М.М. УМЛРОВ
cconi/итивнля
13ОТфИК04иИЯ

М. М. УМ АРОВ
АССОЦИАТИВНАЯ
АЗОТФИКСАЦИЯ
ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
1986

УДК 631.46
Умаров М. М. Ассоциативная азотфиксация.— М.: Изд-во Моск.
ун-та, 1986. — 136 с.
Монография посвящена одному из основных направлений в
изучении биологической фиксации атмосферного азота в почЕе —
ассоциативной азотфиксации. Большое внимание уделено экологическим
особенностям ассоциативной азотфиксации, ее зависимости от типа
фотосинтеза, от влажности и температуры почвы, от концентрации СОг,
влажности и температуры воздуха и пр. Освещены вопросы
продуктивности ассоциативной азотфиксации ц ее роли в азотном балансе
различных биогеоценозов, подробно рассматриваются микробные
ассоциации, осуществляющие процесс фиксации атмосферного азота в
прикорневой зоне и на поверхности растений, их физиологические
особенности и продуктивность азотфиксации в отличие от известных чистых
культур азотфикенрующих бактерий. Обсуждаются современные
проблемы охраны природы в связи с интенсивным применением азотных
удобрений.
Для почвоведов, биологов, агрономов.
Рецензенты:
академик Е. Н. Мишустин,
доктор биологических наук, профессор В. Т. Емцев
Печатается по постановлению
Редахционно-издательского совета
Московского университета
3802020000--128 fi4_«fi © Издательство Московского
У~077(02)-86 университета, 1986

ПРЕДИСЛОВИЕ
Биологическая фиксация молекулярного азота —
одна из важнейших проблем современной науки, поскольку
именно азот атмосферы играет ведущую роль в создании и
поддержании азотного статуса биосферы Земли. Познание
основных закономерностей этого процесса позволит перейти к
активному его регулированию в естественных и искусственных
экосистемах, что, несомненно, станет крупнейшим достижением
практической микробиологии.
В последние 10—15 лет достигнуты существенные успехи в
изучении ассоциативной азотфиксации, которая превратилась
в самостоятельный раздел учения о «биологическом» азоте.
Первоначально основное внимание уделялось взаимодействию
нескольких азотфиксирующих бактерий (Spirillum lipoferum,
Azospirillum brasilense и др.) с корневой системой тропических
злаковых растений. Обстоятельная сводка данных, полученных
в этот период, содержится в сборнике статей «Associative
nitrogen fixation» (vol. 1, 2. Eds. P. Vose, A. Ruschell, N. Y. — L.,
1981). Однако ныне стало очевидным, что проблема
ассоциативного связывания азота атмосферы охватывает значительно
более широкий круг вопросов, а утверждения об уникальности
свойств азоспирилл, важнейшими из которых являлись
способность к селективной колонизации корней некоторых злаков и
проявляемая при этом высокая азотфиксирующая активность,
оказались сильно преувеличенными. Ассоциативная азотфикса-
ция осуществляется самыми разными бактериями при развитии
в ризосфере и филлосфере всех растений, во всех природных
зонах, в силу чего имеет большую экологическую значимость.
Данные об ассоциативном связывании азота накапливаются
так быстро и сведения проистекают из столь разнообразных
источников, что уследить за всеми достижениями в этой области
становится все труднее. Возникшая необходимость в
систематизации знаний по ассоциативной азотфиксации на основе
новых теоретических посылок и с учетом последних взглядов в
области экологии, физиологии и биохимии азотфиксирующих
микроорганизмов и послужила одной из причин написания
этой книги. В ней рассмотрены наиболее важные работы в
области экологии ассоциативной азотфиксации и не делается
попытки охватить всю обширную литературу, как-либо связанную
3

с этим явлением. Практически не затронуты вопросы генетики
и биохимии ассоциативной азотфиксации, а основной целью
было показать разностороннее экологическое значение ее,
необходимое для понимания роли этого явления во многих
природных процессах.
Большая часть упоминаемых в книге исследований
проведена совместно с аспирантами и студентами, которым автор
глубоко признателен.
М. Умароа

ВВЕДЕНИЕ
Интерес к проблеме микробиологической фиксации
атмосферного азота, проявляемый ныне широким кругом
исследователей, обусловлен не только главенствующей ролью этого
процесса в азотном балансе биосферы Земли; в еще большей
степени он вызван его перспективностью как источника
связанного азота для обеспечения быстрорастущих нужд сельского
хозяйства и промышленности. Увеличивающееся загрязнение
природной среды при современных интенсивных способах
ведения сельскохозяйственного производства, односторонне
ориентирующегося на применение высоких доз минеральных азотных
удобрений, и быстро растущая энергоемкость его при
ограниченных запасах невозобновляемых энергоресурсов на планете
привели к выводу о необходимости более полно использовать
«биологический» азот. Основными аргументами при этом
выступают его полная безвредность для человека и окружающей
среды и относительно небольшие затраты энергии на
активизацию микроорганизмов, осуществляющих азотфиксацию.
Именно по этим причинам проблема «биологического» азота
отнесена в настоящее время к числу важнейших в области
биологических исследований во всех индустриально развитых
странах, обладающих хорошо развитой азотной промышленностью.
В последние годы достигнуты серьезные успехи в изучении
биохимии, генетики, физиологии азотфиксации, являющихся
наиболее быстро прогрессирующими направлениями на пути
овладения этим сложным природным процессом. Традиционным
объектом исследования служит фиксация азота для почвенной
и сельскохозяйственной микробиологии, основное внимание
уделяющим экологическим особенностям азотфиксации, ее
значению в азотном питании культурных растений и азотном балансе
почв.
Знание экологии азотфиксации необходимо уже сейчас для
правильного обоснования мероприятий по практическому
использованию достижений генной инженерии и прикладной
микробиологии с целью управления азотфиксирующими
микроорганизмами в почве, а в перспективе роль экологических
исследований будет быстро возрастать. В частности, они будут иметь
важное значение для обоснования системы мер по
рациональному использованию почвенного покрова планеты, поскольку
высокоэффективное природопользование на основе разумного
5

сочетания хозяйственных потребностей общества с требованиями
охраны природы предполагает в качестве необходимого этапа
оптимизацию применения азотных удобрений с целью
увеличения доли «биологического» азота в урожае.
Повышение отдачи полей в последнее десятилетие было
достигнуто главным образом за счет широкого использования
минеральных удобрений. Внедрение в практику сельского
хозяйства интенсивных, высокоурожайных сортов растений
потребовало создания в корнеобитаемом слое почвы все более
высоких концентраций легкодоступных соединений азота, что в
свою очередь обусловило необходимость наращивания
производства азотных удобрений. Однако дальнейшее увеличение
выпуска « применения азотных удобрений связано с решением
широкого круга проблем, из которых наиболее важными
представляются две — энергетическая (экономическая) и
экологическая.
Согласно многочисленным оценкам энергозатраты на
производство, транспортировку, хранение и внесение удобрений
растут значительно быстрее (экспоненциально) по сравнению
с ростом урожаев; повышение урожайности зерновых культур
в 2 раза (с 20 до 40 ц/га) требует увеличения суммарных затрат
энергии в 10 раз, причем основная доля в них приходится на
синтез азотных удобрений. Так, в США энергозатраты на
производство и использование азотных удобрений составляют
около 35% от общего объема энергопотребления в сельском
хозяйстве, а в странах Западной Европы они достигают 42% (Ро-
stgate, 1978).
Столь высокий уровень энергозатрат обусловлен большой
энергоемкостью применяемых в настоящее время
промышленностью способов получения азотных удобрений и
необходимостью многократного в течение вегетационного периода внесения
их в почву. Ограниченность запасов углеводородных
энергоносителей (нефть, газ, уголь), на использовании которых
базируется почти 90% мирового производства энергии, и все более
усложняющиеся условия их добычи вызывают быстрый рост
стоимости азотных удобрений и общее удорожание продукции
сельского хозяйства. Считается, что, несмотря на быстрый
прогресс атомной энергетики, еще не менее 150—200 лет основным
источником энергии на планете будет углеводородное топливо,
вследствие чего имеющаяся ныне тенденция к росту стоимости
азотных удобрений будет устойчиво сохраняться.
Экологическая проблема широкого применения все более
высоких доз азотных удобрений обусловлена в первую очередь
низким (не более 50%) коэффициентом использования их
растениями и, как следствие, массированным сбросом
легкорастворимых азотнокислых и аммонийных солей в водоемы,
накоплением их в почве, поступлением газообразных соединений азота
в атмосферу.
Эвтрофикация водоемов и происходящий при этом сдвиг
6

экологического равновесия в них приводят к ухудшению
биологического состояния водной среды, резко понижают
хозяйственную ценность воды. Повышенные дозы азотных удобрений
в почве вызывают нежелательные изменения в химическом
составе растений, что в свою очередь приводит к снижению
продуктивности сельскохозяйственных животных, отрицательно
сказывается на здоровье людей. Загрязнение атмосферы окислами
азота способствует усилению процессов мутагенеза и
канцерогенеза.
Если решение энергетической проблемы производства
азотных удобрений в перспективе возможно (хотя и связано с
такими сложными вопросами, как тепловое «загрязнение»
планеты), то задачи, связанные с охраной природной среды от
избытка этих соединений, будут сохранять свою остроту длительное
время.
Не случайно в последние годы усиливается интерес к новым
и нетрадиционным методам земледелия и растениеводства,
предполагающим широкое использование биологических
механизмов защиты и питания растений, способствующих
существенному ограничению использования или полному отказу от
применения ядохимикатов в сельском хозяйстве и уменьшению
доз азотных удобрений. Появляется все больше данных в
пользу мнения, что оптимизация водного и воздушного режимов
почвы и ее гумусного и химического состояний, активное
регулирование концентрации углекислоты в приземном слое
воздуха, использование принципиально новых методов управлений
гекотипической и модификационной изменчивостью организмов
на базе последних достижений теоретической биологии
позволят в будущем перейти от современного «химического»
земледелия к конструированию крупномасштабных агробиогеоцено-
зов на «биологической» основе.
Именно этим обусловлен возрастающий интерес к проблеме
«биологического» азота не только у микробиологов, генетиков
и биохимиков, но и у агрохимиков, экологов, экономистов,
многих других специалистов. Микробиологическая фиксация
атмосферного азота — единственный экологически чистый путь
снабжения растения связанным азотом, при котором принципиально
невозможно загрязнение почв, водоемов и атмосферы. Кроме
того, микробная азотфиксация осуществляется главным
образом за счет энергии Солнца и позволяет избежать громадных
затрат энергетического сырья. Считается, что полное освоение
процесса микробиологической фиксации молекулярного азота
позволит решить проблему питания в условиях быстрого роста
населения планеты и сокращения запасов нефти, газа и угля
(Мишустин, 1983).
Согласно последним оценкам (Мишустин, 1983) суммарная
годовая продукция азотфиксации в наземных экосистемах
составляет около 175—190 млн. т, из которых 99—110 млн. т
приходится на почвы сельскохозяйственных угодий. Ежегодный
7

выпуск минеральных азотных удобрений в мире достиг 60 млн. т;
кроме того, на поля вносится около 15 млн. т азота в составе
органических удобрений.
С учетом коэффициента использования азота из этих
удобрений (не более 50% для минеральных и около 15—30% для
органических) сельскохозяйственные растения получают ;из этих
источников 30—35 млн. т азота в год. В то же время
ежегодный вынос азота из почвы с продукцией сельского хозяйства
составляет около ПО млн. т (FAO production yearbook, 1981).
Следовательно, основная масса азота в урожае (70—75%)
имеет другое происхождение — она представлена азотом
«биологическим» и азотом минерализующегося органического
вещества почвы, в основной массе также имеющим
микробиологическое происхождение. На сегодняшний день нет данных о
доле участия каждого из этих источников в азотном питании
растений, и определение соотношения между ними представляет
важнейшую задачу биологии и химии почв. Отсутствие
сведений о масштабах азотфиксации в почвах основных типов и под
основными сельскохозяйственными культурами было
обусловлено отсутствием надежных полевых методов оценки
азотфиксации. Длительное время она проводилась лишь
ориентировочно — путем экстраполяции данных лабораторных (Измерений
или же на основе балансовых расчетов. Невозможность
изучения азотфиксации непосредственно в~тгриродной обстановке не
позволяла получить точную количественную характеристику
этого динамичного процесса в почве и выявить степень
зависимости его от конкретных природных факторов. Последнее
необходимо для решения вопроса о величине вклада разных групп
азотфиксирующих микроорганизмов в азотный баланс почв.
Обычно участие их в суммарном процессе фиксации
атмосферного азота в почве оценивалось по результатам, полученным
при лабораторном культивировании ограниченного числа
штаммов того или иного вида. Поскольку исследовались главным
образом чистые культуры микроорганизмов-азотфиксаторов, то
тем самым исключалось действие такого важного
общебиологического фактора, как взаимодействие организмов, нередко
играющего ведущую роль в природе.
Общая слабая изученность экологии азотфиксации и
отсутствие количественных данных об активности этого процесса в
почвах агроэкосистем не позволяли до последнего времени
установить истинное значение микроорганизмов-диазотрофов в
азотном питании растений и оценить долю «биологического»
азота в урожае. Не мог быть решен и принципиально важный
вопрос о возможности управления азотфиксацией в почве.
По источникам доступной энергии диазотрофные
микроорганизмы обычно относят к двум основным группам — автотро-
фам и гетеротрофам, хотя в свете последних данных
(Кондратьева, Гоготов, 1981) такое деление представляется в достаточной
степени условным.
8

Автотрофные фиксаторы атмосферного азота — цианобак-
терии и фотосинтезирующие анаэробные бактерии — играют
заметную роль лишь в переувлажненных и затопленных почвах
(болота, рисовники), где фиксируют до 25—50 кг азота в год
на гектар (Watanabe et al., 1982). В автономных почвах
основных типов они развиваются непродолжительное время и только
в хорошо освещаемых и прогреваемых самых поверхностных
слоях, вследствие чего их вклад в суммарное азотонакопление
невелик и не превышает нескольких килограммов азота на
гектар за год. Кроме того, в агроэкоеистемах с высоким уровнем
агротехники, предполагающим обязательное внесение азотных
удобрений и применение пестицидов, их азотфиксирующая
активность быстро подавляется — значительно быстрее, нежели
у гетеротрофных азотфиксаторов (Watanabe et al., 1981).
В почвах всех типов, в ризосфере и филлосфере растений
наиболее распространены и многочисленны гетеротрофные азот-
фиксирующие микроорганизмы, что косвенно свидетельствует
оих важной роли в обеспечении растений азотом.
Роль различных групп гетеротрофных азотфиксаторов в
азотном балансе почв изучена неодинаково. Наиболее хорошо
известно значение клубеньковых бактерий в азотном питании
бобовых растений и в обогащении почв азотом. Однако в
масштабах биосферы их роль относительно невелика, поскольку даже
в агроэкоеистемах в настоящее время бобовые растения
занимают скромное место — около 10% от общей площади посевов
сельскохозяйственных культур, а в естественных климаксных
фитоценозах их практически нет (Работнов, 1985).
Вклад других представителей гетеротрофных симбиотиче-
ских азотфиксаторов (эндосимбионты ольхи, облепихи и др.)
еще не оценен, но предположительно значителен (Калакуцкий,
Парийская, 1982).
Наименее изученной является деятельность несимбиотиче-
ских («свободноживущих») гетеротрофных азотфиксирующих
бактерий, хотя представители именно этой группы были
впервые описаны как азотфиксаторы. Широко распространено
мнение, что в почвах зоны умеренного климата они связывают не
более 3—5 кг азота на гектар в год, а сама группа уникальна
и немногочисленна. С другой стороны, в последние годы, было
выявлено широкое распространение и большое видовое
разнообразие гетеротрофных бактерий-азотфиксаторов в почвах всех
биоклиматических зон, в прикорневой зоне и непосредственно
на поверхности небобовых и бобовых растений, в водоемах,
•илах и осадках, в кишечнике насекомых, рыб и высших
животных, во многих других местообитаниях, что дало основание
предполагать их более важную роль в природе. Правомочность
такого вывода следует и из общеэкологического принципа
дублирования, постулирующего, что ни один из важнейших
природных процессов не может осуществляться узкой группой
высокоспециализированных организмов (Одум, 1975).
9

Разработанные в последнее время высокочувствительные
газохроматографические методы определения азотфиксации
впервые позволили проводить измерения активности
азотфиксации непосредственно в природе, в условиях, максимально
приближенных к естественным, и подойти к точной
количественной оценке значения этого процесса в азотном балансе
различных экосистем. Применение новых методов привело к
существенному расширению знаний по экологии азотфиксации.
Одним из важнейших достижений явилось обнаружение
повышенной азотфиксирующей активности в фитоплане
(ризосфере и филлосфере) небобовых растений, получившее название
«ассоциативной азотфиксации». Сама возможность активизации
азотфиксации в прикорневой зона небобовых растений была
предсказана еще в 1926 г. С. П. Костычевым, а
экспериментально подтверждалась различными исследователями при
использовании балансового метода. В частности, это было
показано в длительных (80—140 лет) опытах по возделыванию
небобовых растений без применения азотных удобрений (Брэд-
бокский опыт в Англии, поля Прянишникова в СССР, опыт
«вечная рожь» в ГДР и др.). Бессменное возделывание небобовых
культур (озимой пшеницы, ячменя, ржи, риса и др.) не
приводило к заметному снижению содержания азота в почве
несмотря на ежегодное отчуждение его с урожаем, тогда как в
вариантах без растений («вечный» пар) происходило непрерывное
уменьшение количества гумуса и азота в почве.
К настоящему времени изучение ассоциативной
азотфиксации превратилось в самостоятельный раздел учения о
биологическом азоте. Показано широкое распространение
ассоциативной азотфиксации, выяснены многие физиологические и
биохимические особенности этого процесса, активно изучаются
микроорганизмы, осуществляющие его в ассоциации с
растениями. Изучение особенностей ассоциативной азотфиксации
привело к выводу о большой ее экологической значимости —
именно этим путем вероятнее всего происходит пополнение фонда
доступного азота в большинстве природных экосистем. В
ближайшей перспективе стоит практическое освоение этого
процесса.

ГЛАВА 1
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ
АЗОТФИКСАЦИИ В ПОЧВЕ
Изучение микробиологических процессов
непосредственно в природной среде, с учетом всего многообразия ее
факторов, было начато еще С. Н. Виноградским. Тем не менее
и в настоящее время это важнейшая проблема экологической
микробиологии. Знание характера и интенсивности
осуществляемых микроорганизмами в их естественных местообитаниях
процессов необходимо для решения широчайшего круга
вопросов биологии и медицины, почвоведения и геологии, геохимии
и геофизики, многих других наук о Земле. Важно оно и в
космических исследованиях.
Решение этой проблемы во многом зависит от разработки
точных и высокочувствительных методов измерения
концентрации различных микробных метаболитов в конкретных
природных средах: водоемах, атмосфере, почвах.
Несовершенство методов изучения жизнедеятельности
микроорганизмов непосредственно в почве являлось в течение
длительного периода основным сдерживающим моментом не только
в развитии самой почвенной микробиологии, но и не позволяло
с достаточной уверенностью переносить результаты
лабораторного изучения тех или иных процессов на природную
обстановку.
Если для изучения превращений ряда биофильных
элементов — углерода, кислорода, серы — уже созданы достаточно
точные методы, позволяющие проводить измерения активности
процессов не только в лабораторном эксперименте, но и, что
наиболее важно, осуществлять наблюдения в полевых условиях,
то с изучением микробиологических превращений азота
положение обстоит более сложно.
Сравнительно низкие и быстро меняющиеся концентрации
различных соединений азота в почве, крайняя гетерогенность
ее как среды обитания микроорганизмов не позволяют
известными ранее методами получить представление о скорости их
появления и исчезновения, о масштабе отдельных этапов в
цикле азота в природной обстановке, хотя детальные исследования
в этой области становятся все более необходимыми и важными
как с общеэкологических позиций, так и для решения вопросов
контроля окружающей человека среды, сельского и лесного
хозяйства, здравоохранения.
II

Метод Кьельдаля
Длительное время, с момента открытия явления
микробиологической фиксации атмосферного азота,
утверждения о фиксации азота микроорганизмами основывались или
на их росте в среде, лишенной соединений азота, или на
накоплении азота в среде по мере их культивирования, когда
содержание его оценивалось по методу Кьельдаля. Рост на субстрате,
предположительно не содержащем доступных соединений азота,
еще не дает убедительных оснований об азотфиксации; более
того, как свидетельствует обширная литература, он нередко
приводит к ошибочным выводам.
Определение азота по методу Кьельдаля отличается
небольшой точностью и для достоверной прибавки азота в среде
необходима длительная, в несколько суток, инкубация образцов
почв, илов или воды в фиксированных условиях температуры,
влажности, газового состава атмосферы, что полностью
исключает возможность его использования в полевых исследованиях.
Изотопные методы
С появлением в 40-х гг. высокочувствительного
масс-спектрометрического, а затем и эмиссионного
спектрального методов определения стабильного изотопа 15N2
неоднократно предпринимались попытки использовать его не только
для лабораторного изучения азотфиксации в природных
образцах, но и для исследований в полевых условиях. Главной
трудностью при этом, помимо чисто технических сложностей масс-
спектрометрического и спектрального анализов изотопного
состава, было осуществление длительной (до нескольких суток)
экспозиции неизменных участков почвы или ила с растениями
в атмосфере, обогащенной 15N2, вследствие чего обычно
прибегают к определению азотфиксации в пробах небольшого объема
(0,5—1,0 см3) свежеотобранной почвы или ила или- же в
небольших монолитах почвы с растениями. Считается, что
накопление азота менее 100 кг/га в год в полевых условиях трудно
уловить этим методом (Дарт, Дэй, 1979).
Разработка сравнительно простого и быстрого способа
получения радиоактивного изотопа азота 13N2 с помощью циклотрона
(Austin et al., 1975) позволяет использовать его для изучения
азотфиксации. Однако все преимущества точных и
высокочувствительных радиоизотопных методов определения
азотфиксации ограничены коротким периодом полураспада (около 10 мин)
этого изотопа — обычно время работы не превышает 1,5 ч.
Вследствие этого он применяется лишь для исследования
быстротекущих процессов на первых этапах микробиологической
фиксации молекулярного азота.
Другие радиоактивные изотопы азота имеют еще более ко-
12

роткий период жизни и поэтому не представляют интереса при
изучении азотфиксации.
Ацетиленовый метод
При изучении свойств нитрогеназы было
обнаружено, что фиксация ею азота избирательно подавляется
ацетиленом и что ацетилен восстанавливается при этом до этилена
в количестве, пропорциональном количеству азота, которое
может быть восстановлено в тех же условиях (Dilworth, 1966).
Метод, основанный на этом явлении, получивший название
ацетиленового, было предложено использовать для изучения азот-
фиксации (Stewart et al., 1967).
Использование ацетилена в качестве аналога азота
позволило применить для анализа образующегося этилена методы
газовой хроматографии, что существенно повысило пределы
обнаружения азотфиксации — более чем в 106 раз по
сравнению с методом Кьельдаля и в 103 раз, чем при использовании
стабильного изотопа азота 15N2. Соответственно возросла,
точность анализов и значительно сократилось (до 30—90 мин)
время определений, упростилась техника исследований.
Преимущества метода редукции ацетилена были столь
очевидны, что в короткий срок он. вытеснил все другие методы
и в настоящее время является основным в практике физиолого-
биохимических и экологических исследований азотфиксации.
Катализируемая нитрогеназой реакция восстановления
молекулярного азота может быть схематично представлена в виде
«следующего уравнения:
N2+6H++6e-^2NH3. (1)
Молекула ацетилена, как и N2, имеет линейное строение с
примерно тем же межатомным расстоянием, что и объясняет
механизм его восстановления активным центром нитрогеназы.
Нитрогеназа характеризуется малой специфичностью в
отношении субстрата и может восстанавливать, помимо ацетилена,
ряд других соединений — HCN, CH3CN, N20, азид, метилаце-
тилен, циклопропил и их гомологи. Наиболее важным
преимуществом использования ацетилена в качестве субстрата при
изучении азотфиксации является то, что единственным
конечным продуктом этой реакции является этилен:
С2Н2+2Н++ 2ё->С2Н4. (2)
Константа Михаэлиса для реакции восстановления С2Н2
примерно в 10 раз ниже, чем для редукции N2, а растворимость
ацетилена в воде примерно в 60 раз выше, чем азота (при 20°
и 1 атм в литре воды растворяется около 1000 мл С2Н2 и
только 15 мл N2). Вследствие этого при наличии в атмосфере 8—
10% ацетилена восстановление N2 полностью тормозится и
протекает только этиленообразование (рис. 1).
13

Как следует из уравнений реакций 1 и 2, фиксация одной
молекулы N2 соответствует образованию трех молекул этилена
из ацетилена, т. е. теоретически коэффициент перехода от С2Н2-
редукции к Ы2-фиксации при использовании ацетиленового
метода равен 3. Величину этого коэффициента неоднократно
проверяли изотопным и балансовым методами (Hardy et al., 1973;
Chapman, Hemond, 1982). Тем не менее в некоторых работах
сообщалось о значительных
колебаниях его в зависимости
от условий проведения
эксперимента, что дало основание
для критического отношения к
ацетиленовому методу.
Как было установлено
специальными исследованиями*
отклонения коэффициента
перехода от теоретического
обусловлены главным образом:
длительной (свыше 2 ч)
инкубацией исследуемых образцов
в атмосфере ацетилена (Dart,.
Day, 1975; Roskoski, 1981;
_ Умаров и др., 1984). Ацетиле-
чо новый метод, требующий
короткого времени
инкубирования образцов, обычно
сопоставляют со значительно
менее чувствительными метода-
10 20 30
Дадление С2н2 , мм Нд
CL pasteurianum ми, время инкубации при ис-
Рис. 1. Ингибирование активности
нитрогеназы ацетиленом: / — Az.
vinelandii, 2 — CI.
(Schollhom, Bums, 1967) пользовании которых
составляет от нескольких суток до
нескольких недель. Поскольку невозможно подобрать азотфик-
сирующую систему, длительное время обладающей
неизменным уровнем нитрогеназной активности, то и получаемые
результаты не остаются стабильными. Весьма показательны а
этом отношении данные Дэвида и Фэя (David, Fay, 1977),,
изучавших влияние времени контакта с ацетиленом на
активность нитрогеназы у различных азотфиксирующих
микроорганизмов: Anabaena cylindrica, Anabaena circularis, Rhodospiril-
lum rubrum, Azoiobacler vinelandii.
Скорость восстановления ацетилена и соответственно
коэффициент перехода от С2Н4-редукции к Ыг-фиксации мало
изменялись в течение первых двух часов инкубации с ацетиленом,,
затем быстро возрастали и резко падали примерно через 6 ч.
Аналогичные данные для почв разных типов были ранее
получены Броузесом и Ноулзом (Brouzes, Knowles, 1973),
исследовавшими границы применимости ацетиленового метода при:
определении им азотфиксации в почве.
Сравнительно простой способ оценки коэффициента перехо-
14

Коэффициент
пересчета
0гС2Н4 к N2
4h
ЗУ
2Y
да основан на сравнении величины активности азотфиксации,
полученной в параллельных пробах двумя методами — по
убыли газообразного азота в инкубационном сосуде и по редукции
ацетилена (Умаров и др., 1984). Исследуемый образец
(культура микроорганизма, клубеньки с корней бобовых растений,
пробы почв) инкубируют в течение 12—18 ч в
герметизированном сосуде и периодически измеряют концентрацию N2 газо-
:хроматографически, вводя
соответствующие поправки на
разбавление азота углекислотой.
В параллельной пробе
определение азотфиксации проводят
ацетиленовым методом,
периодически, через каждые 2—3 ч,
вводя С2Н2 на 15—30 мин и затем
«проветривая» сосуд (рис. 2).
Помимо измейения
коэффициента перехода, длительная
инкубация с ацетиленом может
вызвать торможение развития
некоторых микроорганизмов —
псевдомонад и бацилл
(Федорова, Милехина, 1975), сульфатвос-
станавливающих вибрионов*
(Payne, Grant, 1982), нитрификато-
ров (Hynes, Knowles, 1982), что
приводит к снижению их
численности в исследуемых образцах.
Тормозящее действие
ацетилена при длительной инкубации
показано и для почвенных микроорганизмов (табл. 1).
Помимо снижения численности микроорганизмов влияние
ацетилена проявилось и в изменении группового состава — на
безазотных питательных средах вне зависимости от типа почвы
преобладали актиномицеты и коринеподобные бактерии, тогда
как представители других таксонов были в меньшинстве. При
выращивании посевов в обычных условиях, на воздухе,
соотношение перечисленных групп бактерий было противоположным.
Таким образом, главным условием использования
ацетиленового метода для изучения азотфиксации в почве является
сведение к минимуму времени инкубации исследуемых
образцов в атмосфере с С2Н2. Достигается это применением
современных газовых хроматографов с повышенной
чувствительностью, оптимизацией газового и температурного режимов
анализа, увеличением скорости диффузии газов в почве,
уменьшением объема инкубационной камеры и Др.
Наиболее важно выполнение этого условия при изучении
азотфиксации в модельных системах «почва—растение» и при
лолевых исследованиях, поскольку экстраполяция во времени
3 6 9 12
Время, ч
Рис. 2. Изменение коэффициента
пересчета C2H4/N2 при
кратковременной инкубации почвы в
атмосфере СгН2
15

и в пространстве полученных данных существенно увеличивает
размеры ошибок и может привести к неверным выводам.
Одной из частых причин возникновения ошибок при
применении ацетиленового метода является недостаточный контроль
за неспецифическим образованием этилена в почве. Этилен об-
Таблица I
Численность бактерий в почвах различных типов по данным учета
их при инкубации на воздухе и в атмосфере ацетилена, тыс/г
воздушно-сухой почвы
Почва
Серая лесная
Каштановая
Горно-луговая
Чернозем обыкновенный
Чернозем типичный
Ацетилен
среда
Эшби
220
230
7750
9 470
21600
среда
Федорова—
Калининской
210
240
4 000
17 320
18 800
Воздух
среда
Эшби
3 460
2 290
17 000
74 200
96 200
среда
Федорова-
Калининской
5110
3 200
29 750
93 200
108 800
разуется в почве и в отсутствие ацетилена большинством
почвенных грибов и бактерий (Lynch, 1975; Smith, 1976). Он
выделяется корнями многих растений, в особенности при
поражении их грибами (Graham, Linderman, 1980). Кроме того, этилен
постоянно присутствует в техническом ацетилене, используемом
для анализа, нередко обнаруживается в воздухе лабораторных
помещений, где источниками его являются пламя газовых
горелок и спиртовок, а также разрушающиеся на свету и при
нагревании полиэтилен, резина и пр.
В почве интенсивность неспецифического образования
этилена определяется ее свойствами — почвы, богатые
органическим веществом, выделяют этилен в наибольших количествах.
Повышенному образованию этилена способствует также
избыточное увлажнение. Напротив, азотные удобрения, соединения
железа и марганца тормозят этиленообразование.
Помимо выделения этилена в почве постоянно протекает и
поглощение его — как за счет адсорбции, так и главным
образом в ходе окисления почвенными микроорганизмами.
Показано, что многие из них способны использовать этилен в качестве
единственного источника энергии или при соокислении (Flett
et al., 1975; De Bont, 1976), однако наиболее активными
окислителями этилена являются метанокисляющие бактерии и ко-
ринеподобные бактерии (De Bont, 1976).
Помимо этилена коринеподобные бактерии и нокардии
способны окислять и ацетилен (Kanner, Bartha, 1982).
Существенно важным с точки зрения применимости
ацетиленового метода для изучения азотфиксации является
зависимость процесса окисления этилена от наличия ацетилена в
газовой фазе — окисление этилена полностью прекращается уже
16

при содержании С2Н2 в 0,0001 атм и мало зависит от свойств,
почвы (рис. 3). Таким образом, поскольку Км для С2Н2 у
большинства азотфиксирующих микроорганизмов колеблется в
пределах от 0,01 до 0,75 атм (Hardy et al., 1973), то окислением
этилена при ацетиленовом методе можно пренебречь.
Поэтому вторым важным условием при применении
ацетиленового метода для изучения
точная оценка величины
неспецифического этиленогенеза
и размеров адсорбции
этилена в почве. Наиболее важно
соблюдение этого условия при
анализе сильногумусирован-
ных почв и почв с тяжелым
механическим составом, а
также при низкой активности
С2Н2-редукции.
Среди других причин,
влияющих на точность
результатов при использовании
ацетиленового метода, можно
отметить следующие.
1. Отсутствие механизма
«обратной связи» при
использовании ацетилена в качестве
субстрата; в обычных
условиях аммоний и другие
продукты восстановления молеку
лярного азота нитрогеназой оказывают регулирующее действие
на синтез и активность этого фермента в клетках
азотфиксирующих микроорганизмов, тогда как этилен таким действием
не обладает; в результате возможно завышение активности
азотфиксации.
2. Длительное воздействие ацетилена может снизить содер-»
жание аммония и других азотсодержащих метаболитов в
клетках до уровня, при котором начнется синтез нитрогеназы;
образующееся дополнительное количество фермента может привести
к ошибочному выводу об усилении азотфиксации.
3. Этилен, являясь мощным гормоном растений, может
существенно изменить скорость метаболизма в организме
растения-хозяина; как следствие, возможно изменение активности
симбиотических и ассоциированных с растением
азотфиксирующих микроорганизмов.
4. Повышенная растворимость ацетилена в воде по
сравнению с молекулярным азотом может привести к различиям в
доступности субстрата для нитрогеназы; напротив, постоянная
высокая насыщенность почв молекулярным азотом
предопределяет отсутствие торможения азотфиксации из-за недостатка
азотфиксации в почве является
0.6
%
%W
0.2
12 5 8
Время, су т.
Рис. 3. Влияние ацетилена на
окисление этилена в легкосуглинистой
почве (/) и тяжелосуглинистой почве
(2):
1 и 2 — в присутствии СгН2; 1а и
2а — без С2Н2 (Lethbridge et al.,
1982)
17

субстрата; затрудненная диффузия ацетилена в почве может
привести к недооценке реальной активности азотфиксации.
Высокая чувствительность, экспрессность и относительная
простота ацетиленового метода обусловили его необычайно
широкое применение — от изучения молекулярно-генетических
механизмов действия нитрогеназы до попыток оценить
величину азотфиксации в желудочно-кишечном тракте насекомых и
жвачных животных, от разнообразных микробиологических
экспериментов в лабораторных условиях до многоплановых
исследований непосредственно в природной среде.
Однако широкое использование этого метода далеко не
всегда сопровождается учетом его недостатков и ограничений, что
в особенности важно при наиболее сложных и ответственных
видах измерений, как например определение активности
азотфиксации в почве с целью выяснения масштабности процесса
и его роли в азотном питании растений.
Анализ имеющегося в литературе материала
свидетельствует о некоторых характерных методических ошибках при
применении ацетиленового метода в почвенно-микробиологических
исследованиях. Обусловлены они новизной метода и отсутствие
ем общепринятых руководств по его использованию.
Наиболее широко распространенной ошибкой является
произвольное увеличение времени инкубации изучаемого образца
в атмосфере ацетилена. Чаще всего прибегают к этому при
попытке повысить чувствительность обнаружения этилена,
изучая азотфиксирующие системы с небольшой активностью.
Нередко образцы почвы инкубируют от 6—12 ч до нескольких
суток, что приводит к получению недостоверных данных.
Другой причиной увеличения времени инкубации является
желание начать измерения в области линейного возрастания
активности, наблюдающейся после своеобразной лаг-фазы
длительностью от 6—8 ч до 12—24 ч и вызванной,
предположительно, перестройкой популяций азотфиксирующих
микроорганизмов в почве (Dobereiner et al., 1981).
Разноречивые предложения имеются относительно
концентрации ацетилена в инкубационной камере — от 1,5 до 20% от
общего объема газовой фазы.
Нередко расчет продуктивности азотфиксации проводится
по нерепрезентативной выборке, полученной без учета
временной динамики процесса и его пространственной неоднородности.
Экстраполяция во времени и в пространстве ограниченного
числа данных может привести к грубому искажению реальной
картины. Частой причиной занижения активности азотфиксации*
является использование почвенных проб небольшого объема и
массы, в которых протекает быстрая инактивация нитрогеназы
кислородом воздуха. Существенной недооценке размеров азот-»
фиксации способствует и повышенная влажность почвы,
многократно понижающая скорость диффузии в ней аналитически
важных газов — ацетилена, этилена и др.
18

Имеется также еще ряд ошибок, влияющих на конечные
результаты анализа: отсутствие поправок на адсорбцию этилена
почвой и на растворение его в воде, недостаточный контроль
за присутствием этилена в ацетилене, использование ацетилена
в качестве внутреннего стандарта. Наконец, точность
получаемых данных в немалой степени зависит от совершенства
методики газохроматографического определения. Ошибки возникают
из-за неполного разделения компонентов газовой смеси и
наложения хроматографических пиков, из-за «дрейфа» базовой
линии, нарушения герметичности при вводе пробы, вследствие
повышенного «фона» детектора и применения эталонных
смесей газов без предварительного их перемешивания и др.
Основные этапы исследования азотфиксации
ацетиленовым Методом
Инкубация с ацетиленом — первый и наиболее
важный этап — предполагает в качестве обязательного условия
быструю и равномерную диффузию газов в исследуемой
системе. Последней может быть культура микроорганизма в жидкой
или агаризованиой питательной среде, образец почвы
нарушенного или естественного (.монолит) сложения, участок почвы
известной площади, вегетационный сосуд с растениями и пр.
Благодаря хорошей растворимости исследуемых газов
(ацетилена, этилена, пропана) в воде это условие хорошо
выполняется для питательных сред, для водных и песчаных культур
растений, для почв легкого механического состава. Более
сложно протекает газообмен в почвах тяжелого механического
состава и в переувлажненных почвах, что приводит к недооценке
реального уровня азотфиксации. Одним из способов ускорения
газообмена может быть принудительная подача ацетилена
внутрь почвы.
Длительность инкубации с ацетиленом может оказывать
значительное влияние на конечные результаты при оценке
азотфиксации. Помимо отмеченных причин такое влияние
проявляется в виде вторичной реакции растений и микроорганизмов
на изменение температуры и повышение концентрации
углекислоты в замкнутом объеме инкубационной камеры
(«парниковый эффект»). Наиболее заметно оно при изучении
азотфиксации в ризосфере и филлосфере растений, когда создаются
условия, способствующие возрастанию микробной активности.
Стимуляция их возможна из-за патологической реакции
растений и микроорганизмов на присутствие ацетилена и этилена
или, что более вероятно, в результате активизации фотосинтеза.
В зависимости от конкретных задач исследования и условий
проведения эксперимента время инкубации колеблется от 15—
30 мин до 1—1,5 ч и не должно превышать 2 ч.
В период инкубации и по ее окончании отбираются пробы
газа из инкубационной системы. Количество проб выбирается
1*

с учетом последующей статистической обработки и должно быть
не менее трех для каждого срока отбора образцов.
Объем газовых проб зависит от возможности их
последующего анализа — при невозможности немедленного проведения
анализа объем проб должен быть большим. Пробы хранят в
любых герметизированных сосудах, предварительно вакууми-
рованных с целью избежать разбавления образца.
Газохроматографический анализ может проводиться на
хроматографах любой конструкции, имеющих
пламенно-ионизационный детектор. В качестве газа-носителя используют азот
марки «особо чистый» (ТУ 6-21-27-77) или аргон той же марки
(ГОСТ 10157-79). Возможно применение и других газов —
гелия, углекислоты. Для питания пламенно-ионизационного
детектора необходимы водород и воздух, тщательно очищенные
от пыли. Водород можно получать из баллонов или же из
генераторов водорода, например типа СГС-2.
Хроматографическая колонка прибора должна обеспечивать
четкое разделение и «линейность» пиков следующих
углеводородов: метана, пропана, этилена, ацетилена, бутана. Метан
нередко присутствует в почвенном воздухе, а пропан,
используемый в качестве внутреннего стандарта при работе с
инкубационными камерами переменного объема, часто содержит примесь
бутана.
При анализе методом газоадсорбционной хроматографии
для наполнения колонок используют силикагель, сферосил,
молекулярные сита. При газожидкостной хроматографии твердыми
носителями могут быть силикагель, кизельгур, бентонит, а в
качестве стационарной фазы — высококипящие эфиры.
Перед началом работы прибор эталонируется чистым
этиленом в различных разведениях и пропаном в тех же
разведениях, а затем их смесью в определенных пропорциях —
определяется время удержания каждого газа, измеряется высота
{точнее, площадь) хроматографических пиков и рассчитывается
«цена деления» прибора. Одновременно фиксируются рабочие
параметры хроматографа: температура термостата и камеры
впрыска, давление и скорость подачи газа-носителя, водорода
и воздуха, которые должны оставаться постоянными и при
повторном включении прибора.
Объем вводимой пробы газа обычно составляет 0,5—1,0 мл.
Для введения ее в прибор чаще всего применяют медицинские
шприцы на 0,5—1,0 мл («туберкулиновые» или «инсулиновые»)
с силиконовыми уплотнительными кольцами на поршне или
микрошприцы типа МШМ. Шприцы других типов менее
пригодны, так как не обеспечивают необходимой герметичности в
момент введения пробы в ток газа-носителя, находящегося под
значительным (3—5 атм) давлением. Для обеспечения полного
введения пробы в камеру впрыска необходимо постоянно
контролировать состояние ее эластичной мембраны и периодически
ее менять.
20

