/
Author: Звягинцев Д.Г.
Tags: почвоведение почвенные исследования биохимия микробиология агрохимия учебное пособие для студентов издательство мгу почвенная микробиология
ISBN: 5—211—01675—0
Year: 1991
Text
МЕТОДЫ
ПОЧВЕННОЙ
МИКРО
БИОЛОГИИ
И БИОХИМИИ
Методы
почвенной
микробиологии
и биохимии
Под ред. профессора Д. Г. Звягинцева
Издание 2-е, переработанное
и дополненное
Допущено Государственным комитетом СССР по
народному образованию в качестве учебного
пособия для студентов университетов,
обучающихся по специальности «Агрохимия и
почвоведение»
ИЗДАТЕЛЬСТВО
МОСКОВСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
1991
ББК 40.3
М54
УДК 631.46
Авторы:
И. В. Асеева, И. П. Бабьева, Б. А. Вызов, В. С. Гузев, Т. Г.
Добровольская, Д. Г. Звягинцев, Г. М. Зенова, П. А. Кожевин,
А. В. Кураков, Л. В. Лысак, О. Е. Марфенина, Т. Г. Мирчинк,
Л. М. Полянская, Н. С. Паников, И. Н. Скворцова, А. Л.
Степанов, М. М. Умаров
Рецензенты:
Кафедра микробиологии ТСХА, зав. кафедрой докт. биол. наук,
проф. В. Т. Е м ц е в;
академик Е. Н. Мишустин
М54 Методы почвенной микробиологии и биохимии: Учеб.
пособие/Под ред. Д. Г. Звягинцева. —М.: Изд-во МГУ, 1991.—
304 с: ил.
ISBN 5—211—01675—0.
В пособии рассматриваются прямые микроскопические методы для
наблюдения и учета микроорганизмов в почве, методы определения
биологической активности почвы. Описываются методы изучения динамики
микробных популяций в почве, определения кинетики роста почвенных
микроорганизмов. Приводятся методы изучения микроорганизмов
ризосферы и ризопланы, изучения клубеньковых бактерий, франкий и
микоризы. Среди новых методов излагаются методы инициированного
микробного сообщества, регидратационный метод учета микробной биомассы,
методы учета абсолютного количества микроорганизмов в почве, методы
дифференциации активного мицелия и спор грибов и актиномицетов,
методы учета микроорганизмов в ризоплане и т. д.
Для студентов, аспирантов, преподавателей и научных работников,
специализирующихся в области почвенной микробиологии, биохимии,
агрохимии, почвоведения, экологии.
. 3702010000(4309000000)—086 „__ лле%
М 151—91 ББК 40.а
077(02)—91
ПРЕДИСЛОВИЕ
Методы почвенной микробиологии и биохимии широко
используются для характеристики биологической активности почв и ее
изменений под действием антропогенных факторов, что
приобретает особое значение, поскольку необходимо решение проблемы
борьбы с загрязнением окружающей среды. Эти методы широко
используются не только почвенными микробиологами, но и
почвоведами, агрохимиками, экологами различных профилей, земледе-
лами, растениеводами и т.д., а кроме того, общими
микробиологами и биотехнологами для выделения новых микроорганизмов или
для изоляции микробов — продуцентов различных ценных веществ
(антибиотиков, витаминов, аминокислот, ферментов,
полисахаридов, поверхностно-активных веществ, токсинов, микробных
пестицидов, сидерофоров, органических кислот, гормонов и т.д.).
Второе издание пособия выходит через 10 лет после первого.
За это время появился ряд новых методов, многие старые методы
были усовершенствованы, некоторые методы утратили свое
значение. При составлении нового издания оказалось целесообразным
существенно расширить круг авторов и пойти по тому пути, что
конкретный метод описывает либо автор метода, либо сотрудник,
который много работал с данным методом. В пособие включено
много методов, непосредственно разработанных на кафедре
биологии почв Московского университета. Эти методы были
апробированы и нашли широкое применение у нас в стране и за
рубежом. Авторы не ставили своей целью описать все имеющиеся в
почвенной микробиологии и биохимии методы. Предпочтение
отдано широкоприменяемым и перспективным новым методам.
Объединение методов почвенной микробиологии и биохимии в
одном руководстве обусловлено тем, что почвенные
микробиологи и другие специалисты используют ряд биохимических методов
в своей повседневной работе. В руководстве нет возможности дать
готовые правила, в каком случае следует применять те или
другие методы. Выбор должен сделать сам исследователь, причем это
ответственная и часто трудная задача. От правильного ее решения
зависит успех всей работы. Нередко при исследованиях
используются методы, непригодные для решения поставленных задач. В
качестве примера можно привести использование методов по
потенциальной биологической активности почв для оценки
интенсивности реально протекающих в природе процессов или оценки общего
количества микроорганизмов »в почве на основе метода посева, а
также оценки биомассы микроорганизмов в почве с помощью этих
^е методов; сюда можно отнести и попытки установить ломинитп-
вание микроорганизмов в почве по доминированию на
определенной питательной среде.
В руководстве даны новые методы учета грибов в почве с
помощью люминесцентной микроскопии при окрашивании почвы
калькофлором, методы определения микробной биомассы
(физиологический, фумигационный, регидратационный). Подробно
изложены «е только методы выделения и идентификации грибов и
дрожжей, но и ряда групп бактерий, чего не было ранее.
Пособие рассчитано на студентов университетов и других
вузов, однако оно может быть полезным практическим руководством
для аспирантов и научных сотрудников, работающих в области
почвенной микробиологии и биохимии, общей экологии, охраны
природы и сельского хозяйства.
Авторы с глубокой благодарностью примут от читателей все
замечания и предложения по улучшению книги.
Д. F. Звягинцев
РАЗДЕЛ 1
ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПОЧВЕННЫХ ОБРАЗЦОВ
ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
При сборе образцов преследуют две цели: выделения
микроорганизмов из почвы и микробиологическая характеристика почв
в экологических целях. В последнем случае требования к
способам и методам отбора почвенных образцов резко возрастают.
Однако среди почвенных микробиологов распространено неверное
представление, что экологические вопросы можно решать
побочно в связи с выполнением главной цели — сбора, например,
микробов— продуцентов антибиотиков. К отбору почвенных образцов
нужно относиться с большим вниманием, так как все последующие
данные, часто получаемые в результате очень сложных и
трудоемких лабораторных исследований, будут зависеть от того,
насколько правильно были собраны образцы. Часто образцы берут у
дорог, они не являются средними и не могут отразить естественных
закономерностей. При взятии образцов следует учитывать
чрезвычайную макро-, мезо- и микрогетерогенность почв по всем
свойствам, и в первую очередь по микробиологическим.
Необходимо анализировать большое число индивидуальных
образцов. В этом случае исследователь получает представление не
только о среднем количестве микроорганизмов, но и о размахе
колебаний количественного и качественного порядка в отдельных
точках, что дает возможность судить о разнообразии, степени
разброса и достоверности полученных данных. Очень сильно
количество микроорганизмов колеблется на отдельных участках
целинных почв, например лесных. К сожалению, эти рекомендации
часто не могут быть выполнены в полном объеме из-за громоздкости
микробиологических экспериментов. Можно с пробной площади
брать 3 или 5 образцов и анализировать их отдельно (рис. 1).
В этом случае получаются данные о пространственном
варьировании количества микроорганизмов. Для получения представления
о среднем количественном и качественном составе микрофлоры
иногда анализируют тщательно отобранный средний почвенный
образец, который составляется смешиванием 3—7 индивидуальных
проб массой по 100—200 г.
Образцы почвы отбирают в стерильные пергаментные пакеты,
полиэтиленовые мешки или в стеклянные банки с ватными
пробками. Хранить почву более суток в полиэтиленовых мешках нельзя,
так как в них создается особый газовый режим. Пробы с
поверхности берут^следующим образом. Из толстого слоя почвы,
вынутого лопатой, при помощи почвенного ножа отбирают образец.
;
2
I
♦
i
i
q>.—^-.-o •—6
I
1
I
I
Рис. 1. Схема отбора образцов почвы:
/ — по диагонали; 2 — конвертом; 3 — зигзагом
Перед взятием пробы многократно втыкают нож в почвенный
горизонт, из которого будет взят образец. При исследовании
микрофлоры разных горизонтов образцы берут из почвенного разреза.
Разрез должен быть вырыт непосредственно перед взятием образцов.
Образцы берут по всей толще горизонта, что особенно
необходимо для последующего пересчета результатов на столбик почвы с
площадью поверхности 1 см2. При большой однородности
почвенного профиля часто делают пропуски и с некоторых глубин
образцы не берут, а затем полученные данные интерполируют на весь
профиль. Особенно важно отдельно по слоям анализировать
подстилку в лесу или в степи, а также дерновый слой в луговых
почвах.
Обычно отдельно анализируют ризосферную почву, в которой
микробов содержится больше и они отличаются по качественному
составу. Растения (10 экз. и более) подкапывают лопатой и после
извлечения их из почвы стряхивают с корней непрочно
удерживающуюся на них почву и оставляют почву, прочно связанную с
корнями. Затем корни срезают в стерильный пергаментный пакет,
который немедленно доставляют в лабораторию, где проводится
микробиологический анализ. Часто отдельно анализируют
микроорганизмы, располагающиеся на поверхности корней растений в
ризоплане. Образцы корней растений берут так же, как это
описано выше для анализа микроорганизмов ризосферы. Если стоит
задача сравнения микроорганизмов, обитающих на корнях
различных типов, то в случае мочковатой корневой системы можно
анализировать всю массу корней; при стержневом типе корневой
системы для получения сравнимых результатов берут боковые корни.
Микробиологические исследования должны быть сделаны в
день взятия образцов, так как при хранении влажных образцов
состав микроорганизмов в них сильно изменяется. При
невозможности проведения анализа за 24 ч прибегают к высушиванию
образцов. Следует иметь в виду, что в сухих образцах
обнаруживается гораздо меньше микроорганизмов и, что особенно важно
И4
хх]
6
отметить, сильно искажаются соотношения между отдельными
группами микроорганизмов. Если все-таки анализ сразу провести
нельзя и высушивание необходимо, то проводить его следует
непосредственно после взятия образцов за 2—4 ч при температуре
не выше 30°. Хранить сухие образцы нужно в стерильных
пергаментных пакетах, заложенных в полотняные мешочки. Иногда
прибегают к замораживанию образцов. Почвенные образцы
непосредственно после взятия помещают в широкогорлые сосуды
Дьюара с сухим льдом (твердый С02). Хранят их в замороженном
состоянии, посев же проводят непосредственно после оттаивания.
ПОДГОТОВКА ПОЧВ К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ АНАЛИЗАМ
Тщательная подготовка почв к микробиологическим анализам
имеет первостепенное значение. Обычно применяемое 10-минутное
перемешивание почвенной суспензии в колбе с водой является очень
несовершенным методом (предварительной подготовки почв. При
проведении количественного учета почвенных микроорганизмов
необходимо добиться того, чтобы клетки в суспензии находились в
виде одиночных свободноплавающих клеток. Для выполнения
этого условия необходимо осуществить 3 процесса: 1)
диспергирование почвенных агрегатов, 2) десорбцию клеток микроорганизмов
с почвенных частиц, 3) разделение микроколоний на отдельные
составляющие их клетки. Все три процесса осуществляются одними
и теми же приемами, причем 'наиболее эффективными
оказываются механические воздействия (растирание почвы, увлажненной до
состояния пасты); обработка на пропеллерной мешалке (микрораз-
мельчитель тканей, миксер); обработка ультразвуком низкой
частоты и мощности. Химические средства диспергирования
(поверхностно-активные вещества, пирофосфат натрия, щелочь)
оказываются менее эффективными.
Особенно тщательное проведение 'предварительной подготовки
почв к микробиологическому анализу необходимо при сравнении
количества микроорганизмов в почвах разных типов,
отличающихся по степени оструктуренности, в почвенных образцах из
разных генетических горизонтов, почв сухих и влажных или
увлажненных до различной степени, а также в замерзших и незамерз-
ших почвах.
Предварительная подготовка почв перед подсчетом количества
микроорганизмов прямыми микроскопическими методами
Почвенную суспензию в отношении 1 : 10 (10 г почвы на 90 мл
воды) обрабатывают на ультразвуковой установке УЗДН-1 (Змин,
сила тока 0,40 А, частота 15 кГц). Ультразвуковая обработка дает
очень хорошее диспергирование, если даже часть клеток и
погибает, они сохраняют первоначальную форму, окрашиваются эри-
трозином и акридином оранжевым и их можно достаточно точно
подсчитать. Этот метод можно применять и при подготовке поч-
7
венной суспензии к электронно-микроскопической работе, а также
при определении длины гиф грибов и антиномицетов.
В случае отсутствия в лаборатории ультразвуковой установки
для подготовки почвенной суспензии можно воспользоваться
растиранием почвы, увлажненной до пастообразного состбяния.
Берут 1 г почвы, увлажняют ее до состояния пасты и растирают
резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке в течение
5 мин. Нужно следить, чтобы не произошло массированное
заражение почвы микроорганизмами, поэтому ступку и пестик
необходимо тщательно мыть чистой водопроводной водой. При
определении длины гиф грибов используют пропеллерную мешалку
(микроизмельчитель тканей РТ-2, 10 г почвы на 90 мл воды, обработка
в течение 5 мин при 5000 об/мин), которая дает вполне
удовлетворительное диспергирование. Для полного учета бактерий такое
диспергирование часто оказывается недостаточным.
Предварительная подготовка почв
перед микробиологическим посевом
Для правильного учета количества микроорганизмов в почве
методом посева необходимо выполнение двух условий: в
почвенной суспензии, из которой производится посев, должны
содержаться только одиночные свободноплавающие клетки, и каждая
клетка, попав на питательную среду, должна дать колонию.
Первое условие выполняется путем использования различных приемов
диспергирования почв, а второе условие — путем подбора
питательных сред. До сих пор ни то ни другое условие не могут быть
выполнены полностью. Для выполнения первого условия возможно
применение растирания почвы, увлажненной до пастообразного
состояния, обработка почвенной суспензии на пропеллерной
мешалке или ультразвуковая обработка почвенной суспензии. В
случае свежих слабооструктуренных <почв эти приемы дают примерно
одинаковые результаты, для почв сухих и хорошо оструктуренных
значительно большее число клеток определяется после
ультразвуковой обработки, хотя эта обработка приводит к гибели
некоторого количества клеток и, возможно, к гибели некоторых
чувствительных к ультразвуку видов микроорганизмов. Сильно
повреждаются ультразвуком грибы, и при учете этой группы
микроорганизмов ультразвук применять не рекомендуется.
Как наиболее общую и достаточно эффективную обработку
почвы перед проведением микробиологического анализа мы
рекомендуем применение микроизмельчителя тканей (РТ-2).
Приготовляют почвенную суспензию (1 г почвы на 100 мл стерильной
водопроводной воды). Время обработки 5 мин при 5000 об/мин.
Затем приготовляют нужное для посева разведение. Стержень и
пропеллер мешалки следует тщательно очищать от почвенных
частиц, механически удаляя их струей воды и чистой тряпочкой.
Затем стержень протирают спиртом, спирту дают испариться и
производят обработку новой пробы почвы. Стаканчики, в которых
проводят обработку, стерилизуют в автоклаве или сухим жаром,
lix можно тщательно мыть, счищая приставшую почву со стенок,
й стерилизовать спиртом, однако последний способ хуже, и
некоторое количество жизнеспособных клеток в стаканчике остается.
Обычно этим можно пренебречь, так как по сравнению с
миллионами клеток, содержащихся в 1 г почвы, это количество будет
весьма малым, но при выяснении вопроса о различии
качественного состава микроорганизмов разных почв такое загрязнение может
быть весьма нежелательным.
Ультразвуковую обработку можно рекомендовать при учете
бактерий в сухих образцах оструктуренных почв. Берут 1 г
почвы на 100 мл стерильной водопроводной воды. Почвенную
суспензию обрабатывают на ультразвуковой установке УЗДН-1 в
течение 3 мин при силе тока 0,40 А и частоте колебаний 15 кГц.
В случае отсутствия в лаборатории мешалки и ультразвуковой
установки можно применять растирание почвы, 1 г почвы
увлажняют до состояния пасты. Важно, чтобы почва не была слишком
увлажнена или недоувлажнена. Именно в состоянии пасты она
подвергается наилучшему диспергированию. Почву помещают в
небольшую фарфоровую чашку или ступку и растирают в течение
5 мин резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке.
Выполняя все операции, соблюдают правила работы в стерильных
условиях.
Применение приемов диспергирования по сравнению со старым
методом (10-минутное перемешивание почвенной суспензии в
колбах) дает возможность определять в 2—10, а иногда для особенно
оструктуренных сухих почв и в 100 раз больше бактерий.
Учет мицелиальных организмов грибов и актиномицетов на
питательных средах имеет более условный характер по сравнению с
учетом бактерий, так как здесь является более неопределенной
величина зародыша, давшего колонию, — это может быть и спора, и
гифа, и скопление гиф. Предварительная обработка дает
возможность разбить гифы на куски примерно одинаковой величины, и
хотя размер учитываемых зачатков продолжает различаться в
несколько раз, но он уже не различается в десятки раз, как это
было до диспергирования почвы.
Подготовка корней к учету микроорганизмов ризосферы и ри-
зопланы описана на с. 62.
МЕТОДЫ РАСЧЕТА КОЛИЧЕСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВЕ
Количество микроорганизмов обычно пересчитывают на 1 г
воздушно-сухой почвы. Если посев производится из
воздушно-сухой почвы, никаких пересчетов вообще не требуется. Если посев
производят из влажной почвы, нужно взять навеску почвы 5—Юг
Для определения влажности почвы, высушить ее, определить
содержание воды в процентах и сделать пересчет количества
микроорганизмов на 1 г воздушно-сухой почвы. Имеются способы пере-
Чета числа микроорганизмов на 1 г почвенного органического вё-
щества или на 1мг азота, но, поскольку нет прямой связи между
общим содержанием органического вещества или азота и развитием
микроорганизмов, такие пересчеты делать вряд ли целесообразно.
Расчет количества микроорганизмов на 1 г почвы не дает
возможности вскрыть специфику количественного распределения
микроорганизмов 'по почвенным типам. В этом случае пересчет
необходимо вести на весь профиль почвы. Например, в северных
примитивных почвах иногда в благоприятные для развития микробов
периоды обнаруживается очень большое количество клеток на 1 г
мелкозема, но такой биологически активный слой очень тонок, в
черноземе же количество микроорганизмов в верхнем слое может и
не достигать такой величины, но зато оно велико даже на
сравнительно большой глубине. Поэтому целесообразно определять
количество микроорганизмов на единицу площади поверхности
почвы. При определении запасов в почве органического вещества,
азота и т. д. такой пересчет обычно делают в тоннах на 1 га. При
учете количества микроорганизмов вести пересчет на 1 га
неудобно, так как получаются очень большие цифры. Мы рекомендуем
проводить пересчет на 1 см2 поверхности почвы, учитывая
количество микроорганизмов во всех генетических горизонтах, вплоть
до почвообразующей породы.
Расчет количества микроорганизмов в определенном слое
почвы или в генетическом горизонте следует проводить по формуле
М = абд, где М — количество микроорганизмов в данном горизонте
в расчете на 1 см2 поверхности этого горизонта; а — количество
микроорганизмов в 1 г почвы; б — мощность генетического
горизонта или слоя почвы (в см); д — объемная масса почвы, т. е.
удельная масса почвы с ненарушенной структурой.
Затем следует суммировать количество микроорганизмов,
определенное в разных горизонтах:
Мо6щ=Ма+Мв+МС,
где Ma, Mb, Мс — количество микроорганизмов в
последовательных слоях или почвенных горизонтах.
Большое значение имеет определение средней плотности
заселения поверхности почвенных частиц. Для разных почв она
существенно различается. В этом случае суммарную величину
поверхности почвенных частиц определяют по адсорбции паров воды или
другими методами, а также по адсорбции метиленовой сини (с. 63).
Этот метод необходим для сравнения количества микроорганизмов
в ризоплане и в контрольной или ризосферной почве.
По данным прямой микроскопии (но не метода учета на
питательных средах!) рассчитывают биомассу бактерий, грибов, акти-
номицетов в 1 г почвы или на 1 га почвы. В последнем случае
необходимо иметь данные по содержанию микроорганизмов в разных
почвенных горизонтах.
При определении биомассы микроорганизмов следует исходить
из следующих предпосылок. Средний размер почвенных бактерий
равен 0,1 мкм3, средний диаметр гиф грибов равен 4 мкм, актино
мидетов 0,5 мкм, удельная масса (плотность) всех
микроорганизмов равна 1,1 г/см3. Для более точных определений нужно в
каждой конкретной почве учитывать средний размер микроорганизмов.
Определяют живую биомассу, содержащую 80% воды, и
биомассу сухого вещества, которая равна 7б от живой биомассы
микроорганизмов.
Определение соотношения биомассы бактерий, грибов и акти-
номицетов в каждой почве представляет большой интерес и
характеризует как особенности почвы, так и особенности ее
состояния в данный момент времени.
РАЗДЕЛ 2
МЕТОДЫ ДЛЯ НАБЛЮДЕНИЯ И УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ
В ПОЧВЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ БИОМАССЫ
ПРЯМЫЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Прямые микроскопические методы дают возможность
определять общее количество отдельных групп микроорганизмов. Однако
даже и при применении прямых микроскопических методов можно
подсчитать только количество бактерий. Особые микроскопические
методы необходимо применять для подсчета грибов и совершенно
специфические — для подсчета почвенных водорослей и
беспозвоночных животных. Таким образом, когда определяется общее
количество микроорганизмов в почве (точнее было бы говорить об
определении общего количества бактерий), то из полученных
данных можно определить только биомассу бактерий, а не общую
биомассу почвенных микроорганизмов. По результатам посева на
любую питательную среду определять общую биомассу
микроорганизмов в почве невозможно. Согласно имеющимся сведениям
биомасса бактерий и грибов в почве выражается величинами не
одного порядка, но в разных почвах и в разные периоды могут
преобладать по массе грибы.
Следует учитывать, что общее количество микроорганизмов (и
их биомасса) характеризует только потенциальный запас
микроорганизмов в почве, но эти цифры еще не говорят о том, какая
часть микроорганизмов находится в активном, а какая часть в
покоящемся состоянии. Для получения более полной информации
нельзя ограничиваться определением количества микроорганизмов
и их биомассы в 1 г почвы, а необходимо проводить пересчет
количества микроорганизмов на единицу 'поверхности почвы с
учетом количества микроорганизмов по всему почвенному профилю,
расчета содержания микроорганизмов в столбике почвы с
площадью поверхности 1 см2 (определения количества
микроорганизмов на единицу поверхности почвы).
Общее содержание микроорганизмов — величина
консервативная и малоподвижная, поэтому определение его мало пригодно
для установления влияния различных факторов на микрофлору
почв (например, влияния пестицидов, удобрений и т.д.). Прямые
методы определяют в 100—1000 раз больше бактерий, чем посев
на питательные, даже малоэлективные среды.
Метод Виноградского
Часто для прямого микроскопического изучения почвы
применяют метод С. Н. Виноградского, причем обычно пользуются моди-
Ликацией этого метода, предложенной О. Г. Шульгиной.
Тщательно отобранную среднюю пробу почвы массой 5 г помещают в
250-миллилитровую колбу, содержащую 45 мл воды. Вода не
должна содержать клеток микроорганизмов. По оригинальной
прописи колбу энергично встряхивают 5 мин. Мы рекомендуем для
более полного учета числа бактерий обрабатывать почвенную
суспензию ультразвуком или при отсутствии ультразвуковой
установки на микроизмельчителе тканей. В течение 30 с дают осесть
наиболее крупным почвенным частицам и затем пипеткой с точно
вымеренной величиной капли наносят одну каплк? на поверхность
чистого обезжиренного предметного стекла. Одновременно с
каплей суспензии на стекло наносят каплю 0,1%-ного очищенного от
микробных клеток агара. На стекле предварительно отмечают
прямоугольник площадью 8 см2, ширина которого равна ширине
стекла. Нанесенную взвесь при помощи покровного стекла
помешивают и равномерно распределяют по поверхности всего
прямоугольника. Препарат подсушивают, фиксируют над пламенем
газовой горелки 95%-ным этиловым спиртом или парами осмия и
окрашивают карболовым эритрозином (по 5 г карболовой
кислоты и эритрозина на 100 мл воды). Окрашивание в зависимости
от качества краски продолжается от 1 ч до суток. Во время
окрашивания препараты не должны высыхать, для чего их помещают
в эксикатор, кристаллизатор или погружают в маленькие
стаканчики с краской. Краску смывают, последовательно погружая
стекла в 4—5 стаканов с водой. Препараты высушивают и помещают
под микроскоп (масляная иммерсия, 90Х). Необходимо
приготовить несколько повторных стекол.
Расчет количества клеток в 1 г воздушно-сухой или абсолютно
сухой почвы проводят по формуле
м= А8.10ЧР+Ю0)
БВГ
где А — общее количество учтенных на стекле клеток; Б —
площадь поля зрения (мкм2), определяется при помощи
объекта-микрометра; В — объем нанесенной суспензии (мл); Г — количество
просчитанных полей зрения; Р — влажность почвы (%).
После проведения количественного учета микроорганизмов
следует вычислить величину биомассы микроорганизмов в почве. Для
этого нужно знать среднюю величину клетки микроорганизмов,
которую можно получить после измерения под микроскопом
размеров клеток, встречающихся в данной почве. Затем количество
клеток в 1 г почвы умножается на средний объем клетки и на их
удельную массу (rf=l,10 г/см3). Часто делают пересчет биомассы
микроорганизмов в т/га. Вычисляют массу живых и сухих клеток.
При оценке количества микроорганизмов (бактерий) в почве
проявляется субъективность. В нашей лаборатории разные
исследователи в одних и тех же препаратах подсчитали количества
микроорганизмов, которые отличались в 2—3 раза. Восприятие того,
что следует считать за клетку бактерий, оказываетбя весьма субъ-
активным. В то же время один опытный исследователь все время
получает довольно стабильные результаты. Если подсчет ведется
на разных препаратах, окрашенных разными партиями красителя,
то результаты получаются совсем несопоставимыми. Люминис-
центно-микроскопические наблюдения отличаются большей
определенностью по сравнению с методом Виноградского, и разные
исследователи учитывают примерно одно и то же количество
бактерий, что было показано в специальном опыте, проведенном на
кафедре биологии почв МГУ.
Количественный учет бактерий в почве
с помощью люминесцентной микроскопии
Одним из наиболее совершенных методов выявления, изучения
и количественного учета микроорганизмов в их естественной среде
обитания является люминесцентная микроскопия в падающем
свете. Метод сводится к тому, что приготовленные из почвенной
суспензии препараты окрашиваются специальным красителем
(флуорохромом) — акридином оранжевым. При использовании
данного метода достигается более уверенный подсчет бактерий в
почве по сравнению с методом Виноградского. Яркие зеленые
клетки хорошо заметны на темном или красном фоне почвенных
частиц и препарата, причем микроскопия в отраженном свете по-
зволяет учитывать и адсорбированные клетки, которые, как
правило, не видны в проходящем свете (метод Виноградского).
Предложено несколько вариантов методов люминесцентной
микроскопии для количественного учета почвенных
микроорганизмов: от окрашивания почвенной суспензии с подсчетом
микроорганизмов в специальных камерах или в капиллярах Перфильева до
окрашивания фиксированных препаратов. Окрашивание этих
препаратов является наилучшей модификацией метода. В этом
случае отпадает необходимость в предварительном подборе
оптимальной концентрации флуорохрома для каждой почвы и не требуется
специальной камеры для количественного подсчета. К тому же
препараты до окрашивания и подсчета могут достаточно долго
храниться, что позволяет проводить подсчет не по ходу опыта, а в
удобное для исследователя время.
