/
Author: Сэги Й.
Tags: почвоведение почвенные исследования биология микробиология агрономия микроорганизмы
Year: 1983
Text
SZEGIJÖZSEFTALAJMIKROBIOLÖGIAI
VIZSGÀLATI MÖDSZEREKA 8.2 szâmü fejezet Gyurkö Pal., a 4.1., 6.2.2., 6.2.3.,Г).3М 6.4 szâmü fejezet Timâr M. Éva munkâjaMEZÔGAZDASÂGI KIADÖ
.BUDAPEST • 1979
ЙОЖЕФ СЭГИМЕТОДЫ ПОЧВЕННОЙ
МИКРОБИОЛОГИИПеревод с венгерского И. Ф. КуренногоПод редакцией и с предисловием академика
ВАСХНИЛ Г. С. МуромцеваМОСКВА
„КОЛОС“ 1983
Отдельные разделы книги написали:
Пал Дюрко — 8.2.Тимар М. Ева — 4.1, 6.2.2, 6.2.3, 6.3, 6.4.Рекомендована к изданию секцией сельскохозяйствен¬
ной микробиологии Президиума ВАСХНИЛС э г и Й. Методы почвенной микробиологии/Пер. с венг.
И. Ф. Куренного; Под ред. и с предисл. Г. С. Муромцева. — М.:
Колос, 1983. — 296 стр.В книге обобщен опыт, накопленный в области методов исследо¬
вания почвенных микроорганизмов. Рассмотрены вопросы микро-
скопирования, стерилизации, выделения из почвы и культивирова¬
ния микроорганизмов, их морфологии и систематики, количествен¬
ного учета. Особое внимание уделено методам исследования мета¬
болизма почвенных бактерий и грибов, их взаимодействию с выс¬
шими растениями, изучению влияния пестицидов на биологические
процессы, происходящие в почве.Иллюстраций 66, таблиц 15, список литературы 214 назв.3802020000—038 53—82035(01)—83© Szegi Jôzsef, Gyurkô Pâl, Timâr M. Éva, 1979
© Перевод на русский язык, «Колос», 1983
ПРЕДИСЛОВИЕ К РУССКОМУ ИЗДАНИЮПоследние два — три десятилетия проблемы почвенной микробиологии привле¬
кают серьезное внимание ученых и специалистов сельского хозяйства. Бурная
интенсификация земледелия ставит перед почвенными микробиологами новые
большие задачи. Назовем лишь некоторые из них. Еще не так давно многим
представлялось, что применение высоких доз минеральных азотных удобрений
делает ненужной деятельность азотфиксирующих почвенных микроорганизмов.
Жизнь убедительно показала ошибочность этой точки зрения. Ряд важных
причин — как экономического, так и экологического характера — заставляет нас
уделить проблеме микробиологической фиксации атмосферного азота особое
внимание. Среди них на первое место следует поставить возрастающий дефицит
энергии. Производство минеральных азотных удобрений весьма энергоемко.
Подсчитано, что в развитых странах на это тратится почти ‘/з всей энергии,
расходуемой в сельскохозяйственном производстве. Другая причина — прогрес¬
сирующее загрязнение окружающей среды в связи с применением высоких доз
минеральных удобрений, среди которых на первое место следует поставить азот¬
ные. Масштабы «деятельности» почвенных азотфиксирующих микроорганизмов
велики. Подсчеты показывают, что в настоящее время микробы-азотфиксато-
ры связывают в наших почвах почти столько же атмосферного азота, сколько
его производит вся наша химическая промышленность.Другой важный вопрос — проблема фосфора в земледелии. Если запасы
азота на Земле практически безграничны, то рудные запасы фосфора весьма
ограничены, а биогеохимический круговорот его в целом носит неблагоприятный
характер. Не имея газовых форм, фосфор необратимо вымывается в мировой
океан. Все это усугубляется быстрой и прочной фиксацией его в почве, в связи
с чем коэффициент усвоения растениями фосфора суперфосфата не превышает
25%, снижаясь на некоторых почвах до 10%. Поэтому одно из важных направ¬
лений в почвенной микробиологии — исследование способности почвенных мик¬
роорганизмов, в частности эндомикоризных грибов, улучшать снабжение расте¬
ний фосфором из почвы.Все большее практическое значение приобретают вопросы экологии почвен¬
ных микроорганизмов, которые еще совсем недавно представлялись весьма ака¬
демичными. С ними теснейшим образом связана важнейшая проблема химиче¬
ского и биологического загрязнения окружающей среды. Микрофлора почв и
водоемов играет решающую роль в разрушении многочисленных загрязнителей—
пестицидов, промышленных стоков, отходов крупных животноводческих ферм
и т. п. Биологическое загрязнение почв — накопление в них фитопатогенных
микроорганизмов — также связано с интенсификацией земледелия, в частности,
с упрощением севооборотов. Важными вопросами становятся здесь изучение
экологии как самих почвенных фитопатогенов, так и антагонистической микро¬
флоры, подавляющей их жизнедеятельность.Понятно, что все эти и многие другие не менее важные вопросы требуют
для своего решения прежде всего эффективных и надежных методов. К сожале¬
нию, в отечественной литературе до сих пор отсутствует современное фунда¬
ментальное пособие по методам почвенной микробиологии, которое обобщило бы
и систематизировало многочисленные методики, зачастую описанные только в
периодической литературе, предложило бы наиболее рациональные из них. Этот
недостаток восполнит предлагаемая вниманию советского читателя книга про¬
фессора Й. Сэги. Ее автор — крупный специалист в этой области, хорошо зна¬
комый советским почвенным микробиологам. На протяжении длительного време-5
ни он возглавляет отдел почвенной микробиологии института агрохимии и поч¬
воведения Академии Наук ВНР в Будапеште.Автор поставил перед собой нелегкую задачу — описать методы исследова¬
ний но всем разделам микробиологии, с которыми может столкнуться экспери¬
ментатор, работающий с почвенными микроорганизмами. Большие главы книги
посвящены микроскопии и стерилизации, методам выделения микроорганизмов
из почвы и их культивирования, морфологии и систематике. Читатель найдет в
книге описание методов количественного учета микроорганизмов. Особое место
занимает важный раздел о методах исследований метаболизма почвенных мик¬
роорганизмов, преобразования ими углерод-, азотсодержащих и других соеди¬
нений.Большое внимание уделено экологическим аспектам почвенной микробиоло¬
гии. Автор посвящает этому вопросу три специальных главы: изучение взаимо¬
влияния микроогранизмов и высших растений, методы изучения ассоциаций мик¬
роорганизмов и влияния пестицидов на почвенные биологические процессы.Пользуясь этой книгой, следует иметь в виду, что это не просто сводка ме¬
тодик, а труд, обобщающий опыт, накопленный в области методов исследования
почвенных микроорганизмов. Несомненное достоинство книги — широкое исполь¬
зование работ советских ученых.Естественно, что в такой большой книге не все разделы равнозначны. По-
видимому, явления микробного антагонизма следовало бы описать в разделах,
посвященных экологии, а не метаболитам-антибиотикам. В главе 11 следовало
бы уделить больше внимания вопросам инактивации и разрушения пестицидов
микроорганизмами.С согласия автора в русское издание книги внесены небольшие изменения и
дополнения. Заново написан раздел «Почвенные микроорганизмы, мобилизующие
фосфор из труднодоступных фосфатов» (Муромцев Г. С.). Добавлены небольшие
разделы: «Определение числа микроорганизмов-антагонистов в почве методом
разведений» (Муромцев Г. С., Маршунова Г. H.), «Эндомикоризные грибы»
(Муромцев Г. С., Маршунова Г. H., Зольникова Н. В.), «Использование комби¬
нированных камер для изучения жизнедеятельности микроорганизмов в почве»
(Муромцев Г. С., Лагутина Т. H.).В целом автору хорошо удалось систематизировать, изложить в доступной
форме и на достаточно современном уровне громадный и весьма многообразный
материал, касающийся методов изучения почвенных микроорганизмов. Нет сом¬
нений в том, что эта нужная и полезная книга будет с удовлетворением воспри¬
нята всеми, кто работает в этой области микробиологии.Г. С. МУРОМЦЕВ
ПРЕДИСЛОВИЕ К ВЕНГЕРСКОМУ ИЗДАНИЮПочва — естественная среда обитания для самых различных микро¬
организмов. В каждом грамме верхнего ее слоя обитают миллионы,
даже миллиарды микроорганизмов. Эта биомасса с очень большой
активной поверхностью оказывает значительное влияние на процес¬
сы, происходящие в почве, и на ее плодородие. Микроорганизмы
разрушают попадающие в почву органические вещества и перево¬
дят их органогенные элементы в формы, усваиваемые растениями.
Не меньшее значение имеет синтезирующая деятельность микроор¬
ганизмов, а также их участие в образовании гумуса.Параллельно с индустриализацией современных сельскохозяйст¬
венных систем все более возрастает роль почвенных микроорганиз¬
мов в повышении плодородия почв. Элементы многих минеральных
удобрений, вносимых в почву, включаются в клетки микроорганиз¬
мов и, таким образом, обеспечение растений питательными вещест¬
вами в определенной мере зависит от направленности и интенсив¬
ности микробиологических процессов. Одна из важных задач сель¬
ского хозяйства состоит в максимальном использовании почвенных
азотфиксируклцих микроорганизмов.Не менее важную роль играют почвенные микроорганизмы и в
борьбе с загрязнениями окружающей среды. Достаточно отметить
хотя бы их способность разлагать остатки пестицидов, коммуналь¬
ные отходы, а также отходы крупных животноводческих хозяйств.Перечисленные факторы и объясняют стремительное развитие
почвенной микробиологии. Новые научные направления привели к
разработке большого числа очень важных методов исследования.При подготовке данного издания автор преследовал цель дать
специалистам методическое пособие, обобщающее методы почвенной
микробиологии, хотя и не в максимальном их объеме. В первую
очередь приведены те методы, которые получили наибольшее рас¬
пространение и проверены на практике. Многие из них разработаны
с участием автора. Критической оценкой отдельных методов иссле¬
дования автор стремился привлечь внимание специалистов к ограни¬
ченным возможностям соответствующих методик.В первой части книги описаны основное оборудование лабора¬
торий и правила его эксплуатации. Здесь же изложены методы куль¬
тивирования, определения и поддержания микроорганизмов в куль¬
туре.Вторая часть посвящена методам почвенной биологии: методи¬
ке исследования метаболизма почвенных микроорганизмов, в осо-7
бенности превращениям углерод- и азотсодержащих соединений,
изложению методов изучения ассоциаций почвенных микроорганиз¬
мов, исследования их взаимодействия с растениями, а также опре¬
деления биологической активности почв.Автор выражает признательность коллегам, замечания и советы
которых помогали ему в работе над книгой. В первую очередь ав¬
тор благодарит д-ра Каройне Баконди, д-ра Ференца Гуяша, д-ра
Жужу П. Комароми, кандидата сельскохозяйственных наук Михая
Крамера, кандидата биологических наук Кальмана Сенде и доктора
биологических наук йожефа Вереша, ценные советы которых были
очень полезными при работе над рукописью. Автор обращается со
словами благодарности и к коллегам, оказавшим весьма ценную
помощь в процессе технической работы над книгой.Будапешт, 1978ИОЖЕФ СЭГИ
ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ1.1. МИКРОСКОПЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ1.1.1. Устройство светового микроскопаСовременные световые микроскопы дают увеличение в 1600—
2000 раз. В них различают оптический и механический узлы.
Оптический узел состоит из осветительной системы, объектива и
окуляра. К осветительной системе относят источник света и кон¬
денсор. В более простых микроскопах старых конструкций лучи
от естественного или искусственного источников света направля¬
ют на исследуемый объект при помощи зеркала.Микроскопы новейших систем выпускают с встроенными ис¬
точниками света. Для устранения хроматической аберрации меж¬
ду конденсором и источником света помещают светофильтр.Конденсор расположен под предметным столиком. Его опти¬
ческая система обеспечивает равномерное освещение поля зрения
микроскопа. Конденсор необходим прежде всего при работе с
масляно-иммерсионными системами. В нижней его части разме¬
щена диафрагма, позволяющая регулировать освещенность объ¬
екта.Объектив состоит из нескольких простых линз (рис. 1). На¬
ружную линзу, находящуюся непосредственно над исследуемым
объектом, называют фронтальной; на противоположной стороне
объектива расположена так называемая задняя линза объектива.
Сложная оптическая система позволяет уменьшить недостатки
изображения, полученного при помощи простых линз. Один из та¬
ких недостатков, называемый сферической аберрацией, проявля¬
ется в том, что точка исследуемого объекта на полученном изо¬
бражении выглядит небольшой черточкой.Явление сферической аберрации объясняется неодинаковым
преломлением лучей, проходящих через центр и края линзы.
Практически это означает, что четкое изображение центральной
и периферийной частей картины, наблюдаемой под микроскопом,
одновременно получить невозможно. Сферическую аберрацию
можно устранить при помощи линз с различными радиусом кри¬
визны и оптическими свойствами. К объективам с устраненной
сферической аберрацией относятся, в частности, планахроматы и
планапохроматы.Другую погрешность изображения называют хроматической
аберрацией. Вызывается она несовпадением фокусных расстоя¬
ний для лучей света с различной длиной волны. В белом свете
получают нечеткое изображение, окруженное цветной каймой.9
Рис. 1. Различные типы объективов в разрезе.Оптическую систему, скорректированную по двум цветам, назы¬
вают объективом-ахроматом, по трем — апохроматом. В объекти-
вах-планахроматах и планапохроматах скорректированы и сфе¬
рическая, и хроматическая аберрации.Степень увеличения изображения исследуемого объекта зави¬
сит от фокусного расстояния объектива или кривизны линз. Чем
больше кривизна линзы, тем меньше фокусное расстояние и со¬
ответственно тем больше увеличение. Для определения собствен¬
ного увеличения объектива расстояние наилучшего видения (для
нормального зрения — 250 мм) нужно разделить на фокусное
расстояние объектива. Например, при фокусном расстоянии 2 мм
собственное увеличение объектива составляет 250:2=125, т. е.
объектив увеличивает в 125 раз.Важной частью оптического узла микроскопа является окуляр
(рис. 2). Окуляр увеличивает изображение, полученное в объек-10
тиве, и, кроме того, мо¬
жет служить для устра¬
нения остаточных цве¬
товых искажений и при¬
менения различных вспо¬
могательных приспособ¬
лений (окулярной сетки,
перекрестия, микромет¬
ра).На оправе окуляров
указано их собственное
увеличение (5, 7, 10, 15,20). Наибольшее распро¬
странение получили оку¬
ляры двух типов. Окуля¬
ры Гюйгенса обладают
такими же оптическими
свойствами, как и объек¬
тивы-ахроматы, и обычно применяются для работы с этими объ¬
ективами. Окуляры второго типа — компенсационные — устра¬
няют остаточную хроматическую аберрацию объективов-апохрома¬
тов и всегда применяются при работе с ними, хотя с успехом мо¬
гут быть использованы и в комбинации с объективами-ахромата¬
ми высокой разрешающей способности.Еще одна основная деталь микроскопа — тубусодержатель.
В верхней части тубуса установлен окуляр, к нижней части кре¬
пится револьвер с объективами. Большинство микроскопов име¬
ют четыре или пять объективов, смена которых осуществляется
поворотом револьвера. Револьверы изготовлены с очень высокой
точностью, поэтому при их вращении объективы устанавливаются
строго по оптической оси микроскопа. Исключение составляют
только иммерсионные объективы, характеризующиеся малой ве¬
личиной рабочего расстояния. При помощи двух рукояток для
фокусировки тубусодержатель вместе с тубусом и установлен¬
ными на нем окуляром и объективами можно перемещать вверх
или вниз.Грубую фокусировку осуществляют рукояткой макрометриче-
ского винта, для точной фокусировки предназначен микрометриче¬
ский винт.В основание штатива микроскопа встроено осветительное обо¬
рудование. Предметный столик крепится к штативу; на нем же
подвижно установлен тубусодержатель и обеспечивающие его
перемещение макро- и микрометрический винты.На предметном столике имеются пружинные прижимные лап¬
ки, предназначенные для установки предметного стекла. При по¬
мощи двух винтов препаратоводителя, смонтированного на пред¬
метном столике, предметное стекло можно передвигать в двух
взаимно перпендикулярных направлениях.Рис. 2. Различные типы окуляров в разрезе:а — окуляр Гюйгснса; б, в — компенсационные оку¬
ляры.и
1.1.1.1. Оптический узелХод лучей в оптической системе микроскопа показан на рисун¬
ке 3. Увеличение (X) микроскопа равно произведению показате¬
ля увеличения объектива на увеличение окуляра. Например, сис¬
тема, состоящая из масляно-иммерсионного объектива 90X и
окуляра 15Х, дает увеличение, равное 1350 (90X15=1350). Эти
расчеты справедливы только при длине тубуса 160 мм.Комбинируя разные объективы и окуляры, можно получать
различные увеличения. Однако пригодность микроскопа к работе
зависит не только от увеличения, но и от его разрешающей спо¬
собности, т. е. от наименьшего расстояния между двумя точками,
которые можно видеть раздельно. Чем меньше это расстояние,
тем выше разрешающая способность микроскопа, которая опре¬
деляется только оптическими характеристиками объектива. Раз-12
решающая способность объектива (d) зависит от числовой апер-
туры и длины волны света. Математически эта зависимость вы¬
ражается следующей формулой:где X — длина волны света и А — числовая апертура объектива, указанная на
его оправе.Так как спектральная чувствительность человеческого глаза
лежит обычно в диапазоне световых волн длиной 0,4—0,7 мкм, за
основу расчетов принимают усредненную длину волны 0,55 мкм.
При исследованиях под микроскопом световые лучи, попадающие
в его оптическую систему, преломляются, поэтому разрешающая
способность объектива наполовину меньше, чем при прямом ос¬
вещении.Таким образом,Наибольшее значение числовой апертуры (у лучших иммерсион¬
ных систем) і— около 1,30. Максимально достижимая разрешаю¬
щая способность объектива примерно 0,21 мкм (табл. 1).1. Зависимость между числовой апертурой, разрешающей
способностью и полезным увеличениемЧисловая апертураРазрешающая способность
(мкм) при длине световых
волн 550 нмДиапазон полезного
увеличения0,102,7550—1000,201,37100—2000,300,92150—3000,400,69200—4000,500,55250— 5000,600,46300—6000,700,39350—7000,800,34400-8000,900,31450—9501,000,27500—10001,100,25550—11501,200,23600—12501,300,21650—1350Числовая апертура определяется произведением половинного
синуса угла входного отверстия объектива на показатель пре¬
ломления среды (п) между фронтальной линзой объектива и
предметным стеклом:. sin а
А = п~2~-13
Угол входного отверстия объектива зависит от конструкции по¬
следнего, но характеристики показателя преломления среды меж-
ду фронтальной линзой и препаратом могут быть улучшены при
помощи жидкости, имеющей более высокий показатель прелом¬
ления. Если между предметным стеклом и фронтальной линзой
поместить каплю кедрового масла, разрешающая способность
объектива значительно возрастет. Кедровое масло имеет такой
же показатель преломления, как и стекло, т. е. 1,51. Целесообраз¬
но заполнять кедровым маслом и пространство между конденсо¬
ром и предметным стеклом.Если промежуток между объективом и исследуемым объек¬
том заполнен какой-либо жидкой средой, говорят об иммерсии
(иммерсия — погружение).Реализация числовой апертуры, указанной на объективе, за¬
висит от толщины покровного стекла. Объективы рассчитаны на
покровные стекла толщиной 0,1,7+0,01 мм; допуск по этому по¬
казателю указан на оправе объектива. Если стекло не соответ¬
ствует допуску, необходима регулировка вращением кольца кор¬
рекционной оправы, которым оснащены высококачественные
объективы. При отсутствии объектива с коррекционной оправой
аберрацию можно скорректировать, поднимая или опуская тубус
микроскопа.1.1.1.2. Бинокулярная насадкаСовременные исследовательские микроскопы оснащены биноку¬
лярной насадкой, что особенно важно при ведении длительных
наблюдений. Существенная особенность насадки — наличие приз¬
матической системы, в которой происходит преломление и раз¬
двоение светового пучка. Бинокулярная насадка обладает собст¬
венным увеличением, обычно до 16Х, и, таким образом, для
определения полного увеличения системы показатель увеличения
микроскопа необходимо помножить на показатель собственного
увеличения насадки. При помощи установочного кольца увеличе¬
ние новейших бинокулярных насадок системы «Оптовар» можно
увеличить в 1—2 раза, не прерывая наблюдений. Расстояние
между окулярами насадки поддается регулировке. У большинст¬
ва людей острота зрения правого и левого глаза неодинакова, по¬
этому для корректировки левый тубус обычно оснащен регулиро¬
вочным кольцом.1.1.1.3. МикрофотонасадкаФотографирование позволяет наиболее быстро и точно докумен¬
тировать наблюдения. Приборы для микрофотосъемки можно
разделить на три группы. К первой относятся обычные фотоап¬
параты с призматическим или зеркальным видоискателем
(«Экзакта», «Зенит», «Контакс» и т. д.). С помощью соответст¬
вующих переходных муфт их можно установить на тубусе микро-14
скопа. Во вторую группу входят специальные приборы для мик¬
рофотографирования, выпускаемые различными заводами. За¬
крепленные на микроскопе переходными муфтами, они позволяют
фиксировать наблюдаемую картину на фотопластинке или фото¬
пленке. И наконец, в некоторых микроскопах фотокамера вмон¬
тирована в тубусодержатель. Например, фотомикроскоп системы
Ратенау позволяет непосредственно в ходе наблюдений вести
фотосъемку на пленку с размером кадра 24X36 мм.Микрофотосъемку можно вести только с объективом или с
объективом и окуляром. Если для получения увеличенного изоб¬
ражения используют только объектив, говорят о простом микро¬
скопе, в сложном микроскопе увеличенное изображение дают и
объектив, и окуляр. Простой микроскоп дает четкое обратное
изображение. Увеличение определяется по формулегде N — увеличение; h — расстояние от светочувствительной пластинки до объ¬
ектива; s — расстояние между фронтальной линзой объектива и исследуемым
предметом.Применяя одновременно объектив и окуляр, получают прямое
изображение большего увеличения. Для микрофотографирования
используют специальные окуляры. При работе со сложным микро¬
скопом не рекомендуется превышать определенный предел уве¬
личения, тем более что разрешающая способность при этом не
возрастает. Обычно линейное увеличение не должно превышатьУвеличение фотографического изображения зависит от рас¬
стояния между верхней линзой окуляра и светочувствительной
пластинкой (оптической длины камеры), а также от собственно¬
го увеличения объектива и окуляра. Чем дальше от верхней лин¬
зы окуляра расположена светочувствительная пластинка, тем
больше увеличение. Если светочувствительный материал отстоит
от окуляра на расстоянии 250 мм, масштаб полученного изобра¬
жения будет таким же, как увеличение при визуальном наблюде¬
нии через оптическую систему микроскопа. Масштаб изображе^-
ния, полученного при помощи сложного микроскопа, определяют
по формулеN=06-0K-gL-,где Об — собственное увеличение объектива; Ок — собственное увеличение оку¬
ляра; On-—длина камеры.Например, при собственном увеличении объектива 40Х, увели¬
чении окуляра 10Х и длине камеры 250 ммЯ = 40.10.-Ц-=40°.Таким образом, увеличение микроскопа составит 400Х.15
1.1.2. Изучение живых клеток с помощью
специального оборудованияСветовой микроскоп прежде всего пригоден для изучения фик¬
сированных и окрашенных препаратов. Однако при фиксации ми¬
кроорганизмы неизбежно деформируются, что отражается на ре¬
зультатах исследований. Поэтому разработаны особые методы
наблюдений, позволяющие изучать живые, неокрашенные биоло¬
гические объекты. К ним относятся метод, темного поля, метод
фазового контраста и флуоресцентная микроскопия.1.1.2.1. Метод темного поляМетод темного поля основан на так называемом эффекте Тинда¬
ля, который можно наблюдать даже в темной комнате, куда про¬
никает узкий луч света. В световом пучке становятся видимыми
очень мелкие пылинки, совершенно незаметные при обычном
естественном освещении.При наблюдении методом темного поля объект освещен сбоку
проходящими по краям конденсора косыми лучами, которые не
попадают в объектив; поэтому создается темный фон (рис. 4).
Когда свет падает на препарат, часть рассеянных лучей попа¬
дает в объектив и в результате на темном фоне вырисовываются
светящиеся объекты. По разрешающей способности темнополь¬
ный микроскоп почти в 10 раз сильнее обычного.Для проведения исследований в темном поле можно использо¬
вать и обычный световой микроскоп, оснащенный соответствую¬
щим конденсором.Наибольшее распространение получили темнопольные конден¬
соры, различающиеся по механизму преломления света.Весьма важно, чтобы толщина
предметных стекол, обычно ука¬
занная на конденсоре, не превыша¬
ла 1,2 мм. При работе этим мето¬
дом необходим гораздо более мощ¬
ный источник света, так как темно¬
польный конденсор направляет на
объект только часть лучей. Осо¬
бое внимание нужно обратить на
следующее:— необходимо соответствующим
образом отцентрировать световой
поток; плоское зеркало устанавли¬
вают таким образом, чтобы обеспе¬
чить совершенно равномерное ос¬
вещение;— на верхнюю линзу конден¬
сора наносят каплю иммерсионно¬
го масла и поднимают конденсорРис. 4. Принцип темнопольной
микроскопии:1 — центральная диафрагма; 2 —
исследуемый объект; 3 — объектив;
4 — оправа конденсора; 5 — линза
конденсора; 6 — световые лучи.16
до соприкосновения масла с предметным стеклом; следует избе¬
гать образования пузырьков в масле;— зеркало микроскопа должно быть установлено таким обра¬
зом, чтобы на темном фоне четко вырисовывались исследуемые
объекты. Если при помощи зеркала фокусировку выполнить не
удается, конденсор осторожно перемещают вверх или вниз до
получения четкого изображения. При толщине предметного стек¬
ла меньше номинальной конденсор необходимо сместить вниз;— толщина слоя жидкости между предметным и покровным
стеклом должна быть минимальной; чем толще препарат, тем
меньше четкость изображения;— под покровным стеклом не должно быть пузырьков воздуха,
так как они очень затрудняют наблюдение.Метод темного поля позволяет наблюдать только форму ис¬
следуемых микроорганизмов (в особенности бактерий небольших
размеров). Для изучения внутренних структур клетки этот метод
менее пригоден.1.1.2.2. Применение фазово-контрастного микроскопаМетод светлого поля пригоден прежде всего для изучения окра¬
шенных и обладающих значительным светопреломлением объек¬
тов. Описанный выше темнопольный микроскоп также не лишен
недостатков. Применяя этот метод, мы наблюдаем на темном фо¬
не обратное изображение: светлые участки выглядят темными,
и наоборот. Кроме того, темное поле затрудняет определение
различий в толщине отдельных деталей препарата.Фазово-контрастный микроскоп не имеет отмеченных недос¬
татков и позволяет получать на светлом фоне чрезвычайно конт¬
растное изображение живых неокрашенных объектов. Возмож¬
ность создания фазово-контрастного микроскопа была показана
голландским физиком Цернике.Принцип фазового контраста основан на следующем. Свет, или кванты све¬
та совершают волновые колебания. Каждая из волн обладает собственным све¬
товым вектором, или амплитудой. Кроме того, волновые колебания в каждый
момент характеризуются определенным состоянием — фазой колебания.Если световые волны проходят через объект, отдельные участки которого
обладают различным светопоглощением, их амплитуда соответствующим обра¬
зом изменяется. Если же все участки объекта в равной степени прозрачны, но
неодинаковы по толщине, амплитуда остается неизменной, но происходит сдвиг
фаз волновых колебаний. Человеческий глаз способен улавливать изменение
только амплитуды колебаний, фазовые изменения улавливаются лишь в том
случае, если одновременно происходит интерференция световых волн. Для дости¬
жения этого эффекта нужен еще один световой луч со сдвигом по фазе на 180°.
В результате интерференции разница фаз преобразуется в изменения ампли¬
туды.Почти все биологические объекты под микроскопом прозрачны и поэтому
не вызывают значительных изменений амплитуды, позволяющих получить до¬
статочно контрастное изображение. Цернике заметил, что при наблюдении пред¬
метов, дающих незначительные фазовые изменения, световые волны, освещаю¬
щие поле зрения в заднем фокусе объектива, отклоняются в меньшей степени,
приобретают сдвиг по фазе на 90° и имеют значительно большую амплитуду.И. Gsm 7 7
Если на пути этих лучей в задней фокальной плоскости объектива поместить-
так называемую фазовую пластинку, сдвигающую фазу волновых колебаний еще
на 90° и поглощающую значительную часть этих лучей, то колебания, сдвинутые
по фазе уже на 180°, вызывают значительные амплитудные различия относительно
остальных световых лучей. В результате образуется очень контрастное изобра¬
жение. Фазово-контрастная диафрагма, в которой размещение прозрачных и
непрозрачных элементов противоположно их положению в обычной диафрагме,
дает эффект негативного фазового контраста. Если же диафрагма фазового
конденсора точно проецируется на фазовую пластинку, получают позитивный
фазовый контраст.Для проведения исследований методом фазово-контрастной
микроскопии необходимы: 1 —- осветитель; 2 — вспомогательный
микроскоп небольшого увеличения; 3 — фазовый конденсор с ре¬
вольвером и диафрагмы для отдельных объективов; 4 —• объек¬
тивы с обозначением Ph*, оснащенные фазовым кольцом; 5 —
светофильтры (желательно зеленые).Фазово-контрастный микроскоп дает удовлетворительные ре¬
зультаты лишь при достаточно сильном освещении, поэтому пер¬
вой и важнейшей задачей является создание хорошей освещен¬
ности фона. Для этого используют специальную фокусирующуюмикроскопную лампу, нить нака¬
ливания которой должна четко вы¬
рисовываться на апертурной диаф¬
рагме конденсора. На апертурную
диафрагму помещают матовое
стекло, затем исследуемый препа¬
рат устанавливают на предметном
столике и закрывают диафрагму
осветителя. Конденсор перемещают
вверх или вниз до получения мак¬
симально четкого изображения
препарата при закрытой диафраг¬
ме (рис. 5).При слишком светлом фоне
изображения можно использовать
дополнительный светофильтр. За¬
тем отворачивают зеркало, цент¬
рируют диафрагму, после чего от¬
крывают ее настолько, чтобы ос¬
вещенная площадь была не боль¬
ше поля зрения микроскопа. От¬
крывать диафрагму шире нецеле-Рис. 5. Ход лучей в фазово-контрастном*
микроскопе:Î — фазовая пластинка; 2 — объектив; 3 — объект;.
4 — конденсор; 5 — кольцевая диафрагма.* На оправе объективов отечественного производства — буква «Ф». — Прим..пер.18
■сообразно. При выполнении этой операции диафрагма фазового
конденсора должна быть установлена на «О». После этого выни¬
мают окуляр, вставляют в тубус вспомогательный микроскоп и
фокусируют его на изображение кольца. Затем устанавливают
.диск револьвера на цифру, соответствующую характеристике
объектива, и центрируют диафрагму конденсора с кольцом объ¬
ектива таким образом, чтобы светлое и темное кольца совмести-
.лись. Для этого двумя боковыми винтами предметного столика
перемещают револьвер конденсора. После центрирования диаф¬
рагмы вспомогательный микроскоп вынимают и на его место воз¬
вращают окуляр. Вслед за этим можно начинать исследование
препарата методом фазового контраста. При негативном фазо¬
вом контрасте увеличение объектива обозначается на конденсоре
цифрами зеленого цвета, при позитивном фазовом контрасте —
белыми цифрами.Для исследования методом контраста можно использовать и
сухие, и иммерсионные системы.1.1.2.3. Люминесцентная микроскопияВсе более широкое применение в биологических исследованиях
получает люминесцентный микроскоп. Его действие основано на
явлении вторичного испускания света определенными флуоресци¬
рующими веществами при освещении их первичным источником
излучения. Исследуемый объект облучают или невидимыми
ультрафиолетовыми или синими лучами диапазона 360—450 нм.В первом случае необходима специальная кварцевая оптика,
во втором же можно использовать обычный микроскоп с силь¬
ным источником света (дуговая или кварцевая лампа). С по¬
мощью соответствующего фильтра из спектра излучения лампы
выделяют инфракрасные лучи и направляют их в поле зрения
микроскопа. В окуляр микроскопа помещают так называемый за¬
граждающий фильтр, который поглощает ультрафиолетовые,
фиолетовые и синие лучи и пропускает только видимые, испуска¬
емые исследуемым флуоресцирующим объектом вторичные зеле¬
ные, желтые, оранжевые и красные лучи. Таким образом, флуо¬
ресцирующие цвета будут наблюдаться на темном фоне.Для исследований методом люминесцентной микроскопии не¬
обходимо следующее оборудование: 1 —■ источник света (ранее
применяли дуговую лампу, в настоящее время используют ртут¬
ные лампы); с помощью соответствующих оптических систем свет
направляют таким образом, чтобы в конденсор микроскопа по¬
падал пучок параллельных лучей; 2—первичные фильтры для от¬
деления лучей видимой части спектра; рекомендованы стеклян¬
ные фильтры Шотта определенной плотности; 3 — кювета, напол¬
ненная 2—5%-ным раствором сернокислой меди для поглощения
красных лучей; 4 —> окулярный заграждающий фильтр, задержи¬
вающий ультрафиолетовые и синие лучи.Большинство бактерий флуоресцируют очень слабо, поэтому
препарат предварительно обрабатывают специальными флуорес¬■2* 19
цирующими красителями — флуорохромами. В микробиологиче¬
ской практике наибольшее распространение получил флуорохром
акридин оранжевый в разбавлении 1:5000 или 1:10 000. Этот
анилиновый краситель окрашивает протоплазму живых клеток в
темно-зеленый, ядро :— в светло-зеленый, зерна хроматина — в
красный, а вакуоли — в розовый цвет. Протоплазма погибших
клеток под действием акридина оранжевого приобретает красный
цвет, поэтому такая обработка позволяет отличать живые клетки
от мертвых. К хорошим флуорохромам относится и нейтральный
красный, окрашивающий протоплазму в зеленовато-желтый, а
ядерный хроматин — в темно-красный цвет. В результате окра¬
шивания берберином протоплазма становится серовато-желтой,
а ядерный хроматин флуоресцирует желтым цветом.Если исследованию подвергают неживые клетки, препарат
обычным способом (стр. 55) наносят на предметное стекло, фик¬
сируют нагреванием или спиртом и в течение нескольких минут
окрашивают флуорохромом, после этого препарат помещают на
предметный столик микроскопа и исследуют. Акридин оранжевый
позволяет проводить исследование бактерий методом висячей
капли. Техника приготовления препаратов с висячей каплей изло¬
жена в третьей главе.1.1.2.4. Стереоскопический микроскопСтереоскопический микроскоп пригоден для проведения иссле¬
дований как в проходящем, так и в отраженном свете. Большая
глубина резкости и объемное изображение позволяют изучать в
отраженном свете небольшие колонии микроорганизмов на ага¬
ровых пластинках и плодовые тела отдельных грибов. В боль¬
шинстве биологических лабораторий ВНР пользуются стереоско¬
пическим микроскопом марки SMXX (Карл Цейс Иена, ГДР). Он
оснащен револьверной головкой с четырьмя встроенными объек¬
тивами и двумя парами окуляров (16Х и 25Х); максимальное
увеличение —і ЮОХ. Как и прочие световые микроскопы, стерео¬
скопический микроскоп пригоден для фотографирования объек¬
тов. Для этого вместо бинокулярной насадки устанавливают
специальный переходник, присоединяя его к насадке МР. Сле¬
дует иметь в виду, что при фотографировании глубина резкости
изображения значительно снижается.1.1.2.5. Устройство и принцип действия
электронного микроскопаПервый электронный микроскоп был сконструирован в 1932 г.
немецкими учеными Кноллем и Руской. За прошедшие с тех пор
четыре с половиной десятилетия этот прибор получил широкое
распространение.По принципу действия электронный микроскоп сходен со све¬
товым, но имеет некоторые отличительные особенности. Во-пер-20
вых, в электронном микроскопе исследуемый объект просвечива¬
ется не световыми, а электронными лучами, имеющими намного
меньшую длину волн: если у световых волн она равна 400—
800 нм, то у электронных лучей обычно не достигает 1 нм.Длина волны электронного луча обратно пропорциональна
корню квадратному из величины ускоряющего напряжения; на¬
пример, при напряжении 40 кв она составляет 0,006 нм, а при
100 кв — 0,004 нм.При изложении принципа действия светового микроскопа от¬
мечалось, что между длиной волны света и разрешающей способ¬
ностью микроскопа существует обратная зависимость. Это спра¬
ведливо и для электронного микроскопа, т. е. уменьшение длины
волны электронного луча в принципе позволяет достичь очень
высокого разрешения. Разрешающая способность современных
электронных микроскопов достигает 0,5—-1 нм. Обычные широко
распространенные электронные микроскопы дают увеличение
30 000—50 000 X, а приборы высокого разрешения — 100 000—
200 000 X. Соответствующая техника фотосъемки позволяет по¬
лучить приблизительно десятикратное дополнительное увеличе¬
ние, однако разрешающая способность при этом, естественно, не
возрастает.Второе существенное различие между световым и электрон¬
ным микроскопами состоит в том, что фотоны нейтральны, а
электроны несут отрицательный электрический заряд. В электрон¬
ном луче движение электрона очень ограниченно; более того, дви¬
жущиеся электроны могут поглощаться различными веществами,
в частности газами. Это одна из причин, обусловливающих необ¬
ходимость создания высокого вакуума в колонне электронного
микроскопа (10-5—ljO-10 мм рт. ст.).Существенны различия и в конструкции оптических частей
светового и электронного микроскопов. В определенных условиях
электронные и световые лучи распространяются по прямой и пре¬
ломляются по определенным законам.. Для фокусирования и пре¬
ломления лучей света в световом микроскопе применяют системы
особым образом отшлифованных стеклянных линз, а в электрон¬
ных используют электронно-оптические линзы, создающие в за¬
висимости от типа микроскопа магнитные или электростатические
поля. Исследование объекта под световым микроскопом ведется
непосредственно, а электронные лучи становятся видимыми на
специальном экране.Между электронными микроскопами разных типов также су¬
ществуют различия, но основные их элементы одинаковы
(рис. 6). Типичная часть всех электронных микроскопов — колон¬
на, в которой смонтированы источник электронов, электронно¬
оптическая линзовая система, объектодержатель, различные ди¬
афрагмы, экран и оборудование для фотографирования. Другая
важная часть электронного микроскопа — насосная система, со¬
стоящая из ротационного масляного насоса (форвакуумного) для
создания предварительного разрежения и масляного диффузион-21
Рис. 6. Принцип действия электронного микроскопа:/ — электронная пушка; 2 — конденсорная линза; 3 — объект; 4 — объ-
ективная линза; 5 — первичное изображение; 6 — проекционная линза;
7 — изображение.ного насоса, предназначенного для создания глу-
бокого вакуума. В некоторых электронных микро¬
скопах вместо масляных применяют ртутные диф¬
фузионные насосы.Электрическое оборудование состоит из блока
питания для получения постоянного тока высоко¬
го напряжения, стабилизатора или аккумулятора
для питания электронно-оптических линз.Так называемая электронная пушка излучает
в вакууме пучок электронов, который проходит
через конденсорную линзу (в микроскопах неко¬
торых типов — конденсорную диафрагму) и попа¬
дает на исследуемый объект. На объекте элект¬
роны рассеиваются в соответствии с законами со¬
ударений и участвуют в формировании изобра¬
жения.Объективная линза собирает электроны и образует первич¬
ное увеличенное изображение. В некоторых типах микроскопов
это первичное изображение можно наблюдать на специальном
экране. Далее электронный луч проходит через промежуточную
и затем через проекционную линзу, в которой и достигается ко¬
нечное увеличение.Изображение можно наблюдать на флуоресцирующем экране;
по нему осуществляют выбор объекта для фотосъемок и наводку
на резкость.В электронной микроскопии нельзя использовать предметные
стекла, применяемые в обычных световых микроскопах, так как
электронные лучи сквозь них не проникают. Вместо этого иссле¬
дуемый объект наносят на пленку из особого материала; толщи¬
на пленки вместе с объектом не должна превышать 250 нм. Плен¬
ки готовят на густой сетке, сделанной из очень тонкой проволоки
(100 ячеек на 1 мм2).Перед исследованием объект необходимо тщательно очистить
от чужеродного материала. Нужно следить за тем, чтобы он был
совершенно сухим, так как пар, выделяющийся из влажного пре¬
парата, делает наблюдение невозможным. На пленке объект дол¬
жен быть распределен равномерно.Для исследования ультраструктуры микроорганизмов, клеток
растительного и животного происхождения готовят срезы толщи¬
ной не более 80—90 нм.При помощи электронного микроскопа живые объекты наблю¬
дать нельзя, так как под воздействием глубокого вакуума и
электронного излучения все живые организмы погибают. Сотруд¬
ники, работающие с электронным микроскопом, должны строго
соблюдать правила техники безопасности.22
С целью повышения контрастности изображения на поверх¬
ность исследуемого объекта наносят различные вещества обычно
методом вакуумного напыления. Напыление можно осуществлять
или перпендикулярно к поверхности объекта или под углом. Пер¬
вый способ позволяет получать отпечатки для исследования ме¬
тодом репликации, второй обеспечивает «тень», необходимую или
для повышения контраста, или для количественных измерений.
Для напыления соответствующих веществ (мышьяка, платины,
золота, алюминия, палладия) их можно испарять отдельно или,
если это необходимо для достижения желаемого эффекта, в соот¬
ветствующих комбинациях.1.2. СТЕРИЛИЗАЦИЯВ микробиологической практике стерилизация — одна из посто-
янных операций. Этот термин происходит от латинского слова
sterilis, т. е. «бесплодный». В микробиологии под стерилизацией
понимают полное уничтожение всех микроорганизмов, присутст¬
вующих в данном материале. Стерилизации подвергают пита¬
тельные среды, различную лабораторную посуду (чашки Петри,
пипетки и т. д.).Понятия «обеззараживание», или «дезинфекция», и «стерили¬
зация» нетождественны. Дезинфекция — это уничтожение только
патогенных форм, в то время как при стерилизации погибают все
микроорганизмы.Для уничтожения микроорганизмов применяют различные ви¬
ды стерилизации. Выбор соответствующего способа определяется
прежде всего особенностями стерилизуемого объекта. Различают
следующие виды стерилизации: высокой температурой, фильтро¬
ванием, химическими веществами и лучами.1.2.1. Стерилизация сухим жаром1.2.1.1. ПрокаливаниеДанный способ применяют прежде всего для стерилизации не¬
больших предметов из металла или стекла (бактериальных пе¬
тель, скальпелей, пинцетов, стеклянных палочек и т. д.). При
этом стерилизуемый предмет выдерживают несколько секунд в
пламени горелки Бунзена. Иногда предмет перед прокаливанием
смачивают 96%-ным спиртом.1.2.1.2. Стерилизация в сушильном шкафуСтерилизация горячим воздухом — наиболее распространенный
способ обеззараживания лабораторной посуды. Печь для стери¬
лизации сухим жаром представляет собой стальной шкаф, обши¬
тый асбестом и оснащенный газовым или электрическим нагре¬
вательным устройством. Внутри шкафа размещены одна или не¬23
сколько металлических полок для стерилизуемых предметов.
Температура внутренних стенок шкафа намного выше темпера¬
туры воздуха в нем, поэтому контрольный термометр необходимо
устанавливать так, чтобы его нижняя часть на 6—8 см выступала
в глубь шкафа. Стерилизуемые предметы не должны соприка¬
саться со стенками шкафа. При их размещении необходимо сле¬
дить и за тем, чтобы в шкафу оставалось пространство для цир¬
куляции горячего воздуха. Электрические шкафы для стерилиза¬
ции сухим жаром оснащены регулятором, позволяющим устанав¬
ливать необходимый температурный режим.Стерилизацию сухим жаром проводят в течение 2 часов при
170 °С. Начало стерилизации отсчитывают с того момента, когда
ртутный столбик термометра достиг деления 170 °С. В ходе сте¬
рилизации температуру необходимо контролировать, так как при
ее понижении стерилизация будет неполной, а при слишком вы¬
сокой температуре может обуглиться бумага, в которую заверну¬
ты стерилизуемые предметы.Дверь шкафа нельзя открывать непосредственно после окон¬
чания стерилизации, так как стеклянная посуда может потрес¬
каться из-за резкого снижения температуры. Шкаф открывают
только после охлаждения воздуха в нем. до 50°С.Стерилизованные предметы, хранящиеся в сухом месте завер¬
нутыми в бумагу, считают стерильными в течение 4—5 суток.1.2.2. Стерилизация паром1.2.2.1. Стерилизация в автоклавеОбработка насыщенным водяным паром под давлением — наибо¬
лее надежный и распространенный способ стерилизации. Метод
основан на том, что высокой температуре в камере с на-2. Зависимость между давлением насыщенного пара и температуройТемпература, °СДавление пара, атмИзбыточное давление,
атм1001,00,0102,71,10,1105,21,20,2107,51,30,3109,21,40,4111,71,50,5113,71,60,6115,51,70,7117,31,80,8119,01,90,9120,62,01,0128,02,51,5133.93,02,0139,03,52,5144,04,03,024
сыщенным водяным паром
вегетативные клетки и споры
микроорганизмов довольно
быстро погибают. С повыше¬
нием давления увеличивается
и температура в котле авто¬
клава (табл. 2).Автоклав представляет со¬
бой герметически закрываю¬
щийся котел с двойными
стенками, в котором в ходе
стерилизации образуется пар
(рис. 7). В последнее время
выпускают только автоклавы
с электрическими нагрева¬
тельными элементами, ранее
были распространены авто¬
клавы с газовым подогревом.Внутренняя часть автокла¬
ва — это стерилизационное
пространство, или стерилиза- рис 7 Цилиндрический автоклав про-
ционная камера, в которую изводства предприятия «Лабор».
помещают обрабатываемые
предметы. Для выпуска воз¬
духа и пара из стерилизационного пространства предусмотрен
выпускной кран; манометр позволяет следить за давлением, в
котле.Автоклавы в обязательном порядке оснащены предохрани¬
тельным клапаном, предотвращающим взрыв котла при чрезмер¬
ном давлении. В пространство между стенками автоклава нали¬
вают дистиллированную воду до уровня, обозначенного на водо¬
мерной трубке. Превышать этот уровень не рекомендуется, так
как кипящая вода может попасть в манометр и повредить его.
Автоклавы новейших конструкций оснащены и термометрами, что
позволяет следить за температурой в камере.Межстенное пространство связано со стерилизационной ка¬
мерой с помощью закрывающегося отверстия, через которое пар
поступает в камеру. Чугунная или медная крышка фиксируется
при помощи винтов. Герметичность обеспечивает резиновый
уплотнитель на внутренней поверхности крышки. При работе с
автоклавом необходимо помнить, что: 1) автоклав —■ это источ¬
ник повышенной опасности, в связи с чем в эксплуатации дол¬
жны быть только совершенно исправные системы; специалисты
обязаны систематически проверять техническое состояние авто¬
клавов; 2) строго запрещено превышать верхнюю границу до¬
пустимого давления (на манометре отмечено красной линией);
3) к работе с автоклавом допускают только лиц, прошедших со¬
ответствующий курс обучения; 4) работающий автоклав нельзя
оставлять без надзора.U U25
''ЧрIN?1б,Рис. 8. Различные
способы закрывания
пробирок.I — ватная пробка: а —
правильно; 6 и в — не*
правильно; II — колпа¬
чок из алюминиевой
фольги; III — колпачки
Капсенбсрга: а — разрез;
б — вид сбоку.///Перед стерилизацией сосуды (колбы, пробирки) заполняют
стерилизуемым субстратом только наполовину. Очень важно пра¬
вильно готовить ватные пробки (рис. 8), так как хорошая ват¬
ная пробка предотвращает попадание в сосуд микроорганизмов,
но не препятствует газообмену.Так называемая хозяйственная вата малопригодна для изго¬
товления пробок, так как она содержит значительное количество
синтетических волокон, обладает меньшей сцепляемостью и при
нагревании усаживается. Самые лучшие пробки можно сделать
из хирургической целлюлозной ваты. С успехом используют и бу¬
мажную вату.При выполнении отдельных операций (приготовлении сте¬
рильных серий разведения, столбиков агара и т. д.) для закры¬
вания пробирок вместо ватных пробок можно использовать и
различные металлические колпачки. При этом движение воздуха,
проникающего в пробирку, осложняется, и опасность инфициро¬
вания среды становится минимальной.По наблюдениям автора, для запечатывания пробирок с ото¬
гнутыми краями пригодны тонкие алюминиевые пластинки соот¬
ветствующих размеров, в частности пластинки несколько толще
алюминиевой фольги; иногда можно использовать и сложенную
вдвое фольгу.Верх стерилизуемых сосудов можно обвязать пергаментной
бумагой; это позволит избежать увлажнения пробок каплями
влаги, сконденсировавшейся на внутренней поверхности крышки
автоклава.Эксплуатация автоклава. Перед началом стерилизации необходимо прове¬
рить уровень воды по водомерной трубке 9 (см. рис. 7). При необходимости
воду заливают через кран 8, оснащенный воронкой. Стерилизуемый материал
размещают на перфорированной пластине, расположенной в нижней части ка¬
меры. Крышку автоклава закрывают и закрепляют винтами. При этом всегда26
попарно затягивают диаметрально противоположные, а не лежащие рядом вин¬
ты. Затем открывают паровой кран 6 и включают электроподогрев. Все осталь¬
ные краны, кроме крана водомерной трубки 10, закрыты, последний должен быть
открыт постоянно. Примерно через 5 минут после того, как из котла через вы¬
пускной кран начнет выходить пар, кран необходимо закрыть и подождать, пока
стрелка манометра 7 не достигнет необходимой отметки. После этого из камеры
удаляют воздух, открывая кран паропровода 1 и выпускной кран 2. Находя¬
щийся под давлением пар быстро вытекает и создает в рабочей камере вакуум.
Примерно через две минуты краны 1 к 2 закрывают. Удалив воздух, открывают
кран 3, и пар начинает поступать в стерилизационную камеру, при этом его дав¬
ление снижается. Необходимо подождать, пока стрелка манометра снова достиг¬
нет соответствующего деления, с этого момента начинается процесс стерилиза¬
ции. Температурный режим стерилизации можно регулировать, включая и вы¬
ключая подогрев. Спустя соответствующее время электрический ток отключают
и перекрывают кран 3 подачи пара. Когда стрелка манометра упадет до нуля,
внутреннее и наружное давление сравняются. Далее освобождают винты, при¬
жимающие крышку, и открывают кран воздушного фильтра 5, через который
в стерилизационное пространство поступает воздух. После устранения остаточно¬
го вакуума открывают нижний кран 4 для отвода пара и конденсата и откры¬
вают крышку. Спустя 5—10 минут стерилизованный материал можно извлечь
из автоклава.Для получения пробирок со скошенным агаром стерилизован¬
ные пробирки с еще не остывшим агаром устанавливают наклон¬
но в проволочных или деревянных штативах. Затем питательную
среду для контроля на несколько суток помещают в термостат.Выбор давления (температуры) и длительности стерилизации
определяется особенностями обрабатываемой среды. Стерилиза¬
цию субстратов, разлагающихся при температуре около 120 °С
(желатин, среды с молоком, сахаром и т. д.ї, следует проводить
при давлении 0,5 атм в течение 30 минут. Другие среды (мясо-
иептонный агар, агар с овсяными хлопьями и т. п.) целесообраз¬
но стерилизовать в течение 20 минут при 1 атм. Стерилизация
некоторых субстратов, например почвы, очень сложна. Их реко¬
мендуется обрабатывать в течение двух часов под давлением 1—-
1,5 атм.Существенное влияние на процесс стерилизации оказывает и
кислотность питательной среды. В кислой среде отдельные ком¬
поненты естественных питательных сред могут гидролизоваться.
Под действием температуры и длительности стерилизации сте¬
пень гидролизации увеличивается, и в результате питательные
среды, приготовленные на основе агара, не застывают. В щелоч¬
ной питательной среде соли железа могут образовывать хлопье¬
видный осадок, сахара карамелизуются и среда становится не¬
пригодной к использованию. В некоторых случаях отдельные
компоненты питательных сред стерилизуют раздельно. Термочув¬
ствительные соединения стерилизуют другими способами (напри¬
мер, фильтрованием) и затем смешивают.Для стерилизации небольших количеств субстрата с успехом
можно использовать и бытовую кастрюлю-скороварку. Длитель¬
ность стерилизации в скороварке следует подбирать с учетом то¬
го, что в ней создается избыточное давление около 0,6 атм.
1.2.2.2. Дробная стерилизацияВпервые дробная стерилизация была применена английским уче¬
ным Тиндалем. Ее можно использовать для обработки субстра¬
тов, не выдерживающих температуры выше 100 °С. В частности,
этот способ пригоден для стерилизации пластинок силикагеля,
приготовленных по методу Виноградского, а также питательных
сред, содержащих желатин и углеводы. Дробную стерилизацию
проводят текучим паром без повышения давления в три стадии
продолжительностью по 30 минут каждая и с интервалами в
24 часа между отдельными стадиями обработки. Для дробной
стерилизации наиболее пригоден аппарат Коха, хотя можно ис¬
пользовать и автоклав с открытым паровым клапаном. Стерили¬
зация начинается в тот момент, когда из клапана начинает вы¬
текать пар.Аппарат Коха представляет собой высокий цилиндрический
сосуд, снаружи обычно покрытый асбестом для уменьшения теп¬
лоотдачи. В нижней части цилиндра установлена решетка для
размещения стерилизуемых предметов. На дно аппарата налива¬
ют воду, которую нагревают до кипения при помощи электриче¬
ского нагревательного элемента или газовой горелки. Перед на¬
чалом стерилизации аппарат накрывают крышкой, имеющей от¬
верстия для отвода пара.Посуду с питательной средой в этом случае также следует на¬
крыть пергаментной бумагой, чтобы защитить ватные пробки от
конденсирующейся влаги.Температура 1,00 °С достаточна только для уничтожения веге¬
тативных клеток, споры при этом сохраняют жизнеспособность.
Поэтому в интервале между отдельными стадиями стерилизации
питательные среды целесообразно помещать в термостат, где
прорастание спор ускоряется. Если субстрат не выдерживает
100 °С, стерилизацию проводят, нагревая среду только до 60—
75 °С и повторяя обработку через каждые 24 часа в течение пяти
суток.По окончании обработки питательные среды извлекают из ка¬
меры. Полного охлаждения аппарата дожидаться не следует, так
как при этом ватные пробки могут пропитаться влагой.Обычный способ стерилизации не во всех случаях дает удов¬
летворительный результат. Возможно, что в течение кратковре¬
менного периода между обработками отдельные термостойкие
споры не прорастут, но сохранят при этом жизнеспособность и
впоследствии будут развиваться на питательной среде.Если субстрат подвергнут только однократному нагреванию
до температуры ниже 100 °С, говорят о частичной стерилизации,
или пастеризации. Этот метод был разработан Пастером и в на¬
стоящее время находит широкое применение в молочной и пище¬
вой промышленности для уничтожения вегетативных клеток мик¬
роорганизмов.28
1.2.3. Стерилизация фильтрованиемВ микробиологической практике стерилизация фильтрованием
получила широкое распространение. Применяют этот метод в тех
случаях, когда стерилизуемая среда содержит вещества, разру¬
шающиеся при нагревании, в частности антибиотики, витамины
и летучие соединения. Фильтрованием можно стерилизовать жид¬
кие культуральные среды, содержащие метаболиты микроорга¬
низмов; их активность при этом, снижается минимально. Принцип
метода состоит в пропускании субстрата через фильтр из мелко¬
пористого материала, на поверхности которого задерживаются
бактерии. Действие большинства бактериальных фильтров осно¬
вано на адсорбировании микроорганизмов в порах фильтра.
Объясняется это тем, что клетки микроорганизмов в водных сус¬
пензиях обычно заряжены отрицательно, а фильтры изготовляют
из материала, несущего положительный заряд.В микробиологической практике получили распространение
бактериальные фильтры двух типов — пластинчатые и фильтры-
свечи.К пластинчатым фильтрам относятся асбестовые, стеклянные и нитроцеллю-
лозные.Пластинчатые фильтры Зейтца типа ЕК изготовляют из смеси целлюлозы и
асбеста; их проницаемость возрастает с увеличением относительного содержания
целлюлозы. Верхняя, соприкасающаяся с субстратом поверхность фильтров твер¬
дая. Фильтры помещают в металлические держатели и зажимают винтами, дер¬
жатель с фильтром устанавливают в колбу Бунзена. Между отводной трубкой
колбы и водоструйным насосом помещают фильтр из ваты или другого мате¬
риала. Держатель с фильтром и резиновой пробкой заворачивают в бумагу и
стерилизуют отдельно.Стеклянные фильтры представляют собой пластинки из пористого стекла.
В ВНР распространены стеклянные фильтры марки «Шотт Иена», размер пор
которых характеризуется индексами от Gi до G5. В качестве бактериальных
фильтров можно применять стеклянные фильтры только марки G5. Их стерили-
зуют так же, как и фильтры Зейтца. Стерильные фильт¬
ры помещают в держатель с помощью резиновой проб¬
ки, укрепленной в колбе.Мембранные фильтры «Миллипор» изготовляют из
нитроцеллюлозы. Круглые фильтры толщиной 0,1 мм
могут иметь поры различного диаметра. Целям мик-Рис. 9. Оборудование
для стерилизации фильт¬
рованием:а — свеча Беркефельда; б —
стеклянный фильтр Шотт
Иена; в — фильтр Зейтца
ЕК; I — фильтр; 2 — филь¬
трующая пластинка; 3 — к
насосу.29
робиологического фильтрования наиболее соответствуют мембранные фильтры
№ 1. Стерилизацию их проводят в закрытой ватой конической колбе с дистилли¬
рованной водой в течение 15—30 минут под давлением 1 атм. Держатель фильт¬
ра и колбу стерилизуют раздельно.К фильтрам-свечам относятся свечи Шамберлана, изготовленные из обож¬
женной смеси каолина п кварца, а также свечи Беркефельда из инфузорной
земли.Размер пор фильтров Шамберлана обозначают индексами от Li (наиболее
крупные поры) до Lu (наименьшие). Фильтры Беркефельда имеют обозначения
W, N и V; W — наименьший размер пор (3—4 мкм).Фильтры-свечи подсоединяют к вакуумному насосу через стерильный воз¬
душный фильтр. Приступая к фильтрованию, в содержащий фильтруемую жид¬
кость сосуд вводят свечу и создают в ее полости вакуум. В результате жид¬
кость проникает во внутреннюю полость, которая должна быть стерильной. Раз¬
личные типы фильтров представлены на рисунке 9.Фильтры-свечи и стеклянные фильтры после использования
промывают дистиллированной водой, затем на сутки помещают
в концентрированную серную кислоту, содержащую небольшое
количество NaN03 и КС1, и после этого многократно промывают
водой и кипятят. Не рекомендуется обрабатывать их раствором
бихромата калия в серной кислоте, так как хромат адсорбиру¬
ется на посерхпостп фильтров и может повредить их. Следует
также избегать промывки фильтров концентрированными щело¬
чами, поскольку она приводит к увеличению размеров пор. Орга¬
нические загрязнения на свечах удаляют прокаливанием их в му¬
фельной печи. При стерилизации фильтрованием следует обра¬
щать внимание на состав стерилизуемой среды, так как, помимо
бактериальных клеток, фильтры могут адсорбировать различные
соединения, например отдельные жирные кислоты, белки и поли¬
сахариды. Если необходимо выполнить анализ химического соста¬
ва фильтрата или выявить в нем наличие различных веществ
(витаминов, антибиотиков и т. п.), следует принимать во внима¬
ние физико-химические свойства фильтра, диаметр пор и ско¬
рость фильтрации.1.2.4. Лучевая стерилизацияВ микробиологических лабораториях для стерилизации исполь¬
зуют излучение ультрафиолетовой части спектра. Наиболее выра¬
женным бактерицидным эффектом обладают лучи с длиной вол¬
ны 253—265 нм.При поглощении ультрафиолетовых лучей нуклеиновыми кис¬
лотами микроорганизмов образуются димерные пиримидиновые
комплексы. В результате ДНК утрачивает способность к дупли¬
кации, и размножение микроорганизмов становится невозможным.
В малых дозах ультрафиолетовое излучение оказывает мутагенное
действие. Летальная доза для спор приблизительно в два раза
превышает дозу, оказывающую бактерицидное действие на веге¬
тативные клетки микроорганизмов. Длительность стерилизации
ультрафиолетовым излучением следует определять опытным пу¬
тем. Такой обработке можно подвергать пластмассовую посуду,
пробнркл для центрифуг, силикагелевые пластинки Виноградско¬30
го. Успех стерилизации зависит от мощности источника излуче¬
ния и расстояния между источником и стерилизуемым объектом.
Этот метод применяют также для частичной стерилизации шка¬
фов для посева в микробиологических лабораториях, а также
других помещений (операционные, больничные палаты и т. д.).Стерилизация гамма-лучами находит применение прежде все¬
го в промышленности. Проникающая способность и бактерицид¬
ный эффект этих лучей, обладающих высокой энергией, очень
велики. Наиболее часто данный вид излучения применяют для
обеззараживания консервов и фармацевтической продукции, но
он с успехом может быть использован и для стерилизации пита¬
тельных сред.1.2.5. Химическая стерилизация и дезинфекцияДезинфицирующими средствами в микробиологической практике
в основном служат химические вещества, но в последнее время
все более широкое распространение получают методы газовой
стерилизации. К ним относится, в частности, стерилизация окисью
этилена и ß-пропиолактоном. Особенно успешно этот метод мо¬
жет быть применен для стерилизации лабораторной посуды, изго¬
товленной из синтетических материалов. Преимущество подоб¬
ных веществ состоит в том, что они не вступают во взаимодейст¬
вие с обрабатываемым материалом. Газовую стерилизацию мож¬
но проводить в специально оборудованных шкафах.Широко используют в лабораториях производные гликоля,
формалин и т. д. В виде аэрозолей их можно применять для обез¬
зараживания воздуха, поверхностей приборов, мебели и стен по¬
мещений. Водные растворы этих веществ используют для мытья
рук, протирания столов и стен. Семена растений, предназначен¬
ные для получения стерильных культур, также подвергают хими¬
ческой стерилизации.Наиболее распространены следующие стерилизующие вещест¬
ва:а — органические: 1—3%-ные растворы производных фенола
(фенол, крезол, лизол, гексахлорфен), формальдегид и его 1—
3%-ные водные растворы, тиомерзал (мертиолат), стерогенол,
этанол (70%), газообразные окись этилена и ß-пропиолактон.б — окислители: хлорированная вода (водный раствор газа
С1г), хлорная известь, 0,1—0,3%-ные растворы хлорогена (нео-
магнол), 0,3—3,0%-ные растворы перекиси водорода (гиперол),
0,1—1,0%-ные растворы перманганата калия.в — соли тяжелых металлов: азотнокислое серебро, 1,0%-ный
раствор хлорной ртути (сулемы), уксуснокислое серебро.Механизм действия перечисленных дезинфицирующих ве¬
ществ неодинаков. Одни из них вызывают денатурацию белков,
другие разрушают окислительно-восстановительные системы мик¬
роорганизмов, третьи вступают во взаимодействие с группами
NH2- и ОН-белков и нуклеиновых кислот.31
і. Стерилизация различных питательных сред и оборудования* ЯТО gVO 3ч Яо н« W
со«оm х я
0.3 SЯ Н тою а ^О п.Ю о9- « о ^G СЗ Січот а
« н« я ж ф
q Он * «■*" ї>н ^ CÛ2 >»2 оС CU Ь2>» W £ ТОО с Сн 5 >>; О) Кі С -©“»К
: я о! С S я•Яоя*« сСОSнтоCNIюяо,ян>>яяО)яятоCÛоо.чи:оf—я<CL)ТОS,?Я Н $
ю О то^
a tfl*0CQCQSfr-тоясияяяSосчSнтоюo'яо.сн>>яяSосоо<м■ ffl t<2
2 о&Ля S'0! ясо^ я
<v о кÿ<U2 о* ся
: яяОчсоVO «2,0 53VOоясисн>>яяЖосчячяяЯ О)саяЯ W
_ То Оаа û.
Я о Я
CQ си £9
ТО н тоЧ Д ч
« ч «о я о
н А, Н
я^яяяsfячяо.яоосиезтооси
со Н
<и ja
си Ч
о я
^s ■*= Iто *Я Йо 5
си
н s
J3 си5 g
ёто*SяX>>яяятоСПясгЯ s
Си О
«и си
нияятоаосияяточконя<a«=(я*«яÉ-3яяэто«сиО)<оо- яaГ>Э*в*
0,0
° кси>> С
си С*5a *5 »•Ач aь I”1я ссü)U аа° «*Я О X
S сч то
оÏ О й)5 * *<и Э
я то£ *
SЯ а)« 3
о— О"з 2m я «О Л1 а2 я =t
я * <и
си а си2 s °ТО Я й)g яя 5 я
я лнясиаяяяп
н U
я 0ÛJ о
я о
оо ^« о-
Я яН о
Я о
& ^
Яо*я D ÿ§ Э то <и3 3 н яя m £ иС§*з|* I»> к
С41 А
я g
'S10ja -ws4g «С£ 4)2 CUЯ °с XаЛ *2 ля чя й> ^то Н яя 2 «CJ н яси 2 н
и С о
то я
я ао я
н я *
Я Н ьж Ш se g
я то 5
о 54) В ч ®
g g і «5 “ * ь
t s Sch S - «У Он Я aя о ^ B
>» *2
y У0 0 3 то
ffl « Ä eu
oM.sx
a §•« $
о s n*X 3 'S кк ^ 9, sCQ О я <uІ1І1&4 s S'S5 5 2 ®?s>.°У 5 2"Я ». CU t? С** 2І о ^ 5^ С- H QCQ СтоX я
к Ч -Я О <0я сио н я
Ч я оо О ж
>> W о
я
r° SяXюосия0>аяояяаси<иаяасичто я
я X
CU NO£ >*
f-1 ОнтоtoCUогЯ X ия аиз Я 03
Н 0я оЯ Ч очXа 5 2я я *ja *û4 ч £5 S ЙСи Си 2^ в> Й л)ь н О «о о си о.zннaтояоюо"яяосиняSня>»яяS Я
Зь2ю&Ê?
с соС)чоя•©*О)яятосинJ3точяо>>сия0)яятоячCJ*оняблучтом<осияо#я Оя gя 2£ »яВ ан я
а> лягся>»аояятояооотоО Ч
то а;
ч ис»яяя32
Хорошие дезинфицирующие вещества должны быть достаточ¬
но эффективными уже в незначительных концентрациях и без¬
опасными для человека даже в больших дозах, инертными по
отношению к обрабатываемому материалу и активными в тече¬
ние длительного времени. Перечисленные выше вещества в той
или иной степени отвечают этим требованиям.В таблице 3 приведены методы стерилизации, применяемые в
микробиологической практике.1.3. ИНКУБАЦИОННОЕ ОБОРУДОВАНИЕ1.3.1. ТермостатыНеобходимая принадлежность микробиологических лабораторий—
термостат, позволяющий в определенных пределах поддерживать
постоянную температуру (+1—2 °С) и создавать благоприятные
условия для инкубации культур микроорганизмов. Бактериологи¬
ческий термостат представляет собой шкаф из листовой меди с
двойными стенками, пространство между которыми заполнено
дистиллированной водой. Вода в таком кожухе, охватывающем
весь рабочий объем шкафа, подогревается электрическими наг¬
ревательными элементами с автоматическим включением и вы¬
ключением.К внутренней гофрированной стенке шкафа прикреплены ме¬
таллические уголки, поддерживающие алюминиевые решетчатые
полки. Для теплоизоляции термостата используют асбест и мине¬
ральную вату. В верхней части термостата имеются два отвер¬
стия, одно из которых предназначено для термометра, опуска¬
емого в рабочее пространство, а второе — для вентиляции.Сквозь застекленную дверцу, расположенную за наружной
изолирующей дверью, можно вести наблюдение за культурами,
помещенными в термостат. Дополнительные отверстия в верхней
его части предназначены для заливки воды, введения водомерной
трубки и терморегулятора.Для стерилизации рабочей камеры термостата пригодны раз¬
личные жидкие дезинфицирующие средства (70%-ный этанол,
стерогенол и т. д.). Следует избегать применения для этой цели
кислот и щелочей, так как они могут вызвать коррозию стенок
и полок. Не допускается заполнение водяного кожуха водопро¬
водной водой, дающей накипь.В лабораториях, где при одинаковых температурных условиях
одновременно инкубируют большое количество культур (произ¬
водственные, исследовательские и контрольные лаборатории,
учебные заведения), целесообразно оборудовать термостат-»
ную комнату с соответствующим подогревом и теплоизоляцией.
Культуры микроорганизмов можно размещать на полках вдоль
стен. Для дезинфекции этого помещения пригодны аэрозольные
дезинфицирующие средства.З й. Сэги 33
1.3.2. АнаэростатАнаэростат — это толстостенная металлическая емкость с гер¬
метически закрывающейся крышкой, в которую вмонтирован
манометр и два крана. Один из них предназначен для откачива¬
ния воздуха, т. е. для удаления кислорода, а второй — для за¬
полнения объема нейтральными газами (аргоном, азотом, водо¬
родом, гелием). Анаэростат способен долго сохранять вакуум, и
это существенно облегчает культивирование и очистку анаэроб¬
ных бактерий, поскольку в подобных условиях посев можно про¬
водить в обычные чашки Петри и пробирки. После размещения
культур в рабочем объеме анаэростат герметически закрывают,
прижимая крышку винтами, и откачивают воздух, доводя дав¬
ление до 15—20 мм рт. ст. Затем анаэростат заполняют соответ¬
ствующим газом или, не заполняя его, помещают в термостат,
поддерживающий необходимую температуру. Следует ежеднев¬
но контролировать показания манометра анаэростата и в случае
необходимости повторно откачивать воздух.Для контроля за содержанием кислорода применяют специ¬
альные индикаторы, которые помещают в установленную в стен¬
ке анаэростата стеклянную трубку (см. стр. 46).Иногда вместо анаэростата можно использовать и вакуумные
эксикаторы, но они не оснащены манометрами, и вакуум в этом
случае можно контролировать только по кислородному индика¬
тору.В ГДР и ВНР для культивирования анаэробных бактерий вы¬
пускают анаэробные термостаты, в которых поддерживаются не¬
обходимая температура в пределах 30—70 °С и нейтральная бес-1.4. ХОЛОДИЛЬНИКИОбычно в лабораториях ис¬
пользуют бытовые холо¬
дильники, но для исследо¬
вательской работы более
пригоден специальный ап¬
парат с системой подогре¬
ва и охлаждения типа
СР-114 Лабор, в котором
необходимый температур¬
ный режим устанавлива¬
ется быстрее и точнее. Ла¬
бораторные холодильники,
поддерживающие темпе¬
ратуру в пределах 4—5 °С,
используют довольно широ¬
ко. В них можно хранить
(но не более суток) гото¬.кислородная атмосфера.Рис. 10. Ламинарный бокс с горизонталь¬
ным воздушным потоком:/ — люминесцентные лампы; 2 — фильтр «Нера»;
3 — рабочий стол; 4 — первичный фильтр; 5 — вен¬
тилятор.34
вые и не стерилизованные питательные среды, а также собран¬
ные для анализов образцы почвы, навоза и растений. Микробио¬
логическое исследование этого материала целесообразно прово¬
дить в ближайшие после сбора образцов дни, так как при дли¬
тельном хранении количественные и качественные характеристи¬
ки микрофлоры могут измениться.Культуры микроорганизмов следует содержать в отдельном
холодильнике (5°С), следя за тем, чтобы они не были поврежде¬
ны избытком влаги. Сосуды с летучими веществами и газами
необходимо герметически закрыть. Хранение продуктов питания
в микробиологических лабораториях запрещено.1.5. ШКАФЫ, ЛАМИНАРНЫЕ БОКСЫ
И КАБИНЫ ДЛЯ ПОСЕВАШкафы для посева, использующиеся в микробиологической прак¬
тике, изготовляют из нержавеющего металла. Верхняя часть пе¬
редней стенки этих шкафов застеклена и установлена под углом
45° к горизонтальной плоскости. В нижней части сделаны два
отверстия для рук с закрепленными в них резиновыми перчатка¬
ми. К задней стенке шкафа подсоединены электрические провода
и трубы для подвода газа. Их стерилизуют с помощью дезинфи¬
цирующих веществ или ультрафиолетовой лампы.В последнее время вместо стерильных кабин все шире приме¬
няют так называемые ламинарные боксы [24]. Передняя часть
ламинарного бокса полностью открыта, в ней поддерживается
постоянный и очень слабый ток стерильного воздуха. Ламинар¬
ный (без завихрений) поток воздуха проходит через фильтры
«Нера» (high efficiency particulate air), которые почти со
100%-ной надежностью задерживают частицы размером более
0,3 мкм. В зависимости от направления воздушного потока раз¬
личают горизонтальные и вертикальные ламинарные боксы. На
рисунке 10 представлен один из боксов горизонтального типа.Кабина для посева — это изолированная часть лаборатории»
обеспечивающая возможность работы в стерильных условиях.
Водопроводные и газовые трубы встроены в стену, на поверхность
которой нанесено влагостойкое покрытие. Стерилизуют кабину
вмонтированными в нее кварцевыми лампами.
2МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ
И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ2.1. ВЗЯТИЕ ОБРАЗЦОВПравильная оценка почвенных микробиологических процессов
может быть дана лишь в том случае, если образец почвы верно
отражает характер бактериальной флоры данной территории. По¬
лучение такого образца — весьма сложная задача, поскольку
количественное распределение и состав микроорганизмов чрезвы¬
чайно неоднородны даже на небольшой площади.В литературе дается множество указаний на возможные ошиб¬
ки при взятии образца. Разброс данных для отдельных образцов
во многих случаях делает невозможным обобщение результатов.
Если столь значительные различия встречаются при химических
и физических исследованиях, то дисперсия ошибок при проведе¬
нии микробиологического анализа должна быть еще большей,
так как грамм почвы содержит миллионы и даже миллиарды
микроорганизмов, количество и состав которых в большей степе¬
ни, чем абиотические факторы, зависят от внешних условий.Способы отбора образцов почвы для микробиологических ис¬
следований еще далеко не унифицированы. Из теории статистиче¬
ских расчетов известно, что для получения наиболее достоверных
для данной площади микробиологических характеристик необхо¬
димо обработать как можно большее количество случайных об¬
разцов. Однако на практике число образцов зависит от возмож¬
ностей лаборатории. Поэтому для количественного определения
почвенных микроорганизмов Фехер [26] рекомендует проводить
анализ усредненной пробы, полученной путем смешивания не¬
скольких образцов.Усредненный образец составляют только из отдельных проб
с площади, характеризующейся одинаковыми почвенными харак¬
теристиками на всех участках. Это означает, что почва на данной
площади имеет выровненную поверхность, а ее цвет, связность,
структура, содержание питательных веществ и извести, а также
морфология профилей примерно одинаковы. О степени однород¬
ности почвы можно судить и по растительному покрову. Нельзя
собирать усредненный образец на площади с неравномерным раз¬
витием растений, так как в этом случае отдельные участки поч¬
вы могут различаться по содержанию питательных веществ, фи¬
зическим или химическим свойствам.Если в целом площадь выглядит однородной, по на ней встре¬
чается 1—2 незначительных по размеру пятна с иными почвен¬36
ными характеристиками, образцы почвы с таких участков брать
не следует.Количество точек, намеченных для взятия образцов, зависит
от размеров и однородности обследуемой площади. Чем больше
таких точек, тем точнее усредненный образец отражает свойства
площади. На опытной делянке площадью 100 м2 для получения
образца достаточно взять пробы в 6—8 точках; если площадь
больше, число таких точек может достигать 15—20. Полученные
при этом образцы смешивают в стерильных условиях.С площадей, не отвечающих вышеперечисленным критериям,
берут отдельные образцы и анализируют их раздельно. Точно
так же поступают и в тех случаях, когда цель исследования за¬
ключается не в определении микробиологических характеристик
поверхностного слоя почвы, а, например, в изучении бактериаль¬
ной популяции, сформировавшейся на разлагающихся раститель¬
ных остатках, или микроорганизмов прикорневой зоны живого
растения.Для взятия образцов наиболее пригодны хорошо закрывающие¬
ся алюминиевые коробки, предварительно стерилизованные су¬
хим жаром при 170 °С. Таким же образом стерилизуют ножи, ло¬
патки, пинцеты, хотя вместо этого их можно на месте обрабо¬
тать горящим спиртом. В зависимости от цели исследования об¬
разец можно брать из пахотного слоя глубиной 20—25 см или
более глубоких почвенных слоев. В первом случае стерильным
ножом или лопаткой соскабливают поверхностный слой почвы
глубиной несколько сантиметров, затем другой лопаткой берут
образец, который осторожно переносят, в стерильный сосуд. При
взятии образца для биологических исследований Мюллер [106]
рекомендует пользоваться специальным почвенным буром, поз¬
воляющим отбирать 1 см3 грунта; бур стерилизуют горящим
спиртом.Если задача исследования состоит в изучении почвенной
микрофлоры и связанных с нею микробиологических процессов
на различных глубинах, образцы отбирают из ямы, подоб¬
ной тем, которые закладывают при изучении почвенного профи¬
ля. Стенку ямы зачищают лопатой, предварительно обработанной
горящим спиртом, затем стерильным ножом соскабливают слой
почвы толщиной 1—2 см и стерильной лопаткой отобранный об¬
разец переносят в сосуд. При проведении исследований такого
рода образцы следует отбирать из всех слоев, отличающихся
от остальных цветом, структурой, содержанием карбонатов или
химической реакцией.Если цель исследования заключается в изучении микроорга¬
низмов, обитающих в прикорневой зоне, растение выкапывают
вместе с землей, следя за тем, чтобы не повредить корневую сис¬
тему. Затем встряхиванием и с помощью пинцета удаляют круп¬
ные комки почвы, а частицы почвы, непосредственно соприкасаю¬
щиеся с поверхностью корней,, пинцетом переносят в стерильную
коробку для образцов. Если почва переувлажнена, эту операцию37
выполнить невозможно, поэтому образцы слишком влажной поч¬
вы отбирать не следует.Корневую систему растений, так же как и образцы почвы, до¬
ставляют в лабораторию в стерильной таре, помещают в холо¬
дильник, поддерживающий температуру 5 °С, и исследуют в тече¬
ние ближайших 1—2 дней.2.2. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ
ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДВыделенные из почвы микроорганизмы культивируют на пита¬
тельных средах. Эти среды не только являются источником пита¬
тельных веществ, но и обеспечивают физические и химические
условия, необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов.Питательные среды должны содержать различные компоненты
в строго определенной концентрации. Соотношение отдельных
компонентов оптимально в том случае, если оно совпадает с от¬
носительным их содержанием в бактериальной клетке. Если одно
и то же соединение одновременно служит источником углерода
и энергии, его содержание в субстрате должно покрывать и энер¬
гетические затраты, и потребности процессов биосинтеза.Существует несколько принципов классификации микробиоло¬
гических питательных сред. По составу они могут быть естествен¬
ными, полусинтетическими и синтетическими. В зависимости от
цели исследования применяют элективные и дифференциально¬
диагностические питательные среды. По консистенции их разде¬
ляют на жидкие и плотные.Естественные питательные среды состоят из продуктов растительного или
животного происхождения, используемых в виде отваров или вытяжек.Состав синтетических питательных сред всегда известен, причем содержание
всех компонентов строго определено. Полусинтетические питательные среды на¬
ряду с одним-двумя компонентами биологического происхождения содержат и
вещества известного химического состава.К элективным относятся питательные среды, на которых развиваются только
определенные микроорганизмы, в то время как развитие других бактерий или
замедлено, или совершенно подавлено. На этих питательных средах различные
микроорганизмы выделяют из их естественной среды обитания.Дифференциально-диагностические среды служат для быстрого разделения
отдельных видов микроорганизмов. Состав этих сред подбирается с таким рас¬
четом, чтобы в процессе культивирования особенно четко проявился какой-либо
характерный признак данного вида. Часто этого достигают путем добавления
определенного красителя, окрашивающего колонии микроорганизмов в соот¬
ветствующий цвет. Особенно широко дифференциально-диагностические среды
используют в медицинской микробиологии, но они находят применение и при
определении видовой принадлежности микроорганизмов.Для приготовления питательных сред обычно берут кониче¬
скую колбу большой емкости. Культуры на жидких питательных
средах инкубируют в небольших конических колбах, пробирках
или в специальных горизонтально лежащих флаконах. Нагретую
агаровую питательную среду при помощи дозировочной воронки
разливают в пробирки. Для этого в лабораторном штативе уста¬38
Рис. 11. Воронка для до¬
зирования питательных
сред.навливают воронку на 200 мл, на нижнюю
часть которой надета резиновая трубка
длиной 10 см. Снизу в резиновую трубку
вставляют небольшой стеклянный нако¬
нечник.Для дозировки жидкого агара, вытека¬
ющего из воронки, пользуются зажимом
Мора, установленным на резиновой труб¬
ке (рис. 11).В процессе приготовления питательной
среды следует строго соблюдать соответ¬
ствующие рекомендации. Во всех случаях
необходимо обращать внимание на сле¬
дующие условия:— чистота используемых колб и про¬
бирок — важнейшее требование; стеклян¬
ную посуду, вымытую различными мою¬
щими средствами или хромовой смесью,
вначале ополаскивают водопроводной, за¬
тем дистиллированной водой;— необходимо следить за чистотой ис¬
пользуемых химических веществ. По мере
возможности следует применять химика¬
ты аналитической чистоты, особенно еслипитательная среда будет использована для идентификации и под¬
держания культур;— готовя питательную среду, нужно очень точно дозировать
соответствующие компоненты. Большие количества веществ взве¬
шивают на технических, а небольшие —■ на аналитических весах.
Если необходимо приготовить навеску минимального количества
какого-либо вещества, целесообразно отвешивать десяти- или
стократное его количество, растворяя в необходимом количестве
дистиллированной воды. Нужное количество растворимой навес¬
ки переносят в питательную среду с помощью пипетки;— отдельные компоненты растворяют поочередно в том поряд¬
ке, в каком они приводятся в рецепте питательной среды, каждый
последующий компонент добавляют после полного растворения
предшествующего. Агар-агар расплавляют на водяной или паро¬
вой бане, использование открытого пламени для ускорения плав¬
ления агара не допускается;— после приготовления питательной среды проверяют, а в
случае необходимости корректируют химическую реакцию полу¬
ченного раствора. Для установки pH обычно используют 0,1 н.
раствор гидроокиси натрия или соляной кислоты;— при стерилизации в автоклаве необходимо строго выдержи¬
вать температурный режим (давление) и длительность обработ¬
ки, предписанные для данной питательной среды;— по окончании стерилизации рекомендуется проверить pH
питательной среды;39
— необходиімо проверить стерильность приготовленной пита¬
тельной среды. Для этого готовую среду после стерилизации по¬
мещают на 2—3 дня в термостат при 28 °С;— хранят питательные среды в прохладном сухом помеще¬
нии;— разлитые в пробирки питательные среды не следует хранить
более 1—2 недель. Пересевают микроорганизмы всегда на све¬
жеприготовленную питательную среду.В последние годы в продажу поступает все больше готовых
питательных сред и прежде всего — разнообразная продукция
фирм «Дифко» и «Оксоид». Эти препараты обладают стабильны¬
ми характеристиками и обеспечивают получение воспроизводи¬
мых и сопоставимых результатов. Стандартизация методов мик¬
робиологических исследований будет способствовать более широ¬
кому использованию готовых питательных сред.Составы и способы приготовления питательных сред, наиболее
часто применяемых в почвенной микробиологии, приведены в
конце книги (см. гл. 12). В дальнейшем при изложении методов
культивирования микроорганизмов в круглых скобках указыва¬
ются порядковые номера соответствующих питательных сред.2.3. ПОЛУЧЕНИЕ ОБОГАЩЕННЫХ КУЛЬТУРКультивирование почвенных микроорганизмов — обычно дли¬
тельная и трудоемкая процедура, одним из промежуточных эта¬
пов которой во многих случаях является получение обогащенных
культур. Обогащенной называют такую культуру, в которой пре¬
обладают микроорганизмы определенной группы или вида, хотя
наряду с ними в небольшом количестве встречаются и другие
бактерии.Необходимость в обогащенной культуре возникает в том слу¬
чае, если содержание в почве микроорганизмов данного вида не¬
велико в сравнении с другими видами; в процессе обогащения
оно возрастает. Обогащенные культуры получают на элективных
питательных средах, обеспечивающих наиболее благоприятные
для данного вида условия развития. Использование элективных
сред связано с тем, что для развития различных микроорганизмов
нужны неодинаковые условия. Соответствующая элективность
питательных сред достигается введением в них в одних случаях
специальных источников углерода (целлюлоза, лигнин, воск, па¬
рафин и т. д.), в других — специфических источников азота (мо¬
лекулярный азот, карбамид). Так, на питательных средах, не со¬
держащих азота, могут развиваться прежде всего микроорганиз¬
мы, усваивающие атмосферный азот. Однако избирательность пи¬
тательной среды может быть достигнута не только за счет опре¬
деленного химического ее состава, но и путем подбора соответ¬
ствующих условий культивирования (температура, аэрация, осве¬
щенность, присутствие антибиотиков или иных химических ве¬
ществ) .40
2.4. ПОЛУЧЕНИЕ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР2.4.1. Аэробные микроорганизмы2.4.1.1. Метод посева в толщу средыДля получения чистых или обогащенных культур в микробиоло¬
гической практике наиболее широко применяют метод посева в
толщу среды. Разработка этого метода связана с именем Коха,
который впервые получил и использовал плотные питательные
среды. На их поверхности развиваются изолированные колонии
микроорганизмов, и благодаря этому чистая культура может
быть легко выделена.Сущность данного метода заключается в приготовлении серии
разведений обогащенной культуры или субстрата (почва, навоз
и т. п.), из которых требуется выделить культуру соответствую¬
щего микроорганизма. Навеску (10 г) почвы или гомогенизиро¬
ванного навоза вносят в 90 мл дистиллированной воды и в тече¬
ние получаса встряхивают. После этого 1 мл полученной суспен¬
зии стерильной пипеткой переносят в пробирку, содержащую 9 мл
стерильной воды, и тщательно перемешивают встряхиванием. Та¬
ким же образом готовят следующие разведения, количество ко¬
торых зависит от плотности суспензии. Затем по 1 мл суспензии
каждого разведения в стерильных условиях переносят в чашки
Петри. Туда же заливают охлажденную до 50 °С жидкую агари-
зованную питательную среду (15—20 мл), которую круговыми
движениями чашки тщательно смешивают с бактериальной сус¬
пензией. После застывания агаровой пластинки чашки Петри по¬
мещают в термостат и инкубируют от 2 до 10 суток, в зависи¬
мости от особенностей культивируемого микроорганизма (подав¬
ляющее большинство бактерий проходит полный цикл развития
за 2—3 суток, грибы растут несколько медленнее, а для развития
актиномицетов требуется еще больше времени).По окончании инкубации отбирают те чашки, в которых от¬
дельные колонии выросли на достаточном расстоянии одна от
Л,ругой, и затем в зависимости от консистенции колонии с по¬
мощью иглы или петли для посева необходимый материал пере¬
севают на скошенный агар.Отдельные колонии на агаровой пластинке развиваются обыч¬
но из единственной бактериальной клетки, поэтому часто уже
после первого пересева получают чистую культуру. Если же по¬
сле первого пересева культура еще содержит сопутствующие мик¬
роорганизмы, повторно готовят разведения и высевают материал
на агаровую пластинку. Очень трудно получить чистую культуру
микроорганизмов, имеющих слизистую капсулу (Azotobacter),
поскольку к ней очень часто прилипают относительно мелкие
сопутствующие бактерии. В таких случаях можно попытаться от¬
делить их, встряхивая суспензию с кварцевым песком или каким-
либо иным методом.41
2.4.1.2. Посев петлейМетод посева петлей применяют для культивирования таких мик¬
роорганизмов, колонии которых имеют определенные, заметные
невооруженным глазом различия. Этот метод, широко используют
для отделения обогащенных культур плесневых грибов и актино¬
мицетов от сопутствующих бактерий. С этой целью в чашке
Петри готовят плотную агаризованную питательную среду, по ме¬
ре возможности обеспечивая более благоприятные условия для
роста выделяемых микроорганизмов. Петлей для посева из обо¬
гащенной культуры набирают небольшое количество материала,
и, приподняв крышку чашку Петри, по всей поверхности агаро¬
вой пластинки проводят волнистые линии. Поскольку в исходном
материале преобладают клетки выделяемого микроорганизма,
очевидно, при нанесении линий на питательную среду на петле
дольше будут оставаться именно эти бактерии. Вдоль последних
линий можно наблюдать уже не сплошной рост, а развитие еди¬
ничных изолированных колоний (рис. 12). Затем проводят пере¬
сев отдельных колоний на скошенный агар или (с целью контро¬
ля) вторичный посев петлей на пластинку.Одна из модификаций этого метода предусматривает нанесе¬
ние на поверхность агаровой пластинки по 0,1 мл различных раз-
ведений бактериальной суспензии. С помощью стерильного шпа¬
теля субстрат равномерно растирают по поверхности среды и
после инкубации осуществляют пересев единичных колоний. По¬
сев шпателем можно применять только после испарения влаги с
поверхности агаризованной среды, так как на влажной пластинке
колонии срастаются. Готовые пластинки перед использованием
переворачивают вверх дном и выдерживают в термостате до ис¬
парения капель воды, попавших на внутреннюю поверхность
крышки.Рис. 12. Очистка бактериальных культур посевом штрихом.42
2.4.1.3. Метод почвенных пластинок УоркапаМетод выделения грибов. В стерильную чашку Петри вносят
0,005—0,015 г измельченной почвы. Оптимальную величину на¬
вески определяют опытным путем в зависимости от интенсивно¬
сти роста колоний на питательной среде. К почвенному образцу
добавляют 10 мл агара Чапека-Докса (70), нагретого до 45 °С и
содержащего 0,5% дрожжевой вытяжки; pH устанавливают на
уровне 4. Круговыми движениями чашки почву равномерно рас¬
пределяют по всей ее площади. Комковатую почву перед добав¬
лением агара размачивают 1—2 каплями стерильной воды. После
застывания питательной среды перевернутые вверх дном чашки
Петри помещают в термостат, инкубируют в течение нескольких
суток и затем пересевают выросшие колонии.Преимущество метода Уоркапа [1,71] по сравнению с метода¬
ми, основанными на приготовлении серий разведений, состоит в
том, что в данном случае исследователь имеет дело с естествен¬
ной, нетронутой массой спор микроорганизмов и таким образом
получает больше шансов на выявление всего видового разнооб¬
разия микроорганизмов.В принципе аналогичен и предложенный Новогрудским способ
культивирования микроорганизмов путем нанесения измельчен¬
ной почвы на поверхность застывшей агаризованной питательной
среды.2.4.1.4. Получение монокультур методом
влажной камерыРазработанный Гансеном так называемый метод, влажной каме¬
ры позволяет получать чистые культуры из крупноклеточных
микроорганизмов (дрожжевых грибов) и конидий микроскопиче¬
ских грибов.Принцип метода Гансена состоит в следующем: на середину
стерильного предметного стекла помещают стеклянное кольцо
внутренним диаметром 15 мм и толщиной 1 мм, нижняя и верх¬
няя поверхности которого смазаны вазелином. В центр кольца
вносят одну каплю стерильной воды и накрывают его покров¬
ным стеклом. На нижнюю поверхность покровного стекла нане¬
сен тонкий слой агаризо¬
ванной питательной среды,
в которой содержатся и
клетки выделяемых микро¬
организмов (рис. 13). Под- с Агаровая
готовленную влажную ка- ^щ0 средамеру помещают под микро- / скоп и отыскивают участок ~ ел L и ’ агаровой пластинки, на ко- ^ватепинтором видны только клеткинужного микроорганизма; Рис. 13. Камера Гансена.;•р,зч5в»78•9mn12mn»1643
более удобно пользоваться покровным стеклом, расчерченным на
квадраты. Выбранные квадраты соответствующим образом отме¬
чают, затем влажную камеру помещают в стерильную чашку
Петри и инкубируют в термостате. После инкубации под микро¬
скопом отыскивают точки роста микроорганизмов и с помощью
стерильной иглы проводят пересев образовавшихся микроколо¬
ний.2.4.1.5. Получение монокультур с помощью
микроманипулятораПрименяемые в микробиологической практике микроманипуляци-
онные методы позволяют осуществлять всевозможные тонкие
операции (например, связанные с получением монокультур и
т. д.). Микроманипуляторы делятся на две группы. Если в одном
случае все манипуляции микроиглами, микропипетками, микрото¬
мами осуществляют системой микрометрических рычагов, то в
системе, разработанной французским биологом Фонбрюном, при¬
менен пневматический привод этих инструментов. Микроманипу¬
ляторы с пневматическим приводом более чувствительны, чем
механические.Рабочие инструменты микроманипуляторов видны в поле зре¬
ния микроскопа, и экспериментатор с помощью рычагов опериру¬
ет ими, выделяя отдельные бактериальные клетки из висящей
во влажной камере капли с целью размножения их на соответ¬
ствующей питательной среде. Культуры, полученные с помощью
микроманипулятора, совершенно чисты, так как обычно их выра¬
щивают из одной-двух клеток; кроме того, за процессом выделе¬
ния можно следить при помощи микроскопа.Однако микроманипуляторы можно применять для получения
чистых культур не во всех случаях. Иногда разобщенные, изоли¬
рованные клетки отдельных микроорганизмов или не размно¬
жаются совсем, или же этот процесс идет очень медленно. Ско¬
рость размножения возрастает, если в питательной среде присут¬
ствует много бактерий данного вида. В других случаях получение
монокультур затруднено присутствием посторонних микроорга¬
низмов, прилипающих к слизистой капсуле выделяемых бакте¬
рий.2.4.2. Методы культивирования анаэробных бактерийБольшинство бактерий — облигатных анаэробов — способны раз¬
виваться при окислительно-восстановительном потенциале суб¬
страта не выше минус 0,33 в. Для сравнения можно отметить, что
гН воды при нормальном атмосферном давлении составляет
+0,80 в. Результативность культивирования в анаэробных усло¬
виях зависит прежде всего от того, насколько удается снизить
окислительно-восстановительный потенциал субстрата до указан¬
ного уровня. Осуществить это можно путем, удаления молекуляр-44
Рис. 14. Жидкая культура в запаянной стеклянной трубке:
а — исходная пробирка; б — запаянная пробирка; 1 — к насосу; 2 —
резиновая пробка; 3 — ватная пробка; 4 — культура.ного кислорода. При анаэробном культивирова¬
нии для удаления кислорода используют как
механические, так и химические средства. Куль¬
тивированию в анаэробных условиях способст¬
вует и добавление в питательную среду неболь¬
ших доз восстановителей, нетоксичных для дан¬
ных микроорганизмов.Культивирование в запаянных трубках. Дан¬
ный метод, получивший распространение при
выращивании культур на жидких питательных
средах, с успехом может быть применен и для
культивирования в анаэробных условиях. Для
этого используют специальные пробирки, сужен¬
ные в верхней трети. После внесения посевного
материала в питательный бульон в пробирку вводят ватную проб¬
ку, проталкивая ее до сужения. Затем из пробирки откачивают
воздух и с помощью специальной газовой горелки оплавляют ее
суживающуюся часть (рис. 14). Запаянные трубки инкубируют в
термостате. О размножении анаэробных микроорганизмов свиде¬
тельствует помутнение питательной среды.Культивирование в трубках Вейона. Для культивирования
анаэробных бактерий на плотной питательной среде применяют
особые стеклянные трубки, более тонкие и длинные, чем обычные
пробирки (10X200 мм). Такие трубки заполняют агаром на 2/з, а
при стерилизации следят за тем, чтобы ватная пробка не намок¬
ла. Пока питательная среда не застыла (45°С), посевной мате¬
риал пастеровской пипеткой вносят на дно трубки. В результате
над культурой находится столбик агара высотой более 100 мм.Культивирование в закрытых сосудах. Большие массы ана¬
эробных культур можно инкубировать в емкостях, из которых
выкачивают воздух. Специально для этой цели созданы анаэро-
статы, но их можно заменить лабораторными вакуумными экси¬
каторами. После размещения культур в анаэростате из него от¬
качивают воздух, доводя давление до 15—20 мм рт. ст. Посколь¬
ку при длительной инкубации вакуум поддерживать довольно
трудно, откачиваемый воздух обычно заменяют каким-либо нейт¬
ральным газом (водород, азот и т. п.). Рекомендуется вначале
«ополоснуть» емкость вводимым газом и затем вместе с ним от¬
качать оставшийся кислород.С целью удаления остаточного кислорода в емкость можно
поместить небольшое количество зерен палладия, затем откачать
воздух и заменить его водородом. Палладий катализирует реак¬
цию между кислородом и водородом.45
Рис. 15. Пирогаллоловый метод культивирования в анаэробных ус¬
ловиях по Бурри:Î — резиновая пробка; 2 — хлопок; 3— бумажная вата; 4 — скошенный агар.Для контроля за поддержанием бескислородной
атмосферы служат кислородные индикаторы — агаро¬
вый анаэробный индикатор Лукаса (находящийся в
продаже) и индикатор Филдса-Макинтоша, состав и
способ приготовления которого приведен в конце книги
(13). Индикатор в открытой ампуле устанавливают в
боковой стеклянной трубке анаэростата или в вакуум¬
ном эксикаторе и по изменению окраски судят о присут¬
ствии кислорода.Пирогаллоловый метод. В микробиологической практике при
культивировании анаэробных микроорганизмов широко исполь¬
зуют свойство щелочного раствора пирогаллола интенсивно пог¬
лощать молекулярный кислород (щелочной раствор 1 г пирогал¬
лола связывает 260 мл О2). По методу культивирования, пред¬
ложенному Бурри, анаэробные бактерии высевают в пробирки на
скошенный агар, как при выращивании культур аэробных микро¬
организмов. Затем бритвой срезают верхнюю выступающую часть
бумажной или ватной пробки, закрывающей пробирку, а остав¬
шуюся часть пинцетом проталкивают вглубь почти до верхнего
края агара. На пробку бросают 1—2 гранулы гидроокиси натрия
или калия, сверху на них помещают пропитанную концентриро¬
ванным пирогаллолом (2—4 мл) вату и пробирку быстро закры¬
вают резиновой пробкой (рис. 15). Удалить пропитанную пиро¬
галлолом вату довольно сложно, поэтому нижнюю часть пробир¬
ки обычно обрезают и отверстие закрывают резиновой пробкой,
а при пересеве удаляют ее.Недостаток пирогаллолового метода — образование при окис¬
лении пирогаллола небольшого количества моноокиси углерода,
подавляющей рост некоторых культур. Кроме того, на размноже¬
ние культур может влиять и связывание щелочью двуокиси кис¬
лорода из воздуха. Определенный уровень содержания двуокиси
углерода благоприятно сказывается на росте анаэробных культур.Во многих случаях удаление кислорода дополняют введением
в питательную среду восстановителей (до 0,05% цистеина, 0,01 —
0,02% тригликолята натрия и т. д.).Выращивание анаэробных культур в чашках Петри. Некото¬
рые исследователи рекомендуют применять метод культивирова¬
ния на агаровых пластинках, получивший широкое распростране¬
ние при выращивании культур аэробов. Для этого целесообразно
использовать чашки Петри, оснащенные крышками Брюэра. Та¬
кая крышка прилегает к краям агаризованной питательной среды
в чашке, причем под крышкой остается полностью изолированное
пространство (рис. 16). При отсутствии таких чашек Петри по¬
верхность агара можно покрыть слоем стерильного парафина
толщиной 1 мм. Чашки с парафиновым покрытием, как и чашки46
с крышками Брюэра, инкубиру¬
ют в анаэростате или вакуум¬
ном эксикаторе.Термическая очистка споро¬
образующих видов. Облигатные
анаэробы обычно относятся к
спорообразующим видам и, сле¬
довательно, более термостойки.Поэтому для очистки таких культур от сопутствующих микроор-
ганизов их можно выдерживать определенное время на водяной
бане. При этом погибают вегетативные клетки выделяемых мик¬
роорганизмов, жизнеспособность сохраняют только споры. Соот¬
ветствующий температурный режим определяют опытным путем.
