Оглавление
Предисловие к английскому изданию.........5
Благодарности...............................6
Предисловие к русскому изданию............7
Введение.................................17
1.	Органеллы растительных клеток................19
1.1.	Клеточная стенка обеспечивает механическую
прочность растительной клетки......................21
Клеточная стенка растительной клетки
состоит преимущественно из углеводов
(полисахаридов) и белков.....................21
Плазмодесмы соединяют соседние клетки
и способствуют межклеточным
взаимодействиям..............................24
1.2.	Функции вакуолей.............................26
1.3.	Пластиды - эволюционные потомки
цианобактерий................................27
1.4.	Митохондрии также произошли путем
эндосимбиоза.................................31
1.5.	В пероксисомах проходят реакции с образованием
токсичных продуктов-интермедиатов............33
1.6.	Эндоплазматический ретикулум и аппарат
Гольджи образуют пространственную
трехмерную сеть, отвечающую за распределение
продуктов биосинтеза.........................34
1.7.	Препаративное выделение функционально
активных органелл растительных клеток..............37
1.8.	Различные транспортные процессы обеспечивают
обмен метаболитами между компартментами
растительной клетки...............................38
1.9.	Переносчики-транслокаторы обеспечивают
избирательный транспорт продуктов метаболизма
и молекул-субстратов..............................40
Все белки-транслокаторы имеют сходное
строение.....................................43
Аквапорины облегчают транспорт воды
через мембрану...............................44
1.10.	Высокая пропускная способность ионных каналов.46
1.11.	Для белков-поринов характерна р-складчатая
структура......................................49
Дополнительная дитература......................53
2.	Использование энергии солнечного света
в процессе фотосинтеза - основа жизни
на Земле...................................55
2.1.	Как возник фотосинтез?.....................55
2.2.	Пигменты поглощают энергию солнечного света.56
Энергия световой волны зависит
от ее длины................................56
Хлорофилл — основной пигмент
фотосинтеза................................58
2.3.	Поглощение света переводит молекулу
хлорофилла в возбужденное состояние........60
Переход из первого синглетного уровня
на основной может происходить
у хлорофилла разными путями................61
2.4.	Антенна служит для сбора света.............64
Каким образом энергия фотонов,
поглощенная антенной,передается
в реакционный центр?.......................65
Функции антенны на примере антенны
ФС II.......................................66
Фикобилисомы позволяют
цианобактериям и красным водорослям
фотосинтезировать даже при слабом
свете......................................69
Дополнительная литература..................72
3.	Транспорт электронов в процессе
фотосинтеза.....................................73
3.1.	Фотосинтетический аппарат имеет
модульную организацию...........................73
3.2.	В процессе фотосинтеза образуются окислитель
и восстановитель................................76
3.3.	Основная структура фотосинтетического
реакционного центра была расшифрована
с помощью рентгено-структурного анализа.........77
Рентгеновская структура
фотосинтетического реакционного
центра.....................................78
Реакционный центр Rhodopseudomonas
viridis имеет симметричную структуру.......80
3.4.	Как функционирует реакционный центр........81
3.5.	У водорослей и растений два фотосинтетических
реакционных центра функционируют в тандеме.83
10
Оглавление
3.6.	Окисление воды происходит в фотосистеме II.86
Комплекс фотосистемы II очень сходен
с реакционным центром пурпурных
бактерий..................................89
Механизированное сельское хозяйство
обычно требует применения гербицидов......91
3.7.	Цитохрохром-Ь6 /7-комплекс обеспечивает транспорт
электрона между фотосистемами..................92
Атомы железа в составе цитохромов
и железосерных центров выполняет важнейшую
функцию передачи электрона................92
Электронный транспорт
в цитохром-/>6//-комплексе сопряжен
с транспортом протонов....................94
Число протонов, перекаченных через
цитохром-£6//-комплекс, может быть
удвоено в результате работы Q-цикла.......95
3.8.	Фотосистема I восстанавливает НАДФ........97
При циклическом транспорте электрона
в ФС I энергия света используется
только для синтеза АТФ....................99
3.9.	В отсутствие других акцепторов электроны
могут передаваться с фотосистемы I на кислород.... 101
3.10.	Регуляторные механизмы контролируют
распределение поглощенных фотонов между
двумя фотосистемами...........................104
Избыточная энергия диссипируется в тепло.... 106
Дополнительная литература..................107
4.	В процессе фотосинтеза образуется АТФ.. 109
4.1.	Протон-движущая сила является промежуточной
формой запасания энергии в процессе
синтеза АТФ...................................109
4.2.	Электрохимический протонный градиент может
быть диссипирован в тепло с помощью
разобщителей..................................111
Хемиосмотическая гипотеза была
доказана экспериментально................113
4.3.	Н+-АТФ-синтазы бактерий, хлоропластов
и митохондрий имеют сходную структуру..........114
Рентгеноструктурный анализ F] части
АТФ-синтазы позволил изучить
механизм синтеза АТФ.....................115
4.4.	Синтез АТФ происходит за счет изменения
конформации белка..............................116
В фотосинтетической электрон-
транспортной цепи стехиометрия
синтезированных НАДФН/АТФ все еще
является предметом дискуссий.............119
Н+-АТФ-синтаза хлоропластов
регулируется светом......................119
V-АТФаза родственна F-АТФ-синтазе........120
Дополнительная литература................120
5.	Митохондрии — энергетические станции
клетки.........................................122
5.1.	Биологическое окисление происходит за счет
разложения субстратов с образованием водорода
иСО2...........................................122
5.2.	В митохондриях локализовано клеточное дыхание.... 123
Митохондрии образуют отдельный
метаболический компартмент.....................124
5.3.	Расщепление субстрата для биологического
окисления происходит в матриксе................124
Пируват окисляется мультиферментным
комплексом................................126
Ацетат полностью окисляется в цикле
трикарбоновых кислот......................127
Отток интермедиатов цикла
три карбоновых кислот возмещается
за счет анаплеротических реакций..........129
5.4.	Сколько энергии может быть запасено
в результате окисления НАДН?...................130
5.5.	Дыхательная цепь митохондрий имеет много
общего с электрон-транспортной цепью
фотосинтеза....................................131
Комплексы митохондриальной
дыхательной цепи..........................131
5.6.	Транспорт электронов в дыхательной цепи сопряжен
с синтезом АТФ через транспорт протонов........135
Митохондриальный электронный
транспорт приводит к образованию
мембранного потенциала ...................137
Синтез АТФ в митохондриях служит для
удовлетворения потребностей цитозоля
в энергии ................................137
5.7.	У растительных митохондрий есть особые
метаболические функции.........................138
Митохондрии могут окислять НАДН
без образования АТФ.......................139
НАДН и НАДФН из цитозоля могут
окисляться в дыхательной цепи
растительных митохондрий..................140
5.8.	Для компартментации митохондриального
метаболизма необходимы специальные
мембранные переносчики ........................140
Дополнительная литература.................142
6.	В цикле Кальвина происходит
фотосинтетическая ассимиляция СО2..............143
6.1.	Ассимиляция С02 происходит в темновых
реакциях фотосинтеза...........................143
6.2.	Рибулозобисфосфаткарбоксилаза катализирует
реакцию фиксации С02...........................144
Оксигеназная реакция RubisCO:
дорогостоящая побочная реакция............147
Оглавление
11
Рибулозобисфосфаткарбоксилаза/
оксигеназа: особые свойства...............148
Активация RubisCO.........................148
6.3.	При восстановлении 3-фосфоглицерата
образуется триозофосфат........................149
6.4.	Рибулозобисфосфат регенерирует
из триозофосфата...............................150
6.5.	Кроме восстановительного пентозофосфатного
пути есть также окислительный пентозофосфатный
путь...........................................156
6.6.	Восстановительный и окислительный
пентозофосфатные пути регулируются.............157
Восстановленные тиоредоксины
передают «сигнал об освещении»
ферментным белкам.........................160
Активация хлоропластных ферментов
тиоредоксином происходит благодаря
встроенному регуляторному домену..........161
Многоуровневая регуляция обеспечивает
согласованность разных этапов
восстановительного пентозофосфатного
пути......................................162
Дополнительная литература.................163
7.	При фотодыхании происходит
рециклирование фосфогликолата,
образовавшегося в результате
оксигеназной активности RubisCO .................165
7.1.	Рибулозо-1,5-бисфосфат регенерирует
из 2-фосфогликолата..............................165
7.2.	NH4+, который выделяется в процессе
фотодыхания, затем вновь фиксируется
в хлоропластах..................................170
7.3.	Для восстановления гидроксипирувата
необходима поставка восстановительных
эквивалентов в пероксисомы......................171
Восстановительные эквиваленты
вносятся в пероксисомы через малат-
оксалоацетатный челнок.....................172
«Малатный кран» контролирует экспорт
восстановительных эквивалентов
из хлоропластов............................174
7.4.	Матрикс пероксисом - специализированный
компартмент для утилизации токсичных отходов.....174
7.5.	Насколько дорого обходится растениям
оксигеназная активность RubisCO?.................174
7.6.	В точке углекислотной компенсации
суммарная фиксация СО2 равна нулю................176
7.7.	Хотя фотодыхание требует затрат энергии,
этот метаболический путь может быть полезен
растению........................................177
Дополнительная литература...................177
8.	Фотосинтез сопряжен с потерями воды.....178
8.1.	Поступление СО2 в ткани листа
сопровождается испарением воды................178
8.2.	Устьица регулируют газообмен листа.......179
Малат играет важную роль в метаболизме
замыкающих клеток........................179
Степень открытости устьиц сложным
образом регулируется.....................181
8.3.	Поступление СО2 в растительную
клетку путем диффузии....................183
8.4.	С4-растения ассимилируют СО2 с меньшими
затратами воды, чем С3-растения .........185
Концентрирование СО2 у С4-растений.......186
С4-метаболизм у растений
НАДФ-малатдегидрогеназного типа .........192
С4-метаболизм НАД-малатдегидро-
геназного типа...........................192
С4-метаболизм ФЕП-карбоксикиназного
типа.....................................192
Кранц-анатомия со специализацией клеток
на мезофилл и обкладку не является
необходимой для С4-метаболизма...........194
Ферменты С4-метаболизма регулируются
светом...................................194
Продукты С4-метаболизма могут быть
идентифицированы с помощью
масс-спектрометрии.......................194
К С4-растениям относятся как
сельскохозяйственные культуры,
так и сорняки............................195
8.5.	Метаболизм по типу толстянковых (САМ)
позволяет растениям выживать в условиях засухи ... 195
СО2 фиксируется ночью и запасается
в форме яблочной кислоты (малата).............196
Фотосинтез происходит при закрытых
устьицах.................................197
С4-метаболизм, как и САМ, возникал
неоднократно в процессе эволюции.........199
Дополнительная литература................199
9.	Полисахариды как запасные
и транспортные формы углеводов,
образованных в процессе фотосинтеза .... 201
Крахмал и сахароза — основные продукты
ассимиляции СО2 у многих растений........202
9.1.	Большие количества углеводов могут запасаться
в клетках в виде крахмала.....................202
Синтез крахмала осуществляется через
стадию образования АДФ-глюкозы...........206
Деградация крахмала происходит двумя
различными путями........................206
Избыточные продукты фотосинтеза могут
временно запасаться в хлоропластах
посредством синтеза крахмала.............207
12
Оглавление
9.2.	Синтез сахарозы происходит в цитозоле.......210
9.3.	Утилизация триозофосфата, продукта
фотосинтеза, строго регулируется...............211
Фруктозо-1,6-бисфосфатаза регулирует
поступление углеводов в процесс
биосинтеза сахарозы.........................211
Сахарозофосфатсинтаза регулируется
не только метаболитами, но также
ковалентной модификацией....................214
Распределение ассимилятов между
сахарозой и крахмалом обусловлено
взаимодействием нескольких
регуляторных механизмов.....................215
9.4.	У некоторых растений ассимиляты из листьев
экспортируются как сахароспирты
или олигосахариды семейства раффинозы .........216
9.5.	Фруктаны как запасные вещества
откладываютсяв вакуоли ........................216
9.6.	Целлюлоза синтезируется ферментами,
локализованными на плазматической мембране ....220
Синтез каллозы часто индуцируется
механическим повреждением ..................220
Полисахариды клеточной стенки
синтезируются также в аппарате Гольджи......222
Дополнительная литература...................222
10.	Ассимиляция нитратов крайне важна
для синтеза органического вещества.............224
10.1.	Существуют два последовательных этапа
восстановления нитрата до NH4+.................224
Нитрат восстанавливается до нитрита
в цитозоле..................................226
Восстановление нитрита до аммония
происходит в пластидах......................227
Фиксация NH4+ осуществляется
с помощью некоторых ферментов,
участвующих в фотодыхании ..................228
10.2.	Ассимиляция нитрата происходит также в корнях ....230
Окислительный пентозофосфатный путь
производит восстановительные
эквиваленты для восстановления
нитрита в лейкопластах.........................230
10.3.	Ассимиляция нитрата строго контролируется .231
Синтез белка нитратредуктазы
регулируется на уровне экспрессии гена......231
Нитратредуктаза также регулируется
обратимой ковалентной модификацией..........232
14-3-3-белки являются важными
метаболическими регуляторами...............233
В регуляции нитратредуктазы
и сахарозофосфатсинтазы много общего.......233
10.4.	Конечным продуктом ассимиляции нитрата
является целый спектр аминокислот .............234
В процессе ассимиляции СО2
производятся углеродные скелеты
для синтеза конечных продуктов
ассимиляции нитрата .....................234
Для синтеза глутамата требуется участие
митохондриального метаболизма ...........237
Биосинтез пролина и аргинина.............237
Аспартат как предшественник пяти
аминокислот..............................239
Ацетолактатсинтаза участвует в синтезе
гидрофобных аминокислот..................241
Шикиматный путь синтеза ароматических
аминокислот .............................243
Глифосат действует как гербицид..........245
Существенная часть общей биомассы
растений образуется через шикиматный
путь.....................................245
10.5.	Глутамат служит предшественником для синтеза
хлорофиллов и цитохромов......................246
Протопорфирин является также
предшественником синтеза гема............249
Дополнительная литература................249
11.	Симбиотическая азотфиксация позволяет
растениям использовать азот воздуха...........251
11.1.	Бобовые образуют симбиоз с клубеньковыми
бактериями....................................252
Образование клубеньков обусловлено
регулируемым взаимодействием
экспрессии специфических бактерий
и генов растения ........................254
Обмен метаболическими продуктами
между бактероидами и клетками
расте ния-хозяина........................254
Редуктаза нитрогеназы поставляет
электроны для нитрогеназной реакции......255
N2, как и Н+, восстанавливаются
нитрогеназой одновременно................256
11.2.	Азотфиксация может осуществляться лишь
при очень низких концентрациях кислорода......257
11.3.	Затраты энергии для использования N2 в качестве
источника азота значительно выше, чем для
использования N03"............................259
11.4.	Растения улучшают свое питание
путем симбиоза с грибами......................259
Арбускулярная микориза широко
распространена...........................260
Эктомикориза снабжает деревья
элементами минерального питания..........261
11.5.	Симбиоз с образование клубеньков, возможно,
эволюционировал на основе физиологических
механизмов, регулирующих формирование
арбускулярной микоризы........................261
Дополнительная литература................262
Оглавление
13
12.	Ассимиляция сульфата
и синтезсеросодержащих веществ................263
12.1.	Фотосинтез обеспечивает энергией
и восстановителями ассимиляцию сульфата.......263
Сходство процессов ассимиляции
сульфата и нитрата.......................263
Активация сульфата перед
восстановлением..........................264
Сходство сульфит-редуктазы
с нитрит-редуктазой......................266
Фиксация H2S в форме цистеина............266
12.2.	Глутатион как антиоксидант и средство
детоксикации посторонних вредных веществ......267
Детоксикация ксенобиотиков с помощью
конъюгации...............................268
Фитохелатины и защита растений
от тяжелых металлов......................269
12.3.	Синтез метионина из цистеина............269
S-аденозилметионин — универсальный
метилирующий реагент.....................269
12.4.	Избыточные концентрации диоксида серы
в атмосфере токсичны для растений.............271
Дополнительная литература................271
13.	Флоэма транспортирует и распределяет
фотоассимиляты в места их потребления
или запасания.................................273
13.1.	Два способа загрузки флоэмы.............274
13.2.	Транспорт по флоэме происходит
за счет массового тока...................276
13.3.	Ткани-акцепторы снабжаются фотоассимилятами
путем разгрузки флоэмы........................277
Крахмал откладывается в пластидах........278
Гликолиз является центральным
метаболическим путем расхода углеводов...278
Дополнительная литература................265
14.	Продукты ассимляции нитратов
откладываются в растении в виде
запасных белков...............................283
14.1.	Глобулины являются наиболее распространенными
запасными белками.............................284
14.2.	Проламины образуются как запасные белки злаков.. 284
14.3. 25-Белки присутствуют в семенах
двудольных растений......................285
14.4.	Особые белки защищают семена
от поедания животными.........................285
14.5.	Синтез запасных белков осуществляется
в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме...285
14.6.	Протеиназы позволяют использовать аминокислоты,
отложенные в составе запасных белков..........288
Дополнительная литература................288
15.	Глицеролипиды являются компонентами
мембраны и служат запасом углерода............289
15.1.	Полярные глицеролипиды - важные
компоненты мембраны...........................289
Текучесть мембраны зависит от доли
ненасыщенных жирных кислот
и содержания стеринов...................292
Мембранные липиды содержат
разнообразные гидрофильные группы ......292
15.2.	Триацилглицерины служат запасными
веществами...................................294
15.3.	Синтез жирных кислот de novo происходит
в пластидах..................................294
Ацетилкоэнзим А — предшественник
в биосинтезе жирных кислот..............296
Ацетил-КоА-карбоксилаза — начальный
фермент биосинтеза жирных кислот........297
Дальнейшие этапы биосинтеза жирных
кислот происходят также при помощи
мультиэнзимных комплексов...............300
Первая двойная связь в новообразованную
жирную кислоту внедряется растворимой
десатуразой.............................301
Ацил-АПБ (продукт синтеза жирных
кислот в пластидах) может использоваться
двумя путями............................303
15.4.	Глицерин-З-фосфат является предшественником
в синтезе глицеролипидов.....................304
Мембрана ЭР является местом
удлинения жирных кислот и введения
дополнительных двойных связей...........307
Некоторые из липидов пластидной
мембраны образуются
по эукариотическому пути................308
15.5.	Триацилглицерины образуются в мембранах
эндоплазматического ретикулума...............308
Растительное масло находит применение
как продукт питания, а также
для технических целей...................309
Свойства растительных жиров можно
улучшить методами генной инженерии......311
15.6.	Во время прорастания семян запасные липиды
мобилизуются в пероксисомах для синтеза
углеводов....................................312
Глиоксилатный никл позволяет
растениям синтезировать гексозы
из ацетил -Ко А.........................315
В пероксисомах протекают реакции
с образованием токсичных интермедиатов..315
15.7.	Липоксигеназа участвует в синтезе оксилипинов,
играющих роль сигнальных и защитных
соединений...................................316
Дополнительная литература................320
14
Оглавление
16.	Вторичные метаболиты выполняют
в растениях прежде всего экологические
функции.......................................322
16.1.	Вторичные метаболиты защищают растения
от патогенных микроорганизмов и травоядных....322
Микроорганизмы — потенциальные
патогены.................................322
В ответ на поражение патогенными
микроорганизмами растения
синтезируют фитоалексины.................323
Некоторые вторичные метаболиты
могут быть опасны для человека...........324
16.2.	Алкалоиды объединяют обширную группу
вторичных метаболитов на основе гетероциклов..324
16.3.	Некоторые растения для защиты от животных
используют синильную кислоту..................326
16.4.	Некоторые растения при повреждении
выделяют летучие горчичные масла..............327
16.5.	Синтез непротеиногенных аминокислот - еще один
способ защиты растений от травоядных..........328
Дополнительная литература................328
17.	Изопреноиды — обширная группа
вторичных метаболитов растений,
обладающих широким спектром
биологической активности......................330
17.1.	Два различных пути биосинтеза изопреноидов
у высших растений.............................332
Ацетил-СоА — предшественник синтеза
изопреноидов в цитозоле..................332
Пируват и D-глицеральдегид-З-фосфат —
предшественники биосинтеза
изопентенил-пирофосфата в пластидах......332
17.2.	Пренилтрансферазы катализируют соединение
изопреновых звеньев...........................334
17.3.	Некоторые растения выделяют газообразный
изопрен.......................................336
17.4.	Многие соединения, входящие в состав эфирных
масел, являются производными
геранилпирофосфата............................337
17.5.	Фарнезилпирофосфат - предшественник
биосинтеза сесквитерпенов.....................338
Фарнезилпирофосфат — предшественник
синтеза стероидов........................339
17.6.	Геранил геранилпирофосфат - предшественник
биосинтеза фитогормонов, каротиноидов
и вторичных метаболитов, выполняющих
защитные функции..............................340
Интенсивное смолообразование — эффективное
средство защиты деревьев
от вредителей............................340
Каротиноиды — пигменты растений
и источник витамина А для животных......341
17.7.	Пренильные группы позволяют веществам
проявлять липофильные свойства...............343
Белки могут заякориваться на мембране
путем пренилирования....................343
Долихолы — важные посреднки в процессе
гликозилирования белков.................344
17.8.	Регуляция синтеза изопреноидов.........344
17.9.	Изопреноиды отличаются высокой
стабильностью и устойчивостью.................345
Дополнительная литература...............345
18.	Фенилпропаноиды - компоненты клеточной
стенки и предшественники вторичных
метаболитов ароматической природы............347
18.1.	Исходная стадия биосинтеза фенилпропаноидов -
дезаминирование фенилаланина при участии
фермента фенилаланинаммиаклиазы...............347
18.2.	Биосинтез фенолов с участием
монооксигеназ.................................349
18.3.	Полимеризация фенилпропаноидов.........351
Защитные функции лигнанов...............353
Лигнин образуется при
свободнорадикальной полимеризации
производных фенилпропаноидов ...........353
Суберин и кутин формируют газо-
и водонепроницаемые слои на поверхности
клеточных стенок........................355
18.4.	Флавоноиды и стильбены - фенольные
соединения с двумя ароматическими кольцами....356
Стильбены — природные фунгициды.........357
18.5.	Функции флавоноидов в растительном организме.... 357
18.6.	Защитные функции пигментов антоцианов..358
18.7.	Таннины прочно связываются с белками,
что обусловливает их защитные функции.........359
Дополнительная литература...............361
19.	Комплексная регуляция роста, развития
и приспособления к окружающей среде
растительного организма.................362
19.1.	Цепи передачи сигналов, обнаруженные
у животных организмов, действуют и в растении.362
G-белки играют роль молекулярных
выключателей............................362
Регуляторные функции малых G-белков.....363
Са2+ как мессенджер в цепи передачи
сигналов................................364
Фосфатидил-инозитольная система открывания
Са2+-каналов............................364
Кальмодулин — посредник при работе
ионов кальция...........................365
Оглавление
15
Роль фосфорилирования белков
при передаче сигнала......................367
19.2.	Основные классы фитогормонов.............369
19.3.	Ауксин стимулирует рост растяжением......369
19.4.	Гиббереллины регулируют удлинение стебля.372
19.5.	Цитокинины стимулируют деление клеток....374
19.6.	Абсцизовая кислота контролирует водный баланс
растений.....................................376
19.7.	Этилен и созревание плодов...............378
19.8.	Стероидные и пептидные гормоны растений..378
Брассиностероиды и контроль развития
растений..................................379
Полипептидные гормоны.....................380
Системин и защита от животных,
поедающих растения........................380
Фитосульфокины регулируют деление
клеток....................................380
19.9.	Взаимодействие нескольких сигналов
при защитных реакциях........................381
19.10.	Рецепторы света и регуляция роста
и развития растений..........................382
Дополнительная литература.................385
20.	Три генома растительной клетки..............388
20.1.	Организация генетической информации в ядре.388
Секвенирование и анализ ДНК ядерного
генома в двудольных и однодольных
растениях...................................391
20.2.	Транскрипция ДНК ядерного генома
РНК-полимеразами..............................391
Регуляция транскрипции структурных
генов.....................................392
Элементы, регулирующие транскрипцию.
Промотор..................................392
Регуляция транскрипции гена...............393
Микро-РНК и ингибирование экспрессии
генов.....................................393
Транскрипция структурных генов............394
Созревание мРНК...........................397
Синтез рРНК и тРНК........................398
20.3.	Полиморфизм ДНК и генетические маркеры
при скрещивании растений.....................398
Полиморфизм длин рестрикционных
фрагментов как метод характеристики
индивидуальных различий ..................399
Метод RAPD при исследовании
Д Н К-полиморфизма........................401
Полиморфизм микросателлитной ДНК
как генетический маркер...................402
20.4.	Мобильные элементы ДНК...................404
20.5.	Вирусы растительных клеток...............405
Ретротранспозоны и ретровирусы............407
20.6.	Кольцевой геном пластид..................408
Сходство пластидного транскрипционного
аппарата с бактериальным..................410
20.7.	Митохондриальный геном растения..........411
Пост-транскрипционное редактирование
мтРНК.....................................414
Мужская стерильность растений — важный
инструмент при выведении гибридов.........415
Дополнительная литература.................417
21.	Биосинтез белков..........................419
21.1.	Синтез белков на рибосомах...............419
Синтез пептидной цепочки..................421
Специфические ингибиторы трансляции
рибосом разного типа......................422
Регуляция трансляции......................425
21.2.	Формирование трехмерной структуры белков.425
Многостадийный процесс сворачивания
белков....................................425
Защита белков в процессе сворачивания....426
Белки теплового шока и защита
от температурных повреждений..............426
Взаимодействие шаперонов
с несвернутыми белками....................426
21.3.	Белки, кодируемые в ядре, распределяются
по разным компартментам клетки...............428
Транспорт белков в митохондрии............429
Транспорт белков в хлоропласты............431
Транспорт белков в пероксисомы............433
21.4.	Протеасомная деградация белков...........434
Дополнительная литература.................436
22.	Применение генно-инженерных технологий
в сельском хозяйстве, пищевой
промышленностии индустрии....................437
22.1.	Выделение гена...........................437
Использование для выделения гена генетических
библиотек.................................437
Хранение генных библиотек в фагах.........439
Хранение геномных библиотек
в плазмидах...............................440
Поиск нужного гена в генной
библиотеке................................441
Идентификация клона с помощью
антител к нужному белку...................442
Идентификация клона с помощью
проб ДНК..................................443
Выделение генов, кодирующих
неизвестные белки.........................444
Идентификация генов с помощью
транспозонов или Т-ДНК....................444
22.2.	Агробактериальная трансформация
растительных клеток..........................445
Генетическая информация Ti-плазмиды.......446
16
Оглавление
22.3.	Ti-плазмида как трансформационный вектор.448
Регенерация растений
из трансформированных клеток листа......450
Биобаллистический метод трансформации.....452
Трансформация протопластов..............452
Трансформация пластид...................452
22.4.	Выбор подходящего промотора............455
Транспорт продуктов гена в различные
компартменты клетки с помощью
сигнальных последовательностей..........456
22.5.	Выключение генов с помощью трансформации.456
22.6.	Применение генной инженерии
растений очень разнообразно.............458
Защита растений от насекомых
с помощью БТ-токсина....................458
Защита растений от вирусов с помощью
генных технологий.......................459
Получение растений, устойчивых
к грибным инфекциям...................460
Получение растений, устойчивых
к гербицидам..........................460
Повышение качества и урожайности
сельскохозяйственных культур..........461
Использование трансгенных растений
для получения сырья в промышленности
и фармакологии........................461
Повышение устойчивости растений
к стрессовым воздействиям методами
генной инженерии......................461
Возможные риски при культивировании
трансгенных растений..................462
Дополнительная литература.............462
Предметный указатель.......................464
Введение
Биохимия растений изучает молекулярные про-
цессы, происходящие в растительном организ-
ме. Центральное место среди этих процессов
занимает фотосинтез, происходящий в основ-
ном в листьях у высших растений. Преобразуя
солнечную энергию, фотосинтез обеспечивает
потребности растений в углеводах и аминокис-
лотах, которые образуются из двуокиси углеро-
да, воды, нитратов и сульфатов. По проводящей
системе большая часть продуктов фотосинтеза
транспортируется из листьев по стеблю далее в
те части растения, где фотоассимиляты необ-
ходимы (например, в корни, чтобы снабдить их
энергией). Поэтому листья принято называть
донорами, а корни — акцепторами фотоасси-
милятов. Запасные ткани семян также являются
важными акцепторами. В зависимости от вида
растений в них откладываются углероды, белки
или жиры, что позволяет людям получать раз-
нообразные продукты питания из сельскохозяй-
ственных растений.
В противоположность большинству живот-
ных площадь поверхности растений очень вели-
ка, а листья приобретают небольшую толщину
для того, чтобы уменьшить до минимума рас-
стояние для диффузии СО2 и уловить настолько
много квантов света, насколько это возможно.
Многочисленные тонкие корневые волоски
позволяют растениям эффективно поглощать
воду и минеральные вещества из почвы. Вся
эта огромная площадь поверхности тела делает
растения особенно уязвимыми по отношению
к таким неблагоприятным фактором, как за-
суха, жара, охлаждение или даже замерзание, а
также избыток солнечного света. Смена дня и
ночи заставляет клетки листа переключаться с
фотосинтетических процессов в световое время
на окислительный метаболизм в темноте. Рас-
тения быстро приспосабливаются к этим рез-
ким изменениям внешних условий при помощи
удивительно гибких перестроек метаболизма,
которые были бы невозможны без множества
регуляторных процессов. Поскольку растения в
силу неподвижного образа жизни не могут убе-
жать от своих врагов, они разработали широкий
«арсенал» соединений, защищающих их от по-
едания.
Сельское хозяйство является основой для
обеспечения человечества продуктами питания.
Генно-инженерные технологии с применением
растений (которые можно рассматривать как
один из разделов биохимии или молекулярной
биологии растений) уже вносят свой вклад в
решение глобальной продовольственной про-
блемы, которая возникает в результате роста
населения земного шара. Приобрело большое
экономическое значение использование эко-
логически безопасных гербицидов, защита рас-
тений от вирусных и грибковых заболеваний с
помощью генной инженерии. Достижения мо-
лекулярной генетики растений стали важным
инструментом для оценки результатов скрещи-
вания и для создания новых особенно продук-
тивных сортов сельскохозяйственных растений.
Растения являются источником разнообраз-
ного сырья для промышленного производства,
такого, как техническое масло, крахмал. На
основе растительного сырья производят так-
же многочисленные лекарственные препараты.
Как ожидают, в ближайшем будущем развитие
генно-инженерных технологий приведёт к даль-
нейшему расширению использования растений
в различных отраслях промышленности и меди-
цины.
Это краткое перечисление областей приме-
нения растений призвано показать, что биохи-
мия и молекулярная биология растений — это
не просто важные фундаментальные науки,
объясняющие функции молекул в растениях.
Они имеют громадное практическое значение
18
Введение
и в настоящий момент переживают пору свое-
го революционного развития, вносят свой вклад
в решение важных экономических проблем.
Чтобы достичь решения практических задач,
потребуется тесная кооперация и интеграция
всех знаний о растительном организме, нако-
пленных такими отраслями наук о растениях,
как биоэнергетика, биохимия первичного и
вторичного метаболизма, молекулярная биоло-
гия, физиология растений, клеточная биология.
Только путём интеграции результатов и методов
работы в рамках различных наук можно достичь
понимания того, как функционирует раститель-
ный организм, и применить накопленные зна-
ния для получения экономического эффекта.
В книге приведены лишь некоторые примеры
того, каким образом этого можно достичь.
К настоящему времени издано много учеб-
ников по обшей биохимии, элементарные био-
химические понятия здесь не рассматриваются,
поскольку читатель может почерпнуть эти зна-
ния из других книг.
Органеллы растительных клеток
У высших растений фотосинтез осуществля-
ется преимущественно в мезофилле — важ-
нейшей ткани листа, содержащей хлоропласты.
На рисунке 1.1 представлена электронная
микрофотография клеток мезофилла листа, а
на рис. 1.2 — схема строения клетки мезофилла.
От внешней среды клеточное содержимое от-
делено плазматической мембраной (плазма-
леммой) и жесткой клеточной стенкой. Вну-
триклеточное пространство подразделяется на
компартменты — органеллы. В зависимости от
типа клетки, органеллы выполняют различные
Рис. 1.1. Электронная микрофотография губчатого мезофилла табака. У многих
клеток видна крупная центральная вакуоль (v). Клетки рыхло связаны между собой,
есть большие межклетники (ig). (с) — хлоропласты, (cw) — клеточная стенка, (п) —
ядро, (т) — митохондрия (по D.G. Robinson, Гейдельберг)
20
1. Органеллы растительных клеток
Хлоропласт
Пероксисома
Митохондрия
Ядрышко
Плазмодесма
Ядерная оболочка
Ядро
Гладкий (агранулярный)
эндоплазматический ретикулум (ЭР)
Шероховатый (гранулярный) ЭР
Аппарат Гольджи
Срединная пластинка
Клеточная стенка
Плазматическая мембрана (плазмалемма)
Рис. 1.2. Схема строения клетки мезофилла листа
специфические функции, которые будут обсуж-
даться более подробно в последующих главах
(табл. 1.1).
Органеллы погружены в цитоплазму, суще-
ственную часть которой составляет цитозоль.
Самая большая органелла клетки — вакуоль.
Она заполняет 80% от общего клеточного объ-
ема. К крупным органеллам относят также хло-
ропласты. Остальной объем клетки приходится
на цитозоль, митохондрии, пероксисомы, ядро,
эндоплазматический ретикулум (ЭР), аппарат
Гольджи. В цитоплазме некоторых раститель-
ных клеток (например, в семенах или тканях
корневых клубеньков) содержатся сферические
липидные капли (олеосомы), которые форми-
руются в ЭР за счет накопления молекул триа-
цилглицеридов.
Содержимое ядра клетки окружает ядерная
оболочка, состоящая из двух мембран, возника-
ющих в телофазе из мембран ЭР. Пространство
между мембранами называют перинуклеарным
пространством. Ядерная оболочка пронизана
ядерными порами диаметром около 50 нм. В
ядре клетки содержится хроматин, который со-
стоит из двойных спиралей ДНК, связанных с
комплексами белков — основных гистонов, про-
являющих щелочные свойства. Совокупность
генов, локализованных в ядре, составляет ядер-
ный геном. В ядре также расположено ядрышко,
где при транскрипции ДНК происходит синтез
РНК рибосомальных субъединиц (рРНК). Эти
рибосомальные субъединицы и матричные РНК
(мРНК) мигрируют через ядерные поры в цито-
золь к рибосомам, осуществляющим биосинтез
белков. Синтезированные белки распределяют-
ся между различными компартментами клетки в
соответствии с их конечным назначением.
Заполненное цитозолем внутриклеточное
пространство пронизано трехмерной сетью из
белковых нитей — цитоскелетом, который пред-
ставляет собой совокупность микротрубочек и
микрофиламентов, построенных из особых
глобулярных белков. Микротрубочки образуют-
ся путем сборки двух глобулярных мономеров
а- и р-тубулина. Микротрубочки связаны с раз-
личными моторными белками и осуществляют
транспорт органелл в присутствии АТР. Микро-
филаменты образованы цепочками белка акти-
1.1. Клеточная стенка обеспечивает механическую прочность растительной клетки
21
Таблица 1.1. Внутриклеточные органеллы клеток мезофилла* и некоторые их функции
Процент
от общего объема	Функции
клетки
Вакуоль	79	Поддержание тургора клетки, накопление запасных и токсичных ве- ществ
Хлоропласты	16	Фотосинтез, синтез липидов и крахмала
Цитозоль	3	Осуществление процессов внутриклеточного метаболизма, синтез сахарозы
Митохондрии	0,5	Дыхание клетки
Ядро Пероксисомы Эндоплазматический ретикулум (ЭР) Олеосомы Аппарат Гольджи	0,3	Хранение генетической информации клетки (генома) Место синтеза нуклеиновых кислот (репликация, транскрипция) Осуществление метаболических реакций с образованием и распадом активных форм кислорода Запасание ионов Са2+, синтез и транспорт белков в вакуоль, экспорт белков из клетки Запасание триацилглицеридов Модификация, сортировка и транспорт белков в вакуоль, экспорт белков из клетки
* На примере клетки мезофилла шпината (по Winter, Robinson, Helt, 1994)
на (сходного по строению с мышечным акти-
ном), который при взаимодействии с миозином
также способствует внутриклеточному движе-
нию. Цитоскелет формирует пространственную
опорно-двигательную систему клетки, осущест-
вляет взаимосвязь и перемещение внутрикле-
точных структур, отчасти обеспечивает термо-
стойкость клетки, а также участвует в клеточном
делении и межклеточных взаимодействиях.
1.1. Клеточная стенка обеспечивает
механическую прочность
растительной клетки1
Одно из основных отличий растительных кле-
ток от животных — наличие жесткой полисаха-
ридной клеточной стенки, защищающей содер-
жимое клетки и поддерживающей ее размер и
форму. Под давлением пассивно поступающей
1 Это лишь одна из функций клеточной стенки (достаточ-
но важная). Кроме того, клеточная стенка обладает опреде-
ленными ионообменными свойствами, служит источником
сигнальных молекул (олигосахаринов), содержит различные
ферменты и т.д. — Прим. ред.
в клетку воды плазмалемма прижимается к вну-
тренней поверхности эластично растягиваю-
щейся клеточной стенки, создавая внутреннее
тургорное давление, препятствующее дальней-
шему осмотическому проникновению воды и
разрыву клетки.
Клеточная стенка растительной клетки
состоит преимущественно из углеводов
(полисахаридов) и белков
Клеточная стенка высших растений почти на
90% состоит из полисахаридов и только на
10% из белков. Одним из основных углевод-
ных компонентов клеточной стенки является
целлюлоза, представляющая собой линей-
ную цепь остатков D-глюкозы, соединенных
между собой (р-(1—>4))-гликозидными связя-
ми (рис. 1.3л), при этом каждый последующий
глюкозный остаток повернут на 180° относи-
тельно предыдущего. Такая структура позволяет
образовывать длинные полимерные цепочки,
содержащие от 2000 до 25000 глюкозных остат-
ков. Отдельные макромолекулы целлюлозы
соединяются между собой водородными свя-
22
1. Органеллы растительных клеток
Р-1,4-D-глюкан
а	(Целлюлоза)
L-арабиноза
о-ксилоза	D-ксилоза
б	D-галактоза
I
D-фукоза
Ксилогликан (Гемицеллюлоза)
(К ДЭе
Н ОН	Н ОН
поли-р-1,4-0-галактуроновая кислота, основная структурная единица пектина
Рис. 1.3. Основные структурные компоненты клеточной стенки: (а) целлюлоза,
(б) гемицеллюлоза, (в) строение пектинов
зями с образованием пространственных пара-
кристаллических структур — микрофибрилл.
У высших растений каждая микрофибрилла в
поперечном сечении состоит примерно из 36
цепочек целлюлозы. Микрофибриллы целлю-
лозы нерастворимы в воде, обладают повышен-
ной механической прочностью, чрезвычайно
устойчивы к химическому и ферментативному
(энзиматическому) гидролизу. Тем не менее
целлюлоза может разрушаться под действием
гидролитических ферментов (целлюлаз) неко-
торых грибов и бактерий. Такие ферменты вы-
деляют симбиотические бактерии, составляю-
щие микрофлору желудочно-кишечного тракта
некоторых травоядных животных (например,
жвачных), что позволяет им эффективно пере-
варивать траву и солому.
Еще один важнейший компонент клеточной
стенки — гемицеллюлозы, представляющие
собой гибкие полисахаридные структуры, под-
дающиеся экстракции щелочными раствора-
ми. Первоначально гемицеллюлозы ошибочно
считали предшественниками целлюлозы, впо-
следствии название сохранилось1. Гемицеллю-
лозы представляют собой обширную гетероген-
1 В биохимии растений термин «гемицеллюлоза» все чаще
заменяют на «сшивочные гликаны». — Прим. ред.
1.1. Клеточная стенка обеспечивает механическую прочность растительной клетки	23
ную группу полисахаридов, которые помимо
D-глюкозы содержат в своем составе остатки
гексоз (D-маннозы, D-галактозы, D-фукозы)
и пентоз (D-ксилозы и L-арабинозы). На
рис. 1.3# в качестве примера показана струк-
тура полимерной молекулы ксилоглюкана.
Основой ксилоглюканов является линейная
цепочка р-1,4-О-глюкана, к которой (al—>6)-
гликозидными связями присоединены остатки
D-ксилозы, связанные в свою очередь с остат-
ками D-галактозы и D-фукозы. Кроме того, по
2-ОН-группам к остаткам глюкозы может при-
соединяться L-арабиноза.
Помимо целлюлозы и гемицеллюлоз в состав
клеточной стенки входят пектины, представ-
ляющие собой смесь кислых полисахаридов,
основу полимерной цепи которых составляют
остатки D-галактуроновой кислоты, связанные
([И—>4)-гликозидным и связями (рис. 1.3в). При
метилировании карбоксильных групп возмож-
но образование метоксилированных пектинов.
Свободные карбоксильные группы соседних
макромолекул полигалактуроновых кислот спо-
собны взаимодействовать с ионами Са2+ и Mg2+,
что приводит к сшиванию отдельных полимер-
ных цепочек в единую пространственную сеть,
которая формирует аморфный гель, способный
к набуханию (рис. 1.4). В отсутствие ионов Са2+ и
Mg2+ пектин превращается в растворимое веще-
ство. Благодаря этим свойствам пектин широко
используется в пищевой промышленности.
Разветвленные цепочки полисахаридов свя-
заны гликозидными «мостиками» с некоторыми
структурными белками клеточной стенки, обра-
зуя гликопротеины, от 50 до 90% массы которых
составляют углеводы. В клеточной стенке также
могут содержаться воска (глава 15), кутин и су-
берин (глава 18).
Снижение прочности клеточной стенки
и ослабление связи между компонентами ма-
трикса приводит к тому, что клеточная стенка
растягивается, при этом происходит рост клет-
ки. В процессе растяжения участвуют белки
экспансины, чья функция, по-видимому, со-
стоит в разрушении водородных связей между
микрофибриллами целлюлозы и связующими
полисахаридами. Экспансины обязательно при-
сутствуют в растущих тканях всех цветковых
растений.
Клеточные стенки делят на два типа — пер-
вичную и вторичную. Первичная клеточная
стенка формируется на заключительных эта-
пах роста клетки. Она проницаема для молекул
воды. У однодольных растений первичная кле-
точная стенка «среднестатистической» клетки
на 20—30% состоит из целлюлозы, 25% — геми-
целлюлозы, 30% — пектина и на 5—10% из струк-
турных белков. В первичной клеточной стенке
пектины, гемицеллюлозы и гликопротеины об-
разуют несколько пространственных сетей, в
которые встроены микрофибриллы целлюлозы.
Вторичная клеточная стенка образуется при
достижении клеткой окончательного размера за
счет отложения новых слоев целлюлозы с вну-
тренней стороны первичной клеточной стен-
ки. При этом микрофибриллы целлюлозы рас-
полагаются под разными углами, что приводит
к созданию сложной многослойной структуры
(рис. 1.5).
Образование вторичной клеточной стенки
и прекращение роста у некоторых клеток совпа-
дает с началом синтеза лигнина, образующего-
Рис. 1.4. Сшивание отдельных макромолекул полигалактуроновых кислот
ионами Са2+ и Mg2+
24
1. Органеллы растительных клеток
Рис. 1.5. Клеточная стенка зеленой морской водоросли Oocystis solitaria.
Микрофибриллы целлюлозы ориентированы под различными углами, формируя
многослойную сетчатую структуру. Снимок получен методом замораживания /
скалывания (по D.G. Robinson, Гейдельберг)
ся при полимеризации фенилпропаноидов —
кумарового, кониферилового и синапового
спиртов (этот процесс подробно описывается
в разделе 18.3). Лигнификация (или одревесне-
ние) клеточных стенок приводит к образованию
жесткой и прочной структуры, которая позво-
ляет дифференцированным клеткам и после
отмирания выполнять функцию своеобразного
опорного скелета (например, при ветвлении или
формировании стеблей травянистых растений).
Лигнин — одно из самых распространенных
веществ в природе после целлюлозы. Так, сухая
древесина состоит из 30% лигнина, 40% — цел-
люлозы и 30% — гемицеллюлоз.
Плазмодесмы соединяют соседние
клетки и способствуют межклеточным
взаимодействиям
Межклеточное взаимодействие осуществля-
ется по плазмодесмам, пронизывающим кле-
точную стенку. Через плазмодесмы могут про-
никать небольшие молекулы с молекулярной
массой 800—900 Да, например такие продукты
метаболизма, как растворимые сахара, амино-
кислоты и свободные нуклеотиды1. Отдельная
растительная клетка может содержать от 1000
до 10000 плазмодесм1 2. Плазмодесмы соединяют
цитоплазму клеток в единый протяженный ком-
партмент — симпласт, по которому из клетки в
клетку могут диффундировать различные веще-
ства (рис. 1.6). Контактирующие между собой
клеточные стенки соседних клеток с межклет-
никами формируют апопласт (см. рис. 1.2).
Схема строения плазмодесмы показана на
рис. 1.7. Каждая плазмодесма представляет со-
бой канал (трубку), выстланный плазмалем-
мой, которая непрерывно переходит из клетки
в клетку. В центральной части канала распола-
гается десмотрубочка, связывающая эндоплаз-
1 По современным данным через плазмодесмы селективно
могут проходить и более крупные молекулы (белки, рибону-
клеопротеиновые комплексы). — Прим. ред.
2 Не все клетки имеют плазмодесмы. — Прим. ред.
1.1. Клеточная стенка обеспечивает механическую прочность растительной клетки
25
Рис. 1.6. Плазмодесмы соединяют
цитоплазму смежных клеток в единую
систему — симпласт. Контактирующие
между собой клеточные стенки соседних
клеток с межклетниками формируют
апопласт. На рисунке представлено
схематическое изображение такой системы.
В действительности каждый участок
контактирующих клеточных стенок
содержит не одну, а множество плазмодесм
Рис. 1.7. Схема строения плазмодесмы.
Плазмодесма представляет собой канал,
выстланный плазмалеммой, непрерывно
переходящей из клетки в клетку. В центре
канала расположена десмотрубочка —
мембранная структура, являющаяся
частью ЭР соседних клеток. Пространство
между плазмалеммой и мембраной ЭР
заполнено спирально расположенными
белковыми субъединицами, расстояние
между которыми определяет пропускную
способность плазмодесмы:
(а) продольный срез, (б) поперечный срез
Плазмалемма
б
26
1. Органеллы растительных клеток
магический ретикулум (ЭР) смежных клеток в
единую систему. По пространству между плаз-
малеммой и десмотрубочкой осуществляется
диффузия веществ между цитоплазматически-
ми компартментами соседних клеток. Белковые
частицы прикреплены к наружной мембране
плазмодесмы и к мембране десмотрубочки, и
при этом соединены друг с другом с помощью
сократимых белков. Предполагают, что благода-
ря изменению свободного пространства между
белковыми частицами регулируется пропуск-
ная способность плазмодесм. Многочисленные
вирусы растений, включая вирус табачной мо-
заики (ВТМ), синтезируют особые белки, от-
ветственные за перемещение вируса из клетки в
клетку (virus movement proteins). Эти белки из-
меняют проницаемость плазмодесм настолько,
что вирусная нуклеиновая кислота, связанная с
транспортирующим белком, может проникать
через плазмодесму. Таким образом, после зара-
жения одной клетки вирус распространяется по
всему пространству симпласта. Оказалось, что в
расширении плазмодесм при помощи вирусных
белков, заметную роль играет цитоскелет. Су-
ществует также естественный механизм обмена
макромолекулами (РНК, белками) по плазмо-
десмам между соседними клетками. Подобный
механизм могут использовать вирусы при рас-
пространении по растению. Вероятно, есть соб-
ственные транспортные белки растений, кото-
рые переносят макромолекулы с затратой АТФ.
По этому пути по симпласту могут распростра-
няться сигнальные молекулы, например, транс-
крипционные факторы.
Клеточная стенка растительных клеток может
разрушаться (лизироваться) под действием ги-
дролитических ферментов грибов и микроорга-
низмов — целлюлаз и пектиназ. Клетки, лишен-
ные клеточной стенки (например, в результате
инкубации растительной ткани с соответствую-
щими ферментами), называют протопластами.
У протопластов нарушена регуляция водообме-
на, поэтому они стабильны только в изотониче-
ских средах, осмотическое давление которых
соответствует осмотическому давлению вну-
триклеточной жидкости. Если поместить изо-
лированный протопласт в чистую воду, он будет
увеличиваться в объеме за счет осмотического
поступления воды до полного разрушения. При
культивировании на специально подобранных
питательных средах протопласты некоторых
растений способны вновь синтезировать кле-
точную стенку, делиться, образовывать каллус и
регенерировать целое растение.
1.2.	Функции вакуолей
Вакуоль растительной клетки представляет со-
бой органеллу, заполненную жидкостью и окру-
женную мембраной — тонопластом. В клетках
растений разных видов вакуоли значительно
отличаются по форме и размерам. Как правило,
молодые клетки содержат много маленьких ва-
куолей, занимающих небольшую часть клеточ-
ного объема. По мере роста и развития клетки
мелкие вакуоли сливаются в несколько крупных
или в одну центральную вакуоль (см. рис. 1.1 и
1.2). За счет увеличения размера вакуолярного
компартмента происходит растяжение и увели-
чение размеров самой клетки. В клетках запа-
сающих и эпидермальных тканей вакуоль мо-
жет занимать практически все внутриклеточное
пространство.
Одна из важнейших функций вакуоли — под-
держание тургора клетки. За счет транспорти-
руемых через тонопласт солей органических и
неорганических кислот содержимое вакуоли
обладает высоким осмотическим потенциа-
лом. Вода за счет осмоса поступает в вакуоль,
которая при этом увеличивается в объеме и
оказывает давление на сравнительно жесткую
клеточную стенку. Именно тургорное давление
поддерживает стебли и листья травянистых рас-
тений в вертикальном положении и придает им
упругость. При недостатке воды тургорное дав-
ление падает, и растение увядает.
Важная функция вакуолей — разрушение
и реутилизация тех клеточных структур, кото-
рые повреждены или не нужны в данный мо-
мент. Некоторые вакуоли содержат различные
гидролитические ферменты — гидролазы, ко-
торые способствуют расщеплению различных
метаболитов — белков, нуклеиновых кислот,
полисахаридов, а также участвуют в утилизации
структурных компонентов клетки. В процессе
эндоцитоза клеточные органеллы (например,
митохондрии) включаются в литическую ва-
куоль и подвергаются деградации. Аминокис-
лоты и углеводы, образующиеся в результате
действия ферментов, транспортируются из ва-
1.3. Пластиды — эволюционные потомки цианобактерий
27
куоли в клетку и вторично используются в про-
цессах клеточного метаболизма. Рециклизация
веществ особенно актуальна во время запро-
граммированного старения клеток и тканей
(раздел 19.5), когда перед листопадом из листьев
выводятся метаболически важные соединения,
которые в дальнейшем используются при фор-
мировании семян.
Еще одна важная функция вакуолей — обез-
вреживание ядовитых соединений, которые
изолируются в вакуолярных системах и таким
образом исключаются из обмена веществ клет-
ки. Например, так происходит накопление ток-
сичных продуктов клеточного метаболизма (за
исключением газообразных метаболитов), а
также различных ксенобиотиков в вакуолях ли-
ста (глава 12).
Кроме того, вакуоли растительных клеток
используются для запасания различных ве-
ществ. В вакуолярных системах хранится запас
нитратов и фосфатов, в вакуолях клеток листа
накапливается яблочная кислота (раздел 8.5),
в вакуолях запасающих тканей откладываются
углеводы (раздел 13.3) и запасные белки (гла-
ва 14). Многие растительные клетки одновре-
менно содержат и литические, и запасающие
вакуолярные системы, изолированные друг от
друга.
Благодаря запасающим свойствам вакуолей,
растения можно использовать как природные
«фабрики» белков. Современные методы ген-
ной инженерии позволяют создавать транс-
генные растения-продуценты с повышенным
содержанием экономически ценных типов бел-
ков, например, специфичных антител, которые
будут в значительных количествах накапливать-
ся в запасающих вакуолях растительных клеток.
Отработка методов культивирования таких рас-
тений позволит значительно снизить затраты на
получение подобных веществ.
1.3.	Пластиды - эволюционные
потомки цианобактерий
Пластиды — органеллы, которые характерны
только для растительных клеток. Они способны
к интенсивному делению, наследование пла-
стид происходит чаще всего через яйцеклетку
(материнское наследование). Предшествен-
никами всех типов пластид являются пропла-
стиды, которые в процессе дифференциации
клетки могут превращаться в зеленые фотосин-
тезирующие хлоропласты, в хромопласты,
содержащие цветные пигменты (желтые, оран-
жевые или красные каротиноиды) или в бесц-
ветные лейкопласты. Для пластид характерно
наличие пластидного генома (пластома), ор-
ганизация которого напоминает структуру ге-
нома прокариот, например — цианобактерий.
Все пластиды обладают собственной кольцевой
ДНК и набором ферментов, которые отвечают
за дупликацию и экспрессию генов1, а также
совместно с ядерным геномом контролируют
синтез пластидных белков, причем ядерными
генами кодируется большая их часть. В пла-
стидном геноме чаще всего кодируются белки
электрон-транспортной цепи фотосинтетиче-
ского аппарата и некоторые субъединицы АТФ-
синтазного комплекса.
В 1883 г. ботаник Андреас Шимпер выдвинул
гипотезу об эндосимбиотическом происхожде-
нии пластид1 2. В соответствии с этой теорией
пластиды образовались в результате симбиоза
прокариот (например, цианобактерий) с пер-
вичными эукариотическими клетками. Клетки
бактерий могли попадать в клетку-хозяина за
счет фагоцитоза (рис. 1.8), в процессе форми-
рования новой составной клеточной системы
часть генетической информации эндосимби-
онта могла изменяться и переноситься в ядро.
В результате такого перемещения большей ча-
сти прокариотических генов пластиды попада-
ли под контроль клеточного ядра, теряя способ-
ность к самостоятельной жизнедеятельности.
Так, например, проведенный сравнительный
анализ последовательностей ДНК, кодирующих
некоторые белки хлоропластов с одной сторо-
ны, и первичных форм цианобактерий с другой,
показал, что все хлоропласты растений скорее
всего произошли в результате одного симбиоти-
ческого события, что также служит веским аргу-
ментом в пользу эндосимбиотической теории.
1 Функция редупликации генома пластид находится под
ядерным контролем (собственных ферментов нет). Экс-
прессия части генома происходит при участии РНК-по-
лимеразы фагового типа, транспортирующейся в пласти-
ды из цитороля, хотя имеется и собственная пластидная
РНК-полимераза. — Прим. ред.
2 Приоритет на самом деле принадлежит русскому учено-
му М. Д. Мережковскому. — Прим. ред.
28
1. Органеллы растительных клеток
Рис. 1.8. Симбиоз цианобактерии и клетки-хозяина
Пропластиды (рис. 1.9а) — небольшие не-
дифференцированные сферические органел-
лы диаметром 1 — 1,5 мкм. Они являются пред-
шественниками всех пластид и содержатся в
основном в меристематических клетках (в кор-
нях, молодых побегах). Как и у других типов
пластид, содержимое пропластид отделено от
цитоплазмы двумя мембранами. В соответствии
с эндосимбиотической теорией считается, что
внутренняя мембрана была сформирована плаз-
малеммой прокариота-симбионта, а внешняя —
плазматической мембраной клетки-хозяина.
Хлоропласты (рис. 1.90 дифференцируют-
ся из пропластид (рис. 1.10). Количество хло-
ропластов в клетках не одинаково, например,
клетки мезофилла листа могут содержать около
50 хлоропластов. От остальных типов пластид
хлоропласты отличаются наличием зеленого
пигмента хлорофилла, зеленый цвет которо-
го может маскироваться содержанием других
пигментов (например, у бурых и красных во-
дорослей). Хлоропласты имеют линзовидную
форму, длина хлоропластов высших растений
составляет 3—10 мкм; они могут изменять свое
местоположение в клетке так, чтобы улавли-
вать оптимальное количество света. Двойная
мембранная оболочка хлоропластов ограничи-
вает внутренний матрикс — строму, содержа-
щую разветвленную систему мембран, которая
образуется при дифференциации хлоропластов
за счет тесно соприкасающихся друг с другом
складок (инвагинаций) внутренней мембраны
оболочки — тилакоидов (термин «тилакоид»
предложен Вильгельмом Менке в 1960 г. от греч.
«похожий на мешок») (рис. 1.11). Соединенные
между собой и уложенные в стопки группы
тилакоидов формируют граны, которые видны
в световой микроскоп как небольшие уплотне-
ния во внутреннем пространстве хлоропластов
(тилакоиды граны). Соседние граны могут быть
связаны между собой одиночными тилакоида-
ми (тилакоиды стромы). В результате в хлоро-
пластах образуется единое внутритилакоидное
пространство. В мембранах тилакоидов содер-
жатся функциональные белковые комплексы
фотосинтетического аппарата растительной
клетки (глава 3).
Хлоропласт можно разделить на три
компартмента: 1) межмембранное простран-
ство между внешней и внутренней мембрана-
ми оболочки; 2) пространство стромы между
внутренней мембраной и мембранами тила-
коидов: 3) внутритилакоидный люмен, пред-
ставляющий собой пространство, окружен-
ное тилакоидными мембранами. Внутренняя
мембрана оболочки обладает высокой избира-
тельной проницаемостью по отношению к ме-
таболитам, которые пересекают ее только при
помощи специализированных переносчиков
(раздел 1.9). Внешняя мембрана оболочки со-
держит неспецифичные поровые белки пори-
ны, образующие поры, позволяющие свободно
диффундировать веществам с молекулярной
массой до 10000 Да, но не пропускающие ма-
кромолекулы (белки, нуклеиновые кислоты)
(раздел 1.11). Благодаря сложной организации,
тилакоидная мембрана образует барьер между
метаболическими компартментами хлороплас-
та — стромой и люменом, который играет роль
внешнего пространства по отношению к стро-
ме и служит для накопления протонов при соз-
дании протонного градиента (глава 3).
