МЕТОДЫ о

ИССЛЕДОВАНИЙ

В

ИММУНОЛОГИИ

ИЗДАТЕЛЬСТВО „МИР'
Immunological Methods

Edited by

Ivan Lefkovits

Basel Institute for Immunology

Basel, Switzerland

Benvenuto Pernis

Health Sciences Center

Columbia University New York,

New York

Academic Press

New York San Francisco London, 1979
МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЙ
В ИММУНОЛОГИИ

Под редакцией И. Лефковитса, Б. Перниса

Перевод с английского
канд. мед. наук В. А. Абалакина,
канд. биол. наук Т. С. Котовой и
канд. мед. наук Н. П. Перепечкиной
под редакцией
канд. мед. наук А. Н. Маца

Издательство «Мир»

Москва 1981
4 УДК 576.80/85

Коллективная монография, написанная ведущими специалис-
тами, работавшими в Базельском институте иммунологии (Швей-
цария), посвящена методам иммунохимии и клеточной иммуноло-
гии. Авторы имеют большой опыт в этой области, что определяет
основные достоинства книги — удачный подбор методов и исчер-
пывающее, но вместе с тем краткое описание каждого из них. Рас-
смотрены определение активности антител, их анализ методом пеп-
тидных карт, исследование белков методами электрофореза, изо-
электрофокусирования и изотахофореза, методы иммунофлуорес-
ценции, культивирования лимфоцитов, изотопные и другие ме-
тоды.

Для иммунологов, иммунохимиков, микробиологов, вирусоло-
гов, биохимиков, генетиков, врачей, лаборантов научно-исследо-
вательских и клинических лабораторий, аспирантов и студентов
биологических специальностей.

Редакция литературы по биологии

2001040000

21007—128	(g) 1979, by Academic Press, Inc.

M-------------128__81 ч. 1

041(01)—81 ,	' '	© Перевод на русский язык, «Мир»,

1981
ПРЕДИСЛОВИЕ РЕДАКТОРА ПЕРЕВОДА

Американское издание этой книги вышло в свет в весьма знаменательный
для иммунологии период. В 60-е — 70-е годы имело место чрезвычайно бурное
развитие этой науки (отдельные ее отрасли стремительно развиваются и по
сей день), в результате которого она превратилась из конгломерата разнопла-
новых дисциплин в единую экспериментальную науку с четко очерченным пред-
метом исследования и специфической методологией. Центральное место в ней
заняла молекулярная биология иммунного ответа со своей особой проблемати-
кой (гены иммуноглобулинов и иммунного ответа, гены и антигены гистосов-
местимости, антитела, рецепторы иммунокомпетентных клеток, межклеточные
взаимодействия в иммунной системе). Стремительное развитие иммунологии —
это не только новые идеи и новые задачи. Это прежде всего новые методиче-
ские возможности.

Именно новейшая иммунологическая методология — основное содержание
этой книги. В ней определены наиболее существенные методические достиже-
ния последних лет: разработка способов культивирования и выделения клонов
иммунокомпетентных клеток; методика слияния В-клеток, образующих антите-
ла, с клетками плазмоцитомы н последующее клонирование гибридбм, синте-
зирующих моноклональные антитела (иммунодиагностические реагенты, при-
кладное значение которых трудно переоценить); методы аналитического и
препаративного разделения такой «тонкости» и чувствительности, которая по-
зволяет анализировать ианомолярные количества антигенов и из общей смеси
иммуноглобулинов выделять антитела, синтезированные одиим-единствениым
клеточным клоном (в этом отношении поразительно эффективно изоэлектрофо-
кусирование в тонком слое).

Предлагаемая книга — превосходное методическое пособие, полезное и для
тех, кто уже считает себя специалистом в области фундаментальной иммуно-
логии, и для тех, кто только собирается в этом направлении специализиро-
ваться. Книга настолько гармонична и подчинена общему замыслу, что ее мож-
но назвать «монолитным» руководством, хотя ее писали 38 авторов, каждый из
которых уже проявил в иммунологии свою творческую индивидуальность.

Первая и последняя главы руководства, насыщенные математической тер-
минологией и моделями и написанные с известной академической изыскан-
ностью, создают особую интонацию. Благодаря ей книга становится ие только
источником методических приемов и прописей, но и уникальным учебником
экспериментального поиска в иммунологии.

Тридцать четыре главы руководства — это 34 публикации Базельского
института иммунологии, подготовленные в 1977 г. Для любого иммунолога
этот институт — чрезвычайно авторитетное учреждение. Начав функциониро-
вать в 1971 г., он поразил научную общественность своей эффективностью и в
последние годы стал ведущим иммунологическим центром всего мира. Сама
методика организации работы в этом институте могла бы стать темой еще од-
ной главы в настоящем издании. В штате института всего около 60 научных
сотрудников, причем штатные места на срок от 2 до 4 лет занимают специалис-
ты из разных стран. Каждый из них работает по собственному плану. Выбор
научной программы ничем не ограничен. Для сотрудничества ученых («объеди-
нения таланта и опыта») требуется лишь их взаимная договореииость. В инсти-
туте нет деления на отделы, лаборатории, группы и т. п.; нет иных титулов,
кроме «сотрудник Института»; нет авторитета, основанного на чем-либо ином,
кроме научной компетентности [1]. В институте постоянно работают около
60 лаборантов и столько же сотрудников административной и технической
служб. При столь ограниченном штате Базельский институт иммунологии в
1977 г. вел 111, а в 1978 г. 133 научно-исследовательские темы и за семь лет
своего существования опубликовал 733 работы, каждая из которых содержит
элемент несомненной новизны. Разработка и усовершенствование методов
иммунологических исследований — весьма важный раздел работы института.
Однако нигде так хорошо, как в Базельском институте, ие понимают, что такое
достоверный факт и чем он отличается от артефакта. Критическая оценка ме-
тода— это, пожалуй, наиболее важный аспект всех методических разработок
этого учреждения. И ие случайно директор института Нильс Кай Ерие (выдаю-
щийся иммунолог, чье имя хорошо известно советскому читателю), подводя
итог методическим достижениям 1979 г., осторожно заметил: «...Мне кажется,
мы обладаем сейчас набором методов, которые, я надеюсь, будут прояснять,
а ие затуманивать суть изучаемых явлений» [2].

В нашей стране развитию фундаментальной иммунологии уделяетси особое
внимание. Прежде всего, специалисты в области биоорганической химии и моле-
кулярной биологии рассматривают иммунологию как кратчайший путь практи-
ческой реализации своих достижений. Привлекает традиционная связь имму-
нологии с медициной (с вакцинопрофилактикой инфекций, с иммунодиагнос-
тикой и иммунотерапией опухолей и т. д.). Благодаря этому широкий круг
специалистов-биохимиков, ранее незнакомых ни с микробиологическими, ин с
иммунологическими методами исследования, нуждается не только в освоении
самих методов иммунологического анализа, но и навыков критической оценки
и интерпретации получаемых результатов. Для них эта книга будет особенно
полезной.

А. Н. Мац

1.	Jerne N. К. Basel Institute for immunology. Annual Report, 1977, p. 15—16.

2.	Jerne N. K. Basel Institute for immunology. Annual Report, 1978, p. 16.
Прогресс современной иммунологии гораздо больше, чем развитие других
биологических дисциплин, связан с эволюцией методов, используемых для ре-
шения ключевых проблем данной науки. С момента «революции» в биологии,
которая произошла в 50-х годах нашего века, иммунология сразу оказалась
в лучшем положении — иммунологами были разработаны принципиально но-
вые методы для решения проблем трансплантации, аутоиммунных заболеваний,
толерантности, иммунной реконституции и рака. Эти новые методы, которые
становятся все более аналитичными (что вообще свойственно биофизической и
биохимической методологии), включают такие подходы, как перенос клеток и
культура ткани, оказавшиеся особенно полезными при анализе иммунокомпе-
тентных и вспомогательных клеток.

Именно богатство методов лежит в основе непрерывного бурного развития
иммунологии — науки, постоянно расширяющей свои горизонты. В настоящее
время нет недостатка в руководствах по иммунологическим методам, однако в
большинстве из них описаны общепринятые, ставшие уже традиционными ме-
тоды. Замысел этой книги — прямое следствие той поистине уникальной ситуа-
ции, которая создалась в Базельском институте иммунологии, когда он стал
своего рода местом встреч для иммунологов различных стран. Очень часто во
время своих кратких или продолжительных визитов в Институт иммунологии
наши коллеги делились со штатными сотрудниками своим оригинальным, весь-
ма ценным методическим опытом, начиная от рациональных и более практич-
ных способов проведения известных процедур и кончая совершенно новыми
подходами к решению ключевых проблем. Из всего богатого опыта, накоплен-
ного в Базельском институте иммунологии, мы отобрали ряд методов, которые,
по нашему мнению, могут быть особенно необходимы и полезны в современных
иммунологических лабораториях.

В результате получилось краткое руководство по методам современной
фундаментальной иммунологии, используемым в крупнейших институтах этого
профиля. Особое внимание уделено новейшим методам. Как мы считаем, книга
написана специалистами высокого класса. Ряд методов разработан или модифи-
цирован для решения конкретных задач самими авторами, и подробные описа-
ния таких методов публикуются впервые.

В 34 главах изложены методы определения, выделения и очистки антител
(включая дансилироваиие, двумерную хроматографию, изоэлектрофокусирова-
ние, электрофорез в полиакриламидном геле и изотахофорез); методы опреде-
ления констант равновесия (равновесный диализ, равновесная фильтрация и
седиментация); способы маркировки реагентов изотопами и флуоресцентными
красителями и определение компонентов клеточной поверхности; меры предос-
торожности при работе в изотопной лаборатории; методы химической модифи-
кации белков, гаптенов и нерастворимых носителей; приемы получения анти-
сывороток к аллотипам и антигенам гистосовместимости и получения антител
доминирующего клонотипа; методы оценки гистосовместимости и реакций в
смешанной культуре лимфоцитов; методы разделения клеток на гелях, несу-
щих гаптен, и с помощью розеткообразоваиия; метод выявления клеток, секре-
тирующих антитела и связывающих аллоантигены; определение иммунного от-
вета in vitro и его анализ методом лимитирующих разведений; метод для изуче-
ния образования растворимых факторов Т-клеток и получения клеточных гиб-
ридов; способы поддержания клеточных линий и клонирования в полужидкой
среде; методы математического анализа иммунологических данных.

Мы предложили авторам сборника дать материал в такой форме, которая
им больше всего импонирует и лучше всего отражает характерные особенности
их собственного подхода — по сути, их индивидуальность. Правда, впоследст-
вии мы провели с рядом авторов подробные обсуждения, стремясь связать от-
дельные части руководства в единое целое.

Мы надеемся, что эта книга окажется полезной и для исследователей, и
для лаборантов, ведущих как фундаментальные, так и прикладные работы в
области иммунологии. В настоящее время иммунологические методы весьма
широко используются как инструмент исследования специалистами других об-
ластей, и такое использование продолжает экспоненциально расти. Ряд мето-
дических тонкостей и определенные сведения, которые обычно передаются устно
при личном контакте, благодаря этой книге станут доступными для таких
специалистов-«иеиммуиологов». Кроме того, книга может оказаться полезной
при обучении иммунологическим методам.

Мы глубоко признательны нашим многочисленным коллегам, которые так
или иначе помогли иам довести до конца работу по созданию этого ие совсем
обычного лабораторного пособия: д-ру Морису Лэнди, сыгравшему важную
роль в разработке и осуществлении нашего замысла и активно участвовавшему
в обсуждении вопроса об объеме и основных особенностях книги; авторам — за
их старание представить в наиболее ясной и содержательной форме целый на-
бор разнообразных иммунологических методов, необходимых для решения
ряда специальных задач, и за терпение, которое они проявили, перерабатывая
материал в соответствии с нашими требованиями; Стивену Фазекас де Сент-
Гроту— за глубокий интерес к работе иад книгой и за полезные замечания и
предложения; Кэйти Перрет и Маргарет Мараджуло — за перепечатку текста
и его черновых вариантов и, наконец, сотрудникам издательства Academic Press
за их бесценную помощь, обеспечившую превращение рукописи в печатное из-
дание.

Эту книгу можно также считать одним из плодов той щедрой финансовой
помощи, которую нам оказывает фирма Hoffmann-La Roche и которая так спо-
собствует проведению фундаментальных исследований в Базельском институте
иммунологии. Широкая, всесторонняя исследовательская программа, разрабо-
танная в последние годы, неразрывно связана с лабораторными методами, опи-
санными в этой книге.

И. Лефковитс
Б. Пернис
СПИСОК АВТОРОВ

Alkan $efik $. (гл. 22), Basel Institute for Immunology

Bernoco Domenico (гл. 14), University of California at Los Angeles, Medical

School, Los Angeles, California 90024

Brandt Daniel Ch. (гл. 2), University of Geneva, Geneva, Switzerland

Braun Dietmar G. (гл. 5, 6, 26), Basel Institute for Immunology

Cosenza Humberto (гл. 19), Basel Institute for Immunology

Elliott Bruce E. (гл. 16, 21), Division of Cancer Research, Department of Pa-
thology, Queen’s University, Kingston, Ontario K7L 3N6, Canada

Fathman C. Garrison (гл. 13), Department of Immunology, Mayo Medical
School, Rochester, Minnesota 55901

Forni Luciana (гл. 9), Basel Institute for Immunology

Freeh Ruedi (гл. 33), Basel Institute for Immunology

Haas Warner (гл. 11, 18), Basel Institute for Immunology

Hild Kerstin (гл. 5), Basel Institute for Immunology

Iscove Norman N. (гл. 29), Basel Institute for Immunology

Jaton Jean-Claude (гл. 2), Department of Pathology, University of Geneva,
Geneva, Switzerland

Johnson Judith (гл. 12, 17), Basel Institute for Immunology

Kiefer Hansruedi (гл. 8), Basel Institute for Immunology

Kohler Georges (гл. 7, 31, 32), Basel Institute for Immunology

Lefkovits Ivan (гл. 19, 27), Basel Institute for Immunology

Luzzati Alma L. (гл. 25), Basel Institute for Immunology

Meo Tommaso (гл. 15), Basel Institute for Immunology

Moss В. А. (гл. 3), CSIRO Animal Genetics, Delhi Road, North Ryde, New
South Wales, Australia

Nobholz Markus (гл. 21), 1SREC, Lausanne, Switzerland

Nagy Zoltan (гл. 21), Academy of Sciences, Budapest, Hungary

Piazza Alberto (гл. 34), Istituto di Genetica Medica dell’Universita di Torino,
Via Santena 19, 10126 Torino, Italy

Pink J. Richard L. (гл. 10), Department of Pathology, University of Geneva,
Geneva, Switzerland

Pohlit Helmut M. (гл. 11, 33), Basel Institute for Immunology

Schalch Wolfgang (гл. 6), Basel Institute for Immunology

Schreier Max H. (гл. 24, 28, 29), Basel Institute for Immunol ogy

Shulman Marc (гл. 20), Basel Institute for Immunology

Fazekas de St. Groth S. (гл. 1), CSIRO Animal Genetics, Delhi Road, North

Ryde, New South Wales, Australia

Stocker John W. (гл. 14), Basel Institute for Immunology

Takacs Bela (гл. 4), Hoffmann—La Roche, Inc., Grenzacherstrasse 124, Ba-
sel, Switzerland

Taussig Michael J. (гл. 23), Agricultural Research Council, Institute of Animal
Physiology, Barbraham, Cambridge, United Kingdom

Tees Reet (гл. 30), Basel Institute for Immunology
10 Список авторов

Vassalli Pierre (гл. 2), University of Geneva, Geneva, Switzerland

Boehmer Harald von (гл. 11), Basel Institute for Immunology

Weimann Bernd J. (гл. 28), Basel Institute for Immunology

Widmer Jiirg (гл. 33), Basel Institute for Immunology

Ziegler Andreas (гл. 5, 7, 10), MRC Laboratory of Molecular Biology, Hills

Road, Cambridge CB2 2QH, United Kingdom
Глава 1

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА АНТИТЕЛ
И КЛЕТОЧНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

С. Фазекас де Сент-Грот

I.	ВВЕДЕНИЕ

Обычным титрованием определяют конечную точку, которая
зависит как от количества, так и от качества реагентов. Реакцию,
лежащую в основе титрования, можно свести к реакции практи-
чески нулевого порядка, работая при большом избытке одного из
компонентов, и тогда количество другого компонента может быть
оценено независимо. Но в таких системах нельзя определить ка-
чество реагентов, поскольку оно либо проявляется только вместе
с количеством, либо совсем не оказывает влияния. Это справед-
ливо и для бинарных реакций (таких, как реакция преципитации
в растворе или в геле, активная или пассивная агглютинация,
связывание комплемента и т. п.), и для тройных систем, где акцеп-
тор и индикатор конкурируют за третий компонент (например,
при ингибировании любой бинарной реакции, нейтрализации ток-
синов или живых патогенных организмов и т. д.).

Простейшей мерой сил, связывающих эпитоп и паратоп, т. е.
мерой качества последних в иммунологическом смысле, служит
константа равновесия. В тех случаях, когда изучается не только
величина, но й природа этих сил, нужно определять термодина-
мические параметры (такие, как изменения энтальпии, энтропии,
теплоемкость и т. д.). Все это сводится, однако, не более чем к
измерению констант равновесия при разных внешних условиях
(обычно при разных температурах, реже при изменении давле-
ния или объема). Поэтому в настоящей главе речь идет о теории
и практике определения констант равновесия иммунологических
реакций.
II.	ПРОСТЫЕ РАВНОВЕСИЯ

А. Теория

1.	Одновалентные реагенты

Рассмотрим реакцию между эпитопами в концентрации [Е]
и паратопами в концентрации [Р]. Молекулы обоих реагентов на-
ходятся в тепловом движении и сталкиваются между собой с ве-
роятностью, которую можно вычислить. Комплексы эпитоп — па-
ратоп, х, будут образовываться со скоростью, пропорциональной
концентрации свободных реагентов [Е—х] и [Р—х] и частоте эф-
фективных соударений, k\. Формально концентрация комплексов
будет возрастать со временем по закону

-^- = ^[£-х][Р-х].	(1)

at

Имеющиеся комплексы диссоциируют со скоростью и, сле-
довательно, их концентрация убывает со временем согласно
уравнению

at

Полная скорость получается объединением уравнений (1) и (2):

-^- = ^[E-x][P-x]-fea[x].	(3)

at

Равновесие определяется как состояние, в котором d[x]/dt=O,
т. е. такое, в котором ассоциация и диссоциация точно уравнове-
шивают друг друга (Примечание 1). Таким образом, при равно-
весии имеем:

ki[E — х][Р— х]— /г2 [х] = 0.	(4)

И

»

П римечание 1. Характер приближения к равновесию определяется путем
интегрирования уравнения (3). Так, концентрация комплексов эпитоп—паратоп
л момент времени t есть

хх (х0 — х2) — х2 (х0 — хх) exp {(хх — х2) fex (t —10
(х0 — х2) — (х0 — хх) exp {(хх — х2) fex (t — /0)}

пли, наоборот, время, необходимое для того, чтобы концентрация комплексов
достигла определенного значения xt, есть

,	1	, (xt — хх) (х0 — х2)

t ==------------ In-------------------,

fex (хх — х2)	(х( — х2) (х0 — хх)

где Хо — концентрация комплексов в нулевой момент времени, а хх и х2 —
корни уравнения (5):
Xi, ха= 1 /2 {Е + Р + К ± [(Е + Р + К)2 - 4ЕР\'12}.

Равновесная концентрация х, которая достигается при есть, очевидно, х2,
т. е. меньший корень уравнения (5).

Константа равновесия, К, есть просто отношение k2 и k\, как
видно из уравнения (4):

fe2   [Е — х] [Р — х]   [свободные эпитопы] [свободные параголы] .
fe,	[х]	[комплексы]

(5)

Константа равновесия имеет размерность концентрации и
обычно выражается в единицах молярности (моли на литр). Для
биологического материала, например для клеток, более разумно
использовать единицы системы СГС, т. е. говорить об эпитопах
или паратопах на кубический сантиметр (см. Jerne et al., 1974).
Поскольку в 1 моле 6,023-1023 молекул и, следовательно, в 1 см3
одномолярного раствора 6,023-1020 молекул, константы, опреде-
ленные в этих системах единиц, легко перевести друг в друга:
Ксгс = 6,023-1020Кмоль-

(Некоторые иммунохимики определяют К как

fel _	[X]

[Е — х] [Р — х] ’

что формально не вызывает возражений, однако при этом К при-
обретает странную размерность литров на моль. Это может оза-
дачить тех, кто привык оперировать концентрациями, и, во вся-
ком случае, требует обращения при обычных термодинамических
вычислениях.)

2.	Поливалентные реагенты

Уравнение (5) справедливо для одновалентных реагентов, та-
ких, как малые гаптены и Fab-фрагменты антител. Принимая во
внимание валентность целых молекул антител, находящихся в
концентрации А и содержащих п паратопов на молекулу, можно
выразить концентрацию паратопов как Р = пА. Тогда уравнение
равновесия приобретает вид

[Е — х] [nA — х] = %	(5а)

И

Для корпускулярных поливалентных антигенов (таких, как
клетки, бактерии, вирусы), находящихся.в концентрации [С] и
имеющих на каждой частице по п эпитопов, соответствующее
уравнение имеет вид
[nC—х][Р —х] _ „
[х]

(Валентность антител в такой ситуации, как правило, можно не
принимать во внимание. Для проверки корректности такого пре-
небрежения можно сравнить поведение целых молекул 1g с пове-
дением выделенных из них Fab-фрагментов.)

(56)

3.	Микроравновесия

В уравнении .(56) не учитывается то, что эпитопы находятся
на частицах и потому встречаются в реакционной смеси в виде
групп по п штук. Можно, однако, показать, что при отсутствии
взаимодействия между эпитопами их поведение не зависит от то-
го, встречаются ли они поодиночке или как части поверхности
корпускулярных носителей (Примечание 2).

Примечание 2. Рассмотрим микроравновесие между состояниями с (Z—1)
и с i занятыми эпитопами, например иа эритроците:

= Д1Р~Х1.	(6)

*i-i

Здесь xi обозначает число всех состояний, в которых { из п мест связывания
заняты. При этом

X- =	__ ______________

‘ [Р — х]	[Р — х]г

п	\ I

с - 2 xi П Ki

1	/ 1

Если все места связывания идентичны и эквивалентны, то все акты ассо-
циации характеризуются одной константой равновесия К, и тогда Ki=K[n—
— (<’—1)1/». поскольку существует п—(»—1) способов присоединения одной мо-
лекулы антитела, чтобы получить х; из х<-1 и i способов отщепления одной мо-
лекулы, чтобы получить xj-i из х/. Соответственно уравнение (7) может быть
переписано в виде

Среднее число молекул антител, связанных одной клеткой, равно

Число занятых мест х	хх + 2х2 + • • • + пхп	,о.

---Г,-------------- = ТГ = /-------п—\------------------------• (°)

Число клеток	С / „	I ,	,

С — 2j хг + Xi + х2 4- • • • + хп
\ 1 /

Подставив выражение (7а) и упростив, получим
" /п\
^/(Р-х)р
— =------------------------1	-------------•	(9)

с	/п\

1+5	[К/(Р- х)1г

1 \i /
Знаменатель здесь представляет собой биномиальное разложение [1 +
+К/(Р—х)]я, а числитель—его производную по К.ЦР—х). Таким образом,

X _ п[1 +К/(Р —х)]"'1 * ________п	ц0,

С [1+К/(Р-х)Р	1 + к/(р_Х)’	V 7

что непосредственно преобразуетси к виду

[пС —х][Р —х]	„

[х]

совпадающему с уравнением (56).

Б. Практические ограничения

Уравнение (5) может быть решено численно для любого на-
бора наблюдаемых величин. Однако квадратичная форма (см.
Примечание 1) неудобна для графического изображения и осо-
бенно для статистической оценки параметров. Параболу следует
преобразовать в прямую линию, после того как решено, какие
оценки мы хотим сделать.

1.	Разделение компонентов реакции

Для практических измерений по крайней мере один из трех
компонентов, составляющих равновесную смесь (свободные эпи-
топы, свободные паратопы, комплексы эпитоп — паратоп), дол-
жен быть отделен от двух других. Если имеется существенная
разница в размерах, разделение не составляет труда. Так, гап-
тены будут диффундировать сквозь мембраны, задерживающие
антитела, создавая с наружной стороны мембраны концентра-
цию, равную [Е—х]1. В случае корпускулярных антигенов остав-
шиеся свободными антитела [Р—х] могут быть отделены либо в
виде надосадочной жидкости после центрифугирования, либо в
виде фильтрата при пропускании равновесной смеси через
фильтр, задерживающий антиген, а значит, и комплексы анти-
ген — антитело. Когда два реагента имеют сходные размеры, как,
например, в реакциях идиотоп — антиидиотоп, простое механиче-
ское разделение невозможно. В этих случаях используются дру-
гие приемы (в частности, мечение одного из реагентов и исполь-
зование преципитирующего агента к одному из них, регистрация
образования комплексов по каким-либо физическим, обычно оп-
тическим, изменениям в системе или привязывание одного из
реагентов к нерастворимой основе или к частицам носителям, что
позволяет далее воспользоваться механическим разделением).

1 В оригинале изолируемые компоненты реакционной смеси названы «ком-

партментами» (compartment — «отсек»). — Прим, перед.
В любом случае нужно определить концентрацию выделенно-
го реагента, т. е. (Е—х) или (Р—х), и сравнить ее с исходной
концентрацией [£] или [Р]. Поэтому принято выражать х в долях
от исходной концентрации реагентов. В большинстве случаев мы
вынуждены прибегать к такой практике, поскольку обычно уда-
ется определить только титры (т. е. неизвестные кратные абсо-
лютных концентраций), причем [£] и [Р] сами являются парамет-
рами, которые нужно определить.

2.	Линейные анаморфозы

Поскольку уравнение равновесия симметрично по [£] и [Р],
дальнейшее формальное рассмотрение можно с одинаковым ус-
пехом вести как по одной, так и по другой переменной. Здесь мы
возьмем в качестве примера клетку, несущую п эпитопов, т. е.
в клеточной взвеси мы имеем исходную концентрацию [пС] эпи-
топов, реагирующих с [Р] паратопами. В этой системе выделен-
ным компартментом будут свободные антитела, поэтому мы вве-
дем х = аР (т. е. доля 0<а<1 антител связана в комплексах
эпитоп — паратоп) и перепишем уравнение (56) в виде

[яС-аР] [P-aPJ ==^==[пС_ apj #	Ц J)

[<хР]	а

Уравнение (11) может быть представлено в шести эквива-
лентных формах, которым соответствуют шесть различных ли-
нейных анаморфоз. Эти формы получаются умножением обеих
частей уравнения на один из общих множителей и приведением
к виду у=а+Ьх (Примечание 3).

Примечание 3.

Множитель	Линейная форма	
	у = а + Ь	• X
a	а	пС Р
		— — — а	(На)
(1 - а) К	1 —а	К К	'
1	1	Р , пС 1
(l-a)K	1 —а “	— (11б>  А	да
1	1	Р	. К 1
(1— a) пС	а пС	1 пС 1—а	(НВ)
1	1 —а	К р
пС	а	-7г + -т? (1 -“)	(Пг)
1		К пС 1—а
Р	1 —а = —	
а

пС К а

Р ~ Р 1—а

(Не)

Прн равновесном дналнзе [когда используется уравнение (5а)] концентра-
цию свободного гаптена обозначают буквой с, а отношение связанных антител
к общему количеству антител—г (в принятых нами обозначениях с=[Е—х],
а г=х/А). Константа равновесия определяется как fei/fe2- Неизвестные пара-
метры обычно определяются по одной нли двум линейным анаморфозам. Пер-
вая из ннх

— = Кп — Кг,
с

нлн, в наших обозначениях,

а	П Е

А(1—а) =~к	~АК а’

есть, очевидно, уравнение (На), перенормированное множителем 1/А. Второе
уравнение,

-L = -b+-L,

г псК п

превращается в

А К 1

аЕ [пЕ (1 — а)] П

в наших обозначениях и, как можно видеть, эквивалентно уравнению (Нв),
помноженному иа AjE. В литературе эти линейные формы обычно связывают
с именами авторов (отложение Скэтчарда, отложение Лайнвивера — Бёрка
и т. д.). Стремление увековечить авторство по поводу столь тривиальных
преобразований кажется нам чрезмерной данью тщеславию.

3.	Информативная область

Каждое из этих уравнений может быть использовано для оп-
ределения параметров по отрезку а, отсекаемому графиком на
оси ординат, н по наклону Ь. (В случае необходимости может
быть использована и координата пересечения с осью абсцисс с =
= —а/Ь.) Целесообразно выбрать такие отложения, которые
обеспечивают наибольшую точность, т. е. позволяют найти пере-
сечения с осями при минимальной экстраполяции и дают наклон
графика, близкий к единице. Каждое уравнение мы рассмотрим
с этой точки зрения после того, как будет выбрана оптимальная
область концентраций реагентов. Относительно такого выбора у
нас имеется два соображения, которыми можно руководствовать-
ся. Во-первых, система должна быть далека от насыщения, что-
бы избежать взаимодействия между местами связывания. В рас-,
сматриваемом примере это означает, что большая часть эпитопов
должна оставаться свободной. Тем самым требуется [пС]10[аР].
Во-вторых, количество отделяемого реагента должно составлять
Рис. 1. Линейные анаморфозы уравнения закона действующих масс.

малую долю от исходного, чтобы отличие было существенным.
Этим требуется а^0,9. Эти два условия определяют соотноше-
ния между параметрами для наиболее информативной области
в опытах по определению констант равновесия. Следовательно, в
этом случае Р ~ К и пС~ ЮК-

Рис. 1 показывает ход всех шести линейных анаморфоз в пре-
делах десятикратного изменения концентрации антигена. Для
графиков пС принималось постоянным, но был введен фактор
разведения антигена d (l^d^lO), который включался в соот-
ветствующие переменные.
4.	Определение параметров

Уравнения (Па) и (Не), если их оценивать статистически,
наиболее предпочтительны/ Оба имеют наклоны, которые можно
оценить весьма точно, пересечения с осью у для уравнения (Па)
и с осью х для уравнения (Не) достигаются при минимальной
экстраполяции и достаточно далеки от нуля. Информация, из-
влекаемая из этих двух уравнений, совершенно одинакова, по-
скольку одно из них является обратной функцией по отношению
к другому. Их общий недостаток — то, что Р не может опреде-
ляться независимо и всегда содержит ошибку определения К.

Следующая пара — уравнения (Нг) и (Ид)—дает удовлет-
ворительные оценки К (содержащиеся в координатах пересече-
ния осей у и х), но плохо служит для оценки Р, хотя наклон и не
зависит от К.

Последняя пара— (Нб) и (Пв) —имеет пересечения осей х
и у вблизи начала координат и потому будет давать надежные
оценки Р только в том случае, если экспериментальные точки
будут укладываться на теоретическую прямую с малым разбро-
сом. Из этих двух предпочтительнее уравнение (Пв), так как оно
обеспечивает независимые оценки параметров Р и К.

В. Усложнения

1.	Гетерогенность

Поскольку даже простейший антиген может стимулировать
множество различных клеток, наблюдаемый иммунный ответ яв-
ляется суммой большого, обычно неизвестного, числа клональ-
ных ответов. Уравнение (5) не учитывает этого, и потому наблю-
даемая константа равновесия, Ко, — это в действительности сред-
нее значение для неизвестного распределения частных констант
равновесия, Ki (l^/i^lV), где само число W неизвестно.

Как это обычно делают в таких случаях, Полинг и сотр. (Pau-
ling et al., 1944) предположили нормальное распределение для
свободных энергий ассоциации, т. е. логарифмически-нормальное
для К (Примечание 4).

Примечание 4. Естественно, что такое произвольное предположение долж-
но иметь свои ограничения. Более того, оно кажется интуитивно неприемле-
мым, так как всегда имеется больше способов получить плохое соответствие,
чем хорошее. Действительно, во всех немногочисленных сообщениях, анализи-
рующих субпопуляции антител (Fazekas de St. Groth, 1967; Werblin, Siskind,
1972; Werblin et al., 1973; Kim et al., 1974), демонстрируются распределения,
сильно скошенные в сторону антител низкой аффинности. Истинная форма
распределения, однако, неизвестна, и, что еще хуже, известно, что она меня-
ется со временем даже у одного индивидуума по мере «созревания» ответа.
При этих условиях предположение о нормальности распределения сохраняют
просто, как наиболее удобный компромисс; кроме того, оказалось, что оно
оправдывается иа практике, если измерения не охватывают слишком широкой
области.

Мера гетерогенности, о, определяется как квадратный корень
из оцениваемой дисперсии. Поскольку значение о приходится на-
ходить путем громоздкой эмпирической подгонки, обычно подби-
рают распределение, которое сходно с нормальным, но более
удобно для обработки. Из многих распределений, аппроксимиру-
ющих нормальное, выбор иммунохимиков (Nisonoff, Pressman,
1958) пал на одно из распределений, предложенных Сипсом
(Sips, 1948) (Примечание 5).

Примечание 5. Функция Сипса
г _ (КрсГ
П 1 + М1

записанная здесь в иммунохимических терминах, представляет собой недавнее
переоткрытие логистического распределении, метаметрическое преобразование
которого есть Р=е17(1+ег). В формулировке Сипса Р определяет вероят-
ность для отдельного паратопа быть занятым, тогда как У (логит Р) прирав-
нивается к alnKoC-

Это далеко не лучшее приближение (оно существенно отклоняет-
ся от нормального около ±а и становится все более неприемле-
мым после удаления от среднего значения за ±2а), и оно не го-
дится для стандартных статистических оценок точности. Но его
достоинство, в известной мере окупающее недостатки, состоит в
том, что оно формулируется в тех же терминах, которые истори-
чески использовались при обработке результатов опытов по им-
мунохимическому равновесию (см. Примечание 3). Таким обра-
зом,

log—— = a log Ко + a log с.	(12)

п — г

Индекс гетерогенности, а, можно определить непосредственно по
наклону прямой линии, а Ко пересчитать из координаты пересе-
чения с осью у или лучше прямо из координаты пересечения с
осью х. Значение а лежит между 0 и 1, причем гомогенности со-
ответствует а= 1.

Уравнение равновесия, лежащее в основе соотношения (12),
в наших обозначениях будет иметь вид

[Е-х]а [Р - х]	„д

W Л<>’

а линейная анаморфоза, пригодная для оценки а, —
log — 1'1 = a (log a (log —!—V	(12а)

\ аЕ /	\ Е }	\	1 — а /

В уравнениях (12) и (12а) используется вся информация, необ-
ходимая для определения а и Ко, и они могут быть решены лишь
при условии, что все остальные параметры ([£], [Р] и [х]) извест-
ны.

2.	Комплексные связи

Простое рассмотрение равновесий предполагает независимое
поведение каждого из эпитопов и паратопов. В действительности
же молекулы иммуноглобулинов, находящиеся в сыворотке, так
же как и большинство естественных антигенных молекул и час-
тиц, никогда не бывают одновалентными. Поэтому не исключено,
что некоторые n-валентные молекулы антител, присоединившись
к антигенной частице одним из своих паратопов, могут затем об-
разовать вторую, третью, ...n-ую связь эпитоп — паратоп с той
же самой антигенной частицей. То, что такие комплексы сущест-
вуют, хорошо известно из ряда работ 1960-х годов (Lafferty, 1963;
Lafferty, Oertelis, 1963; Almeida et aL, 1963; Greenbury et aL,
1965; Klinman, Karush, 1967; Feinstein, Munn, 1969), но скорость
их образования и относительное содержание в конкретных рав-
новесных смесях неизвестны. Определить эти параметры не прос-
то, поскольку приходится учитывать не только число и гибкость
частей молекулы иммуноглобулина, несущих паратопы, но так-
же и топографию эпитопов на антигене. Экспериментальное ис-
следование одной системы (Klinman et al., 1967; Hornick, Karush,
1969, 1972; Gopalakrishnan, Karush, 1974) показало, что комп-
лексные связи встречаются с высокой вероятностью, и поэтому
наблюдаемые Ко для IgG были близки к квадрату Ко одиночных
•связей. В другой системе ван Регенмортель и Харди (van Regen-
mortel, Hardie, 1976) обнаружили, что в зависимости от концент-
раций реагентов частота комплексных связей может изменяться
от практически нулевой до максимальной, когда в них участву-
ют все молекулы IgG.

Это явление — скрытый источник ошибок при оценке гетеро-
генности, которую как раз и определяют при разных концентра-
циях реагентов. Однако существует простой способ учета комп-
лексных связей. Дело в том, что Fab-фрагменты данной популя-
ции антител имеют то же сродство и ту же гетерогенность, что
и исходная популяция, но не образуют комплексных связей. По-
этому различие Ко и а, определенных для антисыворотки и для
полученных из нее Fab-фрагментов, может служить мерой обра-
зования комплексных связей.
3.	Взаимодействие между местами связывания

Наиболее распространенный тип взаимодействия между ан-
тителами, прикрепившимися к соседним местам связывания, —
это электростатическое взаимодействие. В результате такого
взаимодействия возникает дополнительный член, отражающий
изменения электростатической свободной энергии, а наблюдае-
мая К уже не будет постоянной, так как будет зависеть от плот-
ности комплексов эпитоп — паратоп (Примечание 6).

Примечание 6. Если все эпитопы на антигенной частице эквивалентны и не
взаимодействуют друг с другом, то константа равновесия, характеризующая
связывание i-го паратопа, К, будет равна (п—i+l)K/i [см. уравнения (6) и
(7а) ]. Для соответствующего изменения стандартной свободной энергии будем
иметь:

— АД» = RT In Ki = RT In [К (n — i + 1) !i\.

Из теории Дебая — Хюккеля можно вывести, что электростатическое взаимо-
действие изменит свободную энергию на

#Е222 / 1	%	\

Д/'электр = — ~~— I	F ' 1(2; — 1),

2D \ г 1 + рх/

где М—число Авогадро, е — заряд электрона, z — заряд молекулы антитела,
D — диэлектрическая постоянная, р — расстояние, до которого могут сбли-
жаться противоположно заряженные ионы, и 1/х — толщина ионной атмосфе-
ры по теории Дебая — Хюккеля. Таким образом,

П — i + 1	— (2Г—1) w

Ki =-------:----- Ке

i

если обозначить через w постоянный член

Мг2г2 / 1 х \

2RTD + 1 + рх / '

Канальский и Спитник (Katchalsky, Spitnik, 1947), а также Скэтчард (Scatchard,
1949), предложили очень простое приближение, которое, будучи записано в
форме, аналогичной уравнению (56), имеет вид

[пС — хЦР — х] 2а>х!с

--------—--------— Ке .	(1о)

W

Можно показать, что максимальная ошибка этого приближения меньше
±1,2% при п=3, меньше ±0,3% при п=4, и пренебрежимо мала при числах
эпитопов, характерных для таких крупных носителей, как клетки.

Взаимодействия проявляются только вблизи насыщения (т. е.
когда х!пС приближается к единице). Эффект заключается в ка-
жущемся постепенном возрастании К; поэтому кривая становит-
ся вогнутой в сторону оси ординат при использовании отложения,
в котором К выступает множителем при независимой переменной,
как в уравнении (Не). Поскольку при малых x/пС по наклону
все еще можно правильно оценить /Со, его экспоненциальный член
[см. уравнение (13)] наилучшим образом определяется при отло-
жении 2аР/С (удвоенное отношение числа комплексов к числу
клеток) в зависимости от 1п{[(1—а)/а](пС—аР)} (логарифм
концентрации свободных эпитопов, умноженной на отношение
свободных паратопов к связанным). Наклон дает непосредствен-
но значение w, а на оси ординат график должен отсечь InJC, как
это следует из уравнения (Не). Функциональное соотношение
имеет вид

In М—[пС —aP^lnK + w —.	(14)

\ а	)	С

Для взаимодействий с неизвестным механизмом и неопреде-
ленной величины (таких, как стерическое ингибирование или ал-
лостерические изменения поблизости от занятого эпитопа) мож-
но найти «кажущуюся константу равновесия» по Уаймэну (Wy-
man, 1948), откладывая \п[(пС/аР) — 1] в зависимости от
1п[Р(1—а)]. Этой величине соответствует пересечение с осью х
(где пС=2аР,. т. е. это точка 50%-ного насыщения). Наклон
больше единицы в точке пересечения указывает на положитель-
ное взаимодействие; наклон меньше единицы означает наличие
отрицательных взаимодействий, хотя при этом не исключаются
и некоторые положительные взаимодействия. Величина взаимо-
действия при разных уровнях насыщения может быть проградуи-
рована сравнением «кажущейся константы равновесия» с Ко,
полученной из графиков уравнений (11а) — (Не) вдали от на-
сыщения.

Г. Практика

1.	Равновесный диализ

а.	Принцип. Равновесный диализ основан на задержании ан-
тител полупроницаемыми мембранами, свободно пропускающи-
ми антигеи. Диализуемые антигены (т. е. молекулы с мол. весом
менее 3000, а чаще всего менее 1000) обычно не иммуногенны.
Это гаптены, способные связываться с антителами, но неспособ-
ные индуцировать синтез антител. Таким образом, метод равно-
весного диализа исходно предполагает неидентичность иммуно-
гена и испытываемого антигена. Этот факт не следует забывать,
так как именно из-за него равновесный диализ используется при
изучении только гетерологичных, но не гомологичных систем ан-
тиген — антитело: ведь неидентичность иммуногена и испытывае-
мого антигена и есть формальный признак перекрестной реакции.

Несмотря на указанное ограничение, метод все же способен
дать вполне определенный результат: свободный гаптен оказы-
вается по одну сторону мембраны, и поэтому, зная исходные кон-
центрации гаптена и антител, можно вычислить среднюю конс-
танту равновесия, подставляя соответствующие значения в лю-
бое из уравнений (На) — (Не). Это справедливо для идеально-
го случая, когда 1) равновесие достигнуто, 2) оно не искажено
осмотическими эффектами и 3) мембрана или вообще поверх-
ность прибора не взаимодействует ни с одним из реагентов.
В практических системах ни одно из этих условий не удовлетво-
ряется само собой. Ниже будут описаны способы выяснения и
исправления потенциальных систематических ошибок.

б.	Оборудование. Некоторые классические измерения равно-
весий были выполнены с диализными мешками, завязанными с
обоих концов и погруженными в раствор гаптена. Сейчас техни-
ка и более экономна в отношении материалов, и менее подвер-
жена случайностям.

Диффузионные камеры емкостью 1,5 мл имеются в продаже’,
но могут быть изготовлены и самостоятельно, для чего достаточ-
но отрезать верхнюю треть 5-миллилитрового флакона для анти-
биотиков и отшлифовать поверхность среза. Перед употреблени-
ем полученные таким образом камеры очищают горячей азотной
кислотой или смесью КОН — этанол, тщательно промывают дис-
тиллированной водой и силиконируют для уменьшения адсорб-
ции. Между опытами их промывают под краном, а затем дистил-
лированной водой. Камеры высушивают и хранят в защищенном
от пыли месте, например в большой чашке Петри. Пару диффу-
зионных камер можно скрепить вместе зажимами (Quickfit
JC-19) или латунными рамками (Drummond Scientific Со., Бру-
молл, Пенсильвания, США).

Мембраны для диализа (20/32—32/32, Visking Corp., Чикаго,
США) обрезают до подходящего размера, например 10X10 см2,
и погружают в дистиллированную воду. Через час воду доводят
до кипения, а затем оставляют на час при комнатной температу-
ре. После этого мембраны отмывают холодной дистиллирован-
ной водой в трех сменах по 30 мин каждая и, наконец, хранят
готовыми к употреблению в 0,01 М NaNa (0,06% в НгО).

Поскольку возникающие во время диализа градиенты кон-
центраций необходимо свести к минимуму, диализуемые раство-
ры следует перемешивать. Простое устройство для этой цели —
вертикальный диск, вращающийся со скоростью 5—10 об/мин,
вроде используемого при культивировании тканей. На нем можно
укрепить 20—60 собранных диализных ячеек, его удобно смонти-
ровать на крышке лабораторного стола. При термодинамическом
анализе равновесия необходим более точный контроль темпера-

1 Bellco Glass Со., Вайнленд, Нью-Джерси, США. Микрокамеры на 50—

100 мкл можно получить от Gateway Serum Со., Каокия, Иллинойс, США.
туры, чем в обычных термостатах или в термальных комнатах.
Имеющиеся в продаже мешалки либо слишком малы, либо не-
совершенны в работе. Было описано простое и эффективное уст-
ройство с перемешиванием (Karush, Karush, 1971); оно вмеща-
ет 36 диализных ячеек и оборудовано легко доступными охлаж-
дающими банями с постоянной температурой.

в.	Выполнение эксперимента. Диализные ячейки собирают на-
кануне эксперимента. Прежде всего отполированную поверхность
среза каждой полуячейки покрывают тонким слоем силиконовой
смазки (например, Art. 7921 фирмы Merck, Дармштадт, ФРГ) и
помещают на столе лицевой стороной вверх. Затем диализную
мембрану подсушивают между двумя листами плотной не остав-
ляющей волокон впитывающей бумаги (например, “Photowipes”,
Sorg Paper Со., Мидлтаун, Огайо, США) и острым пробойником
для пробок из нее вырезают диски точно по размеру диализных
ячеек (из мембраны 10X10 см2 получается 16 дисков диаметром
22,5 мм). На каждую полуячейку накладывают свободную от ви-
димых дефектов мембрану, расправляют ее, накрывают другой
полуячейкой и скрепляют все вместе. Чтобы обнаружить невиди-
мые дефекты мембраны и недостаточность уплотнения по краям,
верхнюю половину, ячейки заполняют 1 миллилитром воды и под-
соединяют к источнику сжатого воздуха или азота через закры-
вающую резиновую пробку. Создают давление 0,1 ати (1,5 psi’),
и любая существенная утечка через мембрану или между мемб-
раной и краем полуячейки проявится в ближайшие 5 мин. После
этого давление сбрасывают, диализную ячейку переворачивают
и процедуру повторяют, чтобы проверить уплотнение между
мембраной и краями нижней полуячейки. Если эксперимент бу-
дет проходить в водяной бане, то место соединения полуячеек
промазывают расплавленным парафином (точка плавления 62—
65°С; нагреть примерно до 100°С), чтобы избежать просачивания
воды во время диализа. Собранные ячейки в положении на боку
оставляют на ночь при комнатной температуре. Незначительные
остатки воды, обычно менее 0,1 мл, за это время испаряются, и
ячейки готовы к использованию.

Перед постановкой опыта диализные ячейки метят. В верхние
полуячейки с помощью мерных пипеток отмеривают растворы
гаптена и герметизируют ячейку. Коммерческие ячейки имеют
завинчивающиеся крышки, но мы считаем их неудовлетворитель-
ными по двум причинам. Во-первых, при закрывании крышки
ячейка иногда скручивается и мембрана натягивается или разры-
вается; даже если закрывать ячейку с максимальной осторож-
ностью, все равно в ней создается избыточное давление. Во-вто-
рых, в канавках резьбы крышек сохраняется вода, и если канавки

1 1 psi = l фунт/кв. дюйм. — Прим, перев.
предварительно не залить воском (что означает дополнительную
операцию), эта вода разбавляет образцы, искажая резуль-
таты, определяемые в конце опыта. Поэтому мы пользуемся ре-
зиновыми пробками, которыми закрывают флаконы для анти-
биотиков. Сначала пробку в центре прокалывают 15-миллимет-
ровой инъекционной иглой 22-го калибра (чтобы обеспечить
возможность выравнивания давления), азатем вдавливают в гор-
лышко полуячейки до упора. После того как все растворы зали-
ты, иглы извлекают и ячейки переворачивают. Отмеривание рас-
творов антител и герметизацию нижних полуячеек производят
точно так же. Затем диализные ячейки закрепляют во вращаю-
щем устройстве и оставляют на предусмотренное время для диф-
фузии.

После того как установилось равновесие, горлышко ячейки
осушают фильтровальной бумагой, в пробку гаптенной секции
вводят иглу, а затем пробку вынимают. Образцы отбирают пас-
теровской пипеткой, при этом ячейку слегка наклоняют и каса-
ются стенки, но не мембраны (!), кончиком пипетки. При такой
технике в ячейке обычно остается не более 0,05 мл жидкости. Хо-
тя точный объем остаточного капиллярного слоя оценить трудно,
при использовании поправки +0,05 мл ошибка составляет всего
лишь около ±2%. В большинстве исследований требуется опре-
делить только концентрацию гаптена, однако на всякий случай
лучше опорожнять секцию антител точно таким же образом и оп-
ределять количество извлекаемой жидкости.

г.	Схема эксперимента и контроли. Поскольку один из реа-
гентов— гаптен — обычно одновалентен, при равновесном диа-
лизе отпадает необходимость учитывать взаимодействие между
местами связывания (см. разд. II, В, 3). Есть, однако, другие со-
ображения, которые ограничивают информативность метода.
Прежде всего концентрация комплексов эпитоп — паратоп полу-
чается как разность между общей концентрацией гаптена и кон-
центрацией свободного гаптена. Это повышает требования к точ-
ности определения исходных концентраций, так как погрешности
этих определений входят как систематическая ошибка в оценку
концентрации комплексов. Кроме того, нужно, чтобы разница
между концентрациями свободного и связанного гаптена была
как можно больше, поскольку дисперсии их ошибок складывают-
ся. На практике это сводится к тому, что концентрацию антител
устанавливают выше константы равновесия, для того чтобы обес-
печить связывание более чем на 50% (Примечание 7).

Примечание 7. Обычно концентрация иммуноглобулинов в сыворотке жи-
вотных не превышает 10-4М, а фракция глобулинов гипериммунной сыворотки
содержит всего лишь несколько процентов специфических антител. Поэтому
измерение констант равновесия выше 10~6М (или 6-Ю14 в системе СГС) ста-
новится весьма дорогостоящей процедурой. При этом возрастает опасность
получения ошибочных данных — отчасти потому, что при таких высоких кон-
центрациях резко увеличивается неспецифическое связывание (про некоторые
из наиболее часто используемых гаптенов известно, что они связываются и вне
паратопа), а отчасти потому, что начинает проявляться эффект Доииаиа, так
как глобулины — это полиионы, и концентрация заряженных групп, задержи-
ваемых мембраной, перестает быть пренебрежимо малой по сравнению со сво-
бодно диффундирующими веществами.

Неспецифическое связывание можно оценить в контрольных ячейках с
глобулином, не содержащим антител, взятым в той же концентрации, что и
иммуноглобулин в опытных ячейках. Однако положительный результат — это
скорее предупреждение об артефакте, чем точная мера неспецифнческого свя-
зывания. Отдельные препараты, особенно моноклональные антитела, могут
сильно отличаться от «средних» контрольных глобулинов по интенсивности не-
спецнфического связывания в ту и другую сторону.

Доннановский эффект обычно нивелируется ионами, присутствующими в
изотонических буферах (~0,16М). Он может повлиять на результаты, когда
работают с высококонцентрированными препаратами антител, т. е. при изме-
рении аффинностей выше 10-4'5М. Это влияние не очевидно из хода кривых
связывания: оио сказывается подобно увеличению гетерогенности иизкоаф-
фннных антител. Предостерегающими признаками могут быть иеравеиство
объемов раствора в верхней и нижней полуячейках в конце опыта, а также
значительные различия в концентрациях свободного гаптена при постановке
опыта сначала в 0,1М, а затем в 0,2М буфере. Влияние доннановского эффек-
та можно снизить, прибавив в полуячейку для гаптена какие-либо макромоле-
кулярные полиноны. Понятно, что «лекарство не должно быть хуже самой
болезни»: уравновешивающие макромолекулы не должны взаимодействовать с
гаптеном.

Есть и другой повод стремиться к высокому отношению свя-
занный гаптен : свободный гаптен в момент равновесия. Диализ-
ные мембраны сами связывают некоторую долю лиганда, которая ,
в виде поправки учитывается при обработке результатов. Ее же-
лательно сделать как можно меньшей, и не только потому, что
ошибка измерения гаптена, потерянного из-за адсорбции, добав-
ляется к ошибке определения количества гаптена, специфически
связанного антителами, но главным образом потому, что диализ-
ные мембраны неоднородны и даже тщательно определенные по-
правочные кривые не могут передать индивидуальных особен-
ностей изделия. Поскольку количество гаптена, связанного с
мембраной, зависит, вообще говоря, от концентрации свободного
гаптена, сдвиг равновесия в сторону связывания (с антителами)
ограничит обсуждаемую ошибку.

Когда начинается работа с системой, параметры которой не-
известны, прежде всего следует провести предварительные экспе-
рименты. Сначала нужно решить вопрос о периоде установления
равновесия. Это делается путем заполнения верхних полуячеек
раствором гаптена с концентрацией от 10-4М до предела чувст-
вительности метода, например до 10~7М. Нижние полуячейки за-
полняются буфером. Через определенные интервалы времени
(обычно 12, 24, 36 и 48 ч) определяют концентрацию гаптена по
обе стороны мембраны. В большинстве систем асимптота дости-
гается за 24 ч, но для основного эксперимента следует добавить
еще по меньшей мере 12 ч, так как суммарный перенос через
мембрану будет больше, если большая часть гаптена должна
связаться с антителами.

Тот же самый предварительный опыт дает информацию о ко-
личестве гаптена, удерживаемого мембраной. Это количество
оценивается по разнице между наблюдаемой и ожидаемой кон-
центрациями гаптена, т. е. между средней концентрацией, нахо-
димой в двух полуячейках, и половиной исходной концентрации.
Предварительный эксперимент не заменяет специальной попра-
вочной кривой, но он достаточен для того, чтобы подобрать нуж-
ные концентрации антител и гаптена. Так, если при исходном ко-
личестве гаптена, скажем, 10~8 моль (1,0 мл 10-5М раствора)
окажется, что мембрана связывает 0,1 • 10-8 моль, то концентра-
ция антител, связывающая более чем 0,5-10—8 моль, обеспечит
достаточную точность измерения.

Концентрацию, в которой следует брать антитела, определяют
во втором эксперименте. В нижние полуячейки помещают макси-
мально доступные дозы антител, скажем по 10-8 моль, или по од-
ной десятой этого количества. В верхние полуячейки помещают
растворы гаптена 10-5, 10-6 и 10-7М. После установления равно-
весия (необходимый для этого период определен в первом экспе-
рименте) измеряют концентрации свободного гаптена и вычис-
ляют долю гаптена, связанного с антителами, учитывая неспеци-
фическое связывание с мембраной (приблизительная величина
которого также известна из первого эксперимента). Для основно-
го эксперимента выбирают дозу антител, связывающую полови-
ну гаптена при исходной концентрации в десять раз выше преде-
ла выявляемости. Это обеспечит и надежность результатов, и
экономию реагентов (Примечание 8).

Примечание 8. Пример: в предварительном эксперименте определяем про-
цент связаииого гаптена:

Исходное количество антител,моль	Исходные концентрации гаптена		
	10~5 М	IO-6 М	10-’ м
IO"8	73%	90%	91%
10-9	9%	39%	49%

Большое исходное количество антител связывает больше половины гапте-
на при любой из его концентраций. Следовательно, исходное количество анти-
тел порядка 10~8 моля удовлетворит нас даже при концентрации гаптена не-
сколько выше, чем 10-5М, но это слишком расточительно. Низкая доза анти-
тел связывает около 50% гаптена при его концентрации 10-7М и может быть
удовлетворительной только при концентрациях гаптена ниже этой величины.
Однако определение свободного гаптена в концентрации ниже 10-7М неосу-
ществимо. Значит, нужно брать исходное количество антител в интервале от
3 до 5-10~9 моль (1,0 мл 3—5-10-6М раствора) против концентраций гаптена
в интервале от 8-10-6 до 2- 10-6М.

Как показано выше, предварительный опыт, в котором выби-
рают исходное количество антител, позволяет также определит^
и соответствующий диапазон -концентраций гаптена. Если попу-
ляция антител имеет обычную гетерогенность, информативная об-
ласть метода простирается от той концентрации, при которой по-
ловина гаптена связана, до концентрации, приблизительно в че-
тыре раза меньшей.

Основной опыт проводится в двадцати диализных ячейках, со-
бранных накануне. Прежде всего необходимо приготовить разве-
дение антител (Примечайие 9) и серию разведений гаптена (При-
мечание 10).

Примечание 9. Для основного опыта требуется 12 мл раствора антител
в концентрации, определенной предварительным экспериментом. Для контро-
лей равновесия требуется еще 1 мл раствора антител в два раза больше кон-
центрации.

В качестве разбавителя мы используем 0,138М раствор NaCl, забуферен-^
ный 0,02М фосфатами с pH 7,25 и содержащий 0,01М NaNa. Этот раствор го-
товят на воде, полученной в кварцевом дистилляторе, и фильтруют через по-
ристый стеклянный фильтр. Азид добавляют, чтобы предотвратить рост мик-
робов во время эксперимента. Буферный раствор бактерициден и может хра-
ниться неограниченно долго при комнатной температуре.

Примечание 10. Необходимы две серин разведений гаптена: одна для ос-
новного опыта (пять пробирок, содержащих по 3,2 мл буфера каждая), дру-
гая— для контролей (шесть пробирок, содержащих по 2,0 мл буфера). Вна-
чале готовят 20 мл основного раствора гаптена той концентрации, которая
должна дать 50%-иое связывание с выбранным исходным количеством анти-
тел. Основной раствор последовательно разводят в пяти пробирках, перенося
по 10 мл в 3,2 мл. Серия 4'/5-кратных разведений охватывает интервал четы-
рехкратного уменьшения концентраций, выбранных для основного опыта. Ес-
ли выразить эти концентрации в долях от исходной концентрации (т. е. по от-
ношению к основному раствору гаптеиа), то получится ряд 1,00; 0,76; 0,57;
0,43; 0,33 и 0,25. Это ожидаемые концентрации, и указанные цифры никак ие
избавляют от необходимости тщательнейшим образом определять истинные
концентрации.

Для контрольных проб 3,0 мл исходного раствора гаптена переносят из
пробирки в пробирку, каждая из которых содержит по 2,0 мл буфера, что да-
ет серию из шести 10^5-кратных разведений, охватывающую интервал десяти-
кратного уменьшения концентрации. Ожидаемые концентрации в долях от ос-
новной концентрации гаптена дают ряд 0,60; 0,38; 0,23; 0,15; 0,09; 0,06.

Для контролей равновесия 1 мл основного раствора гаптена разбавляют
равным объемом буфера.

Затем в верхние отделения двенадцати ячеек помещают по
1,0 мл каждого из шести разведений гаптена (по две ячейки
на разведение). Полуячейки герметизируют, ячейки перевора-
чивают и в каждое нижнее отделение отмеривают по 1,0 мл
раствора антител. После герметизации нижних отделений проб-
ками диализные ячейки закрепляют во вращающемся устройстве.

В шесть ячеек, которые послужат для построения контроль-
ной кривой, заливают по 1,0 мл из контрольной серии разведений
гаптена в одно отделение и по 1,0 мл буфера в другое.

В две оставшиеся ячейки (контроли равновесия) вносят по
0,5 мл раствора гаптена с концентрацией вдвое меньшей, чем в
основном разведении, вместе с 0,5 мл раствора антител удвоен-
ной концентрации в верхние полуячейки и по 1,00 мл буфера в
нижние.

При исследовании диализа разных гаптенов против одной и
той же сыворотки или при изучении одной и той же системы при
разных температурах нужно ставить полный набор контролей
для каждого гаптена и каждой температуры. Когда исследуется
несколько препаратов антител против одного и того же гаптена,
необходима только одна серия контролей, но в этом случае чис-
ло контрольных диализных ячеек можно увеличить либо дубли-
рованием, либо (лучше) поставив больше разведений в том же
интервале концентраций. Две ячейки для контроля равновесия
необходимы при любой схеме эксперимента.

д.	Обработка данных. Данными для расчетов служат: исход-
ная концентрация антител [А], шесть исходных концентраций гап-
тена [//]]—[Д]б и шесть исходных концентраций контрольной
серии [С]] — [С]6; все эти данные определяются в начале экспе-
римента. По окончании опыта получаем шесть пар значений кон-
центраций свободного гаптена [й]1—[й]в, шесть пар значений кон-
центраций гаптена в контроле, [ct]i—[й]б в верхних полуячейках
и [сь]]—[сьЬ в нижних полуячейках, и пару значений концентра-
ций свободного гаптена в двух ячейках контроля равновесия, [у].

Прежде всего нужно сравнить [у] с [й]6. Если они не совпада-
ют в пределах точности определения концентрации гаптена, то
равновесие не было достигнуто, т. е. опыт прошел неудачно.
(О сравнении средних величин см. в гл. 34.)

Следующая операция — сравнение пар концентраций гаптена
в контрольной серии ([Ct]i с [сь]1): при равновесии они должны
быть неразличимыми в пределах ошибки измерения. Если это
так, то строят поправочную кривую, причем по оси абсцисс от-
кладывают средние концентрации свободного гаптена ’Afct+cbli,
а по оси ординат — соответствующие поправки [C]i—[<ч + сь]ь
Плавную кривую можно провести через экспериментальные точки
на глаз; менее субъективная процедура — подгонка к логариф-
мической функции вида у=а + Ь\пх, где х — концентрация сво-
бодного гаптена и у — поправка к значению концентрации. Тео-
ретическая кривая используется также для уменьшения погреш-
ности графической интерполяции (о подгонке и проверке кривых
регрессии см. гл. 34).
С	10,86	6,90	4,20	2,80	1,66	1,12
c(t)	4,84	2,95	1,65	1,04	0,56	0,40
с(Ь)	4,75	2,85	1,63	1,00	0,58	0,42
с	4,795	2,90	1,64	1,02	0,57	0,41
ПОЛЯ	1,27	1,10	0,92	0,76	0,52	0,30
поправка к концентрации =				0,704 » (г2 *	0,380 In Ес] 0,9859)	
н	18,05	13,71	10,26	7,80	5,94	4,49
h( 1)	3,95	2,42	1,465	0,985	0,670	0,475
h(2)	3,85	2,40	1,50	0,950	0,685	0,465
ПОПР.	1,22	1,04	0,85	0,70	0,56	0,42
1 El	8,42	6,34	4,71	3.55	2,69	2,04
к(1)	4,47	3,92	3,25	2,57	2,02	1,57
У<1)	1,13	1,62	2,22	2,60	3,01	3,29
х(2)	4,57	3,94	3,21	2,60	2,01	1,58
у(2)	1,19	1,64	2,14	2.74	2,93	3,39

ь = -0,730 + 0,021	К = 1,37 к 10 Н <8,2S х 10 /мл> 2,9Х

с " “i1®2 ± 0,12«	Л - 6,16 х IO'6 И <3,71 х 1015/мл> 2,05Х

(Г2 = 0,9916)

Поправочная кривая

0,2 0,3 Q5

.^Кривая связывания

2 3 5	10- 10’6Л/

5 • 10“б М

Рис. 2. Ппотокол экспепнмента по равновесному диализу.

Гаптен: 1,8-10-5М 2,4,6-триннтрофенол. Антитела: иадосадочная жидкость
48-часовой культуры клона клеток Вг-19 (5,6-105 клеток/мл) была сконцентри-
рована в 56 раз и для исследования взята глобулиновая фракция.

Перед построением кривой связывания находят концентрацию
эпитопов [£], фактически взаимодействующих с паратопами в
данном опыте, для чего из исходных концентраций гаптена [Я]
вычитают поправки, соответствующие концентрациям свободного
гаптена в момент равновесия Для обычной обработки требу-
ется подсчитать г — молярное отношение связанного гаптена и
антител [n= ([£]i—2[Л]1)/Л]. При использовании какого-либо из
уравнений (Па) — (lie) необходимо вычислить величину ai =
= 1— (2[ft]i/[£]i). В последнем случае исходные величины относят-
ся ко всему объему, и поэтому в вычислениях следует брать
[£]i/2 и [А]/2 (Примечание 11).

Примечание 11. Экспериментальные результаты лучше всего заносить в
специальные бланки. Если вычисления будут производиться с помощью ком-
пьютера, то достаточно записывать необработанные данные; в ином случае
пересчитанные значения можно вносить в тот же бланк. На рис. 2 представлен
пример оценки количества и качества моноклонального угглобулина анти-
ТНФ, сиитезированиого линией гибридных клеток.
Экспериментальные данные соответствуют здесь уравнению (На), т. е.
х=аЕ=[Е]— [ft] и у=а/(1—a)=x/[ft], Кривая связывания не проявляет
сколько-нибудь значимого отклонения от линейности; об этом свидетельствует
не только форма графика, но еще более убедительно — высокое значение г2
[99,16% вариации объясняется регрессией (о проверке линейности см. гл. 34)].
Таким образом, моноклональные антитела ведут себя как однородная популя-
ция и их количество и качество оцениваются данным методом с точностью
лучшей, чем ±3%.

Если наносимые на график данные укладываются в прямую
линию, то интересующие нас параметры — К и либо [Л], либо п —
определяются однозначно. Если регрессия оказывается нелиней-
ной, те же данные можно использовать для оценки индекса гете-
рогенности (см. разд. 11, В, 1), после того как значение п или
[Л] уже определено экстраполяцией кривой связывания. Из этой
кривой можно определить даже значение Ко', это концентрация
свободного реагента в точке, где а=1—а = 0,5 или, иначе, где
г=0,5п.

е.	. Область применимости и ограничения. И положительные,
и отрицательные стороны метода равновесного диализа опреде-
ляются способом отделения свободного антигена от других ком-
понентов системы. Предельный размер пор в диализных мембра-
нах мал, и поэтому в качестве лигандов могут использоваться
только небольшие молекулы. С одной стороны, это хорошо, так
как исключаются усложнения, обычные при работе с многова-
лентными антигенами (см. разд. 11, В), и наблюдения допускают
прямую интерпретацию. Однако это отсутствие усложнений —
сомнительное благо: оно подчеркивает искусственность системы,
где иммуноген и исследуемый антиген — не одно и то же, где ли-
ганд заполняет лишь малую часть полости паратопа и где проч-
ность связывания на несколько порядков ниже, чем для боль-
шинства крупных антигенных молекул.

Равновесный диализ имеет и свои специфические сложности,
главным образом из-за применения целлюлозных мембран. Диф-
фузия, особенно через мембраны, — это медленный процесс; по-
этому достижение равновесия требует значительного времени,
что исключает какие-либо кинетические исследования в системе.
Еще большую проблему создает неспецифическое связывание
лиганда, которое заставляет вести измерения в области высоких
концентраций антител, а это в свою очередь вызывает явление
электроосмоса и удорожает процедуру.

2. Равновесная фильтрация

а. Принцип. Равновесная фильтрация основана на удержа-
нии корпускулярных антигенов мембранными фильтрами, сво-
бодно пропускающими антитела. Поскольку макроглобулины
частично задерживаются мембраной с диаметром пор меньше
20 нм, а поры коммерческих фильтров, вопреки утверждениям
изготовителей, могут отклоняться от номинального размера по
крайней мере на 15%, наименьший средний размер пор, прием-
лемый для разделения антител и корпускулярных антигенов, —
это 25 нм. Этим обусловливается нижний предел для величины
антигенной частицы — диаметр 30 нм или мол. вес ~ 107, что со-
ответствует размерам мелких вирусов. Как правило, такие анти-
гены состоят из повторяющихся субъединиц чаще всего несколь-
ких типов. А поскольку даже одна субъединица может иметь не-
сколько различных эпитопов, следует рассмотреть и либо исклю-
чить, либо учесть все усложнения, перечисленные в разделе II, В.

Антиген и антитела смешивают в одной пробирке; при этом
равновесие достигается быстрее, чем при равновесном диализе.
Отделение свободных антител занимает всего лишь около мину-
ты, что позволяет проводить также и кинетические измерения.

Критерии достоверности (Примечание 12) — обратимость со-
единения антигена с антителом, достижение полного равновесия,
отсутствие взаимодействия между поверхностью прибора и ка-
ким-либо из реагентов — такие же, как в любых равновесных из-
мерениях. Данные правильно поставленного опыта позволяют од-
нозначно определить среднюю константу равновесия и — в до-
полнение к этому — число молекул антител или антигенных час-
тиц либо валентность тех или других.

Примечание 12. Фильтрация (т. е. уменьшение объема, в котором содер-
жатся свободные и занятые эпитопы) не нарушает равновесия. Если это не
очевидно само собой, то можно представить формальное доказательство этого,
переписав уравнение (5) в явной форме, т. е. без квадратных скобок, указы-
вающих концентрацию. Таким образом, если исходный объем равновесной
смеси был о и он уменьшен фильтрацией до w (0<w<t>), мы имеем до
фильтрации

Е__х Р ~ - х I х

------  ---/ — = К,отсюда (Е — х) (Р — х) — vxK. - 0;

V	V / V

и то же самое после фильтрации:

——— • -—— /— = К, отсюда (Е — х) (Р — х) — vxK. - 0.
w v / w

б.	Оборудование. Пригодны устройства для фильтрации лю-
бых типов, например такие, как шприцы (“Yale lock” без само-
произвольного обратного хода поршня) с фильтрами-насадками
типа “Swinney”1, в которых используются мембраны диамет-

1 Millipore Со., Бэдфорд, Массачусетс, США, номера по каталогу ХХЗО
012 00, SX00 013 00 и SX00 025 00; Sartorius Membranfilter GmbH., Гёттиигеи,
ФРГ, номера по каталогу 162 22, 162 14 и 165 17.
ром 13 или 25 мм. Оборудование, специально предназначенное
для равновесной фильтрации (Fazekas de St. Groth, Webster,
1961) *, позволяет одновременно использовать 24 ячейки, имеет
холостой объем менее 0,05 мл на ячейку и свободно от недостат-
ков, обычных для фильтров-насадок типа „Swinney", — таких,
как воздушные пробки над мембраной и утечка между шприцем
и фильтром.

В продаже имеются мембраны со средним размером пор 25,
50 и 100 нм1 2. Мембраны фирмы Sartorius, изготовленные из пол-
ностью замещенного ацетата целлюлозы, связывают значитель-
но меньше глобулина, чем мембраны фирмы Millipore. Неспеци-
фическое связывание можно уменьшить до ничтожно малого
уровня, либо выдержав мембраны в 0,1%-ном растворе сыворо-
точного глобулина, либо профильтровав через мембрану около
1 мл этого же раствора.

В продаже имеются также3 комплекты прокладок, состоящие
из одного плоского и одного круглого в сечении тефлонового
кольца и опорной сетки из никеля или нержавеющей стали. Если
фильтр не затягивать слишком сильно, то таким комплектом
можно пользоваться довольно долго. Использование гаечного
ключа, рассчитанного на малый крутящий момент (например, ди-
намометрического ключа Warren and Brown Pty. Ltd., Сидней,
Австралия), скажем на 100 см/кг, обеспечивает и надежную гер-
метизацию, и долговечность уплотнения.

в.	Проведение опыта. При сборке фильтрационных ячеек в
нижнюю часть корпуса последовательно укладывают. плоское
кольцо, сетку, мембранный фильтр и круглую прокладку, а затем
навинчивают верхнюю часть корпуса.

Смеси антигена и антител приготовляют в маленьких пробир-
ках (13X75 мм). Удобно доводить конечный объем до 1,2 мл, ив
которого можно получить 1,1 мл фильтрата. Сначала готовят
разведения антигена, помещая от 1 до 24 стандартных капель4
основной суспензии антигена в отдельные пробирки и доводя
объем в каждой из них до 24 капель буфером. Затем в них отме-
ривают равные объемы (0,6 мл) раствора антител, проще всего
капельницей по 12 50-микролитровых капель, и пробирки тща-
тельно встряхивают.

После достижения равновесия каждую смесь переносят в от-

1 Может быть получено от W. Junghans Feintnechanik, Базель, Швейцария.

2 Фирма Millipore, № по каталогу VC WP013 00, VM WP013 00, VS013 00,
VC VP 025 00, VM WP 025 00 и VS 025 00. Фирма Sartorius, № по каталогу
SM 113 09, SM 113 10 и по специальному заказу SM 111 09 и SM 111 10 из
триацетата целлюлозы.

3 Фирма Millipore, № по каталогу XX 30 012 03.

4 Cook Laboratory Products, Александрия, Вирджиния, США; № по ката-
логу М5, М17 и М35, М36 для капельниц на 25 мкл и 50 мкл соответственно-
дельную фильтрационную ячейку, присоединяют систему подачи
воздуха и создают давление до 0,6 атм (10 psi). Фильтрация
1,2 мл раствора через мембраны с 25-, 50- или 100-нанометровы-
ми порами занимает примерно ПО, 50 или 20 сек соответственно.

г.	Схема эксперимента и контрола. Равновесная фильтрация,
как предполагают, позволяет определить константы равновесия
и количество эпитопов или паратопов в системе с поливалентны-
ми и гетерогенными реагентами. В связи с этим опыты должны
охватывать ту область концентраций, в которой можно прене-
бречь искажающими усложнениями, т. е. где большая часть эпи-
топов остается свободной. Даже тогда, когда нужно исследовать
взаимодействия между соседними местами связывания, линия
отсчета устанавливается измерениями, сделанными вдали от на-
сыщения, или — формально — при [Е\^ 10[х].

С другой стороны, для точности исследования требуется, что-
бы большая часть антител была связана, т. е. [х]>0,9[Р]. Оба
требования удовлетворяются в таких условиях эксперимента,
когда E^IO/C и /<~[Р]. На практике это означает примерно
100-кратный избыток исходной концентрации антител над преде-
лом чувствительности метода, когда, согласно предположению,
при связывании от 90 до 99% титры свободных антител будут
уменьшаться от 10 до 1.

Так происходит в идеальном случае, когда неспецифическое
связывание пренебрежимо мало. Чтобы проверить, так ли это,
подвергают фильтрации ряд разведений антител (с титрами от 1
до 50) и сравнивают титры до и по^ле фильтрации. Если обна-
ружится, что часть антител задержана мембраной, то экспери-
мент повторяют с фильтрами, подвергнутыми до помещения в
фильтрующую ячейку предварительной обработке: мембраны вы-
держивают (не погружая!) на поверхности 0,2%-ного раствора
желатины в буфере в течение 10 мин при комнатной температуре
и подсушивают между двумя листами впитывающей бумаги. Та-
кая обработка обычно уменьшает неспецифическое связывание
до приемлемого уровня, но она примерно вдвое увеличивает вре-
мя фильтрации. Если эта обработка не вполне удовлетворительна,
мембраны выдерживают на 0,1 %-ном растворе глобулина, гомо-
логичного исследуемому, но не содержащего специфических ан-
тител. Последняя процедура дороже и еще больше снижает ско-
рость фильтрации, но она практически полностью исключает не-
специфическое связывание. После предварительной обработки
мембран желатиной или глобулином их можно хранить в сухом
виде (между двумя листами фильтровальной бумаги) и исполь-
зовать по мере надобности.

Период установления равновесия в этой системе относительно
короткий: мы инкубируем смеси антиген — антитело 1 ч при
комнатной или более высокой температуре и 2—4 ч при более
2*
низкой температуре. Для объективной оценки необходимого вре-
мени готовят смесь, которая должна дать приблизительно
99%-ное связывание, и равные ее порции фильтруют через опре-
деленные интервалы времени, например 15, 30, 60, 120 и 240 мин.
Период преинкубации, выбираемый для основного эксперимента,,
должен по меньшей мере вдвое превышать время, необходимое
для достижения асимптоты. Выбор большего периода, разумеет-
ся, не повлияет на результаты.

Нужная концентрация антител определяется тремя независи-
мыми критериями. Во-первых, она должна быть по крайней ме-
ре в 10 рдз ниже концентрации эпитопов, чтобы обеспечить усло-
вия, далекие от насыщения эпитопов даже при более чем
90%-ном связывании антител. Во-вторых, самая низкая концент-
рация свободных антител должна еще находиться в пределах
чувствительности метода. В-третьих, метод определения антител
должен учитывать только их количество, а не суммарный эффект
количества и качества. Соответствие третьему критерию абсо-
лютно необходимо для достоверности результатов, поскольку при
гетерогенности антител фильтрат всегда будет иметь более низ-
кую среднюю аффинность, чем исходная их популяция. Наибо-
лее чувствительные методы, такие, как нейтрализация бактерио-
фагов через конъюгированные с ними антигены или обычные ра-
диоиммунологические методы, не удовлетворяют этому
требованию и дают систематические ошибки, завышая аффиннос-
ти и занижая концентрации реагентов. Третий критерий, разуме-
ется, не относится к равновесию моноклональных антител, для
измерения которых лучшим из одинаково точных методов будет
тот, который наиболее чувствителен.

Когда подходящий метод определения антител выбран, берут
исходную концентрацию антител, приблизительно в сто раз пре-
вышающую предел чувствительности этого метода. Если такой
уровень оказывается слишком высоким относительно концентра-
ции эпитопов, то исходную концентрацию антигена следует уве-
личить, чтобы сохранить соотношение 10:1 между реагентами.

Поскольку константа равновесия заранее не известна, диапа-
зон концентраций антигена необходимо определить в предвари-
тельном опыте. Для этого готовят серию трехкратных разведе-
ний антигена в интервале концентраций примерно от 10й до
1014 эпитопов/мл и по 0,6 мл каждого разведения смешивают с
равным объемом раствора антител, имеющего титр 100. После
соответствующего периода достижения равновесия смеси фильт-
руют и находят пробы, где произошло 90- и 99%-ное связывание.
Концентрации антигена в соответствующих пробах охватывают
тот их интервал, который следует использовать в основном опыте
(Примечание 13). Тарой предварительный эксперимент нужно
ставить для каждого препарата антител. Неразумная экономия
времени и реагентов на этом этапе может обернуться снижением
достоверности результатов: если выбрана область слишком низ-
ких концентраций антигена, то свободные антитела превысят
предел измерения, а если концентрации антигена слишком высо-
ки, то кривые связывания утратят линейность.

Примечание 13. Для антител низкой аффинности дозы антигена в инфор-
мативной области так высоки, что могут блокировать фильтр. Например, 1010
частиц вируса гриппа, представляющих 2-1013 эпитопов, прн плотной упаковке
покроют площадь 0,64 см2, т. е. всю доступную поверхность мембраны диа-
метром 13 мм. Блокирующий эффект можно преодолеть по крайней мере от-
части, добавив к равновесным смесям 100 мг кизельгура и создав тем самым
простейший префильтр. Более правильный путь—перейти к другому методу,
на который .не влияет избыток антигена, например к равновесной седимен-
тации:

Исходный раствор антигена, который следует использовать в
основном опыте, соответствует концентрации, обеспечившей при-
мерно 96—98%-ное связывание в предварительном эксперименте.
Ряд из десяти разведений, охватывающий шестикратный диапа-
зон, удобно готовить из 4 мл исходного раствора, распределяя
его по 24, 21, 18, 15, 12, 10, 8, 6, 5 и 4 капли, объемом 25 мкл каж-
дая, в 10 пробирок и добавляя буфер до объема в 24 капли.
В две контрольные пробирки помещают только буфер. Затем в
каждую пробирку добавляют 0,60 мл основного раствора анти-
тел (всего требуется 8 мл с титром 100); содержимое пробирок
тщательно встряхивают и инкубируют при выбранной температу-
ре в течение периода достижения равновесия, установленного в
предварительных опытах. За несколько минут до окончания это-
го периода содержимое каждой пробирки переносят в ячейку
для фильтрации и, наконец, фильтруют под давлением 0,6 ати.
Объем фильтратов достаточен для двукратного титрования. Тит-
рование начинают с неразбавленных образцов. Оставшийся ос-
новной раствор, антител также титруют, но, чтобы было исключе-
но неспецифическое связывание мембраной, титры двух фильтро-
ванных контрольных образцов антител и нефильтрованного ос-
новного раствора должны быть одинаковыми.

д.	Обработка данных. Данные, подлежащие обработке, пред-
ставляют собой только титры, т. е. величины, кратные неизвест-
ным абсолютным концентрациям. Поэтому одна из задач равно-
весных измерений — найти множитель, которым титр может быть
преобразован в число молекул антител. Другая задача — оценка
константы равновесия. Поскольку по линейной регрессии могут
быть оценены только два параметра, это означает, что третий па-
раметр — концентрация эпитопов — известен. Действительно, бы-
ло бы лучше знать его точно, поскольку его ошибка будет вклю-
чаться в погрешности всех оценок и увеличивать их неточность.

Обработка экспериментальных данных производится в три
этапа. Сначала нужно выразить титры фильтратов, т. е. свобод-
ных антител, в виде долей от исходного количества. Так как тит-
ры обычно даются в логарифмах, средний титр контрольных про-
бирок вычитают из каждого титра в опыте, что дает log(l—а),
.по которому в таблице антилогарифмов находят (1—а). Записы-
вают также соответствующие коэффициенты разбавления анти-
гена и значения а.

Второй этап — выбор одного из уравнений (Па) — (Не) и
подготовка переменных для отложения на графике'.

Третий этап — подгонка теоретической кривой к полученным
данным и, если регрессия прошла проверку значимости, вывод
оценок константы равновесия и концентрации молекул антител,
а также их ошибок (Примечание 14).

Примечание 14. О подгонке линий регрессии см. гл. 34. Все необходимые
вычисления удобно выполнять с помощью карманного электронного калькуля-
тора. Программируемые типы калькуляторов позволяют также выполнить
преобразования первого и второго этапов и затем использовать готовую про-
грамму для подгонки линейной регрессии.

По запросу мы можем выслать программу на языке Фортран, написан-
ную специально для равновесий вирус—антитела; оиа легко может быть при-
способлена и для других данных по равновесной фильтрации. Используя на
входе необработанные экспериментальные данные, она осуществляет подгон-
ку по максимуму подобия всех шести уравнений (На) — (Не), применяет
критерий достоверности, наилучшим образом производит скомбинированные
взвешенные оценки интересующих нас параметров, проверяет значимость
регрессии и отклонений от линейности, а также выполняет термодинамические
вычисления по набору данных, полученных при разных температурах.

е.	Область применимости и ограничения. Метод равновесной
фильтрации обладает некоторыми важными преимуществами.
Во-первых, его можно применить к гомологичным системам, т. е.
ставить опыт с тем же антигеном, который использовался для им-
мунизации. Во-вторых, можно работать с неочищенными реаген-
тами. В-третьих, этот метод экономичен: для опыта достаточно,
например, 10 мкл гипериммунной сыворотки, а в случае виру-
сов — одной десятой того количества вирионов, которое можно
вырастить в одном курином эмбрионе или в одном флаконе с
культурой ткани. В-четвертых, он легко выполним: 20 полных
опытов, включающих 240 фильтраций, могут быть поставлены и
обработаны за полдня. В-пятых, опыт равновесной фильтрации
занимает мало времени и поэтому позволяет производить кине-
тические измерения на разбавленных системах.

1	Имеются (Fazekas de St. Groth, 1961) числовые таблицы для решения
уравнений равновесия, дающие значения а и 1 —а между 0,001 и 0,999 с ша-
гом 0,001 и производные от них переменные 1/а, 1/(1 —а), а/(1 —а),
(1—а)/а и а(1—а). В указанной работе приводится также пример обработки
данных по равновесной фильтрации.
Недостатки метода столь же многочисленны. Во-первых, при-
емлемые размеры антигенных частиц ограничены снизу наи-
меньшим размером пор, еще пропускающих антитела, а сверху —
необходимостью обеспечить нужную плотность эпитопов и при
этом избежать блокирования фильтра. Во-вторых, метод не го-
дится для измерения малых аффинностей — по той же самой при-
чине, что большое количество антигена может блокировать
фильтр. В-третьих, поливалентность крупных антигенных частиц
при равновесной фильтрации порождает те же проблемы, что и
при равновесном диализе. В-четвертых, метод основывается на
сравнении титров антител и, следовательно, не может претендо-
вать на точность, присущую химическим измерениям. В-пятых,
он требует специальных приемов для раздельного определения
количества и качества антител.

3. Равновесная седиментация

а.	Принцип. Равновесная седиментация основывается на
осаждении антигенных частиц под действием тяжести или цент-
робежной силы из раствора, в котором антитела остаются в рас-
творенном состоянии. Поскольку иммуноглобулин, молекулы ко-
торого обладают самыми большими размерами, имеет константу
седиментации 19S, нижний предел для размеров антигенных час-
тиц—это размеры рибосом или малых вирусов при работе на
ультрацентрифуге или размеры бактерий или митохондрий, если
разделение осуществляется на обычной центрифуге. Верхнего
предела для размеров антигенных частиц в данном методе, разу-
меется, нет. Очень крупные частицы, как правило, представляют
собой поливалентные гетерогенные антигены; с ними вряд ли
можно достичь простого равновесия, если не говорить об услови-
ях, далеких от насыщения эпитопов.

Реагенты смешивают непосредственно друг с другом и после
периода достижения равновесия антиген и комплексы антиген —
антитело отделяют осаждением. Поскольку время центрифугиро-
вания сравнимо со временем достижения равновесия, система не
годится для кинетических измерений.

Из всех равновесных методик седиментация менее всего под-
вержена влиянию неспецифического связывания на поверхности
прибора, используемого для отделения свободного реагента. Ес-
ли равновесие достигнуто, опыт дает неискаженную величину
(Примечание 15) средней константы равновесия и еще один па-
раметр системы.

Примечание 15. Равновесие, установившееся в объеме v, не нарушается
после разделения, когда нозиикают дна компартмента — один объемом v—w,
содержащий часть (и—w)/v свободного реагента, и другой объемом w, содер-
часть свободного реагента

Е-х1

вместе с комплексами

(w/v) (Р — х) / X

Р — х

V

-— = к =
V







жаший остальную
реагентов:

Е—х

v

б.	Оборудование. Для равновесных измерений годятся любые
центрифужные стаканы, но из соображений экономии лучше ис-
пользовать малообъемное оборудование, например полиэтилено-
вые пробирки емкостью 0,5 или 1,5 мл (пробирки Эппендорф,
которые можно получить от любой фирмы, поставляющей лабо-
раторное оборудование) и миницентрифуги (например, Microfu-
ge, Beckman Instrument Co., Фуллертон, Калифорния; Minifuge,
Heraeus A. G., Остероде, ФРГ). Впрочем, в настоящее время
большинство лабораторных центрифуг имеет роторы для большо-
го числа маленьких пробирок. При использовании ультрацентри-
фуг выбирают подходящее стандартное оборудование (не при-
способленное для работы с малыми объемами или с большим
числом образцов) и специальные приспособления к нему, изго-
товленные, разумеется, с высокой точностью. К последним отно-
сятся вставки из перспекса или найлона для 38,5-миллилитровых
стаканов, имеющие по шесть высверленных гнезд диаметром 6 мм
и глубиной 30 мм (Fazekas de St. Groth, Webster, 1963). При по-
мощи таких вставок в каждое гнездо ротора помещают группу
центрифужных пробирок, так что в роторе 30 или 60 Beckman
Spinco можно одновременно центрифугировать соответственно 72
или 60 равновесных смесей по 0,6 мл.

Из дополнительного оборудования требуется еще только пас-
теровская пипетка с загнутым на пламени концом (последние 2—
3 мм), необходимая для отбора надосадочной жидкости из ма-
лых пробирок без нарушения осадка.

в.	Выполнение опыта. Антиген и антитела смешивают в объе-
ме 1,2 мл в пробирках 13X75 мм точно так же, как для равновес-
ной фильтрации (см. разд. II, Г, 2, в). Это лучше, чем готовить
смесь прямо в центрифужных пробирках, так как вряд ли можно
обеспечить хорошее перемешивание в их небольшом, заполнен-
ном до краев объеме. Кроме того, в случае крупных антигенных
частиц, таких, как клетки, смесь нужно встряхивать, чтобы час-
тицы не осели раньше, чем будет достигнуто равновесие. После
периода достижения равновесия каждую смесь переносят в 1,5-
миллилитровую пробирку для обычного центрифугирования или
помещают в две 0,6-миллилитровые пробирки для скоростного
центрифугирования. По окончании центрифугирования над-
.осадочную жидкость осторожно отбирают пипеткой, оставляя
примерно 0,1 мл над осадком.

г.	Схема эксперимента и контроли. Соображения, которыми
руководствуются, планируя эксперимент, здесь те же, что и при
равновесной фильтрации (ем. разд. II, Г, 2, г). Чтобы избежать
усложнений, концентрацию эпитопов следует сделать намного
выше константы равновесия, а концентрацию антител — настоль-
ко низкой, насколько позволяет метод их выявления. Поскольку
в первую очередь связываются антитела высокой аффинности,
полученные надрсадочные жидкости будут качественно отличать-
ся от исходного раствора. Мржно надеяться получить неискажен-
ные величины средней константы равновесия и концентраций
эпитопов или паратопов только в том случае, если титрование
количественное, т. е. с одинаковой чувствительностью выявляет
антитела высокой и низкой аффинности.

Неспецифическое связывание не имеет значения при равно-
весной седиментации, однако отделение свободных антител весь-
ма проблематично. В случае субмикроскопических частиц, осе-
дающих лишь ненамного быстрее антител, необходимо в предва-
рительных экспериментах убедиться, что удовлетворяются два
критерия достоверности опыта, а именно — что надосадочиая
жидкость не содержит антигена и что она содержит все свобод-
ные антитела. Знание константы седиментации антигена сокра-
тит затрату времени на предварительные опыты, но оно не дает
основания вовсе отказаться от экспериментальной проверки пред-
сказаний. После того как установлены минимальное время и ин-
тенсивность центрифугирования, необходимые для осаждения
свыше 99% антигена, в тех же самых условиях ставят опыты с
несколькими разными разведениями антител. Если верхняя и
нижняя трети надосадочной жидкости имеют одинаковые титры,
второй критерий тоже удовлетворяется.

Период, требуемый для достижения равновесия, а также кон-
центрации антигена и антител при равновесной седиментации
подбираются так же, как для опытов с равновесной фильтрацией,
за исключением того, что нет ограничений на массу антигена, ис-
пользуемого в опыте. Протокол основного опыта также аналоги-
чен (см. разд. II,Г,2,г), с тем единственным отличием, что рав-
новесные смеси, содержащие очень крупные антигенные частицы
(вроде клеток), следует встряхивать во время инкубации.

д.	Обработка данных. Экспериментальные данные обрабаты-
ваются точно так же, как в опытах с равновесной фильтрацией.
Чтобы не повторять то, что уже сказано в разд. П,Г,2Д мы при-
ведем практический пример, в котором метод равновесной седи-
ментации используется для оценки плотности эпитопов на клет-
ках и для сравнения аффинностей антител к свободным и свя-
занным гаптенам.

Готовят равновесную смесь эритроцитов, нагруженных три-
нитрофенилсульфонатом (ТНФС), со специфическими монокло-
нальными антителами, концентрация которых и аффинность
определены равновесным диализом (см. рис. 2). Для этого берут
разведение антител 1:100, т. е. 3,71-Ю13 молекул антител в
1 мл, и смешивают с равным объемом взвеси ТНФС-нагружен-
ных эритроцитов, начиная с концентрации 2,4-109 клеток/мл
(рис. 3).

В первом столбце таблицы на рис. 3 приведен фактор разбав-
ления d, который удобно выражать числом капель исходной взве-
си клеток в равновесных смесях; во втором столбце даны титры
гемагглютининов надосадочной жидкости в двух параллельных
пробах, выраженные в loga. Это и есть наши экспериментальные

данные.

Первая стадия обработки состоит в подсчете долей связан-
ных (а) и свободных (1—а) антител. Для этого четыре контроль-

ных титра усредняют и их среднее значение вычитают из каж-
дого экспериментального титра: в третьем столбце таблицы при-
ведены средние значения разностей loga(1—а). Значения (1—а)
и а получают преобразованием данных столбца 3 в десятичные
логарифмы (т. е. умножением на logio2=0,3010...), нахождением
их антилогарифмов (столбец 4) и вычитанием этой цифры из 1
(столбец 5).

На втором этапе обработки выводят значения переменных для
какого-либо из уравнений (11а) — (Не). Компьютерная програм-

Титр d	log] (1 —а)	1 - а а	X в	> «  1/(1 -a) d/a
24 *'8  1.9  21  2.0  •• %  15 £  - %  10 W  * з:з  5 3’9  3,9  4 4’2 •,2	-3,225	0,107	0,893  -3,025	0,123	0,877  -2,875	МЗб	0,864  -2,525	0,174	0,826  -2,325	0,200	0,800  —2,075	О;237	0,763  -1,875	0,273	0,727  -1,425	0,372	0,628  -1,175	0,443	0,557  -0,875	0,545	0,455	9,35	26,85  8,14	23,94  7Д4	20,84  5,76	18,15  5,01	14,99  4,21	13,11  3,67	11,00  2,69	9,56  2,26	8,96  1,83	8,80
5,1 л 5,0 ° Л  5,1	[А]-3,71 х 10п/м«  [тнфс-э]-5,о х да/мя	

о = 1,903 ± 0,591 я-3,90x10'
Ь - 2,669 ± 0,096	*= 5,20 x10"

Рис. 3. Протокол эксперимента по равновесной седиментации. Прн построении
графика использовано уравнение (11в). [А] — исходная концентрация анти-
тел; [ТНФС-Э] — концентрация эритроцитов, нагруженных ТНФС.
ма, по которой были обработаны табличные данные рис. 3, по-
зволяет производить подсчеты по каждому из уравнений (На) —
(Не). Здесь мы выбрали уравнение (Нв), чтобы продемонстри-
ровать, что при достаточно точных данных даже это наименее
обещающее из шести преобразований эффективно. В уравнении
(Пв) число эпитопов равно пС, причем п означает число эпито-
пов на клетку, а С — число клеток. Но число клеток изменяется
в зависимости от фактора d, так что число эпитопов составляет
dnC. Поскольку факторы разбавления должны входить только в
переменные (но не в параметры), мы умножаем обе части урав-
нения (Нв) на d, выбирая в качестве двух переменных 1/(1—а)
и d/а. Их вычисляют и записывают в столбцы 6 и 7 соответст-
венно.

Наконец, вычерчивают кривую связывания и оценивают ее
наклон (Ь) и пересечение с осью ординат (а). (Такой график, по-
строенный по данным столбцов 6 и 7, представлен на рис. 3.) Ка-
жется, что три нижние точки не попадают на прямую, но статис-
тическая обработка данных (см. гл. 34) показывает, что только
две последние значительно отклоняются от линейности, т. е. раз-
личного рода осложнения сказываются лишь начиная с 40%-ного
связывания. В связи с этим наклон и пересечение с осью у оцени-
вают только по первым восьми точкам; подгонка линии регрес-
сии, изображенной на рис. 3, также основана на этих восьми па-
рах данных. Наклон этой линии Ь = К.)пС=2,669, а пересечение с
осью ординат а = Р!пС= 1,903. Концентрация паратопов Р рав-
на 1/2-(исходное количество антител) • (валентность) =3,71 •
• 1013, а С= 1/2-(исходная концентрация клеток)/(фактор раз-
бавления) =5-107. Исходные концентрации взяты в половинных
значениях, так как равновесные смеси готовили из равных объе-
мов обоих реагентов. Подставив найденные величины, получаем
значение плотности эпитопов — 3,9-105 молекул ТНФ на 1 эрит-
роцит— и среднюю константу равновесия — 5,2-1013 (или 1,16*
• 107М.-1). Как видно, полученная аффинность почти в 16 раз вы-
ше той, которая была найдена равновесным диализом против
свободного гаптена — тринитрофенола. Найденная константа
равновесия, однако, представляет собой лишь среднюю величину,
так как даже при гомогенности препарата антител эпитопы могут
быть гетерогенными.

е.	Область применимости и ограничения. Равновесная седи-
ментация практически,свободна от ряда неспецифических эф-
фектов, и в этом отношении она предпочтительнее других исполь-
зуемых равновесных методик. Хотя в принципе с ее помощью
можно было бы решить любую из задач, которые обычно реша-
ются диализом или фильтрацией, для разделения путем скорост-
ного центрифугирования требуется оборудование, приспособлен-
ное для работы с большим числом малообъемных образцов.
Равновесная седиментация по-настоящему эффективна толь-
ко в тех случаях, когда антигенные частицы настолько велики,
что оседают при низких и средних скоростях центрифугирования.
Поэтому она лучше всего подходит для иммунологического ис-
следования клеточной поверхности, например для изучения анти-
телоподобных распознающих структур, антигенных маркеров,
рецепторов для лектинов и т. п. Сама методика проста и эконом-
на в отношении реагентов и при ускорениях порядка 10 000g или
ниже не требует никакого специального оборудования.

Однако при равновесной седиментации невозможны кинети-
ческие измерения. Она неэффективна также при низкой аффин-
ности, так как обычно нельзя создать достаточную концентрацию
эпитопов, когда антигенные детерминанты составляют ничтож-
ную часть всей массы частицы. Крупные антигенные частицы
привносят также весь набор усложнений, связанных с полива-
лентностью и гетерогенностью поверхностей.

III. КОНКУРЕНТНЫЕ РАВНОВЕСИЯ

А. Теория

1.	Конкурентное торможение

Рассмотрим схему реакции, в которой два различных эпитопа
в концентрациях [£] и [/] могут обратимо связываться с одним и
тем же паратоп'ом Р:

Е х

+

Р

+
7 у

Два типа комплексов, х и у, будут образовываться со скоростя-
ми, определяемыми уравнением (3), с тем единственным отличи-
ем, что две реакции имеют общий пул свободных паратопов
[Р—(х+у)]. Таким образом,

= k^E - х] [Р - (х + у)] - k2 [х]
at

л	•	(15]

= 11 (/ - у\ [Р - (X + у)] - k [у]

at

В равновесии, когда dxldt~dyldt=§, мы имеем по аналогии
с уравнением (5):
[Е—х]Р —(х+у)] д ^2 _
[х]	kt

[/ — у] [Р — (х + у)] . _ /2 _ т
[</1	G

(16)

Отметим, что при малом заполнении паратопов (когда
(х+у)<^.Р, т. е. [Р—(х+ у)\~[Р]) эти уравнения становятся эф-
фективно независимыми друг от друга ’ (Примечание 16) и кон-
куренция не имеет места.

Примечание 16. Заметим также, что, разделив первое уравнение на вто-
рое, мы получим

К/Е = [(Е-х)/х]/[(/-у)/у].

Это значит, что отношение обеих констант равновесия всегда может быть оп-
ределено по долям связывания независимо от концентрации свободных эпи-
топов.

Поэтому стандартные конкурентные измерения предполагают из-
быток одного компонента: тогда общий реагент, за который про-
исходит конкуренция, в основном связан — в нашей системе это
означает, что [Р—(x+z/)]<C[P]. Из этого следует, что концентра-
ция одного из комплексов, например [у], должна почти равняться
JP], а это может быть достигнуто лишь в том случае, если одно-
временно {/]>[/’] и [I]>L. Мы можем поэтому упростить второе
уравнение, заменив на [/] практически постоянную концентрацию
•свободного ингибитора. Но в этих условиях концентрация свобод-
ных паратопов численно будет ниже К — константы равновесия
конкурента, откуда следует второе упрощение, а именно то, что
[Е—х]~[£], так как [£]5>[х]. При этих упрощениях уравнение
(16) можно представить в виде

[Е][Р-(х + у)]_
-----Й---------

|'ЦР-(«+»)!	,		16а)

[</)

Находя [у] из первого уравнения и подставляя его во второе,

получим

[х] =

L [Е] [Р]
K([Z]+L) + L[E]

(17)

Поскольку в практических измерениях концентрация ингибитора
будет независимой переменной, уравнение (17) может быть пре-

образовано к виду

1 = [Е] + К ,	*[/]

1х]	[Е][Р]	Е[Е][Р]

(17а)
Это уравнение прямой линии, из наклона которой и пересече-
ния с осью ординат могут быть выведены обе константы равнове-
сия. Отметим, что в отсутствие конкуренции, когда [/] — 0, урав-
нение (17а) сводится к обычной обратной форме закона дейст-
вующих масс:

1	[Е] + К

[*о]	[Е] [Р]

2.	Неконкурентное торможение

Если на реакцию антиген — антитело воздействует ингибитор,
связывающийся с молекулой антитела вне паратопа (как в не-
которых системах идиотоп — антиидиотоп), то одновременно
протекают четыре реакции

с тройным продуктом, который либо неактивен, либо недости-
жим по одному пути. Соответствующие уравнения закона дейст-
вующих масс могут быть упрощены так же, как в случае конку-
рентного торможения, если учесть, что [£—(x+z)]«[E] и
[/— (// + ?)]«[7]. Соответственно

[Е][Р-(х+у + г)] _ _ „
И

[/ЦР-(х+ у + г)] L
[</1

[Е] [У1

[г]

[ЛИ

(18)

Мы произвольно приписали вторичным реакциям константы
равновесия К.' и L' первичных реакций, подразумевая независи-
мость мест связывания. Однако использование других констант
не изменило бы общий вид результатов.

Тем же самым путем, как в случае конкурентного торможения,
мы приходим к выводу, что
— = ia+А + Л + _£_) _Е!_,	(19а)

* И |Р| V |Г) I L |Р]

а это дает линейное уравнение для оценки обеих констант рав-
новесия.

Отметим в качестве проверки, что при [/] = 0, т. е. при отсутст-
вии конкуренции, второй член исчезает и уравнение (19а) сво-
дится к обратной форме закона действующих масс.

3. Стерическое торможение

Ингибитор может мешать образованию комплексов антиген —
антитело, занимая паратоп (конкурентное торможение), лишая
его способности к связыванию вследствие какого-то аллостери-
ческого изменения (неконкурентное торможение) или же ни тем
ни другим способом, а просто оказываясь на пути. Такое стери-
ческое ингибирование впервые было обнаружено при нейтрали-
зации ферментов антителами, и в той же работе была представ-
лена математическая модель этого явления (Fazekas de St. Groth,
1963). Оно может возникать, по-видимому, всякий раз, когда не-
зависимые реакции недостаточно разделены в пространстве, на-
пример когда антитела нескольких специфичностей одновремен-
но реагируют с мозаикой эпитопов, скажем, на клетке.

Рассмотрим поэтому клеточную поверхность, состоящую из п
доменов, каждый из которых в центре имеет эпитоп и содержит
также s мест, способных связывать ингибитор. Ингибитор I (ко-
торый предполагается в избытке) соединяется случайным обра-
зом со своими местами связывания, так что в равновесии мы
имеем:

Средняя степень заполнения ингибитором мест связывания
равна y/sn.C=[I]/([I]+L), и эффективность ингибитора в блоки-
ровании эпитопов принимается пропорциональной этой степени
заполнения с множителем р (0<р< 1) (Примечание 17). Таким
образом, при определенной степени заполнения доля р[/]/(Ш + L)
доменов будет недоступной для антител, а доля {1—р[Л/([7] +
+ L)} останется свободной.

Примечание 17. Фактор стерического торможения р можно рассматривать
как долю связанных молекул ингибитора, которые блокируют секторы про-
странства на пути к эпитопам. Геометрическая вероятностная задача, подоб-
ная этой, была предложена и решена Стивенсом (Stevens, 1939) следующим
образом.

На окружности единичной длины выберем случайным образом п дуг дли-
ной х (х<1). Вероятность того, что дуги покроют всю окружность, составит
р •= 1 - (fl (1 -х)я-1 - (fl (1 -2х)"-1---------(fl (1 -jx)«-i,

где jx<l<(j+l)x.

Асимптотическое значение вероятности того, что окружность не покроет-
ся дугами, 1—Р=п(1—х)’-', в действительности представляет собой хоро-
шее’приближение в весьма широкой области значений х и п.

Равновесие между избытком паратопов и эпитопами можно
выразить как

{n.C — x-nCpH(I + L)}[P]

(21)

= Л,

где концентрация свободных эпитопов равна общему числу доме-
нов за вычетом числа доменов, действительно занятых паратопа-
ми (х), и числа доменов, ставших недоступными для паратопов,
[n,CpI/(I+L)]. Соответственно этому для концентрации парато-
пов, связанных в присутствии ингибитора, имеем

[х] =	(1------.	(22)

Л + [Р] \ [Л + L )

В отсутствие ингибитора уравнение (22) сводится к [х]=
= [пС] [Р]/(Л+[Р]), т. е. к стандартной форме закона действую-
щих масс при избытке паратопов. Обратная форма,

__L_ = К+[Р) Л , Р[Л	\	/22ах

[х]	[пС] [Р] ( + (1 -p)[l] + L J’ .	( '

в этом случае менее удобна, отчасти потому, что она нелинейна,
а отчасти потому, что она содержит дополнительный параметр р.
Однако следует заметить, что при увеличении концентрации ин-
гибитора член в скобках асимптотически стремится к 1/(1—р), а
при низких концентрациях ингибитора он приближенно равен
1+ (р[Л/^)> что позволяет оценить все параметры.

4. Различительные признаки механизмов торможения

Поскольку все уравнения (17), (19) и (22), определяющие
три типа торможения, содержат общий член, лучше всего сна-
чала исключить этот член, а затем рассмотреть различия в том,
что останется. Для этого мы введем величину R, выражающую
отношение концентрации комплексов эпитоп — паратоп в отсут-
ствие и в присутствии ингибитора:

Яконк =	= 1 +

*конк

К [Л

L (К+ [Е])
7?неконк .—

Нетер —

Хд

Хнеконк

Хр

Хстер

[Л

L ’

Р[Л

(l_pj[/]+Z,

(23)

Все три графика пересекают ось ординат в одной и той же
точке, и при этом первые два линейны, когда [7] — независимая
переменная. По этому критерию можно идентифицировать стери-
ческое торможение, если только р не слишком велико. В послед-
нем случае стерическое торможение трудно будет отличить от
неконкурентного.

При изменении [£] конкурентное торможение отличается от
двух других, так как только Нконк зависит от исходной концент-
рации эпитопов. Это имеет место во всей области концентраций,
где наблюдается конкуренция, поскольку здесь [£] не может
стать пренебрежимо малой по сравнению с К. Неконкурентное
и стерическое торможение можно отличить одно от другого даже
при р~1, сравнивая наклоны графиков R: для первого наклон
равен 1/-L, а для второго — p/L. Однако такой подход подразуме-
вает независимую и точную оценку констант равновесия, что, ко-
нечно, не самый простой путь.

Поэтому мы введем второй набор дискриминант, D, которые
отражают разницу между степенями связывания паратопов в
присутствии и в отсутствие ингибитора. Таким образом,

^конк		[Р] =  Х0	К[П  L[£] ’		
	Хконк				
^неконк ~	[Р]	[Р]	= (! + —)  \ [£]/	[Л	(24)
	^неконк	Хр		L ’	

[Р]___[Р] = / Р[Л \ К + [Р]

«стер х0 \(1-Р)[Л + Р/ [£]

Графики D для конкурентного торможения проходят через
начало координат, какая бы величина из двух — [/] или [£] — ни
была независимой переменной. Для неконкурентного торможе-
ния имеет место то же самое, когда изменяется [7], но при изме-
нении [£] пересечение с осью ординат [Ц/L значительно отличает-
ся от нуля, поскольку [/]>£, если должно наблюдаться торможе-
ние. График D для стерического торможения нелинеен при
изменении [/], но линеен и проходит через начало координат при
изменении [£]. Кроме того, в отличие от двух других графиков он
зависит от[Р].
Б. Практика

1.	Анализ разделенных реагентов

а.	Принцип. Отделив какой-либо один из свободных реаген-
тов при тройном равновесии, можно выяснить природу конку-
ренции и оценить ее параметры. Такие измерения могут основы-
ваться на любой из трех равновесных методик, обсуждавшихся
в разд. II, Г. Единственная дополнительная проблема, которая
может возникнуть, состоит в том, что изучаемый компартмент
(диализат, фильтрат или супернатант), содержавший в случае
простых равновесий один из свободных реагентов, здесь может
содержать два. Эта проблема наиболее остра в случае равновес-
ного диализа, где концентрация одного гаптена должна опреде-
ляться на фоне избытка другого. Тем не менее некоторые даже
весьма сходные гаптены можно различить спектрофотометриче-
ски или, если это не удается, конкурент, присутствующий в мень-
шей концентрации, метят изотопом, а затем, определив общую
концентрацию свободных эпитопов оптически, измеряют концент-
рацию меченого компонента по радиоактивности. При равновес-
ной фильтрации и седиментации эта проблема возникает только
в случае конкуренции двух видов антител за один антиген. Если
при этом антитела не различаются по другим свойствам, напри-
мер по чувствительности к реагентам, разрывающим S—S-связи,
по фиксации комплемента, аллотипу и т. д., то по крайней мере
один из видов антител должен быть специфически очищен и по-
мечен.

Разрешив эти проблемы, можно затем определить два пара-
метра тройного равновесия (например, обе константы равнове-
сия, число эпитопов или паратопов или степень гетерогенности).
Этого достаточно, так как после предварительных и контрольных
измерений, в которых равновесие достигается в отсутствие кон-
куренции, остается определить лишь вторую константу равнове-
сия (обозначенную L b теоретической части). Всю дальнейшую
информацию лучше всего использовать для оценки гетерогеннос-
тей, чтобы доказать, что вся популяция мишеней является объек-
том конкуренции.

б.	Схема опыта и контроли. Концентрация комплексов эпи-
топ — паратоп представляет собой зависимую переменную во
всех без исключения равновесных опытах. В то же время отде-
ленный компартмент при равновесном диализе содержит свобод-
ные эпитопы, а при равновесной фильтрации и седиментации —•
свободные паратопы. Это различие отражается в схеме опытов
по конкурентному торможению.

При равновесном диализе концентрации антител и конкурен-
та должны быть подобраны так, чтобы в отсутствие конкуренции
концентрация свободного гаптена была почти на пределе воз-
можности выявления. В этом случае конкурентное торможение
связывания приведет к тому, что концентрация свободного гап-
тена будет все еще намного ниже исходной, тогда как неспецифи-
ческое связывание мембраной останется лишь малой долей от
специфического связывания. С другой стороны, при равновесной
фильтрации и седиментации желательно, чтобы в отсутствие кон-
куренции было связано такое минимальное количество антител,
которое еще допускает достоверность измерений. В этом случае
после воздействия ингибитора отделенный компартмент все еще
будет содержать выявляемое количество антител. Чтобы достичь
этого на практике, приходится увеличивать исходную концентра-
цию антител приблизительно в 10 раз, несмотря на то что изме-
рения такого рода при простом равновесии, как указано выше,
необходимо проводить при минимальных концентрациях антител.

К опытам с конкурентным равновесием приступают обычно
уже тогда, когда определены равновесные параметры хотя бы од-
ного из конкурентов. Предварительный опыт имеет лишь одну
задачу — определить эффективную область, концентраций инги-
битора. Это значит, что при равновесном диализе следует начи-
нать с такой исходной концентрации гаптена, которая обеспечит
измеримое количество свободного гаптена в отделенном компарт-
менте после 95%-ного связывания. Исходные концентрации ин-
гибитора, в 10, 100 и 1000 раз большие, обычно перекрывают об-
ласть, в которой доля измеряемого свободного гаптена возраста-
ет от 5 до 50%. Этот диапазон и следует использовать в
основном эксперименте. При равновесной фильтрации и седимен-
тации стартовая концентрация антител должна выражаться тит-
ром 1000, а исходная концентрация исследуемого антигена
должна уменьшать этот титр в 20—50 раз, т. е. связывать в от-
сутствие конкуренции 95—98% антител. Область концентраций
тормозящего антигена должна быть такой, чтобы титр антител
уменьшался вместо этого в 5—20 раз.

В основном опыте необходимо варьировать концентрации обо-
их конкурентов, для того чтобы сделать выбор между механиз-
мами. Поскольку пересечения кривых связывания с осью орди-
нат либо известны из предварительных экспериментов, либо оп-
ределяются теоретически, достаточно продублировать только
контроли — равновесные смеси, не содержащие ингибитора. Об-
ласть эффективных концентраций ингибитора, устанавливаемая
в прикидочном опыте, перекрывается четырьмя шагами разведе-
ния. Таким образом, один опыт с постоянными исходными кон-
центрациями (Е] и [Р] состоит из шести проб. Вторая переменная,
[Е] (конкурент, несвязанную долю которого требуется измерить),
изменяется в трехкратном диапазоне в соотношении 1:2:3. По-
этому основной опыт включает 18 проб. К этому нужно добавить
еще шесть проб контроля адсорбции при равновесном диализе
или две пробы контроля антител для каждого разведения сыво-
ротки в случае фильтрации или седиментаций.

При равновесном диализе растворы конкурентов помещают в
одно отделение, а антитела — в другое. При равновесной фильт-
рации и седиментации сначала отмеривают растворы конкурен-
тов, а затем мишени. В остальном опыты с конкурентным равно-
весием проводятся так же, как и опыты с простым равновесием.

в.	Обработка данных. Сначала по данным предварительных
экспериментов или из контрольных опытов определяют констан-
ту равновесия К таким же образом, как в случае простых равно-
весий (см. разд. II,Г, 1д, 2д, Зд). Полученные результаты позво-
лят. предсказать координату пересечения кривых связывания с
осью ординат. При правильной постановке опыта найденная ко-
ордината пересечения должна совпадать с предсказанной в пре-
делах статистической ошибки.

В линейной регрессии, соответствующей экспериментальным
данным, концентрация ингибитора [7] будет независимой пере-
менной, а некая функция от концентрации комплексов эпитоп —
паратоп — зависимой переменной. Если выбрана величина 1/[х],
кривые связывания будут следовать уравнениям (17а), (19а) или
(22а). Обычно удобнее использовать, в качестве зависимой пере-
менной непосредственно измеренную концентрацию свободных
эпитопов или паратопов. Соответствующие уравнения имеют вид

где (1—а) —доля свободного реагента в соответствии с опреде-
лением, данным в разд. II,Б,2.

Если кривая связывания уменьшает свой наклон и в конце
концов становится параллельной оси абсцисс, можно заключить,
что торможение является стерическим; при этом значение р вы-
водится из асимптоты как

р=1-ж W+2L „ли „ =	.tPl.+ A-

[ЕЦР1	' '	К

соответственно. Значение р может далее быть использовано для
определения L из величины начального наклона, но это лучше
делать, строя график дискриминанта R и находя А из его началь-
ного наклона, который равен p/L независимо от. того, отклады-
вается ли отношениехо/х или (1—cto)/(l—а)-
Если кривая связывания линейна или, во всяком случае, не
выходит на асимптоту, то строится график дискриминанта D
с [£] в качестве независимой переменной. В случае конкурентного
торможения линия регрессии проедет через начало координат,
в то время как неконкурентное торможение даст положительный
отрезок I/L на оси ординат, по которому можно непосредственно
определить L. Наилучшая оценка L при неконкурентном тормо-
жении получается из первоначальной кривой связывания, где
1/(1—а) откладывается в зависимости от [/]: наклон здесь ра-
вен 1/L.

2.	Метод локального гемолиза в геле

а. Принцип. С помощью локального гемолиза в геле (Jerne,
Nordin, 1963) можно выявить отдельные антителообразующие
клетки при внесении их в среду, содержащую гаптенизированные
эритроциты и комплемент. Зона гемолиза — это область, занятая
лизированными эритроцитами, в центре которой находится лим-
фоцит, выделяющий антитела. Теория и практика этого метода
изложена в обзоре Jerne et al., 1974 (см. также гл. 19). При оцен-
ке качества антител с помощью этого метода существенны следу-
ющие моменты.

1.	Метод — «дискретный», т. е. приходится оперировать чис-
лами, а не концентрациями.

2.	Число зон гемолиза относительно мало: в препарате их
должно быть столько, сколько удобно для подсчета; кроме
того, они не должны сливаться друг с другом.

3.	Распределение зон гемолиза по размерам — усеченное:
при интенсивности синтеза антител ниже некоторого уров-
ня клетка не будет выявлена.

4.	Размеры зон гемолиза зависят и от количества, и от качест-
ва выделяющихся антител: при одинаковом числе молекул
высокоаффинные антитела образуют меньшие зоны, чем
низкоаффинные.

5.	Размеры зон гемолиза зависят также от плотности эпито-
пов индикаторной системы: при данном числе молекул ан-
тител зоны будут тем меньше, чем больше плотность эпи-
топов на эритроцитах.

6.	Система открытая: в центре зоны находится источник ан-
тител, а за ее краем в пределах радиуса диффузии также
содержатся антитела, но в концентрации, недостаточной
для того, чтобы вызвать заметный лизис.

Первый и последний моменты исключают возможность пря-
мых измерений качества, даже в том случае, если не обращать
внимание на моменты 3, 4 и 5, которые также могут стать доста-
точным препятствием. Единственная возможность — это исполь-
зовать дискриминанты R или D [см. уравнения (23) и 24)], т. е.
определять аффинность, так же как и природу торможения, в ре-
акции уменьшения зон гемолиза. В сущности, механизм этой ре-
акции сводится к конкурентному торможению, поскольку инди-
каторная система непригодна “для простых равновесных измере-
ний, и единственный параметр, доступный для определения, —
это L, константа равновесия для взаимодействия антител с ин-
гибитором.

Если предположить, что и стационарная фаза диффузии, и
равновесие достигаются (Примечание 18) в начале опыта, то
конкуренция за антитела между свободными и связанными с клет-
ками эпитопами будет следовать уравнению (16); а поскольку
оба конкурента находятся в избытке, доля паратопов, связанных
с клетками, х, дается уравнением (17). Ерне и сотр. (Jerne et al.,
1974) показали как теоретически, так и на примерах из литера-
туры, что в пределах каждого опыта число зон гемолиза пропор-
ционально х (например, рх). Они показали также, что радиус зо-
ны гемолиза тоже прямо зависит от х и что в практически дости-
жимой области размеров зон эта зависимость линейна и наклон
графика равен единице.

Примечание 18. Стационарное состояние достигается, когда ki[E]>l[t в
уравнении (15). В стандартных опытах это условие всегда выполнимо, по-
скольку [£]~ 1013(2-108 клеток/см8 и, скажем, 5-Ю4 эпитопов на 1 клетку),
ki ~ 10-16 и /=7200 с.

Время, требуемое для достижения равновесия при избытке эпитопов, по-
лучается интегрированием уравнения (3):

х (1 - ехр {-	[£] + й8) /}) =

[CJ [KJ

Это уравнение сводится к стандартному закону действующих масс, когда экс-
поненциальный член приближается к нулю, т. е. когда ^i[£] + fe2>3/<. Посколь-
ку А1[£]~10~3 и /=7200 с, константы скорости диссоциации й2>10-3 отвеча-
ют этим требованиям, и это вряд ли изменится даже в том случае, если анти-
тела будут обладать более высокой аффинностью.

б.	Схема эксперимента и контроли. Различные варианты ме-
тода локального гемолиза обсуждаются в главе 19. Особого вни-
мания заслуживает проблема достоверности и точности равновес-
ных измерений при локальном гемолизе. Правильно поставленный
опыт предполагает достижение стационарной фазы диффу-
зии антител, а также равновесия между эпитопами и паратопа-
ми. То и другое можно проверить в одном и том же предвари-
тельном эксперименте с тремя концентрациями эритроцитов, на-
пример 108, 2-108 и 4*108 клеток/мл. Если &i[£]<&2 и ^j[£]+^2>
>^lt, то число зон гемолиза будет одинаковым во всех трех чаш-
ках, а размеры зон распределятся в обратном отношении к кон-
центрации эритроцитов.
Вопрос о точности метода был детально рассмотрен Ерне и
сотр. (Jerne et al., 1974), и они пришли к выводу, что, помимо не-
устранимых ошибок выборки, правильно поставленные опыты
локального гемолиза имеют ошибку метода, которая увеличива-
ет дисперсию на 0.0044Р2 (Р — число подсчитанных зон) (При-
мечание 19). Чтобы сохранить точность метода на одном уровне,
в опытах с уменьшением зон гемолиза следует увеличить число
параллельных чашек в тех случаях, когда ожидается малое чис-
ло зон, т. е. в области более высоких концентраций ингибитора.

Примечание 19. 95%-ные доверительные интервалы для отдельных резуль-
татов указаны в скобках: 50(34—66), 100(76—124), 200(161—239), 300(247—
353), 400(334—466).

Эффективная концентрация ингибитора подбирается эмпири-
чески. Для того чтобы торможение было заметным, требуется со-
отношение [7]>[Е], а так как комплексные связи возможны с
клеточными, но не с изолированными эпитопами, нижний предел
концентрации ингибитора следует выбирать ниже 1014 моле-
кул/мл (~10~7 М). Поэтому предварительный опыт ставят в об-
ласти концентраций от 10~7 до ЮНМ с десятикратным шагом и
определяют концентрацию, дающую уменьшение зон гемолиза
на 50%.

Основной опыт ставят на 10 чашках. Число иммуноцитов на
чашку подбирают таким образом, чтобы в отсутствие ингибитора
образовалось около 400 зон. Если поставлены четыре контроль-
ные чашки (без ингибитора), две с полной дозой клеток и две с
половинной, то ожидаемая ошибка счета будет около ±7%.
В опытные чашки (по две на каждую дозу ингибитора) вносят
полную дозу клеток с разными концентрациями ингибитора —
50, 100 и 200% от той, которая давала уменьшение числа зон на
50% в предварительном опыте. В остальном опыт выполняется и
анализируется так же, как в случае простого локального гемо-
лиза в геле (см. гл. 19).

в.	Обработка данных. Наименьшая видимая зона гемолиза в
соответствии с угловой разрешающей способностью человеческо-
го глаза имеет размеры около 0,1 мм; следовательно, минималь-
ный радиус зоны Го равен 0,05 мм. Поэтому уменьшение числа
зон гемолиза на 50% сводится к уменьшению среднего радиуса
зон до значения несколько ниже г0. Поскольку функция f(x, г)
линейна с наклоном, равным единице, во всей экспериментальной
области (см. разд. III,Б, 2,а) уменьшение числа зон гемолиза
вдвое равносильно также го/^-кратному изменению числа парато-
пов, связанных с индикаторными клетками. Таким образом, по
уравнению (17)

X =	[5]

Р К+[Е]
в отсутствие ингибитора и

[х]л> _L[E]

[Р]г К (/и + L) + L [El

в присутствии /50 — концентраций ингибитора, уменьшающей
число зон вдвое. Поделив первое уравнение на второе и пере-
группировав члены, получим:

— = 1 -4-	/	%

г0 L к/<+[£].

(25)

Ерне и сотр. (Jerne et al., 1974), игнорируя член в скобках,
получили очень простую формулу для константы равновесия:
L—roIsoKr—Го). Применение этой формулы экономит время, не-
обходимое для,постановки опыта. Это позволяет повторить ис-
следование при других концентрациях клеток. Если результаты
не изменятся (т. е. [Е]<сЛ), то эта формула верна; но если при
изменении концентрации эпитопов величина L изменится, фор-
мула не верна. И все же эти дополнительные усилия не беспо-
лезны: определив концентрации ингибитора, вызывающие умень-
шение числа зон гемолиза, для нескольких значений концентра-
ции клеток, мы получим линейное уравнение

= ~г~ + TV [EL	(26)

Г — Г0 /50 /боА

график которого, пересекаясь с осью ординат, однозначно опре-
деляет L. В свою очередь наклон этого графика может быть ис-
пользован для оценки К, если есть возможность определить кон-
центрацию клеточных эпитопов. Как показано в разд. П,Г,3,е, для
этого имеются реальные возможности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Almeida J. D., Cinader В., Howatson А. (1963). J. Exp. Med., 118, 327.

Fazekas de St. Groth S.	(1961). Aust.	J.	Exp. Biol., 39, 563.

Fazekas de St. Groth S.	(1963). Ann.	N.	J. Acad. Sci., 103, 674.

Fazekas de St. Groth S. (1967). Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biot, 32,525.

Fazekas de St. Groth S., Webster R.	G.	(1961). Aust. J. Exp.	Biot,	39, 549.

Fazekas de St. Groth S., 'Webster R.	G.	(1963). J. Immunol.,	90,	151.

Feinstein A., Munn E. A. (1969). Nature (London), 224, 1307.

Gopalakrishnan P. V., Karush F. (1974). J. Immunol., 113, 769.

Greenbury C. L., Moore D. H., Nunn L. A. C. (1965). Immunology, 8, 420.

Hornick C. L., Karush F. (1969). Isr. J. Med. Sci., 5, 163.

Hornick С. E., Karush F. (1972). Immunol. Chern., 9, 325.

Jerne N. K., Nordin A. A. (1963). Science, 140, 405.

Jerne N. K., Henry C., Nordin A. ,A., Fuji H., Koros A. M. C., Lefkoeits I.

(1974). Transplant. Rev., 18, 130.

Karush F., Karush S. S. (1971). Methods Immunol. Immunochem. 3, 383.

Katchalsky A., Spitnik P. (1947). J. Polym. Sci., 2, 432.

Kim Y. T., Werblin T. P., Siskind G. W. (1974). J. Immunol., 112, 2002.
Klinman N R., KarusH F. (1967). Immunochemistry, 4, 387.

Klinman N. R., Long C. A., Karush F. J. (1967). J. Immunol., 99, 1128.

Lafferty K. J. (1963). Virology, 21, 76.

Lafferty K- J., Oertelis S. (1963). Virology, 21, 91.

Nisonoff A., Pressman D. (1958). J. Immunol., 80, 417.

Pauling L., Pressman D., Grossberg A. L. (1944). J. Am. Chern. Soc., 66, 784.

Scatchard G, (1949). Ann. N. Y. Acad. Sci., 51, 660.

Sips R. (1948). J. Chern. Phys., 16, 490.

Stevens IF. L. (1939). Ann. Eugen. London., 9, 315.

van Regenmortel IF. H. V., Hardie G. (1976). Immunochemistry, 13, 503.

Werblin T. P., Siskind G. IF. (1972). Immunochemistry, 9, 987.

Werblin T. P., Kim Y. T., Quagliata F., Siskind G. IF. (1973). Immunology,
24, 477.

Wyman J. (1948). Advan. Protein Chern., 4, 407.
Глава 2

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ, АНТИТЕЛ
И ИХ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙ

Ж.-К /Катон, Д. Ч. Брандт, П. Вассалли

I.	ВВЕДЕНИЕ

Иммуноглобулины составляют группу макромолекул, чрез-
вычайно гетерогенную по биологической активности, заряду и мо-
лекулярному весу. Это наиболее щелочные из сывороточных
глобулинов, обладающие наименьшей электрофоретической по-
движностью (обзор: Eisen, 1973). Для их отделения от осталь-
ных белков сыворотки используют либо обычные физико-химиче-
ские методы, такие, как высаливание, ионообменная хроматогра-
фия, гель-фильтрация и препаративный зональный электрофорез,
либо аффинную хроматографию; последний метод особенно при-
годен для выделения из сыворотки специфических антител. Все
эти методы достаточно просты, не требуют большой затраты
времени и обеспечивают хороший выход иммуноглобулинов. Им-
муноглобулины разных животных различаются по заряду, мо-
лекулярному весу и электрофоретической подвижности, поэтому
методы фракционирования, пригодные для выделения иммуно-
глобулинов одного вида, не всегда будут без каких-либо измене-
ний пригодны для глобулинов другого вида; в каждом отдельном
случае необходима подработка методики. В этой главе дается
краткое описание общих методов фракционирования, позволяю-
щих выделять иммуноглобулины большинства видов животных.

II.	РАЗДЕЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ КОНЦЕНТРИРОВАННЫХ
РАСТВОРОВ НЕЙТРАЛЬНЫХ СОЛЕЙ

Для предварительного выделения иммуноглобулинов из сы-
воротки большинства видов животных обычно используют метод
высаливания сульфатом натрия или аммония (Kekwick, 1940).
Сывороточные иммуноглобулины осаждаются при комнатной
температуре или на холоду растворами сульфата аммония или
сульфата натрия, забуференными до pH 7,3 при конечном насы-
щении 33% или 18% соответственно. Образующийся осадок от-
деляют центрифугированием, снова растворяют в ЗФР и осажда-
ют вторично 33%-ным сульфатом аммония или 12—15%-ным
сульфатом натрия. При необходимости переосаждение можно
повторить еще один или два раза. Затем осадок растворяют в
ЗФР и удаляют избыток солей гель-фильтрацией через колонку
с сефадексом G-25 или путем диализа против ЗФР до отрица-
тельной пробы с хлористым барием. Описанный метод обычно
позволяет получать относительно чистые препараты IgG челове-
ка и кролика, иногда лишь с небольшой примесью а-глобулинов.
Этим методом можно также достаточно быстро получить доволь-
но чистые иммуноглобулины кур; он может быть использован и
для выделения иммуноглобулинов из сывороток других млекопи-
тающих — например, IgG морской свинки лучше всего высали-
ваются при 40%-ном насыщении сернокислым аммонием.

III.	ОЧИСТКА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

А. Хроматография на диэтиламиноэтилцеллюлозе

Ионообменная хроматография оказалась чрезвычайно эффек-
тивным методом очистки иммуноглобулинов (Peterson, Sober,
1956). Чаще всего используют диэтиламиноэтилцеллюлозу
(ДЭАЭ-целлюлозу). Белки задерживаются анионообменником в
результате ионных взаимодействий и могут быть легко элюиро-
ваны с адсорбента при повышении ионной силы и (или) измене-
нии pH в сторону их изоэлектрической точки.

1.	Иммуноглобулины человека

Сначала проводят диализ цельной сыворотки (10 мл) против
стартового 0,01 М калий-фосфатного буфера с pH 8,0. Затем сы-
воротку осветляют центрифугированием и наносят на колонку
ДЭАЭ-целлюлозы, уравновешенную тем же буфером (для колон-
ки 2,5X20 см требуется около 9 г целлюлозы DE-52 фирмы
Whatman) (Fahey, Horbett, 1959). Для последовательного гради-
ентного элюирования сывороточных белков используют 0,015М—
0,3 М калий-фосфатные буферы. Элюат содержит три основных
пика. В первом пике, который элюируется 0,02 М буфером, выхо-
дит более 80% фракции IgG, свободной от других сывороточных
белков. Второй пик содержит р-глобулины и часть а-глобулинов,
а самый большой, третий пик в основном состоит из сывороточно-
го альбумина. С ионообменника удается элюировать 75—85% на-
несенных иммуноглобулинов. Когда требуется выделить только
IgG, собирают белки, элюируемые 0,02 М. фосфатным буфером с
pH 8,0.