Для удаления сопутствующих бактерий используют методы, осно¬
ванные на применении элективных питательных сред.2.4.3. Культивирование водорослейПолучение чистых культур водорослей сопряжено с очень боль¬
шими трудностями, поскольку к слизистым клеточным стенкам
водорослей прилипают различные почвенные бактерии и удалить
их весьма трудно. Поэтому культуры почвенных водорослей выра¬
щивают в так называемом «получистом» состоянии.Способы культивирования и содержания водорослей обычно
совпадают с методами, разработанными для бактерий и грибов,
с той лишь разницей, что водоросли как автотрофные фотосин¬
тезирующие организмы требуют для развития периодического или
постоянного освещения источником света силой в 200—500 све¬
чей. Предназначенные для культивирования водорослей почвен¬
ные образцы отбирают, соблюдая стерильность, и затем навески
по 20 г помещают в стерильные чашки Петри. Эти образцы про¬
питывают питательной средой (48, 49) и в течение 4—5 недель
инкубируют при температуре 24 °С, используя искусственное или
естественное освещение (при этом постоянно восполняют испаряю¬
щуюся влагу). По истечении соответствующего времени при по¬
мощи микроскопа определяют, развились ли на почве водоросли,
отбирают кусочек почвы с большим их количеством, помещают
его в колбу емкостью 100 мл, содержащую 25 мл жидкой пита¬
тельной среды с минеральными добавками для водорослей, и ин-
кХ’бируют в тех же условиях. После инкубации, длящейся 2—3 недели, в питательной среде происходит массовое размножение
водорослей. Далее готовят минеральную питательную среду для
водорослей, содержащую 2% агара, а также серию разведений
обогащенной культуры водорослей. В чашках Петри отливают
агаровые пластинки с добавлением водорослевой суспензии раз¬
личной концентрации; материал отдельных колоний, полученных
после инкубации, пересевают на скошенный агар. Перед приго¬
товлением серии разведений суспензию рекомендуется тщательно
размешать, встряхивая ее с кварцевым песком, чтобы освобо¬
диться от сопутствующих бактерий.Рис. 16. Чашка Петри с крышкой
Брюэра для культивирования ана¬
эробных бактерий.47
2.5. ПОДДЕРЖАНИЕ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВВ условиях длительного лабораторного культивирования тот или
иной микроорганизм может утратить отдельные биохимические
особенности, изменяется и морфология колоний и клеток. К таким
изменениям относятся, в частности, прекращение образования
воздушного мицелия актиномицетами; утрата способности орга-
низмов-антагонистов синтезировать антибиотики и способности
бактерий разлагать целлюлозу; ослабление или полное прекраще¬
ние фиксации атмосферного азота. Изменчивость такого рода
может возрастать при слишком частых пересевах, изменении сос¬
тава питательной среды, условий освещенности, влажности или
температуры. В специальной литературе приведено множество
методов правильного поддержания микробиологических куль¬
тур. Основная их особенность состоит в доведении до минимума
процессов жизнедеятельности культивируемых клеток.Исходя из этого, следует стремиться к более редким пересе¬
вам штаммов, проводя их через равные промежутки времени и
всегда на питательную среду неизменного состава. Выросшие
культуры следует хранить в прохладном сухом шкафу или в хо¬
лодильнике при +5 °С.2.5.1. Поддержание микроорганизмов в почвеОпределенные микроорганизмы, прежде всего грибы, актиноми-
цеты и некоторые спорообразующие бактерии, в высушенном со¬
стоянии можно хранить в стерильной почве или кварцевом пес¬
ке. В пробирку вносят 10—15 г воздушно-сухой тонкоразмолотой
почвы или кварцевого песка и в течение 1,5—2 часов стерилизуют
в автоклаве при 1,5—2 атм. Длительная стерилизация под
большим давлением, особенно важна при работе с почвой,
так как она содержит большое количество бактериальных
спор, устойчивых к высоким температурам. Необходимо сле¬
дить за тем, чтобы в процессе стерилизации в почве ие обра¬
зовались токсичные вещества, отрицательно влияющие на бакте¬
риальную культуру.Клетки или споры соответствующего микроорганизма вносят
петлей для посева в стерилизованную и высушенную почву или
песок. Пробирки хранят в прохладном сухом месте. Для получе¬
ния культур материал высевают в толщу питательной среды или
жь вместе с кварцевым песком (почвой) пересевают непосредст¬
венно на скошенный агар.2.5.2. ЛиофилизацияЛучший способ хранения микроорганизмов —> это лиофилизация
(высушивание в замороженном состоянии). Проведенные в тече¬
ние нескольких десятилетий исследования показали, что подав¬
ляющее большинство микроорганизмов переносят замораживание
и высушивание без повреждений. Можно отметить следующие пре¬
имущества хранения лиофилизованных микроорганизмов.48
— отпадает необходимость в частых пересевах, нередко при¬
водящих к заражению и гибели культур;— лиофилизованная культура сохраняет все морфологические,
биохимические, серологические и иммунологические характерис¬
тики;— лиофилизованный препарат более неприхотлив к условиям
и длительности хранения;— для хранения лиофилизованных культур не нужно много
места.Для лиофилизадии наиболее пригодны бактериальные культу¬
ры, развивавшиеся в течение 24 часов. Культуры медленно расту¬
щих микроорганизмов (в частности, актиномицетов) лиофилизи-
руют на 5—10-е сутки развития, когда они уже вполне сформи¬
ровались. Для смывания культур в ампулы или пробирки исполь¬
зуют раствор так называемого защитного коллоида, предохра¬
няющего культуры от потерь при замораживании и высушива¬
нии. В качестве защитного коллоида лучше всего использовать
стерильный обрат или отфильтрованную на бактериальном филь¬
тре и инактивированную сыворотку крови. И обрат, и сыворотку
можно применять с одинаковым, успехом. В каждую пробирку
вносят по 1 мл защитного коллоида и смывают бактериальные
клетки с поверхности агара. По 0,1—0,2 мл полученной плотной
эмульсии переносят пипеткой в стерильные ампулы, закрытые
ватными пробками.Для лиофильной сушки применяют установки различных кон¬
струкций, но принцип их действия остается неизменным. Лиофи-
лизируемый материал замораживают в процессе центрифугиро¬
вания, при этом он распределяется по стенкам ампулы и засты¬
вает. В условиях глубокого вакуума лед из замороженного
материала испаряется. Степень высушивания препарата пропор¬
циональна длительности сушки и глубине вакуума.После этого, также в условиях вакуума, ампулы запаивают,
контролируют герметичность и хранят при температуре 5 °С. Ка¬
чество препарата определяется глубиной вакуума в запаянной
ампуле.2.5.3. Хранение грибов в жидком азотеКультуру гриба суспендируют в стерильном 10%-ном растворе
глицерина, по 0,5 мл суспензии вносят в ампулы из бористого
стекла, после чего ампулы запаивают. Для проверки качества
запечатывания ампулы на 30 минут помещают в раствор краси¬
теля, осматривают и отбраковывают те, в которые проникает
краситель. Хорошо запаянные ампулы высушивают, ставят в ме¬
таллический штатив и выдерживают в течение часа у отверстия
сосуда с жидким азотом (температура около минус 35°С). После
предварительной стадии замораживания вертикально установлен¬
ные в штативе ампулы погружают в жидкий азот (минус 196°С).
При необходимости ампулы извлекают из жидкого азота и сразу
же переносят в водяную баню с температурой 30 °С.4 Й. Сэги 49
Холодильник с жидким азотом представляет собой емкость
с двойными стенками из нержавеющей стали. Для теплоизоляции
в межстенном пространстве создается вакуум, сверху емкость за¬
крывают толстой крышкой из синтетических материалов. В эти
холодильники один раз в неделю заливают жидкий азот с таким
расчетом, чтобы он покрывал штативы с ампулами. При работе
с жидким азотом следует соблюдать необходимые меры предосто¬
рожности. Запрещены работа с жидким азотом без асбестовых
рукавиц и вскрытие ампул без защитного щитка на лице.Этот метод дает возможность длительного хранения культуры
грибов и актиномицетов. Преимущество его состоит в том, что
он позволяет хранить культуры грибов, не переносящих лиофили-
зацию.2.5.4. Поддержание культур грибов на силикагелеОбезжиренный молочный порошок (50 г) растворяют в 1000 мл
дистиллированной воды и по 2 мл полученного молочного раство¬
ра вносят в пробирки. Закрытые ватными пробками пробирки с
разведенным молоком в течение 10 минут стерилизуют при
1 атм. До использования их хранят в холодильнике.Сосуды для культур с герметически завинчивающимися крыш¬
ками на заполняют силикагелем без индикатора (6—22 меш,
№ 7553 по каталогу фирмы «Хопкинс и Уильямс»), В течение по¬
лутора часов силикагель стерилизуют сухим жаром при 180 °С,
после чего сосуды хранят в сухом месте при 37 °С. Если в процес¬
се хранения гель пропитается влагой, его вновь высушивают.Сосуды, содержащие стерильный силикагель, устанавливают
на поднос и погружают в воду, уровень которой не должен до¬
стигать резьбы крышки. Затем подносы переносят в морозиль¬
ную камеру, в которой вода застывает.Культуры грибов или актиномицетов, а также пробирки со
стерильным молоком на одну ночь помещают в термостат, под¬
держивающий температуру 4 °С. Такое предварительное охлаж¬
дение необходимо, так как при увлажнении геля выделяется зна¬
чительное количество тепла, а это опасно для микроорганизмов.Густую суспензию грибной культуры, приготовленную в мо¬
локе, в стерильных условиях переносят на гель, следя за тем,
чтобы он не был полностью насыщен. Сосуды еще в течение 20
минут выдерживают на ледяной бане, затем приоткрывают и
высушивают при комнатной температуре до тех пор, пока кри¬
сталлы можно будет перемешать встряхиванием. После этого
крышки плотно завинчивают, и сосуды устанавливают для хра¬
нения в холодильник при 4 °С. Низкий уровень влажности в кон¬
тейнере с сосудами поддерживают при помощи индикаторного
силикагеля, который регенерируют 1—2 раза.Культуры можно содержать на силикагеле длительное время.
Для пересева из сосуда берут 1—2 кристалла.
зМИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ КУЛЬТУР
МИКРООРГАНИЗМОВПри микроскопировании исследуемый объект обычно помещают
на предметное стекло, представляющее собой прямоугольную
стеклянную пластинку размером 75X25 мм и толщиной не более
1,2 мм. Более толстое предметное стекло не позволяет получать
четкое изображение объекта и мешает наблюдениям. Качество
препарата в значительной степени определяется чистотой пред¬
метного стекла, присутствие на его поверхности мелких загрязне¬
ний затрудняет микроскопирование. Если же стекло покрыто жи¬
ровыми загрязнениями, оно непригодно для приготовления мазка
исследуемого материала. Для очистки предметные стекла на не¬
сколько суток помещают в хромовую смесь, затем промывают во¬
дой, а после высыхания — 96%-ным спиртом. Хороший результат
дает протирание предварительно промытых водой предметных
стекол эфиром. Такое стекло можно использовать сразу же после
испарения эфира. Применения концентрированных растворов ще¬
лочей для очистки предметных стекол следует избегать, так как
щелочи разъедают стекло и оно утрачивает прозрачность. Чистые
предметные стекла следует хранить в специальных стеклянных
ванночках, заполненных спиртом.Покровное стекло представляет собой тонкую стеклянную
пластинку, которой накрывают водный препарат. Размеры по¬
кровного стекла—25X25 мм при толщине не более 0,15—0,17 мм.
Более толстое стекло ухудшает качество изображения.В зависимости от цели исследования препарат может содер¬
жать живые или фиксированные бактериальные клетки. В пре¬
паратах с живыми клетками микроорганизмы сохраняют форму,
структуру, размеры и подвижность, но они плохо окрашиваются
и для наблюдения за ними нужны сухие объективы небольшого
увеличения. Фиксированные препараты хорошо окрашиваются, их
можно наблюдать с использованием иммерсионных объективов, од¬
нако при фиксации бактериальные клетки деформируются и те¬
ряют подвижность.3.1. МИКРОСКОПИРОВАНИЕ ЖИВЫХ КУЛЬТУР3.1.1. Приготовление водного препаратаНа поверхность предварительно очищенного предметного стекла
наносят каплю водопроводной воды. Дистиллированная вода для
этой цели непригодна, так как гипотонический раствор вызовет4* 51
деформацию клеток. При исследовании жидких культур одну
каплю материала стерильной пипеткой переносят на предметное
стекло и смешивают с водой. Если клеточная суспензия культуры
не слишком густа, наносить на предметное стекло воду необяза¬
тельно.При помощи петли для посева клетки культуры, выра¬
щенной на плотной питательной среде, вносят в каплю воды и
осторожно суспендируют в ней. Покровное стекло помещают реб¬
ром на предметное и осторожно опускают его на суспензию, сле¬
дя за тем, чтобы между стеклами не было пузырьков воздуха.
Избыток воды удаляют фильтровальной бумагой. Затем препарат
помещают на предметный столик микроскопа и исследуют, ис¬
пользуя сухие объективы.Живые бактериальные клетки можно окрашивать 0,001 —
0,0001 %-ным раствором метиленового синего или нейтрального
красного. Краситель добавляют к культуре перед накрыванием
покровным стеклом. Приготовленный таким образом водный пре¬
парат пригоден для изучения формы, размеров, спорообразова¬
ния и подвижности микроорганизмов.3.1.2. Препарат «висячая капля»Препарат «висячая капля» обычно используют при изучении
подвижности микроорганизмов, но он с успехом может быть при¬
менен для исследования размножения бактериальных клеток,
процессов спорообразования и прорастания спор, а также реак¬
ции клеток на различные химические агенты.Висячую каплю готовят следующим образом. На середину
чистого покровного стекла наносят каплю исследуемой бактери¬
альной суспензии так, чтобы она не растекалась. Каплю материа¬
ла покрывают предметным стеклом с лункой, причем стекло не
должно касаться капли. Покровное стекло вместе с предметным
быстро переворачивают, при этом капля оказывается висящей
над углублением предметного стекла, но не соприкасается с ним
(рис. 17). Для предотвращения высыхания препарата края покров¬
ного стекла смазывают вазелином. С этой целью петлей для по¬
сева набирают вазелин, на мгновение вводят его в пламя горелки
и затем петлей проводят вдоль краев покровного стекла. Расплав¬
ленный вазелин вновь застывает, герметически запечатывая
влажную камеру с висящей каплей жидкости.Если препарат нужно изучать длительное время, предметное
и покровное стекла предварительно стерилизуют в автоклаве или
горящим спиртом. Висячую каплю целесообразно готовить из пи¬
тательного бульона.При изучении подвижно¬
сти микроорганизмов следует !». учитывать возможные пере- 1мещения жидкости в каплеи броуновское движение. Рис. 17. Препарат «висячая капля».52
3.1.3. Приготовление микрокультуры
в агаровой пленкеДля изучения процессов деления бактерий, образования конидий
грибами и актиномицетами готовят культуры на предметном
стекле. На середину предметного стекла наносят каплю агаризо-
ванной питательной среды и петлей для посева распределяют ее'
тонким слоем. На полученную агаровую пленку высевают иссле¬
дуемый материал и накрывают покровным стеклом, края кото¬
рого смазаны вазелином. Если культура не запечатана вазели¬
ном, ее следует инкубировать в атмосфере, насыщенной водяным
паром.3.1.4. Приготовление отпечатка колонииПрепарат-отпечаток пригоден прежде всего для изучения спор и
спороносцев актиномицетов и грибов, которые в этом препарате
совершенно не повреждаются. Из агаризованной питательной сре¬
ды вырезают колонию диаметром около 10 мм, извлекают ее из
чашки Петри и помещают на предметное стекло колонией вверх.
Затем пинцетом берут чистое покровное стекло и осторожно, не
сдвигая его в сторону, прижимают к колонии. После этого покров¬
ное стекло опускают на предметное стекло с каплей воды или
раствора метиленового синего. Готовый препарат исследуют с
применением сухих оптических систем.На предметном стекле также можно получить отпечаток куль¬
туры, который затем фиксируют и соответствующим образом ок¬
рашивают.3.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ФИКСИРОВАННЫХ
ПРЕПАРАТОВ3.2.1. Методы фиксацииМорфологические особенности культивируемых бактерий наибо¬
лее удобно изучать на фиксированных и окрашенных препаратах.
Такие препараты можно применять для контроля чистоты куль¬
туры, для количественного определения бактерий и т. д. Проце¬
дура получения фиксированного препарата состоит из приготов¬
ления мазка, высушивания, фиксирования и окрашивания.Для приготовления мазка на обезжиренную поверхность пред¬
метного стекла наносят каплю воды, в которой равномерно сус¬
пендируют клетки исследуемой бактериальной культуры. Полу¬
ченную суспензию возможно более тонким, слоем распределяют
по площади 15X15 мм. Правильно приготовленный мазок быстро
высыхает при комнатной температуре. .Высушенный мазок необходимо зафиксировать, поскольку
фиксированный препарат лучше закрепляется на поверхности
предметного стекла и при последующей окраске материал с него •53
не смывается. Кроме того, фиксированный препарат лучше окра¬
шивается, и, наконец, в процессе фиксации патогенные микроор¬
ганизмы утрачивают способность вызывать заболевания.В микробиологической практике применяют различные спосо¬
бы фиксации препаратов. Наиболее простой и быстрой является
термическая фиксация, когда предметное стекло мазком вверх
трижды проносят над верхней частью пламени газовой горелки.Для химической фиксации применяют различные вещества:
соединения хрома, формалин, осмиевую кислоту, ацетон, метило¬
вый и этиловый спирты, эфир и т. д. Наибольшее распростране¬
ние получили методы фиксации с применением смеси этилового
спирта и эфира в соотношении 1:1 (жидкость Никифорова), а
также фиксирующего раствора Карноя (8). Фиксирующий раствор
наносят на поверхность мазка пипеткой или же предметное стек¬
ло с мазком погружают в кювету с фиксирующим веществом.
Продолжительность фиксации в метиловом спирте 3—5 минут.
Метиловый спирт обладает и обезжиривающим действием. По
истечении времени фиксации фиксирующий раствор смывают во¬
дой, избыток воды удаляют с помощью фильтровальной бумаги
и затем препарат высушивают при комнатной температуре или
помещают для сушки на верхнюю полку стола Коха.Как термическая, так и химическая фиксация основаны на
осаждении белков бактериальных клеток, которые при этом, за¬
крепляются на предметном стекле. Применение сильных коагу¬
лянтов может вызывать изменение морфологии бактериальных
клеток.3.2.2. Окраска фиксированного препаратаПравильный выбор метода окраски бактерий — необходимое
условие диагностического исследования. Известно множество спо¬
собов окраски, среди которых различают простые, сложные, диф¬
ференциальные, а также специальные методы.Для окрашивания микроорганизмов применяют как кислые,
так и основные красители. Первые вступают в реакцию с основ¬
ными, а вторые — с кислотными радикалами. В клетках микроор¬
ганизмов присутствуют и кислотные (СООН) и основные (NH2)
радикалы, поэтому для их окрашивания одинаково пригодны оба
типа красителей.Наиболее распространенные основные красители:
красные — нейтральный красный, пиронин, сафранин, фуксин;
фиолетовые — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый,
метиленовый фиолетовый, гематоксилин, тионин;
синие — виктория, метиленовый синий;зеленые — янус зеленый, метиленовый зеленый, малахитовая зелень;
коричневые — везувин, хризоидин;
черный — индулин.Наиболее распространенные кислые красители:
красные и розовые — кислый фуксин, эритрозин;
черный — нигрозин;желтые — конго, пикриновая кислота, флуоресцин.54
Окрашивание может быть позитивным или негативным. При
позитивном процессе окрашиваются клетки микроорганизмов, при
негативном — пространство между бактериальными клетка¬
ми; в последнем случае неокрашенные клетки выглядят светлы¬
ми на равномерно окрашенном фоне.3.2.3. Простая окраскаПри простых способах окраски препарат обрабатывают красящим
раствором один раз. Обычно для этого применяют анилиновые
красители, из которых наиболее известны метиленовый синий,
основной фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый фиоле¬
товый. Состав и способ приготовления отдельных красителей при¬
ведены в приложении, в дальнейшем даются ссылки (в скобках)
на соответствующие номера прописей.Красящий раствор наносят на мазок пипеткой или же пред¬
метное стекло с мазком на 1—2 минуты погружают целиком в
кювету с красителем. После этого препарат промывают, осторож¬
но подавая воду на верхний край предметного стекла до полного
обесцвечивания стекающей воды. Затем остатки воды на поверх¬
ности мазка осторожно удаляют фильтровальной бумагой и вы¬
сушивают препарат на воздухе.3.2.4. Сложная дифференцированная окраскаПри окраске этим способом препарат обрабатывают двумя раз¬
личными красящими растворами — основным и дополнительным.
Возможность сложной окраски объясняется неодинаковой вос¬
приимчивостью различных клеточных структур к отдельным кра¬
сителям. Дифференцированная окраска весьма важна при диаг¬
ностическом исследовании бактерий.3.2.4.1. Окраска методом ГрамаЭтот метод окрашивания был разработан датским ученым Хри¬
стианом Грамом в 1884 г., и хотя с тех пор описано множество
модификаций данного метода, основной его принцип остался не¬
изменным. В микробиологической практике окрашивание по
Граму служит важным диагностическим методом.Метод основан на том, что под действием генциаиового фиоле¬
тового (или кристаллического фиолетового) и йода в клетках
бактерий отдельных видов образуется комплекс йодпарарозали-
на, не растворяющийся в спирте или других органических раство¬
рителях (эфире, ацетоне). Такие бактерии называют грамполо-
жительными в отличие от грамотрицательных, клетки которых
после обработки красителями обесцвечиваются под действием
органических растворителей и в дальнейшем могут быть окра¬
шены в другой цвет.55
Результат окрашивания по Граму во многих случаях зависит
и от возраста бактериальной культуры. Молодые клетки отдель¬
ных бактерий окрашиваются как грамположительные, в то время
как более взрослые культуры или не окрашиваются совсем, или
окрашиваются слабо. В связи с этим метод Грама пригоден для
молодых 1—2-дневных культур. Для контроля целесообразно про¬
водить окрашивание известных грамположительных и грамотри-
цательных культур.Окрашивание по Граму дает хороший результат лишь в том
случае, если мазок достаточно тонок и бактериальные клетки
распределены равномерно, без больших скоплений на предметном
стекле. Окрашивание проводят следующим образом. Зафиксиро¬
ванный в пламени горелки мазок 1—2 минуты обрабатывают
карболовым раствором генцианового фиолетового (19) или кри¬
сталлического фиолетового (21). С препарата, не промывая во¬
дой, удаляют избыток краски, наливают на него раствор Люголя
(27) и выдерживают 1—2 минуты. После обработки раствор Лю¬
голя сливают и, не промывая препарат водой, несколько раз по¬
гружают его в сосуд, содержащий 96%-ный спирт.В результате обработки спиртом из грамотрицательных кле¬
ток краситель вымывается. Обесцвечивание .— наиболее деликат¬
ный этап всей процедуры окрашивания, поскольку при слишком
продолжительной обработке спиртом могут обесцветиться и
грамположительные клетки. В обратном же случае краситель
может остаться в грамотрицательных бактериальных клетках.
Процесс обесцвечивания считают законченным, когда с покров¬
ного стекла вместе со спиртом уже не стекают частицы красите¬
ля. Целесообразно одновременно окрашивать несколько препара¬
тов, меняя продолжительность спиртовой обработки.После обесцвечивания препарат промывают водопроводной
водой, в течение двух минут окрашивают фуксиновым раствором
по Пфайферу (35) и исследуют под микроскопом с иммерсионной
системой.Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолето¬
вый цвет, а грамотрицательные бактерии, воспринимая дополни¬
тельную окраску, приобретают светло-малиновый цвет.Окраска по Граму в модификации Копелоф — Бирмана. Дан¬
ный метод [62] обладает тем преимуществом, что после окрашива¬
ния препарат не содержит скоплений цветных клеток, часто вво¬
дящих исследователя в заблуждение. Модификацию метода Гра¬
ма особенно широко применяют для окрашивания препаратов из
культур, выращенных на жидких питательных средах. Для этого
используют смесь растворов А и Б, приготовленных по методу
Бэка (6) и взятых в определенном соотношении.На предметном стекле готовят мазок и высушивают его на
воздухе; подогревать препарат не следует. Непосредственно перед
окрашиванием к 1,5 мл раствора А добавляют 0,4 мл раствора Б
и полученной смесью красят мазок в течение 5 минут. Затем рас¬
твором йода, приготовленным по методу Копелоф — Бирмана56
(24), смывают краску и покрывают на две минуты мазок. Рас¬
твор йода смывают водопроводной водой, мазок промокают филь¬
тровальной бумагой и еще во влажном состоянии обрабатывают
смесью эфира и ацетона в соотношении 1 : 1 до обесцвечивания
стекающей жидкости; обесцвечивание можно ускорить, увеличив
содержание ацетона. После этого препарат высушивают на воз¬
духе и в течение 5—10 секунд красят раствором сафранина крас¬
ного по Бэку (7). Затем краску смывают, препарат высушивают
и исследуют под микроскопом с иммерсионной системой. Грам-
положительные клетки окрашиваются в темно-синий, грамотрица-
тельные — в красный цвет.3.2.4.2. Окраска кислотоустойчивых бактерий
по Цилю—НильсенуПервооткрывателем данного принципа окрашивания был Эрлих,
но в 1882—1883 гг. Циль и Нильсен [107, 178], изучая возбудите¬
ля туберкулеза, модифицировали его метод. В настоящее время
он стал общепризнанным для диагностики кислотоустойчивых
бактерий. Эти микроорганизмы (все виды Mycobakterium, отдель¬
ные представители Nocardia и Streptomyces), отличающиеся вы¬
соким содержанием липидов в клетках, окрашиваются очень пло¬
хо и воспринимают красители только в условиях так называемо¬
го «агрессивного» окрашивания (обработка карболовой кислотой,
подогревание). В то же время, уже окрашенные клетки не обес¬
цвечиваются даже смесью спирта и кислоты.Окрашивание методом Циля — Нильсена выполняют следую¬
щим образом: на препарат, зафиксированный в пламени горелки,
наносят несколько капель карболового фуксина (46) и накры¬
вают фильтровальной бумагой. Мазок, накрытый пропитанной
фуксином бумагой, нагревают над пламенем в течение 5 минут.
При нагревании над бумагой появляются пары, но доводить крас¬
ку до кипения не следует. Нельзя допускать и высыхания препа¬
рата, с этой целью в случае необходимости добавляют 1—2 капли
дистиллированной воды. По окончании окрашивания и охлажде¬
ния пластинки бумагу удаляют, а мазок промывают водой. Обес¬
цвечивают препарат, погрузив его на 3—5 секунд в 5%-ный рас¬
твор серной или 3%-ный раствор соляной кислоты. После смыва¬
ния обесцвечивающей жидкости водой препарат докрашивают
синькой Лёффлера (25). В результате кислотоустойчивые бакте¬
рии окрашиваются в красный, а остальные клетки — в синий
цвет.3.2.4.3. Окраска спор бактерийЧрезвычайно жизнеспособные споры бактерий имеют круглую
или овальную форму и могут быть расположены в средней части
бактериальной клетки (центральное расположение), на каком-
либо ее конце (терминальное расположение) или ближе к одному
из концов клетки (субтерминальное расположение). В том слу¬57
чае, если диаметр споры меньше поперечного размера бактери¬
альной клетки, мы имеем дело со спорами бациллярного типа.
Если же диаметр споры больше и в месте ее размещения тело
клетки утолщается, говорят о клостридиальном или плектриди-
альном типе расположения споры в зависимости от того, находит¬
ся ли она на конце или в центре клетки. Размер и тип размеще¬
ния споры — постоянные и характерные для каждого вида приз¬
наки.Споры бактерий окрашиваются с большим трудом, но после
окрашивания не обесцвечиваются при обработке кислотами. Это
объясняется как толщиной и плохой проницаемостью оболочки
спор, так и высоким содержанием в них липидов и низким содер¬
жанием воды. Перед окраской споры необходимо обработать
каким-либо веществом (кислотой, щелочью), увеличивающим
проницаемость оболочки. Затем можно проводить окрашивание
методом, аналогичным способу окраски кислотоустойчивых бакте¬
рий (с нагреванием). После окраски препарат обесцвечивают
смесью кислоты и спирта, в результате протоплазма бактери¬
альных клеток обесцвечивается, а споры остаются окрашенными;
протоплазму затем докрашивают в какой-либо контрастный цвет.
Таким образом, принципы окрашивания спор и кислотоустойчи¬
вых бактерий очень схожи.По методу Бартоломью и Митвера [7] окрашивание выпол¬
няют следующим образом: мазок фиксируют, многократно про¬
нося его в пламени горелки, на 10 минут покрывают насыщенным
на холоду раствором малахитовой зелени и в течение 10 секунд
промывают холодной водой. На препарат наносят 0,25%-ный рас¬
твор сафранина и выдерживают 15 секунд. Избыток красителя
смывают водой, препарат досуха промокают фильтровальной бу¬
магой.Споры окрашиваются в зеленый, а вегетативные клетки — в
красный цвет.Метод окрашивания спор по Цилю — Нильсену в модифика¬
ции Мюллера. Несколько модифицированный метод окраски кис¬
лотоустойчивых бактерий по Цилю — Нильсену можно приме¬
нять и для окрашивания спор. С той целью на поверхность маз¬
ка, зафиксированного над пламенем, на 5—10 минут наносят
5%-ный раствор хромовой кислоты. Затем кислоту смывают, на
препарат наносят несколько капель карболового фуксина, накры¬
вают его фильтровальной бумагой и нагревают до появления
паров красителя (но не до кипения). Для предотвращения высы¬
хания препарата на фильтровальную бумагу наносят 1—2 капли
дистиллированной воды. После нагревания в течение 7 минут
краску смывают водой, затем окрашенную цитоплазму в течение
15—30 секунд обрабатывают 1%-ным раствором соляной кисло¬
ты. После этого соляную кислоту смывают водой, а цитоплазму
докрашивают метиленовым синим (25). В результате споры окра¬
шиваются в красный, а цитоплазма — в синий цвет.58
3.2.4.4. Окрашивание капсулОтдельные виды бактерий, особенно на богатых углеводами пи¬
тательных среДах, образуют слизистую капсулу, которая не окра¬
шивается обычными методами. Для окраски капсул применяют
так называемое негативное окрашивание, в результате которого
межклетное пространство окрашивается тушью или каким-либо
красителем, а клетки остаются неокрашенными. На черном фоне
хорошо заметна бесцветная капсула, окружающая клетку.На чистом обезжиренном покровном стекле каплю туши (43)
смешивают с каплей жидкой бактериальной суспензии и с по¬
мощью покровного стекла готовят тонкий мазок. Мазок высуши¬
вают на воздухе и исследуют под микроскопом с иммерсионной
системой. В поле зрения микроскопа на черном фоне четко вы¬
рисовываются бактериальные клетки и окружающие их капсулы.Окрашивание капсул по способу Гинса. Вышеописанным спо¬
собом готовят негативно окрашенный тушью препарат и после
высыхания окрашенный мазок в течение 2—3 минут обрабаты¬
вают 7%-ным раствором хлорной ртути, концентрированным ме¬
тиловым спиртом или смесью эфира и этилового спирта в соот¬
ношении 1:1; обработка двумя последними веществами длится
5—10 минут. Зафиксированный таким образом препарат промы¬
вают водой и окрашивают разбавленным в соотношении 1 :3
карболовым фуксином Циля (46). Длительность окрашивания
3—5 минут. В поле зрения микроскопа на темном фоне видны
светло-малиновые клетки, окруженные бесцветными капсулами.3.2.4.5. Окрашивание жгутиковЧисло и расположение жгутиков бактерий служат важными диа¬
гностическими признаками. Обычные способы окраски бактерий
не позволяют наблюдать жгутики в проходящем свете, поскольку
их диаметр не превышает 0,04 мкм, а объекты таких размеров
выходят за пределы разрешающей способности микроскопа. Жгу¬
тики отдельных бактерий можно наблюдать при микроскопиро-
вании в темном поле. В последнее время для исследования жгу¬
тиков все шире применяют электронный микроскоп.Все без исключения способы окраски жгутиков основаны на
протравливании мазка танином. В результате такой обработки
диаметр жгутиков увеличивается и достигает размеров, превы¬
шающих разрешающую способность микроскопа. Далее жгутики
окрашивают, и в конечном счете они становятся видимыми при
микроскопировании в проходящем свете.Жгутики легко отделяются от поверхности клетки, поэтому
важнейшее условие правильной окраски — это абсолютная чисто¬
та предметного стекла. Для этого отбирают совершенно новые
стекла, 24 часа выдерживают их в смеси концентрированной сер¬
ной кислоты и бихромата калия, промывают водой и хранят в
кювете с 96%-ным этиловым спиртом. Перед использованием
предметные стекла прокаливают в пламени горелки.59
При частых пересевах процесс образования жгутиков становит¬
ся более интенсивным, поэтому за 4—5 дней до исследования
рекомендуется начать серию пересевов, проводя их по возможно¬
сти ежедневно. Для исследования можно отбирать молодые (12—
18 часов) культуры. С этой целью выросшую на агаре культуру
осторожным встряхиванием смывают в 2—3 мл стерильной воды
и полученную суспензию переносят в стерильную пробирку. Не
рекомендуется соскребать культуру с поверхности агара петлей
для посева. В зависимости от плотности суспензии ее разбавля¬
ют, добавляя 5—8 мл стерильной водопроводной воды, готовят
препарат «висячая капля» и под микроскопом исследуют под¬
вижность бактерий. Характер движения легко проверить, смешав
суспензию исследуемой культуры с 0,1%-ным раствором ртути
или 5%-ным раствором фенола в соотношении 1 : 1. После такой
обработки активное перемещение бактерий в висячей капле не
происходит, но броуновское движение остается неизменным.Метод окрашивания жгутиков по Лёффлеру. Каплю исследу¬
емой суспензии наносят на предварительно очищенное предмет¬
ное стекло, высушивают при комнатной температуре, однократно
проносят в пламени горелки и обрабатывают протравой Лёффле-
ра (26) при нагревании в течение 3—5 минут; в условиях ком¬
натной температуры обработка длится 15—20 минут.По истечении этого времени препарат промывают дистилли¬
рованной водой, высушивают при комнатной температуре и 3—
4 минуты окрашивают карболовым фуксином Циля (46). Затем
краску смывают и препарат исследуют с применением иммерси¬
онных систем. В результате окрашивания и бактериальные клет¬
ки и жгутики приобретают розовый цвет.Метод окрашивания жгутиков по Морозову. Окрашивание вы¬
полняют следующим образом: мазок обрабатывают раствором
I Морозова (32) и спустя минуту промывают водой. Затем на
мазок наносят раствор II, в течение одной минуты осторожно
нагревают (до появления паров) и вновь промывают водой. Пос¬
ле этого на препарат наносят раствор III и осторожно нагре¬
вают до появления темно-коричневой окраски (1—2 минуты).
Наконец, препарат вновь промывают водой, высушивают и иссле¬
дуют с применением иммерсионных систем.3.2.4.6. Методы окрашивания ядерного
материала бактерийПростые способы окраски дают равномерное окрашивание прото¬
плазмы бактерий, их клеточные структуры при этом неразличи¬
мы. Однако электронная микроскопия, радиоавтография и спе¬
циальные методы окраски позволяют выявить в отдельных бак¬
териях структуры, соответствующие клеточному ядру более высо¬
коорганизованных организмов. Отличие ядерного материала бак¬
терий состоит в том, что он не покрыт мембраной и не содержит
ядрышка.60
Ядерная структура содержит генетический фонд бактерий и
представляет собой скрученную двойную макромолекулу ДНК
длиной около 1200 мкм с молекулярной массой в несколько мил¬
лионов. В отличие от более высокоорганизованных клеток в этой
молекуле ДНК соотношение пар оснований аденин — тимин:гуа-
нин — цитозин непостоянно и меняется в зависимости от вида
бактерий. Способы окраски ядерного материала основаны на ре¬
акции определенных веществ с ДНК-Метод окраски ядерного материала по Романовскому — Гим-
зе. Данный метод пригоден и для окраски волютина. Приготов¬
ленный и высушенный мазок в течение 5 минут обрабтывают ме¬
тиловым спиртом или фиксирующим раствором по Карною (8).
После фиксации этиловым спиртом смывают следы уксусной кис¬
лоты и мазок подсушивают на воздухе. Для окраски препарата
применяют краску Гимзы — смесь азура II (органический краси¬
тель, получаемый из метиленового синего) и эозина, растворен¬
ную в смеси глицерина и метилового спирта. Перед употребле¬
нием 10 капель краски растворяют в 10 мл дистиллированной во¬
ды с pH 7,2; полученный препарат используют для окрашивания
ядерного материала. Окрашивание, которое длится 24 часа, про¬
водят в специальной ванночке. Избыток красителя смывают во¬
дой, препарат высушивают и микроскопируют с применением
иммерсионных систем. Ядерный материал окрашивается в фиоле¬
тово-красный, а протоплазма — в бледно-розовый цвет.Окраска ядерного материала методом Фёльгена. Метод осно¬
ван на окрашивании молекулы ДНК- При мягком кислотном
гидролизе от образующих ядерный материал нуклеопротеидов
отщепляются пуриновые и пиримидиновые основания, в резуль¬
тате из ДНК высвобождаются молекулы дезоксирибозы. В про¬
цессе гидролиза дезоксирибоза превращается в ß-гидроксилеву-
линовый альдегид, вступающий в реакцию с радикалом серной
кислоты бесцветного сернокислого фуксина. Фуксин, высвобожда¬
ющийся в результате реакции, окрашивает ядерный материал,
который хорошо различим в цитоплазме.Высушенный на воздухе мазок в течение 5 минут обрабатыва¬
ют фиксирующим составом по Карною (8) и промывают абсо¬
лютным спиртом. Затем препарат на 7 минут помещают в подо¬
гретый до 60 ЧС 1 н. раствор НС1, на 1—2 минуты переносят в
холодный солянокислый раствор и обрабатывают в течение 3—4 часов сернистокислым раствором фуксина (39).По окончании обработки препарат на 20 минут помещают в
кювету С подкисленной H2SO4 водой, повторяя эту процедуру
еще дважды, промывают водой, высушивают и микроскопируют
с иммерсионным объективом. Ядерный материал окрашивается в
фиолетовый цвет.Оформленные ядерные структуры встречаются лишь у части
бактерий, поэтому окраска ядерного материала дает положи¬
тельный результат не во всех культурах.61
3.2.4.7. Окрашивание протоплазматических
включений бактериальных клеток3.2.4.7.1. Методы окрашивания метахроматических
зеренВ молодых клетках некоторых видов микроорганизмов встреча¬
ются метахроматические зерна (волютин). Известно, что они сос¬
тоят из фосфатно-липидных комплексов, но их физиологическая
роль изучена пока недостаточно. В бактериях и актиномицетах
волютин встречается в цитоплазме, а в клетках дрожжей и пле¬
сневых грибов локализован в вакуолях.Окраска волютина методом Омелянского. Высушенный на
воздухе мазок фиксируют над пламенем горелки и 30 секунд
окрашивают карболовым фуксином Циля (46) без нагревания.
После этого препарат промывают водой, 20—30 минут обесцвечи¬
вают в 1%-ном растворе серной кислоты, смывают ее остатки
водой и проводят контрастное окрашивание метиленовым синим
(1:40). В поле зрения микроскопа красные зерна волютина
резко выделяются на фоне протоплазмы, окрашенной в синий
цвет.Окраска волютина методом Нейссера. Мазок, зафиксирован¬
ный над пламенем горелки в течение 1—2 минут, окрашивают
смесью растворов А и Б Нейссера (33), взятых в соотношении2: 1 ; необходимое количество смеси готовят непосредственно пе¬
ред использованием. Препарат промывают, в течение 1—2 минут
проводят контрастное окрашивание раствором В, затем краску
смывают, препарат высушивают и исследуют с применением им¬
мерсионных систем. В желтой цитоплазме отчетливо видны зерна
волютина, окрашенные в темно-синий цвет [108].3.2.4.7.2. Выявление включений гликогенаОдин из типов клеточных включений представляют зерна глико¬
гена, встречающиеся в протоплазме дрожжевых грибов и отдель¬
ных бактерий. Особенно много гликогена содержат дрожжевые
клетки, культивируемые на мальтозном агаре (113). Гликоген
может быть обнаружен при помощи раствора йода в йодистом
калии (17).Небольшое количество исследуемого материала наносят на
предметное стекло петлей для посева или пипеткой и суспенди¬
руют в капле воды. Для культур на жидких питательных средах
вода нужна лишь в том случае, если суспензия слишком густа.
Затем к суспензии добавляют каплю раствора йода в йодистом
калии (17) и накрывают материал покровным стеклом. Получен¬
ный препарат исследуют с использованием иммерсионного объек¬
тива. Присутствующие в клетках зерна гликогена окрашиваются
в красновато-коричневый цвет.62
3.2.4.7.3. Окрашивание гранулезыГранулеза представляет собой крахмалоподобный углевод, на¬
капливающийся перед спорообразованием прежде всего в клет¬
ках молочнокислых бактерий (Clostridium acetobutyricum). К сус¬
пензии исследуемой бактериальной культуры на предметном
стекле Добавляют каплю раствора Люголя (27), накрывают по¬
кровным стеклом и микроскопируют с применением иммерсион¬
ного объектива. В результате обработки гранулеза окрашивается
в темно-синий цвет.Липиды встречаются в клетках почти всех микроорганизмов.
Особенно большое количество жиров содержат старые культуры.На предметное стекло наносят каплю 40%-ного раствора фор¬
малина и петлей суспендируют в нем исследуемый материал.
Формалин убивает микроорганизмы и вызывает разбухание кле¬
ток. Примерно через 5 минут добавляют каплю метиленового
синего (1:40), а еще через 10 минут — каплю раствора Судана
ÎII (41). Затем препарат накрывают покровным стеклом и ис¬
следуют с применением иммерсионного объектива. В результате
окрашивания плазма принимает синий цвет, жировые капли —
розовый, а вакуоли остаются бесцветными.При микроскопировании может возникнуть необходимость в оп¬
ределении размеров исследуемого организма. Для этого необхо¬
димы фиксированный препарат, а также окуляр-микрометр и
объект-микрометр. Окуляр-микрометр представляет собой круг¬
лую стеклянную пластинку, в центре которой нанесен отрезок3.2.4.7.4. Окрашивание липидов3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАЗМЕРОВ МИКРООРГАНИЗМОВРис. 18. Окуляр-микро¬
метр.63Рис. 19. Объект-микрометр.
прямой длиной 5 мм с делениями по 0,1 мм (рис. 1,8). Окуляр-
микрометр вставляют (всегда шкалой вверх) в верхнюю часть
окуляра на диафрагму, предварительно вывинтив верхнюю линзу
окуляра. Расстояние, соответствующее показаниям окуляр-микро-
метра, определяют с помощью объект-микрометра следующим
образом.Окуляр-микрометром определяют, скольким делениям шкалы
соответствуют размеры (длина, ширина) клетки. Затем препарат
удаляют и на его место помещают объект-микрометр (рис. 19).
После наведения микроскопа на резкость окуляр вместе с микро¬
метром вращают до совмещения шкалы окуляра с плоскостью
шкалы объект-микрометра и определяют, сколько делений оку¬
ляр-микрометра совпадает с одним делением объект-микрометра.
Если деления на двух шкалах совпадают, то в данной системе
окуляр — объектив каждое деление окуляра равно 10 мкм. Если
на три деления объект-микрометра (30 мкм) приходится 14 деле¬
ний окуляр-микрометра, деление последнего составляет
30: 14 мкм. Расчет цены одного деления выполняют по следую¬
щей формуле:0 ЛхЮ мкм
п = 2 ъ ,где п — цена деления окуляр-микрометра; А — число делений объект-микромет-
ра, совпадающих с делениями шкалы окуляр-микрометра; В — число делений
окуляр-микрометра, совпадающих с делениями объект-микрометра; 10 — цена
одного деления объект-микрометра (10 мкм).Вычисленные значения справедливы только для данной систе¬
мы объектив — окуляр, следовательно, расчет следует проводить
для каждой из использованных комбинаций. В дальнейших ис¬
следованиях пользуются уже только окуляр-микрометром и по
таблице с расчетными данными определяют размеры изучаемых
объектов. Повернув соответствующим образом окуляр вместе с
микрометром, можно измерить не только длину, но и ширину
клетки микроорганизма.Если нужно подсчитать число объектов, находящихся в поле
зрения микроскопа, пользуются окулярной сеткой. Подобно оку¬
ляр-микрометру, она представляет собой круглую стеклянную
пластинку, которую и в этом случае помещают под верхнюю лин¬
зу окуляра. Размеры делений сетки также определяют отдельно
для каждой из комбинаций при помощи объект-микрометра. Зная
размер отдельных ячеек сетки и количество объектов, располо¬
женных в ячейках, можно легко подсчитать общее количество
объектов во всем, препарате.Для определения диаметра поля зрения микроскопа шкалу
объект-микрометра располагают таким образом, чтобы она про¬
легала вдоль диаметра поля зрения, а край поля совпадал с од¬
ним из делений шкалы. После этого подсчитывают число делений.
ПРИНЦИПЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯПОЧВЕННЫХМИКРООРГАНИЗМОВ4.1. СИСТЕМАТИКА БАКТЕРИИПри исследовании биологических характеристик почв часто воз¬
никает необходимость в систематизации почвенных организмов.
Общепринятым руководством для этого служит определитель
Берги [10J, который переиздавался восемь раз. Новые данные и
расширение методологической базы позволили более четко опре¬
делить и связать в единую систему отдельные таксономические
единицы. В настоящее время таксономия микроорганизмов бази¬
руется на положениях определителя Берги 8-го издания (1974 г.).Этот определитель охватывает прокариоты, но в него не вклю¬
чены синезеленые фотосинтезирующие бактерии. В 8-м издании
определителя бактерии разделены на 19 групп. Их названия от¬
ражают характерные свойства соответствующих микроорганиз¬
мов и часто совпадают с наименованиями таксонов. Различают
следующие группы бактерий:I —фотосинтезирующие бактерии;II —подвижные, ползающие бактерии;III —бактерии, окруженные капсулой;IV — почкующиеся и ветвящиеся бактерии;V — спирохеты;VI —спиральные и изогнутые бактерии;VII —грамотрицательные аэробные палочковидные формы и
кокки;VIII—грамотрицательные палочковидные факультативные
анаэробы;IX — грамотрицательные анаэробные бактерии;X — грамотрицательные кокки и коккобациллы;XI —грамотрицательные аэробные кокки;XII —грамотрицательные хемолитотрофные бактерии;XIII — бактерии, продуцирующие метан;XIV — грамположительные кокки;XV — палочковидные формы и кокки, образующие эндоспо¬
ры;XVI — грамположительные палочковидные формы, не обра¬
зующие спор;XVII — актиномицеты и сходные с ними организмы'XVIII — риккетсии;XIX — микоплазмы.Внутри групп, насколько позволяли принципы классификации,
выделены роды. Систематическое положение многих родов микро¬5 И. Сэги 65
организмов точно не установлено, поэтому они отнесены к соот¬
ветствующим группам с примечанием «Род неопределенного сис-
стематического положения».Описание таксономических единиц в определителе дается в следующем по-
.рядке:1) структурные особенности (форма, размеры, специфика спорообразования,
движение, морфология колоний, результат окрашивания по Граму и т. д.);2) биохимические особенности и характер питания (утилизация химических
соединений, их преобразование, продукты жизнедеятельности);3) физиологические особенности (потребность в кислороде, температурные
условия, оптимальный уровень pH среды, отношение к антибиотикам);4) экологические особенности;5) генетические особенности;6) характерный штамм.Первый шаг к определению микроорганизмов — это получе¬
ние чистых культур, техника выделения которых рассмотрена в
первой главе книги.Определение некоторых важнейших особенностей в большин¬
стве случаев уже позволяет установить, к какой из групп может
быть отнесена данная культура. Исходя из специфики естествен¬
ной среды обитания и способа культивирования, можно устано¬
вить тип питания микроорганизма и на основании этого отнести
его к одной из трех следующих групп.Хемолитотрофы-автотрофы. Единственный источник энергии—
энергия химических связей неорганических молекул (Н2, NH3,
NO2, Fe++ и т. д.). Источником углерода служат неорганические
углеродсодержащие вещества. Микроорганизмы этой группы
растут на питательных средах, не содержащих органические ве¬
щества или содержащих их следы.Фотосинтезирующие бактерии. Источник энергии для микро¬
организмов этой группы — световая энергия, хотя некоторые из
них способны утилизировать и органические соединения углеро¬
да. Фотосинтетические процессы этих организмов отличны от фо¬
тосинтеза высших растений. В определенных условиях (на свету)
их можно отличить по присутствию хлорофилла.Хемогетеротрофные микроорганизмы. Источник энергии —
энергия связи органических соединений. В качестве органогенов
им необходимы органические вещества.Таксономическое определение выделенной и соответствующим
образом проверенной на чистоту культуры следует начинать с
исследования морфологических признаков и особенностей окра¬
шивания. При этом необходимо обращать внимание на форму
клеток (сферическая, овальная, спиральная формы; у палочко¬
видных форм концы клеток могут быть прямыми, заостренными
или закругленными), на внутриклеточные образования (спора,
включения запасных питательных веществ, газовые вакуоли), а
также на взаимное расположение клеток. Эти признаки необхо¬
димо изучать под микроскопом как на живом материале, так и
в окрашенном препарате. Поскольку одним из важных критериев
систематизации служит реакция на окрашивание по Граму, целе¬66
сообразно проводить его в начальной стадии исследования (см.
стр. 55).Препарат «висячая капля», приготовленный из жидкой куль¬
туры, позволяет установить, способен ли данный микроорганизм
к активному движению. Для исследования препаратов с живыми
объектами с успехом применяют фазово-контрастный микроскоп
(см. стр. 17).Морфологически более разнообразные и более крупные, в не¬
которых случаях покрытые слизистой капсулой или прикреплен¬
ные к твердому субстрату формы гетеротрофных микроорганиз¬
мов (ранее их относили к группе высших бактерий) легко отли¬
чить от морфологически простых небольших микроорганизмов
(которых ранее относили к истинным бактериям). Однообразие
морфологических признаков последних требует накопления боль¬
шего количества данных о физиологических и биохимических
особенностях этих организмов. К физиологическим характеристи¬
кам, позволяющим проводить таксономическое определение, от¬
носятся потребность микроорганизмов в кислороде и способ ути¬
лизации глюкозы. Облигатные аэробы развиваются только в при¬
сутствии кислорода и усваивают углеводы в процессе метаболи¬
ческого окисления. Факультативные анаэробы размножаются как
в присутствии воздуха, так и в бескислородных условиях; в пос¬
леднем случае конечным продуктом обмена веществ являются
органические кислоты, накапливающиеся в окружающей среде.
Облигатные анаэробы в присутствии кислорода не развиваются.Определение перечисленных морфологических и физиологиче¬
ских признаков уже позволяет с большей или меньшей уверенно¬
стью отнести исследуемый организм к той или иной группе. Для
классификации микроорганизмов внутри групп необходимо при¬
нимать во внимание множество других особенностей выделенной
культуры. Для каждой группы разработаны системы критериев,
определяющих соответствующие признаки. При внутриродовой
классификации и определении вида микроорганизма руководст~
вуются этими же принципами.4.1.1. Изучение почвенных бактерийпри таксономических исследованияхВ почвах, обладающих самыми разнообразными свойствами,
встречаются представители многих таксономических единиц, от¬
носящихся к большинству из перечисленных 19 систематических
групп микроорганизмов.При изучении почвенных биологических процессов наиболее
часто возникает необходимость в определении систематического
положения характерных почвенных аэробных или факультативно-
анаэробных хемогетеротрофных и некоторых хемолитотрофных
организмов, участвующих в преобразовании биогенных веществ.
Гетеротрофные организмы автохтонной почвенной микрофлоры в
большинстве своем относятся к семействам Pseudomonadaceae и5* 67
Rhizobiaceae VII группы, семейству Bacillaceae XV группы и раз¬
личным родам, входящим в XVII группу. К последней группе
принадлежат обитающие в почве непатогенные Corynebacterium,
представители рода Arthrobacter, а также виды семейств Nocar-
diaceae и Streptomycetaceae, выделенные в роды. Большинство
почвенных хемогетеротрофных микроорганизмов, участвующих
в процессах преобразования биогенных элементов, относятся кXII группе.Некоторые почвенные бактерии в искусственных условиях
поддаются культивированию с трудом или вообще не растут в
культуре. Изучать такие микроорганизмы можно только в есте¬
ственных условиях, методы наблюдений за ними изложены в со¬
ответствующих разделах книги.После определения некоторых характерных признаков микро¬
организмов, выделенных из почвы и культивируемых в искусст¬
венных условиях, исследуемую культуру обычно уже можно от¬
нести к той или иной группе определителя Берги. Опираясь на
полученные данные, следует изучить специальную литературу о
соответствующей систематической единице, и дальнейшая работа
должна быть направлена на определение признаков, позволяю¬
щих установить порядок, семейство, род и вид организма.В дальнейшем изложении приведено описание наиболее рас¬
пространенных методов исследования, некоторые из них более
подробно рассмотрены в других разделах книги.4.1.1.1. Морфологические особенности колонийОсобенности колоний, вырастающих на поверхности плотных пи¬
тательных сред, имеют большое значение для диагностики бак¬
терий (рис. 20). В микробиологической практике для этого наи¬
более часто применяют мясо-пептонную агаризованную питатель¬
ную среду. Исследуемый материал вносят методом рассева в глу¬
бину среды или же с помощью шпателя высевают на ее поверх¬
ность.Обычно для исследования отбирают колонии, выросшие на
поверхности среды, поскольку при развитии в глубине агара они
морфологически различаются незначительно.Форма колонии бывает округленной, неправильной, ризоидной,
мицелиевидной.По рельефу различают плоско-выпуклые, куполообразные, ко¬
нусообразные, а также колонии с вдавленным и приподнятым
центром.Поверхность колоний может быть гладкой, шероховатой,
складчатой, бородавчатой, концентрически или радиально исчер¬
ченной. По прозрачности и светоотражающей способности разли¬
чают блестящие, матовые, мутные, опаловые и прозрачные коло¬
нии.По цвету различают бесцветные (грязно-белые колонии также
.относят к бесцветным) или пигментированные — белые, желтые,68
Рис. 20. Характеристика бактериальных колоний:I—форма (J — круглая, 2 — неправильная, 3 — амебовидная, 4 —ризоидная, 5 — мицелие¬
видная); II — поверхность (/ — плоская, 2 — выпуклая, 3 — с вдавленным центром, 4 — ко¬
нусообразная); III —контур края (/ — ровный, 2 — волнистый, 3 — фестончатый, 4 — зазуб¬
ренный); IV — консистенция (1 — гомогенная, 2 — мелкозернистая, 3 — крупнозернистая, 4 —
вязкая, 5 — волокнистая).оранжевые, красные, черные, серые, коричневые и другие коло¬
нии.Размеры, колоний (диаметр крупных измеряют линейкой, раз¬
мер очень мелких колоний определяют с помощью измерительных
устройств микроскопа при небольшом увеличении) могут быть
точечные (диаметр менее 1 мм), мелкие (1—2 мм), средние (2—4 мм) и крупные (диаметр более 4 мм).Контур края колоний (при рассмотрении под стереомикроско¬
пом или лупой) может быть ровным, волнистым, фестончатым,
бахромчатым.69
По структуре различают (при исследовании под микроскопом
с небольшим увеличением или под лупой) гомогенные, зернистые,
гиалиновые колонии.По консистенции колонии бывают (при прикосновении бакте¬
риальной петлей): твердыми и вросшими в агар (петлей трудно
отделить колонию от питательной среды) ; твердыми, но не врос¬
шими в агар; слизистыми, тянущимися, волокнистыми, жесткими.4.1.1.2. Морфологические особенности клетокОдин из основных критериев систематизации бактерий — это
форма бактериальной клетки. Обычно ее изучают в окрашенном
препарате.Размеры и форма клеток могут меняться в зависимости от
условий культивирования, поэтому целесообразно проводить срав¬
нительные исследования организмов и культур разного возраста,
выращенных на различных питательных средах.По форме клеток бактерии делятся на палочковидные (в т. ч.
спороносные бациллы и барабанные палочки), кокки, спириллы,
Y-образные, вибрионы, почкующиеся. Характерные формы клеток
приведены на рисунке 21.Среди прочих морфологических особенностей важным диаг¬
ностическим признаком служит наличие и расположение (рис. 22)Рис. 21. Характерные формы бактериальных клеток:І — палочковидные; 2 — кокки; 3 — спириллы; 4 •— спирохеты; 5 — спороносные бацил¬
лы; 6 — серповидные клетки; 7 — Y-образные и ветвящиеся; 8 — вибрион, 9 — почкую¬
щиеся, 10 *— барабанные палочки.70
Рис. 22. Расположение жгутиков на бактериальных клетках:1 — монотрихальное; 2 и 3 — лофотрихальное; 4 — перитрихальное.или отсутствие жгутиков. Исследовать жгутики можно методами
электронной микроскопии или, после специального окрашивания
(26, 32), с помощью светового микроскопа (стр. 60).4.1.2. Изучение физиологических
и биохимических особенностейПоложительные и отрицательные результаты тестирования мета¬
болических процессов могут быть использованы в таксономиче¬
ском исследовании лишь в том случае, если микроорганизм
культивировали в соответствии со всеми методологическими пред¬
писаниями, касающимися состава питательной среды и данной
культуры. При тестировании в качестве контроля целесообразно
использовать какой-либо вид из коллекции штаммов, относящих¬
ся к предполагаемому таксону.4.1.2.1. Определение источника углеродаОдин из первых шагов при определении неизвестных культур —
это выяснение вопроса о том, какие углеводы (главным образом
из сахаров и органических кислот) использует данный организм
в качестве единственного источника углерода и энергии.При определении источника углерода культуру высевают на
жидкую или плотную питательную среду, которая, помимо испы¬
тываемого источника углерода, содержит только минеральные
вещества. К таким средам относится среда Цукамуры (155), ши¬
роко применяемая при исследовании источников углерода для
почвенных микроорганизмов.Каждое вещество —■ источник углерода стерилизуют фильтро¬
ванием и добавляют к стерилизованному в автоклаве солевому
раствору с таким расчетом, чтобы конечная концентрация угле¬
родсодержащего вещества составила 0,5%.Стейниер с сотр. при исследовании представителей Pseudo¬
monas применял солевой раствор, необходимый уровень pH кото¬71
рого обеспечивал фосфатный буфер по Сёренсену (37), и к этому
раствору добавлял 1, г/л сульфата аммония (141).Способность микроорганизма использовать какое-либо веще¬
ство в качестве источника углерода может быть оценена путем
сравнения скорости его роста со скоростью роста культуры на
среде, не содержащей соответствующего источника углерода.Источники углерода изучают различными способами. Иссле¬
дуемую культуру можно высевать на скошенный или высокий
агар; в последнем случае количество агара составляет всего лишь
3 г/л. В зависимости от условий аэрации в высоком агаре можно
наблюдать рост культуры, газообразование, а в присутствии ин¬
дикатора в незабуференной питательной среде — выделение
культурой кислоты.Способность микроорганизма усваивать крахмал исследуют
на агаризованной питательной среде, содержащей 0,2% раствори¬
мого крахмала. Если культуры образуют мелкие колонии, на пи¬
тательную среду можно высеять 5—10 точечных колоний. По
окончании инкубации поверхность агара заливают разбавленным
раствором йода. Прозрачные зоны свидетельствуют о положи¬
тельной реакции. В отсутствие фермента амилазы питательная
среда окрашена в синий цвет.При изучении способности микроорганизмов усваивать нерас¬
творимые в воде целлюлозу, хитин и пектин эти вещества рас¬
тирают в порошок и смешивают с питательной средой. Прозрач¬
ные зоны, образующиеся вокруг выросших колоний, свидетель¬
ствуют о положительной реакции.Если необходимо определить способность микроорганизма ис¬
пользовать несколько источников углерода, с успехом применяют
метод репликации. Например, при изучении Pseudomonas в чаш¬
ки Петри разливают плотную питательную среду, содержащую
5 г дрожжевой вытяжки и минеральные вещества, и на строго
определенные участки этой среды высевают исследуемые микро¬
организмы. При помощи обтянутого стерильным бархатом дере¬
вянного диска соответствующего размера материал с выросших
колоний переносят на агаризованные питательные среды, содер¬
жащие различные источники углерода. Результат эксперимента
оценивают путем сравнения скорости роста микроорганизмов в
присутствии и в отсутствие источника углерода.Способность микроорганизмов усваивать органические кисло¬
ты изучают, вводя в питательную среду индикатор (феноловый
красный, бромтимоловый синий). Утилизация кислот сопровож¬
дается повышением pH питательной среды, о чем свидетельствует
изменение цвета индикатора.Если при изучении возможных источников углерода обычно
испытывают множество соединений, то способ утилизации (окис¬
лительный или ферментативный) в большинстве случаев опреде¬
ляют только для глюкозы и лактозы.Как уже отмечалось, роль Ог в утилизации микроорганизма¬
ми углеводов можно изучать, высевая исследуемый материал72
Рис. 23. Изучение выделения газа бактериями с ис¬
пользованием трубок Дархэма:1 — исходное положение; 2 — газообразование.Л'уколом в столбик содержащего индикатор
агара; при этом иглу вводят почти до дна
пробирки. Содержание агара в питатель¬
ной среде невелико (0,3%). Изменение
цвета индикатора, отмечающего подкис-
ление среды у ее поверхности или вдоль
следа укола, свидетельствует об окисли¬
тельной утилизации углевода аэробным
микроорганизмом.Продукты метаболизма факультатив¬
ных анаэробов вызывают изменение цвета
всего объема питательной среды, но обли¬
гатные анаэробы вначале вызывают изме¬
нение окраски лишь у дна пробирки.В мягком агаре хорошо заметно образо¬
вание пузырьков газа.Исследуя возможность использования 7 гв качестве источника углерода глюкозыили других простых сахаров для выявления процессов их фер¬
ментативного разложения, поверхность одной из засеянных пита¬
тельных сред целесообразно залить стерильным парафином. Па¬
рафин прекращает доступ кислорода и препятствует протеканию
окислительных процессов. Хью и Лейфсон [43] применяли окис¬
лительно-ферментативное тестирование при определении видов
Pseudomonas, колиформных и других бактерий (88). Источники
углерода стерилизовали фильтрованием и добавляли в стерили¬
зованную в автоклаве теплую жидкую агаризованную питатель¬
ную среду с таким расчетом, чтобы их конечная концентрация
составила 1%. В присутствии некоторых окисляющих глюкозу
бактерий аммиак, образующийся из пептона, может нейтрализо¬
вать выделяемые микроорганизмами кислоты, однако питатель¬
ная среда, предложенная Бордом и Голдингом [62], позволяет
устранить этот нежелательный эффект.Для изучения процессов выделения газов бактериальными
культурами можно также использовать трубки Дархэма. Стек¬
лянные трубки диаметром 6—8 мм и длиной 40 мм, запаянные
с одной стороны, перед стерилизацией помещают открытым кон¬
цом вниз в пробирку с жидкой питательной средой. При стери¬
лизации жидкость полностью заполняет трубку, а в процессе
размножения микроорганизмов в ней скапливаются газообразные
продукты (рис. 23).Состав питательной среды в конечном счете зависит от опти¬
мальных для данного микроорганизма условий, в значительной
степени определяющихся источником азота и факторами роста.73
4.1.2.2. Методы выявления некоторых метаболических
процессов и метаболитовТестирование по методу Вогес — Проскауэра [/(57] с использова¬
нием метилового красного. В аэробных условиях некоторые виды
Enterobacter и Bacillus образуют ацетнлметилкарбинол, который
можно обнаружить тестом Вогес — Проскауэра. Одновременно
устанавливают, в какой мере кислоты, образовавшиеся из глюко¬
зы, снизили pH питательной среды до 4,2 или еще сильнее.По 5 мл жидкой питательной среды, рекомендованной для
этого исследования (161), разливают в пробирки. После инкуба¬
ции в одну из пробирок добавляют индикатор метиловый красный
(30). Красная окраска свидетельствует о положительной реакции.
При окраске между желтой и красной результат нельзя со всей
определенностью оценить как положительный. Для обнаружения
ацетилметилкарбинола к 1 мл жидкой культуры добавляют 0,5 мл
5%-ного спиртового раствора а-нафтола, затем 0,5 мл 16%-ного
раствора КОН, после чего пробирки многократно встряхивают.
Красная окраска обычно появляется уже спустя 5 минут после
добавления реактивов, но окончательно устанавливается по мень¬
шей мере в течение часа. Отрицательный результат — отсутствие
красной окраски — может быть констатирован лишь через не¬
сколько часов.4.1.2.3. Утилизация циклических ароматических
соединенийФерменты микроорганизмов, способных использовать ароматиче¬
ские соединения, расщепляют бензольное кольцо в мета- и орто¬
положениях, причем часто обе реакции протекают одновременно.Стейниер [141] применял этот метод для изучения представи¬
телей Pseudomonas, но его можно использовать и при исследова¬
нии других организмов. Изучаемую культуру выращивают на
питательной среде Стейниера (136), используя в качестве единст¬
венного источника углерода п-гидроксибензоат. После культиви¬
рования колонии вырезают из питательной среды и суспендируют
в 2 мл раствора следующего состава: 0,02М трис-буфера (pH 8),
0,5 мл толуола, 20 мкМ Ыа-протокатехуата.Появление желтой окраски при встряхивании суспензии сви¬
детельствует о расщеплении бензольного кольца в метаположе¬
нии. При получении отрицательного результата пробирку в тече¬
ние часа выдерживают на водяной бане при 30 °С и время от
времени встряхивают. Расщепление бензольного кольца в орто¬
положении регистрируют с помощью цветовой реакции с ß-кето-
адипатом, для обнаружения которого используют реакцию Роте-
ра. К суспензии добавляют приблизительно 1 г кристаллического
(NH4)2S04, затем каплю 1%-ного раствора нитропруссида нат¬
рия и 0,5 мл 34%-ного раствора аммония. Появление темно-лило¬
вой окраски после перемешивания смеси свидетельствует о поло¬
жительной реакции.74
4.1.2.4. Утилизация азотсодержащих соединенийМикроорганизмы способны использовать многие источники азота,
в том числе атмосферный азот, неорганические азотистые соеди¬
нения, аминокислоты и белки. Как и при исследовании источни¬
ков углерода, способность микроорганизмов использовать раз¬
личные азотсодержащие соединения можно изучать на питатель¬
ных средах, содержащих доступные органические и минеральные
вещества, но азот в них присутствует лишь в форме изучаемого
азотистого соединения. Способность микроорганизмов усваивать
данное соединение азота определяют, сравнивая исследуемую
культуру с ростом контрольной культуры на питательной среде,
не содержащей источника азота.По составу питательная среда сходна со средами, применя¬
емыми при изучении источников углерода; различие состоит лишь
в том, что в данном случае используют иные источники азота.
Азотсодержащие соединения обычно добавляют к питательной
среде в концентрации 0,1%. При исследовании Pseudomonas в
качестве источника углерода можно использовать молочнокислый
натрий (1 г/л), в других случаях в среду одновременно вводят
несколько источников энергии, например глюкозу, соли лимон¬
ной, уксусной и янтарной кислот, соли натрия и глюконат каль¬
ция в 1%-ной концентрации. Выбор источника углерода опреде¬
ляется особенностями исследуемого организма.4.1.2.4.1. Восстановление нитратов и нитритовВ зависимости от особенностей микроорганизма и условий окру¬
жающей среды нитраты и нитриты используются в процессах
высвобождения энергии, анаболических процессах или же и в
тех, и в других. Ассимилируемый нитрат восстанавливается до
нитрита, а затем и аммиака, который включается в синтез ами¬
нокислот, идущих на построение клеточных белков и других сое¬
динений. Организмы, способные восстанавливать нитраты в про¬
цессах диссимиляции, используют нитраты и нитриты в роли
терминальных акцепторов электронов вместо кислорода. Некото¬
рые микроорганизмы выделяют в окружающую среду нитриты в
качестве одного из промежуточных продуктов диссимиляционно-
го восстановления нитрата. Конечный продукт этих процессов
можно наблюдать в виде пузырьков N2. С целью изучения про¬
цессов восстановления азота микроорганизмы культивируют на
питательном агаре (123), содержащем 1,1% KN03. При изучении
Pseudomonas используют питательную среду с легкодоступным
источником углерода (яблочная или янтарная кислоты и т. п.).
Нитрит, образующийся в качестве промежуточного продукта, об¬
наруживают с помощью реактива Грисса — Илошваи (14), для
чего к 5 мл культуры добавляют 0,5 мл раствора I, а затем0,5 мл раствора II. Появление красной окраски свидетельствуето положительной реакции. При получении отрицательного ре-75
зультата необходимо установить, изменилось ли содержание нит¬
рата в питательной среде за время культивирования. Появление
красной окраски после добавления цинковых опилок (1 мг/мл
раствора) к содержащему реактив раствору свидетельствует о
присутствии в нем нитрата. Нитрат можно обнаружить и другим
способом: в пробирку вносят одну каплю культуры, добавляют
каплю концентрированной серной кислоты и после охлаждения
смеси — несколько миллиграммов дифениламина; в присутст¬
вии нитрата появляется синяя окраска. Целесообразно изучать
способность микроорганизмов утилизировать не только нитраты,
но и нитриты.4.1.2.4.2. Использование органических
соединений азотаОбразование индола. Положительная реакция на индол свиде¬
тельствует о способности культуры превращать триптофан в ин¬
дол. Для культивирования используют богатую триптофаном
(содержащую 1% пептона), но лишенную глюкозы питательную
среду. В некоторых случаях целесообразно введение дополни¬
тельного количества триптофана. Определению индола может
мешать присутствие глюкозы, а также загрязнение химических
реактивов, поэтому в каждом случае следует проводить конт¬
рольные опыты с известными индолположительным и индолотри-
цательным микроорганизмами. Многие бактерии способны рас¬
щеплять индол; следовательно, тестирование необходимо
проводить повторно на различных стадиях инкубирования. Обра¬
зование индола протекает наиболее активно обычно на второй-
третий день, однако если в течение первых дней положительный
результат не получен, реакцию определения индола проводят
ежедневно в течение недели.Согласно одной из методик, реактив Эрлиха (10) осторожно
наслаивают на поверхность культуры, выращенной на жидкой
питательной среде. Появление красной окраски свидетельствуето положительном результате тестирования. В соответствии с дру¬
гим методом культуру встряхивают в пробирке с 1—2 мл органи¬
ческого растворителя (эфир, ксилол), затем на поверхность рас¬
творителя наслаивают реактив Эрлиха. Для определения индола
можно применять и реактив Ковача (20). В этом случае о при¬
сутствии индола свидетельствует появление лиловой окраски.Образование сероводорода. Многие бактерии разлагают орга¬
нические серосодержащие соединения, выделяя при этом серо¬
водород. Согласно одному из методов определения образующего¬
ся H2S, серу в питательную среду вводят в форме пептона. Пита¬
тельная среда должна содержать 0,05% уксуснокислого свинца
или 0,025% железо-аммонийного цитрата (100). В присутствии
сероводорода питательная среда темнеет.При определении сероводорода еще одним распространенным
методом фильтровальную бумагу пропитывают концентрирован¬76
ным раствором уксуснокислого свинца, высушивают и разрезают
на полоски. После стерилизации полоски размещают над пита¬
тельной средой в пробирках с исследуемыми культурами. В при¬
сутствии сероводорода бумага чернеет. В интервале температур
22—30 °С H2S обычно выделяется сильнее, чем при более высокой
температуре.Уреазная активность. Определение основано на том, что при
разложении присутствующего в питательной среде карбамида об¬
разуется аммиак, подщелачивающий среду. При выборе пита¬
тельной среды необходимо следить за тем, чтобы она не имела
буферных свойств. Для проведения исследования можно рекомен¬
довать питательную среду Кристенсена (69) в виде скошенного
агара, залитого в пробирки. При положительной реакции она
окрашивается в красный цвет. В опытах с Pseudomonas свобод¬
ный аммиак подавлял активность уреазы, поэтому карбамид до¬
бавляют к уже хорошо растущей культуре, а за изменением pH
следят, комбинируя индикаторы.Декарбоксилирование аминокислот. Питательную среду, со¬
держащую исследуемую аминокислоту (51), разливают в неболь¬
шие пробирки и на поверхность среды наслаивают стерильное
парафиновое масло (на столбик агара высотой 20 мм — 5 мм мас¬
ла). Исследуемый материал вводят в питательную среду сквозь
слой масла прямой иглой. Культуры проверяют ежедневно в те¬
чение четырех дней. Вследствие ферментации глюкозы индика¬
тор приобретает желтую окраску. В контрольной пробирке, не
содержащей данной аминокислоты, индикатор имеет желтый
цвет. В присутствии исследуемого соединения, когда тестирова¬
ние дает положительный результат, он приобретает фиолетовую
окраску, свидетельствующую о том, что в результате декарбокси-
лирования образовались щелочные продукты распада. Если пита¬
тельная среда содержит аргинин, изменение цвета может быть
вызвано действием двух ферментов: декарбоксилазы и дигидро-
лазы, часто встречающихся одновременно.Разложение лецитина. Плотная питательная среда, рекомен¬
дованная для данного исследования, содержит яичный желток
(153). Среду разливают в чашки Петри, затем штрихами прово¬
дят посев исследуемого микроорганизма. Вокруг колоний, обла¬
дающих лецитиназной активностью, появляются прозрачные зо¬
ны.Протеиназная активность. При проведении этого исследования
обычно изучают способность микроорганизма расщеплять или
разжижать желатин, хотя отдельные культуры, дающие отрица¬
тельную реакцию на него, могут расщеплять другие протеины.
Прозрачные зоны, появляющиеся вокруг колоний на молочном
(149) и желточном (153) агаре, свидетельствуют о наличии про-
теиназной активности.Разжижение желатина. При расщеплении микроорганизмами,
обладающими протеолитической активностью, желатин разжижа¬
ется. Для исследования в пробирки вносят 10 мл 1(5%-ного пита¬77
тельного желатина, посев выполняют уколом в середину желати¬
нового столбика. Поскольку при температуре выше 25 °С желатин
разжижается, эксперимент проводят при более низкой темпера¬
туре.Согласно другому методу наблюдения за расщеплением жела¬
тина, питательную среду, содержащую 0,4% желатина и агар
(123), разливают в чашки Петри и проводят посев исследуемого
материала штрихами или отдельными точками. По истечении
времени инкубации поверхность питательной среды покрывают
раствором, содержащим 15% HgCb и 20% концентрированной
НС1. Относительно прозрачные зоны вокруг колоний свидетельст¬
вуют о положительной реакции. При тестировании данным мето¬
дом длительность инкубации возрастает.4.1.2.5. Исследование дыхательных ферментовОпределение каталазы. Бактерии, образующие фермент катала-
зу, разлагают перекись водорода с выделением молекулярного
кислорода. Исследуемый организм культивируют на скошенном
агаре и затем на поверхность культуры пипеткой наносят 3%-ный
по объему раствор Н202. Появление пузырьков газа свидетельст¬
вует о присутствии каталазы. Для выращивания культуры в дан¬
ном случае нельзя использовать кровяной агар, так как красные
кровяные тельца содержат каталазу.Определение цитохромоксидазы. Наличие или отсутствие цито-
хромоксидазы служит диагностическим признаком при исследова¬
нии грамотрицательных аэробных организмов и факультативных
анаэробов. Положительный результат тестирования говорит о
присутствии цитохромов с. Для выполнения исследования по ме¬
ре возможности выбирают питательную среду, не содержащую
сахаров. Со скошенного питательного агара, рекомендованного
Ковачем для проведения тестирования на оксидазу, платиновой
петлей отбирают часть материала и наносят тонким слоем на су¬
хую фильтровальную бумагу, пропитанную тетраметил-п-фени-
лендиаминдигидрохлоридом (1%)- При положительной реакции
мазок в течение 10 секунд приобретает фиолетовый цвет. Ис¬
пользование петли из другого металла может дать ошибочный
результат.4.1.2.6. Подавление роста микроорганизмов
цианистым калиемПитательную среду для данного исследования (95) стерилизуют
в автоклаве и добавляют к ней стерилизованный фильтрованием0,5%-ный раствор KCN из расчета 15 мл/л среды. Питательную
среду разливают в стерильные пробирки с завинчивающимися
пробками, которые в период инкубирования герметически закры¬
вают. Рост культуры свидетельствует о том, что KCN не подавляет
этот процесс. В конце эксперимента в пробирки вносят кристал-78
лик FeS04 и 0,1 мл 40%-ного раствора КОН, чтобы предотвра¬
тить выделение циана при обработке в автоклаве и мытье по¬
суды.4.1.2.7. Оценка результатов культивирования
в лакмусовом молокеДля приготовления питательной среды к свежему, полностью
обезжиренному сепарированному молоку добавляют насыщенный
спиртовой раствор лакмуса до получения смеси бледно-фиолето¬
вого цвета. Разлитую в пробирки питательную среду стерилизуют
текучим паром трижды по часу в течение трех дней; стерильность
среды необходимо проверить. Пробирки с посевами инкубируют
в течение шести недель, еженедельно проводя наблюдения. Изме¬
нения могут быть связаны прежде всего с расщеплением микро¬
организмами лактозы и казеина.Образование кислоты. Покраснение лакмуса чаще всего сви¬
детельствует о процессе образования кислоты из лактозы.Образование кислоты и осаждение казеина. Лакмус приобре¬
тает красный цвет, а казеин выпадает в осадок под воздействием
образующейся кислоты. Вслед за этим в процессе ферментации
лактозы выделяется газ и раствор осветляется.Осаждение казеина под действием ферментов группы ренни-
на: кислота не образуется совсем или ее мало, выпадающий в
осадок материал осаждается.Расщепление казеина. Просветление питательной среды явля¬
ется следствием протеолитических процессов. Обычно этот про¬
цесс наблюдают в верхней части питательной среды, иногда он
сопровождается подщелачиванием раствора.Редукция лакмуса. Лакмус обесцвечивается; в некоторых слу¬
чаях это можно заметить только после осаждения казеина в ре¬
зультате подкисления.Щелочная реакция. Подщелачивание питательной среды без
проявления протеолитической активности свидетельствует о про¬
цессах утилизации цитратов молока.4.1.3. Выделение актиномицетов по системе
Сабо и МартонаПри изучении систематического положения актиномицетов наря¬
ду с культуральными особенностями важную роль играют и мор¬
фологические признаки микроорганизмов. Большое преимущест¬
во методики Сабо — Мартона {145] и разработанного ими ключа
к определению состоит в том, что они основаны лишь на несколь¬
ких признаках. Поэтому с их помощью можно быстро и точно вы¬
делять видовые группы стрептомицетов, не образующие мутовча¬
тых разветвлений.Отдельные группы различают по следующим диагностическим
признакам:79
Рис. 24. Типы мицелия и спороносцев актиномицетов:1—2 — прямые; 3—4 — спиральные; 5 — мутовчатый.а) морфология воздушного мицелия и спороносцев (рис. 24);б) окраска воздушного мицелия, точнее, спор;в) окраска вегетативного мицелия.Питательные среды:1. Крахмальный агар (99).2. Глюкозо-аспарагиновый агар (82).3. Агар Чапека — Докса (70).4. Синтетический агар (144).5. Картофельный агар (66).Морфология спороносцев. За спороносцами необходимо по¬
стоянно наблюдать на разных стадиях развития культуры. Не¬
созревший или несущий мало спор мицелий для диагностического
исследования непригоден. Процесс спорообразования контроли¬
руют методом репликации (стр. 53). На основании морфологи¬
ческих особенностей спороносцев стрептомицеты разделяют на
две группы:1) Rectus-flexibilis: спороносны прямые или волнистые; коли¬
чество ответвлений, описывающих в пространстве полную спи¬
раль, незначительно. Истинные спирали встречаются редко, хотя
и не исключены полностью;2) спиральные: спороносцы закручены в рыхлые или плотные
спирали. В отдельных культурах прямых спороносцев больше,
чем спиральных, но последние все же встречаются довольно час¬
то и регулярно.Цвет воздушного мицелия. Одно из основополагающих усло¬
вий определения заключается в хорошем развитии и наличии со¬
зревших спор хотя бы на отдельных участках воздушного мице¬80
лия. Необходимо следить за тем, чтобы окраска вегетативного
мицелия и примеси растворимых пигментов не помешали опреде¬
лению истинного цвета воздушного мицелия и спор. По этим
признакам различают шесть групп организмов:1. Niveus —воздушный мицелий белый.2. Azureus — воздушный мицелий голубой.3. Cinereus —воздушный мицелий пепельно-серый.4. Prasinus — зрелый мицелий имеет ровную зеленую окраску.5. Cinnamoneus — основной компонент окраски воздушного ми¬целия красный.6. Griseus — воздушный мицелий окрашен смесью желтого,зеленого и серого цветов.Цвет вегетативного мицелия. В отличие от воздушного цвет
вегетативного мицелия в значительной степени зависит от соста¬
ва питательной среды; более того, цветовые оттенки могут су¬
щественно изменяться в культурах разного возраста. В зависи¬
мости от цвета культуры относят к одной из следующих групп:1. Flavus-brunus (желто-коричневые) — на всех питательных
средах окраска вегетативного мицелия меняется от желтой до ко¬
ричневой. Возможно появление красноватых, синих или зеленых
оттенков, но они не подавляют чистые или имеющие сероватый
оттенок желтые и коричневые тона.2. Flavus-brunus+Ruber (желто-коричневые+красные) — по
меньшей мере на одной питательной среде и в одной фазе разви¬
тия вегетативный мицелий имеет красный цвет.3. Flavus-brunus+Caeruleus (желто-коричневые -+- синие) —
по меньшей мере на одной питательной среде и в одной фазе раз¬
вития вегетативный мицелий имеет синий, фиолетовый или сине¬
вато-красный цвет.4. Flavus-brunus + Viridis (желто-коричневые + зеленые) —
по меньшей мере на одной, питательной среде и в одной фазе
развития вегетативный мицелий имеет зеленый цвет.Ключ к определению серий и секций. Прежде всего организмы
делят на стерильные и фертильные формы. Фертильные культуры,
в свою очередь, могут быть отнесены к двум группам: Rectus-fle-
xibilis и спиральным. По признаку окраски спор первая из этих
групп подразделяется на четыре, а вторая —■ на пять секций.
Далее каждая секция делится на четыре серии в зависимости от
цвета вегетативного мицелия (желто-коричневая — главная, ос¬
тальные — вспомогательные). Если дополнительный цвет выра¬
жен настолько слабо, что заметен только его оттенок, необходи¬
мо сравнение с окраской типичных представителей вспомогатель¬
ных серий.Схема ключа к определению серий, разработанного Сабо и
Мартоном, приведена в таблице 4. Впоследствии Сабо с сотр.
[146] разработали методику определения вплоть до вида, однако
объем данной книги не позволяет подробно рассмотреть этот
вопрос.6 й. Сэги 81
4. Классификация по секциям и сериям видов Streptomyces, не образующих мутовчатых разветвлений,
на основании важнейших культуральных признаковcfsШ* сЗ- КС -
ч сч’ °- Ш °0
!§-- Я ю
І «-
! 5-
4 s3 г»Î Э
; а ..• hQ »Xя2 <о*
>>счЧ <N
U <Nя2гs®Cdн3 сч"к sч & -о.°8 І?<U X™а жof со
Ч * >
UN О
„ СЧ £2>%KtО)Чо’ *“■ К —Гсо3®я -►Д СО45 • •а,«а> s
но а> ^
—- а сою --
о - с
Ef ^ ГЯ_<N.ä
оа°1&S со
S ~ .«о
соно‘сa ^СОя«CQ® О ■ -ng —
•* **s ^ с .У£ <М £ С
м - Öß с”2 SÆ<--"3 v “-4 i*I _ wС (Л. cd cd
со Ä
со COсо*яш s ..Я о<2XЛ О 'СС5s 2 в
о, gсосог г о «э~ g1
s'"!-⧫■§ г.ls.esg S5 ЄСи с; <л
•*«»
со352ІГ«>^Ц е С 2.~~§ S g££S?_ . • сл С"С -І; Л <Е
CU <у% л Ж 'ЯЇЇ fe « m"»_Р и Й»я^з;и"!^« ^
a •- - о g g -s
■° « S'“соs-;w ir і-h 52t S;5 Й »Я О Ö ^
8й «Й^ „ " <я £ ^
SE'SНчCO£ S&.aCQ 453 ЯsoЯ <L>О Я
О Чя о
о cfОн я2 Sо3 'Я (
о !
С=(я л
S 5ЗшяÄ н
R cdОн нСЗ о
М U«и
„ иs «а* S
я я
ч я
а> a
Sf оF- Ои аV иЯ 2>> &
ооо яя 3S о,к оЯ *“я ®с> cd5 2S cd
Я н
я= 5О) яч яо; cdе( sûа> Оо- n>осоSсо5 сQ cd
H tio с2-h Scd олсояXIа)XiЯРнû ’С
> >соЫ)оВо-СgО)cdJCa<ЛО—Ссоcdbßя>ц-•оаСсГ+я>Ц-s :=и >+ +
сЛ с/5я я
с я
я яи. и,Л «Лз З ЇЇ
>з >.ЇЇ
cd u. cd "Оlu EI<лЯСя|_-ОСЛя>cdЕяС*+СЛяСс;cdи+
сп*п>+соСЯСяlavus-biruleusX)СЛ>.ïï
cd тзCl-Li-S a g-CD >» ®r аО о
ч о
о *•©■Оа g*о оS5оН=S 5S3 3S Ч Э*|
glë-l-
і s s ! ^о ° и онО)соонсл «£
3 —о 2а> •*-'Она 4}
ю =
о *
о 5
Є-ЯчяD-Р „
H J3CJ яоНчяон82
uco^ эоч-> 0>
CU ^|1Б d03*3^
1*
§§
. CiV. •—«
00<u д <uö3 <U«J NС (fl pG g ^coC3•І1?0
^ I 8S-g-®
>, с -ЬI55"01$|
^0>®>Pn T3 '—' та ц-га-^слюх!?^
X! О іЛ ю *£ соЦн й (?) Л U ^
о >»—* I— —• . „*•
О со — h«с . ?ЗЙ*
•2~2 fe S^2-
S з із" "cü 3 ^й 0.з *5
§•§
Is3.SCi. tiû« 00 XSSsö'Sfe-^
öß.S? ^* a’^ « ca <u
«*S ö CX sÜbsoS^I-B5 .'S*5 w. ф то^ —< л äeQ
• •СО и» 3W-G с a» dm
to s « « " аgeo'^ Ю'C«£>cu
О
t- §
LC 2O» «со 33 S^ нЗн
£*- ШЬОф *=гa «
5о якX fflS№^00s «* s« 2H я<U соu Sй °-
СО си^’ч E s» s
— -. Я Й С И Кьо!,СПа о .5»3 Qj
Ï) ІЗЛ
•2 g ЙtiûX *ö,-аё?СІтз а с •8 -"gjL««л і.’