При изучении азотфиксации в почве ацетиленовым методом
было предложено различать «актуальную» (полевую) и
«потенциальную» активность азотфиксирующих микроорганизмов-
(Умаров, 1976). «Актуальная» азотфиксация измеряется
непосредственно в поле, в конкретных условиях природной среды
и характеризует реальную интенсивность процесса в почве в
определенный момент. «Потенциальная» активность
оценивается при оптимуме влажности, температуры и при избытке
энергетического субстрата и поэтому является показателем
максимально возможного в данной почве уровня микробиологической
«фиксации азота.
Разделение этих понятий цолезно в методическом
отношении, поскольку позволяет во многих случаях вместо
проведения сложных измерений в полевых условиях ограничиться
сравнительно простым и быстрым определением «потенциальной»
.активности азотфиксации и по ней судить об изменениях в
лочве.
Результаты таких исследований все более широко
применяются для ранней диагностики загрязненности почв тяжелыми
металлами, пестицидами, другими ксенобиотиками,
используются при санитарно-гигиеническом нормировании токсических
веществ и соединений в почве.
По известным величинам потенциальной активности можно
с достаточной точностью вычислять значения полевой
активности азотфиксации при учете влажности, температуры и других
факторов среды по соотношению:
^акт = ^макс '#* * в • *т, (о)
где Лакт — актуальная активность азотфиксации; Лмакс —
потенциальная активность азотфиксации; FB и FT — факторы
влажности и температуры, изменяющиеся от 0 при
неблагоприятных до 1 при оптимальных значениях влажности и
температуры; а — коэффициент, служащий для учета влияния на азот-
фиксацию других природных факторов — концентрации
легкодоступных соединений углерода, аэрированности почв, рН, ОВП
и др.
Имеющиеся к настоящему времени данные не позволяют
установить вид зависимости активности азотфиксации от этих
параметров среды подобно тому, как это сделано для
влажности и температуры. Поэтому значения коэффициента а
определяются опытным путем — сравнением расчетных и
экспериментальных величин для каждой почвенной разности на основе
небольшой серии измерений.
Актуальную и потенциальную активность азотфиксации
кроме почвы определяют и в филлосфере растений,
микроорганизмы которой также участвуют в суммарном процессе
ассоциативной азотфиксации. Соотношение, позволяющее перейти от
потенциальной активности азотфиксации в филлосфере
растений к актуальной, имеет следующий вид:
21

^*акт— ^пот* *в * * г'* о, (4)1
где Лакт — актуальная активность азотфиксации в филлосфере;
^пот — потенциальная активность азотфиксации в филлосфере;
FB, Fr к F0 — факторы влажности (в), температуры (т) и
освещенности (о),
рассчитанные по данным,
полученным в модельных опытах с
растениями (рис. 4).
Как показала проверка,
расчетные величины
актуальной азотфиксации в
почве (ризосфере) и в
филлосфере разных видов
растений хорошо согласуются
с оценками актуальной
(полевой) активности
азотфиксации, получаемыми при
полевых определениях.
Учитывая сложность и
трудоемкость полевых
измерений азотфиксации и
обусловленную этим их
сравнительно небольшую повторность, можно полагать, что
предложенные соотношения найдут широкое применение в
практике изучения азотфиксации.
Применение ацетиленового метода
для определения активности азотфиксации в почве,,
ризосфере и филлосфере
С момента обнаружения возможности оценки
азотфиксации по величине редукции ацетилена были разработаны
и предложены для практического использования
многочисленные модификации его применительно к конкретным объектам
исследования и для самых разных условий, в том числе и для
определения нитрогеназной активности в почве. Как отмечалось,
определение истинных размеров фиксации азота в почве под
растениями представляет наиболее важную в практическом
отношении и сложную в методическом плане задачу современной
почвенной и сельскохозяйственной микробиологии. Крайняя
гетерогенность почвы как среды обитания азотфиксирующих
микроорганизмов, большие колебания в ее сложении, порозно-
сти, механическом и агрегатном состояниях даже в пределах
одной почвенной разности вызывают значительные трудности
при оценке масштабов азотфиксации.
Именно неоднородностью почв в пространстве и изменением
их свойств во времени обусловлена широкая амплитуда
величины азотфиксации, приводимая разными авторами. Однако
ю 20 зо t;c зо бо go w%
мгЫ-Ю~Удм2/ч
10 20 30 Е
клк
Рис. 4. Зависимость азотфиксации в
филлосфере растений от температуры
(А)% влажности (Б) и освещенности (Б)
22

существенная роль в широком варьировании
экспериментальных оценок принадлежит и использованию недостаточно
надежных методов определения азотфиксации в почве. Критический
анализ показывает, что большинство из имеющихся методов
неудовлетворительны по ряду причин: измерения проводятся
на небольших образцах почв нарушенного сложения, при
длительной инкубации в атмосфере ацетилена и пр. Но наиболее
•общим существенным недостатком является то, что растения
при определении азотфиксации в почве или вовсе отсутствуют,
или нарушена их нормальная жизнедеятельность. Преодолеть
указанные недостатки можно при использовании
унифицированных методов, прошедших широкую апробацию в различных
условиях.
Потенциальную активность азотфиксации определяют в све-
жеотобрапных или воздушно-сухих образцах почв. Для этого
5 г освобожденной от корешков и просеянной через сито с
диаметром ячеек 1 мм почвы помещают в «пенициллиновый»
флакон, вносят 2% глюкозы (от массы абсолютно сухой почвы) и
увлажняют стерильной водопроводной водой до влажности
около 80% от полной влагоемкости. Почву тщательно
перемешивают до получения однородной по влажности массы, закрывают
флакон ватной пробкой и инкубируют в течение суток при 28°.
При этом из каждого почвенного образца отбирают не менее
трех навесок для определения потенциальной активности
азотфиксации. Через сутки инкубации в термостате флакон
закрывают резиновой пробкой и вводят внутрь шприцем около 0,5 мл
ацетилена, после чего вновь помещают в термостат на 1 ч. По
истечении этого срока шприцем отбирают пробу газовой смеси
из флакона объемом 0,5 мл и вводят ее в газовый
хроматограф. После окончания измерения первой пробы проводят
измерение двух последующих проб из параллельно отобранных
образцов почв. Полученная средняя величина и характеризует
потенциальную активность азотфиксации в изучаемой почве.
Ее выражают в миллиграммах или микрограммах
фиксированного азота на килограмм почвы за час.
Актуальную (полевую) активность азотфиксации определяют
диффузионным методом (Balandreau, Dommergues, 1973) или
методом почвенных монолитов (Умаров и др., 1984). Оба
метода характеризуются малым нарушением естественного
состояния почвы и растений, отличаются хорошей воспроизводимостью
и обеспечивают надежное определение азотфиксации в
природных условиях.
Полевое определение активности азотфиксации
диффузионным методом проводят с помощью прибора, имеющего
металлическую камеру — цилиндр со съемным колпаком из
полиэтиленовой пленки и устройством для отбора газовых проб
(рис. 5).
Цилиндр погружают в почву на глубину около 10—15 см,
почву по внешнему периметру цилиндра увлажняют на ширину
23

5—10 см для предотвращения утечки газов. Внутрь цилиндра»
на поверхность почвы помещают бюкс с 25—30 г карбида
кальция СаС2, служащего «генератором» ацетилена. На
металлический обруч натягивают полиэтиленовый мешок, размеры
которого соответствуют высоте растений, а в кольцевую канавку
на цилиндре наливают воду для создания водяного затвора.
Карбид кальция в бюксе увлажняют водой и цилиндр
быстро накрывают полиэтиленовым мешком, обруч которого должен
быть погружен в воду в
кольцевой канавке. Через
резиновую пробку в мешке
(устройство для ввода и отбора
газов) внутрь его вводят
шприцем точно измеренное
количество пропана, служащего
внутренним стандартом, и
отмечают начало инкубации. При
определении объема пропана,
который вводят внутрь
инкубационной системы, исходят
из того, чтобы в ходе
последующего газохроматографиче-
ского анализа его можно
было бы измерить при тех же
чувствительностях прибора,,
при которых проводится
измерение этилена. Поэтому
пропан обычно вводят в
количестве, примерно
соответствующем количеству
образующегося этилена,— для этого
достаточно провести однократное
предварительное определение.
Длительность инкубации с ацетиленом не должна превышать
1,5—2,0 ч при полевых определениях, по результатам которых
предполагается проводить расчеты продуктивности азотфикса-
ции. Одним из путей достижения этой цели является
применение инкубационных камер возможно наименьшего объема для
уменьшения разбавления образующегося этилена.
В начале инкубации, а затем дважды в течение
инкубации — через 1 ч и через 2 ч — отбирают газовые пробы. Для
этого через устройство для отбора проб засасывают большим
шприцем (20 мл) газовую смесь из инкубационной камеры и
примерно 15 мл ее вводят в предварительно вакуумированный
«пенициллиновый» флакон. Пробы подписывают и хранят до-
анализа при комнатной температуре в темноте.
Параллельно с опытным проводят контрольное
определение величины неспецифического этиленогенеза — почву
инкубируют как и в опыте, но без введения ацетилена (карбида
и Устройство для
™ отбора проб
I Колпак аз
I полиэтиленовой пленка
Металлический обруч
Кольцевая канадка
Металл аческай
цилиндр
Рис. 5. Схема прибора для
определения азотфиксации в почве
(ризосфере) ацетиленовым диффузионным
методом (Balandreau, Dommergues,
1973)
24

кальция) в инкубационную камеру. О размерах потерь этилена
в опытном цилиндре из-за адсорбции его почвой, растворения
в воде и т. д. судят по убыли пропана в газовой фазе
контрольного цилиндра за период инкубации.
Для определения величины активности азотфиксации
вычисляют площадь почвы внутри цилиндра и рассчитывают
объем инкубационной системы по начальной концентрации пропана.
Окончательные расчеты проводят по следующей схеме:
А — чувствительность прибора к пропану (площадь или
эысота пика при введении 1 мл чистого пропана, выраженная
в условных единицах);
В — чувствительность прибора к этилену (площадь или
высота пика при введении 1 мл чистого этилена, выраженная в
условных единицах);
С — количество пропана (мл), введенного внутрь
инкубационной системы;
ах — количество пропана (в усл. ед.) в 1 мл газовой пробы,
отобранной в первый срок (1 ч) инкубации;
а2 — количество пропана (в усл. ед.) в 1 мл газовой пробы,
отобранной во второй срок (2 ч) инкубации;
Ь\ — количество этилена (в усл. ед.) в 1 мл газовой пробы,
отобранной в первый срок;
Ь'2 — количество этилена (в усл. ед.) в 1 мл газовой пробы,
отобранной во второй срок.
Тогда в инкубационной камере в первый срок взятия пробы
Ьг-А.с
содержалось всего этилена — , а во второй срок, с учетом
аг
не только увеличения его концентрации, но и разнообразных
потерь (адсорбции, растворения, утечки и пр.), уже **
Следовательно, абсолютный прирост концентрации этилена
за время между двумя сроками отбора проб составляет:
Х= lh±£-h±£.\ : в + ^- (мл).
\ а2 ах ) В
д
Поскольку отношение — для каждого прибора является
величиной постоянной, а величина С также константа для
каждой серии опытов, то величины а\ и а2 зависят только от С и
от потерь в ходе определения (адсорбции, растворения, утечки
и пр.), а величины Ь\ и Ь2— от интенсивности азотфиксации
(этиленообразования) и от потерь этилена в ходе определения.
Таким образом, при использовании пропана в качестве
внутреннего стандарта окончательное измерение сводится к простой
операции определения соотношения двух газов — этилена и
пропана — в одной пробе газовой смеси. В силу того что
соотношение этих газов можно считать мало изменяющимся даже в
случае утечки их из флаконов в процессе хранения до анализа,
результаты газохроматографического определения не зависят от
25

таких потерь. Хотя пропан может окисляться почвенными
микроорганизмами, тем не менее этим процессом можно пренебречь
из-за кратковременности инкубации.
Основным недостатком диффузионного метода является его
тесная зависимость от влажности почвы, ее механического
состава, плотности, пористости и т. д., вследствие чего
результаты определения активности азотфиксации обычно занижены.
Медленная диффузия ацетилена в почву и неполный выход
этилена из почвы приводят к необходимости увеличения времени
инкубации свыше 2 ч, что также вызывает большие ошибки в-
оценках азотфиксации.
С целью преодоления недостатков диффузионного метода
разработаны способы принудительной подачи (инъекции)
ацетилена в почву с последующей откачкой почвенного воздуха
для определения содержания в нем этилена. Наибольшие
трудности при использовании этого метода вызывает оценка объема
почвы, в котором протекала редукция ацетилена (азотфикса-
ция).
Определение активности азотфиксации методом почвенных
монолитов также основано на принудительной подаче
ацетилена в почву и освобождении образовавшегося этилена; поскольку
объем монолита известен, то дальнейшие расчеты не вызывают
трудностей.
Монолит почвы с растениями массой 2—5 кг
непосредственно в поле помещают внутрь цилиндра прибора (рис. 6) на
сетчатую перегородку так, чтобы между монолитом и стенками
цилиндра не было зазоров. Цилиндр сверху герметично
закрывают прозрачной крышкой с помощью болтов. Через крышку
и дно цилиндра проходят трубки, соединенные гибкими
шлангами с эластичными резервуарами переменного объема. После
укладки монолита и герметизации камеры в нее вводят
шприцем ацетилен. Одновременно для контроля герметичности
системы и оценки величины адсорбции и растворения газов в-
почве в камеру вводят точно измеренное количество пропана.
Поочередно изменяя объем эластичных резервуаров,
продувают ацетилен-пропановую смесь через весь слой псчвы с
растениями со скоростью 2—5 л/мин.
Во время измерений камеру прибора экспонируют на свету
для обеспечения фотосинтетической активности растений.
Общая длительность экспозиции — 30 мин. Через 15 мин после
начала инкубирования с ацетиленом отбирают шприцем первую
пробу газовой смеси в трехкратной повторности в вакуумиро-
ванные пенициллиновые флаконы и через 30 мин — вторую
пробу. Расчет активности азотфиксации проводят по формуле:
Х = А(Щ-±-,
где X — количество азота, фиксированного за время инкубации;
26

au b\ и аг, b2 — концентрации этилена (Ь) и пропана (а) в
газовых пробах в первый (15 мин) и второй (30 мин) сроки
отбора; А — коэффициент пересчета, учитывающий количество
вводимого в прибор пропана, чувствительность прибора к
этилену и пропану, стехиометрическое отношение этилен—азот.
При изучении азотфиксации в условиях вегетационных
опытов более удобно другое устройство (рис. 7).
Рис. 6. Схема прибора для
определения азотфиксации в почве
(ризосфере) методом продувки через
монолит почвы:
/ — металлический цилиндр, 2 —
сетка, 3 — винты, 4 — прозрачная
крышка, 5 — трубки, 6 — шланги,
7 — эластичные резервуары, 8 —
устройство для отбора проб
Рис. 7. Схема прибора для
определения азотфиксации в вегетационных
сосудах с растениями методом
продувки:
/ — вегетационный сосуд, 2 —
гранитная крошка, 3 — стеклянная
трубка, 4 — полиэтиленовый мешок,
5 — шланг, 6 — трубка, 7 — шланг,
8 — устройство для отбора проб,
9 — резиновая груша
Растения выращивают в сосудах, обернутых черной бумагой
или закрашенных снаружи; на дно сосудов насыпают слой
гранитной крошки или битого стекла. При наполнении (набивке)
сосудов почвой вставляют трубку, соединяющую придонную ее
27

часть с поверхностью. Во время измерений на сосуд с
растениями герметично одевают полиэтиленовый колпак, в который
вделаны две эластичные трубки. Одну из них надевают на
проходящую через почву стеклянную трубку, а другую соединяют
с устройством для продувания ацетилен-пропановой смеси.
Газовые пробы отбирают через 15 и 30 мин после введения
ацетилена и пропана. Для контроля за неспецифическим
образованием этилена через почву продувают воздух с пропаном, на
без ацетилена.
Как показала проверка, методы с принудительной продувкой
ацетилена через монолит почвы повышают скорость определе-
Таблица 2
Коэффициент корреляции между значениями азотфиксации
в почвах с различным механическим составом при определении
диффузионным методом и методом продувки
Почва
Дерново-подзолистая
тяжелосуглинистая
Дерново-подзолистая
супесчаная
Угодье
тимофеевка
овсяница
черный пар
ячмень
картофель
междурядья
Коэффициент
корреляции
+0,331
+0,424
+0,714
+0,897
+0,815
+0,847
ния по сравнению с диффузионным методом примерно в 4—
6 раз. Продувка обеспечивает быстрое проникновение
ацетилена в поры почвы и более полный контакт его с клетками
азотфиксирующих бактерий, быстрый вынос образующегося
этилена в газовую фазу, что в итоге позволяет получить
объективную характеристику азотфиксирующей активности почв.
Сравнение данных по активности азотфиксации в двух
почвах, различающихся по механическому составу, методом с
продувкой и диффузионным методом показало, что наблюдается
хорошее совпадение для дерново-подзолистой супесчаной почвы,
обладающей высокой проницаемостью (табл. 2). В дерново-
подзолистой тяжелосуглинистой почве различия между
данными, полученными указанными методами, были значительными,,
что связано с затрудненной и неравномерной диффузией газов.
Наиболее заметно эти различия проявляются при повышении
влажности почв. На рис. 8 показано соотношение между
значениями азотфиксации по методу продувки (Н2) и по
диффузионному методу (Hi) в двух почвах при различной влажности.
Хотя в обеих почвах это соотношение закономерно возрастает
по мере увеличения влажности, но наиболее резко изменяется
для тяжелосуглинистой почвы. При повышении влажности с 2
до 25% отношение Н21НХ изменяется от 5 до 10, а при
влажности 40% оно достигает 25—30. Для супесчаной почвы
отношение Н2/Нх значительно меньше во всем интервале изменения
28

влажности почвы и возрастает с 2 при 3% влажности до 5—7
при 30% влажности.
Таким образом, данные, получаемые диффузионным
методом, оказываются сильно заниженными при повышенной
влажности почвы, причем наиболее сильно — в почвах тяжелого
механического состава. В почвах, где передвижение ацетилена
и этилена осуществляется относительно легко и быстро (легкий
Рис. 8. Зависимость соотношения между значениями активности азотфик-
сации по методу продувки (Я2) и по диффузионному методу (#i) от
влажности почвы (W):
1 — для дерново-подзолистой тяжелосуглинистой почвы, 2 — для
дерново-подзолистой супесчаной почвы
механический состав, пахотный горизонт, невысокая влажность
почвы), результаты, получаемые двумя методами, хорошо
совпадают.
Именно с учетом этих ограничений должны использоваться
оба метода. При этом основным преимуществом диффузионного
метода является минимальное нарушение естественного
состояния почвы и растений. Принудительная продувка ацетилена
через почвенный монолит с растениями во всех диапазонах
условий обеспечивает более полное выявление азотфиксации,
повышает точность и сокращает время определений. Недостатками
этого метода являются неизбежное повреждение корневой
системы растений и возможность ингибирования нитрогеназы
кислородом воздуха, хотя кратковременность инкубации
позволяет считать их несущественными.
Определение азотфиксации в филлосфере растений является
необходимым этапом при изучении ассоциативной азотфикса-
29

ции, поскольку азотфиксирующие микроорганизмы постоянно
присутствуют и на надземных органах растений. Измерения
азотфиксации з филлосфере начаты сравнительно недавно, хотя
микроорганизмы-диазотрофы были обнаружены дазно. Первой
изучала азотфиксацию в филлосфере тропических растений
Руинен (Ruinen, 1961), использовавшая метод Кьельдаля. Джонс
(Jones, 1970) впервые применил изотопный метод для
определения азотфиксации в филлосфере растений зоны умеренного
климата (сосна, ель, дуглассия, дуб и Др.). В 1973 г. Бессем
(Bessems, 1973) одним из первых использовал ацетиленовый
метод для изучения азотфиксации в филлосфере кукурузы,
гватемальской травы и др. Позднее другими исследователями было
предложено несколько модификаций этого метода, однако в
большинстве случаев анализировали срезанные листья или
побеги растений.
Потенциальную активность азотфиксации в филлосфере
определяют, помещая срезанные листья в герметичные флаконы
объемом 20 см3, содержащие по 3 мл среды Эшби со
смешанным набором углеводов (глюкозы, мальтозы, маннита,
яблочной кислоты), примерно соответствующим составу экскретов
из листьев. Через 2 ч инкубации при 28° во флаконы вводят
около 2 мл ацетилена и инкубируют еще 1 ч при 28°, после чего
определяют количество образовавшегося этилена.
Актуальную (полевую) активность азотфиксации в
филлосфере растений определяют модифицированным методом Мейе-
ра и Линдберга (Meyer, Lindberg, 1976) с использованием
пропана в качестве внутреннего стандарта. На ветку дерева или
целиком на всю надземную часть, в случае травянистого
растения, надевают мешок из полиэтиленовой пленки, плотно
перевязывают у основания, вводят ацетилен (примерно 10% от
объема системы) и пропан. Через 15, 30 и 60 мин из мешков
отбирают в трехкратной повторное™ газовые пробы в вакууми-
рованные «пенициллииовые» флаконы. В контрольных
вариантах инкубируют растения без введения ацетилена. Площадь
поверхности листьев и побегов определяют при помощи
планиметра или наложением на миллиметровую бумагу.
Окончательный расчет активности азотфиксации проводят выражая ее в
миллиграммах (мкг) фиксированного азота на 1 дм2
поверхности листьев за 1 ч.
Для лабораторных экспериментов с растениями используют
различного рода камеры, позволяющие раздельно определять
азотфиксацию в филлосфере и ризосфере, измерять скорость
поступления ацетилена в прикорневую зону через
воздухоносные ткани растений и др. (рис. 9).
Б ряде случаев азотфиксацию изучают в «гнотобиотических
системах», состоящих из стерильно выращенных растений, ино-
кулированных на определенной стадии развития азотфиксирую-
щими микроорганизмами. Поскольку в таких системах растения
проращивают на безазотных питательных растворах, то они
30

могут быть полезны при определении размеров поступления в
растения фиксированного микроорганизмами азота. В целом,
несмотря на присущие им недостатки, «гнотобиотические
системы» позволяют избежать влияния множества трудноучитывае-
мых факторов при изучении особенностей ассоциативной азот-
фиксации и в особенности при исследовании взаимодействия
между микроорганизмами и растениями.
Освещение растений в период инкубации с ацетиленом при
проведении всех видов полевых определений должно быть мак-
ГЛ
Верхняя
камера
Нижняя
камера
В
Рис. 9. Схема различного типа инкубационных камер для
измерения активности азотфиксации в ризосфере и филлосфере:
Л — камера, состоящая из двух больших пробирок; Б —
вегетационный сосуд, накрыт полиэтиленовым мешком или
стеклянным сосудом; В — приспособление, позволяющее
вводить С2Н2 раздельно к стеблям и корням растений.
/ — растение, 2 — почва или песок, 3 — парафиновая
перемычка (80% парафина+20% вазелинового масла), 4 —
пробка, 5 — резиновое кольцо, 6 — устройство для отбора проб,
7 — полиэтиленовый или стеклянный сосуд, 8 —
парафинированный песок (для предотвращения роста водорослей)
симально приближено к естественному уровню, так как
интенсивность фотосинтеза быстро и сильно отражается на
активности ассоциированных с растениями азотфиксирующих
микроорганизмов.
Влажность воздуха, влияющая на степень раскрытия устьиц
у растений и соответственно на интенсивность фотосинтеза,
31

также может изменять активность ассоциативной азотфиксации,
что имеет место при длительной инкубации растений в
замкнутой камере.
Температура воздуха сравнительно мало влияет на
интенсивность фотосинтеза в пределах между 16° и 29°, но заметно
тормозит азотфиксацию в филлосфере при понижении ее
ниже 20°.
Концентрация углекислоты в атмосфере может существенно
изменять не только активность фотосинтеза, поскольку
обычное содержание С02 в воздухе в 0,03% является
субоптимальным для растений, но и заметно повышать активность
ассоциативной азотфиксации (см. ниже) при возрастании ее до 0,2—
0,3%.
В целом ризосфера и филлосфера не являются
изолированными ячейками проявления микробиологической активности в
сложной и взаимообусловленной системе «почва—растение—
микроорганизмы», вследствие чего активность ассоциативной
азотфиксации зависит от всего комплекса факторов: почвы (ее
типа, влажности, температуры, концентрации доступных
соединений азота, фосфора, калия, молибдена и пр.), растения (типа
и интенсивности фотосинтеза, масштабов экзоосмоса и др.),
атмосферы (света, влажности, температуры, концентрации С02
и др.), микроорганизмов (типа и интенсивности
взаимодействия, характера и скорости окисления субстрата при
азотфиксации и др.).
Лишь при учете изменений этих факторов во времени и в
пространстве можно с наибольшей точностью и полнотой
оценить размеры азотфиксации.
ГЛАВА 2
АССОЦИАТИВНАЯ АЗОТФИКСАЦИЯ
В РАЗЛИЧНЫХ БИОКЛИМАТИЧЕСКИХ ЗОНАХ
Экологической нишей, в которой протекает
ассоциативное связывание атмосферного азота, является фитоплан
(ризоплан и филлоплан) — зона обитания микроорганизмов на
поверхности подземных и надземных органов растений, где
имеется необходимое энергетическое обеспечение в виде продуктов
экзоосмоса и корневого опада, существует обмен многими
другими метаболитами как результат синтрофного взаимодействия
различных организмов, а также создаются условия,
способствующие активизации нитрогеназы — пониженное парциальное
давление 02, постоянный дефицит легкодоступных соединений
азота, повышенная влажность и температура и др. Хотя
систематическое изучение экологических особенностей ассоциативной
азотфиксации началось сравнительно недавно, уже давно было
замечено, что добавление в почву глюкозы, сахара, крахмала,
32

мелассы, зеленого удобрения и других легкоассимилируемых
соединений сильно и быстро стимулирует азотфиксацию, причем
этот эффект проявляется во всех почвах, вне зависимости от
их свойств. Из этих наблюдений можно сделать однозначный
вывод — азотфиксирующий генофонд всех почв достаточно
богат, а деятельность гетеротрофных азотфиксирующих бактерий
в них лимитирована главным образом недостатком
легкодоступного энергетического субстрата, например углеводов.
Выполненные к настоящему времени многочисленные
работы однозначно свидетельствуют о том, что именно
фотосинтетическая деятельность растений существенно влияет на
динамику и интенсивность азотфиксации в фитоплане и в конечном
счете повышает продуктивность ее в экосистеме. Однако пока
мало данных о масштабах ассоциативной азотфиксации в
конкретных фитоценозах, поскольку они могут быть получены
только на основе многократных измерений реальной скорости
процесса в природной среде, являющихся пока трудоемкими и
длительными. Значительно больше так называемых реперных
оценок, полученных при однократных измерениях <и обычно в
периоды активного развития растений. Тем не менее эти данные
представляют определенный интерес как для общей
характеристики ассоциативной азотфиксации, так и для накопления
сведений о возможных величинах ее в конкретных экосистемах.
В течение длительного периода времени, до того, когда
была понята роль небобовых растений в активизации
азотфиксации, изучали деятельность несимбиотических азотфиксаторов
в почвах разных типов. Несмотря на то что эти исследования
велись при неизменных условиях среды и без учета влияния
растений, применявшиеся инструментальные методы были
несовершенны, а наиболее широко использовавшийся балансовый
метод позволял оценить лишь конечный итог (чистую прибыль),
анализ полученного в ходе этих работ материала
(отличающегося большой неоднородностью и поэтому имеющего
ориентировочный характер) дает возможность получить
представление об эколого-географических особенностях несимбиотической
азотфиксации и о масштабах ее в основных биоклиматических
зонах.
Несимбиотическая азотфиксация
в различных биоклиматических зонах
С точки зрения определения роли
несимбиотических диазотрофных бактерий в азотном балансе наземных
экосистем интерес представляют данные об азотфиксирующей
активности почв различных природных зон.
В почвах тундровой зоны изотопным и ацетиленовым
методами установлена очень низкая активность азотфиксации —
0,5—1,5 кг/га/год (Granchall, Lid-Torsvik, 1975; Егоров, 1982).
Характерно, однако, что в этой же зоне на куртинах осоково-
2 М- М. Умаров
зз

моховой растительности интенсивность азотфиксации была
значительно выше — до 40—90 кг N2/ra в пересчете на гектар за
теплый период (Basilier et al., 1978). Об увеличенной
активности азотфиксации на моховых болотах Шведской Лапландии
по сравнению с голыми, лишенными растительности, участками
озовых валоБ сообщили Росвалл и Гранхалл (Roswall, Gran-
chall, 1980). По их же данным, в минеротрофных болотах
активность азотфиксации была значительно выше в
периферийных, хорошо освещаемых частях ассоциации мхов, нежели во
внутренней их части. Азотфиксация была выше в зеленых
частях сфагнума, чем в незеленых, и изменялась от интенсивности
освещения в течение сезона — была значительной в ясные,
теплые дни и менее выраженной — в холодные, облачные дни.
Годовой максимум активности был зарегистрирован в середине
июля, а суточный — около полудня, т. е. в те сроки, когда
отмечалась наибольшая интенсивность фотосинтеза.
Азотфиксация мало зависела от рН, но очень сильно — от наличия
фосфора: на участках с наименьшим содержанием фосфора азот-
фиксирующая активность была самой низкой.
В подзолистых почвах таежной зоны фиксируется в год от
2,7 до 4,9 кг N2/ra (Granchall, Lindberg, 1978; Егорова,
Калининская, 1980). При этом под сосняками уровень фиксации
выше — от 12 до 23 кг Ы2/га/год (Jorgensen, Wells, 1971; Todd
et al., 1978). По данным Броузеса с соавт. (Brouzes et al.,
1969), в таежных лесах Канады за счет гетеротрофной несим-
биотической азотфиксации мобилизуется 10—20 кг Ы2/га/год.
Биллингтон и Александер (Billington, Alexander, 1978),
изучавшие азотфиксацию в лесах из черной пихты (Picea mari-
апа) с хорошо развитыми мхами и лишайниками, оценили ее
средний уровень в 246 мкМ С2Н4/м2/день. В почве под сосной
ладанной (Pinus taeda) фиксируется в среднем около
23 кг/га/год (Caldwell et al., 1979), а в сосняках Австралии —
до 50 кг/га/год (Richards, 1973). Примерно такой же уровень
несимбиотической азотфиксации в сосновых лесах Англии (Ovin-
gton, 1965).
В лесах подзоны южной тайги азотфиксирующая активность
достигает 18,7 мг N2/10 см2/ч (Bentley, Carpenter, 1980). В
серых лесных почвах Англии под лиственным лесом несимбиоти-
чески фиксируется около 49 кг Ы2/га/год (Day et al., 1971).
В Канаде в серых и бурых лесных почвах под лесами разных
типов уровень азотфиксации по данным изотопного метода
составляет в среднем 20—50 кг/га/год, а в хорошо окультуренных
пахотных лесных почвах — до 200 кг/га/год (Brouzes et al.,
1969). На Ротамстедской опытной станции в Англии в серой
лесной почве под многолетней залежью, занятой различными
злаками, но в отсутствие бобовых растений фиксируется 28—
39 кг азота/га/год (Дарт, Дэй, 1979).
По мнению Е. Н. Мишустина (1979), гетеротрофные
почвенные азотфиксаторы могут поставлять в пахотные почвы в зоне
34

умеренного климата 6,8—53 кг N2/ra/roA в зависимости от типа
почвы. Согласно оценкам, сделанным на основе балансовых
расчетов, в почвы основных типов СССР за счет несимбиоти-
ческой азотфиксации ежегодно поступает от 26—48 кг N2/ra
(Мишустин, Черепков, 1976; Захарченко и др., 1982) до 77—
86 кг/га (Гуревич, 1962). В интразональных почвах избыточного
увлажнения (пойменных, болотных, рисовниках) активность
наиболее высока и составляет от 16,5 кг/га/месяц до
67,5 кг/га/месяц (Калининская, 1982). В зоне субтропиков в
красноземных, коричневых, желтоземных и бурых почвах азот-
фиксирующая активность также высока и составляет в среднем
40 кг/га/200 дней (Мишустин и др., 1978; Гочелашвили, 1978).
Наиболее интенсивно несимбиотическая азотфиксация
протекает в почвах тропической зоны, где средний уровень ее равен
200 кг/га/год (Dart, Wani, 1982), а в максимуме 600 кг/га/год
(Purschase, 1978).
Определение реальных размеров азотфиксации в почве
возможно лишь на основе изучения временной и пространственной
дисперсий ее в конкретной экосистеме. С учетом этих условий
нами проведено исследование несимбиотической азотфиксации
в ельнике и березняке Ярославской области, на стационаре
Лаборатории лесоведения АН СССР. Для исключения влияния
травянистой и кустарничковой растительности опытные
площадки располагали на мертвопокровных участках (парцеллах)
леса. Результаты определений азотфиксирующей активности в
первый (1979) год наблюдений представлены на рис. 10.
В ельнике летом наблюдали два ее пика до 1,6 мг/м2/ч, а
максимальный уровень — до 3,9 мг/м2/ч был отмечен в конце
сентября.
В березняке максимальный уровень азотфиксации
(2 мг/м2/ч) приходился на июнь—июль, но, как и в ельнике,
активность процесса была довольно высока и осенью —
1,2 мг/м2/ч.
Как в ельнике, так и в березняке наблюдался большой
разброс значений азотфиксации в одни и те же сроки, что наиболее
вероятно связано с неоднородностью почвенного покрова в лесу.
Как известно, свойства лесных почв, их неодинаковое сложение,
порозность, значительное варьирование мезо- и микрорельефа,
а также различия в поступлении растительного опада на
поверхность почвы и в разложении его в подстилке обусловливают
большое пространственное варьирование микробиологических
процессов. Кроме того, лесные почвы характеризуются
значительной микрозональностью в отношении почвенных
микроорганизмов (Голимбет, Звягинцев, 1984). Вероятно именно этими
причинами в большинстве случаев и объясняется значительная
пространственная дисперсия несимбиотической азотфиксации.
Результаты определений полевой азотфиксирующей
активности на тех же мертвопокровных площадках в 1980 г.
представлены на рис. 11. Максимальное значение азотфиксирующей
2*
35

активности в ельнике (2,2 мг азота/м2/ч) наблюдали в конце
июля, а минимальное (0,1 мг/м2/ч) — в конце августа.
В березняке наиболее высокие значения азотфиксирующей
активности были отмечены в начале лета и в конце сентября —
соответственно 1,5 и 2,0 мг/м2/ч. В остальные сроки измерения
ее значения не превышали 1 мг/м2/ч.
В ельнике колебания активности азотфиксации были
выражены более резко, но с хорошим совпадением ее сезонной ди-
мгН21м21ч
мгЫ2/м2/ч
Ц
май июнь июль ад г уст сентябрь
гН21м2/ч
Ч
3
2
7
май июнь июль абгусг сентябрь
мгН2/м2/ч
1/
1 7 ,
Ельник
7
i
2
1'\
I*/ ^i
It/ \
т4/ У
i
7
У<г
пай июнь июль август сентябрь
Рис. 10 Динамика полевой
активности азотфиксации на мертвопокров-
ных участках в ельнике и березняке
в 1979 г.
1,2 — на двух соседних площадках,
3 — среднее из двух
май июнь июль абгуст сентябрь
Рис. 11. Динамика полевой
активности азотфиксации на мертвопокров-
ных участках в ельнике и березняке
в 1980 г.:
1,2 — на двух соседних площадках,
3 — среднее из двух
намики на всех площадках. Так, в начале лета активность
азотфиксации была максимальна и не отличалась более чем в два
раза на площадках, удаленных друг от друга на 5—10 м. В
середине лета на всех площадках отмечалось увеличение
активности до 2 мг/м2/ч, затем общее снижение и новый подъем
осенью. Подобные колебания, по-видимому, связаны с
энергетическим обеспечением несимбиотической азотфиксации в
лесных почвах в виде продуктов разрушения опада и подстилки.
В изучавшемся ельнике имеется мощная подстилка,
содержащая большой запас органического материала. Как было
установлено Ремаклем (Remade, 1977), имеется тесная корреляция
(г = 0,91) между «индексом разложения подстилки» и уровнем
несимбиотической азотфиксации в еловых и буковых лесах.
36

Поскольку общая годовая продукция фитомассы многолетних
ельников достигает 17 т/га, а чистая первичная продукция —
10—11 т/га (Глазов, 1979), запаса энергии в ежегодном опаде
достаточно для активного протекания несимбиотической азот-
фиксации. В спелых ельниках, где не проводится рубок ухода
и вывоза древесины, запасы его достигают 80—100 т/га
(Молчанов, 1975), а поскольку ежегодное разрушение опада в
ельниках южной тайги происходит в среднем на одну треть (Ма-
лишевская, 1973), то азотфиксирующие микроорганизмы лесных
почв обеспечены продуктами разрушения опада. При
разложении опада в первую очередь минерализуются водорастворимые
соединения — простые сахара, крахмал, органические кислоты
(Witkamp, 1974). Опад лиственных пород разлагается
значительно быстрее, чем опад хвойных, так как содержит меньше
трудноразлагаемых соединений и бактерицидных веществ (Еп-
werson, 1976). Таким образом, в лесных почвах главным
источником энергии для почвенных микроорганизмов является
лесной опад и отпад; при микробиологической трансформации
входящих в их состав веществ возможно осуществление и
несимбиотической азотфиксации.
Суммарная продуктивность азотфиксации в ельнике в
течение двух лет наблюдений была примерно одинакова и
составила около 24—26 Kr/N2/ra за весенне-летне-осенний период.
В березняке продуктивность азотфиксации в 1979 г. составила
21 кг/га, а в 1980 г. уменьшилась до 15 кг N2/ra.
Сравнение сезонной динамики азотфиксации в почве обоих
типов леса выявило ее сходность, что, вероятно, связано с
определяющим воздействием погоды в теплый период. Не
исключая прямого влияния погодных факторов на активность нитро-
геназы (изменение условий аэрации, концентрации почвенного
раствора и др.), можно полагать, что воздействие их связано
главным образом с изменением скорости разложения опада и
подстилки. Простое сопоставление метеорологических данных
и динамики азотфиксирующей активности не позволило
установить однозначной зависимости между каким-либо погодным
фактором и уровнем азотфиксирующей активности; вероятно,
погодные условия комплексно влияют на величину
азотфиксации.
Регрессионный анализ позволил выявить два фактора,
влияние которых в 76% случаев на активность несимбиотической
азотфиксации оказалось значимым с вероятностью Р = 0,90. Эти.
факторы — «осадки» (X) ,<и «влажность воздуха» (А).
Полученное уравнение регрессии имеет вид:
У=—2,859 + 0,0233*+0,0379Л.
Отсутствие тесной корреляции между азотфиксацией и
температурой почвы позволяет сделать вывод о том, что в лесных
почвах температурные условия в весенне-летне-осенний период
не лимитируют процесс азотфиксации. Только ранней весной и
37

поздней осенью при понижении ее до +4—6° наблюдалось
уменьшение интенсивности азотфиксации. Этот вывод косвенно
подтверждается и в работах А. И. Чундеровой с соавт. (1979).
Таким образом, влажность почвы и подстилки является одним
из главных погодных факторов, определяющих динамику и
продуктивность несимбиотической азотфиксации в лесных почвах.
Поскольку симбиотические азотфиксаторы редки для
хвойных лесов (Granchall, Lindberg, 1978), то в лесных почвах
важную роль играют гетеротрофные несимбиотические бактерии.
Активность их зависит от множества факторов: температуры
и влажности, наличия энергетического субстрата и
парциального давления кислорода, рН и концентрации различных
минеральных соединений, которые по-разному сочетаются в профиле
лесных почв. По данным С. В. Егоровой и Т. А. Калининской
(1980), в сосняках максимум азотфиксирующей активности
приходится на подстилку, а в минеральных горизонтах она
незначительна. В то же время И. К. Зубко и др. (1979) установили,
что в дерново-подзолистой почве под лесом высокий уровень
азотфиксации наблюдается и в собственно почвенных
горизонтах. Наиболее удобно оценивать различия в величине
азотфиксации в отдельных горизонтах по показателю потенциальной
активности азотфиксации, являющейся мерой максимально
возможного уровня процесса и косвенно отражающей численность
микроорганизмов-диазотрофов в почве.
Результаты определения потенциальной азотфиксирующей
активности в ельнике в образцах подстилки из слоя Ао1—А02,
Таблица 3
Потенциальная азотфиксирующая активность в подстилке
и почве на разных парцеллах ельника-кисличника, мкг/кг/ч
Парцеллы
Хорошо освещенная мертвопокровная
Средне освещенная мертвопокровная
Затененная мертвопокровная
Умеренно освещенная с травянистой
р а стительностью
Слои подстилки, горизонты почвы
Л1 А2
А0 — А0
166
127
79
149
A0 — At
12 440
19 220
5 360
12 240
А2
948
1000
510
662
из слоя Ао3—Ai и в образцах из горизонта А2
дерново-подзолистой почвы представлены в табл. 3.
На всех изученных парцеллах потенциальная активность
азотфиксации закономерно изменялась по генетическим
горизонтам. Минимальной активностью характеризовался верхний
слой подстилки, где она не превышала 150—170 мкг/кг/ч.
Максимальная активность наблюдалась в слое А03—Аь на переходе
от разлагающейся, гумифицированной подстилки к минераль-
38