1.3. Пластиды - эволюционные потомки цианобактерий
Рис. 1.9. Различные типы пластид:
(а) пропластида из клеток молодых листьев Cucurbita pepo (цуккини);
(б) хлоропласт из клеток мезофилла листьев табака, зафиксированный в конце
ночи;
(в) амилопласт из клеток корня Cestrum auranticum;
(г) хромопласт из клеток лепестка Cestrum auranticum
(по D. G. Robinson, Гейдельберг)
30
1. Органеллы растительных клеток
Пропластида
Строма
Межмембранное пространство
Рис. 1.10. Схема дифференциации пропластиды в хлоропласт
Рис. 1.11. Уложенные в стопки тилакоиды
гран и связывающие их между собой одиночные
тилакоиды стромы формируют единое
тилакоидное пространство (люмен) (по Weier,
Stocking, 1963)
1.4. Митохондрии также произошли путем эндосимбиоза
31
Строма хлоропласта содержит крахмальные
зерна. Крахмал служит хранилищем углеводов,
накопленных в дневное время в результате ин-
тенсивного фотосинтеза. Запасенные углеводы
становятся источником энергии для процес-
сов жизнедеятельности клетки в ночное время,
о чем можно судить по уменьшению размеров
крахмальных зерен (раздел 9.1). Образование
крахмала в растительных клетках всегда проис-
ходит именно в пластидах.
В строме пластид также присутствуют пла-
стоглобулы — осмиофильные безмембранные
образования, содержащие помимо других ве-
ществ резервный пул липидов и пластохинонов.
Максимальное количество пластоглобул в хло-
ропластах наблюдается в период осеннего отми-
рания листьев. По-видимому, в этих структурах
накапливаются продукты деградации мембран
тилакоидов стареющих хлоропластов.
Кроме того, в строме присутствует пластид-
ный геном (может быть от 10 до 100 идентичных
копий), который локализован в особой обла-
сти — нуклеоиде. Присутствующие в хлоропла-
сте рибосомы либо свободно расположены в
стромальном пространстве, либо связаны с по-
верхностью тилакоидных мембран.
В листьях растений, выращенных в темноте
(этиолированные растения), образуются бледно-
желтые этиопласты. Этиопласты формируются
из пропластид и считаются промежуточной ста-
дией развития хлоропластов. В этиопластах от-
сутствует хлорофилл, а также некоторые из хло-
ропластных белков. Во внутреннем пространстве
этиопластов расположена рельефная мембран-
ная структура — проламеллярное тело, образо-
ванное липидами, которые обычно составляют
внутренние мембраны хлоропластов.
Лейкопласты (см. рис. 1.9в) представляют
собой целую группу неокрашенных (бесцвет-
ных) пластид, выполняющих различные функ-
ции. К ним относят амилопласты1, которые
содержат гранулы крахмала и встречаются в за-
пасающих тканях и органах растений, например
в корнях, семенах и клубнях (глава 9). В лейко-
пластах бесхлорофилльных тканей также осу-
ществляется биосинтез липидов. У некоторых
1 Амилопласты часто выделяют в отдельный тип пластид.
Существуют также лейкопласты, специализированные на
синтезе изопреноидов. — Прим. ред.
видов растений промежуточная стадия ассими-
ляции нитратов — восстановление нитритов до
аммония (глава 10) — происходит в лейкопла-
стах клеток корня.
Хромопласты (рис. 1.9г) — пластиды, кото-
рые содержат каротиноиды и в зависимости от
комбинаций пигментов (рис. 2.9) могут быть
желтого, оранжевого или красного цвета. Раз-
меры хромопластов схожи с размерами хлоро-
пластов. Хромопласты ответственны за окраску
цветков и плодов растений (например, красный
цвет томатов), про их метаболические функции
достоверно ничего неизвестно.
1.4.	Митохондрии также произошли
путем эндосимбиоза
Митохондрии отвечают за процесс клеточного
дыхания и содержат системы окислительного
фосфорилирования, обеспечивающие энерге-
тические потребности клеток (глава 5). Как и
пластиды, новые митохондрии могут образовы-
ваться за счет деления уже существующих мито-
хондрий. Митохондрии наследуются, как пра-
вило, через яйцеклетку. Митохондрии обладают
собственным геномом (митохондриальный ге-
ном растительных клеток помимо крупных
кольцевых молекул ДНК, содержит некоторое
количество кольцевых и линейных молекул
меньшего размера), а также собственными си-
стемами биосинтеза белка, редупликации и
экспрессии генов, причем геном митохондрий
кодирует лишь незначительную часть митохон-
дриальных белков (табл. 20.6), а большая часть
кодируется ядерным геномом. Митохондрии,
как и пластиды, имеют эндосимбиотическое
происхождение, что подтверждается исследо-
ваниями последовательностей ДНК. Считает-
ся, что митохондрии образовались в результате
симбиоза предковой протеобактерии и анаэ-
робной бактерии (например, архебактерии).
Эндосимбиотическое происхождение (см.
рис. 1.8) объясняет наличие двух мембран, от-
деляющих содержимое митохондрий от ци-
топлазмы (рис. 1.12). Подобно мембранам
хлоропласта, внешняя мембрана оболочки
митохондрий содержит белки-порины и про-
ницаема для небольших молекул метаболитов
размером 4000—6000 Да. Внутренняя мембрана
обладает избирательной проницаемостью по
32
1. Органеллы растительных клеток
Рис. 1.12. Строение
митохондрии
отношению к этим соединениям; большинство
веществ транспортируется через внутреннюю
мембрану при помощи белков-переносчиков
и специализированных каналов. Особенности
строения внешней и внутренней мембран ми-
тохондриальной оболочки позволяют рассма-
тривать межмембранное пространство как
отдельный компартмент, функционально соот-
ветствующий внутритилакоидному простран-
ству (люмену) хлоропластов.
Внутреннее содержимое митохондрий, огра-
ниченное внутренней мембраной, называют
митохондриальным матриксом. Внутренняя
мембрана оболочки образует инвагинации
(складки) различной формы — митохондриаль-
ные кристы (рис. 1.13), которые глубоко вне-
дряются в матрикс и значительно увеличивают
поверхность мембраны. Структура таких мем-
бранных складок напоминает тилакоиды хло-
ропластов, однако, в отличие от тилакоидов,
систему крист нельзя рассматривать как отдель-
ный компартмент. Во внутренней мембране ти-
лакоидов локализованы компоненты электрон-
транспортной цепи дыхания, а также системы,
отвечающие за формирование на этой мембра-
не протонного градиента.
Рис. 1.13. Внутренняя
мембрана оболочки образует
складки различной формы,
которые глубоко внедряются
в матрикс и значительно
увеличивают поверхность
мембраны. На фотографии
показаны митохондрии клеток
алейронового слоя ячменя
(по D. G. Robinson, Гейдельберг)
1.5. В пероксисомах проходят реакции с образованием токсичных продуктов-интермедиатов
33
1.5.	В пероксисомах проходят
реакции с образованием
токсичных продуктов-
интермедиатов
Пероксисомы (один из типов микротелец) —
небольшие сферические органеллы эука-
риотических клеток диаметром 0,5—1,5 мкм
(рис. 1.14). В отличие от пластид и митохондрий
они ограничены мембраной и не обладают соб-
ственным генетическим аппаратом. Матрикс
пероксисом представляет собой специализи-
рованный компартмент, в котором содержатся
различные ферменты, катализирующие реак-
ции, проходящие с образованием токсичных
продуктов-интермедиатов. Так, например, при
работе окислительных ферментов в перокси-
сомах образуется перекись водорода, кото-
рая немедленно разлагается присутствующей в
этих же органеллах каталазой (раздел 7.4). Пе-
роксисомы характерны практически для всех
эукариотических клеток. В клетках растений
Рис. 1.14. Пероксисомы:
(А) Пероксисомы клеток мезофилла листа табака. Близкое расположение
пероксисом (Р), митохондрий (М) и хлоропластов (С) способствует быстрому
обмену метаболитами между этими органеллами в процессе фотодыхания (глава 7);
(Б) глиоксисомы семядолей проростков Cucurbitapepo (цуккини). Для
эффективного превращения запасенных липидов в сахара в ходе глиоксплатного
цикла (раздел 15.6) необходимо тесное взаимодействие между липидными каплями
(L), глиоксисомами (G) и митохондриями (М) (по D. G. Robinson, Гейдельберг)
34
1. Органеллы растительных клеток
выделяют два основных типа микротелец — пе-
роксисомы листьев (рис. 1.14А), участвующие
в процессах фотодыхания (глава 7), и глиок-
сисомы (рис. 1.14Б), содержащие ферменты
глиоксилатного цикла и [3-окисления жирных
кислот. Глиоксисомы присутствуют в прорас-
тающих семенах масличных растений и отвеча-
ют за превращение жирных кислот в углеводы
(раздел 15.6). Механизм формирования новых
пероксисом до сих пор неясен. Считается, что
пероксисомы либо возникают de novo из скла-
док мембран эндоплазматического ретикулума,
либо, подобно пластидам и митохондриям, об-
разуются при делении предсуществующих орга-
нелл1. Собственного генетического аппарата в
пероксисомах нет. Сравнение аминокислотных
могли иметь общего предка. Был ли это эндо-
симбионт, как в случае митохондрий и хлоро-
пластов, который в процессе эволюции утратил
свой геном, до сих пор неясно.
1.6.	Эндоплазматический
ретикулум и аппарат Гольджи
образуют пространственную
трехмерную сеть, отвечающую
за распределение продуктов
биосинтеза
На фотографии электронной микроскопии эн-
доплазматический ретикулум (ЭР) выглядит
своеобразным лабиринтом, пронизывающим
Рис. 1.15. Шероховатый эндоплазматический ретикулум. Видны пересекающие
клетку вытянутые полости ЭР (узкие стрелки), а также тангенциально
расположенные цистерны (широкие стрелки). Комплексы из нескольких рибосом,
ассоциированных с одной молекулой мРНК, называются полисомами. Полисомы
могут быть свободными или закреплёнными на мембране ЭР. На фотографии
показан участок клетки семядолей созревающих семян гороха (по D. G. Robinson,
Гейдельберг)
последовательностей ферментов, содержащих-
ся в пероксисомах растений, животных и гри-
бов, позволяет предположить, что пероксисомы
1 В настоящее время окончательно доказано, что новые
пероксисомы образуются только путём деления старых. —
Прим. ред.
внутриклеточное пространство (рис. 1.15). ЭР
представляет собой непрерывную систему, об-
разованную канальцами, цистернами и пу-
зырьками, которые ограничены одинарной
мембраной. Обычно выделяют два типа ЭР —
шероховатый и гладкий ЭР. Гладкий (аграну-
лярный) ЭР состоит преимущественно из труб-
1.6. Эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи
35
чатых канальцев, шероховатый (гранулярный)
ЭР образован системой плоских цистерн, на
внешней поверхности мембран которых рас-
положены рибосомы, участвующие в синтезе
белка.
Присутствие рибосом на внешней мембране
ЭР временно. Рибосомы закрепляются на мем-
бране только в том случае, когда синтезируемый
ими белок идет на экспорт из клетки или пред-
назначен для использования в самом ЭР или в
вакуолях. В таких случаях в синтезируемой бел-
ковой цепочке присутствует сигнальный пеп-
тид (лидерный пептид), включающий механизм
переноса белковой молекулы через мембрану в
люмен (внутреннее пространство) ЭР (раздел
14.5). При помощи электронной микроскопии
можно обнаружить рибосомы, закрепленные
на мембране в момент синтеза пептида, предна-
значенного для люмена ЭР (шероховатый ЭР).
Помимо белков в ЭР осуществляется синтез
большинства мембранных липидов. При этом
жирные кислоты, необходимые для биосинтеза,
поступают из пластид.
В клетках семян и некоторых тканях маслич-
ных растений присутствуют сферические липид-
ные тела — олеосомы. Олеосомы являются про-
изводными эндоплазматического ретикулума и
служат для накопления молекул триацилглице-
ридов. Олеосомы имеют важное экономическое
значение, поскольку именно в этих органеллах
накапливается растительное масло таких расте-
ний, как маслина, рапс и др. Каждое масляное
тело окружено фосфолипидным монослоем, где
гидрофильные фосфатные группы обращены к
цитоплазме, а гидрофобные — к триацилглице-
ридному матриксу олеосомы (раздел 15.2).
Способность ЭР к биосинтезу и накоплению
белков широко используют в генной инженерии
растений. Синтезируемые в ЭР модифициро-
ванные белки снабжают сигнальными последо-
вательностями, одни из которых (N-концевые
сигнальные пептиды) включают механизм пере-
носа пептидной цепочки через мембрану ЭР,
другие (С-концевые сигнальные тетрапептиды
KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu)) отвечают за локали-
зацию белка в полости ЭР. Люмен ЭР клеток
листа может накапливать огромные количества
таких модифицированных белков (от 2,5 до 5%
от общего содержания белка), причем это не
оказывает существенного влияния на функцио-
нирование ЭР в целом.
Попадая во внутреннее пространство ЭР,
белки могут подвергаться модификации за счет
присоединения цепочек моносахаридов к ами-
нокислотным остаткам — N-гликозилированию
(раздел 17.7).
Экзоцитоз
Рис. 1.16. Схема возможных взаимодействий между ЭР и аппаратом Гольджи:
транспортировка белков от ЭР к вакуолям и выведение (секреция) белков из клетки
36
1. Органеллы растительных клеток
Рис. 1.17. Диктиосома аппарата Гольджи в клетках зеленой водоросли
Chlamydomonas reinhardii. С — цис-компартмент, t — транс-компартмент. Транс-
компартмент расширяется и образует трубчатый ретикулум — транс- Гольджи -
сеть (широкие стрелки). Шероховатый ЭР типичен для этого типа клеток. На
поверхности мембран ЭР (кроме тех областей, где отпочковываются транспортные
везикулы) видны рибосомы (по D. G. Robinson, Гейдельберг)
Из люмена ЭР вновь синтезированные белки
при помощи транспортных пузырьков (везикул)
переносятся к аппарату Гольджи и сливают-
ся с цис-поверхностью ближайшей цистерны
(рис. 1.16). Транспортные пузырьки отпочковы-
ваются от мембран ЭР и несут на поверхности
специальные белки оболочки — СОР (от англ.
coat protein), состоящие из 6—7 субъединиц.
Белки СОР необходимы для направленного
транспорта пузырька (targeting) в нужный ком-
партмент.
Аппарат Гольджи (АГ) был открыт при по-
мощи световой микроскопии в 1898 году итальян-
цем Камилло Гольджи. Функциональная единица
аппарата Гольджи может содержать до 20 диско-
образных уплощенных цистерн Гольджи или дик-
тиосом, которые расположены параллельно друг
другу и собраны в стопки. Каждая диктиосома
окружена гладкой мембраной, не несущей рибо-
сом на поверхности (рис. 1.17). В стопках всегда
различают цпс-компартмент (проксимальный или
формирующийся), промежуточный компартмент
и дирянс-компартмент (дистальный или зрелый).
При прохождении через компартменты АГ неко-
торые белки подвергаются О-гликозилированию
за счет присоединении цепочек из моносахаридов
к аминокислотным остаткам, главным образом
серину и треонину.
Цистерны АГ всегда ассоциированы с мно-
жеством мелких мембранных пузырьков, кото-
рые группируются по периферии диктиосом и
участвуют в транспорте продуктов биосинтеза.
Предполагают, что существуют два основных
механизма транспорта веществ через аппарат
Гольджи.
1. По модели везикулярного челнока (vesicle
shuttle) везикулы отпочковываются от мембран
ЭР и АГ и транспортируют белки между цистер-
нами, при этом каждая цистерна в стопке имеет
четко фиксированное положение (см. рис. 1.16).
2. Согласно модели образования цистерн
(cisternae progression) транспортные везикулы
сливаются на цис-стороне диктиосомы с обра-
зованием новой цистерны, которая перемеща-
ется в промежуточное положение, и затем — на
дирянс-стороне в свою очередь распадаются и
формируют новые везикулы для дальнейшего
транспорта белков. Полученные в последнее
время данные указывают на то, что эти процес-
сы могут происходить в клетке параллельно.
Аппарат Гольджи осуществляет перенос син-
тезированных белков в соответствии с их функ-
1.7. Препаративное выделение функционально активных органелл растительных клеток
37
Рис. 1.18. Структура клатриновой оболочки везикулы:
(а) при ассоциации трех а- и трех р-субъединиц клатрина образуется тример
в форме трискелиона; (б) при полимеризации клатрин формирует замкнутую
трехмерную сеть в виде гексагональной решетки, окружающей везикулу — (в)
(из Kleinig, Sitte)
циями либо к поверхности клетки (секреция),
либо к запасающим и литическим вакуолям (раз-
дел 1.2), причем распределение белков между ва-
куолярными компартментами регулируется сиг-
нальными последовательностями. Транспорт к
литическим вакуолям осуществляется клатрин-
окаймленными везикулами. Клатрин — особый
белок, состоящий из двух различных субъеди-
ниц (а-субъединица 180000Да, [3-субъединица
35000—40000 Да). При ассоциации трех а- и
трех р-субъединиц клатрина образуется три-
мер в форме трискелиона. При полимеризации
клатрин формирует замкнутую трехмерную сеть
в виде гексагональной решетки, окружающей
везикулу (рис. 1.18). «Простые» везикулы (без
клатриновой оболочки) транспортируют белки
к запасающим вакуолям. Белки, несущие толь-
ко один сигнальный пептид для ЭР, переносятся
секреторными везикулами (пузырьками) по се-
креторному пути к плазмалемме и выводятся из
клетки при помощи экзоцитоза.
Совокупность мембранных структур — мем-
браны ЭР, аппарата Гольджи, транспортные ве-
зикулы и ядерную оболочку — называют эндо-
мембранной системой растительной клетки.
1.7.	Препаративное выделение
функционально активных
органелл растительных клеток
Для выделения органелл необходимо нарушить
целостность клетки и разрушить ее на отдель-
ные фрагменты, при этом клеточные органел-
лы попадают в среду выделения и образуют
клеточный гомогенат. Чтобы предотвратить
набухание и разрушение клеточных органелл
при гомогенизации, используют изотониче-
ские среды выделения, осмотическое давление
которых (за счет присутствия осмотиков, на-
пример — сахарозы) соответствует осмотиче-
скому давлению жидкой фазы внутри самих ор-
ганелл. Обычно используют среды, содержащие
0,3 моль/л сахарозы или сорбита.
На рисунке 1.19 в качестве примера пред-
ставлена схема получения суспензии хлоро-
пластов. Кусочки листовой пластинки по-
мещают в гомогенизатор и измельчают при
высоких скоростях вращения в течение не-
скольких секунд. Время гомогенизации долж-
но быть непродолжительным, иначе выде-
ляющиеся в среду органеллы также могут
разрушиться. Следует отметить, что такой
метод гомогенизации пригоден только для тех
видов растений, клетки тканей листа которых
обладают достаточно хрупкой клеточной стен-
кой (например, для шпината). В тех случаях,
когда клеточная стенка растительной клетки
оказывается слишком прочной (например, у
различных видов злаковых), из фрагментов
листовой пластинки сначала выделяют прото-
пласты по описанной в п. 1.1 методике; затем
изолированные протопласты протирают через
сито с размером ячеек меньшим, чем размеры
самих протопластов.
Необходимые органеллы можно отделить от
гомогената при помощи дифференциального
центрифугирования или центрифугирования
в градиенте плотности.
38
1. Органеллы растительных клеток
Схема выделения хлоропластов из листьев
(все операции проводят при температуре О °C)
Кусочки листовой пластинки
в среде выделения
Гомогенизация в миксере
3 сек
Г омогенат
Фильтрация суспензии через
несколько слоев марли для
удаления крупных фрагментов
ткани и клеточных стенок
Фильтрат
Центрифугирование 1 мин
при 4000 д,
у отделение супернатанта
Осадок ресуспендирован
в среде выделения
Промывка
Центрифугирование 1 мин
при 4000 д,
отделение супернатанта
Осадок ресуспендирован
в среде выделения -
СУСПЕНЗИЯ
ХЛОРОПЛАСТОВ
Рис. 1.19. Методика выделения функционально
активных хлоропластов
Для дифференциального центрифугирова-
ния используют среды, плотность которых мень-
ше плотности гомогената, при этом скорость
осаждения компонентов клеточного экстракта
при ускорении, созданном в центрифуге, будет
зависеть в основном от размера содержащихся
в гомогенате частиц (крупные частицы оседают
быстрее мелких). (Важен не только размер, но
и плотность органелл. — Прим, ред.) Как пока-
зано на рис. 1.19, достаточно чистую суспензию
изолированных хлоропластов можно получить в
течение короткого времени за счет центрифуги-
рования в несколько этапов с последовательным
увеличением скорости вращения. (На рисунке
это не показано, поэтому при данной методике
в суспензию хлоропластов попадают также ядра.
Это не так важно при изучении фотосинтетиче-
ских процессов, но недопустимо при выделении
хлоропластной ДНК. — Прим, ред.)
При необходимости более точного разделе-
ния фракций клеточного экстракта используют
центрифугирование, формируя градиент плот-
ности (рис. 1.20). Для этого в центрифужную
пробирку наслаивают среды таким образом,
чтобы плотность раствора уменьшалась в на-
правлении от дна пробирки. Чтобы предотвра-
тить изменения осмотических концентраций
среды, для достижения высоких плотностей
обычно используют «тяжелые» макромолекулы
(например, Percoll). Поверх приготовленной
Суспензия-гомогенат
Г радиент
плотности
Рис. 1.20. Разделение частиц различной плотности при помощи центрифугирования
в градиенте плотности
1.8. Различные транспортные процессы обеспечивают обмен метаболитами
39
таким образом среды наносят исследуемый об-
разец и центрифугируют до тех пор, пока ком-
поненты гомогената не опустятся в те слои
раствора, плотность которых равна их собствен-
ной. Поскольку центрифугирование в градиенте
плотности требует более длительного времени и
более высоких скоростей, данный метод обычно
применяют после предварительного дифферен-
циального центрифугирования для окончатель-
ной очистки экстрактов.
Совмещая методы фракционирования, мож-
но получать функционально активные препара-
ты выделенных хлоропластов, митохондрий, пе-
роксисом и мембран вакуолей высокой степени
очистки для проведения дальнейших исследова-
ний метаболических процессов.
1.8.	Различные транспортные
процессы обеспечивают
обмен метаболитами между
компартментами растительной
клетки
Каждая из упомянутых в предыдущих главах
органелл играет свою четко определенную роль
в клеточном метаболизме. Для обеспечения
взаимосвязи метаболических процессов, про-
текающих в различных компартментах клетки,
необходимо наличие развитой системы транс-
порта веществ через мембраны клеток и орга-
нелл. Транспорт соединений может осущест-
вляться различными способами: при помощи
специфических белков-переносчиков, через
ионные каналы, поры, за счет везикулярного
транспорта, а в некоторых случаях — для моле-
кул СО2 или О2 — за счет пассивной диффузии
через мембраны. Транспорт через плазмодесмы
и везикулярный транспорт уже рассматривался
в предыдущих главах.
На рисунке 1.21 показаны схемы основных
транспортных процессов. Перенос веществ че-
рез мембрану может осуществляться нескольки-
ми способами. При унипорте через мембрану
переносится единичная молекула или ион; при
антипорте вещества переносятся через мем-
брану в противоположных направлениях; при
симпорте через мембрану в одном направле-
нии одновременно переносятся два соедине-
ния. Транспортные процессы, проходящие по
той же схеме, но с одновременным переносом
заряда, носят название электрогенных. На-
правленный (векторный) транспорт против
градиента электрохимического потенциала с
затратой энергии фотонов или энергии хими-
в
Первичный активный
транспорт
Вторичный активный
транспорт
Рис. 1.21. Классификация мембранных транспортных процессов
40
1. Органеллы растительных клеток
ческих связей называют активным или пер-
вичным активным транспортом. Примером
активного транспорта может служить транспорт
протонов за счет энергии переноса электронов
в электрон-транспортной цепи при фотосин-
тетических реакциях (глава 3), в дыхательной
цепи (глава 5) или за счет использования энер-
гии АТФ (рис. 1.21 в). Транспорт протонов, без-
условно, является электрогенным транспортом,
поскольку перенос положительно заряженных
ионов ведет к образованию мембранного потен-
циала. Другим примером первичного активного
транспорта является АТФ-зависимый транспорт
конъюгатов глутатиона в вакуоль (раздел 12.2).
Вторичным активным транспортом назы-
вают процесс переноса веществ через мембрану
за счет электрохимического потенциала. Так,
в случае электроген ного ун и порта, мембран-
ный потенциал обеспечивает перенос молекул
субстрата против градиента его концентрации.
Примером такого транспорта является про-
цесс накопления малата в вакуолях (глава 8,
рис. 1.21в). Еще один пример вторичного ак-
тивного транспорта — процесс накопления са-
харозы в результате симпорта сахарозы и Н+ за
счет протонного градиента, образующегося при
участии первичного активного транспорта (см.
рис. 1.21 в). Эти транспортные процессы играют
важную роль при накоплении сахарозы в сито-
видных элементах флоэмы (глава 13).
1.9.	Переносчики-транслокаторы
обеспечивают избирательный
транспорт продуктов
метаболизма
и молекул-субстратов
В клеточных мембранах присутствуют специали-
зированные транспортные белки, осуществляю-
щие избирательный транспорт веществ через
мембрану. Еще совсем недавно считалось, что
эти белки действуют как переносчики, — свя-
зываясь с молекулой субстрата с одной стороны
мембраны, они перемещаются через мембрану,
чтобы освободиться от молекулы субстрата с
другой стороны. В настоящее время существуют
доказательства в пользу совершенно иного меха-
низма. Молекулы субстрата перемещаются через
специальную структуру — пору с избирательной
способностью. Транспортные белки, форми-
рующие поровую структуру1, называют транс-
локаторами. Для того чтобы понять структуру
и принцип действия таких белков, здесь и далее
рассмотрим в качестве примера работу фос-
фат/триозофосфатного транслокатора хлоро-
пластов— одного из самых распространенных
транспортных белков растений. Этот транс-
портер отвечает за экспорт фотоассимилятов
из хлоропластов, обеспечивая распределение и
взаимообмен фосфатов и триозофосфатов (ди-
гидроксиацетонфосфата или 3-фосфоглицери-
нового альдегида.
Для того чтобы наиболее точно количественно
оценить транспорт субстратов в хлоропласты или
другие клеточные органеллы, используют метод
центрифугирования с фильтрацией через слой
силиконового масла (рис. 1.22). Соответствую-
щий субстрат добавляют в суспензию выделенных
хлоропластов и проводят центрифугирование с
одновременной фильтрацией через слой силико-
нового масла для осаждения хлоропластов из су-
спензии. Затем рассчитывают количество субстра-
та, поглощенного выделенными хлоропластами.
Изучая зависимость скорости поглощения
фосфата хлоропластами от исходных концентра-
ций фосфата в растворе можно получить гипер-
болическую кривую, подобную кривым кине-
тики насыщения для реакций, катализируемых
ферментами (рис. 1.23). При низких концентра-
циях фосфата в среде скорость его поглощения
растет пропорционально росту концентрации.
Однако при высоких концентрациях фосфата
наблюдаемая скорость его поглощения замед-
ляется, и при достижении некоторой величины
максимальной скорости поглощения (Vmax)
кривая выходит на плато. По аналогии с фер-
ментативным катализом, где субстрат (S) связы-
вается с ферментом (Е) с последующим образо-
ванием продукта (Р) и его освобождением:
Е + S ES катализ ЕР Е + Р
процесс переноса субстрата специфическим
белком-транслокатором происходит по сходной
схеме:
S + Т —> ST —> транспорт —> TS —> Т + S
1 Важно отметить, что пора у транслокаторов попеременно
открывается то с одной, то с другой стороны мембраны при
изменении конформации белка. У каналов пора сквозная,
может быть одновременно открыта с обеих сторон (см. да-
лее). — Прим. ред.
1.9. Переносчики-транслокаторы обеспечивают избирательный транспорт продуктов метаболизма... 41
Молекула субстрата взаимодействует со спец-
ифическим участком — сайтом связывания —
белка-транслокатора (Т), транспортируется че-
рез мембрану и освобождается от переносчика.
Максимальная скорость поглощения (Vmax) со-
ответствует состоянию полного насыщения всех
сайтов связывания белков-транслокаторов суб-
стратом. Также по аналогии с ферментативными
реакциями, Км для белков-транслокаторов соот-
ветствует концентрации субстрата, при которой
достигается */2 максимальной скорости поглоще-
ния. Подобно ферментам, белки-транслокаторы
обладают высокой избирательной способностью
(селективностью или специфичностью) по отно-
шению к транспортируемым молекулам субстра-
та. Так, фосфат/триозофосфатный транслокатор
хлоропластов С3 растений (раздел 9.1) может
транспортировать ортофосфат, дигидроксиаце-
тонфосфат (ДГАФ), 3-фосфоглицериновый аль-
дегид (3-ФГА) или 3-фосфоглицерат (3-ФГК),
но не 2-фосфоглицерат. Кроме того, различные
субстраты могут конкурировать между собой
за сайты связывания переносчиков. Например,
фосфат будет конкурирующим ингибитором
транспорта 3-фосфоглицерата. Поскольку фос-
фат/триозофосфатный транслокатор работает
Шпатель
Исследуемый субстрат
О
Суспензия
выделенных
хлоропластов
©° ©
О о
°о°о®
@ @
О О
Супернатант
Центрифугирование

Слой
силиконового
масла
Перхлорная
кислота
Осадок, содержащий
денатурированные
хлоропласты
Рис. 1.22. Метод центрифугирования с использованием фильтрации через
слой силиконового масла: оценка степени поглощения субстрата выделенными
хлоропластами. Для проведения эксперимента на дно центрифужной пробирки
наливают перхлорную кислоту, на которую наслаивают силиконовое масло.
На слой силикона помешают суспензию хлоропластов. В суспензию при
помощи небольшого шпателя добавляют некоторое количество исследуемого
субстрата. Для упрощения идентификации обычно используют соединения с
радиоизотопными метками (32Р или |4С). При скоростном центрифугировании
хлоропласты в течение нескольких секунд проходят через слой силиконового
масла и попадают в перхлорную кислоту, где подвергаются денатурации. Измеряя
радиоактивность осевшей фракции можно рассчитать количество поглощенного
вещества. Не поглощенный хлоропластами субстрат в основном остается в
супернатанте, однако за счет неспецифического переноса через силиконовый
слой (на внешней поверхности пластид или в межмембранном пространстве)
некоторое количество не поглощенного субстрата может также оказаться в
осевшей фракции. Для того, чтобы исключить возможную ошибку, проводят
контрольный эксперименте использованием субстратов (например, сахарозы),
не способных проникнуть через внутреннюю мембрану исследуемых пластид
42
1. Органеллы растительных клеток
Скорость поглощения
Рис. 1.23. Скорость поглощения как функция
концентрации переносимого вещества.
Анализируя ход кривой кинетики поглощения
вещества, можно определить механизм транспорта
субстрата — неспецифическая (пассивная)
диффузия через мембрану (а) или специфический
(селективный) транспорт (б)
а Пинг-понг-механизм
б Параллельный перенос
Рис. 1.24. Две модели транспорта в
режиме анти порта двух молекул субстрата
(А и Б): (а) пинг-понг-механизм: один
белок-транслокатор обеспечивает
последовательный перенос через мембрану
в противоположных направлениях двух
молекул субстрата (А и Б);
(б) параллельный перенос: два связанных
между собой транслокатора одновременно
транспортируют через мембрану в
противоположных направлениях две
молекулы субстрата (А и Б)
1.9. Переносчики-транслокаторы обеспечивают избирательный транспорт продуктов метаболизма... 43
в режиме антипорта, молекулы одного из суб-
стратов (например, фосфата) будут транспорти-
роваться в хлоропласт в обмен на транспорти-
руемые из пластиды молекулы другого субстрата
(дигидроксиацетонфосфата).
На рисунке 1.24 показана схема такого транс-
портного процесса. Фосфат/триозофосфатные
транслокаторы хлоропластов, а также белки-
транслокаторы митохондрий и других компар-
тментов (пластид), как правило, состоят из двух
субъединиц и образуют поровую структуру, дей-
ствующую по принципу воротного механизма.
Субъединицы образуют единый сайт связыва-
ния, который может быть доступен для субстрата
как с внешней, так и с внутренней стороны мем-
браны в зависимости от конформации белка-
транслокатора. Молекула субстрата (А) взаи-
модействует с сайтом связывания на внешней
стороне мембраны, переносится на внутреннюю
сторону за счет обратимых изменений конфор-
мации субъединиц и освобождается. Свободный
сайт связывания связывает молекулу субстата (Б)
и по той же схеме переносит ее на внешнюю сто-
рону мембраны. Активация системы переноса и
изменение конформации белка-транслокатора
происходит только после взаимодействия сай-
та связывания и молекулы субстрата. Подобная
модель транспорта в режиме антипорта получи-
ла название пинг-понг механизма (рис. 1.24я).
В частности, фосфат/триозофосфатные транс-
локаторы хлоропластов работают именно по
этому механизму. Кроме того, существует модель
параллельного (одновременного) антипорта двух
субстратов — параллельный (одновременный)
перенос (рис. 1.246). В соответствии с этой схе-
мой два транслокатора связаны между собой та-
ким образом, что изменение конформации про-
исходит только в том случае, когда одновременно
оба сайта связывания заняты (или не заняты)
молекулами транспортируемого субстрата. По
такому механизму действуют митохондриальные
белки-транслокаторы.
Все белки-транслокаторы имеют
сходное строение
Транслокаторы — это интегральные мембран-
ные белки. Они погружены в липидый бислой
мембраны и имеют вид а-спиралей с гидро-
фобными боковыми радикалами, состоящими
из гидрофобных аминокислот: аланина, вали-
на, лейцина, изолейцина или фенилаланина.
Благодаря высокой гидрофобности мембран-
ные интегральные белки не растворимы в воде.
Для выделения таких белков применяют мягкие
неионогенные детергенты, например— октил-
гликозид (рис. 1.25). Гидрофобные участки белка
связываются гидрофобными остатками октанола
детергента, и за счет свободных глюкозных остат-
ков образующийся агрегат (мицелла) становится
водорастворимым. При удалении детергента вы-
деленные белковые агрегаты склеиваются и пре-
вращаются в нерастворимую вязкую массу.
При помощи этой методики был выделен це-
лый ряд транспортных белков-транслокаторов,
что позволило проанализировать их амино-
кислотную последовательность. По результа-
там анализа гидрофобности аминокислотных
остатков в пептиде можно предсказать, какие
именно участки белковой цепочки будут обра-
зовывать трансмембранные спирали (hydropathy
analysis). Так, в частности, было выявлено, что
в активном (функциональном) состоянии фос-
фат/триозофосфатный транслокатор хлоропла-
стов состоит из двух идентичных субъединиц,
каждая из которых сформирована пептидом
из 324 аминокислотных остатков. Этот пептид
образует 6 трансмембранных спиралей (рис.
1.26) длиной около 6 нм (что приблизительно
равно толщине мембраны), каждая из кото-
рых содержит по 20 аминокислотных остатков.
Сравнение результатов сиквенса аминокислот-
ных последовательностей различных белков-
транспортеров показало, что практически все
белки-транслокаторы бактерий, растительных
и животных клеток имеют сходное строение
Н2СОН
Рис. 1.25. Октилгликозид — гликозид,
состоящий из остатков а-D-глюкозы и
октилового спирта (октанола). Мягкий
неионогенный детергент, позволяющий
выделять мембранные белки без
нарушения структуры (без денатурации)
н/н
н6\он
/ОК /ОК /ОК
о-сн2	сн2 сн2 сн2
н он
Октилгликозид
СК
44
1. Органеллы растительных клеток
Рис. 1.26. Фосфат/триозофосфатный транслокатор шпината образует
6 трансмембранных спиралей. Аминокислоты условно обозначены кругами.
Схема расположения трансмембранных спиралей была получена при анализе
гидрофобности отдельных аминокислотных остатков. Отмеченные знаком «+»
аминокислоты, несушие положительный заряд (спираль 5) — это аргинин и лизин.
Возможно, эти аминокислотные остатки образуют анионные сайты связывания
фосфата и триозофосфата (по данным Fliigge et al., 1989)
и состоят либо из димера, где каждый мономер
образует по 6 трансмембранных спиралей, либо
из мономера, образующего 12 трансмембранных
спиралей. Совсем недавно при помощи рентге-
ноструктурного анализа (см. описание метода
в разделе 3.3) была получена модель трехмер-
ной структуры митохондриального АТФ/АДФ-
транслокатора, мономер которого формирует
поровую структуру, также состоящую из 6 транс-
мембранных спиралей.
Аквапорины облегчают транспорт воды
через мембрану
Сравнивая осмотическое поведение различных
клеток и клеточных органелл, можно сделать
вывод, что их мембраны значительно отлича-
ются по водопроницаемости. Водопроницае-
мость самого липидного бислоя достаточно
низкая. В 2003 г. Петер Агре из Университета
Джона Хопкинса в Балтиморе был удостоен
Нобелевской премии по химии за выделение
и идентификацию в эритроцитах и клетках
почечной ткани специфических мембранных
белков — аквапоринов. Он открыл, что эти
белки формируют каналы облегченного по-
ступления воды через клеточные мембраны.
Позже аквапорины были обнаружены также
и в растительных клетках, в основном в плаз-
малемме и в тонопласте. Следует подчеркнуть,
что именно эти мембранные структуры играют
главную роль в регуляции водного обмена рас-
тительной клетки.
1.9. Переносчики-транслокаторы обеспечивают избирательный транспорт продуктов метаболизма... 45
Растительная клетка может содержать множе-
ство изоформ белков-аквапоринов. Например, у
Arabidopsis thaliana (раздел 20.1) было идентифи-
цировано около 30 различных генов, кодирующих
белки аквапоринов. Контроль за изменением водо-
проницаемости мембран растительной клетки осу-
ществляется за счет регуляции экспрессии генов, а
также за счет регуляции транспортной активности
аквапоринов в мембранах (механизм не ясен до сих
пор)1. Такая система позволяет растительному ор-
ганизму эффективно приспосабливаться к измене-
ниям условий окружающей среды.
Рентгеноструктурный анализ и электронная
криомикроскопия показали, что полипептид-
ная цепочка каждой субъединицы аквапорина
также образует 6 трансмембранных а-спиралей
(раздел 3.3). В мембране 4 субъединицы аква-
порина объединены в тетрамерную структуру,
где каждый мономер формирует узкий канал,
способный транспортировать от 109 до 10й мо-
лекул воды в секунду. Каждый водный канал
содержит сайты связывания для 4 молекул воды
и действует как гидрофобная пора, где сай-
ты связывания выполняют роль селективного
фильтра для специфического водного транспор-
та. Предполагается, что по ряду энергетических
причин эти водные каналы практически непро-
ницаемы для протонов. Кроме того, недавно по-
лучены данные о том, что аквапорины плазма-
леммы табака помимо молекул воды могут также
транспортировать СО2. Возможно, аквапорины
играют роль дополнительных транспортеров-
переносчиков СО2 в растениях.
Интересно отметить, что термин аквапорин
не совсем удачен, поскольку строение аквапори-
нов значительно отличается от структуры белков-
поринов, речь о которых пойдет в разделе 1.11.
Аквапорины, также как и белки-транслокаторы
и ионные каналы, формируют трансмембранные
спиралевидные структуры, тогда как порины об-
разуют р-складчатые структуры.
1.10. Высокая пропускная
способность ионных каналов
Пропускная способность упомянутого выше
фосфат/триозофосфатного транслокатора хло-
1 Показано, что проницаемость аквапоринов регулируется
путём фосфорицирования. — Прим. ред.
ропластов составляет около 80 с1 при 25 °C. Это
означает, что данный белок-транслокатор спо-
собен транспортировать 80 молекул субстрата в
секунду. Пропускная способность других транс-
локаторов может варьировать в интервале от 10
до 1000 с1. Однако клеточные мембраны содер-
жат также группы белковых комплексов — ион-
ные каналы, — которые способны распозна-
вать и достаточно селективно транспортировать
различные ионы с гораздо большей скоростью,
чем транслокаторы (106—108 ионов в секунду).
Ионный канал представляет собой специаль-
ную структуру — пору, которая в отличие от
транслокаторов может быть открыта одновре-
менно с обеих сторон клеточной мембраны.
Интенсивность перемещения ионов по каналу
настолько высока, что позволяет определять
пропускную способность одиночного ионного
канала путем измерения проводимости тока.
Такая методика регистрации ионного транс-
порта была впервые разработана немецкими
учеными Эрвином Нейером и Бертом Сакманом
и получила название пэтч-кламп метода (patch-
clamp). За это открытие в 1991 г. Э. Нейеру и
Б. Сакману была присуждена Нобелевская пре-
мия по медицине и физиологии. Для проведения
эксперимента необходима стеклянная пипетка
со встроенным микроэлектродом, заполненная
электролитом (см. рис. 1.27). При определенных
условиях может формироваться плотный кон-
такт между кончиком пипетки (диаметром око-
ло 1 мкм) и исследуемым участком клеточной
мембраны. Количество ионов, транспортируе-
мых через изолированный участок мембраны в
единицу времени, можно оценить, регистрируя
ионные токи [обозначают как проводимость в
Сименсах (S)]. На рисунке 1.28 в качестве при-
мера представлены результаты измерения токов
через одиночные ионные каналы плазмалеммы
замыкающих клеток устьиц бобовых. По изме-
нению величины электрического тока можно
определить периоды открытия и закрытия кана-
ла. Такая способность обратимо переходить из
открытого (активного, проводящего) состояния
в закрытое (неактивное, непроницаемое) явля-
ется особенностью функционирования ионных
каналов. Проводимость различных каналов в
открытом состоянии варьирует от нескольких
pS до нескольких сотен pS, а периоды открытия
и закрытия могут длиться от нескольких милли-
46
1. Органеллы растительных клеток
4 Электролит
\	/ Наконечник пипетки
Протопласт	Схема для
Измерение для целой клетки
в условиях плотного контакта,
внешняя часть мембраны
обращена наружу
Измерение ионных токов
на изолированном участке
мембраны, внешняя поверхность
которой обращена внутрь пипетки
Рис. 1.27. Способы измерения ионных токов пэтч-кламп методом.
Стеклянная пипетка с диаметром кончика около I мкм содержит встроенный
микроэлектрод и заполнена электролитом. При создании небольшого разряжения
внутри пипетки создается плотный контакт между кончиком пипетки и фрагментом
исследуемой мембраны протопласта или клеточной органеллы (например, вакуоли).
При увеличении отрицательного давления мембранный фрагмент под пипеткой
разрушается и между микроэлектродом и клеточным содержимым устанавливается
изолированный от внешней среды прямой проводящий путь. Таким образом можно
измерить токи для всех ионных каналов в мембране (измерение для целой клетки в
условиях плотного контакта, внешняя часть мембраны обращена наружу). Еще один
вариант — измерение ионных токов на изолированном участке мембраны, внешняя
поверхность которой обращена внутрь пипетки. Поскольку контакт мембраны со
стеклом механически очень прочен, находящийся под кончиком пипетки фрагмент
можно вырвать из целой мембраны и изолировать. В этом случае можно измерить
проводимость только для тех каналов, которые находятся в изолированном
фрагменте
секунд до нескольких секунд в зависимости от
типа канала. Очевидно, что пропускная способ-
ность ионного канала в единицу времени будет
зависеть от проводимости канала в открытом
состоянии, а также от продолжительности ак-
тивного (открытого) периода.
Ионные каналы различают по селективности
к различным ионам (ионной специфичности).
Мембраны растительных клеток содержат высо-
коспецифичные катионные каналы для транс-
порта К+, Н+ и Са2+, а также высокоспецифич-
ные анионные каналы для СГ и дикарбоновых
кислот (например, малата). В отличие от живот-
ных клеток специфичные Na+-каналы в расте-
ниях пока не обнаружены. Поскольку открытие
и закрытие большинства ионных каналов, как
правило, стимулируется мембранным потен-
циалом, мембранные структуры играют важную
роль в регуляции ионных потоков. Так, напри-
мер, в замыкающих клетках устьиц (раздел 8.1)
1.10. Высокая пропускная способность каналов
47
400 мс
Канал
открыт
Канал
закрыт
Рис. 1.28. Результаты измерений токов через одиночный К+-выходной канал
изолированного фрагмента плазмалеммы замыкающих клеток устьиц Vicia faba
(концентрация К+ во внешней среде 50 мМ, в цитоплазме 200 мМ, напряжение
+35 мВ) (данные проф. G. Thiel, Дармштадт)
гиперполяризация плазмалеммы (>—100 мВ)
активирует каналы, обеспечивающие приток
ионов калия в клетку (К+-входные каналы),
тогда как деполяризация открывает каналы, по
которым идет отток ионов калия из внутрикле-
точного пространства (К+-выходные каналы).
Открытие ионных каналов может также регули-
роваться Са2+-ионами, протонами или фосфо-
рилированием полипептидов, формирующих
канал. Такая система позволяет контролировать
активность каналов при помощи сигнальных
молекул и продуктов различных метаболиче-
ских процессов (глава 19).
В настоящее время уже выяснены амино-
кислотные последовательности полипептидов
многих ионных каналов. Интересно, что одно-
типные каналы имеют очень близкое строение
(например, К+-каналы животных и раститель-
ных клеток, а также бактерий). Родерику Мак-
Киннону с коллегами (Университет Рокфеллера,
Нью-Йорк) при помощи рентгеноструктурного
анализа удалось воссоздать трехмерную струк-
туру К+-канала бактерии Streptomyces lividans
(раздел 3.3). Это открытие, за которое Р. Мак-
Киннон был награжден Нобелевской премией
по химии в 2003 г., позволило впервые предста-
вить молекулярный механизм работы ионных
каналов. Долгое время считалось, что структура
ионного канала сформирована двумя идентич-
ными белковыми субъединицами, каждая из
которых состоит их двух трансмембранных спи-
ралей, соединенных петлей из 30 аминокис-
лотных остатков (рис. 1.29я). Также было из-
вестно, что эта петлеобразная структура отвечает
за ионную селективность канала. Проведенный
структурный анализ показал, что в реальности
К+-канал представляет собой тетрамер из 4 та-
ких белковых комплексов (рис. 1.29 6, в). Одна
из спиралей (наружная) каждой субъединицы
контактирует с липидным бислоем, другая (вну-
тренняя) — выстилает внутреннюю поверхность
ионного канала (поры). Внутренняя полость
поры заполнена водой и отделена от внешне-
го пространства так называемым селективным
фильтром, который образован пептидными пет-
лями четырех субъединиц (см. выше). Это самая
узкая часть канала, и для проникновения через
поровое отверстие ионы К+ подвергаются деги-
дратации на одном из участков поры. На этом
участке присутствует кольцеобразная область из
атомов кислорода, которые замещают молекулы
воды, разрушая гидратную оболочку ионов, и
образуют комплексы с ионами К+, компенсируя
затраты энергии на дегидратацию. Пора в цен-
тре канала также несет множество фиксирован-
ных отрицательных зарядов и имеет множество
сайтов связывания для катионов. Входящие че-
рез устье поры ионы К+ облегчают вытеснение
дегидратированных ионов на другую сторону
фильтра за счет электростатического отталки-
вания. Такое строение селективного фильтра
определяет специфичность К+-канала и препят-
ствует транспорту остальных ионов, например,
Na+, которые слишком малы для того, чтобы об-
разовать комплекс и «освободиться» от гидрат-
ной оболочки. Следует отметить, что формиро-
вание селективных фильтров петлеобразными
пептидными фрагментами, соединяющими
трансмембранные спирали, характерно для всех
К+-каналов микроорганизмов, животных и рас-
тительных клеток. Исследования К+1каналов
растений показали, что К+-избирательность
селективных фильтров обусловлена наличием
в четырех «петлях» глициновых остатков. Сход-
ные результаты были получены при изучении
трехмерной структуры хлоридных каналов бак-
48
1. Органеллы растительных клеток
1.11. Для белков-поринов характерна [^складчатая структура
49
терий Salmonella и Е. coll (Cl-каналы относят к
семейству анионных каналов прокариот и эука-
риот). Эти каналы также сформированы транс-
мембранными а-спиралями, которые связаны
между собой пептидными петлями, образующи-
ми селективный фильтр и связывающими хло-
ридный анион за счет электростатического взаи-
модействия. Вполне вероятно, что приведенная
выше модель работы К+-канала Streptomyces яв-
ляется общей для всех ионных каналов.
В структуре ионных каналов и транслокато-
ров есть определенное сходство. Исследования
показывают, что при помощи определенных
химических реакций можно превратить транс-
локатор (например, фосфат/триозофосфатный
транслокатор хлоропластов) в канал, открытый
одновременно по обе стороны мембраны, и
его транспортная способность будет аналогич-
ной проводимости ионных каналов. Основное
функциональное отличие транслокаторов от
ионных каналов заключается в том, что цен-
тры связывания транслокатора могут быть до-
ступны для субстрата только с одной из сторон
мембраны, а сам транспорт осуществляется за
счет конформационных изменений белковых
субъединиц, тогда как заполненная водой пора
открытого ионного канала может быть открыта
с обеих сторон мембраны. Такая разница в ме-
ханизме действия обусловлена особенностями
строения полипептидных цепочек.
1.11. Для белков-поринов
характерна [3-складчатая
структура
Как уже было отмечено, благодаря присутствию
порообразующих белков — поринов — внеш-
ние мембраны митохондрий и хлоропластов об-
ладают неспецифической проницаемостью по
отношению к некоторым клеточным метаболи-
там, в частности — к нуклеотидам и фосфатам
сахаров.
Разработана методика по определению раз-
меров поры и пропускной способности пори-
нов с применением искусственной мембраны,
основанная на фиксации изменений величины
тока в системе (рис. 1.30). Две емкости, запол-
ненные электролитом, разделяют перегородкой
с небольшим отверстием. На отверстие наносят
некоторое количество мембранных липидов,
которые образуют двойной слой и формируют
искусственную мембрану. Растворенные в де-
тергенте мембранные белки-порины добавля-
ют в электролит одной из емкостей. Благодаря
своей гидрофобности, молекулы полипептидов
постепенно встраиваются в липидный бислой
с образованием новых пор, что отражается на
проводимости системы. Каждый «скачок» в
увеличении проводимости тока соответствует
проводимости единичной поры. При помощи
этого метода было установлено, что для пори-
4 Рис. 1.29. Модель структуры К+-канала бактерии Streptomyces lividans\
(а)	предполагаемая укладка полипептида одной из субъединиц К+-канала в мембране.
Два трансмембранных спиральных сегмента соединены между собой при помощи
«порового» петлевидного фрагмента пептида. В составе петли есть еще одна спираль,
которая, тем не менее, не выступает за пределы мембраны в нативной конформации;
(б)	двойное стереоизображение К+-канала — вид сверху (с внешней стороны
мембраны). К+-канал представляет собой тетрамер из 4 белковых субъединиц
(обозначены черным и серым цветом). Одна из спиралей (наружная) каждой
субъединицы контактирует с липидным бислоем, другая (внутренняя) — выстилает
внутреннюю поверхность ионного канала (поры). Черный шарик в центре поры —
ион К+;
(в)	двойное стереоизображение К+-канала — вид сбоку. Восемь трансмембранных
спиралей и петлевидные фрагменты формируют канал с селективным фильтром (по
результатам рентгеноструктурного анализа, Doyle et al., 1998).
Как увидеть объемную картинку: вы смотрите на изображение, но глаза сфокусированы
не на самой картинке, а на точке, расположенной позади рисунка. Например, подойдите
к окну и сфокусируйте взгляд на какой-либо удаленной точке. Не меняя фокусировки,
быстро поместите перед глазами картинку. Вы увидите три изображения вместо двух и
центральное будет иметь стереоэффект
50
1. Органеллы растительных клеток
Измерение
величины тока
о
Встраивание поринов
в мембрану
I
I
1 Проводимость
? единичной
J поры
Время
Рис. 1.30. Определение пропускной способности поринов.
Две ёмкости, заполненные электролитом и содержащие встроенные электроды,
разделены перегородкой с небольшим отверстием. На отверстие наносят некоторое
количество мембранных липидов, которые образуют двойной слой и формируют
искусственную мембрану. Растворенные в детергенте мембранные белки поринов
добавляют в электролит одной из емкостей. Благодаря своей гидрофобности,
молекулы полипептидов постепенно встраиваются в липидный бислой с
образованием новых пор, что отражается на проводимости системы. Каждый
«скачок» в увеличении проводимости тока соответствует проводимости единичной
поры
Рис. 1.31. Если пептид принимает конформацию
P-слоя (складчатая структура), радикалы
аминокислот располагаются сверху и снизу
относительно поверхности слоя
1.11. Для белков-пори нов характерна ^складчатая структура
51
б
p-слой порина
Рис. 1.32. Схема строения мембранной поры, образованной поринами:
(а) вид сверху;
(6) строение поры в продольном разрезе. 16 p-слоев молекул поринов, каждый из
которых состоит из 13 аминокислот, формируют пору в мембране. Аминокислотные
остатки, обращенные к мембранной стороне поры, обладают гидрофобными
свойствами, а те, которые обращены к водной фазе в центре поры, гидрофильны
р-слой порина
нов внешней мембраны митохондрий диаметр
пор в среднем составляет 1,7 нм, а для хлоропла-
стов — 3 нм.
Порины впервые были выделены из наруж-
ных мембран грамотрицательных бактерий
Escherichia coli. В настоящее время известно
несколько типов поринов, отличающихся по
своим свойствам. Чаще всего порины образуют
неспецифические диффузионные поры, кото-
рые представляют собой цилиндрические на-
полненные водой каналы. Порины этого типа
сформированы субъединицами с молекуляр-
52
1. Органеллы растительных клеток
ной массой около 30 кДа. В мембранах они су-
ществуют в виде тримеров, где каждый из трех
идентичных мономеров формирует отдельную
пору. В отличие от транслокаторов порины
не способны образовывать трансмембранные
а-спирали, поскольку в полипептидах поринов
отсутствуют ответственные за формирование
подобных структур сплошные гидрофобные об-
ласти, образованные аминокислотными после-
довательностями. При помощи рентгенострук-
турного анализа (раздел 3.8) было установлено,
что диффузионные поры в бактериальных пори-
нах представляют собой цилиндрические обра-
зования из 16 р-складчатых структур (тяжей),
связанных водородными связями (рис. 1.31).
Каждая такая структура, как правило, состоит
из 13 чередующихся гидрофильных и гидро-
фобных аминокислотных остатков (рис. 1.32б/).
Гидрофобные остатки располагаются с одной
стороны p-слоя и контактируют с липидной фа-
зой мембраны, тогда как гидрофильные остат-
ки расположены с противоположной стороны
P-слоя и формируют в наполненный водой по-
ровый канал (рис. 1.326). В целом строение по-
ринов напоминает бочку, где p-слои выполняют
роль отдельных досок (планок). По сравнению с
ионными каналами, порины имеют более эко-
номичную структуру — молекулярная масса
белковой молекулы порина в два раза меньше,
чем у пептидов ионных каналов, однако при
этом она формирует транспортный канал гораз-
до большего размера.
Еще один тип поринов — порины, образую-
щие селективные поры и содержащие сайты
связывания для различных ионов и неионоген-
ных молекул (например, углеводов). Пример
поринов такого типа — порины Escherichia coli
для транспорта мальтодекстринов. Они так-
же состоят из 16 р-складчатых структур, сайты
связывания мальтодекстрина расположены на
соединяющих р-тяжи участках полипептидной
цепи белка, так называемых петлях, погружен-
ных в полость поры.
Аналогичную р-складчатую структуру име-
ют и митохондриальные порины. Изучение
свойств митохондриальных поринов при помо-
щи искусственных мембран (см. рис. 1.30) пока-
зало, что в открытом состоянии их поры имеют
анионную специфичность, однако воздействие
слабого напряжения порядка 30 мВ приводит
к сужению (закрытию) канала, и порин прояв-
ляет чувствительность к катионам. Благодаря
этой особенности митохондриальные порины
получили название селективных потенциал-
зависимых анионных каналов (voltage-dependent
anion selective channel — VDAC). Физиологиче-
ские функции такой регуляции открытия и за-
крытия пор пока остаются под вопросом.
Во внешней мембране оболочки хлороплас-
тов был обнаружен порин с молекулярной мас-
сой 24 кДа (outer envelope protein — ОЕР24),
образующий неспецифичную диффузионную
пору. Его свойства весьма сходны со свойства-
ми VDAC, несмотря на отсутствие гомологии
последовательностей. В открытом состоянии
ОЕР24 способен пропускать различные метабо-
литы.
Кроме того, внешняя мембрана оболочки
хлоропластов содержит также порин с молеку-
лярной массой 21 кДа (ОЕР21), который фор-
мирует селективный анионный канал, специали-
зирующийся на транспорте фосфорилированных
метаболитов (например, 3-фосфоглицерата или
дигидроксиацетонфосфата). Переключение это-
го канала регулируется процессами связывания
и освобождения субстратов. До сих пор не ясно,
зависит ли поток метаболитов через внешнюю
мембрану оболочки хлоропластов от работы
ОЕР24 и ОЕР21, и в какой степени.
Еще один порообразующий белок локализо-
ван в мембране пероксисом (раздел 7.4).
Дополнительная дитература
Aaziz, R., Dinant, S., Epel, В. L. Plasmodesmata and
plant cytoskeleton. Trends Plant Sci 6, 326—330 (2001).
Benz, R. Permeation of hydrophilic solutes through
mitochondrial porins. Biochim Biophys Acta 1197,
167-196(1994).
Blatt, M. R. Plant potassium channels double up. Trends
Plant Sci 2, 244-246 (1997).
Cavalier-Smith, T. Membrane heredity and early
chloroplast evolution. Trends Plant Sci 5, 174—182
(2000).
Choi, D., Lee, Yi., Cho, H.-Т., Kende, H. Regulation
of expansin gene expression affects growth and
development in transgenic rice plants. Plant Cell 15,
1386-1398 (2003).
Doyle, D. A., Cabrai, J. M., Pfuetzner, R. A., Kuo, A.,
Gulbis, J. M., Cohen, S. L., Chait, В. T., MacKinnon,
R. The structure of the potassium channel: Molecular
Дополнительная литература
53
basis of К+ conduction and selectivity. Science 280,
69-77(1998).
Dutzler, R., Campbell, E. B., Cadene, M., Chait, В. T.,
MacKinnon, R. Xray structure of a CIC chloride channel
at 3.0 A reveals the molecular basis of anion selectivity.
Nature 415, 287-294 (2002).