1. Почвенную суспензию (1 : 10) сразу же после
предварительной подготовки (с. 7) переносят в мерный цилиндр на 100 мл.
После 2-минутного отстаивания пипеткой отбирают 2 мл
суспензии из средней фракции (с отметкой на цилиндре 50 мл) и
переносят в колбу с 18 мл воды.
2. Перед приготовлением препаратов колбу энергично
встряхивают и суспензию наносят микропипеткой на тщательно
обезжиренное предметное стекло (0,01 мл на препарат) и равномерна
распределяют петлей на площади 4 см2 (квадрат 2x2 см). При
данной площади на каждом стекле можно приготовить 3
препарата. Рекомендуется (Предварительно начертить расположение пре-
ларатов в натуральную величину на бумаге, на которую в
дальнейшем кладут предметные стекла для приготовления препаратов.
3. Препараты высушивают на воздухе при комнатной
температуре. Затем после фиксации легким нагреванием на пламени
газовой горелки окрашивают препараты водным раствором акридина
оранжевого (разведение 1 : 10 000; 2—4 мин).
4. Избыток флуорохрома удаляют в процессе промывки, для
чего стекла погружают на 10 мин в стакан или кювету с
водопроводной водой. Окрашенные препараты высушивают при комнатной
температуре.
5. Для микроскопии на препарат наносят каплю воды и
покрывают обезжиренным покровным стеклом. Правильно
приготовленный препарат не содержит пузырьков воздуха. Лишнюю воду
удаляют фильтровальной бумагой. Препараты просматривают на
люминесцентном микроскопе МЛ-1; МЛ-4; ЛЮМАМ-ИЗ
(светофильтры ЖС-19, ЖС-18, объектив Х90 Л, окуляры Х4 или Х5).
Количество микробных клеток, содержащихся в 1 г почвы,
вычисляют по формуле
Р
где М — количество клеток в 1 г почвы; а — среднее число клеток
в поле зрения; р — площадь поля зрения (мкм2); н — показатель
разведения. В данном случае н=100, что приемлемо для верхних
горизонтов почв основных типов, однако степень разведения
может быть изменена в зависимости от численности
микроорганизмов в конкретном образце. Желательно подобрать разведение
таким образом, чтобы среднее число клеток в поле зрения
составляло 5—10. На этих же препаратах в 50 полях зрения ведется
подсчет длины актиномицетного мицелия с помощью окулярной
линейки.
Препараты для количественного учета спор и мицелия грибов
готовят так же, как и для бактерий. Для подсчета рекомендуется
из каждого почвенного образца готовить 3 препарата и на
каждом препарате подсчитывать споры и мицелий грибов в 50 полях
зрения, измерение длины мицелия проводят с помощью окулярной
линейки.
Окраску спор и мицелия грибов производят калькофлором
белым. Этот краситель связывается преимущественно с хитином и
целлюлозой клеточных стенок грибов, поэтому мицелий и споры
грибов легко выявляются по четко очерченной ярко-зеленой
люминесценции. Разведение калькофлора белого, используемого для
окраски,— 1 : 10 000, время окрашивания 15 мин.
Биомассу бактерий, грибов и актиномицетов вычисляют
следующим образом. Удельная масса (плотность) микроорганизмов
равна 1 г/см3, а содержание воды в клетках — 80%. Показатели
сухой биомассы составляют для 1 бактериальной клетки объемом
0,1 мкм3 — 2-Ю"14 г, для 1 м грибного мицелия диаметром
5 мкм — 3,9-Ю-6 г, для 1 грибной споры диаметром 5 мкм —
15
МО*11 и для 1 м мицелия актиномицетов диаметром 0,5 мкм—J
3,9-Ю-8 г. ;
Для подсчета бактерий рекомендуется из каждого почвенного
образца готовить два препарата и на каждом препарате
подсчитывать клетки в 20 полях зрения. Необходимое число проб и соот*
ветствующее суммарное число полей зрения, обеспечивающие
получение заданной величины относительной погрешностью оценки
среднего для двух уровней значимости а, приведены в табл. К
Таблица I
Необходимое число проб ф) и соответствующее суммарное число
полей зрения (N)
а
0,10
0,05
ь
83
115
5
N
830
1150
Относительная погрешность, %
10
Ъ
22
30
N
220
300
15
Ь
11
15
N
ПО
150
ъ
7
10
20
N
70
100
Такие рекомендации составлены с учетом того, что основную
лимитирующую роль при количественном учете играют факторы
утомляемости (Звягинцев, Дмитриев, Кожевин, 1978).
При подсчете клеток бактерий крайне важно не выбирать поля
для 'подсчета, а переходить к новому полю зрения, поворачивая
микрометр столика на определенную величину. Следует избегать
также подсчитывать микроорганизмы в близко расположенных
•полях зрения из-за возможной корреляции между числом
бактерий в них. Эти замечания справедливы только при количественном
учете и, конечно, при других целях исследования становятся
необязательными.
Следует выделить моменты, от которых зависит успех метода.
Одно из основных требований — применение тщательно
обезжиренных стекол. Новые и использованные стекла предварительно
кипятят в растворе стирального порошка, промывают и держат до
употребления в свежем растворе хромпика (не менее 3—4 сут)
или в спирте.
Все этапы приготовления препаратов могут проводиться с
нестерильной водопроводной водой только в том случае, если в
предварительных опытах (препараты из воды) получены данные о
достаточно низком уровне численности микроорганизмов в воде ш>
сравнению с таковым в почвенной суспензии (меньше в 1000 или
более раз). Если таких гарантий нет, следует применять
очищенную от микробных тел воду, например фильтрацией через
бактериальные фильтры. Стерильная вода может содержать
бактериальные тела, которые будут мешать правильному учету почвенных
бактерий.
16
При постановке продолжительных опытов нужно иметь в видуг
что по мере эксплуатации источника света снижается яркость
свечения клеток. Замена ртутно-тсварцевых ламп в ходе опыта может
привести к регистрации фиктивных колебаний численности.
Поэтому желательно периодически проводить контрольный подсчет
на другом микроскопе и использовать другие способы контроля.
Рекомендуется также готовить сразу значительное количество
основного 0,1%-ного раствора акридина оранжевого в
дистиллированной воде, которым и пользоваться в течение всей серии
опытов. Основной раствор красителя следует хранить при 4° в посуде
из темного стекла с притертой пробкой. Рабочие растворы
акридина оранжевого (1: 10 000) не хранят. При микроскопии
применяется специальное нелюминесцирующее иммерсионное масло,
которое при необходимости можно заменить аптечным парафиновым
или вазелиновым маслом. Предварительно следует убедиться, что
заменитель не люминесцирует.
Все методы визуального подсчета почвенных микроорганизмов
при микроскопии в той или иной степени содержат элемент
субъективизма, что главным образом связано с необходимостью
принятия решения в процессе подсчета: клетка или частица? По этой
причине трудно ожидать абсолютного совпадения результатов при
воспроизведении подсчета разными наблюдателями или даже
одним и тем же исследователем, но в разное время. Опыт
показывает, что при люминесцентной микроскопии результаты подсчетов,
выполненных разными исследователями, различаются не более чем
на 30%. Для метода Виноградского эти различия более
существенны (в 2—3 раза), что позволяет говорить о меньшей
субъективности метода люминесцентной микроскопии.
Важный шаг в достижении большей точности и
воспроизводимости подсчетов такая организация труда, при которой
непрерывная продолжительность подсчета не (превышает 1—2 ч, после чего
следует делать перерыв для отдыха или другой работы. Подсчеты
рекомендуется проводить в тихой комнате со слабым освещением.
Можно отметить, что два исследователя работают быстрее и с
большей точностью, чем один: наблюдатель концентрирует
внимание на микроскопии, а ассистент регистрирует результаты
подсчета. Необходимость записи каждого результата, прежде чем
перейти к следующему полю зрения, значительно нарушает ритм работы.
Можно использовать диктофон. Для сравнения почв по степени
обогащенности микроорганизмами предлагается пользоваться
табл. 2.
Электронно-микроскопический метод по Никитину
Современные электронные микроскопы с разрешением
2-10-10—5-10~10 м позволяют различить мельчайшие
микроорганизмы в почвенной суспензии и определить их численность. Работы
Д. И. Никитина показали, что в почвах содержится множество
новых форм микроорганизмов, которые не выявляются с помощью
Таблица 2
Шкалы для оценки степени обогащенности почв микроорганизмами
(люминесцентно-микроскопический метод, метод посева на питательные
среды, Звягинцев, 1978)
Степень
обобщенности почв
Очень бедная
Бедная
Средняя обога-
щенность
Богатая
Очень богатая
Степень
обогащены ости почв
Очень бедная
Бедная
Средняя обо га-
щенность
Богатая
Очень богатая
Общее количество
бактерий
млрд/г
^1
1-2
2-5
5-10
>ю
млрд/см*
^50
50—100
100—200
200—400
>400
Сухая
биомасса
бактерий
кг/га
^42
42-85
85—170
170-340
>340
Длина гиф грибов
мг
^30
30—100
100—300
зоо—юоо
>1000
Количество бактерий на МПА
млн/г
2-
5-
>1
L
-2
-5
-10
0
млн/см*
-^25
25—50
- 50-125
125—250
>250
м/см*
--750
750—2500
2500—7500
7500—2500
>2500
Сухая
биомасса грибов
кг/га
^120
120—400
400—1200
1200—4000
>4000
| Количество бактерий на средах
Эшби, Чапека, крахмал о-аммиачной
млн/г
-^2
2-4
4-10
10—20
>20
млн/см*
--50
50-100
100—250
250—500
>500
других методов. При применении методов предварительного
диспергирования почвы и десорбции микроорганизмов с помощью
электронной микроскопии удается подсчитать наибольшее по
сравнению с другими методами количество микробов.
Диспергированную почвенную суспензию помещают в
стерильный мешок из синтетического полупроницаемого материала и
подвергают диализу в стерильной дистиллированной воде в течение
3—12 ч. Мешочки для диализа, 'прикрепленные к стеклянному
кольцу, закрывают ватной пробкой, а весь стакан — ватой,
смоченной толуолом. После диализа взвесь наносят на пленки-подложки
для электронного микроскопа. Разведение почвенной суспензии
подбирается эмпирически. Мутность суспензии должна быть
примерно в 10 раз более высокой по сравнению с применяемой при
работе со световым микроскопом. Для нанесения капель суспензии
используют стерильные микропипетки объемом 0,1 мл с
оттянутым в капилляр концом. Перед отбором суспензии конец пипетки
покрывают тонким слоем стерильного вазелина при помощи про-
стерилизованной полоски фильтровальной бумаги. Слой вазелина
препятствует затеканию взвеси на нижнюю часть пипетки и
образованию 'капель избыточного объема. При изготовлении
препаратов, предназначенных для количественного учета, отбирают сетки
18
с одинаковыми диаметрами полей зрения (3000—3400 мкм) и
квадратными отверстиями (со стороной квадрата 30 мкм).
Препараты просматривают в бинокулярном микроскопе (МБС-1). На
сетку наносят каплю объемом 3—8 мкл. При нанесении капли
пипетку следует держать под углом 30—40° к плоскости сетки.
Расстояние капилляра от пленки колеблется в пределах 5—8 мм. Капля,
сформировавшаяся на кончике пипетки, не (переливается на сетку,
а падает, образуя небольшую сферу, не выходящую за край
сетки. В противном случае сетки выбраковывают. После высыхания
капель препараты оттеняют металлом (хромом или окисью
вольфрама) и просматривают в электронном микроскопе.
Перед нанесением капель сетки одной партии с коллодиевыми
пленками могут быть расположены рядами на донышке чашки
Петри, к которой снизу прикреплен лист бумаги с пронумерованными
квадратами. Это облегчает заполнения паспорта на каждую сетку,
где указан номер, диаметр, размер поля зрения сетки и объем
нанесенной «капли. Для каждого варианта опыта подготавливают
10—20 сеток. Во всех сетках производят подсчет количества ми-
кробных клеток в возможно большем числе полей зрения.
Просмотр препарата на сетке и учет клеток в пределах каждого поля
зрения целесообразно проводить то определенному порядку.
Например, поля и объекты в каждом поле следует просматривать,
начиная с левого края сетки (или левой стороны квадрата в поле
зрения), и далее по часовой стрелке (точнее по спирали) до
центра сетки. Количество микробных клеток удается без особых
затруднений учитывать в среднем в 10—30 полях зрения (из 100)
на каждой сетке, (препятствия для учета возникают в тех
сравнительно редких случаях, когда скопление почвенных частиц в поле
зрения оказывается значительным по диаметру (3—4 мкм и
больше) и может маскировать собой микробные клетки.
Число клеток» обнаруженных в каждом поле зрения, при учете
площадей поля и сетки в целом и объема капли, нанесенной на
сетку, позволяет рассчитать количество клеток в 1 г почвы. Для
расчета количества микробных клеток предложена следующая
формула:
м= nnR2
aWp '
где М — количество клеток микроорганизмов в 1 г почвы; п —
количество микроорганизмов в просчитанном квадрате (среднее
арифметическое); R — радиус сетки, мкм; а — сторона квадрата
поля зрения, мкм; V — объем капли, мл; р — разведение суспензии.
Следует подчеркнуть, что такие расчеты ориентировочны. Для
получения достоверных данных необходима
вариационно-статистическая обработка материала, позволяющая установить ошибку
средней арифметической, разброс рассчитанных величин, точность
и надежность опыта.
19
Определение содержания мицелия грибов в почве
методом агаровых пленок
Метод агаровых пленок Джонса и Моллисона как один из
наиболее простых до сих пор довольно широко используехся для
определения содержания мицелия в почве. Навеску почвы от 0,5 до
4 г (в зависимости от количества в ней грибов) помещают в
фарфоровую ступку, увлажняют небольшим количеством
дистиллированной воды, тщательно растирают пестиком или пальцем в
перчатке. Растертую почву (переносят в колбу со 100 мл 1,5%-ного
расплавленного и слегка охлажденного раствора агара и
равномерно перемешивают. После этого каплю суспензии распределяют
в гемоцитометре (камере Горяева). Необходимая для просчетов
глубина квадратов достигается /притиранием покровного стекла до
появления полос интерференции по его краям.
Более четкая картина получается при подкраске
светлоокрашенных грибных гиф, для чего используют раствор анилинового
голубого в 5%-ном водном феноле (1 мл 1%-ного красителя в
15 мл водного фенола). Подсчет длины гиф рекомендуется
проводить с помощью окуляра-микрометра при увеличении 10X8 или
10x20 в 40 квадратах камеры Горяева в трех повторностях для
каждого анализируемого образца почвы. Окончательный расчет
длины гиф в 1 г проводится по следующей формуле:
м== а 250- 103*1Q-4- 100
40С
где М — суммарная длина грибных гиф в 1 г почвы, выраженная
в см; а — длина гиф в единицах окуляра-микрометра; х — цена
деления окуляра-микрометра (мкм); С — навеска почвы (г).
Площадь одного квадрата камеры Горяева равна 0,004 мм2, глубина—
0,1 мм, объем — 0,004 мм3, или 0,004-103 см3. Массу мицелия
рассчитывают так же, как и в методе мембранных фильтров.
К недостаткам метода следует отнести то, что результаты
могут быть несколько завышены за счет содержания
светлоокрашенного мицелия. Это обусловлено малым увеличением, используемым
в этом методе (большие увеличения применять невозможно из-за
большой толщины камеры). При этих условиях трудно отличить
светлоокрашенный мицелий от посторонних примесей в агаре,
имеющих сходство с гифами.
Учет мицелия (спор) грибов методом мембранных фильтров
Метод мембранных фильтров широко применяют в
микологических исследованиях, так как он имеет ряд преимуществ. Он
прост и быстр в исполнении, зафиксированные препараты до
подсчета могут долго храниться, что позволяет проводить учет не по
ходу опыта, а в удобное для исследователя время, т. е.
анализировать большое число образцов. Этот метод дает возможность
дифференцировать темно- и светлоокрашенный мицелий, чего нельзя
сделать биохимическими методами, а также оценить ряд морфо-
метрических показателей мицелия и спор.
у нас в стране метод мембранных фильтров Хансена
используют в модификации Демкиной и Мирчинк. Для определения
длины мицелия и количества спор грибов берут навеску почвы 0,5—
2 г в зависимости от типа почвы и заселенности ее грибами.
Можно рекомендовать для верхних горизонтов почв подзолистой
зоны, красноземов, сероземов, серых лесных почв, черноземное —
1 г, №я лесных подстилок — 0,5 г, для каштановых, высокогорных
и песчано-пустынных почв — 2 г. Большую навеску почвы,
несмотря на малое содержание в ней грибного мицелия, рекомендовать
нецелесообразно, так как просмотру гиф и спор в микроскопе
мешают почвенные частицы. В случае же слишком большого
содержания грибных гиф в почве целесообразнее не брать навеску
почвы меньше 0,5 г, а увеличить разведение.
Навеску воздушно-сухой почвы тщательно растирают в
фарфоровой ступке'пестиком с резиновым наконечником до тех пор, пока
почва не будет гомогенной. Растертую почву помещают в 500 мл
чистой нестерильной дистиллированной воды. Если содержание
гиф велико, что имеет место в подзолистых, серых лесных почвах
или в лесных подстилках, то почвенную суспензию разводят еще
в 10 раз. Затем эту суспензию встряхивают на качалке в течение
5 мин, выливают в цилиндр емкостью 500 мл и, не давая
отстояться, берут 10 мл суспензии 'каждый раз с одного и того же
уровня из середины цилиндра. Суапензию берут без отстаивания, чтобы
не дать осесть частицам, на поверхности которых могут быть
закреплены гифы.
Далее берут фильтр Зейца, куда вместо асбестовой прокладки
на металлическую сетку помещают 6 слоев обеззоленной
фильтровальной бумаги, поверх нее кладут мембранный фильтр.
Используют фильтры марки «Синпор» (Чехословакия) с диаметром
пор 1,5—2,6 мкм и собственным диаметром 35 мм. Через поры с
таким диаметром пройдет большая часть почвенных частиц,
имеющих меньшие размеры, и в основном не смогут пройти
фрагменты грибных гиф и споры.
Фильтры предварительно кипятят в дистиллированной воде
в течение 20 мин, дважды меняя воду. В фильтры Зейца
помещают 10 мл почвенной суспензии и фильтруют на колбах Бунзена
с водоструйным насосом. Если на фильтре остается слишком
много почвенных частиц, то его несколько раз промывают
дистиллированной водой, но так, чтобы при наливании новой порции воды
на фильтре еще оставалась 7з начального объема суспензии.
Таким образом достигается равномерное распределение
фрагментов мицелия и почвенных частиц на фильтре.
Мембранные фильтры с почвенной суспензией вынимают из
фильтров Зейца, высушивают на воздухе, а затем окрашивают.
Для этого в чашку Петри помещают диск фильтровальной бумаги,
хорошо смоченной красителем (дианиловым голубым или метиле-
Довым синим), на который кладут мембранный фильтр с почвен-
ной суспензией. Фильтр окрашивают не менее 2 ч, а затем
высушивают при комнатной температуре в чистой чашке Петри.
Краситель готовят следующим образом: 1%-ный раствор краски и
5%-ный раствор фенола смешивают в соотношении 1 : 5. После
окраски и просушивания фильтр осветляют иммерсионным маслом
или глицерином (капают на фильтр 2—3 капли соответствующего
реактива, которые, расплываясь по фильтру, осветляют его) и
сверху накладывают покровное стекло.
Для подсчета числа грибных фрагментов, спор и измерения
длины гиф мицелия просматривают три фильтра по 50 <полей
зрения на каждом. Просчитывают число спор и измеряют длину гиф
в каждом поле зрения с помощью окуляра-микрометра. Длину
гиф измеряют в единицах окуляра-микрометра и вычисляют их
суммарную длину во всех подсчитанных полях зрения.
Для измерения длины гиф используют увеличение 10X40, для
подсчета спор—10X90 (иммерсия). Оптимальное число гиф
должно быть 1—3 фрагмента в поле зрения. Суммарную длину
гиф мицелия в 1 г почвы рассчитывают по формуле
Ьх 10-4 R4 10-2 _ bxR2n
bOrWClOr* ~~ 0,5r2VC '
где а — длина гиф в 1 г почвы (см); Ь — средняя длина гиф на
фильтре в одном поле зрения в единицах окуляра-микрометра;
х — цена деления окуляра-микрометра (мкм); R — радиус
фильтра (мм2); п — разведение почвенной суспензии; г — радиус поля
зрения (мкм2); V—объем наносимой суспензии; С — навеска
почвы (г).
Объем гиф, выраженный в см3, рассчитывается по формуле
У=аяг210-8 см3.
Средний радиус мицелия определяют на фильтре. Принимая
удельную массу 1 г/см3, рассчитывают массу мицелия в 1 г почвы.
Можно рассчитать отдельно биомассу светлоокрашенного и
темноцветного мицелия. Масса 1 м мицелия составляет 0,02 мг.
Следовательно, массу мицелия можно рассчитать, умножив длину
мицелия на массу 1 м:
£==аО,02ХЮ-2.
Зная биомассу в определенном объеме, можно рассчитать
биомассу мицелия в столбике почвы в 1 см3 и далее в 1 га почвы на
любую глубину почвенного профиля. Масса мицелия в 1 га
равняется
£=£гИ08,
где g — масса мицелия в 1 см3 почвы; / — глубина горизонта.
Используя метод мембранных фильтров, можно подсчитать
число спор грибов в определенной навеске почвы. Необходимо так-
22
же просчитать 50 полей зрения. Число спор в 1 г почвы
рассчитывают по формуле
м mR2nlQr2 _ mR2n
~~ 50r2VC10-8 ~ br*VC\Qr*> '
где jvi — число спор в 1 г почвы; т — среднее число спор в одном
поле зрения; остальные обозначения те же, что и для расчета
длины гиф.
Биомасса спор рассчитывается по формуле
g=Vd9
где V — объем споры, d — удельная масса, равна 1,2.
Объем споры рассчитывают следующим образом:
у мм3 = — аЫ0-\
6
где а — больший; Ь — меньший диаметр споры (мкм).
БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОМАССЫ
МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВЕ
Фумигационный метод
Фумигационный метод основан на явлении интенсификации
дыхания почвенного образца после его обработки фумигантом
(парами летучих токсических соединений — хлороформа, бромоформа,
окиси этилена и др.). Фумигация приводит к гибели большей
части (90—95%) микроорганизмов в почве и не затрагивает мертвое
органическое вещество. Биомассу определяют в инкубационном
эксперименте по приросту выделения С02 из фумигированной
почвы по сравнению с контролем (почва без обработки). При
этом предполагается, что единственным источником
дополнительного количества СОг в обработанной почве служит некромасса
погибших клеток, которая служит субстратом для роста тех 5—
10% микроорганизмов, которые сохранили жизнеспособность.
Реактивы: хлороформ. Коммерческий препарат очищают от
стабилизирующих веществ (этанола), встряхивая трижды в
делительной воронке с равным объемом 5%-ной H2SO4. Далее
хлороформ промывают 5 раз водой, высушивают над безводным
К2СО3 и перегоняют. Хранят очищенный реактив над К2СО3 в
темноте в течение нескольких недель.
Оборудование: анализатор СОг, вакуумный насос,
вакуумный эксикатор, термостат.
Ход анализа. Навески почвы по 50 г помещают в 4 стек-
лянных сывороточных флаконах объемом 500 мл, два из них
ставят в холодильник при 0—4° (контроль), другие два подвергают
обработке парами хлороформа. Для этого открытые флаконы с
лочвой помещают в вакуум-эксикатор, который содержит чашку
23
Петри с хлороформом и кипятильниками (керамическая крошка
или изломанные стеклянные'капилляры). Эксикатор закрывают, и
оставляют всю систему в темноте при комнатной температуре на
18—24 ч. Затем флаконы с обработанной почвой переносят в
другой вакуум-эксикатор и удаляют пары хлороформа путем 4—6-
кратного вакуумирования сначала водоструйным, а потом
масляным насосом. Обработанную и контрольную почву при
необходимости увлажняют до 60% от полной влагоемкости, флаконы
закрывают резиновыми пробками и инкубируют 10 сут при 25°.
В конце инкубации из каждого флакона отбирают шприцем
пробу воздуха и определяют в ней концентрацию СОг на газовом
хроматографе.
Биомассу микроорганизмов рассчитывают по формуле
*=[СФ-Ск] VJK/m, (1)
где Сф и Ск— концентрация СОг в флаконах с фумигированной
и контрольной почвой соответственно (мкг СОг—С/см3);
V—объем воздушной фазы флакона (см3); т — навеска почвы (r); k —
пересчетный коэффициент, обычно принимают равным 0,4.
Фумигационный метод имеет следующие недостатки:
длительность определения (10-суточная инкубация), его трудоемкость
(очистка фумиганта, многократное вакуумирование обработанного
образца для удаления хлороформа), невозможность определения в
некоторых ?почвах (кислых, унавоженных и др., где выход СОг из
фумигированной почвы уменьшается по сравнению с контрольной) у
и наконец, токсичность фумигантов, «которая создает опасность
для исполнителя анализа.
Регидратационный метод
Регидратационный метод основан на том же принципе, что и
фумигационный. Процедура фумигации в качестве биоцидной
обработки заменена простым высушиванием почвы при умеренно
высокой температуре (65—70°, 24 ч). В ходе высушивания
нарушается барьер проницаемости клеток вследствие денатурации цито-
плазматических мембран, при этом мертвое органическое
вещество не разрушается. Последующая регидратация (встряхивание
высушенной почвы с водой или разбавленным солевым раствором)
приводит к высвобождению внутриклеточного содержимого
микроорганизмов в жидкую фазу. Биомассу микроорганизмов
определяют по приросту содержания водорастворимых соединений в
высушенной почве по сравнению с контрольной свежей почвой.
Концентрацию органических веществ измеряют методом бихроматного
окисления. Недостатком регидратационного метода является его
трудоемкость, особенно при определении пересчетного
коэффициента в каждом анализируемом образце.
Реактивы: экстрагент (вода или 0,5 н K2SO4, готовят,
растворяя 42,6 г соли в 1 л воды), сернохромовая смесь (готовят.
растворяя 23,2 г К2СГ2О7 в 400 мл воды, затем осторожно
приливают 2 л конц. H2S04 с плотностью 1,84 г/см3).
Оборудование: спектрофотометр или ФЭК, центрифуга,
термостат.
Ход анализа. 50 г свежей почвы, предварительно
просеянной через сито с ячейками 1—3 мм и освобожденной от корней
растений, помещают в коническую колбу емкостью 300 мл и
высушивают в сушильном шкафу при 70° в течение 18—24 ч.
Параллельно определяют содержание влаги в свежем образце почвы.
Одновременно контрольный образец (без прогрева) заливают 0,5 н,
раствором K2SO4 (соотношение почва: вытяжка=1 : 2) и
взбалтывают на качалке в течение 30 мин. Затем суспензию фильтруют
через двойной складчатый крупнопористый фильтр или
центрифугируют. Вытяжку хранят до анализа в холодильнике при 4° в
течение 18—24 ч. Из высушенной почвы вытяжку готовят
аналогичным образом. При этом необходимо учесть ту влагу, которая
содержалась в свежей почве и испарилась при высушивании. Легче
всего это сделать путем увлажнения высушенной почвы до
исходного состояния перед приготовлением вытяжки. В пробирки
отбирают по 1,6 мл вытяжки из контрольного и опытного образцов,
добавляют'по 2,4 мл сернохромовой смеси и перемешивают.
Инкубационную смесь прогревают при 140° в течение 20 мин, охлаждают
и измеряют оптическую плотность при 590 нм. Параллельно ставят
холостую пробу на реактивы (вместо надосадочной жидкости
используют соответственно раствор K2SO4 или дистиллированную
воду). Следует помнить, что во избежание выпаривания при
прогревании инкубационной смеси пробирки необходимо закрывать
крышками (стеклянными или из фольги). Применение ватных или
резиновых пробок недопустимо, поскольку содержащиеся в них
органические вещества могут исказить результаты анализов.