.->2і со.3-з£« D 1) С!ЧчСОСО 3оLO tq2ш1 -«S ^»3 LO 'j w ы zg у к ~’ Sg » « * а £§S äS «а^о ^ оÎJ ^ о S С-Лф g! >* .
К X* О со »SJ ,Т- и й и « яcs ^ п ^ р іо .а чм« ю и~ w. g м * о а■+-» НСО оЯяшоО)яно; еJ воN 5S ^
з ‘+-2LIls
Ip1 *"• ГІ! >>s-SUw«§&è1 О
I О)І щ sS ÜJ> *0 £^ 32 h
і о Ч о* Н Ч .і m r kсо‘їй 5 ся о
О й ~£j ’С
п ,5і с
iJ SS и
•fc’ECÆf>-\ та и-*>3-8
5эт\2 с<м га
.„Єї bo g
■У '- ■ • W
j:с 5 со
00'S 0 'S S d
- e e 5Й Д Ф <5) ^
2 <u ö tio ç«E£°.g S
■fg 15 S ;c g^ с о D §
r, га <-> . ~E ‘ “~|ЙЭ-Ä -S-ra g .2 to сЯ enU ж .i ^Не 5сл яÆ с ^ж є«^1/3 ^
ai’sSs;Ь» соr-. Ï> --Н CMg—.а 2Ë Ы С
л а й^s: <ü ИН П
св О Дн %^ st3 є.§ « 2
•-л-IS«^ уо"с g; IS ’QÖJ' ä:
« 0>t^- NiS Я з&> XI ^~ о Üä
сw ь<5J
0) >o
N 3W.* M-. П ÖI S. ►ТЗ . ^ ся сяoo ÔOÛ^^ÎО ^ 03 TOo: cco
coÜ3ext-3DhU.2|ScXIзU<n‘я>03tL,fQ3Ctf+ся3СП3u-O >
+ +»О (O -Û
СЯ ? сЯ?- g м
> Э > ;—
Я я ^т uiз>Cl,Æ304
+
ся
Зсзз>83
Продолжение іО. 4)
\о Я
О SСО1Л 05а«а;3—1Й
та СП)соgooо; j£ 34> ^ _
4) N ^ ’П
N 3 ^ °
3 со
.2 0соХ
С .,
JU О)0С1 § І §
s I § I— О тос S W ^'Sїї о я
I- N*3 З "Я
Щ со
О <иNs ё 3,3 -5 тоQj bûOsc
Р‘С «*
е Ма .£ Й
с со £СО
>Ь-^'СО «■> оLC . . О) ^2^s N с— ю з —;■ . <У> ъ 'S)со ^ -4 Ö W« с/э t-4j W а ^аЯ "ОО з5И ,2 аз О ^
-5 « «з 3 >‘S'-S »w. a«о -с. “csсо СО СО§ 3
52о ~С5. с8 SІЗ М•*«.СОсо
=г ^<и -*«»О.С0
н
“ g
о §йï w в>
с( К ^£ ол S“» m« 8.2
О О -*~*
g a; CDm О «
■У N
« □
о USж р О
* ^0 ° о1 коО ° ^
CQ>ч к!
Л ^
сл СО
Яг- ’га СО ’
Л *-2Ґ
05gСО о>.
. . 00о •о).2Д
N Е3 о "Я
«о :
сз!л с •,. (Л 3•52 <л р*а û S
с• ^ W со?су 3С/J .Оv. Q —. . 05
w. к, —*
•■*<«» •**»
со СОсо **
. - ссч £*
Ю СОо>'— ь-
-ю
с о»
’53 ~
: -о _:
: с со> -S*-! 1= Ш: 3 ä3 е f2
Oî <Ü ^Ь й
С) со^ єсл Н2^
3 -О
Û. 3« с
X *>-S’■оо ° Є
S С О® 5«
с ^—‘ J2 <ота ТО ^g£j <Ъ *Q О)
j- Cü D Л— а с ~+* СО ж* >^ СО ОО J5 à Ö "£ s<u o> 﫧«ç on -^ч сл5 « ~ Th «e \*К —• со
05fc£-* з o
С я СХОSï.-a£5\$1ё
» д 05 (Л‘О^и
; с — со> V. |_ ÄСО- С 3* СО
aj •- 05 о»и м О Г>1о о«^-О 4) 0О •S’. _>> й) ид
о га - -^ Э «^/5 с
о з я ^.У J;* М ^2 , Ь с/5.Sjî 2 g сH CQ Ci. g ^ ^Si <u 2 а^-з"" 33X т- і- О ^Ï 5 5i ^ ^
3 S ^ ^ с a
£ S' 'С та
Й у С ьй В 5.
^ со>о>йз£3UiО8-о•35слІ2
S—<S_г>>О слОа> за>о£>к<ь-.’ об05•—оз>О> >> >>>> >аз gоТОU+сл>+(Л3СZ3сл -ОСЯ ? СЛ (Лз— = В) 3> з >-2 >ТО U СО тэ ТО
Ü- Он Ц--Dа(X+<лСа+(О3ааU-Q со
ся ?>+(Л СЛа з
с с
а зU >“-Q X»ся сла а
> >
я .2
£ LbзС*+з>U-и+XJ <л
сл 3
з ^
> аТО 1-І
£>+с/з3с3З сл з
>.ïi >
СО ТЗ СО53^03 >i яОнсоЕсоСGиоНоН£• ^
I-S' °
о с
^ «оНкJ3ЧСОоЬОоН84
5 è È 2^^ со 03^2.S|S5S:gSDS§.8g|a **â s |igg s?sfegc« ^s<o_§.gbiSS.'5,«S^ -b-fa ^ u ^° = 2 u» і я S? <u ^ »lil I S£a2?.!SS s і .S SSfc<*S £.8.23 = ô ёд^Д^о S £ . 3 « ^
iï|® Q^feE .«S§, 22g|H >22| |'Eu?s|l s°S“° ^
IïÎ%£Is4k*§s -s-5”“l^il|l -i^-»-sS " J ..i^g^-SI-a^SSSl» ^-s5“«^5^|i| |-Bg-=c^*'.aJSi5«gS{SI4.
£ § « І-§#І"й_" * S SÏ«-SW-:SE4:5 -“E51^èls§st820
.■SS^i§|ï2“T3â| n||fc||2c^« ■-Stlâ|№^p ^IIÎ|!:.gë;!||»й|“ї Щ Säll|sl*l^2gft1* S I Sirйй« 1 8й s s8 8 § . OS S *, _• _: . äh g > .с — >-o> Ch050-* g en jS ,5
S Н^О^С/Э^чСО V..OÙJW о S сл w. to «о*— w. •—і к E О) со со v. —■ «—-.г-" ■*•* <у -тз — — СО ü ■w-х>3з о» се о со.5 со и? -2 .Sи > >> >з я .аеа и >+ + +1Л СО СЛ СЛ3 3 3 зс с с с3 3 3 33 3^3^ 3> >3 >:*= >со со и- со тЭ соЕ £ U. Ь*ОєсоССион85
ооС5.Сз5* яО ЯU Яи СҐtu Яя S«ORО t- к
® $ чЯ ц>S з gей >. ®34S4 ё
£§■
|i5 “2§га> ся
О 53
% «^ Uoc
"Її §>S gSo,
I 58|2èisg* 5 *- 5 Єта Я ÖLO M
05 СО;°°
î ьГ-LO5 05<ФS>>ti 0)
«л05 О)
—« N
. Я3 .5:Э £-
•5J2СЛ «
£§ §-5? 2 £Q. Л £* <я М-.••2 "я о «я|Й1!о ^^ 22
«—і •«* t»^ Й« t
. 05 . О} .W. — и. — W. ^ »■V» -к* *♦«» Ччсо СО СО 00®Ос^ ,05 сяа> »S ^TO3fc<оW.S
? а22
&22
СО .—.Рbag
О т1r* hUІ>
tuD
'S С£ S! Sто *—іЁ ь to£§3j J аT\ Я со
'—" Я w.00LO05ÖЩe2а
?> c
тоc Єloo ;
•с ю f*СО 05 gс
. о* <ü
о-. О) >>
fr-то ез
і) си" ÿsи-5 s
¥.3 ч.С Ы (О
W ? иaâ ё•S 5-І
Й S 2
Q .5 то^ О^сч СОСО ^ со g«о Ся3 2£СОС/5 со— tÄ 1/5
. 05 Oj Ö>чв»С Q.H
•£» Осо ИЯ <и н
5 n ' R£? m îS ОЧ и Я О0 К ч *2 ш sh« я я о~ я ЕСs-âs f-’>* 5г «H ^ eûй°«яS'S З*
*§,*яX о « *3 н си Й1 § ö SЯ ю m4 * и 8
Si § 4Э g « *
йі*г*о S« д.
«’S 1 55 2 О)я я ч m« g
Й-е*=4 оа» о
«2со3аёV аа> *35
&°
м »s
о я
- °-
05 CJ
о иtuOс>3ф>и05О сяа; 32 с
8 &
иио —
со СОсрЬй01> оа,ос> > ~XXXt_<УлаС*І)тои>.-Q а)
я то
0JU’С>i_оXяОнà)тоt»>++++ +++++(ЯЯсяясЯЯсяся ся
Я ЯсяЯ<ясяясяяСЯяясЯЯС ССсСЯЯ(-<-Dя-9и<со ЛЯ1-^X!Я Я
и- S-.”9 *9яи.
ся XяихзЯ(-4дряиX слЯt_-ÛСЯя>сяя>S §3 > --!/}Я>ся ся
Я Я
> >ЯЯся>•2сяЯ>сЯЯ>ся 3
Я Ü> 3ся>.2тоТои. ja "отото тои.то ~ототоТО 1—>ТО ТЭЕCJLЕц-а, ШЕЦ.Еtuи_соЕоН3
я
из4
то
а-
s
я
UчЯ Ф
а. § ^
" о
© н86
4.2. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ КЛАССИФИКАЦИИ ГРИБОВПочвенные грибы можно поделить на две большие группы — низ¬
шие и высшие, различающиеся особенностями развития. Для низ¬
ших грибов характерно нитевидное многоядерное одноклеточное
вегетативное тело. У наиболее древних видов этих грибов нет
клеточной стенки, поэтому колония представлена голой цитоплаз¬
матической (амёбоидной) массой. У низших грибов споры поло¬
вого размножения образуются непосредственно из женских по¬
ловых клеток. Во многих случаях они прорастают после опреде¬
ленного периода покоя.Значительная часть высших грибов в результате оплодотворе¬
ния образует особого рода сумки (аски) или же базидии. В каж¬
дой сумке формируется восемь эндогенных аскоспор, а на бази¬
дии — четыре экзогенные базидиоспоры. Системы классификации
грибов в меньшей степени опираются на культуральные свойства
организмов и строятся главным образом на особенностях поло¬
вого и бесполого размножения.4.2.1. Краткое изложение систематики грибовВ природе встречается свыше ста тысяч видов грибов. Система¬
тизация такого количества организмов чрезвычайно сложна, и
подробное изложение систематики грибов выходит за пределы
данной книги, тем более что подавляющее большинство их не
может быть отнесено к типичным почвенным грибам. Ниже при¬
ведено описание четырех классов грибов по книге советского ми¬
колога Литвинова [74]. Более подробно будет рассмотрен только
порядок Moniliales, к которому относится большая часть почвен¬
ных грибов.1-й класс — PhycomycetesПредставителей этого класса называют низшими грибами. Для их мицелия ха¬
рактерны полное отсутствие перегородок в гифах и многоядерные клетки (иногда
встречаются зачаточные перегородки). Бесполое размножение протекает с обра¬
зованием зооспор, спорангиоспор, а у более развитых видов — и с помощью ко¬
нидий; последние формируются на особых образованиях мицелия ■— конидиенос-
цах. Половое размножение — оогамия или зигогамия, в отдельных случаях про¬
исходит копуляция двух зооспор. Конечные продукты процесса полового размно¬
жения— ооспора или зигоспора (рис. 25).2-й класс •— AscomycetesСумчатые грибы имеют развитой многоклеточный гаплоидный мицелий. Бесполое
размножение происходит с образованием конидий. Орган полового размноже¬
ния — сумка, в которой развивается восемь аскоспор. К сумчатым грибам отно¬
сят около 40 тысяч видов, но среди них встречается всего несколько десятков
типичных почвенных грибов (рис. 26).1. Plectascales: плодовое тело закрытое, сумки расположены внутри клей-
стотеция. У наиболее простых форм сумки образуются в совершенно открытом
или состоящем из рыхлого сплетения гиф плодовом теле.2. Sphaeriales: на вершине перитеция, часто вытянутого в форме клюва,,
имеется хорошо заметное отверстие. Перитеций твердый, кожистый, шерохова-87
Рис. 25. Некоторые грибы класса Phycomycetes:a — Mucor racemosus; б — Thamnidium etegans; в — Phycomyces nitens; г — Rhizopus
Рис. 26. Некоторые грибы класса Ascomycetes:; — Pénicillium glaucum; б — Aspergillus glaucum; в — Aspergillus tiiger.
Рис. 27. Некоторые грибы класса Deuteromycetes:л — Fusarium moschatum; б — Verticillium; в — Alternaria; г — Botrytis cinerea.
тый, часто окрашен в черный цвет. Строма лежит глубоко, поэтому стенка пе¬
ритеция всегда хорошо выражена.3. Hypocreales: перитеций мягкий, окрашен в светлые или яркие тона, имеет
отверстие. Стенка перитеция может быть полностью погружена в строму, в та¬
ких случаях она незаметна.3-й класс — BasidiomycetesБазидиомицеты имеют разделенный перегородками многоклеточный мицелий.
Специфические органы полового размножения ■— базидии. На их концах форми¬
руется по четыре одноклеточных гаплоидных базидиоспоры, развивающие при
прорастании гаплоидный мицелий. Позднее эти первичные гомоталличные или
гетероталличные мицелии образуют вторичный диплоидный мицелий. Базидиаль-
ные грибы делят на два подкласса:1-й подкласс — Heterobasidiomycetidae, или Phragmobasidiomycetidae. В ба-
зидиях образуются перегородки, разделяющие их на четыре клетки, каждая из
которых образует по одной базидиоспоре.2-й подкласс — Holobasidiomycetidae, или Homobasidiomycetidae. Базидии
не разделены перегородками, на их вершине образуется по четыре базидиоспоры.Базидиомицеты будут описаны более подробно при рассмотрении грибов,
образующих микоризу с корнями древесных растений (стр. 193).4-й класс ■— Deuteromycetes (Fungi imperfecti)Класс несовершенных грибов охватывает более 30 тысяч видов. Несколько со¬
тен из них можно отнести к типичным обитателям почвы, играющим важную
роль в почвенных биологических процессах (рис. 27). Этот класс грибов делят
на пять порядков.1. Monitiales: конидии образуются по одной, группами или располагаются
на конидиеносцах, формируя слой; всегда растут на поверхности питательной
среды.2. Melanconiales: конидиеносцы, погруженные в питательную среду, образуют
плотный слой; формируются на поверхности так называемого ложа.3. Sphaeropsidales (Pycnidiales): образуют короткие конидиеносцы, располо¬
женные в особых плодовых телах — пикнидах.4. Leptostromatales (Pseudopycnidiales): образуют короткие конидиеносцы,
расположенные в пикнидах равномерным гимениальным слоем; пикниды разви¬
ты не полностью, в них различают базальный слой и покровную щитовидную
часть.5. Mycelia sterilia: репродуктивных органов не образуют, вегетативное раз¬
множение происходит путем фрагментации гиф или с помощью склероциев.4.2.2. Общая характеристика порядкаК порядку Moniliales относят около 7500 видов грибов, среди ко¬
торых насчитывается свыше 500 почвенных организмов. Это озна¬
чает, что существенную часть почвенных грибов составляют пред¬
ставители Moniliales. Именно этим обстоятельством объясняется
необходимость более подробного рассмотрения данного порядка.Мицелий представителей Moniliales, бесцветный или темно-
окрашенный, разветвлен, разделен перегородками гиф на клетки,
хорошо растет как на поверхности, так и в глубине питательной
среды. Представители отдельных таксонов образуют специфиче¬
ские подушкообразные стромы. На определенной стадии развития
из мицелия вырастают спороносные гифы (конидиеносцы), несу¬
щие споры бесполого размножения. На субстрате конидиеносцы
расположены по одному (реже группами), плотными пучками (ко-91
?аРис. 28. Споры вегетативного размножения грибов:
а — бактоспоры Candida albicans; б — хламидоспоры; в — артроспоры
Geotrichum candidum; г — геммы Mucor racemosus.ремий) или же образуют на поверхности мицелия сплошной слой.
Конидии могут формироваться непосредственно на конидиеносце
или на особом коротком выросте последнего — стеригме. Среди
гифомицетов встречаются и такие виды, конидии которых обра¬
зуются путем распада гиф на отдельные клетки — споры. Конидии
в большинстве случаев экзогенные, реже псевдоэндогенные.Кроме размножения репродуктивными органами, отдельные
представители грибов данного порядка способны и к вегетатив¬
ному размножению. Этот процесс может происходить за счет ро¬
ста кусочков мицелия или с помощью вегетативных спор (хлами¬
доспоры, геммы, бластоспоры, артроспоры и т. д.). Споры обра¬
зуются непосредственно из гиф мицелия без участия специальных
спорообразующих органов (рис. 28).Порядок Moniliales подразделен на четыре семейства: Moni-
liaceae, Dematiaceae, Stilbaceae и Tuberculariaceae.I. На поверхности субстрата размещены одиночные или сгруп¬
пированные конидиеносцы и спороносные гифы, никогда не обра¬
зующие пучков.А. Мицелий, конидиеносцы и конидии бесцветны или ярко
окрашены.Семейство Moniliaceae.Примечание: исключение составляют отдельные виды Aspergil¬
lus, образующие черные или окрашенные в темные тона конидии.
Б. Мицелий и конидиеносцы темноокрашенные (обычно тем-4.2.2.1. Определитель грибов порядка Moniliales92
нокоричневые, оливково-коричневые или черные). Конидии в
большинстве случаев темноокрашенные (обычно темнокорич¬
невые, оливково-коричневые, черные), изредка дымчатые, свет¬
лые или почти бесцветные.Семейство Dematiaceae.II. Конидиеносцы расположены вертикальными группами, об¬
разуя плотные пучки (коремий).Семейство Stilbaceae.III. Конидии на поверхности субстрата образуют густой слой.
Большей частью они создают плотное сплетение гиф, над которым
возвышаются яркоокрашенные подушечки — спородохий. Иногда
конидии образуются на рыхлом сплетении гиф.Семейство Tuberculariaceae.Из представителей порядка Melanconiales в почве обычно
встречается Cryptomella acustispora (семейство Melancotiiaceae).
Несколько шире распространены грибы порядка Sphaeropsidales,
хотя и они довольно редки. Среди них чаще встречаются виды се¬
мейства Sphaeropsidaceae, для которых характерны шаровидные,
темноокрашенные, кожистые пикниды — закрытые или имеющие
отверстие.4.3. ПРИНЦИПЫ КЛАССИФИКАЦИИ ПОЧВЕННЫХ
ВОДОРОСЛЕЙНаряду с бактериями и грибами в почве обитает значительное
количество водорослей, образующих органичный элемент почвен¬
ного микробиоценоза. Согласно опубликованным данным, в за¬
висимости от влажности и температурных условий количество
водорослей в 1 г верхнего слоя почвы может достигать и даже
превышать сто тысяч особей.Водоросли — растительные хлорофиллоносные организмы; мно¬
гие их виды, помимо хлорофилла, содержат и другие пигменты.
В зависимости от пигмента различают синезеленые, желтозеле¬
ные, бурые и красные водоросли. Водоросли относятся к авто-
трофным организмам, хотя отдельные виды приспособлены и к
гетеротрофному способу питания; последние обитают и в более
глубоких слоях почвы.По классификации Мишустина [98] почвенные водоросли под¬
разделяются на три группы. К первой относятся влаголюбивые
виды водорослей, размножающихся в насыщенной влагой почве.
Эти водоросли доминируют в ранневесенний период. Вторая груп¬
па представлена видами, предпочитающими условия средней
влажности, а к третьей относятся водоросли, встречающиеся в
засушливых условиях. Поселяясь в трещинах скалистых пород и
камней, они используют благоприятные для себя микроклимати¬
ческие условия. Согласно выводам Комароми [60], состав сину-
зий почвенных водорослей зависит и от типа почвы.Почвенные водоросли чрезвычайно устойчивы к неблагопри¬
ятным условиям. При засухе отдельные виды (Botrydium) фор¬93
мируют цисты, у представителей других видов в цисты превраща¬
ется все вегетативное тело. Диатомовые водоросли в засушливых
условиях перемещаются в глубокие слои почвы.Водоросли играют важную роль в почвообразовании, посколь¬
ку на поверхности каменистых пород они поселяются раньше
других организмов, почти одновременно с началом процессов вы¬
ветривания. Выделяя С02, они могут ускорять эти процессы, а
отмершие водорослевые клетки служат источником энергии для
бактерий и грибов. Отдельные виды водорослей способны фикси¬
ровать молекулярный азот.По классификации Петерфи [120] водоросли можно разделить
на 11 различных типов. Согласно Мишустину, наибольшее зна¬
чение имеют синезеленые, желтозеленые, зеленые и диатомовые
водоросли, поэтому в данном случае можно ограничиться рас¬
смотрением соответствующих таксонов.Синезеленые водоросли (Cyanophyta)—наиболее примитив¬
ные представители растительного мира. Хлорофилл в них не со¬
средоточен в хлоропластах, а рассеян по всей цитоплазме. Поми¬
мо хлорофилла, они содержат и другие пигменты, в частности
синий фикоцианин, каротин и фикоэритрин. Среди синезеленых
водорослей встречаются как одноклеточные, так и нитчатые виды;
последние могут быть прямыми или разветвленными. Существует
и промежуточная форма колоний между одноклеточной и много¬
клеточной: дочерние клетки не отделяются, а существуют вместе,
окруженные общей слизистой оболочкой.Синезеленые водоросли часто встречаются в поверхностном
слое увлажненных почв. К ним относятся и многие виды азот-
фиксирующих водорослей. Из одноклеточных заслуживают вни¬
мания роды Synecoccus и Chroococcus, а среди колониальных ви¬
дов — представители рода Gloeocapsa. Из нитчатых форм чаще
всех встречаются виды, относящиеся к родам Oscillatoria, Lyngbya,
Phormidium, Scytonema, Nostoc, Anabaena.Клетки зеленых водорослей (Chlorophyta) содержат хлоро¬
филлсодержащие хроматофоры (хлоропласты). Оболочка кле¬
ток состоит из целлюлозы. В большинстве они одноядерны, одна¬
ко встречаются и многоядерные клетки. Зеленые водоросли могут
быть одно- и многоклеточными; последние образуют простые или
ветвящиеся нити.Вегетативное размножение одноклеточных форм наиболее час¬
то происходит с помощью автоспор или зооспор. При образовании
автоспор протоплазма материнской клетки делится на две или
более частей. Сформировавшиеся таким образом автоспоры окру¬
жают себя собственными клеточными оболочками, находясь еще
внутри материнской клетки, и затем выходят из нее. Зооспоры
образуются в зооспорангии при делении одной клетки и после
выхода из него некоторое время сохраняют жгутики.При половом размножении (оогамия, изогамия) две клетки
(обычно половые гаметы) сливаются и образуют зигоспору, из
которой в дальнейшем развивается новая особь.94
живишгшРис. 29. Почвенные водоросли.I — синезеленые; а— Anabaena circinalis; 6 — Nostoc commune; в — Phormidium autumnale;
г — Oscillatoria limosa. II — диатомовые: a — Pinnularia borealis; б — Pinnularia viridis;
в — Hantzschia amphixys var. capitata. Ill — зеленые: a — Hormidium flaccidum; (/ — нить;
.2—зооспоры); б — Scenedesmus quadricauda; в — Pleurococcus vulgaris.С точки зрения почвенной биологии важнейшие представители
одноклеточных зеленых водорослей встречаются в родах Chlamy-
domonas и Chlorella. Из колониальных наиболее распространены
представители Scenedesmus, а среди нитчатых преобладают роды
Ulothrix, Hormidium (Chlosthormidium) и Voucheria.Желтозеленые водоросли (Xantophyta) по строению и формам
размножения близки к зеленым водорослям. Их клетки содержат
желто-зеленые хроматофоры, включающие, кроме хлорофилла,
каротин и ксантофилл. Зооспоры этих водорослей передвигаются
при помощи двух неодинаковых по длине жгутиков. В числе жел¬
тозеленых водорослей есть подвижные одноклеточные формы,
встречаются формы, для которых характерны ризоподии и тет¬
распоры; кроме того, существуют и прикрепленные к субстрату
нитчатые водоросли.Среди обитающих в почве желтозеленых водорослей встреча¬
ются одноклеточные представители родов Pleurochoris, Vischeria
и Characiopsis, виды Botrydium, для которых характерен сифо-
нальный таллом, и нитчатые Tribonema, Heterococcus и Heteroth-
rix.Диатомовые водоросли (Bacillariophyta) — это одноклеточные
формы, живущие обособленно или образующие колонии. Их кле¬
точная оболочка содержит окись кремния и состоит из двух ство¬
рок— нижней (hipotheca) и верхней (epitheca); более крупная
верхняя створка закрывается, подобно крышке. В створках раз¬95
личают покровную (valva) и боковую (pleura) части. В цитоплаз¬
ме встречается сравнительно много крупных включений. Хлоро¬
пласта имеют желтоватый или светло-коричневый цвет. Отдель¬
ные виды неподвижны, другие способны к скользящему передви¬
жению, некоторые плавают.Размножаются диатомовые водоросли делением. Половые аук¬
соспоры образуются при слиянии протопластов двух клеток.
Клеточная оболочка ауксоспор вначале состоит из пектина, крем¬
нийсодержащая оболочка образуется позднее.Из почвенных диатомовых водорослей можно отметить пред¬
ставителей родов Navicula, Pinnularia, Hantzschia, Nitzschia. Не¬
которые виды перечисленных типов водорослей приведены на ри¬
сунке 29.Таким образом, при таксономическом определении водорослей
главными критериями служат их форма и содержание пигментов.
В одних случаях решающее значение может иметь форма клеток
(диатомовые водоросли, Desmidium), в других необходимо изу¬
чение субмикроскопического строения клеточной оболочки и жгу¬
тиков, цитологические исследования для определения числа и
расположения хромосом. Важные диагностические признаки — это
форма хроматофора, а также цвет и химические свойства допол¬
нительных пигментов и запасных веществ. В отдельных случаях
большое значение имеет изучение особенностей онтогенетического
развития и среды обитания (пресноводный или морской орга¬
низм). Для определения водорослей наиболее широко используют
ключ, разработанный Смитом [136].
5КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗПОЧВЕННЫХМИКРООРГАНИЗМОВМетоды количественного определения микроорганизмов можно
разделить на две группы. В первую входят методы прямого мик-
роскопирования почвенной суспензии, во вторую — количественное
определение почвенных микроорганизмов при культивировании их
на плотных или жидких питательных средах. Показатели, полу¬
ченные этими методами, сравнивать нельзя. Данные прямых на¬
блюдений могут на несколько порядков превосходить значение
чисел, определенных путем подсчета микроорганизмов на пита¬
тельных средах. Оба способа анализа имеют множество видоиз¬
менений, наиболее известные из которых рассмотрены ниже.5.1. МЕТОДЫ ПРЯМОГО ПОДСЧЕТАПрямой подсчет почвенных микроорганизмов под микроскопом
стал возможен благодаря предложению Конна и Виноградского
использовать кислый краситель для окраски препаратов, приго¬
товленных из почвенной суспензии. Красители этого типа окра¬
шивают прежде всего клетки микроорганизмов, тогда как мине¬
ральные частицы почвы и аморфные кусочки органического ма¬
териала окрашиваются плохо или вообще не воспринимают кра¬
сители.Метод имеет недостаток: погибшие клетки окрашиваются
так же, как и живые, поэтому получаемые результаты превышают
показатели фактического содержания микроорганизмов.5.1.1. Метод Виноградского в модификации ШульгинойНавеску исследуемой почвы (5 г) вносят в коническую колбу
емкостью 250 мл, содержащую 45 мл стерильной воды. Ватную
пробку колбы заменяют резиновой, затем содержимое колбы в
течение 5 минут взбалтывают на установке для встряхивания.
Согласно Звягинцеву, почву, увлажненную 0,1%-ным раствором
пирофосфата натрия (Na4P207) в количестве 0,4—0,8 мл, целесо¬
образно предварительно растереть в стерильной ступке или чашке
Петри. По окончании встряхивания необходимо подождать, пока
крупные частицы почвы осядут на дно. Затем стерильной пипет¬
кой емкостью 1 мл, имеющей деления по 0,01 мл, на предметное
стекло наносят 0,02 мл полученной суспензии, немедленно добав¬7 И. Сэги 97
ляют каплю 0,1%-ного агарового раствора, перемешивают и го¬
товят равномерный мазок на площади 400 мм2. Водный агаризо-
ванный раствор рекомендуется готовить из агара Дифко, не со¬
держащего часто встречающихся в волокнистом агаре бактериаль¬
ных загрязнений. Целесообразно предварительно начертить на по¬
верхности предметного стекла квадрат 20X20 мм. Высохший
мазок фиксируют 96%-ным спиртом или парами осмия и пример¬
но на 45 минут помещают в стеклянную кювету с карболовым
раствором эритрозина (18); при необходимости длительность
окрашивания можно увеличить. После окрашивания краску смы¬
вают, последовательно погружая стекла в 4—5 стаканов с чистой
водой. Удалив лишнюю краску, препарат высушивают и микро-
скопируют с применением иммерсионного объектива.Из каждого образца почвы рекомендуется готовить не менее
пяти препаратов. Для каждого препарата вычисляют средний
иоказатель по 100 полям зрения микроскопа. При известной пло¬
щади поля зрения можно легко подсчитать, какую часть преиа-
j ата оно составляет. Площадь поля зрения вычисляют при по¬
мощи окуляр- и объект-микрометра (см. стр. 63).Если площадь препарата — 400 мм2, а поле зрения — 0,02 мм2,
то поле зрения микроскопа в 20 000 раз меньше площади препа¬
рата:Среднее число клеток, полученное для поля зрения, умножают
па частное от деления двух площадей (20 000) и получают коли¬
чество клеток, нанесенных на предметное стекло вместе с сус-
пгпзией (0,02 мл).Этот показатель необходимо пересчитать на 1 г абсолютно су-
xr'i! почвы. С этой целыо определяют и содержание влаги в иссле¬
дуемом образце почвы.5.1.2. Метод ГермановаНедостаток вышеизложенного метода состоит в том, чго он не
позволяет провести подсчет бактерий, адсорбированных почвенны¬
ми частицами. Существенный элемент модификации Германова —
десорбция микроорганизмов перед их подсчетом. Для этого 1 г
исследуемой почвы многократно промывают 2 н. раствором NaCl
до полного удаления ионов Са++, проверяя результативность про¬
мывания реакцией со щавелевокислым аммонием. Затем 0,04 н.
раствором NaOH почву смывают в коническую колбу емкостью
200 мл, доводят объем до 50 мл и содержимое колбы взбалты¬
вают 5 минут. После оседания крупных частиц на дно колбы кап¬
лю верхнего слоя жидкости наносят на предметное стекло. Все
последующие операции проводят в соответствии с методикой
Шульгиной.98
5.1.3. Метод Джонса —МоллисонаВ стерильной стеклянной или фарфоровой чашке 1 г почвы сме¬
шивают с 5 мл стерильной дистиллированной воды, разминая не¬
размокшие частицы стеклянной палочкой. Полученную суспензию
сливают в предварительно стерилизованную коническую колбу
емкостью 100 мл, а остаток почвы смывают в колбу новой порцией
воды (5 мл). В 40 мл стерильной дистиллированной воды раство¬
ряют 0,75 г агара Бакто и еще жидкий агаризованный раствор
добавляют к почвенной суспензии при тщательном размешивании.
Небольшое количество незастывшего агара стерильной пипеткой
переносят в лунку счетной камеры (Тома, Бюркер) и накрывают
другим предметным стеклом. Застывшую агаровую пленку осто¬
рожно извлекают из углубления счетной камеры, помещают на
чистое предметное стекло и высушивают. Сухой препарат на по¬
верхности предметного стекла окрашивают феноловым анилино¬
вым красителем (11) в течение часа. Затем краску смывают 96%-
ным спиртом и обезвоживают препарат абсолютным (100%-ным)
спиртом. Подсчет клеток проводят в 20—25 полях зрения извест¬
ной площади, используя иммерсионный объектив.Исходя из объема углубления счетной камеры и разбавления
суспензии, можно вычислить количество микроорганизмов в 1 г
почвы (см. стр. 115). Преимущество метода [51] состоит в том,
что данный красящий раствор удовлетворительно окрашивает не
только бактериальные клетки, но и гифы грибов и актиномицетов,
плохо воспринимающие карболовый эритрозин.5.1.4. Метод люминесцентной микроскопии СтраггераПомимо обычных красителей, для окрашивания микроорганизмов
в почвенной суспензии с успехом можно применять и специаль¬
ные краски, так называемые флуорохромы, флуоресцирующие
различными цветами при освещении ультрафиолетовыми или
фиолетовыми лучами. Для этой цели наиболее часто используют
акридиновый оранжевый, окрашивающий частицы почвы в крас¬
ный, а микроорганизмы — в зеленый цвет. В сравнении с обыч¬
ным окрашиванием обработка флуорохромами имеет два преи¬
мущества: 1 — микроорганизмы резко отличаются от частиц поч¬
вы; 2 — метод позволяет подсчитать не только свободно плаваю¬
щие, но и адсорбированные на поверхности почвы клетки.Определение числа бактериальных клеток с применением флуо-
рохромов выполняют следующим образом. В коническую колбу
емкостью 250 мл наливают 100 мл дистиллированной воды; од¬
новременно стерилизуют такую же пустую колбу, закрытую ват¬
ной пробкой. Затем внутреннюю поверхность небольшой фарфо¬
ровой ступки стерилизуют, сжигая в ней спирт, вносят туда 1 г
исследуемой почвы и добавляют немного воды до получения ка¬
шицеобразной массы. Почву тщательно разминают стеклянной
палочкой и смывают в пустую колбу, многократно добавляя сте*7* 99
рильную воду из второй колбы. 100 мл полученной суспензии5 минут взбалтывают на установке для встряхивания и полминуты
отстаивают. По 1 мл почвенной суспензии вносят пипеткой в семь
пробирок, затем в каждую из них добавляют по 1 мл акридино¬
вого оранжевого различной концентрации. Звягинцев рекомендует
применять для этого растворы красителя следующих разведений:1 : 500, 1 : 1000, 1 :2000, 1 : 4000, 1 : 8000, 1 : 16 000, 1 : 32 000. Необ¬
ходимость приготовления серии разведений объясняется тем, что
характер почвы влияет на качество окрашивания. Из серии раз-
ведений красителя следует отобрать концентрации, наиболее от¬
вечающие конкретным условиям. Для исследования богатых орга¬
ническими и минеральными коллоидами луговых почв и черно¬
земов пригодны более концентрированные растворы красителя,
для рыхлых песков — разбавленные препараты.При изучении очень тяжелых луговых глинистых почв для
суспендирования образцов вместо воды рекомендуется использо¬
вать раствор пирофосфата натрия. В этом случае ускоряется
диспергирование почвы и, кроме того, происходит десорбция мик¬
роорганизмов с почвенных частиц. В зависимости от свойств поч¬
вы используют 0,1, 0,5, 1%-ный или 5%-ный раствор пирофосфата.Образцы для микроскопирования отбирают из пробирок, в
которых жидкость над осевшими частицами почвы слабо флуо¬
ресцирует.Для подсчета клеток используют специальные камеры глуби¬
ной около 10—20 мкм. Более глубокие счетные камеры непри¬
годны, так как не позволяют отфокусировать микроскоп на всю
глубину. Исследование выполняют с иммерсионным объективом
90X и окуляром 5—7Х- Вместо кедрового масла на покровное
стекло наносят каплю нефлуоресцирующего парафинового масла.5.1.5. Количественный анализ водорослей
методом СтайнаНаряду с бактериями, грибами и актиномицетами почва содержит
большое количество синезеленых и диатомовых водорослей. Чаще
всего они встречаются вблизи поверхности почвы, поскольку для
их развития нужен свет, но в отдельных случаях заселяют и более
глубокие слои. Будучи автотрофными организмами, водоросли не
участвуют в разложении попадающего в почву органического ма¬
териала, но ассимиляционные их процессы влияют на газообмен
почвы, а после их отмирания остается органический материал,
усваиваемый другими микроорганизмами. Многие виды синезе¬
леных водорослей способны связывать молекулярный азот.Метод, разработанный Стайном для подсчета водорослей, за¬
ключается в следующем. В пробирке смешивают 1 г почвы и 4 мл
стерильной воды, в течение 3 минут смесь встряхивают, затем
отстаивают 30 секунд и после оседания грубых частиц супернатант
сливают в центрифужную пробирку. К оставшейся в пробирке
лочве добавляют 3 мл воды, встряхивают одну минуту, дают от-100
«тояться 30 секунд и жидкость сливают в ту же центрифужную
пробирку; эту процедуру повторяют еще раз. В другую центри¬
фужную пробирку наливают соответствующее количество воды и
затем материал центрифугируют одну минуту при 500 об/мин. Су-
пернатант осторожно сливают с осажденной почвы, добавляют к
ней 5—10 мл стерильной дистиллированной воды, тщательно пе¬
ремешивают, пипеткой переносят каплю материала (0,05 мл) на
чистое предметное стекло и накрывают покровным стеклом. Ис¬
пользуя 40-кратный сухой объектив, подсчитывают водоросли, на¬
ходящиеся в поле зрения микроскопа. Искомую величину опре¬
деляют как среднюю арифметическую для 25—50 полей зрения.При известной площади поля зрения легко вычислить площадь
жидкости под покровным стеклом, а отсюда и количество водорос¬
лей во всей суспензии (5—10 мл), что равно их числу в 1 г поч¬
вы. В полученные значения необходимо ввести поправку на влаж¬
ность почвы. Подсчет клеток можно ускорить, установив в оку¬
ляре вкладыш с сеткой, размеры ячеек которой предварительно
должны быть определены с помощью объект-микрометра (см.
стр. 63).5.2. МЕТОДЫ НЕПРЯМОГО ПОДСЧЕТА
МИКРООРГАНИЗМОВМетоды непрямого подсчета микроорганизмов первоначально бы¬
ли разработаны для применения в медицинской и промышленной
микробиологии. Наибольшее применение они получили в связи с
разработкой методики использования плотных питательных сред,
впервые предложенных Кохом. Общая особенность этих методов
заключается в следующем: соответствующим образом подготов¬
ленный исследуемый материал наносят на питательную среду и
по количеству выросших колоний определяют число микроорга¬
низмов в единичном количестве материала.Как уже отмечалось, методы непрямого подсчета также не
позволяют установить численность бактерий в материале с абсо¬
лютной точностью. Один из наиболее значительных источников
ошибок — адсорбция бактерий на поверхности частиц почвы, прак¬
тически не позволяющая получить совершенно гомогенную сус¬
пензию. Не менее существенные ошибки обусловлены далеко не
одинаковыми условиями развития различных групп микроорга¬
низмов на различных питательных средах. Именно поэтому в
микробиологической практике для культивирования бактерий, гри¬
бов и актиномицетов используют неодинаковые среды. Исследо¬
вание актиномицетов затруднено еще и тем обстоятельством, что
полученные результаты часто отражают не содержание активного
мицелия в почве, а количество покоящихся спор.Разработаны специальные методы количественного определе¬
ния микроорганизмов, относящихся к различным физиологическим
группам. Подобные методы повышают степень достоверности по¬
лученных результатов, поскольку они предусматривают высев от¬101
дельных разведений почвенной суспензии на большее количество
различных питательных сред.Из вышеизложенного логически вытекает, что показатели, по¬
лучаемые при помощи данных методов, намного ниже показате¬
лей действительного содержания микроорганизмов в почве. В свя¬
зи с этим их нельзя сравнивать с результатами иных методов, и
они могут служить в первую очередь для выявления самых общих
тенденций распространения почвенных микроорганизмов.5.2.1. Подсчет колоний на плотных
питательных средах5.2.1.1. Метод почвенных пластинок НовогрудскогоДанный метод позволяет получать сведения не только о харак¬
тере количественного распределения почвенных микроорганизмов,
но также об особенностях их роста и конкурентных взаимоотно¬
шениях между отдельными группами. Кроме того, этот метод по¬
зволяет наблюдать даже те группы микроорганизмов, которые
нельзя обнаружить обычными широко распространенными мето¬
дами.Метод Новогрудского [111] весьма прост: на поверхность так
назыпаемого водного агара, не содержащего питательных веществ,
равномерным слоем наносят мелкоизмельченную почву. После
инкубации вокруг частиц почвы разрастаются колонии микроор¬
ганизмов. Исходя из их числа и количества почвы, нанесенной
на поверхность питательной среды, можно рассчитать содержание
микроорганизмов в исследуемом образце. В основу метода поло¬
жена способность микроорганизмов размножаться в слое тонкой
водяной пленки, обволакивающей частицы почвы на агаризо-
ванной среде. Данная среда не содержит питательных субстра¬
тов, поэтому микроорганизмы растут вокруг частиц почвы, ис¬
пользуя содержащиеся в ней питательные вещества. Важным ус¬
ловием является отсутствие этих веществ в агаре (1,5%). Если
для приготовления среды используют волокнистый агар, его сле¬
дует предварительно промывать несколько дней в проточной во¬
допроводной воде. Для этого навеску агара помещают в кониче¬
скую колбу емкостью 2—3 л, в которую опускают резиновую
трубку, верхним концом надетую на водопроводный кран. Горлови¬
ну колбы обвязывают марлей и медленно подают в нее воду. Пос¬
ле промывания агар 3—4 раза споласкивают дистиллированной
водой и затем используют для приготовления водного агара. Це¬
лесообразно брать для этого очищенный агар Бакто или какой-
либо другой агар, не содержащий загрязнений.Для посева измельченной почвы на поверхность агара Ново-
грудский рекомендует пользоваться так называемой посевной во¬
роночкой, представляющей собой трубку внутренним диаметром
10 мм, один из концов которой закрывается стеклянным краном.
Упакованную трубку стерилизуют сухим паром. В автоклаве от¬
дельно стерилизуют ватную пробку, которой закрывают свободный102
конец трубки. Затем в нее
вносят навеску сухой поч¬
вы, предварительно про-1
сеянной через сито с ячея¬
ми размером 0,25 мм, от¬
крывают кран и, осторожно ,,1 1 * 1 Рис. 30. Сито для нанесения мелких час-постукивая по трубке, вы- ТИц почвы на агаровую пластинку [по 125].
севают почву на поверх¬
ность агара.Разумовская [125] вместо вороики предлагает использовать
«ситечко», представляющее собой металлическую трубку внутрен¬
ним диаметром 10 мм и длиной 40 мм; на одном из ее концов
закреплено сито с ячеями по 0,25 мм (рис. 30). В стерилизован¬
ное спиртовым факелом и охлажденное ситечко вносят 1—2 г
воздушно-сухой предварительно просеянной почвы, свободный ко¬
нец трубки закрывают также стерилизованной резиновой пробкой.
При помощи ситечка исследуемый образец почвы наносят на пи¬
тательную среду быстрее и равномернее, чем через воронку. Разу¬
мовская рекомендует высевать в чашки Петри по 50—100 мг поч¬
вы. Для каждого исследуемого образца готовят не менее четырех
параллельных посевов. Взвесив ситечко после нанесения почвы на
питательную среду, можно определить массу высеянного образца.Длительность инкубации зависит от характера изучаемых ор¬
ганизмов. При определении числа грибов она длится 1—2 суток,
для бактерий составляет 3—5 суток, а для актиномицетов —
10—15 суток.По истечении срока инкубации открытую чашку Петри уста¬
навливают на предметном столике микроскопа и изучают внача¬
ле при небольшом увеличении. В поле зрения микроскопа можно
хорошо различать бактерии, актиномицеты и грибы, поэтому при
подсчете следует обращать внимание и на морфологические при¬
знаки культур.Чтобы избежать многократного открывания чашки Петри, при
помощи металлической трубки (сверла для пробок) диаметром
8—10 мм вырезают пять кружочков питательной среды. До и пос¬
ле этой операции трубку стерилизуют, прокаливая ее в спирто¬
вом факеле. Вырезанные диски размещают на отдельных пред¬
метных стеклах и таким же образом стерилизованным бритвен¬
ным лезвием разрезают на четыре части, затем каждый из секто¬
ров— еще на три части. После этого микроскопируют отдельно
каждый из кусочков агара.При микроскопировании определяют число колоний, выросших
на питательной среде, и соотносят его с массой взятой для иссле¬
дования почвы. Недостаток метода состоит в том, что колонии,
появляющиеся вокруг частиц почвы, обычно происходят не от од¬
ной бактериальной клетки. Таким образом, полученный результат
нельзя считать точной количественной характеристикой и скорее
можно использовать в качестве основы для сравнения.103
5.2.1.2. Определение числа почвенныхмикроорганизмов на агаризованной среде
методом разведенийДанное исследование состоит из трех этапов: приготовление се¬
рии разведений почвенной взвеси, посев на агаризованную
питательную среду и определение числа выросших колоний. 35—
40 г исследуемой почвы помещают на часовое стекло, предвари¬
тельно стерилизованное горящим спиртом. Стерильным пинцетом
удаляют камни и растительные остатки. После этого взвешивают
10 г очищенной почвы и вносят ее в коническую колбу емкостью
250 мл, содержащую 90 мл стерильной водопроводной воды. Па¬
раллельно 20 г почвы используют для определения содержания в
ней влаги.Почвенную взвесь в колбе Эрленмейера взбалтывают в тече¬
ние 10 минут. Перед взбалтыванием целесообразно заменить ват¬
ную пробку резиновой.Принимая во внимание, что одного только взбалтывания недо¬
статочно для суспендирования прочно склеенных частиц почвы,
Звягинцев рекомендует предварительно растирать почву в фар¬
форовой или стеклянной чашке, добавляя немного стерильной
еоды. Полученную кашицеобразную почвенную массу переносят
в стерильную колбу, многократно смывая остатки почвы со сте¬
нок чашки. Необходимо следить за тем, чтобы общий объем ис¬
пользованной воды составлял 90 мл (вместе со стерильной водой,
добавленной при растирании почвы). После этой операции пока¬
затель содержания микроорганизмов в почве в 2—7 раз превы¬
шал аналогичную величину для образцов, которые не были рас¬
терты перед суспендированием. Для некоторых почв (луговые,
чернозем) Звягинцев рекомендует использовать вместо воды 0,1—
5%-ный раствор пирофосфата натрия, способствующего десорб¬
ции сцепленных с почвенными частицами бактериальных клеток.После взбалтывания почвенную взвесь в течение 30 секунд от¬
стаивают, затем стерильной пипеткой емкостью 1 мл отбирают1 мл суспензии и вносят ее в пробирку с 9 мл стерильной воды.
Полученную суспензию перемешивают встряхиванием, чистой пи¬
петкой отбирают 1 мл жидкости и переносят ее в пробирку, так¬
же содержащую 9 мл воды. Эту операцию повторяют 6—8 раз,
используя в каждом случае чистые пипетки. Пробирки с отдель¬
ными разведениями надписывают. Если запланирован посев на
большое число питательных сред и 9 мл суспензии для этого бу¬
дет недостаточно, ряд разведений готовят в колбах емкостью
100 мл, добавляя 5 мл суспензии к 45 мл воды. Разведения же¬
лательно готовить с таким расчетом, чтобы концентрация каждого
последующего члена серии разведений была в 10 раз меньше кон¬
центрации предыдущего (рис. 31).По 1 мл суспензии каждого разведения используют для при¬
готовления не менее четырех параллельных посевов. Начинать
посев всегда следует только с суспензии наибольшего разведения,104
1мл! мл1млРис. 31. Схема культивирова¬
ния микроорганизмов методом
серийных разведений.обозначая ее степень на чашках Петри. При исследовании пло¬
дородных почв нет необходимости высевать материал исходной
суспензии (1:10) и двух последующих разведений (1:100 и
1:1000), поскольку такие посевы нельзя проанализировать из-за
сплошного роста колоний. В отдельные чашки Петри из пробирок
выливают по 20 мл агаровой питательной среды с температурой
50 °С и осторожными круговыми движениями смешивают ее с ис¬
следуемой суспензией. После застывания агара перевернутые чаш¬
ки Петри помещают в термостат, это предотвращает возможность
попадания водного конденсата с крышки на поверхность агара.
Перед переносом в термостат чашки с посевами целесообразно
вложить попарно в бумажные пакеты. В зависимости от характе¬
ра питательной среды инкубация длится от 2 до 10 суток. При ко¬
личественном определении бактерий чашки с посевами выдержи¬
вают в инкубаторе 2—4 суток, при исследовании грибов — 3—7,
актиномицетов — 7—10 суток.Согласно одной из модификаций этого же метода, материал
не смешивают с агаровой средой, а 0,5 мл суспензии наносят на
уже застывший агар и с помощью шпателя равномерно распре¬
деляют по его поверхности. Эта модификация может быть при¬
менена лишь при наличии агаризованных сред с сухой поверх¬
ностью, для получения которых чашки Петри с агаром в течение
2—3 суток следует выдержать в термостате. При определении105
числа анаэробных бактерий чашки Петри помещают в анаэроб¬
ный термостат и откачивают воздух. В отдельных случаях на по¬
верхность агаризованной среды наливают слой стерильного пара¬
фина или стерильной питательной среды толщиной 1—2 мм; под¬
счет колоний проводят в проходящем свете.По истечении соответствующего времени инкубации отбирают
посевы 1—2 разведений, пригодные для подсчета колоний; соглас¬
но общепринятому правилу, такими считаются посевы с числом
колоний не более 200 и не менее 50. При подсчете чашку Петри
переворачивают вверх дном, ее поверхность разделяют вертикаль¬
ными линиями на четыре части и определяют число колоний в
каждой из них. Каждую зафиксированную колонию следует обо¬
значать фломастером, это позволит избежать повторений при под¬
счете.Для подсчета колоний, выросших в чашках Петри, наиболее
удобно специальное устройство. Одно из них — прибор «Титри-
плак ОХ-205» (производство фирмы «Лабор», ВНР), состоящий
из светло- и темнопольного осветителя, лупы, счетных электродов
и электромагнитного счетчика. Подсчет колоний проводят следую¬
щим образом: на подсвечиваемый экран помещают перевернутую
вверх дном чашку Петри. Иглу электрода прижимают ко дну чаш¬
ки напротив колонии, при этом включается электрический счет¬
чик. Окрашивание точки в месте прикосновения позволяет избе¬
жать повторного учета той же колонии. Если колонии имеют не¬
значительные размеры, при подсчете пользуются лупой.После подсчета выросших колоний на основе массы суспенди¬
рованного образца почвы и степени разведения определяют чис¬
ло микроорганизмов, обитающих в 1 г почвы. С учетом содержа¬
ния почвенной влаги полученную величину пересчитывают на 1 г
абсолютно сухой почвы.Пример. При разведении 10-4 на поверхности питательной среды выявлено
75 колоний; влажность почвы равна 25%. В этом случае число микроорганизмов
в 1 г почвы определяют следующим образом:75 10 ОООX = —Q-75— = 1 000 000 ’т. е. в 1 г абсолютно сухой почвы содержится 1 ООО ООО клеток микроорганиз¬
мов.Для количественного определения отдельных групп микроор¬
ганизмов рекомендуют использовать следующие питательные
среды:— Бактерии: стандартная среда Торнтона (150); модифициро¬
ванный агар с почвенной вытяжкой (64); мясо-пептонный агар
(90); агар Чапека (70).— Актиномицеты: питательная среда Йенсена (94); глицерин-
аспарагиновый агар Конна (81); глюкозо-аспарагиновый агар
Крука, содержащий 0,4% пропионовокислого натрия (82).— Грибы: пептонно-декстрозный агар Мартина с добавлением
бенгальского розового и стрептомицина (116); картофельио-дек-106
строзный агар, содержащий 100 мг/л новобиодина (68); оксгал-
ловый агар с кристаллическим фиолетовым и стрептомицином
(126); синтетический кислый агар (145).5.2.2. Подсчет клеток методом предельных
разведений5.2.2.1. Определение физиологических групппочвенных микроорганизмов методом ПошонаПочвенные микробиологические процессы определяются совокуп¬
ностью процессов жизнедеятельности микроорганизмов, относя¬
щихся к различным физиологическим группам. В почвообразова¬
тельных процессах и поддержании плодородия почв особенно важ¬
ную роль играют микроорганизмы, участвующие в круговороте
углерода и азота. Именно поэтому в почвенной микробиологии
широко практикуется количественное определение микроорганиз¬
мов различных физиологических типов: целлюлозоразлагающих,
аммонифицирующих, нитрифицирующих, денитрифицирующих.При количественном анализе отдельных физиологических групп
применяют метод определения титра микроорганизмов в жидких
питательных средах. В пробирки с жидкой питательной средой
определенного состава высевают равные объемы почвенной сус¬
пензии различных разведений. Этот метод так называемого пре¬
дельного разведения допускает, что в пробирку с наибольшим раз¬
ведением, при котором еще идет рост культуры, с суспензией бы¬
ла внесена единственная бактериальная клетка. Исходя из степени
разведения объема внесенной суспензии, количества суспендиро¬
ванной почвы и ее влажности, можно определить число микроор¬
ганизмов в 1 г почвы.Основной недостаток метода заключается в том, что присутст¬
вия единственной бактериальной клетки в жидкой питательной
среде обычно недостаточно для начала размножения культуры.
Общеизвестно, что активность размножения микроорганизмов в
жидкости зависит от количества внесенного при посеве материала.
Кроме того, только теоретически можно получить такое разведе¬
ние суспензии, при котором в каждом миллилитре жидкости со¬
держится единственная клетка и все они равномерно распределе¬
ны в объеме жидкости.Следовательно, из-за неточности методов получаемые резуль¬
таты имеют приближенный характер и могут быть использованы
для выяснения характера распределения микроорганизмов в поч¬
ве и сравнения количественных признаков микрофлоры различных
биотопов. Таким образом можно получить некоторые сведения, не¬
обходимые для изучения почвенных микробиологических процес¬
сов.При постановке экспериментов готовят пять параллельных по¬
севов. Для проведения большого числа посевов серии разведений
суспензии целесообразно готовить в колбах, содержащих 45 мл107
5. Таблица определения числа микроорганизмовЧисловаяхаракте¬ристикаНаиболее
вероятное
число ми¬
кроорга¬
низмовЧисловаяхаракте¬ристикаНаиболее
вероятное
число ми¬
кроорга¬
низмовЧисловаяхаракте¬ристикаНаиболее
вероятное
число ми¬
кроорга¬
низмовЧисловаяхаракте¬ристикаНаиболее
вероятное
число ми¬
кроорга¬
низмов0000,02031,24001,35138,50010 22101,74011,75205,00020,42110,94022,05217,00100,22121,24032,55229,50110,42200,94101,752312,00120,62211,24112,052415,00200,42221,44122,552517,50210,62301,64202,05308,00300,62311,44212,553111,01000,22401,44223,053214,01010,43000,84302,553317,51020,63011,14313.053420,01030,83021,44324,053525,01100,43101,14403,554013,01110,63111,44414,054117,01120,83121,74504,054225,01200,63132,04515,054330,01210,83201,45002,554435,01221,03211,75013,054545,01300,83222,05024,055025,01311,03301,75036,055135,01401.13312,05047,555260,02000,53402,05103,555390,02010,73412,55514,5554160,02020,93502,55126,0555180,0стерильной водопроводной воды. Для приготовления исходной
суспензии берут 10 г почвы и 90 мл воды, затем по 5 мл полу¬
ченной взвеси переносят в колбы, используя в каждом случае чис¬
тую пипетку. Подготовку к приготовлению исходной суспензии
целесообразно выполнять с учетом рекомендаций Звягинцева
(стр. 100).При оценке результатов вероятное количество микроорганиз¬
мов рассчитывают по таблицам Мак-Креди (табл. 5), определяя
содержание их в 1 мл суспензии данного разведения, которое за¬
тем можно пересчитать на 1 г почвы.Числовая характеристика состоит из трех показателей. Первый
из них соответствует числу пробирок последнего разведения, при
котором во всех параллельных посевах идет рост культуры. Два
следующих показателя соответствуют числу пробирок с параллель¬
ными посевами двух последующих разведений, в которых идет
рост микроорганизмов. В том случае, если в посевах последующе¬
го разведения также обнаруживают пробирку с растущей куль¬
турой, ее прибавляют к числу пробирок двух предшествующих
разведений с растущими культурами. По таблице отыскивают108
число микроорганизмов, соответствующее числовой характеристи¬
ке, и с учетом степени разведения пересчитывают его на 1 мл
исходной суспензии. В данном случае следует исходить из того
разведения, которое дает рост культур микроорганизмов во всех
пяти пробирках. Если содержание бактериальных клеток в сус¬
пензии столь незначительно, что уже первое разведение не дает
роста во всех пробирках, исходят из числа пробирок, в которых
микроорганизмы размножаются. Применение данного метода мож¬
но проследить на следующих примерах.Пример 1.Степень разведения:10-' ю-2 ю-3 ю-4 ю-5 io-6 io-7 io-8 io-910-10.Число пробирок, в которых идет рост:555555321 0.Числовая характеристика: 532+1=533.Вероятное число микроорганизмов для данного разведения:533=17,5.Вероятное число микроорганизмов в 1 мл исходной суспензии:17,5X10е.Пример 2.Степень разведения:ю-1 10-* ю-3 ю-4 ю-5 ю-6 ю-7.Число пробирок, в которых идет рост:5 5 5 5 0 0 0.Числовая характеристика: 500.Ниже изложены возможности применения метода Пошона
[122] для определения микроорганизмов, относящихся к различ¬
ным физиологическим группам. В Венгрии данный метод впервые
применили Гал с сотр. [35]. При описании методов изучения раз¬
личных групп микроорганизмов использован опыт, накопленный
этими исследователями. Вначале из исследуемого образца почвы
готовят серию разведений от 1 до 10~10. Исходную суспензию
взбалтывают 15 минут, суспензии последующих разведений — по5 минут. Затем из полученных суспензий готовят по пять парал¬
лельных посевов на каждой из питательных сред, отмечая на про¬
бирках с посевами степень разбавления. Посевы всегда начинают
с наибольшего разведения. Культуры микроорганизмов отдельных
физиологических групп инкубируют в соответствии с предписа¬
ниями.Определение общей численности бактерий на питательной среде с почвенной
вытяжкой. С этой целью по 8 мл среды с почвенной вытяжкой (147) разливают
в пробирки. Посев выполняют, добавляя в среду по 1 мл почвенной суспензии.
Для каждого разведения готовят по пять параллельных посевов. Инкубацию
проводят в термостате при 28 °С в течение 14 суток. Результат оценивают по
помутнению питательной среды, сравнивая посев со стерильной средой.Определение числа свободноживущих аэробных азотфиксирующих бактерий.
По 5 мл безазотистой питательной среды Эшби (57) или Федорова (77) разли¬
вают в пробирки. Как и в предыдущем случае, среду засевают 1 мл суспензии
и в течение 14 суток инкубируют в термостате, в котором не протекают микро¬
биологические процессы, связанные с продуцированием аммиака. В пробирках
с развивающимися культурами на поверхности питательной среды образуется
тонкая пленка.109
Количественное определение анаэробных азотфиксирующих бактерий. В про¬
бирки разливают по 9 мл питательного бульона (55), рекомендованного для
этого исследования. Для обнаружения процессов газообразования в каждую
пробирку помещают трубку Дархэма (см. стр. 73) и стерилизуют 40 минут
при 1 атм. В 100 мл дистиллированной воды вносят 10 г глюкозы, раствор
стерилизуют на фильтре Зейтца ЕК. В отдельные пробирки в стерильных усло¬
виях вносят по 1 мл раствора глюкозы, которую в соответствии с вышеописан¬
ной методикой предварительно засеяли 1 мл суспензии каждого разведения.
Посевы инкубируют в термостате при 28 °С в течение 21 суток. При оценке
результатов наряду с помутнением среды следует обращать внимание и на вы¬
деление газа, поскольку для организмов данной группы характерно интенсивное
газообразование.Количественное определение аэробных целлюлозоразлагающих бактерий.
В пробирки разливают по 10 мл питательного бульона (47) и помещают полос¬
ки фильтровальной бумаги с таким расчетом, чтобы о. гчступали из раствора.
После стерилизации при 1 атм в течение 40 минут прово„... посев, как описано
выше. Инкубация длится 30 суток при 28 °С. В пробирках, где присутствуют
целлюлозоразлагающие бактерии, фильтровальная бумага разлагается.Количественное определение анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий.
В пробирки разливают по 10 мл питательного бульона (53), туда же в качестве
источника углерода помещают полоску фильтровальной бумаги, полностью по¬
гружая ее в жидкость. Стерилизацию и посев выполняют так же, как в преды¬
дущем случае. Инкубация длится 30 суток в эксикаторе при давлении 20 мм
рт. ст. или в анаэробном термостате при 35 °С. О присутствии анаэробных цел¬
люлозоразлагающих бактерий свидетельствует разложение фильтровальной
бумаги.Ниже описаны методы, которые позволяют определять не ко¬
личество бактериальных клеток, а значения биологической актив¬
ности. Для их сравнения вычисляют индексы, характеризующие
процесс, или вычерчивают соответствующие диаграммы, отражаю¬
щие данные отдельных экспериментов.Определение протеолитической активности. В агглютинационные пробирки
разливают по 2 мл желатиновой питательной среды (91) ив течение трех дней
трижды по 30 минут стерилизуют их текучим паром. По 0,5 мл суспензии каж¬
дого разведения высевают в три пробирки с питательной средой. Инкубация
длится в термостате при 28 °С в течение 12 суток. Наблюдение ведут непрерыв¬
но, для этого пробирки через каждые 24 часа на 1—2 часа помещают в холо¬
дильник, поддерживающий температуру 5 °С. Протеолитическую активность реги¬
стрируют в тех пробирках, где желатин остается жидким и при охлаждении.Для вычисления индекса протеолитической активности количество пробирок,
давших положительную реакцию (с учетом каждого разведения), делят на
показатель наибольшего разведения, давшего положительную реакцию. В табли¬
це 6 приведен пример определения индекса активности.6. Определение протеолитической активностиСтепень разведенияДлительность инкубации,дней5678910Количество пробирок, давших положительную реакцию10-123333310-222233310-»112333ю-4———1235:36:37:310:411:412:4Индекс1,662,002,332,502,753,00110
7. Определение активности аммонификацииСтепень разведенияДлительность инкубации, дней2 j 46 j 81012ю-1 т*А*10-2 тАIO-3 Т
А10-4 Т
А* Т — реакция на ті+ + +
4- 4—ь
4-4-4-
-j г +ірознн; А —- + -
+ - +
+ + +
4-4-4--н + +реакция на+ Н—Ь
+ + -
+ + +
+ + +
- 4- -
4-4-4-аммиак.4-4-4-+ + + ++ + +
+ + +1 + 1 + 1 + 1
+ + + 1 + 1 + 1
+ + + 1 + 1 + 1+ + 4-
+• + 4-
+ 4- +
4-4-4-Определение активности аммонификации. В стерильных условиях в пробир¬
ки разливают по 10 мл тирозинсодержащего субстрата (52). Посев проводят в
трех повторениях, используя по 1 мл суспензии. Затем пробирки инкубируют в
термостате при 28 °С в течение 14 суток. Результаты контролируют каждые два
дня. Для этого стерильной пипеткой из культивируемых пробирок отбирают по1 мл жидкости; одну половину этой пробы используют для определения тиро¬
зина, вторую — для определения аммиака. При определении тирозина в агглю-
тинационные пробирки вносят 0,5 мл субстрата и две капли реактива Миллона
(31); после чего 30 минут выдерживают в водяной бане при 40 °С. В присутст¬
вии тирозина раствор окрашивается в розовый цвет. Аммиак обнаруживают в
белой фарфоровой чашке при помощи реактива Несслера (34); в присутствии
аммиака субстрат окрашивается в коричневый цвет. Результаты можно свести
в таблицу. Так, в таблице 7 приведен пример определения активности аммо¬
нификации.Полученные данные могут быть также изображены графически. График на
рисунке 32 отражает результаты обнаружения NH3+.Положительным считают разведение, дающее соответствующую реакцию
хотя бы в двух пробирках.Определение активности нитрификации.В агглютинационные пробирки вносят по1 мл приготовленного для этой цели суб¬
страта. Пробирки закрывают ватными проб¬
ками и в течение 30 минут стерилизуют при
0,5 атм. При посеве в пробирки вносят по
0,5 мл суспензии, для каждого из разведе¬
ний готовят четыре параллельных образца.Инкубация длится 15 суток в термостате
при 28 °С. По истечении соответствующего
времени при помощи реактива Грисса—Илошваи (14) проводят реакцию на нитрит.Результат оценивают по индексу нит¬
рификации. Если нитрит обнаружен во всех
пробирках данного разведения, индекс ра¬
вен 1; при положительной реакции лишь
в одной из четырех параллельных пробирок
индекс составит 0,25. Все индексы актив¬
ности данной серии суммируют. Получен¬
ную величину называют индексом нитри¬
фикации, который и служит основой дляЮ'1 7 -г.10 ■Ч\\1G" ' 'г и 6 в io 11Длителоность инкубации,
суткиРис. 32. График процесса аммо¬
нификации в исследуемом образ¬
це.
8. Определение активности нитрификацииРазведениеСерииIIIIIIIV10“1ю-210-3ю-*Индекс+ + + +
+ + + +
+ + —
2,50+ + + ++ + 1,50Н—h н—1-
+ + + +
+ + + +
3,25+ + + +
+ + + ++ Ь +2,75сравнения результатов эксперимента. Пример вычисления индекса приведен в
таблице 8.Определение активности денитрификации. В агглютинационные пробирки
вносят по 1 мл питательного бульона. После стерилизации при 0,5 атм в течение
20 минут в них добавляют по 0,5 мл суспензии. Для каждого разведения гото¬
вят восемь параллельных образцов. Длительность инкубации—16 суток. Резуль¬
тат культивирования контролируют через каждые два дня.Для определения результатов опыта содержимое пробирок делят на две
части. Одну половину субстрата используют для выявления нитрита при помо¬
щи реактива Грисса — Илошваи (14), вторую — для проведения реакции на ам¬
миак (34). Данные наблюдений приведены в таблице 9. Результаты определения
NH3 можно изобразить и графически (рис. 33).5.2.3. Определение фекальной загрязненности почвыОтсутствие или неудовлетворительное функционирование очистных
сооружений может привести к временному загрязнению почвы
бактериями кишечной группы, среди которых встречаются и па-9. Определение активности денитрификацииРазведенияСерия А1Серия Бдлительность инкубации24681012141624681012141610-1А*++++————+++Н*++——————++——————ю-2А++++++———++++————Н++++—4-——++——————10-3А+++++———+++++++—Н++++————+++10-“А++++++——++++++——Н .++H“+++++—10-5Н+++++++++++++++А+++++++————•А —присутствиеаммиака,н —присутствиенитрита112
тогенные виды, например Sal¬
monella, Shigella и т. д. По¬
добного рода опасность осо¬
бенно часто связана с поливом
сельскохозяйственных угодий
сточными водами крупных жи¬
вотноводческих ферм. При не¬
правильном использовании та¬
ких вод попадающие на расте¬
ния бактерии могут служить
источником инфекций для жи¬
вотных и человека. Кишечные
бактерии не относятся к есте¬
ственной почвенной микро¬
флоре, поэтому через некото¬
рое время после попадания в
почву они погибают. Их жизнеспособность в почве может коле¬
баться в широких пределах — от одних-двух суток до нескольких
месяцев; это зависит частично от видовых особенностей микроор¬
ганизмов, а частично — от физических, химических и биологиче¬
ских характеристик почвы. В связи с интенсивным развитием
крупных животноводческих комплексов перед почвенными лабо¬
раториями может встать задача по контролю чистоты почвы, во¬
дохранилищ, вод, используемых для орошения, и выявлению фе¬
кальных загрязнений.В практике санитарно-бактериологических лабораторий оценка
фекальной загрязненности основывается на определении коли-ин-
декса и коли-титра.Естественная среда обитания Escherichia coli и других коли-
формных бактерий — это кишечник млекопитающих животных и
человека. При санитарно-гигиенических лабораторных обследова¬
ниях E. coli и прочие колиформные бактерии служат санитарно-
показательными микробами, по присутствию которых можно су¬
дить о загрязненности и другими кишечными бактериями.E. coli относится к семейству Enterobacteriaceae и представля¬
ет собой факультативно анаэробную грамотрицательную палоч¬
ковидную неспорообразующую бактерию. К биохимическим осо¬
бенностям E. coli относятся способность разлагать лактозу с вы¬
делением газа и образовывать индол из триптофана. На тест
Вогес-Проскауэра (стр. 74) дает отрицательную, а на тестирова¬
ние метиловым красным (стр. 74) — положительную реакцию.
Основой для определения E. coli служат перечисленные диагно¬
стические признаки.Колиформные бактерии — это грамотрицательные неспорооб¬
разующие палочковидные формы, разлагающие лактозу с выде¬
лением газа и растущие в аэробных условиях на питательных
средах, содержащих желчь или соли холевой кислоты. Помимо
E. coli, к колиформным бактериям относятся виды, входящие в
роды Enterobacter и Klebsiella.Длительность инкубации, суткиРис. 33. График процесса денитрифика¬
ции в исследуемом образце.И. Сэги ] ] з
Присутствие E. coli во всех случаях свидетельствует о свежем
фекальном загрязнении, прочие колиформные бактерии могут
быть и следами давних загрязнений, а обнаружение одних толь¬
ко представителей Klebsiella не всегда связано с попаданием в
почву фекалий.Коли-индексом называют общее число колиформных бактерий
в 1 г почвы или 1 мл загрязненной воды. Коли-титр — это наи¬
меньшее количество исследуемого материала, в котором могут
быть обнаружены колиформные бактерии. Для обнаружения
E. coli и колиформных бактерий наиболее часто применяют бро¬
дильный метод Эйкмана.5.2.З.1. Метод ЭйкманаДля тестирования на брожение используют избирательные пита¬
тельные среды, содержащие лактозу, вытяжку из желчи или соли
холевой кислоты. К ним относятся желчный бульон с бриллиан¬
товой зеленью (63) и бульон Мак-Конки (111). Вытяжка из жел¬
чи или соли холевой кислоты служит для подавления развития
аэробных спорообразующих бактерий. Некоторые из питательных
сред такого рода производятся крупными химическими фирмами
(«Мерк», «Дифко»).Исследование проводят следующим образом: по 10 мл жидкой
питательной среды, содержащей желчь или соли холевой кисло¬
ты, разливают в пробирки и в каждую из них опускают трубки
Дархэма (стр. 73). После суспендирования образцов в стерильной
воде готовят серию разведений исследуемой почвы или сточной
воды. По 1 мл суспензий разведением от 10-1 до 10~5 вносят в
две серии пробирок по 5 штук в каждой. Первую серию инкуби¬
руют в термостате при 30 °С, вторую — при 44 °С в течение 24 и10. Классификация колиформных бактерий по биохимическим
реакциямТипы бактерийГазообразо¬
вание при
44 °С на сре¬
де с лакто¬
зой и солями
холевой кис¬
лотыИндолМетиловыйкрасныйТест
Вогес—
ПроскауэраРост на
аммонийно-
цитратной
средеE. coli, тип I (фекаль¬
ный)+++E. coli, тип II——+——Промежуточный тип I——+—+Промежуточный тип II—++—+В. aerogenes, тип I—+—+4-В. aerogenes, тип II——++В. cloaca——++Неправильный тип I (фе¬
кальный)++Неправильный тип II++——Неправильный тип IV+—++114
48 часов соответственно. Выделение газа в обеих сериях свиде¬
тельствует о свежем фекальном загрязнении, так как только
E. coli I (фекальный тип) разлагает лактозу при высокой темпе¬
ратуре. Если газообразование идет только при 30 °С и получен¬
ные данные совпадают с показателями таблицы 10, в исследуе¬
мом образце присутствуют колиформные бактерии.Результат бродильного тестирования по пробиркам, давшим
положительную реакцию, оценивают с помощью таблицы числовых
характеристик Мак-Креди (стр. 108).Если тестирование дает положительный результат и при 44 °С,
проводят пересев материала на среду Мак-Конки (112) или мо¬
дифицированную среду Дригальского (73). Выросшие колонии
проверяют на индолообразование (стр. 74) при температурах
37 °С и 44 °С, ставят тест Вогес — Проскауэра (стр. 74), реакцию
с метиловым красным и проверяют способность бактерии утили¬
зировать цитрат на цитратной питательной среде Симмонса (139).E. coli I разлагает лактозу как при 30 °С, так и при 44 °С, на
модифицированной среде Дригальского дает колонии желтого
цвета, образует индол при 30 °С и при 44 °С, дает отрицательную
реакцию на тест Вогес — Проскауэра, положительную реакцию с
метиловым красным и не растет на цитратном агаре Симмонса
(139). Если полученная культура отвечает этим критериям, на¬
лицо свежее фекальное загрязнение исследуемого образца.5.2.4. Применение счетных камерДля определения числа микроорганизмов в жидких культурах
наибольшее распространение получил метод счетных камер, ко¬
торый наряду с быстротой и простотой счета позволяет получать
достоверные данные. Счетная камера представляет собой специ¬
альное предметное стекло с ячейкой (камерой) для жидкости
строго определенного объема на поверхности. К нижней части ка¬
меры приклеена тонкая стеклянная пластинка с начерченной квад¬
ратной сеткой. Камеру заполняют исследуемой суспензией и на¬
крывают покровным стеклом, следя за тем, чтобы в ней не оста¬
вались пузырьки воздуха. При известных площадях отдельных
квадратов и глубине слоя жидкости легко определить число кле¬
ток в камере и пересчитать его на 1 мл суспензии.5.2.4.1. Счетная камера ТомаНа предметном стекле закреплено стеклянное кольцо толщиной0,2 мм, в середину которого вклеен стеклянный диск (0,1 мм).
На его поверхность нанесена сетка с площадью каждого квадра¬
та 0,0025 мм2 (рис. 34). Таким образом, глубина слоя жидкости
над диском составит 0,1 мм. В камере, закрытой покровным стек¬
лом, над квадратами остается место для 0,0025X0,1=0,00025 мм3
жидкости. Удовлетворительным считается такое разбавление пре¬
парата, при котором каждый квадрат содержит в среднем8* ns
2—6 клеток, т. е. в 100 просчи¬
танных квадратах их не более
600. Суспензию большей плотно¬
сти следует разбавить. Среднее
число клеток, приходящееся на
один квадрат, умножают на 4
миллиона и получают содержа¬
ние клеток в 1 мл суспензии (это
число следует еще умножить с
учетом степени разбавления).5.2.Д.2. Счетная камера
БюркераПринцип устройства камеры тот
же, что и камеры Тома, но пред¬
метное стекло имеет две. расчер¬
ченные на квадраты лунки для
жидкости, накрытые одним покровным стеклом. Глубина слоя
жидкости 0,1 мм. В одной из лунок размеры квадратов те же,
что и в камере Тома, во второй они намного больше и соот¬
ветственно объем жидкости над каждым из таких квадратов ра¬
вен 0,004 мм3. Для определения числа клеток в 1 мл жидкости,
помещенной в лунку с крупными квадратами, среднее число кле¬
ток, приходящееся на один квадрат, умножают на 250 000. Для
другой лунки множитель остается тем же, что и для камеры То¬
ма, — 4 000 000.Камеры Тома и Бюркера предназначены прежде всего для
подсчета числа крупных бактерий, дрожжевых клеток и спор гри¬
бов. Довольно широко распространены также счетные камеры
Гельбера — Глинна и Петрова — Хойссера. Толщина слоя жидко¬
сти в этих камерах составляет 0,02 мм при том же размере квад¬
ратов, как в камере Тома, и это позволяет применять их и для
подсчета бактерий небольшого размера.В промышленной микробиологии для определения числа кле¬
ток в жидкости применяют и инструментальные методы, которые
ранее были разработаны для подсчета форменных элементов кро¬
ви. Содержание клеток можно определять также методом нефе¬
лометрии, когда по калибровочной кривой, построенной на осно¬
вании данных светопоглощения, оценивают плотность клеточной
су ent пзии. Для построения калибровочной кривой значения экс-
тинкции (светопоглощения) выражают как функцию от числа
клеток, определенного при помощи микроскопа.Рис. 34. Счетная камера Тома:1 — покровное стекло; 2 — диск с деления¬
ми; 3 — предметное стекло.
6РОЛЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
В БИОЛОГИЧЕСКОМ КРУГОВОРОТЕ
ВЕЩЕСТВМикроорганизмы участвуют в различных сложных почвенных про¬
цессах. Параллельно с минерализацией азотистых и не содержа¬
щих азота органических веществ они из простых соединений син¬
тезируют сложные органические молекулы. Особые группы поч¬
венных микроорганизмов включают молекулярный азот в свои
клетки, окисляют или восстанавливают минеральные компоненты
почвы. Все эти процессы оказывают прямое влияние на почвооб¬
разование и плодородие почв.Основные компоненты попадающих в почву растительных остат¬
ков — это безазотистые органические вещества. При их разложе¬
нии в атмосферу вновь возвращается двуокись углерода, которую
зеленые растения используют в процессе ассимиляции для син¬
теза органических соединений.Подавляющая часть безазотистых органических веществ пред¬
ставлена пектином, целлюлозой, гемицеллюлозой и лигнином, в
разложении которых участвуют различные микроорганизмы.Пектин — это не растворяющееся в воде межклеточное вещество,
служащее для скрепления растительных клеток и тканей. Разло¬
жение пектина имеет большое промышленное значение, поскольку
переработке различных волокнистых растений должно предшест¬
вовать разложение первичных ламелл, и лишь после этого волок¬
на можно отделить одно от другого. При кипячении в воде пектин
гидролизуется с образованием пектиновой кислоты, ее кальциевой
пли магниевой соли и арабана (арабинозного ангидрида). Моле¬
кулы пектина построены весьма сложно, их основным компонен¬
том является тетрагалактуроновая кислота, но, помимо этого, они
содержат арабинозу, галактозу, уксусную кислоту и метиловый
спирт. В природе пектины разлагаются различными анаэробными
и аэробными бактериями, имеющими специфическую пектиназную
ферментную систему.6.1. ПРЕОБРАЗОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ
БЕЗАЗОТИСТЫХ СОЕДИНЕНИЙ6.1.1. Микробиологическое разложение пектина117
6.1.1.1. Анаэробное сбраживание пектинаАнаэробные пектинразлагающие бактерии утилизируют пектины
с выделением обычных продуктов маслянокислого брожения: мас¬
ляной и уксусной кислот, этилового спирта (в отдельных случаях
бутилового), а также двуокиси углерода и водорода. Одна из
таких бактерий — Clostridium felsineum с клетками длиной 3,1—
6,1 мкм и диаметром 0,5—0,9 мкм. Характерная особенность этого
вида — поперечная полосчатость, обусловленная своеобразным
расположением зерен гранулезы. Спороносные клетки имеют фор¬
му барабанной палочки. Оптимальный температурный режим—■
25—37 °С.Известно нескі ъко методов культивирования анаэробных пек-
тинразлагающих бактерий. Наиболее распространен метод Фри-
беса, заключающийся в следующем. Нарезанные кусочки льняной
соломки длиной 40—50 мм связывают в пучки диаметром 10 мм,
помещают в пробирки, заполненные водопроводной водой, и в
течение 7—10 минут выдерживают на кипящей при 100 °С водяной
бане. Кипячение необходимо для удаления различных сопутствую¬
щих веществ, затрудняющих процесс сбраживания пектина. Жел¬
тый отвар, содержащий экстрактивные вещества, выливают, про¬
бирки вновь на 3/4 наполняют водопроводной водой и в течение
четверти часа стерилизуют при 1 атм. Затем в середину пучка
соломки вставляют не подвергавшийся термообработке кусочек
льняного стебля и пробирку помещают в термостат с температу¬
рой 35°С. Спустя 2—3 суток в пробирке наблюдается помутнение
жидкости, интенсивное выделение газа, а пучок льняной соломки
всплывает на поверхность воды.Из перебродившего пучка пинцетом извлекают один стебель
и скальпелем выдавливают из него каплю жидкости на предмет¬
ное стекло. В случае необходимости к препарату добавляют кап¬
лю воды, накрывают его покровным стеклом и микроскопируют.
Раствор йода в йодистом калии окрашивает бактериальные клет¬
ки в синий цвет.В полученной таким образом культуре вместе с бактериями,
сбраживающими пектин, встречаются и другие микроорганизмы.
Для их отделения и получения чистой культуры рекомендуют
применять галактозный агар (79) или агар на морковном отваре
(136). В пробирке с высоким агаром или с пирогаллолом
(стр. 46) обогащенную культуру инкубируют в термостате при
35 °С. Спустя 2—3 суток в питательной среде появляются оран¬
жевые, похожие на вату колонии пектинразлагающих бактерий.6.1.1.2. Аэробное разложение пектинаКроме анаэробных пектинразлагающих бактерий, в природе встре¬
чается большое количество микроорганизмов, разлагающих пек¬
тины в присутствии кислорода. Они неспецифичны, поскольку, по¬
мимо пектина, способны использовать и многие другие источники118
углерода. Из числа бактерий к ним относятся Вас. subtilis, Вас.
mesentericus, Вас. asterosporus, Вас. carotovorus и т. д. Среди
грибов использовать пектин в качестве источника энергии способ¬
ны многие виды родов Aspergillus, Pénicillium, Rhizopus, Mucor,
Cladosporium, Botrytis и др.Для обнаружения аэробных пектинразлагающих микроорга¬
низмов Федоров рекомендует минеральный питательный бульон
(48). Его наливают в конические колбы и на поверхность жидко¬
сти помещают измельченную льняную соломку, пектиновые ком¬
поненты которой служат источником углерода и энергии для
микроорганизмов. Одновременно соломка является посевным ма¬
териалом, поскольку на ее поверхности всегда присутствуют пек-
тинразлагающие микроорганизмы. Колбы помещают в термостат
при 28 °С, и спустя двое суток на поверхности соломки можно
наблюдать колонии пектинразлагающих бактерий и грибов.Для выделения культур аэробных пектинразлагающих микро¬
организмов с успехом можно использовать питательные среды,
рекомендованные для выращивания анаэробных пектинразлагаю¬
щих бактерий.6.1.2. Микробиологическое разложение целлюлозыВажнейший компонент растительных тканей — целлюлоза, огром¬
ные массы которой ежегодно попадают в почву. По химическому
составу она представляет собой полисахарид, состоящий из моле¬
кул глюкозного ангидрида (СбИщОб). Молекулярная масса макро¬
молекулы целлюлозы равна 3000—10 000. Она весьма устойчива
к действию щелочей и кислот. Под воздействием ферментов цел-
люлаз, выделяемых целлюлозоразлагающими бактериями, гидро¬
лизуется, образуя в качестве конечного продукта глюкозу согласна
следующему химическому уравнению:(C„Hio05)„ -f- tû I j С) = лС6Н1206.В разложении целлюлозы участвуют бактерии, актиномицеты
h микроскопические грибы. В зависимости от условий аэрации
почвы разложение бывает аэробным или анаэробным.6.1.2.1. Анаэробное разложение целлюлозыАнаэробные целлюлозоразлагающие бактерии впервые были опи¬
саны Омелянским [115]. Их палочковидные клетки имеют длину
6—12 мкм. В результате спорообразования один из концов клет¬
ки утолщается, и она принимает булавовидную форму (рис. 35,а).
Разлагая целлюлозу, эти бактерии продуцируют масляную и ук¬
сусную кислоты, этиловый спирт и различные газы — водород,
метан, двуокись углерода и т. д.Трудности выделения чистых культур долгое время не позво¬
ляли решить вопрос о систематическом положении целлюлозо¬
разлагающих бактерий. В настоящее время их относят к роду
а5Рис. 35. Целлюлозоразлагающие бактерии:
а — Clostridium thermocellum; б — Cytophaga hutchinsonii.Clostridium, в котором различают мезофильные и термофильные
виды.При выращивании анаэробных целлюлозоразлагающих бакте¬
рий в пробирку помещают 0,2 г измельченной фильтровальной бу¬
маги и на 3U объема заполняют рекомендованной Теппер с сотр.
[152] жидкой питательной средой (54), в которую для стимули¬
рования роста бактерий добавляют пептон. Затем ее засевают
лочвенной суспензией в различных разведениях.Мезофильные целлюлозоразлагающие анаэробы растут при
30—35 °С, термофильные — при 60—65 °С. Активность размноже¬
ния мезофильных микроорганизмов сравнительно невелика. Под
их влиянием фильтровальная бумага постепенно ослизневает и
распадается на волокна. Медленно выделяющиеся пузырьки газа
заметны главным образом при встряхивании пробирок. Термо¬
фильные целлюлозоразлагающие бактерии размножаются намного
быстрее. Брожение начинается уже спустя 2—3 суток после за¬
сева. Вследствие интенсивного размножения сопутствующих бак¬
терий питательная среда мутнеет, на ее поверхности образуется
пена. Бумага желтеет, ослизневает и превращается в рыхлую
аморфную массу. Завершается брожение в течение 1—2 недель.
Отмечено, что анаэробные целлюлозоразлагающие бактерии раз¬
множаются гораздо интенсивнее, если в питательную среду ввести
очень незначительное количество белковых веществ.При культивировании анаэробных целлюлозоразлагающих бак¬
терий одновременно очень интенсивно развиваются и различные
сопутствующие микроорганизмы, освободиться от которых чрез¬
вычайно трудно. Описываемые в литературе соответствующие ме¬
тоды очистки культур весьма далеки от совершенства, попытки
применить микроманипуляторы также оказались безрезультатны¬
ми. Вероятно, это можно объяснить тем обстоятельством, что раз-120
множение сопутствующих бактерий начинается лишь при одно¬
временном внесении в питательную среду множества клеток. Ниже
описана техника очистки культур по методу Имшенецкого [46].
Этот метод очень сложен, но позволяет получить наиболее при¬
емлемые результаты.Имшенецкий рекомендует получать чистые культуры в три
этапа, на каждом из которых культуру очищают от одной из
групп сопутствующих бактерий.1. Пробирки с целлюлозой на '/з заполняют жидкой питатель¬
ной средой, рекомендованной Теппер с сотр. (54). К 75 мл пита¬
тельной среды добавляют 250 мл фекальной вытяжки и засевают
небольшими кусочками разлагающейся фильтровальной бумаги,
взятой из обогащенной культуры.После размножения в среде бактерий, о чем свидетельствует
начало сбраживания фильтровальной бумаги, пробирки на 20 ми¬
нут помещают в кипящую воду. При этом погибают сопутствую¬
щие бактерии, не образующие спор.2. Материал обработанной нагреванием культуры пересевают
на новую питательную среду. Кусочки фильтровальной бумаги
предварительно промывают в стерильной воде и только после это¬
го помещают в питательную среду. Для обеспечения строго ана¬
эробных условий пробирки запаивают в вакууме (стр. 45) и по¬
мещают в термостат. После 3—4 пересевов разлагающиеся ку¬
сочки фильтровальной бумаги с помощью стерильной петли для
посева переносят в чашки Петри на мясной агар. Кусочки бу¬
маги, на которых спустя 48 часов бактерии не развились, пере¬
севают на новую питательную среду. Полученные таким образом
культуры уже не будут содержать аэробных сопутствующих бак¬
терий.3. Из культуры удаляют анаэробные сопутствующие микроорга¬
низмы, помещая ее на 10 минут в кипящую воду; при этом поги¬
бают вегетативные клетки целлюлозоразлагающих и сопутствую¬
щих бактерий. Затем пробирку осторожно встряхивают до полу¬
чения гомогенной массы целлюлозных волокон. С помощью пи¬
петки получают разведения этой массы 1:10, 1 : 100 и 1 : 1000.
Одновременно готовят мясо-пептонный агар (90), который филь¬
труют через хлопковую вату на подогреваемой воронке до полу¬
чения совершенно прозрачного раствора. Питательную среду раз¬
ливают в пробирки, наполняя их на 3Д, и после стерилизации
охлаждают до 40—45°С. Вращая пробирки между ладонями, по¬
севной материал равномерно распределяют в питательной среде,
затем пробирки помещают в термостат. Поскольку целлюлозораз¬
лагающие бактерии на мясо-пептонном агаре без фильтровальной
бумаги не растут, спустя несколько дней можно отобрать пробир¬
ки, в которых бактерии не развились. Из слегка подогретых про¬
бирок питательную среду переносят в стерильные чашки Петри.
Скальпелем, стерилизованным горящим спиртом, вырезают тонкие
кусочки питательной среды, используют их в качестве инокулята
для пересева на жидкую среду Теппер, затем пробирки с посева¬121
ми запаивают и помещают на инкубацию. Если в процессе инку¬
бации наблюдается брожение, следует проверить чистоту куль¬
туры.По Имшенецкому, для оценки чистоты культуры можно использовать сле¬
дующие признаки:— анаэробные целлюлозоразлагающие бактерии не растут на мясном бульо¬
не или мясном агаре, не содержащем целлюлозу. Развитие культуры на этих
питательных средах свидетельствует о ее загрязненности;— на минеральных питательных средах, содержащих только целлюлозу,
■анаэробные целлюлозные бактерии развиваются очень медленно. Следовательно,
наблюдающееся на таких питательных средах интенсивное брожение служит
показателем вероятного присутствия сопутствующих бактерий;— целлюлозоразлагающие бактерии локализуются на волокнах целлюлозы
на дне пробирки, а сопутствующие бактерии встречаются во всем объеме жид¬
кости, поэтому питательная среда чистых культур обычно прозрачна;— при микроскопировании загрязненной культуры наряду с тонкими, про¬
долговатыми грамотрицательными целлюлозоразлагающими бактериями видны и
<5олее толстые, короткие часто грамположительные палочковидные бактерии;— среди сопутствующих бактерий часто встречаются гнилостные микроорга¬
низмы. Следовательно, характерный для гниения запах — это показатель присут¬
ствия сопутствующих бактерий;— анаэробные целлюлозоразлагающие бактерии не восстанавливают суль¬
фаты и не образуют сероводород на белковых питательных средах. Появление в
культуре на фильтровальной бумаге черных пятен сульфида железа говорит о
наличии сульфатредуцирующих бактерий.6.1.2.2. Аэробное разложение целлюлозыВ процессах аэробного разложения целлюлозы участвуют бакте¬
рии, актиномицеты, а также грибы. Наиболее распространенные
целлюлозоразлагающие бактерии — это Cytophaga, представители
порядка Myxobacteriales. Слегка изогнутые остроконечные палоч¬
ковидные клетки длиной 4,5—8 мкм (рис. 35,6) не образуют ни
цист, ни плодового тела, однако в культуре можно наблюдать
образования, напоминающие не вполне сформировавшиеся плодо¬
вые тела. Размножаются продольным делением. В более взрослых
культурах концы клеток постепенно округляются. Бактерии этих
видов образуют на фильтровальной бумаге желтые, оранжевые,
желто-зеленые или розовые пятна.Sporocytophaga в отличие от вышеописанных бактерий образу¬
ют микроцисты. В молодых культурах клетки вытянутые, со слег¬
ка заостренными и изогнутыми концами. Постепенно они округля¬
ются, клетка утолщается, приобретает ромбовидную форму и пре¬
вращается в круглую или овальную микроцисту.Виды Polyangium, относящиеся к порядку Myxobacteriales, об¬
разуют микроцисты, цисты и плодовые тела. Их палочковидные,
несколько утолщенные клетки с округленными концами слегка
изогнуты. В центральной части клеток видны зерна хроматина,
в некоторых случаях формирующие структуру, похожую на ядро.