С помощью ионообменной хроматографии на такой же колон-
ке можно провести дальнейшую очистку иммуноглобулинов, вы-
соленных сернокислым аммонием или натрием из 10—20 мл сы-
воротки. IgM человека задерживаются ДЭАЭ-целлюлозой и I
элюируются при более высокой ионной силе; поэтому они обычно ]
больше загрязнены другими белками, такими, как а-глобулины. <
(В разд. IV будет описан более эффективный и быстрый метод ‘
выделения IgM. любого вида животных путем гель-фильтрации
на сефадексе G-200 или биогеле Р-300.) Иммуноглобулины A j
(IgA) также задерживаются на колонке и элюируются 0,1—0,15М
фосфатным буфером. Полученные фракции содержат IgA и мно-
го других сывороточных компонентов. Хроматография только на ;
ДЭАЭ-целлюлозе сама по себе не позволяет получить чистую
фракцию IgA, кроме случаев с миеломной IgA-сывороткой, в ко-
торой IgA значительно больше, чем других иммуноглобулинов.
Иммуноглобулин D (IgD), которого в нормальной сыворотке ,
очень мало (30—50 мкг/мл), обычно элюируется в фракциях, вы-
ходящих между IgG и IgA. Для его выделения в значительных
количествах и с высокой степенью чистоты необходимо иметь
миеломную IgD-сыворотку.

При хроматографии не следует перегружать колонку белком,
особенно в тех случаях, когда сыворотка содержит большое ко-
личество иммуноглобулинов (миеломные сыворотки или сыворот-
ка при макроглобулинемии Вальденстрёма), так как белки могут
элюироваться раньше, чем обычно, и загрязнять друг друга. Од-
нако нужно также избегать избытка адсорбента по отношению
к белкам сыворотки, который может быть причиной повышенной
неспецифической адсорбции иммуноглобулинов. Как правило, пе-
ред фракционированием больших количеств белка следует про-
вести предварительное разделение небольшого количества.

2.	Иммуноглобулины кролика

Эти иммуноглобулины можно весьма эффективно очистить на
колонке с ДЭАЭ-целлюлозой после предварительного осаждения
33%-ным сернокислым аммонием. Осадок диализуют против
0,0175М фосфатного буфера с pH 6,3 (Levy, Sober, 1960) и после
нанесения на колонку элюируют тем же буфером. При этом полу-
чают хороший выход IgG, не загрязненного другими сывороточ-
ными белками и обладающего низкой электрофоретической по-
движностью. При промывании колонки 0,2 М фосфатным буфе-
ром с pH 8,0 элюируется второй пик IgG с большей подвиж-
ностью. Однако эта фракция может быть слегка загрязнена
аз-глобулинами, и для ее очистки необходимо провести повтор-
ную хроматографию на том же адсорбенте.
3.	IgGi и IgG2 морской свинки

Два подкласса IgG морской свинки — IgG2 (с низкой электро-
форетической подвижностью) и IgGi (быстро мигрирующий ком-
понент) можно выделить хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе
(Oettgen et al., 1965), используя для элюции градиент ионной си-
лы (Leslie, Cohen, 1970). Так как содержание IgGi в сыворотке
относительно невелико, выделить эту фракцию без примеси IgG2
довольно трудно. Для разделения этих подклассов проводят хро-
матографию на ДЭАЭ-целлюлозе (DE-52 фирмы Whatman),
применяя для элюции ступенчатый градиент (Tracey et al.,
1976). Фракцию IgG, высоленную из 330 мл сыворотки 40%-ным
сернокислым аммонием, диализуют против 0,005 М фосфатного
буфера с pH8,0 и наносят на колонку (5,0X60 см); белки элюи-
руют ступенчатым градиентом фосфатного буфера: 0,005 М с
pH 8,0; 0,01 М с pH 6,5; 0,04 М с pH 6,2; 0,06 М с pH 6,1; 0,3 М с
pH 5,3. Фракция IgG2 снимается 0,005 М фосфатным буфером с
pH 8,0, а фракция IgGi — 0,06 М буфером с pH 6,1.

4.	Иммуноглобулины мышей

Мышиные иммуноглобулины (IgG2a и IgG2b) осаждают 18%
Na2SO4 и проводят дальнейшую очистку хроматографией на
ДЭАЭ-целлюлозе. Для элюции с адсорбента миеломных IgG2a
(МОРС 173) Бургуа и Фужеро использовали 0,017М фосфатный
буфер с pH 7,3 (Bourgois, Fougereau, 1970). Сначала можно вы-
делить неочищенные IgG с помощью зонального электрофореза
в певиконе1 на 0,054М барбиталовом буфере с pH 8,6. Затем пик
IgG наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой и элюируют чистые
IgG 0,04М фосфатным буфером с pH 8,0 (Carpa et al., 1975).
Для выделения миеломных IgM мыши лучше всего применять
гель-фильтрацию на биогеле Р-300 (или сефадексе G-200), элюи-
руя белок 0,5 М NaCl с 0,02 М фосфатным буфером (pH 7,0), ли-
бо электрофорез в певиконовом или агарозном блоке (см.
разд. V).

5.	Иммуноглобулины крыс

Подробно описана методика очистки трех классов и четырех
подклассов иммуноглобулинов крысы — IgM, IgA, IgE, IgGb
IgG2, IgG2b и IgG2c (Bazin et al., 1974). Она включает осаждение
40—50%-ным сернокислым аммонием с последующей хромато-
графией на ДЭАЭ-целлюлозе и гель-фильтрацией на сефадексе
G-200.

1 Сополимер поливинилхлорида и поливинилацетата. — Прим. ред.
Б. Гидрофобная хроматография в присутствии высокой
концентрации солей

Описан интересный способ очистки IgA человека методом гид-
рофобной хроматографии в присутствии сульфата аммония
(Doellgast, Plaut, 1976). Высокие концентрации (NH4)2SO4 ис-
пользуют для усиления взаимодействия белков с гидрофобным
лигандом, ковалентно связанным с сефарозой. IgA из нормальной
или миеломной сывороток адсорбируются на колонке с L-фенил-
аланин-сефарозой в присутствии IM (NH4)2SO4 и десорбируются
при снижении концентрации соли до 0,8 М. Для удаления неболь-
ших примесей других белков в большинстве случаев необходимо
затем проводить гель-фильтрацию. Метод оказался быстрым и
воспроизводимым, и его можно использовать для частичной
очистки почти всех сывороточных белков.

IV.	ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ

Гель-хроматография с использованием биогеля Р-300 или се-
фадекса G-200 позволяет разделить сыворотку или смесь имму-
ноглобулинов по величине белковых молекул. Чаще всего этот
метод используют для количественного фракционирования IgM,
который можно отделить от IgG и IgA одноэтапной хроматогра-
фией. В присутствии концентрированных солей (0,5 М NaCl на
0,02 М фосфатном буфере с pH 7,3 или 0,05 М трис-HCl с pH 8,0)
IgM большинства животных не входят в гель и элюируются в
первом пике. При диализе сывороток против буферов с низкой
ионной силой многие IgM и макроглобулины Вальденстрёма вы-
падают в осадок, так как они являются эуглобулинами. Промы-
тый осадок растворяют в забуференном 0,5М NaCl и фракцио-
нируют на колонке с сефадексом G-200. Фракции, выходящие в.
свободном объеме, содержат IgM. Выделенные таким образом
IgM мышей и кроликов часто содержат примесь а2-макроглобу-
лина, который элюируется вместе с IgM. С наибольшим успехом
примеси можно удалить электрофорезом в агарозном блоке:
IgM мигрирует к катоду, а а2-макроглобулин — к аноду (см.
разд. V).

V.	ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ В ГЕЛЕ

Это один из самых простых методов препаративного электро-
форетического разделения, и его широко применяют с конца
60-х годов. В качестве поддерживающей среды раньше обычно
использовали крахмал и певикон (Muller-Eberhard, Osterland,
1968). В настоящее время их заменяет агароза, так как с ней лег-
че работать, и, кроме того, в агарозном геле почти полностью от-
сутствует электроэндоосмос.
Электрофорез в агарозном блоке

Большое преимущество этого метода — высокий выход анти-
тел в целом или отдельных иммуноглобулинов при фракциониро-
вании сывороток и возможность разделения двух или более ви-
дов антител, относящихся к одному классу 1g, но имеющих раз-
личную электрофоретическую подвижность. Кроме того, можно
одновременно проводить электрофоретическое разделение не-
скольких образцов (Braun, Krause, 1968; Johansson, 1972). Одна-
ко в отличие от ранее упоминавшихся методов (хроматографии
на ДЭАЭ-целлюлозе, гель-фильтрации) количество наносимого
на гель материала здесь очень ограничено; кроме того, экспери-
мент занимает много времени, но это окупается простотой отде-
ления иммуноглобулинов от других белков и хорошей воспроиз-
водимостью.

Методика

а.	Реагенты и прибор. Схема аппарата показана на рис. 1.
Образец сыворотки диализуют в течение ночи, а затем проводят
электрофоретическое разделение компонентов в 0,054 М. барбита-
ловом буфере с pH 8,6.

б.	Приготовление агарозы. Готовят 0,5%-ный раствор агаро-
зы (Seakem Brand Marine Colloids, Inc., Biomedical Systems,
Спрингфилд, США), расплавляя ее на кипящей водяной бане при
100°С до получения прозрачного раствора. Затем агарозу охлаж-
дают до 50°С и осторожно выливают в двухлитровую ванну.
Гель затвердевает при комнатной температуре, затем его покры-

Рис. 1. Схема аппарата для проведения электрофореза в агарозном блоке.
Ванна изготовлена из пластинки плексигласа (50x 40 x0,5 см), окруженной
бортиками высотой 1,7 см. Блок можно разделить по длине иа несколько час-
тей и проводить одиовремеииое фракционирование нескольких образцов. 1 —
положение альбумина; 2 — положение а- и Р-глобулинов; 3 — канавка для
нанесения образца; 4 и 5 — область миграции иммуноглобулинов. А — каме-
ра для барбиталового буфера (0,054 М, pH 8,6); Б — камера для фосфатного
буфера (0,2 М, pH 7,5). Камеры А и Б соединены стеклянными мостиками.
вают полимерной пленкой (Saran Wrap), чтобы уменьшить испа-
рение, и оставляют на ночь при 4°С.

На расстоянии 19 см от анодного края геля вырезают канав-
ку шириной 1 см для внесения образца (см. рис. 1). Так как блок
обычно разделяют вдоль на две равные части, делают две канав-
ки. В каждую можно внести до 14 мл сыворотки.

в.	Нанесение образца. Сыворотку (14 мл), предварительно
отдиализованную против 0,054 М барбиталового буфера в тече-
ние ночи, прогревают 5 мин при 50°С и быстро смешивают с 2 мл
подогретого до 50°С 4%-ного золя агарозы на буфере, с тем что-
бы конечная концентрация агарозы составляла 0,5%• Получен-
ную смесь заливают в канавку, даЮт застыть, а затем подливают
2—5 мл 0,5%-ного раствора агарозы (50°С) для выравнивания
поверхности. Блок покрывают полимерной пленкой (Saran
Wrap) и проводят электрофорез при 4°С. Электрический контакт
блока с буферными камерами осуществляется через мостики из
фильтровальной бумаги, которые должны покрывать гель на 5—
10 см с обоих концов. Электрофорез продолжается 48—72 ч при
постоянном напряжении 600 В.

г.	Элюирование фракций. После электрофореза участок бло-
ка между 15 и 30 см от анода нарезают на полоски шириной 0,5—
1 см. Их помещают в центрифужные пробирки и замораживают
в течение ночи при температуре —20°С. Затем пробы быстро раз-
мораживают (замораживание и оттаивание разрушает агароз-

Рис. 2. График элюции антител, содержащихся в одной и той же сыворотке и
разделенных электрофорезом в агарозном блоке.

Антисыворотку 4184 к пневмококковому полисахариду типа III (14 мл) вноси-
ли в блок агарозы и проводили электрофорез в течение 48 ч (как описано в
тексте). Каждая фракция соответствует полоске геля шириной 1 см (нумера-
ция от анода, т. е. слева). Образец наносили в каиавку, расположение которой
соответствует фракции 19. Белок в элюатах определяли по методу Лоури.
(Подробности см. в тексте.)
Рис. 3. Изоэлектрофокусированне (ИЭФ) фракций антител, выделенных элек-
трофорезом в агарозном блоке.

А — фракция 2; В — фракция 3: С — фракция 4. Анализ проводили в 5%-ном
акриламидном геле, содержавшем 2% амфолинов (pH 5—9), в течение 14 ч
при 450 В, а затем еще 2 ч при 600 В. Фракции окрашивали бромфеноловым
синим. Подробности метода аналитического ИЭФ описаны в гл. 5.
ный гель) и центрифугируют 30 мин при 27 000 g. Надосадочнукх
жидкость собирают, а осадки промывают дважды 3 миллилитра-
ми 0,1 М трис-НСЬбуфера с pH 8,0, содержащего 0,5 М NaCl и
0,02% NaN3. Надосадочную жидкость от всех проб объединяют
и определяют белок по методу Лоури (Lowry, Hunter, 1945).
Фракции, образующие отдельные пики, объединяют, концентри-
руют ультрафильтрацией и диализуют против ЗФР с pH 7,4. Го-
могенность фракций оценивают, например, при помощи микрозо-
нального электрофореза, изоэлектрического фокусирования или
электрофореза в полиакриламидном геле.

На рис. 2 представлена типичная картина электрофоретичес-
кого разделения в агарозном блоке: из сыворотки кролика 4184-
изолировали три популяции антител к пневмококку типа III, об-
ладающих различной электрофоретической подвижностью. Сы-
воротка содержала около 15 мг антител класса IgG в 1 мл. Полу-
чены четыре основные фракции, содержащие иммуноглобулины.
Картина изоэлектрического фокусирования для трех из них
(рис. 3) подтверждает эффективность электрофоретического ме-
тода; можно видеть, что фракция 4 содержит в основном антите-
ла с pl 7,7-—8 (медленно мигрирующий компонент), а фракция 2
(быстро мигрирующий компонент) — антитела с pl 5,9—6,2.
Фракция 3, как и следовало ожидать на основании электрофоре-
граммы, содержит примесь фракции 2. Фракция 1 (на рис. 3 не
Показана) по данным микрозонального электрофореза загрязне-
на другими сывороточными белками. С помощью количественной
преципитации с полисахаридом пневмококка типа III было пока-
зано, что в элюат из геля выходит в общей сложности 74,2% ан-
тител, содержавшихся в нанесенном образце сыворотки.

При дополнительном более длительном электрофоретическом
разделении каждой фракции (72—96 ч) можно получить доста-
точно очищенные антитела.

VI. АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ИММУНОСОРБЕНТОВ НА ОСНОВЕ СЕФАРОЗЫ

Антиген ковалентно привязывают к нерастворимому носите-
лю, обычно к сефарозе 4В или 6В (Ахёп et al., 1967; Cuatrecasas.
Anfinsen, 1971), и конъюгатом антиген-сефароза заполняют хро-
матографическую колонку. Затем через колонку пропускают сы-
воротку с соответствующими антителами. Специфические анти-
тела адсорбируются конъюгатом, после чего их элюируют либа
- неспецифически (например, кислотами или высокой концентра-
цией соли), либо специфически (гаптеном, использованным в ка-
честве лиганда).

Этот метод позволяет довольно быстро получать хороший вы-
ход специфических антител к белковым антигенам, таким, как ге-
моцианин или бычий сывороточный альбумин, к конъюгатам бе-
лок-гаптен, к гликопротеидам и к полисахаридным антигенам
(см. разд. VI,Б). При этом можно раздельно выделять из одной
и той же сыворотки антитела, обладающие разной аффинностью
к антигену.

Так как прямое связывание высокомолекулярных полисаха-
ридных антигенов с активированной CNBr сефарозой 4В невоз-
можно, предварительно получают конъюгаты полисахаридов с
белком, которые затем присоединяют к активированной сефарозе
обычным методом через белок (Ахёп et al., 1967).

А. Получение комплекса белок — пневмококковый полисахарид
типа III

Метод конъюгации, в первоначальной своей форме описанный
Гебелем и Эвери (Goebel, Avery, 1931), применим для любых по-
лисахаридов. Вначале получают n-нитробензиловый эфир поли-
сахарида, восстанавливают его в n-аминопроизводное, затем пе-
реводят в диазониевую соль, которую потом соединяют через
диазогруппу с любым белком, содержащим остатки ароматичес-
ких аминокислот (Pincus et al., 1970; Jaton et al., 1970). В 100 мл
воды растворяют 250 мг SHI, доводят pH до 11 разведенным
NaOH, помещают в водяную баню при 100°С и пятью порциями
добавляют 1 г n-нитробензилбромида. Смесь перемешивают до
полного растворения кристаллов нитробензилбромида (около
2 ч), поддерживая pH между 10 и 11 добавлением 5 н. NaOH.
Опалесцирующий раствор желтого цвета диализуют против дис-
тиллированной воды и полученное нитропроизводное SIII восста-
навливают в аминопроизводное в присутствии избытка дитионита
натрия при pH9,0 и температуре 60°С. Раствор осветляется через
20—30 мин. n-Аминопроизводное исчерпывающе диализуют про-
тив дистиллированной воды, центрифугируют и образовавшийся
небольшой осадок отбрасывают. Надосадочную жидкость, содер-
жащую около 210 мг n-аминобензилового эфира SIII, лиофили-
зируют. Полученный желтый порошок суспендируют в 30 мл
0,25 н. НС1, и на ледяной бане, энергично перемешивая, медленно
(в течение 20 мин) добавляют к нему небольшой избыток 0,5 М
нитрита натрия. Затем раствор соли диазония быстро вливают
в раствор 500 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) в
50 мл 0,2 М боратного буфера с pH 9. Раствор хорошо перемеши-
вают, поддерживая pH между 10 и 11 с помощью разведенного
NaOH. Смесь оставляют при 0°С и pH 10 на 4 ч, а затем получен-
ный темно-оранжевый раствор конъюгата SIII-азо-БСА диализу-
ют против воды и после удаления центрифугированием неболь-
шого осадка лиофилизируют. Конъюгат содержит по весу около
50% полисахарида.
Б. Присоединение конъюгата SIII-азо-БСА
к активированной CNBr сефарозе 4В

Метод активации сефарозы 4В описан в ряде работ (Ахёп et
al., 1967; Cuatrecasas, Anfinsen, 1971) (готовый препарат сефаро-
зы 4В, активированной CNBr, поставляет фирма Pharmacia, Уп-
сала, Швеция). Лиофилизированную сефарозу 4В, активирован-
ную CNBr (15 г), регидратируют в 0,001 М НС1 и промывают
примерно двумя литрами этого же раствора на пористом стек-
лянном фильтре. К промытому осадку сефарозы добавляют
130 мг конъюгата, растворенного в 100 мл 0,1 М NаНСОз с pH 8,3,
содержащего 0,5 М NaCl, и осторожно перемешивают 2 ч при
комнатной температуре или в течение ночи при 4°С. Несвязав-
шийся белок отмывают тем же буфером на пористом стеклянном
фильтре, избыток активных групп блокируют 1 М этаноламином
(pH доводят до 8,5 с помощью НС1) при комнатной температуре
в течение 2 ч. Избыток блокирующего реагента отмывают на
стеклянном фильтре буферным раствором, в котором проводи-
лось конъюгирование, затем конъюгат промывают, чередуя 0,1 М
ацетатный буфер с pH 4, содержащий 1 М NaCl, и 0,1 М боратный
буфер с pH 8, содержащий 1 М NaCl. Для удаления следов анти-
гена, не связанного ковалентно с носителем, требуется около пя-
ти отмываний чередующимися буферами. Последний раз иммуно-
сорбент промывают ЗФР, содержащим 0,02% NaN3. Иммуносор-
бент сохраняют при 4°С (не замораживать!). Взвешивая коли-
чество конъюгата, не связавшегося с сефарозой, определяют ко-
личество ковалентно связанного конъюгата, которое может быть
от 1,5 до 2,5 мг на 1 мл плотного осадка гранул сефарозного геля.

Рис. 4. Фракционирование антител сыворотки 3968 на иммуносорбенте анти-
ген — сефароза.

Объем фракций — 3,5 мл; поглощение измеряли при 280 нм. Кривая с крести-
ками — градиент pH; G — начало градиента. (Подробности в тексте.)
Рнс. 5. Изоэлектрофокусирование фракций антител, полученных из сыворот-
ки 3968 (см. рис. 4).

А — сыворотка 3968 до фракционирования; В — фракция 2; С — фракция 3;

D — фракция 4; £ — смесь равных количеств фракций 2 и 4.
1.	Адсорбция специфических антител и элюция их

с иммуносорбента

Максимальную емкость нммуносорбента определяют в опытах
насыщения, добавляя к одному и тому же его количеству возрас-
тающие объемы антисыворотки. Определив оптимальное соотно-
шение антиген — антитело, проводят эксперимент в большом
объеме. Пример типичного опыта: на колонку (1,5X30 см), за-
полненную иммуносорбентом (50 мл), нанесли 12 мл антисыво-
ротки № 3968 к пневмококку SIII, содержащей смесь антител;
иммуносорбент промывали ЗФР до тех пор, пока оптическая
плотность при 280 нм не стала меньше 0,05; при этом адсорбция
была сочтена полной, так как в буфере, выходившем из колонки,
не обнаруживались антитела. Для выделения отдельных популя-
ций антител из смеси можно провести элюцию нисходящим гра-
диентом pH с восходящим градиентом ионной силы. Градиенты
готовили с помощью двухкамерного смесителя. В смесительную
камеру помещали 250 мл ЗФР, а в другую камеру — 250 мл 0,2 н.
СНзСООН с ЗМ NaCl. График элюции представлен на рис. 4;
здесь видны пять пиков. Фракции, собранные как показано на
рис. 4, диализовали против ЗФР, концентрировали ультрафильт-
рацией и анализировали методом аналитического ИЭФ (рис. 5).
Хотя все фракции элюировались прн различных pH (различие на
1 единицу pH), фракции 2 и 4 были очень сходны, но не идентич-
ны, что четко видно при ИЭФ их смеси (рис. 5, гель Е). Эти фрак-
ции очень сильно отличаются от фракции 3. Методом количест-
венной преципитации было показано, что общий выход антител
в фракциях составляет 68% от общего содержания их в сыворот-
ке. Так же, как и при электрофорезе в агарозном блоке, ни одна
из фракций не бывает здесь абсолютно чистой. Рециклическая
аффинная хроматография отобранных фракций часто позволяет
получить гомогенные антитела, которые в ИЭФ не отличаются от
типичных миеломных белков.

2.	Другие методы элюции1

Хороший выход антител можно получить, используя ступен-
чатую или градиентную элюцию 0,1 М HCl-глициновым буфером
с pH2,5, ЗМ тиоцианатом аммония (Dandliker et al., 1967) или
2М Nai (Avrameas, Ternynck, 1967).

1 В нашей лаборатории в настоящее время проводятся эксперименты по
специфической элюции антител к полисахаридам с помощью олигосахаридных
лигандов различной величины, полученных при частичном кислотном гидроли-
зе целой молекулы полисахарида.
В. Выделение специфических антиаллотипических антител

Метод аффинной хроматографии можно также использовать
для выделения специфических кроличьих антиаллотипических
антител. Иммуноглобулины или гомогенные антитела с известной
аллотипической специфичностью присоединяют к сефарозе 4В,
а элюцию проводят 4М гуанидином на 0,05 М глициновом буфере
с pH 3,5 (Aasted et al., 1967) или 0,2 М уксусной кислотой (Jaton
et al, 1976).

Г. Выделение специфических антиидиотипических антител

Кроличьи антитела к идиотипам можно выделить из соответ-
ствующей антисыворотки (9 мл) аффинной хроматографией на
сефарозе 4В (40 мл), к которой ковалентно привязаны антитела
данного идиотипа (20 мг). Колонку промывают забуференным
физиологическим раствором, адсорбированные антитела элюиру-
ют ЗМ NH4SCN на том же растворе, а затем пропускают через
вторую колонку с сефарозой, к которой ковалентно привязана
смесь кроличьих IgG. На второй колонке из элюата удаляют свя-
зывающиеся неспецифически IgG. Элюат с колонки содержит
2,4 мг специфических антиидиотипических антител. (Sogn et al,
1976).

Д. Выделение антител к гаптенам

Антитела к ДНФ (Ollander, Little, 1975) и к фосфорилхолину,
(Chesebro, Metzger, 1972) можно выделить таким же образом,
используя производные соответствующих гаптенов, прямо свя-
занные с сефарозой 4В. Элюцию проводят растворами гаптенов
(Goetzl, Metzger, 1970), избыток лиганда удаляют либо диали-
зом против нейтральных буферов, либо — в случае заряженных
гаптенов (Little, Eisen, 1966) — хроматографией на ионообмен-
нике.

Если антитела обладают высокой аффинностью к данному
гаптену, то для их выделения используют комплекс сефарозы с
другим, перекрестно-реагирующим гаптеном, обладающим мень-
шей аффинностью к данным антителам, и его же используют для
элюции антител с сорбента. Избыток гаптена удаляют диализом,
а гаптен, связанный с антителами, можно удалить денатурацией
в 6М гуанидин-HCl при температуре 4°С. Белок затем ренатури-
руют диализом против растворов с убывающими концентрациями
гуанидина-HCl, а потом проводят диализ против ЗФР. Выход ан-
тител при денатурации — ренатурации в случае антител к диги-
токсину колеблется в пределах от 73 до 94% (Curd et al, 1971).
Е. Регенерация иммуносорбентов

Для удаления всех антител иммуносорбент отмывают 0,2 н.
СНзСООН, 0,1 М HCl-глициновым буфером или ЗМ тиоцианатом,
затем снова уравновешивают ЗФР, содержащим 0,02% NaNs, и
хранят при 4°С.

Ж. Общие соображения об очистке класс-специфических
иммуноглобулинов

Следует подчеркнуть, что большинство препаратов иммуно-
глобулина определенного класса обычно содержит примеси 1g
других классов, за исключением IgG, выделенных хроматогра-
фией на ДЭАЭ-целлюлозе, и IgM, выходящих в первом пике при
хроматографии на сефадексе G-200. Поэтому рекомендуется про-
водить рехроматографию полученных препаратов на той же ко-
лонке и в тех же условиях, либо использовать какую-то иную
процедуру, например электрофорез в агарозном блоке или гель-
фильтрацию. Для той же цели можно применить и аффинную
хроматографию на сефарозе с класс-специфической антисыворот-
кой. Миеломные белки классов G, А и М и парапротеины при
макроглобулинемии Вальденстрёма удается очистить одноэтап-
ной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе или зональным элект-
рофорезом, поскольку они являются основным компонентом сы-
воротки. Чистоту каждой фракции иммуноглобулинов исследуют
с помощью иммуноэлектрофореза, двойной иммунодиффузии или
радиоиммунным методом с класс- или подкласс-специфическими
антисыворотками. Чистые белки хранят при 4°С в присутствии
0,02% NaNs или замораживают растворы с концентрацией 10—
30 мг/мл.

3.	J-цепь

J-цепь обнаружена в молекулах IgM и полимерного IgA, но
не в мономерных IgA и субъединицах IgM (Morrison, Koshland,
1972). Она найдена в полимерных 1g многих позвоночных, в том
числе у акул (Koshland, 1975). По своим размерам J-цепь сход-
на с L-цепью; через дисульфидную связь она присоединяется к
Fc-участку а- или p-цепи. Предполагают, что J-цепь служит «со-
единительным» белком и участвует в полимеризации 1g, связы-
вая молекулы через дисульфидные мостики. J-цепи, мигрирую-
щие к аноду быстрее L-цепей, можно отделить от последних пу-
тем электрофореза. J-цепи менее растворимы в воде, чем L-цепи,
и этим также можно воспользоваться для их частичного разделе-
ния. Для очистки больших количеств J-цепей обычно применяют
гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию. Примесь
Н-цепей (а, ц) или L-цепей можно удалить аффинной хромато-
графией с соответствующими сыворотками анти-а, анти-ц или
анти-L (Wilde, Koshland, 1973).

VII. ИММУНОСОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ БЕЛКОВ,
СШИТЫХ ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ

Глутаровый альдегид можно использовать в качестве сшива-
ющего реагента для полимеризации антигенов и антител. Сши-
тые белки становятся нерастворимыми вблизи своей изоэлектри-
ческой точки (pH 4,5—7,5). Нерастворимые перекрестно-сшитые
белки стабильны в растворах мочевины и додецил сульфата нат-
рия и могут быть использованы как иммуносорбенты для очистки
соответствующих антигенов или антител с помощью колоночной
или бесколоночной хроматографии. Метод не требует больших
затрат времени, воспроизводим и может быть использован для
всех белков, содержащих свободные а- или 8-аминогруппы (Av-
rameas, Ternynck, 1969).

А.	Полимеризация бычьего сывороточного альбумина (БСА)

БСА (400 мг) растворяют в 10 мл 0,2 М ацетатного буфера с
pH 5,0 и при перемешивании добавляют по каплям 2,5%-ный рас-
твор глутарового альдегида (2 мл). Для гелеобразования смесь
оставляют при комнатной температуре на 3 ч.

Б. Полимеризация сывороточных белков человека

Сыворотку человека (10 мл) диализуют в течение ночи про-
тив 0,15 М NaCl, затем добавляют либо 1 мл 1 М фосфатного бу-
фера с pH 7,4, либо 1 мл 1 М ацетата натрия с pH 5,0. К получен-
ному раствору приливают 3 мл 2,5%-ного раствора глутарового
альдегида и оставляют при комнатной температуре на 3 ч. Гель
обычно образуется уже через 20 мин.

В.	Полимеризация очищенного IgG

IgG (25 мг) диализуют против 0,1М фосфатного буфера с
pH 7,4, раствор разбавляют до концентрации 50 мг/мл. По кап-
лям добавляют 0,1 мл 2,5%-ного раствора глутарового альдеги-
да. Полимеризация начинается почти мгновенно, но для заверше-
ния процесса гель оставляют при комнатной температуре на 3 ч.
Бесколоночный метод

Полимеризованные белки (24—200 мг) суспендируют в 0,2 М
фосфатном буфере (20—200 мл соответственно) и размельчают
в гомогенизаторе Поттера. Затем суспензию центрифугируют
10 мин при 5000 об/мин и 4°С и осадок ресуспендируют в фосфат-
ном буфере. Эту операцию повторяют трижды. Затем иммуносор-
бент суспендируют и промывают элюирующим раствором (0,2 н.
СНзСООН, 0,1 М HCl-глициновым буфером с pH 2,5 или ЗМ
NH4SCN) до тех пор, пока оптическая плотность надосадочной
жидкости при 280 нм не станет меньше 0,02.

Иммуносорбент суспендируют и промывают физиологическим
раствором, забуференным фосфатами (pH 7,2), и он готов для
работы. Соответствующие количества антисыворотки или антиге-
на перемешивают с суспензией иммуносорбента в течение 30 мин
при комнатной температуре. Неадсорбированный материал уда-
ляют, промывая суспензию несколько раз забуференным физио-
логическим раствором, а адсорбированные белки снимают с им-
муносорбента, суспендируя его в элюирующих растворах. Элю-
цию необходимо проводить небольшими объемами (4—20 мл) и
повторять два или три раза до тех пор, пока в элюирующем рас-
творе не перестанет обнаруживаться белок.

Использованный иммуносорбент отмывают несколько раз за-
буференным физиологическим раствором и хранят при 4°С в
присутствии 0,02% NaNs.

Выход антител, элюированных с нерастворимого антигена, до-
стигает 60—90%, в то время как выход гомологичного антигена,
снятого с нерастворимых антител, составляет только 30—85%.
При выделении антигена необходимо иметь в виду, что после
каждого цикла адсорбционная способность нерастворимых анти-
тел или антисывороток значительно снижается (Avrameas, Тег-
пуп ck, 1969).

Подобные иммуносорбенты можно использовать и в колон-
ках, но результаты получаются хуже, так как в колонке трудно
установить постоянную скорость протекания растворов, особенно
после нескольких циклов регенерации.

VIII.	РАЗДЕЛЕНИЕ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙ

Тяжелые (Н) и легкие (L) цепи иммуноглобулинов связаны
одним межцепочечным дисульфидным мостиком, а две Н-цепи со-
единены между собой в области шарнира одной или нескольки-
ми — в зависимости от подкласса — дисульфидными связями
(Milstein, Pink, 1970). Для разделения цепей необходимо восста-
новить все межцепочечные дисульфидные связи, что достигается
путем воздействия меркаптанами с последующим алкилировани-
ем образовавшихся сульфгидрильных групп и диссоциацией це-
пей в присутствии 1 М уксусной или пропионовой кислоты. Пос-
ледний этап разделения цепей обычно проводится на колонках с
сефадексом G-100, однако при этом фракция Н-цепей обычно со-
держит примесь L-цепей (Fleischman et al., 1962). Для получения
чистых Н-цепей всех видов животных желательно использовать
более сильный диссоциирующий агент, чем 1 М уксусная кислота,
например 6М мочевину в 1 М уксусной кислоте или 5М гуани-
дингидрохлорид при pH 3,5. Восстановление межцепочечных ди-
сульфидных связей называют мягким или частичным, так как
внутрицепочечные дисульфидные связи при этих условиях (0,1 М
2-меркаптоэтанол или 0,01 М дитиотреитол при pH 8,3 без дена-
турирующих реагентов) обычно не разрываются. Для полного
восстановления всех дисульфидных связей необходимы концент-
рированные растворы денатурирующих веществ (ЮМ мочевина
или 6—8М гуанидин-HCl) (Small, Lamm, 1966).

А. Частичное восстановление 2-меркаптоэтанолом

Препарат 1g любого класса или подкласса (600 мг в объеме
30 мл) диализуют против 200 объемов 0,4 М трис-НС1-буфера с
pH8,4 и добавляют 0,36 мл 0,15М 2-меркаптоэтанола. Пробирку
закрывают пробкой и помещают в водяную баню при 37°С на
60—90 мин. Алкилирование проводят, добавляя иодацетамид
(1,1 г, 0,2М) в 5 мл 0,4М трис-НС1-буфера с pH8,3 (иодацета-
мид берут в небольшом молярном избытке относительно 2-мер-
каптоэтанола); смесь выдерживают 30 мин на ледяной бане. Ес-
ли проводят алкилирование иодуксусной кислотой, то ее сначала
нейтрализуют NaOH или 1М трис-НС1-буфером с pH 8,3, так
как для получения количественного результата очень важно при
алкилировании поддерживать pH среды 8,3. В противном случае
иодуксусная кислота сдвинет pH в кислую область и может на-
чаться алкилирование остатков метионина (Wilkinson, 1969).
Иодацетамид и иодуксусную кислоту перед использованием необ-
ходимо дважды перекристаллизовать для удаления следов сво-
бодного иода.

Б. Восстановление дитиотреитолом

Частичное восстановление можно проводить при условиях,
описанных выше, обрабатывая препараты дитиотреитолом
(10 мМ) в течение 2 ч при комнатной температуре, с последую-
щим алкилированием при помощи иодацетамида (22 мМ) в те-
чение 30 мин при 0°С.
Разделение цепей

Частично восстановленный и алкилированный IgM диализуют
в течение ночи против 1 М уксусной или 1 М пропионовой кисло-
ты. Раствор белка (600 мг в объеме около 35 мл) наносят на ко-
лонку (5X150 см) с сефадексом G-100, уравновешенную 1 М ук-
сусной или пропионовой кислотой. Фракции Н- и L-цепей опреде-
ляют по поглощению при 280 нм. В этих условиях Н-цепи, как
известно, агрегируют и элюируются в большом пике, перед кото-
рым обычно идет пик полимерного материала. Пик L-цепей мень-
ше и должен быть полностью обособлен от пика Н-цепей.

В случае IgG фракция L-цепей должна составлять 1/3 всего
препарата. В действительности выход L-цепей достигает лишь
26—30% всего элюированного материала, поглощающего при
280 нм. Если выход ниже 28%, то небольшие количества L-цепей
обнаруживаются в пике агрегатов Н-цепей, что объясняется ли-
бо неполным восстановлением, либо неполной диссоциацией в
1 М уксусной кислоте. В последнем случае нужно использовать
более сильные диссоциирующие агенты, например 1 М раствор
уксусной кислоты, содержащий 6 М мочевину или 5 М гуанидин-
НС!; в таких условиях выход L-цепей приближается к теорети-
ческому (33%).

Фракции Н- и L-цепей в 1 М уксусной кислоте собирают от-
дельно и лиофилизируют. Если для элюции используется моче-
вина или гуанидин, то препараты перед лиофилизацией диализу-
ют против НгО. Высушенный материал лучше всего хранить при
4°С в хорошо закрытых склянках.

Препараты цепей хорошо растворимы в ацетатном буфере
при pH ниже 5, но при pH выше 7 растворимость, особенно Н-це-
пей, уменьшается. Растворимость Н-цепей можно повысить по-
лиаланилированием (Fuchs, Sela, 1965); если количество вклю-
ченного аланина не очень велико, антигенные свойства препарата
не изменяются (Freedman, Sela, 1966а, b).

Разделение частично восстановленных цепей молекул IgM
обычно проводят на сефадексе G-150 или G-200 в присутствии
денатурирующих агентов (Riesen, Jaton, 1976). При работе с мы-
шиным IgM для элюции используют 1 М уксусную кислоту с 6М
мочевиной (Robinson et al., 1973).

Степень чистоты препаратов Н- и L-цепей лучше всего опре-
делять методом электрофореза в 5 %-ном полиакриламидном ге-
ле с додецилсульфатом натрия (Weber, Osborn, 1969) или двой-
ной иммунодиффузии со специфическими антисыворотками к Н-
и L-цепям.
IX.	ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БЕЛКА A STAPHYLOCOCCUS

AUREUS В КАЧЕСТВЕ ИММУНОСОРБЕНТА

ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

Белок А ковалентно связан с пептидогликанами клеточной
стенки стафилококка, и его выделяют с помощью ферментатив-
ного переваривания лизостафином (Sjoquist, 1972). Для дальней-
шей очистки пользуются ионообменной хроматографией и гель-
хроматографией. Белок А начал привлекать внимание исследова-
телей в 1970 г. благодаря своей поразительной способности проч-
но связываться с Fc-участком IgG различных животных (Fors-
gren, Sjoquist, 1966; Sjoquist et al., 1967). Это позволяет выделять
его в чистом виде с помощью аффинной хроматографии на ко-
лонке с IgG-сефарозой 4 В (Hjeim et al., 1972). Элюирование про-
водят 0,1 М HCl-глициновым буфером с pH 3,0. С другой стороны,
можно присоединить белок А к сефарозе 4В (Hjeim et al., 1972)
и получить таким образом иммуносорбент, содержащий 4 мг бел-
ка на 1 мл плотного геля и способный связать до 20 мг IgG на
1 мл геля. Элюцию IgG проводят 0,1 М HCl-глициновым буфером
с pH 3,0 и получают до 95% IgG, свободного по данным иммуно-
электрофореза от примесей 1g других классов. Этот метод приго-
ден для выделения IgG из сывороток различных видов живот-
ных. С помощью такого иммуносорбента можно удалять IgG из
препаратов других классов 1g. Это намного облегчает приготов-
ление препаратов IgA, IgM, IgD и IgE, которые не реагируют с
белком А. Кроме того, с ним не связывается подкласс IgGs чело-
века (Kronvall, Williams, 1969), что позволяет отделить этот 1g
от других подклассов. Белок А можно также использовать для
удаления Fc-фрагментов из папаинового перевара IgG.

Применение белка А для выделения и анализа следовых
количеств меченых иммуноглобулинов

Выделение иммуноглобулинов, связанных с поверхностью
клетки, а также их внутриклеточных предшественников (или
предшественников секреторных 1g) всегда сопряжено со значи-
тельными трудностями. Радиомаркирование, позволяющее выя-
вить следовые количества 1g, облегчает решение этой задачи.
После маркирования клетки солюбилизируют в детергенте и об-
рабатывают лизаты сывороткой анти-Ig, полученной у другого
вида; иммунные комплексы обычно осаждают затем второй анти-
сывороткой к 1g первой антисыворотки. Меченые клеточные 1g,
находящиеся в преципитате, исследуют методом электрофореза
в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН) в
присутствии восстанавливающих агентов или без них (Laemmli
1970). Меченые полипептидные цепи, разделенные в геле, опре-
деляют по радиоактивности либо в отдельных кусочках геля, ли
бо методом радиоавтографии после высушивания геля. Мето/
можно улучшить, заменяя вторую антисыворотку стафилококков
штамма Cowan, несущим белок А. Эта модификация, предложен
иая Кесслером (Kessler, 1975), позволяет исключить непрямук
иммунопреципитацию. Белок А быстро и прочно связывает им
мунные комплексы через Fc-участок с минимальной неспецифи
ческой сорбцией других клеточных компонентов (Kessler, 1975)
При этом можно использовать очень небольшие количества ан
ти-Ig, что значительно увеличивает чувствительность и разреша-
ющую способность электрофореза в полиакриламидном геле с
ДСН. Комплексы клеток стафилококка с мечеными клеточными
Ig и анти-Ig (IgG-фракция сыворотки) осаждают, центрифуги-
руя с малой скоростью, и отмывают без потерь радиоактивногс
материала. Затем осадок анализируют методом электрофореза в
полиакриламидном геле с“ДСН и проводят радиоавтографию вы-
сушенного геля. Количество лимфоцитарных Ig мыши, получае-
мое этим методом, значительно больше, чем при использовании
обычного метода с двойной системой антител (Kessler, 1975).

Для идентификации и выделения мембранных Ig или других
типов клеточных Ig в нашей лаборатории в настоящее время при-
меняется следующий метод. Метку вводят в белок либо в процес-
се его биосинтеза (инкубируя клеточную суспензию в присутст-
вии одной или нескольких радиоактивных аминокислот), либо
путем радиоиодирования интактных клеток в присутствии лакто-
пероксидазы, что приводит к маркировке поверхностных белков
(Marchalonis et al., 1971) (см. гл. 10). Вместо того чтобы добав-
лять перекись к клеточной суспензии (Hubbard, Cohn, 1972),
применяют более мягкую процедуру — получают перекись прямо
в реакционной среде, проводя радиоиодирование с лактоперокси-
дазой в присутствии глюкозооксидазы и небольших количеств
глюкозы. Для маркировки ЗХЮ7 лимфоидных клеток использу-
ют около 0,5 мКи 1251, свободного от носителя. После иодирова-
ния клетки отмывают несколько раз физиологическим раствором
с фосфатным буфером и 5 мМ KI, а затем лизируют путем мяг-
кой гомогенизации в присутствии 0,5% нонидет Р-40 (NP-40) в
0,05 М трис-НС1-буфере с pH 7,4, содержащем 0,05 М КС! и
0,005М MgCl2. Оседающие частицы (например, ядра и рибосо-
мы) удаляют из лизата центрифугированием при 100000—
150 000g в течение 30 мин, а лизат диализуют 18 ч против боль-
шого объема ЗФР, содержащего 0,02% NP-40. После диализа ин-
кубируют фракции лизата (с радиоактивностью около 0,5—1Х
ХЮ6 имп/мин) 30 мин при 37°С с 10—20 мкл 2%-го раствора
IgG, содержащего антитела к иммуноглобулинам мембран, под-
лежащим выделению. Затем добавляют 10%-ную суспензию ста-
филококка, приготовленную и отмытую по методу Кесслера (Kes-
Рис. 6. Авторадиография меченых цепей 1g после электрофореза в полиакрил-
амидном геле с додецилсульфатом натрия в присутствии восстанавливающих
агентов. Иммунные комплексы меченых 1g с фракциями IgG специфических
антисывороток адсорбировали на клетках стафилококка, несущих белок А
(подробности в тексте).

А.	Клетки мышиной селезенки, меченные ,251. Клеточный лнзат (1,4х
Ю6 нмп/мин) преципитировалн антнмышннымн IgG кролика (слева); конт-
роль — нормальный кроличий IgG (справа). Электрофорез лизата проводили
в 7,5%-ном полиакриламидном геле с додецнлсульфатом натрия.

Б. Популяции клеток мышиной селезенки, меченные в процессе биосинтеза
355-метиоиином, с большим количеством IgM.-плазматических клеток через
3 дня после внутрибрюшинной инъекции липополисахарида Е. colt. Электро-
форез клеточного лизата проводили в 17,5 %-ном полиакриламидном геле.
Клеточный лнзат (около 1-105 нмп/мнн) преципитировалн антимышииымн
IgG кролика (слева); контрольный IgG (справа) — то же количество нор-
мального кроличьего IgG, но интенсивность метки в 4 раза выше.

В.	Популяции клеток мышиной селезенки с повышенным содержанием
IgM-плазматнческих клеток, меченные в процессе биосинтеза нС-лейцнном.
Слева — прецнпнтат, образованный IgG кролика к мышиным 1g с белками,
полученными при инкубации (72 000 нмп/мнн) клеток в среде. Выявляются Ц-,
Y- н L-цепн. Справа — прецнпнтат той же антисыворотки с соответствующим
клеточным лизатом (160 000 нмп/мин). Кроме цепей 1g четко выявляется свя-
занный с мембраной белок, сорбирующий иммуноглобулины (MAID).
sler, 1975), и инкубируют 15 мин при комнатной температуре;
после центрифугирования (2—5 мин при 1000—1500g) осадок
промывают несколько раз ЗФР (0,2—0,5 мл), суспендируют в
40 мкл буфера с ДСН и с восстанавливающим агентом или без
него и кипятят. Затем пробы центрифугируют и надосадочную
жидкость наносят на полиакриламидный гель с ДСН (Laemmli,
1970). Такой же метод применяют и для выделения из клеток ра-
диоактивных 1g, меченных в процессе их биосинтеза.

На рис. 6 представлены результаты, полученные описанным
методом. Радиоавтография цепей 1g, меченных 1251, после элект-
рофореза в полиакриламидном геле с ДСН и восстанавливающи-
ми агентами указывает на присутствие ц-, б-подобных и L-цепей;
«б-подобные» цепи обычно выделяются в виде широкой полосы
(рис. 6, гель А). Полипептидные цепи (р и L) определяются и в
лизате из клеток селезенки, меченных в процессе биосинтеза
355-метионином через три дня после внутрибрюшинного введения
липополисахарида Escherichia coli (рис. 6, гель Б). В области
L-цепей выявляется несколько полос — картина, обычно наблю-
даемая при электрофорезе поликлональных 1g из мышиных спле-
ноцитов. Линия с промежуточной подвижностью соответствует
белку, описанному как «связанный с мембраной белок, сорбиру-
ющий иммуноглобулины», или MAID (Premkumar et aL, 1975).

На рис. 6 показана также сравнительная электрофоретичес-
кая подвижность внутриклеточных (справа) и секретируемых
(слева) ц-цепей (гель В); видно, что внутриклеточные ц-цепи
обычно обладают большей подвижностью (Р. Vassalli, В. Li-
sowska-Bernstein, неопубликованные данные).

В заключение можно сказать, что описанная процедура выде-
ления следовых количеств меченых цепей 1g путем образования
комплексов со специфическими антителами к 1g и Staphylococcus
и анализ этих комплексов при помощи электрофореза в поли-
акриламидном геле с ДСН с последующей радиоавтографией слу-
жат высокочувствительным и точным методом, пригодным для
изучения клеточных иммуноглобулинов.

* *

ж.

Эта работа частично поддержана Швейцарским националь-
ным научным фондом (грант № 3.733.76).

Автор признателен д-ру М. Лэмму за полезные советы и кри-
тические замечания по поводу рукописи и д-ру Б. Лизовска-
Бернштейн за часть материала, представленного на рис. 6.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Aasted В., Sogn J. A., Kindt Т. J. (1967). J. Immunol., 116, 387.

Avrameas S., Ternynck T. (1967). Biochem. J., 102, 37c.

Avrameas S., Ternynck T. (1969). Immunochemistry, 6, 53.

Axen R., Porath R., Ernback S. (1967). Nature (London), 214, 1302.

Bazin H., Beckers A., Querinjean P. (1974). Eur. J. Immunol., 4, 44.

Bourgois A., Fougereau M. (1970). Eur. J. Biochem., 12, 558.

Braun D. G., Krause R. M. (1968). J. Exp. Med., 128, 969.

Capra J. D., Tung A. S., Nisonoff A. (1975). J. Immunol., 114, 1548.

Chesebro B., Metzger H. (1972). Biochemistry, 11, 767.

Cuatrecasas P., Anf insen С. B. (1971). Annu. Rev. Biochem., 40, 259.

Curd J., Smith T. W., Jaton J. -C., Haber E. (1971). Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 68, 2401.

Dandliker W. B., Alonso R., de Saussure V. A., Kierszenbaum F., Levinson S. A.
Shapiro H. C. (1967). Biochemistry, 6, 1460.

Doellgast G. I., Plaut A. G. (1976). Immunochemistry, 13, 135.

Eisen H. N. (1973). In: Microbiology (B. D. Davis et al., eds.), p. 352, Harper,
New York.

Fahey J. L., Horbett A. P. (1959). J. Biol. Chern., 234, 2645.

Fleischman J. B., Pain R., Porter R. R. (1962). Arch. Biochem. Biophys.
Suppl., 1, 174.

Forsgren A., Sjoquist J. (1966). J. Immunol., 97, 822.

Freedman M. H., Sela M. (1966a). J. Biol. Chern., 241, 2383.

Freedman M. H., Sela M. (1966b). J. Biol. Chern., 241, 5225.

Fuchs S., Sela M. (1965). J. Biol. Chern., 240, 3558. .

Goebel W. F., Avery О. T. (1931). J. Exp. Med., 54, 431.

Goetzl E. J., Metzger H. (1970). Biochemistry, 9, 1267.

Hjelm H., Hjelm K-, Sjoquist J. (1972). FEBS Lett., 28, 73.

Hubbard A. L., Cohn Z. A. (1972). J. Cell Biol., 55, 390.

Jaton J. -C., Waterfield M. D., Margolies M. N., Haber E. (1970). Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 66, 959.

Jaton J. C.-, Schweizer M., Knight K. L. (1976). Eur. J. Immunol., 6, 878.
Johansson B. G. (1972). Scand. J. Clin. Lab. Invest,, 29, Suppl., 124, 7.

Keckwick R. A. (1940). Biochem. J., 34, 1248.

Kessler S. W. (1975). J. Immunol., 115, 1617.

Koshland M. E. (1975). Adv. ImmunoL, 20, 41.

Kronvall G., Williams R. C., Jr. (1969). J. Immunol., 103, 828.

Laemmli U. K. (1970). Nature (London), 227, 680.

Leslie R. S. Q., Cohen S. (1970). Biochem. J., 120, 787.

Levy H. B., Sober H. A. (1960). Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 103,250.

Little J. R., Eisen H. N. (1966). Biochemistry, 5, 3385.

Lowry О. H., Hunter T. H. (1945). J. Biol. Chern., 159, 465.

Marchalonis J. J., Cone R. E., Santer V. (1971). Biochem. J., 124, 921.

Milstein C., Pink J. R. L. (1970). Prog. Biophys. Mol. Biol., 21, 209. )
Morrison S. L., Koshland M. E. (1972). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 124.
MUller-Eberbard H. J., Osterland С. K. (1968). Methods Immunol. Immuno-
chem., 2, 57.

Oettgen H. F., Binaghi R. A., Benacerraf B. (1965). Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,
118, 3'36.	.

Ollander J., Little J. R. (1975).’Immunochemistry, 12, 383.

Peterson E. A., Sober H. A. (1956). J. Am. Chern. Soc., 78, 751.	*

Pincus J. H., Jaton J.-C., Block K. J., Haber E. (1970). J. Immunol., 104,
1143.

Premkumar E., Potter M., Singer P. A., Sklar M. D. (1975). Cell, 6, 149.
Riesen W. F., Jaton J.-C., (1976). Biochemistry, 15, 3829.	*

Robinson E. A., Appella E., McIntire K. R. (1973). J. Biol. Chern., 248, 7112.
Sjequist J., Forsgren A., Gustafson G. T., Stalenheim G. (1967). Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol., 32, 577.

Sioquist J., Melon B., Hjelrn H. (1972). Eur. J. Biochem., 29, 572.

Small P. A., Lamm M. (1966). Biochemistry, 5, 259.

Sogn J. A., Yarmush M. L., Kindt T. J. (1976). Ann. Immunol. (Paris), 127c,
397.

Tracey D. E., Liu S. H., Cebra J. J. (1976). Biochemistry, 15 , 624.

Weber K-, Osborn M. (1969). JJ. Biol. Chern., 244, 4406.

Wilde С. E., Koshland M. E. (1973). Biochemistry, 12, 3218.

Wilkinson J. M. (1969). FEBS Lett., 4, 170.
Глава 3

МЕТОД ПЕПТИДНЫХ КАРТ ДЛЯ АНАЛИЗА
НАНОМОЛЯРНЫХ КОЛИЧЕСТВ БЕЛКА

Б. А. Мосс

I.	НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА

Традиционный вариант метода пептидных карт, или «отпе-
чатков пальцев», с использованием в качестве носителя бумаги
(Ingram, 1963; Bennett, 1967; Canfield, Anfinson, 1963; Laver,
1969) очень полезен при изучении структуры белков, но для
анализа здесь, как правило, требуется не менее 50—100 нмоль
белка. Между тем многие белки могут быть выделены лишь в
микрограммовых количествах, н в связи с этим нужны более чув-
ствительные модификации метода пептидных карт. Повышения
чувствительности можно достичь, применяя в качестве носителя
тонкие слои целлюлозы или силикагеля и проявляя затем пептид-
ные пятна хромогенными (Burns, Turner, 1967; Bates et al., 1975)
или флуоресцирующими (Atherton, Thomson, 1969; Blitz, Fine,-
1974; Vandekerckhove, van Montagu, 1974; Fey, Hirt, 1974; Schmer,
Kreil, 1967; Zanetta et al., 1970; Spivak et al., 1971; Kremer,
Ullrich, 1971) реагентами, или же метод радиоавтографии (Rice,
Means, 1971; Bray, Brownlee, 1973; Waterson, Konigsberg, 1974;
Gruenstein, Rich, 1975; Davison, 1976). Мы пользуемся двумерной
тонкослойной хроматографией дансил пептидов, обладающих соб-
ственной флуоресценцией в ультрафиолете. Носителем служит
силикагель. Метод обеспечивает хорошее разделение триптиче-
ского перевара, для проведения анализа достаточен 1 нмоль
белка.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Если нельзя провести полный анализ аминокислотной после-
довательности, то первичную структуру исходных белков можно
сравнить по гомологии пептидов, полученных при ферментатив-
ном или химическом расщеплении. При структурном анализе ча-
ще всего используют трипсин, так как действие его специфично:
он разрывает только те пептидные связи, в которых участвуют
карбоксильные группы лизина и аргинина. Полученные трипти-
ческие пептиды разделяют двумерным электрофорезом и хрома-
тографией в тонком слое целлюлозы или силикагеля.

При этом получают характерные для каждого белка пептид-
ные карты, что позволяет установить сходства и различия между
ними. Относительная подвижность пептидов в том и другом нап-
равлении зависит от их аминокислотного состава и в меньшей
степени от последовательности аминокислот.

Традиционный метод пептидных карт обычно не позволяет
разделить вариабельное «ядро» нерастворимых пептидов, а
электрофоретически нейтральные пептиды недостаточно хорошо
разделяются при электрофорезе. В том и другом случае могут
быть не замечены существенные различия в первичной структуре
близко родственных белков. Частично эти трудности можно пре-
одолеть, присоединяя к пептидам дансилхлорид1. Это вещество
ковалентно связывается со свободными аминными, фенольными,
имидазольными и сульфгидрильными группами. Дансильные
производные обладают флуоресценцией от интенсивно-желтого
до желто-оранжевого цвета, которая позволяет выявлять наномо-
лярные количества пептидов. Кроме того, дансилирование делает
пептиды более гидрофобными, что улучшает их разделение при
двумерной хроматографии в тонком слое силикагеля в различ-
ных системах органических растворителей.

III.	РЕАГЕНТЫ И ПРИБОРЫ

Все реагенты должны иметь квалификацию “analytical grade”
или выше. Растворы готовят на воде, свободной от аммиа-
ка. Чтобы ее приготовить, дистиллированную воду пропус-
кают через ионообменную смолу “mixed-bed”2 и снова
дважды перегоняют в сосуде из кварцевого стекла.

Денатурирующий буфер: 7М. гуанидингидрохлорид — 0,5М
трис — 2 мМ ЭДТА; pH доводят ледяной уксусной кисло-
той до 8,5.

Иодуксусная кислота (Koch-Light Laboratories, Колнбрук,
Англия), перекристаллизованная из «-гептана

Трипсин-ТФХК3 (Worthington Biochemical Corp., Фрихолд,
Нью-Джерси, США): 0,5 мг растворяют в 1 мл 1 мМ НС1
с 2,5 мМ СаСЬ

Дансилхлорид той квалификации, которая требуется при ана-
лизе последовательности аминокислот, в виде 10%-ного
(вес/объем) исходного раствора в обезвоженном ацетоне
или кристаллического препарата; а также дансилирован-

1 Сокращения: дансил — 1-диметиламиноиафталин-5-сульфонил; даис-
ОН — 1-диметиламинонафталин-5-сульфоновая кислота; даис-МН2 — 1-диме-
тил аминонафталин-5-сульфонамид.

2 Смесь эквивалентных количеств катионита и анионита. — Прим. ред.

3 Панкреатический трипсин крупного рогатого скота, обработанный
Ь-(тозиламидо-2-феиил)этилхлорметилкетоном для подавления химотрипти-
ческой активности. — Прим. ред..
ные аминокислоты, 2-меркаптоэтанол, дитиотреитол и гуа-
нидин-HCl, которые можно получить от фирмы Pierce Che-
mical Со. (Рокфорд, Иллинойс, США)

20 мМ раствор дансилхлорида (5,4 мг/мл) готовят перед опы-
том из исходного раствора или из кристаллического пре-
парата на обезвоженном ацетоне. Концентрацию проверя-
ют по поглощению при 369 нм (Е = 3,67-103) (Gray, 1964;
Neuhoff, 1973)

Абсолютный этанол (Е. Merck, Дармштадт, ФРГ) и 70%-ный
водный раствор этанола

Метилацетат, изопропанол и изобутанол (Merck), подвергну-
тые перегонке перед употреблением

Триэтиламин (Merck), дефлегмированный над фталевым ан-
гидридом (1 г/л) в течение 1 ч, затем столько же времени
над нингидрином (1 г/л) с последующей перегонкой над
нингидрином (1 г/л)

Водные растворы триэтиламина (ТЭА): 0,1 М ТЭА и 0,2 М
ТЭА-бикарбонат с pH 8,5; последний приготовляют, про-
пуская СОг через 0,2 М ТЭА до получения нужного pH

Камеры для тонкослойной хроматографии с крышками из ма-
тового стекла и тонкими стеклянными пластинками 20X
Х20 см (например, поставляемые фирмой Desaga, Гей-
дельберг, ФРГ). Стеклянные пластинки промывают неаб-
разивным детергентом (5%-ным раствором RBS 35, Pierce
Chemical Со.), трижды споласкивают дистиллированной
водой, один раз метанолом и протирают мягким льняным
полотенцем. Сухие пластинки хранят в пыленепроницае-
мом контейнере из пластика

Грушевидные колбы для перегонки (25 мл, Pyrex) и склянки
для реактивов с завинчивающимися крышками (3 мл, Pier-
ce Chemical Со.) силиконируют для предотвращения ад-
сорбции дансилпептидов на стекле. Для этого чистую, вы-
сушенную на воздухе посуду обрабатывают не менее 1 мин
5%-ным раствором триэтилхлорсилана (Merck) в толуоле,
дважды споласкивают дистиллированной водой и дважды
ацетоном, сушат на воздухе и выдерживают в течение но-
чи при 105°С

Хроматографические колонки размером 0,7 смХЮ см, на дно
которых помещают силиконированную стеклянную вату
(например, фирмы Supelco Со., Бельфонт, Пенсильвания,
США)

Дауэкс 50-Х4, 200—400 меш, в Н+-форме (Bio-Rad Laboratori-
es, Ричмонд, Калифорния, США), обрабатывают три ра-
за смесью ацетона и 25%-ного аммиака (1:1 по объему),
отмывают водой до нейтрального pH и уравновешивают
0,01 М уксусной кислотой с pH 3,5
Силикагель (кизельгель G по Шталю, тип 60, Merck). Тонкие
стеклянные пластинки покрывают слоем силикагеля тол-
щиной 0,3 мм с помощью распределителя Camag (Mittenz,
Швейцария)

Сухожаровая печь на 105°С с принудительной циркуляцией
воздуха

Камера для просмотра хроматограмм в ультрафиолете (на-
пример, Chromato-Vue, Ultra-Violet Products, Inc., Сан-
Габриэль, Калифорния, США)

Смеситель (например, Whirlmix или Vortex Genie).

IV.	МЕТОДИКА

Обработку сравниваемых белков (восстановление, алкилиро-
вание, ферментолиз, хроматографирование) проводят одновре-
менно и в одинаковых условиях.

А. Восстановление и алкилирование белков

Исследуемые белки помещают в склянки с завинчивающими-
ся крышками и проводят полное восстановление и S-карбоксиме-
тилирование в денатурирующем буфере. 100—200 мкг белка (т. е.
2—4 нмоль белка с мол. весом 50 000) в 75 мкл буфера восста-
навливают в атмосфере азота 1 ч при 50°С с помощью дитиотреи-
тола, прибавленного в 25 мкл денатурирующего буфера, в
50-кратном молярном избытке относительно сульфгидрильных
групп белка. Затем белки алкилируют нейтрализованной иодук-
сусной кислотой в атмосфере азота при 25°С в темноте, прибав-
ляя кислоту в 25 мкл денатурирующего буфера. Иодуксусную
кислоту берут в 3-кратном молярном, избытке относительно кон-
центрации дитиотреитола. Алкилирование останавливают по про-
шествии 1 ч, добавляя избыток 2-меркаптоэтанола (10 мкл). Бе-
лок осаждают 1 миллилитром холодного (—20°С) абсолютного
этанола, подкисленного ледяной уксусной кислотой (10 мкл).
Пробу оставляют для флокуляции по меньшей мере на 30 мин
при —20°С, затем осадок отделяют центрифугированием (1500g,
10 мин) и отмывают холодным (—20°С) 70%-ным этанолом для
удаления солей (3 раза по 1 мл). Избыток этанола отсасывают
тонкой пастеровской пипеткой, а осадок белка высушивают в
струе азота.

Б. Переваривание белков трипсином

Восстановленный и S-карбоксиметилированный белок (100—
200 мкг) суспендируют в 0,1 мл дистиллированной воды и нагре-
вают в течение 2 мин на кипящей водяной бане. После охлажде-
ния до комнатной температуры добавляют 0,1 мл 0,2М ТЭА-би-
карбонатного буфера с pH 8,5, а затем при легком помешива-
нии— 1 мкг трипсина-ТФХК в 2 мкл 1 мМ НС1 с 2,5 мМ СаСЬ;
смесь инкубируют в атмосфере азота при 37°С. Суспензия обыч-
но просветляется за 1 ч. Спустя 2 ч добавляют еще 2 мкл рас-
твора трипсина-ТФХК и продолжают инкубацию еще 4 ч. Трип-
тический перевар можно дансилировать сразу же после фермен-
толиза.

В- Дансилирование пептидов

Метод картирования дансилпептидов на силикагеле в орга-
нических растворителях был предложен Шмером и Крейлем
(Schmer, Kreil, 1967). Описываемая здесь методика представля-
ет собой модификацию оригинального метода и методов Zanetta
et al. (1970) и Tamura et al. (1973).

Примечание: так как флуорофор дансила подвержен фотохи-
мическому расщеплению (Zanetta et al., 1970; Gray, 1967; Seiler,
1970), все операции следует проводить быстро и по возможности
в темноте.

К триптическому перевару в 0,2 мл 0,1 М ТЭА-бикарбонатно-
го буфера (где обычно содержится до 100—200 нмоль пептидов)
прибавляют 0,8 мл 0,1 М ТЭА с pH 12; pH полученной смеси, оп-
ределяемый стеклянным электродом, должен на этом этапе дос-
тигать 10,5—11. Затем к смеси добавляют 1 мл 20 мМ раствора
дансилхлорида в ацетоне (100—200-кратный молярный избыток).
Склянку, завернутую в алюминиевую фольгу для защиты от све-
та, заполняют азотом, плотно закрывают и встряхивают на сме-
сителе Vortex (pH этой смеси должен быть 10—10,5). Дансили-
рование пептидов производят при 37°С в течение 2 ч; за это вре-
мя pH снижается до 9—9,5. В конце реакции добавляют 10—
25 мкл ЗМ КОН, чтобы перевести возможный избыток дансил-
хлоридных групп в данс-ОН. Оранжево-желтый цвет первона-
чального раствора дансилхлорида должен на этом этапе сменить-
ся бледно-желтым. Затем pH смеси дансилированных пептидов
доводят до 3,5 по индикаторной бумаге, добавляя 50—150 мкл
ледяной уксусной кислоты.

Г. Отделение дансилпептидов от побочных продуктов

После доведения pH до 3,5 реакционную смесь наносят на ко-
лонку с Дауэксом 50-Х4 (0,7X1 см), уравновешенную 0,01 М ук-
сусной кислотой с pH 3,5. Склянку из-под реакционной смеси
промывают двумя порциями 0,01 М уксусной кислоты (по 1 мл),
и их также наносят на колонку. Свободную данс-ОН, которая
Дает голубовато-зеленую флуоресценцию, и соли элюируют с ко-
лонки 75 миллилитрами 0,01 М уксусной кислоты с pH 3,5, а за-
тем дважды смесью (по 5 мл) ацетона с 0,01 М уксусной кисло-
той (1 : 4 по объему). Элюаты отбрасывают.

Полосу дансилпептидов, которая дает желтую флуоресцен-
цию, элюируют смесью (17,5 мл) вода: ацетон: 25%-ный аммиак
(0,85 : 1 : 0,15 по объему) и собирают в силиконированную груше-
видную колбу емкостью 25 мл. Колбу закрывают пленкой «пара-
фильм», которую потом перфорируют и содержимое заморажива-
ют в смеси спирта со льдом. Колбу заворачивают в алюминиевую
фольгу, осторожно помещают в защищенный от света аппа-
рат для лиофилизации и лиофилизируют в течение ночи. Лиофи-
лизат дансилпептидов растворяют в 100—200 мкл смеси ацетона
с водой (1:1) для проведения двумерной тонкослойной хромато-
графии. Чтобы уменьшить испарение ацетона, желательно дер-
жать образец на ледяной бане.

Д. Двумерная тонкослойная хроматография дансилпептидов

В закупоренной колбе Бюхнера на 250 мл смешивают 54 г
силикагеля G со 125 мл дистиллированной воды, затем в течение
1 мин удаляют воздух с помощью водоструйного насоса. Гомо-
генную суспензию силикагеля выливают в воронку распредели-
теля, которая внизу имеет поперечную щель, расположенную на
высоте 0,3 мм над поверхностью стеклянной пластинки. При бы-
стром проталкивании пластинок (20X20 см) через распредели-
тель они покрываются тонким слоем силикагеля. Нанесение си-
ликагеля на 8—10 пластинок должно занимать примерно 1 мин.
Пластинки высушивают на воздухе в горизонтальном положении
до помутнения силикагеля; после этого их можно хранить в шта-
тиве при комнатной температуре. Толщина сухого слоя обычно
достигает 0,2 мм.

Перед нанесением образца пластинки активируют в потоке
горячего воздуха при 105°С в течение 30 мин и охлаждают
10 мин при комнатной температуре. Пластинки ориентируют та-
ким образом, чтобы разделение в первом направлении шло по
ходу распределения силикагеля. Точка нанесения исследуемого
материала находится в нижнем левом углу пластинки на расстоя-
нии 2 см от обоих краев (Zanetta et al., 1970).

Смесь (25—50 мкл), содержащую дансилпептиды, получен-
ные примерно из 1 нмоль белка, наносят на пластинку по частям,
подсушивая пятно феном каждый раз после нанесения. Жела-
тельно наносить материал порциями по 2,5 мкл тонко оттянутой
капиллярной пипеткой на 10 мкл. Для хорошего разделения дан-
силпептидов необходимо, чтобы диаметр пятна был меньше 5 мм
(около 2,5 мм). После нанесения материала пластинки прогрева-
ют в течение 5 мин при 105°С, а затем 5 мин выдерживают при
комнатной температуре. Хроматографию проводят в камере без
насыщения (Brenner, Niederwieser, 1967). Разделение в первом
направлении проводят в 140 мл смеси метилацетат — изопропа-
нол— 25%-ный аммиак (9:6:4 по объему) в течение 1,5 ч.
К концу инкубации фронт растворителя должен находиться на
расстоянии около 2 см от верхнего края пластинки. Затем плас-
тинку высушивают феном до помутнения силикагеля, помещают
на 5 мин в сухожаровую печь при 105°С и охлаждают 10 мин при
комнатной температуре в хроматографической камере. Хромато-
графию во втором направлении проводят в 140 мл смеси изобу-
танол — уксусная кислота — вода (15:4:2 по объему) в течение
3,5 ч или до тех пор, пока фронт растворителя не окажется на
расстоянии 2 см от верхнего края пластинки. Затем пластинку
быстро высушивают феном, просматривают в длинноволновом
ультрафиолете и быстро обрисовывают флуоресцирующие пятна
до наступления фотохимической деградации.

Е. Контроли

В каждом опыте наносят контрольные пробы, содержащие все
компоненты, кроме изучаемого белка, и подвергавшиеся анало-
гичной обработке. В качестве контроля на полноту ферментатив-
ного расщепления целесообразно проводить параллельную об-
работку и хроматографию референс-белка, например лизоцима
из куриного яйца.

Перед хроматографией на пластинку можно нанести в качест-
ве маркеров дансиламинокислоты (Zanetta et al., 1970), однако
важнее максимально использовать всю площадь пластинки для
разделения дансилпептидов. Удобными маркерами при сравне-
нии различных хроматограмм могут служить следовые количест-
ва данс-ОН и данс-ЫНг, а также некоторые неизвестные побоч-
ные продукты ферментолиза, которые всегда движутся вместе с
фракцией дансилпептидов (Schmer, Kreil, 1967; Zanetta et al.,
1970).

V.	ОЦЕНКА МЕТОДА

Картирование флуоресцирующих дансилпептидов с помощью
двумерной тонкослойной хроматографии в силикагеле G с успе-
хом использовалось для сравнительного анализа наномолярных
количеств сходных белков и для частичного выяснения их пер-
вичной структуры (Schmer, Kreil, 1967; Zanetta et al., 1970; Спи-
вак и др., 1971; Moss, Hamilton, 1974). Исследование таких ре-
ференс-белков, как бычий сывороточный альбумин, рибонуклеа-
за, лизоцим куриных яиц и глобины цыплят, показало, что этот
метод позволяет выявлять более 90% теоретически ожидаемых
триптических пептидов.

С его помощью можно обнаружить сходства и различия меж-
ду любыми гомогенными белками, имеющимися в количествах
порядка 100 мкг. Однако нужно отметить некоторые недостатки
метода. Хотя в настоящее время дансилхлорид — это один из луч-
ших реагентов для маркировки аминокислот и пептидов, реакция
дансилирования зависит от ряда трудно контролируемых факто-
ров, что особенно существенно в тех случаях, когда желательно
получить количественный результат. Эти факторы были детально
изучены в ряде лабораторий (Спивак и др., 1971; Neuhoff, 1973;
Gros, Labouesse, 1969; Gray, 1972). Оказалось, что оптимальное
дансилирование большинства аминокислот и пептидов происхо-
дит в зоне pH 9,5—10,5 при многократном избытке дансилхлори-
да. Так как дансилхлорид гидролизуется водой и гидроксильны-
ми ионами до данс-ОН, его связывание реактивными группами
аминокислот зависит от способности последних в выбранных ус-
ловиях конкурировать за него с гидролизующими ионами. Ис-
пользование относительно высоких концентраций дансилхлорида
ведет к появлению значительных количеств данс-ОН в ходе реак-
ции, а поскольку примесь данс-ОН может быть помехой при тон-
кослойной хроматографии, от нее нужно избавляться.

Дансилирование пептидов, аминокислоты которых не имеют
реактивных боковых групп, обычно не представляет труда; одна-
ко дансилирование пептидов, содержащих остатки лизина, тиро-
зина, гистидина и N-концевой глутамин, из-за различной реак-
тивности боковых цепей и неодинаковой стабильности дансили-
рованных функциональных групп может давать различные
продукты. Эти затруднения можно в основном преодолеть, про-
водя дансилирование по методу Тамура (Tamura et al., 1973).
Реакцию проводят в водном растворе триэтиламина, что позволя-
ет исключить буферные соли и приблизиться к условиям проведе-
ния тонкослойной хроматографии. Реакционная смесь в 50 %-ном
ацетоне имеет pH около 10,5, и концентрация дансилхлорида в
ней равна 10 мМ, что приблизительно в 50 раз превышает моляр-
ную концентрацию реактивных групп. Такие условия обеспечива-
ют количественное дансилирование е-аминогрупп лизина и гид-
роксильных групп тирозина и не допускают превращения дансил-
глутаминовой кислоты и дансилглутамина в дансилпироглутами-
новую кислоту. Нестабильный имидазол-дансилгистидин гидро-
лизуется в щелочной среде, создающейся при удалении данс-ОН.
Нами были получены идентичные пептидные карты послр данси-
лирования пептидов в течение 16 ч при 8°С (по Tamura et al.,
1973) и 2 ч при 37°С, как описано в настоящей главе. Пептиды,
содержащие метионин и S-карбоксиметилцистеин, могут давать
дополнительные продукты в результате окисления во время хро-
матографии. Чтобы предотвратить это, в систему растворителей
добавляют 2-меркаптоэтанол (5мМ).

Дансиламинокислоты и дансилпептиды нестабильны на плас-
тинках силикагеля и в результате фотохимического расщепления
за несколько часов превращаются в нефлуоресцирующие желто-
ватые производные. О-дансилтирозин и имидазол-дансилгисти-
дин в результате кратковременного воздействия ультрафиолета
или солнечных лучей легко превращаются в производные с голу-
бовато-зеленой флуоресценцией. Хранение пластинок в темноте
не предотвращает распада. Склонность дансилпроизводных к
распаду затрудняет их количественное определение по интенсив-
ности флуоресценции (Pouchan, Passeron, 1975) и заставляет
проводить исследование быстро и в темноте.

Было показано (Zanetta et al., 1970), что для проведения тон-
кослойной хроматографии дансилпептидов лучше использовать
пластинки силикагеля, а не полиамида, так как элюция с послед-
них затруднена и они обладают малой емкостью. Кроме того,
пептидные карты на полиамиде трудно воспроизводимы и многие
пятна образуют «хвосты». Этими же недостатками обладают име-
ющиеся в продаже готовые пластинки из силикагеля, для коли-
чественных определений они не пригодны. Предложен способ
(Zanetta et al., 1970) приготовления пластинок из силикагеля G,
которые в сочетании с растворителями, имеющими диэлектриче-
ские постоянные порядка 20—25, обеспечивают хорошее разде-
ление дансилпептидов даже при анализе высокомолекулярных
белков. Для получения четких пептидных карт достаточно всего
лишь 0,1 нмоль белка, но оптимальное количество белка, напри-
мер, с мол. весом 50 000 составляет 0,5—1,5 нмоль.

Предлагаемый метод, как и другие методы картирования
триптических пептидов, не дает теоретически ожидаемого разре-
шения. Отклонения могут быть связаны с неполным разрывом
связей лизина и аргинина, когда гидролизат одновременно содер-
жит и нерасщепленные исходные, и расщепленные дочерние пеп-
тиды. Возможен также неспецифический гидролиз. Кроме того,
при картировании триптических пептидов трудно с точностью оп-
ределить их число, так как интенсивность флуоресценции не про-
порциональна количеству пептида в пятне (Fey, Hirt, 1974;
Schmer, Kreil, 1967; Zanetta et al., 1970; Спивак и др., 1971). Эти
проблемы можно разрешить, проводя последующий анализ пеп-
тидов специальными методами (Zanetta et al., 1970; Спивак и
сотр., 1971; Neuhoff, 1973; Brown, Perham, 1973). Препятствием
для сравнительного картирования может быть и малая подвиж-
ность некоторых крупных дансилпептидов на таком сильно ад-
сорбирующем носителе, как силикагель; однако эти пептиды мож-
но исследовать отдельно, применяя другие методы ферментатив-
ного или химического гидролиза.
ЯТ60 HAf ;		аз! О|  зе|  >1  1	
			
. О CW			
	*		
			
	.С .'	-	Й’	
29G НА1	A.-.-.-.-.Vi. .1-	1ЭС на2	*
'.Д			
о CW			
	- V- *		
			
-i?			
НТ60		WQ НА2	
>  W W/   о ?  < -л		29С  «-' - ?Л-'	; - 5
0		0	
		О J	
			О
			

*1

Рис. 1. Пептидные карты дансилпептидов триптического гидролизата: срав-
нительный анализ субъединиц НА] и НА2 гемагглютининов, выделенных из ви-
русов двух штаммов NT 60 и 29С (Moss, Underwood, 1978, с разрешения
Springer-Verlag).

Субъединицы гемагглютининов были восстановлены и S-карбоксиметилированы,
а затем гидролизованы трипсином-ТФХК и дансилированы. Дансилпептиды из
1 нмоль белка разделяли двумерной тонкослойной хроматографией на сили-
кагеле G. Хроматографию в первом направлении (I) проводили в течение
1,5 ч в смеси метилацетат — изопропанол — 25%-ный аммиак в объемном со-
отношении 9:6:4. Хроматография во втором направлении (11) продолжалась
3,5 ч в смеси изобутанол — уксусная кислота — вода в объемном соотношении
15:4:2. К каждой ’системе растворителей добавляли 2-меркаптоэтанол до
концентрации 5 мМ. Пятна данс-ОН, даис-ХН2 и неопределенных побочных
продуктов затушеваны. Кроме того, гидролизаты сходных субъединиц обоих
штаммов (NT 60 и 29С) были смешаны в равных количествах и тоже под-
вергнуты хроматографии. Стрелками указаны пептиды, которые представляют-
ся различными. Черным выделены пятна, содержащие |4С-карбоксиметилцис-
Ни один метод картирования не дает абсолютно воспроизво-
димых результатов, и дансильный метод не составляет исключе-
ния. Хотя в повторных опытах с дансилированными триптически-
ми гидролизатами общая картина повторяется, детальное сопос-
тавление возможно только при параллельном анализе изучаемых
белков. Необходимым контролем служит хроматография смеси
различных дансилированных триптических гидролизатов, с по-
мощью которой можно выявлять хроматографические аномалии
и идентифицировать химически различные пептиды.

VI.	ПРИМЕР ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ДЛЯ

ИССЛЕДОВАНИЯ АНТИГЕННЫХ ВАРИАНТОВ
ГЕМАГГЛЮТИНИНА ВИРУСА ГРИППА А

Исходным материалом служили очищенный вирус гриппа
(NT60) и его одноступенчатый антигенный мутант 29С (Fazekas
de St. Groth, Hannoun, 1973; Fazekas de St. Groth. 1978). С по-
мощью контролируемого гидролиза бромелином из этих препара-
тов были выделены антигенные белки — гемагглютинины (НА),
а затем проведено их восстановление, S-карбоксиметилирование
и выделены малая (НА2) и большая (HAi) субъединицы (Moss,
Underwood, 1978).

Полученные белки были проанализированы в параллельных
опытах. Пептидные карты представлены на рис. 1. Карты НА2 из
двух источников представлялись идентичными, и это было под-
тверждено в опыте с хроматографией смеси НА2 из NT60 и 29С:
соответствующие дансилпептиды обоих вирусов мигрировали
вместе. Карты НА] были также идентичны, за исключением од-
ного большого и одного минорного пептидов, указанных стрелка-
ми. Белки НА] обоих вирусов разделялись на 36 основных и не-
сколько минорных пептидов, а НА2 — на 22 основных и несколь-
ко минорных пептидов. Теоретически ожидаемое число трипти-
ческих пептидов, рассчитанное по содержанию лизина и аргини-
на (Moss, Underwood, 1978), составляло 37 для HAi и 24 для
НА2. Таким образом, на полученных картах были, вероятно,
представлены все триптические пептиды. Эти результаты указы-
вают на замену по меньшей мере одной аминокислоты в большой
субъединице гемагглютинина HAi, с которой связана антигенная
специфичность молекулы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Atherton R. S., Thomson A. R. (1969). Biochem. J., Ill, 797.

Bates D. L., Perham R. N., Coggins J. R. (1975). Anal. Biochem., 68, 175.
Bennett J. C. (1967). In: Methods in Enzymology (С. H. W. Hirs, ed.), Vol.

11, p. 330, Academic Press, New York.
Blitz A. L., Fine R. E. (1974). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 175.

Bray D., Brownlee S. M. (1973). Anal. Biochem., 55, 213.

Brenner M., Niederwieser A. (1967). In: Methods in Enzymology (С, H. W.

Hits, ed.), Vol. 11, p. 39, Academic Press, New York.

Brown J. P., Perham R. N. (1973). Eur. J. Biochem., 39, 69.

Burns D. J. W., Turner N. A. (1967). J. Chromatogr., 30, 469.

Canfield R. E., Anfinson С. B. (1963). In: The Proteins (H. Neurath, ed.), 2nd,
ed., Vol. 1, p. 311, Academic Press, New York.

Davison P. F. (1976). Anal. Biochem., 75, 129.

Fazekas de St. Groth S. (1978). In: Topics in Infectious Diseases (W. G. Laver,
H. Bachmayer and R. Weil, eds.), Vol. 3, p. 25, Springer-Verlag, Wien and
New York.

Fazekas de St. Groth S., Hannoun C. (1973). R. Hebd. Seances Acad. Sci., Ser.
D, 276, 1917.

Fey G., Hirt B. (1974). Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 39, 235.

Gray W. R. (1964). Ph. D. Thesis, University of Cambridge.

Gray W. R. (1967). In: Methods in Enzymology (С. H. W. Hirs, ed.), Vol. 11,
p. 139, Academic Press, New York.

Gray W. R. (1972) In: Methods in Enzymology (С. H. W. Hirs and S. N. Tima-
sheff, eds.), Vol. 25, p. 121, Academic Press, New York.

Gros C., Labouesse B. (1969). Eur. J. Biochem., 7, 463.

Gruenstein E., Rich A. (1975). Biochem. Biophys. Res. Commun., 64 , 472.

Ingram V. W. (1963). In: Methods in Enzymology (S. P. Colowick and N. O.

Kaplan, eds.),Vol. 6, p. 831, Academic Press, New York.

Kremer B., Ullrich J. (1971). Hoppe-Seyler’s Z. Physiol. Chern., 352, 189.

Laver W. G. (1969). In: Fundamental Techniques in Virology (K. Habel and

N. P. Salzman, eds.), p. 371, Academic Press, New York. [Имеется перевод:
Методы вирусологии и молекулярной биологии. —М.: Мир, 1972.]
Moss В. A., Hamilton Е. А. (1974). Biochim. Biophys. Acta, 371, 379.

TWoss В. A., Underwood P. A. (1978). In: Topics in Infectious Diseases (W. G.

Laver, H. Bachmayer and R. Weil, eds.), Vol. 3, p. 145, Springer-Verlag,
Wien and New York.

Neuhoff V. (1973). In: Micromethods in Molecular Biology (V- Neuhoff, ed.),
p. 85, Chapman and Hall, London.

Pouchan M. I., Passeron E. J. (1975). Anal. Biochem., 63, 585.

Rice R. H., Means G. E. (1971). J. Biol. Chern., 246, 831.

Schmer G., Kreil G. (1967). J. Chromatogr., 28, 458.

Seiler N. (1970). Methods Biochem. Anal., 18, 259.

Спивак В. А., Левянт M. И., Катруха С. П., Варшавский Я- М. (1971).

Anal. Biochem., 44, 503.

Tamura Z., Nakajima T., Nakayama T., Pisano J. J., Udenfriend S. (1973).
Anal. Biochem., 52, 595.

Vandekerckhove J., van Montagu M. (1974). Eur. J. Biochem., 44, 279.

Waterson R. M., Konigsberg W. H. (1974). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71,
376.

Zanetta J. P., Vincendon C., Mandel P., Gombos G. (1970). J. Chromatogr., 51,
441.
Глава 4

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ В ПЛАСТИНКАХ

ПОЛИАКРИЛАМИДНОГО ГЕЛЯ

Б. Такач

I.	ВВЕДЕНИЕ

С тех пор как в 1959 г. Орнстейн (Ornstein, 1964) и Дэвис
(Davis, 1964) описали диск-электрофорез, этот метод широко ис-
пользуется для аналитического разделения белков, полипепти-
дов и нуклеиновых кислот.

Преимущества этого метода обусловлены тем, что поддержи-
вающей средой здесь служит полиакриламидный гель, а не жид-
кость или гранулы. Полиакриламид химически устойчив и инер-
тен, нерастворим в большинстве растворителей, его можно ис-
пользовать в широком диапазоне pH, ионной силы и температу-
ры. В продаже имеются высокоочищенные препараты, из которых
можно с хорошей воспроизводимостью приготовлять прозрачные
гели с различными размерами пор.

Полиакриламидный гель образуется при полимеризации ак-
риламида (СНг = СН—CONHj) в присутствии небольших коли-
честв бифункционального сшивающего реагента, обычно N,N-Me-
тилен бисакриламида (Бис, CH2 = CH-CONH—СН2—HNCO—
—СН = СНг). Поры создающейся при этом трехмерной сетчатой
структуры способны задерживать макромолекулы. Решающую
роль играет весовое соотношение акриламида и сшивающего
агента, поскольку оно определяет плотность и хрупкость образу-
ющегося геля. Для получения эластичного геля необходимо по-
высить концентрацию акриламида и одновременно снизить кон-
центрацию сшивающего реагента.

Термин «диск-электрофорез» означает неоднородную (discon-
tinuous) разделяющую электрофоретическую систему (Ornstein,
1964). В отличие от однородной системы, где в геле и в обеих ка-
мерах используется один и тот же буфер, при диск-электрофорезе
используются буферы с различными pH, что создает прерывис-
тые градиенты электрического потенциала и pH. Система вклю-
чает крупнопористый концентрирующий гель с низким pH, рас-
положенный над мелкопористым разделяющим гелем с высоким
pH. Полипептиды быстро проходят через крупнопористый гель и
концентрируются на поверхности разделяющего геля. Это позво-
ляет получить хорошее разделение при использовании относи-
тельно больших объемов разведенных белковых растворов.
Существует большое число многофазных буферных систем,
позволяющих разделять белковые смеси при любом pH. В на-
стоящее время разработана компьютерная программа для созда-
ния 4269 различных многофазных систем катодного и анодного
буферов для всей шкалы pH с интервалом 0,5 единицы при тем-
пературах 0 и 25°С (Jovin, 1973).

В этой главе приводится лишь несколько наиболее удачных
буферных систем с низким или высоким pH с использованием
ДСН или мочевины в качестве диссоциирующих агентов. Более
подробную информацию о методе электрофореза в полиакрил-
амидном геле читатель найдет в обзорах (Maurer, 1971; Gordon,
1975).

II.	ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

А. Реактивы

1.	Акриламид и Бис

Качество коммерческих препаратов акриламида и Бис в боль-
шинстве случаев позволяет использовать их в опытах без допол-
нительной очистки. Если, однако, требуется выделить анализи-
руемое вещество из геля или применить прямое сканирование,
при котором недопустимы УФ-поглощающие примеси, акриламид
и Бис можно легко перекристаллизовать из хлороформа или аце-
тона соответственно (Loenins, 1967). 100 г акриламида растворя-
ют в 1 л хлороформа при 50°С; 10 г Бис растворяют в 1 л ацето-
на при 50°С. Оба раствора в горячем виде фильтруют без вакуу-
ма через бумагу Whatman № 1, затем оставляют на ночь при
—20°С. Образовавшиеся кристаллы промывают соответствую-
щим холодным растворителем путем вакуумной фильтрации.

Акриламид и Бис можно также очистить с помощью колоноч-
ной хроматографии на ионообменной смоле „mixed-bed”1 (Dues-
berg, Rueckert, 1965). Весьма целесообразно хранить растворы
акриламида над такой смолой. При этом из раствора все время
удаляются продукты гидролиза (например, МНз и акриловая кис-
лота) , которые могут снизить электрофоретическую подвижность
разделяемых белков (Raymond, Nakamichi, 1962). Следует избе-
гать вдыхания акриламида и Бис и попадания их на кожу, так
как они нейротоксичны (Allen et al, 1965; Fullerton, Barnes,

1 См. примечание [2] на стр. 84.
1966). Летальная доза (LD50) для мышей в остром опыте со-
ставляет 170 мг/кг.

Чистота препаратов акриламида и Бис может сильно разли-
чаться у разных поставщиков. Препараты фирмы Serva (Гей-
дельберг, ФРГ) дают удовлетворительные результаты даже без
дальнейшей очистки.

2.	Додецилсульфат натрия (ДСН)

ДСН следует очищать перекристаллизацией из 95%-ного эта-
нола, однако препараты некоторых фирм (например, BDH Che-
micals Ltd., Пул, Англия) можно использовать без предвари-
тельной очистки; 10%-ный раствор ДСН должен быть прозрач-
ным и бесцветным.

3.	ТЕМЭД

Это вещество (Г4,Г4,М',М'-тетраметилэтилендиамин) использу-
ют как катализатор полимеризации; оно представляет собой жид-
кость, стабильную при 4°С. Дополнительной очистки его не тре-
буется.

4.	Персульфат аммония

Персульфат аммония применяют вместе с ТЕМЭД в качестве
источника свободных радикалов при химической полимеризации
акриламида. Водный раствор персульфата аммония (10%) гото-
вят ежедневно, так как это вещество быстро разрушается при
комнатной температуре.

5.	2-меркаптоэтанол

Под пробкой при 4°С этот препарат достаточно стабилен. Его
применяют для восстановления дисульфидных связей в белках.

Б. Приготовление образца

ДСН — один из наиболее эффективных детергентов, раство-
ряющих ковалентно не связанные белковые агрегаты. Под дейст-
вием ДСН в сочетании с восстановителем (2-меркаптоэтанолом)
и прогревом при 100°С в течение 1 мин все белки денатурируются
и расщепляются на отдельные полипептидные цепи. Так как 1 мг
белка связывает 1,4 мг ДСН (Reynolds, Tanford, 1970b), для пол-
ной солюбилизации обычно добавляют пятикратный избыток де-
тергента по весу.

Образцы белка, взятые для анализа в виде преципитата, лио-
4—233
филизата или взвеси частиц, растворяют или суспендируют в
50 мМ растворе NaHCOs. Добавляют 5 мг ДСН на 1 мг белка и
инкубируют 1 мин на кипящей водяной бане. Затем добавляют
5% (по объему) 2-меркаптоэтанола и инкубируют еще 2 мин.
Образец охлаждают и перед электрофорезом диализуют против
буфера, предназначенного для нанесения образцов (см. табл. 1).
Если образцы белков не содержат большого количества свобод-
ных ионов, особенно К+ и Са2+, их можно сразу растворить в
этом буфере (0,05—1 мг белка на 1 мл), проинкубировав на ки-
пящей водяной бане в течение 3 мин.

Таблица 1

Состав «буфера для нанесения»

	IX	2х	Зх
1 М трис-НС1, pH 6,8 . . 2-меркаптоэтанол . . . Глицерин 	  ДСН	•	. . . .  Бромфеноловый синий, 0,1% 	  Дистиллированная вода	6,25 мл  5 мл  10 мл  2,3 г  1 мл	12,5 мл 10 мл 20 мл  4,6 г  2 мл  до 100 мл	18,75 мл  15 мл  30 мл  6,9 г  3 мл

Если образцы белков находятся в растворе, то иногда их
удобнее просто разбавить равным объемом двукратного концент-
рата «буфера для нанесения» или добавить половину объема
трехкратного концентрата того же буфера.

При растворении сухих образцов или больших количеств им-
мунного преципитата вокруг белка иногда образуется гелеобраз-
ный слой ДСН. Чтобы избежать этого, перед добавлением буфе-
ра осадок суспендируют в небольшом объеме дистиллированной
воды или раствора NaHCO3.

Концентрирование образцов

Если растворы белков слишком разбавлены, для анализа их
можно сконцентрировать несколькими способами. Например, для
этой цели удобна лиофилизация, однако после нее препараты
нужно диализовать против «буфера для нанесения», так как кон-
центрация солей выше 50 мМ мешает электрофоретическому раз-
делению белка. Можно также воспользоваться вакуумным диали-
зом; преимущество его в том, что одновременно с концентриро-
ванием раствора он обеспечивает и удаление избытка солей.
Кроме того, можно поместить образец в диализный мешок и по-
грузить в сухой порошок сб^^^кса (G-100 или G-200) либо дру-
гого высокомолекулярного гигрофильного материала, например
полиэтиленгликоля 40 000. Ча1це всего разбавленные образцы
концентрируют, осаждая белок трихлоруксусной кислотой
(ТХУ), сульфатом аммония, ацетоном или спиртом. Осадок бел-
ков, осажденных 10%-ной ТХУ, промывают холодным ацетоном
для удаления избытка кислоты. При работе с очень разбавленны-
ми растворами, например с элюатами из кусочков геля, белки
можно осаждать смесью (1:9) карбонат-бикарбонатного буфера
с ацетоном (Weinenet al., 1972).

В. Состав гелей

Стандартная система гелей для диск-электрофореза, описан-
ная ниже, включает концентрирующую систему (Ornstein, 1964;
Davis, 1964) с добавлением ДСН, согласно модификации Лемм-
ли (Laemmli, 1970).

Подходящие прописи разделяющих гелей для диск-электро-
фореза приведены в табл. 2.

Таблица 2

Прописи разделяющих гелей с разной плотностью сетки дли диск-электрофореза.
(Из Cold Spring Harbor Methods Manual.)

Раствор

Количества различных растворов, необходи-
мые для приготовления 30 мл раствора
с указанной конечной концентрацией (%)
акриламида для геля, мл

5%	7,5% 10% 12,5% 15%	17,5% 20%

30%-ный акриламид...............

1 % -иый бисакриламид...........

1,5 М трис-НС1, pH 8,7 .........

Дистиллированная вода...........

10%-ный персульфат аммония . . . .

10%ДСН1.........................

ТЕМЭД ..........................

5,0

7,8

7,5

9,3

0,1

0,3

0,01

7,5

5,2

7,5

8,8

0,1

0,3

0,01

10

3,9

7,5

8,2

0,1
0,3

0,01

12,5

3,1

7,5

6,5

0,1

0,3

0,01

15

2,6

7,5

4,5
0,1

0,3
0,01

17,5

2,2

7,5

2.4

0,1
0,3
0,01

20

2,0

7,5
0,1
0,1
0,3
0,01

’ Перед добавлением ДНС и ТЕМЭД раствор дегазируют.

Для приготовления концентрирующего геля используют сле-
дующие компоненты: 30%-ный раствор акриламида — 1,0 мл;
1%-ный раствор бисакриламида— 1,0 мл; 0,5 М трис-НС1-буфер
с pH6,8—2,5 мл; дистиллированная вода — 5,35 мл; 10%-ный
раствор персульфата аммония — 0,05 мл; 10%-ный раствор
ДСН — 0,1 мл; ТЕМЭД — 0,005 мл.
р34







igwmi HOORii

ргПА

SS

«Мк м> «м> «м» —»

•50ЙЙ»

8»’й«4^^Яв*?<г®

а)	4 9 14 19 24 29 34 39 44 49

Ь)	8 13 18 23 28 33 38 43 48 53

Рис. 1. Кинетика синтеза белков, кодируемых бактериофагом, в клетках
Е. coli В. Радиоавтограф электрофореграммы клеточных лизатов в ДСН-по-
лиакриламидном геле.

А — промежуток времени (мин) между заражением и введением метки; С —
конец введения метки. Клетки культивировали в среде М-9 (Bolle et al., 1968)
при 30°С. Бактериальную культуру (4-108 клеток/мл) инфицировали в соот-
ношении 5 фаговых частиц на одну клетку amber-мутантом бактериофага
Т4, HL-626. Через каждые 4 мин после заражения в одну из параллельных
проб вводили 14С-аминокислоты (1 мкКи на 1 мл культуры). Через 4 мин до-
бавляли большой избыток казаминовых кислот (конечная концентрация 1%).
Образцы быстро охлаждали и клетки отделяли центрифугированием. Осадки
растворяли в «буфере для нанесения» и инкубировали 3 мин при 100°С.
Затем проводили электрофорез в 10%-ном полиакриламидном геле. Кодируе-
мые фагом белки идентифицировали как полосы, содержащие метку, и обо-
значали по названию структурного гена с предшествующей буквой р (напри-
мер, продукт гена 34 — это белок р34). Подробнее см. Takacs, Rosenbusch,
1975.


Рис. 2. Секреция IgD-подобных иммуноглобулинов восемью клоиами одной
перевиваемой линии лимфобластоидных клеток человека. Клеточную суспен-
зию культуры (2-Ю6 клеток/мл) метили в процессе биосинтеза в течение 12 ч
14С-лейцином (1,5 мкКи/мл). Надосадочные жидкости каждой культуры ин-
кубировали в течение ночи при 4°С с кроличьей антисывороткой к d-цепям че-
ловека и с убитой суспензией стафилококков, несущих белок А. Клетки
стафилококка и иммунные комплексы осаждали и отмывали 3 или 4 раза ЗФР,
центрифугируя 10 мин при 6000g. Осадки суспендировали в «буфере для на-
несения» и инкубировали 3 мин при 100°С. Затем проводили электрофорез в
12,5%-ном геле при силе тока 20 мА на пластинку. Гель фиксировали, окра-
шивали, обесцвечивали и высушивали на фильтровальной бумаге. Высушен-
ную пластинку геля экспонировали на медицинской рентгеновской пленке
Kodirex. Полученные полипептиды имели приблизительно следующие молеку-
лярные веса: а — 63 000; Ь — 55 000; с — 51 000; d — 28 000; е — 25 000; f —
24 000.

Г. Аппаратура для электрофореза и приготовления геля

Прямоугольные пластинки полиакриламидного геля имеют
ряд преимуществ по сравнению с цилиндрическими гелями; по-
этому ниже приводится описание аппаратуры для электрофореза
на пластинках, хотя из тех же самых растворов можно пригото-
вить и цилиндрические гели. Электрофорез на одной пластинке
удобнее всего для прямого сравнения нескольких образцов в со-
вершенно одинаковых условиях (pH, температура, сила тока,
градиент напряженности поля). Пример представлен на рис. 1:
здесь изучалась кинетика синтеза белков, кодируемых бактерио-
фагом Т4, в клетке Escherichia coli. В данном случае особенно
важна идентичность условий, так как спектр синтезируемых по-
липептидов быстро меняется и различия в величине молекулы
между некоторыми синтезируемыми белками весьма незначи-
тельны. Другой пример показан на рис. 2: здесь удалось устано-
вить очень небольшие различия в величине молекул IgD-подоб-
ных иммуноглобулинов, секретируемых восьмью клонами одной
линии лимфобластов человека.
Пластинки полиакриламидного геля достаточно тонки и быст-
ро высыхают, что позволяет проводить радиоавтографию без разт
резания геля. Если в образце содержится несколько разных изо-
топов, пластинку геля перед растворением и счетом можно легко
разрезать с помощью простого приспособления (см. рис. 7).

Аппарат для электрофореза, используемый в нашей лабора-
тории, впервые описали Рейд и Белески (Reid, Bieleski, 1968), за-
тем он был модифицирован (Studier, 1973). Акриламид полиме-
ризуют между двумя стеклянными пластинками (рис. 3,А). Одна
пластинка прямоугольная, 14X18 см; другая таких же размеров,,
но имеет на одном из длинных краев выемку 2x14 см. Пластин-'
ки складывают вместе так, чтобы выемка была наверху, а между
ними, по бокам и снизу, помещают плексигласовые прокладки
шириной 5 мм. Толщина прокладок определяет толщину геля.
Мы используем прокладки толщиной 0,8—1,0 мм. Пластинки со-,
единяют обычными канцелярскими скрепками; для уплотнения
камеры края снаружи заливают расплавленным 1,5%-ным ага-
ром. Целесообразно также внести небольшое количество вакуум-
ной смазки в места соединений боковых коротких прокладок с
нижней длинной.

Раствор нижнего разделяющего геля заливают в пространст-
во между пластинками так, чтобы верхний уровень примерно на
2 см не доходил до края выемки. Сверху осторожно наслаивают
бутанол, насыщенный водой. Пластинки помещают в водяную
баню при 35°С и оставляют на 1 ч для полимеризации. Водяная
баня необходима для ускорения полимеризации и отведения теп-
ла, образующегося при этом процессе. Важно следить за тем,
чтобы во время полимеризации камера находилась в вертикаль-
ном положении. Для того чтобы полимеризация проходила рав-
номерно, уровень воды в бане должен быть не ниже верхнего
уровня геля. Через час камеру вынимают из воды. Пластинку ге-
ля можно использовать в тот же день или оставить на ночь при
комнатной температуре.

Прежде чем налить раствор верхнего концентрирующего геля,
сливают бутанол и слой незаполимеризовавшегося раствора и
промывают край нижнего геля верхним буфером. Остатки буфе-
ра можно удалить полоской хроматографической бумаги, не ка-
саясь поверхности геля. Затем вставляют шаблон в виде «гре-
бешка» (рис. 3, Б) так, чтобы до поверхности нижнего геля оста-
валось около 5 мм, и заливают раствор верхнего геля. Гель
оставляют для полимеризации на 30 мин, а затем пластинку сра-
зу же используют в диск-электрофорезе, так как со временем раз-
личие в pH между верхним и нижним гелями сглаживается и в
результате концентрирующая способность верхнего геля падает.
После полимеризации концентрирующего геля нижнюю плекси-
гласовую прокладку удаляют и камеру помещают в аппарат для
Рис. 3. Камера для полимеризации геля, образованная двумя стеклянными
пластинками с плексигласовыми прокладками между ними.

Л. Разделяющий гель после полимеризации. Б. Концентрирующий гель, поли-
меризованный с вложенным «гребешком» над разделяющим гелем.
электрофореза так, чтобы выемка на стеклянной пластинке точно
совпала с выемкой в стенке верхнего буферного резервуара
(рис. 4). Края последнего для уплотнения смазывают вакуумной
смазкой. Нижний резервуар заполняют электродным буфером
(0,025М трис, 0.192М. глицин, 0,1% ДСН) до уровня на 3—4 см
выше нижнего края пластинки. Во время заполнения буфером
аппарат можно наклонить, чтобы на нижнем крае пластинки геля
не оставалось пузырьков воздуха; вместо этого с той же целью
можно сначала заполнить нижний резервуар буфером, а потом
погрузить в него камеру с гелем под углом. Верхний резервуар
заполняют буфером выше края выемки и вынимают «гребешок»;
при этом буфер должен заполнить «карманы» для внесения об-
разцов. Затем пипетками Эппендорф в «карманы» вносят иссле-
дуемые образцы (содержащие 10—15% глицерина). Заполняя
«карманы» до самого дна, можно в каждый из них внести до
50 мкл образца.

После этого электроды соединяют с источником тока; анод
подключают к нижнему резервуару, катод — к верхнему. Элект-
рофорез проводят при постоянном токе (20—30 мА на пластинку
толщиной 0,8—1,5 мм) при комнатной температуре до тех пор,
пока свидетель — бромфеноловый синий —не дойдет до нижней
границы геля, для чего обычно требуется 3—4 ч.

Рис. 4. Аппарат для электрофореза в пластинке геля.
Электрофорез в градиентном геле

При электрофорезе в градиентных гелях с постепенно умень-
шающимися размерами пор белки образуют более четкие полосы.
В градиентных гелях при постоянной напряженности поля нарас-
тающий ситовой эффект ведет к замедлению миграции данного
белка в соответствующем участке геля. Однако полного прекра-
щения миграции никогда не происходит, вероятно потому, что
размеры пор в любом участке геля имеют значительный разброс
(Rodbard et al., 1971).

Пример электрофореза на пластинке градиентного геля пред-
ставлен на рис. 5. Культуру Е. coll в экспоненциальной фазе роста
инфицировали диким типом и различными amber-мутантами бак-
териофага Т4 и метили 14С-аминокислотами в интервале от 3 до
8 мин после заражения. Распределение отдельных белков, коди-
руемых фагом, определяли на радиоавтографе после окращива-
ния геля и обесцвечивания фона. На пластинке видно четкое раз-
деление полипептидов, молекулярные веса которых различаются
всего лишь на 200—500 дальтон.

Для создания экспоненциальных или линейных градиентов ак-
риламида в геле можно использовать стандартные градиентные
смесители. В нашей лаборатории для приготовления линейного
градиента используют три канала многоканального перистальти-
ческого насоса. На магнитной мешалке осторожно перемешива-
ют определенное количество разбавленного раствора акрилами-
да, равное половине объема, необходимого для заполнения
камеры для геля. Раствор подается по двум каналам перисталь-
тического насоса через длинные иглы на дно этой камеры. Одно-
временно по третьему каналу в смесительную камеру вводят кон-
центрированный раствор акриламида. Для повышения стабиль-
ности градиента в концентрированный раствор акриламида
добавляют 10% глицерина. Чтобы во время образования гради-
ента не началась полимеризация, растворы акриламида должны
быть холодными (ниже 10°С). После заполнения камеры иглы
удаляют, гель оставляют для полимеризации, а затем готовят
пластинку, как описано выше.

Таким же образом приготовляют экспоненциальные градиен-
ты, но при этом подают раствор акриламида из градиентного
смесителя в камеру для геля только по одному каналу насоса.

Прописи растворов акриламида тех концентраций, которые
чаще всего используются для приготовления градиентного геля,
даны в табл. 3. Разумеется, можно приготовить гели любой дру-
гой концентрации.

Для приготовления гелей с высокой концентрацией акрилами-
да, например 30 или 40%, мы с успехом пользуемся прописями,
приведенными в табл. 4.
Рис 5. Идентификация пререпликативных белков Т4.

культура £. coli В была инфицирована различными мутантами бактериофа-
га Т4. Клетки метили 14С-амииокислотами через 3 мни после заражения. Вве-
дение метки заканчивалось через 8 мин после заражения. Условия электро-
фореза те же, что указаны в подписи к рис. 1.

А. Окрашенная, фиксированная и обесцвеченная пластинка после высушива-
ния. Б. Радиоавтограф этой пластинки. Электрофорез проводили в градиентном
геле, приготовленном из 7,5%-иого и 20%-иого растворов акриламида. Под-
робности см. в тексте (разд. 11, Г). Треугольными стрелками указаны места,
где исчезли полосы полипептидов или появились amber-фрагмеиты.___________ :

а б в. г д е ж з и к ,

Мутант В22 AS04 В263 В277 ocgt - г88Н г196 HL618 - + 116 j
Sgt -	;

Геи	43	43	43	43	— А В 32	-	39 =

____________J
Прописи градиентных гелей для диск-электрофореза с ДСН

Таблица 3

Исходные растворы	Количества различных растворов, необходимые для приготовления раствора с указанной концентрацией (%) акриламида для геля, мл				
	7,5%	ю%	12,5%	15%	20%
1,5М трис-HCl, рН8,8—0,4% ДСН ..	7,5	7,5	7,5	7,5	7,5
30%-ный акриламид—0,8%-ный Бис . . .	7,5	10	12,5	15	20
Дистиллированная вода 		14,9	12,4	6,9	4,4	
10%-иый персульфат аммония		0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Глицерин!		—	—	3	3	2,4
ТЕМЭД 		0,01	0,01	0,01	0,01	0,01

Глицерин добавляют только к растворам с высокой концентрацией.

Таблица 4

Прописи для приготовления гелей с высокой концентрацией акриламида

Исходные растворы	Количества различных растворов, необ- ходимые для приготовления раствора с ука- занной концентрацией (%) акриламида для геля	
	30%	40%
1,5Мтрис-НС1,рН 8,8—0,4%ДСН,мл	7,5	7,5
Акриламид, г 		6	8
Бис, г		0,12	0,16
Дистиллированная вода		до 20 мл 	
10%-иый персульфат аммония, мл . .	0,1	0,1
ТЕМЭД, мл		0,01	0,01

Д. Окрашивание гелей

Текстильный краситель кумасси ярко-синий R250 впервые
применили Фазекас де Сент-Грот и сотр. (Fazekas de St. Groth
et al., 1963) для окрашивания белков на ацетат-целлюлозной
мембране. Позднее он был применен для выявления белков в по-
лиакриламидном геле (Meyer, Lamberts, 1965); в качестве рас-
творителя использовали смесь метанол — уксусная кислота —
дистиллированная вода в объемном соотношении 5:1:5. Кумас-
си ярко-синий равномерно связывается с различными белками и
обладает высокой чувствительностью, поэтому в настоящее время
его наиболее широко используют для окрашивания электрофоре-
грамм.

После окончания электрофореза камеру с гелем извлекают из
аппарата. Плексигласовые прокладки удаляют, а стеклянные
пластинки осторожно разъединяют шпателем под струей воды.
Надо сделать так, чтобы гель соскользнул в большую чашку Пет-
ри (диаметром 20 см) с подогретым до 37°С окрашивающим рас-
твором (0,25% кумасси ярко-синий в смеси метанол — уксусная
кислота — дистиллированная вода 5:1:5). Во время окрашива-
ния (45—60 мин) чашку медленно покачивают на платформе ка-
чалки, помещенной в термостат, при 37°С. Можно также исполь-
зовать водяную баню с качалкой (New Brunswick, Нью Брунс-
вик, США), содержащую такое количество подогретой до 37°С
воды, чтобы чашка не плавала.

Другой метод окрашивания белков в полиакриламидном геле
с помощью того же красителя в разведенной хлорной кислоте
предложили Рейснер и сотр. (Reisner et al., 1975). Метод
основан на том, что при связывании с белком краситель восста-
навливает свой цвет, измененный в хлорной кислоте. Поскольку
гель окрашивается в бледно-оранжевый цвет, а полосы белка —
в интенсивно синий, при этом методе не требуется обесцвечива-
ние. Кроме того, метод очень удобен для окрашивания гелей пос-
ле изоэлектрофокусирования, так как краситель в хлорной кис-
лоте не связывается амфолитами.

Гриффит (Griffith, 1972) предложил выявлять белки с по-
мощью ремазоловых красителей. Окрашивание производят при
растворении образца до электрофореза в полиакриламидном ге-
ле с ДСН. После этого миграцию и разделение белков при элект-
рофорезе можно наблюдать визуально.

Окрашивание гликопротеидов

Существует ряд методов выявления гликопротеидов при по-
мощи реакции с иодной кислотой и реактивом Шиффа (Clarke,
1964; Caldwell, Pigman, 1965; Keyser, 1965). Один из методов
окрашивания гликопротеидов в полиакриламидном геле (Zacha-
rius et al., 1969) приведен в табл. 5.
Таблица 5

Окрашивание гликопротеидов в полиакриламидном геле
(Zacharius et al., 1969)

Этап	Обработка	Время, мин
1	Гель погружают в 12,5%-ную трихлоруксусную кислоту	30
2	Слегка ополаскивают дистиллированной водой 		0,5
3	Погружают в 1%-ный раствор иодиой кислоты на 3%-ной	
	уксусной кислоте		60
4	Тщательно отмывают (10 раз по 10 мин) дистиллирован- ной водой; проба на IO3 с AgNO3 должна быть отри-	
	нательной (проводится в темноте)			100
5	В темноте погружают в фуксин-сульфитиый реактив (2%-ный раствор розанилина в воде обесцвечивают SO2, обрабатывают древесным углем и разбавляют	
	в 20 раз водой) 		50
6	Промывают гель (3 раза по 10 мин) свежеприготовлен-	
	ным 0,5%-ным раствором Na-метабисульфита ....	30
7	Тщательно промывают дистиллированной водой, часто	
	меняя отмывки и встряхивая 		В течение ночи
8	Хранят в 7%-ной уксусной кислоте		

Е. Обесцвечивание фона

После окрашивания удаляют краситель водоструйным насо-
сом и заливают обесцвечивающий раствор (метанол — уксусная
кислота — дистиллированная вода в соотношении 5: 1 :5), в ко-
торый добавляют немного технического анионита (ионообменную
смолу № 3 Asi поставляет Lienberger AG, Берн, Швейцария).
Прибавив смолу, можно ограничиться лишь одной порцией обес-
цвечивающего раствора. Обесцвечивание продолжается около
60 мин при 37°С и легком покачивании.

Ж. Высушивание

После того как обесцвечивание закончено, гель отмывают от
смолы обесцвечивающим раствором или водой, переносят на по-
лимерную пленку (Saran Wrap; или можно использовать, напри-
мер, часть полиэтиленового пакета) и покрывают листом мокрой
хроматографической бумаги (Whatman ЗММ) по размеру не-
сколько больше геля. Затем гель переносят в аппарат для сушки
и укладывают бумажным слоем на пористую пластинку (рис. 6).
В аппарате создают вакуум, например с помощью водоструйного
насоса, и высушивают гель. Этот процесс можно ускорить нагре-
ванием, поместив над гелем на расстоянии около 50 см инфра-
Рнс. 6. Аппарат для высушивания геля.

красную лампу. При высушивании пластинка геля становится
тонкой, твердеет и в виде гладкой пленки остается на бумаге.

3.	Радиоавтография

Высушенные пластинки геля можно хранить под прессом (на-
пример, между страницами блокнота), чтобы предотвратить их
скручивание; для получения радиоавтографов эти пластинки на-
кладывают на медицинскую рентгеновскую пленку (Kodirex) и
экспонируют; время экспозиции лучше всего определять опытным
путем. Для электрофореграммы смеси пептидов (50—100 полос)
с общей радиоактивностью порядка 50 000 имп/мин обычно нуж-
на экспозиция 24—36 ч. Затем пленку проявляют и закрепляют
коммерческими реактивами по инструкции изготовителя.
Рис. 7. Приспособление для разрезания геля (вверху — в разобранном, вни-
зу — в собранном виде).

Радиоавтографы электрофореграмм можно представить гра-
фически, использовав денситометр с записывающим устройством.
Следует выбирать такое время экспозиции, при котором высота
пиков на денситограмме линейно зависит от радиоактивности
белковых полос. Для количественной оценки радиоавтографов
необходим денситометр, снабженный интегратором; площади пи-
ков на денситограмме можно также определить либо триангуля-
цией, либо вырезая отдельные пики и взвешивая их.

Существуют методы, повышающие эффективность выявления
радиоактивных полос (Randerath, 1970; Bonner, Laskey, 1974).
В частности, с их помощью можно определять в полиакриламид-
ном геле полипептиды, меченные 3Н. Гель обезвоживают в диме-
тилсульфоксиде, затем пропитывают РРО, после чего высушива-
ют и экспонируют при —70°С. При этом на пленку действуют не
сами 0-частицы, а излучение, возникающее при взаимодействии
0-частиц с РРО.

И. Разрезание геля

Радиоавтографию можно проводить только с изотопами, име-
ющими относительно высокую активность, такими, как 14С, 35S,
з2Р, 1251, 1311. Если гель содержит 3Н или несколько разных изото-
пов, количественную оценку радиоактивности лучше проводить,
разрезав гель и определяя активность каждого кусочка в сцин-
тилляционном счетчике.

Пластинки геля можно разрезать с помощью простого устрой-
ства из параллельно расположенных бритвенных лезвий или на-
тянутых тонких проволочек. Сначала гель разрезают лезвием
бритвы на продольные полоски, которые в свою очередь делят
на небольшие кусочки размером около 1 мм с помощью приспо-
собления, показанного на рис. 7. Каждый кусочек пинцетом пе-
реносят в отдельный сцинтилляционный стаканчик и добавляют
растворитель, деполимеризующий гель.

К. Растворение геля

Каждый кусочек геля растворяют в 0,5—1,0 мл 30%-ной Н2Ог
при 60°С в течение ночи в закрытых сцинтилляционных стакан-
чиках. Перед определением радиоактивности в стаканчики добав-
ляют по 10 мл сцинтилляционной жидкости (7 частей толуола,
содержащие 4 г РРО и 0,2 г РОРОР на 1 л, и 6 частей тритона
Х-100).

В другой методике используют растворитель NCS (Amers-
ham/Searle Corp., Арлингтон Хейте, Иллинойс, США), вызываю-
щий набухание кусочков геля и диффузию белков в сцинтилля-
ционную жидкость (Ames, 1974). К каждому кусочку геля добав-
ляют 10 мл сцинтилляционной смеси (143 мл растворителя NCS,
3,73 л толуола, 14 г РРО и 0,21 г РОРОР) и в закрытых стакан-
чиках инкубируют в течение ночи при 37°С.

Растворимые полиакриламидные гели можно получать, ис-
пользуя вместо Бис этилендиакрилат (ЭДА) (Choules, Zimm,
1965) или М,М'-диаллилтартардиамид (ДАТД) (Anker, 1970).
Кусочки геля, приготовленного с ЭДА, растворяют в течение не-
скольких часов при комнатной температуре в щелочной среде, на-
пример в 0,5—1 мл концентрированного NH4OH, а затем добав-
ляют водорастворимую сцинтилляционную жидкость. Гели, при-
готовленные с ДАТД, растворяют в 0,5—1 мл 2%-ного раствора
иодной кислоты в течение 30 мин при комнатной температуре.
Л. Элюирование белков из кусочков геля

Отдельные белковые полосы, полученные в результате элект-
рофореза, можно элюировать, погрузив каждый кусочек геля до
фиксации и окрашивания в 5мМ раствор NaHCOe, содержащий
0,1 % ДСН. Обычно для полной элюции достаточно держать ку-
сочек в этом растворе при перемешивании в течение 12 ч при
37°С. Часть полученного элюата можно использовать для повтор-
ного электрофореза, часть — для определения радиоактивности,
а остальное ренатурировать, удалив ДСН (см. разд. II, Н). Вы-
деленными белками (даже не удаляя ДСН) можно иммунизиро-
вать животных для получения антител.

Количество белка, содержащееся в каждой полосе, можно по-
высить, если увеличить толщину геля, взяв более толстые плек-
сигласовые прокладки (до 0,5 см), или нанести увеличенный
объем образца по всей ширине концентрирующего геля. В этом
случае концентрирующий гель полимеризуют без «гребешка».

М. Препаративный электрофорез

Существует два основных подхода при разделении больших
количеств белковой смеси в полиакриламидном геле. Во-первых,
можно проводить электрофорез в пластинках геля большей дли-
ны, ширины и толщины, а затем разрезать гель и элюировать по-

Рис. 8А. Аппарат для препаративного электрофореза в плоском слое.
Вход-выход^
буфера для
злюции,

Б

Контир нижней
части камеры
с гелем

ТЪнкая прокладка
из силиконовой
резины

Подложка uz
плексигласа
‘З^Х.Вход-выход буфера
& оля элюцшл*

Тонкая прокладка
из силиконовой
резины

/~7~t	7 Диализная

/ / / 7		/ мембрана

Тонкая прокладка
из силиконовой
резины

Выход для
пузырьков —>
Воздуха

Рис. 8Б. Схема сборки собирающей ячейки.

Подложка из
плексигласа
t. Выход для
пузырьков
воздуха

лученные фракции, как описано выше. Во-вторых, можно исполь-
зовать короткие колонки или блоки и собирать выходящие фрак-
ции непрерывным потоком буфера, омывающим нижний срез ге-
ля. Аппарат для проведения такого электрофореза изображен на
рис. 8. Он представляет собой модификацию стандартного при-
бора для аналитического диск-электрофореза в пластинках геля
и изготовлен в наших мастерских. Самая главная его часть — это
собирающая ячейка, сделанная из плексигласа (рис. 8, Б) и гер-
метично соединенная с нижней частью камеры. Диализная меМб-;
рана, натянутая в собирающей ячейке, ограничивает небольшое
пространство под нижней поверхностью геля; с одной стороны
вводят в это пространство элюирующий буфер, а с другой — от-
бирают фракции. Чтобы элюируемые белки меньше адсорбирова-
лись на мембране, ионная сила элюирующего буфера должна
быть выше ионной силы буфера для геля. В табл. 6 приводится
состав электродного и элюирующего буферов, а также растворов
для приготовления разделяющего и концентрирующего гелей
(Duesberg, Rueckert, 1965). Для приготовления гелей с ДСН,
применяемых в препаративном диск-электрофорезе, можно ис-
пользовать растворы, состав которых приводится в разд. 11,В.

Таблица 6

Исходные растворы для приготовления разделяющих и концентрирующих
гелей (катиоииая и авионная система) (Duesberg, Rueckert, 1965)

Раствор	Компонент	Анионная система с pH 9,9*	
		Разделяющий гель	Концентриру- ющий гель
А  Б	10 н. НС1, мл	  Трис, г 		  .  ТЕМЭД, мл	  ЮМ мочевина, мл	  Акриламид, г	  Бис, г	  ЮМ мочевина, мл 		12  80  5,8  800  30  0,8  80	12  72,6  11,5  800  30  0,8  80
		Катионная система с pH 4,5*	
		Разделяющий гель	Концентри- рующий гель
В  Г  д	СН3СООК, г	  СН3СООН, мл	  ТЕМЭД, мл	  ЮМ мочеввна, 10 мл	  Акриламид, г 	  Бис, г 	  ЮМ мочевина, мл 	  Дистиллированная вода, мл	  Рибофлавин, мг 	  Дистиллированная вода, мл		30  120  25  800	30  60  3  800  10  2,5  80  До 100  40  До 100

1	Для приготовления щелочного разделяющего геля смешивают 16 мл раствора А, 9 мл
Раствора Б и 30 мл 8 М мочевины; полимеризацию проводят, добавляя холодный раствор,
содержащий 22,5 мг персульфата аммония в 15 мл 8 М мочевины. Концентрирующий гель
готовят, смешивая 1,8 мл раствора А, 1,8 мл раствора Б и 7,8 мл 8М мочевины; полимериза-
цию проводят, добавляя раствор, содержащий 4,5 мг персульфата аммония в 3 мл 8М мо-
чевины. Верхнюю и нижнюю электродные камеры заполняют трис-глицнновым буфером
(0.05М трнс, 0,4 М глицин). Собирающая ячейка омывается раствором, содержащим 52 г
трис, 14 мл уксусной кислоты и 800 мл ЮМ мочевниы.

Для приготовления кислых гелей смешивают 3 мл раствора В, 6 мл раствора Ан 15 мл
8М мочевины; полимеризацию проводят, добавляя 27,5 мг персульфата аммония в 24 мл
$М мочевины. Верхний гель получают фотополнмеризацией 0,4 мл раствора В, 2 мл раст-
вора Г и 5,6 мл 8М мочевины с 0,1 мл раствора Д. Верхнюю н ннжнюю электродные
камеры заполняют раствором, содержащим 31,2 г р-аланина н 8 мл уксусной кислоты в 1 л
Дистиллированной воды. Белкн элюируют раствором, содержащим 19 мл уксусной кислоты,
14 г ацетата аммония и 800 мл ЮМ мочевины.
При проведении препаративного электрофореза часто проис-
ходит довольно сильный разогрев геля, что может вести к ис-
кривлению полос, поэтому необходимо отводить выделяющееся
тепло. Эта проблема, по крайней мере частично, разрешена в
конструкции прибора, показанного на рис. 8. Применяемые в
нем пластинки тоньше большинства цилиндрических гелей, и всю
камеру можно погружать в постоянно охлаждаемый нижний
электродный буфер. Вторая проблема, с которой приходится
сталкиваться при проведении препаративного электрофореза, —
это разбавление элюируемых фракций. Дело в том, что высоко-
молекулярные белки выходят из слоя геля значительно медлен-
нее, чем низкомолекулярные, и поэтому подвергаются разбавле-
нию. Чтобы уменьшить разбавление, можно во время
электрофореза по соответствующей программе снижать скорость
подачи элюирующего буфера или использовать градиентный гель
(см. разд. II, Г), что более эффективно.

Н. Удаление ДСН

ДСН благодаря своим превосходным солюбилизирующим
свойствам очень часто оказывается наилучшим средством для
диссоциации биологических комплексов. Однако после разделе-
ния комплексов белок-ДСН перед дальнейшим изучением полу-
ченных образцов (например, изоэлектрофокусированием или про-
ведением серологических реакций) необходимо удалить детер-
гент. Простого диализа может быть недостаточно для полного
удаления связанного ДСН (Weber, Kuter, 1971). Однако описаны
два метода, с помощью которых можно количественно отделить
ДСН от белка. Освобождение ряда ферментов от ДСН ведет к
их ренатурации и частичному восстановлению активности.

Тушински и Уоррен (Tuszynski, Warren, 1975) проводили
электродиализ комплекса белок — ДСН в 1 мМ трис-НС1-буфере
с pH 7,7, содержащем 1%-ный меркаптоэтанол и 5М мочевину, в
течение 11 ч при постоянной силе тока 20 мА. При этом возможно
полное освобождение белка от ДСН.

Для отделения ДСН можно также использовать ионообмен-
ную хроматографию в 6М мочевине (Weber, Kuter, 1971). В рас-
твор, содержащий комплекс белка с ДСН, добавляют сухую мо-
чевину до концентрации 6М или проводят диализ против 50 мМ
трис-ацетатного буфера с pH 7,8, содержащего 10 мМ 2-меркап-
тоэтанол и 6М мочевину. Затем раствор наносят на небольшую
колонку с Дауэкс 1-Х2, уравновешенную тем же буфером. Один
миллиметр смолы может связать до 100 мг ДСН. Мочевина
удерживает белок в растворенном состоянии и ослабляет взаимо-:
действие между белком и детергентом. Полноту удаления ДСН;
из раствора определяют качественной реакцией с концентриро-
ванным раствором КС1: ДСН образует с КС1 нерастворимый оса-
док. Мочевину удаляют из раствора белка диализом или хрома-
тографией на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной буфером без
мочевины. Колонку с адсорбированным белком промывают бу-
фером, а затем элюируют белок обычными методами (например,
растворами с высокой ионной силой).

О- Определение молекулярного веса

Для оценки молекулярного веса белков, образующих при
электрофорезе отдельные полосы, необходимо параллельно на
той же пластинке проводить электрофорез смеси белков с извест-
ными молекулярными весами. В качестве стандартов не рекомен-
дуется брать протеолитические ферменты (например, трипсин
или химотрипсин), так как они сохраняют активность и после
кипячения с 2% ДСН. При идентификации белков методом ра-
диоавтографии удобно использовать белковые стандарты, мечен-
ные 14С-иодацетатом или 14С-уксусным ангидридом.

Молекулярные веса исследуемых белков можно оценивать,
сравнивая их подвижность с подвижностью стандартных белков
на одной и той же пластинке.

Изучение гидродинамических свойств комплексов белок —
ДСН показало, что это палочкообразные частицы, длина которых

т ।	।---1--г-—।----1---г

- \

р— РНЦ-полимераза

ДЭ-р-Галатозидаза

—Фосфорилаза а
РНК-полимераза р

- Каталаза<\^_ 1д

Унк-полимераза-^0й^6^Лг

.	<а> АТКазаЮ^™^

Химотрипсиноген—[д

АТКаза

Лизоцим—О%

Цитохром с— О

4	6

Расстояние от старта, см

Рис. 9. Калибровочная кривая для определения молекулярных весов методом
электрофореза в пластинке полиакриламидного геля.

БСА — бычий сывороточный альбумин; IgG (Н и L) — тяжелые и легкие
цепи иммуноглобулинов; АТКаза (С) и АТКаза (R) — каталитическая и ре-
гуляторная полипептидные цепи аспартаттранскарбамилазы Е. coli; ГАФДГ —
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из дрожжей. Использован 10%-ный
полиакриламидный гель.
зависит от молекулярного веса белка (Reynolds, Tanford, 1970а;
Fish et al., 1970). Так как при электрофорезе в полиакриламид-
ном геле с ДСН свободная подвижность комплексов белок —
ДСН почти постоянна, молекулярные размеры таких комплексов
в известном диапазоне величин можно определять по графику
зависимости относительной подвижности от логарифма молеку-
лярного веса. Поскольку на одной пластинке геля белки под-
вергаются электрофорезу в одинаковых условиях (pH, темпера-
тура, сил.а тока, градиент напряженности), можно непосредствен-
но сравнивать и молекулярные .веса. Расстояние, пройденное
каждым стандартным белком от верхней границы геля, отклады-
вается на полулогарифмической бумаге против соответствующей
величины молекулярного веса (рис. 9). Молекулярные веса неиз-
вестных белков экстраполируются по расстоянию, пройденному
ими при электрофорезе.

Из рис. 9 видно, что зависимость пройденного расстояния от
логарифма молекулярного веса выражается сигмоидальной кри-
вой. Однако в области молекулярных весов от 15 000 до 100000
эта зависимость близка к линейной. Определение молекулярного
веса возможно и вне этих пределов, но только при наличии хоро-
шо охарактеризованных маркеров.

III. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование метода электрофореза в полиакриламидном
геле для анализа и разделения сложных смесей белков и нуклеи-
новых кислот значительно расширило наши знания о многих кле-
точных и вирусных системах. Электрофорез в полиакриламидном
геле имеет ряд преимуществ перед другими аналитическими ме-
тодами: он отличается простотой в исполнении, хорошей воспро-
изводимостью результатов и не требует сложного оборудования.
В комбинации с двумерным разделением и изоэлектрофокусиро-
ванием он может быть использован не только для аналитических,
но и для препаративных целей.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Allen R. С., Popp R. A., Moore D. J. (1965). Histochem. Cytochem., 13, 249.
Ames G. F. (1974). J. Biol. Chem., 249, 634.

Anker H. S. (1970). FEBS Lett., 7, 293.