Расчет концентрации углерода в вытяжках производят по
формулам
с _ (DB-DK)V с ^ (РС-Р*)У (2)
в k*a ' к k*a W
где Св— содержание органических веществ в высушенной почве
(мкг С/г); Ск — содержание органических веществ в контрольной
(без высушивания) почве (мкг С/г); V — объем вытяжки (мл);
а — масса почвы, взятой для анализа (г); DB — оптическая
плотность пробы из высушенной почвы; Dc — оптическая плотность
пробы из свежей (контрольной) почвы; Ьк—оптическая плотность
холостой пробы; k* — пересчетный коэффициент от оптической
плотности к концентрации (мл/мкг С).
Пересчетный коэффициент k* определяют по калибровочному
графику с серией растворов глюкозы (50—500 мкг С/мл, что
соответствует 125—1250 мкг глюкозы/мл). Пример определения k*
показан на рис. 2: k* рассчитывают по тангенсу угла наклона гра-
дуировочной шкалы к оси абсцисс.
25
0,6 \
оМ
0,2
1,0
Of
_ *
250
Б
1
500
i
750
мкгС/мл
J 1_Sl
ю
20
SO 40
мкгС/мл
Рис. 2. Калибровочные графики для
бихроматного метода
определения концентрации органических
веществ в водных вытяжках из
почвы:
А — для концентрированных
растворов (измерение оптической
плотности при 590 нм); Б — для
разбавленных растворов (измерение
оптической плотности при 340 нм)
v, мкгС/ч-г
1пУ1
20 Время,«
Рис. 3. Нахождение пересчетного
коэффициента Q = nlY на примере
определения биомассы
микроорганизмов, использующих глюкозу:
А — динамика интенсивности
дыхания (1) и остаточного
количества глюкозы (2); Б — расчет
удельной скорости роста [i (1) и
стехиометрического коэффициента
Y (2)
Если концентрация органических веществ в вытяжке низкая,
то используют более чувствительную модификацию бихроматного
метода: в составе сернохромовой смеси количество К2СГ2О7
снижают с 23,2 до 1,28 г, а спектрофотометрию продуктов окисления
осуществляют при 340 нм в кварцевых кюветах. Остальные
операции остаются в неизменном виде. В области 340 нм находится
максимум поглощения Сг2072", поэтому о количестве органических
веществ судят по снижению оптической плотности реакционной
смеси по сравнению с холостой пробой. Это наглядно видно по
рис. 2, на котором приведен пример градуировочной кривой.
Нахождение пересчетного коэффициента и
расчет биомассы. Биомассу микроорганизмов рассчитывают по
формуле
x=(CB—CK)/k, (3)
где х—биомасса (мкг С/г почвы); Св и Ск — содержание
растворимых органических веществ соответственно в высушенной и
9fi
контрольной почве (мкг С/г почвы); k — пересчетный
коэффициент, который по своему смыслу есть доля клеточных
компонентов, переходящих в раствор в результате высушивания — регидра-
тадии. о
Для прямого нахождения величины k почвенный образец
инкубируют с известным количеством глюкозы (1—5 мг/г почвы),
определяя в динамике потребление субстрата бихроматиым
методом в водных вытяжках и выделение С02 методом газовой
хроматографии. Прирост углерода микробной биомассы Ах
рассчитывают по уравнению материального баланса
A*=s0—s—Ap, (4)
где so — доза субстратного обогащения почвы (мкг С-глюкозы/г
почвы); 5 — остаточное количество глюкозы (мкг С/г почвы);
др—выделившийся С02 в избытке по сравнению с контролем
(необогащенной почвой; мкг С/г почвы). Параллельно
определяют количество органических веществ в вытяжках из почвы после
высушивания — регидратации. Аналогичные определения проводят
для необогащенной почвы.
Коэффициент пересчета k находят для каждого срока
инкубации по формуле
k= «г-сЧ-«*-*> , (5)
где Св и С — количество углерода растворимых органических
соединений в почве после высушивания — регидратации и в почве
без обработки соответственно, индекс «г» обозначает почву,
обогащенную глюкозой, а индекс «к» — контрольную почву без
субстратного обогащения.
Примечание. Обычно коэффициент k составляет
примерно 0,25.
Кинетические методы
Биомассу микроорганизмов рассчитывают по кинетическим
параметрам потребления (превращения) вносимого в почву
субстрата. Зависимость скорости потребления субстрата v от его
концентрации 5 и биомассы микроорганизмов х описывается
известным уравнением
v=xQsf(ks+*s)1 (6)
где Q — максимальная удельная скорость потребления субстрата,
ks — константа насыщения.
После внесения в почву избытка субстрата (s^ks) величина
v становится прямо пропорциональной х:
v = Qx. (7)
Чтобы найти величину Q, которая служит пересчетным коэффи-
27
циентом от v к х, почву инкубируют с субстратом несколько
дольше, чем требует замер v. При этом учитываемые микроорганизмы
начинают расти по экспоненциальному закону, что приводит к
соответствующему увеличению v:
x(t)=x(0)e>*9 ь (8)
v(t)=Qx(t)=v(0)&«. (9)
По условию материального баланса скорость роста
микроорганизмов \х и удельная скорость потребления субстрата Q связаны
между собой простым соотношением
Q = n/Y, (Ю>
где У—стехиометрический (экономический) коэффициент.
Величину (а находят по динамике прироста v(t) в
полулогарифмических координатах «lnv(t)—t» (\i оценивают по наклону
прямой, аппроксимирующей экспериментальные точки, рис. 3).
Стехиометрический коэффициент Y определяют в чистых культурах
или in situ путем учета доступных измерению слагаемых
материального баланса микробного роста, шричем для каждой группы
организмов задача решается индивидуально.
Таким образом, зная величину скорости превращения
субстрата в начальный момент времени v(0) и значение пересчетного
коэффициента Q, биомасса микроорганизмов до субстратного
обогащения почвы может быть рассчитана по формуле
*(О)-0(О).У/|1. (И)
Использование в качестве субстрата различных соединений
(глюкозы, аммония, молекулярного водорода и т.д.) (позволяет
оценить биомассу микроорганизмов конкретных физиологических
групп. Однако следует помнить, что кинетический метод
справедлив только для тех ситуаций, когда на внесенном в почву
субстрате имеет место экспоненциальный рост микроорганизмов.
МИКРООРГАНИЗМЫ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕ ГЛЮКОЗУ
Подавляющее большинство хемоорганотрофных
микроорганизмов способно использовать глюкозу в качестве единственного
источника углерода и энергии. Конечным продуктом окисления
глюкозы является СОг, поэтому о скорости потребления субстрата
удобно судить по интенсивности дыхания (ИД) обогащенной
почвы. Применение в сочетании с глюкозой ингибиторов белкового
синтеза про- и эукариот позволяет расширить границы метода и
дифференцированно учесть вклад грибов и бактерий в суммарную
биомассу почвенных микроорганизмов.
Реактивы: концентрированная глюкозо-минеральная смесь
(КГМС), мг/мл: глюкоза —200, К2НР04— 20, (NH4hS04 — 20.
Оборудование: анализатор С02 (газовый хроматограф с
детектором по теплопроизводности, ИК-анализатор ГИАМ-5М,
28
Инфралит и т-п-> кондуктометрические устройства), термостат
на 25°.
Ход анализа. В пенициллиновые флаконы помещают по
2 г свежей почвы, добавляют по 0,1 мл глюкозо-минеральной
смеси (конечное количество вносимой глюкозы—10 мг/г почвы),
увлажняют при необходимости до 60% от полной влагоемкости и
инкубируют при 25° в термостате. Следует отметить, что глюкозо-
минеральную смесь вносят без перемешивания почвы, поскольку^
последняя операция может вызывать избыточное выделение СО2.
При использовании газового хроматографа ИД измеряют
следующим образом: сразу после внесения субстрата пенициллиновые
флаконы с (почвой герметично закрывают пробками, ставят в
термостат, отбирают шприцем пробу воздуха объемом УПр=1,0 мл
и проводят ГХ-определение СОг (С\). Через 0,5—1,0 ч инкубации
проводят повторный отбор пробы воздуха и второе определение
СОг (Сг). Расчет ИД осуществляют по формуле
где v—ИД почвы (мкг СОг—С/ч/г почвы); С\ и Сг —
концентрация СОг (мкг С/см3); Уф — объем воздушной фазы флакона (см3);
т — масса почвы (г); At—время инкубации (ч). Газовый
хроматограф калибруют, используя газовые смеси с известной
концентрацией СОг.
Нахождение пересчетного коэффициента и
расчет биомассы. ИД измеряют не однократно, а через каждые
1,5—2 ч в течение 8—10 ч. Между определениями ИД флаконы
инкубируют открытыми. Величину \х находят, как показано на
рис. 3.
Для нахождения стехиометрического коэффициента У
дополнительно iK измерениям динамики ИД определяют динамику
остаточной глюкозы и продуктов ее трансформации бихроматным
методом (см. рис. 2). Величину Yx/P рассчитывают по формуле
v As —Др
Yx/p=:—zr~' (13>
где As—потребление внесенного органического субстрата по
разнице между исходным (в момент внесения) и остаточным его
количеством (мкг С/г почвы); Ар— выделение С02 за тот же
период (подсчитывают по площади фигуры под кривой v(t) (мкг
С/г почвы).
Биомассу микроорганизмов х рассчитывают по формуле
*(0)=у(0).Ух/РЛг, (14)
где * —выражено в мкг С/г почвы, v(0)— ИД в начальный
момент инкубации (мкг С02—С/ч/г почвы).
Примечание. Для длительных динамических наблюдений
каждый раз определять \i и У необязательно — достаточно одно-
29*
кратного измерения. В таких случаях для расчета биомассы
требуется знать лишь величину ИД почвы в момент субстратного
обогащения почвы. В работе может быть также учтено то, что у
большинства использующих глюкозу микроорганизмов около 50%
потребленного субстрата идет на построение биомассы, оставшиеся
50%, как правило, окисляются до ССЬ. Таким образом, величина
Yx/P составляет 1 мкг С—х/мкг СО2—С.
ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫЙ УЧЕТ ГРИБОВ И БАКТЕРИЙ В ПОЧВЕ
(ингибиторный анализ)
В основу дифференцированного определения эукариотных
(преимущественно грибов) и прокариотных (главным образом
бактерий) микроорганизмов положена избирательность действия
ингибиторов белкового синтеза актидиона (А) и хлорамфеникола (X)
или стрептомицина (С). При условии правильно подобранной
концентрации антибиотики полностью .подавляют рост, но не дыхание
соответственно про- и эукариот. В оригинальном методе (Anderson,
Domsch, 1978) оценивается не биомасса грибов и бактерий, а
прирост соответствующих парциальных активностей в ходе
8—10-часовой инкубации почв с глюкозой и антибиотиками. Для
корректной оценки биомассы грибов и бактерий в исходной необогащен-
ной почве требуется использовать описанный выше принцип
кинетического метода, а парциальную дыхательную активность
грибов и бактерий в исходной почве (Vr° и Ve° соответственно)
рассчитывают путем экстраполяции кривых динамики ИД к моменту
t = 0. Экстраполяцию осуществляют путем сглаживания
экспериментальных точек следующими уравнениями:
v = vb е^ + v°r ellT*—глюкоза,
va = vr + vb еЦь*—глюкоза + актидион,
(15)
vx = vb + vy е^т*—глюкоза + хлорамфеникол,
уА+х = vb + vl—глюкоза + актидион + хлорамфеникол,
Цг и [хб — удельные скорости роста грибов и бактерий
соответственно.
Реактивы: концентрированная глюкозо-минеральная смесь,
актидион, хлорамфеникол (или стрептомицин).
Оборудование: см. с. 28, для расчетов желательно
использовать ЭВМ.
Ход анализа. В пенициллиновые флаконы помещают по
2 г почвы и вносят по 0,1 мл раствора глюкозы с антибиотиками
в разных сочетаниях: 1) КГМС, 2) КГМС + актидион, 3) КГМС +
4- КГМС + хлорамфеникол, 4) КГМС + актидион + хлорамфеникол.
Количество вносимой глюкозы—10 мг/г почвы, антибиотиков —
по 2 мг/г почвы, К2НРО4 и (NH4)2S04 — см. выше. Почву
инкубируют при 25° во влажной камере, чтобы предотвратить высыхание.
30
и, мкгС02-С/ч-г
75V
r динамике через каждые 3—6 ч измеряют ИД почвы после вне-
ния глюкозы и антибиотиков. Пример определения приведен на
°ис 4 О правильности подобранных концентраций ингибиторов
судят по .неизменности ИД почвы в варианте «глюкоза+ акти-
дион + хлорамфеникол».
Нахождение
пересчетного коэффициента и расчет 7
биомассы. Вклад грибов и
бактерий в суммарную дыхательную
активность • и соответствующие
удельные скорости роста
рассчитывают следующим образом: на ЭВМ
подбирают такие значения i#, v£y
Мт, М^б при которых ошибка
имитации по приведенным уравнениям
минимальна. Yx/P принимают
равным единице, а расчет биомассы
грибов и бактерий в начальный
момент времен осуществляют по
формуле (14).
ХЕМООРГАНОТРОФНЫЕ
МИКРООРГАНИЗМЫ
Рис. 4. Динамика интенсивности
дыхания почвы в присутствии
ингибиторов белкового синтеза.
Кривые рассчитаны по уравнениям 15:
/ — глюкоза + КГМС; 2 — ■
КГМС+актидион; 3 —
хлорамфеникол; 4 — КГМС+актидион+
+ хлорамфеникол
Для более полного учета хемо-
органотрофных микроорганизмов
вместо глюкозы можно
использовать еще Mt/нее селективные
органические субстраты, например стерилизованную почву. В ней
субстратом являются гумусовые вещества и содержимое убитых
микробных клеток. О процессе потребления данных субстратов
почвенными микроорганизмами свидетельствует (как и в случае
внесенной глюкозы) ИД обогащенной почвы.
Реактивы: почва, стерилизованная автоклавированием.
(1 атм, дважды по 0,5 ч).
Оборудование: см. раздел «Микроорганизмы,
использующие глюкозу».
Ход анализа. 1 г свежей почвы помещают в пенициллино-
вые флаконы, добавляют 1 г стерилизованной почвы, тщательно
леремешивают и инкубируют три постоянной влажности 60% от
полной влагоемкое™ и температуре 25°. ИД почвы измеряют по
скорости выделения СОг, как описано выше.
Нахождение пересчетного коэффициента и
расчет биомассы. Постановку опытов и расчет осуществляют так
же, как и при внесении глюкозы в почву. При расчете биомассы
необходимо помнить, что живые микроорганизмы содержатся лишь
в свежей почве, а стерилизованная почва служит только
субстратом.
Примечание. В качестве субстрата для хемоорганотроф-
ных микроорганизмов могут быть рекомендованы автоклавирован-
31
ные образцы почвы. Чтобы достичь условия насыщения субстратом
(s^>Ks> см. уравн. 6), для внесения может быть использована
обогащенная микробной биомассой почва (например, предвари,
тельно проинкубированная с глюкозой).
МИКРООРГАНИЗМЫ, ПОТРЕБЛЯЮЩИЕ ВОДОРОД (МПВ)
В число микроорганизмов, использующих водород, входят
прокариоты (сульфатредукторы и метанобразующие бактерии), фото-
трофные про- и эукариоты (пурпурные, зеленые и цианобактерии,
водоросли), а также аэробные водородные бактерии,
представляющие разные таксоны. В автоморфных почвах основную работу
по потреблению водорода осуществляют водородные бактерии.
Реактивы: водород 100%.
Оборудование: газовый анализатор Нг (желательно
газохром 3101 или газовый хроматограф с детектором по
теплопроводности), анализатор С02 (см. с. 28), термостат.
Ход анализа. В стеклянные сывороточные флаконы
помещают 50—100 г свежей почвы, герметично закрывают резиновыми
пробками, вводят шприцем водород до конечной концентрации в
воздушной фазе от 100 до 200 нг/см3 (в зависимости от активности
почвы) и инкубируют при 25°. В начале инкубации и через 60—
120 мин отбирают пробы воздуха над почвой и определяют
концентрацию водорода. Скорость потребления водорода
рассчитывают по формуле (12). Газовый анализатор калибруют с помощью
газовой смеси с известной концентрацией водорода.
Нахождение пересчетного коэффициента и
расчет биомассы. Величину \i определяют по динамике v(t) при
длительном инкубировании почвы под водородом. Открытые
флаконы с почвой помещают в эксикатор с небольшим отверстием в
крышке, закрытым резиновой или силиконовой прокладкой.
Через прокладку в эксикатор вводят Нг до достижения объемной
доли 0,1—0,2%. Ежедневно в течение 4—5 сут флаконы изымают
из эксикатора для измерения скорости потребления водорода, а
затем возвращают в эксикатор, восстанавливая исходный
уровень Н2. Удельную скорость роста МПВ рассчитывают по кривой
динамики скорости потребления водорода. Экономический
коэффициент У оценивают по соотношению v(t) и по соотношению
скорости автотрофной фиксации С02 (усо2), которую рассчитывают
как разность ИД почвы в отсутствие и присутствии водорода.
Величина У при этом равна
Y=^oJv. (16)
Определение У проводят следующим образом: в одних и тех же
флаконах измеряют скорости потребления водорода и ИД почвы.
Затем водород удаляют путем проветривания флаконов и измеряют
ИД еще раз уже в отсутствие водорода. При этом время инкуба-
32
йй в обоих случаях должно быть одинаковым. Величину vcK рас-
считывают по разности между вторым и первым определениями.
Окончательный расчет биомассы МПВ осуществляют по уравне-
нию (И).
ФОТОТРОФНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
Способность использовать свет как источник энергии,
необходимой для роста, присуща пурпурным, зеленым, цианобактериям
и водорослям: Фототрофные пурпурные и зеленые бактерии
обитают в анаэробных зонах многих водоемов. На поверхности почвы
и других пород наибольшее распространение получили цианобак-
терии и зеленые водоросли. Углекислота, ассимилируемая в
процессе фотосинтеза, идет на построение биомассы клеток, поэтому
критерием роста фотосинтетиков может служить скорость
фотоассимиляции СОз (0ф).
Оборудование: анализатор С02 (см. с. 28), люминостат.
Ход анализа. Образцы почвы помещают тонким слоем в
прозрачные стеклянные флаконы и инкубируют в люминостате
(освещенность 10 клк) открытыми для непрерывного поступления
углекислоты при постоянной влажности и температуре. Убыль
влаги в почве ежедневно восполняют по массе. Скорость
фотоассимиляции СОг определяют следующим образом: флаконы
закрывают резиновыми пробками, затеняют экраном из фольги и
инкубируют в течение 1—2 ч, шприцем отбирают пробы воздуха,
определяют в них концентрацию С02 на газовом хроматографе и
рассчитывают интенсивность темнового дыхания (vT). Затем
непрозрачный экран снимают и продолжают измерять концентрацию
СОг в периодически отбираемых пробах воздуха, рассчитывая
скорость потребления (выделения) С02 на свету (асв).
Интенсивность фотоассимиляции СОг рассчитывают по разности
г/ф = ит—vCB. (17)
Если концентрация С02 на свету падает, то усв<0, величину v$
определяют соответственно по формуле
Ьф = Ут—(—УСв)=^т+|^св|. (18)
Если скорость фотоассимиляции С02 высока, то время инкубации
необходимо сократить.
Нахождение пересчетного коэффициента и
расчет биомассы. Удельную скорость роста фотосинтезирую-
Щих микроорганизмов оценивают по динамике 1>ф. Величина У
для фототрофов равна единице, поскольку по разнице темнового
и светового дыхания определяют не истинную, а кажущуюся
скорость фотоассимиляции за вычетом фотодыхания и прижизненных
выделений.
Таким образом, биомассу фототрофов перед 'началом
освещения почвы рассчитывают по формуле (14).
2 Зак. 42
33
НИТРИФИЦИРУЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
Автотрофные нитрифицирующие бактерии осуществляют
процесс превращения аммония:
NH4+-^N02--*N03-.
Помимо автотрофных в кислых почвах существуют гетеротрофные
яитрификаторы, которые окисляют аммоний в результате побочных
метаболических реакций. Гетеротрофные нитрификаторы требуют
для роста органические соединения. Поскольку при внесении в
почву одних минеральных веществ (HN4+) для них не может быть
даже короткого экспоненциального роста, то принцип
кинетического метода (определение лересчетного коэффициента) для
определения гетеротрофных нитрификаторов неприменим.
Дифференцировать вклад автотрофных и гетеротрофных нитрификаторов
можно с использованием специфического ингибитора нитрапири-
на, который подавляет рост автотрофных микроорганизмов.
Реактивы: (NH4)2S04, K2HP04, 10%-ный раствор NaOH,
0,05%-ный раствор K2S04, дисульфофеноловая кислота, реактив
Грисса (а-нафтиламин, 0,6%-ный раствор; сульфаниловая кислота,
0,6%-ный раствор), нитрапирин.
Приготовление дисульфофеноловой кислоты. В мерную колбу
на 100 мл помещают 3 г чистого фенола, приливают 20 мл конц.
H2S04 (пл. 1,84 г/см3), закрывают корковой пробкой с
вертикальной стеклянной трубкой длиной 50 см, служащей обратным
холодильником. Содержимое 'колбы хорошо перемешивают, после
чего колбу опускают в кипящую водяную баню и выдерживают в
течение 6 ч. Приготовленную дисульфофеноловую кислоту хранят
в посуде из темного стекла с притертой крышкой.
Приготовление сульфаниловой кислоты и а-нафтиламина. 6 г
сульфаниловой кислоты растворяют в дистиллированной горячей
воде (750 мл) и добавляют ледяную уксусную кислоту (250 мл).
1,2 г ia-нафтиламина растворяют в дистиллированной Н20,
прибавляют 50 мл ледяной уксусной кислоты и доводят до 200 мл
водой.
Оборудование: спектрофотометр или ФЭК, анализатор
С02 (с 28), термостат, центрифуга.
Ход анализа. В серию флаконов помещают почву, вносят
по 10 мг/г (NH4)2S04 и 3 мг/г К2НР04 как источник P и К, почву
тщательно перемешивают и инкубируют при постоянной
влажности 60% от полной влагоемкости в термостате при 25°.
Ежедневно определяют содержание в почве 'нитратов с дисульфофеноловой
кислотой и нитритов с реактивом Грисса.
Для определения концентрации нитратов и нитритов в почве
готовят вытяжку из расчета почва: раствор K2S04=1:5.
Суспензию интенсивно взбалтывают в течение 3 мин, затем фильтруют
или центрифугируют. Концентрацию нитратов определяют
следующим образом: 1 мл надосадочной жидкости выпаривают в
стеклянных пробирках в сушильном шкафу при 105°. К выпаривше-
34
осадку добавляют 1 мл дисульфофеноловой кислоты и доби-
МУ тсЯ полного растворения осадка. Через 5—10 мин кислоту ней-
ва й3уют 15 мл раствора NaOH до слабощелочной реакции сре-
ТР Содержимое пробирки количественно переносят в мерные кол-
* i на ЮО мл и доводят водой до метки. Полученный раствор
еКТрофотометрируют при 410 нм. Расчет осуществляют по
калибровочной шкале, полученной для стандартных растворов KN03.
Опр.деление концентрации нитритов включает несколько эта-
оВ- 1 мл почвенной вытяжки помещают в мерную колбу на 50 мл
П последовательно добавляют 40—45 мл дистиллированной Н20
и 1 мл сулЬфаниловой кислоты. Через 5 мин прибавляют 1 мл
свежеприготовленного раствора а-нафтиламина, смесь снова
перемешивают и доводят водой до метки. Полученный раствор спектро-
фотометрируют при 520 нм. Расчет осуществляют по
калибровочной шкале, полученной для стандартных растворов. Скорость
образования нитритов vNO- и нитратов t>NO_ рассчитывают по
2 3
приросту концентраций соответствующих соединений за известный
промежуток времени.
Параллельно ставят опыт для определения скорости
гетеротрофной нитрификации в почве. Для этого одновременно с
(NH4)2S04 и К2НРО4 в почву вносят ингибитор нитрапирин
(0,1 мг/г) и в динамике проводят те же определения. Скорость
автотрофного образования нитритов и нитратов рассчитывают по
разности.
Нахождение пересчетного коэффициента и
расчет биомассы. Удельную скорость роста нитрификаторов 1-й и
2-й фаз нитрификации jxi и \х2 рассчитывают, линеаризуя
экспериментальные точки в KOopRHuaTax'fln(vNcr + vNOJ)—tiiii"lnvNcr—
— t" соответственно, Y — по скорости автотрофной фиксации
С02 в ходе интенсивного окисления аммония. Для установления
стехиометрического коэффициента параллельно с определением
скоростей образования нитритов и нитратов измеряют ИД почвы
в контрольном (без аммония) и опытном образцах. При этом
величину Y рассчитывают по формуле
У:=^тЛюГ (19>
Стехиометрический коэффициент Y отвечает суммарной величине
выхода биомассы нитрификаторов:
Y=YX + Y2, (20)
гДе Уь У2 — выход биомассы нитрификаторов соответственно 1-й
и 2гй фаз. Исходя из термодинамических характеристик
процесса нитрификации, Fi = 3y2-
Окончательный расчет биомассы нитрификаторов х\ и х2
проводят по следующим формулам:
2*
35
где »NO_ и yNO_— скорости образования нитритов и нитратов со-
2 3
ответственно.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИНАМИКИ БИОМАССЫ ВНОСИМЫХ В ПОЧВУ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Чаще всего в качестве микробных препаратов, применяемых
для удобрения почв, используют диазотрофные микроорганизмы..
Кинетический метод может быть применим для определения
биомассы таких диазотрофов, как Azospirillum brasilense. Для этого
в почву вносят не один, а два субстрата — сукцинат и глюкозу.
В чистой культуре азоспирилл окисление сукцината протекает в
&а раз быстрее по сравнению с глюкозой. В контрольной почве
(без интродукции микробного препарата) соотношение скоростей
окисления сукцината и глюкозы kn иное (kn<ka)y это и позволяет
раздельно учесть биомассу азоспирилл (ха) и аборигенных
почвенных микроорганизмов (хп) по следующим формулам:
Ха t Хп — - , \ь*}
где vc и vr — величины ИД почвы, обогащенной соответственно
сукцинатом и глюкозой; jxnr и \х&с — удельные скорости роста
почвенных микроорганизмов и азоспирилл на глюкозе и сукцинате
соответственно; Упг и Уас — соответствующие стехиометрические
коэффициенты.
Реактивы: глюкозо-минеральная смесь (см. выше), сукци-
нат-минеральная смесь.
Оборудование: анализатор С02 (см. с. 28), термостат.
Ход анализа. Клетки бактерий Azospirillum brasilense
вносят по 1 мг в серию пенициллиновых флаконов с 2 г почвы и
инкубируют при 25° и влажности 60% от полной влагоемкости.
Для определения биомассы азоспирилл берут 4 флакона, в два из
них вносят глюкозо-минеральную смесь, в другие два — сукцинат-
минеральную смесь (до концентрации органических веществ
10 мг/г почвы), закрывают пробками и инкубируют при 25° в
течение 1 ч, измеряя ИД по приросту С02 в воздушной фазе (см.
выше). Параллельно измеряют ИД в контрольной почве (без
инокуляции азоспирилл) и в чистой культуре бактерий после
внесения глюкозы и сукцината в тех же количествах.