Бактерии этих видов образуют па фильтровальной бумаге пятна
желтого, оранжевого или темнокоричневого цвета.Виды, способные разлагать целлюлозу, встречаются не только
среди миксобактерий, но и среди представителей порядка Eubac-122
teriales. В последнее время специалисты оспаривают правомер¬
ность выделения родов Cellvibrio и Cellfalcicula, описанных Вино¬
градским (1929). Согласно выводам Берг [10], они, вероятно,
относятся к роду Pseudomonas. Активно разлагают целлюлозу и
виды Cellulotnonas.Наряду с бактериями большую роль в разложении целлюлозы
играют грибы и актиномицеты. Активно разлагают целлюлозу
грибы, относящиеся к родам Trichoderma, Aspergillus, Pénicillium,
Chaetomium, Stachybotrys, Fusarium и др. Способны разлагать
целлюлозу и многие виды актиномицетов, хотя в этом отношении
они гораздо менее активны, нежели грибы.Для выращивания аэробных микроорганизмов, разлагающих
целлюлозу, широко используют метод бумажных дисков, пропи¬
танных минеральной питательной средой. Стерильный диск филь¬
тровальной бумаги помещают на силикагель Виноградского (143)
или водный агар и пропитывают его минеральным питательным
бульоном. Наибольшее распространение получила минеральная
питательная среда Виноградского (158), 2—3 мл которой наносят
на поверхность стерильных дисков фильтровальной бумаги, поме¬
щенных на силикагель или агар.По 25—30 крупиц исследуемой почвы помещают на бумаж¬
ный диск в чашки Петри и устанавливают в термостат при 28 °С.
Спустя несколько дней вокруг крупиц почвы появляются колонии
целлюлозоразлагающих бактерий и грибов различной окраски.Аэробные целлюлозоразлагающие бактерии с успехом можно
культивировать и на агаре с целлюлозой. Для его приготовления
в субстрат с минеральными добавками вносят 5 г целлюлозного
порошка, используя питательную среду Хатчинсона — Клейтона
(92) или любой другой субстрат, в котором единственным источ¬
ником углерода служит целлюлозный порошок. Целлюлозный агар
можно применять для выделения, очистки и определения количе¬
ства целлюлозоразлагающих микроорганизмов. На таком агаре
удовлетворительно растут многие микроорганизмы, и наличие цел-
люлозолитической активности наиболее удобно определять по
размерам прозрачных зон вокруг дисков. Недостаток метода сос¬
тоит в том, что культуры быстрорастущих микроорганизмов могут
вытеснять виды, развивающиеся медленно.Целлюлозоразлагающие микроорганизмы рекомендуется куль¬
тивировать и в пробирках с жидкой питательной средой, в кото¬
рую помещают полоску фильтровальной бумаги. Отдельные про¬
бирки содержат по 5 мл среды, в которую на 2/з длины погруже¬
на бумажная полоска. Такую питательную среду можно исполь¬
зовать как для количественного определения аэробных целлюло¬
зоразлагающих бактерий (см. стр. 110), так и для поддержания
их культур. Разложение целлюлозы некоторыми видами бактерий
сопровождается интенсивным образованием пигментов. В других
случаях пигментации нет, и о размножении целлюлозоразлагаю¬
щих бактерий можно судить по ослизневению или разложению
фильтровальной бумаги.123
Рис. 36. Культивирование аэробных целлюлозоразла¬
гающих бактерий на конусе из фильтровальной бу¬
маги [по 46].Имшенецкий [46] рекомендует выра¬
щивать целлюлозоразлагающие бактерии
на жидкой питательной среде в конических
колбах. Для этого в колбу на 100 мл нали¬
вают 20 мл питательной жидкости и поме¬
щают конус из фильтровальной бумаги
(рис. 36). Бактерии интенсивно развивают¬
ся на поверхности выступающего из жид¬
кости конуса. Недостаток метода заключа¬
ется в том, что спустя несколько суток цел¬
люлозные волокна разрыхляются, конус
опадает и бумага погружается на дно кол¬
бы. Обычно при этом прекращается и про¬
цесс разложения целлюлозы.Для выращивания целлюлозоразлагаю¬
щих бактерий, встречающихся на разла¬
гающихся корнях растений или иных растительных остатках, ис¬
пользуют следующий метод: навеску растительных остатков (5 г),
с которых предварительно пинцетом удалили крупные частицы
почвы, стерильными ножницами и скальпелем разрезают на ку¬
сочки по 2—3 см. Растительный материал 4—5 раз промывают в
водопроводной воде и по мере возможности растирают в стериль¬
ной фарфоровой чашке с кварцевым песком. Затем измельченный
материал переносят в колбу со стерильной водой (на 5 г корней—
45 мл воды), в течение 5 минут взбалтывают и готовят серию раз-
ведений, которые используют для засева питательной среды.В природе аэробные целлюлозоразлагающие бактерии встре¬
чаются вместе с различными сопутствующими видами микроорга¬
низмов, часть которых стимулирует развитие бактерий. Очистка
аэробных целлюлозоразлагающих бактерий от сопутствующих
микроорганизмов — очень сложная задача; особенно это относит¬
ся к видам, способным использовать в качестве источника угле¬
рода только целлюлозу.Многие виды целлюлозоразлагающих бактерий, например не¬
которые миксобактерии (Polyangium) и вибрионы, хорошо разви¬
ваются не только на целлюлозе, но и на крахмале. Разведенные
суспензии таких бактерий высевают в чашки Петри в толщу пи¬
тательной среды. Для этого используют питательную среду Хат¬
чинсона— Клейтона (92), в которую вместо целлюлозы в качестве
источника углерода вводят 2% крахмала. С успехом можно ис¬
пользовать и агар, приготовленный на картофельном отваре (65).Отдельные виды целлюлозоразлагающих бактерий (Sporocyto-
phaga) образуют микроцисты, более устойчивые к действию вы¬
соких температур, чем вегетативные клетки сопутствующих бак-124
терий. Принимая во внимание, что последние обычно не образуют
спор, Имшенецкий [46] предлагает подвергать культуры терми¬
ческой обработке с целью освобождения от сопутствующих бак¬
терий. Для этого старую культуру Sporocytophaga гомогенизиру¬
ют в пробирке, содержащей 10 мл стерильной воды. По 0,5 мл
полученной суспензии вносят в пробирки с 5 мл стерильной воды
и на 10 минут помещают на водяные бани с различными темпе¬
ратурами (40, 50, 60, 70, 80, 90°С). В каждом температурном ре¬
жиме обрабатывают по три пробирки. Затем материал из проби¬
рок пересевают на жидкую питательную среду, в которую погру¬
жена полоска фильтровальной бумаги. После инкубации исследу¬
ют культуры, выдержавшие наиболее высокую температуру. На¬
пример, если после обработки на водяной бане с температурой
70 °С бактерии развивались, а выдержанные при 80 °С погибли,
в дальнейшем изучают только первые культуры.6.1.2.2.1. Изучение целлюлозолитической
активности культурДля определения количества разложенной целлюлозы по окон¬
чании инкубации измеряют ее остаток в питательной среде. При
этом важно, чтобы отдельные культуры содержали одинаковое
исходное количество целлюлозы. Перед постановкой эксперимен¬
та ее высушивают при 105 °С до постоянной массы и на аналити¬
ческих весах делают навески.На точности измерения остаточной целлюлозы может отрица¬
тельно сказаться биомасса микроорганизмов, находящихся меж¬
ду целлюлозными волокнами. Для снижения возможной погреш¬
ности Фэреус (1944) рекомендует проводить многократную про¬
мывку. Остаточную целлюлозу, помещенную в фильтровальную
воронку (стеклянный фильтр G-4, Иена), вначале промывают
горячим 1%-ным содовым раствором, затем многократно — горя¬
чей водой, раствором соляной кислоты (1 : 10) и в заключение —
вновь горячей водой. Метод Фэреуса позволяет удалить из неис¬
пользованной целлюлозы входящие в состав питательной среды
минеральные соли, слизь микроорганизмов, а также часть лизи-
рованных бактериальных клеток.Однако метод многократной промывки дает приемлемый ре¬
зультат только при изучении целлюлозоразлагающих бактерий.
После промывки между целлюлозными волокнами сохраняется
значительная масса мицелия и спор грибов. Поэтому промытую
по Фэреусу остаточную целлюлозу автор в своих исследованиях
[147] подвергал разрушению методом Кьельдаля, а затем по об¬
щему количеству азота и содержанию белков в грибном мицелии
рассчитывал массу последнего. В этом случае следует добивать¬
ся полного вымывания азотистых компонентов почвы, используя
в качестве контроля питательную среду с целлюлозой, не содер¬
жащую бактериальной культуры.125
Мицелий большинства грибов в жидких культурах можно от¬
делить от остаточной целлюлозы более простым способом. Он
основан на том, что грибная культура концентрируется на поверх¬
ности жидкости в виде пленки различной толщины, в то время
как остаточная целлюлоза находится на дне сосуда. Разложение
ее происходит под действием выделяемого грибами экзофермента
целлюлазы в отличие от бактерий, вступающих с целлюлозными
волокнами в прямой контакт. Таким образом, для очистки куль¬
туры от грибов достаточно удалить пленку мицелия с поверхности
жидкости и многократно промыть остаточную целлюлозу горячей
водой.Остающуюся в питательной среде целлюлозу отделяют от кле¬
точного белка и химическим путем. Для этого 1 г целлюлозы
растворяют в 500 мл реактива Швейцера (40), 50 мл раствора
отфильтровывают на стеклянном фильтре G-4 и, добавляя к филь¬
трату 200 мл 30%-ного этилового спирта, осаждают растворенную
целлюлозу. Осадок собирают на другом фильтре и последователь¬
но промывают его 1%-ным раствором соляной кислоты, горячей
водой, 2%-ным раствором гидроокиси калия, вновь — горячей во¬
дой и 96%-ным спиртом и эфиром. После высушивания целлю¬
лозу взвешивают и путем соответствующих расчетов определяют
массу остаточной целлюлозы в культуре.6.1.2.2.2. Изучение целлюлозолитической
активности почвыВ лабораторных условиях целлюлозолитическую активность поч¬
вы можно определить несколькими методами.Одинаковые навески (200—250 г) высушенной и измельченной
почвы смешивают в фарфоровой чаше с водой, доводя влажность
до 60% от полной влагоемкости почвы. Влажную почву помеща¬
ют в чашку Коха или другой аналогичный стеклянный или пласт¬
массовый сосуд. Поверхность почвы разглаживают, помещают на
нее кружок фильтровальной бумаги и осторожно прижимают бу¬
магу к почве. Подготовленные таким образом образцы помещают
на инкубацию при 28 °С. В термостате целесообразно установить
несколько открытых чашек с водой, чтобы в увлажненной атмо¬
сфере почва медленнее высыхала.При длительной инкубации может возникнуть необходимость
восполнения испарившейся воды. Для определения ее количества
почву взвешивают. Инкубация длится до полного разложения
фильтровальной бумаги; активность этого процесса выражают
как функцию от времени.В соответствии с другой модификацией метода высушенный
до постоянной массы и взвешенный на аналитических весах диск
фильтровальной бумаги зашивают в пакетик из неплотной синте¬
тической ткани (тюлевой). Подготовку и увлажнение исследуе¬
мой почвы проводят, как описано выше. Вначале в сосуд помеща¬
ют половину образца почвы, сверху укладывают нейлоновый паке¬126
тик с фильтровальной бумагой, затем накрывают его остальной
частью почвенного образца. Сосуды с почвой инкубируют в тече¬
ние 2—4 недель в термостате с увлажненной атмосферой. После
инкубации пакетик вынимают из почвы, осторожно извлекают
остатки целлюлозы, высушивают ее при 105 °С и взвешивают на
аналитических весах.Чтобы избежать ошибки, связанной с возможным попаданием
в целлюлозу частиц почвы, взвешенную фильтровальную бумагу
сжигают в муфельной печи и массу оставшейся в тигле золы
пычитают из массы остаточной целлюлозы. Разница между ис¬
ходной и остаточной массой равна массе разложившейся целлю¬
лозы, которую выражают в процентах.Биологическую активность почвы можно определить по интен¬
сивности целлюлозолитических процессов как в естественных, так
и в лабораторных условиях. Соответствующие методы и оценка
результатов рассмотрены в специальном разделе книги (см.
стр. 240).6.1.3. Биологическое разложение гемицеллюлозыГемицеллюлоза — это неоднородное вещество, состав которого за¬
висит от вида растения, его возраста и других факторов. В ре¬
зультате кислотного гидролиза гемицеллюлоза распадается на
сахара и уроновые кислоты. Сахара представлены главным обра¬
зом производными пентозанов (арабан, ксилан, арабоксилан),
метилпентозанов (рамнозан, фруктозан) и гексозанов (глюкан,
■фрукан). Гемицеллюлоза менее устойчива к бактериальному раз¬
ложению, чем целлюлоза.Для проведения исследований гемицеллюлозу получают в ла¬
бораторных условиях из различных растительных материалов.
Пошон- [122] рекомендует следующий способ получения гемицел¬
люлозы: 600 г тонкоразмолотого растительного материала четы¬
ре раза промывают в воде при 70 °С; для промывки берут по 4 л
воды.Промывка длится каждый раз по 15 минут, при этом ма¬
териал непрерывно встряхивают. Воду отделяют от промытого
материала фильтрованием. Затем материал высушивают и 48 ча¬
сов выдерживают в 6 л 4%-ного раствора гидроокиси натрия,
многократно при этом встряхивая. После обработки щелочью
растительный материал отделяют от щелочи на стеклянном филь¬
тре большого размера и промывают 1 л дистиллированной воды,
которую сливают в сосуд с щелочыо. Затем этот раствор подкис¬
ляют уксусной кислотой до появления хлопьев гемицеллюлозы,
добавляют 0,5 л 96%-ного спирта и отстаивают до полного осаж¬
дения хлопьев. Жидкость отсасывают с помощью водоструйного
насоса, а осадок центрифугируют в течение 30 минут при
2000 об/мин, суспендируют в спирте и вновь центрифугируют. Эту
процедуру повторяют трижды. Затем осадок промывают смесью
эфира и спирта, взятых в отношении 1:1. Жидкость от твердого127
материала отделяют на большом стеклянном фильтре (G-4, Иена),
используя вакуумный насос. Затем в вытяжном шкафу осадок
дважды промывают чистым эфиром. В связи с огнеопасностью
эфира промывание следует выполнять очень осторожно. Необхо¬
димо следить за тем, чтобы вентиляция вытяжного шкафа была
включена; нельзя зажигать спички, оставлять горящие горелки,
включать и выключать электрические приборы. Запрещается
также оставлять в рабочем положении оборудование, оснащенное
искрящими переключателями или автоматическими контактными
устройствами.После промывания осевшей на фильтре гемицеллюлозы эфи¬
ром ее вначале подсушивают в вытяжном шкафу, а после испа¬
рения эфира досушивают в сушильном шкафу при 60 °С. Получен¬
ный порошок светложелтого цвета используют для постановки экс¬
периментов. Микроорганизмы, разлагающие гемицеллюлозу, мож¬
но культивировать на плотной или жидкой питательной среде
(86). Для выращивания микроорганизмов, утилизирующих геми¬
целлюлозу, пользуются методом посева в толщу питательной сре¬
ды (см. стр. 41,). Появление на поверхности агаровой пластинки
зоны растворения вокруг колонии указывает на использование ге¬
мицеллюлозы.При изучении активности разложения гемицеллюлозы в жид¬
кой культуре целесообразно делать навески для каждой из куль¬
тур. Количество разложенной гемицеллюлозы определяют так же,
как и активность разложения целлюлозы (см. стр. 125).Присутствие в питательной среде неиспользованной гемицел¬
люлозы определяют флороглуциновым тестом. Для этого 1 мл
жидкости переносят в пробирку и прибавляют 10 капель раство¬
ра флороглуцина, затем на 20 минут помещают в кипящую водя¬
ную баню. Если субстрат содержит гемицеллюлозу, на дно про¬
бирки выпадает коричневый осадок.6.1.4. Микробиологическое преобразование лигнинаСодержание лигнина в растениях довольно значительно: в соло¬
ме зерновых — 20—25%, древесных растениях — 25—30%, а в
отдельных растительных волокнах, в частности кокосовой паль¬
мы,— более 40%. Лигнин представляет собой полимер, состоящий
из фенилпропановых звеньев. В состав его молекул входят угле¬
род, кислород и водород.Ароматические компоненты лигнина отдельных групп растений
неодинаковы, об этом свидетельствует анализ продуктов его ще¬
лочного гидролиза. В частности, при гидролизе лигнина хвойных
пород образуется главным образом ванилин и незначительное
количество п-гидроксибензальдегида, лигнин двудольных гидро¬
лизуется на ванилин и сирингальдегид, а однодольных — на п-гид-
роксибензальдегид, ванилин и сирингальдегид.Главную роль в разложении лигнина играют грибы, хотя участ ■
вовать в этих процессах способны также актиномицеты и неко¬128
торые близкие к ним организмы. Среди более высокоорганизован¬
ных грибов интенсивно разлагают лигнин, особенно в условиях
леса, представители Polyporaceae (Polyporus, Pleurotus, Armilla-
ria, Fomes, Porca и т.д.). Микроскопические грибы в этом отно¬
шении гораздо менее активны.Для определения содержания лигнина наиболее часто исполь¬
зуют метод Кёнига или модификацию этого метода, предложен¬
ную Комаровым [61]. Оба метода основаны на обработке мате¬
риала 72%-ным раствором серной кислоты. Предварительно обес-
смоленную древесину или размолотую солому высушивают при
105 °С до постоянного веса и навеску 1 г помещают в колбу Эр-
ленмейера емкостью 100 мл. Добавив 15 мл 72%-ного раствора
серной кислоты, колбу выдерживают 48 часов при 10 °С, периоди¬
чески перемешивая ее содержимое.Комаров модифицировал этот метод, повысив температуру до
25 °С и сократив до 2,5 часа длительность обработки, которую
следует проводить при частом помешивании, чтобы избежать об¬
разования комков. После обработки 72%-ной серной кислотой ма¬
териал переносят в колбу емкостью 500 мл, доводят объем жид¬
кости до 200 мл и полученную смесь в течение часа кипятят в
колбе, оснащенной обратным холодильником. После этого из
остывшего сернокислого раствора лигнин выделяют на фильтре
G-4, промывают его большим количеством дистиллированной во¬
ды, затем высушивают в тигле при 105 °С, охлаждают в эксика¬
торе и взвешивают.Описанный метод позволяет проводить количественное опре¬
деление лигнина. Для лабораторных исследований наиболее при¬
годны первичный лигнин, выделяемый спиртовой экстракцией, и
лигнин, получаемый по методу Фройденберга с использованием
реактива Швейцера (40).6.1.4.1. Получение первичного лигнина экстракцией
спиртомЛигнинсодержащий материал вываривают в автоклаве при дав¬
лении 1,5 атм и многократно промывают на фильтре горячей во¬
дой. Затем материал высушивают и 48 часов экстрагируют смесью
спирта и бензола, взятых в отношении 1:1. Высохший экстраги¬
рованный материал 24 часа обрабатывают 5%-ным раствором
NaOH, часто встряхивая смесь. По завершении обработки щелочь
удаляют, многократно промывая лигнинсодержащий материал
дистиллированной водой, а остаток высушивают. Затем его двое
суток выдерживают в 17%-ном растворе соляной кислоты, после
чего вновь промывают до полного удаления ионов С1~ и высуши¬
вают. Сухой лигнинсодержащий материал 8 часов кипятят в 96%-
ном спирте, содержащем 2% безводной соляной кислоты. Кипя¬
чение проводят в колбе, оснащенной обратным холодильником.
Из упаренного до '/з спиртового фильтрата лигнин осаждают
добавлением воды.9 и. сэги 129
6.1.4.2. Получение лигнина методом Фройденберга
с использованием раствора ШвейцераФройденберг впервые применил лигнин, полученный при помощи
раствора Швейцера (40), для культивирования лигнинразлагаю-
щих микроорганизмов. Метод основан на растворении медноокис-
ным аммиачным реактивом целлюлозы, присутствующей в лиг¬
нинсодержащем материале; при этом лигнин выделяется в виде
коричневого осадка.Материал, предварительно многократно вываренный в авто¬
клаве при 1 атм, промытый горячей водой и 1%-ным раствором
H2S04, а затем высушенный, помещают в раствор Швейцера из
расчета 20—25 г на 1 л.Раствор вместе с древесиной или размолотой соломой 6 часов
взбалтывают на установке для встряхивания. Затем под вытяж¬
ным шкафом раствор отделяют от нерастворившегося осадка.
По опыту автора, для этого наиболее удобна сложенная в не¬
сколько слоев и помещенная в стеклянную воронку плотная стек¬
лоткань, заменяющая фильтровальную бумагу. Объясняется это
тем, что поры заводских стеклянных фильтров быстро забиваются
и фильтрование становится невозможным. Выделенный на филь¬
тре осадок многократно промывают, а обработку реактивом Швей¬
цера повторяют 2—3 раза, в зависимости от того, как скоро будет
получен совершенно гомогенный темнокоричневый порошок, не
содержащий кусочков древесины или соломы.Для культивирования микроорганизмов, разлагающих лигнин,
некоторые специалисты используют производные лигнина извест¬
ной химической структуры. К таким веществам относятся вани¬
лин, сирингальдегид, п-гидроксибензальдегид, образующиеся при
щелочном окислении лигнина. Кроме того, в микробиологических
исследованиях применяют такие производные лигнина, как аро¬
матические карбоновые кислоты, п-гидроксибензойную, ванилино¬
вую и сиреневую кислоты, производные фенилпропана, а также
конифериловый спирт и конидендрин.6.1.4.3. Культивирование грибов,
разлагающих лигнинРазлагающие лигнин микроскопические грибы культивируют на
пропитанных 2 мл минерального питательного бульона (109) си-
ликагелевых пластинках, на поверхность которых наносят 0,25 г
порошкообразного лигнина. Автор в своих исследованиях добил¬
ся наилучших результатов при работе с лигнином, полученным
по методу Фройденберга.На пластинку геля с питательным бульоном и порошком лиг¬
нина наносят 1 мл почвенной суспензии и препарат инкубируют
в термостате с увлажненной атмосферой при 28 °С. Через 3—4 не¬
дели на поверхности лигнина появляются окрашенные в различ¬
ные цвета колонии микроорганизмов, разлагающих его. Петлей130
для посева колонии пересевают на питательную среду Чапека —
Докса (70) и в грибной мальтозный бульон (113).Гендерсон и Фармер [41], а также другие авторы для выделе¬
ния разлагающих лигнин микроорганизмов использовали в каче¬
стве источника энергии различные производные лигнина (вани¬
лин, сирингальдегид, п-гидроксибензальдегид). При этом какой-
либо из перечисленных производных в концентрации 0,01% вво¬
дят в среду Чапека — Докса, которую готовят в 10-кратном раз¬
бавлении (вместо 100 мл воды добавляют 1000 мл). Повышать
концентрацию производных лигнина в питательной среде не ре¬
комендуется, поскольку они, как и все фенолы, токсичны для мик¬
роорганизмов. Для застывания питательной среды в нее вводят
2% промытого агара. Необходимо обращать особое внимание на
чистоту агара, поскольку в противном случае сопутствующие мик¬
роорганизмы будут использовать загрязнения в качестве источ¬
ника энергии и это затруднит выделение организмов, разлагаю¬
щих лигнин. Затем в чашки Петри вносят по 1 мл почвенной сус¬
пензии и заливают приготовленную питательную среду. После
застывания агара чашки помещают в термостат, поддерживающий
температуру 28 °С. В течение 24—30 суток на поверхности ага¬
ровой пластинки появляются колонии разлагающих лигнин мик¬
роорганизмов.Способность микроорганизмов использовать лигнин определя¬
ют методом, аналогичным методу выявления целлюлозолитической
способности. Соответствующие организмы инкубируют на описан¬
ной выше жидкой питательной среде. На аналитических весах де¬
лают навеску лигнина, содержание которого в питательной среде
должно составлять 0,5%. Для ускорения роста культуры через
жидкую питательную среду небольшими порциями продувают
воздух. После инкубации, длящейся 6—12 месяцев, неиспользо¬
ванный лигнин отделяют на предварительно взвешенном фильтре
G-4 от питательной среды и промывают горячей водой до тех пор,
пока стекающая вода содержит нитратные и аммиачные ионы.
После этого оставшуюся на фильтре смесь лигнина и мицелия
высушивают и взвешивают. Из полученной величины вычитают
массу мицелия, который рассчитывают, исходя из содержания азо¬
та по Кьельдалю.6.1.5. Микробиологическое окисление жировМикроорганизмы гидролизуют жиры, попадающие в почву из
погибших растительных и животных клеток, при помощи фермен¬
та липазы с образованием глицерина и жирных кислот. Эти соеди¬
нения далее разлагаются почвенными микроорганизмами вплоть
до С02 и Н20. Микробиологическая утилизация жирных кислот
протекает гораздо медленнее, чем утилизация глицерина, поэтому
они обычно накапливаются в искусственной питательной среде.
Жирные кислоты подвержены и анаэробному разложению, в ре¬
зультате которого образуются углеводороды, содержащие 10—9* 131
25 атомов углерода. С этим процессом связывают возможность
микробиологического происхождения нефти.Среди аэробных почвенных микроорганизмов способностью
окислять жирные кислоты обладают бактерии (Pseudomonas, Ach-
romobacter и Flavobacterium), а также многие грибы (Aspergillus,
Pénicillium, Oidium lactis и т. д.) и актиномицеты, в том числе
представители Nocardia.Для культивирования микроорганизмов, гидролизующих жи¬
ры, рекомендуют использовать питательную среду Рана (133).
В конические колбы разливают питательный бульон, так чтобы
глубина его слоя составила 10—15 см, добавляют 3% касторо¬
вого масла, стерилизуют и засевают почвенной суспензией (1 мл).Размножающиеся микроорганизмы разлагают жиры, которые
Омыляются, и в питательной среде накапливаются свободные жир¬
ные кислоты. Присутствие жирных кислот приводит к помутнению
ранее прозрачного касторового масла. О содержании свободных
жирных кислот можно судить по кислотному числу. Для его
определения присутствующие в питательной среде жиры вначале
растворяют смесью этилового спирта и эфира, взятых в отноше¬
нии 1 : 1, а затем титруют 0,1%-ным раствором КОН.6.1.6 Культивирование микроорганизмов,
разлагающих парафинДля культивирования микроорганизмов, способных использовать
парафин, и определения активности различных организмов при¬
меняют питательную среду Макклана (110).Расплавленную питательную среду наливают в чашки Петри,
до ее застывания добавляют 3—4 капли расплавленного парафи¬
на и перемешивают. На поверхность застывшей агаровой пластин¬
ки, где образуются островки парафина в виде тонкой пленки,
наносят 1 мл почвенной суспензии и инкубируют в термостате при
28 °С в увлажненной атмосфере. Затем проводят пересев колоний,
выросших на парафиновой пленке.Подобным же образом изучают и способность культур микро¬
организмов разлагать парафин, нанося на агаровую пластинку
суспензию исследуемой культуры.Особенно активно утилизируют парафин представители рода
Nocardia и отдельные виды семейства Actinomycetaceae.6,2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ
АЗОТИСТЫХ СОЕДИНЕНИЙ6.2.1. АммонификацияВ почве обитает множество различных микроорганизмов (бак¬
терий, актиномицетов, микроскопических грибов), разлагающих
органические азотсодержащие соединения с образованием аммиа¬132
ка как конечного продукта. Отсюда этот процесс получил назва¬
ние аммонификации.При разложении образуются различные промежуточные про¬
дукты, количество и качественный состав которых зависят от ус¬
ловий культивирования, характера субстрата, а также от видовой
принадлежности микроорганизмов, участвующих в этих процессах.Накопление свободного аммиака в питательной среде можно
выявить, если отношение С : N в разлагаемом субстрате не выхо¬
дит за пределы 20 : 1.Из различных азотистых органических соединений почвы в
наибольшем количестве встречаются белки, затем (в порядке
уменьшения) —карбамид и хитин.6.2.1.1. Аммонификация белковБольшинство белков содержат около 16% азота. Начальные про¬
цессы микробиологического разложения белков протекают вне
клеток микроорганизмов. Выделяемые ими в субстрат протеоли-
тические ферменты расщепляют определенные связи пептидных
цепей, образовавшиеся при этом продукты проникают сквозь кле¬
точную стенку микроорганизмов и в протоплазме под воздействи¬
ем ферментов пептидаз расщепляются на аминокислоты. Часть
аминокислот непосредственно утилизируется микроорганизмами,
остальные вначале подвергаются дезаминированию.Первичные продукты разложения белков ранее называли пеп¬
тонами. В настоящее время этим термином обозначают белковые
продукты, идущие на приготовление питательных сред. Пептон
получают при обработке белка трипсином. Поступающий в про¬
дажу пептон на 30% состоит из свободных аминокислот, осталь¬
ная его часть представлена ди- и трипептидами, а также водорас¬
творимыми кислыми полипептидами.В аммонификации белков принимают участие различные груп¬
пы микроорганизмов. Характерные их представители—это аэроб¬
ные виды родов Pseudomonas и Bacillus, факультативные анаэро¬
бы Proteus, а также большинство облигатных анаэробов рода
Clostridium. Процесс анаэробного разложения белков называют
гниением.В разложении белков наряду с бактериями важную роль иг¬
рают актиномицеты и почвенные грибы. К наиболее известным
представителям последних относятся различные виды Trichoderma,
Aspergillus, Pénicillium, Mucor, Botrytis.Для выделения и культивирования микроорганизмов, разла¬
гающих белки, применяют различные питательные среды. В мик¬
робиологической практике наибольшее распространение получили
мясной бульон, содержащий 2—3% пептона, и эта же среда с до¬
бавлением агара (89, 90).Выявление продуктов распада белков. Наиболее простой путь
выявления процесса разложения белков — контроль динамики из¬133
менения pH среды, вызванного
накоплением в ней аммиака.
С этой целью увлажненную крас¬
ную лакмусовую бумажку с по¬
мощью пробки укрепляют в про¬
бирке над культуральной жид¬
костью. Для количественного оп¬
ределения аммиака можно ис¬
пользовать и реактив Несслера
(34), хотя мясной бульон, осо¬
бенно содержащий сахар, не да¬
ет характерной оранжевой ок¬
раски.Для определения аммиака,
высвобождающегося из культур
аммонифицирующих микроорганизмов, широко используют мик-
родиффузионный метод Конвея [20]. Исследование проводят в
так называемых чашках Конвея, представляющих собой стеклян¬
ные сосуды диаметром 60—70 мм и высотой 30—35 мм. В цент¬
ральную часть дна чашки впаян другой стеклянный сосуд диамет¬
ром 25—30 мм, который примерно на 5 мм ниже наружного со¬
суда (рис. 37).Сверху чашка Конвея герметически закрывается притертой
стеклянной пластинкой. В больший сосуд вносят суспензию иссле¬
дуемого микроорганизма с белковой жидкой питательной средой,
в меньший помещают 5 мл 0,1 н. серной кислоты и затем чашку
герметически закрывают. После инкубации в течение 2—3 суток
высвободившийся и связанный серной кислотой аммиак опреде¬
ляют титрованием.При разложении белков в питательной среде, помимо аммиа¬
ка, накапливаются также сероводород, меркаптаны, индол и ска¬
тол, придающие культуре неприятный зловонный запах.Присутствие сероводорода, как и аммиака, выявляют с по¬
мощью лакмусовой бумаги. Для этого полоску фильтровальной
бумаги пропитывают раствором уксуснокислого свинца, высуши¬
вают и помещают в пробирку, укрепив ее ватной пробкой. В при¬
сутствии сероводорода полоска бумаги через несколько дней чер¬
неет.Образование на поверхности почерневшей бумаги серебри¬
стого налета свидетельствует о выделении и других соединений
серы (меркаптанов). При введении в состав питательной среды
лимоннокислого или виннокислого железа выделение сероводорода
ведет к почернению всей среды.Присутствие индола в питательной среде определяют при по¬
мощи индолового реактива (15). К культуре, выросшей в 30—
50 мл питательной среды, добавляют 5 мл индолового реактива и
5 мл насыщенного раствора сернокислого калия. В присутствии
индола питательная среда окрашивается в красный цвет.Рис. 37. Чашка Конвея для изуче¬
ния аммонификации.134
6.2.1.2. Определение аммонифицирующей
активности почвыАммонифицирующая активность почвы зависит от м.ногих слож¬
ных факторов, в том числе от ее физических характеристик (тем¬
пература, влажность, механический состав, структура и т. д.),
а также особенностей белкового субстрата. Известно несколько
методов определения аммонифицирующей активности.Согласно наиболее простому из них, образец почвы просеивают
через сито с ячеями размером 2 мм, навеску в 100 г почвы по¬
мещают в фарфоровую чашку и тщательно перемешивают с 1%
кровяной муки или пептона (вместо них можно взять 2% горохо¬
вой муки). Затем почву переносят в коническую колбу емкостью
250 мл и в течение 7 суток инкубируют в термостате при 30 °С.
По завершении инкубации 5 г почвы переносят в другую колбу
емкостью 250 мл, добавляют 100 мл 1 н. раствора КС1 и в течение
часа взбалтывают. Содержание в фильтрате аммиака определяют
дистилляцией по Парнассу — Вагнеру (стр. 148).Для определения активности процесса аммонификации в поч¬
ве можно применять и описанный выше метод Конвея. В большую
чашку Конвея помещают 25 г почвы, содержащей 1 г белкового
субстрата, а в меньшую чашку — 5 мл 0,1 н. серной кислоты. Ди¬
намику образования аммиака можно регистрировать периодиче¬
ским титрованием кислоты.6.2.1.3. Микробиологическое разложение гумусаКоличество гумуса, содержащегося в верхнем слое почвы и воде,
оценивается в 1400 млрд. тонн. Его химическое строение полно¬
стью не изучено. Гуминовые кислоты представляют собой арома¬
тические полимерные комплексы, скелет которых образован на¬
поминающей антрахинон полициклической структурой. С этим
скелетом связаны ароматические карбоновые кислоты и фенил-
пропаны. Около 48% углеродных атомов гуминовых кислот вхо¬
дит в состав ароматических структур, 22% расположены в карбо¬
ксильных группах и 30%—в алифатических или алициклических
структурах. В числе последних встречаются и азотистые соедине¬
ния, в частности аминокислоты и полипептиды. Кислотным гид¬
ролизом из препаратов гумуса можно удалить около 50% азота в
форме аминокислот. Это свидетельствует о том, что оставшаяся
часть азота входит в состав гуминовых молекул.В гумусе встречаются все вещества, необходимые для питания
высших растений. Содержание азота в нем составляет около 5%,
соотношение углерода и азота—10:1 —11:1. Гумус чрезвычайно
устойчив к декомпозиционным воздействиям. В естественных ус¬
ловиях его разлагают микроорганизмы.Вопрос о видовой принадлежности этих микроорганизмов окон¬
чательно не решен. Виноградский [166] предполагал наличие в
почве особой микрофлоры (автохтонной), осуществляющей разло¬135
жение гумуса. Эта теория получила дальнейшее развитие в ис¬
следованиях Теппер [153], выделившей много бактериальных
культур (Bactoderma, Nocardia, Mycobacterium). Как оказалось,
единственным источником углерода и азота для этих микроорга¬
низмов служат гуминовые производные. Другие исследователи
считают, что использовать питательные вещества (в особенности
азот), встроенные в гуминовые молекулы, способны очень многие
микроорганизмы и круг их гораздо шире.Кислотным или щелочным гидролизом из почвы извлекают раз¬
личные фракции гумуса и после соответствующей очистки исполь¬
зуют в микробиологических исследованиях. Отсюда следует, что
развитие микроорганизмов, культивируемых на содержащей гумус
питательной среде, в значительной степени зависит от способа его
извлечения из почвы. При проведении исследований предваритель¬
но очищенный препарат гумуса смешивают с минеральным пита¬
тельным бульоном; гумус служит источником углерода и азота.
Препараты гумуса вносят в небольшой концентрации, поскольку
большие его дозы для микроорганизмов токсичны.Извлечение гумуса из почвы. Для получения гумуса чаще всего применяют
метод Тюрина [161]. 1 кг воздушно-сухой почвы размалывают, удаляют из нее
растительные остатки и переносят в стеклянный цилиндр емкостью 6 л. Преж¬
де всего из почвы выводят кальций. Если она содержит карбонаты, добавляют
5 л 1 п. соляной кислоты, следя за тем, чтобы пенящаяся суспензия не выплес¬
нулась из сосуда. После отстаивания в течение 24 часов соляную кислоту слива¬
ют, а почву многократно промывают 0,05 н. раствором соляной кислоты. Про¬
мывание продолжают до полного удаления ионов Са++, затем дистиллированной
водой из почвы вымывают и ионы С1_.Если почва не содержит карбонатов, ее промывают таким же объемом
0,05 н. серной кислоты до удаления ионов Са++. Ионы S04— также вымывают
дистиллированной водой.К декальцинированной и промытой почве добавляют 5 л 0,1 н. раствора
гидроокиси натрия, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и оставляют
на 24 часа. Отстоявшуюся темнокоричневую жидкость осторожно сливают и
фильтруют на бумажном фильтре.К отфильтрованному раствору добавляют серную кислоту до достижения
pH в пределах 2—3. Подкисленную жидкость подогревают до 80 °С и отстаи¬
вают 24 часа. В результате подкисления и нагревания гуминовые соединения
коагулируют и оседают на дно сосуда, в растворе остаются только фульвокис-
лоты, окрашивающие его в желтый цвет. Раствор, содержащий фульвокислоты,
сливают. Высаженные гуматы натрия промывают дистиллированной водой до
полного удаления ионов SO*—. Наиболее удобный способ отделения воды от
гуминовых веществ — центрифугирование, так как коллоиды засоряют поры
стеклянных фильтров.6.2.1.З.1. Методы культивирования микроорганизмов
на гумусовых питательных средахОчищенный гуминовый коллоид растворяют в 0,02 н. гидроокиси
натрия и на холоде стерилизуют при помощи фильтра Зейтца ЕК-
По наблюдениям автора, для исследования процесса разложения
гумуса можно с успехом использовать минеральный компонент
питательной среды (86), описанный при рассмотрении методов136
изучения распада гемицеллюлозы. К этому компоненту добавля¬
ют гумат натрия в таком количестве, чтобы его конечная концент¬
рация составила 0,01%. Опыт автора свидетельствует о том, что
фосфорсодержащий компонент питательной среды (К2НРО4) це¬
лесообразно заменить фосфатным буфером Сёренсена (34) при
pH 7. Буферный раствор в концентрации 15М смешивают с пита¬
тельным бульоном в отношении 1:1. Содержание минеральных
компонентов питательного бульона увеличивают вдвое. Необхо¬
димость применения буферной системы связана с возможным из¬
менением pH в процессе инкубации, которое влияет не только на
условия культивирования, но и на окраску гуминового компонен¬
та, а это в свою очередь затрудняет оценку результата. Питатель¬
ный бульон, гуминовый и буферный растворы следует стерилизо¬
вать раздельно и затем в стерильных условиях готовить необхо¬
димые композиции.Питательный бульон темного цвета засевают исследуемой куль¬
турой и инкубируют 3—6 месяцев при 28 °С. Время от времени в
культуры необходимо добавлять в стерильных условиях воду вза¬
мен испарившейся.По окончании инкубации с помощью фильтра биомассу отде¬
ляют от культуральной жидкости, высушивают при 105 °С и взве¬
шивают. Объем фильтрата культуральной жидкости в мерной
колбе доводят до исходного и с помощью фотометра определяют
степень обесцвечивания раствора относительно к контролю. Ми-
шустин и Никитин осаждали гуматы из культуральной жидкости
при помощи кислоты и по их массе определяли количество неис¬
пользованных гуминовых веществ.Для изучения разложения фульвокислот жидкость, слитую
после высаживания гуминовых кислот, не выливают, а фильтруют
через фильтр G-4 и упаривают при 80—90 °С. Выпаривание про¬
должают до выделения из раствора кристаллов Na2S04. Затем
содержащий фульвокислоты раствор сливают с кристаллического
Na2S04 и определяют содержание в нем углерода*.Раствор фульвокислот разбавляют дистиллированной водой в
зависимости от содержания в нем углерода, затем стерилизуют
на бактериальном фильтре и вводят в состав питательной среды.О способности микроорганизмов использовать фульвокислоты су¬
дят по увеличению их биомассы.Для культивирования микроорганизмов, разрушающих гуми-
новые вещества, с успехом можно применять силикагелевые плас¬
тинки, пропитанные гуматом натрия (143) и минеральным пита¬
тельным бульоном Виноградского (156). Отдельные пластинки
геля содержат 2—3 мл питательного раствора и 8—10 мг гумата
натрия. Последний наносят на поверхность пластинок в виде
1—2 мл раствора в гидроокиси натрия невысокой (0,02 н.) кон¬
центрации. После впитывания растворов в гель и испарения из¬* Метод определения углерода описан в книге Балленэггера и Ди Глериа
«Методы изучения почвы и навоза». — Будапешт, 1962.137
лишка воды пластинки засевают различными разведениями иссле¬
дуемой почвенной суспензии. На поверхность каждой пластинки
наносят 1 мл суспензии, затем чашки Петри помещают во влаж¬
ную камеру, которую устанавливают в термостат при 28 °С. Спус¬
тя 40—50 суток на поверхности пластинок появляются радужные
колонии микроорганизмов, разлагающих гумус. Представители ро¬
дов Nocardia, Mycobacterium, Micromonospora образуют мелкие
окрашенные в коричневый цвет колонии, проникающие в сили¬
кагель, бактерии рода Bactoderma — мелкие бархатистые колонии
белого и розового цвета. Вокруг отдельных колоний видны зоны
растворения. По числу колоний, выросших из материала отдель¬
ных разведений, можно судить о содержании в почве микроорга¬
низмов, минерализующих гумус.6.2.1.4. Аммонификация карбамидаОсновная масса карбамида попадает в почву с мочой животных,
хотя в последнее время все большее количество этого вещества
вносят на поля в виде удобрения. Высшие растения не способны
усваивать карбамид, и прежде чем стать доступным, он должен
быть аммонифицирован особой группой почвенных микроорганиз¬
мов, так называемыми уробактериями. Это гетерогенная группа
бактерий, представленных кокками и палочковидными формами.
Культуры этих бактерий очень сильно подщелачивают питатель¬
ную среду, поэтому они весьма устойчивы к действию щелочных
сред. Низший уровень pH, при котором эти бактерии начинают
размножаться, — около 7, а оптимальная для них кислотность
среды характеризуется значением выше 8. Уробактерии не спо¬
собны использовать в качестве источника энергии углерод карба¬
мида. Источником углерода для них служат соли различных орга¬
нических кислот (уксусной, лимонной, яблочной и янтарной), а
также моносахариды, декстрин и крахмал.К наиболее известным уробактериям
относятся следующие виды: 1. Bacillus
pasteurii (Bacillus probatus) — крупные
палочковидные перитрихии, образующие
эндоспору (рис. 38). По данным Федоро¬
ва, эти бактерии способны разложить
140 г карбамида в 1 л раствора. 2. Spo-
rosarcina ureae (Sarcina ureae) — несу¬
щая жгутики сарцина, образует колонии
желтого цвета и в 1 л раствора может
гидролизовать не более 30 г карбамида.Для культивирования уробактерий
Федоров рекомендовал питательную сре¬
ду с виннокислым натрием или калием
(76), которую наливают в колбы, стери¬
лизуют и затем засевают кусочком поч¬Рис. 38. Разлагающая кар¬
бамид бактерия Bacillus
pasteurii.138
вы или навозом. Образование аммиака при инкубации регистри¬
руют по посинению лакмусовой бумажки, закрепленной в горло¬
вине колбы ватной пробкой.Для получения чистых культур уробактерий или определения
их числа готовят серию разведений исследуемого субстрата, по
1 мл разведений вносят в чашки Петри и заливают описанной
выше питательной средой, содержащей агар. Кроме перечислен¬
ных микроорганизмов, использовать карбамид в качестве источ¬
ника азота способны и многие другие бактерии, грибы и актино-
мицеты.6.2.1.5 Аммонификация хитинаХитин содержится в клеточных стенках грибов и покровных тка¬
нях различных насекомых. По химическому составу—это азот¬
содержащий полисахарид, разлагающийся под действием фермен¬
та хитиназы на аммиак и растворимые сахара. В микробиологи¬
ческом разложении хитина принимают участие различные орга¬
низмы. Ранее был известен лишь один вид бактерий, способных
использовать хитин в качестве источника углерода и азота, — не¬
спорообразующие перитрихи Bacterium chitinovorum. Однако в
ходе дальнейших исследований был описан целый ряд бактерий,
разлагающих хитин и относящихся к различным таксономическим
группам (Achromobacter, Pseudomonas, Flavobacterium и т. д.).
Очень активно разлагают хитин актиномицеты и грибы, в част¬
ности многие виды родов Aspergillus, Mucor, Pénicillium, Tricho-
derma, Fusarium.Для культивирования разлагающих хитин микроорганизмов ис¬
пользуют питательные среды, в которых это соединение служит
единственным источником углерода и азота. Исследователи обыч¬
но сами извлекают необходимый хитин из крыльев насекомых,
панцирей некоторых пресноводных и морских ракообразных или
из скелета каракатицы.Цехмайстер и Пинцеши [177] рекомендуют следующий метод извлечения
хитина из крыльев майских хрущей: 1000 шт. крыльев (приблизительно 13 г)
промывают холодной водой, затем многократно кипятят в дистиллированной
воде и обрабатывают 3%-ным раствором NaOH до тех пор, пока биуретовая
реакция (4) не даст отрицательный результат. После этого промыванием холод¬
ной, а затем теплой водой из материала удаляют щелочь (до нейтральной ре¬
акции), в течение нескольких часов вываривают в 1%-ном растворе соляной
кислоты и вновь промывают. Затем материал на 8—10 часов погружают в
2%-ный раствор КМп04. Выпадающие в осадок окислы марганца растворяют
многократно сменяемой 1%-ной щавелевой кислотой. Остающееся после про¬
мывания белое вещество несколько часов выдерживают в 96%-ном спирте, за¬
тем спирт удаляют, а материал в течение нескольких минут кипятят в эфире на
водяной бане при 50 °С и высушивают. Перед использованием полученный гру¬
бый порошок белого цвета при 0—10 °С растворяют в насыщенной соляной кис¬
лоте, переосаждают в ледяной дистиллированной воде и солянокислый раствор
сливают.Сырой хитин, содержащий по Кечкешу [55] 5,86% азота, вно¬
сят в питательную среду с таким расчетом, чтобы его конечная139
концентрация составила 2%, и на 1 л раствора добавляют 0,3 г
MgS04, столько же К2НРО4 и 2% агара.На пластинках, приготовленных из этой питательной среды,
можно определять содержание в почве микроорганизмов, разла¬
гающих хитин. Их легко распознать по образованию вокруг ко¬
лоний так называемых зон растворения, диаметр которых позво¬
ляет судить и об активности использования хитина.Бактерии, разлагающие хитин, можно культивировать и на
жидких питательных средах. При этом деятельность микроорга¬
низмов сопровождается просветлением раствора питательной сре¬
ды, мутной от присутствия хитина.6.2.2. НитрификацияИоны аммония, образующиеся в результате минерализации, могут
быть утилизованы во многих биологических процессах. Нитрифи¬
цирующие бактерии превращают «избыточный» (с точки зрения
обеспечения растений питательными веществами) аммоний в нит¬
рит, а затем в нитрат. Хотя нитрифицирующие виды описаны и
среди гетеротрофов, характерными участниками этих процессов
являются микроорганизмы, энергетические потребности которых
покрываются при окислении аммония и нитрита, а источником
углерода служит СО2. Нитрифицирующие бактерии встречаются
как в почве, так и в воде, их экологическим потребностям соот¬
ветствуют аэрируемая и бедная растворимыми органическими ве¬
ществами среда с pH от 7 до 8,5. При pH около 6 процессы жиз¬
недеятельности нитрифицирующих микроорганизмов замедляются,
а при pH 5 нитрификация прекращается.Относительно процессов нитрификации в почве следует сказать,
что специалисты не всегда считают их желательными. Вопрос о
возможностях подавления этих процессов представляет интерес
не только для ученых. В некоторых странах искусственное сни¬
жение интенсивности процесса нитрификации находит применение
в сельском хозяйстве. Необходимость этого диктуется следующими
обстоятельствами. Нитраты вымываются почвенными водами лег¬
че, чем аммоний, и это приводит к потере доступного для расте¬
ний источника азота. Попадая в значительном количестве в водое¬
мы, нитраты вызывают существенные и неблагоприятные для че¬
ловека изменения биологического равновесия в водной среде. Нит¬
риты, образующиеся в результате этих процессов, токсичны для
живых организмов. Для блокирования процесса нитрификации
наиболее пригодным оказался 2-хлор-6- (трихлорметил) -пиридин,,
действующий в относительно небольших концентрациях и не ока¬
зывающий существенного влияния на гетеротрофные организмы
и растения. Применение этого ингибитора действительно позволяет
уменьшить вымывание азота, однако эффективность препарата за¬
висит от типа почвы и прочих условий.Рассматривая роль нитрифицирующих организмов в почвенных
процессах, следует отметить, что азотная кислота, образующаяся140
в результате окисления аммония, может способствовать растворе¬
нию соединений калия, фосфора, магния, железа и кальция и тем
самым улучшать условия питания растений.Содержание нитрифицирующих бактерий в почве невелико —
обычно несколько тысяч клеток на 1 г почвы. Интересно отме¬
тить, что в окислительных бассейнах и отстойниках очистных соо¬
ружений содержание нитрифицирующих бактерий может дости¬
гать крайне высоких значений.Хемоавтотрофные организмы семейства Nitrobacteriaceae де¬
лятся на две группы. Представители родов Nitrosomonas, Nitro-
sospira, Niirosococcus, Nitrosolobus окисляют аммоний до нитрита.
Нитриты преобразуются в нитраты видами бактерий, относящихся
к родам Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus. Таким образом, уже
названия нитрифицирующих бактерий показывают, что они пред¬
ставлены морфологически различными формами и критерием клас¬
сификации их по родам служит форма клеток.6.2.2.1. Количественное определение и методика
выделения почвенных нитрифицирующих
организмовДля количественного определения нитрифицирующих бактерий
можно использовать широко распространенный в почвенной мик¬
робиологии метод разведений. Однако большинство этих микро¬
организмов развиваются лишь в строго аэробных условиях на пи¬
тательных средах с pH 7—8,5, лишенных органических материа¬
лов и содержащих карбонаты кальция или магния, а также мик¬
роэлементы. При изготовлении пластинок используют силикагель
(143). На поверхности силикагелевых пластинок тонким слоем
распределяют 0,5 мл почвенной суспензии соответствующего раз¬
ведения (10_3—10-4). С целью изучения бактерий, окисляющих
аммоний, Сорино и Уокер [140] добавляли к почвенной суспензии
0,5—0,6 мл смеси равных частей ЫагЭЮз и К^Юз, три капли
0,04%-ного водного раствора бромтимолового синего, 0,25 г сте¬
рильного СаСОз и 1,5 мл кислого питательного бульона (140).Стерильные пластинки в течение 3—4 недель инкубируют в
термостате с увлажненной атмосферой при 28 °С. О присутствии
бактерий, окисляющих аммоний до нитрита, свидетельствует по¬
явление на поверхности пластинок светлых зон, связанное с рас¬
творением СаС03. Образующийся нитрит определяют в кусочке
геля с культурой при помощи реактива Гриса — Илошваи (14).Нитратные бактерии, преобразующие нитриты в нитраты, мож¬
но выделить на агаровой питательной среде соответствующего со¬
става (140).При помощи КОН реакцию агаровой среды доводят до pH 8,5.
После стерилизации показатель кислотности изменяется до
7,8—8,0.Получение чистых гомогенных культур из материала, выросше¬
го на агаровых пластинках, требует большого терпения, посколь-141
ку на питательных средах, не содержащих растворимые органи¬
ческие вещества, гетеротрофные сопутствующие микроорганизмы
развиваться не могут и их присутствие остается незамеченным.6.1.2.2. Методы изучения нитрифицирующей
способности почвДля определения активности процессов нитрификации до на¬
стоящего времени с успехом применяют классический метод Ви¬
ноградского. Согласно этой методике, стерильные силикагелевые
пластинки пропитывают 2 мл раствора I и 1 мл раствора II (159).
Избыток влаги испаряют в сушильном шкафу при 35—40 °С. На
поверхности пластинки равномерно распределяют 0,5 г стериль¬
ного порошка СаСОз, суспендированного в минимальном объеме
воды, затем пластинку вновь подсушивают и помещают на ее по¬
верхность 50 крупиц почвы (для этого шпатель смачивают дистил¬
лированной водой и затем прикладывают к образцу почвы; при¬
липшие частицы легко перенести на поверхность пластинки).
С целью более равномерного распределения частиц почвы под
чашки следует подложить соответствующим образом размеченный
бумажный круг. Инкубируют пластинки в течение трех недель в
увлажненной атмосфере при 28 °С. После инкубации подсчитыва¬
ют частицы почвы, вокруг которых образовались зоны растворе¬
ния. При соответствующем количестве повторений отношение чис¬
ла частиц, образовавших зоны растворения, к общему количеству
частиц почвы может служить характеристикой нитрифицирующей
способности почвы.Нитрифицирующую активность почвенной микрофлоры можно
изучать и с помощью перколяционного фильтра, описываемого
ниже (стр. 257). При пропускании растворов, содержащих аммо¬
ний и нитриты, через помещенную в колонку перколятора почву
нитрифицирующая флора обогащается, а возможность постоянного
отбора проб позволяет измерять кинетику процессов превращения
веществ.Еще один путь изучения нитрифицирующей способности почв—
это так называемый метод компостирования. Обычно его приме¬
няют для измерения способности почвы продуцировать питатель¬
ные вещества. В справочнике по методике почвенного анализа
[6] приведен следующий метод Петербургского.Почву компостируют в одинаковых стеклянных стаканах ем¬
костью 200 мл. В середине стакана устанавливают выступающую
из него на 1—2 см стеклянную трубку диаметром 0,5—1 см. Дно
стакана засыпают битым стеклом, на которое сверху помещают
100 г слегка уплотненной почвы, предварительно определив ее
водоудерживающую способность и влажность.Затем добавляют воду с таким расчетом, чтобы влажность
почвы составила 60% влагоемкости, рассчитанной для абсолютно
сухой почвы. Стаканы с образцами на 12 суток помещают в тер¬
мостат при 28 °С. Испарившуюся воду ежедневно восполняют, до¬142
ливая ее попеременно то сверху (на почву), то через трубку на
дно стакана. Через 12 суток определяют содержание нитритов.
Для оценки нитрифицирующей способности почву, обогащенную
(NH4)2S04 (100 кг почвы+0,14 г (NH4)2S04], инкубируют в таких
же условиях. В конце эксперимента определяют и содержание
нитрата в этом образце. Нитрифицирующую способность почвы
можно оценить, сравнивая содержание нитрата в некомпостиро-
ванной, компостированной, но не обработанной, а также в ком¬
постированной и обогащенной сульфатом аммония почве.Для определения нитрата рекомендован метод, основанный на
реакции с фенолдисульфокислотой. Компостированную почву из
стакана без потерь переносят в колбу емкостью 1 л и добавляют
500 мл дистиллированной воды. Полученную смесь встряхивают
в течение трех минут и фильтруют на складчатом бумажном филь¬
тре. Если фильтрат не абсолютно прозрачен, его фильтруют по¬
вторно. Для облегчения фильтрования солонцовых почв вытяжку
необходимо обработать 0,005—0,05 н. НС1 и раствором квасцов
или СаС12. При окрашивании фильтрата на каждые 100 мл до¬
бавляют 0,6—12 мл 13%-ного A12(S04)3 и 0,4—1,6 мл 7%-ного
раствора КОН. После отделения выпавшего осадка получают бес¬
цветный раствор. 50 мл чистого фильтрата выпаривают в фарфо¬
ровой чашке досуха и сухой остаток стеклянной палочкой тща¬
тельно смешивают с 1 мл фенолдисульфокислоты. Спустя 10 ми¬
нут добавляют 10 мл дистиллированной воды и затем раствор
нейтрализуют, добавляя 10%-ные NH4OH, NaOH или КОН.В присутствии нитрата желтая окраска при перемешивании не
исчезает. После добавления еще одной капли щелочи содержи¬
мое чашки количественно переносят в мерную колбу емкостью
50 или 100 мл, доводят объем жидкости до метки и по интенсив¬
ности желтой окраски определяют количество нитрата.6.2.3. ДенитрификацияПосле процессов аммонификации и нитрификации очередным эта¬
пом круговорота азота может быть восстановление окисленного
соединения, то есть денитрификация. Этот процесс также проте¬
кает при участии бактерий, обитающих в почве и воде. Процессы
денитрификации разделяют на ассимиляционное и диссимиляци-
онное восстановление нитратов.В процесе ассимиляционного восстановления микроорганизмы
синтезируют из нитрата белки и другие азотистые органические
вещества.Микроорганизмы, способные осуществлять диссимиляционное
восстановление нитратов, — это факультативные анаэробы, кото¬
рые вместо кислорода используют нитраты в качестве акцептора
электронов.Азот, вошедший в состав бактериальных клеток при ассими¬
ляционных процессах, остается в почве, а газообразные продукты143
Диссимиляционной редукции нитратов (N20, NO, N2) уходят в ат¬
мосферу. В естественных условиях такая потеря азота в резуль¬
тате диссимиляционного восстановления нитратов — важный этап
функционирования экологической системы. При этом избыточный
в данный момент азот накапливается в атмосфере, откуда в слу¬
чае необходимости он может быть извлечен азотфиксирующими
организ(мами.Диссимиляционное восстановление азота осуществляют многие
почвенные микроорганизмы (отдельные виды Pseudomonas и Ba¬
cillus). Хорошо изучена также физиология Paracoccus denitrificans
и Thiobacillus denitrificans. Диссимиляционные редуценты нитра¬
та остаются активными элементами почвенной микрофлоры и при
отсутствии нитрата в аэробных условиях. Они способны также
осуществлять денитрификацию в присутствии усвояемых органи¬
ческих веществ в бедной кислородом нейтральной или щелочной
среде.Характерная особенность представителей рода Pseudomonas
состоит в том, что в анаэробных условиях они активны только
в присутствии нитрата. Качественный состав ассимилируемых ор¬
ганических веществ в аэробных и анаэробных условиях обычно
одинаков, но в последнем случае на единичном количестве орга¬
нического субстрата образуется меньше бактериальных клеток.Для обогащения бактериальной суспензии при выделении дис-
симиляционных редуцентов нитрата небольшое количество почвы
инкубируют в питательной среде (мясной бульон, синтетическая
среда), содержащей около 1,2% KNO3.Если культивирование проводят в сосудах с глубоким слоем
жидкой питательной среды (в пробирках, цилиндрах), необходи¬
мость в создании анаэробных условий отпадает, поскольку они
неизбежно сформируются в результате метаболических процессов.
Процесс денитрификации сопровождается интенсивным газообра¬
зованием. Из обогащенных культур, в которых к концу срока ин¬
кубации идет выделение газа и отсутствуют нитраты и нитриты,
готовят серию разведений. Материал полученных суспензий высе¬
вают на агаровые пластинки. Колонии, выращенные методом по¬
сева в толщу питательной среды, снова переносят в жидкую пи¬
тательную среду. Если вновь появляются признаки, характерные
для обогащенных культур, необходимо приготовить новую серию
разведений и повторить всю процедуру до получения гомогенной
культуры.Для разделения ассимиляционной и диссимиляционной редук¬
ции нитратов необходимо провести культивирование в анаэроб¬
ных условиях в присутствии нитрата и без него. Если рост Pseu¬
domonas в анаэробных условиях идет только в присутствии нит¬
рата, это со всей определенностью свидетельствует о способности
данных организмов к диссимиляционному его восстановлению.
При изучении других микроорганизмов для решения этого воп¬
роса следует наблюдать также за образованием газа и утилиза¬
цией нитрата.144
В настоящее время достаточно простые методы измерения по¬
терь почвенного азота вследствие образования N02 и N2 еще не
разработаны. Содержание инертного N2 и нестабильных газов
N20, NO и N02 можно определять методами газовой хроматогра¬
фии и масс-спектрографии.Сложность измерения усугубляется и тем обстоятельством, что
в лабораторных экспериментах потери азота из небольших образ¬
цов почвы невелики даже при самых благоприятных условиях.
В естественных же условиях существуют трудности иного рода,
связанные с необходимостью герметической изоляции исследуе¬
мой почвенной поверхности и с выделением образующихся газо¬
образных продуктов.6.2.4. Биологическая фиксация атмосферного азотаСпособностью связывать атмосферный азот и использовать его в
процессах ассимиляции обладают лишь отдельные группы микро¬
организмов. Значение биологической фиксации азота очень ве¬
лико.Среди азотфиксирующих микроорганизмов различают свобод-
ноживущие организмы и симбионты растений (клубеньковые бак¬
терии). Последние способны размножаться в почве так же, как
и свободноживущие азотфиксаторы, однако связывают азот они
исключительно в симбиозе с растениями*. По отношению к моле¬
кулярному кислороду свободноживущие азотфиксирующие орга¬
низмы разделяют на аэробные и анаэробные.Кроме азотфиксирующих бактерий, атмосферный азот связы¬
вают и другие группы микроорганизмов, и прежде всего синезеле¬
ные водоросли (Cyanophyceae).6.2.4.1. Свободноживущие анаэробные
азотфиксирующие бактерииАнаэробные азотфиксирующие бактерии относятся к роду Clostri¬
dium. Наиболее известный их представитель — Clostridium paste-
urianum, описанный Виноградским в 1893 г. Эти бактерии — обли¬
гатные анаэробы, осуществляющие, подобно анаэробным целлю¬
лозоразлагающим бактериям, маслянокислое брожение, т. е. раз¬
лагающие углеводы с образованием масляной и некоторых других
органических кислот, спирта, двуокиси углерода и водорода. На
1 г сброженного сахара эти бактерии способны связать 2—3 мг
азота.Молодые клетки C. pasteurianum — палочковидные перитрихи
длиной 3—4 мкм. Их размеры могут варьировать в зависимости
от состава питательной среды и условий культивирования. Старые* По последним данным, на специфических питательных средах при умень¬
шенном парциальном давлении кислорода клубеньковые бактерии способны фик¬
сировать молекулярный азот. — Прим. ред.10 й. Сэги 145
клетки образуют терминально расположенную спору. Поскольку
размер споры больше диаметра клетки, последняя приобретает
характерную для клостридий булавовидную форму.Для выделения C. pasteurianum из почвы используют электив¬
ную среду Виноградского (157). Питательную среду разливают
в пробирки, непрерывно встряхивая их для равномерного распре¬
деления нерастворимого в воде СаСОз- Заполненные на 2/з про¬
бирки стерилизуют 35 минут при 0,5 атм, засевают небольшими
частицами почвы, помещают в анаэростат или вакуумный эксика¬
тор, куда вместо откачанного воздуха нагнетают азот, и инкуби¬
руют при 30°С. Спустя 5—6 суток питательная среда в пробирках
мутнеет, интенсивно образуются пузырьки газа. Инкубация длит¬
ся 2—3 недели.С це^Тью очистки культуры С. pasteurianum полученную опи¬
санным способом обогащенную культуру 15 минут выдерживают
в водяной бане при 70 °С; в результате погибают сопутствующие
бактерии, не образующие спор. Пересевы и одновременную тер¬
мообработку продолжают проводить до получения совершенно
чистой культуры. Очистить культуру можно и методом посева в
толщу среды. Для этого в упомянутую питательную среду вносят1,5 г агара и разливают ее в чашки Петри, используя в качестве
посевного материала различные разведения обогащенной культу¬
ры. Азотфиксирующие бактерии культивируют при 30°С в ваку¬
умном эксикаторе, где воздух замещен азотом. Выросшие на
пластинках колонии пересевают в пробирки на жидкую питатель¬
ную среду; после инкубации чистоту культуры контролируют мик-
роскопированием. Принимая во внимание, что выделение чистой
культуры С. pasteurianum — задача чрезвычайно трудная, выше¬
описанные операции по очистке следует проводить на возможно
большем количестве образцов.В ходе исследований может возникнуть необходимость опреде¬
ления количества азота, связанного культурой. Для этого в уз¬
когорлую колбу емкостью 100 мл вносят ровно 100 мл питатель¬
ной среды, которая заполняет всю сферическую часть колбы и
имеет незначительную поверхность соприкосновения с воздухом.
После стерилизации колбу засевают суспензией исследуемых мик¬
роорганизмов, готовя не менее четырех параллельных посевов,
и в течение трех недель инкубируют при 30 °С по мере возможно¬
сти в азотной атмосфере. Затем культуру переливают в мерную
колбу емкостью 100 мл и восполняют жидкость, испарившуюся
при инкубации. Содержимое мерной колбы тщательно перемеши¬
вают и методом Бертрана [28] определяют количество оставшейся
несброженной глюкозы. Количество связанного азота выявляют
методом Кьельдаля (Балленэггер и Ди Глериа, 1962). На основа¬
нии этих данных рассчитывают количество связанного азота на
1 г использованной глюкозы.Определение сахара методом Бертрана основано на способно¬
сти СиО окислять соединения типа альдегидов. В результате ре¬
акции между сахаром и окисью меди СиО превращается в Си20146
11. Определение глюкозы методом БертранаГлюкоза,мгМедь, мгГлюкоза,мгМедь, мгГлюкоза,мгМедь, мгГлюкоза,мгМедь, мг1020,43465,558109,882149,3и22,43568,359111,183150,91224,33670,160112,884152,51326,33772,061114,585154,01428,33873,862116,186155,61530,23975,763117,987157,21632,24077,564119,688158,81734,24179,365121,389160,41836,24281,866123,090162,01938,14382,967124,791163,62040,14484,768126,492165,22142,04586,469128,193166,72243,94688,270129,894168,32345,84790,071131,495169,92447,74891,872133,196171,52549,64993,673134,797173,12651,55095,474136,398174,62753,45197,175137,999176,22855,35298,976139,6100177,82957,253100,677141,23059,154102,378142,83160,955104,179144,53262,856105,880146,13364,657107,681147,7и выпадает в виде красного осадка. Осадок отделяют фильтрова¬
нием и обрабатывают сернокислым раствором трехвалентного
сульфата железа, который растворяет его и вновь окисляет до
СиО.Одновременно сульфат трехвалентного железа восстанавлива¬
ется до сульфата двухвалентного железа, который легко окисля¬
ется под действием КМп04. Этот процесс можно выразить сле¬
дующими уравнениями химических реакций:CuO + Fe2(S02)3 + H2S04 = 2CuS04 -f 2FeS04 + H2;10FeS04 + 2KMn04 + 8H2S04 = 5Fe2(S04)3 + 2MnS04 + K2S04.Как видно из второй части уравнения, на 10 атомов железа
приходится два атома КМп04. Поскольку в превращении одного
атома СигО в СиО участвует один атом железа, две молекулы
КМп04 будут соответствовать 10 атомам меди. Зная концентра¬
цию и объем израсходованного при титровании раствора КМп04,
легко вычислить количество восстановленной меди, а отсюда по
таблице 11 определить и соответствующее количество сахара.Сахар определяют следующим образом: в коническую колбу
емкостью 100 мл вносят 20 мл исследуемого раствора, содержание
сахара в котором не должно превышать 100 мг (если сахара
больше, раствор разбавляют). Затем туда же добавляют 20 мл
раствора Фелинг I (3) и столько же раствора Фелинг II (3).10* 147
Колбу накрывают часовым
стеклом, жидкость кипятят
3 минуты и затем содержи¬
мое колбы вместе с красным
осадком без остатка перено¬
сят на стеклянный фильтр
G-4. На фильтре осадок от¬
деляют от жидкости и не¬
сколько раз промывают го¬
рячей водой. Затем заменя¬
ют склянку под фильтром и
в воронку фильтра налива¬
ют 20 мл реактива III (3).
Растворившийся осадок от¬
фильтровывают в чистую
колбу, а фильтр несколько
раз промывают холодной
дистиллированной водой,
которую собирают в ту же
колбу. После этого филь¬
трат титруют раствором
КМп04 (5 г/л) до появле¬
ния бледнорозового оттенка.Определение азота по>
Кьельдалю основано на раз¬
ложении азотистых органи¬
ческих веществ концентри¬
рованной серной кислотой,
в результате которого весь
азот превращается в амми¬
ак. Аммиак высвобождают
подогреванием щелочной среды, поглощают его 0,1 н. серной кис¬
лотой, аналитический фактор которой известен, и затем кислоту
титруют щелочью.Исследуемый материал вносят в колбу Кьельдаля соответст¬
вующего размера (для определения азота в 100 мл культуры не¬
обходима колба емкостью 500 мл) и добавляют 20 мл концент¬
рированной серной кислоты и небольшое количество сернокислой
меди. Чтобы ускорить окисление, в жидкость целесообразно до¬
бавить 5—10 г K2SO4 или Na2S04, повышающих точку кипения
серной кислоты. Разложение проводят в специальных штативах,
установленных в вытяжном шкафу, который должен быть посто¬
янно включен. Кусочки неразложившегося материала, прилипшие
к стенкам колбы, смывают небольшим количеством серной кисло¬
ты и продолжают процедуру до полного осветления исследуемого
раствора.По завершении окисления содержимое колбы Кьельдаля ко¬
личественно переносят в мерную колбу емкостью 10 мл, жидкость
перемешивают и после охлаждения доводят объем до метки. ДляРис. 39. Аппарат Парнасса-Вагнера для ди¬
стилляции аммиака.148
определения аммиака наиболее целесообразно пользоваться мик¬
родистиллятором Парнасса — Вагнера (рис. 39).Дистилляцию проводят следующим образом. Воду, налитую в колбу /, на¬
гревают на газовой горелке до кипения. Кран 10 при этом открыт, краны 8 я 11
закрыты. В колбу-сборник 2 наливают 20 мл 0,1 н. раствора серной кислоты и
столько воды, чтобы трубка холодильника на 5—6 мм была погружена в рас¬
твор. Затем 20 мл исследуемого раствора из мерной колбы через воронку 3
заливают в сосуд 4 и добавляют 20 мл 33%-ного раствора NaOH, после чего
сразу же перекрывают кран 10. Жидкость в колбе 4 должна иметь щелочную
реакцию; ее проверяют, добавляя 1—2 капли фенолфталеина. После перекрытия
крана 10 водяной пар вскоре начинает проходить через жидкость колбы 4, увле¬
кая за собой высвобождающийся в щелочной среде аммиак, который через хо¬
лодильник попадает в сборник и связывается кислотой. Дистилляция длится
10 минут. Затем колбу 2 опускают ниже, чтобы трубка холодильника не сопри¬
касалась с кислотой, трубку ополаскивают дистиллированной водой, которую
собирают в ту же колбу, и прекращают подогрев жидкости в колбе 1. При этом
образуется вакуум, содержимое сосуда 4 по трубке 5 переходит в сосуд 6 и
при открытом кране 8 попадает в сборник или сливается. Дистилляторы новей¬
ших конструкций оснащены электрическими нагревателями, и манипуляции с
газовой горелкой заменены операцией включения и выключения обогревателя.
При многократной дистилляции нет необходимости каждый раз промывать со¬
суд 4. Избыток кислоты в сосуде 2 титруют 0,1 н. раствором NaOH в присут¬
ствии бромкрезола зеленого или комбинированного индикатора, и по количеству
нейтрализованной аммиаком серной кислоты вычисляют содержание азота; 1 мл0,1 н. H2S04 соответствует 1,4 мг азота.6.2.Д.2. Свободноживущие аэробные
азотфиксирующие бактерииИз этой группы бактерий более детально будут рассмотрены пред¬
ставители рода Azotobacter, хотя в последние годы получены дан¬
ные, свидетельствующие о способности фиксировать азот многими
другими аэробными бактериями. Виды Azotobacter широко рас¬
пространены в природе. Наиболее известен Azotobacter chroococ-
cutn, повсеместно встречающийся в почвах Венгрии. Овальные,
часто сдвоенные клетки размером
3,5X2 мкм окружены слизистой
капсулой (рис. 40). Старые культу¬
ры синтезируют коричневый пиг¬
мент, который, по мнению некото¬
рых исследователей, играет опреде¬
ленную роль в образовании гумуса.Кроме A. chroococcum, к обита¬
телям почв относятся также A. vi-
nelandii и A. indicum. Последний
встречается прежде всего в кислых
тропических почвах, в настоящее
время его относят к роду Beijerin-
ckia.В воде встречаются A. agile, их
клетки несколько крупнее клеток
A. chroococcum. Культура продуци¬
рует желтый флуоресцирующий пиг¬
мент.Рис. 40. Своободноживущие азот¬
фиксирующие бактерии Azotobac¬
ter chroococcum.149
Все Azotobacter грамотрицательны, клетки одних видов имеют
жгутики лишь в молодых культурах, другие же (A. agile) несут
жгутики постоянно.Для культивирования и содержания азотобактера используют
синтетические питательные среды, не содержащие азота. Наи¬
большее распространение получили безазотистые питательные
среды Эшби (57) и Федорова (77).Существует несколько методов определения азотобактера в
почве. Наиболее прост метод почвенных пластинок Виноградского,
который можно применять для исследования почв, содержащих
большое количество этих бактерий.100 г сухой почвы растирают в тонкий порошок и смешивают
с 1% маннита или глюкозы, а в отсутствие этих веществ — с 5%
растворимого крахмала. Затем, добавляя к почве дистиллирован¬
ную воду, доводят ее до кашицеобразного состояния и в чашке
Петри готовят пластинки толщиной 10 мм. Поверхность почвен¬
ной пластинки разглаживают влажным покровным стеклом и
помещают в термостат при 28 °С. Спустя 48 часов на поверхности
почвы появляются слизистые колонии азотобактера.Возможно, что азотобактер на поверхности почвенной плас¬
тинки не вырастет. Причиной этого могут быть неблагоприятные
почвенные условия (слишком кислая или щелочная реакция), не¬
хватка фосфора или извести и т. п. В таких случаях следует по¬
пытаться вырастить культуру на силикагеле (143).Предварительно стерилизованные пластинки силикагеля про¬
питывают 1 мл безазотистого питательного раствора десятикрат¬
ной концентрации. Для его получения компоненты питательных
сред Эшби (57) или Федорова (77) растворяют не в 1 литре, а
в 100 мл дистиллированной воды. Как и при культивировании
нитрифицирующих бактерий (стр. 141), на поверхность пластинок
помещают на равных расстояниях по 50 крупиц почвы и чашки
инкубируют в термостате при 28°С. Спустя 1—2 суток вокруг час¬
тиц почвы появляются слизистые прозрачные колонии A. chroo-
соссит, через несколько дней приобретающие коричневую окраску.
Данный метод применяют и для регистрации частоты встречае¬
мости азотобактера. При этом число комочков почвы, в которых
обнаружены эти бактерии, соотносят с общим количеством ко¬
мочков, помещенных на поверхность пластинки. Проанализировав
таким образом соответствующее количество пластинок, можно
рассчитать процентную частоту встречаемости азотобактера.Для определения количества клеток азотобактера в почве при¬
меняют методы посева в толщу среды (стр. 104) и предельного
разведения (стр. 107).Очистка культуры азотобактера от сопутствующих бактерий—-
задача довольно сложная. Трудности связаны с тем, что очень
мелкие палочковидные бактерии прилипают к слизистой капсуле,
из которой их невозможно удалить обычными методами разведе¬
ния и посева в толщу среды. Согласно наблюдениям автора, наи¬
лучшие результаты дает очистка азотобактера на питательной150
среде, содержащей в качестве источника углерода 0,2% бензоата
натрия. Значительная часть видов Azotobacter способна утилизи¬
ровать бензоат, а сопутствующие бактерии его не усваивают. При
очистке культуры посевом в толщу среды (стр. 41) вместо ука¬
занных в прописях источников углерода в состав питательных
сред для азотобактера вводят 0,2% бензоата натрия. В более
высоких концентрациях бензоат токсичен, поэтому повышать его>
содержание не следует.Чистоту культуры азотобактера можно проверить на мясо-пеп-
тонном агаре (90), так как на этой питательной среде он не раз¬
множается; следовательно, интенсивный рост бактерий будет сви¬
детельствовать о том, что культура еще не очищена.Азотфиксирующую способность отдельных видов или штаммов
азотобактера определяют на жидкой безазотистой питательной
среде. В колбы емкостью 100 мл наливают по 30 мл питательного
раствора Эшби или Федорова и засевают ее суспензией азотобак¬
тера. В качестве источника углерода в питательную среду вводят
20 г глюкозы. После инкубации, длящейся четыре недели, опреде¬
ляют остаток глюкозы в питательной среде методом Бертрана
(стр. 147), а затем в культуральной жидкости — азот по Кьель-
далю. По полученным данным рассчитывают количество связан¬
ного азота на единицу (1 г) источника углерода; этим показате¬
лем характеризуется азотфиксирующая активность культуры [28].
Активные штаммы способны ассимилировать 13—16 мг азота в
пересчете на 1 г глюкозы.В некоторых странах культурой азотобактера заражают семе¬
на сельскохозяйственных культур. Для этого бактерии размно¬
жают на агаровых пластинках в плоских стеклянных сосудах и
готовят суспензию бактериальных клеток, которой опрыскивают
семена. Опрыскивание следует проводить в затененном месте, по¬
скольку ультрафиолетовые солнечные лучи обладают сильным
бактерицидным действием. В качестве балластного материала в
некоторых случаях применяют тонкоразмолотую нейтральную,
предварительно стерилизованную торфяную пыль, с которой сме¬
шивают суспензию. Семена заражают непосредственно перед вы¬
севом в почву.6.2.4.3. Изучение азотфиксирующей способности
почвыДля изучения азотфиксирующей способности почвы Федоров [29]
предложил следующий метод: 100 г воздушно-сухой почвы тща¬
тельно перемешивают с 2 г маннита или глюкозы и смачивают
водой, доводя влажность до 60% от полной влагоемкости почвы
и перемешивая образец вилкой для получения мелкокомковатой
структуры. Затем почву переносят в пластмассовую коробку или
стеклянную чашку и инкубируют в термостате в течение 30 суток,
восполняя по мере надобности испарившуюся воду. Для опреде¬
ления количества испарившейся воды проводят контрольные взве¬151
шивания. По окончании инкубации 10 г почвы разрушают мето¬
дом Кьельдаля и определяют содержание азота, которое пересчи¬
тывают на абсолютно сухую почву и сравнивают с содержанием
азота в неинкубированной почве.6.2.4.Д. Изучение азотфиксирующих симбионтов
бобовых растенийВстречающиеся в почве бактерии семейства Rhizobiaceae при по¬
мощи так называемых инфекционных нитей через корневые во¬
лоски проникают в ткани растения и стимулируют процесс деле¬
ния клеток, в результате чего на корнях образуются клубеньки
(рис. 41). Сами бактерии, находящиеся в клубеньках, также пре¬
терпевают изменения. Почвенные бактерии представлены палоч¬
ковидными клетками размером 0,5—0,9X1—3 мкм; размеры клу¬
беньковых бактероидных форм (Y-, V-, Т-образных, звездчатых
или грушевидных) могут быть и в десять раз больше. Начало
азотфиксации сопровождается появлением инволюционных форм и
образованием гемоглобина.Представители семейства Rhizobiaceae грамотрицательны. Оп¬
ределитель Берги [10] объединяет их в род Rhizobium. В преде¬
лах рода по этой классификации различают шесть видов, каждый
из которых имеет свое растение-хозяина. На основании данных,
полученных современными физиологическими, биохимическими и
генетическими методами, многие специалисты оспаривают право¬
мерность такой классификации.Чистые культуры этих бактерий обычно выделяют из клубень¬
ков. Так как их поверхность заражена почвенными бактериями,
стерилизация клубеньков — это важнейший и одновременно самый
сложный этап выделения культуры. Для стерилизации применяют
химические реактивы.Винцент [165] рекомендует следующий метод культивирования клубенько¬
вых бактерий.1. Здоровые клубеньки, содержащие гемоглобин, отделяют ножом или пин¬
цетом от корня, помещают в марлевый или нейлоновый мешочек и промывают
в проточной водопроводной воде.2. Вымытые клубеньки на 1—2 секунды погружают в 96%-ный спирт и по¬
мещают в кислый раствор сулемы. Продолжительность обработки сулемой зави¬
сит от размеров клубеньков и степени зараженности их поверхности. Обычно
достаточно обработки в течение 4—5 минут, но в отдельных случаях для сте¬
рилизации может потребоваться и 30 минут.3. Стерилизованные клубеньки многократно промывают в стерильной ди¬
стиллированной воде. Винцент рекомендует шестикратную промывку каждый
раз в чистой воде.4. В стерильных условиях клубеньки раздавливают или разрезают в зави¬
симости от их размеров и высевают на агаризованную питательную среду, со¬
держащую дрожжевую вытяжку и маннит (115).5. Чашки помещают в термостат, поддерживающий температуру 28 °С. Спу¬
стя 2—3 дня на поверхности агара появляются небольшие опаловые слизистые
колонии клубеньковых бактерий. Для отдельных видов необходима более дли¬
тельная инкубация.152
Клубеньковые бакте¬
рии можно выделить и из
почвы, хотя это более
сложная задача. Мате¬
риалом, полученным на
агаризованной среде с
дрожжевой вытяжкой и
маннитом или на бобо¬
вом агаре (59), заража¬
ют стерильные семена
бобовых растений и за¬
тем из клубеньков выде¬
ляют бактерии. Их мож¬
но изучать и непосредст¬
венно в клубеньках. Для
этого готовят тонкий срез
клубенька, помещают его
в капле воды на предмет¬
ное стекло и добавляют
разбавленный раствор ме¬
тиленового синего (44). Если срез достаточно тонок, под микро¬
скопом в растительных тканях можно наблюдать палочковидные
и бактероидные клетки клубеньковых бактерий.Для изоляции бактерий отделенные от растительной ткани и
вымытые клубеньки разрезают скальпелем и стеклянной палочкой
выжимают клубеньковый сок на предметное стекло. К соку до¬
бавляют каплю стерильной воды и столько же разбавленного
раствора метиленового синего или фуксина (35, 44), накрывают
покровным стеклом и микроскопируют.Чистоту выращенной из клубеньков культуры трудно прове¬
рить только по форме колоний и бактериальных клеток, посколь¬
ку морфологически клубеньковые бактерии весьма разнообразны.
Для очистки культуры пользуются известным методом посева в
толщу среды. На агаре с маннитом и дрожжевой вытяжкой клу¬
беньковые бактерии образуют слизистые опаловые непрозрачные
колонии. Для их диагностики применяют разбавленный в 400 раз
водный раствор конго красного, 10 мл которого добавляют к 1 л
питательной среды, содержащей маннит и дрожжевую вытяжку.После заливки агаровых пластинок колонии клубеньковых
бактерий не окрашиваются. В зависимости от скорости роста их
можно разделить на две группы. Бактерии, живущие в клубень¬
ках сои и люпина, растут медленно (4—8 суток), а культуры,
выделенные из клубеньков гороха, клевера, люцерны и некоторых
других растений, развиваются значительно быстрее (2—3 суток).
В молодых культурах клетки палочковидной формы имеют жгу¬
тики, но среди них встречаются также овальные клетки и кокки.
Позднее они утрачивают подвижность, и под микроскопом можно
наблюдать крупные палочковидные и Т-образные клетки. Как со¬
общает Разумовская [125], клетки клубеньковых бактерий, заРис. 41. Клубеньки на корнях бобовых рас¬
тений.153
исключением симбионтов люцерны, не способны расти на мясо-
пептонном и картофельном агаре, поэтому эти среды можно ис¬
пользовать для контроля чистоты культур.Ценность клубеньковых бактерий для сельского хозяйства оп¬
ределяется двумя их свойствами. Первое — вирулентность, под
которой понимают способность данной расы вызывать образова¬
ние клубеньков на корневой системе растения-хозяина. Второе
свойство — эффективность данной культуры, т. е. мера способно¬
сти бактерий удовлетворять потребность растений в азоте. Оба
эти свойства можно изучать в стерильных опытах с растениями,
которые будут рассмотрены детально.Вирулентность определяется количеством и характером рас¬
положения клубеньков на корнях, а эффективность — количест¬
венными и качественными характеристиками урожая, полученного
с зараженного растения. Эффективность определяют на основа¬
нии данных о содержании азота в растении, полученных методом
Кьельдаля.6.2.4.4.1. Определение нитрогеназной активности
методом восстановления ацетиленаБиологическая фиксация атмосферного азота представляет собой
восстановительный процесс, в котором участвует ферментный
комплекс нитрогеназы, относящейся к группе гидрогеназ. В со¬
ответствии с приведенными уравнениями химических реакций
промежуточными продуктами этого процесса являются диимиди
гидразин, а конечным продуктом — аммиак.хАТФ хАТФN„ ► NesN >- HN=NH *~2 2(H) 2(H)диимидхАТФ ► H,N—NH, >- 2NH3.2 2 2(Н) згидразин аммиакСвободные промежуточные продукты в субстрате не встре¬
чаются, так как с поверхности ферментного комплекса высво¬
бождается только конечный продукт.Ферментный комплекс нитрогеназы, кроме газообразного
азота, способен восстанавливать целый ряд других соединений.
В их число входит и ацетилен, из которого в результате восста¬
новления образуется этилен:хАТФС„н, —► нс=сн *- Н2С=СН, ► С2Н4.2 2 2(Н) 2 2 2 іНа способности нитрогеназы восстанавливать ацетилен ос¬
нован метод определения ее активности. Большое преимущество
метода заключается в том, что он позволяет исследовать бакте¬
рии непосредственно в клубеньках.154
Рис. 42. Создание ацетиленовой атмосферы вокруг
корневой системы с помощью пластикового па¬
кета.При работе этим методом необходимо
прежде всего учитывать взрывоопасность
ацетилена и соблюдать меры предосто¬
рожности при его хранении. Газ хранят
в металлических баллонах растворенным
в ацетоне, в ниппельной камере мяча
или же получают из карбида кальция
непосредственно перед проведением
опыта.Для измерения активности восстанов¬
ления ацетилена можно использовать
или всю корневую систему растения,
или же только неповрежденные клубень¬
ки. В первом случае исследуемое расте¬
ние извлекают из почвы и очищают кор¬
невую систему, стараясь не повредить
клубеньки. Бэррис [15] предлагает соз¬
давать ацетиленовую атмосферу не в
сосуде, а в полиэтиленовом пакете. Для
этого на корневую шейку растения наде¬
вают просверленную и разрезанную ре¬
зиновую пробку и плотно привязывают
к ней пакет. Щель между отверстием и
стеблем растения заделывают замазкой
или каким-либо иным пластичным мате¬
риалом (рис. 42). Откачивание воздуха
из пакета и заполнение его газовой смесью проводят через специ¬
альное отверстие.Газовую смесь (0,15 атм ацетилена, 0,20 атм кислорода и
0,65 атм аргона) удобно вводить в пакет пластиковым шприцем
емкостью 50 см3. Спустя 10—15 минут после ее введения неболь¬
шим шприцем емкостью 5 мл отбирают образец атмосферы и
переносят его в закрытый шприц-сборник для дальнейших ис¬
следований. Ацетилен и образовавшийся этилен разделяют ме¬
тодом газовой хроматографии, измеряя высоту пика хромато¬
граммы и сравнивая ее с пиком стандартов.Для определения нитрогеназной активности можно исполь¬
зовать растения, растущие в горшках. Их накрывают пластико¬
вым чехлом, в который вмонтирована резиновая пробка. Через
пробку откачивают воздух и шприцем вводят под чехол газовую
смесь; ацетилен быстро проникает к находящимся в почве клу¬
бенькам.При изучении активности неповрежденных клубеньков их от¬
деляют от корней и по 1 г помещают в герметически закрытый
резиновой пробкой сосуд типа флакончиков для вакцин, в кото¬155
ром воздух заменен ацетиленом; все остальные процедуры ос¬
таются без изменений.Результаты анализа можно выразить в показателях восста¬
новления ацетилена или азота. В последнем случае пользуются
коэффициентом пересчета, учитывая, что при восстановлении
ацетилена происходит переход двух, а при восстановлении азо¬
та — шести электронов. Поскольку в ацетилене транспорт элек¬
тронов протекает быстрее, чем в азоте, фактор пересчета равен
не '/з. а колеблется между '/з и 7-і-6.2.4.4.2. Применение клубенькового инокулята
в сельском хозяйствеВпервые искусственное заражение семян бобовых растений
клубеньковыми бактериями применили в конце прошлого века
немецкие ученые Ноббе и Гильтнер [109]. В Венгрии первый
эксперимент по внесению в почву бактериальных удобрений
провел Керпей в 1896 г. За истекшие с тех пор три четверти ве¬
ка использование клубеньковых бактерий в качестве удобрения
стало одним из важных агротехнических приемов при выращива¬
нии бобовых культур. Во многих странах мира выпускают со¬
держащие клубеньковые бактерии препараты под различными
наименованиями (нитрагин, бактонит, радицин, ризонит и т. д.).В первой половине века применяли главным образом агари-
зованные препараты. Для их приготовления внутреннюю боко¬
вую поверхность плоского стеклянного флакона заливали агари-
зованной питательной средой, засевали клубеньковыми бакте¬
риями и размножали их в инкубационных камерах. Приготов¬
ленные таким образом препараты поступали в продажу. На
сельскохозяйственных предприятиях культуру смывали с поверх¬
ности агара водой и полученной суспензией опрыскивали семе¬
на перед посевом. Для более равномерного распределения ино¬
кулята увлажненные семена многократно перемешивали, после
чего просушивали в затененном месте, поскольку мелкие влаж¬
ные семена склеиваются, затрудняя тем самым посев. Инокуля¬
цию следует проводить в затененном месте, так как ультрафио¬
летовые солнечные лучи обладают бактерицидным действием.Один из существенных недостатков агаризованного препара¬
та клубеньковых бактерий состоит в том, что культура не вы¬
держивает длительного хранения. Кроме того, инокуляция и
высушивание семян — это трудоемкие процессы.В последнее время во всем мире широко распространены по¬
рошкообразные препараты. Для их приготовления бактерии раз¬
множают на жидкой питательной среде в ферментерах, а затем
в стерильных условиях смешивают с твердыми тонкоразмолоты-
ми наполнителями (нейтральная торфяная пыль, бентонит, као¬
лин, тальк и т. п.). Твердый препарат лучше хранится; его упа¬
ковка, перевозка и заражение семян значительно упрощены;
обработанные семена не нуждаются в подсушивании и пригодны156
к высеву в почву сразу же после инокуляции; более того, при
необходимости инокуляцию можно проводить и непосредствен¬
но в сеялке. Наполнитель порошкообразного препарата должен
хорошо удерживаться на поверхности семян.В Венгрии главным производителем препаратов клубенько¬
вых бактерий является предприятие «Филаксия» по производ¬
ству вакцин и питательных сред. Бактериальное удобрение, из¬
готовленное этим предприятием, поступает в продажу под наи¬
менованием «Ризонит-форте». Наполнителем служит нейтраль¬
ная торфяная пыль; после размола ее стерилизуют и смешива¬
ют с ферментированной жидкостью. Рекомендованная норма
расхода препарата — 400 г/га.Научно-исследовательский институт кормовых культур Министерства пище¬
вой промышленности (с. Ирегсемче) выпускает бактериальное удобрение нитро-
фикс для обработки сои, используя иную технологию. С корневой системы увяд¬
ших растений сои собирают клубеньки, подсушивают их и тонко размалывают.
К размолотому материалу добавляют наполнитель и краситель эозин, после чего
препарат готов к применению. Эозиновая метка служит для контроля сцепляе-
мости препарата с поверхностью семян. Контроль за качеством препарата осу¬
ществляет лаборатория Центра агрохимии и охраны растений Министерства
пищевой промышленности в соответствии с требованиями, определенными поста¬
новлением № 51/880/1958 министра земледелия. Качественный препарат должен
удовлетворять следующим требованиям:— влажность свежеизготовленного порошкообразного препарата — не выше
20%, а через четыре недели—15%;— содержание клеток в 1 г препарата — не менее 500 млн;— зараженность (количество посторонних бактериальных клеток) — не вы¬
ше 5%;— в экспериментах, поставленных на песчаной культуре в горшках, зеленая
масса надземной части инокулированного растения должна превышать массу
контрольного растения не менее чем на 50%;— порошкообразный препарат должен покрывать не менее 50% поверхно¬
сти семян.6.3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ПРЕВРАЩЕНИЕ
СОЕДИНЕНИИ СЕРЫДля биологического круговорота серы в почве характерны сле¬
дующие процессы. Микроорганизмы минерализуют сернистые
органические соединения животного происхождения и соедине¬
ния серы, попадающие в почву с осадками, превращая их в се¬
роводород. Облигатные или факультативные автотрофы, в свою
очередь, окисляют сероводород до сульфата, который вновь ис¬
пользуется растениями. Избыточные (временно не усвоенные
растениями) растворимые сернистые соединения легко вымыва¬
ются из почвы или снова превращаются в сероводород в ана¬
эробных условиях. Вымытые из почвы сернистые соединения ас¬
симилируются водными организмами, а их избыток может пре¬
вратиться (также микробиологическим путем) в элементарную
серу или осесть в илистых отложениях в форме нерастворимых
сульфидов металлов. С помощью микроорганизмов сера из это¬
го «склада» может вновь включиться в цепь круговорота. В ес¬
тественных условиях скорость возвращения материала из отло-157
жений в биосферу невелика. В анаэробных условиях Desulfo-
vibrio, использующие сульфатный ион в качестве акцептора
электронов, способны из богатых легкорастворимыми натриевы¬
ми солями, периодически заливаемых водой связных почв на¬
копить большое количество сульфида натрия; в результате pH
почвы значительно возрастает. Этот процесс может играть су¬
щественную роль в формировании солончаковых почв..6.3.1. Окисление сернистых соединенийСогласно опубликованным данным, гетеротрофные организмы
также способны окислять восстановленные соединения серы, од¬
нако усвоенные соединения они используют в процессах ассими¬
ляции. Облигатные или факультативные хемолитотрофы, а так¬
же часть фототрофных организмов используют восстановленные
неорганические сернистые соединения в качестве источника
энергии. В этом случае потребление субстрата оказывается зна¬
чительно большим, чем при усвоении сернистых соединений в
ассимиляционных процессах. К важнейшим почвенным автотро-
фным микроорганизмам, способным окислять сернистые соеди¬
нения, относятся представители рода Thiobacillus.Клетки этих бактерий имеют палочковидную форму, их тол¬
щина— 0,5 мкм, длина варьирует от 1—3 мкм; передвигаются
в большинстве случаев с помощью одного жгутика, расположен¬
ного на конце клетки, но два вида серобактерий неподвижны.