Fliigge, U.-L, Fischer, K., Gross, A., Sebald, W.,
Lottspeich, F., Eckerskorn, C. The triose phosphate-3-
phosphoglycerate-phosphate translocator from spinach
chloroplasts: Nucleotide sequence of a full-length cDNA
cloneand import of the in vitro synthesized precursor
protein into chloroplasts. EM BO J 8, 39—46 (1989).
Fliigge, U.-L Transport in and out of plastids: Does the
outer envelope membrane control the flow? Trends
Plant Sci 5, 135-137 (2000).
Fliigge, U.-l. Phosphate translocators in plastids. Annu
Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50, 27—45 (1999).
Frandsen, G. I., Mundy, J., Tzen, J. T. C. Oil bodies
and their associated proteins, oleosins and caleosin.
Physiologia Plantarum 112, 301—307 (2001).
Gunning, D. E. S., Steer, M.W. Ultrastructure and the
biology of plant cells. Edward Arnold, London (1975).
Jackson, D. Opening up the communication channels:
Recent insights into plasmodesmal function. Curr Opin
Plant Biol 3, 394-399 (2000).
Kjellbom, P., Larsson, C., Johansson, L, Karlsson, M.,
Johanson, U. Aquaporins and water homeostasis in
plants. Trends Plant Sci 4, 308—314 (1999).
Kramer, R. Functional principles of solute transport
systems: Concepts and perspectives. Biochim Biophys
Acta 1185, 1-34(1994).
Kuo, A., Gulbis, J. M., Antcliff, J. F., Rahman, T.,
Lowe, E. D., Zimmer, J., Cuthbertson, J., Ashc-
roft, F. M., Ezaki, T., Doyle, D. A. Crystal structure
of the potassium channel KirBacl.l in the closed state.
Science 300, 1922-1926 (2003).
Li, X., Franceschi, V. R., Okita, T. W. Segregation of
storage protein mRNAs on the rough endoplasmatic
reticulum membranes of rice endosperm cells. Cell 72,
869-879 (2001).
Lucas, W. J., Wolf, S. Connections between virus
movement, macromolecular signaling and assimilate
allocation. Curr Opin Plant Biol 2, 192—197 (1999).
Maathius, F. J. M., Ichida, A. M., Sanders, D., Schroeder,
J. I. Roles of higher plant K+ channels. Plant Physiol
114, 1141-1149(1997).
Maeser, P., Hosoo, Y., Goshima, S., Horie, T.,
Eckelman, B., Yamada, K., Yoshida, K., Bakker, E. P.,
Shinmyo, A., Oiki, S., Schroeder J. L, Uozumi N.
Glycine residues in potassium channel-like selectivity
filters determine potassium selectivity in four-loop-per-
subunit HKT transporters from plants. Proc Natl Acad
Sci USA 99, 6428-6433 (2002).
Moreira, D., Le Guyader, H., Philippe, H. The origin of
red algae and the evolution of chloroplasts, Nature 405,
69-72 (2000).
Murata, K., Mitsuoka, K., Hirai, T., Walz, T., Agre, P.,
Heymann, J. B., Engel, A., Fujiyoshi, Y. Structural
determinants of water permeation through aquaporin-1.
Nature 407, 599-605, (2000).
Murphy, D. J., Herandez-Pinzon, L, Patel, K. Role of
lipid body proteins in seeds and other tissues. J Plant
Physiol 158,471-478 (2001).
Nebenfuhr, A., Staehelin, L. A. Mobile factories: Golgi
dynamics in plant cells. Trends Plant Sci 6, 160—167
(2001).
Overall, R. L., Blackman, L. M. A model on the
macromolecular structure of plasmodesmata. Trends
Plant Sci 307-311 (1996).
Pebay-Peyroula, E., Dahout-Gonzalez, C., Kahn, R.,
Trezeguet, V., Lauquin, G.-J.-M., Brandolin, G.
Structure of mitochondrial ATP/ADP carrier in complex
with carboxyatractyloside. Nature 426, 39—44 (2003),
Pennell, R. Cell walls: Structures and signals. Curr Opin
Plant Biol 1,504-510(1998).
Pohlmeyer, K., Soil, J., Grimm, R., Hill, K.,Wagner, R.
A high-conductance solute channel in the chloroplastic
outer envelope from pea. Plant Cell 10, 1207—1216
(1998).
Reiter, W. D. The molecular analysis of cell wall
components. Trends Plant Sci 3, 27—32 (1998).
Robinson, D. G. Plant membranes. John Wiley and Sons,
New York (1985).
Robinson, D. G. ed. The Golgi apparatus and the plant
secretory pathway. Blackwell, Oxford, UK (2003).
Santoni, V., Gerbeau, P., Javot, H., Maurel, C. The high
diversity of aquaporins reveals novel facets of plant
membrane functions. Curr Opin Plant Biol 3, 476—481
(2000).
Sul, H., Han, B.-G., Lee, J. K., Wallan, P., Jap, В. K.
Structural basis of water-specific transport through the
AQP1 water channel. Nature 414, 872—878 (2001).
Tanner, W, Carpari, T. Membrane transport carriers.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47, 595—626
(1996).
Uehlein, N., Lovisolo, C., Siefritz, F., Kaldenhoff, R.
The tobacco aquaporin NtAQPl is a membrane CO2
pore with physiological functions. Nature 425, 734—737
(2003).
54
1. Органеллы растительных клеток
Very, A.-A., Sentenac, Н. Molecular mechanism and
regulation of K+ transport in higher plants. Annu Rev
Plant Biol 54, 575-602 (2002).
Wandelt, С. I., Kahn, M. R. I., Craig, S., Schroeder, H. E.,
Spencer, D. E., Higgins, T. J. V. Vicilin with carboxy-
terminal KDEL is retained in the endoplasmatic
reticulum and accumulates to high levels in leaves of
transgenic plants. Plant J 2, 181 — 192(1992).
Ward, J. M. Patch-clamping and other molecular
approaches for the study of plasma membrane
transporters demystified. Plant Physiol 114, 1151 — 1159
(1997).
Winter, H., Robinson, D. G., Heldt, H.W. Subcellular
volumes and metabolite concentrations in spinach
leaves. Planta 193, 530-535 (1994).
Zhou, Y., Morais-Cabral, J. H., Kaufmann, A.,
MacKinnon, R. Chemistry of ion coordination and
hydration revealed by a K+ channel-Fab complex at 2.0
A resolution. Nature 414, 4348 (2001).
Использование энергии солнечного света
в процессе фотосинтеза - основа
жизни на Земле
Растения и цианобактерии поглощают сол-
нечный свет и используют его энергию для
синтеза органических соединений из неоргани-
ческих молекул и ионов, таких, как СО2, нитрат
и сульфат. Эти организмы относятся к фото-
автотрофам. Образующиеся соединения могут
использоваться для синтеза различных клеточ-
ных компонентов. В процессе фотосинтеза при
использовании энергии фотонов происходит
окисление воды с образованием кислорода и
водорода, который, в конце концов, оказывает-
(СН2О)п + пО2
Углеводы
Гетеротрофные
организмы,
в т.ч. животные
ся связанным в молекуле НАДФН1. Этот про-
цесс называют световой стадией фотосинтеза.
Преобразование энергии фотонов происходит в
реакционных центрах фотосистем, встроенных
в тилакоидную мембрану. В дальнейшем про-
исходит транспорт электронов, сопряженный
с синтезом АТФ. НАДФН и АТФ расходуют-
ся в так называемых темновых реакциях для
синтеза углеводов из СО2 (рис. 2.1). В результа-
те фотосинтеза растений и цианобактерий на
Земле образовались органические вещества, в
том числе запасы нефти и газа, а также атмос-
ферный кислород. Жизнь животных зависит от
поступления углеводов и других органических
веществ с пищей, поэтому их относят к гете-
ротрофам. Энергию, необходимую для жизне-
деятельности, они получают путем окисления
органических веществ, синтезированных рас-
тениями, при этом потребляя кислород и выде-
ляя углекислый газ. Следовательно, солнечный
свет, использованный растениями, служит так-
же источником энергии для жизненных процес-
сов в организмах животных.
2.1. Как возник фотосинтез?
При изучении радиоизотопного состава древ-
нейших пород было установлено, что планета
Земля образовалась около 4,6 млрд лет назад.
Наиболее ранние свидетельства жизни — это
остатки бактериоподобных структур, возраст
которых примерно 3,5 млрд лет. Когда на Земле
появилась первая жизнь, в атмосфере не было
кислорода. Этот вывод был сделан на основа-
нии того, что в очень древних осадочных по-
Рис. 2.1. Жизнь на Земле связана с циклом СО2
1 На самом деле в результате окисления воды образуются
кислород, протоны и электроны, которые восстанавливают
НАДФ+ до НАДФН. — Прим. ред.
56
2. Использование энергии солнечного света в процессе фотосинтеза — основа жизни на Земле
родах железо присутствует в форме Fe2+. В при-
сутствие кислорода железо в составе минералов
окисляется1. По современным представлениям,
изначально атмосфера Земли содержала угле-
кислый газ, молекулярный водород, метан, ам-
моний, синильную кислоту и пары воды.
В 1922 г. русский ученый Александр Опарин
предложил интересную гипотезу о самопроиз-
вольном синтезе органических веществ в ат-
мосфере ранней Земли за счет энергии ультра-
фиолетового излучения (защитного озонового
слоя тогда не было), электрических разрядов
(молнии), а также тепловой энергии вулкани-
ческих извержений. Он предположил, что орга-
нические вещества постепенно накапливались
в первичном океане и затем стали компонента-
ми первых форм жизни. В 1953 г. американские
ученые Стэнли Миллер и Гарольд Юри под-
твердили гипотезу Опарина, осуществив «пред-
жизненный» синтез органических веществ. Они
воссоздали состав первичной атмосферы Земли,
смешав Н2О, СН4, NH3 и Н2, и пропускали че-
рез эту смесь электрические разряды при 80 °C
в течение недели. В результате эксперимента
были синтезированы аминокислоты, такие, как
глицин и аланин, а также другие органические
кислоты: муравьиная, уксусная, молочная и ян-
тарная. Другие экспериментаторы добавляли
в газовую смесь дополнительные компоненты,
такие, как СО, HCN и формальдегид, и в этих
работах были получены данные о том, что мно-
гие компоненты живых клеток (например, угле-
воды, жирные кислоты, тетрапирролы, а также
азотистые основания аденин, гуанин, цитозин и
урацил) могут самопроизвольно образовывать-
ся в «первичной атмосфере» при участии элек-
трической или тепловой энергии.
Предполагают, что органические вещества,
образованные таким образом, т. е. абиотиче-
ски, накапливались в древних морях, озерах
и лужах задолго до появления первой жизни.
В отсутствие атмосферного кислорода и живых
организмов органически вещества не окисля-
лись и не разлагались. Опарин говорил об оке-
1 Геохимические данные изложены не совсем верно. В при-
сутствие кислорода Fe2+ окисляется до Fe3+. Гидроксид же-
леза (III) малорастворим, поэтому усиливается образование
осадочных пород, содержащих железо. При дальнейшей ме-
таморфизации степень окисления железа в минералах может
вновь становиться равной +2. — Прим. ред. .
ане того времени как о «первичном бульоне»,
в котором накапливался материал для возник-
новения жизни. Поскольку в то время на Зем-
ле не было кислорода, первые организмы были
анаэробами.
В настоящее время считается, что первые
организмы на Земле по типу энергетического
метаболизма относились к хемолитотрофам.
Например, они могли получать энергию за счет
реакции
FeS + H2S -> FeS2 + Н2 (AG° = - 42 кДж/моль)
Вполне возможно, что уже на самой ранней
ступени эволюции катализ этой реакции был
сопряжен с генерацией на клеточной мембра-
не протон-движущей силы (раздел 4.1), кото-
рая обеспечивала энергией синтез АТФ с уча-
стием примитивного варианта АТФ-синтазы
(раздел 4.3). За счет этой реакции могут синте-
зировать АТФ архебактерии (археи) — ныне
живущие организмы, способные существовать
в анаэробных условиях при экстремальных
температурах (например, вблизи горячих ис-
точников на дне океана). В настоящий момент
архебактерии рассматриваются как ближайшие
родственники первых организмов. Вероятно,
способность использовать энергию солнечного
света для синтеза органических молекул появи-
лась достаточно рано, и ее появление стало на-
стоящим прорывом в эволюции жизни на Зем-
ле. Пурпурные бактерии и зеленые серные
бактерии, широко распространенные в настоя-
щее время, рассматривают как реликты раннего
этапа эволюции фотосинтеза.
Прежде чем перейти к рассмотрению про-
цесса фотосинтеза в главе 3, мы обсудим, как
растения улавливают свет и как световая энер-
гия передается в фотосинтетическом аппарате.
2.2. Пигменты поглощают энергию
солнечного света
Энергия световой волны зависит
от ее длины
В начале XX века в Берлине нобелевские лау-
реаты Макс Планк и Альберт Эйнштейн про-
вели знаменитые опыты, в ходе которых была
доказана двойственная природа света. С одной
стороны, свет — это электромагнитная волна,
с другой стороны — это поток частиц, которые
2.2. Пигменты поглощают энергию солнечного света
57
называют квантами света, или фотонами.
Энергия фотона пропорциональна частоте ко-
лебаний световой волны
E = h v =h -г-,	(2-1)
л
где h — постоянная Планка (6,6-10-34 Джс), с —
скорость света (З Ю8 м-с-1), X — длина световой
волны.
Моль — величина, которая выражает коли-
чество молекул или фотонов. За 1 моль приня-
то 6 1023 молекул или фотонов (число Авогадро
Na). Энергия одного моля фотонов рассчитыва-
ется как
E=h^NA
(2.2)
С точки зрения термодинамики, чтобы энер-
гия фотона могла быть использована в фотохи-
мической реакции, она должна быть, по край-
ней мере, равна свободной энергии Гиббса для
данной реакции. [На самом деле значительная
доля энергии теряется в процессе перехода из
одной формы в другую (раздел 3.4), и из этого
следует, что энергия фотона должна быть боль-
ше, чем энергия Гиббса для соответствующей
реакции.] Мы можем приравнять энергию Гиб-
бса к энергии фотона:
\G = E = h^-NA	(2.3)
Л
Подставляя численные значения констант,
получаем:
Л4 4 1П~34 /П \ 3 • 1О8(М)	1	6 • 1023 /П Д\
ЛС7 = 6,6-10 (Джс)--(Е)	x^O’O^) (24)
\G=
119,000
Х(нм)
[кДж/моль фотонов] (2.5)
Для описания фотосинтетических окисли-
тельно-восстановительных реакций, которые
будут разобраны в главе 3, необходимо исполь-
зовать величину электрического потенциала
(Д£), который можно выразить через энергию
Гиббса:
F
(2.6)
где F — количество зарядов в 1 моле, которое
равно 96,480 Амп с моль-1. Подставляя это зна-
чение, получаем
\Е=-	[Вольт (2.7)
гл(нм) л(нм)
Из широкого спектра электромагнитных
волн человеческий глаз воспринимает лишь
узкий диапазон с длиной волны между 400 и
700 нм (рис. 2.2). У поверхности Земли интен-
сивность солнечного излучения в этом диапазо-
не наиболее высока. Видимая часть спектра ис-
Рис. 2,2, Спектр электромагнитного излучения. Снизу приведена видимая
часть спектра. (' По другим данным видимая часть спектра шире — от 360 до
760 нм. — Прим, ред.)
58
2. Использование энергии солнечного света в процессе фотосинтеза — основа жизни на Земле
Таблица 2.1. Содержание энергии для фотонов разных длин волн
и рассчитанная исходя из формулы (2.7) разность электрохимических потенциалов
Длина волны, нм	Цвет	Содержание энергии, кДж/моль фотонов	ДЕ, эВ
700	красный	170	1,76
650	красно-оранжевый	183	1,90
600	жёлтый	199	2,06
500	сине-зелёный	238	2,47
440	синий	271	2,80
400	фиолетовый	298	3,09
пользуется растениями в процессе фотосинтеза.
В процессе бактериального фотосинтеза, кроме
видимого света, используется также свет в ин-
фракрасной области.
В соответствии с формулой 2.3 энергия све-
та обратно пропорциональна длине волны.
В таблице 2.1 представлены значения энергии
для моля фотонов разных длин волн. Напри-
мер, фиолетовый свет имеет энергию примерно
300 кДж/моль фотонов. Красный свет с мак-
симальной длиной волны, которая может быть
использована в фотосинтезе (700 нм), содержит
170 кДж/моль фотонов, т.е. примерно в 2 раза
меньше, чем фиолетовый свет.
Хлорофилл — основной пигмент
фотосинтеза
В фотосинтезе зеленых растений функцию
«сбора света» выполняют преимущественно
хлорофиллы — пигменты, которые поглоща-
ют свет с длинами волн меньше 480 нм и в диа-
пазоне 650—700 нм (данные для хлорофилла а,
см. рис. 2.3). Когда белый (дневной) свет пада-
ет на слой молекул хлорофилла, зеленый свет
с длинами волн 480—650 нм не поглощается, а
проходит сквозь него. Поэтому хлорофилл, со-
держащийся в листе, и весь лист целиком, име-
ют зеленый цвет.
Эксперименты, проведенные в 1905—1913 го-
дах в Цюрихе и Берлине Ричардом Вильштет-
тером и его коллегами, привели к открытию
структурной формулы зеленого пигмента листа
хлорофилла — весьма значительному событию
в истории химии. Это открытие было настолько
грандиозным, что Ричард Вилыптеттер был на-
гражден Нобелевской премией по химии почти
сразу — в 1915 г.
Существует несколько хлорофиллов. На ри-
сунке 2.4 представлена структурная формула
хлорофиллов а и b (Хл-я, Хл-Л). Основой струк-
туры хлорофилла является кольцо, состоящее из
четырех пиррольных циклов, тетрапиррол, ко-
торый также называют порфирином. Mg2+ рас-
положен внутри кольца в качестве центрального
атома: с двумя атомами азота тетрапиррола он
связан ковалентно, с двумя другими — коорди-
национно. Пятое циклопентановое кольцо при-
креплено к кольцу с. В кольце d остаток про-
пионовой кислоты образует эфир со спиртом
фитолом. Фитол представляет собой длинную
углеводородную цепочку с одной двойной С=С
связью. Он является изопреноидом из 4 изопре-
новых единиц (раздел 17.7). Длинный гидро-
фобный хвост фитола делает хлорофилл хоро-
шо растворимым в неполярных растворителях,
и, таким образом, обеспечивает его внедрение
в липидную фракцию в искусственных систе-
мах. Однако в живых организмах хлорофилл
всегда находится в связи с белками. В кольце b
хлорофилл-Z) содержит формальдегидную груп-
пу, а хлорофилл-б/ — метильный остаток. Это
небольшое отличие приводит к значительному
изменению спектра поглощения. На рисунке 2.3
видны различия в спектрах поглощения Хл-я и
Хл-/>.
У растений отношение Хл\-а/Хл-Ь составляет
примерно 3:1. Только Хл-я является основным
компонентом реакционных центров фотосистем
(разделы 3.6 и 3.8), поэтому его считают основ-
ным пигментом фотосинтеза. Однако на боль-
шом участке видимого спектра Хл\-а не поглоща-
ет. Этот участок называют «зеленым провалом» в
спектре поглощения. Эта область становится уже
за счет поглощения Хл-Z?: его первый максимум
2.2. Пигменты поглощают энергию солнечного света
59
Рис. 2.3. Спектры поглощения хлорофилла-67 (Хл-я), хлорофилла-/? (Хл-/>)
и ксантофилла лютеина в ацетоне. Для сравнения приведена интенсивность
солнечного излучения при разных длинах волн
расположен в более длинноволновой области, а
второй — в более коротковолновой области по
сравнению с соответствующими максимумами
Хл-67. Как будет сказано в разделе 2.4, световая
энергия, поглощенная Хл-/>, может с высокой
эффективностью быть передана на Хл-а. Таким
образом, Хл-b используется растениями для бо-
лее эффективного использования солнечной
энергии.
Структура хлорофиллов в процессе эволюции
оставалась на удивление консервативной. Пур-
пурные бактерии, которые возникли, предполо-
жительно, более 3 млрд лет назад, содержат фото-
синтетический пигмент бактериохлорофилл-б/,
который отличается от хлорофилла-^, изобра-
женного на рис. 2.4, только одной боковой цепью
и отсутствием одной двойной связи. Однако это
небольшое отличие обеспечивает сдвиг одно-
го максимума поглощения из красной области
в инфракрасную, а второго — из синей в более
коротковолновую часть спектра. Это приводит к
расширению участка спектра, на котором погло-
щение бактериохлорофилла незначительно.
В процессе эволюции тетрапиррольное коль-
цо не только осталось почти без изменений во
всех хлорофиллах, но также обеспечило вы-
полнение различных функций, не связанных с
фотосинтезом. Тетрапиррольная структура с Ni
в качестве центрального атома участвует в об-
разовании метана у бактерий. С центральным
атомом Со та же структура образует кобаламин
(витамин В12), который в качестве кофактора
участвует в реакциях переноса водорода и ор-
ганических групп. Когда центральным атомом
становится Fe, тетрапиррольное кольцо образу-
ет базовую структуру гемов (рис. 3.24), которые,
с одной стороны, функционируют как редокс-
кофакторы в цепи переноса электрона (цитохро-
мы) (разделы 3.7 и 5.5), а, с другой стороны, за-
пасают и переносят кислород в тканях аэробных
организмов (гемоглобин, миоглобин). Тетрапир-
рольное кольцо гема в гемоглобине животных
60
2. Использование энергии солнечного света в процессе фотосинтеза — основа жизни на Земле
Рис. 2.4. Структурная формула хлорофилла-67. У хлорофилла-/? метильная группа
в кольце b заменена альдегидной группой (обозначена цветом). Фитольный «хвост»
гидрофобен и обеспечивает заякоривание в белковых комплексах липидной
мембраны
незначительно отличается от тетрапиррольного
кольца хлорофилла-^ (см. рис. 2.4).
Удивительно, что соединение, приспосо-
бленное в процессе эволюции для выполнения
определенной функции, после незначительных
структурных изменений может выполнять со-
вершенно иную функцию. Причина многофунк-
циональности таких соединений, как хлорофилл
и гем, заключается в том, что их активность в
значительной степени контролируется белками,
с которыми они связаны.
Молекулы хлорофилла в клетке связаны со
специальными белками. Спектр поглощения
хлорофилл-белкового комплекса может сильно
отличаться от спектра поглощения свободно-
го хлорофилла. То же самое можно сказать и о
других соединениях, поглощающих свет, таких,
как каротиноиды, ксантофиллы и фикобили-
ны, которые также находятся в комплексах с
белками. Эти соединения будут рассмотрены в
следующих разделах. Далее в тексте вещества,
поглощающие свет в видимой области будут на-
зываться хромофоры (от греческого «цвет» и
«нести»), а хромофоры в комплексе с белками
будут называться пигментами. Пигменты часто
называют по длине волны максимума поглоще-
ния (например, Хл-я700 означает хлорофилл-^
с максимумом поглощения 700 нм). Еще одно
распространенное сокращение — Р700 (от pig-
ment) — не содержит информации о структуре
хромофорной группы.
2.3. Поглощение света переводит
молекулу хлорофилла
в возбужденное состояние
Что происходит, когда хромофор поглощает фо-
тон? При возбуждении фотоном определенной
энергии молекулы хромофора, которая погло-
щает свет данной длины волны, энергия фотона
передается электронам, и они переходят на более
высокий энергетический уровень. В соответствии
с законом сохранения энергии (первый закон тер-
модинамики) энергия хромофора увеличивается
за счет энергии поглощенного фотона, и молеку-
ла хромофора переходит в возбужденное состо-
яние. Этот процесс происходит по принципу «все
или ничего». Энергия может поглощаться только
дискретно (квантами), энергетические уровни
также дискретны. Количество энергии, которая
необходима для возбуждения хромофора, зависит
от структуры хромофорной группы. Общее свой-
ство хромофорных групп заключается в том, что
они содержат большое количество сопряженных
двойных связей (десять в случае тетрапирроль-
ного кольца Хл-я). Электроны этих двойных свя-
зей делокализованы. На рисунке 2.5 изображены
две возможные резонансные формы.
2.3. Поглощение света переводит молекулу хлорофилла в возбужденное состояние
61
Рис. 2.5. Резонансные структуры хлорофилла-я. В области, обозначенной
красным, двойные связи делокализованы; л-электроны распределены по всей
системе сопряженных связей. Альдегидная группа хлорофилла-/? оттягивает на себя
электронную плотность, что отражается на всей системе л-электронного сопряжения
После поглощения энергии электрон сопря-
женной системы поднимается на более высокую
орбиталь без изменения своего спина. Такое воз-
бужденное состояние молекулы хлорофилла на-
зывается синглетным. На рисунке 2.6 схематично
показано поглощение фотона. Как правило, чем
больше число двойных связей в сопряженной си-
стеме, тем меньшее количество энергии требуется
для перехода молекулы в первое синглетное состо-
яние. Для возбуждения хлорофилла достаточно
красного света (длинноволновое излучение), тог-
да как для возбуждения бутадиена — соединения
с двумя сопряженными связями — необходимо
высокоэнергетическое ультрафиолетовое излу-
чение (коротковолновое). На поглощение света
системой сопряженных двойных связей тетра-
пиррольного кольца влияют также боковые цепи.
Различия в спектрах поглощения хлорофиллов
-а и -/?, о которых говорилось выше, можно объ-
яснить тем, что карбонильная боковая цепьХл-/?
оттягивает электроны от кольца (см. рис. 2.5).
Спектры поглощения Хл-я и Хл-/> (см.
рис. 2.3) имеют два основных максимума по-
глощения, которые соответствуют двум воз-
бужденным состояниям. Кроме того, у хлоро-
филлов есть минорные максимумы, которые
мы не будем обсуждать в рамках данной книги.
Два основных возбужденных состояния хлоро-
филла — первое (S0 и второе (S2) синглетные
состояния (см. рис. 2.6). Полосы поглощения
хлорофилла достаточно широкие, и при более
высоком разрешении становится видно, что
каждая полоса образована несколькими отдель-
ными спектральными линиями. Сложная струк-
тура спектра поглощения обусловлена тем, что
молекулы хлорофилла и в основном, и в обоих
синглетных состояниях могут находиться на раз-
ных колебательных и вращательных подуров-
нях. На энергетической диаграмме (см. рис. 2.6)
колебательные и вращательные подуровни обо-
значены тонкими линиями, а соответствующие
электронные уровни (состояния) — жирными
линиями. Колебательные и вращательные по-
дуровни основного состояния перекрываются
с наиболее низкими по энергии подуровнями
первого синглетного состояния (SJ. Поду-
ровни первого и второго синглетных состояний
также перекрываются по энергии. Если молеку-
ла хлорофилла поглощает свет в области синего
максимума, один из ее электронов поднимается
на второй синглетный уровень (S2). Время по-
лужизни второго синглетного состояния всего
10-12 сек, поэтому это состояние слишком неста-
бильно, чтобы использовать избыточную энер-
гию для совершения химической работы. Воз-
бужденная молекула рассеивает часть энергии в
форме тепла за счет вращений и колебаний, при
этом электрон переходит на первый синглетный
уровень. На уровень S| молекула может перейти
также из основного состояния (So) за счет по-
глощения фотона красного света, который со-
держит меньше энергии, чем фотон синего све-
та. Первое синглетное состояние гораздо более
стабильно, чем второе: время полужизни этого
состояния составляет 4-10-9 с.
Переход из первого синглетного уровня
на основной может происходить
у хлорофилла разными путями
1.	Наиболее важный механизм превращения
энергии, которая освобождается при переходе из
первого синглетного состояния в основное, — ис-
62
2. Использование энергии солнечного света в процессе фотосинтеза — основа жизни на Земле
Второе возбужденное состояние
(второй синглет, S2)
Первое возбужденное состояние
(первый синглет, SJ
Основное состояние, So
Рис. 2.6. Схема возбужденных состояний хлорофилла-я и его возвращения
в основное состояние, в процессе которого высвобожденная энергия
возбуждения превращается в фотохимическую работу, свет флуоресценции или
фосфоресценции, или рассеивается в виде тепла. На этой упрощенной схеме
показаны только возбужденные состояния, соответствующие двум основным
максимумам поглощения хлорофиллов
2.3. Поглощение света переводит молекулу хлорофилла в возбуждённое состояние
63
пользование ее для совершения химической ра-
боты по переносу Н+ против градиента концен-
трации и созданию ДцН+ на мембране1. Молекула
хлорофилла передает возбужденный электрон с
первого синглетного уровня Sj акцептору; при
этом образуется положительно заряженный хло-
рофилл (радикал Хл+е). Это происходит потому,
что возбужденный электрон связан с молекулой
хромофора слабее, чем электрон в основном со-
стоянии So. В разделе 3.5 детально описано, как
электрон может возвращаться обратно с акцепто-
ра на Хл+* через электрон-транспортную цепь, в
результате чего молекула хлорофилла вновь пере-
ходит в основное состояние, а свободная энергия
используется для создания ДцН+ на мембране.
В другом случае дефицит электрона в радикале
Хл+е может восполняться за счет донора электро-
на [например, волы (раздел 3.6)].
2.	Возбужденный хлорофилл может вернуть-
ся в основное состояние So, расходуя энергию
на излучение света. Это явление носит название
флуоресценции. В связи с колебанием и вра-
щением групп атомов в молекуле часть энергии
возбуждения обычно успевает рассеяться в фор-
ме теплового излучения, поэтому кванты света
при флуоресценции несут меньше энергии, чем
было затрачено для перехода на первый синглет-
ный уровень (а значит, имеют большую длину
волны, чем возбуждающий свет) (рис. 2.7).
3.	Возможен возврат с первого синглетного
уровня Sj на основной So путем постепенного
Поглощение Флуоресценция
Рис. 2.7. Спектр флуоресценции обычно сдвинут
в более длинноволновую область, по сравнению
с возбуждающим светом
1 Эта энергия, в конце концов, запасается в виде энергии
химических связей. Процесс преобразования энергии осу-
ществляется через ряд промежуточных стадий (см. далее). —
Прим. ред.
перехода через различные колебательные и вра-
щательные уровни. При этом вся энергия дис-
сипирует в тепло.
4.	Диссипируя часть энергии в тепло, моле-
кула хлорофилла может перейти на возбужден-
ный уровень с более низкой энергией, который
называется первым триплетным уровнем (Tj).
Молекула не может перейти в триплетное со-
стояние непосредственно из основного за счет
поглощения света. При переходе в триплетное
состояние спин возбужденного электрона ме-
няется на противоположный. Так как вероят-
ность обращения спина невелика, триплетное
состояние возникает редко, но при достаточ-
но высоком уровне поглощения квантов света
часть молекул хлорофилла все же переходит в
это состояние. Молекула может перейти из три-
плетного состояния Tj в основное, испуская так
называемый свет фосфоресценции. Свет фос-
форесценции имеет меньшую энергию, чем та,
которая была затрачена для перехода молекулы
в первое синглетное состояние. Возврат элек-
трона с триплетного уровня на основной тре-
бует обращения спина. Поскольку вероятность
этого мала, первое триплетное состояние (Т0,
по сравнению с первым синглетным, отличает-
ся большим временем полужизни: 10~4—10~2 с.
Хлорофилл втриплетном состоянии не участвует
в выполнении фотосинтетической функции как
таковой. Однако триплетный хлорофилл может
передать энергию на кислород и перевести его,
таким образом, в возбужденное синглетное со-
стояние, после чего кислород становится очень
реакционноспособным и может вызвать разру-
шение клеточных компонентов. В разделе 3.10
описано, как растение противостоит разруши-
тельному действию синглетного кислорода.
5.	Возврат в основное состояние может быть
сопряжен с возбуждением соседней молекулы
хромофора (процесс миграции энергии). Переда-
ча возбуждения — функция антенных пигментов.
Она будет рассмотрена в следующем разделе.
2.4. Антенна служит для сбора света
Для того чтобы передать возбуждение на пиг-
мент реакционного центра, фотон определен-
ной энергии должен возбудить молекулу хло-
рофилла в реакционном центре. Вероятность
того, что фотон не только несет определенную
64
2. Использование энергии солнечного света в процессе фотосинтеза — основа жизни на Земле
энергию, но и столкнется именно с той моле-
кулой хлорофилла, которая находится в реак-
ционном центре, очень невелика. Поэтому эф-
фективный фотосинтез возможен лишь тогда,
когда энергия фотонов разных длин волн захва-
тывается, так называемой антенной (рис. 2.8).
Фотосинтез, подобно радио и телевидению, не
мог бы функционировать в отсутствие антенны.
Антенны растений состоят из многих моле-
кул хлорофилла, связанных с белком, которые
поглощают фотоны и передают их энергию в ре-
акционный центр. Если произвести усреднен-
ный расчет для всей поверхности листа, то ока-
жется, что в состав реакционных центров входят
всего несколько тысяч молекул хлорофилла.
Остальные сотни тысяч молекул хлорофилла
расположены в антенных комплексах. Наблюде-
ния, сделанные Робертом Эмерсоном и Уилья-
мом Арнольдом в США в 1932 году, показали,
что абсолютное большинство молекул хлоро-
филла не входит в состав реакционных центров.
Исследователи освещали суспензию зеленой
водоросли Chlorella импульсами света длитель-
ностью 10 мкс с интервалами 20 мс. Интенсив-
ность выделения кислорода использовали как
количественный показатель фотосинтеза. Им-
пульсы света были так коротки, что хлорофилл
мог перейти в возбужденное состояние только
один раз, а интенсивность света была настоль-
ко высокая, что выделение кислорода достигало
своего максимума. Таким образом, фотосинте-
тический аппарат оказывался насыщен фотона-
ми. Анализ содержания хлорофилла в суспензии
водорослей показал, что при насыщающей ин-
тенсивности света на 2400 молекул хлорофилла
образуется лишь одна молекула О2.
В последующие годы Эмерсон уточнил эти дан-
ные: он показал, что при освещении импульсами
очень низкой интенсивности количество выделен-
ного кислорода увеличивалось пропорционально
интенсивности света. Отсюда было рассчитано,
что выделение одной молекулы кислорода требу-
ет поглощения как минимум восьми фотонов.
Эти результаты положили начало длительному
научному диспуту с Отто Варбургом, который на
основании своих экспериментов заключил, что
для формирования одной молекулы О2 требуется
лишь четыре фотона.
Результаты Эмерсона и Арнольда привели к
заключению, что потребность в квантах для вы-
деления одной молекулы кислорода составляет
восемь фотонов, причем два реакционных цен-
тра, как было показано позже, используют по
4 фотона каждый. С одним реакционным цен-
тром ассоциировано около 300 молекул хлоро-
филла. Эти молекулы входят в состав антенны.
Антенны комплексы водорослей и высших
растений содержат дополнительные пигменты
для использования фотонов, длины волн которых
лежат в области «зеленого провала», между мак-
симумами поглощения хлорофилла. У высших
растений это каротиноиды, преимущественно
ксантофиллы, включая лютеин и сходный с ним
по структуре виолаксантин, а также каротины
Рис. 2.8. Фотоны собираются с помощью антенны, и их энергия передается в
реакционный центр. На этой схеме квадратами обозначены молекулы хлорофилла.
Возбуждение, переданное в реакционный центр, вызывает разделение зарядов
(раздел 3.4)
2.4. Антенна служит для сбора света
65
р-Каротин
(каротин)
Лютеин
(ксантофилл)
Виолаксантин
(ксантофилл)
Рис. 2.9. Структурные формулы каротина (Р-каротин) и двух ксантофиллов
(лютеина и виолаксантина). Благодаря сопряженным связям в изопреноидной цепи
эти молекулы поглощают свет. Каротиноиды — гидрофобные соединения
(преимущественно, p-каротин) (рис. 2.9). Кро-
ме сбора света, каротиноиды в составе антенны
выполняют еще одну важную функцию: они за-
бирают на себя энергию от опасного для клетки
триплетного состояния хлорофилла (TJ, которое
упоминалось выше (раздел 3.10).
Важными компонентами антенны у циано-
бактерий являются фикобилины, которые бу-
дут рассмотрены в конце этого раздела.
Каким образом энергия фотонов,
поглощенная антенной,
передается в реакционный центр?
Можно было бы предположить, что энергия
мигрирует по антенне за счет передачи элек-
трона от одного хромофора к другому в се-
рии окислительно-восстановительных реакций,
подобно тому, как это происходит в электрон-
транспортных цепях фотосинтеза и дыхания
(которые будут рассмотрены ниже). Такой элект-
ронный транспорт должен был бы иметь замет-
ную энергию активации. Но было установлено,
что поток энергии возбуждения в антенне про-
исходит даже при температуре 1°К. При столь
низкой температуре поглощение света и флуо-
ресценция все еще могут происходить, в то вре-
мя как химические процессы, катализируемые
ферментами, полностью блокированы. Очевид-
но, передача энергии в антенне происходит по
механизму, сходному с механизмом поглощения
света и флуоресценции.
Когда хромофоры расположены очень близ-
ко друг к другу, возможна передача энергии фо-
тона от одного хромофора к другому. Подобно
тому, как квант световой энергии называется
фотоном, квант энергии возбуждения, пере-
данной от одной молекулы к другой, называется
экситоном1. Обязательным условием передачи
экситонов является определенное расположение
хромофоров, участвующих в передаче, которое
достигается за счет их взаимной ориентации на
молекуле белка. Поэтому хромофоры антенны
всегда входят в состав пигмент-белковых ком-
плексов.
Антенны растений состоят из внутренней и
внешней частей (рис. 2.10). Внешняя часть, об-
разованная светособирающими комплексами
(ССК), поглощает свет. Внутренняя часть антен-
ны, состоящая из коровых комплексов, ассоци-
ирована с реакционным центром; она поглоща-
1 В немецкой традиции преподавания фотосинтеза при-
нято говорить только об экситонном механизме передачи
энергии и чётко различать квант света и экситон. Однако су-
ществуют и другие механизмы передачи энергии в антенных
комплексах: индуктивный резонанс, излучение кванта света
с последующим поглощением, полупроводниковые токи,
позволяющие обмен электронами без участия ферментов.
Термин «экситон» в нашей научной литературе использует-
ся ограниченно. — Прим. ред.
66
2. Использование энергии солнечного света в процессе фотосинтеза — основа жизни на Земле
Тилакоидная
мембрана
Рис. 2.10. Обобщенная схема строения антенны
ет свет, а также передает экситоны, собранные
внешней антенной, в реакционный центр.
ССК состоят из полипептидов, с которыми
связаны Хл-<7, Хл-/), ксантофиллы и каротины.
Эти белки, которые называют полипептидами
ССК, кодируются в ядре. У растений было об-
наружено много различных полипептидов ССК.
Например, у томата найдено как минимум 19
сходных между собой генов, кодирующих поли-
пептиды ССК. Эти гены гомологичны, так как
в процессе эволюции они возникли от общей
предковой формы, и образуют мультигенное се-
мейство.
У растений есть два типа реакционных цен-
тров, определенным образом расположенных
в тилакоидной мембране: реакционный центр
фотосистемы II (ФС II), который имеет макси-
мум поглощения 680 нм, и реакционный центр
фотосистемы I (ФС I) с максимумом поглоще-
ния 700 нм. Функции этих реакционных цен-
тров будут рассмотрены в разделах 3.6 и 3.8.
Функции антенны на примере антенны ФС II
Антенна реакционного центра ФС II содер-
жит 4 основных ССК, названных ССК-П а—d.
Главный компонент — ССК-П-/); на нем рас-
положено 67% всего хлорофилла антенны
ФС II. ССК-П-/) — белок, наиболее широ-
ко представленный в тилакоидной мембране,
поэтому он был детально изучен. Скорее все-
го, он находится в мембране в форме тримера.
Мономер (табл. 2.2) состоит из полипептида, с
которым соединены две молекулы лютеина (см
рис. 2.9). Полипептид содержит остаток треони-
на, который может быть фосфорилирован про-
теинкиназой с использованием АТФ. Фосфо-
рилированием регулируется активность ССК-П
(раздел 3.10).
Прорыв в расшифровке трехмерной струк-
туры ССК-П-/) был совершен при исследова-
нии кристаллических слоев тримеров ССК-П-/)
методом электронной криомикроскопии при
температуре 4 °К (рис. 2.П). Пептид ССК-П-/)
образует три трансмембранных спирали. Две
молекулы лютеина располагаются в толще мем-
браны крест-накрест. Молекулы Хл-/), у кото-
рых красный максимум поглощения находится
в более коротковолновой области спектра, чем у
Хл-я, расположены в наружной части комплек-
сов. Всего одна молекула Хл-я расположена в
периферической части; остальные расположены
в центральной части. На рисунке 2.12 схематич-
но изображена вертикальная проекция мономе-
ров, образующих тример. Хл-я, расположенный
в периферической части, обеспечивает передачу
энергии в соседний тример или в реакционный
центр. Другие пептиды ССК-П (a, cf d) очень
похожи на пептид ССК-П-/); они отличаются
лишь 5% аминокислотной последовательности
и, соответственно, по трехмерной структуре
тоже очень сходны. Соотношение Хл-а/Хл-Ь
значительно выше вССК-П-я и вССК-П-с, чем
в ССК-П-/?. Вероятно, ССК-П-я и ССК-П-с
расположены между ССК-П-/) и реакционным
центром.
2.4. Антенна служит для сбора света
67
Таблица 2,2, Состав мономера ССК-11-b
Пептид	232 аминокислоты
Липиды	1 фосфатидил гл и церин, 1 диацилглицерин
Хромофоры	7 Хл-а, 5 Хл-Ь, 2 лютеина
(Kuhlbrandt, 1994)
На рисунке 2.13 приведена гипотетическая
схема организации антенного комплекса ФС II.
Наружные комплексы, состоящие из тримеров
ССК-П-/?, находятся на периферии антенны.
Экситоны с хлорофилла-/? в ССК-П-/?, пере-
даются на Хл-# в центральной части мономера
ССК-П-/? и далее через контактирующие моле-
кулы Хл-я соседних тримеров — во внутренний
антенный комплекс. Внутренние комплексы
связаны маленькими хлорофилл-содержашими
субъединицами с коровым комплексом. Он со-
стоит из антенных белков СР 43 и СР 47, тесно
связанных с реакционным центром (рис. 3.22),
каждый из которых содержит 15 молекул Хл-я.
Тилакоидная
мембрана
Рис, 2.11. Пространственное расположение мономера ССК-П-/? в тилакоидной
мембране, вид сбоку. Три а-спирали белка пронизывают мембрану. Хлорофилл-#
(черный) и хлорофилл-/? (красный) ориентированы почти перпендикулярно к
поверхности мембраны. Две молекулы лютеина (черные) в центре комплекса
функционируют в качестве внутренней крестообразной распорки (с любезного
разрешения W. Kuhlbrandt, Гейдельберг)
68
2. Использование энергии солнечного света в процессе фотосинтеза — основа жизни на Земле
Рис. 2.12. Тример CCK-II-/? в тилакоидной мембране, вид сверху со стороны
стромы. В каждом мономере центральная пара спиралей образует левозакрученную
суперспираль, которая окружена молекулами хлорофилла. Молекулы Хл-/>
(красные) расположены на периферии мономеров (С любезного разрешения
W. Kiihlbrandt, Гейдельберг)
Поскольку максимум поглощения Хл-b рас-
положен в более коротковолновой области, чем
у Хл-я, передача экситонов от Хл-b к Хл-а со-
провождается потерями энергии в виде тепла.
Это обеспечивает ток экситонов с периферии
к реакционному центру. Связь между внешни-
ми ССК (ССК-П-£) и ФСП нарушается при
фосфорилировании ССК-П-£. Таким образом,
общий размер антенн комплексов может быть
адаптирован к интенсивности освещения (раз-
дел 3.10).
Фотосистема I содержит меньше ССК, чем
фотосистема II (раздел 3.8), так как ее коровая
антенна больше, чем у ФСП. ССК ФС1 сходны
с ССК ФСП. Анализ аминокислотной последо-
вательности показал, что ССК-I и ССК-П эво-
люционировали из одной предковой формы.
Предположительно, в фосфорилированном со-
стоянии ССК-П-£ может также функциониро-
вать как антенна ФС I (подвижная антенна —
см. раздел 3.10).
Механизм миграции экситонов в антенне еще
не полностью установлен. Экситон может быть
делокализован путем распределения по целой
группе хромофорных молекул. С другой сторо-
ны, экситон может в определенный момент на-
ходиться в какой-то конкретной хромофорной
молекуле и быть передан другой молекуле. Такая
передача экситона была названа механизмом
Фёрстера. Передача экситонов между очень
2.4. Антенна служит для сбора света
69
Тилакоидная
мембрана
Свет
Коровая антенна
Рис. 2.13. Схема расположения светособирающих комплексов в антенне
фотосистемы II (вид на мембрану тилакоида сверху) (по Thornber). а обозначает
ССК-П-я, b — ССК-П-£, и т.п. Комплексы внутренней антенны связаны
мономерами CCK-II-я и ССК-П-сс коровым комплексом. Функции CCK-II-J
и ССК-1 I-е ещё не до конца выяснены1
близко расположенными молекулами хлоро-
филла внутри ССК, скорее всего, происходит
путем делокализации электронов, а передача
от ССК в реакционный центр — по механизму
Фёрстера. Измерения поглощения с помощью
ультраскоростной лазерной техники показали,
что передача экситона между двумя молекула-
ми хлорофилла происходит за 0,1 пс (10-13 с).
Таким образом, скорость передачи экситона в
антенне гораздо выше, чем разделение зарядов
в реакционном центре (3,5 пс), которое будет
рассмотрено в разделе 3.4. Реакционный центр
функционирует как энергетическая ловушка
для экситонов, которые мигрируют по антенне.
1 На рисунке показаны устаревшие сведения. По современ-
ным рентгеноструктурным данным белок СР 43 находится в
непосредственном контакте с реакционным центром, и не
контактирует с СР 47. — Прим. ред.
Фикобилисомы позволяют
цианобактериям и красным водорослям
фотосинтезировать даже при слабом свете
У цианобактерий и красных водорослей имеются
антенные структуры, которые могут собирать свет
при очень низкой интенсивности освещения. Эти
антенны представляют собой частицы, располо-
женные на мембране рядом с реакционными цен-
трами фотосистемы II (рис. 2.14). Эти частицы,
названные фикобилисомами, состоят из белков
(фикобилипротецдов), ковалентно связанных с
хромофорами фикобилинами. Фикобилины — те-
трапирролы с открытой цепью, т.е. соединения, по
структуре родственные хлорофиллам. Тетрапир-
ролы с открытой цепью также содержатся в желчи
(bile), отсюда и название — фикобилины. Фикоби-
лины связаны с белком тиоэфирной связью, обра-
зованной SH-группой белка и винильной боковой
цепью хромофора. Белок фикоэритрин связан с
хромофором фикоэритробилином, а белки фи-
70
2. Использование энергии солнечного света в процессе фотосинтеза — основа жизни на Земле
Рис. 2.14. Схема структуры фикобилисомы, вид сбоку. Каждая из показанных на
рисунке единиц состоит из трех а- и трех р-субъединиц (по Bryanth)
Белок
I
SH
Фикоцианин
(Фикоэритрин)
Рис. 2.15. Структурная формула фи кобил и протеидов, входящих в состав
фикобилисом: фикоцианина (черный) и фикоэритрина (отличия от фикоэритрина
показаны красным). Соответствующие хромофоры фикоцианобилин и
фикоэритробилин ковалентно связаны с белками тиоэфирой связью, образованной
SH-группой цистеинового остатка белка и винильной группой хромофора.
Сопряженные двойные связи (обозначены красным) придают молекуле
хромофорные свойства
2.4. Антенна служит для сбора света
71
Длина волны (нм)
Рис. 2.16. Спектры поглощения фи кобил и протеидов фикоэритрина,
фикоцианина и аллофикоцианина, а также хлорофилла-# (для сравнения)
коцианин й аллофикоцианин — с хромофором
фикоцианобилином (рис. 2.15). Базовая структура
фикобилипротеидов — гетеродимер (а, 0). Каждая
из субъединиц содержит 1-4 молекулы фикобили-
на. Гетеродимеры агрегируются, образуя тримеры
(а, ₽)3 — «кирпичи», из которых строится фикоби-
лисома. Так называемые линкерные (связующие)
полипептиды служат «цементом», сцепляющим
«кирпичи».
На рисунке 2.14 представлена структура фи-
кобилисомы. Она прикреплена к мембране с
помощью заякоривающих белков. Три агрегата
из 4—5 (а, ₽)3 «кирпичей» образуют ядро, со-
держащее пигмент аллофикоцианин (АР). КАР
прикреплены цилиндрические стержневидные
структуры, каждая из которых состоит из 4—6
«кирпичей». «Кирпичи», обращенные к ядру,
содержат преимущественно фикоцианин (PC),
а внешние — фикоэритрин (РЕ). Функциональ-
ное значение такой структурной организации
обусловлено спектрами поглощения различных
фикобилипротеидов, представленными на ри-
сунке 2.16. Коротковолновый свет поглощается
на периферии стержня фикоэритрином, а длин-
новолновый свет поглощается фикоцианином
в подлежащих слоях. Пигменты ядра передают
экситоны в реакционный центр. Неравномерное
пространственное распределение длинновол-
новых и коротковолновых пигментов в антенне
ФС II было показано в предыдущем разделе на
примере высших растений.
Благодаря фикобилипротеидам фикобили-
сомы могут весьма эффективно поглощать зе-
леный свет (см. рис. 2.16), что позволяет циано-
бактериям и красным водорослям жить в воде на
большой глубине. Практически весь видимый
свет, кроме зеленого (см. рис. 2.3), поглощается
зелеными водорослями, живущими в поверх-
ностном слое воды, и на глубину доходит лишь
зеленый свет. Поэтому водоросли, живущие на
глубине, чтобы осуществлять фотосинтез при
такой низкой интенсивности света, вынуждены
72
2. Использование энергии солнечного света в процессе фотосинтеза — основа жизни на Земле
тратить значительную часть строительного ма-
териала клеток на образование фикобилисом.
Фикобилипротеиды у водорослей составляют до
40% от общей белковой массы. Эти организмы
расходуют столько белкового материала, чтобы
собрать необходимое для выживания количе-
ство света.
Дополнительная литература
Bada, J. L., Lazcano, A. Prebiotic soup—revisiting the
Miller experiment. Science 300, 74—746 (2003).
Cerullo, G., Polli, D., Lanzani, G., De Silverstri, S.,
Hashimoto, H., Cogdell, R. J. Photosynthetic light
harvesting by carotenoids: Detection of an intermediate
excited state. Science 298, 2395—2398 (2002).
Emerson, R. The quantum yield of photosynthesis. Annu
Rev Plant Physiol 9, 1—24 (1958).
Glazer, A. N. Photosynthetic accessory proteins with bilin
prosthetic groups. The Biochemistry of Plants, Vol.
8 (eds. M. D. Hatch, N. K. Boardman), pp. 51—96.
Academic Press, New York (1981).
Govindjee, Knox, R. S., Amesz, J. (eds.) Photosynthetic
unit: Antenna and reaction centers. Photosynth Res 48,
1-319(1996).
Kuhlbrandt, W. Structure and function of the plant light
harvesting complex, LHC-П. CurrBiol 4, 519—528
(1994).
Nilsson, A., Stys, D., Drakenberg, T., Spangfort, M. D.,
Forsen, S., Allen, J. F. Phosphorylation controls the
three-dimensional structure of plant light harvesting
complex II. J Biol Chem TH, 18350-18357 (1997).
Ruban, A. V., Wentworth, M., Yakushevska, A. E.,
Andersson, J., Lee, P. J., Keegstra W., Dekker, J. P.,
Boekema, E. J., Jansson, S., Horton, P. Plants lacking
the main light-harvesting complex retain photosystem II
macroorganization. Nature 42, 648—652 (2003).
Scheer, H., Chlorophylls. CRC. Boca Raton, Fla. (1991).
Turconi, S., Weber, N., Schweitzer, G., Strotmann, H.,
Holzwarth, A. R. Energy charge separation kinetics
in photosystem I. 2. Picosecond fluorescence study
of various PSI particles and light-harvesting complex
isolated from higher plants. Biochim Biophys Acta,
1187, 324-334(1994).
Vogelmann, T. C., Nishio, J. N., Smith, W. K. Leavesand
light capture light propagation and gradients of carbon
fixation in leaves. Trends Plant Sci 1, 65—70 (1996).
Xiong, J., Fischer, W. M., Inoue, K., Nakahara, M.,
Bauer, С. E. Molecular evidence for the early evolution
of photosynthesis. Science 289, 1724—1730 (2000).
3___________________________________
Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
В предыдущей главе говорилось о том, как
фотоны захватываются антенной и пере-
даются в виде экситонов на реакционные цен-
тры. В этой главе речь пойдет о функциони-
ровании реакционных центров и о том, как
энергия фотонов превращается в химическую
энергию, которая используется клеткой для
различных энергоемких процессов. Как было
сказано в главе 2, фотосинтез растений, ско-
рее всего, эволюционировал из бактериального
фотосинтеза, поскольку основные механизмы
фотосинтетических реакций сходны у растений
и бактерий. Бактерии — удобные объекты для
изучения основных процессов фотосинтеза,
потому что их реакционные центры устроены
проще, чем у растений, и их легче выделять. По
этой причине мы рассмотрим сначала бактери-
альный фотосинтез, а затем поговорим о том,
как фотосинтез происходит у растений.
3.1. Фотосинтетический аппарат
имеет модульную организацию
Фотосинтетический аппарат бактерий состо-
ит из комплексов, которые похожи на компо-
ненты фотосинтетического аппарата расте-
ний. Как будет описано в главе 5, некоторые
из этих комплексов аналогичны компонентам
электрон-транспортной цепи митохондрий.
Эти комплексы можно рассматривать как мо-
дули, сформировавшиеся на ранних этапах
эволюции, которые могут различным образом
комбинироваться для выполнения конкретных
функций. Для удобства рассмотрения основ-
ных функции этих модулей они будут сначала
описаны как «черные ящики»; детализация их
структуры и функций будет дана ниже.
Фотосинтетические реакционные центры
и главные компоненты электрон-транспортной
цепи всегда расположены на мембране. У пур-
пурных бактерий есть только один реакцион-
ный центр (рис. 3.1). В нем энергия поглощен-
ного фотона возбуждает электрон, при этом
молекула хромофора приобретает отрицатель-
ный редокс-потенциал (становится восстано-
вителем). Возбужденный электрон переходит
на первичный акцептор и далее возвращается
к реакционному центру в результате его пере-
дачи по цепи переносчиков, расположенных в
цитохром-A/cj-комплексе. Запасание энергии
происходит за счет сопряжения электронного
транспорта с переносом протонов через мем-
брану. При этом энергия возбужденного элек-
трона переходит в энергию электрохимического
протонного градиента на мембране.
При участии АТФ-синтазы энергия протон-
ного градиента используется для синтеза АТФ
из АДФ и фосфата. В форме АТФ энергия, ко-
торая высвобождается в процессе электронного
транспорта, в дальнейшем используется для син-
теза органических веществ (белков и углеводов).
Так как возбужденный электрон у пурпурных
бактерий всегда возвращается обратно в реак-
ционный центр, электронный транспорт в этом
случае называется циклическим. У пурпурных
бактерий протонный градиент, помимо синтеза
АТФ, используется также для восстановления
НАД+ при участии НАДН-дегидрогеназного
комплекса (см. рис. 3.1). При его работе в дан-
ном случае электроны передаются от восстанов-
ленного соединения (например, органических
кислот или сероводорода) на НАД+. Расход
энергии протонного градиента позволяет сдви-
нуть равновесие в сторону образования восста-
новленного НАДН.
АТФ и НАДН, образованные в результате
бактериального фотосинтеза, используются для
синтеза органических веществ; особенно вели-
ко значение синтеза углеводов из СО2 в цикле
Кальвина (глава 6).
74
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Е
Рис. 3.1. Схема фотосинтетического аппарата пурпурных бактерий. Энергия
поглощенного кванта света (экситона) в реакционном центре переводит
электрон на возбужденный энергетический уровень, что позволяет сдвинуть
редокс-потенциал бактериохлорофилла в более электроотрицательную область.
Электрон возвращается в основное состояние через электрон-транспортную цепь,
включающую цитохром-^/cj-комплекс и цитохром-с. Свободная энергия, которая
высвобождается при этом, запасается в форме электрохимического потенциала
протонов (АцН+), который используется как для синтеза АТФ, так и для передачи
электронов от доноров (например, H2S) на НАДН. У многих пурпурных бактерий
при этом образуются гранулы свободной серы, которые могут далее окисляться до
серной кислоты
НАДН
НАД®+Н®
АТФ
АДФ+Ф
Реакционный центр зеленых серных бак-
терий (рис. 3.2) в общих чертах похож на ре-
акционный центр пурпурных бактерий, что
указывает на возможное происхождение этих
групп организмов от общего предка1. У зеленых
серных бактерий АТФ также образуется в ре-
зультате циклического транспорта электронов.
Электрон-транспортная цепь и АТФ-синтаза,
которые участвуют в этом процессе, также сход-
ны с комплексами пурпурных бактерий. Одна-
ко, в отличие от пурпурных, у зеленых серных
бактерий НАДН образуется в процессе неци-
клического транспорта электронов. В этом
случае возбужденные электроны передаются на
ферредоксин-НАД-редуктазный комплекс,
который восстанавливает НАД+ до НАДН. По-
скольку возбужденные электроны в нецикли-
1 Проблема дискуссионна. Общепринято, что есть два раз-
личных типа реакционных центров, причём у пурпурных и
зелёных серных бактерий они существенно различаются.
Часто считают, что эти реакционные центры имеют различ-
ное эволюционное происхождение. — Прим. ред.
ческом пути не возвращаются в реакционный
центр, возникает дефицит электронов, который
восполняется за счет донора — H2S, который
окисляется до элементарной серы и далее — до
сульфата.
