Author: Пол У.
Tags: биологические науки в целом общая физиология обмен энергией иммунология
ISBN: 5-03-001444-6
Year: 1989
Text
Fundamental Immunology
Editor William E. Paul, M. D.
Laboratory of Immunology
National Institute of Allergy and
Infectious Diseases
National Institutes of Health
Bethesda, Maryland
Raven Press New York
Иммунология
Под редакцией У. Пола
В ТРЕХ ТОМАХ
Том 3
Перевод с английского
канд. биол. наук Т. Н. Власик,
канд. биол. наук А. А. Нейфаха,
канд. биол. наук А. Ю. Руденского,
канд. биол. наук А. С. Серпинской
под редакцией
чл.-корр. АН СССР Г. И. Абелева,
д-ра биол. наук Р. С. Незлина,
д-ра биол. наук Е. В. Сидоровой
ББК 28.073
И53
УДК 57.04
Авторы: Берзофски Д. А., Берковер А. Дж., Браун Э. Дж., Джой-
нер К. А., Фрэнк М. М., Хэнни К. С., Джиллис С.,
Грин М. И., Шаттен С., Бромберг Дж. С., Паркер Ч. В.,
Кирней Дж. Ф., Шер И., Мэйдж М. Дж., Фэтмен С. Г.,
Фитч Ф. В.
Иммунология: В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ ./Под ред. У. Пола.—
И53 М.: Мир, 1987—1989.—360 с., ил.
ISBN 5-03-001444-6
Монография, написанная коллективом ведущих специалистов США. В т. 3
всесторонне рассмотрены механизмы иммунитета, а также основные методы
исследования иммунной системы.
Предназначена для научных работников — иммунологов, молекулярных би-
ологов, вирусологов, биохимиков, медиков, а также студентов биологических и
медицинских вузов.
„ 2007020000—190
041(01)—&9 п0дписн- "ЭД-
ББК 28.073
Редакция литературы по биологии
Научное издание
Джей А. Берзофски, Айра Дж. Берковер, Эрик Дж. Браун и др.
Иммунология
Под ред. Уильяма Е. Пола
В 3-х томах. Том 3
Заведующий редакцией члеи-корр. АН СССР Т. М. Турпаев. Зам. зав. редакцией М. Д. Гроздова
Старший научный редактор Л. Г. Тер-Саркисяи. Младшие редакторы Р. Ф. Куликова и
О. Б. Шагинян. Художник В. А. Медников. Художественный редактор А. Я. Мусин
Технический редактор Е. С. Потапенкова. Корректор А. Ф. Рыбальченко
ИБ Mi 6117
Сдано в набор 06.09.88. Подписано к печати 09.03.89. Формат 70ХЮ0'/16. Бумага типографская
Mi 1. Печать офсетная. Гарнитура обыкновенная. Объем 11,25 бум. л. Усл. печ. л. 29,25.
Усл. кр.-отт. 29,25. Уч.-изд. л. 34,99. Изд. Mt 4/4956. Тираж 27 000 экз. Зак. 0395. Цена 2 р. 80 к.
Издательство «Мир» В/О «Совэкспорткнига» Государственного комитета СССР по делам
издательств, полиграфии и книжной торговли. 129820, ГСП, Москва, И-110, 1-й Рижский пер., 2.
Отпечатано с готовых пленок Московской типографии ,№ 7 «Искра революции» В/О «Совэкспорткнига»
в Московской типографии .У? 4 Государственного комитета СССР по делам издательств, полиграфии и книжной
торговли. 129041, Москва. I». Иеренславская. 46.
ISBN 5-03-001444-6 (русск.)
ISBN 0-89004-923-8 (англ.)
© 1984 by Raven Press Books, Ltd.
© перевод на русский язык, допол-
, нение, «Мир», 1989
| 1;.'ЖС БГгСЯ-ШТЕЯА
£ ИМ. Н. И. МдиаогмлгА
Часть VI
Эффекторные механизмы иммунитета
Глава 23
Взаимодействие антиген-антитело
Джей А. Берзофски, Айра Дж. Берковер
(Jay A. Berzofsky, Ira J. Berkower)
В основе взаимодействия антигена с антителом лежат те же принципы, что
и в основе любой другой бимолекулярной реакции. Более того, связывание ан-
тигена с антителом в целом может быть описано в рамках тех же теорий и изучено
с помощью тех же экспериментальных подходов, что и связывание гормона со
своим рецептором, субстрата с ферментом или кислорода с гемоглобином.
Однако взаимодействие антигена с антителом имеет несколько существенных
отличий от других типов связывания. Во-первых, в отличие от большинства
ферментов и многих гормонов антитела, связываясь с лигандом (антигеном),
не претерпевают необратимых изменений. Поэтому реакции антиген-антитело,
по крайней мере в принципе, всегда обратимы. Во-вторых, исследователь
может направленно получать антитела, специфичные практически к любому
известному веществу. В каждом случае можно обнаружить антитела с таким
же сродством (аффинностью) и с такой же специфичностью, какими обладают
ферменты по отношению к субстратам или рецепторы по отношению к своим
гормонам. Следовательно, взаимодействие антитела с антигеном может рассмат-
риваться как пример взаимодействия макромолекул с лигандами вообще.
Благодаря наличию у антител таких особенностей, как обратимость связы-
вания и большое разнообразие специфичностей, они служат поистине
бесценным орудием при идентификации, количественном анализе и даже
очистке все увеличивающегося количества биологически важных и необхо-
димых для медицины соединений.
Есть у антител еще одна особенность, которая до последнего времени ос-
ложняла их изучение и использование в сравнении, скажем, с ферментами.
Это — их исключительная гетерогенность. Даже „очищенныеВ * * * * * 14 антитела из
иммунной антисыворотки, специфичные к одному и тому же веществу и имею-
щие одну и ту же характерную для иммуноглобулинов структуру (см. гл. 7),
на самом деле представляют собой гетерогенную смесь молекул различных
подклассов с разной аффинностью, степенью специфичности и способностью
отличать перекрестно-реагирующие антигены. Недавнее открытие гибридом-
ных моноклональных антител [1—3] (гл. 28) дало возможность получать го-
могенные антитела почти к любому антигену, на который могут быть получены
антисыворотки. Тем не менее гетерогенные антисыворотки до сих пор широко
используются и даже в некоторых случаях обладают определенными прей-
6
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
муществами, например в реакциях преципитации. Поэтому при чтении данной
главы (да и большей части всей книги) надо иметь в виду, что излагаемые здесь
принципы взаимодействия одного антитела с одним антигеном необходимо
модифицировать таким образом, чтобы они охватывали и случай гетерогенных
компонентов реакции.
В данной главе мы обсудим теоретические вопросы, связанные с количест-
венной характеристикой взаимодействия антигена с антителом, а также экспе-
риментальные методы, используемые как для изучения этого взаимодействия,
так и для применения антител в качестве количественных реагентов. Кроме
того, мы выясним природу участков, благодаря которым небольшие молеку-
лы и макромолекулы становятся антигенными, и узнаем, какое влияние ока-
зывает на молекулу антитела ее связывание с антигеном.
23.1. Термодинамика и кинетика
23.1.1. Термодинамика аффинности
Как мы уже отмечали выше, в основе взаимодействия антиген—антитело ле-
жат те же законы термодинамики, что и в основе любой обратимой бимолеку,
лярной реакции связывания. Сейчас мы рассмотрим эти законы в том виде-
в каком они приложимы к данной иммунологической реакции.
23.1.1.1. Химическое равновесие в растворе
Для описания взаимодействия антиген-антитело обозначим буквой S
антигенсвязывающий участок антитела, буквой L — связывающий участок
антигена (лиганда), SL — комплекс антитело-лиганд. Тогда для реакции
S + L^SL (1)
закон действующих масс утверждает, что
К ISL] (о\
асс— [S] [L] ’ К )
где jfiTacc — константа ассоциации (или аффинность), а квадратные скобки
обозначают концентрацию (молярную) соответствующего реагента. Смысл
уравнения в том, что для заданных условий (температура, pH и кон-
центрация соли) отношения концентрации комплекса к концентрациям реа-
гентов в состоянии равновесия всегда постоянно. Следовательно, при измене-
нии концентрации одного из реагентов (либо антитела, либо лиганда) будет
соответственно меняться концентрация комплекса при условии, что ни один
из реагентов не лимитирован, т.е. их концентрация не достигла еще насыщения
и имеется достаточно времени для достижения нового состояния равновесия.
Более того, поскольку концентрации антител и лиганда входят в данное урав-
нение совершенно симметрично, то при увеличении концентрации антител или
антигена в два раза концентрация комплексов антиген-антитело также уве-
личивается в два раза, при условии, что другой реагент находится в достаточ-
ном избытке. Эта оговорка, отражающая только что высказанную мысль, свя-
зана с тем, что [S] и [L] представляют собой концентрации свободного S и сво-
бодного L соответственно, а не полные концентрации, включающие в себя и
часть реагентов, находящуюся в составе комплекса. Следовательно, если нет
значительного избытка L, то удвоение [S] должно приводить к уменьшению
23. Взаимодействие антиген—антитело
7
[LJ, поскольку некоторая часть L будет переходить в комплекс и в результате
[SL] увеличится менее чем в два раза. Сходным образом уменьшение объема
вдвое вызывает увеличение в два раза общей концентрации антитела и лиганда.
В этом случае, если часть обоих реагентов, входящая в состав комплекса, пре-
небрежимо мала (что могло бы иметь место при низкой аффинности реагентов
друг к другу), то концентрация комплекса увеличится в четыре раза. Однако
в большинстве реальных ситуаций концентрация комплекса составляет сущест-
венную часть общей концентрации или антигена, или антител, или обоих реа-
гентов. Поэтому реально концентрация увеличивается менее чем в четыре раза.
Из данного примера следует еще один важный, кажущийся очевидным, но часто
забываемый вывод: поскольку в закон действующих масс входят концентрации,
а не количества каждого реагента [уравнение (2)1, то при переносе тех же ко-
личеств антигена и антител в меньший объем количество образовавшегося ком-
Рис. 23.1. Зависимость концентрации связан-
ного лиганда от концентрации свободного ли-
ганда при условии, что полная концентрация
связывающих участков антител [S]t остается
постоянной. Кривая асимптотически приближа-
ется к уровню концентрации связанного ли-
ганда, равной [S]t.
Концентрация свободного лиганда
плекса увеличится, при разбавлении же реагентов в большем объеме количест-
во комплекса значительно уменьшится. Более того, эти изменения пропор-
циональны примерно квадрату объема, поэтому при планировании экспери-
мента учет объемов, в которых протекают реакции, имеет важнейшее значение.
Как изменяется концентрация комплекса [SL] при увеличении концен-
трации свободного лиганда [L] и постоянной концентрации антител показано
на рис. 23.1. Закон действующих масс [уравнение (2)] можно переписать в виде
[SL] = Ka(:c [S] [L] = 7Гасс ([S]f - [SL]) [L] (3)
или
rci 1_Касс [SJt [L] /о/.
[SL] 1 + Хасс [L] ’
где [S]r — общая концентрация связывающих участков антител, равная [S] -[-
4- [SLJ. Вначале, пока концентрация комплекса [SL] составляет незначитель-
ную часть общей концентрации антител [8]е, она будет расти приблизительно
линейно с увеличением концентрации лиганда. Однако чем больше антител
входит в состав комплексов, тем наклон кривой становится все меньше и мень-
ше и концентрация комплекса [SL] асимптотически приближается к уровню
плато [S]f, когда все антитела оказываются связанными с лигандом. На осно-
ве такой кривой насыщения связывания можно определить концентрацию свя-
зывающих участков антител, если принять ее равной концентрации меченого
лиганда, связанного в состоянии насыщения (лиганд метят радиоактивным
изотопом или каким-либо другим способом1). Эту величину иногда называют
антигеновязывающей емкостью.
1 Это предположение абсолютно верно только для моновалентных лигандов, однако
большинство поливалентных лигандов при сильном избытке антигена (а именно в этих
условиях производится измерение уровня плато) эффективно ведут себя как моновалентные
лиганды.
8
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
Общая концентрация лиганда, при которой антитела начинают насыщаться,
есть функция не только концентрации антител, но также и константы ассоци-
ации Касс, называемой часто аффинностью (или сродством). Эта константа
имеет размерность М"1 или л/моль [если все концентрации в уравнении (2)
молярные]. Поэтому величина Kacc [L] оказывается безразмерной. Именно
отношение этой величины к единице, как видно из уравнения (3'), показывает,
насколько насыщены антитела. Например, антитела с аффинностью 107 м-1 не
будут насыщены, если концентрация лиганда равняется 10~8М (Аасс [L] = 0,1),
даже если общее количество лиганда значительно превышает общее количество
антител. Из уравнения (3') следует, что при этом связанные антитела будут
составлять только 0,1/1,1, или около 9%. Данный аспект аффинности, а также
способы ее измерения рассматриваются значительно детальнее в следующем
разделе.
23.1.1.2. Свободная энергия
Аффиность Аасс имеет важнейшее значение и с точки зрения термодина-
мики, так как она прямо связана со свободной энергией реакции следующими
уравнениями:
AF° = _ RT\nKacc (4)
или
Аасс = е-дгв/ЙТ (4')
где R — это универсальная газовая постоянная (1,98717)кал/(К-моль), Т —
абсолютная температура в градусах Кельвина, In — натуральный логарифм,
а е — основание натуральных логарифмов. Знак минус введен в соответствии
с договоренностью, по которой положительное связывание сопровождается от-
рицательным изменением свободной энергии. A F° — стандартное изменение
свободной энергии, определяемое как изменение свободной энергии при реак-
ции 1 моля антигена и 1 моля связывающих участков антител, в ходе которой
образуется 1 моль комплексов в расчете на единицу концентрации.
Важно отметить очевидное различие уравнений (4) и (4'). Как следует из
уравнения (2), Аасс имеет размерность М-1 (т.е. л/моль), в то время как в урав-
нении (4') эта величина безразмерная. Причина такого несоответствия заклю-
чается в том, что в уравнении (4'), строго говоря, Аасс должно выражаться че-
рез мольные доли, а не через концентрации. Мольная доля растворенного ве-
щества — это отношение молей данного вещества к общему количеству
молей всех компонентов раствора. Поскольку вода (55 М) — превалирующий
компонент большинства водных растворов, для удобства можно превратить
Аасс в безразмерное отношение мольных долей, поделив все концентрации
в уравнении (2) на 55 М. Такое преобразование делает уравнение (4') строго
корректным, но вводит в уравнение (4) дополнительный член, равный — /?Т1п55,
который соответствует энтропии разбавления. Этот постоянный член уничто-
жается при вычитании величин A F, но не при их делении.
Из этих уравнений можно вывести важное мнемоническое правило. Пос-
кольку In 10 = 2,303, то десятикратному увеличению константы связывания
соответствует при 37°С (310,15 К) изменение свободной энергии A F, равное
лишь 1,42 ккал/моль (аналогичные величины для 25°С и 4°С — 1,36 и 1,27
ккал/моль соответственно). Это меньше одной трети энергии водородной свя-
зи (около 4,5 ккал/моль). С другой стороны, очень высокой аффинности 101&
М-1 соответствует AF, равное лишь 14,2 ккал/моль, что приблизительно эк-
вивалентно энергии трех водородных связей. (Конечно, поскольку водород-
23. Взаимодействие антиген—антитело
9
ные связи с водой разрушаются при образовании водородных связей между
антигеном и антителом, энергия, приходящаяся на одну водородную связь,
оказывается ближе к 1 ккал/моль.) Этот пример с очевидностью показывает,
что из многих типов взаимодействий (гидрофобных, ионных, водородных свя-
зей), возникающих между контактирующими участками антигена (например,
белка) и антигенсвязывающего центра антитела, почти столько же отталкива-
ющих, сколько и притягивающих. Именно небольшое различие в несколько
килокалорий между значительно большими величинами, соответствующими
суммам взаимодействий притяжения и отталкивания, и ответственно за воз-
никновение «высокой аффинности». Поэтому неудивительно, что небольшие
модификации антигена могут приводить к очень большим изменениям сродст-
ва. Единственная водородная связь способна изменить аффинность во много
раз. Аналогичные рассуждения справедливы и в отношении гидрофобного
и других взаимодействий. Все это необходимо будет иметь в виду при об-
суждении вопросов, касающихся структуры антигена и специфичности его
узнавания антителом.
23.1.1.3. Роль температуры, pH и концентрации соли
Ранее уже говорилось, что КЛС<. — величина, постоянная при любом
заданном наборе условий, таких, как температура, pH и концентрация соли.
Однако при варьировании любого из этих условий Касс может изменяться.
Мы видели, что соотношение между свободной энергией и аффинностью зави-
сит от температуры. Тем не менее свободная энергия сама по себе является
функцией температуры:
= T AS0, (5)
где АЯ — это изменение энтальпии (тепловой эффект реакции)1, AS — изме-
нение энтропии (величины, характеризующей степень неупорядоченности си-
стемы)1, а Т — абсолютная температура, измеряемая в К.
Можно показать, что константа ассоциации Касс зависит от темпера-
туры следующим образом:
d In А'асс_ДЯ° .г*.
dT "" ВТ2 ' 1 '
или, что эквивалентно,
dlntfacc _ -ДЯ°
d (1/Т) ” R 1 '
Вопрос о том, как были получены эти уравнения, выходит за рамки данной
книги (см. руководство Мура [4]). Однако рассмотрим его практическое исполь-
зование. Во-первых, исходя из наклона графика функции 1пАасс от 1/71,
определяют стандартное изменение энтальпии А Н°. Во-вторых, для сильно
экзотермического взаимодействия (т.е. связанного с большим отрицательным
АЯ — например образование водородной или полярной связи) аффинность будет
уменьшаться с повышением температуры. Следовательно, во многих случаях
взаимодействие между антигеном и антителом при 4СС будет сильнее, чем при
25 или 37°С, так что максимальное связывание для данных концентраций
может быть достигнуто на холоду. В противоположность этому неполярные
или гидрофобные взаимодействия, наоборот, определяются в значительной сте-
пени энтропийным членом T&S, а АЯ° для них близко к нулю. В этом случае
аффинность слабо зависит от температуры.
1 Более полное описание этого вопроса можно найти в любом учебнике по физиче-
ской химии, например в руководстве Мура [4].
10
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
Что касается влияния pH и концентрации соли (или ионной силы) на аф-
финность, то оно может быть различным в зависимости от природы взаимодей-
ствующих групп. Большинство реакций антиген-антитело изучается при зна-
чениях pH, близких к нейтральным, и при физиологических концентрациях
соли (0,15 М Nad). Если связывание осуществляется главным образом в резуль-
тате ионных взаимодействий, то высокая концентрация соли будет снижать
аффинность.
23.1.2. Кинетика реакции антиген-антитело
Фундаментальная связь между термодинамикой и кинетикой реакции ан-
тигена с антителом выражается соотношением:
^асс = ^1/^-1? (7)
где kl и k_t — константы скорости прямой (ассоциация) и обратной (дис-
социация) реакций.
Скорость прямой реакции в значительной степени определяется скоростью
диффузии [теоретический верхний предел — 109 л/^моль^с)] и вероятностью
того, что данное столкновение приведет к связыванию, т.е. главным образом
вероятностью правильной ориентации антигена и антитела для соответствую-
щей «подгонки» реагирующих участков. Можно показать [5], что константу
скорости диффузии можно приближенно определить с помощью уравнения
Смолуховского:
А'[Н-.4лаО(6-102°), (7а)
где а — это выраженная в сантиметрах сумма радиусов молекул обоих реаген-
тов, & D — сумма констант диффузии индивидуальных реагентов, выраженная
в см2/с. Множитель 6 • 1020 необходим для приведения величины A'dl к раз-
мерности М-1с-1. Например, если а = 10-6 см, a D = 10-7 см2/с, то Кйх ~
~7,5-108 М-1с-1. Скорости ассоциации для больших белковых антигенов в об-
щем будут ниже, чем для небольших гаптенов. Этот факт может быть обуслов-
лен меньшей величиной D, ориентационными эффектами при сталкивании и
другими особенностями белок-белкового взаимодействия, не связанными с
диффузией. В результате скорости ассоциации для белковых антигенов по
порядку величины чаще всего оказываются равными 105 — 10е М^с'1 (см.
ниже). Этот факт, однако, может частично объясняться лишь меньшей скоро-
стью диффузии. Если радиусы предположительно сферических молекул реаген-
тов равны гх и г2, то в уравнении (7а) а = гх + г’2. В то же время D пропорци-
онально l/rf 4- 1/г2. Константа скорости диффузии, следовательно, пропор-
циональна выражению
(Г1 + г2) (7-+7") = (ri + г2)2/г1г2. (76)
Отсюда можно видеть, что если rt — г.} — г, то выражение (76) просто стано-
вится равным 4. Таким образом, в случае взаимодействия двух молекул оди-
накового размера константа скорости диффузии не будет зависеть от того,
являются данные молекулы большими или малыми [6]. Однако, если одна из
молекул большая, а другая — малая, то скорость диффузии будет выше, чем
в том случае, когда обе молекулы большие. Это происходит из-за того, что
уменьшение радиуса гх (когда г2 остается постоянным и большим, чем т\)
оказывает большее влияние на увеличение D, пропорционального l/rt 4- 1/г2
23. Взаимодействие антиген—антитело
11
(в котором меньший радиус г( дает больший член), чем на уменьшение а (в
которое теперь больший вклад вносит радиус г2). Например, если, как и рань-
ше, r2 = г, a rt — 0,1 г, то числитель в уравнении (76) уменьшится с 4 г2
лишь до 1,21 г2, в то время как знаменатель сократится с 1 г2 до 0,1 г2. В ре-
зультате отношение увеличится с 4 до 12,1. Другими словами, увеличение
диффузионной подвижности небольшого гаптена перевешивает уменьшение
размеров реагирующего участка в сравнении с таковым большего белковог'о
антигена, поскольку все равно в реакции присутствует антитело, у которого
площадь реагирующего участка достаточно велика.
Скорость диссоциации к_{ зависит от прочности связей, определяющих
высоту энергетического барьера активации диссоциации, и от энергии тепло-
вого движения кТ (где к — постоянная Больцмана), обеспечивающей преодо-
ление этого барьера. Энергия активации диссоциации представляет собой
разность энергий начального состояния и переходного высокоэнергетического
состояния, в которое система должна перейти для того, чтобы диссоциация
стала возможной.
Эйзен [7] указывает, что при сравнении способности связываться с анти-
телом у ряда родственных антигенов, имеющих близкие размеры и сходные фи-
зические свойства, скорость ассоциации во всех случаях окажется очень близ-
кой, а различия в аффинности в значительной степени будут определяться раз-
личием скоростей диссоциации.
Наглядным примером могут служить антитела к белковому антигену —
стафилококковой нуклеазе [8]. Антитела к нативной нуклеазе фракционирова-
ли на колонках с различными фрагментами нуклеазы. В результате была по-
лучена фракция антител, специфических к участку, находящемуся между ос-
татками 99 и 126. Константа ассоциации этих антител с нативным антигеном
составляла 8,3-108 М-1, а константа скорости ассоциации ков = 4,1-105
М“’ с-1. В полном соответствии с тем, что говорилось выше, значение коп
оказалось на несколько порядков меньше величины, наблюдаемой для неболь-
ших гаптенов [9]. Подставив эти значения в уравнение (7), получили зна-
чение величины ко!(, равное 4,9-10“4 с-1. Зная kots, представляющую собой
константу реакции первого порядка, можно определить время полужиз-
ни комплекса (поскольку tl/2 = In 2/kott), оказавшееся равным 23 мин.
Подобные скорости, по-видимому, типичны для антител, обладающих высокой
аффинностью Аасс ~ 109М-1 по отношению к небольшим белковым анти-
генам, таким как нуклеаза (мол.масса ~ 17 000). Скорость диссоциации важ-
но знать при постановке эксперимента, поскольку если само измерение нару-
шает равновесие, то время , в течение которого должно проводиться измерение
(т.е. отличие связанного реагента от свободного), определяется временем полу-
жизни комплекса. Например, если i1/2 = 23 мин, то двухминутная процеду-
ра, включающая разбавление смеси антиген-антитело, может быть завершена
еще до того, как произойдет значительная диссоциация. Однако, если бы ско-
рость прямой реакции осталась неизменной, а аффинность уменьшилась в 10
раз, оставаясь еще довольно значительной — 8-107 М-1, то за время , необхо-
димое для проведения эксперимента, смогло бы диссоциировать 50% комплек-
сов. Это соображение весьма существенно при обсуждении методов определе-
ния сродства и способов изучения кинетики связывания.
Поскольку при постановке эксперимента знание скорости диссоциации
может оказаться весьма важным, необходимо сказать несколько слов о методах
ее измерения. По-видимому, наиболее широко распространенный метод свя-
зан с использование.м антигена, меченного радиоактивным изотопом. После
того, как достигнуто состояние равновесия и определена равновесная концен-
12
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
трация связанной радиоактивности, добавляется большой избыток немеченого
антигена. Поскольку любая диссоциировавшая из комплекса радиоактивная
молекула антигена быстро замещается немеченой молекулой, вероятность то-
го, что радиоактивная молекула вновь войдет в состав комплекса, очень мала.
Следовательно, для определения константы диссоциации комплекса можно
измерять уменьшение концентрации связанной радиоактивности со временем1.
23.2. Аффинность
Из сказанного выше представляется очевидным, что существенная инфор-
мация о реакции антиген-антитело заключена в одной единственной величине—
аффинности. В этом разделе мы рассмотрим аффинность более подробно,
обсудив в том числе методы измерения аффинности и определения гетероген-
ности молекул по сродству. Кроме того, мы выясним влияние на аффинность
поливалентности антител и (или) антигена и проанализируем пространствен-
ные эффекты, наблюдающиеся в том случае, когда взаимодействие антиген-
антитело происходит на твердой поверхности (в двухфазных системах).
j 23.2.1. Взаимодействие антител с моновалентным лигандом
в растворе
'Наиболее простой случай — это взаимодействие антител с моновалент-
ным лигандом. Сюда мы можем отнести реакцию антигаптеновых антител с ис-
тинно моновалентными гаптенами, а также реакцию с макромолекулами спе-
цифических антител, фракционированных для получения популяции, взаимо-
действующей только с одним неповторяющимся участком на антигене2. В пос-
леднем случае антиген ведет себя как моновалентный лишь при взаимодейст-
вии со строго определенной популяцией антител. Замечание о том, что учас-
ток узнавания (антигенная детерминанта) не должен быть повторяющимся, т.е.
может встречаться в каждой молекуле антигена лишь однажды, конечно же
является принципиальным.
Если антигенсвязывающие центры, находящиеся на одной молекуле ан-
титела, независимы (т.е. не обнаруживают при связывании антигена ни поло-
жительной, ни отрицательной кооперативности), то во многих случаях такие
участки, реагирующие с моновалентными лигандами, ведут себя так, как если
бы они представляли собой отдельные молекулы. Поэтому многие (но не все)
свойства, которые мы будем обсуждать, можно анализировать на уровне кон-
центрации связывающих участков антител независимо от количества таких
участков, приходящихся на одну молекулу антитела (2 для IgG и IgA, 10 для
IgM).
При определении аффинности какого-либо антитела обычно измеряют рав-
новесные концентрации связанного и свободного лиганда при увеличивающей-
1 В данном методе предполагается, что все связывающие участки независимы. Для
антител и моновалентных лигандов это предположение, как правило, справедливо. Если же
при связывании имеет место отрицательная или положительная кооперативность, то дис-
социация из комплекса одной радиоактивномеченной молекулы антигена будет приводить
к изменению скорости диссоциации меченых молекул антигена, связанных с другими участ-
ками.
2 Такие фракционированные антитела могут представлять собой смесь антител, спе-
цифичных к перекрывающимся участкам в пределах какого-либо одного домена на антигене.
Тем не менее если две молекулы антител (или два участка связывания одной молекулы анти-
тела) не могут одновременно связываться с одной и той же молекулой антигена, то антиген
эффективно будет вести себя как моновалентный.
23. Взаимодействие антиген—антитело
13
ся общей концентрации лиганда и постоянной концентрации антител. Можно и
и наоборот, варьировать концентрацию антител, но тогда анализ несколько
усложняется. По-видимому, теоретически наиболее изящным методом опреде-
ления равновесных концентраций является равновесный диализ [10, 11], схе-
матически показанный на рис. 23.2. При равновесном диализе лиганд (анти-
ген) распределяется между двумя отсеками, свободно проходя через разде-
ляющую их полупроницаемую мембрану, непроницаемую для антител, на-
ходящихся лишь в одном из отсеков. Преимущество данного метода перед боль-
шинством других состоит в том, что концентрацию лиганда в каждом отсеке
можно определять, не нарушая равновесия. Однако метод имеет тот недостаток,
Полупроницаемая
мем врана
Камера А | Камера Б
Рис. 23.2. Равновесный диализ. Сосуд разде-
лен на две камеры полупроницаемой мем-
браной, которая свободно пропускает ли-
ганд и совсем не пропускает антитела.
Антитела добавляются в одну камеру (Б),
а лиганд — в какую-нибудь одну или в обе
камеры. Независимо от того, как был рас-
пределен лиганд первоначально, через неко-
торый промежуток времени, достаточный
для того, чтобы установилось равновесие, его
распределение станет вполне закономерным.
Концентрация свободного лиганда в обеих
камерах окажется одинаковой и, кроме
того, в отсеке Б будет находиться дополни-
тельное количество лиганда, связанного
с антителами. Таким образом, концентрация
связанного лиганда будет равна разности
концентраций лиганда в камерах Б и А, а
концентрация свободного лиганда—концент-
рации лиганда в камере А. Поскольку эти
концентрации должны удовлетворять за-
кону действующих масс [уравнение (2)],
то, зная их, можно, пользуясь уравнением
(3) или (3') и сделав некоторое графическое
построение (например, построив описывае-
мый в тексте график Скэтчарда), опреде-
лить аффинность Хасс.
что он применим лишь для достаточно небольших по размеру антигенов, спо-
собных свободно проходить через непроницаемую для антител мембрану. Еще
один технический недостаток метода заключается в том, что концентрация свя-
занного антигена определяется как разность суммы концентраций связанного
и свободного антигена в другом отсеке, а не измеряется независимо от свобод-
ного антигена.
В методах, относящихся к другой группе, используются радиоактивно-
меченные лиганды, находящиеся в равновесии с антителами. В этих методах
предусматривается физическое разделение свободного и связанного с антите-
лами лиганда и независимый подсчет количества того и другого. Ряд методов,
используемых для разделения свободного и связанного антигена, будет обсуж-
даться ниже в разделе, посвященном радиоиммунологическому анализу. Их
применение обычно позволяет провести независимое измерение концентраций
связанного и свободного антигена, но при этом может нарушаться равновесие.
14
Дж. А. Верзофски, А. Дж. Берковер
23.2.1.1. Анализ по Скэтчарду
Если данные уже получены, то существует много способов расчета аф-
финности, из которых мы рассмотрим здесь два. По-видимому, наиболее широ-
ко используется способ, описанный Скэтчардом [12] (рис. 23.3). Закон дейст-
Концентрация связанного
миоглоБина, нм
Концентрация связанного
миоглоБина, нМ
Рис. 23.3. Графики Скэтчарда, описываю-
щие связывание меченного 3Н миоглобина
кашалота с моноклональными антителами
к миоглобину (Л) и с сывороточными анти-
телами, выделенными из той же мыши, клет-
ки селезенки которой использовались для
получения гибридомы (Б). Для монокло-
нальных антител (клон HAL 43-201Е11,
клон 5) график Скэтчарда представляет
собой прямую с наклоном 1,6-10е М~х, чис-
ленно равным —Аасс. Отрезок, отсекаемый
этой прямой на оси абсцисс, равняется кон-
центрации связывающих участков антител.
Для сывороточных антител (в отличие от
моноклональных) график Скэтчарда пред-
ставляет собой вогнутую вниз кривую, что
свидетельствует о гетерогенности антител
по аффинности ([13]; печатается с разре-
шения).
вующих масс для условия равновесия, как уже указывалось, записывается в
форме уравнения (3): I
[SL] = Кясс ([S]f - [SL]) [L], (3)
Заменив [SL] и [L], обозначающие концентрацию связанного и свободного ли-
ганда, соответственно на В иЕ, получим уравнение Скэтчарда:
-|^Kacc([S]t-B). (8)
Заметим, что при таком, на первый взгляд, очень простом преобразовании
было сделано одно весьма существенное предположение. Величина [SL] в урав-
нении (3) обозначает концентрацию насыщенных участков связывания антител,
так что ([S]t — [SL])= свободные [S]. В уравнении (8) эта же величина обоз-
начается буквой В. Если лиганд ведет себя как моновалентный, то такая за-
мена законна, поскольку каждой связанной молекуле лиганда соответствует
насыщенный участок связывания на антителе. Но если лиганд поливалентен
23. Взаимодействие антиген—антитело
15
и может связываться более чем с одним участком антитела, то уравнение (8)
остается справедливым только при условии избытка лиганда, когда вероят-
ность связывания данной молекулы лиганда более чем с одним участком на
антителе оказывается весьма малой. В данной части мы будем рассматривать
лишь моновалентные лиганды, однако в других случаях при проведении ана-
лиза Скэтчарда это замечание необходимо иметь в виду.
Из уравнения (8) видно, что график зависимости величины B/F от В дол-
жен представлять собой прямую (если все антитела имеют одинаковое сродство)
с наклоном Хасс, отсекающую на оси абсцисс отрезок, численно равный
концентрации связывающих участков антител (рис. 23.3). Это так называемый
график Скэтчарда. Используется и другой вариант графика, нормированный
на концентрацию антител, который особенно удобен в тех случаях, когда дан-
ные были получены при различных общих концентрациях антител [А](, а не
при постоянной [A]t. Однако для построения этого варианта графика требуется
независимое измерение общей концентрации антител, не связанное с измере-
нием длины отрезка, отсекаемого на оси абсцисс. Разделив тогда уравнение (8)
на общую концентрацию молекул антител (безотносительно к тому, сколько
участков связывания приходится на одну молекулу), получим
^ = KaCC(n-r), (9)
где г — количество насыщенных участков, приходящееся на одну молекулу
антитела, п — общее количество участков, приходящихся на одну молекулу
антитела, ас — концентрация свободного лиганда (с — F), т.е. г — B/[A]f,
п — [S]t/[A]t, где [A]f — общая концентрация антител в молях. В данном ва-
рианте графика Скэтчарда (зависимость r/с от г) наклон прямой также равняет
ся —Аасг, а на оси абсцисс отсекается отрезок, равный п. В результате мож-
но определить количество участков связывания, приходящееся на одну моле-
кулу. Конечно, если [S]f определяется через длину отрезка, отсекаемого на оси
абсцисс графиком зависимости от В [см. уравнение (8)], то тогда, разделив [S]t
на измеренную любым независимым способом концентрацию антител, можно
также определить и количество участков связывания, приходящееся на одну
молекулу. Поэтому единственное преимущество предварительной нормировки
всех экспериментальных точек и построения r/c-варианта графика проявляется
в том случае, когда данные бывают получены при различных концентрациях
антител. Если же концентрация антител неизвестна, но остается постоянной,
то B/F-форма графика более удобна, так как показывает собственно кон-
центрацию антител (участков связывания лиганда). Поскольку теперь мы знаем
значение п для каждого класса антител (2 для IgG и сывороточных IgA, 10 для
IgM), то во многих случаях концентрацию антител легко можно перевести в
концентрацию участков связывания лиганда и обратно.
23.2.1.2. Гетерогенность по аффинности к антигену
Следующий уровень сложности возникает тогда, когда применяют смесь
антител, обладающих различным сродством к данному лиганду. Как прави-
ло, используют антитела из иммунной сыворотки. В некоторых случаях ан-
титела разделяют таким образом, чтобы они оказались специфичными к одно-
му и тому же участку антигена, т.е. были моноспецифичными. На рис. 23.3
представлены графики Скэтчарда для антител к миоглобину. График Скэтчар-
да для моноклональных антител к миоглобину представляет собой прямую
линию (рис. 23.3, А), тогда как аналогичный график для сывороточных анти-
16
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
тел из той же самой! мыши, которая была использована для получения гиб-
ридомных моноклональных антител имеет вид изогнутой кривой (рис. 23.3,Б).
Такой характер графика Скэтчарда типичен для смеси антител, гетерогенных
по аффинности. В некоторых системах, как, например, в системе гормон-
рецептор, где между участками связывания на рецепторе возможна отрица-
тельная кооперативность (т.е. когда связывание гормона с одним участком
Рис. 23.4. График Скэтчарда, построенный
для реакции антигена со смесью двух субпо-
пуляций антител с различной аффинностью.
Антитела обладают аффинностью, равной
Xi и К2 и имеют соответственно п, и п2 участ-
ков связывания на одной молекуле, г —
концентрация связанного антигена, разде-
ленная на полную концентрацию антител
(т. е. количество связанных участков, при-
ходящееся на одну молекулу), а с — кон-
центрация свободного антигена. Кривая
представляет собой гиперболу, в которой
можно выделить две асимптоты, соответ-
ствующие линейным графикам Скэтчарда
отдельных компонентов смеси антител.
Касательные к кривой, построенные в точ-
ках пересечения кривой с осями координат,
лишь приблизительно соответствуют этим
асимптотам, так что из наклонов касатель-
ных можно получить лишь оценочные, но
не точные значения аффинности антител
каждой из субпопуляций. Однако отрезок,
отсекаемый кривой на оси абсцисс, равен
п.1 + п2. Заметим, что в данном случае
rei и п2 должны быть выражены через пол-
ную концентрацию антител, а не через
концентрацию каждого компонента.
снижает сродство к гормону других участков молекулы рецептора), нелиней-
ность графика Скэтчарда может быть вызвана отрицательной кооператив-
ностью при отсутствии какой-либо истинной гетерогенности по сродству.
Однако в случае антител (для которых было продемонстрировано отсутствие
аллостерических эффектов) вогнутость графика Скэтчарда свидетельствует
о наличии гетерогенности по сродству.
Можно было бы предположить, что тангенсы наклона кривой в разных точ-
ках численно равны аффинности разных субпопуляций антител. Хотя мате-
матически это не совсем корректно, тем не менее более крутая часть кривой
соответствует антителам с более высокой аффинностью, а сравнительно поло-
гая — антителам с относительно низкой аффинностью. Для более точного
количественного анализа слагаемых таких кривых были предложены графи-
ческие методы [14, 15], а также написанная Мансоном и Родбардом [16] ком-
пьютерная программа «LIGAND», обладающая широкими возможностями и
легко изменяемая. Это позволило использовать такие кривые для характе-
23. Взаимодействие антиген—антитело
17
ристики смеси некоторого количества субпопуляций антител, различающихся
по аффинности. В данной главе мы разберем лишь случай двух субпопуляций
антител с разной аффинностью, а затем рассмотрим методы расчета средней
аффинности, предложенные для тех случаев, когда имеет место значительно
большая гетерогенность. Кроме того, будет дана математическая оценка сте-
пени гетерогенности (аналогичная оценке дисперсии распределения).
Если популяция антител состоит только из двух субпопуляций с различ-
ной аффинностью, равной соответственно К1 и К2, то мы можем добавить
в уравнение (3') еще один член и получить
r_r I r _ Kl-glC I П2К2С
2 1+К1С + 1 + К2С ’
так что
г _ nlKj I п2&2 (Л П'\
с 1 + XiC 1 + K2C ’ ' '
где индексы соответствуют двум различным субпопуляциям. В этом случае
график зависимости г/с от г окажется гиперболой, асимптоты которой факти-
чески будут представлять собой линейные графики Скэтчарда обоих компонент
(рис. 23.4). Данный случай проанализировал графически Брайт [17]. Нетруд-
но показать, что при с —► 0 и с -> оо отрезок, отсекаемый кривой от оси
абсцисс, равен п1 4- п2 (или в случае графика зависимости В/F от В — общей
концентрации связывающих участков [S]t), а на оси ординат — п1К1 + п2К2.
Таким образом, измеряя длину отрезка, отсекаемого кривой от оси абсцисс,
можно определить суммарную величину п (или [S]t). Проблема заключается
в нахождении аффинности обеих субпопуляций К, и Ki4 а также концентра-
ций каждой из них (соответствующих п1 и п2). Если К2, то аффинность
для каждой из популяций можно определить, исходя из наклона касательных
к кривой, проведенных в точках пересечения кривой с осями координат (рис.
23.4), однако эти касательные в общем случае не будут точно параллельны
двум асимптотам, дающим истинные значения аффинности, так что при опре-
делении и К2 таким способом вносится ошибка, зависящая от относительных
значений nt и га2, а также и К2- Графический метод точного определения
сродства разработал Брайт [17], а компьютерные методы — Мансон и Родбард
23.2.1.3. Средние значения аффинности
Конечно, на практике очень редко можно быть уверенным, что имеешь де-
ло именно с двумя субпопуляциями, поскольку большинство антисывороток
значительно более гетерогенно. Поэтому приведенный выше пример имеет
скорее иллюстративное, чем практическое значение. Пользуясь нелинейным гра-
фиком Скэтчарда, обычно определяют среднюю аффинность и оценивают сте-
пень ее гетерогенности. Однако выяснить на основе этого графика точное ко-
личество субпопуляций с различной аффинностью, по-видимому, невозможно.
Предположим, что имеется т субпопуляций, каждая из которых присут-
ствует в концентрации [SJ и характеризуется аффинностью Кх. Обозначая
концентрацию свободного лиганда через [L], получим уравнение для концен-
трации комплексов каждого типа антител с лигандом, аналогичное уравнению
(3'):
Т> _ [S|]t [L] м
В| -1 + X1[L] •
18
Дж, А. Берзофски, А. Дж. Берковер
Тогда общая концентрация комплексов будет равна сумма:
т т
в=2в1=Бт#'#. ' (И')
1~ГЛ|
1=1 1=1
Подставляя F вместо [L] и деля обе части равенств? на эту величину, получим
— = J) AdSjh. (12)
1=1
Или, что равносильно:
Эти уравнения можно рассматривать как обобщение уравнений (10) и (10').
Перейдя к пределам при F —> 0 и F* е. получим, что
m
Отрезок, отсекаемый на оси ординат =- 3 (13)
i-J
и
т
Отрезок, отсекаемый на оси абсцисс — S l^ih — [S]t. (14)
1=1
Следовательно, и в этом случае, измерив отрезок, отсекаемый на оси абсцисс,
можно определить общую концентрацию участров связывания на антителах
(рис. 23.5).
Рис. 23.5. Различные способы получения зна-
чения среднего сродства для гетерогенной
популяции антител на основе графика Скэт-
чарда. Ко представляет собой наклон каса-
тельной к кривой в точке, где В = [S]}/2,
т. е. где половина связывающих участков
антител занята. Таким образом, Ко соот-
ветствует срединной аффинности. АСр —
наклон хорды, стягивающей кривую Скэт-
чарда, заключенную между точками ее
пересечения с осями координат. АСр соот-
ветствует взвешенному среднему значению
аффинности. Аффинность каждой субпопу-
ляции антител входит в Кср с весом, про-
порциональным ее концентрации (по [18];
с изменениями).
На основе графика Скэтчарда можно получить два различных средних
(average) значения аффинности [18]. Величину Ко, которая более употреби-
тельна, строго говоря, следует называть срединной (median), а не усредненной
(mean) аффинностью. Эта величина определяется как наклон касательно^
23. Взаимодействие антиген—антитело
19
проведенной через точку кривой, в которой половина связывающих участков
оказывается занятой (рис. 23.5). Второе значение средней аффинности, которое
мы будем обозначать как /£ср, представляет собой взвешенное усредненное
(mean) значение аффинностей, полученное взвешиванием каждой аффинности
по относительной доле данной субпопуляции в суммарной популяции антител.
Это можно записать в виде выражения
т
*CP=S tfJWlSh. (15)
Из уравнений (13) и (14) очевидно, что Кср — это отношение двух отрезков,
отсекаемых кривой Скэтчарда на осях B/F и В соответственно, т.е. попросту
наклон изображенной на рис. 23.5 хорды. В связи с этим значение усреднен-
ного сродства Кср в некоторых случаях получить графически значительно лег-
че, чем Ко. В дальнейшем мы увидим, что Кср оказывается полезной и в гра-
фиках других типов.
23.2.1.4. Показатели гетерогенности: график Сипса
Для гетерогенной антисыворотки, кроме того, представляет иртерес оцен-
ка степени гетерогенности по аффинности. Например, если бы аффинность име-
ла нормальное (гауссово) распределение, интересно было знать дисперсию
этого распределения [19, 20]. Были разработаны и более сложные способы ана-
лиза, не требующие особых предположений относительно формы распределения
[21—23]. Однако определение наиболее часто встречающегося и хронологичес-
ки появившегося раньше других показателя гетерогенности связано с произ-
вольным предположением о том, что распределение аффинности соответствует
нормальному распределению, впервые описанному Сипсом [24]. Приложение
данного подхода к гетерогенным антителам разработали Низонофф и Прессмен
[25], а в общем виде изложили Каруш и Каруш [26]. При использовании этого
подхода предполагается справедливость уравнения
П (Кос)а
1 + (ХО<0а ’
(16)
которое аналогично уравнениям (3') и (11) (изотерма адсорбции Ленгмюра),
за исключением наличия показателя степени а, характеризующего степень ге-
терогенности. Этот показатель изменяется от 0 до 1. При а = 1 уравнение (16)
эквивалентно уравнению (3) и гетерогенность отсутствует. По мере того, как
а убывает до 0, гетерогенность возрастает. Для получения величины а графи-
ческим способом необходимо преобразовать уравнение (16) следующим обра-
зом:
log (т=т) = ® log с Д-a log Ко.
(17)
Очевидно, что наклон графика зависимости log от 1°8 с Равен показа-
телю гетерогенности а.
Ч. Де Лизи (личное сообщение) установил, как выражается дисперсия
(второй момент) относительно среднего значения распределения Сипса через
свободную энергию RT In Ко. Результаты показывают, что разброс (или
ширина распределения), нормированный на RT, зависит от а следующим об-
20
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
разом:
^Сипса Л2 (1—а2) „ q,
R2T2 ~ За2
Это выражение полезно для определения величины аСиПса> которая
может рассматриваться как аналогичное стандартному отклонению гауссового
распределения, если при этом иметь в виду, что данное распределение не яв-
ляется истинно гауссовым. Кроме того, как отмечалось выше, использование
распределения Сипса предполагает, что распределение аффинности (на самом
деле значений свободной энергии) является непрерывным, симметричным от-
носительно усредненного (mean) и может быть аппроксимировано гауссовым
распределением. Это предположение часто не выполняется.
23.2.1.5. График зависимости В/F от F или Т
В другом методе, используемом для оценки степени гетерогенности аф-
финности, строится график зависимости отношения концентрации связанного
Рис. 23.6. График зависимости отношения
концентраций связанного и свободного ан-
тигена (R), от концентрации свободного (F)
антигена или общей (Т) концентрации анти-
гена. Кривые имеют аналогичную S-образ-
ную форму, однако, если положение сре-
динной точки (в которой R = Ro/2) графика
зависимости R от Т определяется концент-
рацией связывающих участков антител [S](,
то срединная точка графика зависимости R
от F в точности соответствует F = 1/К
и не зависит от концентрации антител (по
[18]; с изменениями).
(В) и свободного (F) лиганда от концентрации свободного (F) лиганда или об-
щей (Т) концентрации лиганда [18] (рис. 23.6). Для удобства обозначим отно-
шение В/F через R, a Ro определим как предельное значение R, при F —0
(т.е. как длину отрезка, отсекаемого графиком на оси В/F). Вначале, в случае
гомогенной популяции антител, из уравнения (3') получаем
р В X[S]t
F 1 + KF
и
7?n = lim B/F = ЛГ [S]t.
F->0
Определим срединную точку графика (рис. 23.6) как точку, в которой R
равняется половине начальной величины, 7?0, т.е. где R = К [S]f/2. В слу-
чае гомогенных антител (т.е. имеющих одинаковую аффинность), подставив
A7[S]t/2 (т.е. RJ2) вместо В/F в уравнение (8) [18], для срединной точки
(19)
(20)
23. Взаимодействие антиген—антитело
21
получим 1
F = l/X (21)
В —[S]4/2, (22)
поэтому общая концентрация лиганда Т равняется:
Т = В+Р = -ф- + -1-. (23)
Таким образом, если мы построим график зависимости B/F от F, то по поло-
жению срединной точки прямо получим величину ПК. Однако для экспери-
ментатора часто более удобным оказывается построение графика зависимости
B/F от Т. В этом случае срединная точка уже не соответствует величине, об-
ратной аффинности. Как видно из уравнения (23), предположение о том, что
срединная точка соответствует 1/А, приведет к ошибке, равной половине кон-
центрации антителосвязывающих участков. Таким образом, используя за-
висимость B/F от Т, по положению срединной точки можно довольно точно
оценить величину сродства, если [S]t/2<C ПК, т.е. если концентрация анти-
тел мала по сравнению с константой диссоциации. Если же аффинность нас-
только велика, что ПК [S](/2, то таким способом будет определяться кон-
центрация антител, но не аффинность [18] (см. рис. 23.6).
Для гетерогенной антисыворотки, как уже было показано,
/?o = S^1[S1]<. (13)
i
Следовательно, в срединной точке, т.е. когда B/F = R0/2, будет
k«p=("f) ("Tsir)=“ish~ ’ (24)
т.е. при этом оказывается возможным получить еще и значения средней аф-
финности (определение этой величины дано выше [18]).
Даже если гетерогенность не изменяет средней аффинности, она вызывает
уширение кривой или уменьшение ее наклона. Это можно попять, если пред-
ставить кривую зависимости B/F от F в виде ступенчатой функции. Каждая
субпопуляция антител с данной аффинностью К1 будет титроваться до 50%
своего микроскопического значения В/F при концентрации свободного ли-
ганда F = 1/К, Антитела с высокой аффинностью будут титроваться при низ-
ких значениях F, а с низкой аффинностью — при более высоких значениях F.
Результирующая ступенчатая функция аналогична последовательным пере-
ходам, соответствующим различным значениям рК при рН-титровании.
23.2.1.6. Истинная аффинность
Обсуждавшаяся до сих пор аффинность Аасс — это как раз та величина,
которая была названа истинной аффинностью, т.е. аффинностью каждого
взятого в отдельности антигенсвязывающего центра антитела. Введение дан-
1 Важно отметить, что /?0 должно быть предельным значением В/F, когда F действи-
тельно приближается к нулю. В методе РИА, в котором используемые концентрации метки
существенны по сравнению с ПК, даже уменьшение концентрации немеченного лиганда
до нуля не приведет к истинному предельному значению 7?0, поскольку для определения
Яо концентрация метки также должна быть пренебрежимо малой. Если же это не так, то
полученные значения величин Ло, а следовательно, и К, окажутся заниженными.
22
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
ной величины в наши уравнения допустимо безотносительно к валентности
антител, если при этом используется концентрация антигенсвязывающих
центров [S], а не концентрация молекул антител [А], способных . иметь более
одного участка связывания. Даже в отсутствие кооперативности между анти-
генсвязывающими центрами возникает статистический эффект, приводящий
к тому, что функциональная аффинность отличается от истинной, если анти-
тела поливалентны и используется концентрация молекул антител, а не свя-
зывающих участков. Возникновение этого различия может быть лучше всего
проиллюстрировано на примере бивалентных антител, таких как IgG. Мы
предполагаем, что оба участка связывания в молекуле IgG эквивалентны и не
оказывают влияния друг на друга. Лиганды, как и везде в данном разделе,
предполагаются моновалентными. Связывание лиганда при этом происходит
в два этапа:
A + l£aL, AL + I,SaL2, (25)
каждому из которых соответствует
аффинности:
К tAL]
[A] [L]
определенное значение функциональной
is [AL2]
2 - [AL] [L] •
(26)
Если истинная аффинность обоих эквивалентных участков равна К, то когда
самая первая молекула только собирается связаться на этапе 1, Ki будет в
действительности в два раза больше К2, поскольку концентрация доступных
при этом участков [S] будет в два раза больше концентрации антител. Одна-
ко если один участок связан, то обратная реакция этапа 1, может идти толь-
ко в одном участке — именно в том, который занят. Наоборот, на втором
этапе для прямой реакции имеется лишь один оставшийся свободным участок,
тогда как в случае обратной реакции AL2 ->• AL + L для возврата в AL-coc-
тояние диссоциация может идти в любом из связывающих центров. Занятый
второй участок совсем не обязательно должен освободиться первым, а пос-
кольку центры связывания идентичны, ни о каком различии между ними при
диссоциации говорить не приходится. В результате для этапа 2 эффективная
концентрация связывающих центров для обратной реакции окажется в два
раза выше, чем для прямой реакции, а аффинность К2 для второй реакции
будет составлять лишь половину истинной аффинности К.
Данный статистический эффект, как легко видеть, можно экстраполиро-
вать на антитела, имеющие п центров связывания [27]. При этом
Кх — пК и Кп — ~К. (27)
Для получения значений функциональной аффинности промежуточных эта-
пов можно использовать два способа [уравнения (7, 27)], каждый из которых
дает
Kl = 1 к. (28)
Если лиганд (L) является моновалентным и присутствует в столь низкой
концентрации, что реально может связаться лишь с одним антигенсвязываю-
щим центром молекулы антитела, то важное значение приобретает функцио-
нальная (выражающаяся через молярную концентрацию), а не истинная аф-
финность. Тогда для IgG или IgM (имеющих 2 и 10 центров связывания на
молекулу соответственно) кажущаяся аффинность теоретически будет в 2
или 10 раз выше истинной. В большинстве случаев, однако, удобнее пользо-
23. Взаимодействие антиген—антитело
23
ваться концентрацией участков связывания и истинной аффинностью. С по-
мощью описанных выше методов анализа, включающих в себя построение гра-
фика зависимости В/F от F (График Скэтчарда) или же зависимости В или
r/с от г, легко определяется значение истинной аффинности. Именно эта
величина дает нам информацию о природе взаимодействия антитело-лиганд.
В случае поливалентных лигандов эффективное сродство, функциональ-
ная аффинность, учитывающая многоцентровое связывание между поливалент-
ными молекулами антител и поливалентными молекулами лиганда, может ока-
заться значительно более высокой, чем истинная аффинность, описывающая
взаимодействие каждого из центров связывания. Данный вопрос подробно
обсуждается в следующей части.
23.2.2. Взаимодействие с поливалентными лигандами
Итак, мы обсудили лишь те случаи, когда лиганд моновалентен или ока-
зывается функционально моновалентным по отношению к данным конкретным
изучаемым антителам. Однако часто молекула лиганда имеет многократно
повторяющиеся идентичные детерминанты, каждая из которых может неза-
висимо связываться с несколькими одинаковыми антигенсвязывающими цент-
рами бивалентного или поливалентного антитела1. Хотя истинная аффинность
взаимодействия одиночного антигенсвязывающего участка и одиночной анти-
генной детерминанты может быть сравнительно небольшой (см. предыдущую
часть), не исключено, что реальная или функциональная аффинность окажется
значительно более высокой. Такой эффект обусловлен способностью одного
антитела связывать две и более идентичные детерминанты поливалентной
молекулы антигена. Каруш [28] назвал это явление моногамной бивалентнос-
тью (monogamous bivalency). Подобное моногамное связывание может иметь
место между двумя молекулами, одна из которых находится в растворе, а дру-
гая — в растворе или на твердой поверхности, например на стенке пластиковой
ячейки или на поверхности клеточной мембраны. Теперь мы сначала рассмот-
рим ситуацию, когда молекулы находятся в растворе, а затем обсудим особен-
ности процесса связывания, возникающие в том случае, когда один из реаген-
тов находится на твердой поверхности.
23.2.2.1. Моногамная бивалентность
Рассмотрим бивалентную молекулу антитела, реагирующую с молеку-
лой антигена, имеющей две идентичные детерминанты. Этот случай детально
описали Крозерс и Мецгер [29], а также Каруш [28]. Обозначим участки свя-
зывания на антителе буквами S и S', а антигенные детерминанты буквами D
и D', понимая при этом, что в действительности, мы не в состоянии отличить
S от S' и D от D'. Взаимодействие антигена с антителом может быть представ-
лено в виде двух этапов, на первом из которых протекает бимолекулярная реа-
S D *. S-D
l+l^l I
S' ГУ S' ГУ
(29)
1 Если поливалентен только антиген, а антитела моновалентны (например, в случае
Fab-фрагментов), то такую ситуацию можно анализировать с помощью тех же самых стати-
стических методов.
24
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
кция, а на втором — внутримолекулярная реакция
S-D k, S-D
11*11
S' ГУ S'—ГУ
(30)
Константа ассоциации для первого этапа Кх связана с истинной аффинностью
К через коэффициент, равный 4 и обусловленный эквивалентностью S и S'
и D и D'. Первый этап представляет собой типичную реакцию второго поряд-
ка между антигеном и антителом. Однако второй этап [уравнение (30)] — это
реакция первого порядка, поскольку она представляет собой переход между
двумя состояниями одного и того же молекулярного комплекса, т.е. S' и D'
вступают в реакцию, будучи уже химически связанными (пусть и не ковалент-
но) через связь S — D, образованную на первом этапе. В результате констан-
та равновесия К2 данной реакции в отличие от Ki не будет функцией концен-
трации S — S' и D — D' в растворе. Скорость прямой реакции при этом
скорее должна определяться геометрией комплекса и гибкостью сочленений
между доменами. Другими словами, вероятность столкновения друг с другом
ориентированных должным образом S' и D' будет зависеть от расстояния меж-
ду ними в цепи S' — S — D — D' и их подвижности относительно друг друга"
а не от плотности молекул в растворе (т.е. концентрации).
С другой стороны, следует ожидать, что константа скорости обратной
реакции второго этапа будет близкой по величине к константе скорости прос-
той реакции первого порядка S — D -> S + D, поскольку диссоциация опреде-
ляется прочностью связи S' — D' (или S — D) и не зависит от заполненности анти-
генсвязывающего центра, если, конечно, при одновременной ассоциации антите-
ла с двумя молекулами антигена в структуре не возникает напряженностей.
Необходимо отметить, что К2 должна быть в два раза меньше константы К'2
для аналогичной реакции, в которой S и D в цепи S' — S — D — D' свя-
заны между собой ковалентно. Это обусловлено тем, что прямая реакция [урав-
нение (30)] идет лишь в одном из двух связывающих центров, тогда как обрат-
ная реакция может идти в любом из них, причем продукт реакции в обоих слу-
чаях будет одним и тем же.
Представляет интерес знание величины кажущейся или наблюдаемой
аффинности всей реакции
i+VM-? (31)
S D S-D
Поскольку свободная энергия для обоих этапов реакции равна сумме свобод-
ных энергий AFj и AF2 каждого из этапов, то наблюдаемая аффинность бу-
дет равна
Янабл = ад, (32)
где и К2 определены таким образом, что содержат в себе множители ста-
тистической вырожденности1. Константы равновесия К{ и К2, как и в урав-
1 В некоторых работах эти множители в и К2 не введены и поэтому соответствую-
щее уравнение приобретает вид ЛГнабл = 2К±К2.
23. Взаимодействие антиген—антитело
25
нении (7), представляют собой отношения констант скоростей прямой и обрат-
ной реакций. Все четыре данные константы скорости входят в соответствую-
щие выражения для значений истинной аффинности между S и D (за исклю-
чением обсуждавшейся выше прямой внутримолекулярной реакции, идущей
на этапе 2). Таким образом, трудность предсказания Хнабл в значительной
степени связана с проблемой учета геометрических (стерических) факто-
ров, определяющих К2, если принять, что истинная аффинность К уже извес-
тна. Крозерс и Мецгер [29] провели анализ данной проблемы для некоторых
частных случаев. В целом можно сказать, что, будет ли К2 больше или мень-
ше, чем К, определяется сближенностью S' и D' на этапе 2 и расстоянием
между D и D' в сравнении с возможными разрешенными расстояниями меж-
ду S и S', что в свою очередь зависит от длины плеч Y-образной молекулы
антитела и подвижности шарнира между ними (см. гл. 7). В результате, пос-
кольку Ki можно приближенно считать равной К (с учетом статистических
множителей), диапазон значений наблюдаемой аффинности Ктбл при
таком «моногамном бивалентном» взаимодействии может простираться от ве-
личин, значительно меньших, до значительно больших, чем К2. Если порядок
величины К2 такой же, как и величины К, то Кнабп будет по порядку величи-
ны равна № и в некоторых случаях может оказаться просто огромной (напри-
мер, если К ~ 109М-1, то Кнабл может быть ~ 1018 М-1). Время полужиз-
ни комплекса при этом будет измеряться тысячами лет. Легко видеть, каким
образом подобное моногамное бивалентное взаимодействие может оказаться
необратимым, хотя на практике наблюдаемая аффинность редко превышает
величину К для одиночного участка более чем на несколько порядков, что,
возможно, обусловлено возникновением стерических напряжений при связы-
вании [30].
Если подобные значения наблюдаемой аффинности могут быть достигнуты
при моногамном бивалентном взаимодействии, еще большие величины могут
наблюдаться при многоцентровом связывании молекулы IgM с поливалентны-
ми лигандами. Хотя по отношению к небольшим моновалентным лигандам
IgM обладают десятью валентностями, при связывании с большими полива-
лентными лигандами они часто ведут себя как пятивалентные вследствие на-
личия стерических ограничений. Однако даже взаимодействие пятью центра-
ми может приводить к очень прочному связыванию. Поэтому, даже несмотря
на то что истинная аффинность молекул IgM в целом ниже таковой молекул
IgG к тому же антигену [28], наблюдаемая аффинность IgM может оказаться
достаточно высокой.
23.2.3. Двухфазные системы
Точно такое же увеличение сродства, какое имеет место при многоцентро-
вом связывании, наблюдается и в двухфазных системах. Примерами взаимо-
действий такого типа служат реакции поливалентных антител с антигеном,
прикрепленным к клеточной или искусственной поверхности (например, к се-
фарозе или к стенкам пластиковых пластинок для микротитрования), реакция
поливалентных лигандов с антителами, находящимися на поверхности В-кле-
ток, гранул сефарозы или на стенках пластиковых лунок, а также реакция
любого из компонентов с преципитатом антиген-антитело. По причинам, из-
ложенным выше, «моногамное» взаимодействие может приводить к тому, что
наблюдаемая аффинность поливалентного антитела или антигена к твердой
поверхности, имеющей много участков узнавания, окажется очень большой и
связывание станет практически необратимым.
26
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
Однако существует еще один эффект, также приводящий к увеличению
наблюдаемой аффинности в двухфазной системе и имеющий место даже в слу-
чае моновалентных антител (Fab-фрагментов) или моновалентных лигандов. '
Этот эффект связан с тем, что на поверхности локальная эффективная концен-
трация связывающих участков оказывается во много раз выше концентрации
такого же числа участков, распределенных по всему объему раствора [31].
Иными словами, данный эффект обусловлен тем, что на границе твердого тела
и жидкости нарушается высказанное при обсуждении константы ассоциации
/Сасс предположение, что реагенты распределены по всему объему случайно
(до некоторой степени это учитывалось, когда мы говорили об увеличении аф-
финности поливалентных реагентов). Данная ситуация была проанализирована
в работах ДеЛизи [32], а также ДеЛизи и Вигеля [33], которые разбили реак-
цию на два этапа — диффузионный процесс, необходимый для того, чтобы
сблизить реагенты на требуемое расстояние и установить в правильной ориен-
тации, и собственно реакцию. Комплекс антиген-антитело, в котором реагенты
находятся в соответствующем положении, но еще друг с другом не реагируют,
называется ориентированным комплексом. Тогда можно записать реакцию
S + D =₽± S... D =₽*= SD, (33)
A_ A-1
где S — это связывающий участок антитела, D — антигенная детерминанта,
/с+ и к_ — константы скорости прямой и обратной диффузии, a kY и к_^ —
константы скорости прямой и обратной реакций в том случае, когда ориен-
тированный комплекс уже образован. Если концентрация ориентированных
комплексов не меняется со временем, то полные константы скорости будут
задаваться уравнениями
к^к^Цк^к.), (34)
кт = k_ikj (*, + *_), (35)
где индексы f и г относятся к прямой (forward) и обратной (reverse) реакциям
[32]. Константа ассоциации, согласно уравнению (7), представляет собой от-
ношение этих двух констант, т.е.
^асс = kjcjk^k.. (36)
Соотношение между величинами ki и к_ определяет предположительную
судьбу ориентированного комплекса, показывая, какой процесс более вероя-
тен — реакция с образованием SD или же распад комплекса на свободно диф-
фундирующие Реагенты.
Предположим, что к_ мала по сравнению с kt. Тогда связанный комп-
лекс SD и ориентированный комплекс S .... D могут много раз превращаться
друг в друга, до того как ориентированный комплекс распадется и один из
реагентов перейдет в раствор. Если на поверхности имеется много антигенных
детерминант D, то даже для моновалентного антигена (Fab) в случае диссоциа-
ции SD до S ... D может оказаться значительно легче вновь вступить в реакцию
с той же самой или соседней детерминантой, чем перейти в раствор (возмож-
ность этого опять-таки определяется относительными величинами констант
скорости к1 и &2). Именно в большей вероятности снова вступить в реакцию
с поверхностью, чем перейти в раствор, и заключается описываемый эффект.
Более подробное математическое описание реакций на поверхности клеток
дано у ДеЛизи [32], а также у ДеЛизи и Вигеля [33].
Несколько отличный от предыдущего, но представляющий значительный
23. Взаимодействие антиген—антитело 27
интерес анализ того же самого или очень похожего явления провели Силхеви
и др. [34]. Эти авторы изучали случай диффузии лиганда из диализного мешка,
содержащего белок, к которому лиганд имеет значительное сродство. Когда
концентрация лиганда становится настолько низкой, что свободные участки
связывания на поверхности белка оказываются в избытке, то скорость выхода
лиганда из диализного мешка перестает быть просто скоростью диффузии или
просто скоростью диссоциации комплексов белок—лиганд. Авторы показывают,
что в данных условиях выход лиганда представляет собой реакцию квазипер-
вого порядка, хотя время полужизни при этом оказывается в (1 -f- [Р] Аасс)
раз больше, чем в отсутствие белка:
г+==М1 + [РИасс), (37)
где [Р] — это концентрация лигандсвязываюгцих участков, /£асс — аф-
финность, a t+ и t_ — время полужизни в присутствии и в отсутствие белка
в диализном мешке соответственно.
В описанном случае белок находился в растворе, так что авторы могли ис-
пользовать действительную концентрацию белка и действительную истинную
аффинность Касс. Если же белок находится на какой-нибудь двухмерной
поверхности, то вопрос о том, что считать эффективной концентрацией, стано-
вится сложнее. Однако можно принять, что высокая локальная концентрация
белка, заключенного в диализном мешке, аналогична высокой локальной кон-
центрации белка, присоединенного к твердому носителю. Поскольку в основе
обоих явлений лежит по существу один и тот же механизм, можно предположить
существование сходных эффектов. Например, в случае диализа присутствие
в умеренной концентрации 10 мкм антител с аффинностью 10® М-1 может умень-
шать скорость выхода лиганда в тысячу раз. В результате диализ, который в
противном случае занимал бы три часа, теперь будет идти четыре месяца! Лег-
ко понять, что из за такого «задерживающего эффекта» даже не очень высокие
значения аффинности будут казаться бесконечными, а реакции будут произ-
водить впечатление необратимых. Данный задерживающий эффект возникает
не только в иммунологических, но и в других системах — например на клеточ-
ной поверхности или между клеточными компартментами, где локальная кон-
центрация белка может быть высокой.
В заключение необходимо подчеркнуть следующее: поскольку описанные
эффекты задержки зависят от наличия большого количества незанятых участ-
ков связывания, добавление значительного избытка немеченого лиганда для
насыщения этих участков будет приводить к уменьшению или исчезновению
эффекта задержки и к существенному ускорению диссоциации или выхода
меченого лиганда. Такое действие немеченого лиганда может быть исполь-
зовано в качестве теста на наличие задержки, хотя необходимо иметь в виду,
что в определенных случаях тот же самый эффект может служить указанием
на наличие отрицательной кооперативности между различными лигандсвязы-
вающими участками.
23.3. Радиоиммунологический анализ (РИА)
и родственные ему методы
Радиоиммунологический анализ (РИА) впервые описали Ялоу и Берсон в
1960 г. [37]. Ныне РИА — наиболее чувствительный и весьма широко исполь-
зуемый метод определения концентрации различных биологических молекул.
Основные принципы, необходимые для понимания и применения этого метода,
28
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
уже были изложены в первых разделах данной главы. В настоящем разделе мы
обсудим важнейшие идеи и методологические подходы, используемые в РИА.
Для более детального изучения РИА читатель отсылается к книге Чарда
[36] и обзорам Родбарда [37] и Ялоу [38].
Основная идея РИА заключается в том, что связывание высокорадиоак-
тивномеченного антигена, взятого в бесконечно малой концентрации, со спе-
цифическими антителами, обладающими по отношению к нему значительной
аффинностью и присутствующий в малой концентрации, оказывается очень
чувствительным к конкуренции со стороны немеченого антигена и весь-
ма специфичным к антигену. Вследствие этого концентрацию антигена в неиз-
вестном образце можно определять по его способности конкурировать с ме-
ченым антигеном за связывание с антителами. Метод может быть использован
для измерения низких концентраций молекул, даже в тех случаях, когда в
исследуемой биологической жидкости имеются многочисленные примеси. Для
этого необходимо приготовить радиоактивно меченный антиген и антитела,
обладающие по отношению к нему высокой аффинностью, научиться отличать
связанный меченый антиген от свободного, найти оптимальные для получения
максимальной чувствительности концентрации антител и меченого антигена и,
зная концентрации конкурирующего немеченого антигена, построить стан-
дартную кривую, с помощью которой затем определить концентрацию антиге-
на в неизвестных образцах. Кроме того, необходимо выбрать наиболее удоб-
ный способ графического (или численного) представления данных. Здесь мы не
будем излагать методы приготовления антител и меченых антигенов, а обсу-
дим другие этапы, а также наиболее сложные вопросы, касающиеся исполь-
зования РИА.
23.3.1. Разделение связанного и свободного антигенов
Какой бы параметр мы не использовали для количественного описания
конкуренции немеченого антигена с меченым, он всегда будет функцией кон-
центрации связанного, или концентраций связанного и свободного радиоак-
тивномеченного антигена. Поэтому одно из наиболее жестких методических
требований заключается в том, чтобы уметь отличать связанную с антителом
радиоактивномеченную молекулу антигена от свободной. Это обычно предпо-
лагает физическое разделение связанной и свободной метки и независимое
измерение радиоактивности в обеих фракциях. Если фракция связанного ли-
ганда загрязнена свободным лигандом, или наоборот, то в результате может
получиться очень большая ошибка, величина которой будет зависеть от того,
какой части стандартной кривой соответствуют условия эксперимента.
23.3.1.1. Методы разделения в растворе
Проведение РИА в растворе имеет то преимущество, что связывание в этом
случае определяется истинной аффинностью антител. Однако при этом связан-
ный и свободный антигены должны быть разделены способом, который не нару-
шает равновесия. Подходы, используемые для этого, относятся к трем основным
типам: осаждение антител со связанным антигеном, когда свободный антиген
остается в растворе, осаждение свободного антигена, когда в растворе остаются
антитела и связанный антиген, и, наконец, разделение свободных и связанных
с антителами молекул антигена в растворе по размеру с помощью гель-фильтра-
ции. Последний способ слишком трудоемок, чтобы его можно было использо-
вать, когда необходимо исследовать большое количество образцов. К тому же
23. Взаимодействие антиген—антитело
29
он оказывается настолько медленным, что в ходе эксперимента равновесие
может нарушиться. В связи с этим колоночная гель-фильтрация в РИА почти
не применяется.
По-видимому, наиболее широко используются методы, в которых осаж-
даются антитела. Если антиген значительно меньше, чем антитело (мол. масса
<30 кДа), то с помощью сульфата аммония [39] или полиэтиленгликоля с мол.
массой 6000 Да (10% по весу) [40] (а именно эти реактивы наиболее часто исполь-
зуются для данной цели) можно осадить практически все антитела, тогда как
антиген будет оставаться в растворе. Например, осаждение полиэтиленглико-
лем и центрифугирование, могут быть проведены в течение менее чем 2 мин,
что дает возможность разделить связанный и свободный антигены раньше,
чем произойдет сколько-нибудь значительная диссоциация, обусловленная
эффектом разбавления вследствие добавления полиэтиленгликоля [41]. Отме-
тим, что если используется не цельная сыворотка, то для образования макроско-
пического осадка необходимо добавить в качестве неспецифического носителя
гамма-глобулин. Однако если мол. масса антигена значительно больше
30 000 — 40 000 Да или если антиген не имеет формы глобулы, то полиэтилен-
гликоль в концентрациях, полностью осаждающих антитела, может также
осадить более 10% свободного антигена, что в результате будет приводить
к неприемлемо высокому уровню фона (неспецифического связывания в отсут-
ствие специфических антител). В этих условиях необходимо использовать более
специфические методы осаждения. Если антитела исходно относятся к некоему
подклассу иммуноглобулинов G, связывающихся со стафилококковым белком
А, то можно воспользоваться преимуществом высокого сродства белка А к IgG,
взяв для осаждения антител либо сефарозу с пришитым к ней белком А, либо
убитые формалином целые клетки стафилококков (штамм Cowan I). Поскольку
и гранулы сефарозы, и клетки стафилококков представляют собой большие
частицы, их можно легко осадить центрифугированием, а вместе с ними и анти-
тела со связанным антигеном, тогда как свободный антиген при этом останется
в растворе [42]. Если и эта процедура не удастся, то можно попытаться осадить
антитела, используя специфичные вторые антииммуноглобулиновые анти-
тела, полученные путем иммунизации животных другого вида. Этот метод при-
меняется очень широко, однако он также весьма громоздок. Как будет пока-
зано ниже, максимальное осаждение происходит не в условиях избытка антител,
а в «точке эквивалентности» — в середине кривой титрования, где антиген
(в данном случае первые антитела) и антитела (антииммуноглобулиновые) на-
ходятся примерно в одинаковых концентрациях. Поэтому для достижения
максимального эффекта надо определить точку эквивалентности путем титро-
вания с помощью вторых антииммуноглобулиновых антител, а для поддержа-
ния концентрации иммуноглобулинов на постоянном уровне следует добавить
иммуноглобулиновый носитель. Необходимо, однако, иметь в виду, что реакция
преципитации идет весьма медленно, поскольку формирование преципитацион-
ной сетки и образование агрегатов, достаточно больших для того, чтобы их
можно было осадить, протекает значительно медленнее, чем собственно реакция
антиген—антитело. В результате инкубация со вторыми антителами обычно
занимает от 24 до 48 ч или даже больше, по сравнению с несколькими секун-
дами, требуемыми для осаждения полиэтиленгликолем. Столь долгое время
инкубации не только задерживает получение результатов, но приводит также
к тому, что равновесие между антигеном и антителами, сдвигаемое вследствие
разбавления реагентов при добавлении вторых антител, устанавливается на
новом уровне. Поскольку при уменьшении концентраций уменьшается также
образование комплексов (см. выше), чувствительность метода понизится, если
30
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
увеличение объема образца, обусловленное добавлением вторых антител, не
будет сведено к минимуму. Некоторые из этих трудностей могут быть преодо-
лены повышением эффективности осаждения с помощью низких концентраций
полиэтиленгликоля.
Другой метод разделения заключается в адсорбции свободного антигена
на поверхности какого-либо реагента, так, чтобы антиген, связанный с анти-
телами, оставался при этом в растворе. Наиболее широко для этой цели исполь-
зуются активированный уголь и тальк. Поскольку способность связываться
с данными реагентами зависит от размеров и гидрофобности антигена, акти-
вированный уголь и тальк могут использоваться для адсорбции лишь некоторых
антигенов. Описанный метод недорог и достаточно быстр. Однако, чтобы полу-
чить с его помощью воспроизводимые результаты и избежать при этом адсорб-
ции комплексов антиген—антитело, необходимо точно устанавливать и вни-
мательно следить за pH, ионной силой и температурой. Более того, поскольку
активированный уголь и тальк обладают высоким сродством к антигену, они
могут конкурировать за связывание с ним с низкоаффинными антителами и тем
самым сдвигать положение равновесия. Кроме того, так как активированный
уголь является гасителем p-излучения в сцинтилляционной жидкости, его
можно использовать лишь в том случае, когда для мечения берутся у-излучаю-
щие изотопы, например 1251.
23.3.1.2. Методы разделения на твердой фазе
При проведении РИА метод разделения на твердой фазе особенно удобен
тогда, когда необходимо обработать большое количество образцов. Преимущест-
вом его является потенциальное увеличение аффинности антитела к лиганду по
сравнению с собственной (intrinsic) аффинностью (что обусловлено обсужденными
выше эффектами на границе твердой и жидкой фаз). Однако данный метод имеет
и недостатки, связанные с тем, что в нем вследствие этих же самых эффектов
измеряется не истинная собственная (true intrinsic) аффинность. Сам по себе
метод достаточно прост. Сначала необходимо пришить антитела к твердой
поверхности, например к гранулам сефарозы, на стенку пробирки или пласти-
ковой лунки. В последнем случае, поскольку большинство белков неспецифиче-
ски сорбируется на пластике (на поливинилхлориде легче, чем на полистироле),
то обычно просто инкубируют антитела в пластиковой лунке, а затем таким же
образом другим белком (например, бычьим сывороточным альбумином) запол-
няют незанятые места. Чтобы избежать при этом конкуренции со стороны дру-
гих сывороточных белков, на данной стадии необходимо использовать только
очищенные антитела. Концентрацию сорбирующихся антител можно менять,
варьируя тип пластика или концентрацию антител в среде. После того как
стенки лунок (или гранулы сефарозы) покроются слоем антител, в этих лунках
инкубируют меченый антиген в присутствии или в отсутствие немеченого кон-
курирующего антигена, и после отмывки прямо измеряют количество радио-
активной метки, адсорбировавшейся на стенках (для этого предварительно
вырезают данную ячейку из пластикового планшета) или на гранулах сефарозы.
Метод связывания со стенками лунок пластикового планшета особенно поле-
зен для обработки большого количества образцов. Однако, поскольку кон-
центрация или даже количество адсорбировавшихся на стенках антител неиз-
вестны и поскольку определяемая таким образом аффинность не является
собственной аффинностью, этот метод нельзя использовать для получения
химических характеристик реакции антиген—антитело. К тому же с помощью
данного метода обычно определяют лишь концентрацию связанного антигена
23. Взаимодействие антиген—антитело 31
и очень редко при этом измеряют независимо концентрацию свободного анти-
гена. Тем не менее если требуется узнать концентрацию неизвестного конку-
рентного антигена путем сравнения результатов эксперимента со стандартной
кривой, то для данной задачи метод связывания на стенках пластиковых лунок,
по-видимому, является идеальным. Детальный анализ того, при каких значе-
ниях параметров этот метод дает наилучшие результаты, осуществили Цоллин-
гер и др. [43].
23.3.2. Определение концентраций антител
и меченого антигена, соответствующих
максимальной чувствительности
Основное, что определяет чувствительность метода,— это аффинность
антител, концентрация антител и меченого антигена, а также точность (вос-
производимость) получаемых данных. В целом при более высокой аффинности
можно добиться большей чувствительности. Если же антитела обладают очень
высокой аффинностью, то это будет ограничивать диапазон, в пределах которого
можно варьировать другие параметры. Например, поскольку в ходе экспери-
мента находящийся в исследуемом образце немеченый антиген конкурирует
с меченым, то утверждение о том, что чем ниже концентрация метки, тем мень-
шую концентрацию антигена в неизвестном образце можно измерить, будет
справедливо лишь до определенного предела. Этот предел, как следует из при-
веденных выше теоретических рассуждений, определяется величиной аффин-
ности Касс [36]. Самый крутой участок кривой титрования соответствует
концентрациям, близким к 1//Гасс. При концентрациях лиганда, значительно
меньших 1/Касс, большинство антигенсвязывающих участков остается неза-
нятым, вследствие чего конкуренция оказывается менее эффективной. Поэтому
нет никакого смысла уменьшать концентрацию метки до такого уровня, при
котором Касс превышает ее более чем в несколько раз. Следовательно, хотя
в целом увеличение удельной радиоактивности меченого антигена и уменьше-
ние его концентрации представляется полезным, однако при этом важно пом-
нить о существовании предельного значения концентрации 1/Аасс. Увеличение
удельной радиоактивности, более чем это необходимо для достижения макси-
мальной чувствительности, может приводить к денатурации антигена, а слиш-
ком сильное ее уменьшение будет неизбежно вызывать неудобства, связанные
с удлинением времени счета.
Аналогичным образом понижение концентрации антител будет до опре-
деленного предела приводить к увеличению чувствительности. Этот предел
также зависит от значения 1/Аасс и от величины фонового «неспецифического
связывания». Ясно, что уменьшение концентрации антител до того значения,
когда связывание метки в отсутствие немеченого антигена становится слишком
близким к уровню фона, будет приводить к потере чувствительности вслед-
ствие понижения точности. В целом условия эксперимента должны быть такими,
чтобы часть метки, связанной в отсутствие конкурента, была больше, чем 0,2
и как можно ближе к 0,5 (см. [44]).
Удобный способ получения оптимальных концентраций метки и антител
заключается в следующем. Прежде всего необходимо определить наименьшую
концентрацию метки, которая дает требуемую точность счета за достаточно
удобное время счета и точность счета при связывании от половины до десятой
части всей метки. Затем, оставляя данную концентрацию метки постоянной,
следует в отсутствие конкурента разбавить антитела настолько, чтобы отно-
шение концентраций связанного и свободного антигена стало бы близким
32
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
к 1,0 (тогда отношение концентраций связанного и суммарного антигена будет
равно 0,5). При данных концентрациях антитела и метки чувствительность
обычно оказывается близкой к оптимальной с точностью в пределах описанных
выше границ. Важно иметь в виду, что при изменении концентрации метки для
получения оптимальной чувствительности необходимо соответственно изменить
и концентрацию антител.
23.3.3. Анализ данных: графическое и численное
представления
Мы уже знаем, как оцределить аффинность с помощью графиков зависи-
мости отношения концентраций связанного и свободного лигандов от концент-
рации связанного лиганда (график Скэтчарда), свободного лиганда или сум-
марной концентрации лиганда. Последняя зависимость представляется осо-
бенно полезной для обработки данных по конкуренции, получаемых с помощью
РИА. Независимой переменной должна быть всегда суммарная концентрация
антигена, поскольку она является именно тем известным параметром, при варь-
ировании которого получается стандартная кривая. Обозначим концентрацию
F илиТ (в линейном масштабе)
Рис. 23.7. График зависимости В/F или
В/Т (отношение концентрации связанного
антигена к концентрации свободного или
суммарного антигена) от концентрации сво-
бодного (F) или суммарного (Т) антигена,
когда независимая переменная (F или Т)
отложена в линейном масштабе. Сравните
с аналогичным графиком, в котором неза-
висимая переменная отложена в логариф-
мическом масштабе (рис. 23.6).
связанного (bound), свободного (free) и суммарного (total) антигена как В, F
и Т соответственно. Мы уже видели, что для определения аффинности Аасс
более удобен график зависимости В/F от F, чем от Т. Однако с помощью РИА
определяется именно Т, и поэтому независимой переменной при построении
стандартной кривой должна быть тоже Т. Другое отличие ситуации, имеющей
место при РИА, от ситуации, которую мы обсуждали ранее, заключается в том,
что в первом случае в реакционной смеси присутствуют меченый и немеченый
антигены. Зависимой переменной является отношение концентраций связанной
и свободной метки В/F, поскольку лишь концентрации меченых реагентов
могут быть измерены в РИА непосредственно. Значение В/F для немеченого
антигена в условиях равновесия должно быть точно таким же, как и для мече-
ного, если допустить, что тот и другой связываются с антителами одинаково
(т. е. с одной и той же Аасс). Это допущение не всегда правомерно и требует
экспериментальной проверки. Даже если оно окажется неверным, все же с по-
мощью стандартной кривой можно определить неизвестные концентрации, одна-
ко любой более детальный анализ становится сложным.
На рис. 23.6 видно, что график зависимости В/F от F или Т в том случае,
когда F или Т («доза») отложено в логарифмическом масштабе, имеет S-об-
разную форму. То же самое должно быть справедливо для графика зависимости
В/Т от F или Т. Отметим, что поскольку В + F = Т, то
b/f=t^=fw <38>
23. Взаимодействие антиген—антитело
33
В B/F
Т ~ 1 + B/F •
(39)
Эти преобразования могут оказаться полезными. Если на графике зависимости
В/F или В/Т от F или Т независимая переменная отложена в линейном масшта-
бе, то кривая по форме будет напоминать гиперболу (см. рис. 23.7). График за-
висимости В/F от логарифма Т был первым способом представления данных,
Рис. 23.8. Использование координатной
системы логит-log для представления дан-
ных, полученных с помощью РИА, в виде
прямой. В и Т — это концентрации свя-
занной метки и суммарного антигена соот-
ветственно, а Во — это значение В в отсут-
ствие немеченого антигена. Функция логит
определяется согласно уравнению (40): ло-
гит (У) = In [У/(1 — У)].
полученных с помощью РИА. Тем не менее и до сих пор он остается одним из
самых информативных. Максимальная чувствительность РИА достигается
в условиях, соответствующих наибольшему наклону кривой.
С помощью вероятностного анализа было показано, что, если антиген
имеет несколько детерминант, каждая из которых способна связываться с ан-
тителом независимо от другой, то чем больше таких детерминант на молекуле
антигена может одновременно взаимодействовать с антителами, тем сильнее
будет наклон кривой [45]. Такой эффект связывания с несколькими детерми-
нантами обусловлен тем, что в РИА молекула антигена считается связанной,
если к ней присоединена хотя бы одна или несколько молекул антитела, а сво-
бодной лишь в том случае, когда она вообще не связала антител. Поэтому ве-
роятность того, что данная молекула антигена окажется свободной, равна про-
изведению вероятностей того, что каждая из ее детерминант будет свободной.
Данный эффект может приводить к значительному увеличению наклона кри-
вой, что было подтверждено экспериментально [45].
Представить данные в виде прямой во многих случаях позволяет так назы-
ваемое логит-преобразование [46, 47]. Чтобы его использовать, сначала в каж-
дой точке вычисляют отношение В/Во, где Во — это концентрация связанной
метки в отсутствие конкурента. Затем проводят логит-преобразование полу-
ченного отношения, используя следующую формулу:
Логит (Y) = In (q-У у-) , (40)
где In означает натуральный логарифм (т. е. логарифм по основанию е). График
зависимости логит (В/Во) от In Т, как правило, представляет собой прямую
(рис. 23.8). В простейшем случае, когда моноклональные антитела связывают
моновалентный антиген, наклон этой прямой обычно равен —1. Очевидно, что
представление результатов в виде прямой оказывается весьма полезным при
графической интерполяции, которую проводят для того, чтобы с помощью
стандартной кривой определить концентрацию антигена. Дополнительное
преимущество данного представления заключается в том, что при сравнении
прямых линий облегчается тест на параллельность. Если неизвестный антиген
идентичен антигену, использованному для получения стандартной кривой,
2-0395
34
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
то в координатной системе логит-log кривая, соответствующая исследуемому
антигену, будет параллельна стандартной кривой (конечно же, параллельность
кривых не гарантирует идентичности антигенов). Если же антигены не иден-
тичны, то данный тест использовать нельзя.
Эти и другие методы анализа данных, включающие в себя методы стати-
стической обработки, подробно обсуждаются Фелдманом и Родбардом [48],
а также Родбардом [37].
23.3.3.1. Поправки к В, F u Т
Перед тем как закончить раздел, посвященный обработке данных РИА,
необходимо указать несколько способов контроля и внесения поправок, без
которых результаты могут оказаться ошибочными.
Во-первых, в любом методе, использующем преципитацию антител и свя-
занного с ними антигена (или использующем антитела, пришитые к твердой
фазе), всегда может существовать фракция антигена, осаждающаяся или свя-
зывающаяся неспецифически в отсутствие специфических антител. Поэтому
для определения неспецифического или фонового связывания всегда необхо-
димо проводить контрольные эксперименты по связыванию с неиммунной сы-
вороткой (или с другим эквивалентным контрольным препаратом). Неспеци-
фическое связывание обычно линейно возрастает с увеличением дозы антигена.
Фракция антигена, обусловливающая такое связывание, должна составлять
одну и ту же часть в препаратах как немеченого, так и меченого антигенов,
т. е. не может вызывать насыщения. Полученное в этом контрольном экспери-
менте значение величины связывания следует вычесть из В, а величину F, если
она определялась независимо, следует при этом оставить без изменений. Если
же F определяется как разность между Т и В (для меченого антигена), то F
изменится, поскольку Т в этом случае тоже должно быть скорректировано на
величину неспецифического связывания. Другими словами, значение суммар-
ной концентрации антигена представляет собой сумму концентраций связан-
ного специфически и свободного антигена. Весь антиген, который связался
неспецифически, следует вычесть из всех выражений, в которые он входит.
Вторая поправка, возможно, менее очевидная, чем первая, связана с нали-
чием радиоактивной метки, не связанной с иммунологически активным анти-
геном. Во многих случаях меченый антиген загрязнен радиоактивным изото-
пом, находящимся либо в свободном состоянии, либо в ассоциации с денатури-
рованным антигеном (который, возможно, и денатурировал именно в процессе
радиоактивного мечения) или с антигенно неактивной примесью в препарате
антигена. Чтобы определить, какая часть радиоактивного материала специфи-
чески взаимодействует с антителами в данном конкретном случае, можно ис-
пользовать раствор с постоянной концентрацией меченого антигена, добавляя
в него все увеличивающиеся количества антител. Если загрязнения иммуноло-
гически неактивным материалом нет, то при достаточно большой концентрации
антител вся радиоактивность должна оказаться связанной. Если же при повы-
шении концентрации антител количество метки, связавшейся с антителами,
выходит на плато на уровне, меньшем, чем 100%, то лишь эта часть и будет
иммунологически активной. Насколько важно вносить поправки на иммуноло-
гически неактивную фракцию, можно показать на следующем примере. Предпо-
ложим, что часть метки, являющаяся иммунологически активной, составляет
лишь 80%, а неактивной — 20%, и пусть истинное значение величины B/F
в какой-то точке равняется 3, т. е., согласно уравнению (39), B/F — 0,75. Эти
величины относятся лишь к иммунологически активной фракции метки, т. е.
23. Взаимодействие антиген—антитело
35
к 80% метки. Оставшиеся 20%, которые не связываются, будут ошибочно
включены в свободную метку, и в результате концентрация свободной метки
получится в два раза больше реальной. Это приведет к тому, что рассчитанное
значение В/F окажется равным 1,5 (т. е. 0,6/0,4) вместо 3 (0,6/0,2). Такая раз-
ница в два раза свидетельствует о существенном различии между истинным
значением аффинности и получаемым, например, с помощью анализа Скэтчар-
да. Кроме того, в этом случае в графике Скэтчарда на участке, соответствую-
щем большим значениям B/F, будет появляться плато, поскольку если 20 % метки
всегда остаются в свободном состоянии, то В/F никогда не сможет превысить
4 (т. е. 0,8/0,2). Для внесения потенциально весьма существенной поправки на
данный эффект необходимо всякий раз определять концентрацию иммунологиче-
ски неактивной метки в каждой партии антигена и вычитать ее из F и Т. Если
В и F измеряются независимо, а Т вычисляется как их сумма (а не просто
равняется общей концентрации антигена, включая немеченый конкурирующий
антиген), то удобный способ вносить поправки без каких бы то ни было пред-
положений относительно величины Т сводится к следующему: вычисляют отно-
шение В/Т = В/ (В + F), вносят поправку путем деления на долю метки,
являющуюся иммунологически активной (в приведенном выше примере эта
доля равнялась 0,8) и затем определяют В/F, используя уравнение (38).
23.3.4. Неравновесный РИА
До сих пор мы предполагали, что меченый и немеченый антигены добав-
ляются одновременно, и при этом время инкубации достаточно велико для
того, чтобы система смогла перейти в состояние равновесия. Конечно же, при
определении аффинности должно быть достигнуто равновесие. Однако пред-
положим, что единственная цель нашего эксперимента заключается в измере-
нии с помощью РИА концентрации конкурента. В этом случае оказывается
возможным существенно повысить чувствительность метода, если сначала нанести
немеченый конкурент, позволяя ему свободно взаимодействовать с антителами,
а затем — добавить меченый антиген и через небольшой промежуток времени
провести измерения. Интервал времени должен быть достаточно малым, чтобы
равновесие не успело установиться. В такой постановке эксперимента дается
существенное преимущество конкурирующему антигену. Можно показать,
что в данном случае наклон кривой графика «доза — эффект» (зависимости
В/F от общей концентрации добавленного антигена), численно характери-
зующий чувствительность эксперимента, в области низких доз будет увеличи-
ваться. Подробный математический анализ этой процедуры можно найти в
работе Родбардаидр. 149]. Отметим, однако, что использование подобных нерав-
новесных условий требует очень тщательного контроля за временем и темпе-
ратурой.
23.3.5. Иммуноферментный анализ (ИФА)
Существует еще одна твердофазная система, позволяющая изучать реак-
ции антиген—антитело. В основе ее лежит так называемый иммунофермент-
ный анализ (ИФА) [50]. В принципе единственное отличие ИФА от РИА заклю-
чается в том, что антитела и антиген вместо того, чтобы связываться с радио-
активным изотопом, ковалентно пришиваются к какому-либо ферменту, пос-
ле чего определяется связанная ферментативная активность (а не связанная
радиоактивность). Растущая популярность ИФА объясняется безопасно-
стью и удобством работы с нерадиоактивными материалами, а также широ-
2*
36
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
ким распространением специальных спектрофотометров, с помощью которых
за одну минуту можно измерить поглощение в 96 лунках. Поскольку и в ИФА,
и в РИА действуют одни и те же термодинамические ограничения, а присутствие
фермента может быть обнаружено, если он находится в том же диапазоне моляр-
ных концентраций, в котором обычно используются радиоактивные изотопы, то
чувствительность и избирательность обоих методов оказываются сравнимыми.
Мы рассмотрим четыре основных схемы применения ИФА для обнаружения
специфических антител, антигена или перекрестно реагирующих антител.
На рис. 23.9А показана схема непрямого ИФА, представляющего собой
простейший способ обнаружения специфических антител в исследуемой анти-
сыворотке и измерения их* концентрации. Антиген нековалентно связывается
со стенками каждой лунки пластикового планшета для микротитрования.
Именно поэтому оказалось удачным, что большинство белков неспецифично
сорбируется на пластик. Избыток свободного антигена отмывается, а лунки
инкубируют с раствором альбумина, блокирующего оставшиеся свободными
участки неспецифического связывания белков. Затем добавляется тестируемая
антисыворотка, и молекулы специфических антител связываются с иммобили-
зованным на твердой фазе антигеном. При последующей отмывке удаляются
несвязавшиеся антитела.
После этого добавляются связанные с ферментом антитела против имму-
ноглобулинов, узнающие связавшиеся с антигеном специфические антитела.
Несвязавшиеся конъюгаты антиглобулин-фермент отмываются, после чего
добавляется субстрат. В результате действия фермента на субстрат появляется
окрашенный продукт, обнаруживаемый спектрофотометрически по увеличению
поглощения.
Хотя данный метод является быстрым и весьма чувствительным, с его
помощью часто бывает трудно получить количественные характеристики. В пре-
делах определенного диапазона концентраций увеличение оптической плот-
ности пропорционально количеству специфических антител, добавленных
на первом этапе. Однако количество связанных антител измеряется не прямо,
поскольку концентрация антител в образце оценивается путем сравнения со
стандартной кривой, построенной для известного количества антител. Столь же
трудным представляется определение с помощью этого метода аффинности
антител, так как иммобилизованность антигена на твердой фазе приводит
к повышению функциональной аффинности. Для обнаружения очень малых
количеств антител, чувствительность данного метода оказывается вполне удов-
летворительной, особенно когда в качестве связанного с ферментом реагента
используются аффинно очищенные антитела к иммуноглобулинам. Одни и те
же связанные с ферментом антитела против иммуноглобулинов можно исполь-
зовать для регистрации антител ко многим различным антигенам. В то же
время антитела к определенным классам иммуноглобулинов могут быть ис-
пользованы для выяснения того, в какой степени специфический иммунный
ответ обусловлен иммуноглобулинами каждого из классов. Очевидно, что
воспроизводимость метода зависит от степени однородности покрытия антиге-
ном стенок каждой из лунок (этот параметр может варьировать), а специфич-
ность зависит от используемого для покрытия стенок очищенного антигена.
На рис. 23,9, Б показан метод обнаружения антигена, основанный на
конкуренции. На первом этапе растворенный антиген смешивают с огра-
ниченным количеством специфических антител. Затем смесь добавляют в лун-
ки, стенки которых покрыты антигеном, и обрабатывают так, как показано
на рис. 23.9, А . Образование комплексов антиген—антитело на первом этапе
будет приводить к снижению количества адсорбировавшихся на стенках анти-
а lol +
Лунка, покрытая
антигеном
Специфические
антитела
Б
Свободный
антиген
Лунка, покрытая
антителами
' и
Фермент
Фермент
Антитела против иммуно- .Сэндвич
глобулинов, ковалентно
сшитые с ферментом
Специфические Комплекс Лунка, покрытая
антитела антиген-антитело антигеном
Антиген
Лунка, покрытая Антитела,специфич-
антигеном 1 ные к антигену 1
Фермент
а
Антитела не Антитела против имму- Сэндвич
связываются ногловулинов, ковалентно не овра-
сшитые с ферментом зуется
г-Фермент
Антитела против антигена, Сэндвич'
ковалентно сшитые с ферментом
Фермент
Антиген 2,ковалентно .Сэндвич'
сшитый с ферментом
23. Взаимодействие антиген—антитело
Рис. 23.9. Четыре метода обнаружения специфических реакций антиген—антитело с помощью метода
ИФА. А — прямое связывание. Б— торможение связывания в присутствии конкурента. В — схема «сэн-
двича», в которой центральным элементом является антиген. Г — схема «сэндвича», в которой цен-
тральным элементом является антитело.
38 Дж. А, Берзофски, А. Дж. Берковер
тел и, следовательно, к уменьшению поглощения, измеряемого на конечном
этапе. Описанный метод позволяет найти аффинность свободного антигена,
определяемую половиной тормозящей концентрации антигена. Кроме того,
при использовании данной схемы можно оценить степень перекреста между
антигеном, находящимся в растворе и на стенках лунки.
На рис. 23.9, В показан используемый для обнаружения антигена так
называемый метод «сэндвича». Стенки пластиковых лунок покрывают специфи-
ческими антителами, связывающимися затем с антигеном. После этого добав-
ляют вторые антитела, сшитые с ферментом. Они связываются с комплексами
антиген—антитело, вследствие чего молекулы фермента оказываются иммобили-
зованными на твердой фазе. Далее избыток вторых антител отмывают, после
чего добавляют субстрат. Измеряемое в этом случае поглощение будет опре-
деляться концентрацией антигена в тестируемом растворе, значение которой
можно будет определить с помощью стандартной кривой. Специфичность дан-
ного метода зависит от специфичности антител, адсорбированных на стенки
лунки и используемых для обнаружения антигена. Чувствительность же
определяется значениями аффинности и количеством находящихся на стен-
ках первых антител, которое можно увеличить, если на этапе адсорбции исполь-
зовать аффинно очищенные антитела. Возможность одновременного связыва-
ния антигена с антителами обоих типов зависит от того, является ли антиген
бивалентным. Если же он моновалентен, то первые и вторые антитела должны
обладать специфичностью к различным антигенным детерминантам одной и
той же молекулы антигена. В том случае, когда эти антитела связываются
с одной мономерной молекулой антигена и представляют собой два различных
клона моноклональных антител, с помощью данного метода можно выяснить,
могут ли эти антитела одновременно связываться с одной и той же молекулой
или же они конкурируют за один участок или за различные, но настолько
близкие друг к другу участки, что одновременное связывание невозможно
из-за стерических препятствий [51].
На рис. 23.9, Г показано, как метод «сэндвича» может быть использован
для обнаружения перекреста антител. Сначала стенки лунки покрывают анти-
геном 1, после чего добавляют антитела, которые специфично с ним связы-
ваются. Избыток антител отмывают и добавляют антиген 2, сшитый с фер-
ментом. Если связавшиеся антитела перекрестно реагируют и с антигеном 2,
то связанный с ферментом антиген 2 будет также сорбироваться на твердой
фазе. Количественно это будет проявляться как увеличение поглощения в ре-
зультате проведения катализируемой ферментом реакции. Данный метод был
использован для изучения перекрестных реакций антиидиотипических сыво-
роток с двумя препаратами идиотипа, а также для обнаружения анти-антии-
диотипических антител (см. гл. 9 и 22). Возможны и другие варианты взаим-
ного расположения антител и антигена. Наличие в «сэндвиче» дополнительных
слоев может приводить к повышению чувствительности, однако оно вызывает
увеличение фона и вариабельность получаемых результатов.
Примером использования первой из описанных выше схем служит обна-
ружение человеческих антител к вирусу гриппа [52] (см. рис. 23.10). Лунки,
располагающиеся в соседних колонках планшет, покрывались поочередно
вирусом гриппа и бычьим альбумином. Разбавленную в 10 раз сыворотку
добавляли в два верхних ряда лунок каждой пары колонок и последовательно
разбавляли четырехкратно в направлении сверху вниз. Последняя окрашенная
лунка указывает на титр, а отсутствие окрашивания в лунках, покрытых аль-
бумином, свидетельствует о специфичности. Еще одно использование этого
метода связано со скринингом супернатантов культур при получении моно-
23. Взаимодействие антиген—антитело
39
клональных антител. Чувствительность и скорость метода ИФА делает воз-
можным его использование для скрининга большого количества образцов при
получении специфических антител. Клоны, отобранные по этому методу, обыч-
но имеют высокое сродство к антигену. Возможно, это обусловлено диссоциа-
цией антител с низкой аффинностью при отмывке.
Рис. 23.10. Типичный пластиковый план-
шет, используемый в методе ИФА прямого
связывания. Лунки планшета разделены на
несколько секций, в каждой из которых
имеются 2 колонки. Ячейки всех секций,
находящихся в левой колонке, покрывали
вирусом гриппа, а в правой — бычьим сы-
вороточным альбумином. Тестируемые об-
разцы противовирусных антител добавляли
в верхние ячейки каждой секции и затем
проводили четырехкратное разбавление в
направлении сверху вниз. Результаты конт-
рольного титрования известной стандарт-
ной антисыворотки показаны в колонках
2 и 3. В качестве проявляющего реагента
использовали ковалентно сшитые с фер-
ментом козьи антитела против иммуногло-
булинов человека. (Фото любезно предо-
ставлено R. Yarchoan и D. L. Nelson.)
23.4. Специфичность и перекрестные реакции
Специфичность антител (или антисыворотки) определяется по их способ-
ности отличать антиген, против которого они были получены (гомологичный
антиген, или иммуноген), от любого другого антигена. На практике невозмож-
но проверить все антигены, поэтому обычно тестируют только отдельные анти-
гены, имеющие что-то общее с иммуногеном. Специфичность, понимаемая таким
образом, может быть определена только экспериментально и лишь для того
набора антигенов, который был отобран для сравнения. Каруш [28] дал опре-
деление родственного термина — избирательности — как способности антител
различать по принципу «все или ничего» два сходных лиганда. Таким образом,
избирательность зависит не только от относительной аффинности антитела
40
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
к двум лигандам, но и от экспериментально найденной нижней границы обна-
ружения взаимодействия. Например, антитела против какого-либо угле-
вода, аффинность которых к данному иммуногену составляет 108 М-1, будут
считаться высокоизбирательными, поскольку в 100 раз меньшая аффинность
(10s М-1) к сходному углеводу экспериментально не обнаруживается. С другой
стороны, антитела, связывающиеся с иммуногеном с аффинностью, равной
109 М’1, могут показаться менее избирательными, поскольку в 100 раз меньшая
аффинность к сходному лиганду будет обнаруживаться довольно легко.
В отличие от избирательности, иммунологический перекрест определяется
как способность взаимодействовать со сходными лигандами, отличными от
иммуногена. Чаще всего этот термин употребляется по отношению к лиганду.
Иными словами, если антиген Y связывается с антителами, полученными
против антигена X, то говорят, что Y перекрестно реагирует с X. Отметим,
что в указанном смысле перекрестно реагируют друг с другом антигены, а не
антитела. Тем не менее перекрест двух антигенов X и Y может быть определен
лишь по отношению к данным конкретным антителам или конкретной анти-
сыворотке. Например, может оказаться, что какая-то другая группа антител
против X совсем не взаимодействует с Y, так что по отношению к этим анти-
телам Y не будет перекрестно реагировать с X. Можно использовать тот же
термин еще в одном смысле, говоря, что некоторые антитела против X пере-
крестно реагируют с антигеном Y.
В большинстве случаев перекрестно реагирующие лиганды имеют к дан-
ным конкретным антителам более низкую аффинность, чем иммуноген. Однако
имеются и исключения, когда перекрестно-реагирующие антигены связывают-
ся с антителами с более высокой аффинностью, чем собственно иммуноген.
Это явление называется гетероклитичностъю, а антиген, обладающий большей
аффинностью к антителам, чем иммуноген,— гетероклитичным. Антитела,
проявляющие такие свойства, также называются гетероклитичными. Хорошим
примером гетероклитичных антител служат антитела мышей линии C57BL/10,
полученные против гаптена нитрофенилацетата (НФ). Эти антитела, как пока-
зали Мекеле и др. [53], связываются с перекрестно реагирующим гаптеном нитро-
иодофенилацетилом (НИФ) с более высокой аффинностью, чем с НФ.
Во многих реальных ситуациях наличие иммунологического перекреста
обнаруживается методом преципитации, например преципитацией в агаре
(метод Ухтерлони), гемагглютинации (описание обоих методов см. ниже) или
сходных методов. Все эти методы характеризуются неспособностью отличать
разницу в аффинности от разницы в концентрации, что в сочетании с гете-
рогенностью иммунных сывороток по составу привело к неоднозначности
в употреблении терминов иммунологический перекрест и специфичность. С по-
явлением РИА данная неоднозначность в терминологии, а также в интерпре-
тации получаемых результатов стала очевидной.
Учитывая это, Берзофски и Шехтер [54] недавно предложили различать
два типа специфичности и, соответственно, два типа реакций иммунологиче-
ского перекреста, соответствующие двум различным кривым конкуренции
в РИА, изображенным на рис. 23.11.
Иммунологическим перекрестом первого типа, или истинным перекре-
стом, называется способность двух лигандов связываться с разной аффин-
ностью с одним и тем же участком на одной и той же молекуле антитела. Напри-
мер, похожие гаптены динитрофенил (ДНФ) и тринитрофенил (ТНФ) могут
с различной аффинностью реагировать с антителами, полученными к ДНФ.
В белковых антигенах подобное различие может возникать при небольжих
изменениях первичной последовательности (например, при консервативной
23. Взаимодействие антиген—антитело
41
замене треонина на серин) или при изменении конформации (например, при
расщеплении белка на фрагменты) (рис. 23.12). Если пептидный фрагмент
содержит все контактирующие остатки антигенной детерминанты (т. е. все
те остатки, которые контактируют с антигенсвязывающим центром антитела),
то он, в принципе, мог бы взаимодействовать с антителами, полученными
против нативной детерминанты, хотя и с меньшей, чем нативный белок, аф-
финностью (уменьшение аффинности обусловлено тем, что конформация пепти-
да будет отличаться от нативной). Явление иммунологического перекреста
первого типа проиллюстрировано на рис. 23.11 (кривая, конкурента СА).
Рис. 23.11. Графики зависимости R (отно-
шение концентраций связанного с антите-
лами и свободного меченого лиганда) от
концентрации немеченого лиганда, пост-
роенные для иммуногена L и двух пере-
крестно реагирующих с ним лигандов СА
и Сц. Между СА и L имеет место иммуно-
логический перекрест первого типа, или
истинный иммунологический перекрест (об
этом свидетельствует следующее: во-первых,
при больших концентрациях немеченого СА
меченый лиганд вытесняется полностью, и,
во-вторых, аффинность антител к СА ниже,
чем к L). Для Св характерен иммунологи-
ческий перекрест второго типа, или частич-
ный перекрест (что следует из существова-
ния плато на уровне, соответствующем
неполному вытеснению). Отметим, что аффин-
ность Св к антителам совсем не обязатель-
но должна быть меньше, чем у иммуногена
L. R — это отношение концентраций свя-
занного и свободного радиоактивномеченных
лигандов, a Ro — предельное значение R,
получаемое в том случае, когда концентра-
ции всех лигандов, включая меченые, при-
ближаются к нулю ([54]; печатается с раз-
решения).
Видно, что при достаточно высоких концентрациях немеченого СА метка
будет полностью вытеснена из комплексов с антителами. Однако в этом случае
для вытеснения определенной части метки требуется более высокая концент-
рация лиганда, чем в случае иммуногена L.
Иммунологическим перекрестом второго типа, или частичным перекрес-
том, называется способность перекрестно реагирующего лиганда взаимодей-
ствовать с некоторой субпопуляцией антител в гетерогенной сыворотке. Сле-
довательно, данный тип иммунологического перекреста возможен лишь тогда,
когда популяция антител гетерогенна (что, однако, справедливо для боль-
шинства обычных антисывороток). В этом случае аффинность перекрестно
реагирующего лиганда может оказаться не меньше, чем аффинность имму-
ногена, т. е. кривая, описывающая вытеснение метки из комплексов с анти-
телами, совсем не обязательно должна сдвигаться вправо. Следует, однако,
заметить, что при перекресте второго типа данная кривая будет выходить
на плато не при полном вытеснении метки (рис. 23.11, кривая конкурента
Св). В качестве примера рассмотрим белок, имеющий детерминанты X и Y.
5
Рис. 23.12. Изображение пространственной
структуры N-концевого участка р-цепи
гемоглобина. А. Первые 11 остатков рА-це-
пи. Б. Соответствующий участок р8-цепи.
Замена Glu-б в белке дикого типа на валин
приводит к появлению новой антигенной
детерминанты, на которую могут быть по-
лучены антитела [55, 56]. В. Тот же фраг-
мент, что и на рис. А, но развернутый при
денатурации белка. Данный участок можно
отщепить от белка (или синтезированного
пептида) [57], что приведет к изменению
антигенных свойств. С помощью антисыво-
ротки, полученной к гемоглобину (или
только к его p-цепи) можно обнаружить
иммунологический перекрест со структу-
рами, изображенными на рис. Б и В, при
этом молекулярные механизмы перекреста
в двух данных случаях будут различны.
Атомы полипептидного «скелета» имеют бе-
лый цвет, а в боковых группах атомы кис-
лорода показаны штрихом, углерода — сет-
кой, а азота закрашены в черный цвет
(по [54, 58]).
23. Взаимодействие антиген—антитело
43
Пусть антисыворотка против него содержит как антитела против X, так и
антитела против Y. Тогда для мутантного белка, в котором детерминанта Y
изменена настолько, что уже не может узнаваться антителами против Y, а де-
терминанта X осталась неизменной, будет иметь место иммунологический
перекрест второго типа. Такой мутантный белок сможет конкурировать с бел-
ком дикого типа только за антитела против X (возможно, даже с той же аффин-
ностью), но не за антитела против Y.
Если для определения концентрации комплексов антиген—антитело ис-
пользуются вторичные реакции, то правило, согласно которому иммуноло-
гический перекрест второго типа может иметь место, лишь когда антисыворот-
ка гетерогенна, иногда нарушается. В случае, когда при изучении реакции
антиген—антитело участвуют вторичные реакции, например в опытах Шарона
и др. [59] и Цизара и др. [60], в реакции гомогенных миеломных или гибри-
домных антител с декстранами плато появлялось на уровне, меньшем чем
100%-ное связывание. Следует, однако, заметить, что в данных случаях исполь-
зовался метод количественной преципитации, в котором наличие такого плато
может объясняться, например, неодинаковой растворимостью различных
комплексов. Если бы было возможно наблюдать взаимодействие антиген—
антитело прямо в растворе, не прибегая к помощи какой-либо вторичной реак-
ции, способной искажать конечные результаты, то в случае гомогенного анти-
гена и гомогенных антител плато реакции или ее торможения теоретически
не могло бы появиться на уровне, меньшем чем 100%. Поэтому, когда подобное
плато возникает, оно, по-видимому, должно быть обусловлено вторичными
реакциями конкуренции.
Конечно, оба типа иммунологического перекреста могут наблюдаться
одновременно. Проанализируем возможность этого на примере все того же
пептидного фрагмента, который мы использовали при обсуждении иммуно-
логического перекреста первого типа. Пусть в состав фрагмента, хотя бы и не
в нативной конформации, входят остатки, формирующие детерминанту X,
и не входят остатки, относящиеся ко второй детерминанте Y, также при-
сутствующей на поверхности нативного белка. Если в антисыворотке к натив-
ному белку содержатся антитела к каждой из детерминант, то пептид будет
конкурировать лишь за связывание с антителами против X (иммунологиче-
ский перекрест второго типа), обладая даже по отношению к ним меньшей
аффинностью, чем нативный белок. Вследствие этого кривая конкуренции
сдвинется вправо и выйдет на плато до того, как будет достигнуто полное
вытеснение х.
В случае гомогенных (например, моноклональных) антител, у которых
возможен лишь иммунологический перекрест первого типа (или «истинный»
перекрест), с помощью графика, аналогичного обсуждавшемуся выше гра-
фику зависимости В/F от F, можно количественно определить различие в аф-
финности по отношению к разным перекрестно реагирующим лигандам. Пред-
положим, что лиганды X и Y способны взаимодействовать с некими монокло-
нальными антителами, полученными к лиганду (т. е. X и Y перекрестно реаги-
1 Реально могут наблюдаться неоднозначные случаи, в которых различие между двумя
типами иммунологического перекреста выражено довольно нечетко. Например, пусть все
антитела реагируют с детерминантой X, но при этом оказываются сильно гетерогенными по
аффинности. Некоторые из таких антител могут иметь настолько низкую аффинность по отно-
шению к перекрестно реагирующей детерминанте X', что будет создаваться впечатление, что
они вообще с ней не связываются. В этом случае кривая конкуренции при добавлении
лиганда X' могла бы, по-видимому, выходить на плато на уровне меньшем, чем 100%, даже
несмотря на то, что все антитела являются специфичными к X, а единственным отличием
X' от X оказывается величина аффинности.
и
Дж. A. Берзофски^ A. Дж. Берковер
руют с L). Если построить графики зависимости отношения концентраций
связанного и свободного радиоактивно меченного лиганда L (B/F = R) от ло-
гарифма концентрации конкурирующего лиганда (соответственно X или Y),
то при определенных условиях (см. ниже) две кривые конкуренции окажутся
параллельными (рис. 23.13). Условие заключается в том, чтобы концентрация
Рис. 23.13. Схематическое изображение
кривых, получаемых с помощью РИА. Кри-
вые иллюстрируют влияние аффинности на
положение срединной точки и на угол на-
клона в этой точке, а также демонстрируют
удобство использования концентрации сво-
бодного лиганда по сравнению с общей кон-
центрацией лиганда. По оси ординат отло-
жено отношение концентраций связанных
и свободных радиоактивно меченных моле-
кул лиганда. Ло — это предельное значе-
ние величины R, когда все концентрации
лиганда стремятся к нулю. Если х и у —
это концентрации лигандов X и Y, при
которых Л = Л0/2, то в том случае, когда
по оси абсцисс отложена общая концентра-
ция лиганда, будут справедливы равенства:
х = 1/Хх + [S]t/2 и у = 1/Ку + [S]t/2,
где [S]। — это концентрация антителосвя-
зывающих участков, а Хх и Ку — аффин-
ность антител к соответствующим лиган-
дам. Однако если по оси абсцисс от-
ложена концентрация свободного лиганда, то
х = 1/Хх и у = 1/Ху, так что отношение
х/у (или разность log х — log у, если кон-
центрация отложена в логарифмическом
масштабе) соответствует отношению величин
сродства Ку/Кх. Отметим, что если кон-
центрации отложены в логарифмическом
масштабе, то наклоны обеих кривых в сре-
динных точках будут одинаковы, а если
в линейном масштабе, то наклон кривой Y
будет составлять лишь Ку 1КХ от наклона
кривой X. По оси абсцисс отложен лога-
рифм общей концентрации лиганда или
концентрации свободного лиганда ([54]; пе-
чатается с разрешения).
свободной метки была меньше, чем 1//CL(/CL — аффинность радиоактивноме-
ченного лиганда L). В этом случае можно показать [54], что в срединной точке
графика, т. е. когда R = R0/2, будет справедливо следующее приближенное
равенство:
[Х]своб
где Кх. — аффинность антител к X. Данное равенство аналогично урав-
нению (21), если в качестве немеченого иммуногена взять конкурирующий
лиганд. Кроме того, по аналогии с уравнением (23) можно показать, что если
вместо концентрации свободного лиганда [Х]СВОб взять общую концентрацию
конкурента [X]t, то в уравнении (41) появится дополнительный член:
[X]t (при R = /?0/2) = J- +1^1. (42)
Таким образом, если концентрация конкурирующего лиганда отложена в ли-
нейном масштабе, то разность концентраций, соответствующих срединным
23. Взаимодействие антиген—антитело
45
точкам двух кривых, будет равна 1/Ях — i/K? безотносительно к тому,
что отложено по оси абсцисс — общая концентрация лиганда или концент-
рация свободного лиганда. В то же время лишь во втором случае отношение
концентраций, соответствующих срединным точкам, будет равно KyjK^-
Данное замечание оказывается существенным, если по оси абсцисс отложен
логарифм концентрации конкурента (а именно так обычно и строят этот график),
поскольку в данном случае величина горизонтального смещения двух кри-
вых соответствует отношению концентраций [X]/[Y], а не разности между
ними [54].
Если выполнено и второе условие, а именно что концентрация связанной
метки должна быть малой по сравнению с концентрацией антигенсвязываю-
щих участков [S]t, то наклон в срединной точке (т. е. когда R — RJ2) графи-
ка, в котором концентрация отложена в линейном масштабе, будет пропор-
ционален аффинности данного конкурента ЛГХ или Кч [54]. (Оба условия
выполняются одновременно, когда концентрация меченого L мала относительно
как K-l, так и IS]t.) Если [Х]своб и [Y]CB06 отложены в логарифмическом
масштабе, то наклоны кривых окажутся равными (т. е. кривые будут казаться
параллельными), поскольку линия, сдвинутая на графике с логарифмической
шкалой параллельным переносом на т единиц вправо, будучи построенной
в линейном масштабе, во всех точках пойдет в l/т раз круче.
Если антитела гетерогенны по аффинности, то кривые будут уширяться
и в общем случае они окажутся непараллельными. Следует подчеркнуть, что
в том случае, когда антитела обладают гетерогенностью по специфичности
и имеется иммунологический перекрест второго типа, частичное вытеснение
метки, достигаемое при выходе на плато графика зависимости В/F от кон-
центрации свободного конкурирующего лиганда, не будет пропорционально
доле антител, взаимодействующих с конкурентом, но окажется пропорцио-
нальным их взвешенной доле, в которой концентрации антител взвешены по
их аффинности к меченому антигену [54].
Существование двух типов иммунологического перекреста приводит к необ-
ходимости введения двух соответствующих определений специфичности [54].
Количественной мерой специфичности первого типа служит относительная
аффинность данных гомогенных антител к иммуногену и к любому из пере-
крестно реагирующих лигандов. Если аффинность антител к иммуногену ока-
зывается значительно выше, чем к любому из тестируемых перекрестно реа-
гирующих лигандов, то про такие антитела говорят как об высокоспецифи-
ческих, т. е. хорошо отличающих данный лиганд от других. Если аффинность
антител к перекрестно реагирующим лигандам оказывается ниже чувствитель-
ности метода, то, как уже обсуждалось [28], специфичность первого типа
проявляется как избирательность. Специфичность можно даже определить
как отношение величин аффинности антител к иммуногену и к перекрестно
реагирующему лиганду [61]. Именно специфичность первого типа большин-
ство иммунохимиков называет истинной специфичностью, точно так же как
иммунологический перекрест первого типа — истинным перекрестом.
Общепринятое использование понятия «иммунологический перекрест»,
включая сюда частичную реактивность или реактивность второго типа, для
описания явления частичного перекреста привело ко второму определению
специфичности, применяемому только к гетерогенным популяциям антител,
таким как антисыворотки. Подобную специфичность мы называем специфично-
стью второго типа. Если все находящиеся в смеси антитела связываются
с иммуногеном, но лишь небольшая их доля взаимодействует с каким-либо
перекрестно реагирующим антигеном, то про антисыворотку говорят, что она
46 Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
относительно специфична к иммуногену. Отметим, что не имеет значения,
будет ли аффинность субпопуляции антител, которые взаимодействуют с пере-
крестно реагирующим антигеном, высокая или низкая (иммунологический
перекрест первого типа). До тех пор, пока эта субпопуляция составляет малую
часть всех антител, смесь будет оставаться специфичной. Таким образом,
специфичность второго типа зависит от относительных концентраций антител
в гетерогенной антисыворотке, а не только от величин их аффинности. От-
метим также, что данные относительные концентрации субпопуляций антител
можно использовать для сравнения специфичности какой-либо антисыворотки
к двум перекрестно реагирующим лигандам. Однако было бы бессмысленным
сравнивать специфичность двух различных антисывороток по отношению
к одному и тому же лиганду путем сравнения долей антител в каждой сыво-
ротке, реагирующих с данным лигандом. Хотя понятие специфичности вто-
рого типа может показаться менее фундаментальным, чем понятие специфич-
ности первого типа, именно специфичность второго типа непосредственно
измеряется в таких методах анализа, как, например, двойная диффузия в агаре
по Ухтерлони. В других случаях, например при гемагглютинации (см. ниже),
оба типа специфичности могут проявляться в равной степени. Кроме того,
необходимо подчеркнуть, что понятие специфичности второго типа естествен-
ным образом приводит к описываемой далее концепции полйспецифичности.
23.4.1. Полиспецифичность
Теорию полиспецифичности разработали Талмэдж [62] и Инман [63, 64],
а проанализировали на структурном уровне Ричардс и др. [65]. В теории
полиспецифичности предлагается механизм, с помощью которого можно объяс-
нить существование громадного разнообразия антисывороток с различной
специфичностью, не делая предположения о существовании соответствую-
щего разнообразия структур антител (или структурных генов). Идея заклю-
чается в том, что каждое антитело в действительности может с высокой аф-
финностью связываться со множеством совершенно разных антигенов. Если
проводят иммунизацию с помощью иммуногена А, то при этом происходит
отбор различных антител, обладающих тем общим свойством, что все они реа-
гируют с А. На самом деле каждое такое антитело может реагировать и с
другими соединениями, но если доля антител, взаимодействующих с В, состав-
ляет менее 1 %, взаимодействующих с С — менее 1 % и так далее, то по опре-
делению специфичности второго типа сыворотка в целом будет характеризовать-
ся высокой специфичностью по отношению к А. Отметим, что субпопуляция
антител, связывающих В, может реагировать с В с такой же или более высокой
аффинностью, чем с А, так что данная субпопуляция не будет обладать спе-
цифичностью первого типа по отношению к А. Эта же самая субпопуляция
будет, по всей вероятности, отобрана, если иммунизацию проводить с помощью
В или любого другого из сотен иммуногенов, взаимодействующих с данными
антителами. В результате разнообразие высокоспецифических сывороток
( в смысле специфичности второго типа), которые можно получить путем имму-
низации данного организма, оказывается значительно большим, чем разно-
образие требуемых для этого клонов В-клеток (или структур антител). Однако
пока концепция полиспецифичности остается лишь одной из интересных гипо-
тез, не получивших еще экспериментального подтверждения (см. обзор [54]
и список литературы в нем).
23. Взаимодействие антиген—антитело
47
23.5. Природа антигенных детерминант
23.5.1. Гаптены
При реакции с антигеном не всегда связывающие центры антитела охва-
тывают весь антиген. Часть последнего, непосредственно взаимодействую-
щая с антителом, называется антигенной детерминантой. Одна молекула
может содержать одну и более антигенных детерминант. Для изучения спе-
цифичности антител необходимо иметь антитела, направленные против инди-
видуальных антигенных детерминант. Небольшая функциональная группа,
представляющая собой одну антигенную детерминанту, называется гаптеном.
Гаптенами могут быть различные органические соединения, например ТНФ
(тринитрофенильная группа), фениларсонат, моно- и олигосахариды, такие
как глюкоза и лактоза, а также олигопептиды, например пентализин. Хотя
эти гаптены способны связываться с антителами, тем не менее они обычно
не являются иммуногенами, т. е. иммунизация ими не приводит к образо-
ванию антител (относительно имеющихся исключений см. работу [66]). В то
же время иммунный ответ часто можно вызвать с помощью гаптена, ковалентно
присоединенного к большой молекуле, называемой носителем. Этот носитель
иммуногенен сам по себе, и иммунизация конъюгатами гаптен-носитель вызы-
вает появление антител как против носителя, так и против гаптена. Полу-
ченные таким образом специфичные к гаптену антитела можно изучать мето-
дом равновесного диализа в присутствии свободного (не связанного с носителем)
гаптена с помощью иммунопреципитации, используя для этого гаптен, при-
шитый к другому носителю, или же применяя метод торможения преципита-
ции свободным гаптеном.
Описанный способ получения и исследования антигаптеновых антител,
впервые примененный Ландштейнером [67], помог выяснить, какие элементы
тонкой структуры антигенной детерминанты определяют ее специфичность.
Например, на основе данных об относительной аффинности к разным гаптенам
антител, полученных против конъюгатов янтарная кислота—сывороточный
белок, был сделан вывод о существовании специфического взаимодействия
этих антител с малеиновой кислотой в tyuc-конфигурации и об отсутствии
взаимодействия с фумаровой кислотой в тиране-конфигурации [68]. Это дало
возможность сделать предположение о том, что иммуногенная форма янтар-
ной кислоты соответствует ^нс-конфигурации [68]. Способность антител раз-
личать цис- и тиране-конфигурации нашла подтверждение в более поздней
работе, посвященной измерению относительной аффинности антител к конъ-
югатам носителя либо с малеиновой, либо с фумаровой кислотой [69] (табл.
23.1, А). В табл. 23.1, Б представлены данные по специфичности антител
полученных против иара-азофениларсоната, ковалентно пришитого к бычьему
гамма-глобулину [70]. Поскольку в этом случае гаптен связан с ароматическим
аминокислотным остатком носителя через пара-азогруппу, то следует ожи-
дать, что специфичность сходных по структуре гаптенов, имеющих в пара-
положении объемный заместитель, будет в значительной степени подобна
специфичности исходного иммуногена. Оказалось, что действительно пара-ме-
тилзамещенный фениларсонат имел большее сродство к антителам, получен-
ным против пара-азофениларсоната, чем незамещенный фениларсонат. В то
же время метилирование по любому другому положению бензольного кольца
вызывало уменьшение аффинности, обусловленное, по-видимому, возникно-
вением стерических помех со стороны данной метильной группы при взаимо-
действии гаптена с антигенсвязывающим центром антитела. Таким образом,
48
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
Таблица 23.1. Специфичность антигаптеновых антител по отношению к небольшим
различиям в структуре гаптена
А - из книги Прессмана и Гроссберга [69]
Б — из статьи Прессмана и др. [70]
В — из статьи Каруша [71]
метилирование может приводить как к увеличению, так и к уменьшению энер-
гии связывания в зависимости от того, к какому именно атому присоединяется
метильная группа. В табл. 23.1, В представлены сравнительные данные по
специфичности антилактозных антител к лактозе и целлобиозе [71]. Эти диса-
хариды отличаются друг от друга лишь ориентацией гидроксила, присоеди-
ненного к С4-атому первого сахара и направленного соответственно вверх
или вниз от гексозного кольца. Эти и многие другие факты [66] свидетель-
ствуют о том, что антитела специфичны по отношению к цис- или транс-кон-
фигурации, положению заместителей (орто, пара или мета) и стереоизомер-
ной форме антигенной детерминанты.
Сравнительное изучение связывания антител с различными гаптенами
показало, что узнавание антителами «своего» гаптена оказывается специфич-
ным, даже несмотря на гетерогенность полученной популяции антител. В отли-
23. Взаимодействие антиген—антитело
49
чие от антител, направленных против полидетерминантных антигенов, попу-
ляция антител, специфичных к одной детерминанте (гаптену), относительно
ограничена. Это обусловлено тем, что связывание гаптена с антигенсвязываю-
щим центром антитела требует определенных структурных ограничений для
точного соответствия их друг другу. В то же время специфичность антисы-
воротки зависит от специфичностей всех входящих в нее антител, что в свою
очередь определяется структурами их антигенсвязывающих центров. При
изучении перекрестных реакций с аналогами гаптена оказалось, что некоторые
аналоги образуют комплексы со всеми имеющимися в сыворотке антителами
(Кас0 таких аналогов, как правило, невелика), тогда как связывание других
аналогов быстро достигает насыщения, поскольку их структура хорошо соот-
ветствует структуре антигенсвязывающего центра лишь некоторых антител
(см. предыдущий раздел, посвященный иммунологическому перекресту). Анти-
тела, полученные от разных животных, могут проявлять разную способность
к иммунологическому перекресту при взаимодействии с тем же самым набором
родственных гаптенов. Даже у одного и того же животного, как известно,
в определенных условиях аффинность и специфичность антител с увеличе-
нием времени, прошедшего с начала иммунизации, могут возрастать [72].
Таким образом, наличие или отсутствие иммунологического перекреста любых
двух гаптенов отражает как структурные различия между ними, определяю-
щие возможность или невозможность антигена и антитела связаться друг
с другом, так и разнообразие антигенсвязывающих центров, имеющихся в дан-
ной антисыворотке.
23.5.2. Антигены углеводной природы
Антигенные детерминанты некоторых биологически важных соединений
построены из углеводов. Такие детерминанты часто входят в состав гликоли-
пидов (например, антигены клеточных стенок бактерий и главные антигены
групп крови) и гликопротеинов («минорные» групповые антигены крови, такие,
как резус-фактор Rh). Кроме того, некоторые спонтанно появляющиеся мие-
ломные белки, как было показано, обладают специфичностью по отношению
к углеводам, что, возможно, отражает широкую распространенность угле-
водных антигенов в окружающей среде. До появления гибридом такие миелом-
ные белки широко использовались для изучения реакции антигена с моно-
клональными антителами.
Из экспериментов следует, что основные антигенные детерминанты поли-
сахаридов часто представляют собой короткие олигосахариды (длиной 1—5
остатков сахара), находящиеся на невосстановленных концах полимерных це-
пей [73]. Каждая детерминанта аналогична гаптену, состоящему из несколь-
ких остатков сахара и пришитому к большому полисахаридному остову, не
обладающему антигенными свойствами. Полимерная цепь в данном случае
служит для усиления иммуногенности антигенной детерминанты, т. е. играет
ту же роль, что и носитель для гаптена. Кроме того, наличие в полисахариде
точек ветвления дает возможность одной макромолекуле иметь много анти-
генных детерминант. Это оказывается важным для иммунопреципитации,
поскольку позволяет сформировать преципитационную решетку (см. ниже).
Для определения антигенных детерминант полисахаридов наиболее широ-
ко используется так называемый метод торможения гаптеном [73], заклю-
чающийся в том, что при добавлении коротких олигосахаридов реакция
преципитации антигена с помощью антител может тормозиться. Такие олиго-
сахариды обладают достаточно большим размером, чтобы связываться с анти-
телами с той же аффинностью и с той же специфичностью, что и полисахариды,
50
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
однако, являясь мономерами, они оказываются неспособными вызывать преци-
питацию. По мере увеличения количества добавленного ингибитора в моле-
кулах антител остается все меньше антигенсвязывающих центров, которые
могут принимать участие в реакции преципитации. Используя в качестве
препарата антител антисыворотку, специфичную к какой-либо одной антиген-
ной детерминанте, часто путем добавления коротких олигосахаридов, соот-
ветствующих невосстанавливающему концу полисахаридной цепи, можно
полностью блокировать преципитацию. Эти данные свидетельствуют не только
об «иммунодоминантности» невосстанавливающего конца цепи, но также и о
том, что специфические свойства антигенной детерминанты полисахарида
определяются последовательностью входящих в ее состав сахаров и спосо-
бом их соединения друг с другом, а не конформацией. Полное ингибирование
можно получить лишь в том случае, когда все антитела в изучаемой системе
специфичны к одной и той же антигенной детерминанте. Для достижения
максимальной чувствительности концентрации антигена и антител должны
соответствовать точке эквивалентности.
Теперь на трех классических примерах О-антигенов бактерий рода сальмо-
нелл, групповых антигенов крови и декстранов, связывающихся с миелом-
ными белками, мы рассмотрим более подробно типы встречающихся антигенов
углеводной природы.
23.5.2.1. Иммунохимические свойства О-антигенов сальмонелл
Антигенное разнообразие многочисленных видов сальмонелл обуслов
лено структурными различиями липополисахаридного (ЛПС) компонента
наружной мембраны [74]. Молекулы ЛПС служат основной мишенью, на кото-
рую направлены антитела, вырабатываемые против этих бактерий. Поли-
сахаридная часть ЛПС несет антигенную детерминанту, а липидная часть
отвечает за действие ЛПС как эндотоксина. По химическому строению моле-
кулу ЛПС можно подразделить на три участка (рис. 23.14). Район I содержит
О-полисахарид, обладающий специфическими антигенными свойствами. Этот
О-полисахарид обычно построен из повторяющихся олигосахаридных блоков,
очень различных у разных штаммов. Район II представляет собой общий олиго-
сахарид (так называемый «кор»), сходный у многих различных штаммов. Му-
танты, не способные синтезировать данный олигосахарид или сшивать его с по-
лисахаридом района I, характеризуются «шероховатой» морфологией колоний
и отсутствием О-антигена (R-мутанты — от англ, rough шероховатый). Район
III содержит липидную часть ЛПС, называемую липидом А, который имеется
у всех сальмонелл и служит для прикрепления ЛПС к наружной мембране.
В ранних работах по иммунологической классификации О-антигенов была
обнаружена значительная перекрестная реактивность (иммунологический
перекрест) между различными штаммами сальмонелл. Это выяснилось в опы-
тах по агглютинации бактерий одного штамма с помощью антисыворотки,
полученной против бактерий другого штамма. На основе полученных дан-
ных каждой детерминанте, по которой имел место иммунологический пере-
крест, присваивался номер, а каждый штамм характеризовался набором О-ан-
тигенных детерминант, в совокупности называемым серотипом штамма. Все
штаммы были разбиты на группы в зависимости от наличия в серотипе ка-
кой-либо из сильных О-детерминант. Например, штаммы группы А имеют
детерминанту 2, а штаммы группы В — детерминанту 4 (табл. 23.2). Кроме
того, у каждого штамма есть дополнительные О-детерминанты, с помощью
которых его можно отличить от соседей по группе. Например, у бактерий
23. Взаимодействие антиген—антитело
51
А. Структура' короврго олигосахарида (район П)
Район I
Повторяющиеся блоки
О-специфических боковых цепей
------- 1 ---------
----2-я----—I— 1-я ----------•
----------- I ---------
Район! Район Ш
I Наружный кор Внутренний нор |
GlcNAc Gal Hep КОО
I ♦ ♦ , I
Glc—Gat—Glc—Hep—1Hep — KDO — KDO —Липид A
Б. Олигосахаридные антигены (район!)
Группа Штамм . Антигенные детерминанты Структура повторяющегося Блока
A S. paratyphi А 1.2,12 61с Рат
6а1-Цг— В S.typhimurium 4,5,12 61с 2-ОАс-Л 1,4 « 1,3 2. 1.2 ; Man — --5, Rtia а । “ ОАс be а Man 1’4 . ntn 1-3
а п S. typhi 9,12 (2-OAc-)G1c а Туч
1,4 1.3 а
6а1 —1,2-» Man Rha —
а а а
Рис. 23.14. Структура липополисахарида
сальмонелл. Район I содержит специфиче-
ские антигенные детерминанты О-антигена,
состоящие из повторяющихся олигосахарид-
ных блоков. Этот район соединен с липид-
ной составляющей ЛПС через коровый
полисахарид. В качестве примера приведе-
ны структуры трех олигосахаридных блоков
[74]. А — структура корового олигосахари-
да [73]. В — олигосахаридные антигены [74].
Таблица 23.2. Серотипы О-антигена сальмонелл ([73]; печатается с разрешения)
Штамм Salmonella S. paratyphi А S. paratyphi В S. typhi Серотипическая группа А В D О-Антигенная детерминанта 1,2, 12 1,4, 5, 12 9, 12
Антисыворотка Истощена с помощью Протестирована с помощью Обнаруженная детерми нанта 12 9
апти-5. typhi анти-5. typhi S. paratyphi А S. paratyphi В S. typhi
Salmonella paratyphi наряду с детерминантой 2 имеются детерминанты 1 и 12.
С проблемой иммунологического перекреста, обусловленного частичным пе-
рекрыванием наборов антигенных детерминант, приходится все время стал-
киваться при изучении сложных систем антиген—антитело. Ситуацию можно
52
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
упростить, если иметь моноспецифические антитела к индивидуальным анти-
генным детерминантам. С этой целью либо из антисыворотки путем адсорбции
удаляют постоянные антитела, либо отбирают для работы перекрестно реа-
гирующие штаммы, у которых имеется лишь одна детерминанта, общая со
штаммом, использованным для иммунизации. Реакция каждой детерминанты
со специфичным к ней антителом может рассматриваться как автономная систе-
ма антиген—антитело. Поэтому антисыворотку против бактерий S. typhi,
содержащую антитела анти-9 и анти-12 (см. табл. 23.2), можно истощить спо-
мощью S. paratyphi А, удалив, таким образом, анти-12 и получив в резуль-
тате реагент, специфичный к антигену 9 (табл. 23.2, В). С другой стороны,
неистощенную антисыворотку можно использовать для изучения взаимодей-
ствия анти-12-антител с антигеном 12, например в реакции агглютинации
бактерий штамма S. paratyphi В, имеющих только один антиген (антиген-12),
общий с иммуногеном. Поскольку других детерминант штамма S. paratyphi В
нет у штамма S. typhi, антисыворотка против последнего не будет содержать
антител против них.
Если антитела специфичны лишь к одной антигенной детерминанте, то
для реакции торможения можно использовать в качестве гаптена различные
олигосахариды. Поскольку О-антигены состоят из повторяющихся блоков
олигосахаридов, часто оказывается возможным путем мягкого химического
или ферментативного гидролиза полисахаридного компонента ЛПС полу-
чить модельные олигосахариды. Среди этих олигосахаридов идентифици-
руется тот, который в наибольшей степени ингибирует преципитацию. Затем
определяют его химическую структуру. В качестве ингибиторов преципитации
могут быть использованы не только природные, но и различные синтетиче-
ские моно, ди-, три- и олигосахариды. Например, результаты, приведенные
в табл. 23.3, показывают, что преципитация антигена 1 антителами к нему инги-
Таблица 23.3. Анализ структуры О-антигенов сальмонелл (торможение гаптеном) ([73];
печатается с разрешения)
Максимальное торможение гаптеном, % Тестируемая система
1. анти-1 19. анти-19
D-Glu Me-cc-D-Glu cc-D-glu (1 -> 6)-D-Gal Glu. Gal. Man Glu. Gal. Man. L-Rham Предполагаемая структура детерминанты 35 80 80 >70 a-D-Glu (1 6)-D-Gal 0 10 25 70 >70 D-Glu-D-Gal-D-Man-L-Rhan
бируется метил-а-глюкозидом. Впоследствии были исследованы различ-
ные дисахариды, имеющие в своем составе эту структуру. Наибольший
ингибирующий эффект возникал при добавлении a -D-Glu (1 -> 6) D-Gal.
Затем проверке подвергались различные трисахариды, содержащие данную
последовательность. Результаты исследования говорят о том, что детерми-
нанта, узнаваемая антителами анти-1, представляет собой дисахарид с приведен-
ной выше структурой. Последовательность сахаров в антигенной детерминанте
можно выяснить путем анализа продуктов расщепления ЛПС,; вклю-
чающих в себя тетрамеры D-Glu-D-Gal-D-Man-L-Rham. Результаты, приве-
23. Взаимодействие антиген—антитело
53
денные в табл. 23.3, дают также возможность предположить, что различие
между детерминантами 1 и 19 заключается в длине олигосахарида, узнавае-
мого антителами, специфичными к каждой из детерминант. В пользу этой
гипотезы свидетельствует тот факт, что детерминанта 1 обнаруживается как
у штаммов, имеющих детерминанту 19, так и у штаммов, не имеющих ее, тогда
как детерминанта 19 всегда присутствует вместе с детерминантой 1. Как пока-
зано в таблице, максимальное торможение реакции преципитации, прово-
димой с помощью антител анти-19, достигается в том случае, когда в качестве
ингибитора используется тетрасахарид, включающий в себя структуру, соот-
ветствующую детерминанте 1. Эти результаты не только позволяют расшиф-
ровать структуру антигена, но, кроме того, свидетельствуют о том, что различ-
ные антигенные детерминанты могут отличаться друг от друга лишь по раз-
меру.
Генетические исследования влияния лизогенизирующих фагов на анти-
гены полисахаридной природы у сальмонелл [75] показали, что ступенчатая
химическая модификация невосстанавливающего конца полисахарида может
приводить к последовательным изменениям серотипа (табл. 23.4). Так, на-
Таблица 23.4. Постадийное изменение серотипа штамма S. anatum (3,10),
обусловленное фаговой лизогенизацией и связанное с модификациями
невосстанавливающего конца ЛПС ([75J; печатается с разрешения)
Концентрация гаптена, вызывающая 5 0%-ное торможение преципитации, мМ Тестируемая система
детерминан- та 10 4- ан- титела анти-10 детерминан- та 1 5 4- ан- титела анти-15 детерминан- та 34 4- ан- титела анти-34
AcO-Gal-Man-L-Rham 0,013 НО 1) НО !)
Gal-Man-L-Rham >1,6 0,005 0,16
Gal-Man -2) 0,027 »0,2
Man-L-Rham -2) 0,083 » 0,2
Glu-Gal-Man -2) 0,027 0,05
Glu-Gal -2) 1,0 0,10
Определенные структуры детерминант:
Детерминанта 10 AcO-Gal а (1 -+• 6) Man а (1 ->4) L-Rham
Фаг Е15 |
Детерминанта 15 Gal В (1 -э-6) Man а (1 -► 4) L-Rham
Фаг Е34 |
Детерминанта 34 а-D-Glu а (1 -> 4) Gal 3 (1 6) Man
1) НО - не определили.
2) Торможение преципитации не наблюдалось ни при какой концентрации гаптена.
пример, в результате лизогенизации бактерий штамма S. anatum с помощью
фага Е15 серотип штамма меняется с детерминант 3, 10 на 3, 15, а последую-
щая лизогенизация фагом Е34 вызывает исчезновение обеих детерминант
и появление детерминанты 34. Данные по ингибированию гаптеном свиде-
тельствуют о том, что все эти три О-антигена абсолютно различны. При пер-
вой лизогенизации прекращается ацилирование концевой галактозы, а связь
а (1 ->6) между двумя сахарами заменяется на связь ф (1 —>6). Это приводит
к исчезновению детерминанты 10 и возникновению детерминанты 15. В ходе
следующей лизогенизации к ф-D-Gal присоединяется D-Glu и детерминанта
54
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
15 в результате исчезает, а вместо нее появляется детерминанта 34. Поскольку
концевой сахар является иммунодоминантным, такие модификации, как отщеп-
ление ацетильной группы, изменения первой дисахаридной группы или при-
соединение еще одного сахара в любом случае будут приводить к изменению
детерминанты О-антигена. Индуцируемые фагом биохимические изменения,
по-видимому, обусловлены появлением гликозилтрансферазы, способной добав-
лять к имеющейся сахаридной цепи новый сахарный остаток. Этот фермент
может кодироваться каким-либо фаговым или дерепрессированным эндоген-
ным бактериальным геном.
23.5.2.2. Антигены группы крови
Основные групповые антигены крови А и В первоначально были обна-
ружены по способности сыворотки крови индивидов, у которых они отсут-
ствуют, агглютинировать эритроциты, имеющие эти антигены (см. обзоры
[33, 76—78]. Кроме того, у индивидов с группой крови 0 имеется антигенная
детерминанта Н, не обнаруживаемая на эритроцитах А- или В-типов. Нако-
нец, у индивидов всех трех групп могут быть и другие детерминанты, например
Льюис-антигены (Le). И АВН- и Le-антигенные детерминанты входят в состав
углеводных цепей. Эти углеводные цепи в свою очередь могут быть компо-
нентами самых различных соединений, представленных на поверхности
клетки, — гликолипидов (антигены АВ и Н) и глиопротеинов (Le-антигены).
Первые из них синтезируются в клетках, тогда как вторые адсорбируются из
сыворотки. В слизистых секретах, например в слюне, эти соединения пред-
ставлены гликопротеинами. Молоко, кистозная жидкость яичников, слизи-
стая желудка являются источниками растворимых олигосахаридов, содер-
жащих групповые антигены крови. Данные антигены, к тому же, часто обна-
руживаются и у других видов, в том числе примерно у половины бактерий
кишечной флоры [76]. Столь широкая распространенность групповых антиге-
нов крови человека может объяснять вездесущность активностей анти-АВ
в сыворотке крови даже таких индивидов, которые никогда не подвергались
воздействию этих антигенов при переливании крови или беременности.
Имиунохимическое изучение этих антигенов сильно упростилось после
того, как выяснялось, что для данной цели можно использовать метод тор-
можения гаптеном, если в качестве гаптена брать различные антигенные оли-
госахариды. Например, олигосахариды группы А будут тормозить агглюти-
нацию эритроцитов группы А антителам анти-А. Кроме того, они будут
подавлять проводимую с помощью тех же антител иммунопреципитацию гли-
копротеинов, несущих антигены группы А. Вследствие мономерности оли-
госахаридов их реакция с антителами будет приводить лишь к блокированию
антигенсвязывающих участков антител, не вызывая образования преципитата.
Подавляющие иммунопреципитацию олигосахариды из кистозной жидко-
сти яичников были выделены и изучены. В них найдены D-галактоза, L-фукоза,
N-ацетилгалактозамин и N-ацетилглюкрзамин. Олигосахариды, обладающие
наиболее выраженным тормозящим действием на каждый из антигенов, при-
ведены на рис. 23.15. Видно, что и у АВН-, и у Le-антигенов последователь-
ность корового олигосахарида одна и та же, а различия связаны лишь с са-
харами, присоединенными к концу цепи или в точках ветвления. О наличии
у различных детерминант общих свойств говорят не только данные, получен-
ные с помощью метода торможения гаптеном, но и результаты других биохи-
мических исследований. При ферментативном расщеплении антигенов А, В
и Н образуется один и тот же коровый олигосахарид, который перекрестно
23. Взаимодействие антиген—антитело
55
реагирует с антисывороткой, специфичной к пневмококковому полисахариду
ипа XIV, и имеет с этим полисахаридом общие структурные элементы (рис.
3.15, внизу). Кроме того, предшественник групповых антигенов крови с точно
акой же структурой был выделен из кистозной жидкости яичников.
Fuc Fuc
а(1 - 2) I * I о(1—* 4)
о(1 - 3) ♦ 0(1 - 3) L »
Gal NAc ----------- Gal ------». GNAc--------
Fuc
«(1 — 2) I * I o(1- 4)
0(1 - 3) I 0(1 - 3) L ♦
Gal ------*. Gal -------- GNAc------
В
Рис. 23.15. Специфичность
олигосахаридных цепей. Струк-
туры антигенов группы крови
АВН и Le, установленные ме-
тодом торможения гептеном
[73, 77]. Для каждой из этих
детерминант существуют два
варианта структуры, разли-
чающиеся способом присоеди-
нения Gal к GNAc: связью
Р (1 — 3) или р (1—4). Кроме
того, для антигенов А и В
характерна гетерогенность,
связанная с наличием или
отсутствием дополнительной
фукозы, обнаруживаемой и у
Le-антигенов. В молекулах с
дополнительной фукозой, в
зависимости от того, присое-
динена Gal к GNAc связью
Р (1 —3) (тип 1) или Р (1 — 4)
(тип 2), фукоза будет присое-
диняться к GNAc соответ-
ственно связью а (1—4) или
а (1 — 3). Звездочки показы-
вают места, где такая вариа-
бельность наблюдается.
Fuc
«(1—2)1 *
♦ 0(1-3)
Gal ------ GNAc------
Fuc
W — I-"-'
Gal ---► GNAc----
Fuc Fuc
o(1 — 2) I * I O(1 — 4)
‘ ♦ 0(1-3) I
Gal ------- GNAc-------
0(1 - 3)
Gal ---------►
GNAc-----
Пневмококковый
полисахарид
типахпг
Н
Детерминанта Н образуется из предшественника путем присоединения
L-фукозы к галактозе, детерминанта Lea — присоединением L-фукозы к
N-ацетилглюкозамину, а детерминанта Leb — присоединением L-фукозы
к каждому из двух сахаров. При присоединении к Н N-ацетилгалактозамина
получается детерминанта А, а при присоединении галактозы — детерминан-
та В. В обоих случаях специфичность, характерная для детерминанты Н,
утрачивается.
Генетический контроль образования антигенов АВН и Le в рамках данной
схемы последовательного присоединения сахаров зависит от наличия соот-
56 Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
ветствующей гликозилтрансферазы для каждой из реакций. Аллельный харак-
тер антигенов АВ объясняется присоединением к Н-антигену N-ацетилгалакто-
замина или галактозы. При редко наследуемом признаке, заключающемся
в неспособности синтезировать Н-детерминанту из вещества-предшественника
(бомбейский фенотип), одновременно оказывается блокированным и образо-
вание антигенов А и В ввиду отсутствия необходимого субстрата для А- и
В-трансфераз. В то же время появление на поверхности эритроцитов Льюис-
антигенов (Lea) не зависит от наличия антигена Н. Структура Lea, изобра-
женная на рис. 23.15, может быть получена прямо из предшественника, минуя
промежуточную фазу, связанную с синтезом Н. Сравнительное изучение раз-
личных индивидов показывает, что появление антигена Lea на поверхности
эритроцитов коррелирует с его присутствием в слюне, поскольку антиген
Lea не является собственно компонентом мембраны, а адсорбируется на ней
в составе сывороточных гликопротеинов, появление которых в свою очередь
зависит от секреции. Помимо того что синтез Ьеа-антигена идет по незави-
симому пути, его секреция также не связана с секрецией антигенов АВН. В ре-
зультате у индивидов, в слюне которых нет антигенов АВН (они составляют
20% всех индивидов), антиген Lea может секретироваться, если в организме
у них имеется фукозил-трансфераза, кодируемая геном Le. В то же время
у индивидов, антигены АВН которых способны секретироваться в слюну,
в результате воздействия Н-специфической фукозил-трансферазы на антиген
Lea может образовываться антиген Leb, секретирующийся затем с помощью -
секреторной системы ABH-антигенов. Поскольку антиген Lea в данном слу-
чае служит субстратом для дальнейших биохимических реакций, его секреция
уменьшается настолько, что на поверхности эритроцитов индивидов, харак-
теризующихся нормальней секрецией антигенов АВН, его обычно невоз-
можно обнаружить, тогда как антиген Leb, наоборот, присутствует лишь
у этих индивидов.
23.5.2.3. Декстрансвязывающие миеломные белки
Поскольку антигены полисахаридной природы распространены повсе-
местно, неудивительно, что среди случайно индуцированных миеломных имму- •
ноглобулинов часто обнаруживаются белки, специфичные по отношению
к углеводам. Тщательное изучение этих моноклональных антител послужило
доводом в пользу клональной модели разнообразия антител: в отношении
аффинности и специфичности гетерогенные антисыворотки ведут себя как
сумма многих индивидуальных клонов антител. Было показано, что два миелом-
ных белка W3129 и W3434, принадлежащих классу IgAx, оказались специ-
фичными к декстранам, имеющим в своем составе связи a-Glu (1 —>6) [60].
Эксперименты по торможению преципитации с помощью различных моно-, ди-
и олигосахаридов возрастающей длины показали, что энергия связывания бел-
ка с одной молекулой глюкозы составляет 75%, с двумя — 95%, с тремя —
95—98%, а с четырьмя — 100% максимальной энергии взаимодействия белка
с олигосахаридом. Эти результаты показывают, что наибольший вклад в энер-
гию взаимодействия декстрана со специфичным к нему антителом вносит кон-
цевой сахар декстрана и что олигосахариды с длиной цепи 4—6 остатков
обычно заполняют весь антигенсвязывающий центр антитела. Человеческие
антидекстрановые антитела ведут себя аналогичным образом. Энергия их
связывания с тетрасахаридами составляет 95% максимальной энергии свя-
зывания. На основе этих экспериментов впервые было получено приближенное
значение размера антигенной детерминанты, равное 4—6 остаткам [79, 80].
23. Взаимодействие антиген—антитело
57
И миеломные белки, и антисыворотки обладают высокой специфичностью по
отношению к гликозидной а (1 —► 6)-связи концевого сахара в сравнении
с а (1 —>3)-связью, а их аффинность к декстрану оказывается весьма чувст-
вительной к модификациям концевого сахара. В то же время модификации
третьего или четвертого сахара олигосахарида сравнительно мало влияют на
способность гаптена тормозить преципитацию декстрана реагирующими с ним
миеломными белками и сывороточными антителами.
В исследованиях, выполненных на других декстрансвязывающих миелом-
ных белках [81], было обнаружено, что не все антиполисахаридные моно-
клональные антитела специфичны именно к невосстанавливающему концу
олигосахарида. Таким свойством не обладают, например, антитела QUPC52.
Эксперименты по конкурентному торможению моно- и олигосахаридами свя-
зывания этих антител с декстранами показали, что энергия взаимодействия
моно- и дисахарида с антителом составляет менее 5%, энергия связывания
трисахарида — 72%, тетрасахарида — 88%, гексасахарида — 100%. Эти
результаты отличны от данных, полученных с другими миеломными белками.
Второе отличительное свойство миеломного белка QUPC52 заключается в его
способности осаждать неразветвленный декстран длиной в 200 остатков. По-
скольку у неразветвленного декстрана имеется лишь один невосстанавливаю-
щий конец цепи и поскольку белок QUPC52 является моноспецифичным, то
связывание данного белка с невосстанавливающими концами молекул такого
декстрана не должно приводить к образованию преципитационной решетки.
Поэтому наблюдаемую в этом случае преципитацию можно объяснить лишь
тем, что белок QUPC52 связывается с какой-либо другой детерминантой, пред-
ставляющей собой, по-видимому, неконцевой олигосахаридный фрагмент
длиной 3—7 остатков. В отличие от QUPC52 белок W3129 специфичен именно
к концевой детерминанте и, естественно, не способен осаждать неразветвлен-
ные декстрановые цепи. Антитела, осаждающие линейные цепи декстрана,
обнаружены также в шести человеческих антидекстрановых сыворотках, состав-
ляя в них от 48 до 90% всех антител, специфичных к разветвленным декстра-
новым цепям. Таким образом, антидекстрановые антитела можно разде-
лить на специфичные к концевым и к внутрицепочечным олигосахаридам.
В настоящее время получены моноклональные антитела как одного, так и дру-
гого типа, в человеческой же иммунной сыворотке присутствуют оба типа анти-
тел. Цизар и др. [81] предположили, что различие в специфичности белков
W3129 и QUPC52 по отношению к концевым и внутренним олигосахаридным
участкам связано с разной топологией их антигенсвязывающих центров.
Концевые и внутренние олигосахаридные участки имеют почти идентичную
структуру, различаясь лишь наличием у внутренних участков гликозидной
связи в том месте, где у концевых участков находится связь С—ОН. Возможно,
что специфичность белков W3129 и QUPC52 обусловлена пространственной
структурой их антигенсвязывающих центров, например существованием у
W3129 полости, в которую может поместиться лишь конец цепи, и наличием
на поверхности QUPC52 желобка, позволяющего остальным частям поли-
мера выходить наружу с обеих сторон. Более точный ответ на этот вопрос
можно получить лишь на основе рентгеноструктурного анализа комплексов
молекул антигена с антигенсвязывающими центрами моноклональных антител
известной специфичности.
Развитие гибридомной техники дало возможность получать моноклональ-
ные антитела любой заданной специфичности. С помощью иммунизации мы-
шей слаборазветвленным декстраном (предпочтительным антигеном для
QUPC52) и последующих слияния (гибридизации) и отбора антител, свя-
58
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
зывающих линейный декстран, было получено 12 гибридом [82] со специфич-
ностью, аналогичной специфичности QUPG52. В исследованиях по торможе-
нию олигосахаридами связывания каждого из 12 типов моноклональных анти-
тел с декстранами увеличение количества мономеров в олигосахариде с 2
до 6 приводило, во-первых, к значительному возрастанию аффинности олиго-
сахарида к антителам; при этом энергия взаимодействия антитела с триса-
харидом составляла 49—77% от ее максимального значения [59]. Во-вторых,
антитела всех 12 типов обладали специфичностью по отношению к связи
а (1 ->6), так как все они были способны осаждать линейный декстран.
В-третьих, 9 из 11 типов моноклональных антител BALB/c давали иммуно-
логический перекрест с QUPG52 и ни один — с W3129 [83]. Эти данные под-
тверждают гипотезу, согласно которой различные антитела с одинаковой
специфичностью и сходной желобоподобной структурой антигенсвязывающего
центра могут происходить из одного и того же семейства гаметных Ун-генов [83].
Большое количество антигенов углеводной природы в окружающей среде
и высокая степень специфичности антител, появляющихся в ответ на каждый
такой антиген, дают основание предположить, что существует колоссальное
разнообразие молекул антител, из числа которых могут быть отобраны анти-
тела на все возможные антигены. Для объяснения механизма регуляции работы
такой системы была выдвинута теория «сети», согласно которой антитела сами
по себе узнаются другими антителами в качестве антигенов (см. гл. 22 и ра-
боту [84]). Иммунный ответ на стрептококковый полисахарид представляет
собой яркий пример того, как антиидиотипические антитела могут регули-
ровать ответ на антиген [85].
23.5.3. Антигенные детерминанты белковой
и полипептидной природы
Антигенные детерминанты белковой природы, как и белки вообще, состоят
из аминокислотных остатков, расположенных в пространстве определенным
образом. Те остатки, которые приходят в соприкосновение с остатками ком-
плементарного антигенсвязывающего центра антитела, называются контакти-
рующими. Чтобы взаимодействие имело место, эти остатки, конечно же, должны
находиться на поверхности белка, а не быть запрятанными внутрь гидрофоб-
ного ядра. Ответственные за специфичность узнавания гипервариабель-
ные участки антител занимают область (30—40 А) X (15 — 20 А) X 10 А
(Д. Р. Дэвис, личное сообщение). Это означает, что составляющие антигенную
детерминанту контактирующие остатки могут покрывать значительную часть
поверхности белка. Аналогичный вывод был сделан на основе оценок размера
антигенсвязывающего участка антитела, проведенных с помощью простых
синтетических олигопептидов увеличивающейся длины, в частности олиголи-
зина. Результаты, полученные в серии тонких экспериментов [86—88], дают
основание думать, что длина цепи, способной разместиться в антигенсвязы-
вающем центре, составляет 6—8 остатков. Это хорошо соответствует обсуж-
давшимся выше данным, полученным при изучении олигосахаридов [79, 80].