Потребность в энергии эти бактерии покрывают за счет окисле¬
ния сульфидов, элементарной серы, тиосульфатов, политионатов
и сульфитов. Обычный конечный продукт окисления — сульфат,
но в отдельных случаях выделяются элементарная сера или по-
литионаты. Большинство серобактерий строго автотрофны и для
синтеза собственных органических соединений используют дву¬
окись углерода. Некоторые виды способны покрывать потреб¬
ность в углероде за счет простых углеродистых соединений.
Thiobacillus denitrificans может использовать нитрат в качестве
акцептора электронов и поэтому сохраняет активность в ана¬
эробных условиях. Оптимум pH для отдельных видов Thiobacil¬
lus варьирует. Одним видам (Th. thiooxidans, Th. denitrificans,
Th. ferrooxidans) необходима сильнокислая среда, для других
оптимальна слабощелочная среда.Для культивирования серобактерий необходимо в первую
очередь получить обогащенную культуру. При выращивании ви¬
дов, предпочитающих кислую и слабощелочную питательную
среду, используют разные питательные среды (соответственно
127 и 151).Смешанную культуру очищают методом разведений, исполь¬
зуя агаризованную питательную среду и силикагелевую плас¬
тинку. На пластинке серобактерии образуют мелкие бесцветные
колонии. Виды, выделяющие элементарную серу, дают колонии
желтого или белого цвета. Все виды Thiobacillus окисляют тио¬158
сульфат, а способность утилизировать сероводород, сульфид и
другие сернистые соединения варьирует в зависимости от вида.6.3.2. Восстановление сульфатов и других
сернистых соединенийКак и высшие растения, многие виды микроорганизмов также
способны восстанавливать сульфаты. Образующиеся при этом
более простые соединения (сульфиды) встраиваются в белки и
утилизируются в процессах ассимиляции. Бактерии неспорооб¬
разующего рода Desulfovibrio и спорообразующего Desul-
fotomaculum используют сульфат в качестве акцептора электро¬
нов, утилизируя высвобождающуюся при этом энергию. Оба ро¬
да микроорганизмов различаются не только способностью обра¬
зовывать споры; цитохром с3 и пигмент десульфовиридин про¬
дуцируют только виды Desulfovibrio. В эти два рода входят об¬
лигатные анаэробы, использующие в качестве доноров водорода
органические кислоты, спирты и молекулярный водород.Для культивирования сульфатредуцирующих бактерий также
используют обогащенные культуры. Рекомендованную Бирсом
питательную среду (58) засевают водой или илом, содержащи¬
ми десульфатирующие бактерии, и инкубируют в строго ана¬
эробных условиях, используя для этого запаянные пробирки или
какие-либо иные емкости. Желательно, чтобы отбираемый об¬
разец как можно меньше соприкасался с воздухом. Очистку де-
сульфатирующих бактерий можно проводить одним из способов,
разработанных для очистки анаэробов.Десульфовибрионы способны расти при окислительно-восста¬
новительном потенциале в интервале от минус 200 до минус 300
мв. В обогащенных культурах низкое значение потенциала свя¬
зано с деятельностью других анаэробных организмов, в чистых
культурах такие условия можно создать при помощи питатель¬
ной среды Адамса — Постгейта (72).При очистке посевной материал, полученный методом разве¬
дений, высевают в глубь высокого агара в пробирках, пользу¬
ясь приемами, изложенными при описании методов культивиро¬
вания анаэробных бактерий (стр. 45). Появляющиеся на плот¬
ной питательной среде (72) сульфатредуцирующие бактерии
можно узнать по образованию вокруг их колоний черных зон.6.4. ПОЧВЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ,
МОБИЛИЗУЮЩИЕ ФОСФОР
ТРУДНОДОСТУПНЫХ СОЕДИНЕНИИФосфор содержится в почве в основном в виде труднодоступ¬
ных минеральных и органических соединений. Первые представ¬
лены главным образом ортофосфатами кальция (нейтральные и
щелочные почвы), железа и алюминия (кислые почвы), вто¬
рые — инозит-фосфатами, фосфорсодержащими протеинами, ну¬159
клеиновыми кислотами, фосфо¬
липидами и др. Из них наиболее
устойчивы, и поэтому преимуще¬
ственно накапливаются, фосфа¬
ты инозита, на долю которых
иногда приходится до 50% орга¬
нического фосфора почвы. Осо¬
бенно широко распространен
инозитол-гексафосфат (фитин,
фитиновая кислота).Методы учета микроорганиз¬
мов, растворяющих ортофосфаты
кальция, железа и алюминия.
Наиболее удобный метод выде¬
ления фосфатрастворяющих мик¬
роорганизмов— чашечный, когда
активные микроорганизмы отби¬
рают из колоний на агаровой
пластинке в зонах растворения
фосфата. Четкие зоны формиру¬
ются в том случае, когда плотная агаризованная среда достаточ¬
но и равномерно мутна, а количество нерастворимого фосфата в
ней сравнительно невелико. Это достигается тем легче, чем выше
дисперсность вносимого в среду фосфата. Поэтому наибольший
эффект дает внесение свежеосажденных солей.Для внесения в питательную среду фосфатов кальция, пре¬
имущественно Саз(Р04)г, используют методику осаждения,
предложенную Герретсеном [184], в модификации Муромцева
[194]. В стерильную расплавленную агаризованную среду вно¬
сят (из расчета на 1 л) 3,3 г СаС12-6Н20 (можно в небольшом
избытке), а после его растворения — 3,8 г Na3P04-12Н20. Соли
вносят в сухом виде, что позволяет избежать быстрого гидроли¬
за Na3P04 в растворе, обеспечивая взаимодействие этой соли с
СаС12 по мере ее растворения. По расчету на 1 л среды прихо¬
дится 1,5 г свежеосажденного Са3(Р04)2.В опытах используют глюкозо-аспарагиновую среду следу¬
ющего состава [194]: глюкоза — 10 г, аспарагин—1 г, K2S04—
0,2 г, MgS04 — 0,2 г, кукурузный экстракт — 0,02%, агар — 20 г,
водопроводная вода — 1 л. Аспарагин выбран как универсаль¬
ный и в то же время физиологически нейтральный источник азо¬
та; последнее важно при исследовании процессов растворения
фосфатов.По 20 мл плотной среды с фосфатом Са разливают в чашки
Петри, засевают поверхностно 0,1 мл почвенной суспензии в
разведении ЬО-4—10~6 и инкубируют при 27 °С. По образованию
зон просветления вокруг колоний активных микроорганизмов су¬
дят о растворении фосфата кальция (рис. 43).Для выделения активных микроорганизмов можно пользо¬
ваться и готовыми препаратами фосфатов, но зоны растворенияРис. 43. Зоны растворения фосфатов
вокруг колоний активных микроор¬
ганизмов.160
будут менее отчетливыми. Рекомендованы следующие количест¬
ва фосфатов для внесения в агаризованную среду (г/л):
Са3(Р04)2— 4—5, фосфорит — 6—7, апатит—8—10. Порошок
фосфата всыпают в горячий расплавленный агар и дают отсто¬
яться для осаждения крупных частиц.Для выделения из почвы микроорганизмов, способных к
растворению ортофосфатов железа и алюминия, используют
сходные методы [197]. Свежеосажденные фосфаты получают,
сливая по 10 мл стерильных (фильтр Зейтца) растворов Na3P04
и А1С1з (для получения А1Р04) или FeCl3 (для получения
FeP04). После тщательного перемешивания осажденный фосфат
вместе с надосадочной жидкостью вносят в расплавленный
глюкозо-аспарагиновый агар вышеуказанного состава.Согласно расчету, на 1 л среды берут 570 мг Na3P04-12H20
и 362 мг А1С13-6Н20 или 405 мг FeCl3-6H20. Готовая среда
содержит 264 мг А1Р04-ЗН20 или 280 мг FeP04-2H20 в 1 л.
Кислотность среды доводят до 6,8 10%-ным раствором NaOH;
агар имеет хорошо выраженную мутность.Посев почвенной суспензии проводят так же, как и на агаре
с Са3(Р04)2. После инкубации вокруг колоний активных микро¬
организмов видны хорошо выраженные зоны просветления.Методы учета микроорганизмов, мобилизующих фосфор фи-
татов. Фитаты в нейтральных и щелочных почвах представлены
в основном солями Са и Mg, а в кислых — солями Fe и А1. Про¬
цесс микробиологической мобилизации фосфора этих соедине¬
ний осуществляется в два этапа: I — неферментативное раство¬
рение фитатов Ca, Mg, Fe и Al; II — ферментативное дефосфо-
рилирование.Способность к растворению фитатов, как и к растворению
ортофосфатов, широко распространена среди почвенных микро¬
организмов и не носит специфического характера. Второй этап
осуществляется специфическими микроорганизмами, среди ко¬
торых есть формы, способные использовать фитин в качестве
единственного источника углерода и энергии.В качестве фитата Ca—Mg обычно используют фармацевти¬
ческий препарат фитин, а соли Fe и А1 получают из него [199].
Для этого препарат растворяют в 2%-ной соляной кислоте и
осаждают фосфат концентрированным водным раствором FeCl3.
Обильный осадок фитата железа отделяют на воронке Бюхнера
и промывают соляной кислотой до тех пор, пока смывной филь¬
трат не перестанет мутнеть при нейтрализации NaOH до pH7,0.Аналогичным путем с помощью А1С13 получают фитат А1 с
той лишь разницей, что перед внесением хлористого алюминия
pH раствора фитина в соляной кислоте доводят с помощью
NaOH до 3,5. Осадок на воронке отмывают таким же раство¬
ром.Микроорганизмы выделяют из почвы вышеуказанным спосо¬
бом на глюкозо-аспарагиновом агаре. Используют свежеосаж-11 П. Сэги ]ßl
денный фитат Са—Mg, для чего препарат фитин растворяют и
переосаждают. С этой целью 0,5 г препарата растворяют в 10 мл
1 н. НС1 и добавляют 1 н. NaOH (примерно 10 мл) до pH 7,0.
При этом выпадает мелкозернистый осадок фитата Ca—Mg, ко¬
торый после отстаивания вносят в 500 мл расплавленного пита¬
тельного агара, предварительно отделив надосадочную жид¬
кость. мПо 0,1% фитатов Fe и Al тщательно размешивают в горя¬
чем агаре до получения равномерного помутнения; pH среды до¬
водят до 7,0.Для выделения из почвы фосфат- и фитатрастворяющих ми¬
кроорганизмов можно использовать почвенный агар [180]. Зоны
просветления вокруг колоний появляются через 8—10 суток, их
образование ускоряется при добавлении в почвенный агар 1%
глюкозы.Выделение микроорганизмов, использующих фитин в качест¬
ве единственного источника углерода и энергии. С этой целью
используют накопительную культуру [197, 198].Жидкую среду I (на 1 л дистиллированной воды 5 г глюко¬
зы, 1 г (NH4)2S04, 0,2 г K2S04, 10 г фитата натрия, 0,02% куку¬
рузного экстракта, pH 7,0) стерилизуют 20 минут при 0,5 атм.,
разливают по 100 мл в колбы емкостью 750 мл и вносят по 1 г
почвы. Колбы встряхивают на ротационной качалке (220 об/мин)
при 27 °С.Через две недели, когда виден рост микроорганизмов, по
1 мл суспензии из каждой колбы переносят в 100 мл порции
среды II (тот же состав, но без глюкозы) и встряхивают в тех
же условиях еще неделю. Затем делают пересев из колб в чаш¬
ки Петри с агаризованной средой II, так чтобы выросшие
(27°С) колонии микроорганизмов были изолированы друг от
друга. Для этого достаточно одной капли накопительной культу¬
ры на чашку Петри; в необходимых случаях прибегают к раз¬
ведениям.Чистые культуры, полученные из изолированных колоний,
хранят на агаризованной среде II,Выделенные чистые культуры проверяют на способность к
дефосфорилированию фитина. С этой целью проводят фермента¬
цию во встряхиваемых колбах при вышеуказанных условиях на
среде II, внося в каждую колбу по 1 мл суспензии десятисуточ¬
ной микробной культуры со скошенного агара. Контролем на
содержание растворенного фосфора служит встряхиваемая в тех
же условиях стерильная среда II.Ферментацию проводят неделю, определяя концентрацию
фосфора в культуральном фильтрате каждые 24 часа, начиная
со вторых суток. Для этого используют метод Лоури и Лопеса в
модификации Скулачева [202].
7МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
МЕТАБОЛИТОВПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВВ естественной среде микроорганизмы обитают в своего рода
сообществах. Между отдельными группами существует система
взаимосвязей, сформировавшихся в процессе эволюции. Одни
организмы влияют на другие зачастую при помощи синтезируе¬
мых ими метаболитов. Метаболиты микробиологического проис¬
хождения обычно делят на стимулирующие и ингибирующие ве¬
щества. Такое разделение далеко от совершенства уже хотя бы
потому, что проявление стимулирующего или ингибирующего
действия зависит от особенностей испытываемого микроорганиз¬
ма, дозировки метаболита и других факторов.К стимуляторам микробиологического происхождения отно¬
сят аминокислоты, витамины, ауксины, гиббереллины и некото¬
рые другие вещества, а ингибиторы представлены антибиотика¬
ми и различными токсинами. Аминокислоты и витамины игра¬
ют важную роль прежде всего при образовании сообществ ми¬
кроорганизмов, а гиббереллины и ауксины оказывают стимули¬
рующее действие на высшие растения. По Красильникову, к ан¬
тибиотикам можно отнести метаболиты, избирательно подавля¬
ющие развитие других групп микроорганизмов. К токсинам Кра¬
сильников относит такие метаболиты, которые подавляют про¬
цессы жизнедеятельности высших растений и животных, но ток«
сичность которых по отношению к микроорганизмам невелика.
Подобную классификацию, естественно, можно принять лишь в
общих чертах, поскольку известно множество токсинов и анти¬
биотиков, занимающих промежуточное положение между этими
группами. Если большинство микроорганизмов, продуцирующих
антибиотики, представлены актиномицетами, то большую часть
токсинов синтезируют грибы.По химическому составу и стимуляторы, и ингибирующие
вещества довольно гетерогенны. Среди них встречаются кисло¬
ты, основания, нейтральные и амфотерные соединения, всевоз¬
можные ароматические, гетероциклические вещества, содержа¬
щие атомы кислорода и азота, пептиды и т. д. Состав метаболи¬
тов определяется как генетическими характеристиками, так и
условиями внешней среды. Среди последних существенную роль
играют компоненты питательной среды (прежде всего количест¬
во и тип источника углерода и азота), pH, аэрация, температу¬
ра и пр.11*163
7.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТИМУЛЯТОРОВ
И ИНГИБИТОРОВ В КУЛЬТУРАХ
МИКРООРГАНИЗМОВПрисутствие стимулирующих и ингибирующих метаболитов мож¬
но выявить как на плотных средах, так и в жидких субстратах.7.1.1. Исследования на плотных питательных средах7.1.1.1. Метод агаровых блоковМетоды данной группы называют также диффузионными, по¬
скольку они основаны на способности растворенных метаболи¬
тов диффундировать в агаровой пластинке и в зависимости от
интенсивности воздействия образовывать более или менее широ¬
кие зоны угнетения или стимулирования роста.Взвесь исследуемого микроорганизма равномерно высевают
в чашки Петри на поверхность агаровой пластинки (стр. 42) и
помещают в термостат на инкубацию при 28 °С. Чашки инкуби¬
руют до появления на поверхности среды сплошного слоя коло¬
ний.При культивировании бактерий для этого необходимо око¬
ло двух суток, грибов — 4—5, актиномицетов — 8—10 суток. За¬
тем в стерильных условиях с помощью металлической трубки с
острыми краями (сверло для пробок) из участка агаровой плас¬
тинки со сплошным ростом культуры вырезают диски диаметром
10 мм. После извлечения каждого диска металлическую трубку
стерилизуют спиртовым факелом,Параллельно с проведением этой операции на поверхность
агаризованной питательной среды или вглубь высевают тестовый
микроорганизм, подбирая питательную среду с учетом его по¬
требностей, сразу же извлекают стерильным пинцетом вырезан¬
ные агаровые диски и переносят их на поверхность пластинки с
посевом. На каждую пластинку обычно помещают по четыре
диска (можно и больше), размещая их на равном расстоянии друг
от друга. Посевы тестового микроорганизма с агаровыми дисками
вначале помещают в холодную камеру при 10 °С и спустя 10 ча¬
сов переносят в термостат с температурой 28 °С. Выдерживание
в холодильнике создает условия для диффундирования метабо¬
литов из агарового диска в питательную среду, прежде чем тес¬
товый микроорганизм начнет интенсивно размножаться. В ин¬
кубационной камере пластинки находятся 1—2 суток в зависи¬
мости от скорости развития тестового микроорганизма на их
поверхности. Затем, осматривая пластинки, устанавливают по¬
явление вокруг агаровых дисков зон угнетения или стимулиро¬
вания роста микроорганизма (рис. 44) и при наличии таких зон
измеряют их диаметры. Если колонии тестового микроорганизма
равномерно обросли агаровый диск, исследуемый микроорганизм164
в данных условиях не выделяет
метаболиты, влияющие на рост
тестовой культуры.Метод агаровых блоков нахо¬
дит применение в тех случаях,
когда исследуемый и тестовый
микроорганизмы культивируют
на питательных средах различно¬
го состава.7.1.1.2. Штриховой методЕсли исследуемый и тестовый
микроорганизмы в равной степе¬
ни хорошо развиваются на одной
питательной среде, для выявле¬
ния биологически активных ме¬
таболитов часто пользуются
штриховым методом. При этом
обычно готовят мясо-пептонный
агар (90) или какую-либо моди¬
фикацию этой среды. Штриховой
метод позволяет изучать чувст¬
вительность нескольких тестовых
микроорганизмов на одной пластинке. Недостаток его состоит в
том, что граница зон угнетения или стимулирования выражена
не столь отчетливо, как при использовании метода агаровых бло¬
ков.Исследуемый микроорганизм высевают на агаровую пластин¬
ку проходящим через ее центр штрихом длиной 50—60 мм, куль¬
туру помещают в термостат при 28 °С. После инкубации в тече¬
ние двух суток на месте посева появляется штриховая колония
исследуемого микроорганизма. Инкубация бактерий длится двое
суток, грибов — 4—5, актиномицетов — 8—10 суток. Затем в
стерильной камере чашки Петри осторожно открывают и мате¬
риалом 1—2-суточных культур тестовых микроорганизмов про¬
водят несколько перпендикулярных штрихов строго в направле¬
нии к выросшей колонии; при направлении штриха от колонии
будет вновь выполнен посев не тестового, а исследуемого микро¬
организма. Расстояние между штрихами отдельных тестовых
микроорганизмов составляет около 15 мм, т. е. на одну пластин¬
ку можно нанести одновременно четыре тестовых микроорга¬
низма.После посева пластинки вновь помещают в термостат и ин¬
кубируют в течение суток, а в случае необходимости и более
длительное время. По истечении срока инкубации определяют,
насколько близко к колонии исследуемого микроорганизма раз¬
виваются тестовые культуры (рис. 45). Если вблизи колонии
микроорганизм не растет, исследуемый объект является антаго¬
нистом и продуцируемое им антибиотическое вещество угнета-165Рис. 44. Изучение мё^аболитов
микроорганизмов методом агаро¬
вых блоков:а — вид сверху, б — вид сбоку.
Рис. 45. Принцип штрихового метода;
исследуемая культура в различной степе¬
ни подавляет рост различных тестовых
микроорганизмов.ет рост тестовой культуры. Если
же вблизи колонии исследуемо¬
го организма тестовая культура
растет более интенсивно, чем по
краям пластинки, следовательно,
среди метаболитов присутствуют
стимулирующие вещества. В том
случае, когда культуры тестового
микроорганизма развиваются
равномерно (независимо от рас¬
стояния до колонии исследуемого микроорганизма), можно счи¬
тать, что среди метаболитов нет ни стимуляторов роста, ни инги¬
бирующих веществ и' таким образом, исследуемый микроорга¬
низм нейтрален по отношению к тестовому.7.1.1.3. Метод точечного тестированияПри использовании метода точечного тестирования тестовый
микроорганизм в отдельном агаровом слое наносят на поверх¬
ность колонии исследуемого организма. Этот метод обычно при¬
меняют для выявления антагонизма актиномицетов. Существен¬
ным его преимуществом является возможность одновременного
изучения действия метаболитов нескольких микроорганизмов на
какой-либо тестовый объект.Исследуемый микроорганизм высевают на поверхность ага¬
ровой пластинки в виде точечной колонии; на отдельные плас¬
тинки можно высевать не более 5—6 культур. При посеве гри¬
бов и актиномицетов необходимо следить за тем, чтобы не было
рассеивания спор по поверхности пластинки. Затем чашки инку¬
бируют в термостате при 28 °С до развития колоний. После до¬
стижения ими диаметра 5—6 мм тестовый микроорганизм сус¬
пендируют в 6—8 мл подогретой и охлажденной до 50 °С агари¬
зованной питательной среды и еще не застывшую среду наслаи¬
вают на поверхность колоний исследуемых культур. Чашки на
10 часов помещают в холодильник с температурой 10 °С и затем
в течение 1—2 суток культивируют при 28 °С. После инкубации
изучают характер зон, образовавшихся вокруг колоний. Если
метаболиты какого-либо из исследуемых микроорганизмов диф¬
фундируют в содержащий тестовые микроорганизмы агаровый
слой и стимулируют или угнетают их рост, вокруг колоний об¬
разуются такие же зоны, как и при исследовании методом ага¬
ровых блоков. При отсутствии образования зон метаболиты ис¬
следуемых микроорганизмов в данных условиях на развитие те¬
стового микроорганизма не влияют.166
71,4 блока Вагаровой * ™
пластинкеДанный метод применяют в
тех случаях, когда для раз¬
вития исследуемого и тесто¬
вых микроорганизмов необ¬
ходимы различные пита¬
тельные среды и при этом нужно определить чувствительность
нескольких тестовых объектов.Из агаровой пластинки, содержащей колонию исследуемого
микроорганизма, вырезают блок диаметром около 15 мм (для
этого можно воспользоваться любой металлической трубкой с
заостренными краями, перед применением стерилизованной
спиртовым факелом). Вырезанный блок стерильным пинцетом
помещают точно в центр предварительно стерилизованной пус¬
той чашки Петри. Затем вокруг блока разливают питательную
среду для тестовых микроорганизмов.Блок должен приблизительно на 1 мм выступать над поверх¬
ностью агаровой пластинки. Необходимо следить за тем, чтобы
температура питательной среды не превышала 50 °С, в против¬
ном случае блок может расплавиться. После застывания агаро¬
вой пластинки на ее поверхность штрихами высевают тестовые
микроорганизмы, проводя штрихи в направлении к блоку (рис.
46). На каждой пластинке можно высевать шесть микроорганиз¬
мов, располагая штрихи радиально вокруг агарового блока. По¬
сле посева чашки 10 часов выдерживают в холодильнике при
10 °С, чтобы метаболиты диффундировали в агаровую пластин¬
ку, но микроорганизмы не могли интенсивно размножаться, и
затем инкубируют в термостате при 28 °С. Спустя 1—2 суток
после появления тестовых культур анализируют влияние диф¬
фундирующих из агарового блока метаболитов на отдельные
тестовые микроорганизмы. Результаты оценивают так же, как
и при штриховом методе (стр. 165).7.1.2. Исследования метаболитов в жидком субстрате7.1.2.1. Метод лунокМетод лунок очень широко применяют в микробиологической
практике. Благодаря быстроте и простоте анализа его исполь¬
зуют для постановки серийных опытов в лабораториях, занима¬
ющихся изучением антибиотиков. Тестовую культуру смешива¬
ют с нагретым и вновь охлажденным до 50 °С агаром и затем
разливают в чашки Петри или же вносят в чашки и заливают
еще не застывшим агаром. Кроме того, 0,5 мл взвеси тестового
микроорганизма можно нанести на застывшую агаровую плас¬
тинку и стерильным шпателем распределить по ее поверхности.Рис. 46. Метод заливки блока в агаровой
пластинке:а — агаровый блок в центре чашки Петри; 6 —
блок, залитый агаризованной питательной сре¬
дой с тестовым микроорганизмом.167
Затем стерильным пробочным свер¬
лом из агаровой пластинки выре¬
зают диски диаметром 10 мм, обыч¬
но получая четыре симметрично
расположенных отверстия. Диски
извлекают стерильным скальпелем
из пластинки и выбрасывают, а в
отверстия вносят равные дозы жид¬
кости, содержащей исследуемый
метаболит (приблизительно 0,2 мл).
Уровень жидкости в лунках должен
быть несколько ниже поверхности
пластинки. Необходимо следить за
тем, чтобы жидкость из отверстия
или пипетки не попала на поверх¬
ность пластинки, поскольку в этом
случае результаты эксперимента
оценить невозможно. После внесе¬
ния жидкости в лунки чашки осто¬
рожно устанавливают в холодильник при 10 °С и спустя 10 часов
переносят в термостат с температурой 28 °С. Через 24 часа изме¬
ряют ширину колец ингибирования или стимулирования роста,
образовавшихся вокруг отверстий (рис. 47).По одной из модификаций этого метода вместо вырезания от¬
верстий в агаровой пластинке на ее поверхность изогнутым пин¬
цетом помещают стерилизованную в автоклаве металлическую
или стеклянную трубку диаметром 6—8 мм и примерно такой
же высоты. Основание трубки должно несколько уйти в агар,
но не слишком глубоко, чтобы не препятствовать процессу диф¬
фузии (рис. 48). Исследуемый субстрат заливают в трубки, все
дальнейшие операции остаются прежними.7.1.2.2. Метод бумажных дисковДанный метод применяют в том случае, когда метаболиты рас¬
творены в жидком субстрате, а тест-культура растет на плотной
питательной среде. Из фильтровальной бумаги вырезают диски
диаметром 6-—10 мм, погружают их в содержащую метаболиты
культуральную жидкость, а после пропитывания раскладывают
на поверхности агаровой пластинки, засеянной культурой тесто¬
вого микроорганизма. Чашки Петри
в этом случае также вначале поме¬
щают в холодильник при 10 °С и
через 10 часов переносят в инкуба¬
ционную камеру с температурой
28 °С. Спустя 24 часа определяют
размеры зон ингибирования или Рис- 48- Установленные на по-
ґ ґ г верхности агаровой пластинкистимулирования роста, появляю- Трубки с введенными в них мета-
щихся вокруг бумажных дисков, болитами.Ш гг!Ь/////у?//////////////:77////уАРис. 47. Зоны стимулирования
(внизу) и угнетения роста (ввер¬
ху) вокруг отверстий в агаровой
пластинке при исследовании ме¬
тодом лунок.168
Если этих зон нет, культуральная жидкость не содержит метабо¬
литов, влияющих на тестовый микроорганизм.Метод бумажных дисков широко применяют для определе¬
ния чувствительности различных культур микроорганизмов к
антибиотикам. В продажу поступают бумажные диски отечест¬
венного и импортного производства, содержащие известные до¬
зы различных антибиотиков. В последнее время при диагности¬
ке микроорганизмов определяют и их чувствительность к анти¬
биотикам.7.1.2.3. Определение числа
микроорганизмов-антагонистов
в почве методом разведенийЕсли нужно определить численность антагонистов в почве как
общий показатель ее антибиотического потенциала, не ставя
целью выделение микроорганизмов в чистой культуре, можно
использовать метод разведений [196а]. Анализ проводят на сре¬
дах, пригодных для роста как почвенных, так и тестовых мик¬
роорганизмов, например на водной почвенной вытяжке (соотно¬
шение почва : вода равно 1:1), обогащенной 0,5% глюкозы, или
на разбавленной вдвое среде Чапека. В пробирки с 10 мл сре¬
ды одновременно вносят культуру тестового микроорганизма и
1 мл соответствующего разведения почвенной суспензии (от
10_3 до 10~7). После пяти суток инкубации при 25—27 °С конт¬
рольный вариант (чистая культура) сравнивают с опытными,
отмечая характер роста тест-организма и те разведения, где он
развит слабее, чем в контроле, или не вырос совсем. На основа¬
нии этих показателей по таблицам Мак-Креди (раздел 5.2.2.1.)
определяют число антагонистов изучаемого тест-микроорганиз¬
ма.Метод разработан для учета численности антагонистов поч¬
вообитающих фитопатогенных грибов, но может быть применим
к любому другому микроорганизму, рост которого в жидкой сре¬
де визуально легкоразличим (микромицеты, актиномицеты, ок¬
рашенные дрожжи, бактерии и т. п.).7.1.2.4. Использование комбинированных камер
для изучения жизнедеятельности
микроорганизмов в почвеМетод представляет собой модификацию известного метода мем¬
бранных фильтров. Фильтры используют для приготовления ка¬
мер, в которых чистые культуры микроорганизмов вносят в поч¬
ву, чтобы проследить за их развитием [179, 196, 201] в естест¬
венных условиях обитания.Основной материал мембранных фильтров •— нитроцеллюло¬
за, устойчивая к действию воды, разбавленных кислот и ряда
других химических агентов [193]. Мембранные фильтры отлича¬169
ются высокой пористостью: объем пор составляет 60—80% от
общего объема фильтра. Широкий ассортимент фильтров, разли¬
чающихся размерами пор, позволяет варьировать их по прони¬
цаемости. Помещенные на мембранный фильтр микроорганизмы
можно изучать с помощью светооптической [196], электронной
[213] и люминесцентной [206, 207] микроскопии.Метод комбинированных камер позволяет наблюдать за
развитием представителей почвенной микрофлоры или характе¬
ром взаимоотношений между различными микроорганизмами
непосредственно в их среде обитания — почве [187]. Комбини¬
рованная камера состоит из мембранного фильтра, обернутого
крупноволокнистой стеклотканью. Перед употреблением мемб¬
ранные фильтры заливают дистиллированной водой, нагревают
до 80 °С, сливают воду и кипятят в новой порции воды 15—
20 минут. Это позволяет удалить загрязнения и воздух из пор
фильтров, а также снизить их электростатический заряд.На промытый и высушенный мембранный фильтр наносят
инокулюм исследуемого микроорганизма и заворачивают в стек¬
лоткань. Полученную таким образом трехслойную камеру скреп¬
ляют по периметру разъемной диапозитивной рамкой. Затем ка¬
меру с помещенным в нее тест-объектом вводят в почву на лю¬
бой необходимый срок. Крупные размеры пор стеклоткани (по¬
рядка 140 мкм) обеспечивают быстрый контакт тест-объекта с
почвой. Камеры снабжают этикетками, выведенными на поверх¬
ность почвы. Извлеченные из почвы камеры фиксируют, высуши¬
вая их при комнатной температуре до воздушно-сухого состоя¬
ния.Окрашивание тест-объекта для анализа с помощью светооп¬
тической микроскопии проводят следующим образом. Камеру
раскрывают, удаляют стеклоткань, мембранный фильтр с нахо¬
дящимся на его поверхности тест-объектом помещают на 1—3
минуты в раствор карболового эритрозина (0,25%-ный эритро-
зин в 0,25%-ном феноле) и высушивают при комнатной темпе¬
ратуре до воздушно-сухого состояния. Хорошая сохранность за¬
фиксированных и окрашенных препаратов позволяет микроско-
пировать их даже спустя несколько месяцев.Для микроскопирования тест-объекта необходимо окрашен¬
ный мембранный фильтр осветлить иммерсионным маслом. При
просмотре препарата можно наблюдать морфологические изме¬
нения тест-объекта —- прорастание спор, склероциев, лизис ми¬
целия и т. д.Для получения статистически надежных данных необходимо
просмотреть в каждом препарате не менее 20 полей зрения. По¬
вторность камер на вариант 4—8-кратная.Комбинированные камеры по вышеописанной методике ис¬
пользовали и для изучения антагонистических (конкурентных)
взаимоотношений между двумя видами грибов в почве [195]. В
этом случае исследуемые грибы наносили на разные стороны
крупнопористого мембранного фильтра (диаметр пор 2,5 мкм)170
строго напротив друг друга и с помощью светооптической ми¬
кроскопии последовательно анализировали активность развития
каждого из микроорганизмов.При изучении взаимоотношений бактерий и грибов их нано¬
сят совместно на одну сторону мелкопористого (диаметр пор
0,23 мкм) фильтра. Различия в морфологии этих групп микро¬
организмов позволяют легко различать и оценивать характер
развития каждого из исследуемых тест-объектов.7.2. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ
МИКРООРГДНИЗМОВ-АНТАГОНИСТОВВ различных почвах встречается большое количество микроор-
ганизмов-антагонистов, особенно среди актиномицетов и бакте¬
рий. Подтверждением этому служит то обстоятельство, что по¬
давляющее большинство используемых в медицине антибиотиков
получают из актиномицетов. В естественных условиях антибио¬
тические вещества имеют большое значение в борьбе с конку¬
рентными организмами. Существуют различные методы выделе¬
ния антагонистов из почвы [47].7.2.1. Нанесение тест-культуры на поверхность
колоний, выросших на агаровой пластинкеМетодом разведений, применяемым для культивирования и ко¬
личественного определения почвенных микроорганизмов, прово¬
дят посев культур (стр. 41). После инкубации выбирают плас¬
тинки, на которых колонии различных микроорганизмов не ели«
ваются; целесообразно отбирать пластинки с числом колоний не
более 20. В соответствии с техникой точечного тестирования
(стр. 166) тестовую культуру смешивают с 6—8 мл жидкого ага¬
ра с температурой 50 °С и наносят смесь на поверхность коло¬
ний. Чашки с застывшим агаром помещают в холодильник при
10 °С и лишь спустя 10 часов переносят в термостат, поддержи¬
вающий температуру 28 °С. После инкубации в течение 1—2 су¬
ток определяют колонии, угнетающие рост тестового микроорга¬
низма. Материал этих колоний пересевают и освобождают от
сопутствующей микрофлоры. Синтез антибиотиков в значитель¬
ной степени зависит от состава питательной среды, поэтому ре¬
комендуется культивировать микроорганизмы-антагонисты на
средах, благоприятствующих их продуцированию. Актиномице-
ты активно синтезируют антибиотики на модифицированном Ко¬
ном глицерин-аспарагиновом агаре (81), а грибы—на питатель¬
ной среде Викерхэма (163).Выделение антибиотиков бактериями можно успешно изу¬
чать на питательной среде Гаузе (80).171
7.2.2. Определение наименьшей бактериостатической
концентрации антибиотиковОпределенное количество исследуемого антибиотика (10—100мг
в зависимости от его особенностей) растворяют в Ш мл стериль¬
ной дистиллированной воды. Из основного раствора готовят
серию разведений с таким расчетом, чтобы в каждом последую¬
щем разведении содержание антибиотика было в два раза мень¬
ше, чем в предыдущем; для этого 5 мл раствора антибиотика
каждого разведения смешивают с 5 мл стерильной дистиллиро¬
ванной воды. Получают не менее 10, а в случае необходимости
и больше разведений.Одновременно с приготовлением серии разведений готовят со¬
ответствующее число агаровых пластинок, в которые еще до
застывания агара вводят тестовый микроорганизм. В каждой из
пластинок вырезают по четыре отверстия (стр. 168), в стериль¬
ных условиях удаляют диски и в отверстия вносят по 0,2 мл ра¬
створа каждого разведения. Таким образом, для всех разведе¬
ний ставят по четыре параллельных опыта. Чашки устанавлива¬
ют в холодильник при 10 °С и спустя 10 часов переносят их в
термостат с температурой 28 °С. Инкубация длится 24 часа, пос¬
ле чего оценивают результаты опыта. Бактериостатическим по
отношению к тестовому микроорганизму признается то наиболь¬
шее разведение, при котором вокруг отверстия в агаровой пла¬
стинке еще можно обнаружить зону задержки роста. Минималь¬
ную бактериостатическую концентрацию антибиотика выражают
в микрограммах на 1 мл раствора. При проведении этого иссле¬
дования вместо вырезания отверстий в агаре можно пользовать¬
ся отрезками трубочек; их устанавливают на поверхности ага¬
ровой пластинки с тестовой культурой и вносят соответствующую
дозу антибиотика (стр. 168).7.2.3. Определение чувствительности целлюлозных
бактерий к антибиотикамПодавляющее большинство целлюлозных бактерий размножают¬
ся только на питательных средах, содержащих целлюлозу. Сле¬
довательно, для изучения их чувствительности к антибиотикам
обычные методы непригодны. При участии автора был разрабо¬
тан метод, позволяющий проводить исследования такого рода
[149]. На основе 1,5%-ного агара Бакто готовят так называе¬
мый водный агар, не содержащий питательных солей, разлива¬
ют его в чашки Петри и дают ему застыть.Из качественной фильтровальной бумаги вырезают диски
диаметром 35 мм и стерилизуют их 12 часов при 105 °С. Более
высокая температура непригодна, так как обожженная фильтро¬
вальная бумага менее доступна для бактерий.На поверхности агаровой пластинки равномерно размещают
четыре бумажных диска с расстоянием между ними не менее172
10 мм, на каждый диск наносят 0,2 мл питательной среды Вино¬
градского (158) и 0,1 мл взвеси целлюлозных бактерий. Сразу
же после этого в центр каждого диска укладывают готовый бу¬
мажный кружок, содержащий антибиотик. Чашки Петри поме¬
щают в термостат и при 28 °С инкубируют в течение нескольких
суток. Во избежание высыхания агаровой пластинки в инкуба¬
ционной камере рекомендуется установить открытый сосуд с во¬
дой. Через несколько суток вокруг содержащего антибиотик бу¬
мажного диска видна задержка роста культуры, выраженная в
отсутствии окраски и сохранении структуры фильтровальной
бумаги.Этот же, но несколько модифицированный метод пригоден
для исследования жидких антибиотических препаратов. В цент¬
ре бумажного диска вырезают отверстие диаметром 10 мм и та¬
кие же отверстия готовят в агаровой пластинке, используя для
этого сверло для пробок. Жидкие субстраты исследуют мето¬
дом лунок (стр. 167).7.2.4. Приближенное определение содержания
антибиотика в культуральной жидкости7.2.4.1. Метод агаровых пластинокДанный метод пригоден в том случае, когда известна химичес¬
кая структура антибиотика в культуральной жидкости. Именно
поэтому он нашел наиболее широкое применение для примерной
оценки количества антибиотика, накопившегося в ферментере.
Метод агаровых пластинок основан на сравнении диаметров зон
угнетения, образованных взятым из питательной среды натив¬
ным антибиотиком, и чистым препаратом антибиотика. Посколь¬
ку между диаметрами зон, образованных препаратом антибио¬
тика, и его содержанием существует логарифмическая зависи¬
мость, надежные результаты можно получить лишь при тести¬
ровании небольшими дозами антибиотика. В частности, в опы¬
тах со стрептомицином, где в качестве тест-культуры служит
Вас. mycoid.es, допустимое содержание антибиотика составляет
1,5; 1,4; 1,3; 1,2; 1,1; 1,0; 0,9; 0,8; 0,7 и 0,6 ед/мл. Для других
антибиотиков дозы могут быть иными.Получив серию разведений чистого препарата антибиотика,
равные объемы материала каждого разведения вносят в отвер¬
стия или трубочки на поверхности агаровой пластинки, засеян¬
ной тестовым микроорганизмом. Чашки Петри помещают в холо¬
дильник, а спустя 10 часов переносят в термостат с температу¬
рой 28 °С. После 24-часовой инкубации измеряют диаметр зон
угнетения роста и на основании полученных данных на милли¬
метровой бумаге вычерчивают калибровочную кривую. Затем
готовят серию разведений культуральной жидкости, содержащей
нативный антибиотик, и аналогичным образом проводят тести¬
рование. Серию разведений культуральной жидкости готовят,173
добавляя 3 мл жидкости к 1 мл стерильной дистиллированной
воды.Величины диаметров зон угнетения роста, полученные при
тестировании нативных антибиотиков, соотносят с калибровоч¬
ной кривой и таким образом вычисляют примерное содержание
антибиотика в 1 мл культуральной жидкости.Для тестирования антибиотиков рекомендованы распростра¬
ненные в международной практике испытанные штаммы тесто¬
вых микроорганизмов, которые можно получить из разных кол¬
лекций.7.2.4.2. Нефелометрический методКак и в предыдущем случае, параметры размножения тестового
микроорганизма сравнивают с калибровочной кривой, вычерчен¬
ной по характеристикам зон угнетения роста известными доза¬
ми антибиотика. Путем сравнения устанавливают примерное со¬
держание антибиотика в культуральной жидкости. Скорость
размножения определяют по степени помутнения, измеряемого
с помощью фотометра.В эксперименте используют оптимальную для данного микро¬
организма питательную среду. Она не должна содержать нера¬
створимых в воде соединений, поглощающих световые лучи и
затрудняющих измерение.Питательную среду разливают в пробирки (по 9 мл в каж¬
дую). В пробирки с культурами, предназначенными для постро¬
ения калибровочной кривой, добавляют по 1 мл раствора анти¬
биотика различных разведений. При необходимости культураль¬
ную жидкость также разбавляют. Для посева используют 0,1 мл
взвеси тестового микроорганизма; в каждую пробирку следует
внести равное число бактериальных клеток, количество которых
определяют опытным путем. Слишком большое содержание кле¬
ток может повлиять на точность определения, так как бактери¬
альные клетки поглощают свет и в контрольном образце. Для
сравнения в одну из пробирок вместо питательной среды нали¬
вают дистиллированную воду.В каждом случае ставят по четыре параллельных опыта.
Пробирки с посевами инкубируют в термостате при 37 °С. Куль¬
туры готовы к измерению, когда светопоглощение контроля, не
содержащего антибиотик, составляет около 40%. Обычно это
дает инкубация в течение 12—14 часов.Между степенью помутнения культуральной жидкости и со¬
держанием антибиотика существует логарифмическая зависи¬
мость. Отсюда следует, что метод позволяет получать приемле¬
мые результаты лишь при небольших дозах антибиотика и не¬
значительных изменениях его содержания в отдельных разве¬
дениях. Например, концентрация основного раствора антибиоти¬
ка хлорамфеникола равна 50 мкг/мл, а в серии разведений она
изменяется в последовательности 1 : 10, 1:15, 1 : 20, 1 : 25, 1 : 30,174
1 : 35 и т. д. Для других антибиотиков эти значения могут быть
иными.Перед использованием культуральную жидкость следует от¬
фильтровать в стерильных условиях; это особенно важно при
замутнении исследуемой культуры. Для фильтрования наиболее
пригодны целлюлозные фильтры «Миллипор».Оба приведенных метода позволяют получать лишь весьма
приближенные данные, поскольку опыты ставят на культураль¬
ной жидкости, не очищенной от прочих метаболитов, которые мо¬
гут оказывать на тестовый микроорганизм и стимулирующее
действие. Преимущество нефелометрического метода в сравне¬
нии с методом лунок состоит в том, что определение можно вы¬
полнить в течение одного дня.7.2.5. Определение антибиотиков в почвеСудьба антибиотиков в почве в значительной мере зависит от
ее химических свойств. Основные антибиотики (стрептомицин)
адсорбируются на поверхности органических и минеральных
коллоидов очень активно, амфотерные соединения —■ в несколь¬
ко меньшей степени. Кислые антибиотики связываются гораздо
слабее, поэтому их инактивация и вымывание происходят во
много раз быстрее.Для определения содержания антибиотиков в почве широко
применяют методы микробиологического тестирования. Некото¬
рые из них рассмотрены более подробно.7.2.5.1. Метод закопанных пластинокРазработка данного метода связана с именем Стивенсона [142,
143]. Его применяют главным образом для изучения способнос¬
ти актиномицетов продуцировать антибиотики в почве. Для тес¬
тирования используют споры фитопатогенного гриба Heltnin-
thosporium sativum. Скорость прорастания этих спор зависит от
присутствия антибиотических веществ.Навеску сухой почвы (200 г) равномерно смачивают водой,
доводя влажность почвы до 60% от полной влагоемкости. В сте¬
клянной или пластмассовой коробке почву засевают суспензией
спор актиномицета-антагониста и инкубируют при 28 °С в термо¬
стате. Для предотвращения быстрого высыхания почвы в термо¬
стат помещают открытые сосуды с водой. Если продуцирование
антибиотиков нужно изучить в стерильных условиях, опыт ста¬
вят на стерильной почве. Стерилизацию проводят в течение ча¬
са при 1 атм. Очень часто исследуют влияние органических до¬
бавок (целлюлозы, крахмала, растительной муки и т. п.) на
выделение антибиотиков. Эти добавки, содержание которых
равно 1—2%, перемешивают с почвой перед ее увлажнением.Культуру гриба H. sativum выращивают на картофельно-
декстрозном агаре (стр. 269). Суспензию спор смешивают с 1%-175
ным жидким водным агаром, не содержащим минеральных со¬
лей и источника углерода, при температуре не выше 50 °С пере¬
мешивают и, прежде чем агар застынет, окунают в него чистые,
стерилизованные спиртовым факелом предметные стекла. Удер¬
живая стекла в вертикальном положении, дают стечь избытку
агара; в конечном счете на поверхности стекла остается тонкий
агаровый слой. После его застывания одну сторону стекла очи¬
щают, соскабливая агар бритвенным лезвием. Затем стеклян¬
ные пластинки помещают в созревшую почву, стараясь при этом
не повредить агаровую пленку, и выдерживают в термостате при
28 °С.С помощью микроскопа в 1, 3 и 7-й день эксперимента на¬
блюдают прорастание спор в пленке. Результаты наблюдений
сравнивают со скоростью прорастания спор в контрольной поч¬
ве и в чашке Петри, не содержащей почвы.Согласно одной из модификаций данного метода, о присут¬
ствии в почве антибиотиков можно судить по аномалиям роста
гиф гриба. Предметные стекла, смоченные содержащим споры
H. sativum водным агаром, помещают в стерильную чашку Пет¬
ри и в увлажненной атмосфере инкубируют 24 часа. За это вре¬
мя из спор вырастают гифы длиной около 200 мкм. Предметные
стекла с такими «проращенными» спорами помещают в исследуе¬
мую почву и на 1, 3 и 7-й день инкубации проводят наблюдения,
по результатам которых делают вывод о наличии или отсутствии
антибиотика. При этом учитывают такие признаки, как угнете¬
ние роста и деформация гиф. Аномалии роста могут выражать¬
ся в образовании вздутий, беспорядочном ветвлении; встречает¬
ся и лизис гиф. Результаты наблюдений сравнивают с контро¬
лем.7.2.S.2. Метод «почвенный сэндвич»Метод был разработан Гессайоном [44] для выявления в почве
трихотецина — устойчивого к нагреванию антибиотика, выделяе¬
мого грибом Trichothecium roseum.Навеску почвы (60 г) увлажняют водой, доводя влажность
до 60% от полной влагоемкости, и затем почвенный образец
помещают в чашку Петри. В почву высевают суспензию микро-
организма-антагониста, выделяющего термостойкий антибиотик.
Контролем служит почва, в которую внесена суспензия клеток,
убитых нагреванием. Такая постановка опыта позволяет учиты¬
вать и минимальное количество термостойкого антибиотика, вне¬
сенного с посевным материалом. Для исключения ошибки, свя¬
занной с возможным влиянием конкурентных микроорганизмов
на организм, выделяющий антибиотик, целесообразно ставить
параллельные опыты на стерилизованной и нестерилизованной
почве. Кроме того, рекомендуется сравнивать содержание ан¬
тибиотика в почве, обогащенной органическими источниками
энергии и углерода (растительная мука, крахмал, глюкоза, цел¬176
люлоза и т. д.), с его количеством в образцах, не содержащих
подобных добавок.Почвенный образец, засеянный культурой антагониста Tric-
hothecium roseum, выделяющего термостойкий антибиотик, по¬
мещают в термостат с температурой 28 °С. Для создания в ин¬
кубационной камере увлажненной атмосферы, препятствующей
быстрому высыханию почвы, туда же ставят открытые сосуды с
водой. После инкубации в течение двух недель почву делят на
четыре части, переносят в отдельные чашки Петри и распреде¬
ляют тонким слоем. Затем чашки упаковывают в бумагу, укла¬
дывают в автоклав и стерилизуют 30 минут при 1 атм. На по¬
верхность стерилизованной почвы наносят 10 мл 1,5%-ного вод¬
ного агара, а после его застывания — еще 20 мл питательного
агара (123). Чашки 24 часа выдерживают в холодильнике при
10 °С, в течение этого времени антибиотик из почвы диффундиру¬
ет в агар. Поверхность пластинок, извлеченных из холодильни¬
ка, засевают культурой гриба Helminthosporium sativum, инку¬
бируют в течение нескольких суток и затем изучают скорость
роста гриба, диаметр колоний и степень деформации гиф. Ре¬
зультаты наблюдений сравнивают с контролем.Для выявления трихотецина в качестве тест-организма можно
использовать и Fusarium oxisporum var. cubense. Небольшие до¬
зы трихотецина стимулируют рост этого патогенного гриба, па¬
разитирующего на растениях.7.2.5.3. Изучение устойчивости антибиотика,
внесенного в почвуСтепень сохранения в почве чистых антибиотических препаратов
зависит от многих факторов, важнейшими из которых являются
физические и химические свойства почвы, а также особенности
самого антибиотика. По сохранности введенного в почву анти¬
биотика можно судить об активности микроорганизмов-антаго-
нистов и синтезируемых ими антибиотических веществ.К 25 г воздушно-сухой почвы добавляют воду в количестве,
соответствующем 60% от полной влагоемкости, и при помощи
вилки тщательно размешивают. Антибиотик целесообразно за¬
ранее растворить в этой же воде из расчета 2000 единиц на
1 г воздушно-сухой почвы. Антибиотическую активность опреде¬
ляют' по культуре тестового микроорганизма, выращенной на
агаризованной среде в чашке Петри. На поверхность агаровой
пластинки помещают комочки почвы и спустя 1—2 суток прове¬
ряют, сформировались ли вокруг них зоны задержки роста. Со¬
держание антибиотика в почве определяют сначала при поста¬
новке опыта и затем через каждые 2—3 суток. В течение этого вре¬
мени почву выдерживают при комнатной температуре или в ин¬
кубационной камере, восполняя по мере надобности испаряющу¬
юся воду. Для создания в термостате увлажненной атмосферы
рекомендуется устанавливать в нем сосуды с водой.12 и. сэги 177
Для исключения влияния биологических инактивирующих
факторов ставится опыт и со стерильной почвой. В этом случае
сохранность антибиотика определяется химическими и физико¬
химическими свойствами почвы. Перед постановкой опыта в поч¬
ву добавляют половину необходимого количества воды, затем
образец перемешивают и стерилизуют в течение двух часов при1 атм. В стерильную почву добавляют оставшуюся часть сте¬
рильной воды, содержащей и антибиотик, смешивают ее с поч¬
вой в стерильных условиях и переносят в стерильные чашки
Петри.Биологическая инактивация в значительной степени зависит
от количества питательных веществ, доступных для почвенных
микроорганизмов. Если в почву необходимо добавить нераство¬
римое в воде вещество (например, целлюлозный порошок), его
следует перемешать с почвой еще до ее увлажнения. Водораст¬
воримый источник углерода, как и антибиотик, растворяют в
добавляемой к почве воде. Добавки органического материала
составляют 1—2% от массы почвы.Контролем служит также почва, не содержащая антибиотика.7.3. Методы изучения токсиновВыше уже отмечалось, что метаболитами отдельных микроорга¬
низмов могут быть и токсины. Красильников [67] относит к
токсинам метаболиты, вызывающие отравления прежде всего
высших животных и растительных организмов и в меньшей сте¬
пени влияющие на микроорганизмы. Например, типичный фито¬
токсин фузариевая кислота ядовита для многих растений уже в
дозах порядка 0,1—5,0 мкг/мл, в то время как рост бактерий не
угнетает и стократная доза этого вещества.Характерную группу микотоксинов составляют афлатоксины,
синтезируемые различными видами грибов (Aspergillus flavus,
A. parasiticus, A. oryzae и т. д.), которые развиваются на поверх¬
ности влажных плесневеющих семян растений, прежде всего
масличных. Афлатоксины — производные кумарина, чрезвычайно
токсичные для человека и животных; более того, согласно но¬
вейшим данным, эти соединения канцерогенны.Некоторые из токсинов ядовиты не только для высших орга¬
низмов, но и для многих микроорганизмов, причем уже в малых
дозах. Такие вещества являются переходными между токсинами
и антибиотиками и могут быть отнесены к обеим группам.7.3.1. Определение токсичности субстратовМикроорганизмы размножают в жидкой культуре. Для культи¬
вирования грибов целесообразно использовать питательную среду
Викерхэма (163) или Беккера [8], актиномицеты удобно выра¬
щивать на глицерин-аспарагиновой среде Кона (81), а бакте¬
рии—на среде Гаузе (80).178
Микроорганизмы культивируют от трех до десяти суток в
зависимости от скорости их роста, а затем фильтрованием на
бумаге отделяют биомассу от культуральной жидкости. При¬
сутствие токсинов определяют по скорости прорастания семян
растений. Красильников рекомендует брать для этого семена с
небольшим содержанием запасных веществ, поскольку их рост в
большей степени зависит от свойств субстрата. Наиболее часто
для тестирования применяют семена белой горчицы, пшеницы и
вики, но хорошие результаты можно получить и на семенах го¬
роха несмотря на то, что они богаты питательными веществами.Предназначенные для тестирования семена 24 часа вымачи¬
вают в фильтрате культуральной жидкости и затем проращива¬
ют в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге, поме¬
щая в-чашки по 15—25 семян в зависимости от их размера. В
целом при постановке опыта целесообразно проращивать не ме¬
нее 100 семян, в этом случае уменьшается погрешность, связан¬
ная с разбросом результатов. Проращивают семена 5—7 суток в
термостате или растильной камере, создавая в них увлажненную
атмосферу. Измеряя длину проростков и корешков, оценивают
токсичность культуральной жидкости. Контролем служат семе¬
на, выдержанные в питательной среде.Если содержание токсинов в исследуемом субстрате настоль¬
ко велико, что процесс проращивания семян полностью подавлен,
следует приготовить соответствующие разведения, которые и
используют для вымачивания семян.В соответствии с другим методом, также предложенным Кра¬
сильниковым, проростки выращивают на содержащем токсин
фильтрате. Для этого отфильтрованную культуральную жид¬
кость или ее соответствующие разведения наливают в химичес¬
кие стаканы емкостью 100 мл, которые сверху обвязывают не¬
плотной нейлоновой тканью. На ткань помещают проросшие се¬
мена, чтобы корешки достигали жидкости; при необходимости в
ткани можно сделать отверстия. Для каждого исследуемого филь¬
трата ставят по четыре параллельных опыта, помещая в каж¬
дый стакан по 10 семян. В течение двух недель растения выра¬
щивают в теплице и затем по длине проростка и корня оценива¬
ют влияние культуральной жидкости на тестовые семена.7.3.2. Определение токсинов в почве7.З.2.1. Тестирование на целлофане
методом КрасильниковаСогласно наблюдениям Красгільникова [68], свободноживущий
азотфиксирующий Azotobacter chroococcum чрезвычайно чувстви¬
телен к токсичным веществам, накапливающимся в почве. Исхо¬
дя из этого, Красильников вместе с сотрудниками разработал
метод определения токсичности почвы с использованием данного
вида бактерий.12* 179
В стерильную чашку Петри заливают безазотистую среду
Эшби (57) или Федорова (77) и после застывания покрывают
ее стерилизованным в автоклаве целлофановым диском такого
же размера. Для того чтобы под целлофаном не образовались
пузырьки воздуха, он должен плотно прилегать к агаровой плас¬
тинке. Затем на целлофан по диаметру чашки помещают четыре
почвенных диска диаметром 10 мм. Для их приготовления мож¬
но с успехом использовать разработанный с участием автора ме¬
тод прессования (стр. 255).Чашки Петри на 24 часа устанавливают в холодильник с
температурой 10 °С. За это время токсин из почвы сквозь цел¬
лофан диффундирует в агар. Затем почвенные диски и целло¬
фан осторожно удаляют с поверхности агара, равномерным сло¬
ем наносят на него суспензию двухсуточной культуры азотобак¬
тера, смытой со скошенного агара, и помещают чашки на инку¬
бацию в термостат при 28 °С. Полученный результат оценивают
после инкубации в течение 48 час. Если на участке агаровой
пластинки, соответствующем положению почвенных дисков, поч¬
ва содержит токсин, на нем формируются зоны задержки роста.7.3.2.2. Выделение токсинов из почвыМетоды выделения токсинов из почвы очень разнообразны. Наи¬
более простой из них —прессование, когда жидкость из влажной
почвы выдавливают почвенным прессом, создающим давление
100 атм, и используют для обработки семян перед проращива¬
нием (стр. 255).Экстракция водой или различными органическими раствори¬
телями — еще один метод выделения токсинов. Для этого наи¬
более часто используют ацетон, метанол, бутанол, бутилацетат.
К навеске почвы добавляют четырехкратный объем растворите¬
ля, смесь встряхивают в течение часа и затем фильтруют на
бумажном фильтре; растворитель упаривают в вакууме. Если
растворителем служит вода, ее достаточно упарить на 'До—•
7зо часть исходного объема. Таким же способом определяют со¬
держание токсинов в воде из лизиметра. При использовании ор¬
ганических растворителей высушенный остаток растворяют в
небольшом количестве этанола и разводят водой. Присутствие
токсинов определяют по интенсивности прорастания семян рас¬
тений или ранее описанным методом лунок (стр. 167). В каче¬
стве тестового микроорганизма целесообразно использовать азо¬
тобактер.7.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ
В КУЛЬТУРАХ МИКРООРГАНИЗМОВВ определенных условиях микроорганизмы синтезируют значи¬
тельное количество тех или иных аминокислот, которые будут на¬
капливаться в окружающем субстрате. В настоящее время это180
свойство микроорганизмов нашло применение при промышлен¬
ном производстве отдельных аминокислот в ферментерах. Одна¬
ко некоторые микроорганизмы не способны к такому синтезу
или продуцируют недостаточное количество ряда аминокислот,
необходимых для их роста. В естественных условиях такие ви¬
ды микробов могут выжить лишь в сообществе с другими мик¬
роорганизмами, которые синтезируют и «поставляют» дефицит¬
ные аминокислоты.7.4.1. Предварительный отбор синтезирующих
свободные аминокислоты микроорганизмов
методом БалицкойНа агаровой пластинке посевом в толщу среды (стр. 41) выра¬
щивают культуру микроорганизмов, выделенных из почвы или
ризосферы. Балицкая рекомендует использовать для этого спе¬
циальную питательную среду (60).После появления на поверхности пластинок колоний отби¬
рают чашки с числом колоний не выше 100. Из хроматографи¬
ческого ватмана вырезают диск, полностью закрывающий ага¬
ровую пластинку, укладывают его на поверхность пластинки в
чашку Петри, спустя час извлекают и просушивают. Затем с по¬
мощью пульверизатора диск опрыскивают 0,2%-ным раствором
нингидрина, как при проявлении хроматограмм на бумаге.В местах соприкосновения бумажного диска с колонией мик¬
роорганизма, синтезирующего свободную аминокислоту, появля¬
ется окрашенное пятно. После идентификации соответствующих
колоний их изолируют и выделяют чистые культуры.Активность продуцирования свободных аминокислот в зна¬
чительной степени зависит от состава питательной среды, поэто¬
му микроорганизмы следует выращивать одновременно на не¬
скольких средах.7.4.2. Хроматографическое определение
свободных аминокислотПри изучении способности микроорганизмов выделять свободные
аминокислоты их культивируют вначале на синтетической среде..
Для этого рекомендованы разработанные японскими учеными
Асаи (56) и Киносита (101) питательные среды, в которых бак¬
терии и дрожжевые грибы инкубируют в течение 4—5, а грибы
и актиномицеты — 6—8 суток. Биомассу и питательный раствор
разделяют центрифугированием и определяют содержание ами¬
нокислот в жидкости.Культуральная жидкость содержит сравнительно немного ами¬
нокислот, поэтому часто возникает необходимость в очистке ис¬
следуемого раствора от соединений, затрудняющих определение
(белки, жиры, неорганические соли). Наиболее удобный способ
очистки — пропускание раствора через колонку с соответствую¬
щей катионообменной смолой. Кислоты и вещества, не несущие
зарядов, не задерживаются в колонке, тогда как аминокислоты181
связываются смолой и затем могут быть элюированы аммиачным
раствором; одновременно из колонки высвобождаются и неорга¬
нические катионы. В дальнейшем аммиачный элюат выпаривают
досуха и обессоливают ацетоном, содержащим 1 % соляной кисло¬
ты. Ацетоновую вытяжку высушивают сухим воздухом, остаток
растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды и два-три раза про¬
мывают такими же объемами эфира. Водный раствор высушивают
в эксикаторе над серной кислотой, остаток растворяют в 100 мл
воды. В дальнейшем используют полученный раствор. Хроматогра¬
фическое исследование аминокислот выполняют обычными химико¬
аналитическими методами.7.4.3. Определение свободных аминокислот в почвеСвободные аминокислоты можно выделить из почвы экстраги¬
рованием. Для этого применяют различные растворы, особенно
часто — 80%-ный этанол.В колбу вносят 50 г почвы и добавляют 75 мл дистиллиро¬
ванной воды. Смесь 30 минут взбалтывают на установке для
встряхивания и затем центрифугированием отделяют почву от
раствора; при необходимости мутный супернатант очищают на
бумажном фильтре. Экстрагирование с добавлением 50 мл дис¬
тиллированной воды повторяют еще раз. Для проведения треть¬
ей и четвертой экстракций вместо воды берут по 50 мл 80%-ного
этанола, встряхивая смесь 20 и 15 минут соответственно. Полу¬
ченные после центрифугирования супернатанты объединяют и
упаривают в вакууме при 30 °С. Сухой остаток растворяют в не¬
большом количестве воды, раствор переносят в делительную во¬
ронку и многократно промывают небольшими порциями эфира
для растворения пигментов, жиров и других веществ, мешающих
хроматографированию. После встряхивания водную и эфирную
фазы разделяют. Водную фазу, содержащую аминокислоты, упа¬
ривают в вакууме при 30 °С, к сухому остатку добавляют под¬
кисленный ацетон, содержащий 1% соляной кислоты, и встряхи¬
вают; выпавшие в осадок соли удаляют центрифугированием.
Совершенно чистый раствор выпаривают в вакууме, твердый ос¬
таток растворяют в 1—2 мл изопропилового спирта и переносят
в небольшую пробирку с пробкой. Содержание аминокислот в
растворе определяют методом восходящей хроматографии.Для хроматографирования берут 30, 50 и 100 мкл раствора.
Содержание аминокислот пересчитывают на 1 г сухой почвы.7.5. СПОСОБНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
СИНТЕЗИРОВАТЬ ВИТАМИНЫСреди метаболитов различных микроорганизмов в большем или
меньшем количестве встречаются и витамины. Их продуцирова¬
ние имеет важное экологическое значение, так как многие мик¬
роорганизмы не способны синтезировать те или иные витамины
и могут существовать в почве лишь в сообществе с группами182
микроорганизмов, продуцирующих соответствующие соединения
в избытке и выделяющих их в субстрат. Таким образом, синтез
витаминов (как антибиотиков и аминокислот) может в значи¬
тельной мере влиять на видовой состав сообществ почвенной
микрофлоры и па условия их обитания. Кроме того, продуциру¬
емые микроорганизмами витамины в естественных условиях мо¬
гут влиять на развитие высших растений.7.5.1. Определение отдельных витаминов группы В
методом ОдинцовойВ опытах используют тестовые микроорганизмы, неспособные
продуцировать данный витамин и развивающиеся в зависимос¬
ти от его содержания в специальной питательной среде. Ско¬
рость роста тестового микроорганизма можно определить грави¬
метрическим или нефелометрическим методом. Полученные дан¬
ные сопоставляют со стандартной кривой, отражающей скорость,
роста микроорганизма при известном содержании витамина, и
таким образом рассчитывают его количество в субстрате.Микробиологические методы определения витаминов намного
проще химических. Единственным источником ошибки этих ме¬
тодов может служить присутствие в исследуемом субстрате, по¬
мимо витаминов, значительных количеств других метаболитов,,
способных стимулировать или угнетать рост тестового микроор¬
ганизма. В связи с этим целесообразно контролировать влияние
субстрата на тестовый микроорганизм методом лунок (стр. 167).Успех определения витаминов микробиологическими метода¬
ми зависит от чувствительности и скорости роста тестового ми¬
кроорганизма, а также от простоты избранного метода. При
проведении подобных исследований обычно используют отдель¬
ные виды молочнокислых бактерий (Lactobacillus), многие штам¬
мы которых не способны синтезировать тот или иной витамин.
Одинцова [114] разработала метод определения витаминов, ос¬
нованный на использовании в качестве тестового организма
дрожжевых грибов. Большим преимуществом данного метода
является его простота и надежность. Необходимую питательную
среду можно приготовить быстро и без затруднений, для этого
не нужны сложные соединения.Метод Одинцовой можно применять для выявления мезоино-
зита, биотина, пантотеновой и никотиновой кислот, тиамина
(аневрина), пиридоксина. С этой целью используют следующие
дрожжевые культуры: Saccharomyces carlsbergiensis (Carls¬
berg)— для определения мезоинозита, Zygosaccharomyces mon¬
goliens (Saito)—для биотина, Saccharomyces cerevisiae (ленин¬
градский штамм) — для пантотеновой кислоты, Debaryomyces dis-
porus (Beijerinck) Dekker — для пиридоксина и тиамина, Zygo¬
saccharomyces marxianus № 735 — для никотиновой кислоты.Перечисленные дрожжевые культуры на агаре с солодом
плотностью 7 °С хранят в холодильнике при 10 °С, проводя еже¬
месячно пересевы.183
При исследованиях используют питательную среду, рекомендованную Один¬
цовой (125). Важнейшее условие, которое необходимо соблюдать в процессе ее
приготовления, — высокая степень чистоты посуды и химикатов, поскольку имен¬
но от этого главным образом зависит успех эксперимента. В качестве источника
энергии для микроорганизмов используют исключительно глюкозу производства
фирмы «Дифко», не содержащую витаминов.Питательную среду разливают в предварительно стерилизованные и закры¬
тые ватной пробкой пробирки, в каждую из которых в стерильных условиях
вносят 3 мл раствора. Практика показала, что эту операцию наиболее удобно
проводить с помощью особой лабораторной бюретки. Предварительно упакован¬
ную в бумагу и стерилизованную в автоклаве бюретку закрепляют на штативе
подвижным зажимом. В стерильных условиях в бюретку заливают питательный
раствор и переворачивают ее; таким образом, раствор можно дозировать, не
опасаясь заражения среды при разливании по пробиркам. Верхнее отверстие бю¬
ретки закрывают ватной пробкой.После разлива питательной среды приступают к приготовлению основных
растворов витаминов. В пробирки, содержащие 10 мл стерильной дистиллиро¬
ванной воды, вносят приготовленные из чистых кристаллических препаратов на
аналитических весах навески следующих витаминов: 50 г мезоинозита, 25 мг
пантотеновой кислоты, 50 мг никотиновой кислоты, 25 мг пиридоксина, 10 мг
тиамина, 0,01 мг биотина. Столь незначительное количество биотина можно от¬
мерить путем разведения более концентрированного раствора. Полученные ос¬
новные растворы 10 минут кипятят на водяной бане.Для определения витаминов из основных растворов готовят
смеси, которые должны быть дефицитными по определяемым ви¬
таминам. По 1 мл каждого из основных растворов вносят в
стерильную пробирку и доводят объем до 10 мл. В каждую из
пробирок с питательной средой добавляют по 0,1 мл приготов¬
ленной витаминной смеси. Из основного раствора определяемого
витамина также отбирают 1 мл, добавляют такое же количест¬
во стерильной дистиллированной воды и разводят далее — до
10-кратного разведения. Эта серия разведений служит для по¬
строения калибровочной кривой. Из каждого разведения отби¬
рают 0,1 мл раствора и переносят его в пронумерованные соот¬
ветственно разведению пробирки, содержащие дефицитную по
витамину смесь и 0,1 мл отфильтрованной культуральной жид¬
кости. В случае надобности последнюю также разводят.После внесения витаминной смеси, разведения определяемо¬
го витамина (для построения калибровочной кривой) и фильтра¬
та культуральной жидкости готовят дрожжевую суспензию для
посева в питательную среду. Петлей для посева отбирают не¬
большое количество двухсуточной дрожжевой культуры, выра¬
щенной на мальтозном агаре, и переносят его в пробирку, со¬
держащую 10 мл стерильной дистиллированной воды. Для сус¬
пендирования клеток петлю для посева прижимают к стенке
пробирки примерно на 10 мм выше уровня воды, оставляя кусо¬
чек культуры размером с булавочную головку. Затем петлю из¬
влекают и прокаливают, вновь вводят в пробирку, растирают
культуру по стенке с небольшим количеством воды и смывают в
воду. Вращая пробирку между ладонями, материал равномерно
суспендируют в жидкости. Следует отметить, что при определе¬
нии тиамина готовят очень разбавленную суспензию клеток
Debaryomyces disporus, который пригоден также для определения184
пиридоксина. В первом случае 1 мл суспензии содержит около
3000 клеток, во втором — несколько больше. При приготовлении
суспензий нужно избегать условий, вызывающих помутнение
жидкости. В культуральную жидкость нельзя вносить много
клеток, так как вместе с суспензией в нее может попасть и ви¬
тамин из питательной среды.При посеве в каждую пробирку вносят 1 каплю суспензии,
пробирки устанавливают в термостат в наклонном положении.
Для этого наиболее удобны штативы, предназначенные для при¬
готовления скошенного агара. В результате культура имеет
большую площадь соприкосновения с воздухом и дрожжи раз¬
множаются быстрее. Период инкубации в термостате при
30 °С — 48 часов.По окончании инкубации методом нефелометрии измеряют по¬
казатели светопоглощения культур, выращенных с целью по¬
строения калибровочной кривой. Если культура слишком густа,
содержимое всех пробирок следует соответствующим образом
разбавить. Как и при проведении фотоколориметрических изме¬
рений, в данном случае можно использовать лишь среднюю, вос¬
ходящую часть калибровочной кривой. Сравнение степени по¬
мутнения исследуемого субстрата не следует проводить по верх¬
ним и нижним участкам, переходящим в плато. В подобных
случаях опыт необходимо повторить с учетом поправки на ко¬
личество внесенного фильтрата. Определение проводят в четы¬
рех параллельных опытах, полученные результаты пересчитыва¬
ют на 1 мл субстрата.7.5.2. Определение витаминов в почвеМетод Одинцовой, пригодный также для определения содержа¬
ния в почве свободных и связанных витаминов, был несколько
модифицирован Красильниковым с сотр.Для определения содержания свободных витаминов в сосуд
с 20 г почвы добавляют 80 мл дистиллированной воды и поме¬
щают его на водяную баню температурой 100 °С. В процессе ча¬
совой термообработки содержимое сосуда многократно взбал¬
тывают. Затем суспензию фильтруют через бумажный фильтр.
При необходимости фильтрование повторяют многократно до
получения чистого фильтрата. Фильтрат переливают в чистую
колбу, закрывают ее ватной пробкой и стерилизуют 20 минут
при 1 атм. Затем 1 мл фильтрата вносят в описанный выше рас¬
твор, дефицитный по соответствующему витамину. С целью по¬
лучения калибровочной кривой берут соответствующее количест¬
во дистиллированной воды.Для определения общего содержания витаминов в почве не¬
обходимо высвободить связанные витамины. С этой целью поч¬
венную суспензию подвергают автолизу, в результате которого
в раствор переходят молекулы витаминов, содержащихся в клет¬
ках почвенных микроорганизмов.185
Суспензию 20 г почвы в 80 мл воды в течение четырех су¬
ток выдерживают в сушильном шкафу при 48 °С, по мере надоб¬
ности восполняя испаряющуюся воду. Дважды в день к суспен¬
зии добавляют по две капли толуола, в результате температура
суспензии значительно повышается. По завершении автолиза
суспензию стерилизуют 30 минут при 1 атм и затем фильтруют
через бумажный фильтр. Все дальнейшие операции остаются
неизменными.7.6. СИНТЕЗ ГИББЕРЕЛЛИНОВГиббереллины представляют собой биологически активные со¬
единения, влияющие на метаболические процессы высших расте¬
ний, но не действующие на микроорганизмы. Прежде всего они
влияют на метаболизм соединений углерода и азота, в частнос¬
ти ускоряют рост растений, стимулируют цветение, способству¬
ют удлинению растительных клеток. Гиббереллины выводят
почки из состояния покоя, обработка ими заменяет яровизацию
тех растений, для развития которых необходимо воздействие
низких температур. По имеющимся данным, из микроорганиз¬
мов способностью синтезировать значительные количества гиб-
береллинов обладает только Fusarim moniliforme Sheld — гриб,
паразитирующий на растениях.Для определения гиббереллинов применяют физико-химичес¬
кие и биологические методы. Последние основаны на явлениях
удлинения междоузлий и ускорения роста растений под дейст¬
вием гиббереллинов. Для биологического тестирования применя¬
ют как целые растения, так и отдельные их части. Определение
основано на существовании линейной зависимости между увели¬
чением размеров растений или их частей и логарифмом концен¬
трации гиббереллина. Контрольную калибровочную кривую стро¬
ят с учетом воздействия известных концентраций гиббереллина.Агнистикова и Муромцев [105] определяли концентрацию
гиббереллина в культуральной жидкости, наблюдая стимуля¬
цию развития проростков гороха сорта Пионер. С этой целью
одинаковые по размеру семена проращивали на фильтровальной
бумаге при 24°С в течение 2—3 суток. Затем проросшие кореш¬
ки удаляли, семена разрезали и для тестирования отбирали по¬
ловинки с зародышами. В чашке Петри готовили пластинку
0,5%-ного водного агара, помещали на него отобранные поло¬
винки семян и на каждый эпикотиль наносили по капле (0,5 мкл)
исследуемого раствора; в контроле раствор заменяли водой.Чашки на 60 часов помещали в термостат при температуре24 °С. После инкубации проростки отделяли от семян и измеря¬
ли их длину. Для каждого опыта рекомендуется брать 25—50
семян; результат выражают в виде среднего значения.Другие авторы определяют концентрацию гиббереллинов
по удлинению гипокотиля огурцов [11] или салата [2].
8ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
МИКРООРГАНИЗМОВ
И ВЫСШИХ РАСТЕНИИВ литературе обычно отмечают четыре основные формы взаимо¬
действия высших растений и микроорганизмов. Одна из них
представлена симбиозом бобовых растений и азотфиксирующих
клубеньковых бактерий, рассмотренных при изложении механиз¬
ма биологической фиксации атмосферного азота (стр. 152). В
последнее время установлено, что в клубеньках на корневой си¬
стеме многих других, прежде всего древесных растений также
обитают азотфиксирующие бактерии. Другая характерная фор¬
ма симбиоза — микориза, образуемая грибами и корнями де¬
ревьев. К третьему типу относят влияние микроорганизмов, кон¬
центрирующихся в ризосфере растений и покрывающих поверх¬
ность их корней. В формировании четвертого типа взаимодейст¬
вия участвуют эпифитные микроорганизмы, поселяющиеся на
надземных частях растений и утилизирующие различные их
выделения.Исследованиями в области физиологии растений давно установ¬
лено, что через корневую систему высшие растения выделяют
в почву различные органические вещества. За вегетационный пе¬
риод количество таких выделений может достигать 5% массы
растения. Значительную их часть составляют органические кис¬
лоты, в частности яблочная, янтарная, виннокаменная, лимон¬
ная, фумаровая и щавелевая. Корневые выделения содержат
также различные сахара, нуклеотиды, аминокислоты и амиды.
Существуют большие различия в количественном и качествен¬
ном составе корневых выделений отдельных видов растений.Корневые выделения — это превосходный источник пита¬
тельных веществ для микрофлоры, что и обусловливает концент¬
рирование микроорганизмов на поверхности корней.Термин «ризосфера» был предложен в 1904 г. Хилтнером. В
зарубежной специальной литературе различают понятия «ризо-
плана», под которой понимают непосредственно зону поверхнос¬
ти корней, и «ризосфера»; в более широком понимании это зо¬
на, включающая прилегающие к корневой поверхности частицы
почвы.8.1. ИЗУЧЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
ПРИКОРНЕВОЙ ЗОНЫ РАСТЕНИЙ187
Микроорганизмы, обитающие в прикорневой зоне, представ¬
лены видами, которые интенсивно продуцируют витамины, ами¬
нокислоты, гетероауксины и ферменты и поэтому оказывают
определенное влияние на развитие растений. В ризосфере также
встречается сравнительно большое количество антагонистов,
препятствующих размножению патогенных видов в прикорневой
зоне.Обладая рядом положительных свойств, микроорганизмы ри¬
зосферы могут в то же время участвовать в некоторых нежела¬
тельных процессах. В частности, они могут поглощать питатель¬
ные вещества, вносимые с удобрениями, что приводит к повы¬
шенному расходу последних. Кроме того, значительная часть не¬
спороносных ризосферных микроорганизмов восстанавливает
азотистые соединения до элементарного азота, и это сопровож¬
дается потерей части питательных веществ.8.1.1. Прямые методы изучения микроорганизмов
прикорневой зоныВпервые присутствие микроорганизмов на поверхности корневых
волосков обнаружили Том и Хумфельд [154]. Для их изучения
пригодны первичные корешки многих растений, в частности кле¬
вера, люцерны, пшеницы и т. д. Семена растений проращивают,
затем срезают корешки и с помощью кисточки переносят их в
чашку Петри со стерильной водой, сюда же смывая частицы
почвы с поверхности корешков. Затем корешки окрашивают
разведенным в 10 раз водным раствором метиленового синего
(44). В результате клетки микроорганизмов приобретают свет¬
лосиний цвет, а растительные ткани остаются бесцветными. Рем-
пе и Сорокина [127] помещают промытые и измельченные ко¬
решки на 30—40 секунд в раствор метиленового синего и затем
1—2 минуты выдерживают в стерильной воде. Березова реко¬
мендует дополнительное окрашивание кусочков корешков в те¬
чение двух минут в растворе эозина. Такая обработка облегча¬
ет изучение локализации микроорганизмов на поверхности кор¬
ней.Изучение локализации микроорганизмов ризосферы на поверх¬
ности корней можно с успехом проводить методом стекол обра¬
стания Холодного—Росси. При высеве семян в почву помещают
стеклянные пластинки, так чтобы корешки росли вдоль их по¬
верхности. Спустя определенное время пластинки извлекают,
окрашивают карболовым эритрозином (18) и микроскопируют.Для проведения микробиологического анализа корневой си¬
стемы растений Красильников применял специальные вегетаци¬
онные садки (рис. 49). Как видно из рисунка, одной из стенок
этого узкого прямоугольного садка является съемная стеклян¬
ная пластина. Садок заполняют землей или песком и после вы¬
сева семян устанавливают под углом 45° стеклянной стенкой188
Рис. 49. Садки Красильникова для изучения микроорганиз¬
мов, обитающих в корневой зоне растений.вниз. В этом случае корни растений плотнее прилегают к внут¬
ренней поверхности стекла.В садке Красильникова очень удобно размещать и предмет¬
ные стекла по методу Холодного—Росси. Для этого садки с
растениями укладывают на стол стеклянной стенкой вверх,
снимают ее и в соответствующем месте помещают на корни
предметное стекло. Затем вновь устанавливают стеклянную
стенку и продолжают выращивать растения. Спустя определен¬
ное время предметные стекла извлекают (при необходимости
устанавливая новые) и после окрашивания изучают под микрос¬
копом организмы, расположенные вокруг отпечатка корня (стр.
221). Перед укладкой предметного стекла на корни его поверх¬
ность можно покрыть тонким слоем питательного агара, фильт¬
ровальной бумагой или целлофаном.8.1.2. Непрямые методы исследования
микроорганизмов ризосферы8.1.2.1. Изучение микроорганизмов прикорневой зоныПрикорневая зона включает прилегающий к корням слой почвы
толщиной 5—10 мм. Растение еще способно влиять на количе¬
ственный и качественный состав обитающих здесь микроорга¬
низмов, но значительно слабее, чем на микроорганизмы, живущие
непосредственно на поверхности корней. Красильников [69, 70]
рекомендует следующий метод изучения этих микроорганизмов.Растение извлекают из почвы вместе с корнями и оставшей¬
ся на них почвой. Стерильным пинцетом и ножницами срезают
отдельные корни, счищают частицы почвы и собирают их в сте-189
рильную чашку Петри. Для получения усредненного образца це¬
лесообразно собирать почву с поверхности корней нескольких
растений. Почву перемешивают на стерильном часовом стекле
и навеску в 1 г суспендируют в 100 мл стерильной водопровод¬
ной воды. Параллельно с этим определяют влажность почвы.
Затем готовят серию разведений почвенной суспензии в отноше¬
нии 1 : 10. Методом посева в толщу среды определяют количе¬
ство и состав микроорганизмов различных групп в отдельных
разведениях. Определение бактерий проводят на питательном
агаре (123), актиномицетов — на казеино-глюкозном агаре (94),.
а микроскопических грибов — на питательной среде Мартина,
содержащей бенгальский розовый и стрептомицин (116).Культуры наиболее часто встречающихся микроорганизмов
пересевают, очищают и определяют их видовую принадлежность.8.1.2.2. Методы исследования микроорганизмов,
обитающих на поверхности корнейСуществуют различные методы культивирования микроорганиз¬
мов, живущих в контакте с поверхностью корней (микроорганиз¬
мов ризопланы). Общим для всех методов является прежде
всего удаление с корней почвы и затем отделение с их поверх¬
ности микроорганизмов.Культивирование микроорганизмов ризопланы методом Бере¬
зовой. Корневую систему растения извлекают из почвы, в сосу¬
де с водопроводной водой размачивают прилипшие к корням
частицы почвы, еще 2—3 раза переносят в сосуды с чистой водо¬
проводной водой, а затем несколько раз промывают в стериль¬
ной воде. Очищенные таким образом корни измельчают стери¬
лизованными спиртовым факелом пинцетом и ножницами и по¬
мещают в стерильную чашку Петри. На стерилизованном горя¬
щим спиртом часовом стекле взвешивают 5 г корней, растирают
их в стерильной фарфоровой ступке и, соблюдая стериль¬
ность, смывают водой в колбу емкостью 200 мл с таким расче¬
том, чтобы объем суспензии составил 50 мл. Суспензию встряхи¬
вают в течение пяти минут. Если в воду внести 5 г кварцевого
песка, микроорганизмы легче отделяются от поверхности корней.
Затем 5 мл жидкости переносят в другую колбу, содержащую
45 мл стерильной воды. Повторив эту процедуру несколько раз,
получают серию 6—7 разведений, которые высевают на поверх¬
ность или в толщу агаровой питательной среды. Для первого
посева берут 0,1 мл суспензии, для последнего — 1 мл.После инкубации подсчитывают колонии бактерий, актиноми¬
цетов и грибов. Для количественного определения ризосферных
бактерий используют питательный агар (123), число актиноми¬
цетов определяют на казеино-глюкозном агаре (94), а грибов —
на питательной среде Мартина (116). Содержание микроорга¬
низмов пересчитывают на 1 г абсолютно сухих корней.190
При выкапывании растения значительная часть корней оста¬
ется в почве. Если для исследования необходима вся корневая
система, растения выращивают в специальных сосудах, из ко¬
торых можно извлечь корни полностью. Для этой цели Березо¬
ва [9] рекомендует применять прямоугольные пластмассовые со¬
суды сечением 100x100 мм и высотой 180 мм, одну из сторон
которых образует съемная стеклянная пластина; сосуд заполня¬
ют почвой или кварцевым песком. Семена растений высевают
непосредственно у стекла, чтобы можно было наблюдать за
развитием корней. После инкубации стекло удаляют, и растение
извлекают вместе со всей почвой, которую затем смывают. Даль¬
нейший ход исследования остается неизменным, т. е. корни рас¬
тирают, готовят серию разведений корневой суспензии и опреде¬
ляют число колоний, выросших на питательных средах.Изучение микроорганизмов ризопланы методом Теппер.
Растение выкапывают вместе с прилипшими к корням кусочка¬
ми почвы. Стерильными ножницами и пинцетом отделяют 1 г
молодых корней примерно одинаковой толщины вместе с части¬
цами почвы. Корни помещают в 100 мл стерильной водопровод¬
ной воды и встряхивают в течение двух минут. Затем изготов¬
ленным из бактериологической петли стерильным крючком их
извлекают из воды и переносят в другую колбу, также содержа¬
щую 100 мл стерильной воды. Содержимое колбы встряхивают
в течение двух минут и вновь повторяют ту же процедуру, по¬
следовательно промывая корни в семи колбах. В последнюю
(седьмую) колбу вносят 5 г кварцевого песка, стерилизованно¬
го вместе с водой. Воду, оставшуюся в отдельных колбах после
промывания корней, высевают на различные питательные среды
[питательный агар (123), агар Чапека (70), казеино-глюкозный
агар (94), питательную среду Мартина (116)]. Для этого 0,1 мл
суспензии высевают на поверхность застывшей агаровой плас¬
тинки или 1 мл суспензии смешивают с еще не застывшей сре¬
дой.При последовательных промываниях число микроорганизмов
в воде закономерно не уменьшается, наоборот, их количество
может возрасти. В то же время видовой состав микроорганиз¬
мов претерпевает значительные изменения. Суспензия первого
промывания дает на питательной среде главным образом круп¬
ные колонии спороносных бацилл. С каждым промыванием со¬
держание этих бактерий уменьшается, но в то же время возрас¬
тает число типичных неспороносных ризосферных бактерий
(Pseudomonas, Arthrobacter, Flavobacterium, Mycobacterium vit. д.)
Типичных представителей микроорганизмов, обитающих на по¬
верхности корней, можно обнаружить в воде шестого и седьмо¬
го промывания, они образуют колонии небольших размеров. Ма¬
териал колоний различной окраски, морфологии и консистенции
пересевают, культуры очищают и определяют их видовую при¬
надлежность. Таким образом сравнивают микрофлору на корнях
различных растений.191
Метод Теппер позволяет проводить и количественный анализ
микроорганизмов, обитающих в прикорневой зоне и на поверх¬
ности корней. С этой целью вначале определяют содержание
клеток в воде первого промывания, а воду 2—7-го промывания
сливают в один сосуд, смешивают и готовят серию разведений.
Прежде чем приступить к приготовлению серии разведений 1 :
: 10, исходную суспензию встряхивают в течение пяти минут.
Описанным выше методом (стр. 104) подсчитывают колонии
бактерий, грибов и актиномицетов, выросших на агаровых плас¬
тинках. Число микроорганизмов, обнаруженных в воде первого
промывания, пересчитывают на 1 г абсолютно сухой почвы, а
количество клеток в воде 2—7-го промываний — на 1 г абсолют¬
но сухих корней.8.1.2.3. Эффект ризосферы и его расчетВведенное Кацнельсоном [54] понятие «эффект ризосферы», или
«ризосферный коэффициент», означает соотношение между ми¬
кроорганизмами ризосферы и микрофлорой почвы, не содержа¬
щей корней растений. Это соотношение может быть выражено
как количественными, так и таксономическими или физиологиче¬
скими показателями. Ризосферные и в узком понимании почвен¬
ные микроорганизмы сравнивают также по их способности синте¬
зировать витамины, продуцировать антибиотики и т. д.Для численного выражения эффекта ризосферы число микро¬
организмов, обитающих в ризосфере, делят на число микроор¬
ганизмов, живущих в почве. Например, если 1 г почвы содержит1,00 миллионов микроорганизмов, а 1 г корней несет 500 миллио¬
нов клеток, определенных методом Теппер, эффект ризосферы
будет равен 5 (500 000 000: 100 000 000).8.1.2.4. Исследование корневых выделенийСемена стерилизуют поверхностно (стр. 214) и затем проращи¬
вают на пластинке питательного агара; оказавшиеся нестериль¬
ными семена удаляют.Проросшие семена помещают в закрытые ватой пробирки на
стерильный кварцевый песок, который перед стерилизацией был
пропитан растворами Гелльригеля (85) или Кнопа (102). Про¬
бирки с семенами устанавливают в штатив и помещают в теп¬
лицу или в иное хорошо освещенное место. Испарившуюся воду
и запасы питательных веществ в песке еженедельно восполняют.Когда растение в пробирке достигнет определенных разме¬
ров, его извлекают из песка и корневую систему многократно
промывают стерильной дистиллированной водой, собирая ее в
один сосуд. Песок также многократно промывают стерильной
дистиллированной водой, чтобы растворить оставшиеся в нем
корневые выделения. Всю воду после промывания сливают в од¬
ну емкость, остатки корней отделяют фильтрованием или цент¬192
рифугированием. Путем упаривания воды под вакуумом из все¬
го ее объема, затраченного на промывание 10 растений, получа¬
ют 1 мл жидкости.Содержание в полученном концентрате различных органиче¬
ских кислот и аминокислот, сахаров и других соединений опре¬
деляют методом хроматографии.Перед хроматографированием веществ, дающих реакцию с
нингидрином, вытяжку необходимо обессолить, поскольку рас¬
твор содержит значительное количество входящих в состав пи¬
тательной смеси солей, присутствие которых может осложнить
хроматографирование. Обессоливание выполняют следующим об¬
разом: к вытяжке добавляют такой же объем фенола и полу¬
ченную смесь встряхивают. Феноловую фракцию сливают, сме¬
шивают с равным объемом эфира и двумя объемами дистилли¬
рованной воды и снова встряхивают. Затем обессоленную водную
фазу, содержащую аминокислоты, упаривают под вакуумом и
растворяют в 0,1 н. растворе НС1.Для определения аминокислот рекомендован метод двухмер¬
ной хроматографии. В качестве первого элюента можно исполь¬
зовать 80%-ный раствор фенола, а второй этап хроматографи¬
рования проводят смесью бутанола, уксусной кислоты и воды
(50:10:10). Для хорошего разделения второе хроматографиро¬
вание должно длиться не менее 22 часов.Стандартные образцы аминокислот растворяют в 0,1 н. НС1;
пятна аминокислот проявляют, опрыскивая хроматограмму
0,2%-ным спиртовым раствором нингидрина.Содержание сахаров можно определить одномерной хрома¬
тографией обессоленного экстракта. Для этого на хроматогра¬
фическую пластинку наносят стандартные растворы сахаров из¬
вестной концентрации рядом с различными дозами экстракта.
После хроматографирования пластинку высушивают на воздухе,
опрыскивают анилинфталатом и сушат 10 минут при 105 °С. За¬
тем хроматограмму опрыскивают 0,2 н. раствором НС1, содер¬
жащим 2% орцина, подсушивают на воздухе и 1—2 минуты вы¬
держивают в сушильном шкафу при 90 °С.После первого опрыскивания проявляются пентозы, альдо-
гексозы и целлобиоза. В результате второго опрыскивания в
яркожелтый цвет окрашиваются кетозы или кетонсодержащие
сахара.8.2. ГРИБЫ, ОБРАЗУЮЩИЕ МИКОРИЗУМолодые корневые волоски деревьев основных лесных пород,
участвующие в поглощении питательных веществ из почвы, ок¬
ружены сплетением гиф грибного мицелия. Гифы способны про¬
никать в корень, чаще всего в межклетные ходы, но иногда про¬
никают и в клетки тканей корня. В середине прошлого века Хар-
тиг считал, что это явление связано с заселением деревьев па¬
разитическими грибами. Спустя более двух десятилетий благо¬
даря работам Каменского и главным образом Франка стало из¬13 й. Сэги 193
вестно, что в данном случае речь идет не о паразитировании, а
о симбиозе. Грибокорень, сформировавшийся в результате физи¬
ологического взаимодействия грибного мицелия и корня расте¬
ния и отличающийся от обычного корня и морфологически и
функционально, Франк назвал микоризой. Позднее понятие
«микориза» в переносном смысле употребляли и для обозначе¬
ния существования физиологической связи между грибами и рас¬
тениями.Участие грибов в корневом питании растений распространено
очень широко и встречается даже у мхов и папоротников, хотя
оми, строго говоря, не имеют корневой системы. По мнению Хен-
нига [42], около 80% видов высших растений вступает или спо¬
собно вступать в симбиоз с грибами. Разнообразие и физиологи¬
ческие особенности партнеров, а также изменьчивость условий
среды привели к образованию различных морфологических и
физиологических типов микоризы. Основной критерий их клас¬
сификации— это характер морфологических изменений, связан¬
ных с обменом веществ между клетками корня и мицелием гри¬
ба. Франк различает два главных типа микоризы: эктотрофную
и эндотрофную. В эктотрофной микоризе гриб образует вокруг
молодого корня густое сплетение гиф, так называемую мантию.