Цианобактерии и растения в качестве доно-
ра электронов в процессе фотосинтеза исполь-
зуют воду (рис. 3.3). При этом образуется моле-
кулярный кислород, поэтому такой фотосинтез
был назван оксигенным. Две фотосистемы (I
и II) в этом случае образуют функциональный
тандем. Фотосинтетический аппарат при окси-
генном фотосинтезе составлен из тех же моду-
лей, которые были описаны для бактериального
фотосинтеза. Реакционные центры ФС II и ФС
I сходны по структуре с реакционными центра-
ми пурпурных бактерий и зеленых серных бак-
терий, соответственно. Ферменты АТФ-синтаза
и ферредоксин-НАДФ-редуктаза также весьма
сходны у растений и фотосинтезирующих бак-
терий. Электрон-транспортная цепь цитохром-
д6/Лкомплекса хлоропластов имеет в прин-
H2s H2so4
Рис. 3.2. Схема фотосинтетического аппарата зеленых серных бактерий. В отличие
от схемы на рис. 3.1, часть электронов, поднявшихся на возбужденный уровень,
передается через электрон-транспортную цепь (ферредоксин-НАД редуктазу) на НАД,
и при этом образуется НАДН. Дефицит электрона, образующийся в реакционном
центре, восполняется за счет доноров электронов, таких как H2S. Как и у пурпурных
серных бактерий, сначала образуются гранулы элементарной серы, которые могут
окисляться до серной кислоты
Ч
н2°	72°2 + 2Н®
Рис. 3.3. В фотосинтетическом аппарате цианобактерий и растений два
реакционных центра, соответствующие по своим функциям фотосинтетическим
реакционным центрам пурпурных и зелёных серных бактерий (рис. 3.1 и 3.2),
расположены последовательно
76
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
ципе примерно такую же структуру, как цепь
цитохром-d/c/-комплекса бактерий.
Для энергетического обеспечения процесса
окисления одной молекулы воды при оксиген-
ном фотосинтезе необходимо четыре экситона:
Н2О + НАДФ+ + 4 экситона */2 О2 + НАДФН + Н+
В процессе нециклического транспорта элек-
троны передаются на НАДФ+, а протоны транс-
портируются через мембрану. При этом генери-
руется протонный градиент, необходимый для
синтеза АТФ. Таким образом, при образовании
одной молекулы НАДФН в процессе оксиген-
ного фотосинтеза одновременно могут синте-
зироваться от 1 до 2 молекул АТФ (раздел 4.4).
Большая часть образующихся АТФ и НАДФН
используется при ассимиляции СО2 и неорга-
нических соединений азота для дальнейшего
синтеза углеводов и аминокислот. Оксигенный
фотосинтез у растений происходит в хлоропла-
стах — клеточных органеллах, относящихся к
пластидам (раздел 1.3).
3.2. В процессе фотосинтеза
образуются окислитель
и восстановитель
В 1920-е годы Отто Варбург предположил, что
энергия света передается на СО2 и углекислый
газ, активированный таким образом, реагирует
с водой с образованием углеводов и выделени-
ем кислорода. В соответствии с этой гипотезой
кислород, выделяющийся при фотосинтезе, об-
разуется из СО2. В 1931 году эта гипотеза была
оспорена Корнелиусом ван Нилем, который
утверждал, что в процессе фотосинтеза образу-
ется восстановитель, который затем реагиру-
ет с СО2. Так называемое уравнение ван Ниля
описывает фотосинтез следующим образом:
СО2 + 2Н2А CUel- [СН2О] + Н2О + 2А
([СН2О] — углеводы).
Ван Ниль предположил, что вещество Н2А
разлагается за счет энергии света на восста-
навливающую компоненту (Н) и окисляющую
компоненту (А). Для оксигенного фотосинтеза у
цианобактерий и растений это уравнение может
быть представлено как:
свет
СО2 + 2Н2О-----► [СН2О] + О2
В соответствии с этим уравнением кислород,
выделяющийся в процессе фотосинтеза, образу-
ется из воды.
В 1937 году Роберт Хилл в Кембридже доказал,
что при фотосинтезе образуется восстановитель.
Он впервые успешно выделил хлоропласты, об-
ладающие частичной фотосинтетической ак-
тивностью, но лишенные интактной наружной
оболочки и содержащие только тилакоидные
мембраны. Когда эти хлоропласты освещали в
присутствии ([Fe(CN)6]3 ), выделение кислорода
сопровождалось восстановлением Fe3+ до Fe2+.
Н2О + 2Fe3+ Свет» 2Н+ + уО2 + 2Fe2+
Поскольку СО2 не участвовал в «реакции
Хилла», этот эксперимент доказывал, что фото-
химическое разложение воды может быть отде-
лено от восстановления СО2. Таким образом,
суммарную реакцию фотосинтетической асси-
миляции СО2 можно подразделить на две реак-
ции.
1, Так называемая световая реакция, в кото-
рой вода окисляется за счет энергии фотона
с образованием сильного восстановителя (в
форме НАДФН) и запасанием химической
энергии (в форме АТФ).
2. Так называемая темновая реакция (глава 6),
в которой происходит ассимиляция СО2 с
использованием восстановительной силы
(НАДФН) и АТФ.
В 1952 году голландский ученый Луис Дюй-
зенс сделал важное наблюдение, которое по-
могло объяснить механизм фотосинтеза. При
освещении изолированных мембран пурпур-
ных бактерий Rhodospirillum rubum короткими
вспышками происходило снижение поглоще-
ния света при 890 нм, но оно немедленно вос-
станавливалось при помещении бактерий в тем-
ноту. Аналогичный эффект «выцветания» при
870 нм был обнаружен у пурпурных бактерий
Rhodobacter sphaeroides. Позже Бессил Кок в
США и Хорст Витт в Германии также обнару-
жили выцветание пигментов при 700 и 680 нм
в хлоропластах. Эффект выцветания был соот-
несен с первичной реакцией фотосинтеза, а со-
ответствующие пигменты реакционных центров
были названы Р870 (у Rh. sphaeroides), Р680 и Р700
(в хлоропластах). При добавлении окислителя
(например, [Fe(CN)6]3 ) эффект выцветания
достигался не только на свету, но и в темноте.
3.3. Основная структура фотосинтетического реакционного центра
77
Эти результаты показали, что изменения в по-
глощении пигментов были обусловлены ре-
акцией восстановления. Так было впервые
показано, что хлорофилл может быть окислен.
Измерения электронного парамагнитного ре-
зонанса выявили образование радикалов при
«выцветании». «Выцветание» наблюдается даже
при очень низких температурах — при 1 °К. Это
свидетельствует о том, что участники реакции,
приводящей к формированию радикалов, рас-
положены настолько близко, что тепловые ко-
лебания, которые обычно имеют большое зна-
чение для химической реакции, в этом случае не
являются необходимым условием окислительно-
восстановительного процесса. Спектральные
измерения показали, что участники первичной
окислительно-восстановительной реакции —
пара близко расположенных молекул хлорофил-
ла, которые получили название «специальной
пары».
3.3. Основная структура
фотосинтетического
реакционного центра была
расшифрована с помощью
рентгено-структурного анализа
Реакционные центры пурпурных бактерий
оказались чрезвычайно удобными объектами
для изучения структуры и функции фотосин-
тетического аппарата. Важный этап в изучении
фотосинтеза ознаменовала разработка амери-
канским ученым Родериком Клейтоном в 1970
году метода выделения реакционных центров
пурпурных бактерий. Анализ компонентов ре-
акционных центров различных пурпурных
бактерий (в табл. 3.1 приведены данные для
бактерии Rh. sphaeroides) показал, что реакци-
онные центры всех исследованных видов имеют
одну и ту же базовую структуру. Минимальная
структура включает в себя три субъединицы: L,
Таблица 3.1. Состав реакционного центра Rhodobacter sphaeroides (Р870)
1 субъединица L
1 субъединица М
1 субъединица Н
4 бактериохлорофилла-а
2 бактериофеофитина-а
2 убихинона
1 белок, содержащий негеминовое железо
1 каротиноид
Молекулярная масса
21 кДа
24 кДа
28 кДа
Рис. 3.4. Бактериохлорофилл-а
78
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Рис. 3.5. Убихинон. Длинная изопреноидная цепь придает веществу липофильные
свойства
М и Н (light, medium, heavy). Субъединицы L
и М — гомологичные пептиды со сходной ами-
нокислотной последовательностью. Реакци-
онный центр Rh. sphaeroides содержит четыре
бактериохлорофилла-я (Бхл-я, рис. 3.4) и два
бактериофеофитина-я (Бфео-я). Феофитины
отличаются от хлорофиллов отсутствием цен-
трального атома магния. Реакционный центр
содержит также атом железа, который не вхо-
дит в состав гема, и поэтому называется неге-
миновым железом, и две молекулы убихино-
на (рис. 3.5), которые обозначают как QA и QB.
Убихинон Qa прочно связан с реакционным
центром, тогда как QB лишь слабо ассоцииро-
ван с ним.
Рентгеновская структура
фотосинтетического реакционного центра
В случае если из белка могут быть получены
упорядоченные кристаллы, пространственную
структуру белковой молекулы можно изучать с
помощью рентгеноструктурного анализа. [Про-
странственная структура кристаллических мо-
лекулярных слоев может быть также изучена ме-
тодом электронной криомикроскопии (раздел
2.4), но использование этого метода требует зна-
чительных материальных затрат.] При исполь-
зовании рентгеноструктурного анализа образец
облучают рентгеновскими лучами. Электроны
в атомах молекул вызывают рассеяние рентге-
новских лучей. Когда лучи проходят через регу-
лярно повторяющуюся структуру, наблюдается
дифракция лучей. Суммарная дифракционная
картина фиксируется на рентгеновской пленке,
помещенной позади кристалла, или регистриру-
ется каким-либо другим детектором. Принцип
метода представлен на рис. 3.6. Для того чтобы
получить максимальное количество изображе-
ний с разных сторон, кристалл, помещенный в
капилляр, вращают. Для получения одного на-
бора данных необходимо от нескольких десятков
до нескольких сотен облучений, в зависимости
от формы кристалла и размера решетки кристал-
ла. Для установления ранее неизвестной струк-
туры белка требуется несколько наборов данных,
в том числе белка со связанным или встроенным
Пленка
Источник
рентгеновских
лучей
Кристалл белка
в капилляре
Вращение
Проявление
Рис. 3.6. Метод рентгеноструктурного анализа белкового кристалла. Капилляр,
содержащий кристалл, медленно вращается, а дифракционная картина фиксируется
на рентгеновской пленке. В настоящее время вместо пленок используются более
современные регистрирующие системы. Дифракционная картина, представленная
здесь, была получена в результате структурного анализа реакционного центра Rh.
sphaeroides (с любезного разрешения Н. Michel, Франкфурт)
3.3. Основная структура фотосинтетического реакционного центра
79
Рис. 3.7. Детергент N,N-ди мети л додецил амин-	СН3
N] ОкГСИП	О ' ®	^*СН2\	^*СН2\	^СН2\	^СН2\ .xCHq
IN-оксид	Q_N_CH/" 2^СН2^ СН£^ 2 СН^ 2 СН2^ СН< 3
СНз
Л/,Л/-диметилдодециламин-Л/-оксид
в белковую молекулу ионом тяжелого металла.
С помощью специальных компьютерных про-
грамм, исходя из правил рассеяния рентгенов-
ских лучей атомами с различной электронной
плотностью, реконструируют пространственную
структуру изучаемого белка.
Рентгеноструктурный анализ требует значи-
тельных технических возможностей и временных
затрат, но обычно ограничивающим фактором
в установлении пространственной структуры
становится получение образцов кристаллов, при-
годных для анализа. До 1980 года считалось, что
кристаллы, пригодные для рентгеноструктурного
анализа, невозможно приготовить из гидрофоб-
ных мембранных белков. Применение детергента
^ЬГ-диметилдодециламин-ТЧ-оксида (рис. 3.7)
позволило решить эту проблему. Этот детергент
образует растворимые в воде мицеллы, содержа-
щие искомый белок, которые могут быть кристал-
лизованы при добавлении сульфата аммония или
полиэтиленгликоля. Мицеллы образуют регуляр-
ные решетки в кристаллах (рис. 3.8). Белок в кри-
сталле остается в своем нативном состоянии, так
как его гидрофобные участки, которые обычно
граничат с гидрофобной мембраной, покрыты
гидрофобными цепями детергента.
Мембранный белок
Кристаллизация
Рис. 3.8. Мицеллы образуются
после солюбилизации1 детергентом
мембранного белка. Гидрофобный
участок мембранного белка, а также
липиды мембраны и детергент
обозначены черным, гидрофильные
участки — красным. Кристаллические
структуры могут быть образованы
за счет ассоциации гидрофильных
областей мицелл детергента. (’ Мицеллы
из белка и детергента не образуют
истинного раствора в воде, поэтому
переведение в водную фракцию
называют солюбилизацией (от solution —
раствор}. — Прим, ред.}
Кристаллическая структура мицелл с детергентом
80
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Используя этот метод, Хармут Михель из
Мюнхена успешно получил кристаллы реак-
ционного центра пурпурной бактерии Rho-
dopseudomonas viridis и совместно со своим
коллегой Иоганном Дайзенхофером из отдела
Роберта Хубера провел рентгеноструктурный
анализ этих кристаллов. Можно представить,
насколько трудоемкими были эти исследования,
если учесть тот факт, что только обработка по-
лученных данных заняла два с половиной года.
Так впервые была получена трехмерная струк-
тура мембранного белка. За эту работу Михель,
Дайзенхофер и Хубер получили Нобелевскую
премию по химии в 1988 г. Этим же методом был
изучен реакционный центр Rh. sphaeroides, и
оказалось, что принципиальные структуры ре-
акционных центров у этих бактерий на удивле-
ние сходны.
Реакционный центр Rhodopseudomonas
viridis имеет симметричную структуру
На рисунке 3.9 изображена трехмерная струк-
тура реакционного центра пурпурной бактерии
Rhodopseudomonas viridis. Он имеет цилиндри-
ческую форму и достигает в длину примерно
8 нм. Гомологичные субъединицы L (изображе-
на красным цветом) и М (изображена черным)
расположены симметрично и включают моле-
кулы бактериохлорофилла и бактериофеофити-
на. Субъединица Н прикреплена как крышка к
нижней части цилиндра.
На рисунке 3.10 показано расположение
хромофоров в реакционном центре; белковый
комплекс показан в той же проекции, что и на
рис. 3.9. Все хромофоры расположены парами,
разделенными осью симметрии. Две молекулы
Бхл-л (Dm, Dl) расположены в верхней части
комплекса. Два тетрапиррольных кольца на-
столько сближены (0,3 нм), что в возбужденном
состоянии их орбитали перекрываются. Этот
факт подтвердил гипотезу о существовании «спе-
циальной пары» молекул бактериохлорофилла,
в которой происходят первичные окислитель-
но-восстановительные процессы фотосинтеза.
Гипотеза была выдвинута на основании спек-
троскопических исследований. Хромофоры, ко-
Рис. 3-9- Стереопара трехмерной структуры реакционного центра Rh. viridis.
Пептидная цепь субъединицы L обозначена красным, субъединицы Н — белым,
а субъединицы М — черным. Полипептидные цепи изображены в форме лент, а
хромофоры (бактериохлорофиллы, бактериофеофитины) и хиноны изображены
в виде проволочных моделей. Верхняя часть реакционного центра граничит с
периплазматическим компартментом, а нижняя — с цитоплазмой
(с любезного разрешения Н. Michel и R.C.R.D. Lancaster, Франкфурт). О том, как
рассматривать стереоизображение, см. подпись к рис. 1.29)
3.4. Как функционирует реакционный центр
81
Рис. 3.10. Стереопара трехмерного расположения хромофоров и хинонов
в реакционном центре Rh. viridis. Проекция относится к структуре, представленной
на рис. 3.9. Пара БХл-д DMDL (см. в тексте) изображена красным цветом
(с любезного разрешения Н. Michael и R.C.R.D. Lancaster, Frankfun. Изображения
для рис. 3.9 и 3.10 были подготовлены Р. Kraulis, Uppsala, с помощью программы
MOLSCROPT)
торые могут участвовать в передаче электрона от
специальной пары, образуют две практически
идентичные ветви, каждая из которых включает
в себя мономер Бхл-д (ВА, Вв) и Бфео (ФА, Фв).
В то время как пара бактериохлорофиллов (DM,
Dl) связана с обеими субъединицами L и М,
бактериохлорофилл ВА и бактериофеофитин ФА
связаны с субъединицей L, а Вв и Фв — с субъе-
диницей М. Хинонное кольцо QA связано водо-
родными связями и гидрофобными взаимодей-
ствиями с субъединицей М, а слабо связанный
QB ассоциирован с субъединицей L.
3.4.	Как функционирует
реакционный центр
Анализ структуры фотосинтетического аппара-
та и изучения кинетики фотосинтеза позволили
детально описать функционирование бактери-
ального реакционного центра. Исследование ки-
нетики включало спектроскопические измерения
поглощения и флуоресценции после вспышек
света длительностью менее 1013 с, а также изме-
рения ядерного магнитного и электронного пара-
магнитного резонансов. Хотя реакционный центр
имеет симметричное строение с практически
идентичными ветвями хромофоров, транспорт
электронов идет только по одной из ветвей (пра-
вой на рис. 3.10) — расположенной на субъедини-
це L. Мономер бактериохлорофилла (Вв) на сто-
роне М находится в тесном контакте с молекулой
каротиноида, которая обезвреживает опасные
триплетные состояния бактериохлорофилла ре-
акционного центра (разделы 2.3 и 3.7). Функции
бактериофеофитина Фв и негеминового железа
на субъединице М пока не до конца ясны.
На рисунке 3.11 приведена схема реакци-
онного центра, на которой участники реакции
расположены в соответствии со своим электро-
химическим потенциалом. В результате первич-
ной реакции с участием экситона, приходящего
с антенны (раздел 2.4), пара бактериохлорофил-
лов переходит в возбужденное состояние. Пер-
вичное возбужденное состояние (S0 имеет
очень короткое время полужизни, очень быстро
происходит разделение зарядов и затем, благо-
даря большому перепаду электрохимического
потенциала, электрон за несколько пикосекунд
передается на бактериофеофитин, который при
этом восстанавливается.
(Бхл)2 + 1 экситон (Бхл)*
(Бхл)*+ Бфео (Бхл)2+* + Бфео-*.
Возможно, электрон сначала передается на мо-
номер бактериохлорофилла (ВА), а затем на фео-
фитин (ФА). Процесс второй передачи электрона
происходит за 0,9 пс, т.е. примерно в четыре раза
быстрее, чем передача на ВА. Радикал бакте-
риофеофитина имеет тенденцию возвращаться
в основное состояние (So), отдавая полученный
электрон обратно на ВА. Чтобы предотвратить
82
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Рис, 3-11 - Схема циклического электронного транспорта в процессе фотосинтеза
Rh. sphaeroides. Возбужденное состояние, обозначенное звездочкой, приводит
к разделению зарядов; электрон передается через бактериофеофитин, хиноны
Qa и Qb и цитохром-Ь/сх-комплекс к положительно заряженному радикалу
бактериохлорофилла. Q — хинон, Q-* — семихинон-радикал, QH2— гидрохинон
это, в течение 200 пс электрон передается с ради-
кала бактериофеофитина на хинон (QA) с боль-
шим перепадом потенциала (см. рис. З.П). При
этом образуется радикал семихинона, который
передает электрон дальше по градиенту потен-
циала слабо связанному убихинону QB. В резуль-
тате образуется убисемихинон; после передачи
второго электрона образуется убигидрохинон
(рис. 3.12). В отличие от лабильных интермедиа-
тов радикальной природы, описанных выше,
убигидрохинон — стабильный переносчик. Но
эта стабильность дорого обходится: при передаче
электрона от первичного возбужденного состоя-
ния бактриохлорофилла до стабильного убиги-
дрохинона более половины энергии экситона
рассеивается в виде тепла.
Наличие в молекуле убихинона (см. рис. 3.5)
гидрофобной изопреноидной боковой цепи де-
лает его хорошо растворимым в липидной фазе
фотосинтетической мембраны. Изопреноидная
цепь в молекуле бактериохлорофилла взаимо-
действует с гидрофобными радикалами амино-
кислот, входящих в состав белковых субъединиц
реакционного центра (раздел 2.2). В отличие от
бактериохлорофилла, бактериофеофитина и QA,
прочно связанных с белками, убихинон рвлишь
3.4. Как функционирует реакционный центр
83
Семихинон-
радикал
(Q®)
Гидрохинон
(QH2)
Рис. 3-12- Одноэлектронное восстановление
хинона приводит к образованию семихинон-
радикала. При дальнейшем восстановлении
образуется гидрохинон
Экситон
Рис- 3-13- Циклический транспорт электрона при
фотосинтезе (аналогия электрической цепи)
слабо ассоциирован с реакционным центром и
может заменяться другим убихиноном. Убиги-
дрохинон, оставаясь в липидной фазе, может
быстро диффундировать в мембране, поэтому он
выполняет функцию мобильного окислительно-
восстановительного агента. Он передает элек-
троны на цитохром-£/С]-комплекс, который
также расположен в мембране; затем электро-
ны передаются обратно в реакционный центр
через цитохром-с. Энергия, высвобожденная в
процессе транспорта электронов, запасается в
форме протонного градиента (раздел 4.1), кото-
рый используется для синтеза АТФ. Структура
и механизм работы цитохром-/?/<?!-комплекса и
АТФ-синтазы будет описан в разделе 3.7 и в гла-
ве 4, соответственно.
В целом циклический электронный транс-
порт у пурпурных бактерий можно рассматри-
вать как простую электрическую схему, изобра-
женную на рис. 3.13. Пара бактериохлорофиллов
и бактериофеофитин, между которыми электрон
передается с затратой энергии света, могут быть
рассмотрены как две пластинки конденсато-
ра, между которыми генерируется напряжение,
движущая сила тока электронов. Значительная
часть энергии электрона рассеивается в тепло
при падении напряжения в резисторе. Генера-
тор использует оставшееся напряжение для пре-
образования в химическую форму энергии.
3.5.	У водорослей и растений два
фотосинтетических реакционных
центра функционируют в тандеме
Квантовая затрата (количество поглощенных
фотонов на молекулу О2), равная примерно
восьми, была определена для фотосинтетиче-
ского окисления воды у зеленых водорослей
(раздел 2.4). В настоящее время вместо кван-
товой затраты обычно используют обратную
величину — квантовый выход (количество
молекул на поглощенный фотон). Исследова-
ния зависимости квантового выхода от длины
волны света облучения (спектр действия) пока-
зали, что квантовый выход очень резко падает,
когда водоросли освещают красным светом с
длиной волны более 680 нм (рис. 3.14). Сначала
этот эффект, получивший название «красного
падения», оставался необъясненным, так как
водоросли содержат хлорофилл, полощающий
свет при 700 нм. Роберт Эмерсон и его коллеги
решили эту проблему в 1957 г., когда они на-
блюдали резкое возрастание квантового выхода
на участке спектра с длиной волны более 680 нм
при одновременном облучении оранжевым све-
84
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Рис. 3.14. Квантовый выход выделения О2
у зелёной водоросли (Chlorella) в зависимости от
длины волны действующего света. Верхняя кривая
при дополнительном освещении светом с длиной
волны 650 нм (по Emerson и Rabinowitch)
том (650 нм). Квантовый выход был выше, чем
сумма квантовых выходов при облучении све-
том разных длин по отдельности.
Открытие эффекта Эмерсона привело уче-
ных к заключению, что у зеленых водорослей
(а также у цианобактерий и высших растений)
в процесс фотосинтеза вовлечены два различ-
ных реакционных центра. В I960 г. Роберт Хилл
и Фэй Бендалл предложили схему реакций
(рис. 3.15), в которой два реакционных центра
функционируют в тандеме и связаны электрон-
транспортной цепью, включающей цитохромы-/>6
и -f (цитохром-/— это цитохром с-типа; см. раз-
дел 3.7). Диаграмма, на которой переносчики
электронов расположены в соответствии со сво-
им окислительно-восстановительным потенциа-
лом, имеет форму зигзага и поэтому получила
название Z-схемы. Нумерация фотосистем от-
ражает порядок их отрытия. Фотосистема II
(ФС II) может использовать свет с длиной волны
не более 680 нм, тогда как фотосистема I (ФС I)
может использовать свет с длиной волны до
700 нм. Фотосистема II образует очень сильный
окислитель, который необходим для окисления
воды, а фотосистема I образует сильный вос-
становитель, который восстанавливает НАДФ+
(см. рис. 3.3).
На рисунке 3.16 представлен путь транспорта
электрона через фотосинтетические комплек-
сы; переносчики электронов расположены по
Рис. 3.15. Z -схема фотосинтеза растений. Электроны передаются двумя
фотосистемами, функционирующими в тандеме, от воды к НАДФ+, и в результате
электронного транспорта синтезируется АТФ. Количество образующейся АТФ
точно неизвестно, но предположительно оно составляет между 2 и 3 молекулами на
4 экситона, захваченные в каждом из реакционных центров (раздел 4.4)
3.5. У водорослей и растений два фотосинтетических реакционных центра функционируют в тандеме 85
Вольт
2НАДФ®+2Н®
воссту
2 НАДФН
ОКИСЛ
Фотосистема II
Рис, 3-16- Схема нециклического электронного транспорта у растений.
Редокс-компоненты расположены в соответствии со своим окислительно-
восстановительным потенциалом и местом в том или ином комплексе,
участвующем в электронном транспорте. Звездочка обозначает возбужденное
состояние. Поглощение 4 экситонов происходит последовательно (по одному).
Электронный транспорт между комплексом фотосистемы II и цит-^/^комплексом
осуществляется пластогидрохиноном (PQH2), который окисляется цит-^/f-
комплексом до пластохинона (PQ). Электроны передаются с цит-^/^комплекса в
фотосистему I через пластоцианин (Пц). От возбужденного Р700 электрон поступает
на филлохион через хлорофилл а695 (на схеме не показан). Та же последовательность
реакций имеет место и у цианобактерий, только вместо пластоцианина второй
перенос электрона между комплексами осуществляет цитохром-с. Подробности см.
на рис. 3.18 и 3.31
градиенту электрохимического потенциала, как
на рис. З.П. На рисунке 3.17 показано, каким
образом фотосинтетические комплексы рас-
положены в тилакоидной мембране. Разность
потенциалов между реакциями окисления воды
и восстановления НАДФ+ составляет примерно
1,2 В. Суммарная энергия, которая достигается
при поглощении двух фотонов (680 и 700 нм),
эквивалентна разности потенциалов 3,45 В (раз-
дел 2.2, уравнение 2.7). Таким образом, лишь
около трети энергии фотонов, поглощенных
двумя фотосистемами, используется для пере-
носа электронов от воды к НАДФ+. Кроме того,
около 1/8 части световой энергии, поглощен-
ной фотосистемами, запасается за счет пере-
носа протонов в люмен тилакоидов при участии
фотосистемы II и цитохром-£6/Лкомплекса (см.
рис. 3.17). Этот процесс приводит к формиро-
ванию протонного градиента между люменом
и стромой. АТФ-синтаза, также расположенная
в тилакоидной мембране, использует энергию
протонного градиента для синтеза АТФ.
Таким образом, примерно половина энергии
света, поглощенного двумя фотосистемами, не
используется для совершения химической рабо-
ты, а рассеивается в тепло. Значение тепловых
86
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Рис. 3.17. Схема расположения фотосинтетических комплексов и Н+-АТФ-
синтазы в тилакоидной мембране. Электронный транспорт между комплексом
фотосистемы II и цит-£6/Лкомплексом осуществляется пластогидрохиноном
(PQH2), а между цит-^/^комплексом и ФС I — пластоцианином (Пц). Окисление
воды происходит на люменальной стороне мембраны, а образование НАДФН
и АТФ — на стромальной стороне. Электрохимический градиент протонов,
накопленных в люмене, является движущей силой синтеза АТФ. Количество
протонов, переносимых в люмен в процессе электронного транспорта и затраты
протонов на синтез АТФ пока точно неизвестны (раздел 4.4)
потерь энергии при фотосинтетическом элек-
тронном транспорте было обсуждено в преды-
дущем разделе.
3.6.	Окисление воды происходит
в фотосистеме II
Несколько лет назад группы ученых под руко-
водством Норста Витта и Вольфганга Сэнжера в
Берлине исследовали трехмерную структуру ФС
II, проводя рентгеноструктурный анализ кри-
сталлов ФС II термофильной цианобактерии
Synechococcus elongatis. В результате этой рабо-
ты было установлено, что ФС II построена по
тем же принципам, что и реакционные центры
пурпурных бактерий (раздел 3.4). Эти данные,
вместе с результатами анализа аминокислотной
последовательности, указывают на наличие
общей предковой формы. ФС II также содер-
жит пару молекул Хл-я, хотя расстояние между
ними настолько велико, что, вероятно, в реак-
цию в экситоном вступает лишь одна из них.
3.6. Разложение воды происходит в фотосистеме II
87
Две ветви, каждая из которых включает Хл-я и
феофитин, связаны с центральной парой так
же, как у пурпурных бактерий (см. рис. 3.10). У
цианобактерий, по-видимому, также лишь одна
из двух ветвей участвует в транспорте электро-
нов.
При возбуждении Р680 электрон передается
через мономер Хл-я на феофитин, а оттуда — на
прочно связанный пластохинон (QA) с образо-
ванием семихинон-радикала (рис. 3.18). Далее
этот электрон передается на слабо связанный
пластохинон (QB). Пластохинон (PQ) (рис. 3.19)
принимает два электрона и два протона один
за другим, и при этом восстанавливается до ги-
дрохинона (PQH2). Гидрохинон освобождается
из фотосинтетического комплекса и может рас-
сматриваться как конечный продукт фотосисте-
мы II. Эта последовательность событий, вклю-
чающая передачу отдельного электрона между
(Хл-я)2 и QA и транспорт двух электронов между
Qa и Qb> соответствует последовательности ре-
акций, установленной для Rh. sphaeroides (см.
рис. 3.11). Единственное различие заключается
в том, что хиноны бактерий относятся к убихи-
нонам и менахинонам, а хиноны фотосистемы
II — к пластохинонам.
Как бы то ни было, сходство реакционных
центров ФС II и фотосистемы пурпурных бак-
терий относится только к акцепторной части.
Функции донора электронов в ФС II карди-
нально отличаются от таковых у пурпурных
бактерий. Дефицит электрона в паре (Хл-я)2+в,
образовавшийся в процессе нециклического
электронного транспорта, компенсируется за
Рис. 3-18- Схема фотосинтетического электронного транспорта в комплексе
фотосистемы 11. Возбуждение при поглощении фотона приводит к передаче по цепи
одного электрона. Образующийся при этом радикал хлорофилла с положительным
зарядом восстанавливается за счет остатка тирозина, а тот, в свою очередь,
за счет четырех атомов марганца, участвующих в окислении воды (рис. 3.20).
Отрицательный заряд хлорофилла передается далее на феофитин (Фео) и хинон QA,
на пластохинон QB
88
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Пластохинон
Рис, 3-19- Пластохинон
счет электронов, полученных при окислении
воды. Катионы марганца и остатки тирозина
участвуют в транспорте электронов от воды к
хлорофиллу. Радикал (Хл-я)2+* с окислительно-
восстановительным потенциалом примерно
+ 1,1 В является настолько сильным окислите-
лем, что он способен отнять электрон у остатка
тирозина в составе белка реакционного центра;
при этом образуется радикал тирозина. Обыч-
но тирозин, участвующий в этой реакции, обо-
значают как Z. Дефицит электрона в радикале
тирозина компенсируется за счет окисления
ионов марганца (рис. 3.20). Комплекс ФС II со-
держит четыре иона марганца, расположенных
близко друг к другу. Эта группа ионов марган-
ца получила название марганцевого класте-
ра. Марганцевый кластер представляет собой
редокс-систему, которая может отдавать после-
довательно четыре электрона акцептору и за-
тем отбирать их у донора. При этом ионы Мп,
очевидно, могут находиться в состояниях Мп3+
и Мп4+.
Чтобы образовать в процессе окисления воды
одну молекулу О2, реакционный центр должен
передать четыре электрона, а значит, получить
четыре экситона. Временной промежуток между
захватами отдельных экситонов реакционным
центром зависит от интенсивности освещения.
Если бы окисление воды проходило ступенчато,
возможно было бы образование в качестве про-
межуточных продуктов радикальных форм кис-
лорода, особенно при низких интенсивностях
света. Радикальные формы кислорода разрушают
биомолекулы, такие, как липиды и белки (раз-
дел 3.10). Механизм разложения воды в Мп кла-
стере минимизирует образование кислородных
радикалов, снабжая реакционный центр через
тирозин четырьмя электронами один за другим
(см. рис. 3.20). Марганцевый кластер в процессе
перехода к основному состоянию (So) проходит
четыре последовательных редокс-состояния (ко-
торые обозначаются, соответственно, как S]_4).
Эксперименты Пьера Джолиота и Вессела
Кока доказали, что система окисления воды мо-
жет находиться в пяти состояниях, включая So
(рис. 3.21). Когда хлоропласты, которые держали
в темноте, затем освещали серией вспышек све-
та, наблюдали колебания выделения кислорода.
После первых двух вспышек выделения кис-
лорода практически не происходило, оно было
максимальным после трех вспышек, затем после
следующих четырех вспышек, и т. д. При возрас-
тании количества вспышек, однако, происходило
Рис- 3.20. Механизм окисления
воды в фотосистеме 11.
М означает кластер, состоящий из
четырех атомов марганца. Атомы
марганца находятся в разных
состояниях (которые обозначаются,
соответственно, как So и Sj_4).
Кластер функционирует как редокс-
единица и поставляет один за другим
четыре электрона в реакционный
центр ФС 11. Дефицит четырех
электронов восполняется за счет
разложения 2 Н2О до О2 и 4 Н+.
М означает (4 Мп)п+, М+ означает
(4 Мп)(п+1)+, и т. д.
3.6. Разложение воды происходит в фотосистеме II
89
Рис. 3.21. Количество кислорода, выделенное
хлоропластами в зависимости от числа вспышек
света. Хлоропласты, прединкубированные
в темноте, освещали импульсами длительностью
2 мкс с перерывом 0,3 с (по Forbush, Kok
и McGoild, I97l)
12	16	20
Число вспышек
все большее сглаживание колебаний. Это можно
объяснить тем, что не все вспышки возбужда-
ют реакционные центры, поэтому происходит
десинхронизация осцилляций. В хлоропластах,
выдержанных в темноте, водоокисляющий ком-
плекс переходит в Sj состояние. После того, как
система достигает четвертого редокс-состояния,
высвобождается молекула О2, и система воз-
вращается в основное состояние (So). Протоны,
высвобождающиеся при окислении воды, посту-
пают в люмен тилакоидов. Эту реакцию можно
записать так:
2 Н2О-> 4Н++ 2О2
2О2 + М4МО2+ М
Образно говоря, четыре электрона, необхо-
димые реакционному центру, берутся «взаймы»
у Mn-кластера и затем разом возвращаются к
ионам марганца при окислении воды до кисло-
рода. Таким образом Mn-кластер минимизирует
вероятность образования кислородных радика-
лов в фотосистеме II. Несмотря на эту «систему
безопасности», в ФС II, по-видимому, образу-
ется достаточно радикалов, чтобы повреждать
белки комплекса; последствия этого процесса
будут описаны в разделе 3.10.
Комплекс фотосистемы II очень сходен
с реакционным центром пурпурных
бактерий
Фотосистема II — комплекс, состоящий
как минимум из 17 различных субъединиц
(табл. 3.2), из которых только две непосред-
ственно входят в состав реакционного цен-
тра. Функции нескольких субъединиц до сих
пор не установлены. На рис. 3.22 изображены
только те субъединицы, функции которых из-
вестны. Комплекс ФС II окружен антенной,
состоящий из светособирающих комплексов
(см. рис. 2.13).
В центре комплекса ФС II находится гетеро-
димер, состоящий из двух белковых субъединиц
Dj и D2. С этими белками связаны шесть Хл-я,
два феофитина, два пластохинона и одна или
две молекулы p-каротин. Белки D] и D2 гомоло-
гичны друг другу и белкам L и М реакционного
центра пурпурных бактерий (раздел 3.4). Как и
у бактерий, только та из молекул феофитина,
которая связана с белком Dh участвует в транс-
порте электрона. С другой стороны, QA в ФС II
связан с белком D2, a QB — с белком Dr Мар-
ганцевый кластер, очевидно, связан с обоими
белками. Тирозин Z, который участвует в пере-
даче электрона, входит в состав белка DP Субъе-
диница MSP (Manganese stabilizing protein) ста-
билизирует Mn-кластер. Внутреннюю антенну,
изображенную на рис. 2.10, образуют СР 43 и
СР 47 (СР значит chlorophyll protein). С каждой
из субъединиц связано примерно 15 молекул
хлорофилла, которые образуют СР 43 и СР 47 с
двух сторон окружают комплекс Dj-D2. Цитох-
ром /?559, по-видимому, не участвует в транспор-
те электрона в ФС II; возможно, его функции
связаны с защитой комплекса ФС II от фотоде-
струкции.
90	3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Таблица 3.2. Белки фотосистемы II (неполный список)				
Белок	Молекулярная масса, кДа	Локализация	Кодирование	Функция
D,	32	в мембране	хлоропласт	связывание Р680, Фео, QB, Туг, Мп- кластера
d2	34	-//-	-//-	связывание Р680, Фео, QA, Мп- кластера
СР47	47	-//-	-Ц-	коровая антенна, контакт с перифе- рической антенной ССК
СР43	43	-н-	—п—	-п—п-
ЦИТ-Ь559а	9	-п-	-п-	связывание гема, защита ФС II от повреждений светом
ЦиТ-ЬзБдр	4	—п—	—п—	-//-
Марганец- стабилизирующий белок	33	перифери- ческая (в люмене)	ядро	стабилизация Мп-кластера
Р	23	—//—	-//-	?
Q	16	—и—	-//-	?
R	10	периферичес- кая: строма	-п-	?
(noVermaas, 1993)
Комплекс фотосистемы II
Рис. 3.22. Схематическое изображение комплекса фотосистемы II. Схема построена
на основании данных структурного анализа, проведенного сотрудничающими
группами Witt и Saenger (Берлин), а также на исследованиях связывания хинона с
субъединицами D1 и D2, которые гомологичны субъединицам L и М пурпурных
бактерий. Оказалось, что в структуре ФС II и реакционного центра пурпурных
бактерий много общего. См. также табл. 3.2. Две коровые антенны СР43 и СР47
фланкируют D1-D2 комплекс (не показано на рисунке)1
Р Приведены устаревшие данные о строении комплекса фотосистемы II. См.
примечание к рис. 2.13. — Прим, ред.]
3.6. Разложение воды происходит в фотосистеме II
91
Белок D] комплекса ФС II имеет высокую
скорость оборота; он постоянно обновляется
(время его полужизни составляет около 30 ми-
нут). Очевидно, этот белок быстро выходит из
строя из-за повреждающего действия кислород-
ных радикалов, которые образуются, несмотря
на защитные механизмы. Показано, что Dj за-
меняется после 106—107 каталитических циклов
в реакционном центре ФС II.
Некоторые соединения, по структуре сход-
ные с пластохинонами, могут блокировать сайт
связывания пластохинонов белка Db вызывая
остановку транспорта электронов при фотосин-
тезе. Такие соединения используют как герби-
циды. Прежде чем детально разбирать эффект
этих веществ, мы рассмотрим некоторые общие
вопросы, связанные с применением гербици-
дов.
Механизированное сельское хозяйство
обычно требует применения гербицидов
На гербициды расходуется примерно половина
средств, которые тратятся в мире на вещества
для зашиты растений. Высокая стоимость тру-
да — одна из основных причин использования
гербицидов в сельском хозяйстве. Проше и де-
шевле избавляться от сорняков, обрабатывая
поля гербицидами, чем использовать для этой
цели ручной труд. Контроль за сорными рас-
тениями необходим не только потому, что уро-
жай снижается из-за конкуренции культурных
растений с сорняками, но также потому, что
сорняки затрудняют механизированный сбор
урожая. Поля, лишенные сорняков, — необхо-
димое условие механизированного земледелия.
В качестве гербицидов используют вещества,
малотоксичные для человека и животных, но
блокирующие реакции, необходимые для жиз-
ни растений. Большое количество гербицидов
(конкретные примеры будут даны в конце этого
раздела) ингибируют ФС II, являясь антагони-
стами пластохинонов. Молекулы гербицидов
должны связаться с большей частью реакцион-
ных центров каждого растения. Для эффектив-
ного воздействия используют от 125 до 4000 г
гербицида на гектар.
С целью уменьшить количество гербицидов,
необходимое для эффективной обработки, были
разработаны новые гербициды, блокирующие
определенные биосинтетические процессы, на-
пример, синтез жирных кислот, определенных
аминокислот, каротиноидов, хлорофилла. Есть
также гербициды, действующие подобно фито-
гормонам или ингибиторам митоза. Некоторые
из них эффективно действуют в количестве 5 г
на гектар.
Одни гербициды поступают в растение толь-
ко через корни, другие — через листья. Напри-
мер, чтобы освободить железнодорожные пути
от сорняков, применяют неселективные герби-
циды, которые уничтожают любую раститель-
ность. Для таких целей часто используют герби-
циды, которые не разлагаются и накапливаются
в корнях или в молодых побегах. Неселективные
гербициды также используют в сельском хозяй-
стве (например, для уничтожения сорняков на
плантации цитрусовых), но в этом случае герби-
циды проникают только в листья травянистых
растений, но не в листья цитрусовых, покрытые
толстой кутикулой. В этом случае гербициды
распыляют на уровне земли.
Особенный интерес представляют селектив-
ные гербициды, которые уничтожают только
сорные растения и затрагивают жизнедеятель-
ность культурных растений лишь в минималь-
ной степени (разделы 12.2 и 15.3). Селективность
может быть обусловлена несколькими причина-
ми, такими, как различия в поступлении гер-
бицидов в ткани растения, в чувствительности
метаболизма разных растений к этим соедине-
ниям, в способности растений к детоксикации
гербицида. Важнейший механизм детоксикации
растениями гербицидов и других инородных
веществ (ксенобиотиков) — включение в них
гидрокисильной группы при участии фермента
Р-450-монооксигеназы и образование глутатио-
новых конъюгатов (раздел 12.2). Селективные
гербициды имеют важное преимущество перед
неселективными: их можно использовать тогда,
когда посевы уже взошли, и высохшие сорняки
образуют мульчирующий слой, который сохра-
няет воду в почве и защищает ее от эрозии.
В некоторых случаях применение герби-
цидов привело к появлению среди растений
гербицид-устойчивых мутантов (раздел 10.4).
В программах гибридизации с использованием
этих мутантов были получены сорта, устойчи-
вые к гербицидам. Однако эти результаты полу-
чены благодаря случайности; сейчас гербицид-
устойчивые сорта можно получить методом
92
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
генной инженерии. Это позволяет использовать
гербициды, которые быстро разлагаются и мо-
гут эффективно использоваться в маленьких до-
зах. Примеры будут рассмотрены в разделах 10.1
и 10.4.
Большое количество гербицидов ингибиру-
ют фотосинтез: производное мочевины DCML
(Диурон, производимый фирмой «Дюпон»),
триазин Атразин (ранее Циба Гейджи), Бентазон
(BASF) (рис. 3.23) и другие аналогичные соеди-
нения используют как гербициды. Эти вещества
связываются с сайтом связывания пластохинона
на белке Dj и таким образом блокируют фото-
синтетический электронный транспорт. В на-
стоящее время DCMU используется в сельском
хозяйстве довольно редко, потому что эффек-
тивен в высоких дозах и медленно разлагается,
однако это соединение довольно часто исполь-
зуется в лабораторных исследованиях как ин-
гибитор фотосинтеза (например, в листе или в
суспензии выделенных хлоропластов). Атразин
действует селективно: растения кукурузы до-
вольно устойчивы к этому гербициду, потому
что обладают способностью к его эффективной
детоксикации (раздел 12.2). Однако он медленно
разлагается в почве, поэтому применение атра-
зина запрещено в ряде стран. На территориях,
Диурон (DuPont)
3-(3,4-дихлорфенил)-
1,1 -диметилмочевина
(DCMU)
Атразин
(Ciba Geigy)
Рис. 3.23. Ингибиторы фотосистемы II, которые
применяются как гербициды
где определенные гербициды использовались
много лет подряд, сорняки приобрели устойчи-
вость к этим соединениям. В некоторых случаях
оказывается, что эта устойчивость обусловлена
точечной мутацией: заменой отдельной амино-
кислоты в D] белке. Это изменение не оказывает
значительного влияния на фотосинтез сорного
растения, но заметно ослабляет связывание гер-
бицида с D1 белком.
3.7.	Цитохрохром-Ь6/^-комплекс
обеспечивает транспорт
электрона между
фотосистемами
Атомы железа в составе цитохромов
и железосерных центров выполняет
важнейшую функцию передачи электрона
Цитохромы — белки, с которыми связано одно
или два тетрапиррольных кольца, — обнаруже-
ны во всех организмах, кроме облигатных анаэ-
робов. Тетрапирролы цитохромов очень сход-
ны с хромофорными группами хлорофиллов.
Однако хлорофиллы содержат в качестве цен-
трального атома Mg2+, а цитохромы — железо
(рис. 3.24). Тетрапиррольное кольцо цитохрома
с центральным атомом железа носит название
гема. Связанный атом железа может менять
степень окисления с Fe3+ на Fe2+, поэтому
цитохромы работают как переносчики одно-
го электрона, в отличие от хинонов, НАД(Ф) и
ФАД, которые переносят два электрона вместе
с протонами.
Цитохромы подразделяются на три основ-
ные группы: цитохромы-я, -Ь и -с, содержа-
щие, соответственно, гемы-л, -Ь и -с. Гем-/?
можно рассматривать как исходную структуру
(см. рис. 3.24). У гема-с SH2 группа цистеи-
на добавляется к каждой из двух винильных
групп гема-/?. Таким образом, гем-с ковалент-
но связан сульфидными мостиками с белком
цитохрома. Такая разновидность ковалент-
ной связи уже была описана на примере фи-
коцианина (см. рис. 2.15). В соответствующих
апопротеинах есть определенная последо-
вательность аминокислот, ответственная за
связывание гемов. В геме-я (не показан) изо-
преноидная боковая цепь из трех звеньев при-
креплена к одной из винильных групп гема-/?.
Эта боковая цепь выполняет функцию гидро-
3.7. Цитохрохром-Ьб/f комплекс обеспечивает транспорт электрона между фотосистемами
93
Гем-Ь
Н
R-i, R2 С—СН2
Гем-с
Н
R-|, R2 С СНд
S Cys Protein
Рис. 3.24. Гем-6 и гем-с — простетические группы цитохромов. Гем-с ковалентно
связан с апопротеином цитохрома через два остатка цистеина апопротеина и две
вин ильные группы гема-6
фобного «мембранного якоря»1, как у хино-
нов (см. рис. 3.5 и 3.19). Гем-я упомянут здесь
только для полноты картины. Он не участвует
в фотосинтезе, однако вовлечен в электронный
транспорт в митохондриях (раздел 5.5).
Атом железа в составе гема может образо-
вывать шесть координационных связей. Четы-
ре из них связывают железо с атомами азота
тетрапиррольного кольца, имеющего плоскую
структуру. Две оставшиеся связи соединяют
атом Fe с двумя гистидиновыми остатками,
которые расположены перпендикулярно пло-
скости кольца (рис. 3.25). Цитохром-/ (/зна-
чит foliar, т.е. присутствующий в листьях)
содержит, как и цитохром-с, один гем-с, и по-
этому относится к с-типу цитохромов. У ЦИТ-/
атом Fe связан одной координационной свя-
зью с терминальной аминогруппой белка, а
другой — с остатком гистидина.
Железосерные центры — универсальные пе-
реносчики электронов, которые также присутству-
ют в фотосинтетической электрон-транспортной
цепи. Остатки цистеина в составе белка, образу-
ющие железосерные центры (рис. 3.26), связаны
координационными или ковалентными связями
с атомами Fe. (В некоторых белках с атомами Fe
1 Гемы, как и хлорофиллы, всегда находятся в комплексах
с белками. Гидрофобный «мембранный якорь» взаимодей-
ствует с гидрофобными аминокислотами в белках, а не с ли-
пидами. — Прим. ред.
могут быть связаны остатки гистидина.) Атомы
железа связаны друг с другом S-мостиками. При
помещении белков в кислую среду сера, располо-
женная между атомами Fe, высвобождается в виде
H2S, поэтому она получила название лабильной
Гем-Ь
Fe
Цитохром-Ь
Гем-с
Н
Prot— N
I
Н
Fe
СН2—Prot
,	His
Цитохром-/"
Рис. 3.25. Осевые лиганды атомов железа
в гемовой группе цитохромов-6 и -/ Из шести
возможных координационных связей атома
Fe в геме четыре заняты N-атомами плоского
тетрапиррольного кольца. Две оставшиеся связи
образуются либо с двумя гистидиновыми остатками
белка, расположенными перпендикулярно к
плоскости тетрапиррола, либо с терминальной
аминогруппой и одним гистидиновым остатком
белка. Prot — белок
94
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Рис. 3.26. Структура металл-содержащих кластеров
железосерных белков
серы. Железосерные центры обычно имеют со-
став 2Fe-2S или 4Fe-4S. Атомы Fe в этих центрах
присутствуют в двух степенях окисления: Fe3+ и
Fe2+. Независимо от числа атомов Fe в составе
центра, окисленное и восстановленное состоя-
ние центра отличается лишь на единичный заряд.
Поэтому железосерные центры могут принимать
и отдавать только один электрон. Различные же-
лезосерные центры могут сильно отличаться по
значению редокс-потенциала, которое зависит от
белкового окружения.
Электронный транспорт
в цитохром-b6/f-комплексе сопряжен
с транспортом протонов
Пластогидрохинон (PQH2), образовавшийся
в ФС II, диффундирует в липидной фазе тила-
коидной мембраны и передает электроны на
цитохром-bjf-комплекс (см. рис. 3.17). Этот
комплекс, в свою очередь, передает электроны
на пластоцианин, который при этом восста-
навливается. Поэтому цитохром-bjf-комплекс
также называют пластохинон-пластоцианин
оксидоредуктазой. Пластоцианин — белок с
молекулярной массой 10,5 кДа, содержащий
атом меди, который координационно связан с
цистеиновым, метиониновым и двумя гистиди-
новыми остатками в составе белка (рис. 3.27).
Этот атом меди может менять степень окисления
между Си+ и Си2+, поэтому он функционирует
как одноэлектронный переносчик Пластоциа-
нин растворим в воде и располагается в люмене
тилакоидов.
Транспорт электрона в цитохром-^/Лкомп-
лексе происходит по градиенту потенциала. Раз-
ность потенциалов между PQH2 и пластоциани-
ном составляет примерно 0,4 В (см. рис. 3.16).
Энергия, которая высвобождается при перено-
се электрона по градиенту редокс-потенциала,
запасается за счет сопряженного транспорта
протонов в люмен против электрохимического
градиента (ДцН+). Цитохром-^/Лкомплекс —
мембранный белковый комплекс, состоящий
из многих субъединиц: цит-/?6, цит-/, железо-
серный белок, названный белком Риске в честь
ученого, который его обнаружил, и субъединица
IV. Кроме этих основных субъединиц, в состав
комплекса входят более мелкие пептиды, а так-
же хлорофилл и каротиноид, функции которых
неизвестны. Белок Риске содержит 2Fe-2S центр
с высоким положительным редокс-потенциалом
(+0,3 В), который не характерен для железосер-
ных центров. Возможно, положительный потен-
циал обусловлен связью 2Fe-2S центра с остат-
ками гистидина.
Цитохром-bjf-комплекс имеет асимме-
тричную структуру (рис. 3.28). Цит-/?6, со-
держащий две молекулы гема-/?, пронизывает
—Cys—S Си S—Met—
I I I
Рис. 3.27. Пластоцианин. Два гистидиновых, один
метиониновый и один цистеиновый остатки этого
белка связаны с одним атомом Си, который меняет
степень окисления между Си+ и Си2+ (отдает или
принимает электрон)
3.7. Цитохрохром-Ьб/f комплекс обеспечивает транспорт электрона между фотосистемами
95
мембрану, как и субъединица IV. В цитохром-
/?6/Лкомплексе две молекулы гема расположе-
ны одна над другой, и таким образом образу-
ют редокс-цепь, соединяющую две стороны
мембраны. Одна аминокислотная цепь пит-/
внедряется в мембрану, образуя якорь. Гем-с
(функциональная группа цит-/) расположен на
периферии мембраны со стороны люмена. На
той же стороне расположен и белок Риске, кото-
рый лишь слегка утоплен в мембране.
Цитохром-bjf-комплекс по своей структуре
является аналогом цитохром-Л/cj-комплекса
бактерий и митохондрий (раздел 5.5). В табли-
це 3.3 суммированы функции этих комплексов.
Они сходны по структуре и функциям. Амино-
кислотная последовательность цит-Z? в цито-
xpoM-A/cj-комплексе бактерий и митохондрий
соответствует суммарной последовательности
цит-/?6 и субъединицы IV цитохром-/^//'-комп-
лекса. По-видимому, в процессе эволюции
произошло разделение гена цит-/? на два гена:
цит-/>6 и субъединицы IV. В то время как
цитохром-bfjf-комплекс растений восстанав-
ливает пластоцианин, цитохром-Ь/сх-комплекс
бактерий и митохондрий восстанавливает
цит-с. Цит-с — очень маленький белок, кото-
рый растворим в воде и подобно пластоциа-
нину переносит электроны в водной фазе от
цитохром-/)/^-комплекса к следующему ком-
плексу цепи. У цианобактерий, у которых так-
же есть цитохром-Л/с,-комплекс, электроны от
этого комплекса передаются на фотосистему I
через цит-с (вместо пластоцианина). Значитель-
ное сходство между цитохром-/>6//'-комплексом
растений и цитохром-/)/^-комплексом бак-
терий и митохондрий указывает на то, что эти
комплексы выполняют сходные функции в фо-
тосинтезе и дыхании: они представляют собой
транслокаторы протонов, которые работают за
счет гидрохинон-пластоцианин (или цит-с) ре-
дуктазной активности.
Рис. 3.28. Структура цитохром-/^//-комплекса.
Схема основана на молекулярной структуре,
предсказанной на основании аминокислотной
последовательности (по Hauska)
Перенос протонов из стромы в люмен тила-
коидов осуществляется при окислении и вос-
становлении хинонов, поскольку эти процес-
сы происходят на разных сторонах мембраны.
Протоны, необходимые для восстановления
пластохинона в комплексе ФС II, берутся со
стромальной стороны, а окисление пластоги-
дрохинона, которое сопровождается выделе-
нием протонов, происходит на люменальной
стороне цитохром-/^//-комплекса (рис. 3.29).
Таким образом, после получения комплексом
ФС II четырех экситонов из стромы в люмен
переносятся четыре протона. Кроме того, че-
тыре протона высвобождаются в люмен при
окислении воды в ФС II.
Таблица 3.3. Функции цитохром-Ь/с-комплексов
Пурпурные бактерии	Cyt-Ь/С!	восстановление цит-с	протонная помпа
Зелёные серные бактерии	Cyt-Ь/С!	-//-	-//-
Митохондрии	Cyt-Ь/С!	—и—	-//-
Цианобактерии	Cyt-be/f	-п-	—и—
Хлоропласты	Cyt-bf/f	восстановление пластоцианина	—Ц—
96
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Число протонов, перенесенных через
цитохром-Ь6/7-комплекс, может быть
удвоено в результате работы Q-цикла
Исследования работы электрон-транспортной
цепи митохондрий показали, что в процес-
се электронного транспорта в цитохром-/?/^ -
комплексе число перенесенных протонов в рас-
чете на один электрон больше, чем показано на
рис. 3.29. Питер Митчелл, который разработал
хемиосмотическую гипотезу запасания энер-
окисляется железосерным центром белка Риске в
л юменальном сайте связывания. Благодаря своему
высокому положительному потенциалу белок Ри-
ске отнимает один электрон у пластогидрохинона.
Поскольку образовавшийся семихинон облада-
ет очень низким отрицательным потенциалом, и
поэтому нестабилен, он передает свой электрон
первому гему-/? цит-/?6 (/?L), с которого он пере-
ходит на второй гем-/? (Ьн)*. При этом потенциал
гема-/?ь составляет примерно - 0,1 В. Только одна
Рис. 3.29. Протонный транспорт сопряжен с электронным транспортом в ФС
II и цит-/?6//-комплексе в отсутствие Q-цикла. Схема основана на данных о том,
что окисление воды в ФС II и окисление пластогидрохинона (PQH2) цит-/?6//:
комплексом происходит на люменальной стороне тилакоидной мембраны
гии (раздел 4.1), предложил так называемый
Q-цикл, за счет которого количество протонов,
перенесенных через цитохром-/?/С|-комплекс
при транспорте одного электрона, удваивается.
Позже выяснилось, что Q-цикл функционирует
и в электрон-транспортной цепи фотосинтеза.
На рисунке 3.30 показан принцип работы
Q-цикла в хлоропластах. Цитохром-/?6/Лкомплекс
содержит два сайта связывания хинонов: один
расположен на стромальной, а другой — на люме-
нальной стороне тилакоидной мембраны. Пла-
стогидрохинон (PQH2), образовавшийся в ФС II,
из двух образованных молекул пластохинона (PQ)
возвращается в комплекс ФС II. Вторая молекула
PQ диффундирует в липидной фазе мембраны к
сайту связывания на стромальной стороне и по-
следовательно восстанавливается в нем за счет
гема-/?£, который обладает сравнительно высоким
потенциалом относительно пары семихинон/ги-
1 bL означает низкопотенциальную форму, а Ьи — высо-
копотенциальную (от англ. L — low — низкий; Н — high —
высокий). Электрон как отрицательно заряженная частица
движется от bL к £н. — Прим. ред.
3.8. Фотосистема I восстанавливает НАДФ
97
н©
н©
СТРОМА
Сайт связывания
PQ/PQH2
на стромальной
стороне
Сайт связывания
PQ/PQH2
на люменальной
стороне
Рис. 3.30. Число протонов, которое высвобождается из цит-/>6//-комплекса
в люмен, удваивается в результате Q-цикла. В основе функционирования цикла
лежит тот факт, что окислительно-восстановительные реакции с участием PQ и
PQH2 протекают в двух сайтах связывания, один на стромальной, другой — на
люменальной стороне тилакоидной мембраны. Функционирование цикла описано
в тексте
ЛЮМЕН
дрохинон. Эта реакция сопровождается поглоще-
нием двух протонов из стромы. Образовавшийся
гидрохинон в дальнейшем окисляется на люме-
нальной стороне, и т. д. Суммарно число пере-
несенных протонов удваивается в Q-цикле (1/2 +
+ 1/4 + 1/8 + 1/16 + . . . + l/n = 1). Когда Q-цикл
работает в полную силу, транспорт четырех элек-
тронов через цитохром-bjf-комплекс приводит к
переносу восьми протонов из стромы в люмен.
