способ

определения молекуляр-

ного веса.

Рис. 27. Распределение концентрации с (А) и производной концен-
трации dc/dx (Б) в кювете при седиментационном равновесии

На рис. 27 приведено характерное распределение концентра-
ции исследуемого вещества. Кривые 1—4 соответствуют началь-
ным стадиям установления равновесия, кривая 5 — установивше-
муся равновесию.

Как уже указывалось, единственным недостатком этого ме-
тода является большое время установления равновесия, дости-
гающее иногда нескольких суток.

Это время можно значительно сократить уменьшением высо-
ты слоя в кювете до 1—2 мм, используя ячейки специальной
конструкции [44]. При этом время установления седиментацион-
ного равновесия белков и полипептидов уменьшается до несколь-
ких десятков минут.

Метод седиментационного равновесия позволяет также судить
о полидисперсности исследуемого вещества [5], но на этом оста-
навливаться здесь не будем.
В настоящее время для определения молекулярных весов
гораздо чаще применяется метод приближения к равновесию, или
метод Арчибальда [28]. Этот метод для проведения опыта требует
существенно меньше времени, достаточно точен, требует малого
количества вещества и также позволяет оценить степень гомо-
генности препарата. Исследуя условия движения вещества в
центробежном поле, Арчибальд воспользовался следующим гра-
ничным условием для раствора в кювете: поток вещества через
мениск и дно ячейки равны нулю. Это условие выполняется неза-
висимо от того, достигнуто или нет равновесное распределение.
Следовательно, согласно уравнению (28), имеем

1

1

сд

(30)

Индекс м относится к условиям у мениска, индекс д — к усло-
виям у дна.

Аналогично выводу уравнения (29), также используя выра-
жение (19), получаем для мениска и дна соответственно

(31а)

(ЗЮ)

Если вещество гомогенно, то Мм = Mg", неравенство этих вели-
чин свидетельствует о наличии полидисперсности образца. На
рис. 28 приведено распределение концентрации и градиента концен-
трации в кювете в начальных стадиях установления равновесия.

Если в качестве регистрирующей системы применяется оптика
_	de

Фильпота — Свенссона, производную — можно определить непосред?
dx

ственно из снимка. Она равна ординате у дна и мениска, отсчиты-
dc

ваемой от продолжения базовой линии, где — = 0. Концентрация в
dx

этих точках определяется графически из седиментационной диаграммы
по формулам

х

1

C(j — Cq
хд

Хд

X2

dx.
Здесь X — координата точки, где — = 0; хм и Хд — координаты
dx

мениска и дна (соответственно).

Начальная концентрация может быть легко определена из
параллельного опыта с искусственной границей. Для этого на
исследуемый раствор наслаивается растворитель. Спустя некото-
рое время регистрируют размытую границу между раствором и

растворителем (рис. 29),
изображенную на седимен-
тационной диаграмме в виде
пика, площадь которого с

Расстояние от оси вращения
ротора

Рис. 29. Схематическое изображение
производной концентрации и концентра-
ции раствора при наслоении раствори-
теля на раствор в ячейке для получе-
ния искусственной границы

Рис. 28. Распределение градиента
концентрации и концентрации . в
кювете во время приближения к
равновесию (метод Арчибальда)4

учетом коэффициентов увеличения оптической системы равна
начальной концентрации с0. Определение начальной концентра-
ции должно выполняться в тех же условиях, при которых произ-
водится опыт для нахождения распределения концентрации.
Расчет требует графического интегрирования [45].

Имеются модификации метода Арчибальда [46, 47], в частно-
сти вариант, предложенный Эренбергом, упрощающий процедуру
расчета, [47]. В этом случае определяется величина s/D согласно
уравнению

de
dx

й*хм ^(AS-A)K ’

/ de \

где — | — ордината градиентной кривой на линии мениска; хм —
\dxJM

расстояние от оси вращения ротора до линии мениска; К—величина,
обратная фактору увеличения системы по оси х; As— площадь пика
на снимке, полученном в ячейке с искусственной границей; Л—пло-
щадь, ограниченная линией мениска, базовой линией и градиент-
ной кривой в опыте приближения к седиментационному равнове-
сию.

Величина так же, как и в методе Арчибальда, определяется
из независимого опыта с искусственной границей. Молекулярный вес
определяют, комбинируя уравнение (19) и выражение (32). Метод
Арчибальда и его модификации в настоящее время широко применя-
ются в практике определения молекулярных весов белков и синтети-
ческих полипептидов. Несмотря на меньшую точность определения
молекулярного веса по сравнению с методом седиментационного
равновесия, метод Арчибальда привлекателен быстротой проведения
опыта, что является существенным при работе с быстро деградирую-
щими препаратами.

е.	Равновесная седиментация в установившемся
градиенте плотности

При длительном ультрацентрифугировании концентрированных
солевых растворов в кювете устанавливается стационарное распреде-
ление плотности, которое характеризуется градиентом —где рр —
dx
плотность растворителя в данной точке кюветы, находящейся на
расстоянии х от оси вращения ротора. Возникновение градиента обус-
ловлено перераспределением концентрации соли при ультрацентрифу-
гировании. Величина установившегося перепада плотности в данной
точке кюветы относительно мениска раствора или дна кюветы зави-
сит от состава растворителя, температуры, угловой скорости и рас-
стояния от оси вращения.

Если макромолекулы исследуемого вещества находятся в таком
концентрированном солевом растворе, то в соответствии с* выраже-
нием (19) они имеют коэффициент седиментации s~(l—Урр). Это
означает, что в тех областях кюветы, где 1, вещество седи-
ментирует; в области, где Урр^> 1, вещество движется против центро-
бежного поля (коэффициент седиментации имеет отрицательный знак).
В результате вещество, локализуется в той области кюветы, где
плотность раствора равна плотности макромолекулы У =	.

\ Рм /

Таким образом, если в концентрированном солевом растворе в началь-
ный момент времени растворенное вещество было распределено по
объему равномерно, то с установлением градиента плотности веще-
ство после достижения равновесия сосредоточивается в узкой полосе,
плотность в которой равна плотности исследуемой макромолекулы
(рис. 30).
Гомогенное вещество при этом локализуется в полосе опре-
деленной ширины, что обусловлено тепловым движением макро-
молекул (броуновское движение). Полидисперсность по молеку-
лярному весу вызывает дополнительное симметричное расшире-
ние полосы, полидисперсность по плотности вызывает обычно
асимметричное расширение полосы, как это показано на рис. 31
для ДНК тимуса теленка.

Расстояние от оси вращения,

Рис. 30. Распределение плотности
CsCl и концентрации ДНК до начала
опыта (а) и после установления гра-
диента плотности (б)

Расстояние от оси вращения

Рис. 31. Распределение концен-
трации ДНК тимуса теленка
в CsCl после достижения рав-
новесия. Асимметричность по-
лосы свидетельствует о поли-
дисперсности плотности

Распределение концентрации гомогенного вещества в зоне
его локализации является гауссовым и имеет вид:

____X8

с = сое 202

(33)

где х — расстояние от любой точки полосы до ее центра; о — дис-
персия гауссова распределения, характеризующая ширину
полосы, Со—-концентрация вещества в центре полосы.

Распределение концентрации в полосе при равновесной седи-
ментации в градиенте плотности можно исследовать как в анали-
тической, так и в препаративной ультрацентрифуге. В последнем
случае используются роторы с откидными стаканами. После до-
стижения равновесия содержимое пробирок анализируется ана-
логично тому, как это делается в опытах с градиентом сахарозы
(см. соответствующий раздел). Время установления равновесия
как в аналитическом, так и в препаративном опыте может быть
оценено из соотношения:

t In- +1,26) L>a,

D \ D J
где D — коэффициент диффузии исследуемого вещества; L —вы-
сота слбя в кювете или пробирке по радиусу ротора; о — ширина
гауссового распределения.

Обычно время достижения полного равновесия составляет от
12 до 60—70 час.

В аналитических ультрацентрифугах регистрация результатов
ведется как методом поглощения света, так и методом Фильпо-
та— Свенссона. Первый метод применяется для малых концент-
раций веществ, поглощающих в ультрафиолетовой области.
Здесь необходимо подчеркнуть, что в этом случае следует
работать с выдержками, обеспечивающими линейную зависи-
мость почернения пленки от концентрации. Для правильного
выбора концентрации вещества в полосе можно воспользоваться
следующим соотношением между начальной концентрацией cQ
полимера в растворе и конечной концентрацией ск в полосе:

с0 = _Д1. £Ск=0,40-

/2л	°

с

(в частности, при сг=0,02 см — =24).

Если в опыте используется абсорбционный метод, оптика
Фильпота — Свенссона служит для регистрации градиента плот-
ности раствора. Этот метод может применяться и для самостоя-
тельного изучения вещества в градиенте плотности.

В методе Фильпота — Свенссона для повышения точности
применяется двухсекторная кювета. Выбор начальной концентра-
ции исследуемого вещества может быть произведен по формуле

de	0,40 LcK

--- = ------------ *

d*]	УТ а2

На рис. 32 и 33 приведены примеры измерений, выполненных
методом поглощения в ультрафиолете и методом Фильпота —
Свенссона.

Месельсон, Шталь и Виноград [50], впервые предложившие
метод установившегося градиента плотности, показали, что для
гомогенного вещества ширина полосы связана с молекулярным
весом соотношением.

а2 =------,	(34)

/ dp \

М ( — ) cd2jt

\ dx J

где R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура; ро—-
dp

плотность растворителя в центре полосы; у-_____градиент плот-

ности; х — расстояние от оси вращения до центра полосы;
Рис. 32. Распределение ДНК Streptotnyces viridochro-
mogenes и ДНК легкого мыши в градиенте плот-
ности CsCl. Полоса 1 соответствует ДНК Streptomy-
ces uiridochrotnogenes. р=1,729 г!см5, полосы 2 и
и 3 — ДНК легкого мыши р =1,701 и 1,690 г]см? [48]

Рис. 33. Распределение растворимого кол-
лагена в градиенте плотности CsBr. Кон-
центрация коллагена 0,3 мг!мл. Фотогра-
фия получена при помощи метода Филь-
пота— Свенссона [49]
w — угловая скорость; М— молекулярный вес; о — дисперсия
гауссова распределения, для гомогенного вещества.

• Для нахождения дисперсии сг необходимо экспериментально опре-

делить распределение концентрации вещества в полосе и построить
график: — 1п ~ .v-j-hi т. е. зависимость 1пс от х2 (33).

Для гомогенного вещества эта зависимость линейна и о определяет-
1 тт

ся по тангенсу угла наклона, равному —. Наличие полидисперсно-

сти по молекулярному весу вызывает искривление этой прямой, обра-
щенное выпуклостью вверх. Выпуклость вниз указывает на наличие
полиднсперсности плотности. Прн наличии полиднсперсности только
по молекулярному весу формула (34) дает так называемый средне-
численный молекулярный вес Мп (см. примечание, стр. 231). Нали-
чие полиднсперсности по плотности весьма усложняет задачу, так
как в этом случае дисперсия гауссова распределения состоит из двух
независимых членов, требующих их раздельного определения:

о = Ор.	(35)

Здесь Ор — дисперсия, вызванная тепловым движением (т. е. диф-
фузией) макромолекул; сгр — дисперсия, обусловленная полндиспер-
сиостью плотности.

Только в некоторых частных случаях, когда возможно неза-
висимым способом вычислить среднечнсленный молекулярный
вес, а затем, пользуясь формулой (34), вычислить от, дисперсию
(7Р определяют из выражения (35). Возможность применения
такого способа оценки полиднсперсности плотности была пока-
зана Суеока [51] для ДНК тимуса теленка. Таким образом, к
оценке молекулярного веса методом седиментационного равнове-
сия в установившемся градиенте плотности необходимо подхо-
дить осторожно. Основной величиной, определяемой этим мето-
дом, является плотность исследуемой частицы, которая вычис-
ляется с точностью до 0,001 г/см*. Плотности макромолекул ле-
жат в широком интервале значений: от ~1,3 г/мл (для белков),
до —1,7 г/мл (для ДНК); РНК при плотности 1,9 г/мл еще седи-
ментирует. При надлежащем выборе растворителя этот метод
позволяет исследовать обширный класс веществ. Если в градиен-
те ‘плотности находится несколько образцов макромолекул, то
достаточно хорошее разрешение полос получается уже прн раз-
ности плотностей макромолекул порядка нескольких сотых г/см3.
Описанный метод дает возможность получать уникальную ин-
формацию о зависимости плотности от химического состава мо-
лекулы [50], о механизме репликации ДНК и переносе генетиче-
ской информации [53, 54], о процессах денатурации и ренатура-
ции ДНК [55, 56]. Метод применим также для исследования
белков [49, 57] и синтетических полимеров [58]. Наиболее полную
информацию о применениях Метода равновесного градиента
плотности читатель может найти в обзоре Винограда и Хирс-
та [29].

3. Двойное лучепреломление в потоке

Метод двойного лучепреломления (ДЛП) в потоке сочетает
в себе оптический и гидродинамический подход к изучению строе-
ния макромолекул. В комбинации с другими методами, прежде
всего с вискозиметрией, метод ДЛП в потоке широко характери-
зует исследуемые молекулы, позволяя определить разность глав-
ных поляризуемостей молекул, коэффициент вращательной диф-
фузии, жесткость молекулы и другие параметры.

С явлением двойного лучепреломления мы сталкиваемся, изу-
чая тела анизотропные, т. е. такие тела, свойства которых (и в
частности, скорость распространения света) зависят от направ-
ления приложенного воздействия. Таковы, например, почти все
кристаллы, волокнистые и слоистые структуры, такие, как асбест,
слюда.

Анизотропия может быть создана и в телах изотропных, свой-
ства которых одинаковы во всех направлениях. Так, анизотропия
обнаруживается в упруго деформированных телах, в растянутых
полимерных пленках, в некоторых жидкостях при их течении.

Оптически анизотропная среда 1 характеризуется избранным
направлением, называемым оптической осью, по которому поля-
ризованный свет распространяется в среде со скоростью и ц, от-
личной от скорости распространения Уд света, поляризованного
перпендикулярно этому направлению. Свет с любым другим на-
правлением поляризации, проходя сквозь оптически анизотроп-
ную среду, становится эллиптически поляризованным.

Двум различным скоростям v ц и 1»д отвечают соответственно
два разных коэффициента преломления — Пц и пд. Оптически
анизотропная среда, следовательно, является двулучепредом-
ляющей. Рассмотрим механизм возникновения оптической ани-
зотропии.

а.	Механизм ДЛП

Молекулы вещества, сквозь которое проходит световая волна,
способны электрически поляризоваться в поле, создаваемом вол-
ной. Дипольный момент р данной молекулы, возникший под дей-
ствием возбуждающего электрического поля Е, связан с ним
соотношением

р = ХЕ.

1 Здесь и в дальнейшем речь будет идти об одноосных анизотропных
средах.
Здесь-у— поляризуемость молекулы в направлении поля. В ре-
зультате поляризации молекул возникает вторичное электромаг-
нитное поле, так что суммарная электромагнитная волна, рас-
пространяющаяся в данной среде, отлична от падающей волны.
Это выражается прежде всего в изменении скорости распростра-
нения и в преломлении света.

Из молекулярной оптики известно (см., например, [59]), что
коэффициент преломления п связан с поляризуемостью у моле-
кул соотношением

и2 = 1—4aNy,	(36)

где N — число молекул в единице объема.