Нахождение пересчетных коэффициентов и
расчет биомассы. Удельную скорость роста собственно
почвенных микроорганизмов на глюкозе |шпг рассчитывают по динамике
окисления глюкозы почвой без внесения азоспирилл, jbiac — по
динамике ИД чистой культуры бактерий, обогащенной сукцинатом»
Величины стехиометрических коэффициентов принимают равными
36
или определяют в чистых культурах азоспирилл и по
еДИвнению материального баланса роста в процессе разложения
^юкозы в почве. Биомассу азоспирилл рассчитывают по
приведенной выше формуле.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
И РАСЧЕТ ФИЗИЧЕСКОЙ МАССЫ КЛЕТОЧНОГО ВЕЩЕСТВА
Описанные выше кинетические методы предполагают строго
пропорциональную взаимосвязь между скоростью превращения
субстрата v и ростом микробной биомассы х. Это значит, что обе
переменные v и х должны возрастать в динамике по простому
экспоненциальному закону сразу 'после внесения избытка
субстрата. Однако известно, что часто после переноса на богатую
питательную среду микроорганизмы обнаруживают лаг-фазу. Она
обусловлена адаптацией микроорганизмов к повышенным
концентрациям питательных веществ и тем продолжительней, чем в менее
активном физиологическом состоянии пребывали микробные
клетки до момента субстратного обогащения. Оценивают
физиологическое состояние микроорганизмов с помощью переменной JR,
которая обозначает долю функционально активных соединений клетки
(РНК, белки и пр.). В совокупности процессы роста, потребления
субстрата и физиологической адаптации микроорганизмов могут
быть описаны следующей системой уравнений:
s=—qx9 q=RQS/(Ks+s),
x=Yqx, (23)
R=aYq(l—R),
где Y — выход биомассы на единицу потребленного субстрата;
q — удельная скорость потребления субстрата; а — константа,
R — переменная физиологического состояния.
При поддержании условий среды постоянными и внесении
избытка субстрата (т. е. когда s^>Ks) скорость процесса возрастает
во времени экспоненциально, а биомасса — по более сложному
закону:
х=х{0) [IR(0) (е^— I)]1/*, (24)
где х(0) и R(0) —величины х и R в момент субстратного
обогащения почвы £(0). С учетом физиологического состояния
микроорганизмов их биомассу в почве до обогащения находят по
формуле, которая следует из (23):
*(0) = -!№-. (25)
1 ' \iR (0) v '
Находят R(0) по форме кривой динамики количества
микроорганизмов после внесения в почву избытка субстрата,
аппроксимируя экспериментальные точки уравнением (24). Учет
микроорганизмов для определения (х') осуществляют любым доступным
неидеальным методом (в частности, посевом на питательные
среды), достаточно, чтобы систематическая ошибка этого метода бы*
ла постоянна, т. е. x'=k*xy где х — истинная биомасса, х' —
условная мера количества микроорганизмов, a k — константа.
Ход анализа (на примере микроорганизмов, использующих
глюкозу). В почву вносят глюкозо-минеральную смеешь и
инкубируют при постоянных гидротермических условиях, как описано
выше в разделе «Микроорганизмы, использующие глюкозу». В
динамике определяют ИД по скорости выделения ССЬ и остаточное
количество глюкозы, а также численность бактерий на МПА.
Частота отбора проб 1—2 ч, продолжительность всего опыта
10—24 ч в зависимости от исходного физиологического состояния
сообщества микроорганизмов данной почвы.
Расчет биомассы и переменной
физиологического состояния. Величину R(0) находят по кривой
динамики численности бактерий на МПА. Для этого экспериментальные
точки аппроксимируют уравнением (24), подбирая на ЭВМ те
численные значения параметров /?(0), \л и а, которые минимизируют
ошибку имитации. Могут быть использованы любые доступные
программы нелинейной регрессии, вполне удовлетворительные
результаты получаются при использовании метода случайного
поиска со скольжением.
По кривой динамики ИД рассчитывают величины jut и v(0),
а (по соотношению ИД и скорости потребления глюкозы — У.
Подстановка полученных величин в формулу (25) позволяет
рассчитать биомассу микроорганизмов в единицах физической массы.
Начальное значение R служит усредненной характеристикой
физиологического состояния микроорганизмов данной
функциональной группы in situ.
Заметим, что во всех предыдущих примерах, когда переменная
R не учитывается, результаты определения получаются в
единицах «активной биомассы», которая меньше физической массы
живого вещества в 1/R (0) раз.
Метод определения грибной биомассы по содержанию хитина
в субстрате
Этот метод имеет ограниченное применение, так как хитин
содержится не только в мицелии грибов, но и в тканях многих
беспозвоночных животных. Поэтому биомассу грибов по хитину
можно определять только там, где грибы изолированы от других
образующих хитин организмов.
Берут 100 мг испытуемого материала, гидролизуют 5 мл 6 н.
НС1 в запаянных ампулах при 80° 16 ч. До запаивания материал
выдерживают в кислоте при комнатной температуре 3 ч.
Полученный гидролизат фильтруют, выдерживают при 75° и сухой
остаток растворяют в дистиллированной воде. Раствор наносят на
колонку ионообменной "смолы Дауэкс-50 и 'Промывают водой и 2 н.
НС1, нейтрализуют NaOH и конденсируют с ацетил ацетоном на
38
ой бане при 89—92° 45 мин. Затем добавляют реактив
о0<Д иха следующего состава: парадиметиламинобензальдегид —
1 Л 96%-ный этанол — 95 мл, НО концентрированная — 20 мл.
п результате образуется розовый раствор. Интенсивность свето-
глощения раствора определяют на спектрофотометре при 530 нм
П°сравнивают со стандартной кривой, построенной в пределах от
8 до 28 мкг гексозамина. Пересчет производят по формуле
е ц7 —биомасса мицелия на единицу материала;
G—содержание х люкозамина, установленное опытным путем в испытуемом
материале; F — содержание его в мицелии. Содержание глюкозо-
амина в грибном мицелии обычно 2,5 мкг/мг сухой массы мицелия,
т.' е. 0,25%, но поскольку содержание хитина колеблется у
разных видов грибов и, возможно, в зависимости от стадии развития,
то метод неточный.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МИКРОБНЫХ АССОЦИАЦИЙ И ВЗАИМООТНОШЕНИЙ
МЕЖДУ РАЗНЫМИ ГРУППАМИ ОРГАНИЗМОВ НЕПОСРЕДСТВЕННО
В ПОЧВЕ
Методы прямого микроскопического подсчета не дают
возможности составить представление о естественном распределении
микробов, об ассоциациях почвенных микроорганизмов в
естественных условиях. При использовании этих методов почвенные
микробы оказываются перемешанными в процессе приготовления
почвенной суспензии. Существуют специальные методы, которые
позволяют судить о естественном распределении микроорганизмов в
почве.
Метод стекол обрастания Холодного
Метод Холодного и его модификация широко применяются в
почвенной микробиологии. С их помощью были получены
интересные данные о почвенных микробных ассоциациях, открыты
новые формы микроорганизмов, изучены микроорганизмы разных
почв и т. д. В почву вносятся предметные стекла, поверхность
которых вскоре покрывается почвенными коллоидами, где
микроорганизмы развиваются в условиях, близких к естественным.
Поверхность стекла, конечно, не может (полностью имитировать
поверхность почвенных частиц, на которых в действительности
развиваются почвенные микроорганизмы. В связи с этим неоднократно
Делали попытки заменить стекло другими материалами
(нейлоновая ткань, полиэтилен), но пока это не получило большого
распространения.
Перед закладкой в почву предметные стекла тщательно
очищают, выдерживая их в концентрированной серной кислоте, и
отмывают в 1%-ном растворе соды и в дистиллированной воде. На
поверхности почвы делают разрез ножом и в него вертикально
вставляют ^предметное стекло. Необходимо по возможности сохра-
39
нить естественное сложение почвы и, зарывая стекло, стремиться
создать такую же плотность почвы, какая была до постановку
опыта. Стекла закапывают так, чтобы их верхний край был не
ближе, чем «а 1—3 см от поверхности почвы. Всегда ставят
несколько параллельных стекол. Места нахождения стекол
отмечают. В почве стекла экспонируют месяц и более.
По истечении срока экспозиции стекла извлекают так, чтобы
не повредить микробные ассоциации на той стороне стекла, ко-
торая будет подвергаться микроскопированию. Нельзя допускать
скользящего движения стекла по почве, так как при этом
развившиеся на стекле микроорганизмы могут счищаться. Нижнюю
сторону стекла тщательно протирают, а верхнюю подсушивают на
воздухе, фиксируя на пламени горелки или в парах осмия, и
помещают в стакан с водой, чтобы отделить от стекла крупные
почвенные частицы, которые мешали бы дальнейшему исследованию.
После промывки препарат красят карболовым эритрозином (см.
метод Виноградского) и просматривают под микроскопом.
Из вариантов метода Холодного наибольшее распространение
получила модификация А. В. Рыбалкиной и Е. В. Кононенко.
В этом случае перед закладыванием стекол в почву на их
поверхность наносят тонкий слой крахмало-аммиачного агара.
Микроорганизмы развиваются быстрее и лучше, но внесенное на стекло
органическое вещество создает специфические условия для
развития микроорганизмов.
Хорошие результаты получаются при изучении стекол
обрастания при помощи люминесцентной микроскопии. Стекла
окрашиваются водным раствором акридина оранжевого (1 : 10 000). Клетки
микробов в этом случае по сравнению с окрашиванием
эритрозином видны более четко, кроме того, видны клетки, расположенные
на (поверхности почвенных частиц, прилипших к стеклу.
Капиллярный метод Перфильева (педоскопы)
Б. В. Перфильев и Д. Р. Габе сконструировали специальный
капиллярный прибор — педоскоп, который служит для изучения
почвенных микроорганизмов и их ассоциаций. При использовании
этого прибора удается наблюдать ряд микробов, которые
другими методами не выявляются. Это вызвано тем, что условия
развития микроорганизмов в педоскопе, вставленном в почву, близки
к условиям развития микроорганизмов в самой почве: и в том и
в другом случае развитие идет в капиллярах, микробы растут,
прикрепляясь к их стенкам. Педоскоп (рис. 5) состоит из набора
5-ходовьгх капиллярных ячеек с тонкой кровлей, вставленных в
стеклянную обойму. Каналы капилляров имеют ширину 0,65—
1,0 мм и высоту 0,2—0,3 мм. В них и происходит развитие
микробов.
Для работы используют педоскопы, простерилизованные
сухим жаром. В рыхлую почву педоскопы вставляют без каких-либо
дополнительных приспособлений под небольшим нажимом, в уп-
40
Рис. 5. Капиллярный педоскоп:
У4 — общий вид капиллярных педоскопов разных вариантов; 1,2 — вариант с
капиллярными ячейками, каналы которых ориентированы перпендикулярно оси
держателя; 3 — вариант с продольно расположенными каналами капиллярных
ячеек; Б — капиллярные ячейки и держатель в разрезе; 4, 5 — капиллярные
ячейки первого варианта; 6 — держатель в разрезе с капиллярными ячейками
первого варианта; 7 — капиллярный педоскоп с продольно ориентированными
ячейками в поперечном разрезе
лотненную почву — при помощи специального пробойника (рис.6).
Помещать педоскопы в почву следует так, чтобы каналы ячеек
приняли вертикальное положение, т. е. положение по
преобладающему направлению движения почвенного раствора.
После экспозиции в течение месяца или более длительного
срока педоскопы извлекают из почвы. Их поверхность тщательна
протирают и затем микроорганизмы, развившиеся в каналах
капилляров, рассматривают или в живом состоянии, или после
фиксации и окрашивания.
При просмотре содержимого капилляров в живом состоянии
педоскопы, извлеченные из почвы, помещают на специальный
столик (рис. 6, Л), который предохраняет каналы капилляров от
высыхания. Можно ходы каналов просто замазать парафином или
пластилином. В случае рассмотрения фиксированных препаратов
микроорганизмы в извлеченных из почвы педоскопах фиксируют
в парах осмиевой кислоты, для чего педоскопические ячейки
помещают в чашку Петри, содержащую несколько капель 2%-ной
осмиевой кислоты. Препараты после фиксации выдерживают 30 мин
на воздухе и затем окрашивают эритрозином. Канадским
бальзамом ячейки укрепляют на специальной тонкой пластине
(толщина 0,3—0,2 мм), заменяющей предметное стекло, и пластину
вставляют в специальный держатель (рис. 6,5), который помещают на
крестообразный столик микроскопа. Во время микроскопирования
необходимо ввести иммерсионное масло в каналы капилляров, им-
мергировать конденсор и объектив.
41
Рис. 6. Металлический пробойник (/) для закладки капиллярных педоскопов в
почву:
а — общий вид; б — в поперечном разрезе.
Приспособление для микроскопирования препаратов (//):
А — столик для просмотра педоскопов с живым материалом (1 — нижняя
пластинка столика; 2 — стеклянный брусок, укрепленный металлическими
бортиками; 3, 4 — съемный стеклянный брусок, прижимаемый к педоскопу 6
пружиной 5); Б —- металлическая рамка для тонких предметных стекол для
микроскопирования капиллярных ячеек с иммерсионным объективом
Модификация капиллярного метода по Лристовской
Т. В. Аристовская (1965) рекомендует использовать метод
Перфильева в следующей модификации. Стенки капилляров перед
закладкой педоскопов в почву покрываются определенными
фракциями гуминовых веществ. Это дает возможность приблизить
условия развития микробов в педоскопах к почвенным условиям,
при этом выявляются новые специфические для почвы
микроорганизмы.
Для работы с почвами подзолистой зоны можно применять ор-
ганоминеральные комплексы, полученные из аккумулятивного
горизонта торфяно-подзолистой почвы или из гумусово-иллювиально-
го горизонта подзола: 50 г почвы заливают 1 л 0,1 н. NaOH, a
через 18—20 ч почву отфильтровывают и, добавляя 0,2 н. НС1,
доводят рН фильтрата до 5,0. После этого в него по каплям
прибавляют 20%-ный раствор FeCl3 до шлного выпадения гумусовых
шеств в форме органоминерального геля. Полученный гель от
лильтровывают и отмывают от солей (проба на С1~ с 1%-ныь
д^ЧОз)- Примерно 5 мл геля растирают в ступке, взбалтывают i
1 л воды, добавляют 0,1%-ный раствор агара и стерилизуют. Пр]
исследовании других типов почв следует извлекать интересующук
исследователя фракцию гуминовых веществ, применяя разрабо
тайные для этих почв химические методы.
Гумусовые вещества с 0,1%-ным раствором агара выливают i
стерильную чашку Петри и педоскопы боковой стороной погружа
Ют в них* Среда должна заполнить все капилляры. Затем педоско
пы вынимают, обтирают их поверхность и помещают в стерильньк
чашки Петри, где среда подсыхает и равномерно покрывает стеню
каналов и капилляров. В каналах не должно образовываться пе
ремычек. Часть среды можно оттянуть из каналов при помощ]
стерильной фильтровальной бумаги. Подсушенные капиллярь
вставляют в почву.
Люминесцентно-микроскопическое изучение микроорганизмов
почвы на почвенных монолитах по Звягинцеву
Использование люминесцентной микроскопии в падающем све
те дает возможность изучать прижизненно окрашенные почвенньг
микроорганизмы непосредственно на поверхности почвенных моно
литов, агрегатов, структурных отдельностей, корней и т. д
Во многих отношениях метод дает возможность наиболее близю
подойти к рассмотрению микроорганизмов и их ассоциаций в есте
ственных условиях.
Приготовляют формочку из
нержавеющей стали, пластмассы
или стекла. Формочка должна
иметь острые края (рис. 7).
Расчищают поверхность почвы и
вдавливают в нее формочку.
Формочку можно вдавливать и в
любой горизонт почвы,
используя для этого обычный
почвенный разрез. Расчищают почву,
находящуюся по бокам от
формочки, и осторожно вынимают
ее так, чтобы над краями
формочки возвышался слой почвы.
Затем острой бритвой срезают
лишнюю почву. При этом
верхняя грань монолита должна
оказаться на уровне краев формоч- i 2
ки. На поверхность почвы
помещают каплю раствора акридина ? Формочка с монолитом по
оранжевого и накрывают ее вы по Звягинцеву:
очень тонким покровным стек- l — без растения; 2 •— с растенш
4
лом (0,10—0,12 мм). Через 10—20 мин формочку помещают на
предметный столик люминесцентного микроскопа и
рассматривают почву, применяя иммерсионный объектив. Так как свет пода-
ется через объектив, величина монолита принципиального
значения не имеет — он может быть большим. Можно рассматривать
монолит и без покровного стекла при малых увеличениях.
Микроорганизмы на хорошо приготовленных препаратах видны и в
этом случае. Часто полезно рассмотреть не срез, а естественный
излом монолита или грань структурной отдельности, а также
срезы через почвенные агрегаты.
Большое значение имела бы разработка метода импрегнирова-
ния (пропитывания) монолита полимером с целью приготовления
шлифов или срезов и рассмотрения в люминесцентный микроскоп
микроорганизмов на этих срезах. Пока такой метод не
разработан. Одна из трудностей состоит в наличии собственной
люминесценции у большинства полимеров.
При помощи описываемого метода удается рассмотреть и
микрофлору ризосферы. Вынимают корень растения из почвы
(толщина корня не имеет значения), окрашивают его акридином
оранжевым и помещают на столик микроскопа. Удается хорошо видеть
клетки, прикрепившиеся к 'поверхности корня, корневых волосков
и частиц почвы, приставших к корню. При окрашивании
акридином клетки корня обладают зеленым свечением, как и
микроорганизмы, однако они имеют другой оттенок зеленого свечения и
хорошо видны на фоне клеток корня и корневых волосков. Можно
поместить монолит почвы с проходящими через него корнями в
формочку (рис. 7), сделать срез, который пересекал бы корень,
и рассматривать микрофлору ризосферы.
В лабораторных условиях микрофлору корней изучают
следующим образом. Берут небольшой стеклянный цилиндр, дно которого
делают съемным. Под него подстилают одно или несколько
покровных стекол. В сосуд насыпают почву и высевают семена
какого-либо растения (рис. 7). Корни стелются по стеклу. Дно
снимают, под покровное стекло сбоку подают краситель, сосуд вверх
дном помещают под микроскоп и изучают микрофлору. Опыт
можно вести в динамике.
Основные трудности при использовании этого метода состоят в
необходимости тщательного подбора оптимальной концентрации
красителя. Для каждой почвы эту концентрацию приходится
устанавливать опытным путем. Для получения более четкой картины
можно пользоваться тушителями, которые уменьшают свечение
лочвенных частиц и выявляют свечение клеток микроорганизмов.
Методы для выделения грибов, развивающихся на различных
субстратах в почве
Для определения этих групп грибов в почве обычно применяют
так называемый метод «приманок», в качестве которых помещают
в почву специфические питательные субстраты, используемые
определенными трофическими группами грибов. Этот метод широко
44
пространен в фитопатологии, а для почвенных грибов при вы-
РаС цИИ грибов, разлагающих целлюлозу, хитин и кератин. В по-
явЛ ние годы его применяют не только для выявления грибов —
^азрушителей естественных субстратов, но и для выделения
гримов-- биодеструкторов промышленных материалов. Метод
приманок используется <как в полевых, так и в лабораторных условиях.
МЕТОД ПРИМАНОК ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОРАЗРУШАЮЩИХ
ГРИБОВ ИЗ ПОЧВ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ
Почву увлажняют до пастообразного состояния (60% от
полной влагоемкости) в чашках Петри. С помощью слегка
увлажненного шпателя поверхность (почвы в чашках Петри выравнивают до
получения блестящей гладкой поверхности. На поверхность почвы
помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги или
наносят тонкий слой порошковидной карбоксиметилцеллюлозы,
природных субстратов с высоким содержанием целлюлозы
(измельченную солому злаков, древесные опилки). Необходимо следить,
чтобы субстрат плотно прилегал к почве и был увлажнен.
Почвенные пластинки 'Помещают во влажную камеру и инкубируют в
термостате при 26° в течение нескольких недель. Появление грибного
мицелия на фильтровальной бумаге, как правило, происходит
после недельной инкубации почвы, образование спороношений —
на 2—4-ю неделю. Выделение грибов осуществляют
непосредственно с почвенной пластинки на питательные среды Гетчинсона,
Чапека, сусло-агар (мицелий и споры берут препаровальной
иглой под контролем бинокулярного микроскопа).
МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОРАЗЛАГАЮЩИХ ГРИБОВ В ПОЛЕВЫХ
УСЛОВИЯХ С ПОСЛЕДУЮЩИМ ВЫЯВЛЕНИЕМ ИХ СОСТАВА
Для выделения целлюлозолитических грибов в почву помещают
стерильную фильтровальную бумагу или отмытый целлофан. По
мере зарастания «приманок» мицелием их вынимают из почвы,
просматривают и отсевают выросшие грибы. Причиной сложности
идентификации грибов, выявленных таким способом, являются
преимущественное развитие вегетативного мицелия и скудное споро-
ношение. В целях более полной оценки грибной деструкции
целлюлозы, особенно в полевых условиях, О. Е. Марфениной был
предложен способ заселения целлюлозы с последующей
«проявкой». Стерильные куски фильтровальной, крафтовой бумаги или
целлофана размером 5x5 см закрепляли в диапозитивных
рамках для проектора и помещали вертикально в соответствующий
горизонт исследуемого почвенного профиля. Повторность для
каждого варианта не менее трех раз. После экспозиции, время
которой определяется предварительно экспериментальным путем
(например, для фильтровальной бумаги в верхнем горизонте
почвы 7—10 дней), куски целлюлозы извлекают из почвы, очищают
и помещают на твердую питательную среду с бактериальным ин-
45
гибитором (например, молочной кислотой, 4 мл/л среды), а затем
' на неделю в термостат. Целесообразно использовать минеральную
среду Гетчинсона без добавок органического вещества.
Экспозиция на питательной среде и выдерживание в термостате kslk бы
«проявляют» пластинки целлюлозы, заселенные
микроскопическими грибами непосредственно в ненарушенных почвах, так как
стимулируют развитие спороношений у грибов и дают
возможность их родовой идентификации.
Пластинку микроскопируют целиком, оценивая заселенность
отдельными грибами от общей площади пластинки и частоту их
встречаемости на нескольких (5—10) пластинках в каждом
варианте. Затем при визуальном микроскопическом контроле грибы
выделяют стерильной иглой в чистую культуру для видовой
идентификации. При использовании этого метода наряду с обычными
целлюлозоразлагающими удается выделить значительно большее
разнообразие грибов, особенно медленно растущих темноокрашен-
ных форм, обычно ллохо выделяющихся на твердые питательные
среды.
Этим методом при последовательном извлечении пластинок
может быть охарактеризована и сукцессия грибов в процессе
разложения целлюлозы.
ВЫДЕЛЕНИЕ ФИТОПАТОГЕННЫХ ГРИБОВ МЕТОДОМ ПРИМАНОК
Для выделения фитапатогенных грибов, которые в почве ведут
сапротрофный образ жизни, используют различные приманки
растительного происхождения. В стерильные чашки Петри или
стеклянные стаканчики кладут по 10 г исследуемой почвы, заливают
стерильной водой (в ряде случаев увлажняют до 60% от полной
влагоемкости), помещают приманки и ставят в термостат для
инкубации. Через 2—3 сут приманки начинают просматривать под
бинокулярным микроскопом и -появившиеся грибы отсевают на
агаризованные среды. Как правило, применяют .среды, в состав
которых входят отвары естественных субстратов, например
овсяный и картофельный, кукурузная мука и др. При выявлении
видов Fusarium хорошими приманками служат стерильные кусочки
клубней картофеля, Verticillium — отрезки стеблей и черенков
листьев шелковицы, ивы, томатов, Pythium — семена конопли,
Phytophthora — яблоки, ягоды земляники. Для подавления роста
сапротрофных грибов на приманках в почву можно вносить
фунгицид, так, беномил добавляют при обнаружении Phytophthora.
Приманочный метод используют также и в полевых условиях для
оценки степени зараженности фитопатогенными грибами почвы.
ВЫДЕЛЕНИЕ ХИТИНРАЗЛАГАЮЩИХ ГРИБОВ МЕТОДОМ ПРИМАНОК
Для выделения грибов, разлагающих хитин, используют
препараты хитина. Описано приготовление такого препарата из
покровных тканей, например крабов и каракатицы. Предварительно
ни декальцинируют в 10%-ной НС1. Полученный хитино-про-
Теиновый комплекс гидролизуют 6 ч 10%-ной NaOH при 105° в
автоклаве. Хитозан удаляют 5%-ной НС1. Полученный хитин в
виде пленки толщиной 0,25 мм разрезают на квадраты 0,5x0,5 см,
приклеивают на покровное стекло и помещают в почву. Через
определенное экспериментальное время инкубации учитывают грибы,
развившиеся на хитине.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КЕРАТИНОФИЛЬНЫХ ГРИБОВ МЕТОДОМ ПРИМАНОК
Кератины — специфические серосодержащие белки,
характеризующиеся высокой устойчивостью к различным биологическим и
химическим воздействиям. В почву кератины могут попадать с
покровных тканей животных (эпидермиса кожи, роговых
образований, перьев, шерсти). Ряд грибов может разлагать кератины,
причем одни виды используют кератин мертвых тканей, другие
способны развиваться и на живых тканях, вызывая заболевания —
дерматомикозы. Поэтому выявление качественного состава и
уровня развития этих грибов может быть важным в специфических
экологических ситуациях — почвах животноводческих угодий, на
территориях переработки кератинсодержащих соединений и т.д.
Образцы точв (20—100 г) в нескольких повторностях
отбирают на исследуемом участке и помещают в чашки Петри,
увлажняя почву стерильной водой. На поверхность почвы наносят
стерилизованные волосы (в виде кусочков по 4—7 мм) или другие
приманки — роговые вещества, шерсть животных и т.д. Чашки
термостатируют в темноте при 20—25° в течение 1—6 недель.
Контроль осуществляют микроскопически при малых увеличениях
(20X10). При появлении мицелия на приманках их извлекают из
почвы и -переносят на среду Сабуро (на 1 л дистиллированной
воды: пептона 16 г, глюкозы 20, глицерина 5, агара 12,5 г),
содержащую циклогексимид (0,5 г/л) и хлорамфеникол (0,05 г/л).
Затем мицелий, выросший вокруг приманок, пересевают на свежие
косяки со средой Сабуро. Как характеристика плотности в почвах
отдельных видов кератинофильных грибов учитывается процент
приманок, заросших определенными грибами.
При работе с кератинофильными грибами следует соблюдать
особую осторожность, так как наряду с са'протрофными возможно
выделение патогенных дерматофитов.
Методы изучения микробных сообществ, ассоциированных
с сапротрофными почвенными беспозвоночными животными
СОСТАВ САПРОТРОФНОГО КОМПЛЕКСА ПОЧВЕННЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
ЖИВОТНЫХ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИХ ЛАБОРАТОРНОГО
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
К экофизиологической группе почвенных сапротрофов
относятся беспозвоночные, кормовой базой которых являются мертвые
ткани растений и животных. Это обитающие в подстилке, разла-
гающейся древесине, навозе или почве представители мезофауны*
дождевые черви, энхитреиды, диплоподы, мокрицы, личинки дву^
крылых насекомых, жуки-ксилофаги, термиты; среди
представителей микрофауны — панцирные клещи.
Наблюдение за особенностями питания и ростом почвенных
беспозвоночных и различные экспериментальные исследования по
организации зоомикробных комплексов (ЗМК) требуют
культивирования животных в лабораторных условиях. Достаточно хорошо
разработаны методы содержания в культуре большинства
почвенных сапротрофов (Количественные методы в почвенной зоологии,
1987). В настоящем разделе укажем лишь те из них, которые
необходимо учитывать микробиологу, изучающему зоомикробные
взаимоотношения.
Мокриц и диплопод можно содержать большими
группами в стеклянных сосудах (эксикаторах) с почвой или песком на
дне и листовым опадом сверху, взятыми из тех местообитаний, где
были собраны животные. Как диплоподы, так и мокрицы хуже
переносят избыток влаги, чем ее недостаток, поэтому необходимо
следить за тем, чтобы на опаде не было 'капельной влаги.