Функции Q-цикла в цепи дыхания в мито-
хондриях сейчас приняты бесспорно. В случае
фотосинтетического электронного транспорта его
функции до сих пор обсуждаются. По аналогии с
цитохром-/)/<?!-комплексом предполагается, что
Q-цикл, связанный с цитохром-/?6/Лкомплексом,
играет важную роль в хлоропластах. Однако пока
функционирование Q-цикла у растений наблюда-
ли в основном в условиях низкой освещенности.
Предположительно, Q-цикл подавляется высоким
протонным градиентом на тилакоидной мембра-
не, который формируется, например, при высо-
ких интенсивностях света. Таким образом, поток
электронов может быть адаптирован к потребно-
стям растительной клетки через Q-цикл.
3.8.	Фотосистема I
восстанавливает НАДФ
Пластоцианин, восстановленный в цитохром-
/>6//-комплексе, диффундирует в люмене тила-
коидов и связывается с положительно заряжен-
ным сайтом связывания на комплексе ФС I. Он
передает электрон в ФС I, и затем диффундиру-
ет обратно к цитохром-/)6//-комплексу в окис-
ленной форме (рис. 3.31).
Реакционный центр ФС I с максимумом по-
глощения 700 нм также содержит пару хлорофил-
лов (Хл-я)2 (рис. 3.31). Как и вФС II, поглощение
98
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
1/2НАДФ® + Н® 1/2 НАДФН
Ферредоксин-
НАДФ редуктаза
Рис. 3.31. Схема электронного транспорта в фотосистеме I. Образовавшийся
после возбуждения специальной пары хлорофилл с высокоэлектроотрицательным
редокс-потенциалом, вызывает восстановление НАДФ+ путем последовательной
передачи электрона через Хл-я, филлохинон и три железосерных белка. Дефицит
электрона в положительно заряженном радикале хлорофилла компенсируется за
счет электронов пластоцианина
фотона приводит к разделению зарядов, т.е. к об-
разованию (Хл-а)+, который затем восстанав-
ливается за счет пластоцианина. Предположи-
тельно (Хл-я)2 передает электрон мономеру Хл-а
(АД который, в свою очередь, передает его на
прочно связанный филлохинон (Aj) (рис. 3.32).
Филлохинон выполняет функции, аналогичные
Qa в фотосистеме II. От филлохинона в форме
семихинона электрон передается на железосер-
ный центр, получивший название Fx.
3.8. Фотосистема I восстанавливает НАДФ
99
Таблица 3.4. Белки фотосистемы I (неполный список)
Белок	Молекулярная масса (кДа)	Локализация	Кодирова- ние	Функция
А	83	в мембране	хлоропласт	связывание Р700, Хл-а, Ао, Av Q, Fx,
				антенная функция
В	82	-//-	-п-	
С	9	периферическая:	-н-	связывание FA, FB, ферредоксина
		в строме		
D	17	-п-	ядро	
Е	10	-п-	-п-	
F	18	периферическая: люмен	-п-	связывание пластоцианина
Н	10	периферическая: строма	ядро	связывание фосфорилированного CCKII
1	5	в мембране	хлоропласт	?
J	5	-п-	-II-	?
Рис. 3.32. Филлохинон
Fx — это 4Fe-4S центр с очень низким отри-
цательным окислительно-восстановительным
потенциалом. Он передает один электрон на
два следующих 4Fe-4S центра (FA, FB), кото-
рые, в свою очередь, восстанавливают ферре-
доксин — белок с молекулярной массой 11 кДа,
в состав которого входит 2Fe-2S центр. Фер-
редоксин принимает и передает только один
электрон. Восстановление происходит на стро-
мальной стороне тилакоидной мембраны. Для
этого ферредоксин связывается с положитель-
но заряженным сайтом на субъединице С ФС I
(рис. 3.33). В результате восстановления НАДФ
с участием ферредоксина, которое катализиру-
ется ферредоксин-НАДФ-редуктазой, обра-
зуется НАДФН — конечный продукт фотосин-
тетического транспорта электронов.
Комплекс ФС I состоит минимум из 11 раз-
личных субъединиц (табл. 3.4). Центральная
часть комплекса ФС I (как и ФС II) представля-
ет собой гетеродимер, состоящий из субъеди-
ниц А и В (см. рис. 3.33). Молекулярные массы
каждой из субъединиц А и В (82—83 кДа) соот-
ветствуют примерно сумме молекулярных масс
белков D] и СР43 и D2 и СР47, соответственно, в
ФС II (см. табл. 3.2).
Подобно D] и D2 в ФС II, с субъединицами А
и В связаны хромофоры Р700 (Хл-я)2 и перенос-
чики электронов (филлохинон, Fex) реакцион-
ного центра. Кроме того, в их состав входят при-
мерно 100 молекул Хл-я, антенных пигментов.
Таким образом, гетеродимер, состоящий из А и
В, включает в себя реакционный центр и вну-
треннюю антенну. Несколько лет назад группы
Сэнджера и Витта в Берлине методом рентге-
ноструктурного анализа получили трехмерную
структуру фотосистемы I термофильной циано-
бактерии Synechococcus elongatus с разрешени-
ем 2,5 А. Было обнаружено, что базовая струк-
тура фотосистемы I, с двумя молекулами Хл-а
в центральной части и двумя системами транс-
порта электронов, по две молекулы хлорофилла
Хл-я695 в каждой, очень похожа на фотосистему
II и бактериальную фотосистему, представлен-
ную на рис. ЗЛО1. Пока не установлено, одна или
обе ветви участвуют в транспорте электрона.
Считают, что FeS-центры FA и FB расположе-
ны на субъединице С, а субъединица F является
сайтом связывания пластоцианина.
1 Представленная точка зрения дискуссионна. Более рас-
пространено мнение, что ФС II похожа на реакционный
центр пурпурных бактерий, а ФС I — на реакционный центр
зелёных серных бактерий. — Прим. ред.
100
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Рис. 3.33. Схема расположения положительно заряженных доменов в белках
цит-^/Лкомплекса и фотосистемы I (обозначено как +++). Эти участки служат
для связывания (doking) небольших белков, несущих отрицательный заряд (—):
пластоцианина и ферредоксина
При циклическом транспорте электрона
в ФС I энергия света используется только
для синтеза АТФ
Помимо нециклического транспорта, который
обсуждался до сих пор, есть и циклический транс-
порт, при котором электроны от возбужденной
фотосистемы I транспортируются по цепи, но
тем не менее возвращаются в основное состоя-
ние в той же фотосистеме. Циклический транс-
порт, предположительно, происходит при участии
цитохром-^/Лкомплекса (рис. 3.34). Энергия,
которая высвобождается при этом, используется
только для синтеза АТФ, а НАДФН не образу-
ется. Этот процесс получил название цикличе-
ского фотофосфорилирования. В интактных
листьях, и даже в изолированных интактных хло-
ропластах, довольно трудно бывает эксперимен-
тально различить циклическое и нециклическое
фотофосфорилирование. Долгое время остава-
лось неясным, происходит ли циклическое фос-
форилирование в нормальных физиологических
условиях, и если да, то в какой степени. Недавние
измерения стехиометрии протонов при фотофос-
форилировании (раздел 4.4) показали, что выход
АТФ в нециклическом электронном транспорте
не может удовлетворить потребности процесса
ассимиляции СО2, и поэтому циклическое фос-
форилирование необходимо. Более того, цикли-
ческое фотофосфорилирование должно происхо-
дить с высокой скоростью в хлоропластах клеток
обкладки некоторых С4-растений (раздел 8.4).
Эти клетки имеют большую потребность в АТФ,
и характеризуются высокой активностью ФС I и
низкой активностью ФС II. По всей вероятно-
сти, циклический поток электронов регулируется
редокс-состоянием акцептора фотосистемы I та-
ким образом, что при повышении восстановлен-
ное™ пула НАДФ и ферредоксина повышается
доля электронов, транспортируемых по цикличе-
скому пути. Функция циклического транспорта
3.9. В отсутствие других акцепторов электроны могут передаваться с фотосистемы I на кислород 101
Фотосистема I
Цит-Ь6//-комплекс
Рис. 3.34. Циклический транспорт электронов с участием фотосистемы I
и uwr-bjf-комплекса. Путь электронов из возбужденной ФС I к \iwr-bh/f-комплексу
остается неясным
электронов, по-видимому, состоит в приведении
скоростей образования АТФ и НАДФН в соот-
ветствие с потребностями клетки, а также в защи-
те электрон-транспортной цепи от избыточного
восстановления.
Несмотря на интенсивное изучение, пути
передачи электрона из ФС I в цитохром-/>6//’-
комплекс при циклическом электронном транс-
порте пока не выяснены. Предположительно,
циклический транспорт структурно отделен от
цепи линейной передачи электрона. Большин-
ство экспериментов по изучению циклического
электронного транспорта были проведены на
изолированных тилакоидных мембранах, в ко-
торых при добавлении таких посредников, как
ферредоксин или флавинаденинмононуклеотид
(ФМН, рис. 5.16) происходит только цикличе-
ский транспорт. Циклический транспорт элек-
тронов ингибируется антибиотиком анти ми ци-
ном А. Пока неясно, с каким сайтом связывается
этот ингибитор. Антимицин А не подавляет не-
циклический электронный транспорт. Удиви-
тельно то, что белки НАДН-дегидрогеназного
комплекса дыхательной цепи митохондрий
(раздел 5.5) были обнаружены в тилакоидной
мембране хлоропластов. Функции этих белков в
хлоропластах остаются невыясненными. Белки
этого комплекса очень часто встречаются в хло-
ропластах из клеток обкладки С4-растений, в ко-
торых невелико содержание ФС II, но высока ак-
тивность циклического фотофосфорилирования
(раздел 8.4). Эти наблюдения позволили пред-
полагать, что циклический поток электронов от
НАДФН или ферредоксина к пулу пластохино-
нов происходит с участием комплекса, сходного
с митохондриальным НАДН-дегидрогеназным
комплексом. Как будет показано в разделе 5.5,
митохондриальный НАДН-дегидрогеназный ком-
плекс передает электроны от НАДН на убихи-
нон. У цианобактерий было показано участие
НАДФ-дегидрогеназного комплекса, сходного
с митохондриальным НАДН-дегидрогеназным
комплексом, в циклическом электронном тран-
спорте.
102
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
3.9.	В отсутствие других акцепторов
электроны могут передаваться
с фотосистемы I на кислород
Когда пул ферредоксина перевосстановлен, ста-
новится возможной передача электронов от
ФС I на кислород с образованием супероксид-
радикала (’Of) (рис. 3.35). Этот процесс по-
лучил название реакции Мелера. Супероксид-
радикал может восстанавливать ионы металлов,
такие, как Fe3+ и Си2+ (Мп+):
•О2 -+ Мп+—> О2 + м(п-,)+
Супероксиддисмутаза катализирует дис-
мутацию • О2_ с использованием двух протонов,
в результате которой образуются Н2О2 и О2:
2-О2 + 2Н+—>О2 + Н2О2
•О2_, Н2О2 и *ОН называют активными
формами кислорода (АФК). Ионы металлов,
восстановленные супероксидом, реагируют с
перекисью водорода с образованием гидроксил-
радикала:
Н2О2 + М(п ,)+ -> • он + мп+
Гидроксил-радикал (• ОН) представляет из
себя очень реакционноспособное соединение,
повреждающее ферменты и липиды путем их
окисления. Растительная клеткалишена каких бы
то ни было защитных ферментов для ликвидации
• ОН. Поэтому, чтобы не допустить восстановле-
ния ионов металлов, происходит быстрая элими-
нация *О2_ при участии супероксиддисмутазы.
Но перекись водорода также может повреждать
многие ферменты. Чтобы предотвратить это по-
вреждение, перекись разрушается при участии
аскорбатпероксидазы, которая локализована в
тилакоидной мембране. Аскорбат, важнейший
антиоксидант в растительной клетке (рис. 3.36),
окисляется этим ферментом до радикала моно-
дегидроаскорбата, который самопроизвольно
превращается в аскорбат за счет ферредоксина,
восстановленного в фотосистеме I. Монодеги-
дроаскорбат может быть также восстановлен до
аскорбата НАД(Ф)Н-зависимой монодегидроа-
скорбатредуктазой в строме хлоропластов и в ци-
тозоле.
В качестве альтернативы последней реакции,
две молекулы монодегидроаскорбата могут дис-
Рис. 3.35. Схема реакции Мелера. Когда пул ферредоксина в значительной мере восстановлен,
электроны передаются в реакции Мелера на кислород, и при этом образуется супероксид-радикал.
Удаление этого агрессивного радикала включает реакции, катализируемые супероксиддисмутазой
и аскорбатпероксидазой
3.9. В отсутствие других акцепторов электроны могут передаваться с фотосистемы I на кислород 103
Аскорбат
Радикал моно-
дегидроаскорбата
Дегидроаскорбат
Рис. 3.36. Окисление аскорбата происходит через образование радикала
монодегидроаскорбата
2 Монодегидро-
аскорбат
само-
Аскорбат
произвольно
Дегидро-
аскорбат
.2 GSH GSSG
Глутатион-
редуктаза
НАДФН® НАДФН+Н®
Рис. 3.37. Дегидроаскорбат может
восстанавливаться с образованием аскорбата
с участием глутатиона и глутатионредуктазы
тиона. Восстановление GSSG катализируется
глутатионредуктазой, использующей НАД(Ф)
Н в качестве восстановителя (см. рис. 3.37).
Главная функция Мелер-аскорбат-перокси-
дазного цикла — диссипация в тепло избыточ-
ной энергии возбуждения фотосистемы I. По-
глощение восьми экситонов ФС I приводит
к образованию двух супероксид-радикалов и
двух молекул восстановленного ферредоксина,
который в дальнейшем используется в каче-
стве восстановителя для разложения Н2О2 (см.
рис. 3.35). В каком-то смысле передачу электро-
нов на кислород в реакции Мелера можно рас-
сматривать как процесс, обратный окислению
воды в ФС II. Как будет сказано в следующем
разделе, реакция Мелера происходит в ситуа-
ции, когда пул ферредоксина перевосстановлен.
При этом генерируется протонный градиент,
так как электроны транспортируются в фото-
системе II и цитохром-£6//’-комплексе. При на-
личии АДФ протонный градиент может быть
использован для синтеза АТФ. Но обычно при
тех условиях, при которых идет реакция Меле-
ра, наблюдается дефицит АДФ, поэтому про-
мутировать с образованием аскорбата и деги-
дроаскорбата. Дегидроаскорбат превращается в
аскорбат за счет восстановленного глутатиона
в реакции, катализируемой дегидроаскорба-
тредуктазой в строме хлоропластов (рис. 3.37).
Глутатион (GSH) — универсальный анти-
оксидант в клетках растений (раздел 12.2). Он
представляет из себя трипептид, состоящий из
аминокислот глутамата, цистеина и глицина
(рис. 3.38). Окисление GSH происходит с об-
разованием дисульфидного мостика (GSSG)
между остатками цистеина двух молекул глута-
Glu—Cys—Gly
SH
SH
I
Glu—Cys—Gly
Восстановленный
глутатион
(GSH)
2 e®+ 2 H®
Glu—Cys—Gly
S
I
Glu—Cys—Gly
Окисленный
глутатион
(GSSG)
Рис. 3.38. Окисление и восстановление глутатиона
104
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Метилвиологен
(паракват)
Рис. 3.39. Метилвиологен, гербицид, который также называют паракватом, при
передаче электрона от возбужденной ФС I восстанавливается с образованием
радикала. Радикал передает электрон на кислород с образованием агрессивного
супероксид-радикала. Паракват продается компанией ICI под торговым названием
Грамоксон
тонный градиент может достигать значительной
величины. Циклический транспорт электрона и
реакция Мелера имеют общее свойство: они не
служат для образования НАДФН за счет восста-
новления НАДФ. Поэтому электронный транс-
порт, приводящий к реакции Мелера, получил
название псевдоциклического электронного
транспорта.
Не так давно у растений была обнаружена
еще одна группа антиоксидантов: это так на-
зываемые пероксиредоксины. Эти белки, в
состав которых в качестве редокс-агентов вхо-
дят SH группы, были ранее открыты в клетках
животных. У модельного растения Arabidopsis
было идентифицировано 10 различных генов
пероксиредоксинов. Эти белки присутствуют в
хлоропластах и других компартментах клетки
и отличаются от рассмотренных ранее антиок-
сидантов глутатиона и аскорбата тем, что они
могут восстанавливать широкий спектр перок-
сидов, включая Н2О2, алкилпероксиды и пе-
роксинитриты. В хлоропластах окисленные
пероксиредоксины восстанавливаются за счет
фотосинтетического электронного транспорта в
фотосистеме 1; в качестве интермедиатов высту-
пают ферредоксин или тиоредоксин.
Вместо ферредоксина ФС I может восста-
навливать метилвиологен. Метилвиологен, ко-
торый также называют паракват, производит-
ся в промышленных масштабах и используется
как гербицид (рис. 3.39). Его гербицидный эф-
фект обусловлен восстановлением кислорода до
супероксид-радикала за счет восстановленного
параквата. Кроме того, паракват конкурирует с
дегидроаскорбатом за восстановительные экви-
валенты, образующиеся в фотосистеме I.
Таким образом, в присутствии параквата
аскорбат не может регенерировать из дегидроа-
скорбата и реакция, катализируемая аскорбат-
пероксидазой, останавливается из-за отсутствия
субстрата. Повышение продукции супероксида
и прекращение процесса детоксикации переки-
си водорода в присутствие параквата вызывает
серьезные окислительные повреждения клеток
мезофилла, которые проявляются в обесцвечи-
вании листьев. Ранее паракват использовался
для уничтожения полей конопли.
3.10.	Регуляторные механизмы
контролируют распределение
поглощенных фотонов между
двумя фотосистемами
Нециклический транспорт электронов с уча-
стием двух фотосистем требует равномерного
распределения поглощенных экситонов между
ними. Как говорилось в разделе 2.4, экситоны
преимущественно транспортируются к тому
3.10. Регуляторные механизмы контролируют распределение поглощенных фотонов
105
Рис. 3.40. Распределение фотосинтетических белковых комплексов между
спаренными и неспаренными участками тилакоидной мембраны. Стыковка
мембран, предположительно, обеспечивается светособирающими комплексами II
(ССК II). PS I - ФС I; PS II - ФС II; LHC II - ССК II
хромофору, который требует меньше энергии
для возбуждения. Для возбуждения фотосисте-
мы I (Р7оо) требуется меньше энергии, чем для
ФС II (Р680), а значит, при свободной конкурен-
ции между фотосистемами экситоны преимуще-
ственно передавались бы в ФС I. Поэтому рас-
пределение экситонов регулируется, в том числе,
за счет пространственного разделения двух фо-
тосистем и их антенн в тилакоидной мембране.
Тилакоидные мембраны хлоропластов подраз-
деляются на спаренные (stacked) и неспаренные
(unstacked) мембраны. Наружная поверхность
неспаренных мембран обращена к пространству
стромы; эти мембраны называются ламеллами
стромы (рис. 3.40). В спаренных мембранах со-
седние тилакоидные мембраны находятся в пря-
мом контакте друг с другом. Эти стопки мембран
в световой микроскоп видны как зерна (граны), и
поэтому получили название ламеллы гран.
АТФ-синтаза и комплекс ФС I (включая све-
тособирающие комплексы) расположены либо в
ламеллах стромы, либо на внешней поверхности
ламмелл гран. Таким образом, эти белки име-
ют свободный доступ к АДФ и НАДФ стромы.
Комплекс ФС II, наоборот, располагается преи-
мущественно в ламеллах гран. Периферические
субъединицы комплекса ФС II (раздел 2.4) мо-
гут взаимодействовать с субъединицей ССК II,
локализованного на спаренной мембране, вы-
зывая слипание мембран. Кроме ФС II и ССК
II, в спаренных мембранах находится цитохром-
/>6//’-комплекс. Поскольку белки ФС I и F-АТФ-
синтазы выдаются в пространство стромы, они
не помещаются в зазоре между спаренными
мембранами. Таким образом, комплексы ФС II
в спаренных мембранах пространственно отде-
лены от комлексов ФС I, расположенных в не-
спаренных мембранах. Предположительно, это
предотвращает неконтролируемый «перелив
экситонов» из ФС II в ФС 1.
Как бы то ни было, существует простран-
ственное разделение двух фотосистем. Кроме
того, существует специальный механизм, регу-
лирующий перелив экситонов с ФС II на ФС I.
Если возбуждение ФС II больше, чем в ФС I, это
приводит к накоплению пластогидрохинонов,
106
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Деэпоксидаза
Люмен тилакоида
pH 5,0
Эпоксидаза
Строма
Рис. 3.41. Виолаксантиновый цикл (по Demming — Adams)
которые ФС I через цитохром-^/Х’-комплекс не
может окислить достаточно быстро. В этих усло-
виях активируется протеинкиназа, которая ка-
тализирует фосфорилирование гидрокисльных
групп треониновых остатков периферических
субъединиц ССК II, вызывая изменение их кон-
формации. В результате этой реакции сродство
ССК II к ФС II снижается, и он отсоединяется
от комплекса ФС II. С другой стороны, благо-
даря изменению конформации субъединицы
ССК II приобретают способность связываться
с ФС I. Это повышает долю экситонов, уходя-
щих с ССК II на ФС I. Таким образом, нако-
пление восстановленного пластохинона может
снизить возбуждение ФС II в пользу ФС I. Про-
теинфосфатаза осуществляет обратную регу-
ляторную реакцию. Этот процесс, описанный
здесь в упрощенном виде, позволяет растениям
оптимально распределять поглощенные фото-
ны между двумя фотосистемами, независимо от
спектрального состава поглощенного света.
Избыточная энергия диссипируется в тепло
Растения достаточно часто сталкиваются с тем,
что интенсивность освещения чересчур велика
по сравнению запросами фотосинтетического
метаболизма на НАДФН и АТФ. Это проис-
ходит в том случае, когда скорость метаболиз-
ма не соответствует высокой интенсивности
света. Такая ситуация наблюдается, например,
при низкой температуре, когда метаболизм за-
медляется из-за снижения ферментативной
активности (холодовой стресс) или при высо-
кой температуре, когда устьица закрываются,
чтобы предотвратить потерю влаги. Избыточ-
ное возбуждение фотосистем могло бы приве-
сти к перевосстановлению компонентов фото-
синтетической электрон-транспортной цепи.
Избыточное возбуждение фотосистемы II, ко-
торое определяют по накоплению пластоги-
дрохинонов, приводит к повреждению фото-
синтетического аппарата, которое называется
фотоингибированием. Основная причина этих
Дополнительная литература
107
повреждений — перевозбуждение реакцион-
ного центра, за счет которого молекулы хлоро-
филла переходят в триплетное состояние, и это
приводит к образованию агрессивного синглет-
ного кислорода (раздел 2.3). Повреждающий
эффект триплетного хлорофилла можно на-
блюдать, поместив небольшое количество хло-
рофилла под кожу человека; освещение вызовет
острое повреждение тканей. Этот фотодинами-
ческий принцип используется в медицине для
местного лечения рака кожи.
Каротиноиды (например, р-каротин,
рис. 2.9) способны переводить триплетный
хлорофилл и синглетный кислород в основное
состояние за счет образования триплетного
каротиноида, который диссипирует энергию в
тепло. Таким образом, каротиноиды выполняют
важнейшую защитную функцию. Однако ино-
гда каротиноидная защита не может справить-
ся с избыточным возбуждением ФС II, и тогда
синглетный кислород повреждает комплекс ФС
II. Наиболее вероятный объект повреждения —
белок D] реакционного центра ФС II, который
даже в нормальных условиях фотосинтеза име-
ет высокую скорость оборота (раздел 3.6). Ког-
да скорость разрушения белка Dj превышает
скорость его ресинтеза, скорость фотосинтеза
падает; другими словами, происходит фотоин-
гибирование.
У растений выработалось несколько меха-
низмов для защиты фотосинтетического аппа-
рата от повреждения светом. Один механизм за-
ключается в перераспределении хлоропластов
внутри клетки: при высокой интенсивности све-
та хлоропласты перемещаются с поверхности
клеток, обращенной к свету, к боковым стенкам
клетки. Другой механизм состоит в рассеива-
нии энергии избыточных экситонов в форме
тепла. Этот процесс называют нефотохимиче-
ским тушением энергии экситонов. Хотя ин-
формация об этом процессе еще неполна, не-
сомненно, важную роль в этом процессе играет
зеаксантин. Зеаксантин вызывает тепловую
диссипацию энергии экситонов за счет взаи-
модействия с хлорофилл-связывающим белком
(СР 22) фотосистемы II. Зеаксантин образуется
путем восстановления диэпоксида виолаксанти-
на. В качестве восстановителя выступает аскор-
бат, помежуточным продуктом реакции явля-
ется моноэпоксид антераксантин. Зеаксантин
может превратиться обратно в виолаксантин
в реакции эпоксидации, требующей НАДФН
и О2 (рис. 3.41). Образование зеаксантина, ка-
тализируемое деэпоксидазой, происходит на
люменальной стороне тилакоидной мембраны
и имеет оптимум pH 5,0, тогда как регенерация
виолаксантина с участием эпоксидазы проис-
ходит на стромальной стороне при pH 7,6. Та-
ким образом, для образования зеаксантина
требуется высокий градиент pH на тилакоидной
мембране. Как уже обсуждалось в связи с реак-
цией Мелера (раздел 3.9), высокий градиент pH
может служить признаком высокой степени воз-
буждения фотосистемы II. Когда поток квантов
света больше, чем нужно, рост градиента pH
инициирует синтез зеаксантина, который рас-
сеивает избыточную энергию комплекса ФС II
в тепло. На ярком солнечном свету растения от
50 до 70% энергии поглощенных фотонов рас-
сеивают в форме тепла. Нефотохимическое ту-
шение энергии экситонов — главный защитный
механизм растений от избыточного освещения.
Для сравнения, реакция Мелера (раздел 3.9) и
фотодыхание (раздел 7.7) почти что при любых
условиях играют минорную роль в рассеивании
избыточной энергии возбуждения.
Дополнительная литература
Allen, J. Е Cyclic, pseudocyclic and non cyclic
photophosphorylation: new links in the chain. Trends
Plant Sci 8, 5-19(2003).
Asada, K. The water-water cycle in chloroplasts:
Scavenging of active oxygens and dissipation of excess
photons. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50,
601-639(1999).
Chitnis, P. R. Photosystem 1: Function and physiology.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 52, 593—626
(2001).
Deiner, B. A., Rappaport, E Structure, dynamics, and
energetics of the primary photochemistry of photosystem
11 of oxygenic photosynthesis. Annu Rev Plant Biol 53,
551-580(2002).
Deisenhofer, J., Michel, H. Nobel Lecture: The
photosynthetic reaction center from the purple bacterium
Rhodopseudomonas viridis. EM BO J 8, 2149—2169
(1989).
Demmig-Adams, B., Adams III, W. W. The role of the
xanthophyll cycle carotenoids in the protection of
photosynthesis. Trends Plant Sci 1, 21—26 (1996).
108
3. Транспорт электронов в процессе фотосинтеза
Depege, N., Bellafiore, S., Rochaix, J.-D. Role of
chloroplast protein kinase Stt7 in LHC11 phosphorylation
and state transition in Chlamydomonas. Science 299,
1572-1575 (2003).
Dietz, K.-J. Plant peroxiredoxins. Annu Rev Plant Biol
54, 93-107 (2003).
Ermler, (J., Fritzsch, G., Buchanan, S.K., Michel, H.
Structure of the photosynthetic reaction center from
Rhodobacter sphaeroides at 2.65 A resolution:
Cofactors and protein-cofactor interactions. Structure
2, 925-936(1994).
Govindjee. A role for a light-harvesting antenna complex
of photosystem 11 in photoprotection. Plant Cell 14,
1663-1668 (2002).
Govindjee, Gest, H. (eds.). Historical highlights of
photosynthesis research 1. Photosynth Res 73, 1—308
(2002).
Govindjee, Gest, H. (eds.). Historical highlights of
photosynthesis research II. Photosynth Res 79, 1—450
(2003).
Heller, B. A., Holten, D., Kirmaier, C. Control of electron
transfer between the L- and M-sides of photosynthetic
reaction centers. Science 269, 940—945 (1995).
Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of
light harvesting in green plants. Annu Rev Plant Physiol
Plant Mol Biol 47, 655-684 (1996).
Kasahara, M., Kagawa, T., Oikawa, K., Suetsugu, N.,
Miyao, M., Wada, M. Chloroplast avoidance movement
reduces photodamage in plants. Nature 420, 829—832
(2002).
Konig, J., Baier, M., Horling, E, Kahmannm, U.,
Harris, G., Schurmann, P. The plant-specific function
of 2-Cys peroxiredoxin-mediated detoxification of
peroxides in the redox-hierarchy of photosynthetic
electron flux. Proc Natl Acad Sci USA 99, 5738—5743
(2002).
Joliot, P., Joliot, A. Cyclic electron transfer in plant leaf.
Proc Natl Acad Sci USA 99, 10209-10214 (2002).
Jordan, P., Fromme, P., Witt, H. T., Klukas, O.,
Saenger, W., Kraub, N. Three-dimensional structure of
cyanobacterial photosystem 1 at 2.5 A resolution. Nature
411,909-917 (2001)
Li, X.-P., Bjorkman, O., Shih, C., Grossman, A. R.,
Rosenquist, M., Jansson, S., Niyogi, К. K. A pigment-
binding protein essential for regulation of photosynthetic
light harvesting. Nature 403, 391—395 (2000).
Lunde, C., Jensen, P. E., Haldrup, A., Knoetzel, J.,
Scheller, H. V. The PS1-H subunit of photosystem I is
essential for state transitions in plant photosynthesis.
Nature,408, 613-615 (2000).
Melis, A. Photosystem-II damage and repair cycle in
chloroplasts: What modulates the rate of photodamage
in vivo? Trends Plant Sci 4, 1130—135 (1999).
Mittler, R. Oxidative stress, antioxidants and stress
tolerance. Trends Plant Sci 7, 405—410 (2002).
Niyogi, К. K. Safety valves for photosynthesis. CurrOpin
Plant Biol 3, 455-460 (2000).
Ort, D. R., Yocum, С. E (eds.). Oxygenic photosynthesis:
The light reactions. (Advances in Photosynthesis).
Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The
Netherlands (1996).
Orr, L., Govindjee. Photosynthesis and the web: 2001.
Photosynth Res 68, 1—28 (2001).
Osmond, B., Badger, M., Bjorkman, O., Leegood, R. Too
many photons: Photorespiration, photoinhibition and
photooxidation. Trends Plant Sci 2, 119—121 (1997).
Powles, S. B., Holtum, J. A. M. Herbicide resistance in
plants. Lewis Publishers, Boca Raton, Ann Arbor,
(1994).
Roy, C., Lancaster, D., Michel, H. The coupling of
light-induced electron transfer and proton uptake as
derived from crystal structures of reaction centers from
Rhodopseudomonas viridis modified at the binding site
of the secondary quinone, QB. Structure 5, 1339—1359
(1997).
Schubert, W.-D., Klukas, O., Saenger, W., Witt, H. T.,
Fromme, P., Kraub, N. A common ancestor for oxygenic
and anoxygenic photosynthetic systems: A comparison
based on the structural model of photosystem 1. J Mol
Biol 280, 297-314(1998).
Vener, A. V., Ohad, L, Andersson, B. Protein
phosphorylation and redox sensing in chloroplast
thylakoids. Plant Biol 1, 217-223 (1998).
Wada, M., Kagawa, T., Sato, Y. Chloroplast movement.
Annu Rev Plant Biol 54, 455-468 (2003).
Werck-Reich hart,	D., Hehn, A., Didieijean, L.
Cytochromes P450 for engineering herbicide tolerance.
Trends Plant Sci 5, 116—123 (2000).
Zouni, A., Witt, H. T., Kern, J., Fromme, P., Kraub, N.,
Saenger, W., Orth, P. Crystal structure of photosystem
11 from Synechococcus elongatus at 3.8 A revolution.
Nature 409, 739-743 (2001).
В процессе фотосинтеза образуется АТФ!
В главе 3 мы обсуждали перенос протонов
через тилакоидную мембрану в процессе
фотосинтетического электронного транспор-
та и то, каким образом при этом генерируется
протонный градиент. В этой главе речь пойдет
об использовании протонного градиента для
синтеза АТФ.
В 1954 г. Даниэль Арнон (Беркли) обнару-
жил, что при освещении суспензии тилакоид-
ных мембран из АДФ и неорганического фос-
фата образуется АТФ. Этот процесс называют
фотофосфорилированием. В дальнейших экс-
периментах было установлено, что фотофосфо-
рилирование сопряжено с синтезом НАДФН.
Это был неожиданный результат, ведь в то время
считали, что в хлоропластах, как и в митохон-
дриях, синтез АТФ сопряжен с транспортом
электронов с НАДФН на кислород. Вскоре ста-
ло ясно, что механизм фотофосфорилирования,
сопряженного с фотосинтетическим электрон-
ным транспортом, очень сходен с механизмом
синтеза АТФ, сопряженного с транспортом
электронов в митохондриях, который называет-
ся окислительным фосфорилированием (раз-
дел 5.6).
В 1961 г. Питер Митчелл (Эдинбург) выдви-
нул свою хемиосмотическую гипотезу, которая
заключалась в том, что в процессе синтеза АТФ,
сопряженного с электронным транспортом, об-
разуется протонный градиент, и что именно
протон-движущая сила этого градиента обе-
спечивает синтез АТФ. Первое время многие
ученые, работавшие в этой области, возражали
против революционной теории Митчелла, од-
нако со временем экспериментальные данные,
полученные разными авторами, подтвердили хе-
миосмотическую гипотезу, которая в настоящее
время стала общепринятой. В 1978 г. за разработ-
ку этой гипотезы Питер Митчелл был награжден
Нобелевской премией по химии.
4.1. Протон-движущая сила является
промежуточной формой
запасания энергии в процессе
синтеза АТФ
Рассчитаем для начала, сколько энергии на са-
мом деле нужно, чтобы синтезировать АТФ.
Свободную энергию, необходимую для синтеза
АТФ из АДФ и фосфата, можно рассчитать по
уравнению Вант Гоффа:
ag=ag’ + '!’'I"(AWpI	,4|>
Стандартная свободная энергия1 синтеза
АТФ составляет:
AG0 = 4-30,5 кДж/моль.
Концентрации АТФ, АДФ и фосфата в стро-
ме хлоропластов в значительной степени зави-
сят от метаболизма. По приблизительной оцен-
ке концентрации могут составлять:
АТФ = 2,5- 10-3 М;
АДФ = 0,5- IO 3 М;
Ф = 5- 10-3М.1 2
Подставляя эти значения в уравнение 4.1
(R=8,32 Дж/моль-К, Т = 298 °К), получаем
энергию, необходимую для синтеза АТФ в этих
условиях:
AG = + 47,8 кДж/моль.
Эта величина, конечно, варьирует, так как
она зависит от метаболических условий. В даль-
нейших рассуждениях мы будем оперировать
средним значением 50 кДж/моль, которое и обо-
значим как А(7атф.
1 В данном случае - стандартная свободная энергия при
pH = 7. — Прим. ред.
2 Для точной оценки необходимо знать не концентрации, а
активности участников реакции. В биологических системах
активность определить очень сложно. — Прим. ред.
110
4. В процессе фотосинтеза образуется АТФ
а Мембрана проницаема
для противоиона
можно измерить как разность напряжений на
мембране. Величину ДТ принято считать поло-
жительной, если катион переносится в направ-
лении более положительного заряда. Разность
потенциалов и свободная энергия связаны сле-
дующим уравнением:
=	(4.3)
б Мембрана непроницаема
для противиона
- Н®
0
где т — заряд иона (в случае протона равен 1), а
F— число Фарадея, равное 96480 Дж/моль К.
Транспорт протонов через биологическую
мембрану приводит к образованию протонного
концентрационного градиента и мембранного
потенциала. Таким образом, свободная энергия
для транспорта протона из А в Б рассчитывается
как сумма свободных энергий, затраченных на
генерацию концентрационного градиента Н+ и
потенциала на мембране:
Дб=/?Пп
[Н1В
[Н+]А
+ /АТ
(4.4)
О
Рис- 4-1 - а. Транспорт протонов через мембрану,
проницаемую для противоионов, таких как хлорид,
приводит к формированию концентрационного
градиента протонов; б. когда мембрана
непроницаема для противоиона, транспорт
протонов приводит к формированию мембранного
электрического потенциала
Транспорт протонов через мембрану может
иметь различные последствия. Если мембрана
проницаема для противоионов протона [напри-
мер, хлорид-ионов (рис. 4.1 а)], заряд протонов
будет скомпенсирован, так как вслед за каждым
перенесенным протоном будет устремляться
хлорид-ион. При этом будет генерироваться
концентрационный градиент протонов. Сво-
бодная энергия транспорта протонов из ком-
партмента А в компартмент Б составляет:
Д<7=/?Пп7^ [Дж/моль] (4.2)
L*i 1а
Если мембрана непроницаема для противо-
ионов (рис. 4.1 (б)), компенсация заряда пере-
несенного протона оказывается невозможной.
В этом случае перенос всего лишь нескольких
протонов через мембрану приводит к формиро-
ванию мембранного потенциала Д^Р, который
В хлоропластах энергия, которая запасается
в форме протонного градиента, соответствует
изменению свободной энергии в процессе пере-
носа протонов из люмена в строму:
Д(7= ЛПпЩ+U+77ДЧ/,	(4.5)
Щ 11
где S = строма, L = люмен, а ДТ = электриче-
ская разность потенциалов между люменом
и стромой.
Переходя к десятичному логарифму, полу-
чаем:
Д(7= 2,3 • /?71og	+ /AH'
[П JL
(4.6)
Дробь под логарифмом — обратная разность
между pH люмена и стромы:
log[H+]s — log[H+]L = — ДрН
После преобразования получаем:
ДG = —2,3 RT • ДрН + ГДУ (4.7)
При 25 °C: 2,3 • RT = 5700 Дж/моль
Отсюда: Д6’= —5700ДрН+ Ш [Дж/моль] (4.8)
Величина AG/F называется протон-движущей
силой (обозначим ее как proton motive force —
PMF). Она выражается в вольтах:
.А2 = РМР = -^|!^ДрН + ДЧ' [В] (4.9)
4.2. Электрохимический протонный градиент может быть диссипирован в тепло
111
2,3/?Т „
При 25 °C: —р— = 0,059 В
Отсюда: PMF = -0,059 • АрН + АТ [В]	(4.10)
Уравнение 4.10 универсально и может быть
использовано для оценки величины химиче-
ской работы при синтезе АТФ, сопряженном с
электронным транспортом. При окислитель-
ном фосфорилировании в митохондриях PMF
в основном образуется за счет мембранного по-
тенциала. В хлоропластах, наоборот, мембран-
ный потенциал не вносит заметного вклада в
величину РМЕ В этом случае PMF почти пол-
ностью образуется за счет концентрационного
градиента протонов на тилакоидной мембране.
В хлоропластах на свету АрН на тилакоидной
мембране составляет около 2,5. Подставляя эту
величину в уравнение 4.8, получаем:
АС = —14,3 кДж/моль
Сравнение этой величины с АС образования
АТФ (50 кДж/моль) показывает, что перенос как
минимум четырех протонов необходим для син-
теза одной молекулы АТФ из АДФ и фосфата.
4.2. Электрохимический
протонный градиент может
быть диссипирован в тепло
с помощью разобщителей
Фотосинтетический транспорт электронов от
воды к НАДФ сопряжен с фотофосфорилиро-
ванием. Электронный транспорт происходит
в норме в том случае, если есть субстраты для
синтеза АТФ: АДФ и фосфат. При добавлении
разобщителя электронный транспорт идет с
высокой скоростью в отсутствие АДФ; в этом
случае он не сопряжен с синтезом АТФ. В при-
сутствии разобщителя синтез АТФ нарушается.
Хемиосмотическая гипотеза объясняет эф-
фект разобщителей (рис. 4.2). Разобщители —
амфифильные вещества, растворимые в воде
и липидах. Они способны входить в липидную
фазу мембраны путем диффузии и при этом пе-
реносить протон или ион щелочного металла,
снимая протонный градиент или мембранный
потенциал, соответственно. В присутствие ра-
зобщителя из-за отсутствия протонного гради-
ента АТФ-синтаза способна переносить прото-
ны из стромы в люмен тилакоида с потреблением
АТФ, который при этом гидролизуется до АДФ
и фосфата. По этой причине разобщители вы-
зывают гидролиз АТФ (АТФ-синтаза проявляет
АТФазную активность).
На рисунке 4.2# показан эффект разобщи-
теля карбонилцианид-пара-трифторметокси-
фенилгидразона (FCCP), который является
слабой кислотой. FCCP диффундирует в недис-
социированной (протонированной) форме из
компартмента с высокой концентрацией прото-
нов (слева на рис. 4.2#) через мембрану в ком-
партмент с низкой концентрацией протонов,
где диссоциирует с образованием протона и
аниона FCCP. Протон остается в этом компарт-
менте, а анион возвращается в другой компарт-
мент, где снова протонируется. Присутствие
FCCP в концентрации всего 710-8 М вызывает
полную диссипацию протонного градиента. Ве-
щество SF6847 (3,5-ди-(длредл-бутил)-4-гидро-
ксибензилдималононитрил) (рис. 4.3) обладает
еще более ярко выраженным разобщающим эф-
фектом. Разобщители, которые переносят про-
тоны через мембрану, как FCCP и SF6847, на-
зываются протонофорами.
Кроме протонофоров, есть и другой класс
разобщителей — ионофоры, которые могут
переносить через мембрану катионы щелоч-
ных металлов и таким образом уменьшать мем-
бранный потенциал. Валиномицин, антибио-
тик из Streptomyces, относится к ионофорам
(рис. 4.26). Валиномицин представляет собой
циклическую молекулу, содержащую последо-
вательность (Е-лактат)-(Ь-валин)-(О-гидро-
ксиизовалерианат)-(В-валин), повторяющуюся
трижды. Благодаря своей гидрофобной наруж-
ной поверхности валиномицин может диффун-
дировать через мембрану. Атомы кислорода,
ориентированные внутрь молекулы, образуют
сайт связывания и замещают воду в гидратной
оболочке катионов и ионов Rb+ и К+. Ионы Na+
связываются валиномицином весьма непрочно.
Добавление валиномицина к суспензии в при-
сутствии ионов К+ приводит к исчезновению
мембранного потенциала. Ионофор грамици-
дин, который мы не будем здесь подробно об-
суждать, тоже представляет из себя полипептид.
Грамицидин встраивается в мембраны, образуя
трансмембранный ионный канал, по которому
катионы щелочных металлов и протоны могут
диффундировать через мембрану.
112
4. В процессе фотосинтеза образуется АТФ
Н®
Карбонилцианид-
лара-трифтормето-
ксифенилгидразон
(FCCP)
Н3С сн3 Н3С сн3
Валиномицин
Рис. 4.2. Протондвижущая сила протонного градиента снимается разобщителями.
а. Гидрофобность FCCP позволяет ему диффундировать через мембрану как
в протонированной, так и в депротонированной форме. Этот разобщитель
может диссипировать протонный градиент за счет опосредованного протонного
транспорта.
б. Валиномицин, антибиотик с циклической структурой, сворачивается в
сферическую гидрофобную молекулу, во внутренней части которой связывается К+.
Валиномицин, связавший ионы К+, может диффундировать через мембрану.
Таким образом, валиномицин снимает мембранный потенциал, перенося ионы К+
через мембрану
4.2.	Электрохимический протонный градиент может быть диссипирован в тепло
113 000
SF6847
Рис. 4.3. 3,5 -ди-(трет)-бутил)-4-гидро-
ксибензилиден-малонитрил (SF6847) — очень
эффективный разобщитель. В концентрации всего
лишь Ю-9 М он вызывает полную диссипацию
протонного градиента на мембране. Как и в
случае FCCP (рис. 4.2А), разобщающее действие
SF6847 основано на проницаемости мембраны для
протонированной и депротонированной формы
этого вещества
Хемиосмотическая гипотеза
была доказана экспериментально
В 1966 г. американский ученый Андре Яген-
дорф представил окончательное доказательство
справедливости хемиосмотической гипотезы
для фотофосфорилирования в хлоропластах
(рис. 4.4). Он инкубировал тилакоидные мем-
браны в кислой среде (при pH 4), чтобы повы-
сить кислотность в люмене тилакоидов путем
неспецифического переноса протонов. Он до-
бавил в суспензию тилакоидов неорганический
фосфат и АДФ, и затем повысил pH среды до 8,
добавляя в нее щелочный компонент буфера.
Это привело к внезапному возникновению про-
тонного градиента АрН = 4, и некоторое время
в суспензии происходил синтез АТФ. Посколь-
ку эксперимент проводили в темноте, было до-
казано, что синтез АТФ в хлоропластах может
идти без освещения только за счет градиента
pH на тилакоидной мембране.
Суспензия тилакоидных
мембран
pH среды 4
pH среды 4
pH в люмене 4
pH среды 8
pH в люмене 4
Рис. 4.4. Тилакоидные мембраны могут синтезировать АТФ в темноте за счет
искусственного протонного градиента. В суспензии тилакоидных мембран pH
среды снижается до 4,0 путем добавления янтарной кислоты (а). После 30-минут-
ной инкубации pH в люмене тилакоидов уравновешивается с pH среды за счет
медленной утечки протонов через мембрану (б). На следующем этапе в суспензию
добавляют АДФ и фосфат, меченый изотопом 32Р (в). После этого pH среды
повышают до 8.0, добавляя КОН (г). Таким образом между люменом тилакоидов
и внешней средой образуется градиент АрН = 4,0, и этот градиент используется
для синтеза АТФ из АДФ и фосфата. После короткой инкубации (д) реакцию
прекращают путем добавления в суспензию хлорной кислоты (НСЮ4), которая
вызывает денатурацию белков, и затем определяют количество меченого АТФ
(по Jagendorf, 1966)
114
4. В процессе фотосинтеза образуется АТФ
4.3.	Н+-АТФ-синтазы бактерий,
хлоропластов и митохондрий
имеют сходную структуру
Каким образом энергия протонного градиен-
та используется для синтеза АТФ? Работающая
с переносом протонов АТФ-синтаза (Н+-АТФ-
синтаза) есть не только в хлоропластах. Эта си-
стема сформировалась в эволюции довольно
рано и обнаружена в мембранах бактерий, хло-
ропластов и митохондрий. У бактерий этот фер-
мент катализирует не только синтез АТФ за счет
энергии протонного градиента, но и обратную
реакцию транспорта протонов против концен-
трационного градиента с затратами АТФ. Пред-
положительно, эта функция была первична для
фермента. У некоторых бактерий АТФаза, гомо-
логичная Н+-АТФ-синтазе, функционирует как
АТФ-зависимый №+-транспортер.
Современные представления о структуре
и функциях Н+-АТФ-синтазы основаны на из-
Мочевина
F^: нет АТФазной активности,
связывает олигомицин
Рис. 4.5. Везикулы, полученные при
ультразвуковом разрушении митохондрий, содержат
функционально интактную Н+-АТФ-синтазу.
Растворимый фактор Fh обладающий
АТФазной активностью, удаляется при обработке
мочевиной. Олигомицин-связывающий фактор Fo
остается в мембране
Fp АТФазная активность,
не чувствительны
к олигомицину
учении митохондрий, хлоропластов и бактерий.
К I960 г. развитие электронной микроскопии
привело к обнаружению маленьких частиц, ко-
торые прикреплены с помощью ножек ко вну-
тренней мембране митохондрий и к тилакоид-
ной мембране хлоропластов (грибовидные тела).
Эти частицы есть только на стороне, обращен-
ной в матрикс в митохондриях или в строму в
хлоропластах, соответственно. Эфраим Рэкер
с сотрудниками из Корнельского Университета
успешно отделили эти частицы от митохондри-
альных мембран с помощью мочевины. Эти ча-
стицы катализировали гидролиз АТФ до АДФ и
фосфата. Рэкер назвал их F]-АТФаза. Мордехай
Аврон из Реховота, Израиль, показал, что соот-
ветствующие частицы из мембран хлоропластов
также проявляют АТФазную активность.
Везикулы, содержащие частицы, можно при-
готовить из внутренней мембраны митохондрий.
В этих везикулах может происходить дыхание, со-
пряженное с синтезом АТФ. Как и в интактных
митохондриях (раздел 5.6), добавление разобщи-
телей приводит к повышению АТФазной актив-
ности. Гидролиз АТФ, индуцированный разоб-
щителем, как и синтез АТФ, происходящий в этих
везикулах, ингибируется антибиотиком олигоми-
цином. Митохондриальные везикулы, из которых
были удалены F]-частицы, не проявляли АТФаз-
ной активности, но обладали высокой проницае-
мостью для протонов. Эта проницаемость пода-
влялась в присутствии олигомицина. АТФазная
активность изолированных F]-частиц, напротив,
не изменялась под действием олигомицина. Эти
и другие эксперименты показали, что Н+-АТФ-
синтаза митохондрий состоит из двух частей.
1.	Растворимый фактор (F0, который в со-
ставе комплекса осуществляет синтез АТФ.
2.	Мембрано-связанный фактор, обеспе-
чивающий перенос протонов через мембрану,
с которым связывается олигомицин.
Рэкер назвал этот фактор Fo (О, олигомицин)
(рис. 4.5). В целом такой же результат был полу-
чен для Н+-АТФ-синтаз хлоропластов и бакте-
рий, с той лишь разницей, что Н+-АТФ-синтаза
хлоропластов не чувствительна к олигомицину.
Тем не менее мембранная часть хлоропласт-
ной Н+-АТФ-синтазы также обозначается Fo.
Н+-АТФ-синтазы хлоропластов, митохондрий
и бактерий, как и Н+- и №+-АТФазы бактерий,
называются F-АТФ-синтазы и F-АТФазы. Та-
4.3. Н+-АТФ-синтазы бактерий, хлоропластов и митохондрий имеют сходную структуру
115
Таблица 4.1. Состав F-АТФ-синтазы хлоропластов. Номенклатура как для F-АТФсинтазы Е. coli.
Субъединицы	Количество на один комплекс FgFi	Молекулярная масса (кДа)	Кодирование
а	3	55	Пластидный геном
р	3	54	Пластидный геном
У	1	36	Пластидный геном
6	1	21	Ядерный геном
£	1	15	Пластидный геном
F0:a	1	27	Пластидный геном
b	1	16	Ядерный геном
Ь’	1	21	Пластидный геном
с	12*	8	Пластидный геном
* Число субъединиц с в составе комплекса может варьировать. — Прим. ред.
кие обозначения, как FoFj-АТФ-синтаза и FoFr
АТФаза, также употребляются.
Fh после отсоединения от мембраны, пред-
ставляет собой растворимый олигомерный бе-
лок, имеющий состав а3р3уб£ (табл. 4.1). Этот
состав был показан для хлоропластов, бактерий
и митохондрий. Fo — сильно гидрофобный бел-
ковый комплекс, который может быть выделен
из мембраны только с помощью детергентов.
Дициклогексилкарбодиимид (DCCD) (рис. 4.6)
связывается с Fo, встроенным в мембрану, и за-
крывает протонный канал. В хлоропластах че-
тыре различных субъединицы были охарактери-
зованы как главные составляющие Fo. Они были
названы а, Ь, Ь’ и с. Субъединица с, предполо-
жительно представленная в Fo хлоропластов в
12 копиях, содержит две трансмембранные спи-
рали и сайт связывания DCCD. Субъединицы
с образуют цилиндр, который проходит сквозь
мембрану. С наружной стороны цилиндра в
мембране расположены субъединицы а, Ь, и Ь’,
причем b и Ь’ контактируют с Fj через субъеди-
ницу 6. Субъединицы у и £ образуют централь-
ную связь между F] и Fo.
Хотя структура Fo, представленная на рис. 4.7,
еще в какой-то мере гипотетична, структура
F] уже изучена весьма тщательно. Частицы Fj
так малы, что детали их структуры не видны на
электронной микрофотографии. Как бы то ни
было, более подробную информацию о строе-
нии комплекса можно получить в том случае,
если огромное количество электронных микро-
фотографий Fj проанализировать с помощью
компьютерного анализа изображений. На
рисунке 4.8 представлен усредненный снимок
F-АТФ-синтазы хлоропластов. В боковой про-
екции видна ножка, соединяющая Fj с мембра-
ной. С использованием более сложного анализа
изображения недавно между Fj и Fo были обна-
ружены две ножки: толстая и тонкая (на рисунке
не показаны). В вертикальной проекции видна
гексагональная структура, соответствующая че-
редующимся а- и р-субъединицам. Исследова-
ния изолированного белкового комплекса Fj
показали, что он имеет три каталитических сай-
та связывания АТФ или АДФ. Один из них занят
прочно связанной АТФ, которая высвобождает-
ся только тогда, когда белок использует энергию,
полученную в форме протонного градиента.
Дициклогексил-
карбодиимид
(DCCD)
Рис. 4.6. Дициклогексилкарбодиимид (DCCD),
ингибитор Fo части F-АТФ-синтазы
Рентгеноструктурный анализ части
АТФ-синтазы позволил изучить механизм
синтеза АТФ
В 1994 г. группа ученых под руководством Джона
Уокера в Кэмбридже (Великобритания) успеш-
но проанализировала трехмерную структуру Fj
части АТФ-синтазы. Для этого были исполь-
зованы кристаллы Fj из митохондрий сердца
116
4. В процессе фотосинтеза образуется АТФ
Рис. 4.7. Структура F-АТФ-синтазы. Структура
р! субъединицы приведена по результатам
рентгеноструктурного анализа, которые
обсуждаются в тексте (по Junge)
быка. Перед кристаллизацией препарат Fl был
насыщен смесью АДФ и аналога АТФ (5'-аде-
нилил-имидодифосфата, АМФ-PNP). Этот ана-
лог отличается от АТФ последними двумя фос-
фатными остатками, связанными через атом
азота. Он связывается с сайтом связывания АТФ
так же, как АТФ, но не гидролизуется АТФазой.
Структурный анализ подтвердил чередующееся
расположение субъединиц аир (рис. 4.7 и 4.9).
Одна а- и одна Р-субъединица образуют функ-
циональную единицу, содержащую сайт связы-
вания адениннуклеотида. В катализ синтеза АТФ
вовлечена субъединица р. В изученном кристал-
ле F] одна (ар)-единица содержала одну моле-
кулу АДФ, вторая — аналог АТФ, а третья была
свободна. Эти различия в связывании нуклеоти-
дов сопровождались различиями в конформации
трех р-субъединиц, как схематически показано
на рис. 4.9. Субъединица у расположена асим-
метрично: проходит через центр F] и изгибается
в сторону около (ар)-единицы, в которой нахо-
Рис. 4.8. Усредненное по 483 электронномикроскопическим фотографиям
изображение F-АТФ-синтазы хлоропластов шпината. А. Вертикальная проекция
Fj части. Гексамерная структура отражает чередующиеся (ар)-субъединицы.
Б. Боковая проекция, на которой видна ножка, соединяющая F! часть с мембраной
(Р. Graeber, Штутгарт)
4.4. Синтез АТФ происходит за счет изменения конформации белка
117
Рис. 4.9. Схематичное изображение вертикальной
проекции р! части F-АТФ-синтазы. Фермент
содержит три сайта связывания нуклеотидов, каждый
сайт состоит из одной а и одной р субъединицы.
Все три р-субъединицы находятся в разных
конформационных состояниях, у-субъединица,
расположенная в центре, вертикально по
отношению к наблюдателю, крепится кайр
субъединицам, в активном сайте которых находится
АДФ. Это представление основано на результатах
рентгеноструктурного анализа, проведенного Walker
с сотрудниками, которое упоминалось в тексте
дится АДФ (рис. 4.7 и 4.9). Эта асимметрия име-
ет важное значение для функционирования р!
части АТФ-синтазы. Нужно сделать несколько
общих предположений о АТФ-синтазе прежде,
чем разбирать более детально этот вопрос.
4.4.	Синтез АТФ происходит за счет
изменения конформации белка
Для реакции:
АТФ + Н2О АДФ + Фосфат
стандартная свободная энергия составляет:
AG0’ = —30,5 кДж/моль.
Из-за высокой свободной энергии гидроли-
за АТФ считается энергетически богатым веще-
ством. Следует заметить, однако, что стандартное
значение АС?0’ определено для водного раствора,
в котором концентрация АТФ, АДФ и фосфата
составляет 1 М, соответственно, концентрация
воды составляет приблизительно 55 М. Если бы
концентрация воды была равна 10 М, А(7° для ги-
дролиза АТФ составляло бы + 2,2 кДж/моль. Это
означает, что при очень низких концентрациях
воды равновесие химической реакци смещено
в сторону самопроизвольного синтеза АТФ. Та-
ким образом, в отсутствие воды синтез АТФ не
требует затрат энергии.
В каталитическом центре фермента может об-
разовываться безводная среда. Такие сайты обыч-
но расположены в гидрофобной части фермент-
ного белка, и субстраты в этих сайтах реагируют
друг с другом в отсутствие воды. Поэтому когда
АДФ и фосфат прочно связаны с ферментом,
синтез АТФ может происходить самопроизволь-
но без затрат энергии (рис. 4.10). Это положение
было доказано для Н+-АТФ-синтазы. Поскольку
сам по себе синтез АТФ происходит без затрат
энергии, то количество энергии, которое необхо-
димо для образования АТФ из АДФ и фосфата,
потребляется каким-то другим способом, напри-
мер, для удаления прочно связанной новооб-
разованной молекулы АТФ из каталитического
центра. Это может происходить путем энергоза-
висимого изменения конформации белка.
АДФ+Ф
Фермент
АТФ
^^AG~0 ?
(АДФ+ ф)
Фермент
AG-0
( АТФ )
Фермент
Фермент
Рис. 4.10. В отсутствие Н2О синтез АТФ может
происходить без затрат энергии. В этом случае
энергия, необходимая для синтеза АТФ в водном
растворе, расходуется на связывание АДФ и фосфата
и/или на высвобождение вновь образованной
АТФ. По последним данным, реализуется вторая
возможность
118
4. В процессе фотосинтеза образуется АТФ
В 1977 г. Пол Бойер (США) выдвинул гипо-
тезу о том, что три идентичных сайта связы-
вания в белке Ft последовательно изменяют
свои связывающие свойства (рис. 4.П). Один
из сайтов связывания находится в L форме, т.е.
непрочно связывает АДФ и фосфат и не про-
являет каталитической активности (loose —
свободный). Второй сайт, Т, прочно связывает
АДФ и АТФ и проявляет каталитическую актив-
ность (tight — плотно закрытый). Третий сайт,
О, открыт, связывает АДФ и АТФ непрочно
и каталитически неактивен (open — открытый).