Молекулы могут обладать разной поляризуемостью в различ-
ных направлениях. Пусть, например, поляризуемость молекулы
равна у || для некоторого направления (назовем его оптической
осью молекулы) йух для любого направления, перпендикулярно-
го оптической оси. Предположим также, что молекулы одинако-
во ориентированы. Пусть свет падает перпендикулярно оптиче-
ским осям молекул. Тогда для компонентов световой волны, поля-
ризованных соответственно параллельно и перпендикулярно оп-
тическим осям, коэффициенты преломления будут различны:

п} =1—4aNy у,	(36а)

nj_=l—4лМт_1_.	(366)

Таким образом, анизотропия поляризуемости молекул приводит
к двойному лучепреломлению. Оптическая ось анизотропной
среды параллельна оптическим осям ориентированных молекул.

Предположим, что падающий свет линейно поляризован и на-
правление его поляризации не совпадает с направлением опти-
ческой оси среды. Разложим этот свет на составляющие, поляри-
зованные параллельно и перпендикулярно оптической оси среды.
Колебания электрических векторов этих составляющих до про-
никновения в анизотропную среду синфазны. В среде, вследствие
различия в скоростях распространения этих компонентов падаю-
щего света, синфазность нарушается, и свет становится эллипти-
чески поляризованным.

Образовавшуюся разность фаз можно компенсировать, на-
пример, помещая на пути света, выходящего из данного анизо-
тропного слоя, другой оптически анизотропный слой с осью, пер-
пендикулярной к оси первой среды. Тогда компоненты света с по-
ляризацией вдоль и поперек оптической оси, попадая во второй
анизотропный слой, меняются ролями и при соответствующем вы-
боре толщины компенсирующего слоя суммарный сдвиг фаз
после прохождения сквозь обе среды становится равным 0. Для
этой цели в оптике применяются специальные компенсаторы раз-
личных конструкций. На рис. 34 изображена принципиальная
оптическая схема определения ориентации оптической оси и раз-
ности фаз, возникающих в анизотропной среде. Ориентация опти-
ческой оси исследуемой среды определяется при помощи скре-
щенных поляризатора П и анализатора А. Если исследуемая
среда изотропна, то сквозь систему поляризатор — среда — ана-
лизатор свет не проходит ни при какой ориентации скрещенных
П и А (перед наблюдателем — темное поле зрения). Если среда
анизотропна и направления ее главных поляризуемостей совпа-
дают с направлениями осей поляризатора и анализатора, свет

Рис. 34. Принципиальная оптическая схема опре-
деления силы ДЛП и направления оптической осн
анизотропной среды

также не проходит. Однако уже при небольшом повороте скреп-
ленных П и А от этого положения поле зрения просветляется.
Это и позволяет определить ориентацию оптической оси иссле-
дуемой двулучепреломляющей среды.

Для определения разности фаз между двумя поляризованны-
ми взаимно перпендикулярно компонентами проходящего сквозь
среду света используется компенсатор, например схематически
изображенный на рис. 34 компенсатор Бабинэ (А), состоящий из
двух кварцевых клиньев с взаимно перпендикулярными оптичес-
кими осями. Компенсирующий сдвиг фаз создается разностью
толщин первого и второго клина, которую можно регулировать.
При этом плоскости поляризации П и А устанавливаются под уг-
лом 45° к направлению оптической оси среды. Для точных изме-
рений обычно применяются более сложные компенсаторы [60, 61]
в сочетании с полутеневыми устройствами.

Зная толщину образца d, можно определить разность между
главными показателями преломления, пользуясь соотношением

п || — п I = бф ’
"	2nd

где X — длина волны падающего света; бф— измеренная раз-
ность фаз.

б.	ДЛП в потоке

Молекулы движущейся жидкости или частицы, растворенные
в ней, ориентируются в потоке жидкости при наличии градиента
скорости течения. Это впервые обнаружил Максвелл [62], наблю-
дая появление двулучепреломления в канадском бальзаме, при
его течении. Поскольку оптические свойства анизотропной среды
связаны со свойствами составляющих ее молекул, эффект Мак-
свелла дает нам удобный метод исследования некоторых моле-
кулярных характеристик.

Основной способ создания градиента скорости в жидкости для
наблюдения ее оптической анизотропии — это помещение жидко-
сти в зазор между коаксиальными цилиндрами, один из которых

Рис. 35. Прибор для исследования
эффекта Максвелла (динамоопти-
метр) с внешним и внутренним рото-
рами

А — система термостатирования; Б и В —
стеики статора; R — ротор; Д7?! и Д/?2 —
внутренний и внешний зазоры; Г — перфо-
рация в роторе для наблюдения; Д —
смотровые окошки

равномерно вращается. Величина зазора намного меньше диа-
метра цилиндра, так что градиент скорости можно считать по-
стоянным. На рис. 35 показан один из вариантов такого прибо-
ра [63]. Существенно, чтобы течение жидкости, вызванное вра-
щением одного из цилиндров, было спокойным, без -завихрений
(так называемый ламинарный поток). Только тогда имеет смысл
говорить об определенном градиенте скорости В этом отноше-
нии небезразлично, который цилиндр вращается, так как при вра-
щении внешнего цилиндра, при неподвижном внутреннем, можно
достичь больших градиентов, сохраняя ламинарность потока.

• Рассмотрим поведение жестких частиц в таком потоке с гра-
диентом скорости g (рис. 36). В результате того, что поток, омы-
вающий частицу с одной стороны (на рисунке сверху), движется
в большей скоростью, чем поток.с другой стороны (снизу), на
частицу действует вращающий момент так, что частица непрерыв-
но вращается в потоке. При этом сферическая частица вращается
с постоянной скоростью, тем большей, очевидно, чем больше
градиент g. Иначе обстоит дело с частицами удлиненной формы.
Если такая частица ориентирована вдоль направления потока, то
вращательный момент, действующий на нее, значительно меньше,
чем когда она ориентирована поперек потока. Поэтому такая
частица вращается неравномерно. Она дольше задерживается в
положении, когда ее ориентация близка к направлению потока, и
быстро проходит через другие положения.

Для палочкообразных частиц

<й = g Sin2 ф,

(37)

где со — угловая скорость вращения частицы; ф — угол между
осью частицы и осью X — направлением движения потока (см. рис.
36) (боковыми движениями частицы для простоты пренебрега-

Рис. 36. Палочкообраз-

ная частица в потоке

ен). Доля частиц р(ф), ориентирован-
ных в данный момент времени под уг-
лами от ф до ф+с/ф к потоку, назы-
вается функцией углового распределе-
ния частиц. По смыслу распределение
р(ф) эквивалентно среднему времени
пребывания каждой отдельной части-
цы в интервале углов [ф, ф+с/ф]. Оче-
видно, для сферических частиц р(ф)=
= Для удлиненных частиц р(ф),

как следует из изложенного, макси-
мально при фт=0, т. е. в ансамбле ча-

стиц, находящихся в стационарном
потоке, в каждый момент времени большая их часть оказывается
ориентированной вдоль потока.

Такая простая картина поведения жестких частиц в потоке,
однако, соответствует действительности только в случае больших
градиентов скорости. Дело в том, что градиент скорости в пото-

ке жидкости — не единственная причина вращения частиц в рас-
творе. Имеется еще беспорядочное тепловое вращательное дви-

жение частиц, зависящее от температуры, аналогичное поступа-
тельному броуновскому движению. Тепловое вращательное дви-
жение существенно ослабляет ориентирующее действие потока.
Это естественно, так как чем больше частиц ориентировано в
данном направлении, тем большее их количество «диффундирует»
в состояния с иной ориентацией. Рассмотрим на примере палочко-
образных частиц, как в этом случае изменится распределение
р (ф) по углам ориентации частиц в потоке. Без учета теплового
движения это распределение имеет максимум при ф = 0. При этом
поток осей вращающихся частиц, приходящих в зону максимума,
равен потоку осей, выходящих из этой зоны. Только благодаря
этому распределение не изменяется во времени. Диффузионное
вращение создает потоки осей в обе стороны от максимума,
уменьшая поток приходящих осей и увеличивая выходящий по-
ток. В результате равновесие нарушается, и максимум распреде-
ления смещается навстречу приходящему потоку. Это смещение
тем больше, чем больше роль диффузионного вращения. Каждое
направление <р в новом стационарном состоянии пересекает, во-
первых, поток осей частиц, вращение которых вызвано градиен-
том скорости, во-вторых, — поток диффузионный. Первый поток
равен произведению со(<р)р(<р), второй, подобно обычной посту-
пательной диффузии, пропорционален производной dp. Сум-
Лр

ма этих двух потоков для всех углов одинакова и равна среднему

вращательному потоку и (<р)р(<р) = — • — = —. В максимуме
2 2л 4л

установившегося распределения, где—=0, диффузионный поток
сДр

отсутствует и

® (ф) Р (ф) =

или, пользуясь уравнением (37),
• 2	1

Sin2 ф = -------- .

4яРмакс (Ф)

Распределение р(ф) в предельном случае малых градиентов
скорости потока мало отличается от равномерного, т. е. при g-*0
1	1

Рмакс (ф) -> —-, тогда sin2 ср —, Т. С. ф^45°.
2л	2

Таким образом, преимущественная ориентация удлиненных
частиц в потоке может быть любой в интервале углов от 0° (боль-
шой градиент скорости, малая диффузия) до 45° (большая диф-
фузия, малый градиент скорости). Вследствие очень большой
вращательной диффузии малых частиц, даже при максимально
достижимых градиентах скорости потока такие частицы ориен-
тированы под углом 45° к потоку (например, молекулы диметил-
фталата). Мы будем рассматривать поведение полимерных мо-
лекул, имеющих значительно большие размеры.

в.	Жесткие эллипсоидальные частицы

Петерлин [64], вычислил функцию распределения по углам ф
для вытянутых эллипсоидальных частиц, учитывая как ориенти-
рующее действие потока, так и дезориентирующее влияние тепло-
вого движения. При очень малых градиентах скорости эта функ-
ция имеет вид:

Р(ф) =	[1+у.	5*п2ф"1 •	(38)

2л [	4 \Dr J J
п2 — 1

Здесь b0 =------

0	Р2+1

где р — отношение геометрических осей эллип-

соидальной частицы. Dr — коэффициент вращательной диффу-
зии— величина, аналогичная коэффициенту D поступательной
диффузии, равная, по Эйнштейну — Дебаю [65]:

Dr = ^.

где W — коэффициент вращательного трения частиц; k — константа
Больцмана; Т — абсолютная температура. Величины Dr и W, естест-
венно, зависят от формы и размеров частицы. Так, для вытянутых
эллипсоидов

Dr = —/21п^- —1
16лц0а!^ у а2

Здесь ау и а2—главные оси эллипсоида; г]о— вязкость растворителя.

Пользуясь более общим выражением для р (<р) эллипсоидальных
частиц, с учетом боковых движений частиц в потоке, можно полу-
чить выражение для <рт — углового положения максимума функции
распределения р (ср). При малой величине отношения g/Dr это выра-
жение имеет вид:

л

ф,л = —

4

g

12Д

(39)

Мы видим, таким образом, что по начальному наклону зависимости
<pm(g) можно определить коэффициент вращательной диффузии Dr—
важнейшую характеристику частицы, связанную с ее формой. Вопрос
только в определении срт — угла преимущественной ориентации час-
тиц в потоке. Если удлиненная частица оптически анизотропна, то
<рт можно найти, определяя положение оптической оси раствора,
двулучепреломляющего в результате преимущественной ориентации
частиц в потоке.

Рассмотрим теперь, о чем позволяет судить сила ДЛП (лц— п±)
такого раствора. Если мы знаем направление оптической оси рас-
твора, удобно пользоваться системой координат, в которой одна из
осей (х) совпадает с оптической осью раствора (рис. 37). Пусть уц
и у_[_ — главные поляризуемости эллипсоидальной частицы. Можно
определить поляризуемости ул- и уу частицы, произвольно ориентиро-
ванной в потоке, по осям х и у соответственно. Далее нас будет
интересовать разность этих поляризуемостей — ул- — %у. По Петерлину
и Штуарту [64], среднее значение ух—у у для всех частиц, нахо-
дящихся в текущем растворе, равно

Гх-Ху = (Гц-Г1)/Л^

(40)

где f , b0\—функция ориентации; b0= р 1 . Для различных
\ Dr )	Р* + 1
-~~и &о.значения f ^~d~’ вычислены При малыхвыра-
жение (40) приобретает вид:

(41)

Пользуясь выражениями (36, а, б), для разности (пх — пу) имеем:

(«х — Пу) --=

пх-п2у.^ пх-п1
пх + пу

2п	,

= — W (Y.V — Г у) =
п

= —(П-ТхИ^Л).
n	\Dr ]

(42)

где п — коэффициент преломления растворителя. Таким образом, сила
ДЛП Ди == (пх — Пу) для раствора эллипсоидальных частиц в
потоке пропорциональна разности их главных поляризуемостей и

зависит от формы частиц (за счет Ьо
и Dr).

До сих пор мы говорили об ани-
зотропных частицах. Однако удлинен-
ные частицы из изотропного веще-
ства при погружении в среду с коэф-
фициентом преломления п, отличным
от их собственного коэффициента
преломления, также должны обладать

Рис. 37. Эллипсоидальная
частица в потоке. Ось х —
направление преимущест-
венной ориентации

различными поляризуемостями в нап-
равлениях вдоль и поперек своей глав-
ной оси. В результате возникает так
называемая анизотропия формы.

Общее выражение для Тц —yj_

эллипсоидальных частиц, полученно:

Максвеллом [67], имеет вид:

4iw (п2 — п2)

- «2) («? ~ ~ «2) (L2 — Ll)

+----------------------------------.	(43)

/ п2 — п2 \ / п2 — п2 \

I 4л -|-	- Ai 114л Ц- - L2 I

\	п2 1 \	п2 /

Здесь v — объем эллипсоидальной частицы; п{ и п2— главные
показатели преломления частиц, если они анизотропны; Ц и L2 —
функции р (осевое отношение) (L2>-^i)- Первый член этого вы-
ражения связан с внутренней анизотропией частицы и исчезает
при п\ = п2. Вторым членом описывается анизотропия формы. Он
не равен нулю в случае, если частица изотропна. Однако если
rii = n2 = n, то этот член тоже обращается в нуль. Таким образом,
в текущем растворе изотропных жестких удлиненных частиц в
среде с таким же коэффициентом преломления эффект Максвел-
ла отсутствует.

Соответственно, выражение (42) для Ли также содержит два
слагаемых. Легко видно, что в среде, для которой п.\=п или
п2 = п, Ап есть результат только собственной анизотропии частиц.

Поскольку 12>Д, эффект анизотропии формы всегда положи-
телен, т. е. (т||—Уд)ф>0 и Лнф=(п||—яд)ф> 0. Сила ДЛП (42)
есть величина, зависящая от градиента скорости потока и от кон-
центрации частиц в растворе (N) и потому характеризует не толь-
ко исследуемые частицы, но и условия эксперимента. Более удоб-
ным параметром, характеризующим только исследуемые частицы,
является характеристическое двойное лучепреломление [н], ко-
торое определяется соотношением

[га| = lim (	.	(44)

« \ /

g-s-0

Здесь с — концентрация растворенных частиц; т]о — вязкость рас-
творителя.

Воспользовавшись выражениями (41) и (42), получаем для
раствора вещества с молекулярным весом М

[п]

2лУл60

15 nr\0MDr

(Гц — Г±),

(45)

поскольку

с = (Мл — число Авогадро). Величина Dr может быть

определена из измерения угла ориентации (39). Другие входящие в
(45) величины, Ьо и М, должны быть определены каким-либо иным
способом. Например, Ьо =	- можно оценить по измерениям вяз-

р2 + 1

кости раствора (8). Тогда выражение (45) позволяет по измеренным
методом ДЛП величинам Dr и [п] получить разность (тц —уд)
главных поляризуемостей, важную характеристику макромолекул, не
получаемую никаким иным методом. Заметим, что можно избежать
определения М, если известна характеристическая вязкость [ц] рас-
твора исследуемых жестких частиц. Между [п] и [т]] существует
связь, которая выражается соотношением

[»] _ 4л Ьо ,	.