Bolle A., Epstein R. H., Salser W., Guiduschek E. P. (1968). J. Mol. Biol.,
31, 325.

Bonner W. M., Laskey R. A. (1974). Eur. J. Biochem., 46, 83.

Caldwell R., Pigman W. (1965). Arch. Biochem. Biophys., 110, 91.

Choules G. L., Zimm В. H. (1965). Anal. Biochem., 13, 336.

Clarke J. T. (1964). Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 428.

Davis B. J. (1964). Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 404.

Duesberg P. H., Rueckert R. R. (1965). Anal. Biochem., 11, 342.
Fazekas de St. Groth. S., Webster R. G., Datyner A. (1963). Biochim. Biophys.
Acta, 71, 377.

Fish W. W., Reynolds J. A., Tanford C. (1970). J. Biol. Chem., 245, 5116.

Fullerton P. M., Barnes J. M. (1966). Br. J. Ind. Med., 23, 210.

Gordon A. H. (1975). In: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecu-
lar Biology. Electrophoresis of Proteins in Polyacrylamide and Starch Gels
(T. S. Work, and E. Work, eds.), Vol. 1, Part I, North-Holland, Amsterdam.

Griffith I. P. (1972). Anal. Biochem., 46, 402.

Jovin T. M. (1973). Ann. N. Y. Acad. Sci., 209, 477.

Keyser J. W. (1965). Anal. Biochem., 9, 249.

Laemmli U. K. (1970). Nature (London), 277, 680.

Loening U. E. (1967). Biochem. J. 102, 251.

Maurer H. R. (1971). In: Disc Electrophoresis and Related Techniques of Poly-
acrylamide Gel Electrophoresis (K- Fishbeck; ed.), De Gruyter, Berlin.

Meyer T. S., Lamberts B. L. (1965). Biochim. Biophys. Acta, 107, 144.

Grnstein L. (1964). Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 321.

Randerath K- (1970). Anal. Biochem., 34, 188.

Raymond S., Nakamichi M. (1962). Anal. Biochem., 3, 23.

Reid M. S., Bieleski R. L. (1968). Anal. Biochem., 22, 374.

Reisner A. H., Nemes P., Bucholtz C. (1975). Anal. Biochem., 64, 509.

Reynolds J. A., Tanford C. (1970a). J. Biol. Chem., 245, 5151.

Reynolds J. A., Tanford C. (1970b). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 66, 1002.

Rodbard D., Kapadia G., Chrambach A. (1971). Anal. Biochem., 40, 135.

Studier F. W. (1973). J. Mol. Biol., 79, 237.

Takacs B. J., Rosenbusch J. P. (1975). J. Biol. Chem., 250, 2339.

Tuszynski G. P., Warren L. (1975). Anal. Biochem., 67, 55.

Weber K-, Kuter D. J. (1971). J. Biol. Chem., 246, 4504.

Weiner A. M., Platt T., Weber K- (1971). J. Biol. Chem., 247, 3242.

Zacharius R. M., Zell T. E., Merrison J. H., Woodlock J. J. (1969). Anal. Bio-
chem., 30, 148.
Глава 5

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ МЕТОДОМ
АНАЛИТИЧЕСКОГО
ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЯ

Д. Браун, К. Хильд, А. Зиглер

I.	ВВЕДЕНИЕ

Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в пластинках полиакрил-
амидного геля в настоящее время широко применяется при изу-
чении гетерогенности антител и при исследовании специфических
антител различных линий лабораторных животных (Williamson
et al., 1973; Williamson, 1971; Kreth, Williamson, 1973; Pink, As-
konas, 1974; Braun et al., 1973; Cramer, Braun, 1974; Wabl, Du
Pasquier, 1976). С помощью ИЭФ в сыворотках человека опреде-
ляют естественные антитела к группоспецифическим полисахари-
дам стрептококков (Riesen et al., 1976). При использовании по-
лиакриламидных гелей этот метод не позволяет анализировать
крупные молекулы (такие, как IgM), так как они не проникают
в гель. Эту трудность можно преодолеть, если проводить ИЭФ в
тонком слое геля, используя в качестве антиконвекционной сре-
ды сефадекс (Ziegler, Kohler, 1976). Чувствительность метода
можно повысить на несколько порядков, проявляя ИЭФ-форе-
граммы антигенами с изотопной меткой. Таким образом, этот ме-
тод применим для исследования сложных биологических смесей,
таких, как сыворотка, моча, асцитическая жидкость или спинно-
мозговая жидкость.

11.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Метод ИЭФ обладает высокой разрешающей способностью.
Он позволяет разделять в бессолевой среде такие амфолиты, как
аминокислоты и олиго- и полипептиды, а также белковые моле-
кулы по их изоэлектрическим точкам (pl). Однако этот метод
стал широко применяться для фракционирования макромолеку-
лярных амфолитов лишь тогда, когда были разработаны подхо-
дящие амфолиты-носители и естественные градиенты pH (Svens-
son, 1961, 1962 a, b; Vesterberg, Svensson, 1966). В жидкой среде
пологий градиент pH создается низкомолекулярными амфолита-
ми и стабилизируется градиентом плотности сахарозы (Svensson,
1962b). Впервые он был применен для изучения гетерогенности
миоглобинов, цитохрома с, лактопероксидазы и многих других
белков (Vesterberg, Svensson, 1966; Vesterberg, 1967; Flatmark,
Рис. 1. Оборудование для ИЭФ.

А. Плексигласовая камера для изоэлектрофокусирования с пластинкой геля
(крышка не показана). Полиакриламидный гель, как на подложке, держится
на желатинизированной стеклянной пластинке Илфорд. Фильтровальные бу-
мажки с образцами наложены на поверхность геля. Пластинка перевернута
гелем вниз и лежит на двух графитовых электродах.

Б. Камера для полимеризации геля, образованная стеклянной силиконирован-
ной пластинкой с одной стороны и стеклянной желатинизированной пластин-
кой Илфорд — с другой; между пластинками проложен силиконовый шланг, и
они скреплены пружинными зажимами.

Vesterberg, 1966; Haglund, 1967). При фракционировании имму-
ноглобулинов колоночное ИЭФ используется в основном для пре-
паративного разделения: на полиакриламидных гелях, которые
обладают лучшими стабилизирующими свойствами и высокой
разрешающей способностью, можно идентифицировать в смеси
антител и других белков продукт даже одного клона лимфоцитов
(клонотип) (Williamson, 1971; Braun et al., 1973; Askonas et al.,
1970; Eichmann, 1972). Последний метод будет описан подробно
в двух модификациях: на пластинке полиакриламидного геля и
в тонких слоях геля, содержащего сефадекс.

Ш. РЕАГЕНТЫ И ПРИБОРЫ

Стеклянные пластинки (220X170X3 мм), силиконированные
Репелкотом (Hopkin a. Williams, Чадуэлл Хеле, Англия)

Покрытые желатиной стеклянные пластинки Илфорд (Эссекс,
Англия) размером 21,6X16,8 см

Силиконовые шланги с наружным диаметром 2,4 мм и 1,2 мм
Металлические пружинные зажимы 1413 (Myers, Бирмингем,
Англия; шесть зажимов для приготовления одной пластин-
ки геля; см. рис. 1,5)
Камера для фокусирования (33X23X10 см) с плексигласовой
герметичной крышкой и двумя палочкообразными графи-
товыми электродами (19X1 см) с предохранительной бло-
кировкой (см. рис. 1,Л)

Источник постоянного напряжения

Поверхностный мембранный электрод (Ingold, Цюрих,
Швейцария) и рН-метр

Растворы (хранить при 4°С в темноте):

А)	1,0 мл М,М,М',М'-тетраметилэтилендиамида (ТЕМЭД)
в 150 мл трижды дистиллированной или свежедеиони-
зированной воды;

Б) 100 г перекристаллизованного акриламида и 2,7 г
Ц,Ц'-бисметилакриламида в трижды дистиллированной
или свежедеионизированной воде до объема 300 мл;

В)	2 мг рибофлавина в 100 мл трижды дистиллированной
или свежедеионизированной воды;

Г) 5%-ный этилендиамин на деионизированной воде;

Д) 5%-ная фосфорная кислота на деионизированной воде
Амфолины [фирма LKB Producter АВ (Стокгольм, Швеция)
выпускает серию амфолинов]; смешивая соответствующие
амфолины, можно приготовить ряд различных градиентов
pH; самый широкий диапазон pH 2,5—11

IV. методики

А.	Сборка камеры для геля

Пластинку Илфорд помещают стороной, покрытой желати-
ной, напротив силиконированной стеклянной пластинки. Между
пластинками с трех сторон вкладывают силиконовый шланг с на-
ружным диаметром 1,2 мм так, чтобы образовалась прямоуголь-
ная камера (объем около 30 мл), открытая с одной стороны
(рис. 1). Обе пластинки соединяют металлическими зажимами,
ставят вертикально и заполняют раствором полиакриламидного
геля.

Б. Приготовление 5°/0-ного полиакриламидного геля

Для того чтобы в геле не образовывались пузырьки воздуха,
смесь (раствор А — 1,5 мл; раствор Б — 6,0 мл; амфолины —
2 мл; трижды дистиллированная вода —26,5 мл) помещают в
250-миллилитровую колбу с отсосом (водоструйный насос) на
2 мин при непрерывном магнитном перемешивании. Затем до-
бавляют 4 мл раствора В, хорошо перемешивают и быстро вли-
вают смесь пипеткой в камеру для геля, избегая образования воз-
душных пузырьков. На поверхность геля пастеровской пипеткой
наливают слой трижды дистиллированной воды высотой до 0,5 см
и оставляют полимеризоваться под ультрафиолетовой лампой в
течение 4—12 ч.

При изоэлектрофокусировании специфических антител из ги-
периммунных сывороток рекомендуется добавить в гель до 2 М
концентрации свежедеионизированную мочевину (Cramer, Bra-
un, 1974). Для деионизации исходный ЮМ раствор мочевины
перемешивают 30 мин со смолой Амберлит МВ-1 (analytical gra-
de; BDH, реактивы для лабораторных работ, выпускается The
Rohm a. Haas Со., Филадельфия, США), затем амберлит удаля-
ют фильтрацией через стеклянный пористый фильтр. В присутст-
вии мочевины непрочные агрегаты антител и комплексы анти-
ген — антитело распадаются, но разделенные антитела пол-
ностью сохраняют способность к последующему соединению сан-
тигенами.

В.	Внесение образцов в гель

После того как произойдет полимеризация геля, камеру кла-
дут пластинкой Илфорд вниз, силиконовый шланг и зажимы ос-
торожно удаляют, а затем снимают силиконированную пластин-
ку. Гель должен остаться на пластинке Илфорд.

Пластинку гелем вверх помещают на миллиметровую бумагу
и на один конец наносят образцы. В принципе можно наносить
образцы на любой конец, но, как показывает опыт, при работе с
антителами лучшее разрешение получается при нанесении их на
анодный конец. Образцы в объеме 2—50 мкл наносят на полоски
фильтровальной бумаги для высоковольтного электрофореза
(5X10—20 мм). Эти полоски прикладывают к поверхности геля,
и они остаются во время изоэлектрофокусирования.

Г. Фокусирование

Изоэлектрофокусирование (Awdeh et al., 1968) проводят во
влажной камере при 4°С (рис. 1). Электроды протирают, верх-
нюю поверхность анодного электрода слегка смачивают 5%-ной
фосфорной кислотой, а катодного — 5%-ным этилендиамином.
Приготовленные пластинки геля с нанесенными образцами на-
кладывают на электроды гелем вниз так, чтобы полоски бумаги
не касались анода (рис. 1). Если электроды не закреплены, их
следует расположить параллельно узкому краю геля.

Фокусирование начинают при силе тока ниже 6,5 мА на плас-
тинку. Затем в течение 2 ч постепенно, через каждые 30 мин, по-
вышают силу тока до 6,5 мА; при этом напряжение на пластинке
становится равным 450 В, и в таком режиме проводят фокусиро-
ванне в течение 20 ч. Через 20 ч напряжение увеличивают до
600 В и фокусируют еще 2—3 ч; к этому времени сила тока на
пластинку становится равной 1—2 мА.

После окончания фокусирования прибор выключают, осто-
рожно снимают бумажные полоски и проводят дальнейшую об-
работку геля.

Д. Определение градиента pH

Градиент pH, образующийся в геле при фокусировании, изме-
ряют поверхностным мембранным электродом (Ingold, Цюрих,
Швейцария) и откладывают на миллиметровой бумаге. Измерять
pH необходимо как можно быстрее, чтобы не произошла диффу-
зия образца в геле. В разд. IV, Д приводится пример измерения
градиента pH при изоэлектрофокусировании специфических ан-
тител с последующей маркировкой мечеными антигенами. Для
разделения других систем антиген — антитело оптимальные ус-
ловия могут быть иными.

Е. Связывание антигена и радиоавтография

Первоначально метод состоял в том, что на пластинку геля
при 37°С наслаивали (и оставляли на 45 мин) физиологический
раствор на боратном буфере с pH 7,2, содержавший 10 мКи по-
лисахаридного антигена, меченного 131I (Williamson, 1971; Cra-
mer, Braun, 1974; Askonas et al., 1970). Мы отдаем предпочтение
методу, разработанному Кеком и сотр. (Keck et al.,. 1973), с не-
большими видоизменениями (Cramer et al., 1976); этот метод да-
ет электрофореграмму лучшего качества, его подробное описа-
ние приводится ниже.

Гель погружают при комнатной температуре на 1 ч в 400 мл
забуференного 18%-ного раствора Na2SO4 (раствор трижды за-
меняют свежим). При этом из геля вымываются мочевина и ам-
фолины и происходит осаждение иммуноглобулинов. Все опера-
ции проводят при слабом встряхивании.

Затем гель переносят на 1 ч в 400 мл того же раствора, но с
добавкой 0,05% (по объему) глутарового альдегида. При этом
происходит слабая полимеризация белков, что делает их нерас-
творимыми. Избыток глутарового альдегида удаляют, промывая 5
гель в течение 2 ч в трех порциях буфера по 400 мл (ЗБР — '
забуференный боратом физиологический раствор: 0,01 М борат, ,
0,15М NaCl, pH8,1), содержащего 10 мкг/мл NaBH4.	;

Гель отмывают 30 мин в этом растворе, а затем подготавли- <
вают для контакта с радиоактивным меченым антигеном. Для ]
этого пластинку с гелем прикладывают к другой стеклянной плас- j
тинке, поместив между ними в качестве прокладки силиконовый 1
шланг с внутренним диаметром 0,4 мм и внешним диаметром
2,4 мм так, чтобы получилась камера объемом около 30—35 мл.
Приготовление камеры описано выше. Камеру устанавливают
вертикально, медленно заполняют ЗБР, содержащим 10 мкКи ио-
дированного антигена (удельная активность 0,5—2 мкКи/мкг),
и инкубируют 16—18 ч при комнатной температуре. Затем избы-
ток радиоактивного материала выливают, вторую пластинку
удаляют, гель промывают в течение 2 ч ЗБР, меняя его трижды,
высушивают на воздухе и радиоавтографируют.

При работе с антигенами, меченными 13Ч, гели экспонируют
на рентгеновской пленке (Kodak RP Royal X-Omat RP/R-54 или
Agfa-Gevaert Osray M3-DW) в течение 12—72 ч. Использование
антигенов, меченных 1251, менее удобно, так как время их экспо-
зиции может длиться от 2 до 15 дней.

Ж. Окрашивание белков

После фокусирования иммуноглобулины обычно выявляют
путем окрашивания кумасси ярко-синим или бромфеноловым
синим.

Перед окрашиванием кумасси ярко-синим пластинки в тече-
ние нескольких часов отмывают от амфолинов 10%-ным раство-
ром трихлоруксусной кислоты, затем их погружают на 1 ч в
0,25%-ный раствор красителя в смеси метанол — дистиллирован-
ная вода — уксусная кислота (5:5: 1); обесцвечивание произво-
дят в растворе, содержащем 7,5% уксусной кислоты и 5% мета-
нола (Awdeh et al., 1968).

Перед окрашиванием бромфеноловым синим пластинки сна-
чала 30 мин отмывают от амфолинов и мочевины в 400 мл обес-
цвечивающего раствора (30% этанола, 5% уксусной кислоты и
65% дистиллированной воды), затем в течение 1 ч окрашивают в
0,1%-ном растворе бромфенолового синего (в смеси 40% этано-
ла, 5% уксусной кислоты и 55% дистиллированной воды) и от-
мывают в обесцвечивающем растворе.

3. Приготовление полисахаридного антигена, меченного 1317

Для того чтобы пометить групповые полисахаридные антиге-
ны стрептококка изотопом 1311, их сначала активируют бромциа-
ном, а затем к ним ковалентно присоединяют тирамин, который
и служит акцептором изотопа.
Методика

Растворяют 10 мг (около 10~6 моль) очищенных групповых
полисахаридов (Cramer, Braun, 1974) в дистиллированной воде;
pH доводят до 10,5—11 с помощью 0,01 н. NaOH, а затем при
постоянном перемешивании добавляют 2 мг бромциана (Fluka,
Buchs, Швейцария), продолжая поддерживать тот же pH добав-
лением 0,01 н. NaOH, Через 6 мин pH снижают до 8,5, добавляя
2М NaHCOg. Тирамин (13,7 мг, 10~4 моль; Fluka Buchs, Швей-
цария) растворяют в 1 мл 1 М ЫаНСОз и добавляют к активиро-
ванному полисахариду; смесь перемешивают при комнатной тем-
пературе в течение 4—5 ч. Затем смесь оставляют на ночь для
диализа против дистиллированной воды при 4°С. До и после ти-
рамйнирования необходимо определить ультрафиолетовый
спектр (220—350 нм) полисахарида.

Иодирование проводят по методике с хлорамином-Т. Готовят
свежие растворы хлорамина-Т (2 мг/мл) и Na2S20s (2,5 мг/мл).
В трехмиллилитровую пластиковую пробирку наливают 0,1 мл
0,3 М раствора натрий-фосфатного буфера с pH 7,5, затем добав-
ляют 0,5 мл раствора (2 мг/мл) тираминированного полисахари-
да и 0,1 мл раствора хлорамина-Т. Через 1 мин вносят 1 мКи нат-
риевой соли 13Ч без носителя (Radiochemical Centre, Amersham,
Англия), хорошо перемешивают и оставляют на 1 мин. Реакцию
останавливают, добавляя раствор NajSsOs. Для удаления несвя-
завшегося иода (см. гл. 33) реакционную смесь помещают в не-
большой диализный мешок или фракционируют на колонке
(0,5X2 см) сефадекса G-25, отбирают пробы и определяют удель-
ную радиоактивность полисахарида. Приготовленный таким спо-
собом реагент готов к употреблению.

И. Изоэлектрофокусирование в тонкослойном геле сефадекса

Преимущество этого метода в том, что он позволяет анализи-
ровать также IgM (Ziegler, Kohler, 1976; A. Ziegler, W. F. Riesen,
неопубликованные данные).

В течение ночи при комнатной температуре перемешивают 15 г
сефадекса G-75, сверхтонкого (Pharmacia, Упсала, Швеция), с
280 мл раствора, содержащего 4% акриламида, 0,13% N.N'-ме-
тиленбцсакриламида и 2,8% амфолинов — носителей соответст-
вующего диапазона pH. На желатинизированные стеклянные
пластинки Илфорд с помощью тонкослойного распределителя
(Desaga, Гейдельберг, ФРГ) наносят слой сефадекса толщиной
мм. Пластинки оставляют при комнатной температуре на
30 мин. Нанесение образца и фокусирование проводят как описа-
но выше, за исключением того, что электроды накладываются
на слой сефадекса. Напряжение медленно повышают до 150 В,,
проводят фокусирование при этом напряжении в течение 15 ч, а
затем повышают напряжение до 500 В и фокусируют еще 3 ч;
мощность никогда не должна превышать 1 Вт.

После того как фокусирование закончено, измеряют градиент
pH, как указано в разд. IV, Д, затем опрыскивают гель полимери-
зующим раствором (1 М фосфат, pH которого доведен трисом до
6,15, 1% ТЕМЭД и 10% персульфата аммония) и инкубируют
пластинку в атмосфере азота. Если полимеризующий раствор
приготовлен не ранее чем за неделю до опыта, полимеризация за-
канчивается через 2 мин. Когда требуются более мягкие условия
полимеризации, можно использовать Другой раствор — 1,6 мг
рибофлавина и 0,4 мл ТЕМЭД в 100 мл дистиллированной воды
или буфера. Пластинку выдерживают 30 мин в атмосфере азота
под ультрафиолетовой лампой.

Окрашивание белков и идентификацию специфических анти-
тел с помощью полисахаридного антигена, меченного 1311, прово-
дят как описано выше.

При изоэлектрофокусировании 19S-IgM слой сефадекса дол-
жен содержать 8М мочевину и 0,5% нонидета Р-40. Так как им-
муноглобулины в этих условиях денатурируются, идентификацию
меченым антигеном провести невозможно.

~V. ПРИМЕНЕНИЕ, ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ

И ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ ИЭФ

Аналитическое ИЭФ широко применяется для определения
небольших различий в изоэлектрических точках разнообразных
молекул, в частности макромолекул (Righetti, Drysdale, 1974).
Так как полиакриламидный гель не может быть использован для
разделения очень крупных белков (например, IgM), его заменя-
ют тонкослойным гелем сефадекса (Ziegler, Kohler, 1976). Для
идентификации фокусированных белков применяют различные
методы (Righetti, Drysdale, 1974); например, ферменты можно
определять, накладывая на гель бумагу, пропитанную субстра-
том (Delincee, Radola, 1971), а специфические антитела — иден-
тифицировать в реакции гемолиза (Philips, Dresser, 1973) или
методом радиоавтографии комплексов антител с меченым анти-
геном (Williamson et al., 1973; Williamson, 1971; Kreth, William-
son, 1973; Pink, Askonas, 1974; Braun et al., 1973; Cramer, Braun,
1974; Wabl, Du Pasquier, 1976; Riesen et al., 1976).

Разрешающая способность и чувствительность метода на-
столько высоки, что с его помощью можно определять в иммун-
ной сыворотке или в культуральной жидкости микрограммы ан-
тител, синтезируемых отдельными лимфоцитарными клонами,
состоящими всего лишь из нескольких сот клеток (Braun et al.,
1976).


Рис. 2. Радиоавтографы олигоклональных и поликлональных антител, синте-
зированных in vivo и in vitro. ИЭФ проведено в 5%-ном полиакриламидном
геле. ИЭФ-фореграммы проявлены групповым полисахаридом стрептококка,
меченным 1251. Показан градиент pH.

А. Две мышиные антисыворотки к полисахаридам стрептококка группы А. На
пластинку наносили по 15 мкл каждой антисыворотки. Показана динамика
иммунного ответа после введений антигена (указаны стрелками). Кровь брали
еженедельно после начала иммунизации. Представлен гетерогенный ответ мы-
ши линии В9/17 и олигоклональный — мыши В9/13. (Cramer, Braun, 1975).
Б. 5 мкл антисыворотки (кролик К27-293) к полисахариду стрептококка груп-
пы A-вариант и смесь надосадочных жидкостей из микрокультур лимфоцитов
кролика К27-293, стимулированных гомологичной стрептококковой вакциной
(А—С). Звездочкой отмечено положение доминирующего клоиотипа (14,5 мг
антител в 1 мл сыворотки) (Braun et al., 1976).

Метод ИЭФ имеет большое значение при изучении гетероген-
ности специфических антител (Williamson, 1971; Kreth, William-
son, 1973; Cramer, Braun, 1974; Braun, Jaton, 1974). Его разреша-
ющая способность близка к разрешающей способности антиидио-
типических антисывороток. В ряде хорошо документированных
5—233
Ри
Рис. 3. ИЭФ в геле сефадекса, содержащего 2,8% амфолинов с указанным
градиентом pH.

А. На верхнюю часть геля наносили 200 мкг белка Бенс-Джонса Whi, на сред-
нюю — 100 мкг миоглобина кашалота, на нижнюю — 50 мкг вируса кустистой
карликовости томатов. Окрашивание бромфеноловым синим (Ziegler, Kohler,
1976).

случаев идиотипической идентичности клонотипов ИЭФ-форе-
граммы частично совпадали (Eichmann, 1972; Braun, Kelus,
1973). Так как идиотипирование и ИЭФ характеризуют различ-
ные свойства антител, возможны ситуации, где одним методом
удалось бы получить больше сведений, чем другим; однако такие
ситуации еще не выявлены.

(Рис. 2, продолжение)

В (стр. 130). ИЭФ-фореграммы образцов (по 30 мкл) сыворотки больных с
различными острыми стрептококковыми инфекциями, проявленные иодирован-
ным полисахаридом стрептококка группы А, за исключением образца 15', элек-
трофореграмму которого проявляли иодированным полисахаридом вариан-
та А (виден доминирующий перекрестно-реагирующий клонотип). Представ-
лен также образец нормальной человеческой сыворотки (С), содержащий одни
клонотип (Riesen et al., 1976.)
(Рис. 3, продолжение).

Б. Радиоавтографы двух кроличьих антисывороток к стрептококковому поли-
сахариду группы А (вариант), проявленные иодированным гомологичным ан-
тигеном (Ziegler, Kohler, 1976).

Наш собственный опыт позволяет утверждать, что аналити-
ческое ИЭФ служит быстрым и надежным методом исследования
генетического контроля иммунного ответа на уровне отдельных
клонов. Этот метод превосходит идиотипический анализ при изу-
чении экспрессии нескольких клонотипов в процессе иммунного
ответа, так как на одной пластинке можно идентифицировать до
5—7 клонотипов.

На рис. 2, 3 и 4 представлены примеры ИЭФ различных об-
разцов в разных условиях. Из рис. 4 видно, что при прямом кон-
такте геля с раствором, содержащим меченый антиген (William-
son, 1971; Cramer, Braun, 1974; Askonas et al., 1970), получаются
менее четкие радиоавтографы, чем после предварительной поли-
меризации фокусированных антител глутаровым альдегидом
(Keck et al., 1973; Cramer et al., 1976).
Рис. 4. Сравнение ИЭФ-фореграмм кроличьих гипериммуиных сывороток
№ 1—11 к полисахариду стрептококка группы А (вариант).

А. Проявление гомологичным меченым антигеном без предварительной обра-
ботки глутаровым альдегидом (Williamson, 1971; Cramer, Braun, 1974; Askonas
et al., 1970).

Б. Проявление после обработки глутаровым альдегидом по методу Keck et al.
(1973).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Askonas В. A., Williamson A. R., Wright В. Е. G. (1970). Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 67, 1398.

Awdeh Z. L., Williamson A. R., Askonas B. A. (1968). Nature (London), 219,
66.

Braun D. G., Jaton J.-C. (1974). Curr. Top. Microbiol. Immunol., 66, 29.

Braun D. G., Kei us A. S. (1973). J. Exp. Med., 138, 1248.

Braun D. G., Kjems E., Cramer M. (1973). J. Exp. Med., 138, 645.

Braun D. G., Quintans J., Luzzati A. L., Lefkovits I., Read S. E. (1976). J.

Exp. Med., 143, 360.

Cramer M., Braun D. G. (1974). J. Exp. Med., 139, 1513.

Cramer M., Braun D. G. (1975). Scand. J. Immunol., 4, 63.

Cramer M., Schwartz M., Mazes E., Sela M. (1976). Eur. J. Immunol., 6, 618.

Delincee H., Radiola B. J. (1971). Protides Biol. Fluids, Proc. Colloq., 18,
493.

Eichmann K. (1972). Eur. J. Immunol., 2, 301.
Flatmark Т., Vesterberg О. (1966). Acta Chem. Scand., 20, 1497.

Haglund H. (1967). Sci. Tools, 14, 18.

Keck K-, Grossberg A. L., Pressman D. (1973). Eur. J. Immunol., 3, 99.

Kreth H. W., Williamson A. R. (1973). Eur. J. Immunol., 3, 141.

Philipps J. M., Dresser D. W. (1973). Eur. J. Immunol., 3, 524.

Pink J. R. L., Askonas B. A. (1974). Eur. J. Immunol., 4, 426.

Riesen W. F., Skvaril F., Braun D. G. (1976). Scand. J. Immunol., 5, 383.

Righetti P. G., Drysdale J. W. (1974). J. Chromatogr., 98, 271.

Svensson H. (1961). Acta Chem. Scand., 15, 325.

Svensson. H. (1962a). Acta Chem. Scand., 16, 456.

Svensson H. (1962b). Arch. Biochem. Biophys., Suppl., 1, 132.

Vesterberg 0. (1967). Acta Chem. Scand., 21, 206.

Vesterberg 0., Svensson H. (1966). Acta Chem. Scand., 20, 820.

Wabl M., Du Pasquier L. (1976). Nature (London), 264, 642.

Williamson A. R. (1971). Eur. J. Immunol., 1, 390.

Williamson A. R., Salomon M. R., Kreth H. R. (1973). Ann. N. Y. Acad. Sci.
209, 210.

Ziegler A., Kohler G. (1976). FEBS Lett., 64, 48.
Глава 6

ПРЕПАРАТИВНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С ПОМОЩЬЮ
ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЯ

В ГОРИЗОНТАЛЬНОМ СЛОЕ СЕФАДЕКСА G-75

В. Шальх, Д. Браун

I.	ВВЕДЕНИЕ

Гомогенные антитела нужны для определения аминокислот-
ных последовательностей и трехмерной структуры иммуноглобу-
линов, для получения антиидиотипических сывороток и вообще
для работ, направленных на выяснение структурно-функцио-
нальных взаимоотношений в иммунной системе.

Источником гомогенных антител чаще всего служат миеломы
(Eisen et al., 1968). При аналитическом изоэлектрофокусирова-
нии (ИЭФ) такие антитела обычно дают от трех до пяти полос
(Askonas et al., 1970). Имеются данные, что эта микрогетероген-
ность — следствие тех небольших модификаций, которые антите-
ла претерпевают в момент секреции или (и) после выхода из ан-
тителообразующих клеток (Awdeh et al., 1970). Поэтому даже
при работе с миеломными белками необходима дополнительная
очистка антител. В этой главе будет рассмотрено применение
препаративного ИЭФ для выделения кроличьего моноклонально-
го IgG из материала поликлонального происхождения.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Основная трудность в препаративном ИЭФ состоит в том,
чтобы предотвратить конвекцию, которая ведет к смешиванию
разделенных фракций.

В классическом методе препаративного ИЭФ (Vesterberg,
Svensson, 1966) используются вертикальные колонки с градиен-
том сахарозы в качестве стабилизирующей среды. Однако пре-
ципитация белков при фокусировании и частичное перемешива-
ние сфокусированных белков на выходе из колонки в известной
мере снижают эффект разделения. Тем не менее можно улучшить
разделение (Hoffman et al., 1972; Schlach, Bode, 1975), в частнос-
ти проводя ИЭФ в горизонтальном, а не вертикальном слое.
При этом белки, иногда выпадающие в осадок при фокусирова-
нии, не могут влиять на соседние зоны. При такой постановке
опыта разделяющая среда доступна на всех стадиях эксперимен-
та, что позволяет наносить образец на любой участок геля и ос-
танавливать диффузию сразу после окончания фокусирования,
вырезая определенные участки.

Было предложено два метода горизонтального препаративно-
го ИЭФ. Вэлмет (Valmet, 1969) описал метод электрофореза, в
котором происходила самостабилизация конвекции; при этом ис-
пользовался довольно сложный прибор и фокусирование проис-
ходило в среде без сахарозы или ее эквивалента. Стабилизирую-
щей средой служили сами фокусируемые белки.

Другой метод предложил Радола (Radola, 1974). В нем при-
меняется очень простой прибор, а для стабилизации среды ис-
пользуются гранулированные гели, например сефадекс G-75,
очищенный от заряженных примесей, которые могут помешать
образованию градиента pH. Пластинку для ИЭФ приготовляют
из тонкого слоя набухшего сефадекса, испаряя воду до тех пор,
пока гель не приобретет нужную консистенцию.

Образец в зависимости от его объема можно либо заранее
распределить по всему объему геля, либо внести в виде узкой зо-
ны на любом его участке. Сразу после окончания фокусирования
в гель для ограничения диффузии вдавливают разделяющую
решетку и определяют градиент pH. Затем извлекают кусочки
геля с соответствующими фракциями и небольшими количества-
ми подходящего буфера элюируют содержащиеся в них белки.
Чистоту каждой фракции исследуют с помощью аналитического

Рис. 1. Комплект приспособлений для ИЭФ: лоток
(а) с аппликатором (б) и разделяющая решетка (в).
ИЭФ и одинаковые фракции объединяют. Белок отделяют от
амфолитов-носителей гель-фильтрацией через сефадекс G-50.

В опытах по препаративному ИЭФ, описанных в настоящем
разделе, использовали электрофоретическое оборудование Муль-
тифор фирмы LKB Producter АВ (Стокгольм, Швеция) и набор
амфолитов-носителей «ЛКБ-амфолины» для электрофокусирова-
ния в гранулированных гелях. С помощью этого метода нам уда-
лось выделить отдельные гомогенные в ИЭФ фракции кроличье-
го IgG, которые при других способах разделения дают гетероген-
ный препарат.

III.	МАТЕРИАЛЫ И ПРИБОРЫ

Прибор Мультифор (LKB2117)

Комплект приспособлений для электрофокусирования в гра-
нулированных гелях (LKB 2117-501), состоящий из лотка
24,2Х 11,0x0,6 см (рис. 1,-а), аппликатора для внесения
образцов (рис. 1,6) и разделяющей решетки (рис. 1,в)

Полоски фильтровальной бумаги для контакта с электродами,
10,5X0,65 см

Фильтровальная бумага Whatman № 3

Источник тока (0—1000 В, 0—200 мА)

Ультродекс — специально обработанный сефадекс G-75>
сверхтонкий (фирмы LKB)

Небольшой вентилятор	;

40%-ный раствор амфолинов нужного диапазона pH

30 шприцев разового пользования

pH-метр с поверхностным электродом (Ingold, Цюрих, Швей-
цария)

1 М ортофосфорная кислота (для анода)

1 М NaOH (для катода)

Трижды дистиллированная вода, используется для приготов-
ления всех растворов

IV. МЕТОДИКА

Препаративное ИЭФ осуществляют по инструкции фир-
мы LKB (указание 198) с незначительными изменениями.

А.	Образцы

Раствор антител или антисыворотку диализуют против 1 %-не-
го раствора глицина. Максимальный объем наносимого образ-
ца — 95 мл.
Б. Приготовление геля

На оба узких края лотка (рис. 1,о) в три слоя накладывают
смоченные в 2%-ном растворе амфолинов полоски фильтроваль-
ной бумаги для контакта с электродами. Если объем фракциони-
руемого образца превышает 3 мл, то его смешивают в 150-мил-
лилитровом стакане с 5 мл 40%-ного раствора амфолинов и
добавляют до 100 мл трижды дистиллированную воду; затем мед-
ленно, при легком помешивании, вносят 4 мг порошка ультродек-
са. Получив гомогенную суспензию, взвешивают стакан и акку-
ратно переносят суспензию в лоток; после этого, повторно взве-
сив стакан, вычисляют точный вес перенесенного геля. Для ис-
парения влаги над лотком устанавливают вентилятор; при этом
поток воздуха не должен создавать волн на поверхности геля.
Количество испарившейся воды определяют, время от времени
взвешивая поднос. Подлежащий удалению объем воды зависит
•от партии ультрадекса и указан на упаковке. Обычно эта величи-
на составляет 25—35% первоначального веса суспензии. Для ис-
парения обычно требуется 100—150 мин; после этого гель готов
для ИЭФ. Если объем образца 3 мл или меньше, его можно вно-
сить на узком участке геля с помощью аппликатора (рис. 1,6).
В этом случае концентрацию амфолинов в образце доводят до
2% по объему; в приготовленном и подсушенном геле в выбран-
ном месте вдавливают аппликатор и внутри аппликатора смеши-
вают образец с суспензией геля. После этого аппликатор удаля-
ют и оставляют гель для гидростатического уравновешивания
на 2—3 мин.

В.	Фокусирование

Лоток помещают на охлаждаемую (5°С) плиту Мультифор,
на которую нанесен слой 0,1%-ного водного раствора додецил-
сульфата натрия. Полоски фильтровальной бумаги для контак-
тов с электродами, ранее погруженные в гель, на анодной сторо-
не опускают в 1 М фосфорную кислоту, а на катодной стороне —
в IM NaOH. Прибор присоединяют к источнику тока и устанав-
ливают напряжение и силу тока так, чтобы мощность составля-
ла 7—8 Вт.

Для разделения IgG при таком режиме требуется около 24 ч.

Г. Измерение pH

Сразу после выключения прибора разделяющую решетку
вдавливают в гель (рис. 1, в), разрезая его на 30 полосок. В каж-
дой из них измеряют pH с помощью поверхностного стеклянного
электрода (см. гл. 5). Если нет таких электродов нужного раз-
мера, можно измерить pH с достаточной точностью, суспендиро-
вав каждую фракцию в дистиллированной воде.

Д. Элюирование фракций

Полоску геля из каждого отсека решетки переносят шпателем
в маленькую колонку (5X1 см). Такие колонки можно легко
сделать из 5- или 10-миллилитровых шприцев разового пользо-
вания, в канюлю которых вкладывают стеклянную вату. Гель сус-
пендируют в 2,5 мл подходящего буфера (обычно ФБР) или в
дистиллированной воде, если еще не измеряли pH. Когда частич-
ки геля осядут и весь раствор войдет в гель, для окончательной
элюции добавляют еще 2 мл буфера. Элюаты собирают в ма-
ленькие пробирки.

Е. Анализ фракций

В инструкции фирмы LKB для предварительной оценки раз-
деления рекомендуется делать отпечатки с поверхности геля. Од-
нако при этом происходит значительная потеря материала, поэто-
му мы не пользовались этим методом, а сразу элюировали фрак-
ции, уравнивали объемы и измеряли оптическую плотность при
280 нм. Подробную картину разделения мы получали, исследуя
каждую фракцию в аналитическом ИЭФ. Этим же методом мож-
но было более точно определить одинаковые фракции, подлежа-
щие объединению. Определение белка по методу Лоури и сотр.
(Lowry et al., 1951) на этом этапе, разумеется, невозможно из-за
присутствия амфолитов.

Ж- Отделение белка от амфолитов

После объединения фракции концентрируют до нужного объема
ультрафильтрацией или лиофилизацией и проводят гель-фильт-
рацию на сефадексе G-50 (мелкозернистом). На колонке длиной
20 см и диаметром 2,5 см можно обессолить образец объемом
до 6 мл.

V.	ПРИМЕНЕНИЕ

На рис. 2 показан радиоавтограф аналитических ИЭФ-форе-
грамм последовательных фракций, полученных в препаративном
ИЭФ. Аналитические ИЭФ-фореграммы были проявлены иодиро-
ванным (1311) антигеном [полисахарид стрептококка группы А
(вариант)]. Препаративному ИЭФ были подвергнуты 150 мг IgG,
выделенного из антисыворотки кролика препаративным электро-
форезом в блоке агарозы (Braun, Krause, 1968; см. также гл. 2).
n 141516171819 20 2122 232425262728

Номера фракций

Сыворотка

116-700

Рис. 2. Пример радиоавтографа аналитических ИЭФ-фореграмм (подробности
см. в тексте, стр. 139). Время фокусирования 20 мин.
Общее количество белка, которое можно ввести в гель для пре-
паративного ИЭФ, зависит от гетерогенности данного образца и
от диапазона величин pH, необходимого для разделения. Макси-
мальное количество белка, которое может сфокусироваться в от-
дельной зоне, варьирует в пределах от 5 мг при фореграмме, рас-
тянутой в широком диапазоне градиента pH (например, 3,5—10),
до 40—50 мг при фокусировании в узком диапазоне pH, когда
одна фракция содержит 60—70% исходного материала.

VI.	ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА

Количество цельной сыворотки, которое удается разделить в
препаративном ИЭФ, весьма незначительно из-за избытка аль-
бумина. Не следует наносить более 10—20 мг сывороточных бел-
ков при фокусировании в широком диапазоне pH и 80—100 мг —
в узком диапазоне. Поэтому лучше предварительно очистить ан-
титела, например, путем осаждения сульфатом аммония, препа-
ративным электрофорезом в блоке агарозы, аффинной хромато-
графией или комбинацией этих методов (см. гл. 2).

VII.	СТЕПЕНЬ ОЧИСТКИ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ

Как видно из рис. 2, препаративное ИЭФ — это метод, позво-
ляющий эффективно разделять очень близкие клонотипы анти-
тел, получая от трех до пяти полос в тех случаях, когда другие
методы выявляют лишь одну полосу. Таким образом, метод по-
зволяет изучать молекулярные основы гетерогенности гомологич-
ных антител. Кроме того, с помощью препаративного ИЭФ мож-
но избирательно сконцентрировать белки одного клонотипа, на-
ходящиеся в иммунной сыворотке в очень низкой концентрации
и не определяемые обычными методами.

VIII.	ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ

Несмотря на хорошую воспроизводимость метода от опыта к
опыту, фракции, полученные в разных опытах, можно объединять
только после исследования в аналитическом ИЭФ.

В. Шальх выражает благодарность Европейской организа-
ции по молекулярной биологии (ЕМВО) за продолжительную
финансовую поддержку.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Askonas В. A., Williamson A. R., Wright В. Е. G. (1970). Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 67, 1398.

Awden Z. L., Williamson A. R., Askonas B. A. (1970). Biochem. J., 116, 241.

Braun D. G., Krause R. M. (1968). J. Exp. Med., 128, 969.

Eisen H. N., Simms E. S., Potter M. (1968). Biochemistry, 7, 4026.

Hoffman D. R., Grossberg A. L., Pressman D. (1972). J. Immunol., 108, 18.

Lowry О. H., Rosebrough N. J., Farr A. L., Randall R. J. (1951). J. Biol. Chem

193, 265.

Radola B. J. (1974). Biochim. Biophys. Acta, 386, 181.

Schalch W., Bode W. (1975). Biochim. Biophys. Acta, 405, 292.

Valmet E. (1969). Sci. Tools, 16, 8.

Vesterberg 0., Svensson H. (1966). Acta Chem. Scand., 20, 820.
Глава 7

ИЗОТАХОФОРЕЗ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

А. Циглер, Ж- Кёлер

I.	ВВЕДЕНИЕ

Иммуноглобулины одного класса (например, IgG) представ-
ляют собой группу очень сходных молекул, и если нет возмож-
ности использовать антигенные и антигенсвязывающие свойства,
то единственным различительным признаком остается изоэлект-
рическая точка. Начиная с первых работ, показавших, что для
различения индивидуальных IgG может быть использовано изо-
электрофокусирование (ИЭФ) в полиакриламидном геле (Awdeh
et al., 1968), определение изоэлектрических точек нашло широ-
кое применение.

Один из недостатков полиакриламидного геля как носителя
при ИЭФ — невозможность исследования очень больших моле-
кул — в последнее время был преодолен путем использования в
качестве антиконвекциониой среды горизонтального слоя сефа-
декса (Ziegler Kohler, 1976а; см. также гл. 5). Другой, более
серьезный, недостаток ИЭФ состоит в том, что многие белкн при
фокусировании имеют тенденцию выпадать в осадок из-за низ-
кой ионной силы среды.

Подобного рода затруднения можно, по крайней мере в изу-
ченных нами случаях, преодолеть, используя изотахофорез
(ИТФ) — один из методов электрофореза, основанный на прин-
ципе «регулирующей функции» Кольрауша (Kohlrausch, 1897).
При ИТФ ионы разделяемого образца располагаются в порядке
уменьшающейся электрофоретической подвижности между дву-
мя соответственно подобранными видами ионов, один из которых
(«ведущие ионы») имеет более высокую подвижность, чем дру-
гой («замыкающие ионы»). Так как принцип регулирующей
функции действителен как для больших, так и для малых ионов,
ИТФ при выполнении некоторых условий позволяет анализиро-
вать белки без особых затруднений. Эти условия следующие:

1)	среда, в которой проводится ИТФ, - не должна создавать
стерических ограничений;

2)	следует выбирать ведущие и замыкающие ионы с такой
электрофоретической подвижностью, чтобы подвижность разде-
ляемых молекул была промежуточной;

3)	необходимо тщательно подбирать тип и количество «ио-
нов-прокладок» (это добавляемые к образцу ионы, которые бла-
годаря своей промежуточной электрофоретической подвижности
располагаются между разделяемыми ионами образца, увеличивая
тем самым эффект разделения).

Соблюдение этих трех условий позволяет реализовать два
наиболее ценных преимущества аналитического изотахофореза
(Ornstein, 1964; Haglund, 1970; Routs, 1971; Jovin, 1973): во-пер-
вых, можно проводить разделение в широком диапазоне величии
ионной силы; во-вторых, ионы разделяемого образца несут сум-
марный заряд, не равный нулю, поэтому преципитация белков в
изоэлектрической точке или вблизи нее исключается.

Мы опишем здесь применение ИТФ в пластинках полиакрил-
амидного геля для анализа меченых (радиоактивных) мышиных
IgG, секретируемых в культуре различными миеломами (Ziegler,
Kohler, 1976b).

II.	МЕТОДИКА

Обычно используют прибор для электрофореза в пластинках
геля, предложенный Стадиером (Studier, 1973), однако мы реко-
мендуем гели толщиной 0,1 см. Необходимы следующие исход-
ные растворы:

Раствор А: 1 М раствор фосфорной кислоты; pH доводят до
6,5 трис-(гидроксиметил)амииометаном (трис). ,
Раствор Б: акриламид (32%) и М,1Ч'-диаллилтартардиамид
(ДАТД) (5,7%) в дистиллированной воде (оба
реактива от фирмы Serva, Гейдельберг, ФРГ).

Раствор В; 1^,Ы,Ы',Ы'-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЭД).

Раствор Г: свежеприготовленный раствор персульфата ам-
мония (15 мг/мл).

Ведущим буфером служит 0,05 М раствор фосфорной кислоты,
pH которого доводят трисом до 6,5, а замыкающим буфером —
0,3М 6-аминокапроновая кислота с pH 9,1 (доводится трисом).
В качестве ионов-прокладок применяют амфолиты-носители для
диапазона pH 3,5—10 (амфолины LKB Produkter АВ, Стокгольм,
Швеция). Свидетелем служит бромфеноловый синий (БФС).

Две стеклянные пластинки и три прокладки скрепляют вмес-
те, как описано у Стадиера (Studier, 1973), и заливают по краям
2%-ным раствором агарозы. Смешивают 2 мл раствора А, 5 мл
раствора Б и 31 мл воды, дегазируют 5 мии с помощью водоструй-
ного насоса; затем добавляют 0,03 мл раствора Г, 2 мл раство-
ра Д, смесь заливают между стеклянными пластинками и встав-
: ляют «гребешок» — шаблон для образования лунок (10—25 лу-
 иок, подробности описаны в гл. 4).

Когда акриламид заполимеризуется, из геля извлекают «гре-
бешок» и нижнюю прокладку. Камеру с гелем вставляют в при-
бор для электрофореза, нижний резервуар прибора заполняют
ведущим буфером и удаляют пузырьки воздуха с нижнего края
геля. В верхний резервуар прибора заливают замыкающий буфер
так, чтобы все лунки в геле были заполнены жидкостью. (Буфер
из верхнего резервуара не может проникнуть между задней стен-
кой камеры с гелем и стенкой прибора благодаря слою вазелина

Рис. 1. Радиоавтографы изотахофореграмм шести образцов надосадочной
культуральной жидкости, содержащих иммуноглобулин G, меченный 14С-лизи-
иом (Ziegler, Kohler, 1976b).

Электрофорез проводили в присутствии амфолитов-носителей в качестве ионов-
прокладок в пластинке полиакриламидного геля, полимеризованного с ДАТД.
Образцы готовили так, как описано в разд. II. Каждый образец содержал
20 мкл амфолинов для pH 3,5—10. Электрофорез продолжался 18 ч; катод
вверху, а. Перевиваемая миелома P3-X63 Ag8, секретирующая IgG, который
содержит у] и х цепи. б. Sp2/HL (у2ь; х). [Sp — это клонированные сублинии
гибридов миеломных клеток с клетками селезенки (Kohler, Milstein, 1976); если
тяжелые и легкие цепи секретируемых ими иммуноглобулинов контролируются
генами селезеночной клетки, их обозначают Н и L, а если генами миеломы, то
G и К (дли у- и х-цепей).] Во всех сублиниях родительскими были клетки мие-
ломы P3-X63 Ag8. в. Sp2/HK (у2ь; х). г. Sp3/HK (у,; х). д. Sp3/HLK (уг, х).
е. PIBul (перевиваемая миелома у2а; х секретирует также свободные легкие
цепи).
Мест#

—нанесения
образу



«ММ» «*ш

,м«ад»лда4::

Рис. 2. Радиоавтографы изотахофореграмм образцов надосадочной культу-
ральной жидкости, содержащих иммуноглобулин G, меченный 14С-лизином.

К каждому образцу добавляли по 20 мкл амфолинов для pH 3,5—10, сахаро-
зу и БФС, как описано в разд. II; ИТФ проводили в пластинке полиакрил-
амидного геля, полимеризованного с ДАТД, в условиях, указанных в подпи-
си к рис. 1. Стрелками отмечены Места нанесения образцов, положение аль-
бумина и фронт свидетеля БФС. а. 25 мкл W6/32+25 мкл P3-X63 Ag8 (смесь
лошадиной сыворотки и сыворотки плода коровы). [W6 — это клонированные
линии, секретирующие антитела к поверхностным клеточным антигенам чело-
века; они происходят от гибридов миеломных клеток (линии P3-NSI/l-Ag4-l)
с клетками селезенки и подробно описаны в статье Barnstable et al., 1978).]
б. 50 мкл W6/32 (надосадочиая жидкость содержит 10% сыворотки плода
коровы), в. 50 мкл P3-X63 Ag8 (надосадочиая жидкость содержит 10% ло-
шадиной сыворотки), г. 50 мкл W6/34 (надосадочиая жидкость содержит 10%
сыворотки плода коровы), д. 25 мкл W6/34+25 мкл P3-X63 Ag8 (смесь лоша-
диной сыворотки и сыворотки плода коровы).

или силиконовой смазки; эту смазку закладывают заранее в тот
момент, когда в лежащий горизонтально прибор вставляют ка-
меру с гелем.)

Исследуемые образцы радиоактивно меченной надосадочной
жидкости каждой из культур (в наших опытах обычно 50 мкл)
смешивают со 100 мкл водного раствора, содержащего 25% са-
харозы и 0,005% БФС. Количество амфолитов-носителей, добав-
ляемых в каждой пробе, должно быть одинаковым в одном опы-
те, но может варьировать от опыта к опыту.

Пробы вносят в лунки гамильтоновским шприцем. Анодный и
катодный электроды соединяют с резервуарами, содержащими
ведущий и замыкающий буферы соответственно. Электрофорез
проводят при комнатной температуре и постоянном . токе 5 мА;
продолжительность зависит от количества добавленных амфо-
литов-носителей. Если в каждую лунку вносят не более 50 мкл
амфолинов-носителей, то электрофорез обычно продолжается
12—24 ч.

После электрофореза гель осторожно извлекают и в течение
1,5 ч окрашивают в 0,2% БФС в смеси этанол — дистиллирован-
ная вода — уксусная кислота (100:85: 15 по объему), затем 6ч
обесцвечивают в смеси тех же веществ (6:13:1 по объему). Ок-
рашенный гель помещают на влажный целлофан и покрывают
несколько большим по размеру листом влажной бумаги Whatman
ЗММ; затем, перевернув целлофаном вверх и прижав тяжелой
рамкой, гель сушат на подогреваемой плите под вакуумом. Мы с
успехом использовали коммерческое приспособление для сушки
пластинок геля (модель 224, Bio-Rad Laboratories, Ричмонд, Ка-
лифорния). Затем гель радиоавтографируют (можно использо-
вать пленку Kodak RP Royal X-Omat).

Два типичных примера изотахофореза иммуноглобулинов, ме-
ченных 14С-лизином, представлены на рис. 1 и 2; иммуноглобули-
ны, радиоавтографы которых обозначены буквами б и в на рис. 1
и б и г на рис. 2, не удается проанализировать методом ИЭФ,
так как при низкой ионной силе они выпадают в осадок.

III.	ОБСУЖДЕНИЕ

Метод аналитического ИТФ в пластинках полиакриламидно-
го геля можно использовать при изучении даже таких белков, ко-
торые выпадают в осадок в растворах с низкой ионной силой, как
это происходит, например, при ИЭФ (Ziegler, Kohler, 1976b).
Метод позволяет дифференцировать молекулы IgG, различаю-
щиеся только вариабельными частями легких цепей (сравните
радиоавтографы б и в на рис. 1).

Этим методом можно также с успехом изучать молекулы им-
муноглобулинов других классов, обладающих сходными свойст-
вами (Barnstable et al., 1978; A. Ziegler, неопубликованные дан-
ные). Однако в ИТФ сравнительный анализ иммуноглобулинов,
содержащихся в разных сыворотках, имеет одно существенное
ограничение. Дело в том, что любой вид отрицательно заряжен-
ных ионов, содержащихся в исследуемом образце, будет усили-
вать разделяющее действие амфолитов-носителей. Поскольку
каждая из сравниваемых сывороток всегда имеет свой собствен-
ный набор разновидностей отрицательных ионов, сопоставление
электрофореграмм становится невозможным; подобное явление
не имеет места при ИЭФ. Правда, сходство или различие компо-
нентов в двух образцах можно установить, исследуя в ИТФ их
смесь. Кроме того, мы обходили указанное затруднение, внося во
все образцы одинаковые количества гетерогенной смеси немече-
ных ионов (10% лошадиной сыворотки или сыворотки плода ко-
ровы), так, чтобы они были в большом избытке по сравнению с
исследуемыми радиоактивными IgG. Еще один недостаток ИТФ
по сравнению с ИЭФ в слое сефадекса (Ziegler, Kohler, 1976а)
состоит в том, что в обычных полиакриламидных гелях крупные
молекулы (например, IgM) встречают стерические препятствия.
Однако, как мы уже говорили, ИТФ обеспечивает ряд йреиму-
ществ, к которым относятся возможность работать с белками, не
поддающимися фокусированию из-за пониженной растворимости,
использование стандартного прибора для электрофореза в геле
и незначительная стоимость эксперимента.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Awdeh A. L., Williamson A. R., Askonas В. А. (1968). Nature (London), 219,
66.

Barnstable С. J., Bodmer IF. F., Brown G., Galfre G.,Milstein C., Williams A. F.,
Ziegler A. (1978). Cell, 14, 9.	.

Haglund H. (1970)7 Sci. Tools, 17, 2.	/

Jovin T. M. (1973). Biochemistry, 12, 871.

Kohler G., Milstein C. (1976). Eur. J. Immunol., 6, 511.

Kohlrausch F. (1897). Ann. Phys. (Leipzig) [3], 62, 209.

Ornstein L. (1964). Ann. N. Y. Acad. Sci., 121, 321.

Kouts R. J. (1971). Ph. D. Dissertation, Eindhoven University of Technology,
Eindhoven.

Studier F. W. (1973). J. Mol. Biol., 79, 237.

Ziegler A., Kohler G. (1976a). FEBS Lett., 64, 48.

Ziegler A., Kohler G. (1976b). FEBS Lett., 71, 142.
Глава 8

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ,
ГАПТЕНОВ И НЕРАСТВОРИМЫХ НОСИТЕЛЕЙ

X. Кифер

1.	ВВЕДЕНИЕ

Приготовление антигенов или направленно модифицирован-
ных носителей часто представляет значительную трудность для
тех, кто не имеет специальной химической подготовки. Поэтому
мы прежде всего рассмотрим механизмы некоторых основных ре-
акций; усвоив эти начальные знания, нам легче будет применить
известные методы при изучении новых систем. Все методы моди-
фикации, описанные в этой главе, широко используются, и их
легко приспособить для работы с самыми разнообразными анти-
генами и носителями. Однако, приступая к новому синтезу, нуж-
но строго соблюдать следующие условия:

1)	растворители должны быть совместимы с реагентами;

2)	необходимо учитывать требования к pH и температуре;

3)	выбранные условия реакции должны обеспечивать ста-
бильность реагентов (особенно белков);

4)	нужно исключить нежелательные побочные реакции (на-
пример, образование поперечных сшивок);

5)	если реакция в зависимости от условий может протекать
с разной скоростью, необходимо подобрать нужную продолжи-
тельность ее проведения и соответствующую температуру.

II.	ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ

А. Присоединение гаптенов к макромолекулам

1.	Присоединение к белкам и пептидам

Чтобы избежать образования перекрестных сшивок между
молекулами белка, лучше активировать гаптены, а не функцио-
нальные группы белковой молекулы. Чаще всего используются
два механизма присоединения: а) нуклеофильное замещение и
б) азосочетание. Со стороны белка в реакциях нуклеофильного
замещения участвуют главным образом аминогруппы остатков
лизина, а в реакциях азосочетания — остатки тирозина и гисти-
дина.
Приводим примеры нуклеофильного замещения (реакции /—
3) и азосочетания (реакция 4).

Важно отметить, что скорости всех этих реакций зависят от pH
(pH 8—9), и для того, чтобы реакция нуклеофильного замещения
в ароматическом кольце протекала достаточно быстро, необходи-
мо наличие по крайней мере двух групп NO2 (в орто- или пара-
положении). Вместо сульфогруппы (—SO3H) в реакциях нуклео-
фильного замещения (1) аналогичным образом может участво-
вать атом фтора или хлора (например, в случае присоединения
к белку 2,4-динитрофторбензола или пикрилхлорида).

Реакция сочетания солей диазония с тирозином протекает с
оптимальной скоростью при pH около 8, но она может идти и при
pH ниже 8; однако оптимум pH для присоединения этих солей к
ароматическим аминам лежит около 6.

2.	Присоединение к углеводам

Для активации как растворимых, так и нерастворимых угле-
водов лучше всего использовать бромциан или хлорацетат. При-
водим примеры активации (реакция 5) и сочетания (реакции
6—8).
нс-он

I

нс-он

I

CNBr

-НВг

I

НС-О

I c=nh

НС-о

I

НС-он

I

НС—О —C = N

I

НС—О^

I C-NH
нс-о'

I

Реактивная
группа

НС-ОН

I „ „ Нереактивнйя

НС—О—С—NH2 группа

1 О

(5)

I
нс-о

I C N-R
HC-OZ

I

НС—О—С—NH— R Изомочевина

НС-ОН

I

Я-замещенный
имидокароонат

НС—O-C-NH—R

Н-замещенный
карбамат

НС-ОН
I

НС —ОН |	___ НС — О — СН2—COO'Na+ + НС1

О-СН	СН2-СОО Na	но-сн

I	I

,1с

I	ON»	О HN

I	II + IP эдк’	II ।

11С-О-СН2-С..~Х С	——»- нс-о-сщ-с-о-с

I	4>н и	II

1	N,	N

н2	R,

НС -О —CHj—С —NH -CHj-CHj-NHj

ЭДА1 2 t	+

О

II

R,—NH-C—NH-R2

1 ЭДК— 1 -этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид. — Прим. ред.

2 ЭДА — этилендиамин. — Прим. ред.
Активация бромцианом обычно требует высоких значений pH :
(10,5—11,5), но сочетание амина с активированным полисахари- >
дом можно легко осуществить в 0,1 М ЫаНСОз. Именно этот ме-
тод в основном используется при получении сорбентов для аф-
финной хроматографии (Cuatrecasas, 1970).

Первый этап хлорацетатного активирования, которое Инмен
(Inman, 1975) применил для присоединения антигенов к модифи-
цированному фиколлу, также протекает при очень высоких зна-
чениях pH (в 1 н. NaOH). Здесь уместно будет рассмотреть ме-
ханизм действия широко используемых карбодиимидов, которые
применяются на втором этапе этой реакции активации.

Карбоновая кислота с активированной карбоксильной груп-
пой в реакции с амином образует амид. В этом случае активация
состоит в образовании под действием карбодиимида промежуточ-
ного соединения — О-ацилизомочевины, которую нельзя выде-
лить, так как она нестабильна в водных растворах. Однако в при-
сутствии аминов она реагирует с образованием соответствующего
амида. Образование О-ацилмочевины ускоряется протонировани-
ем одного из атомов имидного азота. Поэтому на данном этапе
реакцию проводят в слабокислой среде и только потом добавля-
ют свободный амин. В этих условиях образование амида проис-
ходит с оптимальной скоростью в весьма широком диапазоне pH
(4,7—7). Необходимо помнить, что под действием карбодиимидов
всегда в известной мере происходит внутренняя поперечная сшив-
ка самих белковых молекул, так как обе реагирующие группы
находятся на одной и той же молекуле. Карбодиимиды реагиру-
ют не только с карбоновыми кислотами, но также с молекулами
воды, фенолами, тиосоединениями, аминами и спиртами, что час-
то ведет к образованию довольно стабильных промежуточных
веществ.

Новый интересный метод активации сефадекса недавно пред-
ложили Уилсон и Накане (Wilson, Nakane, 1976). Вначале сефа-
декс окисляют перйодатом, а затем основание Шиффа восста-
навливают с помощью NaBH4. Приводим примеры активации та-
кого типа (реакция 9) и самой реакции присоединения (реак-
ция 10).

R-NH,
Б. Присоединение гаптенов к нерастворимым носителям

Гаптены, присоединенные к нерастворимым носителям, ис-
пользуются главным образом для специфического связывания
антител, антигенов или клеток с целью очистки. Роль носителя
для гаптенов может выполнять поверхность волокон, пробирок,
чашек или бус. Мы ограничимся рассмотрением следующих носи-
телей: а) полисахаридных гранулированных гелей, б) полистиро-
ловых бус и чашек и в) найлоновых волокон.

1.	Полисахаридные гранулированные гели

Аффинная хроматография на гаптенизированных полисаха-
ридных гранулах (например, сефарозы) широко используется,
для очистки специфических антител. В продаже имеются такие
гранулы активированного бромцианом геля (Pharmacia, Упсала,
Швеция), к которым можно легко присоединить любой амин.
В качестве промежуточных соединений (спейсеров) можно ис-
пользовать диамины типа H2N (CH2)nNH2. Эти реакции описаны
в разд. II,А,2.

2.	Полистироловые пробирки, чашки или бусы (латекс)

Часто стирол сополимеризуют с дивинилбензолом или акрило-
вой кислотой, благодаря которой сополимер приобретает реак-
ционноспособные алифатические карбоксильные группы (получа-
ются карбоксильные латексы). В составе таких сополимеров
всегда содержится то или иное количество ионных или неионных
детергентов, гидрофильные группы которых выходят на поверх-
ность и вместе с карбоксильными создают общий поверхностный
заряд. Кстати, именно эти поверхностные заряды удерживают
гранулы латекса от спонтанной агглютинации.

Один из методов введения функциональных групп в структуру
полистирола, из которого изготовляют пробирки, чашки и бусы,
заключается в нитровании носителя с последующим восстанов-
лением нитросоединений до ароматических аминов (реакция//).
Преимущество ароматических аминов в качестве функцио-
нальных групп — то, что они позволяют осуществить целый ряд
сочетаний. Реакция с карбоновыми кислотами, активированны-
ми карбодиимидом, обсуждалась в разд. II,А,2. Еще одна воз-
можная реакция состоит в получении солей диазония с последу-
ющим азосочетанием (реакция 12).

no2"
н +

(12)

Можно также получить светочувствительные ароматические
азиды и использовать их для ковалентного связывания при фото-
аффинной маркировке (Layer и сотр., 1976) (реакции 13 и 14).

n;
(И)

Необходимо иметь в виду, что большинство полистиролов раст-
воримы в органических растворителях, таких, как эфиры и аце-
тон.

3.	Найлон

Найлон (полиамид 6—6)—это сополимер гексаметиленди-
амина и адипиновой кислоты (см. реакцию 15), который исполь-
зуют для формования различных изделий и получения волокон.

НООС-(СН2)4-СООН + Н2Ы-(СН2)в-ЫН2

280"С

(15)

О	о

II	II	~

-C(CH2)4-C-NH-(CH2),-NH-	+ Н2О

J я

При эмульсионной полимеризации образуются не бусинки, как в
случае стирола, а пузырьки («искусственные клетки» — Chang,
1972). Для присоединения гаптенов можно использовать конце-
вые аминные и карбоксильные группы. Количество таких функ-
циональных групп на поверхности сополимера можно увеличить
путем мягкого кислотного гидролиза (Зн. НС1). В отличие от по-
листирола найлон нерастворим в большинстве органических рас-
творителей. Поэтому диапазон химических реакций для его мо-
дификации гораздо шире. Приводим последовательность реак-
ций введения легко отщепляющегося спейсера (16).
—(CH2)4COOH

— (CH2)6NH2

Янтарный
ангидрид

Бензол

О

II

—(CH2)4CNH~~(CH2)2NH2

II II

—(CH2)eNHC(CH2)4CNH(CH2)2NH2

HaN —(СН2)2“NHa

—(CH2)4COOH
О
II

- (C H2 )6NHC (C H2)4COOH

Бензол PC1S

О

— (CH2)4CC1
о	о

II	II

-(CHJjNHCfCHj^CCl

(16)

Далее через концевую аминогруппу можно привязывать к найло-
ну гаптены или антигены, например с помощью карбодиимида.
Активация

(17)

0

II

1-с-о-с
11

'	CH—C-NH—СНгСН,

О

Сочетание

и

— С—NH—R +

^ОН
С
II
СН-С-NHCH.CH,
II

Для активации карбоксильных групп найлоновых волокон в;
водных растворах лучше всего подходит реакция 17.

В. Присоединение белков к нерастворимым носителям

Способы присоединения белков к нерастворимым носителям
были разработаны в основном для получения иммобилизованных
ферментов. В принципе при наличии активированного носителя
можно использовать те же методы, что и для присоединения гап-
тенов. Как уже упоминалось, активация белков часто сопровож-
дается образованием нежелательных межмолекулярных сшивок.
Кроме реакций, представленных в предыдущих разделах, для со-
четания можно использовать ряд бифункциональных реагентов,
например приведенные ниже:

4,4-дифтор-3,3-динитрофенил-
сульфон (нерастворим в во-
де) (MacLeod, Hill, 1968)

znh2

CH,-CH,-CH2-CH2-C'
2 г	ОСН

Диметиладипимидат (Dut-
ton et al., 1966)

5исдиазобеизидин (Silmdn,
Katchalski, 1966)

Фенил- 1,4-диизо тиоцианат
(Laursen et al., 1972)
Все реагенты, кроме бисдиазобензидина, реагируют с нуклеофи-
лами (—NH2).

III.	ПРАКТИЧЕСКОЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ

А. Присоединение гаптенов к макромолекулам

1.	Присоединение тринитрофенильных групп (ТНФ)

к гемоцианину моллюска фиссуреллы (KLH) (реакция 1)

Берут 500 мг KLH (Calbiochem, Ла Джолла, Калифорния,
США) и 500 мг К2СО3 и перемешивают в течение ночи в 25 мл
дистиллированной воды при комнатной температуре. Мутный рас-
твор центрифугируют 20 мин при 27 000g в центрифуге Sorvall,
затем надосадочную жидкость смешивают с 500 мг ТНФ-сульфо-
ната в 25 мл 0,1 М раствора К2СО3. Реакционную смесь переме-
шивают в течение ночи при комнатной температуре и диализуют
против 0,01MNaHCO3, затем против двух смен ЗФР и при не-
обходимости снова центрифугируют.

Содержание ТНФ-групп измеряют с помощью ультрафиолето-
вого спектрофотометра при 348 нм (Ет= 15400). Белок опреде-
ляют по методу Лоури. Содержание ТНФ в полученных нами
конъюгатах оказалось равным 23 моль на 1 моль белка с мол. ве-
сом 100 000.

Этим же методом удалось получать конъюгаты с бычьим сы-
вороточным альбумином, яичным альбумином и ГЛТ (сополи-
мер L-Glu : L-Lys : L-Tyr, 62:34 :4).

2.	Присоединение ДНФ к фиколлу (Inman, 1975)

а.	Получение карбоксиметилированного фиколла (КМвз-фи-
колла, реакция 7). Исходный 1,35 М раствор хлорацетата на-
трия приготовляют следующим образом: 64,4 г хлоруксусной ки-
слоты растворяют в смеси из 300 мл дистиллированной воды и.
135 мл 5,0 н. NaOH; раствор охлаждают до 25°С, подводят pH
до 6,8—7,2 добавлением 5 н. NaOH или 10%-ного (вес/объем)
раствора хлоруксусной кислоты и доводят объем до 500 мл ди-
стиллированной водой.

Компоненты реакционной смеси предварительно нагревают до
40°С. Фиколл (13,3 г) растворяют в 185 мл 1,35 М хлорацетата
натрия. При перемешивании добавляют 50 мл 10 н. NaOH (на-
чальный момент реакции) и доводят объем до 250 мл дистилли-
рованной водой. Таким образом, реакционная смесь вначале со-
держит хлорацетат в концентрации 1,0 М и NaOH в концентрации
2 М. Смесь помещают в термостатированную баню при 40°С. Че-
рез 30 мин добавляют 10 мл 2 М NaH2PO4 и доводят pH до 7
с помощью 5 н. НС1. Нейтральный раствор в течение 4—5 дней
диализуют при 4°С против дистиллированной воды, насыщенной
толуолом, меняя ее один или два раза в день. Для задержки или
предотвращения роста микроорганизмов на каждые 2 л воды при-
бавляют 1 мл толуола и встряхивают.

Диализованный раствор используют сразу на следующем эта-
пе реакции или лиофилизируют и хранят в сухом виде.

б.	Получение И-(2-аминоэтил)карбамилметилированного фи-
колла (АЭКМ-фиколла) (реакция 8). Измеряют объем диали-
зованного раствора КМ83-фиколла. На 100 мл диализата добав-
ляют 14,3 г дигидрохлорида этилендиамина (ЭДК-НС1) (East-
man Organic Chemicals, Рочестер, штат Нью-Йорк, США). Дово-
дят pH раствора до 4,7 с помощью 1 н. NaOH и в течение 10 мин
при перемешивании добавляют ЭДК-НС1 (1,25 г на 100 мл диа-
лизата). Все это время и еще в течение 3,5 ч pH раствора под-
держивают около 4,7, добавляя при надобности 1 н. НС1 или
1 н. NaOH. Раствор диализуют на холоду двое суток против
0,5 М раствора NaCl, насыщенного толуолом, меняя его дважды
в день, а затем 4 дня против дистиллированной воды, насыщен-
ной толуолом, меняя ее раз в день. Полученный АЭКМ-фиколл
лиофилизируют.

в.	Получение 2,4-динитрофенилированного АЭКМ-фиколла
(ДНФ-АЭКМ-фиколла). АЭКМ-фиколл динитрофенилируют с
различной степенью замещения либо (1) 1-фтор-2,4-динитробен-
золом (ФДНБ), либо (2) На-2,4-динитробензолсульфонатом
(Na-ДИБС), как описано ниже.

1.	Используют буфер: 0,2 М бицин [Н,Н-бпс(2-гидрокси-
этил)глицин] с 0,1 М NaOH (pH 8,35). В трех миллилит-
рах этого буфера растворяют 180 мг АЭКМ-фиколла (ра-
нее приготовленного из КМ33-фиколла). Добавляют 3 мл
этанола и 21 мкл (для других объемов см. табл. 1) 1,0 М
ФДНБ (Eastman Organic Chemicals) в этаноле. Смесь вы-
держивают 2,5 ч при комнатной температуре в темноте, ди-
ализуют 3 дня на холоду против дистиллированной воды,
насыщенной толуолом, осветляют центрифугированием и
лиофилизируют.

2.	АЭКМвз-фиколл (636 мг, 1,5 мкмоль) растворяют в 10 мл
карбонатного буфера (0,946 М Na2CO3, 0,054 М NaHCO3,
pH 10;6). Для растворения фиколл растирают и перемеши-
вают стеклянной палочкой в течение 15 мин. Добавляют и
растворяют Na-ДНБС (количества, использованные в раз-
личных экспериментах, указаны в табл. 2). Смесь встря-
хивают с несколькими каплями толуола и выдерживают
2,7 дня в темноте при комнатной температуре. После этого
темно-желтый раствор диализуют 2 дня на холоду против
0,2 М NaCl и 3 дня против дистиллированной воды, освет-
ляют центрифугированием и лиофилизируют.

Реакция АЭКМ-фиколла с ФДНБ (Inman, 1975)

Таблица 1

Количество добавлен- ного ФДНБ, мкмоль1	Количество ФДНБ, добавленного на 1 моль фнколла, моль	Количество ДНФ- групп, связанных с 1 моль фнколла, моль2	Доля связанного ФДНБ, %
21	49	48	98
30	71	58	82
42	99	66	67

1	Соответствует числу микролитров 1 М раствора ФДНБ в этаноле, добавленного к 180 мг
(0,425 мкмоль) АЭКМвз-фиколла, растворенного в бициновом буфере, содержащем этанол,
с pH 8,35.

2	Эта величина, п, определяется спектрофотометрически. За 1 моль фнколла принято
4’ 10s г фнколла без веса введенных групп. Таким образом, п представляет собой плотность
эпитопов в расчете на сухой вес без учета молекулярного веса носителя, который не всегда
можно установить. Тем не менее эта величина дает представление о среднем числе гаптениых
групп на одну молекулу полимера.

Таблица 2

Реакция АЭКМ-фиколла с Na-ДНБС при pH 10,6 (Inman, 1975)

Количество добавлен- ного Na-ДНБС, мг1	Количество добав- ленного Na-ДНБС на 1 моль фнколла, моль	Количество связан- ного ДНФ на 1 моль фикола, моль2	Доля связанного Na-ДНБС, %
36,5	90	10	и
142	350	39	11
365	900	56	6

1	Добавлено к 636 мг (1,5 мкмоль) АЭКМм-фиКолла, растворенного в 10 мл 1 М карбо-
натного буфера с pH 10,6.

2	См. второе примечание к табл. 1. Л

Б. Присоединение гаптенов к нерастворимым носителям

1.	Получение ДНФ-Ьуз-сефарозы

а.	Активирование сефарозы (Givol et al., 1970) (реакция 5).
Берут 4,5 г (вес набухшего геля) отмытой сефарозы 4В (Phar-
macia), суспендируют в 15 мл дистиллированной воды и добав-
ляют 0,5 г CNBr (Eastman Kodak, Рочестер, штат Нью-Йорк,
США), pH суспензии доводят до 11,0 и поддерживают в течение
8 мин, добавляя 2 н. NaOH, Реакцию останавливают, трижды от-
мывая сефарозу на фильтре холодной дистиллированной водой
(100 мл).
б.	Присоединение ДНФ-лизина (Givol et al., 1970, реакция 6).
Активированную сефарозу суспендируют в 30 мл 0,1 М раствора
NaHCO3>. содержащего 200 мг ДНФ-лизина (Sigma Chemical Со.,
Сент-Луис, США). Суспензию перемешивают в течение ночи при
4°С, гранулы геля отделяют на фильтре и отмывают несколько
раз до тех пор, пока поглощение элюата при 280 нм не станет
меньше 0,01.

2.	Нитрование и восстановление полистирола

Метод применим для обработки поверхности частиц латекса,
пробирок и чашек.

а.	Модификация полистиролового латекса (реакция 11). Го-
товят смесь концентрированных кислот H2SO4 и HNO3 (2:1 по
объему), охлаждают до 0°С и при перемешивании добавляют
2,5 мл латекса Dow с диаметром гранул 5,7 мкм (Serva или
Feinbiochemica, Гейдельберг, ФРГ); перемешивание продолжают
10 мин. Затем смесь центрифугируют 5 мин при 2500g, кислоту
удаляют, а гранулы дважды промывают холодной дистиллиро-
ванной водой. Для восстановления растворяют 11 г SnCU
(Merck, Дармштадт, ФРГ, analytical grade) в 10 мл концентри-
рованной НС1 и добавляют к отмытому нитролатексу. Смесь пе-
ремешивают 1 ч при комнатной температуре, затем центрифуги-
руют и латекс отмывают 0,1 н. НС1, дистиллированной водой,
0,1 н. NaOH, снова дистиллированной водой и ресуспендируют в
первоначальном объеме буфера, используемого для сочетания
белков.

б.	Присоединение KLH к латексу. Берут 4 мл азотированного
и восстановленного латекса (10%-ной суспензии) и смешивают
с 8 мг KLH и 40 мг М-циклогексил-М/-[р-(К-метилморфолино)-
этил]карбодиимид-п-толуолсульфоната (ЦМК) (Merck-Schu-
chardt, Хоэнбрунн, ФРГ), растворенными в 4 мл ЗФР (pH 7,0)
и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Затем латекс
отмывают 5 раз в ЗФР и ресуспендируют в 70%-ном этаноле для
хранения.

3.	Активация иайлоновых волокон (Edelman et al., 1971;

Kiefer, 1973, 1975) (см. реакцию 16).

ДНФ-диски. Поверхность сетчатых дисков, изготовленных из
найлоновых волокон, подвергают гидролизу 3 н. НС1 при комнат-
ной температуре по методу Эдельмана (Edelman et al., 1971).

На первом этапе диски обрабатывают 10 мин при температуре
дефлегмации насыщенным раствором янтарного ангидрида в бен-
золе, затем последовательно отмывают бензолом, эфиром, 1 н.
NaOH, дистиллированной водой, 0,1 н. НС1, снова дистиллиро-
ванной водой и абсолютным этанолом. После этого для реакции
со свободными карбоксильными группами диски обрабатывают
0,1 М раствором 1,2-диаминоэтана в дистиллированной воде, со-
держащим 2 г ЦМК на 50 мл; pH раствора доводят до 7,0 три-
хлоруксусной кислотой. Диски выдерживают 2 ч при комнатной
температуре, затем отмывают дистиллированной водой, 0,1 щ
NaOH, дистиллированной водой и этанолом.

После этого диски обрабатывают 5 мин при 60°С раствором,
содержащим 4 мг/мл PCI5 в абсолютном бензоле; не отмывая, их
переносят в 5%-ный (по объему) раствор 1,2-диаминоэтана в
бензоле и встряхивают 5 мин, а затем отмывают бензолом, эфи-
ром, 1 н. NaOH, этанолом и тетрагидрофураном (ТГФ). Сразу-
после отмывки диски помещают в раствор, содержащий 20 мг
хлорида дитионитробензола (ДТНБ) на 1 мл абсолютного ТГФ,
и встряхивают 2 ч при комнатной температуре, затем промывают
три раза ТГФ и быстро переносят в 5%-ный раствор 1,2-диамино-
этана в ТГФ и встряхивают еще час до тех пор, пока диски не
станут почти бесцветными. После промывания этанолом и дис-
тиллированной водой к поверхности дисков присоединяют гап-
тены или антигены при помощи карбодиимида, как описано ра-
нее (Kiefer, 1973).

Количество гаптена, ковалентно связанного с диском, можно

определить, измеряя светопоглощение при 420 нм при двух раз- личных значениях pH.		
Гаптен	pH	Поглощение
ДТНБ, обработанный меркапто- этанолом 		9,0	при 420 нм, е(М-1)  17000
ДТНБ, обработанный меркапто- этанолом 		1,0	0
ТНФ-капроновая кислота ....	9,0	6600
ТНФ-капроновая кислота		1,0	6600
ДНФ-капроновая кислота ....	9,0	6600
ДНФ-капроновая кислота ....	1,0	6600
Измерения проводят в 0,05 М NaHCO	з при	pH 9,0 (добавляют

NaOH) и при pH 1,0 (добавляют НС1).

Таким способом можно измерить как количество отщепляю-
щегося гаптена, так и количество непосредственно связанного
гаптена; последнее определяют путем гидролиза в концентриро-
ванной НС1. В среднем у нас оказывается 10~5 мкмоль отщеп-
ляющегося гаптена на диск, что соответствует плотности 3,8-10®
молекул гаптена на 1 мкм2.
В. Присоединение эритроцитов к сетчатым дискам
из найлоновых волокон, активированным К.-реактивом
Вудварда (реакция 17)

Найлоновый диск промывают в пентане и четыреххлористом
углероде, затем его обрабатывают в течение 1 ч 3 н. НС1 и тща<
тельно отмывают дистиллированной водой, 0,1 н. NaOH и снова
дистиллированной водой до нейтрального pH. Диск высушивают
в этаноле и эфире. Растворяют 10 мг К-реактива Вудварда
(Woodward, Olofson, 1961) (Fluka, Букс, Швейцария) в 10 мл
охлажденной (4°С) дистиллированной воды и добавляют 10 мл
предварительно охлажденного до 4°С 0,2 М. ЗФР с pH 7,0. Най-
лоновый диск погружают в этот раствор, а через 45 мин отмы-
вают 0,1 М. ЗФР. Кровь Xenopus собирают в ЗФР с гепарином
(1 ед/мл). Эритроциты отмывают три раза, взвесь разбавляют до
1/100 по сравнению с кровью и встряхивают 1 ч при комнатной
температуре с диском в стакане, помещенном на качалку
(70 об/мин). Время от времени клетки осторожно ресуспенди-
руют.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Рекомендуемая литература

Means G. Е., Feeney R. Е. (1971). Chemical Modification of Proteins, Holden-
Day, San Francisco, California.

Weetail H. H. (1972). Insolubilized antigens and antibodies. In: The Chemistry
of Biosurfaces (M. L. Hair, ed.), Vol. 2, pp. 598—610.

Zaborsky 0. R. (1973). Immobilized Enzymes, CRC Press, Cleveland, Ohio.

Цитир уемая литература

Chang T. M. S. (1972). Artificial Cells, Thomas, Springfield, Illinois.

Cuatrecasas P. (1970). J. Biol. Chem., 245, 3059.

Dutton A., Adams M., Singer S. 7,(1966). Biochem. Biophys. Res. Commun.,

23 730.

Edelman G. M., Rutishauser U., Milette C. F. (1971). Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 68, 2153.

Givol D., Weinstein Y., Gorecki M., Wilcheck M. (1970). Biochem. Biophys.

Res. Commun., 38, 825.

Inman J. K- (1975). J. Immunol., 114, 704.

Kiefer H. (1973). Eur. Immunol., 3, 181.

Kiefer H. (1975). Eur. J. Immunol., 5, 624.

Laursen R. A., Horn M. J., Bonner A. G. (1972). FEBS Lett., 21, 67.

Layer P., Kiefer H. R., Hucho F. (1976). Mol. Pharmacol., 12, 958.

MacLeod R. M., Hill R. J. (1968). Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol., 27,

521.

Silman H. I., Katchalski E. (1966). Annu. Rev. Biochem., 35, 873.

Wilson M. B., Nakane P. K- (1976). J. Immunol. Methods, 12, 171.

Woodward R. B., Olofson R. A. (1961). J. Am. Chem. Soc., 83, 1007, 1010.
Глава 9

ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ АНТИТЕЛА
И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ АНАЛИЗЕ
АНТИГЕНОВ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК

Л. Форни

I.	ВВЕДЕНИЕ

Метод иммунофлуоресценции появился в клеточной биологии
в начале 40-х годов, когда Кунс, Крич и Джонс (Coons et al.,
1941) впервые показали, что можно присоединять флуоресцент-
ные красители к молекулам иммуноглобулинов без повреждения
их специфической активности, и сообщили об использовании та-
ких флуоресцирующих реагентов как о специфическом и весьма
чувствительном методе выявления корпускулярных и раствори-
мых антигенов в животных тканях. В последующие пятнадцать
лет Кунс и его сотрудники добились стандартизации метода, и с
тех пор его успешно применяют многие исследователи. Возмож-
ности метода иммунофлуоресценции еще более возросли, когда
Кунс и сотр. (Coons et al., 1955) стали выявлять с его помощью
специфические антитела в тканях, пользуясь соответствующими
растворимыми антигенами. «Непрямой» метод, который предло-
жили Меллорс и сотр. (Mellors et al., 1955, 1959), еще больше
расширил область применения иммунофлуоресценции.

Когда был налажен коммерческий выпуск флуоресцентных
красителей и в продаже появились укомплектованные флуорес-
центные микроскопы, метод иммунофлуоресценции стал доступен
и для менее специализированных лабораторий; в настоящее вре-
мя он широко применяется в вирусологии, микробиологии и пато-
логии как в исследовательских, так и в диагностических целях.
Благодаря методу иммунофлуоресценции были достигнуты зна-
чительные успехи в изучении дифференцировки иммуноцитов;
(Pernis, 1967). В последние годы этот метод зарекомендовал се-
бя как весьма полезный инструмент для исследования мембран-
ных антигенов и в цитофизиологии (МбПег, 1961; Pernis et al.,
1970; Frye, Edidin, 1970).

С самого начала одним из недостатков метода было происхо-
дящее иногда неспецифическое окрашивание тканей и клеток
конъюгатами. Кунс и Каплан (Coons, Kaplan, 1950) эмпирически
нашли способ устранения таких конъюгатов с помощью адсорб-
ции на тканевых порошках. Позднее Кёртейн (Courtain, 1958}
выяснил, что неспецифическое окрашивание обусловлено сум-
марным зарядом избыточно флуорохромированных молекул и что
эти молекулы можно удалить из реакционной смеси с помощью
электрофореза или, еще лучше, анионообменной хроматографии
(Courtain, 1961; Riggs et al., 1960; Goldstein et al., 1961).

Разумеется, для получения надежных результатов необходи-
мы высокоактивные и высокоспецифические флуоресцирующие
реагенты. Многие из широко используемых реагентов, например
антисыворотки к иммуноглобулинам человека, имеются сейчас
в продаже, однако выбор их, конечно, весьма ограничен. В на-
стоящей главе мы рассмотрим приготовление, очистку и контроль
препаратов антител, меченных флуорохромами, и применение
таких антител для анализа мембранных антигенов живых клеток
и внутренних антигенов фиксированных клеток. 'Читатель не най-
дет здесь полного обзора методов иммунофлуоресценции, а по-
знакомится с практическими рекомендациями, помогающими в
их освоении.

Проблемы теории и количественной оценки флуоресценции,
принципы флуоресцентной микроскопии, а также разнообразные
способы применения метода флуоресцирующих антител в послед-
ние годы были предметом обсуждения на многочисленных кон-
ференциях, и им посвящена большая литература; некоторые из-
дания указаны в разделе «Рекомендуемая литература» в конце
главы.

Мы не касаемся здесь вопросов приготовления антисывороток
и выделения чистых антител. Антисыворотки конкретной специ-
фичности, которые могут понадобиться при работе методом флуо-
ресцирующих антител, настолько разнообразны, что их трудно
даже перечислить. Отметим только, что главное условие приго-
товления антиглобулиновых реагентов и чистых антител — это
предварительное выделение высокоочищенных антигенов.

Многие методы очистки антигенов и антител, методики конт-
роля активности и специфичности антисывороток, а также спо-
собы получения ряда антисывороток конкретной специфичности
описаны в других главах настоящей книги. Описание основных
иммунохимических методов можно найти в руководствах, ука-
занных в конце главы.

II.	РЕАГЕНТЫ ДЛЯ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ

А.	Очистка иммуноглобулинов

Иммуноглобулины антисыворотки осаждают сульфатом ам-
мония, а затем очищают с помощью анионообменной хромато-
графии (Cebra, Goldstein, 1965). Цель очистки — выделение
фракций, как можно более гомогенных в отношении изоэлектри-
ческой точки (см. гл. 2). В этом случае флуорохромирование дает
наибольший выход конъюгатов с нужными свойствами: препа-
раты обладают высокой специфической активностью и дают лишь
незначительное неспецифическое окрашивание.

Антисыворотку разводят равным объемом физиологического
раствора, забуференного фосфатами (ЗФР)1, и охлаждают на
ледяной бане. К разведенной сыворотке при помешивании добав-
ляют по каплям равный объем 3,2 М раствора сульфата аммония
(конечная концентрация 1,6 М соответствует 33% насыщения на
холоду). Смесь осторожно перемешивают на мешалке 30 мин,
затем центрифугируют при 5000g в течение 20 мин при 4°С. Оса-
док растворяют в ЗФР, объем которого равен исходному объему
сыворотки, и повторно осаждают в тех же условиях. Полученный
новый осадок растворяют в половине исходного объема ЗФР и
диализуют против него же на холоду. Перед хроматографией вы-
деленный препарат иммуноглобулинов диализуют в течение ночи
на холоду против 100 объемов 0,01 М фосфатного буфера с
pH 7,5. Образовавшийся в результате диализа осадок удаляют
центрифугированием, а затем прозрачный раствор наносят на
колонку анионообменной целлюлозы.

Диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза)2, 0,6 —
0,7 м-экв/г, дважды отмывают 0,01 М фосфатным буфером с
pH 7,5 и помещают в колонку. Количество целлюлозы опреде-
ляют из соотношения 1 г сухого веса целлюлозы на 2 мл исход-
ной антисыворотки.

Раствор диализованного белка наносят на колонку и дают ему
впитаться в слой целлюлозы. Элюцию ведут стартовым буфером
и собирают фракции, составляющие около половины объема рас-
твора, нанесенного на колонку. Удобно пользоваться коллекто-
ром, регистрирующим УФ-поглощение, однако это не обязатель-
но. После элюции первого пика белка, в котором содержится
фракция IgG с более основными свойствами, стартовый элюи-
рующий буфер заменяют смесью его с 0,05 М NaCl (pH 7,5) и
собирают второй пик, содержащий «кислый» IgG.

Полученные две фракции иммуноглобулина изотонизируют
либо с помощью диализа, либо добавлением соответствующего
объема 10-кратного концентрата ЗФР, концентрируют до 5—
10 мг/мл и хранят при —20°С.

Дополнительные замечания

1.	В большинстве антисывороток к белковым антигенам спе-
цифическая активность почти равномерно распределена между

1 0,15 М NaCl, 0,01 М натрий-фосфатный буфер, pH 7,2.

2 Поставляется фирмами Serva (ФРГ) под коммерческим названием
DEAE-SS, Whatmann (Великобритания), Bio-Rad (США) и др.
обеими фракциями IgG, однако антитела к гаптенам могут быть
представлены только в одной из них. Поэтому перед флуоро-
хромированием целесообразно с помощью двойной диффузии в
агаре определить содержание нужных антител в обеих фракциях.

2.	Соотношение основных и кислых IgG в разных сыворотках
может быть различным. Кроме того, сыворотки разных видов жи-
вотных по-разному ведут себя при хроматографическом разделе-
нии. Например, при фракционировании на ДЭАЭ-целлюлозе в
описанных выше условиях сыворотки человека и кролика дают
один пик основного IgG, элюируемого стартовым буфером, тогда
как бараньи сыворотки обычно дают два пика, один из которых
элюируется в свободном объеме, а другой — несколько позднее.
По нашим данным, оба пика можно объединить. При выделении
мышиных иммуноглобулинов на- ДЭАЭ-целлюлозе выход очи-
щенного материала часто бывает очень низким.

Б. Приготовление фрагментов иммуноглобулинов

В некоторых случаях, когда присутствие Fc-фрагмента может
помешать выявлению мембранных антигенов, для некоторых спе-
циальных целей приходится использовать двухвалентные фраг-
менты антител, получаемые ферментативным перевариванием.
Ниже описан метод расщепления по Нисонову (Nisonoff, 1964)
с небольшими модификациями.

Очищенный препарат иммуноглобулина диализуют против
0,1 М ацетатного буфера с pH 4,3, затем к нему добавляют кри-
сталлический пепсин 1 в соотношении глобулин : пепсин 50 : 1 н,
если необходимо, доводят pH до 4,3 1 М уксусной кислотой.
Смесь оставляют на водяной бане при 37°С на 8—14 ч, затем
охлаждают во льду. Осадок, который может образоваться во вре-
мя реакции, удаляют центрифугированием и доводят pH до 8,0 с
помощью 1 М NaOH; при этом значении pH пепсин инактивиру-
ется. Чтобы удалить мелкие пептиды, ферментированный имму-
ноглобулин диализуют против большого объема ЗФР или добав-
ляют сульфат аммония до конечной концентрации 2,4 М, центри-
фугируют 30 мин при 5000g, осадок растворяют в ЗФР и раствор
диализуют для удаления ионов сульфата. Чистоту готового пре-
парата проверяют с помощью иммунодиффузии в агаровом геле
(если имеются сыворотки анти-Fab и анти-Fc) или более чувст-
вительным методом электрофореза в полиакриламидном геле с
ДСН (см. гл. 4), сопоставляя интактный, восстановленный и ал-
килированный образцы. Если ферментолиз прошел не полностью

1 Дважды перекристаллизованный пепсин поставляется фирмой Sigma
(США).
и в препарате осталось много целых молекул IgG, их удаляют
гель-фильтрацией на сефадексе G-1501.

Дополнительные замечания

При ферментолизе иммуноглобулинов разных видов живот-
ных выход пепсиновых F(ab')2-фрагментов может быть различ-
ным. При указанных выше значениях pH кроличий иммуногло-
булин полностью расщепляется до F(ab')2, тогда как иммуно-
глобулин барана более устойчив к пепсину даже при снижении
pH до 3,9. У мышей в отличие от других животных разные под-
классы иммуноглобулинов сильно различаются по чувствитель-
ности к пепсину, по крайней мере в случае очищенных миелом-
ных белков (L. Forni, неопубликованные наблюдения). По этой
причине может быть очень низким не только общий выход
F(ab')2-фрагментов, но и выход фрагментов какого-то определен-
ного подкласса. А это весьма нежелательно, если, как часто бы-
вает, специфическая активность антител неравномерно распре-
делена между подклассами IgG.

Из пепсиновых фрагментов, приготовленных по описанной ме-
тодике,можно получить моновалентные Fab'-фрагменты антител
путем восстановления и алкилирования. Для этого препарат
F(ab')2 диализуют против 0,1 М нагрий-ацетатного буфера с
pH 5,0, а затем добавляют восстановитель, например меркапто-
этаноламин-HCl или дитиотреитол2 до конечной концентрации
0,01—0,015 М. Смесь инкубируют в закрытых пробирках на во-
дяной бане при 37°С в течение 1—2 ч, а затем реакцию останав-
ливают, добавив иодацетамид3 до конечной концентрации
0,022—0,036 М, после чего смесь диализуют против ЗФР.

В этих условиях происходит полное восстановление двухва-
лентных фрагментов. Выход очень близок к расчетному. Полу-
ченные таким образом моновалентные фрагменты обладают
большей растворимостью, чем Fab-фрагменты, образующиеся
при папаиновом ферментолизе.

В.	Флуорохромирование

Ниже мы приводим методику конъюгации антител с флуоро-
хромом, разработанную на основе ряда методов, описанных ра-
нее (Cebra, Goldstein, 1965; Amante, Giuriani, 1969; Amante et al.,
1972). Процедура флуорохромировання и очистки конъюгатов

1 Производится фирмой Pharmacia (Швеция).

2 Меркаптоэтаноламин-HCl поставляет фирма Sigma (США), дитиотре-
итол (реактив Клеланда) — фирма Calbiochem (США).

3 Иодацетамид поставляет, в частности, фирма BDH (Великобритания).
занимает один день и не требует сложного оборудования. На ос-
новании собственного опыта мы рекомендуем в один прием флуо-
рохромировать лишь небольшое количество антител (около
10 мг очищенного иммуноглобулина), так как во время хранения
конъюгаты часто теряют активность.

По нашим наблюдениям, оптимальная концентрация белка
при флуорохромировании составляет около 4—5 мг/мл. При этом
на 1 мг белка следует брать 12,5 мкг флуоресцеинизотиоцианата
(ФИТЦ), 12,5 мкг кристаллического тетраметилродаминизотио-
цианата (ТРИТЦ)1 или 15 мкг аморфного тетраметилродамин-
изотиоцианата. Если приходится работать с менее концентриро-
ванными растворами белка, например с чистыми антителами,
относительное количество флуорохромов уменьшают, чтобы избе-
жать избыточного флуорохромирования и связанной с этим поте-
ри активности антител. Флуорохромирование двухвалентных и
моновалентных фрагментов иммуноглобулинов проводят при
низких концентрациях флуорохромов, не выше 10 мкг на 1 мг
белка.

Необходимую навеску флуорохрома готовят непосредственно
перед опытом и растворяют в 50—100 мкл 0,1 М ЦагСОз или ди-
метилсульфоксида. Раствор белка (2,5 мл) охлаждают во льду,
доводят до pH 9,0 с помощью 0,1 М ЫагСОз и добавляют к рас-
твору флуорохрома, осторожно перемешивая. Реакция должна
идти на ледяной бане. В реакционной смеси нужно поддерживать
pH возможно ближе к 9,0, добавляя в случае необходимости
0,05 М раствор карбоната или бикарбоната натрия. Если pH сме-
си не изменяется в течение 15 мин, сосуд закрывают пробкой и
оставляют во льду при легком помешивании на 18 ч в защищен-
ном от света месте. Для флуорохромирования кристаллическим
ТРИТЦ достаточно четырех часов; большая длительность реак-
ции часто приводит к появлению большого количества молекул,
перегруженных флуорохромом. После окончания реакции смесь
центрифугируют, чтобы удалить образующийся иногда осадок, и
приступают к очистке.

Г. Очистка конъюгатов

Берут 4—5 г мелкозернистого сефадекса G-50, отмывают 2—
3 раза 0,01 М фосфатным буфером с pH 7,5, удаляя мелкие час-
тицы декантацией, и помещают в колонку диаметром 8—9 мм и
длиной 60 см. После флуорохромирования реакционную смесь
наносят на колонку и после того, как вся жидкость всосется в

1 ФИТЦ, изомер I, поставляется фирмой Baltimore Biological Laboratories
(США), ТРИТЦ — той же фирмой и фирмой Nordic Immunology (Тильбург,
Нидерланды).
слой геля, начинают элюцию тем же буфером. Вскоре окрашен-
ная смесь разделяется на две фракции; в первой из них, движу-
щейся с большей скоростью, находится флуорохромированный
иммуноглобулин, а во второй — не связавшийся флуорохром.

Для очистки фрагментов и чистых антител, флуорохромиро-
ванных кристаллическим ТРИТЦ, нередко бывает достаточно
одноэтапной гель-фильтрации. Полученный с колонки элюат
анализируют и обрабатывают далее, как указано в разд. II, Д и
II,Е.

Однако обычно гель-фильтрация не освобождает реагент от
свойства неспецифически окрашивать клетки. Это объясняется
тем, что раствор иммуноглобулинов, исходно гомогенный по изо-
электрической точке, после флуорохромирования становится ге-
терогенным. Возникновение этой гетерогенности обусловлено в
основном различиями в числе молекул флуорохрома, присоеди-
нившихся к разным молекулам иммуноглобулина. Поэтому для
разделения компонентов, имеющих разный заряд, целесообразно
применить анионообменную хроматографию с элюцией раствора-
ми NaCl возрастающей концентрации.

Уравновешивают 1,5 г ДЭАЭ-целлюлозы 0,01 М. фосфатным
буфером с pH 7,5 и помещают в небольшую колонку или стеклян-
ный шприц. Элюат с сефадекса G-50 наносят на слой анионооб-
менника и элюируют сначала тем же буфером, а затем раствора-
ми этого буфера, содержащими 0,05, 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 М. NaCl.
Каждый пик собирают отдельно и определяют содержание бел-
ка и соотношение флуорохром/белок, как описано ниже.

При очистке ТРИТЦ-конъюгатов нужные фракции находятся
в порциях элюата, содержащих 0,05 и 0,1 М NaCl. Фракции, вы-
ходящие при более высоких концентрациях соли, обычно бывают
избыточно флуорохромированы.

При очистке ФИТЦ-конъюгатов, наоборот, низкие концентра-
ции соли обычно элюируют с ионообменника гипофлуорохроми-
рованные молекулы белка, тогда как фракции с подходящей сте-
пенью флуорохромирования выводятся буфером, содержащим
0,4 М NaCl.

Д. Определение степени флуорохромирования

Концентрацию белка и отношение флуорохром/белок опреде-
ляют по оптической плотности реагента при 280 нм и 495 нм для
ФИТЦ, 515 нм для аморфного ТРИТЦ и 555 нм — для кристал-
лического ТРИТЦ. Указанные длины волн видимого спектра со-
ответствуют максимуму светопоглощения (Cebra, Goldstein,
1965; Amante, Giuriani, 1969; Amante et al., 1972). Вычисления
проводят по следующим формулам, в которых учитываются
спектры поглощения разных флуорохромов:
ФИТЦ

^28о —(0,35 • Л19Г.) __ ]^онценТрацИЯ белка (мг/мл)

1,4

—2,87 ' Aisf>-= Число молей ФИТЦ на 1 моль IgG

^aso — (0,35 • A49s)

ТРИТЦ (кристаллический)

-—°- = Концентрация белка (мг/мл);

1,4

6,6 ' Лб55 = Число молей ТРИТЦ на 1 моль IgG;
мг/мл

ТРИТЦ (аморфный)

^2”—(в’|в/.Л515). _ Концентрация белка (мг/мл).

Для аморфного ТРИТЦ невозможно вычислить, сколько
групп флуорохрома приходится на одну молекулу IgG. В этом
случае приблизительную оценку степени конъюгации дает соот-
ношение Л515/Л280-

Е. Хранение конъюгатов

Растворы флуорохромированных антител изотонизируют диа-
лизом против ЗФР и доводят концентрацию белка до 0,5 мг/мл.
Препараты чистых антител можно использовать при более низ-
ких концентрациях — порядка 50 мкг/мл.

Растворы флуорохромированных иммуноглобулинов стерили-
зуют фильтрацией через мембранные фильтры фирмы Millipore,
разливают небольшими порциями и хранят в темноте при 4°С.

Ж. Контроль активности и специфичности конъюгатов

1.	Эффективность окрашивания

Исходя из соотношения флуорохром/белок нельзя точно пред-
сказать эффективность реагента для окрашивания. На практике
приходится встречаться с широкими вариациями этой эффек-
тивности в зависимости от вида животных и исходной активности
антисыворотки.

Как правило, образцы с молярным отношением меньше 1 ока-
зываются плохими реагентами, хотя антитела в них не инакти-
вированы. Это связано с тем, что присутствующие в смеси неме-
ченые молекулы антител конкурируют с мечеными. Молярное
отношение, равное 2—3, обеспечивает вполне удовлетворитель-
ные результаты при работе с флуоресцеиновыми конъюгатами,
тогда как родаминовые конъюгаты дают неспецифическое окра-
шивание.

При одинаковой специфичности и степени флуорохромирова-
ния реагенты, приготовленные из кроличьих и козьих антисыво-
роток, могут сильно различаться по окрашивающим свойствам.
Дело в том, что иммуноглобулины кролика теряют свою актив-
ность при молярном соотношении больше 2 или 3, в то время как
бараньи или козьи антитела сохраняют способность к окрашива-
нию даже после интенсивного флуорохромирования (до 5—7 мо-
лекул флуоресцеина иа молекулу IgG).

На основании собственного опыта мы считаем, что лучшим
способом оценки активности и специфичности конъюгатов может
быть пробное окрашивание образцов клеток, их мембран или ци-
топлазмы. Действительно, классические контроли специфичности
окрашивания, такие, как торможение избытком немеченых анти-
тел или адсорбция антисыворотки соответствующим антигеном,
очень часто практически неосуществимы. В этих случаях одно-
типное окрашивание фиксированных мазков, приготовленных из
клеток какой-либо другой ткани или другого вида, свидетельст-
вуют о неспецифичности конъюгата.

2.	Специфичность меченых антисывороток

Прямое окрашивание клеток также служит одним из лучших
контролей специфичности антисыворотки. Нередко антисыворот-
ки, достаточно специфичные в иммунодиффузии или в реакции
гемагглютинации, еще содержат примесные антитела, выявляе-
мые в реакции непрямой иммунофлуоресценции или другим, бо-
лее чувствительным методом.

Антисыворотки к аллотипам иммуноглобулинов, к антигенам
гистосовместимости или к любым другим антигенам внутривидо-
вого полиморфизма необходимо тестировать на клетках особей
(инбредных линий), заведомо положительных и отрицательных
по данному аллоантигену.

С помощью пары антиглобулиновых сывороток, меченных раз-
ными флуорохромами, можно проводить двойное окрашивание
клеток и выявлять иммуноглобулины разных классов или под-
классов. Двойное окрашивание лишь тогда дает надежные и
четкие результаты, когда из двух видов молекул разной специ-
фичности только один скапливается на одном из полюсов клетки
(образование «шапочки», см. разд. III). Известно, что молекулы
разных иммуноглобулинов, находясь в одной и той же клетке, пе-
редвигаются в плоскости ее мембраны независимо друг от друга
(см. Rowe et al., 1973; Knapp et al., 1973). Поэтому скопление
двух разных меченых иммуноглобулинов на одном полюсе клет-
ки (двойное окрашивание «шапочки») указывает на то, что по
крайней мере один из реагентов недостаточно специфичен. В этом
случае препараты флуорохромированных иммуноглобулинов сле-
дует истощить с помощью иммуносорбентов и повторить тести-
рование активности и специфичности.

III.	ОКРАШИВАНИЕ

А. Выявление мембранных антигенов

Для выявления мембранных антигенов проводят окрашивание
живых клеток в суспензии. Клетки, выделенные из тканей и полу-
ченные в культуре, окрашивают по однотипной методике. В обо-
их случаях клетки тщательно и осторожно промывают сбаланси-
рованным солевым раствором, содержащим 1% БСА или 10%
сыворотки плода коровы (СПК), чтобы удалить мешающие окра-
шиванию сывороточные, секретируемые или спонтанно освобож-
дающиеся белки. Удобно проводить окрашивание при концент-
рации клеток 10—20-106/мл в маленьких круглодонных пласт-
массовых или стеклянных пробирках. Желательно иметь про-
бирки для одноразового использования, так как присутствие
следов детергента резко нарушает антигенную структуру клетки
и активность антител, даже если его концентрация недостаточна,
чтобы вызвать цитолиз.

1. Прямое окрашивание

Смешивают 50—100 мкл клеточной суспензии (1—2-Ю7 кле-
ток) с равным объемом соответствующей меченой антисыворот-
ки, осторожно ресуспендируют и держат во льду 20—30 мин. За-
тем добавляют 3 мл холодной среды (СР, содержащий белок)
и осаждают клетки центрифугированием (10 мин, 100g, при
охлаждении). Осадок ресуспендируют и повторяют отмывание
трижды, как указано выше. Чтобы избежать нежелательного
перемещения мембранных антигенов к одному полюсу клетки
после их связывания со специфическими антителами (кэпинг —
образование «шапочки»), помимо проведения всей процедуры
на льду нужно использовать среду, содержащую 10—20 мМ. ази-
да натрия (Taylor et al., 1971; Loor et al., 1972)'.

Если окрашивание приходится повторять более чем один раз,
то меченую антисыворотку отмывают другим, более щадящим
способом. Для этого взвесь клеток пропускают через большой
объем сыворотки плода коровы. Используется неразведенная сы-
воротка или ее ступенчатый градиент: 6 мл — 100%, 3 мл —
75% и 2 мл — 50% сыворотки. Смесь клеток с меченой анти-
сывороткой разбавляют средой до 1 мл и осторожно наслаивают
на сыворотку плода коровы, пробирку центрифугируют на холоду
15 мин при 200g. Надосадочную жидкость удаляют отсасывани-
ем, осадок ресуспендируют в 50 мкл среды для дальнейшей ра-
боты.

Двойное окрашивание

Двойное окрашивание одной и той же клеточной суспензии
двумя разными антисыворотками, меченными различными флуо-
рохромами, можно проводить либо в один этап (как описано в
разд. Ill, А, 1, одновременно воздействуя на клетки смесью двух
антисывороток), либо в два этапа, осуществляя контакт последо-
вательно. Второй вариант используют, когда возможно нежела-
тельное взаимодействие между самими антисыворотками или
между ними и мембранными антигенами.

Если ставится задача выявить на одной и той же клетке два
заведомо или предположительно присутствующих антигена, при-
меняют другой вариант двойного окрашивания. Было показано
(Taylor et al., 1971; Loor et al., 1972), что молекулы в мембране
лимфоцитов (а также и других клеток), реагируя с лигандами,
перераспределяются и скапливаются на одном полюсе клетки.
Этот феномен образования «шапочки» (кэпинга) требует затра-
ты энергии и зависит от температуры; поэтому для его предот-
вращения окрашивание обычно проводят при низкой температуре
и добавляют ингибиторы обмена, например азид натрия. Однако
иногда можно воспользоваться этим феноменом для лучшего
выявления двух мембранных антигенов или при изучении воз-
можных пространственных соотношений и физиологических вза-
имодействий между молекулами клеточной мембраны (см., на-
пример, Forni, Pernis, 1975).

Методика состоит в следующем. Сначала клетки обрабатыва-
ют одной флуоресцентной сывороткой на ледяной бане в течение
20 мин, как описано выше; затем к клеточной суспензии добавля-
ют 0,5 мл среды без азида натрия и инкубируют 10 мин на водя-
ной бане при 37°С. После такой инкубации в суспензию добав-
ляют 3 мл холодной среды, содержащей азид натрия, и отмыва-
ют, как указано выше. Затем проводят второе окрашивание —
антисывороткой второй специфичности, меченной другим флуоро-
хромом; реакция должна все время идти на холоду (4°С) и в
присутствии азида натрия.
3.	Непрямое окрашивание

К непрямому окрашиванию прибегают в том случае, если
имеющееся количество специфической антисыворотки недоста-
точно для конъюгации или если она содержит очень мало анти-
тел; так может обстоять дело с некоторыми аллоантисыворотка-
ми к мембранным антигенам, а также с антисыворотками, актив-
ность которых обычно определяется лишь в реакции комплемент-
зависимого цитолиза; содержание антител в них часто не превы-
шает нескольких микрограммов на 1 мл.

Клетки окрашивают так же, как и в прямом методе, повторяя
процедуру дважды. Сначала их инкубируют с соответствующей
антисывороткой в подходящем разведении, а затем после отмы-
вания обрабатывают флуоресцирующей антисывороткой, содер-
жащей антитела к иммуноглобулинам первой сыворотки. Такой
флуоресцирующий реагент наиболее удобен в том случае, когда
первая антисыворотка получена от животного другого вида. Од-
нако применение аллоантисыворотки при работе с таким объек-
том, как лимфоциты (которые могут нести на своей мембране' эн-
догенные иммуноглобулины), исключает возможность использо-
вания антител к иммуноглобулинам в качестве второго реагента.
В этом случае можно присоединить к аллоантителам гаптен и на
втором этапе реакции применить антигаптенные антитела, мечен-
ные флуорохромом; этот метод очень чувствителен и специфичен
(WofsyetaL, 1974).

Непрямой метод иммунофлуоресценции используют также
для выявления клеток, связывающих антиген. Для этого клетки
сначала инкубируют 30 мин на льду с раствором антигена в кон-
центрации, не превышающей 50 мкг/мл. Затем клетки тщательно
отмывают путем центрифугирования и окрашивают соответствую-
щими антителами, меченными флуорохромом.

Для микроскопии окрашенные тем или иным способом клетки
ресуспендируют в нескольких каплях глицерина, забуференного
фосфатами *. Каплю клеточной суспензии помещают на предмет-
ное стекло, накрывают покровным стеклом и герметизируют ла-
ком для ногтей.

Чтобы сохранить препарат на несколько дней, можно пригото-
вить мазок. Как показал наш опыт, для получения достаточного
количества клеток в поле микроскопа нужно ресуспендировать
клетки в минимальном объеме 3%-ного БСА в СР или в 50%-
ной СПК- Пастеровской пипеткой помещают каплю клеточной
суспензии на кончик писчего пера и проводят несколько линий
на предметном стекле. Мазок высушивают на воздухе, фиксиру-

1	60 мл глицерина, 30 мл дистиллированной воды, 10 мл десятикратного
концентрата ЗФР и 1 мл IM NaNa.
ют 5 мин в этаноле, регидратируют ЗФР, меняя его два или три
раза, и заключают в глицерин, забуференный фосфатами. Фик-
сация препаратов предотвращает какие бы то ни было изменения
в распределении меченых молекул на клеточной мембране. Такие
изменения могли бы произойти во время микроскопического ис-
следования, если бы клетки оставались нефиксированными при
комнатной температуре. Наш собственный опыт показал, что этот
метод весьма удобен для подсчета редко встречающихся клеток,
например клеток, связывающих антиген. В этом случае важно
не посчитать одну и ту же клетку дважды; и такой оплошности
легко избежать, если мазок приготовлен штрихами.

4.	Дополнительные замечания

Полезно будет рассмотреть ряд артефактов, связанных с не-
которыми свойствами флуоресцирующих антител. Например,
окрашивание лимфоцитарной мембраны может быть обусловле-
но не присутствием соответствующего антигена, а взаимодейст-
вием антител с особыми структурами на мембране — с так назы-
ваемыми рецепторами для гс, которые связываются с Fc-частью
молекулы IgG. Многочисленные противоречивые данные относи-
тельно присутствия IgG на мембране В-лимфоцитов можно объ-
яснить именно наличием таких рецепторов (Winchester et al.,
1975). Чтобы избежать нежелательного окрашивания, Уинчестер
и его сотрудники предложили при работе с лимфоидными клет-
ками использовать во всех вариантах метода иммунофлуоресцен-
ции пепсиновые фрагменты антител.

Как известно, Fc-рецепторы лимфоцитов реагируют главным
образом, если не исключительно, с молекулами IgG, агрегирован-
ными физическими способами или находящимися в комплексах
антиген — антитело (Basten et aL, 1972). Поэтому в наших экспе-
риментах мы удаляли из антисывороток нежелательные антитела
путем истощения на иммобилизованных антигенах, а агрегаты с
коэффициентом седиментации больше 40S устраняли ультра-
центрифугированием при 100 000g в течение часа. После такой
обработки антисывороток мы не наблюдали связывания антител
с Fc-рецепторами. Кроме того, мы отметили, что IgG после конъ-
югации с флуоресцеином или тетраметилродамином теряют спо-
собность связываться с Fc-рецепторами (Forni, Pernis, 1975)
и с белком A Staphylococcus aureus (Forni, неопубликованные
данные). Как показали Трэшер и сотр. (Trasher et al., 1975),
флуорохромированные антитела лишены также и других свойств,
зависящих от Fc, таких, например, как способность связывать
комплемент.
Б. Выявление внутриклеточных антигенов

Для выявления внутриклеточных антигенов клетки обраба-
тывают фиксаторами, которые до такой степени нарушают струк-
туру поверхностной мембраны, что она становится проницаемой
для флуоресцирующих антител. Ниже будет описан метод выяв-
ления интрацитоплазматических антигенов в отдельных клетках.

Клетки суспендируют в растворе, обогащенном белком, на-
пример в ЗФР с 3% БСА или 50% СПК- Концентрация клеток в
суспензии может быть различной в зависимости от их типа. При
изучении иммуноглобулинов в плазматических клетках, которые
составляют лишь малую долю клеточной популяции селезенки,
лимфатических узлов или других лимфоидных органов, обычно го-
товят густую суспензию с плотностью 4-106 клеток в 1 мл. На-
против, если ожидаемая доля клеток, несущих иммуноглобули-
ны, значительно выше (как, например, в суспензии клеток солид-
ной плазмоцитомы или костного мозга при множественном
миеломатозе, а также в случае перевиваемых лимфобластов и
стимулированных культур лимфоцитов), концентрация клеток не
должна превышать 106 в 1 мл. Для приготовления мазков очень
удобно пользоваться цитоцентрифугой. Центрифуги этого типа
(например, фирмы Shandan, Лондон) позволяют собрать клетки
в монослой на участке диаметром 5—7 мм и окрасить их неболь-
шим объемом (10—20 мкл) меченой антисыворотки.

Предметные стекла помещают в лунки цитоцентрифуги и
предварительно центрифугируют со 100 мкл 3%-ного БСА —
ЗФР, чтобы на поверхности стекла образовалась тонкая белко-
вая пленка. Затем в каждую лунку вносят по 100 мкл клеточной
суспензии и вновь центрифугируют 15 мин при 800—1000 об/мин
(для хрупких клеток, например клеток миеломы или экспланти-
руемых клеток, скорость должна быть меньше). После центри-
фугирования алмазной иглой на стекле очерчивают круг, внутри
которого должно находиться клеточное «пятно», плохо различи-
мое на влажной поверхности. Препарат фиксируют этанолом или
смесью этанола с 5% уксусной кислоты в течение 10 мин, а затем
трижды по 10 мин отмывают в ЗФР; после этого вокруг очерчен-
ного пятна стекло подсушивают фильтровальной бумагой и на
клетки наносят 10—20 мкл меченой антисыворотки. Стекла ин-
кубируют во влажной камере при комнатной температуре; в слу-
чае высыхания антисыворотки возникает яркое неспецифическое
свечение фона. После инкубации предметные стекла трижды от-
мывают ЗФР и заключают в забуференный фосфатами глицерин.
Фиксированные клетки можно окрашивать непрямым способом,
инкубируя их сначала со специфической немеченой антисыворот-
кой, а затем, после тщательного отмывания, — с флуоресцирую-
щим антиглобулиновым реагентом.
Подобным образом можно выявить клетки, продуцирующие
антитела данной специфичности. Для этого образцы сначала
инкубируют с соответствующим растворимым антигеном в кон-
центрации не более 50—100 мкг/мл, а затем, после отмывания, —
со специфической флуоресцирующей антисывороткой.

Двойное окрашивание клеток, осевших на стекле, можно про-
водить так же, как и в суспензии, двумя антисыворотками, ме-
ченными разными флуорохромами, одномоментно или в два эта-
па. Одномоментное окрашивание возможно только с такими анти-
сыворотками, которые не взаимодействуют друг с другом. При
этом очень важно, чтобы реагенты были очищены с помощью им-
мобилизованных антигенов, так как присутствие в антисыворот-
ках свободного антигена или растворимых комплексов антиген —
антитело (при избытке антигена) приводит к взаимной инакти-
вации реагентов.

В. Выявление мембранных и внутриклеточных антигенов в одной
и той же клетке

Описанные выше приемы окрашивания поверхностных и вну-
триклеточных антигенов можно объединить. Сначала клетки
окрашивают в суспензии для выявления мембранных антигенов,
обычно с помощью антисыворотки, меченной ТРИТЦ. После от-
мывания клетки ресуспендируют (в соответствующей концентра-
ции) в 3% БСА — ЗФР и готовят препараты на стеклах с по-
мощью цитоцентрифуги, как описано выше, фиксируют в этаноле
в течение 10 мин и проводят внутриклеточное окрашивание вто-
рой антисывороткой, меченной флуоресцеином.

IV. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ

А. Воспроизводимость метода флуорохромирования

Воспроизводимость результатов достаточно велика. Однако,
как и следовало ожидать, наблюдаются значительные вариации
степени флуорохромирования иммуноглобулинов, принадлежа-
щих разным видам животных.

Наиболее часто применяемый кроличий иммуноглобулин
флуорохромируется слабее бараньего или козьего. В зависимости
от свойств флуорохромов эти видовые особенности могут быть
выгодны или невыгодны. Например, при работе с флуоресцеином
хорошее окрашивание дают сильно флуорохромированные ре-
агенты (2—5 ФИТЦ-групп на молекулу IgG), такими могут быть,
иммуноглобулины барана или козы, но не кролика. В случае
ТРИТЦ, напротив, успешное окрашивание достигается при ела-
бом флуорохромировании (одна группа ТРИТЦ на молекулу
IgG), а при сильном возникает неспецифическое свечение; поэто-
му данным флуорохромом лучше метить кроличий, а не бараний
или козий иммуноглобулин. Таким образом, для метки иммуно-
глобулинов кролика целесообразно использовать ТРИТЦ, а для
иммуноглобулинов козы и барана — ФИТЦ.

По нашим данным, иммуноглобулины человека и лошади хо-
рошо метятся и флуоресцеином, и родамином. Флуорохромирова-
ние человеческих сывороток анти-HLA часто приводит к значи-
тельной потере их активности, возможно, из-за низкого содержа-
ния антител. Нам не удавалось удовлетворительно флуорохро-
мировать IgG мышей даже в преципитирующих антисыворотках
к аллотипам иммуноглобулинов.

Б. Возможные расхождения между результатами,
получаемыми методом иммунофлуоресценции
и в цитотоксическом тесте

Одни и те же мышиные аллоантисыворотки при исследовании
методом непрямой иммунофлуоресценции и в цитотоксической
реакции часто дают несовпадающие результаты. Во многих слу-
чаях аллоантисыворотки, вполне специфичные по всем критериям
(цитотоксичность и адсорбция), окрашивали клетки мышей, не
обладавших данным антигеном. Следует, правда, отметить, что
чаще окрашивались отдельные субпопуляции, а не все клетки.
Мы обнаружили это отклонение у трех сывороток анти-Thy-l и
у некоторых сывороток анти-Н-2 и анти-1а, высокоспецифичных
в цитотоксической реакции. Эти расхождения можно было бы
объяснить присутствием дополнительных антител, не фиксирую-
щих комплемент.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Рекомендуемая литература

Fifth International Conference on Immunofluorescence and Related Staining
Techniques (Ann. N. Y. Acad. Sci., 1975, 254).

Goldman M. (1968). Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York.
Holborow E. J., ed. (1970). Standardization in Immunofluorescence, Blackwell,
Oxford.

Kabat E., Mayer H. H. (1971). Experimental Immunochemistry, Thomas,
Springfield Illinois.

Kawamura A., Jr. (1969). Fluorescent Antibody Techniques and Their Appli-
cations, Univ. Park Press, Baltimore, Maryland.

Weir D. M. (1973). Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, Black-
well, Oxford.

WiiliamsC. A.,ChaseM. W. eds. (1967). Methods in Immunology and Immuno-
chemistry, Vol. 1, Academic Press, New York.

Williams C. A., Chase M. W., eds. (1967). Methods in Immunology and Im-
munochemistry, Vol. 2, Academic Press, New York.
Цитированная литература

Amante L., Giuriani М. (1969). Boll. 1st. Sieroter. Milan, 48, 411.

Amante L., Ancona A., Forni L. (1972). J. Immunol. Methods, I, 289.

Baden A., Miller J. F. A. P., Sprent J., Pye J. (1972). J. Exp. Med., 135, 610.'

Cebra J. J., Goldstein G. (1965). J. Immunol., 95, 230.

Coons A.H., Kaplan M. H. (1950). J. Exp. Med., 91, 1.

Coons A. H., Creech H. J., Jones R. N. (1941). Proc. Soc. Exp. Biol. Med.,
47, 200.

Coons A. H., Leduc E. H., Connolly J. M. (1955). J. Exp. Med., 102, 49.

Courtain С. C. (1958). Nature (London), 182, 1305.

Courtain С. C- (1961). J. Histochem. Cytochem., 9, 484.

Forni L., Pernis B. (1975). In: Membrane Receptors of Lymphocytes (M. Se-
ligmann, J.  L. Preud’Homme and F. M. Kourilsky, eds.), p. 193,
North-Holland, Publ., Amsterdam.

Frye L. D., Edidin M. (1970). J. Cell Sci. , 7, 319.

Goldstein G., Silizys I. S., Chase M. W. (1961). J. Exp. Med., 114, 89.

Knapp W., Bolhuis R. L. H., Radi J., Hijmans W. (1973). J. Immunol., Ill,
1295.

Loor F., Forni L., Pernis B. (1972). Eur. J. Immunol., 2, 203.

Mellors R. C., Arias-Stella J., Siegel M., Pressman D. (1955). Am. J. Pathol.,
31, 687.

Mellors R. C., Heimer R., Corcos J., Korngold L. (1959). J. Exp. Med., 110,
875.

Moller G. (1961). J. Exp. Med., 114, 415.

Nisonoff A. (1964). Methods Med. Res., 10, 132.

Pernis B. (1967). Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 32, 333.

Pernis B., Forni L., Amante L. (1970). J. Exp. Med., 132, 1001.

Riggs J. L., Loh P. C., Eveland W. C. (1960). Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 105,
655.

Rowe D. S., Hug K., Forni L., Pernis B. (1973). J. Exp. Med., 138, 965.

Taylor R. B., Duff us P. H., Raff M. C., de Penis S. (1971). Nature New Biol.,
233 225

Trasher S. G., Bigazzi P. E., Yoshida T., Cohen S. (1975). J. Immunol., 114,
762.

Winchester R. J., Fu S. M., Hoffman T., Kunkel H. G. (1975). J. Immunol.,
114, 1210.

Wofsy L., Barker P. C., Thompson K-, Goodman J., Kimura J., Henry C. (1974).
J. Exp. Med., 140, 523.
РАДИОАКТИВНОЕ МАРКИРОВАНИЕ
И ИММУНОСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ
МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПОНЕНТОВ
КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ

Дж. Л. Пинк, А. Циглер

I.	ВВЕДЕНИЕ

Располагая специфическими антисыворотками, можно в чис-
том виде выделять небольшие количества меченых компонентов
поверхностной клеточной мембраны из лейкоцитарного (или ино-
го) лизата. Для этого используется простой метод, состоящий из
трех этапов.

Первый этап — включение изотопной метки в клеточные ма-
кромолекулы путем химического присоединения, биосинтеза или
ферментативного катализа. Обычно клеточные белки метят иоди-
рованием с помощью лактопероксидазы (разд. II, А) или вклю-
чением радиоактивных аминокислот в процессе биосинтеза в
кратковременной клеточной культуре (разд. II, Б). Гликопротеи-
ды и углеводы можно пометить методом восстановления бор-
гидридом (разд. II, В) или путем биосинтетического включения
радиоактивных сахаров (используя процедуру, сходную с опи-
санной для включения аминокислот).

На втором этапе меченые клетки разрушают в среде, содер-
жащей обычно неионный детергент, который вызывает солюби-
лизацию мембран (разд. III). Чтобы выделить нужные макромо-
лекулы, лизат наносят на колонку иммуносорбента или смешива-
ют его со специфической антисывороткой; во втором, более
удобном варианте образовавшиеся иммунные комплексы выделя-
ют, добавляя либо вторую антисыворотку — к иммуноглобули-
нам первой (непрямая иммунопреципитация), либо взвесь стафи-
лококков, несущих белок А, который связывает иммуноглобули-
ны (разд. III).

Перед специфической очисткой желательно удалить приме-
си, которые могли бы неспецифически связаться с иммуносорбен-
том или иммунным преципитатом. Кроме того, из лейкоцитарно-
го лизата нужно удалить меченые иммуноглобулины, связанные
с клеточной поверхностью (если они сами не являются предме-
том исследования, см. гл. 2), иначе они попадут в преципитат,
взаимодействуя с антиглобулиновым реагентом или стафилокок-
ками, несущими белок А. Эти примеси обычно удаляют путем
осаждения или адсорбции перед этапом специфической очистки.
Очищенный таким образом радиоактивный материал может
быть далее подвергнут анализу методом электрофореза в поли-
акриламидном геле с додецилсульфатом натрия (см. гл. 4).

II.	МЕТОДИКА МАРКИРОВАНИЯ

А.	Иодирование белков клеточной поверхности с помощью
лактопероксидазы

Этот метод первоначально был применен для изучения по-
верхностных белков эритроцитов (Phillips, Morrison, 1970, 1971)
а в дальнейшем с его помощью были охарактеризованы поверх-
ностные иммуноглобулины лимфоцитов (Vitetta et al., 1971), ан-
тигены главного комплекса гистосовместимости (Silver, Hood,.
1974) и многие другие маркеры клеточной поверхности (см., на-
пример, Marchalonis et al., 1971; Vitetta et al., 1975). Метод рас-
смотрен в обзорах: Morrison, Schonbaum, 1976; Hubbard, CohnF
1976.

Точный механизм происходящей реакции неизвестен. Предпо-
лагают, что в присутствии лактопероксидазы и перекиси водоро-
да иодид-ионы окисляются и дают связанный с ферментом про-
межуточный продукт, который может превращать доступные
остатки тирозина в белке в одноиодистые (главным образом)
производные. Может также иодироваться гистидин, но в горазда
меньшей степени (Morrison et al., 1970; Hubbard, Cohn, 1976)-
Перекись водорода можно добавлять в готовом виде (Marchalo-
nis et aL, 1971) или получать ее непосредственно в реакционной
смеси с помощью фермента глюкозооксидазы в присутствии глю-
козы (Hubbard, Cohn, 1972).

Метод лактопероксидазного иодирования технически несло-
жен; при этом выявлять радиоактивный иод (с помощью у-счетчи-
ка или радиоавтографии) гораздо проще, чем тритиевую метку.
Кроме того, определенные типы клеток (например, эритроциты
и спермин) в процессе биосинтеза могут включать лишь очень
небольшое количество метки; в этих случаях для маркирования
мембранных белков иодирование становится методом выбора.

При высоком проценте жизнеспособных клеток в исходной
взвеси радиоактивный иод связывается главным образом с кле-
точной поверхностью. Поэтому поверхностные компоненты кле-
ток обычно включают больше метки, чем при биосинтетическом
маркировании. Например, антигены главного комплекса гисто-
совместимости, выделенные с помощью электрофореза в поли-
акриламидном геле с ДСН из лизата иодированных куриных
лейкоцитов, содержат 0,05—0,2% метки, а те же антигены, полу-
ченные из клеток, включавших 3Н-лейцин или 3Н-лизин в ходе
биосинтеза, — всего лишь 0,02—0,1% метки (Ziegler, Pink, 1976).
Однако это преимущество иногда нивелируется из-за того, что
часть молекул клеточной поверхности может быть недоступна
для иодирования (Walsh, Crumpton, 1977; Schwartz et al., 1978).

Обычно при работе по описанной ниже методике 10—20% до-
бавленной радиоактивной метки связывается с клетками и не
удаляется при отмывании. Однако значительная часть этой мет-
ки становится диализабельной после разрушения клеток и, воз-
можно, представляет собой иодированные липиды. После лизиса
и диализа в лизате остается приблизительно 1—5% внесенной
метки, и практически вся она осаждается трихлоруксусной кис-
лотой. Таким образом, при внесении 1 мКи можно рассчитывать,
что в диализованном лизате будет содержаться 4-107 имп/мин
1251. Процент метки, связавшейся с тем или иным поверхностным
компонентом, зависит от количества и доступности содержащих-
ся в нем остатков тирозина. Как уже говорилось, очищенные ан-
тигены главного комплекса гистосовместимости содержат 0,05—
0,2% метки (около 4-Ю4 имп/мин). Если мы предположим, что
на клеточной поверхности находится около 105 молекул антигена
(Sanderson, Welsh, 1974) и что очистка дает 100%-ный выход,
то это будет означать, что в молекулах иодируется от 1/100 до
1/10 всех остатков тирозина.