В соответствии с ротационной гипотезой, син-
тез АТФ происходит циклически. Сначала АДФ
и фосфат непрочно связываются с L-сайтом.
Конформационные изменения в Fj белке пре-
вращают свободный L-сайт в закрытый Т-сайт,
в котором АТФ синтезируется из АДФ и фос-
фата в безводном окружении. Молекула АТФ,
которая при этом образуется, прочно связана с
белком. Еще один конформационный поворот
превращает закрытый сайт в открытый (О), и
синтезированная молекула АТФ освобождается
в окружающую среду. Основное положение ги-
потезы заключалось в том, что с конформацион-
ным изменением в белке Fj, которое происходит
за счет энергии протонного градиента, конфор-
мация трех сайтов меняется одновременно на
следующую по схеме
(L-э Т, Т-э О, О-э L).
Результаты рентгеноструктурного анализа,
приведенные выше, подтверждают ротацион-
ную гипотезу. Четко видно три субъединицы F]i
одна свободна, вторая загружена АДФ, третья —
негидролизуемым аналогом АТФ — АМФ-PNP.
Эти субъединицы находятся в разных конфор-
мационных состояниях. Пол Бойер и Джон Уо-
кер получили Нобелевскую премию в 1997 г.
Дальнейшие исследования показали, что
центральная субъединица у вращается. Субъе-
диницы у и с белка Fj вместе с двенадцатью
субъединицами с комплекса Fo образуют ротор
(выделен цветом на рис. 4.7). В статоре, образо-
ванном субъединицами (оф)3, 5, а, b и Ь*, ротор
вращается, и при этом изменяется конформа-
ция каждого из каталитических центров, пока-
занных на рис. 4.П. Скорость вращения F-АТФ-
синтазы в хлоропластах оценивается примерно
в 160 оборотов в секунду. Все еще не до конца
ясно, каким образом транспорт протонов запу-
скает вращение ротора. Данные недавнего ана-
лиза структуры фермента указывают на то, что
вращение является результатом взаимодействия
между субъединицей а, которая является ча-
стью статора, и субъединицей с, относящейся
к ротору. В соответствии с предварительной мо-
делью, в составе субъединицы а есть протонный
канал, который открыт со стороны люмена, но
перекрыт в середине мембраны. Предполагают,
что через протонный канал протоны из люме-
Рис. 4.11. Синтез АТФ по механизму изменения конформации сайтов связывания,
предложенному Бойером. Главной особенностью предложенного механизма
является то, что синтез АТФ происходит в F! комплексе с тремя сайтами связывания
нуклеотидов, которые находятся в трех различных состояниях: сайт в конформации
L непрочно связывает АДФ и Ф, сайт в конформации Т прочно связывает АДФ и Ф
и катализирует образование АТФ; образовавшаяся молекула АТФ также прочно
связана. В открытой конформации (О) образовавшаяся молекула АТФ выходит
из сайта. Ток протонов через F-АТФ-синтазу, возникающий под действием протон-
движущей силы, приводит к согласованному конформационному изменению трёх
сайтов связывания в процессе вращения
4.4. Синтез АТФ происходит за счет изменения конформации белка
119
на тилакоидов достигают сайта связывания,
расположенного на субъединице с (возможно,
карбоксильной группы остатка аспарагиновой
кислоты). Поворот ротора на один шаг пододви-
гает сайт связывания с протоном к протонному
каналу, который открывается с другой сторо-
ны, выпуская протон на стромальную сторону.
В соответствии с этой моделью перенос про-
тонов из люмена в строму вызывает прогрес-
сивное вращение ротора на один шаг (на одну
с-субъединицу). Протонный градиент между
люменом и стромой обеспечивает необрати-
мость вращения.
Как было упомянуто выше, у некоторых бак-
терий была обнаружена F-АТФ-синтаза, ко-
торая использует для вращения Na+ градиент.
Модель ротора, работающего на протонном гра-
диенте, рассмотренная выше, объясняет работу
этого фермента, если допустить, что субъединица
с в №+-АТФ-синтазе связывает ионы Na+, а две
половины канала проницаемы для Na+.
Еще не до конца ясно, сколько с-субъединиц
входит в состав ротора. К настоящему момен-
ту количество с-субъединиц в одной F-АТФ-
синтазе оценивают как 12 —14 в хлоропластах,
Ю — в митохондриях, 12 — у Е. coli. Однако эти
данные не окончательные. Изучение Е. coli пока-
зало, что число с-субъединиц на один ротор мо-
жет варьировать в зависимости от метаболизма
даже у одного организма. В связи с этим общие
заключения о количестве субъединиц следует де-
лать с осторожностью.
В фотосинтетической электрон-
транспортной цепи стехиометрия
синтезированных НАДФН/АТФ все еще
является предметом дискуссий
В соответствии с моделью, которая обсуждалась
выше, в роторе F-АТФ-синтазы хлоропластов
12—14 с-субъединиц, значит, полный оборот
требует переноса 12—14 протонов. Поскольку
при полном обороте образуются 3 молекулы
АТФ, получаем стехиометрию Н+/АТФ = 4,7.
Независимые измерения показали, что в хло-
ропластах для синтеза одной молекулы АТФ
необходим перенос, по крайней мере, 4 про-
тонов, что вполне согласуется со стехиометри-
ей роторной модели. Не совсем ясно, какой
вклад вносит Q-цикл в транспорт протонов.
При нециклическом электронном транспорте
на каждую молекулу НАДФН через мембра-
ну без участия Q-цикла переносится 4 протона
(ФС II: 2Н+, Цит-/?6//'-комплекс: 2Н+), а с уча-
стием Q-цикла — 6 протонов (Цит-^//1 комп-
лекс: 4Н+) (раздел 3.7). При стехиометрии
Н+/АТФ = 4,7 в нециклическом транспор-
те с функционирующим Q-циклом на каж-
дую молекулу НАДФН будет синтезироваться
1,3 АТФ, а в отсутствие Q-цикла — всего 0,9.
Если эти стехиометрические соотношения со-
блюдаются, нециклического фотофосфорили-
рования не будет достаточно для удовлетворе-
ния нужд ассимиляции СО2 в цикле Кальвина
(АТФ/НАДФН = 1,5 — см. главу 6) и цикличе-
ское фотофосфорилирование (раздел 3.8) также
будет необходимо. Окончательный ответ на во-
прос о стехиометрии фотофосфорилирования
до сих пор не найден. Скорее всего, в живой
клетке стехиометрия очень изменчива и нахо-
дится под регуляторным контролем.
Н+-АГФ-синтаза хлоропластов
регулируется светом
Н+-АТФ -синтаза катализирует реакцию, ко-
торая в принципе обратима. В хлоропластах
градиент pH на тилакоидной мембране гене-
рируется только на свету. В темноте, поскольку
синтез АТФ обратим, можно было бы ожидать,
что АТФ-синтаза начнет катализировать обрат-
ную реакцию с переносом протонов в люмен и
затратой АТФ. Чтобы избежать такого неэконо-
мичного обращения химической реакции, ак-
тивность АТФ-синтазы находится под жестким
контролем. Есть два основных регуляторных
механизма. Если градиент pH на тилакоидной
мембране снижается до некоторого порогово-
го уровня, каталитические сайты р-субъединиц
мгновенно выключаются. Они включаются сно-
ва в тот момент, когда градиент pH восстанавли-
вается на свету. Механизм этого процесса еще не
до конца изучен. Кроме того, АТФ-синтаза хло-
ропластов регулируется путем тиольной модуля-
ции (раздел 6.6). При этом дисульфидная связь
у-субъединицы F] восстанавливается на свету
ферредоксином до двух SH-групп. Восстановле-
ние происходит опосредованно через тиоредок-
син. Восстановление у-субъединицы активирует
каталитические центры р-субъединиц. Таким
образом свет включает F-АТФ-синтазу. В тем-
ноте две SH-группы окисляются кислородом
120
4. В процессе фотосинтеза образуется АТФ
воздуха до дисульфида, вследствие чего катали-
тические центры р-субъединиц оказываются вы-
ключенными. Одновременное действие двух ре-
гуляторных механизмов позволяет эффективно
контролировать активность АТФ-синтазы в хло-
ропластах.
V-АТФаза родственна F-АТФ-синтазе
Помимо F-АТФаз, в растительной клетке на
мембранах существует еще ряд АТФаз, кото-
рые не могут синтезировать АТФ. Эти АТФазы
за счет энергии гидролиза АТФ могут создавать
протонный градиент. Примером может служить
V-АТФаза тонопласта.
V-АТФаза — консервативна у всех эукариот.
У растений V-АТФазы расположены не толь-
ко на тонопласте (вакуолярной мембране, в
честь которой они и были названы), но также
на плазмалемме, мембранах ЭПР и аппарата
Гольджи. У Arabidopsis thaliana были иденти-
фицированы гены как минимум 12 различных
субъединиц этого фермента. Основные функ-
ции этой АТФазы — закисление вакуоли и ге-
нерация на мембранах протонных градиентов,
которые могли бы служить движущей силой для
транспорта ионов. V-АТФаза также участвует
в закрывании устьиц. По структуре V-АТФаза
сходна с F-АТФ-синтазой, но устроена несколь-
ко сложнее. Она состоит из нескольких белков,
погруженных в мембрану (аналогично Fo части
F-АТФ-синтазы), к которым с помощью нож-
ки крепится сферическая часть, выдающаяся в
цитозоль (аналогично Fj)1. Сферическая часть
состоит из трех А- и трех В-субъединиц, кото-
рые чередуются подобно (оф)-субъединицам
F-АТФ-синтазы. F-АТФ-синтаза и V-АТФаза1 2
эволюционировали от общей предковой фор-
мы. V-АТФаза переносит два протона на каж-
дую гидролизованную молекулу АТФ и может
генерировать протонный градиент, который из-
меряют экспериментально (концентрация Н+ в
вакуолях составляет 1,4 моль/л, см. раздел 8.5).
Вакуолярные мембраны также содержат фер-
мент Н+-пирофосфатазу, которая за счет гидро-
1 По аналогии части V-АТФазы обозначают как Vo и V,. —
Прим. ред.
2 Вопрос о происхождении F- и V-АТФаз является дис-
куссионным. V-АТФаза растений отличается от F-АТФазы
многочисленными аминокислотными заменами. F-АТФаза
типична для бактерий. — Прим. ред.
лиза одной молекулы пирофосфата до фосфата
переносит в вакуоль один протон, но не гене-
рирует такой высокий градиент, как V-АТФаза.
Н+-пирофосфатаза, предположительно, состоит
из единственного белка с 16 трансмембранными
спиралями. Вклад каждой из транспортных си-
стем в суммарный перенос протонов в вакуоль
еще не выяснен. Остается загадкой, зачем нужны
два фермента, транспортирующих протоны че-
рез тонопласт. Плазмалемма содержит еще одну
Н+-АТФазу, переносящую протоны Р-АТФазу,
которая будет рассмотрена в разделе 8.2.
Дополнительная литература
Abrahams, J. Р., Leslie, A. G. W., Latter, R., Walker, J. Е.
Structure at 2.8 E resolution of F|-ATPase from bovine
heart mitochondria. Nature 370, 621—628 (1994).
Boekema, E. J., van Heel, M., Graber, P. Structure of
the ATP synthase from chloroplasts studied by electron
microscopy and image processing. Biochim Biophys
Acta 933,365-371 (1988).
Boyer, P. D. The binding change mechanism for ATP
synthase—Some probabilities and possibilities. Biochim
Biophys Acta 1149, 215-250 (1993).
Dimroth, P. Wirkung des Fo-Motors der ATP-Synthase.
Biospektrum 5, 374—380 (1999).
Drozdowicz, Y. M., Rea, P. A. Vacuolar H+
pyrophosphatases: from the evolutionary backwaters into
the mainstream. Trends Plant Sci 6, 206—211 (2001).
Junge, W., Panke, O, Chrepanov, A, Gumbiowski, K,
Engelbrecht, S. Intersubunit rotation and elastic power
transmission in F0F]-ATPase. FEBS Lett 504, 152—160
(2001).
Kramer, D. M., Cruz, J. A., Kanazawa, A. Balancing the
central roles of the thylakoid proton gradient. Trends
Plant Sci 8, 27-32 (2003).
Leigh, R. A., Gordon-Weeks. R., Steele, S. H.,
Korenkov, V. D. The H+- pumping inorganic
pyrophosphatase of the vacuolar membrane of higher
plants. In Blatt, M. R., Leigh, R. A., Sanders, D. (eds.).
Membranes for Experimental Biology, Cambridge
University Press, Cambridge, pp. 61—74 (1994).
Luttge, U., Ratajczak, R. The physiology, biochemistry
and molecular biology of the plant vacuolar ATPase.
In R. A. Leigh, D. Sanders (eds.). The Plant Vacuole,
Advances in Botanical Research 25, Academic Press,
New York, pp. 253-296 (1997).
Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M., Kinosita Jr., K. Direct
observation of the rotation of F|-ATPase. Nature 386,
299-302(1997).
Дополнительная литература
121
Rastogi, V. К., Girvin, М. Е. Structural changes linked to
proton translocation by subunit c of the ATP synthase.
Nature 402, 263-268 (1999).
Sambongi, Y., Iko, Y., Tanabe, M., Omote, H., Iwamoto-
Kihara, A., Ueda, I., Yanagida, T.,Wada, Y, Futai, M.
Mechanical rotation of the c subunit oligomer in ATP
synthase (FoF^: Direct observation. Science 286, 1722—
1724(1999).
Seelert, H., Poetsch, A., Dencher, N. A., Engel, A., Stahl-
berg, H., Muller, D. J. Proton-powered turbine of a plant
motor. Nature 405,418-419 (2000).
Stock, D., Leslie, A. G.W.,Walker, J. E. Molecular
architecture of the rotary motor in ATP synthase.
Science 286, 1700-1705(1999).
Sze, H., Schumacher, K., Mueller, M. L., Padmanaban, S.,
Taiz, L. A simple nomenclature for a complex proton pump:
VHA genes encode the vacuolar H+-ATPase. Trends Plant
Sci 7, 157-161 (2002).
Митохондрии — энергетические станции клетки
В процессе биологического окисления суб-
страты, такие как углеводы, постепенно
разлагаются с образованием воды и СО2. Био-
логическое окисление можно рассматривать
как обращение процесса фотосинтеза. Эво-
люционно этот процесс окончательно сфор-
мировался только после того, как в результате
фотосинтеза в атмосфере накопился кислород1.
И биологическое окисление, и фотосинтез слу-
жат для генерации энергии в форме АТФ. Био-
логическое окисление включает транспорт
электронов по митохондриальной электрон-
транспортной цепи, которая частично сходна
с фотосинтетической электрон-транспортной
цепью, рассмотренной в главе 3. В данной гла-
ве мы покажем, что аппарат митохондриаль-
ного электронного транспорта также имеет
модульную организацию. Из трех комплексов,
входящих в состав электрон-транспортной
цепи, центральный имеет структуру, сходную с
цитохром-£6//'-комплексом хлоропластов. Как
и при фотосинтезе, электронный транспорт в
дыхательной цепи и синтез АТФ сопряжены че-
рез образование протонного градиента. Синтез
АТФ осуществляется с участием F-АТФ-син-
тазы, похожей по структуре на АТФ-синтазу
хлоропластов, которая была описана в главе 4.
5.1.	Биологическое окисление
происходит за счет разложения
субстратов с образованием
водорода и СО2
Суммарная реакция биологического окисления
эквивалентна реакции горения. Но, в отличие
1 Такое представление слишком упрощенно и схематично.
На самом деле процессы окисления происходили до возник-
новения оксигенного фотосинтеза. Выделение кислорода
в атмосферу позволило использовать О2 в окислительно-
восстановительных реакциях, резко повысив их энергетиче-
ский выход. — Прим. ред.
от горения, биологическое окисление проис-
ходит в последовательных частичных реакциях,
которые позволяют запасать большую часть вы-
свобождаемой энергии для синтеза АТФ.
Принципиальная схема биологического окис-
ления была сформулирована в 1932 году лауреа-
том Нобелевской премии Генрихом Виландом
хн2 + у2о2 —> х + н2о
Сначала от субстрата ХН2 отнимается водо-
род, который затем окисляется до воды. Таким
образом, в процессе окисления углеводы [СН2О]П
сначала расщепляются в реакции с водой с об-
разованием СО2 и связанного водорода [Н], а
последний в дальнейшем окисляется до воды:
[СН2О] + Н2О----> СО2 + 4[Н]
4[Н] + О2---> 2Н2О
В 1934 году Отто Варбург (лауреат Нобелев-
ской премии по медицине 1931 г.) показал, что
перенос водорода от субстрата к месту окисле-
ния происходит в форме «связанного водорода»
в молекуле НАДН. На основании эксперимен-
тов с гомогенатом летательной мышцы голубя в
1937 г. Ганс Кребс открыл цикл трикарбоновых
кислот (также называемый циклом Кребса)
как механизм расщепления субстрата, произ-
водящий восстановительные эквиваленты для
восстановления кислорода в процессе биологи-
ческого окисления. В 1935 г. он был награжден
Нобелевской премией по медицине за это от-
крытие. Функционирование цикла трикарбо-
новых кислот (ЦТК) будет рассмотрено в раз-
деле 5.3.
5.2.	В митохондриях локализовано
клеточное дыхание
Исследования многих типов клеток с помощью
светового микроскопа показали, что клетки со-
5.2. В митохондриях локализовано клеточное дыхание
123
держат небольшие органеллы, внешне похожие
на бактерий. В начале прошлого века ботаник
К. Бенда назвал эти органеллы митохондриями,
что значит «нитевидные тельца». Однако долгое
время функции митохондрий оставались неизу-
ченными.
Но уже в 1913 г. Отто Варбург понял, что кле-
точное дыхание — одна из функций этих органелл
клетки. Он успешно выделил из дрожжей белок,
который назвал «дыхательным ферментом». Этот
фермент катализировал окисление субстрата
кислородом. Варбург также показал, что в этом
катализе участвуют атомы железа. В 1925 г. Дэвид
Кейлин из Кэмбрижда (Великобритания) открыл
цитохромы и показал их участие в клеточном ды-
хании. Используя спектроскоп с ручным управ-
лением, он идентифицировал цитохромы а, а3, b
и с (см. рис. 3.24).
В 1928 г. Отто Варбург показал, что в со-
став его «дыхательного фермента» входит
цитохром-а3. Следующим важным событием
для выяснения механизма клеточного дыха-
ния было открытие Германа Калкара, кото-
рый в 1937 г. обнаружил, что образование АТФ
в аэробных системах зависит от потребления
кислорода. Взаимосвязь клеточного дыхания
и синтеза АТФ в процессе окислительного
фосфорилирования теперь стала очевидной.
В 1948 г. Юджин Кеннеди и Альберт Ленинджер
показали, что митохондрии содержат ферменты
цикла трикарбоновых кислот и окислительного
фосфорилирования. Это открытие указывало
на роль митохондрий в клетке: они выполняют
функции «энергетических станций».
Митохондрии образуют
отдельный метаболический компартмент
Как и пластиды, митохондрии являются органел-
лами с отдельным внутренним метаболическим
компартментом. Структура митохондрий обсуж-
далась в разделе 1.4. На рисунке 5.1 представле-
на общая схема энергетического окислительного
метаболизма митохондрий. Расщепление суб-
стратов до СО2 и водорода (который связывается
с НАДН) происходит в матриксе митохондрий.
Образовавшийся в цикле Кребса НАДН диф-
фундирует к внутренней мембране митохондрий
и там окисляется в дыхательной цепи. В дыха-
тельной цепи происходит ряд последовательных
окислительно-восстановительных реакций, в
результате которых электроны передаются от
НАДН на кислород. Как и при фотосинтетиче-
Рис- 5-1 - Схема энергетического метаболизма митохондрий
124
5. Митохондрии — энергетические станции клетки
ском электронном транспорте, высвобождаемая
энергия используется для генерации протонно-
го градиента, который, в свою очередь, является
движущей силой для синтеза АТФ. АТФ, образу-
ющаяся в результате работы цепи, выносится из
митохондрий и используется для нужд клеточно-
го метаболизма. Энергетическая функция мито-
хондрий универсальна для всех эукариотических
клеток.
5.3.	Расщепление субстрата для
биологического окисления
происходит в матриксе
Пируват (пировиноградная кислота, ПВК), ко-
торый образуется в процессе гликолитического
катаболизма углеводов в цитозоле, является тем
первичным субстратом, который подвергается
дальнейшему расщеплению в ЦТК (рис. 5;2).
СООе
I
с=о
I
СН3
соое
I
СН3
2 н2О + н®
2 СО2
Пируват	Ацетат
Рис. 5.2. Суммарная реакция окисления пирувата митохондриями. Ацетат образуется в
форме ацетил-кофермента А. [Н] обозначает связанный водород в форме НАДН и ФАДН2
Малат
Пируват
Г лутамат
Малат
НАД-малик-
энзим
МАТРИКС МИТОХОНДРИИ
Пируват
НАД©
НАДН + Н©
Глутамат
НАД© НАДН + Н©
+ со2
KoA-SH
Пируват-
дегидрогеназа
дегидрогеназа
I дегидрогеназа л
Оксалоацетат
НАДН + Н©
НАД©
---► Малат
Фумараза
ФАД
Сукцинат-
дегидрогеназа
Фумарат
ФАДН,
СО
Ацетил-КоА KoA-SH
Цитрат
Цитрат-
синтаза
Сукцинат
+ NH®
4
а-Кетоглутарат
Аконитаза
СО
Изоцитрат
НАД© Изоцитрат- I
НАДН + Н© । дегидрогеназа I
а-Кетоглутарат
KoA-SH НАД©
СО2НАДН + Н®
дегидрогеназа
АТФ
АДФ + Ф
Сукцинил-КоА
рукцинаттио
киназа
Рис. 5.3. Цикл Кребса (ЦТК). Ферменты цикла локализованы в матриксе
митохондрий, за исключением сукцинатдегидрогеназы, которая расположена во
внутренней митохондриальной мембране. Особенностью растительных митохондрий
является наличие в их матриксе НАД-зависимого маликэнзима. Поэтому
растительные митохондрии могут окислять малат в цикле Кребса даже в отсутствие
пирувата. Глутаматде гидрогеназа позволяет им также окислять глутамат
5.3. Расщепление субстрата для биологического окисления происходит в матриксе
125
Сначала пируват окисляется до ацетата (в фор-
ме ацетил-кофермента А), который затем пол-
ностью расщепляется до СО2 в ЦТК с образова-
нием Ю восстановительных эквивалентов [Н],
которые затем будут окисляться в дыхательной
цепи для синтеза АТФ. На рисунке 5.3 показа-
ны реакции ЦТК.
Пируват окисляется
мультиферментным комплексом
Окисление пирувата катализирует пируват-
дегидрогеназный комплекс (ПДК), мультифер-
ментный комплекс, расположенный в матрик-
се митохондрий. Он состоит из трех различных
катал итичес ких субъед и ниц: пируватдегидро-
геназы, дигидролипоилтрансацетилазы и
дигидролипоилдегидрогеназы (рис. 5.4). Пи-
Рис. 5.4.
Окисление пирувата
пируватдегидрогеназным
комплексом, состоящим
из субъединиц:
пируватдегидрогеназы
(простетическая
группа —
тиаминпирософосфат),
дигидролипоилтранс-
ацетилазы
(простетическая
группа — липоевая
кислота)
и дигидролипоилдегидро-
геназы (простетическая
группа — ФАД). Реакции
цикла описаны в тексте
°\	I®
/	Q	У?
I Резонанс	।	H®N—С-	Тиаминпирофосфат
126
5. Митохондрии — энергетические станции клетки
а Тиаминпирофосфат
Тиазольное кольцо
Рис. 5.5. Группы, участвующие
в окислении пирувата:
a — тиаминпирофосфат;
б—	амид липоевой кислоты;
в — кофермент А
Карбоанион
б
I	гл	Липоевая кислота
NH	U
I ^СН2\	/СН2\	/СН2\	/СН2\
н—с—СН2	СН2 IM СН2 СН2 CH —S
I	н	/
q=C	Лизин	Н2С\
I	CH2-S
Белковая цепь
В Кофермент А
О	О н сн3
II	II	I	I
HS— СН2— СН2— N— с— СН2— сн2— N— С— С— С—
Н	Н I I
но сн3
руват дегидрогеназа содержит в качестве про-
стетической группы тиаминпирофосфат (ТРР,
рис. 5.5a) Активным участком молекулы ТРР
является тиазольное кольцо. Благодаря присут-
ствию положительно заряженного атома азота
тиазольное кольцо содержит С-атом, придаю-
щий гетероциклу свойства кислоты. После дис-
социации протона образуется карбоанион, кото-
рый способен связывать карбонильную группу
пирувата. Положительно заряженный N-атом
тиазольного кольца облегчает декарбоксилиро-
вание пирувата с образованием гидроксиэтил-
ТРР (см. рис. 5.4). Гидроксиэтильная группа за-
тем передается на липоевую кислоту.
Липоевая кислота является простетиче-
ской группой дигидролипоилтрансацетилазы.
Карбоксильная группа липоевой кислоты кова-
лентно связана с остатком лизина ферментного
белка через амидную связь (рис. 5.56). Остаток
липоевой кислоты фактически связан с белком
длинной цепью и поэтому может реагировать с
различными сайтами мультиферментного ком-
плекса. Липоевая кислота содержит два атома
серы, связанных дисульфидной связью. Когда
гидроксиэтиловый остаток передается на оста-
ток липоевой кислоты, она восстанавливается
до дигидролипоевой кислоты, а гидроксиэтиль-
ный осаток окисляется до ацетильного остатка.
Последний присоединяется к дигидролипоевой
кислоте через тиоэфирную связь. Таким обра-
зом, энергия, высвобожденная при окислении
карбонильной группы, запасается в богатой
энергией тиоэфирной связи. После этого аце-
тильный остаток передается дигидролипоил-
трансацетилазой на сульфгидрильную группу
кофермента А (рис. 5.56) с образованием ацетил
кофермента А. Ацетил-КоА — его еще называ-
ют активной уксусной кислотой — был открыт
5.3. Расщепление субстрата для биологического окисления происходит в матриксе
127
Ацетил-КоА
Цитратсинтаза
СК S-KoA
Р'
н-с-н
Н
О\ .S-KoA
I
н н-с-н
Н2О KoA-SH q. о + н
" с
Резонанс
н с н
о=с-соо°
I
сн2
соое
ео-с-соое
I
сн2
соое
НО-С-СОСУ
сн2
соое
Оксалоацетат	Цитрат
Рис. 5.6. Конденсация ацетил-КоА с оксалоацетатом с образованием цитрата
Теодором Линеном из Мюнхена (Нобелевская
премия по медицине 1984 г.). Дигидролипоевая
кислота окисляется обратно в липоевую кисло-
ту с помощью дигидролипоилдегидрогеназы.
При этом НАД+ восстанавливается до НАДН
через ФАД (рис. 5.16). Заметим, что пируват был
найден также в хлоропластах, но его функции в
метаболизме липидов будут обсуждаться в раз-
деле 15.3.
Ацетат полностью окисляется в цикле
трикарбоновых кислот
Ацетил-кофермент А входит в цикл Кребса
и реагирует с оксалоацетатом с образованием
цитрата (рис. 5.6). Эта реакция катализирует-
ся ферментом цитратсинтазой. Тиоэфирная
группа отнимает протон у ацетильного остатка,
и образующийся при этом карбоанион связы-
вается с углеродом карбонильной группы окса-
лоацетата. Последующее освобождение KoA-SH
делает реакцию необратимой. Фермент акони-
таза (рис. 5.7) катализирует обратимую изо-
меризацию цитрата до изоцитрата. В этой
реакции выделяется первая молекула воды, а
^wc-аконитат остается связанным с ферментом
и преобразуется в изоцитрат при участии воды.
Кроме митохондриальной аконитазы, есть так-
же изоферментная форма аконитазы в цитозоле
растительной клетки.
Окисление изоцитрата до а-кето глутарата
НАД-изоцитратдегидрогеназой (рис. 5.8) при-
водит к образованию НАДН. Оксалосукцинат об-
разуется как промежуточный продукт, который,
будучипрочносвязаннымсферментом,декарбок-
силируется с образованием а-кетоглутарата (его
также называют 2-оксоглутарат). Это декарбок-
силирование делает окисление изоцитрата необ-
ратимым. Кроме НАД-изонитратдегидрогеназы
в митохондриях есть и НАДФ-зависимый фер-
мент. НАДФ-изоцитратдегидрогеназа присут-
ствует также в строме хлоропластов и в цитозоле.
Функции этого фермента в этих компартментах
будут рассмотрены в разделе Ю.4.
Окисление а-кетоглутарата до сукцинил-КоА
(см. рис. 5.8) катализируется а-кетоглутарат-
дегидрогеназным мультиферментным ком-
Аконитаза
СОО0
I
н-с-н
но-с-соо0
I
н-с-н
I
соое
н2о
соо°
I
н-с-н
с-соо0
II
с-н
I
соо°
Н2О
соо°
I
н-с-н
н-с-соо0
I
но-с-н
соо°
Цитрат
цис-Аконитат
Изоцитрат
Рис. 5.7. Изомеризация цитрата до изоцитрата
128
5. Митохондрии — энергетические станции клетки
НАД-изоцитрат-
дегидрогеназа
а-Кетоглутарат-
дегидрогеназа
соое
I
СН2
н-с-соо0
I
НО-С-Н
I
соо0
НАД НАДН + Н
соо0
I
сн2
н-с-соо0
I
с=о
I
соое
COO0
I
СН2
СН2
с=о
I
СООе
KoA-SH
соо0
I
СН2
СН2
с=о
S-KoA
Изоцитрат
Оксалосукцинат
а-Кетоглутарат
Сукцинил-КоА
Рис. 5.8. Окисление изоцитрата с образованием сукцинил-КоА
плексом, в состав которого входят тиамин-
пирофосфат, липоевая кислота и ФАД, аналогично
рассмотренному выше комплексу, окисляющему
пируват до ацетил КоА.
Тиоэфирная связь сукцинил-КоА богата
энергией. В сукцинат-тиокиназной реакции
свободная энергия, высвобождаемая при ги-
дролизе этого тиоэфира, запасается в форме
АТФ (рис. 5.9). Следует отметить, что в мета-
болизме животных клеток в митохондриаль-
ной сукцинат-тиокиназной реакции образует-
ся ГТФ. Сукцинат, который образуется в этой
реакции, окисляется сукцинатдегидрогеназой
до фумарата. Сукцинатдегидрогеназа — един-
ственный фермент ЦТК, расположенный не в
матриксе, а на внутренней митохондриальной
мембране так, что сайт связывания сукцина-
та доступен со стороны матрикса (раздел 5.5).
Восстановительные эквиваленты, полученные
при окислении сукцината, передаются на уби-
хинон. В реакции, катализируемой фумаразой,
вода реагирует с двойной С=С связью фумарата
путем лиряяс-присоединения с образованием
L-малата. Эта реакция обратима (см. рис. 5.9).
Окисление малата малатдегидрогеназой, в
результате которого образуется оксалоацетат и
НАДН, является последней реакцией ЦТК (см.
рис. 5.9). Равновесие реакции сильно сдвинуто в
сторону образования малата.
[НАДН] • [оксалоацетат]
[НАд+] [Малат] = 2,8 • 10 (pH 7)
Сукцинат-
тиокиназа
Сукцинат-
дегидрогеназа
Малат-
дегидрогеназа
соо®
I
сн2
сн2
с=о
S-KoA
АДФ АТФ
+ Ф + KoA-SH
СОО®
I
сн2
сн2
соо®
ФДД фадн2
соо®
I
сн
II
НС
соо®
Фумараза
соо®
I
сн2
н-с-он
соо®
НАД1 НАДН+ Н‘
СОО®
I
сн2
с=о
соо®
Сукцинил-
КоА
Сукцинат
Фумарат
L-Малат
Оксалоацетат
Рис. 5.9. Превращение сукцинил-КоА в оксалоацетат
5.3. Расщепление субстрата для биологического окисления происходит в матриксе
129
Поскольку эта реакция равновесная, для
функционирования ЦТК особенно важно, что-
бы реакция цитратсинтазы была необратимой.
С помощью цитратсинтазной реакции окса-
лоацетат удаляется из равновесной системы
малатдегидрогеназы, и равновесие сдвигается
в сторону образования оксалоацетата. Изофер-
менты малатдегидрогеназы также есть вне мито-
хондрий. В цитозоле и в матриксе пероксисом
найдены НАД-малатдегидрогеназы, а в строме
хлоро пластов — Н АДФ-малатдегидрогеназа.
Эти ферменты будут рассмотрены в главе 7.
Отток интермедиатов цикла трикарбоновых
кислот возмещается
за счет анаплеротических реакций
ЦТК может функционировать только в том слу-
чае, если оксалоацетат, необходимый в качестве
акцептора для ацетильного остатка, полностью
регенерируется. В разделе Ю.4 описывается,
как цитрат и а-кетоглутарат выходят из ЦТК
для синтеза аминокислот в процессе ассими-
ляции нитрата. Таким образом, необходимо
восполнять недостаток интермедиатов цикла
за счет анаплеротических реакций (от греч.
anaplero — восполнять, доводить до полно-
го числа). В отличие от митохондрий клеток
животных, растительные митохондрии могут
транспортировать оксалоацетат с помощью
специального транслокатора на их внутрен-
ней мембране (раздел 5.8). Так что ЦТК может
поддерживаться за счет притока оксалоацетата,
который образуется фосфоенолпируваткарбок-
силазой в цитозоле (раздел 8.2)1. Оксалоацетат
может также получаться путем окисления мала-
та в митохондриях. Малат запасается и хранит-
ся в вакуоли (разделы 1.2, 8.2 и 8.5) и является
важным субстратом для митохондриального
дыхания. Особенностью растительных мито-
хондрий является их способность окислять ма-
лат до пирувата с восстановлением НАД и вы-
свобождением СО2. Эту реакцию катализирует
фермент НАД-маликэнзим, локализованный
в матриксе (рис. 5.10). Таким образом, актив-
1 На самом деле транспорт оксалоацетата из цитозоля име-
ет минорное значение. Гораздо большую роль играет посту-
пление малата через малат/фосфатный антипортер (малат
образуется в цитозоле при восстановлении оксалоацетата).
Есть также обмен оксалоацетата на малат или цитрат в экви-
толярных соотношениях, но этот транспортный процесс не
столь важен для поддержания ЦТК. — Прим. ред.
соо°
I
сн2
н-с-он
соо°
L-Малат
НАД-маликэнзим
СН3
с=о
соо°
Пируват
Рис. 5.10. Окислительное декарбоксилирование
малата с образованием пирувата
ность малатдегидрогеназы и НАД-маликэнзима
позволяет образовать цитрат из малата без
прохождения полного цикла (рис. 5.3). Сле-
дует отметить, что НАДФ-зависимый мали-
кэнзим есть также в хлоропластах, особенно у
С4-растений (раздел 8.4).
Еще один важный субстрат митохондриаль-
ного окисления — глутамат, который являет-
ся одним из основных продуктов ассимиляции
нитрата (раздел ЮЛ). Во многих растительных
клетках глутамат — второе органическое веще-
ство после сахарозы по концентрации в цито-
золе. Окисление глутамата, сопровождающееся
образованием НАДН, катализируется глутамат-
дегидрогеназой, расположенной в матриксе ми-
тохондрий (рис. 5.П). Существует изоформа это-
го фермента, которая также реагирует с НАДФ.
Активность НАДФ-глутаматдегидрогеназы так-
же обнаружена в пластидах, хотя функция фер-
мента в этом компартменте неясна.
Глицин — главный субстрат дыхания в мито-
хондриях клеток мезофилла в листьях на свету.
Окисление глицина является частью метаболи-
Г лутаматдегидрогеназа
L-Глутамат
Рис. 5.11. Окисление глутамата
СОО°
I
сн2
сн2
с=о
I
соо°
а-Кетоглутарат
130
5. Митохондрии — энергетические станции клетки
ческого пути фотодыхания, который мы рассмо-
трим в разделе 7.1.
5.4.	Сколько энергии может быть
запасено в результате окисления
НАДН?
Сначала зададимся вопросом: сколько энергии
выделяется в процессе митохондриального ды-
хания или, точнее, насколько велика разность
свободных энергий субстратов и продуктов
окислительно-восстановительной реакции в
митохондриях? Чтобы ответить на этот вопрос,
надо знать разности редокс-потенциала в па-
рах, задействованных в процессе. Эта разность
потенциалов может быть рассчитана по уравне-
нию Нернста:
г r^RT У
Е= Е +— In
nF
[окисленное вещество]
[восстановленное вещество]
где ЕУ — стандартный потенциал при pH 7,
25 °C; R (универсальная газовая постоянная) =
= 8,31 Дж/(К моль); Т= 298 К; п — число пере-
данных электронов; F (константа Фарадея) =
= 96480 (Дж с)/(В моль).
Стандартный потенциал для редокс-пары
НАД+/НАДН составляет
= -0,32 В.
(5.1)
При определенных метаболических услови-
ях соотношение НАД+/НАДН в митохондриях
листа равно 3. Подставляя это значении в (5.1),
получаем
Д1АД+/НАДН = -0,320 1пЗ = -0,306 В
Стандартный потенциал для пары Н2О/О2
составляет
= +0,815 В ([Н2О] в воде составляет 55 М)
Парциальное давление кислорода в воздухе
можно подставить в уравнение в качестве актив-
ности для газообразного [О2].
Ен2о/о2 = 0,8! 5 + InVp О2 (5.2)
Парциальное давление кислорода в воздухе
(рО2) равно 0,2. Подставляя это значение в вы-
ражение (5.3), получаем
£н2о/о2 = 0,815 В	(5.3)
Разность потенциалов составляет
= ^Н2О/О2_ ^НАД+/НАДН =	1 1 В
Свободная энергия (ДО связана с \Е следу-
ющим соотношением:
\G=-nFbE	(5.4)
В этой реакции передаются два электрона.
Выражение для &Е из (5.5) демонстрирует, что
изменение свободной энергии при окислении
НАДН вдыхательной цепи равно
&G= —214 кДж/моль	(5.5)
Сколько энергии требуется для образования
АТФ? В разделе 4.1 мы подсчитали, что синтез
АТФ в хлоропластах требует изменения свобод-
ной энергии AG « +50 кДж/моль. Эта величи-
на также относится к молекулам АТФ, которые
синтезируются в митохондриях для экспорта в
цитозоль.
Таким образом, свободная энергия, которая
выделяется при окислении НАДН, была бы до-
статочна для синтеза четырех молекул АТФ, но
на самом деле количество АТФ, который син-
тезируется при окислении НАДН, значительно
меньше (раздел 5.6).
5.5.	Дыхательная цепь митохондрий
имеет много общего с
электрон-транспортной цепью
фотосинтеза
Фотосинтез цианобактерий привел к накопле-
нию кислорода в ранней атмосфере и, таким об-
разом, сформировал основу для окислительного
метаболизма митохондрий. Многие цианобак-
терии могут удовлетворять свою потребность в
АТФ как за счет фотосинтеза, так и за счет окис-
лительного метаболизма. Цианобактерии содер-
жат фотосинтетическую электрон-транспортрую
цепь, которая состоит из трех модулей (ком-
плексов), а именно: фотосистемы II, цит-7>6//-
комплекса и фотосистемы I (глава 3; рис. 5.12).
Эти комплексы расположены во внутренней
мембране цианобактерий — там же, где и фер-
менты дыхательной электрон-транспортной
цепи. Эта дыхательная цепь также состоит
из трех модулей: НАДН-дегидрогеназного
комплекса, в котором происходит окисление
НАДН, того же цит-Л6//'-комплекса, который
5.5. Дыхательная цепь митохондрий имеет много общего с ЭТЦ фотосинтеза
131
Свет
Свет
Н2О
1/2О2 + 2Н®
НАДН
НАД® + Н®
Рис. 5.12. Схема фотосинтетического и окислительного электронного транспорта
у цианобактерий. В обеих электрон-транспортных цепях цитохром-bjf-комплекс
функционирует как центральный комплекс переносчиков
является компонентом фотосинтетической цепи,
и цит-а/а3-комплекса, в котором происходит
восстановление кислорода до воды. Пластохи-
нон отдает электроны на цит-/?6//'-комплекс не
только при фотосинтезе (раздел 3.7), но и в ды-
хательной цепи цианобактерий. Аналогично,
цитохром-с обеспечивает передачу электрона от
um-bjf-комплекса как на фотосистему I, так и
на цит-я/я3-комплекс. Взаимосвязь фотосинте-
тического и окислительного электронного транс-
порта у цианобактерий вполне очевидна; обе
электрон-транспортные цепи имеют один и тот
же центральный модуль — цит-^/Лкомплекс.
В разделе 3.7 описано, как в цит-/?6//'-комплексе
энергия, выделяющаяся при переносе электро-
на, используется для создания протонного гра-
диента. Участие цит-£6//'-комплекса в дыхании
и фотосинтезе свидетельствует о том, что фото-
синтетический и окислительный электронный
транспорт построены по одному принципу.
Митохондриальная дыхательная цепь ана-
логична дыхательной цепи цианобактерий
(рис. 5.13), но вместо убихинонов в качестве
переносчика электронов функционирует пла-
стохиноны; имеются также незначительные
отличия в структуре цитохромов. Вместо цит-
НАДН
Н® + НАД®
Сукцинат Фумарат
1/2О2 + 2Н®
Н2О
Комлекс I	Комплекс III
Комплекс IV
Рис. 5.13. Схема электронного транспорта в митохондриях. Дыхательная
цепь состоит из четырёх комплексов; центральный цитохром-6/cj-комплекс
соответствует цитохром-bjf-комплексу цианобактерий и хлоропластов
132
5. Митохондрии — энергетические станции клетки
£6/Лкомплекса в митохондриях функционирует
сходный с ним цит-£/С]-комплекс. И цит-с, и
цит-/содержат гем-с.
На рисунке 5.13 в качестве примера еше одно-
го участка в митохондриальной дыхательной
цепи приведена сукцинатдегидрогеназа. Этот
фермент (его историческое название — ком-
плекс II) катализирует окисление сукцината до
фумарата и передает электроны на пул убихино-
нов. Эта реакция является частью никла Кребса
(см. рис. 5.9).
Комплексы митохондриальной
дыхательной цепи
Подразделение дыхательной цепи на несколько
комплексов восходит к Ёссефу Хатефи, кото-
рый в 1962 г., работая с митохондриями сердца
быка, успешно выделил четыре различных ком-
плекса, которые и назвал комплексами I—IV.
Недавно было показано, что в митохондриях
растений комплексы I и III могут быть объеди-
нены в суперкомплекс. В комплексах I, III и IV
перенос электрона сопровождается снижением
редокс-потенциала (рис. 5.14); энергия, которая
выделяется при этом, используется для форми-
рования протонного градиента.
НАДН-дегидрогеназый комплекс (ком-
плекс I) (рис. 5.15) снабжает дыхательную цепь
электронами от НАДН, который образуется при
окислении субстратов в матриксе. Электроны
передаются на убихинон через флавинмоно-
нуклеотид (ФМН) и несколько железосерных
центров. Комплекс I имеет наиболее сложную
структуру из всех митохондриальных электрон-
транспортных комплексов. Он состоит из более
40 различных субъединиц (из них от 7 до 9, в
зависимости от организма, кодируются в мито-
хондриальном геноме). Одна часть комплекса
погружена в мембрану (мембранная часть), а
другая (периферическая) выступает в матрикс.
Периферическая часть содержит сайт связыва-
ния НАДН, связанный ФМН (рис. 5.16) и, по
меньшей мере, три Fe-S-центра (см. рис. 3.26).
Мембранная часть содержит еше один Fe-S-
центр, а также сайт связывания убихинона.
Транспорт электрона ингибируется рядом ядов
растительного и бактериального происхожде-
ния, таких, как ротенон (который защищает
Вольт
-0.4-
0-
0.4-
0.8-
НАДН
Н® 4- НАД®
Сукцинат
Фумарат
н2о
72О2 + 2Н®
Рис. 5.14. Схема комплексовдыхательной цепи, которые расположены
в соответствии с их редокс-потенциалом. Обозначения: НАДН-ДГ —
НАДН-дегидрогеназный комплекс, Сукц-ДГ — сукцинатдегидрогеназный комплекс
5.5. Дыхательная цепь митохондрий имеет много общего с ЭТЦ фотосинтеза
133
НАДН-
дегидрогеназный
комплекс
(Комплекс I)
Цит-Ь/сг
комплекс
(Комплекс III)
Цит-а/а3-
комплекс
(Комплекс IV)
2
Ингибиторы:	Ротенон
Пиерицидин
Амитал
Антимицин А
Миксотиазол
KCN
СО
Рис. 5.15. Схема расположения комплексов I, III и IV дыхательной цепи во
внутренней мембране митохондрий
растения от поедания травоядными животны-
ми); антибиотик пиерицидин А и барбитурат
амитал. Электронный транспорт, который ка-
тализируется комплексом I, обратим: возможна
передача электронов от убихинона к НАД+ за
счет протон-движущей силы протонного гради-
ента. За счет подобного процесса в гомологич-
ном НАДН-дегидрогеназном комплексе пур-
пурные бактерии обеспечивают себя НАДН (см.
рис. 3.1).
Сукцинатдегидрогеназа (комплекс II) (см.
рис. 5.9) из растительных митохондрий состоит
из семи субъединиц. В качестве акцептора элек-
тронов она содержит флавинадениндинуклеотид
(ФАД, рис. 5.16); в качестве переносчиков элек-
тронов — несколько Fe-S-центров (рис. 3.26), а
также цитохром-Z?, функция которого неизвест-
на. Перенос электронов на убихинон с участием
сукцинатдегидрогеназы происходит без значи-
тельного снижения редокс-потенциала, поэтому
в процессе транспорта электрона с сукцината на
убихинон запасания энергии не происходит.
Убихинон, восстановленный НАДН-дегидро-
геназой или сукцинатдегидрогеназой, окисляет-
ся цит-Ь/сх-комплексом (комплексом III) (см.
рис. 5.15). В митохондриях этот комплекс состоит
из Н субъединиц, и только одна из них (цит-/?)
кодируется в геноме митохондрий. По структуре
и функциям цит-/?/С]-комплекс очень сходен с
цит-/?6//'-комплексом хлоропластов (раздел 3.7).
Электроны в этом комплексе передаются на
цит-с, который связан с наружной поверхностью
мембраны. Несколько антибиотиков, таких, как
антимицин А и миксотиазол, ингибируют элек-
тронный транспорт в цит-/?/С] комплексе.
После получения электрона восстановлен-
ный цит-с приобретает «отрицательный» за-
ряд и диффундирует вдоль положительно за-
ряженной поверхности внутренней мембраны
к цит-я/я3-комплексу (см. рис. 5.15), который
также называют комплексом IV, или цитох-
’ Число субъединиц всех комплексов ЭТЦ может варьиро-
вать у различных организмов. — Прим. ред.
134
5. Митохондрии — энергетические станции клетки
R
Окисленный флавин
R
Семихинонная форма
Восстановленный флавин
R:	|	Флавин-
СН2 мононуклеотид
н-с-он <ФМН>
I
н-с-он
I
н-с-он о
1	11 А
н-с—о—р—ое
R: |	Флавин-
СН2 адениндинуклеотид
н-с-он	(фАД)
I
н-с-он
Н-С—О—Р—О—P-О—Рибоза-аденин
I	L	।
н	ое	ое
Рис. 5.16. ФМН и ФАД, окисленные и восстановленные формы
Гем-а
Цитохром-а
His	Cys	Met
Glu Cys His
Рис. 5.17. В медь-серном кластере
цитохром-я/я3-комплекса, который обозначают
как CuA, Си2+ и Си+ ионы соединены двумя
цистеиновыми остатками белковой молекулы,
а также связаны с белком через два гистидина, один
глутамат и один метионин. СиА, предположительно,
переносит один электрон. Структура этого
редокс-кластера была установлена с помощью
рентгеноструктурного анализа цитохром-а/аъ-комп-
лекса, который был одновременно произведен во
Франкфурте (Германия; Iwata et al., 1995) и в Осаке
(Япония; Tsukihara et al., 1995)
Гем-а
Fe
Цитохром-а3
Рис. 5.18. Осевые лиганды атомов железа
в гемовых группах цитохромов -а и -ау. Из шести
координационных связей, которые образует атом
Fe в центре гема, четыре заняты N-атомами,
которые входят в состав плоского тетрапиррольного
кольца. В то время как в цитохроме-я две
оставшиеся координационные связи Fe-атома
оказываются занятыми гистидиновыми группами
белка, расположенными с обеих сторон от
тетрапиррольного кольца, в цитохроме-я3 одна из
связей свободна и работает как сайт связывания
молекулы О2. Обозначения: Prot — белковая цепь
5.6. Транспорт электронов в дыхательной цепи сопряжен с синтезом АТФ через транспорт протонов 135
ромоксидазой. Этот комплекс состоит из 13
различных субъединиц1, три из которых ко-
дирует митохондриальный геном. Недавно
трехмерная структура комплекса была изуче-
на с помощью рентгеноструктурного анали-
за комплексов из митохондрий сердца быка и
Paracoccus denitrifleans. Комплекс имеет боль-
шой гидрофильный участок, который выступа-
ет в межмембранное пространство и содержит
сайт связывания цит-с. При окислении цит-с
электроны передаются на медь-серный кла-
стер, содержащий два атома Си, который обо-
значают СиА. Эти два атома Си связаны двумя
S-атомами боковых цепей цистеина (рис. 5.17).
Медь-серный кластер, предположительно, за-
бирает один электрон и передает его на цит-я
биядерного центра, состоящего из цит-я3
и атома Си (Сив), связанного с гистидином.
Биядерный центр функционирует как единая
редокс-единица, в которой атом Fe гема цит-я3
вместе с Сив, переносят два электрона.
[Fe3+ • CuB+] + 2е -> [Fe2+ • CuB]
В отличие от цит-я и других цитохромов
дыхательной цепи, в геме цит-я3 шесть коор-
динационных связей Fe-атома не насыщены
аминокислотными остатками белка (рис. 5.18).
Свободные координационные связи, как и Сив,
являются сайтами связывания молекулы кис-
лорода, которая четырьмя последовательно по-
Рис. 5.19. Регистрация потребления кислорода
выделенными митохондриями. Фосфат и
малат последовательно добавляют к суспензии
митохондрий в буфере с осмотиком.
При добавлении АДФ скорость дыхания
повышается. Последующее снижение потребления
кислорода означает, что весь добавленный АДФ
превратился в АТФ. После добавления разобщителя
высокая скорость дыхания достигается без
добавления АДФ: теперь дыхание разобщено с
синтезом АТФ
лученными электронами восстанавливается до
воды:
О2 + 4е” -> 2СУ + 4Н+ -> 2Н2О
Скорее всего, Сив играет важную роль в пе-
реносе протонов, который будет обсуждаться в
следующем разделе. Вместо О2 со свободными
координационными связями цит-я3 могут очень
прочно связываться СО или CN-, что приводит
к ингибированию дыхания. Поэтому угарный
газ и синильная кислота (HCN) являются силь-
нейшими ядами.
5.6.	Транспорт электронов
в дыхательной цепи сопряжен
с синтезом АТФ через транспорт
протонов
Электронный транспорт в дыхательной цепи со-
пряжен с образованием АТФ. Эту связь иллю-
стрирует эксперимент, показанный на рис. 5.19,
в котором скорость дыхания в суспензии мито-
хондрий определяли по снижению концентрации
кислорода в среде. Добавление субстрата (напри-
мер, малата) вызывало незначительное усиление
дыхания. Последующее добавление ограничен-
ного количества АДФ приводило к значитель-
ному усилению дыхания. Через некоторое время
136
5. Митохондрии — энергетические станции клетки
скорость дыхания снижалась до уровня, который
был до добавления АДФ, потому что весь добав-
ленный АДФ превратился в АТФ. Дыхание в при-
сутствии АДФ называют активным дыханием,
дыхание после того, как АДФ израсходован, на-
зывают контролируемым дыханием. Посколь-
ку весь добавленный в суспензию АДФ превра-
щается в АТФ, количество АТФ, образованного
при окислении определенного субстрата, может
быть определено по отношению добавленного
АДФ к потребленному кислороду (АДФ/О). Для
субстратов, при окислении которых образуется
НАДН (например, для малата), этот показатель
имеет величину, близкую к 2,5, а для сукцината,
от которого электроны передаются непосред-
ственно на убихинон — 1,6. Проблема стехиоме-
трии АТФ в процессе дыхания будет рассмотрена
в конце раздела.
Как и фотосинтетический электронный транс-
порт (глава 4), электронный транспорт в дыхатель-
ной цепи сопровождается образованием протон-
движущей силы (см. рис. 5.15), которая, в свою
очередь, обеспечивает синтез АТФ (рис. 5.20). По-
этому такие вещества, как FCCP (рис. 4.2), дей-
ствуют как разобщители и в фотосинтетическом,
и в окислительном (дыхательном) электронном
транспорте. На рисунке 5.19 показано, что до-
бавление разобщителя FCCP приводит к сильной
стимуляции поглощения О2. Как обсуждалось в
разделе 4.2, разобщающее действие FCCP обу-
словлено с пассивным переносом протонов через
мембрану, который приводит к снятию протонно-
го градиента. В этом случае дыхание становится
разобщенным с синтезом АТФ и свободная энер-
гия, которая выделяется в процессе электронного
транспорта, рассеивается в тепло.
МАТРИКС
пН® -
МЕЖМЕМБРАННОЕ
ПРОСТРАНСТВО
n Н©
Дыхательная
цепь
ДУ
n Н©
АТФ40
Рис- 5.20. Для синтеза АТФ в митохондрии
требуется поступление фосфата (через фосфатный
переносчик в обмен на ОН- ионы), и АДФ
(который осуществляется АДФ/АТФ переносчиком).
Поскольку за счет транспорта электронов
по дыхательной цепи на митохондриальной
мембране генерируется мембранный потенциал,
АДФ, которая находится в виде АДФ3-,
предпочтительно транспортируется вовнутрь,
а АТФ (в форме АТФ4 ) — наружу, и, как следствие,
отношение АТФ/АДФ в цитозоле выше,
чем в матриксе. АТФ/АДФ транспорт ингибируется
карбоксиатрактилозидом (связывается снаружи)
и бонгкрековой кислотой (связывается
со стороны матрикса). F-АТФ-синтаза митохондрий
ингибируется олигомицином
5.6. Транспорт электронов в дыхательной цепи сопряжен с синтезом АТФ через транспорт протонов 137
Чтобы координировать скорость дыхания
и потребности клетки в энергии, дыхание ре-
гулируется с помощью двух различных меха-
низмов. Классический механизм дыхательного
контроля основан на том факте, что когда от-
ношение АТФ/АДФ повышается, замедляется
синтез АТФ, поэтому увеличивается протонный
градиент, что, в свою очередь, вызывает сниже-
ние скорости электронного транспорта в дыха-
тельной цепи. Кроме того, было обнаружено,
что АТФ аллостерически подавляет электрон-
ный транспорт путем связывания с одной из
субъединиц нитохромоксидазы, что приводит к
снижению активности всего комплекса IV.
Митохондриальный электронный
транспорт приводит к образованию
мембранного потенциала
В отличие от хлоропластов, у митохондрий нет
замкнутого тилакоидного пространства для об-
разования протонного градиента. Вместо этого
в процессе электронного транспорта в митохон-
дриях протоны переносятся из матрикса в меж-
мембранное пространство, которое сообщается
с цитолозем через поры, образованные пори-
нами (см. рис. 1.30). Образование протонного
градиента АрН = 2,5 на мембране хлоропластов
приводит к снижению pH в люмене тилакои-
дов с 7,5 до 5,0. Если бы в случае митохондрий
такое сильное закисление происходило в цито-
золе, это бы имело нежелательные последствия
для активности цитозольных ферментов. На
самом деле в процессе контролируемого дыха-
ния в митохондриях разность значений pH на
внутренней мембране составляет всего 0,2. Это
связано с тем, что митохондриальный протон-
ный транспорт приводит преимущественно к
формированию электрического мембранного
потенциала (АТ ® 200 мВ). Митохондрии не мо-
гут генерировать больший протонный градиент,
потому что их внутренняя мембрана непрони-
цаема для анионов, таких как хлорид. Как пока-
зано на рис. 4.1, концентрационный протонный
градиент может быть образован только в том
случае, если заряд переносимых протонов ком-
пенсируется за счет диффузии противоиона.
Наши представления о механизме сопряже-
ния митохондриального электронного транспор-
та и переноса протонов до сих пор еще неполны,
несмотря на интенсивное изучение этой про-
блемы в течение 30 лет. Четыре протона, пред-
положительно, берутся из матрикса при переда-
че двух электронов от НАДН-дегидрогеназного
комплекса на убихинон, а затем высвобож-
даются в межмембранное пространство при
окислении убихинона на цит-^/^-комплексе
(см. рис. 5.15). Считается, что в митохондри-
ях цит-^/с*!-комплекс катализирует Q-цикл
(рис. 3.30), в котором передаются два электро-
на и два дополнительных протона переносятся
из матрикса в межмембранное пространство
(2Н+ + 2Н+ = 4Н+). Комплекс цит-я/я3 пере-
носит два протона на два электрона. Недавно
полученная трехмерная структура цит-я/я3-
комплекса показала, что биядерный центр,
включающий цитохром-я3 и Сив, участвует в
переносе протонов. Если приведенная стехио-
метрия верна, при окислении НАДН суммарно
переносятся Ю протонов, а при окислении сук-
цината — всего 6.
Синтез АТФ в митохондриях служит
для удовлетворения потребностей
цитозоля в энергии
Энергия протонного градиента в митохондри-
ях используется для синтеза АТФ с помощью
F-АТФ-синтазы (рис. 5.20), структура которой
весьма сходна со структурой F-АТФ-синтазы
хлоропластов (раздел 4.3). Однако между этими
ферментами есть и существенные отличия, на-
пример, чувствительность к олигомицину, анти-
биотику Streptomyces. В то время как активность
митохондриальной F-АТФ-синтазы очень сильно
ингибируется олигомицином из-за присутствия
в составе фермента олигомицин-связывающего
белка, хлоропластный фермент к ингибитору
нечувствителен. Несмотря на это отличие, ме-
ханизмы синтеза АТФ обоими ферментами, по-
видимому, не отличаются. Протонная стехио-
метрия митохондриального синтеза АТФ также
окончательно не установлена. Если принять, что
ротор F-АТФ-синтазы в митохондриях состоит из
Ю с-субъединиц, то в соответствии с механизмом,
который обсуждался в разделе 4.4, для синтеза
I моля АТФ необходимо 3,3 протона. Эта цифра
более или менее согласуется с экспериментальны-
ми данными, полученными в независимых экспе-
риментах.