[ц] 5nkT F(py “	-1-
Здесь b^jF (р) функция формы частицы, k — постоянная Больцмана,
Задача. особенно проста при р>5, когда отношение bJF(p) мало
отличается от единицы.

г.	ДЛ П цепных молекул

Особый интерес представляет изучение методом ДЛП молекул
высокополимеров. Эта задача гораздо сложнее, чем исследование
жестких частиц, прежде всего из-за деформируемости и непостоян-
ства формы цепных молекул, находящихся в потоке жидкости. По
существующим представлениям, гибкая цепная молекула в растворе
имеет форму гауссова клубка [5], апроксимируемого эллипсоидом
вращения с отношением осей, равным 2. Достаточно удаленные один

Рис. 38. Свобод-
но сочлененная
цепь

Рис. 39. Увеличение силы ДЛП с увели-
чением градиента скорости потока для
жестких (/), деформируемых (2) и лег-
ко деформируемых (3) частиц

от другого участки молекулярной цепи ориентируются независимо.
Простейшая модель такой молекулы — цепь из соединенных концами
отрезков, свободно вращающихся относительно точек соединения
(рис. 38). Асимметричную клубкообразную молекулу вместе с про-
питывающими ее молекулами растворителя, вовлекаемыми в движе-
ние вместе с клубком, можно весьма приближенно рассматривать
как жесткую эллипсоидальную частицу, способную ориентироваться
в потоке жидкости. Уже этим в значительной мере можно объяс-
нить наблюдающуюся оптическую анизотропию текущих растворов
таких молекул. Однако, оптическое поведение полимерных молекул
в -потоке существенно отличается от поведения жестких частиц, для
которых сила ДЛП изменяется с градиентом скорости так же, как
функция ориентации	в выражении (42), монотонно возра-

стая с насыщением при достаточно больших градиентах [66].
Одновременно уменьшается угол ориентации <рт. При изменении <рт
от 45 до 35° сила ДЛП увеличивается с градиентом почти линейно.
Зависимость Д/г (gj для высокополимерных молекул имеет совершенно
иной характер. В этом случае ее можно считать линейной в значи-
тельно большем интервале градиентов. При этом линейность сохра-
няется при уменьшении срт вплоть до 20°. Если молекулярная цепь
очень, легко деформируема, то в некоторых случаях зависимость
A/z(g) становится еще более сильной (рис. 39 [68]). Теория внут-
ренней вязкости полимерных молекул, развитая Серфом [69], связы-
вает такое поведение Д/г при изменении g с возникающей в потоке
деформацией (удлинением) молекулярных клубков, в результате
которой уменьшается угол ориентации <р,„. и увеличивается Дп,
поскольку увеличивается асимметрия молекул. На жесткие частицы
поток оказывает чисто ориентационное влияние, не изменяя формы

частиц.

Для суждения о деформируемости молекул удобно пользоваться
также зависимостью характеристического угла ориентации j от

Рис. 40. Зависимость характери-
стического угла ориентации от
вязкости растворителя для жест-
ких (/) и деформируемых (2)
частиц

вязкости ц0 растворителя. Согласно
теории внутренней вязкости моле-
кул, жестким частицам отвечает
прямая, проходящая через начало
координат — , Ло (Рис- 40). Лег-

L g J

ко деформируемым молекулам отве-
чает прямая, пересекающая ордина-

V
ту при некотором значении — ,
характеризующем деформируемость
клубкообразной молекулы.

Асимметрия клубкообразных мо-
лекул — не единственная причина
оптической анизотропии растворов
таких молекул. Каждый отдель-
ный сегмент цепной молекулы мо-

жет обладать собственной анизотропией, связанной с разной поляри-
зуемостью сегмента в различных направлениях, и анизотропией фор-
мы (43). Сегменты цепной молекулы частично ориентированы по
направлению главной оси эллипсоида, апроксимирующего клубок.
Это вызывает, соответственно, эффект собственной анизотропии клубка
и эффект микроформы, называемый так в отличие от рассмотренного
выше эффекта макроформы, связанного с асимметрией клубка в це-
лом. Характеристическое ДЛП движущегося раствора макромолекул
состоит, соответственно, из трех слагаемых:

[«1 = И+соб +

1^1микроформы

+ [п]

макроформы •
Теория ДЛП недеформированных гауссовых клубков дает для этих трех
слагаемых следующие выражения [5]:

4л (п2 + 2)2

Исоб = ^7--------[П]о (а н - а±),	(47)

(п2 ф- 2)2 (п.% - п2)2

Ммикроформы 180 nRTn'^p	(^2 ~ Kt)f>	(4^)

0,058 Ф (п2 4- 2) (п£ — п2)2

1П1 макроформы = np2NARThi	(49)

Здесь п — показатель преломления растворителя; nk — показатель преломления
полимера; [г]]0 — характеристическая вязкость раствора при g — 0; р — плотность
сухого полимера, Ф = 2,1 • 1023 — постоянная Флори; s — число мономеров в сег-
менте, (L2 —	— функция осевого отношения сегмента; (а ц — а^) — разность

его главных поляризуемостей; Л1С — молекулярный вес мономера.

Два последних слагаемых в выражении (46) обращаются в нуль,
если показатель преломления полимера не отличается от показателя
преломления растворителя. Это создает принципиальную возможность
наблюдать только эффект собственной анизотропии.

Пользуясь выражением (47), можно определить, следовательно, собственную анизот-
ропию сегмента а ц — а^. Для этого достаточно только измерить характеристи-
ческую вязкость [ц]0 раствора.

д.	ДЛП растворов биополимеров

Один из первых биологических объектов, на котором был ис-
пытан метод ДЛП в потоке,— вирус табачной мозаики (ВТМ).
Относительно крупные цилиндрические частицы ВТМ дали хо-
рошую возможность для проверки теории ДЛП в растворе жест-
ких асимметричных частиц. О жесткости частиц ВТМ свидетель-
у

ствует линейность зависимости — от вязкости rjo растворителя.

Размеры вирусных частиц, определенные по величине коэффици-
ента вращательной диффузии Dr, хорошо согласуются с дан-
ными, полученными методом седиментации и прямыми электрон-
номикроскопическими измерениями.

В таком же хорошем согласии с другими методами находятся
полученные методом ДЛП в потоке данные о некоторых палочко-
образных белковых молекулах (коллаген [70], фибриноген [71]).
При этом вполне удовлетворительным оказывается простое эл-
липсоидальное приближение. В этом приближении изучены также
многие другие белки [72]). Как показывают данные по измерению
угла ориентации и эффекта ДЛП растворов белков в различных
растворителях, белковые молекулы представляют собой жесткие
частицы с разной для различных белков асимметрией. Для неко-
торых из них установлена изотропность поляризуемости (колла-
ген).
В растворах нативной ДНК обнаруживается большой по ве-
личине отрицательный эффект ДЛП. Анализ поляризуемостей
отдельных оснований, составляющих двойную молекулярную
цепь ДНК [73], показывает, что отрицательный эффект связан
с отрицательной собственной анизотропией сегментов ДНК
вследствие расположения плоскостей оснований перпенди-
кулярно оси двойной спирали. При этом подразумевается,
что ДНК представляет собой свободносочлененную цепь из
жестких отрезков двойной спирали. Эффект макроформы
для ДНК пренебрежимо мал, так что наблюдаемое дву-
лучепреломление вызвано собственной анизотропией ДНК и
анизотропией микроформы. При исследовании внутренней вяз-
кости ДНК обнаружено (рис. 41, [74]), что при малых вязкостях
растворителя характеристический угол ориентации ~ пропор-

LgJ

Рис. 41. Зависимость характеристиче-
ского угла ориентации молекул на-
тивной ДНК от вязкости раствори-
теля

ционален вязкости раствори-
теля. Следовательно, в области
малых цо молекула ДНК ведет
себя как жесткая частица. При
больших вязкостях раствори-
теля наблюдается деформи-
руемость молекул ДНК (пра-
вая часть кривой). Такое пове-

дение при изменении цо

соответствует представлению о
ДНК, как о полужесткой клуб-
кообразной молекуле. Изучение
эффекта ДЛП в растворах
ДНК, деструктированной уль-
тразвуком (фракции с молеку-
лярным весом от 1,5 • 106 до
15 • 10s), также показывает, что
конфигурация молекул ДНК в

растворе является промежуточной между прямым стержнем и
гауссовым клубком [75].

Вопрос о структуре РНК менее ясен. В растворах РНК наблю-
дается относительно небольшой положительный эффект ДЛП,
сильно зависящий от ионной силы и pH раствора [76]. Этот ти-
пичный полиэлектролит не проявляет жесткости, свойственной
ДНК и по своим гидродинамическим и оптическим свойствам со-
гласуется с известной моделью Доти.

В растворах транспортной РНК, однако, обнаруживается не-
большой отрицательный эффект ДЛП [77], что позволяет припи-
сывать молекулам транспортной РНК ДНК-подобную структуру
с несовершенной спирализацией молекул «на себя».
ЛИТЕРАТУРА

1.	А. Эйнштейн, М. С молуховский. Броуновское движение, ОНТИ,
1936.

2.	R. S i m h a. J. Phys. Chem., 1940, 44, 25.

3.	W. Kuhn, H. Kuhn, P. Buchner. Erg-'bn. exakt. Naturwiss., 1951, 25, 1.

4.	Успехи химии, 1941, 10, 527.

5.	В. H. Цветков, В. Е. Эскин, С. Я. Френкель. Структура макромо-
лекул в растворах. М., изд-во «Наука», 1964.

6.	W. К г i g b a u m, P. F 1 о r y. J. Polymer Sci., 1953, 11, 37.

7.	W. E v e r e 11, J. F о r s t e r. J. Amer. Chem. Soc., 1959, 81, 3464.

8.	J. E i g n e r, P. D о t y. J. Mol. Biol., 1965, 12, 3, 549.

9.	H. D i e u, J. Polymer Sci., 1954, 12, 417.

10.	W. Carter, R. Scott, M. Magot. J. Amer. Chem. Soc., 1946, 68, 1480.

И.	В. H. Ц в e т к о в, К. 3. Ф а т т х о в, О. В. К а л л и с т о в. ЖЭТФ, 1954, 26,
351.

12.	J. Р о u г a d i е г, А. V е п е t. J. Chim. Phys., 1950, 47, 391.

13.	G. М е у е г h о 1 f. Das Papier, 1957, 11, 43.

14.	Т. Nishihara, Р. Doty. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A„ 1958, 44, 411.

15.	С. Э. Ф p n ш, А. В. T и м о p e в а. Курс общей физики, т. 1. М., Физматгиз,
1962.

16.	S. С 1 а е s s о п, U. L о h m a n d е г. Makromolek. Chem., 1961, 44—46, 461.

17.	Методы исследования полимеров. М., ИЛ, 1961.

18.	J. Е i g n е г. The native, denatured and renatured states of desoxyribonucleic
acids. Theses, Harvard, 1960.

19.	E. Frey, D. Treves, H. Eisenberg. J. Polymer Sci., 1957, 25, 273.

20.	B. Zimm, D. Crothers. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 1962, 48, 905.

21.	Handbook of Chemistry and Physics. Chem. Rubber Publ. Co., Cleveland,
1956.

22.	В. П. К У ш н е р, С. Я. Ф р е н к е л ь. Биохимия, 1962, 27, 1111.

23.	Н. Е i s е п b е г g. J. Polymer Sci., 1957, 25, 257.

24.	Р. Doty, В. McGill, S. Rice. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 1958, 44,
432.

25.	В. H: Цветков, С. Я. Любина, К. Л. Б о л e в с к и й. В сб.: «Карбо-
цепные соединения». М., 1963.

26.	Т. Svedberg, К- О. Pedersen. The Ultracentrifuge. Oxford, 1940.

27.	H. К. S ch a ch man. Ultracentrifugation in Biochemistry. Acad. Press,
N. Y.— London, 1959.

28.	W. J. A r c h 1 b a 1 d. J. Phys, and Coll. Chem., 1947, 51, 1204.

29.	J. V i n о g r a d, J. E. Hearst. In: Fortschritte der Chemie organischer Na-
turstoffe. Springer-Verlag, Wien, 1962.

30.	Б. В. Иоффе, Рефрактометрические методы в химии. Л., Госхимиздаг,
1960.

31.	Н. К. S с h а с h m а п. Biochemistry, 1963, 5, 887.

32.	S. Hanlon, К. Larners, G. Lauterbach, R. Jonson, H. K. S c h a-
ch m a n. Arch. Biochem. and Biophys., 1962, 99, 157.

33.	H. K. S c h a c h m a n, L. G г о p p e r, S. Hanlon, F. Putney. Arch. Bio-
chem. and Biophys., 1962, 99, 175.

34.	H. F u j i t a. J. Chem. Phys., 1956, 24, 1084.

35.	С. E. Бреслер. Введение в молекулярную биологию. М.— Л., изд-во
АН СССР, 1963.

36.	Н. К- S с h а с h m а п. Methods in Enzymology. Acad. Press, N. Y., 1957.

37.	E. J. С о h n, J. T. E d s a 11, eds. Proteins, Amino acids and Peptides. Rein-
hold Publ. Corp., N. Y„ 1943.

38.	J. W. Williams, R. L. Baldwin, W. M. Sounder, P. G. Squire.
J. Amer. Chem. Soc'.; 1952, 74, 1542.

39.	W. N. Shumaker, H. K. S ch a ch man. Biochim. et biophys. acta, 1957,
23, 628.
40.	C. Duve, J. Bernet, H. В e a u f a u. Progr. Biol. Biophys. Chem., 1954.

57, 194.

41.	C. D u v e, J. В e r n e t. Int. Rev. Cyt., 1954, 3, 225.

42.	P. Y. Cheng, H. K- S c h a c h m a n. J. Amer. Chem. Soc., 1955, 77, 1498.

43.	P. G. M a r t i n, B. N. A r m e s J. Biol. Chem., 1961, 23S, N 5.

44.	D. A. Y p h a n t i s. Ann. N. Y. Acad. Sei., 1960, 88, 586.

45.	В. O. Ill п e к и т e p. Современные методы в биохимии, т. I. М., изд-во «Ме-
дицина», 1964.

46.	В. Я. Ч е р н я к. Биофизика, 1964, 9, 239.

47.	А. Е h г е n b е г g. Acta Chem. Scand., 1957, 11, 1257.

48.	S. Kit. J. Mol. Biol., 1961, 6, 711.

49.	J. H. F e s s 1 e r, A. J. H о d g e. J. Mol. Biol., 1962, 4, 446.

50.	N. F. M e s e 1 s о n, F. Stahl, J. Vinograd. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A.,
1957, 43, 581.

51.	N. Sueoka. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 1959, 45, 1480.

52.	N. Sueoka, J.Marmur, P.Doty. Nature, 1959, 183, 1429.

53.	N. F. M e s с 1 s о п, E. W. Stahl. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 1958, 44,
671.

54.	B. D. Hall, S. Spiegelman. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 1961, 47,
137.

55.	К. I. Berns, S. A. Thomas. J. Amer. Chem. Soc., 1961, 83, 2439.

56.	J. M a r m u r, D. L a n e. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A., 1960, 46, 453.

57.	D. J. Cox, W. N. Schumaker. J. Amer. Chem. Soc., 1961, 83, 2439.

58.	С. E. Бреслер, Л. M. П ы p к о в, С. Я. Френкель. Высокомолекуляр-
ные соединения, 1960, 2, 261.

59.	Г. С. Л а н д с б е р г. Оптика. М., Гостехиздат, 1957.

60.	G. S с i v е s s у. Handbook d. Physik, 1928, 19, 918.

61.	Н. J е г г а г d. J. Opt. Soc. Amer., 1948, 38, 35.