ному горизонту Аь В подзолистом горизонте А2 величина
потенциальной азотфиксации была сравнительно невелика.
Высокий уровень гетеротрофной азотфиксации в нижних
слоях подстилки, отличающихся наибольшей гумифицирован-
ностью, свидетельствует о тесной связи процессов деструкции
органического вещества, осуществляемых в основном
микроскопическими грибами с процессом мобилизации молекулярного
азота, протекающим за счет деятельности бактерий. Можно
предполагать, что на этом этапе происходит сопряжение циклов
двух важнейших био-
Таблица 4
Активность несимбиотической
азотфиксации в почвах основных типов
(Мишустин и др., 1978)
Почва
Азотфиксация,
кг/га/год
Дерново-подзолистая
Серая лесная
Чернозем
Каштановая
Серозем
10—13
18—30
37—53
18—30
18—30
фильных элементов
углерода и азота, и,
следовательно,
наличие легкоразрушае-
мых, легкоминерали-
зуемых органических
веществ в почвах под
лесом является
наиболее важным по своему
влиянию на
деятельность гетеротрофных
азотфиксирующих
микроорганизмов.
Вследствие того что указанные процесы осуществляются
микроорганизмами, относящимися к весьма далеким друг от друга
таксонам, но тем не менее тесно взаимодействующим в
экосистемах, результаты исследования позволяют сделать вывод о
совокупной деятельности грибов и бактерий в составе смешанных
популяций почвенных микроорганизмов, направленной на
увеличение азотного потенциала лесных почв. Взаимодействие
эукариотов и прокариотов в процессе фиксации атмосферного
азота изучено пока слабо, хотя представляет большой интерес
из-за важной роли, которую предположительно играют такие
ассоциации в азотном балансе многих почв.
Заканчивая рассмотрение масштабов несимбиотической
азотфиксации в почвах разных биоклиматических зон, нужно
указать, что изучение эколого-географических особенностей этого
процесса, проведенное под руководством Е. Н. Мишустина,
привело к обнаружению важной закономерности — активность
азотфиксации в почвах возрастает при переходе от северных
почв к южным (табл. 4).
Потенциальная азотфиксирующая активность
почв различных типов
Размеры несимбиотической азотфиксации в почве
резко возрастают при создании оптимальных условий для ее
осуществления — при внесении легкодоступного
энергетического субстрата, при повышенной влажности и температуре.
39

Хотя в природных условиях единовременное сочетание всех
этих условий в оптимуме мало вероятно, тем не менее данные
о максимально возможном уровне азотфиксации в почвах
разных типов и разного уровня плодородия могут быть интересны
не только как показатели их биологической активности, но и
полезны при создании замкнутых автономных экосистем,
включающих почву, а также для парниково-оранжерейных хозяйств.
Так, согласно Ноулзу (Knowles, 1965; OTool, Knowles, 1973),
черноземные и каштановые почвы могут фиксировать лишь за
счет поддержания температуры на постоянном уровне в 30° до
162—343 кг Ns/га/год, а при оптимизации и других
параметров — до 500—1000 кг/га/год. Изучение потенциально
возможного уровня азотфиксации необходимо для получения исход-
Таблица 5
Потенциальная азотфиксирующая активность
почв основных типов
Почвы
Дерново-подзолистые
Серые лесные
Черноземы и черноземно-
луговые
Каштановые
Сероземы
Солончаки и солонцы
Место сбора образцов
Г Калининская обл.,
\ Московская обл.
( Тульская обл.
\ Московская обл.
[ Курская обл.,
1 Воронежская обл.,
] Тамбовская обл.,
( Северо-Осетинская АССР
Ростовская обл.
Ашхабадская обл.,
( Чимкентская обл.
1 Воронежская обл.,
] Ростовская обл.,
[ Красноводская обл.
Количество
изученных
образцов
49
18
165
16
93
28
Азот-
фиксация,
кг/га/год
38—192
48—216
90—312
135—330
215—516
69—540
ных данных при прогнозировании урожаев
сельскохозяйственных культур и поэтому проводится ныне во все более широких
масштабах.
В нашей стране подобные исследования велись локально,
для почв отдельных регионов. В табл. 5 приведены данные о
размерах потенциальной азотфиксации в почвах основных
типов СССР. ,
Закономерное увеличение активности в почвах при
движении с севера на юг наблюдается и в случае потенциальной
азотфиксации и обусловлено, вероятно, общим возрастанием!
40

биологической активности почв. Наиболее важно, что уровень
потенциальной активности азотфиксации в общем мало зависит
от такого важнейшего показателя типа почвы, каким является
содержание гумуса, хотя, как предполагалось, гумус служит
одним из главных источников азота для питания растений и
почвенных микроорганизмов. Например, сероземы,
характеризующиеся наименьшим в изученном ряду содержанием гумуса,
отличаются не только высокой потенциальной активностью
азотфиксации, но и высоким естественным плодородием.
Многовековой опыт дореволюционного земледелия на сероземах
при полном отсутствии минеральных удобрений и весьма
малых дозах органических удобрений показывает, что эти почвы
способны давать вполне удовлетворительные урожаи только
за счет рациональной агротехники и орошения (Жученко, 1982).
Примерно такая же картина наблюдается и в случае
солонцеватых почв, в отличие от солончаков, имеющих высокое
потенциальное плодородие, наиболее полно проявляющееся при
удалении солей из корнеобитаемого слоя. Имеется ряд данных,
позволяющих предполагать, что в почвах с низким природным
содержанием гумуса и высокой потенциальной активностью
азотфиксации важная роль в азотном питании растений при-
Таблица6
Потенциальная азотфиксирующая активность почв
вертикально-зонального ряда Северного Кавказа
Почвы
Горно-луговые под альпийским
разнотравьем
Горно-лугово-лесная
Бурые горно-лесные под
пихтарником и буком
Горная серая лесная под
грабинником
Высота над
ур. моря, м
1760—2500
1750
650—1750
220
Количество
изученных
образцов
18
14
42
4
Азотфикса-
ЦИЯ,
кг/га/год
16-36
24—48
46—124
72—180
надлежит ассоциативной азотфиксации и, следовательно, по
величине потенциальной активности азотфиксации можно судить
о масштабах ассоциативной азотфиксации.
Если различные почвы широтно-зонального ряда
неоднократно исследовались на способность к азотфиксации, то
вертикально-зональные почвы горных районов в этом отношении
практически не изучены. В табл. 6 приведены некоторые
данные о потенциальной азотфиксирующей активности горных почв
Большого Кавказского хребта.
Минимальной азотфиксирующей активностью отличаются
горно-луговые почвы альпийского и субальпийского поясов,
наиболее характерными свойствами которых являются высокое
содержание (до 32%) органического вещества, кислая реакция
41

(рН около 5,0), ненасыщенность почвенного поглощающего
комплекса.
В горно-лесных почвах содержание гумуса заметно ниже
(до 20%), реакция их близка к нейтральной (рН 6,9), они
имеют повышенное содержание физической глины и ила.
Соответственно в этих почвах и более высокий уровень
потенциальной азотфиксирующей активности. Максимальной азотфик-
сирующей активностью обладают горные серые лесные почвы
с относительно низким содержанием гумуса (6%). Таким
образом, вертикально-зональные почвы горных районов в целом
имеют такую же закономерность в распределении величин
потенциальной активности азотфиксации, что и широтно-зональ-
ные почвы.
Следовательно, хорошо известная аналогия между почвами
основных типов равнин и горных областей, выявленная для
многих их морфологических, физических и химических
показателей, получила подтверждение и в отношении важнейшего
биологического свойства — азотфиксации. Характерно также,
что и для вертикально-зональных почв сохраняется указанная
ранее закономерность — их азотфиксирующая активность
растет по мере усиления почвообразовательных процессов и по
мере снижения содержания гумуса в почве.
Хотя пока нет данных о масштабах ассоциативной
азотфиксации в горных экосистемах, тем не менее, основываясь на
различиях в величинах потенциальной активности
азотфиксации, можно предполагать, что и для ассоциативной
азотфиксации будет сохраняться закономерное возрастание по мере
снижения высоты местности и изменения свойств почв и состава
фитоценозов. Некоторое подтверждение этому было получено
при раздельном изучении потенциальной активности
азотфиксации в образцах ризосферной и неризосферной почв,
собранных на площадках на тех же высотных поясах Большого
Кавказского хребта. Азотфиксирующая активность ризосферной
почвы не только постоянно превышала активность
неризосферной, но и, что еще более важно, закономерно возрастала с
уменьшением высоты гор.
Несимбиотическая азотфиксация
в ризосфере (ризоплане) растений
различных биоклиматических зон
Одним из первых сообщений о более высоком
уровне азотфиксации в ризосфере является работа Ринодо (Ri-
naudo, 1970), в которой приведены данные о нитрогеназной
активности в вегетационных сосудах с растениями кукурузы и
риса и без них — активность была обнаружена лишь в сосудах
с растениями. При этом корни стерильно выращенных растений
были неактивны, тогда как нестерильные быстро
восстанавливали ацетилен до этилена. Различия в уровне азотфиксации
42

между сосудами с растениями (1,84—5,11 мг N2/r почвы/день)
и без растений (0,001—0,002 мг/г/день) составили более трех
порядков.
Нельсон с соавт. (Nelson et al., 1976), изучавшие нитроге-
назную активность в ризосфере различных злаков на лугах
Орегона (США), а также на участках, лишенных
растительности, установили, что активность в ризосфере ячменя и полевицы
была примерно в 100—200 раз выше, чем в почве междурядий.
Таблица 7
Скорость восстановления ацетилена в ризосфере
некоторых злаков, моль С2Н2/га/день
„ I ' . i Контрольная
Растение Ризосфера ! почва
Ячмень обыкновенный
Полевица тонкая
Пшеница мягкая
Овес посевной
Костер безостый
Сорго посевное
2,03
3,96
0,57
0,20
0,77
0,90
0,01
0,04
0,01
0,01
0,26
0,04
Для других злаков эти различия были несколько меньше, но
явно выражены во всех случаях (табл. 7).
По данным Т. А. Калининской с соавт. (1977), изучавшим
изотопным методом азот-фиксацию в черноземных почвах,
активность в прикорневой зоне проростков риса была примерно
в 50 раз выше, чем в почве без растений (табл. 8).
Таблица 8
Фиксация азота в прикорневой зоне риса,
мкг N2/Kr пбчвы/сут
Почва
Без растений
С растениями риса
Возраст растений, сут
7
0,0
26,0
10
4,1
210,0
14
3,2
144,0
Азотфиксирующая активность под дикорастущей
растительностью на лугово-болотной почве на участках с низкой
плотностью растений составляет в среднем 30% от активности на
участках с нормальной плотностью (Tjepkema, Evans, 1976).
В табл. 9 суммированы некоторые данные по уровню азот-
фиксирующей активности в ризосфере различных растений.
Ассоциативная азотфиксация протекает с той или иной
скоростью практически во всех почвах в прикорневом пространстве
или на корнях растений самых разных мест обитания. Высокий
43

ХО
9S
S
X
н
X
2
S
У
О.
СУ
•е-
со >»ю ю >~>сэ
~ - *"" >>
~ и. г • и. са
су су •-* >» <d о
оо д л се с
й су ^_г су £
з о са сз о сз
tXQQQQcO
СХ>
-4 ^ .4
2^ и
са су су
£.5 .5
"О*о3 'су
С «- Ui
я (U о
еа о о
0QQQ
.. оо
<3>
?& с?
СО
., о
су
я « с
са ч-» су
СУ ф Д
t3 i^'cy
С су «-;
са са О
CQCOQ
ю
са
О
су
с
со
с
*СУ
r( са
о **.£•
и >^
1а^2
^£-
о г^
— са О
^ и о
•я Г** С
-4 £^1а
^ о, d *—
я о *•
СУ
X)
О
Q
сх
о
«
су
л
о
а
3"
СУ
Я
я
СУ»
Р >* •
-5.^. с 5е я о
<NQ>
СУ
Я
§•
и:
£
cr> uZ ст> *-14- и
— iiX * I XcoE
ем
U
я
Я
00
са
•е-
>»
2 л
О о
О
а" в
2 О.
СЗ
«5.
а
§.
«5.
со
st
<и
3 3 3 "ГЗ 3
•о
о
н-» -^* со
О
О
О
Q> О-
***» со
О
S3
S3 cl
•г» со
•h о
Си l\J
•2
СД>
0Q
О
Си
3
Си
со
а.
ел
Б
о
N
со
St
6
3
Си си
Cu«tr-
со О
N Си
^С0
еа
а.
н
3
s
S
ю
н
и
са
Б
S
С
О
S
з
о
st
II
о Q
саО,
со
st
«о
^)
CJ
с»
са Ь
а
со
со
си
st
са t\
CQ ,~*»
CD Си
си
V.
я Q*
ps
я "о>
S.CO
У 2
1^
3
Б
«а сЗ
8*1
в
§
Си
а>
»я
о
Си
о
3
я
aoHHUodigXo и aoMHUodx нное нвьоц
44

щ
00
0>
СО
Id
S
со
U»
о
•О
<У
фО>
2.S5&
~^ <=> е W
СО _ ^ >
5^ со ^ _г я>
c"o,2 аЗ <у
о cCQJg £
со •£§.«£
О)
В
3 00
2|.
•ssag
*S cu a>
& 8^8-8
a» —.
о
•a
со
G
2
^ 00 • "
oi p:oo
"cO ^f r
W f+- -4-»
со '—, a) ;
со
o>
г со
oo н t*»
Q> CO -н
.-« о • *
«—< Г 1 /^ч CO
00
о
oo" -
со w_m
СУ CO J"
си о w a»
да я ф с
g g-o#3T
~^ CO
« c3 7o"0
it
Ctfc/)
о
u
CI
о
s
н a,
2 *
CO
1-Й «O
Oi ли
<? a) u О
я Ч
• a-oo о
~1 о— «
СО StfQj О
X
2 и =
^с5СО О
^+1
(NO* Ю Ж
»я н
г СО *"—>• «*
щ со^^О а«
и Т *7^*су"
«SIS
-(NO(N
"»
СО <N
4i g
§• bto. 8-8^"
^•§.3 3 § § §
•8 -S § '2 .ts .5 .£
за
■а а
»S
a>
В
л
S
•«^ со
а я
«о а1
S Я «
"о «Я о § |
ю
я
со 3
ё °
g о
« Ь* л\ ^* —■
cL«
-- ч» ^ »^ w с гг *>*
со S С
&в S * is
Q^m
o> а. со ci
g О g Q | g'SlS
ca a.§^> §л Q.C
° л^г S^ k о о)
я я С ^> ji ^ S -2t
о S -2 .o
о
я
со
»я
3
я
о.
о,
о
aoHHUodipXo и eoMHuodi иное паьоц
45

CO Г
2 «=c *=?
§2
a:
co;r
to?
i
С
О
ел
со со со £2
15-S15&
OJ **
CD О) О»
с с с S
о о о g
j/э j/э ^сл S
<D <D CU о
СО СО^Г
С> 00 С75
3 '
PQ
>
о -
О СО
"су
Iso
0)
си
со
ema,
jepk
*дро
СО
СО
ZQZqQHCQ
о л
t=C «З
со со t* <,
IpW*
гг-^я
'2 1
gco g^^£g
о. u t- ■
О « « U +
н н н ю
>*>* >>£
CJ О О О
со со "со* С
<n « ^ щ
uuu0
• х к к—■
£г-осо I
1
*С0*
U
оо
о"
ь Ш 1
1 222. u
о%ии^о
eZ x xcoZ. я
со ui>.cn I ^00
COMOO^^(N
О
О,
со
со
•«^
CJ
О
0Q
си
'|3
S ^6
си . .
ж* СЛ СО
С Q Q
Я
>о
о
сх
ст>
0Q
X
X
о.
S
СО
о
CD
я
X
I II
coco
I
X
о.
>»
н
о
СО
о.
о
5 я
с* *
s ч
2
X
со _»•
>>а
X
СО СГ
о «
ёхеишгх 0J0HH9dawX наьоц

3
CD
Oi
_^_. ^- Z- *-
-Ьз ф с
s >^
iS >»:£ ex
(T)
г
cd
<D
a
cd
CU
*T3
о
OO
C5
'—«
-
cx
fct
S
s
4
CQ
cd"
03
О
3
Он
si
cd cd
&S2
'3 £2
cro-g
oo
S 3
Eoq acna
S
fcrf Cd Cd ert
^ fc «- u «X
cd u o-
f
; P
-«-. cd —»7 -^
« c- cd ^ cd
CD I ^«
I 1<Ч4
— cd
*]?$
p-^Z
•&Z <-
2 u *
^ *o
Zo**
с-ссГ о
« I ч
J °
Ю со О
cd •~~-'-ri CQ
C- •<« Я
**я s
lOcDo
p
о -^
С cd
S 00
t- to
°- I
о oo
S
а
CO
о
О
Г О
CX»-
„ от «С
(Я Сц к
■^ си
^* »о сз
.2* ©^
со w. О
^t* о
о
Я
Я*
я
я
со
г от
9? ^
W CU
^§
a S й
о 'Г! г
Ь СХ
си
3
я
о
о
ех
о- ***»
3 О ОТ jjT ^
:s о
^"?^ СХ
- Q cxj.
'С 'С to Й
сз сз
ср со»о "*^ о ^ в
н о о? Й S -Й 2
^^ о
Cj со СЗ -s.
со со С С
о
о-
си
я
О
Он Я
от s
» Си
Ь <1>
^3 VD
-*- я
СО
О)
S *я s
Я'&СХ
ХО О CU
о
Utah «
m cd
cd xo
cd
Я
CQ
CU
4
О
e
л s
са м
2- cx
3 о
vo о
3 %
§2
S ё
m-5
3
CO
cd
CX
H
§
CO
о
и
>ъ
с?
о
я
X
3
о
ч
о
ХО
си
3
я
я
си с
s с;
8
II
3 _£
о_ от
£4 CU
о-*-*
е cd d?
SsgS
^ cd Я g
Од й,3
я
«
я
Т!
кустар
я
евья
5е
4)
S
вечноз
cd
здоцу
Он
Ё
Я*
bibwhith 0J0HH9dawX неьоц
47

ее уровень обнаружен в ризосфере большого числа тропических
растений, как культивируемых (сорго, маис, сахарный тростник,
рис, пшеница), так пастбищных и дикорастущих (паспалум,
просо, росичка, перистощетинник и др.). В почвах зоны
умеренного климата азотфиксация выявлена в ризосфере широкого
набора растений. Это — возделываемые зерновые культуры,
корнеплоды, клубнеплоды, пастбищные и дикорастущие злаки,
однолетние и многолетние сорняки, растения влажных и
суходольных лугов, лесные травы.
Повышенная нитрогеназная активность обнаружена на
корнях и в прикорневой зоне ряда деревьев умеренной и
субтропической зон, во влажных сообществах мхов субарктических
болот, в ризосфере пресноводных и морских покрытосеменных.
При таком практически повсеместном распространении
ассоциативной азотфиксации эффективность деятельности диазо-
трофных бактерий, а следовательно, и экологическая значимость
процесса далеко не одинаковы под разной растительностью.
Наиболее высокого уровня для почв зоны умеренного
климата ассоциативная азотфиксация достигает в рисовниках:
в лугово-болотной черноземовидной почве (Краснодарский
край) в месяц фиксируется 12—29 кг N2/ra (Калининская с
соавт., 1973).
В луговых и лугово-болотных почвах Канады и США под
злаковой и сорной растительностью накапливается за сезон от
7,6—19 до 40—74 кг N2/ra. Скорость фиксации азота несимбио-
тическими бактериями может в этих условиях составлять 0,8—
1 кг/га/день.
Особенно высокого уровня ассоциативная азотфиксация
достигает в почвах тропической зоны.
В хорошо окультуренных почвах под рисом азотфиксация
протекает в среднем со скоростью 45—80 кг Ы2/га/год и даже
до 92—330 кг Ы2/га/месяц.
В красноцветных почвах под пшеницей фиксируется около
20 кг азота/га/год, под кукурузой — около 10 кг Ns/га/год.
В ризосфере кукурузы (маиса) и сахарного тростника скорость
азотфиксации достигает 2 кг 1М2/га/день.
В тропических почвах, занятых пастбищами, в ризосфере
таких трав, как Paspalum notatum, Pennisetum purpureum, Di-
gitaria decumbens и др., азотфиксация за счет деятельности
диазотрофных бактерий достигает 1—2,4 кг/га/сут (Dobereiner,
1978). В среднем в год в этой зоне фиксируется от 30 до 90—
100 кг N/ra. В почвах тропических дождевых лесов
фиксируется до 600 кг N/га/год.
Активность ассоциативной азотфиксации в почве зависит
главным образом от наличия легкодоступного энергетического
материала. Высокий уровень азотфиксации в прикорневой зоне
обусловлен притоком сюда больших количеств органических
веществ — корневых выделений и корневого опада.
Считается, что большинство растений тропической зоны под-
48

держивает высокую активность азотфиксации в их ризосфере
и ризоплане за счет того, что общим свойством этих растений
(маиса, сахарного тростника, росички, паспалума) является
способность использовать при фотосинтезе путь через С—4-ди-
карбоновые кислоты (Tjepkema, Burris, 1976; Jagnow, 1979).
Растениям этого типа требуется интенсивное освещение, и
максимальная скорость фотосинтеза у них значительно выше, чем
у растений, использующих цикл Кальвина (С—3-путь) (риса,,
овса, ячменя, пшеницы). Предполагается, что, поскольку
растениями С—4-типа расходуется мало углеводов при
фотодыхании, большее их количество может быть использовано лля роста
корней и усиления корневой экссудации (Jagnow, 1979). Па
мнению Постгейта (Postgate, 1978), особую агрономическую
ценность имеют те растения, которые обладают способностью
быстро «пропускать» метаболизированные источники углерода
через свои корни в количестве, достаточном для защиты и
функционирования нитрогеназы ризосферных микроорганизмов.
Более высокий уровень нитрогеназной активности в
ризосфере небобовых растений по сравнению с почвой, где растения
отсутствуют, свидетельствует о том, что несимбиотическая азот-
фиксация лимитируется в первую очередь источниками
углеродной пищи, а также другими экологическими факторами, а
не отсутствием или недостатком «свободноживущих» диазотроф^
ных бактерий.
Сезонная динамика ассоциативной азотфиксации
Процесс азотфиксации подвержен влиянию
сложного и динамичного комплекса различных факторов, вследствие
чего азотфиксирующая активность почв может сильно
колебаться в течение периода вегетации растений. Поэтому для
оценки продуктивности ассоциативной азотфиксации в агроце-
нозах недостаточно нескольких определений ее уровня, а
необходимо изучение динамики процесса в течение вегетационного
периода непосредственно в полевых условиях. Кроме того,
сопоставление динамики азотфиксации в ризосфере с фенофазами
развития сельскохозяйственных культур позволяет косвенно
оценить степень влияния растений на деятельность диазотроф-
ных бактерий.
Для иллюстрации рассмотрим динамику ассоциативной
азотфиксации в течение двух вегетационных периодов (1978 и
1979 гг.) под посевами луговых злаков — тимофеевки (Phleum
pratense) и овсяницы (Festuca rubra), ячменя (Hordeum vul-
gare), под посадками картофеля (Solarium tuberosum) и на
участках, не занятых растениями (черный пар, междурядья).
Для дерново-подзолистой тяжелосуглинистой почвы под
посевами тимофеевки и овсяницы за вегетационный период 1978 г.
динамика актуальной активности азотфиксации по данным
диффузионного метода представлена в табл. 10. В табл. 11 приве-
49

дены среднемесячные величины некоторых погодных
параметров за этот период.
Под посевами обеих культур активность азотфиксации
менялась в течение вегетации растений, колеблясь в пределах от
0,06 до 0,33 мг N2/m2/4 под тимофеевкой и от 0,03 до 0,43 мг
Ыг/м2/ч под овсяницей. Активность постепенно нарастала с
момента появления всходов (май) до созревания (август). Резкое
Таблица 10
Динамика активности азотфиксации в дерново-подзолистой
тяжелосуглинистой почве под посевами луговых злаков
в течение вегетационного периода 1978 г.
Угодья
Месяцы
VI
VII
VIII
IX
.XI
Среднемесячная актуальная активность азотфиксации, мг Ыг/м2/ч
Тимофеевка I 0,14 I 0,20 I 0,22 I 0,33 I 0,30 I 0,28 I 0,06
Овсяница 0,08 0,08 0,25 0,43 0,40 0,20 0,03
Черный пар | 0,02 | 0,04 | 0,05 | 0,06 | 0,06 | 0,05 | 0,02
Среднемесячная потенциальная активность азотфиксации, мг Ы2/кг почвы/ч
Тимофеевка
Овсяница
Черный пар
0,11
0,09
1 0,10
0,11
0,08
0,09
0,10
0,11
0,10
0,09
0,08
0,10
0,11
0,07
0,08
0,09 1
0,10
0,06 1
не опр.
не опр.
не опр.
Таблица И
Погодные условия в течение вегетационного периода 1978 г.
Параметры
Средняя температура почвы, °С
Средняя относительная
влажность воздуха, %
Осадки, мм
Испарение, мм
Месяцы
V
11,3
54
49,5
нет
данных
VI
13,0
60
101,9
48,7
VII
15,6
60
76,4
42,9
VIII
15,7
63
46,1
41,0
IX
11,3
75
65,0
27,6
X
5,5
73
62,5
снижение активности отмечено в ноябре при наступлении
холодов. В незасеянной почве (черный пар) азотфиксация
протекала в течение всего лета со скоростью примерно на порядок
меньшей, чем под злаками, и среднемесячные значения ее
изменялись мало.
Нитрогеназная активность под посевами тимофеевки и
овсяницы в дерново-подзолистой тяжелосуглинистой почве в
течение второго вегетационного периода (1979 г.) менялась в
широких пределах и имела два максимума (рис. 12). Она
постепенно возрастала с развитием всходов (с середины мая до
50

середины июня) и достигла первого максимума (0,53 и 0,38 мг
Ы2/м2/ч для тимофеевки и овсяницы соответственно) в начале
колошения. После первого укоса и с наступлением относительно
жаркого и сухого периода (середина июня) активность
снизилась до 0,21—0,22 мг Ы2/м2/ч. Затем, по мере отрастания рас-
адгусг сентябрь
Рис. 12. Динамика актуальной (полевой) активности
азотфиксации в дерново-подзолистой
тяжелосуглинистой почве под тимофеевкой (1), овсяницей (2) и в
пару (3) по данным диффузионного метода в течение
вегетационного периода 1979 г.
тений второго урожая, скорость азотфиксации снова начала
увеличиваться и достигла второго максимума (0,52 мг ^/м2/ч
под тимофеевкой и 0,48 мг Ыг/м2/ч под овсяницей) в фазу
цветения злаков. В конце августа и сентябре скорость
азотфиксации уменьшилась.
В почве незасеянного участка азотфиксирующая активность
была ниже, чем под посевами злаков, и изменялась незначи-
МгН/м2/ч
мои
июнь
июль
адгусг
Рис. 13. Динамика актуальной
(полевой) активности азотфиксации в
дерново-подзолистой супесчаной почве
под ячменем (/) ив междурядьях
(2) по данным диффузионного
метода в течение вегетационного периода
1979 г.
мгЫ/м2/%
0.6
0,2
июнь
июль
адгусг
Рис. 14. Динамика актуальной
(полевой) активности азотфиксации в
дерново-подзолистой супесчаной почве
под картофелем (1)ив междурядьях
(2) по данным диффузионного
метода в течение вегетационного периода
1979 г.
тельно в течение всего лета. Некоторый подъем активности
(около 0,2 мг N2/m2/4) отмечен в первой половине июля, когда
влажность почвы была особенно высокой (до 40%).
Важно подчеркнуть, что высокая активность азотфиксации
отмечена во время колошения и цветения злаяов и низкая —
после укоса. Однако максимальным ее уровень оказался в фазу
51

активного развития растений при наиболее высокой влажности
почвы. Хотя в это время нитрогеназная активность резко
возросла и в незасеянной почве, тем не менее ее уровень здесь
*был в 1,5—2 раза ниже, чем под злаками, что свидетельствует
о стимулирующем влиянии растений на азотфиксацию даже на
фоне сравнительно благоприятных условий внешней среды.
Аналогичные закономерности получены и при изучении
динамики азотфиксации в дерново-подзолистой супесчаной почве
на полях ячменя (рис. 13) и картофеля (рис. 14). Под ячменем
наивысший уровень азотфиксации (0,73 мг азота/ч) также
соответствовал фазе активного вегетативного развития растений.
По мере созревания активность постепенно снизилась до 0,20 мг
Ыг/м2/ч. Азотфиксация на участках без растений была намного
ниже — 0,02—0,28 мг Ы2/м2/ч. Под картофелем на
дерново-подзолистой супесчаной почве активность азотфиксации
изменялась в пределах от 0,16 до 0,61 мг Ыг/м2/ч. Скорость процесса
постепенно возрастала с момента появления всходов,
оставалась на высоком уровне (0,44—0,61 мг Ыг/м2/ч) во время
активного вегетативного развития и цветения и снижалась к концу
вегетации (0,25 мг Ыг/м2/ч). На участках без растений
нитрогеназная активность была ниже, чем под растениями — 0,05—
0,28 мг Ы2/м2/ч.
Параллельно с измерениями уровня полевой (актуальной)
азотфиксирующей активности почв определяли их
потенциальную активность в течение всего периода вегетации для того,
чтобы выяснить, насколько различаются между собой эти два
показателя и существует ли между ними взаимосвязь.
Под посевами луговых злаков на дерново-подзолистой
тяжелосуглинистой почв'е потенциальная активность азотфикса-
мгн/кгпочды/ч
016
май
июнь июль адгуст сентябрь
Phv'. 15. Динамика потенциальной активности азотфиксации в дерново-
подсЗолистой тяжелосуглинистой почве под тимофеевкой (i), овсяницей
(2) и в пару (3) в течение вегетационного периода 1979 г.
ции превосходила уровень полевой активности по данным
диффузионного метода в среднем приблизительно в 20—50 раз, по
данным метода продувки — в 5—10 раз. Потенциальная ак-
52

тивность находилась примерно на одном уровне в образцах
почвы из-под злаков и почвы без растений и во всех трех
вариантах опыта (тимофеевка, овсяница, пар) мало изменялась
в течение вегетационного периода (рис. 15).
В дерново-подзолистой супесчаной почве под ячменем
уровень потенциальной активности азотфиксации был выше поле-
JMrH/tcr почды/ч
0,08
от
июнь
июль
ад г ист
мгн/кг лочды/1
аов\
июнь
июль
адгуст
Рис. 16. Динамика потенциальной
активности азотфиксации в дерново-
подзолистой супесчаной почве под
ячменем (1) ив междурядьях (2) в
течение вегетационного периода
1979 г.
Рис. 17. Динамика потенциальной
активности азотфиксации в дерново-
подзолистой супесчаной почве под
картофелем (1) ив междурядьях
(2) в течение вегетационного периода
1979 г.
вой активности приблизительно в 10—30 раз (рис. 16). Под
картофелем значения двух показателей азотфиксирующей
активности различались в 5—20 раз (рис. 17).
Таблица 12
Коэффициенты корреляции между значениями полевой
и потенциальной активности азотфиксации
Почва
Дерново-подзолистая
тяжелосуглинистая
Дерново-подзолистая
супесчаная
Угодье
тимофеевка
овсяница
черный пар
ячмень
междурядья
картофель
междурядья
Нп1Нх
—0,Ю0
+0,239
+0,332
—0,512
+0,020
—0,403
+0,442
Ип!Нг
—0,040
+0,087
+0,276
—0,258
+0,190
—0,579
+0,517
Примечание. Яп — потенциальная активность азотфиксации; Н\ —
полевая активность азотфиксации (диффузионный метод); #2 — полевая
активность азотфиксации (метод продувки).
Под культурами и в междурядьях потенциальная азотфик-
сирующая активность различалась мало: в образцах почвы из-
под ячменя значения активности варьировали в течение лета
в пределах 0,67—0,98 мг Иг/кг почвы/ч, в почве междурядий —
в пределах 0,64—0,86 мг N2/Kr почвы/ч; в почве под картофелем
53

пределы варьирования активности составили 0,20—0,48 мг
N2/kt почвы/ч, в почве междурядий — 0,21—0,47 мг Ы2/кг
почвы/ч.
В течение вегетационного периода уровень потенциальной
активности азотфиксации относительно мало изменялся как в
почве под растениями, так и без них.
При сопоставлении значений потенциальной активности
(#п) азотфиксации с динамикой полевой активности по данным
диффузионного метода (#i) и метода продувки (Я2)
корреляции между этими величинами не выявлено ни в одном из семи
вариантов опытов (табл. 12).
Сравнительно небольшие колебания потенциальной
активности азотфиксации, являющейся косвенным показателем
численности диазотрофных микроорганизмов в почве, могут
служить дополнительным подтверждением вывода, что не
количество азотфиксирующих бактерий лимитирует скорость процесса,
а источники их питания и экологические факторы.
Суточная динамика
актуальной активности азотфиксации
Изучение особенностей ассоциативной
азотфиксации в различных экосистемах привело к заключению, что для
расчетов суммарной продуктивности ее за сезон необходима
учитывать изменения уровня активности процесса в течение дня.
Изучение суточной динамики азотфиксации под культурами
важно также с точки зрения выяснения степени влияния не
только различных видов, но и разновидностей растений на этот
процесс, поскольку большие колебания активности выявлены
даже для отдельных сортов, рас и линий (Rennie, 1981).
Суточная периодичность ассоциативной азотфиксации
впервые выявлена Баландро с соавт. (Balandreau, Villemin, 1973;
Balandreau et al., 1974) на посевах риса. Максимум активности
приходился обычно на середину дня (12—15 ч), ночью
активность падала. Аналогичные закономерности выявлены также
для других растений умеренной зоны (Tjepkema, Burris, 1976)
и для тропических трав (Dobereiner, Day, 1975). Однако для
некоторых растений тропической зоны характерны не только
дневные, но и ночные пики нитрогеназной активности
(Dobereiner, Day, 1975). Эти растения относятся к С—4-типу и
ночные пики объясняются растворением крахмальных зерен,
которые аккумулируются в хлоропластах С—4-растений в течение
дня и метаболизируются ночью. Для растений С—3-типа зоны
умеренного климата характерна более низкая продуктивность
фотосинтеза, продукты которого метаболизируются сразу, а не
откладываются частично в хлоропластах. Поэтому в ризосфере
большинства растений умеренной зоны активация деятельности
диазотрофных бактерий наряду с другими микроорганизмами
происходит днем, при максимальной освещенности, когда наи-
54

«более интенсивны фотосинтез и зависящая от него скорость
экссудации метаболитов в фитоплан.
Четкая суточная периодичность нитрогеназной активности
наблюдается в ризосфере и филлосфере всех растений. Так, в
наших опытах под ячменем днем азотфиксация достигала 0,40—
0,50 мг Ыг/м2/ч, тогда как ночью — лишь 0,17—0,14 мг Ы2/м2/ч
(рис. 18). Под картофелем эти различия были также велики —
0,46—0,61 днем и 0,20—0,24 мг Ы2/м2/ч ночью (рис. 19).
В почве без растений активность азотфиксации изменялась
в течение дня на ячменном поле от 0,011 до 0,086 мг N2/m2/4,
wn/m2/v
М,6
0,4
■0,2
\
/
S
Л
6
/\
12
^^х
78
Время
X/
24
суток,
мг
0,6
0,*
0,2
N//W
-
У^^
и—
6
7\ч
72
Уч
\/
78 24
Время суток, ч
Рис. 18. Суточная динамика
актуальной (полевой) активности
азотфиксации в дерново-подзолистой
супесчаной почве под ячменем (1) и в
междурядьях (2)
Рис. 19. Суточная динамика
актуальной (полевой) активности
азотфиксации в
дерново-подзолистой супесчаной почве под
картофелем (/) и в междурядьях (2)
на картофельном — от 0,056 до 0,123 мг Ы2/м2/ч (см. рис. 18,
19). Изменения уровня активности в почве без растений не
соответствовали динамике процесса в ризосфере.
Результаты наших наблюдений в течение двух сезонов за
полевой азотфиксирующей активностью почв показывают, что
последняя значительно изменяется как на протяжении
вегетационного периода, так и в течение суток. Динамика
азотфиксации неодинакова в почве под растениями и в почве без них
и различна для разных культур.
В почве под всеми изученными культурами азотфиксирую-
щая активность на протяжении вегетационного периода
неизменно оказывалась выше, чем в почве, где растения
отсутствовали. При этом наиболее интенсивно азотфиксация протекала
под посевами злаков в фазу их колошения и цветения, в почве
под картофелем — во время активного вегетативного развития
и в начале цветения.
Таким образом, стимулирующее влияние растений на
деятельность диазотрофных бактерий, выражающееся в наличии
сезонной и суточной динамики ассоциативной азотфиксации,
наиболее вероятно объясняется поступлением в прикорневую
зону легкодоступного энергетического материала из корневого
55

экссудата и корневого опада. Известно, что интенсивность
корневой экссудации возрастает в фазы активного развития
растений (Сытник с соавт., 1972; Долгих, Грачева, 1977) и при
высокой скорости фотосинтеза (Balandreau, Dommergues, 1973).
У злаков (Шатилов, Вербицкая, 1973) в этот период
максимального размера достигает ассимиляционная поверхность
растений и возрастает продуктивность фотосинтетического
аппарата. Имеется ряд данных (см. ниже) о тесной зависимости
азотфиксации в ризосфере растений от интенсивности их фото-
сиитетической деятельности. В частности, только этой
зависимостью можно объяснить суточную динамику азотфиксации &
ризосфере. Под двумя разными культурами (ячменем,
картофелем) в наших опытах скорость азотфиксации возрастала
днем и уменьшалась ночью, а в неризосферной почве
активность в течение суток изменялась мало и ее колебания не
соответствовали динамике процесса в почве под растениями.
Подтверждением тому, > что поступление корневых
выделений и опада в большой степени определяет уровень
ассоциативной азотфиксации, могут служить данные по потенциальной
активности азотфиксации в ризосферной и неризосферной
почве. Во-первых, она незначительно различалась в почве из-под
растений и без них и, во-вторых, относительно мало менялась
в течение вегетационного периода. Потенциальная активность
азотфиксации косвенно характеризует численность диазотроф-
ных бактерий. Так как в условиях достаточного энергетического
обеспечения и оптимальной влажности азотфиксирующая
активность ризосферной и неризосферной почвы примерно
выравнивается, то, следовательно, численность диазотрофов не
лимитирует скорости процесса в почве в такой степени, как
источники энергии и влажность. Активность микробиологических
процессов далеко не всегда совпадает с численностью
осуществляющих их микроорганизмов.
В частности, нередко нет корреляции между азотфиксацией
и общим числом диазотрофных микроорганизмов в ризосфере
(Vlassak et al., 1973). Микробные ассоциации могут
перестраиваться при изменении погодных условий, обусловливая
колебания активности азотфиксации, но главным лимитирующим
азотфиксацию фактором в почве является доступность энерго-
дающих соединений. Более высокий уровень процесса в
полевых условиях в ризосфере по сравнению с почвой без растений
можно объяснить только массированным поступлением в
прикорневую зону легкодоступного энергетического субстрата в
виде прижизненных растительных выделений и опада.
Зависимость интенсивности фиксации атмосферного азота
диазотрофными почвенными микроорганизмами-гетеротрофами
от выделительной деятельности корневых систем растений, а в
конечном счете от фотосинтетической активности
свидетельствует о тесной сопряженности двух уникальных биологических
процессов — азотфиксации и фотосинтеза. Подтверждением
56