В энергию связывания вносят вклад несколько различных типов взаи-
модействия. Многие расположенные на поверхности белкового антигена и об-
ращенные в сторону растворителя аминокислотные остатки являются
гидрофильными. Они могут ассоциировать с контактирующими остатками путем
полярных взаимодействий. Например, несущая отрицательный заряд кар-
боксильная группа глутаминовой кислоты будет притягиваться к противо-
положно заряженной аминогруппе лизина, а боковая цепь амида глутами-
23. Взаимодействие антиген—антитело
59
новой кислоты будет образовывать водородные связи с аналогичными поляр-
ными группами. В то же время важную роль могут играть и гидрофобные
взаимодействия. Белки не способны существовать в водном растворе в виде
стабильных мономеров, если у них на поверхности находится слишком много
гидрофобных остатков. По этой же самой причине поверхностные гидрофобные
остатки могут играть важную роль в связывании антитела с антигеном. При
сближении гидрофобных остатков, входящих в состав антигенной детерми-
нанты, имеющей белковую или углеводную [73] природу, с аналогичными
остатками антигенсвязывающего центра, молекулы воды, до того окружавшие
эти остатки, будут вытесняться. Это приведет к значительной стабилизации
взаимодействия антиген—антитело.
23.5.4. Конформация или последовательность?
Любая антигенная детерминанта белковой природы определяется не только
тем, какие аминокислотные остатки входят в ее состав, но и тем, как они при
этом располагаются в трехмерном пространстве. Поскольку эти остатки нахо-
дятся на поверхности белка, их взаимное расположение в пространстве мож-
но называть топографией антигенной детерминанты. Сёла [89] разделил бел-
ковые антигенные детерминанты на две группы — на зависимые в основном
от аминокислотной последовательности или от конформации. В то же время,
поскольку антигенсвязывающий центр в составе нативного антитела имеет
одну из энергетически предпочтительных топографий, представляется ве-
роятным, что некоторые конформации полипептидной цепи антигена будут
лучше соответствовать антигенсвязывающему центру, чем другие, и, следо-
вательно, будут связываться более эффективно. Отсюда можно сделать вывод,
что конформация или топография в определенной степени имеют важное зна-
чение для любой антигенной детерминанты.
Более того, как видно из атомной модели поверхности белка, очень трудно
установить направление полипептидной цепи и положение спиралей (ср. рис.
23.16 и 23.17), а также определить, являются ли сближенные в пространстве
остатки соседними в самой цепи, или же они относятся к удаленным друг от
друга участкам последовательности и оказались рядом лишь в результате
свертывания полипептидной цепи. Если при связывании с антителом белок
сохраняет свою нативную конформацию, то и антитело не сможет различать
соседние и удаленные по цепи остатки. Поэтому вероятность того, что анти-
генные свойства данной детерминанты нативного глобулярного белка опре-
деляются лишь последовательностью аминокислот, оказывается довольно
малой. Даже в том случае, когда большая часть детерминанты представляет
собой непрерывную последовательность, все равно другие, находящиеся ря-
дом остатки тоже должны влиять на связывание. И лишь в том случае, когда
белок перэд иммунизацией расщепляют на фрагменты, есть определенные
основания считать, что соответствующие детерминанты окажутся зависимыми
от последовательности.
Хотя имеются данные о том, что подобное «созревание» (расщепление на
фрагменты) антигена происходит при узнавании его Т-клетками, тем не менее
в громадном большинстве остальных случаев антитела образуются именно
на нативную конформацию антигенных детерминант, если в качестве иммуно-
гена используется нативный белок. Например, было показано, что антитела
к нативной стафилококковой нуклеазе обладают по отношению к иммуногену
примерно в 5000 раз большей аффинностью, чем к соответствующему поли-
пептиду, который был пришит к сефарозе и использовался для их выделения
60
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
Рис. 23.16. Схематическое изображение
взаимного расположения в пространстве
участков цепи нативного миоглобина каша-
лота. Боковые группы аминокислотных
остатков не показаны (за исключением аро-
матических колец гистидинов F8 и Е7,
взаимодействующих с атомом гемового же-
леза). Остатки метионина 55 и 131 соот-
ветствуют участкам расщепления цепи с по-
мощью бромциана на три фрагмента. Боль-
шинство спиралей и других характерных
деталей нативной конформации молекулы
при расщеплении цепи исчезает. Удаление
гема и превращение белка в апомиоглобин
связано с менее значительными конформа-
ционными изменениями, обусловленными
тем, что гем взаимодействует с несколькими
спиралями и стабилизирует их положение
относительно друг друга. Про остальные
отмеченные остатки (Glu-4, Lys-79, Glu-83,
Lys-140, Ala-144 и Lys-145) известно, что
они входят в состав антигенных детерминант,
узнаваемых моноклональными антителами
[90]. Следует принять во внимание, что
в результате расщепления цепи с помощью
бромциана в разных фрагментах оказыва-
ются остатки Lys-79 и Glu-4, а также оста-
ток Glu-83 и остатки А1а-144 и Lys-145.
Детерминанта, определяемая последователь-
ностью [91] (остатки 15—22), находится
в районе изгиба цепи между концом спира-
ли А и началом спирали В (справа внизу)
(по [92]; с изменениями).
[95]. Еще более яркий пример антител к нативному миоглобину и к апомиоглоби-
ну приводит Крамптон [96]: при связывании антител, полученных против на-
тивного ферримиоглобина с миоглобином, наблюдается образование коричне-
вого осадка, свидетельствующее о том, что в белке сохранился гем, причем
его окружение близко к нативному, но эти же самые антитела были неспособ-
ны прочно связываться с апомиоглобином, не содержащим гема и находя-
23. Взаимодействие антиген—антитело
61
щимся в несколько отличной от нативного миоглобина конформации. С дру-
гой стороны, при добавлении к нативному (коричневому) миоглобину антител,
направленных против апомиоглобина, получается осадок белого цвета. Эти
антитела настолько сильно предпочитают не содержащую гема конформацию
апомиоглобина, что с их помощью можно фиксировать состояние тех молекул,
которые случайно оказались в этой конформации, и, таким образом, сдвигать
равновесие в сторону апоформы. Фигурально выражаясь, антитела как бы
вытесняют гем из миоглобина. G термодинамической точки зрения это озна-
чает, что предпочтение антител к апоформе по сравнению с нативной формой
обусловлено большей свободной энергией связывания белка с антителом, чем
с гемом. Подводя итог, можно сказать, что при иммунизации образуются ан-
титела, весьма специфичные к конформации белка, используемого в качестве
иммуногена.
Миоглобин, кроме того, представляет собой удобный объект для изучения
широкого спектра антигенных детерминант, начиная от сравнительно зави-
симых от последовательности и кончая существующими лишь в нативной кон-
формации белка (рис. 23.16). Типичной детерминантой первого типа является
участок последовательности, находящийся в N-концевой части молекулы и
включающий остатки 15—22. Впервые Крамптон и Уилкинсон .[97] обнару-
жили, что получаемый в результате расщепления химотрипсином фрагмент,
содержащий остатки 15—29, связывается с антителами, направленными как
против нативного, так и против апомиоглобина. Затем две группы исследо-
вателей показали, что синтетические пептиды, соответствующие более корот-
кой последовательности 15—22, связываются с антителами, получаемыми про-
тив нативного миоглобина кашалота, даже несмотря на то, что содержат лишь
7—8 остатков [91, 98]. Пептиды такой длины не могут, находясь в растворе,
в течение длительного времени пребывать в конформации, соответствующей
конформации данного участка в составе нативного белка. G другой стороны,
аффинность антител к этим пептидам оказывается в несколько сотен раз ниже,
чем к нативному белку. Таким образом, даже несмотря на то, что последо-
вательность 15—22 составляет большую часть детерминанты, тем не менее
антитела оказываются значительно более специфичными (в смысле специфич-
ности первого типа) по отношению к фрагменту, имеющему нативную конфор-
мацию, чем к пептиду со случайной конформацией. Кроме того, не исключено,
что в построении данной детерминанты принимают участие другие остатки,
находящиеся рядом на поверхности миоглобина, но не входящие в данную
последовательность х.
Ярким примером, подтверждающим важную роль вторичной структуры
антигенной детерминанты в узнавании ее антителами, служит пептид, пред-
ставляющий собой петлю в лизоциме куриного яйца (остатки 64—80) [103].
Эта петля образована дисульфидной связью между цистеиновыми остатками
Cys-64 и Gys-80, и, как было показано, служит основной антигенной детерми-
нантой лизоцима [103]. Содержащий данную петлю пептид 60-83, будучи выде-
ленным в свободном состоянии, связывает антитела с высокой аффинностью,
1 Детерминанта 15-29 — это единственная определяемая последовательностью детер-
минанта миоглобина, существование которой было четко установлено несколькими незави-
симыми группами исследователей. Крамптон и Уилкинсон [97] измеряли антигенную актив-
ность получаемого при расщеплении химотрипсином фрагмента 147-153, перекрывающегося
с еще одной обнаруженной детерминантой такого типа [99]. Однако существование двух дру-
гих определяемых последовательностью детерминант [99], соответствующих остаткам 56-62
и 94-100, не подтвердилось при тестировании с помощью других антисывороток, даже когда
те были получены от животных того же вида [100]. Результаты аналогичных исследований
описаны в работах [101—102].
62
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
однако «открывание» петли путем расщепления дисульфидной связи приводит
к исчезновению большей части антигенной активности по отношению к анти-
лизоцимным антителам [103].
На другом полюсе требований, предъявляемых к конформации полипеп-
тидной цепи, лежат детерминанты, составленные из удаленных друг от друга
по первичной структуре остатков, оказавшихся сближенными вследствие
свертывания полипептидной цепи. Примеры таких, называемых топографиче-
скими, детерминант также имеются в миоглобине. Из шести различных изу-
ченных Берзофским и др. [13, 90] типов моноклональных антител к миогло-
бину кашалота ни одни антитела не связывались ни с каким из фрагментов,
Рис. 23.17. Стереоизображение объемной
компьютерной модели миоглобина кашало-
та на основе координат атомов, полученных
Такано [93] с помощью рентгеноструктурно-
го анализа. Данная ориентация белка (та
же самая, что и изображенная на рис. 23.16),
произвольно названа «видом спереди».
Компьютерный способ получения стерео-
изображений описан Фелдманом и др. [94].
Гем и атомы углерода ароматических колец
показаны самым темным цветом. Затем по
порядку от темного к светлому следуют:
атомы кислорода карбоксильных групп,
другие атомы кислорода, атомы азота пер-
вичных аминогрупп, другие атомы азота и,
наконец, боковые цепи алифатических остат-
ков. Атомы полипептидного «скелета» и бо-
ковых цепей неалифатических остатков по-
казаны белым цветом. На данном рисунке,
в отличие от рис. 23.16, направления «-спи-
ралей не указаны. Остатки Glu-4, Lys-79
и His-12, как полагают, входят в состав топо-
графических антигенных детерминант, уз-
наваемых моноклональными антителами
к миоглобину. ([90]; с изменениями.) Трех-
мерное изображение можно получить, рас-
сматривая данную стереопару с помощью
соответствующего приспособления, напри-
мер недорогого «стереоскопа».
получаемых при расщеплении белка с помощью бромциана и составляющих
вместе полную молекулу. Следовательно, эти моноклональные антитела (все
они имеют аффинность от 2*108 до 2 «109 М-1) высокоспецифичны по отношению
именно к нативной конформации. Затем данные антитела были исследованы
путем сравнения величин их относительной аффинности к ряду выделенных
из различных видов животных нативных миоглобинов, аминокислотные после-
довательности которых были известны. Использование таких миоглобинов
позволило идентифицировать некоторые остатки, участвующие в связывании
с антителами трех из шести данных типов. Удивительным оказалось то, что
два из этих трех типов антител узнавали топографические детерминанты (в том
смысле, в котором они были определены выше). Антитела первого клона узна-
вали детерминанту, включающую в себя остатки Glu 4 и Lys 79, входящие
соответственно в состав А-спирали и колена Е-F, но находящиеся на расстоя-
нии 2 А друг от друга и образующие в нативной молекуле солевой мостик
(рис. 23.17). Антитела другого клона узнавали детерминанту, включающую
23. Взаимодействие антиген—антитело
63
в себя остаток Glu 83, располагающийся на колене Е-F, а также остатки
А1а-144 и Lys-145, принадлежащие Н-спирали (рис. 23.18). Опять же, эти
остатки удалены друг от друга в аминокислотной последовательности, но
вследствие свертывания полипептидной цепи оказались в нативной конфор-
мации сближенными на расстояние 12 А. Аналогичные данные недавно были
получены для моноклональных антител, направленных против миоглобина
человека [104] и лизоцима [105]. Кроме того, в некоторых случаях существова-
ние подобных конформационно-зависимых антигенных детерминант было
предположено на основе результатов исследований, проведенных с помощью
Рис. 23.18. Стереоизображение объемной
модели миоглобина кашалота, построенное
с помощью компьютера. Показан вид слева,
полученный путем поворота на 90° модели,
изображенной на рис. 23.17. Атомы закра-
шены так же, как и на рис. 23.17. Остатки
Glu-83, Ala-144 и Lys-145, как считается,
входят в состав топографической антигенной
детерминанты, узнаваемой антимиоглоби-
новыми моноклональными антителами вто-
рого клона [90]. Обратите внимание на на-
личие впадины на поверхности молекулы
примерно в центре антигенной детерминан-
ты между Glu-83 и Ala-144/Lys-145 [90].
поликлональных сывороток, специфичных к таким белкам, как инсулин [106],
гемоглобин [107], белок вируса табачной мозаики [108] и цитохром с [109].
Насколько часто в поликлональных антисыворотках встречаются анти-
тела, специфичные к топографическим детерминантам по сравнению с анти-
телами, связывающимися с одним протяженным фрагментом полипептидной
цепи? Этот вопрос изучали Ландо и др. [НО], пропускавшие козьи, бараньи
и кроличьи антисыворотки к миоглобину кашалота через колонки с сефарозой,
на которой были иммобилизованы фрагменты, полученные в результате рас-
щепления миоглобина с помощью бромциана и составляющие вместе всю пос-
ледовательность молекулы. Антисыворотки пропускались последовательно и
повторно через каждую из трех колонок до тех пор, пока адсорбция антител
не прекращалась. Однако после такой процедуры в каждой из сывороток
30—40% первоначально присутствовавших антител оставались несвязанными.
Эти антитела тем не менее обладали высокой аффинностью по отношению к на-
тивной молекуле миоглобина, но, как было показано с помощью РИА, не свя-
зывались в растворе ни с одним из фрагментов. Таким образом, во всех четы-
рех тестируемых антимиоглобиновых сыворотках от 60 до 70% антител могли
связываться с пептидами, а от 30 до 40% — только с белком, имеющим ин-
тактную нативную конформацию.
На основе результатов, полученных в серии подобных исследований, было
предположено, что значительная часть поверхности любого белка способна
проявлять антигенные свойства [111]. При этом поверхность можно разделить
64
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
на отдельные антигенные области [90, 101, 102, 104], каждая из которых состо-
ит из многих перекрывающихся детерминант, узнаваемых различными анти-
телами.
Анализируя результаты описанных выше исследований, можно сделать
еще одно интересное предположение, касающееся топографии антигенных
детерминант белковой природы. На стереоизображении (рис. 23.18) видно,
что составляющие антигенную топографическую детерминанту остатки 83,
144 и 145 миоглобина кашалота располагаются по разным сторонам глубокой
щели или впадины на поверхности белка. Не исключено (хотя это пока и не
доказано), что в антигенсвязывающем центре антитела имеется комплемен-
тарная выпуклость, которая при взаимодействии антитела с антигеном попа-
дает в эту впадину. На основе данных по изучению миеломных белков, свя-
зывающих небольшие гаптены или углеводы, принято считать, что антиген
заполняет собой некоторую полость или трещину на антителе [112]. Однако
в случае антигенов, представляющих собой глобулярные белки, ситуация
оказывается структурно более симметричной (а связывание антигена с анти-
телом является к тому же и термодинамически симметричным). В результате
обе модели, в одной из которых выпуклость на антителе соответствует впадине
на антигене, а в другой, более традиционной, наоборот, впадина на антителе
соответствует выпуклости на антигене, становятся равновероятными. В на-
стоящее время, когда можно получить моноклональные антитела против лю-
бых антигенов белковой природы, по-видимому, будут обнаруживаться оба
типа комплементарности. Не исключено, что именно наличие у детерминанты,
изображенной на рис. 23.18, впадины, как раз и обусловливает узнавание
этой детерминанты антигенсвязывающим центром антитела.
Более полная информация по данному вопросу содержится в специальных
обзорах [89, 96, 112].
23.5.4.1. Конформационное равновесие у антигенных
детерминант белковой и пептидной природы
Мы уже обсуждали тот факт, что антитела, полученные против нативного
белка, обладают более высокой аффинностью к нативной, чем к какой-либо
другой конформации, принимаемой полипептидной цепью в результате фраг-
ментирования или денатурации. Аналогичным образом антитела, полученные
против фрагментов или денатурированных молекул, имеют большую аффин-
ность именно к ним, а не к нативной конформации белка. В данной части мы
обсудим возможные механизмы возникновения подобных различий в аффин-
ности и выясним, каким образом такие различия можно использовать при
изучении конформационного равновесия в белках и пептидах.
Предложено несколько механизмов, с помощью которых можно объяс-
нить, почему антитела, специфичные к нативному белку, связываются с пеп-
тидным фрагментом, находящимся в случайной конформации, с более низкой
аффинностью. Конечно же, в пептиде могут отсутствовать некоторые из остат-
ков, входивших в состав антигенной детерминанты и контактировавших с ан-
тителом. Поэтому естественно, что энергия связывания его с антителом будет
меньше. Однако существуют и другие механизмы, за счет которых аффинность
пептида к антителам может уменьшаться даже в тех случаях, когда в пептиде
присутствуют все контактирующие остатки. Во-первых, взаимное расположе-
ние этих остатков может не столь хорошо соответствовать структуре анти-
генсвязывающего центра антитела, как у белка, находящегося в нативной
конформации. Во-вторых, не исключено, что функциональная аффинность
23. Взаимодействие антиген—антитело
65
оказывается пониженной из-за того, что в каждый момент времени лишь не-
большая часть молекул пептида имеет конформацию, близкую к нативной.
В данной модели предполагается, что антитела связываются только с теми
молекулами, которые находятся в нативной конформации. Поскольку такие
молекулы составляют лишь ПК часть всех молекул пептида (К — константа
конформационного равновесия пептида), то в соответствующее число раз
уменьшится и величина функциональной аффинности (см. ниже). Эта модель
по сути аналогична аллостерической модели. В-третьих, возможно, что при
первоначальном связывании антитела с пептидом, находящимся в ненатив-
ной конформации, имеет место неполная комплементарность. Однако затем
вследствие внутримолекулярных изменений пептид переходит в состояние
минимума энергии и принимает конформацию, близкую к нативной. Данная
гипотеза, называемая гипотезой промежуточного состояния, аналогична
модели индуцированного соответствия. Уменьшение аффинности в ней обус-
ловлено тем, что для изменения конформации пептида требуется определен-
ная энергия, от величины которой зависит значение константы конформацион-
ного равновесия, фигурирующей во второй гипотезе. Какая из этих моделей
справедлива в действительности, можно с некоторой степенью достоверности
выяснить с помощью кинетических экспериментов, поскольку первая гипоте-
за предсказывает более высокие скорости «прямой» и «обратной» реакций,
чем вторая [54].
Хотя с помощью второй гипотезы невозможно объяснить все имеющиеся
данные, тем не менее она оказалась полезной, поскольку на ее основе был
предложен метод оценки констант конформационного равновесия в белках
и пептидах [95, 114[. Исходя из этой гипотезы, можно записать:
(43)
где А — антитела, Пн — нативный пептид, Псл — пептид, находящийся
в случайной конформации. И тогда:
^функц = ^конф X Анативн. (44)
Таким образом, отношение значения наблюдаемой константы ассоциации
антитела с пептидом к константе ассоциации антитела с нативной молекулой
должно равняться константе конформационного равновесия пептида. Необ-
ходимо отметить, что в данном случае полная концентрация пептида прини-
мается приблизительно равной [Псл]. Обычно это предположение оказывается
справедливым, поскольку для большинства пептидных фрагментов лишь
незначительная их часть находится в нативной конформации, т. е. величина
^конф= (П„]/[ПСЛ] оказывается много меньше единицы. Кроме того, надо
сказать, что если в какой-то степени верны первая или третья гипотезы, то
получаемое с помощью данного метода значение АК0Нф будет завышенным.
С другой стороны, если меньшая аффинность пептида обусловлена отсутствием
некоторых контактирующих с антителом остатков антигенной детерминанты,
то величина Аконф окажется заниженной (поскольку в данном методе пред-
66
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
полагается, что все различие в аффинности обусловлено конформационными
эффектами). Две эти ошибки могут до некоторой степени взаимно скомпенси-
роваться. Полученная с помощью данного метода величина АК0Нф одного из
пептидных фрагментов стафилококковой нуклеазы .оказалась равной 2-10~*
[95]. Использование антител, специфичных к этому фрагменту, дало возмож-
ность оценить, какую часть времени нативная нуклеаза проводит, находясь
в ненативной конформации. В данном случае она оказалась близкой к 1/3000.
23.6. Другие методы
У нас осталось место для обсуждения еще лишь нескольких методов изу-
чения взаимодействия антиген—антитело. Здесь мы не имеем возможности
рассказать о таких весьма полезных методах, как тушение триптофановой
флуоресценции антител при связывании их с определенными антигенами
[115] (чувствительный метод, используемый, например, при изучении кине-
тики быстрых процессов), а также ингибирование образования стерильных пятен
при добавлении антител к конъюгатам антиген-бактериофаг [116] (метод столь
же чувствителен, что и РИА, т. е. позволяет обнаруживать весьма малые коли-
чества фаговых вирионов).
23.6.1. Количественная преципитация
Способность нейтрализовать патогенные бактерии и образовывать осадок
при добавлении к надосадочной жидкости бактериальной культуры была од-
ной из первых известных свойств антител. Оба свойства характеризовались
высокой специфичностью по отношению к тому бактериальному штамму, про-
тив которого антисыворотка была получена. Осадок состоял из белка антител
и бактериального продукта. По мере образования осадка надосадочная жидкость
содержала все меньшее количество белка антител и при правильно подобран-
ных условиях в конце концов теряла способность к нейтрализации бактерий.
Однако определение количества преципитированных антител оказалось до-
вольно сложной задачей, поскольку осадок содержал и белок антител, и белок
антигена. Данную проблему решили Гейдельбергер и Кендолл [117, 118] после
того, как обнаружили, что антитела против пневмококков были способны пре-
ципитировать очищенный полисахарид из клеточной стенки этих бактерий.
В описанном случае весь содержавшийся в преципитированном белке азот
принадлежал антителам. График зависимости количества преципитирован-
ного белка антител от количества добавленного антигена при неизменном объ-
еме антисыворотки приведен на рис. 23.19.
Как видно на рис. 23.19, количество преципитированных антител сначала
возрастает, выходит на плато, а затем опять снижается. Было обнаружено,
что максимальная преципитация совпадает с полным истощением нейтрализу-
ющих антител. Это происходит в точке, называемой точкой эквивалентности.
Количество белка антител преципитировавшего в точке эквивалентности, дол-
жно быть равно полному количеству специфических антител в данном объеме.
Та часть графика, где кривая идет вверх, называется зоной избытка антител
(или недостатка антигена), а та часть, где она идет вниз, — зоной избытка
антигена.
Для каждой из зон графика, изображенного на рис. 23.19, был проведен
тщательный анализ состава осадка и надосадочной жидкости. В условиях не-
достатка антигена отношение количества антител к количеству антигена в осад-
23. Взаимодействие антиген—антитело
67
ке было высоким. В надосадочной жидкости при этом присутствовали свобод-
ные антитела, а антиген не обнаруживался. По мере того как добавлялось все
больше антигена, количество антител в осадке росло, но отношение количества
антител к количеству антигена падало. В точке эквивалентности надосадоч-
ная жидкость не содержала ни свободных антител, ни антигена. При последу-
ющем добавлении антигена количество антител в осадке уменьшалось, однако
отношение количества антител к количеству антигена оставалось постоянным.
Заны
Зона эквива-
А.
Количество
осажденного
велна (мкг)
I о
I количество
Iдобавленного
I антигена (мнг)
! О
Рис. 23.19. Количественная иммуно-
преципитация. К определенному количе-
ству специфических антител добавляли
увеличивающиеся дозы антигена небелко-
вой природы. Показана зависимость
количества осажденного белка антител
от количества добавленного антигена (Л),
а также приведены структуры комплек-
сов антиген—антитело для различных
относительных количеств обоих реаген-
тов (В). При избытке антигена осадок
исчезает, а в надосадочной жидкости
обнаруживаются растворимые иммунные
комплексы.
Б.
Образующиеся
продукты л
оое
О
Отношение антитело/ан-
...тиген 2И
Результат: осаждение
о
°^о
1 1
। '
V1 | 1:2
Эквимолярное I Растворимые
[осаждение | иммунные
комплексы
i w *
!
В надосадочной жидкости теперь содержалось больше комплексов антиген—
антитело, так как в избытке антигена их размеры уменьшились настолько, что
комплексы стали растворимыми. Свободные антитела при этом не обнаружи-
вались.
Все эти наблюдения можно объяснить в рамках модели преципитации, на-
зываемой теорией решетки [117, 118]. В данной модели предполагается, что
антитела являются поливалентными, а антигены—би- или поливалентными. Это
дает возможность образоваться длинным цепям, в которых антитело связано
с антигеном, связанным в свою очередь с другим антителом, и так далее. Чем
больше будет размер агрегатов, тем в меньшей степени продукт окажется рас-
творимым. В условиях, соответствующих зоне избытка антител, появляются
точки ветвления на тех молекулах антигена, которые связаны с тремя анти-
телами. Наличие таких точек приводит к образованию больших нераствори-
мых комплексов. Например, если отношение антитело/антиген будет равно
3:1, то в среднем каждая молекула антигена окажется связанной с тремя мо-
лекулами антител, что приведет к формированию трехмерной решетчатой струк-
туры. Если же антитела и антиген присутствуют в эквимолярных концентра-
циях (это соответствует точке эквивалентности), то вероятность связывания
данной молекулы антигена более чем с Двумя антителами станет меньше. В
результате количество точек ветвления понизится и продукт будет представ-
лять собой множество длинных разветвленных цепей, в которых молекулы
3»
68
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
антител и антигена чередуются друг с другом. По мере увеличения концент-
рации антигена в преципитате начинают преобладать линейные цепи с экви-
молярным соотношением антител и антигена. При дальнейшем возрастании
концентрации антигена все большее количество его молекул становится свя-
занным лишь с одним антителом или находится в свободном состоянии. Посколь-
ку связывание антигена только с одним антителом означает обрыв цепи, то в
результате в растворе будут обнаруживаться цепи все меньшей длины. В кон-
це концов комплексы антиген—антитело окажутся настолько малыми, что
опять станут растворимыми. Такие „иммунные комплексы" существуют в усло-
виях, соответствующих зоне избытка антигена, когда свободные антитела не
обнаруживаются.
В теории решетки не только на статистическом уровне объясняются явле-
ния, связанные с преципитацией, но, кроме того, делается важное предсказа-
ние о бивалентности или поливалентности антител. При дальнейших структур-
ных исследованиях антител (гл. 7) были выяснены их молекулярные массы и
валентность. Антитела действительно оказались бивалентными, за исключе-
нием IgM, которые функционально пятивалентны, и, следовательно, образу-
ют преципитаты еще более эффективно.
Антигены могут быть поливалентными благодаря тому, что имеют либо мно-
жество копий одной и той же детерминанты, либо много различных детерминант,
каждая из которых взаимодействует со своей субпопуляцией антител из гете-
рогенной антисыворотки. Выше был рассмотрен пример, иллюстрирующий
возможности реакции преципитации для изучения поливалентного антигена,
все детерминанты которого одинаковы. У полисахаридов наиболее иммуноген- ~
ные антигенные детерминанты часто находятся на невосстанавливающих концах
цепи. Поэтому разветвленные полисахаридные цепи, имеющие больше одного
конца, обычно поливалентны. Неразветвленные цепи декстрана (полимера глю-
козы) ведут себя как моновалентные при взаимодействии с антидекстрановыми
антителами, направленными против концевых участков цепей и не преципити-
руются ими [73]. Однако существует еще одна группа антидекстрановых ан-
тител, специфичных к внутренним участкам полиглюкозных цепей. Посколь-
ку в декстране имеется множество подобных участков, по отношению к таким
антителам он будет поливалентным. В результате с помощью неразветвлен-
ного декстрана оказывается возможным различать антитела, специфичные к
концевым и к внутренним участкам цепей, ибо преципитация будет наблюдать-
ся лишь со вторыми из них [73, 81]. Мономерные антигены белковой природы,
такие как миоглобин (см. выше) или лизоцим, являют собой примеры антиге-
нов второго типа, поскольку по отношению к гетерогенным антисывороткам
они ведут себя как поливалентные, а по отношению к моноклональным анти-
телам — как моновалентные. Это следует из того, что молекулы таких анти-
генов содержат множество антигенных детерминант, но лишь по одной копии
каждой из них. Таким образом, при добавлении полиспецифической антисы-
воротки, содержащей антитела, направленные против нескольких детерми-
нант антигена, каждая молекула окажется способной связать более одного
антитела, что в результате будет приводить к образованию решетки. В то же вре-
мя при использовании антител, специфичных по отношению к одной детерминан-
те (например, моноклональных антител), преципитации наблюдаться не будет.
В данном случае реакция антиген— антитело количественно может быть охарак-
теризована с помощью одного из описанных ранее методов, например РИА или
ИФА.
23. Взаимодействие антиген—антитело 69
23.6.2. Иммунодиффузия
Чаще всего иммунопреципитация используется в сочетании с какой-либо
системой диффузии [119]. Диффузию можно наблюдать при добавлении капли
раствора белка в чашку с водой (добавлять белок следует осторожно, чтобы не
вызвать перемешивания жидкости). Скорость перемещения молекул белка
в жидкости, согласно закону Фика, пропорциональна произведению градиен-
та концентрации на коэффициент диффузии белка:
где Q — это количество вещества, проходящее через сечение площади А за
d с
время t, D — коэффициент диффузии, зависящий от размера молекул, а —
градиент концентрации. Поскольку молекулы антител довольно велики,
их коэффициенты диффузии оказываются весьма малыми, так что в большин-
стве систем за один день фронт диффузии распространяется лишь на 5—20 мм.
Чтобы жидкая фаза в течение столь долгого времени оставалась стабильной,
диффузию обычно проводят в геле, препятствующем перемешиванию, но не
затрудняющем передвижения молекул белка. Практика показала, что 0,3 —
1,5% агара или агарозы позволяют белкам такого размера, как антитела, дви-
гаться свободно и в то же время ослабляют механические и термические по-
токи в жидкости. Если тщательно подобрать концентрации антигена и анти-
тител, то с помощью данной системы можно определять количество присутствую-
щих в смеси антигенных компонентов и концентрацию каждого из них. Кроме то-
го, иммунодиффузия позволяет путем варьирования геометрии входящих в сос-
тав геля реагентов получать полезную информацию как об антигенах (их иден-
тичности, различиях, частичном перекресте, чистоте), так и об антителах (на-
пример, об их специфичности). Ниже рассматриваются четыре наиболее ши-
роко используемые схемы проведения иммунодиффузии.
23.6.2.1. Диффузия одного компонента в одном направлении
В данном методе антитела вводят в гель, находящийся внутри стеклянной
трубки. Раствор антигена наслаивают на гель, после чего молекулы антигенов
начинают диффундировать внутрь геля (рис. 23.20,А). Через определенное
время концентрация антигена а в некотором месте становится равной концен-
трации антител к этому антигену (т.е. достигается точка эквивалентности),
что приводит к образованию там полосы преципитации в По мере диффузии
антигена его концентрация будет возрастать и в конце концов антиген ока-
жется в избытке по отношению к антителам. Это вызовет растворение полосы
преципитации Ч и смещение ее в направлении диффузии к t2. Интегрируя ура-
внение Фика, получим, что пройденное расстояние пропорционально квад-
ратному корню от времени. Если диффундируют два различных антигена,
а и б, а антисыворотка содержит антитела против них обоих, то образуются
две независимые полосы, движущиеся с независимыми друг от друга скорос-
тями. При этом скорость движения каждой полосы будет определяться кон-
центрацией соответствующего антигена в образце, его коэффициентом диффу-
зии (размером) и концентрацией специфичных к нему антител в агаре. Одна-
нако, поскольку полосы со временем перемещаются, использование описан-
ного метода для получения количественных характеристик наталкивается на
определенные трудности.
70
Дж, А. Берзофски, А. Дж, Берковер
Движущаяся полоса преципитации
А.
Раствор
антигена а
Концентрация
антигена а
Концентрация
антигена
В.
фиксированное положение
полосы преципитации
Расстояние, мм
Расстояние,мм.
Рис. 23.20. Иммунодиффузия. А. Диффузия
одного компонента в одном направлении.
Б. Диффузия одного компонента в двух
направлениях (планшет Манчини). В. Диф-
фузия двух компонентов в одном направ-
лении. На нижней части каждого рисунка
по вертикали отложена концентрация диф-
фундирующего компонента.
23. Взаимодействие антиген—антитело
71
23.6.2.2. Диффузия одного компонента
в двух направлениях (метод Манчини)
В данном методе [120], как и в предыдущем, антитела предварительно
вводят в гель, однако диффузия антигена идет не в одном, а в двух направле-
ниях (рис. 23.20,В). Раствор, содержащий антиген а, вносят в небольшую
лунку, вырезанную в геле, сформированном в чашке Петри. Таких лунок де-
лается несколько, и в каждую из них антиген добавляют после очередного
разбавления. Внесенный антиген начинает диффундировать, вследствие чего
вокруг каждой лунки возникает градиент его концентрации. Когда на неко-
тором расстоянии от лунки концентрация антигена достигнет точки эквива-
лентности, вокруг лунки появится кольцо преципитации соответствующего
радиуса. Чем выше была первоначальная концентрация антигена в лунке,
тем на большее расстояние он продиффундирует до того, как сформируется
кольцо, и тем шире будет это кольцо. Площадь кольца прямо пропорциональ-
на начальной концентрации антигена. Данный метод представляет собой удо-
бный количественный тест, широко используемый при определении класса
иммуноглобулинов. С этой целью тестируемую сыворотку вносят в лунку, а
антисыворотки против каждого класса иммуноглобулинов добавляют в агар.
Чувствительность можно увеличить путем понижения концентрации антисыво-
ротки в геле. При этом размеры кольца увеличиваются, поскольку антигену
для образования кольца необходимо будет иметь меньшую концентрацию.
Однако антисыворотку нельзя разбавлять слишком сильно, поскольку тогда
преципитация вообще не будет иметь места.
23.6.2.3. Диффузия двух компонентов в одном направлении
Внутри стеклянной трубочки находится гель, приготовленный на основе
чистой агарозы. Один конец трубочки погружают в раствор, содержащий ан-
тиген а, а на противоположный торец наносят антитела против антигена а. В
течение первых нескольких часов антиген и антитела будут диффундиро-
вать навстречу друг другу (рис. 23.20,В), пока, наконец, йе встретиться. В не-
который момент времени в какой-то точке геля концентрации антигена и ан-
тител станут таковыми, что сможет произойти иммунопреципитация, в резуль-
тате которой появится полоса, изображенная на рис. 23.20, В слева. Положение
этой полосы определяется несколькими факторами, в том числе концентраци-
ями и коэффициентами диффузии всех участвующих в ее образовании реаген-
тов. Полоса преципитации служит барьером для дальнейшей диффузии реаген-
тов, вследствие чего ее положение будет оставаться стабильным. Как видно
в средней части рис. 23.20,5, диффузия иммунологически неродственного ан-
тигена б не влияет на преципитацию а-анти-а. На рис. 23.20, В справа показа-
но независимое образование полосы преципитации при взаимодействии анти-
гена б с антителами к нему, присутствующими в антисыворотке. Таким обра-
зом, наличие или отстутствие каких-либо антигенов или специфичных к ним
антител будет отражаться на наличии или отсутствии соответствующей полосы
преципитации. Количество линий показывает количество имеющихся в геле
систем антиген-антитело. Возможность с помощью иммунодиффузии разделить
различные системы антиген-антитело предоставляет исследователю удобный
способ оценки чистоты антигена или специфичности антител.
72
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
23.6.2.4. Диффузия двух компонентов
в двух направлениях (метод Ухтерлони)
Согласно этому методу 1119], в стеклянной чашке Петри приготовляют
гель на основе чистой агарозы. Затем в нем вырезают три или больше лунок,
как показано на рис. 23.21. Антигены а и б добавляют в верхние лунки, а анти-
сыворотку, содержащую антитела против обоих антигенов, — в нижнюю. При
этом, как и в случае одномерной диффузии, каждая пара антиген-антитело бу-
дет формировать свою полосу преципитации независимо от наличия других
таких пар в системе. Как видно на рис. 23.21, А, эта полоса должна выступать
Рис. 23.21. Иммунодиффузия двух компо-
нентов в двух направлениях. При иммуно-
логическом перекресте имеют место тормо-
жение (укорочение полос) или отклонение
(искривление полос). На рис. Б и Г изо-
бражены линии идентичности, на Д—ли-
ния частичной идентичности [119].
на одинаковую длину с обеих сторон от прямой, соединяющей лунки с антиге-
ном и антителами. Если разные антигены находятся в различных лунках (рис.
23.21,В), то отдельные преципитирующие системы не будут взаимодействовать
между собой и поэтому линии преципитации будут пересекаться. Однако если
в обе лунки добавлен один и тот же антиген (рис. 23.21,В), то каждая линия
преципитации окажется барьером для дальнейшей диффузии образующих ее
антигена и антител, что вызовет укорочение полосы преципитации со стороны
второй лунки. Кроме того, диффузия антигена из этой лунки будет сдвигать
зону избытка антигена, что приведет к искривлению обеих линий преципита-
ции и объединению их друг с другом в одну изогнутую линию. Полное слияние
23. Взаимодействие антиген —антитело
73
линии преципитации без шпор (в противоположность тому, что показано на
рис. 23.21, Д и Г) называется линией идентичности. Ее появление свидетель-
ствует о том, что антиген, находящийся в каждой из лунок, связывается со
всеми антителами, способными взаимодействовать с антигеном, из другой лунки.
Значительную аналитическую мощность этого метода можно проиллюст-
рировать с помощью рисунка 23.21,У. В левую лунку добавлены антигены а. и
б, в правую — антиген б, а антисыворотка содержит антитела как к а, так и к
б. Если антитела к а в избытке, то взаимное расположение линий преципита-
ции окажется таким, как показано на рис. 23.21, Г: со стороны левой лунки
будут видны две линии, а со стороны правой — одна. Две линии, слившиеся
в одну, будут соответствовать антигену 6', а третья линия — антигену а. По
длине пути, который прошли антигены, можно судить об их относительных
концентрациях, если предположить, что коэффициенты диффузии обоих антиге-
нов сравнимы, а антитела против каждого из них присутствуют в равных
количествах. Наконец, поскольку линия преципитации, соответствующая ан-
тигену а, не искривляется и не укорачивается вблизи правой лунки, это озна-
чает, что образец в данной лунке не загрязнен антигеном а и, кроме того, меж-
ду двумя антигенами нет иммунологического перекреста.
Тщательный анализ результатов подобных экспериментов дает возмож-
ность обнаружить дополнительные детали, касающиеся наличия частичного
перекреста между антигенами или антителами. В опытах, схемы которых при-
ведены на рис. 23.21, Д и Е, в левую лунку добавляют антиген, имеющий две
детерминанты а и б, в правую — антиген, имеющий одну детерминанту б, а в
нижнюю — антитела против обеих детерминант. Если при этом антитела анти-
fl находятся в избытке, то взаимное расположение линий преципитации будет
таким, как показано на рис. 23.21, Е. В результате взаимодействия антител к
а с (аб)-частицами появится левая линия преципитации. Однако она будет
служить барьером также и для диффузии антител к б, что приведет к укоро-
чению правой линии преципитации. В то же время линия преципитации ан-
тигена б и антител к нему не оказывает влияния на диффузию антител к а,
поэтому укорочения левой линии наблюдаться не будет. В результате возник-
нет шпора, изображенная на рис. 23.21,Л’. Если же в избытке находятся анти-
тела к б, то расположение линий преципитации будет соответствовать рис.
23.21, Д. В этом случае и (аб)-, и б-антигены связываются с одними и теми же
антителами; поэтому будут иметь место искривление и слияние линий преци-
питации. Одновременно будет наблюдаться шпора, появляющаяся при взаи-
модействии антител к а с (яб)-антигеном. Если между антителами наблюдает-
ся частичный иммунологический перекрест, а антисыворотка представляет
собой смесь антител, направленных против обоих антигенов, то тот компонент
антисыворотки, который ответственен за образование доминирующей линии
преципитации, определяет, каким будет взаимное расположение линий преци-
питации.
Необходимо еще раз подчеркнуть, что иммунологический перекрест, об-
наруживаемый с помощью метода Ухтерлони, соответствует определенному
ранее перекресту второго типа. Описанный метод оказывается непригодным
для измерения различий в аффинности, необходимых для количественного опи-
сания иммунологического перекреста первого типа. Отметим также, что чув-
ствительность метода можно увеличить, если использовать радиоактивпоме-
ченный антиген, а преципитат детектировать с помощью радиоавтографии.
A
Б
a, 6,6
Электрофорез
б б
О „ О
а 6 6
О
a,6,6
] Анти-0
J Анти-оД 0
В Р жепоБке
Больней 1
Антисыворотка
в
яукке
'.-пн-Igb
Ажи-IgA —*►
/Анти- IgM—**
Анти -Ж "" *“
Актива ..
Аит нимму могдооу*
линоык
Сыворотка здорового человека
Сыворотка вомиого----
Сыаорттка вольного----
Сыворотка здорового человека
8 тнеловие
"ШШГ « Анти-IgG
Ацтщ-If А
-м*—- Антй-А
23. Взаимодействие антиген—антитело
75
23.6.2.5. Иммунозлектрофорез
Некоторые системы антиген—антитело слишком сложны для того, чтобы
их можно было изучать с помощью иммунодиффузии. Чаще всего сложность
заключается либо в слишком большом количестве полос преципитации, либо
в слишком близком расположении полос друг к другу. Метод иммуноэлект-
рофореза сочетает в себе электрофорез и иммунодиффузию, идущую в направ-
лении, перпендикулярном направлению электрофореза (рис. 23.22). На пер-
вом этапе тестируемые антигены разделяют с помощью электрофореза по за-
ряду, а на втором происходит их диффузия, которая для каждого антигена на-
чинается из той точки, до которой он дошел в ходе первого этапа. Это эквива-
лентно тому, что каждый антиген как бы начинает диффузию из своей лунки
(см. рис. 23.22, А, справа). Затем в агаре вырезают горизонтальный желобок,
который заполняют антисывороткой, содержащей антитела ко всем компонен-
там. После этого начинается иммунодиффузия между отделенными друг
от друга антигенами и линейным источником антител. Результаты,
полученные для смеси трех антигенов, оказываются близкими к результатам,
полученным для трех антигенов, находящихся в отдельных лунках [119]. Иск-
ривление, слияние и укорочение линий преципитации можно анализировать
точно так же, как было описано выше. Разрешение каждой полосы несколько
ухудшается вследствие размытости источника диффузии во время электрофо-
реза. Тем не менее, например, иммунодиффузия белков нефракционированной
человеческой сыворотки, значительно облегчается, если сыворотку предва-
рительно Подвергнуть электрофорезу. Если же диффузию начинать из одной
общей лунки, то видимыми окажутся лишь наиболее широкие полосы, тогда
как предварительное проведение электрофореза позволяет наблюдать отдель-
ные линии преципитации, соответствующие каждому из разделенных компо-
нентов. Если после этого в геле вырезать параллельно направлению элект-
рофореза желобок и заполнить его моноспецифической антисывороткой, то в
результате можно будет идентифицировать все полосы преципитации (см. рис.
23.22,Б). Иммуноэлектрофорез широко используется для обнаружения мие-
Рис. 23.22. Иммуноэлектрофорез. Образец,
содержащий три компонента (а, б и в), под-
вергают электрофорезу в агарозном геле,
что позволяет разделить антигены в гори-
зонтальном направлении. Затем в геле вы-
резают горизонтальный желобок, который
заполняют антисывороткой, диффундирую-
щей навстречу разделенным антигенам.
Предварительное разделение делает ситуа-
цию аналогичной той, когда три разных ан-
тигена первоначально добавляются в три
различные лунки (Л) [119]. В опыте Б для
идентификации антигена в вырезают второй
желобок, который заполняют моноспеци-
фическими антителами против в. В опыте В
данный метод был использован для иден-
тификации миеломного белка в человече-
ской сыворотке. Сыворотки больного и
здорового индивидов вносили в лунки,
имеющие на фотографии вид небольших
кружков, и затем подвергали электрофоре-
зу. Далее вырезанные параллельно друг дру-
гу желобки заполняли различными анти-
сыворотками, после чего в направлении,
перпендикулярном направлению электро-
фореза, шла иммунодиффузия. У больного 1
(слева) наличие широкой полосы преци-
питации с анти-IgG и анти-х, но не с анти-Х,
свидетельствует о присутствии монокло-
нального белка (IgGx), так как поликло-
нальные иммуноглобулины должны реа-
гировать с антисыворотками против ооеих
легких цепей. При взаимодействии сыворот-
ки больного 2 (справа) с антителами против
IgG и X получаются аномально широкие
полосы преципитации, в то время как при
взаимодействии с антителами против х реа-
гируют лишь те иммуноглобулины, кото-
рые имеются у здоровых людей. Это сви-
детельствует о наличии в сыворотке боль-
ного 2 моноклонального белка IgGX.
(Фотографии любезно предоставлены The-
resa Wilson; национальные институты здо-
ровья, отделение клинической химии.)
76
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
ломных белков в человеческой сыворотке. Тестируемую сыворотку вносят в
лунку и подвергают электрофорезу, после чего проводят иммунодиффузию про-
тив антисыворотки к белкам человеческой сыворотки, к х- или Х-цепям им-
муноглобулинов человека. Наблюдаемое на рисунке 23.22, Б уширение дуги
преципитапии IgG у больных 1 и 2, судя по всему, обусловлено присутствием
аномальных молекул IgG. Точно такой же электрофоретической подвижности
соответствует у больного 1 линия преципитации с антителами к х-цепям, но
не к Х-цепям (у больного 2 — наоборот), что служит серьезным основанием,
для постановки диагноза миеломной или моноклональной гаммапатии, пос-
кольку эти белки, как известно, являются продуктом единственного клона,
синтезирующего легкие цепи только одного из двух типов. У человека в нор-
мальных иммуноглобулинах имеются оба изотипа легких цепей, хотя содер-
жание > цепи превышает содержание Х-цепи примерно в два раза. Как можно
видеть на рис. 23.22,В (больной 2), аномальная дуга с у-подвижностью реаги-
рует с анти-IgG- и анти-Х, но не с анти- х. Следовательно, она соответствует
моноклональному белку IgG-X. У больного 1, наоборот, ненормальный сыво-
роточный компонент реагирует с анти-IgG и анти-х, но не с анти-Х, что гово-
рит о присутствии миеломного белка IgG-x.
23.6.2.6. Ракетный электрофорез [121]
В ракетном электрофорезе, как и в описанном выше методе Манчини, на
стеклянную поверхность наносят слой агарозного геля, содержащего специ-
фические антитела, после чего в небольшие вырезанные в геле лунки добавля-
ют антиген. Под действием электрического поля заряженные молекулы мигри-
руют в гель, тогда как молекулы антител, положение которых примерно со-
ответствует их изоэлектрическим точкам, остаются неподвижными. В отличие
от описанных выше методов диффузии в ракетном электрофорезе перемещение
молекул антигена обусловливается не градиентом концентрации, а движущей
силой, создаваемой электрическим полем. Поскольку при этом из стартовой
лунки выходит весь образец, в опыте можно использовать более низкие кон-
центрации антигена. При прохождении через гель молекулы антигена взаи-
модействуют с находящимися в нем специфическими антителами. Первона-
чально концентрация антигена столь велика, что между антигеном и антите-
лами образуются лишь растворимые иммунные комплексы (антиген2—антитело
и антиген--антитело). В результате движение связанных молекул антигена по
сравнению с избыточными свободными молекулами оказывается замедленным.
Когда свободный антиген проникает в зону, где его концентрация эквива-
лентна концентрации антител, начинает формироваться иммунный преципи-
тат. Экспериментально было обнаружено, что граница области преципитации
антиген—антитело по форме напоминает ракету (отсюда и название метода),
ориентированную в направлении электрического поля и прямо пропорцио-
нальную по высоте начальной концентрации антигена [121].
Хотя интуитивно можно предположить, что площадь ракеты должна быть
пропорциональна концентрации антигена, фактически же в центре ракеты к
концу электрофореза обнаруживается лишь незначительное количество анти-
гена. Для выяснения зависимости размеров ракеты от концентрации антигена
необходимо рассмотреть условия, в которых происходит перемещение границы
преципитации. По мере того как фронт распространения антигена движется
вперед, количество молекул антигена в нем постепенно уменьшается. Это про-
должается до тех пор, пока концентрация антигена на границе не становится
эквивалентной концентрации антител в геле, после чего начинается преципи-
23. Взаимодействие антиген—антитело
77
тация. Зона, следующая за фронтом антигена, содержит комплексы молекул
антигена с антителами (антиген2—антитело и антиген—антитело). В этой зоне
нет свободных молекул антигена, которые могли бы участвовать в дальнейшем
продвижении переднего фронта. В то же время по мере того как комплексы
антиген2—антитело оказываются внутри переднего фронта, они растворяют об-
разовавшийся преципитат и перемещают границу преципитации вперед. Ког-
да комплексы антиген2—антитело кончаются, остаются лишь комплексы анти-
ген—антитело, которые не способны растворять преципитат, поскольку могут
лишь пристраиваться к уже сформированной решетке. Начиная с этого мо-
мента высота ракеты уже больше не будет меняться. Площадь ракеты (и вы-
сота у ракет одинаковой ширины) должна быть пропорциональна отношению
количества антигена (почти целиком находящегося теперь в составе экви-
молярных комплексов антиген-антитело) к концентрации антител в геле (т.е.
к количеству антител, приходящемуся на 1 см2). При электрофорезе положе-
ние границы преципитации не меняется, хотя по мере того, как комплексы
антиген-антитело пристраиваются к решетке, интенсивность полосы увели-
чивается. Соотношение между высотой ракеты и отношением количества ан-
тигена к концентрации антител при этом также остается постоянным.
Существенное преимущество ракетного электрофореза заключается в том,
что он позволяет получать количественные характеристики и является более
чувствительным, чем метод Манчини. Поскольку высота ракеты пропорцио-
нальна концентрации антигена, количество антигена в неизвестном образце
можно определить путем сравнения высоты экспериментально полученной ра-
кеты с высотами нескольких стандартных ракет. При любой концентрации ан-
тигена высоту ракеты, а следовательно, и чувствительность метода можно уве-
личить путем уменьшения заданной концентрации антител в геле. В этом слу-
чае антиген сможет пройти большее расстояние, пока его концентрация не
уменьшится до уровня эквивалентности. Как показывает практика, нижний
предел для обнаружения большинства антигенов с помощью метода ракетного
электрофореза составляет от 1 до 10 нг.
23.6.3. Гемагглютинация и ее торможение
23.6.3.1. Гемагглютинация [122]
Гемагглютинация представляет собой один из наиболее чувствительных
методов, с помощью которых можно получать полуколичественные характе-
ристики взаимодействия антител с антигеном. Метод этот включает в себя аг-
глютинацию с помощью антител эритроцитов, предварительно нагруженных
антигеном [122]. Поскольку антиген в данном случае имеет не эндогенное про-
исхождение, подобная реакция называется пассивной гемагглютинацией. На-
тивные эритроциты несут на себе отрицательный заряд, что приводит к воз-
никновению между ними электростатических сил отталкивания, препятствую-
щих агглютинации. Однако после обработки танином (0,02 мг/мл в течение
10 мин при 37°С) клетки начинают легко слипаться друг с другом.
Необработанные эритроциты довольно просто покрыть легко адсорбиру-
ющимися антигенами полисахаридной природы. Что касается белковых ан-
тигенов, то адсорбция некоторых из них после обработки клеток танином идет
хорошо, а клетки в результате становятся весьма чувствительными к антите-
лам. В то же время связывание других белковых антигенов с эритроцитами ока-
зывается довольно нестабильным. Именно в этом заключается причина огра-
ниченного использования данного метода для определенных антигенов. Оче-
78
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
видно, что небольшие агрегаты и частично денатурированные белки будут ад-
сорбироваться предпочтительно [122]. Чистота антигена на этапе адсорбции
тоже оказывается чрезвычайно важной, поскольку возможные примеси могут
конкурировать за связывающие участки на поверхности клеток. После обра-
ботки танином и адсорбции антигена эритроциты хранят в 1%-ном растворе
Рис. 23.23. Гемагглютинация нагруженных
антигеном эритроцитов с помощью специфи-
ческих антител. Антисыворотку добавляют
в крайние левые лунки планшета и после-
довательно разбавляют слева направо.
Нагруженные антигеном эритроциты до-
бавляют в каждую лунку, после чего про-
исходит их осаждение. Титр, определяемый
как наибольшее разведение, при котором
красные эритроциты еще способны покрыть
дно лунки, равен 212 для образцов А и Б,
2’ — для образцов В и Г. Опыты Д и Е —
это контроли, поставленные с сыворотками,
взятыми до иммунизации. У образцов А
и Б обнаруживается слабый прозонный
эффект в первой лунке. (Фото любезно
предоставлено D. L. Nelson и R. Yarchoan).
сыворотки для предотвращения спонтанной агрегации. Если обработка тани-
ном не была проведена, то адсорбцию некоторых антигенов белковой природы
можно облегчить путем обработки клеток хлоридом хрома, действие которого,
по-видимому, заключается в нейтрализации отрицательных зарядов на кле-
точной поверхности. Наконец, с помощью бивалентных сшивающих агентов, та-
ких как бисдиазобензидин или глутаровый альдегид, или с помощью карбо-
диимида проводят ковалентное присоединение антигенов к поверхности клеток.
Проверку специфичности антител осуществляют путем последовательного
разбавления антисыворотки в U-образных лунках многоячеечного планшета (рис.
23.23). Затем в каждую лунку добавляют по 0,1 мл 1 %-ной суспензии эритро-
цитов, нагруженных антигеном. После перемешивания происходит осаждение
23. Взаимодействие антиген—антитело
79
клеток в течение двух часов. В присутствии специфических антител агглюти-
нированные клетки оседают на круглое дно лунки, покрывая его ровным сло-
ем. Неагглютинированные эритроциты скользят вниз по стенкам лунки и фор-
мируют на самом дне плотный осадок в виде точки. Титр образца определяют
по самому большому разведению, при котором агглютинация еще имеет место.
Агглютинированные клетки образуют непрочную сеть, которую можно еще
раз ресуспендировать после осаждения. При этом, вновь осев на дно, эти клет-
ки, как и в первый раз, покроют его ровным слоем. При использовании гипе-
риммунных сывороток с высокой концентрацией антител можно наблюдать
торможение агглютинации, называемое прогонным эффектом. Было выска-
зано два предположения о природе этого явления. Одно из них зключается в
том, что данный эффект аналогичен торможению образования осадка при ко-
личественной преципитации, когда в условиях большого избытка антител каж-
дая клетка покрывается своими молекулами антител, и вероятность сшивки
двух клеток одной молекулой сильно уменьшается. Во втором случае предпо-
лагается существование некоторых видов малоэффективных антител, которые
связываются с участками на молекулах антигенов, но не вызывают при этом
агрегации клеток [7]. Прозонный эффект обычно наблюдается при значитель-
но меньших разведениях сыворотки, чем агглютинация. Чтобы гарантировать
специфичность узнавания антигена, антисыворотку необходимо перед экспе-
риментом истощить на ненагруженных эритроцитах и, кроме того, каждый
опыт должен включать в себя контроль на связывание антигена с ненагружен-
ными клетками.
Преимущество описанного метода заключается в значительно более вы-
сокой по сравнению с иммунопреципитацией чувствительностью, поскольку в
данном случае единичное происходящее на молекулярном уровне событие
воспринимается как агглютинация целого эритроцита. Специфичность по от-
ношению к антигену при гемагглютинации такая же, как и при иммунопреци-
питации. Если, например, ядерные (незрелые) эритроциты нагружены одним
антигеном, а безъядерные (зрелые) другим, то в результате гемагглютинации
смеси клеток с помощью антисыворотки, содержащей антитела против обоих
антигенов, будут образовываться два типа агрегатов, в каждом из которых
присутствуют эритроциты лишь одного типа. При использовании данного ме-
тода следует, однако, иметь в виду, что чувствительность реакции агглюти-
нации существенно зависит от степени покрытия клеток антигеном, а этот пара-
метр сильно варьирует в зависимости от антигена. Кроме того, как оказалось,
IgM вызывают агглютинацию значительно более эффективно, чем IgG (титры
препаратов, содержащих антитела, различаются иногда в 750 раз), что мо-
жет приводить к неправильной интерпретации результатов титрования. На-
конец, титр может варьировать в два раза просто в силу субъективности вы-
вода о том, какое разведение считать последним.
23.6.3.2. Торможение гемагглютинации
Если титр антисыворотки известен, то ее взаимодействие с нагруженными
антигеном эритроцитами может быть использовано в качестве чувствительного
метода для количественного определения антигена. К постоянному количест-
ву антител (разбавленных до концентрации, в два раза превышающей предель-
ную концентрацию, при которой еще имеет место агглютинация) добавляют
различные количества свободного антигена. Агглютинация будет тормозиться,
когда половина или более антигенсвязывающих центров антител окажется
занятой свободным антигеном. Аналогичным образом антителозависимую аг-
80
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
глютинацию нагруженных антигеном эритроцитов можно затормозить путем
предварительной инкубации антител с анти-идиотипической антисывороткой.
Эта реакция представляет собой чувствительный метод обнаружения и коли-
чественного определения анти-идиотипических антител, реагирующих с вари-
абельными участками антител и таким образом стерически блокирующих свя-
зывание антигена.
23.7. Возможные изменения структуры антитела,
возникающие при связывании антигена
Уже давно известно, что комплексы антиген—антитело, а также денатури-
рованные нагреванием иммуноглобулины могут опосредовать выполнение не-
которых функций, например фиксацию комплемента, тогда как свободные
иммуноглобулины не способны к этому. Другие функции, такие как связывание
клеточных Fc-рецепторов, предпочтительно осуществляются комплек-
сами, а не свободными IgG. Выполнение этих функций происходит при участии
Fc-районов иммуноглобулинов. В то же время связывание антигена осущест-
вляется вариабельным участком Fab-фрагмента, находящимся на противо-
положном конце молекулы. Здесь возникает принципиальный вопрос: каким
образом связывание антигена может активировать эффекторные функции ан-
титела? Для объяснения данного явления были выдвинуты две различные тео-
рии. В одной из них предполагается, что в основе всех изменений, приводящих
к фиксации комплемента, может лежать агрегация иммуноглобулинов в ре-
зультате связывания с неким поливалентным лигандом. Другая теория осно-
вывается на предположении о том, что антиген действует как истинный аллос-
терический эффектор, т.е. что связывание антигена само по себе вызывает кон-
формационные изменения, распространяющиеся через всю молекулу от до-
мена к домену и в конце концов приводящие к конформационной перестройке
Fc-участка. Вопрос о том, какой из двух теорий следует отдать предпочтение,
сводится в основном к экспериментальной проверке принципиальной возмож-
ности активации этих процессов путем связывания истинно моновалентного
лиганда. Данной проблеме было посвящено большое количество работ, выпол-
ненных многочисленными исследователями, однако вопрос до сих пор остается
открытым. Мы попытаемся осветить наиболее важные результаты, полученные
в этом направлении. Для более детального изучения предмета читатель отсы-
лается к обзорам Мецгера [123, 124] и Кату [125].
В 60-х годах было сделано несколько важных открытий. Борсос и Рапп
[126, 127] обнаружили, что одна молекула IgM (представляющая собой пента-
мер) способна активировать комплемент, тогда как если такую активацию про-
водить с помощью IgG, то требуется, чтобы по крайне мере две молекулы им-
муноглобулинов находились в тесном контакте друг с другом. Иными словами,
при активации с помощью IgG агрегация молекул, если и не достаточна,
то уж во всяком случае необходима, тогда как при активации с помощью IgM
она вообще не является обязательной. Конечно, даже в случае IgM в принципе
можно было бы понять, что опосредует эффекторную функцию — сшивка ан-
тигенсвязывающих центров в одном пентамере или аллостерический эффект,
вызываемый ассоциацией одной молекулы моновалентного лиганда с одним
антигенсвязывающим центром. Гении и Ишизака [128] обнаружили, что ког-
да молекулы IgG агрегировали в результате связывания антигена или каких-
то неспецифических взаимодействий, то на их поверхности появлялись новые
антигенные детерминанты. В то же время получить с помощью физических
23. Взаимодействие антиген—антитело 81
методов доказательства наличия конформационных изменений, индуцируемых
только одним моновалентным антигеном, оказалось довольно трудным делом
[123]. Фактически на сегодняшний день не известно ни одного случая, когда
бы можно было с уверенностью утверждать, что свободный гаптен индуциро-
вал конформационные измерения в Fc-районе антитела или фиксацию компле-
мента.
В то же время было показано, что несколько более крупные по размеру
моновалентные лиганды вызывают в структуре Fc-участка определенные из-
менения, обнаруживаемые с помощью кривой поляризации флуоресценции
[129, 130]. Хотя следует указать, что изменения, обнаруживаемые этим мето-
дом, не всегда коррелируют со способностью фиксировать комплемент. Браун
и Кошланд [131] для регистрации конформационных изменений использовали
другой подход. Они определяли антигенные детерминанты J-цепи, которые
в нормальном сосотояиии были запрятаны внутрь молекулы IgM, но в резуль-
тате связывания моновалентного лиганда оказывались на поверхности. При
связывании молекулы рибонуклеазы с прикрепленным одним гаптеном наблю-
далось небольшое, но вполне ощутимое (в 1,4 раза) увеличение экспонирован-
ности J-цепи. Если же этот антиген был поливалентным, то даже в условиях
его избытка, когда по идее вероятность межмолекулярной сшивки сведена к
минимуму, экспонированность увеличивалась сильнее (в 1,9 раза). Те же ав-
торы, кроме того, наблюдали фиксацию комплемента, индуцируемую связы-
ванием тем же моновалентным антигеном с IgM-антителами [132]. Однако кон-
центрации, при которых фиксация комплемента имела место, были при этом
на два-три порядка ниже концентраций, необходимых для наблюдения эф-
фекта экспонирования J-цепи. Кроме того, метод, использованный для по-
лучения моногаптенной рибонуклеазы, несмотря на весьма тщательные пред-
осторожности, не позволял полностью исключить присутствие бивалентного
лиганда в концентрации, меньшей порогового уровня обнаружения. Эта и
другие причины вынуждали Чиянга и Кошланда [133, 134] упорно совершенст-
вовать технику своих экспериментов, которые, по-видимому, наиболее убеди-
тельно демонстрируют возможность с помощью моновалентного лиганда ин-
дуцировать фиксацию комплемента IgM-антителами. Для получения истинно
моногаптенного антигена Чиянг и Кошланд воспользовались тем, что в фер-
менте папаине имеется всего одна активная сульфгидрильная группа. Кроме
того, для предотвращения возможной агрегации белковых молекул лизино-
вые остатки папаина были сукцинилированы. Полученный в результате реагент,
как и ожидалось для моновалентного лиганда, оказался неспособным преци-
питировать антитела. В то же время он, как и поливалентные лиганды, инду-
цировал фиксацию комплемента специфичными к гаптену IgM-антителами.
Более того, при этом наблюдалась поразительная корреляция между разме-
ром носителя и способностью конъюгата этого носителя с моновалентным ли-
гандом индуцировать фиксацию комплемента. Этот результат был получен с
помощью набора различающихся по размеру протеолитических фрагментов
папаина, несущих сульфгидрильную группу с присоединенным к ней гапте-
ном. Экстраполируя в сторону уменьшения размера фрагмента, получим,что
предельно допустимый лиганд, который еще будет обладать активностью, дол-
жен состоять из пяти или шести аминокислотных остатков и гаптена. Этот
вывод согласуется с результатами многих других исследований. Свободный
гаптен не вызывал фиксации комплемента. Было высказано предположение о
том, что в антигене, способном индуцировать конформационные изменения,
приводящие, как считается, к фиксации комплемента, размеры переносчика
должны быть больше размеров свободного гаптена.
82
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
Если моновалентный лиганд вызывает конформационные изменения, рас-
пространяющиеся от антигенсвязывающего центра к Fc-участку и вызывающие
фиксацию комплемента, то возникает следующий вопрос: как эти изменения
могут передаваться от одного домена к другому? Было обнаружено, что
тпранс-контакт между цепями значительно сильнее, чем уис-контакты
между доменами в пределах одной цепи, и что шарнирный участок отличается
особенной гибкостью вблизи своих концов [124]. Чиянг и Кошланд [134] пред-
положили, что присоединение объемного лиганда, даже если он моновалентен,
может приводить к значительному уменьшению подвижности Fab-субъединиц
или, наоборот, индуцировать напряжение в Fab, вызывающее переход междо-
менных сегментов полипептида из подвижной нерегулярной конформации в
более жесткую конформацию обратимого p-изгиба. Развивая эту идею, Чир-
коло и Борсос [135] на основе экспериментов, устанавливающих связь средне-
го расстояния между гаптенами на поверхности эритроцитов и способности
IgG-антител производить комплементзависимый лизис, предположили, что
для фиксации комплемента требуется иммобилизация Fab-субъединиц под оп-
ределенным углом по отношению друг к другу. Некоторые данные, противо-
речащие этой гипотезе, получены недавно Гленни и Стивенсоном [136]. Путем
избирательного удаления из молекулы кроличьего IgG только одного Fab-фра-
гмента они приготовили моновалентный Fab/c-фрагмент, состоящий из интакт-
ных Fc- и одного Fab-субъединиц. Такие фрагменты все еще были способны
опосредовать комплементзависимый лизис клеток. Однако неясно, оказывает
ли удаление одного Fab-фрагмента на оставшуюся часть молекулы эффект,
эквивалентный иммобилизации в определенном положении угла между двумя
Fab-фрагментами. Основываясь на данных о кооперативности связывания пер-
вого компонента комплемента, Хоффманн [137] выдвинул гипотезу «аллостери-
ческого кластера», согласно которой агрегация служит для усиления истин-
ных аллостерических эффектов. Следует, однако, заметить, что ни один из пред-
ложенных механизмов строго не доказан.
По-видимому, можно утверждать, что для IgG агрегация является необ-
ходимым условием, тогда как в случае IgM, представляющих собой пентамеры,
межмолекулярная агрегация оказывается необязательной, а аналогичные из-
менения, приводящие к активации эффекторной функции (фиксации компле-
мента), может вызывать либо сшивка антигенсвязывающих центров, либо при-
соединение объемных моновалентных лигандов. Не исключено, что причина,
по которой для индукции подобных изменений нужен не свободный гаптен, а
объемный лиганд, связана с необходимостью ограничить подвижность Fab-
фрагментов, аналогично тому, как это происходит при сшивке данных фраг-
ментов с помощью поливалентного лиганда. Таким образом, требуемые кон-
формационные перестройки в Fc-районе, судя по всему, возникают из-за огра-
ничения подвижности Fab-субъединиц, а не вследствие локальных конформа-
ционных изменений в аитигенсвязывающем центре, распространяющихся за-
тем последовательно от домена к домену. Для осуществления некоторых дру-
гих функций, например активации тучных клеток при связывании IgE с ре-
цепторами, специфцчными к Fc-району данного изотипа иммуноглобулинов,
сшивка, по-видимому, оказывается решающим сигналом [138]. Возможно, что
подобные эффекторные функции могут реализоваться другим способом по срав-
нению с тем, как происходит фиксация комплемента. Итак, несмотря на зна-
чительный прогресс, достигнутый за последние восемь лет, точный механизм,
с помощью которого антиген вызывает активацию эффекторных функций в
Fc-районе, не установлен.
23. Взаимодействие антиген—антитело
83
Благодарности
Мы весьма признательны Charles DeLisi, Elvin A. Kabat и Henry Metzger
за критический анализ рукописи и многочисленные полезные замечания, а
Fred Karush за ценные советы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kohler G., Milstein С. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined
specificity, Nature, 256, 495—497 (1975).
2. Melchers F., Potter MWarner N. C. Lymphocyte Hybridomas, Springer-Verlag, Berlin,
1978.
3. Kennett В. H., McKearn T. J., Bechtol К. B. Monoclonal Antibodies. Hybridomas:
A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, 1980.
4. Moore W. J. Physical Chemistry, 3rd ed., Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New Jersey,
1962.
5. DeLisi C. The biophysics of ligand-receptor interactions. Q. Rev. Biophys., 13, 201—230
(1980).
6. Fersht A. Enzyme Structure and Mechanism, W. H. Freeman and Co., New York, 1977.
7. Eisen H. N. Immunology, 2nd ed., Harper and Row, Hagerstown, Maryland, 1980.
8. Sachs D. H., Schechter A. N., Eastlake A., Anfinsen С. B. Inactivation of staphylococcal
nuclease by the binding of antibodies to a distinct antigenic determinant, Biochemistry,
11, 4268-4273 (1972).
9. Hammes G. G. Relaxation spectrometry of biological systems, Adv. Protein Chem., 23,
1-57 (1968).
10. Eisen H. N., Karush F. The interaction of purified antibody with homologous hapten.
Antibody valence and binding constant, J. Am. Chem. Soc., 71, 363—364 (1949).
11. Pinckard B. N. Equilibrium dialysis and preparation of hapten conjugates. In: Handbook
of Experimental Immunology, ed. by D. M. Weir, p. 17. 1. Blackwells, Oxford, 1978.
12. Scatchard G. The attractions of proteins for small molecules and ions, Ann. N.Y. Acad.
Sci., 51, 660-672 (1949).
13. Berzojsky J. A., Hicks G., Fedorka J., Minna J. Properties of monoclonal antibodies spe-
cific for determinants of a protein antigen, myoglobin, J. Biol. Chem., 255, 11188—
11191 (1980).
14. Bodbard D., Munson P. J., Thakur A. K. Quantitative characterization of hormone re-
ceptors, Cancer, 46, 2907—2918 (1980).
15. Thakur A. K., Jalle M. L., Bodbard D. Graphical analysis of ligand-binding systems:
Evaluation by Monte Carlo studies, Anal. Biochem., 107, 279—295 (1980).
16. Munson P. J., Bodbard D. LIGAND: A versatile computerized approach for characteri-
zation of ligand-binding systems, Anal. Biochem., 107, 220—239 (1980).
17. Bright D. S. On interpreting spectrophotometric measurements of two quinoline-DNA
complexes, Doctoral dissertation, Colorado State University, Fort Collins, Colorado, 1974.
18. Berzofsky J. A. The assessment of antibody affinity from radioimmunoassay, Clin. Chem.,
24, 419-421 (1978).
19. Pauling L., Pressman D., Grossberg A . L. Serological properties of simple substances.
VII. A quantitative theory of the inhibition by haptens of the precipitation of heterogeneous
antisera with antigens, and comparison with experimental results for polyhaptenic simple
substances and for azoproteins, J. Am. Chem. Soc., 66, 784—792 (1944).
20. Karush F. The interaction of purified antibody with optically isomeric haptens, J. Am.
Chem. Soc., 78, 5519-5526 (1956).
21. Thakur A. K., DeList C. Theory of ligand-binding to heterogeneous receptor populations:
Characterization of the free-energy distribution function, Biopolymers, 17, 1075—1089
(1978).
22. DeList C. Characterization of receptor affinity heterogeneity by Scatchard plots, Biopoly-
mers, 17, 1385—1386 (1978).
23. Thakur A. K., Munson P. J., Hunston D. L., Bodbard D. Characterization of ligand-
binding systems by continuous affinity distributions of arbitrary shape, Anal. Biochem.,
103, 240—254 (1980).
24. Sips B. On the structure of a catalyst surface, J. Chem. Phys., 16, 490—495 (1948).
25. Nisonoff A., Pressman D. Heterogeneity and average combining site constants of anti-
bodies from individual rabbits, J. Immunol., 80, 417—428 (1958).
26. Karush F., Karush S. S. Equilibrium dialysis. 3. Calculations. In: Methods in Immunology
84
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
and Immunochemistry, Vol. 3, ed. by C. A. Williams and M. W. Chase, pp. 389—393,
Academic Press, New York, 1971.
27. Klotz I. M. Protein interaction. In: The Proteins, Vol. 1, Part В 1st ed., edited by
H. Neurath and K. Bailey, pp. 727—806, Academic Press, New York, 1953.
28. Karush F. The affinity of antibody: range, variability, and the role of multivalence. In:
Comprehensive Immunology, Vol. 5, Immunoglobulins, ed. by G. W. Litman and
li. A. Good, pp. 85—116, Plenum Press, New York, 1978.
29. Crothers D. M., Metzger H. The influence of polyvalency on the binding properties of
antibodies, Immunochemistry, 9, 341—357 (1972).
30. Hornick C. L., Karush F. Antibody affinity-III. The role of multivalence, Immunoche-
mis'ry, 9, 325—340 (1972).
31. DeLisi C., Metzger H. Some physical chemical aspects of receptor-ligand interaction,
Immunol. Commun., 5, 417—436 (1976).
32. DeLisi C. The effect of cell size and receptor density on ligand-receptor reaction rate con-
stants, Mol. Immunol., 18. 507—511 (1981).
33. DeLisi C., Wiegel F. W. Effect of nonspecific forces and finite receptor number on rate
constants of ligand-cell bound-receptor interactions, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,
5569—5572 (1981).
34. Silhavy T. J., Szmelcman S., Boos W., Schwartz M. On the significance of the retention
of ligand by protein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 2120—2124 (1975).
35. Y alow R. S., Berson S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man, J. Clin.
Invest., 39, 1157—1175 (1960).
36. Chard T. An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques, North-Holland,
Amsterdam, 1978.
37. Rodbard D. Mathematics and statistics of ligand assays: An illustrated guide. In: Ligand
Assay: Analysis of International Developments on Isotopic and Nonisotopic Immuno-
assay, ed. by J. Langan and J. J. Clapp, pp. 45—101, Masson Publishing USA, New York,
1981.
38. Yalow R. Radioimmunoassay, Rev. Biophys, Bioeng., 9, 327—345 (1980).
39. Farr R. S. A quantitative immunochemical measure of the primary interaction between
I*BSA and antibody, J. Infect. Dis., 103, 239—262 (1958).
40. Desbuquois B., Aurbach G. D. Use of polyethylene glycol to separate free and antibody-
bound peptide hormones in radioimmunoassays, J. Clin. Endocrinol. Metab., 33, 732—738
(1971).
41. Berzofsky J. A. et al. Genetic control of the immune response to staphylococcal nuclease.
III. Time-course and correlation between the response to native nuclease and the response
to its polypeptide fragments, J. Exp. Med., 145, 111—122 (1977).
42. Kessler S. W. Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein-A-anti-
body adsorbent: Parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with pro-
tein A, J. Immunol., 115, 1617—1624 (1975).
43. Zollinger W. D., Dalrymple J. M., Artenstein M. S. Analysis of parameters affecting
the solid phase radioimmunoassay quantitation of antibody to meningococcal antigens,
J. Immunol., 117, 1788—1798 (1976).
44. Ekins R. P. Basic principles and theory, Br. Med. Bull., 30, 3—11 (1974).
45. Berzofsky J. A., Curd J. G., Schechter A. N. Probability analysis of the interaction of
antibodies with multideterminant antigens in radioimmunoassay: Application to the
amino terminus of the 0 chain of hemoglobin S, Biochemistry, 15, 2113—2121 (1976).
46. von Krogh M. Colloidal chemistry and immunology, J. Infect. Dis., 19, 452—477 (1916).
47. Rodbard D., Lewaid J. E. Computer analysis of radioligand assay and radioimmunoassay
data, Acta Endocrinol., 64 (Suppl. 147), 79—103 (1970).
48. Feldman II., Rodbard D. Mathematical theory of radioimmunoassay. In: Principles of
Competitive Protein-Binding Assays, ed. by W. D. Odell and W. H. Daughaday, pp. 158—
203, J. B. Lippincot, Philadelphia, 1971.
49. Rodhard D., Ruder II. J., Vaitukaitis J., Jacobs H. S. Mathematical analysis of kinetics
of radioligand assays: Improved sensitivity obtained by delayed addition of labeled ligand,
J. Clin. Endocrinol. Metab., 33, 343—355 (1971).
50. Voller A., Bidwell D., Bartlett A. Enzyme-linked immunosorbent assay. In: Manual of
Clinical Immunology, 2nd ed., edited by N. R. Rose and H. Friedman, pp. 359—371,
American Society of Microbiology, Washington, D.C., 1980.
51. Kohno Y., Berkower I., Minna J., Berzofsky J. A . Idiotypes of anti-myoglobin antibodies:
Shared idiotypes among monoclonal antibodies to distinct determinants of sperm whale
myoglobin, J. Immunol., 128, 1742—1748 (1982).
52. Yarchoan R., Murphy B. R., Strober W., Schneider H. S., Nelson D. S. Specific anti-
influenza virus antibody production in vitro by human peripheral blood mononuclear cells,
J. Immunol., 127, 2588—2594 (1981).
23. Взаимодействие антиген—антитело
85
53. Makela О., Karialainen К. Inherited immunoglobulin idiotypes of the mouse, Immunol.
Bev . :--A, 119 •!.% (1977).
54. Beriofsky J. A Schechter A. N. The concepts of cross-reactivity and specificity in immu-
nology, Mol. Immunol., 18, 751—763 (1981).
55. Young X. S., Curd J. G., Eastlake A., Furie B., Schechter A. N. Isolation of antibodies
specific to sickle hemoglobin by affinity chromatography using a synthetic peptide, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 72, 4759—4763 (1975).
56 Young /V. A.. Eastlake A ., Schechter A. N, The amino terminal region of the sickle hemo-
globin p chain. (J characterization of monospecific antibodies, J . Biol. Chem., 251, 6431—
6435 (1976).
5~ Card S. C., Young X , Schechter A, N. Antibodies to an amino terminal fragment of Ps
globin. IJ. Specificity and isolation of antibodies for the sickle mutation, J. Biol. Chem.,
251. 1290 — 1295 (1976).
58. Dean J., Schechter A. X. Sickle-cell anemia: Molecular and cellular bases of therapeutic
approaches, N. Engl. J. Med., 299, 752-763, 804-811, 863-870 (1978).
59. Sharon J., Kabat E. A., Morrison S. L. Immunochemical characterization of binding sites
of hybridoma antibodies specific for a (1 -+• 6) linked dextran, Mol. Immunol., 19, 375—
388 (1982).
60. Cisar J., Kabat E. A., Liao J., Potter M. Immunochemical studies on mouse myeloma
proteins reactive with dextrans or with fructosans and on human antilevans, J . Exp. Med.,
135, 159—179 (1974),
61. Johnston M F. M., Eisen H. N. Cross-reactions between 2,4-dinitrophenyl and menadione
(vitamin I\3) and the general problem of antibody specificity, J. Immunol., 117, 1189—
1196 (1976)'.
62. Talmadge D. Immunological specificity, Science, 129, 1643—1648 (1959).
63. inman J. K. Multispecificity of the antibody combining region and antibody diversity.
In: The Immune System: Genes, Receptors, Signals, ed. by E. E. Sercarz, A. R. William-
son, and C. F. Fox, pp. З’7- -52, Academic Press, New York, 1974.
64. Inman J. K. The aniibody «ombining region: Speculations on the hypothesis of general
multispecificity. In. Theoretics! Immunology, ed. by G. I. Bell, A. S. Perelson, and
G, H. Pimbley, Jr., pp. 243 -278, Marcel Dekker, New York, 1978.
65. Richards F. r. Konigsberg W. U., Rosenstein R. И7., Varga J. M. On the specificity of
antibodies. Science, 187, 130—137 (1975).
66. Goodman J. W. Antigenic determinants and antibody combining sites. In: The Antigens,
Vol. 3, ed. by M. Sola, pp. 127—187, Academic Press, New York, 1975.
67. Landsteiner K. The Specificity of Serological Reactions, Charles C. Thomas, Springfield,
Illinois (Harvard University Press, Cambridge, revised edition, 1945), 1936.
68. Landsteiner K., '<rnn her Scheer. Serological studies on azoproteins, Antigens containing
azo components v,ith aliphatic side chains, J. Exp. Med., 59, 751 — 768 (1934).
69. Pressman D., Grossberg A. L. The Structural Basis of Antibody Specificity, Benjamin,
New York, 1968.
70. Pressman L)S>egei MHall L. A . R. The closeness of fit of antibenzoate antibodies about
haptens and the orientation of the haptens in combination, J. Am. Chem. Soc., 76, 6336—
6341 (1954).
71. Karush F. The interaction of purified anti-p-lactoside antibody with haptens, J. Am.
Chem. Soc., 79. 3380-3384 (1957).
72. Eisen H. N.. Siskind G. W. Variation in affinities of antibodies during the immune res-
ponse, Biochemistry, 3, 996 (1964).
73. Kabat E. A. Structural Concepts in Immunology and Immunochemistry, 2nd ed., Holt,
Reinehart and Winston, New York, 1976.
74. J arm К., Westphal O. Microbial polysaccharides. In: The Antigens, Vol. 3, ed. by M. Sela,
pp. 1 —12a, Academic Press, New York, 1975.
75. Uchida T., Robbins I' W.. Luria S. E. Analysis of the serologic determinant groups of the
Salmonella E-group O-antigens, Biochemistry, 2, 663—668 (1963).
76. Springer G. F. Blood group and Forssman antigenic determinants shared between micro-
bes and mammalian cells. In: Progress in Allergy, Vol. 15, ed. by P. Kallos and В. H. Waks-
man, pp. 9—77. S. Karger, Basel. 1971.
77. Marcus D. M. The ABO and Lewis blood-groupsystem. Immunochemistry, genetics, and
relation to human disease, N. Eng. J. Med.. 280, 994—1006 (1969).
78. Watkins W. M. Biochemistry and genetics of the ABO, Lewis, and P blood group systems,
Adv. Hum. Genet., 10, 1 — 136 (1980).
79. Kabat E. A. The upper limit for the size of the human antidextran combining site, J.
Immunol., 84, 82—85 (1960).
80. Kabat E.A. The nature of an antigenic determinant, J. Immunol., 97, 1—11 (1966).
81. Cisar J., Kabat E. A Darner M. M., Liao J. Binding properties of immunoglobulin com-
86
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
bining sites specific for terminal or nonterminal antigenic determinants in dextran, J.
Exp. Med., 142, 435-459 (1975).
82. Sharon, J., Kabat E. A., Morrison S. L. Studies on mouse hybridomas secreting IgM or
IgA antibodies to a (1 -*• 6)-linked dextran, Mol. Immunol., 18, 831 — 846 (1981).
83. Sharon J., D’Hoostelaere L., Potter M., Kabat E. A., Morrison S. L. A cross-reactive idio-
type, QUPC 52 IdX, present on most but not all anti-a (1 6) dextran-specific IgM and
IgA hybridoma antibodies with combining sites of different sites, J. Immunol., 128, 498—
500 (1982).
84. Jerne N. K. Towards a network theory of the immune system, Ann. Immunol. (Inst.
Pasteur), 125C, 373-389 (1974).
85. Eichmann K. Expression and function of idiotypes on lymphocytes, Adv. Immunol., 26,
195-254 (1978).
86. Schlossman S. F., Yaron A., Ben-Efraim S., Sober H. A. Immunogenicity of a series of
a,N-DNP-L-lysines, Biochemistry, 4, 1638—1645 (1965).
87. Schlossman S. F., Levine H. Desensitization to delayed hypersensitivity reactions. With
special reference to the requirement for an immunogenic molecule, J. Immunol., 99,
111-114 (1967).
88. Van Vunakis H., Kaplan J., Lehrer H., Levine L. Immunogenicity of polylysine and poly-
ornithine when complexed to phosphorylated bovine serum albumin, Immunochemistry,
3, 393-402 (1966).
89. Sela M. Antigenicity: Some molecular aspects, Science, 166, 1365—1374 (1969).
90. Berzojsky J. A., Buckenmeyer G. K., Hicks G., Gurd F. B. N., Feldmann R. J., Minna J.
Topographic antigenic determinants recognized by monoclonal antibodies to sperm whale
myoglobin, J. Biol. Chem., 257, 3189—3198 (1982).
91. Koketsu J., Atassi M. Z. Immunochemistry of sperm-whale myoglobin-XVI: Accurate
delineation of the single region in sequence 1—55 by immunochemical studies of synthetic
peptides. Some conclusions concerning antigenic structures of proteins, Immunochemistry,
11, 1-8 (1974).
92. Dickerson R. E. X-ray analysis and protein structure. In: The Proteins, Vol. 2, 2nd ed.,
edited by H. Neurath, pp. 603—778, Academic Press, New York, 1964.
93. Takano T. Structure of myoglobin refined at 2.0 A. resolution. I. Crystallographic refine-
ment of metmyoglobin from sperm whale, J. Mol. Biol., 110, 537—568 (1977).
94. Feldman R. J., Bing D. H., Furie В. C., Furie B. Interactive computer surface graphics
approach to the study of the active site of bovine trypsin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,
5409-5412 (1978).
95. Sachs D. H., Schechter A. N., Eastlake A., Anjinsen С. B. An immunological approach to
the conformational equilibria of polypeptides, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 3790—
3794 (1972).
96. Crumpton M. J. Protein antigens: The molecular bases of antigenicity and immunogeni-
city. In: The Antigens, Vol. 2, ed. by M. Sela, pp. 1—79, Academic Press, New York,
1974.
97. Crumpton M. J., Wilkinson J. M. The immunological activity of some of the chymotryptic
peptides of sperm-whale myoglobin, Biochem. J., 94, 545—556 (1965).
98. Smith J. A., Hurrell J.G.R., Leach S.J. A novel method for delineating antigenic
determinants: Peptide synthesis and radioimmunoassay using the same solid support,
Immunochemistry, 14, 565—568 (1977).
99. Atassi M. Z. Antigenic structure of myoglobin: The complete immunochemical anatomy
of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins, Immunochemistry,
12, 423-438 (1975).
100. Berzojsky J. A., Buckenmeyer G. K., Hicks G., Killion D. J., Berkotver I., Kohno Y., Fla-
nagan M. A., Busch M. R., Feldmann R. J., Minna J., Gurd F. R. W. Topographic
antigenic determinants detected by monoclonal antibodies to myoglobin. In: Protein
Conformation as Immunological Signal, ed. by F. Celada, V. Shumaker, and E. E. Sercarz,
pp. 165—180, Plenum Press, New York, 1983.
101. Hurrell J. G. R., Smith J. A., Todd P. E., Leach S. J. Cross-reactivity between mamma-
lian myoglobins: Linear vs. spatial antigenic determinants, Immunochemistry, 14, 283—
288 (1977).
102. East I. J., Todd P. E., Leach S. J. On topographic antigenic determinants in myoglobins,
Mol. Immunol., 17, 519-525 (1980).
103. Maron E., Shiozawa C., Amon R., Sela M. Chemical and immunological characterization
of a unique antigenic region in lysozyme, Biochemistry, 10, 763—771 (1971).
104. East I. J., Hurrell J. G. R., Todd P. E. E., Leach S. J. Antigenic specificity of monoclonal
antibodies to human myoglobin, J. Biol. Chem., 257, 3199—3202 (1982).
105. Smith-Gill S. J., Wilson A. C., Potter M., Prager E. M., Feldmann R. J., Malnhart C. R.
23. Взаимодействие антиген—антитело
87
Mapping the antigenic epitope for a monoclonal antibody against lysozyme, J. Immunol.,
128, 314-322 (1982).
106. Arguilla E. R., Bromer W. W., Mercola D. Immunology conformation and biological
activity of insulin, Diabetes, 18, 193—205 (1969).
107. Lau H. K. F., Reichlin M., Noble R. W. Preparation of antibodies the? hind to HbF
but not to the isolated a and у subunits, Fed. Proc., 34, 975 (1975).
108. Benjamini E., Shimizu M., Young J. D., Leung C. Y. Immunochemical studies on the
tobacco mosaic virus protein. VII. The binding of octanoylated peptides of the tobacco
mosaic virus protein with antibodies to the whole protein, Biochemistry, 7, 1261—1264
(1968).
109. Urbanski G. J., Margoliash E. Topographic determinants on cytochrome c. 1. The complete
antigenic structures of rabbit, mouse, and guanaco cytochromes c in rabbits and mice,
J. Immunol., 118, 1170—1180 (1977).
110. Lando G., Berzofsky J. A,, Reichlin M. Antigenic structure of sperm whale myoglobin:
I. Partition of specificities between antibodies reactive with peptides and native protein,
J. Immunol., 129, 206—211 (1982).
111. White T. J., fbrahiml I. M., Wilson A. C. Evolutionary substitutions and the antigenic
structure of globular proteins, Nature, 274, 92—94 (1978).
112. Kabat E. A. The structural basis of antibody complementary, Adv. Protein Chem., 32,
1-76 (1978).
11 .3. Reichlin M. Amino acid substitution and the antigenicity of globular proteins, Adv. Immu-
nol., 20, 71-123 (1975).
114. Furie B., Schechter A. N., Sachs D. H., Anfinsen С. B. An immunological approach to
the conformational equilibria of staphylococcal nuclease, J. Mol. Biol., 92, 497—506
(1975).
115. Parker C. W. Spectrofluorometric methods. In: Handbook of Experimental Immunology,
Vol. 1, 3rd ed., edited by D. M. Weir, pp. 18.1—18.25, Blackwells, Oxford, 1978.
116. Haimovich J., Hurwitz E., Novik NSela M. Preparation of protein-bacteriophage conju-
gates and their use in detection of antiprotein antibodies, Biochim. Biophys. Acta 207,
115—124 (1970).
117. Heidelberger M., Kendall F. E. The precipitin reaction between type III pneumococcus
polysaccharide and homologous antibody, J. Exp. Med., 61, 563—591 (1935).
118. Heidelberger M., Kendall F. E. A quantitative theory of the precipitin reaction. II. A study
of an azoprotein-antibody system, J. Exp. Med., 62, 467—483 (1935).
119. Ouchterlony O., Nilsson L. A. Immunodiffusion and immunoelectrophoresis. In: Handbook
of Experimental Immunology, Vol. 1, 3rd ed., edited by D. M. Weir, pp. 19.1—19.44,
Blackwells, Oxford, 1978.
120. Mancini G., Carbonara A. O., Heremans J. F. Immunochemical quantitation of antigens
by single radial immunodiffusion, Immunochemistry, 2, 235—254 (1965).
121. Laurell C.-В., McKay E. J. Electroimmunoassay, Meth. Enzymol., 73, 339—369 (1981).
122. Herbert W. J. Passive haemagglutination with special reference to the tanned cell tech-
nique. In: Handbook of Experimental Immunology, ed. by D. M. Weir, p. 20.1, Black-
wells, Oxford, 1978.
123. Metzger H. Effect of antigen binding on the properties of antibody, Adv. Immunol., 18,
169-207 (1974).
124. Metzger H. The effect of antigen on antibodies: Recent studies. In: Contemporary Topics
in Molecular Immunology, Vol. 7, ed. by R. A. Reisfeld and F. P. Inman, pp. 119—152,
Plenum Press, New York, 1978.
125. Cathou R. E. Solution conformation and segmental flexibility of immunoglobulins. In:
Comprehensive Immunology, Vol. 5, Immunoglobulins, ed. by G. W. Litman and
R. A. Good, pp. 37—83, Plenum Press, New York, 1978.
126. Borsos T., Rapp H. J. Complement fixation on cell surfaces by 19S and 7S antibodies,
Science, 150, 505—506 (1965).
127. Rapp H. J., Borsos T. Forssman antigen and antibody: Preparation of water soluble anti-
gen and measurement of antibody concentration by precipitin analysis, by C'la fixation
and by hemolytic activity, J. Immunol., 96, 913—919 (1966).
128. Henney C. S., [shizaka K. Antigenic determinants specific for aggregated yG-globulins,
J. Immunol., 100, 718-725 (1968).
129. Schlessinger J., Steinberg I. Z., Gtvol D., Hochman J., Pacht I. Antigen-induced confor-
mational changes in antibodies and their Fab fragments studies by circular polarization of
fluorescence, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 2775—2779 (1975).
130. Pecht I., Ehrenberg B., Calef E., Arnon R. Conformational changes and complement activ-
ation induced upon antigen binding to antibodies, Biochem. Bophys. Res. Comm., 74,
1302-1310 (1977).
88
Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер
131. Brown J. С., Koshland М. Е. Evidence for a long-range conformational change induced
by antigen binding to IgM antibody, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5682—5686 (1977).
132. Brown J. CKoshland M. E. Activation of antibody Fc function by antigen-induced con-
formational changes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 5111—5115 (1975).
133. Chiang H.-С., Koshland M. E. Antigen-induced conformational changes in IgM antibody.
I. The role of the antigenic determinant, J. Biol. Chem., 254, 2736—2741 (1979).
134. Chiang H.-C., Koshland M. E. Antigen-induced conformational changes in IgM antibody.
II. The role of the carrier, J. Biol. Chem., 254, 2742—2747 (1979).
135. Ctrcolo A ., Borsos T. Lysis of hapten labelled cells by anti-hapten IgG and complement
effect of cell surface hapten density, J. Immunol., 128, 1118—1121 (1982).
136. Glennie M. J:, Stevenson G. I. Univalent antibodies kill tumour cells in vitro and in vivo,
Nature, 295, 712—714 (1982).
137. Hoffmann J. G. Antibodies as allosteric proteins. I. A hypothesis, Immunochemistry, 13,
725-73C (1976).
138. Metzger H. The IgE-mast cell system as a paradigm for the study of antibody mechanisms,
Immunol. Rev., 41, 186—199 (1978).
Глава 24
Комплемент
Эрик Дж. Браун, Кейт А. Джойнер, Майкл М. Фрэнк
(Eric J. Brown, Keith A. Joiner, Michael M. Frank)
Комплементом называют большую группу взаимодействующих между со-
бой белков и гликопротеинов крови, имеющихся у всех позвоночных. Эти бел-
ки участвуют в воспалительных процессах, опсонизируют чужеродные мате-
риалы для их последующего фагоцитоза и опосредуют непосредственное унич-
тожение различных клеток и микроорганизмов. Первые данные о существова-
нии системы комплемента были получены в конце девятнадцатого века при
изучении механизма защиты организма от проникающих в него бактерий и
механизма уничтожения чужеродных клеток, введенных в кровь [1 — 3]. Эти
исследования показали, что в ответ на проникновение микроорганизмов или
введение чужеродных клеток организм отвечает образованием антител, спо-
собных агглютинировать in vitro использованные для иммунизации микроор-
ганизмы или чужеродные клетки, не вызывая при этом их гибели. Было обна-
ружено, что гибель клеток может вызывать добавление свежей сыворотки к
смеси, содержащей и специфичные антитела. Важное значение этого свойства
свежей сыворотки было сразу осознано, что послужило толчком для ряда ис-
следований, направленных на изучение биохимических и биологических при-
чин такого явления, как лизис клеток.
Исследования последующих нескольких десятилетий продемонстрирова-
ли сложность механизма лизиса. Очень скоро стало ясно, что присутствующий
в свежей сыворотке лизирующий материал — не какое-то однородное вещест-
во. Даже простые химические методы, доступные в то время, позволяли раз-
делить его на несколько компонентов. Например, при диализе сыворотки про-
тив воды лизирующий материал разделялся на осаждаемую фракцию эугло-
булинов и растворимую фракцию псевдоглобулинов. Ни одна из этих фракций
не обладала литической активностью, но при объединении фракций активность
восстанавливалась. Борде (Bordet) назвал взаимодействующие между собой
вещества, вызывающие цитотоксическую реакцию, общим термином алексин,
а Эрлих (Ehrlich) — комплементом (см. [2]). Хотя вначале некоторые иссле-
дователи сомневались в том, что приводящие к лизису реакции следуют прос-
тым химическим законам, вскоре стало очевидным, что это действительно так
и что могут быть разработаны экспериментальные системы, позволяющие де-
тально анализировать эти биохимические события. Многие экспериментальные
модели, разработанные в начале нашего столетия, используются до сих пор и
некоторые из них следует рассмотреть подробно.
В то время исследователи пытались разработать такую систему in vitro,
которая позволяла бы им анализировать все реакции, участвующие в вызывае-
мой комплементом гибели клеток. Они сравнивали эритроциты многих видов
животных для того, чтобы выяснить, какие из них легче всего лизируются ан-
тителами и комплементом. Бараньи эритроциты оказались особенно удобными
90 Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
в этом отношении, так как после обработки антителами они обладали очень
высокой чувствительностью к литическому действию комплемента. Было также
обнаружено, что на поверхности бараньих эритроцитов имеется сильный анти-
ген липополисахаридной природы (названный антигеном Форссмана) [4], к
которому легко можно было получить кроличьи антитела с высоким титром.
Вообще говоря, в качестве источника комплемента можно использовать сыво-
ротку любых млекопитающих, но литическая активность значительно разли-
чается у разных видов. Оказалось, что из доступных сывороток наибольшей
литической активностью обладает свежая сыворотка морских свинок. Поэтому
для изучения комплемента обычно использовалась тест-система, в которой
бараньи эритроциты обрабатывали кроличьими антителами и исследовали их
лизис в свежей сыворотке морских свинок. Со временем стало возможным по-
лучать покрытые антителами эритроциты барана, несущие на всей поверхнос-
ти разнообразные компоненты комплемента. Это позволило исследовать вза-
имодействие каждого вновь найденного белка комплемента с клетками, нахо-
дящимися на соответствующей промежуточной стадии комплементзависимого
лизиса. Вначале усилия исследователей были обращены почти исключительно
на изучение событий, происходящих при лизисе покрытых антителами эрит-
роцитов барана. Эта последовательность событий составляет классический ме-
ханизм действия комплемента. Позднее было установлено, что в лизисе бакте-
рий, происходящем в присутствии или в отсутствие антител, часто может уча-
ствовать другой набор тесно взаимодействующих между собой белков, обу-
Таблица 24.1. Изученные компоненты комплемента
Мол. масса Концентрация в сыворотке, мкг/мл Структура
Классический путь
Clq 410 000 70 6X3 цепей
Clr 190 000 34 2 цепи
Cis 85 000 31 2X1 цепи
С2 117 000 25 1 цепь
С4 206 000 600 а, 0, у
СЗ 195 000 1200 а, 0
Альтернативный путь 95 000 225
Фактор В 1 цепь
Фактор D 25 000 1 1 цепь
Пропердин 190000 25 4 идентичных цепи
СЗЬ 185 000 образуется из СЗ а', 0
Белки, атакующие мембрану 180 000 85
С5 а, 0
С6 128 000 60 1 цепь
С7 120 000 55 1 цепь
С8 150 000 55 а, 0, У
С9 79 000 60 1 цепь
Регуляторные белки 105 000 180
C1EI 1 цепь
С4Ьр 560 000 ? 8 идентичных цепей
Фактор Н (глобулин 01Н) 150000 500 1 цепь
Фактор I (инактиватор СЗЬ/С4Ь) 90 000 34 а, 0
Белок S 80 000 600 1 цепь
24. Комплемент
91
Кл<сскчвский механизм
Активирующий сигнал
,Ч.С4а
С14
S<2b
С142
(Защищающие''
участки поверхности
Б
Р
х- СЗЬВЬР---------ч
Петля амплификации
СЗЬ
С6.С7
С8.С9
Альтернативный механизм
sr----х-СбЬ-9
у Комплекс,
С5а атакующий
мемвраиу
В
Рис. 24.1. Общая схема активации комплемента. Ингибиторы активации не показаны.
словливающих альтернативный механизм действия комплемента. Эти два ме-
ханизма активации конвергируют на этапе активации СЗ и более поздних ли-
тических компонентов в каскаде реакций комплемента (табл. 24.1).
Как будет более подробно рассказано ниже, на ранних этапах классичес-
кого механизма выявляется формирование комплексов антиген-антитело. В
результате образуются ферменты, обладающие активностью сериновых про-
теиназ, которые расщепляют и тем самым активируют СЗ. Белки альтернатив-
ного механизма приводят к тому же конечному результату, хотя и с более мед-
ленной кинетикой активации. Расщепленный СЗ (СЗЬ) соединяется с расщеп-
ляющими СЗ ферментами как классического, так и альтернативного механиз-
ма, и образующийся комплекс расщепляет С5. Расщепленный С5 (С5Ь) взаи-
модействует с остальными компонентами; С6, С7, С8 и С9, — и эти пять терми-
нальных компонентов комплемента, действуя согласованно, осуществляют
лизис клетки. Общая схема активации комплемента представлена на рис. 24.1.
24.1. Классический механизм активации комплемента
24.1.1. Роль иммуноглобулина
Инициация классического механизма происходит при связывании С1, пер-
вого компонента каскада, с комплексом антиген—антитело с последующей ак-
тивацией связанного с антителом С1. Эти реакции были исследованы очень
подробно. Связывать С1 и инициировать классический механизм могут не все
классы антител. Антитела классов IgG и IgM обладают такой способностью,
а антитела классов IgE, IgD и IgA — нет. При некоторых условиях IgA по-
давляют активацию комплемента антителами IgG [5]. Исследования во многих
тест-системах показали, что одна молекула IgM, соединенная с клеткой или
частицей, несущей определенный антиген, способна связать одну молекулу
С1, зимоген-протеиназы [6J. Однако процессы связывания С1 с антителом и
92
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. Л/. Фрэнк
активации С1, т.е. его превращения в эстеразу, способную расщеплять С4 и
С2, не эквивалентны между собой. Недавно было обнаружено, что для актива-
ции С1 молекула антитела IgM должна быть связана с поверхностью антигена
более чем одним своим активным центром [7]. Этот вывод был сделан на основе
результатов, полученных при изучении связывания и активации С1 на поверх-
ности бараньих эритроцитов, покрытых различным количеством гаптена ме-
тотрексата. Было показано, что антитела к метотрексату класса IgM и G1 мо-
гут связываться с клетками и при низких количествах гангона, но активации
комплемента при этом не происходит. При увеличении количества гаптена
процесс активации комплемента усиливается несмотря на то, что количество
связанных молекул IgM и С1 изменяется незначительно. Отсюда можно сде-
лать вывод, что при увеличении числа участков связывания одиночной моле-
кулы IgM, взаимодействующих с расположенным на клетке антигеном, проис-
ходит конформационное изменение антитела, приводящее к активации С1.
В большинстве исследованных модельных систем для связывания и акти-
вации С1 необходимо наличие двух соседствующих (пары) молекул IgG [8].
Необходимость образований пары IgG делает эффективность вызываемой ими
активации классического механизма значительно ниже, чем у IgM. В боль-
шинстве экспериментальных систем лизиса необходимы сотни и тысячи моле-
кул IgG, пока две молекулы случайно не окажутся достаточно близко и не
образуют пару. Если распределение молекул антигена на поверхности не поз-
воляет двум молекулам IgG оказаться достаточно близко друг к другу, то они
вообще не могут активировать комплемент. Активацию классического меха-
низма способны осуществлять антитела не всех подклассов IgG. У человека
IgG 1, IgG2 и IgG3 активируют классический механизм, a IgG4 — нет. У мыши
активаторами являются IgG2a, IgG2b и IgG3, а у морской свинки — IgG2.
Неизвестно, вызывает ли связывание антитела IgG с субстратом структур-
ную перестройку антитела, повышающую его аффинность (сродство) к С1.
Связывание С1 с прикрепленными к поверхности парами IgG может быть
просто следствием кооперативности процесса связывания. Показано, что мо-
номер IgG способен, хотя и слабо, взаимодействовать с нативным С1 [9]. Клас-
тер тесно объединенных молекул IgG может обеспечивать множественность
точек прикрепления С1, стабилизируя тем самым комплекс IgG-Cl. Связывание
С1 происходит путем его прикрепления к СН2-домену Fc-района молекулы
IgG [10]. Прикрепление осуществляется ионным взаимодействием, но точный
характер связывания неизвестен.
В сыворотке С1 находится в виде трехсубъединичной макромолекулы, при-
чем связывание субъединиц между собой происходит только в присутствии
ионов кальция. Субъединица, связывающаяся с комплексом антиген—антитело
через СНа-домен антитела, называется Clq. Ее мол. масса равна примерно 400
кДа, и она состоит из 18 полипептидных цепей: три типа цепей по шесть копий
каждой на молекулу. В белке можно различить центральную сердцевину и
шесть расходящихся лучей, каждый из которых заканчивается похожей на
стручок глобулярной структурой (рис. 24.2). Лучи имеют трехспиральное
строение, похожее на структуру коллагена, и могут расщепляться бактериаль-
ными коллагеназами. Как и коллаген, Clq богат глицином, гидроксилизином
и гидроксипролином. Связывание Clq с СН2~домеяом антитела происходит с
помощью похожих на стручок концов каждого луча. В принципе каждый из
лучей Clq может связаться с СН2-доменом; предполагается, что для прочного
связывания необходимо несколько точек контакта Clq с антителом. В сыворот-
ке Clq обнаруживается в комплексе с двумя другими субъединицами С1:С1г и
Cis. Каждая из этих субъединиц построена из двух идентичных цепей. Цепи
24. Комплемент.
93
Clr имеют мол. массу 95 кДа, а цепи Cis — 87 кДа 111]. После прикрепления
макромолекулярной зимогенной формы С1 к комплексу антиген-антитело про-
исходит ферментативная активация и С1 становится активной сериновой про-
теиназой. Известно, что активация связана с расщеплением каждой из цепей
С1г и Cis на тяжелые и легкие цепи. При этом на каждой из этих субъединиц
появляется активный центр. Cis расщепляется на две тяжелые цепи массой
Рис. 24.2. Электронная микрофотография
молекулы Clq. Центральная субъединица
кажется разделенной вдоль на две части.
Периферические субъединицы имеют длину
65 А, а центральная субъединица — 105 А.
([165]; печатается с разрешения).
59 кДа и две легкие цепи массой 28 кДа; С1г расщепляется на две тяжелые
цепи массой 60 кДа и две легкие цепи весом 35 кДа [12]. Известно также, что
активированный in vitro Clr способен расщеплять и активировать Cis. Акти-
вированный Cis обладает более широкой ферментативной специфичностью,
и именно он представляет собой сывороточный фермент, расщепляющий и С4,
и С2. Механизм активации Clr и Cis при связывании с Clq пока не изучен.
Одно из предположений заключается в том, что при связывании в молекуле
С1 происходит конформационная перестройка. Механизм расщепления Cis
под действием Clr также неизвестен. Одни исследователи предполагают, что
активированный Clr расщепляет полипептидные цепи Cis, расположенного
в той же молекуле С1; другие думают, что протеолиз Cis под действием Clr —
это межмолекулярное событие, для которого необходимо тесное сближение
двух молекул С1 на активирующей поверхности [13].
94
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
Убедительно показано, что некоторые вещества способны связывать и ак-
тивировать С1 в отсутствие специфических антител. К таким неиммунологи-
ческим активаторам относятся столь различные вещества, как С-реактивный
белок острой фазы, кристаллы мононатриевой соли мочевой кислоты, комплек-
сы гепарина и протамина, некоторые бактериальные гликолипиды. Более того,
многие протеиназы могут вызывать расщепление белков комплемента, в том
числе и Cis. Показано, например, что при активации плазмина по фибрино-
литическому пути активируется также С1. Неиммунологическая активация
С1 может вызывать активацию всего каскада реакций комплемента.
24.1.2. С4
Связывание и активация С1 приводит к образованию фермента Cl-эсте-
разы, способной взаимодействовать со вторым белком каскада, С4, и расщеп-
лять его. С4 построен из трех соединенных между собой дисульфидными свя-
зями полипептидных цепей, названных а, р и у и имеющих мол. массу 93,
78 и 33 кДа соответственно. Этот белок синтезируется в виде одноцепочечного
предшественника, и его трехцепочечная структура возникает уже после тран-
сляции [14]. При взаимодействии С4 с Cis происходит расщепление а-цепи
и образуется небольшой фрагмент С4а (9 к Да) и крупный фрагмент С4Ь, про-
должающий каскад комплемента. В отличие от С1 С4Ь связывается с активи-
рующей поверхностью ковалентной связью [15] примерно по тому же меха-
низму, что и СЗЬ (см. ниже). Антитело со связанным с ним активным С1 рас-
щепляет множество молекул С4 и на активирующей поверхности вокруг ан-
титела и С1 образуется кластер прикрепленных молекул С4. В результате на
этом этапе классического механизма активации происходит усиление сигнала.
Гемолитической активностью обладают не все прикрепившиеся молекулы С4
[16]. Каскад комплемента продолжают лишь те молекулы, которые связыва-
ются с комплексом антитела с С1 или рядом с ним. Однако практически все
молекулы С4Ъ, расположенные на клеточной поверхности, способны взаимо-
действовать со специфическими рецепторами клеток хозяина, узнающими этот
фрагмент (см. разд, о рецепторах). Связывание С4Ь с некоторыми частицами
может непосредственно изменять их биологическую активность. Например,
при прикреплении множества молекул С4 к поверхности некоторых вирусов
происходит их нейтрализация: предотвращается их связывание с соответст-
вующими клетками-хозяевами [17].
24.1.3. С2
Третий белок, участвующий в классическом механизме активации комп-
лемента, — это С2. Его молекула представляет собой одну полипептидную
цепь массой 117 кДа, способную связываться с С4Ь. В присутствии ионов
Mg2+ С2 прикрепляется к С4Ь и расщепляется активированными С1. При этом
образуется два фрагмента. Меньший фрагмент С2Ь (мол. масса 30 кДа) отщеп-
ляется от молекулы, а больший фрагмент С2а остается связанным с С4Ь и про-
должает каскадный процесс. Комплекс С2а и С4Ь приобретает новую фермен-
тативную активность — способность взаимодействовать с СЗ и расщеплять его.
Активный центр фермента, также представляющего собой сериновую протеи-
назу, расположен на С2а-части молекулы. С4Ь в этом комплексе связывает
молекулу СЗ и делает ее болео доступной для протеолитического действия С2а.
Комплекс С4Ь2а, представляющий собой СЗ-конвертазу в классическом меха-
низме активации, нестоек и подвергается распаду. При этом фрагмент С2а
переходит в жидкую фазу а теряет ферментативную активность. С4Ь остается
24. Комплемент
95
на поверхности, несущей антиген, и может вновь связать молекулу С2, которая
после расщепления под действием С1 становится СЗ-конвертазой 118].
Описанные выше ранние этапы классического механизма активации на-
ходятся под контролем многих регуляторных белков.
24.1.4. Ингибитор С1-эстеразы
Ингибитор Cl-эстеразы (ИС1Э) представляет собой одноцепочечный гли-
копротеин сыворотки массой 105 кДа с чрезвычайно высоким содержанием
углеводов (около 35 — 40%). Этот белок связывается с активными центрами
активированных Clr и Cis и подавляет их протеиназную активность. Посколь-
ку в молекуле С1 содержится два эстеразных центра Clr и два эстеразных
центра Cis, то одна молекула активированного С1 может в принципе про-
реагировать с четырьмя молекулами ингибитора Cl-эстеразы. Считается,
что связывание ингибитора С1 с активированным С1 приводит к диссоциа-
ции молекулы С1. При этом образуются 98-комплексы, состоящие из Clr, Cis
и двух молекул ИС1Э [19]. Хотя предполагается, что молекулы в этом ком-
плексе удерживаются нековалентными связями, он чрезвычайно стоек и
выдерживает кипячение в присутствии додецилсульфата натрия. Интересно,
что при связывании Clr с ингибитором С1 он теряет свои антигенные свойства
по отношению к большинству антисывороток к Clr. Таким образом, появление
расщепленных полипептидных цепей Clr и Cis на электрофореграмме и исчез-
новение обнаруживаемого иммунологически Clr позволяет следить за кине-
тикой активации С1 и его ингибирования [20]."
24.1.5. С4-связывающий белок
С4Ь и СЗ-конвертаза классического механизма С4Ь2а также находятся
под регуляторным контролем. С4Ь может расщепляться специальным фермен-
том, инактиватором C3b/4b (фактор I), контролирующим несколько этапов
каскада комплемента. Фактор I, однако, не способен расщеплять С4Ь, находя-
щийся в жидкой фазе, в отсутствие кофактора, С4-связывающего белка (С4Ьр)
[21]. Этот гликопротеин, по данным электрофореза, в полиакриламидном геле
в присутствии додецилсульфата натрия имеет кажущуюся мол. массу 560 кДа,
а в восстанавливающих условиях распадается на полипептидные цепи с мас-
сой около 70 кДа. Связывание C4bp с С4Ь дает возможность фактору I расщеп-
лять С4Ь, находящийся в жидкой фазе. Интересно, что для расщепления под
действием фактора I С4Ь, ковалентно связанного с мембраной эритроцита,
С4Ьр не является необходимым кофактором. Связываясь с C4b, С4Ьр ускоряет
также диссоциацию комплекса С4Ь2а, ускоряя тем самым распад СЗ-конвер-
тазы классического механизма. В присутствии С4Ьр (жидкая фаза) или без
С4Ьр (на клеточной поверхности) фактор I расщепляет только а'-цепь С4. На
а'-цепи имеется два участка расщепления. В результате протеолиза по обоим
участкам образуется три фрагмента (47, 25 и 17 кДа). После первого расщепле-
ния образуются обычно фрагменты массой 72 и 17 кДа. При этом их отделения
от молекулы С4Ь не происходит [22]. После второго расщепления образуется
фрагмент 47 кДа (а2, C4d), который спонтанно отделяется от остальной моле-
кулы. Два других фрагмента a-цепи связаны дисульфидными связями с |3-
или "^-цепями [23]. Фрагмент а2 включает в себя тот участок молекулы С4,
I который связывается с активирующей поверхностью. Поэтому в результате
действия фактора I на прикрепленный к поверхности С4 от него отделяется
четырехцепочечная молекула (alt а3, fJ, у) массой 146 кДа, известная как С4с,
a C4d остается ковалентно связанным с поверхностью.
96
Э. Дж. Браун, К. А. Д жойнер, М. М. Франк
24.2. Альтернативный механизм активации комплемента
24.2.1. История вопроса
Альтернативный механизм активации комплемента был описсн в 1954 г.
Луисом Пиллемером и его сотрудниками в университете Кэйз Вестерн Резерв.
Они исследовали процесс инактивации СЗ и компонентов комплемента, дейст-
вующих на поздних этапах, под действием клеточных стенок дрожжей. Они
показали, что препарат нерастворимых клеточных стенок дрожжей, зимозан
[24], способен полностью инактивировать СЗ в ходе инкубации его с сыворот-
кой при 37°С, никак при этом не влияя на титры Cl, С4 или С2 [25]. Процесс
инактивации характеризовался всеми свойствами ферментативной реакции
и требовал факторов, которые можно было удалить из сыворотки, инкубируя
ее предварительно с зимозаном при 17°С. Эти факторы отличались от антител,
так как для их адсорбции из сыворотки были необходимы ионы Mg2+, темпера-
тура выше 10°С, pH от 6,5 до 8,2 и низкая ионная сила. На основе этих данных
было высказано предположение, что инактивация СЗ обусловлена каким-то
ранее неизвестным механизмом ферментативной активации комплемента, на-
званным системой пропердина. Те же авторы показали, что эта система играет
важную роль в бактерицидных реакциях сыворотки, в нейтрализации виру-
сов. а также в кислотном лизисе эритроцитов у больных пароксизмальной ноч-
ной гемоглобинурией. К сожалению, впоследствии обнаружилось, что в сыво-
ротке содержатся естественные антитела к зимозану, и из этого был сделан
вывод, что данные Пиллемера отражают лишь активацию классического ме-
ханизма под действием предсуществовавших антител [26]. В результате, фун-
даментальные открытия Пиллемера и его коллег были забыты, пока деся i is ле-
тнем позже не был вновь открыт альтернативный механизм активации компле-
мента. Этому способствовали исследования взаимодействия комплемента с бак-
териальным липополисахаридом [27, 28] и ух-антителами морской свинки про-
тив ДНФ [29—33]. Из этих исследований был сделан тот же вывод, ^то и на
15 лет раньше Пиллемером, а именно что расщепление СЗ может вызываться
целым рядом веществ и при этом не происходит заметной активации Cl, С4 и
С2. Обнаружение в 1970 г. морских свинок, лишенных С4, у которых актива-
ция комплемента могла происходить только по альтернативному механизму,
убедительно показало, что ни одно из описанных явлений не связано с исполь-
зованием небольших количеств действующих на ранних этапах компонентов,
и позволило систематически исследовать биологические последствия активации
по альтернативному механизму [34—37]. Изучение биохимической основы аль-
тернативного механизма активации началось с выделения в 1971 г. Гетце и
Меллер-Эберхардом проактиватора СЗ (называемого сейчас фактором В).
24.2.2. Белки альтернативного механизма
Считается, что в инициации и контроле активации по альтернативному ме-
ханизму участвует шесть белков нормальной сыворотки. Это — фактор В, фак-
тор В, пропердин, фактор Н (|31Н), фактор I (инактиватор С4Ь/СЗЬ) и сам СЗ.
Для того, чтобы сделать понятным процесс их взаимодействия между собой,
необходимо описать биохимические свойства этих белков.
24. Комплемент
97
24.2.2.1. Фактор D
Фактор D — это одноцепочечный гликопротеин с мол. массой 23 кДа.
В составе сыворотки он имеет электрофоретическую подвижность а-глобулина,
но в очищенном виде он обладает подвижностью у-глобулина. В сыворотке
этот белок присутствует в следовых количествах (4-10-8—8-10-8 М), и его низ-
кая концентрация может ограничивать скорость сборки СЗ-конвертазы альтер-
нативного механизма СЗЬВЬ. Фактор D находится в крови в виде активного
фермента [39], но он не гидролизует синтетические эфиры и мало чувствителен
к диизопропилфторфосфату (ДФФ) [40]. Он не обладает активностью и по от-
ношению к своему природному субстрату фактору В, пока последний не свя-
жется с СЗЬ. Тем не менее по последовательности фактор гомологичен другим
сериновым протеиназам плазмы [41]. По всей видимости, фактор D способен
осуществлять протеолиз фактора В только после того, как в результате связы-
вания с СЗЬ обнажится участок расщепления на факторе В. Этот участок уз-
нается относительно мало доступным активным центром фактора D.
24.2.2.2. Фактор В
Фактор В — это одноцепочечная р-глобулиновая зимогеновая сериновая
протеиназа с мол. массой 93 кДа. Он присутствует в сыворотке в концентрации
около 2-10-6 М (200 мкг/мл). При расщеплении фактора В под действием фак-
тора D образуется два фрагмента: меньший фрагмент массой 30 кДа, назван-
ный Ва, и больший фрагмент весом 63 кДа (ВЬ), содержащий открытый эстеро-
литический центр. В отличие от С4а, СЗа и С5а для Ва биологическая актив-
ность пока неизвестна. Интересно, что, в отличие от других продуктов расщеп-
ления, Ва не имеет а-спиральной структуры [42]. Фактор В во многом похож
на С2: по размеру, строению, фрагментам расщепления, природному субст-
рату [СЗ] и механизму действия. Кроме того, он кодируется геном, тесно сцеп-
ленным с геном С2 в хромосоме 6 (у человека) примерно в 5 сантиморганидах
от гена HLA-D [43]. По-видимому, гены фактора В и С2 возникли в результате
дупликации одного гена.
24.2.2.3. Пропердин
Пропердин (от лат. perdere — разрушать) — белок, с помощью которого
был обнаружен альтернативный механизм активации комплемента; он пред-
ставляет собой у-глобулин с мол. массой 220 кДа и состоит из четырех практи-
чески идентичных субъединиц, соединенных друг с другом нековалентными
связями [44]. Его концентрация в сыворотке составляет около 25 мкг/мл.
Пропердин существует в двух формах: нативной (пР) и активированной (Р),
различающихся между собой, по всей видимости, небольшими конформацион-
ными изменениями [45]. пР может связываться с образовавшей комплекс СЗ/С5-
конвертазой альтернативного механизма (СЗЬВЬ), но не с одиночными моле-
кулами СЗЬ. Его роль заключается в уменьшении скорости распада конвер-
тазы — тем самым он усиливает активацию по альтернативному механизму.
Р может дополнительно связываться с СЗЬ, расположенным на частицах или
в жидкой фазе в отсутствие фактора В. Вследствие этого он ускоряет сборку
СЗЬВЬ. В некоторых условиях он даже может связываться непосредственно
с неактивированными поверхностями и тем самым инициировать активацию по
альтернативному механизму [46]. Факторы, регулирующие превращение пР
4-0395
98
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
в Р, практически неизвестны. В очищенных белковых препаратах наблюдалось
спонтанное превращение пР в Р. После инкубации сыворотки с активаторами
альтернативного механизма с их поверхности элюируется пропердин в фор-
ме Р. Обратного спонтанного превращения Р в пР не наблюдается, но сообща-
лось, что это происходит после инкубации белка с гуанидином.
24.2.2.4. Фактор Н (/31Н)
Фактор Н — это одноцепочечный пептид с электрофоретической подвиж-
ностью р-глобулина и мол. массой 150 кДа. Его концентрация в сыворотке со-
ставляет около 500 мкг/мл (3-10~e М) [47]. В отличие от белков, описанных вы-
ше, факторов D и В, а также пропердина, которые осуществляют сборку СЗ/С5-
конвертазы альтернативного механизма, функция фактора Н — подавлять рас-
щепление СЗ путем ускорения диссоциации ВЬ от СЗЬ. Таким образом, этот
белок подавляет активность СЗ-конвертазы альтернативного механизма. Фак-
тор Н служит также необходимым кофактором фактора I при инактивации
СЗЬ. Связывание Н с СЗЬ не требует каких-либо катионов и возрастает при
низкой ионной силе [48]. Он может связываться с СЗЬ, расположенным на по-
верхности или в жидкой фазе, хотя их аффинность и зависит от характера хи-
мического окружения СЗЬ. Как будет объяснено ниже, эти различия в срод-
стве Н и СЗ, возможно, играют наиболее важную роль в том, почему одни час-
тицы активируют альтернативный механизм, а другие нет.
24.2.2.5. Фактор I (инактиватор СЗЬ/С4Ь)
Фактор I — это гликопротеин с электрофоретической подвижностью (3-
глобулина и мол. массой 90 кДа. Он построен из двух полипептидных цепей
массой 40 и 50 кДа, соединенных между собой дисульфидными связями. Фак-
тор I превращает СЗЬ в C3bi, внося по крайней мере один, а возможно, и два
разрыва в сс-цепь СЗ [49]. Активный центр расположен на легкой цепи массой
40 кДа, и не ингибируется ДФФ, ингибитором трипсина из соевых бобов, то-
зил-Ь-лизилхлорметилкетоном (ТЛХК), бензамидином или фенилметилсульфо-
нилфторидом (ФМСФ). Тем не менее анализ его последовательности выявил
высокую степень гомологии с другими сериновыми протеиназами [50, 51].
По-видимому, активность данного фермента контролируется конформацион-
ными изменениями его субстратов (СЗЬ или С4Ь), осуществляемыми необходи-
мыми кофакторами (фактор Н или С4-связывающий белок). Описанные изме-
нения, очевидно, обнажают участок ферментативного расщепления, что ана-
логично механизму ферментативной активности фактора D по отношению к фак-
тору В.
24.2.2.6. СЗ
СЗ играет центральную роль как в классическом, так и в альтернативном
механизмах активации. Поэтому на нем были сосредоточены усилия многих
исследователей комплемента. СЗ человека представляет собой гликопротеин
с электрофоретической подвижностью а-глобулина и мол. массой 195 кДа.
Он состоит из двух цепей: одна массой 120 кДа (a-цепь), а другая — 75 кДа
((3-цепь), причем углеводы расположены на обеих цепях. Концентрация СЗ
в сыворотке составляет 1—2 мг/мл (7,5 • 10~3 М). При его расщеплении как СЗ-
конвертазой классического механизма (С4Ь2а), так и СЗ-конвертазой альтер-
нативного механизма (СЗЬВЬ) a-цепь распадается на два неравных фрагмента,
24. Комплемент.
99
больший из которых остается ковалентно соединен дисульфидными связями
с Р-цепью. Этот комплекс, называемый СЗЬ, имеет мол. массу 185 кДа. Мень-
ший фрагмент, СЗа, включает 77 N-концевых аминокислот а-цепи [52]. Он ока-
зывает разнообразные воздействия на клетки, имеющие к нему рецепторы, на-
пример на лимфоциты, тучные клетки и эндотелиальные клетки. При превра-
щении СЗ в СЗЬ происходит сложная перестройка пространственной структуры
молекулы [53], при которой обнажается внутримолекулярная тиоэфирная
связь в а-цепи [54, 55]. Эта связь находится в таком участке а-цепи,
C3d, который присоединяется к поверхностям, активированным компле-
ментом. Она соединяет цистеин в положении 23 C3d с глутаминовой кисло-
той в положении 26 [56] (рис. 24.3). Этот участок а-цепи гомологичен пептиду
О
Рис. 24.3. В домене C3d молекулы СЗ имеет-
ся внутренняя тиоэфирная связь. Удалось
определить аминокислотную последова-
тельность этого участка [33]. Цистеин (по-
ложение 23) связан тиоэфирной связью
с глутаминовой кислотой (положение 26).
а-2-макроглобулина, другого сывороточного белка, в функционировании ко-
торого внутренняя тиоэфирная связь также играет важную роль. Обнаженная
тиоэфирная связь СЗЬ может быть разорвана в результате взаимодействия
с альдегидными и карбоксильными группами, азотными нуклеофилами или
даже с водой, что приводит к образованию новой ковалентной связи между
СЗЬ и группой-донором электронной пары. Похоже, что предпочтительным яв-
ляется образование эфирной связи с частицами, такими как эритроциты или
зимозан [57]. В результате активации СЗ и последующего расщепления тио-
эфирной связи возникает новая сульфгидрильная группа [58, 59]. Поскольку
вода также может гидролизовать тиоэфир и обычно находится в огромном мо-
лярном избытке по сравнению с другими потенциальными донорами электро-
нов, процесс связывания СЗЬ с поверхностями частиц мало эффективен. Вообще
говоря, на одну молекулу СЗЬ, связавшуюся с активированной комплементом
поверхностью, должно приходиться множество молекул, у которых тиоэфир-
ная связь провзаимодействовала с водой. Однако недавно было показано, что
некоторые аминокислоты и простые сахара являются преимущественными ак-
цепторами молекул СЗЬ, если превращение СЗ в СЗЬ вели в их присутствии.
В частности, глицерол, треонин и раффиноза очень эффективно образуют ко-
валентные связи с СЗЬ даже в присутствии большого избытка воды [60].
После образования СЗЬ под действием СЗ-конвертазы как классического,
так и альтернативного механизма он подвергается дальнейшему расщеплению,
которое происходит в несколько этапов. Первое расщепление производит фак-
4*
СЗ
nh2
сза-(д,ооо)+сзь
т---------------1----- Р (75,000)
S S
I I
s S-C=o S
-1-----1—I------1-----C00H а (120,000)
СЗ-конвертам
1------------- 1----- р
S S
I I
S S
-1---г—I--------1----- «’(ИО, ООО)
SH с=о
I
о
I
Поверхность
Фактор H
Фактор!
СЗЫ
1—।--------*------ «, (68,000)+а'2 (43,000)
SH с=о
I
Поверхность
Сывороточная протеиназа
(Фактор!?)
СЛ
C3dg
(«2d)
C3d
+ сзд
—1------ ---------1---- в, (25,000)+ <4
+
—।-------j— «*(41,000)
SH с = о
I
Поверхность
| Трипсин'
Т----1---- (33,000)
sh с=о
I
о
I
Поверхность
(8,000)
Рис. 24.4. Расщепление СЗ. Первое рас-
щепление молекулы СЗ осуществляется
С4Ь2а (СЗ-конвертазой классического ме-
ханизма) или СЗЬВЬ (СЗ-конвертазой аль-
тернативного механизма) на N-конце а-це-
пи. После этого расщепления происходит
перестройка молекулы и обнажается внут-
ренняя тиоэфирная связь в a-цепи. Это
приводит к ковалентному присоединению
молекулы к поверхности или к реакции
с Н2О. Чтобы инактивировать СЗЬ, фак-
тор I последовательно расщепляет а-цепь
в двух местах, высвобождая пептид массой
3000. Для этого расщепления необходим
в качестве кофактора фактор Н. Оконча-
тельное ферментативное расщепление а-це-
пи приводит к высвобождению СЗс (145 к Да),
а к активирующей поверхности остается
прикрепленным фрагмент весом 41 кДа
(C3dg, a2d). Это расщепление может также
осуществляться фактором I, но в этом слу-
чае Н не служит кофактором. Фрагмент
массой 41 кДа может быть дополнительно
расщеплен трипсином. При этом к поверх-
ности остается прикрепленным фрагмент
массой 35 к Да (C3d).
24. Комплемент.
101
тор I. При расщеплении в жидкой фазе фактор Н является для него необходимым
кофактором, а при расщеплении на поверхности он ускоряет процесс [611.
Сразу за первым расщеплением следует второе расщепление a-цепи, также вы-
зываемое фактором I. При этом высвобождается фрагмент массой 3000 Да.
Образовавшаяся трехцепочечная молекула, называемая СЗЫ, гемолитически
неактивна, т. е. не способна участвовать в образовании С5-конвертазы как
классического, так и альтернативного механизма, а также в образовании СЗ-
конвертазы альтернативного механизма. Эта молекула построена из цепей
массой 68 и 43 кДа, образовавшихся из а'-цепи СЗЬ, а также из неизменившейся
P-цепи массой 75 к Да. На поверхности моноцитов, полиморфноядерных лейко-
цитов, лимфоцитов, эритроцитов и тучных клеток имеются рецепторы молекулы
C3bi. Находящийся в жидкой фазе СЗЫ дальше, по-видимому, не расщепляется
[62], но на клеточной поверхности он может подвергаться дальнейшему протео-
лизу. При этом расщепляется цепь массой 68 кДа и в жидкую фазу высвобож-
дается трехцепочечная молекула, названная СЗс, массой 145 кДа. Протеолиз
СЗЬ или C3bi до СЗс и C3d in vitro проводили обычно с помощью трипсина, но
тщательный анализ с использованием моноклональных антител показал, что
характер расщепления СЗЫ под действием трипсина несколько отличается от
того, что наблюдается в физиологических условиях [63]. Трипсин удаляет
с клеточной поверхности еще один дополнительный фрагмент массой от 3 до
8 кДа по сравнению с ферментами, находящимися в крови. Остающийся на
клеточной поверхности после обработки трипсином фрагмент СЗ был назван
C3d; фрагмент, образующийся под действием сыворотки, из-за его электрофо-
ретической подвижности был назван Уэстом и др. [166] а Лахманн и др.
[63] предложили термин C3dg. Получены некоторые данные о наличии на лим-
фоцитах рецепторов для C3d или a2d. Однако тщательное изучение сравнитель-
ного сродства этих двух молекулярных форм к клеточным рецепторам не про-
водилось. Фермент или ферменты, ответственные за распад СЗЫ до a2d in vivo
по сути дела неизвестны, хотя некоторые недавние работы показали, что и дан-
ное расщепление молекулы СЗ может осуществляться фактором I [64]. В опы-
тах in vitro эту форму протеолиза может осуществлять поверхностная эластаза
полиморфноядерных нейтрофилов [65]. Кофактором в этом случае служит не
фактор Н, а, возможно, некий компонент эритроцита человека [66]. Схематично
протеолиз СЗ в физиологических условиях показан на рис. 24.4.
24.2.3 . Активация по альтернативному механизму
и ее контроль
Проще всего начать описание процесса активации по альтернативному ме-
ханизму с рассмотрения взаимодействия фактора В с прикрепленным к клетке
или находящимся в жидкой фазе СЗЬ. Для связывания этих двух молекул друг
с другом требуется Mg2+. В результате связывания обнажается участок моле-
кулы фактора В, представляющий собой субстрат для протеолитического дей-
ствия фактора D. В результате протеолиза освобождается Ва и образовавший-
ся бимолекулярный комплекс СЗЬВЬ действует как СЗ-конвертаза (фермент,
расщепляющий СЗ) альтернативного механизма. Активный центр фермента
расположен на молекуле ВЬ, но сам по себе ВЬ не способен расщеплять СЗ.
Очевидно, СЗЬ также необходим для придания комплексу ферментативной ак-
тивности. Это вызвано тем, что СЗЬ способен связывать молекулу СЗ и обнажать
тот ее участок, который расщепляется под действием ВЬ. В этом смысле СЗЬ
СЗ-конвертазы альтернативного механизма аналогичен С4Ь СЗ-конвертазы
классического механизма, а ВЬ аналогичен С2а. Фактор D, по всей видимости,
102
Э. Дж. Браун., К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
не включается в состав СЗ-конвертазы и может использоваться неоднократно:
в отличие от СЗ и фактора В активность фактора D после активации альтерна-
тивного механизма не уменьшается [39]. Ферментативная активность СЗ-кон-
вертазы альтернативного механизма контролируется факторами Н и I. Фак-
тор Н может замещать фактор В в составе конвертазы [67], а также функцио-
нировать, как кофактор расщепления СЗЬ, вызываемого фактором I. Расщеп-
ленный СЗЬ не способен связывать ни фактор В, ни СЗ [68]. Кроме того, даже
в отсутствие регуляторных белков, очищенный фермент СЗЬВЬ имеет тенден-
цию к диссоциации. При 30°С его период полураспада составляет 5 мин. Про-
пердин, как нативный, так и активированный, судя по всему, уменьшает ско-
рость диссоциации СЗЬВЬ и тем самым стабилизирует его ферментативную ак-
тивность. Пропердин может также мешать связыванию фактора Н [69]. Фак-
торы Н и I совершенно необходимы для предотвращения спонтанной сборки
СЗ-конвертазы альтернативного механизма в жидкой фазе и вызванного этим
истощения компонентов альтернативного механизма в результате нерегули-
руемой работы фактора D и СЗЬВЬ. Это было показано in vitro с помощью очи-
щенных белков и подтверждено in vivo на больных с врожденной недостаточ-
ностью факторов I или Н. У таких больных в крови оказалось очень низкое
содержание СЗ и СЗЬ [70, 71].
Даже если СЗЬ образовался в результате активации комплемента по клас-
сическому механизму, он может служить источником формирования СЗ-конвер-
тазы альтернативного механизма. Таким образом, активация по классическому
механизму способна вызывать стимуляцию альтернативного механизма со все
возрастающим расщеплением СЗ и терминальных компонентов комплемента.
В этом случае альтернативный механизм служит механизмом усиления или
амплификации активации комплемента и часто рассматривается именно как
амплификационный механизм. Начальный этап активации альтернативного
механизма, происходящий без участия классического механизма, изучен хуже.
Наиболее правдоподобную последовательность событий предложили Пэнгберн
и Мюллер-Эберхард [72]. Они показали, что тиоэфирная связь в молекуле СЗ
не очень стабильная и подвергается медленному гидролизу даже без расщепле-
ния СЗ на СЗа и СЗЬ. Гемолитически неактивный СЗ с гидролизованной тио-
эфирной связью по многим свойствам сходен с СЗЬ, в том числе по способности
связывать фактор В, фактор Н, нативный СЗ и, как было недавно показано,
рецептор СЗ, расположенный на эритроцитах и фагоцитирующих клетках [73].
Поскольку такой гидролизованный СЗ («C3i») может связывать фактор В и
СЗ, то с его участием может быть образована конвертаза альтернативного ме-
ханизма.
Спонтанный гидролиз СЗ с образованием конвертазы приводит к даль-
нейшему расщеплению СЗ (СЗ-tickover) в сыворотке. Этот фоновый оборот СЗ
происходит с низкой скоростью, так как контролируется факторами Н и I.
Предполагается, что именно этот процесс оборота обеспечивает появление на-
чальной молекулы СЗЬ, которая связывается с поверхностью, активирующей
альтернативный механизм, такой, как эритроциты кролика, зимозан или ли-
пополисахарид. Из этой молекулы формируется связанная с поверхностью СЗ-
конвертаза альтернативного механизма.
Очевидно, что не всякая поверхность может обеспечить сборку СЗ-конвер-
тазы альтернативного пути, даже если к ней присоединится молекула СЗЬ.
Для альтернативного механизма характерна прежде всего способность разли-
чать поверхности, с которыми связывается СЗЬ. Этот механизм представляет
собой примитивное устройство, предназначенное для различения собственных
антигенов, не вызывающих его активацию, и чужеродных антигенов, таких,
24. Комплемент
103
как клеточные стенки дрожжей (зимозан) и бактерий (липополисахарид), акти-
вирующих комплемент. Молекулярная природа этой «различающей способ-
ности» альтернативного механизма отчасти понятна. На поверхности актива-
торов альтернативного механизма имеются участки, «защищающие» связываю-
щийся СЗЬ. В этих участках обеспечиваются такие условия, при которых свя-
зывание фактора В превышает связывание фактора Н. При этом формируется
СЗ-конвертаза альтернативного механизма, способная расщеплять дополни-
тельные молекулы СЗ и не подверженная обычному ингибирующему действию
фактора Н.
В принципе в «защищающих участках» активация альтернативного
механизма может обеспечиваться как повышением аффинности находяще-
гося там СЗЬ к фактору В, так и подавлением связывания фактора Н. Од-
нако никакого изменения связывания фактора В с СЗЬ обнаружено не было и
считается, что активация СЗ-конвертазы альтернативного механизма проис-
ходит в результате уменьшения способности фактора Н связываться с СЗЬ
и его инактивировать. Наиболее убедительно это было показано при исследо-
вании роли сиаловых кислот клеточной поверхности в контроле активации
альтернативного механизма [74, 75]. Бараньи эритроциты не активируют аль-
тернативный механизм в сыворотке человека. Однако после удаления с их по-
верхности сиаловых кислот они приобретают эту способность, причем степень
активации пропорциональна количеству удаленных сиаловых кислот. При
исследовании причин этого явления было обнаружено, что молекулы СЗЬ,
расположенные на поверхности нормальных и десиалированных эритроцитов
барана, в одинаковой степени способны связывать фактор В, но их аффинность
к фактору Н у полностью сканированных клеток в 10—20 раз выше, чем у кле-
ток, лишенных сиаловых кислот. Таким образом, в этой ситуации сиаловые-
кислоты клеточной поверхности предотвращают образование эффективной СЗ
конвертазы альтернативного механизма за счет усиления связывания Н с СЗЬ.
Интересно, что удаление сиаловых кислот с поверхности эритроцитов человека
не приводит к активации альтернативного механизма. Для гепарина, соеди-
ненного с частицами зимозана, был обнаружен сходный механизм контроля
активации комплемента [76]. Гепарин подавлял способность зимозана активи-
ровать альтернативный механизм, повышая аффинность связанного с части-
цами СЗЬ к фактору Н.
Один из белков эритроцитарной мембраны человека может использоваться
вместо фактора Н в качестве кофактора в реакции расщепления СЗЬ под дей-
ствием фактора I [77]. На один эритроцит приходится только 500—1000 моле-
кул этого гликопротеина, масса которого составляет 1200—1500 к Да. Инте-
ресно, что этот белок является рецептором иммунного прикрепления (C3bR,
CRi) эритроцитов человека и, по-видимому, идентичен рецептору СЗЬ поли-
морфноядерных лейкоцитов, моноцитов и лимфоцитов [78]. Кроме того, этот
белок может служить кофактором при расщеплении C3Bi до СЗс и C3dg факто-
ром I, т. е. может играть роль, не присущую фактору Н [66, 79].
Другой способ контроля альтернативного механизма — это снижение
способности данной поверхности связывать СЗЬ. Хотя эритроциты мыши ак-
тивируют альтернативный механизм человека, эритроциты, обработанные
проназой, такой способностью не обладают, что, по-видимому, объясняется
невозможностью связывания с ними молекул СЗЬ [80]. Таким образом, хотя
сродство фактора Н к СЗЬ, расположенному на такой поверхности, низкое,
связывание СЗЬ происходит столь малоэффективно, что СЗ- и С5-конвертазы
образуются в очень незначительном количестве.
104
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
24.2.4 . Роль антител в активации альтернативного
механизма
Исследования взаимодействия антител морских свинок с комплементом,
проведенные в конце шестидесятых годов, показали, что антитела к динитрофе-
нильному гаптену класса yi после соединения с антигеном могут служить
сильным активатором альтернативного механизма. Тогда же было обнаружено,
что Fc-фрагмент антител не нужен для активации, поскольку фрагменты
F (ab')2 сохраняли способность активировать альтернативный механизм. То,
что ух морских свинок, направленные против антигенов, не вызывающих ак-
тивацию комплемента, способны вызывать активацию альтернативного меха-
низма, было подтверждено при исследовании антител к эритроцитам барана
[81]. Кроме того, было показано, что антитела класса IgG различных видов
животных усиливают активацию альтернативного механизма на поверхностях,
способных к такой активации. Эта способность к усилению также не зависит
от Fc-фрагмента иммуноглобулинов [82]. IgM, вообще говоря, не участвуют в ак-
тивации альтернативного механизма, однако сообщалось, что некоторые из
антибактериальных антител класса IgM способны активировать комплемент,
по-видимому, именно этим путем. Агрегированные миеломные белки человека^
в том числе IgM, IgA, IgG и IgE, также могут активировать альтернативный
механизм [83]. Молекулярная природа взаимодействия антител с компонентами
альтернативного механизма неясна. Известно, что заранее сформированные
комплексы антиген-антитело активируют его более эффективно, чем смесь
антигена с сывороткой, содержащей антитела. Возможно, что в некоторых си-
туациях антитела закрывают участки антигена, подавляющие активность аль-
тернативного механизма. Так, например, антитела к капсулам стрептококков
группы В вызывают активацию комплемента, маскируя сиаловые кислоты кап-
сул, которые в неиммунной сыворотке подавляют активацию альтернативного
механизма [84]. В других системах было показано, что антитела способны уве-
личивать скорость расщепления СЗ, вызываемую СЗЬВЬ, количество связан-,
ного с поверхностью СЗЬ, степень расщепления СЗЬ и количество образующейся
СЗ/С5-конвертазы [85—87].
24.2.5 . Агенты, используемые для воздействия
на активацию альтернативного механизма
Многие вещества оказались полезными модуляторами активации альтер-
нативного механизма в лабораторных исследованиях. Их можно разделить на
две группы: вещества, ускоряющие расщепление СЗ, и вещества, подавляющие
расщепление СЗ.
Один из наиболее используемых реагентов подобного рода — это фактор
из яда кобры (CVF), белок массой 140 кДа, функционально аналогичный СЗЬ
[88]. Он может связывать фактор В, ускорять его расщепление под действием
фактора D, участвовать в образовании СЗ-конвертазы альтернативного меха-
низма. В отличие от СЗЬ CVF, однако, не инактивируется под действием фак-
торов Н и I и, следовательно, образует нерегулируемую СЗ-конвертазу. Свя-
зано ли это с дефектным взаимодействием с р1Н или с фактором I,— неиз-
вестно. Нерегулируемая конвертаза способна расщеплять СЗ и фактор В в
жидкой фазе, пока в ней не иссякнут оба белка. Эта способность CVF была ис-
пользована исследователями для удаления СЗ как in vivo, так и in vitro, а
24. Комплемент
105
также как способ получения СЗЬ. Продолжительность подавления активности
альтернативного механизма in vivo зависит от вида животного, а также от дозы
и способа применения CVF [89]. Степень истощения терминальных компонен-
тов комплемента, вызванного активацией альтернативного механизма под дей-
ствием CVF, зависит от источника CVF. CVF, полученный от Naja naja kaoutha,
образует не только нерегулируемую СЗ-конвертазу, но и эффективную С5-
конвертазу. Расщепление С5 сопровождается истощением всех терминальных
компонентов. CVF из яда Naja haje, с другой стороны, не способен к расщепле-
нию С5, и его использование приводит к истощению В и СЗ, но не влияет на
количество терминальных компонентов. Молекулярная основа различий этих
молекул CVF пока не выяснена.
Нормальная регуляция альтернативного механизма подавляется также
двумя различными сложными органическими кислотами. Сурамин [8-(3-бен-
замино-4-метилбензамино)нафталин-1,3,5-трисульфоновая кислота], ингиби-
тор многих сериновых протеиназ, используется для лечения африканского
трипаносомоза. Помимо других его эффектов сурамин подавляет инактивацию
СЗЬ факторами Н и I. По всей видимости, он оказывает действие на саму моле-
кулу СЗЬ, делая ее устойчивой к расщеплению, а не на фактор Н или фермент I
[90]. Молекулярный механизм действия сурамина неизвестен. Возможно, он
подавляет связывание фактора Н с СЗЬ, а возможно препятствует обнажению
расщепляемого фактором I участка молекулы СЗЬ. Сурамин использовался in
vivo и in vitro в экспериментах, направленных на то, чтобы различить эффекты,
вызываемые СЗЬ, и эффекты, вызываемые другими формами СЗ, даже в присут-
ствии цельной сыворотки. Другой агент, монокарбоновая кислота К-76 (6,7-
дигидрокси-2,5,5,8а-тетраметил -1,2,3,4,4а,5,6,7,8,8а-декагидронафталин-1-спи-
ро-2'-(7'-карбокси-6'-формил-4'-гидрокси-2' ,3' ,-адигидробензофуран) предста-
вляет собой продукт Stachybotrys complementi К-76. Этот агент также подавляет
расщепление СЗ факторами Н и I. Механизм его действия заключается, по-
видимому, в непосредственном ингибировании I, хотя возможность его взаимо-
действия с СЗЬ не была окончательно исключена. Этот агент был использован
для получения в одну стадию в исследовательских целях эритроцитов, покры-
тых С4Ь и СЗЬ из сыворотки [91, 92].
СЗ-нефритический фактор [C3NeF] — необычный белок сыворотки чело-
века, увеличивающий активацию альтернативного механизма. Этот белок об-
наруживается в крови некоторых больных мембранопролиферативным гломе-
рулонефритом и гипокомплементемией. C3NeF представляет собой антитело
класса IgG, направленное против СЗЬВЬ, СЗ-конвертазы альтернативного ме-
ханизма. Связываясь со своим антигеном, оно действует как пропердин, ста-
билизируя конвертазу и значительно увеличивая скорость расщепления СЗ
под действием альтернативного механизма даже в отсутствие активирующей
поверхности [93, 94]. C3NeF часто использовали в лабораторных исследованиях
для стабилизации фермента СЗЬВЬ как на поверхности, так и в жидкой
фазе.
Обнаружены также некоторые агенты, ингибирующие активность СЗ-
конвертазы альтернативного механизма. Они действуют как увеличивая ак-
тивность контролирующих белков Н и I, так и непосредственно ингибируя
компоненты альтернативного механизма. К числу первых относится гепарин:
в высоких дозах он препятствует образованию конвертазы, повышая аффин-
ность фактора Н к СЗЬ [76]. Тиомалат Au-Na действует, по-видимому, так же
[95]. Комплестатин, представляющий собой неохарактеризованный продукт
Streptomyces lavendulae, подавляет активацию альтернативного механизма,
взаимодействуя с фактором В и закрывая участок его связывания с СЗЬ [96].
106
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
24.2.6 . Механизм С1-шунта
Существует третий механизм активации комплемента, обнаруженный при
исследовании сыворотки свинок, дефицитных по С4. В этом случае не образу-
ется СЗ-конвертаза классического механизма, но для индукции каскада ком-
племента необходима активация С1. Этот механизм активации был назван ме-
ханизмом С1-шунта [97]. Его природа пока еще не установлена. Одна из воз-
можностей заключается в том, что в концентрированной сыворотке, дефицитной
по С4, активированный С1 выполняет, хотя и малоэффективно, роль фактора D.
Для инициации активации комплемента с помощью этого механизма необхо-
димо большое количество антител. Молекулярная природа СЗ- и С5-конвертаз
в этом случае не известна.
24.3. Терминальные компоненты комплемента
24.3.1. История вопроса
До 1958 г. считалось, что вся система комплемента состоит только из четы-
рех независимых компонентов: С'1, С'4, С'2 и С'З. Затем в период с 1958 по
1966 г. вначале математический анализ, а затем интенсивная работа по биохи-
мическому разделению компонентов, проведенные в лаборатории Нельсона
[98, 99], а также другими исследователями [100, 101], показали, что гемолити-
ческая активность С'З морской свинки осуществляется в результате последова-
тельных реакций шести различных фракций сыворотки. В конце концов была
опубликована схема выделения и очистки из сыворотки морских свинок всех
девяти компонентов комплемента, обеспечивающих гемолитическую актив-
ность [102].
Подробное исследование межмолекулярных взаимодействий терминальных
компонентов, С5—С9, было проведено за последние 15 лет. Известно, что для
осуществления С5 его биологической активности требуется расщепление моле-
кулы С5 на два фрагмента, С5а и С5Ь. Фермент, осуществляющий это расщепле-
ние, образуется изСЗ-конвертазы. Фрагмент С5аобладает сильной, несвязанной
непосредственно с действием комплемента биологической активностью. Фраг-
мент С5Ь последовательно соединяется с С6, С7, С8 и С9, образуя макромолеку-
лярный комплекс, способный нарушать целостность биологических и искусст-
венных мембран. Формируя трансмембранные поры или каналы, он вызывает
лизис клеток. Недавно был описан феномен реактивного лизиса: без участия
компонентов комплемента, действующих на ранних этапах, выделенный комп-
лекс С5Ь6 может индуцировать сборку на поверхности всего окончательного
макромолекулярного комплекса. Эту реакцию широко используют при изуче-
нии факторов, ускоряющих или, наоборот, подавляющих образование терми-
нального комплекса. Интенсивному исследованию были подвергнуты молеку-
лярная структура комплекса С5Ь-9, биохимический механизм прикрепления
этого комплекса к мембране и функциональные и биохимические особенности
вызванного комплементом повреждения мембраны (поры). В частности, возник
серьезный спор о том, действует ли комплемент на структуру фосфолипидного
биослоя аналогично детергенту, как предсказывалось моделью «проницаемых
пятен», или же он образует стабильный гидрофильный трансмембранный канал,
как предсказывалось выдвинутой Майером моделью «пончика» [103].
24. Комплемент
107
24.3.2. Механизм вызванного комплементом
повреждения мембраны
Согласно общепризнанному сейчас мнению, комплемент вызывает лизис
клеток, так как терминальный комплекс образует мембранный канал, достаточ-
но большой, чтобы по нему проходили небольшие молекулы и ионы, но слишком
маленький, чтобы по нему из клеток выходили макромолекулярные компоненты
цитоплазмы. Эффект Доннана приводит к проникновению воды по этим каналам
в клетки, и в результате клетки набухают и лопаются. Множество современных
данных подтверждает, что при формировании комплекса С5Ь-9 он погружается
в липидный бислой мембраны (см. обзор [104]). Об этом свидетельствуют сле-
дующие экспериментально установленные факты: а) в формирующемся комплек-
се С5Ь-9 оказываются открытыми гидрофобные домены, б) при действии компле-
мента на мембрану от нее отделяются фосфолипиды, в) прикрепленный к мем-
бране комплекс С5Ь-9 не удается элюировать меняя ионные условия — для его-
экстракции необходимо использовать детергенты, г) при действии терминально-
го комплекса на плоский липидный бислой наблюдаются изменения электриче-
ского сопротивления бислоя и д) молекулы, входящие в комплекс С5Ь-9 можно
пометить мембранными зондами, которые локализованы исключительно в гид-
рофобном внутреннем слое липидной мембраны.
24.3.3. Лизис эритроцитов
Лизис эритроцитов под действием комплемента служит модельной системой
для изучения процесса иммунного лизиса (см. обзор [105]). В частности, эта
система была использована для определения размера, стабильности и функцио-
нального состояния каналов, образуемых комплементом. Лизис клеток требует
осуществления нескольких этапов уже после действия компонентов комплемен-
та. Бараньи эритроциты, несущие компоненты комплемента С1—С7, способны
связать С8 и С9 при 4°С. Такие клетки, названные Бойлем и Борсосом предшест-
венниками Е* [105], не подвергаются лизису, пока не будет повышена темпера-
тура. Их лизис можно также предотвратить обработкой трипсином. Даже после
повышения температуры лизис предшественников Е* ингибируется этилендиа-
минтетрауксусной кислотой (ЭДТА), солями цинка и уранила; механизм их дейст-
вия пока не вполне понятен.
Завершающий этап лизиса клеток может быть подавлен с помощью коллоид-
ного осмоса. В первых исследованиях, проведенных с помощью 25% альбумина,
было показано, что функциональный размер поры в мембране эритроцита мень-
ше 32—35 А [106]. Большинство последующих работ было проведено с залечен-
ными тенями эритроцитов, липосомами или плоскими черными липидными мем-
бранами [107, 108]. У них, в отличие от эритроцитов после атаки комплемента,
не возникает вторичных повреждений в мембране, образующихся в результате
разрывов, вызванных коллоидным осмосом. В этих исследованиях измеряли
выход внутренних маркеров или обмен меченых молекул с внутренним содержи-
мым. Был сделан вывод, что диаметр образуемой комплементом поры составля-
ет от 10 до 70 А. Последующие исследования позволили сделать ряд дополни-
тельных выводов: а) метод ингибирования лизиса с помощью коллоидного осмо-
са дает ту же оценку диаметра повреждения, что и измерения выхода внутрен-
них маркеров из теней эритроцитов или входа в них наружных маркеров [109];
б) образующиеся в тенях эритроцитов каналы имеют продолжительное, хотя и
конечное время жизни; в) по размеру поры гетерогенны, но они увеличиваются
108
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
при более высоких дозах комплемента [НО]; г) комплемент человека образует
более крупные поры (максимальный диаметр 110 А), чем комплемент морской
свинки (максимальный диаметр 72 А); д) в некоторых экспериментальных си-
стемах размер поры увеличивается при увеличении соотношения С9:С8 и е) раз-
мер канала зависит от свойств мембраны. Причины кооперативного характера
связывания многих молекул С9 с комплексом С5Ь-8, а также кооперативного
действия многих комплексов С5Ь-9, приводящего к образованию крупных по-
вреждений, пока неясны.
24.3.4. Инициация сборки С5Ь-9: С5-конвертаза
Для инициации сборки атакующего мембрану комплекса (АМК) требуется
расщепление С5 (двухцепочечного белка массой 200 кДа) на фрагмент С5Ь мас-
сой 185 кДа и пептид С5а массой 15 кДа [111, 112]. При действии на клетку
гемолитически активный С5Ь может остаться связанным с мембраной, а меньший
фрагмент, С5а, выходит в жидкую фазу.
При активации комплемента как по классическому механизму, так и по
альтернативному механизму образуются ферменты, расщепляющие С5. С5-кон-
вертаза классического механизма представляет собой комплекс С4Ь2аЗЬ. Фермен-
тативная активность принадлежит находящейся в составе комплекса молекуле
С2а. Активный центр С5-конвертазы альтернативного механизма, Р(СЗЬ)2ВЬ,
находится в молекуле ВЬ. Как и в случае с СЗ-конвертазами классического и
альтернативного механизмов, отщепление С2а или ВЬ от комплексов приводит
к потере С5-конвертазной активности. Оба типа С5-конвертаз расщепляют С5
идентичным образом. Согласно последним данным в составе С5-конвертазы аль-
тернативного механизма связанный с клеткой СЗЬ находится в двух молекуляр-
ных формах [113, 114]. Одна молекула функционирует, по-видимому, аналогич-
но СЗЬ конвертазы классического механизма. Другая молекула соответствует
С4Ь. В обеих конвертазах СЗЬ связывает нативный С5, обнажая участок фер-
ментативного расщепления. В С5-конвертазе альтернативного механизма второй
СЗЬ связан, видимо, с ВЬ, поддерживая его в активной конфигурации. Хотя
этот второй СЗЬ действует сходно с С4Ь, он относительно устойчив к действию
фактора I. СЗЬ, находящийся в жидкой фазе, также может связывать С5, кото-
рый затем расщепляется растворимым ферментным комплексом. Похоже, что
основным условием эффективного связывания С5 с клеточной поверхностью и
его последующего расщепления является высокая локальная концентрация
СЗЬ.
24.3.5. Расщепление С5 другими протеиназами
Многие протеиназы, не имеющие отношения к комплементу, расщепляют
С5 с образованием биологически активных пептидов. Описание действия этих
протеиназ выходит за рамки настоящей главы (см. обзор [115]). Поэтому здесь
мы их лишь перечислим. К протеиназам, расщепляющим нативный С5 на био-
логически активные пептиды, относятся трипсин, плазмин, протеиназы поли-
морфноядерных лейкоцитов, такие как эластаза и катепсин G, протеиназы мак-
рофагов, тромбоцитов и бактерий. Сейчас уже известно, что фрагменты, обра-
зующиеся при расщеплении С5 трипсином, не эквивалентны фрагментам, обра-
зующимся при расщеплении С5-конвертазой. Так, например, под действием
трипсина не образуется С5а, хотя биологическая активность, сходная с актив-
ностью С5а, при этом появляется. Анафилатоксическая и хемотаксическая ак-
тивности С5, расщепленного трипсином, принадлежат фрагментам, которые оста-
24. Комплемент
109
ются соединенными дисульфидными связями с высокомолекулярным полипеп-
тидом, сходным с С5Ь.
Между количеством связанного с клетками С4Ь2а или СЗЬ и способностью
клеток связывать С5 имеется прямая линейная зависимость [116]. Однако лишь
небольшая часть С5 связывается с активирующей поверхностью даже в услови-
ях, когда весь гемолитически активный С5 вступает в реакцию. Более того, свя-
завшийся с клетками С5Ь быстро теряет свою гемолитическую активность, хотя
скорость исчезновения С5-антигенов с клеточной поверхности значительно ни-
же. По-видимому, связанный с клетками С5Ь претерпевает быстрое конформа-
ционное изменение и становится гемолитически неактивным. Природа этого
быстрого изменения пока неясна. Присутствие С6 и С7 увеличивает связывание
С5 с эритроцитами, несущими С14Ь2аЗЬ, и стабилизирует гемолитическую ак-
тивность связавшегося С5Ь. Подробнее это явление будет рассмотрено ниже.