62.	J. С. M a x w e 11. Proc. Roy. Soc., London, 1873, A22, 46.

63.	Э. В. Ф p и с м а н, В. H. Ц в e т к о в. ЖТФ, 1955, 25, 448.

64.	A. Peterlin, H. Stuart. Z. Phys., 1939, 112, 1, 129.

65.	П. Д e б а й. Полярные молекулы, ГТТИ, 1931.

66.	H. A. Scheraga, J. Т. Е d s а 11, J. О. G a d d. J. Chem. Phys., 1951, 19,
1101.

67.	J. С. М а х w е 11. Treatize on electricity and magnetism, 1873.

68.	Физические методы органической химии, т. V. М., ИЛ, 1957.

69.	R. С е г f. Fortschr. Hochpolym.— Forsch., 1959, 1, 382.

70.	H. В о e d t k e r, P. D о t у. J. Amer. Chem. Soc., 1956, 78, 4267.

71.	C. Hocking, W. Laskowsky, FI. Sheraga. J. Amer. Chem. Soc.,
1952 74 775.

72.	R. C e r f, H. S c h e r a g a. Chem. Revs, 1952, 51, № 2.

73.	В. H. Ц в e т к о в. Высокомолекулярные соединения, 1963, 5, 740.

74.	M. R e i c h m a n n, B. Bunce, P. Doty. J. Polymer Sci., 1953, 10, 109.

75.	В. H. Цветков, Л. H. Андреева, В. И. С и сен к о. В сб.: «Молеку-
лярная биофизика». М., изд-во «Наука», 1965.

76.	Э. В. Ф р и с м а н, В. И. В о р о б ь е в, Н. К. Я н о в с к а я, Л. В. Щ а г и н а.
Биохимия, 1963, 28, 137.

77.	В. Н. Цветков, С. Я. Любина, Л. Л. Киселев, Л. Ю. Фролова.
Высокомолекулярные соединения, 1964, 6, 568.
Глава V

ЭЛЕКТРОННЫЙ ПАРАМАГНИТНЫЙ И ЯДЕРНЫЙ
МАГНИТНЫЙ РЕЗОНАНС

1.	Электронный парамагнитный резонанс.Л. А .Блюменфельд 289

а.	Сущность явления......................................290

б.	Спектрометры ЭПР......................................292

в.	Параметры спектров	ЭПР...............................293

г.	Применение ЭПР в	биологии.............................296

2.	Ядерный магнитный резонанс. В. И. Брусков . .	. 297

а.	Теоретические основы метода ЯМР.......................297

б.	Основные характеристики сигналов ЯМР..................303

в.	Экспериментальное наблюдение ядерного магнитного ре-
зонанса .................................................306

г.	Применение спектроскопии ЯМР высокого разрешения . 307

д.	Применение спектроскопии ЯМР низкого разрешения .	315

е.	Применение метода спинового эха.......................320

Литература...................................................321

Магнитный диполь, помещенный в магнитное поле; направ-
ленное вдоль оси z, начинает прецессировать вокруг оси z с
определенной частотой <оо- При этом в плоскости (х,у), перпенди-
кулярной направлению магнитного поля-, происходит равномер-
ное вращение проекции магнитного момента диполя на эту плос-
кость с угловой скоростью coo- Следовательно, проекция магнит-
ного момента диполя на произвольную ось, расположенную в
плоскости (х, у), совершает колебания с круговой частотой <oq.
Если на систему действует, кроме того, переменное магнитное
поле, направленное вдоль оси, расположенной в плоскости, то
при частоте поля, равной ®о, наблюдается резонанс между коле-
баниями поля и дипольного момента. В случае, если диполем
служит электрон, явление называется электронным парамагнит-
ным резонансом (ЭПР); если диполем служит атомное ядро, то
говорят о ядерном магнитном резонансе (ЯМР).

1.	Электронный парамагнитный резонанс

Явление электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)
было открыто Е. К. Завойским в Казанском университете в
1944 г. Это открытие положило начало новой области науки —
магнитной радиоспектроскопии.
До начала ,50-х годов метод ЭПР использовался главным
образом физиками для решения некоторых чисто физических за-
дач. Широкое применение метода ЭПР в химии и биологии на-
чалось почти одновременно. В наши дни этот метод служит
мощным орудием изучения механизмов все возрастающего коли-
чества самых разнообразных химических и биохимических про-
цессов [1-5].

а.	Сущность явления

Парамагнетизм атомов и молекул определяется орбитальным
движением электронов и их спинами (собственными механиче-
скими моментами электронов, не зависящими от их орбитально-
го состояния). С движением электрона по орбите, как со всяким
круговым током, связан магнитный момент цОрб , относящийся
к механическому моменту движущегося электрона р0Рб, как

Норб __ е

Рорб 2тс *

Согласно квантовой механике,

рор6 = /(((+ 1)Й,	(2)

Рорб = //(/+ 1) 3-	(3)

где I — орбитальное квантовое число; П — постоянная Планка, делен-
ей
ная на 2л; 3 =-------магнетон Бора — естественная единица атом-

2 тс
ного магнетизма.

Если электрон обладает только спиновым моментом (орбитальный
момент равен нулю), то

Реп = 2 У 8(8^ 1) 3,

Реп =	1) П,

где s — спиновое квантовое число. В этом случае
Реп   е
Реп	тс

Отношение магнитного момента парамагнитной частицы к  её меха-
ническому моменту называют гиромагнитным отношением, или
g-фактором, и выражают в единицах . В этой системе единиц
2 тс

^орб в I’

gen = 2.	(7)

(4)

(5)

(6)
Если и спиновые, и орбитальные моменты электронов не равны
нулю, то в общем случае они складываются и состояние элект-
рона в атоме определяется полным квантовым числом /.

При помещении такого парамагнитного атома в постоянное
магнитное поле напряженностью Н энергетические уровни с
данным значением J расщепляются на 2J +1 подуровней (эф-
фект Зеемана).

Emj = mjgZH,	(8)

где trtj — магнитное квантовое число, которое может иметь зна-
чения J, J—1, J—2,..., —J. Таким образом, в магнитном поле
возникает 2/+1 электронных уровней с растоянием между со-
седними

АЕ = gpE.	(9)

Переменное электромагнитное поле может индуцировать пере-
ходы между этими уровнями при условии совпадения энергии
квантов поля с расстоянием между уровнями (резонанс). При
этом должны выполняться следующие правила отбора:

НХХ_Н,	(10)

Amj=l,	(И)

т. е. магнитный вектор переменного поля должен быть перпенди-
кулярен направлению постоянного поля и переходы могут про-
исходить только между соседними уровнями. В связи с несколь-
ко большей заселенностью нижних уровней переходы снизу
вверх (с поглощением энергии переменного электромагнитного
поля) происходят чаще, чем переходы сверху вниз (с излуче-
нием), в связи с чем при соблюдении условия резонанса

hv = g$H,	(12)

где v — частота переменного поля, образец поглощает электро-
магнитную энергию. Это явление и носит название электронного
парамагнитного резонанса.

В химических и биологических исследованиях наиболее ча-
сто имеют дело с парамагнитными частицами, обладающими
чисто спиновым магнетизмом. В этом случае g = 2 и при легко
достижимых в лабораторных условиях значениях напряженно-
сти постоянного магнитного поля; Н — около 3000 э; резонанс-
ная частота v, согласно (12), составляет около 1010 гц. Соответ-
ствующее электромагнитное излучение с длиной волны около
3 см относится к области сверхвысоких радиочастот (СВЧ),
используемых & радиолокации. Это обстоятельство определяет
технику метода ЭПР.
б.	Спектрометры ЭПР

Спектрометры ЭПР можно разделить на три основных типа:
видеоспектроскопы, спектрометры с высокочастотной (вч) мо-
дуляцией и супергетеродинные радиоспектрометры. Из основно-
го уравнения ЭПР (12) видно, что получить спектр можно двумя
способами: меняя частоту v при фиксированном значении Н и
меняя напряженность поля при фиксированном значении v.
В ЭПР-спектрометрах всех типов используется второй метод, и,
таким образом, спектр ЭПР записывается в координатах: интен-
сивность поглощения I — напряженность магнитного поля №.

Рис. 1. Блок-схема видеоспектрометра ЭПР с проходным
, резонатором

На рис. 1 приведена блок-схема простого видеоспектрометра
3-сантиметрового диапазона. Уровень СВЧ-мощности, генери-
руемой клистроном (/), регулируется аттенюатором (2). Гене-
ратор (7) согласуется с резонатором (6), в который помещается
образец, при помощи фазовращателя (3). Магнитное поле, соз-
даваемое электромагнитом {4), модулируется сетевой частотой
при помощи модуляционных катушек (5). Сигнал ЭПР детекти-
руется полупроводниковым диодом (7), усиливается широко-
полосным усилителем (3) и поступает на вертикальные пласти-
ны осциллографа (5). Горизонтальная развертка осциллографа
синхронизована с питанием модуляционных катушек. Постоян-
ное поле магнита (4) устанавливается вблизи резонансного зна-
чения. Модуляция поля, осуществляемая катушками (5), долж-
на перекрывать линию ЭПР. В момент прохождения поля через
резонансное значение часть энергии СВЧ поглощается образцом,
и уровень мощности, поступающей на детектор, уменьшается.
При синусоидальной развертке это происходит два раза за пе-
риод. Полоса пропускания усилителя (3) должна быть доста-
точно широка, чтобы не допустить искажения линии (обычно
достаточная полоса 10—104 гц). При такой схеме прибора на
экране осциллографа появляется линия поглощения в координа-
тах I — Н. При помощи приборов такого типа удается регистри-
ровать до 1015 свободных радикалов в образце при полуширине

1	Часто вместо / откладывается первая или вторая производная I по Н.
линии 2 э. В большинстве современных спектрометров ЭПР при-
меняются другие схемы: спектрометры супергетеродинного типа
и спектрометры с высокочастотной модуляцией и синхронным
детектированием сигнала. В большинстве случаев записывается
производная спектра поглощения, т. е. линии регистрируются в
координатах — — Н. Стандартные современные спектрометры
dH

ЭПР могут регистрировать ~1012 свободных радикалов в сухом
образце при полуширине линии 2 э. Переход на 8-миллиметро-
вый диапазон и применение многократного прохождения с на-
коплением сигнала понижает эту предельную величину на поря-
док. Использование мощных клистронов и специальных кон-
струкций кювет и резонаторов позволяет работать с водными
образцами без значительного снижения чувствительности.
Специальные приставки дают возможность варьировать темпе-
ратуру образца в пределах от гелиевых температур до 200—
300°, проводить исследования непосредственно при освещении
образца или под электронным пучком.

в.	Параметры спектров ЭПР

g - Ф а кт о р. Как было отмечено выше, для свободного пара-
магнитного атома g-фактор может принимать значения от 1 до
2 в зависимости от величины орбитального и спинового момен-
тов количества движения атома. В молекулах, однако, а также
в атомах и ионах в твердой и жидкой фазах орбитальный элект-
ронный момент парамагнитного центра жестко связан с окруже-
нием и не может свободно ориентироваться в магнитном поле.
Благодаря этому «замораживанию» орбитального момента
g-фактор большинства органических свободных радикалов, па-
рамагнитных ионов в твердой и жидкой фазах оказывается
весьма близким к чисто спиновому значению, т. е. к 2. Откло-
нения могут наблюдаться лишь при наличии низко лежащих
возбужденных орбитальных уровней и больших констант спин-
орбитального взаимодействия, что характерно для сравнительно
тяжелых атомов. Точное определение g-фактора позволяет по-
лучить уникальную информацию о тонких деталях электронной
структуры парамагнитного центра, особенно в случае моно-
кристаллов, когда величина g-фактора зависит от ориентации
кристалла в магнитном поле. Измерение g-фактора органиче-
ских свободных радикалов часто дает возможность локализовать
положение неспаренного электрона. Так, например, если
неспаренный электрон локализуется на легких атомах Н, С, N,
О, то величина g-фактора превышает чисто спиновое значение
(2,0023) не более, чем на несколько единиц в третьем знаке.
В то же время при локализации свободной валентности на ато-
ме серы g-фактор повышается до величины 2,024. Измерение
S’-фактора сигнала ЭПР окисного железа в гемине и метгемо-
глобине (s-фактор оказался сильно смещенным и для монокри-
сталлов при определенной их ориентации в магнитном поле до-
стигал 6) позволило установить природу связей железа в этих
структурах.

Ширина и форма линии. Важную информацию могут
дать измерение ширины и анализ формы линии ЭПР. Согласно
принципу неопределенности Гейзенберга,

ЬЕЫ~Ъ.	(13)

и ширина линии (АЕ) обратно пропорциональна времени жизни
(АО возбужденного состояния. Время жизни возбужденного со-
стояния парамагнитного центра определяется временем релак-
сации спинового магнитного момента, передающего свою энер-
гию атомам и молекулам, окружающим парамагнитный центр.
Это время релаксации принято называть спин-решеточным, или
продольным, временем релаксации и обозначать 7\. Таким обра-
зом, чем больше 1\, тем уже должна быть линия. Как правило,
в биохимических и биологических исследованиях проявляется
почти чисто спиновой магнетизм, взаимодействие спин — решет-
ка мало, Л достаточно велико (~10~5 сек) и определяемая
этим механизмом ширина линии не лимитирует эксперименталь-
но наблюдаемую ширину, которая обычно определяется другими
факторами. Одним из таких факторов может быть спин-спиновое
взаимодействие. Каждый неспаренный электрон находится не
только во внешнем магнитном поле, но и в локальных полях,
создаваемых магнитными моментами соседних неспаренных
электронов. Это приводит к некоторому распределению эффек-
тивных магнитных полей и, следовательно, к уширению резо-
нансной линии. Поскольку распределение полей носит случай-
ный характер, форма линии в этом случае подчиняется уравне-
нию Гаусса:

,(н>='Н-гжЭ’	<14)

где /о — максимальная амплитуда сигнала в центре линии при
Н=На, а <АН2>ср —параметр ширины линии. Естественно,
ширина линии будет в этом случае возрастать при уменьшении
среднего расстояния между неспаренными электронами, т. е. при
повышении концентрации парамагнитых центров в образце.

Любые процессы, приводящие к изменению во времени маг-
нитных полей с частотой, достаточно большой для их эффектив-
ного усреднения, будут приводить к сужению линий ЭПР и
изменению их формы. Такими процессами могут быть делока-
лизация неспаренных электронов по молекуле или по кристаллу,
их обменное взаимодействие, быстрое перемещение . парамаг-
нитных частиц относительно друг друга. Форма линии при этом
меняется и описывается уравнением Лоренца:

Сверхтонкая структура. Обычно, кроме неспаренных
электронов, исследуемые системы содержат ядра, обладающие
собственными магнитными моментами (И1, D2, Nli, С13,
F19 и т. д.). За счет взаимодействия электронных и ядерных маг-
нитных моментов электронные зеемановские уровни подвергают-
ся дополнительному расщеплению и возникает так называемая
сверхтонкая структура (СТС) спектров ЭПР. Рассмотрим воз-
никновение СТС на самом простом примере взаимодействия
неспаренного электрона с одним протоном (ядерный спин i ра-
вен '/2, а его проекция на направление магнитного поля mt мо-
жет принимать значения ±*/2). На схеме представлены уровни,
возникающие в магнитном поле:

Для компонент СТС действительно правило отбора Ат, =0
(спин ядра не меняет ориентации при электронном переходе),
в связи с чем в спектре будут наблюдаться две линии равной
интенсивности. Если неспаренный электрон взаимодействует с
двумя структурно-эквивалентными протонами, то возникают три
равноотстоящие компоненты СТС с соотношением интенсивно-
стей 1:2:1. Таким образом, анализ хорошо разрешенной СТС
часто позволяет сделать однозначные выводы о строении иссле-
дуемых свободных радикалов, о локализации неспаренного
электрона в определенных группах молекул.