Увлажняют субстрат следующим образом. Предварительно высушенный
до воздушно-сухого состояния или свежий опад заливают горячей
водой, воду сливают, а листья раскладывают равномерно по
поверхности фильтровальной бумаги, заворачивают последнюю в
полиэтилен и оставляют на сутки. Затем о)пад извлекают, промаки-
вают от капельно-жидкой влаги и помещают в эксикатор. На
поверхность опада накладывают кружок влажной фильтровальной
бумаги. Возможны два варианта состояния исходного субстрата:
простерилизованный и нестерильный опад. Для изучения
динамики «нормальной» микрофлоры в опаде и влияния на нее пищевой
активности животных целесообразно использовать свежий
нестерильный опад (в случае необходимости лишь доувлажнить его).
Для решения более «тонких» задач, связанных с особенностями
потребления физиологически активных микробных * клеток
беспозвоночными, влиянием состава микроорганизмов опада на
физиологическое состояние животного, на состав микробного
сообщества его кишечника и экскрементов, необходимо иметь исходно
стерильный опад.
Стерилизуют субстрат порциями по 5—10 г в автоклаве при
1 атм трижды, предварительно высушив и размолов опад на
мельнице. Недостатком этого способа, однако, является то, что в
процессе стерилизации происходит высвобождение легкодоступных
компонентов из субстрата. Если затем внести в такой субстрат
микробную биомассу, последняя может неестественно возрасти,
сневилировав тем самым различия, заданные уровнем внесения.
Стерилизация в воде позволяет избежать обогащения опада лег-
кометаболизируемыми органическими веществами, но при этом
вымываются минеральные компоненты подстилки. Наиболее
совершенен метод у-стерилизации в кобальтовой пушке (60Со,
2—3-Ю4 Дж/кг). Этот режим полностью убивает микроорганизмы,.
но не влияет на активность свободных ферментов. Для решения
задач, в которых необходимо иметь субстрат, свободный и от
живой и от мертвой биомассы микроорганизмов, а также не
содержащий ферментов, используют такие «заменители» пищи, как
фильтровальную бумагу, кристаллическую или карбоксиметилцел-
люлозу, хитин и другие полимерные соединения. Их также
предварительно стерилизуют.
Необходимо отметить, что длительное содержание в
лаборатории при постоянной комнатной температуре (18—22°) приводит
к заметному снижению лтищевой активности животных. Особенно
это касается диплопод, у которых уже через 6—7 недель, а иногда
и через месяц происходят изменение структуры сообщества
микроорганизмов кишечника и полная смена доминирующих форм,
приводящие к разрушению перитрофической мембраны, нарушению
пищеварительных функций и в конечном итоге к гибели
животных. Возбудителями «заболевания» часто могут выступать
бациллы, стрептомицеты или дрожжи, появляющиеся в разные периоды
культивирования диплопод. При количественных определениях
показателей пищевой активности животных, а также состава и
организации микробного сообщества кишечника и экскрементов
рекомендуется использовать животных, содержавшихся в лаборатории
не более двух недель. Менее чувствительны к постоянной
температуре молодые особи. Для поддержания трофической активности
животных на уровне, необходимом для нормального роста и
развития, предлагается имитировать суточные и сезонные колебания
температуры, характерные для тех местообитаний, где были
собраны животные. При содержании в лаборатории в зимний период
для активизации трофической деятельности животных можно
помещать на 1,5—-2 мес в холодильник, а затем содержать снова
при комнатной температуре (Стриганова, 1987).
Причиной заражения культуры животных патогенными
микроорганизмами может быть и несоблюдение условий влажности в
эксперименте. При этом опад зарастает грибами, в норме не
дающими такой обильной биомассы. Среди последних встречаются
токсинообразователи, потребление которых животными может
вызвать нарушение гомеостаза микробного сообщества кишечника.
Мокриц рекомендуется содержать при 18—22°. Относительно
устойчивости этих животных к микробному поражению
практически нет прямых данных. Показано лишь, что численность
микроорганизмов в их кишечнике сохраняется на довольно постоянном
уровне в течение 50 дней содержания в лаборатории. Замечено
также, что мокрицы могут длительное время (до года и более)
существовать в культуре и успешно размножаться. Таким
образом, мокрицы долго сохраняют равновесие с микробным
компонентом и являются поэтому удобным объектом для зоомикробиологи-
ческих исследований.
Дождевые черви и личинки насекомых являются
наиболее трудным объектом для лабораторного содержания. Из
дождевых червей легко поддерживается и размножается в куль-
туре лишь компостный червь Eisenia foetida, а из насекомых —
.личинки типулид и бибионид.
Энхитреиды содержатся в лабораторных условиях на
гомогенизированном грубом гумусе елового леса. Оптимальная
температура для содержания—17—18°. Влажность субстрата — 50—
90% от полной влагоемкости. Периодическое увлажнение проводят
дважды в неделю (Стриганова, 1987).
Микробиологические аспекты культивирования дождевых
червей, личинок двукрылых и энхитреид, по-видимому, близки к
таковым для диплопод, однако детальных исследований на эту тему
не проводилось.
Классическим объектом изучения зоомикробных
взаимоотношений являются термиты. Отличительной особенностью термитов
является то, что они практически не поддерживаются в культуре,
что связано, по-видимому, со сложной общественной
организацией, реализующейся в термитниках в естественных условиях и не
поддающейся моделированию. Поэтому все эксперименты проводят
со вновь отобранными животными.
Панцирные клещи (орибатиды) хорошо
поддерживаются и размножаются в лабораторной культуре. Их разводят
группами до 1000 экз. в бюксах с гипсовым слоем (Стриганова,
1987). Пищей орибатидам служат гнилая древесина, опад, кора,
ломтики картофеля; можно добавлять к этим субстратам
культуры грибов. Однако в последнем случае необходим строгий
контроль на токсинообразующую активность, так как инокуляция
субстрата грибами, продуцирующими токсины, может погубить
культуру орибатид. Во избежание естественного заражения субстрата
нежелательными микроорганизмами (которое может легко
произойти вследствие нестерильное™ условий культивирования)
требуется регулярная смена пищи с интервалом 2—3 дня.
Профилактической мерой против заражения являются также регулярное
проветривание сосудов и дренаж, обеспечивающийся наличием
гипсового слоя. Оптимальная температура определяется
эмпирически в соответствии с режимом тех почв, из которых выделялись
орибатиды.
Таким образом, с точки зрения микробиолога проблема
лабораторного культивирования сапротрофных почвенных животных
имеет целый ряд важных аспектов, перечень которых далеко не
полон. В каждом конкретном случае детальное изучение явлений
микробиологического характера, препятствующих поддержанию
животных в культуре, должно лежать в основе исследований
зоомикробных взаимоотношений.
ОБЪЕКТЫ И ВОЗМОЖНЫЕ СХЕМЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
Объектами микробиологического анализа при изучении
зоомикробных взаимоотношений являются: 1) пищевой субстрат
беспозвоночных (листовой или хвойный опад, компост, почва и др.);
яо
о) содержимое кишечника животных; 3) поверхность кишечного
эпителия; 4) специализированные органы и ткани (мицетомы, ми-
цетоциты', бродильные камеры, мальпигиевы сосуды, гепатопанкре-
атичеокие железы, клетки эпителия); 5) экскременты (свежие и
разлагающиеся в толще опада); 6) поверхность тела и
конечностей животных.
В зависимости от задачи схема микробиологического анализа
может меняться от изучения одного из указанных объектов до
подробного описания состава и организации микробных сообществ,
ассоциированных со всеми объектами, в сочетании образующими
зоомикробный комплекс (ЗМК). Понятие ЗМК, с одной стороны,
носит оттенок некоторой условности и неоднозначности, так как
исследователь искусственно ограничивает рамки изучаемых
объектов для более полного и вместе с тем реального одновременного
охвата всей «картины» зоомикробного взаимодействия. При этом
выбранный ЗМК изолируется от всей остальной почвенной биоты и
создаются условия микрокосма. В таком микрокосме возможно
поддерживать строго контролируемые условия, несоблюдение
которых не позволяет получать воспроизводимые результаты. С
другой стороны, представление о ЗМК отражает практически все
возможные аспекты зоомикробных взаимоотношений.
Наиболее распространенной является схема, по которой
одновременно изучаются микроорганизмы пищи, кишечника (включая
его содержимое) и экскрементов животных. В том случае, когда
ставится задача проследить влияние животных на микробную
систему почвы, в микрокосм добавляют почвенный слой и он также
подвергается микробиологическому анализу. Иногда
целесообразно редуцировать полную схему, вычленив из нее системы:
содержимое кишечника — кишечный эпителий; лища— кишечник;
пища — экскременты — почва; экскременты — почва. Такое
упрощение анализа позволяет сконцентрировать внимание на отдельных
звеньях ЗМК и подойти к разрешению таких вопросов, как
потребление и избирательное переваривание микроорганизмов животным;
организация микробного сообщества кишечного эпителия
(пристеночного сообщества) и содержимого кишечника; роль перитрофи-
ческой мембраны в формировании микробного сообщества
кишечника; организация микробных сообществ пищи и экскрементов;
судьба микроорганизмов, попадающих с экскрементами в почву,
и др.
Микробиологический анализ ЗМК следует проводить
периодически. Первому анализу подвергают ЗМК только собранных
животных, и затем в процессе лабораторного культивирования с
периодом в 2—4 недели анализ повторяют. Таким образом,
исследователь получает возможность регистрировать динамическую
смену микробных сообществ ЗМК (или констатировать отсутствие
таковой в определенный промежуток времени). Наблюдение за
Динамикой состава и организации микробных сообществ — основа
Для адекватного объяснения микробиологических процессов в ЗМК.
МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ПОСЕВА
Выделение из опада, подстилки, почвы, компостов
Высев микроорганизмов из этих субстратов осуществляется
традиционным способом (см. раздел «Микробиологические
посевы»).
Выделение из кишечника
Для анализа микроорганизмов содержимого кишечни-
к а используют «сытых» особей, т. е. животных, нормально
питающихся до начала посева. Одновременно анализируют две группы
по 5 особей. Животных обездвиживают в кипятке в течение
1—2 с и вскрывают в стерильных условиях. При аккуратном
вскрытии стерильными инструментами поверхностная
стерилизация животного не обязательна, так как возможно избежать
соприкосновения кишечника с внешней стороной тела. Тем не менее
ряд авторов рекомендуют перед вскрытием обрабатывать
покровы животного гипохлоритом натрия или спиртом. У диплопод,
мокриц, личинок мух, термитов кишечник, представляющий собой
прямую или слабоизогнутую трубку, можно выделить целиком,
часто не вскрывая животное. Для этого надрезают
пищеварительную трубку у ротового отверстия, зацепляют иглой или пинцетом
последний сегмент тела, отделяют его и извлекают вместе с ним
весь кишечник. От кишечника отделяют пищеварительные железы.
При малых размерах животных (энхитреиды, некоторые личинки
двукрылых) из тел беспозвоночных с простерилизованной
поверхностью готовят гомогенат, который затем высевают на среду.
Кишечник разделяют на отделы: передний, средний и задний,
каждый из которых стерильно вскрывается при помощи ланцета из
бритвы и иглы под контролем в бинокулярной лупе. Из
кишечника достают содержимое и помещают на влажную стерильную
фильтровальную бумагу. Содержимое от 5 особей взвешивают
(параллельно определяют влажность содержимого, высушивая его
при 105°), добавляют 2 капли стерильной воды и растирают в
ступке пестиком с резиновым на'юнечником. Объем гомогената
затем доводят до 3 мл стерильной водой. Посев производят либо
без разведения, либо из разведений 1 : 10, 1 : 100 микродозатором
по 50 мкл на чашку в 5—10 повторностях.
Для анализа микроорганизмов, адсорбированных на
кишечном эпителии, используют «голодных» особей. Животных
отсаживают с опада на несколько суток на влажную
фильтровальную бумагу для освобождения ими кишечника от содержимого.
Кишечник стерильно изолируют и разделяют на отделы, не
вскрывая. Каждый отдел прополаскивают последовательно в трех
порциях стерильной воды. Материал от 5 особей собирают в бюксы,
взвешивают и растирают в агатовой ступке с 2 каплями воды
пестиком с резиновым наконечником. Параллельно определяют
влажность тканей кишечника, высушивая их при 105°. Затем в ступку
52
обавляют 2 мл стерильной воды и гомогенат переносят обратно
Д бюкс, в котором исходно содержался материал. Объем гомоге-
ната доводят до 3 мл. Для посева рекомендуется брать разные
количества гомогената (от 25 до 100 мкл) с помощью
микродозатора. Возможен также посев из разведений в порядке 2-кратного
/Но не 10-кратного!) убывания. Этот прием применяют в случае
превышения массы кишечника одной особи значений 5—10 мг
(сухая масса).
Особый интерес представляет выделение перитрофичес-
кой мембраны — хитинсодержащего неклеточного
образования, обволакивающего содержимое кишечника. Наличие перитро-
фической мембраны показано для большинства отрядов насекомых
и диплопод. Мембрана в виде жидкости секретируется на границе
переднего и среднего отделов кишечника специальными клетками
кишечного эпителия. Жидкость застывает на поверхности
кишечного содержимого, и образовавшаяся мембрана вместе с пищей
поступает к заднему отделу кишечника. На границе среднего и
заднего отделов мембрана начинает разрушаться, слущивается к
концу кишечника и с экскрементами выделяется наружу. В
экскрементах можно обнаружить фрагменты перитрофической
мембраны. Одной из функций перитрофической мембраны является
механическое разделение микробного сообщества, населяющего
кишечный эпителий и содержимое кишечника в среднем отделе. У
особей с хорошо заполненным кишечником удается выделить
содержимое кишечника из среднего отдела, заключенное в перитрофи-
ческую мембрану, целиком. Таким образом, высев кишечного
эпителия среднего отдела может быть осуществлен «чисто» (без
контакта с содержимым кишечника). Высев с самой перитрофической
мембраны до сих пор не производился в практике зоомикробиоло-
гических исследований, однако это имеет смысл делать в тех
случаях, когда в результате патогенного процесса происходит
разрушение мембранной структуры, ino-видимому, за счет микробной
деятельности.
Выделение из специализированных органов и тканей
осуществляется следующим образом. Стерильно изолируют нужный
объект, накапливают его, готовят гомогенат в стерильной воде,
которым инокулируют среду. В таких органах, как бродильная
камера термитов, мицетомы некоторых насекомых, условия
анаэробные или микроаэрофильные, поэтому техника выделения
должна быть адаптирована для работы с анаэробными
микроорганизмами.
Выделение из экскрементов
Оно методически близко выделению из содержимого
кишечника. По 5 активно питающихся особей отсаживают на стерильную
фильтровальную бумагу на 1 сут, по прошествии которых
экскременты собирают и взвешивают (параллельно
определяют влажность экскрементов). Готовят гомогенат, и посев
производят из разведений 1:10, 1 : 100. Важно разделять понятие «све-
жие» и «стареющие» экскременты. Состав и организация микроб-
ных сообществ последних могут существенно отличаться от
такового для вновь выделенных экскрементов.
Выделение с поверхности тела и конечностей животного
Эта процедура имеет значение при изучении роли
беспозвоночных в распространении микробных клеток в почве. Высев может
быть осуществлен двумя способами: посевом водного смыва с
кутикулы или аппликационным методом, когда обездвиженное
животное или фрагменты его тела раскладывают на агаризованные
среды. Вариантом этого способа является запуск живых
беспозвоночных на среду, позволяющий получить след из колоний
микроорганизмов, населяющих конечности.
При обработке посевов перечисленные приемы выделения
учитывают все выросшие формы микроорганизмов и степень их
представленности на чашках качественно и количественно.
Состав сред, использующихся для выделения микроорганизмов
из ЗМК, приведен в разделе «Микробиологические посевы».
МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Общие принципы использования микроскопии
В арсенале микроскопических методов почвенные
микробиологи имеют световую, люминесцентную и электронную микроскопию.
Микроскопию в зоомикробиологических исследованиях нужно
использовать в соответствии с некоторыми основополагающими
принципами. Во-первых, микроскопическое изучение ЗМК
начинается с контроля микробного заселения пищевого субстрата,
кишечника и экскрементов животных в световом микроскопе при
малых увеличениях, позволяющего получить предварительную
информацию об объекте; во-вторых, использование люминесцентной
и электронной микроскопии (сканирующей и трансмиссионной)
для детального изучения того или иного микробного сообщества
целесообразно только в тех случаях, когда световая микроскопия
либо уже не обеспечивает исследователя необходимыми данными,
либо описание сообщества принципиально невозможно с помощью
световой микроскопии (при детальном изучении микробного
сообщества кишечного эпителия, шеритрофической мембраны).
Другими словами, световая микроскопия призвана корректировать и
дополнять сведениями общего характера; результаты других видов
микроскопии.
Наблюдение за микроорганизмами, населяющими
растительный опад
Заселение микроорганизмами растительного опада изучают
предварительно под бинокулярноц лупой в отраженном свете при
увеличениях от 7 до 56 X. При этом описывают состав грибов,
актиномицетов в условных терминах, а когда возможно — на
родовом уровне, констатируют наличие бактериальных или дрожжевых
54
пленок. Описанные таким образом фрагменты опада изучают с
полотью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ).
Методические особенности использования СЭМ в зоомикробиологических
исследованиях подробно изложены В. С. Гузевым и др. (1986).
В настоящем разделе остановимся лишь на тех из них, которые
необходимо знать при выборе методики микроскопического
анализа. Изучение растительного слада может с успехом
осуществляться в СЭМ по ряду причин. Одна из них — достаточная структурная
прочность растительного материала, позволяющая проводить
подготовку препаратов по полной схеме. Последняя состоит из
отмывки образцов, фиксации, обезвоживания ацетоном или спиртом,
высушивания с использованием метода «критической точки»,
обеспечивающего дегидратацию препарата без структурных нарушений,
напыления золотом. Вторая—небольшая в сравнении с почвой
и экскрементами животных удельная поверхность опада, что дает
возможность производить количественный учет микроорганизмов.
Третья — простота отбора (проб. При описании микробного
сообщества растительного опада в СЭМ учитывают разнообразие мор-
фотипов клеток, их относительную представленность по
численности клеток на единицу поверхности (в случае немицелиальных
организмов) или по длине мицелия на единицу поверхности (в
случае мицелиальных организмов). При количественных учетах
просматривают не менее 20 полей зрения при увеличениях 300—
100Х—для грибов и 1000—10000Х—для бактерий (актиноми-
цетов) и дрожжей. Для анализа необходимо брать не менее 5
образцов.
Наблюдение за микроорганизмами, населяющими
содержимое кишечника
Для этих целей применяют световую, сканирующую и
люминесцентную микроскопию. В световом микроскопе отмечают
наличие в содержимом кишечника бактериальной или дрожжевой
слизи, актиномицетного или грибного мицелия при малых
увеличениях; если исследователь не располагает другими видами
микроскопии, то более детальное изучение микронаселения субстрата
может быть осуществлено на специально окрашенных препаратах
в тонком слое содержимого на стекле при больших увеличениях.
Недостатками такого метода являются недоучет бактерий,
замаскированных частицами субстрата, малый контраст изображения.
Для учета грибного мицелия и клеток дрожжей обычная световая
микроскопия тем не менее вполне пригодна.
Существенно больше информации можно получить, используя
СЭМ. Под бинокулярной лупой с содержимого кишечника иглой
или тонким пинцетом удаляют перитрофическую мембрану,
субстрат высушивают на воздухе или в вакуумном испарителе при
замораживании в жидком азоте, наклеивают на препаративный
столик микроскопа; напыляют золотом и анализируют в СЭМ.
Процедуры фиксации, обезвоживания ацетоном или спиртом и
высушивания по «критической точке» исключаются из схемы подготов-
ки препаратов, поскольку в содержимом кишечника связь между
отдельными фрагментами легко нарушается при помещении в
жидкость, при этом объект лишается нативной структуры.
При описании микробного сообщества с помощью СЭМ, как
правило, оперируют только качественными показателями:
морфологией клеток, размером и плотностью микроколоний и др.
Подсчет количества тех или иных морфотипов клеток в содержимом
кишечника невозможен вследствие крайне неравномерного
заселения микроорганизмами поверхности субстрата и большой
удельной поверхности содержимого. В СЭМ можно изучать заселение
внутренней и внешней поверхностей перитрофической мембраны.
Для микроскопирования внешней поверхности мембрану не
снимают с содержимого кишечика, а препарат готовят по той же
схеме. Для изучения внутренней поверхности мембраны необходимо
отогнуть часть ее от содержимого и расстелить на поверхности
мембранного фильтра. Эта операция требует большой
аккуратности, так как толщина перитрофической мембраны составляет ми-
краны, а иногда и десятые доли микрона.
Численность микробных клеток в содержимом кишечника
можно учесть с помощью люминесцентного микроскопа. Субстрат
взвешивают и готовят препарат на стекле, окрашивая его
специфическими флюоресцентными красителями: акридиновым оранжевым—
для бактерий (актиномицетов) или калькофлюором белым — для
грибов (дрожжей). Подсчет клеток производят по стандартной
методике (см. раздел «Прямые микроскопические методы»). В
люминесцентном микроскопе можно также изучать закономерности
образования перитрофической мембраны в процессе трофического
акта животного, так как последняя окрашивается калькофлюором
белым и видна в поле зрения в виде зеленого чехла, покрывающего
-содержимое кишечника.
Наблюдение за микроорганизмами, населяющими
кишечный эпителий
Как и при изучении микробного населения содержимого
кишечника, здесь также можно использовать все виды микроскопии. Под
бинокулярной лупой изолированный кишечник разделяют на
отделы, вскрывают, помещают на предметное стекло, накрывают
покровным. В световом микроскопе анализируют микроорганизмы,
имеющие относительно крупные размеры: отмечают наличие и
плотность заселения эпителия грибным мицелием, дрожжевыми
клетками, клетками простейших. Учесть бактерии практически
невозможно.
Для просмотра в СЭМ отпрепарированный кишечник
расстилают на поверхности синтетического мембранного фильтра,
фиксируют 25%-ным раствором глютаральдегида в фосфатном
буфере при 4° 2 ч, обезвоживают в ацетоне (или спирте) с
использованием фильтрующей установки для адсорбции ткани кишечника
на фильтре, высушивают по «критической точке». Таким образом,
осуществляется подготовка препарата к СЭМ по полной схеме.
56
Важным является соблюдение правильной ориентации кишечника
внутренней стороной наверх при его проводке через фиксирующий
й обезвоживающий растворы. Фильтр приклеивают на
препаративный столик микроскопа и напыляют золотом. В случае массо-
в0го анализа можно исключить из схемы фиксацию,
обезвоживание и высушивание по «критической точке». При этом качество
получаемой картины снижается за счет структурных нарушений
при неравномерном высушивании: клетки теряют отчасти
исходную форму. Однако при достаточном опыте работы эти изменения
не мешают интерпретации результатов.
При микроскопировании учитывают состав морфотипов
микробных клеток, плотность микроколоний бактерий и дрожжей, длину
грибного или актиномицетного мицелия, наличие спор. Для
подсчета численности просматривают не менее 20 полей зрения на
каждом из 5 препаратов. На основе количественного подсчета
выделяют доминирующие группы микроорганизмов в каждом отделе
кишечника.
Микроорганизмы кишечного эпителия можно изучать с
помощью люминесцентного микроскопа. Препараты кишечника на
стеклах окрашивают флюоресцентными красителями и
просматривают по описанной выше методике. Недостатком является
маскирующее действие кишечной'ткани, выражающееся в свечении
всего препарата. Применение люминесцентного микроскопа
целесообразно при изучении крупных и хорошо окрашиваемых
объектов: грибного мицелия, дрожжевых клеток, перитрофической
мембраны.
Наблюдение за микроорганизмами, населяющими экскременты
Экскременты (свежие или стареющие), предварительно
проанализированные под бинокулярной лупой, высушивают на
воздухе или в вакуумном испарителе при замораживании жидким
азотом, наклеивают на препаративный столик микроскопа и
напыляют золотом. Как в случае с содержимым кишечника,
приходится исключать /процедуры фиксации, обезвоживания и
высушивания по «критической точке», так как агрегатное состояние
экскрементов нарушается при помещении их в растворы.
Принципы изучения экскрементов в СЭМ аналогичны таковым для
содержимого кишечника. Для количественного учета микроорганизмов
в экскрементах целесообразно использовать люминесцентный
микроскоп.
Наблюдение за микроорганизмами, населяющими
специализированные органы, ткани и покровы беспозвоночных
Для описания микробных сообществ специализированных
органов и тканей используют трансмиссионный электронный
микроскоп (ТЭМ). Техника подготовки препаратов для ТЭМ включает
фиксацию объекта, обезвоживание, заливку в смолы,
изготовление тонких срезов, контрастирование металлами (Гузев и др.,
1981) л требует специальных навыков. Для детального ознакомле-
57
ния с методикой изучения ультраструктуры гепатопанкреатических
желез, мальпигиевых сосудов, мицетомов, мицетоцитов и других
рекомендуем обращаться в каждом конкретном случае к
оригинальным статьям.
Вопросы заселения микроорганизмами внешних покровов
беспозвоночных успешно решаются с помощью СЭМ, причем этот
метод микроскопии является единственно приемлемым для таких
целей (Гузев и др., 1986). Значительная прочность кутикулы
позволяет осуществлять подготовку препаратов по полной схеме.
В процессе микроскопирования описывают морфологию микробных
клеток, плотность заселения ими поверхности кутикулы и
относительную (Представленность в микробном сообществе.
РАЗДЕЛ 3
ВЫДЕЛЕНИЕ, УЧЕТ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ
ПОЧВЕННЫХ МИКРООГРАНИЗМОВ
ПОДГОТОВКА ПОСУДЫ И МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО
ПОСЕВА
В большинстве случаев для изучения и учета почвенных
микроорганизмов проводится поверхностный посев на чашки Петри.
При этом удается использовать один метод для изучения разных
групп микроорганизмов — бактерий, актиномицетов, грибов и
дрожжей.
Для посева необходимо подготовить на каждый почвенный
образец следующее:
1) колбу на 250 мл со 100 мл стерильной воды;
2) пробирки, содержащие по 10 мл стерильной воды, для
приготовления разведения (количество необходимых пробирок
определяется тем, какое последнее разведение необходимо приготовить
для посева, обычно берут 2—3 пробирки);
3) стерильные пипетки на 1 мл. Для каждого нового
разведения нужна новая пипетка, кроме того, нужна пипетка для
нанесения капли суспензии на чашки Петри. Необходимо измерить
размер капель пипеток и отобрать пипетки с одинаковой величиной
капли;
4) стерильные шпатели, по одному на каждое разведение, из
которого будут делать посев. Для каждой среды нужен свой
шпатель;
5) стерильные чашки Петри. Для каждого разведения, из
которого делается посев, для каждого образца и каждой новой среды
требуются 3—5 повторных чашек. Иногда посев делают на две
параллельные чашки, но результаты в этом случае очень неточны;
6) стерильные среды в колбах на 1—1,5 л, средой заполняют
fi/s колбы.
В чашки Петри наливают расплавленную на водяной бане
агаризованную среду, в каждую чашку 20—30 мл среды. После
застывания среды чашки помещают в простерилизованный и
нагретый до 80° сушильный шкаф. Чашки подсушивают для
удаления воды с крышек и появления муаровой поверхности на агаре,
после чего их охлаждают до комнатной температуры и в тот же
день производят посев.
После предварительного диспергирования почвы готовят
разведения почвенной суспензии (рис. 8). Посев производят из
разведения от 1 :2 до 1 : 100 000 и даже больших в зависимости от
группы учитываемых микроорганизмов, типа почвы, сезона,
влажности почвы и т. д. Наиболее точный подсчет получается, если на
чашке развивается 50—200 колоний бактерий и актиномицетов и
1г почвы
I I 1 1M/I 7М/1 1M/I
500 60 15
полоний колоний полоний
Рис. 8. Схема приготовления разведения почвы:
/ — колбы для приготовления исходной суспензии; //—V — пробирки для
последовательных 10-кратных разведений
30—50 колоний грибов. При первых анализах трудно предвидеть,
сколько микроорганизмов содержится в почве, поэтому делают
посев из двух или даже трех последовательных разведений. Для
учета грибов и дрожжей берут разведения на 1—2 порядка
меньше, чем для учета бактерий и актиномицетов. Засеянные чашки
переворачивают вверх дном и помещают в термостат (обычно при
температуре 28°, дрожжи при 22°, при определении психрофилов
посев инкубируют при 0—3°).