24.3.6. С5Ъ6 и реактивный лизис
С5Ь и С6, следующая молекула в каскаде комплемента, образуют в сыво-
ротке прочный комплекс, сохраняющий в течение длительного времени способ-
ность взаимодействовать с клеточными мембранами. При добавлении С7, С8 и
С9 комплекс С5Ь6 может лизировать неактивированные эритроциты и клетки
некоторых других типов. Этот феномен известен под названием реактивный
лизис [117, 118].
Биохимические свойства молекулы С5Ь6 хорошо изучены [119, 120]. Этот
комплекс имеет константу седиментации от 10,4 до 11,5 S, а его мол. масса рав-
на 328—330 кДа. В гемолитически активной форме комплекс содержит по одной
молекуле С5Ь и С6. Его электрофоретическая подвижность совпадаете подвиж-
ностью C5(Pj), но выше, чем у молекул С6(р2). У комплекса С5Ь6 появляется
новая антигенная детерминанта (неоантиген), отсутствующая каку С5, так и у
С6. Ее появление, видимо, связано с конформационными изменениями молекул
С5Ь и С6 при образовании комплекса [119].
Недавно было показано, что закисление смеси очищенных С5 и С6 с после-
дующей нейтрализацией приводит к образованию гемолитически активного
комплекса С56а, сходного с С5Ь6. В комплексе С56а расщеплению подвергается
a-цепь С5. На том основании, что функциональная активность С6 подавляется
ингибиторами сериновых эстераз, было выдвинуто интересное, хотя и не дока-
занное предположение о том, что при кислотной активации ферментативное
расщепление С5 осуществляется молекулами С6.
24.3.7. Образование С5Ь67 и исследование
ингибиторов С5Ь67
Присоединение С7 к С5Ь6 происходит быстро и приводит к образованию
комплекса, который в растворенном виде оказывается лабильным: не будучи
прикрепленным к какой-нибудь поверхности, он агрегирует и теряет гемолити-
ческую активность. Период полураспада С5Ь67 при 0°С составляет пять часов,
однако при 30°С — менее двух минут. Оказывается, что многие вещества об-
ратимо действуют на С5Ь67, находящийся в растворе, препятствуя его прикреп-
лению к эритроцитам в то короткое время, когда его участок связывания с клет-
кой еще сохраняет активность. Один класс таких ингибиторов включает сыворо-
точные липопротеины высокой плотности и сывороточный белок S. Их молекулы
взаимодействуют, по-видимому, с гидрофобным участком связывания с мембра-
ной, имеющимся у комплекса С5Ь67, и тем самым блокируют его последующее
но
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
прикрепление к мембране. Ко второму классу ингибиторов относятся полианио-
ны [121], в том числе гепарин, декстрансульфат и ДНК. С другой стороны, гис-
тоны и протамин усиливают литическую активность С5Ь6 по отношению к эрит-
роцитам. Механизм действия этих ингибиторов и активаторов до сих пор не-
ясен, но, скорее всего, они ослабляют или усиливают ионные или зарядовые
взаимодействия С5Ь6 и С5Ь67 с мембраной клетки-мишени. Показано, что С8
ограничивает образование промежуточного комплекса С5Ь67 с эритроцитом,
предотвращая прикрепление растворенных комплексов С5Ь67 к мембране [122].
Таким образом, в осуществляемом комплементом лизисе клеток С8 играет двой-
ную роль, являясь при этом одним из звеньев внутренней регуляции поздних
этапов действия комплемента.
24.3.8. Физико-химические свойства и субъединичное
строение атакующего мембрану комплекса (АМК),
находящегося в растворе и связанного с мембраной
Значительные усилия были направлены на установление молекулярного
механизма самой реакции лизиса. О деталях этого процесса до сих пор идут спо-
ры. В большинстве случаев атакующий механизм комплемента требует участия
С5, С6, С7, С8 и С9 в составе макромолекулярного комплекса, имеющего сле-
дующие молярные соотношения компонентов: 1С5Ь : 1С6 : 1С7 : 1С8 : 3—6С9
[123, 124]. Уже давно, однако, известно, что комплекс, образованный компонен-
тами С5Ь, С6, С7 и С8, способен медленно лизировать эритроциты, несмотря на
полное отсутствие С9.
После инкубации сыворотки с активаторами классического или альтерна-
тивного механизмов в ней обнаруживаются стабильные растворимые комплексы
с константой седиментации 22,5 S, мол. массой 1,04-10®, электрофоретической
подвижностью а-глобулина, содержащие С5Ь-9. Такой комплекс, сформи-
ровавшийся в растворе, лишен гемолитической активности, но ингиби-
рует вызываемый С9 лизис комплекса эритроцитов, несущих антиген с ЕАСХ_8.
Это, видимо, связано со способностью растворимого комплекса, имеющего мо-
лярное соотношение 1С5Ь : 1С6 : 1С7 : 1С8 : ЗС9, присоединять дополнительные
молекулы С9. Образовавшийся в растворе комплекс содержит также в своем со-
ставе три молекулы белка S, не входящего в состав комплемента [124]. Белок
S представляет собой обычный компонент сыворотки, где его концентрация рав-
на 600 мкг/мл. В процессе образования растворимого С5Ь-9 этот белок взаимо-
действует с гидрофобным участком связывания С5Ь67, блокируя гемолитичес-
кую активность комплекса, стабилизируя его и предотвращая агрегацию [125].
Для исследования физических свойств терминального комплекса, связан-
ного с мембраной, его экстрагировали из эритроцитарных мембран неионными
детергентами, такими как Тритон Х-100 [126]. Такой экстрагированный комп-
лекс имел следующий молярный состав: 1С5Ь : 1С6 : 1С7 : 1С8 : ЗС9. Белок S
в нем отсутствовал. Входящий в состав мембраны комплекс ведет себя как внут-
ренний или интегральный мембранный белок: его нельзя экстрагировать ни
буферными растворами с высокой ионной силой, ни ЭДТА [126]. Это наблюдение
было одним из первых доказательств того, что терминальный комплекс связан
с мембраной гидрофобными неполярными взаимодействиями. Судя по размерам
экстрагированного комплекса, определенным с помощью электронной микро-
скопии, он представляет собой мономерный С5Ь-9 с молекулярной массой, при-
близительно равной одному миллиону. В других работах, однако, сообщалось,
что связанная с мембраной форма терминального комплекса представляет собой
24. Комплемент
111
димер C5b-9 [127] или состоит из мономеров, димеров и тримеров [128], т. е.
АМК может быть гетерогенным по размерам.
Анализ как связанных с клетками, так и растворимых комплексов С5Ь-9
показал, что они содержат димер соединенных дисульфидной связью молекул
С9 [129]. Такие димеры С9 могут играть важную роль в лизисе клеток, вызывая
образование димерных комплексов С5Ь-9 и усиливая тем самым разрушение мем-
браны. Это предположение, однако, требует доказательств.
24.3.9. Электронная микроскопия образованного
комплементом повреждения
В ранних электронно-микроскопических исследованиях, в которых исполь-
зовался метод негативного контраста, было показано, что образованное компле-
ментом повреждение в мембране имеет форму «пончика» с кольцевым ободком
диаметром 15 нм и центральным, электронно-плотным участком диаметром 10—
11 нм, поднимающимся над мембраной [130]. Более подробное исследование
комплекса, экстрагированного детергентом из эритроцитарных мембран, при-
вело к построению модели, согласно которой комплекс содержит цилиндриче-
ский стебель длиной 15—16 нм (рис. 24.55), представляющий собой ту часть
комплекса, которая погружена в гидрофобное мембранное окружение [131].
Над мембраной на расстояние по меньшей мере 10 нм возвышается кольцо, или
тор (рис. 24.5, А), имеющее наружный диаметр 20—25 нм и внутренний диаметр
10—11 нм для комплемента человека и 8,5—9,5 нм для комплемента морской
свинки. При встраивании выделенных комплексов в липидные пузырьки ось
цилиндра ориентируется перпендикулярно мембране, а кольцо располагается
на наружной поверхности пузырька (рис. 24.5,5) [132]. Строение кольца было
исследовано с помощью электронной микроскопии в сочетании с иммунохими-
ческими методами. Эксперименты с антителами к С9, меченными ферритином,
показали, что С9 ассоциирован с кольцевым компонентом структуры [133].
При «избирательном» удалении кольца из мембранного комплекса С5Ь-9 с по-
мощью восстанавливающих агентов и протеолиза освобождается неповрежде-
нная p-цепь С5, а также антигенные фрагменты С6, С7, С8 и С9 [134].
Иную модель, совершенно отличную от изложенной выше интерпретации
строения терминального комплекса, недавно предложили Подак и Чопп [135].
Эти исследователи обнаружили, что продолжительная инкубация очищенного
С9 при 37°С приводит к образованию полимерного комплекса С9, который при
электронно-микроскопическом исследовании выглядит неотличимо от классичес-
кого повреждения, образуемого комплементом. Такие полимерные комплексы
С9 способны встраиваться в фосфолипидные пузырьки, вызывая освобождение
заключенных в пузырьках маркеров, т. е. сам по себе С9 способен повреж-
дать искусственный фосфолипидный бислой. Подак и др. [136] предполагают,
что расположенный на клеточной мембране С5Ь-8 служит лишь местом сборки
полимера С9, а классические повреждения, образуемые комплементом и наблю-
даемые в электронный микроскоп, представляют собой поли-С9.
24.3.10. Неоантигены АМК
При формировании макромолекулярного комплекса С5Ь-9 происходят
конформационные и структурные изменения терминальных компонентов комп-
лемента, что приводит к появлению новых антигенов (неоантигенов), отсутст-
вующих или скрытых в нативных индивидуальных молекулах [137].
112
Э. Дж. Браун, Б. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
Рис. 24.5. Электронные микрофотографии
негативно контрастированных образцов. А.
Эритроцит барана, лизированный компле-
ментом человека [131]. Верхняя половина
кадра получена на тени эритроцита, обра-
ботанной протеиназами, нижняя полови-
на — на только что лизированной тени.
Цилиндрические комплексы С5Ь-9П видны
в боковой проекции вдоль края тени и в осе-
вой проекции вдоль всей мембраны (пока-
заны стрелками). Б. Липосомы из лецити-
на со встроенными комплексами С5Ь-9Л
(показаны стрелками). Цилиндрический
комплекс выступает на 10 нм кнаружи от
мембраны липосомы [132]. В. Выделенные
комплексы С5Ь-9П в растворе детергента.
Высота выделенного цилиндра составляет
15 нм. Масштабные линии на рисунках
соответствуют 50 нм [131]. (Фотографии
публикуются с разрешения)
24. Комплемент
ИЗ
Неоантигены комплекса С5Ь-9 были также обнаружены на нормальных лим-
фоцитах периферической крови человека [138]. По всей видимости они образу-
ются в процессе сбора крови и выделения лейкоцитов, так как образование нео-
антигенов подавляется, если отбирать кровь в раствор ЭДТА. Оказалось, одна-
ко, что нефракционированные лимфоциты периферической крови, Т-лимфоци-
ты и В-лимфоциты, культивируемые в бессывороточной среде при 37°С, также
медленно накапливают поверхностные неоантигены. Этот процесс может быть
заблокирован метаболическими ингибиторами, что указывает на возможность
синтеза de novo. В пользу такого предположения свидетельствовали бы данные
о том, что мононуклеарные лейкоциты периферической крови способны синте-
зировать С5 и остальные компоненты комплемента, но пока что это не доказано.
Возможное участие присоединенных к клеточной поверхности терминальных
компонентов комплемента в функционировании лимфоцитов — совершенно но-
вая область исследований.
24.4. Генетика и биосинтез белков комплемента
Синтез белков комплемента изучают прежде всего с помощью первичных
клеточных культур и длительно культивируемых клеточных линий и в очень
малой степени — на целом животном. Изучение белкового полиморфизма после
ортотопической трансплантации печени показало, что более чем 90% СЗ, С6, С8
и фактора В плазмы синтезируется в печени [139]. Оказалось, однако, что моно-
циты периферической крови и тканевые макрофаги тоже способны синтезиро-
вать большой набор компонентов комплемента и регуляторных белков [140].
Было показано, что лимфоциты также могут синтезировать компоненты компле-
мента, хотя единственный компонент, секреция которого доказана,— это инак-
тиватор СЗ. По всей видимости, большая часть белков комплемента плазмы син-
тезируется гепатоцитами, но локальное образование компонентов комплемента
иммунокомпетентными клетками, концентрирующимися в участке воспаления,
может играть важную роль в воспалительном процессе.
Подробному анализу синтеза и секреции молекул комплемента посвящено
очень мало работ. Многоцепочечная молекула С4 синтезируется в виде одноце-
почечного полипептида (про-С4), который затем расщепляется, видимо, до сек-
реции, образуя трехцепочечную структуру. Тем не менее по крайней мере 5%
белка С4 в плазме морской свинки и человека представлены высокомолекулярной
одноцепочечной молекулой, неотличимой от про-С4 [141]. С4 — это гликозили-
рованный белок, поэтому добавление туникамицина к клеточным культурам по-
давляет секрецию внутриклеточного С4 в культуральную среду. Подавление
гликозилирования не препятствует, однако, внутриклеточному расщеплению
про-С4 до С4 [142].
Для некоторых компонентов комплемента определены генетические локу-
сы. Ген СЗ человека был локализован в хромосоме 19 [1431. С8 кодируется двумя
несцепленными локусами: один ген кодирует [1-цепь, а другой — а- и у-цепи
[144]. Один из наиболее интересных аспектов генетики комплемента заключает-
ся в том, что несколько компонентов: С2, С4, фактор В и С4-связывающий бе-
лок — кодируются генами главного комплекса гистосовместимости или генами,
расположенными вблизи него [145.]. У мыши локус S области Н-2 включает
в себя ген С4 [1461, а у человека гены фактора В, С2 и С4 были картированы в
области HLA. Интересно, что локус S кодирует два белка, С4 и Sip, структур-
но очень родственные. Sip не участвует в функционировании каскада компле-
мента, причем его синтез находится под гормональным контролем, так как его
содержание в плазме выше у самцов. Количество гемолитически активного С4
114
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
мыши, наоборот, не зависит от гормональной регуляции. Генетика локуса С4
человека во многом сходна с его генетикой у мыши. Гены С4 человека располо-
жены в HLA вблизи HLA-B. Применение метода электрофореза с иммунофик-
сацией выявило существование двух неаллельных форм С4, что свидетельству-
ет о существовании у человека двух генов С4. В отличие от того, что наблюдает-
ся у мышей, белковые продукты обоих этих генов у большинства людей гемоли-
тически активны [147]. Тем не менее для обоих локусов С4 были описаны не-
функциональные аллельные варианты. Интересно, что эти два гена С4 оказа-
лись связаны с двумя поверхностными антигенами эритроцитов — Чидо и
Роджерс [148]. Было показано, что данные антигены локализованы на C4d,
т. е. на прикрепляющемся к поверхности фрагменте нативного С4. Остается не-
ясным, каким образом молекулы С4 связываются с эритроцитами, хотя предпо-
лагается, что это вызвано постоянно происходящей медленной спонтанной акти-
вацией классического механизма, аналогичной описанной выше спонтанной ак-
тивации альтернативного механизма. Совершенно непонятным остается нали-
чие антигенов Чидо и Роджерс на эритроцитах крови больных, у которых пол-
ностью отсутствует гемолитически активный С4.
24.5. Клеточные рецепторы фрагментов
компонентов комплемента
В результате активации комплемента как классическим, так и альтерна-
тивным механизмом образуются фрагменты молекул, распознаваемые специфич-
ными рецепторами, расположенными на клетках многих типов. Некоторые из
этих фрагментов, такие как СЗЬ, СЗЫ и C3dg, образуются непосредственно в i
месте активации комплемента. Считается, что связывание этих фрагментов с
клеточными рецепторами активирует многие специфичные реакции, например \
фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов или активацию В-лимфо- j
цитов. При активации комплемента образуется также несколько небольших
пептидов, СЗа, С4а и С5а, возникающих в результате расщепления СЗ, С4 и С5. j
Эти пептиды не остаются в месте активации, а освобождаются в сыворотку или !
тканевую жидкость. Связывание этих полипептидов со специфическими клеточ- j
ными рецепторами также приводит к серии клеточных реакций, играющих 5
важную роль в инициации и поддержании воспалительного процесса. !
СЗа освобождается при расщеплении СЗ, осуществляемом СЗ-конвертазами
как классического, так и альтернативного механизма. Это негликозилированный
белок с мол. массой 9000 Да и ИЭТ 9,7. СЗа представляет собой 77 N-концевых j
аминокислот a-цепи СЗ. Рецепторы СЗа были обнаружены на тучных клетках [
и базофилах, клетках гладких мышц, лимфоцитах и, по-видимому, тромбоци-
тах. Взаимодействие рецепторов тучных клеток и базофилов с СЗа вызывает [
дегрануляцию, сопровождающуюся выходом гистамина и других медиаторов *
анафилаксии. По этой причине СЗа называют анафилатоксином. Инкубация
кусочков ткани с СЗа вызывает сокращение гладкомышечных клеток. Связано
ли сокращение гладких мышц с высвобождением гистамина, — неясно. Анти- j
гистаминные препараты подавляют сокращение мышц кишечника в ответ на
СЗа, но не подавляют сокращения матки [42]. !
С5а, «классический» анафилатоксин комплемента,— это белок с мол. мае- I
сой И ООО Да, соответствующий 74 N-концевым аминокислотам a-цепи С5. i
Около 25 % массы молекулы составляет присоединенный к аспарагину олигоса- !
харид. В качестве анафилатоксина С5а примерно в 20 раз эффективнее, чем
СЗа. Помимо анафилатоксического действия на тучные клетки и гладкие мышцы
24. Комплемент
115
С5а обладает гистаминнезависимым действием на эндотелий, вызывая повыше-
ние сосудистой проницаемости. Кроме этого С5а индуцирует направленное пере-
мещение (хемотаксис) нейтрофилов и моноцитов. Хемотактические рецепторы
С5а у этих клеток хорошо изучены. Константа их сродства к С5а равна2—ЗнМ,
а число рецепторов С5а на одном нейтрофиле составляет 2-105 [149]. В отличие
от С5а, СЗа не индуцирует хемотаксиса лейкоцитов. С5а вызывает ряд других
важных изменений в мембранах нейтрофилов: повышая адгезивность этих кле-
ток, он индуцирует агрегацию нейтрофилов и их прикрепление к эндотелию.
Рис. 24.6. Появление покраснения и отека
в коже человека в ответ на СЗа, С4а и
С5а. Диаметр отека (волдыря) измеряли
через 10—15 мин после внутрикожного
введения. ([150]; печатается с разрешения)
Количество инъецированного человечесного
пептида, моль
Недавно было показано, что СЗа и С5а оказывают противоположное действие
на образование иммуноглобулинов человеческими лимфоцитами in vitro: СЗа
подавляет, а С5а усиливает секрецию иммуноглобулинов. Оба пептида дейст-
вуют, по-видимому, на уровне Т-клеток, взаимодействуя с их рецепторами. Сов-
сем недавно выяснилось, что третий пептид, образующийся при активации ком-
племента, С4а, также обладает анафилаксической активностью. Это негликози-
лированный, положительно заряженный пептид массой 8650 Да. В качестве
анафилатоксина он в 100 раз менее эффективен, чем СЗа, и в 2500 раз менее эф-
фективен, чем С5а (рис. 24.6). Его действие на нейтрофилы и лимфоциты не ис-
следовано.
Все анафилатоксины комплемента в сыворотке быстро расщепляются под
действием карбоксипептидазы N, удаляющей С-концевой аргинин у всех трех
молекул. Поэтому выделение этих молекул из сыворотки всегда проводят в
присутствии е-аминокапроата, инактивирующего фермент. Потеря С-концевого
аргинина вызывает у всех трех молекул исчезновение анафилатоксической ак-
тивности. Однако безаргининовая форма С5а, C5adcsarg74, сохраняет хемотак-
сическую активность, хотя и в 100 раз меньшую, чем нативный С5а. В сыворотке
был обнаружен не относящийся к комплементу белок с мол. массой 60 кДа,
названный фактором-помощником: связываясь с C5ades arg, он увеличивает его
хемотаксическую активность, не восстанавливая при этом анафилатоксической
активности. Возможно, этот белок каким-то образом изменяет свойства углево-
да, присоединенного к С5а, поскольку было показано, что дегликозилирован-
ный C5ades arg в 10 раз более эффективен в качестве хемоаттрактанта, чем немо-
дифицированный C5ades arg [151].
Наиболее изучены те клеточные рецепторы компонентов комплемента, ко-
торые принимают участие в вызываемом комплементом усилении фагоцитоза
бактерий, дрожжей, сенсибилизированных антителами эритроцитов и других
частиц. Было показано, что важную роль в фагоцитозе играют рецепторы к раз-
личным фрагментам СЗ. Идентифицированы три разных рецептора, CR1, CR2 и
116
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
CR3. Впервые клеточные рецепторы комплемента были открыты Нельсоном в
1950 г. [152]. Он показал, что осуществляемый нейтрофилами фагоцитоз Trepo-
nema pallidium и Streptococcus pneumoniae, сенсибилизированных антителами и
комплементом, был более эффективен в присутствии эритроцитов человека.
Вызванное эритроцитами усиление фагоцитоза происходило из-за прикрепле-
ния к ним бактерий. Для прикрепления необходима была активация компле-
мента. В конце концов выяснилось, что связывание бактерий с эритроцитами
обусловлено так называемой иммуноадгезией — взаимодействием СЗЬ, распо-
ложенного на поверхности микроорганизмов, с СЗЬ-рецепторами эритроцитов.
Все эритроциты приматов обладают рецепторами иммуноадгезии; у других
исследованных видов позвоночных эритроциты лишены этих рецепторов, но
функционально эквивалентные рецепторы имеются на тромбоцитах [153]. Ре-
цепторы СЗЬ были обнаружены также у лимфоцитов, моноцитов и нейтрофи-
лов. Недавно было убедительно показано, что у всех клеток крови рецепторы
СЗЬ идентичны. Очищенный рецептор СЗЬ — это гликопротеин мол. массой око-
ло 1,2-106 Да. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии
додецилсульфата натрия он дает одну полосу, соответствующую 225 к Да, т. е.
сам рецептор представляет собой, по всей видимости, пентамер или гексамер
[154]. Рецептор СЗЬ, чтобы отличать его от мембранных рецепторов других фраг-
ментов СЗ, был назван CR1. С помощью специфичных антител к рецептору было
показано, что каждый эритроцит имеет от 300 до 1000 CR1, а лейкоциты — от
20 до 30 тысяч CR1 в расчете на клетку. Поскольку эритроцитов в крови в 1000
раз больше, чем лейкоцитов, то более чем 90% CR1 располагается на эритроци-
тах. CR1 был обнаружен также на тучных клетках, базофилах и клетках почеч-
ных клубочков. В некоторых экспериментальных условиях частицы, покрытые
СЗЬ, прикрепляются к клеткам других типов: к фибробластам, эндотелиальным
клеткам, макрофагам, некоторым опухолевым линиям лимфоцитов (например,
Raji). Пока неизвестно, являются ли СЗЬ-связывающие белки этих клеток моле-
кулами CR1. CR1 связывает СЗЬ с гораздо более высокой аффинностью, чем на-
тивный СЗ — аффинность СЗЬ и СЗ к рецептору различается, по-видимому, более
чем в 1000 раз [73]. Поэтому сывороточный СЗ не подавляет взаимодействия по-
крытых СЗЬ частиц или иммунных комплексов с рецептором.
При расщеплении СЗЬ факторами Н и I образуется трехцепочечная молеку-
ла C3bi. Рецепторы C3bi имеются на клетках многих типов: на эритроцитах,
полиморфноядерных лейкоцитах, моноцитах и тучных клетках. Этот рецептор
(называемый CR3) среди известных мембранных рецепторов фрагментов СЗ изу-
чен в наименьшей степени. Его выявляют по способности лейкоцитов связывать
покрытые СЗЫ частицы; это связывание не подавляется антителами к CR1 или
рецептору C3d [155]. На тучных клетках крысы CR3 более эффективно обеспе-
чивает фагоцитоз опсонизированных эритроцитов, чем CR1, однако система-
тического исследования сравнительной эффективности фагоцитоза, обеспечивае-
мого разными рецепторами СЗ на разных типах клеток, не проводилось. Био-
химические свойватэ CR3, т. е. его размер, строение, аффинность к лиганду,
пока неизвестны. Одна из групп исследователей предполагает, что природным
лигандом CR3 является на самом деле не СЗЫ, a a2d (C3dg).
Рецептор C3d, продукта расщепления СЗЫ под действием трипсина, плаз-
мина или эластазы, известен под названием CR2. Он был выделен из культураль-
ной среды лимфобластоидных клеток Raji и представляет собой одноцепочечный
полипептид массой 70 кДа [156]. Антитела к этому белку связываются с нормаль-
ными В-лимфоцитами и подавляют прикрепление (образование розеток) покры-
тых C3d частиц. Сейчас считается, что фагоцитирующие клетки, полиморфно-
ядерные лейкоциты и моноциты не имеют рецепторов C3d.
24. Комплемент
117
Судьба частиц, прикрепившихся к клеткам с помощью фрагментов СЗ, за-
висит от типа клеток, типа рецептора и самой опсонизированной частицы. Ман-
товани и др. [1571 показали, что эритроциты, покрытые СЗЬ, прочно связыва-
ются с фагоцитирующими клетками через рецепторы СЗЬ. Однако такое связы-
вание не влечет за собой поглощения покрытых СЗЬ частиц клетками; для по-
глощения необходим второй сигнал. Таким вторым сигналом может быть при-
сутствие небольшого количества молекул IgG на поверхности частицы, которые
взаимодействуют с Fc-рецепторами IgG на фагоцитирующей клетке. Эти экспе-
рименты показали, что рецепторы СЗ эффективно обеспечивают связывание час-
тиц, но не их фагоцитоз. Данная точка зрения была подтверждена исследова-
ниями in vivo, в которых определялась скорость удаления из кровотока мор-
ских свинок эритроцитов, покрытых СЗЬ [158]. Многочисленные эксперименты
в различных модельных системах усложнили эту концепцию. В лаборатории
Сильверстайна было показано, что покоящиеся макрофаги брюшной полости
мыши не фагоцитируют с помощью рецепторов СЗ, однако макрофаги, активи-
рованные тиогликолятом, приобретают эту способность. Более того, Гриффин
и Гриффин [159] показали, что покоящиеся макрофаги могут быть индуциро-
ваны к фагоцитозу с помощью рецепторов СЗ, если их предварительно инкуби-
ровать с лимфокинами, образующимися при 'взаимодействии Т-лимфоцитов
с активно фагоцитирующими макрофагами. Таким образом, активация фагоци-
тирующей клетки затрагивает не только связывание, но и поглощение покрытых
СЗЬ эритроцитов. Было, наконец, обнаружено, что фагоцитоз некоторых опсо-
низированных бактерий с помощью рецепторов СЗ может происходить и в от-
сутствие IgG [160]. При взаимодействии рецепторов СЗ с лигандом происходят
и другие клеточные реакции: секреция фактора I из лимфоцитов, секреция лей-
коцитарной эластазы и гистаминазы полиморфноядерными лейкоцитами, акти-
вация дыхания у моноцитов и полиморфноядерных лейкоцитов. Кроме того,
зависящая от антител клеточная цитотоксичность заметно увеличивается, если
с клеткой-мишенью связаны СЗЫ или C3d. Таким образом, фагоцитирующие и
нефагоцитирующие клетки обладают по крайней мере тремя различными рецеп-
торами СЗЬ и продуктов его распада. Однако для достаточного понимания их
биологической и физиологической роли требуются дальнейшие исследования.
У клеток различных типов были обнаружены рецепторы к некоторым дру-
гим компонентам комплемента, но их биологическое значение пока не выясне-
но. Рецептор фактора Н был обнаружен у В-лимфоцитов [161], а также, возмож-
но, у гранулоцитов и моноцитов. По предварительным данным этот рецептор
при электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия и восстанавливаю-
щих агентов мигрирует как одна полоса, соответствующая 50 кДа [162]. Утверж-
дается, что присоединение фактора Н к этому рецептору вызывает секрецию лим-
фоцитами фактора I (инактиватора СЗЬ/С4Ь), а также усиливает хемилюминес-
ценцию моноцитов и их способность восстанавливать нитротетразолий синий.
Сообщалось также о наличии у лимфоцитов, полиморфноядерных лейкоцитов и
тромбоцитов рецептора Clq. У нейтрофилов обнаружено до 10е рецепторов Clq
[163]. Физиологическая роль этого рецептора неясна, но заманчиво предполо-
жить, что он может играть роль в прикреплении активаторов классического ме-
ханизма к фагоцитирующим клеткам. Поскольку ингибитор эстеразы С1 свя-
зывается с Clr и Cis и вызывает их отделение от макромолекулярного комплек-
са С1, то Clq может оставаться прикрепленным к активатору классического ме-
ханизма и взаимодействовать с клеточными рецепторами. Сообщалось также
о наличии у макрофагов рецептора ВЬ, который обеспечивает распластывание
макрофагов на стекле или пластике, покрытых этим белком.
118
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
24.5.1. Другие биологические следствия активации
комплемента
Кроме образования полипептидных, взаимодействующих с клеточными ре-
цепторами и схожих с детергентами макромолекул, вызывающих лизис клеток,
активация комплемента приводит и ко многим другим биологическим последст-
виям. Во-первых, каскад комплемента связан с белками, инициирующими свер-
тывание и образующими кинины. Молекулярный механизм этого взаимодейст-
вия известен только отчасти. Ингибитор эстеразы С1 подавляет активность фер-
ментов механизма свертывания, зависящего от фактора Хагемана, к которым
относится сам фактор Хагемана (фактор ХПа), калликреин, плазмин и фактор
XI [164]. Взаимодействие этих двух механизмов, оба из которых участвуют в
«неспецифической воспалительной реакции», по-видимому, играет большую роль
в инициации и регуляции всех воспалительных процессов.
Активация комплемента иммунными комплексами влияет на размер и со-
став этих комплексов. Присоединение к иммунному комплексу Clq увеличива-
ет его размер и уменьшает его растворимость, что связано, видимо, с множест-
венностью валентностей Clq. С другой стороны, присоединение к иммунному
комплексу СЗ, особенно при активации по альтернативному механизму, умень-
шает размер комплекса. Механизм этого не вполне понятен: считается, что СЗЬ
встраивается в молекулярную сеть иммунного комплекса и разрушает ее. К ка-
ким последствиям в судьбе иммунных комплексов в крови приводят эти эффек-
ты комплемента, неизвестно.
ЛИТЕРАТУРА
1. Humphrey J. A., White R. G. Complement and other auxiliary factors. In: Immunology
for Students of Medicine, pp. 188—203, Davis, Philadelphia, Pa. (1970).
2. Mayer M. M. Complement and complement fixation. In: Experimental Immunochemistry,
ed. by E. A. Kabat and M. M. Mayer, pp. 133—241, Charles C Thomas, Springfield, III
(1967).
3. Borsos T., Rapp H. J. The Molecular Basis of Complement Action, Appleton Century
Crafts, New York, 1970.
4. Forssman J. Die herstellung hochwertiger spezifischer schafhamolysine ohne Verwendung
von schafblut. Ein beitrag zur lehre von heterologer antikorper bildung, Biochem. Zeit-
schrift., 37, 78-101 (1911).
5. Griffiss J. M. Bactericidal activity of meningococcal antisera. Blocking by IgA of lytic
antibody in human convalescent sera, J. Immunol., 114, Д179—1183 (1975).
6. Borsos T. Immunoglobulin classes and complement fixing. In: Progress in Immunology, ,
ed. by B. Amos, p. 841, Academic Press, New York, 1971.
7. Borsos T., Chapuis R. M., Langone J. J. Distinction between fixation of Cl and the acti-
vation of complement by natural IgM anti-Hapten antibody: Effects of cell surface hapten
density, Mol. Immunol., 18, 863—868 (1981).
8. Borsos T., Rapp H. J. Complement fixation on cell surfaces by 19S and 7S antibodies,
Science, 150, 505—506 (1965).
9. Metzger H. Effect of antigen binding on the properties of antibody, Adv. Immunol., 18,
169—207 (1974).
10. Yasmeen D., Ellerson J. R., Dorrington K. J., Painter R. The structure and function of
immunoglobulin domains. IV. The distribution of some effector functions among Cy2
and Cy3 homology regions of human immunoglobulin G, J. Immunol., 116, 518—526
(1976).
11. Cooper N. R., Ziccardi R. J. Reconstitution of Cl in native proenzyme form and its use
in a quantitative Cl activation test, J. Immunol., 119, 1664—1667 (1977).
12. Reid К. В. M., Porter R. R. The proteolytic activation systems of complement, Ann.
Rev. Biochem., 50, 433—464 (1981).
13. Medicus R. G., Chapuis R. M. The physiologic mechanism of Cl activation, Hoppe Seylers
Z. Physiol. Chem., 362, 17 (Abstract) (1981).
14. Hall R. E., Colten H. R. Cell-free synthesis of the fourth component of guinea pig comple-
ment (C4): Identification of a precursor of serum (pro-C4), Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74, 1707-1710 (1977).
24. Комплемент
119
15. Law S. К., Lichtenberg N.A., Holcombe F. H., Levine R. P. Interaction between the
labile binding sites of the forth and fifth human complement proteins and erythrocyte cell
membranes, J. Immunol., 125, 634—639 (1980).
16. Borsos T., Rapp H. J., Colten H. R. Immune hemolysis and the functional properties
of the second and fourth components, J. Immunol., 105, 1439—1446 (1970).
17. Daniels C. A., Borsos T., Rapp H. J., Snyderman R., Natkins A. L. Neutralization of
sensitized virus by the fourth component of complement, Science, 165, 508—509 (1969).
18. Cooper N. R. Enzymatic activity of the second component of complement, Biochemistry,
14, 4245—4251 (1975).
19. Ziccardi R. J., Cooper N. R. Active disassembly of the first component by Cl inactivator,
J. Immunol., 123, 788—792 (1979).
20. Ziccardi R. J., Cooper N. R. Development of an immunochemical test to assess Cl inacti-
vator function in human serum and its use for the diagnosis of hereditary angioedema, Clin
Immunol. Immunopathol., 15, 465—471 (1980).
21. Scharfstein J., Ferreira A., Gigli I., Nussenzweig V. Human C4-binding protein. I. Iso-
lation and characteristics, J. Exp. Med., 148, 207—221 (1978).
22. Nagasawa S., Ichihara C., Stroud R. M. Cleavage of C4b by C3b inactivator: production
of a nicked form of C4b, C3b', as an intermediate cleavage product of C4b by C3b inacti-
vator, J. Immunol., 125, 578—582 (1980).
23. Fujita T., Gigli I., Nussenzweig V. Human C4 binding protein. II. Role in proteolysis of
C4b by C3b inactivator, J. Exp. Med., 148, 1044—1051 (1978).
24. Pillemer L., Ecker E. E. Anticomplementary factor in fresh yeast, J. Biol. Chem., 137,
139—142 (1941).
25. Pillemer L., Blum L., Lepow I. H., Ross O. A., Todd E. W., Wardlaw A . C. The properdin
system and immunity: I. Demonstration and isolation of a new serum protein, properdin,
and its role in immune phenomena, Science, 120, 279—285 (1954).
26. Nelson R.A. An alternative mechanism for the properdin system, J. Exp. Med., 108,
515—534 (1959).
27. Gewurz H., Shin H. S., Mergenhagen S. E. Interactions of the complement system with
endotoxic lipopolysaccharide: Consumption of each of the six terminal components, J.
Exp. Med., 128, 1049—1057 (1968).
28. Marcus R. L., Shin H. S., Mayer M. An alternate complement pathway: C3 cleaving
activity, not due to C32a on endotoxic lipopolysaccharide after treatment with guinea pig
serum; relation to properdin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 1351—1354 (1971).
29. Osler A . G., Olivera B., Shin H. S., Sandberg A. L. The fixation of guinea pig complement
by y, and y.2 immunoglobulin, J. Immunol., 102, 269—271 (1969).
30. Olivera B., Osler A . G., Siriganian R. P., Sandberg A. L. The biologic activities of guinea
pig antibodies. I. Separation of y2 and y2 immunoglobulins and their participation in allergic
reactions of the immediate type, J. Immunol., 104, 320—328 (1970).
31. Sandberg A. L., Osler A. G.t Shin H. S., Olivera B. The biologic activities of guinea pig
antibodies. II. Modes of complement interaction with yt and y, immunoglobulins, J.
Immunol., 104, 329—334 (1970).
32. Sandberg A. L., Olivera B., Osler A. G. Two complement interaction sites in guinea pig
immunoglobulins, J. Immunol., 106, 282—285 (1971).
33. Sandberg A. L., Osler A. G. Dual pathways of complement interaction with guinea pig
immunoglobulins, J. Immunol., 107, 1268—1273 (1971).
34. Ellman L., Green I., Frank M. Genetically controlled total deficiency of the fourth com-
ponent of complement in the guinea pig, Science, 170, 74—75 (1970).
35. Ellman L., Green I., Judge F., Frank M.M. In vivo studies in C4-deficient guinea pigs,
J. Exp. Med., 134, 162—175 (1971).
36. Frank M. M., May J., Gaither T. A., Ellman L. In vitro studies of complement function
in sera of C4-deficient guinea pigs, J. Exp. Med., 134, 176—190 (1971).
37. Root R. K., Ellman L., Frank M. M. Bactericidal and opsonic properties of C4-deficient
guinea pig serum, J. Immunol., 109, 477—486 (1972).
38. Gbtze O., Muller-Eberhard H. J. The C3 activator system: An alternate pathway of com-
plement activation, J. Exp. Med., 134, 90S—108S (1971).
39. Lesavre P. H., Muller-Eberhard H. J. Mechanism of action of Factor D of the alternative
complement pathway, J. Exp. Med., 148, 1498—1509 (1978).
40. Fearon D. T., Austen K. F., Ruddy S. Properdin Factor D: Characterization of its active
site and isolation of the precursor form, J. Exp. Med., 139, 355—366 (1974).
41. Davis A. E., Zalut C., Rosen F. S., Alper C. A. Human Factor D of the alternate comple-
ment pathway. Physicochemical characteristics and N-terminal amino acid sequence,
Biochemistry, 18, 5082—5087 (1979).
42. Hugli T. E., Miiller-Eberhard H. J. Anaphylotoxins: C3a and C5a, Adv. Immunol., 26,
1—53 (1978).
120 Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
43. Jlaum D., Glass D., Carpenter С., A Iper D. А Shur Р. Н. The chromosomal order of genes
controlling the major histocompatibility complex, properdin Factor В and deficiency of
the second component of complement, J. Clin. Invest., 58, 1240—1248 (1976).
44. Minta J. O., Lepow I. H. Studies on the subunit structure of human properdin, Immuno-
chemistry, 11, 361—368 (1974).
45. Medicus R. G., Esser A. F., Fernandez H. N., Muller-Eberhard H. J. Native and activated
properdin: Interconvertibility and identity of amino acid carboxy terminal sequences,
J. Immunol., 124, 602—606 (1980).
46. Konno T., Hirai H., Tomura IV. Binding of activated properdin to untreated erythrocytes,
Immunology, 34, 207—215 (1978).
47. Whaley K., Ruddy S. Modulation of the alternative pathway by piH globulin, J. Exp.
Med., 144, 1147—1163 (1976).
48. Gaither T. A., Hammer С. H., Frank M. M. Studies of the molecular mechanisms of C3b
inactivation and a simplified assay of 61H and the C3b inactivator, J. Immunol., 123,
1195 (1979).
49. Harrison R. A., Lachmann P. J. The phsyiological breakdown of the third component of
complement, Mol. Immunol., 17, 9—20 (1980).
50. Hsiung L., Barclary A. N., Gagnon J., Brandon M. R., Porter R. R. The C3b inactivator
is a serine proteinase, Mol. Immunol., 19, 1376 (Abstract) (1982).
51. Davis A. E. Human C3b inactivator: Sequence homology with serine proteases, Mol.
Immunol., 19, 1367 (Abstract) (1982).
52. Tack B. F., Morris S. C., Prahl J. W. Third component of human complement: Structural
analysis of the polypeptide chains of C3 and C3b. Biochemistry, 18, 1497—1505 (1979).
53. Isenman D. E., Cooper N. R. The structure and function of the third component of com-
plement. I. The nature and extent of conformational changes accompanying C3 activation,
Mol. Immunol., 18, 331—339 (1981).
54. Tack B. F., Harrison R. A., Janatova J., Thomas M. L., Prahl J. W. Evidence for pre-
sence of an internal thioester bond in third component of human complement, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77, 5764—5768 (1980).
55. Janatova J., Lorenz P. E., Schecter A. N., Prahl J. W., Tack B. F. Third component of
human complement: Appearance of a sulfhydryl group after chemical or enzymatic inacti-
vation, Biochemistry, 19, 4471—4478 (1980).
56. Thomas M. L., Janatova J., Gray W. R., Tack B. F. Third component of human comple-
ment: Localization of the internal thioester bond, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1054—
1058 (1982).
57. Law S. K., Levine R. P. Interaction between the third complement protein and cell sur-
face macromolecules, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 2701—2705 (1977).
58. Mann J., O'Brien R., Hostetter M. K., Alper C. A., Rosen F. S., Babior В. M. The third
component of complement: Covalent attachment of radioactive sugar to the labile binding
site of C3 via alternative pathway, J. Immunol., 126, 2370—2372 (1981).
59. Janatova J., Tack B. F., Prahl J. W. Third component of human complement: Require-
ments for its function, Biochemistry, 19, 4479—4485 (1980).
60. Law S. K., Minich T. M., Levine R. P. The binding reaction between C3b and small
molecules in solution, Mol. Immunol., 19, 1383 (Abstract) (1982).
61. Pangburn M. K., Schreiber R. D., Muller-Eberhard H. J. Human complement inactivator:
Isolation, characterization, and demonstration of an absolute requirement for the serum
protein piH for cleavage of C3b and C4b in solution, J. Exp. Med., 146, 257—270 (1977).
62. Lachmann P. J., Oldsoyd R. G., Milstein C., Wright В. W. Three rat monoclonal antibodies
to human C3, Immunology, 41, 503—515 (1980).
63. Lachmann P. J., Pangburn M. K., Oldroyd R. G. Breackdown of C3 after complement
activation: Identification of a new fragment C3g, using monoclonal antibodies, J. Exp.
Med., 156, 205-216 (1982).
64. Medicus R. G., Arnaut M. A. Release of C3c from bound C3bi by C3b inactivator, Molec.
Immunol., 19, 1386 (Abstract) (1982).
65. Gaither T. A., Hammer С. H., Gadek J. E., Katusha K., Frank M. M. Cleavage of mem-
brane bound C3b and C3bi by viable human neutrophils, Fed. Proc., 40, 1018 (Abstract)
(1981).
66. Medicus R. G., Arnaut M. A . Surface restricted control of C3b INA dependent C3c release
from bound C3bi molecules, Fed. Proc., 41, 848 (1981).
67. Weiler J. M.. Daha M. R.. Austen K. F., Fearon D. T. Control of the amplification con-
vertase of complement by the plasma protein (MH. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 3268—
3272 (1976).
68. Lachmann P. J., Muller-Eberhard H. J. The demonstration in serum of «conglutinin acti-
24. Комплемент
121
vating factor and its effect on the third component of complement, J. Immunol., 100,
691 — 698 (1968).
69. Medicus R. G., Gotze 0., Miiller-Eberhard H. J. Alternative pathway of complement:
Recruitment of precursor properdin by the labile C3/C5 convertase and the potentiation
of the pathway, J. Exp. Med., 144, 1076—1093 (1976).
70. Alper C. A., Abramson N., Johnston R. B., Jandl J. H.t Rosen F. S. Increased suscepti-
bility to infection mediated functions and of the third component of complement (C3),
N. Engl. J. Med., 282, 349—354 (1970).
71. Thompson R. A., Winterborn M. H. Hypocomplementemia due to a genetic deficiency of
P1H globulin, Clin. Exp. Immunol., 46, 110 (1981).
72. Pangburn M. K., Miiller-Eberhard H. J. Relation of a putative thioester bond in C3 to
activation of the alternative pathway and the binding of C3b to biological targets of com-
plement, J. Exp. Med., 152, 1102—1114 (1980).
73. Berger M., Gaither T. A., Hammer С. H., Frank M. M. Lack of binding of human C3 in
its native state to C3b receptors, J. Immunol., 127, 1329—1334 (1981).
74. Fearon D. T. Regulation by membrane sciatic acid of fMH-dependent decay-dissolution of
amplification C3 convertase of the alternative complement pathway, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 75, 1971-1975 (1978).
75. Kazatchkine M. D., Fearon D. T., Austen K. F. Human alternative complement pathway:
Membrane-associated scialic acid regulates the competition between В and (J1H for cell
bound C3b, J. Immunol., 122, 75—81 (1979).
76. Kazatchkine M. D., Fearon D. T., Silbert J. E., Austen K. F. Surface associated heparin
inhibits zymosan-induced activation of the human alternative complement pathway by
augmenting the regulatory action of the control proteins on particle bound C3b, J. Exp.
Med., 150, 1202-1215 (1979).
77. Fearon D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an
inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 76, 5867—5871 (1979).
78. Fearon D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the
human erythrocyte, polymorphonuclear leucocyte В lymphocyte and monocyte, J. Exp.
Med., 152, 20—30 (1980).
79. Medof M. E., Prince G. M., Mold C. Release of soluble immune adherence receptors is
mediated by C3b inactivator independently of piH and is accompanied by generation о
C3c, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5047—5051 (1982).
80. Moore F. D., Austen K. F., Fearon D. T. Antibody restores human alternative complement
pathway activation by mouse erythrocytes rendered functionally deficient by pretreatment
with pronese, J. Immunol., 128, 1302—1306 (1982).
81. Nicholson-Weller A., Daha M. R., Austen K. F. Different functions for specific guinea pig
IgG, and IgG2 in the lysis of sheep erythrocytes by C4-deficient guinea pig serum, J.
Immunol., 126, 1800—1804 (1981).
82. Schenkein H. A., Ruddy S. The role of immunoglobulins in alternative pathway activation
by zymosan, J. Immunol., 126, 7—10 (1981).
83. Frank M. MGaither T. A., Adkinson F., Terry W. D., May J. E. Activation of the alter-
nate complement pathway by human immunoglobulins, J. Immunol., 116, 1733 (Abstract)
(1976).
84. Edwards M. S., Kasper D. L., Jennings H. J., Baker C. J., Nicholson-Weller A. Capsular
sialic acid prevents activation of the alternative complement pathway by type III, group В
streptococci, J. Immunol., 128, 1278—1283 (1982).
85. Moore F. D., Fearon D. T.. Austen K. F. IgG on mouse erythrocytes augments activation
of the human alternative complement pathway by enhancing deposition of C3b, J. Immu-
nol., 126, 1805—1809 (1981).
86. Winkelstein J. A., Shin H. S. The role of the Immunoglobulin in the interaction of pneu-
mococci and the properdin pathway: Evidence for its specificity and lack of requirement
for the Fc portion of the molecule, J. Immunol., 112, 1635—1641 (1974).
87. NelsonB., Ruddy S. Enhancing role of IgG in lysis of rabbit erythrocytes by the alternative
pathway of human complement, J. Immunol., 122, 1994—1999 (1979).
88. Ballow M., Cochrane C. G. Two anticomplementary factors in cobra venom: Hemolysis
of guinea pig erythrocytes by one of them, J. Immunol., 103, 944—952 (1969).
89. Joiner K. A., Hawiger A., Gelfand J. A. The effect of cobra venom factor on alternative
pathway hemolytic activity in mice, Immunol. Commun., 9, 277—281 (1980).
90. Lachman P.J., Hobart M.J., Aston W. P. Complement technology. In: Experimental
Immunology, ed. by D. M. Weir, pp. 5A.1—5A.23. Blackwell Scientific Publications,
Oxford, England, 1973.
122
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
91. Hong К., Kinoshita Т., Kitajima Н., Inoue К. Inhibitory effect of К-76 monocarboxylic
acid, an anticomplementary agent, on the C3b inactivatory system, J. Immunol., 127,
104—108 (1981).
92. Hong K., Kinoshita T., Inoue K. Simple methods for preparing EAC/4b2a3b and EAC4b3b
with human or guinea pig complement components using an anticomplementary agent,
K-76 monocarboxylic acid, J. Immunol., 127, 109—114 (1981).
93. Daha M. R., Austen K. F., Fercn D. T. Heterogeneity of polypeptide chain composition
and antigenic reactivity of C3 nephritic factor, J. Immunol., 120, 1389—1394 (1978).
94. Davis A . E., Ziegler J. B., Gelfand E. W.,RosenF. S., Alper C. A . Heterogeneity of neph-
ritic factor and its identification as an immunoglobulin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,^74,
3980—3983 (1977).
95. Burge J. J., Fearon D. T., Austen K. F. Inhibition of the alternative pathway of com-
plement by gold sodium thiomalate in vitro, J. Immunol., 120, 1625—1630 (1978).
96. Kancko I., Fearon D. T., Austen K. F. Inhibition of the alternative pathway of human
complement in vitro by a natural microbial product, complestatin, J. Immunol., 124,
1194—1198 (1980).
97. May J. E., Frank M. M. A new complement mediated cytolytic mechanism: The Cl-bypass
activation pathway, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 649—652 (1973).
98. Nelson R. A., Jr. Complement and body defenses, Transfusion, 3, 250—259 (1963).
99. Inoue K., Nelson R. A., Jr. The isolation and characterization of a new component of
hemolytic complement, C'3e, J. Immunol., 95, 355—367 (1965).
100. Linscott W. D., Nishioka K. Components of guinea pig complement. II. Separation of
serum fractions essential for immune hemolysis, J. Exp. Med., 118, 795—815 (1963).
101. Nilsson U. R., Mtiller-Eberhard H. J. Isolation of beta IF globulin from human serum and
its characterization as the fifth component of complement, J. Exp. Med., 122, 277—298
(1965).
102. Nelson R. A., Jr., Jensen J., Gigli I., Tamura N. Methods for the separation, purification
and measurement of nine components of hemolytic complement in guinea pig serum, Immu-
nochemistry, 3, 111—135 (1966).
103. Mayer M. M. Mechanism of cytolysis by complement, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,
2954—2958 (1972).
104. Mayer M. M., MichaelsD. W., Ramm L. E., Whitlow M. B., Willoughby J. B., Shin M. L.
Membrane damage by complement, Crit. Rev. Immunol., 2, 133—166 (1981).
105. Boyle M. D. P., Borsos T. The terminal stages of immune hemolysis — a brief review,
Mol. Immunol., 17, 425—432 (1980).
106. Green H., Barrow P., Goldberg B. Effect of antibody and complement on permeability
control in ascites tumor cells and erythrocytes, J. Exp. Med., 110, 699—713 (1959).
107. Giavedone E. B., Chow Y. M., Dalmasso A. P. The functional size of the primary comple-
ment lesion in resealed erythrocyte membrane ghosts, J. Immunol., 122, 240—245 (1979).
108. Ramm L. E., Mayer M. M. Life-span and size of the trans-membrane channel formed by
large doses of complement, J. Immunol., 124, 2281—2287 (1980).
109. Simone С. B., Henkart P. Inhibition of marker influx into complement-treated resealed
erythrocyte ghosts by anti-C5, J. Immunol., 128, 1168—1175 (1982).
110. Sims P. J., Lauf P. K. Analysis of solute diffusion across the C5b-9 membrane lesion
of complement: Evidence that individual C5b-9 complexes do not function as discrete,
uniform pores, J. Immunol., 125, 2617—2625 (1980).
111. Shin H. S., Snyderman R., Friedman E., Mellors A., Mayer M. M. Chemotactic and ana-
phylatoxic fragment cleaved from the fifth component of guinea pig complement, Science,
162, 361—363 (1968).
112. Snyderman R., Shin H. S., Phillips J. K., Gewurz H., Mergenhagen S. E. A neutrophil
chemotactic factor derived from C'5 upon interaction of guinea pig serum with endotoxin,
J. Immunol., 103, 413—422 (1969).
113. Daha M. R., Fearon D. T., Austen K. F. C3 requirements for formation of alternative
pathway C5 convertase, J. Immunol., 117, 630—634 (1976).
114. Medicus R. G., Gbtze O., Muller-Eberhard H. J. Alternative pathway of complement:
Recruitment of precursor properdin by the labile C3/C5 convertase and the potentiation
of the pathway, J. Exp. Med., 144, 1076—1093 (1976).
115. Golstein I. M., Perez H. D. Biologically active peptides derived from the fifth component
of complement, Prog. Hemost. Thromb., 5, 41—79 (1980).
116. Cooper N. R., Muller-Eberhard H. J. The reaction mechanism of human C5 in immune
hemolysis, J. Exp. Med., 132, 775—793 (1970).
117. Lachmann P. J., Thompson R. A. Reactive lysis: The complement-mediated lysis of un-
sensitized cells. II. The characterization of activated reactor as C56 and the participation
of C8 and C9, J. Exp. Med., 131, 643-657 (1970).
24. Комплемент
123
118. Thompson R. A., Lachmann P. J. Reactive lysis: The complement-mediated lysis of un-
sensitized cells. I. The characterization of the indicator factor and its identification as C7,
J. Exp. Med., 131, 629—641 (1970).
119. Podack E. R., Kolb W. P., Muller-Eberhard H. J. The C5b-6 complex: Formation, iso-
lation, and inhibition of its activity by lipoprotein and the S-protein of human serum, J.
Immunol., 120, 1841—1848 (1978).
120. Yamamota K., Gewurz H. The complex of C5b and C6: Isolation, characterization, and iden-
tification of a modified form of C5b consisting of three polypeptide chains, J. Immunol.,
120, 2008—2015 (1978).
121. Baker P. J., Lint T. F., McLeod В. C., Behrends C. L., Gewurz H. Studies on the inhibition
of C56-induced lysis (reactive lysis) VI. Modulation of C56-induced lysis by polyanions
and polycations, J. Immunol., 114, 554—558 (1975).
122. Nembrow G. R., Yamamoto K., Lint T. F. Restriction of complement-mediated membrane
damage by the eighth component of complement. A dual role for C8 in the complement
attach sequence, J. Immunol., 123, 1245—1251 (1979).
123. Kolb W. P., Muller-Eberhard H. J. The membrane attack mechanism of complement.
Verification of a stable C5-9 complex in free solution, J. Exp. Med., 138, 438—451 (1973).
124. Kolb W. P., Miiller-Eberhard H. J. The membrane attack mechanism of complement.
Isolation and subunit composition of the C5b-9 complex, J. Exp. Med., 141, 724—735
(1975).
125. Podack E. R., Muller-Eberhard H. J. Binding of desoxycholate, phosphatidylcholine vesi-
cles, lipoprotein and of the S-protein to complexes of terminal complement components,
J. Immunol., 121, 1025—1030 (1978).
126. Bhakdi S., Bjerrum O. J., Rather U., Knufermann II., Wallach D. F. H. Immunochemical
analyses of membrane-bound complement detection of the terminal complement complex
and its similarity to «intrinsic» erythrocyte membrane proteins, Biochim. Biophys. Acta,
406, 21-35 (1975).
127. Biesecker G., Podack E. R., Halverson C. A ., M iiller-E berhard II. J. C5b-9 Dimer: Isolation
from complement lysed cells and ultrastructural identification with complement-dependent
membrane lesions, J. Exp. Med., 149, 448—458 (1979).
128. Ware C. F., Wetsel R. A., Kolb W. P. Physicochemical characterization of fluid phase
(SC5b-9) and membrane derived (MC5b-9) attack complexes of human complement puri-
fied by immunoadsorbent affinity chromatography or selective detergent extraction,
Mol. Immunol., 18, 521—531 (1981).
129. Ware C. F., Kolb W. P. Assembly of the functional membrane attack complex of human
complement: Formation of disulfide-linked C9 dimers, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,
6426—6430 (1981).
130. Humphrey J. II., Dourmashkin R. R. The lesions in cell membranes caused by comple-
ment, Adv. Immunol., 11, 75—115 (1969).
131. Tranum-J ensen J., Bhakdi S., Bhakdi-Lehnen B., Bjerrum O. J., Speth V. Complement
lysis: The ultrastructure and orientation of the C5b-9 on target sheep erythrocyte mem-
branes, Scand. J. Immunol., 7, 45—56 (1978).
132. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. Molecular nature of the complement lesion, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 75, 5655—5659 (1979).
133. Rauterberg E. W., Vngemach B., Gebest H. Quantitative measurement of C9 sites and their
assotiation to the ring-like «lesions» on complement-lysed membranes: A morphometric
immunoferritin study, J. Immunol., 122, 355—365 (1979).
134. Bhakdi S., Tranum-Jensen J., Klump O. The terminal membrane C5b-9 complex of human
complement. Evidence for the existence of multiple protease-resistant polypeptides that
form the trans-membrane complement channel, J. Immunol., 124, 2451—2457 (1980).
135. Podack E. R., Tschopp J. Polymerization of the ninth component of complement. For-
mation of poly(C9) with a tubular ultrastructure resembling the membrane attack complex
of complement, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 574—578 (1982).
136. Podack E. R., Tschopp J., Miiller-Eberhard H. J. Molecular organization of C9 within
the membrane attack complex of complement, J. Exp. Med., 156, 268—282 (1982).
137. Kolb W. P., Miiller-Eberhard H. J. Neoantigens of the membrane attack complex of human
complement, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1687—1689 (1975).
138. Sundsmo J. S., Curd J. G., Kolb W. P., Muller-Eberhard II. J. Leukocyte complement:
Assembly of the membrane attack complex by human peripheral blood leukocytes in the
presence and absence of serum, J. Immunol., 120, 855—860 (1978).
139. Alper C. A., Rosen F. S. Genetics of the complement system. In: Advances in Human
Genetics Vol. 7, ed. by II. Harris and K. Hirschhorn, pp. 141—188, Plenum Press, Lon-
don, 1976.
124
Э. Дж. Браун, К. А. Джойнер, М. М. Фрэнк
140. Whaley К. Biosynthesis of the complement components and the regulatory proteins of
the alternative complement pathway by human peripheral blood monocytes, J. Exp.
Med., 151, 501—516 (1980).
141. Gorski J. P., Muller-Eberhard H. J. Single chain C4 from* human plasma, J. Immunol.,
120, 1775—1776 (Abstract) (1978).
142. Matthews W. JMarino J. T., Gash D. J., Colten H. R. Tunicamycin inhibits secretion
of complement C4 and C2 by guinea pig macrophages, Fed. Proc., 39, 1201 (Abstract)
(1980).
143. Whitehead A. S., Solomon S. P., Chambers S. P., Povey S., Bodmer W. F. Assignment
of the gene for the third component of human complement to chromosome 19 using human
mouse somatic cell hybrids, Mol. Immunol., 19, 1410 (Abstract) (1982).
144. MarcusD., Spira T. J., PetersonB. H., Raum D., Alper C. A. There are two unlinked ge-
netic loci for human C8, Mol. Immunol., 19, 1385 (Abstract) (1982).
145. Alper C. A. Complement and the MHC. In: The Role of the Major Histocompatibility
Complex in Immunobiology, ed. by M. E. Dorf, pp. 173—220, Garland Press, New York,
1981.
146. Parker K. L., Roos M. H., Shreffler D. C. Structural characterization of the murine fourth
component of complement and sex-limited protein and their precursors: Evidence for two
loci in the S region of the H-2 complex, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 5853—5857 (1979).
147. Teisberg P., Olaisen В., Johassen R., Gedde-Dahl T., Thorsby E. The genetic polymorphism
of the fourth component of human complement: Methodological aspects and a presentation
of linkage and association data relevant to its localisation in the HLA region, J. Exp. Med.,
146, 1380—1389 (1977).
148. O'Neil G. J. The genetic control of Chido and Rogers blood group substances, Semin.
Hematol., 18, 32—38 (1981).
149. Chenoweth D. E., Hugli T. E. Demonstration of specific C5a receptor on intact human
polymorphonuclear leukocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3943—3947 (1978).
150. Gorski J. P., Hugli T. E., Muller-Eberhard H. J. C4a: The third anaphylotoxin of the
human complement system, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 5299—5302 (1979).
151. Gerard C., Chenoweth D. E., Hugli T. E. Responce of human neutrophils to C5a: a role for
the oligosaccharide moiety of human C5a^es arg but not of C5a in biologic activity, J.
ImmUnoL, 127, 1978—1982 (1981).
152. Nelson R. A. The immune adherence phenomenon: An immunologically specific reaction
between micro-organisms and erythrocytes leading to enhanced phagocytosis, Science,
118, 733—737 (1953).
153. Nelson D. S. Immune adherence, Adv. Immunol., 3, 131—180 (1963).
154. Fearon D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the
human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte В lymphocyte and monocyte, J. Exp.
Med., 152, 20—30 (1980).
155. Ross G. D., Lambris J. D. Identification of a»C3bi-specific membrane complement receptor
that is expressed on lymphocytes, monocytes, neutrophils, and erythrocytes, J. Exp. Med.,
155, 96—110 (1982).
156. Lambris J. D., Dobson N. J., Ross G. D. Isolation of lymphocyte complement receptor type
two (C'3d receptor) and preparation of receptor specific antibody, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 78, 1828—1832 (1981).
157. Mantovani B., Rabinovitch M., Nussemzweig V. Phagocytosis of immune complexes by
macrophages, J. Exp. Med., 135, 780—796 (1972).
158. Schreiber A. D., Frank M. M. Role of antibody and complement in the immune clearance
and destruction of erythrocytes, J. Clin. Invest.. 51, 575—582 (1972).
159. Griffin J. A., Griffin F. M. Augmentation of macrophage complement receptor function
in vitro, I. Characterization of the cellular interactions required for the generation of
a T-lymphocyte product that enhances macrophage complement receptor function, J.
Exp. Med., 150, 653—675 (1979).
160. Horwitz M. A., Silverstein S. C. Influence of the Escherichia coll capsule on complement
fixation and on phagocytosis and killing by human phagocytes, J. Clin. Invest., 65, 82—94
(1980).
161. Schmitt M., Mussel H., Hammann К. P., Scheiner O., Dierich M. P. Role of piH for the
binding of СЗЬ-coated particles to human lymphoid and pagocytic cells, Eur. J. Immunol.,
11, 739—745 (1981).
162. Lambris J. D., Ross G. D. Characterization of the lymphocyte membrane receptor for
Factor H (PIH globulin) with an antibody to Factor H idiotype, J. Exp. Med., 155, 1400—
1411 (1982).
163. Tenner A. J., Cooper N. R. Stimulation of a human polymorphonuclear leukocyte oxi-
dative response by the Clq subunit of the first complement component, J. Immunol.,
128, 2547—2552 (1982).
24. Комплемент
125
164. Ratnoff О. D., Pensky JOgston D., Naff G. B. The inhibition of plasmin, plasma kalli-
krein, plasma permeability factor, and the Clr subcomponent of the first component of
complement by serum Cl esterase inhibitor, J. Exp. Med., 129, 315—328 (1969).
165. Knoebel H. R., Villigen W., Isliker H. Chemical analysis and electron microscopy studies
of human Clq prepared by different methods, Eur. J. Immunol., 5, 78—82 (1975).
166. West C. D., Davis N. C., Forrestal J., Herbst J., Spitzer R. Antigenic determinants of
human beta 1C and beta 1G globulins, J. Immunol., 96, 650—658 (1966).
167. Bianco C., Griffin F. M., Jr., Silverstein S. C. Studies of the macrophage complement
receptor, Alteration of receptor function upon macrophage activation, J. Exp. Med., 141,
1278—1290 (1975).
Глава 25
Клеточная цитотоксичность
Кристофер С. Хэнни, Стивен Джиллис
(Christopher S. Henney, Steven Gillis)
В работах начала века, в особенности в трудах Пауля Эрлиха, вновь и вновь
высказывалось предположение о способности иммунной системы распознавать
и уничтожать чужеродные клетки. Однако экспериментальные данные в пользу
этой точки зрения накапливались очень медленно, и лишь в последние два де-
сятилетия правомерность гипотезы Эрлиха нашла экспериментальное подтверж-
дение и было доказано, что лимфоидные клетки могут быть цитотоксичными.
Первые данные о цитотоксичности лимфоцитов были получены при изуче-
нии процесса регрессии карцином молочных желез мышей. Оказалось, что ре-
грессии часто предшествует активная инфильтрация опухоли лимфоидными
клетками. Позднее Говертц [1] получил более убедительное доказательство, ус-
тановив, что лимфоциты из грудного протока собак, у которых произошло от-
торжение почечного трансплантата, способны убивать клетки донорской почки
in vitro. Об иммунологической специфичности этой реакции свидетельствовал
тот факт, что почечные клетки неродственных животных при этом не уничто-
жались. Позднее это открытие нашло подтверждение в многочисленных иссле-
дованиях и сейчас стало общепризнанным, что при иммунном ответе млекопи-
тающих на чужеродные («не свои») антигены клеточной поверхности образуются
цитотоксические лимфоциты [2].
У иммунных мышей цитотоксические клетки относятся преимущественно
к той субпопуляции развивающихся в тимусе (Т) лимфоцитов, которая несет
мембранные аллоантигены Lyt-2 и Lyt-З. У человека цитотоксические Т-клетки
также несут характерные мембранные маркеры, аналогичные мышиным алло-
антигенам Lyt-2, Lyt-З. В определенных условиях цитотоксичными оказывают-
ся и другие клетки лимфоидной популяции. Эти клетки не удается отнести ни
к В-, ни к Т-клеткам, и их называют общим термином «нулевые» клетки. Попу-
ляция нулевых клеток состоит как из цитотоксических, так и из нецитотокси-
ческих элементов. К первым относятся клетки, обладающие цитотоксичностью
лишь в сочетании с классическими антителами класса IgG. Эти клетки были
названы К-клетками (от англ, killer — убийца). Недавно в нормальной нести-
мулированной лимфоидной ткани был обнаружен еще один тип клеток, феноти-
пически сходных с К-клетками. Для их активности, однако, не требуется при-
сутствия антител.
Эти клетки, способные in vitro лизировать широкий набор опухолевых
клеток, были названы природными киллерами (ПК, NK).
В этой главе мы вкратце рассмотрим свойства различных цитотоксических
клеток, обнаруживаемых в лимфоидной ткани, и остановимся на механизме
их действия и возможной роли в иммунитете.
25. Клеточная цитотоксичность
127
25.1. Цитотоксические Т-клетки
Среди антигенов клеточной поверхности, способных вызывать образование
цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), наиболее существенны продукты генов
главного комплекса гистосовместимости (МНС), вирусы и опухолеспецифиче-
ские антигены. Интересно, что вирусы и некоторые другие антигены, включая
синтетические гаптены, вызывают образование ЦТЛ, способных лизировать
только те зараженные вирусом или несущие антиген клетки-мишени, у которых
антигены МНС совпадают с соответствующими антигенами цитотоксических
клеток [3]. Для объяснения такой «МНС-рестрикции» активности ЦТЛ были
выдвинуты две основных гипотезы. Первая из них постулирует существование
одного Т-клеточного рецептора, узнающего молекулы МНС после их модифика-
ции, происходящей в результате физического взаимодействия с чужеродным
антигеном (гипотеза «измененного своего»). Согласно второй гипотезе, сущест-
вует два Т-клеточных рецептора: один для чужеродной антигенной детерминан-
ты, а другой — для продукта генов МНС. При анализе имеющихся экспери-
ментальных данных обе гипотезы находили подтверждение, однако сама интер-
претация данных всегда оставалась сомнительной и ни в одном случае не была
принята единодушно. Эти гипотезы имеют то общее, что обе подразумевают
наличие у цитотоксических Т-клеток рецептора, который специфически взаимо-
действует с антигеном. Связывание антигена с рецептором запускает процессы,
обеспечивающие литическую активность ЦТЛ.
25.1.1. Как функционируют цитотоксические Т-клетки?
Наши представления о том, как функционируют цитолитически активные
Т-клетки, в значительной степени сложились в результате изучения in vitro
процесса разрушения опухолей, несущих аллоантигены. Одна из широко ис-
пользуемых экспериментальных систем, впервые предложенная Брюннером и
др. [4], схематически показана на рис. 25.1. В этих опытах ЦТЛ получают у
Мастоцитома
ПВА/2в/бр
11 дней
Удаление селезенки
Рис. 25.1. Схема получения
цитотоксических Т-клеток in
vivo и их выявление in vitro
([4]; печатается с разрешения).
Измерение
выхода s1Cr
Клеточная
Лимфоциты
51Сг-мастоцитома
суспензия
51Сг-мастоцитома
DBA/2
мышей C57BL/6, вводя им внутрибрюшинно клетки аллогенной опухоли (масто-
цитомы Р815 мышей линии DBA/2). Литическую активность популяции лимфо-
цитов иммунизированного животного определяют, культивируя их короткое
время (обычно порядка 4 ч) с меченными 61Сг клетками опухоли, использованной
для иммунизации. Хотя в такой системе лизируются аллогенные клетки, счи-
тается, что по своему механизму этот процесс идентичен тому, при котором ци-
тотоксические клетки уничтожают зараженные вирусом собственные ткани или
128
Л*. С. Хэнни, С. Джиллис
сингенные опухолевые клетки. Поэтому рассмотренные ниже представления о
том, как функционируют цитотоксические Т-клетки, имеют более общее зна-
чение.
25.1.1.1 . Общие представления
Осуществляемое Т-клетками разрушение ткани не зависит ни от антител,
ни от системы комплемента. Так, например, популяции лимфоидных клеток,
в которых не удается обнаружить антитела даже самыми чувствительными ме-
тодами, часто способны лизировать клетки. Осуществляемый Т-клетками лизис
может происходить и в отсутствие сыворотки, причем ни скорость, ни степень
лизиса не меняются при добавлении источника комплемента. Более того, на
осуществляемый клетками лизис не влияют антитела против компонентов ком-
племента С2, СЗ и С5.
Т-клеточный лизис in vitro требует тесного контакта между эффекторной
клеткой и ее мишенью. Если киллерные клетки и клетки-мишени разделены
полупроницаемой мембраной или суспендированы в вязкой среде, например в
агарозе или декстране, лизиса не происходит. Клети-мишени лизируются в ре-
зультате однократного взаимодействия с эффекторной клеткой. Это следует из
линейного характера зависимости степени лизиса от времени и концентрации
эффекторных клеток [5].
О метаболических процессах, необходимых для лизиса, известно очень
мало, но установлено, что эффекторные клетки должны быть живыми. Отсутст-
вие информации по этому вопросу связано прежде всего с проблемой интерпре-
тации полученных результатов. В течение многих лет фармакологи и биохими-
ки исследовали обменные процессы, применяя ингибирующие агенты. Клеточ-
ные биологи, используя этот же прием, но применительно к интактным клеткам,
столкнулись с дополнительными проблемами. Во-первых, метаболические ин-
гибиторы обычно обладают менее избирательным механизмом действия, чем
хотелось бы. Во-вторых, что еще более важно, из того факта, что вызывать лизис
способны лишь живые клетки, почти по определению следует, что метаболиче-
ские ингибиторы должны подавлять литическую функцию. Проблема, таким
образом, заключается в том, чтобы различить ухудшенное функционирование
«больной» клетки от прямого ингибироцания процесса, необходимого для осу-
ществления литической активности.
Несмотря на эти недостатки, эксперименты с ингибирующими агентами
несколько прояснили механизм литического действия Т-клеток: неспособность
некоторых агентов тормозить лизис позволила определить ряд метаболических
путей, не имеющих отношения к литическому действию [6—8]. Так, например,
пактамицин или эметин в концентрациях, полностью подавляющих белковый
синтез, не влияют на цитотоксическую активность лимфоцитов, что убедитель-
но свидетельствует против необходимости белкового синтеза для лизиса. В ана-
логичных экспериментах было показано, что для лизиса клеток-мишеней нет
необходимости ни в размножении эффекторных Т-клеток, ни в синтезе в них
ДНК и РНК. В табл. 25.1 перечислены условия, необходимые, согласно совре-
менным представлениям, для осуществляемого Т-клетками лизиса. Соответст-
вующие экспериментальные данные рассмотрены в других работах [6—8].
Итак, для того, чтобы осуществлять лизис, эффекторные Т-клетки должны
быть жизнеспособными. С другой стороны, нет никаких оснований считать, что
метаболически активными должны быть клетки-мишени. Действительно, в не-
давних исследованиях в качестве клеток-мишеней были использованы клетки,
циксированпые глутаровым альдегидом, и цитопласты, полученные энуклеа-
фией клеток путем их центрифугирования в градиенте плотности в присутствии
25. Клеточная цитотоксичность
129
Таблица 25.1. Условия, необходимые для Т-клеточного лизиса
Условия, необходимые для лизиса Условия, не влияющие на лизис
Живой эффекторный лимфоцит Межклеточный контакт Связывание рецептора Т-клетки с антигеном Двухвалентные катионы (Mg2+ и Са2+) Глюкоза Синтез ДНК, РНК, белка Антитела Система комплемента Синтез лимфокинов Метаболизм клетки-мишени
Общие продукты генов МНС лимфоцита и клет-
ки-мишени (обычно, но не всегда)
Система микрофиламентов и микротрубочек эф-
фекторной клетки (твердо не установлено)
цитохалазина В. При этом фиксированные и энуклеированные клетки эффек-
тивно лизировались. Результаты этих работ показывают, что клетка-мишень
является совершенно пассивным партнером в акте лизиса, и ее роль заключа-
ется лишь в экспозиции антигена. Раньше считалось, что для повреждения клет-
ки-мишени она обязательно должна быть метаболически активной и что после
повреждения клетка способна залечивать свою мембрану. И то, и другое, по-
видимому, неверно. Нет никаких данных о том, что клетка-мишень, атакован-
ная эффекторной клеткой, может избежать гибели.
Эффекторная клетка, напротив, после взаимодействия с клеткой-мишенью
и ее уничтожения выживает и может взаимодействовать с другими мишенями.
Таким образом, процесс Т-клеточного лизиса является циклическим. Наиболее
изящно это было показано в микроманипуляционных экспериментах. В этих
опытах идентифицировали одиночные эффекторные Т-клетки и с помощью мик-
рокапилляра переносили их на новые клетки-мишени. При этом часто оказы-
валось, что киллерные клетки вновь способны были вызвать лизис [9].
Ниже будут изложены современные представления о событиях, приводящих
к разрушению клетки-мишени. Мы отдельно рассмотрим три последовательные
стадии литического цикла: а) межклеточное взаимодействие, б) события, при-
водящие к нанесению летального повреждения в мембране клетки-мишени, на-
зываемые иногда программированием лизиса, и в) разрыв мембраны и выход
содержимого цитоплазмы.
25.1.1.2 . Стадии литического цикла, осуществляемого Т-клетками
25.1.1.2.1 . Межклеточное взаимодействие
Литическая активность эффекторных Т-клеток начинается с взаимодейст-
вия между киллерной клеткой и клеткой-мишенью. Как мы уже отмечали, ли-
зиса не происходит, если воспрепятствовать тесному контакту клеток этих двух
типов.
Долгое время оставалось неясным, связана ли исключительная иммуно-
логическая специфичность Т-клеточного лизиса, например его способность от-
личать клетки, несущие тринитрофенол, от клеток, несущих динитрофенол,
только лишь со специфической межклеточной адгезией, обусловленной взаимо-
действием антигена с комплементарными рецепторными участками на мембране
5-0395
130
К. С. Хэнни, С. Джиллис
эффекторной клетки. Выявить специфические антигенсвязывающие структуры
на поверхностикиллерных Т-клеток оказалось довольно легко. Так, литическая
активность популяции иммунных лимфоидных клеток истощается при инкуба-
ции лимфоцитов с монослоем клеток, несущих антиген, к которому специфичны
эффекторные клетки [10]. Истощения не происходит, если лимфоциты инкуби-
ровать с монослоем других клеток. Эксперименты подобного рода, свидетельст-
вующие о существовании рецепторов антигена на поверхности эффекторных кле-
ток, вызывали постоянное стремление идентифицировать и охарактеризовать
структуры, ответственные за антигенную специфичность. Биохимическая при-
рода антигенного рецептора ЦТЛ остается предметом спора, хотя недавно полу-
ченные данные указывают на некоторое их структурное сходство с иммуногло-
булинами. Так, на поверхности антиген-специфических Т-клеток находятся
продукты генов Ун, и, кроме того, эти клетки имеют общие идиотипические де-
терминанты с В-клетками, иммунными к тем же антигенным детерминантам
(гл. 11).
Метаболические реакции, необходимые для межклеточных взаимодействий.
Для выявления метаболических реакций, необходимых для связывания анти-
гена с антигенным рецептором киллерной клетки, были разработаны две экспе-
риментальные системы. Как уже отмечалось, киллерные клетки быстро и спе-
цифично связываются с гомологичным монослоем аллогенных клеток. Эффек-
тивность связывания легко измерить по исчезновению цитотоксических клеток
из суспензии. Выяснение условий культивирования, при которых происходит
такое связывание, позволило установить, какие метаболические реакции необ-
ходимы для адгезии [11, 12].
Другой подход заключается в том, что эффекторные клетки смешивают с
меченными 61Сг клетками-мишенями и осаждают центрифугированием при раз-
личных условиях [13]. Через короткое время, требующееся для прикрепления
клеток друг к другу, осадок суспендируют в вязкой среде, содержащей декст-
ран, и с помощью мешалки создают в пробирке водоворот (vortex mixing).
Установившиеся в этих условиях межклеточные связи выявляются по образова-
нию микроскопических кластеров, часто называемых конъюгатами. Вязкая
среда предотвращает последующую межклеточную адгезию. Поэтому коли-
чество 51Сг, высвободившегося в таких культурах в среду, отражает число кле-
ток-мишеней, прикрепившихся к эффекторным клеткам при их совместном ин-
кубировании в осадке и лизированных в результате такого прикрепления.
Хотя технически эти два метода анализа межклеточной адгезии различаются,
оба они дали сходные сведения о метаболических реакциях, требуемых для тех
межклеточных взаимодействий, которые приводят к лизису.
Адгезия — это метаболически активный процесс, подавляемый низкими
температурами, азидом и динитрофенолом. Связывание киллерных клеток с
клетками-мишенями ингибируется также цитохалазином В и колхицином, что,
видимо, указывает на роль микрофиламентов и микротрубочек в этом взаимо-
действии [6, 12].
Исследование адгезии в присутствии таких хелирующих агентов, как ЭДТА
и ЭГТА, и использование среды с определенным составом катионов показало,
что связывание киллерных клеток с мишенями требует присутствия двухвалент-
ных катионов. Взаимодействие лимфоцитов с клетками-мишенями осуществля-
ется в присутствии Mga+; оно менее эффективно при замене Mg2+ на Са2+ и вовсе
не происходит в отсутствие катионов [14, 15].
Хотя одного Mg2+ достаточно для взаимодействия между лимфоцитами и
клетками-мишенями, в отсутствие Са2+ в образующихся при этом комплексах
не происходит лизиса. На основе этих результатов был сделан вывод, что двух-
25. Клеточная цитотоксичность
131
валентные катионы играют разную роль в литическом цикле: Mg2+ необходим
для связывания киллерной клетки с ее мишенью, а Са2+ нужен на более поздних
этапах. Эта гипотеза была впервые высказана, когда выяснилось, что смесь Са2^
и Mg2+ оказывает синергическое действие на скорость лизиса. Позднее она под-
твердилась в кинетических исследованиях, в которых цитотоксические куль-
туры инкубировали непродолжительное время с катионами [15]. Из этих опытов
был сделан вывод, что Са2+ выполняет двойную роль, участвуя как в адгезии,
так и в программировании лизиса. В основе такого вывода лежит тот факт, что
Са2+ усиливает адгезию при добавлении к субоптимальным концентрациям Mg2+,
хотя адгезия происходит и в присутствии одного Mg2+.
Заключительные стадии литического цикла не требуют присутствия двух-
валентных катионов и даже могут ускоряться в их отсутствие. Таким образом,
литический цикл можно разбить на три стадии, различающиеся по тому, в ка-
кой степени они нуждаются в двухвалентных катионах. Адгезия зависит от
Mg2+, следующие за ней события («программирование лизиса») зависят от Са2+,
а сам лизис может происходить в отсутствие катионов.
Проведенные надавно исследования показали, что стадия адгезии также
может быть разбита на два этапа: а) катион-независимый цитохалазин А-чувст-
вительный этап и б) ЗУ^2+-зависимый этап. Было высказано предположение,
что чувствительный к цитохалазину А этап соответствует межклеточному узна-
ванию, a Mg2^зависимый этап — неспецифическому «усилению» взаимодейст-
вия киллерной клетки с клеткой-мишенью. Согласно этому предположению,
рецептор, ответственный за специфическое распознавание, может иметь неболь-
шую аффинность (сродство) к лиганду и его роль во взаимодействии эффектор-
ной клетки с клеткой-мишенью может заключаться не в «связывании», а лишь
в «узнавании» [16].
Роль антигенного рецептора. В результате экспериментов, проведенных
с рядом растительных агглютининов, некоторые исследователи пришли к выво-
ду, что единственное условие для лизиса — это тесный контакт киллерной клет-
ки с клеткой-мишенью. Было, например, показано, что специфичность популя-
ции эффекторных Т-клеток изменяется при добавлении к смеси киллерных кле-
ток и клеток-мишеней растительных лектинов конканавалина А или фитогемаг-
глютинина [17]. В присутствии этих лектинов цитолитически активные Т-клет-
ки, взятые у животных, иммунизированных аллогенными клетками, приобре-
тали способность убивать широкий спектр клеток-мишеней, включая сингенные
клетки. Этот процесс был назван лектинзависимой клеточной цитотоксичностью.
Каким же образом эти наблюдения согласуются с исключительной иммуноло-
гической специфичностью, проявляемой эффекторными Т-клетками in vitro в
отсутствие лектинов?
Раз вещества, агглютинирующие клетки, придают эффекторным Т-клеткам
способность к неспецифической цитотоксичности, то можно предполагать, что
расположенный на мембране киллерной клетки рецептор антигена играет в
самом лизисе пассивную роль, т. е. служит только для присоединения клетки-
мишени, подвергая ее тем самым литическому действию эффекторной клетки.
Предположение о том, что рецептор играет роль только связующего мостика,
объясняет специфичность процесса лизиса и подразумевает, что дифференци-
рованной киллерной клетке внутренне присуща литическая функция и стоит
ей оказаться вблизи клетки другого типа, она тут же лизирует эту клетку-
мишень.
Возможна, однако, и другая точка зрения: киллерная клетка потенциаль-
но способна осуществлять лизис, но этого не происходит, пока ее рецептор не
провзаимодействовал с антигеном. Согласно этой модели, между рецептором
5'
132
К. С. Хэнни, С. Джиллис
антигена и литическим механизмом существует прямая связь. Антиген в этом
случае запускает метаболическую систему, осуществляющую лизис.
Недавно были проведены эксперименты, которые должны были прямо отве-
тить на вопрос о роли рецептора антигена в клеточном лизисе [18]. В основе
использованного при этом экспериментального подхода лежало наблюдение
Голстайна [19], показавшего, что киллерные клетки сами по себе могут служить
мишенями для литического действия. В этих опытах был поставлен простой
вопрос: если смешать эффекторные клетки двух различных специфичностей,
подобранных так, чтобы распознавание антигена происходило лишь в одном
направлении, то будет ли при этом лизис клеток происходить в обоих направле-
ниях? Предполагалось, что если рецептор антигена служит только для тесного
ПРЕДПОЛАГАЕМЫЙ РЕЗУЛЬТАТ
ЭКСПЕРИМЕНТ ГИПОТЕЗА РЕЗУЛЬТАТ ЭКСПЕРИМЕНТА
ВЫВОД
Смешанная популяция
эффекторных клеток
{ \ Рецептор необходим только
(А-анти-О^ для сближения клеток
Обоюдное
^ничтоженке
Для лизиса необ-
ходимо связывание
рецептора с антигене
Никогда не
наблюдается
Наблюдается
всегда
Связывание
рецептора с анти-
геном необходимо
для осуществле-
ния лизиса
Рецепторы 1-клеток
j w Детерминанты поверхностных
антигенов Однонаправленное
•—*- Направление лизиса
уничтожение
Рис. 25.2. Возможные варианты участия антигенного рецептора в Т-клеточном лизисе
([18]; печатается с разрешения).
сближения двух клеток, то оба типа эффекторных клеток в этой ситуации проя-
вят свое литическое действие и взаимно уничтожат друг друга. Если же, одна-
ко, для активации лизиса требуется встраивание антигена в рецептор антигена
киллерной клетки, то будет лизироваться только клетка, несущая антиген,
распознаваемый рецептором. Эти соображения схематично показаны на рис. 25.2
и подробно описаны Купперсом и Хэнни [18].
С помощью смешанной культуры лимфоцитов у конгенных мышей были по-
лучены две популяции киллерных клеток: одну популяцию эффекторных клеток
получали, культивируя клетки селезенки мышей В10.А с лимфоцитами мышей
B10.D2 (ее обозначали как а-анти-й-популяцию); другую популяцию получали,
совместно культивируя клетки селезенки мышей B10.D2 и C57BL/10
(обозначалась как d-анти-Ь).
Эти две популяции эффекторных клеток инкубировали совместно при раз-
ных соотношениях числа клеток «а» и «d». Контрольные культуры содержали
вместо эффекторных клеток нормальные клетки селезенки «а» или «d». После
инкубации клеточные культуры добавляли к соответствующим клеткам-мише-
ням и определяли оставшуюся литическую активность. В нескольких подобных
экспериментах эффекторные клетки а-анти-d сохраняли после инкубации с
25. Клеточная цитотоксичность
133
нормальными клетками d или эффекторными клетками d сходный уровень ак-
тивности. В то же время эффекторные клетки d-анти-Ь в значительной степени
теряли активность после инкубации с эффекторами а-анти-d, но не нормальны-
ми клетками а. Таким образом, наблюдалось разрушение эффекторных клеток,
но только в направлении распознавания антигена.
Аналогичные эксперименты с эффекторными клетками других специфич-
ностей давали сходные результаты. Во всех случаях инактивация эффекторных
клеток происходила только в направлении распознавания антигена. Взаимное
уничтожение эффекторных клеток происходило лишь в том случае, если рас-
познавание антигена могло осуществляться в обоих направлениях (например,
при смешивании клеток а-анти-d с клетками d-анти-а).
Итак, если смешивают две литически активные клеточные популяции и
если при этом распознавание антигена может происходить только в одном на-
правлении, то теряется цитотоксическая активность популяции, несущей анти-
ген, и сохраняется активность популяции, несущей рецепторы антигена.
Этот вывод нашел недавно подтверждение в экспериментах, в которых
использовали популяции эффекторных клеток, содержащие высокий процент
киллерных Т-клеток, и в качестве меры межклеточного взаимодействия оцени-
вали способность клеток образовывать видимые под микроскопом кластеры [20].
При исследовании на уровне клеточных популяций инкубация двух типов эффек-
торных клеток, направленных против аллоантигенов друг друга, приводит к
образованию клеточных агрегатов и лизису клеток обоих типов. Однако в тех
случаях, когда под микроскопом прослеживали судьбу каждого индивидуаль-
ного клеточного агрегата, выяснилось, что лизис происходит лишь в одном на-
правлении. Эти результаты показывают, что двунаправленный лизис, наблю-
даемый при исследовании на уровне целых клеточных популяций, есть, по-ви-
димому, результат многих случайных актов лизиса, каждый из которых идет
лишь в одном направлении. Когда две киллерные клетки, способные ко взаим-
ному распознаванию, взаимодействуют друг с другом, видимо только одна из
них (может быть та, у которой рецепторы имеют большее сродство к антигену)
приобретает литическую активность. Другая же клетка не становится цитотокси-
чной и служит только мишенью для лизиса. Таким образом, с литической актив-
ностью тесно связано распознавание антигена и клеточный лизис — это, оче-
видно, не просто столкновение между эффекторной клеткой и клеткой-мишенью.
25.1.1.2.2 . Программирование лизиса
Вторая условная стадия литического цикла, программирование лизиса,
изучена хуже всего. Существование этой стадии следует из экспериментов, в
которых показано, что некоторые химические агенты подавляют лизис, но не
оказывают существенного влияния на взаимодействие лимфоцитов с клеткой-
мишенью [8, 21]. К наиболее интересным химическим агентам такого рода отно-
сятся вещества, повышающие содержание циклического 3',5'-аденозинмонофос-
фата (сАМР) в лимфоцитах.
Обратная зависимость между содержанием сАМР в лимфоцитах и их лити-
ческой активностью впервые наблюдалась в экспериментах со стимулятором
аденилат-цик л азы изопротеренолом и ингибитором фосфодиэстеразы теофилли-
ном. Эти наблюдения были подтверждены в экспериментах с простагландинами.
Была обнаружена тесная корреляция между повышением содержания сАМР
под действием простагландинов и степенью ингибирования лизиса. Так, проста-
гландины Е1 и Е2 оказались мощными стимуляторами аденилат-циклазы и ак-
тивными ингибиторами клеточного лизиса. Простагландины Fla и F2a, напро-
134
К. С. Хэнни, С. Джиллис
тив, практически не вызывали повышения содержания с АМР в суспензии клеток
селезенки и лишь в незначительной степени препятствовали лизису [6, 21].
Очевидно, трудно непосредственно применить эти наблюдения к описанию
механизма Т-клеточного лизиса— главным образом потому, что биохимические
исследования проводились на всей популяции лимфоцитов, из которых лишь
небольшая часть цитотоксична. Недавно, однако, сходные наблюдения были
получены при исследовании клонированных цитотоксичных Т-клеток.
25.1.1.2.3 . Летальный удар
После специфического присоединения киллерной клетки к клетке-мишени
и последующих событий, называемых программированием лизиса, эффекторная
клетка оказывает токсическое воздействие на клетку-мишень. Этот процесс,
обычно называемый летальным ударом,— наиболее интересное и одновременно
наиболее загадочное событие в литическом цикле.
Среди предположений, объясняющих природу токсического воздействия,
значительное внимание привлекла гипотеза о том, что разрушение клетки-
мишени происходит под действием растворимого медиатора, секретируемого
лимфоцитом в ответ на взаимодействие с антигеном. В основе этой гипотезы,
впервые предложенной Грэнджером и сотр. [22], лежало наблюдение, что куль-
туры лимфоидных клеток, стимулированные антигеном или некоторыми мито-
генами, продуцируют фактор, названный лимфотоксином. Этот фактор оказал-
ся способным убивать некоторые типы клеток-мишеней in vitro. Определяющая
роль лимфотоксина как медиатора Т-клеточного лизиса подвергалась, однако,
сомнению, так как многие наблюдения с трудом согласовывались с концепцией
свободно проникающего токсического медиатора (эти наблюдения подробно
описаны в работе [23]). Важнейшие соображения касаются специфичности Т-
клеточного лизиса. Когда несущие антиген клетки-мишени смешивают с цито-
токсическими лимфоцитами и другими клетками-мишенями, у которых нет дан-
ного антигена, наблюдается специфический лизис (т. е. не происходит лизиса
клеток-вневинных свидетелей»). Более того, гипотеза лимфотоксина не дает
удовлетворительного объяснения тому, почему киллерная клетка сама не по-
гибает после взаимодействия с клеткой-мишенью. Как описывалось выше, кил-
лерные клетки сами по себе не обладают врожденной резистентностью к лизису
и вполне подвержены действию эффекторных клеток, специфичных к аллоанти-
генам их клеточной поверхности.
Серия экспериментов, в которых определялась зависимость между продук-
цией лимфотоксина и цитолитической активностью лимфоцитов, породила до-
полнительные сомнения в роли лимфотоксина в Т-клеточном лизисе. Было пока-
зано, что цитолитическую активность популяции лимфоцитов и ее способность
продуцировать растворимые медиаторы можно легко разобщить эксперимен-
тальными воздействиями. Так, обработка лимфоцитов многими агентами (на-
пример, холерным энтеротоксином, колхицином и винбластином) подавляла
прямую цитотоксическую активность этой клеточной популяции, но не оказы-
вала влияния на способность клеток продуцировать некоторые лимфокины,
в том числе лимфотоксин. Наконец, сильные антисыворотки против лимфотокси-
на не препятствовали Т-клеточному лизису.
Кроме концепции растворимого медиатора были предложены еще две весьма
интересные гипотезы. В одной из них постулируется образование цитоплазмати-
ческих мостиков между киллерной клеткой и клеткой-мишенью; другая пред-
полагает наличие специальных ферментных систем на мембране эффекторной
клетки.
25. Клеточная цитотоксичность
135
Было высказано предположение, что ключевым событием индуцированно-
го лимфоцитом лизиса является образование цитоплазматических мостиков меж-
ду киллерной клеткой и клеткой-мишенью, которые обеспечат возможность
межклеточного взаимодействия без контакта с окружающей средой. Это с са-
мого начала кажется маловероятным, так как, хотя цитоплазматические связи
часто возникают между клетками растущей in vitro ткани, имеется лишь не-
большое число сообщений о существовании таких связей между лимфоцитами и
клетками других типов. Большинство исследователей не смогли обнаружить
в месте контакта цитотоксичного лимфоцита с клеткой-мишенью никаких ло-
кальных изменений мембраны: ни слияния мембран, ни специализированных
контактных структур. Более того, акт лизиса происходит слишком быстро (ви-
димо, за 40—60 с) для того, чтобы успели образоваться цитоплазматические
мостики между взаимодействующими клетками.
Согласно многим данным, Т-клеточный лизис может осуществляться цели-
ком на уровне взаимодействия клеточных мембран. Эту точку зрения наиболее
прямым образом подтверждают данные о том, что плазматические мембраны,
выделенные из лимфатических узлов мышей, подвергнутых контактной сенси-
билизации оксазолоном, могут быть цитотоксичными в отношении опухолевых
клеток in vitro [24]. К сожалению, в этих исследованиях не были охарактери-
зованы плазматические мембраны, а также не ставился контроль на цитотоксич-
ность мембран из нормальных лимфоцитов. Следует добавить, что цитотоксиче-
ская активность выделенных мембран — это совершенно неожиданный факт,
поскольку во многих экспериментах было показано, что лизис способны осу-
ществлять лишь живые эффекторные клетки. Эффекторные клетки, убитые на-
греванием, замораживанием и оттаиванием, обработкой ультразвуком или
рентгеновскими лучами, неизбежно теряли литическую активность. Убитые
клетки не подавляли литической активности живых эффекторных клеток, что,
по-видимому, указывает на их неспособность связываться с клетками-мишеня-
ми. Наконец, недавно было показано, что литическая активность мембранных
фрагментов характерна не только для препаратов, полученных из цитотоксич-
ных клеток: даже мембраны эритроцитов в некоторых условиях оказываются
токсичными [25]. Очевидно, что эти данные ставят под сомнение биологическое
значение результата о цитолитическом действии мембран из лимфатических
узлов животных, подвергнутых контактной сенсибилизации.
В одном сообщении указывается на возможную роль в клеточной цитоток-
сичности фосфолипазы, ассоциированной с мембраной. Фрай и Фриу [26] обна-
ружили, что лизис куриных эритроцитов клетками мышиной селезенки в при-
сутствии антител к эритроцитам (цитотоксичность в этом случае не связана с Т-
клетками) подавляется фосфатидилхолином и известным ингибитором фосфоли-
пазы А ацетатом D, L-2, З-дистеароилоксипропил-диметил-2-гидроксиэтиламмо-
ния. К сожалению, в этих экспериментах не контролировалась специфичность
ингибиторов и не исключено, что другие липиды и даже гидрофобные пептиды
также способны подавлять лизис клеток.
В других исследованиях указывается на участие в цитотоксической реак-
ции иных ферментов. Так, например, предполагается участие метилтрансфераз,
поскольку оказалось, что 3-деазоаденозин подавляет лизис. Не исключена так-
же роль ферментов поверхности эффекторных клеток, имеющих трипсиноподоб-
ную активность.
Как уже указывалось ранее, такой подход сталкивается с проблемами ин-
терпретации результатов. Трудно определить, а) действует ли ингибирующий
агент на эффекторную клетку или на клетку-мишень, б) действительно ли инги-
бируемый процесс непосредственно связан с нанесением летального воздействия
136
К. С. Хэнни, С. Джиллис
и в) не связано ли подавление клеточного лизиса просто с нарушением метаболиз-
ма эффекторной клетки. Альтернативный подход, который в конце концов мо-
жет оказаться более полезным для определения природы летального воздейст-
вия, сводится к определению компонентов клетки-мишени, необходимых для
того, чтобы она была подвергнута такому воздействию. Во многих лаборатори-
ях сейчас пытаются использовать в качестве мишеней синтетические мембран-
ные пузырьки (липосомы), поскольку настойчиво высказываются предположе-
ния, что объектом иммунологической атаки являются мембранные липиды.
К настоящему времени показано, что липосомы, несущие закодированные в
МНС гликопротеины, индуцируют дифференцировку цитотоксических лимфоци-
тов, но вот, могут ли они служить адекватными субстратами для литического
воздействия, пока неизвестно.
25.1.1.2.4 . Разрыв мембраны
Последние этапы литического цикла изучены, по-видимому, лучше всего.
В результате взаимодействия с эффекторным Т-лимфоцитом начинается серия
последовательных изменений мембранной проницаемости клетки-мишени, за-
канчивающаяся разрывом клеточной мембраны. На этом этапе присутствие
лимфоцита уже не обязательно. Изменения мембраны клетки-мишени, предшест-
вующие ее лизйсу, были наиболее прямо продемонстрированы с помощью моле-
кулярных маркеров различного размера, использованных в качестве индикато-
ров разрушения клетки-мишени [27]. Результаты этих работ показывают, что
первичное повреждение мембраны приводит к быстрому обмену между клеткой
и средой неорганическими ионами и небольшими молекулами, но не макромоле-
кулами. Обмен макромолекулами становится возможным только после вторич-
ных эффектов, вызванных нарушением осмотической регуляции клетки. Гибель
клетки-мишени наступает, видимо, в результате действия сил коллоидного осмо-
са из-за входа в клетку воды. В основе такого вывода лежит наблюдение, что и
выход макромолекул из поврежденной клетки-мишени, и разрушение ее плаз-
матической мембраны может быть предотвращено добавлением в среду высоко-
молекулярных декстранов [28].
Постепенный характер развития литического повреждения, индуцирован-
ного Т-клеткой, и возможность подавления лизиса с помощью растворов с вы-
соким осмотическим давлением, и наблюдаемый размер первичного поврежде-
ния указывают на заметное сходство этого процесса с изменениями мембранной
проницаемости опухолевых клеток, индуцируемыми комплементом. Хотя, как
уже указывалось ранее, кажется наиболее вероятным, что индуцированные
Т-клетками повреждения мембраны связаны с действием компонентов компле-
мента, гипотеза о том, что лизис вызывается встраиванием в мембрану клетки-
мишени комплекса, состоящего из гидрофобных белков (как в случае компле-
мента), остается пока лишь одной из интересных возможностей *.
1 Согласно современным данным, цитотоксические клетки повреждают поверхностные
мембраны атакуемых клеток и в последних образуются цилиндрические поры диаметром
от 5 до 16 нм.С появлением таких трансмембранных каналов возникает осмотический шок
и клетка гибнет. Сами каналы образуются особыми белками — перфоринами, которые хра-
нятся в виде мономеров в клетках-киллерах. После внедрения в мембрану клеток-мишеней
перфорин полимеризуется при участии ионов кальция в цилиндрические образования.
Для их возникновения не требуется активного участия клеток-мишеней (J. Immunol.
1985, V. 135, № 6, р. 4245—4251.).— Прим. ред.
25. Клеточная цитотоксичность
137
25.1.1.3 . Направления будущих исследований
Таким образом, мы имеем неплохое представление обо всем комплексе со-
бытий индуцируемого Т-клеткой литического цикла (рис. 25.3). В последнее
время, однако, прогресс был невелик и затруднялся он прежде всего гетероген-
ностью клеточных популяций, используемых для измерения цитотоксической
активности. Особенно это касается биохимических исследований, направленных
на выяснение механизма лизиса. Часто лишь небольшая и притом неизвестная
доля клеток, используемых для осуществления лизиса, представляет собой
киллеры. Эта проблема усложняется еще и тем, что при анализе цитотоксич-
ности измеряется активность эффекторных клеток, а не их количество. Дейст-
Рис. 25.3. Стадии Т-клеточного лизиса.
Стадии:
Специфическое
связывание
Программирование
лизиса
Изменение мемвранной
проницаемости
Осмотическое
набухание
Разрыв мемвраны, выход
содержимого цитоплазмы
вительно, небольшое чило клеток, способных эффективно и многократно осу-
ществлять лизис, вносит тот же вклад в общую активность, что и гораздо боль-
шее число клеток, являющихся менее эффективными киллерами. Предпринима-
лись попытки решить эту проблему, но до сих пор не найдено удовлетворитель-
ного метода для измерения числа эффекторных клеток.
Рассматривая проблемы, возникающие при биохимическом анализе попу-
ляции киллеров, в связи с гетерогенностью эффекторных клеток нетрудно пред-
ставить, что те же самые проблемы присущи и другому подходу к анализу Т-
клеточного лизиса: исследованию морфологии комплексов киллерных клеток
с клетками-мишенями. Для подтверждения различных гипотез о механизме
лизиса часто используют подробный электронно-микроскопический анализ
конъюгатов лимфоцита с клеткой-мишенью или цейтраферную киносъемку
культур, в которых происходит лизис. К сожалению, в таких работах обычно
обходится молчанием основная проблема этого экспериментального подхода:
морфологический анализ не позволяет отличить киллерную клетку и нецито-
токсический лимфоцит. Таким образом, если исследуется не сам процесс лизи-
са, то невозможно узнать, содержит ли данный конъюгат клетки-мишени с лим-
фоцитом киллерную клетку, причем такая ошибка делается во многих работах.
До тех пор, пока не будут получены гомогенные популяции эффекторных кле-
ток, морфологические исследования не смогут дать полного представления о
механизме лизиса.
К счастью, в скором будущем следует ожидать решения всех этих проблем.
В настоящее время привлекают внимание два подхода получения гомогенных
138
К. С. Хэнни, С. Джиллис
популяций эффекторных клеток. Один из них — соматическая гибридизация
популяции эффекторных клеток с клеточными линиями, имеющими измененную
чувствительность к какому-либо токсическому агенту. Этот подход уже вызвал
революцию в классической серологии (гл. 28). К сожалению, попытки гибри-
дизации цитотоксических Т-клеток не имели большого успеха. Часто выска-
зывалось предположение, что эффекторные клетки лизируют те клетки, с кото-
рыми они гибридизуются. Однако недавние сообщения из лаборатории Берке
об успешном получении цитотоксических клеточных гибридов показывают, что
это происходит не всегда [56].
Другой подход, заключающийся в длительно поддерживаемом размноже-
нии цитотоксических клеток, обещает гораздо больше и неоднократно обсуж-
дается в настоящей книге. Здесь мы затронем некоторые основные достижения
этого подхода.
Получение таких клеточных популяций, обеспечивающих гомогенный источ-
ник цитотоксичных эффекторных клеток, скорее всего должен оживить биохи-
мическое и морфологическое исследование механизма Т-клеточного лизиса и
в конце концов поможет выяснить молекулярную основу цитолитического про-
цесса. К настоящему времени, однако, такие клеточные популяции получены
лишь в небольшом числе лабораторий и мало изучены с биохимической точки
зрения.
25.1.2 . Дифференцировка, рост и клонирование
цитотоксических Т-клеток
То обстоятельство, что ни из целого организма, ни из клеточной культуры
невозможно получить истинно гомогенные популяции дифференцированных
эффекторных Т-клеток, длительное время тормозило развитие клеточной имму-
нологии. Хотя были применены самые разнообразные методы культивирования
(в том числе гибридизация клеток, повторная стимуляция антигеном и выделение
растущих в культуре мутантов), долгое время не удавалось получить постоян-
ную экспоненциально растущую культуру клонируемых нормальных Т-клеток.
Первый успех в этой области произошел около пяти лет назад, когда исследова-
тели из Национального института рака обнаружили, что добавление культу-
ральной среды от стимулированных митогеном лейкоцитов периферической кро-
ви человека в культуры нормальной или лейкемической крови или костного
мозга приводит к экспоненциальному росту гомогенной клеточной популяции
[29]. Размножающиеся в этих условиях клетки образовывали розетки с эритро-
цитами, не содержали поверхностных иммуноглобулинов и эстеразы, реагиро-
вали в смешанной культуре лимфоцитов и давали пролиферативный ответ на
митогены Т-клеток. Короче говоря, они и были Т-клетками. Это была первая
демонстрация длительного поддержания in vitro нормальных, функциональных
Т-лимфоцитов. Для постоянного размножения этих клеток требовалась, одна-
ко, кондиционированная среда (от обработанных митогеном лейкоцитов).
По аналогии с этими работами среда из культур стимулированных митоге-
нами лимфоцитов была использована для роста мышиных Т-клеток. Более того,
были получены постоянные культуры антиген-специфических эффекторных
(цитолитических) Т-клеток [30]. Для активации Т-клеток использовали стиму-
ляцию антигеном, а не митогеном. После этого многие исследователи развивали
эту технику культивирования и в результате были разработаны воспроизводи-
мые методы клонирования и поддержания в культуре антиген-специфических
мышиных хелперных и цитолитических Т-клеток, а также клонированных ан-
тиген-спицифических человеческих цитолитических Т-клеток. Эти методы под-
робно описаны в гл. 30.
25. Клеточная цитотоксичность
139
В основе современной методологии клонирования и роста линий эффектор-
ных Т-клеток (как мышиных, так и человеческих) лежит абсолютная зависи-
мость этих линий от постоянного присутствия продуцированного лимфоцитами
растворимого медиатора, названного интерлейкином-2 (IL-2), ранее называв-
шегося фактором роста Т-клеток. Интерлейкин-2 оказался основным компонен-
том всех кондиционированных сред, используемых в настоящее время для под-
держания длительного размножения линий эффекторных Т-клеток. Подробно
этот фактор описывается в гл. 21.
Несколько опубликованных сравнительно недавно сообщений показывают,
что IL-2, используемый в практике для поддержания длительных культур Т-
клеток, играет также важную физиологическую роль, регулируя дифференци-
ровку цитотоксических Т-клеток in vivo и in vitro.
25.1.3 . Роль растворимых факторов в дифференцировке
цитотоксических Т-клеток
При совместном культивировании популяций лимфоцитов от доноров с
тканевой несовместимостью наблюдается заметная пролиферация Т-клеток и
дифференцировка ЦТЛ. Такие смешанные культуры лимфоцитов (СКЛ) стали
обычной модельной системой для изучения пролиферации Т-клеток и роли в
этом процессе растворимых медиаторов. Кроме того, реакция СКЛ предоставила
клеточным иммунологам систему in vitro, в которой можно изучать роль раз-
личных клеток в дифференцировке ЦТЛ.
Воздействуя на одну из смешиваемых клеточных популяций рентгеновски-
ми лучами или митомицином С, удается выяснить, какая из популяций Т-кле-
ток размножается в СКЛ. После такой обработки клетки не размножаются,
но сохраняют антигенные свойства и могут стимулировать пролиферацию Т-кле-
ток, с которыми их культивируют.
Для дифференцировки ЦТЛ в СКЛ необходимо присутствие клеток по край-
ней мере трех типов. Два из них относятся к Т-клеткам: предшественники ЦТЛ
и Т-хелперы. Третий тип, «вспомогательные» (accessory) клетки, как было пока-
зано во многих экспериментальных системах, относятся к моноцитам (макрофа-
гам). Следует указать на два свойства взаимодействующих клеток. Во-первых,
в СКЛ Т-клетки (как предшественники ЦТЛ, так и Т-хелперы) только отвечают
на стимул, размножаясь и дифференцируясь, но они не могут презентировать
антиген, необходимый для пролиферации других клеток, т. е. Т-клетки не яв-
ляются стимуляторами. Во-вторых, клетки, служащие стимуляторами, несут
продукты /-области главного комплекса гистосовместимости и по происхожде-
нию могут относиться как к В-клеткам, так и к моноцитам. Взаимодействие меж-
ду клетками разных типов в СКЛ происходит с помощью растворимых факторов,
синтезируемых в ответ на антигенную стимуляцию.
В тех случаях, когда используют Т-клетки, не компетентные в иммуноло-
гическом отношении (например, клетки тимуса или спленоциты бестимусных
мышей), или когда популяцию клеток-стимуляторов подвергают тепловой инак-
тивации, облучению ультрафиолетом или ультразвуком, наблюдается заметное
подавление пролиферации Т-клеток, а дифференцировки ЦТЛ вообще не про-
исходит [31]. Было высказано предположение, что отсутствие дифференцировки
ЦТЛ в таких экспериментальных системах отражает недостаток хелперных Т-
клеток или недостаточную их активацию. Вскоре эти предположения были
подтверждены. Оказалось, что дифференцировка ЦТЛ в культурах, содержа-
щих иммунологически некомпетентные Т-клетки, может быть восстановлена
при добавлении антиген-реактивных хелперных Т-клеток или прикрепляющихся
140
К. С. Хэнни, С. Джиллис
к культуральной подложке клеток, несущих антиген 1а. Особый интерес пред-
ставляют результаты Шоу и др. [32], показавших, что культуральная среда
стимулированных митогеном клеток селезенки может восстанавливать диффе-
ренцировку ЦТЛ в СКЛ, содержащей иммунологически некомпетентные спле-
ноциты. Эти эксперименты показали, что растворимый фактор или факторы иг-
рают, по-видимому, важную роль в реакции образования цитотоксических Т-
клеток. Фактор, способствующий дифференцировке ЦТЛ и названный костиму-
лятором, по данным Шоу и др. представляет собой гликопротеин с молекуляр-
ной массой около 30 кДа, который выделяется Т-клетками Lyt 1+ в ответ на сти-
муляцию митогеном [32].
Вскоре после этого открытия Уотсон и др. [33] обнаружили, что некоторые
хроматографические фракции культуральной среды индуцированных митогеном
лимфоцитов не только обладали активностью костимулятора, но и могли также
поддерживать образование in vitro ЦТЛ из спленоцитов голых мышей. Более
того, те же фракции были способны поддерживать длительную пролиферацию
IL-2-зависимых, антиген-специфических цитолитических Т-клеток.
Это наблюдение, показывающее, что молекулы с одними и теми же физи-
ческими и химическими свойствами являются одновременно и факторами роста
Т-клеток, и обладают костимуляторной активностью, было подтверждено в нес-
кольких лабораториях. Кроме того, было показано, что те же белковые фракции
обеспечивали достаточную помощь Т-клеткам для стимуляции образования
анти-эритроцитарных антител в культурах клеток селезенки бестимусных мы-
шей, активированных бараньими эритроцитами, а также стимулировали раз-
множение тимоцитов.
В нескольких лабораториях исследовалась роль IL-2 в стимуляции диф-
ференцировки ЦТЛ. В большинстве современных работ используются улучшен-
ные серологические и клеточные реагенты для выявления синтеза IL-2. Обна-
ружение линий опухолевых клеток, продуцирующих большое количество IL-2,
помогает получать очищенный лимфокин в значительных количествах [34].
Для выяснения способности этого фактора поддерживать дифференцировку
ЦТЛ использовались как чистый IL-2, так и полученные к нему моноклональ-
ные антитела [35]. Для выяснения роли медиаторов в дифференцировке ЦТЛ
были разработаны экспериментальные системы, в которых использовались
убитые теплом или облученные ультрафиолетом клетки-стимуляторы. В таких
культурах активность ЦТЛ не обнаруживается до тех пор, пока в них не добав-
ляют растворимые медиаторы для дополнительной стимуляции [31].
Среда, не содержащая клеток и собранная через 24 — 48 чпосле начала СКЛ,
так же, как и среда стимулированных митогеном клеток селезенки, восстанавли-
вала способность культур, содержащих метаболически инактивированные клет-
ки-стимуляторы, образовывать ЦТЛ. Более того, оказалось, что стимуляция
митогеном или СКЛ, в результате которой культуральная среда приобретала
способность обеспечивать дифференцировку ЦТЛ, приводила также к появле-
нию значительной активности IL-2, которую независимо измеряли в тесте на
размножение, используя IL-2-зависимую линию Т-клеток. Во всех случаях,
когда обнаруживалась активность хелперов ЦТЛ, выявлялась также актив-
ность IL-2. Эта корреляция побудила исследователей выяснить непосредствен-
но, одни ли и те же молекулы ответственны за обе активности или же эти актив-
ности присущи разным лимфокинам, обнаруживаемым в СКЛ и среде, конди-
ционированной индуцированными митогеном лимфоцитами. Чтобы ответить на
этот вопрос, было использовано несколько подходов.
Активированные митогеном бласты Т-клеток и IL-2-зависимые линии Т-
клеток, по-видимому, имеют рецепторы к IL-2 [36]. Кратковременная инкуба-
25. Клеточная цитотоксичность
141
ция препаратов, содержащих активность IL-2, с такими клетками, как живы-
ми, так и фиксированными глутаральдегидом, приводит к падению этой актив-
ности. Нестимулированные клетки селезенки, напротив, неспособны истощать
активность IL-2 и можно считать, что они экспрессируют ничтожно малое коли-
чество рецепторов IL-2. Истощение культуральной среды СКЛ линией Не-
зависимых цитотоксических Т-клеток приводит к одновременному падению ак-
тивности IL-2 и хелперной активности по отношению к ЦТЛ. Можно поэтому
предполагать, что IL-2 и является медиатором дифференцировки ЦТЛ.
Этот вывод нашел подтверждение в серологических экспериментах с ис-
пользованием моноклональных антител к IL-2 класса IgG [37]. Культуральную
среду из смешанной культуры лимфоцитов или среду от индуцированных мито-
геном лейкоцитов истощали антителами к IL-2, а затем измеряли оставшуюся
хелперную по отношению к ЦТЛ активность. Для истощения среду инкубиро-
вали с антителами, а затем удаляли свободные антитела и антитела, связавшие
антиген, с помощью сефарозы, конъюгированной с белком А. Как и ожидалось,
истощение моноклональными антителами к IL-2 приводило к удалению из среды
фактора, поддерживающего пролиферацию Т-клеток. Более того, одновременно
происходило истощение хелперной активности по отношению к ЦТЛ [37].
Вместе эти два эксперимента убедительно свидетельствуют в пользу гипо-
тезы о том, что лимфокином, ответственным за хелперную по отношению к ЦТЛ
активность, является IL-2. Еще более убедительными были эксперименты, в
которых использовался биохимически очищенный IL-2. Оказалось, что чистые
препараты IL-2, полученные последовательным фракционированием методом
гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и электрофорезом в полиакрил-
амидном геле, индуцируют реакцию образования ЦТЛ в ответ на облученные
ультрафиолетом клетки-стимуляторы. Эти данные показывают, что IL-2 не
только является медиатором, обнаруживаемым в СКЛ и после обработки кле-
ток Кон А и способным индуцировать дифференцировку ЦТЛ, но и то, что этот
фактор необходим и достаточен для индукции ЦТЛ.
Хотя описанные выше работы ясно указывали на важную роль IL-2 в диф-
ференцировке ЦТЛ из нормальных селезеночных предшественников, в них не
ставился вопрос о том, действует ли IL-2 один или вместе с другими растворимы-
ми медиаторами при дифференцировке ЦТЛ из пула незрелых клеток-предшест-
венников. До сих пор удовлетворительный ответ на этот вопрос не найден.
Вполне возможно, что IL-2 — это только первое вещество в каскаде лимфоки-
нов, участвующих в дифференцировке ЦТЛ. Так, например, недавно было пока-
зано, что IL-2 индуцирует образование лимфоцитами другого лимфокина, гам-
ма-интерферона [38]. Это наблюдение ставит нерешенный пока вопрос о роли
данного лимфокина в дифференцировке ЦТЛ. Мы знаем также, что другие лим-
фокины способны усиливать образование IL-2. Итерлейкин-1 (IL-1), медиатор,
продуцируемый клетками ряда моноцитов (макрофагов), при совместном дейст-
вии с антигеном может усиливать секрецию IL-2 [39]. Сам по себе IL-1 образует-
ся в ответ на Т-клеточный лимфокин, который часто называют макрофаг-активи-
рующим фактором, хотя таких факторов может быть несколько. На рис. 25.4
схематически изложены представления о роли лимфокинов в дифференцировке
ЦТЛ.
Эта схема указывает на еще несколько важных принципов, относящихся
к реакции образования цитотоксических Т-клеток. Во-первых, антиген активи-
рует несколько субпопуляций иммунокомпетентных Т-клеток. Эти субпопуля-
ции имеют разные функции и, как у человека, так и у мышей, несут характер-
ные для них поверхностные макромолекулы. Популяции Т-клеток, продуци-
рующих лимфокины, таким образом, и фенотипически, и функционально отли-
142
К. С. Хэнни, С. Джиллис
чаются от тех Т-клеток, из которых дифференцируются цитотоксичные Т-клет-
ки. Во-вторых, антиген стимулирует предшественников цитотоксических клеток
к экспрессии рецепторов для многих гормонов и лимфокинов, например рецепто-
ров IL-2. У покоящихся, неактивированных Т-клеток таких рецепторов нет.
В-третьих, IL-2 вызывает пролиферацию и, по-видимому, дифференцировку
активированных антигеном предшественников цитотоксических клеток. Недав-
ние данные показывают, однако, что предшественники цитотоксических клеток
Рис. 25.4. Роль растворимых медиаторов в дифференцировке цитотоксических Т-клеток.
не обязательно должны размножаться перед тем как приобрести цитотоксиче-
ские свойства и их способность лизировать другие клетки — это дифференциро-
вочная функция, появление которой может предшествовать пролиферации.
Итак, можно уверенно предсказать, что возможность клонировать ЦТЛ
и поддерживать их в длительной культуре в конце концов поможет выяснить
биохимические основы цитотоксического процесса. Аналогично появление кло-
нированных линий клеток, продуцирующих лимфокины, и получение к ним
моноклональных антител неизмеримо продвинет понимание сложного набора
межклеточных взаимодействий, приводящих к дифференцировке ЦТЛ.
25.2. Природные киллеры
В 1976 г. в лимфоидной ткани крыс и мышей была обнаружена цитотокси-
ческая активность нового типа. Необычность этой цитолитической активности
заключалась в том, что она была направлена против широкого спектра опухоле-
вых клеток-мишеней. Поскольку эта активность существовала до всякой на-
правленной иммунизации животных, она была названа природной киллерной
активностью, а обладающие ею клетки — природными киллерами (ПК, NK)
[40]. К настоящему времени ПК были обнаружены в лимфоидной ткани живот-
ных всех исследованных видов, за исключением кошек, что весьма интересно.
Серьезные споры вызвало клеточное происхождение ПК, но большинство спе-
25. Клеточная цитотоксичность
143
циалистов относит их к клеткам Т-типа. Обычно их рассматривают как компо-
ненты лимфоидной системы, поскольку, во-первых, их распространение огра-
ничено лимфоидной тканью и, во-вторых, у мышей и человека на поверхности
ПК расположены макромолекулы (например, аллоантигены Ly 6 и Qa 2), имею-
щиеся только у лимфоидных клеток.
Хотя их относят к лимфоцитам, они не обладают свойствами ни зрелых В-,
ни зрелых Т-клеток. Так, например, у ПК нет поверхностных IgM и рецепторов
СЗ, характерных для В-клеток, и отсутствуют аллоантигены Lyt 1, 2 и 3 зрелых
мышиных Т-клеток. Эксперименты по трансплантации показывают, что ПК воз-
никают из предшественников, расположенных в костном мозге [40].
Таким образом, мышиные ПК легко отличить от цитотоксических Т-клеток
по их поверхностным маркерам. Мышиные ПК не только не имеют некоторых
характерных маркеров ЦТЛ (Lyt 2, 3), но у них имеются собственные поверх-
ностные маркеры, не обнаруживаемые на эффекторных Т-клетках. Аналогич-
ные различия выявляются также между ЦТЛ и ПК человека.
Природные киллеры и ЦТЛ объединяет способность непосредственно лизи-
ровать определенные клетки-мишени. Но и здесь заметны различия между двумя
типами эффекторных клеток. Как указывалось ранее, для ЦТЛ характерна ис-
ключительная иммунологическая специфичность. Они могут, например, раз-
личать тринитрофенильный и динитрофенильный гаптены. ПК, напротив, пол-
ностью лишены классической иммунологической специфичности и могут уби-
вать клетки вне зависимости от их органного, генетического и видового проис-
хождения [40]. Следовательно, в отличие от классических ЦТЛ, цитотоксичес-
кая активность ПК не рестриктирована продуктами генов главного комплекса
гистосовместимости. Независимо от своего видового происхождения ПК обла-
дают способностью лизировать широкий набор типов клеток, в особенности лим-
фомы и клетки других опухолевых линий. Нормальные ткани, в частности фиб-
робласты, тимоциты и часть клеток костного мозга также могут лизироваться
ими, но в целом нормальные клетки гораздо менее подвержены лизису под дейст-
вием ПК, чем опухолевые клетки.
Чтобы объяснить, почему ПК способны лизировать клетки такого широко-
го спектра, было предложено две основных теории. Одна возможность состоит
в том, что специфичности ПК организованы по клональному принципу. Эта
гипотеза предполагает, что способность данной популяции лимфоидных клеток
убивать много различных клеток-мишеней отражает большое количество при-
сутствующих в ней клонов ПК и что данный клон ПК лизирует очень небольшое
число типов клеток. Эта гипотеза не получила экспериментального подтвержде-
ния, хотя последние технологические достижения (см. ниже) позволяют дли-
тельно культивировать клоны ПК in vitro [41, 42]. Такие клоны убивают столь
же широкий спектр клеток-мишеней, что и исходная популяция, из которой
они были получены [42].
Последующие исследования, в которых в качестве источника ПК исполь-
зовалась вся популяция клеток селезенки, показали, что ПК прикрепляется
к монослою чувствительных клеток, но не к монослою клеток, не подверженных
литическому действию ПК. Более того, инкубация с монослоем чувствительных
клеток приводит к истощению активности ПК не только по отношению к этим
клеткам, но и по отношению ко всем типам чувствительных клеток-мишеней
[43]. Таким образом, эти работы также не подтвердили предположение о кло-
нальной специфичности ПК х.
1 Недавно описано два новых типа антигенных рецепторов Т-клеток. Они представ-
ляют собой гетеродимеры, в построении которых участвуют три полипептида ТЗ-комплекса,
вариабельная гамма-цепь и еще какой-то, пока неидентифицированный полипептид. Распоз-
144
С. Хэнни, С. Джиллис
Альтернативная гипотеза, объясняющая широкое разнообразие чувстви-
тельных к ПК клеток-мишеней, предполагает, что все эти клетки имеют какой-
то общий компонент мембраны. Этот компонент для удобства может быть назван
антигеном. Во многих лабораториях сейчас предпринимаются поиски общего
мембранного антигена, служащего потенциальным субстратом действия ПК.
Ранние наблюдения показывают, что решающее значение могут играть мембран-
ные гликоконъюгаты. Очевидно, успех этих исследований зависит прежде
всего от того, какие клеточные популяции используются для анализа. В послед-
нее время проводятся работы по выделению ПК и их поддержания в длительных
культурах.
Отчасти из-за успеха, достигнутого в культивировании IL-2-зависимых
линий эффекторных Т-клеток, а отчасти из-за того, что лимфокины, как оказа-
лось, способны усиливать активность ПК, основные усилия в первых работах
были сконцентрированы на использовании содержащей IL-2 культуральной
среды для поддержания длительного роста ПК, активных по отношению к опу-
холевым клеткам. Наибольший успех был достигнут в том случае, когда популя-
цию ПК селезенки стимулировали интерфероном, а затем культивировали при
низкой плотности (104 клеток/мл) в культуральной среде, содержащей 20—40%
среды от стимулированных Кон А спленоцитов. Размножающиеся клетки рас-
севали каждые 2—3 дня (или при достижении плотности 105 клеток/мл) в свежей
культуральной среде. При этом удавалось получить длительную культуру
клеток с активностью ПК [42].
Клонировать ПК удается пока с трудом. В отсутствие питающих (фидерных)
клеток большинство полученных клеточных линий не растет, если в лунку
диаметром 6 мм пластиковой чашки вносят менее 100 клеток. Из нескольких
используемых в настоящее время типов фидерных клеток эффективность клони-
рования ПК повышают облученные сингенные индуцированные тиогликолятом
клетки перитонеального экссудата и клетки ЗТЗ, трансформированные вирусом
саркомы Кирстен. Тем не менее эффективность клонирования остается невысо-
кой— обычно около 1%. Полученные к настоящему времени клонированные
линии ПК растут относительно медленно со временем удвоения около 24 ч.
Роль IL-2 в стимуляции пролиферации клонированных ПК остается неяс-
ной. Он, безусловно, необходим для поддержания размножения клеток, так
как среда от стимулированных Кон А спленоцитов после удаления IL-2 с по-
мощью моноклональных антител к этому лимфокину неспособна поддерживать
рост клонированных ПК. Однако IL-2 крысы или человека, по-видимому, не-
эффективен для поддержания пролиферации мышиных клеток. Этот результат,
возможно, говорит об уникальной видоспецифичности действия IL-2 на ПК;
8 случае Т-лимфоцитов активность IL-2 не имеет видовых ограничений. Однако
вполне возможно, что клоны мышиных ПК не размножаются в ответ на среду
от митоген-стимулированных спленоцитов крысы по той причине, что им тре-
буется также второй видоспецифичный медиатор. Среди кандидатов на эту
роль наиболее подходящим кажется интерферон. Этот лимфокин обладает четко
выраженной видоспецифичностью и способен усиливать активность ПК.
Биохимическое изучение клонов ПК только начинается, и пока мы имеем
весьма слабое представление о механизме их действия. Клонированные линии
навание Т-клетками, имеющими такие рецепторы, менее специфичное, чем у Т-клеток с обыч-
ными рецепторами. Кроме того, распознавание антигена у Т-клеток с «новым» вариантом
рецептора не требует белков главного комплекса гистосовместимости. Предполагается, что
Т-клетки с таким рецептором обладают активностью природных киллеров и что на их долю
приходится примерно 5% от общего числа всех Т-клеток (Reinherz Е. L., Nature 1987, v. 325,
№ 6106, р. 660—663.).— Прим. ред.
25. Клеточная цитотоксичность
145
мышиных ПК имеют необычайно высокую цитотоксическую активность (чуть
не в 1000 раз выше, чем нормальные клетки селезенки), и в тесте на выход
51Сг за 4 ч лизис удается обнаружить при наличии в лунке менее чем 100 кло-
нированных киллерных клеток. Цитотоксичность нормальных клеток селезенки
удается обнаружить только при наличии в лунке более чем 5-104 таких клеток.
Ясно, что за 4 ч каждая клонированная киллерная клетка лизирует несколько
клеток-мишеней. У наиболее активных клонов каждая эффекторная клетка
лизирует клетку-мишень в среднем каждые 20 мин.
Для лизиса клеток-мишеней ПК, безусловно, необходимы межклеточные
контакты, так как при проведении реакции в лунке с плоским дном требуется
в 10 раз больше эффекторных клеток, чем в лунке с V-образным дном. Кроме
того, среда, кондиционированная большим количеством клонированных кил-
лерных клеток, полностью лишена цитолитической активности. Эти результаты
убедительно показывают, что цитотоксичность клонированных клеточных ли-
ний не связана с выделением токсического фактора или истощением какого-либо
компонента культуральной среды. Кроме того, в отсутствие ионов Са2+ и Mg2+,
необходимых для всех форм осуществляемой клетками цитотоксичности, из-
вестных к настоящему времени, лизиса клеток-мишеней не происходит [42].
Был проведен ингибиторный анализ, аналогичный тому, который проводился
с ЦТЛ, и он дал сходные результаты [44]. Все соединения, ингибирующие Т-кле-
точный лизис (цитохалазин В, колхицин, вещества, влияющие на содержание
сАМР, ЭДТА), подавляют также цитотоксичность ПК. Более того, их действие
проявляется в сходных, если не тех же самых концентрациях. Эти результаты
показывают, что механизм клеточного лизиса, осуществляемого ПК и ЦТЛ,
может быть одинаковым.
Значительное внимание в последнее время привлекает способность несколь-
ких выделяемых лимфоцитами растворимых медиаторов (лимфокинов) регули-
ровать литическую активность ПК. Открытие того факта, что один из лимфо-
кинов, интерферон, усиливает литическую активность ПК, привело к созданию
научной фирмы, недавно начавшей широко разрекламированную кампанию по
клиническому применению интерферона в качестве противоопухолевого агента.
Интерферон, однако, усиливает также активность ЦТЛ. Другой лимфокин,
IL-2, избирательно усиливает активность ПК и, хотя, как мы обсуждали ранее
в этой главе, IL-2 играет также важную роль в дифференцировке ЦТЛ, он не
активирует уже дифференцировавшиеся ЦТЛ.
До сих пор мы уделяли внимание клеткам, непосредственно осуществляю-
щим цитотоксический эффект. Еще одна популяция клеток обладает цитолити-
ческими свойствами только в присутствии антител. К таким клеткам относятся
полиморфноядерные лейкоциты, некоторые популяции макрофагов и популя-
ция лимфоидных клеток, названных К-клетками.
25.3. К-клетки: клеточная цитотоксичность,
зависящая от антител
Впервые зависящую от антител клеточную цитотоксичность описал Моллер
[45] как механизм лизиса in vitro клеток индуцированной метилхолантреном
фибросаркомы. С тех пор стало ясно, что этот феномен имеет общее значение и
относится к широкому кругу клеток-мишеней и нескольким различным типам
эффекторных клеток.
Общее свойство эффекторных клеток — это наличие у них мембранного ре-
цептора для Fc-фрагмента антител класса IgG, хотя и не все клетки, имеющие
146
К. С. Хэнни, С. Джиллис
такой рецептор, могут оказывать цитотоксическое действие [46]. Было показано,
что клетки нескольких типов, различающиеся и по морфологии, и по происхож-
дению, обладают цитотоксической активностью in vitro по отношению к клет-
кам-мишеням, обработанным антителами. К ним относятся полиморфноядерные
лейкоциты, макрофаги, тромбоциты, клетки эмбриональной печени, а также
мононуклеарные клетки из лимфоидной ткани, не несущие характерных марке-
ров Т- и В-клеток и названные К-клетками.
Считается, что механизм лизиса у всех этих клеток одинаков. Поэтому
для описания мы выберем один тип клеток, К-клетки.
Антитела участвуют в К-клеточном лизисе достаточно сложным образом,
и в этот процесс вовлечены как антигенсвязывающий домен молекулы, так и
Антиген мишени
Рис. 25.5. Роль антител
класса IgG в осущест-
вляемом клетками ли-
зисе.
Fc-фрагмент. Считается, что антитела служат «мостиком» между эффекторной
клеткой и клеткой-мишенью, как это схематически показано на рис. 25.5.
Хотя и предполагается, что функция антител заключается только в обра-
зовании мостика, связывающего эффекторную клетку и клетку-мишень путем
взаимодействия антитела с Fc-рецептором, но ни заполнения рецептора Fc-фраг-
ментом, ни межклеточного взаимодействия самих по себе недостаточно для ли-
зиса. Этот вывод основан на экспериментах, в которых популяции лимфоцитов
инкубировали с клетками-мишенями, ковалентно покрытыми неспецифическими
агрегированными нагреванием IgG. В этих условиях Fc-рецептор К-клеток
взаимодействовал с лигандом, но это не сопровождалось лизисом клеток-мишеней
[47]. С другой стороны, когда эффекторные клетки и клетки-мишени соединяли
без участия Fc-рецептора (например, с помощью поли-Б-лизина), лизиса также
не происходило. Можно, таким образом, сделать вывод, что для осуществления
лизиса требуется и участие Fc-рецептора К-клеток, и межклеточное взаимодей-
ствие. По всей видимости, при контакте К-клетки с клеткой-мишенью происхо-
дит перераспределение Fc-рецепторов в область контакта и тем самым заметно
увеличивается прочность связывания эффекторной клетки с клеткой-ми-
шенью [48].
Интересно, что разные клетки-мишени лизируются, по всей видимости,
разными эффекторными клетками. Например, клетки, ответственные за лизис
покрытых антителами эритроцитов, отличаются от клеток, лизирующих покры-
тые антителами опухолевые клетки-мишени. Причина такой избирательности
неизвестна.
Антитела класса IgG каждого из основных изотипов могут поддерживать
К-клеточную цитотоксичность, но, по данным большинства исследователей, ан-
титела классов IgM и IgA неэффективны. Среди субклассов IgG активны как
те, которые могут связывать первый компонент комплемента, так и те, которые
не обладают такой активностью. Таким образом, хотя и в К-клеточном лизисе,
25. Клеточная цитотоксичность
147
и в связывании комплемента участвует Fc-фрагмент молекулы антитела, за эти
две активности отвечают разные участки этой субъединицы.
Зависимая от антител клеточная цитотоксичность, как и лизис, осуществ-
ляемый ПК и Т-клетками, требует взаимодействия эффекторной клетки с ми-
шенью. Ингибиторный анализ, сходный с тем, который был описан выше для
Т-клеточного лизиса, показал, что К-клетки для того, чтобы быть цитотоксич-
ными, должны быть живыми. Так, например, облучение рентгеновскими луча-
ми, присутствие азида натрия или обработка популяции эффекторных клеток
антимицином А (сильным ингибитором процессов транспорта электронов) по-
давляют лизис. Ни синтеза белка, ни синтеза ДНК, по-видимому, не требуется
для цитотоксичности, поскольку пуромицин, циклогексимид и митомицин не
оказывают влияния на лизис. Необратимый ингибитор белкового синтеза
пактомицин также неэффективен. Цитохалазин В, метаболит из грибов с широ-
ким спектром биологических активностей, в том числе способностью разрушать
микрофиламенты, подавляет лизис некоторых клеток-мишеней, но, по-види-
мому, не всех. Вещества, повышающие содержание сАМР в клетках многих
типов, также подавляет лизис. Итак, эти фармакологические исследования по-
казывают, что зависимую от антител клеточную цитотоксичность подавляет
тот же набор ингибиторов, что и прямое цитотоксическое действие Т-клеток
и ПК. Эти исследования показывают, что механизм лизиса под действием К-кле-
ток сходен с механизмом лизиса под действием эффекторных Т-клеток и ПК,хотя
механизмы активации литической активности в разных эффекторных клетках,
очевидно, различны.
Пока нет сообщений о клонировании популяций К-клеток. Интересно, что
клоны ПК, фенотипически сходные с популяциями К-клеток, обычно не обла-
дают способностью к осуществлению зависящей от антител цитотоксичности.
Таким образом, хотя интенсивный поиск поверхностных маркеров не привел
к появлению серологического зонда, способного различить К-клетки и ПК, эти
клетки функционально весьма различаются: ПК лизируют клетки-мишени в от-
сутствие антител и антитела не влияют на реакцию лизиса; К-клеткам совер-
шенно необходимы антитела класса IgG для экспрессии литической активности.
25.4. Биологическая роль цитотоксических клеток
Исследователи, придерживающиеся того взгляда, что иммунная система
осуществляет надзор, препятствующий возникновению опухолевых клеток,
были весьма обрадованы, когда оказалось, что в нормальной лимфоидной ткани
присутствуют цитотоксические клетки. Они утверждают, что такие клетки мо-
гут выполнять роль «надзирателя», лизируя клетки, отличающиеся от собствен-
ных клеток организма. Хотя такая система надзора была бы весьма целесооб-
разна, данные в пользу ее существования, к сожалению, очень немногочислен-
ны. Это говорит отнюдь не о том, что цитотоксические клетки не играют большой
роли в защите организма, а лишь о том, что получить неопровержимые экспери-
ментальные доказательства такой точки зрения очень трудно.
Серия проведенных недавно исследований показывает, что ПК могут играть
важнейшую роль в контроле роста опухолевых клеток in vivo. В одной из работ
Рейд и др. [49] обнаружили, что голые (безтимусные) мыши, постоянно получав-
шие антитела к интерферону, теряют способность подавлять рост первичных
метастазирующих карцином. Опухоли, обычно росшие как доброкачественные,
окруженные капсулой узелки, у животных, получавших антитела к интерферо-
ну, инвазировали и активно метастазировали. Поскольку известно, что интер-
148
К. С. Хэнни, С. Джиллис
ферон регулирует цитотоксическую активность ПК, авторами был сделан вывод,
что первичным нарушением у животных, получавших антитела к интерферону,
была низкая эффективность ПК. Это был наглядный пример роста индуциро-
ванных вирусом опухолей у животных с супрессированной иммунной системой.
Еще одно исследование, указывающее на важное физиологическое значение
ПК, провели Кавасе и др. [50]. Они показали, что мыши с избирательно нару-
шенной функцией ПК неспособны подавлять рост чувствительной к ПК линии
лимфомы. Для удаления ПК мышам постоянно вводили антисыворотку против
гликолипида (асиало-GMl), обнаруженного в этих эффекторных клетках. Кро-
Рис. 25.6. Подтверждение
определяющей роли ПК в
подавлении роста клеток
лимфомы ([50]; печатается
с разрешения).
ме того, ими была найдена интересная обратная корреляция между чувстви-
тельностью к ПК и опухолеродностью. Чувствительная к ПК линия клеток,
не дающая опухолей у нормальных животных, становилась опухолеродной
у животных, лишенных ПК (рис. 25.6).
Другие исследования выявили важную роль ПК в подавлении метастазиро-
вания опухолевых клеток. Так, Тэлмэдж и др. [51] обнаружили заметное уве-
личение числа метастазов меланомы В16 у мышей с наследственным дефек-
том ПК.
Выявить роль К-клеток в защите организма оказалось трудно, хотя су-
ществует предположение об их участии в подавлении некоторых болезней. По-
нятно, что любой иммунный ответ, приводящий к образованию антитела класса
IgG, может приводить к активации К-клеток. Бернстайн и др. [52] недавно по-
казали, что К-клеточная цитотоксичность может играть важную роль в подав-
лении развития Т-клеточных лейкозов, спонтанно возникающих у мышей
AKR. Мышам с лейкозом систематически вводили моноклональные антитела
класса IgG, направленные против компонент а поверхности лейкозных клеток.
У таких животных рост лейкозных клеток прекращался. Поскольку это явле-
ние наблюдалось у мышей с дефицитом в системе комплемента и антитела той же
специфичности, но относящиеся к классу IgM, были неэффективными, то можно
считать, что в подавлении роста опухоли участвует некий механизм, зависимый
от антител класса IgG и независимый от комплемента. Наиболее вероятным кан-
дидатом представляется система К-клеточного лизиса.
Цитотоксические Т-клетки, наиболее изученная и первая охарактеризован-
ная категория цитотоксических клеток лимфоидной ткани, предназначены, по-
видимому, для подавления размножения вирусов, а не для контроля за ново-
образованиями. Роль ЦТЛ была убедительно продемонстрирована при инфи-
цировании верхних дыхательных путей вирусом гриппа. Оказалось, что осу-
ществляемое Т-клетками разрушение клеток организма хозяина, несущих
детерминанты вируса, ограничивает вирусную репликацию [53].
Интересно, что ЦТЛ, в большом количестве образующиеся у реципиентов
с пересаженными участками кожи или трансплантатами других органов, не
25. Клеточная цитотоксичность
149
играют, видимо, определяющей роли в разрушении ткани трансплантанта при
его отторжении. Недавние исследования, проведенные на многих мышиных
экспериментальных системах, показали, что за отторжение трансплантата
ответственна другая популяция Т-клеток, имеющая поверхностные маркеры
хелперов, а не супрессоров (цитотоксических клеток). Цитотоксические клетки,
возможно, и играют при этом определенную роль, и даже важную, но отторже-
ние трансплантата может происходить и в их отсутствие [54].
Хотя приведенные выше примеры показывают, что цитотоксические клетки
принято рассматривать как полезные для организма, известны и другие случаи,
когда появление цитотоксических клеток приводило к разрушению собственных
тканей организма и появлению иммунопатологических изменений. Наиболее
яркий пример — это мыши, которых заражали внутричерепным введением ви-
руса лимфоцитарного хориоменингита (ВЛХМ) [55]. У нормальных животных
Рис. 25.7. Эксперименты, указы-
вающие на то, что патологические
симптомы инфекции вирусом лим-
фоцитарного хориоменингита вы-
званы цитотоксическими Т-клет-
ками, направленными против ви-
руса [55].
Смерть
Жива, но
несет вирус
ВЛХМ
Цитонсан
Смерть с
-----»-------*- классической
4 патологией ЛХМ
Цитотоксические
Т-лимфоциты
после этого возникает острое воспаление сосудистого сплетения, эпендимы,
мягкой и паутинной оболочек мозга, и такие мыши умирают через 6—8 дней
от полного разрушения ткани мозговых оболочек. Иммуносупрессированные
мыши, зараженные этим вирусом, по продолжительности жизни не отличаются
от незаряженных, хотя в течение всей жизни в их мозговых оболочках обнару-
живается вирус. При введении таким животным нормальных Т-клеток они быст-
ро умирают, обнаруживая классическую патологию, характерную для живот-
ных, зараженных ВЛХМ [55]. На рис. 25.7 эти результаты показаны в схема-
тическом виде. Очевидно, образование в организме хозяина ЦТЛ, направленных
к ВЛХМ, вызывает разрушение тканей, несущих этот вирус, что и приводит
к разрушению мозговых оболочек.
Итак, имеется много указаний на то, что цитотоксические клетки — это
важный компонент иммунной системы млекопитающих, но условия, в которых
проявляется действие разных категорий цитотоксических клеток, требуют уточ-
нения. Появление новой технологии, позволяющей длительно культивировать
и клонировать цитотоксические клетки, должно значительно ускорить эту
работу.
ЛИТЕРАТУРА
1. Govaerts А . Cellular antibodies in kidney homotransplantation, J. Immunol., 85,516 (1960).
2. Cerrottini J. C., Brunner К. T. Cell-mediated cytotoxicity, allograft rejection and tumor
immunity, Adv. Immunol., 18, 67 (1974).
150
К. С. Хэнни, С. Джиллис
3. Zinkernagel R. М., Doherty Р. С. Restriction of an in vitro T cellmediated cytotoxicity in
сЬ°г*отеп*п8*,'18 within syngeneic or semiallogeneic system, Nature, 248,
4. Brunner К. T., Mach J., Cerottini J.-C., Charuis B. Quantitative assay for the lytic action
14 ce^s on 51Cr labelled allogeneic target cells in vitro, Immunology,
5. Henney C. S. Quantitation of the cell-mediated response. I. The number of cytolytically
active mouse lymphoid cells induced by immunization with allogeneic mastocytoma cells,
J. Immunol., 116, 146 (1971).
6. Henney C. S. Studies on the Mechanism of T cell cytolysis, Transplant. Rev., 17, 37 (1973).
7. Berke G.t Amos D. B. Studies on the mechanism of lymphocyte-mediated cytolysis and its
role in transplantation immunity, Transpant. Rev., 17, 71 (1973).
8. Martz E. Mechanism of tumor-cell lysis by T lymphocytes, Contemp. Top. Immunobiol.,
7, 301 (1977).
9. Zagury I)., Bernard J., Thierness N., Feldman M., Berke G. Isolation and characterization
of individual functionally reactive cytotoxic T lymphocytes: Conjugation, killing and re-
cycling at the single cell level, Eur. J. Immunol., 5, 818 (1975).
10. Stulting R. D., Berke G. Nature of lymphocyte-tumor interaction. A general method for
cellular immunoadsorption, J. Exp. Med., 137, 932 (1973).
11. Werkele H., Lonai P., Feldman M. Fractionation of antigen-reactive cells on a cellular
immunoadsorbent: Factors determining recognition of antigens by T lymphocytes, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 69, 1620 (1972).
12. Henney C. S., Bubbers J. E. Antigen-T lymphocyte interactions: Inhibition by cytochala-
sin B, J. Immunol., Ill, 85 (1973).
13. Martz E. Early steps in specific tumor cell lysis by sensitized mouse T lymphocytes. I.
Resolution and characterization, J. Immunol., 115, 261 (1975).
14. Golstein P., Smith E. T. The lethal hit stage of mouse T and not-T cell-mediated cytolysis:
Differerces in cation requirements and characterization of an analytical «cation pulse»
method, Eur. J. Immunol., 6, 31 (1976).
15. Plaut M., Bubbers J. E., Henney C. S. Studies on the mechanism of lymphocyte-mediated
cytolysis. VII. Two stages in the T cell-mediated lytic cycle with distinct cation require-
ments, J. Immunol., 116, 150 (1976).
16. Golstein P., Shortman K., MacLennan I. С. M. Mechanism of recognition by cytolytic T
cells, J. Supramol. Struct. (Suppl.), 3, 309 (Abstract) (1979).
17. Moller E. Contact-induced cytotoxicity by lymphoid cells containing foreign isoantigens,
Science, 147, 559 (1965).
18. Kuppers R. C., Henney C. S. Evidence for direct linkage between antigen recognition and
lytic expression in effector T cells, J. Exp. Med., 143, 684 (1976).
19. Golstein P. Sensitivity of cytotoxic T cells on T cell-mediated cytotoxicity, Nature, 252,
81 (1974).
20. Fishelson Z., Berke G. T lymphocyte-mediated cytolysis: Dissociation of the binding and
lytic mechanisms of the effector cell, J. Immunol., 120, 1121 (1978).
21. Henney C. S. T-cell mediated cytolysis: An overview of some current issues, Contemp. Top.
Immunobiol., 7, 245 (1977).
22. Granger G. A., Kolb W. P. Lymphocyte in vitro cytotoxicity’, J. Immunol., 101, 111 (1968).
23. Ballas Z. K., Henney C. S. Relationship between lymphokines and cell-mediated toxicity.
In: Biology of Lymphokines, ed. by E. Pick, J. Oppenheim, and S. Cohen, pp. 165, Acade-
mic Press, New York, 1979.
24. Ferluga J., Allison A. C. Cytotoxicity of isolated plasma membranes from lymph node
cells, Nature, 255, 708 (1975).
25. Kahn-Perles B., Golstein P. Cell-membrane-mediated cytolysis by membranes from noncyto-
lytic cells, Eur. J. Immunol., 8, 71 (1978).
26. Frye L. D., Friou G. J. Inhibition of mammalian cytotoxic cells by phosphatidilcholine
and its analogue, Nature, 258, 333 (1975).
27. Henney C. S. Studies on the mechanism of lymphocyte mediated cytolysis. II. The use of
various target cell markers to stady cytolytic events, J. Immunol., 110, 73 (1973).
28. Henney C. S. Estimation of the size of a T cell induced lytic lesion, Nature, 249, 456
(1974).
29. Morgan D.A., Ruscetti F. W., Gallo R. C. Selective in vitro growth of T lymphocytes
from normal human bone marrow, Science, 193, 1007 (1976).
30. Srendi B., Schwartz R. H. Antigen specific, proliferating T cell clones. Methodology, spe-
cificity, MHC restriction and alloreactivity, Immunol. Rev., 54, 187 (1981).
31. Okada M., Klimpel G. R., Kuppers R. C., Henney C. S. The differentiation of cyto-
toxic T cells in vitro. I. Amolifying factor(s) in the primary response are Lyt 1-f- cell de-
pendent, J. Immunol., 122, 2527 (1979).
25. Клеточная цитотоксичность
151
32. Shaw J., Caplan В., Paetkau V., Pilarski P. L. M., Delovitch T. L., McKenzie I. F.C.
Cellular origins of costimulator (IL-2) and its activity in cytotoxic T lymphocyte responses,
J. Immunol., 124, 2231 (1980).
83. Watson J., Gillis S., Marbrook J., Mochizuki D., Smith K. A. Biochemical and biological
characterization of lymphocyte regulatory molecules. I. Purification of a class of murine
lymphokines, J. Exp. Med., 150, 849 (1979).
84. Gillis S., Scheid M., Watson J. Biochemical and biological characterization of lymphocyte
regulatory molecules. III. The isolation and phenotypic characterization of Interleukin 2
producing T cell lymphomas, J. Immunol., 125, 2570 (1980).
35. Gillis S., Gillis A. E., Henney C. S. Monoclonal antibody directed against Interleukin-2.
I. Inhibition of T-lymphocyte mitogenesis, and the in vitro differentiation of alloreactive
cytolytic T-cells, J. Exp. Med., 154, 983 (1981).
36. Smith K. A., Gillis S., Baker P. E., McKenzie D., Ruscetti F. W. T cell growth factor-
mediated T cell proliferation, Proc. N.Y. Acad. Sci., 332, 423 (1979).
37. Kern D. E., Gillis S., Okada M., Henney C. S. The role of interleukin-2 (IL-2) in the diffe-
rentiation of cytotoxic T cells: The effect of monoclonal anti-IL-2 antibody and absorption
with IL-2 dependent T cell lines, J. Immunol., 127, 1323 (1981).
38. Farrar W. L., Johnson H. M., Farrar J. J. Regulation of the production of immune inter-
feron and cytotoxic T lymphocytes by Interleukin 2, J. Immunol., 126, 1120 (1981).
39. Larsson E. L., Iscove N. N., Coutinho A. Two distinct factors are required for induction
of T cell growth, Nature, 283, 664 (1980).
40. Herberman R., ed. Natural Cell Mediated Immunity Against Tumors, Academic Press,
New York, 1980.
41. Dennert G., Yogeeswaran G., Yamagata S. Cloned cell lines with natural killer activity,
specificity, function, and cell surface markers, J. Exp. Med., 153, 545 (1981).
42. Brooks C. G., Kuribayashi K., Sale G. E., Henney C. S. Characterization of five cloned
murine cell lines showing high cytolytic activity against YAC-1 cells, J. Immunol., 128,
2326 (1982).
43. Durdik J. M., Beck B. N., Henney C. S. The use of lymphoma cell variants differing in
their susceptibility to NK cell mediated lysis to analyze NK cell-target cell interactions.
In: Natural Cell-Mediated Immunity Agains Tumors, ed. by R. B. Herberman, pp. 805—
817, Academic Press, New York, 1980.
44. Quan G., Ishizaka T., Bloom B. Studies on the mechanism of NK cell lysis, J. Immunol.,
128, 1786 (1982).
45. Moller E. Contact-induced cytotoxicity by lymphoid cells containing foreign isoantigens,
Science, 147, 873 (1965).
46. Perlmann P., Holm G. Cytotoxic effects of lymphoid cells in vitro. In: Advances in Immu-
nology, Vol. 11, Academic Press, New York, 1969.
47. Segal D. M., Hurwitz E. Binding of affinity cross-linked oligomers of IgG to cells bearing
Fc receptors, J. Immunol., 118, 1338 (1977).
48. Ziegler H. K., Henney C. S. Studies on the cytotoxic activity of human lymphocytes.
II. Interactions between IgG and Fc receptors leading to inhibition of К cell function, J.
Immunol., 119, 1010 (1977).
49. Reid L. M., Minato N., Gresser I., Holland J., Kadish A., Bloom B. R. Influence of anti-
mouse interferon serum on the growth and metastasis of tumor cells persistently injected
with virus and of human prostatic tumors in athymic nude mice, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 78, 1171 (1981).
50. Kawase I., Urdal D.L., Brooks C.G., Henney C.S. Selective depletion of NK cell activity
in vitro and its effect on the growth of NK sensitive and NK resistant tumor cell variants,
Int. J. Can., 29, 567 (1982).
51. Talmadge J.E., Myers K.M., Prieur D.J., Starkey J.R. Role of NK cells in tumor growth
and metastasis in beige mice, Nature, 284, 622 (1980).
52. Bernstein I., Tamm M., Nowinski R.C. Mouse leukemia: Therapy with monoclonal anti-
bodies against a thymus differentiation antigen, Science, 207, 68 (1980).
53. Tap K.L., Ada G.L., McKenzie I.C.F. Transfer of specific cytotoxic T lymphocytes pro-
tects mice inoculated with influenza virus, Nature, 273, 238 (1978).
54. Loveland B.E., McKenzie I.F.C. Cells mediating graft rejection in the mouse, Transplan-
tation, 33, 407 (1982).
55. Cole G.A., Gilden D.H., Monjan A.A., Nathanson N. Lymphocytic choriomeningitis: Patho-
genesis of acute central nervous system disease, Fed. Proc., 30, 1831 (1971).
56. Kaufmann Y., Berke G., Eshar Z. Cytotoxic T lymphocyte hybridomas which mediate spe-
cific tumor cell lysis in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2502 (1981).
Глава 26
Реакция гиперчувствительности
замедленного типа
Марк И. Грин, Сэм Шаттен, Джонатан С. Бромберг
(Mark I. Greene, Sam Schatten, Jonathan S. Bromberg)
Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) — это зависимая от Т-кле-
ток иммунологическая реакция, проявляющаяся в виде воспаления в месте
попадания в организм антигена — обычно в коже. Максимальная интенсивность
реакции достигается через 24—48 ч после инициации. По этому признаку ее
можно отличить от гиперчувствительности немедленного типа или реакции Ар-
тюса (Arthus), которая определяется наличием антител и достигает максимума
через минуты и часы. Феномен ГЗТ был впервые описан в начале нашего столе-
тия Кохом (Koch) обнаружившим, что кожа больных туберкулезом людей и жи-
вотных чувствительна к туберкулину — продукту микобактерий. Эта реакция
считается теперь классической ГЗТ [1]. Хотя такая зависящая от Т-клеток ре-
акция наблюдается in vivo, было разработано несколько тестов in vitro, кото-
рые, как считается, коррелируют с ГЗТ. К ним относятся реакции пролифера-
ции Т-клеток и определение количества лимфокинов, например фактора, инги-
бирующего миграцию (ФИМ, MIF). Исследование реакций ГЗТ in vivo пролило
свет на специфическую функцию Т-клеток в организме интактного живот-
ного и обогатило наши значения о зависимых от Т-клеток иммунных реакциях
и механизмах их регуляции.
26.1. Варианты замедленной гиперчувствительности
и клетки, участвующие в этой реакции
На ранних этапах изучения иммунологических процессов Мечников при-
шел к выводу, что за приобретенный антимикробный иммунитет отвечают опре-
деленные клетки, которые он называл „активными лейкоцитами" [2]. Неопро-
вержимые данные о том, что за гиперчувствительность замедленного типа отве-
чают лимфоциты, впервые получили Ландштейнер и Чейз [3]. Иммунитет за-
медленного типа, развивающийся в ответ на контакт с сенсибилизирующим
антигеном, оказалось возможным перенести неиммунизированным морским
свинкам с помощью живых интактных клеток, полученных от иммунных до-
норов, но не с помощью иммунной сыворотки от тех же животных. Впоследствии
Чейз установил, что ГЗТ к туберкулину можно таким же образом переносить
с помощью иммунных лимфоцитов. Лимфоциты, способные переносить ГЗТ,
являются Т-клетками и называются Тгзт-лимфоцитами. С помощью иммунных
лимфоцитов можно перенести также ГЗТ к растворенным белковым антигенам.
Одна из форм ГЗТ — контактная чувствительность (КЧ, CS), наблюдается
при нанесении на кожу животных высокореактивных химических соединений,
26. Реакция гиперчувствительности замедленного типа
153
таких, как тринитрохлорбензол (ТНХБ) или динитрофторбензол (ДНФБ) [4].
Эти вещества ковалентно связываются с белками кожи и образуют неоантигены.
Через 4—7 дней контакт с антигеном повторяют, нанося его накожу или на по-
верхность одной из ушных раковин; через 24—48 ч после повторного нанесения
возникает воспалительная реакция. Классический иммунитет типа ГЗТ вызы-
вают и поддерживают с помощью внутрикожного или подкожного введения
антигена. Следует отметить, что в ответ на некоторые антигены ГЗТ возникает
и при их внутривенном или внутрибрюшинном введении [5].
В работах ряда авторов сообщалось, что некоторые формы похожих на ГЗТ
реакций удается переносить у человека и мышей с помощью клеточных экстрак-
тов. В этом переносе принимает участие диализуемый из экстракта лейкоцитов
фактор переноса с мол. массой 10 000 Да [6]. К этим работам следует отно-
ситься с осторожностью, поскольку не удается получить достоверно воспроиз-
водимые данные о специальной роли такого диализуемого фактора в иммуни-
тете (71. Возможно, этому помогут усовершенствованные биохимические ме-
тоды, но пока что о факторе, переносящем ГЗТ, можно лишь с осторожностью
говорить, что это недостаточно точно идентифицированное вещество, участвую-
щее в иммунных реакциях. Таким образом, возможность перенесения реакции
ГЗТ специальными лимфоидными клетками сомнению не подлежит, но перенос
ее с помощью субклеточных структур пока не удается воспроизвести досто-
верно.
Кожная базофильная гиперчувствительность (КБГ, СВН) или реакция
Джонса-Мота [Jones-Mote] представляет собой еще один вариант иммунной вос-
палительной реакции замедленного типа; она переносится В-клетками, антите-
лами сыворотки и, возможно, Т-клетками [8]. В некоторых отношениях эта ре-
акция отличается от классической ГЗТ. Классическая реакция ГЗТ, как и КЧ
переносится только клетками, тогда как реакция КБГ может переноситься так-
же и сывороткой. Все типы замедленных реакций (ГЗТ, КЧ, КБГ) запускаются
через 16—48 ч после инициации. При классической ГЗТ и КЧ возникают ин-
фильтраты с преобладанием мононуклеаров и наблюдается отчетливое уплот-
нение ткани; базофилы, как правило, отсутствуют. При КБГ уплотнения не
происходит, однако возникают эритематозные повреждения, а среди клеток ин-
фильтрата значительная доля приходится на базофилы. Кроме того, КБГ
встречается не у всех видов животных. Эта быстро преходящая реакция наблю-
дается у людей после введения белковых антигенов в физиологическом раство-
ре, а также у морских свинок, иммунизированных антигеном в неполном адъю-
ванте Фрейнда; у мышей, однако, такие реакции не возникают. Как подчерки-
вается ниже, в возникновении классической реакции ГЗТ и КЧ определяющую
роль играют генетические ограничения, накладываемые главным комплексом
гистосовместимости (МНС)-, в случае КБГ таких ограничений не обнаружено.
Реакция ГЗТ имеет ряд особенностей, отличающих ее от других реакций.
Если для иммунизации использовать антиген в полном адъюванте Фрейнда,
то способность иммунных животных поддерживать реакции, определяемые
Тгзт-Клетками, сохраняется длительное время (несколько недель и даже меся-
цев). В отличие от этого при подкожном введении антигена, ковалентно связан-
ного с клеточной поверхностью, или при нанесении антигена на кожу макси-
мальный иммунитет возникает у мышей уже через 5—7 дней после иммунизации.
Если реакции ГЗТ и КЧ индуцировать в период максимальной реактивности
животного, воспалительная реакция достигнет максимума через 24—48 ч.