На таких корнях корневые волоски или отсутствуют, или их ма¬
ло, и в этом случае питательные вещества из почвы извлекает
мицелий гриба. Выходящие из мантии гифы разветвляются в
почве, а часть их проникает в корень, и в межклеточных ходах
наружного слоя корковой паренхимы образуется так называемая
сеть Хартига, через которую идет обмен веществ между грибом
и растением. В микоризе эндотрофного типа мицелий не обра¬
зует вокруг корня плотной мантии, а грибные гифы проникают
не только в межклетники, но и в сами клетки; в результате
большая часть обмена веществ осуществляется внутриклеточно.
В 30-х годах Мелин выделил еще один, переходный тип — экт-
эндотрофную микоризу. Для нее характерен грибокорень, мор¬
фологически близкий к эктотрофному, но гифы иногда проника¬
ют и в клетки растения. Не претендуя на строгость обобщения,
можно сказать, что эктотрофная и эктэндотрофная микоризы ха¬
рактерны для древесных, а эндотрофная — для травянистых
растений.Большинство исследователей считают, что эктотрофная и
эктэндотрофная микоризы выгодны для обоих партнеров и име¬
ют большое практическое значение. Поэтому в дальнейшем из¬
ложении будут рассмотрены методы изучения именно этих типов
микоризы.8.2.1. Методы исследования грибов,образующих эктотрофную микоризуОдновременно с открытием микоризы возник вопрос: какие гри¬
бы и с какими растениями вступают в симбиоз? Поначалу ответ
пытались получить при изучении внешних и внутренних морфо¬194
логических особенностей микоризы, полагая при этом, что они
в решающей степени зависят от партнеров.Определение систематического положения одного из партне¬
ров симбиоза — гриба может оказаться довольно трудной зада¬
чей. Точное определение грибов возможно лишь по их плодовым
телам. Наблюдая в естественных условиях за частотой соседст¬
ва плодовых тел грибов с деревьями, в ряде случаев можно сде¬
лать вывод о симбиозе данного гриба с данным видом дерева.
Однако проследить развитие гиф от плодового тела гриба до
корней растений очень трудно и удается лишь в редких случа¬
ях, поэтому совершенно естественными были попытки решения
данного вопроса путем изучения морфологических особенностей
собственно грибокорня. Такие исследования были направлены
прежде всего на выявление характера ветвления микоризы и
строения мантии, образованной грибными гифами.Грибокорень легко извлекают лопаткой из верхнего слоя лес¬
ной почвы толщиной около 20 см. В более глубоких слоях поч¬
вы микориза встречается реже. Среди корней, осторожно очи¬
щенных от кусочков почвы и прочих загрязнений, можно без
труда обнаружить молодые грибокорни. Особенно хорошо они
видны при наблюдении в ручную лупу или препаровальный ми¬
кроскоп небольшого увеличения (50—60Х). При микроскопирова-
нии корни помещают на предметное стекло в каплю воды или
глицерина.При исследовании сразу бросается в глаза, что на молодых
грибокорнях обычно нет корневых волосков, а сами корни не¬
сколько короче и толще обычных. На более взрослых, опробко-
вевших участках корня сплетение гиф отсутствует. Молодые
корни имеют характерное ветвление.Мелин [85], изучая форму микоризы, установил, что для микоризы сосны
наиболее типично дихотомическое ветвление. В процессе роста дихотомические
разветвления могут повторяться, образуя своеобразную метелку. Цвет такой ми¬
коризы меняется с возрастом от светло- или желтокоричневого до темнокорич¬
невого, почти черного. Иногда встречается микориза других цветов — грязно¬
желтого, белесого, розового, синеватого или фиолетового. В некоторых случаях
по-разному окрашены отдельные участки одной и той же микоризы. Мелин не
исключает возможности того, что различную окраску микоризе придают мице¬
лии разных грибов, но с другой стороны грибы могут быть окрашены и одина¬
ково.Совсем по-иному выглядит клубеньковая микориза сосны, состоящая из
гроздевидных скоплений ворсистых вздутий размером 3—5 мм. Она также имеет
дихотомическое ветвление, но разветвления здесь очень коротки и полностью
покрыты мантией. По мнению Мелина, такой тип микоризы образуют предста¬
вители Boletus.Простая, но ветвящаяся микориза сосны часто представляет собой молодую
форму дихотомической микоризы, но в отдельных случаях она не образует от¬
ветвлений и с возрастом, достигая длины до 10 мм.Для ели наиболее характерна моноподиальная форма ветвления. Боковые
ветви центральной оси развиваются акропетально, в результате наиболее взрос¬
лые ответвления являются и самыми длинными. В некоторых случаях взрослые
отростки ветвятся моноподиально, образуя так называемую гроздевидную форму.
Помимо ели, такая микориза встречается и на видах Abies, Larix, Fagus, Betula,13* 195
Quercus. Окраска ее может быть столь же разнообразной, как и у дихотомиче¬
ской микоризы сосны.Толщина мантии может широко варьировать. Обычно она из¬
меняется от 10—20 до 50 мкм, но у клубеньковой микоризы до¬
стигает и 200 мкм. Различные грибы образуют мантию разной
толщины, но это в значительной степени зависит и от экологи¬
ческих факторов: при неблагоприятных условиях мантия может
почти полностью отсутствовать.Строение мантии также может быть самым различным. Час¬
то она состоит из плотного сплетения толстых (4—8 мкм) гиф
псевдопаренхимы, которая на периферии постепенно становится
все более рыхлой и наконец разделяется на тонкие (2—5 мкм)
гифы, уходящие в почву. Во многих случаях поверхность псев¬
допаренхимы выглядит гладкой, но под микроскопом видны поч¬
венные гифы.Из мантии в почву иногда отходят пучки гиф, имеющие ха¬
рактерное строение: в центре расположены более толстые (око¬
ло 10 мкм) проводящие гифы, а вокруг них — тонкие (около2 мкм) гифы, которые также образуют уходящие в почву от¬
ветвления.На поверхности мантии видны цистиды и другие образова¬
ния. Толщину и тонкую структуру мантии целесообразно изу¬
чать в срезах при большом увеличении.Следует помнить, что наряду с характерными формами
встречаются самые разнообразные микоризы, различающиеся
как по толщине, строению и поверхности мантии, так и по
строению выходящих из нее гиф и пучков.Форма микоризы зависит от вида партнеров, вирулентности
гриба, особенностей почвы и иных условий. Согласно выводам
Траппе [159], в факультативном или облигатном формировании
эктомикоризы могут участвовать 525 видов грибов и почти 280
видов деревьев; кроме того, известно свыше 1500 комбинаций
деревьев и грибов. Большая часть микоризных грибов относит¬
ся к базидиомицетам и аскомицетам.Наблюдения в естественных условиях очень осложнены тем
обстоятельством, что одно дерево может вступать в симбиоз со
многими видами грибов, а один гриб — со многими видами де¬
ревьев. Об узкой избирательности в этом отношении говорить
нельзя, за исключением симбиоза сосны и Suillus grevillei.Предпринято много попыток систематизации эктотрофной
микоризы, характеризующейся почти бесконечным разнообрази¬
ем форм. Наиболее известна система Доминика [22]. На осно¬
вании внешних морфологических признаков он выделяет 12 под¬
типов, которые, в свою очередь, подразделяются на 1—8 «ро¬
дов». Эта система совершенно искусственна, поскольку к одно¬
му «роду» относятся разные в таксономическом отношении не¬
родственные грибы, и в то же время один и тот же гриб может
входить сразу в несколько «родов». Кроме того, совершенно не
учитывается естественная классификация грибов и деревьев.196
Рис. 50. Продольный срез эктэн-
дотрофной микоризы Betula alba.
Слева — мантия гриба; в центре — вы¬
тянутые клетки эпидермиса (палисад¬
ный слой), содержащие внутриклеточ¬
ный белок и гаустории; справа — суб-
эпидермальные клетки с внутриклеточ¬
ными гифами.В настоящее время опре¬
деление партнеров по мор¬
фологическим особенностям
микоризы, за некоторыми
исключениями, еще не пред¬
ставляется возможным.Окончательного решения
этого вопроса можно ожи¬
дать при разработке систе¬
мы, которая была бы осно¬
вана на определении гри¬
бов, образующих микоризу.Вышеописанный метод
позволяет изучать лишь наиболее общие внешние особенности ми¬
коризы. Ее внутреннее строение исследуют на поперечных и про¬
дольных срезах с помощью микроскопа.На срезах эктотрофной микоризы удобно изучать толщину
и строение мантии, сплетение гиф, окружающих клетки корко¬
вой паренхимы (сеть Хартига), а в некоторых случаях и гифы,
проникающие в клетки (эктэндотрофная форма).Проникающие в корень гифы растворяют межклетные пере¬
городки в первичной коре и образуют сеть Хартига. Эта сеть
наиболее развита между клетками эпидермиса, которые под
воздействием гриба могут увеличиваться в размерах, вытяги¬
ваться в радиальном направлении, создавая так называемый па¬
лисадный слой. В большинстве случаев гифы проникают в меж¬
клеточные пространства двух-трех внешних слоев корковой па¬
ренхимы (рис. 50). Они могут распространиться и по всей пер¬
вичной коре, но никогда не проникают через эндодермис и не
развиваются в меристематической ткани кончика корня.В некоторых случаях гифы встречаются не только в межкле¬
точном пространстве, но и внутри -клеток. Все шире распрост¬
раняется мнение, что в чистом виде эктотрофная форма микори¬
зы не существует. Микориза, образующаяся на корнях сосны,
ели и лиственницы, в начале своего развития имеет чисто эн¬
дотрофный характер. Проникновение гриба в растение вызыва¬
ет защитную реакцию. Растение разлагает внутриклеточные ги¬
фы, и в течение длительного времени сохраняется только сеть
Хартига в межклеточном пространстве. Характер установившего¬
ся равновесного состояния зависит от вирулентности партнеров
и конкретных условий вегетации. Одновременное присутствие197
сети и внутриклеточных гиф особенно характерно для листвен¬
ницы, а также березы и осины. Внутри клеток можно наблюдать
более толстые белковые гифы диаметром около 10 мкм и тон¬
кие гаустории толщиной всего 1 мкм. Мелин относит слой за¬
раженных клеток коры к зоне переваривания.В определенных случаях корни растений могут быть зара¬
жены и обычными почвенными паразитическими грибами, причем
внешние симптомы такого заражения напоминают образование
микоризы. Равновесное состояние при этом не устанавливается,
паразитический гриб может поразить все растение-хозяина и
вызвать его гибель (Pseudomycorrhiza).Для быстрого исследования микоризы можно приготовить
срезы свежего материала с помощью бритвы без предваритель¬
ной обработки. С этой целью небольшой корень зажимают меж¬
ду половинками размягченной в воде влажной сердцевины бу¬
зины. Срезы следует готовить очень осторожно, так как грибная
мантия легко отделяется от корня. Для окраски среза использу¬
ют раствор анилинового синего, подкисленного молочной кисло¬
той. Этот метод пригоден лишь для самых общих исследований
при изучении большого количества материала.Если собранные грибокорни не будут исследованы в течение
ближайшего времени, их помещают в 70%-ный спирт или ка¬
кой-либо другой фиксирующий раствор, в котором образцы мо¬
гут храниться длительно.Для микроскопического изучения тонких структур микоризу
обязательно следует фиксировать, а срезы окрашивать. По мне¬
нию Мелина [85], лучшими фиксирующими растворами явля¬
ются препараты Джуэля (16) и Ценкера (45).Заливку парафиновых блоков и приготовление срезов выпол¬
няют обычными методами. Рекомендованная толщина срезов,
приготовленных на микротоме, — 8—10 мкм.Мелин рекомендует окрашивать срезы следующим методом:
промытые препараты на 24 часа помещают в концентрирован¬
ный раствор орсеиллина-ВВ в 3%-ной уксусной кислоте, про¬
мывают водой и два часа выдерживают в темном растворе
анилинового синего в 3%-ной уксусной кислоте.На основании исследований Зешинской Лобанов [75] реко¬
мендует применять для фиксации микоризы дуба и сосны аце-
тоформоль (1) и хромовоуксусную кислоту (22). Процесс фик¬
сации длится 6—12 часов. Затем материал промывают 50%-ным
спиртом и через серию спиртовых растворов доводят до 80%-ной
концентрации. Наилучшую сохранность дает 70—80%-ный спирт.
При более высокой его концентрации материал становится очень
хрупким.Срезы из материала, фиксированного ацетоформолем или
хромовоуксусной кислотой, окрашивают сафранином и лихтгрю-
ном: вначале проводят двухчасовую обработку 1%-ным водным
раствором хромовой кислоты, затем следует окрашивание в те¬
чение 24 часов спиртовым раствором сафранина (2 г сафранина198
її 100 мл 50%-ного спирта), промывка 50%-ным спиртом, окра¬
шивание 1%-ным спиртовым раствором лихтгрюна в течение2—3 минут и наконец промывание в воде.8.2.2. Эндомикоризные грибыИзучение эндомикоризных грибов — облигатных симбионтов
травянистых растений — представляет большой интерес, так
как сравнительно недавно установлена их способность усиливать
поглощение фосфора из почвы корнями микотрофных растений.
Это особенно важно в связи с тем, что практически все сельско¬
хозяйственные культуры имеют в корнях эндомикоризу везику-
лярно-арбускулярного типа (ВАМ).В отличие от эктомикоризы эндомикориза не образует гриб¬
ного чехла на поверхности корней и не изменяет их внешнего
вида, лишь иногда в участках развития грибов наблюдается
коричневатая или зеленовато-желтая пигментация [207]. Про¬
никая в корень через эпидермальные клетки или корневые во¬
лоски, эндомикоризные грибы образуют в коре корня хорошо
развитый несептированный мицелий с гифами толщиной 8—
12 мкм и характерными бугорками. Рост гиф может быть вне¬
клеточным или внутриклеточным.Вскоре после заражения в результате многократного дихото¬
мического ветвления на верхушках гиф образуются арбускулы.
Весьма характерны для фикомицетных грибов везикулы — сфе¬
рические или овальные пузырчатые вздутия на концах гиф или
утолщения посредине. В зависимости от растения-хозяина и ус¬
ловий питания размеры и форма везикул сильно варьируют —
от 25—60 до 120—150 мкм и более. Везикулы расположены пре¬
имущественно внутриклеточно, они обычно многоядерны, связа¬
ны с несущими их гифами и служат для запасания питательных
веществ, а также для выживания гриба в почве.Все эти структуры отчетливо видны при микроскопировании
корней растений после их мацерации на кипящей водяной бане
в 15%-ном растворе КОН и окраски анилиновым синим в мо¬
лочной кислоте по методу Курсанова (1940) [186].Количественные характеристики степени развития эндомико¬
риз даются в основном в двух параметрах. Первый — частота
встречаемости микоризной инфекции (F), характеризующая со¬
отношение инфицированных и стерильных участков корневой си¬
стемы. Эту величину определяют по формуле:
г гахЮОгде N — общее число просмотренных полей зрения, п — число полей зрения, где
обнаружена микориза.У каждого растения исследуют не менее 20 см корней 1-го
и 2-го порядков и просматривают как минимум по 200 полей
зрения [208].199
Второй параметр — степень микотрофное™ (М), характери¬
зующая обилие гриба в растении. Для этого на каждом иссле¬
дуемом сантиметровом участке корня в пяти полях зрения оп¬
ределяют количество гриба по пятибалльной шкале. Всего про¬
сматривают 20 см корня 1-го и 2-го порядков. На основании оп¬
ределения количества гриба на 10 сантиметровых отрезках кор¬
ня подсчитывают степень микотрофности по формуле:где А — сумма баллов, выражающая количество гриба на 10 см корня и 50 —
число полей зрения на этом же отрезке длины [186].Кроме того, описан фотоколориметрический метод определе¬
ния количества микоризного гриба в корнях растений, основан¬
ный на наличии в клеточных стенках гриба хитина [185].Поскольку эндомикоризные грибы — это облигатные симби¬
онты с неполностью изученным циклом развития, не растущие
на питательных средах, их различают по типу спор. При этом
учитывается структура цитоплазмы, характер сопутствующей
гифы, цвет и размер спор и т. д. Наиболее полно классификация
спор дана в работе Моссе и Бовена [191].Современные представления о систематическом положении
грибов, образующих везикулярно-арбускулярную микоризу,
представлены в работе Гердеманна и Траппа [183]. Они отнесли
эти грибы к семейству Endogonaceae (Zygomycetes, Mucorales),
разделив его на семь родов. Только четыре рода — Glomus, Асаи-
lospora, Gigaspora и Sclerocystis — обладают способностью обра¬
зовывать ВАМ.В настоящее время разработано несколько методов учета и
изоляции спор эндомикоризных грибов из почвы: влажного про¬
сеивания [182], центрифугирования в растворах сахарозы [203],
разделения спор по дифференцированному осаждению в раство¬
рах желатина [192] и глицерина [181], прилипания — флотации[210], чашечный метод [209].Выделенные споры 5—20 минут обрабатывают 2—5%-ным
раствором хлорамина Т для уничтожения посторонних микро¬
организмов, способных подавлять жизнеспособность эндофитов[211]. Наблюдение за прорастанием спор эндомикоризных гри¬
бов проводят в чашках Петри, содержащих 0,75%-ный агар с
добавлением 0,2 г огородной почвы [189] или же водный агар
с 0,02% дрожжевого экстракта Дифко [211].Для установления принадлежности изолированных спор к
грибам, образующим ВАМ, используют микровегетационные
опыты. Проростки тест-растений инфицируют отдельными спо¬
рами и выращивают в пробирках на агаризованной среде Джен¬
сена [190] или в стерильном песке [200].Для поддержания спор эндомикоризных грибов в культуре и
получения большого их количества Моссе [188] рекомендует ис-200
пользовать горшечные культуры эндофитов. Для этого микотро¬
фные растения выращивают в теплице в стерильной глинисто¬
песчаной смеси.При постановке полевых и вегетационных опытов для иноку¬
ляции растений чаще всего используют смесь почвы с микори¬
зованными корнями растений, микотрофные корни, а при не¬
больших объемах — споры эндофитов [207, 208].8.2.3. Методы выделения и культивирования грибовДля изучения морфологии, экологии и физиологии эктотрофных
микоризных грибов, а также для культивирования микоризы не¬
обходимо выделить чистую культуру гриба. В искусственных ус¬
ловиях споры грибов обычно не прорастают, поэтому культуры
выделяют из корней растений или из плодовых тел грибов.Корень, пронизанный грибными гифами, в естественной среде
окружен множеством различных микроорганизмов, поэтому по¬
верхность извлеченного из почвы корня необходимо стерилизо¬
вать и только после этого можно приступать к культивированию
гриба. Очень важно, чтобы микориза была свежей; следователь¬
но, приступать к исследованию рекомендуется вскоре после сбо¬
ра материала. Корень должен быть живым и тугим; старые, по¬
черневшие и вялые корни для выделения гриба непригодны. По¬
сле стерилизации гриб можно выделить и из ризоморфы.Стерилизацию поверхности проводят следующим образом:
корень или ризоморфу разрезают на кусочки длиной 2—10 мм,
обрабатывают дезинфицирующим раствором, промывают водой
и помещают на питательную среду. В качестве дезинфицирую¬
щих препаратов наиболее часто применяют растворы сулемы и
перекиси водорода [175, 176]. В растворе, содержащем 100 мг
HgCh/л, материал обрабатывают 2—3 минуты, а в 30%-ной пе¬
рекиси водорода — 5—20 секунд.Сразу же после извлечения из дезинфицирующего раствора
материал на 2—3 минуты помещают в стерильную воду и за¬
тем переносят в пробирки на скошенный агар или в чашки Пет¬
ри на агаризованную среду. Кусочки корня следует помещать
на питательную среду по одному, поскольку не исключена воз¬
можность присутствия на них посторонних микроорганизмов.
Именно поэтому из каждого корня готовят не менее 8—10 куль¬
тур.' Если условия культивирования окажутся благоприятными,
из кусочков корней за период от двух суток до двух недель
обычно развиваются культуры грибов. Незараженные культуры
отбирают и пересевают с целью дальнейшего их культивирова¬
ния или изучения.Определение грибов, выращенных из корня, обычно оказыва¬
ется довольно сложной задачей. Уверенное определение возмож¬
но при работе с культурой, полученной из плодового тела, та¬
ким образом можно провести сравнительно-морфологическое ис¬
следование.201
По сравнению с культурой, выделенной из корня, культиви¬
рование из плодового тела имеет преимущество, так как по не¬
му можно точно определить вид гриба. Эта культура также мо¬
жет оказаться зараженной, но вероятность заражения значитель¬
но ниже, чем при культивировании из корня; кроме того, ее
можно снизить постановкой нескольких параллельных опытов.Для выделения следует по мере возможности отбирать моло¬
дые плодовые тела грибов. Многие исследователи рекомендуют
стерилизовать поверхность плодовых тел, однако опыт автора
свидетельствует о том, что эта операция не является необходи¬
мой. Вполне достаточно тщательно удалить с поверхности пло¬
довых тел частицы почвы и прочие загрязнители, чтобы избе¬
жать загрязнения свежей поверхности слома. После очистки по¬
верхности плодовое тело надрезают ножом на глубину 0,5—2 см
в зависимости от его размеров. Шляпочные грибы надрезают в
нижней части ножки вдоль волокон и затем по возможности
вместе с шляпкой расщепляют в направлении надреза.В результате получают совершенно ненарушенную поверх¬
ность плодового тела. С помощью прокаленного и охлажденного
или предварительно стерилизованного скальпеля или другого ин¬
струмента (маленьких ножниц, пинцета, препаровальной иглы)
вырезают кубики длиной в несколько миллиметров и помещают
их на агаризованную питательную среду. Поврежденные насе¬
комыми или загрязненные участки плодовых тел отбрасывают.
Сбор грибов для выделения культур следует проводить сразу
после дождя, так как при культивировании разбухших от влаги
участков плодовых тел трудно избежать бактериального зара¬
жения культуры. Мнения исследователей относительно пригод¬
ности разных участков плодовых тел для культивирования рас¬
ходятся. При выращивании культур шляпочных грибов одни ав¬
торы рекомендуют брать материал из участка перехода ножки
в шляпку; по мнению других исследователей, для этого наибо¬
лее пригодны кусочки пластинок, трубчатой части или участки
шляпки, несущие эти образования. Опыт автора свидетельству¬
ет о том, что культуру гриба можно выделять из любой непо¬
врежденной части плодового тела.Скорость роста культур, полученных из различных плодовых
тел одного и того же вида гриба, может сильно варьировать,
что, вероятно, зависит от возраста мицелия.Помещенные на питательную среду кусочки ткани прораста¬
ют медленно, их рост обычно начинается через 1—2 недели. При
этом образуется погруженный в питательную среду мицелий.
Воздушный мицелий развит слабо или вообще не образуется.
Значительная часть гиф, образующих колонии, проникает в пи¬
тательную среду и формирует на ней плотное сплетение с глад¬
кой поверхностью. Растут колонии погруженного типа очень мед¬
ленно. По мере возможности, обычно через 3—4 недели, куль¬
туры рекомендуется пересевать на новую питательную среду.
При многократных пересевах их рост обычно ускоряется, одно-202
пременно изменяется и тип колоний. Гифы, извлекающие пита¬
тельные вещества, проникают в среду лишь на глубину 2—4 мм,
культуры образуют развитый воздушный мицелий.Для культивирования грибов, образующих микоризу, приме¬
няют разнообразные питательные среды различного состава.
Среды, предназначенные для выращивания грибов-симбионтов,
обычно содержат какую-либо растительную вытяжку, чаще всего
солод. В качестве источника углерода наиболее часто использу¬
ют глюкозу, крахмал или пектин; источниками азота служат со¬
ли аммония, гидролизат казеина, различные аминокислоты,пеп¬
тон и т. д. В состав питательных сред входят также неоргани¬
ческие соли, а во многих случаях — микроэлементы и вита¬
мины.Для культивирования многих грибов, в частности представи¬
телей Boletus, Suillus, Xerocomus, Leccinum и Amanita, пригодна
среда, содержащая солодовую вытяжку и микроэлементы. Ши¬
роко используется агар Хэгема, в состав которого также входит
нытяжка солода. Эти питательные среды можно применять и в
ннде раствора без добавок агара.Питательную среду, разработанную Худяковым и Возняков-
ской (87), Лобанов рекомендует использовать в первую очередь
для культивирования грибов, образующих микоризу на корнях
дуба. Введение тиамина (1 мг/1000 мл) значительно ускоряет
развитие многих грибов, прежде всего видов Boletus.Мозер с сотр. [101] рекомендуют питательную среду с фасо¬
левой мукой, пригодную и для поддержания и для размноже¬
ния культур. Эти же исследователи разработали питательную
среду с дрожжевой вытяжкой и витаминами, пригодную для
культивирования видов Boletinus cavipes, Suillus grevillei, раз¬
личных представителей Phlegmacium, Lactarius и др., выращивать
которые обычно довольно сложно.Для посева в жидкую питательную среду используют кусоч¬
ки культур, взятых с плотной среды, или суспендированный ми¬
целий, фрагментированный в стерильных условиях. Суспензию
отбирают пипеткой, кончик которой следует расширить, чтобы
она не засорялась. После посева в жидкую питательную среду
гомогенизированного фрагментированного материала культуры
грибов вначале развиваются в глубине среды и выступают на
поверхность обычно лишь через 2—3 недели. Постоянное встря¬
хивание жидкости улучшает аэрацию культуры, и скорость ее
развития может значительно возрасти. При тщательно выпол¬
ненном пересеве с плотной питательной среды можно добиться
сохранения инокулята на поверхности жидкости. Поверхностно
культивируемые грибы развиваются сравнительно быстро, и та¬
кие культуры особенно пригодны для фрагментации.Микоризные грибы довольно чувствительны к реакции пита¬
тельной среды. Обычно они развиваются в широком интервале
pH (от 2,8 до 7,1), но большинство их активно образуют воз¬
душный мицелий при pH 4,2—5,0.203
Температурный интервал, в котором грибы сохраняют спо¬
собность к росту, также достаточно широк. Минимальная допу¬
стимая температура обычно около 5 °С, максимальная — около
30 °С, оптимальная температура в большинстве случаев состав¬
ляет 18—22 °С. При подготовке искусственной питательной сре¬
ды и культивировании грибов необходимо учитывать оптималь¬
ные значения pH и температуры.В начальный период исследования микоризных грибов воз¬
ник вопрос о возможности использования в качестве питатель¬
ных сред природных материалов — почвы, торфа, сухой травы,
хвои и т. п. Исследователи высказывали предположения, что
эти субстраты могут обеспечить более благоприятные условия
для развития грибов, рост которых на искусственных питатель¬
ных средах идет медленно. В настоящее время природные суб¬
страты находят применение при выработке инокулята, В экспе¬
риментах были испытаны многие материалы как в чистом виде,
так и в комбинации с различными добавками. Результаты куль¬
тивирования на такого рода субстратах, имеющих очень слож¬
ный и неопределенный химический состав, были очень разными.
Осталось невыясненным и проявляющееся иногда отрицательное
влияние стерилизации. И все же, несмотря на эти неопределен¬
ности, представляется целесообразным рассмотреть субстраты и
методы, дающие в некоторых случаях хорошие результаты и
имеющие практическое значение.При исследовании культуры, выращенной на искусственной
среде, Соботка [137, 138, 139] наблюдал очень хороший рост на
стерильном торфе и хвое лиственницы, ели и сосны. Для увлаж¬
нения субстратов всегда использовали раствор, содержащий 2%
глюкозы.Лобанов [75] высоко оценивает метод Возняковской и Рыж¬
ковой, которые выращивали в жидком картофельном отваре
чистые культуры Boletus и Amanita, а затем размножали этот
материал в стерильной питательной среде с целью получения
хорошего инокулята.Приготовление питательной среды: 10 г картофеля в течение 10 минут ки¬
пятят в литре водопроводной воды, отвар фильтруют, к фильтрату добавляют
0,3% глюкозы и на 10 л фильтрата'—1 мл 0,5%-ного раствора тиамина. После
посева культуры ферментируют в аэрируемых сосудах емкостью 20 л, затем
культуральную жидкость переносят в небольшие сосуды на почву, стерилизован¬
ную в автоклаве. К 150 г почвы добавляют 50 мл культуральной жидкости и
выдерживают при 20—25 °С. К практическому применению готовы культуры,
образовавшие на поверхности почвы густой воздушный мицелий. Даже спустя
шесть месяцев такие «почвенные препараты», пересеянные на искусственную пи¬
тательную среду, растут активнее, чем исходная Культура.Мозер с сотр. выполнили тщательные и обширные исследо¬
вания по разработке состава смесей торфа и лиственной под¬
стилки для культивирования различных микоризных грибов.
Выводы этих исследователей можно обобщить следующим об¬
разом: лиственный перегной различных пород и деревьев (листья204
березы, кедровая хвоя, перегной и почва кедровников) и торф
в чистом виде, без добавок питательных веществ, при увлажне¬
нии чистой водой не обеспечивают благоприятных условий для
развития грибов (Suillus и Leccinum). Для культивирования гри¬
бов обогащенные питательными веществами перегной или торф
должны быть стерилизованы, в противном случае различные ви¬
ды плесневых грибов подавляют рост грибной культуры.Хорошие результаты получены на субстрате из 20 г сухого
торфа или лиственно-торфяной смеси и 70—75 мл питательного
раствора следующего состава: 20 г глюкозы, 3 г тартарата ам¬
мония и 0,5 г КН2Р04 на 1 л водопроводной воды. Обработка в
автоклаве — 20—30 минут при 1 —1,5 атм. На таком субстрате
хорошо развивались представители Suillus и Leccinum, для ви¬
дов Phlegmacium он оказался непригодным.Применение в качестве основы субстрата чистого торфа да¬
вало такие же результаты, как смесь лиственного перегноя с
торфом. На смеси торфа с лиственничной хвоей (2:1) рост
культуры шел более интенсивно, что можно объяснить лучшей
аэрацией субстрата.Минеральные удобрения обычно не стимулируют рост гри¬
бов, лишь томасшлак вызывал некоторое его ускорение. Замена
тартарата аммония сернокислым аммонием на рост культур от¬
рицательно не влияла.Добавки извести оказывали благоприятное воздействие
только на грибы, предпочитающие известкованные почвы (на¬
пример, Suillus tridentinus). В основном культуры грибов реаги¬
ровали на известь индифферентно, более того, в ее присутствии
рост некоторых культур ослабевал.Тиамин и биотин (50 мкг тиамина и 1 мкг биотина на 1 л
питательного раствора) оказывали положительное влияние на
рост многих грибов. В этих случаях сухой торф вначале стери¬
лизовали в колбах, на следующий день добавляли питательную
среду и вновь стерилизовали в автоклаве в течение 10 минут
при 1 атм. Тиамин и биотин стимулировали рост культур
Suillus greuillei, Boletinus cavipes, Paxillus involutus, Phlegmaci¬
um glaucopus, а также Suillus tridentinus, S. aeruginascens, Bole¬
tus edulis, Amanita muscaria, Phlegmacium cephalicum, Phi. cae-
siocanescens.Посевной материал для торфяного и лиственно-торфяного
субстрата можно отбирать из культур, выращенных на агаре,
или же использовать суспендированные гифы. Посев суспензией
гиф дает очень хорошие результаты, однако по невыясненной
причине фрагментированный мицелий прорастает не во всех
случаях. В связи с этим более надежным, хотя и не столь быст¬
рым методом является пересев с агаровой культуры.Для получения большого количества культур на лиственно¬
торфяном субстрате Мозер [102] рекомендует выращивать их
в банках для консервирования овощей емкостью 5 л. Чтобы пре¬
дотвратить высыхание верхнего слоя субстрата, в нем устанав-205
ливают трубки из фильтро¬
вальной бумаги диаметром
10—20 мм, по которым пита¬
тельный раствор поступает из
нижних более влажных слоев.
Кроме того, для сохранения
влаги на дно сосуда рекомен¬
дуется насыпать слой песка
толщиной в несколько санти¬
метров.Развитие микоризных гри¬
бов идет с определенной цик¬
личностью. Наиболее интен¬
сивный рост приходится на
ранневесенний период, приб¬
лизительно с января по конец
апреля. Во второй половине
августа вновь наступает крат¬
ковременный период более ин¬
тенсивного роста грибов, охва¬
тывающий 2—3 недели, в ос-
гис. ai. итерильныи сеянец сосны икультура гриба в чашке Петри, разме- тальное время культуры рас-
щенные в колбе для исследования с тут очень медленно. При вы-
помощью изотопов. ращивании культур на лист-венно-торфяном субстрате сле¬
дует учитывать и это обстоятельство. К счастью, периоды интен¬
сивного роста совпадают по времени с периодами получения и
использования посевного материала.8.2.4. Совместное культивирование
зеленого растения и грибаСовместное культивирование зеленого растения и гриба позво¬
ляет прежде всего установить, образуют ли эти два организма
микоризу и какими морфологическими изменениями сопровож¬
дается этот процесс, если он происходит. Не менее важна и воз¬
можность изучения физиологических особенностей связи симби¬
онтов. Используя методы изотопов, Мелин и Ннльссон в 50-е го¬
ды изучили характер и направление обмена органическими и не¬
органическими питательными веществами между грибом и зеленым
растением (рис. 51). Для получения достоверных данных совме¬
стное культивирование зеленого растения и гриба следует про¬
водить в стерильных условиях, и это требует применения спе¬
циальной методики.Методы получения стерильных культур были разработаны еще в ранних
исследованиях Мелина [85]. Для совместного культивирования хвойных пород
и грибов он обычно использовал конические колбы емкостью 300 мл, субстратом
служил песок или лесной гумус.Подсушенный песок просеивали через сито, отбирали фракцию с размером
зерен 0,5—2 мм, прокаливали и кипятили два часа в концентрированной соля¬206
ной кислоте. После кипячения песок помещали в воронку Бюхнера, в течение
48 часов промывали вначале проточной водопроводной, а затем дистиллирован¬
ной водой, высушивали на воздухе и вносили по 150 г в конические колбы
емкостью 300 мл (слой толщиной около 2 см). Для выращивания растения песок
увлажняли минеральным раствором (118) из расчета 36 мл/100 г песка. При
совместном культивировании растения и гриба к питательному раствору в ка¬
честве источника углерода добавляли 0,5 г глюкозы. Азотистые соединения или
не использовали, или вносили NH4C1 (0,05%), а в некоторых случаях-—KN03
(0,095%). Закрытые ватой колбы стерилизовали текучим паром трижды по
25 минут в течение трех суток; pH среды в колбах — на уровне 4,3.При использовании гумуса материал для субстрата собирали из верхнего,
менее разложившегося слоя почвы хвойного леса. После удаления корней и ве¬
ток материал тщательно перемешивали, насыпали в колбы слой толщиной около
2 см (приблизительно 70 г), увлажняли водой и трижды стерилизовали текучим
паром. Согласно выводам Мелина, в процессе стерилизации в таком субстрате
образуются токсичные для грибов вещества, которые необходимо удалить. С этой
целью в каждую колбу, не извлекая ватной пробки, стерильной пипеткой вводят
приблизительно 50 мл стерильной дистиллированной воды, смесь тщательно
взбалтывают, отстаивают в течение 24 часов, затем воду сливают и повторяют
промывание еще раз. При выполнении этих процедур возможно заражение сре¬
ды, поэтому по окончании препарирования за материалом наблюдают в течение
14 суток и для опытов отбирают только незараженные колбы. После обработки
субстрат содержит около 40% воды, значение pH 3,8—4,0.Семена хвойных пород деревьев перед стерилизацией увлажняли и затем
в течение одной минуты обрабатывали раствором сулемы 1 : 1000, следя за тем,
чтобы на поверхности семян не образовывались воздушные пузырьки. Остатки
сулемы удаляли трехкратным промыванием большим количеством стерильной
воды. Затем семена помещали в чашки Петри на 1,2%-ный водный агар. При¬
мерно через две недели, когда корни достигали длины 1—2 см, проращенные в
стерильных условиях семена переносили в колбы.Для культивирования гриба посевной материал необходимо брать от све¬
жей интенсивно растущей культуры. Кусочек мицелия помещают или прямо на
корневую шейку, или в непосредственной близости от корня. В этих условиях
под воздействием корневых выделений мицелий вскоре начинает расти. При
культивировании вместе с растением микоризные грибы растут намного быстрее,
чем в чистой культуре.При совместном культивировании содержимое колбы в конце эксперимента
проверяют на зараженность путем визуального осмотра и пересевом на агаровые
пластинки.В экспериментах, поставленных по описанной методике, Ме¬
лин сохранял стерильные культуры в течение 2—3 лет, время от
времени восполняя потери влаги. Позднее для этой цели он
применял двойные колбы, соединенные на половине их высоты
впаянной стеклянной трубкой, через которую добавляли воду,
не открывая колбы. Колба-резервуар содержала наполовину
разбавленный питательный раствор.Описанную методику применяют для постановки не слишком
продолжительных опытов и в настоящее время. Недостаток ме¬
тода заключается в том, что в колбе возникают неблагопри¬
ятные для сеянцев растений условия (повышенная относитель¬
ная влажность, высокая концентрация С02) недостаточная осве¬
щенность и т. п.) ив результате их рост замедляется. Для уст¬
ранения этих недостатков в последнее время опыты ставят та¬
ким образом, чтобы корневая система растений и грибы росли
в стерильных условиях, а наземная часть растения находилась207
на открытом воздухе. Вместо песка используют перлит, терролит
или иные субстраты, лишенные органических примесей. Кроме
того, эти материалы имеют большую, чем песок, влагоемкость,
и не изменяют объема при обработке в автоклаве.Траппе [160], применявший модифицированный метод Хач-
кайло, рекомендует доверху наполнить перлитом (размер зерен
1—8 мм) широкогорлый сосуд емкостью 250 мл и смочить его
питательным раствором Шемахановой с таким расчетом, чтобы
толщина слоя жидкости на дне сосудов составила около 5 см.
Такого запаса питательного раствора достаточно для культиви¬
рования примерно в течение четырех месяцев.В перлит устанавливают вентиляционную трубку диаметром2 и длиной 3 см, верхний край которой должен быть на одной
высоте с краем сосуда; сверху сосуд закрывают алюминиевой
фольгой. Над вентиляционной трубкой в фольге проделывают
отверстие, загибают края фольги внутрь трубки и приклеивают
затвердевающей резиновой массой. Сосуд рекомендуется за¬
крыть крышкой или закрепить фольгу нержавеющей проволо¬
кой. Отверстие вентиляционной трубки запечатывают ватной
пробкой, весь сосуд накрывают половинкой чашки Петри и сте¬
рилизуют в автоклаве.Для выращивания сеянцев в асептических условиях можно
использовать семена, обеззараженные сулемой по методу Мели¬
на или 30%-ным раствором Н202 в течение двух часов при по¬
стоянном встряхивании. После обработки семена тщательно
промывают стерильной водой и помещают на водный агар. Про¬
росшие в стерильных условиях растения с корнями длиной 3—
4 см переносят в приготовленный сосуд. Предварительно закры¬
вающую сосуд фольгу протирают спиртом и прокалывают сте¬
рильной иглой, затем корень вводят через отверстие в перлит; от¬
верстие в фольге вокруг гипокотиля заклеивают резиновой мас¬
сой (растворенная в бензоле масса стерильна). Необходимо сле¬
дить за тем, чтобы резиновая масса не была слишком жид¬
кой, так как она может протечь в отверстие и вызвать гибель
сеянца. Чтобы защитить корень, а позднее и гриб от света,
стенки сосуда целесообразно укрыть алюминиевой фольгой. Со¬
суды с сеянцами следует устанавливать с наклоном 45°, по¬
скольку в этом случае корень быстрее достигает стенки сосуда
и это облегчает наблюдение за его развитием.Подготовленный таким образом материал выдерживают в
течение одного месяца при температуре около 18 °С с целью вы¬
явления возможного заражения. Лишь после этого в незаражен-
ные сосуды вводят культуру гриба. Для посева целесообразно
использовать фрагментированный мицелий молодой культуры,
который вносят в субстрат стерильным шприцем непосредствен¬
но через фольгу. Медленно извлекая иглу из сосуда, суспензию
мицелия постепенно выдавливают из шприца, и посевной мате¬
риал распределяется по большей площади. После выполнения
посева место прокола запечатывают резиновой массой.208
Постановка опыта по описанной схеме обеспечивает благо¬
приятные условия для развития культуры. Образование микори¬
зы обычно становится заметным спустя три месяца. При анали¬
зе результатов эксперимента материал необходимо исследовать
на наличие посторонних микроорганизмов.Недостаток перлита — его плохие капиллярные свойства,
приводящие к высыханию верхнего слоя материала при длитель¬
ном культивировании. Высыхание можно до некоторой степени
ослабить с помощью полосок фильтровальной бумаги или бу¬
мажной ваты, помещенных в перлит.8.2.5. Посев микоризыДанные, полученные при исследовании эктотрофной микоризы,
находят практическое применение в естественных условиях.
Большинство важнейших лесных пород деревьев, в том числе
сосна, ель, дуб, бук и др., в условиях Венгрии всегда образуют
микоризу. Это означает, что для данных растений совершенно
необходим симбиоз с грибами, и без микоризы они существовать
не могут. В лесных почвах Венгрии микоризные грибы встреча¬
ются повсеместно, и поэтому симбиотическая связь между моло¬
дыми растениями и грибами образуется без вмешательства че¬
ловека. Необходимость в искусственном посеве грибов возника¬
ет при насаждении лесов на территориях, где в почве или вооб¬
ще нет соответствующих грибов, или же они ослаблены в силу
каких-то неблагоприятных обстоятельств. К таким районам от¬
носятся используемые в течение длительного времени сельскохо¬
зяйственные угодья или почвы, обладающие неблагоприятными
физическими и химическими свойствами (например, карбонатные
песчаные почвы междуречья Дуная и Тиссы, высокогорные рай¬
оны, соответствующие верхней границе распространения ле¬
сов). Химическая обработка почв также может вызвать повреж¬
дение или гибель микоризных грибов.При насаждении лесов на таких площадях в ночву необходи¬
мо высевать соответствующие грибы, иначе значительная часть
саженцев уже к концу первого года лета желтеет, краснеет, от¬
стает в росте и, наконец, той же осенью или в течение следую¬
щего вегетационного периода начинается массовая их гибель.
Если на корневой системе таких саженцев микориза не образу¬
ется, можно предполагать, что причина гибели насаждений за¬
ключается в отсутствии симбиотической связи с грибами.Азотные удобрения при высеве грибов не вносят совсем или
в весьма ограниченном количестве, поскольку высокое содержа¬
ние азота препятствует возникновению симбиоза. Фосфорные и
калийные удобрения вносят в оптимальных дозах.Посевным материалом может служить и суспензия спор, и
лиственный перегной или лесная почва, и чистая культура, по¬
лученная в лабораторных условиях на торфе или лиственно¬
торфяной смеси.14 й. Сэги 209
Для приготовления суспензии споры собирают на пластико¬
вую пленку или стекло, смывают водой в какой-либо сосуд (же¬
лательно в закрывающуюся пробкой колбу) и взвесь тщательно
взбалтывают. Полученную суспензию вносят в почву, окунают
в нее корни высаживаемых растений или же проводят опрыски¬
вание семян растений перед посевом. При внесении суспензии в
почву необходима механическая заделка на глубину 8—10 см,
так как иначе споры остаются в верхнем слое почвы на глуби¬
не 0,5—1 см.Преимущество посева с применением суспензий спор состоит
в том, что в почву вносят точно известный вид гриба и, кроме
того, для хранения спор не нужно много места. К недостаткам
метода можно отнести необходимость сбора плодовых тел гри¬
бов, что не всегда осуществимо, особенно при неблагоприятной
погоде. Оптимальные условия хранения грибных спор пока раз¬
работаны недостаточно. По наблюдениям Частухина [157], су¬
хие споры Boletus subtomentosus, В. variegatus и В. luteus прора¬
стали после хранения в течение года, а жизнеспособность спор
В. granulatus и В. bovinus значительно снижалась уже через пол¬
года. Детальное изучение условий, необходимых для сохране¬
ния жизнеспособности спор отдельных видов грибов, очевидно,
позволит найти более широкое применение данному методу.При использовании в качестве посевного материала почвы ее
берут из-под деревьев в лесу, по мере возможности недалеко от
засеваемого участка, так как в этом случае почвенные условия
сходны, а транспортировка посевного материала проще и обхо¬
дится дешевле. Лес должен быть представлен такими же поро¬
дами деревьев, как и посадки на засеваемом участке. Верхний
неразложившийся слой листьев удаляют и на глубине около
15 см выбирают нижележащий слой гумуса и почвы, обычно
густо пронизанный грибными гифами. Добытую микоризную
почву можно использовать немедленно, но в увлажненном состо¬
янии она хранится в течение нескольких месяцев. Так, для
ранневесеннего посева материал можно заготовить с осени. При¬
мерный расход рыхлой микоризной почвы на 1 га площади —
около 0,4 м3.Согласно выводам Мозера [103], посев микоризы возможен
в течение всего вегетационного периода. Развитие растений от
сроков высева не зависит, и все же необходимо следить за тем,
чтобы и корни, и гриб находились в стадии активного роста.
В связи с этим наиболее целесообразно проводить посев в ве¬
сенний период. При внесении гриба в почву особое внимание не¬
обходимо уделять созданию условий, при которых симбиотичес¬
кая связь между грибом и корнями растений образуется как
можно быстрее.Взятый в лесу посевной материал вносят на дно борозды
глубиной 6—10 см, семена растений размещают непосредствен¬
но на этом материале и борозду закрывают почвой с учетом ус¬
ловий, необходимых для прорастания семян. Посевной материал210
следует предохранять от высыхания, поэтому закладку семян и
засыпку их почвой проводят сразу же после внесения посевного
материала в борозду. В этих условиях корешок прорастающего
семени быстро и наверняка вступит в контакт с посевным ма¬
териалом, между ними образуется симбиотическая связь и при
последующих пересадках сеянцы будут нести на корневой сис¬
теме грибной мицелий. Формирование симбиотической связи
можно проконтролировать через 2—3 месяца. Для этого осмат¬
ривают корневую систему сеянцев и оценивают частоту образо¬
вания и степень развития микоризы. О значительной эффектив¬
ности симбиотической связи свидетельствуют активный рост се¬
янцев, интенсивный зеленый цвет листьев и увеличение содержа¬
ния сухого вещества. Основным показателем при сравнении с
растениями, выращенными в контрольном питомнике без вне¬
сения в почву грибного мицелия, служит в большинстве случаев
скорость роста.Посевной материал вносят в почву не только при закладке
питомника, но и на более поздних стадиях развития растений.
В частности, грибной мицелий следует вносить в прикорневую
зону плохо растущих сеянцев и молодых деревьев вблизи мо¬
лодых корней, обеспечивающих растения питательными вещест¬
вами.Преимуществом микоризной почвы является небольшая сто¬
имость работ при ее применении, так как необходимый посевной
материал не нужно получать в лаборатории. Кроме того, по
мнению некоторых исследователей, при использовании этого ме¬
тода переносится не только гриб, но и прочие члены почвенного
биоценоза, что, в свою очередь, может способствовать успеху.
К недостаткам метода относятся необходимость отбора, пере¬
возки и разбрасывания большого количества материала, а также
опасность заноса на новый участок вместе с лесной почвой раз¬
личных патогенных микроорганизмов и вредителей растений.Применение посевного материала, полученного из чистой ла¬
бораторной культуры, позволяет устранить большую часть не¬
достатков, присущих посеву с использованием микоризной поч¬
вы. Оно исключает возможность переноса вредителей и возбуди¬
телей болезней, требует меньше материала, а вид гриба в этом
случае известен. По наблюдениям Мозера, заражение посевно¬
го материала плесневыми грибами на конечный результат не
влияет. Использование лабораторного посевного материала по¬
зволяет подобрать вид гриба, наиболее соответствующий породе
дерева и условиям среды. Произрастающие в различных услови¬
ях грибы, более того, отдельные расы, относящиеся к одному и
тому же виду, могут отличаться по требованиям к растению-
хозяину, температуре, влажности, а также по морозостойкости,
и эти особенности следует учитывать. Во всех прочих отноше¬
ниях практическое применение лабораторного посевного матери¬
ала не отличается от техники посева микоризной почвы.14« 211
8.3. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ЭПИФИТНЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВПонятие «эпифитная микрофлора» в отличие от микроорганиз¬
мов, обитающих в прикорневой зоне растений, определено недо¬
статочно четко. Одни исследователи относят к этой группе все
непаразитические микроорганизмы, обитающие и размножаю¬
щиеся на наземных частях здоровых растений. Другие авторы
считают эпифитами те виды микроорганизмов, которые могут
быть выделены не только из наземных частей растений, но и из
прикорневой зоны.Эпифитные микроорганизмы более устойчивы к синтезируе¬
мым растениями фитонцидам, нежели прочие представители поч¬
венной микрофлоры, и эту особенность используют для их вы¬
деления. Кроме того, эпифитные микроорганизмы обладают
большей устойчивостью к воздействию света.Несмотря на то, что к такому образу жизни приспособлены
представители лишь одной определенной группы, эпифиты ме¬
нее специфичны, чем ризосферные микроорганизмы. В большин¬
стве это бактерии и дрожжевые грибы, а также отдельные виды
грибов и актиномицетов. К типичным эпифитным бактериям от¬
носится Pseudomonas herbicola аигеит, колонии которой в отдель¬
ных случаях составляют около 50% общей массы микроорга¬
низмов, живущих на поверхности растения. Растение влияет на
видовой состав микрофлоры, обитающей на его наземной части,
в гораздо меньшей степени, чем на микрофлору корневой зоны,
поэтому бактерии одного и того же вида встречаются на поверх¬
ности различных видов растений.При изучении эпифитов 1 г исследуемого органа растения
(лист, плод, корень) вносят в колбу емкостью 250 мл, содержа¬
щую 100 мл стерильной воды. Колбу закрывают стерильной ре¬
зиновой пробкой и взбалтывают в течение пяти минут. Затем
готовят серию разведений, добавляя по 1 мл полученной жидко¬
сти к 9 мл стерильной воды. Материал серии разведений высе¬
вают на специальные питательные среды.Для выращивания эпифитных микроорганизмов наиболее
пригодны питательные среды на растительных отварах. На мя-
со-пептонном агаре типичные эпифиты развиваются очень мед¬
ленно. К наиболее распространенным средам, находящим при¬
менение для культивирования, относятся капустный агар (96),
капустно-солодовой агар с кукурузной вытяжкой (97), агар на
бобовом отваре (59), картофельный (65) и сенной агары (142).Важнейшей отличительной чертой эпифитных микроорганиз¬
мов Красильников [67] считает устойчивость к фитонцидам и
соответственно относит к эпифитам лишь те виды, которые сохра¬
няют способность к росту в их присутствии. Для подавления ро¬
ста неэпифитных организмов он рекомендует применять летучие
фитонциды, хотя можно использовать и нелетучие.212
При использовании летучих фитонцидов применяют следую¬
щую методику: чашки Петри с посевами переносят в закрытый
сосуд (эксикатор). Для контроля в сосуд помещают и чашку с
безазотистой питательной средой, на которую штрихом высеян
азотобактер; этот микроорганизм очень чувствителен к фитон¬
цидам. На дно сосуда помещают кашицу из чеснока или лука
или же свеженарезанный хрен.После инкубации, длящейся несколько суток в термостате
при 28 °С, определяют количество выросших колоний. С учетом
степени разведения проводят пересчет на 1 г абсолютно сухого
растительного материала. Если на агаровой пластинке выросла
и культура азотобактера, фитонцидный эффект летучих ве¬
ществ, продуцируемых растениями, был недостаточным.Для подавления роста нетипичных эпифитных микроорганиз¬
мов можно использовать и нелетучие фитонциды. Для этого 5—
10 г сухих покровных чешуй лука измельчают ножницами и за¬
ливают 30 мл 40%-ного этанола. После настаивания в течение
суток жидкость фильтруют, чешуи отбрасывают. Спиртовую вы¬
тяжку, содержащую значительное количество фитонцидов, до¬
бавляют к 1 л питательной среды; в процессе стерилизации
спирт улетучивается. На приготовленную таким образом пита¬
тельную среду высевают материал различных разведений. Для
контроля на безазотистую агаровую пластинку высевают азото¬
бактер.В питательную среду, приготовленную на отваре клеверного
сена, фитонциды не добавляют, поскольку такая среда содержит
достаточное их количество.Заселение растений эпифитными микроорганизмами наиболее
удобно изучать с использованием пробирок Ру (стр. 216). Для
этого семена растений стерилизуют, заражают эпифитом и, со¬
блюдая стерильность, высевают в пробирку Ру с кварцевым пе¬
ском. По окончании культивирования растение в стерильных
условиях извлекают из пробирки, наземную часть отделяют от
корневой системы и затем по вышеописанной методике опреде¬
ляют содержание микроорганизмов на корнях и наземной час¬
ти. Конечный результат выражают в пересчете на 1 г сухого
растительного материала.8.4. МЕТОДИКА ВЫРАЩИВАНИЯ РАСТЕНИЙ
В СТЕРИЛЬНЫХ УСЛОВИЯХВ некоторых случаях необходимо выращивать растения в сте¬
рильных условиях или в присутствии определенных микроорга¬
низмов. Лишь таким способом можно наблюдать влияние раз¬
личных культур микроорганизмов (микориза, ризосферные ми¬
кроорганизмы, эпифиты и т. д.) и их метаболитов на растения.
Стерильные растительные культуры позволяют изучать количе¬
ственные характеристики и качественный состав корневых выде¬
лений.213
Выращивание высших растений в стерильных условиях —
чрезвычайно сложная задача. В микробиологической практике и
при изучении физиологии растений для этого применяют раз¬
личные сосуды, чаще всего большие культивационные пробирки.
В таких условиях растения можно культивировать более или ме¬
нее длительное время, но довести их до полного созревания
обычно не удается.8.4.1. Стерилизация семянПри стерилизации необходимо уничтожить все микроорганизмы,
находящиеся на поверхности семян, не нарушая жизнеспособ¬
ности последних. Для этого применяют различные вещества. При
их подборе необходимо учитывать строение, размер, форму се¬
мян, а также толщину и особенности их оболочки. Семена бобо¬
вых культур, покрытые толстой и гладкой оболочкой, стерили¬
зуются быстро и качественно. Значительно сложнее обеззаражи¬
вание семян отдельных злаковых культур, покрытых пленками
(ячмень, овес, рис).Перед стерилизацией семена необходимо тщательно пере¬
брать. Больные, поврежденные и недоразвитые семена отбрако¬
вывают. По мере возможности для стерилизации следует отби¬
рать семена одного размера; чешуйки удаляют пинцетом.По наблюдениям автора, для стерилизации семян можно с
успехом применять аппарат Вайсфогля (рис. 52). Обработку се¬
мян проводят в конической колбе емкостью 250 мл. В сосуд ем¬
костью 1,5 л наливают 1 л дистиллированной воды и закрыва¬
ют резиновой пробкой, имеющей два отверстия. Между грушей
для нагнетания воздуха 2 и сосудом устанавливают стерильный
ватный фильтр 3. При стерилизации оба соединенных между со¬
бой сосуда помещают в автоклав; горловина конической колбы
при этом закрыта резиновой пробкой. Всю систему стерилизуют
30 минут при 1 атм.После стерилизации коническую колбу закрепляют в штати¬
ве на 30 см выше сосуда с водой. Трубку, отходящую из нижней
части конической колбы, перекрывают зажимом 8. При помощи
резиновой груши 100 мл воды перекачивают в коническую кол¬
бу, на стенке которой нанесены соответствующие деления; поток
воды можно регулировать зажимом 4. В стерильных условиях
коническую колбу открывают, вносят стерилизующее вещество
(1% мертиолата), после его растворения засыпают семена и
колбу закрывают. Продолжительность обработки (10—60 ми¬
нут) зависит от размеров семян; ее определяют опытным путем.По окончании стерилизации открывают зажим 8 и жидкость
сливают. Семена задерживаются на грубом стеклянном фильт¬
ре 7, встроенном в колбу. Для промывания семян в колбу вновь
перекачивают воду, которую затем сливают, открывая зажим 8;
эту операцию повторяют 4—5 раз. При заключительной про¬
мывке в колбе оставляют небольшое количество воды, которую214
Рис. 52. Аппарат Вайсфогля для стерилизации семян:1 — стерильная вода; 2 — резиновая груша; 3 и 5 —ватные фильтры;4 и 5 —зажимы; 6 — стерилизующая жидкость с семенами; 7 — стек¬
лянный фильтр.вместе с семенами сливают в чашку Петри. Предварительно в
чашку укладывают слой ваты толщиной 10 мм, сверху помеща¬
ют диск из фильтровальной бумаги и всю эту систему стерили¬
зуют.Для контроля стерильности 50 семян помещают на поверх¬
ность мясного агара; стерильные семена не дают роста колоний
микроорганизмов. С целью проверки всхожести стерильные и
нестерильные семена проращивают в чашках Петри на фильтро¬
вальной бумаге. Если всхожесть стерильных семян ниже, чем
необработанных, необходимо уменьшить концентрацию стерили¬
зующего раствора или использовать другой химикат.8.4.2. Методы выращивания стерильных растений8.4.2.1. Культивационные пробирки, обеспечивающие
абсолютную стерильностьНаиболее простой и распространенный способ поддержания сте¬
рильности связан с применением культивационных пробирок
большого размера. Их величина может варьировать в зависимо¬
сти от растения и целей эксперимента. В опытах с крупными
растениями используют пробирки длиной 30—40 и диаметром
5—6 см. На дно пробирки помещают слой кварцевого песка или
агаризованной среды высотой 3—8 см, отверстие закрывают ват¬
ной пробкой. Вату рекомендуется обернуть марлей, чтобы избе¬
жать попадания волокон ваты на растение.При изучении эффективности заражения микоризой стериль¬
ные и зараженные семена высевают в специальный агаровый215
Рис. 53. Пробирка Ру для культивирования стерильных расте¬
ний:/ — ватная пробка; 2 — растение; 3 — кварцевый песок; 4 — стекловата;5 — питательный раствор.столбик (130) или в кварцевый песок, пропитанный
, У растворами Гельригеля (85) или Кнопа (102). Из\ j „ состава этих растворов исключают источник азота.для выращивания небобовых растений песок увлаж¬
няют растворами Гельригеля и Кнопа, содержащими
все необходимые компоненты.Культивационные пробирки стерилизуют в авто-
J клаве, после чего с помощью длинного стерильного
пинцета в питательную среду или в кварцевый песок4 вносят семена (для посева следует брать предвари¬
тельно проращенные семена). Выросшее на песке
растение время от времени необходимо поливать сте¬
рильной водой, которую подают на поверхность сре¬
ды стерильной пипеткой.Для выращивания стерильных растений с успехом можно ис¬
пользовать культивационные пробирки Ру [129], особенностью
которых является сужение в нижней части на высоте около 4 см
(рис. 53).При подготовке опыта в пробирку наливают 50 мл жидкой
питательной среды, а сужение закрывают стекловатой. На вату
насыпают кварцевый песок, который пропитывают питательным
раствором. Подобная система позволяет избежать переувлажне¬
ния, поскольку избыток раствора стекает в нижнюю часть про¬
бирки. Для увлажнения корневой системы пробирку наклоняют,
жидкость из нижней емкости через стеклянную вату проникает
к основанию песчаного столбика и затем поднимается к его
верхним слоям. Стерилизацию пробирок Ру и посев семян про¬
водят, как описано выше.8.Д.2.2. Полустерильные методыПри полустерильном культивировании корневая система расте¬
ния развивается в стерильных условиях, а наземная его часть
не изолирована. Полустерильные методы позволяют проводить
эксперименты на крупных растениях и значительно увеличить
продолжительность культивирования. С их помощью можно изу¬
чать взаимодействие корней растений и почвенных микроорга¬
низмов (обитатели прикорневой зоны, микориза).Метод Леонарда. Разработанный Леонардом культивацион¬
ный сосуд (рис. 54) состоит из двух стеклянных емкостей —
банки для консервирования емкостью 1 л и обычной бутылки с
отрезанным донышком. Горлышко бутылки закрывают стеклян¬
ной ватой, переворачивают и насыпают в нее промытый кварце-216
av"-4Рис. 54. Культивационный сосуд Леонарда:/ — стеклянная банка; 2 — бутылка с отрезанным дном; 3 — пе¬
сок с парафином; 4 — стеклянная крышка; 5 — пергаментная
бумага; 6 — кварцевый песок; 7 — резиновое кольцо; 8—пита¬
тельный раствор; 9 — стекловата.вый песок с таким расчетом, чтобы поверх¬
ность песка была на 2—3 см ниже края бу¬
тылки. Затем бутылку помещают горлышком
вниз в банку, предварительно на 3Д запол¬
ненную соответствующим питательным рас¬
твором. В центре бутылки проходит фитиль,
подающий питательный раствор в песок. Для
обеспечения равномерного его увлажнениянеобходимо следить за тем, чтобы фитиль проходил точно по цент¬
ру бутылки. Во избежание заражения место соприкосновения
двух сосудов закрывают резиновым кольцом длиной 6—8 см, вы¬
резанным из мотоциклетной камеры. Верхний край бутылки на¬
крывают половинкой чашки Петри и обвязывают пергаментной
бумагой. Подготовленный таким образом сосуд стерилизуют в
автоклаве в течение двух часов при давлении 1 атм.Предварительно стерилизованные семена на 15—20 минут
помещают в густую суспензию культуры соответствующего мик¬
роорганизма. Стеклянной палочкой, стерилизованной спиртовым
факелом, в поверхности песка делают углубления, стерильным
пинцетом укладывают в них семена и закрывают их песком. На
поверхность стерильного песка укладывают слой гальки толщи¬
ной 2—3 см, предварительно стерилизованной в течение двух
часов сухим жаром (180°С) в закрытом сосуде. Для этой цели
наиболее пригодна галька размером 3—4 мм.Закрывать сосуды для культивирования можно и парафини¬
рованным песком, подготовка которого, по методу Ван Шревена
[164], заключается в следующем: 10 г парафина с высокой тем¬
пературой плавления растворяют в 1 л бен¬
зола и тщательно смешивают с 10 кг про¬
мытого кварцевого песка. После испарения
бензола песок в течение двух часов стери¬
лизуют сухим жаром при 160°С (Ван Шре-
вен рекомендует проводить стерилизацию
в течение 6 часов при 100°С).Слой гальки или парафинированного
кварцевого песка препятствует перемеще¬
нию микроорганизмов к корневой системе.
Всходы легко проходят сквозь эти защит-Рис. 55. Полустерильное культивирование в стек¬
лянной банке:/ — стеклянная трубка; 2 — ватная пробка; 3 — песок с па¬
рафином; 4 — стеклянный кварцевый песок; 5 — стеклоткань;6 — дренаж (битое стекло или дробленая пемза).217
ные слои, а их корни в песке обеспечены необходимым количест¬
вом питательных веществ и влаги.Сосуд с трубкой для культивирования в полу стерильных ус¬
ловиях. Нижеописанный сосуд, обеспечивающий удовлетвори¬
тельную стерильность подземной части растения, весьма прост
в изготовлении и удобен в обращении. На дно литровой банки
насыпают колотую пемзу или битое стекло слоем 20 мм, сверху
укладывают диск из стеклоткани и стекловаты и устанавливают
стеклянную трубку внутренним диаметром 0,8—1,0 мм, длина
которой совпадает с высотой банки. Нижний конец трубки про¬
ходит сквозь отверстие в стеклоткани и достигает дна сосуда.
Банку наполняют промытым песком и затем пропитывают его
соответствующим питательным раствором, избыток раствора
стекает в нижнюю часть сосуда. Верхнее отверстие стеклянной
трубки закрывают ватной пробкой, а горловину банки обвязы¬
вают пергаментной бумагой или алюминиевой фольгой. Стери¬
лизованные семена высевают в песок и накрывают слоем сте¬
рильного парафинированного песка толщиной 1 см (рис. 55).
Для предотвращения высыхания системы через трубку в дренаж
время от времени вводят стерильную воду, чтобы песок постоян¬
но был увлажненным. Необходимо следить за тем, чтобы вода
не попала на поверхность парафинированного песка, поскольку
она может смыть в сосуд микроорганизмы, находящиеся на его
поверхности. Увлажнять песок можно только снизу.
9МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ
АССОЦИАЦИЙ
МИКРООРГАНИЗМОВОбычно микроорганизмы распределены по поверхности частиц
почвы неравномерно. Они образуют скопления, в которых меж¬
ду отдельными группами формируются сложные взаимосвязи.
Качественный и количественный состав таких ассоциаций зави¬
сит в первую очередь от условий окружающей среды, к малей¬
шим изменениям которых (влажность, содержание кислорода,
наличие питательного субстрата, pH и т. д. ) микрофлора очень
чувствительна. Именно поэтому результаты наблюдений всегда
отражают лишь состояние в данных конкретных условиях. Ко¬
личественные методы определения микроорганизмов не позволя¬
ют выявлять тонкие взаимосвязи между отдельными видами и
экотипами почвенных микроорганизмов. Для этого разработаны
так называемые прямые методы, основанные на исследовании
частиц почвы при помощи микроскопов. Мелкие почвенные час¬
тицы микроскопируют непосредственно или же в почву на опре¬
деленное время помещают какой-либо стеклянный предмет
(пластинку, камеру, трубки и т. п.) и затем изучают размеще¬
ние и морфологические особенности микроорганизмов, поселив¬
шихся на этом предмете. Отдельные методы позволяют прово¬
дить пересев и культивирование выросших колоний. В дальней¬
шем будут рассмотрены некоторые из прямых методов исследо¬
вания. Следует подчеркнуть, что успех их применения зависит
прежде всего от условий внешней среды.Кубиена впервые применил специальный микроскоп, позволяю¬
щий наблюдать в отраженном свете микроструктуры почв.
В частности, он изучал поверхность почвенных срезов, им же в
почве были обнаружены гифы грибов и различные простейшие
организмы. Этот метод был усовершенствован Звягинцевым,
применившим освещение отраженным светом в люминесцентном
микроскопе. Метод Звягинцева позволяет изучать также коло¬
нии бактерий и актиномицетов. Свет проникает в поле зрения
сбоку, освещая не весь препарат, а только его поверхность, по¬9.1. МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ9.1.1. Микроскопирование с помощью
светового микроскопа219
этому почвенные срезы для исследований
можно готовить относительно быстро и без
затруднений [68].Из нержавеющей стали готовят цилиндр
внутренним диаметром 20 и высотой 10 мм
(рис. 56), нижний край которого должен быть
остро отточен. Цилиндр полностью вдавлива¬
ют в гладкую стенку почвенного профиля на
желаемую глубину. С помощью ножа удаля¬
ют почву, окружающую цилиндр, затем его
осторожно извлекают из стенки профиля,
освобождают от прилипшей почвы, на поверх¬
ность среза наносят каплю акридина оранжевого и накрывают
покровным стеклом толщиной 0,10—0,12 мм. Спустя 10—20 ми¬
нут покровное стекло снимают, устанавливают на предметном
столике люминесцентного микроскопа и микроскопируют с при¬
менением иммерсионного объектива.Одно из основных условий успешного применения метода —
правильный подбор концентрации красителя. Концентрацию оп¬
ределяют опытным путем, поскольку для различных типов почв
она неодинакова. Обычно краситель берут в более высокой кон¬
центрации, чем для окрашивания мазков почвенной суспензии.Метод люминесцентной микроскопии пригоден не только для
исследований микропопуляций на срезах почвы, но также и для
изучения расположения микроорганизмов на мелких структур¬
ных единицах, частицах почвы. В отдельных случаях метод при¬
меняют и для исследования срезов частиц почвы.Метод Звягинцева позволяет изучать под микроскопом и по¬
верхность корней. Извлеченные из почвы корни окрашивают ак¬
ридином оранжевым, помещают на предметный столик и иссле¬
дуют, как описано выше. Микроорганизмы на поверхности кор¬
ня окрашиваются в зеленый цвет и легко отличимы от расти¬
тельных клеток, приобретающих зеленый цвет другого оттенка.9.2. МЕТОДЫ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИЗа последние десятилетия проведено много наблюдений за по¬
пуляциями микроорганизмов в почве с применением электрон¬
ных микроскопов. Среди этих исследований особое место зани¬
мают работы Никитина с сотр. [113], которые наблюдали в по¬
чве чрезвычайно своеобразные образования. Некоторые из них
оказались скоплениями новых, ранее неизвестных почвенных
бактерий.Описанный Никитиным метод заключается в следующем: из
собранных образцов почвы готовят суспензию в дистиллирован¬
ной воде (1 : 1), отстаивают ее 1—2 минуты и используют для
изготовления препарата. При изучении почв, богатых мине¬
ральными и органическими коллоидами, можно проводить мяг¬
кое центрифугирование (2000 об/мин) в течение двух минут, вРис. 56. Металличе¬
ский цилиндр с поч¬
венным срезом, на¬
крытый покровным
стеклом.220
других случаях суспензию рекомендуется фильтровать. Препа¬
раты для электронной микроскопии Никитин готовил различны¬
ми способами. По наиболее простому методу одну каплю суспен¬
зии наносят на коллоидную пленку и обрабатывают фосфорно¬
вольфрамовой кислотой (pH 1,7) или парами хрома.Если возникает необходимость в удалении минеральных со¬
лей, в небольшую чашку Петри или тигель наливают дистилли¬
рованную воду и помещают коллоидную пленку. На пленку,
плавающую на поверхности воды, наносят каплю исследуемой
суспензии. После диализа, длящегося 3—4 часа, дистиллирован¬
ную воду сливают, пленку вместе с препаратом наносят на раз¬
мещенную на дне чашки сетку, подсушивают, напыляют хромом
и устанавливают в электронный микроскоп.Хорошие результаты дает предложенный Стефановым метод
так называемой тепловой фиксации. Каплю суспензии без пред¬
варительной очистки вносят в небольшую кювету из алюминие¬
вой фольги, сверху укладывают сетку вместе с прикрепленной к
ней пленкой, после чего кювету помещают на поверхность воды,
нагретой до 50—55 °С. Воду нагревают до кипения, одновремен¬
но слегка охлаждая пленку струей воздуха комнатной темпера¬
туры. После кипячения в течение 2—4 минут сетку извлекают и
переносят на фильтровальную бумагу влажной стороной вниз.
Бумага впитывает воду, оставшуюся на сетке, а исследуемые
частицы под воздействием нагревания закрепляются на ее по¬
верхности. Приготовленный таким образом препарат можно изу¬
чать как без дополнительной обработки, так и после обработки
фосфорно-вольфрамовой кислотой или напыления хромом.Для изучения микроорганизмов, присутствующих на поверх¬
ности частиц почвы, Грей [38] рекомендует применять сканиру¬
ющий электронный микроскоп. Мелкие частицы почвы наносят
на специальную сетку диаметром 12,6 мм, покрытую клейким
материалом, и исследуют непосредственно, без всякой обработки.Лоччи и Кварони [76] также применяли сканирующий элект¬
ронный микроскоп для изучения сообществ микроорганизмов.
Стеклянную трубку вдавливали в почву и затем вместе с со¬
держимым переносили в стакан. На образец почвы подавали за¬
мораживающую жидкость, спустя несколько минут добавляли
небольшое количество воды, затем столбик почвы выталкивали
из трубки и разрезали бритвой. В дальнейшем частицы почвы
напыляли металлом в вакууме и приступали к исследованию.9.3. ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ
СТЕКЛЯННЫХ ПЛАСТИНОК9.3.1. Метод Холодного — РоссиВ соответствии с методикой, разработанной Холодным (1930) и
Росси [130], чистое, стерилизованное сухим жаром предметное
стекло помещают в почву. Поверхность стекла покрывается тон¬221
кой пленкой почвенного раствора,
на которой поселяются различные
микроорганизмы. Спустя 2—3 неде¬
ли пластинки извлекают из почвы,
в вертикальном положении уста¬
навливают в дистиллированной во¬
де и после смывания грубых частиц
почвы просушивают. Препарат фик¬
сируют над пламенем горелки,
окрашивают карболовым эритрози-
ном (18) и изучают под микроско¬
пом. Если цель исследования заключается в изучении микроорга¬
низмов, обитающих только в верхних почвенных горизонтах, в
почве делают ямку глубиной около 10 см, одна из стенок которой
вертикальна (рис. 57). К этой стенке прижимают предметное
стекло, после чего углубление засыпают. Верхний край предмет¬
ного стекла должен находиться на 2—3 см ниже поверхности
почвы; место расположения стекла отмечают колышком.При изучении организмов, обитающих в различных почвен¬
ных горизонтах, необходимо отрыть почвенный профиль, глуби¬
на которого зависит от характера расположения отдельных го¬
ризонтов. Стерильным ножом в исследуемых горизонтах выреза¬
ют ниши глубиной 10—15 мм и шириной несколько больше пред¬
метного стекла; поверхность внутренней стенки ниши должна
быть гладкой. В летний период для защиты от высыхания тыль¬
ную часть предметного стекла закрывают почвой; место уста¬
новки стекла отмечают колышком.С помощью микроскопирования можно изучать характер рас¬
положения различных микроорганизмов на поверхности почвен¬
ных частиц. Грибы и актиномицеты образуют характерные нити.
Бактерии могут встречаться в виде отдельных клеток, но в бо¬
льшинстве случаев образуют микроскопические колонии из не¬
скольких десятков или сотен клеток. На стеклянных пластинках,
установленных близко к поверхности почвы, очень часто встре¬
чаются водоросли и простейшие.Существенное преимущество метода Холодного—Росси состо¬
ит в том, что он позволяет наблюдать микроорганизмы в есте¬
ственных условиях, непосредственно в почве, а это дает воз¬
можность изучать ассоциации почвенных микроорганизмов. При
помощи стекол обрастания Холодного можно изучать лишь мик¬
роорганизмы, присутствующие в почве в физиологически актив¬
ном состоянии. На искусственных же питательных средах раз¬
виваются и организмы, которые в момент взятия проб были не¬
активны. Рыбалкина и Кононенко [133] называют микроорга¬
низмы, появляющиеся на стеклянных пластинках, активной мик¬
рофлорой почвы в отличие от потенциальной микрофлоры, вы¬
растающей на искусственных питательных средах.Метод Холодного—Росси не лишен определенных недостат¬
ков. Связаны они прежде всего с тем, что гладкая стекляннаяРис. 57. Установка стекол обра¬
стания Холодного — Росси в поч¬
ву.222
пластинка, имеющая сравнительно большую поверхность, изме¬
няет почвенные условия на данном участке. В почвах различной
кислотности (прежде всего в кислых) постоянно происходит рас¬
творение определенных компонентов стекла, влияющих на хими¬
ческий состав покрывающего поверхность пластинки почвенного
раствора. Стекло лишь фиксирует состояние ассоциации почвен¬
ных микроорганизмов в данный момент, но не позволяет наблю¬
дать динамику их развития. Поскольку микроорганизмы на стек¬
лянной пластинке можно наблюдать лишь после их фиксации и
окрашивания, выделение и культивирование доминирующих ви¬
дов не представляется возможным.9.3.2. Метод стекол обрастания в модификации
Рыбалкиной и КононенкоРыбалкина и Кононенко рекомендуют перед закладкой предмет¬
ного стекла в почву покрывать его поверхность пленкой крах-
мало-аммиачного агара. В этом случае естественная микрофло¬
ра будет отражена на пластинке не совсем точно, и все же ме¬
тод имеет определенные преимущества. На поверхности, покрытой
агаровой пленкой, микроорганизмы развиваются быстрее. Состав
микроорганизмов, растущих на агаре, определяется не только
химическими компонентами среды, но и температурой, влажно¬
стью, аэрацией почвы, а также характером взаимосвязей меж¬
ду отдельными группами организмов.Для приготовления таких предметных стекол в жидкую пита¬
тельную среду, содержащую 2% крахмала и 0,1% NH4N03, до¬
бавляют 2% предварительно промытого агара и полученный сос¬
тав стерилизуют в автоклаве. С помощью стерилизованного
спиртовым факелом пинцета стерильное предметное стекло
удерживают в наклонном положении, пипеткой наносят на него
горячий агар, который, стекая, покрывает тонким слоем всю по¬
верхность стекла; излишки агара стекают с пластинки. Пред¬
метное стекло, покрытое агаровой пленкой, укладывают в сте¬
рильную чашку Петри и высушивают в сушильном шкафу при
35—45 °С, после чего вышеописанным способом помещают в
почву. Длительность инкубации в почве — 4—10 суток.Некоторые исследователи прикрепляют к поверхности пласти¬
нок Холодного стерильную фильтровальную бумагу. В течение
1—2 месяцев пребывания в почве бумага совершенно разруша¬
ется, и на окрашенных пластинках можно наблюдать целлюлоз¬
ные волокна, заселенные колониями разлагающих целлюлозу
микроорганизмов.9.3.3. Метод влажной камерыДанный метод также был разработан Холодным. Для работы
необходимы предметные стекла с лунками, покровные стекла
размером 18X18 мм и специальное ситечко, закрепленное на223
одном из концов металлической трубки длиной 20—25 мм и
внутренним диаметром 7 мм. Диаметр ячеек сита — 0,25 мм.
Верхнее отверстие ситечка закрывают резиновой пробкой. Пред¬
метное стекло с лункой, покровное стекло и ситечки стерилизу¬
ют горящим спиртом и до охлаждения выдерживают в стериль¬
ной чашке Петри. В ситечко помещают немного измельченной
почвы, мельчайшее количество которой высевают на покровное
стекло таким образом, чтобы почвенные частицы, выпавшие
сквозь отдельные ячейки ситечка, лежали на стекле обособленно.
Покровное стекло перед использованием выдерживают над ки¬
пящей водой, так как увлажненные паром частицы почвы луч¬
ше сцепляются с поверхностью стекла. Плохо закрепленные ча¬
стицы стряхивают, для чего стекло захватывают стерильным
пинцетом, переворачивают и осторожно постукивают пальцем по
пинцету. Почвенные частицы можно также наносить на покров¬
ное стекло, покрытое тонким слоем питательного агара.В лунку предметного стекла стерильной пастеровской пипет¬
кой вносят небольшую каплю стерильной воды, покровное стек¬
ло переворачивают и укладывают на предметное стекло таким
образом, чтобы частицы почвы находились над лункой. Поверх¬
ность предметного стекла вокруг лунки смазывают вазелином.
В полученной камере испаряющаяся вода поддерживает части¬
цы почвы во влажном состоянии.Препарат помещают во влажную камеру и 2—3 суток выдер¬
живают в термостате при 23—25 °С. В течение этого времени
микроорганизмы начинают интенсивно расти вокруг частиц поч¬
вы и становятся доступными для прямого наблюдения под мик¬
роскопом.Интенсивность развития и видовой состав микроорганизмов
зависят прежде всего от особенностей почвы и влажности ка¬
меры. Если в лунке предметного стекла воды недостаточно иона
быстро испарится, в препарате будут доминировать грибы и ак-
тиномицеты, в противоположной ситуации — бактерии.Метод влажной камеры позволяет вести наблюдения за жи¬
выми микроорганизмами, но полученный препарат можно и за¬
фиксировать. Для этого покровное стекло высушивают, проно¬
сят над пламенем горелки и окрашивают карболовым эритрози-
ном.9.3.4. Метод экранированных стеколМетод, разработанный Торнтоном [156], позволяет отделить ак¬
тивные гифы грибов от присутствующих в почве покоящихся
спор. Для этого камеру с агаровой пленкой накрывают стеклян¬
ной пластинкой, имеющей отверстия, и помещают в почву. Гифы
через отверстия проникают в камеру и разрастаются на агаро¬
вой пленке.При подготовке к исследованиям в стеклянную камеру раз¬
мером 100X40 мм и глубиной 3—5 мм (рис. 58) укладывают
стеклянную пластинку (предметное стекло) такой же величины224
/гзРис. 58. Экранированная пластинка Торнтона:а — вид сверху; б — вид сбоку; I — отверстия в стеклянном экране;2 — стеклянный экран; 3 — слой агара; 4 — стеклянная камера.и накрывают стеклом-экраном толщиной 1 мм, имеющим 10 от¬
верстий диаметром 55 мм. Камеру стерилизуют сухим жаром,
затем снимают стекло-экран, на поверхность предметного стекла
наносят 8 мл водного 1,5% -ного агара и вновь накрывают каме¬
ру. Отверстия закрывают покровными стеклами, которые удаля¬
ют при закладке камеры в почву. Эту операцию выполняют так
же, как и при работе со стеклами Холодного — Росси (стр. 221).
При горизонтальной установке камеру Торнтона укладывают на
ровную поверхность почвы отверстиями вниз и спустя 7—10 су¬
ток извлекают. На предметном стекле под объективом с неболь¬
шим увеличением видны развившиеся колонии грибов, которые
можно непосредственно пересеять на скошенный агар или ага¬
ровые пластинки в чашки Петри.9.3.5. Метод стекол-ловушекВ принципе метод стекол-ловушек идентичен методу Торнтона.
Для постановки опыта необходимы два предметных стекла с
лунками, в которых приготовляют препараты «висячая капля».
Завернутые в бумагу стекла стерилизуют сухим жаром, затем
лунку одного стекла заливают подогретым питательным агаром
и сразу же накрывают другим предметным стеклом так, чтобы
лунки совпали. Стеклянные пластинки закрепляют скрепками,
резиновыми кольцами или каким-либо зажимом и на опреде¬
ленный срок закапывают в почву. Активно растущие гифы про¬
никают в щель между стеклами, достигают лунок и разраста-
ются, образуя колонии на питательной среде. Спустя 2—3 неде¬
ли пластинки извлекают из почвы и приступают к изучению вы¬
росших грибов при помощи микроскопа или к пересеву получен¬
ного материала.15 И. сэги 225
9.3.6. Метод капилляров МакуайтиДанный метод [79] был разработан также для изу¬
чения микроскопических грибов. Из стеклянных трубок длиной
76 и диаметром 6 мм вытягивают капилляры диаметром 0,5—1,0 мм. Длина капиллярной части трубки должна составлять
30—40 мм. Широкий конец трубки закрывают ватной пробкой и
по 40—50 капилляров устанавливают в сосуд, содержащий слой
(30—40 мм) горячего агара Чапека—Докса или какой-либо
иной питательной среды для грибов. Сосуд вместе с капилляра¬
ми устанавливают в автоклав и стерилизуют. После затвердева¬
ния агара трубки извлекают из питательной среды, очищают их
от прилипшего агара и расплавленным парафином пропитыва¬
ют ватные пробки, закрывающие более толстые концы трубок.
Капилляры, содержащие питательную среду, вводят в исследуе¬
мую почву. В слишком плотной почве предварительно проделы¬
вают отверстия. Спустя определенное время трубки извлекают и
выявляют развитие колоний грибов в питательной среде внутри
капилляров. При их обнаружении капилляр стерилизуют спир¬
том или каким-либо антисептиком, стерильным пинцетом обла¬
мывают его в месте расположения колонии и пересевают ее в
чашку Петри.9.3.7. Метод капилляров Перфильевав почвенно-биологических исследованияхМетоды капилляров, разработанные Перфильевым и Габе [118],
явились значительным этапом в изучении экологии почвенных
микроорганизмов. Авторы исходили из того, что в естественных
условиях микроорганизмы располагаются настенках капилляров
между частицами почвы. Были предприняты попытки создать ис¬
кусственную систему капилляров, сходную с естественной сре¬
дой обитания микроорганизмов (рис. 59). Путем сплавления
различных стеклянных пластин изготовляют систему, образую¬
щую 4—5 капилляров. Авторы различают тонкостенные (более
хрупкие) пелоскопические капилляры и изготовленные из более
толстого стерла педоскопические капилляры. Изображенная на
рисунке 59 педоскопическая ячейка площадью 10X15 и высо¬
той 1,2 мм имеет пять капилляров высотой 0,36 и шириной
1,35 мм. Размеры ячеек и капилляров могут быть и иными в
зависимости от свойств и влажности почвы. Перпендикулярные
капиллярам торцовые края ячеек срезаны под углом 45°. Это по¬
зволяет компоновать системы из 4—5 ячеек, собираемых в сте¬
клянной обойме-держателе.Ячейки, закрепленные на стеклянном основании, стерилизу¬
ют в сушильном шкафу и затем помещают в исследуемую поч¬
ву. Для облегчения этой операции Перфильев сконструировал
пробойник, вырезающий в почве углубление соответствующего
размера и формы.226
Рис. 59. Капилляры Перфильева и Габе:1—2 — отверстия ячеек перпендикулярны стенкам:
3 — отверстия ячеек параллельны стенкам; 4—5 —
поперечные разрезы капиллярных ячеек.Влага, а также растворенные
неорганические и органические со¬
единения постепенно проникают в
капилляры заложенного в почву пе-
доскопа. Микроорганизмы, также
попадающие в них вместе с почвен¬
ной влагой, размножаются и обра¬
зуют характерные колонии. Спустя
3—4 недели после закладки педо-
скоп можно вынуть из почвы без
повреждения колоний микроорга¬
низмов, выросших в капиллярах.Ячейки извлекают из держателя и
помещают на специальное предметное стекло, предотвращающее
сдвиг капилляров. Высушивать и фиксировать препарат нельзя,
так как при этом характерные микроколонии распадаются на от¬
дельные клетки.Перфильев разработал также оригинальные методы выделе¬
ния монокультур. Бактерии, прикрепившиеся к стенкам капилля¬
ров, выделяют микроизолятором. Из суспензий клеток одного
вида монокультуру получают при помощи микроселектора, а из
смеси клеток различных организмов — при помощи микротур¬
никета. Во всех трех методах применяют особые капилляры.
Данная методика позволила выделить ранее неизвестные формы
бактерий (Cyclobacter, Dictiobacter, Trigonobacter, Metallogenium
и др.).Капилляры очищают концентрированной серной кислотой и
промывают в кипящей воде. Хромовую смесь применять не ре¬
комендуется, поскольку после такой обработки рост микроорга¬
низмов в капиллярах замедляется. Чистоту вымытых капилля¬
ров перед использованием проверяют, осматривая их под ми¬
кроскопом.Как и большинство методик почвенной микробиологии, метод
Перфильева не лишен определенных недостатков. Основной из
них связан с тем, что для успешного применения метода необ¬
ходима почвенная влага. Следовательно, он позволяет изучать
лишь микроорганизмы, обитающие во влажных почвах, и менее
пригоден для исследования почвенно-биологических процессов в
сухих почвах или в засушливый период.Аристовская [4] заполняла капилляры Перфильева гумино-
выми коллоидами, стремясь максимально приблизить метод к
естественным условиям, для которых характерен постоянный
контакт микроорганизмов с гуминовыми веществами. Источни»215* 227
ком гумуса служила та же почва, в которую затем помещали
педоскоп. Для этого 50 г почвы смешивают с 1 л 0,1 н, гидро¬
окиси натрия и отстаивают в течение 18—20 часов. Раствор
фильтруют через фильтровальную бумагу и, медленно добавляя
0,2 н. раствор соляной кислоты, доводят pH фильтрата до 5. За¬
тем по каплям добавляют 20%-ный раствор FeCl3 до выпадения
растворенных гуминовых веществ в хлопьевидный осадок. Полу¬
ченный студенистый материал отфильтровывают и промывают
до полного удаления ионов хлора (контроль — при помощи 1 Яв¬
ного AgN03). В фарфоровой чашке перемешивают 5 г получен¬
ного геля, добавляют 1 л дистиллированной воды и 0,1 г агара
Дифко и 20 минут стерилизуют в автоклаве при 1 атм. Пример¬
но по 25—40 мл стерильного субстрата разливают в чашки Пет¬
ри и туда же помещают вместе с держателем предварительно
стерилизованный сухим жаром педоскоп, который должен быть
полностью погружен в гуминовый субстрат. После заполнения
капилляров жидкостью педоскоп извлекают и обтирают стериль¬
ной ватой. Необходимо следить за тем, чтобы гуминовый субст¬
рат не содержал загрязнений, которые могут закупорить капил¬
ляры педоскопа и препятствовать естественной циркуляции поч¬
венного раствора в системе.Капилляры можно высушить в сушильном шкафу и хранить
длительное время. При сушке гуминовые вещества образуют на
внутренней поверхности капилляров сухой слой, который затем
увлажняется почвенной влагой и обеспечивает благоприятные
условия для развития бактерий.
10МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ
БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ПОЧВЫМетоды определения биологической активности почвы делят на
две группы: одни позволяют измерять действительную, другие—
потенциальную активность. Действительную биологическую ак¬
тивность измеряют в естественных условиях (in situ), в то вре¬
мя как потенциальную — обычно в лаборатории, где можно про¬
извольно изменять внешние условия (температуру, влажность,
аэрацию и т. п.). Результаты, полученные при помощи методов,
относящихся к этим двум группам, необязательно совпадают,
более того, они могут быть и противоположными.Методы измерения общей биологической активности почв не¬
льзя назвать во всех отношениях совершенными. Например, они
не позволяют определять количественные и качественные харак¬
теристики биомассы микрофлоры, в связи с чем параллельно с
измерением биологической активности почвы обычно приходится
выявлять и содержание в ней почвенных микроорганизмов.
Другой недостаток методов состоит в том, что они не регистри¬
руют колебания в составе микробных популяций, происходящие
в результате изменений внешних условий. Так, если в почву
внести ингибитор, его влияние необязательно отразится на пока¬
зателях биологической активности (например, на продуцирова¬
нии со2).Подавление развития той или иной группы микроорганизмов
может сопровождаться более интенсивным размножением кон¬
курентных групп, и в результате количество конечных продук¬
тов метаболических процессов останется неизменным.Результативность измерения в значительной мере зависит от
химических и физических особенностей почвы, поэтому их обя¬
зательно следует учитывать при выборе метода.10.1. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ С02Выделение почвой С02 можно измерять как в естественных ус¬
ловиях, так и в лаборатории. В первом случае измерение про¬
водят в открытой системе, т. е. определенную поверхность поч¬
вы накрывают колоколом и определяют содержание С02 в воз¬
духе под ним. Во втором случае выделение С02 измеряют в за¬
крытой системе при заданных внешних условиях. Новак [110]
различает основное дыхание и индуцированное. Первое отно¬
сится к естественному выделению С02, второе же определяет16 и. сэги 229
выделение С02 в результате внесения органических материалов
и минеральных удобрений. Отношение показателя индуцирован¬
ного дыхания к основному определяет величину так называемо¬
го респирационного коэффициента. По этому показателю мож¬
но судить о степени индукции выделения С02.10.1.1. Измерение С02 в естественных условияхВ естественных условиях выделение С02 зависит от многих
факторов, поэтому анализ полученных результатов требует
большой осмотрительности. Поскольку все известные методы по¬
зволяют проводить лишь кратковременные замеры, полученные
численные значения не могут быть экстраполированы на более
длительный период из-за непостоянства внешних условий (тем¬
пературы, влажности). Следует учитывать и то обстоятельство,
что на площадях, покрытых растительностью, весьма значи¬
тельная часть почвенной углекислоты является продуктом дея¬
тельности корней высших растений. Таким образом, содержание
С02 в почве в значительной степени зависит от количества рас¬
тений. В силу некоторых причин содержание С02 может и сни¬
жаться. Например, растворяющаяся в почвенной влаге углекис¬
лота вымывается из почвы и попадает в почвенные воды более
глубоких горизонтов.10.1.1.1. Измерение С02 на поверхности почвы
под колоколомДанный метод—наиболее старый способ измерения С02, выделяе¬
мого почвой, но широко применяется и в настоящее время. Опреде¬
ленный участок поверхности почвы накрывают металлическим
или пластмассовым колоколом, вдавливая его основание в почву
на глубину 1—2 см. Под колокол в открытом сосуде помещают
гидроокись калия или натрия известной концентрации или же
гранулированную натронную известь. После экспозиции, для¬
щейся несколько часов, методами объемного или гравиметриче¬
ского анализа определяют количество двуокиси углерода, свя¬
занной адсорбентом. Существует множество модификаций это¬
го метода, различающихся размерами накрываемого участка
почвы, формой колокола, а также химическим составом и концен¬
трацией адсорбента. Виткамп [173] рекомендует использовать
цилиндрический колокол с площадью основания 175 см2, края
которого углубляются в почву на 25 мм. Чашка под колоколом
содержит 5 мл 0,1 н. раствора КОН. Содержание С02 опреде¬
ляют после часовой экспозиции.Некоторые авторы предлагают использовать колоколы гораз¬
до больших размеров. Например, под колокол, накрывающий3 дм2 поверхности почвы, в качестве абсорбента помещают
60 мл 0,5 н. КОН или 5,0 г натронной извести; измерение прово¬230
дят спустя 16 часов. Показатель выделения С02 выражают в
граммах и пересчитывают на 1 дм2 поверхности почвы.По наблюдениям Миндермана и Вулто [97], различия в кон¬
центрации растворов щелочи сказываются на абсорбции С02 не¬
значительно. Например, 0,2 н. раствор КОН связывал 1,22 г
С02 в 1 час на площади 100 см2, а для 2 н. раствора щелочи
этот показатель изменился до 1,6 г. Применение натронной изве¬
сти значительно усиливало абсорбцию С02, уровень выделения
составил 3,38 г С02 ч/дм2. На основании этих наблюдений ав¬
торы рекомендуют использовать в качестве абсорбента не раст¬
воры щелочей, а натронную известь.Описанный метод, естественно, не дает точных данных отно¬
сительно количества С02 в почве, и полученные результаты мо¬
гут служить лишь в качестве основы для сравнения. Объясня¬
ется это тем, что диффузия СОг из почвы в атмосферу происходит
по особым законам.Парциальное давление газа в почве зависит от ее пористости,
влажности, температуры и прочих факторов. Концентрация С02 в
газообразной фазе почвы всегда выше содержания углекислоты в
надпочвенном слое воздуха.10.1.1.2. Измерение С02 методом Уоллиса—УайлдаМногие исследователи пытались разработать методики, лишен¬
ные отмеченных выше недостатков. В большинстве случаев это
разные способы откачивания из почвы известного объема возду¬
ха с пропусканием его над каким-либо абсорбентом. Количест¬
во связанного С02 определяют методами объемного или грави¬
метрического анализа.В соответствии с методом Уоллиса и Уайлда [170] на по¬
верхности почвы устанавливают металлический колокол вну¬
тренним диаметром 127,5 мм. На его внутренней поверхности за¬
креплен штуцер, к которому подключают воздушный насос.