Предлагаемая методика представляет собой модификацию
метода иодирования, описанного Хаббардом и Коном для эритро-
цитов (Hubbard, Cohn, 1972). Поскольку различные образцы
лактопероксидазы могут обладать разной удельной активностью,
следует предварительно подобрать оптимальную концентрацию
фермента для связывания метки.

Маркирование

К 1—5-Ю7 живых клеток в 1 мл раствора Дульбеко (pH 7,4),
содержащего 20 мМ глюкозы, прибавляют 20 мкл лактоперокси-
дазы (Calbiochem, Ла Джолла, Калифорния, США или Sigma,
Сент-Луис, США) и 20 мкл глюкозооксидазы (Calbiochem или
Sigma). Оба фермента хранят при —70°С в ЗФР (порциями по
100 мкл): лактопероксидазу — в концентрации 1 мг/мл, глюко-
зооксидазу— в концентрации 1 ед/100 мкл.

Дальнейшие этапы реакции проводят в вытяжном шкафу,
приспособленном для работы с радиоактивными изотопами. Рас-
твор Na125I, свободного от носителя, готовят непосредственно
перед опытом, растворяя 1 мКи метки в 10—20 мкл дистиллиро-
ванной воды. К клеточной взвеси добавляют 0,5—1 мКи Na125I.
Смесь инкубируют в закрытых пробирках 30 мин при 20°С.

Реакцию останавливают, добавляя 5 мл охлажденного ЗФР,
содержащего 10-3 М толуолсульфофторида (ТСФ) и четыре раза
отмывают клетки в 5 мл этого раствора. Определяя радиоактив-
ность надосадочной жидкости после каждого отмывания, можно>
следить за удалением несвязавшейся метки.

Б. Биосинтетическое маркирование поверхностных белков

Включение радиоактивных аминокислот в белок в процессе-
его биосинтеза было использовано при изучении поверхностных
иммуноглобулинов клетки (Melchers, Andersson, 1973) и анти-
генов гистосовместимости (Brown et al., 1974; Jones, 1977). В та-
кого рода опытах часто используют лейцин и лизин; эти амино-
кислоты в значительном количестве содержатся в большинстве-
белков, и их 3Н-производные обладают высокой удельной актив-
ностью. Однако и другие незаменимые аминокислоты легко
включаются в белки в кратковременных культурах лейкоцитов.
Маркирование заменимыми аминокислотами более сложно; при
работе с некоторыми из них (аланин, цистеин, пролин) можно
достигнуть удовлетворительного включения, тогда как с другими
(глицин, серин, аспартат, глутамат) это не удается (Vitetta etal.,
1976). Степень включения метки в различные белки в клетках
разных типов очень сильно варьирует. При работе с лимфоцита-
ми по предлагаемой методике за 6—8 ч инкубации в белок вклю-
чается 5—10% 3Н-лейцина и 3Н-лизина; приблизительно 0,1%
этой метки оказывается в антигенах главного комплекса гисто->
совместимости. Вначале количество включенной метки возраста-
ет в линейной зависимости от времени, но примерно после 12 ч
инкубации оно уже значительно не изменяется.	'

Для биосинтетического маркирования белков можно исполь-
зовать также предшественники, меченные другими изотопами.
Среди них 355-метионин имеет преимущество перед соединениями,
содержащими тритий; применение этого вещества более удобно
для простого радиоавтографического анализа очищенных продук- ;
тов (Laskey, Mills, 1975). Кроме того, имеются препараты мече-
ного метионина с высокой удельной активностью. Однако, учиты-
вая эти преимущества, важно иметь в виду, что большинство
белков содержит относительно мало метиониновых остатков. Что-
бы получить материал для определения последовательности ами-
нокислот в белках, Бэллоу и сотр. (Ballou et al., 1976) разрабо-
тали метод одновременного включения всех 20 аминокислот,
меченных 14С, в одной клеточной культуре. Этим авторам удалось
частично расшифровать последовательность аминокислот в ан-
тигенах гистосовместимости, получив достаточную активность с
помощью 14С-аминокислот и 14С-пирувата.

Ниже приводится методика, предложенная Циглером и Пин-
ком (Ziegler, Pink, 1975) для маркирования лейкоцитов кури-
ной периферической крови 3Н-лейцином и 3Н-лизином.
Маркирование

Клетки инкубируют в пластиковых чашках Петри диаметром
10 см. Для инкубации используют модифицированную среду
Игла (МСИ), не содержащую лейцина и лизина, прибавляют к
ней 10% сыворотки плода коровы (диализованной в течение ночи
против ЗФР), глутамин (2 мМ) и, кроме того, 3Н-лейцин и
3Н-лизин (с удельной активностью 20—50 Ки/ммоль, в концент-
рации 100 мкКи на 1 мл культуральной среды). Если нужно мар-
кировать только лейцином, можно использовать коммерческую
МСИ без лейцина. В табл. 1 приведен состав среды, применяю-
щейся для маркирования не только 3Н-лейцином и 3Н-лизином,

Таблица 1

Состав среды для биосинтетического маркирования

Компоненты	Объем, мл
Сбалансированный солевой раствор (10-кратный концентрат) 		1,0
20-кратный концентрат незаменимых аминокислот без лейцина н лизина 		0,5
20-кратный концентрат заменимых аминокислот	0,5
Витамины (МСИ) — 100-кратный концентрат . . .	0,1
3Н-лейцин, 1 мКи/мл 		— 1,0
3Н-лизин, 1 мКи/мл 		~1,0
Сыворотка плода коровы 		1,0
Глутамин, 200 мМ		0,1
10% NaHCO3		0,2
Дистиллированная вода		до 9,5
Суспензия 5-Ю7 клеток в ЗФР 		0,5

Таблица 2

Состав двадцатихратного концентрата аминокислот

Незаменимые аминокислоты	Заменимые аминокислоты

Аргинин		(0,2 мл)	Аланин 		(0,1	мл)
Гистидин		(0,1 мл)	Аспарагиновая кислота .	(0,1	мл)
Изолейцнн 		(0,4 мл)	Аспарагин		(0,1	мл)
Лейцин 		(0,4 мл)	Цистенн		(0,1	мл)
Лизин		(0,4 мл)	Глутаминовая кислота .	(0,1	мл)
Метионин 		(0,1 мл)	Глицин 		(0,1	мл)
Фенилаланин		(0,2 мл)	Пролин 		(0,1	мл)
Треонни	  Триптофан 	  Тирозин	  Валин 		(0,4 мл)  (0,04 мл)  (0,2 мл)  (0,4 мл)	Серин 		(0,1	мл)
но и другими аминокислотами — порознь и в различных комби-i
нациях. Все компоненты имеются в продаже (источники нера-
диоактивных компонентов указаны в гл. 27, разд. III).

Двадцатикратный концентрат аминокислот приготовляют,
смешивая как указано в табл. 2, исходные 50 мМ растворы всех
аминокислот, исключая ту или те, которые предназначены для
маркирования.

В 10 мл среды инкубируют 5-107 живых клеток при 37°С в те-
чение 6—8 ч в атмосфере с 5% СО2; затем суспензию сливают,
чашку промывают равным объемом ЗФР, смытые клетки добав-
ляют к суспензии; собранные клетки 4 раза отмывают холодным
ЗФР, содержащим 10-3 М ТСФ.

В.	Маркирование поверхностных углеводов клетки путем
восстановления боргидридом

Известно несколько способов маркирования поверхностных
гликопротеидов клетки с помощью боргидрида, меченного три-
тием. Метка включается либо в альдегидные группы, либо в
шиффовы основания, образовавшиеся в результате реакции пи-
ридоксальфосфата с е-аминогруппами лизиновых остатков в
белках (Rifkin et al., 1972). Альдегиды образуются либо при дей-
ствии ионов перйодата на остатки сиаловой кислоты (Van Lenten,
Ashwell, 1971; Blumenfeld et al., 1972), либо при окислении ос-
татков галактозы или N-ацетилгалактозамина, катализируемом
галактозооксидазой (Gahmberg, Hakomori, 1973). Затем альдеги-
ды и шиффовы основания восстанавливаются и маркируются
боргидридом натрия, меченным 3Н.

К сожалению, эффективность этой реакции очень низка. Что-
бы включить в клетки достаточное количество маркера, требует-
ся избыток боргидрида (обычно включается 0,1% внесенной ра-
диоактивности). Таким образом, если нужно пометить белок, со-
держащий сиаловую кислоту или галактозу, 0,1% которых до-
ступна для реакции на клеточной поверхности, необходимо взять
по меньшей мере 10 мКи NaB3H4, чтобы получить включение
10 000 имп/мин. Даже при избытке боргидрида происходит вос-
становление не более чем 10% остатков сиаловой кислоты и га-
лактозы, обычно же — меньше 1%. Однако этот метод вполне
пригоден для маркирования углеводов и гликопротеидов тех
клеток (например, эритроцитов и спермиев), которые не способ-
ны легко включать радиоактивные сахара.

Мы опишем методику окисления перйодатом и восстановле-
ния боргидридом по Л. Ровису (неопубликованные данные) в
модификации Циглера и Пинка (Ziegler, Pink, 1976); метод об-
работки галактозооксидазой предложен Гамбергом и сотр.
(Gahmberg et al., 1976), которые описали также сходную про-
цедуру окисления перйодатом в сочетании с мягким восстанов-
лением боргидридом.

Методика

Суспендируют 3-107 живых клеток в 1 мл ЗФР и добавляют
1 мл NaIC>4 (4,мМ в ЗФР) или инкубируют взвесь в растворе
галактозооксидазы (5 ед/мл). Обработку перйодатом проводят
(например, во вращающихся пробирках) в течение 10 мин (в слу-
чае эритроцитов — 5 мин) при комнатной температуре, а галак-
тозооксидазой — в течение 1 ч при 37°С. Эффективность марки-
рования галактозы можно в несколько раз повысить, если перед
добавлением галактозооксидазы обработать клетки нейрами-
нидазой (12,5 ед/мл, 30 мин при 37°С).

После обработки клетки отмывают три раза в ЗФР и ресу-
спендируют в 4 мл ЗФР. Затем в вытяжном шкафу, приспособ-
ленном для работы с изотопами, добавляют NaB3H4 (около
6 Ки/ммоль) до конечной концентрации 1 мМ и активности 10—
25 мКи на 3-107 клеток. Боргидрид удобно прибавлять порциями
по 50 мкл, растворяя в надлежащем объеме ЗФР непосредствен-
но перед началом реакции. Можно также приготовить разведения
NaB3H4 заранее (например, по 5 мКи в 0,1 мл 0,01 н. NaOH),
быстро заморозить и хранить в течение нескольких месяцев при
—70°С (Gahmberg et al., 1976); в этом случае, чтобы пометить
2-Ю7 клеток, нужны 10 мкл (0,5 мКи) реактива (Gahmberg et
al., 1976; Gahmberg, Andersson, 1977).

После внесения метки клеточную взвесь перемешивают при
комнатной температуре в течение 15 мин, затем 4 раза отмывают
в холодном ЗФР, содержащем 10~3 М ТСФ.

III.	РАЗРУШЕНИЕ МЕЧЕНЫХ КЛЕТОК

Клетки лизируют в неионном детергенте, например в Нониде-
те Р-40 (NP-40) (Schwartz, Nathenson, 1971) или в тритоне Х-100
(Simons et al., 1973), который химически сходен с NP-40. Кон-
центрация детергента должна быть достаточной, чтобы раство-
рить клеточные, но не ядерные мембраны (обычно для разруше-
ния лимфоцитов млекопитающих применяют концентрацию
0,5%; однако, приступая к работе с новым типом клеток, целесо-
образно проверить выход интактных ядер после цитолиза в раз-
личных концентрациях детергента).
Методика

После маркирования и отмывания клетки суспендируют в
ЗФР, содержащем 1 мМ ТСФ, приготовляя взвесь с 1—3-107 кле-
ток в 1 мл. Добавляют NP-40 (2% по объему в ЗФР, содержащем
1 мМ ТСФ) в количестве, равном одной трети объема клеточной
суспензии так, чтобы конечная концентрация NP-40 была 0,5%.
Смесь быстро перемешивают, затем оставляют на 5—10 мин при
комнатной температуре или при 4°С, после чего центрифугируют
10 мин при 1000g для удаления ядер.

Полученную надосадочную жидкость можно затем диализо-
вать против холодного ЗФР, содержащего 1 мМ ТСФ (две смены
по 1—2 л). Этот этап служит для удаления низкомолекулярных
примесей, неспецифически связывающихся иммунными преципи-
татами при очистке лизатов меченых клеток (см. следующий раз-
дел), однако он не обязателен. Для диализа используют диализ-
ную трубку диаметром 7 мм и длиной 15—25 см, проницаемую
для меченых низкомолекулярных примесей. Ее смачивают и
скользящим движением надевают на пастеровскую пипетку с
обломанным концом, как показано на рис. 1. Затем пипетку за-
крепляют в штативе выше диализного сосуда так, чтобы ее конец
был чуть выше, а основная часть диализной трубки — ниже
уровня жидкости. После этого лизат вносят в диализную трубку
целой пастеровской пипеткой. Для извлечения лизата после диа-
лиза трубку разрезают, держа ее пинцетом вертикально над про-
биркой.

Диализованный лизат центрифугируют 15 мин при 2000g для
удаления образующегося иногда осадка, а затем определяют ра-
диоактивность в пробах материала, осаждаемого трихлоруксус-
ной кислотой. Меченый лизат можно хранить при —70°С, но луч-
ше проводить дальнейшие этапы исследования со свежим продук-
том, который не подвергался замораживанию и оттаиванию.

Пастеровская
пипетка

Диализная
трубка.

Рнс. 1. Схема приспособления для диализа.
IV.	СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА

МЕЧЕНЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТКИ

Специфическую антисыворотку можно добавить прямо к ли-
зату (Brown et al., 1974). Можно также обработать лизат имму-
носорбентом (например, антисывороткой, конъюгированной с
сефарозой), колоночным или бесколоночным (Ballou et al., 1976)
способом. Невыгодная сторона применения иммуносорбента (по
сравнению с простой иммунопреципитацией) — то, что здесь тре-
буется большее количество антисыворотки, но есть и важное пре-
имущество: элюат почти не содержит балластных белков. Кроме
того, иммуносорбция происходит очень быстро, и это уменьшает
опасность протеолиза в процессе очистки. Однако в наших опы-
тах выход антигена был выше при специфической иммунопреци-
питации, чем при использовании иммуносорбента. Еще один
крупный недостаток иммуносорбции — необходимость концент-
рировать элюат.

Иммунные комплексы, образующиеся при прямом добавлении
антисыворотки к лизату, можно осадить второй антисыворот-
кой — к иммуноглобулинам — или суспензией стафилококка, не-
сущего белок A (Kessler, 1975, 1976; Cullen, Schwartz, 1976.).
Использование стафилококка для осаждения иммунных комплек-
сов, описанное в гл. 2, сокращает время выделения специфиче-
ских продуктов. Суспензия стафилококка вызывает меньшую не-
специфическую копреципитацию меченого материала, чем анти-
глобулиновый реагент; при этом отпадает необходимость-
титрования самой антиглобулиновой сыворотки. Однако следует
иметь в виду, что белок А связывает иммуноглобулины не всех
классов и не всех видов животных (Kronvall, Williams, 1969;.
Kronwall et al., 1970).

Эксперименты с использованием специфической антисыворот-
ки для преципитации поверхностных компонентов клетки долж-
ны иметь два контроля: один — с нормальной (лучше — иммун-
ной к какому-либо другому антигену) сывороткой вместо специ-
фической сыворотки и, если возможно, второй — с лизатом
клеток, не содержащих данного специфического антигена. В боль-
шинстве экспериментов из лизата удаляли поверхностные имму-
ноглобулины, включившие метку (см. разд. I) на предваритель-
ном этапе преципитации (см., например, Silver, Hood, 1974). Если
такое удаление проведено не полностью, иммуноглобулины будут'
определяться и в опытном, и в контрольном преципитате. Кроме
того, и в опыте, и в контроле преципитат может содержать мате-
риал, неспецифически адсорбируемый любыми иммунными комп-
лексами. Чаще всего происходит неспецифическое связывание
белка с молекулярным весом 45000, идентифицированного как
актин (Jones, 1977), и низкомолекулярных продуктов, вероятно»
остающихся в лизате после неполного диализа. При необходимо-
сти эти примеси можно перед иммунопреципитацией отделить от
мембранных гликопротеидов с помощью аффинной хроматогра-
фии лизата на колонке с иммобилизованным лектином из чечеви-
цы (Cullen et al., 1976).

Методика

Включившие метку иммуноглобулины можно удалить из диа-
лизованного лизата следующим образом. Для усиления преципи-
тации меченых иммуноглобулинов к лизату прибавляют нормаль-
ную сыворотку того вида, клетки которого взяты в опыт. Количе-
ство этой сыворотки (обычно 25 мкл на 107 клеток) должно быть
равным объему прибавляемой позже специфической антисыво-
ротки (см. ниже) или немного большим. Затем добавляют анти-
глобулиновый реагент в наименьшем количестве, достаточном
для полной преципитации иммуноглобулинов. [Это количество
определяют в предварительном титровании, в котором 25 мкл
нормальной сыворотки смешивают с возрастающими объемами
(например, 100, 200... 1000 мкл) антиглобулинового реагента, до-
водят общий объем до 1 мл, добавляя сыворотку с ЗФР, и остав-
ляют для образования преципитата на ночь; находят то мини-
мальное количество реагента, после добавления которого в над-
осадочной жидкости больше не остается иммуноглобулинов (т. е.
новое добавление 100 мкл реагента уже не вызывает преципита-
ции).] Реакцию преципитации в основном опыте проводят в те-
чение 4—16 ч при 4°С, после чего преципитат удаляют центри-
фугированием при 2000g в течение 15 мин. После удаления мече-
ных иммуноглобулинов к двум пробам лизата прибавляют соот-
ветственно специфическую и контрольную сыворотки и инкуби-
руют 1—2 ч при 37°С. Обычно на 107 клеток прибавляют 20 мкл
антисыворотки. Если, предположим, сыворотка содержит
50 мкг/мл антител к антигену, представленному в количестве
5-Ю6 молекул на 1 клетку, то каждая молекула антигена будет
в среднем иметь по два участка, связывающих антитело. Целе-
сообразно в предварительных опытах (используя разные объемы,
например 5, 20 и 50 мкл на 107 клеток) определить то количество
сыворотки, которое дает наибольшее соотношение между радио-
активностью преципитатов в опыте и в контроле. Наконец, ко
всем пробам прибавляют соответствующее количество антиглобу-
линового реагента и инкубируют 4—16 ч при 4°С.

Сформированные преципитаты 4—6 раз отмывают в 2—4 мл
холодного ЗФР, содержащего 0,1% NP-40, центрифугируя по
10 мин при 1000g. Осадки растворяют в 50—100 мкл буфера для
электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН (см. гл. 4,
разд. II, Б) или в 9,5 М мочевине, содержащей 5% 0-меркапто-
этанола, 2% NP-40 и 2% амфолинов (O’Farrell, 1975), — для
анализа методом изоэлектрофокусирования (см. гл. 5). До про-
ведения анализа преципитаты можно хранить при —70°С.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Ballou В., McKean D. J., Freedlender Е. F., Smithies О. (1976). Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 73, 4487.

Blumenfeld 0. 0., Gallop P. M., Liao T. H. (1972). Biochem. Biophys. Res.
Commun., 48, 242.

Brown J. L., Kato K-, Silver J., Nathenson S. G. (1974). Biochemistry, 13,
3174.

Cullen S. E., Schwartz B. D. (1976). J. Immunol., 117, 136.

Cullen S. E., Freed J. H., Hathenson S. G. (1976). Transplant. Rev., 30, 236.

Gahmberg C. G., Andersson L. C. (1977). J. Biol. Chem., 252, 5888.

Gahmberg C. G., Hakomori S. (1973). J. Biol. Chem., 248, 4311.

Gahmberg C. G., Hdyry P., Andersson L. C. (1976). J. Cell Biol., 68, 642.

Hubbard A. L., Cohn Z. A. (1972). J. Cell Biol., 55, 390.

Hubbard A. L., Cohn Z. A. (1976). In: Biochemical Analysis of Membranes
(A. H. Maddy, ed), p. 427, Chapman and Hall, London. [Имеется перевод:
Биохимическое исследование мембран. (Под ред. Э. Медди.)—М.: Мир,
1979, с. 376—447.]

Jones Р. Р. (1977). J. Exp. Med., 146, 1261.

Kessler S. W. (1975). J. Immunol., 115, 1617.

Kessler S. W. (1976). J. Immunol., 117, 1482.

Kronvall G., Williams R. C. (1969). J. Immunol., 103, 828.

Kronvall G., Seal U. S., Finstad J., Williams R. C. (1970). J. Immunol., 104,
140.

Laskey R. A., Mills A. D., (1975). Eur. J. Biochem., 56, 335.

Marchalonis J. J., Cone R. E., Santer V. (1971). Biochem. J., 124, 921.

Melchers F., Andersson J. (1973). Transplant. Rev., 14, 76.

Morrison M., Schonbaum G. R. (1976). Annu. Rev. Biochem., 45, 861.

Morrison M., Bayse G., Danner D. J. (1970). In: Biochemistry of the Phagocytic

Process (J. Schultz, ed.), p. 51, North-Holland Publ., Amsterdam.

0’Farrell P. H. (1975). J. Biol. Chem., 250, 4007.

Phillips D. R., Morrison M. (1970). Bichem. Biophys. Res. Commun., 40 , 284.

Phillips D. R., Morrison M. (1971). Biochemistry, 10, 1766.

Rifkin D. B., Compans R. W., Reich E. (1972). J. Biol. Chem. 247, 6432.

Sanderson A. R., Welsh К. I. (1974). Transplantation, 17, 281.

Schwartz B. D., Nathenson S. G. (1971). J. Immunol., 107, 1363.

Schwartz B. D., Vitetta E. S., Cullen S. E. (1978). J. Immunol., 120, 671.

Silver J., Hood L. (1974). Nature (London), 249, 764.

Simons K., Helenius A., Garoff H. (1973). J. Mol. Biol., 80, 119.

Van Lenten L., Ashwell G. (1971). J. Biol. Chem., 246, 1889.

Vitetta E. S., Baur S., Uhr J. W. (1971). J. Exp. Med., 134, 242.

Vitetta E. S., Uhr J. W., Boyse E. A. (1975). J. Immunol., 114, 252.

Vitetta E. S., Capra J. D., Klapper D. G., Klein J., Uhr J. W. (1976). Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 73, 905.

Walsh F. S., Crumpton M. J. (1977). Nature (London), 269, 307.

Ziegler A., Pink J. R. L. (1975). Transplantation, 20 , 523.

Ziegler A., Pink J. R. L. (1976). J. Biol. Chem., 251, 5391.
ПРИСОЕДИНЕНИЕ ГАПТЕНОВ

К ЖИВЫМ НОСИТЕЛЯМ

X. Полит, В. Хаас, X. фон Бёмер

1.	ВВЕДЕНИЕ

Эта глава касается проблемы присоединения гаптенов к слож-
ным носителям, таким, как белки, бактериофаги и клетки, без
нарушения их функций.

Если конъюгаты гаптен — носитель будут использоваться для
анализа иммунологической специфичности, необходимо удосто-
вериться, что наблюдаемые биологические эффекты обусловле-
ны присоединенным гаптеном, а не связаны с артефактами.

Например, гаптенизация бактериофагов через диазосвязь рез-
ко снижает их инфекционность даже при низкой нагрузке, при
которой другие способы гаптенизации не приводят к инактива-
ции фаговых частиц (Becker et aL, 1970). Скорее всего эта ин-
активация зависит от побочных реакций, а не от самого присут-
ствия гаптена. При других, более щадящих методах тоже не
всегда удается избежать побочных эффектов.

В этой главе описан метод присоединения гаптенов к бакте-
риофагу и лимфоцитам. Использование гаптенизированных лим-
фоцитов для изучения цитотоксичных Т-клеток сопряжено с ря-
дом трудностей, поэтому мы рассмотрим этот вопрос более де-
тально.

А. Наиболее часто применяемые реакции присоединения

При изучении цитотоксичных Т-клеток чаще всего в качестве
гаптена применяют тринитрофенилсульфоиат (Shearer, 1974),
механизм присоединения которого мало изучен; известно только,
что этот гаптен, потеряв сульфогруппу, присоединяется к первич-
ным аминам или сульфгидрильным группам носителя1. Другие
гаптены, например 4-гидрокси-3-иод-5-нитрофенилуксусная кис-
лота (НПФ), присоединяются к лимфоцитам через свои ацилази-
ды (Koren et al., 1975), а ФИТЦ — через группу изотиоцианата

1 Имеются два обзора по присоедииеиию гаптенов к носителям и модифи-
кации белков: Jacoby, Wilcheck, 1974; Atassi, 1977. Они могут быть полезны
как источники общих сведений по близким проблемам. [На эту же тему име-
ются несколько статей в недавно вышедшем русском переводе «Иммуносор-
«бенты в очистке белков», ред. Руослахти, М., Медицина, 1979. — Прим, ред.]
(Starzinski-Powitz et al., 1976). Тринитрофенил и НПФ могут так-
же присоединяться к N-концу трипептидного «спейсера», карбо-
ксильный конец которого соединен с клеткой через.ацилазид
(Rehn et al., 1976). Таким образом, во всех этих случаях имеет
место присоединение к первичным аминам. Другие реакции не
описаны. Нам не удавалось гаптенизировать лимфоциты с по-
мощью солей диазония. Каждый из перечисленных выше гапте-
нов имеет свою собственную реакцию присоединения, поэтому
возможно появление особых артефактов^ свойственных каждому
из них [таковы, например, индуцируемые пероксидазой детерми-
нанты, выявляемые в лимфоцитолизе, обусловленном клетками
(ЛОК) (Schmidt-Verhulst, Shearer, 1976)].

Б. Присоединение через активированные эфиры

По причинам, изложенным ниже, мы выбрали метод сочета-
ния с помощью активированных эфиров N-гидроксисукцинимида
п карбоновых кислот (ГСК).

1.	Приготовление активированных эфиров проще, чем при-
готовление и выделение азидов, которые также используются для
активации карбоксильных групп.

Все полученные до сих пор ГСК-эфиры растворяются в ди-
метилформамиде (ДМФ) в концентрации по меньшей мере
30 мг/мл. Такой раствор используют обычно как основной. В то
же время ДМФ в любых соотношениях смешивается с водой, по-
этому нет проблемы перевода активированного эфира во время
сочетания из органической среды в водную.

2.	Активированные эфиры очень устойчивы в обезвоженных
растворителях. Независимо от степени очистки основные раство-
ры эфиров весьма стабильны при —20°С, что обусловливает вы-
сокую воспроизводимость результатов сочетания. При необходи-
мости эфир можно перевести в другой обезвоженный раство-
ритель без потери активности после предварительной
кристаллизации, осаждения или испарения под вакуумом исход-
ного растворителя.

3.	Если это нужно, конъюгаты активированного эфира с гап-
теном могут быть очищены. Единой системы растворителей для
перекристаллизации всех активированных эфиров (все они твер-
дые вещества) нет. В большинстве случаев перекристаллизацию
проводят с последовательной сменой двух растворителей: тепло-
го и холодного изопропанола или этилацетата и петролейного
эфира.

Однако мы нашли, что для воспроизведения описываемого ме-
тода чаще всего нет необходимости в очистке эфиров. Более
важно и намного проще использовать гаптен, очищенный до эте-
7—233
рификации. Избыток N-гидроксисукцинимида (ГСИ) нетоксичен
для клеток (Dannenberg, 1971) и бактериофагов (Н. М. Pohlit,
неопубликованные данные), а дициклогексилкарбодпимид
(ДЦК) может быть легко и количественно инактивирован с по-
мощью НС1 в органическом растворителе. Производные мочеви-
ны (нерастворимые в ДМФ, ДМСО, ТГФ и диоксане) можно
удалить фильтрацией.

Очистка активированных эфиров иногда необходима для точ-
ного дозирования или для удаления возможных нежелательных
продуктов реакции.

4.	ГСК-эфиры совместимы с водой. Хотя в основном они в во-
де не растворяются, ГСИ-радикал удерживает достаточное ко-
личество воды, которая при переносе в реакционную смесь спо-
собствует быстрому и воспроизводимому диспергированию эфи-
ров гаптена, растворенных в ДМФ. Выпадения осадка обычно не
происходит. Эти особенности, а также нетоксичность других хи-
мических веществ, необходимых для реакции, явились решающи-
ми факторами при выборе ГСК-эфиров, а не других соединений,
дающих иные формы карбонильной активации.

5.	Реакции сочетания большинства гаптенов протекают, ве-
роятно, сходным образом, но точный их механизм остается неяс-
ным (Cuatrecasas, Hollenberg, 1976; Wiinsch, 1974; Cuatrecasas,
Parikh, 1972; Merz, Determann, 1969), поскольку некоторые из
наблюдаемых эффектов связаны с процессом синтеза, а другие —
с реакциями активированного эфира. Ситуацию еще больше ос-
ложняют различия в системах растворителей, применявшихся
разными авторами (водная и неводная среды). Тем не менее
можно полагать, что первичный продукт реакции ДЦК с карбо-
ксильными группами обладает высокой реакционной способно-
стью. Он может реагировать со многими нуклеофилами, в том
числе с алифатическими спиртами. В отличие от других нуклео-
филов N-гидроксисукцинимид после реакции с карбоксильной
группой в известной мере сохраняет активацию карбонильного
углерода. Эта пониженная степень активации сообщает ГСК-
эфиру большую стабильность и большую селективность по от-
ношению к нуклеофилам. Такая дифференциальная активация
проявляется в утрате способности ГСК-эфиров реагировать с
ароматическими аминами и в сохранении ее по отношению к али-
фатическим аминам. С другой стороны, карбоксилы, активиро-
ванные ДЦК, очень хорошо реагируют и с алифатическими, и с
ароматическими аминами (Wunsch, 1974).

Активированные ГСК-эфиры не реагируют с алифатическими
и фенольными ОН-группами. Имеются данные о том, что они ре-
агируют с тиоловыми соединениями и «гидролизуются» имидазо-
лом (гистидином) в водной среде (Cuatrecasas, Parikh, 1972).
Они легче вступают в реакцию с а- и е-аминогруппами амино-
кислот в органических растворителях и в водной среде, чем гид-
ролизуются ионами ОН“ (в воде).

Состояние активации карбоксильной группы определяется
прежде всего спиртовым лигандом, но на него могут влиять так-
же радикалы, присоединенные к а-углероду. Во всяком случае,
когда есть основания пренебречь индуктивными и резонансными
эффектами, можно считать, что все соответствующие активиро-
ванные ГСК-эфиры будут реагировать идентично.

Таким образом, местами присоединения гаптена к клетке
(или белку) служат первичные амины с нуклеофильностью не
меньшей, чем у а-аминогрупп аминокислот. Такими местами мо-
гут быть также тиоловые боковые цепи.

6.	Хотя через активированный ГСК-эфир можно присоединить
значительное число гаптенов, метод имеет ряд ограничений. Мно-
гие гаптены содержат карбоксильную группу, которая может не-
посредственно образовывать активированный эфир. Присоедине-
ние гаптенов, имеющих иные (не карбоксильные) реактивные
группы, можно осуществить через «мостики» из молекул, содер-
жащих акцепторную группу для гаптена и карбоксил, способный
этерифицироваться. Так, например, n-сульфодиазобензол снача-
ла присоединяют к n-гидроксифенилуксусной кислоте, а затем
продукт этой реакции этерифицируют; ТНФ присоединяют к
е-аминокапроновой кислоте, с последующей этерификацией ее
карбоксила.

Разнообразие гаптенов, которые можно присоединить с по-
мощью этого метода, весьма велико, однако существуют некото-
рые ограничения. Этерификации может мешать присутствие спир-
товых ОН-групп. Затруднения вызывают также имидазольная
боковая цепь гистидина, гуанидиновая боковая цепь аргинина и
амидная группа глутамина (Wunsch, 1974; Sakaibara, Inukai,
1965). Естественно предположить, что незащищенные аминогруп-
пы затрудняют обычный ход реакции. Причины этих ограниче-
ний, по существу, не исследовались, а чтобы обойти их, прибегали
к соответствующей защите боковых цепей. Следует четко раз-
личать затруднения при образовании эфира и нарушение его
стабильности после образования. Каждая из сторон проблемы
может иметь свое решение. Например, метод трансэтерификации
с использованием ГСК-эфира трифторуксусной кислоты позволя-
ет обойтись без ДНК (Sakaibara, Inukai, 1964, 1965; Fujino et al.,
1972). Еще один метод присоединения — это окислительно-вос-
становительная конденсация с применением трифенилфосфина и
2,2'-дипиридилдисульфида (Mukaiyama et al., 1970а, b).

Подобно другим процессам активации, этерификация карбо-
ксильных групп часто идет очень медленно, если эта группа на-
ходится в конце длинной цепи — порядка 10 аминокислот
(Wiinsch, 1974).
Гаптены, присоединенные через промежуточную молекулу
(«спейсер», или «мостик»), по антигенным свойствам могут от,
личаться от присоединенных непосредственно (Rehn et al., 1976).
Эти различия могут быть обусловлены повышенной свободой
взаимодействия антигена с активным центром специфического
рецептора или антитела; вероятно, так обстоит дело в случае,
ТНФ и ТНФ/АКК; оба гаптена присоединяются, по-видимому, к
идентичным аминогруппам и различаются поэтому только доба-
вочной 6-углеродной цепью спейсера (Becker, Makela, 1975). Ан-
тигенные различия могут объясняться также разными местами
присоединения одних и тех же гаптенов, как, например, в случае
гаптенизации с помощью солей диазония по сравнению с при-
соединением через упомянутую выше п-гидроксифенилуксусную
кислоту. И, наконец, возможно изменение «специфичности» при
наличии «иммунодоминантного» участка на спейсере. Разумеет-
ся, для оценки специфичности антигенного распознавания весьма
важно учитывать, с каким из этих факторов мы имеем дело в
данном эксперименте.

II.	ПРИГОТОВЛЕНИЕ ГСК-ЭФИРОВ

1.	Растворители

Растворители обезвоживают на молекулярных ситах.

2.	Основные растворы

ГСН (Fluka, Букс, Швейцария) и ДЦК (Fluka) хранят при
4°С в виде 1 М основных растворов в ДМФ, ДМСО, диоксане или
ТГФ (выбор растворителя определяется либо растворимостью
производного карбоновой кислоты, которое нужно этерифициро-
вать, либо другими практическими соображениями). Все раство-
рители — продукты фирмы Merck (Дармштадт, ФРГ). В раство-
ре ДЦК со временем наступает частичная кристаллизация, ко-
торой можно пренебречь, если нет значительного уменьшения
концентрации вещества.

3.	Процедура этерификации

Гаптен, имеющий карбоксильную группу, растворяют в под-
ходящем растворителе в концентрации около 0,1 М. ГСИ и ДЦК
из основных растворов добавляют в таком количестве, чтобы соз-
дать их молярный избыток примерно в 10%. Реакционную смесь
оставляют на 1 день при комнатной температуре. Ход реакции
можно контролировать по образованию из ДЦК производного
мочевины, которое благодаря малой растворимости кристалли-
зуется почти количественно. Это происходит в срок от нескольких
минут до 1—2 ч от начала реакции. При существенном замедле-
нии процесса в него могут начать вмешиваться вредные побочные
продукты реакции (Gross, Bilk, 1968).

4.	Выделение ГСК-эфиров для очистки

Нерастворимые производные мочевины удаляют путем филь-
трации, растворитель выпаривают в вакууме, а сухой остаток
переносят в надлежащую систему растворителей для перекри-
сталлизации (например, горячий и холодный изопропиловый
спирт). Кристаллы высушивают в сушильном шкафу при 50°С.
Во время очистки неизбежны большие потери эфиров. Во многих
случаях для гаптенизации клеток и в особенности белковых но-
сителей такая громоздкая процедура очистки и выделения эфи-
ра не обязательна.

5.	Подготовка ГСК-эфиров для сочетания с носителями
без очистки и выделения

Сначала для инактивации непрореагировавшего ДЦК к эте-
рификационной смеси добавляют НС1 (0,5 мл 1 н. НС1 на каж-
дый миллилитр 1 М ДЦК). Через несколько часов отфильтро-
вывают осадок производного мочевины. Полученный раствор
можно использовать непосредственно для сочетания, если ем-
кость буфера, в котором идет эта реакция, достаточна для ней-
трализации прибавленной кислоты; в противном случае нужно
удалить растворитель путем лиофилизации, а затем перевести
твердый осадок в подходящий растворитель для удаления НС1
и HjO, а также остатков продукта реакции мочевины с ДЦК.
Стандартная концентрация гаптен-ГСК-эфира в этом основном
растворе — 0,1 М.

6.	Синтетические гаптены, тестированные в Л ОК

Таблица 1
Гаптены

Сокращенное обозначение	Название (полусистематическое)
НИФ	3-нод-4-гидроксн-5-ннтрофенилуксусная кислота
ТНФ/АКК	Трнннтрофеннл/е-амннокапроновая кислота
С/ГФУ	Производное n-сульфаниловой кислоты
ФХ/ГФУ	Производное фосфорилхолииа
ГФУ	n-Гидроксифенилуксусиая кислота
УК	Уксусная кислота
В табл. 1 приведены названия гаптенов, полученных в ГСК-
активированной форме по описанной методике; они были ис-
пользованы для сочетания с белком, бактериофагами и лимфо-
цитами. Структурные формулы этих гаптенов приведены ниже
(схема 1).

НИ9

NO,

с=о

(CH2)S
соон
ТН4/АКК

Схема 1. Структурные формулы гаптенов.

Свободные кислоты С/ГФУ и ФХ/ГФУ были получены диазо-
тированием сульфаниловой кислоты (С) и и-аминофенилового
эфира фосфорилхолина (ФХ) соответственно и сочетанием с
n-гидроксифенилуксусной кислотой (ГФУ) (условия сочетания:
концентрации С и ФХ~0,05 М; ГФУ — в 10%-ном избытке;
среда — 0,1 М водный раствор бикарбоната с pH 8—9). После
повторного осаждения при низком pH и ресольватации при
pH 8 нужный продукт очищали тонкослойной хроматографией на
силикагеле. Условия хроматографии: изопропиловый спирт —
вода (7 : 3) или изопропиловый спирт— NH4OH — вода (7:2:1);
время фракционирования ~3 ч. Очищенный продукт дает ярко-
красную полосу, за которой идет фиолетовая полоса (скорее
всего это бпс-диазоаналог очищаемого продукта). Полученное
вещество элюировали дистиллированной водой и перекристалли-
зовывали при pH 3—4. Его анализировали с помощью тонкослой-
ной хроматографии, хроматограммы проявляли реактивом Пау-
ли. Этот реактив хорошо выявляет присутствие (или отсутствие)
ГФУ, которая идет впереди полосы синтезированного продукта;
такой анализ позволяет выявить (или исключить) примесь менее
0,2% ГФУ. Другим показателем чистоты служит отношение оп-
тической плотности при 490 нм к плотности при 330 нм, которое
должно быть равно 0,780±0,005. НИФ получали по Браунстоуну
и сотр. (Brownstone et al., 1966), а ТНФ/АКК—-следующим об-
разом: на ледяной бане к 1,0 М раствору е-аминокапроновой кис-
лоты в воде с 1 М NaOH и 0,2 М бикарбонатом прибавляли рас-
творенную в ДМФ ТНФ-сульфоновую кислоту (приблизительно
в 10%-ном избытке); полученный продукт повторно переосажда-
ли при низком pH и высушивали в вакууме над КОН.

Элементарный анализ всех перечисленных свободных гапте-
нов с карбоксильными группами дал отклонения от ожидаемых
величин в пределах ошибки опыта (0,5%). В чистом виде были
получены только УК- и ГФУ-ГСК-эфиры (перекристаллизацией
в системе горячий — холодный изопропанол). По указанным вы-
ше критериям элементарный анализ дал приемлемые результаты.

Коэффициенты оптической плотности синтезированных про-
дуктов приведены в табл. 2.

Таблица 2
Удельные коэффициенты поглощения света

Гаптен			
(сокращенное обозначение)	е (М-)	Длина волны, нм	Условия
ТНФ/АКК	15-Ю3	345	ЗФР
НИФ	4,9-Ю3	430	ЗФР
ФХ/ГФУ 1  С/ГФУ J	11,5-iO3	490	0,1 н. NaOH ЗФР
ГФУ	1,510s	275	

7.	Стандартная методика определения присоединяющей
активности ГСК-эфиров

Если требуется определить концентрацию гаптена в растворе
белка (например, по оптической плотности или радиоактивной
метке), проста и надежна следующая методика.

Быстро диспергируют 10 мкл 0,1 М раствора ГСК-эфира (или
его разведений в ДМФ) в 1 мл смеси из 9 частей 1 %-кого рас-
твора БСА в ЗФР и 1 части 1 М бикарбоната (оба раствора хра-
нят в качестве основных). Если гаптен поглощает в ультрафиоле-
те только в области 280 нм, вместо БСА используют полилизин
с мол. весом более 10 000. В реакционной смеси нужно поддер-
живать pH между 8 и 9. Через 30 мин берут пробу, чтобы опре-
делить общую концентрацию гаптена (если она не регистриру-
ется автоматически). Остальную порцию диализуют в течение
24 ч (или дольше) против 100—1000-кратного объема ЗФР.
Если все сделано правильно, разбавления диализуемого матери-
ала не происходит. Определение концентрации гаптена после
диализа позволяет судить об эффективности присоединения.
Опыт показывает, что, если нет каких-либо особых причин для
более низкого выхода, эффективность сочетания лежит в преде-
лах 30—80%.

Ложное сочетание (минуя белок) имеет обычно постоянную
величину эффективности связывания ниже 0,5%. Однако иногда
«связывание» вызывается нековалентной адсорбцией гаптена в
форме кислоты (это было показано путем прямого добавления
гаптена-кислоты к тестируемому раствору, как в описанном выше
опыте с гаптен-ГСК-эфиром, с последующим определением удер-
жания гаптена белком). Этот эффект достаточно воспроизводим
и зависит в основном от степени гидрофобности гаптена. Так, на-
пример, С/ГФУ практически не дает нековалентной адсорбции,
однако в случае ГФУ за 20 ч диализа адсорбция достигает при-
мерно 20%, а с аналогами пропионовой кислоты получаются еще
большие величины.

III. ПРИСОЕДИНЕНИЕ ГАПТЕНОВ К НОСИТЕЛЯМ

А. Условия присоединения гаптенов к клеткам

Клетки отмывают несколько раз в ЗФР, чтобы удалить с их
поверхности свободные белки н другой материал, способный кон-
курировать с клеткой за гаптен. Затем клетки суспендируют до
концентрации 107 в 1 мл (в случае лимфоцитов) или 10% (в слу-
чае эритроцитов) и добавляют 2% основного раствора боратного
буфера (до конечного pH 8,2). К 20 частям клеточной суспензии
добавляют 1 часть соответствующего разведения гаптен-ГСК-
эфиров (обычно в ДМФ). Через 20 мин (время, достаточное для
завершения реакции) клетки тщательно отмывают. Общий выход
клеток, обычно без значительного снижения жизнеспособности,
составляет 70—100%.

Поскольку ДМФ растворяет некоторые пластмассы, нужно
соблюдать осторожность при выборе пипеток и пробирок. Акти-
вированный эфир сохраняет стабильность в пластике, резистент-
ном к этому растворителю, но все-таки лучше работать со
стеклом.
Б. Выявление гаптенов на клетках

1.	Агглютинация

Если плотность гаптена на клетках достаточно высока (при
конечной концентрации эфира около 10-4 М), можно качественно
тестировать его присутствие с помощью агглютинации. Для этого
на предметное стекло наносят две капли взвеси обработанных
гаптеном клеток (приблизительно по 10 мкл). К первой капле
добавляют 3 мкл специфической антисыворотки к гаптену, ко
второй — контрольную (нормальную) сыворотку. Обе сыворотки
предварительно истощают лимфоцитами. Чтобы клетки могли
свободно передвигаться, предметное стекло медленно покачива-
ют в течение 15 с. Если сочетание с гаптеном прошло успешно,
в первой капле под микроскопом отчетливо видны крупные агре-
гаты. Однако в реакции агглютинации слабая антисыворотка мо-
жет не выявить гаптен, присоединенный с низкой плотностью,
даже в тех случаях, когда этой плотности достаточно для бласт-
трансформации и ЛОК.

2.	Лизис

Антитела к гаптену в присутствии комплемента могут вызы-
вать лизис клеток при очень низкой плотности гаптена. Учиты-
вать лизис можно по исключению красителя (трипанового сине-
го) или по освобождению радиоактивного хрома 51Сг. Учет ли-
зиса по меченому хрому затруднителен при работе с нормальны-
ми (нестимулированными) клетками селезенки, но обычно
вполне пригоден для работы с опухолевыми клетками и лимфо-
бластами.

3.	Определение радиоактивности меченых гаптенов

Принцип метода очевиден. Нужно только иметь в виду, что
по радиоактивности здесь определяется не только гаптен, связан-
ный на клеточной поверхности, но и гаптен, диффундировавший
внутрь клетки или активно захваченный ею. Доля гаптена, попав-
шего внутрь клетки, может быть значительной, но она не отра-
жает степени гаптенизации.

В. Присоединение гаптенов к бактериофагам

Гаптенизацию бактериофагов мы рассмотрим на примере при-
соединения гаптена С/ГФУ к фагам f2 и Qfi. Эти бактериофаги
не теряют инфекционности даже в 25 %-ном растворе ДМФ, Су-
спензию фаговых частиц очищали в градиенте хлористого цезия
Рис. 1. Бактериофаги f2 в концентрации 10'5 частиц в 1 мл были гаптенизиро-
ваны С/ГФУ при различных исходных концентрациях гаптена (абсцисса).
Определяли иифекциоииость фаговых частиц (т. е. число стерильных пятеи иа
1 частицу фага) (II), число молекул гаптеиа иа 1 частицу фага (///),эффектив-
ность гаптеиизации (отиошеиие количества гаптеиа, связанного с фаговыми
частицами, к общему количеству виесениого гаптеиа) (IV) и степень инакти-
вации гаптеиизироваииых фаговых частиц в избытке сыворотки анти-С/ГФУ
(/). Устойчивость фагов, конъюгированных при высоких концентрациях гап-
тена, к аитигаптеиовой сыворотке пока не получила объяснения.

до и после сочетания с гаптеном. Очищенные препараты фагов
длительно диализовали против ЗФР. Соотношения гаптена и
фага определяли по поглощению при 490 нм в 0,1 н. NaOH
(е= 11,5-103 М-1) и при 260 нм (А = 48 для 1015 частиц в 1 мл).
Нормальная инфекционность этих фагов — около 15% или менее.

Процедура присоединения заключается в следующем.
К 50 мкл 1 М бикарбоната прибавляют 0,5 мл суспензии фаговых
частиц в ЗФР и охлаждают на льду; затем добавляют
50 мкл разведения С/ГФУ-ГСК-эфира в ДМФ. При конечной
концентрации С/ГФУ 10 или 5 мМ может происходить легкая
преципитация, что указывает на гипергаптенизацию. Результаты
представлены на рис. 1. При низких концентрациях С/ГФУ-ГСК-
эфиров связывание гаптена фагом почти пропорционально кон-
центрации гаптена; по мере повышения концентрации гаптена
эффективность связывания его фагом падает с 43 до 9%. Насы-
щение наступает тогда, когда на одну фаговую частицу прихо-
дится около 360 молекул гаптена. Интересно, что это число ровно
вдвое больше числа субъединиц в оболочке фага (180 единиц с
мол. весом 13 700; 6 остатков лизина и 2 остатка цистеина на еди-
ницу).

IV. УСЛОВИЯ лок в культуре1

А. Реагенты и материалы

Среда: RPMI 1640, 10 мМ ГЭПЭС, 5-10_5 М 2-меркаптоэта-
нол, глутамин, пенициллин+стрептомицин (5000 ед/мл) и 10%
СПК.

Среда для отмывания: RPMI 1640, 10 мМ ГЭПЭС и 10% СПК.

ЗФР: 0,05 М фосфат и 0,9% NaCl.

Основной боратный буфер: 13,35 г Na2B4O7-ЮНгО (0,035
моль) и 4,6 г NaCl (0,08 моль) на 1 л дистиллированной воды;
pH 9,1—9,2.

ЗФР-боратный буфер: 1 часть основного боратного буфера +
+ 50 частей ЗФР; pH ~8.

Стимулирующие клетки: клетки селезенки [эритроциты удаля-
ют лизисом с помощью NH4CI в растворе Гея; для удаления по-
гибших клеток фильтруют суспензию через стеклянную вату в
буфере с низкой ионной силой (von Boehmer, Shortman, 1973)].
Клетки дважды отмывают в ЗФР, суспендируют в ЗФР-боратном
буфере для гаптенизации; после тщательного отмывания клетки
облучают (2000 рад) и снова отмывают; конечная концентрация
клеток в культуре — 1,5-106 в 1 мл.

«Отвечающие» клетки: клетки селезенки, отмытые один раз
в ЗФР; конечная концентрация — 3—4-Ю6 в 1 мл.

Клетки-мишени: опухолевые клетки или 2—3-дневная куль-
тура клеток селезенки (2- 10б клеток в 1 мл), стимулированная
ЛПС (50 мкг/мл); к осадку клеток прибавляют по 100 мкл
51Сг-хромата натрия (500—1000 мКи/мг, 10 мКи/мл) на каждые
107 клеток; инкубируют 1 ч при 37°С; затем клетки очищают в
градиенте фиколла (d= 1,077), дважды отмывают в ЗФР и ре-
суспендируют в ЗФР-боратном буфере для гаптенизации.

1 Дополнительные сведения читатель найдет в статье Nabholz et al., 1974.
Б. Исследование цитотоксичности

1.	Получение лимфоцитов, обладающих цитотоксической
активностью

Обычно «отвечающие» клетки культивируют 5—6 дней, затем
осаждают центрифугированием (10 мин при 1000 об/мин) и ресу-
спендируют в отмывающей среде в объеме, равном одной трети
исходного.

2.	Постановка опыта

Тест проводится в панелях для микротитрования с кругло-
донными лунками. Клетки суспендируют в среде, используемой
для отмывания. В лунку наливают 0,1 мл взвеси клеток-мишеней
(2* 105 клеток в 1 мл) и по 0,1 мл разных разведений «отвечаю-
щих» клеток (по меньшей мере три разведения с трехкратным
шагом). Панель центрифугируют 10 мин при 100 об/мин, инку-
бируют 3—4 ч при 37°С в атмосфере СОг; осаждают клетки, цент-
рифугируя 10 мин при 1000 об/мин, и отбирают по 100 мкл над-
осадочной жидкости. Специфическую киллерную активность вы-
ражают в процентах и определяют следующим образом: число
распадов в минуту на 100 мкл надосадочной жидкости делят на
общую радиоактивность клеток-мишеней (перед этим из обеих
величин вычитают радиоактивность 15Сг, спонтанно освобождаю-
щегося в отсутствие «отвечающих» клеток).

V. ВЫВОДЫ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ ОЦЕНКИ ЛОК

В ОТНОШЕНИИ ЛИМФОЦИТОВ, НАГРУЖЕННЫХ
ГАПТЕНОМ

1.	ДМФ не оказывает заметного влияния на гаптенизирован-
ные клетки-мишени и стимулирующие клетки (рис. 2).

2.	Химические воздействия во время гаптенизации не вызы-
вают повреждения лимфоцитов. Из рис. 3 видно, что клетки,
гаптенизированные ацетил-ГСК-эфиром, не вызывают бласт-
трансформации и не лизируются ни одной из сингенных популя-
ций «отвечающих» клеток.

3.	Вопрос о специфичности ЛОК-ответа на клетки, конъюги-
рованные с гаптеном, не ясен. На рис. 3 видна определенная сте-
пень специфичности к гаптенам в реакции «отвечающих» клеток
на мишени, гаптенизированные С/ГФУ и ГФУ, чего и следовало
ожидать ввиду некоторого структурного сходства между этими
двумя гаптенами. Однако рис. 4 демонстрирует неожиданные пе-
рекрестные реакции в ЛОК-ответе клеток, конъюгированных с
Рис. 2. Клетки селезенки нормальных мышей линии СВА стимулировали in
vitro сингенными клетками селезенки, гаптеиизироваииыми НИФ — ГСК
(50 мкМ) при разных конечных концентрациях ДМФ: 1% (черные кружки),
3,3% (квадратики) или 10% (треугольники), а также аллогенными клетками
от мышей линии DBA (белые кружки). Клетками-мишеиями служила 5-днев-
иая культура лимфобластов, стимулированных ЛПС на 3-й день, которые бы-
ли гаптеиизированы НИФ-ГСК аналогичным образом. Отвечающие клетки не
поражали иегаптенизяроваииые клетки-мишеии (на рисунке не показано).

1/27 1/9 1/3 1/1

С/Г9У-СВА.

Рис. 3. Мышей линии СВА иммунизировали клетками селезенки, гаптенизи-
роваииыми С/ГФУ (150 мкМ) (черные кружки), ГФУ (1,5 мМ, белые кружки)
или У (1,5 мМ) (треугольники). Клетки селезенки этих мышей рестнму-
лировали in vitro клетками селезенки, конъюгированными с теми же гаптена-
ми в тех же дозах, кроме С/ГФУ, для которого была взята концентрация
50 мкМ. Цитотоксическую активность определяли через 5 дней культивирова-
ния иа бластах, стимулированных за два дня до опыта ЛПС; эти бласты были
конъюгированы с гаптенами в тех же условиях, что и клетки-стимуляторы.
НИФ-DM

Рис. 4. Клетки селезенки нормальных мышей Fi(CBAxDBA) были стимули-
рованы in vitro клетками СВА (черные кружки и квадратики) или DBA (бе-
лые кружки и квадратики), конъюгированными с НИФ-ГСК (50 мкМ) (круж-
ки) или с ТНФ/АКК (50 мкМ) (квадратики). Цитотоксическую активность
определяли иа 5-диевиой культуре бластов, стимулированных за 2 дня до
опыта ЛПС. Бласты были конъюгированы с гаптеном, указанным над гра-
фиком. Нижние графики: слева — ТНФ/АКК-СВА, справа — ТНФ/AKK-DBA.

НИФ и с ТНФ/АКК; здесь можно также заметить неполное, но
ясно выраженное ограничение киллерной активности сходством
стимулирующих клеток и клеток-мишеней по генам локуса Н-2.

X. М. Полит выражает глубокую благодарность д-ру Д. Гил-
лесену (фирма Hoffman — La Roche) за просмотр рукописи, цен-
ные советы и постоянные, весьма плодотворные критические об-
суждения многих методических вопросов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Atassi М. Z., ed. (1977). Immunochemistry of Proteins, Vol. I, Plenum, New
York.

Becker M., Makela 0. (1975). Immunochemistry, 12, 329.

Becker M. J., Conway-Jacobs A., Wilchek M., Haimovich J., Sela M. (1970).

Immunochemistry, 7, 741.

Brownstone A., Mitchison N. A., Pitt-Rivers R. (1966). Immunology, 10, 465.

Cuatrecasas P., Hollenberg M. (1976). Adv. Protein Chem., 30, 295.

Cuatrecasas P., Parikh J. (1972). Biochemistry, 11, 2291.

Dannenberg H. (1971). Z. Krebsforsch., 76, 216.

Fujino M., Hatanaka C., Mitsuno Y. (1972). Chem. Abstr., 76, 127429.

Gross H., Bilk L. (1968). Tetrahedron, 24, 6935.

Jacoby W. B., Wilchek M., eds. (1974). Methods in Enzymology, Vol. 34, Aca-
demic Press, New York.

Koren H. S., Wunderlich J. R., Inman J. K- (1975). Transplant. Proc. ,7, Suppl.

1,	169.

Merz D., Determann H. (1969). Justus Liebigs Ann., 728, 215.

Mukaiyama T., Matsueda R., Suzuki M. (1970a). Tetrahedron Lett., 22, 1901.

Mukaiyama T., Goto K-, Matsueda R., Ueki M. (1970b). Tetrahedron Lett.
No. 60, P5293.

Nabholz M., Vives J., Young H. M., Meo T., Miggiano V., Rijnbeck A., Shref-
fler D. C. (1974). Eur. J. Immunol., 4, 378.

Rehn T. G., Inman J. K., Shearer G. M. (1976). J. Exp. Med., 144, 1134.

Sakaibara S., Inukai N. (1964). Bull Chem. Soc. Jpn., 37, 1231.

Sakaibara S., Inukai N. (1965). Bull. Chem. Soc. Jpn., 38, 1979.

Schmitt-Verhulst A., Shearer G. M. (1976). J. Immunol., 116, 947.

Shearer G. M. (1974). Eur. J. Immunol., 4, 257.

Starzinski-Powitz A., Pfizenmaier K-, Rollinghoff M., Wagner H. (1976). Eur.

J.	Immunol., 6, 799.

von Boehmer H., Shortman K. (1973). J. Immunol. Methods, 2, 293.

Wunsch E. (1974). In: Methoden der organischen Chemie (E. Muller, ed.), 4th
ed. Vol. XV, p. 149 ff, Thieme, Stuttgart.
ПОЛУЧЕНИЕ И АНАЛИЗ МЫШИНЫХ
АНТИАЛЛОТИПИЧЕСКИХ СЫВОРОТОК

Дж. Джонсон

Молекулы иммуноглобулинов состоят из четырех полипептид-
ных цепей: двух одинаковых тяжелых и двух одинаковых легких.
У мышей обнаружено 6 различных классов тяжелых цепей. Тип
тяжелой цепи, собственно, и определяет класс целой молекулы
иммуноглобулина с присущими ему уникальными биологически-
ми свойствами. Каждая из линий мышей обладает всеми клас-
сами иммуноглобулинов, однако в результате проявления аллель-
ных генов между тяжелыми цепями данного класса у разных ли-
ний мышей существуют структурные (аллотипические) различия.
Иммунизируя мышей одной линии иммуноглобулином другой ли-
нии, можно получать антитела, распознающие эти аллотипиче-
ские различия (Herzenberg et al., 1968). В этой главе будет де-
тально описан способ получения и анализа мышиных антиалло-
типических сывороток (рис. 1). Мышей исследуемого аллотипа
гипериммунизируют суспензией Proteus mirabilis, убитой нагре-
ванием. Полученные иммунные сыворотки смешивают с бакте-
риальной массой, и при этом образуются нерастворимые иммун-
ные комплексы, содержащие антитела нужного аллотипа. Таки-
ми иммунными комплексами иммунизируют мышей другого
аллотипа, у которых образуются антитела к чужеродным для них
детерминантам тяжелых цепей, входящих в состав иммунных
комплексов. Описанная ниже методика позволяет получать анти-
тела, направленные главным образом против аллотипов тяже-
лой цепи IgG2a, которые кодируются локусом Ig-1 (Herzenberg
et al., 1968; Herzenberg, Herzenberg, 1973).
\

la «-Proteus

Ig-lb «-Proteus

YYY
a a a

Protgus
mirabilis

YYY
b b b

Комплексы .
Proteus-l^Ao.
«-Proteus

Комплексы
Proteus-l$-Vo
«-Proteus

ct-Ig-ib

ce^Ig-la

Рис. 1. Получение мышиных антиаллотипических сывороток.
I. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИАЛЛО^ИПИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

А. Приготовление сывороток к протею

1.	Реагенты и приборы

Proteus mirabilis (№ 9921, American Type Culture Collec-
tion, Роклэнд, США)

Косяки с обогащенным питательным агаром
Обогащенный питательный бульон
1%-ный раствор ВаС1г

1	%-ный раствор H2SO4 х. ч.

Физиологический раствор (0,85% NaCl)
Фотоэлектроколориметр

Водяная баня или термостат на 37°С

Десять стеклянных пробирок 10X75 мм

Десять оптически стандартных стеклянных пробирок
120Х10 мм

2.	Методика

а.	Культуру Proteus mirabilis поддерживают на косяках обо-
гащенного питательного агара, например с декстрозофосфатом.
Чтобы приготовить взвесь бактерий для иммунизации, культуры
засевают на бульон в пол-литровые флаконы и выращивают 48 ч
при 37°С. Эти культуры убивают нагреванием, собирают клетки
путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 30 мин,
трижды отмывают физиологическим раствором, автоклавируют
и хранят при 4°С. Для определения количества бактерий в милли-
литре пользуются стандартами Мак-Фэрлэнда (табл. 1). Эти
стандарты представляют собой ряд пробирок, содержащих взвесь
различных количеств частиц BaSCU, мутность которой соответст-
вует мутности бактериальных суспензий известной концентрации
(см. также Campbell et al., 1970). Стандарты приготовляют в
оптически стандартных пробирках, которые затем закрывают и
герметизируют, погружая верхний конец в расплавленный пара-
фин. Концентрацию протея в испытуемой взвеси определяют
визуально по мутности или с помощью фотоэлектроколориметра
по светопоглощению, просто сравнивая разные разведения со
стандартами или пользуясь кривой светопоглощения стандарт-
ных взвесей.

б.	Мышей, имеющих соответствующий аллель Ig-1 (см.
табл. 2), иммунизируют 3—4 раза с интервалом 7—10 дней, вво-
дя внутрибрюшинно по 109 клеток протея в физиологическом рас-
творе.
Приготовление стандартов Мак-Фэрлэнда

Таблица 1

Номер пробирки	Состав		Эквивалентная концентрация бактерий в 1 мл, Х10«
	1%-ный ВаС12, мл	1%-ная H8SO4, мл	
1	0,1	9,9	300
2	0,2	9,8	600
3	0,3	9,7	900
4	0,4	9,6	1200
5	0,5	9,5	1500
6	0,6	9,4	1800
7	0,7	9,3	2100
8	0,8	9,2	2400
9	0,9	9,1	2700
10	1,0	9,0	3000

Таблица 2

Локус Ig-1

Линия мышей	Аллель	Специфичности											
BALB/c	а	1	2							6	7	8			10			12
C57BL/6J	ь	—	—			4	—	——	7	—				—			—
DBA/2J	с	—	2	3	—	—	—-	7	—						—
AKR/J	d	1	2	—	—	5	—	7	—	—	—	—	12
A/J	е	1	2	—	—	5	6	7	8		—-			12
CE/J	f	1	2	—	—	—	—	—	8	—	—	11		
RI11/J	g	—	2	3					—				
SEA/Gn	h	1	2	—	—	—	6	7	—	—	10	—	12

в.	После последней инъекции у мышей берут кровь, приготов-
ляют смешанную сыворотку и определяют титр антител к про-
тею в реакции бактериальной агглютинации. Для этого готовят
серию двукратных разведений антисыворотки в физиологиче-
ском растворе следующим образом: 10 пробирок 10x75 мм ну-
меруют и во все, кроме первой, наливают по 0,5 мл физиологи-
ческого раствора; в первую пробирку к 0,95 мл физиологического
раствора добавляют 0,05 мл сыворотки, перемешивают и 0,5 мл
смеси переносят во вторую пробирку, затем из второй пробирки
0,5 мл переносят в третью и т. д. После этого к каждой пробирке
прибавляют по 0,5 мл взвеси Proteus в физиологическом раство-
ре (5- 10е клеток в 1 мл), перемешивают и пробирки центрифуги-
руют 10 мин при 1000 об/мин. Реакцию агглютинации считают
положительной, если в пробирке появляется осадок, дающий
крупные хлопья при осторожном постукивании по нижней части
пробирки. За титр антисыворотки принимают ее наибольшее раз-
ведение, еще вызывающее агглютинацию.

Б. Получение иммунных комплексов

1.	Реагенты

Сыворотка к протею

Убитый нагреванием Proteus mirabilis
Физиологический раствор (0,15 М NaCl)
Полный адъювант Фрейнда

2.	Методика

а.	Сыворотку к протею разводят физиологическим раствором
до десятикратного титра (например, если титр сыворотки
1 : 320, готовят разведение 1 : 32).

б.	Разведенную антисыворотку смешивают с осадком отмы-
тых бактерий (1010 клеток на 1 мл антисыворотки) и инкубиру-
ют 30 мин при комнатной температуре.

в.	Полученные комплексы трижды отмывают 10 объемами фи-
зиологического раствора, центрифугируя 10 мин при 2500 об/мин,
осадок ресуспендируют в физиологическом растворе, доводя объ-
ем взвеси до объема разбавленной антисыворотки, и смешивают
с равным объемом адъюванта.

В. Получение антиаллотипических сывороток

Выбор линии мышей — продуцентов антиаллотипической сы-
воротки зависит не только от того, какой аллель, контролирую-
щий аллотипическую детерминанту, имеет данная линия, но и от
присутствия в ее генотипе генов иммунного ответа, как сцеплен-
ных, так и не сцепленных с комплексом Н-2 (Lieberman,
Humphrey, 1971 Dorf et al., 1974). Например, высокоактивную
сыворотку к аллотипу Ig-lb можно получить, иммунизируя мы-
шей BALB/c, но не СЗН; аналогичным образом мыши LP/j дают'
более активную сыворотку анти-Ig-la- чем мыши C57BL/6. Мы-
шей иммунизируют иммунными комплексами, вводя внутри-
брюшинно по 0,1 мл с недельными интервалами в течение 4 не-
дель. Через 7—10 дней после последней инъекции у мышей
берут кровь, оставляя их живыми, и индивидуально определяют
антиаллотипическую активность сывороток. Сыворотки со сход-
ными титрами объединяют. Мышей реиммунизируют каждые
4 недели и каждую неделю берут кровь.
II. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА
АНТИАЛЛОТИПИЧЕСКОИ СЫВОРОТКИ

Активность антиаллотипических сывороток часто можно-тес-
тировать в реакции преципитации в геле, однако не все сыворот-
ки мышей содержат преципитирующие антитела. В качестве бо-
лее чувствительного метода применяют реакцию пассивной
гемагглютинации, которая, кроме того, легче поддается количе-
ственному учету. Можно обработать эритроциты формальдеги-
дом, ковалентно присоединить к их поверхности иммуноглобулины
нужного аллотипа и работать с одной и той же серией таких
индикаторных клеток по меньшей мере в течение 6 месяцев. По-
становка реакции гемагглютинации в микротитраторе позволяет
за короткое время оттитровать большое количество индивидуаль-
ных сывороток.

Л. Получение формалинизированных бараньих эритроцитов
(ФБЭ)

1.	Реагенты и приборы

Бараньи эритроциты (БЭ)

Физиологический раствор хлористого натрия, забуферен-
ный фосфатами (ЗФР), с pH 7,2, 0,15 М.

3%-ный нейтрализованный формалин (формальдегид раз-
водят до 3% в физиологическом растворе и pH подводят
до 7,0)

Водяная баня или термостат на 37°С с вращающимся шта-
тивом

Тимеросал (этилмеркуритиосалицилат натрия)

2.	Методика

а.	БЭ отмывают три раза в ЗФР и готовят 8%-ную суспензию
которую смешивают с равным объемом 3%-ного нейтрализован-
ного формалина в колбе Эрленмейера и осторожно перемешива-
ют в течение 18—20 ч при 37°С. Колбу заполняют только на одну
треть и избегают вспенивания.

б.	ФБЭ отмывают 5 раз в ЗФР и хранят в виде 10%-ной сус-
пензии в фосфатном буфере, содержащем 0,01 % тимеросала.
Б. Конъюгирование ФБЭ с антигеном

1. Приготовление бис-диазотированного бензидина (БДБ)
(Campbell et al., 1970)

а. Реагенты

Бензидин. (Внимание! Бензидин — канцероген; следует
исключить контакт с кожей.)

NaNC>2 (нитрит натрия)

6 н. НС1

Охлаждающая смесь: ацетон — сухой лед; ледяная баня
Иод-крахмальная индикаторная бумага
0,11 М. фосфатный буфер с pH 7,4

б.	Методика

I.	При постоянном перемешивании к 0,23 г бензидина прибав-
ляют 25 мл дистиллированной воды, затем по каплям добавляют
1,5 мл 6 и. НС1; продолжают перемешивать еще 5 мин. Снова до-
бавляют 26 мл дистиллированной воды и снова по каплям —
1,5 мл 6 н. НС1. Перемешивание продолжают, пока бензидин не
растворится полностью.

II.	Раствор охлаждают до 0°С в смеси ацетон — сухой лед.
Когда появятся кристаллы льда, раствор можно перенести на
ледяную баню.

III.	Растворяют 0,25 г NaNC>2 в 2,5 мл дистиллированной воды
и при непрерывном перемешивании пипеткой вносят в раствор
бензидина. Контролируют избыток нитрита с помощью иод-крах-
мальной бумажки. Перемешивание продолжают до тех пор, пока
не перестанет определяться свободный нитрит, окрашивающий
иод-крахмальную бумажку в пурпурный цвет.

IV.	Полученный основной раствор БДБ стандартизуют сле-
дующим образом. Наливают в пробирку 0,5 мл раствора и при-
бавляют 7 мл фосфатного буфера. Цвет из лимонно-желтого ста-
новится густым красновато-коричневым, и через 90 с после вне-
сения буфера появляется муть. Если через 95 с таких изменений
не происходит, в основной раствор БДБ нужно прибавить не-
сколько кристаллов бензидина. Если же эти изменения насту-
пают раньше, чем через 85 с, прибавляют небольшое количество
NaNO2 и тест-реакцию повторяют.

V.	На бане с ацетоном и сухим льдом стандартизованный
БДБ разливают порциями по 0,5 мл и хранят при —70°С.

2.	Выделение у-глобулина

а.	Реагенты и приборы

Сефадекс G-200 (Pharmacia, Упсала, Швеция)

Насыщенный раствор сульфата аммония (NH4)2SO4 с pH 7
0,1 М. трис-НСЬбуфер, содержащий 1,0 М. NaCl с pH 8 —
для сефадекса G-200

Хроматографическая колонка 1,0x75 см

Коллектор фракций с автоматической абсорбциометрией
в ультрафиолете

Спектрофотометр

Полиэтиленгликоль 20 000

б.	Методика

Иммуноглобулин нужного аллотипа выделяют из смеси сыво-
роток или из миеломных асцитических жидкостей мышей (если
имеется соответствующая миелома). Глобулин выделяют соле-
вым фракционированием с последующей гель-фильтрацией.

1.	Сыворотку или асцитическую жидкость разводят равным
объемом физиологического раствора и затем для осаждения бел-
ка прибавляют по каплям равный объем насыщенного раствора
сульфата аммония при 4°С, непрерывно перемешивая. Смесь
оставляют при перемешивании на 2—8 ч при 4°С, выпавший оса-
док собирают с помощью центрифугирования при 6000 об/мин в
течение 20 мин и растворяют в первоначальном объеме физиоло-
гического раствора. Процедуру осаждения повторяют еще два
раза. Третий осадок растворяют в минимальном объеме физио-
логического раствора и наносят на колонку сефадекса G-200.

II.	Сефадекс G-200 гидратируют обычным способом. Гель де-
заэрируют и упаковывают колонку при постоянном гидростати-
ческом давлении 6—8 см.

II	I. Колонку промывают в течение ночи, затем наносят на
нее раствор выделенного осаждением белка и пускают ток жид-
кости при давлении 6—8 см. Собирают фракции по 5 мл и реги-
стрируют поглощение при 280 нм. Фракции второго пика, содер-
жащие главным образом 7S-IgG, объединяют и концентрируют.
Для концентрирования выделенную фракцию иммуноглобулинов
можно поместить в закрытый диализный мешок, обсыпанный сна-
ружи порошком полиэтиленгликоля, при 4°С. Концентрат анали-
зируют в иммуноэлектрофорезе с кроличьей антисывороткой к
белкам сыворотки мыши. Концентрацию белка определяют по
Лоури.

3.	Присоединение иммуноглобулина к ФБЭ

Соотношения реагентов для конъюгации нужно подбирать эм-
пирически. Раствор белка в количестве от 0, 01до 0,5 мг смеши-
вают со 100 мкл 50 %-ной взвеси ФБЭ и инкубируют в водяной
бане при 37°С. БДБ размораживают, разводят 1 : 15 фосфатным
буфером и прибавляют в объеме 10—50 мкл к смеси эритроцитов
с белком. Смесь осторожно перемешивают 20 мин, затем эритро-
циты; отмывают 5 раз в 10-кратном объеме фосфатного буфера.
«Нагруженные» эритроциты хранят при 4°С в виде 0,1 %-ной сус-
пензии в фосфатном буфере с 0,01% тимеросала.

В. Титрование

1.	Реагенты и приборы

ФБЭ, «нагруженные» иммуноглобулином определенного
аллотипа (0,1%)

1%-ная нормальная кроличья сыворотка в 0,11 М. фосфат-
ном буфере с pH 7,4

Камеры микротитратора с лунками V-типа из гибкого
пластика (Cooke Engineering, Александрия, США)
Капельная пипетка, дающая каплю объемом 25 мкл
Микросмесительная петля объемом 25 мкл

2.	Методика

Активность мышиных антиаллотипических сывороток тести-
руют индивидуально в реакции пассивной гемагглютинации. Ре-
акцию ставят в микротитраторе с V-образными лунками. Серию
разведений испытуемых сывороток готовят с помощью микросме-
сительной петли на 25 мкл.. В каждую лунку с разведениями сы-
воротки прибавляют сенсибилизированные ФБЭ (25 мкл), пере-
мешивают и инкубируют при комнатной температуре. Титром
сыворотки считают величину, обратную ее наибольшему разве-
дению, проявляющему несомненную агглютинирующую актив-
ность. Иммунная сыворотка не должна давать положительной
реакции с «несенсибилизированными» ФБЭ. В противном случае
сыворотку следует абсорбировать БЭ. Однако чаще всего эта
нежелательная активность не проявляется в разведениях выше
1:20. Титр антиаллотипической сыворотки при таком тестиро-
вании обычно бывает от 1 : 125 до 1 : 10 240.

Г. Контроли

Для подтверждения специфичности антиаллотипической сы-
воротки нужны следующие контроли.

1.	ФБЭ, «нагруженные» иммуноглобулином, не должны аг-
глютинироваться разбавляющей жидкостью, которая содержит
1 % нормальной кроличьей сыворотки.

2.	Сыворотка данного аллотипа должна тормозить агглюти-
нацию «нагруженных» эритроцитов, конкурируя с ними за анти-
аллотипические антитела. Например, если смешать 25 мкл сыво-
ротки анти-Ig-lb с 1 мкл Ig-lb нормальной мышиной сыворотки,
то подученная смесь уже не способна агглютинировать Ig-lb-
ФБЭ. В то же время нормальная сыворотка мыши другого алло-
типа (например, Ig-1а) не тормозит агглютинации. Это тормо-
жение агглютинации зависит от определенного аллотипа имму-
ноглобулина, что можно доказать, использовав конгенных по ал-
лотипу мышей. Мыши CWB (Ig-lb) и C3H.SW(Ig-la), а также
CB.20(Ig-lb) и BALB/c(Ig-la) — это конгенные пары, члены ко-
торых различаются только по участку хромосомы, несущему со-
ответствующие аллели. В реакции агглютинации сыворотки
CWB и СВ.20 будут тормозить активность сыворотки анти-Ig-lb,
но не анти-Ig-la.

III. ПРИМЕНЕНИЕ

Описанную реакцию гемагглютинации можно, видоизменив,

ФБЭ, нагруженные 1д

АГГЛЮТИНАЦИЯ

Рис. 2. Схема определения Ig данного аллотипа.
использовать для количественного определения иммуноглобули-
нов того или другого аллотипа. Для этого необходимо иметь стан-
дартную серию «нагруженных» эритроцитов и антиаллотипиче-
скую сыворотку. В лунки микротитратора, содержащие различ-
ные разведения антиаллотипической сыворотки и «нагруженные»
эритроциты, добавляют известные количества очищенного имму-
ноглобулина данного аллотипа. Затем определяют, каково наи-
меньшее разведение антиаллотипической сыворотки, при котором
ее агглютинирующую активность тормозит та или иная концент-
рация добавленного иммуноглобулина (рис. 2). Полученные дан-
ные позволяют построить стандартную кривую зависимости тор-
можения реакции от количества (в микрограммах) добавляемого
иммуноглобулина. По этой кривой можно определить содержа-
ние иммуноглобулина данного аллотипа в испытуемом образце.

Идентификация и количественное определение иммуноглобу-
линов различных аллотипов открывают возможности для изуче-
ния регуляции аллельного исключения и для выяснения взаимо-
связи между аллотипией антител'и их специфичностью. Кроме
того, аллотип может служить маркером, позволяющим опреде-
лять происхождение антителообразующих клеток в опытах с
адоптивным переносом или у иммунологических химер.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Campbell D. Н., Garvey J. S., Cremer N. Е., Sussdorf D. H., eds. (1970). Methods
in Immunology, Benjamin, Reading, Massachusetts.

Dorf M. E., Dunham E. K., Johnson J. P., Benacerraf B. (1974). J. Immunol.,
112, 1329.

Herzenberg L. A., Herzenberg L. A. (1973). Handbook of Experimental Immuno-
logy, Blackwell, Oxford.

Herzenberg L. A., McDevitt HO., Herzenberg L. A. (1968). Annu. Rev. Genet.,
2, 209.

Lieberman R., Humphrey W., Jr. (1971). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 2510.
Глава 13

ПОЛУЧЕНИЕ МЫШИНЫХ АНТИСЫВОРОТОК
К АНТИГЕНАМ ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ

К.. Фатман

I.	ВВОДНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Со времени первоначального описания группового эритроци-
тарного антигена II (Gorer, 1937) изучение генетики главного
комплекса гистосовместимости (МНС) у мышей развивается на-
растающими темпами (обзор: Shreffler, David, 1975). Огромное
значение для быстрого прогресса в этой области имеет получе-
ние аллоантисывороток к поверхностным антигенам клетки, конт-
ролируемым генами МНС. В этой главе будут подробно описаны
методики приготовления и анализа такого рода антисывороток к
продуктам генного комплекса Н-2.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Образование антител к антигенам Н-2 можно вызвать раз-
личными способами иммунизации, например трансплантацией
кожного лоскута либо инокуляцией клеток лимфоидной ткани
или опухоли. Предлагаемые методы используются в настоящее
время в Базельском институте, другие читатель найдет в рабо-
тах, указанных в списке литературы. Серологическое типирова-
ние аллоантигенов Н-2 у мышей на современном уровне осуще-
ствляется с помощью набора олигоспецифических антисыворо-
ток, для получения которых используют мышей специально вы-
веденных линий (обзор: Klein, 1975).

III.	МЕТОДЫ

А.	Мыши

Антисыворотки к аллоантигенам получают путем иммуниза-
ции животных клетками генетически отличающихся особей того
же вида. Методика получения антисывороток, описанная в этой
главе, вполне применима при работе с обычными линиями ин-
бредных мышей, которые постоянно имеются в продаже и удов-
летворяют критериям, перечисленным Клейном (Klein, 1975).
Чаще всего для приготовления антисывороток используют мы-
шей, поставляемых Джексоновской лабораторией (Бар Харбор,
Мэн, США).

Б. Трансплантация кожи

Для трансплантации кожи по методике, применяемой в Ба-
зельском институте, необходимо следующее: скальпель с лезви-
ем № 10, хирургический пинцет, изогнутые маленькие ножницы,
набор препаровальных булавок, пробковый анатомический ло-
ток, комплект резиновых обхваток, пропитанная вазелином сте-
рильная марля, иммобилизующая повязка (полоски гипсового
бинта шириной 2 см.), 100-ваттная электрическая лампа на гиб-
ком штативе, чашка Петри диаметром 10 см, 50.мл стерильного
ЗФР и флакон с 4%-ным хлоралгидратом (дозировка — 0,1 мл на
10 г веса тела).

В.	Получение сывороток анти-Н-2

Мышей иммунизируют трансплантацией кожного лоскута по
методу Биллингема, как описано ниже; через 3 недели после
трансплантации мышам вводят несколько раз с двухнедельными
интервалами по 2-107 живых лимфоидных клеток внутрибрюшин-
но (Billingham, Silvers, 1961).

1.	Приготовление лоскута донорской кожи

а.	Мышей-доноров, обладающих нужными аллоантигенами
Н-2, забивают путем цервикальной дислокации.

б.	Хвост протирают марлевым тампоном, смоченным в 90%-
ном этаноле.

в.	Скальпелем делают разрез вдоль всей вентральной поверх-
ности хвоста через всю толщу кожи.

г.	У проксимального и дистального концов этого разреза, от-
ступив на 0,5 см от конца, делают круговой надрез на всю тол-
щину кожи.

д.	Лоскут кожи захватывают пинцетом у проксимального кон-
ца со спинной стороны и отделяют его от хвоста.

е.	Кожный лоскут помещают затем в чашку Петри с ЗФР эпи-
дермисом вниз.

ж.	После этого кожу разрезают скальпелем на прямоуголь-
ные кусочки размером приблизительно 5X5 мм, удерживая их
препаровальной иглой.
2.	Подготовка реципиентов

а.	Перед трансплантацией кожи мышей-реципиентов (отли-
чающихся от доноров аллоантигенами комплекса Н-2) наркоти-
зируют, вводя внутрибрюшинно 4%-ный раствор хлоралгидрата
из расчета 0,1 мл на 10 г веса тела.

б.	Наркотизированное животное фиксируют на анатомиче-
ском лотке спинкой вверх — надевают на каждую лапку по рези-
новой обхватке, которые растягивают и прикалывают булавками.

в.	На спине ниже лопаток подготавливают место для транс-
плантата. Хирургическим пинцетом приподнимают кожу по сре-
динной дорсальной линии изогнутыми ножницами вырезают
круглый участок достаточной величины, чтобы поместился донор-
ский кожный лоскут.

г.	В подготовленное ложе помещают трансплантат (один из
прямоугольных кусочков кожи хвоста, приготовленных как ука-
зано выше) эпидермальной стороной вверх и разравнивают.

д.	Уложенный кожный лоскут накрывают сверху нескольки-
ми слоями марли, пропитанной вазелином, стараясь не сдвинуть
трансплантат с места.

е.	Затем, смочив гипсовый бинт, накладывают слабую повяз-
ку вокруг всей грудной клетки мыши.

ж.	Мышь переносят с анатомического лотка в открытую клет-
ку на сухие опилки под зажженную 100-ваттную лампу, находя-
щуюся на расстоянии 20 см. Облучение согревает мышь, пока
не пройдет наркоз. После этого животное можно вернуть в обыч-
ные условия содержания.

з.	Через 6 дней после трансплантации повязку снимают, раз-
резая ее сбоку ножницами, без анестезии.

и.	Состояние трансплантата у каждого реципиента учитывают
отдельно. В момент снятия повязки оно зависит главным обра-
зом от технической успешности трансплантации, а не от иммун-
ного ответа: признаков отторжения в это время еще не должно
быть. Обычно трансплантат хорошо сидит на месте и прикреплен
к подлежащим тканям.

. к. Последующее наблюдение выявляет реакцию отторжения,
которая обычно завершается не позднее 21-го дня.

Через 3 недели после пересадки животных вновь иммунизи-
руют внутрибрюшинно суспензией 2-107 живых лимфоидных кле-
ток (смесь клеток селезенки, лимфоузлов и тимуса) в среде без
сыворотки плода коровы. Такую иммунизацию повторяют еще
три раза каждые 2 недели. Через неделю после каждой иммуни-
зации у мышей из хвоста берут кровь. Активные сыворотки объ-
единяют, разливают мелкими порциями и хранят при —20°С.
Г. Методика исследования гемагглютинирующих антител
анти-Н-21

1.	Реактивы и приборы

Кислый цитратный гемостабилизатор (КЦГ) с глюкозой: ди-
гидрат тринатрийцитрата — 27,2 г, моногидрат лимонной кисло-
ты — 1,7 г, ЫаНгРСЬ-ШгО — 2,2 г, глюкоза — 25 г, дистиллиро-
ванная вода — до 1000 мл; проводят стерилизующую фильтра-
цию и хранят при 4°С.

ЗФР (физиологический раствор, забуференный фосфатами) с
pH 6,8.

Поливинилпирролидон (ПВП) 10%-ный в ЗФР с 0,1% бычье-
го сывороточного альбумина (БСА). 45%-ный водный раствор
ПВП разбавляют ЗФР до концентрации 1%, разливают по фла-
конам, автоклавируют и хранят при комнатной температуре. Не-
посредственно перед употреблением добавляют БСА так, чтобы
1%-ный раствор ПВП содержал 0,1% БСА. После этого раствор
можно хранить несколько дней на холоду, но мы предпочитаем
работать со свежеприготовленными растворами. Мы работали с
ПВП, поставляемым General Aniline a. Film Corp. (Нью-Йорк,
США), тип К-60, 45%-ный водный раствор, серия № 29. Разные
серии неидентичны; могут встретиться серии, неактивные в кон-
центрации 1%.

Пробирки разового пользования 10x75 мм.

Гамильтоновский шприц с автоматическим распределителем,
пипетки и петля для приготовления серийных разведений.

Антисыворотка к аллоантигенам (анти-Н-2).

2.	Получение эритроцитов

а.	Для титрования антисыворотки кровь собирают в градуи-
рованные центрифужные пробирки, содержащие большой избы-
ток КЦГ, эритроциты дважды отмывают в ЗФР и готовят 2%-
ную взвесь в том же растворе.

б.	Для типирования эритроциты удобно получать из крови,
взятой из ретроорбитального синуса. Берут 0,75 мл крови в 2 мл
КЦГ. Затем эритроциты дважды отмывают двумя миллилитра-
ми ЗФР и ресуспендируют в том же его объеме (получается
2%-ная суспензия).

1 Методика Стимфлинга (Stimfling, 1961), модифицированная Беверли
Диком (Стэнфордский университет, Калифорния).
3.	Титрование антисыворотки

Титрование каждого образца дублируют и ставят контроли
с нормальной мышиной сывороткой. Например, приготовляют се-
рийные разведения антисыворотки от 1 : 10 до 1 : 5120 (10 проби-
рок). Наливают в первую пробирку 0,18 мл, а в остальные — по
0,1 мл раствора ПВП. В первую пробирку прибавляют 20 мкл
аллоантисыворотки, после чего готовят серийные разведения, пе-
ренося последовательно по 0,1 мл из одной пробирки в другую, а
из последней пробирки 0,1 мл выбрасывают. Так приготовляют
каждый ряд разведений. В каждую пробирку тест-системы (два
ряда разведений антисыворотки и 1 ряд разведений нормальной
мышиной сыворотки) прибавляют по 0,05 мл 2%-ной суспензии
эритроцитов. Штатив встряхивают в течение 2 ч при комнатной
температуре, затем учитывают реакцию.

4.	Типирование эритроцитов

Для типирования каждого образца эритроцитов берут две
опытные и одну контрольную (с нормальной мышиной сыворот-
кой) пробирки. В опытные пробирки наливают по 0,1 мл того
разведения антисыворотки, которое вызывало оптимальную аг-
глютинацию, в контрольную — 0,1 мл нормальной сыворотки в
том же разведении. Затем в каждую пробирку тест-системы до-
бавляют по 0,05 мл 2%-ной взвеси типируемых эритроцитов,
встряхивают штатив, инкубируют 2 ч при комнатной температуре
и учитывают реакцию.

5.	Контроли

Кроме нормальной мышиной сыворотки, для контроля анти-
сыворотки и при типировании, и при титровании берут заведомо
отрицательные и заведомо положительные по данному аллоанти-
гену эритроциты.

6.	Учет результатов

Чтобы учесть реакцию, пробирки слегка встряхивают, похло-
пав 8—10 раз по краю агглютиноскопа, для определения Rh-ан-
тигенов. Реакцию оценивают по четырехбалльной шкале. Мы при
этом обращаем внимание на прозрачность суспензионной среды
и на величину эритроцитарных агрегатов. Как правило, при чет-
кой положительной реакции на фоне прозрачной среды видны
крупные агрегаты эритроцитов. Наблюдаемую агглютинацию
всегда следует сравнивать с реакцией в контрольной пробирке с
нормальной мышиной сывороткой.
Д. Цитотоксичность, обусловленная антителами 1

1.	Реагенты

а.	Раствор NH^Cl в трис-буфере

Трис: 20,6 мг триса (Schwarz— Mann, Оренджберг, США)
растворяют в 0,5—0,75 л дистиллированной воды в литровой
мерной колбе, концентрированной НС1 подводят pH до 7,2—7,4
(исходное значение pH ~11,0) и объем раствора доводят до
литра дистиллированной водой.

NH4C1: 8,3 г NH4CI растворяют в 1 л дистиллированной воды
(Allied Chemicals, Морристаун, США).

Для приготовления буфера смешивают 9 частей раствора
триса с 1 частью раствора NH4CI и хранят при 4°С. Он пригоден
в течение нескольких недель; перед использованием его подогре-
вают до 37°С.

б.	Среда

1%-ный раствор желатины: 1 г желатины (Nutritional Bioche-
mical Corp., Кливленд, США) в 100 мл дистиллированной воды
нагревают при перемешивании до температуры чуть ниже точки
кипения. Фильтруют в горячем виде через гофрированный бу-
мажный фильтр № 588 (S and S, Кин, Нью-Гемпшир, США), раз-
ливают по 5—10 мл и хранят в замороженном состоянии.

Для приготовления желатиновой среды смешивают 100 мл
среды 199 с 10 мл 1%-ного раствора желатины (перед смешива-
нием желатину следует расплавить при 55 или 37°С на водяной
бане).

в.	Трипановый синий (№ 0508, Allied Chemicals, Морристаун,
США)

Приготовляют основной 1%-ный раствор в дистиллированной
воде; в день опыта его разводят 1:5 физиологическим раствором.
г. Комплемент

В качестве источника комплемента используют сыворотку
кролика илн морской свинки с низкой спонтанной литической ак-
тивностью.

2.	Приготовление клеточной взвеси

а.	У животных извлекают селезенку и помещают ее в чашку
Петри на лед.

б.	Каждую селезенку перфузируют примерно тремя миллилит-
рами трис-буфера с NH4C1, подогретого до 37°С, с. помощью

1 Модификация описанных ранее методов (Gorer, O’Gorman, 1956; Sachs
et al, 1971).
5-миллилитрового шприца и иглы № 22. Из одной мышиной се-
лезенки этим методом можно получить 2—4-Ю7 клеток.

в.	Инкубируют клетки в смеси трис-буфера с NH4CI 5 мин
при 37°С в 15-миллилитровых конических пробирках (Falcon
Plastics).

г.	В пробирки добавляют среду с желатиной и центрифугиру-
ют 6—8 мин при 1400 об/мин.

д.	Надосадочную жидкость сливают, а клетки ресуспеидиру-
ют в 2,0 мл среды с желатиной для подсчета.

е.	Определяют количество и жизнеспособность клеток с по-
мощью трипанового синего. (В опыт берут суспензию, содержа-
щую не менее 90% живых клеток.)

ж.	Для цитотоксического теста суспензию разбавляют до кон-
центрации 5-Ю6 клеток в 1 мл.

3.	Двухэтапная цитотоксическая реакция

Эту реакцию ставят в панелях для микротитрования (Cooke
Engineering, Александрия, США) в объеме 25 или 50 мкл.

а.	Во все лунки наливают по 25 мкл среды с желатиной.
В каждом опыте титрования следует предусмотреть лунки для
контроля среды, сыворотки и комплемента.

б.	В лунку для контроля сыворотки наливают 25 мкл заведо-
мо активной сыворотки анти-Н-2, декомплементированной при
56°С (30 мин).

в.	В одну луику наливают 25 мкл тестируемой сыворотки
(обычно в лунку № 4 после трех контрольных).

г.	Титруют сыворотку с двукратным шагом в объеме 25 мкл
до конца ряда.

д.	В каждую луику вносят по 25 мкл взвеси клеток-мишеней
и перемешивают на микромиксере (Cooke Engineering) в тече-
ние 10 с при скорости 3.

е.	Панели закрывают крышками и инкубируют 15 мин при
37°С.

ж.	Извлекают панели из термостата и во все лунки добавля-
ют по 150 мкл среды с желатиной.

з.	Центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, исполь-
зуя держатели панелей для микротитрования (Cooke Enginee-
ring).

и.	Надосадочную жидкость удаляют отсасыванием или сли-
вают резким движением.

к.	Во все лунки для титрования и в лунку для контроля комп-
лемента добавляют по 25 мкл комплемента, разведенного перед
употреблением.

л.	После интенсивного перемешивания (30 с на микромиксере
8—233
при максимальной скорости) панели закрывают липкой лентой
(Cooke Engineering или NIH).

м. Инкубируют 30 мин при 37°С.

н. Центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин (450g) и 10°С.

о.	Учет реакции: удаляют надосадочную жидкость из пяти лу-
нок, в каждую из них добавляют по 10 мкл трипанового синего,
перемешивают и берут по 5 мкл для счета. Для этой цели удоб-
ны пипетки Эппендорф (Brinkman Instruments, Уэстбери, США).
Подсчет клеток проводят на молочном стекле F500 (Roboz Sur-
gical, Вашингтон, США) под круглым кимблевским покровным
стеклом № 1 диаметром 12 мм.

Е. Оценка цитотоксичности, обусловленной антителами,
по освобождению меченого хрома1 *

1. Реагенты

Используют 5lCr (Amersham/Searle) — 300 мкКи/мл в клеточ-
ной суспензии с концентрацией клеток 108/мл в среде 199 с 0,1%
1 желатины (см. выше).

' 2. Приготовление клеточной взвеси

Клетки получают как описано в разд. III, Д, 2.

3.	Цитотоксический тест

а.	Суспензию, содержащую 108 клеток в 1 мл, маркируют изо-
топом 51Сг (300 мкКи/мл) в течение 40 мин при 37°С в среде 199,
перемешивая каждые 10 мин.

б.	Клетки три раза отмывают (450g) в среде 199 с 0,1% же-
латины и ресуспендируют в той же среде до конечной концент-
рации 5  106 клеток/мл.

в.	Реакцию цитотоксичности ставят в панелях для микротит-
рования (Cooke) с круглодонными лунками, добавляя по 25 мкл
клеточной суспензии к 25 мкл серийных разведений антисыво-
ротки, как при титровании. Обязательно оставляют лунки для
контроля среды и комплемента.

г.	Клетки с антисывороткой инкубируют 15 мин при 37°С;
один раз отмывают холодной средой 199 с 0,1% желатины; над-
осадочную жидкость сливают (не следует забывать, что она ра-
диоактивна) .

1 Модификация методов, описанных ранее (Wigzell, 1965; Sanderson,

1969; Kalis, 1969).
д.	В каждую лунку, включая контроль комплемента, налива-
ют по 25 мкл соответствующего разведения комплемента; в лун-
ку для контроля среды вместо комплемента наливают 25 мкл
среды 199 с 0,1 % желатины.

е.	Инкубируют 30 мин при 37°С.

ж.	Клетки осаждают центрифугированием при 450g и соби-
рают надосадочную жидкость из каждой лунки.

з.	Определяют радиоактивность 51Сг в этих надосадках (стан-
дартным у-счетчиком), а также — в качестве контроля —
в 25 мкл взвеси меченых клеток.

и.	Вычисляют процент лизиса по следующей формуле:

(% лизиса) = 100 • ( И-Д0С^-0Кы- -	_

у o6uwftN общийм I I общийг
иадосадокм \

общийм у

где N — счет в опытной лунке, М — счет контроля среды, Z —
контроль заведомо активной сыворотки анти-Н-2, «общий»
(счет) — радиоактивность (имп/мин) 25 мкл меченых клеток.
Для удобства исследуют не весь надосадок, а пробу (например,
10 мкл) и число импульсов в минуту пересчитывают на весь объ-
ем надосадочной жидкости.

IV.	контроля

Как было отмечено в разд. III, при типировании сывороток
анти-Н-2 любым методом необходимо ставить контроли. В любом
случае включают контроль среды и комплемента (чтобы исклю-
чить возможность лизиса, обусловленного средой, комплементом
или сочетанием обоих этих факторов). И наконец, в качестве
контроля специфичности реакции и активности комплемента вво-
дят активную сыворотку анти-Н-2 известной специфичности и
титра. Кроме этих внутренних контролей, необходим контроль
клеток-мишеней, используемых в опыте, с помощью известной сы-
воротки анти-Н-2, взятой для сравнения с испытуемой; специ-
фичность испытуемой сыворотки контролируют также клетками-
мишенями другой Н-2-специфичности. Обычно используют клет-
ки двух типов:

1)	клетки от линии мышей — продуцентов антисыворотки —
для исключения аутоантител (т. е. антител, реагирующих со
«своим»);

2)	клетки линии мышей с другой Н-2-специфичностью, что-
бы обнаружить неспецифические антитела, реагирующие с дру-
гими антигенами, не относящимися к продуктам системы Н-2.
Лучший источник клеток для этого контроля — линии, конген-
ные по Н-2, которые сходны по антигенному «фону» с линией до-
норов антигена (кроме Н-2 специфичностей), а по типу Н-2 оди-
наковы с линией продуцентов антисыворотки.

Если в сыворотках анти-Н-2 обнаруживаются нежелательные
антитела (антитела к поверхностным антигенам, отличным от
того антигена Н-2, против которого эти сыворотки специально
получали), то их можно удалить истощением. Такой прием очень
часто используется для повышения специфичности сывороток
анти-Н-2. Кроме того, специфическое истощение [т. е. истощение
клетками линии доноров антигена (или антигенов) Н-2] служит
решающим контролем специфичности. Детальный анализ такого
истощения читатель найдет у Клейна (Klein, 1975, рр. 81—93);
методология истощения подробно рассмотрена в другой работе
(Sachs, Cone, 1975).

V.	КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МЕТОДА

Конечная задача серологического анализа состоит в выявле-
нии определенного гаплотипа Н-2, В этом.отношении каждый из
методов, описанных в настоящей главе, имеет свои преимущест-
ва и определенные недостатки. Аллотрансплантация кожи как
способ первичной иммунизации обеспечивает хорошую выработку
антител, но отличается значительной трудоемкостью. Тот же
уровень антител анти-Н-2 можно получить путем многократных
внутрибрюшинных инъекций аллогенных клеток, но для этого
требуется больше времени. Считается, что на длительную внутри-
брюшинную иммунизацию лучше отвечают самки, чем самцы.
Различные методы оценки активности сывороток анти-Н-2 тоже
имеют свои недостатки. Здесь были описаны три наиболее часто
используемых метода, однако известно много других способов
тестирования и их модификаций (для более полного ознакомле-
ния с ними см. Klein, 1975, и гл. 17 настоящей книги).

Первоначально Н-2-антитела были открыты как антиэритро-
цитарные антитела. Различные методические трудности, встре-
тившиеся на ранних этапах применения гемагглютинации, были
в дальнейшем преодолены благодаря использованию в качестве
разбавляющей жидкости коллоидных растворов. Сложности, при-
сущие реакции гемагглютинации, связаны в основном с хрупко-
стью мышиных эритроцитов.

Тест цитотоксичности имеет свои проблемы, более многооб-
разные, чем в случае гемагглютинации; и тем не менее этот тест
используется повседневно во многих лабораториях благодаря
его простоте и быстроте проведения, а также возможности коли-
чественного учета и объективности — при использовании изото-
па 51Сг. В обоих вариантах теста цитотоксичности наиболее серь-
езную проблему представляет комплемент. Большинство лабора-
торий использует в качестве источника комплемента сыворотку
кролика или морской свинки. Активность комплемента варьирует
от образца к образцу и от животного к животному. Каждую объ-
единенную партию комплемента следует проверять на спонтан-
ную цитотоксичность (обычно связанную с антимышиными ан-
тителами), а затем замораживать при —70°С мелкими порциями.
Эти порции размораживают непосредственно перед употребле-
нием и после опыта остаток сыворотки выбрасывают.

Каждый тест имеет своих приверженцев, считающих его хо-
рошо воспроизводимым и количественным. Однако исследовате-
лю лучше испытать несколько разных способов тестирования и
выбрать тот, который будет соответствовать его требованиям в
отношении воспроизводимости и чувствительности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Billingham R. Е., Silvers W. К-, eds. (1961). Transplantation of Tissue and
Cells, Wistar Inst. Press. Philadelphia, Pennsylvania.

Gorer P. A. (1937). Br. J. Exp. Pathol., 18, 31.

Gorer P. A., 0’Gorman P. (1956). Transplant. Bull., 3, 142.

Kalis P. (1969). Transplantation, 8, 526.

Klein J. (1975). Biology of the Mouse Histocompatibility-2 Complex, pp. 67—
127, Springer-Verlag, Berlin and New York.

Sachs D. H., Cone J. (1975). J. Immunol., 114, 165.

Sachs D. H., Winn H: J., Russell P. S. (1971), J. Immunol., 107, 481.

Sanderson A. R. (1969). Br. J. Exp. Pathol., 45, 398.

Shreffler D. C., David C. S. (1975). Adv. Immunol., 20, 125.

Stimpfling J. H. (1961). Transplant. Bull., 27, 109.

Wigzell H. (1965). Transplantation, 3, 423.
Глава 14

HLA-ТИПИРОВАНИЕ в реакции
КОМПЛЕМЕНТ-ЗАВИСИМОГО
ЛИМФОЦИТОЛИЗА

Д. Стокер, Д. Берноко

I.	ВВЕДЕНИЕ

Существует несколько методов выявления антигенов HLA на
поверхности различных клеток человека. В этой главе будет опи-
сан метод комплемент-зависимого лимфоцитолиза. С тех пор
как Терасаки и Мак-Клеланд (Terasaki, McClelland, 1964) пред-
ложили этот тест, он находит широкое применение в качестве
воспроизводимого и удобного способа оценки гистосовместимо-
сти у человека. Условия инкубации и дозы реагентов, указанные
ниже, соответствуют стандартной методике, принятой в Нацио-
нальном институте здравоохранения США (Brand et al., 1970;
Terasaki et al., 1978).

II.	ПРИНЦИП РЕАКЦИИ

Лимфоциты человека выделяют из гепаринизированной пери-
ферической крови. Для этого сначала отделяют «липкие» клетки
на колонке с найлоновой ватой, а затем очищают лимфоциты
центрифугированием в градиенте плотности (В0ушп, 1968).

Выделенные лимфоциты инкубируют с типирующими аллоан-
тисыворотками, содержащими антитела анти-HLA определенной
специфичности. Реакцию ставят в лунках пластиковой панели.
В каждом опыте используют набор различных аллоантисыворо-
ток, включая моноспецифические и олигоспецифические. Эти ан-
тисыворотки получают от многократно рожавших женщин или
от искусственно иммунизированных доноров. Перед использова-
нием полученных антисывороток определяют их специфичность
путем сравнения с известными антисыворотками, а также путем
анализа HLA-специфичностей членов семьи доноров. Применение
микрометода, при котором для проведения реакции достаточно
1 мкл антисыворотки, явилось предпосылкой широкого междуна-
родного обмена типирующими реагентами.

Типируемые лимфоциты инкубируют с антисыворотками, за-
тем добавляют комплемент и продолжают инкубацию. После
контакта с комплементом в реакционную смесь вносят раствор
эозина, чтобы выявить исключающие краситель живые клетки.
Затем препараты фиксируют раствором формальдегида.
Для учета результатов реакции содержимое каждой лунки
исследуют в фазово-контрастном микроскопе, определяя и реги-
стрируя процент живых (неокрашенных) лимфоцитов.

Фенотип HLA данного индивидуума определяют по специфич-
ности тех антисывороток, с которыми исследуемые лимфоциты
дали положительную реакцию в цитотоксическом тесте.

В табл. 1 приведена поэтапная схема цитотоксического теста.

Таблица 1
Поэтапная схема лимфоцитотоксической реакции

Этап	Условия
1.	Подготовка панелей для тнпнрования  2.	Взятие 8—10 мл периферической кровн  3.	Удаление «липких» клеток на колонке с найло- новон ватой  4.	Выделение лимфоцитов в градиенте плотности  5.	Инкубация лимфоцитов с антисывороткой	Хранить при —80°С  В гепарин  37°С, 30 мии  Комнатная температура, 30 мин
6. Добавление комплемента, инкубация	Комнатная температура, 60 мнн
7.	Добавление эозина  8.	Добавление формальдегида  9.	Учет результатов	5 мин  Инвертированный фазово- контрастный микроскоп

III.	ДЕТАЛИ МЕТОДА

А. Реагенты и приборы

Панели для микротитрования (№ 3034, Falcon Plastics, Divi-
sion of BioQuest, Лос-Анджелес, США)

Гамильтоновские микрошприцы: 705N, 710N, 725N, 750N ем-
костью соответственно 50, 100, 250 и 500 мкл с фиксиро-
ванными иглами 3-го типа

Гамильтоновский дозатор РВ-600-1 (Hamilton Со., Уиттиер,
Калифорния, США)

Корнвельский шприц на 5 мл с дозатором (Beckton-Dickinson
Со., Уолтэм, Массачусетс, США)

Минеральное масло: вазелиновое (№ 200 466, Carlo Erba, Divi-
sione Chemica Industriale, Милан, Италия)

Среда Мак-Коя 5А (№ 166, Grand Island Biological Co.,
Гранд-Айленд, штат Нью-Йорк, США)

Эозин Y, чистый для гистологии и окрашивания мазков крови
(№ 45 380, Serva Feinbiochemica, Гейдельберг, ФРГ)
Раствор формальдегида 37% -ный нейтральный (Е. Merck A. G.,
Дармштадт, ФРГ)

Покровные стекла 45X65 мм (Gerhard Menzel, Glasbearbei-
tungswerk К. G., Брауншвейг, ФРГ)

Раствор Хэнкса, 10-кратный концентрат (№ 5774-72, Difco
Laboratories, Детройт, США)

Раствор бикарбоната для культуры тканей, 10%-ный
(№ 5788-60, Difco)

Фиколл 400 (Pharmacia, Упсала, Швеция)

Уровизон 58%-ный (Schering AG, Зап. Берлин/Бергкамен)

Детергент 7Х (Linbro Chemicals Scientifique Со., Хэмден,
штат Коннектикат, США)

Источник комплемента: нормальная кроличья сыворотка, соб-
ранная приблизительно от 100 кроликов, хранится при
—80°С мелкими порциями, или лиофилизированная, со-
храняемая при —20°С. Лиофилизированный комплемент
регидратируют непосредственно перед употреблением.

Б. Проведение реакции

1.	Подготовка панелей для типирования

С помощью дозатора вносят в каждую лунку панели по 2 мкл
минерального масла. Удобно приготовить панели заранее: сло-
жить в стопки по 48 панелей и хранить при —80°С до опыта.
Минеральное масло защищает от высыхания малые обьемы ре-
агентов, используемых в этом тесте.

В каждую лунку с помощью гамильтоновского шприца на
50 мкл вносят по 1 мкл каждой типирующей антисыворотки.
Расположение определенных антисывороток на панелях должно
быть единообразным. Лунки отрицательного контроля содержат
среду Мак-Коя; в качестве положительного контроля используют
кроличью антисыворотку к лимфоцитам человека (АЛС). АЛС
высокого титра нужно предварительно разбавить, чтобы избе-
жать загрязнения соседних лунок антилимфоцитарными антите-
лами во время добавления клеток и комплемента.

2.	Приготовление суспензии лимфоцитов

а.	Удаление адгезивных клеток. В 20-миллилитровый шприц
разового пользования помещают 1,5 г отмытой найлоновой ваты.
Вату отмывают, замочив ее в растворе детергента 7Х на 24 ч;
затем в течение 48 ч промывают водопроводной водой, еще 48 ч
вымачивают в дистиллированной воде, часто меняя ее. После от-
мывания вату высушивают при 37°С. На слой ваты в колонке
наносят 8 мл гепаринизированной крови, с помощью поршня рас-
пределяют ее между волокнами ваты и инкубируют 30 мин при
37°С.

Неприлипшие клетки вымывают из колонки раствором Хэнкса
при комнатной температуре. На каждую колонку наносят 20 мл
раствора Хэнкса.

б.	Разделение лимфоцитов в градиенте плотности. Раствор
уровизона с фиколлом готовят следующим образом: 18,47 г фи-
колла растворяют в 238,8 мл дистиллированной воды, добавля-
ют 50 мл уровизона и эту смесь перемешивают 60 мин' в темноте
при комнатной температуре. Плотность раствора доводят до
1,077, прибавляя дистиллированную воду или фиколл. Раствор
стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры фирмы
Millipore и хранят небольшими порциями при 4°С. Разделение
проводят при комнатной температуре; в центрифужные пробир-
ки наливают по 3,5 мл смеси уровизон — фиколл, на градиент
наслаивают 10—12 мл клеточной суспензии, полученной после
удаления адгезивных клеток. Затем пробирки центрифугируют
при 1000g в течение 20 мин при 20°С.

После центрифугирования слой лимфоцитов располагается на
границе плазмы и градиента, его отсасывают и переносят в чис-
тую пробирку. Затем клетки дважды отмывают раствором Хэнк-
са, ресуспендируют в среде Мак-Коя и после подсчета концентра-
цию клеток во взвеси доводят примерно до 2-106/мл. Можно
обойтись без подсчета клеток, оценивая их концентрацию приб-
лизительно; для этого 1 мкл взвеси вносят в лунку с минераль-
ным маслом и исследуют в инвертированном фазово-контрастном
микроскопе. При большом увеличении удается даже определить
пропорцию примесей гранулоцитов и эритроцитов во взвеси лим-
фоцитов.

3.	Лимфоцитотоксическая реакция

В каждую лунку панели для типирования прибавляют по
1 мкл суспензии лимфоцитов, используя шприц-дозатор. Смесь
клеток с антисывороткой инкубируют 30 мин при комнатной тем-
пературе, затем добавляют по 5 мкл комплемента, который быст-
ро размораживают перед использованием и держат на льду.
Инкубацию с комплементом проводят также при комнатной тем-
пературе в течение 1—1,5 ч; при этом продолжительность кон-
такта зависит от активности данной серии комплемента, которую
определяют, сравнивая каждую новую серию со стандартной в
реакции с одним и тем же образцом лимфоцитов на одной пане-
ли. Время инкубации с новым комплементом подбирают так»
чтобы реакции в присутствии новой и стандартной серий комп-
лемента были одинаковыми.
После инкубации с комплементом в каждую лунку добавля-
ют по 4 мкл 5%-ного раствора эозина Y на дистиллированной
воде. Этот раствор после приготовления фильтруют и сохраняют
при комнатной температуре. Через 5 мин после добавления эози-
на реакцию прекращают, добавляя 10 мкл раствора формальде-
гида, который фиксирует клетки. Перед этим pH основного 37 % -
ного раствора формальдегида подводят до 7,2, прибавляя поро-
шок бикарбоната натрия. Непосредственно перед употреблением
формалин фильтруют. Слой минерального масла, предотвращаю-
щий контакт с воздухом, стабилизирует также pH раствора. Каж-
дую панель накрывают покровным стеклом и оставляют на не-
сколько часов до учета результатов.

4.	Учет результатов цитотоксического теста

Результаты учитывают с помощью инвертированного фазово-
контрастного микроскопа и оценивают по следующей шкале:

Условный	Лимфоцитолиз	
показатель	(% погибших	И нтерпретация
реакции	клеток)	результатов
1	0—19	Отрицательная реакция
2	20—29	Отрицательная реакция при высоком проценте погиб- ших клеток в отрицатель- ном контроле
4	30—49	Слабоположительная реак- ция
6	50—79	Положительная реакция
8	80—100	Резко положительная реак- ция
0	Нельзя определить	Реакция не учитывается

Долю погибших (т. е. окрашенных эозином) клеток устанавли-
вают приблизительно, без подсчета. Приобретя опыт, можно
добиться высокой воспроизводимости результатов даже при их
учете разными исследователями.

5.	Интерпретация результатов

Принято считать, что типируемые лимфоциты имеют те спе-
цифичности HLA, которые распознаются типирующими антисы-
воротками. Исследуемый образец может быть охарактеризован
антигенными специфичностями, соответствующими каждому из
трех локусов (А, В и С). Иногда в пределах одного локуса вы-
является лишь одна антигенная детерминанта. Это возможно
при гомозиготности донора лимфоцитов по данному локусу или
в том случае, когда имеющийся набор антисывороток не выявля-
ет вторую специфичность гетерозиготного донора. Существует ли
действительно вторая специфичность, часто удается установить
только при типировании других членов семьи данного донора.

IV.	СЕМЕЙНЫЙ АНАЛИЗ

Для успешного выявления и идентификации специфичностей
HLA, а также типирования некоторых индивидуумов (в частно-
сти, //LA-гомозигот) требуется семейный анализ. Обследуя не-
скольких членов семьи, можно установить //LA-генотип каждого
из них. Такой пример приведен в табл. 2 и на рис. 1. При HLA-
типировании детей здесь было обнаружено, что трое из них (вто-
рой, девятый и десятый ребенок) унаследовали от родителей
лишь одну специфичность каждого из локусов А и В. При типи-
ровании родителей и сибсов удалось установить, каким образом
происходило расщепление, и получить доказательства истинной
гомозиготности этих трех детей по локусам А и В.
Таблица 2

Семейный анализ СаплоТипов HLA
V.	НЕКОТОРЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

О ЦИТОТОКСИЧЕСКОМ ТЕСТЕ

А. Типирующие антисыворотки

Типирующая антисыворотка рассматривается как моноспеци-
фический реагент, выявляющий данную конкретную специфич-
ность HLA. Однако на практике вероятность такой интенсивной
аллоиммунизации, которая дает подходящую антисыворотку, при
беременности весьма низка. Метод искусственной иммунизации
доноров также имеет свои недостатки: возможность переноса ин-
фекции с лимфоцитами и проблематичность получения антисыво-
ротки узкой специфичности. Антитела анти-HLA всех типирую-
щих антисывороток обычно весьма гетерогенны по авидности и
дают в связи с этим разнообразные перекрестные реакции.
В идеале нужно было бы использовать в качестве типирующих
реагентов гомогенные моноклональные антитела, синтез которых
in vitro, вероятно, станет возможным в будущем при культиви-
ровании гибридом между клетками, образующими антитела ан-
ти-HLA, и клетками плазмацитомы. Кёлер и Мильштейн (Kohler,
Milstein, 1975) описали метод получения таких -гибридом для
клеток, продуцирующих антитела к бараньим эритроцитам.

Другой подход в приготовлении моноспецифических реаген-
тов состоит в иммунизации животных очищенными HLA-антиге-
нами (Ferrone et al., 1973). Однако получаемые'таким способом
ксеногенные антисыворотки не свободны от указанных выше недо-
статков и, кроме того, содержат различные гетерофильные ан-
титела, реагирующие с лимфоцитами человека.

Б. Комплемент

1.	Гетерофильные антитела

Высказано предположение, что особая эффективность кро-
личьего комплемента в реакции лимфоцитолиза обусловлена при-
сутствием в кроличьей сыворотке нормальных гетерофильных ан-
тител к лимфоцитам человека: эти антитела могли бы действо-
вать синергично с антителами анти-HLA типирующих сывороток
(Ferrone et al, 1974).

2.	Путь активации комплемента

В зависимости от природы аллоантисыворотки и определен-
ных условий инкубации активация комплемента в реакции лим-
фоцитолиза может пойти либо по классическому, либо по аль-
тернативному пути (Ferrone et al., 1974; Bernoco et al., 1976).
Благодаря этому антисыворотки, отобранные по активности при
повышенной температуре инкубации (например, по методу
Kissmeyer-Nielsen, Kjerbe, 1967), могут давать неожиданные по-
ложительные и отрицательные результаты при постановке реак-
ции по стандартной методике NIH.

В. Другие методы выявления антигенов HLA-A, -В и -С

Известно много различных методов выявления этих антиге-
нов. Выбор метода, отличающегося от стандартного (предложен-
ного NIH), может быть продиктован специальными эксперимен-
тальными задачами (например, при изучении передвижения де-
терминант HLA по поверхности живой клетки или для более
быстрого выявления антигенов нелимфоидных клеток). Эти ме-
тоды с обсуждением их преимуществ и недостатков подробно
описаны в руководстве по типированию тканей (Ray et al., 1974),
изданном NIH.

VI. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ

СИСТЕМЫ HLA НА В-КЛЕТКАХ

Ван Роод и его сотрудники (van Rood et al., 1975a) описали
новое семейство антигенов, относящихся к HLA и представлен-
ных главным образом на В-лимфоцитах (возможно, они гомоло-
гичны антигенам 1а мышей). Был предложен ряд методов для
серологического выявления этих антигенов. В-лимфоциты состав-
ляют небольшую часть (иногда всего лишь 5—10%) популяции
лимфоцитов нормальной периферической крови. Чтобы их обна-
ружить, нужно модифицировать реакцию лимфоцитолиза, опи-
санную выше, так как при обычной постановке уменьшение доли
живых клеток на 5—10% в результате взаимодействия антисы-
воротки с аллоантигенами В-клеток было бы неотличимо от от-
рицательного контроля. Кроме того, многие антисыворотки, ак-
тивные в отношении аллоантигенов В-клеток, содержат также
антитела анти-HLA (А, В и С).

Одна из предложенных модификаций (Bernoco et al., 1976)
основана на том, что антисыворотки к Рг-микроглобулину спо-
собны блокировать лимфоцитолиз, вызываемый антителами ан-
ти-HLA. По этой методике антигены HLA-A, -В и -С «маскиру-
ются» птичьими антителами к р2-микроглобулину человека или
F(ab') 2-фрагментами кроличьих антител той же специфичности.
Обработанные таким образом клетки не связывают комплемент и
не реагируют с антителами анти-HLA (А, В, С) при 20°С, но мо-
гут вступать в цитотоксическую реакцию с антителами другой
специфичности (не анти-HLA). Этот модифицированный тест
удобно проводить с суспензией лимфоцитов крови, обогащенной
В-клетками (van Rood et al., 1975b).

В другой модификации реакции лимфоцитолиза для выявле-
ния аллоантигенов В-клеток используется двухцветное флуорес-
центное окрашивание. В-лимфоциты выявляются с помощью ан-
тиглобулинового реагента, меченного флуоресцеином, а погибшие
клетки — по включению бромистого этидия. Преимущество этой
методики состоит в том, что здесь нет необходимости выделять
В-клетки из общей популяции лимфоцитов для реакции лимфо-
цитолиза. Просматривая каждую погибшую клетку, можно выяс-
нить, относится ли она к В-лимфоцитам (van Rood et al., 1976).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Bernoco D., Bernoco M., Ceppellini R., Poulik M. D., van Leeuwen A., van
Rood J. J. (1976). Tissue Antigens, 8, 253.

Boyum A. (1968). Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21, Suppl., 97.

Brand D. L., Ray J. G., Hare D. В., К ay hoe D. E., McClelland J. D. (1970).

In: Histocompatibility Testing (P. I. Terasaki, ed.), p. 357, Munksgaard,
Copenhagen.

Ferrone S., Pellegrino M. A., GStze D., Mittal К- K-, Terasaki P. L, Reisfeld
R. A. (1973). Ser. Immunobiol. Stand., 18, 218.

Ferrone S., Cooper N. R., Pellegrino M. A., Reisfeld R. A. (1974). Transplant
Proc., 6, 13.

/<issmeyer-Nielsen F., Kjerbe К- E. (1967). In: Histocompatibility Testing
(E. S. Curtoni, P. L. Mattiuz and R. M. Tosi, eds.), p. 381, Munksgaard,
Copenhagen.

Kohler G., Milstein C. (1975). Nature (London), 256, 495.

Ray J. G., Hare D. B., Pederson P. D., Kayhoe D. A. eds. (1974). Manual of
Tissue Tvping Techniques, NIAID Transplant. Immunol. Branch DHEW.
Publ. No. (NIH) 75—545, USDHEW, Washington, D. C.

Terasaki P. L, McClelland J. D. (1964). Nature (London), 204, 998.

Terasaki P. L, Bernoco D., Park M. S-, Ozturk G., Iwaki Y. (1978). Am. J.

Clin. Pathol., 69, 103.

van Rood J. J., van Leeuwen A., Parlevliet J., Tertniftelen A., Keuning J. J.
(1975a). In: Histocompatibility Testing (F. Kissmeyer-Nielsen, ed.), p. 629,
Munksgaard, Copenhagen.

van Rood J. J., van Leeuwen A., Keuning J. J., Blusse van Oud Albas A.
(1975b). Tissue Antigens, 5, 73.

van Rood J. J., van Leeuwen A., Ploem J. S. (1976). Nature (London), 262,
795.
Глава 15

СМЕШАННАЯ КУЛЬТУРА
ЛИМФОЦИТОВ (СКЛ) МЫШИ

Т. Мео

I. ПЕРВИЧНАЯ СКЛ

А. Принципы

Одним из основных методов иммунобиологии гистосовмести-
мости явилось изучение взаимодействия между аллогенными
лимфоцитами in vitro — метод, получивший название «смешан-
ной культуры лимфоцитов» (СКЛ). В таких смешанных культу-
рах происходит ряд метаболических событий, которые наиболее
четко проявляются в усилении синтеза макромолекул и проли-
ферации клеток. При более подробном рассмотрении становится
очевидной как генетическая, так и иммунологическая природа
взаимодействия клеток в СКЛ. Для реакции вовсе не обяза-
тельно, чтобы один из доноров лимфоцитов был предварительно
иммунизирован антигенами другого; взаимодействие обусловле-
но стимулирующими аллотипическими кодоминантно наследуе-
мыми антигенными детерминантами, которые кодируются огра-
ниченным набором полиморфных генов.

Этот феномен зависит главным образом от двух свойств сме-
шанных популяций лимфоцитов: 1) от экспрессии стимулирую-
щих антигенных детерминант на клеточной поверхности и 2) от
способности лимфоцитов к их распознаванию. Эти два свойства
впервые удалось изучить раздельно с помощью так называемой
однонаправленной СКЛ, в которой одна из двух аллогенных по-
пуляций лишена способности активироваться и может лишь иг-
рать роль стимулятора для клеток другой популяции. Этой одно-
направленности можно добиться двумя способами: 1) генетиче-
ским — культивируя лимфоциты гибридов первого поколения
(стимуляторы) с лимфоцитами родительских линий («отвечаю-
щими» клетками), или 2) биохимическим — подавив синтез ДНК
в одной из двух клеточных популяций (стимулирующей) рентге-
новским облучением или митомицином С. Структуры, ответствен-
ные за распознавание и за стимулирующие свойства лимфоцитов,
точно не известны, однако они, по-видимому, принадлежат клет-
кам разных популяций. Полагают, что все «отвечающие» клетки
относятся к определенным ограниченным субпопуляциям Т-лим-
фоцитов, а В-клетки обладают только сильными стимулирую-
щими детерминантами, хотя имеющиеся данные не позволяют
исключить наличие стимулирующих детерминант и на Т-клетках.
В реакции участвуют и другие клетки, но роль их считается
вспомогательной и, возможно, иммунологически неспецифичной.
Всегда сопутствующие лимфоцитам неактивированные фагоци-
тирующие адгезивные клетки, а также, возможно, и В-лимфоци-
ты выделяют растворимый медиатор, который необходим для ал-
лостимуляции Т-клеток. Остается не ясным, во всех ли типах
культур воздействие этих клеток можно заменить добавлением
2-меркаптоэтанола. Распознавание аллогенных детерминант счи-
тается функцией только одного подкласса Т-лимфоцитов, но надо
принять во внимание, что процесс активации, несомненно, захва-
тывает и другие клетки благодаря вторичному выделению много-
численных факторов, которые могут вырабатываться независимо
от синтеза ДНК.

Генетический анализ инбредных и конгенных линий мышей
позволил выделить два коротких участка хромосомы, в которых
сосредоточены гены (или группы генов), ответственные за сти-
мулирующую способность лимфоцитов в СКЛ. Эти гены и их
продукты обычно обозначают недостаточно строгими терминами
«СКЛ-локусы» и «СКЛ-детерминанты» соответственно. Эта
группа детерминант кодируется главным комплексом гистосов-
местимости, Н-2 (в хромосоме 17), и представляется наиболее
важной не только из-за своей стимулирующей активности, но и
ввиду той связи, которая неизменно прослеживается между ее
функциональным гомологом и главным комплексом гистосовме-
стимости у столь различных животных, как земноводные, птицы
и млекопитающие. В геноме мышей есть еще другая, не сцеплен-
ная с Н-2 система, не имеющая аналогов у других видов. Ее на-
звали локусом Mis (в 1-й хромосоме); она, видимо, менее поли-
морфна (или менее сложна) , чем локусы СКЛ в комплексе Н-2.

Это введение — лишь краткий очерк основных сведений, не-
обходимых при постановке опытов и интерпретации результатов
СКЛ. Более полные данные читатель найдет в ряде других пуб-
ликаций (Bach et al., 1972; Sorensen, 1972; Meo et al., 1973;
Festenstein, 1974; Klein, 1975; Snell et al., 1976), которые были
использованы и при написании настоящего раздела этой главы.

Б. Методы

В различных лабораториях используются разные методы.
Критерии, определяющие условия эксперимента, приходится под-
бирать эмпирически. Приводимые здесь рекомендации основаны
на нашем личном опыте и, конечно, не включают всех опублико-
ванных вариантов методики. Предлагаемый метод будет описан
на примере опытов с мышиными клетками, однако он с успехом
используется и в экспериментах с клетками крысы и морской
свинки.
В. Среды

Для культивирования мышиных лимфоцитов чаще всего ис-
пользуют среду RPMI 1640. Ее дополняют антибиотиками, глу-
тамином и сывороткой; эти реагенты хранят в виде концентриро-
ванных основных растворов и добавляют перед опытом до конеч-
ных концентраций, указанных в табл. 1.

Таблица 1

Культуральная среда для СКЛ мышей

Ингредиент (основной раствор)	Концентрация	Температура хранения, °C	Конечная концентрация
Человеческая сыворотка, инактивированная нагре- ванием	Неразведенная	—20	2,5%
Пенициллин	10’ ед/мл	—20	100 ед/мл
Стрептомицин	10 мг/мл	—20	100 мкг/мл
L-глутамин	2.10-’ М	—20	2-Ю-3 М
2-мерка птоэтан ол	Неразведенный	4	3-105 М
ГЭПЭС	2 М	4	25-Ю-3 М

Если продажная жидкая среда уже содержит глутамин, ее
следует хранить в замороженном виде, иначе перед употреблени-
ем к ней нужно будет добавлять эту аминокислоту. Один из са-
мых важных моментов — выбор подходящей сыворотки. Поло-
жительную реакцию в СКЛ можно наблюдать и в бессывороточ-
ной среде, но такая система еще недостаточно проверена. Обыч-
но мы дополняем среду человеческой сывороткой: она оказалась
менее митогенной, чем сыворотка плода коровы. Для получения
человеческой сыворотки кровь от каждого донора берут в асеп-
тических условиях в стерильную коническую пробирку на 50 мл
и оставляют для свертывания не более чем на 2—3 ч при ком-
натной температуре (в сыворотках, полученных после более дли-
тельного свертывания, накапливаются ингибиторы). Сгустки от-
деляют от стенок, после чего пробирки центрифугируют 1 ч при
2000g. Затем каждую сыворотку стерильно отсасывают с помо-
щью груши, собирают отдельно и проверяют на стерильность.
Все сыворотки объединяют, инактивируют (30 мин при 56°С),
разливают небольшими порциями и хранят при —20°С. Сыворот-
ки отдельных доноров могут различаться по своим свойствам.
Эти различия трудно учитывать, и для того, чтобы уменьшить их
проявление, рекомендуется объединять сыворотки возможно
большего числа доноров. Если замысел эксперимента предусмат-
ривает использование изо- или аллогенной сыворотки, к среде
прибавляют сыворотки мышей. После взятия мышиной крови ее
оставляют для свертывания на 20—30 мин, затем получают сы-
воротку и хранят ее на холоду; концентрация мышиной сыворот-
ки в культуральной среде не должна превышать 2%. Коммерче-
ские препараты мышиной сыворотки для этой цели обычно не
подходят. Отмывать лимфоциты можно той же средой, которая
предназначена для культивирования, или любым сбалансирован-
ным солевым раствором, например ЗФР Дульбекко без ионов
Са2+ и Mg2+. Величину pH культуральной среды стабилизируют
в пределах 7,2—7,4 с помощью 25 мМ N-2-гидроксиэтилпипера-
зин-М'-2-этансульфоновой кислоты (ГЭПЭС).

Г. Мыши

Мышиные лимфоциты как объект исследования обладают
большими преимуществами по сравнению с лимфоцитами чело-
века, так как существуют гомозиготные линии мышей, хорошо
изученные в генетическом отношении. Большинство широко рас-
пространенных линий мышей протипировано по детерминантам
СКЛ локусов Н-2 и Mis (табл. 2). Реактивность лимфоцитов у
мышей снижается с возрастом, поэтому мы работаем с животны-
ми не моложе 6 недель и не старше 6 месяцев.

••	Таблица 2

Инбредные линии мышей, протипироваиные по детерминантам СКЛ локусов
Н-2 и Mis

	Гаплотипы Н-2					
Аллели Mis	а	Ь	d	k	4	s
а  b  с  d	В10.А  A/J	C57BL/6  C57BL/10  C57L	DBA/2  BA LB/с B10.D2	AKR BRVR/DK  B10.К B10.BR CBA/H CBA/HLac Sto CBA/HT6T6 C3H/HeJ C3H/HeLac CBA/J	DBA/1	SJL

Д. Приготовление клеточных суспензий

Мышей забивают непосредственно перед вскрытием. Для по-
лучения клеток лимфатических узлов, особенно из области шеи,
рекомендуется забивать мышей более щадящим способом, чем
цервикальная дислокация, вызывающая значительные внутрен-
ние кровоизлияния. Забитых мышей погружают в 70%-ный вод-
ный раствор этанола и переносят в асептические условия на ана-
томический столик, покрытый алюминиевой фольгой (фольгу
стерилизуют в пламени и меняют перед каждым вскрытием).