этого является низкий уровень несимбиотической и
ассоциативной азотфиксации в районах с низкой продуктивностью
фотосинтеза и высокий их уровень — в районах с высокой его
продуктивностью.
Таким образом, растения в значительной степени влияют
не только на азотфиксирующую активность почвы, но и
являются главным фактором, определяющим динамику
ассоциативной азотфиксации. Именно поэтому при определении и
сравнении продуктивности азотфиксации в разных наземных
экосистемах нельзя исходить из единичных определений уровня нит-
рогеназной активности и не учитывать действия растений. Для
более точного определения вклада диазотрофных
микроорганизмов в азотный баланс почв под различными культурами
необходимо изучать динамику ассоциативной азотфиксации в
течение вегетационного периода и в ходе суток, причем
особенно тщательно — в периоды наиболее активного развития
растений.
Продуктивность ассоциативной азотфиксации
Определение количества азота, которое поступает
в почву под различными сельскохозяйственными культурами
за счет деятельности диазотрофных почвенных бактерий,
является одной из главных задач экологии ассоциативной
азотфиксации. Сведения об уровне ассоциативной азотфиксации в
окультуренных почвах зоны умеренного климата
немногочисленны и нередко противоречивы. Обусловлено это главным
образом тем, что данные получены разными методами —
изотопным, ацетиленовым или методом балансовых расчетов, —
существенно различающимися по своей точности. Среди других
причин, влияющих на точность полученных оценок, необходимо
еще раз упомянуть о методических ошибках при определении
активности и продуктивности азотфиксации. Чаще всего
уровень нитрогеназной активности определяли в почвенных
образцах нарушенного сложения и без растений, что приводило к
получению заниженных результатов. Для оценки общих
масштабов вклада диазотрофных несимбиотических почвенных
бактерий в азотный баланс почв требуется накопление большого
фактического материала. Особое значение имеют исследования,
проводимые непосредственно в поле, позволяющие оценить
уровень азотфиксации в конкретных почвенно-климатических
условиях и учесть влияние на процесс различных возделываемых
культур. Применение ацетиленового метода делает возможными
такие исследования.
Для дерново-подзолистых почв оценка продуктивности
ассоциативной азотфиксации проведена нами на основе изучения
двумя методами сезонной и суточной динамики процесса под
различными сельскохозяйственными культурами и в природных
экосистемах (табл. 13).
57

При наличии активно вегетирующей растительности (ячмень,,
луговые злаки, злаковое разнотравье) суммарная
продуктивность азотфиксации за вегетационный период достигала,
поданным метода продувки, 40—55 кг Ыг/га. В то же время в
парующей почве и в междурядьях ее уровень не превышал 10—
13 кг в пересчете на гектар.
Более низкие значения получены при использовании
диффузионного метода. Так, на дерново-подзолистой тяжелосугли-
Таблица 13
Продуктивность азотфиксации в некоторых экосистемах
в зоне дерново-подзолистых почв
Почва
Дерново-слабоподзолистая
тяжелосуглинистая хорошо окультуренная
Дерново-среднеподзолистая
супесчаная среднеокультуренная
Дерново-слабоподзолистая
среднесуглинистая
Дерново-слабоподзолистая
легкосуглинистая
Дерново-слабоподзолистая
легкосуглинистая
Дерновая среднесуглинистая
Растительность или угодье
тимофеевка
овсяница
черный пар
ячмень
картофель
междурядье
ельник-кисличник
сосняк-зеленомошник
березняк
разнотравный с черникой
ельник-кисличник
ельник мертво-
покровный
луг суходольный
Азотфиксация,.
кг/га за
вегетационный*
период
40,1±2,0
39,2+1,4
13,1±0,5
40,4±1,7
29,6±0,9
10,5±0,6
24—26
18—23
15—23
20—33
20—26
1 51-59
нистой почве под посевами тимофеевки продуктивность
азотфиксации составляла 4,9—6,8 кг/га за сезон, под овсяницей —
4,8—8,7, а на парующем поле — 1,6—1,9 кг N2/ra.
Соответственно под ячменем — 9,7—18,1, под картофелем 5,4—8,3, в
междурядьях 1,9—3,7 кг/га за сезон.
Результаты, полученные диффузионным методом, чаще
всего очень занижены. Более близкими к истинному уровню
следует считать данные, полученные методом продувки. По этому
методу размеры ассоциативной азотфиксации для
дерново-подзолистой тяжелосуглинистой почвы под тимофеевкой и
овсяницей составляют 40,1 и 39,2 кг N2/ra за сезон, а несимбиотиче-
ская азотфиксация на парующем участке — 13,1 кг N2/ra за
сезон.
Для дерново-подзолистой супесчаной почвы размеры
азотфиксации за сезон составляют 40,4 кг N2/ra под ячменем,
29,6 кг N2/ra под картофелем и 10,1 — 10,5 кг N2/ra на почве
междурядий.
Таким образом, в дерново-подзолистых почвах
азотфиксация за вегетационный период составляет под посевами злако-
58

вых растений около 40 кг N2/ra, под картофелем — 30 кг N2/ra.
В то же время на не занятых растениями участках фиксируется
лишь 10—13 кг N2/ra. Очевидно, что именно это количество
молекулярного азота связывается бактериями за счет
использования пожнивных растительных остатков, т. е. в ходе
несимбиотической азотфиксации. Остальные 20—25 кг N2/ra
усваиваются диазотрофами при потреблении ими в качестве
углеродной пищи легкодоступных органических соединений, выделяемых
растениями в прикорневую зону в виде корневого экссудата и
корневого опада, т. е. за счет ассоциативной азотфиксации.
Суммарный урожай за вегетационный период 1979 г.
составил для исследуемых культур следующие величины (т/га):
тимофеевка — 8,6
овсяница — 8,3
ячмень — 7,0
картофель — 13,2
Исходя из биомассы растений можно оценить и примерные
размеры ассоциативной азотфиксации.
Эффективность расходования углерода на процесс
связывания атмосферного азота чистыми культурами диазотрофных
бактерий колеблется от 3—5 до 18—20 мг N2 на 1 г
потребленного углерода (Мишустин, Шильникова, 1968). Факультативно-
симбиотрофные азотфиксирующие микробные ассоциации
связывают около 12—15 мг N2 на 1 г углерода (Калининская и др.,
1977). По нашим оценкам, продуктивность несимбиотической
азотфиксации в дерново-подзолистой почве достигает 23,5 мг
азота на 1 г использованного источника углерода.
Для смешанных культур азотфиксирующих
микроорганизмов эта величина пока не определена, хотя можно полагать,
что она не ниже 10—12 мг азота на 1 г углеродного материала.
Принимая, что около 25% фотосинтезированного растениями
органического вещества тратится на азотфиксацию в ризосфере,
получаем, что за счет корневых выделений и корневого опада
растений фиксируется следующее количество азота (кг N2/ra/ce-
зон):
под тимофеевкой — 20—25
под овсяницей — 22—26
под ячменем — 18—21
под картофелем — 33—40
Таким образом, в дерново-подзолистой почве под
сельскохозяйственными культурами суммарная продуктивность
ассоциативной и несимбиотической азотфиксации не ниже 30—
40 кг Ы2/га/год. Наиболее важно, что основная часть азота
(около 2/3) связывается в процессе ассоциативной
азотфиксации, играющей важную роль в азотном питании растений в
этой зоне.
59

Ассоциативная азотфиксация в филлосфере
(филлоплане) растений
Филлосфера, или филлоплан, — вторая
экологическая ниша на поверхности растений, где может
осуществляться ассоциативная азотфиксация. Благоприятствующими
условиями для активной фиксации азота в филлосфере являются
высокое отношение С: N, поддерживаемое за счет выделения
органических соединений, главным образом углеводов и
органических кислот при экзоосмосе, наличие влаги и сравнительна
небольшие колебания температуры на поверхности листьев и
стеблей за счет транспирации.
Несмотря на то что азотфиксирующие микроорганизмы были
давно обнаружены на надземной части растений, изучение их
азотфиксирующей активности непосредственно в филлосфере
началось сравнительно недавно. Первые экспериментальные
данные о величине азотфиксации были получены при изучении
филлосферы различных тропических трав — обитателей почв,
бедных азотом (Ruinen, 1961; Moore, 1963; Jensen, 1965).
В филлосфере растений зоны умеренного климата
(псевдотсуги, дуба, сосны, пихты и др.) азотфиксацию впервые
измерил Джонс (Jones, 1970). По данным изотопного метода,
активность фиксации составила около 1,79 мг/сут/побег
псевдотсуги. Согласно проведенным им же балансовым расчетам в
филлосфере смешанных и хвойных лесов в условиях Англии
может фиксироваться от 2 до 6,5 кг N2/ra/100 дней (Jones,
1970).
Тодд и Мейер (Todd, Meyer, 1976) ацетиленовым методом
изучали активность азотфиксации в лесах умеренной зоны СШАГ
используя для этого срезанные образцы листьев и веток клена>
дуба и кизила. Активность азотфиксации в этих условиях была
сравнительно невысока — от 0,2-10-7 до 9-Ю-7 г N2/r листьев.
В пересчете на гектар это означало, что в филлосфере таких
лесов фиксируется около 0,22 кг азота в год.
Высокого уровня ассоциативная азотфиксация достигает в
филлосфере мхов — до 6—64 кг в год в пересчете на гектар
(Basilier et al., 1978). По данным Гидденса (Giddens, 1982),
в корках цианобактерий в сообществе с мхами, развивающихся
на поверхности пустынных почв в штате Джорджия (США),.
среднегодовой уровень азотфиксации составляет 54 кг N2 в
пересчете на гектар. При этом корки цианобактерий без зеленых
мхов имеют значительно более низкую активность
азотфиксации, что свидетельствует о важной роли гетеротрофных азот-
фиксаторов, ассоциированных с филлосферой мхов.
В зоне субтропиков и тропиков азотфиксацию в филлосфере
изучали многие исследователи, однако полученные ими данные
сильно различаются. Согласно Бессему (Bessems, 1973), у
срезанных образцов гватемальской травы азотфиксирующая
активность была невелика и составила от 9 нМ до 331 нМ
60

С2Н4/5 сут/100 г сырых листьев. По мнению Гупты и Сена
(Gupta, Sen, 1976), роль филлосферы в азотном питании
растений велика, и, например, опрыскивание растений риса и
пшеницы суспензией азотфиксирующих бактерий приводит к более
быстрому росту их по сравнению с контрольными растениями,,
обработанными автоклавированными культурами тех же бак*
терий. При этом опытные растения содержали примерно вдвое
больше азота, чем контрольные — от 4,65 до 6,20 против 1,40%
соответственно. По данным Готто и Тейлора (Gotto, Teylor,,
1978), активность азотфиксации на срезанных листьях
мангровых деревьев составляет от 0,2 до 4,0 мг/г сухой массы
листьев/ч.
Довольно подробно изучена азотфиксация в филлосфере
широко распространенной в южных морях водоросли талассии,
темпы прироста которой на вновь осваиваемых ею отмелях
наиболее высоки по сравнению с другими водорослями. Согласно
Маршо с соавт. (Marscho et al., 1975), азотфиксирующая
активность в филлосфере талассии достигает 5 кг/га/год.
Считается, что за счет азотфиксации в филлосфере она покрывает
свои потребности в азоте на 8—38% (Capone, Teylor, 1980),
Таким образом, можно заключить, что, хотя наличие азот-
фиксирующей активности в филлосфере растений различных
биоклиматических зон вполне доказано, тем не менее сведений
о реальных масштабах ассоциативной азотфиксации в
филлосфере в природной среде пока мало, поскольку большинства
данных получено на срезанных образцах или в лабораторных
условиях.
Нами изучена азотфиксация в филлосфере растений 13
семейств и 21 вида (табл. 14). У всех изученных видов активность
азотфиксации колебалась в пределах от 0,1 до 7 • 10-4 мг Ыг/дм2
поверхности листьев/ч. Наиболее высокой азотфиксирующей
активностью обладали представители семейства сложноцветных —
до 7,7*10~4 мг/дм2/ч, а минимальной — представители
семейства кленовых — менее 0,1-Ю-4 мг/дм2/ч. В отличие от других
исследователей, расчет активности азотфиксации нами
производился не на единицу веса листьев, а на единицу их
поверхности. Обусловлено это тем, что микроорганизмы
располагаются не в толще, а на поверхности листьев и можно ожидать
прямо пропорциональной зависимости интенсивности
азотфиксации от плотности заселения ее азотфиксирующими
бактериями. Кроме того, различные размеры листьев у разных видов
растений не позволяют проводить сравнение активности
азотфиксации по их весу, поскольку далеко не всегда существует
прямая корреляция между весом и размерами листьев.
Изучение сезонной динамики ассоциативной азотфиксации
было проведено в филлосфере двух видов растений, наиболее
широко распространенных в фитоценозах зоны умеренного
климата, — березы и тимофеевки. На рис. 20 представлены данные
по динамике полевой активности азотфиксации и численности
61

бактерий в филлосфере березы и тимофеевки. В целом
изменения активности азотфиксации у обоих видов растений были
однотипны — наблюдались два пика ее в течение
вегетационного периода. Спад азотфиксирующей активности в середине
лета вероятнее всего был обусловлен крайне низкой влажностью
воздуха в этот период, составившей лишь около 30%, тогда
как в среднем за сезон она была на уровне 60%.
Продуктивность азотфиксации в филлосфере, рассчитанная
на основе данных о сезонной динамике процесса, составила
Таблица 14
Уровень азотфиксации в филлосфере растений
Семейство
Compositae
Gramineae
Cruciferae
Ericaceae
Vacciniaceae
Corylaceae
Rosaceae
Tiliaceae
Polygonaceae
Plinaceae
Betulaceae
Aceraceae
Вид
Tripleurospermum inodo-
rum
Taraxacum officinale
Achillea millefolium
Artemisia absintium
Avena sativa
Phleum pratense
Festuca rubra
Barb area vulgaris
Ledum palustre
Vaccinium uliginosum
Oxycoccus quadripetalus
Corylus avellana
Malus domestica
Sorbus aucuparia
Tilia cordata
Polygonum sp.
Rumex acetosella
Picea abies
Betula pendula
Acer platanoides
Азотфиксация,
мг N2-10~4 дмг/ч
2,05—2,25
3,27—3,35
6,92—7,10
4,80—5,02
3,21—3,53
' 2,70—2,76
| 2,89—3,09
1,50—1,68
1,30—1,42
1 ,06—1,26
1,00—1,08
0,64—0,73
0,67—0,69
0,56—0,62
0,26—0,31
0,24—0,28
0,21—0,23
0,16—0,18
0,12—0,18
0,11-0,13
около 9 кг/га/сезон для березы и около 13 кг/га/сезон для
тимофеевки. Однако, поскольку полученные нами данные об
ассоциативной азотфиксации в филлосфере относятся к середине
дня, то оценка суммарной продуктивности процесса может быть
завышенной. Как уже отмечалось, для точной оценки
масштабов ассоциативной азотфиксации в филлосфере недостаточно
знать сезонную динамику активности азотфиксации, а
необходимо учитывать также суточные изменения этого процесса.
Параллельно с измерением полевой активности
азотфиксации в филлосфере березы и тимофеевки определяли
потенциальную азотфиксирующую активность (рис. 21). Полученные при
этом данные позволили, использовав соотношение: Лакт = ЛПотХ
62

XFe-Ft'Fo, связывающее полевую активность азотфиксации с
величиной потенциальной активности при учете факторов
влажности FB, температуры FT и освещенности F0 для конкретных
значений влажности (В), температуры (Т) и освещенности (О)
(табл. 15), рассчитать величину полевой активности. Расчетные
значения актуальной (полевой) азотфиксации в филлосфере
200
160
120
80
40
(1
'10
-*
- 6(
-ч
- 2
ffjr^
-
Ill
1 ^\
1 ч\
_—J _
$5ъ
7 \
il \
j i
А
i L
„ май. июнь июль абгуст сентябрь
млн/м2 мг-Ю'чЫ/дм2/ч
мг-10~цН/дм21ч
25
май июнь июль абгуст сентябрь
май июнь июль ад густ сентябрь
Рис. 20. Полевая азотфиксирующая Рис. 21. Потенциальная азотфиксиру-
активность (Уакт) и численность бак- ющая активность в филлосфере бе-
терий (п) в филлосфере березы (А) резы (1) и тимофеевки (2) в течение
и тимофеевки (Б): 1 — VaKT; 2 — п\ вегетационного периода
3 — значения УаКт, вычисленные по
формуле
березы и тимофеевки (см. рис. 20) достаточно хорошо
согласуются с оценками, полученными при полевых определениях.
Следовательно, соотношение учитывает наиболее существенные
факторы, определяющие интенсивность процесса азотфиксации
в филлосфере. Помимо этого возможность применения этих
зависимостей, полученных для тимофеевки, для вычисления
актуальной азотфиксации и в филлосфере березы говорит о
возможности использования предложенного соотношения для
расчетов ассоциативной азотфиксации по величинам потенциальной
активности в филлосфере различных видов растений.
Для расчета суммарной величины ассоциативной
азотфиксации в филлосфере за сезон важно знать не только конкретные
63

значения полевой активности азотфиксации в момент
определения, а главным образом среднесуточные значения этого
показателя.
Полученное соотношение позволяет рассчитать и
среднесуточные значения величин актуальной азотфиксации.
^акт — ^пот* -* в " •* т * ■« о »
с с с с
где FB , FT и fо — величины факторов, полученные по
среднесуточным значениям влажности, температуры и
освещенности (см. табл. 15).
Суммарная продуктивность ассоциативной азотфиксации за
сезон, рассчитанная по полученным из последнего соотношения
среднесуточным значениям величин актуальной активности,
составляет приблизительно 7 и 10 кг/га/сезон соответственно для
березы и тимофеевки. Эти величины в 3—5 раз превосходят те
значения азотфиксации, которые получены другими
исследователями при изучении азотфиксации в филлосфере растений
зоны умеренного климата на срезанных образцах листьев (Todd
et al., 1978; Granchall, Lindberg, 1978). Полученные путем
прямых измерений активности азотфиксации в филлосфере березы
и тимофеевки данные по продуктивности ассоциативной
азотфиксации показывают, что она играет немаловажную роль в
азотном питании растений, поскольку установлено, что до 30%
продуктов азотфиксации эпифитных микроорганизмов поступает
в ткани растений (Jones, 1970).
Вследствие того что широко используемые ныне методы
определения азотфиксации в ризосфере (см. гл. 1) не дают
возможности раздельно определить долю участия ризосферы и
филлосферы в ассоциативной азотфиксации (одновременно
определяется их суммарная активность), определенный интерес
представляет вопрос о соотношении азотфиксации в ризосфере
и филлосфере.
Для решения его была проведена серия модельных и
полевых опытов с раздельным определением активности
азотфиксации в филлосфере и ризосфере пшеницы, овсяницы и
тимофеевки. В экспериментах в модельных условиях у
трехнедельных растений пшеницы, выращивавшейся в вегетационных
камерах (см. рис. 9), листья и стебли протирали ватой, смоченной
спиртовым раствором для удаления эпифитных
микроорганизмов. Растения, служившие в качестве контрольных, такой
обработке не подвергали.
В полевых опытах на овсянице и тимофеевке измеряли
активность азотфиксации в филлосфере и суммарную активность
в ризосфере и филлосфере.
Для получения сопоставимых результатов по соотношению
азотфиксации в ризосфере и филлосфере растений опыты
ставили или на одном и том же растении (в полевых
исследованиях), или на группе растений (в лабораторных опытах) «и в
условиях с наименее нарушенным фотосинтезом, для чего азот-
64

я
s
s
* a.
z «
g.8
■1
о*
s °
IS
1|
PI
к
«> н
Si
CQ >»
s ei
■5'
■г
s s
X S
il
is
о о*
a> о
s н
&&
S
s
H
o.
X
о
Среднесуточные значения
Конкретные значения в 12 ч дня
S
о°
.*
к."
^
о
о"
иГ
о
о
н
1 ' «
CQ
Время отбора проб (месяц, день)
со^оо^о^ «t^ С9ЖЪ^°1 <°т ~* °>
ооо оо ооо ооо
~«ю —• ~-«a> сч сч о - о о оо
О* С* СО СО(М ^СЧСМ СЯ ~ (N
0,90
0,47
0,80
0,63
0,68
0,80
0,90
0,48
0,90
0,61
0,63
20,4
9,1
17,2
13,8
14,8
16,3
20,0
15,5
20,5
11,0
12,0
0,70
0,60
0,43
0,43
0,75
0,83
0.84
0,91
0,83
0,88
0,88
оюо ою o<noo ооо
IQrfrt» Tf Ю Г>-^ t>- N 00 00
0,98
1,00
1,00
1,00
1,00
0,90
1,00
1,00
1,00
0,70
1,05
—«C5CI ЮЮ ОСЧ00 Tf 1Л —*
rt« СО 00 t^-Ю СОЮСО •«*• СЯ Tf
0,97
0,60
0,80
0,68
0,83
0,80
0,81
0,84
0,95
0,66
0,68
Г^Г*- О^ <N О I^Tf^ о О О
wo г*- т^оо ь-t^oo со со -^
0,50
0,67
0,40
0,40
0,40
0,91
0,95
0,83
0,80
0,86
0,88
—«ОЮ lO^f СОСО'Ф О 1С О
тМОСО COCO t^OOCO СО t^- СО
Май 4
12
22
Июнь 8
19
Июль 2
10
27
Август 27
10
Сентябрь 27
Умаров

фиксацию определяли под прозрачными колпаками и за время
экспозиции, сведенное до минимума, позволяющего выявить
нитрогеназную активность эпифитов-диазотрофов. Все опыты
проводили три раза в трехкратной повторности.
Наибольшее количество ацетилена восстанавливали
контрольные растения, надземную часть которых це протирали
спиртом (суммарная азотфиксация в ризосфере и филлосфере).
Меньшее количество этилена было обнаружено в опытных
растениях, обрабатывавшихся спиртом (азотфиксации в ризосфе-
Таблица 16
Соотношение активности азотфиксации в ризосфере
и филлосфере пшеницы
Серия опыта
1
2
3
Среднее
мг
С
39,3*5,2
38,1*5,8
36,8*5,3
37,7^5,4
Азотфиксация
N2-1(T3 /сое уд/ч
Р 1 Ф
33,5*3,8
32,4*4,2
29,9*3,9
31,8*3,9
5,8*1,4
6,1*1,6
5,9*1,4
5,9*1,5
% от суммарной
Р
85,2
83,9
83,5
84,2
1 •
14,8
16,1
16,5
15,8
ре). Таким образом, азотфиксацию в филлосфере,рассчитывали
по разнице в уровнях азотфиксации у контрольной и опытной
групп растений. В табл. 16 представлены результаты измерений
суммарной активности азотфиксации (С) у пшеницы, а также
соотношение азотфиксации в ризосфере (Р) и филлосфере (Ф).
Таблица 17
Соотношение активности азотфиксации в ризосфере
и филлосфере овсяницы и тимофеевки
Растение
Овсяница
Тимофеевка
Серия опыта
1
2
3
среднее
1
2
3
среднее
мг N2-10-*
р
8,9*1,2
8,6*1,7
9,3*1,3
8,9*1,4
8,4*1,8
7,9*2,2
8,0*1,3
8,1*1,8
Азотфиксация
/растение/ч
Ф
1,5*0,2
1,6*0,6
1,8*0,3
1,6*0,4
1,4*0,3
1,2*0,2
1,2*0,3
1,3*0,3
% от суммарной
Р | Ф
85,5
84,3
83,0
84,8
85,7
86,8
86,0
86,2
14,5
15,7
17,0
15,2
14,3
13,2
14,0
13,8
Для всех трех серий опытов с пшеницей суммарная
азотфиксация различалась незначительно и составила в среднем около
37,7-10~3 мг Ы2/сосуд/ч. При этом на долю ризосферы
приходилось 31,8-10~3 мг Ы2/сосуд/ч, или приблизительно 84,2%, а на
филлосферу соответственно — 5,9-10—3 мг ^/сосуд/ч, или 15,8%
от суммарной активности. Соотношение Р: Ф составило
приблизительно 6:1.
66

В полевых исследованиях уровень азотфиксации как в
ризосфере, так и в филлосфере овсяницы и тимофеевки по трем
сериям опытов колебался незначительно (табл. 17).
Средняя активность азотфиксации в ризосфере овсяницы,
составила 8,9-10~3 мг ^/растение/ч, а в филлосфере — 1,6Х
XIО-3 мг Ыг/растение/ч, или соответственно 84,8 и 15,2%. В
ризосфере тимофеевки средняя активность азотфиксации
составила 8,Ы0~3 мг Ы2/растение/ч, а в филлосфере — 1,3-lCh3 мг
Ыг/растение/ч, или соответственно 86,2 и 13,8%. Р:Ф как для
овсяницы, так и для тимофеевки близко к 6:1.
В результате проведенных измерений установлено, что у
всех трех растений (пшеницы, овсяницы и тимофеевки)
независимо от метода исследования соотношение азотфиксирующей
активности в ризосфере <и филлосфере составляет в среднем
6:1. Если подобное соотношение будет установлено и для
других растений, то это даст возможность при учете суммарной
азотфиксации в почве с растениями в полевых и вегетационных
опытах проводить пересчет азотфиксирующей активности
отдельно для ризосферных и филлосферных диазотрофных
микроорганизмов. Поскольку поверхность корневой системы
примерно в 10 раз превышает поверхность надземных органов
растения, то указанное соотношение позволяет также
заключить/ что уровень азотфиксирующей активности при расчете
его на единицу поверхности растения будет близким для
ризосферы и филлосферы.
Итак, ассоциативная азотфиксация протекает в фитоплане
всех растений, хотя уровень ее различен и определяется,
вероятнее всего, генотипом растений. Большое влияние на общую
продуктивность процесса оказывают погодные условия,
изменяющие активность азотфиксации в 5—6 раз. Следовательно,
одним из путей повышения обеспеченности растений азотом за
счет деятельности микроорганизмов фитоплана может стать
оптимизация условий внешней среды. Наиболее перспективен
он при выращивании овощных растений в защищенном грунте,
где применение высоких доз азотных удобрений в особенности
нежелательно.
ГЛАВА 3
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
И РАСТЕНИЙ ПРИ АССОЦИАТИВНОЙ
АЗОТФИКСАЦИИ
Изучение сезонных изменений полевой активности
несимбиотической азотфиксации в лочве без растений и
динамики ассоциативной азотфиксации в течение вегетационного
периода позволяет сделать вывод, что именно растения явля-
3*
67

ются одним из главных факторов, стимулирую,щих
деятельность диазотрофных бактерий в фитоплане. Одновременно
активность ассоциативной азотфиксации зависит и от многих
других факторов, поскольку ризосфера и филлосфера
являются лишь частью сложной системы «почва—микроорганизмы—
растения»: от влажности и механического состава почвы,
влияющих не только на жизнедеятельность микроорганизмов
и (растений, но и на степень аэрированности корнеобитаемого
слоя, от температуры почвы и воздуха, концентрации
углекислоты в атмосфере и освещенности растений, наличия в почве
соединений азота, фосфора, калия, многих других элементов,
наконец, от численности, состава и взаимодействия микробных
•популяций в фитоплане. Комплексный характер воздействия
внешней среды на процесс ассоциативною связывания
молекулярного азота, сложность и взаимообусловленность реакции
микроорганизмов и растений на эти воздействия затрудняют
проведение точных эколого-физиологических исследований, в
силу чего многие стороны такого взаимодействия остаются
пока невыясненными. Согласно современным представлениям в
основе процессов массопереноса и энбргообмена по цепям
питания в экосистемах, обеспечивающих их нормальное
функционирование и устойчивость, лежат консорции (Работнов, 1978).
Считается, что консортивные взаимодействия в системе
«почва—микроорганизмы—растения» складываются главным
образом на основе физиолого-биохимических взаимодействий
(Гродзинский, 1973), а метаболическая активность корней
рассматривается как основной фактор ризосферного эффекта, за
счет которой обитающие в прикорневой зоне микроорганизмы
получают доступные источники питания. Другой
отличительной особенностью фитоплана растений является то, что,
несмотря на постоянное поступление продуктов фотосинтеза в
эту зону, численность микроорганизмов в ней не подвержена
резким колебаниям, относительно стабильна (Newman, 1978;
Берестецкий, 1982), что позволяет рассматривать фитоплан в
виде своеобразного природного проточного культиватора
различных групп микроорганизмов, в том числе и азотфиксаторов,
позволяющего им поддерживать высокую метаболическую
активность.
Третьей особенностью фитоплана является то, что в нем
наиболее резко проявляется взаимодействие микроорганизмов
между собой (поскольку развиваются они не изолированно, в
чистой культуре, а в составе многокомпонентных ассоциаций),
выражающееся в повышенной физиолого-биохимической
активности и большой устойчивости к факторам внешней среды,
к конкуренции со стороны других группировок
микроорганизмов и т. д. Нередки среди них и высокоактивные азотфикси-
рующие ассоциации микроорганизмов, что дает основание
предполагать их важную роль в процессе ассоциативной азот-
фиксации.
68

Энергетическое обеспечение
ассоциативной азотфиксации
Термин «ризосфера» был введен Л. Гильтнером в
1904 г. для обозначения слоя почвы, в котором
микроорганизмы подвержены влиянию корней. Позднее Аллен с ооавт.
(Allen et al., 1950) выделили ризоплан — зону корневой
поверхности и ризосферу — почву вокруг корней. В 1965 г. на
Пражском симпозиуме по взаимоотношениям растений и
микроорганизмов была предложена унифицированная терминология
для различных зон корневой системы: ризоплан — зона
корневой поверхности, ризосфера — слой почвы, прилегающий к
корням, и здафосфера — почва, удаленная от корней (Tosic,
1965). Согласно проведенным в последние годы прямым
электронно-микроскопическим (наблюдениям (Звягинцев, 1978), а
также по данным энергетических расчетов (Newman, 1978),
максимальные размеры ризосферы не превышают 250—
1000 мкм, что делает ее в реальности трудноразличимой от
ризоплана, в особенности если учесть чрезвычайную
гетерогенность почвы и корневой системы. Именно в силу этих
причин мы не подразделяем прикорневую зону на ризоплан и
ризосферу при изложении экспериментального материала.
Несмотря на .имеющийся в литературе обширный материал
по активизации несимбиотической азотфиксации в ризосфере
и филлосфере растений, одним из наименее изученных
остается вопрос об энергетическом обеспечении ее. Как известно,
азотфиксация — один из наиболее энергоемких .биологических
процессов. Долгое время полагали, что несимбиотическая азот-
фиксация в почве протекает только за счет энергии
разрушающихся растительных остатков и гумуса. По современным
представлениям одним из важнейших источников энергии в 'почве
являются продукты экзоосмоса и корневой опад растений.
Только прижизненным массированным поступлением
легкодоступного органического субстрата в прикорневую зону и в
филлосферу можно объяснить суточную и сезонную динамику
ассоциативной азотфиксации.
Широко распространено мнение, что объем корнепада и
экзоосмоса (обычно оба этих процесса разделить нельзя)
невелик в сравнении с общей продуктивностью растений и они
составляют в среднем 1—3% (максимально 5—10%) от
ассимилированного растением углерода углекислоты и
синтезированного при этом органического вещества.
Однако в последнее «время появились сведения, что
количество органического материала, прижизненно выделяемого
растением в почву, значительно выше. Иошида (Yoshida,
1971) по данным многолетних опытов с рисом в лизиметрах
пришел к выводу, что только на обеспечение энергией
ассоциативной азотфиксации расходуется 25—37% углерода,
потребленного растением в процессе фотосинтеза. Ранее Шамут с
69

сотр. (Shamoot et al., 1968) оценили размеры корнебого спада
и экзоосмоса в 2—7 т/га. Выращивая различные зерновые
злаки в атмосфере с 14СОг, они (Shamoot et al., 1968)
установили, что общее количество органических веществ,
поступающих в почву в течение вегетационного периода и обычно
остающихся неучтенными, составляет 25—49 г на 100 г корней»
определяемых в конце вегетации весовым методом. Гродзин-
ский (1973), учитывая размеры дыхания почвы, пришел к
заключению, что только водорастворимые корневые выделения
составляют 20—30 ц/га в год. По данным Барбера и Мартина
(Barber, Martin, 1976), на долю корневых выделений и
корневого опада приходится не менее 20% углерода,
ассимилированного .растением при фотосинтезе. Кальман (Coleman, 1976) и
Gmht (Smith, 1976) установили, что на корневые выделения и
слущивающийся с корней органический материал в виде
корневых чехликов и отмирающих корневых волосков приходится
более 30—40% от общего количества органического вещества,
поступающего на поверхность почвы в виде растительного
опада. К. М. Сытник с соавт. (1972) отмечают, что количество
корневых выделений, с которыми в почву в течение
'вегетационного периода поступает много питательных веществ для
микроорганизмов, существенно превосходит массу корня в
конце вегетации.
В серии работ Заузрбека с соавт. (Sauerbeck, Johnen, 1976;
1977; Sauerbeck et al., 1982) подробно излагается методика
проведенных ими с использованием 14С02 экспериментов и
приводятся полученные ими данные о масштабах корневого
экзоосмоса и корневого опада у озимой пшеницы, горчицы,
рапса и ряда других растений. Согласно их оценкам, в
течение вегетационного периода в почву поступает в общей
сложности в 3—4 раза больше органических веществ, чем с
корневой массой, учитываемой в момент созревания растений, т. е.
количество их сопоставимо с биомассой растений в конце
вегетации. По оценкам Ньюмана (Newman, 1978), активный
водорастворимый экссудат корней составляет более 25% от веса
растений, а на нерастворимые остатки корневых чехликов и
волосков приходится до 5% от суммарной продукции
фотосинтеза. По нашим оценкам, полученным в опытах с гнотобиоти-
чсскими растениями, инокулированными азотфиксирующими
ассоциациями бактерий (см. ниже), на обеспечение последних
энергией расходуется не менее 25—35% углерода,
ассимилированного растениями. По данным Ванчуры с соавт. (Ванчура
и др., 1979; Vancura, Prikryl, 1980), только на долю корневых
экссудатов у стерильных растений пшеницы приходится до
50% от веса корней, или 12% от веса всего растения, а при
заражении корней комочком почвы количество их
удваивается. Об усилении экссудации в присутствии микроорганизмов
отмечают многие исследователи (Ремпе, 1967; Данилова, 1974).
Шабу и Ружье (Chaboud, Rougier, 1981), измеряя количества
70

полисахаридов, в прикорневой зоне ряда растений (ячменя,
горчицы, пшеницы), установили, что муцигель — желатинооб-
разные, слизистые выделения корней, в основной массе
представленные полисахаридами, составляет не менее 20% от веса
растений. Муцигель образуется главным образом в месте
контакта корней с почвой или другим субстратом клетками про-
тодермы и корневых волосков, причем, что наиболее важно,
выделение его многократно усиливается в присутствии
микроорганизмов. Роль муцигеля в почве многообразна: он
защищает растущий корень от механических повреждений
осколками минералов, предохраняет его от быстрого иссушения, так
как содержит много связанной воды в своем составе,
поглощает различные токсические вещества (тяжелые металлы,
ксенобиотики и др.), улучшает корневое питание растений за
счет процессов хелатообразования с различными катионами и
выделения некоторых ферментов, играющих важную роль в
транспорте ионов, и, наконец, служит источником энергии для
почвенных микроорганизмов. Т. А. Работнов (1978) указывает,
что масштабы поступления в почву органического материала
из-за непрерывного обновления корневой системы могут быть
значительными. По данным О. А. Берестецкого (1982), у
стерильных проростков разных растений общее количество
корневых экссудатов и корневого опада составляет около 10—
15% от веса растений, причем основными компонентами их
являются углеводы (глюкоза, сахароза, фруктоза) и органиче-
. ские кислоты (щавелевая, яблочная, янтарная и др.).
Помимо высших растений экзоосмос изучался у
фитопланктона, некоторых водорослей и у микроорганизмов. По оценкам
Налевайко с соавт. (Nalewaiko, Schiridler, 1976; Nalewaiko et
al., 1980), изучавшим поступление внеклеточных органических
веществ из фитопланктона в водоем, размеры его составляют
в среднем около 20%; они играют важную роль в жизни
канадских озер. Характерно, 4to масштабы этого процесса были
примерно в 2—3 раза выше в олиготрофных озерах, бедных
питательными элементами, чем в эвтрофных озерах. По их же
данным, хлорелла (Chlorella pyrenoidosa) при развитии в
природной среде способна выделять от 19 до 33% продуктов
фотосинтеза в водоем. Р. Д. Мандева с соавт. (1981), изучавшие
экскрецию различных метаболитов дрожжами при
лимитировании их роста установили, что в большинстве случаев такое
воздействие приводит к выделению ими в макроколичествах уг-
леродсодержащих соединений, — главным образом полиолоз.
В табл. 18 суммированы данные различных авторов о
размерах корневого опада, экзооомоса и внеклеточной секреции
..органических соединений некоторыми организмами.
Увеличению корневой массы и, как следствие, возрастанию
масштабов экзоосмоса и корневого опада способствуют
оптимальная влажность, температура, освещение и в особенности
наличие микроорганизмов, стимулирующих быстрый рост кор-
71

ней. Агрономические мероприятия, .направленные на
повышение урожайности культурных растений, вызывают
одновременно возрастание количества корневых выделений и корневого
опада (Минеев, Шевцова, 1978).
Онтогенез корневого экзоосмоса и корнепада в целом
хорошо коррелирует с развитием растений — корневая
экссудация начинается после прорастания семян, постепенно усили-
Табл ица 18
Размеры и состав корневых экссудатов и внеклеточных
экскретов у некоторых организмов
Организмы
Пшеница
Кукуруза
Ячмень
Пшеница
Ячмень
Кукуруза
Пшеница
Горчица
Горох
Рис
Хлорелла
Фитопланктон
Дрожжи
Условия
культивирования
вегетационные
опыты
водная культура,
нестерильно
водная культура,
стерильно
вегетационные опыты
в атмосфере
с "С02
лизиметрические
опыты
альгологически
чистая культура
олиготрофное озеро
чистая культура
на жидкой среде
при лимитации
роста элементами
минерального питания
Состав
полисахаридный
муцигель и
корневой опад
нерастворимые
и растворимые
вещества
углеводы и
органические
кислоты
«дыхание» почвы
в виде 14СОг
не определяли
углеводы
ацетат, глюкоза
и др.
кислоты цикла
Кребса и полио-
лы
Размеры
700 м3/га/год
|1250 >
300 >
80% от
удержания СобщВ
корнях
10—15% от общей
продукции
фотосинтеза
35—50% от общей
продукции
фотосинтеза
25—35% от
суммарной
биомассы
(зерно+солома Н- корни)
19—34% от общей
продукции
фотосинтеза
20% от первичной
продукции
до 50% от
первоначальной
биомассы клеток
Примечание. (Vancura, Prikryl, 1980; Chaboud, Rougier, 1981; Ман-
дева и др., 1981; Берестецкий, 1982; Sauerbeck et al., 1982.
вается и достигает максимума в фазу цветения (Benneth,
Lynch, 1981).
В филлосфере растений энергетическое обеспечение азот-
фиксирующих микроорганизмов осуществляется за счет
органических и минеральных соединений, вымывающихся из
листьев, а также за счет летучих органических веществ.
Считается, что через филлосферу может выделяться до 15—18% асси-
милятов растений (Hanson, Edelman, 1971). У фасоли и у
других бобовых растений при сильном дожде или в тумане
выщелачивается до*5—6% Сахаров от сухого веса за 24 ч, что
72

соответствует общим их потерям в 400—800 кг/га/год (Tukey,
1970). Такое «вымывание» на -самом деле имеет характер
активного транспорта ассимилятов через анопласт (Сытник и др.,
1972). Подвижные продукты фотосинтеза переходят из
цитоплазмы клеток мезофилла через наружную мембрану на
поверхность ассимилирующих клеток в так называемое
свободное пространство — анопласт и уже отсюда выщелачиваются
наружу под действием росы, тумана или дождя (Курсанов,
1976).
Свет резко усиливает «утечку» углеводов из листьев
(Tukey, 1970), тогда как выход многих других соединений светом
не активируется. Наибольшее количество углеводов было
обнаружено в зрелых листовых оболочках и вблизи апикальных
и интеркалярных меристематических тканей стебля и листьев,
а присутствие излишков продуктов фотосинтеза обеспечивало
благоприятные условия для развития азотфиксирующих
микроорганизмов (Ruinen, 1971). Несомненно, что именно наличием
мощного ассимиляционного аппарата и подверженностью
действия солнечной радиации объясняются высокая
метаболическая активность листьев ;и обусловленное этим
концентрирование микроорганизмов на их поверхности.
Общее количество органического, в основном
углеродоодержащего материала, прижизненно поступающего в фитоплан
(ризосферу и филлосферу) в периоды активного роста и
развития растений, составляет в среднем около 1/3 от продукции
фотосинтеза. Эти сведения получены относительно недавно и
иногда кажутся сомнительными в основном по одной
причине: каков экологический смысл отторжения здоровым
растением столь значительного количества органических веществ?
Действительно, повышенная экссудация у растений (и у
других организмов) наблюдается при лимитации роста, вызванной
дефицитом каких-либо элементов минерального питания
или при различных патологических нарушениях обмена
веществ (Сытник и др., 1972; Либберт, 1976). Однако, если
принять во внимание, что межорганизменный обмен
(метаболитами является одним из важнейших свойств живой природы,
имеющем всеобщий характер, то легко подойти к объяснению
большой масштабности экзоосмоса и корневого опада и
экологической целесообразности этого процесса для экосистемы
в целом с точки зрения мобилизации элементов питания в
окружающей среде и главным образом азота за счет
активизации ассоциативной азотфиксации. Характерно, например, что
онтогенез экзоосмоса и корневого опада в целом хорошо
коррелирует с динамикой ассоциативной азотфиксации — оба
процесса нарастают по мере развития растения, достигают
максимума примерно в фазу цветения и затем постепенно
падают. Активизации процесса азотфиксации в эти периоды
способствует также и то, что все более возрастающая
поглотительная способность растущей корневой системы растений
4 М- М. Ум аров
73