На рис. 26.1 показана гистологическая картина реакции контактной чувст-
вительности через 24 ч. Мышей сенсибилизировали, нанося на кожу живота
раствор ТНХБ, а через 5 дней индуцировали реакцию, нанося тот же раствор
154
М. И. Грин, С. Шаттен, Д. С. Бромберг
на ухо. Отек и уплотнение ткани появляются через 24 ч, не исчезают в течение
48 ч, а затем спадают. Обработка таких иммунных к ТНХБ мышей другим сен-
сибилизирующим агентом не приводит к отеку уха; следовательно, реакция
специфична по отношению к данному антигену. Другой особенностью ГЗТ
является бластогенная реакция клеток в паракортикальной Т-клеточной обла-
сти лимфатических узлов, дренирующих участок нанесения антигена. Через
некоторое время в других участках этих узлов (В-клеточных) также возникают
пролиферативные изменения [5].
Осуществляющие ГЗТ иммунные лимфоциты захватывают антиген, по-
видимому, в непосредственной близости от места его введения. Специфическое
Рис. 26.1. А. Гистологическая картина
участка поражения при контактной чув-
ствительности. Мышам линии BALB/с нано-
сили на часть живота (после удаления воло-
сяного покрова) раствор тринитрохлорбен-
зола (ТНХБ). Через 5 дней тот же раствор
наносили на одно ухо. Через 24 ч после
этого начинался отек ушей. После этого
брали образец пораженного участка уха
для гистологического исследования. Б.
Контроль, ТНХ Бнаносили на ухо без пред-
варительной иммунизации.
узнавание антигена приводит к активации этих клеток, и они начинают синте-
зировать большое количество антиген-специфических факторов, неспецифиче-
ских факторов и лимфокинов. Некоторые лимфокины привлекают и активи-
руют клетки других типов, находящиеся вблизи от места введения антигена.
К последним относятся клетки ряда моноцитов-макрофагов, некоторые другие
мононуклеарные клетки и нейтрофилы. У мышей встречаются довольно много
полиморфноядерных лейкоцитов; у людей и морских свинок их, напротив, очень
мало [5]. На рис. 26.1 хорошо видны мононуклеарные клетки (фотография по-
лучена через 24 ч после нанесения антигена). Необходимо заметить, что при этом
26. Реакция гиперчувствителъноспги замедленного типа
155
наблюдается лишь очень слабый отек, поскольку при реакции ГЗТ проницае-
мость сосудов обычно не меняется. Это приводит к уплотнению ткани, а не к
эритематозной реакции.
Хотя моноциты и макрофаги непосредственно участвуют в этой иммуно-
логической реакции, они, по-видимому, не обладают иммунологической специ-
фичностью. Накопившись в очаге воспаления и будучи активированными взаи-
модействиями с антигенами, специфическими иммунными лимфоцитами и лим-
фокинами, они вызывают неспецифическое разрушение ткани и отек либо непо-
средственно, либо выделяя свои собственные монокины [1, 5]. Во многих
повреждениях ГЗТ вокруг мелких сосудов наблюдаются мононуклеарные ин-
фильтраты. При достаточно сильной реакции могут повреждаться также круп-
ные кровеносные сосуды, в результате их содержимое может попадать в очаг
воспаления.
У человека и морских свинок интенсивность ГЗТ определяют по диаметру
уплотненного участка ткани на поверхности тела, лишенной волос. У мышей
антиген можно наносить на ушную раковину или на подошвы лапок, размер
отека измеряют кронциркулем или микрометром. В качестве контроля для опре-
деления неспецифического отека использовали животных, исходно иммунизи-
рованных другим антигеном после введения им в подошву лапки основного
антигена.
Оценить степень воспаления можно также, используя радиоактивное лече-
ние in vivo. Вскоре после иммунизации антигеном животным вводят различные
радиоактивные нуклеотиды, например 1251-5'-иодо-2-дезоксиуридин (125I-UdR)
19]. Активно делящиеся клетки накапливают метку; появление меченых клеток
в подошве лапок и ушной раковине обычно коррелирует с воспалительной ре-
акцией ГЗТ. Неиммунные клетки, или клетки, иммунизированные другим ан-
тигеном, размножаются в месте введения данного антигена довольно слабо и
метку не поглощают. Этот метод, хотя и коррелирует с появлением воспалитель-
ной реакцией in vivo, обладает более низкой чувствительностью, чем простое
определение размера отека. Большинство исследователей, использующих реак-
цию ГЗТ в качестве системы для определения активности Т-клеток, предпочи-
тают прямое определение степени воспалительного процесса по размеру очага.
С ГЗТ коррелирует синтез активного лимфокина, известного под названием
фактора, ингибирующего миграцию [10]. Этот фактор образуется при стимуля-
ции in vitro иммунных Тгзт-клеток соответствующим антигеном. Содержащую
ФИМ культуральную среду отбирают из культуры Тгзт-клеток и определяют
ее способность ингибировать или ограничивать миграцию клеток перитонеаль-
ного экссудата морской свинки из вертикальных капилляров. Контрольные
клетки перитонеального экссудата мигрируют из таких капилляров, а клетки,
обработанные культуральной средой Тгзт'клеток, мигрируют существенно сла-
бее. Расстояние, на которое перемещаются те и другие клетки, можно измерить
довольно точно. Таким образом, индекс активности в этом тесте определяется
как степень ингибирования миграции.
Мышиные клетки того же фенотипа, что и Тгзт (клетки Lyt 1+2"), выделяют
ФИМ. Как оказалось, эти клетки способны выделять молекулы, сходные с ФИМ
и в смешанной культуре лимфоцитов. Пока неясно, идентичны ди молекулы
ФИМ, выделяемые клетками Lyt 1+ и Lyt 2+. При анализе ФИМ человека, по-
лученного обычным способом, были обнаружены молекулы трех различных
типов, различающиеся по молекулярной массе, чувствительности к трипсину
и химотрипсину, а также по изоэлектрической точке. Возможно, что разные
популяции Т-клеток могут продуцировать различные молекулы, обладающие
сходным эффектом in vitro. В настоящее время считается, что большая часть
156
М. И. Грин, С. Шаттен, Д. С. Бромберг
биологически важных молекул типа ФИМ продуцируется клетками Lyt 1+2~
[10].
Среди лимфокинов, отвечающих in vivo за наличие в воспалительном ин-
фильтрате моноцитов и макрофагов, ФИМ, по-видимому, принадлежит наибо-
лее важная роль (рис. 26.2). Об этом свидетельствует ряд данных. Было пока-
зано, что введение ФИМ in vivo приводит к значительному снижению количест-
Рис. 26.2. Упрощенная схема классической
реакции замедленного типа. Мышей имму-
низируют туберкулином. Через 5—7 дней
(это время для разных антигенов различно)
мышам в подошву лапок вводят тот же ан-
тиген. Наступает отек лапки, размеры
которого через 24— 48 ч можно измерить.
На рисунке в прямоугольнике показан
клеточный и молекулярный процессы при
воспалении. Иммунные Т-клетки с фено-
типом Lyt-1+ синтезируют и секретируют
лимфокины, например фактор, ингибирую-
щий миграцию (ФИМ), и другие молекулы,
вызывающие накопление макрофагов в по-
раженном участке и их активацию. Уплот-
нение ткани при реакции ГЗТ возникает
в результате таких межклеточных взаи-
модействий.
ва циркулирующих в крови моноцитов. Кроме того, культуральная среда,
содержащая ФИМ при локальном введении, вызывает воспалительные явле-
ния. И наконец, при местном введении антитела против ФИМ подавляют вос-
паление [10].
Со способностью к реакции ГЗТ корелирует также тест на пролиферацию
Т-клеток. В этом тесте измеряется способность сенсибилизированных in vivo
мышиных Т-клеток (обычно клеток Lyt-l+2~) размножаться и включать меченый
тимидин in vitro в ответ на соответствующим образом добавленный антиген. Ре-
зультаты многих работ убедительно свидетельствуют о том, что наблюдаемая
в этом случае пролиферация относится не только к клеткам Lyt-1+. Другие типы
клеток (В-клетки, неиммунные Т-клетки) вовлекаются в пролиферативный
процесс клетками Lyt-1+, чувствительными к данному антигену [11, 12]. Хотя
этот тест имеет важное значение для выяснения механизма активации Т-клеток,
не следует, по-видимому, думать, что он полностью коррелирует со способ-
ностью к ГЗТ.
Были изучены свойства клеточной поверхности иммунных лимфоцитов,
участвующих в ГЗТ. В ранних работах было обнаружено, что в отличие от сы-
вороточных антител лимфоидные клетки способны переносить реактивность
26. Реакция гиперчувствительности замедленного типа
157
к ГЗТ. Впоследствии выяснилось, что лимфоциты подразделяются на клетки
двух основных типов — В-клетки, образующие антитела, и Т-клетки, форми-
рующиеся в тимусе. Оказалось, что за клеточные иммунные реакции отвечают
клетки второго типа. Наиболее убедительно это было показано в экспериментах
по переносу реактивности. Оказалось, что популяцию клеток можно лишить
иммунологической компетентности, обработав ее антителами против Т-клеток
(антитела против Thy-1) и комплементом [5]. Действие на иммунные лимфоциты
антител против иммуноглобулинов не влияло на способность их переносить
иммунитет. Стало возможным также обогащать популяцию Т-клеток, исполь-
зуя такие методы, как пропускание клеток смешанной популяции через колон-
ки с нейлоновой ватой или колонки с антителами против иммуноглобулинов
для того, чтобы удалить все остальные виды клеток. Используя такие методы
обогащения, удалось показать, что антиген-специфические реакции замедлен-
ного типа осуществляются иммунными Т-клетками [5].
С помощью антител к Lyt-антигенам был определен фенотип мышиных
Т-клеток, ответственных за классическую реакцию ГЗТ и КЧ. Было показано,
что Т-лимфоциты, осуществляющие ГЗТ к растворимым белкам, перенос клас-
сической ГЗТ и реакцию КЧ (ТКч), имеют фенотип Lyt-1+2" [10, 13]. Имеются
также данные о том, что некоторые Тгзт и Ткч обладают фенотипом Lyt-1“2+
[141. Возможно, эти фенотипически различные клетки ограничены различными
субобластями Н-2 и представляют собой разные типы клеток. Следует отметить,
что антиген Lyt 1 экспрессируется на Т-клетках всех типов [14а]. Следователь-
но, популяция Lyt-1~2+ на самом деле является набором клеток, устойчивых
к лизису антителами против Lyt-1 и комплементом.
Во многих опытах было показано, что гены главного комплекса гистосов-
местимости {МНС) у некоторых видов кодируют продукты, ограничивающие
действие клеток Тгзт. В работе Чейза и Ландштейнера [3] впервые указывалось,
что иммунные лимфоциты могут переносить способность к ГЗТ неиммунизиро-
ванным сингенным морским свинкам. Когда в качестве реципиента использовали
нелинейных морских свинок, у многих животных ГЗТ не развивалась. Тогда
было не очень понятно, почему клетки не могут переносить реакции животным,
несовместимым по антигенам гистосовместимости; предполагалось, что орга-
низм хозяина отторгает перенесенные клетки.
В последующем во многих лабораториях была обнаружена способность
к рестрикции у различных элементов, кодируемых МНС разных видов. От этих
элементов зависит успех взаимодействия размножающихся Т-клеток (Тр) с
клетками, представляющими антиген (КПА), хелперных Т-клеток (Th) с КПА,
а также В-клеток и цитотоксических Т-клеток (Тс) с клетками-мишенями. В пер-
вых двух случаях для взаимодействия Тр с КПА и Th с КПА и В-клетками
элементом рестрикции оказался продукт /-области МНС мышей или морских
свинок (антигены MHG класса II). Элементами рестрикции при взаимодействии
Тс-клеток с клетками-мишенями являются продукты генов Н-2К или H-2D
(антигены МНС класса I).
Регуляторную роль генов МНС в классической реакции ГЗТ у мышей ис-
следовали Миллер и др. [15]. Способность к ГЗТ нельзя было перенести алло-
генным реципиентам, однако ее удавалось перенести реципиентам с идентичным
МНС, даже если другие гены (не МНС) были различны. Ландштейнер и Чейз
предположили, что в данном случае аллогенные клетки отторгаются реципиен-
том [3]. Для исключения такой возможности иммунные клетки гибрида
(линия А X линия В) переносили родительским реципиентам линии В. В этом
случае реципиент мог отвечать на аллогенные детерминанты линии А клеток
Flt но иммунитет переносился успешно. Были проведены также эксперименты
158
М. И. Грин, С. Шаттеи, Д. С. Бромберг
обратного типа, когда иммунные клетки одной из родительских линий перено-
сили неиммунизированным реципиентам гибридов Fv В этом случае могла
возникать реакция «трансплантат против хозяина». Однако способность к ГЗТ
гыла успешно перенесена, так что реакция «трансплантат против хозяина»,
о-видимому, не оказывает влияния на функцию Тгзт-клеток.
Используя конгенные линии мышей, удалось точно идентифицировать те
участки МНС, которые отвечают за взаимодействие клеток, приводящее к ГЗТ.
Такие исследования были проведены со многими антигенами. Например, в од-
ном из них иммунные клетки одной из линий переносили реципиентам, разли-
чающимся по определенной субобласти Н-2. Удалось показать, что в случае
растворимых белковых антигенов, некоторых гаптенов, а также вирусных
и микробных антигенов идентичность по области I-A между донорскими Тгзт-
клетками и реципиентом необходима и достаточна для успешного переноса спо-
собности к ГЗТ. Иной подход сводился к тому, что к клеткам селезенки, обо-
гащенным КПА, присоединяли гаптен. Популяцию сшитых с антигеном КПА,
использовали для иммунизации или индукции вторичных иммунных реакций
у животных из набора конгенных линий. Таким путем было показано, что
донорские КПА, соединенные с антигеном, и клетки-реципиенты должны быть
идентичными по области I-A [14].
В отношении других гаптенов удалось показать, что для переноса иммуни-
тета вполне достаточно идентичности областей Н-2К, I-A и (или) H-2D [14].
Эффекторные клетки, рестриктированные по I-A, имеют, по всей видимости,
фенотип Lyt-l+2“, в то время как клетки, рестриктированные по Н-2К и H-2D,
обладают фенотипом Lyt-1“2+. Эти различия могут влиять на презентирование
антигена, что в свою очередь ограничивает участие Т-клеток тех или иных
типов.
Процессы иммунизации, индукции реакций и эффекторные механизмы ГЗТ
требуют взаимодействий ТГзт со специализированными КПА. Во многих иссле-
дованиях было показано, что как и в случае других популяций Т-клеток, Тгзт
и ТКч рестриктированы по МНС, и для их функционирования требуется сов-
местное узнавание антигена и детерминант МНС, расположенных на поверх-
ности КПА [14]. Эти КПА располагаются в селезенке, а также, в меньшей сте-
пени, в печени, легких, лимфатических узлах, эпидермисе и активированных
перитонеальных экссудатах. Наиболее активными КПА являются дендритные
клетки, недавно описанные у мышей. Это сходные с макрофагами клетки, не-
сущие la-белки и обладающие слабой фагоцитирующей активностью [16].
Каким образом продукты генов Н-2 и антиген взаимодействуют между собой и
активируют Тгзт- и Ткч-клетки, остается неизвестным. Показано, что КПА,
несущие la-белки, захватывают антиген и «презентируют» его предшественни-
кам Тгзт» примируя их. Сходные взаимодействия происходят, по-видимому,
между КПА, несущими антиген, и иммунными ТГзт! последние при этом акти-
вируются. После активации Тгзт или Ткч выделяют разные лимфокины, ответ-
ственные за привлечение мононуклеаров в участок воспаления, а те в свою оче-
редь вызывают неспецифические разрушения ткани.
По характеру генетической рестрикции и взаимодействию с КПА клетки
Тгзт и ТКч напоминают Тр и Th. Большинство из них имеют фенотип Lyt-l+2“(r
и узнавание ими антигена происходит в сочетании с продуктом генов области
I-A — как при примировании, так и при активации иммунных клеток. Такое
сходство в поведении свидетельствует о том, что клетки Тгзт и Тич, возможно,
идентичны. В некоторых исследованиях тем не менее показано, что различные
способы иммунизации могут вызывать либо гуморальный, либо клеточный ответ
на антиген [17]. Если бы клетки Тгзт и Тич были идентичны, этого бы не на-
26. Реакция гиперчувстеительности замедленного типа
159
блюдалось. С другой стороны, в ряде проведенных недавно исследований было
обнаружено, что длительно культивируемые клоны хелперных и цитолитиче-
ских Т-клеток, а также постоянные линии цитолитических Т-клеток способны
вызывать реакцию ГЗТ. Однако кинетика развития реакции, а также гистоло-
гическая картина участков воспаления отличаются в этом случае от того, что
наблюдается при классической реакции ГЗТ [18, 19].
Поскольку агенты, вызывающие контактную чувствительность, способны
химически модифицировать без различия поверхность любых клеток, можно
думать, что антигенные свойства приобретают К-, I- и D-антигены; в этом слу-
чае будут индуцироваться как Ткч с фенотипом Lyt-l+2~, рестриктированные по
области I, так и ТКч с фенотипом Lyt-1“2+, рестриктированные по К- или D-об-
ластям. Растворимые белковые антигены более избирательны; можно думать,
что в специализированных КПА они ассоциированы только с белками I-A
и индуцируют Тгзт, рестриктированные по области I. ГЗТ в ответ на некоторые
вирусы рестриктированы у мышей также по областям К, I и D [20]. Вирусы
способны размножаться в клетках многих типов и вызывать у них появление
новых поверхностных антигенов. Поэтому вирусные антигены могут ассоции-
роваться со многими продуктами области Н-2, что, по-видимому, и объясняет
наблюдаемый характер генетической рестрикции по Н-2.
Таким образом, ассоциация антигена с молекулами МНС может влиять на
фенотип и функциональные свойства индуцируемых популяций Т-клеток. Ис-
следования последних лет показывают, что фенотип Lyt может не строго корре-
лировать с функцией клеток; скорее этот фенотип и соответствующий ему анти-
ген МНС взаимозависимы, а функции клеток зависят от характера стимуля-
ции [21].
26.2. Активация Тгзт в ответ на антигены бактерий,
паразитов и вирусов
Клетки ТГзт с фенотипом Lyt-1+ реагируют не только на белковые
антигены и агенты, вызывающие контактную чувствительность, но и на продук-
ты микроорганизмов, такие, как туберкулин. Реакции ГЗТ активируются
также более распространенными бактериями, такими, как листерия, саль-
монелла, стафилококки. Реакцию ГЗТ может вызывать целый ряд
вирусов (например, вирус лимфоцитарного хориоменингита, вирус гриппа
и реовирусы). Известно, что в борьбе с вирусными инфекциями in vivo
участвуют цитотоксические клетки. Что касается Тгзт, то их роль в ограниче-
нии распространения вирусов пока неясна. Исследование реакции ГЗТ в ответ
на реовирусы млекопитающих показало, что большая часть Тгзт-клеток специ-
фична к гемагглютининовому полипептиду [22]. Это было установлено при ис-
пользовании рекомбинантного вируса, отличающегося лишь геном гемагглюти-
нина и его продуктом. Результаты показывают, что иммунологическая защита
может обеспечиваться реакцией только на один компонент вириона. Однако в
работе с вирусом гриппа показано, что Тгзт-клетки различают подтипы виру-
сов менее эффективно, чем антитела [23].
В недавних исследованиях, проведенных преимущественно на мышах,
была обнаружена активация клеток Тгзт с фенотипом Lyt-l+2_ организмами,
имеющими более сложное строение, чем вирусы и бактерии. Была выявлена
реакция на жгутиконосное простейшее Leishmania tropica. При этом было по-
казано, что, по крайней мере отчасти, защиту обеспечивают Тгзт-клетки с фено-
типом Lyt-l+2~ 1а~ [24]. При острой инфекции, вызванной Trypanosoma, реакция
160
М. И. Грин, С. Шаттен, Д. С. Бромберг
ГЗТ в иммунном ответе не участвует, хотя при патологическом течении инфек-
ции, например при кардиомиопатии, встречающейся при американском трипа-
носомиазе (болезнь Чагаса), она иногда наблюдалась [25]. При шистозоматоз-
ной инфекции постоянная активность Тгзт-клеток может приводить к грануле-
матозным повреждениям печени и портальной гипертонии. Гранулематозные
реакции, по-видимому, регулируются супрессией in vivo [26].
26.3. Роль Тгзт-клеток в отторжении кожного
трансплантата и аллогенных реакциях
Хорошо известно, что отторжение аллогенных кожных трансплантатов —
реакция клеточная. Из-за высокой активности цитолитических Т-клеток с фе-
нотипом Lyt-2+ при отторжении аллотрансплантата именно этим клеткам при-
писывается основная роль. Недавно, однако, было показано, что отторжение
кожных трансплантатов опосредуется Т-клетками с фенотипом Lyt-1+ и что сам
феномен, вероятно, связан с активностью клеток, сходных с ТГзт- В этих рабо-
тах было установлено, что введение большого количества иммунных лимфоци-
тов с фенотипом Lyt-1+ реципиентам, лишенным Т-клеток, приводило к оттор-
жению кожных трансплантатов, отличающихся по МНС. Оказалось, что те же
клетки с фенотипом Lyt-1+ способны передавать реакцию ГЗТ в ответ на алло-
антигены [27].
Помимо больших различий по МНС ТГзт-клетки распознают также и не-
значительные различия. Реакция ТГзТ с фенотипом Lyt-1+ на антиген H-Y
самца подвержена такой же генетической рестрикции, что и отторжение кож-
ного трансплантата [28]. У самок мышей некоторых линий отторжение транс-
плантатов самцов происходит несколько быстрее. Гены, отвечающие за разли-
чия в скорости отторжения, картируются в области Н-2. Исследования, прове-
денные с ТГЗт-клетками, имеющими фенотип Lyt-1+, показали, что антигены
Н-Упрезентируются иммунным лимфоцитам специальными КПА, имеющими в
основном фенотип 1а+. Образование цитолитических Т-клеток против антигена
Н-Y подвержено, однако, другому типу генетической рестрикции Н-2. Реакция
ГЗТ на другие минорные антигены гистосовместимости также оказалась рест-
риктированной по области I-A [29]. Рестрикция этого типа, по всей видимости,
обусловлена способностью КПА с фенотипом 1-А+ презентировать иммунным
клеткам Тгзт минорные антигены гистосовместимости.
26.4. Роль Тгзт—сходных клеток с фенотипом Lyt-1+
в противоопухолевых реакциях.
Согласно современным представлениям, сходные с Тгзт клетки с феноти-
пом Lyt-1+ представляют собой основные эффекторные клетки в реакциях на
различные опухоли. Некоторые, индуцированные метилхолантреном фибро-
саркомы мышей вызывают иммунитет у животных сингенных линий. Так,
например, мышей линии A/J можно легко проиммунизировать некоторыми син-
генными фибросаркомами путем подкожного введения живых клеток и последу-
ющего хирургического удаления выросшей опухоли через 7 дней. Если затем
такой иммунизированной мыши в подошву лапки ввести облученные опухолевые
клетки, идентичные тем, что были использованы при иммунизации, то возник-
нет классическая опухолеспецифичная реакция ГЗТ. Специфичность этой реак-
26. Реакция гиперчувствительности замедленного типа
161
ции доказывается введением других идентичных по Н-2 опухолевых клеток,
индуцированных другим канцерогеном. Такой контроль возможен, поскольку
индуцированные канцерогеном опухоли у мышей содержат на своей поверхно-
сти уникальные антигены; таким образом, опухоль I будет отличаться от опу-
холи II, даже если эти опухоли появляются у животных одной линии под дейст-
вием одного и того же агента. В результате у животных, иммунизированных
опухолью I, возникает сильная реакция ГЗТ на клетки опухоли Г, если же вво-
дить клетки опухоли II, то реакция не наблюдается [30].
Было показано, что иммунные лимфоциты мышей, примированных опухо-
лью, способны переносить иммунитет другим мышам. В опытах по трансплан-
тации иммунных популяций Т-клеток с фенотипом Lyt-1+ и Lyt-2+ было по-
казано, что опухолеспецифический иммунитет передается клетками Lyt-1+.
Эта закономерность была обнаружена при использовании многих эксперимен-
тальных систем [31, 32]. Показано также, что реакция ГЗТ на опухолевые анти-
гены передается этими клетками [33]. В том случае, когда in vivo противоопу-
холевый иммунитет обеспечивается клетками Lyt-1+, обнаружить in vitro цито-
токсические Т-клетки с фенотипом Lyt-1 "2 + удается лишь с трудом. Создается
впечатление, что и аллогенные кожные трансплантаты, и некоторые типы опу-
холей отторгаются в основном при участии иммунных клеток, сходных с Тгзт.
26.5. Формирование гранулем
Роль клеток, сходных с ТГзт, в процессе образования гранулем, была
недавно установлена. Обычно гранулемы образуются при шистоматозах и дру-
гих глистных инфекциях, при некоторых лимфоидных опухолях, а также в от-
вет на чужеродные агенты, такие, как тальк, и продукты различных бактерий,
таких, как БЦЖ или Corynebacterium parvum. Гранулема представляет собой
локальный воспалительный очаг, состоящий преимущественно из мононуклеар-
ных клеток. Она возникает в ответ на постоянную стимуляцию чужеродным
агентом, в том числе живым [34]. Строение гранулем хорошо известно. Между
тяжами фиброзной соединительной ткани располагаются главные клеточные
компоненты — макрофаги. В зависимости от причин возникновения гранулемы
в воспалительном очаге могут присутствовать еще лимфоциты, плазмациты,
эозинофилы и нейтрофилы, а также отложения кальция. На рис. 26.3 показана
развитая гранулема тонкого кишечника, возникшая в ответ на постоянную сти-
муляцию клеток Тгзт, реагирующих на антиген, прикрепленный к полиакри-
ламидным шарикам. Шарики, покрытые лигандом, вводили в подвздошную
кишку мыши, иммунизированной тем же лигандом. Постоянное присутствие
антигена привело к возникновению хронического гранулематозного очага.
Гранулемы могут появляться в результате локальной иммунной реакции
на некоторые постоянно присутствующие в организме антигены. В таком очаге
возникает хроническая реакция, похожая на ГЗТ. Было показано, что разви-
тие гранулем — процесс, активно регулирующийся. В случае гранулем, вы-
званных шистосомами, супрессорные Т-клетки способны предотвращать обра-
зование очага [26].
Гранулематозные поражения, сопровождающие шистоматоз или туберку-
лез, возникают не в результате прямого токсического действия микроорганиз-
мов, а скорее как следствие иммунной реакции. Недавно была получена модель
гранулемы in vitro [35]. Яйца Schistosoma mansoni сначала инкубировали in
vitro с клетками селезенки иммунизированных мышей. При этом мононуклеар-
ные клетки прикреплялись к яйцам и претерпевали бласттрансформацию. Затем
6-0395
162
М. И. Грин, С. Шаттен, Д. С. Бромберг
Рис. 26.3. Гранулема тонкого кишечника
(показана стрелкой). Представляет собой
четко отграниченную структуру, состоя-
щую из мононуклеарных клеток, лежащих
между фиброзными тяжами. Для индукции
гранулемы мышам вводили клетки, конъю-
гированные с азобензоларсонатом (АБА).
Через 5 дней хирургическим путем в под-
вздошную кишку мыши вводили 30 мкл
бычьего сывороточного альбумина, конъю-
гированного с АБА и сшитого с полиакри-
ламидными шариками (АБА-БСА-ПАШ).
Инертные шарики с антигеном вызывали
постоянную антиген-специфическую вос-
палительную реакцию, что приводило к об-
разованию гранулемы.
26. Реакция гиперчувствителъности замедленного типа 163
в реакцию вступали другие лимфоциты, макрофаги, эозинофилы и фибробласты,
синтезирующие коллаген. Как и предполагалось, реакция in vitro зависела от
присутствия антиген-специфической популяции Т-клеток с фенотипом Lyt 1+.
Более того, образование гранулемы in vitro можно было регулировать с по-
мощью определенных популяций супрессорных Т-клеток.
26.6. Регуляция гиперчувствительности
замедленного типа
Регуляция активности клеток Тгзт усиленно исследовалась. Еще 30 лет
назад было показано, что пероральное введение некоторых антигенов приводит
к продолжительному состоянию специфичной ареактивности на последующую
иммунизацию теми же антигенами. Это значит, что реакция на, иммунизацию
данным лигандом отсутствует. Этот эффект известен под названием феномен
Сульцбергера—Чейза [1, 36]. Лишь недавно обнаружилось, что пероральное
введение лиганда приводит к системной ареактивности по крайней мере отчасти,
за счет образования супрессорных Т-клеток (Тс, Ts) [37]. Интересно, что, не-
смотря на системный характер возникающей ареактивности, можно стимулиро-
вать локальный иммунитет, проявляющийся в повышенном синтезе и секреции
IgA [38].
Пока неясно, чем можно объяснить такое расхождение между систем-
ным и локальным иммунологическим эффектом. Возможно, что иммунная функ-
ция клеток слизистой не зависит от влияния регуляторных клеток, действую-
щих на весь организм.
Вслед за изучением ареактивности, вызванной пероральным введением
антигена, было обнаружено, что при внутривенном введении антигенов, свя-
занных с клетками, активность клеток Тгзт также подавляется [39]. Этот фено-
мен интенсивно исследовался на мышах с использованием лимфоидных клеток,
конъюгированных с гаптеном. Выяснилось, что в основе возникающей при этом
ареактивности лежит два механизма. Один из них заключается в фенотипиче-
ской ареактивности: не удается обнаружить специфичных к лиганду эффектор-
ных Т-клеток, инактивированных, по-видимому, антигеном. Кроме того, при
внутривенном введении клеток, связанных с лигандом, происходит индукция
супрессорных Т-клеток [40]. Это дало возможность нескольким лабораториям,
работающим с разными антигенами, исследовать процессы индукции и функцио-
нирования Тч, регулирующих активность ТГзт- При изучении Тч, индуциро-
ванных введением клеток, связанных с лигандом, и их роли in vivo в регуляции
реакции ГЗТ выяснилось, что Ts способны подавлять как образование ТГзТ,
так и их активность. Эти два способа действия Ts были названы, соответственно,
афферентным и эфферентным. Эфферентные Ts подавляют активность Тгзт во
время индукции реакции, тогда как афферентные клетки способны угнетать
Тгзт лишь в момент первичной иммунизации. В настоящее время установлено,
что афферентные и эфферентные Ts родственны между собой и соответствуют
разным стадиям супрессорного ряда дифференцировки.
А реактивность, по имеющимся данным, может также возникать в ответ на
введение растворимых химически активных лигандов, таких, как тринитробен-
зилсульфокислота (ТНБС) [41]. И в этом случае было показано, что ареактив-
ность по крайней мере отчасти, объясняется функционированием супрессорных
Т-клеток, специфичных к лиганду. Следует заметить, что ТНБС может связы-
ваться с клетками in vivo. Сходные химические соединения, неспособные, од-
нако, связываться с клетками, не способны также индуцировать Ts. Было
6*
М. И. Грин, С. Шаттен, Д. С. Бромберг
показано, что Ts выделяют специфичные супрессорные молекулы, взаимодейст-
вующие как с эффекторными Т-клетками, так и с макрофагами. Взаимодействие
супрессорных молекул с эффекторными Т-клетками приводит к специфической
супрессии иммунитета, тогда как взаимодействие с макрофагами ведет к не-
специфической супрессии [41]. Таким образом, регуляция количественной и
качественной активности клеток Тгзт с фенотипом Lyt-1+ осуществляется час-
тично супрессорными Т-клетками.
В настоящее время усилия исследователей сосредоточены на генетических
аспектах осуществляемой супрессорными клетками регуляции функций ТГзт
с фенотипом Lyt-1+2“. Известно, что у мыши в образовании супрессорными клет-
ками супрессорных молекул участвуют два кластера генов [42]. Это локус
Н-2 (хромосома 17) и набор генов, сцепленный с Igh-I (хромосома 12). Анализ
супрессорных клеток и молекул, регулирующих реакцию Тгзт на растворимые
антигены, гаптены, связанные с клеточной поверхностью, и опухолевые клетки,
показал, что в регуляции супрессорными клетками реакции ГЗТ принимают
участие оба кластера.
Было показано, что супрессорные клетки не гомогенны, а представляют
собой три взаимодействующие популяции, названные супрессорами первого
(Т61), второго (Ts2) и третьего (Ts3) порядка. Каждая из этих популяций вы-
полняет определенную и генетически детерминированную функцию, а отличить
их можно по фенотипическим маркерам и функциональной активности [42].
По-видимому, субпопуляция TS1 соответствует упомянутым выше афферент-
ным Ts.
Эти клетки стимулируют клетки Ts2. В некоторых системах такая сти-
муляция происходит в результате образования растворимых факторов. При
регуляции специфичной к гаптенам ГЗТ клетки Ts3 активируются лигандом
и молекулами, выделяемыми Ts2. Активированные клетки Ts3 секретируют су-
прессорные молекулы, способные подавлять Тгзт Lyt-1+ [42]. Пока неизвестно,
осуществляется ли действие этих молекул непосредственно или косвенно. По
всей видимости, субпопуляция Ts3 соответствует эфферентным супрессорным
клеткам.
Клетки Тгзт Lyt-1+ обладают высокой чувствительностью к действию су-
прессорных клеток. Это представляется необходимым, поскольку клетки такого
фенотипа индуцируют воспалительную реакцию ГЗТ. Если бы такие клетки
были относительно устойчивы к регуляторным воздействиям, то в случае актив-
ной реакции ГЗТ возникало бы обширное поражение ткани. Очевидно, супрес-
сорные Т-клетки играют главную роль в регуляции реакций ГЗТ в ответ на
паразитарные инфекции и опухоли. Если клетки Тгзт действительно так чувст-
вительны к регуляции, то иммунологическое разрушение опухоли, вызываемое
клетками Тгзт Lyt-1 +, может подавляться супрессорными Т-клетками, возни-
кающими при росте опухоли. Исследования, проведенные на нескольких моде-
лях, показали, что это действительно так [31]. Оказалось, что растущие опу-
холи вызывают образование супрессорных клеток, препятствующих уничтоже-
нию опухолей эффекторными клетками Lyt+.
Возможно, что продукт субобласти I-J ограничивает активность супрес-
сорных Т-клеток. Эта идея генетической рестрикции наилучшим образом иллю-
стрируется в необычной модели — при действии ультрафиолетового излуче-
ния (УФ).
Хорошо известно, что продолжительное УФ-облучение мышей приводит
к возникновению у них опухолей. Такие опухоли растут на облученных мышах,
но почти всегда отторгаются у обычных, необлученных мышей [43]. Усилиями
ряда лабораторий было показано, что рост этих опухолей отчасти объясняется
26. Реакция гиперчувствительности замедленного типа 165
активностью супрессорных Т-клеток, поскольку последние мешают эффектор-
ным клеткам уничтожать опухоли. Спелмен и Дэйне [43] обнаружили, что
имплантация Т-клеток от УФ-облученных мышей нормальным животным
приводит к возможности роста индуцированных УФ опухолей у этих мышей.
Основной механизм образования Ts в этой системе неизвестен, но интересно,
что Т8-клетки, супрессирующие противоопухолевые реакции, появляются рань-
ше, чем образуется сама опухоль. УФ-облучение мышей приводит к нарушению
процесса презентирования антигена КПА и к системному уменьшению количе-
ства КПА с фенотипом 1-А+ [44, 45]. Многие клетки Лангерганса с таким же
фенотипом (1-А+), присутствие которых имеет важное значение для презенти-
рования иммунных Ткч антигенов, действующих на кожу [46], также исчезают
из кожного слоя [47]. Если УФ-облученных мышей подвергнуть воздействию
агентов, вызывающих реакцию КЧ, или иммунизировать подкожно клетками от
облученных мышей, связанными с гаптеном, у них не возникают реакции ГЗТ.
Вместо этого появляются антиген-специфические супрессорные Т-клетки [44].
Активация супрессорных клеток (а не клеток Тгзт) у УФ-облученных мы-
шей позволяет думать, что для активации супрессии достаточно лишь нарушения
процесса презентирования антигена КПА. На основе этого наблюдения было
высказано предположение о том, что формирование опухолей у УФ-облученных
мышей происходит в результате нарушения процесса презентирования анти-
гена КПА и образования Ts. Предполагается, что Ts активируются в ответ на
УФ-индуцированные неоантигены, которые, возможно, имеются и в опухолях,
вызванных УФ. Поэтому нарушение процесса презентирования антигена и по-
явление под влиянием УФ неоантигенов может вызывать формирование Ts,
возможно, играющих особую роль в развитии чувствительности животного
к опухолевому росту [44]. Можно думать, и это подтверждается некоторыми
экспериментами, что существует специальный тип КПА, ответственных за вза-
имодействие с супрессорными клетками и отличающихся от КПА с фенотипом
1-А+ [48].
Интерес к таким, отличным от I-A элементам, ограничивающим активацию
супрессорных и эффекторных клеток, связан с попыткой избирательно подав-
лять функцию эффекторных клеток Lyt-1+ с помощью антител к I-A, вводимым
in vivo.
Было обнаружено, что антитела к I-A препятствуют презентированию
лиганда клеткам ТГзт. Наиболее убедительно это было показано в следующих
экспериментах. Гаптен химически связывали с КПА линии А или линии В
и вводили эти клетки в качестве иммуногенов мышам (А х B)FV В обоих слу-
чаях у гибридов Fx развивалась реакция ГЗТ. Введение антител, взаимодейст-
вующих с белками I-A линии А, подавляло процесс презентирования гаптена
КПА линии А, но не КПА линии В. В результате, эти антитела избирательно
подавляли активацию Тгзт-клеток [49]. Таким образом можно избирательно
влиять на активацию клеток Тгзт> подавляя процесс презентирования им
лиганда.
Аналогичным способом введение антител к белкам I-J, реагирующих с де-
терминантами супрессорных клеток, подавляло активность супрессоров по от-
ношению к клеткам, сходным с Тгзт Lyt-1+. Это было показано в опытах по
подавлению роста опухолей [50] и в экспериментах с гранулемами, связанными
с реакциями Т-клеток с фенотипом Lyt-1+ в ответ на Schistosoma mansoni [26].
Таким образом, с помощью антисывороток к продуктам генов области I оказа-
лось возможным влиять на клетки, необходимые для индукции ГЗТ, и на клет-
ки, регулирующие активность Тгзт*клеток.
166
М. И. Грим, С. Шаттен, Д. С. Бромберг
26.7. Фармакологическая регуляция
Классическая реакция гиперчувствительности замедленного типа и реак-
ция контактной чувствительности, направленные против многих агентов,
представляют собой важную клиническую проблему. Например, реакция на
яд плюща может служить примером контактной чувствительности к веществу
растительного происхождения, взаимодействующему с белками кожи. С этими
белками реагируют также никель, бериллий и некоторые красители, что ведет
к развитию реакции ГЗТ, значительно осложняющей работу клиницистов.
Поэтому исследование фармакологических способов регулирования данного
иммунологического ответа представляет большой интерес.
Хорошо известно, что многие фармакологические агенты влияют на реак-
цию ГЗТ. Так, гепарин может подавлять реакции ГЗТ у мышей и морских сви-
нок [51]; механизм подобного влияния пока неясен. На воспалительные реакции
in vivo действуют также кортикостероиды, причем механизм их действия ока-
зался весьма сложным. Снижение интенсивности ГЗТ у животных, получавших
стероиды, может быть связано с их лимфолитическим действием [52]. Недавно
было обнаружено, что глюкокортикостероиды, нанесенные на кожу или вве-
денные в организм, приводят к уменьшению количества клеток Лангерганса
в эпидермисе [53]; эти клетки в случае реакции ГЗТ и КЧ играют важнейшую
роль в представлении антигена. Действие стероидов поэтому может быть сход-
ным с действием УФ-облучения, приводящего к потере организмом КПА и
фактически полному исчезновению клеток Лангерганса из эпидермиса.
Противоопухолевые препараты — циклофосфамид, винкристин, митоми-
цин С и 5-фторурацил — напротив, усиливают реакцию ГЗТ у мышей [54].
Считается, что механизм действия этих препаратов связан с подавлением ими
деятельности супрессорных Т-клеток. Предполагается, что супрессорные
клетки обладают повышенной чувствительностью к цитостатикам, поскольку
они быстро пролиферируют в ответ на многие антигены.
Таким образом, различные фармакологические агенты могут нейтрали-
зовать клетки Тгзт, ограничивать процесс презентирования антигена, препят-
ствовать образованию супрессорных Т-клеток. Изучение процессов взаимодей-
ствия между этими различными популяциями клеток и их роли в возникновении
заболеваний должно увеличить наши возможности лекарственной регуляции
реакции ГЗТ.
Заключение
Феномен гиперчувствительности замедленного типа представляет собой
проявление in vivo активности специализированной субпопуляции Т-клеток.
Клетки Тгзт могут активироваться в ответ на самые разнообразные антигены.
Клетки Тгзт и Ткч реагируют на химические группы, связанные с белками
кожи, белковые антигены, аллоантигены, антигены опухолей, а также антигены
вирусов, бактерий, грибов и паразитов. Распознавание столь разнообразных
структур требует процесса презентирования антигена с помощью специальных
клеток, представляющих антиген (КПА). Мы обсудили генетические ограниче-
ния на активацию клеток Тгзт антигеном, связанным с КПА и показали, что
за это ответственны продукты генов МНС. Рассмотрены, кроме того, вопросы
регуляции in vivo клеток ТГзт» осуществляемой популяцией супрессорных
Т-клеток. Было также отмечено, что методы ограничения активации реакции
ГЗТ могут иметь терапевтическое значение, поскольку реакция ГЗТ играет
26. Реакция гиперчувствителъности замедленного типа
167
важную роль в различных заболеваниях. Один из методов подавления ГЗТ
заключается во введении антител к белкам I-A. Другой подход связан с удале-
нием КПА с помощью УФ-облучения. В клинической практике уже использу-
ются лекарственные методы воздействия на реакцию ГЗТ. Исследования по-
следних лет дали много новых данных о том, как лекарственные препараты
влияют на функции Т-клеток и изменяют течение заболеваний.
ЛИТЕРАТУРА
1. Waksman В. Delayed (cellular) hypersensitivity. In: Immunological Diseases, ed. by
M. Sainten, pp. 220—252, Boston Little brown, 1971.
2. Metchnikoff E. Immunity in Infectious Diseases, University Press, Cambridge, 1905.
3. Landsteiner K., Chase M.W. Experiments on transfer of cutaneous sensitivity to simple
chemical compounds, Proc. Soc. Exp. Biol. N.Y., 49, 688—690 (1942).
4. Asherson G.L., Zembala M. Contact sensitivity in the mouse. IV. The role of lymphocytes
and macrophages in passive transfer and the mechanism of their interaction, J. Exp. Med.,
132, 1—5 (1970).
5. Crowle A.J. Delayed hypersensitivity in the mouse, Adv. Immunol., 20, 197—264 (1975).
6. Lawrence H.S. Transfer factor, Adv. Immunol., 11, 195—266 (1969).
7. Bloom, B.R., Chase M.W. Transfer of delayed-type hypersensitivity. A critical review and
experimental study in the guinea pig, Prog. Allergy, 10, 151—255 (1967).
8. Askenase P.W. Cutaneous basophil hypersensitivity in contact-sensitized guinea pigs. I.
Transfer with immune serum, J. Exp. Med., 138, 1144—1155 (1973).
9. Vadas M.A., Miller J.F.A.P., Gamble J., Whitelaw A. A radioisotopic method to measure
delayed-type hypersensitivity in the mouse. I. Studies in sensitized and normal mice, Int.
Arch. Allergy Appl. Immunol., 49, 670—692 (1975).
10. Cohen S., Pick E., Oppenheim J. J. (eds.) Biology of Lymphokines. Academic Press, New
York, 1979.
11. Tse H.J., Schwartz R.H., Paul W.E. Cell-cell interactions in the T cell proliferative res-
ponse. I. Analysis of the cell types involved and evidence for nonspecific T cell recruitment,
J. Immunol., 125, 491—500 (1980).
12. Tse H.Y., Mond J. J., Paul W.E. T-lymphocyte-dependent В lymphocyte proliferative res-
ponse to antigen. I. Genetic restriction of the stimulation of the Blymphocyte proliferat-
ion, J. Exp. Med., 153, 871—882 (1981).
13. Vadas M.A., Miller J.F.A.P., McKenzie I.F.C., Chism S.E., Shen F.W., Boyse E.A.,
Gamble J.R., Whitelaw A.M. Ly and la antigen phenotypes of T cells involved in delayed-
type hypersensitivity and its supression, J. Exp. Med., 144, 10—19 (1976).
14. Vadas M.A., Greene M.I. Role of the MHC in delayed-type hypersensitivity. In: The Role
of the Major Histocompatibility Complex in Immunobiology, ed. by M.E. Dorf,
p.p. 271—301, Garland Press, New York, 1981.
Ledbetter J .A., Rouse R.V., Micklem H.S., Herzenberg L.A. T cell subsets defined by expres-
sion of Lyt-1,2,3 and Thy-1 antigens. Two parameter immunofluorescence and cytotoxicity
analysis with monoclonal antibodies modifies current views, J. Exp. Med., 152, 280—295
(1980).
15. Miller J.F.A.P., Vadas M.A., Whitelaw A .M., Gamble J. Role of major histocompatibilit,
complex gene products in delayed type hypersensitivity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73y
2486—2490 (1976).
16. Steinman R. M., Kaplan G., Witmar M.D., Cohn Z.A. Identification of a novel cell in
peripheral lymphoid organs of mice. V. Purification of spleen dendritic cells, new surface
markers, and maintenance in vitro, J. Exp. Med., 149, 1—16 (1979).
17. Ramshaw I.A., Bretscher P.A., Parish C.R. Regulation of the immune response. I. Sup-
pression of delayed-type hypersensitivity by T cells from mice expressing humoral immuni-
ty, Eur. J. Immunol., 6, 674—679 (1976).
18. Bianchi A.T.J., Hooijkaas H., Benner R., Tees R., Nordin A.A., Schreier M.H. Clones of
helper T cells mediate antigen-specific, Н-2-restricted DTH, Nature, 290, 62—63 (1981).
19. Weiss S., Dennert G. T cells lines active in the delayed-type hypersensitivity reaction (DTH),
J. Immunol., 126, 2031—2035 (1981).
20. Ertl H.C.J. Adoptive transfer of delayed-type hypersensitivity to Sendai virus. I. Induction
of two different subsets of T lymphocytes which differ in H-2 restriction as well as in the
Lyt phenotype, Cell Immunol., 62, 38—49 (1981).
21. Swain S.L., Dennert G., Wormsley S., Dutton R.W. The Lyt phenotype of a long-term al-
lospecific T cell line. Both helper and killer activities to IA are mediated by Ly-1 cells, Eur.
J. Immunol., 11, 175-180 (1981).
168
М. И. Грин, С. Шаттек, Д. С. Бромберг
22. Weiner H.L., Greene М.1., Fields B.N. Delayed hypersensitivity in mice infected with
reovirus I. Identification of host and viral gene products responsible for the immune res-
ponse, J. Immunol., 125, 278—282 (1980).
23. Leung K.-N., Ada G.L., McKenzie I.F.C. Specificity, Ly phenotype, and H-2 compatibility
requirements of effector cells in delayed-type hypersensitivity responses to murine influenza
virus infection, J. Exp. Med., 151, 815—826 (1980).
24. Howard J.G., Hole C., Liew F.Y. Immunological regulation of experimental cutaneous leish-
maniasis. IV. Prophylactic effect of sublethal irradiation as a result of abrogation of sup-
pressor T cell generation in mice genetically susceptible to Letshmania tropica. J. Exp. Med.,
153, 557-568 (1981).
25. Liew F.Y. Regulation of delayed-type hypersensitivity to pathogens and alloantigens, Im-
munol. Today, 3, 18—23 (1982).
26. Green W. F., Colley D.G. Modulation of Schistosoma mansoni egg-induced granuloma format-
ion: I-J restriction of T cell-mediated suppression in a chronic parasitic infection, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1152—1156 (1981).
27. Loveland B.E., Hogarth P.M., Ceredig Bh., McKenzie I.F.C. Cells mediating graft reject-
ion^in the mouse. I. Lyt-1 cells mediate skin graft rejection, J. Exp. Med., 153, 1044—1057
28. Greene M.I., Benacerraf B., Dorf M.E. The characterization of the delayed-type hypersen-
sitivity reaction to H-Y antigens, Immunogenetics, 11, 267—273 (1980).
29. Smith F.I., Miller J.F.A.P. Delayed-type hypersensitivity to allogeneic cells in mice. II.
Sensitivity to cell-surface antigens coded by the major histocompatibility complex and
by other genes, J. Exp. Med., 150, 965—976 (1979).
30. Prehn B.T., Main J. M. Immunity to methylcholanthrene-induced sarcomas, J. Natl. Can-
cer Inst., 18, 769 (1957).
31. Greene M.I. The genetic and cellular basis of regulation of the immune response to tumor
antigens. In: Contemporary Topics in Immunobiology, V. 11, ed. by N.L. Warner, pp. 81 —
116, Plenum Press, New York, 1980.
32. Greenberg P.D., Cheever M.A., Fefer A. Eradication of disseminated murine leukemia by
chemoimmunotherapy with cyclophosphamide and adoptively transferred immune syn-
geneic Lyt-1+2- lymphocytes, J. Exp. Med., 154, 952—963 (1981).
33. Perry L.L., Greene M.I. The relationship between tumor antigens and alloantigens: Cross-
reactivity due to differential context of T cell antigen recognition, J. Immunol., 125, 738—
748 (1980).
34. Epstein W. L. Granulomatous hypersensitivity, Prog. Allergy, 11, 36—88 (1967).
35. Doughty B.L., Phillips S.M. Delayed hypersensitivity granuloma formation around
Schistosoma mansoni eggs in vitro, I. Definition of the model, J. Immunol., 128, 30—36
(1982).
36. Chase M.W. Inhibition of experimental drug allergy by prior feeding of the sensitizing
agent, Proc. Soc. Exp. Biol. N.Y., 61, 257 (1946).
37. Asherson G.L., Zembala M., Perera M.A.C.C., Mayhew B. Thomas W.R. Production of im-
munity and unresponsiveness in the mouse by feeding contact sensitizing agents and the role
of suppressor cells in the Peyer’s patches, mesenteric lymph nodes and other lymphoid
tissues, Cell Immunol., 33, 145—155 (1977).
38. Jackson S., Mestecky J. Oral-parenteral immunization leads to the appearance of IgG auto-
anti-idiotypic cells in mucosal tissues, Cell Immunol., 60, 498—502 (1981).
39. Battista J.R., Bloom B.R. Dual immunological unresponsiveness induced by cell membra-
ne coupled hapten or antigen, Nature, 212, 156—157 (1966).
40. Miller S.D., Claman H.N. The induction of hapten-specific T cell tolerance using hapten-
modified lymphoid cells. I. Characteristics of tolerance induction, J. Immunol., 117, 1519—
1526 (1976).
41. Asherson G.L., Zembala M. Suppressor T cells in cell-mediated immunity, Br. Med. Bull.,
32, 158—164 (1976).
42. Greene M.I., Nelles M.J. Sy М-S., Nisonoff A. Regulation of immunity to the azobenze-
nearsonate hapten, Adv. Immunol., 32, 253—300 (1982).
43. Spellman C. W., Daynes R.A. Modification of immunological potential by ultraviolet ra-
diation. II. Generation of suppressor cells in short-term UV-irradiated mice, Transplantat-
ion, 24, 120—126 (1977).
44. Greene M.I., Sy М-S., Kripke M., Benacerraf B. Impairment of antigen-presenting cell
function by ultraviolet radiation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 6591—6595 (1979).
45. Letvin N. L., Nepom J.T., Greene M.I., Benacerraf B., Germain R.N. Loss of la-bearing
splenic adherent cells after whole body ultraviolet irradiation, J. Immunol., 125, 2550—
2554 (1980).
46. Shelley W.B., Juhlin L. Langerhans cells form a reticuloepithelial trap for external contact
antigens, Nature, 261, 46—47 (1976).
26. Реакция гиперчувствительности замедленного типа 169
47. Toews G.BBergstresser P.R., Streilen J .W. Epidermal Langerhans cell density determines
whether contact hypersensitivity or unresponsiveness follows skin painting with DFNB,
J. Immunol., 124, 445—453 (1980).
48. Ptak W., Zembala M., Gershon R.K. Intermediary roly of macrophages in the passage of
suppressor signals between T-cell subsets, J. Exp. Med., 148 , 424 —434 (1978).
49. Perry L.L., Dorf M.E., Bach B.A., Benacerraf B., Greene M.I. Mechanisms of regulation
of cell-mediated immunity: Anti-I-A alloantisera interfere with induction and expression
of T-cell-mediated immunity to cell-bound antigen in vivo, Clin. Immunol. Immunopathol.,
15, 279—292 (1980).
50. Greene M.I., Dorf M.E., Pierres M., Benacerraf B. Reduction of syngeneic tumor growth by
an anti-I-J alloantiserum, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5118—5121 (1977).
51. Cohen S., Benacerraf B., McCluskey R.T., Ovary Z. Effect of anticoagulants on delayed hy-
persensitivity reactions, J. Immunol., 98, 351—358 (1967).
52. Claman H.N. Corticosteroids and lymphoid cells, N. Engl. J. Med., 287, 388—397 (1972).
53. Belsito D.V., Flotte T.J., Lim H.W., Baer R.L., Thorbecke G.L.. Gigli I. Effect of gluco-
corticosteroids on epidermal Langerhans cells, J. Exp. Med., 155, 291—302 (1982).
54. Goto M., Mitsuoka A., Sugiyama M., Kitano M. Enhancement of delayed hypersensitivity
reaction with varieties of anticancer drugs. A common biological phenomenon, J. Exp.
Med., 154, 204-209 (1981).
Глава 27
Медиаторы: высвобождение и функции
Чарльз В. Паркер
(Charles W. Parker)
В состав основных распознающих единиц иммунной системы входят лим-
фоциты, секретируемые ими иммуноглобулины (1g) и связанные с этим процес-
сом продукты жизнедеятельности Т-клеток. Однако в процессе аллергического
повреждения тканей почти всегда активно участвуют и другие циркулирующие
лейкоциты, а также клетки, фиксированные в тканях, в частности моноциты
или макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, тучные клетки, а также
тромбоциты и лимфоциты. Аллергические реакции могут проявляться различ-
ными способами: от а) гиперчувствительности немедленного типа со скоропро-
ходящим пузырем и кожной эритемой, следы которой исчезают через 30—60 мин,
до б) сильного васкулита, приводящего к отчетливому кровоизлиянию и некрозу
с последующим повреждением данного органа — реакция длится несколько дней
и в) хронических гранулем, сопровождающихся выраженными локальными вос-
палениями и фиброзами и длящихся месяцами или годами. Роль указанных
выше клеток в аллергических повреждениях тканей была продемонстрирована
в опытах с элиминацией определенных клеточных популяций цитотоксическими
агентами с использованием антисывороток к компонентам клеточной мембраны,
лизировавших клетки, или использованием животных с врожденным дефици-
том. Оказалось, однако, что элиминация той или иной популяции обычно
бывает неполной или недостаточно избирательной. Поэтому трудно исключить
побочные эффекты, обусловленные взаимодействием между клетками различ-
ных типов.
Хотя в реакциях гиперчувствительности участвуют различные клетки, ча-
сто доминирует один определенный их тип — особенно на самых ранних этапах
реакции или после того как реакция продолжается уже по меньшей мере не-
сколько дней. Ответы при реакции гиперчувствительности замедленного типа
(ГЗТ) Ваксман [1] классифицировал на нейтрофильные, моноцитарные, базо-
фильные, эозинофильные в зависимости от доминирующего или наиболее
явного типов клеток. Это удобная описательная классификация, хотя всегда
важно помнить, что в клеточных инфильтратах никогда не бывает клеток толь-
ко одного типа и что каждая реакция гиперчувствительности — это динамиче-
ский процесс, при котором состав всей клеточной популяции постоянно ме-
няется.
В определении точной роли клеток разного типа в реакции гиперчувстви-
тельности существенную роль сыграли исследования с изолированными кле-
точными популяциями in vitro. Было показано, что клетки каждого типа син-
тезируют характерные наборы продуктов в зависимости от их биосинтетиче-
ских возможностей. Тем не менее, хотя спектр веществ, продуцируемых in
vivo, вероятно, может быть предсказан, клетки могут сильно различаться по
27. Медиаторы: высвобождение и функции
171
пороговой чувствительности и кинетике синтеза, инактивации и биологическому
действию. Локальное окружение в воспалительном очаге представляет собой
сложный комплекс, в котором присутствуют другие клетки и белки сыворотки,
создающие предпосылки важных синергических или антагонистических эф-
фектов, не выявляющихся при исследовании чистых клеточных популяций.
Действительно, одной из главных ролей различных медиаторов может быть
регуляция функций других клеток, участвующих в воспалительном процессе.
Мы можем идентифицировать медиаторы, на которые клетки отвечают, но опре-
делить их относительную роль в процессе регуляции значительно труднее.
Клетки не только действуют друг на друга, они еще представляют собой
объекты, на которые влияют другие, пока плохо изученные локальные и сис-
темные регуляторные воздействия в организме. Некоторые наиболее мощные
стимулы быстро индуцируют клеточную «безответность», затрудняя возможность
детально интерпретировать их эффективность в сложной ситуации [2]. Таким
образом, экстраполировать события in vitro на ситуацию in vivo с достовер-
ностью трудно.
В противоположность широкому набору антигенов, инициирующему спе-
цифический иммунный ответ, количество клеточных типов, способных вызывать
аллергическое воспаление, весьма ограничено; каждый из них характеризуется
набором синтезируемых продуктов, вне зависимости от того, каким был акти-
вирующий их стимул. К примеру, тучные клетки или базофилы могут секрети-
ровать гистамин в ответ на а) антитела типа IgE или IgGx и антиген; б) анафи-
латоксипы СЗа и С5а, продуцирующиеся в ходе альтернативного или класси-
ческого пути активации комплемента; в) лимфокины активированных
Т-лимфоцитов. Таким образом, целый ряд различных специфических и неспе-
цифических иммунологических стимуляторов может приводить к высвобождению
данного медиатора. Как показано на мышах, медиаторы тучных клеток (в дан-
ном случае в основном серотонин) в реакции гиперчувствительности, опо-
средованной клетками, могут играть такую же важную роль, как в реакциях
немедленного типа, хотя эти две реакции различаются и по скорости, и по па-
тологическим признакам [3]. Очевидно, один и тот же медиатор способен вы-
полнять разные иммунологические функции в зависимости от того, где проис-
ходит реакция и на какой стадии процесса данный медиатор функционирует.
Факторы, контролирующие точный характер воспалительных экссудатов
до конца не исследованы, хотя показано, что различные стимуляторы иммун-
ного ответа проявляют значительную избирательность; разные типы клеток
обладают разной скоростью ответа, а некоторые продукты их жизнедеятельно-
сти могут оказывать анти-, а не провоспалительное действие, способствуя тем
самым контролированию силы и продолжительности ответа. Рассматривая раз-
личные типы клеток, осуществляющие эти реакции, следует различать: а) туч-
ные клетки, моноциты или макрофаги — долгоживущие клетки, способные реп-
лицироваться и дифференцироваться in situ; б) нейтрофилы, эозинофилы и базо-
филы — клетки, короткоживущие, не способные к репликации и нуждающиеся
в постоянном замещении новыми клетками из костного мозга. Кроме того, надо
отличать клетки, предсуществующие в ткани и способные реагировать на по-
явление стимулятора более или менее сразу, и клетки, рекрутируемые извне,
вовлекаемые в уже запущенный процесс.
Следующее различие (третье), хотя речь о нем пойдет позднее, можно про-
вести между клетками, чья первичная функция — фагоцитоз и уничтожение
микробов (нейтрофилы и макрофаги), и клетками, быстро секретирующими ва-
зоактивные медиаторы (тучные клетки и базофилы). Медиаторы способствуют
перемещению клеток и белков плазмы, в том числе антител и компонентов
172
Ч. В. Паркер
комплемента, в отвечающие ткани, где они могут участвовать в воспалительном
процессе, а также помогать инициировать поздние фазы ответа.
В дальнейшем обсуждении особое внимание будет уделено различиям меж-
ду клетками, участвующими в воспалительном процессе, с тем чтобы понять
индивидуальную роль этих клеток в развитии бактериальной устойчивости и
репарации ткани. Несмотря на то что различные типы клеток отличаются друг
от друга по морфологии, содержанию медиаторов и динамике их высвобожде-
ния, а также по активирующим их стимулам, их объединяет ряд общих свойств:
а) все они, за исключением тучных клеток, происходят от общих или, по мень-
шей мере, близкородственных костномозговых предшественников; б) рост, миг-
рация и функции этих клеток частично контролируются Т-лимфокинами и в
меньшей степени В-лимфокинами; в) на поверхности клеток расположены оди-
наковые или тесно связанные рецепторы для иммуноглобулина, комплемента
и множества других стимулирующих агентов, создающих общие механизмы
клеточного распознавания; г) у всех клеток быстро меняются мембранный по-
тенциал [4] и способность отвечать сегментарно на локальную стимуляцию кле-
точной поверхности фагоцитозом, секрецией и образованием токсических
метаболитов кислорода; д) все типы клеток продуцируют активированные ме-
таболиты арахидоновой кислоты (АК), ферменты, влияющие на комплемент
и систему свертывания крови, медиаторы или хемоаттрактанты, определяющие
возможные механизмы для самоактивации, межклеточных взаимодействий и
изменений сосудистых реакций; е) клетки содержат гранулы с ферментами,
обладающими гидролазной активностью, способными уничтожать остатки тка-
ней или микроорганизмов внутри и вне клеток; ж) клеточные популяции доста-
точно гетерогенны в функциональном и морфологическом плане для того, чтобы
обеспечивать разнообразие иммунных реакций; з) клетки обладают биохими-
ческими механизмами, участвующими в процессах активации мембран, внутри-
клеточного переноса сигнала, слияния гранул и высвобождения медиаторов;
такие механизмы могут быть или общими для клеток всех типов, или хотя бы
достаточно сходными; это утверждение, впрочем, нуждается в доказатель-
ствах.
Несмотря на сложность воспалительных ответов, они строго регулируются
и, вероятно, среди клеток различных типов существует значительная коопера-
ция и координация. Кооперирование обеспечивается самими медиаторами
воспалительного ответа, что необходимо всегда иметь в виду при применении
в клинике противовоспалительных средств, препятствующих действию медиато-
ров [5]. Кооперация обеспечивается также разнообразием лимфокинов и моно-
кинов, освобождаемых на различных стадиях активации иммунной системы.
Идентифицированы продукты моноцитов и лимфоцитов, влияющие на каждый
тип клеток, изменяющие их пролиферацию, миграцию и свойства клеточной по-
верхности, а также секрецию медиаторов. Все эти продукты обеспечивают
упорядочение и тонкую регуляцию воспалительного ответа. Другой возможный
механизм координации активности клеточных элементов обусловлен существова-
нием общих рецепторов, например для 1g и различных компонентов компле-
мента. Так, в настоящее время очевидно, что рецепторы 1g имеются не только
на тучных клетках и базофилах, но также на макрофагах, а возможно, и на
эозинофилах, хотя их относительное сродство к IgE различно даже в пределах
животных одного вида. Наличие рецепторов IgE обеспечивает механизм, с по-
мощью которого разные клетки более или менее синхронно реагируют на обра-
зование IgE-антител. Участие этих и других рецепторов 1g придает воспали-
тельному ответу иммунологическую специфичность, и постепенно ведущую роль
в развитии этого ответа приобретает природа антигенного стимула.
27. Медиаторы: высвобождение и функции
173
Схематически нейтрофилы, базофилы, эозинофилы и моноциты можно рас-
сматривать как подвижные носители медиаторов воспаления, обладающие соб-
ственными поверхностными распознающими механизмами. Поскольку эти клет-
ки приходят в очаг воспаления главным образом из других мест и являются не-
обходимыми элементами процесса, то наряду с вопросами о природе медиаторов
и механизмах активации требуется рассматривать вопрос о том, где эти клетки
возникают и как регулируются их образование и миграция. Подробное обсуж-
дение этих вопросов выходит за рамки настоящей главы, однако мы вкратце
опишем свойства этих клеток и способы их активации, а затем перейдем к рас-
смотрению собственно медиаторов.
27.1. Нейтрофилы
Нейтрофилы имеют ряд характерных черт. Это присутствующие в большом
количестве подвижные, короткоживущие клетки, способные к хемотаксису
и фагоцитозу. В результате стимуляции поверхности нейтрофилов в них про-
исходит всплеск окислительных реакций и накапливается большое количество
метаболитов и гидролитических ферментов [6—12], уничтожающих микроор-
ганизмы как в клетках, так и вне их, а также разрушающих остатки тканей.
При большинстве форм острого воспаления, особенно на ранних его стадиях,
нейтрофилы составляют основную часть клеточных элементов. О важной роли
этих клеток в воспалительном процессе свидетельствуют опыты, в которых ней-
трофилы уничтожали введением животным азотного аналога иприта и
антинейтрофильной сыворотки, а животных подвергали воздействию агента, вы-
зывающего воспаление. В результате, подавлялись такие реакции гиперчувстви-
тельности, как феномен Артюса, острый нефротоксический нефрит, генерализо-
ванная реакция Шварцмана, системная агрегированная анафилатаксия, сыво-
роточные заболевания сосудов и гломерулонефрит [7].
Фагоцитоз у нейтрофилов представляет собой процесс, в котором последо-
вательно происходят прикрепление частицы к поверхности, инвагинация этой
части поверхности, замыкание ее вокруг частицы и образование фагоцитарного
пузырька (фагосомы) [10]. Затем фагосома перемещается внутри клетки, и в ре-
зультате слияния ее с внутриклеточными гранулами создаются благоприятные
условия для ферментативного разрушения частицы. Этот процесс несколько
видоизменен в макрофагах, где клеточные псевдоподии способны выдвигаться
наружу и окружать фагоцитируемую частицу до того, как начинается переме-
щение внутрь клетки. Независимо от точной последовательности событий, про-
исходящих на клеточной мембране процесс фагоцитоза требует затраты метабо-
лической энергии, наличия системы сократительных белков и, возможно,
микротрубочек. Однако природа истинного инициатора реорганизации и интер-
нализации клеточной мембраны до сих пор неясна. Фагоцитоз облегчается нали-
чием в среде ионов Са2+ и Mg2+, но некоторая интернализация мембраны на-
блюдается и в отсутствие в среде двувалентных катионов [7]. Лейкоциты отли-
чаются от других клеток млекопитающих тем, что в них содержится мало
митохондрий, и поэтому в этих клетках миграция и поглощение частиц сравни-
тельно слабо зависят от кислорода [11]. Тем не менее, поскольку уничтожение
микроорганизмов зависит от метаболитов кислорода, интенсивность этого про-
цесса часто понижается, когда окислительные процессы ограничены.
Бактерии, особенно полностью инкапсулированные, могут иметь поверх-
ность, к которой клетки трудно прикрепляются, что делает их устойчивыми
к фагоцитозу, повышая в результате их вирулентность. В таком случае специ-
174
Ч. В. Паркер
фические антитела и компоненты комплемента могут покрывать поверхность
бактерий и облегчать прикрепление их к фагоцитирующим клеткам, существен-
но облегчая поглощение таких бактерий. Опосредованная антителами опсони-
зирующая активность свойственна в основном фракции IgG — в частности
IgGr и IgG3- подклассам [7, 13]. Согласно большинству данных, IgA, IgM,
IgE и IgD в основном или частично лишены опсонирующей активности для
нейтрофилов. Антитела, ускоряющие интернализацию клеточной мембраны,
взаимодействуют с бактериями с помощью специфических участков в Fab-об-
ластях, одновременно прикрепляясь к поверхности нейтрофилов через Fc-
фрагменты. Аффинность поверхностных рецепторов нейтрофилов к мономер-
ному IgG сравнительно низка; она существенно повышается, если IgG агреги-
рован с растворимым и особенно с поливалентным антигеном [7]. Перекрестное
сшивание молекул IgG необходимо также для модуляции клеточной поверх-
ности, приводящей к ее активации. В опсонизации большую роль играют также
компоненты комплемента, особенно СЗЬ. Прикрепление СЗЬ к поверхности мик-
роорганизма ускоряет связывание его с нейтрофилами, но не поглощение
ими бактерий [14]. В присутствии ферментов сыворотки СЗЬ превращается в
СЗс и C3d. Поскольку рецепторы для C3d в нейтрофилах отсутствуют, после
частичной деградации СЗЬ связывания с поверхностью не происходит. Опсони-
зирующая активность обнаружена также у фрагментов С4 и С5. Фрагменты
комплемента не только улучшают связывание частиц с поверхностью; ряд
фрагментов — СЗа, С5а (см. ниже), СЗЬ [15] и Cis [16], могут непосредственно
влиять на окислительный метаболизм нейтрофилов или слияние гранул. Не
исключено, однако, что в случае СЗЬ [14] и, может быть, Cis эффект обусловлен
присутствием в препарате примеси IgG. В отличие от СЗЬ агрегированные IgG
ускоряют как адгезию, так и переваривание.
Кроме рецепторов IgG и СЗЬ, нейтрофилы содержат также рецепторы для
пептида F-Met-Leu-Phe (ФМЛФ), С5а, СЗа и лейкотриена В4 (ЛТ-В4), обуслов-
ливающие чувствительность к широкому спектру активаторов. На все или боль-
шинство из них клетки обычно дают вначале максимальный ответ, но быстро
теряют чувствительность к дальнейшей активации. Подобное снижение реак-
тивности специфично или частично специфично в отношении активирующих
лигандов. Чтобы объяснить явление, было предложено множество механизмов:
слущивание или интернализация рецептора, гидролиз или инактивация лиган-
да, нарушение связи между рецептором и системой внутриклеточных ферментов,
истощение внутриклеточных медиаторов или, наконец, индуцированное изме-
нение структуры рецептора, влияющее на его связывающую способность. По
предварительным данным, требующим, однако, дальнейшего подтверждения,
рецепторы для ФМЛФ [17] и СЗЬ [18] существуют не только на поверхности
клетки, но и в специфических гранулах. Большая часть изменений, наблюдае-
мых в активированных нейтрофилах, включает в себя движение клетки или ее
мембраны и переориентацию.
В недавних исследованиях на альвеолярных макрофагах легких кролика
и тромбоцитах человека [19—21] было показано, что в изменениях функций
плазматической мембраны в мигрирующих и фагоцитирующих нейтрофилах
участвует актомиозиновая система. Был выделен белок — гельзолин, мол. мас-
са 90 кДа, чувствительный к ионам Са2+, и этот белок в комбинации с кофакто-
ром связывается и обратимо укорачивает актиновые филаменты. В бесклеточной
системе это взаимодействие индуцирует переход золя в гель, подобный тому,
который наблюдается вблизи поверхности фагоцитирующих клеток или тром-
боцитов во время изменения миграции клеток, фагоцитоза или агрега-
ции.
27. Медиаторы: высвобождение и функции
175
Стимуляция поверхности нейтрофила, сопровождаемая или не сопровож-
даемая действительным поглощением частицы, обычно связана со значительным
увеличением метаболической активности, иногда называемым метаболической
или дыхательной вспышкой [9]. Потребление кислорода при этом может повы-
шаться в несколько раз. Наблюдается также излучение света (хемилюминес-
ценция) и значительное повышение окисления глюкозы через гексозомонофос-
фатный путь [11]. Активаторами метаболической вспышки могут служить кон-
канавалин А (Кон А), ФМЛФ (FMLP), NaF, форболмиристатацетат (ФМА),
С5а, ионофор А-23187, активированные сывороткой частицы зимозана, частицы
латекса, а также различные микроорганизмы, покрытые соответствующими оп-
сонинами. Увеличенное потребление кислорода проявляется через секунды,
длится несколько минут, а затем прекращается [9, 22]. Как будет указано ниже,
вопрос о том, что весь или почти весь дополнительно поглощенный кислород
превращается сначала в супероксид (НО2‘) или его анион (О*). Одновременная
активация ионами Са2+ фосфолипазы и 5-липоксигеназы, возможно, является
одним из наиболее ранних изменений, так как некоторые продукты 5-липокси-
геназы стимулируют агрегацию клеток, их миграцию и высвобождение низких
концентраций ферментов, а некоторые ингибиторы липоксигеназы эти процессы
подавляют [23, 24]. Кроме того, продукты деятельности фермента сами по себе,
могут стимулировать транспорт ионов Са2+ [25, 26].
В нейтрофилах внутриклеточные гранулы подразделяются на два основных
типа [7]. Первичные, азурофильные, гранулы содержат набор разнообразных
гидролаз, в том числе: а) кислые протеиназы, соответствующие катепсинам
A, D, Е; б) а-фукозидазу; в) 5’-нуклеотидазу; г) ^-галактозидазу; д) арилсуль-
фатазу; е) а-маннозидазу; ж) N-ацетил-р-глюкозоаминидазу; з) р-глюкурони-
дазу; и) кислую fi-глицерофофатазу; к) нейтральные протеиназы, соответствую-
щие катепсину G, эластазе и коллагеназе; л) катионные белки; м) миелоперокси-
дазу; н) лизоцим; о) кислые мукополисахариды. Специфические или вторичные
гранулы содержат: лактоферрин, щелочную фосфатазу, белок, связывающий
витамин В12, лизоцим и, возможно, коллагеназу. Большинства обычных гидро-
лазных ферментов в них нет. Учитывая содержимое гранул обоих типов, можно
заметить, что набор этих ферментов достаточен для деградации многих или всех
липидов, полисахаридов и белков чувствительных бактерий, часто приводящей
к значительной деструкции, за считанные часы. Эти ферменты могут действо-
вать как внутри клетки, так и вне ее. Если фермент функционирует внутри
клетки, частица, например бактерия, доставляется в клетку фагосомой. При
продвижении содержащей частицы фагосомы внутрь клетки она сливается с азу-
рофильными и специфическими гранулами и образует фаголизосому; при этом
частица, содержащаяся в фагосоме, подвергается действию ферментов и других
веществ, находившихся в гранулах. В случае особенно сильных фагоцитарных
стимулов большинство гранул может исчезать, однако никогда не исчезают од-
новременно все гранулы [10]. Очевидно, гранулы формируются в аппарате
Гольджи на промежуточной стадии развития в костном мозге. Регенерация
гранул невозможна, поскольку зрелые гранулоциты не способны к синтезу
новых белковых молекул. Слияние фагосом со специфическими гранулами про-
исходит всего через 30 с после начала фагоцитоза, тогда как слияние с азуро-
фильными гранулами можно наблюдать лишь через 1—3 мин [7]. Многие из
ферментов специфических гранул наиболее активны при нейтральном или ще-
лочном pH, тогда как большинство ферментов азурофильных гранул наиболее
активны при кислых значениях pH. Таким образом, последовательность стадий
слияния гранул обеспечивает такие условия, при которых деятельность пере-
варивающих ферментов протекает с наибольшей эффективностью. Аналогичная
176
Ч. В. Паркер
последовательность проявляется и при высвобождении содержимого специфи-
ческих и азурофильных гранул в среду; продукты азурофильных гранул высво-
бождаются медленнее.
Высвобождение из клетки гранулярных ферментов легче всего наблюдать
при усиленном фагоцитозе, когда вновь фагоцитируемые частицы попадают в
уже сформированную фаголизосому [10]. Изучение высвобождения содержи-
мого гранул в среду часто проводят в присутствии цитохалазина В; при этом
нейтрофилы превращаются в клетки с низкой фагоцитирующей активностью,
легко высвобождающие продукты гранул в среду. Тем не менее высвобождение
гранулярных ферментов можно наблюдать и без цитохалазина В — под влия-
нием самых различных частиц. К числу наиболее эффективных стимулов отно-
сятся содержащие молекулы IgG крупные комплексы антигена с антителом,
полученные в зоне эквивалентности. Одна из интересных особенностей систем,
возможно, имеющих физиологическое значение,— отложение комплекса анти-
ген—антитело на мембранах или на мембраноподобных поверхностях [27].
В такой системе высвобождение ферментов происходит вне зависимости от фаго-
цитоза, причем наблюдается выброс самих гранул из клетки в область локаль-
ного стимула, как это бывает при активации тучных клеток. Кроме иммунных
комплексов высвобождение гранулярных ферментов и нейтрофилов вызывают
также различные гуморальные агенты [7, 11, 27—29], в том числе факторы СЗа,
С5а, формилметиониловые олигопептиды, моно- и дигидроксиэйкозатетраено-
вые кислоты (ГЭТЕ), ионофор двухвалентных катионов А23187, активаторы
свертывания крови, лимфокины, лейкоцитарные пирогены. Многие из этих аген-
тов вызывают также хемотаксис и агрегацию нейтрофилов. Все эти различные
стимуляторы оказывают свое действие через разные поверхностные рецепторы.
Обычно можно наблюдать специфическую в отношении стимулятора десенсиби-
лизацию ответа [30].
Высвобождение ферментов из специфических гранул происходит в целом
с большей интенсивностью, чем из азурофильных гранул [7]. Поскольку специ-
фические гранулы сливаются с фагосомами быстрее, чем азурофильные, повы-
шается вероятность освобождения содержимого этих гранул в развивающуюся
фагосому до ее полного замыкания (извержение во время поглощения). В таких
условиях содержимое гранул появляется не только в самой фагосоме, но и в
среде. Хотя большинство стимулов вызывает одинаковое высвобождение фер-
ментов из специфических и азурофильных гранул, среди них есть и такие, кото-
рые индуцируют специфические гранулы, например Кон А, ионофор А23187,
ФМА [7, 10].
Среди различных биохимических регуляторных механизмов, вовлеченных
в регуляцию высвобождения ферментных гранул и агрегации клеток, особого
внимания заслуживают циклические нуклеотиды. Исследования, проведенные
в ряде лабораторий, показали, что различные соединения, повышающие в ней-
трофилах содержание циклического аденозинмонофосфата (сАМР) — [1-адрен-
эргические агонисты, гистамин, теофиллин, холерный энтеротоксин, проста-
гландины Е,— угнетают также процесс высвобождения гранулярных фермен-
тов [12, 27, 31, 32]. С другой стороны, нет уверенности в том, что сАМР являет-
ся физиологически или фармакологически важным регулятором процесса
высвобождения ферментов, поскольку повышение концентрации его незначитель-
но, процесс требует сравнительно высоких доз стимуляторов и часто снижение
уровня высвобождения ферментов бывает не очень сильным. Кроме того, не-
давно было показано, что иммунные комплексы, ионофор А23187, ФМЛФ и
фактор С5а (но не Кон А или ФМА) очень быстро повышают содержание сАМР
и облегчают ответ сАМР на простагландины, несмотря на то, что они являются
27. Медиаторы: высвобождение и функции
177
потенциальными стимуляторами высвобождения ферментов [33—37]. Посколь-
ку эти стимуляторы усиливают секрецию ферментов как из азурофильных, так
и из специфических гранул, можно предположить, что сАМР непосредственно
участвует в секреции, по крайней мере в случае азурофильных гранул.
Особый интерес представляет возможная роль циклического гуанозинмоно-
фосфата cGMP в процессе высвобождения ферментов; по некоторым сообщениям
в стимулированных нейтрофилах содержание cGMP повышается в 50 раз [38],
а, кроме того, холинэргические агонисты и другие агонисты cGMP (например,
ФМА и ПГ-Р2а) улучшают секрецию ферментов [38, 391. Тем не менее в других
работах данные о столь существенном повышении концентрации cGMP не
подтвердились. Не исключено, что cGMP играет какую-то роль на субклеточ-
ном уровне и что эта роль окажется очень важной, однако пока что никаких
убедительных данных о значении cGMP как важного модулятора не имеется.
В нейтрофилах содержится очень много различных нейтральных и кислых
протеиназ, которые, действуя совместно, могут разрушать эластин, коллаген
и различные другие белки, активировать комплемент, образовывать кинины
из различных кининогенов, а также повышать проницаемость сосудов [7, 40,
41]. Эти ферменты в основном или целиком локализованы в азурофильных
гранулах и обеспечивают способность нейтрофилов переваривать или повреж-
дать ткани. Ферменты образуются на промежуточных стадиях созревания
нейтрофилов, а затем поступают в гранулы, где и хранятся после выхода
клеток из костного мозга [42]. Наиболее важными протеиназами с точки зре-
ния их действия вне клетки, по-видимому, являются нейтральные протеиназы
(катепсин G, эластаза, коллагеназа, фермент, конвертирующий ангиотензин);
это связано, по-видимому, с относительно нейтральным pH внеклеточной среды.
Большая часть протеиназ полиморфноядерных лейкоцитов находится, по-ви-
димому, в гранулах в основном в активной форме [40], хотя не исключено, что
некоторая их активация происходит во время выделения гранул.
Среди различных клеток, участвующих в воспалительной реакции, ответ-
ственность за первичные изменения проницаемости сосудов несут, по-видимо-
му, тучные клетки и базофилы. Существенное значение в этом отношении
имеют также нейтрофилы, поскольку они содержат протеолитические ферменты
и вазоактивные липиды. К соединениям, участвующим в воспалительном отве-
те, относятся СЗа, С5а, гистамин, действующий через СЗа и С5а, лейкотриены,
тромбоксан А2, кинины и ангиотензин II — все эти вещества могут, по-види-
мому, принимать участие в процессах изменения сосудистой проницаемости.
Основные метаболиты арахидоновой кислоты, продуцируемые нейтрофила-
ми,— простагландин Е2 (ПГ-Е2), 5-ГЭТЕ и ЛТ-В4, хотя в этих клетках обра-
зуются также в небольшом количестве ЛТ-С4 и, возможно, тромбоксан А2 [24,
43—46]. Тем не менее в пересчете на одну клетку нейтрофилы производят этих
продуктов значительно меньше, чем моноциты, и ответ относительно короток;
он длится лишь 10—45 мин. Некоторые нейтрофильные системы синтезируют
фактор, активирующий тромбоциты (ФАТ),— способность, в значительной
степени зависящая от вида животных [47]. Нейтрофилы содержат также фер-
менты, разрушающие ЛТ-В4, ЛТ-С4 и ЛТ-П4 (см. разд. 27.5.7. о метаболитах
арахидоновой кислоты).
Помимо вазоактивных липидов в нейтрофилах имеются ферментативные
системы, производящие мощные вазоактивные и хемотаксические пептиды. На-
пример, в нейтрофилах животных обнаружена сериновая протеиназа, превра-
щающая ангиотензиноген плазмы в ангиотензин II [48]. Этот белок, по-видимо-
му, идентичен катепсину G [49]. Ангиотензин представляет собой вазоактивный
октапептид, обнаруживаемый при системной артериальной гипертонии, ассо-
178
Ч. В. Паркер
циированной с хронической почечной артериальной ишемией. Возможно
также, что он участвует в процессе хронического гранулематозного воспаления
(см. ниже). Ангиотензин II сужает кровеносные сосуды, повышает кровяное
давление и регулирует образование альдостерона.
Нейтрофилы содержат также низкомолекулярные катионные полипептиды
(мол. масса 4000—8000 Да) и катионные белки, часть из которых обладает
трипсиноподобной протеолитической активностью [7, 40—52]. Эти и, возможно,
другие катионные белки облегчают высвобождение вазоактивных аминов, в том
числе гистамина, из тучных клеток и тромбоцитов, и вызывают необратимую
агрегацию тромбоцитов [7]. Многие протеиназы нейтрофилов действуют также
на систему комплемента, превращая СЗ и С5 в СЗа и С5а соответственно [53, 54].
Неочищенные лизаты гранул содержат активность, по-видимому, отличную от
трипсина и влияющую на альтернативный путь активации комплемента, в ко-
тором СЗЬ и С5Ь образуются под действием эластазы, а СЗЬ — под действием
коллагеназы нейтрофилов [54].
И нейтральные, и кислые протеиназы нейтрофилов принимают участие в об-
разовании кинина, а кинины влияют на сократимость и проницаемость мелких
кровеносных сосудов [40, 55]. Под действием кислой протеиназы образуется се-
рия олигопептидов, состоящих из 20—25 членов (лейкокинины), отличных от
брадикинина [55]. Действие нейтральной протеиназы направлено на белок
плазмы, отличный от кининогена; при этом образуются другие кинины [40].
До сих пор не удается доказать участие кининов в воспалительных процессах
in vivo, однако все же есть основание считать, что они играют важную роль в
этом процессе, особенно когда ответ длится часами.
Нейтрофилы не только участвуют в процессах воспаления, но могут также
в конечном счете помогать контролировать действие вазоактивных медиаторов
и комплемента. Если образуются активированные фрагменты комплемента, то
последующее действие гранулярных протеиназ может вести к разрушению
СЗа и С5а, что в свою очередь может помочь контролировать дальнейшую реак-
тивность клеток [51]. Ферментами нейтрофилов разрушаются также компонен-
ты С4 и Cis. Интересно, что ферменты, катализирующие образование фактора
С5а, находятся главным образом в специфических гранулах, а ферменты, инак-
тивирующие этот фактор,— в азурофильных гранулах [56]. Это обеспечивает
механизм быстрого образования и последующего разрушения С5а. Грануло-
циты содержат также и ингибитор высвобождения гистамина [57] и гистамина-
зу, разрушающую внеклеточный гистамин путем его окисления [15, 58].
Ферменты нейтрофилов способны, благодаря тромбопластиноподобной
активности либо активировать свертывание крови, либо стимулировать лизис
фибрина [59, 60]. Тромбопластиноподобная активность стимулирует высвобож-
дение вазоактивных аминов из тромбоцитов [611 и вызывает образование тром-
бина (и, в конечном счете, превращение фибриногена в фибрин). Исследования
in vivo выявили важную роль нейтрофилов в отложении фибрина при генерали-
зованной реакции Шварцмана [62]. Гранулярные катионные белки могут
влиять на свертывание крови, либо проявляя присущую им антикоагулянтную
активность, либо нейтрализуя гепарин путем ионных взаимодействий [63].
Ферменты нейтрофилов могут также влиять на свертывание крови, расщепляя
фибриноген или отщепляя пептиды фибрина или фибриногена, подавляющие
свертывание путем конкуренции [60]. Фибринолиз вызывается как прямым
протеолизом, так и активацией плазминогена. Лейкоциты человека, по-види-
мому, содержат и активатор плазминогена, и белок, сходный или идентичный
плазминогену плазмы [7].
27. Медиаторы: высвобождение и функции
179
В азурофильных гранулах нейтрофилов и моноцитов содержится также
миелопероксидаза (МПО) — гемопротеин с мол. массой 150 кДа; этот фермент
катализирует окисление ионов галидов (в особенности 1~) до гипогалитов [7].
В сочетании с Н2О2 и галидами, особенно иодидом и бромидом, МПО токсична
для различных клеток, в том числе для микроорганизмов, опухолевых клеток,
нормальных эритроцитов, тромбоцитов и других лейкоцитов. К микроорганиз-
мам, поражаемым МПО, относятся различные бактерии, грибы, вирусы и мико-
плазма. Хотя фагоцитирующие клетки обычно продуцируют пероксид водорода
(Н2О2), бактерии, не продуцирующие каталазы, способны вырабатывать до-
статочное количество Н2О2 для собственного разрушения [42]. Гипогалит ток-
сичен для бактерий даже в концентрации 50 мкМ. Цитотоксичность системы
МПО-Н2О2-галид может объясняться различными механизмами. Если окис-
ляемым галидом является иодид, то повреждение может быть вызвано прямым
иодированием; если в реакции участвует хлорид, то галогенизация в виде основ-
ного механизма, по-видимому, исключается. В таком случае токсичность час-
тично объясняется присутствием синглетного О2. Система МПО также декарбо-
ксилирует аминокислоты, причем настолько эффективно, что чувствительные
микроорганизмы погибают в течение нескольких минут [42]. Продукты окисле-
ния системы МПО могут также вызывать высвобождение вазоактивных аминов
из тромбоцитов и тучных клеток [64]. МПО обладает также рядом других
функций, например она инактивирует окислением хемотаксические олигопеп-
тиды, содержащие метионин [64].
Другим важным ферментом нейтрофилов, играющим, по-видимому, опре-
деленную роль в развитии устойчивости к бактериальной инфекции, является
лизоцим. Лизоцимы — это ферменты, растворяющие различные компоненты
клеточной стенки бактерий [7]. Эти ферменты обладают способностью разрывать
гликозидные связи (в том числе связи 01—4) между N-ацетилглюкозамином и
N-ацетилмурамовой кислотой, что ведет к лизису клеточных стенок микро-
организмов [65], а также и к существенному воздействию на мембраны клеток
млекопитающих.
Специфические гранулы нейтрофилов содержат лактоферрин — белок с
мол. массой 90 кДа, в котором имеется два участка связывания железа. Этот
белок высвобождается во внеклеточное пространство вместе с другими фермен-
тами гранул [66—68]. Хотя вначале предполагалось, что лактоферрин оказывает
прямое бактериостатическое действие, оказалось, что очищенные препараты
белка этим свойством не обладают. Как будет сказано ниже, железо, связанное
с лактоферрином, может играть определенную роль в генерации ОН' из О2
и Н2О2.
27.2. Моноциты и макрофаги
Моноциты (макрофаги) отличаются высокой фагоцитарной активное тью.
Это долгоживущие в тканях клетки, обладающие способностью к локал ьной
дифференцировке и к специфическому взаимодействию с лимфоцитами, ус или-
вающему ответ на антиген. Разнообразные продукты этих клеток (монок ины)
действуют на многие клетки других типов [42, 69—74]. Моноциты могут со дей-
ствовать как воспалительному, так и противовоспалительному процес сам;
обычно это преобладающий элемент в очагах воспаления после первых 8— 12 ч.
Хотя некоторые из наиболее важных функций моноцитов и макрофагов свя заны
с их взаимодействием с лимфоцитами и фибробластами, они могут также в ызы-
вать созревание предшественников лейкоцитов, действовать на систему ком пле-
180
Ч. В. Паркер
мента, свертывание крови, обмен кининов, служить основными источниками
метаболитов арахидоновой кислоты, а также оказывать токсическое действие
на опухолевые клетки и микроорганизмы.
Макрофаги, без сомнения, играют важную роль в устойчивости организма
хозяина к микроорганизмам. Подобно нейтрофилам, макрофаги обладают вы-
сокой фагоцитирующей активностью, значительной подвижностью и способ-
ностью образовывать токсические метаболиты О2 и наборы мощных гидролити-
ческих ферментов; от нейтрофилов макрофаги отличаются продолжительностью
жизни, способностью дифференцироваться in situ, медленной и длительной ре-
акцией на внешние стимулы, способностью использовать фаголизосомы повтор-
но и секрецией нелизосомных белков 174]. Способность к пиноцитозу у макро-
фагов также выше, чем у нейтрофилов: за один час они могут поглощать путем
пиноцитоза до 25% своего клеточного объема [42, 74]. Распределение ферментов
в гранулах макрофагов также отличается от такового в гранулах нейтрофилов;
несмотря на то что после длительной стимуляции поверхности клетки не спо-
собны вновь синтезировать гранулы, они все еще способны производить и сек-
ретировать ферменты, изначально содержавшиеся в этих гранулах [74]. Нако-
нец, макрофаги способны быстр® реконструировать плазматическую мембрану,
в значительной степени используя первоначальную плазматическую мембрану
фагосом. Несмотря на эти различия, между нейтрофилами и макрофагами су-
ществует определенное сходство, главным образом в характере их бактерицид-
ного действия [75], включающего интернализацию микроорганизмов, слияние
фагосом с лизосомами и активацию метаболитов кислорода при уничтожении
микроорганизмов. Важность слияния фаго- и лизосом была показана на при-
мере таких бактерий, как Mycobacterium tuberculosis, М. leprae, Lysteria
monocytogenes, длительно сохраняющих жизнеспособность внутри клеток
[74]. Эти организмы содержат факторы, угнетающие слияние фагосом с
лизосомами, что, по-видимому, имеет важное значение для их длительной
персистенции в клетке.
Изучению дифференцировки моноцитов в макрофаги посвящено очень
много работ; помимо описанных выше изменений в самих макрофагах, которые
приводят к усилению их антибактериальной активности, между моноцитами
и макрофагами было обнаружено много количественных различий. Прежде все-
го, эти клетки различаются по относительной ферментативной активности и
способности к фагоцитозу. В процессе дифференцировки моноцитов в макрофа-
ги исчезают азурофильные гранулы, содержащие пероксидазу. В результате
становятся более заметны лизосомы, содержащие гидролитические ферменты
[71, 76]. Макрофаги отличаются от моноцитов также наличием на поверхности
большего числа рецепторов для иммуноглобулинов и комплемента. Кроме того,
в электронном микроскопе поверхность макрофагов представляется более склад-
чатой.
В активации макрофагов, прикреплении частиц к поверхности и фагоцитозе
большую роль играют, как и в нейтрофилах, поверхностные белки, способные
связывать Fc-фрагменты различных подклассов IgG и компонента СЗЬ. Так,
антитела к пероксидазе хрена повышают скорость фагоцитоза этого белка мак-
рофагами в 4000 раз [771. У человека IgG-антитела, ускоряющие фагоцитоз,
относятся главным образом к подклассам IgGj и IgG3 [78]. Как и в случае ней-
трофилов, у макрофагов СЗЬ сам по себе не повышает скорости фагоцитоза, но
ускоряет прикрепление частиц к поверхности и заметно снижает число моле-
кул IgG, необходимых для эффективного поглощения [73]. Макрофаги сходны
с нейтрофилами также и в том отношении, что связывание IgG с клеточными
рецепторами существенно увеличивается, если молекулы IgG агрегированы;
27. Медиаторы: высвобождение и функции
181
это обеспечивает избирательное связывание комплексов антиген—антитело
даже в присутствии избытка мономерного иммуноглобулина IgG [79].
В одной из ранних работ сообщалось, что количество рецепторов на по-
верхности макрофагов, связывающих агрегированные молекулы IgG, состав-
ляет два миллиона на клетку [80]. В другой работе, посвященной связыванию
IgG с макрофагами кролика, было показано, что после однократной инъекции
животному адъюванта Фрейнда количество участков, связывающих IgG, до-
стигает 1,2-10® на клетку и повышается до 2,2-10® после нескольких введений
адъюванта [81]. Количество рецепторов на мышиных макрофагах для Fc..-участ-
ков оказалось равным (1—4)-105 на клетку для мономерных молекул IgG2a
и (5—9)-105 для агрегированных молекул IgG из того же препарата [82]. Опре-
деление Л'асс Для связывания агрегированных молекул IgG дало величину
(0,7—2,4)-10-7 моль-1 при 37 °C. В дальнейших исследованиях были получены
сходные оценки количества рецепторов и их аффинности к IgG для макрофагов
из разных источников [79, 83—86]. Работы, проведенные на макрофагах и IgG
человека показали, что первичный участок узнавания находится на СЗ-домене
фрагмента Fc молекулы иммуноглобулина, однако максимальное связывание
иммуноглобулина с клеткой достигается лишь при участии еще и С2-домена
[85]. По мере увеличения размера комплекса, агрегированного IgG, возрастает
и сродство к нему мышиных макрофагов линии P388Dj; что происходит, по-ви-
димому, благодаря одновременному связыванию многих молекул IgG комплек-
са с различными рецепторами [79]. По мере того, как комплексы связываются
с клеткой, они могут или агрегировать далее, или подвергнуться интернали-
зации [84] и индуцировать сборку рецепторов в кластеры, что уменьшает веро-
ятность диссоциации комплекса от клетки. Поскольку процесс связывания комп-
лекса с клеткой зависит от плотности распределения рецепторов на поверх-
ности, при увеличении этой плотности существенно увеличивается и связыва-
ние. Макрофаги мыши содержат на своей поверхности Fc-рецепторы IgG двух
основных классов. Одни рецепторы (с мол. массой 67 кДа) чувствительны к
трипсину и узнают мышиные IgG2a. Такие рецепторы обеспечивают связывание
> частиц с поверхностью, но не влияют на поглощение этих частиц. Другие (с мол.
массой 52 кДа) узнают IgGl и IgG2b; эти рецепторы также чувствительны к
действию трипсина и способны обеспечивать и связывание частиц, и их погло-
щение [73, 86, 87]. Недавно был описан и третий класс рецепторов, связываю-
щих мышиные IgG3 [88]. У некоторых макрофагов имеется еще четвертый класс
рецепторов, обладающих специфичностью к е-цепи IgE [89, 90]. 80% макрофа-
гов легких крысы или мыши способны связывать гомологичный IgE [90]. Ки-
нетические исследования реакции связывания IgE с мышиными макрофагами
P388Dj показали, что Кясс этой реакции составляет 7,7-10® М-1, а количество
рецепторов достигает 330 000 на клетку. Как было недавно показано, IgE от-
дельно или в комплексе с растворимыми антигенами может так активировать
нормальные макрофаги, что они становятся цитотоксическими для шистосомул
[91]; отсюда напрашивается вывод, что в процессе уничтожения микроорга-
низмов рецепторы IgE могут играть такую же роль, как и рецепторы IgG.
Вопрос о том, происходит ли солюбилизация различных Fc-рецепторов мак-
рофагов и участвуют ли они в регуляции иммунного ответа в клетках других
типов, подобно тому, как это предполагается для Fc-рецепторов Т-клеток [921
или полиморфноядерных лейкоцитов [931, остается пока открытым.
Рецепторы 1g мыши — IgGj, IgG2a и IgG2b, представляют собой одноце-
почечные гликопротеины с мол. массой от 50 до 70 кДа [86, 94]. Интересно, что
рецептор СЗЬ на альвеолярных макрофагах кролика и Есе-рецептор IgE на ба-
зофильных лейкемических клетках крыс (RBL-1) имеют сходные молекулярные
182
'/. В. Паркер
свойства [95, 96], что может свидетельствовать о структурной гомологии и об-
щем эволюционном происхождении.
Как уже отмечалось, альвеолярные макрофаги кроликов содержат тем
больше рецепторов для агрегированных IgG, чем большее количество раз
кроликам вводили полный адъювант Фрейнда. Такая видимая индукция ре-
цепторов IgG представляет собой общее свойство макрофагов, лимфоцитов и туч-
ных клеток и отражает их способность изменять экспрессию Fc-рецепторов.
Индукция (или видимая индукция) экспрессии поверхностных рецепторов была
обнаружена также и в случае Fc-рецепторов для IgEj на макрофагах крыс и
мышей [89], для IgA, IgGb IgG2, IgG3 и IgE на T- и В-клетках мышей [97], для
IgE и IgA на моноцитах, Т- и В-клетках человека [98—103], а также, косвенно,
для Рсе-рецепторов базофилов человека [104]. Интересно, что в отличие от эндо-
кринной системы, где под влиянием высоких концентраций гормонов количест-
во рецепторов уменьшается (регуляция по типу обратной связи), в случае
Fc-рецепторов большие концентрации 1g или их Fc-фрагментов как in vivo, так
и in vitro повышают количество рецепторов [105]. В результате увеличения ко-
личества поверхностных рецепторов сохраняется способность к ответу на спе-
цифические антитела, содержащиеся в сыворотке в низкой концентрации, даже
в присутствии высоких концентраций иммуноглобулинов того же изотипа, кон-
курирующих с этими антителами за связывание.
До сих пор неясны биохимические основы изменения количества рецепто-
ров Fc в этих разных системах. Было показано, что и эндогенный, и экзогенный
сАМР (но не cGMP) усиливает экспрессию Fc-рецепторов на клетках мышиной
пре-В-клеточной лимфомы [106]. Различные вещества, повышающие содержа-
ние сАМР, вызывают дифференцировку предшественников Т- и В-клеток.
Однако, поскольку при этом не индуцируются другие мембранные белки (1а,
IgG или IgM), то увеличение количества Рс7-рецепторов на клетках лимфомы
не сопровождается общей дифференцировкой per se. В отличие от результатов,
полученных на пре-В-клетках, экспрессия Fc-рецепторов на зрелых макрофа-
гах морских свинок индуцируется cGMP и угнетается сАМР [107]. При стиму-
ляции тучных клеток IgE или антигеном происходит фосфорилирование рецеп-
торов IgE [108]: возможно, это отражает роль сАМР в индукции, однако никак
не коррелирует с повышенным синтезом рецепторного белка.
В экспрессии и функционировании Fc-рецепторов необходимо также учи-
тывать роль метаболитов арахидоновой кислоты. Недавними исследованиями
было показано, что препарат солюбилизированных Б’с72Ь-рецепторов (но не
Ес?2а-рецепторов мышиных макрофагов P388D обладает активностью фосфоли-
пазы А2, стимулируемой агрегированным IgG2b; эта активность сохраняется
даже после тщательной очистки с помощью аффинной хроматографии [109].
В соответствии с этими данными при стимулировании целых клеток агрегиро-
ванным IgG2b (но не IgG2a) увеличивается синтез продукта циклооксигеназы
(ПГ-Е3) [110]. Эти наблюдения представляют существенный интерес, поскольку
они свидетельствуют о том, что по меньшей мере один тип Fc-рецепторов обла-
дает собственной ферментной системой для высвобождения арахидоновой
кислоты, которая в свою очередь может превращаться в ПГ-Е2, помогающий
осуществлять или модулировать клеточный цикл. Тем не менее этому требуется
дальнейшее подтверждение. Не исключено, что очищенный Рс?2Ь-рецептор
образует смешанные мицеллы с фосфолипазой А2, загрязняющей препарат.
Более того, высокоочищенный препарат рецептора Fce из клеток RBL-1 не
содержит активностей обычных фосфолипаз [110а].
Регуляция рецепторов комплемента в макрофагах изучена хуже. Имеется,
однако, сообщение, что лимфоциты мышей продуцируют уникальный лимфо-
27. Медиаторы: высвобождение и функции
183
кин, усиливающий функционирование рецепторов комплемента [111], хотя и не
изменяющий их количества. Эффект лимфокина проявляется очень быстро.
Макрофаги (и, в меньшей степени, неактивированные моноциты) продуци-
руют разнообразные наборы соединений [70], синтез многих из которых регули-
руется липополисахаридами (ЛПС), фагоцитируемыми частицами, лимфокинами,
ТФА, агрегированными иммуноглобулинами, комплексами антиген—ан-
титело, ионофором А23187, ФМЛФ. Макрофаги синтезируют различные компо-
ненты комплемента, такие как Cl, G2, СЗ, G4, С5, фактор В, фактор D, пропер-
дин, инактиватор СЗЬ, р1Н [71]. Хотя другие клетки, в частности гепатоциты,
также синтезируют многие из этих белков в больших количествах [112], однако
продуцирование их макрофагами — процесс куда более интересный, так как он
обеспечивает локальный синтез белков комплемента в воспалительных экссу-
датах. Влияние растворимых продуктов моноцитов на другие клетки во многих
случаях может быть обусловлено прямым участием этих белков комплемента.
Особенно сильно лимфокины и стимуляторы фагоцитоза действуют на синтез
и секрецию компонентов С2 и С4. Синтез С5 тоже подвергается регуляции, но
в данном случае на посттрансляционном уровне [ИЗ]. Действующий через
Н2-рецепторы гистамин (10—1000 мкМ) подавляет синтез макрофагами гемоли-
тически активного и неактивного С5, а также их одноцепочечного предшест-
венника [114].
Во многих работах [1, 115, 116] детально рассматривается вопрос о том, что
макрофаги продуцируют также растворимые белки (монокины) с иной биологи-
ческой активностью, чем у системы комплемента, в том числе фактор, активи-
рующий лимфоциты (ЛАФ) [называемый также интерлейкином I (IL-1)], лейко-
цитарный пироген, а также фактор, активирующий фибробласты и пролифе-
рацию клеток гладких мышц. Все эти факторы имеют мол. массу 15 кДа и,
возможно, индентичны друг другу ([116—121] и гл. 21). К другим монокинам
относятся по меньшей мере одна из форм интерферона [116], факторы, стиму-
лирующие пролиферацию клеток капилляров [122], факторы, влияющие на
, образование колоний гранулоцитов, эритроцитов, макрофагов и мегакариоци-
тов на одном или нескольких уровнях и отличные от ЛАФ или фактора роста
Т-клеток [123, 124], фактор дифференцировки В-клеток [125], белки, убиваю-
щие опухолевые клетки [126], белок с мол. массой 50 кДа, супрессирующий Т-
и В-клетки [127], и, возможно, связанные с ним [128] или обладающие меньшей
молекулярной массой супрессорные факторы [129]. Моноциты тоже продуци-
руют факторы, регулирующие синтез белков в других клетках, например кол-
лагеназы в синовиальных клетках или сывороточного амилоида А в гепатоци-
тах (этот последний, по-видимому, идентичен ЛАФ) [130, 131].
Макрофаги продуцируют также большое количество разнообразных биоло-
гически активных липидов, в том числе ПГ-Е2, тромбоксан А2, лейкотриены
В и С, а также ряд моногидроксиэйкозатетраеновых кислот, таких как 5-ГЭТЕ
и 15-ГЭТЕ [132—135]. В одной из работ указывалось на синтез макрофагами
простациклина, однако эти данные требуют подтверждения, поскольку ре-
зультаты, полученные в разных экспериментах, были различными — возмож-
но потому, что макрофаги, использованные в разных опытах, находились на
различных стадиях дифференцировки. Образование ПГ-Е2, тромбоксанов и
лейкотриенов происходит в макрофагах гораздо интенсивнее, чем в нейтро-
филах и лейкоцитах. ПГ-Е2 способен контролировать или прямо опосредовать
многие эффекты макрофагов in vitro — особенно супрессирующие [133, 136—
138, 167]. ПГ-Е2, синтезирующийся в макрофагах, угнетает цитотоксический
эффект макрофагов и нейтрофилов, пролиферацию лимфоцитов, образование
лимфокинов, опосредуемый лимфоцитами цитотоксический эффект, индукцию
184
Ч. В. Паркер
интерфероном «природных киллеров», а также образование фактора, стимули-
рующего образование колоний макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов.
Помимо способности воздействовать на другие клетки ПГ-Е2, по-видимому,
является эндогенным регулятором синтеза белков, влияющим на образование
интерферона, коллагеназы и колониестимулирующих факторов [139, 140].
Макрофаги способны регулировать липидный обмен и другим путем,
например в культивируемых макрофагах содержатся и высвобождаются липо-
протеинлипазы, разлагающие липопротеины низкой плотности [141, 142].
Наличие этого фермента, возможно, представляет большой интерес в связи с
атеросклерозом, поскольку макрофаги, находящиеся в стенках кровеносных
сосудов, способны поглощать там значительные количества липидов. Липо-
протеин-липаза может превращать хиломикроны и белки, богатые триацилгли-
церолами, в низкомолекулярные продукты, способные проходить через стенку
артерий.
Хотя способность макрофагов убивать микроорганизмы и опухолевые клет-
ки достаточно очевидна, механизм этого явления не так понятен, как в случае
нейтрофилов. Миелопероксидаза макрофагов по ряду параметров отличается от
таковой нейтрофилов [71, 74]. Фермент моноцитов менее эффективно уничто-
жает микроорганизмы, однако может играть более существенную роль в унич-
тожении агентов, вызывающих хронические грануломатозные инфекции.
Подобно полиморфноядерным лейкоцитам, макрофаги продуцируют суперок-
сид, пероксид водорода и гидроксильные радикалы — соединения, присутствие
которых необходимо для уничтожения чужеродных микроорганизмов [76].
Набор протеолитических ферментов макрофагов очень похож на соответст-
вующий набор нейтрофилов, включая присутствие нейтральных и кислых про-
теиназ, активность которых, правда, в макрофагах существенно ниже [143].
Однако в отличие от нейтрофилов макрофаги способны регулировать количе-
ство своих ферментов. Например, в процессе дифференцировки макрофагов,
особенно в присутствии активаторов, резко возрастает секреция эластазы,
коллагеназы и активатора плазминогена [74]. Напротив, лизоцим, содержащий-
ся только в моноцитах и нейтрофилах (но не в клетках других типов), сек-
ретируется лишь покоящимися макрофагами, причем скорость секреции при
индукции клеток не увеличивается. Синтез по меньшей мере одного из фермен-
тов макрофагов — коллагеназы, индуцируется простагландинами Е путем уве-
личения внутриклеточной концентрации сАМР [140].
Одним из ферментов, относительно характерных для макрофагов (хотя и не
только для них), является ангиотензин-конвертаза (АКФ) [144]. Это гликопро-
теин, катализирующий реакцию превращения ангиотензина I (АГ-1) в ангио-
тензин II (АГ-П), а также реакцию инактивации брадикинина; АКФ является
нормальным компонентом сыворотки, но при различных хронических грануло-
матозных заболеваниях количество его резко возрастает. Сравнительно недавно
в опытах с каптоприлом [144, 145] было показано, что АГ-П, предполагаемый
основной продукт активности ангиотензин-конвертазы, участвует в воспали-
тельном ответе.
Моноциты обладают низким базальным уровнем противосвертывающей
активности (ПСА), повышающимся в присутствии стимулированных лимфоци-
тов. После обработки смеси моноцитов с лимфоцитами различными агентами,
в частности комплексами антиген-антитело, ЛПС, фактором С5а, лектинами
или аллогенными клетками, противосвертывающая активность повышается
в несколько раз. Такое повышение обусловлено взаимодействием моноцитов
с лимфоцитами [146—148], но прежде всего данный эффект проявляется на по-
верхности моноцитов. Ранним и характерным признаком гиперчувствительно-
27. Медиаторы: высвобождение и функции
185
сти замедленного типа (ГЗТ), пролиферативного гломерулонефрита и локали-
зованной и генерализованной реакции Шварцмана является отложение фибри-
на [149]. Некоторые особые проявления реакции ГЗТ практически отсутствуют
у лиц с наследственной афибриногенемией, а также после антикоагуляционной
терапии гепарином или варфарином [150]. Предполагается, что локальное от-
ложение фибрина может играть основную роль в иммобилизации макрофагов
продуктами жизнедеятельности лимфоцитов и в реакции исчезновения макро-
фагов [151, 152]. На макрофагах имеются рецепторы фибрина и продуктов
деградации фибриногена [74], способствующие более тесному взаимодействию
клеток с продуктами свертывания.
Макрофаги продуцируют также заметное количество фибронектина [154] —
димерного белка с мол. массой 440 кДа, присутствующего также в плазме и
синтезирующегося тучными клетками и фибробластами. Фибронектин участ-
вует в клеточной адгезии, распластывании и движении клеток, а также влияет
на различные типы фагоцитарных реакций [155]. Он содержит центры связыва-
ния коллагена и клеток, локализованные в разных доменах. Фибронектин
макрофагов обладает значительной хемотаксической активностью для фибро-
бластов, что может играть определенную роль при восстановлении поврежден-
ных тканей. Многие эффекты фибронектина осуществляются частично дегради-
рованным белком. Макрофаги содержат также рецепторы инсулина и глюко-
кортикоидов [71, 74].
27.3. Эозинофилы
, Эозинофилы отличаются от других клеток следующими характерными
признаками: они содержат гранулы, интенсивно окрашивающиеся кислыми
красителями, в частности эозином; часто участвуют в тканевых реакциях, в ко-
торых также принимают участие паразиты или антитела, принадлежащие
к классу IgE; оказывают цитотоксический эффект на паразитов; гранулы этих
клеток содержат уникальные щелочные полипептиды, являющиеся, по-види-
мому, фактором резистентности при паразитарных инфекциях [156—161].
Подобно нейтрофилам и макрофагам, эозинофилы содержат большое количество
лизосомных гидролаз и пероксидазу, хотя активность протеолитических фер-
ментов у них невелика. Эозинофилы, возможно, оказывают «отрицательное
модулирующее действие» при иммунном воспалении, однако истинная роль
этих клеток в различных реакциях изучена еще недостаточно.
Эозинофилы человека содержат примерно 200 гранул на клетку [157. 160,
161]. Большинство гранул, как показано электронно-микроскопическими ис-
следованиями, имеют в диаметре 0,9—1,3 мкм. Зрелые эозинофилы, особенно
те, что некоторое время были в ткани, содержат также гранулы меньшего раз-
мера со средним диаметром 0,05—0,5 мкм. Более крупные гранулы состоят из
кристаллоидной сердцевины, окруженной зоной меньшей плотности. Мелкие
гранулы такой сердцевины не имеют. Основным компонентом крупных гранул
является главный щелочной белок (ГЩБ), локализованный внутри кристалло-
идной сердцевины [162]. ГЩБ эозинофилов человека имеет мол. массу 9200
Да и изоэлектрическую точку выше 10. В клетках больных лейкозом были най-
дены ГЩБ с мол. массой 21 000 Да; при гиперэозинофилии этот белок обнару-
живается в крови и мокроте [162, 163]. Высокая изоэлектрическая точка ГЩБ
обусловливается прежде всего большим содержанием в нем аргинина. Крупные
гранулы содержат также много пероксидов, тогда как в малых гранулах пре-
обладают арилсульфатаза и кислая фосфатаза [157].
186
Ч. В. Паркер
Одной из предполагаемых функций эозинофилов является цитотоксичес-
кая. В относительно низких концентрациях (около 20 мкМ) ГЩБ способен
in vitro убивать шистосомулы [162]. Он также токсичен для эпителиальных
клеток нижних дыхательных путей морских свинок и человека: в концентрации
1 мкМ угнетает движение ресничек. Морфологический эффект, подобный тако-
вому у больных, умирающих от хронической астмы, проявляется при более
высоких концентрациях. Цитотоксический эффект эозинофилов нельзя считать
специфическим, поскольку сравнимая цитотоксичность свойственна и некото-
рым другим нормальным клеткам и тканям [162, 164]. Исследования по цито-
токсичности проводятся, как правило, с восстановленным, а затем алкилиро-
ванным ГЩБ, так как в обычном состоянии этот белок имеет тенденцию агре-
гировать; поэтому результаты изучения цитотоксичности могут на самом деле
быть артефактом. Как будет сказано ниже, в исследованиях, проведенных с
растворимым ГЩБ, может недооцениваться возможная важная роль этого
белка в токсичности клеток для паразитарных организмов, поскольку было
показано, что эозинофилы способны объединяться с паразитом, локально вы-
свобождать содержимое гранул и даже вводить это содержимое непосредствен-
но в цитоплазму паразитов. По другим данным ГЩБ может нейтрализовать
гепарин или ДНК, стабилизовать связывание эозинофилов с паразитами, а
также оказывать действие на свертывание крови или фибринолиз [163].
Независимо от возможной важной роли ГЩБ в цитотоксичности, очевидно,
что эозинофилы способны убивать паразитов in vitro. На их поверхности со-
держатся рецепторы IgG, IgE и комплемента (СЗЬ, С4, Cis, СЗа, С5а), что обес-
печивает активацию клеток и высвобождение содержимого гранул [156, 165,
166]. По данным одной из работ, лишь 10—25% эозинофилов содержат рецеп-
торы IgE, хотя при гиперэозинофилии количество их обычно возрастает [157].
В ряде исследований с экспериментальными системами in vitro было показано,
что IgG-антитела, полученные от экспериментальных животных или инфици-
рованных людей, способны в сочетании с комплементом ускорять прикрепле-
ние эозинофилов к паразитарным объектам (обычно шистосомулам); при этом
происходит не только высвобождение эозинофильных продуктов, но иногда и
длительное проецирование эозинофилов на поверхность мишеней с образова-
нием тесной физической связи между мембранами эозинофила и паразита [164,
166]. В таких случаях прямой токсический эффект наблюдался часто лишь че-
рез 6—18 ч [167]. Интересные данные были получены в одной из работ, пока-
завших, что продукты, секретируемые тучными клетками, повышают цитоток-
сический эффект эозинофилов [168]. Отсюда вытекает, что эти два типа клеток
могут, по-видимому, объединяться в борьбе против паразитарной инфекции.
Поскольку этот эффект способен вызывать и гистамин, и хемотаксический тет-
рапептид, можно предположить, что на поверхности эозинофилов повышается
экспрессия рецепторов СЗЬ. Цитотоксичность эозинофилов могут повышать
не только IgG-антитела. Сообщалось, также о повышении цитотоксичности и
фагоцитоза, опосредованного IgE-рецепторами и IgE-антителами.
Участие эозинофилов в защите от паразитарной инфекции показано также
in vivo: животные, которым была введена антиэозинофильная сыворотка, были,
во-первых, более чувствительны к гельминтозам, а во-вторых, вообще обладали
пониженной реактивностью на инфицирующие воздействия [167]. Поскольку
изменения в уровне чувствительности были количественными, а не качествен-
ными, можно думать, что в этот процесс вовлечены и другие факторы организма
хозяина.
Тот факт, что иммуноглобулины и рецепторы комплемента эозинофилов
способствуют уничтожению микроорганизмов, ставит эти клетки в один ряд
27. Медиаторы: высвобождение и функции
187
с нейтрофилами и другими лейкоцитами. Различия сводятся к спектру микро-
организмов, а также к системам самих рецепторов: а) хотя гранулы эозинофи-
лов сливаются с фагосомами так же, как и гранулы нейтрофилов, эозинофилы
гораздо менее эффективно убивают обычные бактерии in vitro; этим объясня-
ется повышенная восприимчивость к бактериальным инфекциям у лиц с наслед-
ственной нейтропенией и гиперэозинофилией [156]; б) эозинофилы крупнее,
чем нейтрофилы, и обладают большим количеством рибосом и пузырьков, а
также более развитым аппаратом Гольджи [156]; плотность рецепторов IgG и
комплемента на поверхности эозинофилов значительно меньше, чем на нейтро-
филах [159]; в) внутри- и внеклеточная протеолитическая активность эозинофи-
лов и нейтрофилов сильно различается. В тканях, богатых эозинофилами, как
правило, не бывает автолиза или других процессов, ведущих к образованию
гноя, в отличие от таких тканей, в которых доминируют нейтрофилы. Тем не
менее активность протеиназ в эозинофилах достаточно велика и поэтому от-
сутствие автолиза трудно объяснить [157]; г) в определенных условиях in vitro
эозинофилы синтезируют’существенно больше Н2О2, чем нейтрофилы [169];
в ряде случаев пероксид водорода играет заметную роль в цитотоксичности,
например незрелые личинки трихинелл очень чувствительны к Н2О2, который
и является, по всей видимости, основным фактором, убивающим паразитов
[170]; д) помимо наличия ГЩБ в эозинофилах больше пероксидазы, чем в нейтро-
филах. Этот фермент отличается от пероксидазы нейтрофилов спектральными
характеристиками, уровнем активации, субстратной специфичностью, антиген-
ными свойствами, способностью к иодированию и уничтожению микроорганиз-
мов [157, 171]; е) эозинофилы способны фагоцитировать; они гораздо менее ак-
тивны в этом отношении, чем нейтрофилы, и фагоцитоз, судя по всему, не яв-
ляется одной из их главных функций [156].
Очевидно, что цитотоксический эффект эозинофилов в отношении парази-
тических организмов (и в меньшей степени других микроорганизмов и клеток)
обеспечивается целым рядом механизмов. Естественно, нельзя исключить
участие и других клеток в этом процессе. Было показано, что очищенная пе-
роксидаза эозинофилов ускоряет уничтожение трипомастигот Trypanosoma
cruzi несенсибилизированными макрофагами [172]. Поскольку тканевые ин-
фильтраты, богатые эозинофилами, обычно содержат много макрофагов [173],
а макрофаги образуют розетки с эозинофилами при обработке специфическими
антигенами даже через длительное время после сенсибилизации [174], можно
думать о взаимодействии клеток двух типов. Пероксидаза эозинофилов связы-
вается также с гранулами тучных клеток, оставаясь при этом активной [175].
Это может свидетельствовать о взаимопомощи эозинофилов и тучных клеток
в процессе уничтожения паразитарных организмов.
Эозинофилы также продуцируют ПГ-Е2, различные ТЭТЕ (15-ГЭТЕ, в
меньших количествах 5-ГЭТЕ, 11-ГЭТЕ и др.), лейкотриены В и С [132, 176].
Эти свойства, а также наличие IgE-рецепторов на субпопуляциях эозинофилов
предполагают их возможное участие в реакции немедленного типа и защиты
хозяина.
Предполагается также, что эозинофилы служат отрицательными модуля-
торами воспаления. Эозинофилы содержат гистаминазу диаминоксидазного
типа, кининазу, лизофосфолипазу, арилсульфатазу В, фосфолипазу D; боль-
шинство этих ферментов высвобождается или появляется на клеточной поверх-
ности при активации клеток [156, 157, 177, 178]. При аллергическом ответе эти
и другие ферменты эозинофилов могут нейтрализовать продукты тучных кле-
ток или служить «мусорщиками», способствующими уничтожению клеточных
остатков. Например, высвобождение ферментов из эозинофильных гранул на
188
Ч. В. Паркер
поздних стадиях реакции немедленной гиперчувствительности было обнару-
жено in vivo с помощью метода «кожных окон» [179]: возможно, ферментами
производится локальный контроль этой реакции. Более того, эозинофилы спо-
собны фагоцитировать секретируемые тучными клетками гранулы, а ГЩБ
эозинофилов нейтрализует гепарин. Они также почти наверняка содержат
протеиназы, расщепляющие лейкотриены С и D. Эти ферменты, по-видимому,
присутствуют в виде примесей в препаратах арилсульфатазы, вызывающих
частичную инактивацию медленно реагирующих веществ (МРВ) [177]. Воз-
можно, что в инактивации МРВ участвует и пероксидаза [180]. Одной из воз-
можных функций эозинофилов, вероятно, опосредованных ПГ-Е2, является
прямое подавление высвобождения гистамина [181].
Особый интерес представляет присутствие в эозинофилах заметных коли-
честв лизофосфолипазы. Этот фермент с мол. массой 13 000 Да имеет одну сульф-
гидрильную группу и является, по-видимому, основным компонентом крис-
таллов Шарко — Лейдена (Charcot — Leyden), обнаруженных более ста лет
назад в тканях, богатых эозинофилами [182, 183]. Лизофосфолипаза локали-
зуется, в основном, на поверхности клеток; действие ее направлено на частично
деградированные фосфолипиды, содержащиеся в мембранах соседних погиб-
ших клеток. Основной субстрат фермента — лизолецитин — вызывает слияние
липидных бислоев; лизолецитин и лизофосфатидилсерин изменяют процесс
высвобождения гистамина из тучных клеток [184]. Во многих тканях лизоле-
цитин служит также ингибитором аденилат-циклазы и активатором гуанилат-
циклазы [185]; это согласуется с тем, что он является индуктором воспаления.
Более того, высвобождая из фосфолипидов свободные жирные кислоты, лизо-
фосфолипаза способствует образованию арахидоновой кислоты, подвергаю-
щейся дальнейшим ферментативным превращениям. Однако в сыворотке и дру-
гих лейкоцитах имеется значительная активность, разрушающая гистамин.
Активность эта, по-видимому, характерна для любой реакции гиперчувстви-
тельности, сопряженной со значительным нарушением проницаемости сосудов.
Интенсивность разрушения эозинофилами большинства медиаторов тучных
клеток незначительна [156]. Наконец, эозинофилы сами по себе способны вы-
рабатывать лейкотриены В, С и D [132, 176, 186]. Таким образом, трудно пред-
ставить, что эозинофилы могут играть серьезную антивоспалительную роль,
хотя это и не исключено. Возможно, роль ферментов частично сводится к за-
щите самих эозинофилов от инактивации их такими медиаторами, как гистамин.
27.4. Базофилы и тучные клетки
Базофилы и тучные клетки сходны в том отношении, что содержат гранулы,
окрашивающиеся основными красителями благодаря высокому содержанию
кислых протеогликанов [161, 177, 187—194]. Они также продуцируют и за-
пасают гистамин, являясь в большинстве тканей главным его источником.
Наконец, эти клетки содержат значительные количества высокоаффинных ре-
цепторов IgE, обеспечивающих их сенсибилизацию при IgE-ответе на антиген.
В результате антигенной стимуляции клетки высвобождают гистамин и другие
медиаторы, содержащиеся в гранулах, давая быстро развивающуюся реакцию
гиперчувствительности, основными признаками которой являются расширение
сосудов, увеличение их проницаемости, отек и сокращение гладкой мускула-
туры. Базофилы отвечают также на множество других поверхностных стиму-
лов, таких как анафилатоксины и лимфокины. При этом медиаторы высвобож-
даются без участия IgE-рецепторов
27. Медиаторы: высвобождение и функции
189
Тучные клетки и базофилы сильно варьируют по происхождению, биосин-
тетической регуляции и распределению у разных видов. Грызуны, в частности
мыши и крысы, содержат значительные количества тучных клеток и мало базо-
филов. У морских свинок и человека имеются клетки обоих типов 1188, 194].
По-видимому, у представителей этих видов данные клетки дополняют друг
друга. Базофилы, как правило, функционируют в виде клеток, циркулирую-
щих в крови, локализуясь в тканях при особых обстоятельствах. Тучные
клетки в основном функционируют в виде оседлых клеток, >аспределенных
главным образом в кровеносных сосудах, лимфатической и еоединительной
тканях. Особенно много их в тех органах, которые непосредственно соприка-
саются с окружающей средой — в коже, легких, пищеварительном тракте,—
где они могут быстро реагировать на чужеродный стимул.
Роль базофилов и тучных клеток в качестве основного источника медиато-
ров в анафилактической реакции гиперчувствительности немедленного типа
не вызывает сомнений, хотя относительный вклад каждого типа клеток и место
образования медиаторов при системной анафилаксии у человека или морской
свинки пока неясны. При нелетальной системной анафилаксии у животных
была обнаружена частичная дегрануляция базофилов крови; в то же время из-
вестно, что при таком состоянии базофилы способны мигрировать из крови,
а возможно, и обратно в кровь, так что их активация может происходить и
вне кровеносных сосудов [174, 191]. У человека тучные клетки, по-видимому,
служат основным источником медиаторов при отеке и покраснении кожи в от-
вет на антиген среды, тогда как базофилы, вероятно, играют более важную роль
при ответах немедленного типа в носу и глазах, где базофилоподобные клетки
входят в состав секретов. Много тучных клеток в легких; они хорошо отве-
чают на антиген, как в срезах легких, так и в изолированных препаратах туч-
ных клеток из легких аллергических пациентов. Тучные клетки, вероятно,— ос-
новной источник медиаторов при аллергической астме. Однако у больных
аллергией базофилоподобные клетки найдены в бронхиальных назальных сек-
ретах. Возможно, именно здесь и инициируется аллергический ответ на вды-
хаемый антиген [195, 196]. При этом может меняться проницаемость мембран
бронхов и носовой полости, что позволяет антигену проникать в более глубин-
ные тучные клетки и тем самым запускать цепь реакций, составляющих аллер-
гический ответ.
Один из вопросов, касающихся медиаторов и IgE-опосредованной аллер-
гии, связан не столько с острой фазой реакции, сколько с вопросом о том, ка-
ким образом поддерживаются продолжительные аллергические реакции?
Хотя в типичном случае опосредованные IgE реакции достигают максимума
через 10—30 мин и продолжаются в течение 1—2 ч, это отнюдь не общее пра-
вило. Аллергические реакции в коже и бронхах могут продолжаться много
часов или носить двухфазный характер, при котором после прекращения пер-
вичного ответа через 4—8 ч наблюдается вторичный. Многие из этих реакций
опосредованы IgE [197]. Они чаще наблюдаются при высоком уровне гипер-
чувствительности и больших дозах антигена. На поздней фазе ответа реакция
носит эдематозный характер, подобный бронхиальному отеку при тяжелой
хронической астме. Медиаторы, участвующие на этих поздних фазах ответа,
могут по меньшей мере частично отличаться от тех, которые участвуют в более
быстро проходящих ответах, опосредованных IgE.
Тучные клетки и базофилы могут также играть важную роль в клеточных
воспалительных реакциях замедленного типа в коже и других тканях. Для
морских свинок и человека характерна кожная реакция гиперчувствительнос-
ти замедленного типа, которая достигает максимума через 24—48 ч и в которой
190
У. В. II аркер
участвуют базофилы И, 191, 198]. Такая реакция была названа кожной базо-
фильной гиперчувствительностью (КБГ, СВН) или реакцией Джонса — Мота.
КБГ характеризуется существенным покраснением кожи и сравнительно сла-
бым уплотнением ткани в очаге воспаления. Реакция возникает, как правило,
при введении в» кожу небольших количеств антигена в первые 4—8 дней после
сенсибилизации. Она наблюдается при введении растворимых белковых анти-
генов (особенно в смеси с неполным адьювантом), растворимых паразитарных
антигенов, живых паразитов или клещей, контактных аллергенов, опухолевых
или аллогенных клеток. В отличие от более классической реакции гиперчув-
ствительности замедленного типа описываемый ответ характеризуется в основ-
ном реакцией верхних слоев дермы; при этом практически не происходит отло-
жения фибрина.
Из базофилов высвобождается активатор плазминогена, который может
участвовать в регуляции количества фибрина, присутствующего в очаге вос-
паления [198].
Усиленная базофильная инфильтрация может происходить не только
в коже, но и в других органах — главным образом в секретах дыхательных
путей при аллергии, вызываемой антигенами окружающей среды, а также
в почках при хроническом интерстициальном нефрите и отторжении трансплан-
тата 1191]. Гистамин и серотонин, предположительно секретирующиеся из ба-
зофилов крови, возможно, принимают участие в патогенезе нефрита, вызван-
ного отложением иммунных комплексов у кроликов, поскольку, как было по-
казано несколько лет назад, антигистаминные и антисеротонинные препараты
в значительной мере предотвращают аллергические повреждения ткани [199];
последние данные свидетельствуют также о наличии прямой корреляции
между временем и степенью дегрануляции базофилов in vivo и тяжестью про-
теинурии [200]. В этом случае может происходить также и высвобождение фак-
тора активации тромбоцитов; тромбоциты животных с нефритом частично ре-
зистентны к ФАТ in vitro, а их нейтрофилы содержат пониженное количество
секретируемого ФАТ.
В отличие от базофилов участие тучных клеток в хроническом воспалении
убедительнее всего установлено на мышах и крысах, где серотонин тучных кле-
ток играет основную роль в реакции кожной гиперчувствительности замедлен-
ного типа [1, 201] (о серотонине см. разд. 27.5.3). Возможно, что тучные клетки
играют такую же роль и при подостром и хроническом воспалительном ответе
на паразитарные инфекции в кишечнике. Это указывает на возможное значе-
ние тучных клеток в резистентности «хозяина». В пользу этой точки зрения
свидетельствуют опыты, проведенные с мышами линии W/Wv с наследствен-
ной недостаточностью тучных клеток, подверженными длительному инфици-
рованию нематодой Nippostrongylus brasiliensis [202]. Очевидно, конечная фаза
удаления нематод из кишечника при инфекции зависит от медиаторов [203].
Не исключено, однако, что нарушение резистентности у мышей W/Wv связано
с другими иммунологическими нарушениями, а не с недостаточностью тучных
клеток.
Для исследования IgE-опосредованной аллергии и связанным с ней вы-
свобождением медиаторов на клетках человека in vitro чаще всего используют
лейкоциты периферической крови (отвечающими клетками являются базо-
филы), а также фрагменты легких, полученные во время операции или аутоп-
сии (отвечающими являются тучные клетки). Основные затруднения в интер-
претации биохимических данных по освобождению медиаторов создает низкое
содержание в таких препаратах базофилов и тучных клеток, хотя недавно были
разработаны методы получения высоко обогащенных препаратов базофилов и
27. Медиаторы: высвобождение и функции
191
тучных клеток 1204, 205]. Наиболее четкие биохимические исследования были
проведены на смесях тучных клеток из слизистых оболочек брюшины и плевры
крысы, поскольку эти клетки могут быть получены в значительном количестве
и с высокой степенью чистоты [189]. Описаны различия в поведении этих кле-
ток и тучных клеток из других источников. Например, тучные клетки из эпи-
телия кишечника или фасций крысы отличаются от тучных клеток из сли-
зистых крысы по морфологии и по спонтанному высвобождению медиаторов
[206, 207].
Способность тучных клеток и базофилов принимать участие в опосредо-
ванных IgE реакциях зависит от присутствия на их поверхности рецепторов IgE.
У большинства видов основная часть IgE связана с клетками. Молекулы IgE
прочно связываются с тучными клетками и базофилами с Касс от 5-108 до 1 • 1010
в зависимости от источника клеток [96, 187, 188, 208—212]. Связывание осу-
ществляется с помощью Fc-фрагмента молекулы. Попытки определения участ-
ка Fc-фрагмента, ответственного за связывание, пока не принесли успеха.
Можно думать поэтому, что для связывания необходимы несколько Fc-доменов.
Количество рецепторов IgE составляет от 1 • 105 до 5-105 на клетку, причем на
тучных клетках рецепторов больше, чем на базофилах. При нормальных кон-
центрациях IgE большая часть рецепторов in vivo свободна, хотя при очень
высоких концентрациях IgE свободными остаются всего 5% рецепторов. Зна-
чительное количество данных показывает, что большая часть респираторных
аллергий человека объясняется усилением синтеза антител класса IgE (и, сле-
довательно, нарушением регуляции Т- и В-лимфоцитов), а не такими измене-
ниями базофилов и тучных клеток, как их число, распределение, количество
рецепторов IgE и чувствительность к регуляции. Повышение содержания IgE
у индивида приводит к увеличению количества рецепторов для них на поверх-
ности базофилов человека, а, возможно, также на поверхности тучных клеток
и базофилов других видов. Это происходит, по всей видимости, в результате
индукции синтеза рецепторов для IgE [104]. Эти данные, однако, нуждаются
в подтверждении, поскольку способность к синтезу белка в базофилах весьма
ограничена, а изучение связывания IgE с базофилами крови человека связано
с техническими трудностями из-за невозможности получить большое количе-
ство клеток высокой степени чистоты. В связи с этим нельзя исключить, что
индукция происходит на стадии незрелых базофилов. Механизмы такой ин-
дукции в настоящий момент неясны. На Т-клетках человека показано, что при
стимуляции IgE реальным стимулом являются не мономерные, а агрегирован-
ные молекулы иммуноглобулина [97].
В клетках RBL-1 и в нормальных тучных клетках крысы рецептор IgE,
по-видимому, существует в виде комплекса из двух полипептидных цепей.
Один компонент — это гликопротеин с мол. массой 45—60 кДа (а-цепь) [96,
201, 2121, который экспонирован на клеточной поверхности и содержит участок
связывания IgE. Другой компонент представляет собой полипептид с мол. мас-
сой 300 кДа, не содержащий углеводной части (0-цепь). 0-Цепь, по всей види-
мости, локализована внутри плазматической мембраны и может участвовать
в передаче сигнала с поверхности клеток в цитоплазму [96, 210]. Существова-
ние компонента, аналогичного a-цепи, было доказано при исследовании базо-
филов человека с хроническим базофильноклеточным лейкозом [211]. Все изу-
ченные до сих пор a-цепи из различных источников характеризуются значи-
тельной электрофоретической гетерогенностью, а также, хотя и в меньшей сте-
пени, гетерогенностью в связывании IgE [96, 208, 213].
По современным данным мономерный IgE сам по себе не способе?, запус-
кать высвобождение медиатора. Высвобождение происходит только в том слу-
192
Ч. В. Паркер
чае, когда рецепторы IgE подвергаются перекрестной сшивке [214, 215]. Та-
кая сшивка может вызываться поливалентным антигеном в комплексе с IgE,
агрегированным IgE, IgE и двухвалентными антителами против IgE или двух-
валентными антителами против рецепторов [187]. Кроме того, такие полива-
лентные лектины, как Кон А, ФГА, рицин и агглютинин зародышей пшеницы,
которые, по всей видимости, связываются с углеводной частью рецептора,
возможно, стимулируют высвобождение гистамина таким же способом [187,
189, 190, 214]. Высокоразветвленные сахара, такие как декстран, также могут
действовать аналогичным образом [190]. В специфичных к гаптенам системах
одновалентный гаптен не только не вызывает ответа, но, напротив, оказывает
тормозящее действие [214, 215]. Индукция ответа связана с изменениями рас-
пределения IgE на клеточной поверхности [188, 209]. И в тучных клетках, и
в базофилах рецепторы IgE обычно равномерно распределены по клеточной
поверхности. После перекрестной сшивки молекулы рецептора подвергаются
кластеризации и собираются в кэп. После этого они могут слущиваться в среду
или подвергаться интернализации. Интересно, что предварительно образован-
ные комплексы антигенов с IgE не обладают большой аффинностью к тучным
клеткам и базофилам и, как правило, не вызывают высвобождения медиато-
ров [174].
На тучных клетках имеются также рецепторы и для других иммуноглобу-
линов [187], но данные об их распределении и специфичности противоречивы.
У мышей, крыс, морских свинок, кролика и человека образуются антитела
класса IgG, вызывающие анафилактический ответ после короткого периода
сенсибилизации [187, 188, 216]. Эти антитела для каждого из видов называются
соответственно IgGi, IgGa, IgGlt IgGx и IgG KCC (краткосрочная сенсибилиза-
ция, STS). В этих IgG-опосредованных реакциях, по-видимому, участвуют
тучные клетки. В недавно проведенных исследованиях с использованием туч-
ных клеток мышей были получены веские доводы в пользу предположения о
том, что реакции высвобождения медиаторов, индуцированные агрегирован-
ными мышиными IgG, запускаются в результате их связывания с рецептором, от-
личным от рецептора IgE, поскольку агрегированные мышиные IgG не десен-
сибилизируют клеток и не препятствуют их активации IgE и антигеном [217].
На тучных клетках крысы имеются также рецепторы для СЗЬ [218]. Кроме
того, дегрануляцию могут вызывать компоненты СЗЬ, С5а, С4а и СЗа [187, 219],
хотя в одном исследовании с использованием крысиных тучных клеток СЗЬ
стимулировал не секрецию, а фагоцитоз [218]. Другие стимуляторы секреции,
о которых не упоминалось выше,— это а) ионофор А23187; б) АТР и, в мень-
шей степени, дезокси-ATP, но не другие адениловые нуклеотиды; в) коротко-
цепочечные поливалентные амины, например препарат 48/80, полилизин, ки-
нины; г) щелочные олигопептиды (фрагмент АКТГ, мелитин, щелочные окта-
и нонопептидные эфиры из Fc-фрагмента IgE человека), белки (белок полосы
2 из нейтрофилов) или фармакологические агенты (морфин, полимиксин В);
д) рентгеноконтрастные вещества и другие осмотические стимуляторы; е) про-
теиназы, такие, как проназа и химотрипсин; ж) фосфолипазы А и С; з) лизофос-
фолипиды; и) калликреин; к) ПГ-В2 (для базофилов человека, но не для тучных
клеток легких человека); л) ФАТ (PAF); м) фторид; н) пептид ФМЛФ; о) лим-
фокины (177, 187, 189, 190, 194, 220—225). Наконец, соматостатин — тет-
радекапептид, ингибирующий секрецию практически во всех изученных сис-
темах,— стимулирует реакцию высвобождения в перитонеальных тучных клет-
ках крыс [226]. Вероятно, эти стимуляторы не действуют непосредственно на
IgE-рецепторы, хотя ответы на них во многих отношениях сходны с ответами
на IgE. В частности, вне зависимости от природы стимула секретируются одни
27. Медиаторы: высвобождение и функции
193
и те же продукты, хотя из этого правила имеются исключения. Например, ба-
зофилы человека при стимуляции компонентом С5а комплемента или перито-
неальные тучные клетки крысы при стимуляции антигеном и IgE не секрети-
руют МРВ (SRS). Однако секреция МРВ в ответ на другие стимулы тем не ме-
нее может, например, быть усилена компонентом С5а [222, 227].
Недавно было установлено, что в активации базофилов и тучных клеток
принимают участие другие лейкоциты. В частности, тучные клетки и базофилы
активируются продуктами Т-лимфоцитов (лимфокинами, в том числе интерфе-
роном) [223—225], нейтрофилов (катионными белками и протеиназами, акти-
вирующими систему комплемента) (см. разд. 27.1), моноцитов (белки компле-
мента, протеиназы, интерферон) и, возможно, лиофилизированной передней
долей гипофиза, поскольку она стимулирует секрецию гранул изцейтрофилов
[121]. Кроме того, как гибнущие, так и некоторые живые клетки могут высво-
бождать в среду некоторое количество ATP, а АТР — относительно мощный
индуктор секреции медиаторов. Наконец, активированные компоненты системы
комплемента, как и системы свертывания крови, также могут рассматриваться
как мощные стимуляторы секреции. В обеих системах существуют механизмы,
способные вызывать или усиливать секрецию медиаторов в том случае, когда
антитела класса IgE либо отсутствуют, либо не вызывают эффекта.
Кроме агентов, непосредственно стимулирующих тучные клетки и базо-
филы, существуют и другие вещества, которые, будучи сами по себе практи-
чески или полностью лишены активности, значительно усиливают ответ клеток
на другие стимулы. К таким агентам относятся интерферон, ТЭТЕ, аденозин и
ацетилхолин [177, 189, 196, 223, 228—230]. Усиление действия индукторов
этими агентами может быть обусловлено как увеличением количества секрети-
руемого медиатора, так и повышением скорости секреции, а обычно действием
обоих механизмов. Особый интерес представляет действие интерферона [223],
поскольку давно было известно, что острые вирусные инфекции, затрагиваю-
щие дыхательные пути, могут вызывать обострение аллергических ринитов и
астмы или даже индуцировать аллергический процесс [196]. Кроме того, ин-
терферон усиливает хемотактический ответ базофилов [231] и увеличивает ко-
личество рецепторов для IgG и IgE на поверхности Т-клеток, уменьшая одно-
временно экспрессию рецептора IgM [232—234]. Поскольку Т-клетки, содер-
жащие репепторы IgE, по-видимому, участвуют в подавлении биосинтеза IgE
В-клетками [235], интерферон может на ранних стадиях усиливать, а позднее
подавлять гиперчувствительность, опосредованную IgE. Усиление ответа на
медиаторы в присутствии ТЭТЕ, о чем вначале имелись лишь косвенные дан-
ные [229], более выражено для 5-ГЭТЕ, которая по данным хроматографии
синтезируется в тучных клетках, чем для 12-ГЭТЕ [228]. В случае базофилов
ответ существенно больше для 5-гидропероксида (5-ГПЭТЕ), чем для самой
5-ГЭТЕ [230]. Усиливающее действие аденозина было обнаружено в случае
тучных клеток из брюшной полости крысы [236] и легких человека [237], хотя
для базофилов из периферической крови человека тот же самый аденозин слу-
жит ингибитором секреции [238]. В случае тучных клеток крысы усиление от-
вета (по крайней мере втрое) наблюдается при существенно меньшей концент-
рации аденозина, чем та концентрация, которая имеется в тканях и крови [236].
Действие аденозина полностью блокируется теофиллином, известным ингиби-
тором связывания аденозина. Эти данные свидетельствуют о том, что влияние
аденозина обусловлено его взаимодействием со специфическими рецепторами.
Ацетилхолин также усиливает или прямо стимулирует секрецию гистамина
тучными клетками [177].
7-0395
194
Ч. В. Паркер
27.4.1 . Секреция
Высвобождение гистамина и других медиаторов реакции немедленной
гиперчувствительности из тучных клеток начинается через 15—20 с после вве-
дения антигена или других стимуляторов клеточной поверхности. Инициация
реакции высвобождения на ультраструктурном уровне выявляется в виде слия-
ния плазматической мембраны с перигранулярными мембранами гранул непо-
средственно под клеточной мембраной [188, 189, 194]. Вслед за этим в системе
гранул появляются каналы и лакуны, по-видимому, соединяющиеся с внекле-
точной средой. При стимуляции высвобождения медиаторов развитие таких ка-
налов приводит к тому, что общая наружная поверхность клеток увеличивается
в 3,5 раза. Базофилы претерпевают сходные, по более медленные и менее выра-
женные изменения, что подробнее рассматривается ниже. Хотя часть гранул
(особенно в тучных клетках) выбрасывает содержимое прямо во внеклеточное
пространство, другие гранулы высвобождают медиаторы, даже не покидая
клетки. Исследования, в которых проводилась локальная стимуляция с помо-
щью микропипетки, показали, что и процесс высвобождения медиаторов носит
локальный характер — вовлекаются лишь гранулы, лежащие в непосредст-
венной близости от места стимуляции [1891. Опыты с Кон А показали, что ответ
бывает полным лишь при условии, что стимуляция не прекращается. Это сви-
детельствует об участии в процессе какой-то формы тонического стимула. Это
особенно легко продемонстрировать в данном случае, благодаря наличию моно-
валентного углеводного ингибитора а-метилманнозида, вызывающего быструю
диссоциацию связанного Кон А [189, 239].
Секреторные процессы в тучных клетках и базофилах зависят от темпера-
туры; наиболее выраженная секреция идет при 37°С, при комнатной температуре
эффективность процесса резко снижается, а при 4°С высвобождение практически
прекращается [187, 189, 190]. В перитонеальных тучных клетках крыс ответа
на Кон А или вещества, перекрестно сшивающие IgE-рецепторы, не наблюда-
ется, если в среде нет фосфатидилсерина (ФС). ФС необходим для высвобожде-
ния медиаторов также в легких крыс и морских свинок и в брыжейке крыс [240].
Если стимулирующее воздействие производить при пониженной температуре
или в отсутствие кальция, то может наступить стойкая «десенсибилизация», так
что повышение температуры или прибавление кальция не приведет к появлению
ответа [241]. Десенсибилизация наблюдается также, если клетки повторно об-
работать тем же стимулом или стимулировать в отсутствие ФС.
Механизм стимуляции высвобождения медиаторов неясен, и, по-видимому,
он может быть разным в зависимости от используемого индуктора секреции.
Высвобождение — процесс энергозависимый и подавляется в бескислородной
среде в отсутствие глюкозы [187, 190]. Существует строгая зависимость между
содержанием АТР в тучных клетках и их способностью секретировать гистамин.
Это, по-видимому, указывает на непосредственное участие АТР в процессе сек-
реции. Клетки, накапливающие в гранулах биогенные амины, поддерживают
внутри гранул кислотный pH благодаря Н+, транслоцирующемуся АТРазой,
локализованной в мембранах гранул [242]. Эта АТРаза, однако, не участвует
в изменениях структуры перигранулярной мембраны, наблюдаемых при дегра-
нуляции тучных клеток крыс.
Целый ряд данных [187, 189, 194, 243] указывает на участие кальция в
процессе секреции, происходящем в тучных клетках и базофилах: а) способ-
ность ионофора двухвалентных катионов А23187 стимулировать секрецию в
присутствии ионов Са2+, но не Mg2+; б) опыты по микроинъекции ионов в цито-
плазму, показывающие, что Са2+ (но не Mg2+) является стимулирующим агентом
27. Медиаторы.: высвобождение и функции
195
(следует, однако, сказать, что данные по этому вопросу противоречивы); в) сек-
реция гистамина после слияния очищенных тучных клеток с фосфолипидными
пузырьками, содержащими Са2+ (но не другие катионы); г) подавление секреции
при отсутствии во внеклеточной среде ионов Са2+, например в клетках, предва-
рительно инкубированных с этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-Х1Х'-
тетрауксусной кислотой (ЭГТА); д) быстрое увеличение обмена внутри- и вне-
клеточного 45Са2+ при активации тучных клеток; е) стимуляция секреции после
добавления 10—100 мМ ионов Са2+ к клеткам, находящимся в бескальциевой
среде [194]. Эти наблюдения свидетельствуют о первостепенной роли ионов Са2+
в процессе секреции. Однако они не дают однозначного ответа на вопрос о необ-
ходимости внеклеточного Са2+ для секреции, поскольку секреция может проис-
ходить (хотя и менее интенсивно) и в среде, полностью лишенной ионов Са2+.
Многие метаболические функции клетки определяются присутствием Са2+;
некоторые из них могут неспецифически воздействовать на способность клеток
к ответу. Было показано, что перекрестное сшивание IgE-рецепторов приводит
к быстрому повышению входящего и выходящего потока 45Са2+. Следует отме-
тить, что определение поглощения Са2+ осложняется наличием каналов, соеди-
няющихся с внеклеточным пространством в местах, первоначально содержав-
ших интактные гранулы. К сожалению, до сих пор неясно, происходит ли пе-
ремещение ионов Са2+ в процессе высвобождения медиаторов.
Наиболее выраженные изменения внутриклеточного обмена в активирован-
ных тучных клетках касаются метаболизма мембранных липидов. Как и во
многих других клетках, здесь наблюдаются и быстрый распад, и синтез, и взаи-
мопревращение фосфолипидов, входящих в состав мембран. Если очищенные
тучные клетки пометить 32РО4, а затем подвергнуть стимулирующему воздейст-
вию, то включение метки в фосфатидную кислоту (ФК) резко повысится, при-
чем изменения во включении метки отмечаются через 8 с после стимуляции,
а во многих случаях уже через 6 с [244]. Через 30 с окажутся мечеными также
фосфатидилинозитол (ФИ) и фосфатидилхолин (ФХ). Такие изменения проис-
ходят под влиянием самых различных стимулов, в том числе IgE, антител к IgE,
Кон А, ионофоров А23187 и 48/80; более того, зависимости доза — эффект для
процессов высвобождения гитсамина и включения метки в фосфолипиды и
ФК очень сходны. В клетках, стимулированных Кон А, эти изменения продол-
жаются в течение 10—15 мин, но немедленно прекращаются после добавления
а-метилманнозида. При использовании таких ингибиторов секреции, как тео-
филлин или простагландин Е, наблюдается тесная корреляция между подав-
лением высвобождения гистамина и включением меченого фосфата в фосфоли-
пиды и фосфатидную кислоту [245]. Наиболее вероятный путь увеличения радио-
активности фосфатидной кислоты таков: стимулируется фермент, зависимый
от Са2+ — фосфолипаза С, расщепляющая фосфолипиды до 1,2-диацилглицеро-
ла (ДАГ); затем с помощью ДАГ-киназы ДАГ фосфорилируется, образуя фосфа-
тидную кислоту. В подтверждение этой схемы были получены данные о том, что
в первую минуту после стимуляции тучных клеток крыс концентрация ДАГ
повышается в 4 раза [245]. Этот эффект интересен по нескольким причинам.
Прежде всего, ДАГ представляет собой соединение, способствующее слиянию
липидных мембран [246]. Кроме того, ДАГ легко разлагается соответствующей
липазой (весьма активной в тучных клетках) до моноацилглицерола (МАГ) и
свободной жирной кислоты. Цепь реакций, катализируемых фосфолипазой С
и ДАГ-липазой, является возможным механизмом секреции жирных кислот
активированными тучными клетками; нельзя также исключить участие в этом
процессе фосфолипазы А2. Образование МАГ явление, само по себе заслуживаю-
щее внимания, поскольку МАГ, даже более активно, чем ДАГ, способствует
196
Ч. В. Паркер
слиянию мембран. Свободные жирные кислоты действуют на мембраны, АК
превращается в 5-ГЭТЕ и ее пероксид — вещества, индуцирующие секрецию.
Наконец, ДАГ может превращаться также в фосфатидную кислоту, обладаю-
щую свойствами кальциевого ионофора, как показано на модельных липидных
мембранах [247]; эта реакция, возможно, объясняет усиление обмена Са2+ в
процеессе активации тучных клеток. Таким образом, некоторые, если не все,
изменения метаболизма тучных клеток, связанные с экзоцитозом, в том числе
секреция жирных кислот, изменения проницаемости мембраны для Са2+ и слия-
ние мембран, возможно, объясняются согласованным действием фосфолипазы С,
ДАГ-киназы и ДАГ-липазы. Энергетический барьер при слиянии преодоле-
вается благодаря появлению участков мембран, богатых гидрофобными липи-
дами (ДАГ и МАГ) и содержащих мало фосфолипидов с полярными головками
[248].
Другое быстро происходящее изменение метаболизма фосфолипидов в сек-
ретирующих тучных клетках, базофилах или клетках линии RBL-1 — это по-
вышение уровня метилирования. Фосфатидилэтаноламин (ФЭ), постепенно ме-
тилируясь, превращается в монометил-ФЭ, диметил-ФЭ, триметил-ФЭ (идентич-
ный ФХ) и в конечном итоге под действием фосфолипазы А2 может также обра-
зовываться лизо-ФХ [249—253]. Последовательность этих реакций легко про-
демонстрировать, используя в качестве предшественников либо 14С-фосфатидил-
серин (ФС), превращающийся в результате декарбоксилирования в ФЭ, либо
3Н-метил-8-аденозилметионин. В тучных клетках метилирование наблюдается
ужечерез Юс, быстро достигает максимумаи через 30—60 с возвращается к конт-
рольному уровню. Такие агонисты сАМР, как теофиллин и изопротеренол,
как и в случае включения метки в фосфолипиды, угнетают и секрецию гистами-
на, и накопление 45Са2+, и реакцию метилирования. Метилирование подавляется
также такими специфическими ингибиторами, как S-изобутирил-З-деазаадено-
зин, взятый в отдельности или же в комбинации с S-аденозилгомоцистеином
[250]. При этом уменьшается также секреция арахидоновой кислоты [251].
Данные, полученные в опытах с другими клеточными системами, указывают, что
в метилировании участвуют по крайней мере два разных фермента [249]; по
предварительным данным некоторые метилированные фосфолипиды очень быст-
ро переносятся с внутренней на наружную сторону плазматической мембраны.
В отличие от стимуляции включения 32Р в фосфолипиды метилирование не ин-
дуцируется ионофорами А23187 и 48/80, но вызывается Кон А или веществами,
перекрестно-сшивающимися с IgE [252]. Отсюда можно предположить, что ме-
ханизм действия двух первых агентов отличается от такового для двух послед-
них. В пользу этого предположения свидетельствуют, во-первых, неспособность
ионофоров повышать содержание сАМР, что обычно происходит в присутствии
Кон А или других IgE-зависимых стимулов, и, во-вторых, независимость ответа
на ионофоры от экзогенного ФС. Поскольку ФС может метилироваться и превра-
щаться в лизо-ФХ, обладающий способностью сшивать мембраны, это может
объяснить зависимость процессов стимуляции IgE и Кон А от ФС. В других
исследованиях, однако, было показано, что основную роль в действии ФС иг-
рает лизо-ФС, а не лизо-ФХ [184].
Изменения в обороте 32Р-фосфолипидов и их метилировании в активиро-
ванных тучных клетках весьма впечатляющи, однако нельзя забывать, что они
затрагивают лишь небольшую часть всех клеточных фосфолипидов. Если эти
реакции играют столь важную роль в активации клеток, очевидно, что фосфо-
липиды должны располагаться в участках мембраны, наиболее существенных
для активации. Выявить эти участки экспериментальным путем — задача, до-
вольно трудная. Один из возможных подходов к решению этой проблемы —
27. Медиаторы: высвобождение и функции
197
это поиск вариантных линий клеток RBL-1, не содержащих метилтрансферазы
или некоторых других ферментов, участвующих в обмене мембранных липидов
[251]. Однако сколько-нибудь значительное отсутствие метилирования фосфо-
липидов может привести к таким общим нарушениям структуры плазматической
мембраны, что нормальные секреторные реакции станут невозможны. Следова-
тельно, для однозначного вывода в исследованиях подобного рода необходимо
доказать, что фосфолипидный состав клеток не изменяется в целом и что не
происходит потери других белков.
В активированных тучных клетках изменяется также метаболизм цикличе-
ских нуклеотидов. При стимуляции перитонеальных тучных клеток крыс кон-
канавалином A, IgE, антителами к IgE или смесью IgE с поливалентным анти-
геном в них быстро возрастает содержание сАМР, достигающее максимума через
15—20 с, а затем быстро падающее [189, 250, 254—257]. Иногда пик синтеза
сАМР достигается лишь через 3—5 мин, что может объясняться секрецией ПГ-
D2, поскольку процесс подавляется индометацином [255]. Повышение содержа-
ния сАМР наблюдается также при стимуляции базофилов периферической кро-
ви, больных хроническим миелолейкозом [258]. По-видимому, быстрое накопле-
ние сАМР обусловлено активацией аденилат-циклазы, хотя точно это не доказа-
но. Повышение концентрации сАМР непосредственно перед высвобождением
медиаторов указывает на возможное участие этого нуклеотида в индуцировании
секреции в тучных клетках, как это, по-видимому, имеет место в других актив-
но секретирующих клетках [259]. Видимый парадокс заключается в том, что
многие фармакологические агонисты сАМР — ПГ-Ej и ПГ-Е2, теофиллин, мо-
но- и дибутирил-сАМР угнетают, а не стимулируют секрецию [260], хотя это
не всегда связано с увеличением содержания сАМР [189, 259]; ПГ-П2 представ-
ляет собой исключение, так как он не угнетает синтеза сАМР в базофилах чело-
века, а даже стимулирует. Подавление секреции агонистами сАМР особенно
заметно при реакции, стимулированной перекрестно-сшитыми IgE, а не ионо-
форами 48/80 или А23187. Более того, оба ионофора, являясь стимуляторами
секреции в тучных клетках крыс, значительно понижают содержание сАМР
(даже без его транзиторного повышения) [189]. Следовательно, эти ионофоры
стимулируют секрецию медиаторов иным способом, чем Кон А или IgE-зависи-
мые агенты; возможно, ионофоры действуют в поздней фазе индукции. Подав-
ление секреции агонистами сАМР может свидетельствовать либо о том, что быст-
рое нарастание сАМР в ответ на Кон А или антитела к IgE не связано с секре-
цией, либо о том, что угнетающие ферменты действуют на другой внутрикле-
точный пул сАМР [189].
Поскольку наиболее хорошо изученный эффект сАМР в клетках млекопи-
тающих — это стимуляция соответствующих сАМР-зависимых протеинкиназ, то
один из способов выяснения роли сАМР в секреции сводится к изучению фосфо-
рилирования белков [261]. В цитозоле тучных клеток, предварительно стимули-
рованных антителами против крысиных иммуноглобулинов [(РаЬ')2-фрагменты],
через одну минуту обнаруживается повышенная активность протеинкиназы,
комигрирующая при хроматографии вместе со свободной каталитической субъ-
единицей сАМР-зависимой протеинкиназы [255]. Отсюда можно предположить,
что сАМР образуется в количествах, достаточных для стимуляции протеинки-
назы в интактных клетках. Заманчиво также предположить (хотя прямых дока-
зательств нет), что в клетках при стимуляции активируются Са2+-зависимые
протеинкиназы: во-первых, фермент этот широко распространен в различных
клетках [262], во-вторых, ионы Са2+ имеют важное значение для секреции в туч-
ных клетках и, наконец, Са2+-зависимая протеинкиназа легко стимулируется
ДАГ, количество которого в процессе секреции повышается [246]. Независимо
198
Ч. В. Паркер
от вопроса об участии киназ данные по фосфорилированию показывают, что при
стимуляции меченных 32РО4 перитонеальных тучных клеток ионофорами А23187
и 48/80 усиливается включение 32РО4 в белки с кажущейся мол. массой 59 и
42 кДА [263]. При активации тучных клеток крыс наблюдается также быстрое
фосфорилирование а-субъединицы рецептора IgE [108, 264]. Такой ответ отме-
чается при действии как ионофора А23187, так и смеси IgE'и антигена, причем
фосфорилирование становится заметным уже через 15 с и является специфич-
ным, так как 0-компонент рецептора при стимуляции не фосфорилируется.