Лимфоузлы выделяют стерильными инструментами следую-
щим образом. Кожу живота оттягивают пинцетом, надрезают и
прямыми ножницами делают разрез по середине длины тела в
поперечном направлении вокруг всего тела. Животное кладут на
левый бок и шкурку передней половины тела с правой стороны
осторожно отворачивают по направлению к голове так, чтобы от-
крылась правая подмышечная область. Там находят один или
два лимфатических узла, которые не связаны с кожей и поэтому
остаются на мышечной поверхности. Их выделяют пинцетом, ос-
вобождают от соединительной ткани, помещают в стерильную
пластмассовую чашку (№ 3002, Falcon), содержащую 5 мл среды,
и держат на льду. Затем шкурку возвращают на место, живот-
ное переворачивают на другой бок, чтобы таким же образом вы-
делить левые подмышечные узлы. После этого шкурку осторожно
сдвигают вперед, чтобы обнажить вентральную поверхность
шейной области. Выделяют четыре шейных лимфатических узла,
которые легко найти в непосредственной близости от слюнных
желез.

Для выделения паховых лимфоузлов шкурку нижней части
живота рассекают (сохраняя целость брюшины) по средней вер-
тикальной линии. В жировой клетчатке под каждым из двух
нижних квадрантов кожи живота легко обнаружить один или
два лимфоузла. Брыжеечные лимфоузлы выделяют, разрезав
брюшину и полностью раскрыв брюшную полость. Петли кишок
осторожно поднимают и оттесняют из центральной и нижней час-
ти полости в левый верхний квадрант. В результате обнажается
брыжейка. В ней можно различить и бескровно удалить по мень-
шей мере три крупных лимфатических узла. Если это требуется,
отпрепаровывают и селезенку, находящуюся в левой части брюш-
ной полости, и помещают ее в отдельную чашку.

Когда лимфоидные органы мышей одной линии будут собра-
ны, все лимфоузлы и отдельно от них все селезенки стерильно
переносят в пластмассовые пробирки (№ 2001, Falcon, внутрен-
ний диаметр 15 мм), измельчают ножницами в 3 миллилитрах
среды, затем тефлоновым пестиком (диаметр 13 мм), который
свободно входит в пробирку, выдавливают клетки из капсу-
лы, осторожно прижимая ткань к стенке. Для быстрого удаления
крупных клеточных агрегатов и обрывков ткани мы фильтруем
клеточную суспензию через стерильную найлоновую сетку № 100
или через найлоновую вату. Перед фильтрацией найлоновую ва-
ту отмывают детергентом 7Х с последующим интенсивным от-
мыванием водопроводной или деионизированной водой и, нако-
нец, тридистиллированной водой. Пластиковые шприцы объемом
10 мл наполовину заполняют рыхлым слоем найлоновой ваты и
автоклавируют их в одной упаковке с поршнями. После этого
найлоновую вату увлажняют двумя миллилитрами среды и пас-
теровской пипеткой наносят на нее клеточную суспензию. Затем
с помощью поршня суспензию продавливают через слой ваты и
собирают в чистую пластмассовую пробирку (№ 3033, Falcon,
15 мл или № 2070, Falcon, 50 мл). Через слой ваты пропускают
еще 5 мл среды. Обе полученные порции клеток объединяют, ре-
суспендируют с помощью пипетки на 5 мл н центрифугируют
20 мин при 150g и 4°С. Надосадочную жидкость вместе со слоем
жира удаляют (если жира много, рекомендуется поменять про-
бирки), клетки ресуспендируют, постукивая по дну пробирки,
сначала слегка, а затем более энергично, чтобы разбить осадок.
После этого к суспензии добавляют среду (10 мл — в пробирки
№ 3033 и 20 мл — в пробирки № 2070), клетки перемешивают
пипетированием и повторяют центрифугирование.

Общее количество клеток и их жизнеспособность определяют
одновременно. Для этого пробу клеточной суспензии разбавляют
равным объемом 0,5%-ного раствора эозина Y в ЗФР и подсчи-
тывают живые и погибшие (окрашенные) клетки в фазово-конт-
растном микроскопе. Затем доводят концентрацию живых кле-
ток в суспензии до 107/мл. Выход лимфоцитов при приготовлении
взвеси из лимфоузлов варьирует в широких пределах. Но ориен-
тировочно можно принять, что в среднем от одной мыши полу-
чается не менее 3—4-107 живых лимфоцитов при жизнеспособно-
сти клеток в суспензии 75—90%. Если полученные клетки ис-
пользуются в СКЛ в качестве «отвечающих», конечную концент-
рацию суспензии доводят до 5 -106 клеток в 1 мл.

Е. Приготовление стимулирующих клеток для
однонаправленной СКЛ

1.	Обработка митомицином С

Для этой обработки берут такое количество стимулирующих
клеток, которое будет не меньше чем в полтора раза превышать
расчетное, и помещают в пробирку. При этом концентрация взве-
си должна быть 107 клеток в 1 мл (или даже в 2—4 раза больше).
На каждый миллилитр клеточной суспензии добавляют 0,05 мл
основного раствора митомицина С (500 мкг в 1 мл ЗФР), т. е.
25 мкг антибиотика. Клетки инкубируют 30 мин при 37°С, перио-
дически перемешивая. После инкубации добавляют холодную
среду и центрифугируют, как указано выше. После первого осаж-
дения клетки не менее трех раз отмывают в избытке холодной
отмывающей среды (держать на льду), подсчитывают количество
клеток и готовят из них взвесь с концентрацией 107 живых клеток
в 1 мл.

2.	Рентгеновское облучение

Рентгеновское облучение, если оно доступно, позволяет более
эффективно обработать стимулирующие клетки. Мы обычно бе-
рем нужное количество лимфоцитов и приготовляем суспензию,
содержащую 107 клеток в 1 мл, в пластиковом флаконе (3012,
Falcon, объем до 8 мл), закрываем его и кладем широкой сто-
роной под трубку рентгеновского аппарата Phillips RT305 на
расстоянии 30 см от источника излучения. Облучение общей до-
зой 3300 Р проводится при 250 кВ, 10 мА через алюминиевый
(4,0 мм) и медный (1,1 мм) фильтры, при мощности 90—
100 Р/мин. После облучения клетки следует ресуспендировать во
флаконах в той же концентрации и держать на льду до постанов-
ки СКЛ.

Ж. Комбинации клеток в СКЛ

Клетки культивируют в панелях для микрокультур (3040,
Falcon) с 96 плоскодонными лунками. Для реакции с лимфоци-
тами из лимфоузлов в каждую лунку с помощью серологических
пластиковых пипеток (№ 7521, Falcon) вносят по 0,1 мл суспен-
зии отвечающих клеток и 0,1 мл суспензии стимулирующих кле-
ток (т. е. 0,5-106 и 106 клеток соответственно). Каждую комбина-
цию клеток повторяют 3—4 раза. При работе с клетками селе-
зенки отвечающие и стимулирующие клетки берут в половинном
количестве. В каждом опыте, исследуя взаимодействие клеток
двух линий мышей, следует убедиться в их стимулирующей или
отвечающей активности в СКЛ с клетками какой-либо третьей,
контрольной, линии. Необходимо также поставить контрольные
СКЛ с аутологичными или сингенными лимфоцитами, чтобы оце-
нить фоновый уровень активации. Кроме этого, следует пригото-
вить культуры каждой суспензии отвечающих лимфоцитов с не-
специфическим митогеном для Т-клеток (например, с конканава-
лином А в конечной концентрации 2 мкг/мл), а также поставить
совместное культивирование аллогенных пар всех образцов сти-
мулирующих клеток, чтобы оценить эффективность рентгеновско-
го облучения или обработки митомицином С. В некоторых случа-
ях— в зависимости от числа включенных в опыт линий мышей —
лучше заранее смешать в отдельных пробирках суспензии отве-
чающих и стимулирующих клеток, взятые в двойной концентра-
ции. Это позволяет устранить один из источников различия ре-
зультатов в параллельных пробах. Затем панели для микрокуль-
тивирования закрывают неплотно прилегающими пластиковыми
крышками, не препятствующими газообмену (Falcon, 3041), и
инкубируют при 37°С во влажной камере в газовой смеси, содер-
жащей 95% воздуха и 5%СО2.

3.	Количественная оценка ответа

В результате стимуляции лимфоцитов, находившихся в со-
стоянии покоя, в них начинается цепь метаболических событий,
связанных с вхождением клеток в митотический цикл и, возмож-
но, с их функциональной дифференцировкой. О пролиферации
клеток обычно судят по интенсивности синтеза макромолекул
одного из трех основных классов — ДНК, РНК или белка, по-
скольку в делящихся клетках все три вида синтеза взаимосвя-
заны.

Интенсивность синтеза ДНК мы обычно определяем по вклю-
чению меченого тимидина, внесенного за 18—24 ч до окончания
культивирования. Основной раствор 3Н-метилтимидина (удель-
ная активность 1,9 Ки/ммоль) разбавляют культуральной средой
до 40 мкКи/мл, подогревают до 37°С и разливают по 50мкл в каж-
дую лунку с помощью стерилизованных в автоклаве пластико-
вых капельных микропипеток, которыми обычно укомплектованы
микротитраторы (пипетки для микротитрования, Cooke, М17).

Кинетика синтеза ДНК варьирует в зависимости от типа кле-
ток и степени стимуляции: чаще всего более ранний пролифера-
тивный ответ коррелирует с большей степенью стимуляции. Реко-
мендуется оценивать результаты эксперимента через различные
интервалы времени, особенно при работе с неизвестными комби-
нациями клеток. Мы обычно вносим метку в СКЛ лимфоузла
через 4—6 дней после начала инкубации. Культивирование пре-
кращают, поместив панели в холодильник (4°С). Оценку радио-
активности можно произвести в любое удобное время в течение
недели. Для сбора клеток из лунок панели мы пользовались по-
луавтоматическим собирателем проб (Hartzman et al., 1971;
Miggiano et al., 1975).

Из имеющихся в продаже приспособлений для сбора клеток
мы рекомендуем коллекторы фирмы Otto Hiller Scientific Equip-
ment (Мэдисон, США). Коллектор просасывает содержимое
каждой лунки через стекловолокнистый фильтр (934 АН grade,
Reeve Angel, Клифтон), на котором клетки задерживаются, а
надосадочная жидкость смывается дистиллированной водой.

Фильтры, соответствующие каждой лунке, высушивают на
подогревной плите, от каждого фильтра отрезают часть опреде-
ленной величины и переносят в счетный сосуд жидкостного сцин-
тилляционного спектрометра. Обычный объем (10 мл) сцинтил-
ляционной жидкости, приготовленной иа толуоле, можно умень-
шить до 2,5 мл почти без снижения эффективности счета, если
воспользоваться мини-сосудами и плексигласовыми адаптерами.

И. Анализ и представление данных

Включение метки в каждой культуре измеряется числом им-
пульсов в минуту (имп/мин), и каждую комбинацию клеток мож-
но охарактеризовать средней арифметической или медианой из
результатов всех параллельных проб. Сравнивая средние вели-
чины включения метки в опытных смесях аллогенных клеток (О)
и в неетимулированных контрольных культурах (Л), можно уста-
новить наличие или отсутствие ответа. Различия между этими
средними можно подвергнуть статистическому анализу, исполь-
зовав t-критерий Стьюдента и выразив данные в логарифмах,
чтобы уменьшить размах отклонений.

Степень стимуляции обычно представляют либо величиной
Д — разностью между средними величинами включения метки
(имп/мин) в стимулированной и иестимулированной культурах
(Д = О— /С), либо отношением между этими средними, которое
называют индексом стимуляции (ИС = ^). Последний представ-
ляет собой относительную величину, и поэтому им предпочита-
ют пользоваться для сравнения разнородных данных. Однако не-
достаток этого показателя состоит в том, что на него сильно вли-
яет фоновая радиоактивность контроля. Представление
необработанных данных более демонстративно; вместе с тем ве-
личины Д, индексы стимуляции и первичные данные О и К, по
существу, содержат одну и ту же информацию и могут быть лег-
ко взаимно преобразованы:

К =-----— ; О = —-— .

ИС-1	1—1/ИС

II. ВТОРИЧНАЯ скл

В настоящее время существуют методы длительного культи-
вирования лимфоцитов, позволяющие первично иммунизировать
(примировать) популяцию аллореактивных лимфоцитов in vitro,
а затем определять их вторичный ответ в СКЛ (Alter et al., 1976;
Fathman et al., 1977). Примированиые отвечающие клетки зна-
чительно сильнее реагируют при вторичном контакте со стимули-
рующими клетками, которые использовались для примирования.
Оценка вторичного ответа весьма полезна для количественной
(но не качественной) характеристики СКЛ. Кроме того, этот ме-
тод дает возможность получать культуры примированных клеток,
ответ которых иммунологически и функционально более специфи-
чен, чем реакции исходных клеток в СКЛ. При использовании
вторичных СКЛ, вероятно, удастся более подробно изучить мно-
гочисленные межклеточные взаимодействия и метаболические
события, происходящие в первичных СКЛ.

А.	Принцип

В описываемом методе лимфоциты, примированные в СКЛ,
используются в качестве источника отвечающих клеток (назы-
ваемых примированными отвечающими клетками — ПОК)- При
этом можно изучать способность таких клеток к вторичному от-
вету на стимулирующие клетки самых различных типов и таким
образом анализировать реактивность и специфичность аллоим-
мунных лимфоцитов. Вероятно, этот метод позволит глубже ис-
следовать природу антигенных детерминант, стимулирующих
СКЛ, и рецепторов Т-клеток, распознающих эти детерминанты.

Б. Материалы и методы

Первичные культуры получают так же, как было описано вы-
ше, только вместо человеческой сыворотки в среду добавляют
сыворотку плода коровы (СПК) до конечной концентрации 10%
по объему. Из имеющихся образцов этой сыворотки нужно выби-
рать те, которые обладают низкой митогенной активностью. Ми-
тогенные факторы СПК снижают воспроизводимость СКЛ и ме-
шают при анализе специфичности и кинетики этой реакции.

В.	Первичная СКЛ

Отвечающие клетки лимфоузлов (40-10е), полученные как
описано выше, культивируют вместе со стимулирующими клетка-
ми (80-Ю6), облученными в дозе 3300 Р. Для этой первичной
культуры используют пластмассовые флаконы (Falcon, № 3024),
содержащие 15 мл среды для СКЛ (с 10% СПК, инактивирован-
ной нагреванием, вместо 2,5% человеческой сыворотки). Флако-
ны инкубируют в вертикальном положении. Через 4 дня можно
взять из каждого флакона пробу объемом 100 мкл и внести в нее
3Н-тимидин для 24-часовой экспозиции, как описано ранее, чтобы
оценить первичную реакцию СКЛ.

Через 9 дней интенсивность пролиферации в опытных культу-
рах обычно снижается до уровня контрольных культур. Через
14 дней после начала культивирования клетки собирают и опре-
деляют их жизнеспособность. Мы обычно делаем это с помощью
диацетата флуоресцеина (метод описан в другом месте: Rotman,
Papermaster, 1966). Это вещество прибавляют к пробе кле-
точной суспензии до конечной концентрации -5 мкг/мл. (Обычно
мы приготовляем его раствор в ацетоне в концентрации 5 мг/мл
и храним при —20°С во флаконе, закрытом фольгой. Перед опы-
том мы этот основной раствор разбавляем в 100 раз физиологи-
ческим раствором и 10 мкл его прибавляем к клеточной суспен-
зии.) Флуорохромированную суспензию помещаем в счетную ка-
меру и подсчитываем живые флуоресцирующие клетки в
люминесцентном микроскопе. Обычно пользуются стандартным
флуоресцентным микроскопом с опак-иллюминатором (освеще-
ние сверху через объектив) и соответствующими возбуждающими
и запирающими фильтрами *. Жизнеспособными обычно остают-
ся от 10 до 50% исходных отвечающих клеток. Эти живые лим-
фоциты называют примнрованными отвечающими клетками
(ПОК).

Г. Вторичная СКЛ

ПОК снова культивируют на панелях с плоскодонными лун-
ками (№ 3040, Falcon). В каждую лунку помещают по 0,2 мл
среды для СКЛ и НО6 облученных стимулирующих клеток (син-
генных или аллогенных по отношению к ПОК). Количество ПОК
на лунку может быть различным в зависимости от целей экспе-
римента. Обычно мы готовим серию по меньшей мере из трех
разведений ПОК и тестируем по две параллельные культуры на
каждый из сроков, когда предполагается учитывать результат.
В сходных условиях 50-103 ПОК реагируют приблизительно так
же, как 1 • 106 непримированных клеток, т. е. ПОК требуется зна-
чительно меньше, чем непримированных клеток, и статистически
значимый ответ можно получить, взяв для реакции всего лишь
несколько сотен ПОК на одну лунку (Watanabe et al., 1977).
Учет результатов вторичной СКЛ можно проводить через 2, 3 и
4 дня культивирования по схеме, приведенной выше. Пик ответа
обычно наблюдается на 3-й день (клетки собирают через 72 ч
после начала культивирования).

Д. Контрола

Контроля для вторичных СКЛ сходны с теми, которые реко-
мендуются для первичных. Важно поставить контроли не только
с сингенными клетками, но и положительный контроль ответа
ПОК. В последнем случае в качестве стимулирующих берут клет-
ки, которыми ПОК были примированы. Результаты опытов без
анализа зависимости эффекта от дозы могут ввести в заблужде-
ние (Corley, 1977). Поэтому важно в каждом опыте ставить реак-
цию с несколькими концентрациями ПОК и предусмотреть учет
результатов в разные сроки наблюдения.

1	Полное описание метода см. в работе: Rotman, Papermaster, 1966.
III. КРИТИЧЕСКИЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Готовить клеточную суспензию и обращаться с ней следует с
максимальной осторожностью, чтобы свести к минимуму повреж-
дение клеток и предохранить их от контаминирования. Еще не
все признают, что функция стимулирующих клеток не сводится к
простому внесению аллогенных детерминант. Однако стимули-
рующими в СКЛ, по крайней мере в начале культивирования,
могут быть только живые клетки, у которых допускается лишь
необратимая блокада синтеза ДНК. В первичных смешанных
культурах лимфоцитов человека пик синтеза ДНК обычно наб-
людается после 6—7 дней инкубации. Мы показали (неопубли-
кованные данные), что обработка таких культур цитотоксически-
ми антителами анти-HLA, которые реагируют только со стимули-
рующими клетками, резко тормозит активацию отвечающих кле-
ток при воздействии даже после трех дней культивирования. Но
начиная с 4-го дня инкубации цитолиз стимулирующих клеток
уже почти не влияет на уровень ответа в СКЛ. С другой стороны,
можно полностью лишить лимфоциты стимулирующих свойств
такими воздействиями, которые существенно не нарушают струк-
туры клеточной поверхности, например прогреванием и путем
обработки иодуксусной кислотой (Shellekens, Eijsvoogel, 1970),
глутаральдегидом (Hardy et al., 1970), ультрафиолетовым облу-
чением (Lindahl-Kiessling, Safwenberg, 1971), а также хлорис-
тым лантаном и колхицином (Ranney, Pincus, 1975).

При интерпретации результатов СКЛ не следует забывать,
что уровень ответа зависит не только от аллоантигенных разли-
чий данной комбинации лимфоцитов, но и в значительной мере от
«общей» способности к ответу и к стимуляции данных отвечаю-
щих и стимулирующих клеток. В связи с этим, делая вывод о
специфичности ответа, на каком бы уровне он ни регистрировал-
ся, следует также учитывать поведение данных отвечающих и
стимулирующих клеток в других комбинациях (в том же экспе-
рименте). При типировании лимфоцитов неизвестной линии,
особенно тогда, когда уровень стимуляции очень низок, выбор
критерия отрицательного специфического ответа становится
проблематичным. В этом случае целесообразно повторить опыт
и, если возможно, клетки каждого животного-донора культиви-
ровать в изучаемой комбинации раздельно, а полученный ответ
оценивать только после сравнения между собой культур аутоло-
гичных и сингенных клеток. Такое сравнение позволит устано-
вить порог аллогенной стимуляции и тем самым выявит критерий,
с помощью которого можно отнести данную комбинацию клеток
в разряд «не дающих ответа». Правда, некоторые смеси синген-
ных клеток из-за большого разброса результатов в контроле не-
редко дают статистически значимые величины ИС (до 2). Кроме
того, данные значительно варьируют от опыта к опыту, поэтому
следует с осторожностью относиться к выводам, сделанным на
основании одного опыта.

Усиление клеточной пролиферации и синтеза макромолекул —
это опосредованный эффект, отдаленный результат первоначаль-
ного взаимодействия между аллогенными клетками. Неоднознач-
ность такого взаимодействия лежит в основе ложных положи-
тельных .реакций, которые можно наблюдать, в частности, при
культивировании лимфоцитов Fi с клетками родительских линий
или лимфоцитов мышей пи/пи с аллогенными клетками. Как вы-
яснилось, положительный ответ в этих случаях обусловлен «об-
ратной стимуляцией» отвечающих клеток, которая происходит в
результате абортивной аллогенной активации облученных сти-
мулирующих клеток интактными отвечающими клетками.

Удобным методом, особенно при тестировании большого чис-
ла животных, может служить двунаправленная СКЛ. Примене-
ние этого варианта СКЛ в крупномасштабных исследованиях
описано у Мео и сотр. (Мео et al., 1976).

Я благодарен д-ру К. Г. Фатману за его советы и любезно пре-
доставленные материалы по вторичным СКЛ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Alter В. J., Grillot-Courvalin С., Bach М. L., Sondel Р. М., Bach F. Н. (1976)
J. Exp. Med., 143, 1005.

Bach F. Н., Widmer М. В., et al. (1972). J. Exp. Med., 136, 1430.

Corley R. B. (1977). Eur. J. Immunol., 7, 93.

Fathman C. G., Collavo D., Davies S., Nabholz M. (1977). J. Immunol., 118,
1232.

Festenstein H. (1974). Transplantation, 18, 555.

Hardy D. A., Knight S., Ling N. R. (1970). Immunology, 19, 329.

Hartzman R. J., Segall M., Bach M. L., Bach F. H. (1971). Transplantation,
11, 268.

Klein J. (1975). Biology of the Mouse Histocompatibility-2 Complex, Springer-
Verlag, Berlin and New York.

Lindahl-Kiessling K., Safwenberg J. (1971). Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.,
41, 670.

Meo T., Vives G., Rijnbeck A. M., Miggiano V. C., Nabholz M., Shreffler D. C.
(1973). Transplant. Proc., 5, 1339.

Meo T., David C. S., Shreffler D. C. (1976). In: The Role of Products of the
Histocompatibility Gene Complex in Immune Responses (D. H. Katz and
B. Benacerraf, eds.), p. 167, Academic Press, New York.

Miggiano V. C., MeoT., Birgen I., Nabholz M. (1975). Tissue Antigens, 5, 173.
Ranney D. F., Pincus J. H. (1975). Fed. Proc.. Fed. Am. Soc. Exp. Biol., 34,
1011.

Rotman B., Papermaster B. IT. (1966). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55, 134.
Shellekens P. T. A., Eijsvoogel V. P. (1970). Clin. Exp. Immunol., 7, 229.
Snell G. D., Dausset J., Nathenson S. (1976). Histocompatibility, Academic
Press. New York. [Имеется перевод: Снелл Дж., Доссе Ж-, Нэтенсон С.
Совместимость тканей. —М.: Мир, 1979.]

Scprensen S. F. (1972). Acta Pathol. Microbiol. Scand., 230, 1.

Watanabe T., Fathman C. G., Coutinho A. (1977). Immunol- *ev., 35, 3.
МЕТОД ТОНКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ
РОЗЕТКООБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК

Б. Эллиот

I.	НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА

Описанный в этой главе метод служит для выделения клеток,
образующих эритроцитарные розетки (розеткообразующих кле-
ток, РОК) с целью анализа их популяций и проведения функцио-
нальных исследований.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Метод отделения розеток от одиночных клеток основан на
различии их размеров и соответственно разной скорости оседания
под действием силы тяжести (Osoba, 1970; Elliott, Haskill, 1973;
Elliott, 1973). Скорость седиментации розеток пропорциональна
числу связанных эритроцитов и величине самих РОК. Поэтому
розетки оседают быстрее, чем одиночные клетки. Кроме того, этот
метод позволяет разделять субпопуляции РОК, различающиеся
по числу эритроцитов, связанных каждой клеткой.

Чтобы определить, относятся ли к РОК клетки с определен-
ии иммунологическими функциями (например, предшественни-
ки антителообразующих клеток или Т-хелперы), проводят два
варианта разделения: 1) без предварительного розеткообразо-
вания (контроль) и 2) после образования розеток, а затем с по-
мощью соответствующих тестов определяют функциональную ак-
тивность клеток, содержащихся в разных фракциях. Любые клет-
ки, проявляющие данную функциональную активность и одно-
временно фиксирующие эритроциты, будут оседать в составе ро-
зеток быстрее, чем одиночные клетки. В результате кривая рас-
пределения относительной активности исследуемой клеточной
популяции смещается в сторону фракции с большей скоростью
оседания. Таким образом удается выяснить функцию розеткооб-
разующих клеток.

Как мы увидим позже, предлагаемые методы выделения и
анализа РОК предназначены для изучения Т- и В-клеток, участ-
вующих в иммунном ответе на бараньи эритроциты. Однако ос-
новной принцип выделения розеток можно использовать при ра-
боте со многими другими антигенами.
III.	ОБРАЗОВАНИЕ РОЗЕТОК

А.	Среда

Для клеток любого происхождения применялась минималь-
ная среда Игла (Gjbco, Гранд Айленд, США), забуференная
трис (гидроксиметил) аминометаном (Trizma base, Gibco) до
pH 7,2. На 1 л среды мы добавляли 9,6 мл 2,9 М раствора NaCl
и 10 мл десятикратного концентрата изотонического трис-буфера.

Сбалансированный солевой раствор Игла (см. разд. IV, Г, 3)
приготовляли из следующих основных растворов, объемом 2 л
каждый: раствор I — 120,0 г трис-буфера (Sigma), 17,8 г
No2HPO4-2H2O и 0,2 г фенолового красного; раствор II—4,92 г
MgSO4-7H2O и 5,8 г СаС12-2Н2О; раствор III—140,0 г NaCl и
9,0 г КС1. Затем смешивали равные объемы этих основных рас-
творов: сначала II и III, а затем к этой смеси прибавляли рас-
твор I.

Б. Азид натрия

В некоторых опытах использовали 1%-ный (вес/объем) рас-
твор азида натрия (Fisher Scientific Со., Питтсбург, США).

В.	Обработка нейраминидазой

В некоторых экспериментах бараньи эритроциты (8-Ю8) ин-
кубировали в растворе нейраминидазы (General Biochemical Di-
vision, Чагрин Фоллс, США) (50 ед/мл в физиологическом рас-
творе, забуференном фосфатами, с pH 7,4) 30 мин при 37°С, за-
тем три раза отмывали в 10 мл минимальной среды Игла и
смешивали с клетками селезенки для образования розеток, как
описано ниже.

Г. Эритроциты

Бараньи эритроциты получали от одного и того же животного
и выдерживали в растворе Олсвера при 4°С не меньше недели.
Сгустки и нити фибрина удаляли. Для каждого опыта брали пор-
цию эритроцитов и трижды отмывали в минимальной среде Игла,
центрифугируя 10 мин при 800g. В 1 мл плотного осадка содер-
жалось 2 • 1010 эритроцитов.
Д. Приготовление клеточных суспензий

Для опыта брали селезенки не меньше чем от трех мышей, по-
мещали в пластмассовую чашку Петри с 10 мл холодной мини-
мальной среды Игла (во льду). Держа селезенку за один конец
пинцетом с тонкими изогнутыми браншами, надрезали ножница-
ми ее соединительнотканную капсулу на другом конце. Через
полученное отверстие другим тонким пинцетом выжимали клет-
ки. При этом капсула защищает клетки от механического по-
вреждения, возможного при прямом контакте с пинцетом. Энер-
гичное пипетирование суспензии тонко оттянутой пастеровской
пипеткой способствовало диспергированию клеточных агрегатов.
Полученную суспензию оставляли на 10 мин в наклонно постав-
ленной чашке Петри для осаждения оставшихся клеточных агре-
гатов. Затем две верхние трети суспензии, содержащие одиноч-
ные клетки, отбирали и трижды отмывали в среде Игла. После
разрушения эритроцитов 5%-ной уксусной кислотой подсчитыва-
ли клетки с ядрами. Жизнеспособность клеток определяли, сме-
шивая равные объемы клеточной суспензии и 1%-ного раствора
эозина в ЗФР (обычно она составляла 70—90%).

Е. Образование розеток

Так как многие переменные, в частности форма и размеры
пробирок, объем среды, концентрации эритроцитов и клеток с яд-
рами, могут существенно влиять на число и морфологию розеток
(Wilson, 1971; Charreire et al., 1973), во всех экспериментах сле-
дует придерживаться стандартных условий.

Большие количества клеток, необходимые для изучения функ-
циональной активности, мы получали следующим образом. Сме-
шивали 8-107 ядерных клеток с 8-108 бараньих эритроцитов в
2 мл минимальной среды Игла. Такое соотношение (10: 1) ока-
залось оптимальным. Образование розеток происходило в среде
без сыворотки. В некоторых опытах перед образованием розеток
эритроциты обрабатывали нейраминидазой (см. разд. IV, В, 4).
Клеточную суспензию центрифугировали при 4°С в пластмассо-
вых центрифужных пробирках на 15 мл (№ 2057, Falcon Plastcs,
Division of Bio Quest, Окснард, Калифорния) при 100g в течение
6 мин, чтобы образовался ясно видимый осадок на дне пробирки.
После часовой инкубации при 0°С осадок осторожно ресуспенди-
ровали, шесть раз набирая и выдувая взвесь пастеровской пи-
петкой с широким капилляром. В некоторых опытах непосред-
ственно перед ресуспендированием осадка в пробирку наливали
0,1 мл 1%-ного раствора азида натрия в ЗФР (см. разд. VI, В,
3). Полученную суспензию подвергали разделению, как описано
ниже.
IV. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОК

А. Теория

Теория седиментации под действием силы тяжести подробно
изложена в литературе (обзор: Miller, 1973). Основной принцип
состоит в следующем. Если частица движется в жидкости с не-
которой конечной скоростью, то скорость ее седиментации, s
(мм/ч), определяется из уравнения:

„ 2(р — ?’)gr2

9>)

где р — плотность частицы (клетки) в г/см3, р' — плотность сре-
ды, g — ускорение силы тяжести (980 см/сек2), т] — коэффици-
ент вязкости среды иг — радиус (мкм) сферы, эквивалентной
объему частицы. При физиологических условиях большинство
клеток млекопитающих имеют радиусы 2,5—10 мкм и плотность
1,05—1,10 г/см3. В водной среде (р' = 1,01 г/см3) конечная ско-
рость оседания клеток разных размеров может различаться в
16 раз, а клеток разной плотности — только в 2 раза (Miller,

Рис. 1. Аппарат для разделения розеток по скорости оседания.

А — седиментационная камера; Б — сосуд для градиента высокой плотности;
В — сосуд для градиента низкой плотности; Г — промежуточный сосуд; Д —
магнитные мешалки; Е — трубки нз силиконовой резины (Silastic, Dow-
Corning); Ж— трехходовой кран; 3 — заслонка; И — крышка камеры;
К — отверстие в крышке камеры; Л — винт; Af — положение слоя клеток
сразу после заполнения камеры; Н — пробирки для сбора фракций; О —
штатив.
1973). Поэтому величина s зависит в первую очередь от разме-
ров оседающих клеток.

Если плотность и размеры клетки известны, величину s мож-
но вычислить прямо по приведенной формуле. Например, типич-
ная клетка с ядром (р= 1,06 г/см3) будет оседать в водной среде
(р'= 1,01 г/см3, т]= 1,567 сП) со скоростью s, равной г2/4. Вычис-
ленная таким образом величина s очень хорошо коррелирует с
найденной экспериментально (Miller, 1973),.

Б. Аппарат

Назначение аппарата (рис. 1) состоит в том, чтобы создать
тонкий слой клеточной суспензии в верхней части столба жидко-
сти, обеспечить оседание клеток под действием силы тяжести в
течение соответствующего времени и собирать фракции клеток,
оседающих с разной скоростью.

Для фракционирования клеток применялась седиментацион-
ная камера (О. Н. Johns Scientific, Торонто, Канада) 22 см в диа-
метре, дно которой образовывало конус с углом 30°. Все соедине-
ния были выполнены трубками из силиконовой резины (Silastic,
Dow — Corning, Торонто, Канада), прилипание клеток к кото-
рой минимально.

Клетки мы суспендировали в 100 мл «раствора для нанесе-
ния», непосредственно вносили в седиментационную камеру
(Л на рис. 1) и, подавая снизу под давлением из сосудов Б и В
градиент низкой плотности (от 1,007 до 1,011 г/см3), поднимали
их на стартовую позицию. Для создания градиента низкой плот-
ности соединяли последовательно два сосуда, содержащие по

Рис. 2. Профиль сглаженного ступенчатого градиента плотности сразу после
заполнения камеры (Miller, 1973).

9—233
1,2 л 1%-ного и 0,75%-ного растворов фиколла (см. рис. 1). Этот
градиент защищает клетки во время седиментации от конвекци-
онных токов и механических столкновений, не оказывая никакого
влияния на скорость оседания.

Чтобы стабилизировать слой клеток, непосредственно под ним
создают «закругленный» профиль градиента, подавая из проме-
жуточного резервуара (Г) 50 мл 0,35%-ного раствора фиколла;
в результате образуется сглаженный ступенчатый градиент плот-
ности (рис. 2).

Перемешивание жидкости во время заполнения камеры пред-
отвращается заслонкой из нержавеющей стали, которая разби-
вает поток при входе жидкости в камеру. Когда нужно провести
прямое сравнение двух опытов седиментации, камеру можно за-
полнять одинаковыми объемами градиента, отметив верхний уро-
вень его нижним концом винта Л; при воспроизведении опыта
подачу градиента прекращают, как только уровень поднимаю-
щейся жидкости коснется этой отметки.

В.	Процедура фракционирования

Для разделения розеток мы используем процедуру, подробно
описанную ниже.

1.	Собирают аппарат, как показано на рис. 1. В этом аппара-
те градиентные резервуары и промежуточный сосуд имеют внут-
ренний диаметр 12 и 2,5 см соответственно. Для стерильной ра-
боты собранный аппарат автоклавируют.

2.	Готовят растворы фиколла в минимальной среде Игла в
концентрациях, указанных в табл. 1, охлаждают до 4°С и дово-
дят pH до 7,2. Если нужно, добавляют азид натрия до конечной
концентрации 0,05% (см. разд. VI, В, 3).

3.	Заполняют соединительный шланг между сосудами Г и 3
0,35%-ным раствором фиколла в среде Игла, стараясь удалить
все пузырьки воздуха.

4.	Осторожно центрируют заслонку (3) внутри конуса седи-
ментационной камеры.

5.	Перекрывают соединения между сосудами Б, В и Г. Нали-
вают 1,2 л 1,5%-ного раствора фиколла в сосуд Би 1,2 л 0,75%-
ного раствора фиколла в сосуд В; заполняют промежуточный со-
суд 0,35%-ным раствором фиколла до уровня в сосудах Б а В.

6.	Розетирующие клетки, приготовленные как указано в
разд. III, Д и Е, осторожно суспендируют пастеровской пипет-
кой в 100 мл «раствора для нанесения» (табл. 1) и вносят непо-
средственно в камеру (Л, рис. 1), стараясь не сдвинуть заслонку.
(В опытах с параллельным функциональным анализом то же са-
мое количество клеток, смешанных с эритроцитами, фракциони-
руют спустя приблизительно 30 мин в другой камере, предотвра-
тив розеткообразование.)

Таблица 1

Концентрация сыворотки, бычьего сывороточного альбумина
и фиколла для разделения клеток по скорости оседания

Сосуд	БСА, %	Сыворотка плода коровы, %	Фиколл, %	Объем, л
Резервуар для градиента	2,0	30	1,5	1,2
высокой плотности (Б)1 Резервуар для градиента	1,0	15	0,75	1,2
низкой плотности (В)1 Промежуточный сосуд	0,5	7,5	0,37	0,15
_у *  «Раствор для нанесения»2	0,25	3,7	0,17	0,1

1 См. рис. 1. * См. разд. IV, В.

7.	Пускают ток жидкости в камеру при начальной скорости
2—3 мл/мин. Включают магнитные мешалки.

8.	Снимают все зажимы и отмечают время (ti). Нарастание
концентрации фиколла от 0,35 до 0,75% должно происходить
быстро, а от 0,75 до 1,5% — медленно. Когда слой клеток подни-
мется со дна, скорость тока можно увеличить. Заполнение нужно
вести как можно быстрее, не нарушая слоя клеток. Нашу каме-
ру мы заполняли в течение 20—30 мин. Подачу градиента следу-
ет начинать сразу после внесения клеток.

9.	После 1,5 ч седиментации начинают опорожнение камеры
через нижний кран. Весь объем вытекающей жидкости собирают
по фракциям в стеклянные конические пробирки (Bellco, Vine-
land, Нью-Джерси, США) по 40 мл при скорости около
30 мл/мин. Отмечают время начала выхода первой фракции
(t2) и окончания выхода последней (/з). Отмечают номер и объ-
ем последней фракции.

Г. Вычисление величин s

«Приращение» величины скорости s на 1 фракцию (к значе-
нию s последней, самой медленной фракции)—is — вычисляют
по следующей общей формуле (Miller, 1973):

is = VP/(KT),
где V — объем фракции, Т — среднее время седиментации и
К — постоянная, соответствующая объему слоя жидкости тол-
щиной 1 мм в данной камере (при диаметре камеры 22 см К—
= 38,0 мл/мм).

Поскольку седиментация клеток продолжается и во время
сбора фракций, среднее время седиментации Т нужно вычис-
лять по формуле

у _ ^3	^2  J

2 Р

Такое приближение при определении времени седиментации
для разделения розеток допустимо, так как это время доста-
точно мало, а величина is на 1 фракцию велика (1,2 мм/ч). При
более длительной седиментации величина is на 1 фракцию бу-
дет меньше (<0,4 мм/ч); для более точного определения этого
показателя нужно учитывать время оседания клеток в коничес-
кой части камеры в период ее заполнения и опорожнения (Mil-
ler, 1973).

Значение is принимается равным нулю (ts = O) для среднего
уровня нанесенного слоя клеток. Поэтому объем последней
фракции (соответствующей верхнему уровню градиента, т. е.
нижнему уровню слоя клеток) корректируется вычитанием из не-
го половины объема нанесенной клеточной суспензии (в данном
эксперименте нужно вычесть 50 мл).

Скорость (мм/час) для последней фракции определяют, учи-
тывая коррекцию ее объема. Чтобы вычислить среднюю ско-
рость для каждой фракции, нужно к скорости последней фрак-
ции прибавлять величину is, умноженную на порядковый номер
фракций, если пронумеровать их в обратном порядке, считая
«первой» предпоследнюю фракцию.

' v

Д. Подготовка клеток для подсчета и изучения активности

Розетки в каждой фракции необходимо подсчитывать до от-
мывания, так как во время центрифугирования розетки могут
распадаться. Для этого из каждой фракции отбирают по 0,5 мл
суспензии и для окрашивания клеток к 100 мкл этой пробы
прибавляют 10 мкл насыщенного профильтрованного раствора
кристаллического фиолетового в ЗФР; затем каплю суспензии
известного объема наносят на предметное стекло и накрывают
покровным стеклом. Розеткой считается единичная клетка с яд-
ром, окруженная по меньшей мере четырьмя эритроцитами. Под-
считав розетки, вычисляют их количество во всем объеме фрак-
ции.

К остальной суспензии каждой фракции прибавляют 1 мл сы-
воротки плода коровы и 0,1 мл 0,1°/о-ной взвеси бараньих эри-
троцитов; это повышает выход клеток во время центрифугиро-
вания, которое проводят при 250 g и 4°С в течение 20 мин;
надосадочную жидкость удаляют, а клетки ресуспендируют в
1 мл свежей среды. Количество жизнеспособных клеток опреде-
ляют путем окрашивания 1%-ным раствором эозина Y (как в
разд. Ill, Е).

Выяснив распределение клеток по фракциям, соседние фрак-
ции объединяют в соответствии с поставленной задачей и про-
водят тесты на функциональную активность. При изучении им-
мунного ответа in vitro [в частности, при определении хелперов
или предшественников антителообразующих клеток (АОК)] в
полученных фракциях различиями по количеству эритроцитов
можно пренебречь, так как для иммунизации их добавляют в
избытке. Однако перед постановкой других тестов [например,
при оценке цитотоксической активности клеток или их участия в
реакциях гиперчувствительности замедленного типа (Elliott
et al., 1975)] эритроциты нужно удалить. Для этого клетки ре-
суспендируют в гемолитическом буфере (0,01М КНСО3,
0,155 М NH4C1, 0,1 мМ ЭДТА)- до концентрации не более 107/мл.
Взвесь инкубируют 1 мин при 0°С, затем прибавляют избыток
холодной среды Игла и трижды отмывают.

Ж. Определение числа эритроцитов в розетке

1.	Фиксация

Подсчет эритроцитов в розетках и морфологическое исследо-
вание каждой розеткообразующей клетки проводят на фикси-
рованных и окрашенных препаратах. В качестве фиксатора ис-
пользуют глутаральдегид (50 об.%, Fisher Scientific Со.)—ре-
актив, вызывающий образование поперечных сшивок в белках
(Sabatini et al., 1963). Основной раствор разбавляют дистилли-
рованной водой до концентрации 25% и хранят в темноте при 4°С
с активированным углем (одна пятая объема). Перед опытом
раствор разбавляют до 5% охлажденным (4°С) физиологичес-
ким раствором, забуференным фосфатами (pH 7,4). Попавший в
рабочий раствор уголь удаляют центрифугированием.

Конечная концентрация глутаральдегида в клеточной взвеси
должна быть 0,6%. Суспензию осторожно перемешивают и ос-
тавляют при 4°С на 20 мин.

Процесс фиксации останавливают, разбавив суспензию дис-
тиллированной водой. Осадок осторожно диспергируют пипеткой
и, прибавляя дистиллированную воду, доводят концентрацию
клеток (включая эритроциты) до 5-105 в 1 мл. Осторожно пере-
мешав взвесь, пастеровской пипеткой наносят на предметные
стекла капли равного объема и оставляют высохнуть. Концент-
рацию розеток в исходной суспензии определяют по числу их в
капле с учетом разбавления.

2.	Окрашивание клеток и исследование их морфологии

Высушенные капли обрабатывают метанолом, чтобы клетки
прикрепились к стеклу, а затем окрашивают пиронином — мети-
ловым зеленым (British Drug Houses Ltd., Торонто, Канада) в
течение 15 мин. Розетки находят, просматривая препарат под
малым увеличением. При увеличении Х1000 (под масляной им-
мерсией) убеждаются в том, что в центре каждой розетки нахо-
дится лимфоцит, и проводят морфологический анализ. С по-
мощью окуляр-микрометра измеряют диаметр каждой РОК. По
величине лимфоциты подразделяют на малые (<7 мкм), сред-
ние (7—11 мкм) и большие (>11 мкм) (Metcalf, Wiadrowski,
1966). Подсчитывают число эритроцитов, приходящееся на одну
РОК в каждой фракции. Учитывают только морфологически ин-
тактные РОК, не находящиеся в контакте с другими ядерными
клетками.

3.	Определение стабильности и выхода розеток

Стабильность розеток была тщательно проанализирована
следующим образом. Два образца (по 10 мкл каждый) нефрак-
ционированной суспензии розеток вносили в пробирки, содержа-
щие 1 мл «раствора для нанесения» (0,17%-ный раствор фикол-
ла в минимальной среде Игла). Один образец сразу же фикси-
ровали, а другой на время фракционирования оставляли при
4°С и затем фиксировали. В каждом из этих препаратов опреде-
ляли количество Т- и В-розеток в момент начала и конца фрак-
ционирования. Количество В-розеток в эти два срока было оди-
наковым, т. е. они все сохранялись. Высокая стабильность Т-ро-
зеток наблюдалась только в том случае, если после ресуспенди-
рования осадка розеток прибавляли 0,05% азида натрия
(разд. VI, В,3). Выход розеток при фракционировании
(разд. V, Б) определяли, учитывая их стабильность в нефракцио-
нированной суспензии, оставленной при 4°С на весь период раз-
деления.
Рис. 3. А. Разделение розеток по скорости седиментации.

Для образования розеток с бараньими эритроцитами, обработанными
нейраминидазой, использовались клетки из селезенки мышей DBA/2. Розетки
были разделены по скорости оседания. Число клеток с ядрами на 1 фракцию
выражено в процентах к общему числу таких клеток, взятых для разделения.
Число розеток на 1 фракцию определяли после окрашивания клеток метило-
вым фиолетовым в суспензии без отмывания. Б. Для приготовления фикси-
рованных и окрашенных препаратов из каждой фракции брали пробу 0,5 мл;
препараты готовили как описано в разд. IV, Е. Определяли число эритроцитов
иа каждую РОК; каждая точка представляет среднюю величину не менее чем
для 15 розеток.
V. ВЫХОД, ИСТОЩЕНИЕ, ОБОГАЩЕНИЕ

А.	Распределение клеток с ядрами

Выход таких клеток при фракционировании колебался в пре-
делах от 50 до 85%. В нашей системе средняя скорость седимен-
тации малых лимфоцитов (диаметр их у мышей равен или мень-
ше 7 мкм) составляла 3,7 мм/ч (рис. 3,А). При непродолжитель-
ной седиментации большинство ядерных клеток в нормальной по-
пуляции оседает в узких пределах скоростей — между 2,5 и
4,5 мм/ч. У средних клеток (7—11 мкм в диаметре) скорость осе-
дания от 5 до 6 мм/ч; у нормальных животных эти клетки со-
ставляют 10—20% общего количества клеток с ядрами. Менее
2% клеток оседает со скоростью более 8 мм/ч.

Жизнеспособность клеток после фракционирования была
выше 98%; погибшие и разрушенные клетки оседали со ско-
ростью меньше 2,5 мм/ч.

Б. Распределение РОК по фракциям

При контрольном разделении без предварительного розетко-
образования большинство РОК оседали как одиночные клетки
со скоростью 2,5—-4,5 мм/ч.

Когда разделению предшествовало образование розеток, ско-
рость оседания этих розеток (из одной ядерной клетки с че-
тырьмя и более эритроцитами) превышала 6 мм/ч (рис. 3, А).
Она была пропорциональна числу связанных эритроцитов
(рис. 3, Б). Выход розеток при фракционировании составлял
70—100%.

В.	Истощение и обогащение

Фракции клеток, оседавших со скоростью меньше 5 мм/ч, бы-
ли полностью лишены розеток. Во фракциях, соответствующих
скорости 6—8 мм/ч, содержалось некоторое количество одиноч-
ных клеток (рис. 3, А). В более быстрых фракциях (скорость
выше 8 мм/ч) РОК составляли 25—50%. Выход ррзеток в этой
фракции можно было повысить до 75—90%, удалив быстро осе-
дающие одиночные клетки еще до образования розеток.
VI. ПРИМЕНЕНИЕ, ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ
И ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА

А. Определение функциональной активности

В зависимости от замысла эксперимента —функциональную
активность клеток разных фракций (отдельных или после ча-
стичного объединения) можно выразить двумя показателями,

рассмотренными ниже.

1.	Общая активность фракции

Отбирая для функциональных исследований одну и ту же
объемную часть клеточной суспензии каждой фракции и опреде-
ляя ее активность, можно устанавливать общую активность раз-
ных фракций и сравнивать их между собой (т. е. определять
относительную активность фракций). Сопоставляя сумму актив-
ностей всех фракций с активностью неразделенных клеток (в об-
разце, эквивалентном взвеси, нанесенной на градиент), можно
определить выход функциональной активности при фракциони-
ровании.

2.	Удельная активность фракций

Можно поступить иначе — определить активность какого-ли-
бо постоянного количества клеток из каждой фракции, т. е. оце-
нить ее удельную активность и выразить, например, как актив-
ность на 10s клеток. Тогда общую активность фракции можно вы-
числить, умножив удельную активность на число клеток в этой
фракции. Разумеется, при таком подходе ошибка в подсчете
клеток увеличивает погрешность и показатели общей активно-
сти будут менее точными, чем при их прямом определении (см.
разд. VI, А, 1).

Б. Основные результаты, полученные с помощью
описанного метода

Метод был использован для количественной характеристики
антигенспецифичных лимфоцитов, образующих розетки с эрит-
роцитами барана (0,01—0,05% нормальных лимфоцитов пери-
ферической крови мыши), и для выяснения их функции в иммун-
ном ответе. Были получены следующие результаты.

1.	В селезенке неиммунизированых мышей содержатся как
Т-, так и В-РОК. Т-РОК исчезают после тимэктомии у взрослых
животных и после введения антилимфоцитарной сыворотки; они
лизируются сывороткой, анти-ТЬу-1.2 в присутствии комплемен-
та морской свинки. В-РОК устойчивы ко всем перечисленным
воздействиям. Т-РОК связывают меньше бараньих эритроцитов,
чем В-РОК (Haskill et al., 1972). Кроме того, Т-розетки менее
стабильны, чем В-розетки (Elliott, Haskill, 1973).

2.	Большая часть (более 80%) предшественников клеток,
синтезирующих 198-гемолизины к бараньим эритроцитам, из се-
лезенки мыши при фракционировании в отсутствие эритроцитов
оседает в виде одиночных клеток со скоростью меньше 5 мм/ч.
Вместе с тем большинство этих клеток (более 80%) образует од-
нослойные розетки (из 10—18 эритроцитов), оседающие со ско-
ростью 6—10 мм/ч. По данным реакции локального гемолиза,
для 19S-AOK в большинстве случаев характерно образование
многослойных розеток, содержащих более 18 эритроцитов и осе-
дающих со скоростью более 12 мм/ч (Elliott, Haskill, 1973).

Эти результаты получены без обработки эритроцитов нейра-
минидазой и без добавления к среде азида натрия. В таких ус-
ловиях популяция РОК, связывающих более 10 бараньих эрит-
роцитов, обнаруживает свойства В-лимфоцитов.

3.	Для выделения Т-РОК с целью функционального анализа
нужно обратимо ингибировать метаболизм с помощью азида
натрия (конечная концентрация 0,05%), чтобы предотвратить
диссоциацию Т-розеток (Elliott a. Haskill, 1973). Кроме того,
эффективность разделения Т- и В-розеток можно повысить, пред-
варительно обработав бараньи эритроциты нейраминидазой
(рис. 3,.А). Т-хелперы (т. е. Т-клетки, взаимодействующие с В-
клетками в процессе формирования АОК к бараньим эритроци-
там) и от нормальных животных (Elliott et al., 1973), и от им-
мунных животных (Elliott, Haskill, 1975) всегда оседают как
одиночные клетки, не образующие розеток. В отличие от этого
популяция средних лимфоцитов, функционально соответствую-
щая Т-эффекторам, образует розетки Т-типа с 8—10 эритроци-
тами. К этой популяции относятся Т-клетки, активные в адоп-
тивном переносе гиперчувствительности замедленного типа к
бараньим эритроцитам и в цитолитической реакции in vitro (спе-
цифический цитолиз и торможение роста бараньих фибробла-
стов, несущих детерминанты БЭ); эти клетки чувствительны к
сыворотке анти-ТЬу-1,2 в присутствии комплемента морской
свинки. Таким образом, Т-хелперы, участвующие в гуморальном
ответе (198-антитела), отличаются от Т-эффекторов клеточного
иммунитета (гиперчувствительности замедленного типа и цито-
токсичности in vitro).

В. Чувствительность метода

Ниже мы рассмотрим ряд особенностей метода, обусловли-
вающих его высокую чувствительность.
1.	Время оседания

Если для оптимального разделения малых и средних лимфо-
цитов требуется осаждение в течение 3,5—4 ч (Miller, 1973), то
разделение розеток и одиночных клеток происходит быстро —
за 1,5 ч. Поэтому большая часть одиночных клеток остается в от-
носительно узкой зоне, соответствующей скорости оседания
2,5—5 мм/ч, розетки же смещаются намного дальше, оседая со
скоростью более 6 мм/ч, что позволяет получить хорошее раз-
деление.

2.	Объем эритроцитов

Бараньи эритроциты [их объем равен 32 мкм3 (Altman,
1961)] оседают со средней скоростью 1,5 мм/ч, а скорость осе-
дания малых лимфоцитов [их объем 172 мкм3 (Metcalf, Wiadrows-
ki, 1966)] составляет 3,7 мм/ч. Поэтому любой лимфоцит, свя-
завший хотя бы один, два или три эритроцита, оседает намного
быстрее, чем одиночные клетки [со скоростью 4,5—6 мм/ч (см.
рис. 3 и Elliott et al., 1973)]. Благодаря этому сравнение седимен-
тационных профилей функциональной активности до и после ро-
зеткообразования позволяет уловить связывание даже очень не-
большого числа эритроцитов. Удается также выявить значи-
тельные различия в скорости седиментации между популяциями
розеток с разным числом эритроцитов (см. разд. VI,Б).

3.	Азид натрия

Некоторые розеткообразующие клетки, например Т-РОК
(Elliott, Haskill, 1973), дают нестабильные розетки, диссоции-
рующие уже через несколько минут после ресуспендирования
осадка при 0°С. Однако диссоциацию можно предотвратить,
если во время седиментации и ресуспендирования в среде будет
содержаться 0,05% азида натрия. Этот прием можно использо-
вать и в других системах при нестабильности розеток из-за вы-
сокой скорости обменных процессов в клеточных мембранах.
Действие азида натрия обратимо, и его можно снять трехкрат-
ным отмыванием в среде, не содержащей ингибитора. Как пока-
зано выше, функциональная активность Т- и В-лимфоцитов пос-
ле отмывания полностью восстанавливается (Elliott et al., 1973,
1975; Elliott, Haskill, 1975).

4.	Величина розеток

Предварительная обработка эритроцитов нейраминидазой по-
вышает эффективность разделения Т- и В-розеток. В описывае-
мой системе эта обработка увеличивает число бараньих эритро-
цитов, связываемых В-РОК, но не влияет на Т-РОК; общее ко-
личество РОК при этом не изменяется. В таких условиях Т-РОК
связывают в среднем 4—10 эритроцитов, а В-РОК—более 10
(Elliott et al., 1973, 1975; Elliott, Haskill, 1975). Обработка нейра-
минидазой способствует также повышению выхода В-розеток,
так как они оседают с более высокой скоростью и при фракцио-
нировании выходят гораздо раньше одиночных клеток. Однако
при разделении и сравнении популяций В-РОК, различающихся
по способности связывать бараньи эритроциты (например, пред-
шественников АОК и зрелых РОК — см. разд. VI, Б), нейрамини-
дазу не используют.

5.	Размеры клеток

Вариабельность величины РОК может быть причиной плохо-
го разделения клеточных популяций. Например, розетка, со-
стоящая из малого лимфоцита и 18 эритроцитов (750 мкм3), по
объему мало отличается от розетки, образованной средним лим-
фоцитом и 10 эритроцитами (720 мкм3). Обе оседают со скоро-
стью 12 мм/ч (Elliott et al., 1975).

Эффективность разделения можно повысить, если перед ро-
зеткообразованием в течение 3,5—4 ч провести седиментацию
клеток; при этом можно выделить две популяции клеток, более
гомогенных по размерам: малые (2,5—4 мм/ч) и средние (4—
5 мм/ч) лимфоциты. Каждую из этих популяций после розетко-
образования подвергают дальнейшему разделению по описанной
выше методике (Elliott, Haskill, 1973). Однако при интерпрета-
ции получаемых результатов важно учитывать, что каждая из
этих популяций РОК может оказаться неслучайной выборкой
исходных нефракционированных клеток.

Г. Воспроизводимость

Описанные выше результаты хорошо воспроизводятся ка-
чественно и количественно. Однако особое значение имеют ус-
ловия, рассмотренные ниже.

1.	pH

Нужно тщательно подводить pH каждого буферного раствора
под контролем pH-метра, так как эритроциты весьма чувстви-
тельны к изменениям реакции среды.
2.	Температура

Так как скорость седиментации пропорциональна температу-
ре (Miller, 1973), все разделение нужно проводить в холодиль-
ной камере с надежным термостатированием. Оптимальный вы-
ход живых клеток получается при 4°С.

3.	Среда для розеткообразования и скорость седиментации

Среда должна быть изотонизирована и забуферена. В описан-
ной здесь методике (см. разд. III, А) в качестве среды исполь-
зовался трис-буфер, но пригоден и физиологический раствор,
забуференный фосфатами (ЗФР). ГЭПЭС в среде без сыворотки
может быть токсичным для клеток (см. гл. 21), поэтому при
разделении эритроцитарных розеток его не применяют. Для об-
разования и последующего разделения розеток нужно исполь-
зовать одну и ту же среду. Для оптимального выхода функцио-
нально активных РОК в среде должны быть аминокислоты —
такие, которые содержатся, например, в минимальной среде Иг-
ла (см. разд. III, А) или в среде 199 (Difco, Детройт, США).

Для получения градиента низкой плотности, стабилизирую-
щего седиментацию клеток, различные лаборатории используют
три основных реагента: бычий сывороточный альбумин, сыворот-
ку плода коровы и фиколл.'В табл. 1 указаны эти реагенты и их
концентрации, используемые для седиментационной среды. Бы-
чий сывороточный альбумин и сыворотка плода коровы (Gibco,
Гранд Айленд, США)—это белковые материалы, обладающие
выраженными буферными свойствами. Первый из них мы полу-
чаем в виде лиофилизированного препарата фракции V по Кону
(Pentex, США), растворяем в сбалансированном солевом раство-
ре Игла (см. разд. III, А) до концентрации 20%, фильтруем и
храним при 4°С; доводим pH до нужной величины с помощью
1 н. NaOH и необходимое количество раствора добавляем к се-
диментационной среде (как указано в табл. 1).

Фиколл (Pharmacia, Упсала, Швеция) — высокомолекуляр-
ный полисахарид (мол. вес 400 000). Поскольку в нем мало за-
ряженных групп (по сравнению с белками), его влияние на pH
незначительно. Этот реагент относительно инертен, он не об-
ладает адгезивностью к поверхностным мембранным белкам и
не изменяет их заряда. Поэтому фиколл используют при разде-
лении клеток с целью изучения их мембран. Кроме того, он го-
раздо дешевле, чем бычий сывороточный альбумин или сыво-
ротка плода коровы. Перед применением все эти три реагента
должны быть проверены на отсутствие цитотоксичности. Важно
также выяснить, не влияют ли они на те функции клеток, кото-
рые предстоит изучать.
Среда с сывороткой имеет большую вязкость, чем среда с
фиколлом, поэтому клетки в последней оседают быстрее (при-
мерно в 1,2 раза), чем в присутствии сыворотки (см. разд. IV, В).
Это необходимо учитывать при сравнении результатов, получен-
ных в разных лабораториях.

4.	Ограничения, обусловленные «протеканием» при перегрузке
градиента клетками

Феномен «протекания» состоит в том, что сразу после запол-
нения камеры градиентом появляются тяжи, свисающие из слоя
клеток, длиною до нескольких миллиметров (Miller, 1973). При
взгляде сверху слой клеток выглядит испещренным мелкими кра-
пинками. «Протекание» происходит в том случае, когда концент-
рация клеток в слое превышает определенную величину, так
называемый «предел протекания». Этот предел варьирует для
разных типов клеток, и во всех изученных до сих пор системах
отмечена его обратная зависимость от среднего объема клетки.
При использовании сглаженного ступенчатого градиента (см.
разд. IV, Б) «предел протекания» для бараньих эритроцитов со-
ставляет 1,5-107 клеток в 1 мл. Клетки с ядрами от нормальных
животных рекомендуется наносить в концентрации не более
1,5-106 в 1 мл. Клетки от иммунных животных и из культур in
vitro имеют больший объем, поэтому «предел протекания» для
них еще ниже.

Ц. Природа эритроцитов

Очевидное преимущество системы эритроцитарных розеток
состоит в том, что, пользуясь эритроцитами разных видов жи-
вотных, можно сравнивать разные антигенные специфичности.
При проведении эксперимента нужно обратить внимание на сле-
дующие моменты:

1)	требования к изотоничности и условиям хранения для эри-
троцитов разных видов животных могут быть различными, и их
следует точно определить перед постановкой опытов;

2)	такие условия, как оптимальное соотношение эритроцитов
и ядерных клеток, концентрация клеток, объем пробы и режим
центрифугирования, должны быть стандартизованы;

3)	так как эритроциты разных видов различаются по величи-
не, нужно в каждом случае тщательно определять «предел про-
текания» и скорость седиментации.
Е.	Сравнение с методом разделения розеток
центрифугированием в градиенте плотности

Выделение розеток из клеточной смеси центрифугированием
в градиенте плотности фиколла (плотность 1,09 г/мл) описано
Пэришем и Хейуордом (Parish, Hayward, 1974). Клетки осто-
рожно наслаивают на раствор фиколла и центрифугируют
15 мин при 2000 g. Одиночные клетки остаются в плоскости
раздела или в слое фиколла, тогда как розетки (и свободные
эритроциты), обладающие более высокой плотностью, собира-
ются в осадке. Метод обеспечивает высокий выход и эффектив-
ное отделение розеток от одиночных клеток; кроме того, он тре-
бует меньше времени, чем разделение по скорости оседания.

Однако метод, описанный в этой главе, имеет следующие
уникальные преимущества:

1.	Розетки можно разделять и классифицировать в соответ-
ствии с числом связанных эритроцитов.

2.	Можно выявлять клетки, связавшие два и даже один эри-
троцит, так как они оседают значительно быстрее одиночных
клеток. Это особенно важно при изучении функций клеток, свя-
зывающих такое число эритроцитов, которое не учитывается в
других реакциях розеткообразования.

3.	При разделении под действием силы тяжести нет отрица-
тельного влияния на розетки тангенциальных сил, которые воз-
никают при центрифугировании, необходимом для разделения в
градиенте плотности фиколла. Описанный метод позволяет раз-
делять нестабильные розетки в среде с ингибитором метаболиз-
ма (азидом натрия) (см. разд. VI, В, 3).

4.	Метод обеспечивает более тонкое разделение в тех слу-
чаях, когда розетки присутствуют в низкой концентрации (ме-
нее 1 %) среди одиночных клеток.

Таким образом, в экспериментах, в которых эти преимущест-
ва важны, данный метод может быть очень полезен.

VII. РЕЗЮМЕ

Описан метод тонкого разделения розеток по скорости осе-
дания под действием силы тяжести. Так как скорость оседания
розеток зависит от числа связанных эритроцитов, метод позволя-
ет идентифицировать и выделять те или иные популяции РОК,
различающиеся по этому параметру.

В принципе данный метод применим ко многим системам
розеткообразования, например при выявлении рецепторов для
комплемента (ЭАК-розетки1 — Nussenzweig, 1974) или для
Fc фрагмента иммуноглобулинов (ЭА-розетки2 — Cohen et al.,
1971; Krammer et al., 1975).

* *

*

Я благодарен д-ру Дж. С. Хаскиллу за полезные советы и
поддержку при разработке этого метода и Т. Стаковской за пре-
восходную помощь в проведении экспериментов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Altman Р. L. (1961). In: Blood and Other Fluids, p. 119, Fed. Am. Soc. Exp.

Biol., Washington, D. C.

Charreire J., Dardenne M., Bach J. -F. (1973). Cell. Immunol., 9, 32.

Cohen D., Gurner B. W., Combs R. R. A. (1971). J. Exp. Pathol., 52, 41.

Elliott В.	E.,	Haskill	J.	S. (1973). Eur.	J.	Immunol., 3, 68.

Elliott В.	E.,	Haskill	J. S. (1975). J. Exp. Med., 141, 599.

Elliott В.	E.,	Haskill	J.	S., Axelrad M.	A.	(1973). J. Exp. Med.,	138,	1133.

Elliott В.	E.,	Haskill	J.	S., Axelrad M.	A.	(1975). J. Exp. Med.,	141, 584.

Haskill J. S., Elliott В. E., Kerbel R., Axelrad M. A., Eidinger D. (1972). J.

Exp. Med., 135, 1410.

Krammer P. H., Elliott В. E., von Boehmer H. (1975) Eur. J. Immunol., 6, 138.

Metcalf D., Wiadrowski M. (1966). Cancer Res., 26, 483.

Miller R. G. (1973). In: New Techniques in Biophysics and Cell Biology (R. H.

Pain and B. J. Smith, eds.), p. 87, Wiley, New York.

Nussenzweig V. (1974). Adv. Immunol., 19, 217.

Osoba D. (1970). J. Exp. Med., 132, 368.

Parish C. R., Hayward J. A. (1974). Proc. R. Soc. London, Ser. B, 187, 65.

Sabatini D. D., Bensch K., Bernett R. J. (1963). J. Cell Biol., 17, 19.

Wilson J. D. (1971). Immunology, 21, 233.

1 Розетки с эритроцитами, нагруженными антителами и комплементом. —
Прим. ред.

2 Розетки с эритроцитами, нагруженными антителами. — Прим. ред.
ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ КЛЕТОЧНОЙ
ПОВЕРХНОСТИ С ПОМОЩЬЮ
РОЗЕТКООБРАЗУЮЩИХ ЭРИТРОЦИТОВ,
НАГРУЖЕННЫХ СТАФИЛОКОККОВЫМ
БЕЛКОМ А

Дж. Джонсон

I.	ВВЕДЕНИЕ

Методы определения поверхностных клеточных антигенов
нашли широкое применение во многих областях биологии. Сре-
ди антигенов клеточной поверхности первыми были описаны
продукты генов главного комплекса гистосовместимости — те са-
мые антигенные молекулы, которые обусловливают иммунологи-
ческую индивидуальность организма (Klein, 1975). Кроме этих
универсальных поверхностных антигенов, присущих всем клет-
кам данной особи, отдельные клеточные популяции обладают
уникальными, свойственными только им антигенами. Это было
использовано при анализе тканей нервной системы (Schachner
et al., 1975) и особенно успешно — для идентификации многочис-
ленных субпопуляций морфологически неразличимых лимфоци-
тов (Raff, 1971).

Для выявления какого-либо поверхностного клеточного анти-
гена нужно иметь специфичные к нему антитела и метод, позво-
ляющий подсчитать, какое число клеток в данной популяции
связывает эти антитела. Приготовление антисывороток к поверх-
ностным клеточным антигенам подробно описано в гл. 13. Су-
ществуют два основных способа выявления клеток, несущих
такие антигены. Один из них состоит в том, что антисыворотку
обрабатывают флуорохромом, и в результате этого соответст-
вующие клетки флуоресцируют в ультрафиолете (см. гл. 9). Вме-
сто этого можно обрабатывать клеточную популяцию антисыво-
роткой и комплементом; при этом клетки, связавшие антитела,
погибают, и их можно обнаружить с помощью витального краси-
теля, например трипанового синего. В настоящей главе описан
метод определения поверхностных клеточных антигенов, в кото-
ром клетки, связавшие антитела, выявляются с помощью особым
образом обработанных бараньих эритроцитов (БЭ). Преимуще-
ство этого метода состоит в том, что, обладая высокой чувстви-
тельностью, он позволяет достаточно быстро исследовать боль-
шое число клеток; антитела при этом используются в немодифи-
цнрованном виде; кроме того, клетки, содержащие специфичес-
кие антигены, легко могут быть отделены от других клеток по-
пуляции.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Метод включает обработку клеточной популяции антисыво-
роткой к искомому поверхностному антигену, а затем индикацию
клеток, связавших антитела, с помощью бараньих эритроцитов.
Если лимфоидная клетка имеет на своей поверхности соответст-
вующий антиген, эритроциты скапливаются вокруг нее и обра-
зуется легко различимая под микроскопом розетка. Клетки, не
содержащие искомого антигена, не связывают антитела и по-
этому не привлекают индикаторные БЭ. Для приготовления ин-
дикаторных БЭ их нагружают стафилококковым белком А. Это
белок с мол. весом 42 000, который входит в состав клеточной
стенки Staphylococcus aureus и специфически связывает Fc-фраг-
мент иммуноглобулинов класса G некоторых видов животных
(Sjoquist et al., 1972).

III.	РЕАГЕНТЫ

Белок A (Pharmacia, Упсала, Швеция), разведенный в физио-
логическом растворе до концентрации 25 мг/мл; его хра-
нят прн —70°С

Хлористый хром СгОз-бНгО

Бараньи эритроциты (БЭ)

Раствор Хэнкса, содержащий 10% прогретой сыворотки пло-
да коровы (РХ-СПК)

Физиологический (0,15 М) раствор хлористого натрия

Физиологический раствор, забуференный фосфатами, с pH 7,2,
0Д5М (ЗФР)

Раствор Олсвера (рН6,1)—содержит ОДОМ глюкозу,
0,027 М цитрат натрия и 0,072 М хлористый натрий

Раствор фиколла с уровнзоном (плотность 1,090), содержа-
щий 0,1% азида натрия, 50 г фиколла 400 (Pharmacia) и
75 мл 58%-ного уровизона (Schering, Цюрих, Швейца-
рия); довести до конечного объема 360 мл дистиллирован-
ной водой; плотность проверить ареометром

Генцнановый фиолетовый; основной раствор— 10%-ный в ме-
таноле, рабочий раствор — 1 : 20 в ЗФР

Азид натрия, NaNa

Гемолитический буфер; 0,01 М КНСО3, 0Д55М NH4CI,
0,1 мМ ЭДТА; pH доводят до 7,5
IV.	МЕТОДИКА

А. Приготовление бараньих эритроцитов, нагруженных
белком А

Белок А присоединяют к эритроцитам с помощью хлористо-
го хрома. Поскольку ионы фосфата мешают связыванию, все ре-
агенты следует готовить на обычном физиологическом растворе.

1.	Эритроциты трижды отмывают физиологическим раство-
ром и затем готовят 50%-ную взвесь в том же растворе.

2.	Раствор хлористого хрома концентрацией 1 мг/мл (3,8-
10-3 М.) в физиологическом растворе готовят непосредственно
перед употреблением.

3.	Смешивают равные объемы взвеси эритроцитов и раство-
ров хлористого хрома и белка А и оставляют на 4 мин при ком-
натной температуре (без перемешивания). (Целесообразно зара-
нее определить оптимальное время связывания, поскольку этот
параметр может быть различным для разных серий препарата
А-белка и разных образцов эритроцитов).

4.	Реакцию останавливают, прибавляя 20—50 объемов ЗФР.
Нагруженные эритроциты отмывают три раза в ЗФР и затем ре-
суспендируют в РХ-СПК до конечной концентрации 0,5%. Гото-
вые индикаторные клетки можно хранить при 4°С 7—10 дней и
не отмывать перед употреблением.

Б. Приготовление клеточных взвесей

1.	Суспензии клеток из органов

Моноклеточные суспензии готовят в РХ-СПК- Ткань измель-
чают ножницами или продавливают через тонкое проволочное
сито. Агрегаты клеток отделяют отстаиванием клеточной сус-
пензии на льду в течение 5 мин. Клетки, содержащиеся в надоса-
дочной жидкости, трижды отмывают, центрифугируя по 10 мин
при 1000 об/мин и 4°С, затем подсчитывают их число. Если клет-
ки получают из селезенки мыши, то эритроциты удаляют гемо-
лизом. Для этого после отмывания клетки ресуспендируют в ге-
молитическом буфере (0,5 мл на одну селезенку) и оставляют
на 10 мин на льду. Суспензию разводят в 10 мл РХ-СПК, после
чего клетки трижды отмывают.

2.	Лимфоциты периферической крови

Вносят 0,2—0,3 мл цельной крови в 1 мл раствора Олсвера.
Клетки отмывают три раза в РХ-СПК; эритроциты лизируют
двукратной обработкой гемолитическим буфером. Затем лейко-
циты трижды отмывают и подсчитывают.

3.	Культивируемые клетки

Живые клетки выделяют из культуры методом флотации в
растворе фиколла с плотностью 1,090, содержащем азид натрия.
Клетки из промежуточного слой собирают, трижды отмывают и
подсчитывают. Для реакции розеткообразования концентрация
клеточной суспензии должна быть 2-106—5-Ю6 клеток/мл.

В. Антисыворотки

Получение антисывороток к поверхностным клеточным анти-
генам описано в гл. 13. Активность сывороток определяют в ре-
акции розеткообразования с клетками, которые заведомо несут
на своей поверхности искомый антиген; при этом находят оп-
тимальное разведение антисыворотки, варьируя его в пределах
от 1 : 10 до 1 : 100. При небольших разведениях доля розеткооб-
разующих клеток бывает невелика, но по мере разведения она
возрастает и наконец достигает плато — 85—95% розеткообра-
зующих клеток (в случае антисывороток к антигенам гистосов-
местимости). При очень больших разведениях доля розеткообра-
зующих клеток вновь снижается. Стандартные опыты ставят с
теми разведениями антисыворотки, которые соответствуют об-
ласти плато. Например, гипериммунные сыворотки анти-Н-2
обычно применяют в разведениях от 1 : 1000 до 1 :250.

Г. Образование розеток

1.	Смешивают 50 мкл клеточной суспензии с соответствую-
щим количеством антисыворотки в круглодонных стеклянных
пробирках (12X75 мм) и инкубируют 30 мин при 4°С.

2.	Клетки дважды отмывают в 1 мл РХ-СПК, остатки надо-
садочной жидкости отсасывают из пробирок фитильком из
фильтровальной бумаги.

3.	Осадок клеток ресуспендируют и добавляют в каждую
пробирку по 50 мкл индикаторных клеток — бараньих эритро-
цитов, нагруженных белком А (БА-БЭ). После перемешивания
пробы центрифугируют 10 мин при 500 об/мин и 4°С.

4.	Не размешивая полученного осадка, пробы инкубируют в
течение ночи при 4°С или 45 мин при 37°С. Если инкубацию про-
водят при 37°С, то к БА-БЭ прибавляют азид натрия (2 мМ), что-
бы предотвратить кеппинг эритроцитов.
Д. Учет результатов

Осадок клеток осторожно ресуспендируют и добавляют кап-
лю генцианового фиолетового (окрасить можно не весь осадок,
а предварительно отобранную часть суспензии). Готовят пре-
парат «раздавленной капли»: каплю клеточной суспензии поме-
щают на предметное стекло и накрывают покровным. При увели-
чении ‘X 160—250 подсчитывают лимфоциты с розетками и без
розеток (окрашенные клетки). Клетка считается розеткообра-
зующей, если она окружена четырьмя или более эритроцитами.
Следует просчитывать не менее 100 клеток, не принимая во вни-
мание клеточные агрегаты. Можно приготовить также фиксиро-
ванный препарат: на промытом кислотой предметном стекле
делают мазок, высушивают его и фиксируют метанолом. Окра-
сить этот мазок можно любым гематологическим красителем.

V.	КОНТРОЛЯ

Чтобы проконтролировать условия опыта и пригодность БА-
БЭ, проводят весь анализ с клетками селезенки или лимфатиче-
ских узлов мыши, обработанными соответствующей антисыво-
роткой к Н-2-антигенам. Доля розеток в этих образцах должна
быть больше 85%. Необходим также контроль с неспецифичес-
кой антисывороткой и контроль с клетками, заведомо не содер-
жащими искомого антигена. В обоих случаях не должно быть
более 2—3% розеткообразующих клеток.

VI.	ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

1.	Жизнеспособность клеток исследуемой взвеси должна быть
достаточно высокой, так как погибшие клетки обычно розеток
не образуют. При необходимости примесь погибших клеток мож-
но уменьшить путем флотации в растворе фиколла.

2.	Используемая для реакции антисыворотка должна содер-
жать антитела класса IgG, поскольку молекулы IgM не имеют
высокой аффинности по отношению к белку А. Если же сыворот-
ка содержит антитела главным образом класса IgM, то перед
инкубацией с БА-БЭ исследуемые клетки, нагруженные антите-
лами, можно дополнительно обработать антиглобулиновым ре-
агентом, содержащим антитела класса IgG. Инкубация клеток с
антисывороткой и с антиглобулиновым реагентом продолжается
30 мин, после чего клетки отмывают.
VII. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА

А.	Типирование антигенов гистосовместимости у мышей

Лимфоциты из периферической крови инкубируют с соответ-
ствующей сывороткой анти-Н-2 и БА-БЭ. Этот метод дает быст-
рый ответ, так как здесь достаточно качественной оценки пре-
паратов: в положительном случае наблюдается 80—90% розет-
кообразующих клеток, а в отрицательном — не более 5%. Такая
разница хорошо видна при быстром просмотре влажного препа*
рата.

Б. Исследование поверхностных антигенов делящихся клеток

Описанный метод в сочетании с радиоавтографией позволяет;
исследовать поверхностные антигены делящихся клеток. Сначала,
эти клетки метят 3Н-тимидином либо in vitro (удельная актив-,
ность 2—5 Ки/ммоль), либо in vivo (удельная активность 50—
60 Ки/ммоль), а затем ставят реакцию розеткообразования, как
описано выше. Препарат для радиоавтографии приготовляют
следующим образом. К осадку, содержащему розетки (после
последней инкубации), прибавляют 0,1 мл сыворотки плода ко-
ровы и пробы центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин. Осадок
клеток обсушивают бумажным фитильком, а затем осторожно
ресуспендируют. Из этой суспензии готовят мазок на предмет-
ном стекле, промытом кислотой и покрытом желатиновой плен-
кой (0,1%-ный раствор желатины в дистиллированной воде).
После высыхания препарат фиксируют метанолом, подсушивают
и затем погружают в соответствующее разведение эмульсии
(для 3Н — Kodak NTB2 или Ilford К5, разведенные дистиллиро-
ванной водой 1 :2 или 1 :4) и экспонируют в течение необходи-
мого времени (7—10 дней). Препараты фиксируют и проявляют
(Kodak К-19), затем окрашивают по Гимза в течение 5 мин.
В препаратах определяют число свободных и розеткообразую-
щих клеток.

В.	Выделение клеток, содержащих данный поверхностный
антиген

Клетки, образовавшие розетку, можно избирательно выде-
лить из клеточной популяции осаждением при 1g (см. гл. 16)
или флотацией в растворе фиколла с уровизоном (плотность
1,090 г/см3), содержащем 0,1% азида натрия. На 5 мл раствора
фиколла наслаивают 2—5 мл суспензии, содержащей розетки, в
РХ-СПК и центрифугируют 20 мин при 2500 об/мин при комнат-
ной температуре (20°С). Розеткообразующие клетки и свобод-
пые эритроциты оказываются в осадке, свободные лимфоциты —
в промежуточном слое. Лимфоциты, образовавшие розетки, мож-
но освободить от эритроцитов следующим образом: четыре объ-
ема свежеприготовленного 0,83%-кого раствора хлористого ам-
мония (pH 7,2) прибавляют к одному объему клеточной взвеси,
оставляют эту смесь на льду на 5 мин и затем отмывают в сре-
де. Этот метод используют для удаления В-клеток из клеточных
популяций лимфоузлов и селезенки: в результате обработки ан-
тииммуноглобулиновой сывороткой и реакции розеткообразова-
нпя В-клетки, несущие на своей поверхности иммуноглобулин,
легко могут быть удалены из популяции (Ghetie et al., 1975).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Ghetie V., St&lenheim G., Sjoquist J. (1975). Scand. J. Immunol., 4, 471.

Klein J. (1975). Biology of the Mouse Histocompatibility H-2 Complex, Sprin-
ger-Verlag, Berlin and New York.

Raff M. C. (1971). Transplant. Rev., 6, 52.

Schachner M., Wortham K. A., Carter L. D., Chaffee J. K- (1975). Dev. Biol.
44, 313.

Sjoquist J., Meloun B., Helm H. (1972). Eur. J. Biochem., 29, 572.
ВЫДЕЛЕНИЕ ГАПТЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИХ
В-ЛИМФОЦИТОВ С ПОМОЩЬЮ
ИММУНОСОРБЕНТОВ НА ОСНОВЕ ГЕЛЯ
ЖЕЛАТИНЫ, КОНЪЮГИРОВАННОЙ
С ГАПТЕНОМ

В. Хаас

I.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Принцип разделения лимфоцитов, несущих специфический ре-
цептор, с использованием желатины показан на рис. 1. Как и
другие методы иммуносорбции, этот метод основан на иммуно-
специфическом связывании клеток иммобилизованными лиган-
дами. Элюируя клетки с иммуносорбента при помощи свободно-
го антигена или механически, очень редко удается сохранить
их жизнеспособность. Использование желатины в качестве ма-
трицы для сорбента позволяет при расплавлении геля освободить
связанные клетки в жизнеспособном состоянии. В достаточно вы-
соких концентрациях желатина образует сетчатую структуру,
нерастворимую при температуре ниже критической. Точка плав-
ления у желатинового геля выражена сравнительно четко и за-
висит главным образом от концентрации желатины, что харак-
терно для гелей, структура которых стабилизирована вторичны-
ми силами, например водородными связями (Veis, 1964). Плав-
ление 5—10%-ного геля желатины происходит при температуре,
не выходящей за пределы физиологической нормы; присоедине-
ние гаптена к желатине на точку плавления не влияет. Из жела-
тины, конъюгированной с гаптеном, можно легко приготовить
нерастворимый на холоду слой геля и применять его как иммуно-
сорбент для специфического разделения лимфоцитов. Предла-
гаемая методика разработана в Институте Вальтера и Элизы
Холл (Haas et al., 1974; Haas, 1975; Haas, Layton, 1975; Nossal,
Pike, 1976, 1978). В литературе можно также найти другие ва-
рианты метода, основанного на том же принципе (Edelman,
Rutishauser, 1974; Gold et al., 1974; Webb et al., 1975).
4С

Удаление несмзав-
шихся клеток

Рис. 1. Принцип метода специфического разделения клеток. Лимфоидные клет-
ки движутся над тонким слоем ДНФ-желатииы, нерастворимой при 4°С. Свя-
завшиеся клетки выделяют после расплавления геля при 37°С; при этом жиз-
неспособность клеток не страдает.

II.	МЕТОДИКА

А. Приготовление сорбента

1.	Желатина

В качестве источника желатины, получаемой из коллагена
крупного рогатого скота, можно использовать пустые Желатино-
вые капсулы, расплавляя их в дистиллированной воде при 40—
60°С. Чистая желатина из других источников тоже пригодна для
приготовления иммуносорбента, но не нашла широкого приме-
нения. Горячий раствор желатины в дистиллированной воде
(20 г на 100 мл) стерилизуют фильтрацией через мембраны фир-
мы Millipore (размер пор 0,45 мкм) и хранят при 4°С. Концент-
рацию желатины в растворе можно определить по оптической
плотности при 215 нм (коэффициент экстинкции Е i'Cm =17,50).

2.	Присоединение гаптенов к желатине

Ниже приводится описание двух стандартных методик.

а.	Приготовление ДНФ-желатины (Eisen, 1964). Смешива-
ют 20 мл 20%-ного раствора желатины с 10 мл 8%-ного раство-
pa К2СО3 и 10 мл 1%-ного раствора 2,4-динитрофенилсульфо-
ната натрия (ДНФС). Смесь медленно перемешивают в течение
16 ч при 37°С и затем диализуют при 4°С против большого объе-
ма дистиллированной воды и ЗФР. Молярную концентрацию
динитрофенола (ДНФ) находят по onTH4eqKofl плотности при
360 нм (коэффициент экстинкции 2,4-ДНФ-лизина — Е =
= 17 400). Затем определяют степень конъюнгации ДНФ с жела-
тиной, считая, что молекулярный вес желатины равен в среднем
105. Описанная процедура обеспечивает присоединение примерно
четырех групп ДНФ к одной молекуле желатины. Уменьшив кон-
центрацию ДНФС или сократив время реакции, можно полу-
чить меньшую степень замещения.

б.	Приготовление НИФ-желатины (Brownstone et al., 1966)..
Смешивают 50 мл 10%-ного раствора желатины со 140 мл 0,2М
бикарбонатного буфера (pH 9,2) и 100 mi* 4-гидрокси-3-иод-5-
нитрофенилазида (НФА), растворенного в 2 мл диметилформа-
мида (ДМФ). Смесь медленно перемешивают при комнатной
температуре в течение 12 ч и затем диализуют против большого
объема ЗФР (pH 7,3). Степень конъюгации полученного препа-
рата, определяемая спектрофотометрически при 430 нм (коэф-
фициент экстинкции НФА 5,6-103), — приблизительно одна груп-
па НФА на молекулу желатины.

Присоединение других гаптенов к желатине можно прово-
дить с помощью методических приемов, описанных в гл. 8. Как
известно, желатина содержит мало остатков тирозина, но, не-
смотря на это, можно работать также с диазогаптенами, по-
скольку высокая степень замещения чаще всего нежелательна.

Выделение предшественников антителообразующих клеток
лучше проводить при низкой степени замещения — порядка од-
ной группы гаптена на одну молекулу желатины, так как высо-
козамещенная желатина связывает слишком много клеток с низ-
коаффинными рецепторами (Haas, 1975).

3. Приготовление слоя желатины в чашках Петри

Нагревают 5%-ный раствор желатины, ее конъюгат с гапте-
ном илн же смесь того и другого до 40—60°С, после чего разли-
вают пипеткой по 1—2 мл в стерильные чашки Петри (Sterimed)
диаметром 85 мм или чашки для культуры ткаии (Falcon 3003
Optilux) 100X20 мм. Необходимо тотчас распределить раствор
по дну чашки вращательными движениями и избыток его отсо-
сать у бортиков так, чтобы на дне образовался очень тонкий
ровный слой геля. Чашки оставляют на ночь при 4°С для «со-
зревания» геля (Veis, 1964). Затем слой желатины дважды от-
мывают 5—10 мл холодного HCl-глицинового буфера с pH 2,2,
покачивая чашки с буфером каждый раз в течение 5 мин, а за-
тем несколько раз —холодным ЗФР (pH 7,4). Покрытые жела-
тиной чашки можно хранить с ЗФР в течение двух дней при 4°С;
перед употреблением их вновь ополаскивают НСЬглициновым
буфером (pH 2,2) и ЗФР (pH 7,4). Тщательное отмывание необ-
ходимо для того, чтобы удалить весь растворимый конъюгат
гаптена и желатины, не вошедший в структуру геля, так как ма-
лейшая его примесь способна экранировать высокоаффинные ан-
тигенсвязывающие рецепторы клеток.

4. Г ели из поперечносшитой желатины

Для решения некоторых задач целесообразно использовать
конъюгат поперечносшитой желатины, гель которой уже не пла-
вится. Чашки покрывают слоем геля, как описано выше, и про-
мывают несколько раз холодным ЗФР (pH 7,3). Затем ЗФР уда-
ляют и в каждую чашку наливают по 3 мл 2,5%-ного раствора
глутаральдегида в ЗФР. Поперечная сшивка желатины происхо-
дит почти мгновенно (Avrameas, Ternynck, 1969). Глутаральде-
гид оставляют в чашках на 10—20 мин при комнатной темпера-
туре, затем чашки промывают НСЬглициновым буфером и ЗФР,
как уже описано.

Б. Приготовление моноклеточных суспензий

Мышей забивают путем цервикальной дислокации, извлека-
ют селезенки и помещают их в сбалансированный раствор Эй-
зена (СРЭЗ). Селезенки измельчают ножницами, клетки отделя-
ют от капсулы, осторожно продавливая кусочки ткани через
стальную сеточку верхним плоским концом поршня стеклянного
шприца в холодный СРЭЗ. Полученную жидкость разливают в
центрифужные пробирки, в которые предварительно наливают
по 1 мл 100%-ной сыворотки плода коровы (СПК) и для удале-
ния крупных клеточных агрегатов центрифугируют на холоду в
течение 10 мин. Эритроциты можно удалить с помощью раство-
ра Гея; однако они не мешают последующему разделению кле-
ток. Для удаления погибших клеток осадок ресуспендируют в
среде с низкой ионной силой (0,3 М растворе глюкозы в 100 мл
деионизованной воды, смешанном с 10 мл ЗФР), доводя кон-
центрацию клеток до 5-107/мл (von Boehmer, Shortman, 1973).
Суспензию сразу же фильтруют через неплотный слой хлопковой
ваты, кусочек которой помещают в силиконированную пастеров-
скую пипетку выше места сужения. Для получения большого ко-
личества клеток можно использовать силиконированную стек-
лянную колонку с рыхлым слоем хлопковой ваты высотой 1 —
2 см в нижнем конце. Сразу после фильтрации клетки переводят
в среду с физиологической ионной силой, центрифугируя взвесь
и суспендируя осадок в СРЭЗ. Удалять погибшие клетки необ-
ходимо, чтобы предотвратить агломерацию живых лимфоцитов
и их неспецифическое связывание с иммуносорбентом через вы-
сокоадгезивные погибшие клетки или выделившуюся из них во
время цитолиза ДНК. Описанная методика позволяет получить
моноклеточную суспензию, содержащую 95—100% живых кле-
ток и очень мало клеточных агрегатов.

В. Разделение клеток

1.	Среда

Клетки для разделения суспендируют в СРЭЗ или ЗФР без
СПК, которой следует избегать, так как по неизвестным причи-
нам она повышает неспецифическое связывание клеток селезен-
ки слоем желатины. Чтобы экранировать клетки, несущие рецеп-
торы к антигенным детерминантам желатины, можно восполь-
зоваться 0,1%-ным раствором желатины, которая не образует
геля при 4°С. Агрегацию клеток можно уменьшить, прибавив
5 мМ ЭДТА, который связывает ионы Са2+ и Mg2+ и, по-видимо-
му, не мешает специфическому и неспецифическому связыванию
клеток иммуносорбентом.

2.	Техника разделения

Чашки с клетками, подлежащими разделению, помещают на
встряхиватель, движущийся по горизонтали с амплитудой 1,5 см
и частотой 1,33 Гц, смонтированный на платформе, которая откло-
няется по вертикали с амплитудой 20° и частотой 0,33 Гц. Таким
образом обеспечивается то, что клетки не скапливаются в цент-
ре или у краев чашек, а постоянно движутся по всей поверх-
ности слоя геля. Их перемещение не должно быть слишком
быстрым, чтобы не препятствовать специфическому связыванию,
или слишком медленным —во избежание неспецифического свя-
зывания.

3. Предельное количество клеток на одну чашку

В одной чашке Петри можно разделить до 108 клеток селе-

зенки в объеме 3 мл СРЭЗ. Число связывающихся клеток про-

порционально числу клеток, взятых для разделения, пока оно

не превышает 103 * * 6 * на одну чашку. Для связывания 2-106 и более

клеток поверхности иммуиосорбента становится недостаточно.
4.	Время разделения

Если число клеток, нанесенных на чашку, не превышает 108,
в первые 60 мин связывание их возрастает со временем, а затем
остается постоянным (Haas, Layton, 1975). Однако основная
масса связывающихся клеток фиксируется па иммуносорбенте
уже через 15 мин после нанесения. Более того, 15-минутное раз-
деление дает наибольший выход предшественников антителооб-
разующих клеток (AOK) (Nossal. Pike, 1976). При разделении,
которое длится более 15 мин, возможна избирательная десорб-
ция некоторой части клеток, несущих специфические рецепторы.

5.	Удаление несвязавшихся клеток

По окончании процесса разделения клеточную суспензию
сливают со слоя геля. Затем, чтобы удалить несвязавшиеся
клетки, каждую чашку промывают несколько раз СРЭЗ, при-
ливая по 10 мл раствора и осторожно поворачивая чашку. Про-
мывающий раствор можно каждый раз сливать через край, не
боясь повредить связанные клетки, так как на слое геля всегда
остается тонкий слой жидкости. Полноту промывки следует
контролировать с помощью инвертированного микроскопа: свя-
завшиеся клетки легко отличить от свободных, так как послед-
ние при осторожном перемешивании движутся относительно
чашки.

6.	Выделение связавшихся клеток

После последнего промывания в каждую чашку наливают по
10 мл СРЭЗ, подогретого до 37°С. Слой геля сразу же плавится,
и после этого связавшиеся клетки осторожно суспендируют пи-
петкой. Затем суспензию переносят в пробирки, центрифугиру-
ют, ресуспендируют и параллельные пробы объединяют.

Г. Обработка выделенных клеток коллагеназой

Клетки остаются связанными с частицами иммуносорбента и
не могут быть отделены от них простым отмыванием сывороткой
плода коровы. Конъюгат желатины с гаптеном можно отделить
от клеточной поверхности с помощью трипсина или коллагеназы.
В большинстве случаев необходимо пользоваться высокоочи-
щенной коллагеназой марки А, которая не действует на поверх-
ностные белки клеток. К 0,9 мл клеточной суспензии в СРЭЗ или
ЗФР (содержащей до 107 клеток) прибавляют 0,1 мл 0,1%-ного
раствора коллагеназы. При достаточной активности препарата
коллагеназы можно применять более низкие концентрации.
Смесь оставляют на 10 мин при 37°С, затем клетки дважды от-
мывают, подслаивая под 1 мл сыворотки плода коровы. Чтобы
не потерять много клеток, всю обработку проводят в силикони-
рованной посуде. В некоторых случаях целесообразно прово-
дить ферментолиз при 4°С в течение 20 мин. При этом клетки
также очищаются от примеси конъюгата желатины с гаптеном.

III.	ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА

Желатиновый иммуносорбент был с успехом использован для
получения гаптенспецифических В-лимфоцитов при изучении
антиген-связывающих клеток (Nossal, Layton, 1976; Goding,
Layton, 1976) при анализе иммунного ответа на гаптены in vitro
(Nossal, Pike, 1976; Pike, Nossal, 1976; Fidler, Pike, 1977) и в
опытах с выращиванием колоний гаптенспецифических В-лим-
фоцитов (Metcalf et al., 1975). Описанный метод может быть ши-
роко использован и во многих других областях эксперименталь-
ной иммунологии. Однако, приступая к его освоению, важно
учесть присущие ему ограничения.

IV.	ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА

1.	Данным методом трудно выделять большие количества
высокоочищенных клеток.

2.	Метод не обеспечивает выделения из гетерогенной попу-
ляции лимфоцитов всех клеток, несущих рецепторы к опреде-
ленному гаптену, поскольку значительное количество специфи-
ческих клеток не связывается с иммуносорбентом. Поэтому наш
метод нельзя использовать для истощения специфических кле-
ток (Haas, 1975).

3.	В получаемой клеточной суспензии может содержаться
до 30% специфичных к данному гаптену предшественников ан-
тителообразующих клеток (Nossal et al., 1977). Однако в отно-
шении идиотипа и аффинности рецепторов даже наиболее очи-
щенные популяции клеток остаются гетерогенными.

4.	Метод непригоден, если взаимодействие лимфоцитов с ан-
тигеном необходимо изучать при температуре плавления жела-
тинового геля или если обработка коллагеназой нежелательна.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Avrameas S., Ternynck Т. (1969). Immunochemistry, 6, 53.

Brownstone A., Mitchison N. A., Pitt Rivers R. (1966). Immunology, 10, 465.
Edelman G. M., Rutishauser U. (1974). In: Methods in Enzymology (Jakoby
and Wilchek, eds.), Vol. 24, p. 195, Academic Press, New York.

Eisen Et. N. (1964). Methods Med. Res., 10, 94.

Fidler J. M., Pike B. L. (1977). Cell. Immunol., 31, 163.
Coding I. Г., Layton I. Е. (1976). J. Exp. Med., 144, 852.

Gold F., Kleinman R., Ben-Efraim S. (1974). J. Immunol. Methods, 6, 31.

Haas W. (1975). J. Exp. Med., 141, 1015.

Haas W., Layton J. E. (1975). J. Exp. Med., 141, 1004.

Haas W., Schrader J. IT., Szenberg A. (1974). Eur. J. Immunol., 4, 565.

Metcalf D., Nossal G. J. V., Warner N. L., Miller J. F. A. P., Mandel T. E.,
Layton	J.	E.,	Gutman G. A. (1975). J. Exp. Med., 142,	1534.

Nossal G.	J.	V.,	Layton J. E. (1976). J. Exp. Med., 143,	511.

Nossal G. J. V., Pike B. (1976). Immunology, 30, 189.

Nossal G.	J.	V.,	Pike B. L. (1978). J. Immunol., 120, 145.

Nossal G.	J.	V.,	Pike B. L., Stocker J. W., Layton J. E.,	Coding J. W. (1977).

Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 41, 237.

Pike B., Nossal G. J. V. (1976). J. Exp. Med., 144, 568.

Veis A. (1964). The Macromolecular Chemistry of Gelatin, Academic Press, New
York.

oon Boehmer H., Shortman K- (1973). J. Immunol. Methods, 134, 66.

Webb C., Teitelbaum D., Rauch H., Maoz A., Arnon R., Fuchs S. (1975). J.
Immunol., 114, 1469.
ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИТЕЛООБРАЗУЮЩИХ
КЛЕТОК МЕТОДОМ ЛОКАЛЬНОГО ГЕМОЛИЗА
В ГЕЛЕ

И. Лефковитс, У. Козенца

I.	НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА

Метод локального гемолиза в геле применяется для подсче-
та и изучения отдельных аитителообразующих клеток в тех слу-
чаях, когда имеется лишь очень небольшое число их среди мил-
лионов клеток, не образующих антител.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Метод был разработай в 1963 г. Ерне и Нордином (Jerne,
Nordin, 1963). Лимфоидные клетки смешивают с эритроцитами
и иммобилизуют в геле (обычно агаровом) или в жидкой среде,
помещенной в замкнутую камеру (рис. 1). Секретируемые от-
дельной лимфоидной клеткой антитела диффундируют вокруг
нее и тут же фиксируются на антигене. В присутствии компле-
мента вокруг каждой антителообразующей клетки (АОК) соз-
дается зона гемолиза.

Прежде чем применять метод локального гемолиза на прак-
тике, целесообразно обратиться к двум оригинальным работам
(Jerne, Nordin, 1963; Jerne et al., 1963). С вопросами теории и
дальнейшими модификациями метода, в частности с непрямой
реакцией локального гемолиза, с флуоресцентным окрашивани-
ем и авторадиографией зон гемолиза, можно познакомиться в
подробном обзоре Ерне (Jerne et al., 1974).

III.	РЕАГЕНТЫ И ПРИБОРЫ1

Чашки Петри 100X15 мм или 85X15 мм (пригодны любые
типы чашек, например Falcon Plastics, 1001, Sterilin или
Greiner)

Агар (№ 0140-01, Bacto Agar, Difco, Детройт, США)

Агароза (индубиоза)

Сухая минимальная среда Игла (№ 5675-24 Difco)

Стеклянные пробирки на 5—10 мл (так называемые вассер-
мановские)

1 Не все перечисленное ниже применяется прн постановке отдельных мо-
дификаций метода.
Индикаторные
эритроциты

Исследуемые
лимфоидные
клетки

слоя

Добавление 37 С
компле- *
мента 45 мин

АОК

Исследуемые
лимфоидные
клетки

Индикаторные
эритроциты

Парафин и воск





Комплемент

Рис. 1. Схема определения антителообразующих клеток в реакции локального
гемолиза. Вверху — стандартный метод, внизу — модификация Каннингема.

ДЭАЭ-декстран (Pharmacia, Упсала, Швеция)

Раствор Олсвера

Физиологический раствор, забуференный фосфатами (ЗФР)

Сбалансированный солевой раствор (СР)

Комплемент морской свинки (КМС), разведенный 1 : 10 в

ЗФР Дульбекко

Предметные стекла

Двусторонняя липкая лента

Парафин

Воск

Раствор Тюрка (0,01 %-ный раствор генцианового фиолето-
вого в 3%-ной уксусной кислоте)

Трипановый синий (4 части 0,2%-ного трипанового синего и

1 часть 4,5%-ного раствора NaCl)

Глутаральдегид

Счетчик зон гемолиза

Стереоскопический флуоресцентный микроскоп (Bausch and
Lomb)
IV.	ПРИГОТОВЛЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИИ

4. Суспензия лимфоидных клеток

Концентрация лимфоидных клеток в суспензии должна быть
такой, чтобы в наносимом объеме содержалось приблизительно
100 АОК в расчете на 1 камеру Каннингема, 150 — на 1 пред-
метное стекло и 400 — на 1 чашку Петри. Если содержание АОК
в образце неизвестно, его определяют в предварительных опы-
тах. На одну пробу удобнее всего брать сотую часть селезенки
и двадцатую часть клеток, содержащихся в 1 мл культуры.
Лимфоидные клетки дважды отмывают, центрифугируя при
500 g и 4°С в течение 10 мин, ресуспендируют в холодном СР
и до внесения в суспензию эритроцитов держат в ледяной бане.

Количество клеток можно определить двумя способами: а)
подсчитывают в счетной камере клетки с ядрами после раз-
ведения суспензии в растворе Тюрка (следует просчитывать не
менее 100 клеток); б) подсчитывают живые клетки по исклю-
чению трипанового синего (каплю клеточной суспензии при ком-
натной температуре Смешивают с каплей раствора трипанового
синего и через 1—3 мин подсчитывают число погибших, т. е.
окрашенных, клеток).

Б. Индикаторные клетки

В качестве индикаторных клеток лучше использовать эрит-
роциты, выдержанные в течение недели в растворе Олсвера, по-
скольку свежие эритроциты менее чувствительны к иммунному
гемолизу. Перед приготовлением суспензии эритроциты трижды
отмывают, центрифугируя по 10 мин при 2500 g при комнатной
температуре. Затем клетки ресуспендируют в .ЗФР или СР до
концентрации 20% (по объему) для работы в агаровом геле и
8—10% —для методики Каннингема.

V. РАЗЛИЧНЫЕ ВАРИАНТЫ РЕАКЦИИ

А.	Реакция в чашках Петри

Это стандартная процедура, предложенная Ерне и Норлином
(Jerne, Nordin, 1963).

1.	Нижний слой агарового геля

Предварительно чашку Петри покрывают слоем 1,4%-ного
агара. Для этого готовят 2,8%-ный раствор агара в дистилли-
рованной воде, автоклавируют и охлаждают на водяной бане до
45°С, затем смешивают с равным объемом подогретого до 45°С
двойного концентрата среды Игла. Затем агар разливают по
10—15 мл в чашки Петри (100X15 мм); в таком виде его можно
хранить при 4°С 2—3 недели. В день опыта перевернутые вверх
дном чашки без крышек помещают на 1,5 ч в термостат при
37°С, чтобы из агара испарилось по 1—2 мл воды.

2.	Агаровый гель для верхнего слоя

Этот гель должен быть приготовлен в день опыта. Раствор
агара (1,4%-ный) в дистиллированной воде автоклавируют, ох-
лаждают на водяной бане до 45°С и смешивают с равным объ-
емом подогретого до 45°С двойного концентрата среды Игла.
Конечная концентрация агара в верхнем слое составляет, та-
ким образом, 0,7%. Процедуру можно ускорить, заменив авто-
клавирование кипячением. В этом случае суспензию агара нуж-
но кипятить до появления пены, после чего уменьшить подо-
грев и, когда пена опадет, продолжать кипячение. Такую обра-
ботку нужно повторять до тех пор, пока не перестанет образо-
вываться пена или по крайней мере будут только крупные пу-
зыри. Обычно этого удается достичь за 5 мин.

3.	Получение зон гемолиза

В вассермановские пробирки (обычно имеющие объем 5 мл)
наливают по 0,1 мл раствора ДЭАЭ-декстрана и помещают их
в водяную баню при 45°С. Затем нагретой пипеткой в каждую
пробирку с ДЭАЭ-декстраном наливают по 2 мл агарового геля.
Держа пробирки с агаром в водяной бане (45°С), быстро вно-
сят в них последовательно по 0,1 мл суспензии индикаторных
клеток и 0,01—0,5 мл суспензии лимфоидных клеток. Затем эту
смесь быстро выливают в чашку Петри на нижний слой агара.
При этом необходимо быстро распределить клеточную взвесь
равномерно по всей поверхности агарового слоя; иначе, уплот-
нившись, верхний слой будет неровным. Чтобы гель застыл рав-
номерно, чашки ставят на горизонтальную поверхность.

После того как верхний слой застынет, чашки инкубируют
1—2 ч при 37°С. Затем на поверхность агара наливают по 2 мл
комплемента морской свинки, разведенного 1 : 10 в ЗФР, и ин-
кубируют еще 30 мин. Зоны гемолиза видны теперь как мелкие
круглые просветления на матовом фоне целых эритроцитов.
Чашки оставляют при комнатной температуре еще на 1—2 ч,
затем сливают комплемент; теперь их можно хранить при 4°С.
Зоны гемолиза можно считать и невооруженным глазом, одна-
ко лучше воспользоваться малым увеличением стереоскопиче-
ского микроскопа. В центре каждой зоны гемолиза под микро-
скопом можно рассмотреть антител ообразуюшую клетку (АОК),
которую можно зафиксировать, прибавив в чашку 2 мл 0,25%-
ного (по объему) раствора глутаральдегида.

Б. Реакция на предметных стеклах

Предметное стекло следует покрыть тонким слоем 0,1—0,2 % -
ной агарозы и высушить. Образующаяся пленка способствует
плотному прикреплению к стеклу слоя агарозы, содержащего
клеточную суспензию. 0,5%-й раствор расплавленной агарозы в
сбалансированном солевом растворе разливают по 0,5 мл в по-
догретые пробирки, помещенные в водяную баню (45°С). При-
бавляют по 50 мкл 15 %-ной (по объему) суспензии БЭ и по
10—100 мкл взвеси лимфоидных клеток; смесь переносят на
предметные стекла, покрытые пленкой агарозы, и равномерно
распределяют по их поверхности, выравнивая слой боковой по-
верхностью пробирки. Стекла оставляют на горизонтальной по-
верхности, пока не застынет гель, затем их кладут слоем геля
вниз в специальные лотки из люцита с небольшим углублением
(21,5X4,7X0,1 см). Пространство между предметными стеклами
н дном лотка заполняют комплементом морской свинки, разве-
денным СР 1:10. Лотки ставят друг на друга и помещают в
пластиковые коробки, на дно которых для создания влажной
атмосферы кладут мокрую фильтровальную бумагу, и инкуби-
руют 2—3 ч при 37°С. Для подсчета АОК стекла погружают в
физиологический раствор, затем тыльную поверхность нх выти-
рают насухо и просматривают препараты в ярком отраженном
свете. Наилучшие результаты получаются в тех случаях, когда
на одном стекле появляется от 40 до 100 зон гемолиза.

В.	Методика Каннингема

В 1965 г_. Каннингем (Cunningham, 1965) предложил инкуби-
ровать лимфоидные клетки и индикаторные эритроциты не в
геле, а в виде монослоя в камере с жидкой средой. Этот метод
прост, чувствителен и позволяет быстро подсчитать АОК. Он
дает возможность микроманипулировать с живыми неповреж-
денными клетками и изучать их в световом микроскопе.

Камеры для инкубации приготовляют, наклеивая на пред-
метное стекло (75X25 мм) три узкие полоски двусторонней лип-
кой ленты так, чтобы поделить поверхность на две приблизи-
тельно равные части. Сверху плотно накладывают второе пред-
метное стекло, под которым благодаря полоскам ленты созда-
ется узкая щель. Общий объем двух получившихся камер равен
приблизительно 180—200 мкл.

В лунках пластиковой панели микротитратора готовят смесь
лимфоидных клеток с эритроцитами следующего состава:
100 мкл СР, 50 мкл суспензии лимфоидных клеток, 20 мкл 8—
10%-ной суспензии бараньих эритроцитов и 20 мкл комплемента
морской свинки, предварительно истощенного бараньими эрит-
роцитами в разведении 1 : 2. Полученную суспензию перемеши-
вают и с помощью пастеровской пипетки помещают в обе. каме-
ры (они заполняются благодаря капиллярным силам), которые
затем герметизируют, осторожно погружая края стекол в рас-
плавленную смесь парафина и воска (1 : 1). Затем камеры по-
мещают на лоток, инкубируют 1—2 ч при 37°С и подсчитывают
зоны гемолиза в стереоскопическом микроскопе. Подсчет удоб-
нее вести, когда на предметном стекле появляется не более 100—
200 зон гемолиза. При осторожном обращении с камерами мор-
фология зон гемолиза не нарушается. Подсчет зон следует про-
вести в первые 4 ч после их появления, так как со временем из-
за перемещения клеток в жидкой среде зоны становятся нечет-
кими.

VI.	КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Реакцию характеризуют количеством АОК на 1 селезенку
или на 106 клеток с ядрами. Если для исследования взяты клет-
ки из культуры, результат можно выразить числом АОК а) на
культуру, б) на 106 исследуемых клеток или в) на Ю6 получен-
ных жизнеспособных клеток.

VII.	СУЩЕСТВЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ МОМЕНТЫ

А.	ДЭАЭ-декстран и комплемент

При использовании неочищенных препаратов агара, таких,
как Difco, Bacto, Noble или lonagar, необходимо добавлять
ДЭАЭ-декстран (мол. вес~2-106). Этот поликатион снижает
антикомплементарные свойства агара, возможно, благодаря
взаимодействию с сульфатными группами на цепях галактана.
Агароза не обладает антикомплементарностью, поэтому при ра-
боте с ней нет необходимости в ДЭАЭ-декстране. При работе с
агаровым гелем Bacto, содержащим ДЭАЭ-декстран (0,3—
0,5 мг/мл), большинство серий комплемента морской свинки -
(свежей или лиофилизированной сыворотки) наиболее эффектив-
но в конечном разведении 1 : 10; оптимальное конечное разведе-
ние КМС в суспензии клеток при постановке реакции по Каннин-
гему— 1:20. ВЮразболее концентрированный КМС часто аг-
глютинирует эритроциты и снижает количество определяемых
зон гемолиза.
В зависимости от происхождения лимфоидных клеток и
эритроцитов рекомендуется использовать следующие источники
комплемента: комплемент морской свинки — для лимфоидных
клеток мыши и бараньих эритроцитов; комплемент кролика —
для лимфоидных клеток мыши и эритроцитов крысы; компле-
мент человека — для лимфоидных клеток мыши и эритроцитов
хомячка, для лимфоидных клеток хомячка и эритроцитов мыши,
для лимфоидных клеток крысы и эритроцитов мыши; куриный
комплемент — для куриных лимфоидных клеток и бараньих эри-
троцитов.

Б. Концентрация эритроцитов

Оптимальная конечная концентрация эритроцитов—1%
(0,1 мл 20%-ной суспензии на 2 мл агара верхнего слоя). При
более низких концентрациях наблюдаются более крупные зоны
гемолиза, но число их при этом не возрастает.

В.	Условия инкубации

Увеличение времени инкубации до илн после добавления
комплемента лишь незначительно изменяет размеры и число
зон гемолиза. Повышение температуры инкубации от 37 до 40°С
также существенно не изменяет число зон гемолиза. При тем-
пературе ниже 37°С число зон уменьшается.

Г. Ложные зоны гемолиза

Истинные зоны гемолиза образуются только после добавле-
ния комплемента. Под микроскопом в центре зоны гемолиза
должны быть видны антителообразующие клетки.

1.	Похожие на зоны мелкие пузырьки воздуха можно легко
отличить по их четко выраженным краям.

2.	Кусочки ткани в центре зон хорошо видны невооружен-
ным глазом.

3.	В некоторых образцах бараньих эритрЬцитов могут содер-
жаться клеточные элементы, дающие зоны гемолиза. Вероятно,
это клетки, образующие аутоантитела. Такие зоны можно ис-
ключить с помощью контрольного опыта без испытуемых лим-
фоидных клеток.

4.	Эритроциты, используемые в качестве антигена в культуре
лимфоидных клеток, могут связывать такое большое количест-
во антител, что при последующем исследовании культурального
осадка в реакции локального гемолиза эти связанные антитела
могут десорбироваться с эритроцитов и давать ложные зоны, ко-
торые можно отличить по их малым размерам.
Д. Определение общего количества зон гемолиза

Очень часто число антителообразующих клеток определя-
ют, подсчитывая зоны гемолиза, даже если их очень мало, в
одном образце. Однако проявляющееся в этом случае (при ма-
лом числе зон) распределение Пуассона может привести к боль-
шой ошибке. При менее чем 10 АОК на образец результат очень
ненадежен. Приемлемым считается 30—100 АОК на образец;
ошибка при этом колеблется от ±10 до ±20%.

Е. Непрямой метод локального гемолиза

Если испытуемые лимфоидные клетки секретируют антитела,
не способные вызывать прямой гемолиз, в систему следует ввес-
ти «проявляющую» (антиглобулиновую) сыворотку (Dresser,
Wortis, 1965; Sterzl, Riha, 1965). Оптимальное разведение «про-
являющей» сыворотки обычно определяют эмпирически. Воз-
можны два подхода: 1) «проявляющую» сыворотку добавляют
вместе с комплементом и подсчитывают -общее число зон гемо-
лиза— «прямых» и «непрямых»; 2) после добавления компле-
мента и инкубации определяют число «прямых» зон, удаляют
комплемент, добавляют «проявляющую» сыворотку с новой
порцией комплемента, инкубируют и подсчитывают вновь обра-
зовавшиеся («непрямые») зоны гемолиза.

Это можно сделать при постановке реакции и в чашках Пет-
ри, и на предметных стеклах, тогда как при работе по мето-
дике Каннингема (Cunningham, Szenberg, 1968) «проявляю-
щую» сыворотку можно добавлять только вместе со всеми ком-
понентами реакции. Антисыворотки к отдельным классам имму-
ноглобулинов некоторых животных имеются в продаже.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Cunningham A. J. (1965). Nature (London), 207, 1106.

Cunningham A. J., Szenberg А. (1968). Immunology, 14, 599.

Dresser D. W., Wortis H. H. (1965). Nature (London), 208, 859.

Jerne N. K., Nordin A. A. (1963). Science, 140, 405.

Jerne N. K-, Nordin A. A., Henry C. (1963). In: Cell-Bound Antibodies
(B. Amos and H. Koprowski, eds.), p. 109, Wistar Inst. Press, Philadelphia,
Pennsylvania.

Jerne N. K., Henry C., Nordin A. A., Fuji H., Noros A. M. C., Lejkovits I.
(1974). Transplant. Rev. 18, 130.

Sterzl J., Riha I. (1965). Nature (London), 208, 858.
ВЫДЕЛЕНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ
АНТИТЕЛООБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК,
ДАЮЩИХ ЛОКАЛЬНЫЙ ГЕМОЛИЗ

М. Шульман

I.	НАЗНАЧЕНИЕ И ПРИНЦИП МЕТОДА

Настоящий метод позволяет выделять индивидуальные анти-
телообразующие клетки, заключенные в вязкий раствор метил-
целлюлозы, и проводить дальнейшее их культивирование.

Обычно реакцию локального гемолиза проводят в геле агара
или агарозы (Jerne, Nordin, 1963), в узком пространстве между
предметными стеклами (Cunningham, Szenberg, 1968) или в
вязком растворе карбоксиметилцеллюлозы (Nossal et al., 1970).
Во всех трех случаях отдельные антителообразующие клетки
’очень трудно выделить. По предлагаемой методике эритроциты
заключают в гель агарозы, плотная консистенция которого пре-
пятствует агрегации и перемещению эритроцитов. Сверху на-
слаивают лимфоидные клетки, суспендированные в растворе ме-
тилцеллюлозы; 1%-ный раствор метилцеллюлозы обладает
достаточной вязкостью, чтобы иммобилизовать клетки, но при
этом он легко перемешивается и пипетируется. После образова-
ния зон гемолиза каждую антителообразующую клетку микро-
пипеткой переносят в обычную жидкую среду.

В 1976 г. Кёлер и Мильштейн (Kohler, Milstein, 1976) пред-
ложили этот метод для анализа перевиваемых гибридом Spl и
Sp7, продуцирующих IgM-антитела. Гибридомы линии Spl об-
разуют антитела к антигенам бараньих эритроцитов, линии
Sp7 —к тринитрофенильным группам (ТНФ) и поэтому могут
лизировать эритроциты, нагруженные ТНФ-гаптеном. По-види-
мому, этот метод применим для любой системы антиген-анти-
тело, дающей зоны гемолиза в агаровом геле.

II.	РЕАКТИВЫ

Двукратный концентрат среды RH (Wabl et al., 1978) сле-
дующего состава:

2,08 г сухой среды Н18 (Gibco. Гранд-Айленд, США)
(RPMI 1640)

40 мл сыворотки плода коровы (Gibco)

2 мл раствора пенициллин-стрептомицина (10 000 ед/мл)
(Gibco)
6 мл 1М 4-гидроксиэтил-1-пиперазилэтан-2-сульфоновой кис-
лоты (ГЭПЭС) (Flow Laboratories, США)
(Gibco),

5,32 мл 7,5%-ного раствора NaHCOa (Gibco)

Дистиллированная вода, стерилизованная фильтрацией, — до
конечного объема 120 мл

Метилцеллюлоза 4000 (Hoffman — La Roche, США)

Агароза (индубиоза А37, L’Industrie Biologique Frangaise)

Бараньи эритроциты

Тринитрофенол (ТНФ)

Лиофилизированный комплемент морской свинки (Gray,
Behringwerke)

Для приготовления 2%-ного раствора метилцеллюлозу засы-
пают в кипящую дистиллированную воду и сразу прекращают
подогревание. Смесь перемешивают в течение ночи при 4°С, а
затем центрифугируют 2 ч при 10 000 g. Перед опытом готовый
2%-ный раствор метилцеллюлозы смешивают с равным объ-
емом двукратного концентрата среды RH; при этом конечная
концентрация метилцеллюлозы составит 1%. Для точного дози-
рования вязкого раствора метилцеллюлозы удобнее пользовать-
ся шприцем, а не пипеткой.

Агарозу растворяют, кипятя в дистиллированной воде. Рас-
творы агарозы—1%-ный и 0,6%-ный — смешивают с равны-
ми объемами двукратного концентрата среды.

Бараньи эритроциты конъюгируют с ТНФ (Rittdnberg, Pratt,
1969). Перед употреблением взвесь конъюгированных эритроци-
тов разбавляют в 4 раза физиологическим раствором, забуфе-
ренным фосфатами.

III.	МЕТОДИКА

Реакцию локального гемолиза проводят в пластиковых чаш-
ках диаметром 35 мм (Falcon, Лос-Анджелес, США) .В чашку
помещают 1 мл расплавленной 0,5%-ной агарозы в среде RH и
равномерно распределяют ее по дну. Затем наслаивают 0,2 мл
0,3%-ной агарозы в среде RH, содержащей 10 мкл комплемента
и 10 мкл взвеси бараньих эритроцитов. В последнюю очередь
наносят 1 мл суспензии лимфоидных клеток в 1%-ном растворе
метилцеллюлозы в той же среде.

Зоны гемолиза появляются через 2 ч, однако лучше не тро-
гать чашки до следующего дня, поскольку слой 1%-ной метил-
целлюлозы достаточно подвижен и при перемещении чашки
антителообразующие клетки могут сместиться относительно сво-
их гемолитических зон. Через несколько часов опасность такого
смещения уменьшается, так как клетки оседают на слой агарозы.
Зоны гемолиза обычно достигают 1 мм в диаметре (рис. 1).
Идентифицированные АОК извлекают с помощью микропи-
иетки. В наших экспериментах клетки Spl и Sp7 переносили в
микротитратор, в лунках которого в качестве питающего слоя
находились фибробласты ЗТЗ, облученные в дозе 3300 рад; сре-
да, в которой росли фибробласты, была заменена 15 микролит-
рами среды RPM.I 1640, содержащей 30 мМ ГЭПЭС. После не-
которого периода роста клетки Sp переносили в 0,1 мл свежей
среды; в дальнейшем по мере роста клеток количество среды
увеличивали.

Нам удавалось получать микрокультуры из отдельных клеток
в 50% случаев.

Клетки Sp образовывали колонии прямо в метилцеллюлозе,
иоэтому через несколько дней зоны гемолиза оказывались круп-
нее, чем при наблюдении в первые сутки.

Чтобы определить эффективность метода для выявления АОК
в присутствии большого числа клеток, не дающих зон гемолиза,
мы смешивали 100 АОК с различными количествами (0, 104, 105
и 106) клеток, не образующих гемолизины. Несмотря на разные
условия, число выявляемых зон гемолиза было приблизительно
одинаковым, хотя при высокой концентрации клеток, не обра-
зующих гемолизины, фон был настолько мутным, что часть
АОК обнаружить не удавалось. Если подобная ситуация возни-
кает в эксперименте, рекомендуется отметить всю область чаш-
ки, где намечается образование зоны гемолиза, подрастить

Рис. 1. Зоны гемолиза, образованные клетками линии Sp7 после инкубации
ирн 37°С в течение ночи.

А. Чашка при увеличении Х1,2. Б. Две зоны гемолиза. В центре каждой из
них по две антителообразующие клетки, получившиеся в результате деления
во время ннкубацин.
АОК, собрать слой метилцеллюлозы в отмеченном месте и вновь
исследовать при меньшей концентрации клеток.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Cunningham A. J., Szenberg А. (1968). Immunology, 14, 599.

Jerne N. К., Nordin А. А. (1963). Science, 140, 405.

Kohler G., Milstein C. (1976). Eur. J. Immunol., 6, 511.

Nossal G. J. V., Bussard A. E., Lewis H., Mazie J. C. (1970). J. Exp. Med.,
131, 894.

Rittenberg M. B., Pratt K- L. (1969). Proc. Soc. Exp. Med., 132, 575.

Wabl M., Forni L., Loor F. (1978). Science, 199, 1078.
ИЗУЧЕНИЕ Т-КЛЕТОК, СПЕЦИФИЧЕСКИ
СВЯЗЫВАЮЩИХ АЛЛОАНТИГЕНЫ ПРИ
АКТИВАЦИИ В СМЕШАННОЙ КУЛЬТУРЕ
ЛИМФОЦИТОВ

Б. Эллиот, 3. Надь, М. Набхольц

I.	НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА

Описанный здесь метод служит для определения специфично-
сти отдельных Т-клеток, активируемых in vitro в смешанной
культуре лимфоцитов (СКЛ).

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

В первичной СКЛ Т-лимфоциты из отвечающей популяции,
трансформированные в бласты, несут на себе аллоантигены сти-
мулирующих клеток. Эти аллоантигены, по-видимому связанные
с поверхностью отвечающих клеток через специфические рецеп-
торы, могут быть обнаружены с помощью специфических алло-
антител к стимулирующим клеткам методом непрямой иммуно-
флуоресценции. Отвечающие клетки, очевидно, «моноспецифич-
ны» в тодо смысле, что большинство Т-бластов, ответивших на
смесь двух стимулирующих популяций с различными аллоанти-
генными детерминантами, связывают на своей поверхности анти-
гены какого-то одного из двух типов стимулирующих клеток
(Nagy et al., 1976а, b).

Мы показали, что аллоантигены стимулирующих клеток, свя-
занные на поверхности активированных в СКЛ бластов, можно
удалить с помощью трипсина и что после некоторого восстано-
вительного периода такие бласты снова способны специфически
связывать материал стимулирующих клеток (Elliott et al., 1977).

III.	КЛЕТКИ И АЛЛОАНТИСЫВОРОТКИ

А.	Подготовка клеток и методика культивирования

Подготовка клеток и методы культивирования подробно опи-
саны в других публикациях (см. Nabholz et al., 1974; Julius et al.,
1973; см. также, гл. 15). Однако некоторые важные детали будут
рассмотрены здесь.
1.	Среды

В качестве культуральной среды используют среду RPMI 1640
(Grand Island Biological Со., Grand Island, штат Нью-Йорк), за-
буференную ГЭПЭС (30 мМ) и дополненную L-глутамином (до
конечной концентрации 2 мМ), стрептомицином (100 мкг/мл),
пенициллином (100 ед/мл), человеческой* сывороткой (5%) и
2-меркаптоэтанолом (конечная концентрация 3-10-5М).

Для суспендирования и отмывания клеток используют ту же
среду, ио без 2-меркаптоэтанола. Оказалось, что в отсутствие
сыворотки буфер ГЭПЭС токсичен, поэтому при всех процеду-
рах отмывания в среду добавляют не менее 2,5% человеческой
сыворотки.

Человеческую сыворотку следует предпочесть сыворотке пло-
да коровы, так как выяснилось, что она дает более низкий уровень
пролиферации отвечающих клеток, культивируемых с облучен-
ными сингенными клетками (контроль). Человеческую сыворотку
получают следующим образом. Кровь от предварительно подоб-
ранных доноров асептически собирают в стерильные конические
пробирки (Falcon Plastic 2070; 50 мл) и на 2—3 ч оставляют, для
свертывания при комнатной температуре. Для удаления эритро-
цитов и тромбоцитов сыворотку переносят в другие пробирки и
центрифугируют 15 мин при 2000g. Сыворотки из каждой про-
бирки собирают отдельно, проверяют на стерильность, а затем
объединяют, инактивируют прогреванием, разливают небольши-
ми порциями и хранят при —20°С.

2.	Подготовка клеток для СКЛ

Если не указано иное, то на всех этапах клетки центрифуги-
руют 15 мин при 150g и 4°С. Паховые, подмышечные, шейные и
брыжеечные лимфатические узлы и (или) селезенки извлекают
асептически, помещают в холодную среду и измельчают ножни-
цами. Для освобождения лимфоцитов измельченную ткань осто-
рожно раздавливают в пластиковой пробирке при помощи сво-
бодно входящего в нее тефлонового гомогенизатора. Для удале-
ния агрегатов и детрита клеточные суспензии фильтруют через
10-миллилитровый шприц, наполовину заполненный неплотно
упакованной найлоновой или хлопковой ватой. Фильтрацию про-
изводят при помощи поршня, оставшиеся на вате клетки вымы-
вают 5—8 миллилитрами среды. (Этот метод отличается от при-
готовления клеточной взвеси, освобожденной от В-лимфоцитов,
из ткани лимфатических узлов, описанного в разд. III, А, 3.) За-
тем собранные клетки осаждают центрифугированием, надоса-
дочную жидкость, содержащую жир, тщательно удаляют, а клет-
ки ресуспендируют в 10 мл свежей среды. Эту операцию повто-
ряют еще два раза, прежде чем приготовить конечную взвесь
нужной концентрации. Долю живых клеток и общее число клеток
с ядрами определяют перед последним центрифугированием, сме-
шав пробу взвеси с равным объемом 1%-ного раствора эозина Y
(в ЗФР). Жизнеспособность клеток варьировала у нас в пре-
делах от 78 до 93%.

3.	Разделение на колонке с найлоновой ватой

В большинстве экспериментов взвесь клеток из нормальных
лимфоузлов освобождают от В-лимфоцитов путем фильтрования
через колонки с найлоновой ватой по модифицированному мето-
ду Джулиус и сотр. (Julius et al., 1973). Найлоновую вату
(Leuko-Pak leukocyte filer, Fenwall Laboratories, Division of Tra-
venol Laboratories, Inc., Deerfield, штат Иллинойс, США) рас-
правляют пальцами, чтобы устранить узлы и уплотнения, и ав-
токлавируют в стеклянном стакане 20 мин при 110°С. Предвари-
тельное кипячение ваты для первичных СКЛ необязательно.
В качестве колонки используют пластиковый (или стеклянный)
шприц, на который, чтобы среда не вытекала, надевают иглу
№ 18, не снимая с нее пластикового чехла.

Для того чтобы не было воздушных пузырьков, вату помеща-
ют в колонку, заполненную средой (5—10 мл ЗФР с 5% сыво-
ротки плода коровы). Небольшие кусочки найлоновой ваты
(длиной 1—2 см) укладывают в колонку до 6-миллиметровой
отметки. Плотность набивки должна быть такой, чтобы без иглы
скорость протекания достигала 150—200 капель в 1 мин при слое
среды объемом 2 мл над столбиком ваты. Конечный объем ко-
лонки доводят до 6 мл. Колонку промывают 20 миллилитрами
среды, надев иглу (в чехле), а затем инкубируют в вертикальном
положении не менее 1 ч при 37°С, так, чтобы над ватой были 2 мл
среды. Для сохранения стерильности колонку закрывают сте-
рильным бумажным или пластиковым колпачком. Перед внесе-
нием клеток иглу снимают и дают вытечь излишнему объему
среды.

Оптимальное количество клеток, наносимых на колонку, со-
ставляет 1 • 108. Их ресуспендируют в 2 мл среды и пастеровской
пипеткой по каплям равномерно наносят на поверхность колонки.
Для того чтобы клетки проникли внутрь колонки, дополнительно
прибавляют 1,5 мл среды, а вытекшую внизу среду отбрасывают.
Колонку закрывают и в вертикальном положении инкубируют
45 мин при 37°С. Затем снимают иглу и элюируют неприлипшие
клетки с колонки (находящейся в вертикальном положении), до-
бавляя по каплям свежую среду (20 мл), подогретую до 37°С.
Температуру колонки (и среды) поддерживают на уровне 37°С,
поместив ее вблизи слабого пламени бунзеновской горелки. Боль-
шинство неприлипших Т-клеток (более 90%) вымываются пер-
выми 10-миллилитрами среды.

Основная часть неприлипших клеток (97—99%) — это
Т-клетки (они идентифицированы в реакции цитолиза с сыворот-
кой анти-Thy-l, 2 с комплементом морской свинки). Выход
Т-клеток, нанесенных на колонку, составлял у нас 50—90%, а
примесь В-лимфоцитов (клеток Ig+ по данным иммунофлуорес-
ценции) — от 0,5 до 2,5%.

4.	Смешанная культура лейкоцитов (СКЛ)

Однонаправленные культуры СКЛ подготовляют следующим
образом. В качестве отвечающей популяции используют цель-
ную или профильтрованную через найлоновую вату взвесь клеток
лимфоузлов. Концентрацию отвечающей взвеси доводят до
5-106 в 1 мл, а стимулирующей — до 1 • 107 в 1 мл.