приводит к быстрому оттоку азотсодержащих метаболитов
бактериальных клеток и усилению в результате этого
деятельности нитрогсназы. Подтверждением этому является, например,,
значительное различие в содержании азота в клетках азот-
фиксирующей циаиобактерии Nostoc sp., когда она
развивалась в чистой культуре или в составе лишайника (Stewart,
Rowell, 1977). Несмотря «а высокую азотфиксирующую
активность, клетки циаиобактерии были истощены по азоту,
когда находились в составе лишайника, поскольку продукты азот-
фиксации быстро поглощались микобионтом. Как известно,
быстрый перенос азотсодержащих метаболитов из бактероида
в ткани растения и вызванный этим постоянный низкий
уровень содержания их в клубеньках характерен и для бобово-
ризобиального комплекса (Львов и др., 1976; O'Gara, Schan-
mugam, 1977). Можно полагать, что состояние азотного
голодания характерно для азотфикеирующих бактерий, когда они:
ассоциированы с другими организмами, не способными к азот-
фиксации, вследствие чего поддерживается высокая активность
нитрогеназы, экологически целесообразная для всей
взаимодействующей системы организмов.
Микрооргаиизмы-диазотрофы
в ризосфере и филлосфере
Большие успехи в изучении физиологии
азотфиксирующих бактерий, достигнутые в последнее время главным
образом благодаря широкому применению изотопного и
ацетиленового методов исследования, привели к обнаружению
способности ,и фиксации азота у большего числа бактерий,
принадлежащих к различным систематическим группам (Мишу-
стин, Шильникова, 1968; Емцев, 1974; Кондратьева, 1979; Post-
gate, 1978; Dart, Wani, 1982). Список видов гетеротрофных
микроорганизмов, у которых обнаружена азотфиксирующая
активность, неуклонно и быстро расширяется. Помимо хорошо
известных — азотобактера, клостридий, клубеньковых
бактерий и клубеньковых актииомицетов — способность к азотфик-
сации обнаружена у представителей многих других групп
бактерий: Arthrobacter, Bacillus, Beijerinckia, Corynebacterium,
Derxia, Desulfovibrio, Desulfolomaculum, Enterobacter, Erwinia,
Flavobacterium, Klebsiella, Mycobacterium, Pseudomonas,
Vibrio etc.
Из этого списка были исключены эукариотные микроорга-
иизхмы, в том числе грибы и дрожжи, у чистых культур
которых, несмотря на появлявшиеся время от времени сообщения
о наличии у них азотфиксирующей активности, она не была
обнаружена даже высокочувствительным ацетиленовым
методом (Бабьева и др., 1977; Кононков, Умаров, Мирчннк, 1979;
Бабьева, Садыков, 1980). Исходя из современных
представлений о механизмах переноса Nif-гена было постулировано, что
74

способностью к азотфиксации могут обладать большинство,
если не все, почвенных бактерий (Умаров, 1982). Правомочность
такого вывода подтверждается полученными ib последнее
время данными о численности азотфиксирующих бактерий в
почве, ризосфере и филлосфере и их «удельному весу» среди
других микроорганизмов. По данным Ватанабе с сотр. (Watanabe,
Barraquio, 1979; Barraquio, Watanabe et al., 1982), изучавшим
распределение азотфиксирующих бактерий на различных
частях риса и в почве рисовников на Филиппинах, они
составляют:
во внешней почве — 2,4%
в ризосфере — 76%
в ризоплане — 81%
в филлосфере — 38%
При микроскопировании корней большинство из бактерий
было отнесено к p. Pseudomonas; значительно реже
встречались бактерии из p. Azospirillum. Согласно Копонену с сотр.
(Koponen et al., 1980), численность азотфиксирующих бактерий
в ризосфере пырея была в 6—10 раз выше, нежели в неризо-
сферной серой лесной почве, а доля их составляла от 36 до
71% от количества микроорганизмов, (выраставших на
почвенном агаре. Ренни (Rennie, 1980; 1981) исследовал
распространение азотфиксирующих бактерий в различных почвах
Канады, применив для этого ЭВМ и разработанную им
питательную среду. Согласно его данным, около 75% микроорганизмов
в почве обладают способностью к азотфиксации. При этом в
почве пшеничного поля доминировали Erwinia herbicola, Вас.
polymyxa, Ent. cloacea; в почве под донником доминантам был
Az. vinelandii, а в парующей почве — Вас. polymyxa.
В табл. 19 приведены данные о численности
микроорганизмов в почве и ризосфере злаковых трав и о доле
азотфиксирующих (С2Н2-редуцирующих) бактерий.
Вне зависимости от сроков отбора образцов ризосферная
почва характеризовалась не только более высокой
численностью азотфиксирующих бактерлй по сравнению с неризосфер-
ной почвой, но и высоким их «удельным весом» в общем
числе микроорганизмов, вырастающих на безазотных
питательных средах, — доля диазотрофов в ризосфере составляла в
среднем около 65%, а в почве, удаленной от корней, — лишь
около 23%.
Изучение способности к азотфиксации у микробного
населения филлосферы березы и тимофеевки выявило широкое
распространение азотфиксаторов и среди эпифитов. Среди
«выделенных в течение вегетационного периода 392 культур азот-
фиксирующая активность была обнаружена у 215, или у 55%
(табл. 20).
В числе организмов, проявивших нитрогеназную
активность, как и в общем количестве всех выделенных штаммов,
преобладали бактерии семейства Enterobacteriaceae. Домини-
4*
75

рующей среди азотфиксирующих культур была Erwinia herbi-
colay наличие нитрогеыазной активности у которой было
показано ранее (Papen, Werner, 1979). Помимо бактерий в составе
эпифитного микронаселения изученных растений
присутствовали в заметном количестве и дрожжи — в основном
представители родов Aureobasidium, Cryptococcus, Rhodosporidium. Эти
Таблица \9
Доля азотфиксирующих бактерий в общем числе микроорганизмов
в некоторых почвах Кавказа в течение вегетационного периода
по данным учета на безазотной среде Эшби
Почва
Горно-луговая
Горная
серая
лесная
Место сбора образцов
ризосфера
вдали от корней
ризосфера
вдали от корней
Сроки сбора
образцов
май
июль
август
май
июль
август
май
июль
август
май
июль
август
Численность

микроорганизмов, млн/г
почвы
28,1
25,5
20,7
19,3
21,5
23,4
15,2
16,8
17,1
9,9
11,2
10,5
Доля
азотфиксирующих
бактерий, %
48
67
72
23
26
35
70
65
82
21
25
20
Таблица 20
Азотфиксирующая активность эпифитных бактерий
Растения
Береза
Тимофеевка
Всего проверено
культур
182
210
Из них активных
число
118
97
%
65
46
группировки микроорганизмов нередко развивались совместно,
в смешанных культурах, которые так же, как и другие типы
смешанных культур, характеризовались повышенной азотфик-
сирующей активностью. При сбалансированном росте
'бактерий и дрожжей азотфиксирующая активность такой
ассоциации примерно в 30 раз выше, чем в чистой культуре бактерий
(Бабьева, Садыков, 1980).
В последние годы появились сообщения о 'Приуроченности
76

определенных видов азотфиксирующих микроорганизмов к
ризосфере различных травянистых растений. Такие азотфикси-
рующие системы было предложено называть «ассоциативными
симбиозами» (Hardy et al., 1973). Считается, что азотфикса-
ция в таких системах протекает -с высокой скоростью. Одна
из наиболее известных ризосферных ассоциаций между
тропическим злаком Paspalum notatum и Az. paspalii может
фиксировать в год до 90 кг N2/ra (Dobereiner, 1978). В ризосфере
маиса, сорго, риса, пшеницы и тропических пастбищных
злаков (Panicum maximum, Pennisetum purpureum, Digitaria de-
cumbens, Brachiaria muiica) широко распространены
бактерии рода Spirillum {Azospirillum) (Dobereiner et al., 1976; Ba-
landreau, Dommergues, 1977); в ризосфере сахарного
тростника — бактерии рода Beijerinckia (Ruschell et al., 1978).
Постгейт (Postgate, 1978) выявил азотфиксирующие ассоциации
Klebsiella-тюцобных организмов с зерновыми культурами, а
Ларсон и Нил (Larson, Neal, 1976) — Bacillus sp. с корнями
пшеницы.
Доберейнер (Dobereiner, 1978) считает такие «симбиозы» в
разной степени тесными и .весьма специфичными. Азотфикеи-
рующую ассоциацию Beijerinckia indica с сахарным
тростником она относит к типу экторизосферной ассоциации, где иит-
рогеназная активность выявляется главным образом в ризо-
сферной почве, а не на корнях непосредственно.
Ассоциации азоспирилл с тропическими злаками
(например, Paspalum notatum — Azotobacter paspalii) были
отнесены ею к эндоризосферным ассоциациям — наиболее
специфичным и тесным, так как микроорганизмы в данном случае
локализованы в слое муцигеля и отмывание корней водой не
ведет к потере нитрогеназной активности, тогда как
поверхностная стерилизация убивает бактерии.
Согласно Доберейнер (Dobereiner, 1978), азоспириллы
являются типичными бактериями ризосферы растений тропиков.
Однако Тилер с соавт. (Tyler et al., 1979) специально
исследовали распространение этих бактерий в ризосфере различных
растений в субтропических и тропических почвах и пришли к
выводу, что бактерии рода Azospirillum обнаруживаются не
более чем у 10% исследованных растений, причем у
тропических не чаще, чем у растений других зон.
Разрешению вопроса о специфичности и эффективности
связывания азота экто- и эндоризосферными азотфиксирующими
симбиозами способствуют результаты начатых в последнее
время многочисленных экспериментов по инокуляции чистыми
культурами диазотрофных бактерий различных небобовых
растений.
Выводы Доберейнер и других авторов о высокой
специфичности ассоциаций диазотрофных бактерий с корнями
тропических трав оспариваются или полностью отрицаются.
Разные диазотрофные бактерии способны образовывать
77

тесные ассоциации -с корнями одного и того же растения, а
наблюдающаяся иногда специфическая ассоциация некоторых
бактерий с корнями растений не является обязательным
условием проявления высокой азотфиксирующей активности. К
настоящему времени получено достаточно данных,
подтверждающих, что азотфиксирующие ассоциации диазотрофов с
«высшими растениями характеризуются малой специфичностью
в отношении и бактерий, и растений.
Неоднократно сообщалось о присутствии азотфиксирующих
«клубеньков» на корнях ряда небобовых травянистых
растений — различных видов осок, вейника, лисохвоста и др.
Причем утверждалось о специфичности выделенных из них
бактерий и о высокой азотфиксирующей активности «клубеньков»
(Родынюк, Клевенская, 1977; 1980). Однако подробное
электронно-микроскопическое исследование таких «клубеньков»
(Тикк, Сильвере, 1982) показало, что светомикроскопически
видимые в них бактериеподобные клетки являются на самом
деле автономными капельками цитоплазмы растительной
клетки, связанными с цитосегресомами. При тщательном изучении
было выяснено, что большинство корневых «клубеньков»
представляют собой разрастания клеток коровой паренхимы
корней и служат вместилищами запасных веществ. Таким
образом, обнаружение клубеньков на корнях небобовых
травянистых растений и изолирование из них каких-либо
микроорганизмов — недостаточная основа для предположения
бактериального симбиоза у этих растений. Наиболее достоверные
данные о локализации микроорганизмов и о тесноте связи их с
корневыми тканями растений могут быть получены только
методами электронно-микроскопической цитологии и
серологическими методами.
В ризосфере и филлосфере растений обычно развивается
сложная по составу, активно фиксирующая азот смешанная
популяция микроорганизмов, часто включающая и эукариотные
микроорганизмы. В этой связи можно отметить, что в послед*
нее время смешанным культурам уделяется все больше
внимания, поскольку они обладают более высокой
азотфиксирующей активностью и устойчивостью к факторам внешней среды
по сравнению с чистыми культурами бактерий-диазотрофов.
Состав и свойства азотфиксирующих сообществ
микроорганизмов изучены еще очень слабо, хотя о их широком
распространении в почве известно давно. Еще в 1931 г. В. Л. Омелянский
отмечал, что «...фиксация атмосферного азота свободноживу-
щими в почве собирателями азота происходит особенно
успешно именно в смешанных культурах, под влиянием почвенных
микробных смесей. В этих условиях химическая работа
связывания азота протекает гораздо экономнее в смысле
расходования энергетического материала, чем под -влиянием одной
чистой культуры». А. А. Имшенецкий и Л. Н. Солнцева в
1940 г. выделили и описали смешанную культуру азотобакте-
78

pa с целлюлозоразрушающими споровыми бактериями, азот-
фиксирующая активность которой была существенно выше, чем
у чистой культуры азотобактера. Окуда с сотр. (Okuda et al.,
1960) установили, что несериые пурпурные бактерии
фиксируют азот значительно активнее в присутствии других
микроорганизмов. Н. П. Львов и В. И. Любимов (1965) показали, что
активность азотфиксации у микобактерий вдвое выше в
присутствии бактерий-спутников. По данным Т. А. Калининской
(1967), азотфиксирующая активность почвенных микобактерий
выше в совместной культуре с бактериями-целлюлозоразруши-
телями. Другим важным свойством азотфиксирующих
сообществ микроорганизмов является их высокая устойчивость —
состав их не меняется даже при многолетнем культивировании
в лабораторных условиях, что (несомненно свидетельствует о
их стабильности и в природной среде. Кроме того, такие
смешанные культуры характеризуются и относительно постоянной
активностью азотфиксации, которая мало меняется при
пересевах, но резко падает при разделении культур (Кононков,
Умаров, Мирчинк, 1979). Как известно, интегральное действие
сообщества микроорганизмов может существенно отличаться
от действия даже характерных видов, и это особенно важно
при количественном сопоставлении численности
микроорганизмов с наблюдаемой в природе скоростью процесса.
Если чисто бактериальные смешанные азотфиксирующие
культуры известны уже давно и их свойства тщательно
исследуются, то азотфиксирующие ассоциации эукариотов (грибов
и дрожжей) с бактериями пока изучены плохо. У чистых
культур эукариотных микроорганизмов наличие азотфикси-
рующей активности не подтверждено, однако они нередко
присутствуют в составе азотфиксирующих смешанных культур,
выделенных из фитоплана растений или из разрушающихся
растительных остатков.
В табл. 21 представлены результаты изучения видового
состава и азотфиксирующей активности .некоторых ассоциаций,
отличавшихся устойчивостью при пересевах на питательные
среды и характеризовавшихся высокой азотфиксирующей
активностью.
Изучение таких ассоциаций (всего 234 культуры)
позволило выявить ряд характерных особенностей. Так, вне
зависимости от состава ассоциации нитрогеназная активность бактерий
в присутствии грибов была выше, чем при их разделении.
Несмотря на то что ассоциации грибов с бактериями выделялись
из дерново-подзолистых почв, в которых обильно
представлены разнообразные микромицеты, набор видов грибов, входив-*
тих в состав ассоциаций, характеризовался определенной
специфичностью. Типичными для указанных почв являются виды
грибов p. Penlcillium (Pen. claviforme, Pen, notatum и
некоторые другие), а также представители родов Martierella, Mucor,
Cladosporium. В то же время в составе азотфиксирующих ас-
79

социаций доминировали только грибы p. Trichoderma — Tr.
koningii, Tr. pseudokoningii, Tr. harsianum. Широкое
распространение, устойчивость и высокая азотфиксирующая
активность таких и подобных им ассоциаций почвенных прокариот
и эукариот позволяют предполагать, что именно они могут
наиболее эффективно осуществлять процесс фиксации
атмосферного азота в фитоплане растений. При обсуждении
возможности длительного существования ассоциаций грибов с бакте-
Таблица 21
Видовой состав и нитрогеназная активность азотфиксирующих
ассоциаций грибов с бактериями
Видовой состав ассоциаций
Tr. koningii
Tr. pseudokoningii
Pen. notatum
Arthrobacter globiformis
Вас, circulans
Tr. harsianum
Вас. poly my xa
Вас. megaterium
Phialophora atra
Arthrobacter sp.
\Bac. polymyxa
Активность нитрогеназы, 10""* мг
азота/млрд-клеток/ч
компонентов
нет
нет
нет
2,25
0,66
нет
1,76
0,56
нет
0,83
0,65
ассоциации
4,57
3,97
10,51
риями обычно указывается на то, чтф- гриб будет постепенно
вытеснять бактерии из-за конкуренции за субстрат.
Действительно, теоретический анализ показывает (Дегерменджи и др.,
1978; Печуркин, 1981), что конкуренция может приводить к
полной элиминиции всех видов, кроме доминирующего,
причем скорость процесса описывается экспоненциальным
законом. Однако наблюдавшееся нами длительное существование
азотфиксирующих ассоциаций грибов с бактериями
свидетельствует о том, что характер взаимодействия в таких
ассоциациях не исчерпывается только трофическими связями.
Совместное развитие грибов и бактерий в ассоциациях может
определяться совместным метаболизмом этих микроорганизмов, как
например в лишайниках. Особенно характерна в этом смысле
стабилизация активности и видового состава в
азотфиксирующих ассоциациях бактерий с дрожжами и грибами, в которых
лишь прокариоты проводят фиксацию атмосферного азота.
Как известно, все важнейшие природные процессы
осуществляются микробными популяциями сложного состава, причем
состав их относительно стабилен в разных условиях.
Выделенные из природных источников или созданные искусственно
смешанные культуры микроорганизмов находят все более широкое
80

применение и в микробиологической промышленности, так как
обладают не только повышенной активностью, но и высокой
устойчивостью к загрязнению «посторонними
микроорганизмами, что существенно упрощает поддержание стерильности в
ходе процесса. Однако теоретические вопросы их
существования разработаны недостаточно. Наименее изучены
механизмы, ответственные за формирование и устойчивость
микробных ассоциаций в открытых системах, к которым относятся и
азотфиксирующие смешанные культуры — обитатели фито-
плана. Помимо трофических связей стимулирующее действие
в сложных, многокомпонентных сообществах микроорганизмов
объясняют обменом витаминами, разного рода стимуляторами
•и ингибиторами и пр. Однако в целом вопрос о
взаимодействии микроорганизмов в смешанных культурах, в том числе и
в процессе азотфиксации, изучен еще мало и нужно быть
осторожным, привлекая неизвестные витамины для
объяснения экологических механизмов сосуществования
микроорганизмов.
Определенную, возможно noiKa недоучитываемую роль в
стимуляции азотфиксации у азотфиксирующих ассоциаций
могут играть газовые метаболиты. Хорошо известно ингибирую-
щее действие 02 на активность нитрогеназы и обусловленное
этим наличие разнообразных внеклеточных и внутриклеточных
механизмов защиты активного центра ее — образование
слизистой капсулы, наличие гетероцист, компартментализация и
др. Как было установлено (Кондратьева, Гоготов, 1981; Malik,
Schlegel, 1981), существенное влияние на процесс
азотфиксации оказывает молекулярный водород, а коэффициент
использования энергетического субстрата азотфиксирующими
микроорганизмами в первую очередь зависит от способности
полностью утилизировать водород, образующийся нитрогеназой,
за счет его повторного включения в энергетический обмен в
результате рециклизации или межвидового переноса.
Поскольку образование водорода свойственно нитрогеназе из самых
разных организмов, было предложено использовать
способность к водородообразованию в качестве еще одного 'критерия
азотфиксирующей способности, что позволяет утверждать о
наличии ее у большого числа водородообразующих бактерий,
у которых пока азотфиксация не выявлена (Кондратьева,
1979).
Изучение зависимости между процессами азотфиксации и
образования Н2 у чистых культур не привело пока к
однозначным выводам, но тем не менее обнаружена тесная
корреляция между этими признаками. Данных о роли
молекулярного водорода в ассоциациях микроорганизмов еще слишком
мало для каких-либо обобщений, хотя исследования в этом
направлении представляются важными не только для
понимания экологических механизмов азотфиксации, но и для целей
биотехнологии.
81

Проведенное нами определение образования Нг чистыми
культурами бактерий и грибов, изолированных из наиболее
активно фиксировавших азот ассоциаций, показало-, что он
образуется многими, но «е всеми микроорганизмами. Среди
проверенных 124 штаммов грибов способностью выделять
водород обладало лишь около 1/3 (38%) культур, относящихся
к родам Penicillium, Fusarium, Trichoderma, Phialophora.
Одновременно с этим максимальные величины водородообразо-
вания у грибов были невелики и не превышали 10 нМ Нг/про-
бирку/ч. В отличие от грибов все выделенные из ассоциаций
культуры (325 штаммов) бактерий не только фиксировали
азот, но и выделяли водород. Характерным было то, что
активность этого процесса была у них значительно (в 3—10 раз)
выше, чем у грибов. Средний уровень выделения Нг чистыми
культурами бактерий составлял 30—35 нМ Нг/пробирку/ч,
тогда как максимальные величины достигали 165 нМ Н2/пробир-
ку/ч. Проводившееся одновременно определение азотфиксирую-
щей активности этих же культур обнаружило некоторые
интересные особенности. У чистых культур грибов, входивших в
состав азотфиксирующих ассоциаций, нитрогеназной
активности выявлено не было. Однако повышенным водородообразо-
ванием характеризовались в основном те культуры грибов, ко-
Таблица 22
Видовой состав, активность азотфиксации и выделения Н2
у некоторых азотфиксирующих ассоциаций
Видовой состав ассоциаций
Активность азот-
фиксации,
нМ 1М2/пробирку/ч
[Образование водорода,
нМ Н2/пробирку/ч
Тг. koningii
F. solani
Вас. polymyxa
всей ассоциацией
Phiapophora atra
Вас. polymyxa
Arthrobacter sp.
всей ассоциацией
Tr. pseudokoningii
Pen. notatum
Arthrobacter globiformis
Вас. circulans
всей ассоциацией
нет
нет
16,8
24,3
нет
10,1
12,7
48,4
нет
нет
23,5
14,4
59,3
6,9
нет
14,8
9,4
7,
Ю,
25,
16
10,3
3,5
20,5
18,0
18,8
торые были выделены из наиболее активно фиксировавших
азот ассоциаций, что позволяет предполагать наличие
взаимообусловленного метаболизма. Сравнение активности выделения
водорода и азотфиксации у чистых культур бактерий ие
позволяет говорить о взаимосвязи между двумя этими
процессами. Штаммы с «высокой азотфиксирующей активностью могли
82

иметь высокую, низкую или среднюю активность Нг-образова-
ния. Поскольку коэффициент использования энергетического
субстрата азотфиксирующими микроорганизмами в первую
очередь зависит от способности полиостью использовать
водород, то мы пытались обнаружить межвидовой обмен
водородом у азотфиксирующих ассоциаций (табл. 22).
У всех изученных ассоциаций уровень азотфиксирующей
активности превышал нитрогеназную активность чистых
бактериальных культур. Напротив, по выделению водорода
ассоциации в целом уступали не только чистым культурам
бактерий, но и грибов. Именно эти различия позволяют
предполагать, что в ассоциациях микроорганизмов происходит более
полное использование водорода. Можно полагать также, что
взаимообусловленность процессов азотфиксации и водородооб-
разования является важным экологическим условием
существования азотфиксирующих ассоциаций в фитоплане растений.
Влияние растений на активность
диазотрофных бактерий в ризосфере
Изучение суточной и сезонной динамики
ассоциативной азотфиксации в природных условиях приводит к
выводу, что активность связывания атмосферного азота в
фитоплане в значительной степени определяется влиянием растений.
Анализ данных, имеющихся в литературе, и результаты
наших наблюдений позволяют заключить, что стимулирующее
действие растений на ассоциативную азотфиксацию в первую
очередь связано с прижизненным поступлением в 'прикорневую
зону и в филлосферу значительного количества
легкодоступного углеродеодержащего материала, которым могут быть
продукты экзоосмоса и корневой опад, т. е. в конечном счете
продукты фотосинтетической деятельности растений.
Энергетическое обеспечение ассоциативной азотфиксации —
один из наиболее важных экологических вопросов в проблеме
фиксации атмосферного азота. Количество корневых
выделений и опада растений весьма существенно и составляет в
среднем около одной трети от общего количества
ассимилированной растением углекислоты и синтезированного при этом
органического материала (см. табл. 18). Последний может
служить легкодоступным энергетическим субстратом для
почвенных микроорганизмов, в том числе диазотрофных. Неясно,
однако, в какой мере органические соединения, выделяемые
растениями через корни, могут удовлетворять энергетические
потребности ассоциированных с растением бактерий-азотфикса-
торов. Исследования в этом направлении единичны:
способность использовать корневые выделения растений в качестве
единственного источника углерода показана для азотобактера
(Vancura, Macura, 1961) и для некоторых видов клостридий
(Katznelson, 1946). Однако вклад почвенных микроорганизмов
83

в азотфиксацию далеко не исчерпывается деятельностью
только этих бактерий. По современным представлениям, роль их
«невелика по сравнению с факультативно анаэробными
бактериями (Емцев, 1982) и факультативно симбиотрофным'и азот-
фиксирующими ассоциациями (Калининская, 1982). Как уже
•отмечалось, в почве, в ризосфере и филлосфере количественно
доминируют и наиболее активны смешанные азотфиксирующие
культуры микроорганизмов.
С целью изучения возможности использования несимбиоти-
ческими диазотрофными бактериями различных "источников
углерода и для выяснения вопроса о способности их усваивать
атмосферный азот исключительно за счет потребления
органических соединений растительных экссудатов и корневого опада
была проведена серия модельных опытов со смешанными
культурами азотфиксирующих гетеротрофных микроорганизмов.
Культуры выделяли из разных почв и из ризосферы
различных растений. Среди 197 выделенных культур около 1/3
были чистыми (в основном азотобактер и азотфиксирующие
бациллы), а 2/3 представляли собой бактериальные
комплексы, состоящие из 2—3 микроорганизмов.
В составе их были представители следующих родов
бактерий: Arthrobacter, Azotobacter, Bacillus, Beijerinckia,
Clostridium, Pseudomonas и коринеподобные бактерии. Наиболее
часто встречались Вас. polymyxa, Pseudomonas denitrificans и
коринеподобные бактерии. Азотфиксирующая активность куль-
Таблица 23
Характеристика смешанных азотфиксирующих культур,
использовавшихся в модельных опытах
№
культу ры
50
78
114
Бактерии, входящие в ассоциацию
Bacillus polyтуxa
Pseudomonas longa
Bacillus circulans
Bacillus poly my xa
Bacillus cereus
Pseudomonas denitrificans
Нитрогеназная активность, 10""6 мг
Ns/4 на 1 мл среды
на глюкозе на фруктозе
470
300
427
320
260
116
тур варьировала от 0,13 мкг до 609,0 мкг Ы2/ч,/мл среды.
Для модельных опытов были выбраны смешанные культуры,
выделенные из бурой горно-лесной почвы, характеристика
которых представлена ниже (табл. 23).
Были изучены активность азотфиксации и биосинтез
внеклеточных аминокислот смешанными азотфиксирующими куль-
84

турами при росте на жидких безазотных средах с различными
органическими веществами.
В качестве источника углеродного питания в опытах
использовали соединения, доминирующие в корневом экссудате
растений, — углеводы и органические кислоты (Rovira, 1969;
табл. 24). Наивысший уровень нитрогеназной активности у
всех исследованных смешанных культур был на глюкозе и
мальтозе — на этих углеводах оеи фиксировали азот со
скоростью от 300 до 470-10~5 мг Ы2/мл среды в час. Несколько
ниже активность культур была на фруктозе — от 116 до
320 -10~5 мг Ы2/мл среды в час. При росте на сахарозе
активность у культур № 78 и № 114 тоже оставалась высокой — до
(145—168) • Ю-5 мг Ы2/мл среды в час, тогда как у культуры.
№ 50 снизилась до 3,8-10~5 мг Ы2/мл среды в час. Высокая
активность азотфиксации наблюдалась и при росте культур иа
среде с крахмалом — (156—161)-10~5 мг Ы2/мл среды в час.
На арабинозе высокой активность была только у культуры
№ 114 (145-10"5 мг М2/мл среды в час), а у культур № 50
и 78 была незначительной — (0,24—0,11) -10-5 мг N2/mji
среды в час. На ксилозе, рамнозе и манните активность всех
культур была низкой — (0,10—0,35) • 10"5 мг Ы2/мл среды
в час.
При росте «а средах с органическими кислотами нитроге-
назная активность была относительно иизкой у .всех
изученных культур. При- этом максимальные значения активности
отмечены на яблочной кислоте у культур № 78 и № 114 —
(0,14—0,17) • Ю-5 мг К2/мл среды в час) и на фумаровой
кислоте у культуры № 50 (0,13-10~5 мг Ы2/мл среды в час).
Самый низкий уровень активности культуры имели при росте на
винной и яитарной кислотах (0,03—0,10) -10~5 мг Ы2/мл среды
в час.
На средах с молочной, пировиноградной, лимонной и
салициловой кислотами культуры вообще не росли.
Таким образом, по уровню нитрогеназной активности при
росте азотфиксирующих микроорганизмов на различных
источниках углерода последние можно расположить в следующий
ряд: глюкоза, мальтоза, фруктоза, сахароза, крахмал, араби-
ноза, ксилоза, рамлоза, маннит, органические кислоты —
яблочная, фумаровая, винная, янтарная. Этот ряд совладает с
данными, полученными при изучении состава полисахаридов
корневых выделений и корневого опада (Vancura, Prikryl,
1980; Берестецкий, 1982), что позволяет сделать вывод об
определенной адаптации ризооферных микроорганизмов к этим
углеродсодержащим соединениям и дает основание еще раз
подчеркнуть их ведущее значение в энергетическом
обеспечении ассоциативной азотфиксации.
Изучение внеклеточных аминокислот — первых устойчивых
продуктов азотфиксации — у смешанных культур диазотроф-
ных бактерий показало, что относительно высокое суммарное
^85

содержание их в культуралыной жидкости сопряжено с
наибольшей активностью азотфиксации (см. табл. 24).
Максимальное количество всех внеклеточных аминокислот
продуцировала культура № 114 при росте на глюкозе и
фруктозе — 0,45 и 0,41 мкМ/мл среды. На сахарозе, арабинозе и
крахмале свободных аминокислот этой культуры
накапливалось меньше — 0,36, 0,27 и 0,29 мкМ/мл среды. Относительно
высокое содержание аминокислот выявлено в культуральной
Таблица 24
Активность азотфиксации и биосинтез внеклеточных аминокислот
у смешанных культур диазотрофных бактерий на различных
источниках углерода
Источник углерода
Углеводы
глюкоза
мальтоза
фруктоза
сахароза
арабиноза
ксилоза
рамноза
маынит
крахмал
(раств.)
Органические
I4.HL../1U1 Ы
яблочная
янтарная
винная
фумаровая
молочная
пкровино-
градная
лимонная
салициловая
1 Культура № 50
активность

азотфиксации,
• 10"*° мг
М2/мл
среды/ч
427
не опр.
116
3,2
0,24
0,17
0,15
0,35
161
0,06
0
0,05
0,13
0
0
0
0

содержание виекле-
1 точных
1
аминокислот,
мкМ/мл
среды
0,30
не опр.
0,24
ел.
ел.
ел.
ел.
ел.
0,17
ел.
0
0
ел.
о
0
0
0 1
1 Культура № 78
активность

азотфиксации,
•1(Г& мг
N^/мл
среды/ч
300
310
260
168
0,И
0,26
0,10
не опр.
*
0,14
0,09
0,05
ел.
о
0
0
0 J

содержание
внеклеточных

аминокислот,
мкМ/мл
' среды
0,28
0,35
0,28
0,21
ел.
ел.
ел.
не опр.
»
ел.
0
о
о
о
0
0
0
f Культура № 114
активность

азотфиксации,
«л—5
♦ 10 ° мг
Ы8/МЛ
среды/ч
470
не опр.
320
145
145
0,10 I
0,10
ел.
156
0,17
0,03
0,10
0,12
о
0
о
0
|
содержанке
внеклеточных

аминокислот,
мкМ/мл •
среды
0,45
не опт).
0,41
0,36
0,27
ел.
ел.
0
0,2£
ел.
0
ел.
ел.
0
0
0
0
жидкости при росте культуры № 78 .на средах с глюкозой,,
мальтозой, фруктозой и сахарозой (0,21—0,35 мкМ/мл среды).
Культура № 50 выделяла аминокислот в среду с глюкозой
до 0,30 мкМ/мл среды, с фруктозой — 0,24 и с крахмалом —
0,17 мкМ/мл среды.
При росте культур микроорганизмов на других источниках
углерода и при низкой активности азотфиксации суммарное
накопление внеклеточных аминокислот в культуральной
жидкости было очень незначительным (следы).
Анализ, проведенный на автоматическом анализаторе ами.~
86

нокиелот KLA-5, показал, что среди свободных -внеклеточных
аминокислот присутствуют аспарагиновая и глутаминовая
кислоты, треонин, серии, глицин, аланин, валин, метионин, изо-
лейцин, лейцин. Среди них преобладали аспарагиновая и глу-
таминовая кислоты и аланин.
Полученные результаты позволяют заключить, что
углеводы являются наиболее благоприятным энергетическим
субстратом для осуществления процесса азотфиксации евободножи-
вущими гетеротрофными бактериями.
Высокая активность азотфиксации у смешанных культур
сопровождалась накоплением в среде значительного
количества свободных внеклеточных аминокислот. Хотя полученные
сведения далеко не полны, тем не менее они позволяют с
определенной вероятностью утверждать, что именно аминокислоты,
являющиеся первыми устойчивыми продуктами
микробиологической фиксации азота, выделяются в окружающую среду и
могут потребляться растениями непосредственно или после
♦аммонификации другими почвенными 'микроорганизмами.
С целью выяснения вопроса о способности смешанных азот-
фиксирующих культур гетеротрофных микроорганизмов
фиксировать азот исключительно за счет корневого экссудата и
корневого опада растений была изучена активность
азотфиксации в ризосфере «гнотобиотичеоких» растений при инокуляции
их различными культурами азотфиксирующих
микроорганизмов.
В опытах использовали стерильные проростки полевицы
белой и риса, которые культивировали на безазотной и
безуглеродной питательной среде. Десятисуточные растения иноку-
лировали активными азотфиксирующими смешанными
культурами. Контролем служили стерильные растения и инокулиро-
ванная питательная среда без растений.
Регулярно, начиная оо вторых суток после инокуляции
растений, в течение 6 недель проводили измерения нитрогеназ-
ной активности. Одновременно отмечали характер роста
растений, их внешний вид. В течение первой недели очень
низкая активность —0,1—0,2 мкг Ы2/сосуд/ч — была отмечена в
сосудах с инокулированными растениями и в контроле без
растений (рис. 22, 23). Ааотфиксация в этот период
осуществлялась, по-видимому, за счет того небольшого количества
соединений углерода, который был внесен вместе с посевным
материалом. В контроле со стерильными растениями нитроге-
назная активность отсутствовала на протяжении всего
эксперимента.
В течение второй недели в контрольных сосудах без
растений иитрогеназная активность постепенно снизилась до нуля,
тогда (Как в сосудах с инокулированными растениями она
возрастала по мере развития растений. Увеличение азотфикси-
рующей активности наблюдалось при инокуляции каждой из
.азотфиксирующих культур. К концу 6-й недели в варианте с
87

полевицей и культурой № 50 активность азотфиксации
достигла уровня 0,6 мкг ^/сосуд/ч, с культурой № 114 — 1,4 и ,в
варианте с культурой № 78 — 2,5 мкг Ы2/сосуд/ч.
Характерно, что стерильные и инокулироваиные растения
полевицы и риса развивались неодинаково. За <все время
наблюдения инокулированные растения имели более здоровый
вид. Признаки угнетения (пожелтение, скручивание листьев и
т. п.) начали появляться у них лишь к концу 5-й недели, что
и послужило причиной пре-
АА,мкгН /ч
25 34 42 сут.
Рис. 22. Активность азотфиксации
(АА) в системе «полевица —
смешанная культура азотфиксирующих
бактерий» (1) ив смешанной
культуре без растений (2):
а — смешанная культура № 50, б —
№78, в — № 114
кращения наблюдений.
Стерильные растения
развивались значительно хуже, и
признаки сильного угнетения
появились у них уже на 15—
20-е сут, после чего они
погибли.
В этих опытах
единственным источником углерода для
" нми2[ч
Рис. 23. Активность азотфиксации в
системах:
1 — «рис — смешанная культура
азотфиксирующих бактерий», 2 —
«рис — чистая культура», 3 —
смешанная культура без растений
диазотрофных бактерий, кроме углекислоты воздуха, были:
корневые выделения и корневой опад растений. Поэтому
объяснить возрастание нитрогеназиой активности в системе
«растение — азотфиксирующие гетеротрофные микроорганизмы»
можно лишь увеличением поступления углеродсодержащего
материала в виде продуктов экзоосмоса и корневого опада по
мере развития растений.
Результаты этих наблюдений позволяют заключить, что
88

диазотрофные бактерии способны эффективно использовать
органические соединения корневых выделений и корневого опада
в качестве единственного источника углерода. Этот
энергетический субстрат может поддерживать ассоциативную азотфик-
сацию на достаточно высоком уровне и, по-видимому, в фито-
плане растений играет определяющую роль.
Одной из причин сильного угнетения и быстрой гибели
стерильных растений по сравнению с инокулированными
могло быть ингибирующее действие «а растения
накапливающихся в среде токсических веществ корневых выделений. Но более
вероятно, что гибель этих растений вызвана тем, что они не
имели доступного источника азота.
Для инокулированных растений таким источником могла
служить как микробная плазма (Ambrozova, 1979), так и иро-
дукты метаболизма диазотрофных бактерий, например в виде
аминокислот. Известно (Jones et al., 1974), что растения
способны использовать в качестве единственного источника
азота такие аминокислоты, как аепарагиновая, глутаминовая,
аргинин, глицин, хотя чаще всего аминокислоты служат
растениям в качестве дополнительного источника азота.
Показано (Jones et al., 1974; Jones, 1978), что продукты азотфик-
сации могут использоваться высшими растениями как в виде
внутриклеточных азотсодержащих компонентов
микроорганизмов (после гибели клеток), так и в виде внеклеточных
соединений. Известно также (Ruschell et al., 1978), что основная
масса меченого (15N) азота, фиксированного гетеротрофными
азотфиксирующими бактериями, довольно быстро, через 2—
4 ч, обнаруживается в листьях и тканях /растений. По данным
О'Хара и Шанмугама (O'Gara, Schanmugam, 1976; 1977),
клубеньковые бактерии при развитии вне клубенька могут экс-
кретировать до 65—80% фиксированного ими азота в
окружающую среду. Ластиг с сотр. (Lustig et al., 1980)
культивировали ризобии коровьего горошка вместе с каллусной тканью
портулака в квазисимбиотических условиях — в 'пробирке,
разделенной мембраной с порами 150—200 нм, когда прямой
контакт клубеньковых бактерий и растения отсутствовал.
Установлено, что высокая нитрогеназная активность,
определенная как ацетиленовым, так и изотопным методами,
наблюдалась лишь при освещении такой системы и только в
присутствии обоих компонентов системы — бактерий и растения.
Одновременно с этим каллусная ткань обогащалась азотом,
единственным источником которого могли быть продукты азотфик-
сации, поступившие через мембрану; до 80% фиксированного
азота экскретировалось в среду и было поглощено растением.
По данным Юан-шенга с сотр. (Yuan-sheng et al., 1981),
изучавшими азотфиксацию смешанной культурой Enterobacter
cloacea — Alcaligenes faecalis в ризосфере и филлосфере
риса, около 35% фиксированного этими бактериями азота
поступает в растение.
89