Помимо изменений в высвобождении медиаторов под действием фармаколо-
гических агентов, влияющих на метаболизм сАМР, секрецию медиаторов, по
крайней мере в базофилах периферической крови человека, могут подавлять
глюкокортикостероиды [265]. Действие их проявляется как in vitro, так и in
vivo, требует не менее 12 ч обработки и наблюдается при терапевтических кон-
центрациях глюкокортикоидов.
Среди продуктов обмена арахидоновой кислоты в перитонеальных тучных
клетках крыс с помощью масс-спектроскопии можно идентифицировать ПГ-В2)!
ТкВ2, 6-оксо-ПГ-Е1а, ПГ-Р2аи 12-ГЭТЕ [266]. Наличие ТкВ2, ПГ-Е2а и 6-оксо-
-ПГ-Е1а может, однако, объясняться присутствием в препарате макрофагов,
так как они продуцируют большое количество этих веществ. По данным тонко-
слойной и жидкостной хроматографии под высоким давлением эти клетки про-
дуцируют также 5-ГЭТЕ и 5,12-ГЭТЕ [228]. Образование лейкотриена С (ЛТ-С,
LT-C) продемонстрировано как функциональным, так и хроматографическим
анализом [227]. Несмотря даже на то, что в перитонеальных тучных клетках
крысы ЛТ-С синтезируется в значительных количествах в ответ на обработку
их ионофором А23187, высвобождение ЛТ-С, стимулированное антигеном, на-
блюдать регулярно не удается. Недавно, впрочем, оно было убедительно про-
демонстрировано на тучных клетках человека [267]. Эти клетки, а также базо-
филы крови кроликов и человека продуцируют также фактор активации тром-
боцитов (ФАТ, PAF).
27.4.2 . Гранулы тучных клеток
Гранулы базофилов и тучных клеток можно выделить из обработанных
ультразвуком или гомогенизированных клеток центрифугированием в гради-
енте плотности. При использовании этого метода в гранулах сохраняются пери-
гранулярные мембраны и мало изменяется исходное содержание гистамина
[187, 194], который, возможно, связывается в гранулах с карбоксильными груп-
пами белков [194]. Кроме гистамина в гранулах тучных клеток содержится мно-
го гепарина, АТР, протеолитических ферментов, множество других ферментов,
а также факторы хемотаксиса нейтрофилов и эозинофилов, описанные в преды-
дущих разделах. Среди факторов хемотаксиса идентифицированы два эозино-
фильных тетрапептида и некоторые, более крупные молекулы (может быть,
олигопептиды), обладающие сходной активностью. Тучные клетки и базофилы
продуцируют также и фактор хемотаксиса нейтрофилов, представляющий со-
бой белок с мол. массой более 160 кДа [194, 268]. Данный фактор секретируется
лейкоцитами крови и легких человека в процессе IgE-зависимой аллергической
реакции, что, возможно, способствует локальному накоплению нейтрофилов,
наблюдаемому обычно на ранних стадиях аллергических реакций. В аллерги-
ческих реакциях, возможно, также участвуют и такие хемотаксические факторы,
как ЛТ-В4 и хемотаксические тетрапептиды эозинофилов, обладающие пример-
но одинаковой активностью в отношении эозинофилов и нейтрофилов. Тучные
клетки секретируют также полипептид с низкой молекулярной массой, идентич-
27. Медиаторы: высвобождение и функции
199
ный вазоактивному полипептиду кишечника (ВПК, VIP) или сходный с ним
[269]. Вполне возможно, что этот продукт причастен к повышению проницаемо-
сти сосудов при IgE-опосредованных реакциях. В тучных клетках животных
некоторых видов обнаружены серотонин и дофамин, а в гранулах тучных клеток
крыс и морских свинок — значительное количество цинка [194].
Базофилы и тучные клетки человека содержат трипсиноподобную эстеразу
и сходную с трипсином активность. Основной нейтральной протеиназой тучных
клеток легких человека является триптаза с мол. массой около 130 кДа [270].
У низших животных имеется протеиназа, сходная с химотрипсином по субстрат-
ной специфичности [194]. В базофилах и тучных клетках содержатся некоторые
классические ферменты лизосом, но их количество и разнообразие меньше, чем
в нейтрофилах. Хотя имеющиеся данные можно интерпретировать и иначе,
часто создается впечатление, что стимулированные базофилы высвобождают
содержимое гранул постепенно, небольшими порциями, причем в процессе
секреции принимает участие лишь небольшая часть мембран гранул и полного
слияния плазматической мембраны клеток и мембраны гранул не происходит
[191, 194, 271]. В течение еще 24 час или дольше можно наблюдать большие по-
лости, содержащие остаточный материал гранул, который в конце концов
растворяется. При этом, хотя полость гранул свободно сообщается с окружаю-
щей средой, химотрипсиноподобный фермент, характерный для базофильных
гранул экспериментальных животных, может оставаться в течение многих часов
связанным со стенками гранул. Это позволяет базофилам сохранять сущест-
венную ферментативную активность в отношении локальных субстратов в те-
чение еще длительного времени после окончания реакции чувствительности не-
медленного типа.
И тучные клетки, и базофилы продуцируют пероксидазу, супероксид и
пероксид водорода, что свидетельствует о возможных цитоцидных эффектах,
аналогичных эффектам нейтрофилов [187]. Пероксидаза тучных клеток может
также принимать участие в инактивации МРВ, подобно тому, как это происхо-
дит в эозинофилах [180].
В ответ на ряд иммунологических и неиммунологических стимулов тучные
клетки крыс, лейкоциты человека и фрагменты легких человека и морских сви-
нок секретируют протеолитический фермент, превращающий очищенный и
неочищенный препараты кининогена в кинин. Этот фермент, выделяющийся
из лейкоцитов (главным образом, по-видимому, из базофилов), стимулирован
ных антигеном, получен в очищенном виде [272, 2731. Наиболее активная фрак-
ция имела мол. массу 1000—2000 кДа, причем ее активность в отношении ки-
ниногена плазмы человека была не ниже, чем у калликреина. Кроме того, име-
лись активные фракции с мол. массой 400 и 180 кДа. Фермент типа калликреина
особенно активен в отношении эфиров тозил-Ь-аргинина; он действует на кини-
ноген плазмы, хотя не исключено, что кининогены тканей являются не худшими,
если не лучшими субстратами.
Высвобождающиеся из тучных клеток гранулы активно поглощаются мак-
рофагами, нейтрофилами и эозинофилами, и, следовательно, они сами и их
продукты могут играть какую-то, пока еще не совсем понятную роль в различ-
ных процессах, следующих за интернализацией этих клеток [173]. Препараты
гранул тучных клеток, по-видимому, не содержащие таких растворимых медиа-
торов, как гистамин, вызывают подострые воспалительные реакции в коже;
очевидно, в них содержатся другие медленно секретирующиеся молекулы, не-
посредственно участвующие в воспалении [187, 274, 275]. К таким молекулам
относится недавно описанный олигопептид, связанный с гранулами; мол. мас-
са этого олигопептида составляет 1400 [154]. Существованием этих и других
200
Ч. В. Паркер
продуктов тучных клеток могут частично объясняться замедленные кожные и
бронхиальные реакции при иммунологической и неиммунологической стимуля-
ции секреции в тучных клетках.
27.4.3 . Тромбоциты
Тромбоциты — это не размножающиеся клетки, циркулирующие в кровя-
ном русле и участвующие в свертывании крови; они происходят из мегакариоци-
тов костного мозга. Формально тромбоциты не входят в иммунную систему, од-
нако при иммунных реакциях они могут активироваться. Активированные
тромбоциты секретируют факторы роста и свертывания, вазоактивные амины и
липиды, нейтральные и кислые гидролазы; каждое из этих соединений может
участвовать в воспалении [276, 277]. Активированные тромбоциты агрегируют;
с образующимися при этом агрегатами могут связывать отвечающие лейкоци-
ты, вызывая в результате закупорку сосудов.
27.5. Медиаторы
Современные представления о роли медиаторов в реакции гиперчувстви-
тельности основаны на ряде экспериментальных подходов: а) прямом определе-
нии медиаторов и их метаболитов в тканях, крови, серозной жидкости, моче и
секрете дыхательных путей в процессе или по окончании реакции гиперчувст-
вительности in vivo; это позволило выявить секрецию медиаторов, образование
или исчезновение их de novo, а также морфологически обнаружить дегрануля-
цию клеток; б) исследовании in vitro типа и количества медиаторов, секретируе-
мых клетками, тканями и линиями культивируемых клеток, а также исследо-
вании людей или животных с заболеваниями, затрагивающими клетки, проду-
цирующие медиаторы (мастоцитоз человека, базофильный лейкоз); в) изучении
спектра медиаторов, их эффективности, продолжительности фармакологического
воздействия и чувствительности к фармакологическому ингибированию в опы-
тах с использованием очищенных медиаторов или смеси медиаторов на клетках,
сосудах или препаратах гладких мышц; г) патологоанатомическом или физио-
логическом изучении тканей in vivo после введения (путем инъекции, инга-
ляции или per os) отдельных медиаторов; использовании таких систем для вы-
явления потенциальной активности антагонистов медиаторов; д) определении
in vivo при реакциях гиперчувствительности эффектов веществ, разрушающих
данный медиатор (Н2О2 или каталаза), или избирательно блокирующих конеч-
ное их действие на тот или иной орган (антигистаминные препараты), т. е. вы-
явлении снижения патологических или физиологических проявлений реакции
гиперчувствительности; исследовании животных с врожденными и приобретен-
ными нарушениями клеток, секретирующих медиаторы (животные с недоста-
точностью эозинофилов, которым введены антитела против эозинофилов; мыши
линии W/W с недостаточностью тучных клеток), образования медиаторов (ин-
гибиторы гистидин-декарбоксилазы); запасания медиаторов (резерпин), дейст-
вия медиаторов (линии мышей, не чувствительных к гистамину); е) демонстра-
ции тахифилаксии (избирательной способности клетки или ткани к пониженной
восприимчйвости к медиаторам) во время или сразу после окончания реакции
гиперчувствительности in vivo.
Хотя эти исследования и помогли понять особенности функционирования
большинства медиаторов, все же они имеют определенные границы, а в нашем
понимании этой проблемы есть существенные пробелы. Во-первых, такие медиа-
27. Медиаторы: высвобождение и функции
201
торы, как брадикинин, ФАТ или фактор С5а in vivo нестабильны, что снижает
точность количественных исследований. Во-вторых, любые изменения, проис-
ходящие в крови и моче при аллергических реакциях, могут быть плохо замет-
ными из-за того, что медиаторы типа гистамина образуются в организме повсе-
местно и создают высокий фон. В-третьих, инъекция медиатора животному или
введение его в виде аэрозоля не обеспечивают их доставки в те участки тела, где
они высвобождаются при аллергической реакции in vivo. В-четвертых, нет
такого ингибитора, который действовал бы полностью и был бы абсолютно спе-
цифичен. Более того, гетерогенность рецепторов медиаторов, например сущест-
вование Нг и Н2-рецепторов для гистамина и наличие множества мишеней для
действия медиаторов, в ряде случаев активирующихся одновременно (и опять-
таки в качестве примера можно привести гистамин), затрудняет интерпретацию
полученных данных. В-пятых, информация о локальных концентрациях медиа-
торов при реакции гиперчувствительности in vivo очень ограничена. В-шестых,
существуют значительные различия между видами животных в природе и ме-
ханизмами их реакции гиперчувствительности, в связи с чем данные, получен-
ные на животных одного вида, нельзя экстраполировать на животных других
видов. В-седьмых, необходимо учитывать возможные различия между особями
одного вида в чувствительности к медиаторам, а также в образовании, разру-
шении и нейтрализации последних.
27.5.1. Гепарин и другие протеогликаны
Гепарин — протеогликан с множественными сульфатными группами, со-
стоящий из остатков глюкуроновой и идуроновой кислот и 2-глюкозамина, в
большом количестве содержится в тучных клетках животных многих видов
[187, 194]. Неочищенные экстракты тканей, например легких, обычно содержат
гепарины меньшей молекулярной массы, что, возможно, объясняется протео-
лизом, происходящим в процессе выделения, поскольку известно, что многие
ткани содержат значительную гепариназную активность. Например, коммер-
ческие препараты гепарина, используемые для предотвращения свертывания
крови, обычно имеют мол. массу 25 кДа или меньше. По данным одной работы,
гепарин, выделенный из очищенных тучных клеток крысы, имеет мол. массу
750 кДа, а гепарин из частично очищенных тучных клеток легких — мол. массу
в среднем 60 кДа [278]. Следовательно, нативные гепарины, содержащиеся
в этих клетках, имеют большую молекулярную массу. Кроме деградации гепа-
риназой гепарин нейтрализуется протамином, ГЩБ и другими противоположно
заряженными молекулами. Гепарин образует комплексы с антитромбином, ко-
торые предотвращают коагулирующее действие тромбина, блокируя серин-эс-
теразу [187]. Подобным же образом гепарин подавляет действие других белков
сыворотки, участвующих в свертывании, в том числе фрагментов фактора XII,
ФА фактора Х1а, фактора 1Ха, калликреина и плазмина. Хотя гепарин наибо-
лее известен своей способностью предотвращать свертывание, антисвертываю-
щая активность высокомолекулярной формы из легких человека и перитонеаль-
ных тучных клеток крыс составляет лишь 10—20% активности коммерческого
препарата; и лишь 1/3 гепарина из тучных клеток человека связывается с анти-
тромбином 3 [279]. Гепарин тучных клеток может действовать как антикоагу-
лянт, особенно после частичной деградации, однако нельзя не отметить других
его функций: а) участие в регуляции клеточной пролиферации [280]; б) стиму-
ляция миграции эндотелиальных клеток в капиллярах [281]; подавление дейст-
вия комплемента [187]; г) регуляция реакции ГЗТ [282], возможно, путем вме-
шательства в процессы свертывания на поверхности макрофагов или вблизи
202
Ч. В. Паркер
от поверхности; д) нарушение зависимой от антител цитотоксичности эозино-
филов [283]; е) образование электростатических комплексов с ГЩБ; ж) усиле-
ние действия эластазы; з) стимуляция фагоцитоза и пиноцитоза [281]; и) конт-
роль связывания фермента с клеточной поверхностью [284]. Несмотря на все
эти проявления действия гепарина, его истинная роль в воспалительном про-
цессе неясна. Поэтому нельзя утверждать с достоверностью, что антикоагули-
рующая активность гепарина не является его главной функцией.
27.5.2. Гистамин
Гистамин (5-[}-имидазолилэтиламин) — двухосновный вазоактивный амин
образуется при декарбоксилировании гистидина [177, 187, 188, 194, 285—287].
У большинства видов гистамин локализован в тучных клетках и базофилах,
хотя у кроликов он содержится также в тромбоцитах. Основным ферментом, осу-
ществляющим превращение гистидина в гистамин, является гистидин-декарбо-
ксилаза. В клетках мастоцитомы мышей она представляет собой белок, состоя-
щий из одной полипептидной цепи с мол. массой 55 кДа [288]. В качестве ко-
фактора гистидин-декарбоксилазы используют пиридоксаль-5-фосфат. Тучные
клетки и базофилы содержат высокие концентрации этого фермента, в основном
локализованного в цитозоле. Образовавшись, гистамин откладывается в круп-
ных базофильных гранулах этих клеток, откуда он может быстро высвобож-
даться в случае активации клеток. Внутри гранул гистамин, по-видимому, су-
ществует в виде комплексов с карбоксильными группами молекул протеогли-
кана [194, 289]. В неактивированных базофилах периферической крови и пери-
тонеальных тучных клетках крысы гистамин не обновляется или обновляется
крайне медленно, в отличие от центральной нервной системы и пищеваритель-
ного тракта, где наблюдается заметный оборот гистамина [192]. Во время секре-
ции гистамина гранулы выбрасываются из клетки или соединяются со средой
через каналы, достигающие поверхности клеток. В таких условиях гистамин
быстро обменивается с внеклеточным Na+ и, высвобождаясь, проявляет свое
биологическое действие. Поскольку на долю гранул приходится почти 70%
сухого веса тучных клеток, а концентрация гистамина в гранулах, по-видимому,
превышает 0,3 М, то особенно в случае быстрой секреции гистамина локально
выделяются значительные его количества, так что его концентрация может до-
стигать 0,1 мМ [192]. Гистамин биологически менее активен, чем другие медиа-
торы реакции гиперчувствительности немедленного типа (например, JIT-D4,
ЛТ-В4, С5а, ФАТ), поэтому его высокие локальные концентрации, по-видимому,
необходимы для действия гистамина in vivo. Малые размеры молекул и способ-
ность к диффузии позволяют гистамину быстро распространяться из участков
секреции. Таким образом, действие гистамина в данном участке ограничивается
коротким промежутком времени. Клетки, высвободившие гистамин, остаются
жизнеспособными и, по крайней мере тучные клетки, по-видимому, постепенно
восполняют прежний запас гистамина, хотя этот процесс занимает много дней
[290]. Внеклеточный гистамин быстро метаболизируется. Через одну минуту
после введения меченого гистамина человеку более 95% его претерпевает мета-
болические превращения [291]. Большая часть гистамина у людей метилируется
по N-3 гистамин—метилтрансферазой, а затем окислительно дезаминируется
с помощью моноамин-оксидазы до З-метилимидазол-5-уксусной кислоты [285].
Большая часть или все, что остается, окисляется диамин-оксидазой (гистамина-
зой) до имидазол-5-уксусной кислоты, которая в свою очередь превращается
в рибозилимидазол-5-уксусную кислоту. Все эти метаболиты быстро выводятся
с мочой. Ферменты, участвующие в деградации гистидина, содержатся в лейко-
27. Медиаторы: высвобождение и функции
203
цитах, в плазме, а также во многих тканях. В моноцитах преобладает N-метил-
трансфераза, а в нейтрофилах и эозинофилах — гистаминаза [192].
Давно известное физиологическое действие гистамина проявляется в ин-
дукции сокращения гладких мышц трахеи, бронхов, кишечника и эндоэпители-
альных желез, а также в повышении проницаемости сосудов кожи и некоторых
других органов [188, 285]. Эти эффекты подавляются Нрингибиторами гиста-
мина — пириламином и хлорфениламином. Hi-рецепторы специфичны в основ-
ном к этиламиновой цепи гистамина. Увеличение проницаемости сосудов дости-
гается расширением терминальных артериол и сужением посткапиллярных
венул. Гистамин вызывает также кожный зуд, определяемый наличием Щ-
рецепторов. Блокаторы Н2-рецепторов (химетидин, метиамид, буримамид) по-
давляют ряд других эффектов гистамина — индукцию секреции кислоты в же-
лудке, инотропное и хронатропное действие на сердце и различные воздействия
на лейкоциты [286, 287]. Как правило, влияние Н2 опосредуется сАМР, содер-
жание которого повышается в результате стимуляции аденилат-циклазы. В
этом случае связывание зависит от атомов азота и других компонентов пяти-
членного имидазольного кольца.
Степень участия гистамина в реакциях локальной и системной анафилак-
сии различна у разных видов животных. Например, мыши практически устой-
чивы к гистамину, тогда как морские свинки — чувствительны. У человека
гистамин играет существенную роль в возникновении кожной гиперемии и
аллергического ринита; об этом свидетельствует терапевтический эффект Щ-
блокаторов [196]. Роль гистамина в возникновении астмы и системной анафи-
лаксии менее очевидна. Гистамин, введенный в виде аэрозоля, вызывает спазм
бронхов, особенно у больных астмой. Он способен также вызывать сокращение
препаратов гладких мышц трахеи и бронхов in vitro. Поскольку Нх-инактива-
торы гистамина неэффективны в случае астмы, можно предположить, что дру-
гие медиаторы играют более важную роль в возникновении анафилаксии. Крат-
ковременное повышение количества гистамина в крови наблюдается при си-
стемной анафилаксии [292], однако таких данных мало, а другие возможные
медиаторы не исследовались. Кратковременное увеличение количества гистами-
на в крови или моче наблюдается также при других заболеваниях: при экспе-
риментально вызванной крапивнице, при системном мастоцитозе, при миело-
пролиферативных болезнях, а также, неожиданно, при астме, вызванной экспе-
риментальной нагрузкой или вдыханием аллергена [177]. Кроме того, при ал-
лергических заболеваниях трудно или даже невозможно выявить повышение
содержания гистамина или его метаболитов в крови и моче. Некоторые эффекты
гистамина можно частично объяснить действием других медиаторов. Например,
во фрагментах легких человека гистамин повышает синтез ПГ-Е2 и ПГ-Р2а
[293], а последний является более сильным бронхоспазмогеном, чем сам гиста-
мин.
Вначале считалось, что в иммунном ответе гистамин играет лишь роль
медиатора реакции гиперчувствительности немедленного типа, однако недавно
оказалось, что он может прямо действовать на функции и миграцию лейкоцитов
[192, 287, 294—298]. Например, гистамин способен угнетать вызванную лекти-
нами или аллергенами пролиферацию Т-лимфоцитов, высвобождение лимфоки-
нов из Т-клеток, индукцию цитотоксических Т-клеток, цитолиз зрелыми цито-
токсическими Т-клетками, дифференцировку В-клеток, секрецию лизосомных
ферментов нейтрофилами и IgE-зависимое высвобождение гистамина из базофи-
лов. Помимо этого гистамин оказывает хемокинетическое и хемотаксическое
влияние на нейтрофилы и эозинофилы [299]. Концентрация гистамина, требуе-
мая для проявления этих эффектов, составляет 10 мкМ и более [192], и именно
204
Ч. В. Паркер
в таких пределах почти всегда образуется гистамин, хотя бы кратковременно,
in vivo во время реакции гиперчувствительности немедленного типа. Вообще
эти воздействия гистамина на лейкоциты угнетаются Н2-антагонистами. Дейст-
вие антигистаминных препаратов избирательно и подчиняется зависимости
доза — эффект, что подтверждает предположение о наличии на отвечающих
клетках специфических рецепторов для гистамина. Прямо доказать наличие
таких рецепторов трудно из-за слабой аффинности при взаимодействии; данные
по этому вопросу, полученные при исследовании макрофагов [300] и тимоцитов
[ЗОН, противоречивы.
Особый интерес представляет способность гистамина подавлять ответ Т-
клеток на антигены и лектины, поскольку это может быть обусловлено действи-
ем супрессорных Т-клеток и, следовательно, включать в себя обычные механиз-
мы контроля, опосредованные Т-клетками [294, 295]. В организме аллергиков
Т-клетки менее чувствительны к индукции гистамином супрессорной активно-
сти. Очевидно, более высокое содержание IgE у таких организмов связано с
низкой эффективностью контроля за биосинтезом IgE со стороны Т-лимфоцитов.
Хотя механизм Т-клеточной супрессии полностью не изучен, показано, что
Т-клетки, инкубируемые с гистамином в присутствии ЛАФ из моноцитов, сек-
ретируют лимфокины, опосредующие неспецифическую супрессию [116, 295,
302]. У морских свинок такие лимфокины (мол. масса 23—40 к ДА) подавляют
как образование фактора, ингибирующего миграцию (ФИМ, MIF), так и про-
лиферацию других Т-клеток, индуцированную митогенами и антигенами [116,
302].
Гистамин подавляет также индукцию дифференцировки В-лимфоцитов че-
ловека, хотя механизм такой супрессии, по-видимому, отличается от описанного
выше. В данном случае стимуляция гистамином супрессорной функции клеток
осуществляется путем превращения Т-хелперных клеток- в супрессорные Т-
клетки [303, 304], причем до сих пор в культуральном супернатанте не обнару-
жено растворимого ингибитора этого процесса. В результате кратковременной
обработки гистамином in vitro существенная часть Т-клеток человека с феноти-
пом ОКТ 4 (хелперный фенотип) меняет свой поверхностный фенотип на ОКТ 8
(фенотип супрессора); при этом повышается также Fc-рецепторная активность.
Сходное влияние на Т-клетки оказывает аденозин, хотя этот ответ аддитивен
и, кроме того, в ответе, по-видимому, участвуют различные популяции Т-лим-
фоцитов, на каждую из которых приходится около 10% общего числа Т-клеток.
Увеличение супрессорной активности связано с клетками и, по-видимому,
необратимо, по крайней мере после кратковременной инкубации с гистамином.
Напротив, вызванную гистамином супрессию цитотоксических Т-клеток можно
снять, удалив гистамин из среды, в которой клетки подвергаются дальнейшей
инкубации.
Биологическое значение этих столь различных эффектов гистамина еще
предстоит выяснить. Многие ингибиторные эффекты, вызываемые гистамином
в функциях лейкоцитов, расцениваются как антивоспалительные, способные
ограничивать как антителозависимую, так и клеточную гиперчувствительность
[5, 305]. Степень угнетения может быть различной в зависимости от фазы иммун-
ного ответа. Например, в первые несколько недель после иммунизации чувст-
вительность цитотоксических Т-клеток к угнетению гистамином повышается.
Возможно, это связано с изменением количества рецепторов гистамина или их
аффинности [260]. Такие изменения позволяют гистамину сильнее ограничивать
реактивность в поздней фазе ответа, чем в ранней.
С другой стороны, Н^эффекты воздействия гистамина на кровеносные сосу-
ды и кожу во время реакции гиперчувствительности немедленного типа, требую-
27. Медиаторы: высвобождение и функции
205
щие относительно низких концентраций препарата, являются скорее провоспа-
лительными. Гистамин оказывает провоспалительное действие при сывороточ-
ном васкулите, снимаемое Н1-антигистаминными препаратами у кролика [199] и,
возможно, у человека. В этом случае гистамин, по-видимому, действует на эндо-
телий сосудов через Щ-рецепторы, сходные (или идентичные) с теми, которые
участвуют в его действии на проницаемость сосудов, что предрасполагает к от-
ложению иммунных комплексов. Кроме того, гистамин может усиливать опос-
редованные Т-клетками ответы, воздействуя, вероятно, на мелкие кровеносные
сосуды или миграцию лейкоцитов [192], вызывая в результате эффект, противо-
положный супрессии, наблюдаемой in vitro. Суммируя различные наблюдения,
можно с уверенностью сказать, что гистамин сначала усиливает, а затем, позд-
нее, угнетает иммунные ответы.
Один из способов исследовать роль гистамина на разных стадиях иммун-
ного ответа — это использование Нх- и Н2-блокаторов in vivo. В таких иссле-
дованиях, проведенных на различных животных, а также на людях, блокиро-
вание Нх-антигистаминными препаратами анафилактических или сывороточных
ответов выражено значительно сильнее, чем влияние Н2-антигистаминных пре-
паратов на другие фазы иммунного ответа [286]. Возможно, при блокировании
Н2-рецепторов включаются иные механизмы контроля или само блокирование
бывает неполным. С другой стороны, точно так же возможно, что многие воз-
действия гистамина на лейкоциты, наблюдаемые in vitro, не имеют такого важ-
ного значения in vivo.
Помимо влияния на функционирование лимфоцитов определенно сущест-
вует возможность важных регуляторных воздействий Т-клеток на тучные клетки
и базофилы, в частности на их количество, распределение и функции. Накапли-
вается все больше данных о том, что лимфоциты, по-видимому, в основном Т-
лимфоциты, способствуют усилению биосинтеза гистамина, наличию клеток,
продуцирующих гистамин, а также самой способности секретировать гистамин,
опосредованной лимфокинами, которые: а) прямо стимулируют высвобождение
гистамина из тучных клеток и базофилов [223—225]; б) вызывают рост колоний
тучных клеток в селезенке из незрелых предшественников этих клеток в таких
органах, как селезенка, и колоний базофилов в костном мозге; в) прямо стиму-
лируют синтез гистамина в незрелых предшественниках тучных клеток и базо-
филов в костном мозге или в других органах, а также в зрелых тучных клетках,
повышая синтез гистидин-декарбоксилазы [306, 307]; г) действуют на мигра-
цию и локальное накопление базофилов [192, 231, 308, 309]. Эти эффекты про-
дуктов лимфоцитов — дополнение к хорошо изученной роли антител классов
IgE и IgGlt продуцирующихся В-лимфоцитами в процессе высвобождения гис-
тамина.
27.5.3. Серотонин
Серотонин (5-гидрокситриптамин) образуется из 5-гидрокситриптофана
под действием неспецифической карбоксилазы [177, 187, 285, 310]. Он содер-
жится в тромбоцитах и энтерохромаффинных клетках пищеварительного трак-
та, а также в различных других клетках и тканях, включая тучные клетки крыс
и базофилы кролика. Серотонин быстро превращается в 5-гидроксииндолацетат
при помощи моноаминоксидаз, содержащихся, например, в эндотелиальных
клетках легких или в других органах. Антагонистами серотонина на органном
уровне являются метилсергид и ципрогептадин [177]. Резерпин понижает кон-
центрацию серотонина в клетках, конкурентно вытесняя его из внутриклеточ-
ных участков, в которых он обычно содержится. Секретированный серотонин
затем быстро метаболизируется моноаминоксидазами.
206
Ч. В. Паркер
Влияние серотонина на сокращение гладкой мускулатуры и проницае-
мость сосудов подобно действию гистамина, но не столь сильное. Например,
система бронхов человека практически не чувствительна к введению серотонина
в виде аэрозоля, по сравнению с реакцией на введение ацетилхолина й других
спазмогенов [311]. Кроме того, тучные клетки и базофилы многих видов живот-
ных, в том числе человека, практически не содержат серотонина [177, 188, 285].
Действительно, роль серотонина в реакции немедленной гиперчувствительности
была показана лишь на мышах и крысах. Серотонин, возможно, играет сущест-
венную роль в реакции системной анафилаксии у кроликов (см. ниже). Источ-
ником серотонина у кроликов служат базофилы крови и тромбоциты; тромбоци-
ты высвобождают серотонин под влиянием ФАТ — мощного, индуцирующего
высвобождение агента, образующегося в базофилах. У людей, страдающих
метаболическим карциноидным синдромом, серотонин вызывает лихорадку,
диаррею и даже бронхоспазмы, а у пациентов с крапивницей — локальные кож-
ные изменения [177].
Серотонин представляет интерес также в связи с его возможной ролью в
реакции ГЗТ, в частности у мышей [201, 312]. Замечено, что у животных этого
вида локальная чувствительность кожи к ГЗТ прямо коррелирует с количеством
тучных клеток; морфологически заметная дегрануляция тучных клеток наблю-
дается на ранней и промежуточной стадиях. Медиатором тучных клеток при
реакции ГЗТ у мышей является, по-видимому, серотонин, а не гистамин; кожа
этих животных совершенно нечувствительна к гистамину, а сама реакция по-
давляется резерпином и ципрогептадином, но не антигистаминными препаратами
[201, 312]. Кроме того, тучные клетки, содержащие меченый серотонин, вскоре
теряют метку [312]. При реакции «чистой» ГЗТ максимальное высвобождение
серотонина наблюдается не менее чем через шесть или более часов после введе-
ния антигена; при этом, возможно, участвуют лимфокины, продуцирующиеся
сенсибилизированными Т-клетками. Механизм усиления серотонином реакции
ГЗТ до конца не выяснен. Можно, однако, думать, что он частично ускоряет
миграцию сенсибилизированных (и остальных) лейкоцитов через эндотелий со-
судов. Серотонин, кроме того, увеличивает чувствительность мононуклеаров
к различным факторам хемотаксиса, возможно, путем повышения концентрации
сАМР [313]; в присутствии серотонина стимулируется секреция Т-лимфоцита-
ми лимфокина, являющегося фактором хемотаксиса для моноцитов [314]. Хотя
для индукции образования лимфокина необходимы довольно высокие концент-
рации серотонина (100—1000 мкМ), однако в присутствии 10 мкМ гистамина
для индукции оказывается достаточно и 10 мкМ серотонина. Серотонин, гиста-
мин или они оба могут также принимать участие в развитии экспериментально-
го аутоиммунного энцефаломиэлита (ЭАЭ) у мышей [315]. Мыши линий SJL/J
и SWR/J, восприимчивы к ЭАЭ, когда им вводят гомогенат спинного мозга мы-
шей, конъюгированный с адъювантом из В. pertussis. Адьюваит, по-видимому,
повышает чувствительность кровеносных сосудов к гистамину и серотонину.
В такой системе антагонисты серотонина подавляют развитие ЭАЭ. Восприим-
чивость к ЭАЭ определяется соотношением генов Н-2 и генов, определяющих
чувствительность к вазоактивным аминам.
27.5.4. Фрагменты комплемента
Относительно мелкими полипептидными фрагментами СЗ, С4 и С5 являют-
ся, соответственно, СЗа, С4аи С5а (мол. масса примерно 10 000) [219] (табл. 27.1).
Эти фрагменты синтезируются при активации комплемента или системы свер-
тывания крови. Все эти фрагменты обладают анафилатоксической (гистамин-
27. Медиаторы: высвобождение и функции
207
Таблица 27.1. Сравнение анафилатоксинов
Молекуляр- ная масса С-концевые аминокислоты Биологическая активность
сокращение гладких мышц (подвздошная кишка морских свинок) 1) проницаемость кожи человека (in vivo), пм спазм бронхов морских свинок
С4 9 000 Leu-Gin-Arg 1500 нм 1—100
СЗа 9 000 Leu-Ala-Arg 6—15 нм 1—100 200—500 мкг/кг
С5а 11000 Leu-Gly-Arg 0,3—0,6 нм 0,01—0,1 8—10 ум/кг
1) Приведены пороговые концентрации
освобождающей) активностью в отношении тучных клеток и базофилов, что и
отражено наличием буквы «а» в их названии. Данные фрагменты вызывают ос-
вобождение содержимого гранул не только из базофилов, но и из других лейко-
цитов. Они индуцируют, кроме того, сокращение гладких мышц и, кроме того,
повышают проницаемость мелких кровеносных сосудов. Фрагмент С5а облада-
ет мощной хемотаксической активностью для некоторых видов лейкоцитов. Фраг-
менты СЗа, С4а, С5а сходны по последовательности аминокислот (в том числе
по расположению дисульфидных связей), по механизму биосинтеза и по биоло-
гической активности. Каждый из них образуется из С-концевого участка а-цепи
соответствующей молекулы комплемента и на С-конце содержит аргинин, су-
щественный для проявления биологической активности.
Наиболее изученным среди фрагментов комплемента (анафилатоксинов)
является С5а, щелочной фрагмент молекулы С5, имеющий мол. массу 12 000.
Хотя С-конец молекулы С5а необходим для биологической активности фраг-
мента, другие участки молекулы также нужны для проявления реактивности
и избирательности. С5а человека, в отличие от ряда С5а животных, в положе-
нии 64 содержит значительное количество углеводов, стабилизирующих моле-
кулу фрагмента [316]. Углеводная часть способствует модуляции активности
С5а человека после ферментативной модификации молекулы. В случае С5а че-
ловека отщепление С-концевого аргинина вызывает более резкое уменьшение
активности, чем в случае С5а животных [317]. В отсутствие углеводов разница
в активности факторов С5а животных и человека нивелируется. С5а обладает
сильной хемотаксической активностью для базофилов, моноцитов, нейтрофилов
и эозинофилов [219]. У человека С5а характеризуется наиболее мощной хемо-
таксической активностью, характерной для компонентов крови. С5а вызывает
агрегацию клеток, высвобождение гранулярных ферментов и медиаторов и,
возможно, фагоцитоз. Эти эффекты наиболее хорошо изучены в случае полиморф-
ноядерных лейкоцитов человека, содержащих примерно (1—3)-105 высокоаф-
финных участков связывания С5а на клетку [3, 18, 319]. С5а секретируется в
больших количествах при гемодиализе in vivo, а также при использовании
аппарата искусственного кровообращения у человека; по-видимому, данный
фактор играет большую роль в скоропроходящей лейкопении, часто сопровож-
дающей эту операцию и обусловленной быстрым накоплением в легких нейтро-
филов [320].
В концентрации 10-10—10-11 мМ очищенный фактор С5а повышает прони-
цаемость кровеносных сосудов кожи, вероятно, путем локального высвобожде-
ния гистамина из фиксированных в ткани тучных клеток [219]. Секреция гиста-
мина из перитонеальных тучных клеток крыс под влиянием С5а происходит
208
Ч. В. Паркер
сравнительно медленно в течение 30—60 мин, однако, аналогично ответу на
антиген и IgE, зависит от температуры, ионов Са2+ и наличия фосфатидилсерина
1321]. В базофилах периферической крови человека ответ на С5а наступает
значительно быстрее — через 20 с. он проявляется полностью, а интенсивность
его повышается в присутствии простагландинов [322, 323]. При внутритрахеаль-
ном введении фактора С5а животным различных видов очень быстро наступает
острая спазматическая реакция бронхов, которая может длиться более 20—
30 мин [219]. С5а значительно повышает секрецию МРВ, во всяком случае в
легких морской свинки; возможно, это является причиной возникновения стой-
ких спазматических реакций в бронхах различных животных [324]. Под влия-
нием С5а сокращаются гладкие мышцы трахеи, паренхимы легких, подвздошной
кишки, матки [219, 325]. Поскольку антигистаминные препараты существенно
тормозят ответ матки и подвздошной кишки на С5а, можно предположить, что
сам ответ зависит от гистамина, хотя нельзя исключить и наличие независимого
от гистамина компонента [326].
С5а подвергается быстрой ферментативной деградации, которая, вероятно,
имеет особенно важное значение при контроле его биологической активности
in vivo [219]. Отщепление С-концевого аргинина от молекулы С5а человека
разрушает большую часть хемотаксической активности фактора, хотя в присут-
ствии сыворотки некоторая активность сохраняется. Ферментом, ответственным
за эту инактивацию, вероятно, является N-карбоксипептидаза. Инактивация
происходит менее чем за одну минуту. Интересно, что фактор С5а, лишенный
аргинина, сохраняет существенную хемотаксическую активность, хотя и пред-
ставляет собой гораздо менее активный спазмоген. Инактивация С5а может
идти и другими путями.
Все факторы СЗА, выделенные у животных различных видов, имеют на
С-конце одинаковый пентапептид Leu-Glu-Leu-Ala-Arg. С-концевой октапептид
СЗа человека (остатки 70—-77), полученный с помощью химического синтеза,
полностью имитирует биологическую активность нативного СЗа, хотя его ак-
тивность в 50—100 раз ниже [327]. Вообще же эффекты СЗа практически повто-
ряют эффекты С5а, за исключением того, что, во-первых, активность СЗа су-
щественно ниже активности С5а, а, во-вторых, СЗа обладает менее чем 0,01 %
хемотаксической активности С5а.
СЗа и С5а вызывают сокращение подвздошной кишки морской свинки,
действуя, вероятно, на разные рецепторы. Об этом свидетельствует отсутствие
конкуренции между СЗа и С5а за связывание с полосками гладких мышц или
за секрецию серотонина из тромбоцитов; кроме того, при потере чувствительно-
сти к СЗа чувствительность к С5а сохраняется [219, 328, 329]. Сократительные
эффекты СЗа в основном подавляются антигистаминными препаратами, дейст-
вующими на Щ-рецепторы. Это свидетельствует о том, что фактор действует
не прямо, а посредством повышения секреции гистамина. Связывание СЗа с
перитонеальными тучными клетками крыс оценивается цифрой (5—10)-10е свя-
зывающих центров на клетку; при этом выявляется лишь 20% клеток [330].
Скорее всего, эти клетки обладают различными секреторными способностями,
что и ведет к значительной гетерогенности связывания их. с СЗа.
Наличие анафилатоксинов — факторов комплемента, указывает на воз-
можную связь болезней иммунных комплексов с процессом активации компле-
мента, в котором в основном участвуют антитела класса IgG и IgM, а также с
реакцией немедленной гиперчувствительности, в которой принимают участие
антитела класса IgE и IgGv Система комплемента участвует также в острых вос-
палительных реакциях при наследственном дефиците ингибитора эстеразной
активности С1.
27. Медиаторы: высвобождение и функции
209
27.5.5. Токсические метаболиты кислорода
Во время стимуляции фагоцитов возрастает поглощение кислорода и появ-
ляются его высокореактивные метаболиты. В нейтрофилах этот процесс начина-
ется через 30—60 с после стимуляции клеточной поверхности и не сопровожда-
ется ни фагоцитозом, ни секрецией лизосомных ферментов, хотя эти три про-
цесса обычно происходят одновременно [9]. Среди активных производных кис-
лорода в нейтрофилах обнаружены супероксид (О~)’, пероксид водорода (Н2О2),
гидроксильный радикал (ОН’) и, возможно, синглетный кислород (1О2). Помимо
нейтрофилов эти вещества вырабатываются также моноцитами, макрофагами,
тучными клетками, базофилами и эозинофилами. Производные кислорода спо-
собны повреждать ткани и микроорганизмы как сами по себе, так и в комбина-
ции с другими компонентами нейтрофилов (например, с миелопероксидазой,
активируемой Н2О2). Образование метаболитов кислорода в нейтрофилах, по-
видимому, необходимо для эффективного уничтожения микроорганизмов. Весь
кислород или его большая часть первоначально превращается в супероксид-
ный анион (О;)’, 80% которого в свою очередь превращается в Н2О2 — спон-
танным или ферментативным путем. Ферментом, осуществляющим образование
аниона, является скорее всего устойчивая к цианиду флавопротеин-оксидаза,
использующая в качестве донора электронов NADPH, хотя данные по этому во-
просу противоречивы [9]. Исследования, проведенные на нейтрофилах морских
свинок и кроликов, показали, что этот фермент (NADPH-оксидаза) в обычных
условиях латентен и что его Итах в процессе фагоцитоза резко повышается.
Первоначально фермент находили в азурофильных гранулах, однако по резуль-
татам последних исследований, проведенных на полиморфноядерных лейкоци-
тах, он может также локализоваться в плазматической мембране; в этом случае
он подвергается интернализации в фагоцитарные пузырьки, где его активность
сохраняется в течение длительного времени [9, 331].
Сходная последовательность событий происходит и в макрофагах легких
кролика, где за активацией фермента, находящегося на поверхности, следует
перенос его внутрь клетки 1332]. Эти данные свидетельствуют о существова-
нии двух разных участков локализации NADPH-оксидазы, и в этом нет противо-
речия, поскольку вполне возможно существование более чем одного типа фермен-
та [331, 333]. Косвенные данные свидетельствуют о том, что в нейтрофилах учас-
ток мембранного фермента, связывающий кислород, находится внутри самой
мембраны, в то время как NADPH связывается с той частью фермента, которая
локализуется на цитоплазматической стороне мембраны [333]. Независимо от
исходного местонахождения фермента он в конечном счете оказывается в фаго-
сомах, так что некоторая часть (О“)", продуцируемого активированными клет-
ками, производится, по-видимому, там. Хотя это и не доказано прямо, основной
продукт деятельности фермента — пероксид водорода — обнаруживается в
вакуолярном пространстве фагосом [7, 9]. Если в результате слияния гранул в
вакуолях оказалась также миелопероксидаза, она может активироваться перок-
сидом водорода и способствовать разрушению микроорганизмов. Н2О2 и миело-
пероксидаза, возможно, также инактивируют фермент, ответственный за обра-
зование супероксидазы в лизофагосомах; таким образом, становится понятным
тот факт, что через 15—30 мин ответ обычно прекращается [8]. Помимо перокси-
да из супероксида может также (особенно при кислотных значениях pH) полу-
чаться синглетный кислород. Часть О~' может использоваться в ферментатив-
ных реакциях, не превращаясь в пероксид. По-видимому, супероксид способен
прямо взаимодействовать с рядом пероксидаз.
210
Ч. В. Паркер
Быстрый процесс превращения О*' в Н2О2 катализируется супероксид-
дисмутазой и частично NADPH-оксидазой. Супероксид-дисмутазы представля-
ют собой группу из трех различных ферментов, содержащих в качестве кофак-
торов марганец, железо или медь-цинк [7]. В обычных условиях эти ферменты
могут защищать клетки от повреждающего действия активных метаболитов
кислорода. Пероксид водорода разлагается глутатион-пероксидазой, каталазой,
миелопероксидазой, а также неферментативным путем — под действием восста-
новителей, в частности аскорбиновой кислоты или восстановленного глутатиона.
Как впервые показали Хабер и Вейс [334], пероксид водорода и О”’, будучи
в достаточных концентрациях, могут реагировать между собой в присутствии
ионов тяжелых металлов с образованием гидроксильных радикалов (ОН’).
Поэтому Fe3+, связанный с лактоферрином нейтрофилов человека, в 500—
1000 раз более эффективен при формировании ОН', чем Fe3+, входящий в состав
FeCl3 [66]; таким образом, одной из функций лактоферрина может являться
участие в реакции образования ОН’.
По мере изучения метаболитов кислорода стало ясно, что пероксид водо-
рода и некоторые другие метаболиты способны, по-видимому, непосредственно
участвовать в воспалительном процессе, поскольку секретируются во внекле-
точную среду [7, 9, 335—337]. Роль О”' и ряда других частично восстановлен-
ных метаболитов кислорода в воспалении, в котором участвуют нейтрофилы,
была выяснена с помощью нескольких ферментов: ксантиноксидазы, способст-
вующей выработке 0“’ в присутствии ксантина или пурина; супероксид-дисму-
тазы, превращающей О~’ в Н2О2, и каталазы, гидролизующей Н2О2. Наряду
с этими ферментами можно использовать также ингибиторы миелопероксида-
зы — азид и цианид. Было показано, что и пероксид водорода, и супероксид,
и ОН' для клеток токсичны; чувствительность в значительной мере определяет-
ся видом клетки-мишени. В некоторых случаях метаболиты кислорода, участ-
вующие в воспалительном процессе, для проявления своего эффекта должны
подвергнуться дальнейшим метаболическим превращениям. Так, система, про-
дуцирующая супероксид, вызывает воспаление в суставах и легких, предотвра-
щаемое супероксид-дисмутазой [338, 339]. Однако гораздо большей активностью
обладает нестабильный окислитель — гидроксильный радикал ОН’. Примеча-
тельно, что сульфиды и сульфоксиды, в том числе диметилсульфоксид, извест-
ный своей антивоспалительной активностью, являются хорошими разрушите-
лями ОН’ [339].
Пероксид сам по себе также может повреждать ткани, однако несмотря на
то что эндотелиальные клетки или личинки трихинелл чувствительны к дейст-
вию Н2О2 [170, 336], в большинстве систем для проявления такого эффекта тре-
буются нефизиологически высокие концентрации пероксида. Однако в сочета-
нии с миелопероксидазой и ионами галида пероксид водорода является весьма
эффективным цитотоксическим агентом для ряда систем [340]; комбинация этих
веществ обладает цитотоксическим действием на опухолевые клетки и микро-
организмы, наблюдаемым в присутствии лейкоцитов во многих системах in
vivo и in vitro. Это особенно важно при повреждениях, обусловленных иммун-
ными комплексами и комплементом в таких тканях, как, например, легкие
[335, 337]. Исследование легких представляет особенный интерес, поскольку
легкие чаще других органов подвергаются действию высоких концентраций
кислорода и именно легкие быстрее всего повреждаются в процессе лечения
методом гипербарической оксигенации или в результате обработки токсически-
ми дозами параквата [341]. Нет сомнений, что в повреждении легких участвуют
активные метаболиты кислорода. Клетки легочной паренхимы, альвеолярные
макрофаги, клетки, мигрирующие в воспалительный очаг в легких,— все они
27. Медиаторы: высвобождение и функции
211
способны образовывать метаболиты О2. Следовательно, каждый из восстанов-
ленных метаболитов (ОН’, Н2О2 и О“) может прямо или косвенно повышать ци-
тотоксический эффект лейкоцитов. Каким путем они это делают — окислением
липидов, аминов, тиолов или кетонов, модификацией ДНК или полисахаридов,
уменьшением концентрации NADPH или иным механизмом [341] —пока не-
ясно.
Высокореактивные метаболиты кислорода, по-видимому, принимают уча-
стие в процессе хемилюминесценции фагоцитирующих клеток. Существует при-
влекательная гипотеза о том, что индукция хемилюминесценции в нейтрофилах
связана с образованием синглетного кислорода. Однако не исключены и другие
возможности [11], например взаимодействие пероксидазы, галида и пероксида
водорода с образованием метастабильных продуктов обмена, или участие про-
дуктов деятельности липоксигеназы [342]. Окончательное решение этого вопро-
са еще впереди, однако уже сейчас ясно, что люминесценция нейтрофилов пря-
мо или косвенно зависит от наличия аниона супероксида, поскольку этот про-
цесс подавляется супероксид-дисмутазой; кроме того, люминесценция может
быть получена в присутствии изолированной системы образования супероксида
171.
Метаболиты кислорода принимают также участие а) в инактивации а-1
антитрипсина [343, 344], по-видимому, путем окисления метионина, сущест-
венного для проявления активности; б) в инактивации МРВ [180]; в) в инакти-
вации ФМЛФ окислением; г) в процессе неферментативного окисления арахи-
доната [345]; д)в индукции мутагенеза в присутствии полиморфноядерных лейко-
цитов и мононуклеаров [346]. Наличие этого последнего процесса подтвержда-
ется способностью нормальных лейкоцитов, в отличие от клеток, взятых у
больных хроническим гранулематозом, вызывать мутагенез в системе Эймса
(Ames).а-1 антитрипсин подавляет активность эластазы и ряда других фермен-
тов. Следовательно, его инактивация может приводить к воспалительному про-
цессу.
27.5.6. Кинины
Кинины представляют собой щелочные белки с низкой молекулярной мас-
сой, сходные с некоторыми другими медиаторами, участвующими в реакции
немедленной гиперчувствительности. Кинины изменяют тонус и проницаемость
кровеносных сосудов, снижают кровяное давление, вызывают или повышают
секрецию медиаторов лейкоцитами, а также в той или иной степени действуют
на подвижность лейкоцитов, хотя данные по этому вопросу противоречивы
[347]. Кинины образуются в плазме или в тканях в процессе активации сверты-
вания крови или протеолиза из белков более высокой молекулярной массы
(кининогенов) [348—350]. Образование кининов катализируется специальными
ферментами — калликреинами, большая часть которых представляет собой ар-
гининовые эстеразы. Наиболее активным и хорошо изученным кинином являет-
ся брадикинин — олигопептид, состоящий из девяти аминокислот (Arg-Pro-
Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg); этот фермент, подобно гистамину, повышает про-
ницаемость сосудов. В образовании брадикинина принимают участие три белка:
фактор Хагемана (фактор XII), прекалликреин и высокомолекулярный кинино-
ген (К-ВММ).
Все эти белки относятся к факторам свертывания, и их взаимодействие со-
ставляет первую существенную стадию в процессах свертывания и фибриноли-
за. Тройные комплексы из этих трех белков формируются на отрицательно за-
ряженных твердых поверхностях в местах повреждения стенок кровеносных
сосудов или тканей. К-ВММ ускоряет превращение прекалликреина, фактора
212
Ч. В. Паркер
Хагемана и фактора X в соответствующие активированные протеолизом формы,
которые в свою очередь индуцируют свертывание. В результате активации этих
белков сам К-ВММ разлагается с образованием брадикинина. Активированный
фактор XII и калликреин, получающийся при активации прекалликреина, так-
же вызывают образование проактиватора плазминогена из соответствующего
предшественника. В конечном счете формируется плазмин, в функцию которого
входят активация фибринолиза, системы комплемента и дальнейшего протео-
лиза фактора XII, в результате которого он теряет свертывающую актив-
ность, хотя все еще способен вызывать образование кининов. Таким образом,
в результате серии многокомпонентных взаимодействий индуцируется образо-
вание сгустка, а также его растворение. В различных точках сложной цепи фер-
ментативных превращений действует целый ряд ингибиторов протеиназ, таких,
как а-2-макроглобулин, а-1-антитрипсин и антитромбин III, снижающих обра-
зование факторов. Кроме того, что система комплемента непосредственно участ-
вует в процессе свертывания крови, существует связь между этими процессами
и в обратном направлении, а именно активация системы комплемента приводит
к инициации свертывания [192]. И в самом деле, некоторые белки, тормозящие
активацию комплемента, уменьшают также и свертывание крови.
Помимо реакций, ограниченных белками, присутствующими в плазме,
активированные лейкоциты могут выделять кинин-генерирующие ферменты,
уже обладающие протеолитической активностью и способные образовывать ки-
нины из белков плазмы. Например, нейтрофилы содержат кислые протеиназы,
продуцирующие лейкокинины из лейкокининогена — белка, содержащегося
в плазме при определенных условиях [40, 55, 351]. Лейкокинины — это олиго-
пептиды длиной 20—25 аминокислот, обладающие активностью кининов, но
отличающиеся от них структурой. Нейтрофилы содержат еще по крайней мере
два типа ферментов, образующих кинины. В моноцитах, лимфоцитах и базофи-
лах описаны и другие типы калликреинов [40, 272, 351]. В отличие от прекал-
ликреинов крови, происходящих из печени, эти калликреины образуются в
эндокринных и экзокринных железах. Калликреины из желез в качестве пре-
обладающего продукта продуцируют декапептид с N-концевым лизином (лизин-
брадикинин или каллидин) [350].
Хотя истинная роль активации свертывания крови и фибринолиза в реак-
циях гиперчувствительности разных типов in vivo неясна, эти реакции угнета-
ются антикоагулянтами (см. разд. 27.2); между тем при системной анафилаксии
нарушается процесс свертывания [292]. При генерализованной реакции Шварц-
мана часто развивается синдром диссеминированного внутрисосудистого сверты-
вания и может быть усилено и свертывание, и фибринолиз. Было показано, что
наиболее частый стимулятор реакции Шварцмана — эндотоксин — обладает
прямым действием на фибринолитическую активность лейкоцитов [352]. В про-
цессе активации фактора Хагемана могут образовываться следующие медиаторы
реакции гиперчувствительности [192, 348]: а) кинины как таковые; б) калликре-
ин (обладает хемотаксической активностью для базофилов, моноцитов и нейтро-
филов, хотя это доказано неполностью; вызывает образование С5а, Cis и С1г из
предшественников; активирует свертывание, а также нейтрофилы); в)фибринопе-
птиды (обладают хемотаксической активностью по отношению к нейтрофилам,
усиливают действие брадикинина, а также угнетают лимфоцитарный бластогенез)
[354, 356]; г) активатор плазминогена и плазмин (кроме всего прочего стимули-
рует хемотаксис, активирует комплемент и усиливает секрецию ферментов из
лейкоцитах и тромбоцитов).
Скорее всего кинины содержатся в тканях, в которых чаще происходят ре-
акции свертывания и гиперчувствительности, однако данные об их активности
27. Медиаторы: высвобождение и функции 213
как медиаторов воспалительных процессов противоречивы. В нормальной плазме
брадикинин находится в низкой концентрации, но поскольку он быстро дегра-
дирует (время полураспада менее 30 с) и поскольку при взятии и обработке об-
разцов крови его концентрация может искусственно повышаться, определить
его точную концентрацию очень трудно. Чаще всего деградация брадикинина
идет с отщеплением либо С-концевого аргинина (кининазой I), либо дипептида
Phe-Arg (кининазой II) [349]. В любом случае брадикинин, лишенный Phe-Arg,
теряет активность целиком, тогда как без аргинина, в зависимости от конкрет-
ных условий, он может обладать большей или меньшей активностью. Напри-
мер, в матке крысы и подвздошной кишке морских свинок имеются рецепторы
брадикинина типа В2, и в этих системах активность брадикинина, лишенного
Arg, существенно ниже. С другой стороны, в аорте кролика (рецепторы типа
BJ активность брадикинина без Arg возрастает. Следует отметить, что при по-
вреждении ткани количество рецепторов Вх повышается, так что существует
некая форма индукции рецепторов брадикинина.
Локальное введение брадикинина приводит к появлению отека и болезнен-
ных ощущений — все это проявления воспалительного процесса. Брадикинин
вызывает, с одной стороны, сокращение большей части изолированных гладких
мышц, с другой стороны — расширение сосудов, в том числе периферических
артерий. Многие эффекты брадикинина обусловлены вторичным увеличением
секреции простагландинов [348], а в некоторых случаях для проявления дейст-
вия брадикинина необходимы гистамин и серотонин. У больных астмой, в от-
личие от здоровых людей, брадикинин вызывает спазм бронхов. До сих пор не
найдено эффективного конкурента брадикинина за В1-рецепторы [349]. Действи-
тельно, угнетая ферментативную деградацию брадикинина, такие аналоги могут
существенно усилить его биологическое действие. Однако безаргининовый бра-
дикинин, содержащий в восьмом положении Leu, угнетает действие безаргини-
нового брадикинина на рецепторы типа В2.
27.5.7. Метаболиты арахидоновой кислоты
27.5.7.1. Основные пути обмена арахидоновой кислоты
Арахидоновая кислота (АК; рис. 27.1) содержит в своем составе четыре двой-
ных связи в 5-, 8-, 11- и 14-м положениях (считая от С-конца), что делает ее удоб-
ным предшественником во многих биосинтетических реакциях. В клетках мле-
копитающих существует два основных пути превращений арахидоновой кисло-
СООН
l0CX 16 18 20
11 12 13 15 17 19
Рис. 27.1. Структура арахидоновой кислоты
[Snider D. Е., Parker С. W. Prostaglandins.
In: Allergy: Principles and Practice, Midd-
leton E., Reed С. E., Ellis E. F. (eds)
p. 531, С. V. Mosby, St. Louis (1978).
ты — липоксигеназный и циклооксигеназный [45, 132, 357, 358] (рис. 27.2).
Биологически важные продукты действия липоксигеназ в лейкоцитах и туч-
ных клетках продуцируются под действием 5-липоксигеназ. В тромбоцитах
5-липоксигеназы отличаются от 12-липоксигеназ зависимостью от ионов Са2+,
а также природой и разнообразием получаемых продуктов. Среди последних
214
Ч. В. Паркер
имеются медленно реагирующие вещества (МРВ) (особенно глутатионил-МРВ
или лейкотриен С), дигидроксиэйкозатетраеноаты (особенно 5, 12-дигидрокси-
эйкозатетраеноат или лейкотриен В), моногидрокситетраеноат-5-гидрокси-6,8,
10,14-эйкозатетраеноат (5-ГЭТЕ) и его пероксид [43, 44, 358, 359]. Некоторые
клетки продуцируют также 8,9,11,15-моно- или дигидроксипроизвод е вещест-
ва, но в меньших количествах. До сих пор неясно, один или два ф мента при
нимают участие в этих превращениях; кроме того, не исключен также ро
12-ГЭТЕ
I
12-ГПЭТЕ
Фосфолипиды-
Арахидоновая
кислота
Простациклин*
-ПГ-6г/пГ-Н2
(эндопероксиды)
мрв(лт-с и лт-ti) 5 Г?ТЕ
'' Глутатион Т
~ 5-ГПЭТЕ
ГГТ
6-OKCO-nr-Fta
Простагландины
(ПГ-Р2в,ПГ-Е2,ПГ-В2')
Тромвоксан Аг
Тромбоксан В2
5,12 ди-ГЭТЕ
-(лейкотриен В)
Рис. 27.2. Пути метаболизма арахидоновой
кислоты. [Parker С. W. Immunopharmaco-
logy of slow-reacting substance of anaphy-
laxis. In: Immunopharmacology of the Lung,
Newhall H. H. (ed.), p. 30, Marcel Dekker,
Inc., New York (1982).]
неферментативного окисления. Биологически активные продукты, образующие-
ся под действием циклооксигеназы, получаются при окислении и циклизации
арахидоновой кислоты. К ним относятся: простагландины D, Е, F (ПГ-П2,
ПГ-Е2 и ПГ-Р2а), простациклин (ПГ-12, тромбоксан А2 (Тк А2) и эндопероксид-
ные промежуточные продукты. Эти метаболиты арахидоновой кислоты разли-
чаются клеточным происхождением, способностью подавлять действие фарма-
кологических препаратов, стабильностью и биологическим действием, нередко
оказываясь антагонистами. Все они являются продуктами активированных
(а не покоящихся) клеток и ни один из них не запасается в больших количест-
вах. Метаболиты арахидоновой кислоты в целом представляют собой весьма
важную группу веществ, регуляторные или модулирующие функции которых
в иммунной системе лишь начинают проясняться.
27.5.7.2. Образование свободного арахидоната
За исключением реакции, катализируемой 5-липоксигеназой, которая сама
должна быть активирована, скорость образования различных метаболитов ара-
хидоновой кислоты ограничивается наличием неэтерифицированной формы этой
кислоты. Поскольку почти вся арахидоновая кислота в клетках находится в
виде эфиров фосфолипидов и триацилглицеролов, а ее большая часть в крови
связана с белками плазмы, в момент активации этерифицированная кислота
должна ферментативно высвобождаться (рис. 27.3). Механизм ее высвобождения
до конца не установлен. До недавнего времени считалось, что в высвобождении
арахидоновой кислоты участвует фосфолипаза А2, отщепляющая из фосфолипи-
дов жирные кислоты в положении 2. Однако дальнейшие исследования, прове-
денные на тромбоцитах и тучных клетках, показали, что в этом процессе такое
же или даже большее значение имеет последовательное действие двух фермен-
тов — фосфолипазы С, образующей из фосфолипидов диацилглицерол (ДАГ),
27. Медиаторы: высвобождение и функции
215
и диацилглицерол-липазы, превращающей ДАГ в моноацилглицерол (МАГ)
и жирную кислоту [246, 360]. Не исключено также и участие фосфолипазы,
специфичной для ФК [361]. Несмотря на существование ферментативного пути,
главным источником арахидоновой кислоты в активированных лейкоцитах
является фосфатидилинозитол (ФИ), во втором положении которого находится
Фосфолипаза А,
HaCO^-C—R,
О
Фосфолипаза А2
r2— сДосн
О
Рис. 27.3. Участки фосфатидилхолина,
в которых действуют фосфолипазы. [Lenin-
ger A. L. Biochemistry, the Molecular Basis
of Cell Structure and Function, p. 290, Worth
Publishers, New York (1975).]
111
H2COp P-k
Фосфолипаза С CT
О Фосфолипаза D
OCHaCHaN+(CH3)3
необычайно высокая доля арахидоновой кислоты. Иногда в активированных
клетках через короткое время после стимуляции можно наблюдать общее сни-
жение концентрации ФИ. После появления свободной арахидоновой кислоты
начинают работать ферменты, метаболизирующие эту кислоту.
27.5.7.3. Продукты липоксигеназы
Липоксигеназы добавляют молекулярный кислород к цис, ^нс-1,4-пента-
диенам длинных цепей жирных кислот, превращая их в гидропероксиды и вы-
зывая перераспределение двойных связей [362]. В тех липоксигеназах, которые
уже изучены, содержится один атом Fe на молекулу. В определенных усло-
виях субстратами липоксигеназ могут служить также эфиры жирных кислот
и спирты. При использовании в качестве субстрата арахидоновой кислоты место
включения пероксида может быть различным в зависимости от специфичности
фермента. Благодаря пероксидам липоксигеназы подвержены аутокатализу и
аутоингибированию. Образование продуктов липоксигеназной реакции проис-
ходит быстро — в течение 5—10 мин после активации клеток, а затем полностью
прекращается даже в присутствии избытка экзогенной арахидоновой кислоты.
Первым ферментом биосинтетического пути МРВ и ЛТ-В4 является 5-липоксиге-
наза (5-ЛО) [43, 44, 357, 363]. Этот фермент превращает арахидоновую кислоту
в 5-гидроперокси-6,8,10,14-эйкозотетраеноевую кислоту (5-ГПЭТЕ), которая
в свою очередь ферментативным или неферментативным путем превращается
в МРВ, 5-ГЭТЕ или 5,12—диГЭТЕ. Кроме того, в этой реакции могут образо-
вываться тригидрооксикислоты. Один из путей метаболизма ЛТ-В4 — это вклю-
чение гидроксильной или карбоксильной группы в 20-е положение [359]. Нашей
группой была тщательно очищена 5-липоксигеназа из клеток RBL-1 [364].
Это зависимый от кальция фермент с мол. массой мономера около 90 кДа. Мо-
номерный белок совершенно неактивен, но в присутствии ионов Са2+ белок ди-
меризуется и приобретает полную активность. Другие двувалентные ионы, такие
как Mg2+ и Мп2+, не обладают таким действием, зависимостью фермента от Са2+
216
Ч. В. Паркер
может объясняться отсутствие активного фермента в нестимулированных клет-
ках. Однако, поскольку фермент может активироваться фосфолипидами или
ДАГ, существует еще и другой механизм активации. В стимулированных перито-
неальных макрофагах или нейтрофилах, в противоположность культивируемым
клеткам RBL-1 [363], можно наблюдать значительную активность 5-ЛО без
добавления активирующих веществ in vitro [43, 155]. Возможно, это объясня-
ется тем, что клетки уже были активированы in vivo.
27.5.7.4. Медленно реагирующие вещества
Медленно реагирующие вещества (МРВ) — семейство жирных кислот с
20 атомами углерода, имеющими в положении 5 гидроксигруппу, а в положе-
нии 6 — несколько боковых серусодержащих цепей (рис. 27.4). При их образо-
Арахидоновая кислота
Глутатионил-МРВ (ЛТ-С)
Цистеинил-МРВ (ЛТ-Е)
Рис. 27.4. Вероятная последовательность
образования некоторых основных МРВ,
начиная с глутатионил-МРВ с последую-
щим превращением в цистеинилглицил-МРВ
[Parker С. W. Immunopharmacology of
Цистеинилглицил-МРВ(/1Т-Ь)
slow-reacting substance of anaphylaxis. In:
Immunopharmacology of the Lung, New-
hall H. H. (ed.) p. 38, Marcel Dekker,
Inc., New York (1982).]
вании из арахидоновой кислоты в положениях 7 (транс}, 9(транс), 11(цис) и
14(цис) имеются 4 двойных связи. МРВ могут образовываться не только из АК,
но и из 5, 8, 11-эйкозатетраеновой и 5, 8, 14, 17-эйкозатетраеновой кислоты;
в этих случаях появляются МРВ с тремя или пятью двойными связями соот-
27. Медиаторы,: высвобождение и функции
217
ветственно. В обычных условиях in vivo (отсутствие специальной диеты) эти
продукты образуются, по-видимому, в крайне низких концентрациях, что объ-
ясняется нехваткой соответствующих субстратов. Боковыми серусодержащими
цепями могут быть глутатион, лейкотриен С (ЛТ-С4 при наличии четырех двой-
ных связей), цистеинилглицин [JIT-D (JIT-D4 при наличии четырех двойных
связей)] или цистеин [ЛТ-Е (ЛТ-Е4 — при наличии четырех двойных связей)]
[357]. МРВ были впервые описаны в 1938 г. При перфузии легких морской свин-
ки ферментами из яда кобры в перфузатах была обнаружена активность, вызы-
вающая характерное, медленно развивающееся сокращение изолированных глад-
ких мышц, подвздошной кишки морской свинки [365]. Эта же активность была
обнаружена в 1940 г. в легких сенсибилизированных морских свинок, перфузи-
рованных антигеном [3661; позднее было показано, что данная активность выс-
вобождается при аллергических реакциях, вызванных IgE-антителами. В ре-
зультате исследований, проведенных на линии лейкозных базофилов крыс, со-
держащих IgE-рецепторы, в нашей лаборатории было показано, что МРВ —
это метаболиты арахидоновой кислоты, образовавшиеся с помощью 5-ЛО [367—
369]. Позднее мы показали, что все виды МРВ имеют серусодержащую (боковую
цепь) [370] и идентифицировали две из трех цепей как глутатион и цистеин
[371—373]. Было также обнаружено, что МРВ, индуцированные иммунологи-
ческим и неиммунологическим путем, по своей структуре абсолютно идентич-
ны [374]. Самуэльссон и сотрудники [375] показали, что атомы серы находятся
в положении 6 и определили места двойных связей. Позднее они [376], а также
группа Морриса [377] идентифицировали цистеинилглициновую форму моле-
кулы МРВ, выявленного нами ранее. Окончательная структура и расположение
двойных связей в молекулах МРВ были независимо установлены с помощью
органического синтеза двумя группами — Хаммарстрема [3781 и Рокаша [379].
Установленными ими высоковероятными источниками МРВ являются лей-
козные базофилы крыс (линия RBL-1), клетки мастоцитомы мышей, перитоне-
альные альвеолярные моноциты и моноциты крови, нейтрофилы, эозинофилы,
базофилы крови человека, тучные клетки кишечника крысы, клетки человека,
лейкозные базофилы человека и различные сенсибилизированные системы лег-
ких [46, 135, 176, 357, 368]. Синтез МРВ может индуцироваться ионофором
А 23187, ФМЛФ, ядом кобры, активированным сывороткой зимозаном, иммун-
ными комплексами и агрегированными иммуноглобулинами. У морских свинок
высвобождение МРВ под действием антигена наблюдается из фрагментов легких,
сенсибилизированных как IgE-, так и IgGj-антителами; у человека же высво-
бождение МРВ осуществляется главным образом зависимым от IgE способом.
Оказалось трудно или невозможно продемонстрировать IgE-зависимое высво-
бождение МРВ при стимуляции антигеном изолированных перитонеальных
тучных клеток крысы [357], несмотря на то, что эти клетки образуют МРВ в
ответ на иммунологическую стимуляцию ионофором А 23187 и выделяют гиста-
мин в ответ на антиген. В связи с этим появились предположения и эксперимен-
тальные попытки показать, что основным источником МРВ при IgE-зависимых
аллергических реакциях в легких служат макрофаги или другие клетки, обла-
дающие рецепторами IgE [380]. С другой стороны, Лихтенштейн [267] недавно
показал, что в высокоочищенных тучных клетках легких человека синтезирует-
ся достаточно МРВ, чтобы обеспечить ответ в препаратах, полученных из легоч-
ного гомогената. Эти исследования, хотя и нуждающиеся в подтверждении, ука-
зывают на то, что, возможно, не следует искать другого источника МРВ при
аллергических реакциях, кроме тучных клеток.
Значительный интерес представляет поиск фармакологических препаратов,
угнетающих 5-липоксигеназу и предотвращающих образование МРВ и других
218
Ч. В. Паркер
продуктов деятельности 5-ЛО. Активность липоксигеназ ингибируется, на-
пример, такими антиоксидантами, как нордигидрогуаретовая кислота или
витамин Е [362, 363], однако эти агенты не специфичны для 5-ЛО и предотвра-
щают также и образование тромбоксана. Активность 5-ЛО частично подавляется
беноксипрофеном — антивоспалительным агентом, применявшимся в ограничен-
ной степени в клинике [381], однако он неспецифичен по отношению к 5-ЛО и
во всяком случае оказывает сильное токсическое действие. Наиболее избира-
тельными ингибиторами 5-ЛО являются ацетиленовые аналоги С19—С22 нена-
сыщенных жирных кислот [381], а также 15-ГПЭТЕ и 15-ГЭТЕ [382, 383]. Эти
соединения в определенных условиях могут служить физиологическими инги-
биторами фермента, поскольку некоторые клетки, обладающие 5-ЛО, синтези-
руют также и эти ингибиторы. Данные, полученные в последнее время в нашей
лаборатории, свидетельствуют о том, что самым сильным ингибитором 5-ЛО
служит 5-ГЭТЕ.
Последовательность событий, ведущих к присоединению SH-групп к обра-
зовавшемуся 5-ГЭТЕ и перераспределению двойных связей с образованием
МРВ, изучены хуже. Как будет обсуждаться ниже, ЛТС4 (глутатионовая форма
МРВ) — основная, а возможно, единственная форма МРВ, продуцирующаяся
клетками RBL-1 [383]. При лишении этих клеток восстановленного глутатио-
на биосинтез МРВ почти полностью прекращается [384]. Даже снижение кон-
центрации внутриклеточного восстановленного глутатиона на 30—40 %
может привести к ослаблению синтеза МРВ. Следовательно, физиологические
изменения концентрации глутатиона могут, по-видимому, контролировать син-
тез МРВ. Поскольку глутатион является основным внутриклеточным донором
SH-групп, его значение для образования МРВ очевидно. Является ли присоеди-
нение глутатиона ферментативным или неферментативным процессом,— вопрос
пока открытый. 5-ГПЭТЕ может прямо реагировать с SH-соедипениями с по-
мощью перестроенного промежуточного продукта — 5,6-эпоксида (лейкотриена
А), образующегося при реакции гидропероксигруппы с ближайшим углеродом в
положении 6 [359]. С другой стороны, более вероятно наличие ферментативного
процесса, поскольку ряд клеток, в том числе клетки RBL-1, содержат значитель-
ные количества S-глутатионтрансфераз, которые, возможно, и осуществляют
эту реакцию. Каков бы ни был механизм переноса SH-групп, вряд ли эта реак-
ция лимитирует скорость биосинтеза МРВ. Если к клеткам RBL-1 прибавить
экзогенную 5-ГПЭТЕ, то количество синтезируемого МРВ не будет зависеть
от присутствия ионофора А 23187 — наиболее известного стимулятора синтеза
МРВ в этих клетках [363, 365]. Это указывает на то, что клеточный механизм
присоединения гидропероксида к SH-группе полностью активирован и что ос-
новное назначение ионофора — обеспечить образование 5-ГПЭТЭ.
Новосинтезированный ЛТ-С4 быстро выделяется во внеклеточную среду,
где превращается в JIT-D4, а в конечном счете в ЛТ-Е4 — под действием фер-
ментов, имеющихся в плазме, самих лейкоцитах и тканях [386—388]. Превраще-
ние ЛТ-С4 в ЛТ-П4, по-видимому, происходит с участием обычных у-глутамил-
трансфераз, а затем, иногда, в присутствии аминопептидаз или карбоксипепти-
даз образуется ЛТ-Е4. Оба превращения сопровождаются заметными измене-
ниями биологической активности. Эти процессы были детально исследованы
в опытах с гомогенатом легких и на изолированных лейкоцитах, суспендиро-
ванных в среде, не содержащей ни сыворотки, ни белков плазмы. На таких
системах in vitro было показано, что реакция превращения ЛТ-С4 в ЛТ-П4
происходит в течение 3—5 мин и в первые 15 мин ЛТЛ)4 является основным
видом МРВ. Образование ЛТ-Е4 — процесс более медленный, и даже через
30 мин этого соединения в препаратах легких не больше, чем остальных МРВ
27. Медиаторы: высвобождение и функции 219
[386] .» В плазме человека такие превращения ЛТ-С4 могут происходить даже
при разбавлении плазмы в несколько тысяч раз [388]. МРВ могут подвергаться
изомеризации двойных связей или окислению серы, что такжэ приводит к
изменению их биологической активности. Судя по результатам исследований,
проведенных на мышах и обезьянах, и сами МРВ (особенно ЛТ-Е4), и их мета-
болиты в значительных количествах выводятся из организма с мочой и желчью
[389]. Природа, количество и распределение метаболитов МРВ у человека
подлежат дальнейшему исследованию.
Из биологических свойств МРВ наибольшее внимание привлекает их спаз-
могенное действие на гладкие мышцы. Сокращение мышц подвздошной кишки
или мышц трахеи морской свинки наблюдается при концентрации ЛТ-П4 0,1
пмоль/мл [369, 371, 390]. В случае подвздошной кишки JIT-D4 в 60—100 раз
более активен (в пересчете на один моль), чем гистамин, а ЛТ-С4 и ЛТ-Е4 —
соответственно в 2 и 10 раз менее активны, чем ЛТ-П4, но все еще активнее гис-
тамина [357, 387]. Существенно, что МРВ индуцируют устойчивое сокращение
гладких мышц, не вызывая тахифилаксии; поэтому продолжительность их
действия in vivo может быть велика [366]. Поскольку предполагается, что МРВ
играют существенную роль при бронхиальной астме у человека, особенный инте-
рес представляет их действие на гладкие мышцы дыхательного пути [391].
Действие МРВ на гладкие мышцы более специфично, чем действие первич-
ных простагландинов: вызванные ими сокращения избирательно подавляются
соединением FLP 55712 и родственными ему веществами [392], но in vivo это
соединение инактивируется. ЛТ-С4 вызывает сокращение, a JIT-D4 — расшире-
ние подкожных кровеносных сосудов, и оба они снижают артериальное давле-
ние [393]. В присутствии МРВ меняется активность клеток Пуркинье, и, воз-
можно, МРВ оказывают важное действие на центральную и периферическую
нервную систему [394]. Влияние МРВ распространяется на хемотаксис и вы-
свобождение ферментов из гранул, однако в этом отношении активность их су-
щественно ниже активности ЛТ-В4 [132], по крайней мере в тех системах, кото-
рые исследованы.
27.5.7.5. Дигидроксиэйкозатетраеновые кислоты
Лейкотриен В4 (ЛТ-В4) — это дигидроксиэйкозатетраеновая кислота [5(S),
12(В)-дигидрокси-6 {цис), 8, 10 {транс), 14 (грхс)-эйкозатетраеновая кислота]
с тремя сопряженными двойными связями. Это вещество индуцирует хемокине-
тическую активность и секрецию ферментов. В 1979 г. ЛТ-В4 был описан Борже
и Самуэльссоном [44]. Подобно МРВ и 5-ГЭТЕ, ЛТ-В4 продуцируется клетками с
помощью 5-ЛО, поэтому все эти три вещества обнаруживаются вместе. ЛТ-В4
образуется, вероятно, из 5-ГПЭТЕ под действием специфической гидроксили-
рующей ферментной системы, хотя вполне возможно, что наряду с этим про-
исходит и неферментативный гидролиз. При выделении ЛТ-В4 из образцов
биологического происхождения была получена смесь различных диастереоизо-
меров, которые можно отделить друг от друга и от ЛТ-В4 с помощью тонкослой-
ной или жидкостной хроматографии под высоким давлением. Эти вещества
являются, по-видимому, продуктами рацемизации ЛТ-В4, происходящей в
процессе очистки. В целом диастереоизомеры менее активны, чем ЛТ-В4
[132, 395, 396], хотя нельзя исключить, что какой-нибудь из них обладает высо-
коспецифичной активностью. Помимо 5, 12-ди-ГЭТЕ макрофаги и, возможно,
лимфоциты образуют также 8, 15-ди-ГЭТЕ [359], биологическая роль которой
неясна.
220
Ч. В. Паркер
Основными источниками ЛТ-В4 in vivo (как и МРВ) являются тучные клет-
ки, базофилы, нейтрофилы, эозинофилы и, возможно, лимфоциты. Максималь-
ное высвобождение ЛТ-В4 наблюдается через 5—10 мин после активации кле-
ток. Большая часть ЛТ-В4, продуцируемого нейтрофилами, остается связанной
с клетками, однако в конечном счете основная часть ЛТ-В4 появляется в среде
в виде неизменного ЛТ-В4 или его метаболитов [24]. При 37°С нейтрофилы чело-
века быстро превращают ЛТ-В4 в 20-ОН- или 20-СООН-производные [359],
значительно менее активные в отношении хемотаксиса и высвобождения фер-
ментов, чем ЛТ-В4; ЛТ-В4 в низкой концентрации (1 нмоль/мл или даже меньше)
стимулирует хемокинез нейтрофилов человека [132, 395, 396]. Однако в при-
сутствии белков плазмы, таких как альбумин, связывающих ЛТ-В4 и другие
липиды, для стимуляции хемокинеза требуются значительно большие его кон-
центрации. Два основных диастереоизомера ЛТ-В4, полученных биосинтетичес-
ким путем, в 3—10 раз менее активны в этой системе. В присутствии ЛТ-В4
активируется также движение эозинофилов, лимфоцитов и моноцитов, что ука-
зывает на общее влияние ЛТ-В4 на процесс миграции клеток. В более высоких
концентрациях ЛТ-В4 стимулирует хемотаксис нейтрофилов и некоторых дру-
гих клеток.
Низкие концентрации ЛТ-В4 стимулируют высвобождение лизосомных
ферментов из нейтрофилов человека [1321, хотя по данным большинства
лабораторий для проявления этого эффекта необходимо одновременное при-
сутствие цитохалазинов. 5-ГЭТЕ, правда, в высоких концентрациях вызывает
секрецию этих ферментов и без цитохалазинов [397]. Тот факт, что высвобожде-
ние ферментов из гранул совпадает во времени с внутриклеточным образованием
больших количеств и ЛТ-В4, и 5-ГЭТЕ, свидетельствует, конечно, о возможном
прямом участии одного или обоих этих липидов в секреции.
Высокая активность ЛТ-В4 в различных биологических процессах предпо-
лагает наличие высокоспециализированных рецепторов этого вещества. Хотя
связывание молекул растворимых липидов, подобных ЛТ-В4, не так просто-
изучать, как связывание полипептидов, тем не менее усилиями двух лабора-
торий было показано, что нейтрофилы человека содержат специфические рецеп-
торы ЛТ-В4 [398, 399]. Эти исследования проводились при 4°С, поскольку при
более высоких температурах ЛТ-В4 быстро распадается. По данным обеих
групп, среднее значение константы диссоциации комплекса ЛТ-В4 с рецепто-
рами составляет 1-107. Связывание в основном специфично. Об этом свидетель-
ствует следующее: в присутствии избытка немеченого (или меченного 14С ЛТ-В4)
связывание 3Н-ЛТ-В4 снижается на 80%. Связывание стереоспецифично:
диастереоизомеры ЛТ-В4 угнетают присоединение его к рецепторам, только
будучи взятыми в значительно большей концентрации (в 3—5 раз), чем ЛТ-В4.
Эти различия в связывании отражают разницу в уровне хемокинетической
активности данных соединений.
27.5.7.6. Моногидроксиэйкозатетраеновые кислоты
Основной продукт деятельности 5-липооксигеназы в лейкоцитах и тучных
клетках — это 5-ГЭТЕ [24, 363], которая получается при спонтанном или фер-
ментативном восстановлении 5-ГПЭТЕ и представляет собой преобладающую
форму моно-ГЭТЕ. По-видимому, первыми в процесс ферментативного восста-
новления вовлекаются пероксидазы, например глутатион-пероксидаза. Биоло-
гическая активность моно-ГЭТЕ существенно ниже активности МРВ и ЛТ-В4,
тем не менее в отношении хемокинеза и стимуляции высвобождения ферментов.
моно-ГЭТЕ проявляют значительную активность [132, 228, 230, 397] даже в
27. Медиаторы: высвобождение и функции
221
низких концентрациях. Возможно, моно-ГЭТЕ в первую очередь активны
в синтезирующих их клетках. Так, 5-ГЭТЕ индуцирует секрецию ферментов
специфических гранул нейтрофилов [397], а в тучных клетках и базофилах по-
вышает индуцированную антигеном секрецию гистамина, но сама по себе не-
активна [228, 230]. Подобной активностью обладает также и 5-ГПЭТЕ [230],
хотя в присутствии 5-ЛО она может превращаться в продукты, отличные от
5-ГЭТЕ. Механизм действия 5-ГЭТЕ не ясен, однако известно, что она имоно-
гидроксильные С20-жирные кислоты обладают интересным свойством: они
способны ковалентно связываться с фосфолипидами и триацилглицеролами
[24]. Хотя интенсивность такого связывания невелика, существование в «кри-
тических» участках липидных бислоев фосфолипидов, содержащих 5-ГЭТЕ,
оказывает значительное действие на текучесть и функции клеточной мембраны.
Сообщалось также, что гидропероксиды жирных кислот стимулируют гуанилат-
циклазу, повышая тем самым внутриклеточную концентрацию cGMP [400],—
еще один возможный механизм действия моногидроксипроизводных арахидо-
новой кислоты.
Возможно, что ТЭТЕ служат важными медиаторами воспалительного про-
цесса. Концентрация ТЭТЕ повышена в различных очагах воспаления — в коже
больных псориазом [401] и в синовиальной жидкости больных с воспалением
суставов [402].
27.5.7.7. Продукты циклооксигеназы
27.5.7.7.1. Циклооксигеназа
В циклооксигеназном пути молекулярный кислород присоединяется к
арахидоновой кислоте, образуя пару нестабильных промежуточных продуктов
(ПГ-О2 и ПГ-Н2) с циклопентановым кольцом каждый [45, 358], время полу-
распада которых в водном растворе составляет примерно пять минут. Актив-
ность циклооксигеназы проявляется в присутствии молекулярного кислорода
и усиливается простетической группой гема, связанной с молекулой фермента.
Активность циклооксигеназы существенно зависит от наличия пероксида. Даже
низкие концентрации пероксидов (0,1 мкМ) активируют фермент; более того,
для активности фермента, вероятно, необходимо хотя бы небольшое количество
пероксидов.
Поскольку липоксигеназная система образует гидропероксиды жирных
кислот, которые в свою очередь могут восстанавливаться глутатион-пероксидазой
и другими пероксидазами, оба этих фермента могут непрямым образом влиять
на циклооксигеназную активность. В отличие от липоксигеназы, способной
присоединять молекулы кислорода в различных положениях арахидоновой
кислоты, циклооксигеназа из многих тканей для образования циклопентанового
кольца использует лишь 8-, 9-, 10-, 11- и 12-й углеродные атомы арахидоновой
кислоты. Эти данные свидетельствуют о том, что циклооксигеназы различного
происхождения, по-видимому, очень сходны или вообще идентичны. В пользу
такого предположения свидетельствуют также иммунологические исследования
с использованием антител против циклооксигеназы, а также сходство условий
активации циклооксигеназ из различных тканей.
ПГ-Н2 образуется из ПГ-О2 с помощью восстановления гидропероксидной
группы в 15-м положении. В зависимости от типа ткани или клеток ПГ-Н2
может превратиться далее в простагландин, ТкА2 или простациклин, причем,
как правило, образуется смесь из двух или большего числа этих продуктов.
Какое из этих соединений образуется, зависит от присутствия и относительного
уровня активности соответствующих ферментных систем, а именно тромбоксан-
222
Ч. В. Паркер
синтетазы, простациклин-синтетазы, 11-кетол-изомеразы, 9-кетол-изомеразы и
9-кетол-редуктазы. Противовоспалительные агенты, в частности аспирин и
индометацин, подавляют активность циклооксигеназы, уменьшая тем самым
образование ПГ-Н2 и ПГ-в2. Следовательно, они подавляют также и образова-
ние конечных продуктов цепи циклооксигеназой реакции. Тем не менее прос-
тагландиновый, тромбоксановый и простациклиновый пути не обязательно ин-
гибируются в равной мере. Степень инактивации зависит, в частности, от от-
носительного значения Км отдельных ферментов, участвующих в последователь-
ных метаболических превращениях. Ни один из противовоспалительных аген-
тов не может считаться полностью специфичным в отношении циклооксигеназы.
Например, высокие концентрации индометацина угнетают активность перок-
сидазы тромбоцитов, превращающую 12-ГПЭТЕ в 12-ГЭТЕ [403]. На других
системах было показано, что индометацин ингибирует фосфолипазу А2, фосфо-
диэстеразу сАМР, сАМР-зависимую протеинкиназу и лизолецитин-ацилтранс-
феразу [358].
27.5.7.7.2. Простагландины
Простагландины представляют собой С20-жирные кислоты, содержащие
циклопентановое кольцо (рис. 27.5). Простагландины Е, F иН, синтезируемые
тканями в первую очередь, различаются по положению и типу замещающих
групп (гидрокси- или оксо- и гидрокси-) в циклопентановом кольце [45, 358].
Биосинтез простагландинов сопряжен с потерей двух двойных цепей; проста-
гландины, образующиеся из арахидоновой кислоты, сохраняют две двойные
связи (например, ПГ-Е2). ПГ-Н2 превращается в ПГ-О2 и ПГ-Е2 под действием
11-кетол-изомеразы и 9-кетол-изомеразы соответственно. Оба этих фермента
нуждаются в глутатионе. Помимо ПГ-Н2 субстратом 9-кетол-изомеразы может
служить ПГ-О2. Некоторые из этих реакций протекают неферментативным пу-
тем, поскольку образование простагландинов происходит и при спонтанном
распаде эндопероксидов. Существование изомеразы для ПГ-Б2а вызывает сом-
нения. ПГ-Р2а может быть образован из ПГ-Е2 под действием 9-кетол-редуктазы
или при прямом восстановлении ПГ-Н2.
Лейкоциты заметно различаются по способности продуцировать простаг-
ландины [134, 135, 266, 397]. Макрофаги и моноциты образуют значительные
количества ПГ-Е2, довольно много ПГ-Р2а и очень мало или совсем не синтези-
руют ПГ-D 2-Нейтрофилы продуцируют умеренные количества ПГ-Е2 и немного
или совсем не образуют ПГ-Р2а и ПГ-Б2. Тучные клетки синтезируют большие
количества ПГ-В2 и практически не производят ПГ-Р2а или ПГ-Е2. По неко-
торым данным лимфоциты иногда синтезируют ПГ-Е2 и реже ПГ-Е2а, но в зна-
чительно меньших количествах, чем моноциты и макрофаги. Поэтому было вы-
сказано предположение о том, что синтез большей части или всех простаглан-
динов в препаратах лимфоцитов может быть обусловлен небольшой примесью
моноцитов и макрофагов [404]. При исследовании небольшого числа линий Т-
и В-клеток было показано, что клетки двух этих типов синтезируют лишь незна-
чительное количество простагландинов. По-видимому, лимфоциты все же синте-
зируют небольшие количества простагландинов, по крайней мере при некоторых
условиях; в обычных же условиях главным источником простагландинов в лим-
фоидной ткани служат макрофаги. Особый интерес представляют синтези-
рующие ПГ-D2 линии тучных клеток [266] и базофилов [405], поскольку в
большинстве тканей либо вообще не происходит образования ПГ-О2, либо ПГ-О2
образуется присутствующими в ткани тучными клетками.
Интерпретация данных по синтезу простагландинов, полученных в разных
лабораториях, осложняется тем, что количество и даже спектр метаболитов
27. Медиаторы: высвобождение и функции
223
арахидоновой кислоты, синтезируемой клетками данного типа, у различных авто-
ров не совпадают. Исследование моноцитов периферической крови человека
[4061 показало, что противоречивость получаемых данных может быть обуслов-
лена использованием клеток из различных источников и несовпадением методов
их культивирования. Набор метаболитов арахидоновой кислоты, синтезируемых
моноцитами периферической крови in vitro, зависит от продолжительности
Простагландин А Простагландине Простагландине 0 ПростагландинD
Рис. 27.5. Производные арахидоновой кис-
лоты, образующиеся при действии цикло-
оксигеназ. [Metcalfe В., Kaliner М., Don-
Ion М. A. The mast cell. In: Critical Revi-
ews in Immunology, v. 3, p. 51, CRC Press,
Boca Raton, FL (1981).]
культивирования этих клеток. В первый день после адгезии клеток основными
продуктами синтеза были тромбоксаны и простагландины Е. На второй день
уровень синтеза простагландинов Е оставался высоким, а синтез ТкВ2 значи-
тельно снижался. Таким образом, на образование метаболитов арахидоновой
кислоты могут в значительной степени влиять дифференцировка клеток или
их избирательная гибель.
Подобно синтезу других метаболитов арахидоновой кислоты образование
простагландинов изменяется в результате стимуляции клеточной поверхности;
224
Ч. В. Паркер
возможно, при этом меняется доступность свободной кислоты [407, 408]. Напри-
мер, в макрофагах синтез простагландинов усиливается при воздействии на их
мембрану различных агентов — покрытых антителами эритроцитов, Согупе-
bacterium parvum, эндотоксина, двухвалентного катиона ионофора А23187,
комплексов антиген-антитело, колхицина, зимозана [134, 135, 407—409].
Однако некоторые из этих исследований были проведены на популяциях макро-
фагов, загрязненных лимфоцитами. Поэтому если полученные данные и досто-
верны, то, может быть, именно благодаря присутствию лимфоцитов и продук-
тов их секреции. Синтез простагландинов подвержен влиянию лимфокинов.
О важной роли лимфоцитов и их продуктов в модуляции образования проста-
гландинов макрофагами убедительно свидетельствуют последние работы, пока-
завшие, что лимфокины, образующиеся при инкубации сенсибилизированных
лимфоцитов с антигеном, способны стимулировать образование простагланди-
нов макрофагами [358]. Поскольку простагландины в свою очередь подавляют
синтез лимфокинов и митогенез Т-клеток, образование простагландинов макро-
фагами может служить примером отрицательной обратной связи, ограничиваю-
щей ответ лимфоцитов.
Давно известно, что простагландины влияют на тонус кровеносных сосу-
дов и сокращение гладких мышц. Сначала простагландины рассматривались
как гормоны, циркулирующие с кровью. В настоящее время, однако, известно,
что в крови простагландины быстро метаболизируются и классическим меха-
низмом действия гормонов не обладают. Иными словами, простагландины,
выделенные в периферическую кровь из одного органа, не модулируют клеточ-
ные функции других органов [45]. Основным путем метаболизма простагланди-
нов является окисление 15-ОН-группы с образованием соответствующего оксо-
соединения с помощью 15-ОН-дегидрогеназы простагландинов [45]. 15-оксо-
метаболит далее восстанавливается до 13,14-дигидропроизводного. Дальше
метаболизм идет по пути В- и W-окисления. Ферменты, катализирующие раз-
рушение простагландинов, широко распространены в тканях, особенно в лег-
ких. Более 90% введенного ПГ-Е2 инактивируется при однократном прохожде-
нии через легкие. ПГ-Е2, ПГ-В2 и ПГ-С2 также образуются из ПГ-Е2 при деги-
дратировании и изомеризации, однако преимущественно in vitro.
Эффекты, вызываемые действием простагландинов на иммунную систему,
разнообразны. Наиболее изученным и, как правило, наиболее биологически
активным из простагландинов является ПГ-Е2. Этот простагландин индуцирует
дифференцировку незрелых тимоцитов, В-лимфоцитов и клеток-предшественни-
ков гематопоэза, а также приобретение ими функциональных, морфологических
и иммунологических свойств зрелых лимфоцитов или кроветворных клеток
[358]. Так, добавление экзогенного ПГ-Е2 к тимоцитам in vitro приводит к уве-
личению содержания сАМР и вызывает пролиферацию тимоцитов [410]. Другие
агонисты сАМР действуют аналогичным образом. ПГ-Е2 увеличивает также чис-
ло эмбриональных тимоцитов мышей, несущих дифференцировочный антиген
Thy-1. ПГ-Е2 влияет на эритропоэз, действуя непосредственно на предшествен-
ник эритроцитов и освобождая эритропоэтин из почек. Тем не менее ПГ-Е2
стимулирует не все незрелые клетки. Образование колоний макрофагов и Т-кле-
ток заметно ингибируется ПГ-Е2 [411]. ПГ-Е2 может также влиять на дифферен-
цировку более зрелых клеток, о чем свидетельствуют опыты по индукции сек-
реции коллагеназы практически зрелыми моноцитами (см. разд. 27.2).
ПГ-Е2 ингибирует многие функции зрелых лейкоцитов. Он подавляет а)
пролиферацию Т- и В-клеток; б) хемотаксис, хемокинез, агрегацию, распласты-
вание и реакции окисления лейкоцитов; в) цитотоксичность, обусловленную
природными киллерами или Т-клетками; г) высвобождение медиаторов воспа-
27. Медиаторы: высвобождение и функции
225
лительного процесса, монокинов или лимфокинов из тучных клеток, базофилов,
нейтрофилов, моноцитов или лимфоцитов [12, 116]. Кроме того, и ПГ-Е2, и
ПГ-П2 подавляют агрегацию тромбоцитов. Большая часть этих эффектов, веро-
ятно, обусловлена прямым действием простагландинов на отвечающие клетки.
Это, однако, не так в случае подавления простагландинами пролиферации
лимфоцитов у мышей. Простагландины, выделяющиеся из мононуклеаров мыши,
стимулированных лектинами, вызывают высвобождение пептидов с мол. массой
38 и 15 кДа из Т-клеток, прикрепляющихся к стеклу, а эти пептиды в свою
очередь подавляют митогенез Т- и В-клеток.
Простагландины способны как вызывать воспаление, так и подавлять его.
Экзогенные простагландины вызывают лихорадку, эритему, увеличивают про-
ницаемость сосудов и расширяют их [45, 358]. Особенно активно расширяет со-
суды ПГ-Е3, хотя иногда он вызывает и обратный эффект. Расширение сосудов
распространяется на капилляры, артериолы, прекапилляры, сфинктеры и
посткапиллярные венулы. Хотя экзогенные простагландины сами по себе не
вызывают боли, они существенно усиливают боль и отек, вызываемые бради-
кинином и гистамином. Значительное количество простагландинов обнаружи-
вается в воспалительных экссудатах, причем в концентрации, достаточной для
индукции классических признаков воспаления. Более того, кинетика появления
простагландинов в воспалительных экссудатах согласуется с представлением
об их участии в воспалении в качестве медиаторов. Неясно пока, какие клетки
синтезируют простагландины при воспалении суставов и других органов, однако
возможно, что основным источником простагландинов в этих случаях являются
макрофаги. ПГ-Г2а, 15-оксо- ПГ-Р2ап и ПГ-П2 сокращают гладкие мышцы
бронхов, тогда как ПГ-Е2 расширяет их. ПГ-Р2а вызывает сокращение глад-
ких мышц матки.
Были сделаны попытки использовать противовоспалительное действие
ПГ-Е2 в клинике. Так, на экспериментальных животных показано, что в фар-
макологических концентрациях простагландины могут существенно подавлять
отторжение аутотрансплантатов, а также облегчать течение гломерулонефрита,
обусловленного отложением иммунных комплексов, и реакции Артюса [358].
В настоящее время неясно, обусловлено ли это явление первичным действием
простагландинов на кровеносные сосуды, или оно объясняется прямым влия-
нием на лимфоидные клетки.
Скорее всего, ПГ-Е2 оказывает свое физиологическое действие, изменяя
внутриклеточную концентрацию сАМР. Почти во всех исследованных тканях
или изолированных клеточных системах, включая тучные клетки, макрофаги и
нейтрофилы, ПГ-Е 2 стимулирует аденилат-циклазу и увеличивает внутриклеточ-
ную концентрацию сАМР [12]. В жировых клетках, однако, имеет место про-
тивоположная ситуация. Простагландины F-типа менее активно, чем ПГ-Е,
способствуют повышению содержания сАМР. В некоторых тканях простаглан-
дины Е, по-видимому, вызывают увеличение концентрации cGMP, а не сАМР.
Как было сказано выше, ПГ-Е2, ТкА2, ПГ-Н2 и гидропероксиды жирных кислот
также могут влиять на содержание сАМР и cGMP.
Хотя ясно, что различные метаболиты арахидоновой кислоты избирательно
действуют на систему циклических нуклеотидов, механизм такого действия
выяснен пока не до конца. Специфичность эффектов, а также диапазон концент-
раций, необходимых для действия (обычно несколько наномолей или микро-
молей позволяют предположить, что для этих метаболитов существуют специ-
фические рецепторы. Имеющиеся данные несколько противоречивы. Однако
были получены экспериментальные свидетельства в пользу присутствия таких
рецепторов для простагландинов на плазматических мембранах ряда тканей,
8-0395
226
В. Паркер
включая лимфоциты, печень, желудок, кору головного мозга и надпочечники.
Т ак, на плазматических мембранах из печени крысы существуют рецепторы,
специфически связывающие простагландины Е и характеризующиеся KD от
до 2,5-Ю-8. Высокоаффинное связывание (KD = 2-10~9) описано также
для тимоцитов крысы и мононуклеаров из крови человека [358, 412]. В обоих
случаях количество рецепторов составляет 200—300 на одну клетку.
Хотя экзогенные простагландины Е обычно подавляют аллергические
реакции, роль простагландинов как природных эндогенных регуляторов иммун-
ного ответа и воспаления неясна. Выдвигалось предположение о том, что про-
стагландины ответственны за подавление иммунного ответа при некоторых зло-
качественных новообразованиях, особенно при опухолях ретикулоэндотелиаль-
ной системы, например при лимфогрануломатозе. В ряде работ было показано,
что нормальные на вид лейкоциты периферической крови таких больных секре-
тируют больше ПГ-Е in vitro и особенно эффективны в подавлении ответов
Т-клеток [358]. Индометацин снимает эту супрессию. Кроме того, некоторые
опухолевые клетки синтезируют значительные количества простагландинов и
поэтому способны непосредственно оказывать иммуносупрессивное действие.
Некоторые лаборатории не смогли подтвердить эти данные, возможно, из-за
различий в условиях культивирования. Хотя ясно, что простагландины Е по-
давляют митогенез, для подобного действия требуются относительно высокие их
концентрации (10~6 М или выше). Концентрация ПГ-Е2 в культуральной среде
лимфоидных клеток, стимулированных в течение 12—24 ч, составляет примерно
10-8 М. Однако эти исследования могут не точно отражать ситуацию in vivo
поскольку не ясно, каково в организме количество клеток, выделяющих ПГ-Е,
в ответ на стимуляцию.
27.5.7.7.3. Тромбоксаны
Тромбоксан А2 (ТкА2) представляет собой лабильную жирную кислоту с
20 атомами углерода и шестичленным кислородсодержащим кольцом. ТкА2
впервые обнаружили в супернатантах тромбоцитов Хамберг и Самуэльсон [413].
Он синтезируется из ПГ-Н2 ферментом, называемым тромбоксан-синтетазой.
Тромбоксан-синтетаза, по-видимому, осуществляет также превращение ПГ-Н2
в 12-гидрокси-5,8,10-гептадекатетраеновую кислоту (ГГТ) — гидроксипро-
изводное С17-жирной кислоты, образуемое при отщеплении 9-, 10- и 11-го атомов
углерода циклопентанового кольца. Как правило, ТкА2 и ГГТ образуются в
клетках в примерно одинаковых количествах. ГГТ — это единственный из гид-
роксиметаболитов арахидоновой кислоты, который не является продуктом дей-
ствия липоксигеназы. Тромбоксан-синтетаза избирательно ингибируется заме-
щенными производными имидазола [414]. Это позволяет фармокологически
дифференцировать синтез тромбоксанов и простагландинов. Антиоксиданты
также ингибируют синтез ТкА2. Роль других метаболитов арахидоновой кислоты
в регуляции синтеза ТкА2 полностью пока не установлена. Перфузия легких
МРВ увеличивает образование ТкА2, однако не понятно, участвуют ли МРВ в
контроле синтеза ТкА2 в мозгу. Синтез тромбоксанов ингибируется также эндо-
пероксидами простагландинов.
В клетках млекопитающих основными источниками ТкА2, кроме тромбоци-
тов, являются макрофаги и моноциты [134, 135]. Тучные клетки, нейтрофилы и
лимфоциты служат плохим источником ТкА2. В препаратах этих клеток обна-
ружен синтез заметного количества ТкА2 [415]. Однако не исключено присутст-
вие небольшого количества тромбоцитов или моноцитов. Возможно, что в туч-
ных клетках, лимфоцитах и нейтрофилах содержатся ферменты, необходимые для
27. Медиаторы: высвобождение и функции 227
синтеза значительного количества тромбоксанов, однако их активность проявля-
ется лишь в определенных условиях.
Время полужизни ТкА2 в водном растворе составляет примерно 30 с, а
затем он спонтанно деградирует до ТкВ2. Поскольку ТкА2 чрезвычайно лабилен,
при исследовании метаболизма тромбоксанов обычно измеряют концентрацию
ТкВ2. Лабильность и отсутствие стабильного структурно родственного агонис-
та ТкА2 существенно задерживает изучение его биологической активности. Тем
не менее известно, что ТкА2 вызывает сильное сокращение сосудов, особенно
аорты кроликов. Он эффективно сокращает и гладкие мышцы трахеи, бронхов и
всей системы кровообращения. Из всех видов активности ТкА2 в отношении
клеток кровеносной системы, возможно, лучше всего исследована его способ-
ность вызывать агрегацию тромбоцитов [413]. Имеются данные о его возможной
роли в адгезии нейтрофилов. Ингибиторы синтеза тромбоксанов уменьшают ин-
дуцированный лектинами митогенез Т-клеток человека, причем активность их
как ингибиторов синтеза тромбоксана коррелирует с их активностью в качестве
ингибиторов митогенеза. Отсюда можно предположить, что тромбоксаны играют
определенную роль в индукции митогенеза [416]. Возможно, влияние ТкА2 на
митогенез может объясняться усилением межклеточных взаимодействий, которые,
как полагают, необходимы для ответа Т-клеток на такие митогенные лектины,
как Кон А. В отличие от ПГ-12 и ПГ-Е2, ТкА2 снижает внутриклеточную кон-
центрацию сАМР, по крайней мере в тромбоцитах.
Оказывает ли ТкВ2 значительное действие сам по себе, пока неясно. В тех
системах, в которых ТкА2 особенно активен, ТкВ2 в значительной степени ли-
шен активности. Основным продуктом обмена ТкВ2 является минорный ТкВ2,
образующийся при В-окислении. Физиологическая роль ГГТ неясна, хотя из-
вестно, что это соединение обладает слабой хемотаксической активностью для
нейтрофилов.
27.5.7.7.4. Простациклин
Простациклин-синтетаза катализирует превращение ПГ-Н2 в простациклин
(ПГ-12), который в свою очередь спонтанно деградирует в 6-оксо-ПГ-Р1а при
добавлении воды [45, 414]. Время полужизни ПГ-12 в водных растворах при
37°С и нейтральных значениях pH не превышает нескольких минут. Точкой
пересечения липоксигеназного и циклооксигеназного путей обмена является
ингибирование простациклин-синтетазы гидропероксидными промежуточными
интермедиатами — продуктами липоксигеназного пути [358]. ПГ-12 образуется
в эндотелии сосудов, а, возможно, также в макрофагах и в тучных клетках, хотя
данные, полученные разными авторами, разноречивы [417, 418]. Весьма вероят-
но, что некоторые популяции макрофагов синтезируют значительные количест-
ва ПГ-12, тогда как другие популяции такой способностью не обладают. Как
правило,» каждый тип клеток продуцирует или ПГ-12, или тромбоксан А2, но
не оба этих соединения. Эффекты, вызываемые ПГ-12 и ТкА2, часто бывают
противоположны и не исключено, что относительные количества этих двух аген-
тов служат физиологическими механизмами контроля.
Большая часть, или вообще все эффекты ПГ-12 в тканях обусловлены уве-
личением концентрации сАМР. ПГ-12 является мощным агентом, расширяющим
сосуды и ингибирующим агрегацию тромбоцитов. Эти эффекты также, по-види-
мому, обусловлены увеличением содержания внутриклеточного сАМР. ПГ-12
вызывает также сильную системную гипертонию. Воспалительный экссудат при
хронической гранулеме содержит повышенное количество метаболита проста-
циклина 6-оксо-ПГ-Р1а. Помимо расширения сосудов ПГ-12 увеличивает их
проницаемость, а также усиливает действие других медиаторов воспаления на
228
Ч. В. Паркер
проницаемость сосудов. Простациклин является мощным индуктором болевого
синдрома. 6-оксо-ПГ-Е1а может далее метаболизировать до продуктов, содер-
жащих оксогруппу в положении 15.
27.6. Факторы, активирующие тромбоциты:
ацетилглицерильный эфир фосфорилхолина
(АГЭФХ-фактор активации тромбоцитов)
Факторы активации тромбоцитов представляют собой семейство сходных
стабильных нейтральных липидов, содержащих глицерильную основу, фосфо-
рилхолиновую группу в третьем положении, длинноцепочечный алкилирован-
ный эфир (как правило, гексадецил или октадецил) в первом положении и этери-
фицированную ацетильную группу во втором положении [419]. Поскольку ак-
тивные молекулы представляют собой ацетилалкилглицерильные эфирные
аналоги ФХ, для них используются сокращения АГЭФХ или ФАТ. Ацетил-
глицерильные эфиры ФХ были первоначально описаны как относительно ста-
бильные соединения в супернатантах сенсибилизированных лейкоцитов пери-
ферической крови кролика, стимулированных антигенами. Эти соединения
вызывали агрегацию гомологичных или гетерологичных тромбоцитов и высво-
бождение из них вазоактивных аминов и нуклеотидов [420]. Как было показано
позже, аналогичная активность освобождается из лейкоцитов под действием
IgE [421]. Это свидетельствует о возможной роли ФАТ в реакциях немедленной
гиперчувствительности. В работе [422] было показано, что исследуемая моле-
кула имеет глицерилфосфорилхолиновую основу. Окончательную структуру
соединения установили Демопулос и др. [423]. Образование сходных или иден-
тичных соединений впоследствии было обнаружено в базофилах человека и
животных, в тучных клетках, нейтрофилах, моноцитах крови, легочных и
перитонеальных макрофагах, тромбоцитах,срезах легких и мозговом слое над-
почечников. Однако окончательная структура соединений из этих источников
пока не установлена. Неясно также, не обусловлен ли синтез ФАТ в этих образ-
цах присутствием других клеток. Кроме действия на тромбоциты, другие био-
логические эффекты ФАТ включают индукцию агрегации и секреции у нейтро-
филов, увеличение проницаемости сосудов и сокращения гладких мышц.
Ацетилглицерильные эфиры ФХ могут образовываться как при иммуноло-
гической, так и при неиммунологической стимуляции. Неиммунологические
факторы, индуцирующие образование АГЭФХ в нейтрофилах животных и
человека, включают смесь ФМЛФ и цитохалазинов или опсонизированный зи-
мозан [419]. Синтез ФАТ эффективно стимулируется в лейкозных базофилах
человека, лейкоцитах и других клетках под действием ионофора А23187. В ак-
тивированных нейтрофилах и базофилах кролика и в нейтрофилах человека
практически вся активность АГЭФХ образуется de novo во время стимуляции
клеток. В этих системах активность АГЭФХ выявляется уже через 15—30 с
после стимуляции. Активность секретируется в среду через несколько минут,
но даже в более поздние сроки ее количество в среде не превышает одной трети
общего количества синтезированного АГЭФХ. В лейкоцитах и легких человека
обнаружено значительное количество предсуществующего АГЭФХ. Не исклю-
чено, однако, что значительная часть этого АГЭФХ образуется при клеточном
и тканевом процессинге и еще предстоит доказать однозначно, что ФАТ дейст-
вительно существует еще до разрушения клеток.
Механизм биосинтеза АГЭФХ пока не установлен, хотя было показано, что
эта молекула может образовываться ферментативно. В ряде лимфоидных и
27. Медиаторы: высвобождение и функции
229
других тканей, в частности, был описан фермент ацетил-СоА : 1-алкил-2-лизо-
SN-глицерол-З-фосфохолин-ацетилтраисфераза, переносящий ацетильную груп-
пу на эфирные аналоги лизофосфатидилхолина [424]. Более того, известно, что
обычная фосфолипаза А2 способна использовать в качестве субстрата 1-алкил-
2-ацилглицерил-ФХ и, таким образом, синтезировать предшественник лизо-
ГЭФХ. Однако вопрос о том, участвуют ли эти ферменты в образовании ФАТ
при активации клеток, ответа пока не имеет.
In vivo АГЭФХ быстро разрушается. Основной путь инактивации, по-
видимому, включает деацетилирующие ферменты, присутствующие в липо-
протеидной фракции плазмы человека и животных [419, 425]. Имеются пред-
варительные данные в пользу того, что лизо-ГЭФХ обычно присутствует в
крови. Эти данные показывают, что ГЭФХ может освобождаться в кровоток и
деградировать даже в присутствии явной системной стимуляции [419]. Фермен-
ты, деацетилирующие АГЭФХ, присутствуют также в цитозоле печени и селе-
зенки [426]. Из этого следует, что инактивация может происходить не только в
крови, но и в тканях. Другой возможный путь инактивации состоит в расщеп-
лении эфирной или фосфатной связи.
Ацетилглицерильные эфиры ФХ индуцируют агрегацию тромбоцитов кро-
лика и человека, которая обратима, за исключением тех случаев, когда они
используется в высоких концентрациях [419]. Тромбоциты кролика агрегируют
уже при концентрации ФАТ порядка 10-11 М. Другие эффекты, вызываемые
действием ФАТ на тромбоциты, включают в себя высвобождение ADP и другого
содержимого гранул, ТкА2 (измеренного по содержанию ТкВ2), а возможно, и
других метаболитов арахидоновой кислоты. При высоких концентрациях
АГЭФХ агрегация, по-видимому, не требует предварительного высвобождения
ADP или метаболитов арахидоновой кислоты, хотя при более низких концент-
рациях наблюдается двухфазная агрегация, причем вторая фаза подавляется
индометацином и веществами, разрушающими ADP. В случае тромбоцитов
человека для агрегации требуются значительно более высокие концентрации
АГЭФХ. В связи с этим возникает вопрос: играет ли этот медиатор такую же
важную роль у человека, как это имеет место у кроликов. Как описано ниже,
при внутривенном введении кроликам АГЭФХ также наблюдается агрегация
тромбоцитов и образование ТкВ2 in vivo, хотя неясно, освобождается ли в этой
ситуации ТкВ2 именно из тромбоцитов.
Исследования на тромбоцитах кролика с использованием структурных
аналогов АГЭФХ свидетельствуют о том, что для индукции агрегации сущест-
венны все три группы, связанные с глицерильным остовом. Замещение алкиль-
ной группы в первом положении сложным эфиром органической кислоты с той
же длиной цепи приводит к падению активности в 250 раз. Природный аналог
АГЭФХ с алкильной группой 16 : 0 в 5 раз активнее, чем 18 : 0 алкил-АГЭФХ
[213]. Замещение ацетильной группы во втором положении остатком масляной
кислоты уменьшает активность примерно в 10 раз, тогда как лизо-АГЭФХ
вообще неактивен даже в очень высоких концентрациях. Отщепление холина
или ФХ приводит более чем к тысячекратному снижению активности. Мощные
конкурентные ингибиторы связывания АГЭФХ, которые могли бы быть ис-
пользованы для подавления его действия, в настоящее время не описаны.
Кроме действия на тромбоциты, АГЭФХ стимулирует также агрегацию
нейтрофилов человека, причем для этого достаточно таких низких концентраций
агента, как 0,1 нМ [427]. В присутствии цитохалазина В наблюдается также
освобождение из нейтрофилов ферментов, содержащихся в специфических и
азурофильных гранулах. При этом не наблюдается гибели клеток, а процесс
секреции зависит от гликолиза. Ацетил глицерильный эфир ФХ также индуцирует
230
Ч. В. Паркер
образование супероксида и хемотаксис нейтрофилов. Таким образом, АГЭФХ
обладает сильным действием как на нейтрофилы, так и на тромбоциты. В то же
время он не действует на тучные клетки и базофилы.
Быстрое внутривенное введение даже 2,5 мкг АГЭФХ взрослым кроли-
кам приводит к почти немедленной нейтропении, тромбоцитопении, гипотении и
к остановке дыхания, что вызывает гибель животного через несколько минут
[428]. При более низких, не летальных, дозах АГЭФХ уменьшение количества
тромбоцитов в периферической крови является обратимым и содержание тром-
боцитов в периферической крови возвращается к норме через пять минут, тогда
как нейтропения продолжается не менее 30 мин. У выживших животных от-
мечается, кроме того, увеличение давления в легочной артерии и увеличение
сопротивления при прохождении воздуха через дыхательные пути. Сходные
изменения наблюдаются также у сенсибилизированных кроликов при летальной
или нелетальной системной анафилаксии. Отсюда возникло предположение,
что ФАТ является существенным компонентом реакции гиперчувствительности
немедленного типа. Действительно в последнее время получены убедительные
доводы в пользу того, что у кроликов АГЭФХ играет важную роль в опосредо-
ванной IgE системной анафилаксии. К сожалению, пока почти нет данных о
роли АГЭФХ в системной анафилаксии у морских свинок или человека.
Некоторые из эффектов, наблюдающихся при введении ФАТ кроликам,
по-видимому, обусловлены непосредственно им самим. Другие эффекты, вероят-
но, опосредованы тромбоцитами или содержащимися в них веществами, о чем
свидетельствует отсутствие эффектов у животных с тромбоцитопенией, вызван-
ной предварительным введением антител к тромбоцитам [429]. Некоторые из
этих зависимых от тромбоцитов эффектов могут быть опосредованы ТкА3,
поскольку тромбоциты синтезируют значительное количество этого вещества,
а содержание ТкВ2 в плазме существенно увеличивается при введении АГЭФХ.
Тем не менее летальный эффект при внутривенном введении кроликам АГЭФХ,
возможно, не обусловлен ТкА2, поскольку введение индометацина не защищает
животных. При нелетальных реакциях снижение количества тромбоцитов в
крови связано с тем, что они задерживаются в тканях, в частности в легких,
и с образованием крупных агрегатов тромбоцитов, обнаруживаемых вмазках
крови. Эти агрегаты могут вызывать резкое повышение давления в сосудах
легких, что характерно для анафилаксии у кроликов.
Хотя действие внутривенного введения АГЭФХ на артериальное давление
и кровоток через легкие особенно сильно, АГЭФХ может оказывать физиоло-
гически значимое действие и на реактивность сосудов кожи, а также сократи-
мость гладких мышц [419—430]. Для индукции гиперемии и отека кожи чело-
века требуется в 100—1000 раз более низкая молярная концентрация АГЭФХ,
чем гистамина. Более того, низкие концентрации АГЭФХ вызывают пассивные
кожные реакции у обезьян, кроликов, морских свинок и крыс. Реакции кожи
человека не блокируются антагонистами гистамина, связывающимися с Нг
рецепторами; отсюда можно предположить, что АГЭФХ действует на тучные
клетки опосредованно. В сравнительно высоких концентрациях (0,1—1 нМ)
АГЭФХ вызывает медленный сократительный ответ в полосках подвздошной
кишки морской свинки, причем этот эффект слабо обратим. Это наблюдение
позволяет предположить, что АГЭФХ играет значительную роль в реакциях
гиперчувствительности немедленного типа. Кроме того, как это уже обсужда-
лось, АГЭФХ может вносить существенный вклад в иммунный сложный гло-
мерулонефрит у кроликов.
27. Медиаторы: высвобождение и функции
231
ЛИТЕРАТУРА
1. Waksman В. Cellular hypersensitivity and immunity: Inflammation and cytotoxicity. In:
Clinical Immunology, Parker C.W. (ed.), p. 173—218, Philadelphia, W.B. Saunders, 1980.
2. Meuer S., Zanker B., Hadding U., Bitter-Suermann D. Low zone desensitization: a stimulus-
specific control mechanism of cell response, Ja Exp. Med., 155, 698 (1982).
3. Askena.se P.W. Role of basophils, mast cells, and vasoamines in hypersensitivity reaction3
with a delayed time course, Prog. Allergy, 23, 119 (1977).
4. Sugiyama K., Utsumi K. Changes in membrane potential on histamine release from mast
cells: Measurements with a fluorescent dye, Cell Struct. Funct., 4, 257—260 (1979).
5. Melman K.L., Rocklin R.E., Rosenkranz R.P. Autocoids as modulators of the inflamma-
tory and immune response, Am. J. Med., 71, 100—106 (1981).
6. Murphy P. The Neutrophil, Plenum Medical Book Company, New York, 1976.
7. Klebanoff S.J., Clark R.A. The Neutrophil, Elsevier/North Holland, New York, 1978.
8. Roos D. The metabolic response to phagocytosis. In: Cell Biology of Inflammation, ed. by
G. Weissmann, p. 337, Elsevier/North Holland, Amsterdam, 1980.
9. Babior B.M. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes, N. Engl. J. Med., 298,
659-668 (1978).
10. Hoffstein S.I. Intra- and extracellular secretion from polymorphonuclear leukocytes. In:
Cell Biology of Inflammation, ed. by G. Weissmann, p. 387, Elsevier/North Holland, New
York, 1980.
11. Quie P.G., Millas E.L., Holmes B. Molecular events during phagocytosis by human neu-
trophils. In: Progress in Hematology, V. 10, ed. by E.B. Brown, p. 193, Grune and Strat-
ton, 1979.
12. Parker C.W. Modulation of lymphoid cell function and allergic responses. In: Advances
in Cyclic Nucleotide Research, ed. by P. Hamet and H. Sands, p. 181, Raven Press, New
York, 1980.
13. Stossel T.P. Phagocytosis: Recognition and ingestion, Semin. Hematol., 12, 83—116 (1975).
14. Newman S.L., Johnston R.B. Role of binding through C3b and IgG in polymorphonuclear
neutrophil function: Studies with trypsin-generated СЗЬ, J. Immunol., 123, 1839—1846
(1979).
15. Herman J.J., Rosner I.K., Davis A .E., Ill, Zeizer R.S., Arnaout M.A., ColtenH.R. Com-
plement-dependent histaminase release from human granulocytes, J. Clin. Invest., 63,1195—
1202 (1979).
16. Tenner A.J., Cooper N.R. Stimulation of a human polymorphonuclear leukocyte oxidative
response by the Clq subunit of the first complement component, J. Immunol., 128, 2547 —
2552 (1982).
17. Gallin J. Personal communication.
18. Fearon D. Personal communication.
19. Lind S.T., Yin H.L., Stossel T.P. Human platelets contain gelsolin, J. Clin. Invest., 69,
1384—1387 (1982).
20. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage
T4, Nature, 227, 680—685 (1970).
21. Stossel T.P. The mechanism of leukocyte locomotion. In: Leukocyte Chemotaxis, ed. by
J.I. Gallin and P.G. Quie, pp. 143—160, Raven Press, New York, 1978.
22. McPhail L.C., Henson P.M., Johnston R.B., Jr. Respiratory burst enzyme in human neu-
trophil, J. Clin. Invest. 67, 710-716 (1981).
23. Becker E.L., Showell H.J., Naccache P.H., Sha'afi R.I. The role and interrelationships of
Ca2+ and arachidonic acid metabolism in stimulated neutrophil functions. In: Biochemistry
of the Acute Allergic Reactions, ed. by E. Becker, A.S. Simon, and K.F. Austen, p. 257,
Alan R. Liss, New York, 1981.
24. Stenson W.F., Parker C.W. Metabolism of arachidonic acid in ionophore-stimulated neu-
trophils, J. Clin. Invest., 64, 1457—1465 (1979).
25. Bokoch G.M., Boeynaems J.M., Hubbard W.C. Chemotactic and chemokinetic activity of
products of mammalian lipoxygenase. In: Lymphokines, ed. by E. Pick, p. 271, Academic
Press, New York, 1981.
26. Volpi M., Naccache P.H., Sha'afi R.I. Arachidonate metabolite(s) increase the permeabi-
lity iof the plasma membrane of the neutrophils to calcium, Biochem. Biophys. Res. Com-
mun., 93, 1231—1237 (1981).
27. Becker E.L., Henson P.M. In vitro studies of immunologically induced secretion of media-
tors from cells and related fenomena, Adv. Immunol., 17, 94—193 (1973).
28. Plow E.F. Leukocyte elastase release during blood coagulation, J. Clin. Invest., 69, 564—
572 (1982).
232
Ч. В. Паркер
29. Johnston K.L., Varani J. Substrate hydrolysis by immune complex-activated neutrophils:
effect of physical presentation of complexes and protease inhibitors, J. Immunology, 127,
1875-1879 (1981).
30. Henson P.M., Schwartzman N.A., Zanolari B. Intracellular control of human neutrophil
secretion. J. Immunol., 127, 154—159 (1981).
31. Henson P.M. Pathologic mechanism in neutrophil-mediated injury, Am. J. Pathol., 68,
593—606 (1972).
32. Weissmann G. Goldstein I., Hoffstein S. Prostaglandins and the modulation by cyclic
nucleotides of lysosomal enzyme release. In: Advances in Prostaglandin and Thromboxane
Research, ed. by B. Samuelsson and R. Paoletti, p. 803—814, Raven Press, New York, 1976.
33. Jakowski S., Sha'afi R.I. Response of adenosine cyclic 3'5' monophosphate level in rabbit
neutrophils to the chemotactic peptide formyl-methionine-leucyl-phenylalanine, Mol. Phar-
macol., 16, 473—481 (1979).
34. Keller H.U., Gerisch G., Wissler J.H. A transient rise in cyclic AMP levels following che-
motactic stimulation of neutrophil granulocytes, Cell Biol. Int. Rep., 9, 759—765 (1979).
35. Smolen J.E., Weissmann G. Stimuli which provoke secretion of azurophil enzymes from
human neutrophils induce increments in adenosine cyclic 3'—5'-monophosphate, Biochim.
Biophys. Acta, 672, 197—206 (1981).
36. Simchowitz L., Fischbein L.C., Spilberg IAtkinson J.P. Induction of a transient elevation
in intracellular levels of adenosine 3'5'-monophosphate by chemotactic factors: An early
event in human neutrophil activation, J. Immunol., 124, 1482—1491 (1980).
37. Herlin T., Petersen C.S., Esmann V. The role of calcium and cyclic adenosine 3'5'-mono-
phosphate in the regulation of glycogen metabolism in phagocytozing human polymorpho-
nuclear leukocytes, Biochim. Biophys. Acta, 542, 63—76 (1978).
38. Ignarro L.J., George W.J. Mediation of immunologic discharge of lysosomal enzymes from
human neutrophils by guanosine 3'5'-monophosphate, J. Exp. Med., 140, 225—238 (1974).
39. Zurier R.B., Hoffstein S., Weissman G. Mechanisms of lysosomal enzyme release from human
leukocytes. I. Effect of cyclic nucleotides and colchicine, J. Cell Biol., 58, 27—41 (1973).
40. Wintroub В. V. Neutrophil-dependent generation of biologically active peptides. In: Advan-
ces in Inflammation, V. 4, ed. by G. Weissmann, p. 131, Raven Press, New York, 1982.
41. Weissmann G., Dakar P. The role of lysosomes in immune responses, Adv. Immunol., 12,
283-331 (1970).
42. Bainton D.F. The cells of inflammation: A general view. In: Cell Biology of Inflammation,
ed. by G. Weissmann, Elsevier/North Holland, New York, 1980.
43. Borgeat P., Hamberg M., Samuelsson B. Transformation of arachidonic acid and homo-y-
linolenic acid by rabbit polymorphonuclear leukocytes. Monohydroxy acids from novel
lipoxygenase, J. Biol. Chem., 251, 7816—7820 (1976).
44. Borgeat P., Samuelsson B. Arachidonic acid metabolism in polymorphonuclear leukocytes:
Effects of ionophore A23187, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 76, 2148—2152 (1979).
45. Moncada S., Flower R.J., Vane J.R. Prostaglandins, prostacyclins and thromboxane A2.
In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, ed. by L.S. Goodman and A. Gilman,
p. 668—681, Mac-Millan Publishing co., Inc., New York, 1980.
46. Czarnetski B.M., Konig W., Lichtenstein L. Eosinophil chemotactic factor (ECF). I. Release
from polymorphonuclear leukocytes by calcium ionophore A23187, J. Immunol. 117, 229—
234 (1976).
47. Lotner G.Z., Lynch J.M., Betz S.J., Henson P.M. Human neutrophil-derived platelet ac-
tivated factor, J. Immunol., 124, 646 —684 (1980).
48. Lazarus G.S., Daniels J.R., Lian J., Burleigh M.C. Role of granulocyte collagenases in
collagen degradation, Am. J. Pathol. 68, 565—576 (1972).
49. Tonnesen M.G., Klempner M.S., Austen K.F., Wintroub B.J. Identification of a human
neutrophil angiotensin Il-generating protease as cathepsin G. J. Clin. Invest., 69, 25—30
(1982).
50. Janoff A., Schaefer J., Scherer J., Bean M.A. Mediators of inflammation in leukocyte lyso-
somes. II. Mechanism of action of lysosomal protein upon vascular permeability in the rat,
J. Exp. Med., 122, 841—851 (1965).
51. Venge P., Olson I. Cationic proteins of human granulocytes. VI. Effects on the complement
system and mediation of chemotactic activity, J. Immunol., 115, 1505—1508 (1975).
52. Ranadive H.S., Ruben D.H. Mast cell-lysosomal cationic protein interaction: Effects of
motabolic inhibitors and decay of activated cells on enhanced fluorescence of anilinonaphta-
lene sulfonate, Can. J. Biochem., 59, 202—207 (1981).
53. Borel J. R., Keller H.U., Sorkin E. Studies on chemotaxis. XI. Effects on neutrophils of
lysosomal and other subcellular fractions from leukocytes, Int. Arch. Allergy, 35, 194—205
(1969).
54. Johnson U., Ohlsson K., Olsson I. Effects of granulocyte neutral proteases on complement
components, Scand. J. Immunol., 5, 421—478 (1976).
27. Медиаторы: высвобождение и функции
233
55. Greenbaum L.M., Kim K.S. The kinin-forming and kininase activities of rabbit polymorpho-
nuclear leukocytes, Br. J. Pharmacol., 29, 238—247 (1967).
56. Wright D.G., Gallin J.I. A functional differentiation of human neutrophil granules: Gene-
ration of C5a by a specific (secondary) granule product and inactivation of C5a by azurophil
(primary) granule products, J. Immunol., 119, 1068—1076 (1977).
57. Kelly M.T., White A. An inhibitor of histamine release from human leukocytes, J. Clin.
Invest., 53, 1341—1350 (1974).
58. Zeiger R.S., Twarog F.J., Colten H.R. Histamine release from human granulocytes, J. Exp.
Med., 144, 1049—1061 (1976).
59. Rapaport S.I., Hjort P.F. The blood clotting properties of rabbit peritoneal leukocytes
in vitro, Thromb. Diathes. Haemorrh., 17, 222—236 (1967).
60. Plow E.F., Edginton T.S. Alternative pathways for fibrinolysis. I. Cleavage of fibrinogen
by leukocyte proteases at physiologic pH, J. Clin. Invest., 56, 30—38 (1975).
61. Henson P.M. Mechanisms of release of constituents from rabbit platelets by antigen-antibody
complexes and complement. II. Interaction of platelets with neutrophils, J. Immunol.,
105, 490—501 (1970).
62. Horn R.G. Evidence for participation of granulocytes in the pathogenesis of the generalized
Shwartzman reaction: A review, J. Infect. Dis., 128, S134—S143 (1973).
63. Saba H.I., Roberts H.R., Herion J.C. The anticoagulant activity of lysosomal cationic
proteins from polymorphonuclear leukocytes, J. Clin. Invest., 46, 580—589 (1967).
64. Clark R.A., Szot S. Chemotactic factor inactivation by stimulated human neutrophils
mediated by myeloperoxidase-catalyzed methionine oxidation, J. Immunol., 128, 1507 —
1513 (1982).
65. Boggiolini M. The neutrophil. In: Cell Biology of Inflanemation, ed. by G. Weissmann,
p. 163—188, Elsevier/North Holland, New York, 1980.
66. Ambruso D.R., Johnston R.B. Lactoferrin enhances hydroxyl radical production by human
neutrophils, neutrophil particulate fractions, and an enzymatic generating system, J. Clin.
Invest., 67, 352—360 (1981).
67. Masson P.L., Heremans J .F., SchonneE. Lactoferrin, an iron-binding protein in neutrophilic
leukocytes, J. Exp. Med., 130, 643—658 (1969).
68. Leffell M.S. Spitznagel J.K. Association of lactoferrin with lysozyme in granules of human
polymorphonuclear leukocytes, Infect. Immunol., 6, 761—765 (1972).
69. Boros D.L. Hypersensitivity granulomas. In: Allergy: Principlesand Practice, ed. by E. Mid-
dleton, C.E. Reed and E.F. Ellis, pp. 101—114, C.V. Mosby, St. Louis, 1978.
70. Hocking W.G., Golde D.W. The pulmonary-alveolar macrophage, N. Engl. J. Med., 301,
580-587 (1979).
71. Nathan C.F., Murray H.W., Cohn Z. Current concepts: The macrophage as an effector cell,
N. Engl. J. Med., 303, 622-626 (1980).
72. Golde D.W., Hocking W.G. Monocyte and macrophage development. In: Advances in Host
Defence Mechanism, V. 1, ed. by J.I. Gallin and A.S. Fauci, pp. 13—30, Raven Press, New
York, 1982.
73. Griffin F.M., Jr. Mononuclear cell phagocytic mechanisms and host defence. In: Advances
in Host Defence Mechanism, ed. by J.I. Gallin and A.S. Fauci, pp. 31—55, Raven Press,
New York, 1982.
74. Edelston P.C., Monocytes and macrophages: Aspects of their cell biology. In: Cell Biology
of Inflammation, ed. by G. Weissmann, pp. 469—496, Elsevier/North-Holland, New York,
1980.
75. Henson M., Ginsberg M.H., Morrison D.G. Mechanism of mediator response by inflammato-
ry cells. In: Membrane Fusion, ed. by G. Poste and G.L. Nicolson, pp. 411—509, Elsevier/
North-Holland Biomedical Press, New York, 1978.
76. Na.kaga.wara A., Nathan C.F., Cohn Z.A. Hydrogen peroxide metabolism in human mo-
nocytes during differentiation in vitro, J. Clin. Invest., 68, 1243—1252 (1981).
77. Rabinovitch M. Phagocytic recognition. In: Mononuclear Phagocytes ed. by R. Van Furth,
p. 299—313, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1970.
78. Kurlander R.J., Batker J. The binding of human immunoglobulin G1 monomer and small
covalently cross-linked polymers of immunoglobulin G1 to human peripheral blood mono-
cytes and polymorphonuclear leukocytes, J. Clin. Invest., 69, 1—8 (1982).
79. Dower S.K., DeLisi C., Titus J.A., Segal D.M. Mechanism of binding of multivalent im-
mune complexes to Fc receptors. I. Equilibrium binding, Biochemistry, 20, 6326—6334
(1981).
80. Phillips-Quagliata J.M., Levine B.B., Quagliata F., l.'hr J.W. Mechanism underlying
binding of immune complexes to macrophages, J. Exp. Med., 133, 589—601 (1971).
81. Arend W.P., Mannik M. The macrophage receptor for IgG: Number and affinity of bind-
ing sites, J. Immunol., 110, 1455—1463 (1973).
234
Ч. В. Паркер
82. Unkeless J.C., Eisen H.N. Binding of monomeric immunoglobulins to Fc receptors of
mouse macrophages, J. Exp. Med., 142, 1520—1533 (1975).
83. Anderson C.L., Abraham G.M. Characterization of the Fc receptor for IgG on a human
macrophage cell line, U937, J. Immunology, 125, 2735—2741 (1980).
84. Dower S.K., DeLisi C. Titus J.A. Segal D.M. Mechanism of binding of multivalent im-
mune complexes to Fc receptors. II. Kinetics of binding, Biochemistry, 20, 6335—6340
(1981).
85. Barnett Foster D.E., Dorrington K.J., Painter R.H. Structure and function of immunoglo-
bulin domains. VIII. An analysis of the structural requirements in human IgGl for bind-
ing to the Fc receptor of human monocytes, J. Immunol., 124, 2186—2190 (1980).
86. Lane B.C., Cooper S.M. Fc receptors of mouse cell lines I. Distinct proteins mediate the
IgG subclass-specific Fc binding activities of macrophages, J. Immunol., 128, 1819—1824
(1982).
87. Lane B.C., Kan-Mitchell J., Mitchell M.S., Cooper S.M. Structural evidence for distince
IgG subclass-specific Fc receptors on mouse peritoneal macrophages, J.Exp. Med., 152,
1147—1161 (1980).
88. Diamond B., Yelton D.E. A new Fc receptor on mouse macrophages binding IgG3, J. Exp.
Med., 153, 514—519 (1981).
89. Boltz-N itulescu G. Plummer J.M., Spielberg H.L. Fc receptors for IgE on mouse macropha-
ges and macrophage-like cell lines, J. Immunol., 128, 2265—2268 (1982).
90. Anderson C.L., Spielberg H.L. Macrophage receptors for IgE: Binding of IgE to specific
IgE Fc receptors on a human macrophage cell line U937, J. Immunol., 126, 2470—2473
(1981).
91. Capron A., Dessaint J.-P. Josef M., Rousseaux R. Capron M. Bazin H. Interaction between
IgE complexes and macrophages in the rat: A new mechanism of macrophage activation,
Eur. J. Immunol., 7, 315—322 (1977).
92. Gisler R.H., Fridman W.H. Supression in vitro antibody syntesis by immunoglobulin
binding factor, J. Exp. Med., 142, 507—511 (1975).
93. Bich-Thuy L.T., Samarut C., Brochier J., Revillard J.-P. Supression of the alter stages of
mitogen-induced human В cell differentiation by Fc у receptors (Fc yR) released from po-
lymorphonuclear neutrophils, J. Immunol., 127, 1299—1303 (1981).
94. Kulczycki A. Jr., Krause V., Chew-Killion C., Atkinson J.P. Purification of Fc receptor
from rabbit alveolar macrophages that retains ligand-binding activity, J. Immunol., 124,
2772—2779 (1980).
95. Dixit R., Schneider R., Law S.K., Kulczycki A.K., Jr., Atkinson J.P. Ligand binding spe-
cificity of a rabbit alveolar macrophage receptor for C3b, J. Biol. Chem. 257, 1595—1597
(1981).
96. Kulczycki A.K., Jr., Parker C.W. The cell surface receptor for immunoglobulin E. I.
The use of repetitive affinity chromatography for the purification of a mammalian re-
ceptor, J. Biol. Chem., 254, 3187—3193 (1979).
97. Hoover R.G., Dieckgraefe B.K., Lynch R.G. T cells with Fc receptors for IgA: Induction of
Ta cells in vivo and in vitro by purified IgA, J. Immunol., 127, 1560—1563 (1981).
98. Yodoi J., Ishizaka K. Induction of the Fc -receptor bearing cells in vitro in human peri-
pheral lymphocytes, J. Immunol., 124 , 934 —938 (1980).
99. Hoover R.G., Hickman S., Gebel H.M., Rebbe N., Lynch R.G. Expansion of Fc receptor-
bearing T lymphocytes in patients with immunoglobulin G and immunoglobulin A mye-
loma, J. Clin. Invest., 67, 308—311 (1981).
100. Gonzalez-Molina A., Spielberg H.L. A subpopulation of normal human peripheral В lym-
phocytes that bind IgE, J. Clin. Invest., 59, 616—624 (1977).
101. Spiegelberg H.L., O'Connor R.D., Simon R.A., Mathison D.A. Lymphocytes with immu-
noglobulin E Fc receptors in patients with atopic disorders, J. Clin. Invest., 64, 714—720
(1979).
102. Spiegelberg H. L., Simon R.A. Increase of lymphocytes with Fc receptors for IgE inpatients
with allergic rhinitis during the grass pollen season, J. Clin. Invest., 68, 845—852 (1981).
103. Melewica F.M., Zeiger R.S., Mellon M.H., O'Connor R.D., Spiegelberg H.L. Increased
peripheral blood monocytes with Fc receptors for IgE in patients with severe allergic disor-
ders, J. Immunol., 126, 1592—1595 (1981).
104. Malveaux F.J., Conroy M.C., Adkinson N.F., Lichtenstein L.M. IgE receptors on human
basophils: Relationship to serum IgE concentrations, J. Clin. Invest., 62, 176—181 (1978).
105. Kahn C.R., Flier J.S. Immunologic aspects of endocrine disease. In: Clinical Immunolo-
gy, ed. by C.W. Parker, pp. 815—866, W. B. Saunders, Philadelphia, 1980.
106. Burchiel S.W., Warner N.L. Cyclic AMP modulation of Fc receptor expression on a pre-B
cell lymphoma, J. Immunol., 124, 1016—1021 (1980).
27. Медиаторы: высвобождение и функции 235
107. Rhodes J. Modulation of neacrophade Fc receptor expresion in vitro by insulin and cyclic
nucleotides, Nature, 257, 597—599 (1975).
108. Hempstead B.L., Parker C.W., Kulczycki A., Jr. Selective phosphorylation of the IgE
receptor in antigen stimulated rat mast cells, J. Exp. Med. (in press), (1983).
109. Suzuki T., Saito-Taki T., Sadasivan R., Nitta T. Biochemical signal transmitted by Fey
receptors: Phospholipase A2 activity of Fcy2b receptor of murine macrophage cell line
P388DJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 591—595 (1982).
110. Nitta T., Suzuki T. Fcy2e receptor-mediated prostaglandin synthesis by a murine macro-
phage cell line (388D!), J. Immunol., 128, 2527—2532 (1982).
110a.Hempstead B., Kulczycki A., Parker C.W. Personal communication.
111. Griffin F.M., Jr, Griffin J .A. Augmentation of macrophage complement receptor funct-
ion in vitro, J. Immunol., 125, 844—849 (1980).
112. Alper C.A., Rosen F.S. Genetics of the complement system, Adv. Hum. Genet., 7, 141 —
188 (1976).
113. Ooi Y.M., Harris D.E., Edelson P.J., Colten H.R. Post-translational control of comple-
ment (05) production by resident and stimulated mouse macrophages, J. Immunol., 124,
2077—2081 (1980).
114. Ooi Y.M. Histamine supresses in vitro synthesis of precursor (PRO—C5) of the fifth com-
pliment component (C5) by mouse peritoneal macrophages, J. Immunol., 129, 200—205
(1982).
115. Ralph P. Continuous macrophage cell lines: Their use in the study of induced and consti-
tutive macrophage properties and cytotoxicity, In: Lymphokines, ed. by E. Pick, pp. 175—
196, Academic Press, New York, 1981.
116. Rocklin R.E., Bendtzen K., Greineder D. Mediators of immunity: Lymphokines and mo-
nokines, Adv. Immunol., 29, 55—136 (1980).
117. Stadeker M .J., Wyler D .J., Wright J. la antigen expression and antigen presenting function
by macrophages isolated from hypersensitivity granulomas, J. Immunol., 128, 2739—2744
(1982).
118. Murphy P.A., Simon P.L., Willoughby W.F. Endogenous pyrogens made by rabbit peri-
toneal exudate cells are identical with lymphocyte-activating factors made by rabbit al-
veolar macrophages, J. Immunol., 124, 2498—2501 (1980).
119. Schmidt J.A., Mizel S.B., Cohen D., Green I. Interleukin 1, a potential regulator of fib-
roblast proliferation, J. Immunol. 128, 2177—2182 (1982).
120. Glenn K.C., Ross R. Human monocyte-derived growth factor(s) for mesenchymal cells:
activation of secretion by endotoxin and concanavalin A, Cell, 25, 605—615 (1981).
121. Dinarello C.A. Human pyrogen: A monocyte product mediating host defenses. In: Advances
in Host Defense Mechanisms, V. 1, ed. by J.I. Gallin and A.S. Fauci, pp. 57—74, Raven
Press, New York, 1982.
122. Gospodarowicz D. Growth factors for animal cells in culture: A nonimmunologists view of
mitogenic factors other than lymphokines. In: Lymphokines, ed. by E. Pick, pp. 1—35,
Academic Press, New York, 1981.
123. Williams N., Jackson H., Ralph P., Nakolnz I. Cell interactions influencing murine marrow
megakaryocytes: nature of the potentiator cell in bone marrow, Blood, 57, 157—163 (1981).
124. HilfikerM L., Moore R.N., Farrar J. J. Biologic properties of chromatographically separat-
ed murine thymoma-derived interleukin 2 and colony-stimulating factor, J. Immunol.,
127, 1983—1987 (1981).
125. Bobak D. Whisler R. Human В lymphocyte colomy responses. I. General characteristics and
modulation by monocytes, J. Immunol., 125, 2764—2769 (1980).
126. Ruff M .R., Gifford G.E. Purification and physiochemical characterization of rabbit tumor
necrosis factor, J. Immunol., 125, 1671—1677 (1980).
127. Aune T.M., Pierce C.W. Mechanism of macrophage-derived supressor factor produced by
soluble immune supressor-treated macrophages, J. Immunol., 127, 368—372 (1981).
128. Taramelli D., Holden H. T., Varesio L. In vitro induction of tumorocidal and supressor mac-
rophages by lymphokines: Possible feedback regulation, J. Immunol., 126, 2123—2128
(1981).
129. Kennard J., Zolla-Pazner S. Origin and function of supressor macrophages in myeloma,
J. Immunol., 124, 268—273 (1980).
130. Sipe J.D., Vogel S.N., Ryan J.L., McAdam, K.P.W.J., Rosenstreich D.L. Mediator de-
rived from endotoxin-stimulated macrophages that induce the acute phase serum amyloid
A response in mice, J. Exp. Med., 150, 597—606 (1979).
131. Szkin M.B., Luger T.A., Oppenheim J.J. An epidermal cell-derived cytoking triggers the
in vivo synthesis of serum amyloid A by hepatocytes, J. Immunol. 129, 87—90 (1982).
132. Goetzl E.J. Mediators of immune hypersensitivity derived from arachidonic acid. New
Engl. J. Med., 303, 822—825 (1980).
236
Ч. В. Паркер
133. Stenson W.F., Parker C.W. Prostaglandins, macrophages and immunity, J. Immunol.,
125, 1—5 (1980).
134. Pawlowski N.A., Scott W.A., Andreach M., Cohn Z.A. Uptake and metabolism of mono-
hydroxyeicosa tetraenoic acids by macrophage activation, J. Exp. Med., 155, 1653—1664
(1982).
135. Scott W.A., Pawlowski N.A., Murray H.W., Undreach M., Zreike J. Cohn Z.A. Regulation
of arachidonic acid metabolism by macrophage activation, J. Exp. Med., 155, 1148 (1982).
136. Parker C.W. Arachidonic metabolites and immunity. In: Prostaglandins and Cancer, ed.
by T.J. Powles, R.S. Bockman, K.V. Honn and P. Ramwell, pp. 595—607, Alan R. Liss,
New York, 1982.
137. Taffet S.M., Pace J.L., Russel S.W. Lymphokine maintains macrophage activation for
tumor cell killing by interfering with the negative regulatory effect of prostaglandin E2,
J. Immunol. 127, 121—124 (1981).
138. Metzger Z., Hoffeld J .T., Oppenheim J.J. Macrophage-mediated supression. I. Evidence
for participation of both hydrogen peroxide and prostaglandins in supression of murin
lymphocyte proliferation, J. Immunol., 124 , 983 —988 (1980).
139. Wahl L. M., Olsen C.E., Wahl S.M., McCarthy J.B., Sandberg A.L., Mergenhagen S.E.
Prostaglandin and cyclic AMP regulation of macrophage involvement in connective tissue
destruction, Annals N.Y. Acad. Sci., 332, 271—278 (1979).
140. McCarthy J.B., Wahl S.M., Rees J.C., Olsen C.E., Sandberg A.L., Wahl L.M. Mediation
of macrophage collagenase production by 3'—5' cyclic adenosine monophosphate, J. Im-
munol., 124, 2405—2409 (1980).
141. Khoo J.C., Mahoney E.M., Witztum J.L. Secretion of lipoprotein lipase by macrophages
in culture, J. Biol. Chem., 256, 7105-—7108 (1981).
142. Chait A., Iverius P.H., Brunzell J.D. Lipoprotein lipase secretion by human monocyte-
derived macrophages, J. Clin. Invest., 69, 490—493 (1982).
143. Hughes K.T., Coles G.A., Harry T.R., Davies M. Some properties of human blood mo-
nocyte cell lysate neutral proteinase(s), Biochim. Biophys. Acta, 662, 111—118 (1981).
144. Schrier D.J., Ripani L.M., Katzenstein A.L., Moore V.L. Role of angiotensin-converting
enzyme in bacille calmette-guerin-induced granulomatous inflammation, 69, 651—657
145. Weinstock J.V., Ehrinpreis M.N., Boros D.L., Gee J.B. Effect of SQ 14225, an inhibitor of
angiotensin I-converting enzyme, on the granulomatous response to Schistosoma mansoni-
eggs in mice, J. Clin. Invest., 67, 1257—1264 (1981).
146. Levy G.A., Edgington T.S. Lymphocyte cooperation is required for amplification of macro-
phage procoagulant activity, J. Exp. Med., 151, 1232—1244 (1980).
147. Schwartz B.S., Edgington T.S. Immune complex-induced human monocyte procoagulant
activity, J. Exp. Med., 154, 892—906 (1981).
148. Levy G.A., Schwartz B.S., Edgington T.S. The kinetics and metabolic requirements for di-
rect lymphocyte induction of human procoagulant monokines by bacterial lipopolysac-
charide, J. Immunol., 127, 357—363 (1981).
149. De Beer F.C., Baltz M.L., Holford S., Feinstein A., Pepys M.B. Fibronectin and C4-bind-
ing protein are selectively bound by aggregated amyloid P component, J. Exp. Med., 154,
1134—1149 (1981).
150. Colvin R.B., Mosesson M.W., Dvorak H.F. Delayed-type hypersensitivity skin reactions in
congenital afibrinogenemia lack fibrin deposition and induration, J. Clin. Invest. 63,
1302—1306 (1979).
151. Geczy C.L., Hopper K.E. A mechanism inhibition in delayed-type hypersensitivity react-
ions. II. Lymphokines promote procoagulant activity of macrophages in vitro, J. Immunol.,
!26, 1059—1065 (1981).
152. Hopper K.E., Geczy C.L., Davies W.A. A mechanism of migration inhibition in delayed-ty-
pe hypersensitivity reactions. I. Fibrin deposition on the surface of elicited peritoneal mac-
rophages in vivo, J. Immunol., 126, 1052—1058 (1981).
lod. Scherman Lee J- Specific binding of soluble fibrin to macrophages, J. Exp. Med.,
154. Sugiyama K., Kamata O., Katsuda N. Fibronectin on the surface of rat mast cells, Exp.
Cell Res., 133, 449-452 (1981).
155. Tsukamota Y., Helsel W.E., Wahl S.M. Macrophage production of fibronectin, a chemoat-
tractant for fibroblasts, J. Immunol., 127, 673—678 (1981).
15o. Sullivan T.J. The role of eosinophils in inflammatory reactions. In: Progress in Hema-
, r_ Jology, ed. by E.B. Brown, pp. 65—82, Grune and Stratton, New York, 1979.
157. Oltesen E.A., Cohen S.G., The eosinophil, eosinophilia and eosinophil-related disorders.
In: Allergy: Principles and Practice, ed. by E. Middleton, С. E. Reed and E. F. Ellis,
PP- 584-632, C.V. Mosby, St. Louis, 1978.
27. Медиаторы: высвобождение и функции
237
158. Smith J.A. Molecular and cellular properties of eosinophils (a review), La Ricerca Clin.
Lab., 11, 181-193 (1981).
159. Smith J.A., Goetzl E.J. Cellular properties of eosinophils: Regulatory, protective and
potentially pathogenic roles in inflammatory states. In: Handbook of Inflammation II:
The Cell Biology of Inflammation, ed. by G. Weissmann, pp. 189—216, Elsevier, New
York, 1980.
160. Zucker-Franklin D. Eosinophil structure and maturation. In: The Eosinophil in Health
and Disease, ed. by A.A.F. Mahmond and K. F. Austen, pp. 43—60, Grune and Stratton,
New York, 1980.
161. Zucker-Franklin D. Eosinophil function and disorders, Adv. Intern. Med., 19, 1—25
(1974).
162. Gleich G.J., Loegerine D.A., Frigas E., JPassom D.L., Solley G.O., Mann K.G. The major
basic protein of the eosinophil granule: Physiochemical properties, localization and function.
In: The Eosinophil in Health and Disease, ed. by A.A.F. Mahmoud and K.F. Austen,
pp. 79—98, Grune and Stratton, New York, 1980.
163. Venge P., Dahl R., Hallgren R., Olsson I. Cationic proteins of human eosinophils and their
role in the inflammatory reaction. In: The Eosinophil in Health and Disease, ed. by A.A.F.
Mahmond and K.F. Austen, pp. 131—144, Grune and Stratton, New York, 1980.
164. Ward P.A. Chemotactic factors: Specific for cells involved in anaphylasic. In: Immediate
Hypersensitivity, ed. by M.K. Bach, pp. 649—658, Marcel-Dekker, New York, 1978.
165. Phillips S.M., Colley D.G. Immunologic aspects of host response to schistosomiasis: Re-
sistance, immunopathology and eosinophil involvement, Prog. Allergy, 24, 49—182 (1978).
166. Kay A.B., Anwar A.R.E Eosinophil surface receotors! In: The Eosinophil in Health and
Disease, ed. by A.A.F. Mahmond and K.F. Austen, pp. 207 — 230, Grune and Stratton,
New York, 1980.
167. Kazura J. W. Protective role of eosinophils. In: The Eosinophil in Health and Disease, ed.
by A.A.F. Mahmond and K.F. Austen, pp. 231 —248, Grune and Stratton, New York, 1980.
168. Capron M., Rousseaux J., Mazingue C., Bazin H., Capron A. Rat mast cell-eosinophil in-
teraction in antibody-dependent eosinophil cytotoxicity to schistosoma mansoni
schistosomula, J. Immunol., 121, 2518—2525 (1978).
169. Weismann G. Handbook of Inflammation II: The Cell Biology of Inflammation, Elsevier/
North Holland, New York, 1980.
170. Bass D.A., Szejda P. Mechanism of killing of newborn larvae of trichinella spiralis by
neutrophils and eosinophils, J. Clin. Invest., 64, 1558—1564 (1979).
171. Klebanoff S.J., Jong E.C., Henderson W.R.Jr. The eosinophil peroxidase: Purification
and biological properties. In: The Eosinophil in Health and Disease, ed. by A.A.F. Mah-
mond and K.F. Austen, pp. 99—114, Grune and Stratton, New York, 1980.
172. Nogueiga N.M., Klebanoff S.J., Cohn A.Z. T. Cruzi: Sensitization of macrophage killing
by eosinophil peroxidase, J. Immunol., 128, 1705—1708 (1982).
173. Beeson P.B The clinical significance of eosinophilia. In: The Eosinophil in Health and
Disease, ed. by A.A.F. Mahmond and K.F. Austen, pp. 313—322, Grune and Stratton,
New York, 1980.
174. Padawar J. The mast cell and immediate hypersensitivity. In: Immediate Hypersensitivi-
ty, ed. by M.K. Bach, pp. 301—368, Marcel Deker, Inc., New York, 1978.
175. Henderson W.R., Jong E.C., Klebanoff S.J. Binding of eosinophil peroxidase to mast cell
granules with retention of peroxidatic activity, J. Immunol., 124, 1383—1388 (1980).
176. Jorg A., Henderson W.R., Murphy R.C., Klebanoff S.J. Leukotriene generation by eosino-
phils, J. Clin. Invest., 155, 390 (1982).
177. Но P.C., Lewis R.A., Austen K.F., Orange R.P. Mediators of immediate hypersensitivity.
In: Cellular, Molecular and Clinical Aspects of Allergic Disorders, ed. by S. Gupta and
R.A. Good, pp. 179—228, Plenum, New York, 1979.
7 . Tanaka K.R., Valentine W.N., Fredericks R.E. Human leukocyte arylsulfatase activity, Br.
J. Haematol., 8, 86—92 (1962).
179. Keakou D., Garelly E., Gervais P. The vacuolization of eosinophils and its significance
in the skin window test, Acta Allergol., 25, 341—346 (1970).
180. Henderson W.R., Jorg A., Klebanoff S.J. Eosinophil peroxidase-mediated inactivation
of leukotrienes B4, C4 and D4, J. Immunol., 128, 2609—2613 (1982).
181. Zucker-Franklin D. Properties of eosinophils. In: Immediate Hypersensitivity, ed. by
M.K. Bach, pp. 407—430, Marcel-Dekker, New York, 1978.
182. Weller P.F., Bach D., Austen K.F. Human eosinophil lysophospholipase: The sole pro-
tein component of charcot-leyden crystals, J. Immunol., 128, 1346—1349 (1982).
183. Weller P.F., Wasserman S.I., Austen K.F. Selected enzymes preferentially present in the
eosinophil. In: The Eosinophil in Health and Disease, ed. by A.A.f. Mahmond and
K.F. Austen, pp. 115—130, Grune and Stratton, New York, 1980.
238
Ч. В. Паркер
184. Martin T.W., Loganoff D. Interaction of lysophospholipids and mast cells, Nature, 279,
250—252 (1979).
185. Shier ИЛУ. Baldwin O.H., Nilsen-Hamilton M.. Hamilton R.T., Thanassi N.M. Regulat-
ion of guanylate and adenylate cyclase activities by lysolecithin, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 73, 1586—1590 (1976).
186. Ishizaka K., Tomioka H., Ishizaka T. Mechanisms of passive sensitization. I. Presence
of IgE and IgG molecules on human leukocytes, J. Immunol., 105, 1459—1467 (1970).
187. Metcalfe D. D., Kaliner M., Donlon M.A. The mast cell, Crit. Rev. Immunol. 3, 23—74
(1981).
188. Sullivan T.J., Kulczycki A.K., Jr. Immediate hypersensitivity response. In. Clinical
Immunology, ed. by C.W. Parker, pp. 115—142, W.B. Saunders, Philadelphia, 1980.
189. Sullivan M.J., Parker C.W. Pharmacologic modulation of inflammatory mediator relea-
se by rat mast cells, Am. J. Pathol., 85, 437—463 (1976).
190. Kazmierczak W., Diamant B. Mechanisms of histamine release in anaphyactic and ana-
phylactoid reactions, Prog. Allergy, 24, 295—365 (1978).
191. Cvorak A. Biology and morphology of basophilic leukocytes. In: Immediate Hypersen-
sitivity, ed. by M.K. Bach, pp. 369—406, Marcel-Dekker, New York, 1978.
192. Plaut M., Lichtenstein L.M. Cellular and chemical basis of the allergic inflammation,
response: Component parts and control mechanisms. In: Allergy: Principles and Practice,
ed. by E. Middleton, C.E. Reed and E.F. Ellis, pp. 115—138, C.V. Mosby, St. Louis,
1978.
193. Benditt E.P., Lagunoff D. The mast cell: Its structure and function. In: Progress in Al-
lergy, ed. by P. Kallos and B.H. Waksman, pp. 195—223, S. Karger, Basel, 1964.
194. Langunoff D. Cell biology and mast cells and basophils. In: Cell Biology of Inflammation,
ed. by G. Weissmann, pp. 217—266, Elsevier/North Holland, New York, 1980.
195. Warwick M.T., Haslam D. Antibodies in some chronic fibrosing lung diseases, Clin. Al-
lergy, 1, 83—95 (1971).
196. Parker C.W. Asthma and rhinitis. In: Clinical Immunol., ed. by C.W. Parker,
pp. 1372—1432, W.B. Saunders, Philadelphia, 1980.
197. Solley G.O., Gleich G.J., Jordan R.E., Schroeter A.L. The late phase of the immediate
wheal and flare skin reaction: Its independence upon IgE antibodies, J. Clin. Invest.,
58, 408 (1976).
198. Dvorak H.F., Hammond M.E. Cutaneous basophil hypersensitivity. In: Immediate Hy-
persensitivity, ed. by M.K. Bach, pp. 660—692, Marcel-Dekker, New York, 1978.
199. Kniker W,T.. Cochrane C.G. Pathogenic factors in vascular lesions of experimental serum
sickness, J. Exp. Med., 122, 83—98 (1965).
200. Camlussi G., Tetta C., Deregibus M.C., Bussolino F., Segoloni G., Vercellone A. Platelet-
activating factor (PAF) in experimentally-induced rabbit acute serum sickness: Role of
basophil-derived PAF in immune complex deposition, J. Immunol., 128, 86—94 (1982).
201. Askenase P.W., Bursztajn S., Gershon M.D., Gershon H.K. T cell-dependent mast cell
degranulation and release of serotonin in murine delayed-type hypersensitivity, J. Exp.
Med., 152, 1358— 1374 (1980).