Взвесь стимулирующих клеток подвергают рентгеновскому об-
лучению (3300 R, Phillips RT 305 при 300 кВт, 10 мА и
100 об/мин). Два миллилитра взвеси отвечающих клеток (О)
смешивают с равным объемом взвеси стимулирующих клеток
(С) в пластиковом флаконе на 30 мл (№ 0 3012, Falcon Plastics,
Division of BioQuest, Окснард, Калифорния), получая численное
соотношение О и С 1 : 2. Флакон инкубируют 4 дня в вертикаль-
ном положении во влажной атмосфере с 5% СОг и 95% возду-
ха. После 3-го дня инкубации в каждый флакон вносят 40 мкКи
3Н-тимидина активностью 2 Ки/ммоль (The Radiochemical Cent-
re, Эмершем, Англия). Включение 3Н-тимидина определяют на
4-й день культивирования, обработав по 0,2 мл клеточной сус-
пензии из каждого флакона, как описано в гл. 15. Индекс стиму-
ляции (ИС) вычисляют как отношение числа импульсов
(в 1 мин) в аллогенных культурах к числу импульсов в синген-
ных культурах? В большинстве экспериментов был проведен па-
раллельный учет включения 3Н-тимидина в смешанных культу-
рах, содержащих по 100 мкл отвечающей и стимулирующей
взвесей; при этом культивирование проводили в пластиковых
панелях Microtest II, № 3040 (Falcon Plastics).

Б. Приготовление аллоантисывороток

Ниже описан оптимальный способ получения гипериммунных
антисывороток. Сначала мышам-продуцентам подкожно (в под-
мышечную область) и внутрибрюшинно вводят 2—3-108 клеток
селезенки и лимфатических узлов от мышей соответствующей ли-
нии (клетки подготавливают и отмывают в ЗфР без сыворотки).
Через 10 дней повторно вводят внутрибрюшинно 3-106 клеток, а
затем делают еще не менее двух таких же еженедельных инъек-
ций. Через 7 дней после последней инъекции мышей обескровли-
вают и получают сыворотки.

Помимо антисывороток, приготовленных описанным спосо-
бом, мы (Nagy et al., 1976а, b; Elliott et al., 1977) использовали
также сыворотки анти-Н-2 (BlOxA)Fi анти-A.SW, A.TL анти-
A.AL, A.TH анти-A.TL и A.TL анти-А.ТН, любезно предоставлен-
ные нам д-ром Д. Шреффлером (Кафедра генетики, Медицин-
ская школа Вашингтонского университета, Сент-Луис, штат
Миссури, США). Все эти антисыворотки инактивировали прогре-
ванием (56°С, 30 мин), разливали и хранили до момента исполь-
зования при —70°С.

Антисыворотки к стимулирующим клеткам истощают отве-
чающими клетками и клетками мышей какой-либо третьей линии.
Для этого взвеси клеток селезенки и лимфоузлов от мышей ис-
пользованных линий готовят в ЗФР, не содержащем сыворотки, а
затем объединяют в равных объемах. Два объема антисыворотки
смешивают с одним объемом осажденных центрифугированием
клеток селезенки и лимфоузлов в пластиковых пробирках на 1 мл
(No. 39/10А, Sarstedt) и инкубируют 30 мин при 0°С. Затем
клетки осаждают центрифугированием в течение 1 мин в центри-
фуге Eppendorf N 3300. Истощение отвечающими клетками про-
водят однократно, а клетками мышей третьей линии — дву-
или трехкратно. Истощенные сыворотки центрифугируют при
20 000g и хранят при —70°С.

Цитотоксический титр каждой антисыворотки и ее перекрест-
ную реактивность определяют с помощью микрометода в реак-
ции лимфоцитолиза по исключению красителя (Frelinger et al.,
1974), используя в качестве мишеней клетки лимфоузлов надле-
жащих линий.

В.	Реагенты для иммунофлуоресцентного анализа

Приготовляют бараньи антисыворотки к Ig мыши и Ig кроли-
ка и конъюгируют их с изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ)
и с изотиоцианатом; тетраметилродамина . (ТРИТЦ) соответст-
венно (см. гл. 9). Концентрации белка в препаратах, измеряемые
спектрофотометрическим методом, доводят до 0,5 мг/мл; добав-
ляют азид натрия (10 мМ) и хранят при 4°С. Реагенты для имму-
нофлуоресцентного анализа были любезно предоставлены нам
Л. Форни (Базельский институт иммунологии).
IV.	ВЫЯВЛЕНИЕ Т-КЛЕТОЧНЫХ МАРКЕРОВ

И АНТИГЕНОВ СТИМУЛИРУЮЩИХ КЛЕТОК

НА ОТВЕЧАЮЩИХ БЛАСТАХ

А. Подготовка бластов и инкубация с аллоантисыворотками

На 4-й день культивирования клетки ресуспендируют и взвесь
в объеме 4 мл переносят в пробирку Falcon (No 3033). Под кле-
точную суспензию пастеровской пипеткой осторожно подслаива-
ют 2 мл смеси (плотность 1,077 г/см3) фиколла (Pharmacia,
Упсала, Швеция) и уровизона (Schering, Зап. Берлин). После
центрифугирования при 600g в течение 15 мин при комнатной
температуре клетки извлекают (жизнеспособность составляла у
нас не менее 98%) и трижды отмывают в среде RPMI, содержа-
щей 5% инактивированной прогреванием сыворотки плода коро-
вы и 15 мМ буфер ГЭПЭС. После обработки фиколлом выход жи-
вых клеток варьирует в пределах от 5 до 44% исходного числа
отвечающих клеток в культуре. В среднем половину собранных
живых клеток составляют бласты большой и средней величины.
Бластами мы считаем клетки диаметром не менее чем вдвое
больше малого лимфоцита, у которых ядерно-цитоплазматиче-
ское соотношение явно меньше, чем у лимфоцитов, и (в отличие
от нелимфоидных клеток) несегментированное ядро.

Клетки с аллоантисывороткой всегда инкубируют в пластико-
вых пробирках (No TPS-55, Milian Plastics) при 0°С в течение
45 мин. Для этого их (не более 2,5-105 на пробирку) ресуспенди-
руют в 50 мкл среды RPMI с 5% сыворотки плода коровы и
15 мМ ГЭПЭС; затем приливают 50 мкл надлежащей антисыво-
ротки в нужном разведении. Это разведение соответствует двой-
ной рабочей концентрации антисыворотки, и его готовят иа среде
RPMI без сыворотки плода коровы и без ГЭПЭС. Перед каждым
опытом аллоантисыворотки разбавляют и центрифугируют
20 мин при 20000g в пластиковых конических центрифужных
пробирках на 0,5 мл (No. ЕЕТ-23Р, Milian Plastics), чтобы уда-
лить осадок, который может образоваться при замораживании.

Б. Иммунофлуоресцентный анализ

После инкубации с аллоантисывороткой клетки в тех же про-
бирках при 4°С отмывают (см. разд. IV,А) в сбалансированном
солевом растворе Хэикса (Flow Laboratories Ltd., Ирвин, Шот-
ландия), содержащем 5% прогретой сыворотки плода коровы,
15,мМ буфер ГЭПЭС и 10 мМ азид натрия. В этой среде клетки
находятся на протяжении всего опыта. Клетки (не более 2,5 • 105
на пробирку) тщательно ресуспендируют в 50 мкл среды и добав-
ляют 50 мкЛ подходящего флуоресцирующего реагента (разве-
Рис. 1. Взвесь отвечающих клеток мышей СВА, освобожденная от В-лимфоци-
тов, была активирована в СКЛ стимулирующими клетками мышей SJL.
Т-бласты обрабатывали сывороткой анти-Н-28 (1/20) и подвергали двойному
окрашиванию, как описано в тексте, — сначала кроличьей сывороткой анти-Т
(выявляемой с помощью бараньей антисыворотки к кроличьему Ig, меченной
ТРИТЦ), а затем бараньей антисывороткой к мышиному Ig, меченной ФИТЦ.
Одни и те же клетки наблюдали при освещении, возбуждающем флуорес-
ценцию вначале родамина, а затем флуоресцеина.

А.	ТРИТЦ-положительный бласт и малые лимфоциты (Т-клетки). Б. ФИТЦ-
положительный бласт (Ig+) в том же поле. В. Препарат в фазовом контрас-
те при малом увеличении. (Nagy et al., 1976а.)
дение его определяют заранее). Смесь инкубируют 30 мин при
4°С. После инкубации с каждой из антисывороток клетки одно-
кратно отмывают.

Ig+T+’бласты мы выявляли путем трехэтапной обработки —
сначала кроличьим Ig против мышиных Т-клеток (Sauser et al.,
1973) (предоставлен д-ром С. Броном, Институт биохимии Ло-
заннского университета, Швейцария), затем бараньей антисыво-
роткой к кроличьему Ig, меченной ТРИТЦ, и наконец, бараньей
антисывороткой к мышиному Ig, меченной ФИТЦ. Такая.комби-
нация реагентов была выбрана потому, что перекрестные реак-
ции между иммуноглобулинами кролика и барана выражены не-
значительно.

Иногда клетки окрашивают либо непрямым методом, обраба-
тывая сначала кроличьей антисывороткой к мышиным ц-цепям и
затем выявляя ее антитела бараньей антисывороткой к кроличье-
му Ig, меченной ТРИТЦ, либо окрашивают непосредственно при
помощи меченной ФИТЦ козьей антисыворотки к мышиным у-
или ц-цепям.

В последний раз обработав клетки антисывороткой, их дваж-
ды отмывают, подсчитывают, отмывают еще раз и ресуспендиру-
ют в концентрации 2,5-105 в 1 мл. Как выяснилось, такая кон-
центрация позволяет получить мазки подходящей плотности.
После каждого отмывания, слив надосадочную жидкость, осаж-
денные клетки осторожно ресуспендируют до прибавления све-
жей среды, чтобы разбить клеточные комочки. Приблизительно
за 15 мин до приготовления мазков предметные стекла (с четко
помеченными кружками на нижней поверхности) закрепляют в
цитоцентрифуге (Shandon—Elliott), в каждую лунку вносят
25 мкл среды и центрифугируют 10 мин при 800 об/мин.

После этого в каждую лунку помещают по 50 мкл клеточной
взве.си из каждой пробирки и центрифугируют 10 мин при
800 об/мин при комнатной температуре. Препараты подсушивают
на воздухе 5 мин, фиксируют в абсолютном этаноле или метаноле
5 мин, а затем дважды (по 3 мин) отмывают в ЗФР. При фикса-
ции метанолом морфология клеток сохранялась лучше, чем при
фиксации этанолом.

Не высушивая после заключительного отмывания, предмет-
ные стекла помещают на фильтровальную бумагу мазками вверх.
В центр покровного стекла наносят каплю раствора глицерина
в ЗФР (60 мл глицерина, 10 мл 10-кратного концентрата ЗФР,
30 мл дистиллированной воды, 1 мл. 1 н. раствора NaNs, pH 7,2)
и стекло осторожно накладывают на мазок каплей вниз. Избыток
жидкости удаляют кусочком впитывающей бумаги, осторожно
надавливая на покрорное стекло сверху. После этого края пре-
парата герметизируют маникюрным лаком, стараясь не сдви-
нуть покровное стекло.

В.	Просмотр мазков

Препараты просматривают под флуоресцентным микроскопом
Eeitz Orthoplan, оборудованным ртутной лампой Osram НВО-ЮО
и вертикальным опак-иллюминатором для освещения сверху Орак
Fluor Ploem (Е. Leitz GmbH, Ветцлар, ФРГ) с блоками фильт-
ров N (для возбуждения флуоресценции ТРИТЦ) и I (для воз-
буждения флуоресценции ФИТЦ).

С блоком фильтров I наблюдается и некоторое свечение
ТРИТЦ-метки (5—10%). Однако в большинстве случаев харак-
тер флуоресценции ФИТЦ четко отличается от свечения ТРИТЦ.
В сомнительных случаях можно использовать блок фильтров, воз-
буждающих свечение ФИТЦ в условиях, когда любое свечение
ТРИТЦ исключено. Однако этот фильтр не нашел применения,
потому что он исключает также около 30% свечения ФИТЦ.

Чтобы получить оптимальное разрешение флуоресцирующих
объектов, пользуются водно-иммерсионным объективом Leitz
(Х50). Сначала при фазово-контрастном освещении определя-
ют общее число бластов. Учитывают только те клетки, которые
лежат отдельно, без контакта с другими, и выглядят морфологи-
чески интактными.

Препараты, окрашенные двумя метками, учитывают в опреде-
ленной последовательности. Сначала, используя блок фильтров
N, выявляют клетки, окрашенные бараньей антисывороткой к
кроличьему 1g, меченной ТРИТЦ. Затем каждую окрашенную
ТРИТЦ клетку изучают индивидуально с фильтром I, позволяю-
щим выявить связанную с мембраной клетки баранью антисыво-
ротку к мышиному 1g, меченную ФИТЦ. Картины, видимые в фа-
зовом контрасте и при освещении, возбуждающем флуоресцен-
цию ТРИТЦ или ФИТЦ, представлены на рис. 1. Качество
наблюдаемой флуоресценции обсуждается далее в разд. VI, Б.

В препарате мы учитывали не менее 200 бластов и определя-
ли процент T+Ig^-блacтoв.

V. ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОК, СВЯЗЫВАЮЩИХ
АЛЛОАНТИГЕНЫ

А.	Обработка трипсином

Чтобы изучить связывание аллоантигенов бластами, активи-
рованными в СКЛ, необходимо удалить эти антигены с поверх-
ности отвечающих клеток при помощи трипсина. Перед трипси-
низацией обязательно устраняют погибшие клетки, чтобы фер-
ментолиз всегда.проходил при стандартной концентрации живых
клеток. Погибшие клетки элиминируют по методу Дэвидсона и
Пэриша (1975), который обеспечивает хороший выход бластов
и малых лимфоцитов. Все 4 мл культуральной суспензии наслаи-
вают на 2 мл смеси фиколл — уровизон (плотность — 1,09 г/мл)
в пробирке Falcon (No. 3033) и центрифугируют при 2000g без
охлаждения. Затем собирают клетки (не менее 95% живых) из
интерфазного слоя и верхней части градиента, дважды отмыва-
ют в среде RPMI, содержащей 15 мМ буфер ГЭПЭС и 5% про-
гретой сыворотки плода коровы, подсчитывают, отмывают еще
раз в среде RPMI без сыворотки и ГЭПЭС, а затем ресуспенди-
руют в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (Flow Labo-
ratories, Глазго, Шотландия) в концентрации 2-Ю7 клеток/мл.
После разделения выход живых клеток составляет 37—63% бт
исходного числа отвечающих клеток в культуре.

К 0,2—1 мл каждой клеточной суспензии приливают равный
объем ЗФР, содержащий 5 мг/мл трипсина, обработанного тозил-
L-фенилаланин-хлорметилкетоном1 (трипсин — ТРСК, Merck,
Дармштадт, ФРГ). Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, один —
два раза за это время встряхнув для перемешивания. Фермен-
толиз останавливают, прибавив 10 мл охлажденной до 0°С среды

1 Ингибитор химотрипсина. — Прим, перев.
RPMI с 15% сыворотки плода коровы. Клетки подсчитывают,
трижды отмывают и, поместив в свежую культуральную среду
(для СКЛ — с 5% человеческой сыворотки) не более 5-105 клеток
на 1 мл, культивируют в течение ночи при 37°С во флаконе Fal-
con (No. 3012 для объемов 2,5—6 мл; No. 3024 для объемов более
6 мл). После обработки трипсином и культивирования в течение
ночи жизнеспособными остаются 40—88% клеток.

Б. Выделение мембран стимулирующих клеток

Препарат мембранных пузырьков приготовляют из стимули-
рующих клеток следующим образом. Клетки выделяют из селе-
зенки или лимфатических узлов «стимулирующих» линий мышей
по методу, описанному в разд. III, А, 2. Отличие состоит только
в том, что средой служит ЗФР, содержащий 5% сыворотки плода
коровы. Если жизнеспособность клеток в суспензии ниже 85%,
погибшие клетки удаляют фильтрованием через хлопковую вату
в среде низкой ионной силы (von Boehmer, Shortman, 1973). Ког-
да необходимо подготовить большое количество клеток, этот ме-
тод дает оптимальный выход.

Полученные в результате фильтрации клетки подсчитывают и
подготавливают для разрушения под действием азотной кавита-
ции по методу Фербера и сотр. (Ferber et al., 1972), модифициро-
ванному следующим образом. Буферные растворы, в которых
разрушают клетки, готовят из двух компонентов: раствора
А [0,002 М MgCl2, 0,13 М NaCl, 0,02 М ГЭПЭС с pH 7,4] и раство-
ра Б (0,5М сахароза). В день опыта к каждому из этих раство-
ров прибавляют по каплям (при перемешивании) раствор инги-
битора протеаз — фенилметилсульфонилфторида (Schwarz —
Мапп, Торонто, Канада) — до конечной концентрации 10-3М (ин-
гибитор хранят в виде 10~1М раствора в пропаноле). Для уда-
ления возможного осадка ингибитора полученные растворы
фильтруют через мембраны (0,45 мкм) фирмы Millipore.

Клетки ресуспендируют в растворе А до концентрации
6,0-107 ядерных клеток в 1 мл. К этой суспензии (5—50 мл) по
каплям добавляют равный объем раствора Б, непрерывно пере-
мешивая на магнитной мешалке. Взвесь клеток помещают в ста-
кан (на 20 или 50 мл) компрессионного гомогенизатора (Рагг
Instrument Со., Молайн, Иллинойс, США), предварительно
охлажденного на льду. (Чтобы исключить бактериальное загряз-
нение, гомогенизатор перед использованием моют детергентом, за-
тем 70%-ным этанолом и в заключение дистиллированной во-
дой.) Непрерывно перемешивая клетки, в гомогенизатор в тече-
ние 10 мин подают сжатый азот под давлением 800 psi1, затем

1 56,54 ати. — Прим, перев.
газ медленно (в течение 1,5—2 мин) выпускают, а потом вновь
доводят давление до указанной выше величины в течение 15 мин.
Клетки разрушаются в результате продавливания суспензии че-
рез узкое отверстие в стакан, закрытый пленкой Парафильм во
избежание разбрызгивания. В пробах лизата подсчитывают чис-
ло ядер и число целых клеток, микроскопируя их при фазовом
контрасте в той же среде. Такая двухэтапная обработка дает
оптимальный выход мембранных пузырьков из нормальных лим-
фоцитов, оставляя неповрежденными большую часть ядер. Опти-
мальное давление газа и длительность воздействия следует под-
бирать эмпирически для каждого типа клеток (например, для
разрушения бластов или культивированных клеток может быть
достаточно однократной 15-минутной компрессии).

Для удаления ядер клеточный лизат центрифугируют 20 мин
при 750g, осадок ресуспендируют в смеси растворов А и Б, взятых
1 : 1, и вновь центрифугируют. Объединенную надосадочную
жидкость центрифугируют 15 мин при 20 000 g. Осадок отбра-
сывают, а надосадок центрифугируют 60 мин при 120 000 g в
угловом роторе. Осадок мембранных пузырьков ресуспендируют
в 1 мл среды RPMI без сыворотки (во избежание вспенивания),
пропуская шприцем на 1 мл через иглу № 26. При 4°С этот пре-
парат остается стабильным не менее 1 дня. Для длительного
хранения (несколько месяцев) мембранные пузырьки суспенди-
руют в 0,25 М растворе сахарозы с ГЭПЭС (1 мМ, pH 8,2) и за-
мораживают при —70сС. Получаемый материал содержит серо-
логически активные антигены Н-2, которые определяют по спе-
цифическому торможению опосредованного антителами компле-
мент-зависимого лимфоцитолиза. Реакцию лимфоцитолиза мы
ставили в микромодификации, результат учитывали по исключе-
нию красителя (Frelinger et al., 1974); по сравнению с целыми
клетками препарат мембранных пузырьков содержал 50—85%
аллоантигенной активности.

Перед использованием препарат мембран разводят до кон-
центрации, эквивалентной по аллоантигенной активности
1,2-108 клеток/мл, в среде RPMI (с 5% сыворотки плода коровы
или человеческой сыворотки и соответствующими добавками).
Для удаления крупных агрегатов препарат центрифугируют
10 мин при 250 g. Препарат, подвергнутый замораживанию (как
это описано выше), перед разведением диализуют в коллодие-
вом мешке (SM 13 200, Sartorius — Membrane filter GmbH, Гет-
тинген, ФРГ) против среды RPMI.
В.	Экспозиция бластов, обработанных трипсином,
с мембранами стимулирующих клеток и выявление
связанных аллоантигенов

После инкубации в течение ночи обработанные трипсином
клетки подсчитывают, однократно отмывают и ресуспендируют
до концентрации 1,5-10® живых клеток в 1 мл; 0,3-миллилит-
ровые порции этой суспензии дополнительно инкубируют с
0,7 мл свежей среды (полной) для культивирования тканей или
со средой, содержащей мембраны стимулирующих клеток. Затем
клетки вновь подсчитывают; погибшие клетки удаляют центри-
фугированием, нанеся суспензию на смесь фиколл-уровизон
(плотность 1,09 г/мл) (Davidson, Parish, 1975). После 2—4-ча-
совой инкубации с мембранами стимулирующих клеток 90—
100% отвечающих клеток вновь связывали их аллоантигены.
Природу связанного материала мы определяли методом непря-
мой иммунофлуоресценции, обрабатывая отвечающие клетки
сначала аллоантисывороткой к стимулирующим клеткам, а за-
тем — меченным ФИТЦ бараньим 1g к мышиному 1g, как было
описано выше.

VI. КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА: ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА

И ЕГО ОГРАНИЧЕНИЯ

А. Основные результаты и область применения метода

Описанная выше методика позволила получить следующие
результаты.

1.	После аллогенной стимуляции значительная часть (24—
44%) Т-бластов из неразделенной взвеси клеток лимфатических
узлов несет на своей поверхности иммуноглобулины. Произве-
денное перед стимуляцией удаление В-клеток (фильтрованием
через колонки с найлоновой ватой) уменьшает долю Ig-несущих
Т-бластов до 3—6% (Nagy et al., 1976а).

2.	Большинство активированных Т-бластов из популяции очи-
щенных на найлоновой вате отвечающих клеток (или все они) не-
сут на своей поверхности аллоантигены стимулирующих клеток,
которые выявляются антисыворотками к стимуляторам и реаген-
тами для непрямого иммунофлуоресцентного анализа. Аллоанти-
гены стимулирующих клеток фиксируются на поверхности Т-кле-
ток благодаря специфическим рецепторам. О специфичности свя-
зывания свидетельствует то, что в культуре, активированной
смесью двух популяций стимулирующих клеток, все бласты или
большинство их несут на своей поверхности антигенный матери-
ал только одного из двух типов стимуляторов (Nagy et al.,
1976а).

3.	Сходные результаты были получены и в том случае, когда
Т-клетки активировали смесью стимуляторов, раздельно несов-
местимых по областям H-2I и Н-2К, При этом большинство блас-
тов или даже все бласты, связавшие продукт области/С имели на
своей поверхности аллоантиген Ly-2, но не Ly-1. В то же время
бласты, связавшие стимулирующий материал области I, имели
фенотип Ly-1, но не Ly-2 (Nagyet al., 1976 b).

4.	Обработка трипсином удаляет связанные аллоантигены
стимулирующих клеток с поверхности активированных бластов.
Обработанные трипсином бласты после восстановительного пе-
риода (в течение ночи) могут вновь специфически присоединять
свежий материал стимулирующих клеток, полученный из над-
осадочной жидкости СКЛ или из новых клеток, разрушенных с
помощью азотной кавитации (Elliott et al., 1977).

Все перечисленные результаты получены на 4-дневных сме-
шанных культурах непримированных отвечающих клеток со сти-
мулирующими клетками в тот момент, когда наблюдается мак-
симальный процент бластов. В тех же самых культурах отвечаю-
щие малые лимфоциты не связывали антиген. Возможность
связывания аллоантигенов на более ранних этапах культивиро-
вания еще не была детально исследована. Однако в долговре-
менных СКЛ при интенсивном накоплении клеток, которые реа-
гируют на «примирующий» стимулятор (Fathman et al., 1976),
значительная часть (12—18%) сохранившихся малых лимфоци-
тов специфически связывает фрагменты мембран стимулирую-
щих клеток (В. Е. Elliott, неопубликованные данные).

Описанный здесь метод может быть с успехом применен для
анализа любой Т-клеточной популяции, в которой достаточно
большая доля клеток имеет определенную специфичность. Одна-
ко не следует забывать о некоторых ограничениях этого метода
(см. разд. VI, Б).

Б. Замечания к методике

1.	Просмотр мазков

Для получения удовлетворительных результатов важно при-
готовить хорошие препараты. Просмотр мазков значительно об-
легчается при использовании реагентов с двойной флуоресцент-
ной меткой: можно сначала найти в каждом поле клетки с рав-
номерной пятнистой флуоресценцией анти-Т-реагента, характер-
ной для Т-бластов, а затем выяснить, имеется1 ли на их поверх-
ности аллоантиген стимулирующих клеток, по флуоресценции
Пример непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания активированных в СКЛ Т-бластов
с помощью аллоантител к стимулирующим и отвечающим клеткам

Таблица 1

Комбинация линий мышей		Антисыворотка  (разведение)	Отношение числа Т+Т^-бластов к общему числу бластов			Отношение  Т”1§+-бластов к обще- му числу бластов	Общий процент бластов
отвечающие клетки1	стимулирую- щие клетки		яркие	пятнистые	сумма, %		
			(в скобках — %)				
A (kkdd)2  A (kkdd)  A (kkdd)	Вб (ввве)2  Вб (ввве)  Вб (вввв)	-(-)  <*Kk (1/20)3 аВ6(1/50)4	5/181 (2,8)  170/184 (94,4)  9/213 (3,8)	0/181 (0)  0/184 (0)  9/236 (41,9)	2,8  94,4  45,7	1,80 (0,6%)  Не исследовано  Не исследовано	54,7

1 Взвесь неадгезивных клеток лимфатических узлов после фильтрации через найлоновую вату.

2 Гаплотипы Н-2 (строчными буквами указаны аллели областей К., I, S и D соответственно).

8 Антисыворотка мышей A.TL к лимфоцитам мышей A.AL, дважды истощенная клетками селезенки и лимфоузлов мышей'Вб.

4 Антисыворотка мышей СВА к лимфоцитам мышей Вб, дважды истощенная клетками селезенки и лимфоузлов мышей A/I и SJL.
знти-Ig-peareHTa, специфичного для соответствующих аллоанти-
тел.

Присоединенные аллоантигены обычно концентрируются в
виде слабо флуоресцирующих пятен на одном полюсе клетки.
Так как свечение фона и интенсивность специфической флуорес-
ценции могут варьировать от опыта к опыту (даже при одной и
той же комбинации линий мышей), особенно при использовании
разных антисывороток, очень важно в каждый опыт включать
все необходимые контроли, а также учитывать препараты «сле-
пым» методом. В мазке почти все бласты (94,4%) относятся к
отвечающим клеткам, однако иногда можно обнаружить не-
большой процент (3,8%) бластов, образовавшихся из стимули-
рующих клеток (табл. 1). Такие бласты легко отличить: у них
ярко флуоресцирует вся поверхность.

В культурах отвечающих клеток, не содержавших В-лим-
фоцитов, анти-Ig-peareHT без аллоантисыворотки, как правило,
выявлял очень небольшое число (1,7—5,2%) Т-бластов. Возмож-
ны два объяснения таким находкам: 1) примесь В-бластов
(0,5—2,9%) секретирует 1g, который специфически или неспе-
цифически присоединяется к Т-бластам; или 2)исам флуоресци-
рующий реагент распознает на Т-клетках какую-то иную специ-
фичность или же присоединяется к ним неспецифически.

После обработки мазка аллоантисывороткой к клеткам ли-
нии, отличной от стимулирующих и отвечающих клеток, число
таких Т-бластов обычно слегка повышается (дополнительно на
2—4%). Этот эффект наблюдается даже после истощения анти-
сыворотки стимулирующими и отвечающими клетками и объяс-
няется скорее всего остаточной перекрестной реактивностью ан-
тисыворотки или же неспецифическим захватом клетками имму-
ноглобулина из этой антисыворотки. Хотя общее число бластов,
флуоресцирующих без обработки аллоантисывороткой, может
достигать 6,9%, гипериммунная антисыворотка, выявляющая
аллоантигены стимулирующих клеток, окрашивает в 9,2—11,8
раз больше Т-бластов, чем антисыворотка к третьей, неродст-
венной линии.

В отличие от этого неистощенные или не полностью истощен-
ные сыворотки часто окрашивают значительный процент кле-
ток. Возможные объяснения такой «перекрестной реактивности»
рассмотрены в разд. VI, В.

2.	Воспроизводимость и чувствительность метода

Метод обладает хорошей качественной, но не количественной
воспроизводимостью. Мы изучали связывание аллоантигенов на
многих различных комбинациях стимулирующих и отвечающих
клеток, используя различные аллоантисыворотки (Nagy et al.,
1976а). При этом выявляемое число связывающих Т-бластов
значительно варьировало от опыта к опыту. Скорее всего, это
было обусловлено различиями в количестве присоединяемых ал-
лоантигенов в разных опытах.

Если учесть эти различия и тот факт, что концентрация алло-
антител даже при использовании максимально активных анти-
сывороток всегда находится ниже оптимального уровня, при-
дется предположить, что выявление связанных аллоантигенов
производится на границе чувствительности метода. Тем не менее
во многих опытах около 100% бластов несли на своей поверх-
ности определимые количества аллоантигенов стимулирующих
клеток (Nagy et al., 1976а).

3.	Схема опыта

Ограничения метода, рассмотренные в предыдущем разделе,
заставляют проводить опыты таким образом, чтобы выводы
основывались на относительных показателях. Наиболее простой
и надежный способ, гарантирующий однозначную интерпрета-
цию результатов, состоит в использовании того или иного вари-
анта постановки опытов «крест-накрест». Приводим пример
такой схемы:

Культура		Клетки, окрашенные указанными реагентами	Процент Т+1^+-бластов к общему чис- лу бластов
отвечающие клетки	стимулирую- щие клетки		
А	в	анти-В анти-С	
А	с	анти-В анти-С	

Чтобы устранить перекрестно-реагирующие антитела, каж-
дую аллоантисыворотку к стимулирующим клеткам следует
тщательно истощить клетками отвечающей линии и третьей, не-
родственной, линии (см. разд. III, В).

Схема опыта «крест-накрест» легко осуществима при бласт-
трансформации в культуре нормальных аллогенных клеток. Од-
нако в других потенциальных приложениях метода (например,
при изучении связывания опухолевых антигенов или гаптенов
либо связывания антигена предполагаемыми линиями антиген-
специфических Т-клеток, несущих неизвестную антигенную спе-
цифичность) использование этой схемы может быть затруднено.
В.	Природа аллоантигенного материала

Мы специально не исследовали этот вопрос. Однако многие
опыты косвенно свидетельствуют о том, что материал стимули-
рующих клеток, связанный, как это выявлено нашим методом,
на поверхности активированных отвечающих клеток, состоит не
из одиночных молекул, а скорее всего из крупных фрагментов
клеточной мембраны, возможно весьма гетерогенных по вели-
чине. К этому выводу нас привели два наблюдения.

1.	При стимуляции отвечающих клеток клетками, несовмес-
тимыми по всему комплексу Н-2, суммарное число клеток, окра-
шиваемых по отдельности антисыворотками к продуктам /- и
^-областей стимуляторов, оказывалось гораздо больше, чем
число клеток, окрашиваемых смесью этих антисывороток одно-
временно (Nagy el al., 1976а). Но этого не наблюдалось в анало-
гичных опытах, когда отвечающие клетки стимулировали смесью
клеток, часть которых несовместима по /-, а часть — по 2<-облас-
ти (Nagy et al., 1976b).

2.	Материал стимулирующих клеток, связываемый бласта-
ми после трипсинизации, можно осадить из надосадочной жид-
кости СКЛ, центрифугируя ее 60 мин при 100 000 g. Этот факт
позволяет предположить, что определенную часть такого мате-
риала составляют фрагменты мембран. Однако вполне возмож-
но, что Т-бласты связывают и одиночные молекулы, выявление
которых, несомненно, находится ниже порога чувствительности
метода в его настоящем виде (Nagy et al., 1976а).

Все эти факты указывают на то, что аллоантитела, связыва-
емые поверхностью отвечающих клеток, вовсе не обязательно
реагируют с теми же аллоантигенными молекулами, детерми-
нанты которых распознаются предполагаемыми эндогенными
рецепторами этих клеток. (Попутно отметим, что, вероятно, те
сайты на фрагментах мембран стимулирующих клеток, ко-
торыми эти фрагменты присоединяются к отвечающим клеткам,
уже недоступны для добавляемых антител.) Таким образом, ни-
чего не зная о размерах присоединяемых фрагментов мембран и
о характере распределения антигенов в них, мы не можем су-
дить о том, существует ли какая-либо связь между специфично-
стью рецепторов отвечающих клеток и специфичностью аллоан-
тител, реагирующих с прилипшими фрагментами мембраны сти-
мулирующих клеток. Значит, аллоантисыворотки служат на
данном этапе лишь средством выявления антигенного материа-
ла стимулирующих клеток, связанного отвечающими клетками.

Это можно проиллюстрировать на следующем примере. Пос-
ле того как стимулирующие антигены удалены трипсином с по-
верхности клеток СВА, активированных клетками Вб, многие
из клеток СВА вновь присоединяют антигенный материал кле-
ток Вб. Наряду с этим некоторое (хотя и меньшее) число отве-
чающих бластов связывают также материал клеток SJL (Elliott
et al., 1977). Клетки последнего типа можно выявить сыворот-
кой анти-SJL, предварительно истощенной клетками Вб (и СВА).
Если мы предположим, что Т-клетки, реагирующие на антигены
Н-2, моноспецифичны, то прежде всего придется допустить не-
специфичность присоединения материала SJL. Это полностью
согласуется с предположением, что некоторые из клеток, отве-
тивших на аллоантигены Вб, несут рецепторы, перекрестно реа-
гирующие с детерминантами SJL, так как связанный SJL мате-
риал выявляется не через детерминанты, общие с Вб, а через
иные детерминанты, присутствующие на том же фрагменте
мембраны. Такая аргументация, конечно, возможна и в том слу-
чае, когда связанный материал мономолекулярен, так как оди-
ночные молекулы антигенов МНС полидетерминантны.

VII. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Описанный метод обеспечил значительные успехи в изуче-
нии специфических антигенов, связываемых Т-клетками. Он
впервые позволил идентифицировать Т-клетки, реагирующие на
антигены МНС, не по функциональной активности (пролифера-
ция, цитотоксическое действие на клетки-мишени), а по специ-
фическим антигенам, присоединяемым отдельными клетками.
Применение этого метода уже позволило значительно продви-
нуться в понимании различных аспектов иммунологического
распознавания антигенов МНС-реактивными клетками. Однако
остается много нерешенных вопросов. Мы надеемся, что эта
глава привлечет внимание исследователей к данной проблеме.

* *
*

Мы признательны д-ру Д. Шрефлеру, благодаря щедрости
которого мы получили в свое распоряжение гипериммунные сы-
воротки анти-Н-2 и рекомбинантные линии мышей; г-же Л. Фор-
ни, любезно обеспечившей нас иммунофлуоресцентными реаген-
тами; д-ру В. Миджиано и д-ру Б. Пернису за полезные советы
и обсуждения. Мы благодарим г-Жу Б. Хаусманн и г-жу А. М.
Ринбек за квалифицированную техническую помощь.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Davidson W. F., Parish С. R. (1975). J. Immunol. Methods, 7, 291.

Elliott В. E., Nagy Z., Nabholz M., Pernis B. (1977). Eur. J. Immunol., 7, 287.
Fathman C. G., Collavo D., Davies S,, Nabholz M. (1976). J. Immunol., 118,
1232.
Ferber Е., Resch К., Wallach D. F. И., ImmW. (1972). Blochim. Biophys. Acta,
266, 494.

Frelinger J. A., Niederhuber J. E., David C. S., Shreffler D. C. (1974). J. Exp.
Med., 140, 1273.

Julius M., Simpson F., Herzenberg L. A. (1973). Eur. J. Immunol., 3, 645.

Nabholz M., Vives J., Young H. M., Meo T., Miggiano V., Riinbeck A., Shref-
fler D. C. (1974). Eur. J. Immunol., 4, 378.

Nagy Z., Elliott В. E., Nabholz M.., Krammer P., Pernis B. (1976a). J. Exp.
Med., 143, 648.

Nagy Z., Elliott В. E., Nabholz M. (1976b). J. Exp. Med., 149, 1545.

Sauser D., Anckers C., Bron C. (1973). J. Immunol. Methods, 2, 293.

von Boehmer H., Shortman K- (1973). J.Immunol. Methods, 2, 293,
ОЦЕНКА АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ
ПРОЛИФЕРАЦИИ МЫШИНЫХ Т-КЛЕТОК

С. Алкан

I.	НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА

Пролиферативный ответ мышиных лимфоцитов на аллоген-
ные клетки или митогены оценить довольно легко (Thorpe,
Knight, 1974: см. также гл. 15). Известные трудности возникают,
однако, при попытке достоверно оценить в культурах антиген-
специфическую пролиферацию Т-лимфоцитов. В литературе
описано несколько методов (Туап, 1972; Lonai, Me Devitt, 1974;
Phanuphak et al., 1974; Osborne, Katz, 1973a), которые приме-
нялись с различным успехом. Неконтролируемый характер про-
лиферации и участие в ней В-клеток (Osborne, Katz 1973а, b;
Moorhead et al., 1973) ставят под сомнение адекватность этих
методов для оценки функции Т-клеток. Шварц и др. (Schwartz
et al., 1975) описали иную систему, позволяющую изучать ответ
мышиных Т-лимфоцитов, однако и ей присущи некоторые недо-
статки. Во-первых, она требует разработки трудоемкой проце-
дуры очистки лимфоцитов из перитонеального эксудата прими-
рованной мыши. Во-вторых, число лимфоцитов, получаемых от
одной мыши, настолько мало (3-105), что для одного опыта тре-
буется очень много мышей.

В этой главе мы опишем недавно разработанный метод крат-
ковременной микрокультуры (Alkan, 1978), который лишен упо-
мянутых выше недостатков и позволяет надежно оценить инду-
цированный антигеном ответ мышиных Т-лимфоцитов. Новое в
этом методе состоит в том, что в нем используют вместо селе-
зеночных клеток только клетки регионарных лимфатических уз-
лов примированной мыши. Кроме того, в среду для культивиро-
вания добавляют вместо сыворотки плода коровы лошадиную
сыворотку.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

В опытах используют только лимфоциты регионарных лим-
фатических узлов, среди которых много антиген-реактивных
клеток. Животных сенсибилизируют введением антигена в хвост
или в подошвы лапок и затем иссекают регионарные узлы.
Клетки выращивают на панелях для микрокультивирования в
присутствии антигенов (и/или митогенов) либо без них. Проли-
ферацию оценивают по включению 3Н-тимидина. Этот метод
можно использовать для различных антигенов, таких, как моно-
валентные антигены (азобензол-арсонат-Ь-тирозин), белковые
антигены (человеческий у-глобулин, овальбумин), конъюгаты
носителя с гаптеном (арсонат — гемоцианин моллюска фиссу-
реллы (Alkan, 1978) и многие другие (Schwartz et al., 1975).

III.	РЕАГЕНТЫ И ПРИБОРЫ

Сбалансированный солевой раствор (СР)

Забуференный фосфатами физиологический раствор (ЗФР)

Очищенный белковый дериват туберкулина (PPD) без кон-
серванта (Statens Serum Institute, Копенгаген)

Липополисахарид (ЛПС) (Difco, США)

Конкаиавалин А (Кон-А) (Pharmacia, Швеция)

Фильтры фирмы Millipore

Тефлоновый пестик (диаметром 13 мм)

Полный (и/или неполный) адъювант Фрейнда (ПАФ) (Difco,
США)

RPMI 1640 с NaHCO3 (Difco, США)

Смесь пенициллина со стрептомицином (Gibco, США)

L-глутамин (Gibco, США)

ГЭПЭС (Calbiochem, США)

2-меркаптоэтанол (Merck, ФРГ)

Лошадиная сыворотка (Gibco, США)

Панели для микрокультивирования (Falcon Plastics Micro-
test 3040) либо панели с плоскодонными лунками (Cooke)
3Н-метилтимидин TRA-310, 2 Ки/моль (Amersham)

IV.	МЕТОДИКА

А.	Подготовка антигена

Антиген растворяют в ЗФР или в СР, pH доводят до 7,5. Рас-
твор стерилизуют пропусканием через фильтр (размер пор
0,45 мкм) и хранят при 4°С.

Перед иммунизацией смешивают равные объемы раствора -
антигена и адъюванта Фрейнда (полного или неполного в за-
висимости от антигена). Смесь готовят в стеклянном флаконе и
эмульгируют шприцем, затем охлаждают на льду и эмульгируют
повторно. Эмульсию хранят при 4°С. Обычно одной мыши вво-
дят от 10 до 100 мкг антигена, в зависимости от его природы.

11—233
Б. Иммунизация

Мышь иммунизируют введением эмульсии под кожу хвоста
или в подошвы задних лапок с помощью стеклянного шприца
(на 1—2 мл) с иглой № 26. В основание хвоста вводят 40—
50 мкл, при этом следует убедиться, что эмульсия попала имен-
но под кожу. В подошвы задних лапок достаточно ввести ио
25 мкл эмульсии в каждую.

В.	Приготовление среды для культивирования

Основной средой служит среда RPMI 1640 (Gibco) с добав-
лением ингредиентов, указанных в табл. 1.

Таблица 1

Ингредиенты, добавляемые в среду для культивирования и растворы
для отмывания клеток1

Ингредиент	Основной раствор	Температура хранения, °C	Конечная концентра- ция в среде
ГЭПЭС2		2М	4	10 мМ
L-глутамин		0,2М	—20	2 мМ
2-меркаптоэтанол3 . . .	14 М	4	0,028 мМ
Пенициллин 		104 ед/мл	—20	100 ед/мл
Стрептомицин 		104 мкг/мл	—20	100 мкг/мл
Лошадиная сыворотка4 .		—20	5%

* В забуференный фосфатами физиологический раствор или СР (как отмывающие раст-
воры) добавляют пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мг) и лошадиную сыворот-
ку (2,5%).

1 ГЭПЭС (25 г) растворяют в 1 н. NaOH и доливают до 105 мл средой RPMI; затем
смесь стерилизуют пропусканием через фильтр фирмы Millipore.

* Всегда готовят свежий раствор: сначала делают 1000-кратное разведение СР (14 мМ);
затем 0,2 мл раствора этого разведения добавляют к 100 мл среды.

4 Инактивируют прн 56°С 30 мни и хранят при —20° илн —70°С.

Г. Взятие лимфатических узлов

Через 1—4 нед после иммунизации мышей забивают путем
цервикальной дислокации, погружают в 70%-ный этанол и го-
товят для иссечения лимфатических узлов. Если мышей иммуни-
зировали инъекцией в хвост, то иссекают два паховых и три
парааортальных узла. При иммунизации в подошвы лапок берут
только подколенные узлы. Лимфатические узлы помещают в
чашку Петри, содержащую охлажденный ЗФР или СР (с до-
бавками), и освобождают от жира.
Д. Приготовление клеточной суспензии

Лимфатические узлы переносят в 15-миллилитровую пробир-
ку из пластика и, поместив на стенку пробирки, разрезают сте-
рильными ножницами на мелкие кусочки. В пробирку вносят 1—
2 мл ЗФР (с добавками) и с помощью тефлонового пестика из этих
кусочков выдавливают клетки. Затем к суспензии добавляют
10 мл ЗФР, содержимое пробирки перемешивают и ставят на
5 мин на лед. Оставив комочки на дне, суспензию переносят в
следующую такую же пробирку.

Клетки дважды отмывают охлажденным ЗФР (с добавка-
ми), центрифугируя в течение 10 мин при 150 g. После первого
центрифугирования на поверхности ЗФР появляется слой жира,
который следует удалить пипеткой. Перед отсасыванием над-
осадочной жидкости жировой слой необходимо обязательно
удалять.

Затем, взяв пробу для подсчета, клетки еще раз отмывают
в среде для культивирования.

Е. Условия культивирования

Сначала на панелях для микрокультивирования готовят
контрольные культуры — заполняют по две лунки каждым конт-
рольным антигеном или митогеном и две-три лунки либо сре-
дой для культивирования, либо ЗФР. В оставшиеся лунки вно-
сят 20 мкл раствора (в ЗФР) антигена (соответствующей кон-
центрации) и 0,2 мл клеточной суспензии (2-1№/ыл). [Для боль-
шинства антигенов оптимальная концентрация колеблется в
пределах от 10 до 400 мкг на 1 мл культуры (Alkan, 1978). Опти-
мальное число клеток, вносимых в лунку, составляет около (5±
±1) • 105 клеток.] Затем пластины для микрокультивирования
накрывают негерметичными крышками и оставляют в СОг-тер-
мостате при 37°С на 2—4 дня. В зависимости от природы анти-
гена пик клеточной пролиферации в этой системе варьирует в
пределах от 2-го до 4-го дня культивирования. Метку вносят за
16—24 ч до конца культивирования — по2мкКи 3Н-тимидина в
каждую лунку. Для этого основной раствор 3Н-тимидина снача-
ла разводят в среде RPMI 1640 до концентрации 40 мкКи/мл.
Затем одну каплю (50 мкл) раствора изотопа добавляют в каж-
дую лунку.

Для оценки включения метки используют полуавтоматиче-
ский коллектор. Из каждого ряда лунок клетки собирают, от-
мывают на полоске фильтра из стекловолокна и высушивают на
подогревной плите. Затем каждый диск, вырезанный из фильтра,
помещают в сцинтилляционный флакон, в который наливают
Ю мл сцинтилляционной жидкости. Включение радиоактивного
11*
тимидина определяют с помощью жидкостной сцинтилляционной
спектрофотометрии.

Интенсивность клеточной пролиферации выражают либо
в виде индексов, представляющих отношение между средним
числом импульсов в 1 мин в опытных и контрольных культурах,
либо в виде дельты — разности между средним приростом им-
пульсов в опытных и контрольных культурах. При больших (по
объему) опытах все необходимые расчеты производят с по-
мощью ЭВМ.

Ж. Контроли.

1.	Чтобы убедиться в адекватности условий культивирова-
ния, состояния клеток и среды, в качестве контрольных стимуля-
торов следует использовать митогены. В предлагаемой системе
(RPMI+лошадиная сыворотка) оптимальные дозы ЛПС и Кон-А
составляют 500 и 10—20 мкг/мл соответственно, что в 10 раз
выше концентраций митогенов, используемых в культурах, со-
держащих сыворотку плода коровы.

2.	PPD может служить превосходным контрольным стимуля-
тором, если животных иммунизировали смесью антиген-ПАФ.
PPD (50 мкг/мл) индуцирует интенсивное включение тимидина
в культурах клеток лимфатических узлов, полученных от любого
животного, которому вводили ПАФ.

3.	При использовании лимфатических узлов непримиро-
ванных животных одни антигены стимулируют пролифератив-
ный ответ, тогда как другие оказываются токсичными для кле-
ток. Чтобы исключить токсическое действие, все используемые
антигены целесообразно контролировать в культуре с клетками
лимфатических узлов от неиммунизированных мышей или мы-
шей, которым вводили только ПАФ.

4.	Для доказательства того, что антиген не стимулирует про-
лиферации В-клеток, необходимо включить следующие контро-
ли: а) предварительную обработку клеток лимфатических узлов
сывороткой анти-ТЬу-1.2 с комплементом (в этом случае следу-
ет ожидать, что включение тимидина не превысит фонового
уровня); б) определение в культуре антиген-специфических ан-
тителообразующих клеток методом локального гемолиза (следу-
ет ожидать незначительного фонового уровня); в) окрашивание
стимулированных клеток конъюгированной с флуоресцеином
сывороткой к мышиному Ig (пролиферирующие клетки должны
быть Ig-).
V. КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА

Установлено, что данный метод применим для многих анти-
генов (включая синтетические, полу синтетические и естествен-
ные) (Alkan, 1978, а также неопубликованные наблюдения). Од-
нако для каждого антигена следует оптимизировать основные
параметры системы, такие, как 1) доза антигена и время после
иммунизации; 2) оптимальная концентрация антигена в куль-
туре и 3) продолжительность культивирования.

Большинство ранее описанных систем непригодно для оцен-
ки индуцированного антигеном пролиферативного ответа из-за
высокого уровня включения 3Н-тимидина в нестимулированном
контроле. Последнее обстоятельство, как правило, связано с
использованием сыворотки плода коровы. В данном методе эта
проблема отпадает, так как используется 5%-ная лошадиная сы-
воротка. При этом низкий фоновый уровень включения наблю-
дается не с какой-либо отдельной серией лошадиной сыворотки;
сходные результаты мы получили и с двумя другими сериями
фирмы Gibco (США). С успехом также была использована сы-
воротка, которую свыше года хранили при —20°С. Кроме того,
были испытаны сыворотка плода коровы (отобранная по сла-
бым митогенным свойствам) и некоторые человеческие сыворот-
ки. Однако все они давали значительно меньшие индексы сти-
муляции, чем культуры с лошадиной сывороткой.

Панели с плоскодонными лунками оказались наиболее удоб-
ными, однако для некоторых целей могут быть также исполь-
зованы панели с U- и V-образными лунками. Правда, в этих
случаях необходимо подбирать оптимальные параметры культи-
вирования, в частности плотность клеточной популяции. Пос-
леднюю, как правило, приходится уменьшать, а продолжитель-
ность культивирования сокращать.

Необходимо напомнить, что при иммунизации антиген вво-
-дят в область хвоста подкожно, а не внутривенно. Для удобства
используют иглы со стандартным ограничителем. Инъекцию
производят у основания хвоста.

Из периаортальных и паховых лимфатических узлов одной
иммунизированной мыши получают 10—40-106 клеток. Этого
количества достаточно на весь опыт. Кроме того, клетки синген-
ных мышей можно объединять, так как различия в средних по-
казателях между индивидуальными суспензиями и общей
смесью клеток от разных мышей незначительны.

Недавно мы доказали, что этот метод позволяет оценивать
антиген-специфический ответ Т-лимфоцитов на ряд антигенов.
Кроме того, мы установили, что участие В-клеток в ответе ми-
нимально и не играет существенной роли (Alkan, 1978). Для
каждого конкретного антигена исключить участие в ответе
В-клеток можно на основании следующих критериев: 1) предва-
рительная обработка клеток лимфатических узлов сывороткой
анти-Thy 1.2 блокирует пролиферативный ответ; 2) число анти-
ген-специфических антителообразующих клеток в реакции ло-
кального гемолиза не должно нарастать на пике пролифератив-
ного ответа; 3) число В-клеток, выявляемых в культуре по окра-
шиванию их поверхности, не должно возрастать после стиму-
ляции антигеном.

Недавно мне удалось показать, что предварительная обра-
ботка клеток лимфатических узлов бараньей антисывороткой к
мышиному 1g (с комплементом) не влияет на индуцированную
антигеном пролиферацию и вместе с тем подавляет способность
клеток реагировать на ЛПС.

Более подробные данные по этому вопросу можно найти в
работах: Schwartz et al., 1975; Alkan, 1978.

* *

*

Я весьма признателен д-ру Коррейдину за полезный со-
вет— использовать метод внутрихвостовой сенсибилизации, а
также за то, что он дал мне возможность ознакомиться с его
статьей до ее опубликования (Corradin G. et al., J. Immunology,
1977, 119, 1048).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Alkan S. S. (1978). Eur. J. Immunol., 8, 112.

Lonai P., McDevitt H. 0. (1974). J. Exp. Med., 140, 977.

Moorhead J. W., Walters C. S., Claman H. hi. (1973). J. Exp. Med., 137, 411.

Osborne D. P., Jr., Katz D. H. (1973a). J. Immunol., Ill, 1164.

Osborne D. P., Jr., Katz D. H. (1973b). J. Immunol., Ill, 1176.

Phanuphak P., Moorhead J. W., Claman H. N. (1974). J. Immunol., 112, 115.
Schwartz R. H., Jackson L., Paul W. Ё. (1975). J. Immunol., 115, 1330.
Thorpe P. E., Knight S. C. (1974). J. Immunol. Methods, 5, 387.

Tyan M. L. (1972). J. Immunol., 108, 65.
Глава 23

АНТИГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ХЕЛПЕРНЫЙ
ФАКТОР Т-КЛЕТОК И ЕГО АКЦЕПТОР

М. Тауссиг

I.	ВВЕДЕНИЕ

Растворимые факторы Т-клеток служат медиаторами взаи-
модействия между лимфоцитами. Они либо усиливают иммун-
ный ответ {хелперные факторы — от англ, helper — помощник),
либо подавляют его {супрессорные факторы); они могут быть
антиген-специфическими и неспецифическими (Taussig, 1974;
Munro, Taussig, 1975; Katz, Benacerraf, 1976; Taussig et aL,
1974; Taussig, Finch, 1977; Luzzati et al., 1976; Mozes, 1976;
Taniguchi et al., 1976). Некоторые из этих факторов кодируются,
по крайней мере частично, генами главного комплекса гистосов-
местимости— МНС (Major histocompatibility complex). Специ-
фические МНС-контролируемые факторы представляют значи-
тельный интерес как вероятные растворимые продукты антиген-
распознающей системы Т-клеток, и потому, изучая их, можно
выявить, что собой представляет загадочный распознающий ре-
цептор Т-клеток. Кроме того, присутствие (у мыши) в составе
этих факторов детерминант 1а свидетельствует об участии про-
дуктов /-области в межклеточных взаимодействиях. Короче
говоря, создается впечатление, что гены /-области кодируют про-
дукты двух типов, а именно — растворимые факторы и их ак-
цепторы на поверхности лимфоцита. Акцепторы — это молеку-
лы, которые реагируют с факторами и передают их сигнал клет-
ке. Характер взаимодействия фактора и его акцептора кодиру-
ется парой тесно сцепленных генов /-области. Для хелперных
факторов эти гены удалось локализовать пока только в I-A-
субобласти Н-2, а гены специфических супрессорных факторов
и их акцепторов обнаружены в /-/-субобласти (рис. 1).

Специфические хелперный и супрессорный факторы несут
активный центр, связывающий антиген, и ни тот ни другой не
относится к иммуноглобулинам (Ig). Специфический хелперный
фактор — гликопротеид с мол. весом около 50 000, не обладаю-
щий антигенными детерминантами V- и С-областей Ig (Taussig
et al., 1976), но, несмотря на это, он фиксируется на иммобили-
зованном антигене или на иммуносорбенте анти-1а. Предпола-
гается, хотя и не без сомнений, что гены, кодирующие вариабель-
ные области растворимых факторов Т-клеток, находятся в /-
области.
44»н»+

Хелперные
факторы

Акцепторы

Рис. 1. Схема расположения генов в 1-области мышиного комплекса Н-2, ко-
дирующих молекулы, которые обеспечивают межклеточные взаимодействия.

Акцептор хелперного фактора расположен на В-лимфоцитах
и, кроме центра, связывающего сам фактор, несет на себе 1а-
специфичность, кодируемую 7-А-субобластью. И факторы, и их
акцепторы можно, по-видимому, считать продуктами генов им-
мунного ответа (Ir-генов), так как 1) либо хелперный фактор,
либо акцептор отсутствует у низкореактивных мышей и 2) оба
они несут 1а-антигены.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Специфический хелперный фактор получают in vitro в крат-
ковременной культуре Т-клеток, предварительно примирован-
ных («обученных») соответствующим антигеном. Фактор опре-
деляют по его способности к кооперации с В-клетками in vivo.
Акцептор выявляют по способности В-лимфоцитов адсорбиро-
вать фактор (т. е. устранять его активность).

III.	РЕАГЕНТЫ И ПРИБОРЫ

В качестве антигенов наиболее часто используют синтетиче-
ские полипептиды — poly(Tyr, Gly)-poly(DL-Ala)-poly(Lys) [со-
кращенно — (T, G)-A-L]; poly(Phe, Glu)-poly (DL-Ala)-poly
(Lys)[(Phe, G)-O-L] и poly(Tyr, Glu)-poly(Pro)-poly(Lys) [(T,
G) -Рго-L]. Эти антигены синтезировала д-р Э. Мозес. Кроме то-
го, используются бараньи эритроциты, эритроциты лошади, а так-
же конъюгаты гаптен-белок. «Обученные» мышиные Т-клетки
культивируют на минимальной среде Игла без сыворотки в сте-
рильных чашках Петри диаметром 55 мм (Sterilin Р122). Прав-
да, тип чашек не имеет существенного значения для результатов
культивирования.
IV.	МЕТОДИКА

А. Хелперный фактор Т-клеток

Схема получения этого фактора представлена на рис. 2, А.
Примирование мышиных Т-клеток антигеном осуществляли сле-
дующим образом. Мышам после летального облучения вводили
внутрибрюшинно тимоциты (108) в смеси с ПАФ. Выбор линии
мышей диктуется как природой исследуемого антигена, так и
чувствительностью животных к облучению. При работе с
(TG)-A-L предпочтительны линии C57BL, BALB/c и СЗН. Хотя
мыши линии СЗН слабо реагируют на (Т, G)-A-L, тем не менее
их Т-клетки вырабатывают хелперный фактор. Выбор дозы ан-
тигена для примирования Т-клеток, оптимального срока для
сбора клеток и т. д. также в значительной степени зависит от
особенностей антигена и линии мышей. Для примирования 108
Т-клеток облученному реципиенту вводят 0,1 мл 10%-ной суспен-
зии БЭ. Примированные клетки выделяют из селезенки реципи-
ента через 5 дней. Для примирования с помощью (Т, G)-A-L доза
составляет 10 мкг в ПАФ, и клетки получают на 7-й день. В этот
момент в селезенке мышей-реципиентов должны содержаться
«обученные» Т-клетки, специфичные для использованного анти-
гена. Из одной селезенки выделяют 1—5-106 таких клеток. Чтобы
«обучение» проконтролировать, выделенные Т-клетки вместе с
клетками костного мозга переносят второму облученному реципи-
енту. Реципиенты, получившие смесь «обученных» клеток
(1—2-106) с костномозговыми (2-107), должны дать более вы-

7 дней

юв .
тимоцитов

А

ЧЛ-часовая

Ценные
гклетки	~ тшитр

(из селезенки)

(Т,Г)-А—Л/ПА9

2-107клеток костного мозга+Фактор

1	-

2	БЗ

3 (Т,Г)-А-Л

12-й дем
ЛОК/селезенка

10000

Б

Рис. 2. Приготовление антиген-специфического фактора Т-хелперов. А. Полу-
чение фактора из «обученных» Т-клеток. Б. Испытание фактора на облучен-
ных реципиентах.
сокий иммунный ответ, чем реципиенты, получившие только клет-
ки костного мозга. Если смесь клеток не обеспечивает более
высокого ответа, то можно предполагать, что примирования
Т-клеток не произошло.

После того как выяснены условия воспроизводимого прими-
рования, можно приступать к получению фактора. Суспензию се-
лезенки, содержащую обученные Т-клетки, готовят в минималь-
ной среде Игла с глутамином без отмывания. Если же Т-клетки
необходимо отмыть или разделить на найлоновой вате, то в среду
добавляют сыворотку плода коровы (10%). Взвесь клеток
(Т, G)-A-L доводят до концентрации 107/мл и добавляют анти-
ген. Оптимальную концентрацию антигена необходимо подобрать
экспериментальным путем; для (Т, G)-A--L она составляет
1 мкг/мл, для БЭ — 0,1 мл 0,1%-ной суспензии на 1 мл культу-
ры. Чашки Петри, содержащие 2—3 мл суспензии, инкубируют
8 ч в атмосфере из 5% СО2 и 95% воздуха при 37°С. Оптималь-
ную продолжительность культивирования также подбирают эм-
пирически. Жизнеспособность обученных Т-клеток рекомендуется
оценивать в начале и в конце культивирования с помощью три-
панового синего. За это время должно погибать не более 20—
30% клеток. Если жизнеспособность клеток удовлетворительная,
то клетки удаляют центрифугированием и надосадочную жид-
кость используют в качестве источника фактора Т-клеток.

Чтобы определить наличие фактора и степень его активности,
смесь надосадочной жидкости и клеток костного мозга вводят
облученной мыши-реципиенту (рис. 2, Б). Нет необходимости в
том, чтобы Т-клетки — продуценты растворимого фактора — обя-
зательно были сингенны костномозговым клеткам; установлено,
что хелперный фактор одинаково хорошо функционирует как в
сингенной, так и в аллогенной комбинации (Munro, Taussig,
1975; Taussig et al., 1974). Эффективность T — В-кооперации в
изучаемой системе сначала необходимо проверить in vivo при
переносе нормальных или «обученных» клеток тимуса вместе с
костномозговыми клетками, ибо оценка фактора основана на его
способности выполнять специфическую функцию вместо Т-клеток.
Содержащую фактор надосадочную жидкость смешивают с кост-
номозговыми клетками и антигеном и полученную взвесь вводят
в хвостовую вену мышам-реципиентам после облучения их ле-
тальной дозой. Количественное соотношение фактора и клеток
подбирают так, чтобы каждый реципиент получил */2 селезеноч-
ного эквивалента или же один эквивалент (один селезеночный
эквивалент соответствует количеству фактора, образованного
при культивировании клеток одной селезенки) и 2-Ю7 костно-
мозговых клеток. Оптимальное количество антигена следует оп-
ределять экспериментально. Так, для синтетических полипепти-
дов эта доза составляет 10 мкг на мышь, а для эритроцитов —
0,1 мл 10%-ной суспензии на мышь. Наряду с опытной группой
животных, получивших фактор, антиген и В-клетки, необходимо
ввести две контрольные группы, из которых одна получала бы
В-клетки и антиген, а другая (в качестве контроля на антиген-
ную специфичность) — фактор, В-клетки и контрольный антиген,
не дающий перекрестных реакций с испытуемым. Для сравнения
в опыт следует также включить группы животных, получающих
либо только Т-клетки, либо только В-клетки, либо один лишь
испытуемый антиген. Через 8—14 дней после переноса (в зави-
симости от природы антигена и линии мышей) у животных берут
кровь и извлекают селезенку. Целесообразно и титровать сыво-
роточные антитела, и определять число антителообразующих
клеток (АОК) в селезенке. Для этого используют общепринятые
методы, применяя в качестве индикаторных клеток эритроциты,
сенсибилизированные испытуемым антигеном. Синтетические
полипептиды обычно присоединяют к БЭ с помощью хлорида
хрома (III). Условия оптимального присоединения варьируют в
зависимости от природы эритроцитов и антигена, и их следует
определять заранее. Обычно смешивают в указанной последова-
тельности равные объемы осадка эритроцитов, антигена (в кон-
центрации от 1 до 10 мг/мл) и СгС1з (1—10 мг/мл). Все ингре-
диенты реакции готовят на физиологическом растворе без фос-
фатов. Смесь инкубируют 5 мин при комнатной температуре,
затем добавляют избыток физиологического раствора, забуферен-
ного фосфатами, и клетки тщательно отмывают. Если при этом
наблюдается выраженный гемолиз, содержание СгС1з следует
уменьшить. Эффективность сенсибилизации эритроцитов прове-
ряют непосредственно после присоединения антигена в реакции
агглютинации со стандартной антисывороткой. В большинстве
случаев к эритроцитам присоединяют антиген, использованный
для иммунизации. Однако в случае, если антигеном служит
(Т, G)-A-L, для определения АОК в качестве индикаторных кле-
ток обычно используют эритроциты, сенсибилизированные
(Т, G)-Pro-L, которые, как правило, дают более легко учиты-
ваемые зоны гемолиза.

Б. Акцептор

Если хелперный фактор стимулирует ответ В-клеток, это сви-
детельствует о наличии на В-клетке акцепторного сайта. Это лег-
че всего продемонстрировать абсорбцией. Хелперный фактор
Т-клеток смешивают с тест-клетками и оставляют на холоду
(4°С) не менее чем на 30 мин. За это время в отсутствие анти-
гена 107 нормальных костномозговых клеток (В-клеток) «отве-
чающего» животного абсорбируют один селезеночный эквива-
лент фактора. Эффективность абсорбции определяют по актив-
ности фактора в надосадочной жидкости до и после истощения.
Удаление фактора, если оно происходит, бывает, как правило,
полным. Пользуясь этим тестом, можно отдифференцировать:
1) различные типы клеток по наличию или отсутствию акцептора
и 2) акцептор-положительные и акцептор-отрицательные линии
мышей (с высокой и низкой способностью к абсорбции). Для
абсорбции хелперного фактора можно с успехом использовать
как аллогенные, так и ксеногенные В-клетки (Taussig, Finch,
1977). Например, при иммунизации с использованием (Т, G)-
A--L фактор, образованный высокореактивной линией, можно
исследовать с В-клетками различных низкореактивных линий,
чтобы выяснить, какая из линий имеет дефект акцепторного сай-
та. Более того, мышиный фактор можно испытать с клетками
других видов, например при исследовании генов иммунного отве-
та в системе мышь —человек (Taussig, Finch, 1977; Luzzati et
aL, 1976).

Природу акцепторного сайта можно исследовать с помощью
антисывороток, обрабатывая ими В-клетки до абсорбции факто-
ра, а затем учитывая экранирование акцепторов. В таких экспе-
риментах необходимо исключать прямое взаимодействие анти-
сывороток с хелперным фактором.

V.	УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Как правило, опытные и контрольные группы составляют из
5—10 животных. Подсчитывают средние геометрические числа
АОК на группу. Определяют стандартные ошибки или отклонения
и применяют обычные статистические критерии достоверности.

VI.	КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА

Описанный здесь метод получения и испытания антиген-спе-
цифического хелперного фактора успешно используется в течение
нескольких лет как в лаборатории автора (Taussig, 1974; Munro,
Taussig, 1975), так и другими исследователями (Mozes, 1976;
Isac, Mozes, 1977; Mozes et al., 1976). Тем не менее при исполь-
зовании этого метода довольно часты неудачи, причины которых,
а также возможные способы усовершенствования метода важно
рассмотреть. Можно выделить три основные стадии, на которых
возникают трудности, а именно: 1) получение «обученных» Т-кле-
ток in vivo, 2) культивирование «обученных» Т-клеток, при ко-
тором стимулируется освобождение фактора, и 3) испытание ак-
тивности фактора на облученных реципиентах. Рассмотрим эти
этапы последовательно.
А.	Получение «обученных» Т-клеток in vivo

Для примирования тимоцитов у облученных реципиентов час-
то с успехом применяют эритроциты и белковые антигены. Одна-
ко при использовании низкоиммуногенных антигенов, таких, как
(Т, G)-A-L и другие синтетические полипептиды, труднее до-
биться высокого уровня обученных Т-клеток. Необходимо поэто-
му проверять эффективность примирования в каждом случае —
либо путем переноса смеси обученных Т-клеток и нормальных
костномозговых клеток облученным реципиентам, либо путем
культивирования обученных клеток in vitro с источником В-кле-
ток. Некоторые авторы сообщали об успешном использовании
данного метода для примирования Т-клеток in vivo с последую-
щим получением хелперных факторов при ответе на человеческий
и кроличий у-глобулин, а также бычий сывороточный альбумин
(Shiozawa et al., 1977). В то же время другие исследователи
примировали Т-клетки in vitro, используя синтетические полипеп-
тиды [(Т, G)-A--L, полимер L-Glu60-L-Ala30-L-Tyr10(GAT)] и бел-
ки (Howie et al., 1977; Howie, Feldmann, 1977). Для примирова-
ния in vitro удобнее всего использовать метод культивирования
по Динеру — Марбруку. По этому методу неразделенные клетки
селезенки и лимфатических узлов или Т-клетки, выделенные
фракционированием на найлоновой вате, культивируют с анти-
геном (во внутренней камере) в течение четырех дней. Результа-
ты, полученные с синтетическими полипептидами (Howie et al.,
1977; Howie, Feldmann, 1977) и с белковыми антигенами
(McDougal, Gordon, 1977а, b), свидетельствуют о том, что этот
метод может служить надежным способом специфического при-
мирования Т-клеток для последующего освобождения Т-фак-
торов.

Б. Культивирование «обученных» Т-клеток, при котором,
стимулируется высвобождение фактора

Другой потенциальный источник методических трудностей —
это культивирование примированных Т-клеток in vitro для вы-
свобождения хелперного фактора. Конкретные условия опыта
(концентрация клеток и антигена, состав среды, время инкуба-
ции, посуда для культивирования и т. д.) необходимо подобрать
эмпирически. Предполагают, что успешное образование хелпер-
ного фактора в культурах в среде без сыворотки происходит в
результате гибели клеток и освобождения внутриклеточных про-
дуктов. Несмотря на то что выраженную гибель клеток нельзя
считать обязательным условием для появления хелперного фак-
тора в надосадочной жидкости, некоторые исследователи с успе-
хом получают его путем лизиса и гомогенизации (Shiozawa et al.,
1977) или воздействием ультразвука (Tada et al., 1976). Не ис-
ключена возможность, что при культивировании in vitro (особен-
но без сыворотки) происходит протеолиз высвобождаемого фак-
тора, тогда как при быстром высвобождении фактора путем ли-
зиса протеолиз отсутствует. Ферментативный гидролиз фактора
может быть причиной его отсутствия в культуральной среде и его
быстрого исчезновения при хранении надосадочной жидкости.
Ряд авторов модифицировал условия культивирования, при ко-
торых образуется фактор. Так, для накопления хелперного фак-
тора, специфического в отношении антигенов гистосовместимости,
активированные в СКЛ тимоциты культивировали 4 ч в среде без
сыворотки (Kindred, Corley, 1977). Хоуи и Фельдман (Howie,
Feldmann, 1977) культивировали хелперные Т-клетки (1,5-
•107 мл) с (Т, G)-A--L (1 мкг/мл) в среде, содержащей 10% сы-
воротки плода коровы (во флаконах Динера — Марбрука); мак-
симальная активность фактора в надосадочной жидкости была
отмечена через 24 ч после начала культивирования. При тех же
условиях примирования Т-клеток другие исследователи (McDou-
gal, Gordon, 1977) обнаружили активность фактора в надосадоч-
ной жидкости на 4-й день. Таким образом, существует много ва-
риантов метода, с помощью которого удается «заставить» Т-клет-
ки выделять активные молекулы в культуральную среду.

В.	Испытание активности фактора на облученных реципиентах

Завершающий этап метода — это оценка активности фактора.
По нашим данным и результатам других исследователей (Taus-
sig, 1974; Mozes, 1976; Feldmann et aL, 1977), перенос облучен-
ным реципиентам фактора вместе с источником В-клеток —
вполне удовлетворительный метод оценки хелперной активности,
если удается преодолеть трудности, возникающие при работе с
облученными мышами. Большой помехой служат высокая забо-
леваемость и смертность таких животных даже после восстанов-
ления кроветворной системы в результате введения клеток кост-
ного мозга. Единственное решение проблемы — снизить дозу об-
лучения до минимального уровня, еще достаточного для
устранения иммунореактивности хозяина. При этом у самих об-
лученных реципиентов выживает значительное число Т-клеток.
Поскольку после облучения мыши весьма восприимчивы к ин-
фекции, чрезвычайно важно содержать их в чистоте. Вместо об-
лученных реципиентов с успехом были использованы «голые»
(nude) мыши (Kindred, Corley, 1977). Помимо метода оценки
in vivo для испытания хелперного фактора применяются разно-
образные методы с образованием антител в культуре (Shiozawa
et al., 1977; Howie, Feldmann, 1977; McDougal, Gordon, 1977a, b).

Факторы Т-клеток, особенно способные к специфическому
распознаванию антигена, могут служить удобным инструментом
для изучения как самой системы Т-клеточного распознавания,
так и межклеточных взаимодействий. Полученные при этом но-
вые данные можно найти в указанной литературе. К числу ин-
тересных исследований, которые можно осуществить, относится
анализ функции генов иммунного ответа на клеточном уровне.
В табл. 1 представлены результаты исследования фактора и ак-
цептора у низкореактивных в отношении (Т, G)-A-L линий мы-
шей. Применение такого анализа не ограничивается только опы-
тами на мышах, так как, реализуя способность факторов реаги-
ровать в ксеногенной системе, можно изучать гены 1г у
различных видов, в том числе у человека (Taussig, Finch, 1977).

Таблица 1

Клеточные дефекты образования антител к (Т, G)-A- -L

H-2	Линия	Ответ	Хелперный фак- тор Т-клеток	Акцепторный сайт В-клеток
b	BIO	Высокий	Имеется	Имеется
d	B10.D2  BALB/c	»		»
k	B10.Br  C3H	Низкий	»	Отсутствует
i	I/St	»		»
f	B10.M	»	Отсутствует	Имеется
s	SJL	»		Отсутствует
s	A.SW	»	»	Имеется

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Feldmann М., Balt г М., Erb Р., Howie S., Kontiainen S., Woody J., Zvaif-
ler N. (1977). In: The Immune System: Genes and the Cells in Which They

Function (E. Sercarz, L. Herzenberg and C. F. Fox, eds.), ICN—UCLA Sym-
posia on Molecular and Cellular Biology, Vol. VIII, Academic Press, New
Y ork.

Howie S., Feldmann M. (1977). Eur. J. ImmunoL, 7, 417.

Howie S., Feldmann M., Mazes E., Maurer P. H. (1977). Immunology, 32,
291.

Isac R., Mazes E. (1977). J. ImmunoL, 118, 584.

Katz D. H., Benacerraf B., eds. (1976). The Role of Products of the Histocompa-
tibility Gene Complex in Immune Responses, Academic Press, New York.

Kindred B., Corley R. B. (1977). Nature (London), 268, 531.

Luzzati A. L., Taussig M. J., Meo T., Pernis P. (1976). J. Exp. Med., 144, 573

McDougal J. S., Gordon D. S. (1977a). J. Exp. Med., 153, 676.

McDougal J. S., Gordon D. S. (1977b). J. Exp. Med., 145, 693.

Mazes E. (1976). In: The Role of Products of the Histocompatibility Gene
Complex in Immune Responses (D. H. Katz and B. Benacerraf, eds.), p. 485,
Academic Press, New York.
Mozes Е., Isac R., Givol D., Zakut R., Beitsch D. (1976). In: Immune Reactivity
of Lymphocytes (M. Feldmann and A. Globerson, eds.), p. 397, Plenum,
New York.

Munro A. J., Taussig M. S. (1975). Nature (London), 256, 103.

Shiozawa C., Singh B., Rubinstein S., Diener E. (1977). J. Immunol., 118,2199.

Tada T. M., Taniguchi M., David C. S. (1976). Cold Spring Harbor Symp.

Quant. Biol., 41, 119.

Taniguchi M., Tada T., Tokuhisa T. (1976). J. Exp. Med., 144, 20.

Taussig M. J. (1974). Nature (London), 248, 234.

Taussig M, J., Finch A. P. (1977). Nature (London), 270, 151.

Taussig M'. J., Finch A. P., Kelus A. S. (1976). Nature (London), 264, 776,
Taussig M. J., Mozes E., Isac R. (1974). J. Exp. Med., 140, 301,
Глава 24

ИММУНИЗАЦИЯ IN VITRO КЛЕТОК
МЫШИНОЙ СЕЛЕЗЕНКИ В СУСПЕНЗИИ

X. Шрейер

I.	НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА

Культура непримированных лимфоидных клеток, a priori спо-
собных отвечать на антиген, представляется наиболее подходя-
щим инструментом для детального изучения индукции и регуля-
ции гуморального иммунного ответа. Теоретически в такой систе-
ме in vitro необходимо использовать культуральную среду точно
известного состава и полностью контролировать популяцию куль-
тивируемых клеток. Однако на практике в настоящее время не
существует систем, которые удовлетворяли бы этим требованиям.

С конца 60-х годов для изучения гуморального иммунного от-
вета in vitro используются две системы культивирования клеток.
Метод, получивший наиболее широкое распространение, был пред-
ложен в 1966 году Мишеллом и Даттоном. При соблюдении всех
условий, подробно указанных авторами (Mishell, Dutton, 1967),
в культуре клеток селезенки (в малых чашках Петри) под влия-
нием антигена появляются антителообразующие клетки; их ко-
личество и время появления примерно такие же, как при ответе
in vivo. Другую систему культивирования разработал Марбрук
(Marbrook, 1967): суспензию клеток селезенки с антигеном по-
мещают на диализную мембрану, прикрепленную на конце стек-
лянной трубки, и погружают в большой сосуд с культуральной
средой.

В данной главе мы подробно опишем две незначительные мо-
дификации метода Мишелла и Даттоиа (1967), условно назвав
их «системой А» и «системой Б» (Schreier, Nordin, 1977). По ве-
личине и кинетике ответа эти системы дают сходные результаты.
Система А отличается от исходного метода только слегка изме-
ненным составом среды и графиком ее смены. Система Б более
удобна, так как не требует смены среды и позволяет работать с
теми сериями сыворотки плода коровы, которые непригодны для
других методов. По сравнению с точно воспроизведенным исход-
ным методом обе системы дают всегда большее число антитело-
образующих клеток (АОК).
II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Суспензию клеток селезенки (либо подходящую комбинацию
«очищенных» клеток) культивируют в пластиковых чашках Пет-
ри при высокой концентрации — от 5 до 20-Ю6 клеток/мл —
в присутствии антигена (чаще всего БЭ). В культуральную среду
добавляют сыворотку плода коровы специально отобранных се-
рий. Культуры инкубируют в течение 4—6 дней в атмосфере с
низким парциальным давлением кислорода и при осторожном
перемешиваний.

III.	ЖИВОТНЫЕ, РЕАГЕНТЫ, ПРИБОРЫ

А. Мыши

Для индукции ответа на БЭ чаще всего используют молодых
половозрелых мышей C57BL/6J, Fi (C57BL/6JXA/J) или Fi
(C57BL/6JXDBA/2). Решающее значение для исхода иммуни-
зации in vitro имеет микробиологический статус мышей. Мы ис-
пользуем животных, относящихся к категории SPF (specific
pathogen free — свободные от специфических патогенных возбу-
дителей), которых содержали в безмикробных изоляторах по
5 мышей в клетке.

Б. Солевые растворы и среды

Сбалансированный солевой раствор Эрла (СРЭ) без бикар-
боната натрия готовят в виде 10-кратного концентрата: к 68,0 г
NaCl, 4 г КС1, 1,4 г NaH2PO4- Н2О, 2 г MgSO4-7H2O, 10 г D( + )-
глюкозы и 0,1 г фенолового красного доливают до 1 л дистилли-
рованную воду. Раствор стерилизуют фильтрованием через мем-
брану (с порами 200 нм). 100-кратный концентрат раствора
СаС12, содержащий 2 г безводного СаС12 на 100 мл, автоклавиру-
ют. СРЭ готовят перед использованием, смешивая 890 мл трижды
дистиллированной воды со 100 мл 10-кратного концентрата СРЭ
и 10 мл 100-кратного концентрата СаС12. Доводят pH до 7,2 до-
бавлением 0,5 М NaOH (около 1,5 мл/л).

Минимальная основная среда Игла (МСИ) с набором солей
по Эрлу, которую используют для системы А, представляет собой
модификацию исходной среды (Eagle, 1959). Концентрация хло-
рида натрия уменьшена до 100 мМ, а концентрация двухвалент-
ных катионов — до 0,5 мМ. Среду готовят из двух концентратов.
Другие добавочные ингредиенты можно купить у фирмы Gibco
или Flow.
Концентрат 1 (10-кратный) содержит в 1 л: 58,44 г NaCl,
3,73 г КС1, 1,38 г Г^аНгРОд-НгО, 21,2 г NaHCCh и 9 г глюкозы.
Концентрат 2 (100-кратный) содержит в 100 мл: 1,016 г
MgCl2 • 6Н2О и 0,735 г СаСЬ • 2НгО. МСИ готовят из следующих
ингредиентов:

100 мл концентрата 1

10 мл концентрата 2

10 мл 100-кратного концентрата витаминов

20 мл 50-кратного концентрата незаменимых аминокислот
10 мл 100-кратного концентрата заменимых аминокислот
10 мл раствора пирувата натрия, 100 мМ

10 мл 1,0М ГЭПЭС-буфера, pH 7,3

1 мл раствора фенолового красного, 0,5%

Трижды дистиллированная вода (конечный объем дово-
дится до 1 л)

Среда RPMI 1640 продается в готовом виде или ее готовят
из быстрорастворимого порошка.

Питательную смесь, слегка отличающуюся от смеси Мишелла
и Даттона, готовят из следующих основных растворов:

7 мл концентрата 1

0,7 мл концентрата 2

5,0 мл раствора L-глутамина (200 мМ)

2,5 мл 100-кратного концентрата заменимых аминокислот
5,0 мл 50-кратного концентрата незаменимых аминокислот
2,0 мл D-глюкозы (500 мг/мл)

12,5 мл раствора NaHCOs (7,5%)

Трижды дистиллированная вода (конечный объем дово-
дится до 1 л)

В. Сыворотка плода коровы (СПК)

Сыворотку плода коровы, предварительно испытанную на спо-
собность поддерживать иммунный ответ in vitro (серия «сыво-
ротки, специально испытанной согласно договоренности»), мож-
но купить у разных фирм по несколько более высокой цене, чем
обычные серии. Такие сыворотки, как правило, обладают способ-
ностью поддерживать иммунный ответ в системе А. Среди обыч-
ных серий СПК, выпускаемых несколькими фирмами, такие се-
рии составляют около 15% (Shiigi, Mishell, 1975). После добав-
ления 2-меркаптоэтанола процент пригодных сывороток значи-
тельно повышается. Серии сывороток, способных поддерживать
иммунный ответ в системе Б, встречается чаще (до 75% обычных
серий). Серии с высокой поддерживающей активностью как в
той, так и в другой системе редки.
Г. Бараньи эритроциты

Антигенность бараньих эритроцитов от разных особей варьиру-
ет довольно широко, поэтому необходимо специально подбирать
подходящего донора (Mishell, Dutton, 1967). У одного и того же ба-
рана можно брать кровь несколько лет (50 мл в неделю). Для им-
мунизации и выявления антителообразующих клеток использу-
ют эритроциты от одного донора. В кровь, собранную в раствор
Олсвера, добавляют азид натрия в конечной концентрации
0,08% и разливают по порциям, соответствующим 5 мл осадка
эритроцитов. В таком виде эритроциты можно хранить до 3 ме-
сяцев. Перед опытом их трижды отмывают стерильным СРЭ.

Д. Камеры для инкубации и качалки

Культуры помещают в герметичные камеры для инкубации,
в которые затем вводят газовую смесь, состоящую из 7% О2,
10% СО2 и 83% N2 (Mishell, Dutton, 1967). Мы используем ка-
меры из люцита, которые вмещают от 75 до 150 культур. Эти ка-
меры можно приобрести у фирмы Biotec (СН-4124 Шёненбух,
Швейцария). Для перемешивания культур камеры помещают на
платформу-качалку (Bellco Class Inc., Вайнеленд, Нью Джерси,
США), как это описано у Мишелла и Даттона (1967).

IV. МЕТОДИКА

Л. Приготовление суспензии клеток селезенки

Мышей забивают путем цервикальной дислокации, селезенку
извлекают асептически и переносят в пластиковые чашки Петри
с 10 мл СРЭ. Клетки выдавливают из капсулы при помощи шпа-
теля. Конгломераты клеток диспергируют, многократно набирая
и выпуская суспензию 10-миллилитровой пластиковой пипеткой.
Суспензию переносят в пробирку из поликарбоната, где остав-
шимся комочкам дают осесть на дно в течение 2—3 мин. Клеточ-
ную суспензию декантируют, переносят в другую пробирку и
центрифугируют (170g, 15 мин, 4°С). Клетки ресуспендируют в
СРЭ и после повторного центрифугирования ресуспендируют в
полной культуральной среде (около 0,5 мл на селезенку, чтобы
получить конечную концентрацию 2-108 клеток/мл). Подсчиты-
вают число живых клеток (20 мкл+1 мл раствора трипанового
синего). Жизнеспособность обычно превышает 95%.
Б. Посев и культивирование клеток

Полную среду для культивирования готовят, прибавляя к со-
ответствующим культуральным средам L-глутамин, смесь пени-
циллина со стрептомицином, 2-меркаптоэтанол и нативную сы-
воротку плода коровы специальной серии.

Система А

Модифицированная МСИ, 93,0 мл

L-глутамин (200мМ), 1,0 мл

Смесь пенициллина со стрептомицином, 0,5 мл
2-меркаптоэтанол (0,01 М), 0,5 л
Сыворотка плода коровы, 5,0 мл

Система Б

RPMI 1640, 78,0 мл

L-глутамин (200 мМ), 1,0 мл

Смесь пенициллина со стрептомицином, 0,5 мл
2-меркаптоэтанол (0,01 М), 0,5 мл
Сыворотка плода коровы, 20,0 мл

По 1 мл полной среды для культивирования вносят пипеткой
в чашки Петри диаметром 3,5 см (например, Falcon 3001 или
1008). Любой из бесклеточных ингредиентов (таких, как лекар-
ственные препараты, медиаторы, сывороточные фракции) в объ-
еме до 100 мкл переносят пипеткой на дно чашки заранее. Отмы-
тые эритроциты (50 мкл 1%-ной суспензии в среде или в СРЭ)
добавляют в культуры, которые затем для насыщения газовой
смесью помещают в люцитовые камеры и тем самым избегают
защелачивания среды. Наконец, пипеткой Эппендорф прибавля-
ют 50 мкл взвеси клеток селезенки.

Люцитовые камеры вновь заполняют в течение 3—5 мин газо-
вой смесью и помещают на платформе-качалке (примерно 6—8
качаний в 1 с) в термостат при 37°С (Mishell, Dutton, 1967).

При использовании системы А 100 мкл питательной смеси
вносят после 24 и 48 ч культивирования, тогда как в системе Б
культуры не нуждаются в дальнейшем «подкармливании»
вплоть до сбора клеток.

В. Сбор клеток

Спустя 4, 5 и 6 дней клетки в парных культурах собирают
осторожным соскабливанием, пользуясь резиновым скребком.
Содержимое каждой чашки переносят в 15-миллилитровую стек-
лянную градуированную пробирку, содержащую 10 мл СРЭ.
Клетки осаждают центрифугированием (170g, 15 мин) и ресу-
спендируют в таком объеме СРЭ, чтобы в 50—100 мкл получен-
ной суспензии содержалось удобное для подсчета число АОК.
Выход живых клеток составляет 20—40% от количества их в ис-
ходной суспензии.

V. КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МЕТОДА

При введении мышам иммуногенной дозы БЭ число и дина-
мика появления АОК вполне предсказуемы. Судя по литератур-
ным данным и результатам отдельных исследований, накоплен-
ным за весьма продолжительный период времени, величина отве-
та при иммунизации in vitro может варьировать по меньшей мере
на 3 порядка. Но еще в большей степени обращают на себя вни-
мание качественные различия ответа in vitro. Эти различия яв-
ляются причиной многочисленных споров о том, какие клетки
должны обязательно участвовать в ответе и какими линиями кле-
ток, продуктами клеточного происхождения или химическими со-
единениями можно восполнить функцию этих обязательных уча-
стников, когда оии отсутствуют.

Если учесть сложность системы, таким спорам не приходится
удивляться. При культивировании достаточно густой клеточной
суспензии in vitro могут взаимодействовать по меньшей мере
4 типа клеток, а именно прилипающие клетки (макрофаги),
Т-клетки-хелперы, Т-клетки-супрессоры и В-клетки. Субпопуля-
ции каждого из этих типов клеток могут по-разному участвовать в
индукции ответа. Взаимодействуя непосредственно или выделяя
растворимые факторы, эти клетки в зависимости от обстоятельств
положительным или отрицательным образом влияют друг на дру-
га. Конечный же результат, как правило, выражается одним па-
раметром: относительным числом антителообразующих клеток,
появляющихся за определенное время культивирования. Процес-
сы индукции, пролиферации и созревания клеток в отдельности
проследить не удается.

При ответе на данный антиген межклеточные взаимодейст-
вия — как прямые, так и гуморальные — подвержены многочис-
ленным влияниям. Некоторые из факторов, оказывающих такое
влияние, проанализировали Шрейер и Нордин (Schreier, Nordin,
1977), но гораздо большее число факторов еще предстоит изу-
чить и проконтролировать.

Попытки устранить неконтролируемые факторы связаны глав-
ным образом с более точной спецификацией состава культураль-
ной среды и общих условий культивирования или же с уточнени-
ем состава клеточной популяции, выращиваемой в данной среде.
До сих пор ни один из этих подходов не привел к удовлетвори-
тельному решению.

Наименее контролируемой составной частью среды считается
сыворотка плода коровы, абсолютно необходимая для эффектив-
ной индукции антителообразующих клеток in vitro. В исходной
системе Мишелла и Даттона только 15% имеющихся в продаже
препаратов такой сыворотки обладали выраженной «поддержи-
вающей» способностью (Shiigi, Mishell, 1975). Как упомянуто в
разд. III, В, в модифицированной системе Б процент пригодных
серий сыворотки много выше (до 75%). Суть различий между
«поддерживающими» и «неподдерживающими» сериями сыворот-
ки были предметом многочисленных исследований. Представле-
ны данные как в пользу, так отчасти и против обязательного
присутствия митогена для В-клеток, митогена для Т-клеток и
фактора, замещающего макрофаги.

Для строгого исследования роли и механизмов действия сы-
вороточных компонентов необходим постоянный источник стан-
дартных лимфоидных клеток. Однако на практике источник кле-
ток от опыта в опыту неизбежно меняется, что, по-видимому, и
служит основной причиной вариабельности результатов (Schrei-
ег, Nordin, 1977). Это касается использования не только различ-
ных линий мышей, но и одной и той же линии в течение длитель-
ного периода времени. Любые изменения микробиологического
или иммунологического статуса мышей будут давать гораздо
более выраженные колебания in vitro, чем in vivo.

Главное затруднение при попытке стандартизовать клеточную
популяцию состоит в необходимости создавать высокую концент-
рацию взвеси (около 107 клеток/мл) для успешной иммунизации
in vitro. Примесь клеток иного типа даже в высокоочищенных
взвесях (98%-ной чистоты) или истощение клеточной популяции
легко могут стать препятствием для анализа. Для некоторых
опытов в качестве «опорных» клеток можно с успехом использо-
вать облученные клетки селезенки (Osoba, 1969). Однако выде-
ление растворимых факторов из этих облученных клеток пока не
поддается контролю. Нам ни разу не удалось достичь успеха и
тогда, когда «опорными» клетками служили тимоциты.

Первый тип клеток, из-за которых нельзя работать с менее
концентрированными взвесями, — это, по-видимому, прилипаю-
щие клетки, но их действие можно компенсировать, добавив в пи-
тательную среду меркаптоэтанол (Click et al., 1972), который
полностью или частично замещает или усиливает функцию мак-
рофагов (Chen, Hirsh, 1972). Специфические предшественники
В-лимфоцитов, вероятно, всегда присутствуют в избытке в гус-
тых взвесях. Учитывая это, а также другие факты (Schreier,
Nordin, 1977), мы пришли к выводу, что высокая концентрация
суспензии, столь обязательная для успешной иммунизации
in vitro, обеспечивает образование достаточного числа Т-хелпе-
ров или достаточную концентрацию продуктов их жизнедеятель-
ности. С этой точки зрения понятно, почему экспериментальная
система в условиях, не поддерживающих индукцию иммунного
ответа in vitro, начинает функционировать при добавлении экзо-
генных активированных (in vivo) Т-клеток.

Индукция клеток-супрессоров при иммунизации in vitro дол-
гое время оставалась незамеченной. Клетки селезенки мышей,
иммунизированных за 4 дня до вскрытия, можно легко рестиму-
лировать in vitro гомологичным антигеном даже в таких усло-
виях культивирования, которые не поддерживают индукции пер-
вичного ответа (Mishell, Dutton, 1967). Однако клетки селезенки,
которые в течение 4 дней подвергались иммунизации in vitro,
нельзя рестимулировать тем же антигеном. Такие преиммунизи-
рованные клетки способны даже предотвратить индукцию АОК,
если их добавить к первичным культурам. Чтобы вызвать по-
добный супрессивный эффект, требуется мало клеток (104—105).
Роль клетки-супрессора играет нелипкий 0+-бласт, который воз-
никает в отсутствие антигена (Schreier, Lefkovits, 1978). Кроме
этого, были описаны антиген-специфические клетки-супрессоры
(Eeardley, Gershon, 1976). Присутствие или индукция клеток-су-
прессоров может в значительной мере обусловить широкую ва-
риабельность результатов in vitro.

Интерпретируя результаты иммунизации in vitro, эксперимен-
татор почти всегда игнорирует абсолютные значения количест-
венных показателей. Одно и то же число АОК у одного автора
рассматривается как нулевой или исключительно низкий фон, а
другим представляется как «оптимальный ответ». Здесь возника-
ет вопрос: появления какого числа АОК можно ожидать при
иммунизации 107 клеток селезенки in vitro? По аналогии с ре-
зультатами, полученными in vivo, мы должны ожидать около
104 АОК на культуру. Однако если учесть, что in vitro невозмо-
жен эффект привлечения АОК из пула рециркулирующих лим-
фоцитов и нет регулирующих механизмов, эта величина может
оказаться либо слишком высокой, либо слишком низкой. Работая
на мышах C57BL/6J в описанных выше условиях культивирова-
ния, мы постоянно получали на пике ответ от 30 000 до 40 000
АОК на культуру. В течение нескольких лет этот показатель пе-
риодически снижался или повышался в 2—3 раза без видимой
причины.

Более надежным параметром для количественных оценок мог-
ла бы служить частота антигеи-специфических предшественни-
ков. Если принять в расчет самые высокие показатели, которые
получаются в культурах с малой плотностью клеточной взвеси при
стимуляции митогенами (Andersson et al., 1977), можно ожидать
присутствия среди 107 клеток селезенки лишь около 1500 пред-
шественников В-клеток, специфичных для БЭ. Численность одно-
го клона, как это можно легко предсказать, составляет примерно
102-клеток; поэтому вполне очевидно, что в малоэффективных
in vitro системах из имеющихся предшественников в ответ во-
влекается лишь небольшая часть. А по поведению малой части
предшественников В-клеток нельзя обоснованно судить о меха-
низмах индукции и регуляции гуморального иммунного ответа.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Andersson J., Coutinho A., Melchers F. (1977). J. Exp. Med., 145, 1520.

Chen C., Hirsch J. G. (1972). Science, 176, 60.

Click R. E., Benck L., Alter B. J. (1972). Cell. Immunol., 3, 264.

Eagle H. (1959). Science, 130, 432.

Eardley D. D., Gershon R. K. (1976). J. Immunol., 117, 313.

Marbrook J. (1967). Lancet, 2, 1279.

Mishell R. I., Dutton R. W. (1966). Science, 153, 1004.

Mishell R. I., Dutton R. W. (1967). J. Exp. Med., 126, 423.

Osoba D. (1969). J. Exp. Med., 129, 141.

Schreier M. H., Lefkovits I. (1979). Immunology 36 , 743.

Schreier M. H., Nordin A. A. (1977). In: В and T cells in Immune Recognition
(F. Loor and G. E. Roelants, eds.), pp. 127—152, Wiley, New York.

Shiigi S. M., Mishell R. I. (1975). J. Immunol., 115, 741.
ИНДУКЦИЯ ВТОРИЧНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
АНТИТЕЛ IN VITRO В КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВ
ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КРОЛИКА

А. Луццати

I.	НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА

Использование лимфоцитов крови для изучения антителооб-
разования in vitro позволяет экспериментатору проводить пов-
торные исследования с клетками данного животного на разных
стадиях иммунного ответа. Это приобретает особое значение,
когда в опытах используют аутбредных животных, таких, как
кролики или обезьяны. Кроме того, этот метод открывает заман-
чивые возможности для исследования иммунного ответа у чело-
века.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Лейкоциты периферической крови (ЛПК) иммунизированно-
го кролика после удаления эритроцитов и популяции прилипаю-
щих клеток-супрессоров (Luzzati, Lafleur, 1976) культивируют в
присутствии специфического антигена (Luzzati et al., 1973а).

Можно воспользоваться двумя типами культур: 1) обычными
культурами в объеме 1 мл и 2) микрокультурами (см. гл. 27).
Иммунный ответ определяют через различные интервалы време-
ни. В культурах первого типа подсчитывают число АОК> дающих
прямые (IgM) и непрямые (IgG) зоны гемолиза. Ответ культур
второго типа оценивают методами гемолитического пятна или ло-
кального гемолиза.

Надосадочная жидкость положительных микрокультур часто
содержит достаточное количество антител для иммунохимиче-
ского анализа.

III.	РЕАГЕНТЫ

А.	Антиген: бараньи эритроциты (БЭ)

Кровь барана (или овцы) собирают в раствор Олсвера (1 объ-
ем крови на 1 объем раствора Олсвера) и, перед тем как исполь-
зовать, выдерживают не менее 1 недели.

Эритроциты осаждают центрифугированием при 2500 об/мин
в течение 10 мин и дважды отмывают, каждый раз удаляя лейко-
цитарную пленку. Если эритроциты используются для иммуниза-
ции in vivo или в качестве индикаторных клеток, то их, как пра-
вило, отмывают 0,15М раствором NaCl; когда эритроциты ис-
пользуются в качестве антигена in vitro, их отмывают стериль-
ным сбалансированным раствором Хэнкса (СРХ).

f

Б. Желатина из кожи свиньи

Готовят 3%-ный раствор желатины из свиной кожи (Eastman
Kodak Со., Рочестер, штат Нью-Йорк, США, No. 5242) на физио-
логическом растворе (0,15 М NaCl) непосредственно перед опы-
том. Желатину растворяют при 40—50°С, кипятить не следует.
Раствор пропускают через фильтр с порами величиной 0,45 мкм
(Nalge, Sybron Corp., Рочестер, штат Нью-Йорк, США).

В.	Найлоновая вата

В нашей лаборатории используют синтетические волокна,
продающиеся для набивки подушек (Соор, Базель, Швейцария,
609002). Вату замачивают на ночь в детергенте 7Х, промывают
24 ч под струей водопроводной воды, а затем в нескольких сме-
нах дистиллированной воды. Вымытую вату сушат, ворсят и упа-
ковывают в определенных весовых количествах в пластиковые
шприцы (см. ниже), после чего автоклавируют.

Таблица 1

Объем шприца, мл	Количество найлона, г	Объем крови, мл1
10	0,6	4
20	1,2	8
50	3,0	20

1 Объем крови, который может заполнить колонку, содер-
жащую данное количество найлона.

Г. Среда для культивирования

Для культивирования используют среду RPMI 1640 (No. 12-
702 Microbiological Associates, Бетезда, Мэриленд, США),содер-
жащую 10% сыворотки плода коровы и по 50 ед/мл стрептоми-
цина и пенициллина (No 17603F, Microbiological Associates). Не-
обходимо подобрать подходящий образец сыворотки. Некоторые
образцы хорошо поддерживают только IgM-ответ, тогда как
другие способны поддержать также и IgG-ответ. Лишь немногие
серии сыворотки не поддерживают эффективно ни один из видов
ответа. Мы с успехом использовали некоторые серии Rehatuin
(Reheis Chemical Со., Чикаго, США) и отобранные по договорен-
ности сыворотки фирмы Gibco (Grand Island Biological Co.,
Гранд Айленд, штат Нью-Йорк, США).

Д. Сбалансированный солевой раствор Хэнкса (СРХ)

Этот раствор получали от фирмы Microbiological Associates
Бетезда, США (No 10-508).

Е. Минимальная основная среда Игла (МСИ)

Среду получали от Grand Island Biological Со., Гранд Ай-
ленд, Нью-Йорк.

Ж. Агар для подсчета клеток, образующих зоны гемолиза
(0,7%-ный бактоагар)

Готовят 1,4%-ный раствор агара (Bacto agar Difco, Детройт,
США) на дистиллированной воде в день опыта; его разводят
1 : 1 двукратным концентратом МСИ (предварительно подогре-
тым до 45°С) и помещают в водяную баню на 45°С.

3. Агар для определения аллотипов (2%-ный агар Noble)

Готовят 4%-ный раствор агара (Noble agar, Difco, Детройт,
США) на дистиллированной воде; его разводят 1 : 1 0,05 М веро-
наловым буфером с pH 8,6, содержащим 0,5 г азида натрия на
1 л. Полученный 2%-ный раствор агара разливают по колбам;
его можно хранить в холодильнике до 2 месяцев. Перед исполь-
зованием агар расплавляют в кипящей воде.

И. Комплемент

Лиофилизированный комплемент морской свинки (Behring-
werke A. G., Марбург — Лан, ФРГ) растворяют и дважды исто-
щают бараньими эритроцитами на холоду (0,3 мл осадка эритро-
цитов на 10 мл комплемента). Истощенный комплемент хранят
при —70°С.
IV.	МЕТОДИКА

А.	Подготовка и посев клеток

1.	Кровь у кроликов берут из центральной ушной артерии в
гепаринизированные флаконы.

2.	Шприцы, наполненные найлоновой ватой, закрепляют в
вертикальном положении в специальном штативе. Поршень вы-
нимают и вату уплотняют с помощью пипетки, после чего наносят
определенный объем крови. Оптимальные соотношения между
количеством ваты и объемом крови для шприцев различного
объема были указаны в табл. 1.

С помощью поршня кровь набирают в вату, пока она не за-
полнит весь ватный столбик, но не позволяют ей подняться выше
него. Затем носик шприца закрывают. Легким постукиванием по
шприцу добиваются равномерного распределения крови. Запол-
ненные шприцы помещают на 30 мин во влажную атмосферу
СОа-термостата при 37°С. После этого кровь выжимают из
шприца. Вату дважды промывают теплым (37°С) раствором
Хэнкса, каждый раз беря его в объеме, равном половине исход-
ного объема крови. Кровь и промывающую жидкость выжимают
из ваты поршнем, стараясь продвинуть его как можно дальше
внутрь шприца.

3.	К двум объемам профильтрованной крови вместе с промыва-
ющей жидкостью добавляют 1 объем 3%-ного раствора желатины
и перемешивают. Смесь разливают в конические пластиковые про-
бирки (тип 2070, Falcon Plastics), которые помещают в вертикаль-
ном положении в СОг-термостат при 37°С. Спустя 30 мин пробирки
несколько раз поворачивают туда и обратно на 180° вокруг вер-
тикальной оси так, чтобы конгломераты эритроцитов, прилипшие

Илшунохимичвские
исследования

Взятие	Выделение лимфоцитов	Культиви- Исследование

кроем	роеание

Рис. 1. Последовательные этапы методики. ЛГГ — локальный гемолиз в геле;
РГП — реакция гемолитического пятиа.
к стенкам пробирки, отделились и осели вместе с эритроцитами.
Инкубацию продолжают еще 15 мин, затем собирают надосадоч-
ный слой плазмы с лейкоцитами и центрифугируют 10 мин при
1500 об/мин и 20°С.

4.	Осадок дважды отмывают в растворе Хэнкса (1100 об/мин,
10 мин), затем суспендируют в культуральной среде до концент-
рации 4-106 клеток/мл.

5.	На каждый миллилитр клеточной суспензии в качестве ан-
тигена прибавляют 0,05 мл 2 %-ной суспензии бараньих эритроци-
тов в растворе Хэнкса.

6.	Клеточную суспензию разливают либо по 1 мл в пластико-
вые пробирки для обычных культур (тип 2003, Falcon Plastics),
либо по 10 мкл в лунки панелей для микрокультивирования (тип
3034, Falcon Plastics). Культуры обоих типов затем помещают
во влажную атмосферу СОг-термостата (5% СОа) и оставляют
там вплоть до исследования.

Б. Исследование клеток, образующих зоны гемолиза

При сборе клеток параллельные 1-миллилитровые культуры
объединяют. Клетки один раз отмывают в СР и ресуспендируют
в 0,5 мл МСИ. Число АОК, дающих прямые (IgM) и непрямые
(IgG) зоны гемолиза определяют с помощью модифицированного
метода локального гемолиза в геле, описанного в гл. 19.

В стеклянные пробирки (50x80 мм) разливают по 0,5 мл
0,7%-ного раствора Бактоагара, приготовленного на МСИ, после
чего помещают на водяную баню при 45°С. Затем в каждую про-
бирку вносят 20 мкл 1%-ного раствора ДЭАЭ-декстрана
(Pharmacia, Упсала, Швеция), 20 мкл 20 %-ной суспензии БЭ и
от 10 до 50 мкл суспензии лимфоидных клеток. Если ожидается
много АОК, нужно исследовать 10 мкл одного или нескольких
разведений лимфоцитарной суспензии, сделанных с 5-кратным
шагом. Смесь распределяют по поверхности предметных стекол,
предварительно покрытых агаром.

После того как агар затвердеет, предметные стекла, перевер-
нув, вкладывают в специальный лоток с мелким углублением, в
которое заливают определенный объем (примерно 1 мл на стек-
ло) среды для инкубации. Лоток со стеклами помещают в СОг-
термостат на 1 ч при 37°С, залив в углубление МСИ, а затем пе-
реносят стекла в чистые лотки, инкубируют 2,5 ч либо с истощен-
ным БЭ комплементом морской свинки в разведении 1 : 30, либо
с бараньей антисывороткой к кроличьему Ig, добавленной к
комплементу морской свинки в том же разведении. Следует за-
ранее подобрать такое разведение антисыворотки к Ig, которое
выявляет максимальное число АОК, дающих непрямые зоны ге-
молиза, не уменьшая числа прямых зон.
АОК подсчитывают с помощью автоматического счетчика ко-
лоний, помещая предметные стекла под лупу в косом освещении.
Подсчет наиболее надежен, когда на предметном стекле имеется
40—150 зон гемолиза. Число клеток, образующих IgG, определя-
ют, вычитая число клеток, образующих IgM, из общего числа
АОК, выявленных с антисывороткой к 1g.

Число АОК в отдельных лунках панели для микрокультиви-
рования определяют в целом так же.

В.	Изучение антител в культуральной жидкости

В надосадочной жидкости 1-миллилитровых культур доста-
точное для качественного и количественного анализа количество
антител накапливается только в том случае, если среди лимфо-
идных клеток в течение нескольких дней функционирует значи-
тельное число АОК (более 2000—3000 клеток/мл). В положи-
тельных микрокультурах специфические антитела также очень
часто содержатся в высоких концентрациях. Для титрования ан-
тител к БЭ в культуральной жидкости можно использовать реак-
ции гемагглютинации или гемолиза.

Когда культивируют клетки от кроликов, гетерозиготных по
локусу b легких цепей 1g, клональную природу антител в отдель-
ных микрокультурах можно установить по аллотипу. В каждом
клоне должен проявляться только один аллель. Для такого ти-
пирования необходим чувствительный метод, который позволил
бы выявлять очень малые количества специфических антител.
Мы приводим здесь методику торможения гемолиза (Luzzati et
al., 1973b).

На покрытые агаром предметные стекла (для микроскопии)
наслаивают по 1 мл 2%-ного раствора Noble-агара, приготовлен-
ного на веронал-мединаловом буфере. После того как агар за-
стынет, в нем стальным штампом, соединенным с водоструйным
насосом, вырезают триады лунок (рис. 2). Диаметр лунок 1,5 мм,
расстояние между центрами лунок в триаде 5 мм; объем лунок
около 2 мкл.

Пробы надосадочной жидкости из микрокультур, оцененных
методом гемолитического пятна как положительные, помещают

Рис. 2. Расположение луиок для реакции торможения гемолиза.
Рис. 3. Определение аллотипа антител к бараньим эритроцитам, образованных
в микрокультуре клетками от гомозиготного кролика Ь4/Ь4. (Luzzati et al.,
1973b.)

А. В средней лунке — культуральная жидкость; в крайних лунках — нор-
мальная кроличья сыворотка. Б. В центральной лунке — культуральная жид-
кость; в верхней лунке — антисыворотка к Ьб.

в центральные лунки триад. Крайние лунки заполняют неразве-
денными антиаллотипическими сыворотками. Эти сыворотки не
должны содержать перекрестно-реагирующих антител. Так, на-
пример, для исследования клеток гетерозиготного кролика Ь4,
Ьб следует использовать антисыворотки к И и Ьб, полученные
при иммунизации кролика с аллотипом Ь9. Антисыворотки ин-
активируют прогреванием (56°С, 30 мин) и истощают бараньими
эритроцитами.

Предметные стекла оставляют во влажной камере на ночь
при комнатной температуре.

На следующий день стекла промывают 0,15 М раствором
NaCl в течение 5—15 мин. Стекла обсушивают, чтобы убрать
избыток физиологического раствора, внешние края агара обре-
зают бритвой (см. пунктирные линии на рис. 2) и стекла поме-
щают на подогреваемую поверхность. В стеклянных пробирках
(0,5x8 см), находящихся в водяной бане при 45°С, готовят сле-
дующую смесь: 0,25 мл 0,7%-ного раствора Бактоагара в МСИ,
20 мкл 1%-ного ДЭАЭ-декстрана и 20 мкл 20%-ной суспензии
БЭ. Смесь выливают на предметные стекла сразу после приготов-
ления.

Стекла переносят на охлаждаемую поверхность и оставляют
на 1—2 мин, затем, перевернув, их вкладывают в специальные
люцитовые лотки, углубление которых заполняют истощенным
БЭ комплементом морской свинки, разведенным в МСИ 1 : 10.
Расположение гемолитического пятна определяют после 2,5-часо-
вой инкубации во влажной атмосфере СОг-термостата.

Округлое пятно лизиса вокруг средней лунки свидетельствует
о том, что торможения реакции не произошло. Полукруглая зона-
гемолиза означает, что антитела к БЭ были блокированы анти-
аллотипической сывороткой, помещенной в лунку с той стороны,
где лизис отсутствует; это свидетельствует о проявлении данного
аллотипа (рис. 3).

Торможения может не быть потому, что антитела, находящие-
ся в жидкости, не несут испытуемого аллотипа, или потому, что
эти антитела представляют собой смесь двух популяций молекул:
первая популяция молекул несет данный аллотип и, следователь-
но, блокируется антисывороткой, а Вторая — продукт проявления
другого аллеля, антисывороткой не блокируется и дает полный
лизис. Во втором случае смесь антител к двум аллельным алло-
типам, помещенная в одну из крайних лунок, будет вызывать
полное торможение гемолиза.

Чувствительность этого метода трудно точно оценить. Однако
о его надежности при определении примесных антител, образо-
ванных другими клонами, говорит тот факт, что при испытании
пятнадцати произвольно составленных смесей антител двух ал-
лельных аллотипов (Ь4 и 66) во всех случаях были выявлены
оба аллеля.

V.	ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ЗАМЕЧАНИЯ

Вторичное образование антител к бараньим эритроцитам in
vitro лимфоцитами периферической крови (ЛПК) кролика обыч-
но хорошо воспроизводится. До 5-го дня после иммунизации жи-
вотного выраженный ответ наблюдается редко. Затем число АОК
медленно нарастает, достигая максимума между 10-м и 20-м дня-
ми. Это максимальное число АОК может поддерживаться в
течение нескольких дней и даже недель.

Величина и динамика ответа у разных животных могут быть
различными. Вместе с тем повторные опыты с клетками крови,
взятыми от одного и того же животного на протяжении несколь-
ких недель, могут давать поразительно сходные результаты. Как
правило, это наблюдается в том случае, когда животное прими-
руют in vivo не менее чем за год до испытаний. Животные, при-
мированные незадолго до испытаний, обычно дают более слабые
ответы.

Контрольные культуры, не содержащие антигена, обычно да-
ют очень мало АОК и/или мало положительных луиок в микро-
культурах (низкий фон).

Соотношение индуцированных in vitro АОК, дающих прямые
и непрямые зоны гемолиза, в значительной мере зависит от того,
на каком животном ставился опыт, сколько времени прошло пос-
ле примирования, какая была взята серия сыворотки плода ко-
ровы, а также, по-видимому, от каких-то других, пока еще неиз-
вестных условий культивирования и разделения клеток.
- Метод, описанный здесь для оценки ответа на БЭ, был с успе-
хом применен при изучении образования антител к групповым
полисахаридам стрептококка in vitro (Read, Braun, 1974; Braun
et al., 1976), а также при изучении ранней индуктивной фазы об-
разования антител in vitro (Pawlita et al., 1978).

При попытках использовать этот метод для исследования
крови человека возникли значительные трудности — вероятно,
потому, что доноров предварительно не примировали антигеном,
а индукция первичного ответа в культуре лимфоцитов крови име-
ет, по-видимому, свои специфические проблемы. Вместе с тем не
исключено, что человеческие лимфоциты гораздо труднее стиму-
лируются антигеном in vitro, чем кроличьи. Тем не менее с по-
мощью модификации описанного здесь метода (Luzzati et al.,
1976, 1977) и дополнительных стимулирующих агентов удается
проиммунизировать лимфоциты периферической крови человека
in vitro. В самом деле, с помощью мышиного антигеи-специфиче-
ского фактора Т-клеток было индуцировано образование антител
к бараньим и лошадиным эритроцитам и к (Т, G)-A-L (Luzza-
ti et al., 1976). Ответ на те и другие эритроциты был индуциро-
ван при культивировании ЛПК человека со специфическим ан-
тигеном и в присутствии вируса Эпштейна-Барра (Luzzati et al.,
1977).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Braun. D. G., Quintans J., Luzzati A. L., Lefkovits I., Read S. E. (1976). J.

Exp. Med., 143, 360.

Luzzati A. L., Lafleur L. (1976). Eur. J. ImmunoL, 6, 125.

Luzzati A. L., Lefkovits L, Pernis B. (1973a). Eur. J. Immunol., 3, 632.
Luzzati A. L., Lefkovits I., Pernis B. (1973b). Eur. J. Immunol., 3, 636.
Luzzati A. L., Taussig M. J., Meo T., Pernis B. (1976). J. Exp. Med., 144, 573.
Luzzati A. L., Hengartner H., Schreier M. H. (1977). Nature (London), 269,
419.

Pawlita M,, Andersen V., Lefkovits L, Braun D. G. (1978). Scand. J. ImmunoL,
7, 221.

Read S. E., Braun D. G. (1974). Eur. J. ImmunoL, 4, 422.
ИНДУКЦИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА
С ВЫСОКИМ УРОВНЕМ АНТИТЕЛ
ДОМИНИРУЮЩЕГО КЛОНОТИПА

Д. Браун

I.	ВВЕДЕНИЕ

Обычный иммунный ответ — это сумма ответов многих кло-
нов. Однако для того, чтобы изучить клон как таковой или про-
анализировать его продукты, необходимо разделить клоны. Один
из подходов к решению этой задачи — стимуляция такого отве-
та, в котором почти все антитела синтезируются лишь одним или
несколькими клонами.

Залогом успеха в этом случае является однородность иммуно-
гена. Этому требованию удовлетворяют бактериальные стенки,
несущие на своей поверхности монотонно повторяющиеся цепи
полисахаридов: как известно, они могут вызывать образование
антител определенного клонотипа. Доминирование какого-либо
одного клона при иммунизации совершенно разными эпитопами
на одинаковых носителях отражает иерархию среди иммуноцитов
разной специфичности и представляет собой иммунорегулятор-
ный феномен (Braun et al., 1976).

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Антитела доминирующих клонотипов, специфичных к полиса-
харидам, чаще всего образуются у кроликов после внутривенного
введения стрептококковой или пневмококковой вакцины (Braun
et al., 1969; Pincus et al., 1970). У некоторых инбредных линий
мышей как внутривенная, так и внутрибрюшинная иммунизация
этими вакцинами также ведет к образованию большого количе-
ства антител ограниченной гетерогенности (Braun et al., 1972;
Briles, Krause, 1972; Eichmann, 1972). При использовании стреп-
тококковых вакцин такой эффект достигается при двух услови-
ях: 1) следует учитывать генетические особенности кроликов и
мышей и 2) необходимо приготовить убитую бактериальную вак-
цину таким образом, чтобы, например, стрептококковый группо-
вой полисахарид оставался во внешнем слое бактериальной клет-
ки, поскольку его топография имеет важное значение.

В последующих разделах будут описаны широко используе-
мые методы индукции in vivo больших количеств антител огра-
	Й	I *  		

® ©

Рис. 1. Денситограммы, полученные при мнкрозональном электрофорезе кро-
личьих и мышиных гипериммунных антисывороток к бактериальным полиса-
харидам.

А. Кроличья антисыворотка к полисахаридам стрептококка группы А-вариаит
до и после истощения. Б. Кроличья антисыворотка к полисахариду пневмокок-
ка типа II до и после истощения. В. Мышиная антисыворотка к полисахариду
стрептококка группы А до и после истощения. I — иммунная сыворотка:
15,0 мг антител к А-СНО; II — сыворотка, истощенная на колонке с NAGA-.
эпоксисефарозой.
ниченной гетерогенности к различным компонентам клеточной
стенки бактерий (рис. 1), а также даны ссылки на работы, в ко-
торых использовали конъюгаты гаптен-носитель.

Используемые антигены

р-Гемолитический стрептококк: штаммы J17A4 (группа А),
Л486, М.— (вариант группы A), 090R (группа В) и С74
(группа С) (все штаммы из коллекции д-ра В. С. Lancefield,
Rockefeller University, Нью-Йорк, США)

Пневмококки: типы II, III и VIII были получены из American
Type Culture Collection, Атланта, Джорджия, США
Пептидогликан р-гемолитического стрептококка (Schleifer,
Krause, 1971)

Micrococcus lysodeikticus (Strosberg et al, 1974)
D-Ala-D-Ala-стрептококки группы A (Kolb, 1976)
ДНФ-грамицидин S (Montgomery et al., 1975)
«-азобензоат (Appella et al., 1974)

III.	ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВАКЦИН

В качестве примеров я опишу здесь приготовление стрепто-
кокковой и пневмококковой вакцин.

А. Стрептококки

Для получения большого количества вакцины одной серии
используют следующую методику. 1500 мл 16-часовой культуры
стрептококка, выращенной на бульоне Тодда — Хьюитта (Difco,
Детройт, США), центрифугируют дважды по 20 мин при 7000g
и 37°С. Осадок бактерий собирают, дважды отмывают стериль-
ным физиологическим раствором, ресуспендируют в 30 мл того
же раствора, инактивируют прогреванием при 56°С в течение
45 мин, дважды центрифугируют при 7000g по 20 мин. Осадок
ресуспендируют в 30 мл физиологического раствора и доводят pH
до 2 с помощью НС1. Добавляют 75 мг пепсина и проводят фер-
ментолиз при 37°С в течение 2 ч. Доводят pH бактериальной
суспензии до 7 с помощью 2 М раствора NaOH и центрифугиру-
ют. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок отмывают
дважды физиологическим раствором. Затем осадок ресуспенди-
руют в 100 мл стерильного физиологического раствора и доводят
оптическую плотность суспензии при 650 нм до 3,15 ед/мл. Такая
оптическая плотность стрептококковой суспензии соответствует
приблизительно 400 мкг группового полисахарида в 1 мл вакци-
ны. Вакцину контролируют на стерильность высевом на кровяной
агар.
Б. Пневмококки

Пневмококков выращивают 16 ч на среде Тодда — Хьюитта
при условиях, описанных выше для стрептококка. Рост бактерий
прекращают прогреванием (см. разд. III, А). Клетки трижды
отмывают охлажденным физиологическим раствором, содержа-
щим 0,25% формалина, и доводят оптическую плотность суспен-
зии при 590 нм до 5,95 ед/мл, что соответствует 4-109 клеток/мл.
Стрептококковые вакцины на этом этапе обработки стабилизи-
руются, тогда как пневмококковые еще продолжают высвобож-
дать типоспецифический капсульный полисахарид в надосадоч-
ную жидкость. Поэтому перед иммунизацией бактерии необходи-
мо еще один раз отмыть; в противном случае свободный полиса-
харид вызовет толерантность, а не интенсивное образование ан-
тител ограниченной гетерогенности.

IV.	ИММУНИЗАЦИЯ

А. Стрептококковые вакцины

Прежде всего необходимо отобрать кроликов, способных да-
вать высокий ответ ограниченной гетерогенности (частота таких
животных в случайной выборке колеблется от 1 до 10% в за-
висимости от питомника кроликов и используемого штамма
стрептококка). Таких животных затем можно скрещивать и от-
бирать по этому признаку (Braun et al., 1969, 1973; Eichmann
et al., 1971). Ниже приведены две разные схемы (А и Б) имму-
низации кроликов групповыми полисахаридами стрептококков
(Braun et al., 1969, 1973; Davie et al., 1968; Eichmann et al., 1970,
1971; Fleischmann et al., 1968; Miller et al., 1967; Osterland et al.,
1966).

Способ иммунизации во всех случаях внутривенный.

А	Б

Неделя День недели	Количество, мл	День недели	Количест- во, мл
1 Понедельник	0,25	Понедельник	0,5
Вторник	0,25	Вторник	0,5
Среда	0,25	Среда	0,5
Четверг	0,25 .		
Пятница	0,25		
Суббота	0,25		
Пр одолжение				
		А		Б
Неделя	День недели	Количество, мл	День недели Количество, МЛ	
2	Понедельник	0,5	Понедельник	1,0
	Вторник	0,5	Вторник	1,0
	Среда	0,5	Среда	1,0
	Четверг	0,5		
	Пятница	0,5		
	Суббота	0,5		
3	Понедельник	1,0	Понедельник	1,0
	Вторник	1,0	Вторник	1,0
	Среда	1,0	Среда	1,0
	Четверг	1,0		
	Пятница	1,0		
	Суббота	1,0		
4			Понедельник	1,0
			Вторник	1,0
	Среда	Кровопускание	Среда	1,0
		60—70 мл	•	
	Пятница	Кровопускание		
		50—70 мл		
5	Понедельник	Кровопускание	Понедельник	Кровопускание
		50—70 мл		50—70 мл
	Среда	Кровопускание	Среда	Кровопускание
		50—70 мл		50—70 мл
	Пятница	Кровопускание	Пятница	Кровопускание
		50—70 мл		50—70 мл

Кровопускания продолжают делать в следующие 2 недели
раз в два или три дня в зависимости от состояния животного и
уровня антител, который определяют с помощью микрозональ-
ного электрофореза и количественной преципитации с очищен-
ным группоспецифическим полисахаридом (Braun et al., 1969).
Кровь всегда берут из центральной ушной артерии. Применения
ксилола (с целью вызвать у кролика гиперемию уха) следует
избегать, так как это приводит к образованию рубцов. Лучше
осторожно обогревать ухо. Другой способ получения большого
количества крови — это обменная трансфузия кролика (подроб-
нее см. Greenblatt et al., 1973).

Через 6 месяцев после первого курса иммунизации можно
провести второй (Braun et al., 1969). В этом случае кроликов
иммунизируют только в течение 2 недель и начинают кровопус-
кания через 5 дней после последнего введения антигена (на
третьей неделе). Многие кролики дают ответ только после вто-
ричной иммунизации (Braun et al., 1969). Еще через 6 месяцев
можно начать третий курс иммунизации. Как правило, наблю-
дается устойчивое клональное доминирование антител к поли-
сахаридам, которое позволяет собрать за 18-месячный курс до
10—15 г антител (Cramer, Braun 1975b).

Ниже приведены две разные схемы иммунизации инбредных
мышей. [К высокореактивным линиям относятся лишь A/J,
BALB/c и SWR (см. Braun et al., 1972; Briles, Krause, 1972; Cra-
mer, Braun, 1974; 1975a; Eichmann, 1972, 1973).]

Неделя	День недели.	Количество, мл	Способ иммунизации
1	Понедельник	0,05	в/бр
	Вторник	0,05	в/бр
	Среда	0,05	в/бр
2	Понедельник	0,1	в/бр
	Вторник	0,1	в/бр
	Среда	0,1	В/бр
3	Понедельник	0,1	в/бр
	Вторник	0,1	в/бр
	Среда	0,1	в/бр
4	Понедельник	0,1	в/бр
	Вторник	0,1	в/бр
	Среда	0,1	в/бр
5	Понедельник  Среда (кровопускание хвостовой вены)  Пятница	ИЗ	
1	Понедельник	0,1	в/в
	Вторник	0,1	в/в
	Среда	0,1	в/в
2	Понедельник	0,1	в/в
	Вторник	0,1	в/в
	Среда	0,1	в/в
3—6	Перерыв		
7	Понедельник	0,1	в/в
	Вторник	0,1	в/в
	Среда	0,1	в/в
8	Понедельник	0,1	в/в
	Вторник	0,1	в/в
	Среда	0,1	в/в
9	Кровопускание два нли три раза из хвостовой вены или		
	ретроорбитального сплетения.		
Б. Пневмококковые вакцины

Инбредные мыши не образуют больших количеств антител в
ответ на введение вакцины из пневмококков типа III. Приводи-
мая ниже схема иммунизации предназначена только для кро-
ликов, иммунизируемых вакцинами типов II, III и VIII (Chen
et al., 1973; Kimball et al., 1971; Pincus et al., 1970, 1973). Спо-
соб иммунизации внутривенный.

Неделя	День недели	Количество микробных клеток
1	Понедельник	10»
	Вторник	108
	Среда	10»
2	Понедельник	5-10»
	Вторник	5-108
	Среда	5-Ю8
3	Понедельник	10’
	Вторник	10е
	Среда	10®
4	Понедельник	10®
	Вторник	10®
	Среда	10®
5	Три кровопускания: в поне- дельник, вторник и питницу	

Если сыворотки к этому времени содержат большое коли-
чество антител ограниченной гетерогенности, то кровопускания
продолжают в течение последующих 2—3 недель, а затем де-
лают 4-недельный перерыв. После этого иммунизацию повторя-
ют, вводя по 5-109 микробных клеток в первую неделю три раза,
а в последующие 4 недели два раза в неделю. Через 5 дней после
заключительного введения антигена приступают к кровопуска-
ниям. Антитела ограниченной гетерогенности в сыворотках оп-
ределяют с помощью микрозонального электрофореза; количест-
во специфических антител оценивают в реакции количественной
преципитации.

V.	СЕРИЙНЫЙ ПЕРЕНОС ОГРАНИЧЕННОГО

ЧИСЛА КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ

Метод серийного переноса клеток селезенки облученным мы-
шам, разработанный Асконас и сотр., (Askonas et al., 1970) для
клеток, образующих аптптела к ДНФ-группе, Брайлес и Краузе
(Briles, Krause, 1972) и Эйхман (Eichmann, 1972, 1973) приспо-
собили для получения больших количеств моноклональных ан-
тител. Клетки селезенки мышей (2-Ю6—107), образующие анти-
тела одного доминирующего клонотипа, специфичного к полиса-
харидам группы А (их идентифицировали изоэлектрическим
фокусированием), переносят сингенным мышам, облученным в
дозе 600 R. Таким мышам в течение 2 недель вводят внутривен-
но 4 раза по 0,1 мл стрептококковой вакцины группы А. Затем
делают перерыв на 4 недели, после чего проводят обычный 2-не-
дельный курс вторичной иммунизации.

VI.	КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА

Если ранее существование генетического контроля иммунного
ответа с высоким титром антител ограниченной гетерогенности,
свидетельствующим о доминировании какого-либо клона, под-
вергалось сомнению, то в настоящее время способность кроли-
ков отвечать на групповые полисахариды стрептококка опреде-
ленно считается наследственным признаком. Этот признак не
сцеплен ни с аллотипами тяжелых и легких цепей иммуноглобу-
линов, ни с изотипами легких цепей. Выведена, например, линия
кроликов, которые не экспрессируют легкие цепи х-типа (Kelus,
Weiss, 1977), однако значительная часть животных этой частич-
но инбредной линии отвечает на стрептококковый полисахарид
группы А (вариант) образованием большого количества анти-
тел ограниченной гетерогенности (Weiss et al., 1977). За пос-
ледние 8 лет получены две линии кроликов, и в обеих линиях
около 90% крольчат в отдельных помётах способны к интенсив-
ному образованию антител ограниченной гетерогенности
(D. G. Braun, неопубликованные данные).

По интенсивности образования антител ограниченной гетеро-
генности в ответ на полисахариды стрептококка группы А линии
мышей можно разделить на группы сильных, средних и слабых
продуцентов (Cramer, Braun, 1975а). Интенсивность ответа на-
ходится под аутосомальным контролем и не сцеплена с локусом
Н-2, так же как и ответы на подавляющее большинство других
антигенов. Наследование такого ответа (его контролируют не
менее трех генов) тесно сцеплено с локусом Ig, контролирую-
щим экспрессию субклассов иммуноглобулинов (Braun et al.,
1978). Это напоминает генетический контроль иммунореактив-
ности в отношении других полисахаридных антигенов, например
декстрана (Hansburg et al., 1976) и липополисахарида грамот-
рицательных бактерий (R. di Pauli, личное сообщение). Анало-
гичным образом на стрептококковые полисахариды группы А
могут реагировать некоторые инбредные линии крыс; наследо-
вание интенсивности ответа в этом случае также не сцеплено с
главным комплексом гистосовместимости (Stankus, Leslie,
1976). Таким образом, сходный характер иммунореактивности
наблюдается у животных по меньшей мере трех различных ви-
дов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Рекомендуемая литература

Braun D. G., Jaton J.-C. (1974). Homogeneous antibodies: Induction and value
as probe for the antibody problem, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 66,
29—76.

Haber E. (1971). Homogeneous elicited antibodies: Induction, characterization,
isolation and structure, Ann. N. Y. Acad. Sci., 190, 283—304.

Kindt T. J., Thundberg A. L., Mudgett M., Klapper D. G. (1974). A study of
V region genes using allotypic and idiotypic markers. In: The Immune Sys-
tem: Genes, Receptors, Signals (E. E. Sercarz, A. R. Williamson and
C. F. Fox, eds.), pp. 69—88, Academic Press, New York.