Методом изотопного разбавления (15N + 14N) установлено
поступление фиксированного ризосферными бактериями-диазо-
трофами атмосферного азота в различные небобовые растения:
сорго, рис, кукурузу, просо, причем доля его составляла от
13 до 25% (Oilier et al., 1984).
Нами для определения размеров поступления в растения
атмосферного азота был использован метод изотопной (15N)
индикации (Шабаев, Умаров, Смолин, 1985). При этом
растения выращивали нестерильно на отмытом кварцевом песке с
внесением питательных смесей, содержащих азот в виде
меченых изотопом 15N минеральных солей, а в конце опыта
подводили баланс 14N путем учета его в растениях (листья,
стебель, корни) и в семенах. Дополнительное количество
немеченого азота (l4N) в растения могло поступать только за счет
ассоциативной азотфиксации (табл. 25).
Таблица 25
Содержание азота атмосферы в некоторых растениях
Культура
Овес
Райграс
Вариант
контроль
без 15N
0,5 дозы 15N
полная доза 15N
контроль
без 15N
0,5 дозы 15N
полная доза 15N
в конце опыта
м г/сосуд
5,4
11,3
9,0
1,0
13,0
10,5
4N в растениях
4% от общего
выноса
0*N-h"N)
63,0
12,2
5,8
60,0
13,9
6,8
% от фиксиро*
ванного 14N,
35,1
57,1
49,6
8,7
57,0
59,1
Поступление атмосферного азота в растения зависело от
исходной дозы азота (15N) в питательной смеси и достигало в
максимуме 23% от общего его выноса в указанных условиях,
или около 60% от суммарной продуктивности ассоциативной
азотфиксации, измеренной ацетиленовым методом.
Исследования, направленные на определение размеров
усвоения небобовыми растениями азота атмосферы,
представляются весьма важными для решения принципиально важного
вопроса об участии ассоциативной азотфиксации в азотном
питании растений и азотном балансе почв. Несмотря на
немногочисленность таких сведений, они позволяют тем не
менее сделать вывод о существенной роли этого процесса как в
естественных, так и в агроэкосистемах.
Таким образом, представление об ассоциированности и
тесном сопряжении двух важнейших общепланетарных
процессов — фотосинтеза и азотфиксации, известное ранее для
системы «бобовые растения—клубеньковые бактерии», может
быть распространено ныне на значительно более широкий круг
небобовых растений и гетеротрофных несимбиотических азот-
90

фиксаторов. Как известно, растения создают и формируют
вокруг себя микробные сообщества, оказывая мощное влияние
на их активность через продукты своего экзоосмоса и
корневого О'Пада. При этом наиболее важно, что такое влияние на
активность ассоциированных с ним .азотфиксирующих
бактерий оказывается растениями прижизненно, в фазы активного
роста и развития, когда даже относительно небольшое
количество азотсодержащих соединений из диазотрофных бактерий
может играть важную роль в азотном питании растений,
поскольку скорость поступления их в ткани растения находится
в соответствии с образованием в них реакционно-способных
углеродных скелетов. Чем более развитым фотосинтетическим
аппаратом обладает растение и, следовательно, чем больше
энергии Солнца оно транспортирует в ризосферу и филлосфе-
ру, тем выше у него «возможности» для активизации
ассоциативной азотфиксации. Именно в этом, по нашему .мнению, и
заключается важнейший экологический смысл большой
масштабности экзоосмоса и корневого опада. Прижизненный
массированный выброс органических углеродсодержащих
соединений «позволяет» растению сдвигать экологическое равновесие
в фитоплане в сторону, более благоприятную для его
жизнедеятельности, и, в частности, улучшать условия азотного
питания путем активизации азотфиксации. Приток азота в
растение при этом находится в соответствии с интенсивностью
образования в нем реакционно способного углеродистого
материала — фотосинтатов, что является одним из главных
условий нормального, сбалансированного роста. Таким образом, фи-
топлан является зоной тесного взаимодействия растений и не-
симбиотических азотфиксирующих микроорганизмов. Вероятная
схема этого взаимодействия представлена на рис. 24.
Фиксированный бактериями за счет энергии фотосинтатов
молекулярный азот может использоваться растением в виде
внеклеточных азотсодержащих метаболитов, главным образом
аминокислот, прижизненно выделяемых диазотрофами в
окружающую среду, и в виде белков и нуклеиновых кислот,
поступающих в почву после отмирания клеток. Явление
прижизненной экскреции различных белков и аминокислот широко
распространено среди почвенных микроорганизмов (Асеева,,
Умаров, 1979). Характерно также, что микроорганизмы —
активные продуценты аминокислот — значительно чаще
обнаруживаются в ризосфере, нежели в неризосферной почве (Кра-
сильников и др., 1961). Азотфиксирующие бактерии не
являются исключением в этом отношении и экскретируют большую
часть фиксированного ими азота в среду. Постмортальное
поступление азотсодержащих соединений в почву также приводит
к обогащению ризосферы свободными аминокислотами и
аммонием в результате частичной или полной аммонификации
белков и других компонентов клеток диазотрофов. Некоторые
факты позволяют заключить, что этот путь при ассоциатив-
91

ной азотфиксации имеет подчиненное значение по сравнению
с прижизненной экскрецией их. Помимо уже отмечавшихся
наблюдений за азотфиксирующими цианобактериями в составе
лишайников об этом свидетельствуют данные сканирующей
электронной микроскопии ризопланы и результаты
многократных в течение вегетационного периода учетов 'численности
микроорганизмов в ризосфере (Newman, 1978; Берестецкий, 1982).
СО , свет
Белки
КОРНЕВЫЕ ВЫДЕЛЕНИЯ
(полисахаридная
слизь-муцигель)
АЗОТ ПОДВИЖНЫЙ
(аминокислоты,
NH4 и др.)
РИЗОПЛАНА
Рис. 24. Схема взаимодействия гетеротрофных азотфиксирующих бактеръ
и высших растений при ассоциативной азотфиксации
Общими свойствами ризосферы различных растений были
относительно постоянная плотность микробной популяции и
отсутствие резких скачков в количестве населяющих ее бактерий.
Указанные причины позволяют рассматривать фитоплаи в
виде своеобразного природного проточного культиватора
микроорганизмов, в том числе (и азотфиксирующих. Известно, что
именно в условиях проточного культивирования наблюдается
наиболее высокая активность естественных смешанных культур
микроорганизмов, характерная, например, для ассоциативных
целлюлозоразрушающих -бактерий рубца жвачных животных,
для микроорганизмов полости рта, для проточных аэротеншв,
очистных сооружений и др. Азотфиксирующая активность мик-
роорганизмов-диазотрофов в условиях проточного
культивирования может быть высокой даже при небольшой численности.
Их вклад в азотный баланс растений связан при этом не с
общей их биомассой в фитоплане, а с активным
физиологическим состоянием.
92

ГЛАВА 4
ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
НА АКТИВНОСТЬ АССОЦИАТИВНОЙ
АЗОТФИКСАЦИИ
При изучении динамики полевой активности азот-
фиксации было установлено, что в ризосфере и филлосфере
значительное влияние на ее уровень оказывают растения.
Среди других экологических факторов, определяющих уровень
ассоциативной азотфиксации, существенное значение могут
иметь влажность и температура почвы, концентрация
углекислоты, азотные и фосфорные удобрения и др.
Зависимость ассоциативной азотфиксации
от влажности почвы
В природных условиях детальное изучение
зависимости активности ассоциативной азотфиксации от влажности
лочвы не представляется возможным из-за одновременного
действия сложного комплекса различных факторов, влияющих
в той или иной степени на скорость процесса. Выяснение этой
зависимости было проведено в модельных опытах в
лабораторных условиях.
Изучали изменение уровня потенциальной активности
азотфиксации дерново-подзолистой тяжелосуглинистой почвы в
условиях, когда единственным фактором, лимитирующим азот-
фиксацию, было содержание в почве влаги.
Как известно, влажность почвы, выражающая содержание
воды в процентах от массы сухой почвы, лишь косвенно
характеризует физиологическую доступность ее для живых
организмов. Так, при одной и той же влажности (например, 5%)
вода, содержащаяся в песчаных почвах, легко доступна
растениям и микроорганизмам, а в глинистых почвах —
совершенно недоступна, что обусловлено различной величиной и
качеством поверхности почвенных частиц. Более универсальными,
прямо определяющими физиологическую доступность влаги,
являются термодинамические характеристики: активность,
потенциал или давление влаги (Судницын, 1979). Эти
параметры выражают степень взаимодействия ©оды и твердой фазы
почвы, т. е. «связанность» почвенной влаги.
Существует четкая зависимость между некоторыми
показателями жизнедеятельности микроорганизмов (прорастанием
спор и ростом мицелия грибов, интенсивностью дыхания
бактерий и актиномицетов) и активностью (давлением) воды в
окружающей среде (Звягинцев с соавт., 1974; Мирчинк с со-
авт., 1978). Однако влияние давления влаги на активность
азотфиксации до сих пор никак не исследовалось.
93

Активность воды, эквивалентная относительной упругое™
водяного пара, находящегося в динамическом равновесии с
водой (Pi/P0), в свою очередь соотносится с давлением
почвенной влаги (Р):
/>=_J?Lin(/yp0),
где R — универсальная газовая постоянная, Т — абсолютная
температура, Vm — молярный объем воды.
Давление влаги в соответствии с международной системой
единиц выражается в мегапаскалях (МПа) и для связанной
воды имеет отрицательный знак. Давление свободной воды
равно нулю, а при увеличении ее связанности с почвой или
тканями организмов уменьшается.
Пределом физиологической доступности воды для
большинства мезофитных растений принимается величина —5,6 МПа
(соответствующая максимальной гигроскопической влажности
почв), а точкой резкого снижения доступности воды —1,5 МП^
(Судницын, 1979).
Ig/M, wN2/*r почвы/Ч
0,5 -0,3-0,2 ЦР, МПа
Рис. 25. Зависимость полного давле- Рис. 26. Зависимость потенциальной
ния влаги (Р) от влажности (W) активности азотфиксации (АА) от
дериово-подзолистой тяжелосуглини- давления влаги (Р) в дерново-подзо-
стой почвы (Судницын, 1979) листой тяжелосуглинистой почве
Учитывая это, для получения более универсальной
зависимости активности азотфиксации от степени увлажненности
почвы, действительной для широкого спектра почв, мы
использовали не только показатель влажности почвы (W), но и
термодинамическую характеристику — давление почвенной
влаги (Р).
94

Зависимость полного давления почвенной влаги от
влажности, определенная при помощи психрометра конструкции
И. И. Судницына (1979), для дерново-подзолистой
тяжелосуглинистой почвы представлена на рис. 25. При W,
соответствующей полевой влагоемкости (30%), Р = — 0,56 МПа, при W=
= 20% Р = — 1,3 МПа, при влажности завядания растений
(13%) Р = — 2,4 МПа.
В модельных опытах влажность почвы изменяли в
пределах от 8 до 51% (давление влаги от —3,65 до —0,09 МПа).
Данные, полученные в опытах, показали четко выраженное
стимулирующее влияние высокого содержания влаги в почве
на уровень азотфиксирующей активности (АА). В целом
зависимость АА от Р представляет собой S-образную кривую
(рис. 26). При увеличении влажности от 8 до 19% (Р от
—3,65 до —1,41 МПа) активность азотфиксации изменяется
незначительно — от 0,72 до 0,90 мг Ыг/кг почвы/ч. При
дальнейшем увеличении содержания влаги в почве активность
резко возрастает: в интервале W 20—40% (Р = —1,3—0,24 МПа)
АА увеличивается примерно в 50 раз от 1,0 до 49,1 мг N2/kt
почвы/ч. Затем рост активности замедляется.
Закономерности, установленные при изучении
потенциальной активности азотфиксации в почве с различным уровнем
влажности, были подтверждены и в вегетационных опытах с
растениями овсяницы и тимофеевки. При проведении этих
экспериментов температура почвы и освещенность растений были
постоянны, продолжительность каждой серии опытов невелика
(не более недели), а во всех вариантах использовали хорошо
развитые, активно вегетирующие растения. Поэтому изменения
уровня активности азотфиксации определялись главным
образом содержанием влаги в -почве (рис. 27).
Зависимость активности азотфиксации от полного
давления почвенной влаги в условиях вегетационного опыта
оказалась аналогичной зависимости, полученной в модельных
опытах. Максимум активности соответствовал давлению влаги
—0,25 МПа, а начало ее резкого подъема — —1,4 МПа.
Интересно отметить, что последняя величина близка к значению
Р, при котором начинает повышаться и транспирация у
растений. Не исключено, что эта величина отражает достаточно
общие свойства живых организмов — как растений, так и
почвенных микроорганизмов — по отношению к воде,
находящейся в окружающей среде.
Для выяснения степени влияния .влажности почвы на азот-
фиксацию в полевых условиях значения актуальной активности
азотфиксации ((определенные двумя способами)
сопоставляли со значениями влажности почвы в момент измерения нитро-
геназной активности. Хотя в природных (полевых) условиях
на действие фактора влажности накладывается действие
сложного комплекса других факторов, определяющих уровень
азотфиксации в почве (влияние растений, погодные условия, ос-
95

вещенность, содержание соединений азота в почве и проч.), тем:
не менее даже на этом динамичном в течение вегетационного
периода фоне прослеживается стимулирующее влияние
высокой увлажненности почвы на ее азотфиксирующую активность
(рис. 28). При относительно широком разбросе точек тем не
менее и для ризосферы (рис. 28,1), и для почвы без растений
lq АА, мгЫ2/кгпочбы/ч
7
0,4
О?
0.2
Ъ$ААгмгЫ21м21ч>
0,1
0,05
~\Ю
-1 '0,5 -0,5 -0,2 \qPMfla
Рис. 27. Зависимость активности Рис. 28. Зависимость актуальной (по-
азотфиксации (АА) от давления поч- левой) активности азотфиксации
венной влаги (Р) в вегетационных (АА) в дерново-подзолистой тяжело-
опытах с растениями овсяницы (.) суглинистой почве под луговыми зла-
и тимофеевки (,) ками (1) и на пару (2) от давления
почвенной влаги (Р)
(рис. 28,2) прослеживается четко выраженная тенденция: при
повышении содержания влаги в почве возрастает ее азотфик-
сирующая активность.
Таким образом, результаты лабораторных, вегетационных
и полевых опытов свидетельствуют о высокой степени влияния
влажности почвы «а ее азотфиксирующую активность. При
влажности почвы ниже 20% (Р = —1,5 МПа) азотфиксация
остается на относительно низком уровне, .незначительно
изменяясь в диапазоне влажности от 8 до 20% (Р от —3,5 до
—1,5 МПа). При увеличении влажности выше этого уровня
активность азотфиксации начинает быстро расти, достигая
максимума при влажности почвы около 40% (Р = —0,25 МПа).
Полученные результаты могут иметь большое значение для
96

сельскохозяйственной практики, так как поддерживая
увлажненность почвы на уровне, оптимальном для азотфиксации,
можно повысить обеспеченность культур «биологическим»
азотом.
Зависимость ассоциативной азотфиксации
от температуры почвы и воздуха
При сопоставлении значений ассоциативной азот-
фиксации с изменениями температуры почвы в верхних
горизонтах (0—10 см) в течение вегетационного периода
корреляции между этими величинами не установлено (табл. 26).
Это можно объяснить тем, что, во-первых, летом
температура верхних горизонтов почвы колеблется не столь
значительно, как влажность. По многолетним данным
метеорологической станции МГУ средняя температура за три летних
месяца колебалась в пределах от 12 до 19°. Во-вторых,
лимитирующим фактором для азотфиксации температура почвы стано-
Таблица 26
Коэффициенты корреляции между активностью азотфиксации
и температурой почвы
Почва
Угодья
Коэффициент
корреляции (г)
Дерново-подзолистая
тяжелосуглинистая
Дерново-подзолистая
супесчаная
тимофеевка
овсяница
ячмень
картофель
—0,039
+ 0,019
—0,338
—0,181
витея лишь при относительно низких значениях — ниже 7°
(Чундерова с соавт., 1974), летом же температура почвы в
верхних горизонтах в средней полосе редко отпускается
ниже 10°.
Азотфиксация в филлосфере более зависима от изменений
температуры воздуха. Так, по результатам полевых
наблюдений температура начинает тормозить азотфиксацию при
значениях ниже 20°, тогда как при более высокой температуре
воздуха она практически не изменяется. Полное прекращение
азотфиксации в филлосфере происходит при 2—3°.
Характерно, что и фотосинтез в зоне умеренного климата
в теплое время года мало зависит от температуры; >в полевых
условиях продуктивность фотосинтеза почти не изменяется в
(пределах между 16 и 29° (Либберт, 1976).
Таким образом, в природных условиях в течение
вегетационного периода динамика азотфиксирующей активности почвы
определяется помимо влияния растений в значительной
степени влажностью почвы. В отсутствие растений зависимость
уровня азотфиксации от влажности становится наиболее тес-
97

ной. Температурный фактор не играет в течение летнего
периода заметной роли для ассоциативной азотфиксации. Высокая
влажность почвы благоприятствует азотфиксации вследствие
понижения парциального давления кислорода при насыщении
почвенных пор водой. Причем наиболее благоприятными для
азотфиксации являются микроаэробные, а не полностью
анаэробные условия (Калининская с соа.вт., 1977).
Предполагается также, что повышение активности азотфиксации в этих
условиях связано с усилением деятельности факультативно-
анаэробных бактерий-диазотрофов, многочисленных в почве
(Mishustin, Emtsev, 1982).
С другой стороны, насыщение почвы влагой может влиять
на микробиологическую активность не только из-за снижения
парциального давления кислорода. Как известно, вода
является важнейшим регуляторным фактором в различных
биологических процессах, в частности в процессах ферментативного
катализа. Она в значительной степени определяет, например,
подвижность активных центров ферментов, вследствие чего
каталитическая активность многих из них проявляется лишь при
содержании воды выше определенного критического уровня
(Аксенов, 1979). Вероятно, при иссушении почвы наряду с
торможением развития и размножения бактерий происходит
снижение активности нитрогеназного ферментативного
комплекса диазотрофов, что вызывает в итоге падение азотфикеи-
рующей активности почвы при уменьшении ее влажности.
Влияние концентрации углекислоты в атмосфере
на ассоциативную азотфиксацию
Зависимость ассоциативной азотфиксации от
интенсивности фотосинтетической деятельности растений
позволяет прогнозировать, что любые факторы, ограничивающие
фотосинтез, будут в той или иной степени проявляться и на
активности азотфиксации. Помимо уже рассмотренных
факторов — влажности почвы и воздуха, освещенности,
температуры почвы и воздуха — существенное влияние на
ассоциативную азотфиксацию может оказывать концентрация СОг в
атмосфере. Известно, что среднее содержание углекислоты в
земной атмосфере в 0,03% является субоптимальным для
растений, и при повышении концентрации С02 до 0,1—0,2% в
условиях отсутствия лимитирования другими факторами
фотосинтез усиливается. Именно этим обусловлена обязательная
углекислотная подкормка растений, выращиваемых в закрытом
грунте, заметно повышающая урожай. В целом продуктивность
фитоценозов и в особенности агрофитоценозов не в последнюю
очередь определяется содержанием ССЬ в воздухе (Ковдаг
1981). Считается, что нехватка углекислоты для нормального
протекания фотосинтеза — одна из причин снижения
продуктивности агроэкосистем при длительном одностороннем приме-
98

нении минеральных удобрений. В период интенсивного
развития культурные растения синтезируют около 360—380 кг/га
сухой массы за сутки, затрачивая до 720 кг СОг (Шатилов,
1981). В то же время в слое воздуха над гектарным участком
содержится только около 5 кг С02; необходим постоянный
приток углекислоты для поддержания высокой продуктивности
фотосинтеза. По данным В. А. Ковды (1981), продуктивность
фотосинтеза возрастает примерно в 1,5 раза при удвоении
концентрации углекислоты в атмосфере. Как уже отмечалось,
пока мало данных о влиянии различных газов на продуктивность
процессов, осуществляемых микроорганизмами в природе;
почти нет сведений и о действии повышенной концентрации
углекислоты в атмосфере на азотфиксирующую деятельность
микроорганизмов. В 1974 г. на I Международном симпозиуме
по азотфиксации (США) Хавелка и Ха<рди (Havelka, Hardy,
1976) сообщили о четко выраженном стимулирующем влиянии
повышенного содержания углекислоты в воздухе на активность
симбиотической азотфиксации и на увеличение урожайности
бобовых растений.
Нами изучалась активность ассоциативной азотфиксации
в фитоплане растений риса и полевицы в «гнотобиотических
системах» до и после введения дозированного количества
углекислоты в газовую фазу инкубационной камеры. Введение
дополнительного количества углекислоты примерно через 1,5—
2 ч вызывало возрастание азотфиксирующей активности в
системе, причем вне зависимости от того, какая азотфиксирую-
щая ассоциация микроорганизмов использовалась для
инокуляции растений. По результатам этих опытов была проведена
оценка количества углерода, использованного этими
ассоциациями на фиксацию азота в указанной системе, т. е.
определение величины энергообмена между растениями и
микроорганизмами.
Исходя из общепринятых коэффициентов • перехода от
массы потребляемого микроорганизмами энергетического
субстрата к массе связываемого ими в процессе азотфиксации
молекулярного азота (Мишустин, Шильникова, 1968), можно
рассчитать, что в условиях гнотобиотических систем от 25 до
35% углерода ассимилированной растениями углекислоты
использовалось для ассоциативной азотфиксации. Таким
образом, оптимизация содержания С02 в атмосфере может
служить одним из способов повышения не только
продуктивности фотосинтеза, но и масштабов ассоциативной азотфиксации.
Активное регулирование концентрации углекислоты в
приземном слое атмосферы путем внесения навоза, компостов,
запашки соломы и других растительных остатков может
способствовать повышению доли «биологического» азота в урожае.
Именно в повышении продуктивности фитоценозов за счет
усиления поступления СС>2 из почвы — одна из главных
функций органических удобрений, поскольку, как отмечалось, роль
99

их как источников минерального питания и, в частности,
азотного питания для растений невелика.
Влияние инокуляции растений
различными микроорганизмами
на ассоциативную азотфиксацию
Давно, еще до обнаружения явления активизации:
азотфиксации в фитоплане, возникла мысль повышать
активность несимбиотической азотфиксации путем инокуляции
(бактеризации) растений активными культурами различных бак-
терий-диазотрофов. В частности, широкие испытания были
проведены с азотобактерином — микробным почвоудобрительным
препаратом на основе культуры Az. chroococcum,
применявшимся с целью повышения доли «биологического» азота в
урожае небобовых растений. Внесение азотобактерина не дает
положительного эффекта с точки зрения обогащения почвы и
растений дополнительным количеством азота; даже при
активном размножении азотобактера в почве его благоприятное
действие на развитие растений было связано с продуцированием
им различных биологически активных соединений (Мишустин*
1979). В настоящее время предприятия микробиологической
промышленности продолжают выпуск этого препарата, но
лишь как средства для уменьшения пораженное™ растений
болезнями. Предпосевная обработка семян огурцов, томатов и
картофеля азотобактерином увеличивает всхожесть семян,
ускоряет плодоношение и снижает пораженность их
бактериозом. В то же время повышения содержания азота в растениях
или в почве после инокуляции не происходит (Новогрудская
и др., 1981).
Однако в последние годы, после открытия явления
ассоциативного связывания азота в фитоплане, вновь появились
многочисленные предложения проводить инокуляцию растений
активными штаммами азотфиксирующих бактерий. Накоплен
обширный экспериментальный материал, характеризующийся
большой противоречивостью. По данным Доберейнер (Doberei-
ner, 1978), инокуляция корней кукурузы и пшеницы в
вегетационных опытах штаммами Spirillum lipoferum приводила к
достоверному увеличению урожайности и повышала
содержание азота в листьях и стеблях растений. Инокуляция
ризосферы бермудской травы (Cynodon dactylon) культурами Azospi-
rullum brasilense и Azotobacier paspalii при внесении низких
доз минеральных азотных удобрений способствовала усилению
роста надземной части травы на 17%, а содержание общего
азота при этом повышалось на 21% (Baltensperger et al.,
1978). Согласно Смиту с соавт. (Smith et al., 1976),
инокуляция 40 видов тропических трав культурой Sp. lipoferum
вызывает значительное увеличение их сухого веса и повышение
содержания общего азота. Например, для проса такая прибав-
100

ка составила 61—80% по сравнению с контрольными, неино-
кулированными растениями. О высокой эффективности:
бактеризации кукурузы смешанной популяцией Az. chroococ-
cum + Sp. lipoferum сообщили Хегази с соавт. (Hegazi et al.,
1979). По их определениям, количество фиксированного в
ризосфере инокулированных растений азота удваивалось. По
данным канадских исследователей (Shearman et al., 1979),
инокуляция корней проростков мятлика чистыми культурами
Klebsiella pneumoniae, Erwinia herbicola, Enterobacter cloacea
приводила к увеличению азотфиксирующей активности в
ризосфере и к накоплению повышенного количества азота в надземных
частях растений. О высокой эффективности бактеризации фил-
лосферы ряда бобовых растений — сои, нута, чечевицы —
суспензией клубеньковых бактерий сообщили Найди с соавт.
(Nandi et al., 1982). Согласно приводимым ими данным
полевых опытов, азотфиксирующая активность в филлосфере
инокулированных растений возросла почти в два раза — с 497 нМ
до 890 нМ С2Н4/г листьев за час и была близка к ее
значениям в клубеньках на корнях этих растений. Одновременно
было отмечено, что неэффективные для симбиотической азот-
фиксации штаммы клубеньковых бактерий оказались
эффективными для азотфиксации в филлосфере. Эти же
исследователи (Nandi, Sen, 1982) сообщили, 'что после инокуляции
надземной части маша и нута клубеньковыми бактериями у
растений увеличивалась скорость фотосинтеза на 129—240% и
соответственно возросли масштабы выщелачивания различных
органических соединений (сахарозы, глицина, аланина,
яблочной и янтарной кислот) из листьев на 134—281%, в
результате чего резко активизировалась ассоциативная азотфиксация
в филлосфере.
Основной теоретической предпосылкой при проведении
перечисленных работ является бытующее еще представление об
азотфиксации как уникальном процессе, осуществляемом
узкой группой высокоспециализированных микроорганизмов, и о
бедности большинства почв такими организмами. Считается,
что, повысив численность азотфиксирующих бактерий в
прикорневом слое почвы или непосредственно на поверхности
растений, можно достичь и увеличения доли «биологического»
азота в урожае. Помимо перечисленных приемов, когда для
инокуляции корней и надземной части применяли выделенные
из почвы активные штаммы различных азотфиксирующих
бактерий, было предложено использовать и достижения
современной генетики. В частности, предлагается осуществить перенос
Nif-генов из Klebsiella pneumoniae бактериям, обитающим в
ризосфере важнейших сельскохозяйственных растений (Клинг-
мюллер и др., 1981). Было предложено также проводить
бактеризацию небобовых растений высокоактивными в отношении
азотфиксации специально подобранными слабовирулентными
культурами фитопатогенных бактерий (Кордюм, 1982). Одна-
101

ко отсутствие видовой специфичности между бактериями и
растениями при ассоциативной азотфиксации, с одной стороны,
и природное многообразие и обилие азотфиксирующих
микроорганизмов в почвах всех типов — с другой, приводят к
выводу о малой эффективности таких подходов к решению
проблемы «биологического» азота в растениеводстве. Хотя сама
возможность интродукции различных микроорганизмов в почву
доказана (Звягинцев, 1982), тем не менее одной из наиболее
■слож'Ных и пока нерешенных остается проблема сохранения
свойств вносимых в прикорневую зону микроорганизмов в
природной среде, преодоления ими конкуренции со стороны
присутствующих в почве «диких» бактернй-диазотрофов. Наряду
с приводившимися выше данными о богатстве и разнообразии
азотфиксирующего генофонда почв и фитоплана имеются
многочисленные свидетельства неэффективности инокуляции. Бар-
бер с соавт. (Barber et al., 1979) специально изучали в связи
с сообщениями о высокой эффективности бактеризации проса
и кукурузы азотфиксирующей бактерией A. brasilense
действие инокуляции на активность азотфиксации, урожай проса и
кукурузы, содержание азота в растениях, почвах и дренажных
водах. В качестве контроля была использована суспензия
убитых клеток A. brasilense. Согласно полученным ими данным
инокуляция проса и кукурузы активно фиксировавшей азот
культурой A. brasilense не оказывает достоверного влияния на
содержание азота в растениях, почве и дренажных водах
даже в благоприятных для роста и развития растений условиях
теплицы. Проведенные в Канаде (Okon et al., 1980)
углубленные исследования последствий инокуляции корней кукурузы
свежевыделенными и коллекционными штаммами A.
brasilense привели к заключению, что даже в тех случаях, когда у
инокулированных растений наблюдалась повышенная по
сравнению с контрольными растениями активность
азотфиксации, поступление азота н прикорневую зону было
недостаточным для формирования урожая. Инокуляция проростков риса
культурами A. lipoferum, Pseudomonas sp. хотя и приводила
к ускоренному развитию растений, но не оказывала влияния
на общее содержание азота в урожае (Watanabe, Lin, 1984).
Бактеризация сорго селекционными штаммами A. brasilense в
■большинстве случаев не приводила ни к каким
положительным результатам, и лишь в одном из опытов было
обнаружено увеличение сухого -веса растений на 11—24% и содержания
азота на 9—39% (Smith et al., 1984). Практически во всех
работах отмечается, что инокуляция вызывает увеличение
корневой массы растений, вследствие чего возрастает ее
ассимиляционная поверхность и улучшается корневое питание
растений. Положительное влияние инокуляции в большинстве
случаев обусловлено образованием в прикорневой зоне различных
ростстимулирующих соединений.
По данным Тилера с соавт. (Tyler et al., 1979), активность
102

азотфиксации в ризосфере зерновых злаков при инокуляции в
ряде опытов возрастала, но различия между опытными и
контрольными растениями в содержании азота были
недостоверны. К таким же выводам пришли и индийские микробиологи
(Tilak et al., 1982), изучавшие действие различных штаммов
Az. chroococcum и Л. brasilense на ассоциативную азотфикеа-
цию, рост и урожай кукурузы и сорго. Согласно полученным
ими данным, инокуляция опытных растений чистыми
культурами бактерий приводила к увеличению урожая на 8—12%,
однако эти различия с контрольными растениями не были
достоверны. Достоверная прибавка была получена при
использовании в качестве ииокулята смешанной культуры из двух
бактерий — урожай кукурузы при этом повышался на 16—
30%, а сорго — на 6—20%. Более высокий уровень
азотфиксации в ризосфере зерновых злаков при использовании в
качестве ииокулята смешанной культуры A. brasilense с другими
гетеротрофными бактериями по сравнению с чистой культурой
ее был отмечен и в опытах Тилера (Tyler et al., 1979). По
данным Власеака и Рейидерса (Viassak, Reynders, 1978),
тщательное изучение использовавшихся в опытах по инокуляции
озимой пшеницы «чистых» культур Sp. lipoferum привело к
обнаружению в их составе двух «спутников» из рода Pseudo-
monas, очистить от которых изучаемую культуру спириллы
удалось .лишь с большим трудом. Однако у инокулированных
такой смешанной культурой растений активность азотфиксации
в ризосфере была в 2—4 раза выше, чем при использовании
чистой культуры. Характерно также (с точки зрения
возможных причин высокой азотфиксирующей активности некоторых
коллекционных культур A. brasilense), что тщательная
микробиологическая проверка этих культур, считавшихся чистыми,,
показала наличие в их составе по крайней мере еще двух
видов бактерий (Israel et al., 1980).
В наших опытах с гнотобиотическими растениями риса и
полевицы более высокий уровень азотфиксации в ризосфере
был отмечен в тех вариантах, лде для инокуляции
использовались ассоциации микроорганизмов, а не чистые культуры азот-
фиксирующих бактерий. При использовании в качестве
ииокулята смешанных культур азотфиисирующих
микроорганизмов (отличающихся повышенной активностью азотфиксации и
высокой устойчивостью к факторам внешней среды, к
конкуренции со стороны других микроорганизмов) удается
достичь более высоких показателей азотфиксирующей
активности в ризосфере и филлосфере опытных растений по сравнению
с чистыми культурами бактерий-диазотрофов. Однако пока
еще мало данных для того, чтобы предложить ассоциации
микроорганизмов для целей сельскохозяйственного
производства. Лишь тщательное изучение свойств таких смешанных
культур на основе большой и разнообразной коллекции может
дать ответ на вопрос о их практической значимости.
103

Влияние минеральных азотных удобрений
на ассоциативную азотфиксацию
Одними из факторов среды, оказывающими
сильное регулирующее действие на азотфиксацию вообще и на
ассоциативную азотфиксацию в частности, являются
минеральные азотные удобрения. Если в опытах in vitro уже давно
установлено явление торможения азотфиксации при наличии
связанного азота в среде, то вопрос о его влиянии на
азотфиксацию в почве в присутствии растений остается пока сложным-
и малоизученным.
В литературе имеются противоречивые сведения о влиянии
минеральных соединений азота на активность азотфиксации в
почве. Широко распространено мнение, что минеральный азот
сильно тормозит этот процесс. В то же время имеются данные
(Мишустин и др., 1977; Калининская и др., 1977; Watanabe et
al., 1980), что дозы азотных удобрений, обычно
используемых в сельскохозяйственной практике (100—150 кг на га),
вызывают лишь кратковременное подавление азотфиксации, а
существенное торможение наблюдается при дозах связанного
азота в 500—1000 кг/га. Характерно также, что азотные
удобрения действуют в первую очередь на фотосинтезирующие
бактерии-азотфиксаторы и только с увеличением дозы
'начинают ингибировать азотфиксирующую активность
гетеротрофных бактерий. В настоящее время все большую актуальность
приобретают исследования, направленные на повышение
эффективности использования растениями азота почвы и
удобрений, на уменьшение его потерь из почвы. Приходная и
расходная статьи баланса азота в почве во многом определяются
скоростями протекания двух важнейших микробиологических
процессов: азотфиксации и денитрификации. В последние годы
много внимания уделяется проблеме влияния минеральных
азотных удобрений на активность денитрификации в почве
как процесса, от интенсивности которого зависят не только
безвозвратные потери азотных удобрений, но и в значительной
степени активность азотфиксации.
Как известно, активность любого микробиологического
процесса обусловливается прежде всего наличием субстрата,
вовлекаемого в метаболизм микроорганизмов, проводящих
данный процесс. Однако вопрос о влиянии концентрации
нитратов на активность денитрификации в почве не имеет на
сегодняшний день однозначного ответа.
Существует ряд данных, свидетельствующих о
независимости скорости денитрификации от концентрации субстрата в
почве. Было показано, что при добавлении 2 и 33 мг N2/r
почвы регистрировалась одинаковая скорость денитрификации
(Ryden et al., 1979). По данным Чена с соавт. (Chen et al.,
1972), поток меченого 15N2 из донных осадко.в эвтрофного
озера быстро падает при увеличении концентрации нитратов. Тор-
104

можение денитрификадии «при нарастании содержания
нитратов в почве было отмечено и в других работах (Uscha, Alan,
1982). Лиммер (Limrner, 1982) приводит следующие данные,
характеризующие независимость денитрифицирующей
активности двух почв от концентрации нитратов в них (табл. 27).
В противоположность этим данным имеются сведения о
возрастании скорости денитрификации но мере увеличения
Таблица 27
Скорость денитрификации в суглинистой почве при внесении KN03
Окультуренная почва
KN03, мг/г
0
50
100
200
300
500
NaO, мг/ч
0
8,1
7,3
7,4
8,1
9,2
Неокультуренная почва
i
KN03, мг/г N20, мг/ч
0
12,5
25,0
50,0
125,0
—
1,8
4,3
4,9
5,1
5,2
—'
концентрации нитратов в почве (Шабаев, 1981; Cohran et al.,
1982), причем наиболее заметно это при наличии активно веге-
тирующих растений.
Таким образом, концентрация нитратов определяет лишь
денитрифицирующий потенциал почвы; актуальная (полевая)
активность денитрификации зависит от концентрации
субстрата только iB благоприятной экологической обстановке — при
хорошей обеспеченности легкодоступным субстратом для
минерализации и при низком давлении кислорода, поскольку
именно эти факторы являются лимитирующими в природной
зоне.
Являясь гетеротрофами, денитрифицирующие бактерии
окисляют и утилизируют широкий круг углеродных 'соединений.
Установлено, что активность денитрификации в почве
коррелирует с содержанием в ней водорастворимого углерода и
стимулируется добавлением экзогенных органических
соединений (Куракова, Умаров, 1984). Объяснение этого явления
заключено в энергетике процесса денитрификации.
Подавляющее большинство микроорганизмов, осуществляющих этот
процесс, имеют две окислительно-восстановителыные системы:
дыхательную, когда акцептором водорода служит свободный
кислород, и нитратвосстанавливающую, когда роль акцептора
водорода выполняют нитраты. Энергия окисления
органического вещества в процессе дыхания значительно превосходит
энергию окисления его при денитрификации. Поэтому для
перехода к «нитратному дыханию» в условиях свободного доступа
воздуха количество легкоразлагаемого органического вещества
в среде должно в 5 раз превышать количество его, необходи-
5 М. М. Умаров
105

мое при дыхании. Таким образом, денитрификация — процесс,.
идущий с затратой большого количества энергии.
Какие же источники органического вещества используются
денитрификаторами в почве? Вольдендорп (Woldendorp, 1965)
основными поставщикахми легкодоступного органического
вещества для денитрифицирующих микроорганизмов считал
растения, главным образом их корневой опад и прижизненные
выделения. Активность денитрификаторов тесно связана с
концентрацией углеродеодержащих веществ в прикорневой зоне
и поэтому имеет хорошо выраженную сезонную динамику,
совпадающую с динамикой развития растений.
Согласно оценкам последних лет объем корневых
выделений и корневого опада, прижизненно поступающего в почву в
периоды активного роста и развития растений, составляет в
среднем около 1/3 от продукции фотосинтеза. Корневая
система является одним из главных источников углерода в почве и
потому существенно влияет не только на азотфиксацию, но и
на скорость денитрификации.
Кроме того, корни растений, активно поглощая кислород,
значительно уменьшают его концентрацию в прикорневой зоне.
Так, Вольдендорпом (Woldendorp, 1965) было показано, что
поглощение кислорода в почве живыми растениями в 20 раз
превышает потребление кислорода в почве с отмершими
корнями. Корневая система растений активно поглощает ионы
калия из почвы, уменьшение концентрации которого приводит к
увеличению активности денитрификации (Trolldenier, 1979).
Одновременно ризосфера является местом концентрации
денитрификаторов.
Физиологическая группа денитрифицирующих бактерий
включает в себя большое число микроорганизмов,
преимущественно сапрофитных, в обычных условиях окисляющих
органическое вещество за счет свободного кислорода, а в анаэробных
условиях использующих нитраты в качестве акцептора
электронов. При этом способность к восстановлению нитратов не
является систематическим признаком, характеризующим
родовую или видовую принадлежность организма: скорее это
свойство отдельных штаммов того или иного вида.
Денитрификаторами чаще всего являются представители родов Pseudomo-
nas, Alcaligenes, Achromobacter, Bacillus, Micrococcus, нередки
они и среди других родов и семейств прокариот.
Экологическое значение денитрификации, ее роль в
круговороте азота столь велики, что трудно согласиться с
бытующим еще представлением о существовании узкой и строго
специфической группы микроорганизмов, способных к
восстановлению азотсодержащих соединений. Можно полагать, что
потенциальными денитрификаторами являются большинство
почвенных бактерий. Экспериментальные подтверждения тому
получены в самое последнее время. По имеющимся данным 65%
бактерий, выделенных из почв рисовников, обладали способно-
106

стью к денитрификации (Rennie et al., 1982). Ноулз (Knowles,
1982) отмечал, что денитрификаторы широко распространены
во всех экологических нишах. По его оценкам, большая часть
представителей родов Pseudomonas, Alcaligenes потенциально
способна к денитрификации.
В пользу такого вывода свидетельствуют и полученные в
последнее время данные о возможности осуществления одними и
теми же видами микроорганизмов двух диаметрально
противоположных процессов — азотфиксации и денитрификации.
Такую способность обнаружили некоторые штаммы Spirillum li-
poferum, культуры Rhizobium melliloiii, A. brasilense в
условиях дефицита кислорода и в присутствии нитратов (Веденина,
Лебединский, 1983).
Следовательно, в прикорневой зоне растений создаются
условия, благоприятствующие лротеканию денитрификации, а
именно: присутствие большого числа
микроорганизмов-возбудителей, высокий уровень обеспечения легкодоступным
органическим веществом, низкое давление кислорода. Поэтому при
наличии нитратов именно в ризосфере следует ожидать более
высокую активность денитрификации по сравнению с почвой,
где растения отсутствуют.
К настоящему времени накоплен обширный
экспериментальный материал, полученный как с использованием меченых
15N удобрений, так и в ходе прямых газохроматографических
определений, убедительно свидетельствующий об активизации
денитрификации в присутствии растений. Так, в почве под
ячменем потери «нитратного азота достигали 90%, тогда как в
парующей почве они составляли лишь 5% (Ketchenson et al.,
1970). По имеющимся оценкам восстановление нитратов в
ризосфере риса шло в 14 раз быстрее, чем в почве, не занятой
растениями. Бейли (Baily, 1976) наблюдал стимуляцию
денитрификации даже в прикорневой зоне растений, наземная часть
которых была предварительно срезана.
Особого внимания заслуживают эксперименты Стефенсона
(Stefanson, 1972), поскольку он использовал метод прямого
определения газообразных продуктов денитрификации в
герметичных камерах с почвой в условиях, максимально
приближенных к естественным, в присутствии и без растений. На
основании полученных данных он пришел к выводу, что при
уровне увлажнения, близком к полевой влагоемкости, и
достаточно высоком содержании нитратов растения оказывают
сильное стимулирующее действие на денитрификацию. Смит и
Тиджи (Smith, Tiedje, 1979), используя ацетиленовый метод,
показали, что при высоких концентрациях ,в почве нитратов
скорость денитрификации выше в ризосферной почве. В наших
исследованиях с применением ацетиленового метода был
зарегистрирован сильный стимулирующий эффект ризосферы на
денитрифицирующую активность почвы.
В противоположность этому широко распространено мнение
5*
107