Между колоколом и насосом размещен абсорбент С02. С помо¬
щью насоса из почвы откачивают известный объем воздуха, из
которого абсорбент в свою очередь выводит С02. В качестве аб¬
сорбента используют NaOH, которую затем титруют 2 н. раство¬
ром ВаС12. Оставшуюся в растворе NaOH определяют титрова¬
нием 1 н. НС1. Умножив показатель содержания Na2C03 на
0,022, получают количество образовавшейся С02, которое мож¬
но пересчитать на определенную площадь поверхности почвы
(1 м2).Показатели, полученные данным методом, оказываются бо¬
лее высокими по сравнению с результатами других методик.
Объясняется это тем, что насос откачивает богатый двуокисью
углерода воздух и из почвенных пор. Числовые значения С02
и в этом случае существенно зависят от свойств почвы, прежде
всего от ее пористости.16* 231
10.1.1.3. Измерение С02 с помощью инфракрасного
спектрофотометраДля определения содержания С02 в почве все шире применяют
аналитическую инфракрасную спектрометрию. Чувствитель¬
ность данного метода намного выше, он позволяет обнаружи¬
вать весьма низкие концентрации С02 (5—10 мг/л). К недос¬
таткам метода можно отнести его сложность и высокую стои¬
мость инфракрасных спектрофотометров фирмы «Бэкман» или
оборудования других марок. Хотя переключатель каналов по¬
зволяет проводить последовательный анализ образцов, взятых в
различных местах, тем не менее точки взятия проб должны на¬
ходиться в непосредственной близости от прибора. Поэтому дан¬
ный метод не позволяет одновременно проводить замеры на
экспериментальных делянках, расположенных далеко одна от
другой.Сущность метода заключается в следующем [126, 174]. Ме¬
таллическую рамку определенного размера вдавливают в почву
так, чтобы ее верхний край немного выступал над поверхностью
почвы. Рамку накрывают герметической пластмассовой крыш¬
кой, в которую вмонтирован штуцер для введения и откачива¬
ния воздуха.Рейнерс [126] рекомендует применять колокол размером
20X50X20 см, а Уиткэмп и Франк [174] —36X30x15 см. Объ¬
ем откачанного из-под колокола воздуха можно точно измерить.
Инфракрасный спектрофотометр с высокой точностью регистри¬
рует содержание СОг в воздухе, медленно (200—1000 мл/мин)
протекающем через прибор. Одновременно измеряют температу¬
ру и влажность почвы. Количество С02 пересчитывают на еди¬
ницу площади и выражают в граммах. По данным периодичес¬
ких измерений можно оценить суточное, месячное или годовое
выделение С02.10.1.2. Измерение С02 в лабораторных условияхПри изучении дыхания почвы в закрытых системах условия сре¬
ды можно регулировать, и, следовательно, разброс результатов
измерений не столь значителен, как при исследованиях в есте¬
ственных условиях. В лаборатории углекислый газ, выделяемый
корнями растений и образующийся при разложении неравномер¬
но распределенных в почве растительных остатков, не влияет на
результаты измерений. Точность определения повышается также
благодаря возможности проведения необходимого количества
повторных замеров. Безусловно, неблагоприятным фактором яв¬
ляется то обстоятельство, что естественные условия не совпада¬
ют с лабораторными и, таким образом, результаты измерения
С02 в лаборатории не могут быть в полной мере экстраполиро¬
ваны на естественную почвенную среду, в которой интенсивность232
выделения С02 в значительной мере зависит от температуры,
влажности и условий аэрации. Факторы среды в лаборатории
более благоприятны, и поэтому показатели выделения С02 вы¬
ше получаемых в естественных условиях. Следует отметить и то
обстоятельство, что лабораторные эксперименты проводят с не¬
большими образцами почвы (100—500 г), данные по которым
весьма трудно обобщать применительно к большим площа¬
дям.В лабораториях измерение С02 обычно проводят способом
обогащения, который позволяет получать более выразительные
результаты, четко отражающие влияние различных внешних
факторов. В исследуемую почву добавляют 1—2% какого-либо
органического материала растительного происхождения (расти¬
тельная мука, целлюлозный порошок и т. п.), а также различ¬
ные минеральные питательные вещества (NPK), особенно в тех
случаях, когда цель исследования заключается в оценке влия¬
ния удобрений на биологическую активность почвы.10.1.2.1. Измерение С02 в закрытом сосудеВ герметически закрывающийся сосуд помещают известное ко¬
личество почвы, устанавливают небольшую емкость с абсорбен¬
том и закрывают крышкой. Количество поглощенного С02 опре¬
деляют спустя 16—24 часа. Миндерман и Вулто [97] рекомен¬
дуют использовать для взятия образцов открытый с двух сторон
цилиндр объемом 106 см3 с площадью основания 40 см2. Ци¬
линдр вдавливают в почву, затем извлекают, образец почвы
срезают на уровне краев цилиндра и вместе с ним помещают в
сосуд. Одновременно берут образец почвы для определения
влажности. В качестве абсорбента рекомендуют использовать5 г натронной извести, которую размещают в сосуде на неболь¬
шом штативе на несколько сантиметров выше поверхности поч¬
вы. Сосуд закрывают, ставят в термостат с температурой 28 °С
и спустя 16 часов определяют количество поглощенного С02.
Полученные данные пересчитывают на 1 кг абсолютно сухой
почвы.10.1.2.2. Метод КорнфилдаКорнфилд Г21] предложил статический метод определения С02,
отличающийся от предыдущего тем, что для связывания угле¬
кислого газа в данном случае используют перекись бария. Из
переходящей в раствор Ва02 вместо связанного С02 высвобож¬
дается 02 согласно уравнению следующей реакции:2ВяОг + 2СОг = 2ВаС03 + 02.Применение Ва02 позволяет герметически закрывать колбы
без риска нарушения почвенных биологических процессов вслед¬
ствие нехватки кислорода. Автор несколько изменил постановку233
г н. наВа02ВаСО/-0,1 н.
Ва(ОН)гРис. 60. Связывание С02 методом
Корнфилда:Î — стеклянный сосуд; 2 — стеклянный ци¬
линдр; 3 — почва; 4 — стекловата.Рис. 61. Высвобождение СОг из
ВаСОз.опыта, использовав в качестве инкубационного сосуда не про¬
бирку, а коническую колбу емкостью 50 мл.Постановка опыта в модификации автора заключается в
следующем. В широкогорлую коническую колбу емкостью 50 мл
вносят 30 г почвы, которую предварительно равномерно увлаж¬
нили количеством воды, соответствующим 60% от полной вла-
гоемкости. Стеклянной палочкой почву сдвигают к стенкам кол¬
бы, а на освободившуюся центральную часть дна устанавлива¬
ют стеклянную трубку диаметром 15 и длиной 20 мм, в нижнюю
часть которой укладывают немного стекловаты. Трубка служит
для закрепления стеклянного сосуда диаметром 10 и высотой25 мм, в который в соответствии с рекомендацией Корнфилда
вносят 2 мл дистиллированной воды и 0,2 г Ва02 (рис. 60).Для определения количества образовавшегося С02 пинцетом
извлекают сосуд, содержащий смесь Ва02 и ВаСОз, и устанав¬
ливают его в емкость, изображенную на рисунке 61. С помощью
небольшой воронки в колбу емкостью 50 мл, содержащую смесь
Ва02 и ВаСОз, добавляют 2 н. раствор НС1. Необходимо сле¬
дить за тем, чтобы в воронке постоянно находилась кислота,
поскольку в противном случае высвобождающийся из ВаС03 уг¬
лекислый газ может улетучиться через пустую воронку. Если
колба заполнена соляной кислотой, она вытесняет углекислый
газ, перетекающий в сосуд с раствором Ва(ОН)2, и образую¬
щийся ВаС03 выпадает в осадок. Затем ВаС03 фильтруют на
стеклянном фильтре G-4, несколько раз промывают теплой дис¬
тиллированной водой, высушивают при 105 °С и взвешивают на
аналитических весах. При контрольном взвешивании сосуд с
ВаСОз в колбу не помещают, а содержащийся в колбе воздух
пропускают через раствор Ва(ОН)2.234
Поставленный по данной схеме эксперимент может продол¬
жаться 4—6 недель. В течение первых 2—3 недель выделение
С02 измеряют по два раза, а в дальнейшем — один раз в не¬
делю.10.1.2.3. Метод продувания воздухаПостоянное продувание воздуха ускоряет почвенно-биологичес¬
кие процессы, поэтому показатель выделения СОг, определенно¬
го данным способом, будет намного выше, чем в естественных
системах. Существует несколько модификаций метода. Ниже
приводится одна из них, разработанная автором [147].В коническую колбу емкостью 250 мл (инкубационная кол¬
ба) укладывают 100 г гальки диаметром 3—4 м, играющей роль
дренажа. Для удаления карбонатов гальку предварительно в
течение нескольких дней выдерживают в 10%-ном растворе со¬
ляной кислоты. Чтобы частицы почвы не закупоривали про¬
межутки между камнями, на слой гальки укладывают диск, вы¬
резанный из мелкоячеистой пластмассовой сетки.В фарфоровую чашку вносят 1;00 г почвы, высушенной на
воздухе и просеянной через сито с ячеями размером 3 мм.
Влажность почвы доводят до 60% от полной влагоемкости, до¬
бавляя из бюретки небольшие порции воды и равномерно разме¬
шивая почву. В результате получают образец с мелкозернистой
структурой. Если в почву необходимо внести нерастворимый в
воде материал (соломенную муку, целлюлозу, суперфосфат и
др.), его добавляют и перемешивают с почвой еще до ее увлаж¬
нения.Добавки растительного органического материала не превы¬
шают 1%, дозировку минеральных удобрений целесообразно
рассчитывать отдельно. При расчете добавок азота исходят из
содержания углерода в растительном материале согласно соот¬
ношению С : N как 25 : 1. Водорастворимые соединения раство¬
ряют и вводят вместе с водой, предназначенной для увлажнения
почвы.Увлажненную зернистую почву переносят в инкубационную
колбу с резиновой пробкой, в отверстия которой вставляют две
стеклянные трубки диамет¬
ром 5 мм, как показано на
рисунке 62. Нижний конец
более длинной трубки перед
погружением в почву обвя¬
зывают неплотной синтети¬
ческой тканью. Если трубка
все же будет закупорена
почвой, ее следует продуть
воздухом.Аналогичным образом
собирают и поглотительнуюРис. 62. Соединенные между собой инкуба¬
ционная (Л) и поглотительная (fi) колбы:
1—почва; 2 — синтетическая ткань; 3 — слой
гальки.235
колбу емкостью 100 мл, содержащую 50 мл 0,5 н. раствора КОН
или NaOH, предназначенного для поглощения С02- Не рекомен¬
дуется использовать в качестве абсорбента раствор Ва(ОН)2, по¬
скольку образующийся ВаСОз закупоривает конец трубки и сис¬
тема выходит из строя. Две трубки второй колбы изогнуты на
той же высоте, что и трубки колбы, содержащей почву. При со¬
единении длинных трубок обеих колб два сосуда образуют еди¬
ный элемент системы.В термостате можно разместить несколько таких элементов.
Например, в исследованиях, проведенных с участием автора, в
термостат средних размеров марки LP 103 производства пред¬
приятия «Лабор» устанавливали 72 элемента (четыре на каж¬
дой полке в шесть рядов). Сверху на термостате размещали
аквариумный мембранный насос, к которому была подключена
система из двух пустых колб и ловушки с концентрированной
NaOH, предназначенной для улавливания С02 воздуха. При не¬
обходимости ловушку можно составить и из двух колб. Пустые
колбы служат для улавливания концентрированной щелочи, вы¬
текающей из системы при случайном выключении электрическо¬
го тока или повреждении соединительных трубок.Резиновая трубка, связывающая щелочную ловушку с рес-
пирационными сосудами, через верхнее отверстие термостата
проходит в камеру, где подсоединяется к распределителю-трой¬
нику. Три резиновые трубки от тройника проведены к трем пол¬
кам термостата; каждая из них заканчивается распределителем
с шестью ответвлениями. Наблюдения свидетельствуют о том,
что наиболее равномерно воздух поступает из шаровидного рас¬
пределителя диаметром 30—40 мм. Отдельные ответвления свя¬
заны с рядами вышеуказанных респирационных систем, состоя¬
щих из четырех элементов. Равномерность поступления воздуха
к отдельным рядам регулируют при помощи зажимов Гофмана.
Эта регулировка требует большого терпения и иногда занима¬
ет несколько часов, но от тщательности ее исполнения зависит
успех эксперимента. В системе циркулирует избыток кислорода,
поэтому в данных условиях потребность в нем будет удовлетво¬
рена и для последних элементов ряда.Связанный абсорбентом С02 титруют еженедельно, при этом
колбу-сборник заменяют новой, а колбу с содержащей С02 ще¬
лочью закрывают резиновой пробкой.Титрование можно проводить вручную или потенциометром;
при обоих способах в два этапа определяют содержание гидро¬
окиси и карбоната. Для титрования используют 1 н. раствор
соляной кислоты. На первом этапе индикатором служит фенол¬
фталеин, при этом нейтрализуются свободные радикалы ОН-, а
находящийся в растворе карбонат превращается в бикарбонат:NaOH -f- HCI = NaCl + Н20;Na2C03 + HCI = NaHCOj -f- NaCl.236
В среде с pH 8,3 реакция протекает до конца. Затем титро¬
вание продолжают в присутствии метилового оранжевого. В
точке эквивалентности (pH 3,4) из бикарбоната высвобождает¬
ся абсорбированный С02:NaHC03 + HCl = NaCl -f H20 + C02.Данный метод можно применять лишь в тех случаях, когда
количество карбонатов невелико по сравнению с содержанием
гидроокиси, в противном случае изменение окраски фенолфтале¬
ина будет недостаточно выраженным.При наличии необходимых приборов гораздо проще и быст¬
рее проводить потенциометрическое титрование. Этот способ по¬
зволяет устранить возможные ошибки, связанные с неопреде¬
ленностью цветовых переходов фенолфталеина. На приборе ус¬
танавливают значение pH, соответствующее конечной точке тит¬
рования по первому уравнению реакции (pH 8,3). Титрование
проводится автоматически, и по достижении конечной точки ко¬
личество израсходованной кислоты можно прочитать на шкале
прибора. Затем прибор переводят на режим второй реакции
(pH 3,4) и продолжают титрование; по достижении установлен¬
ного значения pH оно автоматически прекращается. Результаты
измерения определяют по шкале и, исходя из разницы объемов,
вычисляют показатели выделения С02. Длительность экспери¬
мента — 4—8 недель, но при необходимости он может быть и
продолжен.Каждая серия состоит из четырех параллельных опытов. В
процессе титрования при демонтаже системы расположение от¬
дельных элементов в ряду изменяют, перемещая последний в на¬
чало ряда и так далее в обратном порядке.10.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОГЛОЩЕНИЯ КИСЛОРОДА
ОБРАЗЦАМИ ПОЧВЫДля определения биологической активности почвы применяют
метод Варбурга, позволяющий измерять не только выделение
С02, но и поглощение 02 исследуемыми образцами. Продуциру¬
емый микрофлорой и микрофауной С02 выделяется из почвы
лишь частично, поскольку некоторую его часть утилизуют авто-
трофные бактерии и водоросли. В связи с этим сопоставление
уровней продуцирования С02 и утилизации кислорода может
значительно обогатить познания в области газообмена почв.
Метод Варбурга позволяет получать очень точные данные, но
его недостаток заключается в том, что респирационные сосуды
малы и поэтому показатели поглощения 02, измеренные на об¬
разце почвы массой в несколько граммов, нельзя экстраполиро¬
вать на значительные площади. Данные, полученные методом
Варбурга, обычно отражают результаты очень кратковременных
исследований (1—2 часа), хотя в последнее время публикуется
все больше сообщений о результатах более длительных исследо¬237
ваний, выполненных этим же методом. Подробное описание ме¬
тода Варбурга приведено в работе Умбрейта [162].Исследование выполняют следующим образом. Очищенную
от корней и прочих растительных материалов сухую почву про¬
сеивают через сито с ячеями размером 1 мм и увлажняют до
60% от полной влагоемкости почвы. В отдельные сосуды аппа¬
рата Варбурга помещают по 4 г почвы, а в маленькую емкость
для щелочи, расположенную в средней части этих сосудов, вно¬
сят 0,2 мл 20%-ного раствора КОН. Притертые части респира-
ционных сосудов и манометров смазывают силиконовым мас¬
лом и устанавливают манометры. Сосуды должны быть пол¬
ностью погружены в нагретую до 25 °С воду. Постоянную тем¬
пературу поддерживают с помощью регулятора, соединенного с
контактным термометром, и мотора. В течение 30 минут, пока
почва нагревается до температуры водяной бани, манометры
остаются открытыми. Затем с помощью винтов уровень жидкос¬
ти манометра устанавливают на деление шкалы, отмеченное
числом 150. Кран перекрывают и в открытой половине трубки
манометра считывают высоту уровня жидкости Бродье (5). Да¬
лее включают двигатель аппарата Варбурга и начинают измере¬
ние.Частоту взятия отсчетов выбирают в зависимости от интен¬
сивности дыхания субстрата; например, показания манометра
можно считывать через 10, 15, 30 или 40 минут.В том случае, если субстрат потребляет кислород, давление
падает и уровень жидкости в закрытой половине трубки мано¬
метра повышается; показания манометра считывают при выклю¬
ченном двигателе. Уровень жидкости в закрытой части трубки ус¬
танавливают на деление шкалы, отмеченное числом 150, и счи¬
тывают показание по открытой трубке манометра.Если через каждые 30 минут показания открытой трубки ма¬
нометра составляют последовательно 125, 103 и 78 мм, а исход¬
ное положение соответствовало 150 мм, то в этом случае изме¬
нение уровня в отдельные периоды составляло минус 25, минус
22 и минус 25 мм, а общее изменение равно 72 мм.Однако в процессе измерения атмосферное давление и тем¬
пературы водяной бани могут измениться, и это может служить
источником ошибок. Такие колебания корректируют по показа¬
ниям термобарометра. В качестве термобарометра используют
один из манометров и инкубационных сосудов аппарата Вар¬
бурга. При измерении дыхания почвы в сосуд термобарометра
также вносят 4 г предварительно стерилизованной увлажненной
почвы. В центральную емкость наливают раствор КОН, однако
в этом случае потребления кислорода не будет, так как биоло¬
гические процессы в системе не протекают. Все измерения с по¬
мощью термобарометра проводят, как описано выше. Например,
если в моменты регистрации показаний рабочих манометров
показания термобарометра составили 150, 148, 149 и 146 мм, то
последовательные изменения давления, составившие минус 2,238
12. Показания манометра и поправкиВремя,минПоказанияманометра,ммИзменение,ммПоказания
термобаро¬
метра, ммПоправка
по термоба¬
рометруСкорректи¬рованныепоказанияманометра,ммОбщее из¬
менение,
мм0150015000030125—25148—223-2360103—22149+ 123—469078—25146—322—68плюс 1 и минус 3 мм, обусловлены какими-либо внешними при¬
чинами. В показания рабочих манометров затем вносят соот¬
ветствующие поправки. Если давление в термобарометре пада¬
ет, на такую же величину уменьшают и показания рабочего ма¬
нометра, и, наоборот, при увеличении давления соответствующее
значение прибавляют к показаниям рабочего манометра.Примеры показаний рабочих манометров и термобарометра,
а также величины поправок приведены в таблице 12.Таким образом, фактическое изменение показаний рабочих
манометров составляет 25—2, 22+1, 25—3, т. е. соответственно23, 23 и 22 мм; суммарное изменение равно 68 мм. Эти скор¬
ректированные показания отражают величину фактического сни¬
жения давления, обусловленного потреблением кислорода.Некоторые исследователи считают целесообразным перед
началом измерений в течение 16—20 часов выдерживать почву на
водяной бане. В этом случае разброс показателей потребления02 будет менее значительным.Как уже отмечалось выше, один из недостатков метода сос¬
тоит в том, что респирационные сосуды имеют небольшие разме¬
ры и поэтому пригодны для исследования весьма малых (4 г)
образцов почвы. Для устранения этого недостатка некоторые ав¬
торы [116] применяли сосуды большого объема, вмещающие
20—25 г почвы. В результате возрастает степень надежности ис¬
следования. При работе с такими сосудами необходимо более
часто снимать показания манометра.10.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗОЛИТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ ПОЧВЫ
МЕТОДОМ ПЕТКОВА И МАРКОВОЙДля определения целлюлозолитической активности в лаборатор¬
ных условиях Петков и Маркова [121] рекомендуют метод, ос¬
нованный на сжигании органического вещества в присутствии
бихромата калия. К 100 г высушенной и тонкоизмельченной поч¬
вы добавляют 1 % целлюлозного порошка и смесь тщательно
перемешивают. Затем ее равномерно увлажняют водой, взятой в
количестве 60% от полной влагоемкости почвы, переносят в
пластмассовую или стеклянную кювету и инкубируют в термос-239
тате при 28 °С. Испарившуюся воду по мере надобности воспол¬
няют. После созревания, длящегося 4—8 недель, образцы высу¬
шивают и гомогенизируют. Навеску в 20 г воздушно-сухой поч¬
вы досушивают при 105 °С до постоянства массы и 1 г почвы
вносят в колбу Кьельдаля с меткой, соответствующей объему
200 мл. В колбу добавляют 20 мл 1 н. раствора бихромата ка¬
лия и 15 мл концентрированной серной кислоты с удельной
массой 184. Полученную смесь кипятят в течение 5 минут, ох¬
лаждают и дистиллированной водой доводят объем до 200 мл.
Содержимое колбы тщательно перемешивают, отстаивают ^ча¬
сов и при помощи спектрофотометра измеряют количество вос¬
становленных ионов Сг+++ (при длине волны 590 нм). Путем со¬
поставления показателей оптической плотности со стандартной
кривой можно определить содержание углерода, соответствую¬
щее количеству Сг+++, и затем пересчитать его на целлюлозу.Для приготовления стандартной кривой к 20 мл 1 н. раство¬
ра К2Сг207 добавляют 15 мл концентрированной серной кисло¬
ты и кипятят в течение 5 минут. Затем в отдельные колбы вно¬
сят в порядке возрастания концентрации (0, 0,5, 1,0, 2,5, 5, 10,
15, 20, 25, 30 мл) титрованный раствор соли Мора и, добавляя
дистиллированную воду, доводят объем жидкости до метки.
После перемешивания жидкости с помощью фотоколориметра
измеряют оптическую плотность при 590 нм.Целлюлозолитическую активность образца рассчитывают пу¬
тем сравнения с контрольными образцами не содержащей цел¬
люлозы почвы.10.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙАКТИВНОСТИ ПОЧВЫМЕТОДОМ ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ СТАНДАРТОВО биологической активности почвы можно судить по интенсивно¬
сти процессов разложения. Одним из критериев их интенсивности
наряду с продуцированием С02 является уменьшение массы по¬
мещенного в почву органического материала растительного про¬
исхождения.Метод, основанный на применении целлюлозных стандартов
[163J, заключается в следующем. Из неплотной синтетической
ткани с помощью нейлоновых ниток шьют мешочки размером
8ХІ6 см (для этой цели наиболее пригоден нейлоновый тюль).В каждый мешочек помещают 5 г хлопковой ваты, предваритель¬
но высушенной до постоянной массы при 105 °С. После равномер¬
ного распределения ваты в мешочке его зашивают. Для приготов¬
ления стандартов пригодна продающаяся в аптеках так называ¬
емая хирургическая вата; более дешевая бытовая ват,а, кроме
целлюлозы, содержит и синтетические волокна. Готовые мешочки
нумеруют, прикрепляя к ним алюминиевые или медные бирки с
выгравированными номерами.240
Мешочки закапывают в почву на глубину 15 см. Для этого
лопату полностью вдавливают в почву и, покачивая черенок ло¬
паты, делают щель такого размера, чтобы в нее можно было го¬
ризонтально уложить мешочек на более длинное ребро. Затем
лопату вводят в почву рядом со щелью и обкладывают мешочек
почвой. Необходимо следить за тем, чтобы мешочки были уложе¬
ны на одинаковую глубину, поскольку от этого в значительной
степени зависит интенсивность разложения. Для серии опытов
обычно берут 8—12 мешочков. При закладке на делянках про¬
пашных культур мешочки следует размещать в рядках растений,
чтобы они не были повреждены при механизированной обработке
междурядий. Места закладки обозначают колышками.В зависимости от длительности вегетации растений мешочки
извлекают из почвы спустя 3—6 месяцев. Извлеченные мешочки
с остатками целлюлозы следует как можно быстрее просушить
на водухе и осторожно удалить с их поверхности остатки почвы.
Затем мешочки вываривают в 1%-ном растворе соляной кислоты
с целью удаления измененной микроорганизмами деполимеризо-
ванной целлюлозы. В процессе вываривания и последующего про¬
мывания материал освобождается от остатков почвы и части ми¬
неральных веществ. Вместо автоклава для вываривания можно
использовать песочную баню или электрический нагревательный
элемент с регулируемым нагревом. В последнем случае необходи¬
мо следить за неизменностью исходного объема жидкости, напри¬
мер используя обратный холодильник. Для вываривания отдель¬
ных мешочков берут равное количество кислоты из расчета 100 мл
раствора НС1 на каждый стандартный образец целлюлозы мас¬
сой 5 г. Длительность вываривания в автоклаве — 1 час, считая
от начала интенсивного парообразования (температура, регист¬
рируемая установленным вблизи пароотводного вентиля термо¬
метром, достигает 100°С). В некоторых случаях продолжитель¬
ность кипения отсчитывают с момента достижения точки кипе¬
ния.По окончании проваривания автоклав оставляют открытым на
10—15 минут, затем сливают раствор соляной кислоты с образ¬
цом и проводят многократное промывание — вначале водопро¬
водной водой при 70—80 °С, после этого — холодной водопро¬
водной водой, стараясь при этом не сминать мешочки, поскольку
через отверстия в ткани могут быть вымыты и короткие целлю¬
лозные волокна. Промывание завершают в дистиллированной во¬
де и мешочки высушивают.Просушенные мешочки с целлюлозными стандартами вскры¬
вают, оставшуюся целлюлозу высыпают на пергаментную бума¬
гу, пинцетом удаляют, корни растений и затем, целлюлозу вместе
с остатками почвы переносят в пронумерованные, высушенные
при 105 °С и взвешенные фарфоровые тигли. Тигли помещают в
сушильный шкаф, целлюлозу высушивают при 105 °С до постоян¬
ной массы, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Затем в вы¬
тяжном шкафу ее сжигают в денатурированном спирте и в тече-241
ниє 2,5 часа прокаливают в электропечи при 600 °С. Оставшуюся
в тигле золу обрабатывают 5—10%-ным раствором карбоната
аммония с целью восстановления карбонатов, высушивают до
постоянной массы, охлаждают в эксикаторе и вновь взвешивают.Массу остаточной целлюлозы определяют как разность массы
материала после просушивания при 105°С и массы после прока¬
ливания. Количество разложенной целлюлозы можно вычислить
по ее исходной и остаточной массе. Для этого необходимо иметь
контрольный целлюлозный стандарт, который не помещали в поч¬
ву, но подвергали такой же промывке, сушке и прокаливанию,
как и опытные образцы. С учетом потерь при прокаливании оп¬
ределяют исходное количество целлюлозы.Один из вариантов данного метода может быть применен в
лабораторных опытах. В мешочки размером 5X15 см помещают3 г хлопковой ваты, а в мешочки 6X6 см укладывают 1,—1,5 г
ваты или фильтровальной бумаги.Различия величин площадей поверхности стандартных образ¬
цов должны составлять не более 5%. В одной серии опытов мож¬
но использовать лишь один вид материала — или вату, или филь¬
тровальную бумагу.При выборе размера мешочков и количества целлюлозы сле¬
дует учитывать, что в течение эксперимента даже в почве с наи¬
высшей целлюлозолитической активностью должно минерализо¬
ваться не более 70—75% целлюлозы; в противном случае значи¬
тельно сокращается активная поверхность и в отсутствие субстра¬
та (целлюлозы) влияние различных условий будет не столь за¬
метно.В экспериментах на небольших делянках (40—50 м2) в естест¬
венных условиях достаточно разместить четыре мешочка в двух
точках делянки. В лабораторных условиях в отдельные сосуды
помещают по 1—2 мешочка с возможно наименьшим содержа¬
нием целлюлозы (1—1,5 г). Если емкость содержит более 5 кг
почвы, образец может содержать и 3 г целлюлозы.10.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ ПОЧВЫС ПОМОЩЬЮ ФОТОБУМАГИ ИЛИ ФОТОПЛЕНКИСветочувствительные компоненты фотографической бумаги и пле¬
нок диспергированы в желатине. Очень многие почвенные микро¬
организмы разжижают желатин, т. е. он может служить для этих
организмов питательным субстратом. На этом основан метод
Мишустина, Никитина и Вострова [99], предложивших использо¬
вать фотобумагу или фотопленку для выявления микроорганиз¬
мов, расщепляющих желатин.Фотобумагу разрезают на прямоугольники размером 6ХІ0 см;
для этого удобен картон, более устойчивый к воздействию поч¬
венной влаги. Вместо фотобумаги можно использовать и фото¬
пленку, позволяющую делать кадры размером 6X6 см. Пленку242
нарезают кусками по 13—14 см и закрепляют эмульсией вверх
на стеклянных пластинках размером 6ХІ0 см. Для лучшей фик«
сации края плеики загибают на обратную сторону стекла и при¬
клеивают клейкой лентой.В почве лопатой делают щель глубиной около 20 см и поме¬
щают в нее фотобумагу или пленку длинной стороной вниз, при¬
жав эмульсию к гладкой поверхности среза почвы и закрепив не¬
подвижно во избежание повреждения желатинового слоя. Верх¬
ний край бумаги должен находиться на уровне поверхности поч¬
вы. Затем лопату вводят в землю на расстоянии 6—8 см от щели
и еще раз прижимают материал к почвенному срезу.В том случае, если протеолитическую активность определяют
на площадях, затопляемых водой (рисовых полях), фотомате¬
риалы можно вдавить в почву и без лопаты. На таких почвах
Востров и Долгих [169] рекомендуют использовать только фото¬
бумагу, поскольку под действием влаги желатиновая эмульсия
легко отслаивается от пленки. Во избежание повреждения жела¬
тинового слоя фотобумагу при закладке рекомендуют помещать
в чехол из стеклоткани.Длительность экспозиции фоточувствительных материалов за¬
висит от влажности, температуры почвы, цели исследования и
обычно составляет 72 часа, но может быть больше или меньше.
Извлечение пластинок из почвы требует большой осторожности,
так как эмульсия может отслоиться от намокшей бумаги; необхо¬
димо следить и за тем, чтобы не повредить желатиновый слой.
После извлечения и высушивания пластинок подсчитывают число
пятен разложения на желатине, которое при наличии соответст¬
вующего количества параллельных образцов может служить ос¬
новой для сравнения протеолитической активности почвы.Если пластинки нужно проявить, их промывают в проточной
воде и обычным способом обрабатывают.Востров и Долгих |[169] в анаэробных условиях наблюдали
появление на поверхности бумаги темных пятен, что свидетельст¬
вует о ее проявлении в почве. Восстановление серебра фоточув-
ствителыюй эмульсии позволяет также регистрировать в увлаж¬
ненной почве зоны, обладающие восстановительной активностью.
Механизм химических реакций, вызывающих восстановление, изу¬
чен пока не полностью; предполагают, что это явление представ¬
ляет собой результат разнородных процессов. Востров и Долгих
считают, что определенную роль при этом играют встречающиеся
в восстановительных зонах гидроокиси железа и феноловые про¬
изводные, которые образуются при разложении растительных
остатков. В пользу этого предположения свидетельствует, в част¬
ности, тот факт, что на бумаге восстановленные пятна появляют¬
ся в местах ее соприкосновения с кусочками растений или корня¬
ми живого растения.При изучении восстановительных зон фотобумагу в пакетах
из стеклоткани выдерживают в почве не так долго, как при опре¬
делении протеолитической активности. Оптимальная длительность243
экспозиции — обычно 48 часов. После осторожного извлечения
из почвы с фотобумаги смывают загрязнения и немедленно поме¬
щают ее в фиксирующий 25%-ный раствор гипосульфита. Фикси¬
рованную фотобумагу можно хранить длительное время.10.6. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
ПОЧВЕННОГО ПРОФИЛЯПо интенсивности процессов разложения можно судить о биоло¬
гической активности почвы. Этот принцип положен советскими
исследователями в основу метода, позволяющего наблюдать био¬
логическую активность почвенных горизонтов. Полоски льняной
или хлопчатобумажной ткани (для этого наиболее подходит про¬
стынное полотно) размером 20X100—120 см вертикально закапы¬
вают в почву таким образом, чтобы ткань одной стороной непо¬
средственно соприкасалась со стенкой почвенного профиля, а с
другой стороны была изолирована от насыпаемой сверху почвы
пластмассовым или стеклянным щитом. Интенсивность разложе¬
ния ткани зависит от биологической активности отдельных поч¬
венных горизонтов, в связи с чем. данный метод можно отнести к
одному из вариантов метода целлюлозных стандартов.Стенку свежеотрытого профиля выравнивают с помощью но¬
жа. Полосу ткани закрепляют на листе твердого полимерного ма¬
териала, ширина которого составляет 30 см, а длина на 2—3 см
превышает длину ткани.Непосредственно перед укладкой ткани стенку профиля сгла¬
живают смоченным в спирте и обожженным ножом, а затем по¬
лоску полотна, накрытую нейлоновой тюлевой тканью, прижима¬
ют к поверхности профиля так, чтобы верхний край образца сов¬
падал с уровнем поверхности почвы. Затем яму засыпают, следя
за тем, чтобы полоска ткани была прижата к ее стенке; для этого
насыпаемую почву несколько уплотняют. Место установки образ¬
ца ткани отмечают колышком.Опытный образец извлекают из почвы через 3^—6 месяцев. Для
этого вновь отрывают яму, не повреждая при этом материал,
осторожно отделяют от стенки профиля полотняную полосу и вы¬
нимают ее. В лаборатории снимают защитную нейлоновую ткань,
удаляют частицы почвы и определяют размер площади, на кото¬
рой видны следы процессов разложения, отмечая при этом и глу¬
бину соответствующих участков. Степень разложения пересчиты¬
вают на единицу площади и выражают в квадратных сантимет¬
рах.Для использования полотняных полос в демонстрационных
целях их следует законсервировать, поскольку в присутствии воз¬
духа процессы разложения могут продолжаться. С этой целью
оставшееся полотно наклеивают на пластину из твердого мате¬
риала (лист черной пластмассы и бесцветный клей, например
«Техноколь»), На истлевших участках ткани эту кропотливую
препарационную работу выполняют с помощью пинцета. Накле-244
енную полотняную полосу следует покрыть прозрачным синте¬
тическим материалом. Для этого с успехом можно применять про¬
дающийся в аптеках ВНР синтетический аэрозольный препарат
«Пластубол», предназначенный для обработки поверхности ран.
Белой краской на лист пластмассы наносят шкалу глубин.Мишустин и Востров несколько модифицировали этот метод
с учетом того обстоятельства, что размножение целлюлозных мик¬
роорганизмов сопровождается появлением на поверхности ткани
различных аминокислот. Проявление аминокислотных пятен поз¬
воляет обнаруживать следы жизнедеятельности микроорганизмов
и на участках ткани, не имеющих видимых признаков разложе¬
ния.Мишустин рекомендует на 20—30 суток закладывать в почву
полоски ткани размером 100X500 мм. Затем освобожденное от
частиц почвы полотно опрыскивают 0,5%-ным раствором нингид-
рина в ацетоне и высушивают. В местах разложения целлюлозы
появляются окрашенные в лиловый цвет пятна аминокислот.10.7. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ
АКТИВНОСТИ ПОЧВЫОдним из широко распространенных методов измерения интенсив¬
ности почвенно-биологических процессов является определение
ферментативной активности. Ферментативная активность почвы
зависит от ее физических и химических особенностей, содержания
питательных веществ, уровня pH, содержания солей и т. д. Часть
почвенных ферментов синтезируют и выделяют через корневую
систему высшие растения. Остальные ферменты почвы имеют
микробиологическое происхождение, являясь продуктами метабо¬
лических процессов почвенных микроорганизмов.Для определения ферментативной активности обычно берут
почву, подсушенную на открытом воздухе; влажные образцы
следует подсушивать в лаборатории при комнатной температуре.
Необходимо следить за тем, чтобы образец не содержал неразло-
жившихся растительных остатков. Комки почвы измельчают и
просеивают через сито с ячеями размером 1 мм. При изучении
ферментативной активности свежего (влажного) образца полному
удалению растительных остатков следует уделять еще больше
внимания. Одновременно с изучением активности определяют и
влажность почвы, полученный результат пересчитывают на 1 г
абсолютно сухой почвы.10.7.1. Определение инвертазной активности почвыМетод измерения инвертазной активности основан на количест¬
венном определении редуцирующих сахаров, образующихся в
результате расщепления сахарозы. Наиболее широкое примене¬
ние нашел метод Бертрана (стр. 146). С этой же целью отдель¬17 п. сэги 245
ные авторы применяют и поляриметрический метод, основанный
на измерении оптических характеристик сахарозы.Образец воздушно-сухой почвы массой 5 г помещают в кони¬
ческую колбу емкостью 100 мл и добавляют 10 мл 5%-ного рас¬
твора сахарозы, 10 мл ацетатного буферного раствора с pH 4,7
и 5—6 капель раствора толуола. Колбу закрывают корковой
пробкой и встряхивают в течение получаса. Затем ее на 24 часа
устанавливают в термостат с температурой 30 °С; содержимое
колбы время от времени встряхивают.В качестве контроля Галстян рекомендует использовать почву,
стерилизованную сухим жаром (в течение 3 часов при 180°С).
Другие исследователи предпочитают проводить стерилизацию в
автоклаве. Субстрат, не содержащий почвы, также может слу¬
жить контролем.После инкубации суспензию фильтруют через бумажный
фильтр, дистиллированной водой смывают на фильтр оставшуюся
в колбе почву, а объем фильтрата доводят в мерной колбе до
100 мл.Пипеткой отбирают 10—20 мл полученного раствора и опре¬
деляют содержание в нем глюкозы (отбираемый для анализа
объем зависит от количества редуцирующих сахаров, содержание
которых не должно превышать 100 мг). Инвертазную активность
выражают как количество глюкозы (мг) в 1 г почвы, определен¬
ное за 24 часа. Анализ рекомендуется проводить на четырех па¬
раллельных образцах.10.7.2. Определение амилазной активности почвыРазличают а- и ß-амилазу, механизм действия которых неодина¬
ков. Основным продуктом гидролитических процессов, протекаю¬
щих при участии а-амилаз, являются цепи декстринов различной
длины, которые не окрашиваются иодом в синий цвет. Кроме то¬
го, образуется и небольшое количество мальтозы, ß-амилазы
прежде всего образуют мальтозу из декстринов, но в небольшом
количестве способны образовывать ее и непосредственно из крах¬
мала. ß-амилаза чувствительна к высоким температурам и инак¬
тивируется при 70 °С в течение 15 минут. Активность а-амилазы
при этих же условиях не меняется, но этот фермент чрезвычайно
чувствителен к уровню pH и полностью теряет активность при
понижении pH субстрата до 3,3. Подобные различия в свойствах
служат основой методов разделения ферментов.По мнению Хофмана, в почве содержится больше ß-амилазы.
Поэтому почвенную амилазную активность определяют по этому
ферменту, так как в его активности в конечном счете отражено
и совместное действие обоих ферментов. Метод основан на коли¬
чественном определении образующейся мальтозы по Бертрану.В коническую колбу емкостью 100 мл вносят 5 г почвы и до¬
бавляют 10 мл 2%-ного крахмального раствора, 15 мл ацетатного246
буфера с pH 5,6 и 0,5 мл толуола, подавляющего жизнедеятель¬
ность микроорганизмов. Колбу закрывают корковой пробкой,
взбалтывают 30 минут и на 24 часа помещают в термостат при
температуре 37 °С, периодически встряхивая ее содержимое. За¬
тем суспензию фильтруют на фильтровальной бумаге, оставшуюся
в колбе почву смывают на фильтр дистиллированной водой и
вновь промывают. Фильтрат собирают в мерную колбу емкостью
100 мл, добавляют дистиллированную воду, доводя объем жидко¬
сти до метки, и содержимое колбы перемешивают. Отобрав 20 мл
фильтрата для определения мальтозы, методом Бертрана
(стр. 146) измеряют содержание редуцирующего сахара.Контролем служит почва, стерилизованная сухим жаром (в
течение 3 часов при 180°С). Для сравнения можно брать и раз¬
личные дозы чистого препарата амилазы. Амилазную активность
определяют по количеству миллиграммов мальтозы, накопившему¬
ся в 1 г почвы за 24 часа.10.7.3. Определение активности ß-глюкозидазыФермент ß-глюкозидаза расщепляет ß-глюкозидные связи дисаха¬
ридов, полисахаридов и ß-глюкозидов. Для измерения активности
этого фермента применяют салицин или амигдалин. В естествен¬
ных условиях используют глюконовый арбутин, или гидрохинон-
ß-D-глюкозид, который благодаря особой химической структуре
не оказывает значительного воздействия на активность фермента.
Определение следует проводить в субстрате, кислотность которо¬
го в зависимости от исследуемого материала изменяется от pH
4,1 до pH 6,2. В процессе ферментативного расщепления ß-глю¬
козидов образуется глюкоза, которую определяют методом Берт¬
рана, основанным на редуцирующей способности глюкозы.В коническую колбу емкостью 100 мл помещают 5 г воздуш¬
но-сухой почвы и добавляют 5 мл 10%-ного раствора арбутина,
15 мл фосфатного буфера с pH 6,2 по Сёренсену (стр. 265) и
0,5 мл толуола. Колбу закрывают корковой пробкой и в течение
получаса взбалтывают, затем в течение 24 часов выдерживают
в термостате при 37 °С, периодически встряхивая.В качестве контроля берут почву, выдержанную три часа в
сушильном шкафу при 180 °С. Кроме того, анализу подвергают и
субстрат, не содержащий почвы.По завершении термообработки субстраты фильтруют через
фильтровальную бумагу. Дистиллированной водой на фильтр
смывают и почву, оставшуюся на стенках колбы. Фильтрат соби¬
рают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят его объем до
метки.Содержимое колбы перемешивают, отбирают 20 мл жид¬
кости и определяют содержание глюкозы. Активность фермента
выражают 'как количество глюкозы, накопившееся в 1 г почвы
за 24 часа.17* 247
10.7.4. Определение активности уреазыУреаза представляет собой строго специфичный однокомпонент¬
ный фермент, гидролизующий только карбамид с образованием
С02 и NH3. Температурный оптимум уреазы зависит от ее приро¬
ды. Фермент, синтезируемый бактериями, обладает наивысшей
активностью при 50°С, а выделенный из культур грибов наиболее
активен при 38 °С. При 70°С уреаза очень быстро инактивирует¬
ся, оптимум pH лежит в пределах 7,2—7,5. В почве она сохраняет
активность в широком интервале значений pH.Измерение активности уреазы основано на количественном
определении аммиака, высвобождающегося из карбамида. В ко¬
ническую колбу емкостью 100 мл вносят 5 г воздушно-сухой поч¬
вы, добавляют 10 мл 1;0%-ного раствора карбамида, 15 мл фос¬
фатного буфера с pH 5,7 по Сёренсену и 5—6 капель толуола.
Колбу закрывают корковой пробкой и встряхивают 30 минут. За¬
тем ее 24 часа выдерживают в термостате при 38 °С, содержимое
колбы также время от времени взбалтывают. После извлечения
колбы из термостата отстоявшуюся жидкость сливают и пропу¬
скают через бумажный фильтр. К оставшейся в колбе почве до¬
бавляют 15 мл 1 н. раствора КС1, смесь взбалтывают 5 минут,
несколько минут отстаивают и жидкость сливают в фильтроваль¬
ную воронку. Встряхивание и осаждение повторяют с 10 мл дис¬
тиллированной воды, после чего суспензию вместе с почвой вы¬
ливают на фильтр. В мерной колбе объем фильтрата доводят до
100 мл и с помощью микродистиллятора Парнасса — Вагнера
(стр. 148) определяют содержание аммиака. Уреазную активность
выражают в мг NH3 на 1 г абсолютно сухой почвы.10.7.5. Определение активности фосфатазыФосфатаза —■ собирательное название большой группы фермен¬
тов, значительно различающихся между собой не только по хи¬
мическим свойствам, но и по чувствительности к реакции суб¬
страта. Одни из них активны в щелочном субстрате (pH 8—9),
другие проявляют максимальную активность в нейтральной (pH
6—7) или кислой (pH 3—5) среде.По методу Крамера и Эрдеи [65] фосфатазную активность при
естественном уровне кислотности почвы определяют следующим
образом. В колбу емкостью 150 мл вносят 5 г почвы и смешивают
ее с 2,5 г толуола. Спустя 15 минут добавляют 20 мл 0,5—2%-но-
го раствора динатрийфенилфосфата и смесь инкубируют при
37°С. Через 2—24 часа добавляют 100 мл 0,5%-ного раствора
квасцов, содержимое колбы энергично встряхивают и затем филь¬
труют на складчатом фильтре. Количество субстрата и длитель¬
ность инкубации следует подбирать с таким, расчетом, чтобы сте¬
пень гидролиза фенола не превышала 10%. 5 мл фильтрата, со¬
держащего 0,08—0,02 мг фенола, вносят в мерную колбу на 25 мл,248
добавляют 5 мл боратного буфера с pH 9,4 и четыре капли реак¬
тива Гиббса (раствор 0,125 г 2,6-дибромхинонхлоримида в 10 мл
спирта). Объем раствора в мерной колбе доводят до метки и за¬
тем при длине волны 600—650 нм измеряют плотность окраски
раствора.Контролем служит почва, выдержанная в течение 3 часов в
сушильном шкафу при 180 °С. Необходим еще один контрольный
опыт, который ставится на одних растворах без почвы.Количество гидролизованной фосфорной кислоты выражают
в миллиграммах Р2О5, накопившегося в 1 г абсолютно сухой поч¬
вы за 24 часа.10.7.6. Определение активности каталазыКаталаза относится к окислительно-восстановительным фермен¬
там и представляет собой двухкомпонентный фермент, состоящий
из белка и активной группы; в состав последней входит гемино-
вый комплекс.Температурный оптимум фермента характеризуется весьма
низкими показателями: по наблюдениям Купревич и Щербаковой,
он охватывает интервал между 0 и 10 °С. При высокой темпера¬
туре и низком, значении pH каталаза очень быстро инактивиру¬
ется.К сильным ингибиторам этого фермента относятся синиль¬
ная кислота, сероводород, гидроксиламин и азид натрия.Каталазу синтезируют практически все живые организмы, по¬
этому данный фермент всегда можно обнаружить в почве.Существуют две группы методов определения активности ка¬
талазы. В первую входят объемные методы, позволяющие выяв¬
лять активность в жидкой среде. Содержание каталазы опре*
деляют титрованием перманганатом калия или методом йодомет-
рии.Метод газометрии, применяемый при исследовании почвенных
ферментов, основан на определении активности каталазы по кис¬
лороду, высвобождающемуся вследствие распада перекиси водо¬
рода. В дальнейшем этот метод рассматривается подробно.Для определения количества высвобождающегося кислорода
наиболее удобен обычно имеющийся в почвенных лабораториях
кальциметр Шайблера, который состоит из трех основных частей
(рис. 63). Широкогорлый стеклянный сосуд 8 емкостью 0,5 л за¬
крыт резиновой пробкой, в которую вставлена стеклянная труб¬
ка. Две стеклянные трубки 2 и 3 закреплены на деревянном, шта¬
тиве 1 ив нижней части соединены резиновой трубкой. Одна из
трубок (2) имеет шкалу с делениями точностью до 0,1 мл, вторая
резиновой трубкой 4, подсоединенной к боковому отводу, соедине¬
на с сосудом Девиля 5 емкостью 1,5 л. Этот сосуд с водой —■
третий важнейший элемент прибора. Резиновая трубка имеет за¬
жим Мора. Трубка 2 соединена с сосудом 8 через кран 6 и рас¬
ширяющуюся часть трубки 7. При открытом кране в систему пе¬249
редается внешнее давление, если же
кран перекрыт, система изолирована.Измерение проводят следующим
образом. В сосуд 8 помещают 1—3 г
воздушно-сухой почвы и добавляют0,5—1 г СаСОз. Затем пинцетом на
дно сосуда осторожно устанавливают
небольшой тигель, содержащий 5—
10 мл 3%-ной перекиси водорода, и
открывают кран 6, обеспечивая тем
самым сообщение системы с атмосфе¬
рой. Сосуд Девиля 5 устанавливают
на верхнюю полку прибора, открыва¬
ют зажим на резиновой трубке и в
стеклянную трубку 2 подают воду до
тех пор, пока меннск жидкости не до¬
стигнет нулевого деления шкалы. Пос¬
ле этого зажим закрывают и с по¬
мощью крана 6 систему изолируют от
наружного давления. На следующем
этапе анализа сосуд 8 наклоняют та¬
ким образом, чтобы перекись водоро¬
да из тигля вылилась на образец поч¬
вы, после чего содержимое колбы
встряхивают; одновременно включают
секундомер. Колбу 5 переносят на
нижнюю полку прибора; спустя мину¬
ту зажим Мора на мгновение ослабля¬
ют для выравнивания уровней жидко¬
сти в двух трубках. По шкале опре¬
деляют объем вытесненной воды. Поч¬
ву в колбе 8 вновь встряхивают, спу¬
стя минуту приоткрывают зажим до выравнивания уровней воды
и вновь определяют положение водного мениска в трубке 2.Каталазную активность выражают как количество высвобо¬
дившегося кислорода в пересчете на 1 г почвы. Контролем слу¬
жит образец почвы, обработанный сухим жаром (1 час при
150°С). Исследование проводят в четырех повторениях при 18=—
20 °С.Рис. 63. Кальциметр Шайблера
для определения каталазной
активности.10.7.7. Определение активности пероксидазПероксидазы относятся к окислительным ферментам, весьма сла¬
бо реагирующим непосредственно с молекулярным кислородом,
но активирующим кислород перекиси водорода и органических
перекисных соединений. Пероксидазы катализируют процессы
окисления полифенолов, и поэтому им отводится важная роль в
синтезе меланинов и гуминовых веществ микробиологического
происхождения.250
Активность пероксидаз определяют по интен¬
сивности образования пурпургаллина, измеряе¬
мой методом фотоколориметрии. 5 г сухой поч¬
вы вносят в колбу емкостью 300 мл, добавляют
100 мл дистиллированной воды и 0,5 мл толуо¬
ла, после чего содержимое колбы встряхивают
20 минут. Затем суспензию фильтруют на бу¬
мажном фильтре, при необходимости — неодно¬
кратно.В подготовленные мерные колбы емкостью
50 мл вносят по 10 мл свежеприготовленного
1%-ного раствора пирогаллола, 2 мл 2%-ного
раствора перекиси водорода, встряхивают и до¬
бавляют к смеси 20 мл фильтрата. В контроль¬
ной пробе фильтрат вначале кипятят 15 минут.Закрытые пробками мерные колбы выдержива¬
ют 30 минут в термостате при 30°С, затем в
каждую добавляют по 5 мл 20%-ной серной
кислоты для инактивации фермента. Образую¬
щийся пурпургаллин отделяют от субстрата в
делительной воронке. Для этого в нее несколько
раз добавляют эфир, смесь встряхивают и рас¬
творяющийся в эфире пурпургаллин собирают в
мерную колбу емкостью 50 мл. Эту операцию
продолжают до тех пор, пока пурпургаллин ок¬
рашивает эфир. Если новая порция эфира уже не окрашивается,
объем собранного эфирного раствора пурпургаллина доводят до
50 мл добавлением чистого эфира и фотоколориметрическим ме¬
тодом определяют интенсивность окраски. Анализ проводят с зе¬
леным светофильтром при длине волны 508 нм, используя кюветы
диаметром 10 мм.При приготовлении раствора для сравнения 0,75 г бихромата
калия растворяют в 1 л 0,5 н. соляной кислоты. Второй метод
приготовления — растворение 5 г кристаллического пурпургал¬
лина в 50 мл эфира.Фотоколориметрический анализ дает удовлетворительный ре¬
зультат лишь в тех случаях, когда исследуемый субстрат содер¬
жит не менее 2 мг пурпургаллина. Если же его содержание не
достигает этой величины, образец почвы должен быть увеличен.
Активность пероксидаз выражают в миллиграммах пурпургал¬
лина на 1 г почвы в течение 24 часов.10.7.8. Определение активности полифенолоксидазПолифенолоксидазы играют важную роль в синтезе гуминовых
веществ и, следовательно, в процессах почвообразования. Коно¬
нова считает, что окислительные ферменты, в том числе и поли¬
фенолоксидазы, имеют решающее значение для синтеза так на¬
зываемых прегуминовых молекул, поскольку в результате ихРис. 64. Про¬
бирка Тунберга.251
активности образуются соединения типа хинона, вступающие в
реакции конденсации с аминокислотами и пептидами.Ароматические соединения попадают в почву с растительными
остатками. Особенно богат этими соединениями лигнин. В расте¬
ниях встречаются монофенолы (тирозин), дифенолы (пирокате¬
хин, резорцин, гидрохинон) и трифенолы (пирогаллол, флоро¬
глюцин, оксигидрохинон).Методика определения активности почвенных полифенолокси-
даз и пероксидаз одинакова, различие состоит лишь в том, что
в исследованиях первых ферментов к субстрату не добавляют
перекись водорода. Кроме того, длительность инкубации состав¬
ляет не полчаса, а 24 часа при 30 °С.10.7.9. Определение активности дегидрогеназАктивность дегидрогеназ обычно определяют по степени обес¬
цвечивания метиленового синего или иного индикатора с низким
окислительно-восстановительным потенциалом. При изучении
дегидрогеназ почвы в качестве акцептора используют бесцвет¬
ные соли тетразолия, которые в анаэробных условиях в присут¬
ствии дегидрогеназы восстанавливаются до красных соединений
формазана.В пробирку Тунберга (рис. 64) помещают 1 г сухой почвы,
60 мг порошкообразного СаСОз, 1 мл 1%-ного раствора глю¬
козы и 1 мл 1%-ного раствора 2,3,5-трифенил-тетразолхлорида.
Содержимое пробирки перемешивают встряхиванием, затем от¬
качивают воздух до давления 10—12 мм рт. ст. и закрывают про¬
бирку поворотом пробки. Далее пробирки инкубируют при 38 °С
в течение 24 часов. После извлечения их из термостата к суб¬
страту добавляют 25 мл этилового спирта, смесь встряхивают
5 минут и фильтруют через бумажный фильтр. Содержание три-
фенилформазана в фильтрате измеряют методом фотоколори¬
метрии при длине волны 546 нм с использованием синего свето¬
фильтра и кювет толщиной 0,5 см. Контролем служит раствор
известного количества трифенилформазана в спирте; в контроль¬
ном опыте пробирка содержит почву, выдержанную три часа
при 180 °С.Активность дегидрогеназ выражают в миллиграммах трифе¬
нилформазана, образовавшегося за 24 часа в присутствии 10 г
почвы.
IlИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ПЕСТИЦИДОВ
НА ПОЧВЕННЫЕ
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫВ специальной литературе опубликовано много сообщений, авто¬
ры которых с помощью различных показателей интерпретируют
интенсивность почвенных биологических и биохимических про¬
цессов. В этих работах, цель которых заключается в оценке так
называемой суммарной биологической активности, токсичность
пестицидов в почве измеряют по выделению СО2, потреблениюО2, активности ферментов, а также по скорости разложения раз¬
личных органических материалов, например целлюлозы, поме¬
щенных в почву. Для сравнительного анализа полученные таки¬
ми методами данные более приемлемы, чем результаты экспери¬
ментов с чистыми культурами, но и они позволяют лишь оценить
деятельность больших групп микроорганизмов и непригодны для
выявления влияния пестицидов на взаимосвязи в сообществах
почвенных микроорганизмов.Таким образом, исследователи не располагают совершенными
методами оценки влияния пестицидов на почвенные биологиче¬
ские процессы. Объясняется такое положение отчасти большим
разнообразием пестицидов и типов почв и отчасти тем обстоя¬
тельством, что исследования в данной области имеют сравнительно
короткую историю. В дальнейшем изложении будут рассмотрены
методы, которые разрабатывались с целью приложения в иной
области, но находят широкое применение для оценки воздействия
пестицидов на биологическую активность почв.Для определения чувствительности к пестицидам различных мик¬
роорганизмов широко применяют методы диффузии в агаре,,
которые были подробно описаны в главе, посвященной измере¬
ниям антибиотической активности (стр. 163). Эти методы при¬
годны для определения бактерицидного эффекта водораство¬
римых пестицидов. Наибольшее распространение получил метод
лунок. Исследуемый микроорганизм высевают в толщу или
на поверхность агаровой пластинки, затем пробочным сверлом,
соблюдая стерильность, в ней вырезают отверстия диаметром
10 мм. На поверхности агаровой пластинки можно также уста¬
новить отрезки металлических или стеклянных трубок. В выре¬
занные отверстия или в трубки вносят равные количества (0,2 мл)
водного раствора исследуемого пестицида.11.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
К ПЕСТИЦИДАМ253
Затем чашку Петри устанавливают в холодильную камеру
при 10 °С и спустя 10 часов переносят в термостат с температу¬
рой 28 °С. После инкубации, длящейся 1—2 суток, измеряют
диаметр зон подавления или стимулирования роста и на основа¬
нии полученных данных оценивают токсичность пестицида. Тес¬
тирование серий последовательных разведений позволяет опре¬
делить наименьшую бактериостатическую дозу препарата.Чувствительность почвенных микроорганизмов к пестицидам
можно успешно определять и методом бумажных дисков. Обыч¬
но для этого из высококачественной фильтровальной бумаги
(ватман № 1) вырезают диски диаметром 10 мм и стерилизуют
их сухим жаром (10 часов при 105°С). Затем диски пропиты¬
вают водным раствором исследуемого пестицида и помещают на
поверхность агаровой пластинки с культурой тестового микро¬
организма. Как обычно, чашки Петри выдерживают вначале
в холодильнике, затем в термостате и после инкубации измеря¬
ют диаметр зон угнетения роста. Если бумажные диски будут
использованы не сразу после пропитывания раствором пестици¬
да, их можно высушить и хранить в холодильнике в закрытом
сосуде. Сушат диски при температуре не более 40 °С.Действие пестицидов на микроорганизмы можно изучать и
в жидких субстратах. Соответствующую жидкую питательную
среду в пробирках или специальных сосудах засевают культурой
тестового микроорганизма и в эту же среду вносят раствор пес¬
тицида. После инкубации, длящейся 1—2 недели, определяют
показатели физиологической активности культуры микроорганиз¬
ма (утилизация источника углерода, фиксация азота и т. д.) и
измеряют ее биомассу. В опытах с жидкой питательной средой
скорость размножения микроорганизмов можно определять мето¬
дом нефелометрии. Такая возможность существует, если: пита¬
тельная среда не содержит соединений, не растворяющихся в
воде; введение пестицида в питательную среду не изменяет ее
окраску и прозрачность; тестовый микроорганизм вызывает рав¬
номерное помутнение субстрата. Нефелометрический метод не¬
пригоден для наблюдения за размножением грибов и актиноми-
цетов, растущих только на поверхности питательного раствора в
виде пленки мицелия.Для определения чувствительности различных микроорганиз¬
мов к пестицидам рекомендуется брать чистые препараты без
балласта, так как некоторые из балластных материалов влияют
на размножение тестовых микроорганизмов и в отсутствие пес¬
тицидов.11.2. МЕТОД ПОЧВЕННЫХ ДИСКОВДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ
ВОДОРАСТВОРИМЫХ ПЕСТИЦИДОВПринцип метода почвенных дисков, описанного Сэги и Гуяшем
{148], аналогичен принципу метода, основанного на диффузии в
агаре. На поверхность пластинки питательного агара с посевом254
тестового микроорганизма помеща¬
ют почвенные диски, содержащие
исследуемый пестицид. Вместе с
почвенным раствором пестицид диф¬
фундирует в агаровую пластинку,
определенным образом влияя на
рост микроорганизма. Если пести¬
цид токсичен для него, вокруг поч¬
венных дисков образуются зоны за¬
держки роста. Результативность
метода зависит от чувствительности
тестового организма.Для выявления присутствующего
в почвенном растворе гербицида
грамоксона (дихлор-1,1-диметил-
4,4-бипиридил) Сэги и Гуяш ис¬
пользовали в качестве тестового
микроорганизма полученный в Со¬
ветском Союзе штамм Azotobacter
chroococcum № 53. В ходе предва¬
рительных исследований было уста¬
новлено, что данный штамм чрезвы¬
чайно чувствителен к грамоксону. Применение азотобактера удоб¬
но еще и в связи с тем, что он способен размножаться на безазо-
тистых элективных питательных средах, в то время как другие
микроорганизмы, присутствующие в почвенном диске, в этих ус¬
ловиях не размножаются.Для приготовления почвенных дисков и размещения их на
агаровой пластинке авторы сконструировали специальный пресс,
состоящий из трех деталей (рис. 65).Первая деталь — выточенная из алюминия пресс-форма 1 с
отогнутыми краями, вмещающаяся в чашку Петри с агаровой
пластинкой так, что ее края опираются на стенки чашки. В ниж¬
ней части пресс-формы, имеющей толщину 4 мм, на определен¬
ном расстоянии одно от другого высверлены отверстия 2, диаметр
которых может быть различным. Расстояние между дном чашки
Петри и основанием алюминиевой пресс-формы — 8 мм.Пресс-форму устанавливают на фаянсовую (керамическую)
или стеклянную пластинку 3 и ровным слоем насыпают в нее поч¬
ву. Изготовленным из алюминия прессом 4 почву вдавливают в
отверстия. С помощью предметного стекла удаляют лишнюю поч¬
ву и устанавливают форму в чашку Петри 7, содержащую посев
суспензии в агаровой пластинке; посев целесообразно выполнять
в толщу питательной среды. Затем в пресс-форму устанавли¬
вают выталкиватель 5, выступы которого точно входят в отвер¬
стия пресс-формы, и выталкивают почвенные диски на поверх¬
ность агаровой пластинки с посевом азотобактера. Пазы на бо¬
ковой поверхности выталкивателя облегчают его установку в
пресс-форму. Чашки Петри с почвенными дисками выдерживают7Рис. 65. Пресс для выдавливания-
дисков:/ — пресс-форма; 2 — отверстия; 3 —
фаянсовая пластинка; 4 — пресс; 5 —
выталкиватель; 6— почвенные диски;
7 — чашка Петри с агаровой пластин¬
кой.255
5 часов в холодильнике при 10 °С и затем на 24 часа устанавли¬
вают в термостат с температурой 28 °С. Если почвенная жид¬
кость содержит свободный грамоксон, вокруг почвенных дисков
образуются зоны угнетения роста. Данный метод обладает очень
высокой чувствительностью: в присутствии 3 мкг действующего
вещества уже образуются зоны угнетения.Успех применения метода почвенных дисков зависит от со¬
держания влаги в образце почвы и ее связности. При малой
влажности образца почвенные диски на поверхности агаровой
пластинки разрушаются. Практический опыт автора свидетельст¬
вует о целесообразности испытания данным методом почвенных
образцов, содержание влаги в которых соответствует 60% от
полной влагоемкости почвы. В некоторых случаях при рабо¬
те с почвами высокой связности почвенные диски прилипают
к поверхности выталкивателя и не выпадают на поверхность
агаровой пластинки. Для исследования таких почв целесообраз¬
но пользоваться устройством, пресс-форма которого имеет всего
пять отверстий диаметром 10 мм. Почвенные диски большего
размера прочнее прилипают к поверхности агаровой пластинки.
При исследовании содержания грамоксона в относительно рых¬
лых почвах с успехом можно применять устройства, имеющие
30 и даже более отверстий диаметром 4 мм.11.3. ИЗМЕРЕНИЕ АДСОРБЦИИ ГРАМОКСОНА
В ПОЧВЕПопадающий в почву грамоксон быстро связывается почвенны¬
ми коллоидами. Этот процесс необратим и приводит к утрате
токсичности гербицида. Штамм Azoiobacter chroococcum № 53
очень чувствителен к грамоксону, и его с успехом можно при¬
менять для определения способности различных почв и почвен¬
ных компонентов связывать этот препарат. Разработанный с
участием автора метод [150] заключается в следующем.Из основного раствора грамоксона готовят серию разведе¬
ний, каждое из которых содержит половинную относительно к
предыдущему разведению дозу действующего вещества. В про¬
бирки, содержащие по 5 мл растворов отдельных разведений,
вносят 5 г воздушно-сухой почвы, закрывают резиновыми пробка¬
ми и почвенную суспензию полчаса перемешивают на установке
для встряхивания. Затем в течение двух часов суспензию отстаи¬
вают в холодильнике при 5 °С. Супернатант отделяют от почвы
пипеткой и методом лунок определяют его токсичность. С этой
целью в агаровой пластинке с посевом азотобактера вырезают
четыре отверстия, в которые вносят по 0,2 мл раствора. Степень
токсичности отдельных разведений определяют в разных чашках.
После добавления почвенной вытяжки чашки в течение 5 часов
выдерживают в холодильнике при 10 °С и затем переносят в
термостат с температурой 28 °С. Результаты эксперимента оцени¬
вают спустя 24 часа, определяя степень разведения, при которой256
зоны угнетения роста не образуются. Принято считать, что в
этом случае все количество добавленного грамоксона связыва¬
ется на поверхности почвенных коллоидов.Данный метод можно с успехом применять для определения
способности отдельных почв и почвенных компонентов связы¬
вать грамоксон. В частности, результаты исследований, выпол¬
ненных данным методом с участием автора, показали, что 1 г
надьхёрчекского чернозема способен связать 1,2 мг действующе¬
го вещества гербицида, а ёрсентмиклошская песчаная почва —1
всего лишь 0,2 мг. Грамм бентонита может связать 18 мг гра¬
моксона. Различное количество этого гербицида связывают от¬
дельные фракции гумуса.11.4. ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ПЕСТИЦИДОВ
МЕТОДОМ ПЕРКОЛЯЦИИМетод перколяции пригоден для определения активности про¬
цессов нитрификации, синтеза и распада биологически активных
соединений в почве, а также для изучения превращений различ¬
ных водорастворимых органических веществ (глюкозы, сахаро¬
зы, аминокислот и т. д.).В естественных условиях почвенная влага перемещается пре¬
имущественно по вертикали. Этот естественный процесс имитирует
перколяционная техника в столбике почвы, через которую пос¬
тоянно просачивается небольшое количество почвенного раство¬
ра. Циркулирующий раствор содержит субстрат и бактериальные
метаболиты. Влажность и условия аэрации в столбике почвы
благоприятствуют интенсивному размножению микроорганиз¬
мов. Из циркулирующего раствора время от времени можно от¬
бирать образцы жидкости для определения степени превраще¬
ния изучаемого субстрата и количества выделяемых метаболи¬
тов.В литературе описано много перколяторов различных конст¬
рукций. Принцип их действия одинаков, существуют лишь опре¬
деленные конструкционные различия. В данном случае будет
рассмотрен только наиболее простой перколятор Аудуса, кото¬
рый можно изготовить в лабораторной мастерской. Он состоит
из двух сосудов, закрепленных в лабораторном штативе один
над другим и соединенных системой трубок (рис. 66). Верхний
сосуд 1, называемый культиватором, представляет собой стек¬
лянную трубку размером 150X20 мм, снизу закрытую пробкой
с одним отверстием, а сверху — с двумя. В нижнюю часть
культиватора укладывают слой стекловаты 2 толщиной 15—
20 мм, на которую насыпают 30—50 г исследуемой почвы 3.
Почву рекомендуется накрывать стекловатой и сверху.Второй элемент перколятора — сосуд-сборник 4, изготовлен¬
ный из делительной воронки на 200 мл. Оба сосуда связаны си¬
стемой из трех стеклянных трубок внутренним диаметром Змм.
Самая короткая из них (5) соединяет нижнюю часть культива¬257
Рис. 66. Перколятор Аудуса.тора и верхнюю часть сборника. По
второй, так называемой подъемной
трубке 6 почвенный раствор посту¬
пает на поверхность столбика поч¬
вы. От подъемной трубки отходит
отводок большего диаметра 7, пред¬
назначенный как для подачи в цир¬
куляционную систему воздуха, так
и для отбора проб. Третья стеклян¬
ная трубка 8, подсоединенная к на¬
сосу, связывает верхние части сосу¬
дов. Для соответствующего обес¬
печения системы воздухом в эту
трубку в двух местах включены
капиллярные участки 9.Через трубку 7 в делительную
воронку перколятора заливают
жидкость. В соответствии с зако¬
ном сообщающихся сосудов в сбор¬
нике и этой трубке уровень жидко¬
сти будет одинаков. С помощью
насоса через трубку 7 в систему
постоянно подается воздух, пузырь¬
ками поднимающийся в культива¬
тор.Перколятор Аудуса может работать и в стерильных условиях.
В этом случае отверстие трубки 7 закрывают ватной пробкой,
а в трубке 9, перед насосом, устанавливают ватный шарик-
фильтр. Перколятор в собранном виде вместе со штативом мож¬
но стерилизовать в автоклаве. Циркулирующую в системе жид¬
кость стерилизуют отдельно и затем заливают в перколятор че¬
рез трубку 7.Пестицид обычно растворяют в циркулирующей жидкости.
Если его растворимость в воде невелика, пестицид смешивают с
почвой еще перед засыпкой ее в культиватор. В процессе пер-
коляции через 1—2 дня отбирают образцы раствора. При нали¬
чии соответствующего тестового микроорганизма токсичность
раствора можно исследовать каким-либо из описанных выше
диффузионных способов. Если в лаборатории есть газовый хро¬
матограф, жидкость подвергают анализу с целью определения
остаточной концентрации пестицида.Жидкость можно использовать в качестве микробиологичес¬
кого посевного материала для количественного анализа микро¬
организмов.В том случае, если перколятор перед исследованием стери¬
лизовали, в систему можно вводить чистые культуры микроорга¬
низмов и изучать их влияние на состав раствора. При этом сус¬
пензию микроорганизмов наносят на поверхность столбика почвы
до подачи жидкости.258
Метод перколяции имеет определенные недостатки. Главный
из них связан с тем обстоятельством, что в естественных усло¬
виях почвенная влага обычно не циркулирует в почве, а под
действием гравитационных сил движется вниз, и физическое со¬
стояние почвы определенным образом влияет на это движение.
Циркуляционная система перколятора не позволяет осуществ¬
лять разделение микробных метаболитов, образующихся на раз¬
личных стадиях инкубации. Этот недостаток устранен в скон¬
струированном. Макурой аппарате с постоянной циркуляцией,
в котором жидкость, пройдя один раз через столбик, попадает
в сборник. Через определенные промежутки времени пробы со¬
держимого колбы-сборника отбирают для анализа [78].Аппарат состоит из емкости, содержащей жидкость, и куль¬
тиватора вместе с почвенным столбиком. Движение жидкости
через почву регулируется автоматическим электрическим реле,
обеспечивающим постоянный оптимальный поток. В почвенный
столбик из 30—50 г почвы с помощью компрессора подают воз¬
дух, не содержащий СО2. В то же время в конструкции предус¬
мотрена установка поглотителя СО2, которая позволяет опреде¬
лять содержание углекислоты в воздухе, прошедшем через поч¬
ву. Это дает возможность точно измерять количество углекисло¬
ты, образовавшейся в процессе культивации.Перед началом экспериментов через столбик почвы пропус¬
кают дистиллированную воду; после увлажнения почвы ее за¬
меняют раствором, содержащим исследуемое вещество. Регуля¬
тор потока жидкости установлен так, чтобы количество раствора,
протекающего через колонку за 24 часа, равнялось массе почвы,
помещенной в культиватор. Каждый эксперимент рекомендуется
проводить в 4—6 культиваторах одновременно.Для выявления устойчивости внесенных в почву пестицидов
широко используют растительные тесты, определяя степень ток¬
сичности по прорастанию семян и развитию растений на почве,
содержащей пестициды. Полученные значения выражают в про¬
центах от аналогичных характеристик для почв, не содержащих
этих веществ. Вместо этого можно измерять и различия в массе
растений. Тестовым растением наиболее часто служит белая
горчица.259
12РЕЦЕПТЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КРАСОК,
РЕАКТИВОВ
И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД*12.1. КРАСКИ И РЕАКТИВЫ1. Ацетоформол для фиксации микоризы, дуба и сосны
50%-ный этанол — 100 мл; ледяная уксусная кислота — 7 мл;
40%-ный формалин — 7 мл.2. Насыщенный спиртовой раствор основного фуксина
10 г красителя растворяют в 100 мл 96%-ного этанола.3. Растворы для определения сахара по БертрануI: CuS04 — 40 г; дистиллированная вода — 1000 мл. II: сегнето¬
ва соль — 200 г; КОН — 150 г; дистиллированная вода —
1000 мл. Ill: Fe2(S04)3 —■ 50 г; концентрированная H2SO4
(удельная масса 1,84) — 200 г; дистиллированная вода — до
1000 мл раствора; загрязнения Fe++ окисляют раствором КМ11О4
до его обесцвечивания. IV: КМп04 — 4,5 г; дистиллированная
вода — 1000 мл.4. Биуретовый реактивВ 200 мл 0,2 н. раствора NaOH растворяют 45 г Na-K-тартарата
(4Н20). В таком же количестве раствора NaOH этой же кон¬
центрации отдельно растворяют 5 г CuS04-5H20 и 5 г KJ. Все
растворы объединяют и, добавляя 0,2 н. раствор NaOH, доводят
объем до 1 л. Реактив хранят в плотно закрывающемся сосуде
из темного стекла.5. Жидкость Бродье для манометраNa-дезоксихолат — 5 г; дистиллированная вода — 500 мл; 100 мг
метиленового синего в 500 мл дистиллированной воды; несколько
капель концентрированного спиртового раствора тимола. Удель¬
ная масса жидкости Бродье при 20 °С — 1,034.6. Красящий раствор БуркеКомпонент А : 1 г кристаллического фиолетового в 100 мл дис¬
тиллированной воды; компонент Б: 1 г NaHC03 в 100 мл дистил¬
лированной воды.7. Сафранин красный по БуркеСафранин 0 (85%-ный) —■ 2 г; дистиллированная вода — 100 мл.8. Фиксирующий раствор КарнояСмесь 60 мл 100%-ного этанола с 30 мл хлороформа и 10 мл ле¬
дяной уксусной кислоты.* Порядковые номера нижеперечисленных прописей соответствуют номерам
внутритекстовых ссылок (в скобках) при упоминании определенных красок, пи¬
тательных сред и реактивов.260
9. Дифениламин для обнаружения нитрата и нитрита1 г дифениламина растворяют в 100 мл концентрированной сер¬
ной кислоты и добавляют 20 мл дистиллированной воды; в при¬
сутствии нитрата или нитрита реактив окрашивает раствор в си¬
ний цвет.10. Реактив Эрлиха для обнаружения индола1 г п-диметиламинобензальдегида добавляют к смеси 95 мл
100%-ного этанола и 20 мл концентрированной соляной кислоты.11. Феноловый анилиновый синий для прямого подсчета мик¬
роорганизмов15 мл 5%-ного (водного) раствора фенола смешивают с 1 мл
анилинового синего и 4 мл ледяной уксусной кислоты; перед при¬
менением необходимо отфильтровать.12. Фенолдисульфокислота для определения нитрата1,5 г чистого фенола размешивают в 37 г (20 мл) серной кисло¬
ты с удельной массой 1,84 и 6 часов выдерживают на водяной
бане при 1,00 °С. После охлаждения реактив в некоторых слу¬
чаях кристаллизуется. Кристаллическую фенолдисульфокислоту
перед использованием переводят в раствор слабым нагреванием.Для приготовления стандартного раствора нитрата 0,1631 г
химически чистого сухого KNO3 растворяют в 1000 мл воды;1 мл полученного раствора содержит 0,01 мг N03.13. Кислородный индикатор Филдса ■.—. Макинтоша для конт¬
ролирования анаэробных условий0,15%-ный раствор метиленового синего, 0,24%-ный раствор едко¬
го натра и 6%-ный раствор глюкозы смешивают в соотношении
1:1:1 и доводят до кипения. В результате кипячения из мети¬
ленового синего образуется бесцветный лейко-метиленовый си¬
ний. Склянку с небольшим количеством бесцветного раствора
помещают в вакуумный эксикатор; подсинение раствора свиде¬
тельствует о присутствии кислорода.14. Реактив Грисса — Илошваи для определения нитрита
Для получения реактива необходимо приготовить два раствора.I раствор: 0,5 г анилинсульфокислоты растворяют в 150 мл
12%-ной уксусной кислоты. II раствор: 0,1 г а-нафтиламина рас¬
творяют в 20 мл дистиллированной воды и добавляют 150 мл
12%-ной уксусной кислоты.Смешивают по 0,5 мл обоих растворов и добавляют 0,5 мл
исследуемого образца. При кипячении смеси в присутствии нит¬
рита появляется яркокрасная окраска.15. Индоловый реактив для изучения продуктов белкового
разложенияРаствор А : 4 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в 30 мл
этанола и добавляют 80 мл концентрированной соляной кислоты;
раствор Б : насыщенный раствор K2SO4.Смесь обоих растворов в отношении 1:1 (5: 5 мл добавляют
к 20—30 мл субстрата) окрашивает индол содержащий субстрат
в красный цвет.261
16. Фиксирующий раствор Джуэля для фиксации среза ми¬
коризы2%-ная хромовая кислота — 25 мл; 10%-ный хлорид платины:—2,5 мл; ледяная уксусная кислота — 1 мл; дистиллированная
вода — 75 мл.17. Раствор йодистого калия с йодом20 г йодистого калия растворяют в 50 мл дистиллированной во¬
ды, добавляют 7 г кристаллического йода и дистиллированной
водой доводят объем раствора до 300 мл.18. Карболовый эритрозин для прямого подсчета микроорга¬
низмов5 г фенола и 1 г эритрозина растворяют в 100 мл дистиллирован¬
ной воды.19. Карболовый генциановый фиолетовый для прямого под¬
счета микроорганизмов1 г генцианового фиолетового растворяют в 10 мл 96%-ного эта¬
нола, добавляют 100 мл 5%-ного фенолового раствора и полу¬
ченную смесь отстаивают.20. Реактив Ковача для определения индола5 г п-диметиламинобензальдегида растворяют в 75 мл амилово¬
го спирта и добавляют 25 мл концентрированной соляной кис¬
лоты.21. Раствор кристаллического фиолетового2 г кристаллического фиолетового растворяют в 20 мл 96%-ного
этанола и смешивают с раствором 0,8 г оксалата аммония в
дистиллированной воде; перед использованием отстаивают 24
часа.22. Хромово-уксуснокислый раствор для фиксации сосновой
и дубовой микоризыХромовый ангидрид — 7 г; ледяная уксусная кислота — 3 г;
дистиллированная вода — 100 мл.23. Хромовая смесь для мытья стеклянной посудыВ 100 мл концентрированной серной кислоты растворяют 50 г
бихромата калия и полученный раствор вливают в 1000 мл дис¬
тиллированной воды.24. Йодистый раствор Копелоф — Бирмана2 г кристаллического йода растворяют в 10 мл 1 н. раствора ед¬
кого натра и добавляют 90 мл дистиллированной воды.25. Раствор метиленового синего ЛёффлераК 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего,
полученного растворением 3 г красителя, добавляют 100 мл дис¬
тиллированной воды и 1, мл 1%-ного раствора КОН.26. Протрава для окрашивания жгутиков по Лёффлеру
Смесь 1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина, 10 мл
20%-ной дубильной кислоты и 5,5 мл насыщенного на холоде
водного раствора NH4Fe(S04)2 отстаивают в течение 2—3 суток;
для повышения эффективности протравы к смеси можно доба¬
вить 0,2 мл 1 н. раствора NaOH.262
27. Раствор ЛюголяВ 50 мл дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого ка¬
лия, затем 1 г кристаллического йода и, добавляя дистиллиро¬
ванную воду, доводят объем раствора до 1,(00 мл. Раствор встря¬
хивают и отстаивают 24 часа. При необходимости для ускорения
растворения йода добавляют несколько кристаллов йодистого
калия. Хранят в склянке из темного стекла.28. Водный раствор малахитовой зелени10 г краски растворяют в 20 мл воды; 5 мл насыщенного водно¬
го раствора добавляют к 100 мл дистиллированной воды.29. Насыщенный раствор метиленового синего3 г краски растворяют в 100 мл 96%-ного спирта. Раствор от¬
стаивают в течение 2—3 суток, затем взбалтывают и фильтруют.