202. Kojima S., Kitamura Y., Takatsu K. Prolonged infection of nippostrongylus brasiliensis
111 8enetically mast cell-depleted W/Wv mice, Immunol. Lett., 2, 159—162 (1980).
203. Mitchell G.F. Responses to infection with metazoan and protozoan parasites in mice, Adv.
Immunol., 28, 451—512 (1978).
204. Day R.P. Basophil leukocyte separation from human peripheral blood. A technique for
their isolation in high purity and high yield, Clin. Allergy, 2, 205 (1972).
205. MacGlashan D.W., Lichtenstein L.M. The purification of human basophils, J. Immunol.,
124, 2519-2521 (1980).
206. Befus A.D., Pearce F.L., Gauldie J., Horsewood P., Bienenstock J. Mucosal mast cells.
I. Isolation and functional characteristics of rat intestinal mast cells, J. Immunol., 128,
2475—2480 (1982).
207. Pearce F.L., Befus A.D., Gauldie J., Bienenstock J. Mucosal mast cells. II. Effects of anti-
allergic compounds on histamine secretion by isolated intestinal mast cells, J. Immunology,
128, 2481-2486 (1982).
208. Froese A. The presence of two kinds of receptors for IgE on rat mast cells, J. Immunol.,
125, 981-987 (1980). ng
209. Metzger H. The cellular receptor for IgE. In: Receptors and Recognition, ed. by P. Cua-
„5ase,s and M-F- Greaves, pp. 75—102, Chapman and Hall, London, 1977.
41U. Holowka D., Hartmann H., Kanellopoulos J., Metzger H. Association of the receptor for
immunoglobulin E with an endogenous polypeptide on rat basophilic leukemia cells,
J. Recept. Res., 1, 41—68 (1980).
. Hempstead B.L., Parker C.W.. Kulczycki A.K., Jr. Characterization of the IgE receptor
isolated from human basophils, J. Immunol., 123, 2283—2291 (1979).
27. Медиаторы: высвобождение и функции
239
212. Conrad D.H., Froese A. Characterization of the target cells receptor for IgE. I. Solubili-
zation of the target cell receptor complexes from rat mast cells and rat basophilic leuke-
mia cells, J. Immunology, 116, 319—326 (1976).
213. Sterk A.R., Ishizaka T. Binding properties of IgE receptors on normal mouse mast cells,
J. Immunol., 128, 838—843 (1982).
214. Keller R. Concanavalin A, a model antigen for the in vitro detection of cell bound reage-
nic antibody in the rat, Clin. Exp. Immunol., 13, 139—143 (1973).
215. Parker G.W., Kern M., Eisen H.N. Polyfunctional dinitrophenyl haptens as reagents for
elicitation of immediate type allergic skin, J. Exp. Med., 115, 789—801 (1962).
216. Parish W.E. Evidence for human IgG antibodies anaphylactically sensitizing man. In:
Immediate Hypersensitivity, ed. by M.K. Bach, pp. 277—300, Marcel-Dekker, New
York, 1978.
217. Fox P.C., Bascino L.K., Siraganian R.P. Mouse mast cells activation and desensitization
for immune aggregate-induced hystamine release, J. Immunol., 129, 314—319 (1982).
218. Vranian G., Conrad D.H., Ruddy S. Specificity of C3 receptors that mediate phagocytosis
by rat peritoneal mast cells, J. Immunol., 126, 2302—2306 (1981).
219. Hugli T.E. The structural basis for anaphylactoxin and chemotactic functions of C3a,
C4a and C5a, Crit. Rev. Immunol., 1, 321—366 (1981).
220. Findlay S.R., Dvorak A.M., Kagey-Sobotka A., Lichtenstein L.M. Hyperosmolar trigger-
ing of hystamine release from human basophils, J. Clin. Invest., 67, 1604—1613 (1981).
221. Stanworth D.R., Kings M., Roy P.D., Moran J.M., Moran D-M. Synthetic peptides com-
prising sequences of the human immunoglobulin E heavy chain capable of releasing hi-
stamine, Biochem. J., 180, 665—668 (1979).
222. Findlay S.R., LL .censtein L.M., Grant J.A. Generation of slow reacting substance by hu-
man leukocytes. II. Comparison of stimulation by antigen, anti-IgE, calcium ionophore
and C5-peptide, J. Immunol., 124 , 238—242 (1980).
223. Hook W.A., Schtffman E.A., Swanikumar S., Suriginian R.P. Histamine release by
chemotactic, formyl methionine-containing peptides, J. Immunol., 117, 594—596 (1976).
224. Barrizai A.K., Kretscmer R.R. Enhancement of antigen-induced leukocyte histamine re-
lease by a mononuclear cell-derived factor, J. Allergy Clin. Immunol., 62, 137—142 (1978).
225. Thueson D.0., Speck L., Grant J.A. Histamine releasing activity produced by human mo-
nonuclear cells, Fed. Proc., 36, 1300a (1976).
226. Theoharides T.C., Betchaku T., Douglas W. W. Somatostatin-induced histamine secretion
in mast cells. Characterization of the effect, Eur. J. Pharmacol., 69, 127—137 (1981).
227. Yecies L.D., Johnston S.M., Wedner H.J., Parker C.W. Slow reacting substance (SRS)
from ionophore A23187 stimulated peritoneal mast cells of the normal rat. II. Evidence
for a precursor role of arachidonic acid and further purification, J. Immunol., 122, 2090—
2095 (1979).
228. Stenson W.F., Parker C.W., Sullivan T.J., Augmentation of IgE-mediated release of hi-
stamine by hydroxyeicosatetraenoic acid and 12-hydroxyeicosatetraenoic acid, Biochem.
Biophys. Res. Commun., 96, 1045—1052 (1980).
229. Sullivan W.F., Parker C.W. Poss ble role of arachidonic acid and its metabolites in me-
diator release from rat mast cells, J. Immunol., 122, 431—436 (1979).
230. Peters S.P., Siege M.I., Kegey-Sobotka A., Lichtenstein L.M. Lipoxygenase products mo-
dulate histamine release in human basophils, Nature, 292, 455—457 (1981).
231. Lett-Brown M.A., Aelvoet M.. Hooks J.J.. Georgiades J.A., Thueson D.O., Grant J.A.
Enhancement of basophil chemotaxis in vitro by virus-induced interferon, J. Clin. Invest.,
67, 547-552 (1981).
232. Yodoi J., Hiroshima M., Bloom B.R., Ishizaka K. Formation of IgE-binding factors by
rat T lymphocytes. I. Induction of IgE binding factors by poly P : C and interferon, J.
Immunol., 127, 1579—1582 (1981).
233. Fridman W.F., Gresser I., Bandu M.T., Aguet M., Neauport-Sautes C. Interferon enhances
the expression of Fc-y receptors, J. Immunol., 124, 2436—2441 (1980).
234. Itoh K., Inoue M., Kataoka S., Kumagai K. Differential effect of interferon expression of
IgG and IgM-Fc receptors on human lymphocytes, J. Immunol., 124, 2589—2595 (1980).
235. Hiroshima M., Yodoi J., Ishizaka K. Regulatory role of IgE binding factors from rat T
lymphocytes. III. IgE specific factor with IgE binding activity, J. Immunol., 125, 1442 —
1448 (1980).
236. Marquardt D.L., Parker C.W., Sullivan T.J. Potentation of mast cell mediator release
by adenosine, J. Immunol., 120, 871—878 (1978).
237. Marone G., Findlay S.R., Lichtenstein L.M. Adenosine receptor on human basophils:
Modulation of histamine release, J. Immunol., 123, 1473—1477 (1979).
238. Lichtenstein L.M., Gillespie E. Inhibition of histamine release by histamine controlled
by H2 receptor, Nature, 244, 287 (1973).
240
Ч. В. Паркер
239. Sullivan T.J., Greene W.C., Parker C.W. Concanavalin A induced histamine release
from normal rat mast cells, J. Immunol., 115, 278—282 (1975).
240. Kay A.B., Anvar A.R.E. Eosinophil surface receptor. In: The Eosinophil in Health and
Disease, ed. by A.A.F. Mahmond and K.F. Austen, pp. 207—230, Grune and Stratton,
Now York, 1980.
241. Sobotka A.K., Dembro M., Goldstein B., Lichtenstein L.M. Antigen specific desensitization
of human basophils, J. Immunol., 122, 511—517 (1979).
242. Johnson R.G., Carty S.E., Fingerhood B.J., Scarpa A. The internal pH of mast cell gra-
nules, FEBS Lett., 120, 75—79 (1980).
243. Foreman J.C. Calcium and histamine secretion from mast cells and leukocytes. In: Bio-
chemistry of the Acute Allergic Reactions, ed. by E.L. Becker, A.S. Simon, and K.F. Au-
sten, pp. 315-330. Alan R. Liss, New York, 1981.
244. Kennerly D.A., Sullivan T.J., Parker C.W. Activation of phospholipid metabolism dur-
ing mediator release from stimulated rat mast cells, J. Immunol., 122, 152—159 (1979).
245. Kennerly D.A., Sullivan T.J., Sylwester P., Parker C.W. Diacylglycerol metabolism in
mast cells: A potential role in membrane fusion and arachidonic acid release, J. Exp. Med.,
150, 1039—1044 (1979).
246. Sullivan T.J. Diacylglycerol metabolism and the release of mediators from mast cells.
In: Biochemistry of the acute Allergic Reactions, ed. by E.L. Becker, A.S. Simon, and
K.F. Austen, pp. 229—238, Alan R. Liss, New York, 1981.
247. Serhan C., Anderson P., Goodman E., Dunham P., Weissmann G. Phosphatidate and oxi-
dized fatty acids are calcium ionophores, J. Biol. Chem., 256, 2736—2741 (1981).
248. Allen D., Mitchell R.H. The possible role of lipids in control of membrane fusion during
secretion, Symp. Soc. Exp. Bioi., 33, 323—336 (1979).
249. Hirata F., Axelrod J. Phospholipid methylation and biological signal transmission, Scien-
ce, 209, 1082—1090 (1980).
250. Ishizaka T., Hirata F., Ishizaka K., Axelrod J. Transmission of triggering signals induced
by bridging of IgE receptors on rat mast cells. In: Biochemistry of Acute Allergic Reaction,
ed. by E. Becker, A.S. Simon, and K.F. Austen, pp. 213—228, Alan R. Liss, New York,
1981.
251. Crews F.T., Morita Y., Hirata F., Axelrod J., Siraganian R.P. Phospholipid methylation
affects immunoglobulin E-mediated histamine and arachidonic acid release in rat leukemic
basophils, Biochem. Biophys. Res. Commun., 93, 42—49 (1980).
252. Hirata F., Axelrod J., Crews F.T. Concanavalin A stimulated phospholipid methylation
and phosphatidylserine decarboxylation in rat mast cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,
4813—4816 (1979).
253. Morita J., Chiang P.K., Siraganian R.P. Effect of inhibitors of transmethylation on hi-
stamine release from human basophils, Biochem. Pharmacol., 30, 785—791 (1981).
254. Sullivan T.J., Parker K.L., Stenson W.F., Parker C.W. Modulation of cyclic AMP in pur-
ified rat mast cells. I. Responses to pharmacologic, metabolic and physical stimuli, J. Im-
munol., 114, 1473—1479 (1975).
255. Lewis R.A., Holgate S.T., Roberts L.J., Oates J.A., Austen K.F., Preferential generation
of prostaglandin D by rat and human mast cells. In: Biochemistry of Acute Allergic React-
ions, ed. by E. Becker, A.S. Simon, and K.F. Austen, pp. 239—256, Alan R. Liss, New
York, 1981.
256. Ishizaka T. Analysis of triggering events in mast cells for immunoglobulin E-mediated
histamine release, J. Allergy Clin. Immunol. 67, 90—96 (1981).
257. Holgate S.T., Lewis R.A., Austen K.F. 3'5'-cyclic adenosine monophosphate-dependent
protein kinase of the rat serosal mast cell and its immunologic activation, J. Immunol.,
124, 2093—2099 (1980).
258. Lichtenstein L.M. Mechanism of allergic inflammation, Prog. Immunol., 32, 430—438
о <1977>- • • V
259. Sydbom A., Fredholm B., Uvnas B. Evidence against a role of cyclic nucleotides in the
regulation of anaphylactic histamine release in isolated mast cells, Acta. Physiol. Scand.,
112, 47—56 (1981).
260. Lichtenstein L.M. The role of the cyclic AMP system in inflammation: An introduction.
In: Cyclic AMP, Cell Growth and the Immune Response, ed. by W. Braun, L.M. Lichten-
stein, and C.W. Parker, pp. 147—175, Springer-Verlag, New York, 1974.
261. Wold F. In vivo chemical modification of proteins post-translational modification, Annu.
Rev. Biochem., 50, 783—814 (1981).
262. Endo T., Hidaka H. Phospholipids and regulation of protein kinase reaction, Arch. Bio-
chem., Biophys., 211, 108—112 (1981).
263. Sieghart W., Theoharides T.C., Alper S.L., Douglas W.W., Greengaard P. Calcium depen-
27. Медиаторы: высвобождение и функции
241
dent protein phosphorylation during secretion by exocytosis in mast cells, Nature, 275,
329—330 (1978).
264. Hempstead B.L., Kulczycki A., Jr., Parker C.W. Phosphorylation of the IgE receptor
from ionophore A23187 stimulated intact mast cells, Biochem. Biophys. Res. Commun.,
98, 815-822 (1981).
265. Schleimer R.P., Lichtenstein L.M., Gillespie E. Inhibition of basophil histamine release by
anti-inflammatory steroids, Nature, 292, 454—455 (1981).
266. Roberts L.J., Lewis R.A., Oates J.A., Austen K.F. Prostaglandin, Thromboxane, and
12-hydroxy-5,8,10,14-eicosatetraenoic acid production by ionophore-stimulated rat serosal
mast cells, Biochem. Biophys. Acta, 575, 185—192 (1979).
267. Lichtenstein L.M., John Hopkins University School of Medicine at Good Samaritan
Hospital, Baltimore Maryland, Personal communication.
268. Lewis R.A., Austen K.F. Nonrespiratory functions of pulmonary cells: The mast cell, Fed.
Proc, 36, 2676—2683 (1977).
269. Cutz E., Chan W., Track N. S., Goth A., Said S. I. Release of vasoactive intestinal poly-
peptide in mast cells by histamine liberators, Nature, 175, 661—662 (1978).
270. Schwartz L. B., Lewis R. A., Seldin D., Austen K. F. Acid hydrolases and tryptase from
secretory granules of dispersed human lung mast cells, J. Immunol., 126, 1290—1294
(1981).
271. Orenstein N. S., Galli S. J., Dvorak A. M., Dvorak H. F. Glycosaminoglycans and pro-
teases of guinea pig basophilic leukocytes. In: Biochemistry of Acute Allergic Reactions,
ed. by E. L. Becker, A. S. Simon, and K. F. Austen, pp. 123—146, Alan R. Liss, New
York, 1981.
272. Newball H. H., Berninger R. W., Talamo R. C., Lichtenstein L. M. Anaphylactic release
of a basophil kallikrein-like activity. I. Purification and characterization, J. Clin. In-
vest., 64, 457—464 (1979).
273. Newball II. II., Talamo R. C., Lichtenstein L. M. Anaphylactic release of a basophil kallik-
rein-like activity. II. A mediator of immediate hypersensitivity reactions, J. Clin. Invest.,
64, 466—475 (1979).
274. Oertel II. L., Kaliner M. The biologic activity of mast cell granules. III. Purification of
inflammatory factors of anaphylaxis (IF-A) response for causing late phase reactions,
J. Immunol., 127, 1398—1402 (1981).
275. Tannenbaum S., Oertel II., Henderson W., Kaliner M. The biologic activity of mast cell
granules. I. Elicitation of inflammatory responses in rat skin, J. Immunol., 125, 325—
335 (1980).
276. Kaplan K. L. Platelet granule proteins: Localization and secretion. In: Platelets in Biology
and Pathology, ed. by J. L. Gordon, pp. 77—90, Elsevier/North-Holland Biomedical
Press, New York, 1981.
277. Nachman R. L., Weksler В. B. The platelet as an inflamatory cell. In: Cell Biology of
Inflammation, ed. by G. Weissmann, pp. 145—162, Elsevier/North Holland, New York,
1980.
278. Metcalfe D. D., Lewis R. A., Silbert J. E., Rosenberg R. D., Wassermann S. I., Aus-
ten K. F. Isolation and characterization of heparin for human lung, J. Clin. Invest., 64,
1537—1543 (1979).
279. Stevens R. L., Austen K. F. Proteoglycans of the mast cells. In: Biochemistry of Acute
Allergic Reactions, ed. by E. L. Becker, A. S. Simon, and K. F. Austen, pp. 69—88,
Alan R. Liss, New York, 1981.
280. Hatcher V. B., Tsien G., Oberman M. S., Burk P. G. Inhibition of cell proliferation and
protease activity by cartilage factors and heparin, J. Supramolec. Struct., 14, 33—46
(1980).
281. Azizkhan R. G., Azizkhan J. C., Zetter B. R., Folkman J. Mast cell heparin stimulates
migration of capillary endothelial in vitro, J. Exp. Med., 152, 931—944 (1980).
282. MacKiness G. Delayed hypersensitivity. In: Immunologic Diseases, ed. by M. Samter,
pp. 281—296, Little, Brown and Co., New York, 1978.
283. Kierszenbaum F., Ackerman S. J., Gleich G. J. Inhibition of antibody-dependent eosino-
phil-mediated cytotoxicity by heparin, J. Immunol., 128, 515—517 (1982).
284. Kjellen L., Petterson I., Hook M. Cell surface heparin sulphate: An intercalaced membrane
proteoglycan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5371—5375 (1981).
285. Douglas W. W. Histamine and antihistamine; 5-hydroxytryptamine and their antagonists.
In: Pharmacologic Basis of Therapeutics, ed. by L. S. Goodman and A. Oilmert, pp. 590—
629, MacMillan Publishing Co., Inc., New York, 1975.
286. Beaven M. A. Histamine, N. Engl. J. Med., 294, 30—36 (1976).
287. Plaut M. Histamine, H, and H2 antihistamines and immediate hypersensitivity reactions,
J. Allergy Clin. Invest., 63, 371-375 (1979).
242
Ч. В. Паркер
288. Hammer L., Hjerten S. Histamine Metabolism. Purification and immunochemical analysis
of histidine decarboxylase from murine mastocytoma, Agents Actions, 10, 92—93 (1980).
289. Uvnas B. Quantitative correlation between degranulation and histamine release in mast
cells. In: Biochemistry of the Acute Allergic Reactions: Second International Symposium,
ed. by K. F. Austen and E. L. Becker, pp. 175—188, Blackwell, Oxford, 1979.
290. Kruger P. G., Lagunoff D. Mast cell restoration: A study of the rat peritoneal mast cells
after depletion with polymyxin B. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 65, 278—290
(1981).
291. Beall G. N., VanArsdel P. P., Jr. Histamine metabolism in human disease, J. Clin. In-
vest., 39, 676—683 (I960).
292. Smith P. L., Kagly-Sobotka A., Blieckes E. R., Traystman R., Kaplan A. P., Gralnick H.,
Valentine M. D., Permutt S., Lichtenstein L. M. Physiologic manifestations of human
anaphylaxis, J. Clin. Invest., 66, 1072—1080 (1980).
293. Platshon L., Kaliner M. The effects of the immunologic release of histamine upon human
lung cyclic nucleotide levels and prostaglandin generation, J. Clin. Invest., 62, 1113—
1121 (1978).
294. Rocklin R. E. Modulation of cellular-immune responses in vivo and in vitro by histamine
receptor-bearing lymphocytes, J. Clin. Invest., 57, 1051—1058 (1976).
295. Rocklin R. E., Greineder D. K., Melmon K. L. Histamine-induced supressor factor (HSF):
Further studies on the nature of the stimulus and the cell which produces it, Cell Im-
munol., 44, 404—415 (1979).
296. Plaut M., Lichtenstein L. M., Gillespie E., Henney C. S. Studies on the mechanism of lym-
phocyte-mediated cytolysis. IV. Specificity of the histamine receptor on effector T cells,
J. Immunol., Ill, 389-394 (1973).
297. Bourne H. R., Melmon K. L., Lichtenstein L. M. Histamine augments leukocyte cyclic
AMP and blocks antigenic histamine release, Science, 173, 743—745 (1971).
298. Sosman J., Busse W. Histamine inhibition of neutrophil lysosomal enzyme release: An
H2 histamine receptor source, Science, 194, 737—738 (1976).
299. Gallin J. I., Weinstein A. M., Cramer E. B., Kaplan A. P. Histamine modulation of human
eosinophil locomotion in vitro and in vivo. In: The Eosinophil in Health and Disease, ed.
by A. A. F. Mahmond and K. F. Austen, pp. 185—206, Grune and Stratton, New York,
1980.
300. Rosner I. K., Colten H. R., Edelson P. J. Human monocytes have binding sites for hista-
mine. Presented at the 1979 Conference of the Society for Pediatric Research, Atlanta,
Georgia, 1979.
301. Osband M., McCaffrey R. Solubilization, separation and partial characterization of hista-
mine Ht and H2 receptors from calf thymocyte membranes, J. Biol. Chem., 254, 9970—
9972 (1979).
302. Rocklin R. E. Histamine-induced supressor factor (HSF): Effect on migration inhibitory
factor (MIF) production and proliferation, J. Immunol. 118, 1734—1738 (1977).
303. Palmar S. H., Birch R. E. Regulation of Fc receptor expression on T-lymphocyte subsets
mediated by adenosine and histamine receptors. In: Immunoregulation and Autoimmuni-
ty, ed. by R. S. Krakauer and M. K. Cathcart, pp. 11—20, Elsevier/North Holland, New
York, 1980.
304. Birch R. E., Polmar S. H. Induction of Fey receptors on a subpopulation of human T
lymphocytes by adenosine and impromide, an H2-histamine agonist, Cell. Immunol. 57,
455-467 (1981).
305. Lichtenstein L. M., Gillespie E. The effects of the Щ and H2 antihistamines on «allergic»
histamine release and its inhibition by histamine, J. Pharm. Exp. Ther., 192, 441—450
(1975).
306. Dy M., Lebel В., Kamoun P., Hornberger J. Histamine production during the anti-allograft
response. Demonstration of a new lyniphokine enhancing histamine syntesis, J. Exp. Med.,
153, 293—309 (1981).
307. Dy M., Lebel B. Production d’histamine et du facteur stimulant des cellules productrices
d’histamine (HCSAF) par des leucocytes incubes avec la concanavalin A. Effect d’une pre-
sensibilisation par une allogreffe de pear, C.R. Acad. Sci. Paris, 393, 399—402 (1981).
308. Ward O. A., Dvorak H. F., Cohen S., Yashida T., Data R., Selvaggio S. S. Chemotaxis of
basophils by lymphocyte-dependent and lymphocyte-independent mechanisms, J. Immu-
nol. 114, 1523—1531 (1975).
309. Left-Brown M. A., Boetchr N. A., Leonard E. J. Chemotactic response of normal human
basophils to C5a and to lymphocyte-derived chemotactic factor, J. Immunol , 117 246—
252 (1976).
310. Page I. H. Serotonin, Yearbook Medical Publishers, Chicago, 1968.
27. Медиаторы: высвобождение и функции 243
311. Brocklehurst W. Е. Slow reacting substance and related compounds, Prog. Allergy, 6,
539—558 (1958).
312. Askenase P. W., Bursztajn S., Gershon M. D., Gershon В. К. T cell dependent mast cell
degranulation and release of serotonin in murine delayed-type hypersensitivity, J. Exp.
Med. 152, 1358-1374 (1980).
313. Sandler J. A., Clyman В. I., Manganiello Г. C., Vaughn M. The effect of serotonin (5-
hydroxytryptamine) and derivatives on guanosine 3'5'-monophosphate in human monocytes,
J. Clin. Invest., 55, 431—435 (1975).
314. Foon K. A., Wahl S. M., Oppengeim J. J., Bosenstreich D. L. Serotonin-induced production
of a monocyte chemotactic factor by human peripheral blood leukocytes, J. Immunol.,
117, 1545-1552 (1976).
315. Linthicum D. S., Frelinger J. A. Acute autoimmune encephalomyelitis in mice. II. Sus-
ceptibility is controlled by the combination of H2 and histamine sensitization genes, J.
Exp. Med., 155, 31—40 (1982).
316. Fernandez II. N., Hugli T. E. Primary structural analysis of the polypeptide portion of
human C5a anaphylatoxin, J. Biol. Chem., 253, 6955—6962 (1978).
317. Gerard C., Chenoweth D. E., Hugli T. E. Response of human neutrophils to C5a: A role for
the oligosaccharide moiety of human C5ades Arg_74 but not of C5a in biologic activity,
J Immunol., 127, 1978 — 1982 (1981).
318. Chenoweth D., Hugli T. E. Demonstration of specific C5a and C5a analogs as probes of the
neutrophil C5a receptor, Mol. Immunol., 17, 151—156 (1978).
319. Chenoweth D. E-, Hugli T. E. Demonstration of specific C5a receptor on intact human poly-
morphonuclear leukocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 3943—3947 (1978).
320. Atkinson J. P., Frank M. Complement. In: Clinical Immunology, ed. by C. W. Parker,
pp. 219—271, W. B. Saunders, Philadelphia, 1980.
321. Cochrane C. G., Muller-Eberhard H. J. The derivation of the two distinct anaphylatoxin
activities from the third and fifth components of human complement, J. Exp. Med., 127,
371—386 (1968).
322. Dupree E., Goldman A. S.. Grant J. A. Complement-mediated release of histamine from
human leukocytes, J. Allergy Clin. Immunol., 53, 75 (1974).
323. Petersson B. A., Nilsson A., Stalenheim G. Induction of histamine release and desensitiz-
ation in human leukocytes. Effects of anaphylatoxins, J. Immunol., 114, 1581—1584
(1975).
324. Stimier N. P., Bach M. K., Bloor С. M., Hugli T. E. Release of leukotrienes from guinea
pig lung stimulated by C5a des lArg anaphilotoxins, J. Immunol., 128, 2247—2251 (1982).
325. Be gal J. F., Eastman A.Y., Pickering B. J. C5a induced tracheal contraction: A histamine
independent mechanism, J. Immunol., 124, 2876'—2878 (1980).
326. Vogt W., Zeman N., Garbe G. Histaminun-abhangige wirkungen von anaphylatoxin auf
glatte muskulatur isolierter organe, Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 262, 399—
404 (1969).
327. Hugli T. E., Erickson B. W. Synthetic peptides with the biological activities and specifity
of human C3q anaphylatoxin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1826—1830 (1977).
328. Vogt W. Preparation and some properties of anaphylotoxin from hog serum, Biochem.
Pharmacol., 17, 727—733 (1968).
329. Meuer S., Ecker V., Haddine U., В itter-S nermann D. Platelet-serotonin release by C3a and
C5a: Two independent pathways of activation, J. Immunol., 126, 1506—1509 (1980).
330. ter Laan В., Moleanaar J. L., Feltkamp-Vroom T. M., Pondman K. W. Interaction of
human anaphylatoxin C3a with rat mast cells demonstrated by immunofluorescence, Eur.
J. Immunol., 4, 393—395 (1974).
331. Babior G. L., Bosin В. E., McMurrich В. J., Peters W. A., Babior В. M. Arrangement of
the respiratory burst oxidase in the plasma membrane of the neutrophil, J. Clin. Invest.,
67, 1724 — 1728 (1981).
332. Lew P. D., Stossel T. P. Effect of calcium on superoxide production by phagocytic vesicles
from rabbit alveolar macrophages, J. Clin. Invest. 67, 1—9 (1981).
333. McPhail L. C., Henson P. J., Johnson В. B., Jr. Respiratory bursts enzyme in human
neutrophils. Evidence for multiple mechanisms of activation, J. Clin. Invest., 67, 710—
716 (1981).
334. Haber F., Weiss J. The catalytic decomposition of hydrogen peroxide to iron salts, Proc.
R. Soc. Lond. A. 147, 332—351 (1934).
335. Johnson K. J., Ward P. W. Role of oxygen metabolites in immune complex injury of
lung, J. Immunol., 126, 2365—2369 (1981). '
336. Weiss S. J., Young J., LoBuglio A. FSlivka A., Nimeh N. F. Role of hydrogen peroxide
in neutrophil-mediated destruction of cultured endothelial cells, J. Clin. Invest., 68.
714-721 (1981).
244
Ч. В. Паркер
337. Till G. О., Johnson К. J., Kunkel R., Ward Р. A. Intravascular activation of complement
and acute lung injury, J. Clin., Invest., 69, 1126—1135 (1982).
338. Rosen H., Klebanofj S. J. Hydroxyl radical generation by polymorphonuclear leukocytes
measured by electron spin resonance spectroscopy, J. Clin. Invest., 64, 1725—1729 (1979).
339. Repine J. E., Eaton J. W., Anders M. W., Hoidal J. R., Fox R. B. Generation of Hydro-
xyl radical by enzymes, chemicals, and human phagocytes in vitro, J. Clin. Invest., 64,
1642—1651 (1979).
340. Clark R. A., Szot S. The myeloperoxidase-hydrogen peroxide-halide system as effector of
neutrophil-mediated tumor cell cytotoxicity, J. Immunol., 126, 1295—1301 (1981).
341. Martin W. J., Gadek J. E., Hunninghake G. W., Crystal R. G. Oxidant injury of lung paren-
chymal cells, J. Clin. Invest., 68, 1277—1288 (1981).
342. Cadenas E., Varsavsky A. I., Boveris A., Chance B. Oxygen or organic hydroperoxide-
induced chemiluminescence of brain and liver homogenates, Biochem. J., 198, 645—654
(1981).
343. Lee С. T., Fein A. M., Lippmann M., Holtzman H., Kimbel P., Weinbaum G. Elastolytic
activity in pulmonary lavage fluid from patients with adult respiratory-distress syndrome,
N. Engl. J. Med., 304, 192—196 (1981).
344. Carp H., Janofj A. In vitro supression of serum elastase inhibitory capacity by reactive
oxygen species generated by phagocytosing polymorphonuclear leukocytes, J. Clin. In-
vest., 63, 793—797 (1979).
345. Perez H. D., Weksler В. B., Goldstein I. M. Generation of chemotactic lipid from arachido-
nic acid by exposure to a superoxide-generating system, Inflammation, 4, 313—328 (1980).
346. Weitzman S. A., Stossel T. P. Mutation caused by human phagocytes, Science, 212, 545—
547 (1981).
347. Wiggins R. C., Giclas P. C., Henson P. M. Chemotactic activity generated from the fifth
component of complement by plasma kallikrein of the rabbit J. Exp Med., 153, 1391—
1404 (1981).
348. Yecies L. D., Kaplan A. P. Urticaria. In: Clinical Immunology, ed. by C. W. Parker,
pp. 1283—1315, W. B. Saunders, Philadelphia, 1980.
349. Regali D., Barake J. Pharmacology of bradykinin and related kinins, Pharmacol. Rev.,
32, 1—46 (1980).
350. Colman R. W. Formation of human plasma kinin, N. Engl. J. Med., 291, 509—515 (1974).
351. Greenbaum L. M. Kinins and immunity. In: Immunopharmacology, ed. by M. E. Rosen-
thal and H. C. Mansmann, pp. 73—78, Spectrum Publications, New York, 1976.
352. Goldstein I. M., Wunschmann B., Astrup T., Henderson E. S. Effects of bacterial endo-
toxin on the fibrinolytic activity of normal leukocytes, Blood, 37, 447—453 (1971).
353. Schapira M., Despland E., Scott C. F., Boxer L. A., Colman R. W. Purified human plasma
kallikrein aggregates human blood neutrophils, J. Clin. Invest., 69, 1199—1202 (1982).
354. Plow E. F., Freaney D., Edgington T. S. Inhibition of lymphocyte protein synthesis by
fibrinogen-derived peptides, J. Immunol, 128, 1595—1599 (1982).
355. Gormann G. H., Pees G. S., Schwarze G., Schreurien P. G. Immunosupression by micromole-
cular degradation products in cancer, Nature, 259, 399—401 (1976).
356. Eckhardt T., Nossel H. L., Hurlet-Jensen A., LaGamma K. S., Owen J., Auerbach M. Measu-
rement of desarginine fibrinopeptide В in human blood, J. Clin. Invest., 67, 809—816
(1981).
357. Parker C. W. The chemical nature of slow-reacting substances. In: Advances in Inflamma-
tion Research, ed. by G. Weissmann, pp. 1—24, Raven Press, New York, 1982.
358. Stenson W. F., Parker C. W. Prostaglandins. In: Immunopharmacology, ed. by P. Sirois
and M. Rola-Pleszczynski, Elsevier/North Holland, Amsterdam, 1982.
359. Samuelsson B. Leukotrienes: An introduction. In: Leukotrienes and Other Lopoxigenase
Products, ed. by B.Samuelsson and R.Paoletti, pp. 1—18, Raven Press, New York, 1982.
360. Ritterboure-Simmons S. Production of diglyceride from phosphatidyl-inositol in activated
human platelets, J. Clin. Invest., 63, 580—587 (1979).
361. Billah M. M., Lapentina E. G., Cuatrecasas P. Phospholipase A2 and phospholipase C
activities of platelets: Differential substrate specificity, Ca2+ requirement, pH dependence
and cellular localization, J. Biol. Chem., 255, 10227—10231 (1980).
362. Galliard T. Degradation of plant lipids. In: Biochemistry of Plant, ed. by P. K. Stumps
and E. E. Conn, pp. 335—357, Academic Press, New York, 1975.
363. Falkenhein S. F., MacDonald H., Huber M. M., Koch D., Parker C. W. Effect of the 5-
hydroperoxide of eicosatetraenoic acid and inhibitors of the lipoxygenase pathway on the
formation of slow reacting substance of rat basophilic leukemia cells. Direct evidence that
slow reacting substance is a product of the lipoxygenase pathway, J. Immunol., 125, 163—
168 (1980).
364. Parker C. W., Aykent S. Unpublished observations.
27. Медиаторы: высвобождение и функции 245
365. Feldberg W., Kellaway С. 11. Liberation of histamine and formation of lysocithin-like
substance by cobra venom, J. PhisioL, 94, 187—226 (1938).
366. Kellaway 11. C., Tretheivie E. R. The liberation of a slow reacting smooth-muscle stimulat-
ing substance in anaphylaxis, Q.J. Exp. Physiol., 30, 121—145 (1940).
367. J akschick B., Parker C. W. Probable precursor role for arachidonic acid in slow reacting
substance (SUS) biosyntesis, Clin. Res., 24, 525 (abstract) (1976).
368. Parker C. W. Aspirin sensitive asthma. In: Asthma: Physiology, Immunopharmacology
and Treatment, ed. by K. F. Austen, L. M. lichtenstein, A. S. Simon, Academic Press,
New York, 1977.
369. Jakschik B. A., Falkenhein S., Parker C. W. Precursor role of arachidonic acid in slow
reacting substance from rat basophil leukemia cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4577 —
4581 (1977).
370. Parker С. W., Jakschik B. A., Huber M. M., Falkenhein S. F. Characterization of slow
reacting substance as a family of thiolipids derived from arachidonic acid, Biochem.
Biophys. Res. Commun., 89, 1186—1192 (1979).
371. Parker C. W., Huber M. M., Hoffman M. D., Falkenhein S. F. Characterization of the two
major species of slow reacting substance from rat basophilic leukemia cells as glutathionyl
thioethers of eicosatetraenoic acids oxygenated at the 5 position. Evidence that peroxy
groups are present and important for spasmogenic activity, Prostaglandins, 18,
673—686 (1979).
372. Parker C. W. SRS-A on rat leukemia and rat mast cells. In: Biochemistry of the Acute
Allergic Reaction, ed. by E. L. Becker, A. S. Simon, and K. F. Austen, pp. 23-36, Alan
R. Liss, New York, 1980.
373. Parker C. W., Falkenhein S. F., Huber M. M. Sequential conversion of the glutathionyl
side chain of slow reacting substance (SRS) to cysteinyl-glycine and cystein in rat baso-
philic leukemia cells stimulated with A23187, Prostaglandins, 20, 863—886 (1980).
374. Watanabe S., Parker C. W. Role of arachidonic acid in the biosynthesis of slow reacting
substance of anaphylaxis (SRS-A) from sensitized guinea pig lung fragments. Evidence
that SRS-A is very similar or identical structurally to nonimmunologically induced forms
of SRS, J. Immunol., 125, 946—955 (1980).
375. Murphy R. C., Hammarstrom S., Samuelsson B. Leukotriene C: A slow reacting substance
from murine mastocytoma cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4275—4279 (1979).
376. Orning L., IIammarstrom S., Samuelsson B. Leukotriene D: A slow reacting substance from
rat basophilic leukemia cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2012—2017 (1980).
377. Morris 11. R., Taylor G. W., Piper P. J., Samhoun M. N., Tippins J. R. Slow reacting sub-
stances (SRSs) from rat basophil leukemia (RBL-1) cells, Prostaglandins, 19, 185—201
(1980).
378. 11 ammarstrom S., Murphy R. S., Samuelsson B., Clark D. A., Mioskowski C., Corey E. J.
Structure of leukotriene C. Identification of the amino acid part. Biochem. Biophys. Res.
Commun., 91, 1266 — 1272 (1979).
379. Rokasch J., Girard Y., Guindon Y., Atkinson J. G., Larue M., Young R. N., Masson P.,
Holme G. The synthesis of a leukotriene with SRS-like activity, Tetrahedron Lett., 21,
1485 — 1488 (1980).
380. Rankin J. A., Hitchcock M., Merrill W. W., Askenase P. W. Slow reacting substance
(SRS): IgE dependent release from alveolar macrophages (AM), Fed. Proc., 40, 1014
(1981).
381. Dawson W., Boot J. R., Kitchen E. A., Walker J. R. Inhibition of lipoxygenase related
effector systems. In: SRS-A and Leukotrienes, ed. by P. J. Piper, Wiley and Sons, Ltd.,
New York, 1980.
382. Jakschik B. A., Sun F. F., Lee L., Steinhoff M. M. Calcium stimulation of a novel lipo-
xygenase, Biochem. Biophys. Res. Commun. 95, 103—110 (1980).
383. Vanderhoek T. Y., Bryant R. W., Bailey J. M. 15-hydroxy 5,8,11,13 eicosatetraenoic acid.
A potent and selective inhibitor of platelet lipoxygenase, J. Biol. Chem., 255, 5996—9988
(1980).
384. Parker C. W., Fischman С. M., Wedner H. J. Relationship of slow reacting substance bio-
synthesis to intracellular glutathione levels, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 6873—6876
(1980).
385. ParkerC. W., KochD. A., Huber M. M., Falkenhein S. F. Incorporation of radiolabel from
[1—14C] 5-hydroxy-eicosatetraenoic acid into slow reacting substances, Biochem. Bio-
phys. Res. Commun., 94, 1037—1043 (1980).
386. Parker C. W., Falkenhein S. F., Huber M. M. Sequential conversion of the glutathionyl
side chain of slow reacting substance (SRS) to cystenyl-glycine and cysteine in rat baso-
philic leukemia cells stimulated with A23187, Prostaglandins, 20, 863—886 (1980).
387. Parker C. W. Immunopharmacology of slow-reacting substance of anaphylaxis. In: Immu-
246
Ч. В. Паркер
nopharmacology of the Lung, ed. by H. H. Newhall, pp. 25—53, Marcel-Dekker, New
York, 1983.
388. Parker C. W., Koch D. A., Huber M. M., F alkenhein S. F. Formation of the cystenyl from
slow reacting substance (leukotriene E4) in human plasma, Biochem. Biophys. Res. Com.
mun. 97, 1038—1046 (1980).
389. Hammarstrom S. Metabolism of leukotriene C3 in the guinea pig. Identification of meta-
bolites formed by lung, liver and kidney, J. Biol. Chem. 256, 9573—9578 (1981).
390. Parker C. W., Huber M. M., Falkenhein S. F. Pharmacologic characterization of slow-
reacting substances. In: Methods in Enzymology, ed. by W. E. M. Lands and W. L. Smith,
pp. 655—667, Academic Press, New York, 1982.
391. Drazen J. M., Lewis R. A., Wasserman S. I., Orange R. P., Austen K. F. Differential
effects of a partially purified preparation of slow-reacting substance of anaphylaxis on
guinea pig tracheal spirals and parenchymal strips, J. Clin. Invest., 63, 1—5 (1979).
392. Appleton R. A., Bantick J. R., Chamberlain T. R., Hardern D. H., Lee T. B., Pratt A. D.
Antagonists of slow reacting substance of anaphylaxis. Synthesis of a series of chromone-2-
carboxylic acids, J. Med. Chem., 20, 371—379 (1976).
393. Drazen J. M., Austen K. F., Lewis R. A., Clark D. A., Goto G., Marfat A., Corey E. J.
Comparative airway and vascular activities of leukotrienes C-l and D in vivo and in vitro,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4354—4358 (1980).
394. Palmer M. P., Mathews R., Murphy R. C., Hoffer B. Leukotriene C illicits a prolonged ex-
citation of cerebellar purkinjie neurons, Neurosci. Lett., 18, 173—180 (1980).
395. Ford-Hutchinson A. W., Bray M. A., Doig M. V., Shipley M. E., Smith M. J. H. Leuko-
triene B: A potent chemokinetic and aggregating substance released from polymorphonu-
clear leukocytes, Nature, 286, 264—265 (1980).
396. Palmer R. M. J., Stepney R. J., Higgs G. A., Eakins К. E. Chemokinetic activity of ara-
chidonic acid lipoxygenase products on leukocytes of different species, Prostaglandins, 20,
411-418 (1980).
397. Stenson W., Parker C. W. Monohydroxyeicosatetraenoic acid (HETEs) induce degranula-
tion of human neutrophils, J. Immunol. 124, 2100—2104 (1980).
398. Kreisle R. A., Parker C. W. Specific binding of leukotriene B4 to a receptor on human
polymorphonuclear leukocytes, J. Exp. Med., 157, 628—641 (1983).
399. Goldman D. W., Goetzl E. J. Characterization of a receptor on human neutrophils for the
chemotactic mediators 5,12-di-hydroxy-6, 14 CIS-8, 10 trans-eicosatetraenoic acid (leuko-
triene B4), Clin. Res., 30, 478A (1982).
400. Graff G., Stephenson J. H., Glass D. B., Haddox M. Г., Goldberg N. D. Activation of soluble
splenic cell guanylate cyclase by prostaglandin endoperoxides and fatty acid hydropero-
xides, J. Biol. Chem. 253, 7662—7676 (1978).
401. Hammarstrom S., Lindgren J. A., Marcelo C., Duell E. A., Anderson T. F., Voorhees J. J.
Arachidonic acid transformations in normal and psoriatic skin, J. Invest. Dermatol.,
73, 180—183 (1979).
402. Klickstein L. B., Shapleigh C., Goetzl E. J. Lipoxygenation of arachidonic acid as a source
of polymorphonuclear leukocyte chemotactic factors in synovial fluid and tissue in rheuma-
toid arthritis and spondyloarthritis, J. Clin. Invest., 66, 1166—-1171 (1980).
403. Siegel M. I., McConnell R. T., Porter N. A., Cuatrecasas P. Arachidonate metabolism via
lipoxygenase and 12L-hydroperoxy-5,8,10,14-icosatetraenoic acid peroxidase sensitive to
anti-inflammatory drugs, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 308—312 (1980).
404. Goldyne M. E., Stobo J. D. Synthesis of prostaglandins by subpopulation of human peri-
pheral blood monocytes, Prostaglandins, 18, 687—695 (1979).
405. Jakschik B. A., Lee L. N., Shuffer G., Parker C. W. Arachidonic acid metabolism in rat
basophilic leukemia (RBL-1) cells, Prostaglandins, 16, 733—748 (1978).
406. Bockman R. S. Prostaglandin production by human blood monocytes and mouse perito-
neal macrophages: Synthesis dependent on in vitro culture condition, Prostaglandins, 21,
9—30 (1981).
407. Humes J. L., Bonney R. J., Pelus L., Dahlgren M. E. Sadowski S. J., Kuehl F. A., Jr.,
Davies P. Macrophages synthesize and release prostaglandins in response to inflammatory
stimuli, Nature, 269, 149—151 (1977).
408. Bonney R. J., Naruns P., Davies P., Humes J. L. Antigen-antibody complex es stimulate
the synthesis and release of prostaglandins by mouse peritoheal macrophages, Prostaglan-
dins, 18, 605—616 (1979).
409. Stenson W. F., Parker C. W. Prostaglandins, macrophages and immunity, J. Immunol.
125, 1—5 (1980). . . . .
410. Scheid M. P., Goldstein G., Hammerling U., Byse E. A. Lymphocyte differentiation from ,
precursor cells in vitro, Ann. N.Y. Acad. Sci. 249, 531—540 (1975).
411. Bockman R. S. Stage dependent reduction in T colony formation coincidence with mono-
cyte synthesis of prostaglandins, J. Clin Invest. 66, 533—538 (1980).
27. Медиатора: высвобождение и функции
247
412. Goodwin J. A., Wilk A., Lewis М., Bankhurst A. D., Williams В. С., Jr. High-affinity
binding sites for prostaglandin E on human leukocytes, Cell. Immunol., 43, 150—159
(1979).
413. Hamberg M., Samuellson B. Prostaglandin endoperoxides. Novel transformation of ara-
chidonic acid in human platelets, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 71, 3400—3404 (1974).
414. Gibson К. H. Prostaglandins, thromboxanes, PGX: Biosynthetic products from arachidonic
acid, Chem. Soc. Rev. 6, 489—510 (1977).
415. Parker C. W. Arachidonic acid metabolism in activated lymphocytes. In: Mechanisms of
Lymphocyte Activation, ed. by K. Resch and H. Kirchner, pp. 47—57, Elsevier/North-
Holand Biomedical Press B.V., New York, 1981.
416. Spagnuolo P. J., Ellner J. J., Hassid A., Dunn M. J. Thromboxane A2 mediates augmen-
ted polymorphonuclear leukocyte adhesiveness, J. Clin. Invest., 66, 406—414 (1980).
417. Humes J. L., Bonney B. J., Pelus L., Dahlgren M. E., Sadowski S. J., Kuehl F. A., Jr.,
Davies P. Macrophage synthesis and release prostaglandins in response to inflammatory
stimuli, Nature, 269, 149—151 (1977).
418. Stringfellow D. Q., Fitzpatric F. A., Sun F. F., McGuire J. C. Prostacyclin biosynthesis in
activated, stimulated and normal mouse peritoneal cell populations, Prostaglandins, 16,
901—910 (1978).
419. Pincard B. N., McManus L. M., Hanahan D. J. Chemistry and biology of acetyl glyceryl
ether phosphorylcholine. In: Advances in Inflammation Research, V. 4, ed. by G. Weiss-
mann, pp. 147—180, Raven Press, New York, 1982.
420. Henson P. M. Release of vasoactive amines from rabbit platelets induced by sensitized
mononuclear leukocytes and antigen. J. Exp. Med., 131, 287—306 (1970).
421. Benveniste J., Henson P. M., Cochrane C. G. Leukocyte-dependent histamine release from
rabbit platelets. The role of IgE basophils, and platelet activating factor, J. Exp. Med.,
136, 1356—1377 (1972).
422. Benveniste J., Le Coeduc J. P., Polonsky J., Tence M. Structural analysis of puryfied
platelet-activating factor by lipases, Nature, 269, 170—171 (1977).
423. Demopoulos C. A., Pincard R. N., Hanahan D. J. Platelet-activating factor. Evidence for
l-O-alkyl-2-acetyl-sn-glyceryl-3-phosphorylcholine as the active component (A new class
of lipid chemical mediators), J. Biol. Chem., 254, 9355—9358 (1979).
424. Wykle R. L., Malone B., Synder F. Enzymatic synthesis of l-alkyl-2-acetyl-sn-glycery-3-
phosphocoline, a hypotensive and platelet-activating lipid, J. Biol. Chem. 255, 10256—
10260 (1980).
425. Farr R. S., Сох С. P., Wardlow M. L., Jorgense R. Preliminary studies of an acid-labile
factor (PAF), Clin. Immunol. Immunopatol.. 15, 318—330 (1980).
426. Renooij W., Wykle R. L., Blank M. L., Lee T. C., Malone B., Fitzgerild V., Snyder F.
Metabolism of l-alkyl-2-acetyl-sn-glycery-3-phosphocholine, an antihypertensive phospho-
lipid, Fed. Proc., 39, 2187 (1980).
427. Shaw J. O., Pinkard R. N., Hanahan D. J. Activation of rabbit platelet phospholipase and
thromboxane synthesis by l-O-hexadecyl/octadecyl-2-acetyl-sn-glyceryl-3-phosphorylcholi-
ne (platelet activating factor), Biochim. Biophys. Acta, 633, 222—229 (1980).
428. McManus L. H., Hanahan D. J., Demopoulos C. A., Pinckard R. N. Pathobiology of the
intravenous infusion of acetyl glyceril ether phosphorylcholine (AGEPC), a synthetic
platelet-activating factor (PAF) in the rabbit, J. Immunol., 124, 2919—2924 (1980).
429. Pinckard R. N., McManus L. M., O’Pourke D. A., Crawford M. H., Hanahan D. J. In-
travascular and cardiovascular effects of acetyl glyceryl ether phosphorylcholine (AGEPC)
infusion in the baboon, Clin. Res., 2 8, 358a (1980).
430. Pinckard R. N., Halonen M., Palmer J. D., Butler C., Shaw J. O., Henson P. M. Intra-
vascular aggregation and pulmonary sequestration of platelets during Ig3-induced syste-
mic anaphylaxis in the rabbit. Abrogation of lethal anaphylactic shock by platelet deplet-
ion, J. Immunol., 119, 2185—2193 (1977).
Часть VII
Важнейшие методы изучения
иммунной системы
Глава 28
Гибридомы и моноклональные антитела
Джон Ф. Кирней
(John F. Kearney)
Современная технология получения моноклональных антител основана
на совместном применении двух независимо возникших биологических подходов.
Первый из этих подходов (заслуга в его разработке принадлежит главным
образом Поттеру) связан с получением индуцированных миелом у мышей [1].
Эти опухоли представляют собой продукты злокачественной пролиферации
единичных клонов В-клеток, каждый из которых секретирует иммуноглобулины
одного какого-то вида, причем некоторые из этих иммуноглобулинов реагируют
с антигенами окружающей среды [2]. Доступность этих линий, возможность
трансплантировать их in vivo, а также адаптировать к росту в условиях in
vitro [3—5] позволили существенно расширить наши представления о струк-
туре, секреции и функциях иммуноглобулинов, а в последнее время было
получено огромное количество данных, проливших свет на структуры и функ-
ции иммуноглобулиновых генов (гл. 7—9).
Второй метод заключается в получении гибридов путем слияния двух
соматических клеток. Хотя слияние клеток наблюдали еще в прошлом столе-
тии [6], первое успешное выделение соматических гибридных клеток было
проведено только в начале 60-х годов [7]. Впоследствии благодаря использо-
ванию селективных сред, описанных Литтфилдом [8], удалось значительно
облегчить процедуру выделения гибридных линий, а использование целого
рода таких, способствующих слиянию агентов, как вирус Сендай [9, 10],
лизолецитин [11] и полиэтиленгликоль [12], помогло повысить собственно
частоту гибридизации. Получение гибридов соматических клеток открыло
новые пути изучения регуляции активности генов в эукариотических клетках,
взаимоотношений между ядром и цитоплазмой, анализа хромосом и взаимоот-
ношений вирус—хозяин.
Своим появлением гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела,
обязаны экспериментам, посвященным изучению экспрессии и регуляции
активности иммуноглобулиновых генов в миеломных клетках. С помощью
вируса Сендай удалось гибридизовать миеломные клетки крысы и мыши [13].
28. Гибридами и моноклональные антитела
249
Затем в двух лабораториях независимо осуществили слияние клеток мышиной
миеломы разных линий [14, 15]. При проведении дальнейших опытов уже
с использованием селективных сред был сделан ряд существенных наблюдений,
касающихся экспрессии иммуноглобулинов и имеющих важное практическое
значение для успешного получения моноклональных антител. Во-первых, оказа-
лось, что в гибридных клетках, образующихся в результате слияния двух мие-
лом, продуцирующих иммуноглобулины, продолжают эксперессироваться оба
родительских набора иммуноглобулиновых легких и тяжелых цепей, которые,
ассоциируясь случайным образом, формируют гибридные молекулы [16]. Далее
Милыптейн и Кёлер показали, что никаких новых иммуноглобулиновых цепей
в гибридных клетках не синтезируется, что указывает на стабильность обра-
зования 1g, а также на независимый контроль экспрессии иммуноглобулиновых
генов от обоих родителей [17, 18]. И наконец, было обнаружено, что если про-
исходит слияние варианта миеломы, не экспрессирующего ни легкие, ни тяже-
лые иммуноглобулиновые цепи штамма дикого типа, с иммуноглобулинопро-
дуцирующей линией, то непродуцирующие клетки не подавляют способность,
клеток другой родительской линии продуцировать иммуноглобулины, но про-
должают поддерживать синтез иммуноглобулинов продуцирующего родителя
[19].
Описанные эксперименты приобрели еще большее значение, когда Кёлер
и Милыптейн [20] осуществили слияние нормальных клеток селезенки мыши,
иммунизированной бараньими эритроцитами, с культивируемыми клетками ми-
еломы и показали, что некоторые из полученных гибридов секретируют анти-
тела к иммунизирующему антигену. Такие гибридные клетки, как и любые
клеточные линии, длительно росли in vitro и выделяли большие количества
специфических гомогенных антител в культуральную среду или могли расти
in vivo в виде трансплантируемых опухолей. В последнем случае антитела об-
наруживались в сыворотке крови и асцитной жидкости.
В этой главе обсуждаются разнообразные теоретические и практические
вопросы, связанные с получением гибридом. Всюду по возможности рассмат-
ривается лишь целесообразность тех или иных процедур и методологии, а не
точные экспериментальные детали. Обширный список литературы позволит
читателю легко найти подробное описание интересующего его метода. Глава
заканчивается обсуждением некоторых примеров, иллюстрирующих различ-
ные возможности применения гибридомной технологии, что послужит своего
рода путеводителем для читателя, желающего использовать этот метод.
28.1. Общие вопросы, касающиеся получения
гибридом
Иммунная система способна давать имунный ответ на почти неограничен-
ное число различных антигенов. Многочисленные антигенные детерминанты
(эпитопы) каждого простого или сложного антигена (иммуногена) активируют
множество клонов, начинающих продуцировать антитела с разной специфич-
ностью, аффинностью и авидностью. В природе почти никогда не наблюдается
истинный моноклональный ответ на антигены, хотя в ряде случаев в процесс
антителообразования вовлекаются, вероятно, очень немногие В-клеточные
клоны [21—23]. Конечно, хорошо известны примеры продуцентов моноклональ-
ных антител — это миеломы и другие опухоли В-клеток. Однако, несмотря на
то, что такие клетки служат бесценным источником некоторых антиген-спе-
250
Д. Ф. Кирней
цифических моноклональных антител, на практике чрезвычайно трудно поду-
чить миелому с заданной антигенной специфичностью [2, 24].
В 1976 г. Кёлер и Милыптейн детально описали метод слияния клеток,
секретирующих антитела какой-то одной специфичности, с клетками непрерывно
растущей миеломы [20]. Клон клеток, содержащих гены иммуноглобулинов,
принадлежавшие как антителообразующей клетке, так и миеломе, наследовал
от обоих антителообразующих родителей генетический материал, определяющий
специфичность данных антител, а от непрерывно растущей миеломы — способ-
ность к неограниченному росту.
Как показано на рис. 28.1, при иммунизации животного антигеном анти-
тела, секретируемые множеством В-клеточных клонов, активированных раз-
личными эпитопами введенного антигена, появляются в виде гетерогенной
Овычная
Моноклональные антитела
гетерогенная антисыворотка
Слияние
с миеломой
Рис. 28.1. Сравнение обычной антисыворот-
ки, полученной in vivo, с моноклональ-
ными антителами, полученными in vitro.
Клонирование гибридом В-клеточного про-
исхождения дает возможность выделять
в неограниченном количестве антитела, про-
дуцируемые индивидуальными клонами. По-
скольку моноклональные антитела моно-
специфичны, с их помощью можно изучать
как отдельные антигены, так и отдельные
эпитопы одного антигена. Ат — антитело,
Аг — антиген, Эп-эпитон.
смеси в иммунной сыворотке. Путем получения гибридом из клеток каждого
эпитоп-специфического клона с последующим клонированием гибридов возмож-
но разделить моноклональные антитела, специфичные к одним и тем же или
разным эпитопам одного антигена. Таким образом удается получить набор
моноклональных антител против различных эпитопов определенной молекулы,
или иммуногена. Такие высокоспецифичные антитела могут быть использованы
для исследования структуры и функции разных частей молекул, а также тех
или иных типов клеток без предварительной иммуноадсорбции. Другое важное
преимущество сводится к возможности наработки фактически неограниченного
количества антител, обладающих не меняющимися со временем специфичностью
и аффинностью.
Из рассмотренных в гл. 10 и 12 физиологических аспектов активации В-
клеток вытекает целый ряд соображений о механизме формирования гибридом.
Поскольку частота встречаемости антителообразующих клеток в иммунной
селезенке низка [10-3—10~5), необходимо во всех случаях стараться макси-
мально увеличивать число антиген-специфических В-клеток, способных к
28. Гибридомы и моноклональные антитела
251
слиянию и образованию нормальных гибридов. Очевидно, что максимум синте-
за антител (определяемых в сыворотке или путем подсчета бляшкообразующих
клеток) не совпадает с максимумом образования специфических гибридов. По-
этому особо важное значение приобретает подбор условий иммунизации и уста-
новление в рамках выбранных условий оптимального времени слияния. По-види-
мому, под влиянием полиэтиленгликоля (ПЭГ) предпочтительно сливаются
пролиферирующие или активированные с помощью антигена В-клетки. Под-
робно данный вопрос обсуждается в работе Паслея и Рузена [25]. Исходя из
этого, следует использовать такую схему иммунизации, при которой слиянию
подвергаются антиген-специфические клетки на той стадии дифференцировки,
когда они пролиферируют или находятся в активированном состоянии (гл. 12).
Способы иммунизации, используемые при получении гибридом, как прави-
ло, так сильно варьируют, что наиболее целесообразно предоставить читателю
возможность самому ознакомиться с соответствующей литературой, где он,
по-видимому, всегда найдет подходящее для себя описание условий иммуниза-
ции, проводившейся с помощью какого-либо похожего антигена [26—29].
Идентификация клеток, продуцирующих антитела заданной специфичнос-
ти,— это, пожалуй, самая важная процедура во всей гибридомной технологии.
Поскольку новообразованные гибридомы могут быть нестабильны в отношении
синтеза антител, желательно, чтобы методы раннего выявления отдельных анти-
тел ообразующих клонов были быстрыми и простыми. Концентрация антител в
лунках, содержащих гибридные клетки, обычно достаточно высока (10—100
мкг/мл). Поэтому чувствительность применяемых методов лимитируется,
как правило, доступностью антигена. В настоящее время наиболее широкое
распространение получили методы, основанные на реакции антиген—антитело,—
радиоиммунологический анализ и(или) иммуноферментный анализ (ИФА,
ELISA) [26-31].
Обнаруженные антителообразующие клоны должны быть немедленно ре-
клонированы. Необходимость быстрого реклонирования связана с тем, что после
слияния во многих гибридах начинается «выброс» хромосом, продолжающийся
до тех пор, пока число хромосом в клетке не станет равным приблизительно
2N. В ходе этого процесса некоторые клетки могут потерять хромосомы, несу-
щие гены иммуноглобулинов. Существует опасность, что такие клетки, неспо-
собные больше продуцировать иммуноглобулины, будут расти лучше антитело-
образующих клеток клона. В зависимости от плотности посева клеток после
гибридизации в каждую лунку может попасть более одного гибридного клона.
В этом случае возникает необходимость отделить ненужные антителообразую-
щие клоны от тех, которые представляют интерес для исследователя.
28.1.1. Гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ).
Обмен и процедуры отбора
При использовании современных методов гибридизации частота слияния
между клетками двух популяций оказывается относительно низкой 1/104)
лимфоидных клеток). Поэтому чтобы отделить гибриды от опухолевых клеток
миеломы или лимфомы (они служат партнерами при получении В- и Т-гибридом
соответственно), нужно убить неслившиеся клетки, которые составляют боль-
шинство и которые в силу своей способности к быстрому и неограниченному
росту in vitro будут неизбежно подавлять рост гибридных клеток. Обычно
для этой цели применяется разработанный Литтлфилдом метод, основанный
на предварительном выведении мутантных клеточных линий, дефектных по
некоторым ферментам, участвующим в синтезе нуклеотидов [8]. В клетках мле-
252
Д. Ф. Кирней
копитающих существуют запасные пути повторного включения предшественни-
ков пуринов и пиридинов в синтез ДНК и РНК (рис. 28.2). Выделение мутантов,
не способных к синтезу ферментов, ответственных за эту реинкорпорацию,
осуществляется воздействием мутагенов на клетки миеломной линии с последу-
ющим культивированием их в среде, содержащей токсичные аналоги азотистых
Основные пути Биосинтеза
пуринов и ПИРИМИДИНОВ
Запасные пути
Гипоксантин Ч’РПЧ’
или --------------
гуанин ГПРРТ
I I
Аминоптерин
Тимидин
Рибонуклеотиды
ДезоксириБонуклв
от иды
ДНК
Рис. 28.2. Основные и запасные пути био-
синтеза ДНК. Токсичные аналоги азотистых
оснований, приведенные в табл. 28.1, вовле-
каются в биосинтез ДНК через запасные
пути. В клетках мутантных линий, дефект-
ных либо по тимидин-киназе (ТК), либо
по гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтранс-
феразе (ГГФРТ), эти основания не вовле-
каются в биосинтез ДНК и не оказывают
токсического действия. Ввиду отсутствия
необходимых ферментов эти мутанты не
способны расти в условиях, когда основ-
ные пути синтеза пуринов и пиримидинов
заблокированы аминоптерином. В резуль-
тате на среде ГАТ смогут выжить лишь те
гибридные клетки, в которых содержится
нормальное количество ТК и ГГФРТ, полу-
ченных от родительской В-клетки, а все
неслившиеся миеломные клетки погибнут.
ФРПФ— фосфорибозил пирофосфат.
оснований. Некоторые из таких аналогов и соответствующие ферменты приве-
дены в табл. 28.1. В среде, содержащей токсичные аналоги, смогут выжить
Таблица 28.1. Токсичные аналоги азотистых оснований
и соответствующая ферментативная недостаточность
Аналоги Нарушенная ферментативная активность
6-тиогуанин 1 8-азагуанин J Бромдезоксиуридин Гипоксантин-фосфорибозилтрансфераза Тимидин-киназа
только мутантные клетки, лишенные функционально активных указанных
ферментов. С помощью таких сред можно выявлять, клонировать и в конечном
итоге выделять клетки, дефектные по тимидин-киназе (ТК-) или по гипоксан-
тин-гуанозин—фосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ-, HGPRT-).
Эти мутантные миеломные линии и служат партнерами для слияния, по-
скольку на их фоне легко отобрать гибриды, если заставить клетки ТК- или
ГГФРТ- использовать запасной путь синтеза нуклеотидов. Последнее достигает-
ся путем добавления в среду аналога фолиевой кислоты, аминоптерина, блоки-
рующего нормальный путь синтеза пуринов и пиримидинов, как показано на
рис. 28.2. В этом случае клетки миеломы оказываются вынужденными исполь-
зовать запасной путь, но, будучи лишены одного из необходимых ферментов,
погибают в среде ГАТ.
Генетические дефекты клеток мутантных линий никак не проявляются
при росте таких клеток в нормальной среде, так как отсутствующие ферменты
28. Гибридомы и моноклональные антитела
253
участвуют только в реакциях запасного пути синтеза нуклеотидов, а в нор
мальных условиях в нем нет необходимости. Клетки же селезенки синтезируют
полный набор ферментов запасного пути, так что гибриды, образовавшиеся
при слиянии с ГГФРТ- или ТК_ миеломными клетками, продуцируют в резуль-
тате достаточно ГГФРТ или ТК для того, чтобы выжить в среде ГАТ, содержа-
щей гипоксантин и тимидин. Таким образом, в этой среде погибают неслившиеся
клетки миеломы, а их гибриды с нормальными клетками продолжают расти. Что
касается нормальных В клеток, то in vitro они имеют лишь ограниченное
время жизни, поскольку не трансформируются и не пролиферируют и вскоре
гибнут.
28.1.2. Ревертанты
Полученные таким способом мутантные миеломные клетки в принципе
могут в результате обратной мутации восстанавливать свою ферментативную
активность, превращаясь в клетки-ревертанты, нечувствительные к среде
ГАТ. Для устранения возможности появления подобных ревертантов, растущих
быстрее истинных гибридом, полученных путем слияния, полезно либо выра-
щивать миеломные клетки в присутствии соответствующего токсичного аналога
азотистого основания, проводя, таким образом, отбор против этих ревертантов,
либо, в качестве альтернативного пути, периодически проверять, погибают ли
миеломные клетки в среде ГАТ.
28.1.3. Слияние клеток разных, непрерывно
растущих опухолевых линий
Для различных экспериментальных целей иногда бывает необходимо
осуществить слияние В-клеток, принадлежащих двум клеточным линиям, одна
(или обе) из которых не чувствительна к среде ГАТ. Для отбраковки несливших-
ся клеток в этом случае обычно используют один из двух методов. Первый
метод предполагает введение в предварительно выделенные ГГФРТ_-клетки
маркера устойчивости к какому-либо другому агенту. Например, при слиянии
клеток некоторых миеломных линий можно взять маркер устойчивости к уабаи-
ну (ингибирующему (Na+-|-K+)-ATPa3y). Если такие миеломные клетки слить
с клетками другой линии в присутствии ГАТ и уабаина, выживут лишь гибри-
ды, тогда как нормальные клетки погибнут [32]. Второй метод, описанный Рай-
том и Хайфликом [33] и использованный Барроузом и др. [34], заключается в
обработке опухолевых клеток летальной концентрацией (2 мМ) иодацетамида
непосредственно перед их слиянием с чувствительной к ГАТ миеломой. В этом
случае будут выживать только опухолевые клетки, слившиеся с миеломой.
28.1.4. Выбор миеломы
Поскольку в гибридомах, получающихся после слияния клеток, продол-
жается синтез и секреция легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов сливаю-
щихся партнеров, появляется возможность образования «смешанных» гибрид-
ных молекул. За счет таких молекул может уменьшаться титр специфических
антител и(или) могут возникать антитела с новой специфичностью, образующей-
ся в результате гетерологичной комбинации цепей. Этого можно избежать, если
для слияния использовать миелому, утратившую способность синтезировать свои
собственные иммуноглобулиновые цепи. В настоящее время имеется несколько
таких миелом (табл. 28.2), которые успешно используются для создания анти-
254
Д. Ф. Кирней
Таблица 28.2. Клеточные линии, пригодные для слияния
Миелома Класс секретируемых Ig Источник
У мыши X63-Ag8 NSl-Ag4/l MPC11-45.6TG1.7 X63-Ag8.C53 SP2/O-Agl4 FO S194/5XXO.BU.1 Yi, к x, внутриклеточно ?2b, X МОРС-21 (миелома) Х63 BALB/c X63-Ag8 Гибридома ( X 63-Ag8 X BALB/c) Клон Sp2/O-Agl4 BALB/c
У крысы 210.RCY3.Ag 1.2.3 —1 x Крыса Lou
телообразующих гибридом, секретирующих чистые антитела, не содержащие
иммуноглобулиновых цепей миеломных родителей.
Последовательность стадий получения одной из таких линий приведена
в табл. 28.3. Изначально для этойцели была выбрана линия ГГФРТ~РЗх63
Таблица 28.3. Получение миеломы P3x63Ag8.653, чувствительной к ГАТ
Название миеломы Цепи в составе Ig Маркер Свойства Источник данных
МОРС-21 I Yi, x — Миелома in vivo [1]
V РЗ I Yi, x — Миелома in vitro [2]
v P3x63Ag8 I Yi, x ГГФРТ- Линия, устойчивая к 8-азотиогуани- ну [101]
P3x63Ag8,6 I —, X+" — Клетки окрашивали меченными ФИТЦ анти-ул. Неокрашенные клет- ки отбирали с помощью проточного цитофлуориметра, 85 % клонов —х+ [101]
P3x63Ag8.65 I —, X+“ — Клетки Ag8.65. Реклонировали, 2 % клонов — х_. Реклонировали снова [101]
P3x63Ag8.653 5 — Стабильный непродуцент, чувстви- тельный к ГАТ [101]
[161. На первом этапе клетки этой линии окрашивали с помощью антител,
специфичных к поверхностным у1-цепям, после чего неокрашенные клетки
были отобраны с помощью проточного цитофлуориметра (FACS — fluorescence-
activated cell sorter) и клонированы. Клетки одного из полученных клонов,
как было затем показано методом иммунофлуоресценции, не экспрессировали
цитоплазматического ул, но содержали в цитоплазме х-цепи. На двух следующих
этапах клонирования было проверено 200 клонов на наличие цитоплазматических
х-цепей и из них отобран один клон P3x63Ag8.653, клетки которого не секрети-
28. Гибридомы и моноклональные антитела
255
ровали родительских ух- и х-цепей даже после слияния. Недавно были описаны
генетические дефекты, ответственные за неспособность клеток синтезировать
разные иммуноглобулины в этом и других подобных случаях [35]. Ныне очень
многие исследователи стремятся использовать несекретирующие миеломы ввиду
их неоспоримых преимуществ. К сожалению, несекретирующих и одновременно
способных к слиянию миелом человеческого происхождения, необходимых для
создания гибридом человек—человек (см. ниже), пока не существует.
28.1.5. Способы иммунизации
Для получения имеющих практическое значение антителосекретирующих
гибридом используются лимфоидные клетки, выделенные из различных источ-
ников, например, из селезенки или лимфатических узлов. При использовании
для первичной иммунизации большинства чужеродных белков, полисахаридов
и т. д. применяют следующую схему иммунизации: обычно вводят внутрибрю-
шинно 1—100 мкг антигена, смешанного с равным объемом полного адъюванта
Фрейнда (ПАФ). Затем с интервалом 2—3 недели проводят одну или более
внутривенных инъекций данного антигена в физиологическом растворе. Через
1—2 дня после последней инъекции клетки селезенки выделяют и сливают с
клетками выбранной миеломной линии. Более интенсивная и короткая схема
иммунизации используется для получения гибридом из клеток лимфатических
узлов. В этом случае мыши вводят подкожно в подушечки задних лап, паховые
районы и в несколько точек вдоль позвоночника 10—300 мкг антигена в ПАФ.
Через три дня процедуру повторяют, используя вместо ПАФ неполый адъювант
Фрейнда, а затем с интервалом в 3-—4 дня делают еще четыре инъекции
антигена в физиологическом растворе. Через день после последней инъекции
регионарные лимфоузлы, дренирующие область подкожных инъекций, удаляют,
суспендируют и далее проводят слияние как обычно. Данная схема иммуниза-
ции является модификацией процедуры получения обычных гетерогенных анти-
идиотипических сывороток, описанной в работе Либермана и др. [36].
Иммунизация корпускулярными антигенами, например чужеродными
клетками крови, бактериями, различными паразитами, опухолевыми клетками
или клетками, инфицированными вирусами, может проводиться без ПАФ путем
3—4 внутрибрюшинных инъекций с интервалами в 2—3 недели. При последней
инъекции 5-Ю7 клеток вводят внутривенно, а спустя 1—2 дня получают клетки
селезенки и проводят слияние.
Данные примеры приведены лишь в иллюстративных целях. В действи-
тельности же схемы иммунизации, применяемые разными исследователями,
значительно варьируют и определяются в большой степени имеющимся количе-
ством и типом антигена. Использование клеток лимфатических узлов обладает
тем преимуществом, что образуется больше гибридов, продуцирующих IgG.
Эти антитела имеют преимущества перед моноклональными IgM-антителами
ввиду большей легкости их выделения и очистки.
Помимо приведенных схем иммунизации описаны методы иммунизации
клеток грызунов in vitro [37]. При получении гибридом грызунов такая иммуни-
зация может и не иметь преимуществ перед иммунизацией in vivo, так как пред-
варяющая слияние антигенная стимуляция В-клеток в данном случае оказы-
вается лишь дополнительным этапом. В то же время, поскольку при создании
человеческих гибридом часто невозможно получить клетки от иммунизирован-
ных больных, можно надеяться, что проведение в этих случаях антигенной
стимуляции in vitro повысит частоту слияния опухолевых клеток с В-клетками
соответствующей специфичности [38, 39].
256
Д. Ф. Кирней
28.1.6. Схемы слияния клеток
Описанная ниже схема слияния (рис. 28.3) — одна из тех, которые успешно
используются во многих лабораториях. Применение полиэтиленгликоля в
качестве сливающего агента широко используется благодаря его эффективнос-
ти, простоте приготовления и воспроизводимости результатов. Другие схемы
Сефароза с
пришитыми ______
к ней
1. Анти-Ig
2. Белком А
3. Антигеном
Очистка моноклональных
антител с помощью
аффинной хроматографии
Глинки планшета
покрыты антигеном
2. В лунки добавлен
раствор, содержащий
щелочную фосфатазу,
сшитую с козьими
антимышиными
72a;72b;73;a-,k-,A-
антителами или с козьи-
ми антимышиными 1g
Очищенные DE52 Дсциты
моноклональные + G200 « ' --—
антитела
Гивридомные клетки
Рис. 28.3. Различные этапы получения моноклональных антител.
слияния могут отличаться от описанной по различным параметрам, однако
существует одно общее правило: лучше использовать какую-то одну из них, а
не сочетание нескольких.
1. Суспензии клеток селезенки или лимфатического узла, выделенных из
иммунизированной мыши, получают стандартным способом в «ледяном» забу-
ференном фосфатами физиологическом растворе.
2. Клетки миеломы выращивают в среде RPMI-1640, содержащей инакти-
вированную нагреванием сыворотку эмбриона коровы (10—20%), пенициллин
(100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (0,25 мкг/мл) и 2-меркап-
тоэтанол (5х10-5М). Такая среда называется полной средой. Она же исполь-
зуется и для добавления ГАТ-ингредиентов. Клетки миеломы, находящиеся в
логарифмической фазе роста, собирают и отмывают однократно безсывороточной
средой RPMI-1640.
3. Равные количества миеломных и лимфоидных клеток смешивают и дваж-
ды отмывают путем центрифугирования в бессывороточной среде RPMI-1640
при 1000 g и 37°С.
4. К осадку клеток, разбитому с помощью легкого потряхивания центри-
фужной пробирки, добавляют 1 мл предварительно нагретого 40%-ного раст-
вора ПЭГ. Клетки инкубируют около 1 мин в присутствии ПЭГ, который затем
медленно разбавляют безсывороточной средой RPMI, добавляемой по каплям
(5 мл в течение первых пяти минут, и затем более быстро еще 15—20 мл). После
этого клетки центрифугируют при 1000g и осторожно переносят с помощью пи-
петки во флакон, содержащий предварительно нагретую среду ГАТ
5. На этой стадии к слившимся клеткам могут быть добавлены сингенные
фидерные (питающие) клетки. Их получают, инъецируя 5—8 мл полной среды
28. Гибридомы и моноклональные антитела
257
в брюшную полость неиммунизированной мыши. При обратном изъятии большей
части этого объема отбирается такое количество перитонеальных макрофагов,
которое достаточно для получения примерно 120 мл среды, содержащей фидер-
ные клетки. Другими источниками фидерных клеток служат нормальная селе-
зенка и тимус.
6. Плотность полученной смеси доводят до (1—5)-105 клеток/мл, после
чего по 1 мл суспензии осторожно разливают в лунки 24-луночного планшета.
28.1.7. Выращивание гибридом в культуре
В первое время наличие большого количества клеточных обломков, а
также несинхронность гибели в среде ГАТ неслившихся миеломных клеток
затрудняет обнаружение гибридных клеток. Однако через 7—9 дней начинают
появляться небольшие кластеры клеток, имеющих типичную морфологию гибри-
дом. В зависимости от изначальной плотности клеток в рассеваемой смеси в
каждой лунке может оказаться один или более кластеров. В этот период надо
следить не только за ростом гибридов и изменением цвета среды в лунках, но
также и за наличием зараженных лунок, которые необходимо соответствующим
образом обрабатывать. При использовании 96-луночных планшетов через каждые
2—3 дня необходимо проводить «подкармливание». Для этого из каждой лунки
следует отбирать половину среды и заменять ее равным объемом свежей полной
среды./Вплоть до 14—21-го дня после слияния в среде должен содержаться ГАТ.
Затем полезно постепенно разбавлять среду ГАТ, заменяя ее нормальной
средой, ибо резкий переход от ГАТ к «чистой» среде может вызвать преждевре-
менную гибель гибридных клеток. Когда кластеры гибридных клеток достиг-
нут размера 2—3 мм в диаметре, супернатанты можно будет тестировать на на-
личие антительной активности. Иногда при использовании высокоиммуногенных
антигенов при скрининге наблюдается высокий уровень фона, обусловленный
антителами, синтезированными нормальными плазматическими клетками, кото-
рые не слились, но оказались в лунках на начальной стадии и продолжали
секретировать антитела в течение нескольких дней после рассева. Эти остаточ-
ные антитела негибридомного происхождения можно удалить до проверки на
активность, если при «подкармливании» хотя бы один раз полностью сменить
среду и провести анализ через 1—-3 дня — время, необходимое для того, чтобы
в среде появилось достаточное количество антител, секретированных гибридомой.
Тестирование гибридом на наличие антительной активности можно прово-
дить различными способами (см. ниже), однако клоны, обнаруживающие соот-
ветствующую специфичность, необходимо реклонировать как можно раньше, а
часть клеток исходного клона должна быть заморожена. Реклонирование тре-
буется по уже известным причинам, связанным с возможностью «выброса»
хромосом и необходимостью отделения ненужных клеток.
Для реклонирования можно использовать следующий путь: клетки сус-
пендируют в полужидком агаре, и эту суспензию наносят на слой агара, содер-
жащий фидерные клетки, с последующим отбором кластеров, образовавшихся
из отдельных клеток. Тестирование реклонированных гибридом на активность
антител производят после роста клонов в жидкой среде. Однако наиболее предпо-
чтительный с точки зрения легкости и удобства метод — это клонирование путем
лимитирующего разведения в 96-луночных планшетах. Он заключается в сле-
дующем: клетки разбавляют и рассеивают их вместе с соответствующими фидер-
ными клетками в такое количество лунок, чтобы рост гибридом наблюдался
примерно в 1/3 лунок. Теоретически этого можно добиться, подсчитав количест-
во клеток в исходной лунке и таким способом определив необходимое разбавле-
9-0395
258
Д. Ф. Кирней
ние, однако такой подход не всегда дает хорошие результаты из-за наличия
индивидуальных различий между гибридомами по эффективности роста, потреб-
ности в фидерных клетках и т. д. Для того чтобы пробы отбирались лишь из
лунок, получивших оптимальное количество клеток, успешно применяют сле-
дующую эмпирическую схему.
1. Из полной среды RPMI-1640 готовят разбавляющую среду, содержащую
перитонеальные фидерные клетки (5-104/мл), полученные от нормальной мыши
соответствующей линии.
2. К 30 мл данной среды добавляют 1—2 мкл суспензии гибридомных кле-
ток. Такое небольшое количество клеточной суспензии лучше всего переносить
с помощью простерилизованных пластиковых наконечников.
3. Используя 5-миллилитровые пипетки или диспенсер, рассевают по
0,2 мл полученной смеси в лунку 96-луночного планшета.
4. В результате остается около 10 мл содержащей гибридомы среды, кото-
рую снова разбавляют 20 мл полной среды и засевают другой 96-луночный
планшет. Повторив эту процедуру 2—3 раза, можно быть уверенным, что по
крайней мере в одном планшете клоны будут встречаться достаточно редко и что
в каждой лунке будет содержаться потомство лишь какой-то одной гибридомной
клетки.
После того как реклонированные гибридомы вырастут, супернатанты из
лунок, содержащих клоны, снова тестируют на наличие антител и их специфич-
ность. После выявления позитивной реклонированной гибридомы ее можно
наращивать (опять же используя фидерные клетки) в культуральных флакона^
увеличивающихся размеров.
28.1.8. Получение моноклональных антител
В зависимости от того, каким образом планируется использовать монокло-
нальные антитела, их можно выделять множеством различных способов.
При росте гибридом в культуре в супернатантах обычно содержится 10-—
100 мкг/мл чистых моноклональных антител. Их можно использовать без допол-
нительной очистки (возможно, после некоторого концентрирования) в качестве
первых антител для непрямой флуоресценции или при иммунопреципитации.
Если необходима дальнейшая очистка антител от присутствующих в культу-
ральной среде сывороточных белков, то можно использовать аффинную хрома-
тографию на сефарозе, конъюгированной с козьими или кроличьими антимыши-
ными Ig или белком А. Если требуются большие количества антител, то гибридому
можно выращивать в виде трансплантируемой опухоли у мышей гистосов-
местимой линии. При этом необходимо предварительно (в период от трех дней
до одного месяца до инъецирования) ввести мыши внутрибрюшинно 0,5 мл
минерального масла, например пристана (Pristane — Aldrich Chemical, Со.,
Milwaukee).
В асцитах накапливается большое количество антител (1—25мг/мл),
которые затем можно очистить с помощью аффинной хроматографии на сефарозе-
4В, конъюгированной с соответствующим антигеном или путем обычной ионо-
обменной хроматографии с последующей гель-фильтрацией. Очищенные антите-
ла следует хранить в забуференном боратом физиологическом растворе, содер-
жащем какой-либо консервант, например 0,1 % азида натрия, при 4°С, так как
повторяющиеся циклы замораживания — оттаивания, судя по всему, пагубно
влияют на стабильность мышиных моноклональных антител.
28. Гибридомы и моноклональные антитела
259
28.1.9. Причины неудач при получении гибридом
Получение гибридомы включает в себя множество in vivo и in vitro этапов,
а каждый дополнительный этап —• это, как известно, еще один источник оши-
бок. По-видимому, наиболее часто неудачи в получении гибридом связаны с
отступлением от устоявшихся методик работы с культурами тканей. Эти методи-
ки предусматривают наличие должного внимания к качеству и чистоте использу-
емой для культивирования посуды, стерильности сред, контролю за влажностью
и pH в инкубаторах для клеток. Типы сыворотки, добавляемой в культураль-
ные среды, также имеют важное значение, поскольку некоторые серии сыворот-
ки плода коровы не способны поддерживать рост гибридных клеток. Многие
фирмы поставляют сыворотку плода коровы, проверенную на способность под-
держивать рост гибридом. Для проведения слияния и поддержания в культуре
полученных гибридов используются цельная и очищенная от иммуноглобули-
нов лошадиные сыворотки [40], однако для получения первичных гибридом
они обычно оказываются менее эффективными, чем сыворотка плода коровы.
Особенно часто неудачи при получении гибридом связаны с инфицированием
какого-либо из сливающихся партнеров микоплазмой. В этих случаях вскоре
после слияния могут появиться кластеры гибридомных клеток, по затем они
перестают расти и в конце концов погибают. Методы обнаружения микоплазмы
описаны в работах [41, 42]. Для этой цели существует также целый ряд ком-
мерческих диагностических наборов. Полное описание способов контроля за
наличием инфицирующих агентов приведено в книге Хаммерлинга и др. [28].
28.2. Скрининг
Здесь дается лишь общее представление о методах скрининга гибридом и
рассматриваются достоинства и недостатки каждого из них. Для более глубокого
ознакомления с данным вопросом читатель отсылается к специальным методи-
ческим работам [26—29]. Поскольку гибридомы секретируют относительно боль-
шие количества антител, то простые, дешевые, удобные и экологически безопас-
ные методы скрининга имеют предпочтение перед высокочувствительными.
В зависимости от того, как предполагается использовать моноклональные
антитела, следует выбирать тот или иной способ скрининга. Например, если
антитела предназначены для изучения антигена иммуноцитологическими метода-
ми, то для первоначального скрининга следует выбрать иммунофлуоресцент-
ный анализ, а если антитела предполагается использовать в составе твердой
фазы в радиоиммунном анализе, то именно этот метод, по-видимому, наиболее
удобно использовать и для первоначального скрининга.
Если требуется получить антитела, направленные против компонента,
выполняющего какую-либо важную функцию, например против поверхностного
мембранного рецептора, то параллельно с тестом на связывание дополнительно
можно использовать биологический тест, в котором измерением определенной
функции метаболически активной клетки-мишени можно обнаружить монокло-
нальные антитела, специфичные к молекулам, выполняющим эту функцию.
Большинство из описываемых методов скрининга можно приспособить для тес-
тирования большого количества гибридом с использованием 96-луночных плас-
тиковых планшетов для микротитрования (клетки при этом могут быть при-
креплены к поверхности пластика множеством различных способов). Для сни-
жения трудоемкости скрининга гибридом разработано различное автоматическое
260
Д. Ф. Кup ней
и полуавтоматическое оборудование, позволяющее проводить распределение,
разбавление, отмывку, а также сбор антител.
Описанные ниже твердофазные методы повсеместно используются при
скрининге.
28.2.1. Иммуноферментный анализ (ELISA)
В последнее время большую популярность приобрел метод скрининга,
в основе которого лежит использование антител, конъюгированных с ферментом.
Согласно данному методу, антиген в разных формах, например в виде раствора,
связывается лунками 96-луночного планшета (при этом существенное значение
имеют pH и концентрация солей). Лунки тех же самых или аналогичных план-
шетов, будучи предварительно обработанными глутаральдегидом или поли-L-
лизином, могут связать и целые клетки, которые в этом случае будут выступать
в качестве иммобилизованных клеток-мишеней. В лунки, покрытые антигена-
ми-мишенями, добавляют супернатанты из содержащих гибридомы лунок и
(после необходимой инкубации) связанные с ферментом антитела, специфичные
по отношению к мышиным иммуноглобулинам. Затем после еще одной инкубации
и отмывки добавляют субстрат фермента и лунки, содержащие мышиные гибри-
домные антитела, связавшиеся с исследуемым антигеном, обнаруживают по
появлению яркоокрашенного продукта реакции.
Использование иммуноферментных реагентов имеет определенные пре-
имущества. Конъюгаты легко приготовить, а при соблюдении соответствующих
условий их можно хранить в течение длительного времени (2—-3 года), так что
отпадает необходимость в частом приготовлении новых препаратов, как в слу-
чае 1261-меченных антител. Продукт реакции субстрата с ферментом, свидетель-
ствующий о наличии в данной лунке гибридомных антител, может быть обна-
ружен визуально и без использования дорогостоящего оборудования, необходи-
мого для измерения радиоактивности. Иногда оказывается, что определенный
антиген, взятый в качестве мишени, обладает собственной ферментативной ак-
тивностью. Например, в цитоплазме В-клеток некоторых человеческих линий
содержится большое количество щелочной фосфатазы. Если в качестве вторых
антител использовать антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, то
будет наблюдаться неприемлемо высокий уровень фона, обусловленный соб-
ственной ферментативной активностью В-клеток. В таких случаях можно посо-
ветовать перейти на другой фермент, например ^-галактозидазу или пероксидазу
хрена [30]. Методы, подобные иммуноферментному, могут быть приспособлены
и для количественного анализа. В продаже имеется несколько высококачествен-
ных приборов, с помощью которых можно быстро и точно измерить оптическую
плотность в лунках, содержащих субстрат. Использование таких приборов
позволяет непосредственно определять содержание антител в супернатантах
и сыворотках. Другое очевидное преимущество данного метода по сравнению
с радиоиммунным анализом — это возможность избежать опасности загряз-
нения окружающей среды, возникающей при использовании реагентов, ме-
ченных изотопами. Более детальное описание различных иммуноферментных
методов и их использования при скрининге гибридом приведено в книге
Энгвалла и Песке [30].
28.2.2. Радиоиммунный анализ
Радиоиммунный анализ растворимых белков, полисахаридов, гаптенов,
липопротеинов и т. д. проводится в целом по той же схеме, как и иммунофер-
ментный анализ. Однако для измерения радиоактивности содержимого каждой
28. Гибридомы и моноклональные антитела 261
лунки при идентификации клеток, продуцирующих антитела заданной специ-
фичности, обычно применяется гамма-спектрофотометр. В этом случае каждую
отдельную лунку, связавшую радиоактивность, необходимо вырезать из план-
шета. Существует и другой метод, при котором целый планшет можно поместить
на рентгеновскую пленку с флуорографическим экраном для сокращения вре-
мени экспозиции [431.
Для обнаружения ассоциированных с клетками антигенов могут исполь-
зоваться и различные варианты радиоиммунного анализа, например прямое
связывание антител с суспензией клеток в жидкой фазе. При этом живые клетки
оставляют в суспензии для взаимодействия с супернатантами гибридом, а затем
их обрабатывают меченными антимышиными Ig. После этого измеряют радио-
активность клеточного осадка. Данный метод позволяет обнаружить лишь по-
верхностные антигены, однако он имеет то преимущество, что позволяет избе-
жать модификации поверхностных компонентов клетки, происходящей при
фиксации. Если же клетки связать с лунками, как описано выше, а затем за-
фиксировать глутаральдегидом, смесью уксусная кислота — этанол или каким-
либо иным фиксатором, то можно обнаружить и различные внутриклеточные
компоненты [44].
28.2.3. Иммунофлуоресцентный анализ
Благодаря своей высокой специфичности и отсутствию загрязнения други-
ми сывороточными компонентами моноклональные антитела оказались особенно
удобными для иммунофлуоресцентного анализа. Поскольку антитела к мембран-
ным компонентам или другим клеточным органеллам, отбираемые на основе
описанных выше тестов, не всегда могут быть пригодны для исследований мето-
дом иммунофлуоресценции, то в тех случаях, когда они нужны для этого, ре-
комендуется проводить скрининг также с помощью иммунофлуоресцентных
тестов. Конечно, скрининг большого количества супернатантов может занять
довольно много времени, однако существует несколько способов, позволяющих
сделать эту процедуру менее утомительной. Клетки-мишени могут быть зафик-
сированы с помощью поли-Ь-лизина или глутаральдегида на микроячейках
предметных стекол (Headley Essex Multispot Slide, Shandon Southern Instru-
ments). Такого же эффекта можно добиться, если клетки сорбировать или вы-
ращивать на стерильных стеклах в виде монослоя. После соответствующей фик-
сации (если это необходимо) к клеткам добавляют небольшое количество надо-
садочной жидкости из каждой содержащей гибридому лунки, и затем клетки,
связавшие антитела, выявляют с помощью антимышиных антител, меченных
флуоресцентным красителем. Такие микроячейки можно сделать самим, если на
предметное стекло наклеить 10—12 полос двусторонней прозрачной липкой
ленты параллельно друг другу с интервалами в 2—3 мм и затем накрыть их
покровным стеклом размером 22 X 64 мм. В результате получится большое коли-
чество микроячеек, в которые, используя капиллярные эффекты, можно внести
окрашенные в суспензии клетки. Края микроячеек затем закрывают с помощью
лака для ногтей. Просмотр индивидуальных клеточных суспензий может
осуществляться путем обычной клеточной микроскопии.
В более сложном анализе для скрининга супернатантов гибридом использу-
ется проточный цитофлуориметр [45]. Наличие различного оборудования для
работы с микропробами, позволяющего быстро инъецировать многочисленные
образцы окрашенных клеток в кювету цитофлуориметра, позволяет быстро
анализировать большие количества индивидуальных супернатантов. Эту про-
цедуру можно сделать еще более удобной, если окрашивание клеток-мишеней
индивидуальными супернатантами осуществлять в лунках 96-луночного план-
262
Д. Ф. Кирней
шета, а стадию отмывки проводить путем одновременного центрифугирования
всех 96 образцов в специальных центрифужных адапторах для 96-луночных
планшетов. Такой метод анализа, безусловно, будет полезным в тех случаях,
когда результаты окрашивания специфическими антителами можно прямо
сопоставить с размером клеток или сравнить с результатами окрашивания, про-
водимого с помощью каких-либо других моноклональных антител, меченных
другим флуоресцентным красителем, так же как и с другими параметрами,
измеряемыми с помощью проточного цитофлуориметра.
28.3. Другие гибридомы
28.3.1. Гетерогибридомы
Большой интерес представляет возможность получения моноклональных
антител от других видов (т. е. не мышиных), и имеются сообщения об использо-
вании мышиных миеломных клеток для создания межвидовых гибридом, секре-
тирующих немышиные антитела человеческого, крысиного и кроличьего про-
исхождения [46—49]. Однако использование этих гибридом ограничено из-за
быстрой сегрегации хромосом, происходящей после слияния клеток, относящих-
ся к разным видам. При получении межвидовых антителосекретирующих гибри-
дом путем слияния с мышиными миеломами предпочтительно элиминируются
человеческие, крысиные и кроличьи хромосомы. Вероятность такой потери
хромосом при слиянии клеток, по-видимому, зависит от степени филогенетичес-
ких различий между соответствующими видами. Причины, вызывающие потерю
хромосом, еще до конца не выяснены, хотя может оказаться, что предпочтитель-
ная элиминация человеческих хромосом обусловлена их происхождением из
сравнительно более медленно растущих родительских клеток. Другой фактор,
обусловливающий потерю хромосом, связан с неправильным взаимодействием
между хромосомами и нитями «чужеродного» веретена, приводящим к предпочти-
тельной элиминации немышиных хромосом [50]. Однако оказалось, что путем
многократного реклонирования, сопровождаемого отбором на каждом этапе
антителообразующих клонов, можно получать межвидовые гибридомы, ста-
бильно секретирующие антитела немышиной природы [47, 48]. Наличие крыси-
ной миеломы (табл. 28.3) позволило создать гибридомы крыса—крыса, хотя
следует заметить, что стабильность гибридом крыса—мышь обычно и так доста-
точно высока, и для получения крысиных моноклональных антител можно
просто слить иммунные клетки крысы с клетками непродуцирующей миеломы
мыши [46].
Сообщения о гибридомах кролик—мышь появляются сравнительно редко
и работать с такими гибридомами трудно [49]. Сообщения о получении гибридом
с использованием клеток животных других видов, не относящихся к млекопи-
тающим, чрезвычайно редки.
Потеря хромосом у межвидовых гибридом, нежелательная при стремлении
получить моноклональные антитела, оборачивается колоссальным преимущест-
вом в тех случаях, когда необходимо выяснить хромосомную локализацию неко-
торых структурных генов [51]. Например, регистрируя с помощью цитохими-
ческих методов элиминацию человеческих хромосом и одновременно проводя
их идентификацию, можно связать наличие определенных хромосом с соответ-
ствующими фенотипическими признаками. Затем можно локализовать отдель-
ные гены в данной хромосоме. Таким способом в человеческой хромосоме 14 был
картирован кластер генов, кодирующих тяжелые цепи [52], а с помощью моди-
28. Гибридомы и моноклональные антитела
263
фицированного метода с использованием кДНК-зондов, взаимодействующих с
ДНК этих межвидовых гибридов, была установлена локализация х- и Х-локу-
сов легкой цепи в определенных мышиных хромосомах [53—55].
28.3.2. Гибридомы человек-человек
В последнее время появились сообщения о получении ГГФРТ“-линий
человеческих В-клеток, которые, по имеющимся данным, пригодны для созда-
ния гибридом человек—человек [56—58]. Некоторые из этих линий приведены в
табл. 28.4. Принципы получения гибридом человек—человек в основном ана-
Таблица 28.4. Человеческие мутантные линии, пригодные для получения
гибридом
Мутантная линия Класс секретируемых Ig Родительская миелома Источник данных
SKO-007 GM1500-GTG-A12 GK-5 е, X ?2, X , Х U-266 (е, X) GM1500 GM1500-GTG- А12 [56] [57] J. Kearney, неопубликован- ные данные
логичны тем, которые используются для получения антителообразующих гиб-
ридом грызунов. До сих пор имеется лишь несколько сообщений об успешном
конструировании гибридом человек—человек с использованием линий ГГФРТ-.
В этих случаях источником лимфоцитов обычно служили клетки селезенки
пациентов, сенсибилизированных во время иммунологических тестов [56],
или клетки периферической крови больных, страдающих различными заболе-
ваниями [57]. Хотя неясно, почему крупномасштабное производство специфи-
ческих антитёлообразующих гибридов человек—человек оказывается не столь
успешным, как в случае гибридом грызунов, тем не менее несколько вероятных
причин можно указать. Во-первых, используемые для слияния человеческие
В-клеточные линии морфологически отличаются от мышиных миеломных линий,
обычно происходящих из активно секретирующих иммуноглобулины плазма-
цитом, свойства которых аналогичны свойствам зрелых дифференцированных
плазматических клеток. Клетки человеческих линий — это лимфобластоидные
незрелые и в типичном случае менее дифференцированные В-плазмабласты.
Они экспрессируют очень мало цитоплазматических иммуноглобулинов, имеют
высокую плотность поверхностных 1g- и DR-антигенов (N. Warner, личное со-
общение), не секретируют иммуноглобулинов активно и, по-видимому, проли-
ферируют значительно быстрее большинства клеток мышиных линий. Многие
линии, кроме того, экспрессируют вирус Эпштейна—Барр. Возможно, что
столь небольшие количества антител, секретируемых гибридами человек—чело-
век, получающимися в результате слияния человеческих антителообразующих
клеток с клетками этих линий, объясняются наложением друг на друга низких
скоростей секреции, характерных для фенотипов клеток обеих родительских
линий. Кроме того, из неопубликованных результатов, полученных в лаборато-
рии автора, с очевидностью следует, что гибридомы человек—человек часто
оказываются существенно менее стабильными в плане секреции специфических
антител, чем гибридомы грызунов, и значительно труднее поддаются клониро-
ванию. Хотя причины подобной нестабильности еще до конца не выяснены, не
264
Д. Ф. Кирней
исключено, что они связаны с различием скоростей пролиферации у нормальных
человеческих антителообразующих клеток и человеческих клеток, чувствитель-
ных к ГАТ, что в результате приводит к потере соответствующих хромосом
(этот вопрос уже рассматривался при обсуждении межвидовых гибридов).
Эффективность методов слияния и выявления антителообразующих клонов
для клеток человека и грызунов, по-видимому, одинакова. Не исключено, что
значительного увеличения эффективности слияния, клонирования и последу-
ющего роста гибридом человек—человек можно добиться, если, как было пред-
ложено выше для чисто мышиных систем, к гибридомам добавлять мышиные
фидерные клетки.
28.3.3. Т-клеточные гибридомы
Хотя большая часть этой главы посвящена обсуждению гибридом В-кле-
точного происхождения, однако имеется много сообщений о Т-клеточных гибри-
домах, полученных с помощью различных ГГФРТ-дефицитных Т-клеточных
линий, например BW 1547 и EL4 [59—63].
Возможность создания и поддержания в культуре Т-клеточных гибридом,
способных секретировать факторы, обладающие многими иммунологическими
активностями, помогла выделить среди Т-клеток различные субпопуляции и
детально охарактеризовать множество хелперных и супрессорных факторов. Не
без основания надеялись, что получение непрерывно растущих Т-клеточных
линий и гибридом с антигенной специфичностью, аналогичной специфичности
некоторых антителопродуцирующих клонов, таких, как, например, ФХ-специ-
фичных идиотип-положительных миелом ТЕРС15, позволит осуществить гене-
тический анализ генов V, участвующих в синтезе антиген-специфичных Т-кле-
точных рецепторов. Пока между перестройками генов в антиген-специфичных
гибридомах и линиях Т-клеток, обладающих аналогичной специфичностью, сход-
ства не обнаружено [64].
При создании Т-клеточных гибридом возникло несколько чисто технических
проблем, в силу которых для получения индивидуальных клонов с определен-
ными свойствами Т-клеточные гибридомы ныне используются меньше, чем
непрерывно растущие Т-клеточные линии. Т-клеточные гибридомы обладают
более выраженной тенденцией к нестабильному вопроизведению желаемых
функций. Это может быть обусловлено несколькими факторами, в том числе
быстрой элиминацией хромосом из Т-клеточных гибридов [65]. Известно мно-
жество разных Т-клеточных субпопуляций, выполяющих различные функции.
Возможно, что для непрерывного осуществления какой-либо хелперной или
супрессорной функции требуется, чтобы клетки сливающейся линии обладали
такими же фенотипическими свойствами, как и нормальные Т-клетки с данной
активностью. Клетки линии BW1547, наиболее часто используемой для гибри-
дизации, имеют фенотип Ly2,3, характерный для супрессорных Т-клеток. Не
исключено, что получение других Т-клеточных линий с соответствующим феноти-
пом облегчит создание в будущем стабильных Т-клеточных гибридом. Следую-
щий фактор, обусловливающий нестабильность воспроизведения желаемых
свойств, может быть связан с тем, что, как было показано, для выполнения
многих функций Т-клетки должны взаимодействовать с другими Т-клетками или
макрофагами. Поскольку после слияния Т-клеточные гибриды клонируются из
смеси нормальных клеток, то такие взаимодействия уже могут больше и не
иметь места, что иногда будет приводить к утрате интересующей Т-клеточной
функции. Тем не менее в последнее время довольно часто стали появляться сооб-
щения о создании стабильных Т-клеточных гибридом [59—63].
28. Гибридомы и моноклональные антитела
265
В большинстве случаев скрининг Т-клеточных гибридом в силу необходимо-
сти основывается на эффекте модуляции иммунного ответа в условиях in vitro.
В результате процедуры определения активности оказываются сложнее, чем при
скрининге специфических моноклональных антител. Более детально эти про-
цедуры описаны в гл. 30 в разделе, посвященном обсуждению вопросов, свя-
занных с клонированием линий Т-клеток и определением их продуктов и функ-
ций.
28.4. Примеры использования гибридом
28.4.1. Разнообразие В-клеток
Создание В-клеточных гибридом не только позволило производить специ-
фические моноклональные антитела, но и помогло глубже понять генетические
механизмы, обусловливающие разнообразие антител. Как говорилось в гл. 3,
пре-В-клетки — первые идентифицируемые элементы В-клеточного ряда —
обнаруживаются в эмбриональной печени млекопитающих. Поскольку популя-
ция пре-В-клеток гетерогенна и немногочисленна, анализирвать иммуноглобу-
линовый фенотип пре-В-клеток в том случае, когда они берутся из свежевы-
деленной печени, довольно трудно [66]. В то же время, получив из пре-В-клеток
гибридомы, можно вырастить клоны сравнительно редких клеток [66], что
позволяет анализировать экспрессию иммуноглобулиновых генов и синтез
иммуноглобулинов. Было показано, что в таких гибридомах гены Ун перестрое-
ны, а гены VL — нет [67, 68]. Это наблюдение подтвердилось в опытах по изуче-
нию линий В-клеток, трансформированных вирусом Абельсона, откуда был
сделан вывод, что при созревании В-клеток определенный ген VH может, по-
видимому, свободно комбинироваться с различными генами [69]. Аналогичный
подход использовали для изучения механизма переключения генов Ig в В-
клетках, трансформированных вирусом Абельсона, где, по-видимому, происхо-
дит спонтанное переключение с синтеза ц-цепей на синтез у2Ь-цепей [34]. Для
этого получали независимые гибридомы из IgM- и из IgGjb-секретирующих
клеток. Таким образом оказалось возможным стабилизировать геном в обеих
произошедших от общего предка клеточных линиях в виде клонов и, сравнивая
р- и у2Ь-секретирующие гибридомы, получить информацию о генных пере-
стройках при переключении изотипа в пределах одной клонированной линии.
Крайне информативным оказалось использование гибридом для анализа
разнообразия антител, образующихся в ходе иммунного ответа. От мышей, имму-
низированных а 1-3-декстраном или фосфорилхолином, стандартными методами
было получено большое количество гибридом со специфичностью именно к
этим антигенам. Несмотря на то что ответ на эти антигены считался высоко
гомогенным, анализ аминокислотной последовательности секретируемых гиб-
ридомами антител показал, что они представляют собой семейство довольно
близких друг к другу, но в то же время достаточно гетерогенных антител [70, 71].
Аналогично для получения информации об иммуноглобулиновых генах и меха-
низмах, обусловливающих разнообразие антител, была успешно использована
панель гибридом, специфичных к гаптенам арсонату и нитрофенилу [72, 73].
Итак, благодаря возможности клонировать клетки иммунной системы было
получено большое количество новых данных о механизмах рекомбинации,
обусловливающих разнообразие V-районов иммуноглобулинов, и особенно о
роли соматических мутаций в возникновении разнообразия антител [74].
К использованию гибридом для изучения генетических механизмов, лежа-
щих в основе разнообразия антител, имеют отношение и попытки создания ан-
266
Д. Ф. Кирней
тиген-специфических гибридом с фенотипами, соответствующими различным
стадиям дифференцировки В-клеток. Подобные попытки, однако, не всегда
были успешными. Частично это может быть связано с несоответствием фенотипов
сливающихся клеток. Некоторые данные по этому вопросу получены в опытах по
слиянию пре-В-клеток с клетками миеломы, в которых полученные гибридомы
синтезировали главным образом секреторные ц-цепи [75]. Усилия по созданию
гибридом, обладающих фенотипом В-клеток, т. е. экспрессирующих специфич-
ные по отношению к антигену поверхностные иммуноглобулины, и остающихся
чувствительными к факторам регуляции роста, оказались безуспешными, что
объясняется, возможно, доминированием фенотипов окончательно дифферен-
цированных клеток миеломных линий, использованных для слияния.
28.4.2. Моноклональные антитела
и лимфогемопоэтические клетки
Клетки лимфогемопоэтической системы весьма разнообразны и включают
в себя как стволовые, так и более дифференцированные клетки. К таким диффе-
ренцированным клеткам относятся: а) клетки, участвующие в образовании анти-
тел; б) большой набор клеток тимусного происхождения (Т-клетки), участвую-
щих в уничтожении чужеродных клеток и в модуляции образования антител; "
в) моноциты или фагоциты, действующие при иммунной защите как антиген-
презентирующие клетки, а также как клетки-мусорщики и клетки-киллеры, и
г) природные киллеры (ПК, NK), природа и функция которых постепенно про-
ясняются [76]. Принадлежа к разным рядам и находясь на разных стадиях диф-
ференцировки, эти клетки экспрессируют соответствующие дифференцировоч-
ные маркеры. Для изучения изменений таких мембранных маркеров оказыва-
ются крайне полезными моноклональные антитела.
На сегодняшний день известно большое количество типов Т-клеток, имею-
щих различные хелперные, супрессорные и киллерные функции. В гл. 4 рассмат-
ривается, каким образом с помощью моноклональных антител можно анализи-
ровать субпопуляции Т-клеток, а также избирательно выделять индивидуаль-
ные типы клеток в тех случаях, когда клетки сходных линий, обладающие
многими одинаковыми дифференцировочными маркерами, могут быть различны
лишь по экспрессии уникальных, узнаваемых моноклональными антителами
антигенов.
Такие панели моноклональных антител интенсивно используются для
изучения различных этапов нормального развития лейкоцитов. Кроме того,
поскольку многие виды лейкоза представляют собой опухолевые заболевания, ха-
рактеризующиеся трансформацией Т- или В-клеток, а также клеток моноцитарно-
го ряда, с помощью моноклональных антител, направленных против поверхност-
ных антигенов этих клеток, можно с определенной степенью достоверности
определить тип клеток, характерных для данного конкретного лейкоза [76]. Это
поможет разработать стратегию лечения, поскольку различные типы клеток
по-разному реагируют на разные способы химиотерапии.
28.4.3. Взаимодействия идиотип — антиидиотип
Большое внимание было уделено предполагаемому сетевому взаимодейст-
вию между идиотипами вариабельных участков иммуноглобулинов, синтези-
руемых и экспрессируемых В-клетками и идиотип-подобными структурами
клеток, принимающими участие в регуляции иммунного ответа [77]. Использо-
вание гибридом позволило провести значительно более тонкий анализ этих
28. Гибридомы и моноклональные антитела
267
взаимодействий. Антиидиотипические антитела, полученные традиционным
путем, обычно представляют собой гетерогенную популяцию антител с различ-
ными изотипами, специфичных к разным идиотипам, находящимся как внутри,
так и вне антиген-связывающих участков районов V одной и той же молекулы
(см. также гл. 9). Использование моноклональных антиидиотипических анти-
тел позволило сравнить биологические активности антиидиотипических анти-
тел разных изотипов [78]. Более того, оказалось, что эти моноклональные
антитела можно использовать и как тест-реагенты на различные районы связы-
вающих участков иммуноглобулинов [79, 80].
Антиидиотипические антитела, используемые в качестве клональных мар-
керов, стали важным биологическим инструментом для изучения процессов,
Скрининг анти-Id (+)-клонов
s"'""” методом ИФА
'**-Реклониромние Моноклональные анти-И-антитела
Рис. 28.4. Схема получения моноклональ-
ных антиидиотипических антител, направ-
ленных против свободных IgA-иммуногло-
булинов, секретируемых опухолевыми
ALL-клетками. Аг — антиген, ИФА — им-
муноферментный анализ.
связанных с возникновением и развитием клонов неопластических В-клеток
[81, 82]. На рис. 28.4 приведена схема изучения острой лимфоцитарной IgA-лей-
кемии человека (ALL — acute lymphocytic leukemia). Поскольку клетки дан-
ной лейкемической линии не секретируют иммуноглобулинов, то сперва,
используя ранее описанный метод [83], осуществляли их слияние с клетками
несекретирующей мышиной миеломы, получая в результате гетерогибридомы,
секретирующие человеческие IgA^.-иммуиоглобулины ALL-природы. Одно-
временно с этим с помощью уже описанной процедуры мышей иммунизировали
интактными ALL-клетками, выделенными из крови больных. Гибридомы, по-
лученные при слиянии клеток лимфатического узла с миеломой, подвергали
затем скринингу на очищенных IgAjx-иммуноглобулинах, выделенных из гете-
рогибридом для идентификации моноклональных антител, имеющих антиидио-
типическую специфичность. За три недели были получены моноклональные ан-
тиидиотипические антитела, специфичные к slgA, имеющимся на поверхности
данных ALL-клеток. Эти антитела были затем использованы для изучения про-
исхождения неопластических В-клеток. Оказалось, что у данного больного
в костном мозге до или на стадии пре-В-клетки произошла неопластическая
трансформация В-клетки, которая и обусловила появление лейкемических
sIgAj-клеток [84].
Наконец, моноклональные антиидиотипические антитела используются
для иммунотерапии больных, страдающих В-клеточной неоплазией; при этом
268
Д. Ф. К up ней
имеется сообщение об успешном лечении больного с В-клеточной лимфомой
[85]. Тем не менее важно подчеркнуть, что, хотя идиотипические маркеры,
по-видимому, являются уникальными и высокоспецифичными маркерами
опухолевых клеток В-клеточного ряда, их использование в подобной иммуно-
терапии не всегда может оказаться успешным. Если трансформация лимфоид-
ной клетки произошла до или на стадии пре-В-клетки, как, например, имело
место в случае IgAlx-ALL, то антиидиотипические антитела не будут реагиро-
вать с поверхностью опухолевых клеток, поскольку такие клетки не экспрес-
сируют функциональных рецепторов [86, 87]. В результате идиотипспецифиче-
ские антитела будут связываться только с более зрелыми клетками В-клеточ-
ного ряда, не взаимодействуя с той популяцией клеток, из которой данные
лейкемические клетки, по всей видимости, и произошли. Подобные проблемы,
как будет показано ниже, могут возникать и при попытках использовать опу-
холеспецифичные антитела для иммунотерапии.
28.4.4. Опухолевые антигены
С давних пор иммунологи, работавшие с опухолями, мечтали выявить
у человека антигены, специфичные для опухолей. Использование монокло-
нальных антител, обладающих точно известной специфичностью, дало возмож-
ность идентифицировать целый ряд антигенов, характерных, по-видимому, для
определенных опухолей. Были описаны антитела, реагирующие с меланомными
антигенами488], с клетками колоректальной карциномы [89], нейробластомы
[90] и с антигенами, общими для различных видов лимфатической лейкемии
[91]. Таков немногочисленный перечень моноклональных антител, выявляю-
щих антигены, экспрессируемые в большей степени или исключительно на по-
верхности опухолевых клеток.
Таким образом, использование моноклональных антител позволяет избе-
жать проблем, связанных с применением обычных антител, индуцируемых опу-
холевыми клетками, когда в ответ на антиген у животного появляется множе-
ство различных антител, реагирующих не только с опухолевыми антигенами,
но также и с антигенами, экспрессируемыми нормальными клетками. Трудности
получения гетерогенных антител, не реагирующих с нормальными клетками,
ранее ограничивали их использование при постановке диагноза и лечении.
28.4.5. Диагностика и терапия
Исключительная специфичность моноклональных антител стимулировала
новые исследования, касающиеся радиологического сканирования опухолей
и метастазов. При использовании данного метода опухолеспецифические моно-
клональные антитела метят каким-либо радиоактивным изотопом и инъеци-
руют в малых дозах в тело больного, после чего с помощью радиографических
методов анализируют распределение метки. Изотопы, связанные с моноклональ-
ными антителами, можно обнаружить внутри и вокруг опухолей, которые уда-
ется таким образом локализовать. Возможности данного метода уже были про-
демонстрированы на животных <[92] (рис. 28.5). Помимо прямой локализации
опухолей и метастазов использование меченых моноклональных антител может
повысить чувствительность выявления в жидкостях организма растворимых
опухолевых продуктов, например карциноэмбрионального антигена или аль-
фа-фетопротеина [93].
По-видимому, наиболее успешно моноклональные антитела можно исполь-
зовать для проведения эффективной иммунотерапии против неопластических
28. Гибридомы и моноклональные антитела
269
клеток. В этом случае опухолеспецифические антитела конъюгируют с метабо-
лическим ядом или с радиоактивным изотопом, характеризующимся высокой
энергией эмиссии; при внутривенном введении эти антитела направляются
прямо на опухолевые клетки аналогично тому, как это происходит при выяв-
лении опухолей. Кроме того, антитела можно еще использовать для уничтоже-
ния опухолевых клеток в результате комплемент-завйсимого лизиса. В послед-
Рис. 28.5. Сцинтиграфическое скани-
рование мыши — носителя опухоли
после введения ей меченных 1311 мо-
ноклональных антител, специфичных к
предварительно трансплантированной
тератокарциноме. (Фотография предо-
ставлена Ballou.) Более детально метод
описан в работе того же автора [92].
нее время появилось несколько сообщений о попытках иммунотерапии больных
с лимфоидными опухолями с помощью данного метода. До сих пор проблемы,
связанные с антигенной модуляцией и образованием комплексов, создают, по-
видимому, главные трудности для использования подходов такого рода, хотя
имеется несколько предварительных сообщений об успешном использовании
этих подходов для лечения больных [85, 94—96]. Можно надеяться, что даль-
нейшие эксперименты на животных повысят эффективность иммунотерапии.
28.5. Распознавание эпитопов моноклональными
антителами
Как уже говорилось при обсуждении общих вопросов, связанных с полу-
чением гибридом, уникальным свойством моноклональных антител является
их способность узнавать один эпитоп в сложной антигенной структуре. Это
270
Д. Ф. Кирней
дает в руки экспериментатору мощное средство биологического анализа слож-
ных структур. В то же время очевидно, что данное уникальное свойство моно-
клональных антител повышает вероятность обнаружения неожиданного имму-
нологического перекреста. В последнее время появилось множество сообщений
о моноклональных антителах, перекрестно реагирующих с неродственными мо-
лекулами. Было показано, что крысиные моноклональные антитела 41—21,
полученные путем иммунизации крысы клетками мышиной Т-лимфомы, связы-
ваются с молекулой Thyl, а также с Ук-идиотипической детерминантой белка
ТЕРС15 мышиной миеломы [97]. Моноклональные антиидиотипические анти-
тела, направленные против фосфорилхолин (ФХ)-специфичного белка ТЕРС15,
как оказалось, взаимодействуют еще и с С-реактивным белком человека (сыво-
роточный белок острой фазы, СВР), реагирующим также с фосфорилхолином.
Связывание СВР и с фосфорилхолином, и с антиидиотипическими антителами
является Са2+-зависимым, причем в обоих случаях оно разрушается в присут-
ствии ЭДТА. В то же время связывание антител 41—42 с ТЕРС15 не зависит
от Са2+ [98]. Другие мышиные моноклональные антитела, полученные путем им-
мунизации мыши человеческим СВР и связывающиеся с СВР Са2+-зависимым
способом, как было показано, весьма специфично узнают структуру на поверх-
ности моноцитов периферической крови человека. Более того, эти антитела
реагируют с внутриклеточными филаментами в человеческих и мышиных
клетках различных типов. Можно предположить, что данные антитела узнают
некий универсальный Са2+-связывающий эпитоп [99]. Про другие моноклональ-
ные антитела известно, что они перекрестно реагируют с цитоскелетными
белками тропомиозином и виментином [100].
Подобные перекрестные реакции не являются неожиданными, если учи-
тывать разницу между гетерогенными и моноклональными антителами, про-
демонстрированную на рис. 28.1. Моноклональные антитела проявляют специ-
фичность по отношению к определенному эпитопу молекулы. Этот эпитоп пред-
ставляет собой трехмерную структуру и может обнаруживаться не только
у родственных, но и у неродственных молекул.
Таким образом, важно отметить, что при идентификации молекулы нельзя
исходить лишь из ее взаимодействия с одним типом моноклональных антител,
а необходимо учитывать и другие данные, характеризующие молекулу. С другой
стороны, наличие иммунологического перекреста может свидетельствовать о
наличии важных структурных и биологических гомологий между макромоле-
кулами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Potter М. Immunoglobulin-producing tumors and myeloma proteins of mice, Physiol.
Rev., 5 , 631 (1972).
2. Potter M. Antigen-binding myeloma proteins of mice, Adv. Immunol., 25, 141 (1978).
3. Pettengill G. S., Sorensen G. D. Murine myeloma cells in suspension culture, Exp. Cell
Res., 47, 608 (1967).
4. Laskov R., Scharff M. D. Synthesis, assembly and secretion of gamma globulin by mouse
myeloma cells, J. Exp. Med., 131, 515 (1970).
5. Horibata K., Harris A. W. Mouse myelomas and lymphomas in culture, Exp. Cell Res.,
60, 61 (1970).
6. Rtngertz H. R., Savage R. E. Cell Hybrids, Academic Press, New York, 1976.
7. Barski G., Sorieul S., Comefert F. «Hybrid» type cells in combined cultures of two dif-
ferent mammalian cell stains, J. Natl. Cancer Inst., 26, 1269 (1961).
8. Li ttlefieldJ. W. Selection of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presum-
ed recombinants, Science, 145, 709 (1964).
9. Harris H., Watkins J. F. Hybrid cells derived from mouse and man: Artificial hetero-
karyons of mammalian cells from different species, Nature, 205, 640 (1965).
10. Okad Y., Murayama F. Multinucleated giant cell formation by fusion between cells of
two different strains, Exp. Cell. Res., 40, 154 (1965).
28. Гибридомы и моноклональные антитела
271
11. Poole A. R., Howell J. I., Lucy J. A. Lysolecithin in cell fusion, Nature, 227, 810 (1970).
12. Pontevorco C. Production of indefinitely multiplying mammaliam somatic cell hybrids
by polyethylene glycol (PEG) treatment, Somatic Cell Genet., 1, 397 (1976).
13. Cotton R. G. H., Milstein C. Fusion of two immunoglobulin producing myeloma cells,
Nature, 244, 42 (1973).
14. Kohler B., Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined
specificity, Nature, 256, 495 (1975).
15. Margulies D. H., Kuehl W. M., Scharff M. D. Somatic cell hybridization of mouse mye-
loma cells, Cell, 8, 405 (1976).
16. Milstein C., Kohler G. Cell fusion and the derivation of cell lines producing specific anti-
body. In: Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, ed. by E. Haber and R. M. Krause,
p. 271, Raven Press, New York, 1977.
17. Milstein C., Adetugbo K., Cowan N. J., Kohler G., Secher D. S., Wilde C. D Somatic
cell genetics of antibody secreting cells: Studies of clonal diversification and a.nalysis by
cell fusion, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 41, 793 (1977).
18. Margulies D. H., Cieplinski W., Dharmgrongartama B., Gefter M. L., Morrison S. L .,
Kelly T., Scharff M. D. Regulation of immunoglobulin expression in mouse myeloma cells,
Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 41, 781 (1977).
19. Kohler G., Howe S. C., Milstein C. Fusion between immunoglobulin secreting and non-
secreting myeloma cell lines, Eur. J. Immunol., 6, 292 (1976).
20. Kohler G., Milstein C.Derivation of specific antibody producing tissue culture and tuneor
lines by cell fusion, Eur. J. Immunol., 6, 611 (1976).
21. Krause R. M. The search for antibodies with molecular uniformity, Adv. Immunol., 12,
1 (1970).
22. Haber E. Antibodies of restricted heterogeneity for structural study, Fed. Proc., 29, 66
(1970).
23. Scher A., Cohn M. Inheritance of an idiotype associated with the immune response of
inbred mice to phosphorylcholine, Eur J. Immunol., 2, 319 (1972).
24. Cohn M. Natural history of the myeloma, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 32,
211 (1967).
25. Paslay J. W., Roozen N. J. The effect of В cell stimulation on hybridoma formation. In:
Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, ed. by G. J. Hammerling, U. Hammerling,
and J. F. Kearney, p. 551, Elsevier/North-Holland Publishers, 1982.
26. Melchers F., Potter M., Warner N., eds. Current Topics in Microbiology and Immuno-
biology, Vol. 81, Lymphocyte Hybridomas, Springer-Verlag, Berlin, 1978.
27. Kennett R. H., McKearn T. J., Bechtol K., eds. Monoclonal antibodies, Plenum Press,
New York, 1980.
28. Hammerling G. J., Hammerling U., Kearney J. F., eds. Monoclonal Antibodies and T Cell
Hybridomas, Elsevier/North-Holland, Amsterdam, 1981.
29. Hurrell J. G. R., ed. Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and applications,
CRC Press, Boca Raton, Florida, 1982.
30. Engvall E., Pesce A. J. Quantitative enzyme immunoassay, Scand. J. Immunol., 8
(Suppl. 7), 23 (1978).
31. Maggro E. T., ed. Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980.
32. Baker R. M., Brunette D. M., Mankovitz R., Thompson L. H., Whitmore G. F., Simino-
vitch L., Till J. E. Quabain-resistant mutants of mouse and hamster cells in culture,
Cell, 1, 9 (1974).
33. Wright W. E., Hayflick L. Use of biochemical lesions for selection of human cells with
hybrid cytoplasms, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 1812 (1975).
34. Burrows P. D., Beck G. B., Wabl M. R. Expression of p. and у immunoglobulin heavy
chains in different cells of a cloned mouse lymphoid line, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78,
564 (1981).
35. Wallach M., Ishay-Michaeli R., Givol D., Laskov R. Analysis of immunoglobulin mRNA
in murine myeloma cell variants defective in the synthesis of the light or heavy polypeptide
chains, J. Immunol., 128, 684 (1982).
36. Lieberman R., Potter M., Humphrey W., Jr., Mushinski E. B., Vrana M. Multiple in-
dividual and cross-specific idiotypes 13 levan-bindig myeloma proteins of BALB/c mice,
J. Exp. Med., 142, 106 (1975).
37. For P. C., Berenstein E. H., Siraganian R. P. Enhancing the frequency of antigen-specific
hybridomas, Eur. J. Immunol., 11, 431 (1981).
38. Hoffman M. K. Antigen-specific induction and regulation of antibody synthesis in cultures
of human peripheral blood mononuclear cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1139 (1980).
272
Д. Ф. Кирней
39. Callard R. Е., Smith С. М. Histocompatibility requirements for Т cell help in specific in
vitro antibody responces to influenza virus by human blood lymphocytes, Eur. J. Im-
munol., 11, 206 (1981).
40. Kennett R. H. Appendix: Fusion Protocols. In: Monoclonal Antibodies, ed. by R.H. Ken-
nett, T. J. McKearn, and К. B. Bechtol, p. 365, Plenum Press, New York, 1980.
41. McGarrity G. J., Vanaman V., Sasamara J. Comparative studies between microbiological
culture and uptake of uridine/uracil to detect mycoplasmal infection of cell culture, Exp.
Cell. Res., 121, 159 (1979).
42. Russel W. C., Newan C., Williams D. H. A simple cytochemical technique for demonstra-
tion of DNA in cells infected with mycoplasmas and viruses, Nature, 253, 461 (1979).
43. Parkhouse R. M. E., Guarnotta G. Rapid binding test for detection of alloantibodies to
lymphocyte surface antigens. In: Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 81,
ed. by F. Melchers, M. Potter, and N. Warner, p. 142, Springer-Verlag, Berlin, 1978.
44. Anderson W. H. N., Burckhardt J. J., Kearney J. F., Cooper M. D. Phylogenetic distribut-
ion of an intermediate filament antigen detected by a mouse monoclonal autoantibody,
Fed. Proc., 39, 778 (1980).
45. Parks D'. R., Bryan V. M., Tai V., Herzenberg L. A. Antigen-specific identification and
cloning of hybridomas with fluorescence activated cell sorter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76, 1962 (1979).
46. McKearn T. J., Smilek D. E., Fitch F. W. Rat-mouse hybridomas and their application to
studies of the maZor histocompatibility complex. In: Monoclonal Antibodies, ed. by
R. H. Kennett, T. J. McKearn, and К. B. Bechtol, p. 219, Plenum Press, New York,
1980.
47. Lane H. C., Shelhammer J. H., Mostmvski H. S., Fauci A. S. Human monoclonal anti-
keyhole limpet hemocyanin antibody-secreting hybridomas produced from peripheral
blood В lymphocytes of a keyhole limpet hemocyanin immune individual, J. Exp. Med.,
155, 133 (1982).
48. Nowinski R., Berglund C., Lane J., Lostrom M., Bernstein I., Young W., Hakamori S.I.,
Hill L., Cooney M. Human monoclonal antibody against Forssman antigen, Science,
4469, 537 (1980). f
49. Y ar mush M. L., Gates F. T., WeisfogelD. R., Kindt T.J. Identification and characteriza-
tion of rabbit-mouse hybridomas secreting rabbit immunoglobulin chains, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 77, 2899 (1980).
50. Weiss M. C., Green H. Human-mouse hybrid cell lines contains partial complements of
human chromosomes and functioning human genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 58, 1104
(1967).
51. McCusick V. A., Ruddle F. H. The status of the gene map of the human chromosome,
Science, 196, 390 (1977).
52. Croce С. M., Shander M., Martinis J., Cicurel L., D’A ncona G. G., Dolling T. W., Koprow-
ski H. Chromosomal location of the genes for human immunoglobulin heavy chains, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3416 (1979).
53. D'Eustachio P., Bothwell A. L., Такого T. K., Baltimore D., Ruddle F. H. Chromosomal
location of structural genes encoding murine immunoglobulin X light chains, J. Exp. Med.,
153, 793 (1981).
54. Swan D., D'Eustachio P., Leinwand L., Seidman J., Keithley D., Ruddle F. H. Chromo-
somal assignment of the mouse x light chain genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 2735
(1979).
55. D'Eustachio P., Pravtcheva D., Marcu K., Ruddle F. H. Chromosomal location of
the structural gene cluster encoding murine heavy chains, J. Exp. Med., 151, 1545
(1980).
56. Olsson L., Kaplan H. S. Human hybridomas producing monoclonal antibodies of prede-
fined antigenic specificity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 5429 (1980).
57. Croce С. M., Linnenbach A., Hall W., Steplewski Z., Koprowski H. Production of human
hybridomas secreting antibodies to measles virus, Nature, 8, 488 (1980).
58. Taniguchi M., Miller J. F. A. P. Specific suppressive factors produced by hybridomas
derived from the fusion of enriched suppressor T cells and a T lymphoma line, J. Exp.
Med., 148, 373 (1978).
59. Kontiainen S., Simpson E., Bohrer E., Beverley P. C. L., Herzenberg L. -I., Fitzpatrick W.C.,
VogtP., Torano A ., McKenzie I. F. C., Feldman M. Hybrid cell lines with T cell characte-
ristics, Nature, 274 , 477 (1978).
60. Taussing M., Covalan J. R. F., Binns R. M., Holliman A. Production of an H-2 related
suppressor factor by a hybrid T cell line, Nature, 277, 305 (1979).
61. Napp J. A., Araneo B. A., Clevinger B. L. Suppression of antibody and T cell proliferative
28. Гибридомы и моноклональные антитела
273
responses to L glutamin-acid60-L-alanine30-L-tyrosine10 by a specific monoclonal T cell
factor, J, Exp. Med., 152, 235 (1980).
62. Lonai P., Puri J., Hdmmerling G. J. H-2 restricted antigen-binding by a hybridoma clone
which produces specific helper factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 549 (1981).
63. Nappler J. W., Skidmore В., White J., Marrack P. Antigen inducible, H-2 restricted inter-
leukin-2-producing T cell hybridomas. Lack of independent antigen and T cell recognition,
J. Exp. Med., 153, 1198 (1981).
64. Kronenberg M., Davis M. M., Early P. W., Hood L. E., Watson J. D. Helper and killer T
cells do not express В cell immunoglobulin Zoining and constant region segments, J. Exp.
Med., 152, 1745 (1980).
65. Grutzmann R., Hdmmerling G. J. Characterization and functional analysis of T cell hyb-
rids. In: Lymphocyte Hybridomas, ed. by F. Melchers, M. Potter, and N. L. Warner,
p. 188, Springer-Verlag, Berlin, 1978.
66. Burrows P., LeJeune J. M., Kearney J. F. Evidence that murine pre-B cells synthesize p.
heavy chains but no light chains, Nature, 280, 838 (1979).
67. Perry R. P., Nelley D. E., Coleclough C., Kearney J. F. Organization and expression of
immunoglobulin genes in fetal liver hybridomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 247
(1981).
68. Maki R., Kearney J., Paige C., Tonegava S. Immunoglobulin gene arrangement in immat-
ure В cells, Science, 209, 1366 (1980).
69. Alt F., Rosenberg N., Lewis S., Thomas E., Baltimore D. Organization and reorganization
of immunoglobulin genes in A-MuLV-transformed cells: Rearrangement of heavy but not
light chain genes, Cell, 27, 381 (1981).
70. Schilling J., Clevinger В., Davie J. M., Hood L. Amino acid sequence of homogeneous anti-
bodies to dextran and DNA arrangement in heavy chain V region segments, Nature, 283,
35 (1980).
71. Gearhart P J., Johnson N. D., Douglas R., Hood L. IgG antibodies to phosphorylcholine
exhibit more diversity than their IgM counterparts. Nature, 291, 29 (1981).
72. Margolies M. N., Marshak-Rothstein A., Gefter M. L. Structural diversity among anti-p-
azophenylarsonate monoclonal antibodies from A/J mice: Comparison of Id" and Id+
sequences, Mol. Immunol., 18, 1065 (1981).
73. Bothwell A. L. M., Paskind M., Reth M., Imanishi-Kari T., Rajewsky K., Baltimore D.
Heavy chain variable region contribution to the NPb family of antibodies: Somatic muta-
tion evident in a у 2a variable region, Cell, 24, 625 (1981).
74. Crews S., Griffin J., Huang H., Calaime K., Hood L. A single Vh gene segment encodes the
immune response to phosphorylcholine: Somatic mutation is correlated with the class of
the antibody, Cell, 25, 59 (1981).
75. Kloppel T. M., Kubo R. T., Cain P. S., Browne С. P., Colon S. M., Kearney J. F.,
Grey H. W. Structural analysis of the u chains synthesized by fetal liver hybridomas, J.
Immunol., 126, 1346 (1981).
76. Herberman R. B., Ortaldo J. R. Natural killer cells: Their role in defenses against disease,
Science, 214, 24 (1981).
77. Bona C. A. Idiotypea and lymphocytes, Academic Press, New York, 1981.
78. Kelsoe G., Reth M., Rajewsky K. Control of idiotope expression by monoclonal anti-idio-
tope antibodies, Immunol. Rev., 52, 75 (1980).
79. Dickerson J., Clevinger B., Friedensen B. Loss of an individual idiotype on chemical modi-
fication, J. Exp. Med., 153, 1275 (1981).
80. Clevinger В., Thomas J., Davie J., Stilling J., Bond M., Hood L., Kearney J. Anti-dextran
antibodies. Sequences and idiotypes. In: Immunological Idiotypes, ed. by C. Janeway,
E. Sercasz, and H. Urigzele, Academic Press, New York, 1981.
81. Kubagawa H., Vogler L. B., Capra J. D., Conrad M. E., Lawton A. R., Cooper M. D.
Studies on the clonal origin of multiple myeloma: Use of individually specific (idiotype)
antibodies to trace the oncogenic event to its earliest point of expression in В cell differen-
tiation, J. Exp. Med., 150, 792 (1979).
82. Hatzubai A., Maloney D. G., Levy R. The use of monoclonal anti-idiotype antibody to study
the biology of a human В cell lymphoma, J. Immunol., 126, 2397 (1981).
83. Levy R., Dilley J. Rescue of immunoglobulin secretion from human neoplastic lymphoid
cells by somatic cell hybridization, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2411 (1978).
84. Mayumi M., Kubagawa H., Omura G. A., Gathings W. E., Kearney J. F., Cooper M. D.
Studies on the clonal origin of human В cell leukemia using monoclonal anti-idiotype
antibodies, J. Immunol., 129, 904 (1982).
85. Miller R. A., Maloney D. G., Warnke R., Levy R. Treatment of В cell lymphoma with
monoclonal antiidiotype antibody, New Engl. J. Med., 306, 517 (1982).
86. Burrows P. D., Kearney J. F., Lawton A. R., Cooper M. D. Bone marrow persistence in
274
Д. Ф. Кирней
anti-p suppressed mice, conversion to В lymphocytes and recovery following destruction
cyclophosphamide, J. Immunol., 120, 1526 (1978).
87. Levitt D., Cooper M. D. Mouse pre-B cells synthesize and secrete и heavy chains but not
light chains, Cell, 19, 617 (1980).
88. Steplewski Z., Herlyn M., Herlyn D., Clark W. H., Koprowskt H. Reactivity of monoclonal
anti-melanoma antibodies with melanoma cells freshly isolated from primary and meta-
static melanoma, Eur. J. Immunol., 9, 94 (1979).
89. Herlyn M., Steplewski Z., Herlyn D., Koprowski H. Colorectal carcinoma specific antigen:
Detection by means of monoclonal antibodies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1438
(1979).
90. Kennett R. H., Gilbert S. Hybrid myelomas producing antibodies against a human neuro-
blastoma antigen present on fetal brain, Science, 203, 1120 (1979).
91. Chessels J. M., Hardesty R. M., Rapson N. T. Acute lymphoblastic leukemia in children,
classification and progress, Lancet, 2, 1307 (1977).
92. Ballou B., Levine G., Hakala T. R., Solter D. Tumor localization detected with radioactiv-
ely labeled monoclonal antibody and external scintigraphy, Science, 206, 844 (1979).
93. Uotila M., Engvall E., Ruoslahti E. Monoclonal antibodies to human alpha-fetoprotein,
Mol. Immunol., 17, 791 (1980).
. 94. Miller R. A., Maloney D. J., McKillop J., Levy R. In vivo effects of murine hybridoma
monoclonal antibody in a patient with T cell leukemia, Blood, 58, 78 (1981).
95. Miller R. A., Levy R. Response of cutaneous T cell lymphoma to therapy with hybridoma
monoclonal antibody, Lancet, 2, 226 (1981).
j 96. Ritz J., Pesando J., Sallan S., Clavell S., Notis-McConarty J., Rosenthal P., Schloss-
man S. Serotherapy of acute lymphoblastic leukemia with monoclonal antibody, Blood,
58, 141 (1981).
97. Pillemer E., Weissman I. L. A monoclonal antibody that detects a Vx-TEPC-15 idiotypic
determinants cross-reactive with a Thy-1 determinant, .T. Exp. Med., 153, 1068 (1981).
98. Volanakis J. E., Kearney J. F. Cross-reactivity between C-reactive protein and idiotypic
determinants on a phosphocholine-binding murine myeloma protein, J. Exp. Med., 153,
1604 (1981).
99. Kilpatrick J. M., Kearney J. F., Volanakis J. E. Demonstration of calcium-induced con-
formational change(s) in C-reactive protein by using monoclonal antibodies, J. Mol. Im-
munol., 19, 1159 (1982).
10(! Blase S. H., Matsumura F., Lin J. J. C. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, (in
press). (1983)
101. Kearney J., Radbruch A., Liesegang B., Rajewsky K. A new mouse myeloma cell line which
has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody secreting
hybrid cell lines, J. Immunol., 123, 1548 (1979).
Глава 29
Разделение и идентификация клеток
Ирвин Шер, Майкл Дж. Мэйдж
(Irwin Scher, Michael G. Mage)
Развитие методов, использующих антитела для специфического анализа
маркеров клеточной поверхности, и последующее выявление с помощью этого
подхода [1—4] гетерогенности лимфоидных клеток заложило основу, на кото-
рой развивались наши представления о клеточных основах иммунитета. В этих
исследованиях обычно использовались два экспериментальных подхода: пря-
мая метка лимфоидных клеток маркированными антителами и лизис клеток-
мишеней при обработке их антителами и комплементом. Последний метод
позволяет также обогатить клеточную смесь присутствующими в ней лимфоид-
ными клетками, не взаимодействующими с антителами, путем лизиса клеток,
реагирующих с ними. Хотя комплемент-зависимый цитолиз получил широкое
применение в качестве метода количественной оценки и( или) обогащения по-
пуляций лимфоидных клеток, у него есть серьезные недостатки, выражающиеся
прежде всего в том, что этот метод представляет собой процедуру отрицательной
селекции, так как клетки, взаимодействуя с цитотоксической антисывороткой,
погибают. Кроме того, клетки с низкой плотностью маркеров/рецепторов мо-
гут быть устойчивы к лизису, а клетки с одинаковой плотностью маркеров/ре-
цепторов могут обладать сильно варьирующей чувствительностью к лизису.
Следовательно, при использовании этой экспериментальной техники могут
иметь место значительные различия в степени обогащения и в оценке числа
клеток данной популяции, несущих определенный маркер, к тому же опреде-
ление чистоты популяции клеток, оставшейся после цитолиза, затруднено,
поскольку антитела, присутствующие на нелизированных клетках, могут пре-
пятствовать их последующему мечению.
Прямое взаимодействие антитела с лимфоидной клеткой можно продемон-
стрировать с помощью прямого введения в молекулу антитела радиоактивной,
ферментативной или флуоресцентной метки, последующей обработки ими клеток
и выявления клеток, связывающих меченые антитела. Эти методы исполь-
зуются во многих исследованиях. Их эффективность и точность при определе-
нии частоты клеток, взаимодействующих со специфическим антителом, доказа-
ны убедительно. Однако, за редким исключением [5], эти методы не дают
количественной информации о числе рецепторов/маркеров на индивидуальных
клетках. Кроме этого, для подобного анализа требуется значительное время,
так что количество образцов и общее число клеток, которое может быть иссле-
довано, ограничено и контроли на неспецифические взаимодействия ставятся
редко. В этой главе мы опишем два метода, с помощью которых можно, во-
первых, оценивать количество антител, связавшихся с клеткой, и, во-вторых,
выделять относительно чистые популяции лимфоидных клеток. Проточная мик-
рофлуорометрия (ПМФ), представляющая собой метод анализа, для которого
необходима сложная аппаратура, используется для быстрого измерения ин-
тенсивности флуоресценции большого числа лимфоцитов [6, 7). С помощью
276
И. Шер, М. Дж. Мэйдж
ПМФ можно также выделять клетки по интенсивности их флуоресценции. Все
это дает возможность быстро проводить количественный анализ интенсивности
флуоресценции большого числа клеток и образцов, постановку контролей на
неспецифические взаимодействия, определение с помощью повторного анализа
гомогенности выделенных клеток. Другая экспериментальная техника —
разделение клеток на покрытых антителами чашках — не требует сложного
оборудования и позволяет разделить большое число клеток по экспрессии
маркеров/рецепторов, к которым специфичны селектирующие антитела.
29.1. Проточная микрофлуориметрия
29.1.1. Принципы действия
Развитие метода проточной микрофлуориметрии началось с сообщения Ка-
ментского и др. [9] о приборе, измеряющем поглощение света и обратное свето-
рассеивание клетками. С помощью этого прибора можно было определять со-
держание нуклеиновых кислот и размер живых неокрашенных клеток. При-
мерно в то же время Фалвайлер [10] описал прибор, позволяющий разделять
клетки на субпопуляции на основе их поверхностного заряда. Этот прибор
основан на технике электростатического отклонения перьевого самописца, опи-
санной Свитом [11]. Впоследствии появился ряд работ, где описаны усовершен-
ствованные модели проточных цитометров с новой техникой ламинарного тока,
с использованием лазера, который обеспечивает мощность излучения при дан-
ной длине волны, достаточную для измерения флуоресценции [12], а также
приборы, анализирующие клетки в струе жидкости в воздухе, а не в проточной
кювете. Такие приборы были названы системами с нулевым разрешением,
поскольку разрешение, определяемое длиной волны возбуждающего пучка
и методом визуализации, оказывается недостаточным для анализа в токе жид-
кости объектов такого размера как клетка.
Проточный микрофлуориметр анализирует клетки в суспензии в струе
жидкости, которую пересекает луч лазера (рис. 29.1). Чтобы сконцентрировать
клетки в центральной части струи и уменьшить число агрегатов, способных
забить выходное отверстие проточной камеры, используется техника тока об-
текающей жидкости («рубашки») (рис. 29.1). Клетки по металлическому патруб-
ку под давлением подаются в проточную камеру, которая промывается током
обтекающей жидкости. Обтекающая жидкость с суспендированными в ней
клетками выходит из камеры через апертуру, размер которой определяет диа-
метр выходящего потока жидкости. Частоту поступления клеток в обтекаю-
щую жидкость можно варьировать, меняя разницу в давлении между обтекаю-
щей жидкостью и вводимым образцом. Этот прием в сочетании с подбором кон-
центрации клеток в образце позволяет создать такие условия, при которых
каждая отдельная клетка последовательно проходит точку пересечения лазер-
ного луча со струей жидкости (рис. 29.1).
Источником света в проточных микрофлуориметрах служат лазеры, обычно
аргоновые, но встречаются также и гелий-неоновые или криптоновые. Следует
подчеркнуть важное значение лазеров в этих системах, поскольку они служат
источником высоко коллимированного (параллельные световые волны), моно-
хроматического света большой интенсивности, который можно сфокусировать
для передачи значительной энергии анализируемым клеткам. Как правило,
аргоновые лазеры настраивают на длину волны излучения 488 нм, что обеспе-
чивает оптимальное возбуждение молекул флуоресцеина, используемого для
мечения антител. Если используется техника анализа по двум параметрам, то
29. Разделение и идентификаиця клеток
277
второй лазер фокусируется на струе жидкости несколько ниже точки пересече-
ния лучом первого лазера. Этот второй лазер настраивают на длину волны
568,2 нм, вызывающую максимальное возбуждение молекул красителя техас-
ского красного, который используется для промечивания антител при анализе
Сигнал
флуоресценции
Ультразвуковой
генератор
Патрувок подачи образца
Обтекающая
жидкость
Фильтр
Проточная
камера
Точна пересечения
лазерного пучка
Линза детентора
флуоресценции
Струя жидкости в воздухе,
./Л содержащая клетки
„Сигнал
светорассеяния
Линза детентора
светорассеяния
Испускаемый свет
хРассеянный свет
Запирающая полоска
Точна отрыва капель
Лазерный
пучок
Рис. 29.1. Схематическое изображение
лазерного сортировщика клеток. Клетки
поступают в проточную камеру по трубке
для подачи образца под давлением, пре-
вышающим давление обтекающей жидкости.
Клетки подхватываются ламинарным пото-
ком обтекающей жидкости и со струей
выбрасываются из сопла (выходного отвер-
стия) проточной камеры. Когда клетка
в токе жидкости пересекает лазерный луч,
он отклоняется. Такой рассеянный свет
фокусируется линзой детектора светорас-
сеяния и регистрируется на фотоумножителе.
Если клетка несет флуоресцентный кра-
ситель, то при пересечении лазерного пучка
происходит испускание света в результате
возбуждения молекул красителя излуче-
нием лазера. Свет, испускаемый клеткой при
возбуждении молекул красителя, проходит
через фильтр, исключающий регистрацию
лазерного излучения фотоумножителем де-
тектора флуоресценции. Этот фотоумно-
житель регистрирует излучение, испускае-
мое клеткой. На основе характеристик
светорассеяния и флуоресценции может про-
исходить сортировка клеток. С этой целью
под действием ультразвука на проточную
камеру струя жидкости «разбивается» на
капли. Эти капли могут быть избирательно
заряжены при подаче заряда на струю
жидкости непосредственно перед образова-
нием капли. Если клетка обладает свой-
ствами, соответствующими отклонению («се-
лекции») в правом направлении, то на струю
будет подаваться положительный заряд,
как только клетка достигнет точки отрыва
капель, и тогда положительно заряженная
капля с соответствующей клеткой будет
отклоняться вправо при прохождении через
заряженные отклоняющие пластины.
по двум параметрам. Другие биологические красители, такие, как акрифлавин,
митромицин, бромид этидия и йодид пропидия, характеризуются поглощением
в пределах длин волн, испускаемых аргоновым лазером. С помощью этих кра-
сителей определяют содержание ДНК в индивидуальных клетках.
278
И. Шер, М. Дж. Мэйдж
29.1.1.1. Сигнал светорассеяния
Когда клетка в токе жидкости встречается с лазерным лучом, свет рассеи-
вается. На величину малоуглового светорассеяния клетками, т. е. на отклоне-
ние лазерного луча менее чем на два градуса, влияет размер клеток и показа-
тель преломления. Поскольку эти параметры изменяются при гибели или сни-
жении жизнеспособности клеток, сигнал светорассеяния может быть использо-
ван для определения относительной жизнеспособности клеток [14]. На практи-
Рис. 29.2. На фотографиях представлены
данные в виде распределения точек на ос-
циллограмме (4), гистограммы светорас-
сеяния (Б) и флуоресценции (В, Г). Эти
данные получены при исследовании эритро-
цитов цыплят, фиксированных глутаровым
альдегидом. Осцилограмма А свидетель-
ствует о том, что распределение интенсив-
ности флуоресценции эритроцитов цыплят
относительно гомогенно, однако эти клетки
характеризуются двумя различными вели-
чинами интенсивности светорассеяния. Это
отражено также и на кривых Б и В, которые
представляют независимые гистограммы
интенсивности светорассеяния (Б) и флуо-
ресценции (В) для определенного числа
фиксированных эритроцитов. Две величи-
ны интенсивности светорассеяния, харак-
теризующие эритроциты цыплят, обуслов-
лены их формой (вогнутый диск) и ориента-
цией при пересечении лазерного пучка. Если
эритроцит пересекает пучок таким образом,
что клетка обращена к пучку своим большим
диаметром, то эритроцит дает большие зна-
чения интенсивности светорассеяния. Если
же клетка обращена к лазерному пучку
ребром, то светорассеяние менее выражено
и отмечаются меньшие значения интен-
сивности светорассеяния. Повышение нап-
ряжения или усиления на детекторе
флуоресценции приводит к линейному уве-
личению регистрируемой интенсивности
флуоресценции, как это показано на гисто-
грамме флуоресценции Г.
29. Разделение и идентификация клеток
279
ке луч лазера, прямо проходящий через ток жидкости, блокируется запираю-
щей полоской, которая помещается между линзой и источником света
{рис. 29.1). Это приспособление прерывает и отклоняет лазерный луч и, следо-
вательно, предотвращает детекцию сигнала до тех пор, пока клетка не изменит
направления лазерного луча. Рассеянный свет, который отклоняется от на-
правления лазерного луча под разными углами и поэтому не блокируется за-
пирающей полоской, регистрируется детектором светорассеяния. Электронные
Рис. 29.3. Гистограмма флуоресценции мы-
шиных клеток селезенки. Сплошной линией
изображена кривая светорассеяния всей
популяции спленоцитов. Лимфоидные клет-
ки обладают сравнительно гомогенной ин-
тенсивностью светорассеяния, тогда как
клеточный детрит и мертвые клетки харак-
теризуются более гетерогенным светорас-
сеянием с более низкой интенсивностью.
Макрофаги и клеточные агрегаты рассеи-
вают свет в большей степени, чем лимфоид-
ные клетки, и обладают по сравнению с ни-
ми более высокой интенсивностью флуорес-
ценции. Анализ характеристик флуоресцен-
ции лимфоидных клеток, при котором не
учитываются мертвые клетки, клеточный
детрит и клеточные агрегаты, связан с ис-
ключением из анализа этих частиц на осно-
ве их электронных характеристик, так что
анализируются только лимфоидные клетки
(пунктирная линия).
сигналы, генерируемые детектором рассеяния, усиливаются и представляются
на осциллографе в виде распределения точек (dot plot) (рис. 29.2, Я) или в виде
гистограммы числа клеток с определенной интенсивностью светорассеяния,
которую можно построить с помощью анализатора амплитуды импульса
(рис. 29.2, Б).
На рис. 29.3 показана кривая светорассеяния, снятая при анализе свеже-
приготовленной суспензии мышиных клеток селезенки на лазерном сорти-
ровщике клеток (ЛСК или FACS — от англ, fluorescence-activated cell sorter).
Частицы с очень низкой интенсивностью рассеяния представлены клеточным
детритом, мертвые или гибнущие клетки локализуются на отрезке кривой
между двумя основными пиками, соответствующими клеточному детриту и жи-
вым лимфоцитам. Частицы на участке осциллограммы правее пика лимфоцитов
представляют крупные клетки или агрегаты из двух и более клеток. Поскольку
сигнал, слабого светорассеяния определяется клеточным детритом и нежизне-
способными клетками, а сигнал сильного светорассеяния определяется агрега-
тами клеток, оператор может исключить эти частицы из анализа. Это дости-
гается установкой нижней и верхней границы сигнала рассеяния, и тогда «раз-
решенной» является флуоресценция только тех клеток, которые дают соответст-
вующий сигнал светорассеяния (рис. 29.3). Таким образом, мертвые, а также
агрегированные клетки не анализируются и проводится экспериментальный
анализ или сортировка только жизнеспособных лимфоидных клеток.
280
И. Шер, М. Дж. Мэйдж
29.1.1.2. Сигнал флуоресценции: анализ по одному
или двум параметрам
Линза, фокусирующая рассеянный свет на детектор светорассеяния, рас-
положена прямо по ходу лазерного луча, а линза, фокусирующая сигнал
флуоресценции, расположена под углом 90° по отношению к лучу (рис. 29.1).
Эта вторая линза фокусирует свет, испускаемый флуоресцентным красителем,
который находится на клетках, пересекающих лазерный луч на уровне детекто-
ра флуоресценции. Чтобы исключить попадание света лазера на детектор флуо-
ресценции, перед ним помещают фильтр, задерживающий излучение лазера,
но не излучение флуоресценции. Электронный сигнал, вызванный попаданием
света на детектор флуоресценции, может быть представлен так же, как было
описано в случае сигнала светорассеяния (рис. 29.2, А и В). Анализ сигналов,
регистрируемых детектором флуоресценции, в масштабе реального времени
позволяет оператору выбрать усиление, соответствующее средней интенсивно-
сти флуоресценции исследуемых клеток. Усиление определяется напряжением,
подаваемым на фотоумножитель. При большем усилении или больших значе-
ниях напряжения повышается чувствительность детектора, и профиль флуорес-
ценции сдвигается вправо (рис. 29.2, Г). При использовании линейных усили-
телей важно так подбирать усиление, чтобы наиболее ярко светящиеся клетки
накапливались в самом верхнем канале, хотя следует убедиться, что эти клетки
составляют не большую часть всей популяции. В этом случае повышается раз-
решающая способность флуоресценции. Если существует значительное разли-
чие в интенсивности флуоресценции между «бледными» и «яркими» клетками,
то логарифмический усилитель повышает расхождение между этими клет-
ками.
В системах с двойной флуоресценцией свет второго лазера фокусируется
на струе жидкости несколько ниже точки пересечения с лучом первого лазера.
Излучение этого лазера возбуждает свечение второго флуоресцентного краси-
теля, который находится на клетках, проходящих в токе жидкости. Свечение,
испускаемое вторым красителем, характеризуется длиной волны, отличной от
свечения, испускаемого при возбуждении первого флуоресцентного красителя
излучением первого лазера. Это излучение фокусируется той же линзой, кото-
рая используется при анализе по одному параметру. Однако в системах анали-
за по двум параметрам делительная пластинка или дихроичное зеркало направ-
ляет половину светового потока на второй детектор флуоресценции. Перед
первым и вторым детекторами помещаются фильтры, которые позволяют ре-
гистрировать излучение, испускаемое соответствующими красителями. По-
скольку луч второго лазера встречается со струей жидкости и, следовательно,
с клетками в точке ниже точки пересечения с лучом первого лазера, то элек-
тронные сигналы с детектором флуоресценции для этих двух источников по-
ступают в разное время.
Уровень флуоресценции клеток, пересекающих лазерный луч, пропорцио-
нален количеству красителя, связавшегося с клетками, и в свою очередь про-
порционален величине сигнала, генерируемого на детекторе флуоресценции.
Таким образов, величина электронного сигнала, вызванного клетками, служит
оценкой количества флуоресцентного красителя на клеточной поверхности,
которое отражает число рецепторов/маркеров, выявляемых данным красителем.
С помощью конъюгации флуоресцентного красителя с молекулой антитела мож-
но получить пробу, которая позволяет определить частоту практически любого
рецептора/маркера, представленного на данной популяции клеток.
29. Разделение и идентификация клеток
281
29.1.1.3. Хранение, извлечение и представление информации
Электронные сигналы с детекторов светорассеяния и флуоресценции могут
быть представлены различными способами. Представление сигналов светорас-
сеяния и флуоресценции в масштабе реального времени дает распределение то-
чек на осциллографе, которое позволяет оператору выбрать подходящий режим
усиления (рис. 29.2, Л). Эта осциллограмма может быть также записана, так
как является быстрым и простым способом представления сигналов светорас-
сеяния и флуоресценции данной клеточной популяции. Однако для анализа
данных по одному параметру необходима кривая флуоресценции. Такую кри-
вую можно получить с помощью анализатора амплитуды импульса, который
ad
О
Е
Интенсивность флуоресценции
Интенсивность флуоресценции
или конъюгированными с флуоресцеином
(А, непрерывная линия) и техасским красным
(Б, пунктирная линия) кроличьими антитела-
ми к ферритину. В этих опытах шкала интен-
сивности флуоресценции делится на 1000
каналов.
Рис. 29.4. Гистограмма флуоресценции мы-
шиных клеток селезенки, окрашенных ме-
ченными флуоресцеином кроличьими анти-
телами против 6-цепей 1g мыши (4, не-
прерывная линия) и меченными техасским
красным кроличьими антителами против
p-цепей 1g мыши (Б, непрерывная линия)
подсчитывает число клеток, дающих сигнал определенной силы, и строит со-
ответствующую гистограмму, где по оси ординат откладывается число клеток,
а по оси абсцисс — сила сигнала (рис. 29.2, Б и В). Большинство анализаторов
амплитуды импульса обладают устройством, позволяющим интегрировать по-
лученные кривые, так что можно определить частоту клеток с данной интенсив-
ностью светорассеяния/флуоресценции. Так, например, полученная с помощью
анализатора амплитуды импульса кривая флуоресценции мышиных клеток,
меченных окрашенными техасским красным кроличьими антителами против
ц-цепей 1g мыши, характеризуется распределением клеток, показанным на
рис. 29.4, Б, причем p-положительные клетки составляют 49% от всей популя-
ции спленоцитов. При отсутствии системы хранения данных, распределение
точек на осциллографе или кривая флуоресценции могут быть сфотографирова-
ны, что довольно трудоемко и существенно ограничивает возможность последую-
щего анализа данных. Очевидно, что в лабораториях, располагающих проточ-
ными микрофлуориметрами, такой метод хранения данных не позволяет
использовать весь аналитический потенциал этих приборов. Например, при нор-
мальных условиях работы через микрофлуориметр проходит 1500 анализируе-
мых клеток в секунду. Если 25% этих клеток можно отбросить на основе их
показателей светорассеяния, чтобы исключить из анализируемого материала
клеточные агрегаты и нежизнеспособные клетки, то анализируется 1125 клеток
282
И. Шер, М. Дж. Мэйдж
за секунду и за 23 с будут накоплены характеристики 25 000 клеток. В серии
образцов, окрашенных одной и той же флуоресцентной меткой, не нужно под-
страивать усиление сигнала флуоресценции или светорассеяния для каждого
образца, так что не составляет труда провести анализ и накопить от 10 000 до
20 000 клеток менее чем за 1 мин. Таким образом, зачастую анализируются
сотни образцов в день, а в некоторых лабораториях их число доходит до тысячи.
Для быстрого накопления такого количества информации, простого ее
извлечения и анализа требуется компьютер соответствующего уровня. Данные,
полученные с помощью анализатора амплитуды импульса, могут храниться
в памяти компьютера, в течение считанных секунд могут быть записаны надис-
ках, магнитной ленте или на любых других записывающих устройствах. Мно-
гие приборы позволяют оператору вводить данные в память компьютера в то
же самое время, когда исследователи обращаются к информации от предыду-
щих опытов. Кроме того, исключительные вычислительные возможности ком-
пьютеров могут быть использованы для анализа данных. Например, кроме
определения частоты клеток с данной интенсивностью светорассеяния и флуо-
ресценции, можно определить среднее значение, медиану, коэффициент вариа-
ции и(или) канал, соответствующий пику флуоресценции или светорассеяния.
Можно и непосредственно сравнивать различные образцы, накладывая друг на
друга полученные кривые (рис. 29.4, А и Б). Так, на рис. 29.4, А сравниваются
кривые флуоресценции клеток селезенки, окрашенных кроличьими ФИТЦ-ме-
ченными антителами против б-цепей Ig мыши и кроличьими ФИТЦ-антиферри-
тин-антителами (контроль на неспецифическое окрашивание).
Наличие компьютера для хранения, извлечения и анализа информации,
полученной с помощью проточных микрофлуориметров, имеет особенно важное
значение в тех случаях, когда исследования ведутся по двум параметрам.
В принципе при таком анализе распределение светорассеяния данной клеточ-
ной популяции используется для того, чтобы исключить из анализа все, кроме
исследуемых жизнеспособных клеток, а интенсивность флуоресценции по двум
параметрам оценивается для каждой исследуемой клетки. Большинство прибо-
ров представляет эти данные в виде распределения точек на осциллографе и не-
обходимость в компьютере отпадает, но, как отмечалось ранее, возможность
анализа ограничена, если для хранения информации используется фотогра-
фический метод. В случае определения двойной флуоресценции прибор должен
регистрировать, а компьютер запоминать два независимых параметра для каж-
дой клетки. Интенсивность сигнала для каждого параметра обычно делится на
меньшее число каналов, чем в случае определения флуоресценции по одному
параметру. Так, при анализе данных исследования по одному параметру с ис-
пользованием 1000 каналов существует 1000 условных состояний, характери-
зующих клетки. В случае исследования по двум параметрам с использованием
1000 каналов должно быть уже 10002 или 106 условных состояний. Снизив число
каналов до 64 при исследовании по двум параметрам, клетки можно распреде-
лить по 642 или 4096 условным состояниям, число которых позволяет проводить
быструю компьютерную обработку данных, хранить и вызывать информацию.