Эффекты насыщения. При повышении СВЧ-мощности,
падающей на образец, можно достичь такого уровня, когда
спин-решеточная релаксация не будет успевать восстанавливать
больцмановское распределение населенностей зеемановских
уровней и эти населенности начнут выравниваться. Это приводит
к уменьшению интенсивности линий ЭПР (при равных населен-
ностях переходы сверху вниз и снизу вверх происходят одинако-
во часто и ЭПР-поглощения не наблюдается), и как показывает
строгая теория, к искажению формы отдельной линии. Кривые
насыщения, связывающие, например, интенсивность линий с
Мощностью СВЧ, определяются, таким образом, временем спин-
решеточной релаксации Т\. Изучение кривых насыщения может
помочь в расшифровке сложного спектра, возникающего за счет
наложения линий СТС парамагнитных центров разной природы.
Поскольку значения этих центров различны, они будут по-
разному вести себя в условиях насыщения.

г.	Применение ЭПР в биологии

В кратком обзоре нет возможности подробно рассмотреть
многочисленные работы, посвященные применению ЭПР-спектро-
скопии в исследованиях биологически важных структур и про-
цессов. Поэтому мы ограничимся перечислением некоторых
направлений.

Изучение механизмов окислительно - восста-
новительных ферментативных реакций. Предполо-
жение об участии свободнорадикальных семихинонных форм
различных коферментов.типа флавинов, хинонов и других в
процессах аэробного и анаэробного окислительно-восстанови-
тельного ферментативного катализа появилось уже в 30-х годах
нашего века после классических работ Михаэлиса по ступенча-
тому окислению. Однако прямое доказательство эта гипотеза
получила лишь после применения метода ЭПР, позволившего
непосредственно детектировать появление свободных радикалов
этого типа в ходе биохимических процессов как в изолированных
ферментных системах, так и в целых клетках и тканях. В на-
стоящее время методы ЭПР-спектроскопии широко применяют-
ся для исследования процессов транспорта электронов в мито-
хондриях, строения и механизмов окисления и восстановления
таких важнейших соединений, как коэнзим Qi0 и другие биоло-
гически активные хиноны, флавины, пиридиннуклеотиды, порфи-
рины, металлопорфирины и хлорофилл. В ряде случаев удается
проследить путь неспаренного электрона на всех участках цепи
электронного переноса от флавина до иона меди цитохромокси-
дазы. Изучение модельных систем и целых 'клеток методом
ЭПР позволяет делать весьма существенные заключения о тон-
ких деталях механизмов аэробного окисления и гликолиза,
о роли воды в этих процессах. Исследования так называемых
ферментативных сигналов ЭПР начинают проводиться и в меди-
цине, так как обнаруживаются достаточно четкие отличия в их
интенсивности при некоторых патологических состояниях.

Радиобиологические исследования. Метод ЭПР
широко применяется и при изучении механизма действия иони-
зирующего излучения на биологические системы. Обнаружены
и идентифицированы свободные радикалы и ион-радикалы, воз-
никающие в целых клетках и тканях и в изолированных амино-
кислотах, пептидах, белках, нуклеиновых кислотах и т. п. под
действием проникающего излучения. Особенно интересны иссле-
дования кинетики накопления и гибели свободных радикалов
в зависимости от величины и мощности дозы, содержания воды,
давления кислорода и т. д. Метод ЭПР впервые позволил подой-
ти к решению вопроса о механизме действия защитных веществ,
например серусодержащих соединений. Спектрометры ЭПР ста-
ли обязательным оборудованием современных радиобиологиче-
ских лабораторий.

Фотобиология и фотосинтез. Фотохимические про-
цессы обычно сопровождаются появлением свободных радика-
лов в качестве промежуточных продуктов. Современные чувстви-
тельные спектрометры ЭПР позволяют регистрировать и иден-
тифицировать эти промежуточные соединения непосредственно
в резонаторе прибора при освещении. Особенно интересна воз-
можность однозначной идентификации возбужденных триплет-
ных состояний. В триплетном состоянии спин системы равен
единице, и, как правило, удается наблюдать сигнал ЭПР при
^-факторе, близком к 4, соответствующий переходу с Аш = 2.

Бурно развиваются сейчас ЭПР-исследования первичных ак-
тов фотосинтеза. При помощи быстродействующих приборов
удается зарегистрировать кинетику накопления и гибели пара-
магнитных центров в первые миллисекунды после импульса
света. Можно не сомневаться, что именно метод ЭПР поможет
расшифровать физические механизмы одного из важнейших про-
цессов, происходящих в природе.

2.	Ядерный магнитный резонанс

В последние годы при помощи спектроскопии ядерного маг-
нитного резонанса (ЯМР) выполнен ряд важных исследований,
в области биохимии и биофизики. Первые попытки обобщить
полученные результаты сделаны в работах [6—8].

В данном разделе дано изложение теории ЯМР, представле-
ние о методе и на примере ряда работ показаны возможности
этого нового мощного метода исследования в применении к био-
логии.

а. Теоретические основы метода ЯМР

Квантовомеханическое рассмотрение. Как из-
вестно, ядра атомов характеризуются собственным механическим
моментом количества движения, или спином /. Механический
момент обусловливает появление у ядер магнитного момента ц.
При помещении в постоянное магнитное поле напряженностью
Но магнитные моменты, первоначально хаотически ориенти-
рованные в пространстве, принимают определенные дискретные
ориентации. Возможны 27+1 ориентации со следующими зна-
чениями проекции спина т на направление поля На:

tn = J, (/:— 1), (7—2), . .., — J.

Если J = 1/а, что имеет место у ядер атомов Н1, PS1 и других,
то возможны две ориентации с проекциями спина, равными +1/2 и
— г/2, т. е. по полю и против поля.

Проекции ядерного магнитного момента р, на направление поля
также имеют 27 + 1 значений и равны соответственно при

абсолютной величине вектора магнитного момента, равной У J (J + 1) р.

Энергия взаимодействия магнитного момента ядра с полем описы-
вается выражением

Е = р/70 = — ^2. ,	(16)

т. е. в поле происходит образование 27 + 1 дискретных энергетиче-
ских уровней с расстоянием ^2- между соседними уровнями. Это

расстояние может быть записано в виде g^0H0, где р0 — ядерный
магнетон, a g = —----фактор расщепления.

Цо7

В результате теплового движения устанавливается равновесное
распределение ядерных моментов по квантовым энергетическим
состояниям, описываемое уравнением Больцмана:

f Е,- \

Л/)-= Д exp ,	(17)

где — число ядер в состоянии, соответствующем энергии; А —
константа; k — постоянная Больцмана; Т — абсолютная температура.

Энергетической разнице двух соседних уровней (16):

ДЕ = (Дт =1)	(18)

соответствует разница населенности этих уровней AN, причем

N + ДУ '	/ ДВ \

——------= ехр ----- .

N	\ kT j

Учитывая, что — «С1, получим для случая 7= /г

kT

&N _ 2цЯ0	(19)

N “ kT '	k
Согласно квантовомеханическим правилам отбора между
энергетическими уровнями разрешены только те переходы, при
которых величина т изменяется на ±1. Следовательно, квант
энергии hvo может вызвать переходы, если он имеет такую же
величину, как и промежуток между уровнями:

hv =	(20)

где h — постоянная Планка.

Если частоту колебаний v0 выражать в Мгц, а напряженность
магнитного поля Но в эрстедах, то условие резонанса (20) для
протонов будет определяться соотношением

v0 =4,257-10-3 Но.

При полях в несколько тысяч эрстед для большинства ядер,
обладающих магнитными моментами, частоты vo находятся в
области обычных радиочастот. Радиочастотное поле будет сти-
мулировать в равной степени переходы спинов как с нижних
энергетических уровней на верхние, так и наоборот. Вследствие
разницы населенностей уровней переходы с нижних уровней на
верхние будут происходить чаще, радиочастотная энергия будет
поглощаться, а населенности энергетических уровней выравни-
ваться.

Если уровни станут равнонаселенными, никакого поглоще-
ния в дальнейшем происходить не будет, наступит так называе-
мое насыщение. Однако этому препятствует спин-решеточная
релаксация.

Спин-решеточной релаксацией называют переход ядер между
двумя состояниями с различными значениями проекции спина
за счет теплового движения соседних атомов и молекул. Избы-
ток энергии при этом рассеивается по внутренним степеням
свободы образца («решетке»), т. е. превращается в тепло.

Спин-решеточная релаксация приводит к непрерывному по-
глощению энергии электромагнитного поля. Процесс избиратель-
ного поглощения электромагнитной энергии, связанный с пере-
ориентацией системы ядерных магнитных моментов в постоянном
магнитном поле, получил название ядерного магнитного резо-
нанса.

Классическое рассмотрение. При помещении об-
разца в постоянное магнитное поле Но, направленное вдоль оси z,
ядерные магнитные моменты начинают прецессировать с лармо-
ровской частотой

соо =2nv0 = гН0	(21)

вокруг направления поля, где у— гиромагнитное отношение
данного ядра:

Г=-Н, Й = Л.

2л
В результате взаимодействия с полем и теплового движения
образуется избыток ядерных магнитных моментов, направлен-
ных вдоль поля. Этот избыток создает намагниченность р2 и мо-
жет быть представлен равномерным распределением магнитных
моментов ядер по поверхности конуса с осью в направлении
оси z (рис. 2). Этот конус как целое вращается вокруг оси z с
частотой и0. Результирующая намагниченность в плоскости ху
равна нулю.

Пусть вдоль оси х приложено линейно-осциллирующее поле
/Лзтсщ/. В плоскости ху оно может быть расположено на два

Рис. 2. Прецессия магнит-
ного момента ц в магнит-
ном поле Нд при действии
радиочастотного поля Ну

вектора поля, поляризованных по
кругу и вращающихся с частотой цц
в противоположные стороны. Эти
поля вращаются относительно кону-
са с частотами w0—и соо+соь Пер-
вое поле вдали от резонанса и вто-
рое поле при любой частоте «ц не
оказывают никакого влияния на пре-
цессионное движение вследствие ма-
лости времени взаимодействия.

При резонансе (wi = (oo) Hi ста-
новится неподвижным относительно
конуса. При этом вектор вращающе-
гося поля отклонит от направления
z векторы тех ядерных магнитных
моментов, которые отстают от него
на 90° по фазе. Результирующий
магнитный момент отклонится от на-
правления z (ось конуса начнет вра-
щаться вокруг z с частотой ио), и в
плоскости ху появится намагничен-
ность цх!/, вращающаяся с частотой
ио. Условие резонанса

2nv0 = ю0 = гЯ0

совпадает с условием (20), полученным ранее при квантовоме-
ханическом рассмотрении.

Из изложенного следует-, что при ядерном магнитном резо-
нансе происходит уменьшение продольной намагниченности в
направлении постоянного магнитного поля Но и появление вра-
щающейся с частотой соо поперечной намагниченности в плоско-
сти, перпендикулярной полю Но.

Оба эти явления используются для регистрации ядерного
магнитного резонанса.
Ядерная магнитная релаксация. Каждое ядро, помимо внеш-
него постоянного магнитного поля, находится в локальном магнитном поле,
создаваемом магнитными моментами соседних ядер. Вследствие непрерывно-
го теплового движения локальное магнитное поле быстро меняется во времени.
Применяя разложение Фурье, можно получить непрерывный спектр возни-
кающих при этом магнитных шумов.

Спектр магнитных шумов, обусловленных тепловым движением, имеет
вид

S (v) = а----—-----,

l+4n2v2Tc

где S(v) —спектральная плотность при частоте v; а—константа; тс — время
корреляции.

Время корреляции характеризует случайный процесс беспорядочного теп-
лового движения и имеет порядок времени, необходимый молекуле, чтобы по-

вернуться на один радиан или проити
расстояние, сравнимое с ее размерами.
Спектры магнитных шумов, характерные
для жидкостей и твердых тел, показаны
на рис. 3.

Спин-решеточная релакса-
ция. Компоненты спектра магнитных
шумов вблизи резонансной частоты
Vo вызывают переходы между энергети-
ческими уровнями и приводят к указан-
ной выше спин-решеточной релаксации,
проявляющейся в том, что при включе-
нии поля Но приближение системы спи-
нов к больцмановскому равновесию про-
исходит с некоторой характеристической
скоростью, а при резонансе с той же ха-
рактеристической скоростью наблюдает-
ся переход из верхнего энергетического
состояния в низшее.

Например, если в момент времени t
ядер на низшем энергетическом уровне п
весия он равен п0> то

dn __ «о

Рис. 3. Спектры магнитных шумов

после включения поля избыток числа
, а при достижении теплового равно-

— п

vjifi Т\ — время спин-решеточной релаксации, характеризующее скорость при-
ближения к равновесию.

Или, если М.гс —намагниченность в направлении оси при равновесии, а
Мг — та же намагниченность в данный момент времени t, то

dM,	М, — М2

z   Zo z

~dt~ 7\

(22

причем MZt =%о^о, где — ядерная магнитная восприимчивость в условиях
теплового равновесия.

Спин-спиновая релаксация. Поперечная намагниченность, воз-
никающая при ЯМР, соответствует неравномерному распределению в плоско-
сти ху элементарных магнитиков, совершающих ларморовскую прецессию
вокруг направления постоянного магнитного поля (рис. 2).

Однако иа постоянное магнитное поле налагаются слабые статические ло-
кальные магнитные поля соседних магнитных ядер (диполь-дипольное взаимо-
действие). Эти поля соответствуют спектру магнитных шумов вблизи нуля ча-
стоты (см. рис. 3). В результате z-компонента поля меняется от точки к точке
и частоты ларморовской прецессии отдельных ядер оказываются несколько раз-
личными. Поэтому неравномерное распределение элементарных магнитиков в
проекции ху все более и более выравнивается и поперечная намагниченность
постепенно исчезает. Аналогичный процесс происходит также из-за неоднород-
ности постоянного магнитного поля Но.

Второй эффект, приводящий к уменьшению поперечной намагниченности,
состоит в одновременном перебросе двух спинов с противоположными относи-
тельно оси z ориентациями. Этот переход осуществляется под действием пере-
менного магнитного поля, возникающего в результате ларморовской прецес-
сии. Суммарная z-компонента намагниченности в обоих случаях остается по-
стоянной, хотя их азимутальная относительная ориентация и, следовательно,
поперечная намагниченность меняются.

Рассмотренные процессы приводят к уменьшению поперечной намагниченности
с характеристическим временем Т2, называемым временем спин-спиновой релакса-
ции, так что

dMr М,

dt Т2

Теория дает следующие выражения для времен релаксаций
1 _ £	/ Д	4тс х

Л “20 г” 1+т2№0тс2 + 14-4Т2/72т2 J ’

Т2_20 г» (	1+т2Я2т2 + 1+4Т'ВД )’

где г — расстояние между двумя магнитными моментами; остальные обозначения
те же, что и выше.

Если = y2H^t2 < 1, что имеет место в жидкостях, то = Т2 и имеет
порядок секунд.

Спин-эхо. Действие высокочастотного поля Нх на вектор намагниченности
М при резонансе заключается в отклонении его от оси г с угловой скоростью
Если поле Нх действует не непрерывно, а в виде высокочастотного импульса,
продолжительность которого /имп настолько мала, что в течение действия им-
пульса релаксационными процессами можно пренебречь, то действие поля Нх
сведется к повороту вектора намагниченности на угол 7Я1/ИМП. Пусть величины
л

Нх и ^имп выбраны таким образом, что	; тогда вектор М после по-

ворота окажется в плоскости ху. Если взять импульс в два раза продолжи-
тельней, то он приведет к повороту вектора намагниченности иа 180°. Эти им-
пульсы называют соответственно 90-градусный и d80-градусный.