Krause R. M. (1970a). Factors controlling the occurrence of antibodies with
uniform properties, Fed. Proc. Fed. Am. Soc. Exp. Biol., 29, 59—65.

Krause R. M. (1970b). The search for antibodies with molecular uniformity,
Adv. Immunol., 12, I—16.

Цитируемая литература

Appella E., Roholt 0. A., Chersi A., Radzinski G., Pressman (1974). Biochem.
Biophys. Res. Commun., 53, 1122.

Askonas B. A., Williamson A. R., Wright В. E. G. (1970). Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 67, 1398.

Braun D. G., Eichmann K., Krause R. M. (1969). J. Exp. Med., 129, 809.

Braun D. G., Kindred B., Jacobson J. B. (1972). Eur. J. Immunol., 2, 138.

Braun D. G., Kjems E., Cramer M. (1973). J. Exp. Med., 138, 645.

Braun D. G., Huser H., Riesen W. F. (1976). In: The Generation of Antibody
Diversity: A New Look (A. J. Cunningham, ed.), p. 31, Academic Press,
New York.

Braun D. G., Schalch W., Schmid I. (1978). In: Streptococcal Diseasses and
the Immune Response (M. McCarty and J. B. Zabriskie, eds.), Academic
Press, New York (in press).

Briles D. E., Krause R. M. (1972). J. Immunol., 109, 1311.

Chen F. W., Strassberg A. D., Haber E. (1973). J. Immunol., 110, 98.

Cramer M., Braun D. G. (1974). J. Exp. Med., 139, 1513.

Cramer M., Braun D. G. (1975a). Eur. J. ImmonoL, 5, 823.

Cramer M., Braun D. G. (1975b). Scand. J. Immunol., 4, 63.

Davie J. M., Osterland С. K-, Miller E. J., Krause R. M. (1968). J. Immunol.,
100, 814.

Eichmann K- (1972). Eur. J. Immunol., 2, 301.

Eichmann K. (1973). J. Exp. Med., 137, 603.

Eichmann K-, Lackland H., Hood L., Krause R. M. (1970a). J. Exp. Med., 131,
207.

Eichmann K-, Braun D. G., Feizi T., Krause R. M. (1970b). J. Exp. Med., 131,
1169.

Eichmann K-, Braun D. G., Krause R. M. (1971). J. Exp. Med., 134, 48.

Fleischman J. B., Braun D. G., Krause R. M. (1968). Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 60, 134.

HansburgD., Briles D., Davie J. M. (1976). J. Immunol., 117, 569.
Greenblatt J. J., Bernstein D., Bokisch V. A., Krause R. M. (1973). J. I mmunol.,
110, 862.

Kelus A. S., Weiss S. (1977). Nature (Nondon), 265, 156.

Kimball J. W., Pappenheimer A. M., Jaton J.-C. (1971). J. Immunol., 106,
1177.

Kolb H. (1976). J. Immunol., 117, 1711.

Miller E. J., Osterland С. K., Davie J. M., Krause R. M. (1967). J. Immunol.,
98, 710.

Montgomery P. C., Rockey J. H., Kahn R. L., Skandera C. A. (1975). J. Im-
munol., 115, 904.

Osterland С. K-, Miller E. J., Karakawa W. W., Krause R. M. (1966). J. Exp.
Med., 123, 599.

Pincus J. H., Jaton J.-C., Bloch K- J., Haber E. (1970). J. ImmunoL, 104,
1143.

Pincus J. H., Mage R. G., Alexander C., Chase N. M. (1973). Eur, J. Immunol.,
3, 435.

Schleifer K--H., Krause R. M. (1971). Eur. J. Biochem., 19, 471.

Stankus R. P., Leslie G. A. (1976). Immunogenetics, 3, 65.

Strosberg A. D., Hamers-Easterman C., Van der Loo H. W., Hamers R. (1974),
J. ImmunoL, 113, 1313.

Weiss S., Kelus A. S., Braun D. G. (1977). J. Exp. Med., 146, 1195.
АНАЛИЗ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИИ

МЕТОДОМ ЛИМИТИРУЮЩИХ РАЗВЕДЕНИИ

И. Лефковитс

I.	НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА

Методику микрокультур используют при анализе клеточных
популяций, вовлекаемых в иммунный ответ, для определения
частоты специфически реагирующих клеток. Как правило, эти
клетки встречаются с весьма низкой частотой. К ним относятся
предшественники антителообразующих клеток (В-клетки),
Т-хелперы и Т-супрессоры. Кроме того, с помощью серийных
микрокультур можно определить средний размер клона (число
потомков одной клетки-предшественника), а также класс, ал-
лотип и другие свойства продуктов В-клеток.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Серию мелких порций лимфоидных клеток культивируют в
присутствии антигена. Количество клеток в каждой порции дол-
жно быть таким, чтобы значительная часть культур не содержа-
ла ни одной клетки-предшественника. При помощи формулы
Пуассона по доле неотвечающих культур можно рассчитать час-
тоту клеток-предшественников (Lefkovits, 1972; Quintans, Lef-
kovits, 1973).

Долю неотвечающих культур определяют, как правило, пу-
тем анализа культуральной жидкости, пробы которой отбирают
автоматическим репликатором и наносят на индикаторный слой
(Lefkovits, Kamber, 1972). Образцы культуральной жидкости,
содержащие антитела, образуют в индикаторном слое зоны ком-
племент-зависимого гемолиза. Нередко кроме культуральной
жидкости исследуют и клетки. В этом случае определяют коли-
чество АОК в каждой культуре. Когда концентрация взвеси дове-
дена до единичных клеток, результаты традиционного флуктуа-
ционного теста трудно интерпретировать. Поэтому приходится
прибегать к более сложному методу, получившему название
«анализа с помощью лимитирующих разведений». Этот анализ
проводят в диапазоне таких доз лимфоидных клеток, в котором
можно с уверенностью ожидать, что ответ лимитируется только
титруемым типом клеток.
III.	РЕАГЕНТЫ И ПРИБОРЫ

А. Среды

1.	Среда для приготовления клеточной суспензии

Минимальная основная среда Игла (МСИ) на основе соле-
вого раствора Эрла без бикарбоната [Grand Island Biological Со.
(Gibco), 109SJ.

2.	Среды для культивирования

Среда А

100 мл МСИ для суспензионных культур, МА (Micro-
biological Associates, Бетезда, Мэриленд, США) 12 126

1 мл L-глутамина (200 мМ), МА 17605

1 мл заменимых аминокислот (100-кратный концентрат),
МА 13114

1 мл пирувата натрия (100 мМ), МА 13 115

1	мл смеси стрептомицин-пенициллин (по 5000 ед/мл каж-
дого), МА 17 603F

2	мл буфера ГЭПЭС (1 М), МА 17 737

0,3 мл 2-меркаптоэтанола (14 мМ), Merck, ФРГ

5	,5 мл сыворотки плода коровы (Reheis Со., Кенеки, Ил-
линойс, США)

Среда Б

80 мл среды RPMI 1640, МА 12 702

1 мл L-глутамина, МА 17 605 F

1	мл смеси стрептомицин-пенициллин (по 5000 ед/мл каж-
дого), МА 17 603 F

0,3 мл 2-меркаптоэтанола (14 мМ),

20	мл сыворотки плода коровы (Reheis Со. либо Gibco)

3. Поддерживающая среда (питательный коктейль)

15 мл МСИ (Gibco, 109S)

2 мл незаменимых аминокислот (50-кратный концентрат),
МА 13 606

1 мл заменимых аминокислот (100-кратный концентрат),
МА 13 114

1 мл L-глутамина (200 мМ), МА 17 605F

3 мл бикарбоната натрия (7,5%), МА 17 613

0,4 мл глюкозы (50%) Difco, США, 0973-60-0

10 мл сыворотки плода коровы (Reheis Со.)
Б- Антигены

Эритроциты (50 мкл 1%-ной суспензии эритроцитов на 1 мл
суспензии лимфоидных клеток)

Стрептококковые вакцины (3 мкг рамнозы на 1 мл суспензии
лимфоидных клеток)

Пневмококковые вакцины (10е убитых нагреванием клеток
R-формы пневмококка, штамм R36A, на 1 мл суспензии лимфо-
идных клеток)

В. Взвесь эритроцитов, используемых в качестве
индикаторных клеток

Эритроциты выдерживают примерно 1 неделю в растворе
Олсвера, затем трижды отмывают ЗФР либо СР при помощи
центрифугирования.

Г. Комплемент

Препарат Огау 20 (Behringwerke AG, Marburg-Lahn, ФРГ)
разводят 1 : 10 в ЗФР Дульбекко.

Рис. 1. Многошприцевый дозатор Hamilton с шестью шприцами, смонтирован-
ными в ряд. Каждый шприц вмещает 500 мкл н распределяет одномоментно
10 мкл. Представлены две модификации прибора. Тщательное 10—15-крат-
ное промывание шприцев стерильной средой обеспечивает стерильность при
последующей работе.
Рис. 2. Репликатор. Этот инструмент позволяет одновременно отобрать про-
бы из 60-луночной панели для микрокультивирования и перенести их на инди-
каторную пластинку, покрытую агаровым гелем с включенными в него инди-
каторными клетками (эритроцитами). Видны также панель для микрокульти-
вирования, штатив с пробирками для проб и пластинка с индикаторным слоем.

Д. Приборы из пластика и стекла

Панели для культуры тканей (Falcon Plastics, тип 3034)

Чашки для культуры тканей (Falcon Plastics, типы 3001 и
3002)

Пробирки (Falcon Plastics, типы 2006 и 2070)

Чашки Петри, 10 см (Falcon Plastics, Greiner или Sterilin)

Е. Многошприцевые дозаторы (рис. 1)

Дозатор Hamilton № 83729: шесть шприцев, на 500 мкг каж-
дый, с минимальной дозой распределения 10 мкл

Дозатор Hamilton № 83726: шесть шприцев, на 50 мкл каж-
дый, с минимальной дозой распределения 1 мкл

Ж. Репликатор (рис. 2)

Репликаторы выпускаются небольшими партиями фирмой
Biotec (Базель, Швейцария). С помощью этого прибора можно
одновременно отобрать 60 проб культуральной среды и перенес-
ти их на поверхность индикаторного слоя или в 60 пробирок, за-
крепленных в специальном штативе (Lefkovits, Kamber, 1972).

Репликатор состоит из четырех основных частей: вакуумной
камеры, калиброванной дозировочной пластинки, резиновой мем-
браны и распределительной части. Калиброванные дозировоч-
ные пластинки можно менять. Объем пробы, которую отбирает
из лунки каждая игла, определяется объемом одного «кармана»
в дозировочной пластинке. Эти четыре компонента скреплены
между собой четырьмя винтами, которые завинчиваются и отвин-
чиваются вручную. Репликатор закрепляют на штативе от мик-
роскопа, на котором оставлен только столик. На этом столике
крепится панель для микрокультивирования. Вакуумную каме-
ру соединяют через педаль с насосом. Для промывания реплика-
тора используют особое устройство, создающее попеременно
вакуум и избыточное давление, причем частоту импульсов под-
бирают заранее. Моющего устройства подобного типа в продаже
нет, но принципиального значения способ мойки не имеет.

Когда необходимо произвести отбор проб, панель для микро-
культивирования помещают на столик, репликатор опускают так,
чтобы все иглы погрузились в культуральную жидкость, нахо-
дящуюся в лунках. Затем, нажав на педаль, создают разреже-
ние и 60 проб всасываются в иглы распределительной части. По-
сле этого репликатор поднимают, а на столик помещают пласти-
ну с индикаторным слоем или штатив с пробирками. Вакуум
сбрасывают и поверхностью индикаторного слоя (или внутрен-
ней поверхностью пробирок) осторожно касаются капель, вися-
щих на концах игл репликатора. Распределительную часть реп-
ликатора после этого опускают в сосуд с ЗФР и подключают к
моющему устройству.

3, Штатив с пробирками для отобранных проб

Отобранные репликатором пробы одновременно переносят в
60 пластиковых пробирок (диаметр 8 мм) разового пользова-
ния. Пробирки закрепляют в штативе вплотную одна к другой,
металлические стержни в нижней части штатива фиксируют
пробирки в вертикальном положении даже в том случае, если
он заполнен не целиком.

IV. МЕТОДЫ

(рис. 3, схема последовательных этапов)

А.	Подготовка и посев клеток

Клеточные суспензии готовят так же, как для культивирова-
ния по Мишеллу-Даттону (гл. 24). Мышей забивают цервикаль-
ной дислокацией, селезенки извлекают асептически и помещают
в стерильную 60-миллиметровую чашку, содержащую по 3 мл
охлажденной среды на селезенку. При помощи хирургических
пинцетов осторожно выделяют и измельчают пульпу селезенки.
Взвесь	Внесение

клеток	антигена

селезенки

Наполнение
мндгошприцевого
дозатора

lllllllllllll

(шншни

Распределение
клеточной
взвеси
в MJHKU

fnmnaxi'
«Г
в смеси
N2,0a.C02

Одновременный отбор
репликатором 60 проб

Нанесение пробна
индикаторный
слой

Реакция
гемолитического
нятна

Лобаывние
комплемента,
инкубация
при 37°С 45лг«л

Рис. 3. Последовательность основных операций метода лимитирующих разве-
дений.

затем суспензию клеток переносят в пробирку и оставляют на
5 мин. За это время большая часть комочков оседает на дно,
надосадочную жидкость переносят в центрифужную пробирку и
клетки осаждают центрифугированием при 500 g в течение
10 мин. Осадок ресуспендируют в небольшом объеме культураль-
ной среды, клетки подсчитывают и взвесь разбавляют до конеч-
ной концентрации 1—2-Ю7 клеток/мл.

В качестве антигена добавляют около 50 мкл 1%-ной суспен-
зии гетерологичных эритроцитов на 1 мл селезеночной суспензии
(либо по 50 мкл другого антигена, например стрептококковую
вакцину, убитые нагреванием пневмококки или растворимый бе-
лок). Смесь клеток селезенки с антигеном набирают в много--
шприцевый дозатор и затем разливают по 10 мкл в каждую из
60 лунок панели для микрокультивирования. Чтобы создать
влажную камеру, около 0,4 мл среды пипетируют в боковой же-
лобок панели, после чего накрывают крышкой. Сначала инкуба-
ционную камеру перфузируют газовой смесью (83% N2, 10% СОг
и 7% О2), затем герметизируют и инкубируют при 37°С.
Б. Поддержание культур

Культивирование продолжается, как правило, 4—6 дней. При
использовании МСИ необходимо ежедневное добавление под-
держивающей среды (питательного коктейля). В случае ис-
пользования среды RPMI культуры не нуждаются в добавках.
В каждую лунку добавляют по 1 мкл поддерживающей среды,
опуская капельки на поверхность микрокультуры. После внесе-
ния среды инкубатор вновь заполняют газом и культуры инку-
бируют при 37°С. Не следует слишком часто открывать культуры,
так как это может привести к частичному испарению среды из
лунок.

В.	Определение антител и антителообразующих клеток

1.	Реакция гемолитического пятиа

Пластинки со слоем агара подсушивают в течение 1 ч при
37°С (нижний слой), затем покрывают верхним слоем агара,

Рис. 4. Оценка образования антител в микрокультурах прн помощи реакции
гемолитического пятиа. Образцы культуральной жидкости из тех лунок, в ко-
торых синтезировались антитела, вызывают образование зон комплемент-за-
висимого гемолиза в индикаторном слое. (Lefkovits, 1974; Precommitment in
the Immune System, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 65, 21.)
содержащего эритроциты (подробное описание приготовления
нижнего и верхнего слоев агара см. в гл. 19). Пробы культураль-
ной жидкости набирают репликатором и переносят на пластинку
(объем капелек 2 мкл). После того как капельки впитаются в
агар, на пластинку наслаивают 2 мл комплемента и инкубируют
45 мин при 37°С. В тех местах индикаторного слоя, где впита-
лись капли из культур, образующих антитела, возникают зоны ге-
молиза (рис. 4). Пластинки с индикаторным слоем можно фикси-
ровать, наслоив 5 мл 0,25%-ного раствора глутаральдегида в
ЗФР.

2.	Выявление АОК с помощью локального гемолиза в геле

а.	Прикидочная оценка. Панель для микрокультивирования
центрифугируют (500g, 5 мин) и затем заливают СР. Удаляют
избыток СР и клетки диспергируют при помощи 5—10 пульсаций
репликатора. Образцы суспензии переносят репликатором на
пластинку с нижним слоем агара. Капелькам дают впитаться и
после этого наслаивают верхний индикаторный слой агара, со-
держащий эритроциты, и инкубируют 1 ч при 37°С. Затем поверх
агара наслаивают 2 мл комплемента и, проинкубировав 45 мин
при 37°С, учитывают реакцию. Число АОК подсчитывают в каж-
дой пробе.

б.	Исследование клеток из отдельных лунок. Панель для ми-
крокультивирования центрифугируют (500g, 5 мин) и заливают
СР. Удаляют избыток СР и в пробах, взятых из каждой лунки,
исследуют антителообразующие клетки по методу Ерне в моди-
фикации Каннингема (гл. 19).

Г. Анализ с помощью лимитирующих разведений

В типичном опыте отвечает только определенная часть микро-
культур. Как известно, в иммунный ответ in vitro вовлекаются
три клеточные популяции: В-клетки, Т-клетки и макрофаги, по-
этому нельзя достоверно считать, что в неотвечающей микро-
культуре отсутствуют именно клетки титруемого типа. Для досто-
верной оценки частоты одного типа, например предшественни-
ков В-клеток, необходимо анализировать клеточные популяции
раздельно, так, чтобы ответ лимитировали только эти клетки.
Чтобы единственной причиной отсутствия ответа в данной лунке
был избирательный дефицит предшественников В-клеток, специ-
фичных к БЭ, используют следующие методические приемы.

1.	В качестве источника В-клеток берут селезенку «голых»
(nude) мышей. Эти клетки титруют в пределах от 1Х104 до
1,8X 105 на микрокультуру.

2.	Функциональный избыток Т-клеточной активности обеспе-
Рис. 5. Гистограммы титрования В-клеток, отражающие соотношения смеши-
ваемых клеточных суспензий трех типов (селезеночных клеток мышей nude,
облученных селезеночных клеток таких же мышей и облученных аллогенных
селезеночных клеток); гистограммы а, б, в, г и д соответствуют пяти группам
культур, указанных в табл. 1. Акт. В — активные В-клетки; алло — аллоген-
ные клетки.

чивают добавлением либо аллогенных Т-клеток, либо хелперного
фактора. Число аллогенных селезеночных клеток сохраняют по-
стоянным: 2—4-104 клеток на микрокультуру. (Если необходимо
исключить участие в ответе В-клеток, то аллогенную суспензию
облучают в дозе 1200 рад.)

3.	Густоту клеточной взвеси поддерживают постоянной, а
убыль титруемых активных селезеночных клеток в последова-
тельных разведениях суспензии компенсируют облученными
клетками селезенки мышей nude. Макрофаги, как принято счи-
тать, радиорезистентны, поэтому постоянная густота клеточной
взвеси гарантирует и постоянное число макрофагов.

Д. Протокол титрования В-клеток (рис. 5)

В табл. 1 представлены два протокола титрования.

Е. Полулогарифмический график

Если В-клетки распределяются по лункам случайно и незави-
симо, то число предшественников, попавшее в лунку, будет четко
соответствовать распределению Пуассона. Среднее число клеток-
предшественников можно рассчитать по доле отрицательных
культур, используя формулу Пуассона
Таблица f

Два протокола титровання-В клеток1

Группа	Облученные аллогенные клетки, мл	Облученные клетки мышей nude, мл	Активные клетки мышей nude, мл	БЭ, капли	Число активных клеток мышей nude в 10 мкл культуры
а	0,5	1,5			2	0
б	0,5	1	0,5	2	5 10*
в	0,5	0,5	1	2	1-Ю5
г	0,5	—	1,5	2	1,5-105
д	—	—	2	2	2 105
Группа	Хелперный	Облученные		БЭ,	Число активных
	фактор Т- клеток, мл	клетки мышей nude, мл	мышей nude, мл	капли	nude в 10 мкл культуры
а	1	1			2	0
б	1	0,75	0,25	2	5-10*
в	1	0,5	0,5	2	МО'
г	1	0,25	0,75	2	1,5105
д	—	—	1 МЛ + 1 мл среды	2	2-10»

1	Верхний протокол: концентрация клеточных суспензий всех трех типов составляет
2-10?/мл. В культурах всех пяти экспериментальных групп конечная концентрация клеток
равна 2'107/млф Группа д—контрольная. Нижний протокол: концентрация клеточных сус-
пензий обеих типов равна 4‘10’/мл. Конечная концентрация клеток в культурах всех пяти
групп равна 2* 107/мл. Группа д — контрольная. Количество хелперного фактора можно
слегка варьировать. Хелперный фактор, полученный в результате аллоиммуииого взаимо-
действия, обычно менее активен, чем фактор, полученный под влиянием конкаиавалина А
(Кои-А). Как указано в протоколе, первый из них добавляют к клеточной суспензии в отно-
шении 1:1, а второй (полученный с Кои-А) часто оказывается активным в разведении J:5.
Желательно предварительно определить активность хелпериых факторов.

где FT — доля культур, содержащих г клеток-предшественников;
и — среднее число клеток-предшественников на лунку и г— на-
блюдаемое число клеток-предшественников в лунке для микро-
культивирования (0, 1, 2, 3 ... ).

При г=0 уравнение Пуассона приобретает вид

F о = е~“.

В логарифмической форме

In Fo = — и,

— In Fo = и.

Это означает, что отрицательный логарифм доли неотвечающих
культур прямо пропорционален среднему числу клеток-предше-
ственников в лунке.

Если откладывать на оси ординат отрицательный логарифм
Рнс. 6. Определение лимитирующего разведения В-клеток.

Все мнкрокультуры содержат по 5-10* облученных аллогенных клеток. Облу-
ченные и необлученные (активные) селезеночные клетки мышей nude смеши-
вают в различных соотношениях, чтобы в итоге в каждой лунке находилось
1,5-105 клеток. По оси абсцисс — число активных селезеночных клеток (от
мышей nude), вносимых в каждую микрокультуру; по оси ординат — доля
иеотвечающих микрокультур (—Info). Каждая точка на графике найдена на
основании реакции гемолитического пятна в 180 микрокультурах (три панели
для микрокультивирования). Около 3-10* активных В-клеток на лунку дают
37% отрицательных мнкрокультур (частота предшественников В-клеток
f=3,310-5).

доли неотвечающих культур (—Info), а на оси абсцисс в линей-
ной шкале — число засеянных клеток, то можно ожидать, что
полученные на графике точки лягут на прямую линию.

При и— 1 вышеуказанное уравнение упрощается:

Fo = e-i = 0,37.

Таким образом, когда среднее число клеток-предшественников
в лунке равно единице, 37% лунок останутся отрицательными.

На рис. 6 представлено графическое определение лимитиру-
ющего разведения В-клеток. Это Пример полулогарифмического
графика. Интерполируя при уровне 0,37, находим 3-Ю4. Таким
образом, один предшественник В-клеток приходится в среднем на
3-104 клеток. Отсюда частота клеток-предшественников состав-
ляет 1/(3-104) =3,3-10-5.
Ж. Протокол титрования Т-клеток

Т-клетки (протокол представлен в табл. 2) титруют так же,

Таблица 2

Протокол титрования Т-клеток1

Группа	Активные клетки мышей nude, мл	Среда, мл	Т-хелперы мл	БЭ, капли	Число Т-хелпе- ров в 10 мкл культуры
а	1	1			2	0
б	1	0,8	0,2	2	2Х104
в	1	0,6	0,4	2	4Х104
г	1	0,4	0,6	2	6Х104

1 Концентрация суспензии селезеночных клеток мышей nude составляет 1,5-10’/мл. Кон-
центрация исходной суспензии Т-клеток 1-10’/мл. Конечная концентрация клеток в культуре
колеблется от 1,5-10’ до 2,1-10’. Облученные Т-клеткн нельзя использовать для поддержа-
ния постоянства общей концентрации клеток, так как облучение не уничтожает хелперной
активности.

Рис. 7. Определение лимитирующего разведения клеток-супрессоров.

Все микрокультуры содержат одинаковое число селезеночных клеток мышей
nude (105 в микрокультуре) и адекватное количество хелперной активности.
Добавляя клетки-супрессоры, концентрацию клеток не корректируют. По оси
абсцисс — число клеток, внесенных в одну микрокультуру; по оси ординат —
доля отвечающих микрокультур. Обратите внимание на то, что в данном слу-
чае учитывают долю отвечающих культур, тогда как при определении лими-
тирующего разведения В-клеток учитывают долю неотвечающих культур (пред-
ставленные результаты получены нами в сотрудничестве с Роном Корлеем и
Беренис Киндред).
как В-клетки, с одним существенным отличием. При титровании
Т-клеток каждая лунка содержит более одного предшественника
В-клеток, а лимитируют ответ только Т-клетки (Waldmann et al.,
1975). Часто, но не всегда наблюдают выраженный фоновый от-
вет без какого-либо влияния Т-клеток извне. Такой ответ созда-
ет серьезные затруднения при анализе результатов.

3.	Протокол титрования клеток-супрессоров

Этот протокол в основном сходен с протоколом титрования
Т-клеток. Отличие состоит только в том, что в культуры прибав-
ляют постоянный объем хелперного фактора.

Результаты опыта вновь наносят на полулогарифмическую
сетку. Необходимо подчеркнуть, что наносят не Fq, a F+, потому
что в этом случае именно в отвечающих культурах число супрес-
соров считается равным нулю (г=0).

Результаты титрования клеток-супрессоров представлены на
рис. 7. Как оказалось, частота супрессорных клеток равна 1 на
104 клеток, т. е. 10~4.

И. Определение численности клона

Для расчета численности клона необходимо, знать показа-
тель и, т. е. среднее число клеток-предшественников в лунке.
Этот показатель вычисляют по формуле Пуассона либо находят
графически по кривой титрования. Теоретическое число клонов
(N) будет в таком случае N=wu, где w — число лунок, исследо-
ванных на наличие антителообразующих клеток. Тогда средняя
численность клона

7=(S АОК)/#,

где SAOK — общее число АОК, обнаруженных в w лунках
(Quintans, Lefkovits, 1974).

V. ОГРАНИЧЕНИЯ И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МЕТОДА

А.	Реакция гемолитического пятна

Если клоны малочисленны (от двух до пяти антителообра-
зующих клеток), то реакция гемолитического пятна может дать
ложный отрицательный результат. В этих случаях необходимо
исследовать АОК в каждой из лунок. Об этом особенно важно
помнить, когда анализируют ответ на некоторые тимус-независи-
мые антигены. Обычные тимус-зависимые антигены, как правило,
Расчет

WH=60			WH = 120					
Пределы довери- тельного интер- вала с 95%-иой вероятностью			Пределы довери- тельного интерва- ла с 95%-иой ве- роятностью			Пределы довери- • тельного интерва- ла с 95%-иой ве- роятностью		
W	о Fo	Нижний Верхний	w„	Fo	Нижний Верхний	w„ F„	Нижний Верхний	
0 1 1 0,98 2 0,97 3 0,95 4 0,93 5 0,92 6 0,90 7 0,88 8 0,89 9 0,85 10 0,83 11 0,82 12 0,80 13' 0,78 14 0,77 15 0,75 16 0,73 17 0,72 18 0,70 19 0,68 20 0,67 21 0,65 22 0,63 23 0,62 24 0,60 25 0,58 26 0,57 27 0,55 28 0,53 29 0,52 30 0,50 31 0,48 32 0,47 33' 0,45 34 0,43 35 0,42 36 0,40 37 0,38 38 0,37 39 0,35 40 0,33 41 0,32 42 0,30 43 0,28 44 0,27 45 0,25 46 0,23 47 0,22 48 0,20 49 0,18 50 0,17 51 0,15 52 0,133 53 0,117 54 0,100 55 0,083 56 0,067 57 0,050 58 0,033 59 0,017 60 0		0,94—1 0,91—1 0,88—1 0,86—0,99 0,84—0,98 0,82—0,97 0,79—0,96 0,77—0,95 0,75—0,94 0,73—0,93 0,71—0,92 0,70—0,90 0,68—0,89 0,66—0,88 0,64—0,87 0,62—0,85 0,60-0,84 0,59—0,83 0,57-0,81 0,55—0,80 0,53—0,78 0,52—0,77 0,50—0,75 0,48—0,74 0,47—0,72 0,45—0,71 0,43—0,69 0,42—0,68 0,40—0,66  0,38—0,65 0,37—0,63 0,35—0 ,62 0,34—0,60 0,32—0,58 0,31—0,57 0,29—0,55 0,28—0,53 0,26—0,52 0,25—0,50 0,23—0,48 0,22—0,47 0,20—0,45 0,19—0,43 0,17—0,41 0,16-0,40 0,15—0,38  0,134—0,36 0,120—0,34 0,110—0,32 0,095—0,30 0,083—0,29 0,071—0,27 0,060—0,25 0,048—0,23 0.038—0,21 0.028—0,18 0,018—0, 16 0,010—0,14 0,004—0,115 0,001—0,089 0	—0,060	0 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18  19  20  21  22  23  24  25  26  27  28  29  30  31  32  33  34  35  36  37  38  39  40  41  42  43  44  45  46  47  48  49  50  51  52  53  54  55  56  57 58  59  60	1 0,99 0,98 0,98 0,97 0,96 0,95 0,94 0,93 0,93 0,92 0,91 0,90 0,89 0,88 0,88 0,87 0,86 0,85 0,84 0,83 0,83 0,82 0,81 0,80 0,79 0,78 0,78 0,77 0,76 0,75 0,74 0,73 0,73 0,72 0,71 0,70 0.69 0,68 0,68 0,67 0,66 0,65 0,64 0,63 0,63 0,62 0,61 0,60 0,59 0,58 0,58 0,57 0,56 0,55 0,54 0,53 0,53 0.52 0.51 0,50	0,97—1 0,95—1 0,94—1 0,93—0,99 0,92—0,99 0,90—0,99 0,89—0,98 0,88—0,98 0,87—0,97 0,86—0,97 0,85—0,96 0,84—0,95 0,83—0,95 0,82—0,94 0,81—0,93 0,80—0,93 0,79—0,92 0,78—0,92 0,77—0,91 0,76—0,90 0,75—0,89 0,74-0,89 0,74—0,88 0,73—0,87 0,72-0,87 0,71—0,86 0,70—0,85 0,69-0,85 0,68—0,84 0,67—0,83 0,66—0,82 0,65—0,81 0,64—0,81 0,64—0,80 0,63—0,79 0,62—0,79 0,61—0,78 0,60-0,77 0,59—0.76 0,58-0,76 0,57—0,75 0,57—0,74 0,56-0,73 0,55—0,73 0,54—0,72 0,53-0,71 0,52-0,70 0,51—0,70 0,51—0,69 0,50—0,68 0,49-0,67 0,48—0,66 0,47—0,66 0,46—0,65 0,46—0,64 0,45—0,63 0,44—0,62 0,43—0,62 0,42—0,61 0,42—0,60 0,41—0,59	61 0,49  62 0,48  63 0,48  64 0,47  65 0,46  66 0,45  67 0,44  68 0,43  69 0,43  70 0,42  71 0,41  72 0,40  73 0,39  74 0,38  75 0,38  76 0,37  77 0,36  78 0,35  79 0,34  80 0,33  81 0,33  82 0,32  83 0,31  84 0,30  85 0,29  86 0,28  87 0,28  88 0,27  89 0,26  90 0,25  91 0,24  92 0,23  93 0,23  94 0,22  95 0,21  96 0,20  97 0,19  98 0.18  99 0,18  100 0,17  101 0,16  102 0,15  103 0,14  104 0,133  105 0,125  106 0,117  107 0,108  108 0,100  109 0,092 110 0,083 111 0,075 112 0,067  113 0,058 114 0,050 115 0,042 116 0,033  117 0,025 118 0,017 119 0,008  120 0	0,40—0,58 0,39—0,58 0,38—0,57 0,38—0,56 0,37—0,55 0,36-0,54 0,35—0,54 0,34—0,53 0,34-0,52 0,33-0,51 0,32—0,50  0.31—0,49  0,30—0,49 0,30—0,48 0,29—0,47 0,28—0,46 0,27—0,45 0,27-0,44 0,26—0,43 0,25—0,43 0,24—0,42 0,24—0,41 0,23—0,40 0,22—0,39 0,21—0,38 0,21—0,37 0,20—0,36 0,19—0,36 0,18—0,35 0,18—0,34 0,17—0,33  0,16—0,32 0,15-0,31 0,15—0,30  „0,14—0,29 „,133—0,28  0,126-0,27  0,119—0,26  0,112—0,26 0,105-0,25  0,098-0,24 0,092—0,23 0,085—0,22  0.078-0,21  0,072—0,20 0,065—0,19 0,059—0,18 0,053—0,17 0,047—0,16 0,041-0,15 0,035—0,138 0,029—0,128 0,024—0,117 0,018-0,106 0,013—0,095 0,009—0,083 0,005—0,071 0.002—0,059 0	—0,046  0	—0,030	

WH — число исследованных лунок; Wo — число отвечающих микрокультур; Fo —доля
доверительных интервалов1

	WH = 180								
	Пределы доверн- , тельного интерва- ла с 95%-ной вероятностью			Пределы довери- тельного интерва- ла с 95%-ной вероятностью			Пределы довери- тельного интерва- ла с 95%-ной вероятностью		
	W.	F.	Нижний Верхний	w„	F„	Нижний Верхний	w„	Fo	Нижний Верхний
	0 1	1  0,99	0,98—1  0,97—1	61	0,66	0,59-0,73	121	0,33	0,26—0,40
	2	0,99	0,96—1	62	0,66	0,58-0,72	122	0,33	0,26—0,40
	3	0,98	0,95—1	63	0,65	0,58—0,72	123	0,32	0,25—0,39
	4	0,98	0,94—0,99	64	0,64	0,57—0,71	124	0,31	0,24—0,38
	5	0,97	0,94—0,99	65	0,64	0,56—0,71	125	0,31	0,24—0,38
	6	0,97	0,93—0,99	66	0,63	0,56—0,70	126	0,30	0,23—037
	7	0,96	0,92—0,98	67	0,63	0,55—0,70	127	0,29	0,23—037
	8	0,96	0,91—0,98	68	0,62	0.55—0,69	128	0,29	0,22—0,36
	9	0,95	0,91—0,98	69	0,62	0,54—0,69	129	0,28	0.22—0^36
	10	0,94	0,90—0,97	70	0,61	0,54—0,68	130	0.28	0,21—0’35
	11	0,94	0,89—0,97	71	0,61	0,53—0,68	131	0,27	0,21—0,34
	12	0,93	0,89—0,97	72	0,60	0,52—0,67	132	0,27	0,20—0,34
	13	0,93	0,88—0,96	73	0,59	0,52—0,67	133	0,26	0,20—033
	14	0,92	0,87—0,96	74	0,59	0,51-0,66	134	0,26	0,19—033
	15	0,92	0,87—0,95	75	0,58	0,51—0,66	135	0,25	0,19—032
	16	0,91	0,86—0,95 .	76	0,58	0,50—0,65	136	0,24	0,18—031
	17	0,91	0,85—0,94	77	0,57	0,50-0,64	137	0,24	0,18—0,31
	18	0,90	0,85—0,94	78	0,57	0,49—0,64	138	0,23	0,17—0,30
	19	0.89	0,84—0,94	79	0,56	0,49—0,63	139	0,23	0,17—0,30
	20	0,89	0.83—0,93	80	0.56	0,48—0,63	140	0,22	0,16—0,29
	21	0,88	0,83—0,93	81	0,55	0,47—0,62	141	0,22	0,16—0^28
	22	0,88	0,82—0,92	82	0,54	0,47—0,62	142	0,21	0,15—0,28
	23	0,87	0,81—0,92	83	0,54	0,46—0,61	143	0,21	0,15—0,27
	24	0,87	0,81—0,91	84	0,53	0,46-0,61	144	0,20	0,14—0,27
	25	0,86	0,80—0,91	85	0,53	0,45—0,60	145	0,19	0.14—0,26
	26	0,86	0,80—0,90	86	0,52	0,45—0,60	146	0,19	0,135—9,25
	27	0,85	0,79-0,90 •	87	0,52	0,44—0,59	147	0,18	0.130—0,25
	28	0,84	0,78—0,89	88	0,51	0,44—0,59	148	0,18	0,125—0^24
	29	0,84	0,78—0,89	89	0,51	0,43—0,58	149	0,17	0,120—0,24
	30	0,83	0.77—0,88	90	о.ьо	0,42—0,58	150	0,17	0.116—0,23
	31	0,83	0,76—0,88	91	0.49	0,42—0,57	151	0,16	0,111—032
	32	0,82	0,76—0,87	92	0,49	0,41—0,56	152	0,16	0,106—032
	33	0,82	0,76—0,87	93	0,48	0,41—0,56	153	0,15	0,101—0,21
	34	0,81	0,75—0,87	94	0,48	0,40—0,55	154	0,14	0,097—0,20
	35	0,81	0,75—0,86	95	0,47	0,40-0,55	155	0,14	0,092—0,20
	, 36	0,80	0,74—0,86	96	0,47	0,39—0,54	156	0,133	0,087—0,19
	37	0,79	0,73—0,85	97	0,46	0,39—0,54	157	0,128	0,083—0,19
	38	0,79	0,73—0,85	98	0,46	0,38—0,53	158	0,122	0,078—0,18
	39	0,78	0,72—0,84	99	0,45	0,38—0,53	159	0,117	0,074—0,17
	40	0,78	0,71—0,84	100	0,44	0,37—0,52	160	0,111	0,069—0,17
	41	0,77	0,70—0,83	101	0,44	0,37—0,51	161	0,106	0,065—0016
	42	0,77	0,70—0,83	102	0,43	0,36—0,51	162	0,100	0,60 —0,15
	43	0,76	0,69—0,82	103	0,43	0,36-0,50	163	0,094	0^056—0,15
	44	0,76	0,69—0,82	104	0,42	0,35—0,50	164	0,089	0,051—0,14
	45	0,75	0,68—0,81	105	0,42	0,34—0,49	165	0,083	0’047—0,134
	46	0,74	0,67—0,81	106	0,41	0,34—0,49	166	0,078	0,043—0,127
	47	0,74	0,67—0,80	107	0,41	0,33—0,48	167	0,072	0 039—0,121
	48	0,73	0,66—0,80	108	0,40	0,33—0,48	168	0,067	0,035—0,114
	49	0,73	0,66—0,79	109	0,39	0,32—0,47	169	0,061	0,031—0,107
	50	0,72	0.65—0,79	110	0,39	0,32—0,46	170	0,056	0,027—0,100
	51	0,72	0,64—0,78	111	0,38	0,31—0,46	171	0,050	0,023—0,093
	52	0,71	0,64—0,78	112	0,38	0,31—0,45	172	0,044	0,019—0,086
	53	0,71	0,63—0,77	113	0,37	0,30—0.45	173	0,039	0,016—0,079
	54	0,70	0,63—0,77	114	0,37	0,30—0.44	174	0,033	0,012—0,072  0,009—0,064
	55	0,69	0,62—0,76	115	0,36	0,29—0,44	175	0,028	
	56	0,69	0,62—0,76	116	0,36	0,29—0,43	176	0,022	0.006—0,056
	57	0,68	0,61—0,75	117	0,35	0,28—0,42	177	0,017	0,004—0,48
	58	0,68	0,60—0,74	118	0,34	0,28—0,42	178	0,011	0	—0,040
	59	0,67	0,60-0,74	119	0,34	0,27-0,41	179	0,006	0	—0331
	60	0,67	0,59—0,73	120	0,33	0,27—0,41	180	0	0	—0,020

иеотвечающнх микрокультур; Заимствовано из Documenta Geicry (К. Diem, ed.), Базель.
не дают ложных отрицательных результатов, за исключением
тех случаев, когда ответ оценивают на 2-й или 3-й день. В этом
случае также рекомендуется исследовать АОК в каждой лунке.

Б. Отклонение от линейной зависимости

При вычислении частоты клеток-предшественников однознач-
но можно интерпретировать только результаты, согласующиеся
с одноударной кинетикой (прямая линия на полулогарифмиче-
ском графике). Когда результаты свидетельствуют о многоудар-
ной кинетике, т.е. многоударных кривых для системы с многими
мишенями, я просто отказываюсь от попыток рассчитать частоту
клеток-предшественников.

Если найденные на графике точки значительно отклоняются
от прямой линии, можно только сделать вывод о том, что а) от-
вет лимитирует более чем один тип клеток, б) для ответа необ-
ходимо присутствие в лунке более чем одной клетки или в) что-
бы выявить ответ, требуется более чем одна клетка.

Во многих системах in vitro диапазон клеточных концентра-
ций, при которых можно получить ответ, очень узок; иначе гово-
ря, нельзя достичь необходимого насыщения только одним видом
клеток. Примером служит модель с кроличьими лимфоцитами
(гл. 25). Если нельзя провести развернутое титрование с различ-
ными концентрациями лимфоидных клеток, то полученную ве-
личину следует называть «частотой отвечающих единиц», а не
«частотой клеток-предшественников».

В.	Доверительный интервал показателей с 95 %-мой вероят-
ностью (табл. 3)

Число микрокультур для каждой экспериментальной точки
на графике должно быть не менее 60. Если возможно, следует
использовать 120 или даже 180 культур. Чем больше культур, тем
уже доверительный 95%-ный интервал и тем лучше анализ дан-
ных. Кривая титрования, представленная на рис. 6, построена по
экспериментальным точкам, каждая из которых найдена в ре-
зультате исследования 180 культур. Вместе с тем можно видеть,
что 95%-ный доверительный интервал для некоторых экспери-
ментальных точек графика еще достаточно широк. Оценки, сде-
ланные на основании исследования 10 культур, совершенно не-
приемлемы.
Г. Эффективность стимуляции

Мы очень мало что знаем об эффективности нашей культу-
ральной системы. Известно только, что можно определить боль-
шинство из тех клонов, которые «включаются» в ответ. Вместе с
тем неизвестно, какой процент клеток-предшественников вовле-
кается по сравнению с ответом in vivo. Более того, мы не знаем
также, существует ли пул клеток-предшественников, которые
уже предетерминированы к выработке специфических антител, но
еще не чувствительны к антигену (вместе с тем, возможно, чувст-
вительны к митогену).

Д. Отсроченная оценка

Когда ответ оценивают по числу антителообразующих клеток
(в обычных культурах и микрокультурах), определение следует
проводить в момент его максимального проявления. Реакция ге-
молитического пятна измеряет антитела, накопившиеся в куль-
туральной жидкости, поэтому эта реакция будет положительной,
если даже клон прекратил свое существование. В какое бы время
культивирования ни образовались антитела, они могут быть об-
наружены данной реакцией. Благодаря этому учет результатов
при необходимости можно отложить на несколько дней после
пика антителообразования, что является одной из удобных осо-
бенностей метода.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Рекомендуемая литература

Lefkovits I. (1974). Precommitment in the immune system, Curr. Top. Micro-
biol. ImmunoL, 65, 21.

Lefkovits I., Quintins J., Munro A., Waldmann H. (1975). T-cell dependent
mediator and В-cell clones, Immunology, 28, 1149.

Luria S. E., DelbrUck M. (1943). Mutation of bacteria from virus sensitivity
to virus resistance, Genetics, 28, 491.

Цитируемая литература

Lefkovits I. (1972). Eur. J. ImmunoL, 2, 360.

Lefkovits I., Kamber 0. (1972). Eur. J. ImmunoL, 2, 365.

Quintans J., Lefkovits I. (1973). Eur. J. ImmunoL, 3, 392.

Quintans J., Lefkovits I. (1974). Eur. J. ImmunoL, 4, 617.

Waldman H., Lefkovits I., Quintans J. (1975). Immunology, 28, 1135.
Глава 28

ПОЛУЧЕНИЕ И ПОДДЕРЖАНИЕ ЛИНИЙ
МЫШИНЫХ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК
В КУЛЬТУРЕ

М. Шрейер, Б. Вейман

I,	НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА

Клоны мышиных В- и Т-лимфом — это однородные клеточные
популяции, в которых лимфоидные клетки находятся на различ-
ных стадиях дифференцировки. Они быстро размножаются
in vivo или дают перевиваемые культуры in vitro; поэтому их
можно использовать для изучения любого рецептора, гетеро- и
аллоантигенов. Такие исследования позволяют лучше понять
структурную и функциональную гетерогенность различных кле-
точных популяций, входящих в состав иммунной системы. Пре-
имущество размножения клеток in vitro состоит в том, что при
этом исключается как примесь других клеток хозяина, так и пас-
сивная адсорбция продуктов этих клеток (например, антител):
и то и другое — возможная причина неправильных выводов. Кро-
ме того, культивируемые клетки можно отбирать по различным
свойствам для дальнейшего размножения, выяснять особенности
их роста и их потребности, а также производить отбор мутантов.

В этой главе описаны методы, которыми мы пользуемся, что-
бы получить размножающиеся in vitro клеточные линии из ти-
мом, спонтанно возникших у мышей AKR, и лимфосарком, инду-
цированных вирусом мышиной лейкемии Эбелсона (A-MuLV).
Индукцию опухолей вирусом A-MuLV in vivo мы опишем под-
робно.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

А. Тимомы мышей AKR

Мыши AKR исходно были выведены как инбредная линия с
высокой частотой спонтанных лейкемий. Тимомы, возникающие
у мышей AKR, обусловлены вертикальной (генетической) пере-
дачей эндогенного опухолеродного вируса. Как показал Гросс
(1951), тимомы могут также передаваться горизонтально путем
инокуляции бесклеточного экстракта, полученного из опухолей
мышей AKR новорожденным мышам СЗН, у которых частота
спонтанных лейкемий исключительно низка. Приблизительно у
50% инокулированных мышей СЗН развивается лейкемия в воз-
расте от 8 до 11 мес. Частота лейкемии у различных сублиний
мышей AKR значительно варьирует (Acton et al., 1973) и может
достигать 90% в возрасте 9 месяцев. Опухолевые клетки несут
0-антиген на своей поверхности. Клетки наиболее часто исполь-
зуемой сублинии AKR/J несут антиген Thy 1.1 (традиционное на-
именование — О'-AKR), тогда как другие сублинии, как, напри-
мер, AKR-Cum, имеют антиген Thy 1.2 (О-СЗН) (Acton et al.,
1973).

Б. Лимфосаркомы, индуцированные вирусом A-MuLV

Эбелсон и Рэбстейн (1970) выделили новый тип . вируса
A-MuLV после того, как они ввели вирус мышиной лекемии Мо-
лони (Mo-MuLV) мышам В ALB/c, у которых с помощью кортико-
стероидов была вызвана и поддерживалась атрофия тимуса.
Введение вновь выделенного вируса новорожденным мышам уже
через 3—4 недели приводит к возникновению у животных опухо-
лей костного мозга, мозговых оболочек и периферических лим-
фатических узлов. Тимус не поражался. Как показали Шер и
Зиглер (Scher, Siegler, 1975), вирусный комплекс Эбелсона со-
держит два вирусных РНК-генома С-типа. Компонент Эбелсона
трансформирует фибробласты мышей BALB/c и NIH-3T3 в ок-
руглые клетки с очаговым расположением. Эту трансформацию
можно использовать для количественного анализа. Вспомога-
тельную активность вируса Mo-MuLV в этом комплексе можно
количественно оценить методом ХС-бляшек (Rowe et al., 1970).

Чтобы получить линии клеток, перевиваемых in vivo, берут
либо опухоли, либо опухолевые клетки из селезенки и лимфати-
ческих узлов

III.	РЕАГЕНТЫ, ЖИВОТНЫЕ, КЛЕТКИ И ВИРУСЫ

А. Солевые растворы и среды

Используют следующие солевые растворы:

1)	сбалансированный солевой раствор Хэнкса (СРХ): 0,14 г
СаС12, 0,4 г КС1, 0,06 г КН2РО4, 0,1 г MgCl2-6H2O, 0,1 г
MgSO4-7H2O, 8 г NaCl, 0,35 г NaHCO3, 0,06 г Na2HPO4-2H2O,
0,01 г фенолового красного на 1 л дистиллированной воды;

2)	забуференный фосфатами физиологический раствор (ЗФР):
0,1 г СаС12, 0,2 г КН2РО4, 0,2 г КС1, 0,1 г MgCl2-6H2O, 8,0 г
NaCl и 1,15 г Na2HPO4-2H2O на 1 л дистиллированной воды.

Модифицированную Дульбекко среду Игла (МСИД) и мини-
мальную основную среду Игла (МСИ) получают от Grand Island
Biological Company (Gibco, США) или от Flow Laboratories, Inc.
(Ирвин, Шотландия).

В среду добавляют 2мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия,
10 мМ ГЭПЭС-буфера (pH 7,3), антибиотики и 5-10~5М 2-мер-
кйптоэтанола. Лошадиную сыворотку и сыворотку плода коровы
инактивируют прогреванием (30 мин, 56°С) и используют в
20- и 10%-ной конечной концентрации соответственно.

Б. Животные

Старые мыши AKR/J как источник спонтанных опухолей и мо-
лодые сингенные мыши, необходимые для серийной перевивки
опухолей in vivo, а также мыши BALB/c обычно имеются в про-
даже. Для индукции опухоли Эбелсона используют новорожден-
ных мышат разных линий, но, как правило, предпочитают
BALB/c.

В. Клеточные линии

Клетки NIH-3T3 (клон I) (Jainchill et al., 1969) хранят в МСИ
с 10%-ной сывороткой плода коровы. Клетки ХС (Svoboda et al.,
1963) (крысиные опухолевые клетки, индуцированные пражским
штаммом вируса саркомы Рауса, Pr-RSV) поддерживают в МСИ
с 10%-ной сывороткой плода коровы (СПК), как описано Кле-
ментом и сотр. (1969). Клетки SC-I сохраняют в МСИ с 5%-ной
сывороткой плода коровы (Hartley, Rowe, 1975).

Г. Вирусы

Вирусы Эбелсона можно получить либо из бесклеточных экс-
трактов солидных опухолей, либо из культуры клеток, трансфор-
мированных вирусом A-MuLV. Такие клетки непрерывно проду-
цируют и выделяют вирусы в культуральную среду (см. разд. IV).

IV.	МЕТОДИКА

А. Подготовка и испытание вируса

1.	Вирус из солидных опухолей

Вирусы из солидных опухолей готовят по Молони (Moloney,
1960) и Эбелсону и Рэбстейну (Abelson, Rabstein, 1970). Около
10 г опухолевой ткани гомогенизируют в 90 мл 0,153М раствора
цитрата калия (pH 7,0) с 1,5 мг гиалуронидазы при помоши го-
могенизатора Поттера (20 движений пестика). Гомогенат пере-
мешивают при комнатной температуре в течение 1 ч, затем дваж-
ды центрифугируют при 2500g 20 мин. Надосадочную жидкость
центрифугируют 10 мин при 10 000g, осадок отбрасывают, а
надосадочную жидкость повторно центрифугируют в течение 1 ч
при 100 000g. Осажденный вирус ресуспендируют в 0,05 М раство-
ре цитрата натрия (pH 6,8) и центрифугируют 10 мин при
10 000g. Инфекционные вирионы после центрифугирования рас-
полагаются вблизи центра пробирки.

2.	Вирус из культуральной среды

Трансформированные вирусом A-MuLV клетки при культи-
вировании непрерывно вырабатывают вирус и выделяют его в
среду, из которой его осаждают центрифугированием в течение
1 ч при 100 000g. Осадок ресуспендируют в небольшом объеме
раствора, состоящего из 0,14М NaCl, 0,05 М трис-НС1 (pH 7,4)
и 0,1 мМ ЭДТА, и центрифугируют в линейном градиенте са-
харозы (20—60%) в течение 3 ч при 40 000 об/мин в роторе
Beckman Spinco SW41. Вирус локализуется в основном в слое
плотностью 1,16 г/см3. Из большого объема культуральной сре-
ды вирус целесообразно сначала сконцентрировать на фильтра-
ционном аппарате фирмы Amicon.

3.	Прямая трансформация клеток ЗТЗ вирусом

мышиной лейкемии Эбелсона

Трансформацию проводят по Шеру и Зиглеру (Scher, Siegler,
1975). Клетки BALB/c-ЗТЗ или NIH-3T3 трипсинизируют за
1 день до инокуляции вируса и 1—2-105 клеток высевают на пла-
стиковые чашки (диаметром 6 см) со свежей средой, содержа-
щей 6—8 мкг/мл полибрена1 (Aldrich Chemical Со., Милуоки,
США). Среду удаляют и клетки заражают вирусом в 5 мл све-
жей среды. Перед использованием вирусные препараты пропус-
кают через миллипоровые фильтры (с размером пор 0*45 мкм).
Среду меняют на 5-й день, очаги трансформации учитывают на
8-й или 10-й день. Их образуют округлые клетки, выделяющие-
ся на фоне фибробластов.

4.	Метод ХС-бляшек

Этот метод подробно описали Роу и сотр. (Rowe et al., 1970).
Для титрования вируса-помощника в комплексе Эбелсона мож-

1 Бромид гексадиметрина (С^НзоВгзЫз) — антагонист гепарина. — Прим,
ред.
но использовать клетки BALB/c-3T3, NIH-3T3 или SC-1.
Клетки BALB/c-ЗТЗ (A3I) и NIH-3T3 хранят в МСИД с 10%-
ной сывороткой плода коровы, а клетки SC-1 — в МСИ с 10%-
ной сывороткой. За 1 день до инокуляции вирусом клетки трип-
синизируют и в количестве 2-106 высевают на пластиковую
чашку диаметром 6 см. Через 24 ч среду удаляют и к клеткам
добавляют 0,5 мл вирусной суспензии в 5 мл полной среды. Чаш-
ку затем инкубируют 4 дня при 37°С. Среду удаляют, а клетки
облучают ультрафиолетом. Необходимое расстояние между ис-
точником УФ и чашкой, а также время облучения, убивающего
клетки, надо определить в предварительных опытах. Облучен-
ные клетки затем засевают ХС-клетками (106 на чашку) и ин-
кубируют 2 дня при 37°С во влажной атмосфере с 5% СОг. Среду
удаляют и чашку однократно промывают ЗФР. Бляшки можно
учитывать сразу под стереоскопическим микроскопом или после
окрашивания в течение, 7 мин смесью, состоящей из 3 частей
1%-ного раствора метиленового синего в метаноле, 2 частей ме-
танола и 1 части раствора карболового фуксина, после чего
чашки промывают и подсчитывают бляшки. Интактные клетки
выглядят темно-синими, а синцитий — розоватым. (Hartley,
Rowe,. 1975.)

5.	Индукция и развитие опухолей Эбелсона

Мышатам через 12—24 ч после рождения вводят внутри-
брюшинно 0,05 мл вирусной суспензии. Спустя 3—4 недели (ла-
тентный период) появляются опухоли в лимфатических узлах,
костном мозге, селезенке и мозговых оболочках (рис. 1). Опухо-
ли можно также индуцировать у молодых половозрелых мы-
шей, введя им внутрибрюшинно 0,05 мл легкого минерального
масла пристана (2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекан) с последую-
щей инокуляцией вируса (Potter et al., 1973).

Б. Получение и поддержание роста клеточных линий
на ранних этапах культивирования

Методика получения клеточных линий из тимом мышей AKR
и из лимфосарком Эбелсона в основном сходна. Опухоли извле-
кают в асептических условиях и помещают в пластиковые чаш-
ки, содержащие 10 мл СРХ. Соединительную ткань удаляют, а
опухоли измельчают, пользуясь пинцетом и ножницами. Этот
метод, по-видимому, следует предпочесть продавливанию через
стальное сито, так как, по нашим данным, он дает in vitro более
высокий выход клеток. Большие агрегаты клеток и оставшиеся
кусочки соединительной ткани (оседающие на дно в течение 2—
3 мин) отбрасывают. Клеточную суспензию центрифугируют
10 мин при 170g, дважды отмывают в СРХ и затем высевают на
Рис. 1. Появление опухолей у мышей линии BALB/c после воздействия виру-
сом лейкемии Эбелсона

среду МСИД в концентрациях 2,5 и 10-105 ядерных клеток на
1 мл. Для культивирования пользуются пластиковыми флако-
нами на 25 см3 или чашками Петри. Жизнеспособность клеток
измеряют по исключению трипанового синего в 0,05%-ном
растворе. Культуры инкубируют при 37°С во влажной атмосфере
с 5% СОа- Каждый 3-й день половину объема среды осторожно
удаляют с помощью пастеровской пипетки, соединенной с насо-
сом, не нарушая клеточного слоя, покрывающего дно фла-
кона.

Лимфосаркомы Эбелсона, как правило, лучше адаптируются
к росту in vitro, чем тимомы. Через 10—14 дней в суспензии по-
являются быстро делящиеся клетки. В концентрации Ы05/мл
клетки переносят в новые флаконы, где они размножаются до
концентрации 4—6-106/мл. Более высокий выход клеток полу-
чается при культивировании во вращающихся флаконах. Многие
из культур, полученных нами из тимом AKR, переживали дли-
тельный период интенсивной гибели клеток, и приблизительно
через 10 дней в них оставалось лишь небольшое число живых
клеток. Смену среды производили до 3-й недели. В большинстве
из этих культур затем появлялись очаги пролиферации, которые
быстро росли, достигая предельной концентрации. В некоторых
случаях клетки из культур с низкой жизнеспособностью собира-
ли и вводили подкожно сингенным реципиентам. При повторной
эксплантации эти клетки росли более успешно.

Необходимо как можно скорее установить время удвоения и
предельные концентрации клеток по кривой роста различных
клеточных линий. Полученные линии можно легко потерять в ре-
зультате «перенаселения»; в частности, тимомы AKR погибают
в течение нескольких часов после достижения предельной кон-
центрации.

Образцы полученной клеточной линии следует хранить в за-
мороженном состоянии. Около 5-106 клеток/мл суспендируют в
среде, содержащей 20% сыворотки плода коровы или лошади-
ной сыворотки и 10% диметилсульфоксида (ДМСО) по объему.
Флаконы обертывают губчатой резиной или бумагой, чтобы соз-
дать условия для медленного замораживания. Продержав фла-
коны 24 ч при —70°С, переносят их в жидкий азот. При такой
методике замораживания клетки после оттаивания всегда про-
являют высокую жизнеспособность. Целесообразно также замо-
розить и клетки исходной,опухоли, чтобы сохранить образцы кле-
ток с исходными свойствами.

V. КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА

Около 3/4 тимом AKR успешно адаптируются к росту in vit-
ro при первой попытке; остальная часть тимом адаптируется
после второго пассажа через животное. Среди опухолей, инду-
цированных вирусом A-MuLV, показатель адаптации к росту
in vitro приближается к 100%. Высокий уровень гибели клеток
в первые дни культивирования in vitro, вероятно, отражает не-
адекватность условий. Факторы роста и питательные вещества,
доступные in vivo, иногда отсутствуют in vitro или находятся
в недостаточном количестве.
В результате многочисленных сравнительных исследований
культур различных тимом AKR на средах с разными добавка-
ми мы пришли к выводу, что разные культуры могут требовать
различных условий для роста. Добавка 2-меркаптоэтанола под-
держивала рост одних опухолевых клеток и не действовала
на другие. Сравнительные эксперименты с использованием сы-
воротки плода коровы, лошадиной сыворотки и смеси их обеих
позволили предположить, что и в этом отношении требования
разных опухолей различны. Полагая, что рост некоторых тимом
зависит от тимусных гормонов, мы в ряде случаев на ранних
этапах культивирования добавляли экстракты тимуса. Благо-
приятный эффект наблюдался только в некоторых случаях.
Однако такая стимулирующая рост активность не бы-
ла тимус-специфичной — экстракты других органов, на-
пример легких, оказались даже более эффективными
(G. Sato, М. Н. Schreier, неопубликованные наблюдения). Кор-
реляции между числом пассажей in vivo и способностью опухо-
левых клеток адаптироваться к росту in vitro не выявлено. ,К это-
му выводу мы пришли на основании исследования клеточных ли-
ний, полученных из опухолей AKR и поддерживаемых несколько
лет путем пассирования in vivo (Kramer et al., 1976). Некоторые
признаки клеточных линий тимом весьма устойчивы. O'-антиген
оставался выраженным на протяжении свыше 100 пассажей in
vitro. В линии F (Krammer et al., 1976), полученной in vitro,
после 22 пассажей in vivo Fc-рецептор был выявлен у 40—60%
клеток. Из 50 клонов, полученных от этой линии, у четырех Fc-
рецептор выявлялся на всех клетках, но одна сублиния (клон
29) не обладала Fc-рецептором (L. Forni, неопубликованные
данные). Эти клоны сохраняли свои признаки на протяжении
почти 100 пассажей in vitro. Потомство клеток, взятых из «пе-
ренаселенных» культур, теряет поверхностный маркер.

Лимфосаркомы Эбелсона, как правило, легко адаптируются
к росту in vitro. Описанный метод отбирает неприлипающие
клетки. Однако в некоторых случаях мы получали значительные
количества прилипающих клеток. В отличие от других авторов
(Premkumar et al., 1975) мы не обнаружили на клетках поверх-
ностные маркеры, такие, как иммуноглобулины, Fc-рецепторы и
O'-антигены. Имеются сообщения о трансформации in vitro кле-
ток мышиной селезенки, эмбриональной печени и костного моз-
га (Rosenberg, Baltimore, 1976).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Рекомендуемая литература

Pollack R., ed. (1973). Readings in Mammalian Cell Culture, Cold Spring Har-
bor Lab., Cold Spring Harbor, New York.

Tooze J., ed. (1973). The Molecular Biology of Tumor Viruses, Cold Spring Har-
bor Lab., Cold Spring Harbor, New York.

Цитируемая литература

Abelson H. T., Rabstein L. S. (1970). Cancer Res., 30, 2213.

Acton R. T., Blankenhorn. E. P., Douglas T. C., Owen. R. D., Hilgers J., Hoff-
man H. A., Boyse E. A. (1973). Nature New Biol., 245, 8.

Gross L. (1951). Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 76, 27.

Hartley J. W., Rowe W. P. (1975). Virology, 65, 128.

Jainchill J. L., Aaronson S. A., Todaro G. J. (1969). J. Virol., 4, 549.

Klemeni V., Rowe IF. P., Hartley J. W., Pugh IF. E. (1969). Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 63, 753.

Krammer P. H., Citronbaum R., Read S. E., Forni L., Lang R. (1976). Cell.

ImmunoL, 21, 97.

Moloney J. B. (1960). J. Natl. Cancer Inst., 24, 933.

Petter M., Sklar M. D., Rowe W. P. (1973). Science, 182, 592.

Premkumar E., Potter M., Singer P. A., Sklar M. D. (1975). Cell, 6, 149.

Rosenberg N., Baltimore D. (1976). J. Exp. Med., 143, 1453.

Rowe IF. P., Pugh IF. E., Hartley J. IF. (1970). Virology, 42, 1136.

Scher C. D., Siegler R. (1975). Nature (London), 253 , 729.

Svoboda J., Chyle P. P., Simkovis D., Hilgert I. (1963). Folia Biol. (Prague),
9, 77.
КЛОНИРОВАНИЕ КЛЕТОК В ПОЛУЖИДКОЙ
ИЛИ ВЯЗКОЙ СРЕДЕ

Н. Искоув, М. Шрейер

I.	ВВЕДЕНИЕ

Культуру клеток в полужидкой или вязкой среде широко
используют для селекции клонов, подсчета потомства специфи-
чески реагирующих клеток и изучения механизмов, контроли-
рующих пролиферацию и дифференцировку клеток. При различ-
ных вариантах метода в качестве поддерживающей среды при-
меняют свернутую плазму (McLeod et al., 1974), агаровый гель
или раствор метилцеллюлозы. В этой главе будут описаны экспе-
риментальные методики, в которых используются агар и метил-
целлюлоза.

Свойства агара и метилцеллюлозы совершенно различны.
При нагревании агар растворяется в воде, а при остывании об-
разуются водородные межмолекулярные связи, так что получа-
ется полужидкий гель. Метилцеллюлоза в отличие от агара оста-
ется водорастворимой в термостате и на холоду. Она фиксирует
положение клеток без гелеобразования благодаря одной лишь
высокой вязкости раствора.

Основное преимущество агара перед метилцеллюлозой —
удобство в обращении. Агар можно переносить пипеткой и сме-
шивать с другими ингредиентами непосредственно в посуде для
культивирования, тогда как метилцеллюлозу из-за ее высокой
вязкости приходится переносить шприцем и смешивать с дру-
гими ингредиентами предварительно — до нанесения на чашки
или пластиковые пластины. Вместе с тем метилцеллюлоза име-
ет некоторые преимущества перед агаром. Она химически лучше
охарактеризована и более инертна по сравнению с неочищен-
ными препаратами агара, которые обычно используются для
культуры тканей. Она не содержит примесей, обладающих ми-
тогенной активностью. Благодаря тому что метилцеллюлоза
растворима в воде при комнатной температуре и температуре ин-
кубации, из нее легко можно извлечь клетки для непосредствен-
ного анализа, дальнейшего культивирования, цитогенетических
исследований [см. Aye et al. (1973)—цитогенетический метод
исследования единичных колоний] и т. д. Наконец, в метилцел-
13*
люлозе значительно облегчается учет малых колоний в резуль-
тате их распределения в одной плоскости на поверхности пласти-
ны благодаря медленному свободному оседанию клеток.

II.	РЕАГЕНТЫ

А. Двукратный концентрат среды

Сухую среду, бикарбонат натрия и другие дополнительные
ингредиенты, взятые в количествах, необходимых на 1 л среды,
растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

Б. Приготовление агара

Для клонирования клеток обычно используют среды, содер-
жащие 0,3% агара (0,3%-ный раствор атара иногда называют
«мягким», а 0,5%-ный — «твердым»; последний используют для
приготовления нижних, или питательных, слоев, когда важно
жестко иммобилизовать клетки. Однако при таких высоких кон-
центрациях агара клеточный рост сильно подавляется. Добавля-
ют 1 г агара (Бактоагар Difco) к 100 мл дистиллированной воды
и кипятят в колбе Эрленмейера. Этот раствор помещают в во-
дяную баню при 43°С; при такой температуре раствор агара не
застывает. (Образование геля происходит при комнатной тем-
пературе. В таком виде его можно хранить. Перед использова-
нием агар растапливают, поместив на кипящую водяную баню.)

В. Приготовление раствора метилцеллюлозы

Один литр 2%-ного раствора метилцеллюлозы (2,5-кратный
концентрат) готовят следующим образом. Взвешивают стериль-
ную двухлитровую колбу Эрленмейера, в нее наливают 450 мл
дистиллированной воды и доводят до кипения над пламенем бун-
зеновской горелки. В колбу всыпают 20 г порошка метилцеллю-
лозы и неплотно закрывают алюминиевой фольгой. Порошок
тщательно ресуспендируют интенсивными круговыми движе-
ниями колбы, пока не останется ни одного комочка. Колбу
вновь нагревают до момента закипания, после чего сразу же
удаляют от пламени (метилцеллюлоза частично гидролизуется
при высокой температуре, что вызывает снижение вязкости,
поэтому следует избегать автоклавирования и длительного ки-
пячения ее растворов; по нашему опыту кратковременного кипя-
чения, описанного выше, вполне достаточно для стерилизации).
Затем суспензию охлаждают до 40—50°С под струей водопровод-
ной воды, приливают 500 мл 2-кратного концентрата среды для
культивирования (комнатной температуры) вместе с другими не-
обходимыми добавками. Содержимое колбы вновь тщательно пе-
ремешивают круговыми движениями, после чего вес содержимо-
го колбы доводят дистиллированной водой до 1006 г (добавляе-
мая вода возмещает потерю воды при нагревании). После оче-
редного тщательного перемешивания колбу погружают в лед на
1—2 ч. В течение этого времени растворится наибольшее (но
не все) количество метилцеллюлозы. Ставший достаточно вяз-
ким раствор аккуратно разливают по 70—80 мл в стерильные
100-миллилитровые флаконы. Флаконы хранятся при —20°С не-
определенно долго. Перед использованием среду оттаивают при
4°С в течение 2 дней. За это время растворяются остатки неги-
дратированной метилцеллюлозы и раствор достигает максималь-
ной вязкости. Однако никогда не наблюдается полного растворе-
ния и всегда остается некоторое количество прозрачных хлопьев
и волокон целлюлозы. Они не влияют на культуру, однако лучше
их удалить центрифугированием (15000g, 2—3 ч), соблюдая сте-
рильность. Рабочий раствор можно хранить при 4°С не менее
4-6 недель.

III.	МЕТОДИКА

В этом разделе описывается приготовление 35-миллиметро-
вых панелей для культивирования; каждая содержит 1 мл куль-
туральной смеси с агаром или метилцеллюлозой. Количества
отдельных ингредиентов смеси, например концентрацию сыво-.
ротки, выбирают произвольно.

А. Приготовление агаровых культур

100 мл полной агаровой среды готовят, смешивая 30 мл 1%-
ного раствора агара (при 43°С) с 70 мл смеси (при 37°С) ука-
занного ниже состава.

Двукратный концентрат
среды (с добавлением
глутамина, антибиоти-
ков и т. д., как требу-
ется)

Сыворотка

Другие ингредиенты, не-
обходимые для конкрет-
ных исследований

Неконцентрированная
среда

30 мл

10 мл

До общего
объема 70 мл

Агаровую среду помещают на водяную баню при 37°С. Кле-
точную суспензию (меньше 5% от общего объема) прибавляют в
полную агаровую среду непосредственно перед нанесением на
панели и равномерно диспергируют. Если оценивают несколько
типов стимуляторов или их концентрации, то стимуляторы мож-
но поместить в чашки перед прибавлением агаровой смеси, со-
держащей клетки. Среду необходимо переносить быстро, чтобы
агар не успел затвердеть в пипетке. Пока не образовался гель,
внесенный материал перемешивают и равномерно распределяют
по поверхности чашки плавными круговыми движениями. Дав
образоваться гелю при комнатной температуре (3—4 мин), чаш-
ки переносят в термостат, в котором во избежание испарения
поддерживают влажность, близкую к 100%. При культивирова-
нии свыше 7 дней агаровые культуры можно «подпитывать», на-
слаивая сверху 1—2 мл жидкой среды.

Б. Приготовление метилцеллюлозных культур

Необходимые ингредиенты добавляют в 15-миллилитровую
пластиковую пробирку Falcon в следующем порядке: сыворотка,
0,25 мл; стимулятор (например, ЛПС, 0,5 мг/мл), 0,25 мл; куль-
туральная среда, 0,65 мл; 2%-ный раствор метилцеллюлозы,
1,0 мл. Эти компоненты осторожно смешивают вручную. Затем
добавляют 0,1 мл клеточной суспензии в культуральной среде и
осторожно перемешивают в течение нескольких секунд в миксе-
ре Vortex. Конечный объем смеси доводят культуральной средой
до 2,5 мл; этого объема хватает на две пластинки.

Основной раствор метилцеллюлозы слишком вязок, чтобы его
переносить пипеткой, поэтому пользуются пластиковым шпри-
цем, снабженным иглой № 15 или 16. Точно отмеренное количест-
во раствора помещают вблизи дна пластиковой пробирки. Ко-
нечную смесь также переносят шприцем. Так как она не такая
вязкая, как основной раствор метилцеллюлозы, ее можно перене-
сти на панель через иглу меньшего калибра (№ 18). Один мил-
лилитр смеси помещают в центр панели и затем круговыми
движениями, наклоняя панель, равномерно распределяют по
всей поверхности, позволяя смеси растекаться до краев панели.

Конечная концентрация метилцеллюлозы составляет около
0,8%. Наилучший рост наблюдается в том случае, когда вяз-
кость среды такова, что позволяет клеткам осесть на дно пане-
ли за 24 ч, но в то же время исключает явные смещения клеток
при исследовании панелей под инвертированным микроскопом.
Оптимальное соотношение основного раствора метилцеллюлозы
к остальным ингредиентам, позволяющее получить смесь необхо-
димой вязкости, определяют титрованием каждой отдельной се-
рии.
IV.	ВАРИАНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ

А. Клонирование клеточных линий

Полужидкую или вязкую среду можно использовать для вы-
деления клонов клеток, не нуждающихся в подложке. Когда ко-
лонии достигнут желаемого размера, их извлекают из агара или
из метилцеллюлозы тонко оттянутой пипеткой и переносят в жид-
кие культуры.

Среди несекретирующей популяции можно идентифицировать
секретирующие клетки, наслоив сверху агар, содержащий анти-
тела к продукту секреции (Coffino, Scharff, 1971). Секретирую-
щие клоны выявляются по реакции иммунопреципитации. Анало-
гично этому можно обнаружить клоны клеток, секретирующие
антитела, наслаивая сверху агар с соответствующими сенсибили-
зированными эритроцитами и комплементом (Kohler, Milstein,
1975).

Чтобы уменьшить вероятность перекрывания клонов, время
культивирования и число засеваемых в культуру клеток необхо-
димо сократить до приемлемого минимума. Посевная концент-
рация взвеси данного типа клеток зависит от способности клеток
образовывать клоны в данных условиях культивирования. Кло-
нообразующую способность можно повысить, добавив в культу-
ру клетки, облученные высокой дозой у- или рентгеновских лу-
чей, либо жидкую среду, в которой ранее уже росли клетки
(«кондиционированная среда»), или же используя нижний слой
агара с «питающими» клетками.

Некоторые линии не могут расти в агаре. Неочищенный агар
содержит сульфатированные полисахариды и другие потенциаль-
но токсичные примеси. Чтобы связать эти полианионы, добавля-
ют ДЭАЭ-декстран (Montagnier, 1971). При использовании очи-
щенных препаратов агарозы или метилцеллюлозы таких проб-
лем не возникает. Тиоловые соединения, такие, как р-меркапто-
этанол или а-тиоглицерин, можно включать во все культуры в
концентрации 5-10-5 М, так как многие линии лимфоидных кле-
ток нуждаются в тиоловых соединениях (Broome, Jeng, 1972) и
нам неизвестны клетки, рост которых подавлялся бы такими кон-
центрациями тиоловых соединений.

Б. Клонирование Т- и В-клеток

Колонии В- и Т-клеток можно выращивать на агаре или ме-
тилцеллюлозе. Рост колоний В-клеток в метилцеллюлозе значи-
тельно усиливается при добавлении в среду 1%-ного БСА. Пе-
ред использованием альбумин следует деионизировать (Worton
et al., 1969). Подробное описание этой методики можно найти в
литературе (Metcalf et al., 1975 a, b, 1976; Metcalf, 1976; Johnson
et al., 1976; Watanabe et al., 1977).

Рост этих клеток зависит от тиоловых соединений, таких,
как p-меркаптоэтанол или а-тиоглицерин, а также от соответст-
вующих митогенов, например ЛПС или ФГА для В- и Т-клеток
соответственно. Неочищенный агар содержит В-клеточный мито-
ген (Kincade et al., 1976), однако концентрацию последнего труд-
но предсказать. Для адекватной стимуляции в очищенный агар
или в метилцеллюлозу можно добавить оптимальное количество
известного митогена.

Если метод используют для подсчета митоген-чувствительных
В- и Т-клеток или их предшественников, необходимо убедиться'
в прямой зависимости числа колоний от числа клеток, посеянных
в очень низкой концентрации. Для роста колоний В-клеток эти
условия, по-видимому, выполнимы в том случае, если культуры
содержат и ЛПС, и агаровый митоген, а не только один из них
(Kincade et al., 1976; Metcalf, 1976). При оптимальных условиях
культивирования, т. е. в присутствии ЛПС и агарового митогена,
.каждая восьмая В-клетка способна образовывать колонии или
небольшие очаги (Kurland et al., 1977); тогда как в жидких куль-
турах, в которых В-клетки растут при лимитирующих разведе-
ниях, каждая третья В-клетка способна генерировать клон под
действием одного лишь ЛПС (Andersson et al., 1977). Следова-
тельно, современные методы клонирования выявляют меньше
митоген-реактивных В-клеток, чем их существует в действитель-
ности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Рекомендуемая литература

Ham R. G. (1972). Cloning of mammalian cells, Methods Cell Physiol., 5,37—74.

Macpherson I. (1973). Soft agar technique. In: Tissue Culture Methods and Ap-
plications (P. F. Kruse, Jr. and M. K. Patterson, Jr., eds.), pp. 276—280,
Academic Press, New York.

Metcalf D., Moore M. A. S. (1971). Haemopoietic Cells, North-Holland Publ.,
Amsterdam.

Цитируемая литература

Andersson J., Coutinho A-, Lernhardt W., Melchers F. (1977). Cell., 10, 27.

Aye M. T., Till J. E., McCulloch E. A. (1973). Exp. Hematol. (Copenhagen),

Broome j. D., Jeng M. W. (1972). J. Exp. Med., 138, 574.

Coffino P., Scharff M. D. (1971). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 219.

Johnson G. R., Metcalf D., Wilson H. W. (1976). Immunology, 30, 907.

Kincade P. W., Ralph P., Moore M. A. S. (1976). J. Exp. Med., 143, 1265.

Kohler G., Milstein C. (1975). Nature (London), 256, 495.

Kurland J. I., Kincade P. W., Moore M. A. S. (1977). J. Exp. Med., 146, 1420.

McLeod D. L., Shreeve M. M., Axelrad A. A. (1974). Blood, 44, 517.
Metcalf D. (1976). J. Immunol., 116, 635.

Metcalf D., Nossal G. J. V., Warner N. L., Miller J. F. A. P., Mandel T. E.,
Layton J. E., Gutman G. A. (1975a). J. Exp. Med., 142, 1534.

Metcalf D., Wilson J. W., Shortman K-, Miller J. F. A. P., Stocker J. (1976).

J. Cell Physiol., 88, 107.

Montagnier L. (1971). Growth Control Cell Cult., Ciba Found. Symp,, 1970,
pp. 33—34, Physiol., 88, 107.

Montagnier L. .Growth Control Cell Cult., Ciba Found. Symp., 1970, pp. 33—44.

Watanabe T., Fathman C., Coutinho A. (1977). Immunol. Rev., 35, 3.

Worton R. G., McCulloch E. A., Till J. E. (1969). J. Cell Physiol., 74, 171.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВИРУСА СЕНДАЙ
ДЛЯ ГИБРИДИЗАЦИИ КЛЕТОК

Р. Тес

I. ВЫРАЩИВАНИЕ ВИРУСА

Оплодотворенные яйца кур (белых леггорнов) помещают на
И дней в инкубатор (38,5°С, относительная влажность 80—
90%, перевертывание каждые 3—4 ч).

Просматривая яйца на просвет, отмечают на скорлупе то мес-
то, против которого расположено свободное от сосудов пятно
вблизи главной пупочной артерии. Скорлупу над этим пятном
удаляют зубоврачебным бором, делая отверстие диаметром 2—
3 мм, обнажающее скорлуповую оболочку (повреждение этой
оболочки, обнаруживаемое по кровотечению, приводит к инфици-
рованию яйца; такие яйца не следует использовать). Яйца по-
мещают иа лоток и участок скорлупы около 2 см в диаметре с
просверленным отверстием в центре стерилизуют, смазывая его
горячим парафином (точка плавления 58—65°С; разогревают
примерно до 120°С, т. е. несколько ниже температуры образова-
ния дыма).

На парафинированную поверхность наносят 0,05 мл физиоло-
гического раствора, содержащего 102—103 ID50 вируса Сендай.
Скорлуповую оболочку прокалывают иглой, простерилизованной
над пламенем. Инокулюм всасывается в полость аллантоиса, где
имеется отрицательное давление. После этого отверстие запеча-
тывают, протирая тампоном, смоченным горячим парафином.

Яйца помещают на лотки воздушным пузырем (т. е. тупым
концом) вверх и держат в обычном термостате в течение 3 дней
(68—72 ч) при 35°С. После этого их охлаждают (оставив при
4°С на ночь или по меньшей мере на 3 ч), чтобы остановить кро-
вообращение и таким образом предотвратить кровотечение при
сборе вируса.

Перед сбором вируса скорлупу над воздушным пузырем раз-
ламывают и удаляют. Проколов обнаженную мембрану и ото-
двинув эмбрион в сторону с помощью стерильного пинцета, сте-
рильной пастеровской пипеткой (с коротким капилляром и жела-
тельно с широким отверстием) отсасывают аллантоисную жид-
кость. В среднем получают около 10 мл жидкости из одного
яйца со значительными индивидуальными колебаниями. Нужно
стараться не повредить амнион и желточный мешок и не про-
никнуть в яичный белок, так как при этом может загрязниться
собранная аллантоисная жидкость.

П. ТИТРОВАНИЕ ВИРУСА

В образцах аллантоисной жидкости перед их объединением и
инактивацией титруют содержание вируса, используя реакцию
гемагглютинации.

Согласно стандартизованной методике, эту реакцию ставят
либо в круглодонных пробирках диаметром 12 мм, либо (лучше)
на панелях для гемагглютинации, рекомендуемых ВОЗ (8 рядов
по 10 лунок со сферическим дном). В первую пробирку вносят
0,5 мл, а в остальные 9 пробирок — по 0,25 мл физиологического
раствора. В первую пробирку добавляют 0,05 мл аллантоис-
ной жидкости (т. е. начальное разведение 1:11, или 1,04 в лога-
рифмических единицах); затем, перенося по 0,25 мл из лунки в
лунку, делают серию двукратных разведений в интервале от
1 : 11 до 1: 5632 (от 1,04 до 3,75 логарифмических единиц). После
этого в каждую лунку вносят по 0,025 мл 5 %-ной взвеси кури-
ных эритроцитов в физиологическом растворе. Панели встряхи-
вают и помещают в холодильник при 4°С. Спустя 20 мин их
встряхивают повторно. Реакцию учитывают после 40 мин инку-
бации при 4°С.

При отсутствии агглютинации (—) осевшие эритроциты об-
разуют на дне лунки плотную пуговку, тогда как при полной
агглютинации (+ + ) они тонким розовым слоем покрывают все
дно. За конечную точку титрования условно принимают такую
степень агглютинации ( + ), при которой диаметр осадка эритро-
цитов составляет одну треть диаметра лунки. Интерполируя к
этой конечной точке, реакцию можно учесть с точностью
+0,033 логарифмической единицы (±8%); если же за конечную
точку титрования принять последнюю пробирку с полной агглю-
тинацией, то ошибка метода возрастет до ±0,27 логарифмичес-
кой единицы (±86%).

Если титрование проводят на панелях микротитратора (в
объеме 0,025 мл; первое разведение 1:2), концентрацию взвеси
эритроцитов уменьшают до 1% и смесь инкубируют дважды по
20 мин при 4°С. Ошибка метода при этом не менее ±0,2 логариф-
мической единицы (±58%).

Вычисление титров

Одна гемагглютинирующая единица (ГАЕ) —это такое коли-
чество вируса, которое вызывает агглютинацию (+) в 1 мл 1 % -
ной суспензии куриных эритроцитов. Эта единица соответствует
примерно 4-Ю7 (7,6 логарифмических единиц) вирусным части-
цам (Fazekas de St. Groth, Cairns, 1952).

Так, например, если при титровании с начального разведения
1:11 реакция ( + ) регистрируется в 6-й пробирке, то в нашей
системе будет содержаться 11-32 (25 = 32) агглютинирующих
доз. Так как реакция происходит в объеме 0,25 мл, мы должны
эту величину умножить на 4. Но, поскольку конечная концентра-
ция эритроцитов в системе равна 0,5%, а не 1%, полученную
величину нужно разделить на 2. В результате получаем титр
704 ГАЕ/мл, или 2,847 логарифмических единиц. То же самое
получается более простым способом при сложении логарифма
начального разведения с логарифмом конечной точки титрования
(т. е. умножении 0,3 на число пробирок: 0,3-6=1,8); получаем
1,04+1,8=2,84. (Различие в третьем знаке после запятой воз-
никает в результате округления логарифмов как начального раз-
ведения, 1,0414 до 1,04, так и множителя 0,30103 до 0,3 = log2).
Подсчет с использованием логарифмов пригоден и для дробных
титров. Так, при начальном разведении 1:500 с полной агглюти-
нацией во второй пробирке (++) и при ее отсутствии в третьей
(—) конечная точка титрования приходится на 2,5 пробирки; от-
сюда логарифм титра будет равен 2,7+(0,3-2,5) =3,45, а сам
титр — 2818 ГАЕ/мл.

В среднем выход вируса Сендай в аллантоисной жидкости ра-
вен около 1800 ГАЕ/мл, или 3,25 + 0,20 логарифмических единиц.

III.	КОНЦЕНТРАЦИЯ ВИРУСА

Содержащие вирус аллантоисные жидкости (обычно около
300 мл, или урожай с 30—40 яиц) в асептических условиях
объединяют и осветляют, удаляя ураты и клеточный детрит
центрифугированием в течение 20 мин при 4000g. Затем прозрач-
ную надосадочную жидкость переносят в ультрацентрифугу (ро-
тор Ti60 Beckman Spinco вмещает при одной загрузке 300 мл)
и центрифугируют 30 мин при 60 000g (30000 об/мин для ротора
Ti60).

Осажденный вирус собирают в минимальном объеме сбалан-
сированного раствора Эрла, содержащем 1% бычьего сыворо-
точного альбумина, как рекомендуют Клебе и сотр. (Klebe et al.,
1970), чтобы избежать потерь вируса на стадии инактивации.
Вирус диспергируют интенсивным пипетированием, после чего
суспензию еще раз осветляют (центрифугируя 20 мин при
•4000g) и титруют (начиная с разведения 1:500).
IV.	ИНАКТИВАЦИЯ ВИРУСА

Инактивацию проводят по Неффу и Эндерсу (Neff, Enders,
1968). p-Пропиолактон (Fluka) разбавляют до 10%-ной концент-
рации (вес/объем) в трижды дистиллированной (в стекле) воде
и затем приливают 4 части бикарбонатно-солевого раствора
[1,68 г NaHC03 + 0,02 мл 1%-ного раствора фенолового красно-
го-)-100 мл 0,9%-ного раствора NaCl на трижды дистиллирован-
ной (в стекле) воде]. Конечный раствор содержит 2% р-пропио-
лактона.

Вирусную суспензию разбавляют до 10000 ГАЕ/мл раствором
Р-пропиолактона, доводя концентрацию последнего до 0,05%
(39 частей вируса-)-1 часть основного раствора р-пропиолакто-
на). Суспензию встряхивают 10 мин при 4°С, затем инкубируют
2 ч при 37°С и, наконец, в течение ночи .осторожно перемешивают
при 4°С, что обеспечивает полный гидролиз избытка пропиолак-
тона.

Инактивированный вирус разводят в сбалансированном
растворе Эрла до 4000 ГАЕ/мл (2 части вируса+ 3 части раство-
ра Эрла), ампулируют по 1,1 мл, мгновенно замораживают в сме-
си твердой СОг с этанолом и хранят при —70°С. Для того чтобы
произошли клеточные слияния во взвеси, содержащей 107 мие-
ломных и 108 селезеночных клеток в 1 мл, требуется 1000—
2000 ГАЕ/мл вируса, что составляет примерно 360 вирионов на
одну клетку.

V.	ОЦЕНКА ИНФЕКЦИОННОСТИ ВИРУСА

Готовят серию десятикратных разведений инактивированного
вируса от 10-1 до 10~6 в сбалансированном растворе Эрла. По
0,05 мл каждого разведения вводят в аллантоис куриного эмб-
риона (по 3 яйца в группе) (см. разд. I). Проинкубировав яйца
при 35°С в течение 68—72 ч, при помощи пастеровской пипетки
через отверстие для инокуляции извлекают около 0,05 мл аллан-
тоисной жидкости, прибавляют к ней 0,25 мл физиологического
раствора и титруют. Затем по пробиркам раскапывают по
0,025 мл 5 %-ной суспензии куриных эритроцитов, штатив встря-
хивают и инкубируют 40 мин при 4°С.

Инактивированный вирус будет давать отрицательные реак-
ции даже в наименьшем разведении (10-1)> тогда как активный
вирус, взятый в той же исходной концентрации, даст полную
агглютинацию эритроцитов вплоть до разведения 10~8.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Fazekas de St. Groth S., Cairns H. J. F. (1952). J. Immunol., 69, 173.
Klebe R. J., Chen T. R., Ruddle F. H. (1970). J. Cell Biol., 45, 74.
Neff J. H., Enders J. F. (1968). Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 127, 260.
СЛИЯНИЕ ЛИМФОЦИТОВ

Ж. Кёлер

I.	НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДА

Метод позволяет получать линии гибридных клеток, секрети-
рующие моноклональные антитела различных классов и опре-
деленной специфичности.

II.	ПРИНЦИП МЕТОДА

Клетки из селезенки мышей, предварительно иммунизирован-
ных антигеном, гибридизуют с клетками миеломной линии, рас-
тущей в культуре. Слияние индуцируют вирусом Сендай (о при-
готовлении вируса см. гл. 30).

Миеломная линия клеток, дефектная по ферменту гипоксан-
тин-гуанин— фосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ), не может вы-
жить в культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминопте-
рин и тимидин (ГАТ). Аминоптерин блокирует основной путь
синтеза ДНК. Запасный путь, по которому в этом случае мета-
болизируется экзогенный гипоксантин, требует наличия фермен-
та ГГФРТ. Нормальные клетки селезенки также погибают при
эксплантации. Только гибриды между миеломными и селезеноч-
ными клетками выживают в ГАТ-среде, так как миелома обес-
печивает способность к росту в культуре, а селезеночные клетки
дают активную ГГФРТ, необходимую для преодоления амино-
птериновой блокады.

ГГФРТ-дефектные миеломные клетки отбирают в один этап по
резистентности к цитотоксическому пуриновому аналогу — 8-аза-
гуанину. Клонируя в мягком агаре 106 миеломных клеток (Х63) в
присутствии 20 мкг/мл 8-азагуанина, удалось получить пример-
но 20 резистентных клонов, которые были чувствительны к
ГАТ-среде. Среди клеток X63-Ag8 не было обнаружено ревер-
тантов.

Сходные методики селекции можно использовать для выде-
ления вариантов миеломных клеток, дефектных по тимидинкина-
зе (ТК) — ферменту, который позволяет использовать экзоген-
ный тимидин и таким образом преодолевать центральную ами-
ноптериновую блокаду. Варианты ТК- отбирают по резистент-
ности к цитотоксическому действию аналога пиримидина 5'-
бромдезоксиуридина (Бд-У), взятого в концентрации 30 мкг/мл.
III.	РЕАГЕНТЫ И ПРИБОРЫ

Сбалансированный солевой раствор Эрла (Gibco-Biocult.,
Пейсли, Шотландия РАЗ 4ЕР)

Минимальная модифицированная среда Дульбекко (Flow
Laboratories, Ирвин, Шотландия), дополненная пеницил-
лином и стрептомицином (100 ед/л), L-глутамином
(4мМ), пируватом натрия (1 мМ) и лошадиной сыворот-
кой, инактивированной прогреванием (20%) (Gibco)

Вирус Сендай, 1000 гемагглютинирующнх единиц (ГАЕ)

107 миеломных клеток (X63-Ag8); эта перевиваемая линия
получена из миеломы МОРС-21 мышей BALB/c, резистент-
на к 20 мкг/мл азагуанина, погибает в ГАТ-среде и се-
кретирует иммуноглобулин IgGi (х)

108 селезеночных клеток

Аминоптерин (100-кратный концентрат): к 1,74 мг прилива-
ют 25 мл дистиллированной воды и 1,2 мл 2 н. NaOH; до-
ливают дистиллированной водой до 100 мл и затем мед-
ленно нейтрализуют с помощью 0,2 мл 2 н. НС1

Гипоксантин (100-кратный концентрат) 136,1 мг/100 мл; для
растворения нагревают при 45°С в течение 1 ч

Тимидин (100-кратный концентрат), 38,7 мг в 100 мл

Панели для культивирования (Costar, Data, Packaging Corp.,
Кембридж, Массачусетс, США)

Термостат (с влажной атмосферой, СО2, 37°С)

IV.	МЕТОДИКА

Методика получения линий гибридных клеток представлена
на приводимой ниже схеме.

Контрола

Оба вида родительских клеток обрабатывают раздельно оди-
наковым образом, чтобы исключить рост селезеночных клеток
или ревертантов из миеломных клеток ГГФРТ-.

Данные типичного опыта с положительным результатом пред-
ставлены в табл. 1. Мышей C57BL/10 иммунизировали внутри-
брюшинно тринитрофенилированными бараньими эритроцитами
(20 мкл осадка БЭ, суспендированные в 0,2 мл физиологическо-
го раствора, забуференного фосфатами). Спустя 3 дня после по-
вторной иммунизации, осуществленной через месяц после пер-
вой, извлекали селезенки и объединяли клетки из трех селезе-
нок. Непосредственно после слияния мы обнаружили среди
108 селезеночных клеток 104 клеток, образующих прямые зоны
гемолиза, и столько же клеток, образующих непрямые зоны в
Миеломные клетки (X63-Ag8)

Подсчет

Центрифугирование в растворе
Эрла (200g), 10 мии

107 клеток

Приготовление суспензии селезеноч-
ных клеток

Подсчет

Центрифугирование в растворе
Эрла (200g), 10 мин

108 клеток

Объединение клеток; центрифугирование (200g), 10 мин

Добавление к 1 мл
осадка 1000 ГАЕ вируса Сендай

Ресуспеидирование

20 мии на льду, с периодическим встряхиванием

1

30 мин при 37°С, с периодическим встряхиванием

1

Двукратное отмывание в модифицированной среде Дульбекко

Ресуспеидирование в 50 мл той же среды

I

Распределение суспензии в лунки двух панелей
(по 1 мл взвеси в 48 лунок)

1

Добавление модифицированной среды Дульбекко, содержащей ГАТ,
на следующий день

1

Смена питательной среды в течение 14 дней (каждый второй или третий день):
удаление половины объема надосадочной жидкости из каждой лунки
и добавление свежей среды

I

Г ибриды?

Да	|	Нет

t

Дальнейшая смена питательной сре-
ды— той же, но без аминоптерина—
следующие 14 дней

i

Повторение всех этапов

I

Добавление минимальной модифици-
рованной среды Дульбекко
Таблица 1

Диализ типичного эксперимента по слиянию клеток

Число культур

всего

72

21

201 * * * * * * В

11

2
2

6

из них обра-
зуют антитела
к БЭ

Приготовлено отдельных культур.........

Выжило гибридов........................

Обнаружена секреция родительской миеломы

X63-Ag8..............................

Обнаружена секреция новых р.- и легких це-
пей ...................................

Обнаружена секреция новых 7- и легких це-
пей ...................................

Обнаружена секреция только новых цепей .

Секреции иовых цепей ие обнаружено . . .

1

1(ЬЬ)

1 Один гибрид секретировал новую молекулу IgM» ио утратил способ-

ность экспрессировать миеломный IgGi.

слое бараньих эритроцитов. При использовании в реакции ТНФ-

БЭ число антителообразующих клеток не увеличилось; значит,

образования антител к ТНФ не происходило. Из 72 1-миллилит-
ровых культур в 21 культуре был обнаружен рост гибридных
клеток. При таком низком соотношении между положительными
и отрицательными культурами можно предполагать, что мы выя-
вили не меньше линий гибридных клеток, чем их образовалось
на самом деле.

Меченные радиоизотопом надосадочные жидкости всех ги-
бридных культур анализировали с помощью электрофореза в по-
лиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и
методом изоэлектрофокусирования. Двадцать культур гибрид-
ных клеток продолжали секретировать миеломный IgG, который
синтезировала родительская миелома, одиннадцать культур —
дополнительный IgM, две культуры — дополнительные молеку-
лы IgG и две — только дополнительные легкие цепи; шесть — не
секретировали дополнительных Ig-цепей. Один из синтезируемых
гибридами IgM и один IgG2b вызывали гемолиз бараньих эрит-
роцитов. Антител к ТНФ-группе не было обнаружено.

V. КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА

В удачных экспериментах образуется 20—80 гибридов, из
которых около 50% секретируют иммуноглобулины IgM и IgG,
а 10% образуют иммуноглобулины, специфичные для антигена,
введенного мышам-донорам. Следовательно, около 50% гибри-
дов являются результатом слияния миеломных клеток с В-клет-
ками селезенки.

Интересно отметить, что слияние миеломных клеток с клет-
ками тимомы приводит к исчезновению специфического для ти-
моцитов поверхностного О-антигена, но при этом продолжается
секреция миеломного IgG (Kohler et al., 1977). При слиянии
миеломных и селезеночных клеток О-положительные гибриды не
обнаружены. Однако 0-антиген проявлялся на гибридах, полу-
ченных при слиянии тимомных и селезеночных клеток, что сви-
детельствует об успешной гибридизации с селезеночными Т-
клетками (Hammerling et al., 1977). Примерно у 50 таких гибри-
дов не наблюдалось секреции Ig. Это говорит о том, что для со-
хранения функций исходных клеток при слиянии необходимо
использовать онтогенетически близкие опухолевые линии. В
противном случае гибридизация с тимомой приводит к утрате
синтеза Ig В-клеток, а гибридизация с миеломой — к утрате &-
антигена Т-клеток.

Гибриды миеломных и селезеночных клеток, как правило, со-
храняли антителообразование к следующим антигенам: к ба-
раньим эритроцитам, ТНФ-липополисахариду, куриному у-глобу-
лину с присоединенным ТНФ (Kohler, Milstein, 1976), крысино-
му аллоантигену (в системе крысиных клеток) (Galfre et al.,
1977), а также к ряду других антигенов, включая растворимые
белки и сахаридные детерминанты (Hammerling et al., 1977).

Успешные слияния получены при сингенной, аллогенной и
ксеногенной комбинациях. Преимущество сингенных и аллоген-
ных гибридов состоит в том, что они могут впоследствии расти в
организме соответствующих мышей как опухоли, давая сыворот-
ки с высокими титрами. Слияние происходит не регулярно. Час-
то простое повторение процесса без изменения условий может
привести к успешной гибридизации. Полиэтиленгликоль индуци-
рует слияние с такой же частотой, как и вирус Сендай. Рекомен-
дуется методика, описанная Гэлфре и сотр. (Galfre et al., 1977).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Galfre G., Howe S. C., Milstein C., Butcher G. W., Howard J. C. (1977). Nature
(London), 266, 550.

Hammerling G. J., Reth M., Lemke H., Hewitt J., Melchers I., Ra.ewsky K-
(1977). Protides Bio. Fluids, Proc. Colloq., 25, 551.

Kohler G., Milstein C. (1976). Eur. J. Immunol., 6, 511.

Kohler G., Pearson T., Milstein C. (1977). Somatic Cell Genetics, 3, 303.
КЛОНИРОВАНИЕ ОПУХОЛЕВЫХ
ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК В МЯГКОМ АГАРЕ.
ВЫЯВЛЕНИЕ ГИБРИДНЫХ КЛОНОВ,
ОБРАЗУЮЩИХ АНТИТЕЛА К БАРАНЬИМ
ЭРИТРОЦИТАМ (БЭ)

Ж. Кёлер

I.	НАЗНАЧЕНИЕ И ПРИНЦИП МЕТОДА

Для выделения отдельных клонов гетерогенные смеси ги-
бридных или лимфоидных опухолевых клеток высевают в мяг-
кий агар (о получении линий гибридных клеток см. гл. 31). Кло-
ны, образующие антитела к БЭ, выявляют по гемолитическим
пятнам, возникающим в слое агара с эритроцитами.

II.	РЕАГЕНТЫ И ПРИБОРЫ

Чашки Петри диаметром 9 см („Falcon”, Becton — Diskin-
son— France, 38 100 Гренобль, Франция)

1%-ный агар (Difco Laboratories, Детройт, США); его гото-
вят на трижды дистиллированной воде и автоклавируют
Среда Игла, модифицированная Дульбекко (МСИД), 10-
кратный концентрат (Gibco Bio-cult, Пайсли, Шотландия
РАЗ 4ЕР). Ее разводят 5 раз, приготовляя смесь следую-
щего состава: трижды дистиллированная вода — 30 мл;
МСИД (10-кратный концентрат)—20 мл; пенициллин-
стрептомицин (5000 ед/мл) —4 мл; L-глутамин (200мМ) —
4 мл; пируват натрия (100 мМ)—2 мл; бикарбонат на-
трия (7,5%) — 10 мл; гидроокись натрия (0,1М) —0,6 мл;
лошадиная сыворотка, инактивированная прогреванием и
не содержащая микоплазм — 40 мл.

Панели для культивирования „Costar” (Data Packing Corp.,
Кембридж, Массачусетс, США)

ЗФР: 0,9%-ный раствор хлорида натрия, содержащий 10 мМ
фосфатный буфер с рН7,2

Индубиоза А37 (L’Industrie Biologique Fran^aise, Жанне-
виллье, Франция), 0,6%-ный стерильный раствор в ЗФР

МСИД, дополненная 10% лошадиной сыворотки (готовят из
10-кратного концентрата, как указано выше, с тем лишь
отличием, что добавляют 20 мл лошадиной сыворотки и
140 мл трижды дистиллированной воды)

Бараньи эритроциты (БЭ) трижды отмывают и доводят фи-
зиологическим раствором до 25%-ной суспензии
Расплавить 100 мл 1%-ного агара на кипящей водяиой бане

I

Поместить на водяную баню при 45°С

I

I

Подогреть 100 мл 2-кратного концентрата МСИД на водяной бане при 45°С

Смешать агар с 2-кратным концентратом МСИД(=МСИД — агар)
I

I

Разлить по 15 мл в 10 чашек Петри (нижний слой). Вновь подогреть часть
смеси МСИД — агар до 45°С

I

Оставить нижний слой для застываиия на 15 мин при комнатной темпера-
туре

I

Смешать клеточную суспензию в МСИД( 10—106 клеток) с подогретой смесью
МСИД — агар 1:1

Наслоить 2 мл полученной смеси клетки — агар, распределив по всей пло-
щади нижнего слоя агара

Выращивать клетки около 10 дней в СО2-термостате во влажной атмосфере

Приготовить 0,6%-иый раствор агарозы в ЗФР при температуре кипения и
держать его при 45°С

I

К 3 мл агарозы добавить 0,1 мл 25%-ной суспензии БЭ, 0,2 мл КМС и
0,03—0,1 мл антисыворотки к мышиному Ig для выявления зон непрямо-
го гемолиза; работать следует быстро, сохраняя раствор теплым

Наслоить 3 мл смеси агароза — БЭ поверх колоний

1

Инкубировать во влажной атмосфере СО2 при 37°С в течение 1—2 ч

Над колониями клеток, образующих антитела к БЭ, появляются зоны ге-
молиза	|

В том месте слоя, где колонии растут
достаточно редко, кончиком пастеровской
пипетки извлечь отдельные колонии и
перенести в 1—2 мл МСИД в лунки панелей
для культивирования «Costar»
Комплемент морской свинки (КМС): свежую сыворотку мор-
ской свинки истощают при 4°С, прибавив 10% (по объему)
осадка БЭ, стерилизуют фильтрацией и, разлив по 2 мл,
хранят при —20°С

Кроличья антисыворотка к мышиному иммуноглобулину. Ее
получают, иммунизируя кролика внутрибрюшинно
0,5 миллиграммами очищенного парапротеина МОРС-21
(IgGix) в полном адъюванте Фрейнда; кровопускание де-
лают в тот момент, когда накапливается достаточно ан-
тител, выявляющих непрямые зоны гемолиза (обычно пос-
ле трех инъекций, сделанных с 3-недельными интервала-
ми). Полученную антисыворотку истощают, прибавив
10% (по объему) осадка БЭ, затем стерилизуют фильт-
рацией и хранят, разлив по 2 мл, при —20°С

III.	МЕТОДИКА

Последовательные этапы клонирования опухолевых лимфо-
идных клеток представлены на стр. 408 в виде схемы.

На рис. 1 приведен пример выделения гибридных клеток, се-
кретирующих IgM-антитела к БЭ. Такие клетки составляют око-
ло 3% всей популяции гибридов. На рис. 1,а можно видеть пря-
мые зоны гемолиза (темные пятна), образованные единичными
клетками среди 6000 гибридных клеток, засеянных в слой ага-
ра. На рис. 1,6 представлены клоны (белые точки), выросшие в
мягком агаре в течение 10 дней из 2000 засеянных жизнеспо-
собных клеток. Эффективность образования клонов составила
около 50%; 33 клона вызывали прямой гемолиз БЭ (зоны гемо-
лиза в виде темного ореола) в нанесенном сверху слое агара с
эритроцитами. Один из положительных клонов извлекли из ага-
ра и культивировали далее в жидкой среде, затем собрали и
вновь клонировали. На рнс. 1, в можно видеть, что фактически
каждый из полученных при этом клонов проявляет гемолитиче-
скую активность. На рис. 1, г такой клон показан при большем
увеличении.

IV.	КРИТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА МЕТОДА

Описанным методом из смеси гибридных клеток были изоли-
рованы клоны, образующие антитела к БЭ при частоте специфи-
ческих клеток 1 на 500 (Kohler, Milstein, 1975). Этот же метод
был использован для выделения клонов, утративших способ-
ность синтезировать цепи неспецифического миеломного Ig, но
образующих тяжелые и легкие цепи, которые синтезировались
исходными селезеночными лимфоцитами (Kohler, Milstein, 1976)
Рнс. 1.,Отбор гибридных клонов, образующих IgM-антитела к бараньим эрит-
роцитам (Kohler, Milstein, 1975). Подробности см. в тексте.

Одно из ограничений метода состоит в невозможности выра-
щивать на одной чашке более 104 клонов, что позволяет выде-
лять только те виды специфических клеток, которые встречаются
с частотой не менее 1 на 104.

Если необходимо выделить клоны, утратившие способность
лизировать эритроциты, то на одной чашке должно находиться
не более 100—200 лизирующих клонов, так как в противном
случае общий лизис БЭ поверхностного слоя будет маскировать
отрицательные клоны.

Этот метод с успехом применяется также при использовании
гаптенизированных БЭ. Но он не годится для реакции локально-
го гемолиза обратного типа, когда антитела к Ig нагружают на
БЭ, чтобы выявить клоны, образующие неспецифические иммуно-
глобулины. Установлено, что в последнем случае помехой служит
лошадиная сыворотка. Эффективность клонирования для раз-
личных гибридных и миеломных клеточных линий значительно
варьирует (от 50 до 0,01%), но, как правило, повышается после
нескольких циклов реклонирования.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Kohler G., Milstein С. (1975). Nature (London), 256, 495.

Kohler G., Milstein C. (1976). Eur. J. Immunol., 6, 511.
ИЗОТОПНАЯ ЛАБОРАТОРИЯ

X. Полит, Ю. Видмер, Р. Фрех

I.	ВВЕДЕНИЕ

Эта глава посвящена частным и общим аспектам организа-
ции работы радиоизотопной лаборатории применительно к им-
мунологическим исследованиям.

II.	РЕАГЕНТЫ И ПРИБОРЫ

А. Общие правила доставки и использования
радиоактивных изотопов

Согласно общему правилу, доставка изотопа осуществляется
специальным персоналом. Поступающий материал проходит че-
рез изотопное бюро, где его регистрируют (как это требуется) и
хранят в соответствующих условиях (либо в холодной комнате,
либо в морозильнике). Сотрудников, затребовавших материал,
незамедлительно информируют о прибытии и месте хранения
материала. Таким образом, все полученное количество изотопов
(оно может быть различным) находится на хранении у специ-
ального персонала — двух сотрудников со специальным образо-
ванием и двух помощников без такого образования. При повсе-
дневном частом использовании изотопов этим сотрудникам
вменяется в обязанность (особенно в необычных случаях, когда
опасность для работающих может превышать норму) информи-
ровать об особых приемах обращения с ними.

Основные растворы изотопов хранят при соответствующих
условиях (в холодильнике или в морозильнике) в помещении
изотопной лаборатории. Часть основного раствора может быть
доступна каждому сотруднику в любое время, тогда как доступ
к другой части раствора радиоизотопа должен быть открыт лишь
персоналу изотопной лаборатории.

Б. Смеси для жидкостной сцинтилляции

При жидкостной сцинтилляции используются два типа сме-
сей, которые готовит специально обученный персонал. Смеси
хранят в 50-литровых стеклянных сосудах, наружную поверх-
ность которых покрывают темной краской, оставляя незакрашен-
ной узкую вертикальную полосу для контроля уровня. Сосуды
держат в вытяжном шкафу. Из сосудов смеси поступают в регу-
лируемый дозатор (Disum, 0—20 мл, изготовляемый фирмой
Struers Scientific Instruments, Копенгаген). Для перемешивания
ингредиентов во время приготовления смесей используют пнев-
матические смесители (тип М 43 100-2200, Pressluft-Goetz, Ман-
гейм, ФРГ).

1.	Смесь толуол—РРО—РОРОР

Один литр этой смеси содержит 5,0 г РРО (№ 2946, Е. Merck,
D-1600, Дармштадт, ФРГ), 0,2 г РОРОР (Merck, № 7249) и
толуол (Merck, № 8325), доливаемый до 1 л.

2.	Смесь толуол—тритон—РРО—РОРОР

Один литр этой смеси содержит 2,7 г РРО (Merck № 2946),
0,1 г РОРОР (Merck № 7249), 460 мл тритона N-101 (Rohm,
Haas, Филадельфия, США) и толуол (Merck, № 8325 ad), доли-
ваемый до 1 л.

Пользуясь этой смесью, можно добавлять до 5 мл дистилли-
рованной воды или водного раствора исследуемого образца на
10 мл сцинтиллятора. Однако, когда объем водорастворимого
образца составляет 200—600 мкл, смесь начинает опалесциро-
вать. Этого можно избежать, добавив больше дистиллированной
воды (так, чтобы общий объем водорастворимого образца стал
больше 600 мкл); но с увеличением объема воды во флаконе зна-
чительно падает эффективность счета.

В. Стандартизация жидкостного сцинтилляционного счетчика

Централизованная доставка сцинтилляционных смесей имеет
определенные преимущества (помимо экономии времени и де-
нег). Жидкостные сцинтилляционные счетчики, работа которых
зависит от состава жидкого сцинтиллятора, необходимо стан-
дартизовать только для двух разных смесей. Каждый счетчик,
канал регистрации и изотоп имеет свою кривую стандартизации.
Первоначальная и эксплуатационная стандартизация всех счет-
чиков с использованием одних и тех же стандартов и методов
позволяет исследователю при необходимости переходить с одно-
го счетчика на другой и тем самым способствует более эффектив-
ному использованию счетного времени.
Г. Специальные счетные системы

Каждый раз при решении конкретной задачи собирают соот-
ветствующую счетную систему. Эти задачи, как правило, быва-
ют разными, поэтому приходится приобретать одну, но функцио-
нально разностороннюю систему. Так, весьма целесообразно
иметь модульное электронное устройство, состоящее из таймера,
счетчика импульсов, дискриминатора, усилителя, аналого-ци-
фрового преобразователя, интенсиметра, источника тока высоко-
го напряжения, различных фотоумножителей и кристалла
NaJ. Такое оборудование можно применить, например, для ре-
гистрации излучения всего тела мыши (низкий фон), для ска-
нирования тонкослойной хроматограммы при работе с 3Н, 14С и
другими изотопами, а также для оценки накопления радиоактив-
ного иода в щитовидной железе.

Д. Пробирки и флаконы для счета

Установлено, что иногда пластиковые сцинтилляционные
флаконы настолько различаются по размеру (либо так изменя-
ют свои размеры под действием органических растворителей), что
это приводит к резкому завышению счета. Некоторые пластико-
вые пробирки недостаточно плотно закрепляются в держателе,
что также может приводить к неожиданному резкому увеличе-
нию показаний гамма-счетчика. В связи с этим был испытан ряд
флаконов, которые в настоящее время рекомендуются для широ-
кого применения в изотопной лаборатории; они указаны ниже.

Тип флаконов	Поставщик

Пластиковые сцинтилляционные
на 20 мл, No. 6008 117

Стеклянные сцинтилляционные
на 20 мл, No. 6 000134

Пробирки для счета ^-излучения
на 10 мл, No. TFR-95

Packard Instrument Interna-
tional S. А. (Цюрих, Швей-
цария)

Packard Instrument Interna-
tional S. A.

Milian Instrument S. A.

(Женева, Швейцария)

III. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДИКИ

А. Удаление несвязанного радиоактивного иода путем диализа
меченого белка

После метки белка многие предпочитают удалять несвязан-
ный радиоактивный иод путем хроматографии реакционной сме-
си на короткой колонке с ионообменником. Это позволяет скон-
центрировать свободный радиоактивный иод в небольшом объе-
Рис. 1. Прибор для диализа большого числа проб (описано в тексте).

ме (объем самого ионообменника), не создавая проблем для об-
работки радиоактивных отходов. Однако при этом выход мечено-
го белка и объем элюата весьма варьируют. Другим удобным
методом служит диализ. Но из-за очень высокой скорости диф-
фузии иодидов через диализную мембрану любые манипуляции
с наполненным диализным мешком приводят к сильному за-
грязнению перчаток и рук, так как перчатки, будь они пластико-
вые или резиновые, одинаково проницаемы 1 для столь малых
молекул. Прибор, представленный на рис. 1, позволит вовсе не
притрагиваться руками к диализному мешку после того, как он
наполнен. Объем образца за время диализа, как правило, не
меняется. Несвязанный иод остается в растворе в виде иодида,

1 Проницаемость неповрежденных перчаток для растворов иодидов пре-
увеличена. — Прим. ред.
так как в реакционной смеси присутствует избыток метабисуль-
фита натрия. Недостаток диализа состоит в том, что несвязав-
шийся радиоактивный иод получается в довольно большом (от
0,5 до 1 л) объеме растворителя. Этого можно избежать, ис-
пользуя диализный мешок наполовину или на одну треть мень-
шего объема (объем образца от 20 до 50 мл обеспечивает разве-
дение свободного иода до концентрации меньше 5% исходной
после достижения первого диализного равновесия). Другое
достоинство метода заключается в том, что он позволяет быстро
и в идентичных условиях обработать большое количество проб;
это может иметь существенное значение при анализе кинетики.
Затруднения, возникающие при серийной обработке большего
числа радиоактивных образцов, нередко существенно тормозят
проведение обширных наблюдений.

1.	Методика

Диализную трубку соответствующей длины (рис. 1,Л) 7 мм
в диаметре (Union Carbide) смачивают в буфере для диализа,
завязывают с одного конца, а другой натягивают на пастеров-
скую пипетку (Wilhelm Ulbrich, Bahnhofstrasse 5, D-65 Майнц,
ФРГ) (рис. 1, Б), обрезанную и. оплавленную на зоостренном
конце.. Широкую часть пастеровской пипетки закрепляют при
помощи втулки (рис. 1, Г) в отверстии крышки (рис. 1, Д).
Если нужно диализовать одну пробу в качестве крышки диализ-
ного сосуда, можно использовать соответствующим образом пер-
форированную крышку для бутылки (на 0,5—1 л). На рис. 1 по-
казана специально изготовленная для многократного использо-
вания тефлоновая крышка (герметично закрывающая пластико-
вый стакан), в которой можно закрепить десять и более диализ-
ных трубок. В качестве втулок могут служить колпачки, кото-
рые обычно продаются в комплекте с пластиковыми пробирками
различных размеров. В колпачке просверливают отверстие, в ко-
тором плотно закрепляется широкая часть пастеровской пипет-
ки. В сосуд можно налить буфер для диализа, а затем вставить
крышку с диализными мешками. Круглый переходник из сили-
коновой (Tygon) трубки вставляют, как указано на рис. 1 (В).
Он должен плотно облегать носик пластикового шприца. Радио-
активную пробу вносят сверху при помощи пастеровской пипет-
ки с длинным капилляром. Если диализный мешок уже погру-
жен в буфер, то гидростатическое давление препятствует запол-
нению. Поэтому верхний уровень вносимой жидкости должен
находиться в стеклянной трубке. Это не помеха, однако проще
сначала заполнить диализные мешки, а затей залить буфер в
диализный сосуд. В любом случае в диализном мешке можно соз-
дать небольшое положительное давление при помощи 2- или
5-миллилитрового шприца разового пользования. Если все герме-
тично, давление поддерживается свыше 24 ч.

2.	Удаление образца

Образец можно извлечь из диализного мешка различными
способами. Однако, как нам кажется, проще всего закрепить
крышку вместе с диализным мешком в штативе и, придерживая
пинцетом, обрезать диализную трубку достаточно близко к уров-
ню жидкого образца, чтобы можно было извлечь его короткой
пастеровской пипеткой. Прибор для диализа выбрасывают, если
он больше не понадобится.

Б. Непрямое иодирование белков, нуклеиновых кислот и других
веществ с помощью реактива Tagit (реактива Болтона —
Хантера)

Чтобы избежать возможного повреждающего действия ре-
агентов на иодируемые вещества, Болтон и Хантер (Bolton, Hun-
ter, 1973; см. также Rudinger, Ruegg, 1973) разработали метод
непрямой метки радиоактивным иодом. Вначале иодируют до-
вольно стабильный активированный эфир З-(га-гидроксифенил)-
пропионовой кислоты и на определенном этапе присоединяют
его к свободным аминогруппам иодируемого вещества. Метод,
описанный ниже, отличался в наших руках высокой воспроизво-
димостью.

1.	Методика

Реакцию иодирования удобно проводить в такой стеклянной
пробирке, которую можно присоединить к аппарату для лиофи-
лизации, а также центрифугировать при небольшой скорости. Все
операции до завершения первого цикла лиофилизации следует
производить в вытяжном шкафу.

В стеклянной пробирке к 20 мкл 0,05 М фосфатного буфера
(ФБ) с pH 72, содержащего радиоактивный иод1, добавляют
20 мкл раствора Tagit [20 мг Tagit в 50 мкл диметилформамида
(ДМФ)]. После этого быстро приливают 10 мкл хлорамина-Т
(5 мг/мл) в ФБ, а через 10—15 с — 10 мкл 1 н. НС1. Жидкость
немедленно замораживают, погружая пробирку в жидкий азот

1 Радиоактивный иод можно получить из трех различных источников:
Amersham/Searle (Амершем, Англия; Вюрелииген, Швейцария) н New England
Nuclear (Бостон, США). Вопреки литературным данным (например, Hunter,
1971) мы ие можем утверждать, что успех иодирования белков зависит от ка-
чества примененных реагентов.
или в ванну со смесью сухого льда и ацетона (можно пользовать-
ся другим источником глубокого холода). Затем пробирку под-
соединяют к аппарату для лиофилизации. Через 3—4 ч (после
завершения лиофилизации) к содержимому пробирки добавляют
примерно 200 мкл бензола. Нерастворившиеся частицы удаляют
центрифугированием при малых оборотах. Надосадочную жид-
кость, содержащую иодированный Tagit, помещают в другую
стеклянную пробирку и вновь лиофилизируют. Содержимое про-
бирки растворяют в 1 мл ДМФ. Меченый Tagit можно хранить
при температуре 4°С и ниже в течение нескольких месяцев без
заметного нарушения его способности к присоединению.

2.	Дополнительные замечания

а.	ДМФ. Эфир Tagit плохо растворяется в воде, поэтому
иодирование проводят в ДМФ. Это позволяет избежать неодно-
родности реакционной среды.

б.	Время реакции. 10-секундную продолжительность реакции
нельзя назвать критической, так как активированный эфир от-
носительно устойчив к гидролизу. С другой стороны, 10 с вполне
достаточно для завершения реакции и увеличение времени инку-
бации ничего не прибавляет.

в.	Лиофилизация. При лиофилизации (см. разд. III, В) в тече-
ние 2—3 ч удаляются ДМФ и вода, а также несвязанный моле-
кулярный иод. При низком значении pH быстрее происходит
окисление иодидов в Ь и более стабилен активированный эфир,
поэтому реакционную смесь перед лиофилизацией целесообразно
подкислять.

г.	Обработка бензолом. Обработка бензолом резко уменьшает
количество хлорамина-Т (и неорганических солей),.от которого
в противном случае трудно избавиться.

д.	ДМФ как конечный растворитель. ДМФ в качестве раство-
рителя для иодированного эфира Tagit имеет ряд преимуществ.
Он менее летуч, чем бензол, не взаимодействует с такими рас-
пространенными пластмассами, как полипропилен и полистирол
(но не люцит и другие), в нем хорошо растворяется Tagit, и, что
наиболее существенно, он смешивается с водой в любых соотно-
шениях. Последнее свойство обеспечивает быструю дисперсию
эфира Tagit в водных растворах и благодаря этому высокую ре-
акционную способность в отношении белков, нуклеиновых кислот
и т. п. С другой стороны, ДМФ (вместе с несвязавшимся эфиром
Tagit) можно легко удалить путем диализа. Растворы ДМФ (не
выше 10%) в водных буферах не оказывают заметного повреж-
дающего действия на биологические материалы (см. гл. И).
Однако нельзя исключить условий, при которых бензол, который
не смешивается с водой, окажется более подходящим промежу-
точным растворителем, чем ДМФ.

е.	Нековалентное связывание. Мы, а также другие исследова-
тели (Cuatrecasas, Hollenberg, 1976) на основании наблюдений
пришли к выводу, что Tagit в форме свободной кислоты, вероят-
но, нековалентно присоединяется к некоторым белкам (напри-
мер, к сывороточным альбуминам).

Так, например, если инактивировать иодированный эфир
Tagit этилендиамином на 98% и более до присоединения к белку,
все равно произойдет связывание метки на 30% и выше. И если
вместо эфира Tagit взять его свободную кислоту, помеченную
аналогичным образом (исключая обработку бензолом, в которой
она плохо растворима), метка также примерно на 30% свяжется
с белком. Гидроксифенилуксусная кислота, которая гомологич-
на га-гидроксифенилпропионовой кислоте, дает меньшую степень
нековалентного связывания, вероятно благодаря меньшей гидро-
фобности.

ж. Оценка присоединения. Чтобы убедиться в ковалентности
связывания меченого эфира Tagit, следует параллельно инкуби-
ровать пробу иодируемого материала с образцом Tagit-125!, кото-
рый был предварительно обработан этилендиамином (или дру-
гим легко доступным первичным амином), и затем провести ди-
ализ.

В качестве испытуемого белка была использована, например,
0,05%-ная желатина (Cuatrecasas, Hollenberg, 1976). Мы же бра-
ли 500 мкл 10%-ного полилизина (мол. вес более 20000), добав-
ляли 5 мкл 1 М раствора МаНСОз в дистиллированной воде и
10 мкл 125I-Tagit. Спустя 20 мин эту смесь диализовали в течение
24 ч против ЗФР. Эффективность связывания определяли по со-
держанию иода до и после диализа.

Полилизин имеет преимущества перед белками, содержащими
тирозин и гистидин, потому что он не может сам присоединять
свободный иод путем трансиодирования или через остаточный
хлорамин-Т.

з. Высокая удельная активность эфира Tagit. Даже при
100%-ной эффективности иодирования иод присоединяет, по-ви-
димому, лишь небольшое количество молекул эфира Tagit. Один
милликюри 1251 — это приблизительно 6* 10~9 моль I, а 3 мг эфира
Tagit — это примерно 6-10~5 моль. Таким образом, только 1 из
10 000 молекул эфира Tagit несет 1251. Разумеется, применять
Tagit в избытке нецелесообразно, а в ряде случаев имеет смысл
использовать эфир с максимальной удельной активностью. В свя-
зи с этим мы проверили эффективность метки, которую обеспе-
чивает эфир, иодированный в низкой концентрации. Оказалось,
что при уменьшении концентрации эфира Tagit в 1000 раз про-
цент связываемого им иода уменьшается с 80 до 40 (т. е. всего в
два раза), а эффективность присоединения такого эфира, напри-
мер, к полилизину (см. разд. III, Б, 2, е) снижается на 50—25%.
Таким образом, удельную активность эфира Tagit можно факти-
чески повысить в 500 раз [т. е. будет помечена 1 молекула из 20
при конечной концентрации эфира (в ДМФ) 50 мкМ], сохранив
при этом эффективность ковалентного присоединения на прием-
лемом уровне.

В.	Лиофилизация радиоактивного иода или иного
летучего изотопного материала

Когда лиофилизируют материалы, содержащие такие летучие
радиоактивные вещества, как молекулярный иод, трудно избе-
жать значительного загрязнения некоторых деталей аппарата
для лиофилизации. Поэтому следует позаботиться, чтобы загряз-
нение ограничивалось только недорогими сменными частями ап-
парата или же теми частями, которые легко поддаются очистке.
Коллектор аппарата для лиофилизации помещают внутри вы-
тяжного шкафа, чтобы избежать вдыхания паров иода. Трубка,
соединяющая пробирку (с образцом) с вакуумным насосом, дол-
жна быть как можно короче. При этом пробирку следует не-
посредственно присоединить к трубке (было бы ошибкой поме-

Рис. 2. Угольный фильтр в вакуумной системе аппарата для лиофилизации:
противогазный фильтр R51 (см. текст) помещают в латунный корпус н уплот-
няют с помощью О-образных прокладок так, чтобы весь воздух проходил че-
рез фильтр. Воздушный поток движется сверху вниз. Фланцы на обоих кон-
цах «стандартизованы» (Pneurop 20KF, внутренний диаметр 20 мм. Leybold-
Heraeus GmbH, D-6000, Кёльн).
щать пробирку внутрь сосуда большего размера, так как это
привело бы к сильному загрязнению ее наружной поверхности).
При лиофилизации по нашей методике загрязняется в худшем
случае только верхний край пробирки. Отрезок соединительной
резиновой трубки следует менять после каждой лиофилизации.

Охлаждаемая жидким азотом ловушка для паров задержива-
ет часть иода. Однако для защиты насоса от попадания радио-
активного иода с гораздо большим успехом применяют специаль-
ный фильтр, установленный на пути от пробы к охлаждаемой
ловушке. Для этой цели подходит угольный фильтр от обычного
противогаза (R51, American Optical Corp., Саутбридж, США),
смонтированный так, как показано на рис. 2. Такой фильтр ис-
ключительно эффективен-и позволяет снизить загрязнение ло-
вушки и вакуумного масла до пренебрежимо низкого уровня.
После испарения 1 мКи 1251, которое произошло в результате ра-
боты насоса в течение примерно 10 ч, почти вся радиоактивность
была задержана первым фильтром: второй такой же фильтр, со-
единенный последовательно с первым, содержал лишь 1/80000
исходной радиоактивности. После более чем годовой эксплуата-
ции аппарата для лиофильной сушки, когда суммарная нагрузка
составила 10—20 мКи 1251, вакуумное масло в насосе содержало
лишь 0,05 мкКи 1251 на 1 л. Фильтр не влияет на производитель-
ность насоса. Несмотря на хорошие эксплуатационные качества
фильтра, выхлоп вакуумного насоса необходимо подсоединять к
вентиляционной системе здания.

IV. НАДЗОР ЗА РАДИАЦИЕЙ

И РАДИОАКТИВНЫМ ЗАГРЯЗНЕНИЕМ

А.	Загрязнение окружающей среды и попадание изотопов
внутрь организма

Излучение радиоактивный соединений, особенно попавших
внутрь организма, причиняет вред здоровью персонала
(см. список рекомендуемой литературы по этой проблеме). Наш
опыт подсказывает, что редкие случаи попадания радиоактивных
веществ внутрь организма не связаны с количеством изотопа, ис-
пользуемого в опыте; как раз наоборот, это почти всегда обуслов-
лено какой-нибудь непредвиденной причиной. Радиоактивный
иод никогда не определяется у лиц, проводящих опыты с больши-
ми количествами изотопов; если его и находят, то только у тех,
кто лишь косвенно связан с этой работой. У нас есть основания
полагать, что причина такого попадания — это, например, мед-
ленное испарение иода из отходов (не обязательно очень актив-
ных) либо из исследуемых проб. Мы убедились в том, что можно
достаточно эффективно снизить общее загрязнение воздуха в
лаборатории радиоактивным иодом, если уменьшить время пре-
бывания как «горячих», так и «холодных» отходов в помещении
и принудительно вентилировать передвижные контейнеры (для
«горячих» отходов), соединив их гибким шлангом с общелабора-
торной вентиляционной сетью. Однако следует учесть, что по-
тенциально опасное скопление изотопа в каком-либо одном месте
может происходить незаметно.

Попадание изотопов внутрь, помимо вдыхания, может проис-
ходить через руки л рот. В частности, средствами защиты, напри-
мер перчатками, часто пользуются неряшливо. Причина ясна:
пластиковые перчатки предохраняют кожу от загрязнения, и со-
трудники нередко забывают о том, что перчатки сами загрязня-
ются, и продолжают, ничего не подозревая, работать в них — от-
крывают двери, прикасаются к оборудованию и т. д. В результате
радиоактивность обнаруживается в типичных местах, что служит
указанием иа значительное загрязнение рук исследователей.
Когда перчатками не пользуются вовсе, то больше стараются из-
бежать загрязнения рук. Поэтому перчатки следует использовать
только в тех опытах и на тех этапах, на которых вероятность
загрязнения рук значительна. Кроме того, следует чаще менять
перчатки между опасными этапами методики и/или проверять их
дозиметром. То же самое относится к портивогазам, защитным
маскам и экранам. Во время работы с изотопами эксперимента-
тор может вольно или невольно прикасаться к этим средствам
защиты, и тогда они становятся переносчиками загрязнения (воз-
можно, например, попадание изотопов через рот). Надо сказать,
что защитное снаряжение вообще повышает риск несчастных слу-
чаев в результате снижения подвижности и ловкости в работе.

Б. Переносные дозиметры

В лабораториях, особенно в обычных (4-й категории), чрез-
вычайно важное значение имеют наличие, широкое использова-
ние и техническое обслуживание простых переносных дозимет-
ров, работающих на электрических батареях. О каждом приборе
необходимо знать, какова его чувствительность в масштабе до-
пустимых уровней загрязнения различными изотопами.

Многие дозиметры различных марок имеют совершенно оди-
наковую конструкцию. Наши потребности вполне Удовлетворяют
следующие модели:

для у-излучеиия —

мини-дозиметр типа 5-40 (с Nal-сцинтилляционным крис-
таллом — тип 5-42);

для р-излучения —
мини-дозиметр типа 5-10 Е (Mini Instruments, Ltd, Лон-
дон) со счетчиком Гейгера — Мюллера (Mallard Limited,
Mallard Hous, Torrington Place, Лондон).