Однако снижение числа каналов снижает разрешающую способность анализа,
как это проиллюстрировано на рис. 29.5. Эта кривая флуоресценции по одному
параметру получена при анализе по двум параметрам мышиных клеток селе-
зенки, окрашенных кроличьими ФИТЦ-анти-б-Ат и кроличьими анти-ц-Ат,
конъюгированными с техасским красным. Сравнение кривой, полученной при
анализе по одному параметру с использованием ФИТЦ-анти-р-Ат, с анализом
той же популяции клеток по двум параметрам (рис. 29.4 и 29.5 соответственно)
демонстрирует различие между этими двумя видами микрофлуорометрии.
29. Разделение и идентификация клеток
283
Существуют разные способы анализа данных по двум параметрам. Кривая
для одного параметра (одной флуоресцентной метки), представленная на
рис. 29.5, получена с помощью компьютерной программы SLICE. Эта про-
грамма позволяет исследователю выбирать определенные каналы интенсивно-
сти флуоресценции первой метки, которая не приводится на графике, так
что представлено только распределение флуоресценции второй метки. На
рис. 29.5, А все клетки, окрашенные меченными техасским красным антите-
лами против ц-цепей (Тк-анти-ц-Ат), селектированы, так что на полученной
Рис. 29.5. Гистограммы флуоресцен-
ции мышиных клеток селезенки, окрашенных
меченными флуоресцеином кроличьими ан-
тителами против 6-цепей 1g мыши (А, не-
прерывная линия) и меченными техасским
красным кроличьими антителами против
ц-цепей 1g мыши (Б, непрерывная линия)
или конъюгированными с флуоресцеином
(А, пунктирная линия) и техасским крас-
ным (Б, пунктирная линия) кроличьими
антителами против ферритина. В этом слу-
чае шкала интенсивности флуоресценции
делится на 64 канала.
кривой представлены все (ФИТЦ-анти-б-Ат)-положительные клетки. Если ин-
терес представляет распределение поверхностного IgD на sIgM-отрицательных,
slgM-положительных «бледных» или sIgM-положительных «ярких» клетках,
то можно получить кривые флуоресценции именно этих клеток. Аналогично
этому, кривую флуоресценции клеток, окрашенных Тк-анти-ц-Ат, можно
получить при анализе всей или части кривой, полученной при окрашивании
ФИТЦ-анти-6-Ат (рис. 29.5, Б). Следует отметить, что в отличие от бимодаль-
ного распределения, наблюдаемого при окрашивании клеток ФИТЦ-анти-6-Ат,
кривая флуоресценции клеток, окрашенных ФИТЦ-анти-р-Ат, характеризуется
большим числом sIgM-положительных клеток, интенсивность флуоресценции
которых лишь немного превышает уровень фоновой флуоресценции slgM-
отрицательных клеток.
Кроме этого метода существует и другой. В этом случае данные анализа
по двум параметрам часто представляют в виде изометрического изображения
(рис. 29.6), являющегося удобным способом демонстрации распределения по-
пуляций клеток после промечивания двумя флуоресцирующими реагентами.
В данном конкретном исследовании наблюдается большой пик slgM-, slgD--
клеток. Если анализировать клетки, несущие slgD, то обнаруживается, что
большинство sIg+-KaeT0K приходится на участок кривой с низкой интенсив-
ностью флуоресценции IgM; следовательно, эти клетки обладают низкой плот-
ностью поверхностных IgM (slgM — от англ, surface). Напротив, клетки, на
которых slgD отсутствует или присутствует в очень малом количестве, экспрес-
сируют промежуточный или высокий уровень slgM. Те же данные могут быть
представлены в виде контурной карты с различными уровнями, обозначающими
284
И. Шер, М. Дж. Мэйдж
Рис. 29.6. Изометрические кривые флуорес-
ценции по двум параметрам мышиных кле-
ток селезенки, окрашенных меченными
флуоресцеином кроличьими антителами про-
тив о-цепей мыши (интенсивность флуорес-
ценции 1) и конъюгированными с техасским
красным кроличьими антителами против
p-цепей 1g мыши (интенсивность флуорес-
ценции 2). Представлены две проекции
одних и тех же данных, развернутые отно-
сительно друг друга на 180°.
определенное число клеток. Напротив, на рис. 29.7 показаны четыре уровня,
представляющие 5, 10, 20 и 30 клеток. Все точки контурной карты с 5, 10, 20
и 30 клетками соединены сплошной линией. Точки, лежащие вне каждой ли-
нии, представлены менее чем 5, 10, 20 или 30 клетками соответственно, тогда
как точки внутри линий, соответствуют большему числу клеток. Существуют
компьютерные программы, позволяющие делить контурные карты на различные
Интенсивность
флуоресценции 1
Рис. 29.7. Контурная карта анализа по двум па-
раметрам мышиных клеток селезенки, окра-
шенных меченными флуоресцеином кроличьими
антителами против 6-цепей 1g мыши (интенсив-
ность флуоресценции 1) и конъюгированными
с техасским красным кроличьими антителами
против p-цепей 1g мыши (интенсивность флуо-
ресценции 2). Представлено три уровня, соот-
ветствующих 5, 15 и 25 клеткам.
уровни (группы) с разными осями координат и определять частоту клеток в
каждой группе. С помощью этих программ можно определить частоту специфи-
чески окрашенных клеток в пределах группы, рассчитывая число клеток на
группу в эксперименте и вычитая из него число неспецифически окрашенных
клеток, обнаруживаемых в тех же координатах при окрашивании контроль-
ными реагентами.
29. Разделение и идентификация клеток
2 85
29.1.2. Приготовление и окрашивание образцов
29.1.2.1. Выделение клеток
Проточные микрофлуориметры анализируют моноклеточные суспензии.
Небольшие агрегаты (из двух и более клеток) не мешают анализу, так как их
легко можно отличить по характеристикам светорассеяния и исключить из
анализа. Однако агрегаты большего размера могут забивать выход проточной
камеры. Поэтому критическим моментом для эффективной работы этих при-
боров является тщательное приготовление клеточной суспензии. В случае
использования периферической крови в качестве источника клеток клеточная
агрегация не составляет проблемы, так как для выделения клеток используется
градиент плотности фиколл-гипака. Клетки, выделенные из лимфоидных ор-
ганов, способны агрегировать и следует принять меры, чтобы свести образова-
ние агрегатов к минимуму. Например, мягкое разрушение органов резиновым
скребком (rubber policeman) или кончиком пластикового шприца одноразового
пользования позволяет получить хорошие препараты клеток. Если для приго-
товления моноклеточной суспензии используются металлические сетки, жизне-
способность клеток снижается и тенденция к образованию агрегатов возрас-
тает. Кроме того, исследователи, старающиеся избежать активного разрушения
клеток при быстром прохождении клеточной суспензии через иглы с узким диа-
метром и позволяющие хорошо осесть клеточному детриту, как правило, полу-
чают препараты лучшего качества (с более высокой жизнеспособностью и мень-
шим числом агрегатов), чем те, кто готовит клетки иным образом. В случае
низкой жизнеспособности клеток, например при использовании культивируе-
мых клеток или клеток, обработанных цитотоксическими реагентами, превосход-
ные препараты можно получить, работая с клетками, выделенными в градиенте
плотности. Образование агрегатов можно уменьшить до приемлемого уровня,
не выделяя клетки в градиенте, если пропускать их через найлоновую сетку
непосредственно перед анализом. Вообще для анализа лучше всего подходят
препараты ядерных клеток, не содержащие эритроцитов, хотя лимфоидные
клетки легко отличить от эритроцитов по распределению светорассеяния.
29.1.2.2. Источник антител
Источник антител, используемых в проточной микрофлуорометрии, не
имеет критического значения, но исследователям необходимо учитывать, что
различия в характеристиках антител могут существенно влиять на результаты
анализа. В связи с исключительной чувствительностью проточной микрофлуори-
метрии необходимо использовать антитела максимально возможной чистоты.
Наиболее подходящий способ очистки таких препаратов представляет аффинное
выделение антител, хотя эта процедура зависит от доступности антигена в
больших количествах и в растворимой форме. Однако даже после аффинной
очистки антитела различного происхождения будут обладать разными свойст-
вами. Например, гетерологичные антитела распознают ряд антигенных детерми-
нант молекулы антигена с разной аффинностью, тогда как моноклональные
антитела распознают только одну детерминанту и только с одной аффинностью.
Следовательно, прямое окрашивание компонентов клеточной поверхности гете-
рологичными антителами, многие из которых будут обладать высокой аффин-
ностью, окажется, по-видимому, ярче и стабильнее, чем окрашивание монокло-
нальными антителами. Однако огромные потенциальные возможности монокло-
286
И. Шер, М. Дж. Мэйдж
нальных антител в выявлении новых специфичностей (структур) делают эти
недостатки не столь существенными.
Выбор источника антител может также влиять на уровень неспецифиче-
ского окрашивания в результате взаимодействия антител с Fc-рецепторами.
Хорошо известна значительная вариабельность в способности Fc-фрагментов
антител разных видов взаимодействовать с Fc-рецепторами лимфоидных клеток
других видов. Например, Fc-рецептор мыши эффективно взаимодействует с кро-
личьим Fc-районом, значительно менее эффективно с Fc-районом 1g козы и
практически не реагирует с Fc-районом 1g кур.
29.1.2.3. Прямое или непрямое окрашивание
Независимо от источника используемых антител их присутствие на поверх-
ности клеток может быть определено только в том случае, если они связаны
с флуоресцентным красителем. Если антитела доступны в больших количествах,
то лучше всего их метить прямой конъюгацией с красителем. Техника такой
конъюгации довольно проста. Прямая конъюгация позволяет исследователю
окрашивать клетки в один этап, исключая возможность ошибок, вносимых
дополнительными этапами, необходимыми для непрямого окрашивания. К ним
может относиться увеличение неспецифического окрашивания, поскольку
при использовании непрямого метода тенденция к неспецифическому взаимо-
действию с клеткой у двух антител будет более высокой, чем у одного антитела,
используемого при прямом методе окрашивания. Кроме этого, использование
в качестве второго реагента конъюгированных с красителем анти-^-антител
может приводить к увеличению неспецифического окрашивания. Например,
при окрашивании смешанной популяции лимфоидных клеток мышиными
моноклональными антителами IgG-класса против Т-лимфоцитов с последующей
обработкой конъюгированными с флуоресцеином антителами против IgG
мыши такие меченые aHTH-IgG-антитела способны взаимодействовать с IgG-не-
сущими В-лимфоцитами и макрофагами. Таким образом, окрашивание «не-Т-
клеток», несущих поверхностный IgG, может искажать результаты. Вероят-
ность таких искажений можно уменьшить, если первое антитело и анализируе-
мые лимфоидные клетки будут получены от представителей различных видов.
Тогда на втором этапе можно использовать антитела, специфичные к первому
реагенту, но не к 1g лимфоидных клеток. Хотя непрямая иммунофлуоресценция
может повышать уровень неспецифического окрашивания, тем не менее в этом
случае большее количество флуоресцентного красителя может связываться
с исследуемыми маркерами, чем при прямом методе. Это обусловлено тем, что
большее число молекул флуоресцеина, конъюгированного со вторым антителом,
может связываться с первым антителом, особенно если второй реагент представ-
ляет собой гетерологичное антитело и распознает многие детерминанты первого
антитела. В результате увеличивается число молекул антител, связывающихся
с исследуемой структурой. В тех случаях, когда общее число молекул на по-
верхности клетки, прямо связанных с меченым реагентом, настолько мало, что
чувствительность микрофлуорометрических систем оказывается низкой для их
определения с помощью непрямого окрашивания, в два или даже в три этапа
удается выявить эти поверхностные молекулы.
Помимо антител, используемых для анализа клеточных поверхностных
структур, существует множество реагентов для количественной оценки содер-
жания ДНК в популяциях лимфоидных клеток. Одним из таких реагентов яв-
ляется митромицин, который, проникая в обработанные спиртом клетки, взаи-
модействует с ядерной ДНК. Комплексы ДНК с митромицином испускают све-
29. Разделение и идентификация клеток
287
товые волны при возбуждении лучом аргонового лазера с длиной волны 488 нм.
Поскольку интенсивность испускаемого излучения пропорциональна количе-
ству ДНК в клетке, то можно определить число пролиферирующих клеток в
популяции. Проточные микрофлуориметры с двумя лазерами позволяют иссле-
дователю окрашивать клетки антителами, конъюгированными с красителем те-
хасский красный, и идентифицировать данную клеточную популяцию, а также
оценивать содержание ДНК в этих клетках. Пример такого исследования при-
веден на рис. 29.8, где приблизительно 3% клеток в исследуемой популяции
Рис. 29.8. Гистограмма флуоресценции мыши-
ных клеток селезенки после обработки спиртом
и митромицином (пунктирная линия). Непре-
рывная линия изображает гистограмму, полу-
ченную для той же клеточной популяции, с
той лишь разницей, что в этом случае тета-
положительные клетки не анализировали.
Интенсивность флуоресценции
находится в фазе S. Если те же клетки пометить антителами против тета (^-ан-
тигена, конъюгированными с техасским красным, и исключить 0+-клетки из
анализа, используя их флуоресцентные характеристики, то частота клеток
в фазе S возрастает до 13 %. В отличие от этого лишь 1 % 0-положительных кле-
ток находится в фазе S.
29.1.3. Экспериментальные контроля
В связи с высокой чувствительностью метода проточной микрофлуоромет-
рии для максимального снижения уровня неспецифических взаимодействий
антител с клетками необходимо, чтобы антитела были максимально очищены.
Поскольку неспецифические взаимодействия имеют место практически при
любой инкубации клеток с антителами, исследователям следует тщательно до-
кументировать уровень неспецифических реакций. Такие неспецифические
взаимодействия происходят при связывании Fc-участков антител с Fc-рецепто-
рами и (или) при связывании белков, таких как антитела, с клетками в резуль-
тате мало изученных неспецифических реакций. Неспецифическое связывание
этого типа возрастает при получении конъюгатов антител с высокими значени-
ями отношения флуоресцентный краситель/белок или при конъюгации антител
с техасским красным в любом соотношении.
Взаимодействия, опосредованные Fc-рецепторами, можно свести к миниму-
му путем а) выделения F (ав)2-фрагментов антител с помощью ферментативного
расщепления и колоночной хроматографии, б) ультрацентрифугирования анти-
тел перед использованием для удаления агрегатов, обладающих высоким
сродством к Fc-рецепторам, или в) использования антител такого видового про-
исхождения, которые либо слабо взаимодействуют, либо вообще не способны
взаимодействовать с Fc-рецепторами исследуемых клеток. Однако даже если
исключены взаимодействия Fc-участков с Fc-рецепторами, антитела будут в раз-
288
И. Шер, М. Дж. Мэйдж
личной степени неспецифически взаимодействовать с некоторыми или 'со
всеми клетками анализируемой популяции. Это особенно существенно в тех
случаях, когда исследуются клетки из популяций, содержащих большое коли-
чество незрелых или умирающих клеток, когда конъюгаты антител с флуорес-
цеином имеют высокое отношение белок/краситель или при использовании
техасского красного при анализе по двум параметрам.
При обычной микроскопии неспецифические взаимодействия антител с
мертвыми, умирающими или незрелыми клетками можно отличить от специфи-
ческих взаимодействий по морфологическим характеристикам или по особен-
ностям окрашивания. Так, раздавленная клетка или клетка с внутрицитоплаз-
матическим окрашиванием не будет учитываться при микроскопической оценке
клеточной популяции. При микрофлуориметрическом анализе ги клетки также
можно не учитывать, так как светорассеяние большинства уми ающих или мерт-
вых клеток отличается от светорассеяния жизнеспособных клеток. Однако этот
метод не позволяет полностью исключить эти клетки из анализа и, кроме того,
существуют неспецифические взаимодействия антител с живыми клетками. Сле-
довательно, для количественной оценки специфических взаимодействий во всех
исследованиях, проводимых с использованием метода проточной микрофлуоро-
метрии, следует тщательно продумывать и ставить контроли. В большинстве
случаев достаточен антительный контроль, так как можно получить посторон-
ние антитела, не взаимодействующие с исследуемыми клетками специфически,
но обладающие той же способностью к неспецифическим взаимодействиям, как
и антитела, использованные в эксперименте. В случае прямого использования
конъюгированных антител соответствующие посторонние антитела в контроле
должны быть того же видового происхождения, так же очищены (например,
с помощью аффинной хроматографии), обладать сходным отношением белок/кра-
ситель и должны использоваться в тех же концентрациях, что и антитела в опы-
те (рис. 29.4,А и Б). Если используется непрямой метод, то в контроле клетки
следует обрабатывать так же, как и в опыте. Так, на первом этапе используются
посторонние антитела того же класса, с тем же соотношением белок/краситель
и того же видового происхождения, что и в опыте. Далее клетки, обработанные
контрольными или опытными антителами, одинаково окрашиваются вторым
реагентом.
В зависимости от свойств использованного в эксперименте антительного
реагента могут быть поставлены дополнительные контроли. Например, конт-
роль с клетками конгенных животных дает возможность подтвердить аллоспе-
цифичность препарата антител. Аналогично «клеточные» контроли подтвержда-
ют органную специфичность антител или специфичность антител к определен-
ному классу лимфоцитов. В качестве примера можно привести отсутствие
окрашивания тимоцитов анти-Ig-антителами. Однако клеточные контроли не
заменяют контролей с использованием посторонних антител, так как они не
позволяют оценить уровень неспецифических взаимодействий с клетками.
При представлении данных проточной микрофлуориметрии контрольные
кривые флуоресценции следует приводить вместе с экспериментальными кри-
выми и при определении частоты клеток, окрашенных данным реагентом, сле-
дует принимать во внимание степень неспецифического окрашивания. Для
решения этой проблемы с помощью компьютера получают кривую, представ-
ляющую разность между экспериментальной и контрольной кривыми. Если не
ясны различия во флуоресцентном окрашивании двух популяций клеток, то
получение с помощью компьютера таких кривых («компьютерное вычитание»,
computer subtraction) является превосходным методом оценки специфического
окрашивания.
29. Разделение и идентификация клеток
289
29.1.4. Сортировка клеток
Для сортировки клеток струя жидкости должна быть разбита на капли
в точке ниже точки пересечения струи с лучом лазера. Капли образуются в ре-
зультате высокочастотной вибрации проточной камеры (40 000 циклов/с), кото-
рую вызывает ультразвуковой генератор (рис. 29.1). Стробоскоп, работающий
при той же частоте, что и ультразвуковой генератор, оптически фиксирует
капли, так что оператор может с помощью микрометра и серии линз определить
расстояние точки отрыва капель от точки пересечения струи жидкости с лазер-
ным лучом (рис. 29.1). Это измерение, а также оценка промежутка между кап-
лями являются критическими для эффективной сортировки, так как по этим
характеристикам определяется время, в течение которого на струю жидкости
и образующиеся капли подается заряд. Благодаря этому капля, в которой нахо-
дится клетка, становится определенным образом заряженной. Например, если
клетка пересекает лазерный луч и дает сигнал флуоресценции, который по сво-
им параметрам соответствует сортировке «вправо» (отклонению клеток в пра-
вом направлении), то капля, в которую попадает эта клетка, при отрыве от
струи жидкости должна нести положительный заряд. Это приводит к тому, что
капля будет отклоняться вправо при пересечении электрического поля между
отклоняющими пластинами. На практике при сортировке заряд подается на
три капли, с тем чтобы убедиться, что капля, содержащая данную клетку, от-
клоняется. Чтобы предотвратить случайные ошибки (наложение капель), элект-
рическая цепь размыкается и заряд перестает подаваться, если вторая клетка
следует сразу же за первой. Поскольку капли могут быть заряжены как поло-
жительно, так и отрицательно, они могут отклоняться право или влево. Неза-
ряженные капли в электрическом поле не отклоняются и проскакивают
прямо.
Ограничение скорости сортировки связано с эффективностью образования
капель и проблемами наложения. Образование приблизительно 40 000 капель
в секунду гарантирует, что в одну каплю попадет только одна клетка и что если
имеется три заряженные капли, то капля, несущая клетку, будет одной из этих
трех. В реальных условиях устанавливается такое давление подачи образца,
что при сортировке через прибор проходит 5000 клеток в секунду. При разде-
лении больших клеточных фракций, например при выделении селезеночных
В-лимфоцитов мыши, на долю которых приходится, как правило, 50%всей
популяции, можно быстро получить значительное количество клеток (50% X
Х5000 = 2500 клеток/с-3,6-102 с/ч = 9 • 10е клеток/ч). Проблема решается
также с помощью обогащения искомой популяции каким-либо другим методом
или с помощью предварительной сортировки на лазерном сортировщике клеток
при очень высокой скорости подачи образца. Такая процедура повысит частоту
искомых клеток в популяции, которую затем можно разделить на этом приборе
при обычных условиях.
Выход клеток при сортировке варьирует в зависимости от источника кле-
точной популяции и выделяемой фракции клеток. В общем случае выход кле-
ток варьирует от 60 до 90% от числа клеток, которые проходят сортировку.
Потери клеток происходят в коллекторных пробирках в результате гибели
клеток или в результате неэффективного концентрирования и сбора образца.
Чтобы свести к минимуму гибель клеток, их собирают в пробирки, содержащие
культуральную среду с белковыми добавками. В ходе сортировки над белковой
средой собирается слой клеток в обтекающей жидкости. Эти клетки следует
как можно скорее суспендировать в белковой среде и перевести в более разве-
10-0395
290
И. Шер, М. Дж. Мэйдж
денное состояние. При работе на большинстве приборов стерильность легко до-
стигается с помощью фильтрации обтекающей жидкости, а также стерилизации
самого образца, соединительных трубок и проточной камеры.
Пробу каждой выделяемой популяции необходимо повторно проанализи-
ровать после окончания сортировки. Это позволяет избежать неудач, связанных
с неправильным промечиванием, и, что более важно, служит доказательством
эффективности сортировки. При сортировке основных фракций исходной по-
пуляции достигается превосходная степень очистки (более 93%). Нефлуорес-
цирующие негативные клетки можно очистить до более высокой степени, чем
флуоресцирующие позитивные клетки, так как при наложений капель пози-
тивная клетка регистрируется с высокой чувствительностью и капли, несущие
одновременно позитивную и негативную клетки, не подлежат сортировке. Ис-
следователей, изучающих функциональные свойства клеток, впечатляет жизне-
способность и активность клеток, выделяемых на лазерном сортировщике. Кра-
ситель в небольшом количестве, необходимом для определения фенотипа кле-
ток, как правило, не мешает последующим функциональным исследованиям.
29.2. Разделение клеток на специфически
покрытых полистироловых подложках
Использование специфически покрытых полистироловых подложек (по-
верхностей) для разделения клеток («плэйтинг» — от англ, plate поверхность,
пластина) оказалось дешевым и эффективным препаративным методом, обеспе-
чивающим стерильность разделяемых клеточных популяций. Общими услови-
ями при использовании этого метода являются возможность получения из раз-
деляемых клеток моноклеточных суспензий и наличие антител к поверхностно-
му маркеру, представленному на части клеток данной популяции. Этому методу
предшествовало применение монослоя клеток-мишеней для изучения иммун-
ного ответа. Кеннеди и Аксельрод [15] использовали покрытую поли-Ь-лизином
поверхность для получения монослоев эритроцитов при исследовании бляшко-
образующих клеток, синтезирующих антитела. Естественная способность мак-
рофагов к прикреплению к субстрату была использована для выявления пря-
мого цитолитического действия на клетки-мишени Т-лимфоцитов, иммунных
к аллоантигенам [16],
При изучении реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) важно было
выяснить, способны ли различные клетки-мишени избирательно связывать ал-
лореактивные клетки, участвующие в РТПХ. Было установлено, что монослои
клеток-мишеней, главным образом мышиных селезеночных лимфоцитов, можно
получить на полистироловых культуральных чашках, предварительно покрытых
поли-Ь-лизином или конканавалином А. При инкубации на таких монослоях
суспензии иммунных к аллоантигенам клеток селезенки удаляется существен-
ная часть их функциональной активности РТПХ. Для выяснения способности
монослоев В-лимфоцитов адсорбировать в качестве клеток-мишеней лимфоци-
ты, участвующие в РТПХ, культуральные чашки Петри перед нанесением
клеток покрывали специфически очищенными антителами к иммуноглобули-
нам. Такие чашки инкубировали затем с суспензией клеток селезенки. В этих
условиях наблюдалось образование клеточного монослоя, более плотного, чем
на чашках, покрытых поли-Ь-лизином или конканавалином А [17].
Эта техника получения монослоев В-лимфоцитов оказалась эффективным
способом разделения Т- и В-лимфоцитов, которое не связано с лизисом клеток
и может быть выполнено препаративно в стерильных условиях [8]. Таким
29. Разделение и идентификация клеток
291
Таблица 29.1. Некоторые примеры непрямого разделения клеток на покрытых
антителами полистироловых подложках
Источник клеток Тип клеток, связываю- щихся с под- ложкой Реагенты, специфичные к клеточным маркерам Антитела для покрытия подложки Температура инкубации клеток с первыми антителами Температура инкубации клеток на подложке Источник данных
Перифери- ческая кровь человека Субпопуля- ции Т-лим- фоцитов Моноклз- нальные антитела ОКТ4 и ОКТ8 Аффино очи- щенные козьи антитела про- тив IgG мыши 0° 4° [25]
Селезенка, лимфоузлы, тимус мыши То же Монокло- нальные антитела к Lyt-2.2 и Lyt-2.1 То же 0° 4° [22]
Селезенка мыши Т-клетки Кроличьи антитела против ти- моцитов мыши Аффинно очи- щенные козьи антитела про- тив IgG кро- лика 0° 4° [24]
Селезеноч- ные Т-клет- ки мыши Т-клетки со специфиче- скими по- верхностны- ми олигоса- харидами Лектин, конъюгиро- ванный с флуоресцеи- ном Аффинно очи- щенные анти- тела против флуоресцеина 0° или ком- натная тем- пература 0° или ком- натная тем- пература В. J. Fowlkes (личное со- общение)
Асциты мы- шей-опухо- леносителей Клетки лим- фомы EL4 Fab-фраг- менты козь- их антител против EL4 Аффино очи- щенные кроли- чьи антитела против Fab- фрагментов 1g козы 0° Комнатная температу- ра [21]
Костный мозг мор- ских свинок Сравнитель- но зрелые предшест- венники нейтрофи- лов Кроличьи антитела против зре- лых ней- трофилов Аффинно очи- щенные бара- ньи антитела против IgG кролика 0° Комнатная температура [20]
способом проводилось разделение не только мышиных, но и кроличьих лимфо-
цитов [18, 19].
Если поверхность, покрытая антииммуноглобулиновыми антителами, мо-
жет связывать В-лимфоциты при взаимодействии с природными поверхностны-
ми молекулами иммуноглобулинов, то очевидно, что с такой поверхностью мо-
жет связываться практически любая клетка, предварительно обработанная in
vitro антителами к какому-либо поверхностному маркеру; Эта процедура
является универсальным методом разделения клеток, поскольку дает воз-
можность разделять антиген-положительные и антиген-бтрицательные клетки.
Такой непрямой метод был впервые использован для отделения относительно
зрелых предшественников нейтрофилов от других клеток костного мозга мор-
ских свинок [20]. При этом суспензию клеток костного мозга морских свинок
инкубировали с кроличьими антителами против нейтрофилов, отмывали от
несвязавшихся антител и затем отмытые клетки наносили на культуральные
ю*
292
И. Шер, М. Дж. Мэйдж
чашки, предварительно покрытые аффинно очищенными антителами против
кроличьего иммуноглобулина. Непрямой метод был также использован для
получения плотно прикрепленного к субстрату монослоя «неприкрепляющихся»
Ig-отрицательных клеток мышиной лимфомы EL4, которые затем были исполь-
зованы как иммобилизованные мишени для проведения микросъемки последо-
вательной адсорбции и литического действия цитотоксических Т-лимфоцитов
в
Неприкрепляющиеся клетки, 96-98% Lyt-2"
—,— __________________к-,.
400 600 800 1000
Номер канала
Исходная популяция Ig’-клеток
селезенки
400 600 800
Номер канала
1000
1д"-клетки селезенки после
инкубации с анти-ку1-2.2.30% Lyt-2*
антителами ^“-клетки селезенки; В — клет-
ки Lyt-2-, неприкрепляющиеся к покрытой
антииммуноглобулиновыми антителами
чашке; Г — клетки Lyt-2 +, прикрепляющие-
ся к покрытой антииммуноглобулиновыми
антителами чашке. В качестве флуоресци-
рующего реагента используются меченные
флуоресцеином козьи антитела к мышиным
иммуноглобулинам.
Рис. 29.9. Микрофлуориметрический ана-
лиз на лазерном сортировщике Т-лимфоци-
тов мышиной селезенки, разделенных на
популяции Lyt-2 + и Lyt-2- путем инкуба-
ции обработанной анти-ЬуЬ2.2-антителами
клеточной суспензии, на полистироловых
культуральных чашках Петри, покрытых
антииммуноглобулиновыми антителами.
А — исходные lg-отрицательные клетки
селезенки; Б — обработанные анти-Lyt 2.2-
(ЦТЛ) [21]. В этом случае клетки в суспензии обрабатывали Fab-фрагментами
анти- ЕЬ4-антител (чтобы предотвратить кэппирование поверхностного анти-
гена и открепление клеток от покрытой антителами подложки),, отмывали и на-
носили на чадпки, предварительно покрытые аффинно очищенными антителами
против Fab-фрагментов.
Другой областью применения этого принципиального метода оказалось
препаративное нелитическое разделение мышиных Т-лимфоцитов, экспресси-
рующих (Lyt-2+) и неэкспрессирующих (Lyt-2-) антиген Lyt-2 [221. Разделение
Т-клеток Lyt-2+ и Lyt-2 - позволило прямо продемонстрировать синэргизм этих
субпопуляций Т-лимфоцитов в развитии РТПХ [22], а также обязательное
участие хелперных клеток в генерации предшественников ЦТЛ, отвечающих
на аллоантиген in vitro [23]. На рис. 29.9 представлен микрофлуориметрический
29. Разделение и идентификация клеток 293
анализ разделенных клеток Lyt-2+ и Lyt-2-. Описана также менее производи-
тельная модификация этого метода, при которой используются бактериологи-
ческие пластиковые чашки Петри [24].
Вкратце разделение лимфоцитов Lyt-2+ и Lyt-2- [8, 22] осуществляют сле-
дующим путем. На первом этапе получают суспензию клеток, не содержащую
агрегатов и комков. На стерильно выделенных селезенках делают по нескольку
надрезов и затем их продавливают через полиэтиленовое чайное ситечко в куль-
туральной среде, содержащей 10% сыворотки новорожденного теленка. В сре-
ду добавляют 0,02 М HEPES (М-2-гидроксиэтилшшеразин^-2-этансульфо-
новая кислота), но не добавляют бикарбонатного буфера, чтобы исключить за-
щелачивание среды в ходе разделения. Полученную суспензию клеток центри-
фугируют, ресуспендируют в изоосмотической среде с низкой ионной силой
[26]. В этой среде мертвые клетки и детрит образуют агрегаты, которые удаляют
фильтрацией через стерильную марлю. Профильтрованные клетки еще раз цент-
рифугируют, ресуспендируют в свежей среде и подсчитывают. Следующий
этап заключается в удалении 1§+-клеток (В-лимфоцитов). Для этого суспензию
клеток наносят на культуральные полистироловые чашки Петри диаметром
100 мм, которые предварительно покрывают раствором аффинно очищенных
антител к мышиным иммуноглобулинам. Иммобилизированные на чашке ан-
титела связывают В-лимфоциты, оседающие на дно чашки. Через полчаса
неприкрепившиеся клетки ресуспендируют легким вращением чашки, перено-
сят на вторую чашку и повторяют эту процедуру. После трех таких инкубаций
клеток на покрытых антителами чашках популяция неприкрепившихся клеток
практически полностью освобождается от В-лимфоцитов (рис. 29.9, А). Теперь
она состоит из ^"-клеток, одна треть которых представлена клетками Lyt-2+,
а две трети — Lyt-2- (рис. 29.9, Б). Для разделения клеток Lyt-2+ и Lyt-2-
суспензию инкубируют с моноклональными антителами к антигену Lyt-2 при
0 °C. Несвязавшиеся антитела удаляют центрифугированием и клеточную
суспензию снова инкубируют с чашками, покрытыми антииммуноглобулиновы-
ми антителами, на этот раз при 4 °C. Клетки Lyt-2+, покрытые антителами про-
тив Lyt-2, связываются с антииммуноглобулиновыми антителами на поверх-
ности чашки. Клетки Lyt-2- (рис. 29.9, В) собирают, покачивая чашку и отса-
сывая среду с неприкрепившимися клетками. Чашку затем осторожно отмывают
5 раз забуференным фосфатами физиологическим раствором (ЗФР) и прикрепив-
шиеся клетки Lyt-2+ (рис. 29.9, Г) удаляют энергичным пипетированием среды
в чашке.
Эффективность разделения зависит от числа связей, образуемых между ас-
социированными с чашкой антителами и мембранно-связанным антигеном,
достаточных для того, чтобы клетка оставалась связанной с чашкой, несмотря
на силы сдвига, развивающиеся при ресуспендировании неприкрепившихся
клеток путем покручивания чашки. В случае таких поверхностных антигенов,
как иммуноглобулины, которые присутствуют на В-лимфоцитах в высокой
концентрации, проблем со связыванием клеток с подложкой, покрытой анти-
телами, не возникает. В реальных условиях эксперимента такие клетки нельзя
выделить, не повредив их. Чтобы снять клетки, чашки покрывают антителами,
которые разводят посторонним белком так, что они связываются с поверхностью
чашки с меныпей плотностью. Тогда в связывании клеток с чашкой участвует
меньшее число связей. В результате можно снять жизнеспособные клетки,
о чем свидетельствует их последующее созревание in vitro в антителообразую-
щие клетки [8, 27]. Для выделения жизнеспособных В-лимфоцитов можно ис-
пользовать и другой метод. В этом случае чашки покрывают глобулиновой
фракцией гипериммунной антииммуноглобулиновой сыворотки, если концент-
Юв-0395
294
И. Шер, M. Дж. Мэйдж
рация антител составляет в ней по крайней мере 10% от суммарного белка.
G другой стороны, когда антиген представлен на клеточной поверхности
в очень низких концентрациях, для эффективного разделения, если оно вообще
возможно, необходимо образование максимально возможного числа связей,
образуемых аффинно очищенными антииммуноглобулиновыми антителами,
которые используются для покрытия чашек. В случае с Lyt-2-антигеном мы-
шиных Т-лимфоцитов конденсация (patching) и кэппинг могут приводить к
снижению плотности антигена на поверхности клетки. При этом разделение
проходит значительно лучше при 0 °C или при 4 °C [22]. Установлена необхо-
димость такого же температурного режима для успешного разделения субпо-
пуляций человеческих Т-лимфоцитов с использованием ОКТ4- и ОКТ8-антител
[251. Чтобы добиться оптимального разделения клеток, следует эмпирически
подобрать подходящее разведение антител к поверхностному антигену. Как
ранее отмечалось, моноклональные антитела распознают только одну детерми-
нанту и только с одной аффинностью. Если аффинность такова, что может
происходить значительная диссоциация, или если используется избыток анти-
тел, то с антигеном будет связан лишь один антиген-связывающий центр моле-
кулы антитела, и диссоциация этой связи приведет к диссоциации всей анти-
тельной молекулы. Как ни странно, характеристики разделения ухудшаются
в случае использования более низких концентраций антител, когда оба актив-
ных центра антитела могут связываться с поверхностным антигеном.
ЛИТЕРАТУРА
1. Moller G. Demonstration of mouse isoantigens at the cellular level by the fluorescent anti-
body technique, J. Exp. Med., 114, 415—434 (1961).
2. Raff M. C. Two distinct populations of peripheral lymphocytes in mice distinguishable by
immunofluorescence, Immunology, 19, 637 (1970).
3. Cantor H., Weissman I. Development and function of subpopulations of thymocytes and T
lymphocytes, Prog. Allergy, 20, 1—64 (1976).
4. Scher I., Sharroiv S. O., Wistar R., Jr., Asofsky R., Paul W. E. B-lymphocyte heteroge-
neity: Ontogenetic development and organ distribution of B-lymphocyte populations defin-
ed by their density of surface immunoglobulin, J. Exp. Med., 14, 494—506 (1976).
5. Osmond D. G., Nossal G. J. V. Differentiation of lymphocytes in mouse bone marrow. I.
Quantitative radioautographic studies of antiglobulin binding by lymphocytes in bone
marrow and lymphoid tissues, Cell Immunol., 13, 132 (1974).
6. Horan P. K., Wheeless L. L., Jr. Quantitative single cell analysis and sorting. Rapid
analysis and sorting of cells is emerging as an important new technology in research and
medicine, Science, 198, 149—157 (1977).
7. Herzenberg L. A., Siveet R. G., Herzenberg L. A. Fluorescence-activated cell sorting, Sci.
Am., 234, 108—117 (1976).
8. Mage M. G., McHugh L. L., Rothstein T. L. Mouse lymphocytes with and without surface
immunoglobulin: Preparative scale separation in polystyrene tissue culture dishes coated
with specifically purified anti-immunoglobulin, J. Immunol. Methods, 15, 47—56 (1977).
9. Kamentsky L. A., Melamed M. R., Derman H. Spectrophotometer: New instrument for
ultrarapid cell analysis, Science, 150, 630—631 (1965).
10. Fulivi/ler M. J. Electronic separation of biological cells by volume, Science, 150, 910—911
(1965).
11. Siveet R. G. High frequency recording with electrostatically deflected ink jets, Rev. Sci.
Instrum., 36, 131 (1965).
12. Van Dilla M. A., Trujillo T. T., Mullaney P. F. et al. Cell microfluorometry: A method
for rapid fluorescence measurement, Science, 163, 1213—1214 (1969).
13. Hulett H. R., Bonner W. A., Barrett J. et al. Cell sorting: Automated separation of mamma-
lian cells as a function of intracellular fluorescence, Science, 166, 747—749 (1969).
14. Loken M. A., Herzenberg L. A. Analysis of cell populations with a fluorescence-activated
sorter, Ann. N.Y. Acad. Sci., 254, 163—171 (1975).
15. Kennedy J., Axelrod M. An improved assay for haemolytic plaque-forming cells, Immunol-
ogy, 20, 253 (1971).
29. Разделение и идентификация клеток
295
16. Brondz В. D. Lymphocyte receptors and mechanisms of in vitro cell-mediated immunity,
Transplant. Rev., 10, 112-151 (1972).
17. Mage M. G., McHugh L. L., Bothstein T. L. Separation of graft-vs-host antigen reactive
cells in vitro. Transplant. Proc., 8, 399—401 (1976).
18. Barker С. R., Worman С. P., Smith J. L. Purification and quantification of T and В lym-
phocytes by an affinity method, Immunology, 29, 765—777 (1975).
19. Nash A. A., Ling N. H., Cell P. G. H. Investigation into the separation and characterization
of rabbit lymphocyte-sub-populations, Abstracts II, p. 70, 10th Leucocyte Culture Con-
ference, 1975.
20. Evans W. H., Mage M. Development of surface antigen during maturation of bone marrow
neutrophil granulocytes, Exp. Hematol., 6, 37—42 (1978).
21. Rothstein T. L., Mage M. G., Jones G., McHugh L. L. Cytotoxic T lymphocyte killing of
immobilized allogeneic tumor target cells measured by time-lapse microcinematography,
J. Immunol., 121, 1652—1656 (1978).
22. Mage M. G., Mathieson B. J., Sharroiv S. O., McHugh L. L., Hammerling U., Kannalopou-
los-Langevin C., Brideau D., Jr., Thomas C. A. Preparative non-lytic separation of Lyt2 +
and Lyt2~ T lymphocytes, functional analyses of the separated cells, and demonstration of
synergy in graft versus host reaction of Lyt2+ and Lyt2~ cells, Eur. J. Immunol., 11, 228—
235 (1981).
23. Mage M., Mathieson B., McHugh L. L., Sharrow S., Farrar J. Highly purified positively
selected Lyt2+ T cells from normal mouse spleen have an obligatory requirement for Lyt2-
helper cells or IL2 for CTL generation in vitro, J. Cell. Biochem., Abstracts, Supplement,
6, 54 (1982).
24. Wysocki L. J., Sato V. L. «Panning» for lymmphocytes: A method for cell selection, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2844—2848 (1978).
25. Payne S. M., Sharrow S. O., Shearer G. M., Biddison W. E. Preparative separation of human
T cells reactive with the OKT4 monoclonal antibody, Int. J. Immunopharmacol., 3, 227 —
232 (1981).
26. Von Boehmer H., Shortman K. The separation of different cell classes from lymphoid organs.
IX. A simple and rapid method for removal of damaged cells from lymphoid cell suspen-
sions, J. Immunol. Methods, 2, 293 (1973).
27. MondJ. J., Mage M. G., Rothstein T. L., Mosier D. E., Asojsky R., Paul W. E. High an
TNP plaque forming cell potential of residual В cells in a T cell population, J. Immunol.,
125, 1526—1529 (1980).
10*
Глава 30
Длительные культуры
иммунокомпетентных клеток
С. Гаррисон Фэтмен, Френк В. Фитч
(С. Garrison Fathman, Frank W. Fitch)
30.1. История вопроса
Разработка методов получения гомогенных популяций клеток значительно
ускорила анализ молекулярных основ клеточных взаимодействий и регулятор-
ных, и эффекторных функций лимфоцитов. Опухолевые миеломные клетки и
В-клеточные гибридомы, сыграли особенно большую роль в определении струк-
туры молекул антител и генетических основ образования иммуноглобулинов.
Разработано три подхода для получения моноклональных функциональных
Т-клеток. Неопластические лимфомы были использованы, например, как
продуценты лимфокинов [1, 2]. Однако существует относительно мало разных
типов функциональных Т-лимфом, и возможность получения таких клеток за-
висит главным образом от спонтанного появления опухолей. Имеется несколь-
ко сообщений об успешных попытках индуцировать Т-лимфомы со специфиче-
ской функциональной активностью [3, 4].
Т-клеточные гибридомы используются, кроме того, для получения различ-
ных лимфокинов, в частности супрессорных факторов [5, 8], а также для изу-
чения условий активации Т-клеток антигеном [9]. Методы получения Т-клеточ-
ных гибридом подробно описаны ниже. Следует, однако, иметь в виду, что при
интерпретации данных, полученных в опытах с Т-лимфомами и Т-гибридомами,
необходимо помнить о возможной роли неизвестных продуктов опухолевых
клеток в наблюдаемых эффектах. Например, Т-клеточная гибридома, получен-
ная гибридизацией Т-клеток мышей, иммунных к гаптену п-азобензоларсонату
(АБА), продуцирует белок, специфически связывающий гаптен АБА, а также
взаимодействующий с антисывороткой против перекрестного идиотипа анти-
арсонатных антител [10](. В дальнейшем было установлено, что такие гаптен-
специфические идиотип-положительные молекулы продуцируются родитель-
ской линией клеток Т-лимфомы, а также другими линиями лимфоидных клеток,
клетками нормальной печени и селезенки [11]. И наконец, последнее предо-
стережение: определение данной линии гибридомных клеток как продукта
слияния Т-лимфомной клетки с нормальной может быть затруднено, поскольку,
по имеющимся данным, некоторые гибридомы, полученные в результате слия-
ния Т- и В-клеточных лимфом, экспрессируют детерминанты Thy-1 каждой ро-
дительской линии [12].
Другой подход к получению большого числа идентичных функциональных
клеток связан с получением клонов нормальных Т-клеток. В настоящее время
разработаны простые методы получения клонированных Т-клеток, которые
можно поддерживать в культуре бесконечно. Это достижение еще более впечат-
ляет, если принять во внимание, что менее 25 лет назад считалось невозможным
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток
297
культивировать лимфоидные клетки. Действительно, функции лимфоцитов
были тогда еще неизвестны [13]. Значительный прогресс в культивировании
Т-клеток был достигнут благодаря относительно небольшому числу важных
технических усовершенствований.
Представление о том, что малые лимфоциты не размножаются в культуре,
было опровергнуто в 1960 г. эвристическим открытием Ноуэллом [14] митоген-
ного действия фитогемагглютинина (ФГА) на лимфоциты.
Вскоре после этого для изучения иммунного ответа на аллоантигены был
разработан метод получения смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ) [15, 16].
Первоначально бласт-трансформация или клеточная пролиферация, индуци-
рованные при стимуляции антигеном, были единственным критерием, свиде-
тельствующим об иммунной реакции. Однако удалось также получить ответ
цитотоксических эффекторных клеток в культуре [17, 18]. Относительно не-
большие изменения техники культивирования, включающие использование
2-меркаптоэтанола, привели к значительному усовершенствованию методов
регистрации ответа in vitro [19—21]. При повторных стимуляциях соответст-
вующим антигеном оказалось возможным культивировать цитотоксические
Т-лимфоциты (ЦТЛ) в течение нескольких недель. Ответ ЦТЛ, генерированных
in vitro, длится недолго и цитолитическая активность клеток затем неизбежно
исчезает [22, 23]. Нецитолитические клетки, которые пролиферируют в ответ
на антигенную стимуляцию, по-видимому, сохраняются в культуре дольше.
Однако длительные культуры нецитолитических клеток в этих работах не
исследовались, поскольку весь интерес был сосредоточен на изучении ЦТЛ.
Незаменимым компонентом для длительного культивирования Т-лимфоци-
тов оказался фактор роста Т-клеток (TCGF). В культуры TCGF может быть до-
бавлен из экзогенных источников, а может продуцироваться и эндогенно при
активации некоторых Т-лимфоцитов. Собственно данные о том, что культураль-
ная среда, полученная при стимуляции лимфоцитов в смешанной культуре,
вызывает пролиферацию других лимфоцитов, были опубликованы за десять
лет до появления статьи, в которой описывался TCGF [26]. Значение этих более
ранних наблюдений в свое время не было понято. Открытие (или повторное от-
крытие) TCGF, как и открытие активации Т-лимфоцитов митогенами, было де-
лом счастливого случая (R. Gallo, личное сообщение). Галло (Gallo) и сотруд-
никам требовалось получить большое количество гранулопоэтических клеток
человека для биохимических и вирусологических исследований. Ранее при по-
иске подходящего источника кондиционированной среды (КС), поддерживаю-
щей длительный рост таких клеток, они использовали среду, полученную после
стимуляции человеческих лимфоцитов ФГА. Как было показано ранее, такая
КС содержит колониестимулирующий фактор (CSF), усиливающий краткосроч-
ный рост гранулопоэтических клеток. При этом наблюдался также выражен-
ный рост лимфобластов, но считалось, что эти клетки представляют собой
В-лимфоциты, трансформированные в результате инфицирования вирусом Эп-
штейна—Барр (ВЭБ). Спустя несколько лет, когда, не удовлетворенные полу-
ченными результатами, Галло и сотрудники снова стали тестировать КС сти-
мулированных ФГА лимфоцитов, они выявили сходный феномен. Однако на
этот раз авторы оценили некоторые свойства полученных лимфобластов. Про-
лиферирующие клетки оказались ВЭБ-отрицательными, но обладали свойства-
ми зрелых Т-лимфоцитов. Активное начало КС было названо фактором роста
Т-клеток [26].
С этим открытием был сделан решающий шаг к клонированию Т-клеток.
Длительные культуры линии мышиных цитотоксических клеток были описаны
год спустя [27], а клоны цитотоксических Т-лимфоцитов были получены еще
298
С. Г. Фзтмен, Ф. В. Фитч
через несколько месяцев [28]. Приблизительно в это же время были получены
нецитолитические Т-клеточные клоны при клонировании в мягком агаре без
добавления экзогенного TCGF, так как последний продуцировался эндогенно
[29]. Через несколько лет после дискуссий на Международном рабочем сове-
щании по лимфокинам, на котором разрабатывалась рациональная номенкла-
тура лимфокинов [30], TCGF был переименован в интерлейкин-2 (IL-2), по-
скольку многочисленные биохимические и биологические исследования пока-
зали, что активность TCGF определяется одной довольно хорошо охарактери-
зованной молекулой.
Все методы клонирования Т-клеток, используемые в настоящее время,
связаны с добавлением IL-2 в культуральную среду. На практике, однако, для
получения Т-клеточных клонов большинство последователей использует не-
очищенную кондиционированную среду или лишь частично очищенный мате-
риал. Кондиционированную среду, содержащую IL-2, можно получить при
стимуляции мышиных лимфоидных клеток в СКЛ, при митогенной стимуля-
ции крысиных [31], мышиных [32, 33] или человеческих [34—36] лимфоидных
клеток или при соответствующей стимуляции отдельных линий клеток лимфо-
мы мыши [1, 2] или человека [37]. Во всех этих средах фактором, необходимым
для роста Т-клеток, по-видимому, является IL-2. Однако, наряду с IL-2, в
кондиционированной среде присутствуют обычно и другие лимфокины, способ-
ные вызывать некоторые из наблюдаемых биологических эффектов. Свойства
ряда лимфокинов, участвующих в регуляции иммунного ответа, детально рас-
смотрены Смитом (гл. 21) и здесь не приводятся. Следует, однако, отметить, что
довольно рискованно приписывать IL-2 все эффекты, наблюдаемые при культи-
вировании Т-клеток в кондиционированной среде, до тех пор, пока не будут
использованы очищенные препараты IL-2. Для удобства в дальнейшем матери-
ал, необходимый для роста Т-клеток и используемый для поддержания проли-
ферации клонированных Т-лимфоцитов, будет обозначаться как «IL-2», но
при этом следует учитывать приведенные выше замечания.
30.2. Общие условия клонирования
Для получения и поддержания Т-клеточных клонов используется два зна-
чительно различающихся подхода. При первом подходе для стимуляции роста
Т-клеток после активации антигеном используется только IL-2. Отвечающие
лимфоидные клетки, собранные после стимуляции антигеном in vivo, культи-
вируют в присутствии соответствующего антигена. Затем такие культуры «под-
кармливают» (периодически обрабатывают) только IL-2. Обычно при таком
подходе необходимо пассировать клетки в суммарной культуре в течение не-
скольких недель до того, как станет возможным с достаточной частотой выде-
лять Т-клеточные клоны, поскольку частота Т-лимфоцитов, способных расти
в присутствии одного IL-2, по-видимому, низка [38]. Действительно, культиви-
руемые Т-цлетки, как правило, хорошо растут в течение нескольких недель,
а затем наступает «кризис», при котором скорость роста снижается. Культуры
затем либо вымирают, либо неожиданно начинают расти значительно лучше.
Клетки, пережившие такой кризис, зачастую ведут свое начало от одного кло-
на [38]. Свойства клонированных Т-клеток, полученных и поддерживаемых в
культуре в присутствии одного IL-2, могут быть нестабильны; например, у
ЦТЛ, полученных таким способом, может изменяться уровень и характер ци-
толиза [28]. У большинства, если не у всех клонированных Т-клеток, получен-
ных таким методом, выявляются кариотипические изменения [39]. Такие кло-
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток
299
нированные Т-клетки могут также утратить способность к ответу на специфиче-
скую стимуляцию антигеном [40].
Второй подход к получению и поддержанию Т-клеточных клонов сводится
к использованию специфического антигена и «филлерных» клеток (клеток-«на-
полнителей») наряду с IL-2. С помощью этого метода можно получить аллореак-
тивные клоны из первичной СКЛ, а эффективность клонирования из вторичных
смешанных культур может приближаться к 100% [41, 42]. При клонировании
Т-клеток, отвечающих на «обычные» растворимые антигены, «филлерные» клет-
ки служат источником la-положительных антиген-презентирующих клеток,
необходимых для Т-клеточной стимуляции [43]. Аллореактивные клонирован-
ные Т-клетки можно стимулировать популяцией облученных прикрепляющих-
ся аллогенных клеток, содержащей макрофаги. Неясно, выполняют ли филлер-
ные клетки какие-либо другие функции, кроме презентации антигена. Во
всяком случае, высокая исходная эффективность клонирования и простота под-
держания клонированных клеток в культуре связаны с присутствием филлер-
ных клеток, которые представлены в популяции сингенных или аллогенных
клеток селезенки, лишенной Т-лимфоцитов [44].
Эти выводы справедливы не|для всех случаев. Антиген-реактивные проли-
ферирующие нецитолитические клонированные Т-клетки способны проли-
ферировать в присутствии только IL-2, причем этот ответ характеризуется стро-
гой зависимостью доза—эффект [45]. Количество IL-2, высвобождаемого при
стимуляции клонированных пролиферирующих Т-клеток антигеном, в свою
очередь зависит от числа клеток в культуре [46]. При высокой плотности клеток
в ответ на антигенную стимуляцию IL-2 может образовываться в количестве,
достаточном для пролиферации клеток. В этом случае отпадает необходимость
в экзогенном IL-2. Однако при низкой плотности требуется некоторое количе-
ство IL-2 экзогенного происхождения, чтобы «разогнать» клетки до такой плот-
ности, когда IL-2 будет продуцироваться в количествах, достаточных для под-
держания клеточного роста. Хотя для роста большинства клонированных
линий ЦТЛ необходим экзогенный IL-2 и один лишь антиген не способен инду-
цировать пролиферацию этих клеток, при культивировании ЦТЛ с аллоанти-
геном в присутствии лимитирующих количеств IL-2 отмечается синергическое
действие антигена и IL-2 [47]. Клонированные ЦТЛ, по-видимому, способны
отвечать на антиген, поскольку после соответствующей антигенной стимуля-
ции могут высвобождаться фактор активации макрофагов (ФАМ), интерферон
и некоторые другие лимфокины [48]. Таким образом, и для пролиферирующих,
и для цитотоксических клонированных Т-клеток сочетание относительно низ-
кого содержания IL-2, антигена и филлерных клеток является достаточным се-
лективным стимулом для роста клеток, эффективно отвечающих на антиген.
Время удвоения клонированных клеток довольно мало — как правило, от 18
до 24 ч [45] — и через несколько недель или месяцев культивирования обычно
появляются измененные клетки. Клетки, обладающие определенными росто-
выми преимуществами, вскоре становятся доминантными. Хотя, как будет об-
суждаться ниже, измененные клоны в некоторых случаях представляют ин-
терес, появление и неожиданная экспансия таких клеток создают значительные
трудности. Обычная процедура селекции может свести к минимуму преиму-
щественный рост измененных клеток. Для сохранения клонированными клет-
ками необходимых свойств следует реклонировать клетки каждые несколько
месяцев.
Эти два разных подхода к получению и поддержанию клонированных
Т-лимфоцитов дают возможность получать клетки, свойства которых могут
значительно различаться. Выбор метода зависит от планируемого применения
300
С. Г. Фэт.чен, Ф. В. Фитч
клеточных клонов. Клонированные клетки, растущие в присутствии одного
IL-2, обладают тем преимуществом, что не содержат клеток других типов. Од-
нако, как отмечено ранее, такие клетки могут характеризоваться фенотипиче-
скими и кариотипическими изменениями. Клонированные клетки, поддержи-
ваемые в присутствии IL-2, антигена и филлерных клеток, по фенотипу и ка-
риотипу обычно не отличаются от нормальных клеток, но такие клонированные
клетки могут включать некоторые клеточные элементы из популяции фил-
лерных клеток. Обработка филлерных клеток антителами против Thy-1 и комп-
лементом служит гарантией, что единственным источником Т-лимфоцитов в
данной популяции будут клонированные Т-клетки. Однако некоторое коли-
чество остаточных радиорезистентных клеток других типов может сохранять-
ся. Если необходимо полностью удалить примесь филлерных клеток, то клони-
рованные клетки можно пассировать с большей частотой и при более высокой
плотности, чем обычно, добавляя лишь больше IL-2. При этом не происходит
видимого изменения фенотипических характеристик в течение нескольких
недель культивирования (A. L. Glasebrook, личное сообщение).
Собственно клоны можно получить в результате клонирования методом
предельных разведений [41, 49], в мягком агаре [29] или с помощью микромани-
пуляционной техники [49]. Если при повторном клонировании все клетки бу-
дут обладать одними и теми же заданными фенотипическими свойствами, мож-
но быть уверенным, что культивируемые клетки являются клоном. Можно
статистически оценить вероятность распределения клонов при клонировании
методом предельных разведений и в мягком агаре, но нельзя быть уверенным
в том, что данный «клон», полученный этими методами, не является потомством
двух или более клеток. Клонирование с помощью микроманипулятора, в осо-
бенности при нескольких реклонированиях, дает наибольшую гарантию истин-
ной клональности.
По каким-то не совсем понятным причинам наилучшие результаты полу-
чаются в том случае, если аллореактивные клонированные линии, поддержи-
ваемые в присутствии IL-2, антигена и филлерных клеток, пассируют каждые
7—10 дней. На этих сроках после экспоненциальной фазы роста число клеток
в культуре начинает снижаться [51]. Для клеток, отвечающих на растворимые
антигены, предпочтительнее могут оказаться более длительные интервалы
между пассажами (10—14 дней) [43]. Оптимальные результаты может дать че-
редование периодов антигенной стимуляции и «отдыха», когда Т-клетки куль-
тивируются с облученными сингенными клетками в отсутствие антигена [41].
Установлено, что аллореактивные Т-клеточные клоны по неизвестным причи-
нам не чувствительны к повторной стимуляции антигеном в период экспоненци-
альной фазы роста [45].
Клонированные Т-клетки можно замораживать и хранить в жидком азоте
в течение по меньшей мере нескольких лет. Для этого на ранней log-фазе роста
клетки центрифугируют и ресуспендируют при 4 °C в среде, содержащей 10%
диметилсульфоксида (ДМСО). Выживаемость замороженных клеток выше при
наличии в среде по меньшей мере 10% сыворотки. Для замораживания ампулы
с клетками упаковывают в пенопластовые коробки и помещают на ночь в низ-
котемпературный холодильник при температуре —70 °C. Выживаемость клеток
выше при хранении ампул в жидком азоте, чем при хранении в низкотемпера-
турном холодильнике. Ампулы с клетками размораживают быстрым оттаивани-
ем в водяной бане при 37 °C. Как только исчезает последний кристаллик льда,
клеточную суспензию разводят десятикратным объемом свежей среды при
4 °C [41]. После центрифугирования клетки переводят в культуру, как описано
ниже, используя соответствующие условия поддержания клонов.
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток
301
30.3. Среды, используемые для клонирования
и культивирования
Несколько видов сред используются разными исследователями со сравни-
мыми результатами. Для культивирования мышиных лимфоидных клеток часто
используется среда Игла в модификации Дульбекко (МДСИ, DMEM), иногда
с дополнительными питательными добавками. При этом следует использовать
среды с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л). Такая среда изотонична
крысиной и мышиной сыворотке [52]. Среда RPMI 1640 используется для
культивирования и мышиных, и человеческих клеток, однако, хотя эта среда
и изотонична человеческой сыворотке, она гипотонична по отношению к мыши-
ной и крысиной сыворотке. При получении клеточных суспензий для последую-
щего культивирования клеток предпочтительнее использовать солевой раствор
Хэнкса или другие подобные среды, изотоничные мышиной сыворотке, чтобы
предотвратить лизис клеток и образование геля ДНК, который может захваты-
вать клетки. МДСИ в модификации Пскова [53] также гипотонична по отно-
шению к мышиной сыворотке.
Культуральная среда для мышиных клеток обычно включает сыворотку
эмбриона коровы в концентрациях от 2 до 10% и 2-меркаптоэтанол, как пра-
вило, в концентрации 5-10-5М. Культуры человеческих клеток обычно полу-
чают в среде, содержащей от 10 до 20% человеческой сыворотки (смесь сыворо-
ток от нескольких доноров). Антибиотики, обычно пенициллин (100 мкг/мл)
и стрептомицин (100 Ед/мл), используются в тех случаях, когда в культуру
переводят клетки, непосредственно полученные прямо от животных. Для улуч-
шения буферных свойств среды могут быть использованы HEPES (25 мМ)
и морфолинпропансульфоновая кислота (МПС) (10 мМ).
30.4. Получение культуральной жидкости,
содержащей IL-2
Для получения соответствующих препаратов IL-2 используются несколько
разных методов. Содержание IL-2 в культуральной жидкости можно просто и
быстро определить, измеряя включение 3Н-тимидина IL-2-зависимой линией
клеток при последовательных разведениях культуральной жидкости [54].
Активность неизвестных образцов сравнивают с активностью стандартного пре-
парата. Несколько различных индикаторных клеточных линий, которые можно
получить в соответствующих лабораториях, дают сравнимые результаты.
Довольно много IL-2 содержится в культуральной жидкости (КЖ) клеток
крысиной селезенки, стимулированных конканавалином А (Кон А КЖ) [31,
32]. В Кон А КЖ обычно представлены и другие лимфокины, включая CSF
и BCGF [55]. Такие супернатанты используются для исходного клонирования
и для поддержания клонированных Т-клеток. Однако в том случае, когда кло-
нированные клетки, полученные в присутствии IL-2, антигена и филлерных
клеток, поддерживают в крысиной Кон А КЖ даже в течение нескольких не-
дель, могут возникнуть фенотипические аномалии.
Для получения Кон А КЖ клетки селезенки крыс культивируют с плот-
ностью 1,25-106 клеток в 1 мл среды (МДСИ, RPMI 1640 или другой подходя-
щей среды), содержащей от 2 до 10% сыворотки эмбриона коровы (СЭК, FCS)
и 5-10~5М 2-меркаптоэтанола. Кон A (Pharmacia Fine Chemicals, Уппсала,
Швеция) добавляют в конечной концентрации от 2,5 до 5 мкг/мл. Через 48 ч
302
С. Г. Фэтмен, Ф. В. Фитч
культуральную жидкость собирают и центрифугируют. Используются также
и другие варианты условий культивирования [31, 32]; детали этой процедуры,
по-видимому, не существенны.
Надосадочная жидкость вторичных смешанных культур лимфоцитов (СКЛ)
также служит удобным источником IL-2 (СКЛ КЖ) [50], однако содержание
IL-2 в ней обычно ниже, чем в Кон А КЖ. Для получения СКЛ КЖ [50] ста-
вят первичную СКЛ, культивируя (25—40) • 10е отвечающих клеток селезен-
ки мышей с (25 —80)-10® облученных (1400 рад) аллогенных селезеночных кле-
ток-стимуляторов в 15—20 мл среды в пластиковых флаконах (Falcon №3013),
поставленных вертикально. Вторичную СКЛ обычно ставят при более низких
значениях отношения числа отвечающих клеток и клеток-стимуляторов по срав-
нению с первичной СКЛ. Например, 5-10® клеток из первичной СКЛ, собран-
ных через 14 дней культивирования, смешивают с 25-10® облученных алло-
генных клеток-стимуляторов в 20 мл культуральной среды. Через 48 ч центри-
фугированием получают культуральную жидкость. Комбинация линий, отли-
чающихся по локусу Mis, дает сильную стимуляцию клеток и более высокое
количество IL-2.
Источником IL-2 могут служить некоторые линии клеток мышиной лим-
фомы. С этой целью клетки LBRM-33 обычно стимулируют ФГА [1]. Соответст-
вующую сублинию опухолевых клеток EL-4 можно стимулировать форболми-
ристатацетатом (ФМА) и получить культуральную жидкость с очень высоким
содержанием IL-2 [2]. 1 мкг ФМА добавляют на 100 мл среды, содержащей
10® клеток EL-4. Через 48 ч культивирования культуральную жидкость соби-
рают центрифугированием и ФМА удаляют адсорбцией на активированном
угле [2]. Такая КЖ может быть использована для поддержания клонов ЦТЛ
в присутствии аллогенных клеток-стимуляторов в течение по крайней мере
нескольких месяцев без видимых фенотипических изменений (A. Glasebrook,
личное сообщение). Другие сублинии EL-4 для получения IL-2-содержащей
КЖ можно стимулировать ФГА [57, 58].
Человеческий IL-2 можно получить, культивируя лейкоциты перифери-
ческой крови или клетки селезенки (5-10®/мл) в среде RPMI 1640, содержащей
ФГА (РНА-Р, Difco, Детройт, Мичиган, США) в конечной концентрации 0,2%.
Через 48 ч КЖ собирают центрифугированием. Человеческий IL-2 можно так-
же получить при митогенной стимуляции клеток Т-клеточной лейкемии чело-
века Jurkat [37]. Недавно получены человеческие Т-Т-гибридомы с постоянной
секрецией IL-2 (Е. Engleman, личное сообщение).
Для полной гарантии стерильности IL-2-содержащую КЖ следует профиль-
тровать, но на фильтрах определенных типов, особенно в случае фильтрации
небольших объемов жидкости, может быть потеряна некоторая часть активно-
сти. Человеческий и мышиный IL-2 можно очистить преципитацией сульфатом
аммония с последующей гель-фильтрацией, ионнообменной хроматографией
и препаративным изоэлектрофокусированием [31, 59]. Однако выход при такой
очистке бывает относительно низким, и для поддержания Т-клеточных линий
и (или) клонов в большинстве случаев можно использовать неочищенную КЖ,
содержащую IL-2.
30.5. Клонирование аллореактивных Т-клеток
Клоны аллореактивных Т-клеток можно получить из популяции рестиму-
лированных клеток селезенки или лимфоузлов, но частота отвечающих клеток
значительно повышается, если их сначала стимулировать аллоантигеном в СКЛ
г
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток 303
[49] . Метод предельных разведений представляет собой обычный способ полу-
чения цитолитических и нецитолитических клонированных Т-клеток. Если
используются нестимулированные Т-клетки, то в лунку микропластины необ-
i ходимо вносить несколько сотен клеток. При использовании клеток из вторич-
ной СКЛ, полученных через 48 ч культивирования, в микропластины добавля-
ют от 0,1 до 1 клетки в расчете на одну лунку. Клонируемые клетки суспенди-
руют в культуральной среде, содержащей IL-2, обычно Кон А КЖ, и по
100 мкл такой суспензии добавляют в лунки, содержащие по 10е облученных
аллогенных клеток селезенки (1400—3300 рад) в 100 мкл среды с 20% СЭК.
Дополнительные 50 мкл среды, содержащие 10% СЭК, и 50 мкл IL-2, добав-
ляют в лунки через 4 дня [51].
Кластеры клеток появляются в лунках приблизительно через одну неде-
лю культивирования. Часть клеток из лунок, содержащих пролиферирующие
клетки, можно отобрать для прямого определения цитотоксической активности
в чувствительном микротесте, основанном на оценке высвобождения 51Сг [60].
Клетки с нужными свойствами наращивают и поддерживают в присутствии
аллогенных клеток и СКЛ КЖ. В лунки микропластин (Linbro 76-033-05
или Costar 3524), содержащие 0,5 мл СКЛ КЖ и 6-10® облученных аллоген-
ных клеток селезенки в 1 мл среды с 2% СЭК, добавляют от 1,6 до 3,2-Ю4
клонированных Т-клеток в 100 мкл среды. Клонированные клетки пассируют
один раз в неделю.
При использовании другого метода пролиферирующие аллореактивные
клетки клонируют в мягком агаре после нескольких последовательных рести-
муляций в СКЛ [43]. Через 24 ч культивирования в последней СКЛ от 3-104
до 4-10® клеток ресуспендируют в 1 мл надосадочной жидкости этой культуры
и смешивают с 2 мл 0,5%-ного раствора агара (Bacto agar, Difco Laboratories)
в том же супернатанте. Эту смесь равномерно наслаивают на фидерный слой из
15 мл 0,5% раствора агара в чашке Петри (Falcon 1005) диаметром 10 см. Спу-
стя неделю на поверхности мягкого агара появляются колонии. Индивидуаль-
ные колонии просматривают под инвертированным микроскопом, извлекают
пастеровской пипеткой и переносят в лунки 96-луночной микропластины
в 0,2 мл свежей среды, содержащие 1-10® облученных аллогенных клеток селе-
зенки на лунку. Клетки из лунок 96-луночной микропластины переносят в лун-
ки 24-луночных микропластин, содержащие 107 облученных аллогенных кле-
ток-стимуляторов в 2 мл среды. Субклонирование таких аллореактивных
клеток проводят в мягком агаре с Кон А КЖ, которую добавляют и в верхний,
и в нижний слой агара в конечной концентрации 20%. Эти клетки можно суб-
клонировать также и методом предельных разведений в 96-луночных микро-
пластинах, содержащих по 1-10® облученных аллогенных клеток селезенки на
лунку, в присутствии 10% Кон А КЖ.
Для получения клонированных клеток, способных расти в присутствии
одного IL-2, суммарную клеточную популяцию необходимо до клонирования
поддерживать в течение двух и более месяцев [29, 43]. Например, для получе-
ния цитолитических Т-клеток, специфичных к гаптен-модифицированным клет-
кам, мышей иммунизируют внутрибрюшинно сингенными клетками селезенки,
модифицированными гаптеном с высокой степенью замещения. Спустя 10 дней
клетки иммунных мышей выделяют и переводят в культуру с облученными гап-
тен-модифицированными сингенными клетками селезенки. Клетки, полученные
после 10-дневной первичной культуры, рекультивируют с начальной плот-
ностью 105 клеток в 1 мл в присутствии Кон А КЖ и пассируют каждые 4—
6 дней в свежей среде с Кон А КЖ. Плотность культуры поддерживают на
уровне от 2-104 до 5-105 клеток/мл. Через два месяца культивирования клетки
304
С. Г. Фэтмен, Ф. В. Фитч
клонируют методом предельных разведений в среде с Кон А КЖ в микропла-
стинах, содержащих по 105 облученных перитонеальных клеток на лунку.
Частота клонов, способных к неограниченному росту в среде, содержащей
IL-2, значительно выше, если клонирование проводят после нескольких меся-
цев культивирования суммарной клеточной популяции. Анализ специфичности
цитолитического действия клонированных клеток, полученных этим способом,
показал, что на самом деле уже такая суммарная популяция становится сама
по себе «клонированной» [38].
30.6. Клонирование мышиных Т-лимфоцитов,
отвечающих на растворимый антиген
Клонирование Т-лимфоцитов, отвечающих на растворимые антигены, про-
водят после сенсибилизации клеток антигеном in vivo [43]. Мышей иммунизи-
руют подкожно в основание хвоста соответствующим количеством антигена
(обычно 100 мкг растворимого белка), эмульгированного в полном адъюванте
Фрейнда [61]. Через 7 дней готовят суспензию клеток паховых и парааорталь-
ных лимфоузлов, затем эти клетки культивируют по 5-10® клеток на лунку
24-луночной пластины в 1,5 мл среды с соответствующим количеством раствор
римого антигена (обычно от 100 до 400 мкг/мл). Спустя 4 дня выделяют живые
клетки и по 1,5-105 Т-клеток переносят в лунки 24-луночных пластин, содержа-
щих по 5-10® облученных сингенных клеток селезенки в 2 мл среды. Через 7—
14 дней 2 • 105 живых клеток рестимулируют антигеном в соответствующей кон-
центрации в присутствии 5-10* облученных сингенных клеток селезенки в лун-
ках 24-луночной пластины в 2 мл среды. Такой цикл стимуляции и пассирова-
ния повторяют четырехкратно. Через 24 ч после последней стимуляции смесь
клеток из лунки смешивают с 0,5%-ным раствором агара (1—2 объема суспен-
зии на 1 объем раствора агара) и наносят на подложку из 0,5% агара. Спустя
7 дней в мягком агаре можно наблюдать колонии, которые затем «выкалы-
вают» и культивируют, как это было описано для аллореактивных клеток.
Для субклонирования в мягком агаре в раствор включают 10 % Кон А КЖ.
При клонировании методом предельного разведения ограниченное число клеток
переносят в среде с 10% Кон А КЖ в лунки 96-луночной пластины, содержа-
щие по 10® облученных сингенных клеток селезенки и антиген в оптимальной
концентрации.
Клеточная пролиферация в ответ на антиген в присутствии соответствую-
щих антиген-презентирующих клеток часто используется как единственный
показатель иммунологической реактивности нецитотоксических клонированных
Т-клеток, специфичных к аллоантигенам или растворимым антигенам. Хелпер-
ная активность или образование лимфокинов может служить другим показа-
телем антиген-специфической реактивности Т-клеточных клонов.
Установлено, что клонированные хелперные Т-клетки поддерживают
специфический антительный ответ при их культивировании с содержащими
Т-лимфрциты сингенными клетками селезенки в бессывороточной среде в при-
сутствии специфического антигена, с которым реагируют клонированные
Т-клетки [62—64]. В ряде случаев наблюдается побочная стимуляция («bystan-
der effect»): Т-хелперные клетки оказывают хелперное действие in vitro на
В-лимфоциты с другой, совершенно посторонней антигенной специфичностью,
но лишь в присутствии обоих антигенов [63, 64]. Показано также хелперное
действие на ЦТЛ-ответ при совместном культивировании клонированных хел-
перных клеток и клонированных ЦТЛ в присутствии аллоантигена [44]. Многие
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток 305
типы функциональной активности опосредуются культуральной средой, полу-
ченной после стимуляции клонированных Т-хелперов специфическим антиге-
ном. Кроме IL-2 в культуральной жидкости были выявлены BCGF [65], колоние-
стимулирующий фактор [48, 66], гамма-интерферон [48, 56, 67], фактор, подав-
ляющий миграцию макрофагов, фактор, индуцирующий экспрессию 1а-молекул
[55], фактор, усиливающий синтез гистамина [68], и фактор, индуцирующий
синтез макрофагами второго и четвертого компонента комплемента [55]. Спектр
лимфокинов, продуцируемых индивидуальными клонами, различен: некоторые
клоны секретируют множество разных факторов, тогда как другие продуци-
руют ограниченный набор лимфокинов [48, 55]. Между видом продуцируемых
лимфокинов и антигенной реактивностью клонированной клетки корреляции,
по-видимому, нет. Как отмечается ниже, некоторые клонированные ЦТЛ так-
же способны продуцировать IL-2 [69].
Для получения клонированных супрессорных клеток было использовано
несколько модификаций метода клонирования. Эти модификации сыграли важ-
ную роль в повышении выхода супрессорных клонов. К настоящему моменту
детально охарактеризован лишь один супрессорный клон [70 ]х. В этой работе
Т-клетки иммунных мышей, выделенные фракционированием на найлоновой
вате, дважды обрабатывали антителами против Lyt-1 и комплементом или
подвергали их положительной селекции на пластиковых чашках, покрытых
антителами против Lyt-2. Затем клетки инкубировали на чашках, предвари-
тельно покрытых специфическим антигеном. После отмывки неприкрепившихся
клеток связавшиеся с чашками клетки снимали энергичным пипетированием
и переносили в лунки 96-луночной микропластины, содержащие монослой об-
лученных филлерных клеток. Клонированные клетки поддерживаются в соот-
ветствующей кондиционированной среде [40]. Эти клонированные супрессор-
ные клетки секретируют белок, специфически подавляющий антительный ответ
на бараньи эритроциты [70]. Белок с мол. массой 70 кДа специфически связы-
вается с бараньими эритроцитами. Такое связывание угнетается гликофори-
ном эритроцитов барана, но не гликофорином эритроцитов животных других
видов. Этот фактор при мягкой обработке папаином дает две субъединицы
с различными биологическими функциями [71]. Клонированные клетки, под-
держиваемые в культуральной среде, содержащей IL-2, постоянно секретируют
этот фактор и, по-видимому, не отвечают на антигенную стимуляцию.
30.7 Клонирование человеческих аллореактивных
Т-лимфоцитов
По методу, описанному Бахом и др. [72, 73], для получения аллореактив-
ных Т-клеток человека выделяют популяцию мононуклеарных клеток перифе-
рической крови в градиенте плотности фиколл-гипак. Перед клонированием
клетки активируют в реакции СКЛ: 5-106 отвечающих клеток и 5-106 клеток-
стимуляторов (4000 рад) в 10 мл среды. Через 4 дня методом «1-g» седиментации
[74] выделяют бластные клетки. Эти клетки клонируют методом лимитирующих
разведений в микропластинах Терасаки (с плотностью 0,2 клетки на лунку)
в присутствии 1-104 облученных фидерных клеток в 15 мкл IL-2, полученного
при стимуляции фитогемагглютинином лимфоцитов периферической крови
человека [36]. Рост клонов обычно отмечается на 11-й день.
1 В последние годы получен ряд хорошо охарактеризованных супрессорных Т-кло-
нов. — Прим, перев.
306
С. Г. Фэпгмен, Ф. В. Фитч
Из микропластин Терасаки клетки переносят с помощью автоматической
пипетки на 20 мкл в U-образные 96-луночные микропластины, содержащие по
200 мкл среды с человеческим IL-2 и 5-Ю4 облученных фидерных клеток. Среду
меняют через день, а свежие фидерные клетки добавляют каждые шесть дней.
Клоны наращивают в лунках 24-луночных пластин, содержащих (5—10)-105
облученных (4000 рад) лимфоцитов периферической крови в 1 мл среды с чело-
веческим IL-2. Клетки пассируют каждые 7 дней. Таким способом могут быть
получены как цитолитические, так и пролиферирующие аллореактивные
клетки.
Процедура, описанная Маллисеном и др. [75, 76], в принципе подобна опи-
санной выше. В качестве источника IL-2 используются клетки миндалин, сти-
мулированные лейкоагглютинином (Leucoa, Pharmacia, Швеция). После пер-
вичной СКЛ или после повторной стимуляции во вторичной СКЛ клетки кло-
нируют методом лимитирующих разведений в 96-луночных пластинах, содер-
жащих 5 • 104 облученных (4000 рад) аутологичных лимфоцитов периферической
крови и лейкоагглютинин (1 мкг/мл). Клонированные клетки наращивают
в среде, содержащей IL-2 или лейкоагглютинин и лимфоциты периферической
крови в качестве фидерных клеток. Так были получены и пролиферирующие
и цитолитические клоны. По-видимому, стабильность цитолитической актив-
ности клонов выше при клонировании клеток, которые были получены от
индивидов, гипериммунизированных ранее против аллоантигенов клеток-сти-
муляторов [76].
30.8. Клонирование человеческих Т-лимфоцитов,
отвечающих на растворимые антигены
Методы, подобные использованным для получения мышиных антиген-реак-
тивных клонов, оказались эффективными и при получении человеческих лим-
фоцитов [77]. В этом случае суммарную популяцию мононуклеарных клеток
периферической крови индивидов, иммунизированных ранее, стимулируют
соответствующим антигеном in vitro в течение пяти дней. Затем клетки высе-
вают в мягкий агар, который содержит стимулирующий антиген в нужной кон-
центрации. Клоны наращивают в среде, содержащей человеческий IL-2. Рекло-
нирование проводят в мягком агаре, содержащем человеческий IL-2.
30.9. Слияние клеток как способ получения
длительно растущих Т-лимфоцитов
Впервые успешное слияние функциональных Т-лимфоцитов и Т-клеточной
тимомы осуществили Танигучи и Миллер в 1978 г. [7]. Эти авторы использо-
вали преимущества двух процедур отбора, что повысило вероятность получения
ими супрессорной Т-клеточной гибридомы. Сначала они отбирали антигенсвя-
зывающие клетки селезенки мышей с индуцированной ранее толерантностью
к человеческому гамма-глобулину (ЧГГ) на чашках, покрытых ЧГГ. Затем
с помощью лазерного сортировщика клеток они отобрали те гибридные клетки,
которые окрашиваются антителами против продуктов субобласти I-J главного
комплекса гистосовместимости (МНС) мыши. В последующих экспериментах
по Т-Т-гибридизации эти подходы использовались во многих лабораториях.
При работе с Т-клеточными гибридомами основная трудность связана с их
функциональной нестабильностью, Которая многократно отмечалась наиболее
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток
307
опытными исследователями. Эту нестабильность объясняют потерей хромосом.
Для сохранения функциональной активности можно реклонировать клетки,
хотя это и трудоемкое дело. Все это накладывает ограничения на работу
с Т-клеточными гибридомами и в настоящее время служит камнем преткнове-
ния для многих исследователей.
Метод, описанный в предыдущих разделах, позволил ряду исследователей
из нескольких лабораторий независимо выделить и поддерживать долгосрочные
культуры иммунокомпетентных Т-лимфоцитов. Главный недостаток этих мето-
дов связан с необходимостью постоянной рестимуляции и тщательной проверки
характеристик культуры для поддержания «нормальных» Т-клеточных линий
в течение длительного периода. Для того, чтобы преодолеть трудности, связан-
ные с длительным культивированием клонов Т-лимфоцитов, некоторые иссле-
дователи обратились к технике слияния соматических клеток, которая рассмат-
ривалась ранее в гл. 28 в связи с получением гибридом, продуцирующих моно-
клональные антитела. Метод слияния Т-лимфоцитов с линией клеток тимомы,
несущей метаболический маркер устойчивости к 6-тиогуанину, подобен изящ-
ной процедуре, которую впервые использовали Кёлер и Милыптейн [781] для
слияния В-лимфоцитов с миеломной линией клеток, несущей метаболический
маркер устойчивости к 8-азагуанину. Детальное описание метода Т-Т-гибриди-
зации можно найти в других работах [8, 9].
Для получения Т-клеточных гибридомных клеток примерно 108 активи-
рованных антигеном Т-лимфоцитов (с супрессорной или хелперной функцией)
и 107 клеток BW 5147 (лишенной гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфе-
разы линии тимомы мышей AKR, полученной доктором Р. Химэном) дважды
отмывают бессывороточным сбалансированным солевым раствором (СбСР)
Хэнкса. Затем клетки центрифугируют при 400 g, надосадочную жидкость уда-
ляют и к осадку в течение 2 мин добавляют по каплям 0,5 мл 50 %-ного раствора
полиэтиленгликоля (ПЭГ, мол. масса 1500) в СбСР, pH 7,8. При этом клетки мяг-
ко перемешивают. Затем так же, по каплям, к клеткам добавляют 0,5 мл бес-
сывороточного СбСР, потом еще 5 мл и, наконец, объем пробирки с клетками
доводят СбСР до 20 мл. Клетки центрифугируют при 400 g, надосадочную жид-
кость удаляют, клеточный осадок ресуспендируют в 100 мл МДСИ с 20% ЭТС
и по 2 мл клеточной суспензии рассевают в каждую лунку 48-луночных пластин
(Linbro). Приблизительно через 24 ч после слияния из лунок отбирают по 1 мл
МДСИ с 20% ЭТС и добавляют 1 мл среды, содержащей гипоксантин, аминоп-
терин и тимидин (ГАТ) (МДСИ, 20% ЭТС, 1,1-10~4 М гипоксантина, 1,6-10_3 М
тимидина и 4-10"7 М аминоптерина). В течение следующих двух дней эту
процедуру повторяют. На 6-, 8- и 10-й день вместо ГАТ-среды добавляют
ГТ-среду (МДСИ, 20% ЭТС, 1,1-10_4М гипоксантина и 1,6-10_5М тимидина).
Затем, начиная с 12—13-го дня, клетки постепенно переводят на МДСИ с 10%
ЭТС, заменяя каждые три дня по 1 мл надосадочной жидкости на 1 мл свежей
МДСИ с 10% ЭТС. Клетки из лунок, в которых через 1—3 недели после рассева
отмечается рост, можно рассеять в другие лунки и перенести в маленькие
культуральные флаконы. В отобранных пробах надосадочной жидкости можно
затем исследовать функциональную активность, характеризующую исходные
Т-лимфоциты, участвовавшие в слиянии с BW5147.
Такие линии Т-клеточных гибридом легко поддерживаются простой под-
кормкой через каждые три дня при условии, что максимальная плотность не
будет превышать 1-10® клеток на 1 мл среды. Эти клетки можно замораживать
и хранить неограниченно долгое время в жидком азоте. Клетки надо заморажи-
вать следующим образом: клетки центрифугируют при 170 g в течение 10 мин
при 4 °C и осадок ресуспендируют в 1 мл среды для замораживания (МДСИ,
308
С. Г. Фэтмен, Ф. В. Фитч
20% ЭТС, 10% ДМСО). Все манипуляции с клетками в среде для заморажива-
ния проводят на льду (4°С). Клетки замораживают в пластиковых ампулах,
которые помещают в коробки из пенопласта и оставляют на ночь в низкотем-
пературном холодильнике при —70 °C. В этих условиях замораживание про-
исходит со скоростью примерно 1 °С/мин. На следующий день клетки можно
перенести в жидкий азот. При размораживании клетки оттаивают в водяной
бане при 37 °C. С исчезновением последнего кристаллика льда клеточйую
суспензию разводят в 10 раз добавлением холодной МДСИ (4 °C), содержащей
20% ЭТС. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 15 мл МДСИ
с 10% ЭТС и переводят в культуру.
С помощью техники слияния BW5147 с иммунными Т-лимфоцитами раз-
личного происхождения были получены гибридные клетки, секретирующие
практически все биологически активные лимфокины. Особый интерес представ-
ляет большая группа данных, свидетельствующая об успешном использовании
этой технологии для получения антиген-специфических супрессорных Т-кле-
точных гибридом [8, 9, 79—84], цитотоксических гибридом [85, 86,], гибридом,
секретирующих лимфокины, одного или более типов, и гибридом с функцией
хелперных Т-лимфоцитов [87 , 88]. Преимущество этой техники перед получе-
нием и культивированием клонированных Т-лимфоцитов связано с относитель-
ной простотой наработки большого количества клеток и (или) биологически
активных продуктов таких клеток.
Одну из наиболее изученных систем антиген-специфических факторов су-
прессорных Т-клеток, полученных с помощью слияния антиген-специфических
Т-супрессоров и тимомы, описали Кэпп и др. [84]. Эти авторы получили свои
гибридомы при слиянии тимомы ВW 5147 и Т-клеток селезенки мышей DBA/1,
которых иммунизировали полипептидом (глутаминовая кислота, аланин, ти-
розин) (ГАТ). Гибридомы отбирали, определяя в биологическом эксперименте
конститутивный синтез Г АТ-специфического Т-супрессорного фактора. С по-
мощью такого подхода авторам удалось выделить несколько гибридом с консти-
тутивной секрецией антиген-специфических супрессорных факторов. Недавно
они описали моноклональный супрессорный фактор Т-клеточного происхож-
дения, продуцируемый Т-гибридомой 258.С4.4; этот фактор очищен до гомоген-
ности [89].
Другой пример изящного использования технологии Т-клеточной гибри-
дизации представляют исследования Кэпплера и др. [9]. Эти исследователи ис-
пользовали Т-клеточные гибридомы для изучения свойств «неуловимого» ан-
тиген-специфического рецептора Т-лимфоцитов \ Они создавали гибридомы
для получения клонированных клеток, одновременно экспрессирующих две
разные антигенные специфичности и две разные рестрикционные детерминанты
1-района. Это позволило авторам проверить две основные теории, касающиеся
одновременно распознавания антигена и продуктов области I. Теории «двух
рецепторов», обсуждавшиеся ранее (гл. 11), постулируют наличие рецепторов,
независимо распознающих на клеточной поверхности антиген и продукты об-
ласти I. Из этого следует, что слившаяся клетка, которая унаследовала две
различные антигенные специфичности и две I-рестрикционные специфичности,
должна распознавать любые комбинации двух антигенов и двух рестриктирую-
щих элементов. Теории «одного рецептора», в отличие от этого, предсказывают,
1 В настоящее время структурная и генетическая организация Т-клеточного рецеп-
тора уже установлена в результате работ ряда авторов (см. примеч. на стр. 35), в том числе
дальнейших исследований данной экспериментальной системы.— Прим, перее.
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток
309
что гибрид, полученный в результате такого слияния, не будет распознавать
смешанные комбинации антигенов и продуктов области I. Полученные авто-
рами результаты свидетельствуют против теории «двух рецепторов» в ее строгой
интерпретации, поскольку при слияниях не было обнаружено гибридом, рас-
познающих «смешанные» пары антиген—молекула 1а.
30.10. Длительное культивирование и клонирование
В-лимфоцитов
В предыдущих разделах этой главы подробно рассмотрены выделение,
наращивание и характеристика клонов Т-лимфоцитов. Позднее были предпри-
няты попытки клонировать В-лимфоциты и поддерживать их в длительных
культурах. Длительно культивируемые нетрансформированные В-лимфоциты
нужны не для изучения основного продукта плазматических клеток, иммуно-
глобулинов, а для анализа клеточных и молекулярных механизмов, контроли-
рующих активацию, пролиферацию, дифференцировку и индукцию толерант-
ности у нормальных В-лимфоцитов. В литературе появилось несколько сооб-
щений об успешном получении колоний мышиных и человеческих В-лимфоци-
тов в мягком агаре при использовании для стимуляции клеток митогенов или
Т-клеточных факторов. Лишь в самое последнее время исследователям удалось
нарастить и клонировать потомство колоний человеческих В-лимфоцитов;
мышиные В-клеткине удалось размножить из В-клеточных колоний. Длитель-
ное поддержание в культуре нетрансформированных вирусом Эпштейна—
Барр В-лимфоцитов из отдельных колоний остается до сих пор сложной про-
цедурой и критические условия для поддержания роста клеток до конца не
установлены. Для детального знакомства с этой проблемой читателю следует
обратиться к работе Средни и др. [90].
Альтернативный подход к получению В-клеточных линий заключается
в культивировании суммарной популяции В-лимфоцитов в течение длительного
времени [91]. Некоторый успех был достигнут при культивировании высоко
очищенных мышиных В-лимфоцитов в присутствии липополисахарида (ЛПС)
в течение 1—4 недель с последующим поддержанием в кондиционированной
среде, содержащей ростовой фактор из культуральной жидкости, стимулирован-
ных ФМА клеток EL-4. Такие В-клеточные линии ведут, добавляя каждые
три дня свежую кондиционированную среду, и поддерживают в культуре до
10 мес. Клетки растут довольно медленно, и в культуре отмечается значитель-
ная их гибель.
Секрецию иммуноглобулинов можно индуцировать как у человеческих
В-клеточных линий, полученных из колоний в мягком агаре, так и у мышиных
В-клеточных линий, полученных из стимулированных ЛПС исходных культур,
в присутствии супернатантов, содержащих факторы, замещающие Т-клетки
(ТЗФ, TRF) или факторы дифференцировки [90, 91].
Описанный выше метод получения В-клеточных линий не годится для по-
лучения гомогенных В-клеток с целью детального функционального анализа.
По-видимому, дальнейший прогресс в этой области будет зависеть от более
точного знания ростовых и дифференцировочных факторов, действующих на
В-лимфоциты, а также от возможности получить такие факторы для рутинного
использования. В настоящее время установлено, что BCGF — это какой-то
фактор, отличный от IL-2; кроме того, достигнуты значительные успехи в изу-
чении свойств дифференцировочных факторов [93].
310
С. Г. Фэтмен, Ф. В. Фитч
30.11. Длительное культивирование и клонирование
других иммунокомпетентных клеток
Недавние работы показали, что использование методов, подобных тем,
которые успешно применялись для культивирования Т-клеток, позволяет
получить долгосрочные линии природных киллеров (ПК, NK). Так были полу-
чены клоны мышиных [94—96] и человеческих [97, 98] клеток, обладающих
ПК-подобной активностью. Природные киллеры представляют собой популя-
цию цитотоксических клеток, которые не нуждаются в антигенной стимуляции
для проявления цитолитической активности. Эти клетки были выявлены по их
способности лизировать различные опухолевые клетки, при том что они пред-
ставлены у нормальных неиммунных животных. Одним из ервых свидетельств,
которое указывало на возможность культивирования и клонирования природ-
ных киллеров, были данные о способности супернатантов стимулированных
Кон А клеток селезенки крыс поддерживать в культуре клетки селезенки бес-
тимусных мышей BALB/c nu/nu. При этом у клеток сохраняется цитотоксиче-
ская активность по отношению к ПК-чувствительным клеткам-мишеням YAC-1
на уровне, одинаковом с активностью свежевыделенных клеток селезенки
BALB/c nu/nu. ПК-активность значительно повышалась в течение первых
2—4 недель культивирования в кондиционированной среде, что указывает на
преимущественную пролиферацию и селекцию ПК-клеток из суммарной по-
пуляции селезеночных клеток BALB/c nu/nu. Характерно, что гетерогенная
популяция ПК-клеток вызывает лизис широкой панели ПК-чувствительных
мишеней. Один из самых давних вопросов, изучавшихся с помощью гомогенных
клонированных популяций ПК-подобных клеток, касался клонального распре-
деления рецепторов к ПК-мишеням. Исходные исследования показали, что ли-
нии ПК-клеток, полученные при клонировании методом лимитирующих разве-
дений, обладают специфичностью, не отличающейся принципиально от специ-
фичности родительских линий или свежевыделенных клеток селезенки. Из
этих результатов неясно, распознают ли ПК-клетки структуру, общую для всех
ПК-чувствительных мишеней, или они обладают множественными рецепторами
с разной специфичностью. Поскольку пролиферация ПК-клеток зависит от
лимфокинов, по всей вероятности, на клеточной поверхности ПК должны быть
представлены рецепторы к лимфокинам. Пока до конца неясно, какой (какие)
из лимфокинов, присутствующих в препаратах культуральной жидкости акти-
вированных митогеном клеток селезенки, определяет пролиферацию ПК-кле-
ток. Тем не менее в настоящее время можно поддерживать долгосрочные линии
ПК-клеток и выделять функциональные гомогенные популяции ПК-«клонов»,
исследования которых позволят ответить на ранее поставленные вопросы о
функции и специфичности ПК-клеток.
30.12. Исключительная роль исследований Т-клеточных
клонов в формировании иммунологических концепций
Один из основных постулатов клонально-селекционной теории состоит
в том, что антиген-специфические клетки-предшественники несут распознаю-
щие структуры, направленные против одной антигенной детерминанты. Дока-
зательства клонально-селекционной теории были получены на уровне В-кле-
точного ответа. В настоящее время во многих лабораториях получены Т-клеточ-
ные клоны со специфической функциональной активностью. Такие клониро-
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток
311
ванные Т-клетки позволили окончательно решить ряд иммунологических
проблем, которые не могли быть адекватно исследованы другими способами.
Среди них проблемы разнообразия Т-клеточного репертуара, механизмов Т-кле-
точной активации, выявления взаимодействий Т-лимфоцитов и других иммуно-
компетентных клеток, специфичности Т-хелперных клеток, необходимых для
переключения синтеза 1g разных изотипов при дифференцировке различных
субпопуляций В-лимфоцитов в антителообразующие клетки, а также вопрос
о существовании антиген-специфических иммунорегуляторных молекул, про-
дуцируемых клонированными Т-клетками. К сожалению, до сих пор нет удов-
летворительного ответа на наиболее важный вопрос о клональной селекции
антиген-распознающих структур на поверхности Т-лимфоцитов, специфичных
к одной антигенной детерминанте.
Рассмотрим вкратце; что дало получение и использование клонов антиген-
реактивных Т-клеток. Во-первых, это данные о широком репертуаре цитолити-
ческих Т-лимфоцитов. В основе ранних оценок репертуара лежал анализ рас-
пределения цитолитической активности клонов ЦТЛ, селектированных по их
способности лизировать Н-2а-положительные клетки-мишени [50]. При анализе
цитолитического ответа 9 разных клонов ЦТЛ на 11 различных видах клеток-
мишеней было выявлено по крайней мере 8 различных типов реактивности. Это
указывает на то, что репертуар специфичности Т-лимфоцитов действительно
велик.
Наиболее четкие результаты получил Шерман [99], исследовавший ответ
мышей B10.D2 (H-2d) на аллоантигены Н-2КЬ [99]. В этих опытах клетки селе-
зенки мышей B10.D2 культивировали с клетками-стимуляторами В10.А (5R),
чтобы ответ был направлен только против молекулы Н-2КЬ. Клоны были полу-
чены методом предельных разведений, а их цитолитическую активность оцени-
вали с помощью клеток-мишеней мышей семи линий, несущих различные му-
тации молекулы Н-2КЬ [99]. Исходя из числа антиген-специфических клонов,
полученных от семи индивидуальных животных, количество уникальных ре-
цепторных специфичностей было оценено равным минимум 50. В дальнейших
опытах Шерман показал, что две конгенные линии мышей, различающиеся
только по МНС, значительно различаются репертуаром ЦТЛ, специфичных
к молекуле Н-2КЬ [100]. Каждая линия обладает определенным набором спе-
цифичностей, который встречается у индивидуальных животных с большей
частотой по сравнению с частотой, ожидаемой при случайном распределении.
Немалый интерес представляет тот факт, что гибриды Fj этих линий характери-
зуются несколькими часто встречающимися типами специфичности, не выяв-
ляемыми у мышей родительских линий [100].
Чужеродные антигенные детерминанты, в формировании которых участ-
вуют гаптены или вирусы, распознаются ЦТЛ в сочетании с собственными ан-
тигенами главного комплекса гистосовместимости клеток-стимуляторов. Не-
которые свойства такого МНС-рестриктированного распознавания антигенов
были выяснены в исследованиях с использованием клонированных ЦТЛ. Пер-
воначальное сообщение о длительном культивировании ЦТЛ казалось бы ука-
зывало на то, что распознавание ассоциированных с вирусом опухолевых
антигенов может быть не рестриктировано по МНС [27], поскольку две линии
Т-клеток лизировали как сингенные, так и аллогенные лейкемические клетки-
мишени, индуцированные вирусом лейкемии Френд (ВЛФ). Однако при кло-
нировании, проведенном через 14 мес после начала культивирования, обнару-
7килось несколько типов специфичности цитотоксического действия полученных
клонов ЦТЛ. Оказалось, что некоторые клоны лизируют только аллогенные
клетки-мишени, которые не экспрессируют ВЛФ-ассоциированные антигены,
312
С. Г. фэтмен, ф. В. Фитч
другие лизируют преимущественно сингенные опухолевые клетки-мишени, а
часть клонов лизирует с равной эффективностью как сингенные опухолевые
клетки-мишени, так и аллогенные мишени, не экспрессирующие ВЛФ-ассоции-
рованных антигенов, а часть клонов вообще не обладает литической актив-
ностью. Эти результаты свидетельствуют скорее всего не о вырожденности
МНС-рестриктированного распознавания антигенов, а о том, что одной и той же
клонированной клеткой могут распознаваться антигенные специфичности, ал-
лоантиген и вирусные антигены, экспрессированные на сингенных клетках.
Частота Т-клеток, распознающих и отвечающих на антигены главного ком-
плекса гистосовместимости других представителей данного вида, необычайно
высока [103]. Взаимоотношения Т-клеток, отвечающих на аллоантигены, и
Т-клеток, отвечающих на «обычные» или растворимые антигены, неясны. Ранее
многие исследователи предполагали, что поскольку частота аллореактивных
клеток так высока, а разнообразие антигенов, которые должны распознавать
Т-лимфоциты, огромно, то эти субпопуляции должны перекрываться [104].
Другими словами, все Т-клетки, распознающие «обычные» антигены, должны
распознавать по меньшей мере один аллоантиген. Как указывалось выше,
при исследовании клонов ЦТЛ было показано, что одна и та же Т-клетка может
быть специфична к аллоантигену и к другому чужеродному антигену [105].
Недавние работы Средни и Шварца [106] свидетельствуют о том, что антиген-
специфические пролиферирующие Т-клетки также характеризуются аллореак-
тивностью. Из высокой частоты Т-клеточных клонов, которые обладают анти-
генной специфичностью в сочетании с аллореактивностью, следует, что проли-
ферирующие Т-клетки, распознающие «обычный» антиген, должны распозна-
вать также и аллоантиген. Можно надеяться, что исследования Т-клеточных
клонов помогут решить возникающий в связи с этими данными вопрос о воз-
можной экспрессии одним Т-клеточным клоном двух независимых рецепторов,
один из которых распознает «обычный» антиген, а другой — аллоантиген. От-
личное от случайного распределение аллореактивности среди Т-клеточных
клонов, отмечавшееся этими исследователями, свидетельствует о связи анти-
генной специфичности и аллоантигенной специфичности. Однако это еще не
значит, что у Т-лимфоцита имеется лишь один рецептор, и пока не будут про-
ведены молекулярно-генетические исследования Т-клеточных рецепторов, спе-
цифичных к антигену и к аллоантигену, проблема останется нерешенной.
Описаны и другие примеры двойного антигенного распознавания клонами
ЦТЛ. Например, 1) распознавание антигена Н-Y и аллоантигена [105], 2) ан-
тигена, ассоциированного с вирусом лейкемии Молони, и аллоантигена [107,
108], 3) антигена вируса гриппа А и аллоантигена [109, 110]. ЦТЛ, отвечающие
на модифицированные гаптеном сингенные клетки, также могут обладать раз-
ными видами перекрестной реактивности [38].
В совокупности эти результаты свидетельствуют о большей гетерогенности
распознавания антигенов цитотоксическими и пролиферирующими антиген-
реактивными Т-лимфоцитами, чем это следует из данных, полученных в обыч-
ных системах анализа. Ответ Т-клеток более чем на одну антигенную детерми-
нанту встречается настолько часто, что его следует считать правилом, а не
исключением.
Оказалось, что цитолитические клоны можно также использовать для выяс-
нения функциональной роли определенных поверхностных молекул клеток.
Было показано, что все клонированные ЦТЛ, взаимодействующие со специфиче-
скими клетками-мишенями, несут молекулы Lyt-2. Обычно литическая актив-
ность клонированных ЦТЛ подавляется антителами к Lyt-2 [111], однако в
уровне угнетения разных клонов наблюдаются различия. Клоны клеток, по-
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток
313
лученные после иммунизации in vivo, менее подвержены угнетению [112]. Для
определения функции поверхностных молекул вариантные клоны ЦТЛ оказа-
лись также полезны [113]. Так, вариантные клетки клона, утратившие Lyt-2,
теряли цитолитическую активность по отношению к специфическим клеткам-
мишеням, но сохраняли активность в системе цитолиза, опосредованного лек-
тином [113]. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что Lyt-2-поверхностный
антиген, по-видимому, участвует в связывании эффекторного ЦТЛ с клеткой-
мишенью, но не вовлечен прямо в литическую активность.
Эти данные в сочетании с наблюдениями о том, что молекулы Lyt-2, выде-
ленные из клонов ЦТЛ, обладают одинаковой подвижностью при анализе ме-
тодом двумерного электрофореза (М. Sarmiento, личное сообщение), указывают
на то, что, по всей вероятности, молекула Lyt-2 не является Т-клеточным ре-
цептором к антигену.
Хотя большинство цитотоксических Т-лимфоцитов нуждается для роста
в IL-2 и не пролиферирует в культуре в ответ на специфический аллоантиген,
небольшая часть ЦТЛ представляет исключение из этого правила. Некоторые
ЦТЛ способны пролиферировать при культивировании в присутствии стимули-
рующего аллоантигена [114, 115] и секретировать определенное количество
IL-2. Клональная природа по меньшей мере части этих ЦТЛ доказана, посколь-
ку они были получены в серии последовательных клонирований с помощью
микроманипулятора [69]. Такие клоны относительно редки (менее 10% от всех
клонов ЦТЛ); с большей частотой они встречаются среди Т-клеток, реагирую-
щих на аллоантигены областей К и D.
Второй важной областью применения Т-клеточных клонов являются
исследования механизмов Т-клеточной активации. Если принять несколько
условное определение генов 1г, как генетически обусловленной способности
иммунных Т-лимфоцитов отвечать на антиген, то очевидно, что именно Т-клетки
доказывают, что молекулы 1а являются продуктами генов 1г [116]. В основу
этих исследований легло использование Т-клеточных клонов, пролиферирую-
щих в ответ на обычный антиген. Такие клоны распознают антиген в сочетании
с продуктами области I [116, 117]. Генетические исследования показали, что
продукты генов 1г во всевозможных комбинациях могут служить рестрикти-
рующими элементами при презентации антигена антиген-специфическим Т-кле-
точным клонам, полученным от животных Ft. При этом могут распознаваться
не только комбинации различных продуктов области I-A, но рестриктирующие
молекулы могут формироваться и в результате комбинаторной ассоциации а-цепи
(Еа), кодируемой в субобласти I-Е, и 0-цепи (Ер), кодируемой в субобласти
I-A МНС [118]. Взаимосвязь молекул I-A и антиген-реактивных Т-лимфоцитов
сама по себе не доказывает того, что молекулы I-A представляют собой продукты
генов 1г.
В двух разных направлениях исследований были получены более веские
доводы в пользу не только ассоциации, но и идентичности этих двух структур.
Первым таким направлением является исследование с использованием моно-
клональных анти-1 а-антител, эффективно блокирующих способность опреде-
ленных антиген-реактивных Т-клеточных клонов отвечать на соответствующие
антигены [119, 120]. Это подавление строго специфично. Антиген-презентирую-
щая клетка (АПК) Fj экспрессирует на своей поверхности набор молекул 1а.
Используя моноклональные анти-1 а-антитела, можно избирательно блокиро-
вать данную молекулу 1а и выявить Т-клеточный клон, который использует для
сочетанного распознавания антигена именно эту молекулу la. С помощью
моноклональных анти-1 а-антител можно специфически отменять ответ ряда
клонов, распознающих одну и ту же молекулу 1а на поверхности АПК, не влияя
314
С. Г. Фэтмен, ф. В. Фитч
при этом на способность тех же АПК презентировать тот же самый антиген
другим Т-клеточным клонам, рестриктирующим элементом которых служит
другая молекула 1а [119]. Вторая группа данных, поддерживающих гипотезу
об идентичности молекул 1а и продуктов генов 1г, получена в исследованиях
с использованием мутантной линии мышей B6.C-Hbm12 (bm.12). Мыши этой
линии, которая впервые была выведена в лаборатории Роджера Мелволда, не-
сут мутацию 0-цепи продукта гена 1-Аь [121]. Исследования на гибридах Fj,
полученных при скрещивании мышей линии А и мутантов Ьт12, убедительно
показали, что молекула 1а является продуктом гена 1г [116]. Эти выводы не-
давно были подтверждены и дополнены результатами сравнительного анализа
ответа мутантов Ьт12 и мышей дикого типа В6 на некоторые антигены. Данные
работы отчетливо показали, что у мышей Ьт12 часть иммунореактивности, свой-
ственной родительской линии В6, сохраняется, а часть утрачивается. По сути
дела мыши приобретают новый спектр иммунореактивности А
Использование Т-клеточных клонов привело к значительным успехам
и в изучении взаимодействий Т-лимфоцитов с другими иммунокомпетентными
клетками, позволив исследователям анализировать передачу сигнала между
отдельными клетками, а не среди клеток. Эти исследования однозначно показа-
ли необходимость ряда лимфокинов для запуска пролиферации и последующих
взаимодействий иммунокомпетентных клеток. Т-клеточные клоны стали основ-
ным источником для выделения и изучения антиген-специфических факторов.
Исследования Кантора и сотр. [40, 70] убедительно продемонстрировали, что
мышиные Т-клеточные клоны с супрессорным фенотипом экспрессируют и либо
секретируют, либо сбрасывают антиген-специфический супрессорный фактор.
Начальные исследования антиген-специфических супрессорных продуктов, об-
разуемых такими Т-клеточными клонами, оказались весьма информативными
и указали на существование нескольких разных типов супрессорных антиген-
специфических факторов.
В недавней работе Сингера и др. было установлено, что один и тот же хел-
перный Т-клеточный клон способен двумя независимыми способами «помогать»
созреванию В-клеток в антителообразующие клетки [64]. Вкратце эти иссле-
дования показали, что Т-клеточный клон, отвечающий на гемоцианин в присут-
ствии высоких концентраций динитрофенил(ДНФ)-гемоцианина, преимущест-
венно индуцирует анти-ДНФ-1§М-ответ В-лимфоцитов Lyb-5+. Для антитель-
ного ответа этой субпопуляции В-лимфоцитов необходимо совпадение по рай-
ону I между Т-лимфоцитом и антиген-презентирующей клеткой, но не требуется
ни совпадения по МНС между Т- и В-лимфоцитом, ни наличия ковалентной
связи между гаптеном, ДНФ и гемоцианином. Тот же самый Т-клеточный клон
при стимуляции низкими дозами конъюгата ДНФ-гемоцианина индуцирует
дифференцировку стимулированных гаптеном В-лимфоцитов Lyb-5- в IgG-сек-
ретирующие клетки. Этот ответ рестриктирован по МНС на уровне Т-В-клеточ-
ного взаимодействия, и в этом случае необходима ковалентная связь гаптена
ДНФ с носителем, гемоцианином.
И наконец, во многих лабораториях, в которых используются Т-клоны,
исследуется Т-клеточный рецептор к антигену. Современные данные указывают
на то, что аллореактивные мышиные Т-клеточные клоны несут уникальные идио-
типические поверхностные структуры [122, 123]. Хотя пока неясно, имеют ли
эти идиотипические структуры отношение к Т-клеточному рецептору-, очевидно,
что сейчас уже существует методический подход к выделению и характеристике
1 Более подробно об этих работах см. гл. 16. — Прим, перев.
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток
315
клонотипических поверхностных структур мышиных Т-лимфоцитов \ Одним
из главных достижений молекулярной генетики является выделение и харак-
теристика антиген-специфического Т-клеточного рецептора. Возможно, что
к моменту выхода в свет следующего издания этой книги можно будет написать
исчерпывающий раздел, посвященный молекулярной генетике антиген-специ-
фического рецептора Т-лимфоцитов. Очевидно, что в настоящее время у нас
нет ясного представления даже о числе рецепторов на одну Т-клетку, не говоря
уже о молекулярных характеристиках этих структур 1 2.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gillis S., Scheid М., Watson J. The biochemical and biological characterization of lympho-
cyte regulatory molecules. III. The isolation and phenotypic characterization of Inter-
leukin 2 producing T cell lymphomas, J. Immunol., 125, 2570 (1980).
2. Farrar J. J., Fuller-Farrar J., Simon P. L., Hllfiker M. L., Stadler В. M., Farrar W. L.
Thymoma production of T cell growth factor (Interleukin 2), J. Immunol., 125, 2555 (1980).
3. Finn O. J., Boniver J., Kaplan H. S. Induction, establishment in vitro and characterizat-
ion of functional antigen-specific, carrier-primed murine T-cell lymphomas, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 76, 4033 (1979).
4. Bicciardi-Castagnoli P., Doria G., Adorini L. Production of antigen-specific suppressive T
cell factor by radiation leukemia virus-transformed suppressor T cells, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 78, 3804 (1981).
5. Harwell L., Skidmore B., Marrack P., Kappler J. W. Goncanavalin A-inducible inter-
leukin-2-producing T cell hybridomas, J. Exp. Med., 153, 893 (1980).
6. Taussig M. J., Corvalan J. R. F., Binns R. M., Holliman A. Production of an H-2 related
suppressor factor by a hybrid T-cell line, Nature, 277, 305 (1979).
7. Tanaguchi M., Miller J. F. A. P. Specific suppressive factors produced by hybridomas
derived from the fusion of enriched suppressor T-cells and a T lymphoma cell line, J. Exp.
Med., 148, 373 (1978).
8. Kontiainen S., Simpson E., Bohrer E., Beverley P. C. L., Herzenberg L. A., Fitzpat-
rick W. C., Vogt P., Torano A., McKenzie I. F. C., Feldmann M. T-cell lines producing
antigen-specific suppressor factor, Nature, 274, 477 (1978).
9. Kappler J. W., Skidmore B., White J., Marrack P. Antigen-inducible H-2 restricted, in-
terleukin-2-producing T cell hybridomas. Lack of independent antigen and H-2 recognit-
ion, J. Exp. Med., 153, 1198 (1981).
10. Pacifico A., Capra J. D. T cell hybrids with arsonate specificity. I. Initial characterizat-
ion of antigen-specific T cell products that bear a cross-reactive idiotype and determinants
encoded by the murine major histocompatibility complex, J. Exp. Med., 152, 1289 (1980).
11. Clark A. F., Capra J. D. Ubiquitous nonimmunoglobulin p-azobenzene-arsonate-binding
molecules from lymphoid cells, J. Exp. Med., 155, 611 (1982).
12. Taussig M., Holliman A., Wright L. J. Hybridization between T and В lymphoma cell
lines, Immunology, 39, 57 (1980).
13. Trowell O. A. The lymphocyte, Int. Rev. Gytol., 7, 235 (1958).
14. Nowell P. C. Phytohemagglutinin: An initiator of mitosis in cultures of normal human
leucocytes, Cancer Res., 20, 462 (1960).
15. Bach F. H., Hirschhorn K. Lymphocyte interaction: A potential histocompatibility test in
vitro, Science, 143, 813 (1964).
16. Bain B., Vaz M. R., Lowenstein L. The development of large immature mononuclear cells
in mixed lymphocyte cultures, Blood, 23, 108 (1964).
17. Hayry P., Defendi V. Mixed lymphocyte cultures produce effector cells: model in vitro
for allograft rejection, Science, 168, 133 (1970).
1 Этот подход, связанный с получением антиклонотипических антител, обеспечил
успешное выделение и характеристику рецепторов клонов человеческих и мышиных Т-лим-
фоцитов.— Прим, перев.
2 В настоящее время происходит подлинная революция в области исследований Т-кле-
точного рецептора, в периодической литературе появляется огромное количество работ,
посвященных структуре, молекулярно-генетической организации и экспрессии рецептора
в ходе дифференцировки и т. д. Для знакомства с этими данными читателю можно поре-
комендовать обзорные работы в сборниках Annual Reviews in Immunology, 1984, 1985, 1986,
1987, а также монографию Б. Д. Брондза, «Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологи-
ческом распознавании», М., «Наука», 1987.— Прим, перев.
316
С. Г. Фэтмэм, Ф. В. Фитч.
18. Hodes R. J., Svedmyr Е. A. J. Specific cytotoxicity of Н-2 incompatible mouse lympho-
cytes following mixed culture in vitro, Transplantation, 9, 470 (1970).
19. Cerottini J.-C., Engers H. D., MacDonald H. R., Brunner К. T. Generation of cytotoxic
T lymphocytes in vitro. I. Response of normal and immune spleen cells in mixed leuko-
cyte cultures, J. Exp. Med., 140, 703 (1974).
20. Hayry P., Andersson L. C., Nordling S., Virolainen M. Allograft response in vitro, Trans-
plant. Rev., 12, 91 (1972).
21. Wagner H., Rollinghoff M., Nossal J. G. V. T-cell-mediated immune responses induced in
vitro: A probe for allograft and tumor immunity, Transplant. Rev., 17, 3 (1973).
22. MacDonald H. R. Restimulation of cytolytic T-lymphocytes in long-term mixed leuko-
cyte cultures. I. Physical and proliferative characterization of cytolytic T-lymphocyte
restimulated at low cell density, Cell. Immunol., 35, 414 (1978).
23. Hayry P. Anamnestic responses in mixed lymphocyte culture-induced cytolysis (MLC-
CML) reaction, Immunogenetics, 3, 417 (1976).
24. Gordon J., MacLean L. D. A lymphocyte-stimulating factor produced in vitro, Nature,
208, 795 (1965).
25. Kasakura S., Lowenstein L. A factor stimulating DNA synthesis derived from the medium
of leukocyte cultures, Nature, 208, 794 (1965).
26. Morgan D. A., Ruscetti F. W., Gallo R. C. Selective in vitro growth of T lymphocytes
from normal human bone marrows, Science, 193, 1007 (1976).
27. Gillis S., Smith K. A. Long-term culture of tumor-specific cytotoxic T cells, Nature,
268, 154 (1977).
28. NabholzM., Engers H. D., Collavo D., NorthM. Cloned T cell lines with specific cytolytic
activity, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 176 (1978).
29. Fathman C. G., Hengartner H. Clones of alloreactive T-cells, Nature, 272, 617 (1978).
30. Aarden L. A. et al. Revised nomenclature for antigen non-specific T-cell proliferation and
helper factors, J. Immunol., 123, 2928 (1979).
31. Gillis S., Smith K. A., Watson J. D. Biochemical and biological characterization of lym-
phocyte regulatory molecules. II. Purification of a class of rat and human lymphokines,
J. Immunol., 124, 1954 (1980).
32. Watson J., Gillis S., Marbrook J., Mochizuki D., Smith K. A. Biochemical and biological
characterization by lymphocyte regulatory molecules. I. Purification of a class of murine
lymphokines, J. Exp. Med., 150, 849 (1979).
33. Rosenberg S. A., Spiess P. J., Schwarz S. In vitro growth of murine T cells. I. Production
of factors necessary for T cell growth, J. Immunol., 121, 1946 (1978).
34. Mier J. IP., Gallo R. C. Purification and some characteristics of human T-cell growth fac-
tor (TCGF) from PHA-stimulated lymphocyte conditioned media, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77, 6134 (1980).
35. Strausser J. L., Rosenberg S. A. In vitro growth of cytotoxic human lymphocytes. I. Growth
of cells sensitized in vitro to alloantigens, J. Immunol., 121, 1491 (1978).
36. Inouye H., Hank J. A., Alter В. J., Bach F. H. TCGF production for cloning and growth of
functional human T lymphocytes, Scand. J. Immunol., 12, 149 (1980).
37. Gillis S., Watson J. Biochemical and biological characterization of lymphocyte regulatory
molecules. V. Identification of an Interleukin 2 producer human leukemia T cell line,
J. Exp. Med., 152, 1709 (1980).
38. Haas W., Mathur-Rochat J., Pohlit J., Pohlit H., Nabholz M., von Boehmer H. Cytotoxic
T cell responses to haptenated cells. III. Isolation and specificity analysis of continuously
growing clones, Eur. J. Immunol., 10, 828 (1980).
39. Johnson J. P., Cianfriglia M., Glasebrook A. L., Nabholz M. Karyotype evolution of cyto-
lytic T cell lines. In: Isolation, Characterization and Utilization of T Lymphocyte Clones,
ed. by C. G. Fathman and F. W. Fitch, p. 183, Academic Press, New York, 1982.
40. Fresno M., Nabel G., McVay-Boudreau L., Furthmayer H., Cantor H. Antigen specific T
lymphocyte clones. I. Characterization of a T lymphocyte clone expressing antigen-specific
suppressive activity, J. Exp. Med., 153, 1246 (1981).
41. Hengartner H., Fathman C. G. Clones of alloreactive T cells. I. A unique homozygous
MLR stimulating determinant present on B6 stimulators, Immunogenetics, 10, 175 (1980).
42. Glasebrook A. L., Fitch F. W. T cell lines which cooperate in generation of specific cytolytic
activity, Nature, 278, 171 (1979).
43. Rimoto M., Fathman C. G. Antigen reactive T cell clones. I. Transcomplementing hybrid
I-A region gene products function effectively in antigen presentation, J. Exp. Med., 152,
759 (1980).
44. Lutz С. T., Glasebrook A. L., Fitch F. W. Alloreactive cloned T cell lines. III. Accessory
cell requirements for the growth of cloned cytolytic T lymphocytes, J. Immunol., 126,
1404 (1981).
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток
317
45. Glasebrook А. L. et al. Murine Т lymphocyte clones with distinct immunological functions,
Immunol. Rev., 54, 225 (1981).
46. El J. M. The kinetics of lymphokine production and release by a cloned T amplifier cell,
Ph. D. Thesis, University of Chicago, 1981.
47. Lutz С. T., Glasebrook A. L., Fitch F. W. Alloreactive cloned T cell lines. IV. Interaction
of alloantigen and T cell growth factors (TCGF) to stimulate cloned cytolytic T lympho-
cytes, J. Immunol., 127, 391 (1981).
48. Glasebrook A. L., Kelso A., Zubler R. H., Ely J. M., Prystowsky M. C., Fitch F. W. Lym-
phokine production by cytolytic and noncytolytic alloreactive T cell clones. In: Isolation,
Characterization and Utilization of T Lymphocyte Clones, ed. by C. G. Fathman and
F. W. Fitch, p. 341, Academic Press, New York, 1982.
49. MacDonald H. R. et al. Quantitation and cloning of cytolytic T lymphocytes and their pre-
cursors, Immunol. Rev., 51, 93 (1980).
50. Zagury D., Bernard J., Thiemesse H., Foldman M., Berke G. Isolation and characterization
of individual functionally reactive cytotoxic T lymphocytes. Conjugation, killing, and
recycling at the single cell level, Eur. J. Immunol., 5, 818 (1975).
51. Glasebrook A. L., Fitch F. W. Alloreactive cloned T cell lines. I. Interactions between
cloned amplifier and cytolytic T cell lines, J. Exp. Med., 151, 876 (1980).
52. Williams TV., Kraft N., Shortman K. The separation of different cell classes from lymphoid
organs. VI. The effect of osmolarity of gradient media on the density distribution of cells,
Immunology, 22, 885 (1972).
53. Iscove N. N., Melchers F. Complete replacement of serum by albumin, transferrin and soy-
bean lipid in cultures of lipopolysaccharide-reactive В lymphocytes, J. Exp. Med., 147,
923 (1978).
54. Gillis S., Ferm M. M., Lu W., Smith К. A. T cell growth factor: Parameters of production
and quantitative microassay for activity, J. Immunol., 120, 2027 (1978).
55. Prystowsky M. B. et al. Alloreactive cloned T cell lines. VII. Multiple lymphokine activities
secreted by cloned T lymphocytes, J. Immunol., 129, 2337 (1982).
56. Ryser J.-E., Cerottini J.-C., Brunner К. T. Generation of cytolytic T lymphocytes in
vitro. IX. Induction of secondary CTL responses in primary long-term MLC by superna-
tants from secondary MLC, J. Immunol., 120, 370 (1978).
57. Farrar J. J., Benjamin ML R., Hilficker M. L., Howard M., Farrar W. L., Fuller-Far-
rar J. The biochemistry, biology and role of interleukin-2 in the induction of cytotoxic T
cell and antibody forming В cell responses, Immunol. Rev., 63, 129 (1982).
58. Shimizu S., Kanaka Y., Smith R. Mitogen-initiated synthesis and secretion of T cell
growth factors by a T lymphoma cell line, J. Exp. Med., 152, 1436 (1980).
59. Gillis S., Watson J. D., Mochizuki D. Purification and characterization of IL-2. In: Isolat-
ion, Characterization and Utilization of T Lymphocyte Clones, ed. by C. G. Fathman and
F. W. Fitch, p. 503, Academic Press, New York, 1982.
60. Engers H. D., Fitch F. W. An estimate of the minimal frequency of cytolytic T lymphocyte
effector cells generated in allogeneic reactions, J. Immunol. Methods, 25, 13 (1979).
61. Corradin G., Etlinger H. M., Chiller J. M. Lymphocyte specificity to protein antigens.
I. Characterization of the antigen-induced in vitro T cell-dependent proliferative response
with lymph node cells from primed mice, J. Immunol., 119, 1048 (1977).
62. Schreier M. H., Iscove N. N., Tees R., Aarden L., von Boehmer H. Clones of killer and
helper T cells: Growth requirements, specificity and retention of function in long-term
cultures, Immunol. Rev., 51, 315 (1980).
63. Schreier M. H., Tees R. Clonal induction of helper T cells: Conversion of specific signals
into non-specific signals, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 61, 227 (1980).
64. Singer A., Asano Y., Shigeta M., Hathcock K. S., Ahmed A., Fathman C. G., Hodes R. J.
Distinct В cell subpopulations differ in their genetic requirements for activation by T
helper cells, Immunol. Rev., 64, 137 (1982).
65. Glasebrook A. L. et al. Alloreactive cloned T cell lines. II. Polyclonal stimulations of В cells
by a cloned helper T cell line, J. Immunol., 126, 240 (1981).
66. Ely J. M., Prystowsky M. B., Eisenberg L., Quintans J., Goldwasser E., Fitch F. W. Allo-
reactive cloned T cell lines. IV. Differential kinetics of IL-2, CSF, and BCSF release by a
cloned T amplifier cells is variant, J. Immunol., 127, 2345 (1981).
67. Marcucci F., Walter M., Kirchner H., Krammer P. Production of immune interferon by
murine T-cell clones from long-term cultures, Nature, 291, 79 (1981).
68. Dy M. et al. Histamine production during the anti-allograft response. Demonstration
of a new lymphokine enhancing histamine synthesis, J. Exp. Med., 153, 293 (1981).
69. Glasebrook A. L. Cytolytic T lymphocyte clones which proliferate autonomously to specific
alloantigenic stimulation. I. Frequency, Interleukin-2 production and Lyt phenotype,
J. Immunol. (1983) (in press).
70. Fresno M., McVay-Boudreau L., Cantor H. Antigen specific T lymphocyte clones. II.
318
С. Г. Фэтмен, Ф. В. Фитч
Purification and biological characterization of an antigen-specific suppressive protein
synthesized by cloned T cells, J. Exp. Med., 153, 1260 (1981).
71. Fresno M. et al. Antigen specific T lymphocyte clones. III. Papain splits purified T sup-
pressor molecules into two functional domains, J. Exp. Med., 155, 981 (1982).
72. Bach F. II., Inouye II., Hank J. A., Later B. J. Human T lymphocyte clones reactive in
primed lymphocyte typing in cytotoxicity, Nature, 281, 307 (1979).
73. Bach F. II., Alter B. J., Widmer M. B., Segall M. S., Dunlap B. Cloned cytotoxic and
non-cytotoxic lymphocytes in mouse and man: Their reactivities and a large cell surface
membrane protein (LMP) differentiation marker system, Immunol. Rev., 54, 5 41981).
74. Miller R. G., Phillips R. A. Separation of cells by velocity sedimentation, J. Cell Physiol.,
73, 191 (1969).
75. Malissen B., Charmot D., Mawas C. Expansion of human lymphocyte populations expres-
sing specific immune reactivities. III. Specific colonies, either cytotoxic or proliferative
obtained from a population of responder cell primed in vitro. Preliminary immunogenetic
analysis, Human Immunol., 2, 1 (1981).
76. Malissen B., Kristensen T., Goridis C., Madsen M., Mawas C. Clones of human cytotoxic
T lymphocytes derived from an allosensitizedindividual. HLA specificity and cell
surface markers, Scand. J. Immunol., 14, 213 (1981).
77. Sredni B., Volkman D., Schwartz R. H., Fauci A. S. Antigen-specific human T-cell clones.
Development of clones requiring HLA-DR-compatible presenting cells for stimulation in
presence of antigen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1858 (1981).
78. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined
specificity, Nature, 2656, 495 (1975).
79. Taussing M. J., Holliman A. Structure of an antigen-specific suppressor factor produced
by a hybrid T-cell line, Nature, 277, 308 (1979).
80. Watanabe T., Kimoto M., Maruyama S., Кishtmoto T., YamamuraY. Regulation of anti-
body response in different immunoglobulin classes. V. Establishment of T-hybrid cell
line secreting IgE class-specific suppressor factor, J. Immunol., 121, 2113 (1978).
81. Hewitt J., Liew F. Y. Antigen-speciiic suppressor factors produced by T cell hybridomas
for delayed-type hypersensitivity, Eur. J. Immunol., 5, 572 (1979).
82. Tanaguchi M., Saito T., Tada T. Antigen specific suppressor factor produced by a trans-
plantable I-J-bearing T cell hybridoma, Nature, 278, 555 (1979).
83. Minami M. et al. Analysis of T cell hybridomas. I. Characterization of H-2 and Igh restricted
monoclonal suppressor factors, J. Exp. Med., 154, 1390 (1981).
84. Kapp J. A., Arane B. A., Clevinger B. L. Suppression of antibody and T cell proliferative
responses to L-glutamic acid 60-L-alanine30-L-tyrosine10 by a specific monoclonal T cell
factor, J. Exp. Med., 152, 235 (1980).
85. Nabholz M. et al. Cytolytically active murine T-cell hybrids, Nature, 287, 437 (1980).
86. Nabholz M., Cianfriglia M., Acuto O., Conzelmann A., Weiss A., Has W., von Boehmer II.
The production of murine cytolytic T cell hybrids. In: Monoclonal Antibodies and T Cell
Hybridomas, ed. by G. H. Hammerling, U. Hammerling, and J. F. Kearney, Elsevier/
North Holland Publishing Company, Amsterdam (1983) (in press).
87. Lonai P., Puri J., Hammerling G. J. H-2 restricted antigen binding by a hybridoma clone
which produced specific helper factor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 549 (1981).
88. Eshhar Z. et al. T-cell hybridoma bearing heavy chain variable region determinants producing
(T, G)-A-L-specific helper factor, Nature, 286, 270 (1980).
89. Krupen К., Araneo В. A., Brink L., Kapp J. A., Stein S., Wieder K. J., Webb D. R. Puri-
fication and characterization of a monoclonal T-cell suppressor factor specific for poly(L-
Glu60-L-Ala30-L-Tyr10), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1254 (1982).
90. SredniB., Sieckmann D. G., Kumagai S., House S., Green!., Paul W. E. Long-term culture
and cloning of nontransformed human В lymphocytes, J. Exp. Med., 154, 1500 (1981).
91. Howard M., Kessler S., Chused T., Paul W. Long-term culture of normal mouse В lympho-
cytes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 5788 (1981).
92. Howard J. et al. Identification of a Tcell-derived В cell growth factor distinct from inter-
leukin 2, J. Exp. Med., 155, 914 (1982).
93. Isakson P. C., Pure E., Vitetta E. S., Krammer P. H. T cell derived В cell differentiation
factor(s). Effect of the isotope switch of murine В cells, J. Exp. Med., 155, 734 (1982).
94. Warner J., Dennert G. Establishment and cloning of cell lines with natural killer activity
in lymphokine-containing media, Lymphokines, 6, 165 (1981).
95. Warner J., Bry C., Dennert G. Cloned cell lines with natural killer activity: TCGF is
required for their proliferation and cytolytic activity, Eur. J. Immunol, (submitted for
publication) (1983).
9 6. Wetzig В. P., Foster C. S., Greene M. I. Ocular immune responses. I. Priming of A/J mice
in the anterior chamber with azobenzenearsonate-derivatized cells induces second-order-
like suppressor T cells, J. Immunol., 128, 1753 (1982).
30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток
319
97. Sugamura К., Tanaka У., Hinuma У. Two distinct human cloned T cell lines that exhibit
natural killer-like and anti-human effector activities, J. Immunol., 128, 1749 (1982).,
98. Pawelec G. P., Hadam M. R., Ziegler A., Lohmeyer J., Rehbein A., Kumbier I., Wernet P.
Long-term culture, cloning, and structure markers of mixed leucocyte culture-derived
human T lymphocytes with natural killer-like cytotoxity, J. Immunol., 128, 1892 (1982).
99. Sherman L. A. Dissection of the BIO. D2 anti-H-2Kb cytolytic T lymphocyte receptor
repertoire, J. Exp. Med., 151, 1386 (1980).
100. Sherman L. A. Influence of the major histocompatibility complex on the repertoire of
allospecific cytolytic T lymphocytes, J. Exp. Med., 155, 380 (1982).
101. Zinkernagel R. M., Doherty P. C. МНС-restricted cytotoxic T cells: studies on the biologic-
al role of polymorphic major transplantation antigens determining T cell restriction speci-
ficity, function and responsiveness, Adv. Immunol., 27, 51 (1979).
102. Baker P. E., Gillis E., Smith K. A. Monoclonal cytolytic T-cell lines, J. Exp. Med., 149,
273 (1979).
103. Simonsen M. The clonal selection hypothesis evaluated by grafted cells reactive against
their host, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 32, 317 (1967).
104. Wilson D. B. Immunologic reactivity to major histocompatibility alloantigens: HABC
effector cells in the problem of memory, Prog. Immunol., 2, 145 (1974).
105. von Boehmer H. et al. Fine specificity of a continuous growing killer cell clone specific for
H-Y antigens, Eur. J. Immunol., 9, 592 (1979).
106. Sredni B., Schwartz R. H. Antigen-specific proliferating T lymphocyte clones. Methodology,
specificity, MHC restriction and alloreactivity, Immunol. Bev., 54, 187 (1981).
107. IVcjss A., Brunner К. T., MacDonald H. R., Cerotttni J.-C. Antigenic speciiicity of the
cytolytic T lymphocyte response to murine sarcoma virus-induced tumors. III. Characteri-
zation of cytolytic clones specific for Maloney leukemia virus associated cell surface anti-
gens, J. Exp. Med., 152, 1225 (1980).
108. Weiss A., MacDonald H. R., Cerottini J.-C., Brunner К. T. Inhibition of cytolytic T
lymphocyte clones reactive with Moloney leukemia virus-associated antigen by monoclonal
antibodies: a direct approach to the study of H-2 restriction, J. Immunol., 126, 482 (1981)
109. Braciale R. J., Andrew M. E., Braciale V. L. Heterogeneity and specificity of cloned lines
of influenza virus-specific cytotoxic T lymphocytes, J. Exp. Med., 153, 910 (1981).
110. Braciale T. J., Andrew M. E., Braciale V. L. Simultaneous expression of Н-2-restricted
and alloreactive recognition by a cloned line of influenza virus-specific cytotoxic T lymp-
hocytes, J. Exp. Med., 153, 1371 (1981).
111. Sarmiento M., Glasebrook A. L., Fitch F. W. IgG of IgM monoclonal antibodies reactive
with different determinants on the molecular complex bearing Lyt 2 antigen block T cell-
mediated cytolysis in the absence of complement, J. Immunol., 125, 2665 (1980).
112. MacDonald H. R., Thiernesse N., Cerottini J.-C. Inhibition of T cell-mediated cytolysis by
monoclonal antibodies detected against Lyt-2: Heterogeneity of inhibition at the clonal
level, J. Immunol., 126, 1671 (1981).
113. DialynasD. P. etal. Lyt-2~/Lyt-3~ variants of a cloned cytolytic Tcellline lack an antigen
receptor functional in cytolysis, J. Exp. Med., 153, 595 (1981).
114. Andrew M. E., Braciale T. J. Antigen-dependent proliferation of cloned continuous lines of
H-2 restricted influenza virus-specific cytotoxic T lymphocytes, J. Immunol., 127, 1201
115. Widmer M. B., Bach F. H. Antigen driven helper cell-independent cloned cytolytic
T lymphocytes, Nature, 294, 750 (1981).
116. Fathman C. G. et al. Reconstitution of Ir genes, la antigens and mixed lymphocyte reac-
tion determinants by gene complementation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1853 (1981).
117. Fathman C. G., Kimoto M. Studies utilizing murine T cell clones: Ir genes, la antigens
and MLR stimulating determinants, Immunol. Rev., 54, 57 (1981).
118. Shigeta M., Fathman C. G. I region genetic restriction imposed upon the recognition of
KLH by murine T cell clones, Immunogenetics, 11, 493 (1981).
119. Beck В. N., Frelinger J. G., Shigeta M., Infante A. J., C limings D., Hammerling G., Fath-
man C. G. T cell clones specific for hybrid I-A molecules: Discrimination with monoclonal
anti-I-Ak antibodies, J. Exp. Med., 156, 1186 (1982).
120. Lerner E. A., Mathis L. A., Janeway C. A., Jones P. P., Schwartz R. H., Murphy D. B.
Monoclonal antibody against an Ir gene product, J. Exp. Med., 152, 1085 (1980).
121. McKean D. J., Melvold R. W., David C. Tryptic peptide comparisons of la antigen alpha
and beta polypeptides from the I-A mutant B6. C-H-2bm12 and its congcnic parental strain
B6. Immunogenetics, 14, 41 (1981).
122. Infante A. J. et al. Definition of T cell idiotypes using anti-idiotypic antisera produced
by immunization with T cell clones, J. Exp. Med., 155, 1100 (1982).
123. Lancki D. W., Lorber M. I., Loken M. R., Fitch F. W. A clone specific monoclonal anti-
body which inhibits T cell mediated cytolysis, Adv. Exp. Med. Biol., 146, 557 (1982).
Словарь терминов и сокращении1
(Составитель А. Н. Мац)
Абросупрессия (эброусупрессия) (от англ, abrogation — отмена). Отмена естественной
супрессии иммунного ответа в результате активации Т-контрсупрессоров.
Агретоп (agretope, antigen-restriction element interaction site). Участок «процессирован-
ного» фрагмента антигена. Соединяется с дезетопом молекулы МНС класса II на клетке,
презентирующей антиген. Участок антигена, взаимодействующий с элементом МНС-ре-
стрикции.
Адаптивная дифференцировка Т-клеток. Приобретение созревающими в тимусе Т-клет-
ками способности распознавать в качестве «своих» детерминанты молекул МНС класса II
экспрессированных на клетках микроокружения.
Адоптивный иммунитет или толерантность (от англ, adopt — принимать). Восприня-
тые иммунитет или толерантность, возникшие у интактного реципиента после адоптивного
переноса лимфоцитов от иммунизированного или толерированного донора.
АЗП. Агглютинин из семян (зародышей) пшеницы (Triticum vulgaris). Лектин.
АКФ см. Ангиотензин-конвертаза.
Аллели (нем. Allele). Альтернативные варианты генов одного и того же локуса.
Аллельное исключение (allelic exclusion). Экспрессия только материнского или только
отцовского аллеля гена иммуноглобулинов (т. е. какого-либо одного аллотипа) у гетерози-
готного индивида.
Аллогенное подавление (allogenic inhibition). Подавление роста или разрушение клеток
в результате контакта с непримированными клетками другого генотипа.
Аллореактивность. Иммунный ответ на аллоантигены.
Аллостерический эффектор. Лиганд, вызывающий обратимое изменение конформации
аллостерического белка.
Аллотипическая супрессия. Подавление синтеза иммуноглобулинов данного аллотипа
Т-супрессорами, специфичными к аллотипической детерминанте.
Аллотипы (allotypes). Аллельные варианты полипептидных цепей иммуноглобулинов.
Аллотоп (allotope). Аллотипическая детерминанта. Антигенная детерминанта данной
аллельной формы полипептидной цепи иммуноглобулина. Аллотопы имеются как в констант-
ных, так и в вариабельных областях.
Аллофенные мыши (allophenic mice — от allogenic phenotype). Тетрапарентальные мы-
ши. Агрегационные химеры мышей двух линий. Получают, смешивая бластомеры, принадле-
жащие эмбрионам двух разных линий, с последующей имплантацией в матку самки одной
из линий.
АМК см. Атакующий мембрану комплекс.
Амплификационная петля. Механизм обратного усиления активации комплемента
по альтернативному пути: к СЗЬ присоединяется ВЬ, образуя комплекс СЗЬВЬ, который,
соединившись с фактором Р, действует как конвертаза СЗ, высвобождая дополнительные
количества СЗЬ.
Амплификационная петля в супрессорной цепи. Каскадный механизм обратного уси-
ления регуляторной иммуносупрессии через цепь Т-супрессоров: Tsl-Ts2-Ts3-Tsl.
Анамнестический ответ. Вторичный иммунный ответ на антиген, которым индивид был
предварительно проиммунизирован.
Анафилатоксины. Низкомолекулярные фрагменты активированных компонентов ком-
плекта — СЗа, С4а и С5а. При введении животным вызывают симптомы системной анафи-
лаксии. Высвобождают из тучных клеток и базофилов гистамин и другие медиаторы воспа-
ления.
Ангиотензин-конвертаза (АКФ). АГ-I-превращающий фермент сыворотки.
Ангиотензины. Ангиотензин I (АГ-1) — декапептид Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-
His-Leu, отщепляемый ренином от ангиотензиногена. Под действием АГ-1-превращающего
фермента сыворотки ангиотензин I теряет дипептид His-Leu, образуя ангиотензин II (АГ-П),
мощный прессорный агент, обусловливающий возникновение эссенциальной гипертонии.
1 В словарь включены термины и сокращения, встречающиеся в трех томах настоящего
издания и требующие краткого пояснения.
Словарь терминов
321
Анизомицин. Антибиотик из Streptomyces griseolus. 2 (п-метоксибепзил)-3,4-пирролидип-
диол-3-ацетат.
Антигены гистосовместимости минорные. 1) Аллоантигены, кодируемые не-МЯС-ге-
нами. У мышей, помимо комплекса Н-2, известно более 40 других локусов гистосовмести-
мости, локализованных в различных хромосомах, например, ген Н-Х, кодирующий секс-
антиген гистосовместимости у самцов. 2) Аллоантигены, кодируемые минорными аллелями
генов Н-2.
Антигены МНС класса I. Антигены гистосовместимости, экспрессированные на всех
ядросодержащих клетках. Трансмембранные гликопротеины. Имеют лёгкую цепь (Р2-ми-
кроглобулин), нековалентно связанную с тяжелой цепью, которая кодируется генами К, D
и L районов Н-2 комплекса у мышей и локусами А, В и С комплекса HLA у человека. Алло-
антигены класса I распознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами и Т-амплифайерами.
Антигены МНС класса II. 1а-антигены у мышей и HLA-DR-антигены у человека. Транс-
мембранные гликопротеины. Экспрессированы на А-клетках, В-лимфоцитах и активирован-
ных Т-лимфоцитах. Играют решающую роль в иммунологическом распознавании (см. МНС-
рестрикция).
Антигены МНС класса III. Белки Ss и Sip у мышей, С4 у мышей и человека. Синтези-
руются и секретируются макрофагами. На клеточных мембранах не экспрессированы.
Антигены (продукты) МНС класса IV. Белки с мол. массой 15—30 кДа. Содержатся
в цитоплазме (но не на мембране) макрофагов, фибробластов и лимфоцитов мышей. Коди-
руются генами, расположенными между районом К и субрайоном I-A комплекса Н-2.
Антигенсвязывающая емкость. 1) Концентрация антигенсвязывающих центров, опреде-
ляемая по количеству связанного меченого антигена, добавленного в избытке, когда все
центры насыщены. 2) Общее количество антител, связывающихся с данным антигеном, неза-
висимо от изотипа.
Антигенсвязывающий участок (центр, сайт) антитела. Паратоп. Активный центр анти-
тела, комплементарно (аффинно) взаимодействующий с антигенной детерминантой (эпи-
топом).
Антимицин А. Антибиотик из Streptomyces kitazawaensis. Ингибитор ферментов клеточ-
ного дыхания.
Анти-Ig-peareHT. Антиглобулин. Содержит антитела (или их F(ab)2) к иммуноглобули-
нам данного вида, выделенные из ксеноиммунной антисыворотки. Используется в иммуноло-
гических реакциях для выявления иммуноглобулинов.
ах-Антитрипсин. Компонент нормальной плазмы крови. Ингибитор протеиназ. ах-
Глобулин с мол. массой 54 кДа. Естественный антитромбин. При ревматоидном артрите в сы-
воротке и суставной жидкости обнаруживается комплекс «j-антитрипсина с IgA, повреждаю-
щий ткани.
Антитромбин III. Основной фактор противосвертывающей системы крови. Естествен-
ный ингибитор тромбина. а2-Глобулин сыворотки.
АПК. Антигенпрезентирующие клетки. А-клетки.
АПЛМ см. MPLA.
Арахидоновая кислота (АК). Эйкоза-5,8,11,14-тетраеновая кислота. Входит в состав
внутриклеточных фосфоацилглицеролов. Предшественник простагландинов PGE2 и PGE2a.
АРК. Антигенреактивные Т-клетки.
Асимптота кривой (гр. asymptotos — несовпадающий). Прямая, к которой неограни-
ченно приближаются точки некоторой кривой по мере удаления в бесконечность.
Атакующий мембрану комплекс (АМК, МАС). Комплекс компонентов комплемента
С5Ь6789. Образуется в результате активации системы комплемента. Разрушает клеточные
мембраны.
Аутбредные животные. Генотипически разнородные животные одного вида. Нестабили-
зированная популяция беспородных животных, полученная бесконтрольным скрещиванием.
Аутокоиды (гр. autos — свой, akos — лекарство). Собирательное название эндогенных
медиаторов с про- и противовоспалительным действием (гистамин, простагландины серии Е,
^-адренергические катехоламины, тафтсин и т. п.).
Аутосомный ген. Ген, расположенный в аутосомах, т. е. в неполовых (соматических)
хромосомах.
Аффинная метка, метка по сродству. Иммунохимический метод анализа структуры
антигенсвязывающего центра антител. Метод основан на способности химически активного
гаптена иммуноспецифически связываться с паратопом, образуя ковалентные связи с остат-
ками аминокислот, входящих в состав полипептидных цепей паратона. Связанные антитела
гидролизуют, а связавшиеся с гаптеном пептидные фрагменты выделяют и идентифици-
руют.
Аффинность. Термодинамическое выражение прочности связи структур, взаимодей-
ствующих на основе стереохимической комплементарности. Выражается константой равно-
весия или ассоциации (К.литр моль-1).
322
Словарь терминов
Аффинная очистка антител или антигенов. Выделение антител или антигенов с помо-
щью биоспецифической аффинной адсорбции-элюции на иммуносорбентах (иммобилизо-
ванных антигенах или антителах).
Безмикробные животные. Животные полностью свободные от любых микроорганизмов:
бактерий, вирусов, простейших и многоклеточных. Гнотобиоты.
P-Складчатый слой. Способ пространственной укладки полипептидной цепи белка, при
котором образуются водородные связи между пептидными группами, расположенными на
параллельных и антипараллельных складках цепи.
Библиотека клонов. Геномная библиотека. Библиотека клонированных генов. Рестрик-
ционные фрагменты ДНК, т. е. фрагменты (генома), либо упакованные в бактериофаги, либо
встроенные в плазмиды или другие векторы и клонированные.
Бирбека гранулы (Birbeck). Цитоплазматические гранулы в клетках Лангерганса и
ОКР. Имеют форму теннисной ракетки. Содержат АТРазу. Окрашиваются хлоридом золота.
Функция не известна.
Бласттрансформация лимфоцитов. Превращение in vitro морфологически зрелых лим-
фоцитов в лимфобласты под действием митогенов, антигенов и интерлейкинов. Увеличивается
цитоплазма, нарастает ее базофилия. Ядра окрашиваются бледнее. Становятся видимыми
ядрышки.
Блоттинг (blot — пятно; blotting — получение реплики пятен). Метод иммунохимиче-
ского анализа и идентификации полипептидов, фрагментов ДНК, РНК, белков и т. д. Раз-
деленные электрофорезом в геле полипептиды, белки или фрагменты ДНК переносят на мем-
бранный микропористый фильтр (или химически модифицированную бумагу) таким образом,
чтобы перенесенный материал копировал электрофореграмму. Перенос осуществляется пото-
ком буфера, во ходящего от геля к мембране под действием капиллярных сил (блоттинг по
Саузерну, Southern blotting. Фамилия автора переводится «Южный». Благодаря игре слов
блоттинг назван южным), либо с помощью электрического поля (western blotting, западный
блоттинг), в которое помещают гель, накрытый мембранным фильтром, и ведут электрофоре»
от геля к мембране. Южный блоттинг широко используется для анализа рестрикционных
фрагментов ДНК в реакции гибридизации с мРНК- и кДНК-зондами. Аналогичный под-
ход при анализе РНК получил название северного блоттинга (northern blotting).
Брадикинин. Нонапептид Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Один из вазоактивных
кининов. Расширяет артериолы. Сужает вены. Повышает проницаемость сосудов. Усиливает
транспорт жидкости из сосудистого русла в ткани.
Бустерный иммунный ответ (booster — усилитель). Ответ на бустерную, усиливающую
дозу антигена, введенную после примирующей (первичной) грундирующей иммунизации.
Характеризуется повышенной и ускоренной продукцией антител.
Бэккросс (backcross). Возвратное скрещивание, т. е. скрещивание межлинейного гиб-
рида первого поколения (Fj) с особью одной из родительских линий.
Вазоактивные амины. Содержащие аминогруппы медиаторы. Например, гистамин и
серотонин, вызывающие расширение просвета и увеличение проницаемости мелких сосудов.
Серотонин вызывает сужение крупных сосудов. Действием на величину просвета и прони-
цаемости сосудов не исчерпывается фармакологическая активность вазоактивных аминов.
Вазоактивный кишечный полипептид (ВКП). Содержится в гранулах тучных клеток.
Секретируется при IgE-зависимой гиперчувствительности. Повышает проницаемость сосудов.
Варфарин. 3 (а-актонилбензил)-4-гидроксикумарин. Актикоагулянт.
Вирусы мышиной лейкемии (ВМЛ). Например, вирус мышиной лейкемии Эбелсона или
вирус мышиной лейкемии Молони.
ВКП см. Вазоактивный кишечный полипептид.
ВМЛ см. Вирусы мышиной лейкемии.
Вуалевые клетки (veiled cells). Клетки с вуалеподобными отростками. Появляются
в оттекающей от лимфатического узла лимфе после первичной иммунизации (примирования
антигеном). Функционируют как А-клетки.
Вырожденность (degeneration) иммунологического распознавания. Сокращение репер-
туара распознаваемых детерминант. Утрата тонкой специфичности распознавания, проявляю-
щаяся перекрестной реактивностью химически различных детерминант.
вэв см. Посткапиллярные высокоэндотелиальные венулы.
Галид (halide, halogen -f- ide). Соединение галогена с другим химическим элементом
или радикалом.
Гаметное (germline) разнообразие генов V. Репертуар генов V, возникший в филогенезе
и вошедший в геном половых клеток.
Гаплоидный (haploid) геном. Геном, содержащий одинарный (гаметный) набор хромо-
сом, т. е. половину соматического набора, присущего особям данного вида.
Словарь терминов
323
Гаплотип (haplotype). Набор локусов МНС, наследуемых от одного нз родителей, т. е.
«половина Л/ЯС-генотипа». Сцепленный кластер аллелей, наследуемых с одной хромосомой.
Аллогруппа.
Гаптен. Вещество, которое иммунохимически связывается с антителами, но не вызы-
вает иммунного ответа. Большинство гаптенов — это вещества с мол. массой менее 1 кДа,
несущие одну антигенную детерминанту. Гаптены приобретают иммуногенность после конъю-
гации с макромолекулярными носителями.
Гаптенизированные белки. Конъюгированные с гаптенами белки, например, гаптени-
зированные изотиоцианатом флуоресцеина, 3-иод-4-гидрокси-5-нитрофенилуксусной кисло-
той, производными n-сульфаниловой кислоты и т. п.
ГАТ. Поли(глутаматв0-аланин30-тирозин10). Синтетический антиген.
Гельзолин. Са2+-зависимый актин-фрагментирующий белок. Определяет переходы гель-
золь-гель в цитоплазме клеток позвоночных, например, в цитоплазме макрофагов. Эти пере-
ходы обусловливают подвижность клеток.
Генетическая рестрикция. Необходимость совпадения по определенным аллелям ком-
плекса МНС и локусов Igh-V и Igh-C (т.е. по их продуктам) между взаимодействующими клет-
ками иммунной системы для реализации функциональной активности при распознавании
антигена (презентационная рестрикция) и в иммунорегуляции (интеракционная рестрик-
ция).
Гетерогибридома. Межвидовая гибридома. Линия гибридных клеток, полученная слия-
нием клеток мышиной миеломы с лимфоцитами животных другого вида.
Гетерозиготность вторичная. Возникшая в результате спонтанной мутации гетерози-
готность особи, принадлежащей к гомозиготной (инбредной) линии животных.
Гетероклитические антитела (Heteroclitic antibodies). Обладают большей аффинностью
к перекрестнореагирующему антигену, чем к гомологичному. Например, иммунизация НФ-
конъюгатом иногда дает антитела с большей аффинностью к ИНА, чем к самому НФ.
ГЗТ. Гиперчувствительность замедленного типа. Одно из проявлений клеточной имму-
нореактивности сенсибилизированного (примированного) индивида. Опосредована Т-эф-
фекторами ГЗТ, секретирующими при контакте с антигеном воспалительные лимфокины.
При ГЗТ внутрикожное введение антигена вызывает местную воспалительную реакцию, раз-
витие которой замедленно. ГЗТ можно адоптивно перенести несенсибилизированному реци-
пиенту, вводя лимфоциты, но не антитела, примированного донора. Возможен также перенос
ГЗТ низкомолекулярными (с мол. массой менее 10 кДа) полипептидами и нуклеопептидами
лимфоцитарных экстрактов (см. Трансфер-фактор).
Гибридные антитела. Молекулы иммуноглобулинов с антигенсвязывающими центрами
разной специфичности, т. е. несимметричные по специфичности. Такие антитела получают
искусственно, рекомбинируя диссоциированные цепи двух видов антител разной специфич-
ности или осуществляя слияние двух гибридов, синтезирующих разные антитела.
Гибридома. Клеточная линия, полученная слиянием клетки плазмоцитомы (миеломы)
с нормальной плазматической клеткой или В-лимфоцитом, либо клетки Т-лимфомы с нор-
мальным Т-лимфоцитом. Клонированные В-клеточные гибридомы образуют моноклональ-
ные антитела.
Гиперчувствительность замедленного типа см. ГЗТ.
Гистотоп (histotope). Участок молекулы МНС класса II на поверхности клетки, пре-
зентирующей антиген, у мышей. Аффинно взаимодействует с реститопом антигенраспознаю-
щего рецептора Т-клеток хелперной группы. Элемент МНС-рестрикции.
Главный щелочной белок эозинофильных гранулоцитов (ГЩБ). Содержится в боль-
ших гранулах эозинофилов. Имеет мол. массу 9,2 кДа и рИО.
Гликофорин. Трансмембранный гликопротеин эритроцитов. Расположен в основном
на наружной поверхности мембраны.
ГЛТ. Триполимер L-глутаминовой кислоты, L-лизина и L-тирозина. Синтетический
антиген.
Гомозиготные типирующие клетки (ГТК). Лимфоциты индивидов, гомозиготных по ал-
лелям HLA-D, т. е. получивших от отца и матери идентичные аллели HLA-D.
Гомологичные области. Участки сходной последовательности аминокислотных остатков
в тяжелых и легких цепях иммуноглобулинов. Каждая гомологичная область насчитывает
105—115 остатков и стягивается внутрицепьевым дисульфидным мостиком, образуя гло-
булярный домен, подобный по форме соседним доменам.
Гомотела (homobodies). Антиидиотипические антитела (Ат2), полученные в результате
иммунизации антителами ATj. Несут идиотопы перекрестнореагирующие с эпитопами анти-
гена, т. е. являются как бы «внутренним образом антигена».
Гранулема. 1) Узелок грануляционной ткани. 2) Ограниченный участок продуктивного
воспаления. Локальное скопление (инфильтрация) макрофагов, эпителиоидных клеток, лим-
фоцитов в соединительной ткани. В гранулемах встречаются также гигантские клетки, плаз-
матические клетки и фибробласты. Гранулемы образуются при хронических инфекциях
324
Словарь терминов
и инвазиях в ответ на введение чужеродных частиц и иммунологических адъювантов. В за-
висимости от этиологии гранулемы имеют различный цитологический состав.
ГТК см. Гомозиготные типирующие клетки.
ГЩБ см. Главный щелочной белок эозинофильных гранулоцитов.
ДАГ. 1,2-диацилглицерол.
Дауди (Daudi) клеточная линия. Перевиваемые лимфобласты человека, полученные из
африканской лимфомы Бэркитта.
Дезетоп (desetop, determinant selection site). Участок молекулы МНС класса II, кон-
тактирующий с агретопом фрагмента «процессированного» антигена при его презентации
Т-хелперу. Дезетоп осуществляет селекцию антигенных детерминант, активирующих Т-
хелперы.
Делеция, нехватка, выпадение (deletion). Потеря какого-либо участка генетического
материала.
Дендритные клетки. 1) ФДК. Фолликулярные дендритные клетки в зародышевых цен-
трах лимфатических узлов и селезенки. Обладают длинными отростками, которые прости-
раются между лимфоидными клетками. На этих отростках длительное время персистирует
антиген, доставленный в лимфоидную ткань. 2) Отросчатые адгезивные интердигитатные
клетки белой пульпы селезенки, коры лимфатических узлов и тимуса. Происходят из костно-
го мозга. Экспрессируют значительное количество антигенов МНС класса II. Функциони-
руют как А-клетки. 3) Дендритные эпителиальные клетки коры тимуса. Экспрессируют зна-
чительное количество антигенов МНС класса II.
Дееенсибилизация. 1) Временное подавление эффекторного звена иммунного ответа
при повторном введении антигена. 2) Гипосенсибилизация. Способ лечения гиперчувстви-
тельности немедленного типа (аллергии). Аллергены вводят многократно в нарастающих
дозах (или однократно в виде депонированного препарата) для стимуляции синтеза блоки-
рующих антител класса IgG, которые либо конкурируют с антителами IgE за аллергены,
либо подавляют дальнейший синтез IgE. При этом возможна также активация специфиче-
ских Т-супрессоров.
Диизопропилфторфосфат (ДФФ). Необратимый ингибитор сериновых протеиназ, на-
пример трипсина. Токсичное фосфоорганическое соединение.
Дифференцировка лимфоцитов. Многоэтапный и многоходовой путь созревания и раз-
вития лимфоцитов от плюрипотетной стволовой кроветворной клетки до иммунокомпетент-
ных клеток, выполняющих специализированную функцию. Конечные стадии дифференци-
ровки происходят в присутствии антигена (антигензависимая дифференцировка). В основе
дифференцировки лежат малоизученные процессы дифференциальной транскрипции генов,
контролируемой белками-регуляторами, а также транслокации последовательности ДНК
в ходе онтогенетической полиферации предшественников иммунокомпетентных клеток. Осо-
бое значение в дифференцировке лимфоцитов имеют дистантные и контактные межклеточные
взаимодействия, реализуемые гормонами, интерлейкинами, аутокондами и т. п.
Дифференцированные антигены. Специфичные для определенной стадии или этапа алло-
или ксеноантигенные маркеры лимфоцитов. Например, ксеноантиген ТЬВ на предшествен-
никах Т- и В-лимфоцитов мышей.
ДНК-зонд. Одноцепочечный радиоактивно- или ферментномеченный клонированный
фрагмент ДНК. Используется в реакции гибридизации для локализации специфических по-
следовательностей нуклеиновых кислот в хромосомах и клетках, для подсчета числа копий
данного гена, для выявления участка последовательности ДНК, транскрибируемой в мРНК
и т. п.
Домен (domain). Стереотипное проявление третичной структуры (пространственной
укладки) белков. Глобулярное образование, включающее участок цепи длиной до 150 ами-
нокислотных остатков, последовательность которых иногда может быть близка (гомологична)
последовательности участка, образующего соседний домен. См. Гомологичные области.
Дополнительная иммунизация (supplemental immunization). Для образования антител
к гаптену, вводимому при первичной иммунизации на носителе А, а при вторичной — на но-
сителе Б, необходимо между первичным и вторичным введением антигена провести дополни-
тельную иммунизацию носителем Б. Возможность получения антител в этом случае свидетель-
ствует о кооперативном взаимодействии между специфичными к носителю Т-лимфоцитами
и специфичными к гаптену В-лимфоцитами в ходе иммунного ответа.
Дофамин. 3,4-дигидроксифенилэтиламин. Один из катехоламинов, нейромедиатор.
Используется в биосинтезе адреналина и норадреналина в мозговом веществе надпочечников
и в нервных клетках.