Рассмотрим явление, называемое' спиновым эхо, на примере воздействия
на систему спинов последовательно 90°-ного и 180°-ного импульсов (рис. 4).

Действие 90°-ного импульса с напряженностью Hi, вдоль оси х приводит к
повороту вектора намагниченности М в отрицательное направление оси у
(см. рис. 4, а).

В связи с неоднородностью локального магнитного поля те спины, кото-
рые находятся в поле, большем /Д, будут прецессировать быстрее, а те, что
Рис. 4. Образование сигнала спинового эха при воздействии 90°
и 180° импульсов

находятся в поле, меньшем Но,— медленнее, чем шо. В результате за время т
в системе координат, вращающейся со скоростью соо относительно оси z, про-
изойдет расщепление вектора намагниченности М в расходящийся веер век-
торов Л4 г, что приводит к исчезновению намагниченности (сигнал затухания
свободной прецессии) (рис. 4,-6).

Через промежуток времени X после действия первого импульса на систему
воздействует 180°-ный импульс и весь веер векторов поворачивается на 180°
вокруг оси х (см. рис. 4, в).

По окончании второго импульса каждый из векторов намагниченности
продолжает двигаться в прежнем направлении относительно вектора, вращаю-
щегося с угловой скоростью шо. Однако теперь, после поворота на 180°, это
движение приводит не к рассыпанию, а к складыванию веера векторов (см.
рис. 4, г).

Через промежуток времени 2т все векторы сойдутся вместе и создадут
сильный результирующий магнитный момент в отрицательном направлении
оси у. Это приведет к наведению в приемной катушке сигнала, называемого
спин-эхо (см. рис. 4, д).

После появления эхо-сигнала вектор намагниченности опять рассыпается
в веер и наблюдается обычное затухание сигнала (см. рис. 4, е).

Хотя наиболее простое качественное объяснение явления спинового эха
можно дать для последовательности 90 и 180° импульсов, аналогичные явле-
ния происходят и при применении других совокупностей импульсов.

б.	Основные характеристики сигналов ЯМР

Ширина линии. Переход между дискретными уровнями
энергии должен давать очень узкую резонансную линию. Огра-
ничение времени пребывания спина в данном энергетическом
состоянии за счет релаксации приводит в соответствии с кван-
товомеханическим принципом неопределенности	к уши-

рению дискретных уровней энергии и, следовательно, к ушире-
нию линии поглощения ЯМР. Второй причиной уширения
сигнала ЯМР является диполь-дипольное взаимодействие маг-
нитных моментов, приводящее к тому, что условие резонанса
выполняется в некотором интервале значений поля.

Для твердых тел диполь-дипольное взаимодействие велико,
вследствие чего наблюдаются широкие (порядка нескольких
гаусс) линии ЯМР. В жидкостях из-за быстрой переориентации

Рис. 5. Химические сдвиги протонов этанола в спектре
ПМР среднего разрешения на частоте 40 мггц и
поле 9400 э

молекул диполь-дипольное взаимодействие в значительной мере
усредняется и оба фактора (спин-решеточная релаксация и
диполь-дипольное взаимодействие) вносят приблизительно рав-
ный вклад в общую ширину сигнала ЯМР, имеющую порядок
миллигаусса.

Химический сдвиг. Существенное влияние на сигнал
ЯМР оказывают электроны атомов и молекул.

Внешнее магнитное поле влияет на движение электронов
внутри вещества, приводя к возникновению наведенного диамаг-
нитного момента в направлении, противоположном приложен-
ному полю. В результате эффективное поле у данного ядра будет
ниже, чем приложенное поле,— происходит магнитное экрани-
рование ядра. Величина экранирования пропорциональна внеш-
нему полю. Поэтому в точке, где находится^ ядро, эффективное
магнитное поле равно

Я = Я0(1-а),

где о — постоянная экранирования, зависящая от характера
электронного окружения.

Ядра одного вида в разных химических соединениях разли-
чаются распределением электронной плотности вокруг них и,
следовательно, имеют разные значения о. В результате появле-
ние резонанса данного ядра в разных химических группах
Рис. 6. Спектр высокого разрешения протонов этильной группы
подкисленного этанола при 40 мггц

происходит при различных внешних полях, их полосы поглоще-
ния смещены одна относительно другой и составляют некоторый
спектр. На рис. 5 показаны химические сдвиги отдельных групп
этилового спирта в спектре протонного магнитного резонанса
(ПМР) среднего разрешения. Спектр состоит из трех линий —
линии группы СН3, линии группы СН2 и линии группы ОН. Ин-
тенсивность линий 3:2:1 соответствует количеству протонов
в этих группах.

Протоны группы СН9

и

Протоны группы СН3

Ожидаемый
спектр

1 : 3 : 3 : /

Рис. 7. Возможные ориентации ядерных спинов протонов этильной группы и
ожидаемое спин-спиновое расщепление линий
Сверхтонкое расщепление. В спектрах высокого
разрешения ЯМР происходит симметричное расщепление сиг-
налов отдельных химических групп (рис. 6). Это расщепление
вызвано спин-спиновым взаимодействием ядер различных хими-
ческих групп через их электронное окружение. В отличие от
прямого диполь-дипольного взаимодействия оно не усредняется
при тепловом движении молекул и в отличие от химических
сдвигов не зависит от величины приложенного поля. В соответ-
ствии с возможными ориентациями спинов, например при
взаимодействии метиленовой и метильной групп, расщепление
для метиленовой группы СН2 представляет квартет с отноше-
нием интенсивностей 1 : 3 : 3 : 1, а для метильной группы— три-
плет с отношением интенсивностей 1:2:1 (рис. 7).

Энергия спин-спинового взаимодействия через электронное
окружение может быть представлена в виде скалярного произ-
ведения ядерных векторов /(1) и /(2):

Е12=4/(1)/(2),

где /12 — константа спин-спинового расщепления (/i2 имеет раз-
мерность энергии и обычно выражается в герцах).

в.	Экспериментальное наблюдение ядерного
магнитного резонанса

Схематически устройство спектрометра ЯМР показано на
рис. 8. Аппаратура состоит из трех основных частей: магнитной
системы, системы приема резонансного сигнала и детекторной
системы.

Магнитная система включает в себя магнит, обычно
электромагнит, источник питания обмоток электромагнита и си-
стему управления магнитным полем. Как правило, резонанса
достигают медленным линейным изменением напряженности
магнитного поля при фиксированной частоте генератора. Маг-
нитная система создает постоянное магнитное поле в направле-
нии оси г и обеспечивает развертку спектра ЯМР.

Система приема -резонансного сигнала состоит
из генератора высокочастотного напряжения, создающего поле
и приемника сигнала ЯМР. На ампулу с исследуемым об-
разцом надета небольшая катушка, расположенная в плоско-
сти xz/, на которую от генератора подается высокочастотное
напряжение. При резонансе регистрируют либо падение высоко-
частотного напряжения на настроенном контуре, в схему
которого входит катушка с образцом, из-за уменьшения г-ком-
поненты намагниченности (сигнал поглощения ЯМР), либо
появление наведенной электродвижущей силы в катушке, распо-
306
ложенной перпендикуляр-
но полю Но и катушке ге-
нератора, за счет появле-
ния при резонансе намаг-
ниченности в плоскости
ху, вращающейся с резо-
нансной частотой вокруг
направления поля Но
(сигнал ядерной индук-
ции).

Детекторная си-
стема представлена де-
тектором, серией каскадов
усиления и регистрирую-
щим устройством.

Общий вид спектро-
метра ЯМР высокого раз-
решения показан на рис. 9.
Современная фирменная
аппаратура ЯМР позво-
ляет наблюдать резонанс
протонов на частотах 40,
60 и даже 100 Мгц. Разре-
шающая способность сов-
ременных спектрометров
достигает свыше 10~8 от
резонансной частоты. Чув-

Рис. 8. Блок-схема спектрометра ЯМР

ствительность при опти-

мальных условиях составляет около 5-1017 протонов в образце.
Однако обычно требуется 1018—1019 протонов для получения не-
обходимого превышения сигнала над шумом.

г.	Применение спектроскопии ЯМР высокого разрешения

Наиболее важным параметром спектров ЯМР высокого раз-
решения является химический сдвиг. Положение линий в шкале
химических сдвигов отсчитывают от определенных эталонных
опорных сигналов. Эти расстояния выражают либо в единицах
напряженности магнитного поля или частоты, либо в более
удобных безразмерных единицах д, определяемых равенством
rj _______________________________я

$__1J образца этало на , |ge

Н
11эталона

и измеряются в миллионных долях (м. Д.).

В качестве опорного сигнала удобно брать узкий сигнал,
удаленный от других линий спектра. Обычно в исследуемое
Рис. 9. Спектрометр ЯМР высокого разрешения JNM-3
фирмы «Electron optics» — Япония

вещество добавляют небольшое количество эталонной жидкости
или в качестве эталона используют сигнал от растворителя
(внутренний эталон). Более предпочтительны внешние эталоны,
когда эталонную жидкость запаивают в капилляр, который по-
мещают внутрь ампулы с исследуемым веществом. Сдвиги,
измеренные относительно тетраметилсилана как внутреннего
эталона, часто выражают в т-шкале, определяемой соотноше-
нием

тмд = 10,00+ 6*,

где 6*— сдвиг относительно SifCHsh в 6-шкале.

Рассмотрим типичные приложения спектроскопии ЯМР высо-
кого разрешения к биологическим проблемам.

Определение первичной химической структу-
ры биологически -активных молёкул. Возможность
определения химической структуры сложных молекул основана
иа следующих положениях.

1.	Место резонансной линии в шкале химических сдвигов ха-
рактеризует электронное окружение ядра и соответствует опре-
деленным химическим группам. Это дает возможность иденти-
фицировать отдельные химические группы в сложных молекулах.

2.	Изучение распределения интенсивностей позволяет устано-
вить относительное содержание различных химических групп в
молекуле.

308
3.	Анализ сверхтонкого расщепления линии свидетельствует
о характере и расположении ближайших соседей дайной хими-
ческой группы.

Из-за отсутствия единого эталона возможны отклонения в
положении химических сдвигов отдельных линий, однако области
спектра, соответствующие определенным химическим группам,
хорошо изучены и линии могут быть строго отождествлены.
В настоящее время составлены таблицы химических сдвигов от-
дельных групп для многих природных соединений.

Как правило, в водных растворах не удается наблюдать ха-
рактеристических пиков таких биохимически важных групп, как
карбоксила, карбоиилгидроксила, амино-, имино-, амидо-, сульф-
гидрильной групп, так как происходит быстрый обмен протоиов
этих групп с протонами воды, причем интенсивный пик воды
заслоняет значительную часть спектра. Поэтому обычно биоло-
гически важные соединения исследуют в растворах DgO и на-
блюдают при этом иеобмеииваемые с растворителем протоны.

Рассмотрим несколько примеров определения химической
структуры биологически важных молекул методом ЯМР. Спектр
ЯМР новой аминокислоты растений, выделенной из семяи арбу-
за, позволил идентифицировать в ее структуре пиразол и уста-
новить, что эта аминокислота является р—1-пиразолилаланином
[9]. Кон, используя ЯМР в сочетании с другими методами, опре-
делил структуру и конформацию обнаруженного в РНК нового
нуклеозида псевдоуридииа [10]. Спектр ЯМР был использован в
установлеийн химического строения нового антибиотика псико-
фуранина (11].

Другой аспект химического строения, решаемый методом
ЯМР, заключается в установлении места протонизации в резуль-
тате ферментативной реакции или обмена протона с раствори-
телем.

Титрование амино- или карбоксильных групп аминокислот в
результате протоннзации или депротоиизации вызывает изме-
нение электронной плотности и сдвиг резонансных пиков прото-
нов, присоединенных к близлежащим атомам углерода; эффект
от более удаленных протонов значительно слабее [12]. Аналогич-
ные кривые титрования получены для аминопроизводных пуринов
и пиримидинов [7]. При этом наблюдают заметные сдвиги резо-
нансных пиков необменнваемых протоиов гетероциклического
кольца, которые удалены от аминогруппы. Это .свидетельствует
о том, что протоны присоединяются скорее к азоту кольца, чем
к аминогруппе. В случае адениииуклеозида и нуклеотида боль-
ший сдвиг С-2 протона согласуется с протонизацией азота пи-
римидина, вероятно N-1, в то время как в случае гуаниннуклео-
тида большой сдвиг С-8 протона указывает, что происходит
протонизация N-7 амидазольиого кольца, т. е. образуются струк-
туры

21 Физические методы исследования белков	309
nh2

I

C N

>CH

HCU\/Z

N N

R—O—P03

О

11

C N+H

hn/VK

>CH

H2NC\A /
N N

R-O-PO3

Площадь сигнала, химический сдвиг и константы спин-спино-
вого расщепления позволяют также сделать выводы о характере
присутствующих таутомеров. Получены, например, данные по
таутомерии восьми основных рибо- и дезоксирибонуклеозидов
[13]. Результаты такого рода представляют особый интерес в свя-
зи с современными теоретическими представлениями о роли тау-
томеров компонент нуклеиновых кислот в процессе мутагенеза.

Исследование распределения заряда в био-
логически активных молекулах. Изменение электрон-
ной плотности влияет на химические сдвиги и дает возможность
исследовать распределение заряда в молекуле. Например, спектр
ЯМР пиридина показывает, что электронная плотность распре-
делена таким образом, что примерно 60% заряда локализуется
на атоме азота [14].

В общем случае, когда химические группы присоединены к
ароматическим кольцам, резонанс наблюдается при более низких
полях, чем в случае алкилпроизводных, под действием «кольце-
вых токов».

Спектры ЯМР порфиринов [15] отчетливо- показывают нали-
чие в кольце большого Тока, Обусловленного системой л-электро-
нов. Однако простой учет этого тока не мог объяснить разницы,
наблюдаемой в химических сдвигах отдельных протонов моле-
кулы. Удовлетворительное объяснение дает гипотеза Полинга,
использованная при вычислении диамагнитной анизотропии по-
лициклических систем. Полинг трактовал углеродный скелет та-
ких соединений как проводящую электрическую сеть, причем
электромагнитное поле считалось пропорциональным площади,
заключенной в каждой петле тока, а сопротивление — числу
связей.
Электроотрицательные группы, такие, как ОН, NH2, С = О,
сдвигают резонансные пики в область более низких полей, когда
они присоединены к соединениям с открытой цепью, так как
уменьшают электронную плотность у магнитного ядра. При при-
соединении к ароматическим веществам они вызывают сдвиг
пиков в противоположном направлении, что можно объяснить
нарушением свободной циркуляции электрона по кольцу и, таким
образом, уменьшением эффекта наведенного тока кольца [7].

Увеличение экранирования СН-протонов при помощи элект-
роотрицательных заместителей наблюдалось для пуринов и пи-
римидинов [16].

Наши знания о распределении электронной плотности в коль-
цах пуриновых и пиримидиновых оснований в растворе весьма
недостаточны. Как известно, эти соединения обладают высокой
специфичностью в ферментативных реакциях, а различные их
производные выполняют роль метаболитов или антиметаболитов.
Поэтому получение данных о распределении заряда и конформа-
ции этих молекул в различных биологических соединениях весьма
существенно для понимания их функционирования.

Некоторые авторы сопоставляют связь канцерогенности по-
лициклических ароматических соединений с характеристическим
распределением электронной плотности в них [17]. Методом ЯМР
можно получить экспериментальные данные, подтверждающие
или опровергающие гипотезу о наличии такой корреляции.

Исследование конформации^ или вторичной
и третичной структуры. Спин-спиновое расщепление, по-
явление разных Сигналов для химически эквивалентных ядер, из-
бирательное изменение ширины линии и другие характеристики
спектров ЯМР могут дать ценную информацию о конформации
молекул.