Бактерии подсчитывают через 3 сут, актиномицеты — через 7—
20 сут, грибы и дрожжи — через 5—7 сут. При посеве на бедные
среды подсчеты производят позже. Просчитав количество колоний
на всех параллельных чашках, определяют среднее количество
колоний на чашке и затем делают пересчет на 1 г воздушно-сухой
или абсолютно сухой почвы по формуле
бвг
а= ,
д
где а — количество клеток в 1 г опочвы; б — среднее количество
колоний на чашке; в — разведение, из которого сделан посев; г —
количество капель в 1 мл суспензии; д — масса воздушно-сухой
или абсолютно сухой почвы, взятой для анализа.
60
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И УЧЕТА БАКТЕРИЯ В ПОЧВЕ
Метод посева на твердые питательные среды
Метод посева на твердые питательные среды широко
распространен в почвенной микробиологии. Он дает возможность
довольно просто выделять чистые культуры микроорганизмов, что
повышает его ценность. Выделенные чистые культуры могут
подвергаться идентификации и дальнейшему всестороннему изучению их
физиологии, биохимии, образования ими физиологически активных
веществ, их действия на другие микроорганизмы, растения и т.д.
Сущность метода состоит в нанесении почвенной суспензии,
содержащей микроорганизмы, на поверхность твердой питательной
среды (агар, кремнекислый гель). Попавшие на среду клетки
образуют колонии, видимые невооруженным глазом. При
количественном учете принимают, что каждая колония возникает в результате
деления одной клетки. Для качественной и количественной
характеристики микрофлоры почв чаще всего используются следующие
среды.
Среда Чапека — для бактерий и актиномицетов (в г/л
дистиллированной воды): КО — 0,5; MgS04 — 0,5; K2HPO4—1;
FeSC>4 — 0,01; NaNC>3 — 2; СаСОз — 3; глюкоза или сахароза —
20; агар — 20.
Среда Эшби — для олигонитрофильных микроорганизмов
(в г/л дистиллированной воды): К2НРО4— 0,2; MgSC>4— 0,2;
NaCl — 0,2; K«S04 — 0,1; СаСОз — 5; сахароза —
20; агар —20.
Крахмало-аммиачная среда — для актиномицетов и
бактерий (в г/л дистиллированной воды): (NH4)2SC>4 — 2;
К2НР04 — 1; MgS04 — 1; NaCl — 1; СаС03 — 3; крахмал
растворимый— 10; агар — 20. Крахмал предварительно размешивают в
небольшом количестве воды и затем приливают к основной среде.
Мясо-пептонный агар (МПА) для бактерий:
питательная среда выпускается в виде порошка или приготовляется из
мясо-пептонного бульона с добавлением в него агара (20 г/л).
Голодный агар: к 1 л водопроводной воды прибавляют
20 г агара. Иногда агар предварительно очищают промыванием
или другими способами.
Почвенный агар Локхида: К2НРО4 — 0,2 г; агар —
15 г; почвенный экстракт—1 л. Почвенный экстракт готовят из
сильноокультуренной удобренной почвы. Просеянную через
3-миллиметровое сито почву смешивают с равным по массе
количеством дистиллированной воды. Смесь автоклавируют 1 ч при 120°.
Горячую суспензию фильтруют через бумажный фильтр при
отсасывании.
Почвенны й агар: к 900 мл водопроводной воды добавляют
100 г почвы и 18 г агара; среду стерилизуют 1 ч при 120°.
В чашки среду разливают с почвенными частицами.
Все обычные среды стерилизуют в автоклаве при 120°. Среды,
содержащие глюкозу, или те среды, в которые вносят витамины и
61
другие малостойкие вещества, — при 112°. Наиболее часто для
выделения бактерий и актиномицетов посев проводят на крахмало-
аммиачную среду, среду Эшби, МПА или МПА, разбавленный
в 10 раз.
Учет количества микроорганизмов методом предельных
разведений на жидких питательных средах
Почвенную суспензию приготовляют точно так же, как и три
использовании чашечного метода, только посев проводят не на
чашки, а в пробирки, содержащие определенное количество жидкой
питательной среды. Из каждого разведения засевают несколько
пробирок. При работе методом предельных разведений нужно
особенно тщательно соблюдать условия стерильности, так как
каждая случайно попавшая клетка может очень сильно повысить
найденный предел количества микроорганизмов. После инкубации в
термостате устанавливают последнее разведение, в котором еще
обнаруживается рост микроорганизмов. На основании этих данных
можно высчитать примерное содержание микроорганизмов
исследуемой группы в почве. Для более точного подсчета нужно
сделать посев на большое количество параллельных пробирок и
пользоваться для расчета таблицами Мак-Креди (Аристовская, 1965).
Метод предельных разведений имеет ряд недостатков, и им
пользуются реже, чем посевом на твердые питательные среды.
Микробиологический анализ образцов ризосферы растений
При посеве необходимо учитывать, что в ризосфере содержится
в десятки, сотни и даже тысячи раз больше микроорганизмов,
чем в окружающей почве, поэтому для посева нужно
пользоваться большими разведениями (способ отбора образцов см.
раздел 1). Одновременно делают посев из контрольной почвы
(такая же почва, но удаленная от корней растений: почва
междурядий или участка, лишенного растительности).
Навеоку корней с почвой (5—10 г) /помещают в колбу со 100 мл
стерильной воды. Суспензию обрабатывают на микроизмельчителе
тканей. Посев проводят обычным способом. После посева корни
вынимают из колбочки, слегка подсушивают между листами
фильтровальной бумаги и взвешивают. По разности массы корней
с почвой и отмытых корней узнают массу ризосферной почвы,
взятой для анализа. Расчет количества микроорганизмов ведут на
1 г почвы. Зная ее влажность, можно произвести пересчет
количества микроорганизмов на 1 г воздушно-сухой и абсолютно сухой
почвы.
Более точные подсчеты можно получить, если после отмывания
корней отфильтровать через бумажный фильтр почвенную
суспензию, подсушить на воздухе осадок почвы и, исходя из его массы,
делать пересчет количества микроорганизмов на 1 г почвы.
62
Микробиологический анализ поверхности корней (ризопланы)
по Гузевой и Звягинцеву
Корни, стерильно отделенные от растения, в течение 5 мин
отмывают от ризосферной почвы в колбе со 100 мл стерильной
воды путем перемещения ее на качалке (180 об/мин). Затем
отмытые корни крючком вынимают из колбы, помещают в стерильнук>
чашку Петри, разрезают на куски в 5—10 мл длиной и после
перемешивания отбирают среднюю навеску в 0,5—1 г. Берут не
менее трех навесок. Каждую навеску помещают в 100 мл стерильной
воды и обрабатывают на микроизмельчителе тканей РТ-2 в
течение 5 мин. После минутного отстаивания суспензии готовят
разведения и производят посев. Расчет количества микроорганизмов
проводят на 1 г сухих корней или на единицу 'поверхности корня.
Суммарная поверхность корней определяется по поглощению
метиленовой сини. Показано, что 1 мг метиленовой сини покрывает
1,05 м2 при мономолекулярной адсорбции. Поэтому общую
поверхность корневой системы определяют по изменению концентрации
раствора сини после погружения в него корней растений.
Для каждого определения наливается раствор метиленовой
сини 0,0003 н., в 3 стакана в 10-кратном количестве по отношеник
к объему корней. Навеску корней для определения поверхности
берут параллельно с навеской для микробиологического анализа
В начале корни погружают последовательно в стаканы с метиле
новой синью 'на 1,5 мин в каждый. После каждого логруженю
корней их оставляют над каким-либо другим стаканом до тех пор
пока раствор краски перестанет с них стекать. Общая поверхност]
корней (в м2) получается путем умножения 1,05 на количеств»
миллиграммов поглощенной метиленовой сини за первые два по
гружения корневой системы в раствор краски. Поглощение мети
леновой сини определяют колориметрически сто изменению кок
центрации раствора. Для этого готовят образцовый раствор и
краски, предварительно высушенной до постоянной массы пр
100°. Молекулярная масса метиленовой сини равна 373,68 г.
Для сравнения количества микроорганизмов в ризосферной по1
ве и на поверхности корней необходимо количество микроорп
низмов в ризосфере пересчитать также на единицу поверхност
почвенных частиц. Удельную поверхность почвы также опред»
ляют по поглощению метиленовой сини.
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ
ИЗ РИЗОСФЕРЫ И РИЗОПЛАНЫ РАСТЕНИЙ
Для проведения анализа отбирают корни растений вместе
почвой. Одновременно берут образцы контрольной почвы (из мез
дурядий или участка, лишенного растительности). Корни отрях
вают от больших комков почвы, оставляя только ризосферную по
ву — слой почвы вокруг корней на расстоянии не более 5—10 м
Ризосферную почву осторожно с соблюдением условий стерильн
«сти удаляют с поверхности корней скальпелем и кисточкой. Затем
почву взвешивают и навески (не менее 0,5—1 г) вносят в колбы
со 100 мл стерильной воды. Десорбцию микромицетов с
почвенных частиц проводят на ми'кроизмельчителе тканей РТ-2 в течение
5 мин или на качалке (180 об/мин) в течение 10—15 мин. Для
посева готовят разведения полученной суспензии ризосферной
почвы (1 : 100, 1 : 1000, 1: 10 000).
Ризосферную почву удаляют также посредством водного смыва
с корней. Навеску корней с почвой (5—10 г) помещают простери-
лизованным над пламенем пинцетом в заранее подписанные
колбы со 100 мл стерильной воды и встряхивают на качалке в
течение 15 мин. Корни предварительно разрезают на кусочки длиной
3—5 см. Отмытые корни вынимают проволочным крючком из
колбы, подсушивают между листами фильтровальной бумаги и
взвешивают. По разности массы корней с почвой и отмытых корней
определяют массу анализируемой ризосферной почвы. Более
точные подсчеты можно провести, если после посева водно-почвенную
суспензию отфильтровать через предварительно взвешенный
фильтр, который сушат с почвой до постоянной массы и таким
образом устанавливают массу ризосферной почвы.
Для выделения микроскопических грибов, развивающихся в ри-
зоплане — на поверхности корней и тонком слое прилегающих к
ней почвенных частиц, а также во внутренних тканях корня,
существует 'несколько методических подходов.
Методы водных смывов. Для изучения состава
микромицетов, заселяющих корневую поверхность, кусочки корней
(3—5 см) после удаления ризосферной почвы помещают в колбу
со 100 мл стерильной воды. Колбу встряхивают на качалке
(180 об/мин) в течение 5—10 мин. Затем корни с помощью
стерильного пинцета или крючка переносят в следующую колбу со
стерильной водой и встряхивают на качалке. Проводят до 5—7
смывов с корней. Посев на питательные среды осуществляют из
последовательных смывов. Более жестким способом десорбции
микроскопических грибов с корней является 1—3-кратная
обработка их в стерильной воде на микроизмельчителе тканей РТ-2
(5000 об/мин) в течение 5 мин. Посев проводят на сусло-агар, агар
Чапека, среды, приготовленные на растительных отварах, овсяной
агар, картофельный агар.
Овсяной агар: овсяная мука—100 г; вода — 600—700 мл
(после кипячения (0,5 ч) отвар фильтруют через проволочное сито),
агар— 15 г; воду доливают до 1000 мл.
Картофельный агар: очищенный картофель — 200 г; агар— 15г;
вода—100 мл; глюкоза — 20 г.
Для оценки представленности микроскопических грибов в
корневой зоне используют показатели частоты встречаемости и
плотности (обилия) вида (раздел «Определение структуры комплекса
почвенных микромицетов»).
Метод посева растертых корней. Для изучения
состава микроскопических грибов ризопланы корни тщательно (до
64
у 10 раз) промывают стерильной водой, режут на кусочки 3—5см
и просушивают между двумя листами стерильной фильтровальной
бумаги. Берут навески корней по 1 г и растирают их в стерильной
фарфоровой ступке с кварцевым песком. Растертую массу
переносят в колбу со 100 мл воды и встряхивают в течение 5 мин. Далее
готовят разведения и проводят посев на питательные среды.
Метод накопления во влажных камерах
используется для исследования грибов, развивающихся на поверхности
корней и инфицирующих их внутренние ткани. В качестве
влажных камер применяют чашки Петри, на дно которых помещают
стерильную фильтровальную бумагу. Влага в чашках держится
дольше, если под фильтровальную бумагу подкладывают
стерильную марлю или вату. Затем с помощью пипетки
фильтровальную бумагу увлажняют стерильной водой, не создавая при
этом избытка воды на поверхности. Отрезки корней (3—5 см)
раскладывают на поверхность фильтровальной бумаги, и чашку
Петри ставят в термостат для инкубации при температуре 18—
24°. Периодически, начиная со 2-х суток, корни просматривают
под бинокулярным микроскопом и с помощью препаравальной
иглы проводят выделение грибов в чистую культуру.
Для выявления видов микромицетов, развивающихся во
внутренних тканях корня, проводят поверхностную стерилизацию
отмытых от почвы корней различными веществами: погружением
исследуемого объекта в 0,1%-ный раствор сулемы и последующей
многократной промывкой в 50% -ном этиловом спирте; обработкой
в течение 1 мин 0,1%-ным раствором азотнокислого серебра,
парами или раствором формалина, 0,1—1%-ной бромной водой; 10—
15%-ным раствором перекиси водорода, 2%-ным раствором гипо-
хлорита натрия. Оптимальные для конкретного объекта реагент,
его концентрация и время экспозиции подбираются
экспериментально. После стерилизации отрезки корней 3—4 раза промывают
стерильной водой для удаления стерилизующего агента (отмывка
сулемы контролируется по качественной реакции на хлор с
азотнокислым серебром). Затем корни помещают во влажную камеру,
инкубируют до появления на их поверхности мицелия и
плодоношения грибов. Микромицеты под контролем светового
бинокулярного микроскопа пересевают препаравальной иглой <на
питательные среды.
Метод посева фрагментов корня. При исследовании
состава микроскопических грибов ризопланы отрезки корня
вместо инкубации во влажной камере на стерильной фильтровальной
бумаге раскладывают на различные питательные среды. Этот
прием в сравнении с методом накопления во влажных камерах на
фильтровальной бумаге позволяет полнее выявить состав
микромицетов, требует меньшего времени для получения результатов.
Если на питательные среды помещают отрезки корпя
размером 1—3 см, то часто отдельные быстрорастущие виды
покрывают всю поверхность корня и питательной среды. Это затрудняет
обнаружение других форм микромицетов, населяющих данный
3 Зак. 42
65
участок корня. Для избежания этого корни разрезают на мелкие
кусочки (0,5—1 мм; толстые корни предварительно расщепляют)^
Стерильной препаравальной иглой или пинцетом с заостренными;
концами переносят по 5—6 кусочков корня в чашку Петри с
питательной средой, равномерно распределяя их по поверхности.
Раскладывают порядка 50 кусочков корня на различные пита-
тельные среды: сусло-агар, среду Чапека, голодный агар и среды»
приготовленные на растительных отварах. Чашки инкубируют в
термостате при 23—25° в течение 5—10 сут, просматривают под
световым микроскопом и выделяют микромицеты в чистые
культуры. Для количественной характеристики представленности ми-
кромицетов в ризоплане растения можно подсчитать следующий
показатель встречаемости вида: отношение участков
(фрагментов) корня, на которых вид выявлен, к общему числу
анализируемых фрагментов корня.
АНАЛИЗ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ БАКТЕРИЙ
Обнаружение и учет бактерий, участвующих
в круговороте азота
Азот — основной элемент, необходимый для развития растений,
во многом определяющий урожай сельскохозяйственных культур.
Круговорот азота на земле и перевод его в доступные для
растений соединения осуществляются благодаря деятельности
микроорганизмов. Основными звеньями круговорота азота являются:
связывание азота атмосферы (азотфиксация), аммонификация,
нитрификация, денитрификация.
АЗОТФИКСАЦИЯ
Азотфиксация — главное звено в цикле азота, поскольку
именно этот процесс лимитирует все остальные звенья превращения
азота. В настоящее время признается, что очень многие бактерии
способны фиксировать молекулярный азот. Активные азотфикса-
торы известны среди анаэробных клостридий, сульфатредуцирую-
щих бактерий, эжтеробактерий, фотосинтезирующих анаэробов,
спирилл, псевдомонад, коринеподобных и нокардиоподобных
бактерий и представителей других систематических групп бактерий.
В настоящее время предложены разнообразные среды и
приемы для выделения как широких, так и таксономически узких
групп бактерий-азотфиксаторов. Для выделения и учета азотфик-
саторов используется среда Федорова (г/л): глюкоза (ман-
нит) -20,0; К2НР04— 0,3; СаНР04—0,2; K2S04 — 0,2; MgS04 —
0,3; NaCl — 0,5; FeCl3 — 0,01; СаСОз — 5,0; смесь
микроэлементов— 1 мл, агар — 20 г, вода дистиллированная. Часто в среду в
качестве источника витаминов добавляют дрожжевой экстракт в
количестве 0,1—0,2 г/л. Смесь микроэлементов по Федорову
(г/л): НзВОз— 5,0; (NH4)2Mo04 — 5,0; KI — 0,5; NaBr — 0,5;
66
ZnS04— 0,2; A12(S04)3 — 0,3; вода дистиллированная. На этой
среде вырастают бактерии родов Azotobacter, Beijerlnckia, Derxia
й также другие свободноживущие азотфиксирующие бактерии.
Для обнаружения в почве азотобактера используют метод
почвенных комочков. Навеску почвы увлажняют
стерильной водопроводной водой до пастообразного состояния и
микробиологической петлей или иглой раскладывают комочки
правильными рядами (по трафарету)—50 комочков на каждую чашку
Петри на среду Эшби. Используют две чашки Петри на каждый
образец почвы. Чашки помещают в термостат во влажной
камере. Через 4—6 сут учитывают результаты опыта, подсчитывая
число комочков почвы, обросших слизистыми колониями
азотобактера. Колонии азотобактера следует отличать от дрожжей-лшюми-
цетов, также часто вырастающих на этой среде. Колонии
азотобактера обычно слизистые, тестообразной консистенции, белые
непрозрачные, с возрастом наблюдается образование коричневатого
пигмента, появляются на 4—6-е сут инкубирования, под
микроскопом клетки выглядят как короткие толстые палочки или кокки,
часто соединенные попарно — «восьмерки», окруженные капсулой.
Дрожжи-липомицеты образуют слизистые, растекающиеся
колонии со стеклянным блеском, появляются на 14—16-е сут.
Среда Эшби (г/л): маннит —20,0; К2НР04 —0,2; MgS04,
NaCl — 0,2; K2SO4 — 0,1; СаСОз—5,0; вода дистиллированная.
Чтобы обнаружить в почве азотобактер, применяют также
метод почвенных пластинок. Навеску почвы (40—50 г),
обогащенную необходимыми для развития азотобактера веществами
(маннит — 0,5, К2НРО4 — 0,1, мел—1% от массы почвы),
помещают в фарфоровую чашечку, увлажняют до пастообразного
состояния, тщательно перемешивают и переносят в чашку Петри.
Почву равномерным слоем распределяют по дну чашки,
предварительно для лучшей аэрации поместив на дно древесный уголь или
«битое стекло в качестве дренажа. В чашку наклонно вставляют
стеклянную трубочку, проходящую через почвенную пластинку и
^обеспечивающую газообмен. Пластинки инкубируют во влажной
камере. После 4—5-дневной инкубации в термостате на
поверхности появляются небольшие колонии азотобактера. Микроскопиро-
ванием убеждаются в том, что это действительно колонии
азотобактера.
Для выявления в почве анаэробных азотфиксаторов исполь
зуют среды Виноградского и Емцева. Накопительнук
культуру Clostridium pasteurianum получают на элективной ере
де Виноградского (г/л): глюкоза — 20,0; К2НРО4—1,0
MgS04 — 0,5; NaCl — 0,5, вода дистиллированная. Среду разли
вают в высокие пробирки, на дно которых насыпают по 100—
200 мг СаСОз, стерилизуют при 0,5 атм. Заражают образцам]
почв (1 г).
Количественный учет Clostridium pasteurianum в почве прово
Дят на среде Емцева следующего состава (г/л): NaH2P04-
0,5; К2НРО4 — 0,5; MgS04 — 0,5; NaCl — 0,5; FeS04 — 0,01
3*
6
MnS04 — 0,01; раствор микроэлементов по Федорову—1 мл; глк>-4
коза — 20,0; пептон — 5,0; дрожжевой автолизат — 0,2 мл-
СаСОз—10; вода дистиллированная. Питательную среду
разливают в высокие пробирки, на дно которых насыпают СаСОз.
Стерилизуют при 0,5 атм. Засевают разведениями почвенной
суспензии. В случае развития клостридий среда мутнеет, приобретает
запах масляной кислоты и в ней появляются пузырьки газа. Мик-
роскопированием убеждаются в наличии клеток бактерий рода
Clostridium. Эти бактерии имеют клетки веретенообразной формы*
содержащие внутри продолговатую спору. От раствора Люголя
они окрашиваются в фиолетово-синий цвет. Численность бактерий
определяют методом предельных разведений.
Клубеньковые бактерии относятся к симбиотическим азотфикса-
торам. Они образуют клубеньки на корнях бобовых растений и в
большом количестве находятся в клетках бактероидной ткани
клубенька. Клубеньковые бактерии могут также развиваться в
свободном состоянии в почве. Довольно просто изолировать
клубеньковые бактерии непосредственно из клубеньков. Корни бобовых
растений с клубеньками тщательно отмывают от почвенных частиц,,
клубенек отрезают, промывают в стерильной воде, трижды сменяя
ее, помещают в раствор сулемы (1 : 1000) в чашке Петри и
выдерживают 2—3 мин. Затем отмывают последовательно стерильной
водопроводной водой, выдерживают в спирте 1 мин, промывают
в стерильной водопроводной воде. После промывания клубенек
переносят в стерильную чашку в каплю стерильной воды и
раздавливают стерильной стеклянной палочкой. Одну петлю взвеси
переносят из капли на поверхность бобового агара в чашках Петри
и распределяют шпателем. Спустя 1—2 сут инкубирования в
термостате при 28° на чашках вырастают слизистые беловатые
колонии. Бобовый агар готовят из бобового отвара. 50 г бобов (белой
фасоли или гороха) заливают 1 л воды, варят до набухания и
растрескивания кожуры (но не до разваривания), фильтруют
через вату, доводят водопроводной водой до 1 л, добавляют 10 г
глюкозы (сахарозы), 0,3 г MgS04, 1 г КгНР04 и устанавливают рН 7
раствором соды. Для получения плотной среды добавляют 1,5—
2% агара. Среду стерилизуют при 0,5 атм.
Сравнительно недавно были выявлены в больших количествах
на корнях трав, особенно злаков, спириллы с высокой азотфикси-
рующей активностью, получившие родовое название Azospirillum.
Они живут в ассоциациях с растениями, распространены и в почве,
но преобладают в зоне корня. Для проявления их азотфиксирую-
щей способности необходимо пониженное содержание кислорода
в среде.
Для получения культуры азосптрилл отмытые кусочки корней
5—8 мм разминают с помощью профламбированного пинцета и
помещают в элективную полужидкую среду без азота следующего
состава.
Среда Доберейнер для выделения азоспирилл (Герхардт,
1983) (г/л): L-яблочная кислота —5; К2НР04 — 0,5; MgS04X
68
ч<7Н2'0—0,2; NaCl — 0,1; CaCl2—0,02; раствор микроэлементов—"
2 мл; бромтимоловый синий (5%-ный спиртовой раствор) — 2мл;
Fe-ЭДТА (1,64%-ный раствор)—4 мл; раствор витаминов—1мл;
£ОН — 4 г; агар—1,75 г; вода дистиллированная; раствор
микроэлементов (г): Na2Mo04 2H20 —0,2; MnS04-H20—
0,2351 Н3ВО3 —0,28; CuS04-5H20 — 0,008; ZnS04-7H20 —0,024;
йода дистиллированная — 200 мл; раствор витаминов (мг):
биотин-10, пиридоксин-20, дистиллированная вода—100 мл.
Доводят рН до 6,8, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин
при 1 атм. Среду охлаждают до 40—50° и разливают по 4 мл в
пенициллиновые флаконы с резиновыми пробками.
Среду можно также инокулировать почвой. Не перемешивая,
инкубируют 40 ч при 32° и затем проверяют способность
накопительной культуры восстанавливать ацетилен (тест на способность
к азотфиксации; с. 230). Стараются не повредить плотную пленку
под поверхностью среды, поскольку это может снизить
активность нитрогеназы. Если культура способна восстанавливать
ацетилен, то продолжают проводить ее накопление на свежей среде
Доберейнер. С помощью микроскопа находят толстые, извитые
подвижные палочки диаметром около 1 мкм, заполненные
гранулами поли-р-оксибутирата, и рассевают их штрихом в чашки ее
средой Доберейнер, но содержащей 1,5% агара и 20 мг дрожже
вого экстракта на 1 л. Через неделю находят маленькие, белы*
плотные колонии и переносят их на полужидкую среду Доберей
нер. Для окончательной очистки культуры со среды Доберейнер
наносят штрихом на картофельный агар (Герхардт, 1983), гд<
следят за образованием типичных розовых, часто складчатые
колоний.
Картофельный агар (г/л): отмытый очищенный карто
фель, нарезанный ломтиками, — 200; L-яблочная кислота — 2,5
КОН — 2; нерафинированный тростниковый сахар — 2,5; раство]
витаминов (как для среды Nfb— 1 мл); бромтимоловый сини]
(0,5%-ный спиртовой раствор) —2 капли; агар—15; вода дистил
лированная. Картофель в марлевом мешке кипятят 30 мин в 1 .
воды. Полученный экстракт фильтруют через вату и фильтра
сохраняют. Яблочную кислоту растворяют в 50 мл воды и добав
ляют 2 капли бромтимолового синего и КОН, пока раствор яблоч
ной кислоты не станет зеленым (рН 7,0). Этот раствор, а такж
тростниковый сахар, витамины и агар добавляют к картофельнс
му фильтрату. Дистиллированной водой доводят объем до 1 л, kv.
пятят до растворения агара и стерилизуют при 1 атм.
АММОНИФИКАЦИЯ
Процессы разложения азотсодержащих соединений с выделе
нием аммиака называются аммонификацией. Аммонификация им<
ет важное значение для питания растения. Процесс этот осущ<
ствляется бактериями в аэробных и анаэробных условиях.
е
Аммонификация белка и полипептидов.
Наиболее часто численность бажтерий-аммонификаторов определяют
на МПА, иногда на пептонной воде (10 г пептона, 0,5 г NaCl, 1 л
водопроводной воды) методом предельных разведений. О
разложении белков в жидкой среде судят по появлению продуктов их
распада: аммиака и сероводорода.
Проба на аммиак. Выделяющийся в атмосферу NH3
окрашивает подвешенную влажную красную лакмусовую бумагу в
синий цвет.
Накопления аммиака в среде устанавливают при помощи
реактива Несслера. На предметное стекло наносят каплю
исследуемой культуральной жидкости и вносят каплю реактива Несслера.
При большом количестве аммиака образуется коричневый или
буроватый осадок, при небольшом — появляется оранжевая или
желтая окраска.
Проба на сероводород. Полоску фильтровальной
бумаги пропитывают раствором уксуснокислого свинца, высушивают и
помещают в пробирку, укрепив ватной пробкой. В присутствии
H2S полоска бумаги через несколько дней чернеет. Образование
на поверхности почерневшей бумаги серебристого налета
свидетельствуют о выделении и других соединений среды
(меркаптанов). При введении в состав питательной среды лимоннокислого
или виннокислого железа выделение H2S ведет к почернению всей
среды.