о сокращении газообразных потерь азота при наличии
сплошного покрова растений. Так, по данным В. Н. Тохвер, Л. На-
ру-ск (1972), присутствие растительности в лизиметрах
уменьшало потери азота от денитрификации в 3 раза, хотя в первые
недели вегетации денитрификация протекала наиболее
активно .в почве под растениями. Б. Н. Макаров, Т. А. Патрикеева
(1974) установили, что присутствие растений более чем в 5 раз
уменьшало газообразные потери из чпючвы. По данным
М. А. Бо-брицкой (1972), потери азота из парующей почвы
были /в 2.4 раза больше, чем из почвы, занятой растениями.
При этом высокая активность денитрификации в парующей
почве, как правило, объяснялась исключением активной
конкуренции корней растений с денитрифицирующими
микроорганизмами за нитраты в почве. Это объяснение было впервые
предложено Харрисоном и Эйером еще в 1913 г. и с тех пор
широко используется при обсуждении данных во многих
работах. Однако к настоящему времени накоплено немало
сведений, ставящих под сомнение аргументированность этой
теории.
Во-первых, коэффициент использования растениями
нитратных удобрений не превышает 50—65%, а по мере возрастания
доз нитратов он быстро снижается. Во-вторых, повышение
концентрации нитратов в почве не приводит к резкому увеличению
активности денитрификации. Денитрифицирующий потенциал
почвы зачастую бывает лимитирован не столько
концентрацией нитратов в ней, сколько количеством доступного углерода;,
активность денитрификации в почве контролируется главным
образом скоростью минерализации органического вещества
почвы, в ходе которого оно становится доступным
денитрифицирующим микроорганизмам.
Таким образом, конкуренция за азот нитратов между
растениями и микроорганизмами-денитрификаторами скорее
всего выражена слабо, а при высоких уровнях внесения
минерального азота и вовсе отсутствует. Экспериментальное
подтверждение этому можно найти в работе Филлери и Влэка
(Fillery, Vlek, 1982), не обнаруживших конкуренции за
нитраты между рисом и обитавшими в его ризосфере
денитрифицирующими микроорганизмами.
Следовательно, активно денитрификация должна протекать
© ризосфере растений, где складываются благоприятные с
точки зрения экологии и физиологии денитрификаторов условия.
Если различные статьи расхода азота в почве изучены
достаточно подробно (Петербургский, 1982), то потери его в
результате денитрификации пока точно не оценены. Эти данные
необходимы для понимания роли азотных удобрений в
процессе ассоциативной и симбиотической азотфиксации, поскольку
экологически денитрификация осуществляется примерно в
таких же условиях, в которых наиболее активно протекает и азот-
фиксация, — оба процесса активизируются при наличии легко-
108

доступного субстрата и дефиците кислорода. Можно полагать,
что при наличии нитратов ib этих условиях и азотфиксирующие
микроорганизмы выступают в роли денитрификаторов, о чем
уже упоминалось. Так, для активно фиксировавшего азот
штамма A. brasilense экспериментально показано, что при
концентрации нитрата в среде выше 10 iMr/мл этот
микроорганизм осуществляет только денитрификацию; при понижении
концентрации нитрата денитрификация прекращается и
культура переходит к азотфиксации (Nelson, Knowles, 1978).
Вероятно, такое «переключение» механизмов трансформации
азота в среде широко распространено среди микроорганизмов и
контролируется по принципу лимитирования субстратом.
В пользу существования такого механизма говорит также то,
что способность к денитрификации (нитратному дыханию)
обнаружена только у бактерий, а ферменты, участвующие в
процессе денитрификации и азотфиксации, имеют ряд сходных
характеристик (Львов, 1982). Нами изучалось влияние
растений на сопряженное протекание 'процессов азотфиксации и
денитрификации в дерново-подзолистой лочве и черноземе
выщелоченном при внесении различных азотных удобрений —
KN03, NH4C1, CO(NH2h — в концентрациях,
соответствующих 90 и 500 кг азота на гектар. В качестве контрольных
служили варианты опыта, в которых в почву вносили те же
соединения и в таких же дозах, но растения не выращивали
(табл. 28).
Как на дерново-подзолистой почве, так и на черноземе
влияние растений на активность процессов азотфиксации и
денитрификации было сходным: при наличии растений активность
этих процессов была выше по сравнению с вариантами без
растений.
Внесение азотсодержащих соединений в
дерново-подзолистую почву вызвало в первые 6 дней (до появления всходов)
подавление азотфиксации, причем больший по силе ингиби-
рующий эффект отмечался в вариантах с NH4C1, СО(ЫНг)2.
В этот период существенной разницы ib уровнях активности
азотфиксации между засеянными и незасеянными вариантами
опыта не обнаруживалось. Изучение денитрификации
показало, что наибольшие потери газообразного азота в это время
были в вариантах с нитратами.
На двенадцатые сутки, в начале фазы кущения растений,
на засеянных пшеницей вариантах опыта азотфиксирующая
активность возросла примерно в полтора раза по сравнению с
парующей почвой, что в целом значительно ослабило ингиби-
рующее действие связанного азота в вариантах с растениями.
Одновременно увеличилась и активность денитрификации,
причем наиболее сильно в почве под растениями. Следует
отметить, что как в вариантах без растений, так и при их наличии
наибольшие величины газообразных потерь отмечались в
образцах с аммонийным и амидным азотом. Видимо, в данных
109

случаях нами оценивались суммарные потери азота в ходе
процессов нитрификации и денитрификации. tJ мч.
На двадцатый день культивирования растений (конец фазы
кущения) нитрогеназная активность по-прежнему была более
•высокой в вариантах с пшеницей. Активность денитрификации
в эту фазу развития растений достигла своего максимума и
оставалась наибольшей в (вариантах, удобренных хлоридом
аммония и мочевиной.
На черноземе в целом прослеживались те же
закономерности: на всех вариантах опыта с растениями наблюдалось
стимулирование азотфиксирующей активности почвы, однако
более слабое по сравнению с дерново-подзолистой почвой. В то
Таблица 28
Баланс «биологического> азота, складывающийся при внесении
азотсодержащих соединений в дерново-подзолистую почву
и чернозем, мг Ыг/кг почвы
Вариант опыта
Контроль
Контроль—растение
KN03 —I—растение
KN03 —II—растение
KN03 —I
KN03 —II
NH4CI —I—растение
NH4C1 —II—растение
NH4C1 —I
NH4CI —II
СО (NH2) 2—I—растение
CO(NH2)2—И—растение
CO(NH2)2-I
CO(NH2)2—II
Дерново-подзолистая
(27 сут)
азот- J денитри-
фиксация1 фикация
71,7
80,6
77,7
69,1
59,6
51,8
66,0
60,6
51,1
49,0
62,7
52,8
52,9
48,5
i
13,2
17,9
43,9
51,0
46,6
45,0
57,4
75,3
39,7
62,6
45,3
69,2
42,8
60,2
баланс
+58,5
+62,7
+33,8
+ 18,1
+ 13,0
+6,8
+8,6
-14,7
+ 11,4
—23,6
+ 17,4
— 16,4
+ 10,1
—11,7
Чернозем (22 сут)
азот- | денитри-
фиксация фикация
i
71,6
74,1
69,8
65,9
62,8
63,6
68,5
56,3
59,8
51,1
69,3
! 59,2
64,6
56,1
11,3
14,0
26,8
32,4
22,2
26,5
34,7
45,0
24,8
38,4
27,9
43,9
24,4
32,1
баланс
+60,3
+60,1
+43,0
+33,5
+40,6
+37,1
+33,8
+ П.З
+35,0
+12,7
+41.4
+ 15,3
+40,2
+24,0
Примечание. I — 90 кг N2/ra, II — 500 кг N2/ra.
же время и величины газообразных потерь на всех вариантах
опыта были несколько меньшими, чем на дерново-подзолистой
почве, однако увеличение скорости денитрификации под
действием растений четко прослеживалось и здесь.
На основе полученных данных был рассчитан баланс
«биологического» азота, складывающийся в ходе параллельного
протекания процессов азотфиксации и денитрификации (см.
табл. 28). Внесение азотсодержащих .веществ в
дерново-подзолистую почву привело к уменьшению ее нитрогеназной
активности и увеличению скорости процесса денитрификации.
Поэтому наибольший приход «биологического» азота отмечается
110

на контроле. Следствием внесения NH4C1, CO(NH2b в дозе
500 кг Кг/га явился отрицательный баланс в этих вариантах
опыта. Однако необходимо отметить, что наличие растений,
вызвавшее возрастание активности азотфиксации и денитрифика-
ции по сравнению -с парующими (вариантами опыта, повлияло
на величину результирующей двух микробиологических
процессов. Так, в вариантах с нитратами растения увеличили
приход «биологического» азота в 2,2—2,5 раза. Однако в
вариантах с аммонийным и амидным азотом влияние растений на
величину баланса азота не было однозначным.
В отличие от дерново-подзолистой почвы на черноземе
растения не оказали заметного влияния на величины баланса
«биологического» азота: как на контроле без растений, так и
при их наличии при внесении азотсодержащих соединений
общий итог был примерно одинаков.
Таким образом, анализ полученных данных позволяет
заключить, что растения способствуют возрастанию нитрогеназ-
ной активности исследуемых почв, но в то же время приводят
и к увеличению газообразных потерь азота из почвы. При этом
чернозем отличался от дерново-подзолистой почвы
значительно менее выраженным «откликом» на внесение азотных
удобрений. Как известно, богатые гумусом почвы отличаются
малой отдачей на внесение минеральных удобрений
(Петербургский, 1979) даже в высоких дозах, тогда как почвы «с малым
содержанием органического вещества характеризуются
высоким коэффициентом отдачи. Указанная закономерность
проявилась и в активности обоих изученных процессов — как
азотфикеация, так и денитрификация протекали «менее
активно в черноземе. Результаты опыта свидетельствуют также и о
том, что при наличии растений азотфиксирующая активность
в фитоплане, подавленная на первых этапах развития
растений из-за высокой концентрации минерального азота в почве,
затем восстанавливается и достигает более высокого уровня,
чем в почве, где растения выращивались без удобрений.
Следовательно, азотные удобрения, стимулируя развитие
растений на первых этапах и повышая продуктивность
фотосинтетического аппарата, способствуют, после удаления
избытка минеральных соединений азота в почве в результате
потребления их растениями и микроорганизмами, просачивания в
грунтовые воды и закрепления в кристаллических решетках
почвенных минералов, возрастанию ассоциативной
азотфиксации на последующих стадиях развития растений.
Закономерно, что скорость протекания указанных процессов
определяется в целом уровнем биологической активности почв. В почвах
с высокой биологической активностью и в особенности в
ризосфере потери азота выше, и в таких почвах быстрее наступает
состояние азотного дефицита. В результате чем выше
биологическая активность почв и чем лучше развиваются растения,
тем быстрее будет исчерпан запас внесенных в почву легко-
111

доступных соединений азота в прикорневой зоне, тем быстрее
растения окажутся в условиях глубокого азотного голода и
как ответная реакция всей системы «почва—микроорганизмы-
растения» на более высоком уровне будет осуществляться
ассоциативная азотфикеация.
Как отмечалось, при нарушении сбалансированности
между поступлением углерода и азота в растительный организм
резко возрастают экссудация и корневой опад как ответная
реакция «а ухудшение условий среды (Сытник и др., 1972).
Падение концентрации минеральных соединений азота в
прикорневой зоне и увеличение масштабов экзоосмоса
способствуют усилению ассоциативной азотфиксации. Чем в большей
дозе вносились в почву азотные удобрения и соответственно
лучше развивались растения, тем выше активность и
суммарная продуктивность ассоциативной азотфиксации.
Вероятно, именно в усилении азотного питания за счет
активизации ассоциативной азотфиксации заключается
экологический смысл массированной экссудации растениями. Этот
своеобразный экологический саморегулирующийся механизм
связывает высшие растения и ассоциированные с ними
микроорганизмы, в том числе и азотфиксирующие.
Азотные удобрения служат в качестве «пускателя» такого
механизма; их можно рассматривать в виде* «стартового
азота», роль которого хорошо известна для азотфиксирующих
микроорганизмов. Усиление ассоциативной азотфиксации в фи-
топлане растений способствует снижению коэффициента
использования азотных удобрений. Именно этим можно
объяснить хорошо известное в агрохимии явление снижения
коэффициента использования минеральных азотных удобрений по
мере увеличения вносимых в почву доз. Следовательно,
оптимизация доз азотных удобрений с учетом свойств почвы,
биологических особенностей растения и экологии ассоциативной
азотфиксации может позволить увеличить долю
«биологического» азота в урожае и более экономно расходовать
минеральные удобрения. Лишь малой изученностью процессов
взаимодействия растений и азотфиксирующих микроорганизмов
можно объяснить отсутствие практических рекомендаций с
целью достижения оптимального соответствия между азотом
«биологическим» и минеральным в продукции растениеводства.
Раскрытие тонких особенностей такого взаимодействия
позволит также понять функциональную роль каждого из членов
системы «почва—микроорганизмы—растения».

ГЛАВА 5
ЗНАЧЕНИЕ АССОЦИАТИВНОЙ АЗОТФИКСАЦИИ
В АЗОТНОМ БАЛАНСЕ ПОЧВ
В последние годы резко возрос интерес к
использованию «биологического» азота в земледелии и
растениеводстве. Это определяется той огромной ролью, которую он
«играет в повышении плодородия почв, увеличении урожая
сельскохозяйственных культур и решении кормовой проблемы, его
дешевизной в сравнении с техническим азотом и, наконец, его
безвредностью для окружающей среды в отличие от
минерального азота, легко вымываемого в грунтовые воды и (водоемы,
аккумулирующегося в зеленой массе растений, овощах и
вызывающего тяжелые заболевания человека и животных. Как уже
отмечалось, наряду с «биологическим» азотом растения могут
использовать и азот минерализующегося органического
вещества почвы — гумуса, причехм определение соотношения между
ними представляет одну из важнейших задач не только
экологии азотфиксации, но и агрохимии, растениеводства. Именно
из-за отсутствия данных о масштабах поступления в агрофи-
тоценозы «биологического» азота за счет ассоциативной и не-
симбиотической азотфиксации широко распространено мнение,
что доля их в приходных статьях баланса азота в почве
невелика и не превышает 3—5 кг/га в год для зоны умеренного
климата, а главным источником азотного питания растений
является азот гумуса. До появления ацетиленового метода,
впервые позволившего начать количественные измерения
активности азотфиксации непосредственно в природной среде, не
существовало надежных способов ее оценки, поскольку ни метод
Кьельдаля, ни изотопный метод не могли быть использованы
для полевых определений. Однако и при применении
ацетиленового метода необходимы длительные и трудоемкие
измерения суточной и сезонной динамики ассоциативной азотф'икса-
ции для того, чтобы рассчитать продуктивность процесса в
конкретной экосистеме, чем и обусловлена относительная
немногочисленность таких данных. Но и эти величины еще не
являются окончательными, поскольку остается неясным вопрос о
коэффициенте использования «'биологического» азота
растениями и микроорганизмами. Вызвано это не только
малочисленностью сведений о величине поступления в растения азота,
фиксированного микроорганизмами, поскольку имеющиеся
оценки позволяют говорить, что по крайней мере одна треть
его используется растениями. Другой причиной является то,
что все ныне существующие методы оценки азотфиксации
позволяют определить активность ее в определенный момент и
за конкретный период, хотя для составления баланса азота в
любой экосистеме требуется знание его накопления как в
отдельных компонентах, так и во всей этой системе. Подробное
ИЗ

рассмотрение приходных статей баланса азота в экосистемах
ьачато лишь в самое последнее время. По данным А. А. Тит-
ляповой с соавт. (1979), изучавшими баланс азота и углерода
в парующем и пшеничном полях, приходная статья с учетом
азотфиксации при наличии растений достигает 250 кг/азота/га
в год. Т. Г. Гильманов и И. М. Рыжова (1982) применили
имитационную модель для изучения круговорота азота в
экосистеме суходольного луга. Согласно их оценкам, в
изучавшемся лугу в целом складывается положительный баланс азота;
разница между поступлением и потерями составляет в среднем
около +5,8 г/м2 за вегетационный сезон, или 58 кг/га, с учетом
всех потерь — -вымывания, денитрификации и нитрификации,
улетучивания в виде аммиака и пр. Установлено, что при этом
около 45% потребности растений в азоте удовлетворяется за
счет ассоциативной азотфиксации. В. Н. Кудеяров (1982),
использовав меченые (lbN) азотные удобрения, при составлении
баланса азота удобрений и почвы с учетом газообразных
потерь и вымывания обнаружил «излишек» азота. Для серой
лесной почвы под овсом в зависимости от доз удобрений этот
«излишек» составил от 3,8 до 8,8 мг азота/100 г почвы, а для
лугово-черноземовидной — от 7,5 до 23,8 мг/100 г почвы.
При условии, что объемный вес лесных почв составляет
для пахотного горизонта 1,3, а масса пахотного горизонта
(20 см) /на одном гектаре равна 2600 т, при пересчете этих
данных величина «излишка» достигает от 98,8 до 228,8 кг/га.
Еще больше она в лугово-черноземовидной почве — до
300 кг/га. Многими исследователями подчеркивалось, что если
бы в почвах не существовало процесса, направленного на
увеличение содержания азота, то вряд ли почвы после ряда лет
сельскохозяйственного использования содержали бы
какие-нибудь следы азота. По-видимому, почва представляет собой
саморегулирующуюся экологическую систему, которая работает
так, что на усиление вьшоса и потерь отвечает усилением
азотфиксации.
В агрохимии давно установлено явление дополнительного
поступления в растения азота из почвы («экстра»-азота, по
определению Ф. В. Турчина, 1972) при внесении в почъу
минерального азотного удобрения. Наиболее важен с
рассматриваемых позиций несколько парадоксальный на первый взгляд
вывод о том, что величина поступающего из почвы «экстрз»-азота
возрастает с увеличением дозы внесенного азотного удобрения.
Так, по данным Н. А. Сапожникова и М. Ф. Корнилова
(1977), ячмень на дерново-подзолистой почве содержал в
урожае от 59 до 86% азота, .поглощенного из почвы, а не из
азотного удобрения, которое вносилось соответственно в средней и
высокой дозах. С. П. Бражник и Ю. А. Полеско (1977)
установили, что озимая пшеница на черноземной почве
удовлетворяла свою потребность в азоте на 88—92% за счет его
почвенных источников несмотря на внесение азотного удобрения. Ха-
114

рактерно, что под влиянием двойной дозы удобрений
мобилизация почвенного азота возрастает в 1,5 раза по сравнению с
одинарной дозой (Зубенко с ©оавт., 1978). При одинаковых
форме, дозе и способе внесения азотных удобрений количество
азота, поступившего в растения из «почвы, зависит от фотосин-
тетической активности растений — оно заметно снижается при
затемнении растений, хотя коэффициент использования азота
удобрений остается практически одинаковым у затемнявшихся
и незатемнявшихся растений (Сирота, 1973). Даже очень
высокие (180 кг/га и более) дозы азотных удобрений не приводят
к снижению «удельного веса» почвенного азота в питании
растений, причем IB почвах с высокой биологической активностью
доля почвенного азота в общем его количестве, поступившем
в растения, выше, чем в биологически малоактивных почвах
(Сапожников, 1974). Подавляющее большинство указанных
выводов сделано в последнее время и с использованием
меченых 15N азотных удобрений, что не позволяет считать эти
результаты случайными или ошибочными. Складывается
впечатление, что мобилизация азота из почвенных источников
зависит каким-то образом от интенсивности 'фотосинтеза у
растений — чем они лучше растут, например, под влиянием
внесения повышенных доз удобрений, тем выше в них содержание
почвенного азота.
Как указывает А. В. Петербургский (1979), в агрохимии
до сих пор нет удовлетворительного объяснения причин,
обусловливающих лучшую мобилизацию растениями азота почвы
при внесении азотного удобрения. По его мнению, это может
быть следствием лучшего развития корневой системы растений
под влиянием азотного удобрения. Н. А. Сапожников (1974)
считает, что происходит усиление поглотительной деятельности
корней в результате более интенсивного обмена веществ в
удобренных растениях и усиления минерализации
органического вещества почвы вследствие интенсивной жизнедеятельности
почвенных микроорганизмов. Таким образом, считается, что
единственным источником дополнительного («экстра») азота,
поступающего в растения на фоне азотного удобрения,
является органическое вещество почвы. Учитывая большие
масштабы поступления в растения «почвенного азота», можно было
полагать, что запасы азота в почве быстро сокращаются.
Однако многочисленные исследования динамики содержания
азота в почвах различных биоклиматических зон, проведенные
как в нашей стране, так и за рубежом, убедительно
свидетельствуют, что заметного снижения содержания азота в почве не
происходит. Даже в условиях монокультуры озимой пшеницы,
ячменя, ржи и других небобовых растений, не получавших в
течение длительного периода (60—135 лет) азотных удобрений,
содержание азота в почве сохранялось относительно
постоянным (Мишустин с соавт., 1978; Дарт, Дэй, 1979; Broadbent,
1981). Наиболее важно отметить, что потери азота из почвы
115

были минимальны при наличии растений, тогда как
бессменное парование сильно ускоряло процесс деградации
органического вещества почвы.
Высокое содержание «почвенного» азота в составе растений,
под которые вносили азотное удобрение, а также
незначительные потери его из органического вещества почвы при
длительном выращивании небобовых растений без азотных удобрений
приводят к выводу о ведущей роли «биологического» азота в
формировании урожая. Чем более развитым *
фотосинтетическим аппаратом обладает растение и, следовательно, чем
больше энергии солнца оно транспортирует в прикорневую зону,
тем больше у него «возможности» для активизации процесса
ассоциативной азотфиксации. Как отмечалось, именно в этом
заключается важнейший экологический смысл большой
масштабности корневого опада и корневых (выделений.
Прижизненный массированный выброс органических углеродсодержа-
щих соединений позволяет растению сдвигать экологическое
равновесие в почве в сторону, более благоприятную для его
жизнедеятельности, в частности улучшать условия азотного
питания путем активизации процесса ассоциативной
азотфиксации. Приток азота в растение при этом находится в
соответствии с интенсивностью образования в нем реакционноспособно-
го углеродистого материала, что является главным условием
нормального сбалансированного роста.
Рассматриваемый механизм взаимодействия растений и
микроорганизмов позволяет подойти к объяснению многих
особенностей превращения азота в почве и, в частности, причин
низкой эффективности использования азотных удобрений
сельскохозяйственными растениями. Азот удобрений, внесенных
весной, используется растениями в течение того времени,
когда концентрация его в прикорневой зоне достаточно велика.
В этот период параллельно с усвоением азота растениями
протекают процессы иммобилизации и денитрификации,
приводящие в итоге к снижению содержания доступных форм его в
почве. Как иммобилизация, так и в особенности
денитрификации наиболее активно протекает в ризосфере растений. При
этом чем более высокой биологической активностью обладает
почва, тем интенсивнее идут указанные процессы и тем
быстрее в ней будет исчерпан запас готового азотного питания,
вследствие чего начнется активизация ассоциативной
азотфиксации. Очевидно, что растения, получившие большую азотную
подкормку в начальный момент развития и сформировавшие
за счет этого более мощный фотосинтетический аппарат, будут
способны затем мобилизовать азот воздуха в больших масшта-?
бах, нежели растения без подкормки или при меньших дозах.
Соответственно чем выше уровень ассоциативной
азотфиксации, тем больше доля «биологического» азота в урожае и
ниже доля азота удобрений.
Кроме активизации процесса азотфиксации при усилении
116

фотосинтеза возхможен также и другой путь мобилизации
азота в ризосфере растений: усиление минерализации
органического вещества почвы. В известной нам литературе нет
прямых указаний об усилении минерализации гумуса при
развитии растений. Тем не менее имеется ряд косвенных
доказательств такой возможности.
В последнее время установлено широкое распространение
явления кометаболизма — способности микроорганизмов
активно разрушать обычно труднодоступные для них соединения
при наличии легкодоступного субстрата (Скрябин, Головлева,
1976). Предполагается, что оно играет важную роль в
круговороте веществ в природе и имеет большую экологическую
значимость. Именно по принципу кометаболизма может
'протекать разрушение гумуса в почве при обогащении ее
легкодоступным косубстратом — корневыми выделениями и корневым
опадом. Образовавшийся ib итоге сложных биохимических и
химических процессов почвенный гумус обычно устойчив к
действию микроорганизмов, и его количество в почве остается
сравнительно постоянным <как результат динамического
равновесия процессов синтеза и распада. Но такое равновесие
может легко смещаться в сторону усиления распада при наличии
легкодоступного для почвенных микроорганизмов
органического субстрата. Об этом свидетельствует хорошо известное
явление энергичного разрушения гумусовых соединений почвы при
внесении в нее даже относительно небольшого количества
легкоусвояемых органических веществ — глюкозы, сахарозы,
зеленого удобрения и др., получившее название «затравочного
эффекта» («priming effect»). Наиболее важно с
рассматриваемых позиций то, что в результате усиленной минерализации
органического вещества почвы в ризосфере в периоды активного
роста растений связанный, малоподвижный азот гумуса пере-
ходит <в состояние более подвижное и может быть
использован растением. Азотсодержащие соединения гумуса
представлены преимущественно аминокислотами (20—40% от общего
азота) и аминосахарами (5—10%). В процессе
микробиологической трансформации гумуса, скорость и масштабы которого
определяются интенсивностью корневой экссудации и
корневого опада, указанные соединения могут перейти в состав
^фракции легкогидролизуемого, подвижного азота. Эта фракция
органического вещества почвы содержит питательные "вещества
<в наиболее доступной для растений форме и поэтому широко
используется ныне для диагностики плодородия почвы. Азот
в ее еоставе представлен в основном аммонием,
аминокислотами и их амидами, аминосахарами (Умаров, Асеева, 1971).
Как уже отмечалось, массированное поступление углеродсо-
держащего субстрата в прикорневую зону растений в виде
корневого опада и корневых выделений является главным
условием активной мобилизации азота в системе
«почва—микроорганизм—растение». Она может осуществляться по следую-
117

щим двум основным направлениям: 1) поступление азота
атмосферы в результате активизации ассоциативной азотфикса-
ции; 2) минерализация органического вещества почвы в
прикорневой зоне (рис. 29).
Все другие источники азота (атмосферные осадки, пыль и
др.) не учитываются в рассматриваемой схеме как играющие
подчиненную роль и не связанные прямо с деятельностью
микроорганизмов.
Обе указанные возможности могут быть реализованы
только при наличии в почве большого количества легкодоступного
энергетического субстрата. Однако «включение» того или дру-
Свет, С0о X
РИЗОПЛАНА
I ( УГЛЕВОДЫ \я
и
С БЕЛКИ ]4
::::
КОРНЕВЫЕ ВЫДЕЛЕНИЯ LlV/ БАКТЕРИИ- \:::
(МУЦИГЕЛЬ) И ОПАД £у*\ ДИА30ТР0ФЫ }.:::
::::
АЗОТ ПОДВИЖНЫЙ
(аминокислоты,
аминосахара и др.)
l^f БАКТЕРИИ- \:::
^Ч минерализаторы 1:::
ГУМУС ПОЧВЫ
Рис. 29. Схема мобилизации азота в системе «почва—микроорганизмы—
растение»
того процесса и их эффективность с точки зрения обогащения
почвы доступным для растений азотом определяются в первую
очередь концентрацией подвижных соединений азота в
прикорневой зоне.
При наличии в этой зоне большого количества
легкодоступного азота (например, лри внесении азотных удобрений)
корневая система растений и почвенные микроорганизмы
используют его в виде главного источника. При этом наряду с
интенсивной иммобилизацией микроорганизмы ризосферы
будут активно осуществлять и денитрификацию, расходуя для
этого энергию корневых выделений и корнепада.
Из-за снижения концентрации легкодоступных форм азота
в прикорневой зоне постепенно активизируется азотфиксирую-
щии аппарат бактерий. Фотосинтетический аппарат растений
должен к этому времени не только обеспечивать энергией
потребности самого растения, но и часть ее транспортировать а
118

прикорневую зону как ответную реакцию на ухудшившиеся
условия азотного питания.
Таким образом, по мере усиления фотосинтетической
деятельности растений и увеличения количества поступающих в
почву легкоусзояемых микроорганизмами веществ
активизируется процесс минерализации гумуса и освобождения
связанного »в его составе азота. После отмирания растений и
поступления их азотсодержащих остатков в почву равновесие
восстанавливается за счет преобладания процесса гумификации.
Общий баланс азота в системе «почва—растение» остается при
этом неизменным, как «например в климаксных экосистемах.
Следовательно, активная фотосинтетическая деятельность
растений вызывает активизацию микроорганизмов — азотфик-
саторов и минерализаторов в ризосфере, обеспечивая в итоге
усиление притока доступных форм азота к корням растений.
Азотные удобрения, повышая фотосинтетическую активность
растений, способствуют и повышению роли «биологического»
азота в формировании урожая. В определенных условиях
азотное удобрение может рассматриваться уже не как основной,
ведущий фактор в этом процессе, а как своего рода
«стартовый азот» для растений, роль которого известна для микро-
организмов-диазотрофов. Оптимизация водного и теплового
режимов почв, активное регулирование концентрации
углекислоты в атмосфере над растениями могут позволить в
сочетании с другими приемами интенсификации фотосинтеза решить
проблему азотного питания растений за счет использования
экологических саморегулирующихся механизмов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Изучение особенностей ассоциативной азотфикса-
ции привело к выводу, что биологическая азотфиксация имеет
существенно большее значение для функционирования
наземных экосистем, чем это предполагалось ранее. Главной
причиной недооценки размеров ее было несовершенство методов
определения полевой активности азотфиксации, не
позволявших учесть влияния растений на активность диазотрофных
бактерий. Для определения размеров ассоциативной
азотфиксации недостаточно единичных измерений уровня ее полевой
активности без учета влияния растений. Неправомерно также
судить об актуальной скорости фиксации азота но
потенциальной активности азотфиксации в нарушенных почвенных
образцах малого объема. Для оценки масштабов ассоциативной
азотфиксации необходимо многократное определение уровня
процесса в течение вегетационного периода с учетом влияния
растений и других экологических факторов на деятельность
бактерий-диазотрофов. Имеющиеся методы позволяют более
полно выявлять активность ассоциативной азотфиксации в
ризосфере и филлоефере, поскольку определения могут
проводиться непосредственно в поле, в условиях, максимально
приближенных к естественным. За счет ассоциативной
азотфиксации в фитоплан луговых и зерновых злаков в зоне
умеренного климата поступает от 30 до 40 кг азота на гектар за
вегетационный период, тогда как в почве без растений (черный
пар, междурядья в посевах, кальвиции среди дикорастущей
растительности и пр.) активность несимбиотической
азотфиксации не превышает 10—13 кг/га/год. Растения стимулируют
деятельность диазотрофных бактерий и определяют суточную
и сезонную динамику ассоциативной азотфиксации. Наиболее
важную роль в стимуляции играют продукты экзоосмоеа и
корневой опад, являющиеся энергетическим субстратом для
диазотрофных микроорганизмов фитоплана, а также высокая
поглотительная деятельность корней, способствующая
быстрому оттоку азотсодержащих продуктов метаболизма бактерий
и поддерживающая высокую активность нитрогеназы.
Метаболиты азотфиксирующих бактерий, главным образом
аминокислоты, аминосахара и продукты их частичной
аммонификации, могут потребляться растениями в качестве
дополнительного, а возможно, и ведущего источника азота.
120

Помимо влияний растений на уровень ассоциативной азот-
фиксации оказывает действие сложный и динамичный комплекс
других экологических факторов. Для прикорневой зоны
наибольшее значение имеет влажность почвы, для филлосферы —
температура и влажность .воздуха, освещенность растений.
Оптимальный уровень влажности для роста и развития растений
примерно соответствует ее оптимуму и для ассоциативной
азотфиксации, что может иметь большое практическое
значение для повышения обеспеченности растений «биологическим»
азотом. Среди других факторов среды большое влияние на
активность ассоциативной азотфиксации оказывает
концентрация углекислоты в атмосфере; регулируя ее содержание,
можно влиять на обеспеченность растений «биологическим» азотом.
Минеральные азотные удобрения являются мощным фактором
повышения не только фотосинтетичеокой деятельности
растений, но и увеличивают продуктивность ассоциативной
азотфиксации из-за тесного сопряжения процессов фотосинтеза и
азотфиксации, имеющего место в фитоплане растений.
Минеральные азотные удобрения играют роль «стартового» азота,
обеспечивающего «запуск» и активное функционирование
экологически саморегулирующегося механизма азотного питания
растений. Продукты экзоосмоса и корневой опад
рассматриваются при этом не как непроизводительные потери
энергетического субстрата, а как 'важный компонент межорганизменного
обмена метаболитов, играющего ведущую роль в
существовании и устойчивости природных экосистем. На наличие такого
механизма указывает автономность большинства естественных
экосистем в отношении источников азотного питания.
Смешанные азотфиксирующие культуры микроорганизмов,
наиболее важным общим свойством которых является
повышенная азотфиксирующая активность и высокая устойчивость
к факторам внешней среды и к конкуренции со стороны других
групп микроорганизмов, составляют основную часть
микробного населения ризосферы и филлосферы. В состав их наряду
с прокариотами-азотфиксаторами могут входить и эукариоты —
грибы и дрожжи. Смешанные культуры микроорганизмов
обладают повышенной активностью азотфиксации, вероятно,
благодаря полному использованию молекулярного водорода при
межвидовом переносе его внутри таких ассоциаций, а
взаимообусловленность процессов азотфиксации и выделения
водорода является важным экологическим условием существования
азотфиксирующих ассоциаций в природных условиях.
Раскрытие основных экологических механизмов
функционирования саморегулирующейся системы
«почва—микроорганизмы—растения» позволяет за счет оптимизации
водно-воздушного режима почв и доз применяемых азотных удобрений, а
также путем направленного изменения концентрации
углекислоты повысить долю «биологического» азота , в растительной
продукции, способствуя тем самым ее удешевлению и
(выполнению многих требований охраны окружающей среды.

ЛИТЕРАТУРА
Аксенов С. И. Состояние воды и ее роль в динамике биологических
структур. — Автореф. докт. дис. М., 1979, с. 49.
Асеева И. В., Умаров М. М. Свободные аминокислоты почвенных
микроорганизмов. — В кн.: Микробные метаболиты. М., 1979, с. 102—112.
Бабьева И. П., Моавад X., Марченко А. И. Азотфиксация в
совместных культурах липомицетов с бактериями. — Микробиология, 1977,
т. 46, вып. 2, с. 270—273.
Бабьева И. П., Садыков Б. Ф. Об отсутствии азотфиксирующей
активности у эпифитных дрожжей. — Микробиология, 1980, т. 49, вып. 1,
с. 177—179.
Берестецкий О. А. Роль культурных растений в формировании
микробных сообществ почв. — Автореф. докт. дис. М., 1982, с. 297.
Б о б р и ц к а я М. А., Москаленко Н. Н., Бойко Т. А. Пути
превращения азотных удобрений в темно-серых лесных почвах. — Агрохимия,
1975, № 7, с. 3—14.
Бражник С. П., Полеско Ю. А. Азот удобрения и почвы в
питании озимой пшеницы. — Агрохимия, 1977, № 12, с. 3—9.
В а н ч у р а В., Л а с и к Я., Дебр явная И. Е. Полисахариды в
ризосфере растений. — Микробиол. ж., 1979, вып. 4, с. 343—346.
Веденина И. Я., Лебединский Н. А. Превращения закиси азота
при денитрификации, диссимиляционном образовании аммония и
нитрификации. — Успехи микробиологии, 1984, т. 19, с. 135—165.
Гильманов Т. Г., Рыжова И. М. Имитационная модель
круговорота азота в экосистеме суходольного луга. — Изв. АН СССР. Сер. биол.,
1982, № 5, с. 670—685.
Глазов М. В. Структура и особенности функционирования биоты
ельников южной тайги Валдая. — В кн.: Организация экосистем ельников
южной тайги. М., 1979, с. 10—29.
Г о д о в а Г. В., Н и ц э Л. К., М о т о р и н а М. Л. Фотосинтез растений
и несимбиотическая фиксация азота в корневой зоне. — Изв. ТСХА, 1983,
№ 1, с. 117—120.
ГолимбетВ. Е., Звягинцев Д. Г. Методы изучения
пространственных и временных колебаний численности микроорганизмов в почве. —
В кн.: Микроорганизмы как компонент биогеоценоза. М., 1984, с. 127.
Гочелашвили 3. А. Фиксация свободного азота в почве и на корнях
цитрусовых деревьев в субтропиках Грузинской ССР. — Микробиология, 1978,
■т. 48, вып. 5, с. 860—865.
Гродзинский А. М. Основы химического взаимодействия растений.
Киев, 1973, с. 200.
Гуревич С. М. Действие минеральных удобрений на мощном
черноземе. М., 1962, с. 127.
Дарт П. Д., Дэй Д. М. Несимбиотическая азотфиксация в почве. —
В сб.: Почвенная микробиология. М., 1979, с. 275—306.
Данилова М. Ф. Структурные основы поглощения веществ корнем.
Л., 1974, с. 206.
Дегерменджи А. Г., Печуркин Н. С, Фуряева А. В. Анализ
взаимодействия двух микробных популяций по типу комменсализма в
непрерывной культуре. — Экология, 1978, № 2, с. 91—94.
Долгих Ю. Р., Грачева Н. П. Микрофлора ризосферы риса и ее
122

связь с корневыми выделениями. — В сб.: Повышение плодородия почв
рисовых полей. М., 1977, с. 114—120.
Егоров В. И. Биологическая фиксация азота в подзолистых почвах
Кольского полуострова. — В сб.: Экологические последствия применения аг~
рохимикатов (удобрения). Пущино, 1982, с. 20—21.
Егорова С. В. Калининская Т. А. Активность фиксации азота в
песчаных почвах сосновых культур. — Лесоведение, 1980, № 4, с. 71—73.
Е м ц е в В. Т. Почвенные анаэробные азотфиксаторы рода Clostridium. —
Успехи микробиологии, 1974, вып. 9, с. 153—182.
Е м ц е в В. Т. Микроорганизмы и регулирование их деятельности в
почве. — Изв. ТСХА, 1982, вып. 6, с. 104—114.
Жученко А. А. Адаптивная стратегия в интенсивном
растениеводстве. — Природа, 1982, № 12, с. 100—104.
3 а х а р ч е н к о И. Г., К р и к у н е ц В. М. и др. Количественная оценка
прихода азота за счет симбиотической и несимбиотической фиксации в почвах
Украины. — В сб.: Экологические последствия применения агрохимикатов
(удобрения). Пущино, 1982, с. 22—23.
Звягинцев Д. Г. Некоторые концепции строения и функционирования
комплекса почвенных микроорганизмов. — Вестн. Моск. ун-та. Сер.
почвовед, 1978, № 4, с. 48—56.
Звягинцев Д. Г. Почвенные микроорганизмы как компонент
биогеоценозов- — В сб.: Микроорганизмы как компонент биогеоценоза. Алма-Ата,
1982, с. 6—7.
Звягинцев Д. Г., П итрюк А. П., Судницын И. И. Дыхание
микроорганизмов в модельных пористых системах. — Почвоведение, 1974„
№ 8, с. 131—136.
Зубенко В. Ф., Шиян П. Н., Корниенко А. Д., Донцов М. В.
Использование растениями азота и вьшывание его лизиметрическими
водами. — Агрохимия, 1978, № 3, с. 3—9.
Зубко И. К., Серегин М. С, Чундерова А. И., Та щи ев С. С.
Роль несимбиотических азотфиксаторов в азотном балансе почв. —
Микробиология, 1979, 48, вып. 1, с. 114—117.
Имшенецкий А. А., Солнцева Л. И. Симбиоз целлюлозных и
азотфиксирующих бактерий. — Микробиология, 1940, т. 9, вып. 9—10„
с. 783—785.
Калакуцкий Л. В., Пар и иска я А. Н. Азотфиксирующие
симбиозы *актиномицетов с растениями. — Изв. АН СССР. Сер. биол., 1982, № 2,
с. 255—265.
Калининская Т. А. Методы выделения и культивирования
азотфиксирующих ассоциаций. — Микробиология, 1967, т. 36, вып. 2, с. 345—349.
Калининская Т. А. Несимбиотическая азотфиксация в почвах
рисовых полей Советского Союза. — В сб.: Экологические последствия
применения агрохимикатов (удобрения). Пущино, 1982, с. 23—24.
Калининская Т. А., Миллер Ю. М., Култышкина И. Т.
Изучение азотфиксирующей активности почв разного типа с помощью 15N2. —
В сб.: Применение стабильного изотопа 15N2 в исследованиях по земледелию.
М., 1973, с. 55—61.
Калининская Т. А., Миллер Ю. М., Белов Ю. М., Р а о В. П.
Изучение с помощью 15N активности несимбиотической азотфиксации в
почвах рисовых полей Краснодарского края. — Изв. АН СССР. Сер. биол. наук,
1977, № 4, с. 565—570.
Клингмюллер В., Бахейтел Дж., Хоманн А. Генетическое
манипулирование с признаком азотфиксации у почвенных бактерий. — В кн.:
Молек. основы генет. процессов. М., 1981, с. 239—247.
К о в д а В. А. Советское почвоведение на службе сельского хозяйства
СССР. Тбилиси, 1981, с. 106.
Кондратьева Е. Н. Образование микроорганизмами молекулярного
водорода. — В сб.: Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе.
М., 1979, с. 131—160.
Кондратьева Е. Н., Гоготов И. Н. Молекулярный водород в
метаболизме микроорганизмов. М., 1981, с. 225.
123