Исследование компонент нуклеиновых кислот — пуринов и
пиримидинов, нуклеозидов и нуклеотидов — методом ЯМР [16,
18—21] позволило получить существенные данные об их конфор-
мации в растворе. Например, было установлено, что кольца ри-
бозы и дезоксирибозы не являются плоскими, причем конфор-
мация кольца рибозы зависит от вида нуклеотида [18], а кон-
формация нуклеотида — от наличия рибозы или дезоксирибозы
[19—21].

Для объяснения роли адениновой части молекулы аденозйн-
трифосфорнрй кислоты (АТФ) в ферментативных реакциях с
участием двухвалентных ионов металла некоторые авторы пред-
полагали, что комплекс металлфосфат может загибаться назад
на аденин, образуя при этом хелатную структуру. Этот процесс
вызвал бы перераспределение электронной плотности в плоско-
сти аденинового кольца, что может быть зарегистрировано ме-
тодом ЯМР по изменению химических сдвигов. Однако экспери-
ментально было показано, что химические сдвиги протонов в
положении 8, 2 и 1 одинаковы для АТФ, Mg-АТФ и Са-АТФ [22,
23]. Этот факт заставляет считать, что предполагаемая конфор-
мация для комплексов Mg++ и Са++ с АТФ в условиях экспери-
мента маловероятна.

Были обнаружены корреляции между конформацией белков
в растворе и характером их спектров ЯМР. В отличие от низко-
молекулярных веществ движение молекулы полимера как цело-
го не может вызвать усреднения локальных полей, достаточного
для получения высокоразрешенного спектра ЯМР. С увеличением
молекулярного веса, как правило, разрешенность спектра белка

Рис. 10. Спектры протонного магнитного резонанса 20%-ной рибонуклеазы
в D2O

Л—спектр рибонуклеазы; Б —то же, в присутствии 8 М мочевины; В—спектр окислен-
ной рибонуклеазы

ухудшается. При этом нужно учитывать, что степень разрешен-
ное™ спектра и ширина сигнала ЯМР для полимера в растворе
зависят главным образом от сегментарной подвижности поли-
мерных цепей, уменьшающей диполь-дипольные взаимодействия.
В случае глобулярных белков такая подвижность в значительной
мере затруднена из-за внутримолекулярных связей. Эти связи
приводят к образованию специфической конформации в виде
компактной сферы или эллипсоида и для многих белков в натив-
ном состоянии спектр ЯМР вообще не наблюдается.

При различных денатурационных воздействиях отмечается
увеличение интенсивности и разрешенности спектра белка [24, 25].
Например, для многих белков наблюдали увеличение разрешен-
ности спектров в концентрированных растворах мочевины и в
трифторуксусной кислоте, где происходит разрыв внутримолеку-
лярных водородных связей и переход белковой молекулы из
а-спиральной конфигурации в беспорядочный клубок (рис. 10).
У рибонуклеазы с разрушенными водородными связями окисле-
ние дисульфидных сшивок еще больше увеличивает разрешен-
ность спектра [26, 27]. В случае бычьего сывороточного альбумина
и альдолазы окисление дисульфидов почти не влияет на характер
спектра. Возможно, что этот факт отражает различия в положе-
нии дисульфидных связей в этих молекулах.

Для синтетических полипептидов методом ЯМР исследованы
переходы спираль — клубок в зависимости от вида растворителя
[25, 28] и температуры [28]. Метод позволяет определить процент
спирализации и его изменение в зависимости от условий среды.

Аналогично белкам и полипептидам характер спектров поли-
нуклеотидов и нуклеиновых кислот и изменения спектров с изме-
нением температуры позволяют установить наличие упорядочен-
ной структуры и ее плавление [29,30]. Комплекс (полиА + полиУ)
и двутяжевая ДНК при температуре ниже температуры плавления
имеют слишком большую ширину линий, не обнаруживаемую
спектроскопией высокого разрешения. Это обусловлено сильным
ядерным диполь-дипольным взаимодействием в жесткой двуспи-
ральной структуре этих соединений. При плавлении возникают
пики, характерные для протонов мононуклеотидов.

Для полинуклеотидов в случае полиУ спектр незначительно
отличается от спектра мононуклеотидов и не меняется с увеличе-
нием температуры. Для полиЦ характерны слабые изменения
спектра с изменением температуры, а в случае полиА обнаружи-
ваются заметные изменения спектра. Эти результаты свидетель-
ствуют об отсутствии какой-либо упорядоченной структуры для
полиУ, слабой упорядоченности в случае полиЦ и наличии опре-
деленной структуры для полиА, сохраняющейся частично вплоть
до 60°. Получены первые результаты по температурной зависи-
мости ЯМР-спектров растворимой РНК [29].

Таким образом, можно получить ценные результаты о вторич-
ной и третичной структурах макромолекул по изменению их спек-
тра ЯМР при действии различных агентов, изменяющих внутри-
молекулярные связи и, следовательно, характер внутримолеку-
лярных движений.

И з у ч е н и е с к о р о с т е й процессов и молекуляр-
ного движения. ЯМР успешно применяется для исследова-
ния скоростей как очень быстрых обменных процессов, так и
медленных процессов изотопного замещения.

При наличии обмена между химическими группами вид спек-
тра ЯМР будет различным в зависимости от скорости обмена.
Если среднее время жизни т данного ядра в каждой химической
группе велико по сравнению со временем, затрачиваемым на пе-
реход, то будут наблюдаться два отдельных пика, соответствую-
щих обеим химическим группам. Картина меняется, если ско-
рость обмена настолько велика, что время жизни в каждом хи-
мическом состоянии много меньше времени перехода между ними.
В этом случае наблюдается одна узкая линия в положении, про-
межуточном между обеими группами (рис. И). Положение этой
линии смещается линейно в зависимости от концентрации той и
другой групп, совпадая в крайних точках с положением линий в
отсутствие обмена. Положение резонансной линии можно изме-
рить проще и гораздо точней, чем ее интегральную интенсивность.
Поэтому ЯМР является удобным методом для измерения кон-
станты скоростей и порядка реакций, которые трудно исследо-
вать другими способами. Наиболее удобны для изучения реакции
со средним временем жизни реагирующих соединений между 0,1
и 0,0005 сек. Возможности этого направления в приложении к
скорости биохимических процессов все еще недостаточно иссле-
дованы.

Рис. 11. Схематическое представле-
ние изменения формы резонансных
линий при обмене протонов между
двумя магнитно неэквивалентными
положениями А и В для [А]/[В]=1 в
зависимости от скорости обмена

а — т ~ 100/2	б-т~

~ 10У2(тЛАВН)-\ в-т-рТ
(лблвй)-г; г — т-0,01/2

-6мН/2

★SMH/2

Развертка магнитного поля

Кинетика медленного изотопного замещения легко регистри-
руется по изменению площади сигнала с течением времени. Виш-
ня и Саундерс исследовали кинетику обмена протонов NH-rpynn
рибонуклеазы в D2O в кислой области [31]. Было обнаружено, что
часть протонов обменивается гораздо медленнее других. Изуче-
ние этого явления привело авторов к заключению, что медленно
обмениваемые протоны принадлежат гуанидиновым группам ар-
гинина. При помощи ЯМР исследовали кинетику дейтерирования
ряда белков и ее связь со стабильностью белковой молекулы и
механизмом денатурации физическими и химическими агента-
ми [32].

Взаимодействие между молекулами. При помо-
щи ЯМР по изменению химических сдвигов, ширины линии
-----) и значения У можно обнаружить и изучить специфиче-
ское и неспецифическое взаимодействие между молекулами и об-
разование комплексов с металлами.

Водородная связь. Резонансный пик протонов, связан-
ных водородной связью, наблюдается при более низких полях,
чем для протонов, присоединенных к тому же атому в отсутствие
водородной связи. Это происходит за счет уменьшения в резуль-
тате электростатического взаимодействия эффективной элек-
тронной плотности у протона. Например, измерение химических
сдвигов протонов воды в концентрированных растворах бычьего
сывороточного альбумина показало, что при этом не происходит
изменения числа водородных связей по сравнению с чистой во-
дой [33]. Так как в бычьем сывороточном альбумине имеется око-
ло 40% гидрофобных остатков, Бови заключил, что на гидрофоб-
ных частях белка водородные связи молекул воды друг с другом
приводят к образованию ориентированных слоев воды.

Взаимодействие воды с биологическими
структурами. Многочисленные данные ЯМР по взаимодей-
ствию воды с биополимерами не позволяют в настоящее время
сделать однозначных выводов о характере такого взаимодейст-
вия. Этот вопрос подробно рассмотрен нами в специальном обзоре
по применению ЯМР в биологических исследованиях [8].

Комплексообразование с металлами. При помо-
щи ЯМР получено первое прямое доказательство различия фос-
фатных групп АТФ в образовании комплексов с металлами [26}.
Химические сдвиги фосфорных пиков показывают, что ионы
Mg++, Са++ и Zn++ образуют комплексы преимущественно с дву-
мя концевыми фосфатными группами АТФ.

Определение химических групп, участвую-
щих в образовании специфических комплексов.
С этой целью были проведены исследования взаимодействия пе-
нициллина и стрептомицина с сывороточным альбумином [34] и
комплекса энзим — коэнзим в случае никотинамиддинуклеотида
(НАД) и алькогольдегидразы [35]. Применение ЯМР в исследова-
ниях такого рода ограничено малой чувствительностью метода,
требующей сравнительно высокой концентрации исследуемых мо-
лекул в.растворе. Дополнительное использование многоканаль-
ного цифрового анализатора позволило Жардецкому и другим
[35] повысить чувствительность ЯМР-спектрометра в 20 раз. Ме-
тодика обеспечила возможность исследования спектра ЯМР
0,002 М раствора НАД в D2O. В спектре НАД в присутствии
алкогольдегидразы происходит исчезновение пиридиновой части
спектра, что является прямым указанием на определяющую роль
пиридиновой части молекулы при взаимодействии НАД и фер-
мента.

д. Применение спектроскопии ЯМР низкого разрешения

Спектроскопия ЯМР низкого разрешения дает ценную ин-
формацию о строении молекул в твердой фазе, позволяя опреде-
лить положение протона и других ядер, а также исследовать
релаксационные процессы, подвижность молекулы и отдельных
ее частей.
Основными характеристиками линии ЯМР в спектроскопии
низкого разрешения являются ширина сигнала, его моменты,
форма линии, наличие тонкой структуры.

Под формой линии подразумевается математический закон,
описывающий кривую интенсивности поглощения. Гауссова
форма линии характерна при дипольном взаимодействии ядер-
ных моментов, так как величина локальных полей распределя-
ется согласно вероятностному закону Гаусса. Лоренцева форма
возникает при наличии интенсивного движения в результате
сильного обменного взаимодействия.

Функции гауссовой и лоренцевой формы описываются соот-
ветственно выражениями

(Н-Нр)8

1г = 10е	,

т---------Ь______

Д№л

и определяются значениями максимальной интенсивности /0 и пара*
метрами АНГ и АНЛ, связанными с полушириной линии соотноше-
ниями

\НГ =	ЬНЛ= -L ДЯ7з,

2 In 2	2	'

а с шириной линии между точками максимального наклона 6Я соот»
ношениями

АЯГ =

2	2 "

Ширина линии твердых тел и полимеров обычно лежит в области
между 30 и 0,1 гаусса [36]. Такая ширина почти всецело обуслов-
лена прямым ядерным диполь-дипольным взаимодействием. Так как
площадь сигнала ЯМР пропорциональна числу' протонов, то большая
ширина линии соответствует очень малой интенсивности. Поэтому
для регистрации широких линий ЯМР поле Н() модулируется звуко-
вой частотой им с амплитудой Ны < ДЯ*/2. R результате модуляции
возникает сигнал с частотой wM, амплитуда которого пропорциональна
производной кривой поглощения (рис. 12). Это дает возможность
применить узкополосный усилитель, что значительно увеличивает
отношение сигнала к шумам. На выходе этот сигнал подвергается
синхронному (фазовому) детектированию, постоянная времени инте-
грирующей PC-цепочки обычно составляет от 1 до 10 сек.

Аппаратурные искажения. Как легко видеть, при записи
производной сигнал пропорционален амплитуде модуляции. При слиш-.
ком большом увеличении Нк происходит искажение формы линии,
поэтому необходимо соблюдать

правило Нм <" — ЬН. Конечная вели-
10

чина амплитуды модуляции приводит к тому, что вычисленный из
данных опыта второй момент несколько превышает истинную величину
АЯГ. В действительности второй момент меньше экспериментального
на величину — //м[37].

4

Сигнал нельзя увеличивать за счет увеличения радиочастот-
ного поля Нь так как необходимо избегать насыщения. Насы-
щение особенно сильно ска-

зывается при исследовании
объектов с длинным време-
нем релаксации Ти посколь-
ку скорость восстановления
больцмановского равновесия
в этом случае мала. Напри-
мер, из-за длинного времени
релаксации и сильного на-
сыщения ядерный резонанс
в чистой воде трудно наблю-
даем; для уменьшения вре-
мени релаксации и степени
насыщения обычно вводят
добавки парамагнитных со-
лей, медный купорос и др.
Небольшая добавка медного
купороса резко сокращает вре
ствия неспаренного электрона

Рис. 12. Модуляция поглощения

мя релаксации за счет взаимодей-
иона Си++ с протонами воды. Это

приводит к значительному усилению сигнала протонного резо-
нанса.

Насыщение не существенно при условии:	< 1 или

/ g/у \‘/i

------1* , что для 7\ = 1 сек. и'бЯ = 5 гс дает Нг<15 мгс.
\ тЛ /д

В простейшем случае (линия без структуры) насыщение уменьшает
интенсивность сигнала в (1 4- у2Н1Т1Т^ раз и во столько же раз
уширяет кривую. Для линий поглощения со структурой влияние
насыщения более сложное.

Высокая скорость прохождения по спектру при использовании
фазового детектора также вызывает искажение формы линии ЯМР.
Обычно скорость записи v и постоянную времени т/?С-цепочки на
выходе фазового детектора необходимо выбирать таким образом, чтобы
было выполнено условие xv<^~0H [37].

/Ядерное диполь-дипольное взаимодействие. Рас-
смотрим наиболее простой случай взаимодействия двух ядер с поло-

винными спинами.
Компонента магнитного момента одного ядра создает в точке
расположения другого ядра локальное магнитное поле Hnw\

//лок = Л(3с°з20-1)-
г3

где г — расстояние между ядрами; 0 — угол между осью z и радиу-
сом-вектором, соединяющим ядра.

Суммарное магнитное поле в точке расположения второго ядра
равно

Н = Нй± ^-(3cos20—1).

В результате происходит расщепление линии ЯМР на две ком-
поненты. Квантовомеханический расчет дает для величины рас-
щепления дополнительный множитель 3/2:

Я = Яо±|-й-(Зсо520-1).

В общем случае диполь-дипольного взаимодействия многих
ядер происходит уширение линии и прямое вычисление контура
линии оказывается непригодным. Однако форму линии можно
охарактеризовать некоторыми интегральными характеристика-
ми — моментами линии ЯМР. Удалось показать [33], что второй
момент линии поглощения ЯМР

ОО

АН2 = -2---------------,

2	ОО

О

где g(H) —функция формы, все же позволяет получить очень
ценную информацию о структуре вещества в твердой фазе. Зна-
чение А//2 легко можно получить из экспериментальной кривой
графическим или численным интегрированием.

Теория Ван-Флека дает в явном виде выражение для ДН2
через межъядерные вектора с учетом их ориентации относитель-
но магнитного .поля Яо--Поэтому можно постулировать модель
структуры исследуемого вещества, в которой эти вектора при-
обретают значения параметров, и судить о достоверности моде-
ли путем сравнения вычисленных и измеренных значений.