В.	Личные дозиметры

1.	Плоский фотопленочный дозиметр

Фотопленочные дозиметры обязательны только для постоян-
ных сотрудников таких лабораторий, в которых уровни радиаци-
онной опасности выше обычного, 4-го уровня. Однако каждый
сотрудник Базельского института имеет возможность носить та-
кой дозиметр, и это поощряется. Индикатор меняют ежемесячно.

2.	Термолюминесцентные детекторы (ТЛД)

Термолюминесцентный дозиметр был недавно предложен в
Швейцарии. Это, несомненно, улучшенный персональный дози-
метр. Оценку накопленной дозы производят каждые 3 месяца в
центральном федеральном агентстве.

3.	Другие личные дозиметры

Для кратковременного использования (для посетителей) или
в тех случаях, когда ожидается, что воздействующая доза может
быть необычно высокой и необходимо сразу знать дозу облуче-
ния, пригодны небольшие дозиметры электрометрического типа
(BF-Vertriebs GmbH f. Messtechnik, D-75, Карлсруэ; тип LB 1300
или LB 1400, 0 — 200 мР).

Г. Исследование мочи

Все анализы мочи осуществляются федеральным агентством.
Накоплено еще очень мало данных, но уже становится очевид-
ным, что исследование мочи, так же как и использование фото-
пленочных дозиметров и ТЛД, позволяет своевременно выявлять
нарушение техники безопасности со стороны научных и техниче-
ских сотрудников. Кроме того, исследование мочи дает возмож-
ность выявить излучение электронов низкой энергии (например,
от 3Н), которое не определяется иным путем.

Д. Исследование щитовидной железы

Накопление в организме радиоактивного иода контролируют
непосредственной радиометрией щитовидной железы; это более
удобный и чувствительный метод, чем исследование мочи. Мы
используем сцинтилляционный кристалл Nai (2,5X4,45 см, алю-
миниевое окошечко 0,025 мм в диаметре; Harshaw Chemie В. V.,
Де-Меерн, Голландия) в детекторе EMI 9656 (EMI, Хейс, Мид-
лесекс, Англия). Уровень чувствительности, определенный на
фантомахуказан в табл. 1.

Таблица 1

Исследование щитовидной железы

	1»!	
Эффективность счета1), имп/мин 	  Фон, имп/мин 		2,4- 10s (2,4-104)’>  120	8,3-103(8,3-102) 170
Чувствительность относи- тельно допустимого уровня для ЛПО3) . .  Допустимая инкорпора- ция для ЛПО (и не- ЛПО), мкКи		2000 (200)’)  1.1 (0, И)2)	50(5)  0,15(0,15)

*) С учетом допустимого уровня инкорпорации изотопа, указанного в пос-
ледней строке таблицы. Например, 2,4-10‘ имп/мин (первая строка) — это
счет сверх инкорпорации 1,1 мкКи >»‘1 (последняя строка).

>) Величины в скобках Называют эффективность счета для лиц, ие подвер-
гающихся профессионально-обусловленному облучению (ие-ЛПО).

) Эти единицы выражают относительный уровень допустимой инкорпорации
изотопа. Так, 2000 означает, что наша установка будет регистрировать сигнал,
равный фону (вторая строка), если инкорпорация изотопа составит 1/2000 часть
допустимого количества.

Е. Надзор за лабораториями и воздухом в лаборатории

1.	Исследование смывов

По нашим данным, исследование смывов — это вполне эф-
фективный метод общего надзора за лабораторией, поскольку его
чувствительность гораздо выше чувствительности простых заме-
ров переносными дозиметрами. Частота замеров (приблизительно
одно исследование в течение 1—3 месяцев для лабораторий
4-й категории) зависит от уровня загрязнения лаборатории в
прошлом, а также от количества и типов используемых вгней изо-
топов. В модельных опытах установлено, что методом смывов

* «Фантомы» — это модели разных частей человеческого тела, обладаю-
щие такими свойствами тела, как поглощение излучения и т. д. Используя
фантомы, можно точно определить интенсивность радиации в моделируемых
условиях.
выявляется от 10 до 70% разлитого изотопа. Эффективность ме-
тода зависит от материала и формы загрязненной поверхности, а
также от химической природы разлитого реагента.

В изотопных лабораториях для смывов вместо обычной спир-
тово-водной смеси часто используют водный раствор детергента.
Этот раствор понижает летучесть и таким образом повышает
растворимость неорганических или нерастворимых загрязнений.

2.	Дозиметрия воздуха

Чтобы определить в атмосфере изотопной лаборатории испа-
рившийся иод, в различных точках лаборатории непрерывно за-
бирают пробы воздуха (см. табл. 2), пропуская их через фильтр
с древесным углем (Schleicher und Schuell AG, Feldbach,
CH-8000 Цюрих, Швейцария). Производительность насоса —
3 л/мин (коллектор аэрозолей, тип 720, Pedrolit GMBH, CH-8000
Цюрих, Швейцария). Фильтры удаляют один раз в неделю, ра-
диоактивность определяют в у-сцинтилляциочном счетчике. Уста-
новлено, что задерживающая эффективность такого фильтра со-
ставляет 25%, поскольку второй идентичный первому фильтр,
установленный последовательно! с первым, накапливает около
50% радиоактивности, обнаруженной в первом фильтре. Для
особых целей используют мощный насос (Pedrolit, тип 710,
800 л/мин); в этом случае применяют фильтрующий противогаз-
ный патрон. Задерживающая эффективность составляет около

Таблица 2

Дозиметрия аэрозолей, содержащих 1251

Место дозиметрии	»»!«)	
	нмп/30 м*	мкКи/м’
Лаборатория 2-й категории		5300 (НО 000)г)	110’4 (2-Ю-3)
Изотопное бюро 		1600	ЗЛО’-
Библиотека Базельского института  Выхлопной воздух после фильтров вы- тяжного шкафа, находящегося в ла-	100	2-10'6
боратории 2-й категории	  В трех милях от Базельского институ-	1600 (11 000)	3-10-» (2-10_*)
та		60	110-’
Фоновый счет 		100	
Допустимая концентрация для ЛИО*)	530 000	1-10'2
Допустимая концентрация для не-ЛПО	18 000	3,3-10'4

*) Радиоактивность (при эффективности счета 80%) угольных фильтров, содержащих 12’1
после забора образцов воздуха. Время забора воздуха 1 неделя; объем воздушной пробы
30 м*

*) Цифры в скобках — максимальные величины счета за последние 2 года. Другие цифры
отражают среднее число импульсов в 1 мин за последние 2 года за вычетом фонового счета.

®) Лица, подвергающиеся профессионально-обусловленному облучению.
99%. Угольные фильтры меньшего размера непригодны для
столь высоких скоростей фильтрации. С другой стороны, проти-
вогазные патроны слишком дороги для повседневной радио-
метрии.

На основании результатов радиометрии воздуха (табл. 2)
можно заключить, что радиометрия воздуха необходима в лабо-
раториях 2-й категории. Кроме того, несмотря на предписанные
предосторожности и всевозможные технические средства защи-
ты, направленные против утечки изотопа на участках повышен-
ной опасности, некоторое количество 1251 (хотя и намного мень-
ше максимально допустимого) все-таки поступает в атмосферу
лабораторий 2-й категории и, видимо, также других категорий.
Мы полагаем, что источниками загрязнения служат предметы,
которые, согласно «здравому смыслу», обычно к ним не относят-
ся (например, перчатки, низкоактивные отходы и пробирки).

3.	Вытяжные шкафы

Первоначально вытяжные шкафы в нашей изотопной лабора-
тории были построены без фильтров. Образование паров радио-
активного иода приводило к постоянному оседанию последнего в
воздушных ходах. При перестройке вентиляционной системы бы-
ли установлены более мощные вентиляторы, что позволило по-
ставить угольные фильтры на пути между вытяжными шкафами.
и воздушными ходами (тип CP-CG1/25, CEAG-Dominit, Дорт-
мунд, а также префильтр Астроцель, тип A 11-J6-R2, CEAG-Do-
minit; установка Sulzer AG, СН-8400 Винтертур, Швейцария). Эти
фильтры эксплуатировались в течение 1 года при 24-часовой ра-
боте вытяжной системы. Из табл. 2 видно, что в выхлопном воз-
духе после фильтров радиация никогда не достигала даже допу-
стимого предела.

Ж. Очистка

1.	Оборудование из стекла

Сильно загрязненные стеклянные приборы лучше всего обра-
батывать хромовой и серной кислотами. Таким способом лабо-
раторную стеклянную посуду можно с успехом очистить до низ-
кого фона. Пары кислот следует удалять с помощью принуди-
тельной вентиляции.

Небольшое или легко растворимое загрязнение можно эффек-
тивно удалять специальными моющими реагентами, например
Deconex 1 INS (Borer Chemia, CH8000 Цюрих, Швейцария).
2.	Полы

В изотопных лабораториях, особенно в лабораториях повы-
шенной категорийности, не следует применять слишком сильные
детергенты, так как они делают покрытие пола более пористым,
что затрудняет последующее удаление загрязнений. Жидкое мы-
ло, видимо, можно считать наиболее эффективным и достаточ-
но щадящим средством.

3.	Лабораторные столы

Для общей уборки столов пригодны любые мягкие бытовые
детергенты. Однако для удаления по настоящему серьезного за-
грязнения следует иметь пенообразующий распылитель (ЗМ Of-
fice Cleaner, ЗМ Со., Switzerland AG, Ch-8000 Цюрих, Швейца-
рия), который позволяет эффективно сконцентрировать очища-
ющую среду на загрязненном участке.

Мы признательны г-ну Холлоуэю из лаборатории MRC, Mill
Hill (Лондон), который помог нам советами в самом начале на-
ших исследований. Нам хотелось бы также с благодарностью
отметить содействие штатных сотрудников изотопной лаборато-
рии Пьера Ликса и покойного Рето Джегги.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Рекомендуемая литература

Faires R. A., Parks В. Н. (1958). Radioisotope Laboratory Techniques, George
Newnes Limited, London.

Steere N. ed. (1971). Handbook of Laboratory Safety, Chem. Rubber Publ. Co.,
Cleveland, Ohio.

U. S. Department of Health, Education and Welfare (1970). Radiological
Health Handbook, rev. ed. Public Health Serv., Rockville, Maryland,
USDHEW.

Wilson B. J., ed. (1966). The Radiochemical Manuals 2nd ed. The Radioche-
mical Centre, Amersham, England.

Цитируемая литература

Bolton A. E., Hunter W. M. (1973). Biochem. J., 133, 529.

Cuatrecasas P., Hollenberg M. (1976). Adv. Protein Chem., 30, 295.

Hunter W. M. (1971). In: Radioimmunoassay Methods (К. E. Kirkham and
W. M. Hunter, eds.),. pp. 16 and 61ff, Churchill, London.

Rudinger J., Ruegg U. (1973). Biochem. J., 133, 538.
Глава 34

АНАЛИЗ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ДАННЫХ

А. Пьяцца

I. ВВЕДЕНИЕ

В последние годы появилось несколько превосходных книг,
специально посвященных использованию статистических методов
в биологии (см., например, Armitage, 1971; Bliss, 1970; Colton,
1974; Mather, 1972; Sokal, Rohlf, 1973), но в иммунологии суще-
ствует ряд специфических аспектов статистического анализа, ко-
торые целесообразно будет рассмотреть здесь в рамках одной
главы. Мы коснемся и математики, и статистики, и генетики, но
лишь поверхностно, по принципу как сделать, а не как доказать.
В связи с этим мы по возможности ограничим число цитируемых
источников, стремясь побудить читателя к дальнейщему само-
стоятельному библиографическому поиску.

Применение различных статистических методов демонстри-
руется на конкретных практических примерах, взятых из лите-
ратуры или из повседневной работы иммунологической лабора-
тории.

И. ПРИМЕРЫ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

А. Серологические исследования

Были опубликованы (Hsia et aL, 1977) интересные данные от-
носительно интенсивности иммунного ответа на вирусные анти-
гены в семьях меннонитов, проживающих в Индиане. У 584 чело-
век (21 семья) были изучены антитела к ряду вирусов, в том чис-
ле к аденовирусу и к вирусам цитомегалии, простого герпеса и
гриппа типа А. Возникла задача — оценить влияние пола, воз-
раста и родственных связей на интенсивность образования ан-
тител.

1. Нормальное распределение и иные распределения

Титры антител, как правило, дают чрезвычайно асимметрич-
ное распределение. Распределение титров антител к вирусу ци-
томегалии (ВЦМ) по частоте записано в левой части табл. 1.
Таблица 1

Распределение титров антител к ВЦМ по частоте и результаты
преобразования экспериментальных данных1

Исходные данные		П реобразование		
частота («,)	обратный тнтр (х.)	гармоничес- кое (100/Xj)	квадратный корень ()/х[)	логарифмиче- ское (loggxp
23	2	50	1,41	1
53	4	25	2	2
90	8	12,5	2,83	3
ПО	16	6,25	4	4
60	32	3,125	5,66	5
34	64	1,563	8	6
10	128	0,781	11,31	7

1 Экспериментальные данные из работы Hsia et al., 1977.

Антитела к ВЦМ были обнаружены в сыворотках приблизитель-
но 65% всей популяции (380 человек). На рис. 1 представлена
соответствующая гистограмма. Можно видеть, что относительно
моды (титр, встречающийся с наибольшей частотой) распределе-
ние асимметрично. Такое распределение называют косым. Когда
нисходящая часть кривой распределения длиннее, чем восходя-
щая, как на рис. 1, мы говорим о положительной асимметрии.

Частота
Если бы титры антител были определены намного точнее, то
на рис. 1 было бы гораздо больше столбиков, а расстояния между
ними были бы так малы, что верхушки столбиков сливались бы
в непрерывную кривую. Такая кривая называется непрерывным
распределением частот.

Непрерывное распределение, которое имеет только одну мо-
ду (унимодальное) и симметрично (в этом случае мода и сред-
няя совпадают), называется нормальным распределением. Такое
распределение имеет форму, весьма напоминающую колокол, с
вершиной посередине и постепенным понижением частот по обе
стороны от вершины. Закономерности нормального распределе-
ния первоначально были сформулированы в виде теории ошибок
физических измерений: если событие подвержено большому чис-
лу малых случайных влияний, то большая часть этих влияний
будет взаимно погашаться и результаты наблюдения сосредото-
чатся около средней; результаты наблюдений, отклоняющиеся в
обоих направлениях от средней, становятся тем менее вероят-
ными, чем они дальше от нее. Значение нормального распределе-
ния состоит не столько в том, что оно позволяет представить ши-
рокий диапазон наблюдаемых частотных распределений, сколько
в оценке гипотез. В самом деле, если даже у нас нет формально-
го доказательства нормальности распределения исходных дан-
ных, мы тем не менее можем это прогнозировать. Для перемен-
ной х при нормальном распределении вероятность попасть между
х и x-\-dx равна

f (х) dx = -о1-Г/Г ехр [— (х — [1 )а/2аа] dx;	(1)

f(x)—это плотность вероятности непрерывного распределения;
ц, и о2 — два параметра. График f(x) имеет вид колоколообраз-
иой кривой, положение которой относительно оси х определяется
параметром ц, а ширина основания «колокола» — параметром а.
Таблицы плотности нормального распределения f(x), определяе-
мые уравнением (1), и интегральную функцию этого распределе-
ния можно найти в любой из книг по статистическому анализу
(Armitage, 1971; Bliss, 1970; Colton, 1974; Mather, 1972; Sokal,
Rohlf, 1973).

2. Меры расположения и дисперсии

Экспериментальные данные — ограниченное число наблюде-
ний вроде представленных в табл. 1, — не ложатся точно на тео-
ретическую кривую. Одна из задач статистического анализа со-
стоит в том, чтобы установить, обусловлено ли это несоответствие
простыми ошибками выборки или же тем, что мы производим
выборку из совокупности с распределением, достоверно отличным
от нормального. В любом случае важно дать один показатель, в
определенной степени отражающий общую «тенденцию» серии
измерений. Такой показатель называют мерой расположения.
Наиболее привычной среди мер расположения считают среднюю
арифметическую. Если имеется N наблюдений переменной х, их
можно обозначить, как Xi(i=l, 2, ..., N). Средняя арифметиче-
ская Xi обозначается /пх:

/7?х

N

У Xi
1=1

N

В более общем виде, если каждая Xi наблюдается раз, мы
имеем

N

У, П\Х\	N

ms. = -	— 2

2 «i	1=1

(2)

где fi=/2i/2/2i.

Средняя величина обратных титров антител, приведенных в
табл. 1, равна

= 23'2 + 53 -4-1---+ 128-10 = 8114 __ 21 35

23 + 53-4-----1- 10	.	380	’ '

Средняя величина logs обратных титров антител i/i = logxi
равна

шу

N

У (logxi) П\
»=1

N

2 ni
1=1

1413 _

380 “

Средняя арифметическая гиу может быть преобразована об-
ратно в единицы исходной шкалы измерения титров, если при-
нять, что

m* = antilog2 /пу;

/пх* называют средней геометрической х.

Когда средняя величина серии замеров уже получена, инте-
рес исследователя обычно сосредоточивается на том, как выра-
зить степень вариации, или разброса, данных. В связи с этим мы
задаем вопрос: что означает мера, носящая различные названия:
вариация, рассеяние, разброс или дисперсия? Наиболее приня-
той мерой дисперсии считают среднее значение квадратов откло-
нений от средней:

N

2 (*i—тх)2

е2 _ <=1 '
о — -	.

у

Эта величина называется вариансой. В более общем виде, если
каждая Xi наблюдается fi раз, мы имеем

N

2«i(xi— mx)2 N

52 = £±~н-------- = 2 А (* ~	(3)

1=1

i=l

где fi — Из общего числа наблюдений [знаменатель уравне-

-2Х’

*=i

ния (3)] обычно вычитают единицу, когда средняя величина
(один параметр) для выборки уже определена.

Варианса измеряется в тех же единицах, что и х, но возведен-
ных в квадрат. Поэтому меру разнообразия удобно выражать в
исходных единицах х, и это легко сделать путем извлечения квад-
ратного корня из вариансы s. Полученная величина известна как
стандартное отклонение. Уравнения (2) и (3) легко выразить в
более общем виде для непрерывных распределений, заменив сум-
мирование интегралом пр. всему пространству, занимаемому
(непрерывной) переменной х:

m (х) — Jxf (х) dx;	(2')

—ОО

s2 (х) =	[х — tn (х)]2 / (х) dx.	(3')

—ОО

В случае нормального распределения, проинтегрировав уравне-
ния (2') и (3') через f(x), выраженное уравнением (1), можно
найти, что, во-первых, средняя нормального распределения за-
дается параметром ц и, во-вторых, варианса нормального рас-
пределения задается параметром о2.

3.	Преобразования в функцию t нормальным распределением
и оценки вывода

Распределение с положительной асимметрией, представлен-
ное на рис. 1, явно отличается от нормального. Поскольку многие
частота

Рис. 2.

Ж" оническое преобразование

икетрия —1,88

г	-28,9

-26,1

-23,2*

-20,3 |

-17,4 I

-14,5 1

-..б i

Ь&7 |

П -5’8

-2,9

-I-------Ц--------1------]------1-------U—0,0'

18,75	25,00	31,25	37,50	43,75 50ДО

Титр антител квцм	"

Рис. 3.
Частота

Рис. 4.

Относительная частота.

статистические критерии основаны на предположении, что эмпи-
рическое распределение соответствует нормальному, часто ока-
зывается достаточным подыскать такие способы преобразования
отклоняющихся данных, которое аппроксимируют их к нормаль-
ному распределению. Три наиболее часто используемые «норма-
лизующие» преобразования указаны в правой части табл. 1 и в
гистограммах на рис. 2—4.

Успешность преобразования оценивают по статистической
асимметрии, равной

S (Xi — m)3

s’

которая при отсутствии скошенности равна нулю, тогда как по-
ложительные или отрицательные значения свидетельствуют со-
ответственно о положительной или отрицательной асимметрии.

Как можно видеть на гистограммах 2—4, гармоническое пре-
образование и извлечение квадратного корня только уменьшают
асимметрию, тогда как после логарифмирования данных их рас-
пределение наиболее соответствует нормальному.

Если обнаружено, что распределение показателей logz обрат-
ных титров антител соответствует нормальному, то преобразо-
ванные данные могут быть использованы для статистического
вывода. Наиболее простой вопрос, на который мы хотели бы от-
ветить, заключается в следующем: если обследованы две группы
лиц, например мужчины и женщины, то имеется ли доказатель-
ство того, что средняя величина ответа (гуморальные антитела)
у женщин значительно отличается от ответа у мужчин? В стати-
стических терминах этот вопрос должен быть сформулирован
так: существует ли критерий, который указал бы нам вероят-
ность ошибки, если мы отклоним гипотезу о том, что обе выборки
взяты из одной и той же совокупности и любые различия между
ними укладываются в случайные отклонения выборки?

Для решения этой задачи пригоден критерий Стьюдента t.
Если mi и /п2— средние двух выборок, а ni, п2 и si, si определя-
ют их численность и вариансы соответственно, то величина

t =________________тх-тг________________

Г foi — 1) 4 + (^8 - в 4' f т+п^ Г2
IL «1 + «2—2 J \ «1«2 /1

не что иное, как распределение, которое зависит от числа сопря-
женных степеней свободы ni + n2—2 и дает указанную выше веро-
ятность. Значения критерия Стьюдента приводятся в любом учеб-
нике по статистическому анализу и в статистических таблицах.
Предположим, что в нашем примере с женской (1) и мужской
(2) группами получены следующие данные (log2 обратных тит-
ров антител):

= 3,742, nt = 296, si = 0,04,
m2 = 3,701, «2 = 288, s2 = 0,04.

Применив уравнение (4), получаем

/582 =  °л?41	= 2,48.

(0,000274)1/2

В таблице значений критерия t можно найти, что величина 2,48,
соответствующая числу степеней свободы, равному 582 (~ оо, по-
следний ряд таблицы), означает уровень вероятности <0,001.
Поэтому мы отказываемся от гипотезы сходства средних (от
предположения, что обе выборки взяты из одной и той же сово-
купности). Иными словами, мы можем заключить, что наблюдае-
мое различие в средних почти наверное обусловлено действи-
тельными различиями между совокупностями, из которых взяты
две сравниваемые выборки: различие в ответе лиц разного пола
нельзя объяснить случайными отклонениями выборок.

4.	Оценка связей

В упомянутой выше работе (Hsia et aL, 1977) описан также
простой анализ варианс для установления возможной связи меж-
ду гуморальным ответом на вирус и гаплотипами внутри семьи.
Обозначим родительские гаплотипы как ab (отцовский) и cd
(материнский). При отсутствии рекомбинации каждый из сибсов
может иметь одну из четырех комбинаций родительских гаплоти-
пов: ас, ad, be или bd. Допустим, что влияние гаплотипов носит
аддитивный характер и что эффект каждого гаплотипа не зави-
сит от трех других; тогда каждый индивидуальный титр можно
рассматривать как сумму влияний двух гаплотипов, присущих
данному индивидууму.

Рассмотрим сначала всех лиц в семье, имеющих гаплотип а,
и предположим, что сумма титров у этих лиц равна Sa, а число
гаплотипов а, Ь, с и d составляет па, пь, пс и nd соответственно.
Допустим, что влияние гаплотипов описывается линейным урав-
нением

?а па + Pbnb + Фспс + Pdnd = Sa ,	(5)

где Ра, рь, Рс и Ра — неизвестные, которые необходимо опреде-
лить из экспериментальных данных. Написав такие же уравнения
для гаплотипов Ь, с и d, получим линейную систему из четырех
уравнений с четырьмя неизвестными, которая может быть легко
решена.

В качестве примера рассмотрим следующие данные, получен-
ные при обследовании семьи меннонитов.

Сибсы

Отец Мать 1	2	3	4	5	6

Гаплотип 		ab	cd	bd be	be ad	bd	ad
Log2 титров-1 антител к ВЦМ 		0	5	0	2	0 3	0	3

Система уравнений типа (5) выглядит следующим образом:

Зра + 1рь + 0рс + 2pd = 6

1Ра + 5РЬ + 2рс + ipd = 2

0Ра +2рь + 3ро+ = 7

2?a + 2pb+ipc + 5pd =11 .

Для первого уравнения па=3, потому что гаплотип а имеют
три лица (отец, сибсы 4 и 6); пь=1, так как только отец имеет
гаплотип ab-, пс = 0, так как гаплотип ас в семье отсутствует, и
па = 2, так как сибсы 4 и 6 несут гаплотип ad. Сумма титров у
этих лиц, несущих а, равна Sa=3+3 = 6. Другие три уравнения —
для титров антител у лиц с гаплотипами Ь, с и d соответствен-
но — составляются сходным способом.

Алгебраическое решение этой системы уравнений дает

?а = 1,42; ₽ь = 1,75; ₽с=2,92; ₽d = 1,75.
Возникает вопрос: как можно оценить, соответствуют ли на-
блюдения нашей модели или же они случайны?

Изложенный прием служит хорошим введением в анализ ва-
рианс, который будет рассмотрен ниже на конкретных примерах
и заключается главным образом в сравнении двух варианс и
оценке их равенства.

Сумму квадратов отклонений от средней величины титра ан-
лтел для п обследованных лиц можно записать в виде

п	п	п	2

2 (Г, _ т). = 2 (Г, - У-'”)' + 2 W - /»),	(6)

f=i	i—1	<=1

где У, — титр антител, обнаруженный у i-ro индивидуума, т —
средний титр антител у всех п обследованных лиц и У1ехр — ожи-
даемый титр антител у i-ro индивидуума, если учесть вычислен-
ные выше аддитивные эффекты двух из четырех гаплотипов 0а>
₽ь, ₽с и 0а. Первая сумма квадратов дает ошибку модели: если
сумма равна нулю, то ожидаемые и наблюдаемые титры антител
совпадают и, следовательно, модель абсолютно верна. Поэтому
вторая сумма квадратов представляет часть разброса, обуслов-
ленного самой моделью: ее величина, отнесенная к величине
ошибки, служит мерой удачности подбора модели. Так как сумма
квадратов пропорциональна вариансе, а отношение

Варианса, обусловленная моделью

Варианса, обусловленная ошибкой

для выборки из нормальной популяции представляет собой из-
вестное статистическое распределение, называемое Г-распреде-
лением, или отношением варианс, всегда можно оценить, отли-
чается ли статистически это отношение от 1, т. е. вычислить ве-
роятность ошибки для отклонения гипотезы двух варианс, отно-
сящихся к выборкам, взятым из одной й той же совокупности.
Для рассмотренной выше семьи установлено следующее:

Варианса, обусловленная моделью = 23,5
Варианса, обусловленная ошибкой модели = 2,33
F3.4	=13,5

Открыв таблицу вероятностей F (см. в разд. II, Б о значении
индексов 3 и 4), находим, что вероятность Р попадает в интервал
0,01 ^Р^0,05. Вывод: данные соответствуют модели, потому что
гипотеза существования двух варианс для выборок, взятых из од-
ной и той же совокупности, отвергается с очень малой ошибкой,
Р ==0,05.
Б. Сравнение количества выделенных клеток

Клетки из селезенки мышей BALB/c или BALB/c nulnu соби-
рали одним из двух методов, затем эритроциты лизировали, а ос-
тавшиеся клетки подсчитывали. Нам нужно установить, сущест-
вуют ли различия в числе собранных клеток в зависимости
1) от метода выделения клеток и 2) от линии мышей.

1.	Вычисление статистических показателей

Число клеток селезенки1

Таблица 2

Мыши BALB/c +/+й		Мыши BALB/c пи/пи*	
метод А	метод Б	метод А	метод Б
178	204	99	78
212	165	93	88
’ 257	158	104	104
191	200	130	113
177	137	94	84
210	147	112	78
107	208	86	96
180	334	94	106
168	211	118	122
196	218	89	96
286	157	107	98
262	194	97	97

1 Клетки собирали в солевой раствор Эрла, эритроциты лизировали при
помощи (NH4)C1, отмывали и подсчитывали на счетчике Коултера. Число
клеток на селезенку указано в миллионах.

* Метод А: селезенки разрезали на кубические кусочки (размером около
2 мм) и пропускали через стальное сито. Метод Б: селезеночную капсулу
вскрывали с обеих концов и клетки выдавливали стерильным шпателем.

Таблица 3

Расчеты, выполненные по данным, приведенным н.табл. 2

	+/+		пи! пи	
	А	Б	А	Б
Сумма х, Sx	2424	2333	1233	1160
Сумма х2, Sx2	515516	483 333	126 481	114 118
Сумма квадратов отклоне-	25 868,0	29 758,9	1836,9	1984,7
ний, Sxxx				
Средняя, m	202,00	194,42	101,92	96,67
Варианса, s2	2351,64	2705,37	166,99	180,42

1 ‘Sxx=2(xi“m)2-
Экспериментальные данные представлены в табл. 2, а в
табл. 3 приведены все расчеты, необходимые для решения задачи.
При беглом рассмотрении табл. 2 можно сказать, что число соб-
ранных клеток, по-видимому, достоверно зависит от линии мышей
и мало зависит от методов (А и Б) их выделения. Для оценки
различий в пределах каждой линии мышей воспользуемся сна-
чала критерием t. Для группы BALB/c +/+ имеем:

,	202,00— 194,42	п

*(22) ----------------------— = 0,369,

[(2351,64+ 2705,37)/12] 7 '

что соответствует уровню вероятностей 0,7<Р<0,8; это значит, .
что тот же самый критерий t мы можем получить случайно в трех
случаях из четырех. Для голых мышей (пи/пи) имеем:

/ (22) =-----101,92-~96,6------= 0,976; 0,3 < Р < 0,4.

[(166,99 + 180,42)/12]’/2

2.	Объединение данных

Так как различие в количестве собранных клеток, выделен-
ных двумя методами, недостоверно (Р>0,05), наблюдения могут
быть объединены. Таким образом, для мышей BALB/c +/+
т= (2424+2333) / 24=198,21; s2 = 2433,56.

Для голых мышей /п=99,29; s2= 173,35.

Сравнивая объединенные показатели для двух линий мышей,
получаем:	*

/(46) =----198,21—99,29-------- g 4g. р 00Q1

[(2433,56 + 173,35)/24]1/2

Поскольку такой результат может получиться случайно менее
чем в одном случае на 1000, различие между двумя линиями мы-
шей высокодостоверно.

Таким образом, по результатам наиболее точной оценки сред-
нее число селезеночных клеток, полученных от мыши BALB/c,
составляет 198,21 • 10е, а от голой мыши — 99,29- 10е.

3.	Дисперсионный (варнансный) анализ

По критерию t иногда сравнивают две средние. В нашем при-
мере мы должны были осуществить две такие оценки, чтобы обо-
сновать возможность объединения данных, а затем при помощи
третьего теста оценить различие между двумя линиями мышей.
Хотя две средние величины также удобно сравнивать при помощи
критерия I, для многочисленных сравнений более эффективным
методом служит дисперсионный, или вариансный, анализ. Прин-
цип этого метода состоит в получении общей суммы квадратов
отклонений1 (так, как если бы все наблюдения были получены
в одной и той же совокупности) и в последующем вычитании из
этой величины сумм квадратов для наблюдаемых подгрупп.

Рассмотрим наиболее простой случай, когда для каждой ком-
бинации метода с линией имеется только одно наблюдение, а
именно только средняя величина, вычисленная из 12 наблюдений
(табл. 3). Данные можно представить в виде табл. 4. Этот ва-

Таблща 4

Средние из данных, представленных в табл. 2

	Линия		Средняя для строки
	+/+	пи (пи	
Метод А	202,0	101,92	151,96
Метод Б	194,42	96,67	145,55
Средняя для столбца	198,21	99,30	Общая сред- няя 148,75

риансный анализ можно представить в общем виде:

		Столбец  1	2...		/ ••	c	Всего	Средняя (Ri/с)
	1	Гп	yi2...	/xj...	Ле	Rx	
	2	y21	Y22- • •	Faj...	^2C	Ra	y2.
Строка	i	Пх	Yi2...	Yi}...	 Yic	Ri	Yi.
	г	Y»	yra-..	Yri...	Yrc	Rr	Yt.
Всего		Сх	C2...	C}...	Cc	T	
Средняя (Cjlr)		V-!	y.a...	Y.i...	У.е		Y = Tire

1 В дальнейшем слово «отклонений» для краткости может опускаться. —
Прим. ред.
Общая сумма квадратов

ssw = i2(Y«-?>2

.=1 /=1

может быть расчленена на различные части. Любое из отклоне-
ний от средней, Уц—У, выражается следующим образом:

Уц-У = (Fi-У) + (y.j-y) + (Уи-У.-У) + У).

Три члена в правой части уравнения отражают то обстоятельство,
что У1 j отличается от У — отчасти благодаря отличительным
свойствам i-й строки, отчасти благодаря отличительным свойст-
вам i-ro столбца, а отчасти на некоторую величину, которую-
нельзя объяснить различиями между строками или столбцами.
Просуммировав и возведя в квадрат все N=rc наблюдений, на-
ходим:

2 2 - 7)2 = 2	- F)2 + 2 - Y)2 +

i !	i	i

(7>

Три суммы квадратов (SS) в правой части уравнения (7) — это
SS (г) «между строками» (в нашем случае — между методами),
затем SS (с) «между столбцами» (в нашем примере — между
линиями) и «остаточная» SS (остаточная, случайная часть от-
клонения) .

Первые две суммы квадратов (SS) используют для оценки
достоверности различий между группами, принадлежащими к
строкам или столбцам соответственно. Предположим, что наблю-
дения в i-й группе образуют случайную выборку из совокупности
со средней щ и вариансой а2. Чтобы определить вероятность раз-
личий между значениями щ, следует проанализировать нулевую-
гипотезу, согласно которой щ не варьирует, оставаясь всегда
равной какой-то нам неизвестной величине ц. При этом для
оценки о2 предлагаются три способа. Мы можем рассчитать эту
вариансу

а)	из «общей» суммы квадратов:

„2	_ SS(Z) .

5общ - ’

б)	из суммы квадратов отклонений «между строками»:

2	_ SS (г) .

Ьстрок —	7" ,

г — 1
в)	из суммы квадратов отклонений «между столбцами»:

2	_ SS (с)

^столбцов —•	•

с — 1

В любом из этих случаев знаменатель отражает число степе-
ней свободы соответствующих источников отклонений. Иными
словами, знаменатель указывает число независимых квадратов
отклонений, которые использованы для оценки вариансы. При
нулевой гипотезе, согласно которой различий между группами
нет, вариансы «2СТрок и «Столбцов не отличаются от вариансы
неконтролируемого (остаточного) источника отклонений, кото-
рая описывается третьей суммой квадратов в правой части урав-
нения (7). Как упоминалось в разд. II, А, 4, гипотеза двух ва-
рианс Si и si в выборках, взятых из одной и той же нормальной
совокупности, оценивается по отношению этих варианс:

<«>

Распределение вероятностей зависит от числа степеней свободы
обеих варианс. Таким образом, рассмотренный дисперсионный
анализ можно суммировать в виде следующей таблички:

Источник отклонений	Число степеней свободы	Сумма квадра- тов '	Варианса	F

Между стро- ками	г-1	SS(r)	,	_ SS(r)  $строк	r	|	serpoK
Между			2	SS(c)	9	> »
столбцами	с—1	SS(c)	Столбцов	c	j	^столбцев4
			SS	
.Остаточный		SS	S2 = 	  (r—l)(c—1)	
Всего	гс— 1	SSP)		

Эту табличку можно заполнить, используя исходные расчетные
данные табл. 2 и 3:
Источник отклонений	Число степеней свободы	Сумма квадра- тов	Варианса	F
Между методами	1	41	41	21,5
Между линиями	1	9784	9784	4892
Остаточный	1	2	2	
Всего	3	9827		

Число степеней свободы для F в этом случае равно 1; 1 (Гщ);
соответствующую вероятность находят в таблицах (например,
Fisher, Yates, 1963; Documenta Geigy, 1962). Как можно видеть,
достоверен только показатель F, отражающий межлинейную из-
менчивость. Таким образом, дисперсионный анализ дает такой
же ответ, что и ранее использованный критерий t.

В разд. II, А, 4 число степеней свободы, соответствующее мо-
дельной сумме квадратов, равно 3 (на единицу меньше, чем пред-
сказанное число гаплотипов), а число степеней свободы, соот-
ветствующее дисперсии ошибки, равно 4, так как общая сумма
квадратов имеет 7 степеней свободы (на единицу меньше, чем
число наблюдений). Вот почему в этом случае отношение F
записывается как Fz. 4.	z

В. Оценка количества и качества антител

Данные, полученные в опыте равновесных измерений (см.
гл. 1, рис. 2), мы используем здесь для иллюстрации подбора
кривой и регрессионного анализа. Мы не рассматриваем здесь
сами результаты измерения, а имеем дело только с преобразо-
ванными показателями (хь ур, х2, у2), которые теоретически мог-
ли лечь на прямую линию. Первая задача состоит в том, как ре-
шить вопрос, насколько обосновано само это теоретическое пред-
положение. Вторая задача заключается в том, чтобы определить
параметры регрессии, а именно наклон и отрезок, отсекаемый на
оси ординат, для графика, лучше всего соответствующего эмпи-
рическим данным, — конечно, при условии, что они удовлетворя-
ют основному критерию достоверности.

1.	Регрессионный анализ

В отличие от предыдущих разделов, в которых речь шла об.
одной переменной (х), здесь мы имеем дело с двумя переменны-
ми (х, у). Если не считать дополнительных вычислений, принци-
пы (и даже практика) анализа во многом остаются теми же са-
мыми.
Из двух переменных одну обычно берут как независимую
(т. е. свободную от ошибки) величину и, как принято, отклады-
вают по оси х. Другую величину, у, считают зависимой перемен-
ной, подверженной экспериментальной ошибке. Соотношение
этих двух переменных называется на языке статистики регрес-
сией у по х. В этом разделе мы рассмотрим линейную регрессию,
которая имеет функциональную форму у=а+Ьх, где а — это от-
резок на оси у (точка, где линия регрессии пересекает ось орди-
нат, т. е. где х=0), а Ь — это наклон линии регрессии (первая
производная функции х, или тангенс угла, образуемого линией
регрессии с осью абсцисс).

2.	Линейная регрессия

Чтобы ответить на первый вопрос, коррелируют ли перемен-
ные между собой, т. е. является ли регрессия значимой, а если
значимой, то линейна ли она, — пользуются тем же методом,, ко-
торый был применен в разд. II, Б, 3. Общую изменчивость рас-
членяют на компоненты, обусловленные регрессией, линейно-
стью и ошибкой. Для этого мы должны сначала подобрать линию
регрессии, т. е. найти такие величины b и а, которые бы „наилуч-
шим образом” Соответствовали нашим экспериментальным дан-
ным. Из теоретических соображений можно вывести следующее
правило. Линия регрессии должна проходить через п разбросан-
ных на диаграмме точектак, чтобы сумма квадратов расстояний

—у* между наблюдаемыми (z/i) и ожидаемыми (у*) точками
была минимальной. Элементарными вычислениями можно по-
казать, что

а =	(9)

п

и

6=Ф-.	(’0)

«Зхх

где сумма квадратов Sxx и сумма произведений Sxy определя-
ется как

5хх = 2(х(-х)2 = 2^-(2х)2/щ

Sxy = 2 (*i—х) (z/i — у) =	(2* 2«/)/«;

х = ^'	у=^1.

п	п
Предположим теперь, что подходящая, для нас линия регрессии
у по х соответствует уравнению

у — а + Ьх,	(И)

где а и b определяются по формулам (9) и (10).

Отклонение у\ от средней у можно разделить на две части:

У\ — У = У,— yi + У\~ У,	(12)

где у* —величина у, вычисленная из уравнения линейной ре-
грессии (11) при x—xi. Возведя в квадрат обе стороны уравнений
(12) и просуммировав по всем наблюдениям, получаем

2 (у,-у)2 = 2 (у>-у*У + 2 (у - у)2•	(13)

Левая часть уравнения — это общая сумма квадратов Syy. Пер-
вый член правой части уравнения — сумма квадратов отклоне-
ний наблюдаемых величин у от линии регрессии (дисперсия
ошибки). Второй член —это сумма квадратов отклонений вели-
чин у*, которые лежат на предполагаемой лйнии регрессии, от
средней (дисперсия регрессии). Дисперсионный анализ линей-
ной регрессии проводится с помощью уравнений (9) — (13), как
это показано в табличке:

Источник «отклоне- ний	Число степеней свободы	Сумма квадратов	Варианса	 F
Регрессия	1	Sxy/Sxx	Sxy /Sxx	Sxy/s2 Sxx
Ошибка	п-2	Syy Sxy /Sxx	s - n_2  - s*y/sxx)	
Всего	п-1	Syy		

Статистически значимое F — это критерий достоверности ре-
грессии.

3.	Методика вычислений

Экспериментальные данные, а также их квадраты и произве-
дения указаны в табл. 5. Следует отметить, что для расчетов
требуются только суммы, так что практически дальнейший ин-
терес представляют только итоговые величины.
Таблица 5

Экспериментальные данные из гл. 1 (рис. 2), использованные
для оценки линейности регрессии

X	У	X2	ху	У*
4,47	1,13	19,9809	5,0511	1,2769
4,57	1,19	20,8849	5,4383	1,4161
3,92	1,62	15,3664	6,3504	2,6244
3,94	1,64	15,5236	6,4616	' 2,6896
3,25	2,22	10,5625	7,2150	4,9284
3,21	2,14	10,3041	6,8694	4,5796
2,57	2,60	6,6049	6,6820	6,7600
2,60	2,74	6,7600	7,1240	7,5076
2,02	3,01	4,0804	6,0802	9,0601
2,01	2,93	4,0401	5,8893	8,5849
1,57	3,29	2,4649	5,1653	10,8241
1,58	3,39	2,9664	5,3562	11,4291
35,71	27,90	119,0691	73,6828	71,7438

Из итоговых цифр мы имеем:

Sxx = 119,07 —(35,71^/12 = 12,802;

Sxy = 73,68—35,71 • 27,9/12 = — 9,343;

Syy= 71,74 — (27,9)2/12 = 6,876.

Дисперсионный анализ дает следующие данные:

Источник отклонений	Число степенен свободы	Сумма квадра- тов	Вариан- са	F	Р
Регрессия	1	6,818	6,818	1136,67	«0,001
Ошибка	10	0,057	0,0057		
Всего	11	6,876			

Достоверность регрессии или, точнее, корреляцию между
переменными можно также оценить другим способом. Вместо
сопоставления варианс делят сумму квадратов регрессии на об-
щую сумму квадратов. Это отношение, условно обозначаемое г2,
показывает, какая часть изменчивости обусловлена регрессией:

<?2

г2=_2^.	,	(14)

SxxSyy

Отметим, что при такой обработке не делается различий между
независимыми и зависимыми переменными. Величина г2 будет
одной и той же, когда сумма квадратов регрессии определяется
как S2Xy/Sxx и как S2xy/Syy, т. е. при регрессии у по х и х по у.
Такой способ оценки корреляции вполне применим в нашем слу-
чае. Исходное уравнение равновесия представляет собой уравне-
ние второй степени, в котором в качестве независимой перемен-
ной выступает концентрация эпитопов. После линеаризующих
преобразований зависимая переменная у (часть эпитопов, заня-
тых паратопами) в той или иной форме появляется в обеих час-
тях уравнения, а х становится сложной переменной, которая
подвержена ошибке.

Достоверность корреляции можно найти в таблицах коэффи-
циента корреляции г:

г =------------ (14')

(SxxSyy)I/2

Его значения колеблются в интервале между —1 и +1; абсолют-
ная величина коэффициента определяет степень корреляции, а
знак — ее направление.

Для наших данных г2=6,818/6,876=0,9916, а вероятность для
г = (0,9916)1/2 = 0,9958 составляет при 10 степенях свободы
Р<0,001.

4.	Линейный характер регрессии

Значимость отношения варианс и достоверность коэффициен-
та корреляции сами по себе не дают ответа на вопрос, имеет ли
регрессия линейный характер. Линейность регрессии можно оце-
нить в ходе анализа, выделив сумму квадратов отклонений для
шести пар параллельных проб и вычтя из этой суммы ранее вы-
численный компонент линейной регрессии. Этот прием позволяет
оценить линейность регрессии и завершает дисперсионный ана-

Таблица 6

Оценка линейности и анализ регрессии для экспериментальных
данных, приведенных в табл. 5

Источник изменчивости	Число степеней свободы	Сумма квадратов	Варианса		р
Регрессия	1	6,818	6,8180	1763,40	<0,001
Отклонения от линейности	4	0,035	0,0087	2,23	~0,2
Между параллельными про-					
бами	5	6,853			
Ошибка	6	0,023	0,0039		
Всего	11	6,876			
лиз (табл. 6). Отклонения от линейности оказались незначимы-
ми, и, следовательно, достоверность модели не вызывает сом-
нений.

Рассматриваемая регрессия имеет следующие параметры: на-
клон прямой Ь =—9,32/12,8 = —0,730; отсекаемый отрезок на оси
ординат а= (27,9 + 0,73-35,71)/12 = 4,498. Таким образом, экспе-
риментальные данные, соответствуют модели линейной регрес-
сии, имеющей уравнение

у = 0,730х + 4,498.

Г, Определение числа предшественников В-клеток

1.	Вероятностные модели

Кёлер (Kohler, 1976) описал метод определения антител к
^-галактозидазе и числа предшественников В-клеток, образую-
щих такие антитела у мышей BALB/c. Число клеток-предшест-
венников определяют, перенося ограниченное число сингенных
селезеночных ’клеток летально или сублетально облученным мы-
шам и исследуя затем характер распределения антител данного
клона в сыворотках реципиентов. Распределение сывороток ре-
ципиентов по числу выявленных клонотипов антител (ни од-
ного, один, два, три, четыре и более) представлено ниже (по ре-
зультатам двух отобранных опытов):

Задача состоит в том, чтобы вычислить среднее число различ-
ных клонотипов, встречающихся в сыворотках реципиентов. Для
решения этой задачи необходима модель, с помощью которой
можно было бы определить ожидаемое число сывороток с 0, 1,
2, 3, 4 и большим числом клонотипов антител. Такая модель на-
зывается вероятностной моделью, так как она предсказывает
i-й результат эксперимента, Х\, при помощи функции f(xi), кото-
рая определяет, сколько раз (с какой частотой) ожидается (ожи-
даемая частота = вероятность) этот результат. Очевидно, что
ожидаемая частота, или вероятность, отличается от эксперимен-
тальной, или наблюдаемой, частоты. При отборе данных на ос-
новании правильной модели можно предполагать, что, повторив
опыт бесконечное число раз, мы получим распределение частот,
приближающееся к распределению вероятностей. Таким обра-
зом, пользуясь понятием вероятности, можно прийти к конечным
выводам. Вероятности и частоты f(xi) обычно нормируют к пол-
ной группе событий, скажем N (т. е. 1=1, 2, ... N)-, таким обра-
зом, мы имеем

(15)

£=1

0<f(xi)< 1.

Когда все f(xi) точно задаются моделью, функцию f называ-
ют распределением вероятностей, тогда как термин распределе-
ние частот, как правило, употребляется применительно к анало-
гичному наблюдаемому распределению. Когда все результаты
наблюдаются с одинаковой вероятностью, мы имеем дело с про-
стым равномерным распределением:

f(Xi) = l/^; 1 = 1,2,..., N.	(16)

2.	Параметры

Распределение характеризуется своим положением на оси и
разбросом. Наиболее простой мерой положения служит сред-
няя, определяемая по формуле

ы

m = 2x/(*i)>	(17)

4—1

которая в случае равновероятных результатов [уравнение (16)]
упрощается до

N

(18)

N

Наиболее простым показателем разброса, или дисперсии, явля-
ется варианса, определяемая формулой

N	N	' N -]2

£=1	’	£=1	Ь=1

(19)

Для общего случая равновероятных результатов [уравнение
(16)] варианса определяется выражением
N

2 (*i —m)2

S2 = SL--------

N

(20>

или, если средняя величина определена из экспериментальный
данных:

N

2 (*1 - «)2

S2 =	----------

N — 1

(20')

Квадратный корень из этого выражения называют стандартным
отклонением.

3.	Построение модели

Задача состоит в том, чтобы построить такую обоснованную
вероятностную модель, с помощью которой мы могли бы срав-
нивать наблюдаемые распределения частот. Модель должна быть
дискретной, так как количество клеток-предшественников выра-
жается только целыми числами 0, 1,2, ..., п. Построение модели
мы начнем с наиболее простого случая. Вместо суспензии, содер-
жащей миллионы клеток, одна или две, из которых являются ис-

комыми клетками-предшественниками, рассмотрим сначала ур-
ну, содержащую, скажем, 1 черный и 9 белых шаров. Шанс из-
влечь черный шар составляет р= 1/10, а шанс извлечь белый шар
равен <?=(1—р)=9/10. Шансы остаются теми же самыми, если

наша урна содержит миллион шаров, одна десятая из которых
черные. Нельзя ожидать, однако, что в каждые десять попыток
мы всегда будем извлекать один черный шар; мы можем лишь
надеяться, что из очень большого числа попыток в среднем одна
десятая часть шаров будут черными.

Что случится, если за одну попытку мы будем извлекать не
один, а, скажем, четыре шара? Не исключено, что все четыре
будут черными, ' но вероятность такого события составит
р-р-р-р = р4= 10-4. Вероятность извлечения трех черных шаров
вместе с одним белым равна p3q-4 (так как белый шар может
извлекаться в любом из следующих четырех сочетаний: pppq,
ppqp, pqpp или qppp). В общем виде w из п шаров можно из-
влечь с вероятностью f (х) = (") pxqn~x, где член (") представля-

ет число сочетаний из х успешных и (п—х) безуспешных попыток

и равен (") = x! [символ п\ называют
означающим произведение п(п—1) (п—2) ...

n-м факториалом,
2-1; 01 = 1].
Сумма таких вероятностей

(") p°qn +

pV-2 + • • • +

х/ \£1

п2_Лрп^Я1 +

(п] pnq°
\п)

представляет собой биномиальное разложение (p+q)n, и поэто-
му дискретное распределение вероятностей, включающее эти вы-
ражения, называется биномиальным распределением. Оно удо-
влетворяет критериям распределения вероятностей, так как сум-
ма п+ 1 членов равна единице и каждый член этой суммы лежит
в интервале между 0 и 1. В соответствии с уравнениями (17) и
(19) средняя биномиального распределения равна пр, а ее ва-
рианса— npq.

4.	Распределение Пуассона

Биномиальное распределение может служить непосредствен-
но в качестве вероятностной модели, потому что оно точно опре-
деляет, с какой частотой следует ожидать образования 0, 1,2, ...
клонотипов антител у реципиентов. Однако при числе перене-
сенных клеток, равном 2-106 или 107, арифметические операции
оказались бы затруднительными. Поэтому от общего выраже-
ния биномиального распределения мы переходим к известному
упрощенному приближению, вполне значимому в условиях наших
опытов. Мы обратили внимание на то, что число переносимых
клеток (п) очень велико, в то время как доля специфических
предшественников (р, вероятность успеха) крайне мала. Можно
сказать, что в этих условиях

М) pXqn-x------(пР)х е-пр. (е = 2,71828 ...).

\XJ п —ОО х
р -> О

Иными словами, если п стремится к бесконечности, ар — к ну-
лю, то биномиальное распределение стремится к своему пуассо-
новскому пределу.

Соответствующий предел для вариансы можно вывести ана-
логичным образом, но само собой очевидно, что при очень малом
р величина (1—р) =q будет приблизительно равна единице, и мы
можем прямо записать, что

npq----->- пр,

'	рО

т. е. варианса равна средней.

Итак, мы имеем дело с распределением Пуассона. Возвра-
щаясь к нашим иммунологическим данным, мы констатируем
следующее: предшественники В-клеток имеют пуассоновское
распределение в общей клеточной популяции; из этой популя-
ции переносят п клеточных выборок; среднее число предшест-
венников разных клонов на выборку равно р, а фактическое чис-
ло предшественников в данной выборке, которое можно обозна-
чить х, будет, разумеется, варьировать от опыта к опыту. В са-
мом деле, х — это случайная переменная, которая может рав-
няться 0, 1, 2, ... и т. д. Какова вероятность какого-то отдельного
значения х? Нетрудно показать, что если величина р ничтожно
мала по сравнению с п, то эта вероятность данного значения х
составляет

f(x) = (х = О, 1,2,...),	(21)

х!

где р = пр — это среднее число различных клонотипов антител
в сыворотке реципиентов.

Уравнение (21) выражает пуассоновское распределение ве-
роятностей. Переменная х принимает значения 0, 1, 2, ..., кото-
рым соответствуют вероятности, определяемые путем подстанов-
ки значений х в уравнение (21). Так, например,

7(0) = е^,

7(1) = ^,	(22)

7(2)=-^-Ги

и так далее. Уравнение (22), переписанное как ц =—ln[f (0)],
позволяет определить среднее число различных клонотипов в сы-
воротках реципиентов по проценту сывороток, не содержащих
никаких антител. В первом эксперименте нашего примера 4 из
19 сывороток не содержали ни одного клонотипа антител; следо-
вательно, среднее число различных клонов составляет у,, =
=—In (4/19) = 1,56. Во втором эксперименте имеем ц2 =
= — 1п(7/19) «1.

Подставляя уравнение (21) в уравнения (17) и (19), нахо-
дим, что и средняя величина, и варианса пуассоновского распре-
деления равны ц.

5.	Усеченное распределение Пуассона

Еще одной общей задачей является определение асиммет-
рии. Как можно видеть из экспериментальных данных, каждую
мышь классифицируют по числу полученных ею клонов: 0, 1, 2,
3, 4 или более. Это обусловлено тем, что метод изоэлектрофоку-
сирования выявляет отдельные клонотипы антител только в том
случае, когда их число невелико, — скажем, меньше 4.
В этом случае мы говорим об усеченном распределении Пуас-
сона. Мы могли бы определить среднюю, применив формулу
ц = —ln[f (0)], но при этом мы, очевидно, не использовали бы
всю информацию, полученную в эксперименте. Мы могли бы
предположить, что мышь, у которой обнаружено k или большее
число клонов, действительно получила k клонов, и рассчитать
среднюю величину обычным способом (т. е. общее число клонов
разделить на общее число мышей); однако такая «фиктивная
средняя» ц* была бы явно неточной. Стейнберг (Steinberg,
1976) предложил весьма полезную итеративную формулу:

rt	.	.

1 — [(nk/n) Q]

где ц* — средняя величина при условии, что мышь с k или
большим числом клонов получила точно k клонов, п — общее
число мышей и nk— число мышей с k и большим числом

е_!—+__________________________

г‘ Л - ,1+	ini

клонов.

(24)

Используя ц* в качестве первого приближения к щ, мы при по-
мощи уравнения (24) получаем значение Q. Это значение Q мы
используем в уравнении (23), чтобы получить второе прибли-
жение к pt- Эту операцию повторяем до тех пор, пока последова-
тельные приближения не перестанут значимо различаться. Пос-
ле того как определена щ, воспользуемся уравнением (21) при
p*=pt, чтобы установить ожидаемое число сывороток с 0, 1, 2, 3,
4 и большим числом клонотипов антител. Результаты обсуждав-
шихся выше двух экспериментов приведены в табл. 7.

Таблица 7

Усеченное распределение Пауссона для оценки частоты
предшественников В-клеток (данные из Kohler, 1976)

Число пере- несенных клеток селезенки		Наблюдаемое (Н) и ожидаемое (О) число сывороток с 0, 1, 2, 3, 4 или большим числом клонотипов антител									
		0		1		2		3		4 или бо- лее	
		Н	О	н	О	Н	о	н	о	Н	о
2- 10е	2,27	4	2,08	3	4,49	4	5,10	3	3,86	5	3,42
110’	2,22	7	2,06	1	4,48	3	5,08	1	3,77	7	3,51
6. Оценка модели

Теперь возникает вопрос, как оценить, могут или не могут
различия между наблюдаемой и ожидаемой частотами быть обу-
словлены случайными колебаниями. Специалист по математи-
ческой статистике отвечает так: я могу рассчитать вероятность
ошибки при отказе от «верной» гипотезы. Если эта вероят-
ность ниже общепринятого уровня (обычно 5%, иногда 1 или
0,1%), то гипотезу при данном уровне вероятности отвергают, в
противном случае от гипотезы не отказываются. Такой способ
рассуждения называют оценкой гипотезы, а когда, как в нашем
примере, гипотеза касается соответствия наблюдаемого распре-
деления частот теоретической вероятностной модели, говорят об
оценке согласия. Теоретическое распределение, используемое для
оценки согласия, называется распределением %2. Оно представлено
в виде таблицы в любом из сборников статистических таблиц
(например, Fisher, Yates, 1963; Documenta Geigy, 1962) и зависит
от так называемого числа степеней свободы (чсс), т. е. числа
независимых сравнений, сделанных с целью оценить согласие.
Формула для расчета %2 выглядит так:

2	(пнабЛ| — пожиД|)2

чсс — Л	~

1^1	“ожид.

(25)

где Пнабл 1 и Пожид t — число соответственно наблюдаемых и
ожидаемых (согласно модели) случаев в группах, имеющих ча-
стоту i. Сумма включает все с групп, а чсс — число степеней
свободы — равно с минус число ограничений. Для первого опыта
из нашего примера, оценивая согласие наблюдаемых данных мо-
дели пуассоновского распределения, мы имеем

2 _ (4 —2,08)2

7'3 ~	2,08

(3 —4,49)2

4,49

(4 —5,10)2
5,10

(3 — 3,86)2

3,86

(5-3.42)2 = 3 36
3,42

Мы сделали пять сравнений, но не все они независимы; в част-
ности, они зависят 1) от общего числа сывороток и 2) от ве-
личины pt, установленной на основании тех же самых данных.
Поэтому для оценки остается только 3 степени свободы. При трех
степенях свободы и 5 %-ном уровне вероятности ожидаемая ве-
личина %2 равна 7,81, как это можно видеть в третьем ряду любой
из таблиц распределения х2- Поскольку 3,36 (наблюдаемая ве-
личина х2) меньше 7,81 (ожидаемой величины х2), мы не отвер-
гаем гипотезу о том, что распределение экспериментальных дан-
ных (в первом опыте) соответствует распределению Пуассона.
Между тем во втором опыте мы имеем:
2 = (7-2,Об)2 (1 — 4,48)2	(3 —5,08)2

Хз 2,06	+	4,48	+	5,08	+

, (1 — З,77)2 , (7 —3,51)2 = 21 0
3,77	3,51	’ '

В этом случае наблюдаемая величина 21,0 больше ожидаемой
величины 7,81, и мы должны отказаться от гипотезы распреде-
ления Пуассона, так как наблюдаемые данные не соответствуют
этой модели. Причина такого плохого соответствия и другие
подробности обсуждаются в оригинале статьи Кёлера (Kohler,
1976): высказано предположение, что лимитирующим фактором
часто бывают Т-клетки.

Отметим, что критерий /2 [уравнение (25)] может быть приме-
нен для любой модели, способной предсказать ожидаемые ре-
зультаты эксперимента. Следует обратить внимание на верное
определение числа степеней свободы.

Д. Конкуренция между клеточными клонами
с различным временем генерации

1. Экспоненциальный рост

Допустим, что в популяции, состоящей из 103 антителообра-
зующих гибридных миеломных клеток, растущих экспоненциаль-
но со средним периодом генерации 7=18 ч, возникает непроду-
цирующий мутант, у которого среднее время генерации равно
12 ч. Как скоро численность мутанта достигнет численности ро-
дительского клона? Каким в это время будет размер общей кле-
точной популяции?

Будем рассматривать число клеток в популяции, N, как не-
прерывную переменную, изменяющуюся во времени. Если изме-
нение величины N, KN, пропорционально N, а также прошедше-
му времени, Л/, то мы имеем

AN = kNM,	(26)

где k — постоянная. Разделив уравнение (26) на А/ и приняв
ограничение, что Ai—*-0, получим дифференциальное урав-
нение

= kN;	(27)

dt

решение (или интеграл) этого уравнения дается формулой

N(0 = Noeft/,	(28)

где No — число клеток в популяции при t~0. Постоянная/г,
называемая специфической скоростью роста, связана с периодом
времени, необходимым для удвоения популяции. Этот период на-
зывают временем удвоения, а если при этом не происходит гибе-
ли клеток, этот же период будет и средним временем генерации,
т. е. средним временем жизни отдельной клетки. Обозначив вре-
мя удвоения через Т, имеем

2N0 = NoekT, или k =	(29)

Подставив уравнение (29) в уравнение (28), получаем

#(0 = М)2//Г -	(30)

Число родительских клеток можно рассчитать для любого
времени t, подставив их исходное число и среднее время гене-
рации в уравнение (30). В нашем случае No= 103 и Т= 18 ч.
Пусть t=0 — это момент, когда возник мутант. Численность по-
пуляции мутанта в момент t, Nm(t) выражается

Nm(t)— 23t/2T,	(31)

так как исходное число мутантов равно 1, а время генерации
мутанта равно (2/3) Г. Время t, в которое численность двух кле-
точных популяций станет равной, определяется из равенства
Nm(t)=N(t) или с помощью уравнений (30) и (31)—из урав-
нения

2</2г = 103.	(32)

Прологарифмировав обе части последнего уравнения, находим

t = —2Т ~ 20Т = 360 ч = 15 дней.
1п 2

В момент, когда численность родительских и мутантных клеток
сравняется, размер общей популяции составит 2N(t), где N(t)
•определяется из уравнения (30), a t удовлетворяет уравнению
(32):

2N (360) = 2 • 103 • 2360/18 ~ 2 • 10» клеток.

Е. Сравнение двух методов оценки образования антител

1.	Таблицы взаимной сопряженности

Квинтенс и Лефковитс (Quintans, Lefkovits, 1973) описали
метод использования микрокультур для определения числа кле-
ток-предшественников, отвечающих на бараньи эритроциты in
vitro, по доле неотвечающих культур клеток селезенки от нор-
мальных мышей. Для расчета среднего числа клеток-предшест-
венннков по наблюдаемой доле отрицательных культур авторы
используют формулу Пуассона [уравнение (21)], как это проде-
монстрировано в разделе Г. Однако в их оригинальной статье
приведены данные о числе антителообразующих клеток в микро-
культурах, полученные двумя разными методами: с помощью
реакции гемолитического пятна (Lefkovits, 1972) и реакции ло-
кального гемолиза в геле. Распределение микрокультур в зави-
симости от результатов двух оценок (выявление ответа обоими
методами) представлено ниже. (Данные взяты из двух разных
опытов, поставленных на панелях для микрокультнвирования с
60 лунками каждая.)

Эксперимент I

Эксперимент 2

Метод гемо-
литического
пятка

Всего в
строке
+ -

Метод гемо-

литического
пятна

+ -

Всего в
строке

Метод ло- 4-3	0

кальиого —	2	55

гемолиза

3

57

Метод ло- 4- 30	6

кальиого — 16	8

гемолиза '

36

24

Всего в
столбце

5 55

Всего в 46 14
столбце

60 .

Такого рода таблицы называют таблицами взаимной сопря-
женности 2X2 (четырехпольными таблицами). По данным пер-
вого опыта, в трех микрокультурах ответ зарегистрирован обои-
ми методами, в двух — только методом гемолитического пятна,
и не было микрокультуры, в которой ответ обнаруживался бы
при оценке методом локального гемолиза, но не выявлялся ме-
тодом гемолитического пятна. В 55 лунках ответ не обнаружен
ни одним из методов. В общем виде четырехпольную таблицу
можно записать так:

Фактор 1

Есть			Нет	Суммы по строкам
Фактор 2	Есть	а	Ь	
	Нет	с	d	

Суммы по
столбцам

Сх = а 4- с

Ct = b+d I А/— а 4-Ь 4-с 4-<2
Нас интересуют здесь два основных вопроса: 1) существует
ли какая-либо связь между двумя факторами? 2) как эту связь
можно измерить?

2.	Критерий х2 для оценки связи

На первый вопрос можно ответить^проверив гипотезу отсут-
ствия связи между факторами 1 и 2. Действительно, если предпо-
ложить, что связь отсутствует, то ожидаемое число микрокуль-
тур, у которых будут присутствовать оба фактора, должно удо-
влетворять соотношению

а __ Rj

”сГ ~ ~ '

По аналогии

В =	_	^261 . g _ RjC2

Р N '	1 N ’	N ’

Так как ожидаемые числа а, (3, у и б четырехпольной таблицы
можно вычислить из наблюдаемых чисел а, Ь, с и d, для оценки
согласия [уравнение (25)] вполне пригоден критерий %2:

(«~°)а + (*>-?)* + fr-7)*.. + ,(d-2j)l.	(33)

а	р	&

В данном случае %2 имеет только одну степень свободы, так как
мы рассматриваем четыре сравнения н три независимых пара-
метра, вычисленных из экспериментальных данных, а именно:
сумму по одной строке, сумму по одному столбцу и общее число
микрокультур. Произведя ряд преобразований, из уравнения
(33) получаем

(34)

Если вероятность, соответствующая полученной величине, не
превышает 5%, мы можем отклонить гипотезу отсутствия связи
(вероятность ошибки при этом очень мала) и сделать вывод
о том, что такая связь, не обусловленная случайными колеба-
ниями, достоверно существует (при 5%-ном уровне вероятности).
Для эксперимента 2 мы имеем:

2	(30-8-6-16)^60 =2

Л 46 • 14 • 36 • 24

При одной степени свободы полученной величине соответствует
вероятность Р в интервале 0,1—0,2. В связи с этим мы заклю-
чаем, что связь между результатами, полученными с помощью
методов локального гемолиза и гемолитического пятна, для этой
панели статистически незначима.
3.	Поправка на непрерывность

Метод поправки на непрерывность для четырехпольных таб-
лиц был описан Ф. Йейтсом (Yates, 1934), и его часто называют
поправкой Йейтса. Распределение х было использовано как при-
ближение к распределению, выраженному уравнением (33) или
(34), при нулевой гипотезе об отсутствии связи и при постоян-
ных суммах для строк и столбцов. Однако в четырехпольных
таблицах с низкими частотами возможное число наборов вели-
чин, которые бы давали неизменные суммы для строк и столбцов,
очень мало (для получения такого набора последовательно
увеличивают один и уменьшают другой из показателей каждый
раз на 1, до тех пор, пока уменьшаемый показатель не обратится
в нуль). Таким образом, результирующее распределение дискрет-
но, тогда как аппроксимирующее его распределение х2 непрерыв-
но. С поправкой на непрерывность вариант уравнения (34), пред-
ложенный Йейтсом, имеет вид

Xi (Йейтса) =	.	(35)

Для эксперимента 2 (в нашем примере) имеем

X? (Йейтса) _ (I 30  8-6  16) | ->/.  60>»	0 023

46 • 14  36  24

Эта величина соответствует вероятности Р в интервале 0,8 —
0,9. Сравнивая этот результат с результатом, полученным выше
для тех же экспериментальных данных, можно видеть, что кри-
терий х2 без поправки на непрерывность завышает вероятность
связи, в результате чего нулевая гипотеза может быть ошибочно
отвергнута.

4.	Точная оценка для четырехпольных таблиц

Если значение а, Ь, с или d очень мало, скажем, меньше 5,
то распределение х2 уже нельзя, к сожалению, рекомендовать
для оценки согласия и использовать при анализе четырехпольной
таблицы взаимной сопряженности на примере эксперимента 1.
В середине 30-х годов этого столетия Фишер предложил метод
для вычисления точной вероятности ошибки при отказе от гипо-
тезы отсутствия связи применительно к четырехпольной таблице.
Эта точная вероятность выражается формулой

Р _	(36)

Y!o!fe!c!d! ‘	1 ’

В литературе этот метод называют точной оценкой для четырех-
польных таблиц (см. также Fisher, 1950). Применяя его (как это
16*
и следует делать) для обработки данных эксперимента 1, по-
лучаем	'

Р = . 5! • 5^..-3! • 57.	= 3-4-5. = 0 00029

60! • 3! • 2! • 55! • 0!	58-59-60

Данный показатель Р настолько мал, что мы можем сделать вы-
вод о высокодостоверной связи между результатами двух
оценок.

Точная формула [уравнение (36)] дает вероятность таблицы
с заданными (указанными выше) частотами а, Ь, с и d. Для того
чтобы определить достоверность этой вероятности и проверить
нулевую гипотезу отсутствия связи, мы должны выяснить, до
какой степени упадет вероятность на краю распределения, сло-
жив вероятность данной таблицы с вероятностями таблиц, от-
ражающих более крайние варианты распределения, и получая
те же самые итоги.

Снова взяв в качестве примера эксперимент 2, мы должны бу-
дем просуммировать вероятности, соответствующие следующим
семи четырехпольным таблицам с одинаковыми итогами строк
и столбцов:

30 61

16 8|

31 5

15 9

32 41	33 3

14 10|	13 11

I

34 2

12 12

35 II
11 13|
I

36 01

10 14|
I

।

Применив уравнение (36) и просуммировав соответствующие ве-
роятности, мы получим Р = 0,212, что и будет точным результа-
том. Следует обратить внимание на то, что поправка Йейтса,
рассчитанная выше, дает приемлемое приближение к этой точ-
ной вероятности. Для быстрого вычисления уравнения (36) мож-
но использовать таблицы Documenta Geigy (1962, стр. 109—123).

5. Корреляция

Второй вопрос, который нам нужно рассмотреть, — это вопрос
о том, как измерить степень связи. Заметим, что степень связи
вовсе не то же самое, что достоверность связи. Можно наблю-
дать высокую степень связи, которая не будет статистически
значимой (Р>0,05), и наоборот, низкую, но статистически
значимую степень связи (Р<0,05). В случае четырехпольных
таблиц связь выражается обычно коэффициентом корреляции:
Отметим, что %2 = JVr2, т. е. коэффициент корреляции зависит толь-
ко от относительных частот; в этом главным образом и состоит
различие между степенью и достоверностью связи. Когда Ь —
= с=0 (оба фактора либо одновременно присутствуют, либо от-
сутствуют), мы имеем максимальную положительную связь и
г=1. Когда a=d=Q (т. е. оба фактора взаимно исключают друг
друга), мы имеем максимальную отрицательную связь (антикор-
реляцию) и г = — 1. При всех остальных комбинациях г находит-
ся между этими двумя пределами. Абсолютное значение г слу-
жит мерой степени связи, а знак отражает совпадение ( + ) или
несовпадение (—) между факторами. Нулевое значение г озна-
чает отсутствие корреляции: в этом случае %2 также равен 0.

В эксперименте 1 мы нашли, что 7$=0,76. Отсутствие полной
связи (7? = 1) обусловлено тем, что микрокультуры в-двух лун-
ках оказались отвечающими при испытании методом гемолити-
ческого пятна и неотвечающими при оценке методом локального
гемолиза. В эксперименте 2 г=0,06, т. е. связь между двумя оцен-
ками отсутствует.

Ж. Типирование СКЛ-детерминант

1.	Непараметрические оценки

Когда лимфоциты от генетически различных особей растут
вместе в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ), то обычно на-
блюдается пролиферация. Отвечающие клетки — это подкласс
Т-лимфоцитов. Их активируют антигенные детерминанты сти-
мулирующих клеток. Эти детерминанты находятся под контро-
лем генов главного комплекса гистосовместимости. Как правило,
ставят СКЛ, дающие однонаправленные ответы (при этом «от-
вечающие» клетки активируются специальным набором «стиму-
лирующих» клеток). При заданной комбинации отвечающих и
стимулирующих клеток на выраженность ответа влияют не-
сколько факторов. Наиболее важный из них — различная стиму-
лирующая и отвечающая способность клеток. Эта способность
значительно варьирует от опыта к опыту. В связи с этим метод
оценки должен быть достаточно «грубым» для того, чтобы при-
вести результаты всех опытов в соответствие с законом нормаль-
ного распределения (см. Thorsby, Piazza, 1975, и указанную там
литературу). Приведенные ниже примеры иллюстрируют такой
метод.

Рассмотрим 24 ответа, которые дали 8 образцов отвечающих
клеток на 3 образца стимулирующих клеток. Были получены
следующие экспериментальные данные (числа импульсов в ми-
нуту) :
Стимула- рующие клетки	Отвечающие клетки								Меди- ана
	1	2	3	4	5	6	7	8	
1	22	100	150	1000	200	2000	2100	50	175
2	3000	3000	3000	3000	10 000	3000	3000	100 000	3000
3	200	250	1000	1000	14 000	81 000	5000	500	1000

Чтобы извлечь достаточно надежную информацию из данных,
подобных этим, обычно пользуются выборочными показателями,
которые не зависят от резко выделяющихся значений. Наиболее
простой из них — медиана, используемая вместо обычной сред-
ней. Это частный случай применения непараметрических оценок
вместо параметрических. Если наблюдаемые результаты распо-
ложить в возрастающем (или убывающем) порядке, то среднее
наблюдение в этом ряду будет медианой (или 50-м проценти-
лем). При нечетном числе наблюдений (п) медиану будет пред-
ставлять величина одного наблюдения. Если п — четное, то ме-
диану определяют как среднюю для двух срединных наблюде-
ний. Например, медиана наблюдений 1, 2, 3 и 10000 равна 2,5;
средняя арифметическая в данном случае равна 2501,5: на нее
сильно влияет крайняя величина 10000.

2.	Приведение данных в- соответствие с законом нормального
распределения

Полученные данные нормализуют в два этапа. Сначала на-
блюдаемое число импульсов для каждого образца стимулирую-
щих клеток выражают в виде доли от соответствующей медиа-
ны, т. е.' каждую величину в строке делят на медиану этой
строки:

Стимулирующие клетки	Отвечающие клетки							
	1	2	3	4	5	6	7	8
1	0,13	0,57	0,86	5,71	1,14	11,43	12,00	0,29
2	1,00	1,00	1,00	1,00	3,33	1,00	1,00	33,33
3	0,20	0,25	1,00	1,00	14,00	81,00	5,00	0,50
Медиана	0,20	0,57	1,00	1,00	3,33	11,43	5,00	0,50

На втором этапе нормализацию проводят в другом направле-
нии, т. е. каждую величину столбца делят на медиану этого
столбца:
Стимулирующие клетки  i	Отвечающие клетки							
	1	2	3	4	5	6	7	8
1	0,65	1,00	0,86	5,71	0,34	1,00	2,40	0,58
2	5,00	1,75	1,00	1,00	1,00	0,09	0,20	66,66
3	1,00	0,43	1,00	1,00	4,20	7,09	1,00	1,00

Такая «двойная, нормализация» (по отвечающим и стимулирую-
щим клеткам) оказалась весьма полезной при оценке результа-
тов типирования клеток. При этом можно использовать не толь-
ко медиану; например, гораздо лучшую шкалу для учета дает
нормализация к 75-му процентилю (Q-й процентиль — это наи-
большая величина из Q% наблюдений; например, медиана —
это 50-й процентиль).

3.	Частоты гаплотипов и неравновесные сцепления

1.	Оценка частот гаплотипов иа основании популяционных
данных

Пусть N индивидуумов протипировано по двум маркерам
А и В, контролируемым двумя генами, каждый из которых име-
ет два аллеля, т. е. А, а и В, Ь. Строчная буква обозначает ре-
цессивный, или «немой» (отрицательный), аллель. На нижесле-
дующей четырехпольной таблице дано распределение фенотипов:

		Реакция на Положи-	маркер А  Отрица-	Маргиналы (итоги)
		тельная.	тельная	
Реакция на мар-	Положительная	/дв	/аВ	fb
кер В	Отрицательная	/аь	/ ab	1—Zb
	Маргиналы (итоги)	/а	’-/а	

Здесь /дв— доля индивидуумов, положительных по А и В,
и т. п. Маргинальные итоговые суммы fA и fe представляют со-
бой фенотипические частоты этих двух маркеров. Очень часто
задача состоит в том, чтобы на основании этих популяционных
данных установить частоты четырех гаплотипов (или гамет).
Приводимая ниже четырехпольная таблица отражает распреде-
ление гамет или гаплотипов.
Гамета В	Наличие  Отсутствие	Гамета А		' Рв  1—Рв
		Наличие  Рав Раь	Отсутствие  Рав  РаЬ	
		Ра	1~РА	1

Здесь Дав — доля гамет с гаплотипом АВ и т. д., а рА и рв —
частоты аллелей двух маркеров. Так как аллель А—доминант-
ный по отношению к аллелю а, а аллель В — доминантный по от-
ношению к Ь, то гипотезу мы можем записать уравнением Хар-
ди— Вейнберга:

P2ab = /!.b’

(1 - Ра)2 = ( Рав + Pab)2 = 1 - Гд = Гав + Г.Ь >

(1 — Рв>2 == ( Рль + Pab)2 = 1 -Гв = ГаЬ + Г.Ь .

Рав ~ 1 Рав Раь Раь»

после некоторых преобразований получаем

Рав Раь Рав Раь»

PAb = (fAb+fab)1/2-(fab)1/2.	(38)

РаВ = (ГаВ + Гаь)1/2-(Гаь),/2,

Pab = ( Гаь)1/2 "

Это уравнения для частот гаплотипов рАв, Раь, Рив и раь, которые
обычно не наблюдаются непосредственно, а выражаются в виде
функции наблюдаемых фенотипических частот [аь, /ав и fab.

2.	Неравновесное сцепление

Сравним частоту гаплотипа АВ с частотой, ожидаемой при
случайных сочетаниях этих двух аллелей. Вероятность случай-
ной ассоциации будет, очевидно, рАрв; поэтому, чтобы оценить
отклонение от гипотезы случайной ассоциации аллелей, обычно
вычисляют величину А:

А = рАВ рА рв .	(39)

Этот показатель называют параметром неравновесного сцепле-
ния. Исходя из тождества

А = Рав~ Ра Рв = Рав Раь = Раь Рав	С40)
и выражений уравнения (38), мы можем записать

A =(WS-|(Z»+/»)(^+ «)'"•	(«)

Эта формула дает оценки связи между гаметами по определяе-
мым обычно фенотипическим частотам. Величина этой связи
варьирует в пределах от —0,25 до +0,25. Согласно уравнению
(40), положительная величина А указывает на преобладание га-
мет АВ и ab, а отрицательная — на избыток гамет АЬ и аВ. До-
стоверность полученной величины А (т. е. ее отличия от нуля)
можно оценить по наблюдаемым частотам фенотипов с помощью
обычного критерия %2 для четырехпольных таблиц.

Корреляция р между маркерами А и В выражается уравне-
нием

_ _____________/АВ fab~ АдьЛ1В_________ __

[( /дВ + /ав) ( /дв + /дь) ( fkb + fab) ( Лв + Ль )V/2

=__________Д[Д + 2(1-Ра)(1-рв)]

{0-РА)а0-Рв)2[1-0-РА)2][1-(1-Рв)«]}1/2 ‘

По форме р легко видеть, что критерий %2 для четырехпольной
таблицы дается уравнением

Х2= Afy2.

3.	Обработка полевых данных

Приводимый ниже пример взят из работы Пьяцца и сотр.
(Piazza et al., 1973), которые исследовали полиморфизм по ан-
тигенам гистосовместимости (HLA) у жителей острова Сарди-
ния— весьма изолированной географической области Средизем-
номорья. Комплекс HLA, так же как и Н-2 у мышей, контроли-
руется многими сцепленными генами, каждый из которых имеет
несколько аллелей. Мы рассмотрим здесь только два локуса,.
HLA-A и HLA-В, и оценим распределение двух аллей Aw30"
(локус А) и В18 (локус В). При обследовании 403 лиц обнару-
жено следующее распределение фенотипов:

	Лш30+	ЛшЗО	
В18+	131  fAB= 131/403=0,326	76 faB=(M88	207 fB = 0,514
В18- .	8  /Аь = 0,019	188 fab = 0-467	196  1— = 0,486
	139 fA —0,345	264  1— fA =0,655	403
Частоты аллелей Aw30 и В18 составляют

рА = 0,191; рв = 0,303.

Частота гаплотипа (Aw30, В18) выражается уравнением (38):
рдВ = 0,177.

Параметр неравновесного сцепления дается уравнением (41):

А = К0Л67 — /(0,655) (0,486) = 0,119.

Для соответствующего %2 имеем

2 = <131 • 188-76-8)8.403 = 15 62.

Л 207 • 196 • 139 - 264

это свидетельствует о достоверности связи между антигенами
(так как при таком высоком показателе х2 связь будет случай-
ной менее чем в 1 случае из 1000). Корреляция фенотипов в дан-
ном случае достигает

XLM/2 = 115^/2 =
N )	\ 403 /

Интересно отметить, что гаплотип Aw30, В18 поддерживается
на столь высоком уровне неравновесного сцепления только сре-
ди сардинцев. В окружающих индо-европейских популяциях это-
го не наблюдается; они, как правило, несут другую хромосомную
комбинацию (Al, В8), которая тоже обнаруживает очень высо-
кий параметр неравновесного сцепления, обычно 0,08. Неравно-
весное сцепление между генами, находящимися в разных локу-
сах одной хромосомы, — это характерная особенность главного
комплекса гистосовместимости у млекопитающих (HLA у чело-
века, Н-2 у мыши и т. д). Неравновесное состояние не поддает-
ся простому объяснению: сцепление, естественный отбор, Мигра-
ция и дрейф генов — все эти факторы могли в свое время под-
держивать стабильность неравновесного сцепления. Однако
•относительное давление каждого из этих факторов оценить труд-
но. Предполагается, что основной фактор, ответственный за соз-
дание и поддержание неравновесных состояний, — это взаимо-
действие между генами, тесно связанными функционально, в ус-
ловиях естественного отбора.

Более полные сведения по этому вопросу читатель найдет
в гл. 5 книги Кавалли-Сфорца и Бодмера (Cavalli-Sforza, Bod-
mer, 1971).
* «
«

Профессор Фазекас де Сент-Грот любезно согласился про-
честь первоначальный вариант этой главы и сделал множество
ценных замечаний, большая часть которых была учтена при пе-
реработке текста. Я глубоко признателен ему за эту бескорыст-
ную помощь, но за все возможные ошибки и упущения считаю
ответственным только себя самого. Кроме того, я выражаю бла-
годарность Центру по изучению иммуногенетики и гистосов-
местимости (CNR, Турин, Италия), который оказывал мне фи-
нансовую поддержку.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Armitage Р. (1971). Statistical Methods in Medical Research, Wiley, New York
Bliss С. I. (1970). Statistics in Biology, McGraw-Hill, New York.

Cavalli-Sforza L. L., Bodmer W.F. (1971). The Genetics of Human Populations,
Freeman, San Francisco.

Colton R. (1974). Statistics in Medicine, Little, Brown, Boston. Documenta
Geigy—Scientific Tables, 6th ed. (1962). Geigy Pharmaceutical Co. Ltd.,
Manchester.

Fisher R. A. (1950). Statistical Methods for Research Workers, Oliver and Boyd,
Edinburg.

Fisher R. A., Yates F. (1963). Statistical Tables for Biological, Agricultural
and Medical Research, Oliver and Boyd, Edinburg.

Hsia S., Howell D. N., Amos B., Woodbury M. A. (1977). J. ImmunoL, 118,
1659.

Kohler G. (1976). Eur. J. ImmunoL, 6 , 340.

Lefkovits 1. (1972). Eur. J. ImmunoL, 2, 360.

Mather K. (1972). Statistical Analysis in Biology, Smith, Gloucester, Massa-
chusetts.

Piazza A., Belvedere M. C., Bernocco D., Conighi C., Contu L., Curtoni E. S.,
Mattiuz P. L., Mayr W., Richiardi P., Scudeller G., Ceppellini R. (1973).
In: Histocompatibility Testing 1972 (J. Dausset and J. Colombani, eds.),
p. 73, Munksgaard, Copenhagen.

Quintans J., Lefkovits I. (1973). Eur. J. ImmunoL, 3, 392.

Sokal R. R., Rohlf F. J. (1973). Introduction to Biostatistics, Freeman, San
Francisco.

Steinberg C. (1976). Eur. J. ImmunoL, 6, 346.

Thorsby E., Piazza A. (1975). In: Histocompatibility Testing 1975 (F. Kissme-
yer- Nielsen, eds.), p. 414, Munksgaard, Copenhagen.

Yates F. (1934). Contingency tables involving small numbers and the y2 test
J. R. Stat. Assoc., 29, 51.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЛС — антилимфоцитарная сыворотка

АОК — клетка, образующая антитела

БА — белок А стафилококка

БДБ — бис-диазотированный бензидин

БдУ — 5'-бромдезоксиуридии

Бис — N, N'-метиленбисакриламид

Бицин — Ц,М-бис(2-гидроксиэтил)-глицин

БСА — бычий сывороточный альбумин

БЭ — бараньи эритроциты

БФС — бромфеноловый синий

ГАЕ — гемагглютинирующая единица вируса

ГАТ — среда для культуры клеток, содержащая гипоксантин,
аминоптерин и тимидин

ГЛТ — сополимер L-Глу : L-Лиз : L-Тир в соотношении 62 : 34 : 4

ГСИ — N-гидроксисукцинимид

ГСК — N-гидроксисукцинимидный эфир карбоновой кислоты

ГЭПЭС — М-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы-2-этансульфрновая ки-
слота

Дансил — 1-диметиламинонафталин-5-сульфонил

Данс-NHs — 1-диметиламинонафталин-5-сульфонамид

Данс-ОН— 1-диметиламинонафталин-5-сульфоновая кислЪта

ДАТД — N.N'-диаллилтартардиамид

ДНБС — 2,4-динитрббензолсульфонат натрия

ДНФ — динитрофенол

ДМСО — диметилсульфоксид

ДМФ — диметилформамид

ДСН — додецилсульф ат натрия

ДТНБ-С1 — хлорид дитионитробензола

ДЦК — дициклогексилкарбодиимид

ДЭАЭ—диэтил аминоэтил-

ЗБР — забуференный боратами физиологический раствор хлори-
стого натрия

ЗФР — забуференный фосфатами физиологический раствор хло-
ристого натрия

ИС — индекс стимуляции
ИТФ — изотахофорез

ИЭФ — изоэлектрофокусирование

КМС — комплемент морской свинки

Кон-А—конканавалин А

КЦГ — кислый цитратный гемостабилизатор

ЛГГ — локальный гемолиз в геле

ЛОК —лимфоцитолиз, обусловленный клетками

ЛПК — лейкоциты периферической крови

ЛПО — лица, подвергающиеся профессионально обусловленно-
му облучению

ЛПС — липополисахарид грамотрицательных бактерий

МСИ — минимальная среда Игла

МСИД —минимальная среда Игла, модифицированная Дуль-
бекко

НИФ — 4-гидрокси-3-иод-5-нитрофенилазид

ПАФ — полный адъювант Фрейнда

ПВП — поливинилпирролидон

ПОК — примированные отвечающие клетки (в смешанной куль-
туре лимфоцитов)

РГП — реакция гемолитического пятна

РОК —клетка, образующая эритроцитарную розетку

СКЛ — смешанная культура лимфоцитов

СПК — сыворотка плода коровы

СР — сбалансированный солевой раствор

СРЭ — сбалансированный солевой раствор Эрла

СРЭЗ — сбалансированный раствор Эйзена

СРХ —сбалансированный раствор Хэнкса

ТГФ — тетрагидрофуран

ТЕМЭД — М,М,Ь1',№-тетраметилэтилендиамии

ТК — тимидинкиназа

ТЛД — термолюминесцентный детектор

ТНФ — тринитрофенильная группа

ТНФ/АКК —тринитробензол-е-аминокапроновая кислота

ТНФС — тринитрофенилсульфоиат

Трис — трис- (гидроксиметил) аминометан

ТРИТЦ — тетраметилродаминизотиоцианат

ТСФ — толуолсульфофторид

ТФХК — тозил-Ь-фенилалаиин-хлорметилкетон

ТХУ — трихлоруксусная кислота

ТЭА — триэтиламин

ФБЭ — формалинизированные бараньи эритроциты

ФГА — фитогемагглютинин

ФИТЦ — флуоресцеинизотиоцианат

ФМСФ — фенилметилсульфонилфторид

чсс — число степеней свободы
ЦМК — М-циклогексил-Ы'-(Р-(Н-метилморфолино)-этил]карбо-
диимид-п-толуолсульфонат

ЭАК — эритроциты, нагруженные антителами и комплементом

ЭДА — этилендиамин

ЭДАК — этилендиакрилат

ЭДК — 3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид

ЭДТА — этилендиаминтетраацетат

A-Mulv (от англ. Abelson murine leukemia virus) —вирус мыши-
ной лейкемии Эбелсона

Mo-Mulv (от англ. Moloney murine leukemia virus) —вирус мы-
шиной лейкемии Молони.

НА — гемагглютинин вируса

HLA (от англ, human leucocytes antigens) — лейкоцитарные
антигены человека

Ю5о — доза вируса, инфицирующая 50% клеток

KLH (от англ. Keyhole limpet hemocyanine) — гемоцианин мол-
люска фиссуреллы

MAID (от англ, membrane-associated immunoglobulin-detaining
protein) — связанный с мембраной белок, адсобирую-
щий иммуноглобулины

МНС — главный комплекс гистосовместимости

Mis — генетический локус, контролирующий у мышей реактив-
ность лимфоцитов в СКЛ (помимо Н-2)

NIH — Национальные институты здравоохранения США

NP-40 — ионидет Р-40 (детергент)

(Phe, G)-A-L — поли(Фен, Глу)-поли(ВЬ Ала)-поли(Лиз)

РОРОР — 1,4-бис['2-(5-фенилоксазолил)]/бензол

PPD (от англ, pure protein derivative) — очищенный белковый
дериват туберкулина

РРО — 2,5-дифенилоксазол

(Т, G)-A--L — поли(Тир, Глу)-поли(ВЬ Ала)-поли(Лиз)

(Т, G)-Pro-L — поли (Тир, Глу)-поли(Про)-поли(Лиз)
ПРЕДМЕТНЫЙ УКАЗАТЕЛЬ

Агар 288, 294, 372, 391—393, 395
— для клонирования опухолевых
клеток 407
— мягкий 407
— приготовление 290—291, 348
Агароза для гемолиза 288, 292
— — электрофореза 62—63, 66
Агглютинация 217, 399

Адгезивные (прилипающие) клетки
232—233, 342, 343

Аденовирус 428

Адипиновая кислота 155

Адсорбция клеток 281
йазагуании 402
Азобеизол-арсоиат-Ь-тирозии 321
Азосочетаиие 149, 150
Акриламид 96—97, 107
Актин 189

Акцептор . (хелперного  фактора)
331—332

Аллантоис 398

Аллантоисная жидкость 400

Аллоантигены 317—318

— связывание с клетками 300, 309—
312

Аллоантисыворотки 219

— приготовление 300, 303—305

Аллоантитела 300, 314

Аллогенные клетки 240, 373

— культуры 303

Аллотипы 348, 352

—	тяжелой цепи Ю12а 208

Альбумины см. Бычий сывороточный
альбумин; Яичный альбумин

Амберлит 123

К’-(21-аминоэтил)карбамилметили-
рованный фиколл (АЭКМ-фи-
колл) 159—160

Амфолиты 122

Аитиаллотипические антитела 71
— сыворотки 129, 208^-218, 352
Антиген — антитело, комплексы 15,
47, 176, 178
------- распад 123

Антиген — сефароза, иммуиосорбент
68

Антиген-связывающие клетки 176, 286
Антигены (см. также Аллоантигены)
— внутриклеточные 165, 177—178
— гистосовместимости 182, 219—231,
238—239, 465—466

—	диализуемые 23

—	лимфоидных клеток 164—165

— мембранные (поверхностные) 165,
167, 173, 178, 273—279

— мечение 125

— опухолевые 316, 383, 389, 406

— рецепторы для них 11—56, 382

— связывание 124—125, 176

— тимус-зависимые 377, 380

— цитотоксический тест 237

—	Micrococcus lysodeikticus 357

—	'Thy 1.1, Thy 1.2 383

Антиидиотипические антисыворотки
129

—	• антитела 71

Антиконвекциоииая среда 120

(Анти) сыворотка антииммуиоглобу-
линовая 101, 224, 279, 295, 356,
409

—	антилимфоцитарная 265

—	анти-1а 179

— анти-SJL 318

— аити-Thy-l.l 179

— анти-Thy-1.2 265, 303, 324

(Аити) сыворотки антиаллотипические
129, 208—217, 352

— гипериммунные 123, 133, 303

— к антигенам гистосовместимости
179, 219—229, 237, 278, 304

—	к бактериальным антигенам 70,
128, 132, 210, 356

—	меченые 172—173

Антитела аитиаллотипические 71

—	антиидиотипические 71

—	высокоаффиниые 53

—	гемагглютинирующие 222—228

—	гетерофильные 237

—	к гаптенам 71, 167

-	• клонотипы 355—363, 448

—	к Ра-микроглобулииу человека 238

— к пневмококку типа III 66

— к полисахаридам 354, 355

— к тяжелым цепям 208

— к HLA 230, 236-239

— моноклональные 135—141, 235, 402

— образование 296, 335

--- вторичное 346—354

— определение 371—372

— оценка качества 11—56

— пепсиновые фрагменты 176

—	перекрестно-реагирующие 316

—	флуоресцирующие 164—165

Антителообразующие клетки (АОК)
288—298, 337, 353

—	индукция 343

—	определение 371—379

—	подсчет 342, 344, 346, 350, 377, 386

 457

—  предшественники 261, 282
Ароматические амины 154

Адпартаттранскарбамнлаза 117

Асцитическая жидкость 215

Аффинная хроматография 58, 66—

73, 152, 153, 190

АЭКМ-фнколл 159—160

Бактериофаг 100

— присоединение гаптенов 192, 201—
203

Бараньи эритроциты (БЭ) 273, 338

----антигенность 263, 340, 342, 344,
352, 353

----в розетке см. Розеткообразую-
щне клетки

----нагруженные белком	(БА-БЭ)
275—277

----получение 254, 340,	346—347,
407

----седиментация 267

—. —	формалинизированные	(ФБЭ)

213—216

Белки алкилированные 86

—	Бенс-Джонса 131

—	иодирование 417—420

—	меченые 414

—	окрашивание 125

—	полимеризация 73—74

—	присоединение к носителям 157

—	радиоактивное маркирование
181—190

— химическая модификация 149—163

—	электрофорез 95—118

Белок А 77—80, 176, 189, 273—279

Беизнднн 214

Биномиальное распределение 451

Бис 96—97

Ы,Ы-бнс(2-гндроксиэтил) глицин	159

Бисдиазобензнднн 157, 158, 214

N.N-бисметнлакриламнд 122

Бифункциональные реагенты 157

Бласт-трансформация 316

Бласты 305—309, 312 {см. также
В-клетки)

— в СКЛ 300, 314

— разрушение 311

— связывание с антигенами 316, 317

Болтона — Хантера реактив 417

Боргидрат 186—187
б'-бромдезокснуриднн 402

Бромелин 93

Бромистый этнднй 239

Бромфеноловый синий 65, 125, 144

Бромциан 150

Бычий сывороточный альбумин
(БСА) 73, 89, 158, 269

-------г- антигенность 67

-------молекулярный вес 117

Вакуумная'камера 369
Варианса 432, 449—451
— анализ 437, 439—443
Вероятностные модели 448—449
Взаимная сопряженность 456—458
Вирус (вирусы) 382—388
— герпеса 428
— гриппа 37, 93, 428
— равновесная фильтрация 38
— Сендай 398—401
— цитомегалии (ВЦМ) 428—429
Вторичная СКЛ 248—250
Вудворда К-реактив. 163
Высаливание 58—59
Вытяжные шкафы 426

Гамма-глобулин 321, 333
— моноклональный 31
Гаплотипы 435—436
— частбты 463—466
— Н-2 228
Гаптены 51, 316
— антитела к ним 71
— как лиганды 66
— концентрации 29—31
— присоединение к желатине 280—
282, 285, 286

-----к живым носителям 192, 200—
206

— синтетические 197—198

— химические модификации 149—163
Гексаметилендиамнн 155

Гелн 53, 99, 105—113; см. также от-
дельные виды гелей

— аппарат для высушивания 110
— тонкослойные 126—127
Гель-фнльтрацня 59, 61—63, 168
Гель-хроматографня 62
Гель-электрофорез 95—118
Гемагглютинация 217, 228
Гемолиз см. также Локальный гемо-

лиз

— эоны 53, 54, 288

-----клетки нх образующие 295,
297—298, 348, 350—351, 353

-----ложные 294
---------- получение 291—292
------счетчик 289, 351
— торможение 54, 351—353
Гемолитические пятна 346, 349, 365,
371—372, 407

Гемоцианин 67, 158, 321

Генциановый фиолетовый 277
Гены см. также Локусы
— взаимодействие н сцепление 466
— комплекса Н-2 227, 228, 313, 327.
328, 362, 465

Гепарин 163
Гетерогенность антител 19—23

---- индекс 32

Гибридизация лимфоцитов 402—406

Гибридные клетки, клонирование

402—411

---- линии 402

Гибридбмы 237, 296

4-гидрокси-3-иод-5-нитрофеннлазид

(НИФ) 192, 193, 197

4-гидрокси-3-иод-5-иитрофениЛук-

сусная кислота 192

N-гидроксисукцинимид (ГСИ) 194,

196

Гиперчувствительиость эамедлеииого
типа 261, 266

Гипоксантин-гуанин — фосфорибо-
зилтраисфераза (ГГФРТ) 402

Гистосовместимость, выявление анти-
генов 219—239

—	главный комплекс (МНС) 182,
219, 273

—	полиморфизм 465—466

ГКС-эфиры 193—200

Гликопротеиды 67

—	мебраниые 190

— окрашивание 108—109

Глицеральдегид-З-фосфатдегндроге-

наза'117

Глобины цыплят 89

Глобулины 59; см. также Гамма-гло-
булин

Глутаровый альдегид 73

Градиент плотности 120, 231, 233,
257, 258, 269, 385

— pH 120, 124, 128, 131, 136, 138—

139

Градиентный электрофорез 105—107

Даисиламииокислоты 89, 91

Даисилхлорид 84, 85, 90

Дауэкс 1-Х2 116

— 50-Х4 85, 87

Дебая — Хюккеля теория 22

Диализ 116, 311

— меченого белка 414—417

— приспособление 188

— равновесный 23—32, 50

Диализные мешки 24, 126, 415—417
— ячейки 25

N.N-диаллилтартардиамид 112, 144

Диметиладипимидат 157

Диметилсульфоксид 388

Диметилформамид (ДМФ) 193, 204,
205, 282, 417—419

2,4-динитробензол сульфонат	натрия

(ДНБС) 159, 282

Динитрофеиол (ДНФ) 158—160, 282

2,4-динитрофторбензол 150

2,2'-дипиридилсульфид 195

Диск-электрофорез, состав гелей 99,
107

Дисперсионный (вариансный) анализ
439—443

Дисперсия 430, 431

Дисульфидные мостики (связи) 60,
72, 74—75

Дитиотреитол 75

Диффузионная камера 24

Диэтиламиноэтилдекстран (ДЭАЭ-
декстран) 289, 291, 293, 350, 352,
395

ДНК 240, 247, 251

ДНФ-грамицидии S 357

ДНФ-диски 161

ДНФ-желатина 281—282

ДНФ-капроновая кислота 162

ДНФХ-лизин 161

ДНФ-Ьуз-сефароза 160

Доверительный интервал 55, 380

-----расчет, таблица 378—379

Додецилсульфат натрия (ДСН) 76,
77, 80, 97—98, 116—117

Дозаторы 231, 367—370, 413

Дозиметрия воздуха 425—426

Дозиметры 422—423

Дониановский эффект 27

Дрейф генов 466

ДЭАЭ-целлюлоза 59, 61, 166, 170

Естественный отбор 466

Желатина 121, 224, 284, 347

— конъюгация с гаптеиамн 280—282

Загрязнение окружающей среды
421—422

Игла среда 338, 348, 366, 407

Идиотоп — аитиидиотоп 15

Изотопная лаборатория 412—427

Изотопы 120, 127, 421—422

Изоэлектрофокусирование 65,	66,

120—133

— оборудование 121, 122, 426

— препаративное 135—141

Имидазол-даисилгистидин 90

Имидокарбоиат N-за мешенный 151

Иммунизация 210, 322, 324, 358—361
— in vitro 337—345

Иммунные комплексы 189

Иммунный отйет 332, 347, 348, 365
-----индукция 355—363
--- у человека 346

Иммуноглобулины (Ig) 58—60, 120—

133 296, 351; см. также Легкие
цепи; Тяжелые цепи

— бараиа 168

— изотахофорез 143—148

—	козьи 178

— кроличьи 60, 137, 168, 172

—	крыс 61

—	мечение 77—80, 101

—	миеломные (МОРС 173) 61

—	морских свниок 61

	— мышей 61, 168

—	на В-клетках 279

•	— на Т-клетках 312

— очистка 59—62, 165—166

-	- фрагменты 167—168

—	человека 56—60

—	IgA 60

— IgD-подобные 101

— IgG 59—61, 76—79, 135, 163, 208,
277, 346

— IgM 62, 120, 277, 346

— J-цепь 72—73

Иммунопреципитация 189

Иммуносорбеиты 70, 72—74, 189,
280—286

Иммунофлуоресцентиый анализ

164—179, 305—309, 312

Иодацетамнд 168

Иодуксусная кислота 84

Ионообменная хроматография 59, 116

Карбамат N-замещеииый 151

Карбоксильные латексы 153

Карболовый фуксии 386

Качалки 340

%-Кв адрат 454—455, 458, 459

Кислые гели 115

Клетки (см. также Антителообразую-
щне клетки; Клеточные линии;
Лимфоциты; Лимфоидные клет-
ки; Макрофаги; «Отвечающие»
клетки; Розеткообраэующие клет-
ки; «Стимулирующие» клетки;
Тимоциты)

— время генерации 455—456

— гибридные 398, 402—411

— жизнеспособные 231, 239, 255, 261,
262, 264

—	индикаторные 290

—	лимфобластоидиые 101

— миеломные 403—405, 455

— «опорные» 343

— опухолевые 384, 385, 407

— «питающие» 395

— подсчет 230, 231, 277, 348, 351,
438—439

— прилипающие 232—233, 342, 343

— «примироваииые» 248, 250, 329
— присоединение гаптенов 192—206
— продуцирующие иммуноглобулины
351

— радиоактивное маркирование
181—190

— разделение 256—264, 280—286
— содержащие антиген 278—279
— трансформация 389
Клетки-мишени 203, 205, 206
Клеткн-супрессоры 344, 346, 377
Клеточная поверхность 382
-----антигены 273—279
-----маркирование 181—191

Клеточные культуры 338—342, 366,
369; см. также Культивирование
клеток; Смешанная культура
лимфоцитов

-----«иеотвечающие» 374—375, 457

-----«перенаселенные» 389

-----стимуляция 381

— суспензии 365

-----приготовление 224—225, 243—

245, 255, 275—276, 283, 340

Клонирование клеток 391—396, 407,
409

Клоны клеточные 101, 365, 377, 395,
409

— — гибридные 407—411
----- конкуренция 455—456
Коллагеназа 285	’

Коллодиевын мешок 311

Колхицин 251

Комплемент 224, 230, 233, 237—238,
267, 289, 292—294, 303, 348, 367,
371, 409

Комплемеит-зависимый гемолиз 371
— лимфоцитолиз 175, 230—239, 311
Кондиционированная среда 395
Коиканавалии А 321

Конкурентное торможение 44—46

Конкурентные равновесия 44—56

Концентрирующие гелн 115

Корреляция между переменными 446,
447, 460—461

Кролик, антисыворотка 101, 224, 356,
409

— антитела 346—354

—	гамма-глобулин 333

—	иммуноглобулины 60

—	лимфоциты 380

— сыворотки 229

Крыса, иммуноглобулины 61

Культивирование клеток 300, 341,
346, 349—350

— — камера 292, 340
Культуральная жидкость 351—353,
385

Кумасси ярко-синий 108, 125

Кэпииг см. «Шапочка»

Лактопероксидаза 78, 120, 182—184

Лантан хлористый 251

Латекс 161

Легкие цепи (L-цепи) 74, 76, 79, 80

----- х-типа 362

Лейкоциты периферической крови 346

Лектин 190

Лнзоцнм 89

Лимитирующие разведения 365—381
Лимфатические узлы 177, 301, 320,
322—323, 333

Лимфобласты 177

Лимфоидные клетки 164—165, 293,
300, 320, 382—389

-----метод ХС-бляшек 385—386

-----опухолевые 407, 411

Лимфомы 382

Лимфосаркомы 383, 386, 388, 389

Лимфоцитолиз 230—239, 311

— обусловленный клетками 197, 201,
203—206

Лимфоциты 230, 232—233, 238, 275—
276; см. также Антнтелообразую-
щие клетки; Розеткообразующне
клетки

— аллореактнвные 248

— в культуре 177, 346, 349—350, 354;
см. также Смешанная культура
лимфоцитов

— присоединение гаптенов 192, 200,
204—206

— слияние 402—406

— В-клетки 238—240, 266, 279—286,
342

----- акцептор хелперного фактора
328, 331—332, 335

----- клонирование 395—396

-----предшественники 365, 372, 377,
452, 453, 488

----- титрование 373—375
----- число 448—449

— Т-клетки 241, 266, 300—326, 340—
342, 372

— — клонирование 395—396

-----«обученные» 329—330, 333—334

----- титрование 376—377
-----хелперы 261, 342, 461
Линейная регрессия 444—445
Линейность регрессии 447—448

Линейные анаморфозы 16—17

Лннни клеток 101, 384, 386—388

-----гибридных 402—406

— мышей 243, 335

Липополисахарид (ЛПС) (грамотри-
цательных бактерий) 321, 324,
396

Локальный гемолиз 288—298, 346,
349—350, 372

—	— принцип и схема опыта 53—56

Локус (ы) см. также Гены

—	СКЛ 241

—	HLA 235, 236, 465

—	/g-1 208

—	Mis 241

Лошадиная сыворотка 320, 389, 407

Макрофаги 342, 343, 372

Мак-Фэрлэнда стандарты 210, 211

Медиана 462

Межклеточные взаимодействия 327

Мембранные пузырьки 310—311

Мембраны для дналнза 23, 24, 32—

35, 126, 415—417

— клеточные 79, 310—312

Метилацетат 85

Метиленовый синий 386

Метилцеллюлоза 299, 391, 392, 394,

395

Микрокультуры 346—350, 365, 369—

372

Миоглобин 131

Мнтомнцин С 240, 245—246

Морская свинка, иммуноглобулины
61

— комплемент 267, 289, 292—294,
348, 409

Моча (выявление изотопов) 423

Мыши, гистосовместимость 219, 241,
278

— «голые» (nude) 334, 373

- иммуноглобулины 61, 168

— иибредные 360

— SPF 338

Найлон, вата 230, 244, 302, 312, 330,
347

— присоединение гаптенов 151—157,
161—163

Нейраминидаза 254, 263

Неконкурентное торможение 46—47

Непараметрнческие оценки 462

Неравновесные сцепления 463—465

Неспецнфнческое связывание 27

Нингидрин 85

Нонндет Р-40 127, 187

Нормальное распределение 428—430,
462—463

Нуклеиновые кислоты, иодирование
417
Одноударная кинетика 380

Окрашивание белков 125

— гелей 107—108

— гликопротеидов 108—109

— клеток 171—176, 230, 239, 261, 262

Опухоли 384—388

«Отвечающие» клетки 203, 204, 245,
248, 300, 303, 305, 306, 310—318,
462, 463

Пара-азобензоат 357

Пара-амииобеизиловый эфир 67

Пара-гидроксифеиилпропноиовая кис-
лота 419

Пара-гидроксифеиилуксусиая кисло-
та 195, 196, 419

Пара-иитробеизилбромид 67

Паратоп 11—15, 21, 22, 26

Певикои 61, 62

Пепсин 167

Пептидные карты 83—93

Первичная СКЛ 240—248, 300

Перистальтический иасос 105

Персульфат аммония 97 

Плазмоцитома 177, 237

Плотность вероятности 430

Пневмококки 357, 358

Пневмококковые вакцины 357, 358,
361—362, 367

Пневмококковый полисахарид 66—68

Полиакриламидный гель для изота-
хофореза 144—148

--------изоэлектрофокусирования

120—123

--------электрофореза 79, 80, 95—
119

------ полимеризация 102—103

Поливииилпирролидои (ПВП) 222

Полипептидиые цепи 58—80

-----синтетические 328, 329

Полисахаридные гели 153

Полисахариды 128—131, 354, 355

Полистироловый латекс 153, 154, 161

Полнэтилеигликоль 215, 406

Полулогарифмический график 373

Поправочная кривая 30, 31

Популяционные данные 463—464

Пристан 386

Р-Пропиолактои 401

Протеазы 310

«Протекание» 270

Пуассона распределение 451—455

-----уравнение 374

Пуассоновский предел 451

Равновесие 12—56

— уравнение 20—22, 447

Равновесная седиментация 39—44
— фильтрация 32—39, 50, 51
Радиация 421—427

Радиоавтография 79, ПО—112, 124—
125, 127—129, 182, 266

Радиоактивное загрязнение 421—427
— маркирование 190

Радиоактивность фоновая 248

Радиоактивные изотопы 412, 417,
420—421

Разделяющие гели 115

Регрессионный анализ 443—446

Ремазоловые красители 108

Рентгеновская плеика 101, 125

Рентгеновское облучение 246
Репелкот 121

Репликатор 368, 369

Рецепторы для антигенов 11—56, 382

----комплемента 272

----- Fc-фрагмеита 176, 272, 389

Реципиенты 221, 334—335

Рибонуклеаза 89

Рибофлавин 115, 122

Розетки 253, 255, 256, 262—264, 267—
271

РозеткообраЗующне клетки (РОК)
253, 261—279

Сахароза, градиент 120, 385
Селезеночные клетки 79, 301, 340
— — гаптеиизация 205, 206
— — иммунизация 337—345
----облученные 343, 371
— серийный перенос 361—362
Седимеитациоииая камера 257—258
Семейиый анализ 235—236

Сефадекс 120, 121, 126—127, 152—153..

— G-25 126

— G-50 169

— G-75 135—137

— G-150 76, 168

— G-200 61, 62, 76, 214, 215

Сефароза 66—68, 71, 160—161
Силикагель 89

Силнкои 85	г

Смешаииая культура лимфоцитов 
(СКЛ) 240—252, 300—303, 461 j

--------детерминанты 461—467

Сорбент 152; см. также Иммуиосор- j
бейты

Средняя (величина) 377, 43.1, 435,.?

449, 462	J

— фиктивная 453	‘ч

Среды для клеточных культур 301^
338, 339, 341, 347—348, 358, 363^
391—396, 407

---- розеткообразоваиия 269—270
-----седиментации клеток 259

— поддерживающие 62

Стандартное отклонение 432, 450

Статистический анализ 428—467

Стафилококки 78, 79, 101, 189

Стеклянная вата 85

Степени свободы 442, 443, 454

Стерическое торможение 47—48
«Стимулирующие» клетки 203, 245—
246, 248, 251, 300, 303, 310—318

Стрептококки 128—131, 357

Стрептококковые вакцины 357—360,
367

Стьюдента критерий 248, 435

Сульфгидрильные группы 75

Супрессорные факторы 327

Сцинтилляционные счетчики 412, 414
Сыворотка как источник комплемента
224 229 409

— лошадиная 320, 389, 407

—• плода коровы 249, 269, 302, 305,
337, 339, 347—348, 366, 389

— человеческая 301, 311

ТЕМЭД 97, 123, 144

Термолюминесцентные детекторы 423

Тетрагидрофуран (ТГФ) 162
2,6,10,14-тетраметилпентадекан 286
М.Ы.Ц'.Ы'-тетраметиленэтилеидиамид
97, 123, 144

Тетраметилродамнн 176

Тетраметилродаминтиоцианат
(ТРИТЦ) 169—171, 178, 179, 304,
307—309

Тимеросал 213

Тимидин 303, 323, 403

Тимидиикиназа (ТК) 402

Тимомы 382—383, 388, 389, 406

Тимоциты 334, 343

Тимус 383, 389

«-Тиоглнцерии 396

Тирозил-Ь-фенилалании-хлорметнл-
кетои 309

ТНФ-капроиовая кислота 162

ТНФ-липополисахарид 406

Тодда—Хьюитта среда 358

Толуол 413

Толуолсульфофторид (ТСФ) 183, 187

Трансплантация кожи 220, 221

Трииитрофеиильные группы (ТНФ)

158, 192, 193, 296, 405

Трипановый синий 224, 225, 289, 387

Трипсий 84, 117

— отделение иммуносорбента 285

— переваривание белков 86—87

— удаление аллоантигеиов 309—310,
312, 313

Тритон X-100 112, 187'

— N-101 413

Трифенилфосфнн 195

Триэтиламин (ТЭА) 85

Триэтилхлорсилан 85

Туберкулин 321, 324

Тяжелые цепи (Н-цепи) 74, 76, 79,

80, 208, 209

Углеводы 150—153, 186—187

Угольный фильтр 420

«Фантомы» 424

ФГА 396

L-фенилаланин-сефароза 62

Фенил-1,4-диизотиоцианат 157

Фенилметилсульфоннлфторид 310

Фенотипические частоты 464

Фибробласты 383

Фиколл 232, 233, 258, 259, 269, 271,
312

— присоединение ДНФ 158—161

Фильтры 33^-34

Флуоресцеин 176, 239, 249, 306

Флуоресценнизотиоцианат (ФИТЦ)

169, 178, 179, 181, 304, 307, 309

Флуорохромироваиие 168—172, 178—

Формалин 213

Формалинизированные бараньи эрит-
роциты 213-^216

Фотоаффинная маркировка 155
Фракционирование клеток 253, 256—

Фталевый ангидрид 85

1-фтор-2,4-динитробензол 159

Харди — Вейнберга уравнение 464

Хелперный фактор 320—325, 342,
343, 374

Химотрипсин 117

Хлорамин-Т 126, 417

Хлорацетат 150

Хроматография	59—63, 85, 88—89,

117

Хэнкса раствор 348

Целлюлозные мембраны 32, 107

Цитотоксичность 204, 224—228, 231,
234, 237—238, 251, 261

Цитохром с 120

Цитоцентрифуги 177
Человек, иммунный ответ 346

— нммуноглобулнвы 59—60, 101

Человеческая сыворотка 131, 301

Четырехпольные таблицы 457, 459—

461

«Шапочка» 172, 174

Шпорцевая лягушка (Xenopus) 163

Шприцы 33; см. также Микрошприцы

Щелочные гели 115

Щитовидная железа 423—424

Экспоненциальный рост 455—456

Электрод мембранный 124

Электростатическое взаимодействиеЯичный альбумин (овальбумин)

22	321

Электрофорез белков 95—118

— аппарат 63, 64, 101—102, 104, 11S

— в геле 62—66

— зональный 58, 356, 359

— препаративный 113—116

Эозин 231, 245, 255, 302

Эпитоп — паратоп, комплекс 11—15,
21, 22, 26, 48

Эритроциты 222, 223, 267—270, 290,
367; см. также Бараньи эритро-
циты

— в розетке 255, 261, 271

Этилендиамнн 122, 123

Эфир 3- (п-гидрокснфеиил) пропионо-
вой кислоты 417; см. также ГКС-
эфиры

— Tagit 418—420

158,
ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие редактора перевода..................................... 5

Предисловие ....................................................... 7

Список авторов..................................................... 9

Глава 1. Оценка качества антител и клеточных рецепторов (С. Фазекас
де Сент-Грот)	 ........................................ 11

I. Введение................................................ 11

И. Простые равновесия...............•...................... 12

III.	Конкурентные	равновесия................................ 44

Список литературы........................................ 56

их полнпептидных цепей (Ж.-К. Жатон, Д. Ч. Брандт,
П. Вассалли)............................................  58

I.	Введение . ............................................. 58

II.	Разделение с помощью концентрированных растворов ней-
тральных солей............................................  58

III.	Очистка иммуноглобулинов............................... 59

IV.	Гель-хроматографня ..................................... 62

V.	Электрофоретическое разделение	в	геле................... 62

VI.	Аффинная хроматография с использованием иммуносорбен-
тов На основе сефарозы...................................... 66

VII.	Иммуносорбенты на основе белков, сшитых глутаровым аль-
дегидом ...................................................... 73

VIII.	Разделение полнпептидных цепей	 ........................ 74

IX.	Использование белка A Staphylococcus aureus в качестве нм-
муносорбента для выделения иммуноглобулинов................. 77

Список литературы........................................ 81

Глава 3. Метод пептидных карт для анализа наномолярных коли-
честв белка (Б. А. Мосс).......................................... 83

I.	Назначение метода....................................... 83

II.	Принцип метода......................................... 83

, III. Реагенты н приборы...................................... 84

IV.	Методика ............................................... 86

V.	Оценка метода .......................................... 89

VI.	Пример применения метода для исследования антигенных ва-
риантов гемагглютинина	вируса гриппа А...................... 93

Спис	ок литературы................................  .	93
Глава 4. Электрофорез	белков	в	пластинках	полиакриламидного	геля

(Б.	Такая}....................................  •	•	95

I.	Введение............................................ •	9$

II.	Проведение	электрофореза	в	полиакриламидном	геле	.	.	"б

Ш. Заключение ...........................................

Список литературы....................................

Глава 5. Изучение иммуноглобулинов методом аналитического изо-
электрофокусирования (Д. Браун, К. Хильд, А. Зиглер) . .	120

I.	Введение..............................................  12®

II.	Принцип метода........................................ *20

III.	Реагенты и приборы	.................................. *21

IV.	Методики ............................................. J22

V.	Применение, чувствительность и воспроизводимость ИЭФ .	127

Список литературы...................................... 133

Глава 6. Препаративное выделение моноклональных антител с по-
мощью изоэлектрофокусироваиия в горизонтальном слое се-
фадекса G-75 (В. Шальх,	Д.	Браун)...................... 135

I.	Введение.............................................. 135

II.	Принцип метода........................................ 135

III.	Материалы и приборы................................... 137

IV.	Методика .....................'....................... 137

V.	Применение ........................................... 139

VI.	Ограничение метода..................................  141

VII.	Степень очистки и чувствительность.................... 141

VIII.	Воспроизводимость..................................... 142

Список литературы...................................... 142

Глава 7. Изотахофорез иммуноглобулинов (А. Циглер,. Ж- Кёлер) 143

I.	Введение .............................................. 143

II.	Методика ............................................. 144

III.	Обсуждение ........................................... 147

Список литературы.....................................  148

Глава 8. Химическая модификация белков, гаптенов и нерастворимых
носителей (X. Кифер)	.	   149

I. Введение............................................... 149

И. Теоретические основы............................ . . .	149

III.	Практическое осуществление........................... 158

Список литературы...................................... 163

Глава 9. Флуоресцирующие антитела и их применение при анализе
антигенов лимфоидных	клеток	(Л.	Форни)................ 164

I.	Введение.............................................. 164

II.	Реагенты для иммунофлуоресценции...................... 165

III.	Окрашивание........................................'	173

IV.	Общие замечания....................................... 178

Список литературы...................................... 179

Глава 10. Радиоактивное маркирование и иммуиоспецифическое выде-
ление макромолекулярных компонентов клеточной поверхно-
сти (Дж. Пинк, А. Циглер)....................................... 181

I. Введение............................................... 181

И. Методика маркирования .............................  .	182
III.	Разрушение меченых клеток.............................. 187

IV.	Специфическая очистка меченых поверхностных компонен-
тов клетки.................................................. 189

Список литературы......................................   190

Глава 11. Присоединение гаптенов к живым носителям (X. Полит,
В. Хаас, X. фон Бёмер)........................................... 192

I.	Введение...............................................  192

II.	Приготовление ГСК-эфнров................................ 196

III.	Присоединение гаптеиа к носителям....................... 200

IV.	Условия ЛОК в культуре................................. 203

V.	Выводы по результатам оценки ЛОК в отношении лимфоци-
тов, нагруженных гаптеном.................................. 204

Список литературы........................................ 207

Глава 12. Получение и анализ мышиных антиаллотнпических сыворо-
ток (Дж.' Джонсон)............................................... 208

I.	Получение аитиаллотипической сыворотки.................. 210

II.	Количественная оценка аитиаллотипической сыворотки . .	213

III.	Применение ..............'. ........................... 217

Список литературы.....................................'	218

Глава 13. Получение'мышиных антисывороток к антигенам гистосов-
местимости (К. Фатман) ..............	219

I.	Вводные замечания . -.............................. 219

II.	Принцип метода..................................... 219

III.	Методы ................................................. 219

IV.	Контроля...............................................  227

V.	Критическая оценка метода.......................... 228

Список литературы................................... 229

Глава 14. HLA-типироваиие в реакции комплемеит-зависимого лимфо-
цитолиза (Д. Стокер, Д. Берноко)................................. 230

I.	Введение........................................... 230

II.	Принцип реакции ........................................ 230

III.	Детали метода.......................................... 231

IV.	Семейный анализ..................................... 235

V.	Некоторые замечания о цитотоксическом	тесте	.	.	.	.	.	237

VI.	Методика определения антигенов системы	HLA на	В-клетках	238

Список литературы........................................ 239

Глава 15. Смешанная культура лимфоцитов (СКЛ) мыши (Т. Мео) 240

I.	Первичная СКЛ........................................... 240

II.	Вторичная СКЛ........................................... 248

III.	Критические замечания..................................  251

Список литературы........................................ 252

Глава 16. Метод тонкого разделения розеткообразуюшнх клеток
(Б. Эллиот)...................................................... 253

I.	Назиачеиие метода ...................................... 253

II.	Принцип метода.......................................... 253

III.	Образование розеток..................................... 254

IV.	Фракционирование клеток................................. 256

V.	Выход, истощение, обогащение............................ 264
VI.	Применение, чувствительность и ограничения метода . . .	265

VII.	Резюме ............................................... 271

Список литературы...................................... 272

Глава 17. Выявление антигенов клеточной поверхности с помощью
розеткообразующих эритроцитов, нагруженных стафилокок-
ковым белком А (Дж. Джонсон) . . . ............................ 273

I.	Введение.............................................. 273

II.	Принцип метода....................................... 274

III.	Реагенты.............................................. 274

IV.	Методика ............................................. 275

V.	Контроли ............................................ 277

VI.	Дополнительные замечания............................. 277

VII.	Применение метода..................................... 278

Список литературы...................................... 279

Глава 18. Выделение гаптен-специфических В-лимфоцитов с помощью
иммуносорбентов на основе геля желатины, конъюгирован-
ной с гаптеном (В. Хаас)........................................ 280

I.	Принцип метода...........'...........................  280

II.	Методика ............................................  281

III.	Применения метода....................................  286

IV.	Ограничения метода.................................... 286

Список литературы...................................... 286

Глава 19. Исследование антителообразующих клеток методом локаль-

ного гемолиза в геле (И. Лефковитс, У. Козенца) ....	288

I.	Назначение метода..................................... 288

II.	Принцип метода....................................... 288

III.	Реагенты и приборы.................................... 288

IV.	Приготовление клеточных	суспензий..................... 290

V.	Различные варианты	реакции........................... 290

VI.	Количественный анализ................................ 293

VII.	Существенные методические моменты..................... 293

Список литературы...................................... 295

Глава 20. Выделение индивидуальных аитителообразующих клеток,
дающих локальный гемолиз (М.	Шульман)................... 296

I.	Назначение н принцип метода........................... 296

II.	Реактивы ............................................. 296

III.	Методика ............................................. 297

Список литературы...................................... 299

Глава 21. Изучение Т-клеток, специфически связывающих аллоанти-
геиы при активации в смешанной культуре лимфоцитов
(Б. Эллиот, 3. Надь, М. Набхольц)............................... 300

I.	Назначение метода..................................... 300

II.	Принцип метода......................................... 300	.

III.	Клетки и аллоантисыворотки............................. 300	'j

IV.	Выявление Т-клеточных маркеров и антигенов стимулирую-
щих клеток на отвечающих бластах.......................... 305

V.	Изучение клеток, связывающих аллоантигены.............. 309	J

VJ. Критическая оценка: применение метода и его ограничения 312 

VII. Заключение ........................................  318 ;

Список литературы.................................... 31
Глава 22. Оценка антнген-специфнческой пролиферации мышиных
Т-клеток (С. Алкан) . . . ...................................... 320

I.	Назначение метода ..................................... 320

II.	Принцип метода................'........................ 320

III.	Реагенты и приборы..................................... 321

IV.	Методика .............................................. 321

V.	Критическая оценка..................................... 325

Список литературы....................................... 326

Глава 23. Аитиген-специфическиб хелперный фактор Т-клеток и его
акцептор (М. Тауссиг)........................................... 327

I.	Введение .............................................. 327

II.	Принцип метода........................................ 328

III.	Реагенты и приборы .................................... 328

IV.	Методика . ............................................ 329

V.	Учет результатов....................................... 332

VI.	Критическая оценка....................................  332

Список литературы....................................... 335

Глава 24. Иммунизация in vitro клеток мышиной селезенки в суспен-
зии (X. Шрейер)................................................. 337

I.	Назначение метода..................................     337

II.	Принцип метода . . ................................... 338

III.	Животные, реагенты, приборы............................ 338

IV.	Методика .............................................  340

V.	Критическая оценка метода............................. 342

Список литературы . . . ................................ 345

туре лимфоцитов периферической крови кролика (А. Луц-
цати)...................................................   346

I.	Назначение метода . .*................................... 346

II.	Принцип метода . . ’..................................... 346

III.	Реагенты................................................. 346

IV.	Методика ................................................ 348

V.	Дополнительные замечания................................. 353

Список литературы......................................... 354

Глава 26. Индукция иммунного ответа с высоким уровнем антител до-

минирующего клонотипа	(Д. Браун) ......................... 355

I.	Введение ................................................ 355

II.	Принцип метода........................................... 355

III.	Приготовление вакцин	. .............................. 357

IV.	Иммунизация.............................................. 358

V.	Серийный перенос ограниченного числа клеток селезенки . .	361

VI.	Критическая оценка....................................... 362

Список литературы......................................... 363

Глава 27. Анализ клеточных суспензий методом лимитирующих раз-

ведений (И. Лефковитс)...............................  365

I.	Назначение метода.................................... 365

II.	Принцип метода ...................................... 365

III.	Реагенты и приборы.................................. 366

IV.	Методы (рис. 3, схема последовательных этапов) ....	369
V.	Ограничения и чувствительность метода................. 377

Список литературы ...................................... 381

Глава 28. Получение и поддержание линий мышиных лимфоидных

клеток в культуре (М. Шрейер, Б. Вейман)................ 382

I.	Назначение метода .....................;............... 382

II.	Принцип метода......................................... 382

III.	Реагенты, животные, клетки и вирусы................... 383

IV.	Методика .............................................  384

V.	Критическая оценка.................................... 388

Список литературы . .	.'.................. 390

Глава 29. Клонирование клеток в	полужидкой или вязкой среде

(И. Искоув, М. Шрейер).................................  391

I.	Введение............................................... 391

II.	Реагенты............................................... 392

III.	Методика ............................................. 393

IV.	Варианты применения................................... 395

Список литературы............".......................... 396

Глава 30. Приготовление вируса Сендай	для гибридизации клеток

(Р. Тес)...............................................  398

I.	Выращивание вируса................................... 398

II.	Титрование вируса...................................... 399

III.	Концентрация вируса .................................. 400

IV.	Инактивация вируса.................................... 401

V.	Оценка иифекциониости вируса	,. ...................... 401

Список литературы....................................... 401

Глава 31. Слияние лимфоцитов (X. Кёлер).......................... 402

I.	Назначение метода.....................................  402

II.	Принцип метода......................................... 402

III.	Реагенты и приборы...................................  403

IV.	Методика ............................................  403

V.	Критическая оценка.................................... 405

Список литературы....................................... 406

Глава 32. Клонирование опухолевых лимфоидных клеток в мягком
агаре. Выявление гибридных клонов, образующих антитела
к бараньим эритроцитам (БЭ) (Ж. Кёлер)........................... 407

I.	Назначение и принцип метода...........................  407

II.	Реагенты и приборы..................................... 407

III.	Методика ............................................. 409

IV.	Критическая оценка метода.............................. 409

Список литературы....................................... 411

Глава 33. Изотопиаи лаборатория	(X.	Полит,	Ю.	Видмер,	Р.	Фрех)	412

I.	Введение.......................................... 412

II.	Реагенты и приборы................................ 412

III.	Специальные методики............................. 414

IV.	Надзор за радиацией и радиоактивным	загрязнением	.	.	.	421

Список литературы.................................. 427
Глава 34. Анализ иммунологических	данных	(А. Пьяцца)............. 428

I.	Введение............................................... 428

II.	Примеры практического	использования................... 428

Список литературы....................................... 467

Список сокращений................................................ 468

Предметный указатель............................................  471
Под редакцией Ивана Лефковитса, Бенвенуто Перннса

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

В ИММУНОЛОГИИ

Ст. научный редактор Ю. И. Лашкевнч

Мл. редактор 3. В. Соллертннская

Художник Е. Н. Урусов

Художественный редактор Б. Н. Юдкин

Технический редактор Л. П. Чуркина

Корректор В. И. Киселева

ИБ № 2197

Сдано в набор 11.03.80. Подписано к печати 4.02.81. Формат 60X90*/i«.

Бумага типографская № 2. Гарнитура литературная. Печать высокая.

Объем 15,25 бум. л. Усл. печ. л. 30,5. Уч.-над. л. 29,52. Изд. № 4/0854.

Тираж 8000 экз. Зак. 233. Цена 3 р. 20 к.

ИЗДАТЕЛЬСТВО «МИР».

Москва, 1-й Рижский пер., 2.

Ярославский полнграфкомбннат Союзполнграфпрома при Государственном
комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли,
150014, Ярославль, ул. Свободы. 97.