Дрейера-Беннета (Dreyer — Bennett) гипотеза. В 1965 г. Уильям Дрейер и Клод Бен-
нет из Калифорнийского технологического института предположили, что V- и С-области це-
пей иммуноглобулинов кодируются разными генами, причем в клетках зародышевого пути
имеется по одному гену для С-области каждой цепи и много тысяч генов, кодирующих синтез
Словарь терминов
325
V-областей. Предполагалось также, что полный VC-ген для молекулы антитела образуется
в результате генетической рекомбинации в предшественниках плазматических клеток. Спра-
ведливость этой гипотезы доказал Сусиму Тонегава, показав с помощью мРНК- и кДНК-
зондов, что в продуцирующих антитела клетках V- и С-последовательности локализованы
в одном и том же рестрикционном фрагменте ДНК. В то же время в эмбриональной ДНК
V- и С-гены разъединены.
Дрейф генетический (genetic drift). Изменение частоты аллелей в популяции в направ-
ленной (устойчивый дрейф) или ненаправленной (случайный дрейф) форме.
Дупликации генов тандемные. Идентичные гены, повторяющиеся в хромосоме один
за другим.
Дупликация генов (gene duplication). Удвоение участка хромосомы в результате ре-
комбинации ДНК (неравного кроссинговера, транслокаций, избыточной региональной репли-
кации и т. п.). Основной механизм накопления избытка генетического материала, появления
новых генов и, следовательно, прогрессивной эволюции.
ДФФ см. Диизопропилфторфосфат.
Дыхательная вспышка (respiratory burst). «Метаболический взрыв». Резкое нарастание
обменных окислительных процессов в мононуклеарных фагоцитах, эозинофильных и ней-
трофильных гранулоцитах, вызванное активацией и фагоцитозом.
Единица генетической карты (map unit). Единица расстояния между локусами на карте
хромосомы, измеряемая частотой рекомбинаций. Морганида. Одна моргаиида соответствует
частоте кроссинговера 1 %.
«Застежки-молнии» гипотеза («zipper» hypothesis). Процессированный антиген нахо-
дится на презентирующей клетке как бы под «застегнутой» поверхностной мембраной и поэ-
тому не доступен антителам. Но при контакте с рецептором Т-клетки эта мембрана «рассте-
гивается».
Зимоген. Неактивный предшественник фермента. Например, Cis — это зимогенная
эстераза, которая активируется при расщеплении под действием Clr.
Зимозан. Смесь Mg-содержащих гликопротеинов, экстрагированных из клеточных сте-
нок дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Активирует систему комплемента по альтернативному
пути. Связывает СЗЬ.
Идиотип (idiotype). Набор идиотопов, присущих антителам, которые образует данный
клон В-клеток. Кроме индивидуального идиотипа, уникального для данного клона В-кле-
ток, существуют общие перекрестнореагирующие идиотипы антител, образуемых разными
клонами с различной антительной специфичностью. Перекрестнореагирующие идиотипы
наследуются. Например, идиотипы А5А, TI5, 1558, ARS и NP у мышей.
Идиотипическая супрессия (idiotype supression). Подавление образования иммуногло-
булинов данного идиотипа антиидиотипическими антителами.
Идиотипической сети концепция (idiotype network concept). Постулированная в 1974 г.
Нильсом Ерне теория функционирования иммунной системы как сетевого сбалансированного
взаимодействия между идиотопами антител и лимфоцитарных рецепторов.
Идиотоп (idiotope, idiotypic determinant). Одна из собственных антигенных детерми-
нант активного центра (вариабельного домена) антител, продуцируемых одним определен-
ным или небольшим числом близких клонов В-клеток. Идиотипические детерминанты выяв-
ляются антиидиотипическими антителами.
ИДК см. IRC и Интердигитатные клетки.
«Измененного своего» гипотеза (altered-self hypothesis). Предположение о том, что
Т-лимфоцит распознает новые или комплексные детерминанты, возникающие при взаимодей-
ствии «своего» антигена МНС с чужеродным антигеном на поверхности презентирующей клет-
ки.
Изоаллотипические немаркерные детерминанты (isoallotypic non-marker determinants).
Антигенные детерминанты, экспрессирующиеся одновременно как аллотипические и как
изотипические. Например, Gm детерминанты экспрессируются как аллотипические на IgG4
и как изотипические на IgG2.
Изотипические детерминанты (isotypic determinants). Антигенные маркеры, в неиз-
менном виде присущие всем представителям данного вида. Например, антигенные детерми-
нанты классов и подклассов тяжелых цепей, а также типов легких цепей иммуноглобулинов.
Иммортализация. Получение «бессмертной» стабильной, способной к неограниченному
размножению, клеточной линии из клеток, чье время жизни в культуре ограничено. Напри-
мер, получение гибридом путем слияния «бессмертных» клеток миеломы с короткоживу-
щими В-лимфоцитами.
Иммунодоминантность (immunodominance). Свойство какой-либо из частей эпитопа
вносить наибольший вклад в энергию связывания с активным центром антитела.
326
Словарь терминов
Иммунологические цепи (immunological circuits). Коммуникационные регуляторные
межклеточные взаимодействия с последовательным вовлечением лимфоидных клеток раз-
личных типов.
Иммунологическое обучение (immunologic learning). Феномен нарастания аффинности
антител в ходе иммунного ответа в прямой зависимости от времени, прошедшего после имму-
низации.
Иммуноприлипание. Иммуноадгезия (immune adherence). Прилипание бактерий и про-
стейших, нагруженных антителами и комплексами антиген — антитело к эритроцитам при-
матов, тромбоцитам кролика, макрофагами полиморфноядерным гранулоцитам млекопитаю-
щих. Прилипание происходит при активации комплемента и опосредовано через СЗЬ и С4Ь.
Например, реакция Кричевского — Риккенберга: прилипание живых трипаносом или спиро-
хет к тромбоцитам при трипаносомиазе и некоторых спирохетозах.
Иммуноцитоприлипание. Иммуноцитоадгезия (immunocytoadherence). Образование ро-
зеток эритроцитов, нагруженных антигеном, вокруг клеток, несущих специфический мем-
бранный или цитофильный иммуноглобулин.
ИНА. См. NIP.
Инбредная линия. Чистая линия. Генетически идентичные, сингенные эксперимен-
тальные животные. Получены последовательным скрещиванием брат—сестра в не менее,
чем 40 поколениях и поддерживаемые этой же системой скрещивания.
Индуцибельность. Зависимость синтеза определенного клеточного антигена от присут-
ствия в культуре индукторов. Например, аллоантиген Lna-1 синтезируется мышиными Т-
и В-лимфоцитами в присутствии индукторов — таких как конканавалин А или бараньи
эритроциты.
Инициации факторы. Белки IF1, IF2, IF3 и т. д., катализирующие начало синтеза
полипептидной цепи в рибосоме на мРНК-матрице. Регулируют скорость белкового син-
теза.
«Инородного тела» клетки. Гигантские клетки с развитой цитоплазмой и многочис-
ленными ядрами. Образуются путем слияния макрофагов в гранулемах и в грануляционной
ткани вокруг неметаболизируемых инородных частиц или тел, попавших в ткани организма
извне и вызвавших хроническое воспаление.
Интегральные мембранные белки. Прочно связаны с липидным бислоем клеточной
мембраны. Выделяются только после его разрушения детергентами или органическими рас-
творителями.
Интегумент (integument). Внешний покров, оболочка.
Интердигитатные клетки (ИДК). Клетки с переплетающимися отростками в тимусза-
висимых областях периферической лимфоидной ткани. Функционируют как А-клетки.
Интеркросс (intercross). Скрещивание между собой межлинейных гибридов первого
поколения (F,).
Интерлейкин-1 (IL-1). Фактор, активирующий лимфоциты, эндогенный пироген, эндо-
генный лейкоцитарный медиатор, фактор мононуклеарных клеток. Белок. Мол. масса 14—
17 кДа, р! 5,0. Синтезируется моноцитами, макрофагами (монокин), дендритными, эндо-
телиальными, эпителиальными клетками, фибробластами, астроцитами и натуральными
киллерами. Функционирует как кофактор для роста и созревания Т- и В-клеток. Активи-
рует Т-, В-клетки и натуральные киллеры. Вызывает хеметаксис нейтрофилов, макрофагов
и лимфоцитов, пирогенную реакцию и усиленный катаболизм.
Интерлейкин-2 (IL-2). Фактор роста и созревания Т-клеток. Ростовой фактор, образуе-
мый Т-клетками. Фактор, заменяющий Т-клетки. Хелперный фактор для киллеров. Белок.
У человека мол. масса 15 кДа, pl 6,8; 7,1. У мышей мол. масса 25 кДа, pl 4,3—4,5; 4,9—
5,1. Синтезируется только активированными Т-клетками. Стимулирует рост активирован-
ных Т-клеток и образование ими лимфокинов. Стимулирует активность цитотоксических
Т-клеток, натуральных киллеров, моноцитов. Функционирует как кофактор пролиферации
В-лимфоцитов. Стимулирует созревание В-лимфоцитов.
Интерлейкин-3. Фактор, стимулирующий рост колоний кроветворных клеток. Фак-
тор роста тучных клеток. У мышей мол. масса 28 кДа, pl 4,5—8,0. Синтезируется активи-
рованными Т-клетками, миеломоноцитарной линией клеток. Стимулирует рост плюрипо-
тентных стволовых кроветворных клеток и их специализированных потомков. Поддерживает
рост пре-В-клеточной линии и тучных клеток. Стимулирует «дыхательную вспышку» фаго-
цитирующих клеток.
Интерлейкин-4. Фактор роста В-клеток, фактор стимулирующий В-клетки, фактор
активирующий макрофаги. Белок. У мышей мол. масса 15—20 кДа, р! 6,4—6,7; 7,4—7,6;
8,5—8,7. Секретируется активированными Т-клетками, тучными клетками, линией В-кле-
ток. Кофактор при стимуляции антителообразования В-клетками. Стимулирует пролифера-
цию В-лимфоцитов. Ростовой фактор для Т-лимфоцитов. Стимулирует антигенпрезентирую-
щую активность В-клеток и макрофагов. Стимулирует образование гигантских клеток.
Ростовой фактор для предшественников кроветворных клеток.
Словарь терминов
327
Интерлейкин-5. Фактор, заменяющий Т-клетки. Фактор роста и созревания эозино-
филов. Фактор роста В-клеток. Хелперный фактор для Т-киллеров. Белок. У мышей мол.
масса 45—60 кДа, pl 5,5. Синтезируется Т-клетками. Стимулирует пролиферацию активи-
рованных В-лимфоцитов и секрецию антител. Стимулирует рост и созревание эозинофилов
и цитотоксических Т-лимфоцитов.
Интерлейкин-6. Фактор роста плазмацитом и гибридом. Фактор, стимулирующий В-
клетки. Фактор дифференцировки В-клеток. Белок. У мышей мол. масса 22 —29кДа, р!
5,0—7,0; у человека — 19—34 кДа, р! 4,9. Синтезируется Т-клетками, моноцитами, мак-
рофагами, фибробластами, стромальными и некоторыми опухолевыми клетками, а также
гибридомами. Стимулирует образование антител В-клетками, синтез острофазных белков
клетками печени и экспрессию молекул МНС класса I на фибробластах. Кофактор при
стимуляции пролиферации Т-лимфоцитов.
Интернализация (internalization). Перемещение во внутрь клетки. Например, опосре-
дованный рецепторами эндоцитоз макромолекул или частиц.
Интерфероны. Белки, подавляющие репликацию вирусов в клетках. Видоспецифичны,
но вирусонеспецифичны. Различают типы: а-интерферон (лейкоцитарный), р-интерферон
(фибробластный) и у-интерферон (иммунный), а- и p-Интерфероны (мол. масса от 17 до
45 кДа) — это классическая индуцированная вирусом форма. y-Интерферон (мол. масса от
20 до 80 кДа) освобождается Т-лимфоцитами, натуральными киллерами и активированными
макрофагами как цитокин и, в отличие от а- и p-интерферонов, лабилен при pH 2,0; стиму-
лирует экспрессию молекул МНС класса II, антимикробную и противоопухолевую актив-
ность макрофагов, а также натуральных киллеров; является кофактором дифференцировки
и активации В-клеток и антагонистом действия на В-клетки интерлейкина-4.
Интроны (introns от англ, intervening regions). Вставочные некодирующие последова-
тельности генов и первичных РНК-транскриптов у эукариот.
Истощение антисыворотки. Устранение нежелательных и перекрестнореагирующих
антител из иммунной сыворотки для повышения ее специфичности.
ИФА см. ELISA.
Каллидин. Лизилбрадикинин. Декапептид Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg.
Образуется из кининогена под действием тканевого калликреина. Повышает проницаемость
мелких кровеносных сосудов. Расширяет артериолы. Сужает вены.
Калликреины. Кининокиназы. Трипсиноподобные сериновые протеиназы (эстеразы).
В крови — 85 кДа, в других тканях (поджелудочная и слюнные железы) — 40 к Да. Превра-
щают кининогены в кинины, плазминоген — в плазмин, проинсулин и проренин — в инсу-
лин и ренин, активируют С1 и С5. Близки по структуре и функции к фактору Хагемана (фак-
тор XII) и фактору XI свертывающей системы крови, а также к Clr и Cis.
Кальмодулин. Кальцийсвязывающий белок. Состоит из 148 аминокислотных остатков.
Мол. масса 16,7 кДа. В цитоплазме клеток Са2+, связываясь с кальмодулином, изменяет его
конформацию и превращает в активатор (регуляторную субъединицу) ферментов, например,
фосфодиэстераз.
Катепсин G. Нейтральная сериновая протеиназа азурофильных гранул (лизосом)
полиморфноядерных гранулоцитов. Сильноосновный белок с мол. массой 28 кДа. Обладает
антимикробным действием.
КБГ см. Кожная базофильная гиперчувствительность. Реакция Джонза — Моу-
та.
К-ВМВ. Кининогены высокого молекулярного веса см. Кининогены.
КГГ. Куриный гамма-глобулин.
кДНК. 1) Комплементарная цепь ДНК, синтезированная на РНК-матрице с помощью
обратной транскриптазы. 2) Клонированная ДНК.
Кининогены. Предшественники кининов. Белки с мол. массой 70 кДа (низкомолеку-
лярные) и 110 кДа (высокомолекулярные). Превращаются в кинины под действием калли-
креинов. Высокомолекулярный кининоген присутствует в плазме крови в комплексе с пре-
калликреином или фактором XI системы свертывания.
Кинины. Низкомолекулярные пептиды, вызывающие сокращение и расслабление глад-
ких мышц, увеличение сосудистой проницаемости и локальное ощущение боли. 1) Брадикини-
ны (брадикинин, лизилбрадикинин и метиониллизилбрадикинин). При местном образовании
из киногенов вызывают транспорт жидкости из сосудистого русла в ткани. 2) Кинины яда
ос, шершней и золотистой ставриды. Брадикинин кожи жаб. 3) Лейкокинины.
Кислорода токсические метаболиты. Нестабильные продукты восстановления кисло-
рода: супероксид-анион О2, пероксид водорода Н2О2, радикал ОНД-ОН) и синглетный кисло-
род 1 О2(1О2). Образуются при «дыхательной вспышке» в цитоплазме фагоцитов вследствие
усиленного окислительного метаболизма. Обладают антимикробными и цитотоксическими
свойствами.
328
Словарь терминов
Кластер (cluster). 1) Группа (агломерат) ранее разобщенных клеток, объединившихся
в результате взаимной адгезии. 2) Сцепленные вместе сходные макромолекулярные струк-
туры. 3) Группа наследуемых сцепленно генов.
Клональная делеция. Клональная анергия. Утрата клона иммунореактивных клеток,
несущих определенный идиотип. Проявляется необратимой утратой способности к иммун-
ному ответу на соответствующий антиген.
Клонирование в космидах. Использование при молекулярном клонировании cos-сай-
тов ДНК фага X. Клонированные в плазмиде cos-сайты лигируют с длинными фрагментами
эукариотической ДНК (порядка 35—45 т.п.н.), которые упаковываются в фаговые головки,
благодаря тому, что ферменты упаковки узнают cos-сайты. Фагами заражают бактерии, в ко-
торых и происходит репликация химерной молекулы ДНК.
Клонирование генов. Выделение и размножение специфических фрагментов чужерод-
ных ДНК в плазмидных или фаговых векторах, реплицирующихся в культурах бактерий
или дрожжей. Центральный метод технологии рекомбинантных ДНК, разработанный в 72—
73 гг. в лабораториях Бойера, Коэна и Берга в Станфорде и в Сан-Франциско (США).
Клонотип-специфические детерминанты (clonally specific). Уникальные, вероятно идио-
типические, детерминанты клона Т- или В-клеток, выявляемые только моноклональными
антителами к данному клону и отсутствующие на других клонах, реагирующих на тот же
самый антиген. Существование клонотип-специфических детерминант объясняется широким
репертуаром идиотипов иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов данной специфичности.
Коагглютинация (co-agglutination). Смешанная агглютинация во взвеси исследуемых
бактерий при добавлении клеток Staphylococcus aureus, нагруженных специфическими к ис-
следуемым бактериям антителами. Используется убитая взвесь стафилококков, богатых бел-
ком А (штамм Cowan), с которым связывает С-концевые участки тяжелых цепей анти-
тел.
Когнатное (cognate— близкий) межклеточное взаимодействие. Хелперный или супрес-
сорный эффект Т-клеток при непосредственном сближении с В-лимфоцитами через антиген-
ный «мостик». Предполагается одновременное узнавание детерминант гаптена В-лимфоцитом
и детерминант носителя Т-лимфоцитом на одной и той же молекуле антигена, сочетанное с уз-
наванием молекул МНС класса II. Из всего репертуара клонов в когнатном взаимодействии
участвуют только клоны Т- и В-клеток, специфичные к данному антигену. Некогнатное взаи-
модействие рассматривается как дистантная, опосредованная растворимыми факторами по-
ликлональная кооперация Т- и В-клеток.
Кодоминантная экспрессия. Полное выражение обоих аллелей данного локуса у гете-
розигот, т. е. ни один из пары генов не доминирует над другим.
Кожная базофильная гиперчувствительность (КБГ). Реакция Джонза — Моута (cuta-
neous basophil hypersensitivity. Jones — Mote reaction). Транзиторная (быстро исчезающая)
гиперчувствительность замедленного типа с отложенной кожной реакцией на антиген (мак-
симум через 24 ч после инъекции). Отличается от классической ГЗТ тем, что в местах введе-
ния антигена накапливаются базофильные гранулоциты, составляющие у морской свинки
до 60% воспалительного инфильтрата, индурация развивается слабее и имеет место локаль-
ное повышение концентрации гистамина.
«Кожного окна» метод (skin window techniques). Метод Рибака (Rebuck). Исследова-
ние клеточного состава воспалительного экссудата, образующегося на участке скарифици-
рованной кожи, при помощи реплик на покровных стеклах в динамике.
Кокэппинг (cocapping). Совместное перемещение нескольких антигенных детерминант
или структур при кэппинге, свидетельствующее об их принадлежности к одной и той же
макромолекуле.
Колониестимулирующие факторы см. CSF.
Колхицин. Трополоновый алколоид из растений семейства Liliaceae. Ингибитор митоза.
Связывается с тубулином и блокирует его участие в полимеризации микротрубочек.
Колцемид. Демеколцин. Х-деацетил-М-метилколхицин. Ингибитор митоза, подобный
колхицину.
Комбинаторные аллоантигенные детерминанты. «Гибридные» антигенные детерминанты
а- и P-цепей молекул МНС класса II. Следствие транскомплементации /r-генов у гетерозигот.
Коммитированность (от англ, commit — поручать) клеток-предшественников. Запро-
граммированность клеток-предшественников на определенное направление дифференциров-
ки или на синтез одного определенного продукта.
Компартментация. Пространственное разобщение по обособленным структурам в клет-
ке и по различным органам и тканям в организме.
Комплемента активация по альтернативному пути (alternative pathway). Активация
компонентов СЗ — С9 без участия Cl, С2 и С4. Пропердиновый путь активации. Начинается
с активации СЗ, образования СЗа и СЗЬ, а также СЗ-конвертазы альтернативного пути, СЗ
активируется без участия антител продуктами бактериального, грибкового и растительного
происхождения (липополисахаридами, пептидогликанами, полисахаридами, стафилококке-
Словарь терминов
329
вым белком А, зимозаном). Не активирующие комплемент по классическому пути агрегаты
и комплексы IgA и Р(аЬ)2-фрагментов с антигеном способны активировать СЗ.
Комплемента активация по классическому пути (classical pathway). Начинается со свя-
зывания Clq с Fc-участками антител, после того как молекулы комплементсвязывающих
иммуноглобулинов (IgM, IgGl, IgG2, IgG3) образуют иммунные комплексы с антигеном или
агрегаты друг с другом. Вслед за С1 в активацию вступают С4 и С2, образуя СЗ-конвертазу
классического пути. Затем происходит последовательная каскадная активация СЗ — С9.
Комплементация генов. Взаимодополняющее фенотипически экспрессируемое действие
гомологичных участков генома, генов и различных сайтов одного гена.
Конверсия генов (gene conversion). Изменения структуры генов вследствие вставок,
делеций и рекомбинаций при ошибках копирования, трансрепликациях, инверсиях, инте-
грации гетерологичной ДНК и т. п.
Конгенные линии мышей. Коизогенные линии. Имеют идентичные генотипы, за исклю-
чением различий по определенному гену или локусу.
Конгенные резистентные линии мышей (КР). Линии с идентичными генотипами, за
исключением различий по генам гистосовместимости. Вследствие этого взаимно резистентны
к межлинейной трансплантации тканей.
Конгенные рекомбинантные линии мышей. Имеют идентичные генотипы, за исключе-
нием различий по отдельным генам комплекса Н-2, возникшим вследствие рекомбинаций
в пределах этого комплекса.
Кондиционированная среда (conditioning — установление требуемого состава). Пита-
тельная среда для культивирования клеток, содержащая в необходимой концентрации мета-
болиты и факторы роста. Для кондиционирования в среде сначала культивируют фидерные
клетки, а затем используют ее для выращивания основной культуры клеток.
Константа конформационного равновесия (conformational equilibrium constant). Соот-
ношение равновесных концентраций пептида в нативной и ненативной (процессированной)
конформации, функционирующего в качестве антигенной детерминанты при связывании
с активным центром антитела.
Конформационные антигенные детерминанты. Топохимические детерминанты. Обус-
ловлены третичной и четвертичной структурой нативного антигена.
Кор (core). Коровая часть. Ядро, сердцевина макромолекулярной структуры.
Костимулятор. Фактор дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов. См.
CDF.
КР см. Конгенные резистентные линии мышей.
Криптодетерминанты см. Скрытые антигенные детерминанты.
Кроссинговер (crossing-over). Перекрест. Взаимный обмен участками гомологичных
хромосом в результате разрывов и соединения в новом порядке их нитей в мейозе и реже
в митозе. Приводит к новым комбинациям генов или их частей.
Кроссинговер неравный (unequal cross-over). Реципрокная транслокация между гомо-
логичными хромосомами с разрывами в неидентичных точках и обменом неравными сегмен-
тами. При этом в одной хромосоме образуется дупликация, а в другой — делеция.
Ксенотип. Структурные или антигенные различия между молекулами, принадлежащи-
ми животным разных видов.
Купферовские клетки. Резидентные макрофаги, выстилающие кровеносные синусы пе-
чени. Активно удаляют чужеродные частицы из кровотока.
КЧ см. Контактная чувствительность.
Кэппивг (capping — колпачок). Скопление агрегированных белков в виде кластеров
или пэтчей в одной области клеточной поверхности. У лимфоцитов агрегированные полива-
лентным лигандом компоненты клеточной мембраны перемещаются в хвостовую часть клет-
ки, образуя «колпачок».
Лактоферрин, лактосидероферрин, лактотрансферрин. Белок с мол. массой около
80 кДа, связывающий от 2 до 6 атомов железа на молекулу. Содержится в грудном молоке,
плазме крови, гранулоцитах и макрофагах. Аполактоферрин обладает бактериостатической
активностью, конкурируя с бактериями за органически связанное железо. Участвует в гене-
рации радикала ОН" и в регуляции гранулопоэза.
Лазерный сортировщик клеток (ЛСК). Прибор для проточной флуорометрии и сорти-
ровки флуорохромированных клеток. Проходя через пучок лучей лазера, клетки рассеивают
их и испускают флуоресценцию. По заданным параметрам светорассеяния и флуоресценции
прибор электрофоретически сортирует клетки, автоматически помещая их в капли среды,
имеющие нейтральный, положительный или отрицательный заряд. См. FACS.
Лангганса клетка (Langhans cell). Гигантская многоядерная клетка гранулемы. Обра-
зуется путем слияния макрофагов, эпителиоидных или эндотелиальных клеток. Характерна
для туберкулезной гранулемы. Ядра расположены на периферии цитоплазмы.
11-0395
330
Словарь терминов
Лангерганса клетка (Langerhans cell). Отросчатая клетка в эпидермисе. Содержится в
цитоплазме гранулы Бирбека. Экспрессирует антигены МНС класса II, рецепторы для Fc IgG
и СЗЬ. Относится к системе мононуклеарных фагоцитов. Функционирует как А-клетка.
Лейкининоген. Белок асцитической жидкости. Мол. масса 41 кДа. Содержится также
в нормальной плазме крови после прогревания при 57°С.
Лейкокинины. 1) Полипептиды, содержащие 21—25 аминокислотных остатков. Обра-
зуются из лейкининогенов, расщепляемых катепсином D. Повышают проницаемость и рас-
ширяют кровеносные сосуды. 2) Лейкофильные у-глобулины сыворотки крови, синтезируе-
мые селезенкой.
Лейкотриены А, В, С, D, Е. Фармакологически активные продукты липоксигеназного
превращения арахидоновой кислоты. Семейство гидроксиэйкозатетраеновых кислот (см.
также НЕТЕ и ОЭТЕ). Освобождаются тучными клетками, лейкоцитами и тромбоцитами.
Лектины. Белки и гликопротеины, способные к специфическому связыванию с угле-
водными компонентами макромолекул и клеточных структур. Лектины выделяют из семян
растений, однако они найдены у большинства живых организмов. Обладают избирательной
митогенной активностью в отношении различных субпопуляций лимфоцитов. Агглютини-
руют эритроциты, специфически взаимодействуя с их поверхностными структурами.
Летали (lethals). Летальные гены. Менделирующие генетические факторы, вызывающие
гибель особи до достижения половозрелости.
Летальный удар. Запуск цитолитического механизма. Фаза взаимодействия между ци-
тотоксическим Т-лимфоцитом и клеткой-мишенью. Приводит к необратимым изменениям
цитоплазматической мембраны клетки-мишени, которая после этого гибнет даже в отсутствие
цитотоксического Т-лимфоцита. Происходит только при 37 °C и требует Са2+.
Лидер. Лидерная (сигнальная) последовательность. Дополнительный пептид из
15—25 аминокислотных остатков, расположенный в молекуле белка-предшественника на
N-концевое.
Лизогенная конверсия. Фенотипическая изменчивость бактерий, наблюдающаяся при
лизогенизации, т. е. при включении профага (генома умеренного бактериофага) в бактериаль-
ную хромосому или при существовании фага в виде изолированной кольцевой молекулы
ДНК.
Лимитирующих разведений метод Лефковитса. Определение частоты клеток-предшест-
венников или клеток, активных в кооперации, путем ретроспективного анализа по числу
пролиферирующих или отвечающих микрокультур в ряду разведений исходной популяции.
Метод сводится к нахождению того разведения, в котором исследуемая клетка будет присут-
ствовать в единственном числе. Создаются условия, при которых каждый клон образуется
из одной клегки-предшественника и ответ в микрокультуре лимитируется только титруемым
типом клеток. Готовят ряд разведений исходной взвеси таким образом, чтобы, согласно пред-
положению, примерно треть последних микрокультур не содержала ни одной клетки с иссле-
дуемой активностью. Микрокультуры выращивают. Воспользовавшись формулой Пуассона,
по доле неотвечающих микрокультур можно рассчитать частоту клеток с исследуемой проли-
феративной и кооперативной активностью в исходной взвеси.
Лимфокины (lymphokine). Собирательное название для не относящихся к иммуногло-
булинам белков и полипептидов, выделяемых примированными лимфоцитами (преимуще-
ственно Т-лимфоцитами) в состоянии активации. Активацию вызывают специфические анти-
гены. Непримированные лимфоциты образуют лимфокины под действием поликлональных
активаторов, аутокоидов, других цитокинов и т. п. Лимфокины функционируют как корот-
кодистантные медиаторы межклеточных взаимодействий в иммунном ответе. Семь лимфо-
кинов идентифицированы химически и получены в чистом виде методами рекомбинантных
ДНК. Они названы интерлейкинами 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7. Некоторые из лимфокинов обла-
дают способностью связываться с антигеном, с идиотопами антител и несут детерминанты
МНС класса II. Действие интерлейкинов плейотропно.
Лимфотоксин. Лимфокин, синтезируемый некоторыми субпопуляциями Т-лимфоцитов.
Мол. масса около 80 кДа. Вызывает неспецифический лизис ряда нелимфоидных клеток-
мишеней. Вопреки ранним представлениям, к цитолитической активности цитотоксических
Т-лимфоцитов отношения не имеет.
Липкие концы (sticky ends). Комплементарные одноцепочечные участки ДНК, обра-
зующиеся в результате ступенчатых разрывов в двухцепочечной ДНК под действием ре-
стриктаз.
ЛСК см. Лазерный сортировщик клеток.
МАГ. Моноацилглицерол.
Матрица. Макромолекулярный шаблон для синтеза новой копии макромолекулы.
На'пример, матричная цепь ДНК, на которой реплицируется дочерняя цепь ДНК с ком-
плементарной последовательностью оснований или транскрибируется молекула мРНК.
Менделирование (Mendelian inheritance). Наследование признака по законам Менделя.
Словарь терминов
331
Мини-гены (minigenes). Согласно частично подтвержденной гипотезе Кэбата (Kabat),
отдельные гены, кодирующие гипервариабельные участки тяжелых и легких цепей в вариа-
бельном домене молекулы иммуноглобулинов. Входят в состав 7-генов.
Митоген. Любой агент, индуцирующий активацию, бласттрансформацию и пролифера-
цию (митозы) лимфоцитов. Например, поликлональные активаторы. В гетерогенной популя-
ции клеток конечный эффект митогенного действия чаще всего опосредован через интерлей-
кины и индукцию рецепторов к ним.
Митоген из фитолакки (МФЛ) (PWM. Pokeweed mitogen). Пять лектинов из Phyto-
lacca americana. Ра 1, 2, 3, 4 и 5. Ра 1 активирует Т- и В-лимфоциты. Ра 2, 3 и 4 активи-
руют только Т-лимфоциты.
Митрамицины. Противоопухолевые антибиотики из Streptomyces plicatus.
МКЛА см. MBLA.
МКТКА см. МКТСА.
Модуляция (modulation). 1) Антигенная модуляция. Исчезновение или появление но-
вых антигенных детерминант на поверхности живых клеток после присоединения специфи-
ческих антител. 2) Иммуномодуляция. Изменение количественных параметров иммунного
ответа в сторону увеличения или уменьшения.
Моногамная бивалентность антител (monogamious bivalency). Способность молекулы
антитела связываться более, чем с одной, идентичной детерминантой одной молекулы поли-
валентного антигена.
Монокины (monokines). Секретируемые мононуклеарными фагоцитами факторы, регу-
лирующие функцию лимфоцитов. Например, интерлейкин-1.
Мономорфные антигены (или гены). Антигены (или гены), не имеющие аллельных ва-
риантов.
МПО. Миелопероксидаза.
Мультиспецифическое связывание. Связывание гомогенных (моноклональных) антител
со структурно различными молекулами антигенов, обусловленное комплементарностью неко-
торых антигенных детерминант отдельным участкам антигенсвязывающих центров анти-
тел.
Мурамилдипептид, М-ацетилмурамил-Ь-аланил-П-изоглутамин. Наиболее простая
структурная единица бактериальных пептидогликанов, способная заменить целые микобак-
терии в составе полного адъюванта Фрейнда. Обладает разнообразными иммуноадъювантны-
ми свойствами.
Мутации соматические. Генные, хромосомные и геномные, спонтанные и индуцирован-
ные изменения структуры ДНК в соматических клетках. Источник генотипической измен-
чивости в онтогенезе.
МФ см. Фактор прилипающих клеток.
МФЛ см. Митоген из фитолакки.
Неоантигены. 1) Новые тканевые антигены, возникающие в организме в результате па-
тологических процессов. В норме не определяются ни у плода, ни у взрослого. Например,
некоторые антигены опухолей. 2) Новые антигены, возникающие при взаимодействии актив-
ных химических веществ, например, динитрохлорбензола или тринитрохлорбензола с бел-
ками кожи при развитии контактной повышенной чувствительности. 3) Антигены, возникаю-
щие при образовании атакующего мембрану комплекса компонентов комплемента С5Ь6789.
Определяются на поверхности Т- и В-лимфоцитов периферической крови. Образуются в ре-
зультате появления новых, отсутствовавших на нативных компонентах, конформационных
детерминант.
Неравновесное сцепление аллелей. Нарушение случайного (равновесного, пропорцио-
нального частотам) сочетания аллелей различных локусов при случайном скрещивании.
НФ. 4-гидрокси-З-нитрофенилацетил. Гаптенная группа.
НФМ. Неспецифический фактор макрофагов (nonspecific macrophage factor). Раствори-
мый фактор, заменяющий макрофаги при индукции Т-хелперов в ответ на корпускулярные
антигены. Не рестриктирован по МНС.
Образование розеток (resetting). Образование агрегатов клеток, например эритроцитов,
вокруг более крупной центральной клетки, например лимфоцита, в первоначально диспер-
гированной взвеси. Следствие взаимной адгезии или рецепторно-акцепторных межклеточ-
ных взаимодействий.
Окаймленные ямки (coated pits). Впячивания плазматической мембраны, имеющие кай-
му из белкового комплекса, трискелиона. Служат для поглощения из внеклеточной жидко-
сти специфических макромолекул путем адсорбционного эндоцитоза, опосредованного ре-
цепторами.
Окислительных реакций всплеск см. Дыхательная вспышка.
и*
332
Словарь терминов
ОКР см. Отросчатые клетки ретикулума.
Олигонуклеотидные зонды. Набор комплементарных олигонуклеотидов, синтезиро-
ванных искусственно, исходя из аминокислотной последовательности исследуемого белка.
Используются для скрининга кДНК или геномных библиотек.
ОЛЛ. Острый лимфобластный лейкоз, при котором лимфобластоподобные клетки обыч-
но лишены маркеров Т- и В-лимфоцитов.
Острое истощение (acute depletion experiment). Устранение аллореактивных клеток ли-
нии А, направленных против антигенов гистосовместимости линии Б, путем фильтрации
в облученном реципиенте Г\ (А х Б) по схеме двухдневной отрицательной селекции. Из
грудного протока реципиентов через два дня после переноса можно получить взвесь лимфо-
цитов, свободную от анти-Б-реактивных клеток.
Острофазные белки (acute phase proteins). Белки плазмы крови, концентрация которых
существенно повышается при воспалении, инфекции и повреждении тканей. Например, С-
реактивный белок, фибриноген, некоторые компоненты комплемента, «j-антитрипсин и оро-
сомукоид.
Отжиг (annealing). Создание условий, обеспечивающих ренатурацию денатурирован-
ных цепей ДНК с восстановлением двухцепочечной структуры.
Отклонение иммунное (immune deviation). Избирательное подавление какого-либо из
проявлений иммунного ответа при использовании особых схем и путем иммунизации. На-
пример, предварительное введение антигена без адъюванта с последующей иммунизацией
в полном адъюванте Фрейнда приводит к образованию антител преимущественно подкласса
IgGl при подавлении ГЗТ и образования антител подкласса IgG2.
Отростчатые клетки ретикулума (ОКР) (interdigitating reticulum cells). Макрофагопо-
добные клетки тимусзависимых областей периферических лимфоидных органов и мозговой
части тимуса. Несут антигены МНС класса II, содержат гранулы Бирбека, функционируют
как А-клетки.
Пактамицин (Pactamycin). Противоопухолевый антибиотик из Streptomyces pactum.
Палиндром. Последовательность ДНК, обладающая симметрией второго порядка, т. е.
читающаяся одинаково как в прямом, так и в обратном направлении (перевертыш).
Память иммунологическая (immunological memory). Способность иммунной системы
быстрее и интенсивнее отвечать на повторную встречу с антигеном. Обусловлена образовани-
ем при первичной встрече с антигеном (примировании) долгоживущих, рециркулирующих
Т- и В-клеток иммунологической памяти.
Папаин. Протеолитический фермент из млечного сока папайи, дынного дерева (Carica
papaya). Расщепляет пептидную связь, гидролизует амиды, эфиры и тиоэфиры. Мол. масса
23 кДа. Используется для фрагментирования иммуноглобулинов и обработки поверхно-
сти эритроцитов, которая делает их чувствительными к агглютинирующему действию непол-
ных антител.
Паракват (paraquat). 1,1-диметил-4,4-бипиридиний, грамоксон, метилвиологен.
Параллельные наборы иммуноглобулинов. Неспецифические иммуноглобулины, обла-
дающие идиотопами, похожими на идиотопы антител с известной специфичностью.
Паратопы (paratopes). Антигенсвязывающие центры молекулы иммуноглобулинов.
Партикулированные антигены (particulate antigens). Корпускулярные антигены. В от-
личие от растворимых антигенов, партикулированные представлены на поверхности есте-
ственных (клетки, бактерии, вирусы, пыльца растений, субклеточные фрагменты и т. п.)
или искусственных (гели, кристаллы, латексы) частиц и быстро не переходят в раствор.
Перекрестная реактивность (cross-reactivity) иммунологическая. Способность иммун-
ной системы, антигенреактивных клеток или антител специфически реагировать с антиге-
ном, отличающимся от использованного при иммунизации. Может быть основана на общих,
совпадающих, либо сходных, но не идентичных, антигенных детерминантах гомологичного
и перекрестнореагирующего антигенов. Гомогенные по специфичности антитела могут все
без исключения связываться с перекрестнореагирующим антигеном, но с меньшей аффинно-
стью, чем с гомологичными (тип I перекрестной реактивности). В гетерогенной популяции
антител с перекрестнореагирующим антигеном может связываться лишь отдельная субпо-
пуляция, но при достаточно высокой аффинности (тип II перекрестной реактивности).
Перфорины (perforins). Токсины, образующие поры. Клеточные цитолизины. Компле-
ментоподобные молекулы, содержащиеся в цитоплазматических гранулах полиморфноядер-
ных гранулоцитов, тучных клеток, натуральных киллеров и, предположительно, Т-лимфо-
цитов.
ПКС. Клетки селезенки, прилипающие к поверхности подложки (spleen adherent cells).
Плейтинг (plating от англ, plate — чашка для культивирования клеток). Фракциони-
рование клеток методом адсорбции—элюции на плоской поверхности пластиковой посуды
для культивирования, нагруженной специфическими лигандами (антителами, антигенами,
клетками-мишенями и т. п.).
Словарь терминов
333
ПМФ. Проточная микрофлурометрия клеток. См. ЛСК и FACS.
Поликлональная активация. 1) Неспецифическая активация многочисленных клонов
В- и Т-лимфоцитов в результате прямого и опосредованного через другие клетки действия
поликлональных активаторов. 2) Неспецифическое вовлечение в иммунный ответ «посторон-
них» клонов Т- и В-лимфоцитов в результате некогнатного, часто МНС-нерестриктированно-
го воздействия Т-амплифайеров, Т-индукторов и Т-хелперов, вступивших в специфический
иммунный ответ. Опосредованный интерлейкинами и другими неспецифическими факторами
межклеточных взаимодействий эффект «свидетеля».
Поликлональная супрессия. Неспецифичное в отношении антигена или идиотипа неког-
натное подавление активности широкого репертуара клонов иммунокомпетентных клеток.
Опосредована неспецифическими факторами Т-супрессоров.
Поликлональные активаторы (polyclonal activators). Собирательное название для ве-
ществ, вызывающих иммунонеспецифическую активацию многочисленных клонов Т- и В-
лимфоцитов, в отличие от антигена, специфически активирующего ограниченный ряд клонов.
Поликлональные активаторы В-лимфоцитов (ПВА) обычно имеют высокую молекулярную
массу и повторяющиеся элементы структуры (бактериальные полисахариды, липополисаха-
риды, пептидогликаны, декстраны, поливинилпироллидон, полиинозинполицитозин, белко-
вое производное туберкулина при действии на лимфоциты мышей, ряд лектинов, антилим-
фоцитарный и антиглобулиновый иммуноглобулин). Активностью ПВА обладают также веще-
ства с низкой мол. массой, но с высоким отрицательным зарядом — сульфат декстрана или
пентозана. См. также лектины и митоген.
Полиморфный аллоантиген. Имеет в пределах вида более одной аллельной формы.
Поляризация флуоресценции круговая (circular polarized fluorescence). Метод анализа
глобулярной подвижности макромолекул, основанный на измерении флуоресценции образца
(например, меченного флуоресцеином иммуноглобулина), возбуждаемой циркулярно поля-
ризованным светом.
Посткапиллярные высокоэндотелиальные венулы (ВЭВ). Специализированные крове-
носные сосуды лимфатических узлов и пейеровых бляшек. Связываясь с эндотелием ВЭВ,
лимфоциты покидают кровеносное русло и мигрируют в паренхиму лимфоидной ткани.
Пре-В-лимфоциты. Коммитированные предшественники В-лимфоцитов, еще не экспрес-
сирующие маркеров зрелых клеток.
Презентирование (представление) антигена (от англ, present — представлять кому-
либо). Начальный этап иммунологического распознавания. Фрагменты процессированного
антигена экспонируются на поверхности А-клеток в комплексе с молекулами МНС класса II
для связывания с рецепторами Т-индукторов, Т-амплифайеров и Т-В-хелперов.
Пре-Т-лимфоциты. Коммитированные предшественники Т-лимфоцитов, еще не прошед-
шие дифференцировки в тимусе и не имеющие маркеров зрелых клеток.
Примирование, праймирование (priming). Первичная иммунизация (сенсибилизация).
Создание иммунологической памяти.
Пристан (pristane). 2,6,10,14-тетраметилпентадекан. Парафин, индуцирующий у мы-
шей при внутрибрюшинном введении миеломы.
«Прогулка по геному» (gene walking). «Прогулка по (вдоль) хромосоме». Метод карти-
рования и молекулярного анализа геномов высших эукариот. Рестрикционные фрагменты
ДНК клонируют в бактериофагах или космидах. Ведут скрининг по перекрывающимся поа
следовательностям концевых участков фрагментов. Получают клоны нескольких групп пере-
крывающихся фрагментов ДНК, составляющих в сумме непрерывный участок хромосомы
размером 50—100 т.п.н.
Прозона (prozone). Зона отсутствия положительной реакции в начале ряда последова-
тельных разведений антисыворотки при постановке серологических тестов (агглютинации,
преципитации и т. и.) вследствие избытка антител, наличия блокирующих (неполных) анти-
тел, образования растворимых иммунных комплексов, неспецифического торможения реак-
ции другими белками или липидами сыворотки.
Промотор. Участок ДНК в начале оперона, с которым связывается РНК-полимераза
и с кэторого начинается транскрипция мРНК. Старт-сигнал для РНК-полимеразы.
Пропердин (от лат. perdition — разрушение). Фактор Р. у-Глобулин сыворотки крови
с мол. массой около 200 кДа. Состоит из четырех полипептидных цепей. Стабилизирует СЗ-
конвертазу альтернативного пути активации комплемента и тем самым усиливает его цито-
литическое действие.
Простагландины (от англ, prostate gland — простата, из ткани которой впервые были
выделены простагландины). Продукты превращения С20-три-, С20-тетра- и С20-пентаеновых
жирных кислот, например арахидоновой, входящих в состав внутриклеточных фосфоацил-
глицеролов.
Процессинг антигена (antigen processing). Многоэтапная переработка макромолекуляр-
ного антигена в цитоплазме А-клеток. После захвата антигена происходит его переваривание
в лизосомах и обнажение Т-эпитопов, затем транспортировка фрагментов на поверхностную
334
Словарь терминов
мембрану, компартметация при комплексировании с молекулами МНС класса II и де-
компартметация фрагментов для взаимодействия с рецепторами Т-лимфоцитов хелперной
группы.
Процессинг РНК. Превращение первичного продукта транскрипции в функционирую-
щую молекулу тРНК, рРНК и мРНК. С обоих концов молекул удаляются избыточные по-
следовательности. У эукариот предшественники мРНК, а также некоторых тРНК и рРНК
подвергаются особому типу процессинга — сплайсингу.
Псевдоаллели (pseudoalleles). Гены, относящиеся к одной серии множественных алле-
лей, между которыми, однако, в редких случаях наблюдается кроссинговер.
Псевдогены (pseudogenes). 1) Участки ДНК, обладающие высокой гомологией с функ-
ционирующими генами, но несущие либо нонсенс-мутацию, либо мутацию со сдвигом рамки
считывания, что лишает их возможности кодировать функциональный пептид. 2) Нефунк-
ционирующие реликты, образовавшиеся в процессе эволюции семейства генов. 3) Сплайси-
рованные безинтронные ДНК копии, вновь встроенные в хромосому путем обратной транс-
крипции цитоплазматических мРНК.
Путресцин. 1,4-диаминобутан. Первичный биогенный амин. Продукт анаэробного рас-
пада белков.
Пэтчинг (patching; от англ, patch — пятно). Конденсация белковых кластеров на по-
верхности лимфоцита в форме пятен неправильной формы (пэтчей), выявляемых при флуоре-
сцентной микроскопии. Пэтчинг вызывают антитела к поверхностным антигенным детерми-
нантам, лектины и другие двух- и поливалентные лиганды.
Ракетный иммуноэлектрофорез (rocket-electrophoresis). Электрофорез в геле, содержа-
щем антитела, по Лореллу. Позволяет определять концентрацию антигена по длине ракето-
образной полосы преципитации, которую он образует, мигрируя в электрическом поле.
Рамка считывания (reading frame). Один из трех возможных способов считывания мат-
рицы в виде последовательного ряда триплетов, зависимого от стартовой точки. Делеции
или вставки, размеры которых не кратны трем, приводят к изменению рамки считывания
при трансляции нуклеотидной последовательности в белок, а следовательно, и к синтезу пеп-
тидов иной структуры.
Распознавание двойное сцепленное (dual recognition hypothesis). Гипотеза иммунологи-
ческого распознавания Т-лимфоцитами, имеющими два типа одновременно и совместно функ-
ционирующих рецепторов — одного к чужеродному антигену, другого — к собственным мо-
лекулам МНС (реализация МНС-рестрикции).
Распознавание единым Т-рецептором. Гипотеза иммунологического распознавания
«изменного своего» (altered-self hypothesis). Т-лимфоциты имеют один тип рецепторов, ко-
торые распознают новую антигенную детерминанту, возникающую при взаимодействии
чужеродного антигена с собственными молекулами МНС (реализация МНС-рестрик-
ции).
Расщепленная толерантность (split tolerance). 1) Иммунологическая толерантность к од-
ним аллоантигенам на поверхности клеток при сохранении иммунореактивности на другие.
2) Иммунологическая толерантность в рамках одной из форм иммунного ответа при сохра-
нении иммунореактивности в других формах. Например, отсутствие гуморального иммуните-
та при сохранении клеточного и наоборот.
Реактивный лизис мембран (reactive lysis). Разрушение клеточных и искусственных
мембран стабильным комплексом С5Ь6 или С56а с привлечением терминальных компонентов
комплемента, но без участия антител и С1 — С4. Например, реактивный гемолиз в остро-
фазной сыворотке, т. е. в сыворотке крови, полученной при острой инфекции.
Редукционистский анализ. Ведущий методологический принцип современного биологи-
ческого исследования. Расчленение сложных и изучение простейших компонентов. Восприя-
тие жизни как особого проявления физических и химических процессов.
Ревматоидный фактор. Аутоантитела к слегка денатурированному IgG в сыворотке
больных ревматоидным артритом. Связывается с денатурированным нагреванием IgG чело-
века или животных, а также с иммунными комплексами.
Рекомбинация генетическая. Образование новых сочетаний отдельных участков ДНК
(хромосом) в результате перераспределения генетического материала. Целенаправленное по-
лучение рекомбинантных (гибридных) ДНК лежит в основе генетической инженерии.
Рег.ертуар антител и лимфоцитарных рецепторов (antibody repertory). Потенциальное
разнообразие специфичностей активных центров антител и лимфоцитарных рецепторов, кото-
рое может обеспечить иммунная система данного индивида или вида.
Реститоп (restitope). Участок антигенраспознающего рецептора Т-лимфоцита хелпер-
ной группы, контактирующий с гистотопом молекулы МНС класса II на клетке, презенти-
рующей антиген.
Рестриктазы. Рестриктирующие эндонуклеазы. Ферменты, распознающие специфиче-
скую последовательность нуклеотидов в ДНК. Разрезают обе цепи ДНК в сайте рестрикции.
Словарь терминов
335
Рестрикции элементы (restriction elements). Продукты генов МНС (Ir, Is) и гена Igh-v,
через которые реализуются генетические ограничения функций Т-лимфоцитов в индукции,
межклеточной кооперации и эффекторных механизмах иммунного ответа. Разные субпопу-
ляции Т-клеток имеют различные элементы рестрикции: цитотоксические Т-лимфоциты —
молекулы МНС класса I; Т-лимфоциты хелперной группы — молекулы МНС класса II,
часть Т-супрессоров — идиотопы мембранных иммуноглобулинов. Элементы рестрикции
распознаются реститопом Т-лимфоцита, т. е. являются гистотопами.
Рецептор мембранный. Участок специфического связывания (акцепции) для молекул
или клеток, расположенный на цитоплазматической мембране. Осуществляет трансмембран-
ную передачу сигнала, возникающего в момент связывания. Специфичность связывания
определяется аффинностью взаимодействия рецептор — лиганд.
Рецепторы антигенные Т-лимфоцитов (Т| lymphocyte antigen receptor). Антигенсвя-
зывающие, антигенраспознающие рецепторы Т-лимфоцитов. Трансмембранные гетеродимеры
с мол. массой 80—90 кДа, образованные ковалентно связанными полипептидными цепями
а (40—54 кДа) и f (39—45 кДа). f-Цепь более вариабельна. Обе цепи имеют С- и V-домены.
Предполагается, что между а- и f-цепью на мембране Т-лимфоцита встраивается молекула
ТЗ из трех компонентов: ТЗ-е (20 кДа), ТЗ-у (25 кДа) и ТЗ-6 (20 кДа). Каждый рецептор вме-
сте с вариабельными доменами молекул МНС класса II антигенпрезентирующей клетки обра-
зует два антигенсвязывающих центра. Рецепторы Т-хелперов, Т-амплифайеров и некоторых
Т-индукторов узнают антиген в контексте молекул МНС класса II. Рецепторы цитотоксиче-
ских Т-лимфоцитов узнают антигены в ассоциации с молекулами МНС класса!. Однако ряд
Т-клеток (специфические Т-супрессоры, индукторы Т-супрессоров, индукторы Т-хелперов,
небольшая часть Т-хелперов 2, часть эффекторов Тгзт) имеют рецепторы, распознающие
антиген непосредственно без МНС-рестрикции (подобно В-лимфоцитам).
Решетки теория (lattice hypothesis). Подтвержденное предположение о том, что двух-
валентные молекулы антител, соединяясь с детерминантами поливалентного антигена в опти-
мальных соотношениях, образуют нерастворимый преципитат, имеющий стру ктуру про
странственной решетки. В зоне избытка антител или антигена образуются растворимые
иммунные комплексы.
РК см. СЗЬ-рецепторы.
Розетирование см. Образование розеток.
РСЛ. Реакция смешанных лимфоцитов (mixed lymphocyte reaction). Смешанная куль-
тура лимфоцитов (СКЛ). Бласттрансформация и пролиферация лимфоцитов при совместном
культивировании клеток от двух неидентичных по антигенам гистосовместимости индивидов.
Сайт-ассоциированный идиотоп (site-related idiotope). Идиотоп, расположенный на ан-
тигенсвязывающем участке антитела.
САМЛ см. MSLA.
Самоубийство радиоактивное. Метод устранения популяции лимфоцитов, обладающих
рецепторами к данному антигену. К клеткам добавляют антиген, меченный высокой дозой
радиоизотопа, либо вызывают антигензависимую пролиферацию этих клеток, добавив в среду
®Н-тимидин высокой удельной радиоактивности, либо бромдезоксиуридин с последующим
ультрафиолетовым облучением. Во всех случаях антигенреактивные клетки гибнут.
Сантиморганида. Сотая часть морганиды. Может соответствовать фрагменту молекулы
ДНК длиной порядка 10е нуклеотидных пар.
Секвенирование (от англ, sequence — последовательность). Определение последователь-
ности элементов, образующих полимер, например аминокислотных остатков в полипептидах
или нуклеотидов в нуклеиновых кислотах и т. п.
Секвестрированный антиген (от англ, sequestered — изолированный). Скрытый, не до-
ступный для иммунологического распознавания антиген. Не контактирует с антителами или
иммунокомпетентными клетками. Не вызывает иммунного ответа.
Секреторный компонент (secretory piece). Полипептид с мол. массой 60 кДа, некова-
лентно связанный с димером секреторного IgA. Синтезируется эпителиальными клетками
слизистых оболочек и секреторных желез. Имеет аффинность к слизи. Облегчает транспорт
IgA через эпителий и тормозит гидролиз IgA ферментами пищеварительного тракта.
Селезеночных колоний метод (splenic focus technique). Определение числа и уровня
дифференцировки клеток-предшественников (стволовых кроветворных, пре-В и т. п.) по ко-
личеству, цитологическому составу колоний (узелков), возникающих в селезенке сублетально
облученной мыши в результате клональной пролиферации изучаемых клеток.
Семиаллогенные клетки (semi-allogenic). Полуаллогенные клетки. Клетки, сохраняющие
частичную идентичность антигенов, например клетки Fj по отношению к клеткам родитель-
ских линий.
Серотип (serotype). 1) Подтип в пределах данного вида бактерий, идентифицируемый
серологическими методами, т. е. по поверхностным антигенам с помощью специфических
антител. 2) Набор общих серологически определяемых детерминант О-антигена данного
штамма сальмонелл или других энтеробактерий.
336
Словарь терминов
Серотонина антагонисты. Метилсергид, ципрогептадин и резерпин.
Сибсы (siblings). Потомки одной пары родителей, происходящие из разных зигот.
Братья и сестры.
Сингенная смешанная культура лимфоцитов см. ССКЛ.
Сингенное предпочтение (syngenic preference). 1) Превышение частоты предшественни-
ков цитотоксических Т-лимфоцитов, рестриктированных по сингенным молекулам МНС
класса I, над частотой аналогичных предшественников с аллогенной рестрикцией. 2) Не-
обходимость совпадения аллельных вариантов молекул МНС (т. е. сингенности для межкле-
точных взаимодействий в ходе иммунного ответа. 3) Феномен, противоположный аллогенно-
му подавлению — взаимному торможению роста аллогенных клеток.
Скрытые антигенные детерминанты (hidden determinants), криптодетерминанты. Анти-
генные детерминанты, пространственно не доступные для распознавания антителам или
лимфоцитам.
Слущивание (shedding) клеточных рецепторов. Утрата клеточных рецепторов в резуль-
тате кэппинга путем освобождения во внеклеточную жидкость или эндоцитоза.
Соединение 48/80. Простой основной полиамин. Усиливает обмен фосфатидилинозитола
в мембранах тучных клеток и секрецию ими гистамина.
Спенсер (spacer). 1) Нетранскрибируемый участок ДНК. 2) Структура, выполняющая
функцию распорки.
Специфичности общие (public specificities). Антигенные детерминанты, определяемые
серо логически на всех молекулах МНС класса I независимо от гаплотипа.
Специфичности частные (private specificities). Уникальные определяемые серологиче-
ски антигенные детерминанты молекул МНС класса I данного гаплотипа.
Специфичность иммунологическая. Избирательная направленность иммунного ответа
на данный конкретный антиген. Отражение взаимной комплементарности (и аффинности
связывания) между антигенными детерминантами и активными центрами антител (и лим-
фоцитарных рецепторов). Специфичность измеряется либо соотношением аффинностей свя-
зывания антител с гомологичным и перекрестнореагирующим антигеном (тип I специфично-
сти), либо соотношением субпопуляций специфических и перекрестнореагирующих антител,
содержащихся в иммунной сыворотке (тип II специфичности).
Спин. Угловой, собственный момент элементарной частицы или системы частиц, напри-
мер атомного ядра.
Спиновая метка. Органическая молекула, содержащая стабильный свободный радикал.
Например соединение со стерически затрудненной нитроксильной группой. Спиновую метку
вводят в исследуемый белок (антиген, иммуноглобулин, гаптен) или нуклеиновую кислоту
и регистрируют спектры электронного парамагнитного резонанса и ядерного магнитного
резонанса. По этим спектрам определяют подвижность отдельных частей молекул, расстоя-
ние между ними и т. п.
а-Спираль. Способ пространственной укладки полипептидной цепи белков, при кото-
ром каждая пептидная группа образует водородные связи с соседними пептидными группами
цепи. В результате цепь закручивается в спираль.
СПК. Сыворотка плода коровы (fetal calf serum).
Сплайсинг (splicing — сращивание). Переделка РНК-транскрипта в ядре у эукариот.
Удаление интронов и объединение экзонов с образованием зрелой мРНК.
Спленомегалия. Увеличение селезенки. Одно из проявлений реакции «трансплантат
против хозяина» при переносе аллореактивных Т-клеток. Происходит пролиферация как
донорских, так их реципиентских лимфоцитов и отек стромы селезенки.
ССКЛ. Сингенная (аутологичная) смешанная культура лейкоцитов. Совместное куль-
тивирование очищенных Т-лимфоцитов человека с аутологичными В-лимфоцитами и моно-
цитами или тимоцитов новорожденных мышей с сингенными облученными клетками селезен-
ки. Пролиферацию Т-лимфоцитов в таких культурах интерпретируют как аутореактивный
ответ на аутоантигены и молекулы МНС класса II.
Стволовые клетки (stem cells). Кроветворные колониеобразующие клетки. Способные
к саморепликации недифференцированные плюрипотентные предшественники всех кроветвор-
ных клеток — лимфоидных, эритроидных, гранулоцитарных и моноцитарных, мегакариоци-
тарных. Содержатся в красном костном мозге и других кроветворных тканях. Пролифери-
руют и дифференцируются под влиянием колониестимулирующих факторов. Вступив в про-
лиферацию, стволовые клетки укрупняются, узкая полоска цитоплазмы становится пиро-
нинофильной и в лептохроматиновом ядре начинают выделяться интенсивно пиронинофиль-
ные ядрышки.
Сульцберга — Чейза феномен (Sulzberger — Chase phenomenon). Форма иммунологиче-
ской толерантности к химическим веществам, способным вызвать гиперчувствительность
замедленного типа. Например, у морских сринок можно специфически подавить развившую-
ся контактную гиперчувствительность к пикрилхлориду, если вводить им пикрилхлорид
энтерально или внутривенно.
Словарь терминов
337
Сурамин (Suramin). 8-(3-бензамино-4-метилбензамино)-нафталин-1,3,5-трисульфоновая
кислота. Ингибитор сериновых протеиназ.
«Сэндвича» метод (от англ, sandwich — многослойная конструкция). Двухэтапное
выявление взаимодействующих партнеров иммунологических реакций (антигенов или анти-
тел). На первом этапе происходит основное взаимодействие — связывание немеченых анти-
тел с антигеном, либо наоборот. На втором этапе в систему вводят меченные (флуоресцентно,
радиоактивно или ферментом) антитела или антигены для того, чтобы выявить иммунные
комплексы, образовавшиеся на первом этапе проведения реакции. Первый выявляющий ре-
агент оказывается в промежуточном слое между объектом анализа и вторым меченым выяв-
ляющим реагентом.
Ткс см. Т-контрасупрессоры.
Тафтсин (Tuftsin от названия университета в Тафте, США, где впервые был выделен).
Торговое название пептида L-Thr-Lys-Pro-Arg, представляющего собой фрагмент тяжелой
цепи IgG (аминокислотные остатки 289—292), синтезируемого в селезенке и названного лей-
кокинином. Обладает слабыми иммуностимулирующими свойствами. Активирует фагоцити-
рующие клетки.
Тахифилаксия (tachyphylaxis). 1) Избирательное снижение тканевой или клеточной
чувствительности в отношении медиаторов воспаления. 2) Быстровозникающее усиление не-
специфической резистентности организма.
Тгзт. Т-клетки — эффекторы гиперчувствительности замедленного типа.
ТЗФ см. TRF.
Теломера. Концевой участок хромосомы.
Тест примированных лимфоцитов (ТПЛ) (primed lymphocyte typing test). Тест вторич-
ной стимуляции. Двухэтапная смешанная культура лимфоцитов. На первом этапе типиру-
ющие лимфоциты 12 дней культивируют с панелью стимулирующих клеток от возможно боль-
шего числа доноров и замораживают в жидком азоте. Пролиферировавшие при первом куль-
тивировании лимфоциты служат типирующими клетками при втором смешанном культиви-
ровании. Они способны быстрее и с большей чувствительностью выявлять тонкие различия
а ллоантигенов.
Тетразолия нитроголубого реакция (nitroblue tetrazolium test). Реакция для оценки
функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов. При стимуляции фагоцитоза
нейтрофильные гранулоциты поглощают имеющий желтую окраску раствор нитроголубого
тетразолия. Содержащиеся в нормальных нейтрофилах ферменты восстанавливают тетразо-
лий, и он выпадает в виде нерастворимых кристаллов формазана, имеющих темно-синий
цвет. Нейтрофилы больных хроническим гранулематозом не способны восстановить краси-
тель.
Техаский красный (Texas red). Торговое название сульфонилхлоридного производного
сульфородамина 101. Имеет красную флуоресценцию. Используется в методе флуоресцирую-
щих антител в качестве второй метки, когда первой меткой служит изотиоцианат флуорес-
цеина.
Тимусные эпителиальные клетки-кормилицы (thymic nurse cells). Крупные клетки
тимусного эпителия, тесно контактирующие с тимоцитами.
Т-контрасупрессор (Ткс, Tcs). Защищает Т-хелперы от действия специфических эффек-
торных Т-супрессоров.
ТНБС. Тринитробензилсульфокислота.
Толерантность иммунологическая (immunological tolerance). Естественное или индуци-
рованное отсутствие (или ослабление) иммунного ответа на конкретный специфический анти-
ген при сохранении иммунореактивности на все прочие антигены.
Толерантность инфекционная (infectious tolerance). Специфическая иммунологическая
толерантность, которую можно адоптивно перенести от толерированного донора сингенному
реципиенту с помощью специфических Т-супрессоров.
ТПЛ см. Тест примированных лимфоцитов.
т.п.н. (т.п.о.). Тысяча пар нуклеотидов (тысяча пар оснований).
Трансверсии (transversion). Один из типов мутационной замены нуклеотидов. Пурино-
вые основания (аденин, тимин) заменяются пиримидиновыми (гуанин, цитозин) и наоборот.
Замены происходят перекрестно, т. е. меняется ориентация пурин — пиримидин в мутантном
сайте двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты.
Трансмембранные белки. Пронизывают насквозь липидный бислой поверхностной кле-
точной мембраны.
Трансфекция. Введение в клетку фрагмента чужеродной ДНК, вызывающее генетиче-
скую трансформацию.
Трансферрин, сидерофилин. Гликопротеин ((^-глобулин) плазмы крови, молока и яич-
ного белка, связывающий два иона Fe3+ на молекулу. Мол. масса около 80 кДа. Конкурируя
338
Словарь терминов
с бактериями за органически связанное железо, обладает бактериостатической активностью.
У людей известен генетический полиморфизм трансферрина. На активированных В- и Т-
лимфоцитах экспрессируется рецептор для трансферрина, запускающего пролиферацию кле-
ток. Трансферрин является фактором роста для гибридом, культивируемых in vitro.
Трансфер-фактор (transfer factor). 1) Фактор переноса антигенспецифической или идио-
типспецифической иммунореактивности (гиперчувствительности замедленного типа, специфи-
ческого клеточного иммунитета, иммунологической памяти), слабо рестриктированный по
МНС. Представляет собой гетерогенную смесь пептидов и рибонуклеопептидов с мол. массой
от 3 до 12 кДа, содержащихся в виде минорной фракции в диализатах и ультрафильтратах
лимфоцитарных экстрактов и связывающихся аффинно с антигенными детерминантами или
идиотопами антител и лимфоцитарных рецепторов. Предположительно это низкомолекуляр-
ные продукты автолитического превращения лимфокинов и рецепторных структур Т-лимфо-
цитов, полученных от иммунизированного индивида. 2) Торговое название препаратов лей-
коцитарных ультрафильтратов с активностью фактора переноса, используемых для иммуно-
терапии недостаточности клеточного иммунитета. Производятся из лекоцитарной массы
человека, а также из лимфоидной ткани и молозива гипериммунизированных крупных жи-
вотных (крупный рогатый скот, свиньи). Препараты обладают иммуноспецифической и имму-
нофармакологической активностью.
Трипановый синий. Тетранатриевая соль 4,4-бис(8-амино-3,6-дисульфо-1-гидрокси-2-
нафтилазо)-3,3-диметилбифенила. 1) Краситель для выявления погибших (прокрашиваю-
щихся) клеток в суспензии. Жизнеспособные клетки не окрашиваются, т. е. исключают три-
пановый синий. 2) Краситель для белков, фракционированных электрофорезом на ацетатцел-
люлозной мембране.
Тромбоксаны. Производные С20-жирных кислот. Продукты превращения простагланди-
на PGH2. Образуются тромбоцитами, моноцитами и макрофагами. Тромбоксан В2 — про-
дукт превращения тромбоксана А2. Тромбоксаны вызывают агрегацию тромбоцитов, повы-
шают адгезивность нейтрофилов, активируют Т-лимфоциты, стимулируют межклеточные
взаимодействия, сужают просвет сосудов.
Тропомиозин. Один из вспомогательных белков тонких нитей миофибрилл. Образован
двумя полипептидными цепями мол. массой 35 кДа каждая. Участвует в Са2+-зависимой
регуляции мышечного сокращения.
Тс-молекула 70 кДа. Иммуносупрессорный белок с мол. массой 70 кДа. Синтезируется
клоном мышиных Т-супрессоров CI.LY23.4, специфичным к гликофорину бараньих эритро-
цитов. Состоит из V-домена мол. массой 24 кДа и С-домена мол. массой 45 кДа. В пикогра-
мовых дозах введенный после антигена инактивирует Т-индукторы, полностью подавляя
иммунный ответ.
Т-супрессоры (suppress — подавлять). Клетки, регулирующие иммунный ответ с по-
мощью супрессии. Обратимо блокируют пролиферацию, дифференцировку и функциональ-
ную активность других лимфоидных клеток. В группу Т-супрессоров входят специфические
Т-супрессоры, неспецифические Т-супрессоры, натуральные Т-супрессоры, Т-контрасупрес-
соры. Некоторые типы не рестриктированы по МНС при взаимодействии с антигенпрезенти-
рующими клетками и способны узнавать антиген непосредственно. Однако при Т-Т-взаимо-
действиях они рестриктированы интеракционно по молекулам МНС класса II и оказывают
супрессию только при тесном контакте. Имеют рецепторы к идиотипам, к Fc-фрагменту IgG,
к гистамину (II,). Выделяют неспецифические, антигенспецифические и идиотипспецифиче-
ские растворимые факторы. Функциональная активность контролируется генами иммуно-
супрессии (Is) и Igh-V.
ТС1 (Т-супрессор первого порядка) см. Ts, Tsi, TsiF.
Тс2 (Т-супресеор второго порядка) см. Ts2.
Тс3 (Т-супрессор третьего порядка) см. Ts3, TseF.
Т-Т-взаимодействия. Взаимодействия между регуляторными и эффекторными субпо-
пуляциями Т-клеток. Рецепторно-акцепторные взаимодействия при тесном межклеточном
контакте и дистантные, опосредованные лимфокинами (факторами) при участии как хелперов,
так и супрессоров. Подвержены интеракционной рестрикции по молекулам МНС класса II.
Туникамицин (tunicamycin). Антибиотик из Streptomyces sp. имеет изомеры А, В, С, D.
Ингибирует присоединение углеводов к белкам при синтезе гликопротеинов.
Т-хёлперы, Т-клетки-помощники (T-helpers). Группа регуляторных субиопуляций Т-кле-
ток, выполняющих центральную функцию в узнавании чужеродного антигена в индуктивной
фазе иммунного ответа. 1) Т-индукторы. Активирующие А-клетки, выделяя ряд факторов
(фактор, активирующий макрофаги, фактор, стимулирующий экспрессию молекул МНС
класса II, факторы, стимулирующие рост колоний и т. п.). 2) Т-амилифаоры (от англ, ampli-
fy — усиливать). Секретируют интерлейкин 2, необходимый для пролиферации всех других
Т-клеток, в частности, предшественников цитотоксических Т-лимфоцитов. 3) Хелперы Т-В.
Секретируют факторы роста и дифференцировки В-лимфоцитов. 4) Т-индукторы эффекторных
Словарь терминов
339
Т-клеток: Т-В-хелперов, Тгзт, Т-супрессоров. У мышей Т-хелперы имеют маркер Lyt-1,
у человека T4/Leu 3.
Т-эпитопы. Эпитопы белковых молекул, распознаваемые рецепторами Т-клеток хел-
перной группы. Имеют не менее семи аминокислотных остатков и стабильную структуру а-
спирали. Секвенциальные (определяемые последовательностями), не зависимые от конфор-
мации, детерминанты фрагмента процессированного антигена.
Уабаин (ouabain). Октагидрат G-строфантина. Кардиотонический гликозид. Ингибитор
Na- и К-зависимой АТРазы. Реагент, используемый для селекции гибридных клеток.
Усиление иммунологическое (immonological enhancement). Усиление роста трансплан-
тированной опухоли у животных, иммунизированных гомологичными опухолевыми анти-
генами. Специфические противоопухолевые антитела способны конкурировать с цитотокси-
ческими Т-лимфоцитами за поверхностные антигены опухолевых клеток. В результате про-
исходит отмена цитолиза. Кроме того, активированные при иммунизации Т-супрессоры могут
подавить специфический клеточный иммунитет.
Фаголизосомы. Фагосомы, с которыми слились лизосомы, наполнив их ферментами.
Место фрагментирования фагоцитированного материала.
ФАКС см. ЛСК и FACS.
Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов (ФИМ) (migration inhibition factor).
Гетерогенная группа лимфокинов, секретируемая при активации индукторами Тгзт и эф-
фекторами Тгзт- В определенных условиях ФИМ образуют Т-супрессоры и В-лимфоциты.
ФИМ подавляет спонтанную миграцию макрофагов in vitro, увеличивая их взаимную адге-
зивность. Известно несколько форм ФИМ с мол. массой 65, 25 и И кДа, являющихся гли-
копротеинами с активностью сериновой эстеразы. Имеются данные о сходстве ФИМ с фак-
тором активации макрофагов и SIRS.
Фактор переноса см. Трансфер-фактор.
Фактор прилипающих клеток (МФ). Не рестриктированный по МНС растворимый фак-
тор А-клеток, способствующий связыванию Т-хелперами фрагментов процессированного
в макрофагах антигена, ассоциированных с молекулами МНС класса II.
ФАТ см. AGEPC.
а-Фетопротеин. Белок плазмы крови плода. Найден также в сыворотке мышей и чело-
века при первичном раке печени, тератокарциномах и некоторых других опухолях. Струк-
турно близок к сывороточному альбумину. Обладает иммунодепрессивными свойствами.
ФЗТ-акцепторы. Рецепторы (на поверхности В-лимфоцитов) для фактора, замещающего
тимус. Экспрессируются после воздействия поликлональных и клоноспецифических актива-
торов: специфического антигена, липополисахаридов бактерий, декстран-сульфата, антител
к ц- и б-цепям иммуноглобулинов, Fc-фрагментов иммуноглобулинов, антиидиотипических
антител.
Фибронектин (от лат. fibre — волокно, necter — связывать). Поверхностный глико-
протеин фибробластов и других клеток, обеспечивающий их взаимную адгезию. Мол. масса
200—250 кДа. При культивировании клеток in vitro служит фактором прилипания моно-
слоя к подложке. Стафилококки, стрептококки и кишечные бактерии обладают рецепторами
к фибронектину.
Фидерные, филлерные клетки (feeder, filler cells). Питающие клетки, используемые
в культурах in vitro для кондиционирования среды и обеспечения метаболитами и ростовыми
факторами других нуждающихся в этом клеток.
Филадельфийская хромосома (от названия города Филадельфия, США — местораспо-
ложения лаборатории, в которой она была впервые открыта). Хромосома 21, укороченная
в результате делеции, при хроническом миелолейкозе.
Фильтрация биологическая (biological filtration). Способ получения из иммуногенного
антигена толерогена путем фильтрации через орган, богатый макрофагами. При энтеральном
введении антигена макрофаги печени захватывают иммуногенную фракцию вводимого ма-
териала. Профильтрованный антиген теряет иммуногенность.
ФИМ см. Фактор, ингибирующий миграцию макрофагов.
ФК. Фосфатидная кислота.
Фланкирующие последовательности (от англ, flank — располагаться по бокам). Последо-
вательности нуклеотидов, пептидов и полисахаридных цепей, прилегающие к рассматриваемой.
ФМА. Форболмиристатацетат. Антилейкозный препарат. Индуктор воспаления и опу-
холей в коже у мышей. Стимулятор пролиферации Т-клеток, секреции интерлейкина 2, акти-
ватор макрофагов, активатор протеиназы С. Мол. масса 616,8 Да.
ФМЛФ. Пептид формил-Ь-метионил-Ь-лейцил-Ь-фенилаланин. Хемотаксический пеп-
тид для нейтрофильных гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов, имеющих для него
рецепторы.
340
Словарь терминов
ФМСФ. Фенилметилсульфонилфторид. Ингибитор трипсина и химотрипсина. Не инги-
бирует холинэстеразу. Менее токсичен, чем диизопропилфторфосфат.
Форсмана антиген (Forssman antigen). Гликолипидный гетерофильный антиген. Встре-
чается в клеточных мембранах многих видов животных: лошадей, овец, мышей, собак и ко-
шек. Отсутствует у человека, кролика, крысы, свиньи и коровы.,
ФПА. Фактор, подавляющий аллергию (SFA).
Фрейнда (Фройнда) полный адъювант (complete Freund adjuvant). Масляный имму-
йоадъювант. Содержит 85% легкого минерального парафинового масла (Bayol F), 15% эмуль-
гатора — моноолеата маннита (Arlacel А) и 0,5 —1,0 мг/мл лиофилизированной массы Mycoba-
cterium butyricum. При смешивании адъюванта с равным объемом водного раствора антигена
образуется стабильная водно-масляная эмульсия, которую вводят под кожу, в кожу, в мыш-
цу или в лимфоузел при гипериммунизации животным. Масляный адъювант без микобак-
терий называется неполным адъювантом Фрейнда.
ФС. Фосфатидилсерин.
ФУА. Фактор, усиливающий аллергию (EFA).
ФХ. Фосфатидилхолин.
ФЭ. Фосфатидилэтаноламин.
Хагемана фактор (Hageman factor). Фактор XII системы свертывания крови. Трипси-
ноподобная сериновая протеиназа в зимогенной форме. Гликопротеин с мол. массой около
80 кДа. Активируется при контакте с отрицательно заряженной поверхностью, фосфолипида-
ми, коллагеном, кристаллами уратов, бактериальными липополисахаридами, взаимодей-
ствуя с прекалликреином и высокомолекулярным кининогеном. Активный фактор пред-
ставлен фрагментами 50 и 30 кДа. Инактивируется С1-ингибитором.
Хемилюминесценция (chemiluminescence). Световое излучение, возникающее при хими-
ческой реакции. По хемилюминесценции можно оценить интенсивность образования свобод-
ных радикалов, например, супероксидного аниона О2, в нейтрофильных гранулоцитах и мо-
нонуклеарных фагоцитах, т. е. дыхательную вспышку, при фагоцитозе.
Химера (Chimaera). В греческой мифологии огнедышащее чудовище с головой льва,
телом козла и хвостом змеи. Животное, содержащее клетки двух и более индивидов разного
генотипа. Естественные химеры возникают при внутриутробных кровеносных анастомозах
между разнояйцевыми близнецами у коров и человека. См. Химера радиационная, Аллофен-
ные мыши.
Химера радиационная. Летально облученное животное, лимфоидная и миелоидная
ткань которого заселена клетками костного мозга, селезенки или печенью плода необлучен-
ного донора.
Холодная мишень. К летка-мишень для цитотоксических Т-лимфоцитов, не содержа-
щая радиоактивную метку.
Целомоциты (от греч. koiloma — полость, cytos — клетка). Мигрирующие и резидент-
ные лейкоциты у беспозвоночных. Выполняют защитную функцию, фагоцитируя и инкап-
сулируя чужеродные частицы.
Циклоспорин A (cyclosporin А). Циклический пептид из И аминокислотных остатков.
Мол. масса 1203 Да. Выделен из плесневого гриба Trichoderma polysporum. Иммунодепрес-
сивный антибиотик. Подавляет синтез интерлейкина-2 Т-амплифайерами, экспрессию моле-
кул МНС класса II, рецептора к интерлейкину-1, рецептора к интерлейкину-2 и к трансфер-
рину на Т-лимфоцитах.
Цитокины (cytokines). Собирательное название для иммуномедиаторов: лимфоканов и
монокинов (интерлейкинов, интерферонов, туморнекротезирующего фактора и т. д.).
Цитопласты. Клетки, из которых искусственно удалено ядро.
Цитотоксические Т-лимфоциты. Одна из субпопуляций эффекторных Т-лимфоцитов.
Непосредственно контактируя с клетками-мишенями, вызывают их лизис. Литическое дей-
ствие иммуноспецифично и рестриктировано по молекулам МНС класса I. Индуцируются
Т-амплифайерами с помощью интерлейкина-2. У мышей имеют маркер Lyt-2,3, у человека
Т5, 8/Leu 2а, 2Ь.
Цитохалазины. Группа метаболитов, выделяемых плесневыми грибами разных видов.
Ингибируют присоединение молекул актина к актиновым филаментам, что приводит к депо-
лимеризации последних. В результате становятся невозможными цитокинез, фагоцитоз
и передвижение клеток. Ингибируют также транспорт через мембрану гексоз и нуклеозидов.
Шульца-Дейла тест (Schultz — Dale test). Биологический тест определения гиперчув-
ствительности немедленного типа. Опыт ставят на фрагментах подвздошной кишки или мат-
ки морской свинки. Если животное было примировано (сенсибилизировано) антигеном, то
добавление специфического антигена в ванну с физиологическим раствором, в которой содер-
жится переживающий фрагмент указанных органов, вызывает сокращение мускулатуры
Словарь терминов
341
последних. Это сокращение происходит в результате выделения вазоактивных аминов при
взаимодействии антигена с гомоцитотропными антителами IgE, фиксированными в тканях.
Фрагменты переживающих органов можно пассивно сенсибилизировать, добавив в ванну
специфическую антисыворотку.
ЭГТА. Этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-Ь1,Ь1'-тетраацетат. Хелатирующее
соединение. Связывает Са2+, но не Mg2+.
ЭИЗ. Электрофорез с измененным зарядом.
Экзоны (Exons от англ, expressed region — экспрессируемый участок). Кодирующие
последовательности прерывистых генов. В структуре гена экзоны разграничены некоди-
рующими нуклеотидными последовательностями — интронами.
Экзоцитоз фагосом. Излияние содержимого фагосомы во внеклеточную среду. При
этом мембрана фагосомы сливается с цитоплазматической.
Элонгация. Наращивание новообразующей полипептидной цепи на рибосомах.
ЭНГрН. Электрофорез в неравновесном градиенте pH.
Энтерохромаффинные клетки, аргентаффинные клетки. Клетки желудочно-кишечного
тракта, содержащие серотонин, который при фиксации проявляет аффинность к слоям хрома
и серебра.
Эпитела (epibodies). Антиидиотипические антитела, связывающиеся с перекрестно реа-
гирующими детерминантами как эпитопов антигена, так и идиотопов специфических антител.
Эпитип (epitype). Семейство близких по специфичности эпитопов.
Эпитоп (epitope). Отдельная антигенная детерминанта.
Эпштейна — Барр вирус (Epstein — Barr virus). ДНК-содержащий вирус человека.
Относится к герпесвирусам. Возбудитель инфекционного мононуклеоза, лимфомы Бэркитта
и некоторых злокачественных опухолей носоглотки.
Эффект носителя (carrier effect). Зависимость антительного ответа на гаптен от носите-
ля, к которому антитела не образуются. Феномен отражает решающую роль взаимодействия
с носительспецифичными Т-хелперами для В-лимфоцитов, отвечающих на гаптен.
Эффект свидетеля (bystander effect). 1) Поликлональная побочная стимуляция и супрес-
сия Т- и В-клеток, коммитированных к посторонним антигенам, при специфическом ответе
на данный антиген (не являющийся поликлональным активатором). Следствие некогнантных
(дистантных) межклеточных взаимодействий, опосредованных лимфокинами. См. Поликло-
нальная активация. 2) Повреждение тканей в результате иммунных реакций в тех случаях,
когда сами эти ткани не являются специфическими мишенями.
Английские термины и сокращения
А23187. Ионофор, подвижный переносчик двухвалентных катионов (обычно Са2+)
через цитоплазматическую мембрану в цитозоль.
ABC (antigen-binding cells). Антигенсвязывающие клетки.
ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity). Зависимая от антител цитоток-
сичность лимфоцитов, макрофагов и гранулоцитов (К-клеток) в отношении клеток-мишеней.
AEF (allogeneic effect factor). Фактор(ы) аллогенного эффекта, выделяемый Т-лимфо-
цитами при аллоиммунной активации, например при РТПХ, и неспецифически стимулирую-
щий продукцию антител к тимусзависимым антигенам в отсутствие Т-клеток.
AGEPC (acetyl glyceryl ether phosphorylcholine). PAF (platelet-activating factor). Фак-
тор, активирующий тромбоциты, ФАТ.
А-клетка (от англ, accessory). Вспомогательная клетка, осуществляет процессинг и
презентацию антигена Т-клеткам, экспрессию антигенов МНС класса II, секрецию интерлей-
кина-1, гамма-интерферона и др. факторов.
ALL (acute lymphoblastic/lymphocytic leukemia). Острый лимфобластный лейкоз, ОЛЛ.
В. Фактор системы комплемента, проактиватор СЗ по альтернативному пути.
ВА0 (brain-associated theta antigen). Антиген, выявляемый на Т-лимфоцитах с помо-
щью ксеноиммунной антисыворотки к гомогенату головного мозга у мышей.
BCDF (В-cell differentiation factors). Факторы дифференцировки В-клеток, выделяемые
активированными Т-клетками, а также моноцитами, некоторыми опухолевыми клетками,
фибробластами.
BCGF (В-cell growth factor). Фактор роста В-клеток, выделяемый активированными
Т-лимфоцитами, интерлейкин-4.
В-лимфоцит. Лимфоцит, происходящий из костного мозга (bone marrow) у млекопитаю-
щих или из фабрициевой сумки (bursa) у птиц, не прошедший созревания в тимусе. Цен-
тральная клетка гуморального иммунного ответа.
342
Словарь терминов
BRMF (В-cell replication and maturation factor). Фактор размножения и созревания
В-клеток.
Р2-Микроглобулин. Легкая цепь антигенов МНС класса I.
С. Символ комплемента.
СЗа. N-концевой фрагмент а-цепи СЗ-компонента комплемента. Полипептид с мол. мас-
сой около 9 кДа и активностью анафилатоксина.
СЗЬ. Фрагмент а-цепи СЗ-компонента комплемента. Обладает аффинностью к поверх-
ности макрофагов, нейтрофилов, В- и Т-лимфоцитов.
СЗЬ-рецепторы. Три типа рецепторов для продуктов расщепления СЗ, расположенных
на поверхности А-клеток (мононуклеарных фагоцитов, нейтрофилов, В-лимфоцитов, клеток
Лангерганса, эпителия гломерул почки): CR1 — для активированного СЗЬ, CR2 -- для рас-
щепленного C3d, CR3 — для инактивированного iC3b. РК.
СЗ-конвертаза. Ферменты системы комплемента, разрушающие СЗ на СЗа и СЗЬ. При
активации по классическому пути СЗ-конвертазой служит комплекс С42, а при активации
по альтернативному пути — комплекс СЗЬВЬР.
С5-конвертаза. Ферменты системы комплемента разрушающие С5 на С5а и С5Ь. При
активации по классическому пути — это С4Ь2аЗЬ, а по альтернативному — комплекс
СЗЬВЬСЗЬ.
C3NeF. СЗ-нефритический фактор. Аутоантитела класса IgG специфичные к СЗ-кон-
вертазе альтернативного пути активации комплемента (СЗЬВЬР), появляющиеся в сыворотке
больных мембранопролиферативным гломерулонефритом и усиливающие альтернативную
активацию комплемента.
С1-шунт. Активация системы комплемента в обход СЗ-конвертазы классического пути.
CBA/N мыши. Инбредная линия с рецессивной плейотропной мутацией zid-гена Х-хро-
мосомы, контролирующего созревание В-лимфоцитов и мат . гфагов, на которых у самцов
не экспрессируется комбинаторная детерминанта Ia.W39.
Са, Cft, СЕ, Cv, Сх, См См. Константные (Constant) области тяжелых и легких цепей
иммуноглобулинов.
CDF (cytotoxic differentiation factor). CTDF (cytotoxic T cell differentiation factor).
Фактор дифференцировки цитотоксических Т-лимфоцитов. Синтезируется Т-амплифайерами.
Состоит из двух факторов TCF 1 и TCF 2 (T-cell cytotoxicity inducing factors}, инду-
цирующих цитотоксичность Т-клеток, с мол. массой 17 и 30 кДа, соответственно.
CDR (complementarity determining regions). Области генома, определяющие компле-
ментарность антител к антигену.
CESS-клетки. Линия человеческих В-клеток, трансформированных вирусом Эпштей-
на — Барр. Имеют slgG.
С-гены. Гены, кодирующие константные области тяжелых и легких цепей иммуногло-
булинов.
Сы. Константная область тяжелой (Heavy) цепи иммуноглобулина.
Сн1, Сн2, Сн3, Сн4. Области гомологии константных частей тяжелых цепей иммуно-
глобулинов. Каждая область гомологии образует трехмерную структуру одноименного до-
мена.
CI (cellular interaction). Гены и молекулы, определяющие рецептор-акцепторные меж-
клеточные взаимодействия.
CML (cell-mediated lymphocytotoxicity lympholysis). Деструкция клеток-мишеней ци-
тотоксическими Т-лимфоцитами.
CRI (cross-reactive idiotype). Перекрестно-реагирующий идиотип.
С-реактивный белок. Нормальный компонент плазмы крови (0,1—0,8 мг/л), у, — гло-
булин, мол. масса 105 кДа, связывается с фосфорилхолином С-субстанции пневмококка.
CSF (colony stimulating factors). Факторы, стимулирующие рост колоний. Образуются
Т-индукторами. Стимулируют in vitro размножение и созревание стволовых клеток гемо-
поэтических тканей с образованием колоний. Потомки стволовых клеток под действием раз-
личных CSF могут образовывать гранулоцитарные, макрофагальные, эритробластоидные,
мегакариоцитарные, пре-Т- и пре-В-лимфоцитарные колонии. К CSF относится интерлей-
кин-3.
CTh (carrier-specific Т helper). Т-хелпер, специфичный к носителю. CTh2 — антиген-
специфический Т-хелпер, способный, в отличие от СТЫ, оказывать и неспецифическую
помощь В-клеткам, отвечающим на посторонний антиген (эффект свидетеля, поликлональная
активация).
CTLP (cytolytic Т lymphocyte precursors). Клетки-предшественники цитотоксических
Т-лимфоцитов.
Словарь терминов
343
CTs (carrier-specific Т suppressor cells). Т-супрессоры, специфичные к носителю.
CTsF (carrier-specific Т suppressor cells factors). Специфичные к носителю факторы Т-су-
прессоров: TsFj — индукторный, TsF2— акцепторный/эффекторный, TsF3 — эффекторный.
CVF (cobra venom factor). Аналог СЗЬ, содержащийся в яде индийской кобры (Naja naja)
и активирующий комплемент по альтернативному пути.
D. Фактор альтернативного пути активации комплемента. Сериновая протеиназа, раз-
рушающая фактор В, после его соединения с СЗЬ.
DANS (l-dimethylaminonaphthalene-5-sulphonyl chloride). Флуорохром, присоединяю-
щийся к белкам. Гаптен.
D-GL. (D-Glu—D-Lys). Сополимер D-глутаминовой кислоты и D-лизина.
Down regulation. Регуляторное подавление функции, например, ограничение иммунно-
го ответа естественными Т-супрессорами.
EFA (enhancing factor of allergy). Фактор, усиливающий аллергию. ФУА.
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Фермент-зависимый иммуносорбцион-
ный анализ. Иммуноферментный анализ. Обнаружение антигена или антител по фермен-
тативной реакции меченного ферментом лиганда (конъюгата). Выявляющим лигандом могут
служить специфические антитела, антигены, лектины, антпглобулины, стафилококковый
белок А. ИФА.
Facb (fragment antigen and complement binding). Фрагмент молекулы IgG, утратив-
ший под действием плазмина СнЗ-домен (pFc’), но связывающий антиген и комплемент.
FACS (fluorescence-activated cell sorter). Система для проточной флуориметрии и сорти-
ровки клеток фирмы Becton Dickinson, США. ФАКС
Fd-фрагмент. N-концевая часть тяжелой цепи иммуноглобулина, гидролпзованной па-
паином. Состоит из доменов Уц и СнК входит в структуру антигенсвязывающего центра.
FPL-55712. Фармакологический антиаллергический препарат. Антагонист медленно
реагирующей субстанции анафилаксии (SRS-A).
Fv-фрагменты антител (variable fragments). Протеолитические фрагменты молекулы
иммуноглобулина. Содержат VL- и Ун-домены, входящие в структуру антигенсвязывающего
центра.
lg-седиментация. Оседание частиц под действием силы тяжести, g — ускорение сво-
бодного падения.
GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor). Фактор, стимулирующий
рост гранулоцитарно-макрофагальных колоний из стволовых клеток in vitro. Продуцирует-
ся Т-индукторами.
gp70. Гликопротеин вируса лейкемии Молони с мол. массой 70 кДа.
GRF (genetically related factor). Генетически контролируемый фактор. Комплекс
фрагмента процессированного антигена с la-молекулой. Выделен из супернатанта культур
А-клеток (с.ч. 1АС, IPM).
GT (L-glutamic acid60 — L-tyrosine60). Полимер глутаминовой кислоты и тирозина:
Н ([ИН). Фактор системы комплемента. Подавляет активность СЗ-конвертазы альтер-
нативного пути. Совместно с фактором I инактивирует СЗЬ.
Нг-блокаторы. Фармакологические противогистаминные препараты, блокирующие Н1-
рецепторы к гистамину, например димедрол, дипразпн, диазолин, супрастин, тавегил, фен-
карол,хлорфениламин.
Н2-блокаторы.Фармакологические противогистаминные препараты, блокирующие П2 —
рецепторы к гистамину, например, ранитидин, циметидин, метиамид, буринамид.
Нг- и Н2-рецепторы (Н от histamine). Рецепторные структуры клеток, акцептирующие
гистамин. Локализованы на гладких мышцах бронхов, кишечника, артерий и вен, на эн-
дотелии капилляров, на нейронах ЦНС и в тканях сердца, на клетках слизистой желудка
и миометрия, на тучных клетках, на эозинофильных, базофильных и нетрофильных
гранулоцитах, на Т-лимфоцитах, на клетках жировой ткани. Через Hj- и Н2-ре-
цепторы реализуются многообразные эффекты гистамина: сокращение гладких мышц, регу-
ляция секреторной функции слизистой желудка, сердечной деятельности, липидного обмена,
аллергических и иммунных процессов, в частности, провоспалительное (через Hi) и про-
тивовоспалительное (через Н2) действие.
Н-2 (Histocompatibility) гены. Главный комплекс гистосовместимости у мышей, рас-
положен в хромосоме 17.
344
Словарь терминов
H-2D. Один из локусов главного комплекса гистосовместимости у мышей. Контроли
рует синтез антигенов МНС класса I.
H-2I. Район главного комплекса гистосовместимости у мышей. Кодирует синтез анти-
генов МНС класса II (1а-молекул).
Н-2К. Локус главного комплекса гистосовместимости у мышей. Кодирует антигены
МНС класса I.
ННТ (12-hydroxy-5,8,10-heptatrienoic acid). Гидроксигептатриеновая кислота. Про-
дукт распада PGH2, обладающий хемотаксической активностью для нейтрофилов.
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid). Буферообразующее со-
единение в средах для культуры ткани.
HETEs (hydroxyeicosatetraenoic acids). Гидроксиэйкозатетраеновые кислоты. Продукт
липоксигеназного окисления арахидоновой кислоты.
, HLA (human lymphocyte antigens). Гены лимфоцитарных аллоантигенов человека.
Главный комплекс гистосовместимости у человека. Расположен в хромосоме 6.
HLA-A,HLA-B, HLA-С. Генетические локусы, аллели которых кодируют антигены
МНС класса I у человека. Одноименные аллоантигены экспрессируются на ядросодержа-
щих клетках, в том числе на лимфоцитах.
HLA-D. Район комплекса HLA, имеет три субрайона — DR, DC и SB, гены которых
кодируют антигены гистосовместимости класса II у человека, аналогичные 1а-антигенам
мышей, экспрессирующиеся на А-клетках, В-лимфоцитах и активированных Т-лимфоцитах.
HPETEs (hydroperoxyeicosatetraenoic acid). Гидропероксиэйкозатетраеновые кислоты.
Продукты липоксигеназного расщепления арахидоновой кислоты.
I. Фактор системы комплемента. Инактиватор СЗЬ и С4Ь. Расщепляет СЗЬ при тормо-
жении активации по альтернативному пути.
1а-антигены (immune region associated). Продукты МНС класса II у мышей, кодируются
генами района I (субрайонов I-A, I-Е, I-J и I-C). Экспрессированы на А-клетках, В-лимфо-
цитах, активированных Т-лимфоцитах. Комплексы 1а с фрагментами процессированного ан-
тигена распознаются рецепторами Т-клеток.
IAC (la-antigenic complex). Комплекс la-молекул с антигеном.
IdTs (idiotype-specific suppressor Т cells). Идиотипспецифические Т-супрессоры. Несут
доминантный перекрестнореагирующий идиотип. Афферентно подавляют ГЗТ.
IEF (isoelectric focusing). Изоэлектрическая фокусировка. Метод разделения амфолитов
(электролитов, несущих как кислые, так и щелочные группы, например, белков и пептидов)
по изоэлектрическим точкам в градиенте pH, создаваемом в электрическом поле.
Igh-C, Igh-V. Кластеры генов на мышиной хромосоме 12, кодирующих V- и С-области
Н-цепей иммуноглобулинов.
IgT-C, IgT-V. Кластеры генов, кодирующих константные и вариабельные области поли-
пептидных цепей антигенраспознающих Т-рецепторов. С тех пор, как установлено, что гены
иммуноглобулинов и Т-рецепторов расположены в разных участках генома, обозначения,
указывающие на роль генов 1g в кодировании Т-рецепторов, утратили смысл.
IgTh (Ig-specific Т helper cells). Иммуноглобулинспецифичные Т-хелперы. Ig-Tx.
IgTs (Ig-specific suppressor T cells). Иммуноглобулинспецифичные Т-супрессоры.
Ig-Tc.
IgVjj-регуляция. Идиотип-антиидиотипические взаимодействия.
IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 (interleukin). Интерлейкины. Идентифицированные
структурно и химически охарактеризованные цитокины (в том числе, лимфокины и моно-
кины), осуществляющие взаимодействие между клетками иммунной системы и участвующие
в регуляции лимфо- и миелопоэза. Белки с мол. массой от 14 до 60 кДа. Факторы антиген-
неспецифических межклеточных дистантных взаимодействий.
IL-2-рецепторы. Трансмембранные гликопротеины активированных Т- и В-лимфоцитов,
акцептирующие интерлейкин-2.
IPM (la-positive moiety). Фрагмент процессированного антигена в комплексе с 1а-мо-
лекулой.
/г-гены (immune response). Гены иммунореактивности. Аутосомные доминантные гены.
Локализованы в К- и, главным образом, в 1-районе Н-2 комплекса у мышей. Кодируют 1а-
молекулы клеток, презентирующих антиген Т-клеткам, определяя тем самым иммунореак-
тивность последних.
IRC (interdigitating reticulum cells). Интердигитатные ретикулярные клетки. Отросча-
тые клетки костномозгового происхождения, выявляемые на срезах в мозговой части тимуса
и тимусзависимых областях периферических лимфоидных органов. Экспрессируют большое
количество молекул МНС класса II. Функционируют как А-клетки.
J-цепь (joining). Соединительная цепь в структуре полимерных форм IgA и IgM.
Словарь терминов
345
К-76. Продукт гриба Stahybotrys complementi К-76. Подавляет расщепление СЗЬ факто-
рами Н и I при активации комплемента по альтернативному пути.
К-клетки (killers). Эффекторные клетки в ADCC, экспрессируют Fc-рецепторы для IgG;
в качестве К-клеток могут функционировать полиморфноядерные гранулоциты, макрофаги,
моноциты, тромбоциты и лишенные маркеров Т- и В-клеток мононуклеарные клетки лим-
фоидной ткани, а также Т-лимфоциты, экспрессирующие Fc-рецепторы для IgM.
KHF (killer helper factor). Фактор Т-хелперов, индуцирующий созревание цитотокси-
ческих Т-лимфоцитов. КХФ.
KLH (Keyhole limpet haemocyanin). Темоцианин моллюска фиссуреллии. Высокоим-
муногенный носитель для позвоночных.
LD-антигены (lymphocyte defined). Аллоантигены лимфоцитарной поверхности, выяв-
ляемые по реакции бласттрансформации в смешанной культуре лимфоцитов.
LIF (leucocyte-migration inhibitory factor). Фактор торможения миграции лейкоци-
тов. Лимфокин с протеазной активностью, подавляющий спонтанную миграцию нейтрофиль-
ных гранулоцитов in vitro.
LTB4, LTC4, LTD4, LTE4. Лейкотриены в форме с четырьмя двойными связями. Фарма-
кологически активные продукты липоксигеназного расщепления арахидоновой кислоты-
Ly-1, Ly-2, Ly-З. (Синонимы Lyt-1, Lyt-2, Lyt-3). Поверхностные аллоантигены раз-
личных субпопуляций Т-лимфоцитов мышей.
Lyb-2, Lyb-3, Lyb-4, Lyb-5, Lyb-6, Lyb-7. Поверхностные аллоантигены мышиных
В-лимфоцитов.
MAC (membrane attack complex). Атакующий мембрану комплекс. Комплекс компо-
нентов комплемента С5Ь6789, разрушающий клеточные мембраны.
MAC-1, MAC-2 (macrophage). Поверхностные антигены мышиных макрофагов, выяв-
ляемые крысиными моноклональными антителами.
MBLA (mouse-specific bone marrow-derived lymphocyte antigen). Поверхностный диффе-
ренцировочный антиген В-лимфоцитов мышей, выявляемый ксеноиммунными сыворотками.
MEL-14. Крысиные моноклональные антитела к рецептору мышиных лимфоцитов,
распознающему эндотелий посткапиллярных венул периферических лимфоидных органов.
МНС (major histocompatibility complex). Семейство генов, кодирующих молекулы четы-
рех классов (I, II, III и IV). Эти продукты МНС обеспечивают соматическую индивидуаль-
ность и иммунореактивность индивида. МНС у мышей — это комплекс Н-2, у человека —
комплекс HLA.
МНС-рестрикция (ограничение). Зависимость функции Т-лимфоцитов (амплифайеров,
хелперов, цитотоксических) и их растворимых факторов от комплементарных взаимодействий
молекул МНС класса I или II с антигеном и с Т-рецептором. Например, чужеродные анти-
гены распознаются Т-клетками хелперной группы только в ассоциации с собственным аллель-
ным вариантом молекул МНС класса II. Ограничение в том, что без ассоциации распознава-
ние не происходит.
MIRF (macrophage la-recruiting factor). Фактор Т-индукторов, стимулирующий экс-
прессию 1а-антигенов на макрофагах.
МКТСА (mouse killer T-cells antigen). Антигенный маркер, выявляемый на цитотокси-
ческих Т-лимфоцитах мышей ксепоиммунной антисывороткой. МКТКА.
MPLA (mouse-specific peripheral lymphocyte antigen). Антиген периферических лимфо-
цитов мышей. Выявляется на лимфоцитах крови и периферических лимфоидных органов
ксеноиммупной антисывороткой. АПЛМ.
MSLA (mouse-specific lymphocyte antigen). Специфический антиген мышиных лимфо-
цитов. Выявляется на Т- и В-лимфоцитах ксеноиммунной антисывороткой. САМ Л.
MSPCA (mouse-specific plasma cells antigen). Специфический антиген мышиных плазма-
тических клеток, выявляемый ксеноиммунной антисывороткой. МСПК.
MTLA (mouse thymus-derived lymphocyte-specific surface antigen). Мышиный поверх-
ностный Т-лимфоцитарный антиген, выявляемый ксеноиммунной антисывороткой.
NIP (4-hydroxy-3-nitro-5-iodophenyl acetyl). Гаптенная группа. ИНА.
NK (natural killer cells). Естественные (натуральные, природные) киллеры. Большие
гранулярные лимфоциты. Низкодифференцированные потомки стволовой кроветворной
клетки. Оказывают неспецифическое токсическое действие на клетки некоторых опухолей
и нормальных тканей. В связи с этим названы киллерами, т. е. истребителями. Функцио-
нируют как эффекторы противовирусного иммунитета.
NP (4-hydroxy-3-nitrophenyl acetyl). Гаптеннаягруппа. НФ. пм/пм-Мыши (nude — го-
лый). Иноредные мыши, гомозиготные по мутантному гену nude. Лишены шерстного покро-
ва, тимуса и Т-лимфоцитов.
346
Словарь терминов
ОКТ (ОКТ antibodies). Торговая марка для препаратов мышиных моноклональных
антител к поверхностным дифференцировочным антигенам человеческих Т-лимфоцитов. Ан-
титела синтезируются гибридомами серии ОК. Производятся американской фирмой Ortho
Diagnostic Systems Inc., Raritan, New Jersey. Специфичность антител ОКТ: периферические
Т-лимфоциты (ОКТ 1, 3, 11), Т-индукторы и Т-хелперы (ОКТ 4, 4А, 4В, 4С, 4D), Т-супрессо-
ры и цитотоксические Т-лимфоциты (ОКТ 5 и 8), тимоциты (ОКТ 6), активированные и про-
лиферирующие Т-лимфоциты, обладающие рецептором к трансферрину (ОКТ 9), предшест-
венники тимоцитов и активированные тимоциты (ОКТ 10). Антитела ОКТ 4 перекрестно реа-
гируют с моноцитами, а ОКТ 8 — с натуральными киллерами.
PAF (platelet activating factor). Фактор, активирующий тромбоциты (кровяные пла-
стинки). Семейство стабильных нейтральных липидов. Освобождаются из активированных
базофилов, тучных клеток, нейтрофилов, моноцитов и макрофагов. Вызывают агрегацию и
дегрануляцию тромбоцитов. Ацетилглицериловый эфир фосфорилхолина. ФАТ.
Р 388Dt. Линия макрофагоподобных мышиных клеток, культивируемая in vitro.
PC-1, PC-2 (plasma cell antigens). Антигены мышиных плазматических клеток, выяв-
ляемые аллоиммунными антисыворотками.
pl (isoelectric point). Изоэлектрическая точка. Величина pH, при которой данная моле-
кула или частица лишена заряда и не мигрирует в электрическом поле.
PGB2, PGD2, PGE2, PGF2, PGG2, PGH, PGI2 (prostaglandins). Простагландины. Биоло-
гически активные липиды. Жирные С20-кислоты, содержащие циклопентановое кольцо.
PGI2. Простациклин. Образуется из PGG2 и PGH2 при обмене арахидоновой кислоты.
Подавляет агрегацию тромбоцитов, расширяет сосуды.
RBL-1 (rat basophilic leukemia). Клетки крысиной базофильной лейкемии.
ri (regulatory idiotopes). Регуляторные идиотопы. Гипотетические идиотопы, которые
несет основная часть данной популяции антител. В ответ на эти идиотопы образуются анти-
идиотипическпе антитела, способные, в свою очередь, стимулировать образование антител
разной специфичности, несущих ri.
S-белок (serum protein). Сывороточный белок, связывающийся с мембраноатакующим
комплексом комплемента С5Ь, С6, С7, С8 и С9 и инактивирующий его.
S-области (switch — переключение). Участки последовательности ДНК 5’С-гена, в ко-
торых происходит рекомбинация при переключении изотопа тяжелых цепей иммуноглобу-
линов.
SB-антиген (secondary В cells). Антиген, выявляемый на В-клетках, пролиферирую-
щих при вторичном иммунном ответе in vitro.
SBA (Soybean agglutinin). Лектин из сои культурной (Glycine max).
SD-антигены (serologically defined). Поверхностные антигены лимфоцитов, опреде-
ляемые серологически, т. е. с помощью антисыворотки.
SFA (suppressive factor of allergy). Фактор, подавляющий аллергию.
SIRS (soluble immune response suppressor). Растворимый фактор, подавляющий иммун-
ный ответ. Неспецифический фактор Т-супрессоров. Взаимодействует с макрофагами и через
них подавляет синтез ДНК и дифференцировку В-клеток. Мол. масса 11 кДа.
sig (cell surface immunoglobulin). Связанная с мембраной В-лимфоцита синтезированная
им молекула иммуноглобулина. Функционирует как антигенсвязывающий рецептор В-лим-
фоцита. Отличается от цитофильного иммуноглобулина, молекулы которого присоединяют-
ся к поверхности клеток из окружающей среды через Fc-рецепторы.
Sip (sex-limited protein). Генетический локус у мышей. Картируется в S-районе ком-
плекса Н-2 вблизи локуса Ss. Кодирует молекулы МНС класса III, а именно, сывороточный
белок Ss аллотипа Sip (вариант мышиного С4), который встречается только у самцов некото-
рых линий (т. е. ограничен полом).
SRS. SRS-A (slow-reacting substance of anaphylaxis). Медленнореагирующая субстан-
ция анафилаксии. Смесь метаболитов арахидоновой кислоты — лейкотриенов С4, D4 и Е4.
Вызывает медленное сокращение гладкой мускулатуры, увеличивает проницаемость сосудов.
Выделяется при гиперчувствительности, обусловленной IgE и IgGl.
Ss (serum substance). Генетический локус у мышей. Картируется в S-районе комплекса
Н-2. Определяет концентрацию сывороточного белка Ss, который является продуктом генов
МНС класса III.
TaF (augmenting Т cell factor). Антигенспецифический фактор. Секретируется индук-
торами Т-хелперов. Усиливает функцию Т-хелперов.
Tai (inducer of augmenting T cells). Индуктор для усиливающих Т-клеток. Амплифайер
для индукторов Т-хелперов.
Словарь терминов
347
Tcs (Т contrasuppressor). Т-контрсупрессор. Защищает Т-хелперы от действия специфи-
ческих эффекторных Т-супрессоров.
TD-антигены (thymus dependent). Тимусзависимые антигены. Для образования анти-
тел к этим антигенам необходима кооперация В-клеток с Т-клетками хелперной группы.
Первичный ответ на эти антигены не развивается у животных, лишенных тимуса. К этим
антигенам относится большинство белков.
TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase). Терминальная дезоксинуклеотидилтранс-
фераза. ДНК-полимераза. Маркер предшественников Т- и В-клеток в костном мозге, селе-
зенке и коре тимуса. Этот фермент появляется в ядре после комитирования стволовой клетки
костного мозга в направлении лимфоидных клеток, затем по мере созревания клеток пере-
мещается в цитоплазму и исчезает.
TI-антигеиы (thymus independent). Тимуснезависимые антигены. В-клетки образуют
антитела к этим антигенам без кооперации с Т-хелперами. Эти антигены вызывают первичный
иммунный ответ у животных, лишенных тимуса. К этим антигенам относятся полимеры с моно-
тонно повторяющимися элементами структуры, например, бактериальные полисахариды.
Th2 (T-helper 2). Вспомогательные Т-хелперы. Имеют рецепторы к антигену, к идиото-
пу 1g и молекулы I-J. Обеспечивают синтез В-клетками 1g определенного идиотипа и пере-
ключение с синтеза IgM на синтез IgG. Реагируют на антиген без МНС-рестрикции.
ТЬВ. Антиген предшественников Т- и В-лимфоцитов мышей. Стадиоспецифический мар-
кер. Выявляется ксеноиммунной антисывороткой. При созревании клеток замещается алло-
антигеном Ly6.
Thy-1 (Thymus). Поверхностный изоантиген Т-лимфоцитов мышей. Раньше назывался
0-антигеном. Существует в двух аллельных формах Thy-1.1 и Thy-1.2 у разных линий мышей.
Tjnd, Tpre, T9U, Tthy. Аллельные серологически определяемые маркеры антигенраспоз-
нающего рецептора Т-лимфоцитов мышей.
Tingible body. Пикнотичные, сильно окрашенные азуром или гематоксилином остатки
клеточных ядер, захваченные макрофагами, расположенными в зародышевых центрах лим-
фоидных фолликулов.
TL (thymus leukemia). Аллоантигены претимоцитов мышей. Относятся к молекулам
МНС класса I.
Tla (thymus leukemia antigen). Генетический локус в Т-районе комплекса Н-2 у мы-
шей. Кодирует TL-антигены.
TRF (T-cell replacing factor). Фактор, заменяющий Т-клетки в кооперации с В-клетка-
ми. Синтезируется хелперами Т-В2. Функционирует как фактор роста В-клеток. Интерле-
кин 5. ТЗФ.
Ts (suppressor Т cell). Т-супрессор. Tsl — антигенсвязывающий, не рестриктирован-
ный по МНС, несущий идиотип, индуктор Т-супрессоров; Ts2 — антиидиотипический транс-
дуктор Т-супрессоров; Ts3 — антигенсвязывающий, несущий идиотип эффекторный Т-су-
прессор.
TseF (Т suppressor effector factor). TsF3. Фактор эффекторных Т-супрессоров. Связы-
вается с антигеном. Несёт идиотоп — продукт гена Igh-V.
Tsi (Т suppressor inducer). Tsl. Индуктор Т-супрессоров. Индуцирует Ts2.
TsiF (Т suppressor inducer factor). TsFl. Фактор, секретируемый индукторами Т-супрес-
соров. Супрессоген. Связывается с антигеном, несёт детерминанту I-J, идиотоп, а также
рестриктирован по аллотипу Igh-V.
тИ-Мыши. Линия CBA/N с рецессивной плейотропной мутацией .rid-гена X-хромосо-
мы, контролирующего созревание В-клеток и макрофагов. У гомозигот по мутантному гену
отсутствует экспрессия детерминанты Ia.W39.
V-ген. Кодирует вариабельные области тяжелой (Vh) и легкой (Vl) цепей иммуногло-
булинов.
WGA (Wheat germ agglutinin). Лектин из зерен (зародышей) пшеницы (Triticum vul-
garis).
Предметный указатель
Абросупрессия II: 388
Агглютинин из зародышей пшеницы (АЗП)
I: 426
— из земляных орехов (PNA) I: 178
— из соевых бобов (SBA) III: 255
АЗКЦ (ADCC) I: 15
Азофениларсонат (АФА) I: 328
АН см. Арахидоновая кислота
Акрифлавин III: 277
АКФ см. Ангиотензин-конвертаза
Алексин III: 89
Аллели Qa и Т1а, распределение по линиям
II: 48
Аллельное исключение I: 23
Аллергические реакции III: 170—171
Аллергический ответ III: 189
Аллергия: история вопроса I: 55
Аллоантиген(ы) лимфоцитов II: 245, 266
— определение концентрации III: 31
— опухолевые III: 268
— презентация макрофагами I: 160
— I-A и I-Е, генетическая организация II:
105
— Н-2К и Qa— II: 88
Аллореактивность Т-лимфоцитов II: 183—
196
Аллотипическая супрессия II: 312
Аллотрансплантат II: 5
Аллофенные мыши II: 290
Американский трипаносомомиаз III: 160
Аминоптерин, обмен III: 251
АМК (атакующий мембрану комплекс) 108
— неоантигены III: 111
— физико-химические свойства и строение
III: НО
Анафилаксия системная III: 173, 212
Анафилатоксины III: 207
Ангиотензин-П III: 177—178
Ангиотензин-конвертаза (АКФ) III: 184
Антиген-антитело взаимодействие, констан-
та равновесия I: 24—25
Антигенная детерминанта III: 47—66
— — новая и комплексная II: 125
— — роль структуры III: 59—66
Антигенные детерминанты, белковые и по-
липептидные III: 58
— — контактирующие остатки III: 58
Антигенный рецептор, функция III: 131
Антиген-неспецифические Т-суПрессоры и их
факторы II: 309
Антигенпрезентирующие клетки I: 36; II:
173—177; III: 166—167
Антигенсвязывающая емкость III: 7
Антигенсвязывающие молекулы Т-клеток
I: 398
Антиген-специфическая супрессия II: 313—
316
Антиген-специфические индукторные моле-
кулы I: 104—105
— Т-супрессоры II: 310
— факторы макрофагов I: 149
Антиген(ы), активация комплемента III: 104
— бактерий и вирусов, активация III: 159
— взаимодействие с антителом III: 583
— влияние на лимфоциты I: 186
— — на SIg-фенотип I: 349
— гетероклитичный III: 40
— группы крови III: 54
— и толерантность II: 366—369
— индукция параллельных наборов II: 431
— класса I II: 76, 78, 88, 92
— класса II II: 76, 100—113
— класса III, структура II: 76
— классификация II: 242
— клеток мыши II: 246—247
— лимфоцитов II: 264—267
- МНС I: 32; II: 73-113
— мутантные II: 89
— превращения в макрофагах I: 135—152
— презентация Т-лимфоцитами I: 124
— примирование Т-супрессоров II: 310
— процессинг I: 146, 151
— сальмонел (О-антиген) III: 50—54
— связывание, схема I: 24—26
— — Т-лимфоцитами I: 387
— углеводной природы III: 49
— угнетение презентации I: 147—148
— Форссмана III: 90
— Гидо и Роджерса III: 114
— DR II: 106—111
— HLA II: 53, 55, 80
— HLA-DR II: 106-111
— la I: 159—163; II: 39—44, 101
— KLH I: 147-148
— Qa и Tla II: 47
— TD I: 348
— TI I: 348
Антиидиотипические антитела II: 387, 432—
435
— взаимодействия II: 277
— нарушения II: 439
— реакции комплементарные II: 427
— регуляторные клетки II: 436
Антисыворотка антиидиотипическая, при-
готовление I: 326
— идиотип-специфическая I: 345
Антитела (антитело) антигаптеновые, спе-
цифичность III: 48
— антиидиотипические см. Антиидиотипи-
ческие антитела
П редметный указатель
349
Антитела взаимодействие с антигеном III:
5-83
— — с лигандом III: 12
— генетические аспекты многообразия II:
340
— гетерогенность III: 5
— гетероклитические III: 40
— индуцированные, вариабельные области
I: 248
— — идиотипы I: 327
— к антигену, влияние на макрофаги I:
141—143
— к миоглобину III: 15
— к фосфорилхолину I: 327
— класса I, гены II: 94
— механизм активции эффекторных функ-
ций II: 80
— образование при индукции толерантно-
сти II: 376
— — при реакции отторжения II: 15
— опосредующие толерантность II: 386
— определение концентрации II: 31
— получение и анализ II: 242
— регуляция образования II: 336—359
— специфичность и перекрестные реакции
III: 39
— сравнение с миеломными белками 1:329
- MEL-14 I: 189—190, 196, 198
Антительный ответ, регуляция II: 274—
278
АПК см. Антигенпрезентирующие клетки
Арахидоновая кислота (АК) III: 172
— — метаболиты III: 177
---обмен III: 213-228
— — производные III: 223
— — свободная III: 214
Ареактивность иммунологическая II: 363
— при белковой перегрузке II: 363
Артмса реакция III: 152
— феномен III: 173
Аутоиммунитет I: 58
Аутотолерантность II: 363
Афибриногенемия наследственная III: 185
Афферентное действие Ts III: 163
Аффинность (сродство, аффинитет) III: 8,
12—27
— в реакции антиген-антитело III: 12—27
— термодинамика III: 6
Бвзофилы III: 188—193
Бактерии, клеточная стенка I: 424
Белок (белки) клеточной стенки бактерий I:
424
- С2 III: 94
— С4 III: 94
— С5, расщепление III: 108
— С5Ь6 III: 106, 109
— QUPC52 III: 57—58
— W 3129 III: 57—58
Бивалентность моногамная III: 23
Бирбэка гранулы I: 117, 121
Бласттрансформация I: 452
Блоттинг по Саузерну I: 259
Брадикинин, образование III: 211—213
Бустерный ответ I: 64
Вариабельная область I I: 19
Взаимодействия (е) близкие, сопряженные
II; 276. См. также Когнатное взаимодей-
ствие
— поликлональное ПП: 277
— В- и Т-лимфоцитов II: 118, 140, 278,
287—293
— Ig-рестриктированное или антиидиотиии-
ческое II: 277
Винкристин III: 166
Вирус лимфоцитарного хориоменингита
(ВЛХМ) III: 149
В-клетки см. также В-лимфоциты
— влияние лимфокинов II: 396, 413—420
— гетерогенность I: 83
— образование I: 76—78
— памяти I: 82
— субпопуляция I: 18, II: 341—345
— филогенез и история вопроса I: 75
— функции I: 87
В-клеточные факторы дифференцировки II:
417
В-клеточный ответ II: 413—420
В-лимфоциты I: 15—19, 74—89, 337—364
— активация I: 17
— взаимодействие с Т-лимфоцитами см.
Взаимодействие В- и Т-лимфоцитов
— дифференцировка и онтогенез I: 16
— как вспомогательные клетки I: 123
— культивирование и клонирование III:
309
— предшественники см. Пре-В-клетки
— распознавание антигена II: 180—183
— — молекул МНС II: 202
Внутренние образы антигенов II: 425, 428
Воспаление, влияние эозинофилов III: 187
Воспалительный ответ III: 171—172
Вспомогательные клетки, активация лимфо-
цитов I: 124—134
— — биологические свойства I: 116—123
— — взаимодействие с В- и Т-клетками I:
131—134
Вуалевые клетки I: 120
Высокоэндотилиальные венулы (ВЭВ) I:
184—192, 196
Гамма-интерферон III: 141
Гаплотип II: 30
Гаптен-специфические Т-клетки I: 105—106
Гаптен(ы) III: 47
— модификация макрофагов I: 144—146
Гат III: 251
Гельзолин1 III: 174
Гемагглютинация и ее торможение III: 77
— пассивная III: 77
Гемоцианин I: 136, 137, 139
Ген(ы) иммунного ответа (Ir) I: 37—38;
II: 18
— — — механизм действия II: 225
— — — открытие II: 213
— — — природа II: 220
— — — функция контроля II: 213—230
— легких цепей А I: 277
— МНС II: 118-207
350
IIредмепгный указатель
Гены МНС и узнавание антигена I:
378
— С геномные I: 265
— Сн, локус I: 283
— Сх у мышей I: 261
— Н-цепей I: 279
— Ig и идиотипы I: 332
— — и рак I: 302
— 1г см. Гены иммунного ответа
— V, множественные I: 261, 265
— V и С, соединение в лимфоцитах
— х I: 276, III: 256
Генетика белков комплемента III: 113
— гистосовместимости см. Гистосовмести-
мость, генетика
— иммуноглобулинов I: 22
Генетически обусловленный фактор (ГОФ)
1: 150
Гепарин III: 201
Гетерогибридомы III: 263
Гетероклитичность III: 40
ГЗТ см. Гиперчувствительность замедлен-
ного типа
Гибридомы, выращивание в культуре III:
257—259
— и моноклональные антитела III: 248—
270
— использование 111:265—269
— скрининг III: 259
— Т-клеточные III: 264
— человек-человек III: 263
Гиперчувствительность замедленного типа
(ГЗТ) III: 163-165, 185
— — и немедленного типа I: 57
— — — медиаторы III: 206
— — — фармакологические реакции III:
166
Гипоксантин, обмен III: 251
Гипотеза «аллостерического кластера» III:
82
— «измененного своего» III: 127
— однообразной иммунизации II:
364
— первичной иммунизации II: 144
— промежуточного состояния III: 65
— центрального угнетения синтеза антител
II: 364
Гистамин III: 178, 183, 190, 202—205
— секреция III: 171, 188, 194—198
Гистосовместимость, генетика II: 6, 10
— гены II: И
Гистотоп I: 36—37
Главный комплекс гистосовместимости
(МНС) I: 31—39; II: 5—68
— — — филогенез II: 204
— щелочной белок (ГГЦБ) III: 185—188
Гликолипиды клеточной стенки бактерий I:
424
Гломерулонефрит III: 173
ГЛТ I: 145
Гомотела 11: 428
ГОФ см. Генетически обусловленный фак-
тор
Группы крови, антигены III: 54
ГЩБ см. Главный щелочной белок
Декстран I: 328
Декстрансвязывающие миеломные белки II:
56
Декстран-сульфат I: 425
Дендритные клетки, активация лимфоцитов
I: 122
— — вспомогательные I: 120—123
Десенсибилизация II: 363
Детерминанты аллотипические I: 208
Джонса — Мота реакция III: 153, 190
Дигидроксиэйкозатетраеновая кислота III:
218, 219
Динитрофторбензол (ДНФБ) III: 153
Дифференцировка адаптивная II: 148
— В-клеток I: 78
— Т-клеток I: 26
х-кДНК, клонирование I: 257
ДНФБ см. Динитрофторбензол
Дыхательная вспышка III: 175
Ерне теория естественного отбора I: 65
— — иммунной сети I: 41
Зона избытка антител III: 66
— — антигена III: 66
Идиотип-антиидиотипическое взаимодейст-
вие III: 266
Идиотипическая сеть регуляторная II: 440—
442
Идиотипические сети II: 423—444
Идиотип-специфическая супрессия Т-клеток
II: 311
Идиотип(ы) I: 20
— влияние на иммунную сеть II: 443
— как аутоантигены II: 426
— перекрестно-реагирующие и общие I: 208
Идиотоп(ы) I: 20; II: 425, 428
ИДК см. Интердигитальные клетки
Изотипы множественные, происхождение II:
338
— появление при иммунном ответе и экс-
прессия II: 341—352
Иммунизация I: 51
— дополнительная II: 281
— способы III: 255
Иммунитет клеточный II: 311
— приобретенный I: 46
— регуляция I: 97
— эффекторные механизмы I: 42
Иммунная сеть II: 426
— — нарушения II: 437—440
— — функциональная II: 443—444
Иммунная система I: 14—45
— — тонкая настройка II: 443
Иммунное отклонение II: 362
Иммунный ответ II: 17—18
— — взаимодействие Т- и В-лимфоцитов II:
278
---гены I: 37—38; II: 213—237
— — изучение I: 455
Предметный указатель
351
Иммунный ответ кинетика появления изо-
типов II: 345
— — регуляция I: 40—42; II: 433
— — Т-зависимый I: 31
Иммунных комплексов болезни, предотвра-
щение II: 444
Иммуноадгезия III: 116
Иммуногематология I: 59
Иммуноген III: 249
Иммуноглобулин(ы) I: 19—26
— аллотип I: 325—334
- биологическая роль II: 430—436
— биологические и эффекторные функции I:
— вариабельные области, структура I: 241 —
— взаимоотношения с антигенами II: 92
— гены, регуляция перестроек I: 299. См.
также Гены Ig
— домены I: 238, 323
— идиотипы I: 313—325
— клеток зародышевых центров, изотипы I:
198
— клеточной поверхности I: 338
— константные области, сравнение I: 233
— молекулярная генетика I: 255—306
— неспецифические II: 430—433
— разнообразие I: 290—299
— секреторный компонент I: 223
— строение и функции I: 204—252
— цепи легкие, строение и функции I: 209
— цепь J I: 216
— шарнирная область I: 235
— эволюция генов I: 239
Иммунодепрессия II: 373
Иммунодиагностика, история вопроса I: 55
Иммунодиффузия III: 69—77
Иммунологическая супрессия I: 108
— толерантность см. Толерантность имму-
нологическая
Иммунологические концепции, формирова-
ние III: 310
— сети I: 40—42; II: 317
Иммунологический перекрест III: 40, 50
— паралич II: 363
Иммунология, история I: 46—72
Иммунопатология 1: 55
Иммуноферментный анализ (ИФА) III: 35—
39, 260
Иммунофлуоресцентный анализ III: 261
Иммуноэлектрофорез III: 75
Инактиватор СЗЬ, синтез в макрофагах III:
183
Инбредные линии II: 6—10
Инбридинг, гистосовместимость II: 6—7
Индукторы I: 383
Инструктивные теории образования антител
Инсулин(ы), активация лимфоцитов I: 462
— распознавание Т-клетками I: 106
Интердигитальные клетки (ИДК) I: 192
Интерлейкины I: 460; II: 401
Интерлейкин-1 (IL-1) II: 401; III: 141, 183
Интерлейкин-2 (IL-2) II: 406; III: 139—145,
301
Интерферон III: 145, 147—148. См. также
Гамма-интерферон
Ионофоры I: 426; III: 176, 183, 194—198,
218
ИФА см. Иммуноферментный анализ
Калликреин III: 211
КБГ см. Кожная базальная гиперчувстви-
тельность
Киллеры природные (натуральные, ПК) III:
142—145
Кининоген высокомолекулярный III: 211
Кинины III: 211
Кислород, токсические метаболиты III: 209—
211
Клетки вспомогательные III: 139
— ГЗТ II: 268
— дендритные I: 14, 178
— иммунной системы I: 14—15
— иммунокомпетентные, длительные куль-
туры III: 296-315
— К (К-клетки), цитотоксичность III: 145 —
147
Клетки-кормилицы III: 178
Клетки лимфоидные, разделение и иденти-
фикация III: 275—294
— презентирующие антиген III: 157—159
— разделение на полистероле см. Плейтинг
— слияние см. Слияние клеток
— сортировка см. Сортировка клеток
— цитотоксические, роль III: 147—149
— Raji III: 116
Клеточная теория иммунитета, история во-
проса I: 60
Клональная делеция II: 386
Клональное абортирование II: 386
Клонирование иммунокомпетентных клеток
III: 298—315
Клоны легких х-цепей 1g
Когнатное взаимодействие I: 18—19, 27—
28; II: 276, 282-283, 317
Кожная базофильная гиперчувствительность
(КБГ, СВН) III: 153, 190
Колхицин III: 145
Комплекс Н-2 II: 27—49
— HLA II: 49-63
Комплемент I: 43—45
— генетика III: ИЗ—118
— значение термина III: 89
— компоненты терминальные III: 106—113
— механизмы активации III: 91—106
— последствия активации III: 118
— регуляция рецепторов III: 182—183
— рецепторы компонентов III: 114
— синтез в макрофагах III: 183
Комплестатин III: 105
Конканавалин А (КонА) I: 163, 422; III:
176
— — восстановление пролиферативного от-
вета I: 130
Константа ассоциации (аффинности) III:
6—9
— конформационного равновесия III: 65
Константная область Ig I: 19
352
П редметный указатель
Контактная чувствительность (КЧ, CS) III;
152
Контрсупрессорная цепь II: 321
Контрсупрессоры I: 41
Конъюгаты III: 130
Костимулятор III: 140
Костный мозг, созревание лимфоцитов I:
173
КПА см. Клетки, презентирующие антиген
Кумса тест I: 320
КЧ см. Контактная чувствительность
Кэппинг и эндоцитоз I; 428—432
Лактоферрин III: 179
Лангганса клетки I: 119
Лангерганса клетки I: 14, 192; III: 165—166
Лейкотриены III: 198, 219
«Лейкоциты активные» III: 152
Лектины I: 420, 426
Летальный удар III: 134
Лизис реактивный III: 109
— Т-клеточный III: 133
Лизолецитин III: 188
Лимфатический узел I: 192, 196
Лимфобласты I: 178, 195
Лимфогемопоэтические клетки III: 266
Лимфоидные клетки, переключение состоя-
ния II: 378
— органы и ткани I: 173—199
Лимфокин(ы) I: 18, 28; III: 141, 183
— секретирующие Т-клетки I: 383
— функция II: 396—420; III: 145
Лимфолиз II: 17—18
Лимфома, подавление роста киллерами III:
148
Лимфотоксин III: 134
Лимфоцитарно-макрофагальные кластеры
III: 157—159
Лимфоциты I: 14—15
— активация I: 124—134, 414—466
— антиген-специфические I: 187
— антигены см. Антигены лимфоцитов
— рециркуляция I: 183
— смешанные, сингенная культура II: 196—
200
— тимусные I: 174
— человека, субпопуляции II: 270
Линии конгенные (рекомбинантные) II: 21 —
26
Линия идентичности III: 73
Липиды и активация лимфоцитов I: 461
Липоксигеназа III: 215
Липосахариды (ЛПС), антигенные и эн-
дотоксиновые свойства III: 50
— индукция параллельных наборов II: 431
Липосомы III: 136
Л ПС см. Липосахариды
Макрофаг-активирующий фактор III: 141
Макрофаг(и) I: 115—168; III: 179—185
— взаимодействие с Т-лимфоцитами I: 152
— как эффекторная клетка I: 164
— модификация гаптеном I: 144—146
— модуляция экспрессии 1а-антигенов I: 159
— продукты I: 167, 183
— процессинг антигена I: 146
— секреторная клетка I: 166
— тканевые I: 119
— Ia-положительные I: 159—164
Манчини метод III: 71
Медиаторы, высвобождение и функции III:
170—230
— и реакция гиперчувствительности III:
194—198; 200
— неспецифические II: 299
Медленно реагирующие вещества (МРВ) III:
188, 214, 216
Мембрана (мембраны) клеточная, структура
I: 417
— лимфоцитов, схематическое изображение
I: 418
— повреждение комплементом III: 107
— при Т-клеточном лизисе III: 136
Мембранные антигены II: 245
Метаболическая вспышка III: 175
Метаболические ингибиторы I: 138
Метод(ы) изучения взаимодействия антиген-
антитело III: 66—80
— «кожных окон» III: 188
Мечникова теория 1: 60—61
Миелома III: 253
Миеломные белки III: 56—58
Миелопероксидаза (МПО) III: 179, 184
Митогены I: 348, 351, 420—427
— активация лимфоцитов I: 128, 432—455
— рецепторы I: 351
— фитолаки (МФЛ) I: 424
Митомицин III: 166
Митромицин III: 277
МНС, гены Ir II: 214—215. См. также Ге-
ны МНС
МНС, молекулы распознавания II: 200—203
— номенклатура II: 19
— отличительные признаки II: 13—21
МНС, продукты II: 73—77
— эволюция II: 204—208
МНС-рестрикция II: 118—124
— при взаимодействии Т- и В-клеток I:
134-135; II: 136, 177, 288
— природа II: 139—158
— роль тимуса II: 153
— Т-клеток II: 135, 138
Модель измененного «своего» II: 124
— сближения или взаимодействия подобных
структур II: 124
Монокины III: 179, 183
Моноклональные антитела и гибридомы III:
248—270
— — распознавание эпитопами III: 269
Моноциты III: 179—185
МРВ см. Медленно реагирующие вещества
Мутанты Н-2 II: 89
МФЛ см. Митоген из фитолаки
Мыши бестимусные II: 169
Нейтрофилы III: 173—179
Некогнатные взаимодействия II: 282—283
П редметный указатель
353
Неоантигены III: 153
— АМК III: 111
Неравновесие по сцеплению II: 60—68
Несочетанное распознавание см. Поликло-
нальное взаимодействие
Неспецифический фактор макрофагов (НМФ)
I: 150—151
Нефрит нефротоксический острый III: 173
Нобелевские лауреаты в иммунологии I:
66—72
Нулевые клетки III: 126
НМФ см. Неспецифический фактор макро-
фагов
ОБИТ I: 155-156
Опсонизация I: 61
Опухолевые клетки, слияние III: 253
Отростчатые клетки ретикулума I: 120
Отторжение трансплантата II: 268
Пактамицин III: 128
Память длительная II: 443
Параллельные наборы II: 430—433
Паратоны (р) II: 425
Переключение тяжелой цепи I: 286
Перекрест истинный III: 45
Перекрестные реакции III: 40
ПК см. Киллеры природные
Плазматическая клетка I: 82
Пластиковый планшет, фотография III: 39
Плейтинг III: 290—294
Поликлональная хелперная помощь II: 283
Поликлональное взаимодействие II: 317
Полиспецифичность III: 46
Полистерол и разделение клеток III: 290—
294
Пре-В-клетки I: 15—16, 79; III: 66—67
Прекалликреин III: 211
Пролиферативный ответ I: 130
Пропердин III: 96, 97, 183
Простагландины I: 163; III: 182—183, 222,
225
Простациклин (ПГ-Н2) III: 227
Протеиназы I: 426
Протеогликаны III: 201
Радиоиммунологический анализ (РИА) III:
27—39; 261
Рак и гены Ig I: 302
Ракетный электрофорез III: 76
Реагины I: 56
Реакция антиген-антитело I: 53—55
— гиперчувствительности замедленного ти-
па (ГЗТ) III: 152—167, 170
— отторжение II: 13
— смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ)
II: 16
— «трансплантат против хозяина» (РТПХ)
III: 158; 290-294
Ревертанты III: 253
Регуляторные механизмы, специфические
для классов Ig II: 352—358
— цепи и супрессия II: 317—323
Регуляция экспрессии изотипов II: 346, 350-
358
Рекомбинация сайт-специфическая III: 267
— VDJ I: 279—283
Рецепторов блокада II: 378
Рецепторы антигенов и активация лимфо-
цитов I: 454
— В-лимфоцитов I: 337—364
— комплемента I: 360
— сшивка I: 427
— Т-клеток I: 402, 404
— Т-лимфоцитов I: 374—410
— факторов роста I: 351—355
— CR3 III: 116
— Fc I: 355-360
— — при экспрессии IgE II: 354
— Ig в воспалительном ответе I: 172
— IgE III: 191
РИА см. Радиоиммунологический анализ
РТПХ см. Реакция «трансплантат против
хозяина»
Сальмонелла, О-антигены III: 50—54
«Свое» и «не-свое», различение II: 443
Селективные теории образования антител I:
65
Сенсибилизация краткосрочная (КСС, STS)
III: 192
Серология антигенов II: 42
— история вопроса I: 55
— определение рецепторов Т-клеток I: 390
Серотонин III: 171, 190, 205
Серотип III: 50
Сипса график III: 19
СКЛ см. Реакции смешанной культуры
лимфоцитов
Скэтчарда анализ, взаимодействие антиген-
антитело III: 14, 16
Слияние клеток III: 253, 256, 306—309
Смулоховского уравнение III: 10
Сортировка клеток для микрофлуориметра
III: 289
Сортировщик клеток лазерный, схема III:
277
Сочетанное распознавание II: 276
Специфичность второго типа и истинная III:
45
— генов Н-2 II: 31
Среды для клонирования и культивирования
III: 301
Стволовая клетка I: 16, 76
Сульцбергера — Чейза феномен III: 163 ~
Супрессия II: 275—325
— индукторы I: 384
Супрессорная цепь II: 318—321
Супрессорные Т-клетки I: 29; II: 269; III: 163
— — и толерантность II: 386
— — Ig-специфические II: 311—313
— Т-клеточные факторы, антиген-специфи-
ческие II: 313—316
Супрессорный эпитоп II: 321
Супрессоры первого, второго и третьего
порядка III: 164
354
Пуедметный указатель
Сыворотки гетерогенные, преимущества III:
5 — 6
Сывороточная терапия I: 51
«Сэндвича» метод III: 37—38
С4-связывающий белок III: 95
С5-конвертаза III: 108
Тгзт см. также Т-клетки, гиперчувстви-
тельность замедленного типа
Тгзт, активация антигенами III: 159
Теория (теории) изгнания I: 47
— истощения I: 49
— образования антител I: 62—66
— приобретения иммунитета I: 46—51
— решетки III: 67
Термодинамика, реакции антиген-антитело
III: 6—10
Тимидин III: 251
Тимоциты, образование I: 99
Тимус и МНС-рестрикция II: 153
— строение и эмбриогенез I: 175—183
ТкА2 см. Тромбоксан
Т-клетки см. также Т-лимфоциты
— антиген-реактивные I: 96
— антиген-специфические, пролиферация I:
124
— влияние лимфокинов II: 396—413
— гиперчувствительность замедленного ти-
па (Тгзт), регуляция III: 163—165
— индукторные, секретируемые молекулы
I: 104—108
— контрсупрессорные I: 386
— литическая активность III: 129
— молекулярные продукты I: 103—108
— образование в онтогенезе I: 98
— программирование в онтогенезе I: 100-
ЮЗ
— различные субпопуляции I: 381
— регуляторные II: 269
— рецептор I: 39—40
— специфичные к носителю II: 284
— структура антигенсвязывающих молекул
I: 398
— субпопуляции, определение I: 94—95
— супрессорные см. Супрессорные Т-клетки
— хелперные см. Хелперные Т-клетки
— цитотоксические (Тс, Тц) II: 269; III:
127—142
Т-клетки Lyl2 I: 386
Т-клеточная реакция II: 269
Т-клеточное распознавание II: 158—168
Т-клеточные факторы, идиотипы I: 333, 353
Т-клеточный ответ, влияние лимфоцитов II:
399—413
— — МНС-рестрикция II: 216
— фактор см. фактор Т-клеточный
Т-лимфоциты I: 26—31, 93—-111. См. также
Т-клетки, Т-хелперы, Т-супрессоры
— активация I: 126; II: 118
— аллореактивные, клонирование II: 183—
196; III: 302, 305
— взаимодействие с В-лимфоцитами см.
Взаимодействие В- и Т-лимфоцитов
— — с макрофагами I: 134, 152; II: 120
— восстановление пролиферативной реак-
ции I: 130
— длительно растущие, получение III: 306
— клонирование II: 134—135
— МНС-рестрикция II: 142, 177, 220
— отвечающие на растворимые антигены
III: 304, 306
— подавление пролиферации I: 139
— пролиферирующие I: 130
— распознавание антигена II: 159
— — молекул МНС II: 201
— рецепторы I: 374—410
— связывание антигена I: 386
— Fj-специфические клоны II: 135
— специфичность, влияние МНС И: 130—133
— торможение II: 129
— хелперные II: 133, 145
— химер II: 150—153
— цитотоксические II: 143, 149
— цитотоксическое действие II: 122—125
ТНБС см. Тринитробензилсульфокислота
ТНФ (тринитрофенильная группа) I: 145;
III: 47
ТНХБ см. Тринитрохлорбензол
Толерантность II: 362
— иммунологическая II: 362—389
— индукция II: 365—367, 374—377
— — Т-супрессоров II: 310
— к «своему» II: 363
— механизмы II: 385—389
— общие сведения II: 365—385
— опосредованная рецептором I: 350
— отмена II: 347—382
— приобретенная и естественная II: 363
— расщепленная II: 362
— частичная, продуцируемые антитела II:
383
Толерантные животные, антигенсвязываю-
щие клетки II: 384
Толероген, элиминация II: 381
Точка эквивалентности III: 66
Трансплантат, отторжение II: 13—16
Трансфер-фактор см. Фактор переноса
Тринитробензилсульфокислота (ТНБС) III:
163
Тринитрохлорбензол (ТНХБ) III: 153—154
Трипсин, влияние на иммуногенность мак-
рофагов I: 137
Триптаза III: 199
Тромбоксан А2 (ТкА2) III: 177—214, 225 —
227
Тромбоциты III: 200
— активация III: 228—230
Т-супрессорные молекулы I: 108-110
Т-супрессоры (Тс, Ts) II: 306—312; III:
163. См. также Супрессоры
Туберкулин I: 138
Тучные клетки III: 188—193, 200
Т-хелперные факторы см. Факторы Т-хел-
перные
Т-хелперы I: 383
— взаимодействие с вспомогательными
клетками I: 131
— специфичные к иммуноглобулинам II:
285
Предметный указатель
355
Ухтерлони метод III: 40, 46, 72—73
Фагосома III: 173
Фагоциты мононуклеарные I: 115—119
Фактор(ы), активирующие тромбоциты
(ФАТ, PAF) III: 192, 198, 206, 228
— аллогенного эффекта II: 299
-— дифференцировки В-лимфоцитов см.
Фактор, заменяющий Т-клетки
— заменяющий Т-клетки (ТЗФ, фактор диф-
ференцировки В-лимфоцитов) II: 300
— ингибирующий миграцию (ФИМ, MIF)
III: 7, 19, 152, 155
— переноса (трансфер-фактор) III: 153
— репликации и созревания В-лимфоцитов
II: 300
— роста В-лимфоцитов II: 302, 414
— Т-клеточный антиген-специфический
(TaF) II: 305
— Т-хелперные, антиген-специфические
(ThF) II: 303—305
— Хагемана (фактор XII) III: 211—212
— В III: 96, 97, 183
— D III: 97, 183
— GRF II: 294
— Н (01Н) III: 98
— I (инактиватор C3b/C4b) III: 98
Фактор-помощник III: 115
Фармакологическая регуляция гиперчувст-
вительности замедленного типа III: 166
ФАТ еле. Факторы, активирующие тромбо-
циты
ФДК см. Фолликулярные дендритные клетки
Фибронектин III: 185
ФИМ см. Фактор, ингибирующий миграцию
Фитогемагглютинин (ФГА) I: 128—130, 421
Флуориметрия проточная III: 276—290
Фолликулярные дендритные клетки (ФДК)
I: 193, 196
Фосфохолин (ФХ), антитела к нему I: 327;
III: 228
5-фторурацил III: 166
ФХ см. Фосфохолин
Хагемана фактор III: 211—212
Хелперная (некогнатная, несочетанная) по-
мощь II: 283
— — поликлональная II: 283
Хелперные взаимодействия II: 282—293
— — молекулярная основа II: 298—306
— влияния II: 275—325
— Т-клетки I: 18, 27, 28; II: 266, 278—282
— — генерация II: 293—294
— — гетерогенность II: 283
— Т-лимфоциты, частота предшественников
II: 294
Химеры аллогенные, распознавание антиге-
на II: 168
— Ft (к. м.) Pj (обл) II: 155, 161, 164
Хлороквин I: 147—148
Цепь I, аллельное исключение и экспрессия
I: 23
Циклооксигеназа III: 221
Циклофосфамид III: 166
Цитотоксические Т-клетки I: 530—31; III:
127-142
Цитотоксичность клеточная III: 126—149
Цитохалазин В I: 138; III: 129, 145
Цитохалазины III: 220
Чагаса болезнь III: 160
Шарко—Лейдена кристаллы III: 188
Шварцмана реакция III: 173, 185, 212
Шунт С1 (Cl-шунт) III: 106
Экспрессия латентная I: 314
— IgA, роль микроокружения II: 352
Эметин III: 128
Эндотоксин, стимулятор реакции Шварц-
мана III: 212
Эндоцитоз и кэппинг I: 428—432
Эозинофилы III: 185—188
Эпитела II: 428
Эпителиальный зачаток I: 99
Эпитоп-специфическая супрессия II: 321
Эпитопы I: 36—37; II: 425
— распознавание моноклональных антител
III: 269
— супрессоры см. Супрессорный эпитоп
Эпитоп-специфическая супрессия II: 321
Эритроциты, лизис иммунный, модельные
опыты III: 107
Эрлиха теория I: 63
Эстераза Cl III: 95
Эффект носителя II: 280
Эфферентное действие III: 163
Указатель латинских названий
Brucella I: 164
— abortus 133, 424; II: 347
Oryctolagus cuniculus I: 318
Canavalia ensiformis I: 422
Cory nobacterium parvurn II: 347; III: 161
Pasterella pestis I: 46
Phytolaca americana I: 424
— octandra I: 424
Proteus mirabilis II: 433
Escherichia coli I: 259, 424; II: 432, 453
Galliformes II: 185
Leishmania tropica III: 159
Listeria I: 146, 161, 164, 165
— monocytogenes I: 31, 118, 146, 165; III: 180
Micrococcus lysodeikticus II: 428, 432
Mus mucculus mollosinus II: 204
Mycobacteria I: 164
Mycobacterium lepra III: 180
— tuberculosis III: 180
Salmonella I: 164
— anatum III: 53
— paratyphi III: 51, 52
— telaviv II: 433
— tranaroa II: 432, 433
— ty phi III: 51, 52
— typ himurium III: 51
Schistos oma mansoni III: 161, 165
Stachybotrys complementi III: 105
Staphylococcus aureus II: 108
Streptococcus sanguis I: 220, 221
— pneumoniae III: 116
Streptomyces lavendulae III: 105
Naja haje III: 105
— naja III: 105
Neisseria gonorrea I: 220, 221
— meningitidis I: 220
Nippostrongylus brasiliensis II: 354, 356, 357;
III: 190
Nocardia I: 351
Treponema pallidum I: 52; III: 116
Trypanosoma III: 159
— cruzi I: 162, 166; III: 187
Xenopus laevis I: 78
Оглавление
Часть VI. Эффективные механизмы иммунитета
Глава 23. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ АНТИГЕН—АНТИТЕЛО. Джей А. Берзофски, Айра
Дж. Берковер (Перевод Т. Н. Власик)..........................................
23.1. Термодинамика и кинетика ....................................
23.1.1. Термодинамика аффинности ....................................
23.1.1.1. Химическое равновесие в растворе...........................
23.1.1.2. Свободная энергия .........................................
23.1.1.3. Роль температуры, pH и концентрации соли...................
23.1.2. Кинетика реакции антиген—антитело ...........................
23.2. Аффинность ..................................................
23.2.1. Взаимодействие антител с моновалентным лигандом в растворе
23.2.1.1. Анализ по Скэтчарду .......................................
23.2.1.2. Гетерогенность по аффинности к антигену....................
23.2.1.3. Средние значения аффинности ...............................
23.2.1.4. Показатели гетерогенности: график Сипса....................
23.2.1.5. График зависимости В/F от F или Т..........................
23.2.1.6. Истинная аффинность .......................................
23.2.2. Взаимодействие с поливалентными лигандами....................
23.2.2.1. Моногамная бивалентность ..................................
23.2.3. Двухфазные системы ...................................... .
23.3. Радиоиммунологический анализ (РИА) и родственные ему методы
23.3.1. Разделение связанного и свободного антигенов ................
23.3.1.1. Методы разделения в растворе ..............................
23.3.1.2. Методы разделения на твердой фазе..........................
23.3.2. Определение концентраций антител и меченого антигена, соответ-
ствующих максимальной чувствительности ..............................
23.3.3. Анализ данных: графическое и численное представления.........
23.3.3.1. Поправки к В, F и Т ........................................
23.3.4. Неравновесный РИА ...........................................
23.3.5. Иммуноферментный анализ (ИФА) ...............................
23.4. Специфичность и перекрестные реакции ........................
23.4.1. Полиспецифичность ...........................................
23.5. Природа антигенных детерминант ..............................
23.5.1. Гаптены .....................................................
23.5.2. Антигены углеводной природы .................................
23.5.2.1. Иммунохимические свойства О-антигенов сальмонелл............
23.5.2.2. Антигены группы крови ......................................
23.5.2.3. Декстрансвязывающие миеломные белки.........................
23.5.3. Антигенные детерминанты белковой и полипептидной природы . . .
23.5.4. Конформация или последовательность? .........................
23.5.4.1. Конформационное равновесие у антигенных детерминант белковой
и пептидной природы .................................................
23.6. Другие методы ...............................................
23.6.1. Количественная преципитация .................................
23.6.2. Иммунодиффузия ..............................................
23.6.2.1. Диффузия одного компонента в одном направлении.............
23.6.2.2. Диффузия одного компонента в двух направлениях (метод Манчини)
23.6.2.3. Диффузия двух компонентов в одном направлении..............
23.6.2.4. Диффузия двух компонентов в двух направлениях (метод Ухтерлони)
23.6.2.5. Иммуноэлектрофорез ........................................
23.6.2.6. Ракетный электофорез ......................................
23.6.3. Гемагглютинация и ее торможение .............................
23.6.3.1. Гемагглютинация ...........................................
5
6
6
6
8
9
10
12
12
15
17
19
20
21
23
23
25
27
28
28
30
31
32
34
35
35
39
46
47
47
49
50
54
56
58
59
64
66
66
69
69
71
71
72
75
76
77
77
358
Оглавление
23.6.3.2. Торможение гемагглютинации .................................... 79
23.7. Возможные изменения структуры антитела, возникающие при свя-
зывании антигена ...................................... 80
Литература ...................................... 83
Глава 24. КОМПЛЕМЕНТ. Эрик Дж. Браун, Кейт А. Джойнер. Майкл М. Фрэнк
(Перевод А. А. Нейфаха)....................................................... 89
24.1. Классический механизм активации комплемента.................. 91
24.1.1. Роль иммуноглобулина ........................................ 91
24.1.2. С4 .......................................................... 94
24.1.3. С2 ............................................................. 94
24.1.4. Ингибитор С1-эстеразы .......................................... 95
24.1.5. С4-связывающий белок ........................................... 95
24.2. Альтернативный механизм активации комплемента................... 96
24.2.1. История вопроса ................................................ 96
24.2.2. Белки альтернативного механизма ................................ 96
24.2.2.1. Фактор D ...................................................... 97
24.2.2.2. Фактор В ...................................................... 97
24.2.2.3. Пропердин ..................................................... 97
24.2.2.4. Фактор II ф 1Н) 98
24.2.2.5. Фактор I (инактиватор СЗЬ/С4Ь) ................................ 98
24.2.2.6. СЗ ............................................................ 98
24.2.3. Активация по альтернативному механизму и ее контроль .... 101
24.2.4. Роль антител в активации альтернативного механизма............. 104
24.2.5. Агенты, используемые для воздействия на активацию альтернатив-
ного механизма ........................................................ 104
24.2.6. Механизм С1-шунта ........................................... 106
24.3. Терминальные компоненты комплемента .................. 106
24.3.1. История вопроса ............................................... 106
24.3.2. Механизм вызванного комплементом повреждения мембраны . . . 107
24.3.3. Лизис эритроцитов ............................................. 107
24.3.4. Инициация сборки С5Ь-9: С5-конвертаза.......................... 108
24.3.5. Расщепление С5 другими протеиназами............................ 108
24.3.6. С5Ь6 и реактивный лизис ....................................... 109
24.3.7. Образование С5Б67 и исследование ингибиторов С5Ь67...... 109
24.3.8. Физико-химические свойства и субъединичное строение атакующего
мембрану комплекса (АМК), находящегося в растворе и связанного
с мембраной ............................................................ ИО
24.3.9. Электронная микроскопия образованного комплементом повреждения 111
24.3.10 Неоантигены АМК............................................ Ш
24.4. Генетика и биосинтез белков комплемента ....................... 113
24.5. Клеточные рецепторы фрагментов компонентов комплемента ... 114
24.5.1. Другие биологические следствия активации комплемента..... 118
Литература ..................................................... 118
Глава 25. КЛЕТОЧНАЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ. Кристофер С. Хэнни, Стивен Джиллис
(Перевод А. А. Нейфаха) ..................................................... 126
25.1. Цитотоксические Т-клетки ...................................... 127
25.1.1. Как функционируют цитотоксические Т-клетки? .................. 127'
25.1.1.1. Общие представления .......................................... 128
25.1.1.2. Стадии литического цикла, осуществляемого Т-клетками.......... 129
25.1.1.3. Направления будущих исследований ............................. 137
25.1.2. Дифференцировка, рост и клонирование цитотоксических Т-клеток 138
25.1.3. Роль растворимых факторов в дифференцировке цитотоксических
Т-клеток .............................................................. 139
25.2. Природные киллеры ............................................. 142
25.3. К-клетки: клеточная цитотоксичность, зависящая от антител . . . 145
25.4. Биологическая роль цитотоксических клеток ..................... 147
Литература ..................................................... 149
Глава 26. РЕАКЦИЯ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА. Марк
И. Грин, Сэм Шаттен, Джонатан С. Бромберг (Перевод А. С. Сер-
пинской) ...................................................... 152
26.1. Варианты замедленной гиперчувствительности и клетки, участвую-
щие в этой реакции .................................................... 152
Оглавление 359
26.2. Активация Т гзт в ответ на антигены бактерий, паразитов и вирусов 159
26.3. Роль Т гзт-клеток в отторжении кожного трансплантата и аллоген-
ных реакциях 160
26.4. Роль Тгзт-исходных клеток с фенотипом Lytl+ в противоопухолевых
реакциях................................................ 160
26.5. Формирование гранулем ........................................... 161
26.6. Регуляция гиперчувствительности замедленного типа....... 163
26.7. Фармакологическая регуляция ..................................... 166
Заключение.............................................. 166
Литература.............................................. 167
Глава 27. МЕДИАТОРЫ: ВЫСВОБОЖДЕНИЕ И ФУНКЦИИ. Чарльз В. Паркер
(Перевод А. С. Серпинской) ............................ 170
27.1. Нейтрофилы .................................................. 173
27.2. Моноциты и макрофаги ...................................... 179
27.3. Эозинофилы .................................................. 185
27.4. Базофилы и тучные клетки .................................. 188
27.4.1. Секреция .................................................... 194
27.4.2. Гранулы тучных клеток ....................................... 198
27.4.3. Тромбоциты .................................................. 200
27.5. Медиаторы ................................................... 200
27.5.1. Гепарин и другие протеогликаны .............................. 201
27.5.2. Гистамин .................................................... 202
27.5.3. Серотонин ................................................... 205
27.5.4. Фрагменты комплемента ....................................... 206
27.5.5. Токсические метаболиты кислорода............................. 209
27.5.6. Кинины ...................................................... 211
27.5.7. Метаболиты арахидоновой кислоты ............................. 213
27.5.7.1. Основные пути обмена арахидоновой кислоты.................. 213
27.5.7.2. Образование свободного арахидоната ........................ 214
27.5.7.3. Продукты липоксигеназы .................................... 215
27.5.7.4. Медленно реагирующие вещества ............................. 216
27.5.7.5. Дигидроксиэйкозатетраеновые кислоты ....................... 219
27.5.7.6. Моногидроксиэйзатетраеновые кислоты........................ 220
27.5.7.7. Продукты циклооксигеназы .................................. 221
27.6. Факторы, активирующие тромбоциты: ацетилглицерильный эфир
фосфорилхолина (АГЭФХ-фактор активации тромбоцитов) . . . 228
Литература .................................................. 231
Часть VII. Важнейшие методы изучения
иммунной системы
Глава 28. ГИБРИДОМЫ И МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА. Джон Ф. Кирней
(Перевод Т. Н. Власик)............................................. 248
28.1. Общие вопросы, касающиеся получения гибридом.............. 249
28.1.1. Гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ). Обмен и процедуры
отбора ............................................................ 251
28.1.2. Ревертанты ............................................... 253
28.1.3. Слияние клеток разных, непрерывно растущих опухолевых линий 253
28.1.4. Выбор миеломы ............................................ 253
28.1.5. Способы иммунизации ...................................... 255
28.1.6. Схемы слияния клеток...................................... 256
28.1.7. Выращивание гибридом в культуре........................... 257
28.1.8. Получение моноклональных антител ......................... 258
28.1.9. Причины неудач при получении гибридом..................... 259
28.2. Скрининг ................................................. 259
28.2.1. Иммуноферментный анализ (ELISA) .......................... 260
28.2.2. Радиоиммунный анализ ..................................... 260
28.2.3. Иммунофлуоресцентный анализ............................... 261
28.3. Другие гибридомы.......................................... 262
28.3.1. Гетерогибридомы........................................... 262
360
Оглавление
28.3.2. Гибридомы человек—человек .................................... 263
28.3.3. Т-клеточные гибридомы......................................... 264
28.4. Примеры использования гибридом ............................... 265
28.4.1. Разнообразие В-клеток ........................................ 265
28.4.2. Моноклональные антитела и лимфогемопоэтические клетки .... 266
28.4.3. Взаимодействия идиотип—антиидиотип ........................... 266
28.4.4. Опухолевые антигены .......................................... 268
28.4.5. Диагностика и терапия ........................................ 268
28.5. Распознавание эпитопов моноклональными антителами............. 269
Литература.................................................... 270
Глава 29. РАЗДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ КЛЕТОК. Ирвин Шер, Майкл
Дж. Мэйдж (Перевод А. Ю. Руденского)................................ 275
29.1. Проточная микрофлуориметрия ................................ 276
29.1.1. Принципы действия .......................................... 276
29.1.1.1. Сигнал светорассеяния..................................... 278
29.1.1.2. Сигнал флуоресценции: анализ по одному или двум параметрам 280
29.1.1.3. Хранение, извлечение и представление информации........... 281
29.1.2. Приготовление и окрашивание образцов........................ 285
29.1.2.1. Выделение клеток ......................................... 285
29.1.2. Источник антител ........................................... 285
29.1.2.3. Прямое или непрямое окрашивание........................... 286
29.1.3. Экспериментальные контроли.................................. 287
29.1.4. Сортировка клеток........................................... 289
29.2. Разделение клеток на специфически покрытых полистироловых
подложках .......................................................... 290
Литература ................................................. 294
Глава 30. ДЛИТЕЛЬНЫЕ КУЛЬТУРЫ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК.
С. Гаррисон, Фэтмен, Фрэнк В. Фитч (Перевод А. Ю. Руденского) 296
30.1. История вопроса ................................................ 296
30.2. Общие условия клонирования................................. 298
30.3. Среды, используемые для клонирования и культивирования . . . 301
30.4. Получение культуральной жидкости, содержащей IL-2............- 301
30.5. Клонирование аллореактивных Т-клеток ........................... 302
30.6. Клонирование мышиных Т-лимфоцитов, отвечающих на растворимый
антиген ................................................................. 304
30.7. Клонирование человеческих аллореактивных Т-лимфоцитов 305
30.8. Клонирование человеческих Т-лимфоцитов, отвечающих на раство-
римые антигены .......................................................... 306
0.9. Слияние клеток как способ получения длительно растущих Т-лим-
фоцитов ........................................................ 306
30.10. Длительное культивирование и клонирование В-лимфоцитов. . . . 309
30.11. Длительное культивирование и клонирование других иммуноком-
петентных клеток ........................................................ 310
30.12. Исключительная роль исследований Т-клеточных клонов в форми-
ровании иммунологических концепций 310
Литература ..................................................... 315
Список терминов и сокращений (Составитель А. Н. Мац).................... 320
Предметный указатель ................................................... 438
Указатель латинских названий ........................................... 356