В отличие от хлоропластов, которые синтези-
руют АТФ исключительно для внутреннего по-
138
5. Митохондрии — энергетические станции клетки
требления, в митохондриях АТФ синтезируется
в основном для экспорта в цитозоль. Это требу-
ет пополнения митохондриального пула АДФ и
фосфата из цитозоля и выноса синтезированно-
го АТФ. Фосфат поступает в митохондрии с по-
мощью фосфатного транслокатора в обмен на
ОН- ионы, в то время как поступление АДФ и
вынос АТФ обеспечивается АТФ/АДФ транс-
локатором (см. рис. 5.20). АТФ/АДФ транс-
локатор митохондрий ингибируется карбок-
сиатрактилозидом, глюкозидом из растений
Atractylis gumnifeга, и бонгкрековой кислотой,
антибиотиком бактерий Cocovenerans, которые
живут на кокосовых орехах. Оба вещества смер-
тельно ядовиты.
АТФ/АДФ транслокатор катализирует обмен
субстратами, или антипорт. На каждую моле-
кулу АТФ или АДФ, вынесенную из митохон-
дрии, АДФ или АТФ, соответственно, входит в
хлоропласт из цитозоля. Поскольку АТФ несет
на один отрицательный заряд больше, чем АДФ,
транспорт является электрогенным. Благодаря
тому, что в процессе протонного транспорта в
дыхательной цепи на мембране образуется вы-
сокий электрический потенциал, энергетически
более выгодно транспортировать АДФ внутрь
митохондрий, а АТФ — наружу. В результате
этого асимметричного транспорта соотношение
АТФ/АДФ снаружи митохондрий гораздо выше,
чем в матриксе. Таким образом, синтез АТФ в
митохондриях поддерживает высокое отношение
АТФ/АДФ в цитозоле. При обмене АДФ на АТФ
один отрицательный заряд выносится из матрик-
са наружу, что, в свою очередь, компенсируется
за счет переноса протона. Поэтому протоны,
формирующие протонный градиент, нужны не
только для синтеза АТФ, но и для экспорта син-
тезированной АТФ из митохондрии.
Вернемся к стехиометрии транспортирован-
ных протонов и АТФ, образовавшейся в про-
цессе дыхания. Принято говорить о трех местах
сопряжения дыхательной цепи, которые соот-
ветствуют комплексам I, III и IV. В учебниках
обычно пишут, что при окислении НАДН в ды-
хательной цепи одна молекула АТФ образуется
на каждом сайте сопряжения, и в результате со-
отношение АДФ/О при окислении НАДН со-
ставляет три, а при окислении сукцината — два.
Однако в экспериментах с изолированными ми-
тохондриями были получены гораздо более низ-
кие значения. Была сделана попытка объяснить
это несоответствие теории и эксперимента утеч-
кой протонов через мембрану изолированных
митохондрий. Но сейчас мы приходим к выво-
ду, что эти теоретические значения ошибочны
сами по себе. Предположительно, при окисле-
нии НАДН через мембрану переносятся Ю про-
тонов. Считая, что для образования молекулы
АТФ нужно 3,3 протона, и еше один необходим
для ее экспорта из митохондрии, получим ре-
зультирующее отношение АДФ/О = 2,3. В экс-
периментах с изолированными митохондриями
отношение АДФ/О достигало 2,5.
В начале главы мы подсчитали, что измене-
ние свободной энергии в процессе окисления
НАДН составляет —214 кДж/моль, а для синтеза
АТФ — примерно +50 кДж/моль. Соотноше-
ние АДФ/О, равное 2,3 при окислении НАДН,
означает, что примерно 54% свободной энер-
гии, которая выделяется в процессе окисления,
используется для синтеза АТФ. Тем не менее эти
теоретически рассчитанные значения, следует
интерпретировать с большой осторожностью.
5.7.	У растительных митохондрий
есть особые метаболические
функции
Функция митохондрий как энергетических
станций клетки, которая обсуждалась до сих
пор, относится к митохондриям всех организ-
мов, от одноклеточных до высших растений и
животных. В фотосинтезирующих раститель-
ных клетках роль митохондрий как источников
энергии относится не только к темному време-
ни суток; митохондрии обеспечивают цитозоль
молекулами АТФ и во время фотосинтеза.
К тому же растительные митохондрии вы-
полняют некоторые специфические функции.
Матрикс митохондрий содержит ферменты,
окисляющие глицин до серина, т.е. катализи-
рующие важный участок фотодыхательного ме-
таболического пути (раздел 7.1):
2 глицин + НАД+ + Н2О---> серин + НАДН
+ СО2+ NH3
НАДН, который генерируется при окисле-
нии глицина, является важным исходным суб-
стратом для генерации АТФ в митохондриях во
время фотосинтеза. Еще одна важная роль рас-
5.7. У растительных митохондрий есть особые метаболические функции
139
тительных митохондрий — реакция оксалоаце-
тата и пирувата с образованием цитрата, пред-
шественника синтеза а-кетоглутарата. Этот
важный путь образования углеродных скелетов
для синтеза аминокислот при ассимиляции ни-
трата (см. рис. Ю.П).
Митохондрии могут окислять НАДН
без образования АТФ
В митохондриальном электронном транспор-
те участие флавинов, убисемихинонов и других
электронных переносчиков приводит к образова-
нию в качестве побочных продуктов супероксид-
радикалов, Н2О2 и гидоксил-радикалов (все эти
продукты называют АФК, активные формы
кислорода). Эти побочные продукты могут вызы-
вать серьезные повреждения в клетке. Поскольку
много АФК образуется в том случае, если компо-
ненты дыхательной цепи восстановлены, необхо-
димо избегать перевосстановления цепи. С другой
стороны, для растений необходимо, чтобы гли-
цин, который образуется в больших количествах
в фотодыхательном цикле (раздел 7.1), окислялся
в митохондриях, даже когда клетка не нуждается
в АТФ. У растительных митохондрий есть запас-
ные пути, которые позволяют окислить НАДН
без синтеза АТФ, с тем чтобы предотвратить пе-
ревосстановленное состояние дыхательной цепи
(рис. 5.21). Во внутренней митохондриальной
мембране со стороны матрикса есть альтерна-
тивная НАДН-дегидрогеназа, которая пере-
носит электроны от НАДН на убихинон без со-
пряжения с протонным транспортом. Этот путь
не ингибируется ротеноном. Однако окисление
НАДН по ротенон-нечувствительному пути идет
только тогда, когда соотношение НАДН/НАД+ в
матриксе чрезвычайно велико. Кроме того, сто-
рона внутренней митохондриальной мембраны,
обращенная в матрикс, содержит альтернативную
НАДФН-дегидрогеназу, которая не показана на
рис. 5.21.
МАТРИКС
НАДФ АДФ© НАДН НАД©	ПРОСТРАНСТВО
+ Н©	+ Н©
Рис, 5,21, Кроме ротенон-чувствительной НАДН-дегидрогеназы (НАДН-ДГ
комплекс I), вдыхательной цепи растений есть дегидрогеназы, которые передают
электроны на убихинон без сопряженного протонного транспорта. Две из них —
альтернативная НАДН-ДГ,П и НАДФН-ДГ,П (на рисунке не показаны) — находятся на
стороне мембраны, обращённой к матриксу. Две другие — НАДН-ДГО1П и НАДФН-
ДГОШ — находятся на наружной стороне внутренней мембраны митохондрий.
Альтернативная оксидаза окисляет убигидрохинон (UQH2). Этот путь нечувствителен
к ингибиторам антимицину А и KCN, но ингибируется салицил гидроксамовой
кислотой (SHAM)
140
5. Митохондрии — энергетические станции клетки
Более того, в растительных митохондриях есть
альтернативная оксидаза, которая может пере-
давать электроны непосредственно с убихинона
на кислород; этот путь не сопряжен с протонным
транспортом. Альтернативное окисление нечув-
ствительно к антимицину-А и KCN (ингиби-
торам комплексов III и II, соответственно), но
ингибируется салицилгидроксамовой кисло-
той (SHAM). Недавние исследования показали,
что альтернативная оксидаза — мембранный бе-
лок, состоящий из двух одинаковых субъединиц
(по 36 кДа каждая). Исходя из аминокислотной
последовательности предполагают, что каждая
субъединица образует две трансмембранные
спирали. Вместе две субъединицы образуют
2-Ее-оксо-центр (как у десатуразы жирных кис-
лот, рис. 15.16), который катализирует окисление
убихинона кислородом.
Электронный транспорт с участием альтер-
нативной оксидазы можно рассматривать как
сокращенный путь, он используется тогда, ког-
да пул убихинонов сильно восстановлен. Когда
метаболиты в митохондрии в избытке, участие
альтернативной НАДН-дегидрогеназы и альтер-
нативной оксидазы приводит к их окислению
без сопутствующего синтеза АТФ, и вся высво-
божденная энергия рассеивается в форме тепла1.
Активность альтернативной оксидазы в митохон-
дриях из разных тканей растений различается и
зависит от стадии развития. Особенно высокая
активность альтернативной оксидазы была за-
регистрирована в початке Sauromatum guttatum,
растения из семейства ароидных, которое ис-
пользует альтернативную оксидазу для разогрева
соцветия. Из-за высокой температуры с его по-
верхности испаряются летучие азотистые соеди-
нения, которые пахнут падалью или фекалиями.
Сильный запах распространяется на большие
расстояния и привлекает насекомых. Образова-
ние альтернативной оксидазы в этих початках со-
пряжено с началом цветения.
НАДН и НАДФН из цитозоля могут
окисляться в дыхательной цепи
растительных митохондрий
В отличие от митохондрий из тканей живот-
ных растительные митохондрии могут окис-
1 Функции альтернативной оксидазы шире. Они включа-
ют детоксикацию активных форм кислорода, дыхание при
стрессах и др. — Прим. ред.
лять цитозольный НАДН, и в некоторых слу-
чаях НАДФН. Окисление наружных НАДН и
НАДФН обеспечивается двумя специальными
дегидрогеназами внутренней мембраны. Сайт
связывания субстрата у этих ферментов направ-
лен к межмембранному пространству. Как и в
случае сукцинатдегидрогеназы электроны от
наружных НАДН- и НАДФН-дегидрогеназ вхо-
дят в дыхательную цепь через пул убихинонов,
поэтому этот путь не ингибируется ротеноном.
Поскольку в окислении цитозольных НАДН и
НАДФН (как и сукцината) не участвует ком-
плекс I (см. рис. 5.21), при окислении цито-
зольных пиридиннуклеотидов выход АТФ
ниже, чем при окислении НАДН, находящего-
ся в матриксе. Окисление наружными НАДН-
дегидрогеназами происходит только тогда, ког-
да цитозольный пул НАД перевосстановлен.
Наружные НАДН-дегидрогеназы можно также
рассматривать как один из запасных путей, ко-
торый начинает действовать только когда в ци-
тозоле слишком много восстановленного НАДН.
Как обсуждалось в разделе 3.10, в некоторых си-
туациях фотосинтез может производить избы-
ток восстановительных эквивалентов, создавая
опасность для клетки. Но у растительной клетки
есть возможность удалять избыточные восстано-
вители, окисляя их в митохондриях с помощью
альтернативных дегидрогеназ и альтернативной
оксидазы2.
5.8.	Для компартментации
митохондриального
метаболизма необходимы
специальные мембранные
переносчики
Внутренняя мембрана митохондрий непрони-
цаема для многих метаболитов. Специфичные
переносчики обеспечивают транспорт метабо-
литов между матриксом и цитозолем по обмен-
ному механизму (рис. 5.22).
Роль АТФ/АДФ транслокатора и фосфатно-
го транслокатора (рис. 5.20) обсуждалась в раз-
деле 5.6. Малат и сукцинат транспортируются
2 Поскольку мембрана хлоропластов непроницаема для
НАДФ+/НАДФН, предложенная схема является дискус-
сионной. Скорее всего, происходит челночный вынос вос-
становительных эквивалентов в цитозоль, а цитозольный
НАДН оказывается доступным для альтернативных ДГ. —
Прим. ред.
5.8. Для компартментации митохондриального метаболизма необходимы специальные...
141
Рис, 5.22. Важные переносчики
внутренней мембраны митохондрий.
Фосфатный и АТФ/АДФ переносчики
уже были представлены на рис. 5.20
в митохондрии в антипорте с фосфатом дикар-
боксилатным транслокатором (обменник ди-
карбоновых кислот). Этот транспорт ингибиру-
ется бутилмалонатом. а-Кетоглутарат, цитрат
и оксалоацетат транспортируются в антипорте
с малатом. Эти переносчики поставляют мета-
болиты, которые могут входить в цикл Кребса.
Глутамат переносится в антипорте с аспартатом,
а пируват — с ионами ОН-. Хотя все эти перенос-
чики присутствуют в растительных митохондри-
ях, наши знания все еще основаны на изучении
митохондрий из тканей животных. Сравнение
аминокислотных последовательностей, которые
известны для АТФ/АДФ, фосфатного, цитрат-
ного и глутамат/аспартатного обменников, пока-
зывает, что они в большой степени гомологичны.
Белки этих переносчиков являются представи-
телями одного семейства, развившимися в про-
цессе эволюции из одной предковой формы. Как
было упомянуто в разделе 1.9, все эти переносчи-
ки состоят из двух субъединиц, в каждой из кото-
рых есть 6 трансмембранных спиралей.
Наличие малат-оксалоацетатного обмен-
ника является особенностью растительных
митохондрий. Он выполняет важную функ-
цию в малат-оксалоацетатном цикле, описан-
ном в разделе 7.3. Он также переносит цитрат
и участвует в поставке углеродных скелетов
для ассимиляции азота (рис. Ю.П). Оксалоа-
цетатный обменник и, в меньшей степени,
а-кето глутаратный обменник ингибируются
дикарбоновой кислотой фталонатом. Транс-
порт глицина и серина, которые участвуют
в фотодыхательном пути (раздел 7.1), еще не
охарактеризован. Хотя это окончательно не до-
казано, считается, что этот транспорт обеспе-
чивают один или два митохондриальных пере-
носчика.
Дополнительная литература
Atkin, О. К., Millar, А. Н., Gardestrom, Р., Day, D. А.
Photosynthesis, carbohydrate metabolism and respira-
tion in leaves of higher plants. In Photosynthesis: Physi-
ology and Metabolism. R. C. Leegood, T. D. Sharkey, S.
von Caemmerer (eds.), pp. 153—175. Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, The Netherlands (2000).
Calhoun, M. W., Thomas, J., Gennis, R. B. The
cytochrome oxidase superfamily of redox-driven proton
pumps Trends Biol Sci 19, 325—330 (1994).
Eubel, H., Jaensch, L., Braun, H.-P. New insights into the
respiratory chain of plant mitochondria. Supercomplexes
and a unique composition of complex II. Plant Physiol
133, 274-286 (2003).
Iwata, S., Ostermeier, C., Ludwig, B., Michel, H.
Structure at 2.8 A resolution of cytochrome C oxidase
from Paracoccus denitrificans. Nature 376, 660—669
(1995).
Kadenbach, B., Arnold, A. A second mechanism of
respiratory control. FEBS Lett 447, 131 — 134(1999).
Kramer, R., Palmieri, E Metabolite carriers in mitochondria in
L. Emster (ed.). Molecular Mechanisms in Bioenergetics, pp.
359—384. Elsevier, Amsterdam (1992).
Kromer, S. Respiration during photosynthesis. Annu Rev
Plant Physiol Plant Mol Biol 46, 45-70 (1995).
Laloi, M. Plant mitochondrial carriers: An overview.
Cellular and Molecular Life Sciences. Birkhauser Verlag,
Basel, 56, pp. 918-944 (1999).
Lambers, H., van der Plaas, L. H. W. Molecular,
Biochemical and Physiological Aspects of Plant
Respiration. SPB Academic Publishing, Den Haag, The
Netherlands (1992).
McIntosh, L. Molecular biology of the alternative oxidase.
Plant Physiol 105, 781-786 (1994).
Millenaar, F. F., Lambers, H. The alternative oxidase: In
vivo regulation and function. Plant Biol 5, 2—15 (2003).
Moller I. M., Gardestrom, P., Glimelius, K., Glaser, K.
(Hrsg.) Plant Mitochondria from Gene to Function.
Backhuys Publishers, Leiden, The Netherlands (1998).
Moller 1. M. Plant mitochondria and oxidative stress:
electron transport, NAD PH turnover, and metabolism
of reactive oxygen species. Annu Rev Plant Physiol Plant
Mol Biol 52, 561-591 (2001).
Moller I. M. A new dawn for plant mitochondrial NAD(P)
H dehydrogenases. Trends Plant Sci 7, 235—237 (2002).
Pebay-Peyroula, E., Dahout-Gonzalez, C., Kahn, R.,
Trezeguet, V, Lauquin, G. J.-M., Brandolin, G.
Structure of mitochondrial ATP/ADP carrier in complex
with carboxyatractyloside. Nature 426, 39—44 (2003).
Raghavendra, A. S., Padmasree, K. Beneficial interaction
of mitochondrial metabolism with photosynthetic car-
bon assimilation. Trends Plant Sci 8, 546-553 (2003).
Saraste, Matti. Oxidative phosphorylation at the fin de
siecle. Science 283, 1488—1493 (1999).
Vanlerberghe, G. C.. Ordog, S. H. Alternative oxidase:
Integrating carbon metabolism and electron transport
in plant respiration. In: С. H. Foyer and G. Noctor
(eds.). Advances in Photosynthesis: Photosynthetic
Assimilation and Associated Carbon Metabolism, pp.
173—191. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The
Netherlands (2002).
Verkhovsky, M. L, Jassaitis, A., Verkhovskaya, M. L.,
Morgan, J. E., Wikstrom. M. Proton translocation by
cytochrome c oxidase. Nature 400, 480—483 (1999).
Xia, D., Yu, C.-A., Kim, H., Xia, J. Z., Kachurin, A. M.,
Zhang, L., Yu, L., Deisenhofer, J. Crystal structure of the
cytochrome be 1 complex from bovine heart mitochondria.
Science 277, 60—66 (1997).
Yoshikawa, S., Shinzawa-Ito, K., Nakashima, R.,
Yaono, R., Yamashita, E., Inoue, N., Yao, M., Jie Fei,
M., Peters Libeu, C., Mizushima, T., Yamaguchi, H.,
Tomizaki, T., Tsukihara, T. Redox-coupled crystal
structural changes in bovine heart cytochrome c oxidase.
Science 280, 1723-1729 (1998).
Zhang, Z., Huang, L., Shulmeister, V. M., Chi, Y.-L,
Kim, К. K., Hung, L.-W., Crofts, A. R., Berry, E. A.,
Kim, S. H. Electron transfer by domain movement in
cytochrome bc\. Nature 392, 677—684 (1998).
6
В цикле Кальвина происходит
фотосинтетическая ассимиляция СО2
В главах 3 и 4 мы говорили о том, как
электрон-транспортная цепь и АТФ-син-
таза тилакоидной мембраны используют энер-
гию света для продукции восстановительных
эквивалентов в форме НАДФН и химической
энергии в форме АТФ. В этой главе мы обсудим
то, как образовавшиеся в процессе фотосинтеза
НАДФН и АТФ используются для ассимиляции
СО2.
9 АТФ 8АДФ+8Ф Н
\	+	н-с-он
3 со2 -----------------► с=о
/	\	Н-С-О-РОз2
6 НАДФН	6 НАДФ	Н
+ 6 Н	+ 3 Н2О
Дигидрокси-
ацетонфосфат
(триозофосфат)
6.1.	Ассимиляция СО2 происходит
в темновых реакциях
фотосинтеза
Выделить из листа хлоропласты с интактной
наружной мембраной сравнительно просто (см.
раздел 1.7). Когда эти хлоропласты переносят в
изотоническую среду, содержащую осмотик и
бикарбонатный или фосфатный буфер, и вклю-
чают свет, можно наблюдать выделение кисло-
рода. Вода разлагается с выделением кислорода
в световой стадии, описанной в главе 3, а вос-
становительные эквиваленты, которые образу-
ются на свету, используются для ассимиляции
СО2 (рис. 6.1). Если хлоропласты интактны (не
повреждены), кислород не выделяется в от-
Фосфат
Триозофосфат
Рис. 6.1. Общая схема фотосинтеза в хлоропласте
Рис. 6.2. Суммарная реакция фотосинтетической
фиксации СО2
сутствие СО2 или фосфата. Это доказывает со-
пряжение световых реакций в интактных хло-
ропластах с ассимиляцией СО2 и показывает,
что в состав конечного продукта ассимиляции
входит фосфат. Главный продукт ассимиляции
в хлоропластах — дигидроксиацетонфосфат,
т.е. триозофосфат. На рисунке 6.2 показано,
что синтез триозофосфата из СО2 требует за-
трат энергии в форме АТФ и восстановитель-
ных эквивалентов в форме НАДФН, которые
образуются в световых реакциях фотосинте-
за. Последовательность реакций образования
триозофосфата из СО2, АТФ и НАДФН раньше
называли темновой стадией фотосинтеза, по-
скольку эти реакции сами по себе не требуют
освещения и теоретически могли бы происхо-
дить в темноте. Однако в темное время суток в
листе эти реакции не идут, потому что некото-
рые ключевые ферменты в цепи реакций био-
синтеза регулируются светом и могут работать
только при освещении (раздел 6.6).
В 1946—1953 годы Мелвин Кальвин и его
сотрудники, Эндрю Бенсон и Эндрю Бэссхем
в Беркли, Калифорния, расшифровали меха-
низм фотосинтетической ассимиляции СО2.
В 1961 году за это фундаментальное открытие
Кальвин был награжден Нобелевской премией
144
6. В цикле Кальвина происходит фотосинтетическая ассимиляция СО2
СТРОМА ХЛОРОПЛАСТА ЦИТОЗОЛЬ
Рис- 6.3. Общая схема реакций цикла Кальвина без учета стехиометрии
по химии. Важной предпосылкой для расшиф-
ровки пути фиксации СО2 было открытие в 1940
году радиоактивного изотопа 14С. Как побочный
продукт ядерной реакции, радиоактивный угле-
род был доступен после 1945 г. в США в боль-
ших количествах. В качестве объекта своих ис-
следований Кальвин выбрал зеленую водоросль
Chlorella. Он добавлял СО2, меченый изотопом
14С, в освещаемые суспензии водорослей, после
короткого периода инкубации убивал клетки,
добавляя горячий этанол и затем, используя бу-
мажную хроматографию, анализировал мече-
ные радиоактивным изотопом продукты фикса-
ции СО2.
Постепенно сокращая время инкубации, ему
удалось показать, что 3-фосфоглицерат является
первым стабильным продуктом фиксации СО2.
Более детальное исследование этого вопроса
показало, что фиксация СО2 происходит в ци-
клическом процессе, который получил название
цикла Кальвина. В этой книге будет встречать-
ся и другое его название: восстановительный
пентозофосфатный путь. Это название отра-
жает тот факт, что в цикле Кальвина происходит
восстановление и образование пентоз.
Цикл Кальвина принято подразделять на три
этапа:
1.	Карбоксилирование пятиуглеродного
(С5) сахара рибулозо-1,5-бисфосфата, приводя-
щее к образованию двух молекул фосфоглице-
риновой кислоты(С3).
2.	Восстановление 3-фосфоглицериновой
кислоты (ФГК) до ФГА триозофосфата;
3.	Регенерация акцептора СО2 рибулозо-1,5-
бисфосфата из триозофосфата (рис. 6.3).
Конечный продукт фотосинтеза, триозо-
фосфат, экспортируется из хлоропластов с по-
мощью специфичных транспортных систем.
Однако большая часть образовавшихся молекул
триозофосфата остается в хлоропласте и прини-
мает участие в регенерации акцептора. Эти ре-
акции будут детально рассмотрены в следующих
разделах.
6.2.	Рибулозобисфосфаткарбоксил аза
катализирует реакцию
фиксации СО2
Ключевая реакция фотосинтетической асси-
миляции СО2 — реакция связывания углекис-
Рис. 6.4. Рибулозобисфосфаткарбо-
ксилаза оксигеназа (RubisCO) может
катализировать две реакции
с РуБФ: карбоксилирование, которое
является фактически фиксацией
СО2, и оксигенирование — побочную
реакцию
Карбоксилазная активность
Н
Н-С-О-РОзе
О=С
I
н-с-он
I
н-с-он
H-C-O-POfe
н
н-с-он
Н-С-О-РО32е
н
З-Фосфоглицерат
Оксигеназная активность
О. /О
ХС
I
н-с-он
Н-С-О-РО^е
н
О. /Ое
хс
н-C-о-POf°
н
З-Фосфо-
глицерат
2-Фосфо-
гл и кол ат
Н
I
1 н—с-о—©
2 О=С
I
з н-с-он
I
4 Н-С-ОН
5 Н-С-О-©
Н
Кето-енольная
изомеризация
Рибулозо-1,5-
бисфосфат
Н
""Wo
НО-С • CSq
с-он
I
н-с-он
Н-С-О-®
н
Ендиол
Конденсация
Н
Н-С-О—®
I
но-с—ссо
с=о
I
н-с-он
I
Н-С-О-®
н
2-Карбокси-
3-кетоарабин итол -
1,5-бисфосфат
З-Фосфоглицерат
Н2О
Н
н-с-о-©
I
НО-С-ССо
н
Оч /Ое
хс
I
н-с-он
н-с-о-®
н
З-Фосфоглицерат
Н
н-с-о-©
I
ноё?-ССо
но-с-о-н
I
н-с-он
н-с-о-®
н
Г идратированная
форма
Рис. 6.5. Реакция карбоксилирования РуБФ ферментом RubisCO.
Для простоты —РО32- обозначена как —Р. Ендиол, образованный в результате
кето-енольной изомеризации карбонильной группы РуБФ (а), делает возможной
нуклеофильную реакцию СО2 с С-2 атомом РуБФ. В результате образуется
3-карбокси-3-кетоарабинитол-1,5-бисфосфат (б). После гидратации (в) связь между
С-2 и С-3 разрывается и образуются две молекулы 3-фосфоглицерата (г)
146
6. В цикле Кальвина происходит фотосинтетическая ассимиляция СО2
н-с-о-©
но-с >0=0
||^
с-он
I
н-с-он
н-с-о-©
н
Ендиольная форма
рибулозо-
1,5-бисфосфата
н
н-с-о-©
но-с-о-о
I
0=0
I
н-с-он
н-с-о-©
н
Пероксидный
интермедиат
(гипотетический)
н-с-о-®
О^ О
2-Фосфогликолат
О. /О *
ХС
I
н-с-он
н-с-о-®
н
З-Фосфоглицерат
Рис. 6.6. Часть последовательности оксигеназных реакций, катализируемых RubisCO
лого газа атмосферы с акцептором рибулозо-
1,5-бисфосфатом (РуБФ) с образованием двух
молекул 3-фосфоглицерата. Эта реакция экзэр-
гоническая, она идет с высвобождением большо-
го количества энергии (Д(70 = —35 кДж/моль) и
поэтому практически необратима. Ее катализи-
рует фермент рибулозобисфосфаткарбоксилаза/
оксигеназа (сокращенно РБФК или RubisCO),
названный так потому, что этот же фермент ка-
тализирует конкурирующую реакцию, в которой
рибулозобисфосфат реагирует с О2 (рис. 6.4).
На рисунке 6.5 показан механизм карбок-
силазной реакций. Кето-енольная изомери-
зация РуБФ приводит к образованию ендио-
ла, который реагирует с СО2 с образованием
и нтермедиата 2 - карбокси - 3 - кетоараби н итол -
1,5-бисфосфата, который распадается на две
молекулы 3-фосфоглицерата. В оксигеназной
реакции кислород предположительно реаги-
рует, как и СО2, с ендиольной формой РуБФ.
При этом образуется пероксидный интермеди-
ат. При последующем распаде этого нестойкого
соединения один атом молекулы О2 освобожда-
ется в форме воды, а другой встраивается в кар-
бонильную группу 2-фосфогликолата (рис. 6.6).
В результате оксигеназной реакции образуются
2-фосфогликолат и 3-фосфоглицерат.
RubisCO — основной фермент1, который
осуществляет фиксацию атмосферного СО2
для формирования биомассы. Поэтому суще-
1 Первичная фиксация углекислоты у С4- и САМ- растений
происходит при помощи фосфоенолпируваткарбоксилазы
(ФЕПК), но запускаемый этим ферментом цикл не при-
водит к синтезу сахаров (глава 8). Минорное значение для
биосферы имеют ферменты цикла Арнона у некоторых бак-
терий, в котором также фиксируется СО2. — Прим. ред.
ствование этого фермента — необходимое усло-
вие существования жизни на Земле.
У растений и цианобактерий белок RubisCO
состоит из 8 одинаковых больших субъединиц
(с молекулярной массой от 51 до 58 кДа у разных
видов) и восьми одинаковых малых субъединиц
(12—18 кДа). Таким образом, RubisCO состо-
ит из 16 субъединиц и является одним из са-
мых крупных ферментов в природе. У растений
большая субъединица кодируется хлоропластным
геномом, а малая — ядром. Каждая из больших
субъединиц содержит один каталитический центр.
Функции малых субъединиц еще не до конца
установлены. Предполагается, что малые субъе-
диницы стабилизируют комплекс, образованный
большими субъединицами. Присутствие малых
субъединиц не является необходимым для про-
цесса фиксации СО2 как такового. У некоторых
пурпурных бактерий RubisCO представляет собой
димер из больших субъединиц, но каталитические
функции соответствующего фермента не имеют
принципиальных отличий от таковых у растений.
Единственное отличие бактериальных фер-
ментов, состоящих из двух больших субъеди-
ниц, от ферментов растений, состоящих из
8 больших и 8 малых субъединиц, заключается
в соотношении оксигеназной и карбоксилазной
активностей: оксигеназная активность выше
у бактериального фермента.
Оксигеназная реакция RubisCO:
дорогостоящая побочная реакция
Хотя концентрация СО2, необходимая для по-
лунасыщения фермента RubisCO (Км [СО2]) го-
раздо ниже, чем О2 (Км [О2]) (табл. 6.1), скорость
6.2. Рибулозобисфосфаткарбоксилаза катализирует реакцию фиксации СО2
147
Таблица 6.1. Кинетические свойства рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RubisCO) при 25°C
Концентрации субстрата при полунасыщении фермента
Км [СО2] : 9 мкмоль/л *
Км [О2]	: 535мкмоль/л *
Км (РуБФ): 28 мкмоль/л
Максимальное число оборотов (для одной субъединицы)
Kcat [СО2] 3.3 с-1
Kcat [О2] 2.4 с-’	Xcat[CO2] / Kcat[O2]
СО2/О2 специфичность = -^у/	= 82
* Для сравнения:
В равновесии с воздухом (0,035% = 350 ppm СО2, 21% О2) концентрации в воде при 25 °C
СО2 : 11 мкмоль/л
О2 : 253 мкмоль/л
(по данным Woodrow, Berry, 1988)
оксигеназной реакции очень высока, поскольку
концентрация О2 в атмосфере составляет 21%,
а СО2 — всего лишь 0,035%. Более того, кон-
центрация СО2 в воздушных полостях листьев
может быть значительно ниже, чем в окружаю-
щем воздухе. По этим причинам соотношение
оксигеназной и карбоксилазной активности в
процессе фотосинтеза в листе при 25 °C обыч-
но находится в пределах 1:4 — 1:2. Это значит,
что приблизительно каждая третья-пятая моле-
кула рибулозо-1,5-бисфосфата вступает в по-
бочную реакцию. С повышением температуры
специфичность фермента СО2/О2 падает1 (см.
табл. 6.1), и, следовательно, отношение оксиге-
назной активности к карбоксилазной возраста-
ет. С другой стороны, повышение концентрации
СО2 в атмосфере снижает уровень оксигеназной
активности, что во многих случаях ведет к усиле-
нию роста высших растений.
В главе 7 будет показано, что рециклирова-
ние побочного продукта активности RubisCO
2-фосфоглицерата, который образуется при
фотосинтезе в больших количествах, потребля-
ет значительную долю энергетических ресурсов
растений.
Этот процесс включает метаболическую це-
почку более 10 ферментативных реакций, кото-
рые локализованы в трех органеллах (хлоропла-
стах, пероксисомах, митохондриях) и требуют
1 При повышении температуры растворимость газов в воде
падает, что приводит к резкому снижению концентрации
СО2 в хдоропластах, в то время как концентрация О2 снижа-
ется незначительно. — Прим. ред.
значительных энергетических ресурсов. В раз-
деле 7.5 будет рассчитано, что примерно треть
фотонов, поглощенных в процессе фотосин-
теза целого листа, тратятся на исправление «по-
следствий оксигеназной реакции».
Очевидно в процессе эволюции дорогостоя-
щая побочная реакция RubisCO не была элими-
нирована. По сравнению с цианобактериями у
высших растений соотношение карбоксилазной
и оксигеназной активностей RubisCO возросло
менее чем вдвое. Похоже, что перед нами при-
мер, когда оптимизация ключевых жизненных
процессов в процессе эволюции достигла преде-
ла, определяемого химизмом реакции. Возмож-
но, это связано с тем, что RubisCO появилась
в эволюции тогда, когда в атмосфере не было
кислорода. Сравнение белков RubisCO из раз-
ных организмов приводит к заключению, что
RubisCO уже существовала 3,5 млрд лет назад,
когда эволюционировали первые хемолито-
трофные бактерии. Когда спустя 1,5 млрд лет
благодаря фотосинтезу кислород появился в ат-
мосфере в достаточно высоких концентрациях,
сложность белка RubisCO, по-видимому, поме-
шала изменению каталитического центра для
устранения оксигеназной активности. Экспери-
ментальные данные подтверждают эту гипотезу.
В генноинженерных конструкциях, в которых в
аминокислотную последовательность активно-
го центра были внесены изменения с помощью
точечных мутаций, не удалось добиться опти-
мизации соотношения между карбоксилазной
и оксигеназной активностью RubisCO. Един-
148
6. В цикле Кальвина происходит фотосинтетическая ассимиляция СО2
ственная возможность снизить оксигеназную
активность методами генной инженерии заклю-
чается в одновременном изменении нескольких
аминокислот в каталитическом сайте связыва-
ния RubisCO, но вероятность такой перестрой-
ки в эволюции крайне мала. В разделе 7.7 мы
поговорим о том, как растения делают это «не-
избежное зло» полезным и используют энерго-
емкую оксигеназную реакцию для расходования
избыточных НАДФН и АТФ, образовавшихся в
световых реакциях.
Рибулозобисфосфаткарбоксилаза/
оксигеназа: особые свойства
Реакция карбоксилирования РуБФ с участи-
ем RubisCO имеет очень низкую скорость (см.
табл. 6.1): число оборотов для каждой субъеди-
ницы составляет всего лишь 3,3 с-1. Это значит,
что при насыщении фермента субстратом только
около трех молекул РуБФ в секунду реагируют в
каждом каталитическом центре RubisCO. Для
сравнения, для дегидрогеназ и карбоангидраз
число оборотов составляет порядка 103 и 105 с-1
соответственно. Из-за низкой скорости реакции
для обеспечения нужд фотосинтеза требуется
огромное количество фермента. RubisCO состав-
ляет до 50% всех растворимых белков листьев.
В связи с преобладанием биомассы растений в
биосфере RubisCO является наиболее широко
представленным белком на Земле. Концентра-
ция больших каталитических субъединиц в стро-
ме достигает 4- Ю 3 М. Сравнение этого значения
с концентрацией СО2 в воде, находящейся в рав-
новесии с воздухом (при 25 °C около 11-10-6 М),
показывает соотношение, совершенно не ти-
пичное для ферментативных реакций: концен-
трация фермента почти в 1000 раз больше, чем
субстрата СО2 и примерно равна концентрации
субстрата РуБФ.
Активация RubisCO
Все большие субъединицы RubisCO содержат
в своей последовательности из 470 аминокислот
лизин в положении 201. Фермент RubisCO ак-
тивен только в том случае, если 8-аминогруппа
этого лизина реагирует с СО2 с образованием
карбамата (амида угольной кислоты), с кото-
рым связывается Mg2+ (рис. 6.7). Активация
происходит при изменении конформации белка
большой субъединицы. Активная конформация
стабилизируется за счет образования комплек-
са с Mg2+. Это является обязательным условием
активности для всех изученных белков RubisCO
из разных организмов. Следует отметить, что
молекула СО2, связанная в форме карбамата, не
является субстратом реакции карбоксилирова-
ния РуБФ.
Для активации RubisCO необходима АТФ,
этот процесс катализируется специальным фер-
ментом — активазой RubisCO. Неактивная (не
образовавшая карбамат) форма RubisCO очень
прочно связывает РуБФ, что приводит к бло-
кировке работы фермента. Используя энергию
АТФ, активаза высвобождает прочно связанный
РуБФ и, таким образом, делает возможным об-
разования карбаматного комплекса в 201 по-
ложении (лизин). Регуляция активазы RubisCO
будет рассмотрена в разделе 6.6.
RubisCO ингибируется несколькими гексо-
зофосфатами и 3-фосфоглицератом. Все эти ве-
щества связываются с активным центром фер-
мента вместо РуБФ. Очень сильный ингибитор
RubisCO — 2-карбоксиарабинитол-1-фосфат
(СА1Р) (рис. 6.8). Это вещество имеет структу-
ру, сходную с 2-карбокси-З-кетоарабинитол-
1,5-бисфосфатом (см. рис. 6.5), который являет-
ся интермедиатом реакции карбоксилирования.
Сродство сайта связывания РуБФ RubisCO
к СА1Р в 1000 раз выше, чем к РуБФ. У неко-
Е- Lys-NH®
о
//
Е— Lys—N С
н О'
//Ч
Е—Lys-N-C	Мд
Н V
Карбамат
(неактивен)
Комплекс
карбамата с Мд2®
(активен)
Рис. 6.7. RubisCO активируется за счет образования комплекса карбамата с Mg2+
в остатке лизина
6.3. При восстановлении 3-фосфо гл и церата образуется триозофосфат
149
Н
Н-С-О-РО32е
1 ^О
но-с-С<ое
н-с-он
I
н-с-он
I
н-с-он
I
н
2-Карбоксиара-
бинитол-1 -фосфат
Рис. 6.8. 2-карбоксиарабинитол-1 -фосфат,
ингибитор RubisCO
торых видов СА1Р накапливается в листьях
ночью, блокируя значительную часть сайтов
связывания RubisCO и, таким образом, инак-
тивируя фермент. Днем СА1Р высвобождается
активазой RubisCO и деградирует с участием
специфичных фосфатаз, которые гидролизуют
связь остатка фосфорной кислоты с остальной
молекулой СА1Р, нейтрализуя, таким образом,
его действие как ингибитора RubisCO. СА1Р
синтезируется из фруктозо-1,6-бисфосфата с
образованием таких гексозофосфа^ных проме-
жуточных продуктов, как гамамелозобисфосфат
и гамамелозомонофосфат. Поскольку СА1Р об-
разуется не у всех растений, его универсальная
роль в регуляции активности RubisCO до сих
пор ставится под сомнение.
6.3.	При восстановлении
3-фосфоглицерата образуется
триозофосфат
Для синтеза ди гидроксиацетонфосфата продукт
карбоксилирования 3-фосфоглииерат фосфори-
лируется ферментом фосфоглицераткиназой.
В этой реакции, которая идет с затратой АТФ,
между новым остатком фосфорной кислоты и
карбоксильной группой образуется смешанный
ангидрид (рис. 6.9). Поскольку свободная энер-
гия гидролиза этого ангидрида примерно та-
кая же, как у фосфатного ангидрида в молекуле
АТФ, реакция фосфоглицераткиназы обратима.
У хлоропластной фосфоглицераткиназы есть
цитоплазматическая изоферментная форма, ко-
торая участвует в гликолизе: она катализирует
образование АТФ из АДФ и 1,3-дифосфоглице-
рата.
Восстановление 1,3-дифосфоглицерата до
D-глицеральдегид-З-фосфата катализирует фер-
мент глицеральдегидфосфатдегидрогеназа
(см. рис. 6.9). На промежуточном этапе реак-
ции при замещении фосфатного остатка на кар-
боксильной группе SH-группой цистеинового
остатка активного центра фермента образуется
тиоэфир (рис. 6.10). Свободная энергия гидро-
лиза этого тиоэфира почти так же велика, как
ангидрида (макроэргическая связь). При восста-
новлении тиоэфира образуется тио-семиацеталь,
свободная энергия гидролиза которого низка.
Фосфогл и церат -
киназа
НАДФ-глицер-
альдегидфосфат-
дегидрогеназа
Триозофосфат-
изомераза
О. /О
хс
I
н-с-он
н-C-о-POje
н
АТФ АДФ
/О-РО2е
^с 3
I
н-с-он
H-C-O-POje
н
НАДФН+Н НАДФ'
О. /Н
хс
I
н-с-он
н—с-о—РО3е
н
н
I
н-с-он
I
с=о
Н-С-О-POfe
н
3-фосфо-
1,3-дифосфо-
гл и церат
глицерат
D-Глицеральдегид-
3-фосфат
Ди гидроксиацетон -
фосфат
T риозофосфаты
Рис. 6.9. Восстановление 3-фосфоглицерата до триозофосфатов
150
6. В цикле Кальвина происходит фотосинтетическая ассимиляция СО2
В реакции, катализируемой глицеральде-
гидфосфатдегидрогеназой и фосфоглиператки-
назой, большая разность энергии химического
потенциала между альдегидной и карбоксиль-
ной группами компенсируется за счет гидролиза
АТФ, поэтому она обратима. Глицеральдегид-
фосфатдегидрогеназа в цитозоле катализирует
превращение глицеральдегидфосфата в 1,3-ди-
фосфоглицерат. В отличие от цитозольного
фермента, который в основном катализирует
окисление глицеральдегидфосфата и в качестве
акцептора водорода использует НАД+, хлоро-
пластный фермент использует НАДФН в каче-
стве донора водорода.
Это пример того, насколько разные роли си-
стемы НАДН/НАД+ и НАДФН/НАДФ+ играют
в метаболизме эукариотической клетки. В то
время как система НАДН в основном служит для
сбора и накопления восстановительных эквива-
лентов, которые затем используются для образо-
вания АТФ, система НАДФН преимущественно
накапливает восстановительные эквиваленты
для большинства процессов биосинтеза. Об-
разно говоря, систему НАДН можно сравнить с
магистралью низкого давления, через которую
восстановительные эквиваленты идут на окис-
ление с генерацией запасов энергии, а НАДФН
систему — с магистралью высокого давления,
через которую восстановительные эквиваленты
направляются в синтетические процессы.
Фосфоангидрид
карбоксильной группы
Тиоэфир
О\ ^S-Фермент
ХС
I
-с-
I
НАДФН + Н'
ИД ПгГ>Ф
СК /Н
ч
I
-с-
I
Альдегид
HS-Фермент
ОН
I
Н—С—S—Фермент
—с—
I
Тио-семиаиеталь
Рис. 6.10. Механизм реакции, катлизируемой гли-
церальдегидфосфатдегидрогеназой. Н-S-фермент
обозначает сульфгидрильную группу цистеинового
остатка в активном центре фермента
Обычно соотношение восстановленных и
окисленных пиридиннуклеотидов для НАДФН
примерно в 100 раз выше, чем для НАДН. Срав-
нительно высокий уровень восстановленное™
НАДФН системы в хлоропластах (примерно
50—60% восстановленных) позволяет очень эф-
фективно восстанавливаеть 1,3-дифосфоглице-
рат до глицеральдегид-3-фосфата.
Триозофосфатизомераза катализирует изо-
меризацию глицеральдегид-3-фосфата до диги-
дроксиацетонфосфата. Промежуточный продукт
этого превращения альдозы в кетозу — 1,2-ен-
диол. В целом реакция триозофосфатизоме-
разы сходна с реакцией, которую катализирует
рибозофосфатизомераза. Равновесие реакции
сдвинуто в сторону образования кетозы. Трио-
зофосфаты — общий термин, обозначающий
оба вещества, участвующих в реакции, при этом
соотношение между ними следующее: 96% ди-
гидроксиацетонфосфата и всего лишь 4% гли-
церальдегидфосфата.
6.4.	Рибулозобисфосфат
регенерирует из триозофосфата
В результате фиксации трех молекул СО2 в ци-
кле Кальвина образуются шесть молекул фос-
фоглицерата, которые затем превращаются
в шесть молекул триозофосфата* 1 (рис. 6.11).
Только одна из них выходит из цикла и вступа-
ет в дальнейшие биосинтетические процессы.
Остальные пять молекул триозофосфата необ-
ходимы для регенерации трех молекул рибуло-
зобисфосфата, которые вновь вступают в цикл.
На рисунке 6.12 показаны метаболические пути
превращения триозофосфатов (обозначены бе-
лыми прямоугольниками) в три пентозофосфа-
та (красные прямоугольники).
Две триозы — дигидроксиацетонфосфат и
глицеральдегид-3-фосфат — конденсируются в
обратимой реакции, катализируемой альдола-
1 Здесь и далее — теоретический расчет стехиометрии цик-
ла Кальвина, который предполагает, что каждая из молекул
превращается в промежуточные продукты. На самом деле
концентрации веществ—участников цикла Кальвина изме-
няются при переходе от темноты к свету и обратно. При не-
достатке РуБФ доля молекул триозофосфатов, выходящих из
цикла, сокращается. Для биосинтеза могут использоваться
промежуточные продукты регенерации: фруктозо-6-фосфат
(синтез крахмала), рибозо-5-фосфат (синтез РНК и ДНК
хлоропластов) и т. д. К указанным соотношениям нужно от-
нестись с осторожностью. — Прим. ред.
6.4. Рибулозобисфосфат регенерирует из триозофосфата
151
Рис. 6.11. Пять из шести молекул триозофосфатов,
образованных в процессе фотосинтеза, необходимы
для регенерации рибулозо-1,5-бисфосфата. Одна
молекула триозофосфата представляет собой
конечный продукт ассимиляции углерода и может
использоваться в хлоропласте или экспортироваться
3 Рибулозо-1,5-	6 З-Фосфо-
хлоропласта
Г лицеральдегид-З-Ф
Дигидроксиацетон-Ф
Седогептулозо-1,7-бисфосфат
Седогептулозо-7-Ф
Ксилулозо-5-Ф
Рис. 6.12. Последовательность реакций превращения пяти молекул
триозофосфатов в три молекулы пентозофосфата
5
152
6. В цикле Кальвина происходит фотосинтетическая ассимиляция СО2
Альдолаза
Дигидроксиацетон-
фосфат
Н
н-с-о-®
с=о
I
I
н-с-он
н-с-о-®
н
D-Глицеральдегид-
3-фосфат
С=О
I
но-с-н
I
I
н-с-он
I
н-с-он
н-с-о-©
н
Эритрозо-
4-фосфат
н-с-о-®
с=о
I
но-с-н
I
н-с-он
I
н-с-он
н-с-о-®
н
Фруктозе-1,6-
бисфосфат
н-с-о-®
с=о
I
но-с-н
I
н-с-он
I
н-с-он
I
н-с-он
н-с-о-®
н
Седогептулозо-
1,7-бисфосфат
Рис. 6.13. Альдолаза катализирует конденсацию
дигидроксиацетонфосфата с альдозой глицеральдегид-
3-фосфатом или эритрозо-4-фосфатом
зой (рис. 6.13). На рисунке 6.14 показан механизм
этой реакции. При взаимодействии остатка ли-
зина активного центра фермента с кетогруппой
дигидроксиацетонфосфата образуется промежу-
точный продукт — Шиффово основание. Обра-
зование этой структуры облегчает отщепление
протона из С-3 положения и делает возможной
нуклеофильную реакцию с С-атомом альдегид-
ной группы дигидроксиацетонфосфата.
Фруктозо-1,6-бисфосфат гидролизуется до
фруктозо-6-фосфата в необратимой реакции, ка-
тализируемой фруктозо-1,6-бисфосфатазой
(рис. 6.15).
Фермент транскетолаза переносит угле-
водный остаток с двумя атомами углерода с
фруктозо-6-фосфата на глицеральдегид-3-фос-
фат. Продуктами этой обратимой реакции явля-
ются ксилулозо-5-фосфат и эритрозо-4-фосфат
(рис. 6.16). В качестве простетической группы в
реакции принимает участие тиаминпирофосфат
(рис. 6.17), который обсуждался в связи с окис-
лением пирувата (раздел 5.3).
Альдолаза (см. рис. 6.13) вновь катализиру-
ет конденсацию: на этот раз эритрозо-4-фосфат
конденсируется с дигидроксиацетонфосфатом
с образованием седогептулозо-1,7-бисфосфата.
Затем седогептулозо-1,7-бисфосфатаза ката-
лизирует необратимый гидролиз седогептулозо-
1,7-бисфосфата. Эта реакция сходна с реакцией
гидролиза фруктозо-1,6-бисфосфата, хотя ката-
лизируется другим ферментом. Снова углеводный
остаток с двумя атомами С передается транске-
толазой с седогептулозо-7-фосфата на дигидрок-
сиацетонфосфат. При этом образуются рибозо-
5-фосфат и ксилулозо-5-фосфат (рис. 6.16).
Три образовавшихся пентозофосфата теперь
преобразуются в рибулозо-5-фосфат (рис. 6.18).
Превращение ксилулозо-5-фосфата катализиру-
ется рибулозофосфатэпимеразой: эта реакция
идет через кето-енольную изомеризацию. Про-
межуточным продуктом является 2,3-ендиол.
Превращение альдозы рибозо-5-фосфата в
кетозу рибулозо-5-фосфат катализируется ри-
бозофосфатизомеразой. Реакция также идет
с образованием промежуточного ендиольного
продукта, хотя в этом случае в положении 1—2.
Три молекулы рибулозо-5-фосфата, которые
образуются в этой реакции, превращаются в ак-
цептор СО2 рибулозо-1,5-бисфосфат в реакции,
катализируемой рибулозофосфаткиназой; ре-
акция идет с затратой АТФ (рис. 6.19). Эта ки-
назная реакция необратима, потому что фосфат
переносится из макроэргической ангидридной
связи в молекуле АТФ в эфирную связь с низкой
свободной энергией гидролиза.
Рисунок 6.20 дает представление обо всей со-
вокупности реакций цикла Кальвина. В цикле
есть четыре необратимые стадии, обозначен-
ные жирными стрелками: карбоксилирование,
гидролиз фруктозобисфосфата, гидролиз се-
догептулозобисфосфата и фосфорилирование
рибулозо-5-фосфата. Фиксация одной молеку-
лы СО2 требует суммарно двух молекул НАДФН
и трех молекул АТФ.
6.4. Рибулозобисфосфат регенерирует из триозофосфата
153
Фруктозо-1,6-бисфосфат
или седогептулозо-1,7-бисфосфат
Дигидроксиацетонфосфат
Н
।
Н-С-О-®
I	®
С=О + Н3М-Фермент
I
но-с-н
I
н
н
I
Н-С-О-®
I	ф
С=о	+ H3N-Фермент
I
но-с-н
I
н-с-он
I
-с-
I
—с—
I
Образование
Шиффова
основания
Карбанион
Г идролиз
Шиффова
основания
Н
I
Н-С-О-®
I Н
С=М-Фермент
I ®
ю-с-н
।	Резонанс
Н	1
н-с=о
I
-с-
I
—с—
I
н
I
Н-С-О-®
I Н
С=М-Фермент
I ®
|Q_p__|_|
е	Конденсация
Н®	=►
® ©
н-с-о
I
-с-
I
-с-
I
Н
I Z
н-с-о-®
I Н
С=М-Фермент
I ®
но-с-н
I
н-с-он
I
-с-
I
—с—
I
D-глицеральдегид-З-фосфат
или эритрозо-4-фосфат
Рис. 6.14. Механизм альдолазных реакций. Ди гидроксиацетонфосфат образует
Шиффово основание с терминальной аминогруппой лизинового остатка
фермента. Положительный заряд на атоме азота облегчает отщепление протона
от С-3, и в результате образуется карбанион. В одной из резонансных форм
глицеральдегидфосфата С-1-атом альдегидной группы несет положительный заряд.
Это облегчает конденсацию С-1-атома с отрицательно заряженным С-З-атомом
ди гидроксиацетонфосфата. После конденсации Шиффово основание снова
распадается и образуется фруктозо-1,6-бисфосфат. Седогептулозо-1,7-бисфосфат
образуется тем же ферментом в реакции с эритрозо-4-фосфатом. Альдолазная
реакция обратима
Фруктозо-1,6-бисфосфатаза
Рис. 6.15. Гидролиз фруктозо-1,6-бисфосфата
фруктозо- 1,6-бисфосфатазой
Н
I
С=О
I
но—с—н
I
н-с-он
I
н-с-он
Н-С-О-РОз®
н
Фруктозо-1,6-
бисфосфат
Н2О
HOPOf
Н
I
н-с-он
I
с=о
I
но-с-н
I
н-с-он
I
н-с-он
Н-С-О- РОзе
н
Фруктозо-6-
фосфат
		Транскетолаза		
п I н-с-он I с=о / I но-с-н I н-с-он +	нЛ /О с^ I н-с-он		h —► Г	К с^ I н-с-он +
н-с-он н-с-о-® н	н-с-о-© н		Г Г	н-с-он н-с-о-© н
Фруктозо-	D-Глицеральдегид-	Эритрозо-
6-фосфат	3-фосфат	4-фосфат
Н
I
Н-С-ОН
I
с=о
I
но-с-н
I
н-с-он
н-с-о-®
н
Ксилулозо-
5-фосфат
Н
I
Н-С-ОН
с=о X I но-с-н	Н?^ /О с' I
н-с-он + I н-с-он I н-с-он н-с-о-©	н—С-он
	н-с-о—© н
Седо- D-Глицеральдегид-
гептулозо-	3-фосфат
7-фосфат
Н.
С^
I
н-с-он +
I
н-с-он
I
н-с-он
н-с-о-©
н
Рибозо-
5-фосфат
H
I
н-с-он
I
с=о
I
но-с-н
I
н-с-он
н-с-о-©
н
Ксилулозо-
5-фосфат
Рис. 6.16. Транскетолаза катализирует перенос С2-фрагментов с кетоз на альдозы
I
-c-
I Резонанс
O=C ◄--------►
I
н-с-он
I
Ri
Фруктозо-
6-фосфат
(седогептулозо-
7-фосфат)
Тиамин-
пирофосфат
(ТРР)
I
—с—
I
о=с
I
н-с-он
I
r2
Ксилулозо-
5-фосфат
Передача -фрагмента,
связанного с ТРР
I
—с—
I
но-с----
I
н-с-он
I
Ri
ТРР-связанная форма
I /N— С
но—с—||
I
—с—
I
но-с---
I
н-с-он
I
н-с-он
I
Ri
н-с-он
R2
r2
ТРР-связанная форма
Эритрозо-
4-фосфат
(рибозо-
5-фосфат)
Н. /О
С^
I
R2
D - Гл и це рал ьде ги д-
3-фосфат
Рис. 6.17. Механизм транскетолазной реакции.
В качестве простетической группы фермент содержит
тиаминпирофосфат (ТРР). Активная группировка ТРР — тиазольное кольцо,
положительный заряд N-атома в котором облегчает отщепление протона
от соседнего С-атома. Это приводит к появлению отрицательно
заряженного С-атома (карбаниона), с которым связывается
С-атом кетогруппы субстрата, имеющий частичный
положительный заряд. Положительно заряженный
N-атом тиазола способствует расщеплению углеродной цепи,
и С-атом в положении 2 становится карбанионом.
Механизм реакции в целом такой же, как в альдолазной реакции
на рис. 6.14. С2-углеводный фрагмент, связанный с тиазолом,
передается в С-l положение гл и церал ьде гид-3-фосфата
Н
I
Рибулозофосфат -
эпимераза
н-с-он
I
с=о
I
но-с-н
I
н-с-он
н-с-о-®
н
I
-с-
I
с-он
II
с-он
I
2,3-Ендиол
Н
I
н-с-он
I
с=о
I
н-с-он
I
н-с-он
н-с-о-®
н
^Рис. 6.18. Превращение ксилулозо-5-фосфата и
рибозо-5-фосфата в рибулозо-5-фосфат. В обоих
случаях на промежуточном этапе реакции образуется
цис-ендиол
Ксилулозо-5-фосфат
Рибулозо-5-фосфат
Рибулозофосфат-
киназа
I
н-с-он
I
н-с-он
I
н-с-он
н-с-о-®
н
Рибозо-5-фосфат
Рибозофосфат-
изомераза
Н\ ОН с II С-ОН 1	Н I н-с-он I со
1,2-Ендиол	н-с-он I 1-1—Г4—он
	П V/ VJil н-с-о-®
	н
Рибулозо-5-фосфат
Н
I
Н-С-ОН АТФ	АДФ
с=о \	/
н-с-он ——►
I
н-с-он
Н-С-О-РО^е
н
Н-С-О-РОз
с=о
I
н-с-он
I
н-с-он
Н-С-О-РОзе
н
Рибулозо-5-фосфат Рибулозо-1,5-бисфосфат
Рис. 6.19. Рибулозофосфаткиназа катализирует
необратимое образование рибулозо-1,5-бисфосфата
2 АДФ
2х
З-фосфоглицерат^ 2 АТФ
Рис. 6.20. Цикл Кальвина (восстановительный пентозофосфатный путь). Ф — фосфат
6.6. Восстановительный и окислительный пентозофосфатные пути регулируются
157
6.5.	Кроме восстановительного
пентозофосфатного пути
есть также окислительный
пентозофосфатный путь
Кроме восстановительного пентозофосфатного
пути (цикла Кальвина), который обсуждался в
предыдущих разделах, в хлоропластах содер-
жатся также ферменты окислительного пен-
тозофосфатного пути. В этом пути, который
есть как у растений, так и у животных, гексо-
зофосфат окисляется до пентозофосфата с
высвобождением одной молекулы СО2 (Окис-
лительный пентозофосфатный цикл идет как в
пластидах, так и в цитозоле, где его часто рас-
сматривают как путь дыхания, альтернативный
гликолизу. — Прим. ред.).
Этот путь обеспечивает НАДФН для «маги-
страли высокого давления», т.е. для биосинтетиче-
ских процессов. Последовательность реакций изо-
бражена на рис. 6.21. Сначала глюкозо-6-фосфат
окисляется до 6-фосфоглюконолактона с участи-
ем фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
(рис. 6.22). Эта реакция сильно экзэргониче-
ская и практически необратима. 6-Фосфоглю-
конолактон, внутримолекулярный эфир, ги-
дролизуется лактоназой. Глюконат-6-фосфат,
который образуется в этой реакции, затем окис-
ляется до рибулозо-5-фосфата с участием фер-
мента глюконат-6-фосфатдегидрогеназы. Эта
реакция идет с выделением СО2 и образованием
НАДФН.