Приготовленный раствор можно хранить длительное время.30. Индикатор метиловый красный0,1 г метилового красного растворяют в 300 мл 96%-ного этанола
и дистиллированной водой доводят объем раствора до 500 мл.31. Реактив Миллона для определения тирозинаК смеси одного объема ртути и двух объемов азотной кислоты
добавляют два объема воды.32. Растворы Морозова для окрашивания жгутиковI раствор: 1 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл формалина в
100 мл дистиллированной воды; II раствор: 5 г уксусной кисло¬
ты и 1 мл фенола в 100 мл дистиллированной воды; III раствор:
5 г кристаллического азотнокислого серебра в 100 мл дистилли¬
рованной воды.К 80 мл раствора азотнокислого серебра по каплям добав¬
ляют нашатырный спирт до растворения образующегося осадка,
в результате получают опалесцирующий раствор. При внесении
избыточного количества нашатырного спирта к раствору добав¬
ляют оставшиеся 20 мл азотнокислого серебра до получения
опалесцирующего раствора. Для окрашивания жгутиков полу¬
ченный основной раствор азотнокислого серебра разбавляют во¬
дой в отношении 1 : 100.33. Растворы Нейссера для окрашивания волютинаРаствор А: 1 г метиленового синего растворяют в 20 мл 96%-ного
этанола, затем добавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты и
1 л дистиллированной воды. Раствор Б : 1 г кристаллического
фиолетового растворяют в 10 мл 96%-ного этанола и дистилли¬
рованной водой доводят объем раствора до 300 мл. Раствор
В : 1 г хризоидина в 300 мл горячей дистиллированной воды.34. Реактив Несслера для определения аммиака20 г KJ растворяют в 50 мл дистиллированной воды и неболь¬
шими порциями добавляют HgJ2 до насыщения (около 32 г). За¬
тем к раствору добавляют 460 мл дистиллированной воды и
134 г КОН. Хранят в прохладном темном месте. В зависимости
от содержания NH4 окрашивается в желтый или коричневый
цвет. При большом содержании NH4 образуется коричневый оса¬
док.263
35. Фуксиновый раствор Пфайффера1 мл карболового фуксина Циля смешивают с 9 мл дистиллиро¬
ванной воды. Раствор не подлежит хранению, готовить непо¬
средственно перед использованием.36. Раствор пикриновой кислоты для изучения кислотоустой¬
чивых бактерий1 г пикриновой кислоты растворяют в 86 мл дистиллированной во¬
ды и добавляют такой же объем абсолютного (100%-ного) спирта.37. Буферные растворыpH при18 °С0,2 М раствор
ацетата натрия,
мл0,2 М раствор
уксусной кисло¬
ты, мл3,60,759,253,81,208,804,01,808,204,22,657,354,43,706,304,64,905,104,85,904,105,07,003,005,27,902,105,48,601,405,69,100,905,89,400,601 — буферная смесь укусно-
кислого натрия и уксусной
кислоты: 0,2 М раствор аце¬
тата Na-3H20; 0,2 М рас¬
твор уксусной кислоты.pHБорат натрия,
млСоляная кисло¬
та, мл7,053,4046,607,954,6545,358,055,8544,158,157,1542,758,258,6541,358,360,9039,308,462,9537,058,565,2534,758,668,0032,008,771,2028,808,875,5024,508,980,5019,509,085,6014,409,191,708,109,298,101,902 — буферная смесь соля¬
ной кислоты и бората на¬
трия: 0,1 н. соляная кисло¬
та; борат натрия — 12,404 г
НэВОз+100 мл 1 н. NaOH;
дистиллированной водой
объем раствора доводят до
1 л.264
З — фосфатный буфер по
Сёренсену: 11,876 г ЫагНРС^
на 1 литр дистиллированной
воды; 9,078 г КН2РО4 на
1 л дистиллированной воды.Na2HP04, млКНгРО*, млpH0,109,904,940,259,755,290,509,505,591,009,005,912,008,006,243,007,006,474,006,006,645,005,006,816,004,006,987,003,007,718,002,007,389,001,007,739,500,508,049,750,258,349,900,108,6710,000,009,1838. Кислый раствор сулемы для стерилизации корневых клу¬
беньков1 г хлорной ртути растворяют в 1 л дистиллированной воды и
добавляют 5 мл концентрированной серной кислоты.39. Реактив Шиффа1 мг измельченного фуксина растворяют в 200 мл дистиллиро¬
ванной воды, раствор фильтруют через бумажный фильтр, филь¬
трат охлаждают до 30ЧС и добавляют к нему 40 мл 1 н. раство¬
ра соляной кислоты. Затем в склянку из темного стекла емкостью
500 мл вносят 1 г кислого сернистокислого натрия (ЫаНБОз) и
вливают раствор фуксина. Обычно в течение суток раствор ста¬
новится совершенно бесцветным или бледножелтым. Раствор
хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой.40. Реактив Швейцера для получения лигнина по Фройден-
бергу25 г медного купороса при нагревании растворяют в 500 мл дис¬
тиллированной воды. В 200 мл дистиллированной воды растворя¬
ют 8 г едкого натра и после полного охлаждения смешивают с
раствором медного купороса. Смесь тщательно встряхивают, об¬
разовавшийся осадок отделяют на стеклянном фильтре G-4 и
дистиллированной водой промывают до тех пор, пока химическая
реакция воды, стекающей с фильтра, не станет нейтральной. За¬
тем осадок переносят в сосуд емкостью 4 л и осторожно, при
постоянном помешивании добавляют концентрированную (24%-
ный раствор) гидроокись аммония до полного растворения сине¬
го осадка. Принимая во внимание токсичность аммиачных паров,
эту операцию следует проводить в вытяжном шкафу.41. Краситель судан III для определения жиров0,5 г краски судан III растворяют в 100 мл этанола или кон¬
центрированной молочной кислоты.18 и. сэги 265
42. Реактив Троммсдорфа для определения нитрита4 г крахмала тонкого помола смешивают с небольшим количест¬
вом дистиллированной воды и при постоянном помешивании до¬
бавляют к раствору 20 г ZnCl2 в 100 мл кипящей воды. Смесь
кипятят до полного растворения крахмала. Затем, в нее добав¬
ляют 2 г ZnJ2 и дистиллированной водой доводят объем до
1000 мл. Полученный раствор переливают в темную склянку и
хранят в прохладном месте. При анализе в небольшой фарфоро¬
вой чашке смешивают три капли реактива и по одной капле
20%-ной серной кислоты и исследуемого раствора. В присутст¬
вии нитрата появляется темносиняя окраска.43. Тушь для окрашивания капсулПоступающую в продажу тушь разбавляют дистиллированной
водой в отношении 1:9 и в пробирке, закрытой ватной пробкой,
полученный раствор стерилизуют 30 минут при 1 атм. Стерили¬
зацию в автоклаве можно заменить добавлением нескольких ка¬
пель формалина. Приготовленный раствор туши отстаивают в
течение двух недель. За это время более крупные частицы осе¬
дают на дно пробирки. Для окрашивания препарата всегда бе¬
рут раствор из верхнего слоя жидкости, стараясь при этом не
взбалтывать осадок.44. Водный раствор метиленового синего1 мл концентрированного раствора метиленового синего добав¬
ляют к 40 мл дистиллированной воды. Для окрашивания обычно
используют этот раствор, который не подлежит длительному хра¬
нению и готовится непосредственно перед использованием. В раз¬
ведении 1:10 раствор применяют для окрашивания бактериаль¬
ной флоры на корнях проростков.45. Смесь Ценкера для фиксации среза микоризыСулема — 5 г; хромистый калий — 2,5 г; сернокислый натрий —1 г; ледяная уксусная кислота — 5 г; дистиллированная вода—
100 мл.46. Основной карболовый фуксин ЦиляК 100 мл 5%-ного водного раствора фенола добавляют 10 мл
насыщенного спиртового раствора основного фуксина. Смесь от¬
стаивают в течение двух суток, затем фильтруют через бумаж¬
ный фильтр. Готовый краситель можно хранить длительное
время.12.2. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ47. Питательная среда Пошона для аэробных целлюлозораз¬
лагающих микроорганизмов [122JК2НРО4 — 1 г; СаС12 — 0,1 г; MnS04 — 0,3 г; NaCl — 0,1, г;
FeClß — 0,1 г; NaOH — 2,5 г; дистиллированная вода — 1000 мл.48. Питательная среда Федорова для аэробных пектинолити-
ческих микроорганизмов(NH4)2S04 — 0,5 г; КгНР04 — 0,5 г; водопроводная вода —
1000 мл. На поверхность жидкой питательной среды, налитой в266
колбы тонким слоем, укладывают также тонкий слой нестериль¬
ной размолотой льняной соломки.49. Питательная среда для водорослей по Голлербаху
NaN03 — 0,25 г; К2НР04 — 0,25 г; MgS04-7H20 — 0,15 г;
СаС12 — 0,05 г; NaCl — 0,05 г; FeCl3 — следовые количества;
агар — 25 г; дистиллированная вода— 1000 мл. pH питательной
среды следует довести до 4,3. Стерилизацию проводят при 1 атм.50. Питательная среда Детнера для водорослейCa(N03)2 — 1 г; КС1 — 0,25 г; MgS04-7H20 — 0,25 г; К2НР04—
0,25 г.51. Питательная среда, пригодная для выявления декарбок-
силирования аминокислотПептон —- 5 г; дрожжевая вытяжка — 3 г; глюкоза —■ 1 г;
10%-ный водный раствор бромкрезола —: 10 мл; дистиллирован¬
ная вода — 1000 мл.52. Питательная среда Пошона для изучения активности
аммонификации [122]К 950 мл дистиллированной воды добавляют 50 мл раствора Ви¬
ноградского и 0,4 г тирозина; среду стерилизуют фильтрованием.53. Питательная среда Пошона для анаэробных целлюлозо¬
разлагающих микроорганизмов [122J(NH4)2S04 — 1,5 г; К2НР04 — 1 г; MgS04-7H20 — 0,5 г;
NaCl — 0,02 г; СаС03 — 5 г; ZnS04 — следовые количества;
дистиллированная вода — 1000 мл; полоски фильтровальной бу¬
маги.54. Питательная среда Теппер для анаэробных целлюлозораз¬
лагающих микроорганизмов [152]NH4HP04 — 0,2 г; КН2Р04 — 0,1 г; СаС12 — 0,03 г; пептон —
0,1 г; MgS04-7H20 — 0,05 г; СаС03 ^ 0,5 г; измельченная
фильтровальная бумага — 1—2 г; дистиллированная вода —
100 мл.55. Питательная среда Пошона для анаэробных азотфикси-
рующих бактерий [122]К 950 мл дистиллированной воды добавляют 0,75 г К2НР04,
33 мл 0,1 н. NaOH, 50 мл раствора Виноградского (160) и
0,05 г СаС03. Раствор 10 г глюкозы в 100 мл воды отдельно
стерилизуют фильтрованием и добавляют к стерилизованной в
автоклаве питательной среде.56. Питательная среда Асаи для определения продуцирования
аминокислотNH4C1 — 9 г; К2НР04 — 0,5 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; СаС03 —3 г; глюкоза — 50 г; дистиллированная вода — 1000 мл.57. Агар Эшби для культивирования аэробных азотфиксиру-
ющих бактерийМаннит — 20 г; К2НР04 — 0,2 г; MgS04-7H20 — 0,2 г; NaCl —
0,2 г; K2S04 — 0,1 г; СаС03 — 5 г; агар — 20 г; дистиллирован¬
ная вода — 1000 мл.58. Питательная среда Бирса для культивирования сульфат-
редуцирующих бактерий18* 267
К2НРО4 — 0,5 г; NH4CI — 1 г; CaS04 — 1 г; MgS04-7H20 —
5 г; 70%-ный раствор молочнокислого натрия — 5 г; дистилли¬
рованная вода — 1000 мл; pH в пределах 7—7,5. Перед исполь¬
зованием к 100 мл питательной среды добавляют 5 мл 1%-ного
раствора FeS04 и столько же раствора (NH4)2S04. Образую¬
щийся осадок на развитие культуры не влияет.59. Бобовый агар для культивирования клубеньковых бак¬
терийВ 1(000 мл водопроводной воды при комнатной температуре в
течение 24 часов вымачивают 50 г белых бобов, затем воду наг¬
ревают и бобы кипятят 15 минут. Отвар пропускают через
фильтр, доливают воду до 1 л, добавляют 10 г маннита и 20 г
агара (Федоров рекомендует также добавлять 1 г К2НР04); pH'7,2.60. Питательная среда Балицкой для культивирования мик¬
роорганизмов, продуцирующих аминокислотыNH4C1 —■ 0,5 г; К2НР04 — 0,5 г; лимоннокислый кальций —
10 г; глицерин —■ 10 г; агар — 14 г; дистиллированная вода —
1000 мл.61. Грибная питательная среда Беккера для продуцирования
жантинеллинаNaNOe — 3 г; глюкоза — 50 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; виннокис¬
лый аммоний — 5 г; КС1 — 0,5 г; 50%-ная кукурузная вытяж¬
ка— 5 г; дистиллированная вода —> Ш00 мл.62. Питательная среда Борда — Голдинга для изучения спо¬
собности использовать источники углерода (для исследования
окислительных ферментативных процессов).NH4H2P04 —< 0,5 г; К2НР04 — 0,5 г; дрожжевая вытяжка і—
0,5 г; агар •— 5 г; дистиллированная вода — 1000 мл. Источник
углерода стерилизуют фильтрованием, и добавляют к среде в ко¬
нечной концентрации 1%.63. Питательный бульон с желчью и бриллиантовой зеленью
Пептон — 10 г; глюкоза — 5 г; Na2HP04 (безводный) —■ 6,45 г;
КН2Р04 — 2 г; сухая говяжья желчь — 20 г; бриллиантовая зе¬
лень —• 0,015 г; дистиллированная вода — 1000 мл.Компоненты вносят в воду и смесь кипятят 30 минут. При
20 °С pH раствора доводят до 7,2, затем в стерильных условиях
бульон разливают в пробирки. Стерилизовать питательную сре¬
ду не рекомендуется, поэтому ее не следует хранить более недели
даже в холодильнике.64. Агар с почвенной вытяжкой по Бант —. Ровира для куль¬
тивирования почвенных бактерий [121К2НР04 — 0,4 г; (NH4)2HP04 — 0,5 г; MgS04-7H20 — 0,05 г;
MgCl2 — 0,1 г; FeCl3 — 0,01 г; СаС12 — 0,1 г; пептон — 1 г;
дрожжевая вытяжка — 1 г; почвенная вытяжка — 250 мл; во¬
допроводная вода — 750 мл.Для получения почвенной вытяжки к 1 кг садовой почвы до¬
бавляют 1 л воды и стерилизуют 15 минут при 1 атм; после сте¬
рилизации смесь фильтруют через бумажный фильтр.268
65. Картофельный агар по Красильникову [66]500 г очищенного и измельченного картофеля заливают 500 мл
водопроводной воды и 15:—20 часов выдерживают при комнат¬
ной температуре или кипятят 30 минут. Затем объем картофель¬
ного отвара доводят до 1000 мл, фильтруют через марлю и до¬
бавляют 20 г агара. В микробиологических исследованиях кар¬
тофельная питательная среда, полученная как кипячением, так
и настаиванием, дает одинаково хорошие результаты.66. Картофельный агар для культивирования актиномицетов
Глюкоза —і 20 г; агар — 18 г; протертый картофель — 200 г;
дистиллированная вода — 1000 мл.67. Картофельные ломтикиПосев микроорганизмов можно провести непосредственно на лом¬
тики картофеля. Способность расти на картофеле :— важный ди¬
агностический признак при определении отдельных микроорганиз¬
мов. Очищенные клубни нарезают тонкими ломтиками, помещают
в пробирки диаметром. 18 мм и добавляют 1. мл водопроводной
воды; питательную среду автоклавируют 35 минут.68. Картофельно-декстрозный агар для культивирования поч¬
венных грибов [128]Измельченный картофель — 200 г; глюкоза — 20 г; дистиллиро¬
ванная вода —н 1000 мл; агар — 17 г. Ломтики картофеля в
500 мл воды 40 минут обрабатывают текучим паром (для тер¬
мообработки можно использовать котел Коха). Агар также рас¬
творяют в 500 мл воды. Объем декантированного или выжатого
картофельного отвара доводят до 500 мл и вместе с глюкозой
сливают с раствором агара. После стерилизации, еще до засты¬
вания агара (при 45—50°С), в питательную среду вмешивают
100 мг/л новобиоцина.69. Питательная среда Кристенсена для определения уреазы
Пептон — 1 г; NaCl — 5 г; глюкоза — 1 г; КН2Р04 <— 2 г; фе¬
ноловый красный (0,2%-ный водный раствор) — 6 мл; агар —
20 г. При культивировании бактерий, нуждающихся в факторах
роста, можно добавить 0,1% дрожжевой вытяжки. Мочевину
стерилизуют фильтрованием и затем добавляют к субстрату
до конечной концентрации 2%; pH 6,9.70. Агар Чапека —■ Докса [123]Сахароза — 30 г; NaN03 — 2 г; К2НРО4 — 1 г; MgS04-7H20 —
0,5 г; КС1 —■ 0,5 г; FeS04-7H20 — 0,01 г; агар — 20 г; дистил¬
лированная вода — 1000 мл.Реакцию питательной среды устанавливают с учетом опти¬
мальных условий для данного микроорганизма. Для культивиро¬
вания грибов наиболее пригоден субстрат с pH 4, а для бактерий
и актиномицетов — с pH 7,2. Стерилизуют питательную среду
30 минут при 0,5 атм.71. Питательная среда Пошона для изучения активности де¬
нитрификацииК 950 мл дистиллированной воды добавляют 2 г KN03, 10 г
глюкозы, 5 г СаСОз и 50 мл раствора Виноградского (160).269
72. Питательная среда Адамса и Постгейта для выращивания
обогащенных культур сульфатредуцирующих бактерий [1]
К2НРО4 — 0,5 г; NH4CI — 1 г; Na2S04 — 1 г; СаС12-6Н20 —
0,1 г; MgS04-7H20 — 2 г; молочнокислый натрий (70%-ный рас¬
твор)— 3,4 г; масляная вытяжка (Бакто) — 1, г; FeS04-7H20—
0,002 г; дистиллированная вода —- 1000 мл; pH 7,5. В инкубаци¬
онные сосуды, соблюдая стерильность, добавляют 0,01% тиогли-
колята натрия и 0,05% FeNH4(S04)2.73. Агаровая пластинка Дригальского (модифицированная)
Один из компонентов пластинки Дригальского — основной агар
по Такачу: Na2HP04- 12Н20 — 2 г; NaCl — 2 г; пептон Витте —2 г; пептон Рихтера — 2 г; дрожжевая вытяжка — 2 г; мясная
вытяжка — 4 г; агар — 18 г; дистиллированная вода «— 1000 мл.Компоненты растворяют в приведенной последовательности,
добавляют агар, после чего pH среды устанавливают на уровне
7,6 — 7,7. Стерилизацию проводят 20 минут при 1 атм. К 800 мл
цветного основного агара добавляют следующие компоненты:
лактоза (не содержащая инозита) —> 8 г; бромтимоловый си¬
ний — 8 мл (1,5 г бромтимолового синего в 100 мл 70%-ного
спирта по объему); раствор кристаллического фиолетового в
100 мл дистиллированной воды. Питательную среду в течение
30 минут выдерживают на кипящей водяной бане, затем разли¬
вают в чашки Петри.74. Дрожжевой автолизат200 г прессованных дрожжей суспендируют в 1 л воды, вносят2 г Na2HP04 и при помощи 1 н. раствора NaOH устанавливают
pH суспензии на уровне 6,1. Затем добавляют 5 мл хлороформа
и смесь отстаивают 48 часов при 37 °С. Добавлением 0,1 н. рас¬
твора NaOH доводят pH до 7,4, переносят ее в котел Коха и ки¬
пятят 30 минут при 100 °С. После охлаждения суспензию филь¬
труют через бумажный фильтр и 30 минут стерилизуют при
0,5 атм.75. Дрожжевая вытяжка1 кг прессованных дрожжей взбалтывают в 1 л воды и в тече¬
ние часа подвергают термообработке в котле Коха. Образовав¬
шуюся массу трижды фильтруют через бумажный фильтр и за¬
тем в течение 30 минут стерилизуют при 0,5 атм.Для приготовления питательных сред намного удобнее поль¬
зоваться готовыми препаратами дрожжевых вытяжек (Бакто,
Оксоид и т. д.).76. Питательная среда Федорова для культивирования бак¬
терий, разлагающих карбамид [29]Карбамид — 50 г; К2НР04 — 0,5 г; MgS04-7H20 — 0,7 г; вин¬
нокислый натрий или калий — 5 г; дистиллированная вода —
1000 мл.77. Безазотистая питательная среда Федорова для культиви¬
рования азотобактераГлюкоза (или маннит) — 20 г; К2НР04 — 0,3 г; СаНР04 —
0,2 г; K2S04 —. 0,2 г; MgS04 -1 0,3 г; NaCl — 0,5 г; FeCl3 —270
0,01 г; СаСОз — 5 г; смесь микроэлементов — 1( мл; агар —
20 г; дистиллированная вода —; 1000 мл.78. Смесь микроэлементов по Федорову [29]Н3ВО3 — 5 г; (NH4)2Mo04 — 5 г; KJ — 0,5 г; NaBr — 0,5 г;
ZnS04 — 0,2 г; A12(S04)3 — 0,3 г; дистиллированная вода —
1000 мл.79. Галактозный агар для культивирования пектинолитиче-
ских бактерийКН2Р04 — 1 г; MgS04-7H20 — 0,25 г; галактоза —10 г; пеп¬
тон — 5 г; СаСОз — следовые количества; агар •— 15 г; дис-
стиллированная вода — 1000 мл.80. Питательная среда Гаузе для выделения почвенных бак-
терий-антагонистов [36]Бульон Хоттингера (содержащий 100 мг% NH4) — 30 мл; пеп¬
тон— 5 г; NaCl — 5 г; глюкоза;—10 г; агар — 30 г; водопровод¬
ная вода — до 1000 мл; pH 7,0—7,2.81. Глицерин-аспарагиновый агар для культивирования ак¬
тиномицетов [19]Глицерин — 10 мл; К2НР04—1 г; аспарагинат натрия — 1 г;
СаСОз — 3 г; агар — 15 г; дистиллированная вода — ЦЮ0 мл;
pH около 7,0.82. Глюкозо-аспарагиновый агар для изучения актиномице¬
товГлюкоза —і 10 г; аспарагин — 0,5 г; К2НР04 — 0,5 г; агар —
15 г; дистиллированная вода — 1000 мл (Крук с сотр. рекомен¬
дуют вводить в состав питательной среды 0,4% пропионата нат¬
рия).83. Грибной агар50 г свежих съедобных грибов измельчают и кипятят 40—50 ми¬
нут. Отвар фильтруют и добавляют к нему 5 г крахмала и 20 г
агара. Питательную среду стерилизуют при 1 атм.84. Агар Хагема для микоризных грибовСолодовый экстракт — 5 г; глюкоза — 5 г; NH4C1 — 0,5 г;
КН2Р04 — 0,5 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; 1%-ный раствор FeCl3 —
0,5 мл; агар — 15 г; дистиллированная вода — 1000 мл.85. Питательный раствор Гельригеля для выращивания сте¬
рильных культур растенийCa(N03)2 (безводный) —> 0,492 г; КН2Р04 — 0,136 г; MgS04
(безводный) — 0,06 г; КС1 — 0,075 г; FeCl3 — 0,025 г; дистилли¬
рованная вода — 1000 мл.86. Питательная среда для микроорганизмов, усваивающих
гемицеллюлозуК2НР04 — 1 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; КС1 — 0,5 г; NH4N03 —1,5 г; гемицеллюлоза — 20 г; дистиллированная вода — 1000 мл;
агар — 20 г.87. Питательная среда Худякова и Возняковской для мико¬
ризных грибовГлюкоза — 15 г; NH4N03 — 1,0 г; гидролизованный казеин —
5,0 мл; КН2Р04 — 1.0 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; NaCl — 0,1 г;271
СаСЬ —і 0,1 г; FeCb — 0,6 г; агар — 15 г; дистиллированная
вода — 1000 мл.Микроэлементы для питательной среды: CuS04 — 0,23 мг;
NaMn04 — 0,043 мг; ZnS04 — 4,3 мг; Na2B407 —> 0,045 мг;
MnCl2 — 0,046 мг.88. Полужидкая питательная среда Хью — Лейфсона для
изучения окислительных ферментативных процессовПептон —і 2 г; NaCl — 5 г; КгНР04 — 0,2 г; агар — 3 г; 0,03%-
ный раствор бромтимолового синего —■ 3 мл; дистиллированная
вода — 1000 мл.Исследуемый источник углерода стерилизуют фильтрованием
и добавляют к стерилизованному в автоклаве субстрату с таким
расчетом, чтобы его конечная концентрация составила 1 % ; pH7,1.89. Мясо-пептонный бульон500 г свежей, лишенной костей нежирной говядины измельчают
ножом или пропускают через мясорубку, добавляют 1 л водо¬
проводной воды и отстаивают при комнатной температуре 12 ча¬
сов. В термостате при 30 °С продолжительность отстаивания
сокращается до 6 часов. За это время из мяса экстрагируются
различные вещества. Затем мясо отжимают через марлю, полу¬
ченный экстракт кипятят 30 минут и выпавшие в осадок белкн
отделяют фильтрованием. Доливая водопроводную воду, объем
фильтрата доводят до 1, л, затем вносят 1% пептона и 0,5% по¬
варенной соли. Для ускорения растворения пептона жидкость
подогревают. Аминокислоты и некоторые другие вещества при¬
дают питательной среде кислую реакцию. Добавлением 0,1 н.
раствора NaOH поднимают pH раствора несколько выше 7.
Соответствующая кислотность раствора достигнута в том случае,
если лакмусовая бумажка синеет, но фенолфталеин еще не при¬
обретает розовой окраски. После этого питательную среду вновь
кипятят 30 минут и затем на бумажном фильтре отделяют бел¬
ки, выпавшие из раствора вследствие изменения его реакции.
Приготовленный таким образом бульон используют в жидком
состоянии или же, добавляя агар или желатин, из него получают
плотную питательную среду. Мясной бульон стерилизуют в ав¬
токлаве 20—25 минут при 1 атм.В последнее время в микробиологической практике все шире
используют готовые мясные экстракты (Дифко, Оксоид). Для
приготовления 1 л питательной среды нужно 5 г экстракта.90. Мясной агарК 1 л бульона добавляют 20 г агара и 30—40 минут кипятят
в котле Коха при 100 °С. После растворения агара еще раз про¬
веряют реакцию питательной среды и при необходимости кор¬
ректируют ее.91. Желатин на мясном бульоне применяют при определении
микроорганизмов, поскольку степень и форма разжижения жела¬
тина — это важный диагностический признак. На 1 л мясного
бульона добавляют 100—120 г желатина, растворение которого272
ускоряют подогревом на водяной бане или текучим паром. В ре¬
зультате растворения желатина питательная среда значительно
подкисляется, поэтому добавлением 0,1 н. раствора NaOH уровень
pH сдвигают в слабощелочную сторону (pH 7,5). После охлаж¬
дения раствора до 40—50°С в него добавляют два яичных белка;
предварительно их размешивают с небольшим, количеством воды
и затем тщательно взбалтывают с питательной средой. Далее
питательную среду разогревают и фильтруют, удаляя все взмучи¬
вающие раствор вещества. В результате получают совершенно
прозрачный субстрат, который разливают в пробирки.Дробную стерилизацию проводят в течение трех суток. При
температуре выше 20 ЧС желатин на мясном бульоне переходит
в жидкое состояние, поэтому культуры инкубируют при комнат¬
ной температуре.92. Питательная среда Хатчинсона —: Клейтона для культи¬
вирования целлюлозоразлагающих бактерийК2НРО4 — 1 г; СаС12 — 0,1 г; MgS04-7H20 — 0,3 г; NaCl —
0,1 г; FeCl3— 0,01 г; NaN03 — 2,5 г; целлюлозный порошок —
5 г; агар — 15 г; дистиллированная вода — 1000 мл.93. Питательная среда для изучения синтеза жантинеллина
NaN03 — 3 г; глюкоза — 50 г; MgS04-7H20 (— 0,5 г; виннокис¬
лый аммоний — 5 г; КС1 — 0,5 г; кукурузная вытяжка ■— 5 г;
дистиллированная вода — 1000 мл.94. Казеино-глюкозный агар Йенсена для культивирования
актиномицетов [49]Глюкоза — 2 г; казеин — 0,2 г (предварительно растворяют в
10 мл 0,1 н. раствора NaOH); К2НР04 — 0,5 г; MgS04-7H20 —
0,2 г; FeCl3-6H20 — следовые количества; дистиллированная во¬
да —' 1000 мл; агар — 15 г; pH 6,5—6,6.95. Диагностическая питательная среда с цианистым калием
Пептон — 3 г; NaCl — 5 г; КН2Р04 — 0,225 г; Na2HP04-2H20 —
5,64 г; дистиллированная вода — 1000 мл; pH 7,6. После стери¬
лизации в питательную среду добавляют 15 мл 0,5%-ного рас¬
твора цианида калия, стерилизованного фильтрованием.96. Капустный агар для эпифитных микроорганизмов200 г мелконарезапной капусты заливают таким же количеством
воды, настаивают несколько часов и затем фильтруют. Для ней¬
трализации кислот к фильтрату добавляют 1 % СаС03, а затем
20 г агара. Стерилизацию проводят 20 минут при 1 атм.97. Капустно-солодовый агар с кукурузной вытяжкой для
культивирования эпифитных микроорганизмов по Возняковской
200 г мелконарезанной капусты заливают 1 л водопроводной во¬
ды и кипятят 10 минут. К отфильтрованному отвару добавляют
5 г солодовой вытяжки и 2,5 г кукурузного экстракта. Для по¬
лучения плотной среды добавляют 15 г агара.98. Крахмало-аммиачная питательная средаРастворимый крахмал — 10 г; (NH4)2S04 — 1 г; MgS04-7H20—
1 г; NaCl —< 1 г; СаС03 — 3 г; дистиллированная вода —
1000 мл; агар — 20 г.273
99. Крахмальный агар для диагностики актиномицетов
Растворимый крахмал — 10 г; KNO3 — 10 г; NaCl — 1 г;
К2НРО4 —II г; FeS04 — 0,1 г; MgS04-7H20 — 0,1 г; СаС03 —
следовые количества; агар — 15 г; дистиллированная вода —
1000 мл; pH 7.100. Питательная среда для определения сероводорода
Мясной экстракт — 7,5 г; пептон — 25 г; NaCl — 5 г; желатин—
120 г; уксуснокислый свинец или железо-аммонийный цитрат
(конечная концентрация соответственно равна 0,05% и 0,025%);
дистиллированная вода — 1000 мл. После стерилизации к еще
жидкому субстрату добавляют 5 мл 10%-ного стерильного рас¬
твора FeCl3.101. Питательная среда Киноситы для получения аминокис¬
лотК2НРО4 — 0,5 г; MgS04-7H20 — 0,1 г; FeCl3 — 0,1 г; глюкоза—
50 г; карбамид — 8 г; дистиллированная вода — 1000 мл.102. Раствор Кнопа для выращивания стерильных раститель¬
ных культурCa(N03)2 (безводный) — 1 г; КН2Р04 — 0,25 г; MgS04 (безвод¬
ный) — 0,25 г; КС1 — 0,12 г; FeCl3 — 0,012 г; дистиллирован¬
ная вода —■ 1000 мл.103. Цитратная питательная среда Козера для диагностики
энтеробактерийЛимоннокислый натрий — 2 г; MgS04-7H20 — 0,2 г; NaCl —
5 г; NH4H2P04 — 1 г; К2НР04 — 1 г; 1,5%-ный раствор бромти-
молового синего 10 мл; агар — 20 г; дистиллированная во¬
да — 1000 мл.104. Кукурузный агарВ 1 л воды вносят 40 г кукурузной муки и в течение часа вы¬
держивают при 58—60 °С, после чего взвесь фильтруют на склад¬
чатом фильтре.К фильтрату добавляют 20 г агара и затем среду стерилизуют
35 минут при 0,5 атм.105. Приготовление лакмусового молока8 г зерен лакмуса измельчают в ступке и растворяют в 30 мл
40%-ного этанола. После отстаивания жидкость декантируют,
осадок вновь растирают и полностью переводят в раствор. Об¬
щий объем спирта, взятого для растворения лакмуса, — 100 мл.
Полученный раствор кипятят в течение минуты и, при необходи¬
мости добавляя 1 н. НС1, доводят его окраску до пурпурной.
Лакмусовый раствор добавляют к обезжиренному молоку до по¬
лучения бледнолиловой окраски.106. Лакмусовый мясной бульон для изучения выделения бак¬
териями кислот и основанийК мясному бульону добавляют небольшое количество лакмусово¬
го экстракта до появления фиолетовой окраски. При культиви¬
ровании на этой питательной среде кислотообразующих бактерий
среда окрашивается в красный цвет, а при выделении микроор¬
ганизмами оснований — в синий.274
107. Лакмусовый экстрактРастертый в ступке лакмус растворяют в горячей дистиллиро¬
ванной воде и фильтруют. Фильтрат подкисляют небольшим ко¬
личеством уксусной кислоты и упаривают до получения густого
сиропа, который постепенно разбавляют 96%-ным спиртом. Наи¬
более чувствительная фракция индикатора при этом осаждается.
Ее улавливают на фильтре, растворяют в дистиллированной во¬
де и снова фильтруют. Хранят полученный раствор в темной
склянке.108. Агар и бульон на мясном экстракте по ЛибигуВ 1 л водопроводной воды вносят 10 г мясного экстракта, 5 г
пептона и 5 г поваренной соли. Для ускорения процесса раство¬
рения компонентов воду можно подогреть. После полного их рас¬
творения pH питательной среды устанавливают на уровне7,2. Питательную среду можно использовать в жидком состоянии
или же путем добавления агара (20 г) из нее готовят плотную
среду.109. Питательный раствор на силикагелевой пластинке для вы¬
ращивания лигнинразлагающих микроскопических грибов [37]
К2НРО4 — 1 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; КС1 — 0,5 г; NH4N03 —1.5 г; дистиллированная вода — 100 мл. На поверхность пластин¬
ки ровным слоем наносят 0,5 г лигнина и добавляют 1 мл пи¬
тательного раствора.110. Питательная среда Мак-Кланга для культивирования
микроорганизмов, разлагающих парафин [82]NaN03 — 2 г; К2НР04 — 1 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; Fe2(S04)3—
0,01 г; МпС12 — 0,008 г; ZnS04 — 0,002 г; дистиллированная во¬
да — 1000 мл; агар — 20 г. До застывания разлитой в чашки
Петри питательной среды в каждую чашку добавляют 2—3 кап¬
ли парафина.111. Бульон Мак-КонкиПептон — 20 г; лактоза — 10 г; таурохолат натрия — 5 г; дис¬
тиллированная вода —і 1000 мл.Компоненты растворяют в кипящей воде, затем добавляют
10 мл 0,75%-ного водного раствора нейтрального красного.
Бульон разливают в пробирки с трубками Дархэма и 20 минут
стерилизуют при 1 атм. Если после стерилизации в пробирках
образуется осадок, вновь приготовленный питательный раствор
взбалтывают с активированным углем (одна чайная ложка) и
24 часа выдерживают в холодильнике при 4 °С. Затем бульон
фильтруют и к фильтрату добавляют раствор метилового крас¬
ного.112. Агар Мак-КонкиПептон — 17 г; протеозный пептон или полипептон — 3 г; лак¬
тоза —і 1/0 г; таурохолат натрия — 1,5 г; NaCl — 5 г; агар —13.5 г; нейтральный красный — 0,03 г; кристаллический фиоле¬
товый — 0,001 г.Перечисленные компоненты растворяют при нагревании. На¬
гретый до кипения раствор охлаждают до 50—60 °С и затем уста-275
навливают pH на уровне 7,0. Стерилизацию проводят 15 минут
при 1 атм.ИЗ. Солодовая питательная среда
Проращенное и высушенное зерно пивоваренных сортов злаков
размалывают, к 250 г полученной муки добавляют литр водопро¬
водной воды и смесь выдерживают на водяной бане при 57 °С до
завершения процесса гидролиза крахмала до мальтозы под дей¬
ствием амилазы (примерно в течение двух часов). Степень гид¬
ролизации крахмала проверяют тестированием йода. Получен¬
ную массу фильтруют и измеряют удельную массу фильтрата при
помощи ареометра Боллинга, деления шкалы которого соответст¬
вуют процентному содержанию сахара в растворе. Для культи¬
вирования грибов содержание сахара в питательной среде до¬
водят до 3—4%, для дрожжей —■ до 6—8%, а для молочнокислых
бактерий — до 10—20%- К 1 л воды добавляют 20—40 г солода,
в зависимости от того, для каких микроорганизмов готовят пита¬
тельную среду.114. Солодовая питательная среда с добавками микроэлемен¬
тов для микоризных грибовСолодовый экстракт — 10 г; глюкоза — 10 г; (NH4)2S04 — 2 г;
КН2Р04 — 2 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; NaCl — 0,1 г; СаС12 —
0,1 г; ZnS04 — 0,5 мл 1%-ного раствора; FeS04 — 1 мл 1%-ного
раствора; МпС12 — 1 мл 2%-ного раствора; CuS04 — 1 мл
0,1%-ного раствора, агар —> 20 г; дистиллированная вода —
1000 мл.115. Маннитсодержащий агар с дрожжевой вытяжкой для
культивирования клубеньковых бактерий [3]Маннит (можно заменить глюкозой или сахарозой) — IP г;
К2НР04 — 0,5 г; MgS04-7H20 — 0,2 г; NaCl — 0,1 г; СаС03 —і3 г; дрожжевой экстракт — 10 г; агар — 20 г; дистиллированная
вода — 1000 мл.116. Питательная среда для грибов по Мартину [8]Сахароза—10 г; пептон — 5 г; К2НР04 — 1 г; MgS04-7H20 —
0,5 г; бенгальский розовый — 0,033 г; стрептомицин — 30 мкг/мл
среды; дистиллированная вода — 1000 мл.Раствор стрептомицина готовят следующим образом: в сте¬
рильных условиях вскрывают бюкс, содержащий 1 г стрептоми¬
цина; из колбы со стерильной водой (100 мл) отбирают 5—
10 мл воды и вносят ее в бюкс. После растворения стрептоми¬
цина, соблюдая стерильность, раствор переносят в ту же колбу
со стерильной водой. Таким образом, 1 г стрептомицина будет
растворен в 100 мл воды. 0,3 мл раствора добавляют к 100 мл
охлажденной до 45 °С агаризованной питательной среды, равно¬
мерно размешивают и немедленно проводят посев микроорганиз¬
мов. После добавления стрептомицина нельзя допускать засты¬
вания питательной среды, так как при подогревании антибиотик
теряет активность. Питательная среда Мартина не требует под-
кисления, поскольку присутствие бенгальского розового и стреп¬
томицина препятствует росту бактерий.276
117. Питательная среда Менкиной для культивирования мик¬
роорганизмов, мобилизующих фосфорорганические соединения
[125](NH4)2S04 — 0,5 г; NaCl 0,3 г; MgS04-7H20 — 0,3 г; FeSO«—
следовые количества; MnS04 — следовые количества; СаСОз —5 г; глюкоза — 1 г; агар — 15 г; дистиллированная вода —
1000 мл.В разлитую по чашкам Петри еще жидкую агаризованную
среду добавляют 5 мг лецитина, содержащего Р2О5. Если источ¬
ником фосфора служат нуклеиновые кислоты, непосредственно
перед использованием питательной среды в нее добавляют 50 мл
1%-ного фенола.118. Питательный раствор Мелина для подкормки саженцев
деревьевК2НР04 — 1 г; СаС12 — 0,1 г; NaCl — 0,1 г; MgS04-7H20 —
0,3 г; FeCl3 — 0,01, г.119. Питательная среда Мозера на бобовой муке для мико¬
ризных грибовСолодовый экстракт — 50 г; бобовая мука — 10 г; пептон — 1 г;
КН2Р04 —і 0,5 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; FeCb — 0,01 г; дрож¬
жевой экстракт — 0,1 г; агар —15 г; дистиллированная вода —
1000 мл.120. Питательная среда Мозера для труднорастущих мико¬
ризных грибовМальтоза — 20 г; глюкоза — 10 г; пептон — 2 г; КН2Р04 —.
0,5 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; ZnS04 — 0,5 мл раствора 1/500;
FeCl3 — 1,0 мл раствора 1/100; дрожжевой экстракт — 0,2 г;
СаС12 — 5,0 мл 0,1М раствора; MnS04 — 0,5 мл раствора 1/100;
аневрин — 5 мкг; биотин —■ 1 мкг; инозит — 50 мг; агар — 20 г;
дистиллированная вода — 1.000 мл.121. Питательная среда Пошона для определения активности
процесса нитрификацииК 950 мл дистиллированной воды добавляют 50 мл раствора Ви¬
ноградского (160), 0,5 г (NH4)2S04 и 1 г СаСОз.122. Питритный агар для культивирования автохтонных поч¬
венных микроорганизмов [152]NaN02 — 0,1 г; Na2C03 (безводный) — 0,4 г; NaCl — 0,05 г;
К2НР04 — 0,05 г; MgS04-7H20 — 0,05 г; FeS04 — 0,04 г; дис¬
тиллированная вода — 1000 мл; агар — 25 г.Питательную среду стерилизуют 30 минут при 0,5 атм. Теп-
пер рекомендует наносить почвенную взвесь непосредственно на
поверхность агаровой пластинки, поскольку нитрит блокирует
рост микроорганизмов других таксономических групп.123. Питательный агарLab-lemco — 1 г; мясной экстракт Бакто — 2 г; пептон — 5 г;
NaCl — 5 г; агар — 20 г; дистиллированная вода— 1000 мл;
pH 7,3.124. Агар с кроличьим пометом для культивирования миксо-
бактерий [125]277
100 г свежего кроличьего помета помещают в 1 л водопроводной
воды, смесь в течение часа обрабатывают текучим паром и филь¬
труют. Затем к фильтрату добавляют 20 г агара и полученную
среду стерилизуют 20 минут при 1 атм.125. Питательный раствор Одинцовой для микробиологичес¬
кого определения витаминов группы В(NH4)2S04 — 3 г; MgS04-7H20 — 0,7 г; NaCl — 0,5 г; КН2Р04—
1 г; К2НР04 ■— 0,1 г; глюкоза — 20 г; прокипяченная и отфиль¬
трованная водопроводная вода — 900 мл; дистиллированная во¬
да — 100 мл.Компоненты питательной среды стерилизуют в три приема.
Один из сосудов содержит (NH4)2S04, MgC03 и NaCl, растворен¬
ные в 820 мл воды. В другой сосуд вносят 100 мл дистиллиро¬
ванной воды и растворяют в ней фосфаты. Водопроводную воду
брать для этой цели не следует, поскольку в ней выпадает оса¬
док. В третьем сосуде в 100 мл водопроводной воды растворяют
глюкозу. Холодный раствор глюкозы фильтруют на фильтре
Зейтца ЕК- После стерилизации три раствора сливают вместе,
соблюдая при этом стерильность.126. Оксгалловый агар для культивирования грибов [173]
Пептон — 10 г; глюкоза — 10 г; оксгалл — 15 г; дистиллирован¬
ная вода — 1000 мл; кристаллический фиолетовый — 1 : 100 000;
стрептомицин — 30 мкг/мл. Стрептомицин добавляют в пита¬
тельную среду после ее стерилизации и остывания (45—50 °С).
Затем готовую питательную среду разливают в чашки Петри.127. Питательная среда Паркера — Фриска для культивиро¬
вания серобактерий в кислой средеNH4C1 — 0,1 г; КН2Р04 — 3 г; MgCl2 —і 0,1 г; СаС12 — 0,1 г;
Na2S203-5H20 — 5 г или 10 г элементарной серы; дистиллиро¬
ванная вода — 1000 мл.Питательную среду, содержащую тиосульфат, обрабатываю!
методом дробной стерилизации текучим паром. При использова¬
нии серы ее подвергают дробной стерилизации текучим паром
а остальные компоненты стерилизуют отдельно под давлени¬
ем. При смешивании двух растворов следует соблюдать стериль¬
ность,128. Питательная среда для изучения синтеза пенициллинаГлюкоза — 40 г; кукурузный экстракт — 20 г; NaN03 — 3 г;
К2НР04 — 0,4 г; MgS04-7H20 — 0,125 г; СаС03 — 5 г; дис¬
тиллированная вода — 1000 мл; pH 6.129. Пептон-глицериновый агар для изучения актиномицетов
Пептон — 10 г; мясной экстракт — 5 г; NaCl — 5 г; глицерин —
15 г; агар — 18 г; дистиллированная вода — 1000 мл.130. Агаровая питательная среда для культивирования бо¬
бовых растений в пробиркахК2НР04 — 0,5 г; NH4C1 — 1 г; Na2S04 — ;1, г; СаС12-6Н20 —
0,1 г; MgS04-7H20 — 2 г; дрожжевой экстракт Дифко — 1 г;
FeS04 — 0,002 г; агар — 20 г; дистиллированная вода— 1950 мл.278
К обработанной в автоклаве питательной среде добавляют
стерилизованный фильтрованием раствор 3,5 г молочнокислого
натрия в 50 мл воды. Непосредственно перед использованием к6 мл питательной среды добавляют 1 мл 0,6%-ного раствора
цистеина. Цистеин-гидрохлорид, обеспечивающий низкий уровень
окислительно-восстановительного потенциала, как и питательную
среду стерилизуют в автоклаве при 1 атм.131. Питательная среда Придхэм — Готтлиба для изучения
процесса утилизации источника углерода(NH4)2S04 — 2,64 г; КН2Р04 — 2,38 г; К2НР04 — 5,65 г;
MgS04-7H20 — 1, г; CuS04 — 0,0064 г; FeS04 — 0,0011 г;
МпС12 — 0,0079 г; ZnS04 — 0,0015 г; агар — 15 г; дистиллиро¬
ванная вода — 1000 мл.Содержание исследуемого источника углерода в питательной
среде — 1%- Из солей микроэлементов готовят основные раство¬
ры, соответствующее количество которых вводят в питательную
среду.132. Питательная среда для определения протеолитической
активности по ПошонуК 950 мл воды добавляют 50 мл раствора Виноградского (160)
и 250 г желатина; pH среды устанавливают на уровне 7.133. Питательный раствор Рана для культивирования микро¬
организмов, разлагающих жирыК2НР04 — 2 г; (NH4)3P04 — 3 г; MgS04-7H20 — 1 г; СаС12 —
1 г; NaCl — 1 г; дистиллированная вода — 1000 мл. К разлитой
в колбы питательной среде добавляют 3% касторового масла.134. Питательная среда Разумовской для культивирования
микроорганизмов, мобилизующих трехзамещенный фосфорнокис¬
лый кальцийNaCl — 0,2 г; MgS04-7H20 — следовые качества; FeS04 — сле¬
довые качества; глюкоза — 20 г; дистиллированная вода —
1000 мл; агар — 20 г; Са3(Р04)2 — 5 г.Перед заливкой питательной среды в чашки Петри вносят
0,1—0,2 г стерильного Са3(Р04)2, который равномерно разме¬
шивают в еще не затвердевшем агаре.135. Питательная среда с конго красным для диагностики
клубеньковых бактерийСахароза — 10 г; К2НР04 — 0,2 г; MgS04-7H20 — 0,2 г; NaCl—
0,1 г; СаСОз — 1 г; дрожжевой экстракт — 1 г; дистиллирован¬
ная вода — 1000 мл; конго красный — 1 г (краситель раство¬
ряют в 400 мл воды и 10 мл раствора добавляют к 1 л питатель¬
ной среды).136. Агар на морковном отваре для культивирования пектин-
разлагающих бактерий200 г протертой моркови заливают 1 литром водопроводной во¬
ды и в присутствии небольшого количества СаС03 кипятят в те¬
чение часа.Отвар фильтруют через вату и добавляют к нему 20 г агара.
Питательную среду стерилизуют в автоклаве.279
137. Питательная среда из морковных ломтиковВ пробирки диаметром 18 мм помещают ломтики моркови, до¬
бавляют 1 мл воды и содержимое пробирок стерилизуют 35 минут
при 0,5 атм. На полученную питательную среду высевают ис¬
следуемые микроорганизмы.138. Питательный раствор Шемахановой для микоризных
грибовГлюкоза — 5 г; К2НР04 — 0,25 г; (NH4)2HP04 — 0,1;25 г;
СаСЬ — 0,05 г; MgS04-7H20 — 0,15 г: 1%-ный раствор железо¬
аммонийного цитрата — 1,2 мл; тиамин — 50 мг; дистиллирован¬
ная вода — 1000 мл.139. Цитратный агар СимонсаMgS04-7H20 — 0,2 г; NH4H2P04 — 1 г; К2НР04 —- 1 г; цитрат
натрия (кристаллический) — 2 г; NaCl — 5 г; бромтимоловый
синий — 0,08 г; агар — 25 г; дистиллированная вода — 1000 мл.
Длительность стерилизации — 15 минут при 1 атм. pH 6,8—7,0.140. Питательная среда Скермана для культивирования нит¬
рифицирующих бактерийNaCl — 0,3 г; MgS04-7H20 — 0,14 г; FeS04-7H20 — 0,03 г.
Компоненты растворяют в 90 мл дистиллированной воды. Добав¬
ляют 10 мл прокипяченного в течение 30 минут и охлажденного
ОДМ раствора КН2Р04. Для культивирования Nitrosomonas
вносят 0,66 г (NH4)2S04, для Nitrobacter — 0,5 г NaN03 и 10 г
СаС03. Добавляя дистиллированную воду, объем раствора пита¬
тельной среды доводят до 1000 мл.Без агара данный состав можно использовать в качестве жид¬
кой питательной среды. При этом глубина слоя жидкости не
должна превышать 10 см.141. Питательная среда Станиера для изучения утилизации
источника углерода представителями Pseudomonas(NH4)2S04 — 1 г; солевой раствор Гутнера — 20 мл.Состав раствора Гутнера: нитрилтриуксусная кислота —
10 г; MgS04-7H20 — 14,45 г; СаС12-2Н20 — 3,335 г;
(NH4)6Mo7024-4H20 — 9,25 мг; FeS04-7H20 — 99 мг; основной
раствор микроэлементов — 50 мл; дистиллированная вода —
1000 мл.Состав основного раствора микроэлементов: этилендиамин-
тетрауксусная кислота — 2,5 г; ZnS04-7H20 — 10,95 г; MnS04-
• 7Н20 — 1,54 г; CuS04-5H20 — 0,392 г; Co7(N03)2-6H20 —
0,248 г; Na2B407-ЮН20 0,177 г; дистиллированная вода —
1000 мл.Конечный объем раствора питательной среды — 1 л. Для
нейтрализации нитрилтриуксусной кислоты сразу же после ее
растворения добавляют 7,3 г КОН. Конечная концентрация ис¬
точника углерода в питательной среде — 1%. Источник угле¬
рода на холоде стерилизуют фильтрованием и после этого до¬
бавляют к прочим компонентам.142. Агар на сенном отваре для исследования эпифитных
микроорганизмов [68]280
40—50 г измельченного клеверного сена 10 минут кипятят в 1 л
водопроводной воды. Жидкость пропускают через фильтр, допол¬
няют объем фильтрата до 1 л и добавляют 1,5—2% агара.143. Приготовление силикагелевых пластинок по Виноград¬
скомуСмешивают одинаковые количества жидкого стекла (удельная
масса 1,06) и соляной кислоты (удельная масса 1,19), строго
обязательно вливая жидкое стекло в соляную кислоту, а не на¬
оборот. При отсутствии ареометра для получения НС1 необхо¬
димой концентрации в равный объем дистиллированной воды
вливают концентрированную соляную кислоту. Концентрирован¬
ное жидкое стекло разбавляют дистиллированной водой в отно¬
шении 1 : 5.В результате получают жидкое стекло, плотность которого
близка к необходимой.После тщательного смешивания двух компонентов силикаге¬
ля зеленоватую смесь разливают в чашки Петри слоем 4—5 мм
и выдерживают 4—6 часов до образования геля. Непосредствен¬
но после сливания растворов соляной кислоты и жидкого стекла
использованную посуду (колбу, м.ерный цилиндр) следует вы¬
мыть, поскольку смесь разъедает поверхность стекла. Затем си-
ликагелевую пластинку в чашке промывают в медленнотекущей
проточной воде до полного удаления следов хлора (для этого
необходимо примерно три дня). Наличие ионов хлора проверяют
реакцией с азотнокислым серебром. Освобожденные от хлора
пластинки промывают дистиллированной водой и при необходи¬
мости подщелачивают 20%-ным раствором К2СО3. Дробную
стерилизацию пластинок проводят при атмосферном давлении
(см. стр. 28). Хорошие результаты дает также стерилизация
ультрафиолетом (см. стр. 30). Длительность облучения — 30 —
40 минут при расстоянии до источника излучения 20—30 см. Для
контроля качества стерилизации целесообразно устанавливать
перед источником излучения чашку с мясо-пептонным агаром.
Если последний сохраняет стерильность после 2—3-дневной ин¬
кубации, продолжительность облучения достаточна.144. Синтетический агар для изучения актиномицетов
К2НРО4 — 1 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; КС1 — 0,5 г; FeS04 —
0,01 г; NaN03 — 2 г; глицерин — 30 г; агар — 15 г; дистилли¬
рованная вода — 1000 мл; pH 7.145. Синтетический кислый агар для выращивания грибов
Глюкоза — 10 г; пептон — 5 г; КН2Р04 — 1 г; MgS04-7H20 —
0,5 г; дистиллированная вода — 1000 мл; агар —• 25 г. Перед
стерилизацией pH среды устанавливают на уровне 4.146. Питательная среда Таусона для сульфатредуцирующих
бактерий(NH4)2S04 — 4 г; >КгНР04 — 0,5 г; MgS04-7H20 — 1 г; соль
Мора — 0,5 г; молочнокислый кальций — 5 г; дистиллированная
вода — 1000 мл; Имшенецкий рекомендует добавлять к пита¬
тельной среде Таусона 1% дрожжевой воды (5 мл/л).19 и. Сэги 281
147. Питательная среда на почвенной вытяжке1 кг богатой гумусом садовой почвы заливают 2 л водопровод¬
ной воды и затем в течение часа смесь стерилизуют в автоклаве
при 1 атм. После охлаждения смесь фильтруют, объем фильтрата
доводят до 2 л и добавляют к нему 1 г К2НРО4. Разлитый в со¬
суды раствор стерилизуют еще раз при 1 атм.148. Питательная среда на почвенном экстракте в модифика¬
ции Фишера1 кг богатой гумусом почвы смешивают с 1 л 1%-ного содового
раствора и 30 минут стерилизуют в автоклаве при 115 °С. После
охлаждения почвенную смесь фильтруют на складчатом фильтре;
если фильтрат мутный, фильтрование повторяют. 100 мл почвен¬
ной вытяжки смешивают с 900 мл воды, добавляют 20 г агара и
доводят pH раствора до 7,2.149. Молочная питательная средаМолочную питательную среду применяют при микробиологиче¬
ской диагностике. Для ее приготовления используют обезжирен¬
ное сепарированное молоко. Его кислотность не должна превы¬
шать 20 градусов Тернера, в противном случае молоко сворачи¬
вается при стерилизации. Разлитое в пробирки молоко стерили¬
зуют 15 минут при 0,5 атм. Увеличивать длительность стерилиза¬
ции или проводить ее при более высокой температуре не реко¬
мендуется, поскольку молочный сахар (лактоза) может караме¬
лизоваться и молоко приобретает коричневую окраску. После
стерилизации молоко помещают в термостат для контроля. Для
приготовления молочного агара в молоко добавляют 2% агара,
доводят смесь до кипения и после растворения агара питатель¬
ную среду разливают в пробирки.150. Стандартная среда Торнтона [155]К2НРО4 —< 1 г; MgS04-7H20 — 0,2 г; СаС12 — 0,1 г; NaCl —
0,1 г; FeCl3 — следовые количества; KN03 — 0,5 г; аспарагин —
0,5 г; маннит — 1 г; агар — 15 г; дистиллированная вода —
1000 мл.151. Питательная среда для видов Thiobacillus, обитающих в
некислой среде(NH4)2S04 — 0,1 г; К2НР04 — 4 г; MgS04-7H20 — 0,1 г; СаС12—
0,1 г; FeCl3-6H20 — 0,02 г; MgS04 — 0,02 г; Na2S3;03- 5Н20 —
10 г; дистиллированная вода — 1000 мл; pH 6,6.152. Яичная питательная среда для изучения протеолитичес-
кой активностиДва тщательно перемешанных яичных белка и один желток за¬
ливают 500 мл дистиллированной воды и вновь перемешивают;
pH устанавливают на уровне 7,6. Полученный материал смеши¬
вают в отношении 1:5с жидким мясным бульоном и разливают
в пробирки. Стерилизацию при 1 атм проводят 20 минут.153. Желточная питательная среда для изучения лецитиназ-
ной активностиПоверхность свежего куриного яйца химически стерилизуют, за¬
тем в стерильных условиях отделяют белок, а желток смешивают282
с равным объемом стерильного 0,85%-ного раствора NaCl. 1 мл
полученной эмульсии добавляют в питательную среду следую¬
щего состава: пептон — 40 г; Na2HP04 — 5 г; КН2Р04 — 1 г;
NaCl — 2 г; MgS04-7H20 — 0,1 г; глюкоза — 2 г; агар — 25 г;
дистиллированная вода — 1000 мл; pH 7,6.154. Питательная среда для синтеза трихотецина [8]
(NH4)2S04 — 1,25 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; молочная кислота —
1,55 г; кукурузный экстракт — 1,0 г; КС1 — 0,5 г; КгНР04 —
1 г; дистиллированная вода — 1000 мл; pH 5,0.155. Питательная среда Цукамуры для изучения процесса
утилизации источника углерода(NH4)2S04 — 2,64 г; КН2Р04 — 0,5 г; MgS04-7H20 — 0,5 г;
агар Бакто — 20 г; дистиллированная вода —■ 980 мл. Источник
углерода стерилизуют фильтрованием и затем добавляют в пи¬
тательную среду. Конечная его концентрация в питательной сре¬
де — 0,5%.156. Питательный раствор Виноградского для культивирова¬
ния автохтонных микроорганизмовК2НР04 — 1 г; MgS04- 7Н20 — 0,5 г; NaCl — 0,5 г; FeS04 —
0,01 г; Mn2(S04)3 — 0,01 г; дистиллированная вода — 200 мл.157. Питательная среда Виноградского для изучения ана¬
эробных азот фиксирующих бактерийГлюкоза — 20 г; К2НР04 —■ 1 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; NaCl —
0,5 г; FeS04 — следовые количества; MnS04 — следовые коли¬
чества; дистиллированная вода — 1000 мл.158. Питательная среда Виноградского для культивирования
целлюлозных бактерийKN03 — 2,5 г; К2НР04 — 1 г; MgS04-7H20 — 0,5 г; NaCl —
0,5 г; FeS04 — 0,01 г; MnS04 —■ 0,02 г; дистиллированная вода—
200 мл.159. Питательный раствор Виноградского для культивирова¬
ния нитрифицирующих бактерийI раствор: (NH4)2S04 — 2 г; К2НР04 — 1 г; MgS04-7H20 —
0,5 г; NaCl —< 2 г; iFeS04 — 0,4 г; СаС03 — 5 г; дистиллирован¬
ная вода — 200 мл. II раствор: NaN02 — 1 г; Na2C03 (безвод¬
ный) — \ г; NaCl — 0,5 г; К2НР04 —t 0,5 г; MgS04 — 0,5 г;
FeS04 — 0,4 г; дистиллированная вода — 1000 мл.160. Раствор Виноградского по ПошонуК2НР04 — 5 г; MgS04-7H20 — 2,5 г; NaCl — 2,5 г; MnS04 —
0,05 г; Fe2(S04)3 — 0,05 г; дистиллированная вода — 1000 мл;
pH 7,2.161. Питательная среда для изучения образования кислот по
Вогес — ПроскауэруГлюкоза — 5 г; К2НР04 —і 5 г; пептон — 5 г; дистиллированная
вода — 1000 мл.162. Питательная среда Возняковской для культивирования
микоризных грибовГлюкоза — 1(0 г; (NH4)N03 — 1 г; гидролизованный казеин —«
0,75 г; КН2Р04 — 1 г; СаС12 — 0,2 г; MgS04-7H20 — 0,5 г;19* 283
NaCl — 0,5 г; FeCl3 — 0,05 г; CuS04 — 0,015 г; ZnS04 — 0,01 мг;
тиамин — 0,01 мг; водопроводная вода — 1000 мл.163. Антибиотическая питательная среда Викерхэма для
культивирования грибовПептон —і 3 г; глюкоза — 2 г; сахароза — 30 г; дрожжевой эк¬
стракт — 2 г; кукурузный экстракт — 5 г; NaN03 — 2 г;
К2НР04-ЗН20 — 1 г; КС1 — 0,2 г; FeS04-7H20 — 0,01 г; агар —
20 г; дистиллированная вода — 1000 мл; pH 7,0.164. Питательная среда с овсяными хлопьями для поддержа¬
ния актиномицетов20 г свежих пищевых овсяных хлопьев вносят в 1000 мл водо¬
проводной воды, доводят до кипения и фильтруют через марлю.
Объем фильтрата доводят до 1000 мл и добавляют 18 г агара.
После расплавления агара питательную среду вновь фильтруют
и разливают в пробирки. Длительность стерилизации — 15 ми¬
нут при 1,5 атм. pH среды 7,2.
ЛИТЕРАТУРА1. Adams М. E., Post gate J. R. On sporulation in sulphate reducing bacte¬
ria. I. gen. Microbiol., 1960, 24, 291—294.2. Агнистикова В. H. Методы определения регуляторов роста и гербици¬
дов. М., Наука, 1966.3. Allen О. Experiments on soil bacteriology. Burgess, Minneapolis, 1957.4. Аристовская Т., Паркина О. М. Новый метод изучения ассоциации
почвенных организмов. Почвоведение, 1961, 1, 20—28.5. Ashby S. F. Some observations on the assimulation of atmospheric nitrogen
by Azotobacter chroococcum of Beijerinck. J. Agr. Sei., 1907, 2, 35—51.6. Ballenegger R., diGlériaJ. Talaj-és trâgyavizsgâlati môdszerek. Mezo-
gazdasagi Kiado, Budapest, 1952.7. Bartholomew J. W., Mitwer T. A simplified bacterial spore stain. Stain.
Technol., 1950, 25, 153—156.8. Беккер E. E. Физиология грибов и их практическое использование. М.,
МГУ, 1963.9. Березова Е. Ф. Микрофлора корневой системы растений и методика ее
изучения. Труды ин-та с. х. микробиологии, 1951, 12, 39.10. Bergey’s Manual of determinative bacteriology (Eight Ed.). Williams and Wil¬
kins Company, Baltimore, 1974.11. Brian P. W., Hemming H. G. Promotion of Cucumber hypocotyl growth
by two new gibberellins. Nature, 1961, 189, 74.12. Bunt J. S., R о vira A. D. Microbiological studies of some subantarktic soils.
J. Soil. Sei., 1955, 6, 99—102.13. В urge ff H. Problematik der Mykorrhiza. Die Naturwissenschaften, 1943, 31,31, 47—48.14. В urke T. The Gram stain in the diagnostic of chronic gonorrhea. Amer. Med.
Assoc., 1921, 77, 1020—1022.15. Burris R. H. The acetilene reduction method. In: A. Quispel. The biology
of nitrogen fixation. North-Holland. American Elsevier, 1974.16. Chesters C. G. C. A method for isolating soil fungi. Trans. Brit. Mycol.
Soc., 1940, 24, 352—355.17. Cholodny N. Ober eine neue Methode zur Untersuchung der Bodenmikro-
flora. Arch. Mikrobioi, 1930; 1, 620.18. Christensen. In: Manual of microbiological methods. McGraw-Hill Com¬
pany, 1957.19. Conn H. J. The use of various culture media in characterizing actinomycetes.
N. Y. Agr. Exp. Sta. Tech. Bull., 1921, 83.20. С о n w a y E. J. Microdiffusion analysis and volumetric error. 2. Ed. Crosby-
Lockwood, London, 1&47.21. Cornfield A. N. A simple technique for determining mineralization of car¬
bon during incubation of soils treated with organic materials. Plant and Soil,
1961, 14, 90—92.22. D о m і n і k T. Projekt nowego podzialu mikoryz ektotroficznych oparty na
cechach morfologiczno-anatomicznych. Rocz. Nauk Roln. Les., 1956, 14, 223.23. Dom sch K. H. Interactions of soil microbes and pesticides. Proceedings of
the symposium on soil microbiology (Ed. J. Sregi), Academiai Kiado, Budapest,1972.24. F a V e r о M. S., В e г q u і s t K. R. Use of laminar air flow equipment in micro¬
biology. Appl. Microbiol., 1968, 16, 182—183.25. F ah raus G. Studies in aerobic cellulose decomposition. The course of cellu¬
lose decomposition by Cytophaga. Ann. Agric. Coll. Sweden, 1944, 12, 1.285
26. Fehér D. A talajlakô baktériumok és gombâk vizsgâlatâra alkalmas môdsze-
rek. In: Talajvizsgâlati mödszerkönyv szerk. Ballenegger R.) Mezôgazdasâgi
Kiadô, Budapest, 1953.27. Fehér D. Talajbiolôgia, Akadémiai Kiadô, Budapest, 1955.28. Федоров М. В. Биологическая фиксация атмосферного азота. М., Сель-
хозгиз, 1950.29. Ф е д о р о в М. В. Руководство к практическим занятиям по почвенной мик¬
робиологии. М., Сельхозгиз, 1956.30. Frank В. F. Uber die auf Wurzelsymbiose beruhende Ernährung gewisser
Bäume durch Pilze. Ber. d. Deut. Bot. Ges., 1-885, 3, 138.31. Frank B. F. Neue Mitteilungen über die Mykorrhiza der Bäume und der Mo-
notropa Hypoipitys. Ber. d. Deut. Bot. Ges., 1885, 3, 27.32. F r a n k B. F. Über neue Mycorrhiza-Formen. Ber. d. Deut. Bot. Ges., 1887,5, 395.33. F r a n k B. F. Über die physiologische Bedeutung der Mykorrhiza. Ber. d.
Deut. Bot. Ges., 1888, 6, 248.34. Freudenberg K. et al. Weitere Versuche mit Lignin XL Mitt. über Lignin
und Cellulose. Ber. Deut. Chem. Ges., 1929, 62, 1814.35. Gâl J. et al. Adatok a fâsitâs termöhelymödositö hatasähoz öntözöcsatornäk
mentén. Erdészettudomanyi Kôzlemények, 1960, 1—2, 3—42.36. Гаузе Ф. Г. Пути изыскания новых антибиотиков. М., АН СССР, 1958.37. G u 1 у ä s F. A mikroszkopikus gombâk szerepe a lignin és a ligninbôl szârmaz-
tathatô aromâs anyagok elbontâsâban. Egyetemi doktori értekezés, ELTE, Bu¬
dapest, 1967.38. G r a y T. R. G. Stereoscan electron microscopy of soil microorganisms. Scien¬
ce N. Y„ 1967, 155, 1668—1670.39. Hais L. M., M a с e k K. A papirkromatogrâfia kézikônyve, Akadémiai Kiadô,
Budapest, 1961.40. Hartig Th. Vollständige Naturgeschichte der forstlichen Kulturpflanzen
Deutschlands. Berlin, 1840—1851.41. Henderson M. E. K., Farmer V. C. Utilization by soil fungi of p-hydro-
xibenzaldehide, syringaldehide, ferrulic acid and vanillin. J. gen. Microbiol.,1965, 12, 37—42.42. Henni g В. Michaet/Hennig Handbuch für Pilzfreunde. Bd. II. VEB. G. Fi¬
scher, Jena, 1960.43. Hugh R., L e і f s о n E. The taxonomic significance of fermentative versus
oxidative metabolism of carbohydrates by various Gram negativ Bacteria.I. Bad., 1953, 66, 24.44. Hessayon D. G. Fungitoxins in the soil. II. Trichothecin, its production and
inactivation in unsterilized soils. Soil. Sei., 1953-, 75, 395—404.45. Hutchinson H., Clayton J. On the decomposition of cellulose by an
aerobic organism Spirohaeta cytophaga n. ap. /. Agr. Sei., 1919, 9, 141.46. И мшен едкий А. А. Микробиология целлюлозы. М., АН СССР, 1953.47. Егоров Н. С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения
антибиотической активности. М., Высшая школа, 1965.48. Егоров Н. С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии.
М., МГУ, 1971.49. Jensen H. L. Actinomicetes in Danish soils. Soil Sei., 1930, ЗО, 59—77.50. Johnson L. F. et al. Methods for studing soil microflora-plant disease rela¬
tionships. Burgess, Minneapolis, 1959.51. Jones P. C. T., Mol 1 і son J. E. A technique for the quantitative estimation
of soil microorganisms. /. gen. Microbiol., 1948, 2, 54—69.52. K a m e n s k і j F. M. Die Vegetationsorgane der Monotropa hvpopitys. Bot.
Zeit., 1981, 29.53. К amen ski j F. M. Über symbiont. Vereinigung von Pilzmycelium mit den
Wurzeln höherer Pflanzen. Bot. Zentralbl., 1887, 30, 2.54. Katznelson H. The «rhizosphere effect» on mangels on certain groups of
soil microorganisms. Soil Sei., 1946, 62, 5.55. Kecskés Kitinbontö mikroorganizmusok élettani tanulmânya. Kandidâtusi
értekezés. Budapest, 1960.56. Kerpely K. Légenygyüjto nôvények as a talajoltâs. Kôztelek, 1896, 6, 1839.286
57. Kiss I. Talajenzimolögia. In: Csapo J. M. Talajtan. Mezô'gazdasâgi és Erdés-
zeti Kiadö, Bukarest, 1968.58. Kiss I. Mikrobiolôgiai vizsgâlati mödszerek az élelmiszeriiparban. I. Mennyi-
ségi vizsgâlatok. Mezôgazdasâgi Kiadô, Budapest, 1974.59. Kiss L. Mikorrhiza szabadföldi oltâsok eredményei. Erdészeti Kutatâsok, 1966,
62, 1—3.60. Komàromy Z s. Comparative algological studies in some soil types of the
Matra montains. Acta Bot. Acad. Sei. Hung., 1975, 21, 289'—304.61. Комаров Ф. P. Руководство к практическим занятиям по химии дрсвесн-
ны и целлюлозы. М., 1934.62. К о р е 1 о f f N., В е е г m a n P. A modification Gram stains. /. Infectious
Diseases, 1922, 31, 480—482.63. Koser S. A., Galt R. H. The oxalic acid test for indol. J. Bad., 1926, 11,
293—303.64. Ко vacs N. Eine vereinfachte Method zum Nachweiss der Indolbildung durch
Bakterien, Ztbl. Immunität forsch., 1927, 55, 311—315.65. Крамер M., Э p д л и Г. Применение метода определения активности фос¬
фатази в агрохимических исследованиях. Почвоведение, 1959, 9, 99—102.66 Красильников Н. А. Актиномицеты-антагонисты и антибиотические ве¬
щества. М., АН СССР, 1950.67 Красильников Н. А. Микроорганизмы почвы и высшие растения. М.,
АН СССР, 1958.68. Красильников Н. А. Методы изучения почвенных микроорганизмов и их
метаболитов. М., МГУ, 1966.69. Красильников Н. А. и др. Влияние корневой системы на микроорганиз¬
мы почвы. Микробиология, 1936, 5, 27.70. Красильников Н. А. и др. Микробиологическая характеристика ризо¬
сферы культурных растений. Микробиология, 1936, 5, 1, 87—98.71. К u b і е n a W. Micropedology, Ames, 1938.72. Leonard L. T. Method of testing bacterial cultures and results of test of
commercial inoculant. 1943 USDA Cire. N 703, Washington D. C., 1944.73. L і 11 m a n M. L. A culture medium for the primary isolation of fungi. Science,
1947, 106, 109—111.74. Ли t в и н о в М. А. Методы изучения почвенных микроскопических грибов.
М., Наука, 1969.75. Lobanow N. W. Mykotrophie der Holzpflanzen. VEB Deutsch. Verl. d. Wis¬
senschaften. Berlin, 1960.76. L о с с і R., Q и а г о n і S. A simple freezing technique for microscopical exami¬
nations of soil. Rivista di Patologia Vegetale, 1969, IV, 5, 213—216.77. Lundegardh H. Der Keislauf der Kohlensäure in der Natur. Jena, 1924.78. Macura J. Continuous flow method in soil microbiology. I. Apparatus. Fol.
Microbiol., 1961, 6, 328—334.79. McWithey H. S. Another modification of the Chesters tube method for
examination of soil microflora. Report of the 36th Annual Convention of the
Northwest Association of Horticulturists, Entomologists and Plant Pathologists.
1957, 5—6.80. Marks G. C., Kozlowski T. T. Ectomycorrhizae. Acad. Press, New York
and London, 1973.81. M a r t і n J. P. Use acid, rose bengal and streptomycin in the plate method for
estimating soil fungi. Soil Sei., 1950, 69, 215—233.82. M с С 1 u n g L. S. Recent developments in microbiological techniques. Ann. Rev.
Microbiol., 1949, 3, 395—422.83. Mel in E. Boletusarten als Mykorrhizen-Pilze der Waldbäume. Ber. d. Deut,
bot. Ges., 1922, 40.84. M e 1 і n E. Untersuchungen über die Larix-Mykorrhiza. I. Synthese der My¬
korrhiza in Reinkultur. Sv. bot. Tidskrift, 1926, 16.85. Mel in E. Experimentelle Untersuchungen über die Konstitution und Ökologie
der Mykorrhizen von Pinus silvestris L. und Picea abies L. Karst. Falck, Myko-
logische Untersuchungen. 1923, II.86. Mel in E. Untersuchungen über die Bedeutung der Baummykorrhiza. Verl.
G. Fischer, Jena, 1925.287
87. M e 1 і n E. Methoden der experimentellen Untersuchungen mykotropher Pflan¬
zen. In: Abderhalden E. Handbuch der biologischen Arbeitsmethoden. Urban
und Schwarzemberg, 1936, 11, 1015—1108.88. M e 1 і n E. Der Einfluss von Waldstreuextrakten auf das Wachstum von Boden¬
pilzen, mit besonderer Berücksichtigung der Wurzelpilze von Bäumen. Symb.
Bot. Upsal. 8.3, 1946.89. M e 1 і n E. Physiology of mycorrhizal relation in plants. Annual Review of
Plant Physiology, 1953, 4.90. M e 1 і n E., Nilsson H. Transfer of radioactive phosphorus to Pine seedlings
by means of mycorrhizal hyphae. Physiol. Plantarum, 1950, 3, 88.91. Mel in E., Nil Ison H. Transport of labelled nitrogen from an ammonium
source to pine seedlings through mycorrhizal mycelium. Sv. Bot. Tidskrift, 1952,46, 3—4, 281.92. M e 1 і n E., N і 11 s о n H. Transfer of labelled nitrogen from glutamic acid to
pine seedling through the mycelium of Boletus variegatus (Sw) Fr. Nature,
1953, 171, 4342, 134.93. Mel in E., Nil Ison H. Transport of labelled phosphorus to pine seedlings
through the mycelium of Cortinarius glaucopus (Schaeff.) et Fr. So. Bot.
Tidskrift, 1954, 48, 2.94. M e 1 і n E., N і Iі 1 s о n H. Ca46 used as indicator of transport of cations to pine
seedlings by means of mycorrhizal mycelium. Su. Bot. Tidskrift, 1965, 49, 1—2.95. M e 1 і n E., N і 11 s о n H. Transport of С14 labelled photosynthate to the fungal
associate of pine mycorrhiza. Sv. Bot. Tidskrift, 1957, 51 (1), 166.96. M e 1 і n E., Nillson H. Translocation of nutritive elements through my¬
corrhizal mycelia to pine seedlings. Bot. Notiser, 1958, 111, 1.97. Minderman G., VultoJ. C. Comparison of techniques for the measurement
of carbon dioxide evolution from soil. Pedobiol., 1973, 13, 73—80.98. M и ш у с т и н E. H. Микроорганизмы и продуктивность земледелия. — М.,
Наука, 1972.99. М и ш у с т и н E. H., Никитин Д. И., Востров И. Ш. Прямой метод
выделения суммарной протеазной активности почвы. Сб. докл. симпозиума по
ферментам почвы. Минск, 1968.100. Мишустин E. H., Никитин Д. И. Актуальность гуминовых кислот поч¬
венной микрофлорой. Микробиология, 1971, 30, 841.101. Moser М. Die künstliche Mykorrhizaimpfung an Forstpflanzen. Forstwiss.
Zbl., 1958, 77, 1/2.102. Moser M. Die künstliche Mykorrhizaimpfung von Forstpflanzen. II. Die Torf-
streukultur von Mykorrhizapilzen. Forstwiss. Zbl., 1958, 77, 9/10.103. Moser M. Die künstliche Mykorrhizaimpfung von Forstpflanzen. III. Die Impf-
methodik im Forstgarten. Forstwiss. Zbl., 1959, 78, 7/8.104. Mueller K. E., L. W. Sampling tubes for soil fungi. Phytopath., 1957, 47,
243.105. Muromcev G. S., Agnyisztyikova V. N. Gibberekkinek, a nôvények
honnonjai. Mezögazd. Kiado, Budapest, 1976.106. M ü 11 e r G. Bodenbiologie. Fischer, Jena, 1965.107. Nee Is en F. Ein causistischer Beitrag zur Lehre von der Tuberculose. Centr.
Med. Wiss., 1883, 21, 497—501.108. N ei ss er M. Die Untersuchungen auf Diptheriebacillen in zentralisierten Un¬
tersuchungsstationen. Hyg. Rundschau, 1903, 13, 705—717.109. Nobbe F., Hiltner L. Wodurch werden die knolchenbesitzenden Legumino¬
sen befähight, den freien atmospherische Stickstoff für sich zu verwerten. Land.
Vers. Sta., 1893, 42, 459.110. Nevak B. Ausnutzung biochemischer Teste in der Bodenbiologie. Zbl. Bakt.,
1973, 11, 128, 336—361.111. Новогрудский Д. M. Природные и культуральные формы почвенных
микроорганизмов. Известия АН КазССР, серия Почвоведение, 1949 5,
30—41.112. Никитин Д. И. Применение электронной микроскопии для изучения поч¬
венных микроорганизмов. Почвоведение, 1964, 6, 86—91.113. Никитин Д. И. и др. Новые редкие формы почвенных микроорганизмов.
М., Наука, 1966.288
114 Одинцова E. II. Микробиологические методы определения витаминов.—
М.: АН СССР, 1960.115 OmelianskyV. Sur la fermentation de la cellulose. Сотр. Rend. Acad. Set.,
1805, 126, 970, 1895.116. Parkinson D., Coups E. Microbial activity in a podzol. In: Soil orga¬
nisms, ed. J. Doeksen and J. van Drift, North Holland Publishing Co., Amster¬
dam, 1963.117. Parkinson D. еЫ. Methods of studing the ecology of soil microorganisms.
Blackwell Scientific Publications Oxford-Edinburgh, 1971.118. Перфильев Б. В., Г а б е Д. Р. Капиллярные методы изучения микроорга¬
низмов. JI., АН СССР, 1961.119. Петербургский А. В. Практикум по агрохимии. М., Сельхозгиз, 1954.120. Péter fi I. Az algâk biologiâja és gyakorlato jelentôsége Ceres Konyvkiado,
Bukarest, 1977.121. P e t k о v P. D., Markova T. Ch. A method of studing of cellulose decompo¬
sition in soil. Soil Biology. Int. News Bull., Paris/N 10. 16 old., 1969.122. Pochon J. Manual technique d’analyse microbiologique du sol. Masson Co.
Paris, 1954.123. Raper К. B., Tom C. A manual of the Penicillia. Williain-Wilkins Co. Bal¬
timore, 1945.124. Rawald W., L y r H. (Red.) Mykorrhiza. Intern. Mykorrhizasymp. Weimar,
VEB G. Fischer Verl. Jena, 1960.125. Разумовская 3. Г. и др. Лабораторные занятия по почвенной микробио¬
логии. Л., ЛГУ, 1960.126. Reiners W. A. Carbon dioxide evolution from the floor of three Minnesota
forests. Ecology, 1968, 49, 471—488.127. Рем ne H. E., Сорокина T. A. О проникновении бактерий внутрь клеток
корня. Агробиология, 1950, 6, 135.128. Riker A. J., Riker R. S. Introduction to research on plant deseases. John
Swift and Co. St. Louis, 1936.129. Robinson R. A. Legume inoculation — a method of testing Rhizobium cul¬
ture. The East African Agric. I., 1957, 22, 130—132.130. Rossi G., Gesué G. Di um nuovo indirizzo nel'lo studio biologico del suolo.
Tech. Agr., 1930, 3.131. Rovira A. D. Plant root excretions in relation to the rhizosphere effect, I,II, and III. Plant and Soil, 1956, 7, 178—217.132. РыбалкинаА. В., Кононенко E. В. Микрофлора, разлагающая расти¬
тельные остатки. Почвоведение, 1959, 5, 21.133. Рыбалкина А. В., Кононенко Е. В. В кн.: Микрофлора почв европей¬
ской части СССР. М., АН СССР, 1959.134. Schaede R. Die pflanzlichen Symbiosen. Dritte Aufl. neu bearb. F. H. Meyer.
G. Fischer Verl. Stuttgart, 1962.135. Schroipp W. Methodenbuch der Vegetationversuch. Bd. 8, Neumann, Berlin,1951.136. Smith G. Manual of phycology. Waltham, (USA), 1951.137. Sobotka A. Ciste kultury z ploduir mykorrhitikych hub. Prace vryzum. Ust.
Lesn. C. S. K. 6, 1954.138. Sobotka A. Pestovani mykorrhiznich hub. v. cistyh kulturach. Born. esl.
Akad. zened., 1955, 28. 3/4.139. Sobotka A. Vyuziti hub umela mykorrhizaci. Ceska mykol., 1955, 9, 4.140. Sorino S., Walker N. The nitrifying bacteria in soils from Rothamsted
classical fields and elsewhere. I. Appl. Bad., 1973, 36, 523—529-.141. Stanier R. et al. The aerobic Pseudomonads: a taxonomic study. I. gen.
Microbiol., 1966, 43, 159.142. Stevenson L. I. Antibiotic activity of actinomycetes in soil and their
controlling effects on root-rot of wheat. J. Gen. Microbiol., 1956 14 440—
448.143. Stevenson L. I. Antibiotic activity of actinomycetes in soil as demonstra¬
ted by direct observation techniques. I. Gen. Microbiol., 1956, 15, 372—380.144. Strugger S. Die fluoreszensmikroskopische Unterscheidung lebender Zellen
mit Hilfe der Acridin-orange Färbung. Dt. tierarztl. Z., 1941, 49.289
145. S z a b б І., M а г t о n М. Az örvös elégazâst nem képezô Streptomyces fajok
ûj rendszerezése. Agrokémia és Talajtan., 1961, 10, 257.146. S z a bo I. M. et al. A diagnostic key for the identification of «species» of Strep¬
tomyces and Streptoverticillium inclued in the International Streptomyces Proect.
Acta Bot., 1975, 21, 387—418.147. Сэги И. Разложение клетчатки и плодородие почвы. Докт. дисс. М., ТСХА,
1973.148. Szegi J., Gulyas F. A Gramozoe hatâsa a cellulöz elbontäsära talajviszo-
nyok között. Agrokémia és Talajtan., 1971, 20, 590—Б98.149. Szegi J., Gamal El Din H. Sensitivity of cellulolytic bacteria to antibio¬
tics. ZW. Bakt., 1977, 11, 132, 388—391.150. Сэги И., Маренко В. K., Гуяш Ф. Изучение адсорбции гербицида гра-
моксона в почвенных условиях. Изв. ТСХА, 1973, 4, 14—19.151. Так âc s J. Az élelmiszerekben elöforgulö fontosabb mikroorganizmusok lei-
râsa és azonositâsa. In: Kiss. J. Mikrobiolôgiai vizsgalâti mödszerek az élemis-
zeripardan 2. Mezôgazd. Kiadô, Budapest, 1978.152. ТепперЗ. С.и др. Практикум по микробиологии. М., Колос, 1972.153. Тсппср Е. 3. Микроорганизмы рода Nocardia и разложение гумуса. М.,
Наука, 1976.154. T h о m С., H u m f і е 1 d H. Notes on the association of microorganisms on root.
Soil Sei., 1932, 34, 29.155. Thornton H. G. On the development of standardized agar medium for
counting soil bacteria, with special regard to the repression of speading colo¬
nies. Ann. Appl. Biol., 1922, 9, 241—274.156. Thornton H. G. The screened immersion plate. A method for isolating soil
microorganisms. Res. London, 1952, 5, 190—'191.157. Tschastuchin W. J. Die Einführung von Mykorrhiza-Pilzen in Boden von
Waldschutzstreifen des Gebiets Woronesh. Arbeiten der Wissenschaftlichen
Komplex-Expedition zu Fragen der Anlage von Waldschutzstreifen, 2, 2. Unter¬
suchungen über die Mykorrhiza von Holzpflanzen. Izd. AN SSSR, Moskwa,1952.158. TsukamuraM. Adansonian classification of mycobacteria. J. gen. Microbiol.,1966, 45, 253.159. T r a p p e J. M. Fungus associates of ectotraphic mycorrhizae. Bot. Rev., 1962,28, 538.160. Trappe J. M. Preculture synthesis of Douglas-Fir mycorrhizae with species
of Hebeloma, Suillus, Rhizopogon, and Astraeus. Forest Science, 1967, 13, 2.161. Тюрин И. В. К методике анализа для совершенного изучения состава поч¬
венного перегноя или гумуса. — Тр. почв, ин-та им. В. В. Докучаева. М.,
АН СССР, 1951, 38, 5.162. Umbreit W. W. et al. Manometric techniques. 4th ed. Burgess, Minneapolis,
1964.163. Unger H. Ober den Aussangewert der mit dem Gazebeuteltest erzielten Zellu¬
loseabbau Ergebnisse. Tagungsberichte DAL Berlin, 1968, 98, 16.164. Van Sehre wen D. A. Method used in the Netherlands for production of
legume inoculants. Nutrition of the legumes, (ed. Hallsworth). Butterworths,
London, 1958.165. Vincent J. Manual for the practical study of root nodule bacteria. Blackwell
Scientific Publications Oxford-Edinburgh, 1970.166. Виноградский С. H. Микробиология почвы. М., АН СССР, 1952.167. Voges-Poskauer. In: Manual of microbiological methods. McGraw-Hill
Book Company, 1957.168. Востров И. С., Петрова А. Н. Определение микробиологической актив¬
ности почвы различными методами. — Микробиология, 1961, 30, 665—672.169. Востров И. С., Долгих И. П. Аппликационные методы определения ак¬
тивности микрофлоры затопленных почв рисовых полей. Сб. «Повышение пло¬
дородия почв рисовых полей». М., Наука, 1976.170. Wallis G. W., Wilde S. A. Rapid determination of carbon dioxide evolved
from forest soil. Ecology, 1957, 38, 359—361.171. Warcup J. H. The soibplate method for isolation of fungi from soil. Nature,
1950, 166, 117—118.290
172. Winogradsky S. Etudes sur la microbiologie du sol sur la degradation de
la cellulose dans le sol. Ann. Inst. Pasteur, 1929, 43, 549—633.173. Witkamp M. Decomposition of leaf litter in relation to environment micro-
flore and microbial respiration. Ecology, 1966, 47, 194—201.174. Witkamp M., Frank Marilyn L. Evolution of C02 from litter, humus
and subsoil of a pine stand. Pedobiol., 1969, 9, 358—365.175. Z a к B. Characterization and identification of Douglas-fir mycorrhizae. Proc.
first North. Am. conf. on mycorrhizae U. S. Dap. of Agric. Forest Serv., 1969.176. Zak B., Marx D. H. Isolation of mvoorrhizil fungi from roots of individual
slash pines. Forest Sei., 1964, 10, 214.177. Zechmeister L., Pinczesi J. Octaacetyl-chetobiose aus Käfern. Hoppe-
Seylers Z. physiol. Chern., 1936, 242, 9, 7.178. Ziehl F. Zur Färbung des Tuberkellbacillus. Deut. med. Woche, 1882, 8 , 451.179. Adams P. B., A burried membrane filter methods for studying behaviour of
soil fungi. Phytopathology, ІФ67, 57, 6, 602—604.180. Большой практикум по микробиологии (Под общ. ред. Г. JI. Селибера) М.,
Высшая школа, 1962.181. Cucey R., McCredy R. Balation of VAM spores a rapid method for remo¬
val of organic debris from wet-sieved sore samples. Canadian lournal of Micro¬
biology, 1982, 28, 3.182. Gerdemann J. Relation of a large soil-borne spore to phycomycetous my¬
corrhizal infections. Mycologia, 1955, 47, 5.183. Gerdemann J., Trappe J. Taxonomy of the Endogonaceae. II. Endomy-
corrhiza. Ed. by F. E. Sanders et al., London, 1975.184. Gerretsen F. C. The influence of microorganisms on phosphate intake by
plant. Plant and Soil, 1948, 1, 51—81.185. Hep per C. M. A colorimetric method for estimating VAM infection in roots.
Soil Biol, and Biochem., 1977, 9.186. Крюгер Л. В., Селиванов И. A., Нозадзе Л. М., Цапаева Н. И.,
Сюзева Н. Г. К методике определения обилия гриба в эндотрофных мико¬
ризах и способах количественной характеристики микосимбиотрофизма в рас¬
тительных ассоциациях. Ученые записки Пермского пед. института. Пермь,
1968, 64.187. Лагутина Г. М., Муромцев Г. С., Глобус Г. А., Черняева И. И.
Использование метода комбинированных камер для изучения экологии поч¬
венных микроорганизмов. Материалы республиканской конференции 6—
7 июня в г. Вильнюсе «Микробиологические процессы в почвах и урожай¬
ность сельскохозяйственных культур», 1978, 16—18.188. Mos se В. Fructifications associated with mycorrhizal strawberry roots Na¬
ture, 1953, 171.189. M о s s e B. The regular germination of resting spores and some observations on
growth requirements of an Endogone sp. causing vesicular-arbuscular mycorrhi¬
za. Trans. Brit. Mycol. Soc., 1969, 42, 3.190. Mos se В. The establishment of vesicular-arbuscular mycorrhiza under aseptic
conditions. J. Gen. Microb.. 1962, 27, 3.191. Mos se В.. Bowen G. A key to recognition of some Endogone spore types.
Trans. Brit. Mycol. Soc., 1968, 51, 3—4.192. Mos se В., Jones G. Separation of Endogone spores from organic soil deb¬
ris by differential sedimentation of gelatin columns. Trans. Brit. Mucol. Soc.,
1968, 51, 6.193. Mul v any T. G. Membrane filter techniques in microbiology. In: Methods in
Microbiology, 1969, 1, 205—253.194. Муромцев Г. С. Методы изучения растворения фосфатов кальция микро¬
организмами. Микробиология, 1957, 26, 2, 172—178.195. Муромцев Г. С., Глобус Г. А. Метод наблюдения антагонистических
(конкурентных) взаимоотношений микроорганизмов в почпе. Доклады
ВАСXНИЛ, 1980, 6, 3—5.196. Муромцев Г. С., Лагутина Г. М., Черняева И. И. Метод мембран¬
ных камер для изучения в почве Verticillium dahliae Kleb. Микробиология и
фитопатология, 1977, 11, 4, 358—363.196а. Муромцев Г. С., Моргунова Г. H., Черникова Н. К. Применение291
метода разведений для установления количества микробов-антагонисов в поч¬
ве. Микология и фитопатология, 1976, 10, 2, 150—153.197. Муромцев Г. С., Павлова В. Ф. Выделение почвенных микроорганиз¬
мов, мобилизующих фосфаты железа и алюминия. Доклады ВАСХНИЛ, 1975,
1, 7—9.198. Муромцев Г. С., Самойлова Т. С. О растворении солей фитиновой
кислоты почвенными микроорганизмами. Доклады. ВАСХНИЛ, 1975, 3,
18—20.199. Муромцев Г. С., Угодина Т. С. Выделение почвенных микроорганиз¬
мов, мобилизующих органические соединения фосфора. Доклады ВАСХНИЛ,1973, 5, 9—10.200. N і с о 1 s о n T. Vesicular-arbuscular mycorrhiza — an universial plant symbio¬
sis. Sei. Progress, Oxford, 1967, 55.201. Никитина 3. И., Антоненко A. M. Изучение роста культур в почве ме¬
тодом мебранных камер. В сб. «Закономерности развития почвенных микро¬
организмов». Л., 1975, 202—212.202. Никулина Г. Н. Обзор методов колориметрического определения фосфора
по образованию «молибденовой сини». М. — Л., Наука, 1965.203. О h ш s Е. A flotation method for collecting spores of phycomycetous mycorrhi-
zal parasite from soil. Phytopathology, 1957, 47.204. Powell G., Development of mycorrhizal infections from Endogone spores and
infected root segments. Trans. Brit. Mycol. Soc., 1976, 66, 3.205. Rothamsted Exp. Sta. Report, 1978—1980.206. Schmidt E. L., Quantitative autecological study of microorganisms in soil
by immunofluorescence. Soil Sei., 1974, 118, 3, 141—149.207. Селиванов И. А. Структура фикомицетных тамнискосфагновых (везику-
лярно-арбускулярных) микориз. В сб. «Микориза растений». Пермь, 1975.208. Селиванов И. А. О способах количественной характеристики развития
фикомицетных эндомикориз в растительных сообществах и в эксперименте.
В сб. «Значение консюртивных связей в организации биогеоценозов». Пермь,
1976, 150.209. Smith G., Skipper H., Comparison of methods to extract spores of vesicu¬
lar-arbuscular mycorrhizal fungi. Soil Sei. Soc. Am. Journ., 1979, 43.210. Sutton J., Barron G. Population dynamics of Endogone spores in soil.
Canad. Journ. Botany, 1972, 5, 9.211. Tommerup J., KidbyD. Production of aseptic spores of vesicular-arbuscu-
lar endoiphytes and their viability after chemical and physical stress. Appl. and
Environm. Microbiol., 1980, 39, 6.212. Фатхиев Ф. Ф. Модифицированный метод приготовления фитата натрия,
используемого при определении фитазной активности. Прикладная биохимия
и микробиология, 1975, 11, 1, 136—137.213. Van Eck W. H. Canadian Journal of Microbiology, 1976, 22, 11, 1628—
1633..214. Zimmerman R., Meyer-Reil Lutz-Aren d. A new method for fluo¬
rescence staining of bacterial populations on membrane filters. Kiel Meeres-
forsch., 1974, 30, 1, 24—27.
ОГЛАВЛЕНИЕПредисловие к русскому изданию 5Предисловие к венгерскому изданию 7Глава 1. Приборы и оборудование для микробиологических исследова¬
ний (И. Сэги) 91.1. Микроскопы и их применение 91.1.1. Устройство светового микроскопа 91.1.2. Изучение живых клеток с помощью специального оборудования . 161.2. Стерилизация 231.2.1. Стерилизация сухим жаром 231.2.2. Стерилизация паром 241.2.3. Стерилизация фильтрованием 291.2.4. Лучевая стерилизация 301.2.5. Химическая стерилизация и дезинфекция 311.3. Инкубационное оборудование 331.3.1. Термостаты 331.3.2. Анаэростат 341.4. Холодильники 341.5. Шкафы, ламинарные боксы и кабины для посева 35Глава 2. Методы выделения и культивирования почвенных микроорга¬
низмов (И. Сэги) 362.1. Взятие образцов 362.2. Общие принципы приготовления питательных сред .... 382.3. Получение обогащенных культур 402.4. Получение чистых культур 412.4.1. Аэробные микроорганизмы 412.4.2. Методы культивирования анаэробных бактерий 442.4.3. Культивирование водорослей 472.5. Поддержание культур микроорганизмов 482.5.1. Поддержание микроорганизмов в почве 482.5.2. Лиофилизация 482.5.3. Хранение грибов в жидком азоте 492.5.4. Поддержание культур грибов на силикагеле 50Глава 3. Микроскопические методы исследования культур микроорга¬
низмов (И. Сэги) 513.1. Микроскопирование живых культур 513.1.1. Приготовление водного препарата 513.1.2. Препарат «висячая капля» 523.1.3. Приготовление микрокультуры в агаровой пленке 533.1.4. Приготовление отпечатка колонии 533.2. Приготовление фиксированных препаратов 533.2.1. Методы фиксации 533.2.2. Окраска фиксированного препарата 543.2.3. Простая окраска 553.2.4. Сложная дифференцированная окраска 553.3. Определение размеров микроорганизмов 63293
Глава 4. Принципы определения почвенных микроорганизмов ... 654.1. Систематика бактерий (Е. Тим ар) 654.1.1. Изучение почвенных бактерий при таксономических исследованиях 674.1.2. Изучение физиологических и биохимических особенностей ... 714.1.3. Выделение актиномицетов по системе Сабо и Мартона (Й. С э г и) 794.2. Общие принципы классификации грибов (И. С э г и) . . . . 874.2.1. Краткое изложение систематики грибов 874.2.2. Общая характеристика порядка 914.3. Принципы классификации почвенных водорослей (И. С э г и) . . 93Глава 5. Количественный анализ почвенных микроорганизмов(И. Сэги) 975.1. Методы прямого подсчета 975.1.1. Метод Виноградского в модификации Шульгиной 975.1.2. Метод Германова 985.1.3 Метод Джонса — Моллисона 995.1.4. Метод люминесцентной микроскопии Страггера 995.1.5. Количественный анализ водорослей методом Стайна . . . . 1005.2. Методы непрямого подсчета микроорганизмов 1015.2.1. Подсчет колоний на плотных питательных средах 1025.2.2. Подсчет клеток методом предельных разведений 1075.2.3. Определение фекальной загрязненности почвы 1125.2.4. Применение счетных камер 115Глава 6. Роль микроорганизмов в биологическом круговороте веществ 1176.1. Преобразование органических безазотистых соединений (И. Сэги) 1176.1.1. Микробиологическое разложение пектина 1176.1.2. Микробиологическое разложение целлюлозы 1196.1.3. Биологическое разложение гемицеллюлозы 1276.1.4. Микробиологическое преобразование лигнина 1286.1.5. Микробиологическое окисление жиров 1316.1.6. Культивирование микроорганизмов, разлагающих парафин . . 1326.2. Микробиологическое разложение азотистых соединений . . . 1326.2.1. Аммонификация (И. Сэги) , . , . 1326.2.2. Нитрификация (E. Т и м а р) 1406.2.3. Денитрификация (Е. Тим ар) . . . 1436.2.4. Биологическая фиксация атмосферного азота (Й. Сэги) . . . 1456.3. Микробиологическое превращение соединений серы (E. Т и м а р) 1576.3.1. Окисление сернистых соединений 1586.3.2. Восстановление сульфатов и других сернистых соединений . . 1596.4. Почвенные микроорганизмы, мобилизующие фосфор труднодоступ¬
ных соединений 159Глава 7. Методы исследования метаболитов почвенных микроорганизмов 1637.1. Определение стимуляторов и ингибиторов в культурах микроорга¬
низмов (й. Сэги) 1647.1.1. Исследования на плотных питательных средах 1647.1.2. Исследования метаболитов в жидком субстрате 1677.2. Методы изучения микроорганизмов-антагонистов 1717.2.1. Нанесение тест-культуры на поверхность колоний, выросших на
агаровой пластинке 1717.2.2. Определение наименьшей бактериостатической концентрации анти¬
биотиков 1727.2.3. Определение чувствительности целлюлозных бактерий к антибиоти¬
кам 1727.2.4. Приближенное определение содержания антибиотика в культураль¬
ной жидкости 1737.2.5. Определение антибиотиков в почве 1757.3. Методы изучения токсинов 1787.3.1. Определение токсичности субстратов 178294
7.3.2. Определение токсинов в почве 1797.4. Определение свободных аминокислот в культурах микроорганизмов 1807.4.1. Предварительный отбор синтезирующих свободные аминокислоты
микроорганизмов методом Балицкой 1817.4.2. Хроматографическое определение свободных аминокислот . . 1817.4.3. Определение свободных аминокислот в почве 1827.5. Способность микроорганизмов синтезировать витамины . . . 1827.5.1. Определение отдельных витаминов группы В методом Одинцовой 1837.5.2. Определение витаминов в почве 1857.6. Синтез гиббереллинов 186Глава 8. Изучение взаимодействия микроорганизмов и высших растений 1878.1. Изучение микроорганизмов прикорневой зоны растений (И. С э г и) 1878.1.1. Прямые методы изучения микроорганизмов прикорневой зоны . 1888.1.2. Непрямые методы исследования микроорганизмов ризосферы . 1898.2. Грибы, образующие микоризу (П. Д ю р к о) 1938.2.1. Методы исследования грибов, образующих эктотрофную микоризу 1948.2.2. Эндомикоризные грибы 1998.2.3. Методы выделения и культивирования грибов 2018.2.4. Совместное культивирование зеленого растения и гриба . . . 2068.2.5. Посев микоризы 2098.3. Методы изучения эпифитных микроорганизмов (Й. С э г и) . . 2128.4. Методика выращивания растений в стерильных условиях (И. С э г и) 2138.4.1. Стерилизация семян 2148.4.2. Методы выращивания стерильных растений 215Глава 9. Методы изучения ассоциаций микроорганизмов (И. С э г и) . 2199.1. Методы микроскопирования 2199.1.1. Микроскопирование с помощью светового микроскопа . . . . 2199.2. Методы электронной микроскопии 2209.3. Исследования с применением стеклянных пластинок . . . . 2219.3.1. Метод Холодного.— Росси 2219.3.2. Метод стекол обрастания в модификации Рыбалкиной и Кононенко 2239.3.3. Метод влажной камеры 2239.3.4. Метод экранированных стекол 2249.3.5. Метод стекол-ловушек 2259.3.6. Метод капилляров Макуайти 2269.3.7. Метод капилляров Перфильева в почвенно-биологических исследо¬
ваниях 226Глава 10. Методы измерения биологической активности почвы(И. Сэги) 22910.1. Методы измерения выделения СОг 22910.1.1. Измерение СОг в естественных условиях 23010.1.2. Измерение СОг в лабораторных условиях 23210.2. Определение поглощения кислорода образцами почвы .... 23710.3. Определение целлюлозолитической активности почвы методом Пет-
кова и Марковой 23910.4. Определение биологической активности почвы методом целлюлоз¬
ных стандартов 24010.5. Определение протеолитической активности почвы с помощью фото¬
бумаги или фотопленки 24210.6. Изучение биологической активности почвенного профиля . . . 24410.7. Методы изучения ферментативной активности почвы .... 24510.7.1. Определение инвертазной активности почвы 24510.7.2. Определение амилазной активности почвы 24010.7.3. Определение активности ß-глюкозидазы 24710.7.4. Определение активности уреазы 21810.7.5. Определение активности фосфатазы 24810.7.6. Определение активности каталазы 24910.7.7. Определение активности пероксидаз 250295
10.7.8. Определение активности полифенолоксидаз 25110.7.9. Определение активности дегидрогеназ . 252Глава 11. Изучение влияния пестицидов на почвенные биологическиепроцессы (И. Сэги) 25311.1. Определение чувствительности почвенных микроорганизмов к пе¬
стицидам 25311.2. Метод почвенных дисков для определения токсичности водораство¬
римых пестицидов 25411.3. Измерение адсорбции грамоксона в почве 25611.4. Изучение устойчивости пестицидов методом перколяции . , . 257Глава 12. Рецепты приготовления красок, реактивов и питательных сред(И. Сэги) 26012.1. Краски и реактивы 26012.2. Питательные среды . 266Литература 285Иожеф СэгиМЕТОДЫ ПОЧВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИЗаведующий редакцией А. Т. Докторов
Редактор А. С. Саломе
Художник С. В. СоколовХудожественный редактор А. И. Бершачевская
Технический редактор Н. В. СуржеваКорректоры: А. К. Варфоломеева, М. Н. П е р к у с, Н. Я. Т у-
м а н ов аИБ № 3008Сдано в набор 26.08.82. Подписано к печати 21.12.82. Формат 60X90'/ie.Бумага тип. № 2. Гарнитура литературная. Печать высокая. Уел. печ. л. 18,5.
Уел. кр.-отт. 18,75. Уч.-изд. л. 21,54. Изд. № 62. Тираж 3600 экз. Заказ № 563.
Цена 1 р. 80 к.Ордена Трудового Красного Знамени издательство «Колос»,107807, ГСП, Москва, Б-53, ул. Садовая-Спасская, 18.Московская типография 11 Союзполиграфпрома при Государственном
комитете СССР по делам издательств, полиграфии и книжной торговли.Москва, 113105, Нагатинская ул., д. 1.