Например, были получены линии поглощения ядер водорода,
лития и фосфора для литиевой соли ДНК [38]. Резонанс фосфора
оказался достаточно чувствительным показателем вторичной
структуры ДНК- Экспериментальное значение второго момента
(1,91 ±0,05 ас2) находится в хорошем соответствии с теоретиче-
ским значением для одной из возможных структур ДНК («форма
в модели 3») [39].

Внутримолекулярные движения приводят к усреднению ло-
кальных магнитных полей и, следовательно, к сужению линии
ЯМР. Ширина линии ЯМР полимерных молекул связана с ло-
кальной подвижностью групп и сегментов, которая, в свою оче-
редь, определяется количеством, видом и длиной боковых цепей,
наличием внутрицепочечных и межцепочечных связей. Измере-
ния, проводимые при низких температурах, соответствуют затор-
моженным внутримолекулярным движениям и приближаются к
модели жесткой решетки. Скачкообразное уменьшение ширины
линии при повышении температуры свидетельствует о появлении
новых степеней свободы и дает возможность вычислить энергии
активации их размораживания, а также времена корреляции для
движений, приводящих к сужению линии. Для синтетических по-
липептидов — полиаланина, полилейцина, полифенилаланина
(ПФА), поли-у-бензилглютамата (ПГБГ), полинатрийглутама-
та—температурная зависимость второго момента в значительной
степени определяется движением боковых групп и сегментов [40].
При 77° К ПФА и ПГБГ имеют жесткую решетку, а у полиалани-
на и полилейцина остаются вращательные степени свободы части
метильных групп. При увеличении температуры выше 120° К про-
исходит размораживание вращения всех метильных групп для
последних двух полимеров. Уменьшение второго момента в обла-
сти 120—400° К для полилейцина и ПФА определяется увеличени-
ем средней амплитуды колебаний изобутильной и бензильной
групп соответственно.

Спектры ЯМР белков и полипептидов состоят из узкого пика,
наложенного симметрично на широкую линию. Узкий пик в ос-
новном обусловлен сорбированной водой, при постепенном высу-
шивании образца он уменьшается и почти исчезает [41, 42]. Воз-
можно, что остатки узкой составляющей сигнала принадлежат
аморфным областям белков и полипептидов [42]. Как известно,
для полимеров широкая часть сигнала обусловлена кристалли-
ческими участками и обычно может быть представлена гауссо-
вой кривой, тогда как узкая линия, соответствующая более по-
движным аморфным участкам, описывается лоренцевой кривой.
Простой и точный метод анализа формы линии заключается в
построении линейных анаморфоз [43]. Исходя из теоретических
формул для гауссовой и лоренцевой форм линий эксперименталь-
ные точки откладываются соответственно в двух системах коор-
динат;

1п-^ = да-яоп

^-1=/[(Я-/70П
Применение этих координат обращает гауссову и лоренцеву
кривые в прямые линии. Возможность спрямления эксперимен-
тальной кривой позволяет однозначно установить форму лини?!,
а из угла наклона прямой определить ширину линии со значи-
тельно большей точностью. Для многофазной системы можно
ожидать нескольких прямолинейных участков.

Изменение ширины и структуры линии для кристалла при
различных его ориентациях по отношению к внешнему полю поз-
воляет определить локализацию протонов, что трудно достижимо
другими методами. Таким способом было установлено, что NH3-
группа в глицине является правильным тетраэдром, ось кото-
рого лежит вдоль С—N-связи, а длина N—Н-связи равна
1,077±0,01 А [44]. Аналогично для ориентированных волокон
коллагена удалось показать, что молекулы воды образуют на по-
верхности коллагена цепочку; ориентированные вдоль направле-
ния оси белка [45].

е. Применение метода спинового эха

Метод спинового эха дает возможность измерять времена релаксации 7\
и Т2 и константу диффузии вещества. Рассмотрим, например, как определяется
Г2. В результате спин-спиновой релаксации х- и (/-компоненты намагничен-
ности убывают пропорционально е и амплитуда эха к моменту времени
_2£

/ик2т уменьшается на множитель е Tz . Поэтому если изменять время т, то
зависимость амплитуды эха от т дает возможность определить значение Т2.

Спин-эхо широко применяется для изучения комплексообразования пара-
магнитных ионов с биополимерами. Этим методом можно получить важные
данные о роли ионов металла в ферментативном катализе.

В присутствии в растворе парамагнитных ионов, магнитный момент кото-
рых на несколько порядков больше магнитного момента протонов, скорость
релаксации протонов воды заметно увеличивается. Это вызвано в основном
флуктуациями магнитного поля в гидратной оболочке иона. Быстрый обмен
протонов гидратной оболочки с остальной массой воды приводит к распро-
странению эффекта на весь объем. Если в раствор парамагнитных ионов до-
бавлены полимерные молекулы, то наличие и характер комплекса между
ионом и полимером приведет к изменению скорости релаксации протонов во-
ды. Эффективность воздействия парамагнитного иона на релаксацию зависит
от числа связанных с ним молекул воды и времени корреляции иона и про-
тонов воды.

Молярная скорость релаксации 7?0, равная
п =д_/д______________________________L\

0 N Го	Тх ) ’

где N—молярная концентрация парамагнитного иона; Tt—время релаксации
протонов в растворе без парамагнитных ионов; Т® — время релаксации про-
тонов в присутствии парамагнитных ионов при связывании иона изменяется в
8 раз;

я* ~ т°

в — ----------,

Ro к
tAe Индекс * относится к комплексу, а индекс 0 — в отсутствие комплексооб-
разования.

Учитывая формулу Соломона — Бломбергена [46]

г6

где р — вероятность нахождения молекулы воды в координационной сфере пара-
магнитного иона; гс —время корреляции для дипольного взаимодействия иона и про-
тона; г — расстояние между ионом и протоном; В — постоянная в условиях, часто
реализующихся в эксперименте, получаем

т[ Р°т2

При комплексообразовании р может только уменьшиться, так как вода в гид-
ратной оболочке замещается другими связями.

Время корреляции определяется в основном двумя величинами: хг и ts

где хг — время корреляции для вращательного движения гидратной оболочки
*

(	Хг	\

иона [обычно — > 1 ); rs— время электронной спиновой релаксации парамаг-

\	ХГ	)

нитного иона; значение Ts можно получить методом электронного парамагнитного
резонанса.

Эйзингер и другие исследовали связывание парамагнитных ионов молекулами
ДНК и природу этих комплексов [47]. Увеличение протонной релаксации (8 > 1) для
ионов Мп++, Си++, Сг+++ в присутствии ДНК показывает, что эти ионы связы-
ваются снаружи, по-виднмому, фосфатными группами ДНК. Для Fe+++ можно
предполагать хелатное связывание ионов между основаниями внутри молекул
ДНК- Ионы Ni++, Со++, Fe++, по всей вероятности, не связываются молекулами
ДНК (8 =1).

По изменению скорости молярной релаксации было показано образование
третичных комплексов фермент—металл—субстрат для креатинкииазы, Мп++,
АДФ и энолазы Мп44* фосфопирувата (или фосфоглицерата) и выявлены ха-
рактерные особенности этих комплексов [48].

Метод спинового эха позволяет исследовать гидратацию биологических
объектов. Например, измерение коэффициентов диффузии молекул воды
в 4%-ном растворе вируса табачной,мозаики (ВТМ) позволило заключить, что
количество прочно связанной воды составляет не более 3% [49]. Такое количе-
ство связанной воды можно рассматривать как обычную гидратацию ионных
групп поверхности вируса. Этот факт опровергает выдвигавшееся ранее пред-
положение о наличии протяженной гидратной оболочки вокруг ВТМ [50].

Л ИТЕРАТУРА

1.	Д. Инграм. Электронный парамагнитный резонанс в свободных радика-
лах. М., ИЛ, 1961.

2.	Л. А,- Б лю м енфе льд, В. В. Воеводский, А. Г. Семенов. Элек-
тронный парамагнитный резонанс и его применение в химии. Новосибирск,
Изд-во СО АН СССР, 1962.

3.	Дж. Пейк. Парамагнитный резонанс. М., изд-во «Мир», 1965.

4.	Свободные радикалы в биологических системах. М., ИЛ, 1963.
5.	А. Э. К а л м а н с о н. Усп. биол. химии, 1963, 5, 385.

6.	Р. В. S о g о, В. М. Т о 1 b е г t. Adv. Biol. Med. Phys., 1957, 5, 1.

7.	O. Jardetzky, C. D. Jardetzky. «Introduction to Magnetic Resonance
Spectroscopy» in D. Glick. Ed. Methods of Biochemical Analysis, 1962, 9,
235.

8.	В. И. Брусков. Биофизика, 1966, 11, 195.

9.	L. F о w d e n et al. Proc. Chem. Soc., 1959, 131.

10.	W. E. С о h n. J. Biol. Chem., 1960, 235, 1488.

11.	W. Schroeder, H. Hoeksema. J. Amer. Chem. Soc., 1959, 81, 1767.

12.	C. D. Jardetzky, O. Jardetzky. J. Biol. Chem., 1958, 233, 383.

13.	L. G a 11 i n, J. C. J. D a v i s. J. Amer. Chem. Soc, 1962, 84, 4464.

14.	J. C. S m i t h, W. G. S c h n e i d e r. Canad J. Chem., 1961, 39, 1158.

15.	R. J. A b r a h a m. Mol. Phys., 1961, 4, 145.

16.	C. D. Jardetzky, O. Jardetzky. J. Amer. Chem. Soc., 1960, 82, 222.

17.	В.	P	u 11 m a n, A. P u 11 m a n. Cancer Research, 1959, 19, 337.

18.	C.	D.	J a r d e t z k y. J. Amer.	Chem. Soc.,	1960, 82, 229.

19.	C.	D.	J a r d e t z k y. J. Amer.	Chem. Soc.,	1961, 83, 2919.

20.	C.	D.	J a r d e t z k y. J. Amer.	Chem. Soc.,	1962, 84, 62.

21.	R. U. Lemieux. Canad. J. Chem,, 1961, 39, 116.

22.	G. G. H a m m e s, G. E. M a c i e 1, J. S. W а и g h. J. Amer. Chem. Soc., 1961,
83 2394

23.	M.'Cohn, T. R. Hughes. J. Biol. Chem., 1961, 237, 176.

24.	M. S a u n d e r s, A. W i s h n j a. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1958, 70, 870.

25.	E. В ov ey et al. J. Polymer Sci., 1959, 38, 73.

26.	P. O. Boyer. Protein Structure and Function. Brookhaven Symposia in
Biology № 13. 1960.

27.	А. К о w a 1 s k y. J. Biol. Chem., 1962, 237, 1807.

28.	M. Goo dm an, I. M a su d a. Biopolymers, 1964, 2, 107.

29.	I. P. M с T a g u e, V. Ross, I. H. G i b b s. Biopolymers, 1964, 2, 163.

30г С. C. McDonald, W. D. Phillips, S. Penman. Science, 1964, 144,
1234.

31.	A. W i s h n j a, M. S a u n d e r s. J. Amer. Chem. Soc., 1962, 84, 4235.

32.	R. Mason, B. N. Figgis. Adv. Mol. Spectrosc., 1962, 3, 1240.

33.	F. А. В о v e y. Nature, 1961, 192, 324.

34.	O. Jardetzky, J. J. Fischer. Forth Intern. Conf. Med. Electr., July
1961.

35.	O. Jardetzky, N. G. Wade, J. J. Fischer. Nature, 1963, 197, 183.

36.	J. G. Powles, Polymer (1960), 1, 219.

37.	И. M. Александров, Ф. И. Скрипов. Усп. физ. наук, 1961, 75, 585.

38.	С. В г о t, Н. С z w а г с. J. Chim. Phys, et Phys.-Chim. Biol., 1963, 671.

39.	R. L a n g r i d g e et al. J. Mol. Biol., 1960, 2, 38.

40.	J. A. E. Kail, J. A. Sauer, A. E. W о о d w a r d. J. Phys. Chem. (1962),

66, 1292.

41.	G. F i 1 i p о v i c h. J. Polymer Sci., 1962, 60, S37.

42.	С. H. Журков, E. А. Егоров. Высокомолекулярные соединения, 1963,
5, 772.

43.	H. Н. Тихомирова, В. В. Воеводский. Оптика и спектроскопия,
1959, 7, 829.

44.	W. Е. W е b b, W. G. М о u 11 о n. J. Chem. Phys., 1962, 36, 1911.

45.	Н. В е г е n d s е n. J. Chem. Phys., 1962, 36, 3297.

46.	J. Solomon, N. В 1 о e m b e r g e n. J. Chem. Phys., 1956, 25, 261.

47.	J. Eisihger, R. G. Shulman, В. M. Szymansky. J. Chem. Phys.,
1962, 36, 1721.

48.	M. С о h n, J. S. L ei g h. Nature, 1962, 193, 1037.

49.	D. C. Douglass, H. L. Frisch, E. W. An d er so n. Biochim. et biophys.
acta, 1960, 44, 401.

50.	C. D. Jardetzky, O. Jardetzky.' Biochim. et biophys. acta, 1957, 26,
668.
Оглавление

Предисловие........................................................ 5

Глава I. Рентгеноструктурный анализ биополимеров (Я. С. Андреева) 11

1.	Рентгеновская структурная кристаллография белков и вирусов 12

2.	Исследование строения фибриллярных структур ....	45

3.	Дифракция рентгеновских лучей под малыми углами на во-
локнах и растворах биополимеров.............................61

Глава II. Электронная микроскопия..................................70

I.	Методы электронномикроскопических исследований биологи-
ческих макромолекул (Я. А. Киселев, В. Ф, Маняков) , .	70

2.	Исследование ультратонких срезов (Ю. С. Ченцов)	.	•	97

Глава III. Оптические методы......................................113

1.	Спектрофотометрия в области электронных переходов
(М. Д. Франк-Каменецкий)...................................115

2.	Инфракрасная спектроскопия (/О. Я. Чиргадзе) .	.	.	132

3.	Спектрополлриметрия (В. И. Пермогоров) ....	148

4.	Люминесценция (Л, А. Тумерман) .	166

Глава IV. Гидродинамические методы (/О. Я. Кфсаганов, Э. Н. Три-
фонов) ......................................................222

1.	Вискозиметрия......................................223

2.	Метод ультрацентрифугирования......................238

3.	Двойное лучепреломление в потоке...................274

Г л а в а V. Электронный парамагнитный и ядерный магнитный резонанс. 289

1.	Электронный парамагнитный резонанс	(Л.	А.	Блюменфельд)	289

2.	Ядерный магнитный резонанс (В. Я.	Брусков)	....	297
Физические методы
исследования белков
и нуклеиновых кислот

Утверждено к печати
Научным советом
по проблемам молекулярной биологии
Академии наук СССР

Редактор Г. С. Столярова

Редактор издательства И. Б. Ветрова

Технический редактор А. П. Ефимова, В, Д, Прилепская

Сдано в набор I9/XI 1966 г. Т-03393 Подписано к печати 25/Ш 1967 г.

Формат бОхЭО’Лв- Бумага машиномелованная. Усл. печ. л. 20,254-1,25 вкл. Уч.-изд. л. 21,0.
Тираж 6500 экз. Тип. зак. 6480.

Цена 1 р. 72 к.

Издательство «Наука»,
Москва, К-62, Подсосенский пер., 21

2-я типография издательства «Наука»,
Москва, Г-99, Шубинский пер., 10
ОПЕЧАТКИ

Страница	Строка	Напечатано	Должно быть
41	8 св.	томов	атомов
114	2 св.	1А = 10*-3 см	1А ~ 10-8 см
121	Формула (13)	1Hoi[2	||*01|
153	2 св.	(еь — е]	[eL — 8r]
182	21 св.	(3)	(39)
284	1 св.	(&] соб  1 \	[л]соб  / 1 \
314	6 сн.	/п 1  j 2/	\	Т8/

Физические методы исследования белков и нуклеиновых кислот