В окислительном пентозофосфатном пути
ксилулозо-5-фосфат образуется из рибулозо-5-
Глюкозо-6-фосфат
НАДФ®
НАДФН +Н®
6-фосфоглюконолактон
Глюконат-6-Ф
НАДФ^
НАДФН
Рис. 6.21. Окислительный
пентозофосфатный путь
Г люкозо-6-фосфат-
дегидрогеназа
Лактоназа
Гл юконат-6-фосфат-
дегидрогеназа
НАДФ® НАДФН + Н®	Н2О Н®
но-с-н о
I
н-с-он
I
н-с-----
Н-С-О—®
НО-С-Н О
I
н-с-он
I
н-с-----
н-с-о-®
н	н
НАДФ® НАДФН
со2
/О
^с	н
I	I
н-с-он	н-с-он
I	I
но-с-н	с=о
I	I
н-с-он	н-с-он
I	I
н-с-он	н-с-он
н-с-о-®	н-с-о-®
н	н
Глюкозо-
6-фосфат
6-Фосфоглю-
конолактон
Глюконат-
6-фосфат
Рибулозо-
5-фосфат
Рис. 6.22. Две окислительные реакции пентозофосфатного пути
Н
I
н-с-он
I
с=о
I
но-с-н
I
н-с-он
I
н-с-он
I --------►
н-с-он
I
н-с-о-®
I
н
Седогептулозо-
7-фосфат
Н. ^о
С^
I
н-с-он +
I
н-с-он
н-с-о-©
н
Н
I
н-с-он
I
с=о
I
но-с-н
I
н-с-он
I
н-с-он
I
н-с-о-©
н
Эритрозо-
4-фосфат
Фруктозо-
6-фосфат
Рис. 6.23. Трансальдолаза катализирует перенос С3-фрагмент с кетона на
альдегид. Реакция обратима. Механизм реакции такой же, как и с альдолазой,
с тем отличием, что после разрыва С—С связи С3-фрагмент остается связанным
с ферментом и высвобождается только после переноса на глицеральдегидфосфат
6.6. Восстановительный и окислительный пентозофосфатные пути регулируются
159
фосфатас помощью фермента рибулозофосфат-
эп и мер азы, а из рибозо-5-фосфата — с помощью
рибозофосфатизомеразы.
Эти два продукта дальше превращаются в
седогептулозо-7-фосфат и глицеральдегид-3-
фосфат под действием транскетолазы. Эта
последовательность реакций является обраще-
нием восстановительного пентозофосфатного
пути. Дальнейшая последовательность реакций
специфична для окислительного пути: транс-
альдолазный перенос нефосфорилирован-
ного С3-остатка с седогептулозо-7-фосфата
на глицеральдегид-3-фосфат с образованием
фруктозо-6-фосфата и эритрозо-4-фосфата
(рис. 6.23). Механизм реакции в целом такой же,
как в альдолазной реакции (см. рис. 6.13), раз-
личие лишь в том, что после разрыва С-С свя-
зи оставшийся С3-остаток связан с ферментом
через Шиффово основание до тех пор, пока он
не будет перенесен. Эритрозо-4-фосфат реаги-
рует с другой молекулой ксилулозо-5-фосфата
в транскетолазной реакции с образовани-
ем глицеральдегид-3-фосфата и фруктозо-6-
фосфата. Таким образом, два гексозофосфата и
один триозофосфат образуются из трех пенто-
зофосфатов:
ЗС5—Р#2С6— Р+ 1 С3—Р
Эта цепь реакций обратима, что позволяет
клетке производить рибозо-5-фосфат для био-
синтеза нуклеотидов даже тогда, когда нет по-
требности НАДФН.
В окислительном пути при окислении
глюкозо-6-фосфата образуются две молекулы
НАДФН и выделяется одна молекула СО2, в то
время как в восстановительном пути фиксация
молекулы СО2 требует не только двух молекул
НАДФН, но и трех молекул АТФ (рис. 6.24).
Такой расход энергии позволяет восстанови-
тельному пентозофосфатному пути идти в на-
правлении, противоположном окислительному
пути, с очень высокой скоростью.
Рис. 6.24. Одновременное протекание восстановительного и окислительного
пентозофосфатных путей привело бы к бесполезной растрате АТФ
160
6. В цикле Кальвина происходит фотосинтетическая ассимиляция СО2
6.6.	Восстановительный
и окислительный
пентозофосфатные пути
регулируются
Ферменты и восстановительного, и окисли-
тельного путей локализованы в строме хлоро-
пластов (см. рис. 6.24). Одновременное функ-
ционирование обоих метаболических путей, в
одном из которых молекула СО2 восстанавли-
вается до углеводного остатка за счет гидроли-
за трех молекул АТФ и двух НАДФН, а в другом
углеводный остаток вновь окисляется до СО2,
и при этом образуются две молекулы НАДФН,
представляло бы из себя бесполезный цикл, при
каждом обороте которого впустую растрачива-
ются три молекулы АТФ. Такую ситуацию пре-
дотвращает метаболическая регуляция, которая
обеспечивает работу основных ферментов вос-
становительного пути только при освещении и
их инактивацию в темноте, тогда как основные
ферменты окислительного пути активны только
в темноте.
Восстановленные тиоредоксины
передают «сигнал об освещении»
ферментным белкам
Важный сигнал о том, что клетка получает поток
света, достаточный для фотосинтеза, передается
от фотосинтетической электронтранспортной
цепи в форме восстановленного тиоредокси-
на (рис. 6.25). Электроны переносятся с ферре-
доксина на тиоредоксин с помощью фермента
ферредоксин-тиоредоксинредуктазы, которая
представляет собой железосерный белок 4Fe-4S
типа.
Тиоредоксины — семейство маленьких бел-
ков, состоящих примерно из 100 аминокислот,
активная группировка которых образована по-
следовательностью Cys-Gly-Pro-Cys, располо-
женной на периферии белка. Благодаря близ-
кому расположению цистеиновых остатков,
тиоредоксин может находиться в двух редокс-
состояниях: восстановленный тиоредоксин с
двумя SH-группами (дитиольная форма) и
окисленный тиоредоксин, у которого два ци-
стеина связнаны дисульфидной связью (S-S-
мостик).
Свет
— S
I
— S
Неактивный
(активный)
фермент
Активный
(неактивный)
фермент
Рис. 6.25. Регуляция активности белков
хлоропластов светом опосредована
восстановленным тиоредоксином
6.6. Восстановительный и окислительный пентозофосфатные пути регулируются
161
Тиоредоксины были найдены у всех живых
организмов от археабактерий до растений и
животных. Они функционируют как оксидо-
редуктазы дисульфидной связи в белках, т.е.
восстанавливают дисульфидные связи в белках-
мишенях до SH-формы или окисляют их обрат-
но до S-S формы. Несмотря на свой маленький
размер, эти белки имеют довольно высокую
субстратную специфичность. Тиоредоксины в
качестве электронных переносчиков принима-
ют участие в восстановлении как высоко-, так и
низкомолекулярных веществ (например, в вос-
становлении рибонуклеотидов до дезоксирибо-
нуклеотидов, восстановлении сульфата, которое
происходит в клетках растений и у микроорга-
низмов (раздел 12.1); а также в восстановитель-
ной активации белков семян при прорастании).
Известно большое число самых разнообраз-
ных процессов, в которых тиоредоксины играют
важную роль, например, сборка бактериофагов
и действие гормонов на свертываемость крови у
животных. Участие тиоредоксинов в регуляции
хлоропластных ферментов светом можно рас-
сматривать как специализированную функцию,
которую они выполняют помимо универсаль-
ных метаболических функций.
Хлоропластные ферменты рибулозофосфат-
киназа, седогептулозе-1,7-бисфосфатаза и
хлоропластная изоформа фруктозо-1,6-бисфос-
фатазы переводятся из неактивного состояния
в активное при помощи восстановленного тио-
редоксина, и, таким образом, активируются при
освещении. Это также относится к ряду других
хлоропластных ферментов, таких, как НАДФ-
малатдегидрогеназа (раздел 7.3) и F-АТФаза
(раздел 4.4). Восстановленный тиоредоксин так-
же участвует в переводе активазы RubisCO
(раздел 6.2) и НАДФ-глицеральдегидфосфат-
дегидрогеназы, содержащихся в хлоропластах,
из менее активного состояния в более активное.
С другой стороны, восстановленный тиоредоксин
инактивирует глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу,
первый фермент окислительного пентозофосфат-
ного пути.
Активация хлоропластных ферментов
тиоредоксином происходит благодаря
встроенному регуляторному домену
Важная информация о механизмах действия
тиоредоксина на хлоропластные ферменты была
получена при их сравнении с соответствующими
изоферментами из других клеточных компар-
тментов. Изоферментные формы фруктозо-1,6-
бисфосфатазы и малатдегидрогеназы в цитозоле
не регулируются тиоредоксином. Это также от-
носится к F-АТФазе митохондрий. Сравнение
аминокислотной последовательности показало,
что, по крайней мере в некоторых случаях, у хло-
ропластных изоферментов есть дополнитель-
ные участки (домены), содержащие два цисте-
иновых остатка, на конце или в средней части
аминокислотной последовательности (рис. 6.26).
SH-группы этих цистеиновых остатков могут
при окислении превращаться в дисульфид и,
таким образом, становятся субстратом для дис-
ульфидоксидоредуктазной активности тиоредо-
ксина.
Изоферменты, которые не регулируются
тиоредоксином и, соответственно, не содержат
этих дополнительных последовательностей, ча-
сто имеют более высокую активность, чем те,
которые регулируются тиоредоксином. Заме-
на цистеиновых остатков, вовлеченных в регу-
ляторный процесс, на другие аминокислоты с
помощью генетической инженерии (глава 22)
приводило к постоянной активности фермен-
тов (даже в отсутствие восстановленного тиоре-
доксина). В окисленном состоянии ферменты,
регулируемые тиоредоксином, за счет образо-
। .Ж....................... zz
Фруктозо-1,6-бисфосфатаза
НАДФ-малатдегидрогеназа
I	И
F-АТФаза (у-субъединица)
О 100	200	300	400
Номера аминокислот
в последовательности полипептида
Рис. 6.26. В отличие от непластидных
изоферментов, некоторые хлоропластные
белки, регулируемые тиоредоксином, содержат
в аминокислотной последовательности
дополнительные участки-домены (обозначены
красным), в которых расположены два остатка
цистеина (по Scheibe, 1990)
162
6. В цикле Кальвина происходит фотосинтетическая ассимиляция СО2
вания дисульфидного мостика принимают кон-
формацию, в которой каталитический центр
инактивирован. Восстановление этого мостика
тиоредоксином снимает блок, и фермент при-
нимает конформацию, в которой каталитиче-
ский центр активен.
Активация ферментов светом, которая обсуж-
далась до сих пор, не относится к эффектам типа
«все или ничего». Активность ферментов опре-
деляется равновесием между восстановлением
ферментного белка тиоредоксином и его после-
дующим окислением. Уровень активации фер-
мента зависит от уровня восстановленное™, а он
определяется не только уровнем восстановленно-
сти тиоредоксина (а значит, уровнем восстанов-
ленное™ ферредоксина), но также присутствием
различных метаболитов1. Так, например, вос-
становительная активация фруктозо- и седогеп-
тулозобисфосфатаз усиливается в присутствии
соответствующих бисфосфатов. Эти эффекто-
ры вызывают снижение редокс-потенциала SH-
групп соответствующих белков, а это усиливает
восстановление дисульфидных групп тиоредок-
сином. Таким образом, активность этих фермен-
тов повышается, когда повышается концентрация
субстрата. С другой стороны, восстановительная
активация НАДФ-малатдегидрогеназы снижается
в присутствии НАДФ+. Это приводит к тому, что
фермент активен только при высоком соотноше-
нии НАДФН/НАДФ+. Окислительная активация
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, наоборот, уси-
ливается в присутствии НАДФ+, а значит, актив-
ность окислительного пентозофосфатного пути
увеличивается, когда клетка ощущает недостаток
НАДФН.
Многоуровневая регуляция обеспечивает
согласованность разных этапов
восстановительного пентозофосфатного
пути
Дополнительная световая регуляция цикла Каль-
вина основана на влиянии светозависимых изме-
нений концентрации протонов и Mg2+ в строме
на активность хлоропластных ферментов. При
освещении изолированных хлоропластов закисле-
ние тилакоидного пространства (глава 3) сопрово-
1 Важную роль играет соотношение активной и неактив-
ной форм фермента, скорость синтеза и деградации соот-
ветствующего белка, а также наличие нескольких сайтов
регуляции ферментативной активности (аллостерическая
регуляция). — Прим. ред.
ждается защелачиванием и повышением концен-
трации Mg2+ в строме. При переносе из темноты
на свет pH в строме может измениться с 7,2 до 8,0.
Фиксация СО2 в выделенных хлоропластах име-
ет оптимум при pH 8,0 с резким снижением при
переходе в более кислую область. Почти такая же
pH-зависимость была обнаружена у светозависи-
мых ферментов фруктозо- 1,6-бисфосфатазы и
седогептулозо-1,7-бисфосфатазы. Более того,
каталитическая активность этих двух ферментов
повышалась при светозависимом повышении кон-
центрации Mg2+ в строме. Активация этих фер-
ментов на свету через тиоредоксиновую систему
вместе с повышением ферментативной активно-
сти за счет светозависимых сдвигов pH и концен-
трации Mg2+ в строме представляет собой очень
эффективную систему для включения и выключе-
ния ферментов в зависимости от внутренних за-
просов клетки и внешних условий (освещение).
Активностьнекоторыхстромальныхферментов
также регулируется концентрациями метаболи-
тов. Хлоропластная фруктозо-1,6-бисфосфатаза
и седогептулозо-1,7-бисфосфатаза ингибиру-
ются соответствующими продуктами: фруктозо-
б-фосфатом и седогептулозо-7-фосфатом. Это
может уменьшать активность ферментов в том
случае, если их продукты накапливаются. Рибу-
лозофосфаткиназа ингибируется 3-фосфоглице-
риновой кислотой, а также АДФ. Ингибирование
в присутствии АДФ важно для координирования
двух киназных реакций восстановительного пен-
тозофосфатного пути. В то время как рибулозо-
фосфаткиназа катализирует необратимую реак-
цию, реакция фосфоглицераткиназы обратима.
Если бы обе реакции конкурировали за АТФ без
какой бы то ни было внешней регуляции, то в
случае дефицита АТФ необратимая реакция фос-
форилирования рибулозо-5-фосфата имела бы
преимущество, что привело бы к разбалансировке
цикла Кальвина. Снижение активности рибуло-
зофосфаткиназы при повышении уровня АДФ2
предотвращает это нарушение.
Наконец, сильное ингибирование фрук-
тозо- 1,6-бисфосфатазы и седогептулозо- 1,7-
бисфосфатазы происходит при повышении
концентрации глицерата. Как будет показано
в разделе 7.1, глицерат — важный интермеди-
2 А также при сдвиге равновесия фосфоглицераткиназной
реакции в пользу исходного субстрата — 3-фосфоглицера-
та. — Прим. ред.
Дополнительная литература
163
НАДФ®
НАДФН
TR В
АТФ Б
З-Фосфоглицерат Б
Рибулозо-5-фосфат
СО2
Глюконат-
6-фосфат
НАДФН+Н®
TR Б
нАДФ®а
НАДФ®
Глюкозо-
6-фосфат
Глюкозо-
6-фосфат-
дегидрогеназа
RubisCO
АТФ И
TR В
2х
АТФ Ш
З-Фосфоглицерат Б
ХрН □ Мд2® В
Рибулозо-1,5-бисфосфат
АДФ
АТФ
Рибулозо-
фосфат-
киназа
^Седогептулозо-
( 7-фосфат
Седогептулозо-
бис-
Ф	\ I фосфатаза
Г 4
- Седогептулозо-
1,7-бисфосфат
TR □
АрН Б
Мд2® □
Г|ИцератБ
Фруктозо-
6-фосфат
З-Фосфоглицерат
2 АТФ
2 АДФ
2х 1,3-Бисфосфоглицерат
2 НАДФН
TR В
►2НАДФ®+2Ф
Глицеральде-
гидфосфат-
дегидрогеназа
2х Триозофосфат
Фруктозо-
1,6-бисфосфат
Фруктозо-
бис-
фосфатаза
Ф
TR В
В	ДРН □
1	Мд20 В
Глицерат Б
Рис. 6.27. Регуляция восстановительного и окислительного пентозофосфатного
путей. Оба пути представлены в упрощенном виде. Обозначены лишь те ферменты,
регуляция которых описана в тексте. [+) повышение и [-] снижение относятся к
изменениям активности, которые вызываются действием факторов, отмеченных
красным, таких, как тиоредоксин (TR), светозависимое защелачивание стромы
(АрН), повышение концентрации Mg2+ в строме и присутствие метаболитов.
Регуляция RubisCO опосредована регуляцией активазы RubisCO
ат рециклирования фосфогликолата, который
образуется за счет оксигеназной активности
RubisCO. Эта регуляторная петля позволяет в
условиях накопления глицерата замедлить реге-
нерацию РуБФ и его карбоксилирование, а зна-
чит, и сопутствующее ему образование гликола-
та, предшественника глицерата.
Кроме того, RubisCO сама по себе является
объектом регуляции. Эксперименты с целыми
листьями показали, что уровень активности
RubisCO коррелирует с интенсивностью осве-
щения и скоростью фотосинтеза. Активное со-
стояние RubisCO обеспечивается регуляцией
активазы RubisCO (раздел 6.2). Активность
этого фермента регулируется тиоредоксином и
зависит от соотношения АТФ/АДФ. Когда это
отношение в строме поднимается, активность
активазы также возрастает. Считают, что таким
образом активность RubisCO подстраивается к
потребностям световых реакций фотосинтеза.
Как бы то ни было, многие наблюдения ука-
зывают на то, что этот механизм не может быть
единственным механизмом регуляции RubisCO
светом. Предположительно, активаза RubisCO
регулируется светозависимым протонным гра-
диентом на тилакоидной мембране. Кроме того,
активность RubisCO ингибируется продуктом ее
реакции — 3-фосфоглицератом. Таким образом,
активность RubisCO может быть уменьшена при
накоплении продукта реакции.
На рисунке 6.27 приведена схема влияния
различных факторов на активность ферментов
восстановительного и окислительного пентозо-
фосфатных путей. Широкое разнообразие регу-
164
6. В цикле Кальвина происходит фотосинтетическая ассимиляция СО2
ляторных процессов обеспечивает подстройку
этих двух путей к нуждам клетки на разных ста-
диях метаболизма.
Дополнительная литература
Allen, D. J., Ort, D. Impact of chilling temperature on
photosynthesis in warm-climate plants. Trends Plant Sci
6, 36-42 (2002).
Andralojc, P. J., Keys, A. J., Kossmann, J., Parry, M. A.
J. Elucidating the biosynthesis of 2-carboxyarabinitol
I -phosphate through reduced expression of chloroplastic
fructose l.6-bisphosphate phosphatase and radiotracer
studies with l4CO2. Proc Natl Acad Sci USA 99, 4742—
4747 (2002).
Balmer, Y., Koller, A., del Vai, G., Manieri, W.,
Schuermann, P., Buchanan, В. B. Proteomics gives
insight into the regulatory function of chloroplast
thioredoxins. Proc Natl Acad Sci USA 7, 370—375
(2003).
Dai, S., Schwendtmayer, C., Schiirmann, P., Ramaswamy,
S., Eklund H. Redox signaling in chloroplasts: cleavage
of disulfides by an iron-sulfur cluster. Science 287, 655—
658 (2000).
Edwards, G., Walker, D. A. C3, C4; Mechanisms
and Cellular and Environmental Regulation of
Photosynthesis. Blackwell Scientific Publications,
Oxford, UK(l983).
Furbank, R. T., Taylor. W. C. Regulation of photosynthesis
in C3 and C4 plants. Plant Cell 7, 797—807 (1995).
Fliigge, U.-L Phosphate translocators in plastids. Annu
Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50, 27—46 (1999).
Gutteridge, S., Gatenby, A. RubisCO synthesis, assembly,
mechanism and regulation. Plant Cell 7, 809—819
(1995).
Kelly, G., J. Photosynthesis: carbon metabolism from
DNA to deoxyribose. Prog Bot 62, 238—265 (2001).
Roy, H., Andrews, T. J. RubisCO: Assemblyandmechanism.
In Photosynthesis: Physiology and Metabolism. R. C.
Leegood, T. D. Sharkey, S. von Caemmerer (eds.), pp.
53—83. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The
Netherlands (2000).
Ruelland, E., Miginiac-Maslow, M. Regulation of
chloroplast enzyme activities by thioredoxins: Activation
or relief from inhibition? Trends Plant Sci 4, 136—141
(1999).
Schnarrenberger, C., Flechner, A., Martin, W. Enzymatic
evidence for a complete oxidative pentose pathway in
chloroplasts and an incomplete pathway in the cytosol
of spinach leaves. Plant Physiol 108, 609—614 (1995).
Schiirmann P., Jacquot, J.-P. Plant thioredoxin systems
revisited. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 51,
371-400 (2000).
Spreitzer,R. J., Salvucci, M. E. RubisCO: structure,
regulatory interactions and possibilities for a better
enzyme. Annu Rev Plant Biol 53, 449—475 (2002).
Stitt, M. Metabolic regulation of photosynthesis. In:
Advances in Photosynthesis, Vol. 5. Environmental
Stress and Photosynthesis. N. Baker (eds.), pp. 151 — 190.
Academic Press, New York (1997).
Von Caemmerer, S., Quick, W. P. RubisCO: Physiology in
vivo. In Photosynthesis: Physiology and Metabolism. R.
C. Leegood, T. D. Sharkey, S. von Caemmerer (eds.),
pp. 85—113. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,
The Netherlands (2000).
Zhang, N., Kallis, R. P. Ewy, R. G., Portis, A. R. Light
modulation of RubisCO in Arabidopsis requires a ca-
pacity for redox regulation of the larger RubisCO acti-
vase isoform. Proc Natl Acad Sci USA 5, 3330—3334
(2002).
При фотодыхании происходит рециклирование
фосфогликолата, образовавшегося
в результате оксигеназной активности RubisCO
В разделе 6.2 мы говорили о том, что зна-
чительные количества 2-фосфогликолата
образуются как побочный продукт при фикса-
ции СО2 в результате оксигеназной активности
RubisCO. В процессе фотодыхания, открытом в
1972 году американским ученым Эдвардом Тол-
бертом, побочный продукт 2-фосфогликолат
рециклируется до рибулозо- 1,5-бисфосфата.
Термин «фотодыхание» указывает на то, что в
результате фотодыхания на свету наблюдается
поглощение кислорода, которое сопровожда-
ется выделением углекислого газа. Но если при
митохондриальном дыхании (клеточное дыха-
ние, глава 5) окисление субстратов до СО2 слу-
жит для получения АТФ, то в процессе фотоды-
хания, напротив, происходит гидролиз АТФ.
7-1 - Рибулозо-1,5-бисфосфат
регенерирует из 2-фосфогликолата
На рисунке 7.1 представлена общая схема реак-
ций фотодыхания и их локализация в клетке.
Рециклирование 2-фосфогликолата начинает-
ся с отщепления фосфорного остатка, которое
катализирует фосфогликолатфосфатаза, ло-
кализованная в строме хлоропластов (рис. 7.2).
Продукт этой реакции — гликолат — выносится
из хлоропластов с помощью специфического
транспортера, расположенного во внутренней
мембране, и поступает в пероксисомы через не-
специфические поры в их мембранах, которые,
предположительно, образованы порином (раз-
дел 1.11).
В пероксисомах спиртовая группа гликолата
окисляется до карбонильной группы в необра-
тимой реакции, катализируемой гликолатокси-
дазой. В результате реакции образуется глиок-
силат. Электроны передаются на молекулярный
кислород с образованием Н2О2 (см. рис. 7.2).
Как и другие оксидазы, образующие перекись
водорода, гликолатоксидаза содержит кофак-
тор флавинмононуклеотид (ФМН, рис. 5.16),
который функционирует как редокс-посредник
между гликолатом и кислородом. Н2О2, образо-
вавшаяся в этой реакции, разлагается до кис-
лорода и воды ферментом каталазой, которая
находится в пероксисомах. Суммарно для окис-
ления одного моля гликолата до глиоксилата
потребляется 0,5 моля О2.
Образовавшийся глиоксилат превращается в
аминокислоту глицин в двух реакциях, происхо-
дящих в пероксисоме одновременно в соотноше-
нии 1:1. Фермент глутамат-глиоксилатамино-
трансфераза катализирует перенос аминогруппы
от донора (глутамата) на акцептор — глиоксилат.
Этот фермент также может использовать в каче-
стве донора аминогруппы аланин. В другой реак-
ци и фермент сери н - гл иоксил атам и нотрансфераза
катализирует переаминирование глиоксилата се-
рином. Эти два фермента, как и другие амино-
трансферазы (например, глутамат-оксалоацетат-
аминотрансфераза, раздел 10.4), содержит
связанный пиридоксальфосфат с активной аль-
дегидной группировкой (рис. 7.3). Механизм ре-
акций изображен на рис. 7.4.
Аминированный продукт — глицин — вы-
ходит из пероксисом через поры и транспор-
тируется в митохондрии. Хотя механизм это-
го транспорта еще детально не исследован,
предполагают, что он происходит с участием
специфического переносчика. В митохондри-
ях две молекулы глицина окисляются с об-
разованием одной молекулы серина и вы-
делением СО2 и NH4+. При этом происходит
восстановление НАД+ (рис. 7.5). Окисление гли-
цина катализируется глициндекарбоксилазо-
166
7. При фотодыхании происходит рециклирование фосфогликолата...
ХЛОРОПЛАСТ
NH3
2 Ферредоксин 2 Ферредоксин
восстановленный окисленный
АТФ	АДФ + Ф
Рибулозо-
АДФ
АТФ
НАДФ®
АДФ + Ф
НАДФН +Н©
гликолат глицерат
АТФ
АДФ
^^АТФ
2 Гликолат
Глицерат
НАД©
НАДН + Н®
2Н2О-»-2Н2О2'*Л,
+ ^2	2Глиоксилат
Г идрокси пируват
2 Глицин	Серин
МИТОХОНДРИЯ
НАД®	НАДН
СО2 + NH®
Рис. 7.1. Компартментация фотодыхания. На схеме не показаны наружные
мембраны хлоропластов и митохондрий, которые неспецифически проницаемы
для метаболитов благодаря наличию поринов. Т — переносчик. Переносчики для
глицина и серина ешё не идентифицированы. Токсичные продукты пероксисом
выделены цветом
серингидроксиметилтрансферазным ком-
плексом. Этот мультиферментный комплекс
состоит из четырех различных субъединиц
(рис. 7.7), которые имеют значительное сход-
ство с пируватдегидрогеназным комплексом,
описанным в разделе 5.3. Н-белок представ-
7.1. Рибулозо-1,5-бисфосфат регенерирует из 2-фосфогликолата
167
Глутамат-глиоксил ат-
аминотрансфераза
Фосфогликолат-
фосфатаза
Гликолат-
оксидаза
Серин-глиоксилат-
аминотрансфераза
СООе
н-С-о-РО32е
н
2-фосфогликолат
Глутамат а-Кетоглутарат или
или серин гидроксипируват
СООе
I
н-с-он
I
н
Гликолат
Рис. 7.2. Последовательность превращений 2-фосфогликолата, приводящих
к образованию глицина
ляет собой центр глициндекарбоксилазного
комплекса, его простетическая группа — амид
липоевой кислоты (см. рис. 5.5). Вокруг это-
го центра расположены Р-белок, содержащий
пиридоксальфосфат, Т-белок, содержащий те-
трагидрофолат (рис. 7.6), и L-белок (который
также называют дигидролипоилдегидрогена-
зой), идентичный дигидролипоилдегидрогена-
зе пируват- и а-кетоглутаратдегидрогеназных
комплексов (см. рис. 5.4 и 5.8). Поскольку дис-
ульфидная группа амида липоевой кислоты в
Н-белке расположена на конце подвижной по-
липептидной цепи (см. рис. 5.4), она может реа-
гировать с тремя другими субъединицами. На
рисунке 7.7 показана последовательность реак-
ций. Фермент серингидроксиметилтрансфера-
за, который находится в непосредственной бли-
зости от глициндекарбоксилазного комплекса,
катализирует перенос формильного остатка на
другую молекулу глицина, в результате чего об-
разуется серин.
НАДН, который образуется при окислении
глицина, может быть окислен в дыхательной
цепи митохондрий с образованием АТФ, или
экспортироваться из митохондрий за счет чел-
ночных механизмов в другие клеточные ком-
партменты, как будет обсуждаться в разделе 7.3.
Растительные митохондрии способны окислять
глицин в огромных количествах. Глициндекар-
боксилазный комплекс митохондрий может со-
ставлять до 30—50% всех растворимых белков
митохондрий в зеленых тканях. Однако в ми-
тохондриях нефотосинтезирующих клеток рас-
тений белки окисления глицина присутствуют
лишь в очень небольших количествах или вовсе
отсутствуют.
Серин, скорее всего, выходит из митохон-
дрий с участием специфического переносчи-
ка, возможно, того же самого, который обе-
спечивает поступление глицина. После того,
как серин входит в пероксисомы через поры в
мембране, он превращается в гидроксипиру-
ват с участием фермента серин-глиоксилат-
аминотрансферазы, которая уже упоминалась
ранее (рис. 7.8).
Рис. 7.3. Пиридоксальфосфат
168
7. При фотодыхании происходит рециклирование фосфогликолата...
а-Аминокислота
СООе
н—C-NH3 +
Пиридоксаль-
фосфат
Н
।	х-X
О=с—(Руг)
а-Кетокислота
СООе
I
с=о +
I
Пиридоксамин-
фосфат
Н
ф I
H3N—С—(Руг)
Н
Образование
Шиффова Н2О
основания
Гидролиз
Н2О Шиффова
основания
СООе Н
I е I
Н— C-N=C—(Ру?
I Н
Миграция двойной связи
СООе Н
C=N—С
। Н |
Рис. 7.4. Механизм аминотрансферазной реакции. Альдегидная группа
пиридоксальфосфата образует с а-аминогруппой аминокислоты (в случае глутамата
или серина) Шиффово основание (а), которое затем превращается в изомерную
форму (б) путем миграции протона. Гидролиз изомерного Шиффова основания
приводит к образованию а-кетокислоты (а-кетоглутарата или гидрокси пирувата), а
пиридоксамин остается (в). Аминогруппа пиридоксамина затем образует Шиффово
основание с другой а-кетокислотой (в данном случае с глиоксил атом), и при
обращении шагов а, би а образуется глицин. Пиридоксаль при этом регенерирует и
оказывается готов к следующему реакционному циклу
Глициндекарбоксилазо-серингидрокси-
метилтрансферазный комплекс
соое
I ф
H-C-NH3
н
соо°
I ф
H-C-NH3
Н
2 Глицин
соое
I ffi
H-C-NH3
н-с-он
I
н
Серин
Рис. 7.5. Суммарное уравнение реакции
превращения двух молекул глицина с образованием
одной молекулы серина, катализируемой
глициндекарбоксилазным комплексом
Тетрагидрофолат
О
II
С — N—
Н
\ ^СН2
(пара-Амино-
Д	бензойная
' 2	кислота)
(Птеридин)
А/5, Л/10-Метилентетрагидрофолат
Рис. 7.6. Тетрагидрофолат и его метилированная
форма
соое
I
с- н
I
сн2
сн2
соое
(Глутамат)
соое	соое
I ф	I ф
н—с—NH3	н— с—NH®
Н	Н— С—ОН
Глицин	Н Серин
Рис. 7.7. Механизм образования молекулы серина из двух молекул глицина. Сначала
аминогруппа глицина реагирует с альдегидной группой пиридоксаля Р-белка с образованием
Шиффова основания (а). Остаток глицина затем декарбоксилируется и передается с Р-белка на
остаток липоевой кислоты Н-белка (б). Затем С] остаток окисляется до формильной группы,
а остаток липоевой кислоты восстанавливается додигидролипоевой кислоты. Замещенная
дигидролипоевая кислота, в свою очередь, реагирует с Т-белком, формильный остаток передается
на тетрагидрофолат, а остаток дигидролипоевой кислоты остается (в). Дигидролипоевая кислота
окисляется до липоевой кислоты с помощью L-белка (дигидролипоилдегидрогеназы), и при этом
НАД4 восстанавливается до НАДН (г). Затем может начаться следующий цикл. Формильный
остаток, связанный с тетрагидрофолатом, передается на вторую молекулу глицина серин-
гидроксиметилтрансферазой, и при этом образуется конечный продукт — серин (д)
170
7. При фотодыхании происходит рециклирование фосфогликолата...
Серинглиоксилат-
аминотрансфераза
Гидроксипируват-
редуктаза
Серин
Гидроксипируват
D-глицерат
Глицерат-
киназа
АТФ АДФ
соо°
I
н-с-он
Н-с-о- РОз°
З-Фосфоглицерат
Рис. 7.8. Последовательность реакций образования 3-фосфогл и церата из серина
За счет окисления НАДН гидроксипируват
восстанавливается гидроксипируватредукта-
зой до глицерата, который выходит из перокси-
сом и импортируется в хлоропласты.
Вход глицерата в хлоропласты осуществляется с
участием того же переносчика, который обеспечи-
вает выход из хлоропластов гликолата (гликолат-
глицератный переносчик). Этот переносчик осу-
ществляет обмен гликолата на глицерат, а также
котранспорт гликолата с протоном. Таким обра-
зом, этот переносчик делает возможным экспорт
двух молекул гликолата в обмен на импорт одной
молекулы глицерата. Глицерат фосфорилирует-
ся глицераткиназой, локализованной в строме
хлоропластов, с использованием АТФ. При этом
образуется 3-фосфоглицерат, который затем пре-
вращается в рибулозо-1,5-бисфосфат в восстано-
вительном пентозофосфатном пути (разделы 6.3,
6.4). Этими реакциями завершается рециклирова-
ние 2-фосфогликолата.
7.2.	NH4+j который выделяется
в процессе фотодыхания,
затем вновь фиксируется
в хлоропластах
Азот является важным элементом питания, ко-
торый часто лимитирует рост растений. Поэтому
для экономичного растительного метаболизма
важно, чтобы весь аммоний, который в больших
количествах выделяется в фотодыхательном пути
при окислении глицина, вновь фиксировался.
Процесс повторной фиксации происходит в хло-
ропластах и катализируется теми же ферментами,
которые участвуют в ассимиляции нитрата (гла-
ва 10). Тем не менее скорость повторной фикса-
ции аммония в фотодыхательном пути в 5—10 раз
выше, чем скорость его фиксации в процессе ас-
симиляции нитрата.
В растительной клетке хлоропласты и ми-
тохондрии обычно расположены близко друг
к другу. NH4+, образованный при окислении
глицина, проходит через внутреннюю мембра-
ну митохондрий и хлоропластов. Происходит
ли это просто за счет диффузии, осуществляет-
ся ли транспорт с помощью переносчиков или
через каналы, пока еще не выяснено. Фермент
глутаминсинтетаза, который присутствует
в строме хлоропластов, катализирует переда-
чу иона аммония на 5-карбоксильную группу
глутамата (рис. 7.9) с образованием глутамина.
Эта реакция происходит за счет гидролиза
одной молекулы АТФ до АДФ и фосфата. На
промежуточном этапе 5-карбоксильная группа
активируется, реагируя с АТФ с образованием
карбокси -фосфатного ан гидрида. Гл утам и н -
синтетаза имеет высокое сродство к NH4+ и ре-
акция, которую она катализирует, практически
необратима. Этот фермент играет ключевую
роль в фиксации NH4+ не только у растений, но
также у бактерий и животных.
Азот, который фиксируется в форме амида в
молекуле глутамина, передается на а-кетоглутарат
путем восстановительного трансаминирования
(см. рис. 7.9). В этой реакции, которая катализи-
руется глутаматсинтазой1, образуются две мо-
лекулы глутамата. Восстановление происходит с
участием двух восстановленных ферредоксинов,
которые образовались в фотосинтетическом
1 По современной номенклатуре ГОГАТ : глутаминоксо-
глутаратаминотрансфераза. — Прим. ред.
7.3. Для восстановления гидрокси пирувата необходимы восстановительные эквиваленты
171
Глутаматсинтаза
/О°	/Ое
а-Кетоглутарат С	С Глутамат
С=О	H-C-NH3
н-с-н	н-с-н
I	I
Рис. 7.9. Последовательность реакций при фиксации аммония с последующим
образованием глутамата из а-кетоглутарата
электронном транспорте (см. раздел 3.8). В зеле-
ных клетках растений глутаматсинтаза располо-
жена исключительно в хлоропластах.
Из двух молекул глутамата, которые образу-
ются при трансаминировании, одна молекула
может экспортироваться из хлоропластов с по-
мощью глутамат-малатного переносчика в об-
мен на малат и затем, войдя в пероксисомы, стать
субстратом в реакции трансаминирования глиок-
силата. Образующийся при этом а-кетоглутарат
может вновь переноситься из пероксисом в хло-
ропласты с участием малат-а-кетоглутаратного
переносчика в обмен на малат.
7.3.	Для восстановления
гидроксипирувата необходима
поставка восстановительных
эквивалентов в пероксисомы
НАДН — восстановитель, необходимый для
конверсии гидроксипрувата в глицерат, которая
происходит в пероксисомах. Поскольку в клет-
ках листа пероксисомы лишены метаболиче-
ского пути, который обеспечивал бы поставку
НАДН в необходимом количестве, они зависят
от поставки восстановительных эквивалентов,
синтезированных в других компартментах.
172
7. При фотодыхании происходит рециклирование фосфогликолата...
Восстановительные эквиваленты
вносятся в пероксисомы через
малат-оксалоацетатный челнок
Обычно цитозольный пул НАДН окислен в та-
кой мере (НАДН/НАД+=Ю-3), что концентрация
НАДН в цитозоле составляет примерно Ю 6 М.
Столь низкая концентрация не позволила бы
поддерживать градиент, обеспечивающий интен-
сивные диффузионные токи НАДН в перокси-
сомы. Поэтому восстановительные эквиваленты
вносятся в пероксисомы косвенно, путем обмена
малата на оксалоацетат (так называемый малат-
оксалоацетатный челнок) (рис. 7.Ю).
Малатдегидрогеназа (см. рис. 5.9), которая
катализирует обратимую реакцию окисления
малата до оксалоацетата, играет ключевую роль
в челночном обмене восстановительными экви-
валентами. Высокая активность малатдегидроге-
назы обнаружена в цитозоле, хлоропластах, мито-
хондриях и пероксисомах. Малатде гидрогеназы в
разных клеточных компартментах являются изо-
ферментами. У них есть различия в структуре и
они кодируются различными, но гомологичными
генами. Очевидно, это родственные белки, ко-
торые возникли в процессе эволюции от общей
предковой формы. Однако малатдегидрогеназы
в цитозоле, митохондриях и пероксисомах ис-
пользуют НАДН, а хлоропластный изофермент
реагирует с НАДФН.
Рис. 7.10. Схема челночного переноса восстановительных эквивалентов из
хлоропластов и митохондрий в пероксисомы. МДГ — малатдегидрогеназа
7.3. Для восстановления гидрокси пирувата необходимы восстановительные эквиваленты
173
СТРОМА ХЛОРОПЛАСТА
ЦИТОЗОЛЬ
З-Фосфоглицерат
З-Фосфоглицерат
Фосфо-
гл и церат-
киназа
НАДФ® -
Глицераль-
дегидфосфат-
дегидрогеназа
Триозо-
фосфат-
изомераза
Фосфо-
гл и церат-
киназа
НАД® -Глицер-
альдегид-
фосфат-
дегидрогеназа
Триозо-
фосфат-
изомераза
Дигидроксиацетонфосфат
Дигидроксиацетонфосфат
Рис. 7.11. Триозофосфат-З-фосфоглицератный челнок, работающий между
стромой хлоропластов и цитозолем. В строме хлоропластов триозофосфат
образуется из 3-фосфогл и церата с затратой АТФ и НАДФН. Триозофосфат
транспортируется через триозофосфатный переносчик через внутреннюю
мембрану в обмен на 3-фосфоглицерат. В цитозоле триозофосфат превращается
обратно в 3-фосфоглицерат, при этом образуются НАДН и АТФ
Восстановительные эквиваленты
экспортируются из митохондрий через
малат-оксалоацетатный челнок
В отличие от митохондрий клеток живот-
ных, внутренняя мембрана которых непро-
ницаема для оксалоацетата, в мембране рас-
тительных митохондрий есть специфический
малат-оксалоацетатный переносчик, который
обменивает малат на оксалоацетат. Посколь-
ку активность малатдегидрогеназы в матриксе
митохондрий очень высока, НАДН, образую-
щийся в митохондриях при окислении глици-
на, может быть использован для восстановле-
ния оксалоацетата до малата с последующим
его экспортом через малат-оксалоацетатный
челнок. Пропускная способность этого челноч-
ного механизма очень велика. Как можно ви-
деть на рис. 7.1, количество НАДН, генерируе-
мого в митохондриях при окислении глицина,
равно количеству НАДН, которое необходимо
для восстановления гидрокси пирувата в перок-
сисомах. Если все молекулы оксалоацетата, об-
разовавшиеся в пероксисомах, окажутся в мито-
хондриях, весь НАДН, который генерируется в
реакции окисления глицина, будет затрачен на
образование малата и больше не будет исполь-
зоваться для образования АТФ в дыхательной
цепи. Однако синтез АТФ в митохондриях во
время фотосинтеза необходим для энергоснаб-
жения цитозоля клеток мезофилла. На самом
деле митохондрии поставляют только полови-
ну восстановительных эквивалентов, необхо-
димых для восстановления гидроксипирувата в
пероксисомах. Другую половину обеспечивают
хлоропласты (рис. 7.Ю). Таким образом, только
половина НАДН, образовавшегося при окис-
лении глицина, отправляется на экспорт через
малат-оксалоацетатный челнок, оставшаяся
часть НАДН окисляется в дыхательной цепи с
образованием АТФ1.
1 Приведенное рассуждение стоит считать лишь одним из
вариантов реальной картины метаболизма. На самом деле
сценариев может быть несколько. Например, в мембране
митохондрий есть специальный малатный транспортер, ко-
торый обеспечивает поступление малата в обмен на фосфат.
В этом случае «подпитка» цикла Кребса позволяет более
полно использовать НАДН митохондрий. Малат (наряду с
пируватом) является одним из продуктов гликолиза расти-
тельных клеток. — Прим. ред.
174
7. При фотодыхании происходит рециклирование фосфогликолата...
«Малатный кран» контролирует экспорт
восстановительных эквивалентов из
хлоропластов
Хлоропласты также способны экспортировать
восстановительные эквиваленты через малат-
оксалоанетатный челнок. Малат и оксалоацетат
транспортируются через внутреннюю мембрану
хлоропласта с помощью специфического пере-
носчика, который работает в режиме антипорта.
Несмотря на высокую активность хлоропласт-
ного малат-оксалоацетатного челнока, между
хлоропластным и цитозольными пулами восста-
новительных эквивалентов существует резкий
градиент: соотношение НАДФН/НАДФ+ в хло-
ропластах более чем в сто раз выше, чем соотно-
шение НАДН/НАД+ в цитозоле. Хотя малатде-
гидрогеназы обычно катализируют обратимую
равновесную реакцию, восстановление окса-
лоацетата хлоропластной малатдегидрогеназой
практически необратимо и не достигает равно-
весия. Это связано с регуляцией хлоропластного
фермента.
В разделе 6.6 мы рассказали о том, что хло-
ропластная малатдегидрогеназа активируется
тиоредоксином и поэтому активна только на
свету. Кроме того, повышение концентрации
НАДФ+ ингибирует восстановительную акти-
вацию фермента тиоредоксином. НАДФ+ по-
вышает восстановительный потенциал регуля-
торных SH-групп малатдегидрогеназы и, как
следствие, восстановительная активация этого
фермента тиоредоксином тормозится. Наобо-
рот, снижение концентрации НАДФ+, которое
означает повышение уровня восстановленно-
сти пула НАДФН/НАДФ+, включает хлоро-
пластную малатдегидрогеназу. Это позволяет
ферменту функционировать подобно «крану»,
через который избыток восстановительных
эквивалентов может быть вынесен из хлоро-
пластов, предотвращая, таким образом, опас-
ную перевосстановленность переносчиков фо-
тосинтетической электрон-транспортной цепи.
В то же время, этот «кран» позволяет хлоропла-
стам обеспечивать восстановительными экви-
валентами реакцию восстановления гидрок-
сипирувата в пероксисомах и другие процессы
[например, восстановление нитрата в цитозоле
(раздел ЮЛ)].
Альтернативным путем экспорта восстано-
вительных эквивалентов из хлоропластов в цито-
зол ь я вл яется триозофосфат- 3 - фосфогл и церат-
ный челнок (рис. 7.И). С помощью этого челнока
в цитозольный компартмент поставляется не толь-
ко НАДН, но и АТФ.
7.4.	Матрикс пероксисом —
специализированный
компартмент для утилизации
токсичных отходов
Возникает вопрос, почему кроме хлоропластов,
в рециклирование 2-фосфогликолата вовлечены
еще две органеллы? Преимущество восстановле-
ния глицина до серина в митохондриях заключа-
ется в том, что дыхательная цепь помогает ути-
лизировать образующийся НАДН для синтеза
АТФ. В процессе превращения гликолата в гли-
цин образуются два токсичных промежуточных
продукта: глиоксилат и Н2О2. При добавлении
низких концентраций перекиси водорода или
глиоксилата в суспензию выделенных хлоропла-
стов фотосинтез полностью ингибируется. Ин-
гибирующий эффект перекиси связан с окис-
лением SH-групп ферментов цикла Кальвина,
активируемых тиоредоксином (раздел 6.6), и их
инактивацией. Глиоксилат, очень реакционно-
способное карбонильное соединение, также
оказывает сильный ингибирующий эффект на
тиоредоксин-зависимые белки, за счет окисле-
ния их SH-групп. Глиоксилат также ингибирует
RubisCO. Компартментация превращения гли-
колата в глицин в пероксисомах вызвана необхо-
димостью переработки токсичных промежуточ-
ных продуктов глиоксилата и Н2О2 — в местах
их образования, чтобы они не выходили в другие
клеточные компартменты.
Как возможна такая компартментация? Ком-
партментация метаболических процессов в дру-
гих клеточных компартментах (например, в стро-
ме хлоропластов или в матриксе митохондрий)
осуществляется благодаря наличию мембран,
которые содержат специфические переносчики
для транспорта определенных метаболитов, но
непроницаемы для промежуточных продуктов.
Как бы то ни было, этот принцип не действует в
случае окисления гликолата, поскольку мембра-
ны обычно проницаемы как для Н2О2, так и для
глиоксилата. Поэтому мембрана сама по себе не
могла бы предотвратить утечку этих веществ из
пероксисом.
7.5. Насколько дорого обходится растениям оксигеназная активность RubisCO?
175
Высокая эффективность компартментации
превращения гликолата в глицин, а серина — в
глицерат связана с особыми свойствами матрик-
са пероксисом. Когда пограничная мембрана
хлоропластов и митохондрий повреждается (на-
пример, при кратковременном суспендировании
органелл в чистой воде, т.е. в условиях осмоти-
ческого шока), растворимые белки стромы и ма-
трикса, соответственно, выходят из органеллы,
чья целостность была нарушена. После повреж-
дения мембраны, отграничивающей перокси-
сому от других компартментов, белки матрикса
остаются агрегированными в форме крупных ча-
стиц, и компартментация пероксисомных реак-
ций поддерживается даже в такой стрессовой си-
туации. Глиоксилат, Н2О2 и гидроксипируват,
образующиеся в процессе окисления гликолата,
не выходят из частиц, полученных при удалении
мембраны пероксисом. Ферменты фотодыхатель-
ного пути собраны в пероксисомном матриксе в
мультиферментный комплекс, поэтому продукт
одной ферментативной реакции тут же связыва-
ется с ферментом следующей реакции и не может
диффундировать из комплекса.
Этот процесс, который называют метаболит-
ное туннелирование, скорее всего, имеет место
не только в матриксе пероксисом. Таким же об-
разом могут быть упорядочены и другие метабо-
лические пути [например, цикл Кальвина в стро-
ме хлоропластов (глава 6)]. Однако у пероксисом
есть и особое свойство: такой сложный мульти-
ферментный комплекс остается интактным по-
сле нарушения окружающей мембраны. Это мо-
жет быть защитным механизмом, необходимым
для того, чтобы гликолатоксидаза не оказалась в
цитозоле в случае повреждения пероксисомной
мембраны. Выход гликолатоксидазы привел бы
к окислению гликолата за пределами пероксисо-
мы и, как следствие, к отравлению клетки из-за
накопления продуктов реакции — глиоксилата и
Н2О2 — в цитозоле.
На случай утечки из пероксисом глиоксилата
и перекиси, которая может произойти, несмотря
на туннелирование, в цитозоле есть защитные
ферменты, которые используют НАДФН для
превращения глиоксилата в гликолат (НАДФН-
глиоксилатредуктаза) и гидроксипируват в гли-
церат (НАД ФН-гидроксипируватредуктаза).
Кроме того, глиоксилат может быть переработан
НАДФН-глиоксилат-редуктазой, которая есть в
хлоропластах.
7.5.	Насколько дорого обходится
растениям оксигеназная
активность RubisCO?
Затраты АТФ и НАДФН (который является эк-
вивалентом двух восстановленных ферредокси-
Таблица 7.1. Затраты АТФ и НАДФН на карбоксилирование рибулозо-1,5-бисфосфата
(ассимиляцию СО2) и на оксигеназную реакцию RubisCO
Затраты (моль)
	АТФ	НАДФН или 2 восстанов- ленных ферредоксина
Карбоксилирование: Фиксация 1 моля СО2 1 СО2 -^0,33 триозофосфата	3	2
Оксигеназная реакция: 2 рибулозо-1,5-бисфосфат + 2О2 2 [3-фосфоглицерата] + 2 [2-фосфогликолата] 2 [2-фосфогликолата]	3-фосфо гл и церат + 1 СО2	2	1
1 СО2 0,33 триозофосфат	3	2
3 [3-фосфоглицерата] 3 триозофосфата	3	3
3,33 триозофосфата -> 2 рибулозо-1,5-бисфосфата	2	
	X 10	Х6
Оксигеназная реакция на 1 моль О2	5	3
176
7. При фотодыхании происходит рециклирование фосфогликолата...
Таблица 7.2. Дополнительные затраты на оксигеназную реакцию с участием
рибулозо-1,5-бисфосфата в отношении к затратам на фиксацию СО2
Отношение
Карбоксилирование/оксигенирование
2
4
Дополнительные затраты
АТФ	НАДФН
83%	75%
42%	38%
нов) на оксигеназную и карбоксилазную реак-
ции RubisCO, вычисленные на основе схем на
рис. 6.20 и 7.1, представлены в табл. 7.1. Данные
показывают, что количество АТФ и НАДФН,
необходимое для компенсации последствий ок-
сигеназной реакции, гораздо больше, чем в слу-
чае карбоксилирования. При фиксации СО2 для
превращения СО2 в триозофосфат требуется три
молекулы АТФ и две молекулы НАДФН, а ок-
сигеназная реакция требует пяти молекул АТФ
и трех молекул НАДФН в расчете на одну моле-
кулу О2. В таблице 7.2 отражен дополнительный
расход АТФ и НАДФН при разных соотноше-
ниях карбоксилазной и оксигеназной реакций.
В листе, где это соотношение обычно составля-
ет от двух до четырех карбоксилазных реакций
на одну оксигеназную, дополнительный расход
НАДФН и АТФ для компенсации оксигеназной
реакции составляет более чем 50% от затрат на
фиксацию СО2. Таким образом, побочная ок-
сигеназная реакция RubisCO стоит растени-
ям более чем трети перенесенных через ти-
лакоидную мембрану протонов.
7.6.	В точке углекислотной
компенсации суммарная
фиксация СО2 равна нулю
При соотношении карбоксилазной и оксиге-
назной реакций 1:2 суммарная фиксация СО2
равна нулю, поскольку количество углекислого
газа, зафиксированного в реакции карбокси-
лирования, равно количеству, которое выделя-
ется в процессе фотодыхания. Такую ситуацию
можно создать в эксперимменте, освещая рас-
тение в герметично замкнутой камере. Из-за
фотосинтеза количество СО2 в атмосфере сни-
жается до концентрации, при которой фикса-
ция и выделение СО2 уравновешиваются. Это
состояние получило название точки углекис-
лотной компенсации1. Хотя СО2 выделяет-
ся не только в фотодыхательном пути, но и в
других реакциях (например, в цикле Кребса в
митохондриях), его количества пренебрежимо
малы в сравнении с количеством углекисло-
го газа, которое выделяется при фотодыхании.
Растения, которые мы обсуждали до сих пор,
называют С3-растениями (этот термин отра-
жает тот факт, что первый продукт карбокси-
лирования — содержащий три атома углерода
3-фосфоглицерат). Концентрация СО2, при
которой С3-растения достигают точки углекис-
лотной компенсации, варьирует в пределах 35—
70 ppm 1 2 *, что соответствует примерно 10—20%
от средней концентрации СО2 в атмосфере.
В водной фазе, где находится RubisCO, это со-
ответствует концентрации СО2 1—210 6М при
25 °C. Для С4-растений, которые будут обсуж-
даться в разделе 8.4, концентрация СО2 в точке
углекислотной компенсации всего лишь 5 ppm.
Как этим растениям удается иметь столь низ-
кую точку углекислотной компенсации по срав-
нению с С3-растениями, мы подробно расска-
жем в разделе 8.4.
Когда растение находится в замкнутой си-
стеме, можно понизить концентрацию СО2 до
величины ниже точки углекислотной компен-
сации, например, захватывая его КОН. В этом
случае при освещении оксигеназная реакция
RubisCO и сопровождающее ее фотодыхание
приводит к суммарному высвобождению СО2 за
счет органических веществ растительной ткани,
которые разлагаются, чтобы обеспечить углево-
ды для регенерации рибулозо-1,5-бисфосфата.
1 Кроме того, есть точка световой компенсации, опреде-
ляемая как интенсивность потока квантов света, при кото-
рой уравновешены скорость фотосинтеза и клеточного ды-
хания (не путать с фотодыханием!). — Прим. ред.
2 Единица измерения ppm (pars pro million) — одна милли-
онная часть; 0,0001%. — Прим. ред.
7.7. Хотя фотодыхание требует затрат энергии, этот метаболический путь может быть полезен
177
В такой ситуации освещение растения вызывает
выделение СО2.
7.7.	Хотя фотодыхание требует
затрат энергии, этот
метаболический путь может быть
полезен растению
Из-за значительных затрат АТФ и НАДФН
в процессе фотодыхания, в точке углекислот-
ной компенсации фотосинтетический мета-
болизм происходит с высокой скоростью, хотя
суммарной фиксации СО2 не происходит. Такая
ситуация наблюдается в том случае, если листья
находятся на ярком свету, а устьица закрыты
из-за недостатка влаги (раздел 8.1), и клетки не
могут поглощать СО2. Перевосстановленность
и избыточная энергия переносчиков фото-
синтетической электрон-транспортной цепи
может вызывать разрушение различных струк-
тур в хлоропластах (раздел 3.10). Растение ис-
пользует энергозатратный путь фотодыхания
для утилизации АТФ и НАДФН, которые об-
разовались в световых реакциях, но не могут
быть использованы для фиксации СО2. Фото-
дыхание, неизбежная побочная реакция фото-
синтеза, используется растением для защиты
фотосинтетического аппарата. Поэтому вполне
вероятно, что снижение оксигеназной актив-
ности RubisCO методами генной инженерии
(глава 22), которое пытались (пока безуспешно)
осуществить многие ученые, приведет не только
к более эффективному использованию энергии
растениями, но и к повышению их чувствитель-
ности к избыточному освещению в условиях не-
достатка влаги (Сомнительное предположение:
снижение оксигеназной активности приведет к
смещению точки углекислотной компенсации
в область более низких значений. Фотодыхание
все равно будет преобладать над фотосинтезом,
но с некоторой задержкой относительно обыч-
ных растений. — Прим, ред.) (глава 8).
Дополнительная литература
Baker, A., Graham, I. A. eds. Plant Peroxisomes. Kluwer
Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands
(2002).
Douce, R., Heldt, H. W. Photorespiration. In
Photosynthesis: Physiology and Metabolism. R. C.
Leegood, T. D. Sharkey, S., von Caemmerer (eds.), pp.
115—136. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The
Netherlands (2000).
Douce, R., Bourrguignon, J., Neuburger, M., Rebeille,
E The glycine decarboxylase system: A fascinating
complex. Trends Plant Sci 6, 167—176 (2001).
Givan, С. V., Kleczkowski, L. A. The enzymic reduction
of glyoxylate and hydroxypyruvate in leaves of higher
plants. Plant Physiol 100, 552-556 (1992).
Husic, D. W., Husic H. D., Tolbert, N. E. The oxidative
photosynthetic carbon cycle or C2 cycle. CRC Critical
Reviews in Plant Sciences, Vol. 1, pp. 45—100, CRC
Press, Boca Raton (1987).
Husic, D. W., Husic H. D. The oxidative photosynthetic
carbon (C2) cycle: An update of unanswered questions.
Rev Plant Biochem and Biotechnol. 1, 33—56 (2002).
Kozaki, A., Takeba, G. Photorespiration protects C3 plants
from photooxidation. Nature 384, 557—560 (1996).
Reumann, S., Maier, E., Benz, R., Heldt, H. W. The
membrane of leaf peroxisomes contains a porin-like
channel. J Biol Chem 270, 17559-17565 (1995).
Reumann, S. The structural properties of plant peroxisomes
and their metabolic significance. Biol Chem 381, 639—
648 (2000).
Tolbert, N. E. Microbodies—peroxisomesandglyoxysomes.
In The Biochemistry of Plants, P. K. Stumpf and E. E.
Conn (eds.), Vol. 1, pp. 359—388, Academic Press, New
York (1980).
8
Фотосинтез сопряжен с потерями воды
Фотосинтез наземных растений неизбеж-
но связан с заметными потерями влаги,
поэтому он часто бывает лимитирован доступ