К о н о н к о в Ф. П., У м а р о в М. М., М и р ч и н к Т. Г. Азотфиксирую-
щие ассоциации грибов с бактериями. — Микробиология, 1979; т. 48, вып. 4,
с. 437—439.
К о р д ю м В. А. Биологическая азотфиксация. Проблемы и
перспективы. — Молекул, биол., (Киев), 1982, № 30, с. 45—57.
Костычев С. П., Ш е л о у м о в а А. М., Шульгина О. М.
Микробиологическая характеристика южных почв. — Тр. с.-х. ин-та. Л., 1926, т. 1,
с. 5—17.
Краен льни ков Н. А., Асеева И. В., Бабьева И. П. и др.
Аминокислоты из микроорганизмов. — Успехи соврем, биол., 1961, т. 52, вып. 2,
с. 149—158.
Кудеяров В. Н. Интенсивность процессов азотного цикла в почве при
применении азотных удобрений. — Изв. АН СССР. Сер. биол., 1982, № 5,
с. 660—669.
Кур а ко в а Н. Г., Ум аров М. М. Роль денитрификации в азотном
балансе почв. — Агрохимия, 1984, № 5, с. 118—129.
Кур санов А. А. Транспорт ассимилятов в растении. М., 1976, с. 645.
Либберт Э. Физиология растений. М., 1976, с. 315.
Л ьвов Н. П. Энзиматические механизмы питания бобовых растений
связанным и атмосферным азотом. — В сб.: Экологические последствия
применения агрохимикатов (удобрения). Пущино, 1982, с. 27—28.
Львов Н. П., Любимов В. И. Изучение физиологии новой азотфик-
сирующей микобактерии. — Изв. АН СССР. Сер. биол., 1965, № 2, с. 250—
256.
Львов Н. П., Сергеев Н. С, Кретович В. Л. Регуляция
активности нитрогеназы у микроорганизмов. — Изв. АН СССР. Сер. биол., 1976, №4,
с. 531—545.
Макаров Б. Н., Патрикеева Т. А. Роль азота в земледелии
дерново-подзолистых почв. М., 1974, с. 72—77.
Малишевская В. А. Динамика опада и скорость его
минерализации. — В сб.: Структура и продуктивность еловых лесов южной тайги. Л.,
1973, с. 75—89.
М а н д е в а Р. Д., Ермакова И. Т., Л о з и н о в А. Б. Экскреция
метаболитов дрожжами при дефиците источников С или N в средах с
различными источниками углерода. — Микробиология, 1981, т. 50, вып. 1, с. 62—68.
Мамилов Ш. 3. Азотфиксирующие ассоциации с Rhodopseudomonas sp.
в затопляемых почвах под рисом. — В кн.: Повышение плодородия почв
рисовых полей. М., 1977, с. 116—122.
М и н е е в В. Г., Шевцова Л. И. Влияние длительного применения
удобрений на гумус почвы и урожай культур. — Агрохимия, 1978, № 7,
с. 134—140.
Мирчинк Т. Г., Г е н д ж и е в М. Г., Судницын И. И. Устойчивость
грибов разных местообитаний к различной активности влаги. —
Почвоведение, 1978, № 6, с. 48—53.
Мишустин Е. Н. Круговорот азота и его соединений в природе. —
В кн.: Роль микроорганизмов в круговороте газов в природе. М., 1979, с. 68.
Мишустин Е. Н. Пути улучшения азотного баланса пахотных почв
СССР и выполнение Продовольственной программы. — Изв. АН СССР. Сер.
биол., 1983, № 3, с. 325—344.
Мишустин Е. Н,, Ш и л ь н и к о в а В. К. Биологическая фиксация
атмосферного азота. М., 1968, с. 325.
Мишустин Е. Н., Черепков Н. И. Биологический азот в
земледелии СССР. — Изв. АН СССР. Сер. биол., 1976, № 3, с. 325—344.
Мишустин Е. Н., Калининская Т. А., Петрова А. Н. Влияние
альголизации на урожай риса. — В сб.: Повышение плодородия почв
рисовых полей. М.,, 1977, с. 204—222.
Мишустин Е. Н., Черепков Н. И., Калининская Т. А. О не-
симбиотической азотфиксации в пахотных почвах. — В сб.: Проблемы
почвоведения. М., 1978, с. 92—96.
Молчанов А. А. Продуктивность органической массы в лесах
различных зон. М., 1975, с. 250.
124

Новогрудская Е. Д., Чекасина Е. В., Макеева А. М.,
Леонтьева Г. В. Азотбактерин как средство снижения пораженности
растений болезнями. — Препараты микробиол. синтеза. М., 1981, с. 109—114.
О д у м Ю,. Основы экологии. М., 1975, с. 740.
Петербургский А. В. Круговорот и баланс питательных веществ в
земледелии. М., 1979, с. 120.
Петербургский А. В. Азот в современном земледелии. — В сб.:
Экологические последствия применения агрохимикатов (удобрения). Пущино,
1982, с. 3—4.
Печуркин Н. С. Смешанные проточные культуры микроорганизмов.
М., 1981, с. 200.
Работнов Т. А. Фитоценология. М., 1978, с. 131.
Работнов Т. А. Экология луговых трав. М., 1985, с. 176.
Р е м п е Е. X. Рост бактерий в условиях накопления корневых
выделений. — Сельскохоз. биология, 1967, т. 2, вып. 4, с. 592—597.
Родынюк И. С, Клевенская И. Л. Симбиотическая фиксация
азота травянистыми растениями Сибири. — В сб.: Проблемы сибирского
почвоведения. М., 1977, с. 200—213.
Родынюк И. С, Клевенская И. Л. Азотфиксирующие системы с
участием клубеньковых бактерий небобовых растений. — Тез. VI съезда
ВМО. Рига, 1980, т. 5, с. 47—48.
Сапожников Н. А. Трансформация азота удобрений в
дерново-подзолистых почвах. — В сб.: Динамика микробиологических процессов в почве,
ч. I. Таллин, 1974, с. 51—55.
Сапожников Н. А., Корнилов М. Ф. Научные основы системы
удобрения в Нечерноземной полосе. Л., 1977.
Сирота Л. Б. Факторы, определяющие поступление почвенного азота
в растение при внесении азотных удобрений. — В сб.: Применение
стабильного изотопа 15N в исследованиях по земледелию. М., 1973, с. 166—177.
Судницын И. И., Движение почвенной влаги и водопотребление
растений. М, 1979, с. 195.
С ы т н и к К. М., Книга Н. М., Мусатенко Л. И. Физиология
корня. Киев, 1972, с. 225.,
Тикк Э., СильвереА. П. Связь микроорганизмов с корневыми
клубеньками травянистых небобовых растений на основе их гистологии и ультра-
ютруктуры. — Изв. АН ЭССР. Сер. биол., 1982, № 2, с. 150—161,
Т и т л я н о в а А. А., К и р ю ш и н В. И., Охинько И. П. и др.
Круговорот углерода и азота в агроценозах на южных черноземах Казахстана. —
Изв. Сиб. отд. АН СССР. Сер. биол., 1979, № 15/3, с. 23—29.
Тохвер В. Н., Наруск Л. О значении биотических факторов в
динамике и балансе почвенного азота. — В сб.: Экология и физиология
микробиологических превращений азота. Тарту, 1972, с. 215—221.
Т у р ч и н Ф. В. Азотное питание растений и применения азотных
удобрений. — Избр. тр. М., 1972.
У м а р о в М. М. Ацетиленовый метод изучения азотфиксации в почвенно-
микробиологических исследованиях. — Почвоведение, 1976, № 11, с. 92—95.
У м а р о в М. М. Значение несимбиотической азотфиксации в балансе
азота в почве (обзор). — Изв. АН СССР. Сер. биол., 1982, № 1, с. 92—105.
Ум аров М. М., Асеева И. В. Свободные аминокислоты почв
основных типов СССР. — Почвоведение, 1971, № 10, с. 55—59.
У м а р о в М. М., К у р а к о в а Н. Г., Зуева Л. Д. Методы изучения
азотфиксации и денитрификации в почве. — В кн.: Микроорганизмы как
компонент биогеоценоза. М., 1984, с. 107—119.
Федорова Р. И., М- и л е х и н а Е. И. Применение С2Н2 для изучения
взаимодействия денитрифицирующих и азотфиксирующих микроорганизмов.—
В сб.: Всесоюз. V съезд микробиол. об-ва. Тез. докл., 1975, Ереван, с. 16—17.
Чундерова А. И., Зубко И. К., Князева В. Л. Влияние физико-
химических факторов среды на численность и активность азотфиксирующих
микроорганизмов. — В сб.: Динамика микробиологических процессов в
почве. Таллин, 1974, ч. II, с. 14—17.
Чундерова А. И., Зубко И. К., Т а щ и е в С. С. К методике расче-
125

тов продуктивности несимбиотической азотфиксации в почве. — Бюллетень
ВНИИ с.-х. микробиол., 1979, № 31, с. 15—16.
Ш а б а е в В. П. Влияние различных доз азотного удобрения на
мобилизацию азота серой лесной почвы. Автореф. канд. дис. М., 1981, с. 21.
Шабаев В. П., Умаров М. М., Смолин В. Ю. Усвоение
фиксированного микроорганизмами азота атмосферы небобовыми и бобовыми
растениями. — Тез. Всесоюз. симпоз. «Метаболизм углерода и азота при
фотосинтезе». Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1985, с. 67—68.
Шатилов И. С., Вербицкая Н. М. Фотосинтетическая деятельность
злаковых многолетних трав при сенокосном использовании. — Изв. ТСХА,.
1973, № 3, с. 4$—54.
Allen О., М с С а 11 а Т., Norman A. Terms relating to rhizosphere. —
Proc. Soil Sci. Amer., 1950, N 15, p. 429—432.
Ambrozova M. Microbialni plazma jako potencialni zdroj vyzivy rost-
lin. — Rostlin vyroba, 1979, vol. 25, N 4, p. 333—342.
Austin S., Galonsky A., Bortins J. A batch process for the
production of 13N-labelled nitrogen gas. — Nucl. Instr. Methods, 1975, N 126„
p. 373—379.
Bailey L. Effect of temperature and root on denitrification in soil. —
Can. J. Soil Sci., 1976, vol. 56, N 2, p. 79—85.
Balandreau J. Mesure de l'activite nitrogenasique des.
microorganisms dans la rhizosphere des quelques graminees. — Rev. Ecol. Biol. Sol., 1975„
N 12, p. 273—290.
Balandreau J., Willemin G. Fixation biologique de l'azote mole-
culaire en savanne de Lamto. — Rev. Ecol. Biol. Sol., 1973, N 10, p. 25—33.
Balandreau J., Dommergues Y. A new method of assaying nitro-
genase activity in the field. — Bull. Ecol. Res. Comm., 1973, N 17, p. 247—
253.
Balandreau J., Dommergues Y. Associative nitorgen-fixing
symbiosis. — Eur. Semin. Biol. Solar Conver. Syst., Grenoble, 1977, p. 1—20.
Balandreau J., Miller C, Dommergues Y. Diurnal variations
of nitrogenase activity in the field. — Appl. Microbiol., 1974, N 27, p. 662—665.
Balandreau J., Umarov M., Dommergues Y., Rinaudo G.
Asymbiotic N2-fixation in paddy soil. — Proc. 1-st Intern. Symp. N2-fixation.
Pullman, USA. Wash. Univ. Press, 1976, p. 111—135.
Baltensperger A., Schank S., Smith R. Effect of inoculation with
Azospirillum and Azotobacter on Turf-type Bermuda genotypes. — Crop Sci.,
1978, vol. 18, N 6, p. 1043—1045.
Barber D., Martin J. The release of organic substances by cereal roots
into soil. — New Phytol., 1976, vol. 76, N 1, p. 69—80.
Barber L., Evans II. Characterization of a N2-fixing bacterial strains
frcm roots of Digitaria. — Can. J. Microbiol., 1976, vol. 22, N 2, p. 254—260.
Barber L., Tjepkema J., Evans H. Acetylene reduction in the root
environment of some grasses and other plants in Oregon. — Ecol. Bull., 1978,
N 26, p. 388—391.
Barber L., Russel S., Evans H. Inoculation of millet with
Azospirillum. — Plant and Soil, 1979, N 52, p. 49—57.
Barraquio W., Watanabe I. Population of aerobic heterotrophic
nitrogen—fixing bacteria associated with wetland and dryland rice. — Appl.
Environ. Microbiol., 1982, vol. 43, N 1, p. 124—128.
Basilier K., Granchall U., Stenstrom T. Nitrogen fixation in
wet mineratrophic moss communities of a subarctic mire. — Oikos, 1978,
vol. 31, N 2, p. 236—240.
Benneth R., Lynch J. Bacterial growth and development in the
rhizosphere of gnotobiotic cereal plants. — J. Gen. Microbiol., 1981, N 125,
p. 95—102.
Bentley В., Carpenter E. Effect of dessication and rehydration orr
nitrogen fixation by ephyphylls. — Microb. Ecol., 1980, N 6, p. 109—113.
Bessems E. Nitrogen fixation in the phyllosphere of Gramineae. — Ag-
ric. Res. Report. Wageningen, 1973, p. 66—75.
126

Billington M., Alexaader V. Nitrogen fixation in a black spruce
forest in Alaska. — Ecol. BulL, 1978, N 26, p.: 209—215. . Г; .
В r i s t о w J. Nitrogen fixation in the rhizosphere of fresh-water angios-
perms. — Can. J. Bot., 1974, N 52, p. 217—221.
Broadbent F. Methodology for nitrogen transformation and balance in
soil. — Plant and Soil, 1981, vol. 58, N 1, p. 383—399.
В г о u z e s R., L a s i к J., Knowles R. The effect of organic amendment,
water content and oxygen on the incorporation of 15N2 by some agricultural
and forest soils. — Can. J. Microbiol., 1969, vol. 15, N 8, p. 889—905.
Brouzes R., Knowles R. Kinetics of nitrogen-fixation in a gluco-
seamended anaerobically incubated soil. — Soil Biol. Biocherru, 1973, vol. 5,
N 2, p. 223—229.
Caldwell В., Hagedorn C, Denison W. Bacterial ecology of an
oldgrowth douglas fir canopy. — Microb. Ecol., 1979, vol. 5, N 2, p. 91—103.
Capone D., Teylor B. N2-fixation in the rhizosphere of Thalassia tes-
tudinum. — Can. J. Microbiol., 1980, vol. 26, N 8, p. 998—1005.
Chaboud A., Rougier M. Secretions racinaires mucilagineuses et
role dans la rhizosphere. — Annee biologique, 1981, vol. 20, N 4, p. 313—326.
Chapman R., Hemond H. Dinitrogen fixation by surface peat and
Sphagnum in an ombrotrophic bog. — Can J. Bot., 1982, vol. 60, N 5,
p. 538—543.
Charyulu P., Ramakrishna C, Rao V. Facultative symbiotrophic
nitrogen fixing associations in rice soils of India. — Proc. Indian Acad. Sci.,
1978, vol. 87, N 10, p. 243—246.
Chen JR., Keen e у D., К о n r a d J. Gas production in sediments of
lake Mendota. — J. of Environ. Quality, 1972, N 1, p. 155—159.
Cohran V., Elliot L., Papendick R. Nitrous oxide emissions from
a fallow field fertilized with anhydrous ammonia. — Soil Sci. Soc. Amer. J.,
1981, vol. 45, N 2, p. 307—310.
Coleman D. A review of root production processes and other influence
•on soil biota in terrestrial ecosystems. — In: The role of terrestrial and
aquatic organisms in decompositions processes. Oxford, 1976, p. 417—445.
Dart P., Day J. Nonsymbiotic nitrogen fixation in soil. — Soil
microbiology. London—Boston, 1975, p. 221—248.
Dart P., Wani S. Nonsymbiotic nitrogen fixation and soil fertility. —
Nonsymbiotic nitrogen fixat. and org. matter. 12 Congr. ISSS, New Delhi, 1982,
vol. 1, p. 3—27.
David K., Fay P. Effects of long-term treatment with acetylene on
nitrogen—fixing microorganisms. — Appl. Environ. Microbiol., 1977, vol. 34, N 6,
p. 640—646.
Day J., Harris D., Dart P. Nitrogen fixation by free—living
organisms. — Cambridge Univ. Press, 1971, p. 255.
D а у J., Harris D., Dart P. The Broadbalk experiment. An
investigation of nitrogen gains from nonsymbiotic nitrogen fixation. — Nitrogen
Fixation by Free—living microorganisms. London, 1975, p. 71—84.
D e В о n t J. Oxydation of ethylene by soil bacteria. —- Antonie van Leeu-
wen., 1976, N 42, p. 59—71.
D i 1 w о r t h M. Acetylene reduction by nitrogen—fixing preparations from
Clostridium pasteurianum. — Biochim. Biophys. Acta, 1966, N 127, p. 285—294.
Dobereiner J. Nitrogen fixation in grass—bacteria association in the
tropics, — In: Isotop. Biol. Dinitrogen Fixat. Proc, Vienna, 1978, p. 51—69.
Dobereiner J., Day J. Nitrogen fixation by free-living microorganisms.
London, Cambridge Univ. Press, 1975, p. 39—56.
Dobereiner J., Marriel I., Nery M. Ecological distributions of
Spirillum lipoferum. — Can. J. Microbiol., 1976, vol. 22, N 10, p. 1464—1473.
Dobereiner J., Boddey R. Association of Azospirillum and other
diazotrophic bacteria with tropical Gramineae. — In: Nonsymbiotic N2-fixat.
and Org. matter, 12 Congr. ISSS, New Delhi, 1982, vol. 1, p. 28—47.
Enwerson W. The mineralization of nitrogen and phosphorus in
organic materials of varying C/N and C/P rations. — Plant and Soil, 1976, vol. 44,
N 1, p. 75—80.
127

FAO production yearbook. 1981, p. 35.
F i 11 e г у J., V1 e к Р. The significance of denitrification of applied
nitrogen in fallow and cropped rice soils under different flooding regimes. — Plant
and Soil, 1982, vol. 65, N 2, p. 153—168.
Fleet R., R u d d J., Hamilton R. Acetylene reduction assays for
nitrogen fixation in freshwater: a note of caution. — Appl. Microbiol., 1975,
vol. 29, N 5, p. 580—583.
Granchall U., Lid-Torsvik V. Nitrogen fixation by bacteria and
free-living blue-green algae in tundra. — Ecol. Bull., 1975, N 16, p. 305—313.
Granchall U., Lindberg T. Nitrogen fixation in some coniferous
forest ecosystems. — Ecol. Bull., 1978, N 26, p. 178—192.
Graham J., Linderman R. Ethylene production by ectomycorrhizal
fungi. — Can. J. Microbiol., 1980, vol. 26, N 11, p. 1340—1347.
G i d d e n s J. Nitrogen fixation in soil crusts of tall fescue sods. — Soil
Sci., 1982, vol. 133, N 5, p. 295—297.
G i 11 e r K., Day J., Dart P., W a n i S. A method for measuring the
transfer of 15N2 to plants. — J. of Microb. Methods, 1984, vol. 2, N 6,
p. 307—316.
Gotto J., Teylor B. N2-fixation associated with decaying leaves of
the Red Mangrowe. — Appl. Environ. Microbiol., 1978, vol. 36, N 5,
p. 781—783.
Gupta В., Sen S. Meeting in the nitrogen requierements of crop plants
with phyllosphere N2-fixing microorganisms. — Sci. and Culture, 1976, vol.42,,
N 6, p. 329—332.
Hanson A., Edelman J. Secretion of photosynthetic products by
Carrot tissue cultures. — Planta, 1971, N 98, p. 87—108.
Hardy R., Burns R., Ho 1st en B. Application of the acetylene-ethylene
assay for measurement of nitrogen fixation. — Soil. Biol. Biochem., 1973„
vol. 5, N 1, p. 41—83.
Harris D., Dart P. Nitrogenase activity in the rhizosphere of Stachys
sylvatica and some other dicotyledenous plants. — Soil Biol. Biochem., 1973,
N 5, p. 277—279.
Havelka V., Hardy R. Further studies on a relationships between
photosynthetic carbon dioxide fixation and nitrogen fixation. — Proc. 1-st Intern.
Symp. N2-fixation. USA, Pullman. Wash. Univ. Press, 1976, p. 241—256.
Hegazi N., Monib M., V1 a s s а к К. Effect of inoculation with N2-
fixing Spirilla and Azotobacter on nitrogenase activity on roots of maize grown
under subtropical conditions. — Appl. Environ. Microbiol., 1979, vol. 38, N 4,
p. 621—625.
Hynes R., Knowles R. Effect of acetylene on autotrophic and
heterotrophic nitrification. — Can. J. Microbiol., 1982, vol. 28, N 3, p. 334—340.
Israel N., О к о n Y., Y i g a I H. Comparative studies of nitrogen-fixing
bacteria associated with grasses in Israel. — Can. J. Microbiol., 1980, vol. 26,
N 6, p. 714—718.
J a g n о w G. Nitrogen-fixing bacteria associated with gramineous roots
with special reference to Spirillum lipoferum. — Zbl. Pflanzen. und Bodenk.,
1979, vol. 142, N 3, p. 399—410.
Jensen H. Nonsymbiotic nitrogen fixation. — Amer. Soc. Agron. Mo-
nogr., 1965, N 10, p. 5—25.
Jones K. Nitrogen fixation in the phyllosphere of the Douglas-fir, Pseu-
dotsuga douglassii. — Ann. Botany, 1970, vol. 34, N 134, p. 239—244.
Jones K., King E., E a s 11 i с к М. Nitrogen fixation by free-living
bacteria in the soil and in the canopy of Douglas fir. — Ann. Botany, 1974,
vol. 38, N 156, p. 765—772.
Jones K., Wilson R. The fate of nitrogen fixed by a free-living blue-
green algae. — Ecol. Bull., 1978, N 26, p. 158—163.
Jorge n sen J., Wells C. Apparent nitrogen fixation in soil, influenced
by prescribed burning. — Soil Sci. Soc. Amer. Proc, 1971, N 35, p. 806—810.
Kanner L., Bartha R. Metabolism of acetylene by Nocardia rhodochro-
us. — J. Bacteriol., 1982, vol. 150, N 2, p. 989—992.
128

Katznelson H. The «rhizosphere effect» of mangles on certain groups
of soil microorganisms. — Soil Sci.,, 1946, vol. 62, N 5, p. 343—354.
Ketchenson J., Jacovlievic M. Effect of plant growth on
transformation of mineral nitrogen in soils. — Plant and Soil, 1970, vol. 32, N 1,
p. 254—257.
К n о w 1 e s R. The significance of nonsymbiotic nitrogen fixation. — Soil
Sci. Soc. Amer. Proa, 1965, vol. 29, N 2, p. 223—227.
К n о w 1 e s R. Effect of ammonium-, nitrite- and nitrate-nitrogen on de-
nitrification. — Microbiol. Rev., 1982, vol. 46, N 1, p. 43—70.
К о р о n e n M., Funke В., G a 1 i t z D. Enumeration of
acetylene-reducing bacteria in a temperate grassland. — Plant and Soil, 1980, vol. 57, N 2,
p. 399—405.
Larson R., N e a 1 J. Acetylene reduction by bacteria isolated from the
rhizosphere of wheat. — Soil Biol. Biochem., 1976, N 8, p. 151—155.
Lethbridge G., Davidson M., Sparling G. Critical evaluation
of the acetylene-reduction test for estimating the activity of nitrogen-fixing
bacteria associated with the roots of wheat and barley. — Soil Biol. Biochem.,
1982, vol. 14, N 1, p. 27—35.
L i m m e r A. Denitrification potentials: measurement of seasonal variation
using a short-term anaerobic incubation technique. — Soil Biol. Biochem.,
1982, vol. 14, N 3, p. 179—184.
Lustig В., Plischke W., Hess D. Nitrogenase activity in a trans-
filter culture of rhizobia with a non-leguminous plant callus culture; transfer
of fixed 15N2 from bacteria to Portulaca callus. — Experientia, 1980, vol. 36,
N 12, p. 1386—1387.
Lynch J. Ethylene production in soil. — Nature, 1975, 256, 5518,
p. 576—577.
Malik K., Schlegel H. Chemolithoautotrophic growth of bacteria able
grow under N2-fixing conditions. — FEMS Microbiol. Let., 1981, N 11,
p. 63—67.
Marsho Т., Burchard R., Fleming R. Nitrogen fixation in the
Rhode river estuary of Chesapeake Bay. — Can. J. Microbiol., 1975, vol. 21,
N 9, p. 1348—1356.
, Meyer R., Lindberg T. Epiphytic nitrogen fixation in a forest
ecosystem. — Abs. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1976, p. 171—178.
Mishustin E., Emtsev V. Anaerobic nitrogen fixation and plant
nutrition. — 12 Congr. ISSS, New Delhi, 1982, N 1, p. 48—53.
Moore A. Nonsymbiotic nitrogen fixation in soil and soil-plant systems.—
Soil and Fertil., 1966, vol. 29, N 2, p. 113—128.
N a n d i A., Sen A. Utility of Rhizobium in the phyllosphere of crop
plants: two—way exchange of metabolites between Rhizobium and the host
plant. — J. Agric. Sci., 1982, vol. 98, N 1, p. 179—182.
Nalewaiko C, Schindler D. Primary production, extracellular
release and heterotrophy in two lakes in the ELA, Northwestern Ontario. — J.
Fish. Res. Board Can., 1976, N 33, p. 219—226.
Nalewaiko C, Lee K-, Fay P. Significance of algal extracellular
products to bacteria in lakes and in cultures. — Microbiol. Ecol., 1980, N 6,
p. 199—207.
Nelson A., Barber L., Evans H. Nitrogen fixation associated with
grasses in Oregon. — Can. J. Microbiol., 1976, vol. 22, N 4, p. 523—540.
Nelson L., Knowles R. Effect of oxygen and nitrate on nitrogen
fixation and denitrification by Azospirillum brasilense grown in continuous
culture. — Can. J. Microbiol., 1978, vol. 24, N 11, p. 1395—1403.
Newman E. Root microorganisms: their significanse in the ecosystems.—
Biol. Revs Cambridge Phil. Soc., 1978, vol. 53, N 4, p. 511—554.
O'Gara F., Schanmugam K. Regulation of nitrogen fixation by
Rhizobia. Export of fixed N2 as NH4+. — Biochim. Biophys. Acta, 1976,
N 437, p. 313—321.
O'Gara F., Schanmugam K. Regulation of nitrogen fixation in
Rhizobia spp. Isolation of mutants of Rh. trifolii which induce nitrogenase
activity. — Biochim. Biophys. Acta, 1977, N 500, p. 277—290.
129

Окоп Y., Israel N., H e n i s Y. An increase in nitrogen content of
Serratia italica and Zea mays inoculated with Azospirillum. — Can. J.
Microbiol., 1980, vol. 26, N 4, p. 482—485.
Okuda A. Nitrogen fixation by Rhodopseudomonas sp. in association with
other bacteria. — Soil and Plant Food, 1960, vol. 6, N 1, p. 35—41.
О ' Т о о 1 P., Knowles R. Effect of ammonium, nitrite and
nitrate-nitrogen on anaerobic nitrogenase activity in soil. — Soil Biol. Biochem., 1973,.
vol. 6, N 6, p. 353—358.
О v i n g t о n J. Studies of the development of woodland conditions under
different trees. — J. Ecology, 1965, N 44, p. 171—178.
Patriquin D. Nitrogen fixation (acetylene reduction) associated with
cord grass. — Ecol. Bull., 1978, N 26, p. 20—27.
Patriquin D. Nitrogen fixation in the rhizosphere of marine angios-
perms. — Marine Biol., 1972, N 16, p. 49—58.
Payne W., Grant M. Influence of acetylene on growth of sulfate-respi-
ring bacteria. — Appl. Environ. Microbiol., 1982, vol. 43, N 3, p. 727—730.
Pedersen W., Chakrabarty P., KlukasR. Nitrogen fixation
associated with roots of winter wheat and sorghum in Nebraska. — Appl.
Environ. Microbiol., 1978, N 35, p. 129—135.
Post gate J. Nitrogen fixation. — Inst. Biol. Stud. Biol., 1978, N 92,.
p. 1—671.
Purschase B. Nitrogen fixation associated with Eichhormia crassipes.—
Plant and Soil, 1978, 46, 1, p. 283—286.
Remade J. Microbial transformation of nitrogen in forests. — EcoL
Plant., 1977, vol. 12, N 2, p. 33—43.
R e n n i e R. Dinitrogen-fixing bacteria: computer-assisted identification of
soil isolates. — Can. J. Microbiol., 1980, vol. 26, N 11, p. 1275—1285.
R e n n i e R. A single medium for the isolation of acetylene-reducing
bacteria from soils. — Can. J. Microbiol., 1981, vol. 27, N 1, p. 8—14.
Rennie D., Aulakh M., Paul E. Gaseous nitrogen losses from
cropped and summer-fallowed soils. — Can. J. Soil Sci., 1982, N 62, p. 187—196.
Richards B. Nitrogen fixation in the rhizosphere of conifers. — Soil
Biol. Biochem., 1973, N 5, p. 149—152.
Rinaudo G. Fixation biologique de l'azote dans trois types de sol de
rizieres. — These Doc. — Ing., Montpelier, 1970, p. 1—215.
Roskoski J. Comparative C2H2 reduction and 15N2 fixation in deciduous
wood litter. — Soil Biol. Biochem., 1981, vol. 13, N 1, p. 83—85.
Roswall Т.. Granchall U. Nitrogen cycling in a subarctic ombrotrop-
hic mire. — Ecol. Bull., 1980, N 30, p. 209—234.
Rovira A. Plant root exudates. — Bot. Rev., 1969, vol. 35, N 1,.
p. 35—57.
Ruin en J. The phyllosphere. 1. An ecological niglected milieu. — Plant,
and Soil, 1961, N 15, p. 81—109.
Ruschell A., Victoria R., Salati E. Nitrogen fixation in sugarcane
(Saccharum ojficinarum). — Ecol. Bull., 1978, N 26, p. 297—303.
R u d e n J., Lund L., L e t e у J., F о с h t D. Direct measurement of de-
nitrification loss from soils. — Soil Sci. Soc. Amer. J., 1979, N 43, p. 110—118.
Sauerbeck D., Johnen B. Der umsatz von pflanzenwurzeln imlaufe
der vegetationsperiode und dessen beitrag zur bodenatmung. — Zbl. Pflan-
zen. und Bodenkund., 1976, N 3, p. 315—328.
Sauerbeck D., Johnen B. Root formation and decomposition during
plant growth. — Soil Org. Matter Stud., 1977, N 1, p. 141—147.
Sauerbeck D., Helali H., Nonnen S. Consumption and turnover
of photosynthates in the rhizosphere depending on plant species and growth
conditions. — 12 Intern Congr. ISSS, New Delhi, 1982, vol. 1, p. 239—249.
Schollhorn R., Burris R. Acetylene as a competitive inhibitor of N2
fixation. — Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1967, N 58, p. 213—216.
Shamoot S., McDonald L., Bartholomew W. Rhizodeposition of
organic debris in soil. — Proc. Soil Sci. Soc. Amer., 1968, N 32, p. 817—825..
Shearman R., Pedersen W., Klukas R. Nitrogen fixation associa-
[30

ted with «Park Kentucky» bluegrass (Poa pratensis). — Can. J. Microbiol.,
1979, vol. 25, N 10, p. 1197—1200.
Smith W. Release of organic materials from the roots of free seedling.—
Ecology, 1976, N 57, p. 324—327.
Smith R., BoutonJ., Schank S. Nitrogen fixation in grasses inoculated
with Spirillum lipoferum. — Science, 1976, N 193, p. 1003—1005.
Smith M., T i e d j e J. Phases of denitrification following oxygen
depletion in soil. — Soil Biol, Biochem., 1979, N 11, p. 261—267.
Staphorst J., Strijdom B. Diazotrophic bacteria associated with
pasture and veld grasses, sugarcane, maize, sorghum in South Africa. — Phy-
tophylactica, 1978, vol. 10, N 1, p. 13—16.
Stefanson R. Soil denitrification in sealed soil-plant systems. — Plant
and Soil, 1972, N 37, p. 127—140.
Stewart W., Fitzgerald G., Burris R. In situ studies on N2
fixation using the acetylene reduction technique. — Proc. Nat. Acad. Sci. USA,
1967, N 58, p. 2071—2078.
Stewart W., R о w e 11 P. Modification of nitrogen-fixing algae in
lichen symbioses. — Nature, 1977, N 5592, p. 371—373.
Tilak K., Singh C., Roy N. Azospirillum brasilense and Azotobacter
chroococcum: effect on yield of maize and sorghum. — Soil Biol. Biochem.,
1982, vol. 14, N 4, p. 417—418.
T j e p к e m a J., Burris R. Nitrogenase activity associated with some
Visconsin prairie grasses. — Plant and Soil, 1976, vol. 45, N 1, p. 89—94.
T j e p к e m a J., Evans H. Nitrogen fixation associated with J uncus
balticus and other plants of Oregon wetland. — Soil Biol. Biochem., 1976, N 8,
p. 505—509.
T j e p к e m a J., van В е г к u m P. Actetylene reduction by soil cores of
maize and sorghum in Brasil. — Appl. Environ. Microbiol., 1977, vol. 33, N 3,
p. 626—629.
Todd R., Meyer R. Epiphytic nitrogen fixation in a forest ecosystem.—
Abs. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol., 1976, p. 171—178.
Todd R., Meyer R. Nitrogen fixation in a deciduous forest in the south—
eastern United States. — Ecol. Bull., 1978, N 26, p. 172—177.
T о s i с L. The unification of systems for phytosphere classification and
methods for their microbial investigation. — In: Plant-microbes relationships
(eds. J. Macura, V. Vancura). Publ. House Csz. Acad. Sci., 1965, p. 15—21.
Trolldenier G. Influence of potassium nutrition of rye grass and soil
moisture on denitrification. — Zbl. Pflanzen. Bodenkund., 1979, N 142,
p. 514—519.
T u к е у Н. The leaching of substances from plants. — Annu. Rev. Plant
Physiol., 1970, N 21, p. 305—324.
Tyler M., Milan J., Smith R. Isolation of Azospirillum from divers
geographic regions. — Can. J. Microbiol., 1979, vol. 25, N 6, p. 693—697.
U s с h a G., Alan A. Denitrification potential of a salt marsh soil. —
Soil Biol. Biochem., 1982, vol. 14, N 2, p. 117—125.
Vancura V., Macura J. The effect of root excretions on
Azotobacter. — Folia Microbiol., 1961, N 6, p. 250—259.
Vancura V., Prikryl Z. Root exudates of plants. — Plant and soil,
1980, vol. 57, N 1, p. 69—83.
V1 a s s а к К-, Paul E., H a r r i s R. Assesment of biological nitrogen
fixation in grassland and associated sites. — Plant and Soil, 1973, vol. 38,
N 3, p. 637—649.
Vlassak K., Reynders L. Associative dinitrogen fixation in
temperate regions. — Isotop. Biol. Dinitrogen Fixat. Proc, Vienna, 1978, p. 71—86.
Von Bulow J., Dobereiner J. Potential for nitrogen fixation in maize
genotypes in Brasil. — Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975, N 72, p. 2389—2393.
Watanabel., Lee K., Alimagno B. Biological nitrogen fixation in
paddy field studied by in situ acetylene reduction assays. — Ecol. Bull., 1978,
N 26, p. 304—310.
Watanabe I., Barraquio W. Low levels of fixed nitrogen requiered
131

for isolation of free-living N2-fixing organisms from rice roots. — Nature, 1979,.
N 277, p. 565—566.
Watanabe I., A p p A., Alexander M. Nonsymbiotic nitrogen
fixation associated with the rice plant in flooded soils. — Soil Sci., 1980, vol. 130,
N 5, p. 281—290.
Watanabe I., De Guzman M., Barrion M. Population of aerobic
heterotrophic nitrogen-fixing bacteria associated with wetland and dryland1
rice. — Appl. Environ. Microbiol., 1982, vol. 43, N 1, p. 124—128.
Watanabe I., Greenland D. The continuing nitrogen enigma. — In:
12 Intern. Congr. ISSS, New Delhi, 1982, Whither Soil Res., p. 123—137.
W i t к a m p M. Direct and undirect counts of fungi and bacteria as
indexes of microbiological productivity. — Soil Sci., 1974, vol. 118, N 3,.
p. 112—115.
W i 11 у J., Day J., Dart P. The nitrogen economy of the Broadbalk
experiments. — Rothamsted Exp. St. Rept, Harpenden, 1977, p. Ill—118.
Woldendorp J. The influence of living plants on denitrification. —
Soil and Fertiliz., 1965, vol. 28, N 1, p. 49—54.
Yoshida T. Soil microbiology. — Ann. Rep. IRRI, Los—Banos, 1971,
p. 35—42.
Yoshida T. Microbial roles in the nitrogen fertility of paddy soils. —*-
Proc. Intern. Semin. Soil Environ. Fertil. Manag. Intensive Agric, Tokyo,
1977, p. 764—768.
Yuan-shengO., Shuping Z., Xiaozhen M. Investigation on
nitrogen-fixing bacteria in the rice rhizosphere. — Proc. Symp. Paddy Soil,
Berlin, 1981, p. 344—347.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие 3
Введение 5
Глава 1. Современные методы изучения азотфиксации в почве . 11
Метод Кьельдаля 12
Изотопные методы 12
Ацетиленовый метод 13
Основные этапы исследования азотфиксации ацетиленовым
методом 19
Применение ацетиленового метода для определения
активности азотфиксации в почве, ризосфере и филлосфере 22
Глава 2. Ассоциативная азотфиксация в различных
биоклиматических зонах 32
Несимбиотическая азотфиксация в различных
биоклиматических зонах 33
Потенциальная азотфиксирующая активность почв
различных типов 39
Несимбиотическая азотфиксация в ризосфере (ризоплане)
растений различных биоклиматических зон .... 42
Сезонная динамика ассоциативной азотфиксации ... 49
Суточная динамика актуальной активности азотфиксации 54
Продуктивность ассоциативной азотфиксации .... 57
Ассоциативная азотфиксация в филлосфере (филлоплане)
растений 60
Глава 3. Взаимодействие микроорганизмов и растений при
ассоциативной азотфиксации 67
Энергетическое обеспечение ассоциативной азотфиксации 69
Микроорганизмы-диазотрофы в ризосфере и филлосфере 74
Влияние растений на активность диазотрофных бактерий
в ризосфере 83
Глава 4. Влияние факторов внешней среды на активность
ассоциативной азотфиксации 93
Зависимость ассоциативной азотфиксации от влажности
почвы 93
Зависимость ассоциативной азотфиксации от температуры
почвы и воздуха 97
Влияние концентрации углекислоты в атмосфере на
ассоциативную азотфиксацию 98
Влияние инокуляции растений различными
микроорганизмами на ассоциативную азотфиксацию 100
Влияние минеральных азотных удобрений на
ассоциативную азотфиксацию 104
Глава 5. Значение ассоциативной азотфиксации в азотном балансе
почв 113
120
122

МОНОГРАФИЯ
Марат Мутагарович Умаров
АССОЦИАТИВНАЯ АЗОТФИКСАЦИЯ
Зав. редакцией Н. М. Глазкова
Редактор Н. А. Жук
Обложка художника С. Н. Оксмана
Художественный редактор Б. С. В е х т е р
Технический редактор К. С. Чистякова
Корректоры В. П. К а д а д и н с к а я,
Л. А. К о с т ы л е в а
ИБ № 2275
Сдано в набор 09.12.85. Подписано в печать
24.06.86. Л-66366. Формат 60X90/16. Бумага
типогр. № 1. Гарнитура литературная. Высокая
печать. Усл. печ. л. 8,50. Уч.-изд. л. 9,42. Тираж
1260 экз. Заказ 266. Цена 1 р. 40 к. Изд. №3704.
Ордена «Знак Почета» издательство Московского
университета. 103009, Москва, ул. Герцена, 5/7.
Типография ордена «Знак Почета» изд-ва МГУ.
119899, Москва, Ленинские горы