Аммонификация мочевины. Бактерии, вызывающие
аммонификацию мочевины, образуют фермент уреазу, который
гидролизует мочевину до аммиака. Представители этой
физиологической группы встречаются среди многих бактериальных
таксонов. Выявляют бактерии, способные к аммонификации мочевины,
по выделению аммиака на средах, содержащих мочевину, а
численность определяют методом предельных разведений. Чаще
всего используют среду Федорова (г/л): К, Na-виннокислый или
Na-яблочнокислый — 5,0; мочевина — 50,0; К2НРО4 — 0,5;
MgS04-7H20— 0,2; вода дистиллированная. Раствор мочевины
стерилизуют отдельно пропусканием через бактериальный фильтр
и добавляют в среду, 'простерилизованную при 1 атм. Среду
разливают по 30 мл в колбы Эрленмейера, заражают разведениями
почвенной суспензии и инкубируют при 25—30° в термостате. Для
обнаружения аммиака используют приемы, описанные выше.
Амхмонификация мочевой кислоты, пуринов и
пиримидинов. Мочевая кислота, пурины и пиримидины легко
сбраживаются в анаэробных условиях представителями родов
Clostridium и Peptococcus.
Среда для выделения пуринферментирующих
клостридий (The Prokaryotes, 1981): мочевая кислота —
2,0 г; 10 н. КОН — 3,0 мл; 70%-ный К2НР04-ЗН20—1,5 мл;
MgS04-7H20— 5 мг; СаС122Н20—5 мг; FeS04-7H20—2 мг;
дрожжевой экстракт—1,2 г; резазурин—1 мг; меркаптоуксусная
кислота— 1,5 мл; вода дистиллированная — до 1 л.
70
Среду готовят следующим образом: к 500 мл
дистиллированной воды добавляют растворы КОН и К2НРО4 и полученный
раствор кипятят. Затем добавляют мочевую кислоту. После ее
растворения раствор охлаждают и добавляют другие ингредиенты среды.
Меркаптоуксусную кислоту добавляют непосредственно перед ав-
токлавированием и доводят рН до 7,2, используя стерильный
60%-ный раствор К2СО3. Вместо меркаптоуксусной кислоты могут
быть использованы другие восстанавливающие агенты: Na-тиогли-
колят (750 мг/л) или цистеингидрохлорид (1 г/л). После автокла-
вирования среду немедленно используют, до горлышка наполняя
стеклянные емкости по 50 мл. После и'нокулядии 0,5 г
пастеризованной почвы емкости инкубируют при 37°. Рост обычно
начинается спустя 24—48 ч. О начавшемся росте судят по подщела-
чиванию среды и уменьшению адсорбции при 290 нм
(использование мочевой кислоты), измеряя на спектрофотометре.
После одного или двух пересевов проводят выделение чистых
культур в строго анаэробных условиях на агаризованной среде того
же состава. Бактерии могут быть идентифицированы по форме спор:
CI. asidiurioi образует терминальные округлые споры, а С/.
cylindrosporum — цилиндрические, которые располагаются в
разных частях материнской клетки, не раздувая ее.
Аминокислоты и низкомолекулярные пептиды активно
поглощаются и используются для роста многими бактериями.
В основную минеральную агаризованную среду добавляют
интересующую аминокислоту в качестве единственного источника
углерода и энергии и проводят высев почвенной суспензии
соответствующих разведений. При работе с аминокислотами следует иметь
в виду, что эти соединения оптически активны, и бактериями в
основном используются L-стереоизомеры, хуже потребляются
рацематы (DL-формы), £)-стереоизомеры могут оказаться
ингибиторами.
Основная минеральная среда (г/л): КН2РО4 — 0,1;
К2НРО4—1; MgSC>4—0,1; СаСЬ — 0,02; раствор
микроэлементов— 1 мл; аминокислота—1; вода дистиллированная; агар
очищенный «Дифко»—15. Большинство аминокислот хорошо
растворяются в воде, некоторые в воде — хуже, но в кислоте и
щелочи— хорошо. Цистин и триптофан обычно растворяют в 0,2—0,4 н.
растворе НС1, аспарагиновую кислоту, тирозин в 0,2—0,4 н.
растворе .NaOH.
Способностью к разложению нуклеиновых кислот обладают
многие почвенные бактерии. Выявить бактерии, способные к
разложению нуклеиновых кислот, можно при помощи следующих
методов.
Первый метод. Этот метод используют для обнаружения
бактерий, гидролизующих как ДНК, так и РНК. ДНК и РНК
растворяют в дистиллированной воде в концентрации, достаточной,
чтобы в агаровой среде их содержалось 0,2%. ДНК легко
растворяется в воде. Для растворения РНК в воду медленно добавляют
1 н. NaOH, следя за тем, чтобы рН не был выше 5,0. Раствор
71
MnS04— 0,01; раствор микроэлементов по Федорову—1 мл; глю^
коза — 20,0; пептон — 5,0; дрожжевой автолизат — 0,2 мл;.
СаСОз—Ю; вода дистиллированная. Питательную среду
разливают в высокие пробирки, на дно которых насыпают СаСОз.
Стерилизуют при 0,5 атм. Засевают разведениями почвенной
суспензии. В случае развития клостридий среда мутнеет, приобретает
запах масляной кислоты и в ней появляются пузырьки газа. Мик-
роскопированием убеждаются в наличии клеток бактерий рода
Clostridium. Эти бактерии имеют клетки веретенообразной формы,
содержащие внутри продолговатую спору. От раствора Люголя
они окрашиваются в фиолетово-синий цвет. Численность бактерий
определяют методом предельных разведений.
Клубеньковые бактерии относятся к симбиотическим азотфикса-
торам. Они образуют клубеньки на корнях бобовых растений и в
большом количестве находятся в клетках бактероидной ткани
клубенька. Клубеньковые бактерии могут также развиваться в
свободном состоянии в почве. Довольно просто изолировать
клубеньковые бактерии непосредственно из клубеньков. Корни бобовых
растений с клубеньками тщательно отмывают от почвенных частиц,
клубенек отрезают, промывают в стерильной воде, трижды сменяя
ее, помещают в раствор сулемы (1 : 1000) в чашке Петри и
выдерживают 2—3 мин. Затем отмывают последовательно стерильной
водопроводной водой, выдерживают в спирте 1 мин, промывают
в стерильной водопроводной воде. После промывания клубенек
переносят в стерильную чашку в каплю стерильной воды и
раздавливают стерильной стеклянной палочкой. Одну петлю взвеси
переносят из капли на поверхность бобового агара в чашках Петри
и распределяют шпателем. Спустя 1—2 сут инкубирования в
термостате при 28° на чашках вырастают слизистые беловатые
колонии. Бобовый агар готовят из бобового отвара. 50 г бобов (белой
фасоли или гороха) заливают 1 л воды, варят до набухания и
растрескивания кожуры (но не до разваривания), фильтруют
через вату, доводят водопроводной водой до 1 л, добавляют 10 г
глюкозы (сахарозы), 0,3 г MgS04, 1 г КгНР04 и устанавливают рН 7
раствором соды. Для получения плотной среды добавляют 1,5—
2% агара. Среду стерилизуют при 0,5 атм.
Сравнительно недавно были выявлены в больших количествах
на корнях трав, особенно злаков, спириллы с высокой азотфикси-
рующей активностью, получившие родовое название Azospirillum.
Они живут в ассоциациях с растениями, распространены и в почве,
но преобладают в зоне корня. Для проявления их азотфиксирую-
щей способности необходимо пониженное содержание кислорода
в среде.
Для получения культуры азосптрилл отмытые кусочки корней
5—8 мм разминают с помощью профламбированного пинцета и
помещают в элективную полужидкую среду без азота следующего
состава.
Среда Доберейнер для выделения азоспирилл (Герхардт,
1983) (г/л): L-яблочная кислота —5; К2НР04 — 0,5; MgS04X
Х7Н20—- 0,2; NaCl — 0,1; СаС12—0,02; раствор микроэлементов —
2 мл; бромтимоловый синий (5%-ный спиртовой раствор) — 2мл;
Fe-ЭДТА (1,64%-ный раствор)—4 мл; раствор витаминов—1мл;
КОН— 4 г; агар—1,75 г; вода дистиллированная; раствор
микроэлементов (г): Na2Mo04 2H20—0,2; MnS04-H20 —
0,235; Н3ВО3 —0,28; CuS04-5H20 — 0,008; ZnS04-7H20 — 0,024;
йода дистиллированная — 200 мл; раствор витаминов (мг):
биотин-10, пиридоксин-20, дистиллированная вода—100 мл.
Доводят рН до 6,8, кипятят до растворения агара и стерилизуют 15 мин
при 1 атм. Среду охлаждают до 40—50° и разливают по 4 мл в
пенициллиновые флаконы с резиновыми пробками.
Среду можно также инокулировать почвой. Не перемешивая,
инкубируют 40 ч при 32° и затем проверяют способность
накопительной культуры восстанавливать ацетилен (тест на способность
к азотфиксации; с. 230). Стараются не повредить плотную пленку
под поверхностью среды, поскольку это может снизить
активность нитрогеназы. Если культура способна восстанавливать
ацетилен, то продолжают проводить ее накопление на свежей среде
Доберейнер. С помощью микроскопа находят толстые, извитые,
подвижные палочки диаметром около 1 мкм, заполненные
гранулами поли-р-оксибутирата, и рассевают их штрихом в чашки со
средой Доберейнер, но содержащей 1,5% агара и 20 мг
дрожжевого экстракта на 1 л. Через неделю находят маленькие, белые
плотные колонии и переносят их на полужидкую среду
Доберейнер. Для окончательной очистки культуры со среды Доберейнер
наносят штрихом на картофельный агар (Герхардт, 1983), где
следят за образованием типичных розовых, часто складчатых
колоний.
Картофельный агар (г/л): отмытый очищенный
картофель, нарезанный ломтиками, — 200; L-яблочная кислота — 2,5;
КОН — 2; нерафинированный тростниковый сахар — 2,5; раствор
витаминов (как для среды Nfb— 1 мл); бромтимоловый синий
(0,5%-ный спиртовой раствор) —2 капли; агар—15; вода
дистиллированная. Картофель в марлевом мешке кипятят 30 мин в 1 л
воды. Полученный экстракт фильтруют через вату и фильтрат
сохраняют. Яблочную кислоту растворяют в 50 мл воды и
добавляют 2 капли бромтимолового синего и КОН, пока раствор
яблочной кислоты не станет зеленым (рН 7,0). Этот раствор, а также
тростниковый сахар, витамины и агар добавляют к
картофельному фильтрату. Дистиллированной водой доводят объем до 1 л,
кипятят до растворения агара и стерилизуют при 1 атм.
АММОНИФИКАЦИЯ
Процессы разложения азотсодержащих соединений с
выделением аммиака называются аммонификацией. Аммонификация
имеет важное значение для питания растения. Процесс этот
осуществляется бактериями в аэробных и анаэробных условиях.
нуклеиновой кислоты добавляют в агаровую среду
непосредственно перед автоклавированием (1 атм) и разливают среду в чашки
после охлаждения до 50°. Делают посев почвенной суспензии на
твердую среду. После инкубации поверхность агара заливают 1 н.
НС1. Положительная реакция: появление вокруг колоний
прозрачной зоны, свидетельствующей о наличии ДНКазной или РНКазной
активности.
Второй метод. Этот метод используют только для
выявления бактерий, разлагающих ДНКазу. Перед автоклавированием
добавляют 100 мг толуидинового синего на 1 л среды,
содержащей 0,2% ДНК. Вместо толуидинового синего может быть
использован раствор метилового зеленого в концентрации 0,005%,
Положительная реакция: появление ярко-розовой зоны вокруг
колоний на чашках с толуидиновым синим и бесцветной зоны на
зеленом фоне чашки с метиловым зеленым. Эти методы дают более
четкую для наблюдения реакцию на ДНКазу, чем первый. Метод
пригоден только для работы с аэробными бактериями.
НИТРИФИКАЦИЯ
Процесс нитрификации может проводиться как автотрофными,
так и гетеротрофными бактериями и грибами. Хемоавтотрофные
бактерии-нитрификаторы превращают аммоний в азотистую и
азотную кислоты. Азотистую кислоту образуют бактерии I фазы,
азотную — II фазы нитрификации.
Для выделения и учета аммонийокисляющих бактерий (I фаза
нитрификации) используют среду Сориано и Уокера
(The Prokaryotes, 1981) следующего состава (г/л): (NH4)2S04—
0,5; КН2Р04 —0,2; СаС12.2Н20—0,04; MgS04-7H20—0,04; цитрат
железа — 0,0005; раствор микроэлементов—10 мл; 0,05%-ный
раствор фенолового красного—1 мл; вода дистиллированная.
Раствор микроэлементов (мг/л): трилон Б—500; FeS04• 7Н20—200;
ZnS04 • 7Н20—10; СиС12 • 2Н20— 1; МпС12 • 4Н20—3; Н3В03—30;
СоС12-6Н20—20; NiCl2.6H20—2; Na2Mo04-2H20 —3; вода
дистиллированная; рН среды 7,5—7,8. Наличие индикатора в среде
Сориано и Уокера, изменяющего окраску при подкислении,
позволяет судить о развитии процессов нитрификации.
Нитрифицирующие бактерии II фазы выделяют на среде Ват-
сона и Уотербери (The Prokaryotes, 1981) следующего
состава (г): NaN02 —0,07; MgS04-7H20 —0,1; СаС12.6Н20 —0,006;
К2НР04 — 0,02; К2НР04 — 0,02; раствор микроэлементов — 1 мл
(см. выше); водопроводная вода — 700 мл; дистиллированная
вода— 300 мл; рН среды после стерилизации — 7,5. Стерилизуют при
1 атм.
Численность нитрифицирующих бактерий определяют методом
предельных разведений путем инокуляции сред разведениями
почвенной суспензии. Посев инкубируют при 25—30° в течение 3—4
недель. О развитии нитрификаторов судят по изменению состава
среды. Через 2—3 недели после посева в среде для возбудителей
72
I фазы нитрификации проводят реакцию на аммоний с реактивом
Несслера, а на азотистую кислоту — реактивом Грисса. При
изучении возбудителей II фазы нитрификации проводят пробу на
азотистую кислоту реактивом Грисса и в случае отсутствия
азотистой кислоты на азотную кислоту с дифениламином (несколько
кристаллов дифениламина помещают в концентрированную серную
кислоту — 2—3 капли на предметном стекле — и добавляют
несколько капель культуральной жидкости; в присутствии МОз~
(появляется темно-синее окрашивание).
Рост нитрификаторов на среде Сориано и Уокера
сопровождается подкислением среды, при этом цвет индикатора меняется от
красного к желтому. Выделить чистую культуру
нитрифицирующих бактерий чрезвычайно трудно. Для этого необходимо
использовать среды, полностью лишенные органических веществ, причем
колонии, образуемые этими бактериями, крайне малы. Кроме того,
нитрифицирующие бактерии растут очень медленно, и поэтому их
культуры часто загрязняются другими микроорганизмами.
Для выделения чистой культуры из активной накопительной
делают серию 10-кратных разведений. Чистые культуры, как
правило, получают в 7—8 разведениях. Посевы инкубируют при 25—
30° в течение 1—4 мес для выявления роста в последних
разведениях. Из последних разведений, где был обнаружен процесс
нитрификации, еще раз делают серию 10-кратных разведений и так
повторяют до тех пор, пока не будет выделена чистая культура.
Чистые культуры аммонийокисляющих бактерий поддерживают на
среде Хармза с соавторами (The Prokaryotes, 1981). Наличие в
среде СаСОз обеспечивает постоянство рН, а адсорбция на нем
бактерий способствует их длительному выживанию.
Состав среды Хармза (г/л): NH4C1 — 0,5; MgS04*7H20—
0,1; KH2P04 —0,02; FeS04-7H20 —0,01; CaC03 —2,5; раствор
микроэлементов (см. выше) — 1 мл; вода дистиллированная.
Стерилизуют при 1 атм, рН среды после стерилизации 7,5—8,0. Для
получения плотной среды к среде добавляли 10 г агара «Дифко».
Проверка чистоты выделенных нитрификаторов производится
путем микроскопирования с целью определения морфологической
однородности, после чего делают рассев на ряд сред, содержащих
органические соединения. Используют следующие среды:
картофельный агар, МПБ (1 : 10), МПБ (1 : 30) с дрожжевым
экстрактом и глюкозой (1%). После 2 недель инкубирования посевы
проверяют на присутствие посторонней микрофлоры, после чего
делают выводы о чистоте выделенной культуры (автотрофные нитри-
фикаторы на этих средах не растут).
Использование этой методики позволяет выделить из почвы
представителей родов: Nitrosomonas, Nitrospira, Nitrosolobus,
Nltrobacter.
В последнее время большое внимание уделяется изучению
нитрификации, вызываемой гетеротрофными микроорганизмами, в
том числе бактериями. Для учета гетеротрофных нитрификаторов
разведения почвенной суспензии высевают в чашках Петри на ере-
ду следующего состава (г/л): сухой питательный агар — 3,5; агар^.
13,5; (NH4)2S04— 0,5; вода дистиллированная; рН 7,0—7,2. По-
сев инкубируют при комнатной температуре в течение 5—10 дней.
Когда появятся отдельные бактериальные колонии, на них наносят
по капле реактив Грисса. Покраснение указывает на образование
нитритов из аммония, введенного в состав среды.
Для выделения чистой культуры гетеротрофных нитрификато*
ров среда Годе и Овербека разливается по 25 мл в колбы Эрлен-
мейера объемом 100 мл и заражается колонией бактерий, анало*
гичной той, что дала покраснение от реактива Грисса. Колбы
инкубируют при температуре 28°. Наличие гетеротрофной нитрифика*
ции отмечается по образованию розовой или красной окраски сре«
ды ;при добавлении реактива Грисса. Среда Годе и Овербека для
гетеротрофных нитрификаторов (г/л): ацетат натрия — 2;
NH4C1 —2; NaHC03 —0,4; MgS04-7H20 — 2,4; СаС12 —0,4;
фосфатный буфер, 1 М раствор, рН 7,2—20 мл; раствор
микроэлементов (см. с. 72)—5 мл; вода дистиллированная. Раствор
микроэлементов и фосфатный буфер добавляют к среде после
стерилизации.
ДЕНИТРИФИКАЦИЯ
Денитрификацию рассматривают как приспособление бактерий
к окислению органических или неорганических субстратов в
анаэробных условиях с использованием нитратов в качестве
конечного акцептора электронов в дыхательной цепи. Поэтому для
выделения денитрифицирующих бактерий используют обычные
питательные среды, учитывая физиологические особенности тех групп
организмов, которые предстоит выделить. При этом общее
правило— добавление в среду нитратов (до 1%) и создание условий
лимитирования по кислороду (залив среды в пробирки высоким
слоем, инкубация в анаэростате, вытеснение кислорода
инертными газами и т.д.). Существенным является определение продуктов
восстановления нитратов в процессе денитрификации (N02~, NO,
N20, N2).
Определение нитритов с помощью реактива
Грисса. Для этого готовят два раствора.
1. Раствор сульфаниловой кислоты: 0,5 г сульфа-
ниловой кислоты растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты.
Добавляют 100 мл дистиллированной воды и фильтруют. Раствор
устойчив в течение месяца.
2. Раствор а-нафтиламина: 0,1 г а-нафтиламина
растворяют в 100 мл кипящей дистиллированной воды. Остужают и
добавляют 30 мл ледяной уксусной кислоты. Раствор фильтруют
и хранят не более недели.
Непосредственно перед употреблением смешивают равные
объемы этих растворов.
Определение газообразных продуктов
денитрификации. Наиболее распространенным является метод
определи
ения газообразных продуктов денитрификации с применением
Лцетилена в качестве ингибитора редуктазы закиси азота. В при-
Зутствии ацетилена (10% от объема) последовательное
восстановление продуктов денитрификации блокируется на стадии
образования закиси азота (N20), по уровню накопления которой в
газовой фазе судят о протекании денитрификации. Для этого
производят посев в пробирки объемом 10 мл или в пенициллиновые
флаконы, закрывают их резиновыми пробками, фиксируют зажимами,
обеспечивающими герметичность, и удаляют кислород путем
вытеснения аргоном. После того как культура вырастает, отбирают
шприцем пробы газа и определяют присутствие закиси азота
методом газовой хроматографии. Технические параметры прибора
приведены на с. 236.
Для выделения денитрифицирующих бактерий часто
используют следующие среды.
Нитратный агар (г/л): мясной экстракт — 3; пептон — 5;
КЫОз— 1; агар— 12; вода водопроводная.
Берут навеску почвы 1 г, делают разведения и распределяют
почвенную суспензию по поверхности среды на чашках Петри.
Засеянные чашки инкубируют (3—5 дней) в анаэробных условиях,
отдельные колонии переносят в жидкую среду того же состава;
пробирки инкубируют в течение недели. Образование закиси
азота свидетельствует о процессе денитрификации.
Минеральная среда. Раствор А (г): КгНРС^-ЗНгО —
0,87; КН2Р04 — 0,54; КШ3—5,0; (NH4)2S04—1,0; глюкоза —4,0;
дистиллированная вода — 980 мл. Раствор В: MgS04-7H20 —
2 г; дистиллированная вода—100 мл. Раствор С (г): СаСЬХ
Х2Н20 —0,2; FeS04'7H20 — 0,1; MnS04-H20 — 0,05; Na2Mo04X
Х2Н20 —0,01; CuS04-5H2 — 0,01; 0,1 н. НС1—100 мл.
Добавляют стерильно 10 мл раствора В и 10 мл раствора С к
раствору А. Если хотят работать с твердой средой, то добавляют
1,5% агара. Посев производят на чашки Петри, которые помещают
в анаэростат, вытесняют воздух аргоном и инкубируют при 28° в
течение 3 сут. Затем колонии пересевают на скошенный агар в
пробирках и помещают в анаэростат на 2—3 сут. Образование
закиси азота свидетельствует о процессе денитрификции.
Обнаружение и учет бактерий, участвующих
в круговороте углерода
АЭРОБНОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ
В аэробных условиях целлюлозу гидролизуют в основном
представители порядка Myxobacterales подпорядка Soranginae
семейства Sorangiaceae, а также представители порядка Gytopha-
gales семейства Gytophagaceae (роды Cytophaga, Sporocytophaga).
Для накопления целлюлозных бактерий предложено несколько
элективных избирательных сред.
75
Среда Гетчинсона (г/л): К2НРО4—1,0; СаС12 —0,1;
MgS04 — 0,3; NaCl — 0,1; FeCl3 — 0,01; NaN03 —2,5; вода дистил-
лированная; рН 7,2—7,3.
Среда Виноградского (г/л): КН2Р04—1,0; MgS04 —
05; NaCl — 0,5; FeS04 —0,01; MnS04 — 0,01; KNO3 — 4,0;<:аСОз—
20,0; вода дистиллированная. Добавлением 10%-ного раствора
К2СО3 рН среды доводится до 7,2.
50 мл одной из этих сред наливают в колбу Эрленмейера на
250 мл, на дно колбы опускают складчатый бумажный фильтр,
направленный конусом вверх, и стерилизуют при 1 атм.
Содержимое колбы засевают комочком почвы. Через 4—5 сут при 28°
можно наблюдать за изменением бумаги. Аэробные бактерии на
уровне жидкости образуют налет желтого или оранжевого цвета.
Когда бактерии хорошо разовьются, они нарушат целостность
бумаги— фильтр постепенно оседает и на нем образуется слизь.
Если подобный опыт проводить не в «олбе, а в пробирке со
средой и опущенной в нее полоской фильтровальной бумаги, то
картина разложения получается более полной.
При использовании кремнекислых пластинок на них помещают
стерильные кружки фильтровальной бумаги и заливают 3—5 мл
одной из приведенных выше сред. Затем на бумагу наносят
исследуемую почву в виде 25—30 комочков исследуемой почвы. Вокруг
комочков почвы на поверхности фильтровальной бумаги
развиваются колонии целлюлозоразрушающих бактерий, которые спустя
5—7 сут образуют окрашенные зоны. Рост различных
целлюлозоразрушающих бактерий проявляется по-разному. Микообактерии
дают влажные слизистые зоны, сравнительно медленно
распространяющиеся по поверхности фильтровальной бумаги. Такого же
характера зоны, только окрашенные в оранжевый цвет,
наблюдаются у спороцитофаг. Культуры же рода Cetlvibrio образуют
менее влажные зоны, которые отличаются от других тем, что
размеры их быстро увеличиваются, а бактерии разлагают бумагу на
отдельные волокна. Наряду с микроскопическими наблюдениями
бактерий остатки неразложившейся фильтровальной бумаги
переносят на воронку с бумажным фильтром, масса которого заранее
известна. Сюда же смывают горячей водой из чашки всю слизь и
отдельные волокна бумаги, находящиеся на поверхности геля.
Затем осадок на фильтре промывают горячим 1%-ным раствором
еоды, а потом соляной кислотой. Кислоту смывают горячей
дистиллированной водой. После высушивания определяют массу
оставшейся клетчатки. Зная исходную массу и массу в конце опыта, по
разности вычисляют процент разложившейся клетчатки.
По методу почвенных пластинок Кристенсена почву,
обогащенную соединениями калия и азота (2 мл 1,5%-ного раствора KN03
на 50 г почвы) и увлажненную до полной влагоемкости,
помещают толстым слоем в чашки Петри. На поверхность почвы
кладут стерильную фильтровальную бумагу или обеззоленный фильтр
и хорошо приглаживают, чтобы бумага плотно прилегала к почве
и была достаточно увлажнена. Чашки с пластинками инкубируют
76
влажной камере в течение нескольких недель. На поверхности
^°маги появляются пигментные зоны и неокрашенные пятна,
свидетельствующие о разрушении клетчатки.
Другой способ предусматривает кроме обнаружения целлюло-
зоразлагающих бактерий их количественный учет. Для этого
используют среду Винограде к ого следующего состава (г/л):
К2НР04—1.0; (NH4)2S04—1,0; MgS04 —0,5; NaCl — 0,5; агар —
20,0; вода водопроводная.
' Среду разливают в чашки Петри и дают ей остыть. После это-
г0 в чашку вносят почвенную суспензию в разведении 1 : 10 —
1: 1000 (в зависимости от количества микроорганизмов) и
равномерно распределяют ее шпателем по поверхности агара. Затем на
поверхность агара кладут стерильный обеззоленный фильтр и
прижимают его к агаровой пластинке. Чтобы избежать высыхания,
чашки выдерживают во влажной камере в термостате при 28° в
течение 1—2 недель. За этот срок на бумаге вырастают отдельные
колонии плесневых грибов, актиномицетов и бактерий и можно
подсчитать, сколько микроорганизмов — разрушителей целлюлозы
содержится в 1 г почвы.
Численность целлюлозоразрушающих бактерий можно
определить также на агаризованной среде Гетчинсона с целлюлозой
(1%). В качестве источника углерода используют целлюлозный
порошок, измельченную на терке фильтровальную бумагу,
микрокристаллическую целлюлозу, обойный клей КМЦ. Обойный клей
следует размочить в холодной воде (2—3 ч), добавить к
минеральной основе и стерилизовать среду при 1 атм. Целлюлозный агар
можно применять для выделения, количественного учета и очистки
целлюлозоразрушающих организмов. На таком агаре растут
многие организмы, а наличие целлюлолитической активности удобно
определить по прозрачным зонам вокруг колоний. Недостаток
метода состоит в том, что культуры быстрорастущих
микроорганизмов могут вытеснять виды, развивающиеся медленно.
Для количественного учета аэробных цел л юл о-
зоразлагающих бактерий пользуются также методом
предельных разведений. Посев разведений почвенной суспензии
производят в пробирки с жидкой средой Гетчинсона с полосками
фильтровальной бумаги. О развитии целлюлозоразлагающих бактерий
судят по разрушению полосок фильтровальной бумаги.
АНАЭРОБНОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ
В условиях ограниченного доступа воздуха целлюлозу
разлагают в основном представители рода Clostridium. Для выделения
анаэробных бактерий, разлагающих целлюлозу, используют
среду Ом елянского (г/л): К2НР04—1; MgS04—1; NaCl —1;
(NH4)2S04— 2; СаСОз — 2; фильтровальная бумага — 30; вода
дистиллированная. Для получения накопительной культуры
анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий часто
пользуются средой Имшенецкого (г/л): NaNH4HP04—1,0;
КН2Р04 — 0,5; К2НРО4 —0,5; MgS04 — 0,4; NaCl-0,1; MnSO
FeS04—1 капля 1%-ного раствора, пептон — 5,0, СаСОэ 2 0*
фильтровальная бумага—15,0; рН 7,0—7,4. Для накопительных* и
чистых культур: МПБ — 500 мл; СаСОз — 2 г; фильтровальная
бумага— 15 г; водопроводная вода — 500 мл.
Жидкие питательные среды разливают высоким слоем в высо~
кие пробирки. Фильтровальную бумагу нарезают полосками ц
опускают на дно пробирки. Засевают комочками почвы и
инкубируют в термостате при температуре 30—35° (обнаружение мезофи-
лов) и 60° (поиск термофилов).
Количественный учет анаэробных целлюлозоразлагающих
бактерий проводят методом предельных разведений. Посев
производят в несколько параллельных пробирок (не менее 5), которые
инкубируют в термостате, просматривают на 5—7-е сут, отмечая
помутнение. Результаты учета обрабатывают то таблице Мак-
Креди. Полученные данные следует рассматривать как
приблизительные, поскольку бактерии адсорбированы на волокнах
клетчатки, где происходит их развитие, и из-за этого не распределяются
равномерно в воде при приготовлении разведений.
Активное разложение целлюлозы осуществляется также в
строго анаэробных условиях в рубце жвачных животных
представителями родов iRuminococcus, Selenomonas, Bacteroides и некоторых
других. Их выявляют на среде Бентли с соавторами
(г/100 мл): целлюлоза — 1,0; мочевина — 0,168; глюкоза — 0,1;
Na2HP04 —0,113; NaH2P04— 0,109; KCl — 0,043; MgC03 — 0,04;
СаС12 —0,004; Na2S04 — 0,015; Na2C03 — 0,2; FeCl36H20 — 0,044;
/гара-аминобензойная кислота — 500 мкг; биотин — 20 мкг.
Мочевину в растворе стерилизуют через бактериальный фильтр.
Глюкозу и биотин в растворе стерилизуют при 0,5 атм. Остальные
компоненты при 1 атм. Значение рН среды доводят до 6,7—6,9
насыщенным стерильным раствором карбоната натрия.
Выделение и культивирование ведут с соблюдением правил
работы со строго анаэробными бактериями (с. 155).
РАЗЛОЖЕНИЕ ГЕМИЦЕЛЛЮЛОЗЫ
Гемицеллюлоза — неоднородное вещество, состав которого за*
висит от вида растения, возраста и других факторов. В
результате кислотного гидролиза гемицеллюлоза распадается на сахара и
уроновые кислоты. Сахара представлены главным образом
производными пентозанов (арабан, ксилан, арабоксилан), метилпен-
тозанов (рамнозан, фруктозан) и гексозанов (глюкан, фруктан).
Гемицеллюлоза менее устойчива к бактериальному разложению,
чем целлюлоза.
Гемицеллюлозу можно получить в лабораторных условиях из
растительных материалов (солома, опилки) следующим образом
(Сэги, 1983): 600 г тонкоизмельченного растительного
материала 4 раза промывают в воде при 70°, для промывки берут по 4 л
воды. Промывка длится каждый раз по 15 мин, при этом материал
78
оерывно встряхивают. Воду отделяют от промытого материала
лчьтрованием. Затем материал высушивают и 48 ч выдерживают
6 л 4%-ного раствора NaOH, многократно при этом встряхивая.
*аосле обработки щелочью растительный материал отделяют от
пелочи на стеклянном фильтре большого размера и промывают
1 л дистиллированной НгО, которую сливают в сосуд со щелочью.
Затем этот раствор подкисляют уксусной кислотой до появления
хлопьев гемицеллюлозы, добавляют 0,5*л 96%-ного спирта и
отстаивают до полного осаждения хлопьев. Жидкость отсасывают с
помощью водоструйного наооса, а осадок центрифугируют в
течение 30 мин при 2000 об/мин и трижды отмывают осадок в спирте
при центрифугировании. Затем осадок (промывают смесью эфира
и спирта (1:1). Жидкость отделяют от твердого материала на
стеклянном фильтре, используя вакуумный насос. Затем в
вытяжном шкафу осадок дважды промывают чистым эфиром. (В связи
с огнеопасностью реактивов процедуры следует проводить с
большой осторожностью.) После промывания осевшей на фильтре
гемицеллюлозы эфиром ее вначале подсушивают в вытяжном
шкафу, а после испарения эфира высушивают в сушильном шкафу при
60°. Полученный порошок светло-желтого цвета используют для
постановки опытов.
Микроорганизмы, разлагающие гемицеллюлозу, культивируют
на плотной питательной среде следующего состава (г/л):
К2НР04 — 1; MgS04-7H20 — 0,5; KC1 — 0,5; NH4NO3 — 1,5; геми-
целлюлоза — 20; агар — 20; дистиллированная вода. Появление
зоны растворения субстрата вокруг 'колоний микроорганизмов
указывает на использование гемицеллюлозы.
При изучении активности разложения гемицеллюлозы в
жидкой культуре присутствие в питательной среде неиспользованной
гемицеллюлозы определяют при помощи флороглуцинового теста.
Для этого 1 мл культуральной жидкости переносят в пробирку и
прибавляют 10 капель 5%-ного раствора флороглуцина в спирте,
затем на 20 мин помещают в кипящую водяную баню. Если
проба содержит гемицеллюлозу, на дно пробирки выпадает
коричневый осадок.
РАЗЛОЖЕНИЕ КРАХМАЛА
Крахмал составляет незначительную часть растительных
тканей, если не считать семян (где его содержится до 70% от сухой
массы) и некоторых клубней. Он расщепляется в почве с
большой скоростью в аэробных и анаэробных условиях.
Для выделения и учета микроорганизмов, гидролизующих
крахмал, производят посев из почвенной суспензии на крахмало-
аммиачный агар в чашках Петри, подбирая разведение так,
чтобы на чашке было 50—70 колоний бактерий. Если чашки залить
раствором Люголя, то среда окрасится в синий цвет. Зоны вокруг
колоний бактерий, гидролизующих крахмал, либо окрасятся в
жрасно-бурый цвет — гидролиз до'шел до стадии декстринов, либо
останутся бесцветными — гидролиз прошел до стадии образования
сахара. Используемые среды для выявления амилолитической
активности не должны содержать легкоусвояемых Сахаров, так как
это ингибирует использование активности крахмала. Наличие е
почве бактерий, способных к разложению крахмала,* можно
установить, используя метод почвенных комочков. Разложив комочкн
на агар с крахмалом и проведя качественную реакцию, можно
обнаружить бактерии, разлагающие крахмал в почве.
Многие виды целлюлозоразлагающих бактерий, например
некоторые миксобактерии и вибрионы, хорошо развиваются не
только на целлюлозе, но и на крахмале. Для их учета разведения
почвенной суспензии высевают на чашки Петри с питательной
средой Гетчинсона, в которую вместо целлюлозы в качестве
источника углерода вводят 2% крахмала.
В анаэробных условиях крахмал расщепляется в основном са-
^аролитическими клостридиями, для выделения и учета которых
^спользуют с р е д у следующего состава (Мишустин, Емцев, 1974)
(г/л): КН2Р04 — 0,5; К2НР04 — 0,5; MgS04 — 0,5; NaCl — 0,5;
j?eS04— 0,01; СаСОз—10; пептон — 5; смесь микроэлементов по
Федорову (с. 66) — 1 мл; картофельный крахмал — 20; дрожжевой
2#толизат — 5 мл; вода дистиллированная. В среду вносят тио-
г<диколевую кислоту — 0,1—0,05%, а также нейтральрот в
концентрации 0,004%. Автоклавируют при 0,5 атм. После автоклави-
р^вания доводят рН до 7,4—7,5 стерильным раствором щелочи,
g процессе роста клостридии дают на этой среде золотисто-жел-
туЮ флуоресценцию вследствие изменения окислительно-восстано-
в^тельного потенциала среды.
Численность бактерий определяют методом предельных разве-
дений.
РАЗЛОЖЕНИЕ ПЕКТИНА
В качестве межклеточного вещества пектин играет важную
р0<дь в тканях растений, входя в состав срединных пластинок,
обязующихся между стенками соседних растительных клеток.
Особенно богаты пектином ягоды и косточковые плоды. В природе
пе#тин разлагается различными аэробными и анаэробными бак-
тернями, имеющими специфическую пектиназную ферментную
систему.
Дэробные бактерии, способные к разложению пектина,
выявляет на среде следующего состава (г/л): (NH4)2S04— 2,0;
j^^P04—3,0; K?HP04— 4,5; дрожжевой экстракт—1,5; пектин —
5q. MgS04 — 0,3; раствор микроэлементов—1,0 мл; агар—15;
г>пя# дистиллированная. Раствор микроэлементов (мг): FeS04—
2оо; СаС12 —200; Н3В03— 10; MnS04— 10; ZnS04 — 17; CuS04—
50- 'ДО0О2—10; вода дистиллированная—100 мл; рН 7,4. Среду
разЛ**вают по чашкам Петри и засевают разведениями почвенной
суспензии, подбирая их таким образом, чтобы на чашке было 30—
50 #олоний. Инкубируют в течение 10—12 дней при 28°. Заливают
80
оверхность пектинового агара 2%-ным раствором гексадецилтри-
метил аммоний бромида (цетавлона), который осаждает негидро-
лизованный пектин. Вокруг колоний бактерий, разлагающих
пектин, образуются прозрачные зоны.
Анаэробные бактерии, образующие пектолитические ферменты,
выявляют на следующих средах (Мишустин, Емцев, 1974).
Среда для выявления и учета бактерий, образующих прото-
пектиназу (№ 1) (мл): картофельный бульон — 500; вода
водопроводная — 500; дрожжевой автолизат — 5; тиогликолевая кислота —
0,5; рН среды 7,2—7,5. Среду разливают в высокие пробирки и в
каждую добавляют кусочек моркови размером 0,3X1,5 см.
Пробирки засевают разведениями почвенной суспензии.
Положительным результатом являются наличие мацерации моркови и
появление пузырьков газа.
Среда для выявления бактерий, образующих пектинэстеразу
(№2) (мл): картофельный бульон—,1000; дрожжевой
автолизат— 5; тиогликолевая кислота — 0,5; бромтимолблау (0,5%) — 1;
пектин — 7 г; рН 7,2—7,5.
Среда для выявления бактерий, образующих полигалактуро-
назу (№ 3) (мл): картофельный бульон—1000; дрожжевой
автолизат — 5; тиогликолевая кислота — 0,5; нейтраль-рот (0,004 % -
ный) — 1; пектин— 13 г; рН 7,2—7,5.
Среды стерилизуют при 0,5 атм. После стерилизации рН
доводят до 7,2—7,5 стерильной 10%-ной NaOH. Пектин для сред № 2
и 3 растворяют в чистом 96%-ном спирте и приливают в
картофельный бульон, нагретый до 80°. В связи с трудностями
получения хорошего пектинового геля добавляют в питательные среды
(после стерилизации) 0,2% СаС12. Результаты учитывают на
4—7-е сут по изменению окраски индикатора и наличию
газообразования. Численность бактерий определяют методом предельных
разведений.
Для приготовления картофельного бульона 0,5 кг очищенного
и нарезанного картофеля заливают 2 л дистиллированной воды,
кипятят 10 мин, фильтруют, затем добавляют дистиллированной
воды до первоначального объема.
РАЗЛОЖЕНИЕ ЛИГНИНА
Лигнин в количественном отношении — один из главных
компонентов растительных тканей, уступающий только целлюлозе и
стоящий наравне с гемицеллюлозами. Содержание лигнина в
деревянистых тканях составляет от 18 до 30% сухой массы. Этот
растительный продукт, образующийся в довольно больших
количествах, наиболее медленно подвергается биологическому разложению.
Главную роль в разложении лигнина играют грибы, хотя
участвовать в этих процессах способны также некоторые бактерии.
Для получения накопительных культур и выделения
микроорганизмов, разлагающих лигнин, лучше всего использовать
очищенный лигнин из растительных тканей. При этом следует избегать
методов выделения, основанных на действии сильных кислот,
щелочей или высоких температур. Лигнин, близкий к нативному,
удается получить с помощью метода Бьоркмана (Шлегель, 1987). Для
этого еловую древесину сначала растирают с толуолс}м до
образования суспензии, а затем отделяют от толуола, высушивают и из
полученной древесной муки экстрагируют лигнин диоксаном; при
этом в раствор переходит около половины всего содержащегося в
древесине лигнина. Выделенный лигнин может служить
единственным источником углерода для бактерий. Можно получать
накопительные культуры некоторых бактерий (Flavobacterium, Agrobac-
terium, Pseudomonas) на минеральных средах с лигнином в
качестве единственного источника углерода. Концентрация лигнина не
должна превышать 0,5%.
Для выделения и количественного учета бактерий, способных
к разложению лигнина, используют агаризованную среду Чапека
с 0,5% лигнина в качестве единственного источника углерода.
Необходимо при постановке опыта пользоваться очищенным от
примесей агаром, поскольку в противном случае сопутствующие
бактерии будут использовать загрязнения «как источник энергии и
это затруднит выделение организмов, разлагающих лигнин. На
поверхность питательной среды с лигнином производят посев
почвенной суспензии и инкубируют в термостате во влажной камере
при 28°. Через 3—4 недели на (поверхности среды появляются
колонии микроорганизмов, способных к разложению лигнина.
Окончательно убедиться в способности бактерий разлагать
лигнин можно в жидкой среде с лигнином в качестве
единственного источника углерода.
РАЗЛОЖЕНИЕ ХИТИНА
Хитин формально можно рассматривать как целлюлозу, в
которой гидроксильные группы при 2-м углеродном атоме остатков
глюкозы замещены ацетилированными аминогруппами. Хитин
широко распространен в почве, это главный компонент клеточной
стенки многих грибов. На среде с хитином в основном выделяются
стрептомицеты, а также представители родов Flavobacterium,
Bacillus, Cytophaga, Pseudomonas, Nocardia и некоторые коринепо-
добные бактерии.
Для выделения и учета почвенных бактерий, способных к
разложению хитина, используется следующая среда (г/л):
К2НР04 — 0,7; КН2Р04 — 0,3; MgS04 — 0,5; FeS04 — 0,01;
ZnS04 — 0,001; MnCl2 — 0,001; хитин (порошок) — 10; агар —20;
вода дистиллированная. рН среды доводят до 8 после автоклави-
рования стерильным 5 н. раствором NaOH, на чашки со средой
дроизводят посев почвенной суспензии. Спустя 7—10 дней
наблюдают появление прозрачных зон гидролиза хитина вокруг хитин-
полсжителькы: колоний.
Для культивирования разлагающих хитин бактерий применяют
среды, в которых это соединение служит единственным источником
82
углерода и азота. Берут или готовый препарат хитина,
производимый зарубежными фирмами, или извлекают его из крыльев
насекомых. Наиболее часто используют метод извлечения хитина из
крыльев майских жуков: 1000 штук крыльев (примерно 13 г)
промывают холодной водой, затем многократно кипятят в
дистиллированной воде и обрабатывают 3%-ным раствором NaOH до тех
пор, пока биуретовая реакция не даст отрицательный результат.
После этого промывают холодной, а затем теплой водой до
удаления из материала щелочи (до нейтральной реакции). Затем в
течение нескольких часов вываривают в 1%-ном растворе НС1 и
вновь промывают. Затем на 8—10 ч погружают в 2%-ный раствор
КМп04. Выпадающие в осадок окислы марганца растворяют
многократно сменяемой 1%-ной щавелевой кислотой. Остающееся
после промывания белое вещество несколько часов выдерживают
в 96%-ном апирте, затем спирт удаляют, а материал в течение
нескольких минут кипятят в эфире на водяной бане при 50° и
высушивают. Перед использованием полученный грубый порошок
белого цвета при 0° растворяют в конц. НС1, переосаждают
ледяной дистиллированной водой и солянокислый раствор сливают.
Биуретовый реактив. В 200 мл 0,2 н. раствора NaOH
растворяют 45 г Na — К-тартрата. В таком же количестве
раствора той же концентрации отдельно растворяют 5 г CuS04 и 5 г
KI. Растворы объединяют и добавляют 0,2 н. раствор NaOH и
доводят объем до 1 л. Реактив хранят в плотно закрывающемся
сосуде из темного стекла.
РАЗЛОЖЕНИЕ ГУМУСОВЫХ ВЕЩЕСТВ БАКТЕРИЯМИ
Разложение гумусовых веществ микроорганизмами — важная
составная часть круговорота углерода, играющая большую роль в
обеспечении высших растений азотом и элементами минерального
питания. Способность к разложению перегноя свойственна
довольно широкому кругу микроорганизмов. Для выявления и
количественного учета бактерий, минерализующих гумусовые вещества,
используют несколько методов.
Метод капилляров Перфильева и Габе в модификации
Аристовской
В естественных условиях в почве бактерии развиваются
преимущественно в капиллярах, стенки которых образованы
почвенными частицами. Б. В. Перфильев и Д. Р. Габе сконструировали
капиллярный прибор — педоскоп (см. рис. 5), который помещают
в почву и после экспозиции в 30 и более дней извлекают. Под
микроскопом просматривают микроорганизмы, развившиеся в
капиллярах.
Т. В. Аристовская предложила использовать метод
Перфильева и Габе для изучения микроорганизмов почвы, участвующих в
разложении гумусовых веществ. Стенки педоскопов покрывают
питательной средой, содержащей фракцию гумуса. В качестве пита-
тельного субстрата применяют органо-минеральные комплексы
гумуса, свойственные исследуемому типу почв.
Для 'покрытия стенок капилляров средой педоскоп боковой
стороной помещают в чашку Петри с агаризованной гумусовой
средой, которая заполняет отверстия капилляров. Затем поверхность
педоскопа тщательно протирают стерильной ватой, подсушивают,
среда в этом случае покрывает только стенки капилляров.
Следует тщательно следить, чтобы среда не образовывала в каналах
капилляров перемычек, которые будут мешать циркуляции по
капиллярам почвенного раствора и в дальнейшем будут затруднять
просмотр и окрашивание бактерий.
Для выявления и количественного учета бактерий,
минерализующих гумусовые вещества, применяют метод Виноградского в
модификации Теппер, который заключается в следующем.
Отмытые от следов хлора и прокипяченные гелевые пластинки
пропитывают минеральной средой без источника углерода и азота
(в г на 200 мл дистиллированной воды): К2НРО4 — 0,1; MgS04—
0,5; NaCl — 0,5; FeS04-7H20 —0,01; MnS04-4H20 — 0,01. В чаш-
ку вносят 3—5 мл минеральной среды, в которую добавляют 0,3 г
СаСОз и 10—50 мг гуматов натрия. Иногда добавляют азот в виде
КЖ)з (14 мг в чашку).
Пропитанные таким образом гелевые пластины подвергают
дробной стерилизации в кипятильнике Коха, после чего их
заражают разведениями почвенной суспензии (10~2, Ю-*3). Чашки
помещают в эксикатор, на дно которого налита вода, и ставят в
термостат при 28°. Через 50—60 дней инкубации производят подсчет
выросших на поверхности гелевых пластин с гуматами мелких
колоний бурого и желто-бурого цвета. Диаметр отдельных колоний
достигает 0,5—1,0 мм, после 4 мес инкубации 1,0—2,5 мм. Более
крупные колонии бактерий образуются, если гуматы используют
только как источник углерода.
На этой среде вырастают в основном представители нокардио-
подобных и коринеподобных бактерий родов Nocardia, Rhodo-
coccus, Arthrobacter и Micromonospora. Этим же путем можно
выявить и количественно учесть бактерии, участвующие в
разложении фульвокислот. В этом случае к основной минеральной среде,
указанной выше, добавляют 10—50 мг фульвокислоты. Для
получения гуминовых и фульвокислот лучшим материалом является
кислый, хорошо разложившийся низинный торф или верхний слой
кислой торфянистой почвы. Торф просевают через сито с ячейками
3—4 мм и обрабатывают 1 н. раствором НС1 в соотношении 1 : 4
(торф : кислота) при получасовом встряхивании. Обработка торфа
производится для удаления из него Са, Fe и других оснований.
После отстаивания в течение 24 ч соляную кислоту сливают, а
почву многократно промывают 0,05 н. раствором НС1. Промывание
продолжают до полного удаления ионов Са2+, а затем
дистиллированной водой из торфа удаляют и ионы С1~.
К декальцинированному и промытому торфу добавляют 0,1 н.
раствор NaOH, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и
Ы
сТавляют на 24 ч. В щелочной раствор переходит комплекс
гуминовых веществ. Отстоявшуюся темно-коричневую жидкость осто-
пожно сливают и фильтруют на бумажном фильтре, а затем
стерилизуют фильтрованием через стерильный мембранный фильтр в
стерильные сосуды или цилиндры. В этих же цилиндрах
производят осаждение гуматов путем прибавления 4 н. H2S04 (108млконц.
H2SO4 в 1000 мл Н20) до рН 2—3. Подкисленную жидкость
подогревают до 80° и отстаивают 24 ч. В результате подкисления и
нагревания гуминовые соединения коагулируют и оседают на дно сосуда, в
растворе остаются фульвокислоты, окрашивающие его в желтый
цвет. Раствор сливают в другой сосуд. Осажденные гуматы натрия
промывают дистиллированной водой до полного удаления ионов (по
реакции с Ва(ОН)2). Наиболее удобный способ отделения воды от
гуминовых веществ — центрифугирование, так как коллоиды
засоряют поры фильтров. Осадок гуминовых кислот высушивают под
феном досуха и хранят в виде порошка. По мере необходимости
нужную навеску растворяют в 0,02 н. раствора NaOH и
употребляют для работы.
Для изучения разложения фульвокислот жидкость, слитую
после осаждения гуминовых кислот, фильтруют через фильтр
G-4 и упаривают при 80—90° на песчаной бане. Выпаривание
продолжают до выделения из раствора кристаллов Na2S04. Затем
содержащий фульвокислоты раствор сливают с кристаллов Na2S04
и лиофильно высушивают. Фульвокислоты растворяют в
дистиллированной воде до нужной концентрации, стерилизуют через
бактериальный фильтр и вводят в состав питательной среды.
Процесс разложения гуминовых веществ чистыми культурами
бактерий идет очень медленно. Внесение в среду легкорастворимых
соединений азота и глюкозы ускоряет процесс разложения
гуминовых веществ. Д. И. Никитиным предложена следующая среда
для культивирования разлагающих гумус организмов (г/л):
К2НР04 — 0,05; КН2Р04 — 0,05; MgS04 — 0,04; NaCl — 0,1;
СаС12 — 0,01; (NH4hS04 — 0,5; глюкоза—10,0; гумат натрия —
25—50 мг. Разложение гуминовых веществ наблюдают на
качалке при 28°. Уже через несколько дней наблюдается обесцвечивание
раствора, свидетельствующее о разложении гумусовых веществ
культурами микроорганизмов. Наиболее высокий процент
обесцвечивания приходится на долю бактерий рода Pseudomonas.
ОКИСЛЕНИЕ ЖИРОВ
Микроорганизмы гидролизуют жиры, попадающие в почву из
растительных и животных остатков, отмерших клеток
микроорганизмов. Эти соединения далее разлагаются почвенными
микроорганизмами (до С02 и Н20). Среди аэробных почвенных бактерий
способностью окислять жирные кислоты обладают представители
«многих родов сапрофитных бактерий. Для выявления бактерий,
гидролизующих жиры, используют питательную среду Рана
{т/л): К2НР04 —2; (NH4)3P04 —3; MgS04.7H20 — 1; СаС12— 1;
NaCl — 1; вода дистиллированная. В конические колбы разливаю?
питательную среду, чтобы глубина слоя составляла 10—15 см, ц
добавляют 3% касторового масла, стерилизуют при 1 атм и
засевают разведениями почвенной суспензией.
При разложении бактериями жиров в питательной среде на*
капливаются жирные кислоты, о чем свидетельствует помутнение
прозрачного касторового масла. Количественный учет проводя*
методом предельных разведений. О содержании свободных жирных
кислот можно судить по кислотному числу. Для его определение
присутствующие в питательной среде жиры экстрагируют смесьнз
этилового спирта и эфира (1 : 1), а затем титруют 0,1%-ным pad
твором КОН. В качестве индикатора используют фенолфталеин;
Этот метод может быть применен для выявления и
количественного учета бактерий, разлагающих жиры различных типов. Он
основан на окрашивании жиров нильским голубым сернокислым,
Окрашенный жир добавляют к расплавленной агаризованной
среде, разливают среду по чашкам Петри и производят посев
почвенной суспензии. Положительная реакция: образование синего
ореола вокруг колоний. Метод основан на том, что нейтральные жиры
окрашены в красный цвет, а жирные кислоты в синий.
Использование нильского голубого
сернокислого для окрашивания жиров. Готовят насыщенный
водный раствор нильского голубого сернокислого, добавляют к нему
1 н. раствор NaOH по каплям до прекращения образования
осадка. Фильтруют и промывают осадок дистиллированной водой при
рН 7,5. Высушивают и хранят до использования. Готовят
насыщенный раствор оксазинового основания нильского голубого
сернокислого, используя приготовленный сухой осадок. Окрашивание
жира: смешивают 1 мл раствора красителя с 10 мл жира (трибу-
тирина, триолеина, говяжьего сала, молочного жира, кокосового,
кукурузного, хлопкового масла и т. п.). При необходимости смесь
помещают в подогреваемую водяную баню для поддержания жира
в жидком состоянии в течение всей последующей процедуры
промывания. Процедура промывания: для промывания жиров,
находящихся при комнатной температуре в жидком состоянии, к
смеси красителя и жира в делительной воронке добавляют 2 объема
диэтилового эфира. Эфирный красный слой отделяют от слоя
воды и несколько раз промывают водой (Осторожно: эфир легко
воспламеняется!). Наконец, отделяют эфирный слой, в котором
находится жир, и выпаривают эфир на роторном испарителе.
Отделяют жир от остатков воды в делительной воронке, стерилизуют
автоклавированием при 0,5 атм и хранят в холодильнике. Перед
применением добавляют 1 мл окрашенного жира к 10 мл
расплавленной стерильной минеральной среды (например, среды Рана),
хорошо перемешивают и разливают по чашкам.
В случае жиров, находящихся при комнатной температуре
в твердом состоянии, смесь красителя с жиром промывают
несколько раз горячей водой и затем разливают жир в
расплавленный нейтральный 0,5%-ный агар —по 10 мл жира на 90 мл агара.
86
«Стерилизуют автоклавированием. Перед использованием жир
растапливают и вносят 1 мл жировой эмульсии в 20 мл
расплавленной стерильной основной среды. Смесь хорошо перемешивают и
разливают по чашкам. Чашки засевают разведениями почвенной
суспензии и подсчитывают на 5—7-е сут число колоний, вокруг
которых появляется синий ореол на розовом фоне.
Определенная трудность при постановке опытов по разложению
жиров связана с тем, что жиры не смешиваются с водой. Поэтому
часто вместо жиров в среду вводят твины — эфиры жирных кислот
я сорбита. Твин-40 содержит пальмитиновую, твин-60 —
стеариновую, а твин-80 — олеиновую кислоту. Твины хорошо растворимы
в воде и имеют нейтральную реакцию. Состав среды (г/л):
твин— 10,0; шштон—10,0; NaCl — 5,0; СаС12-Н20 —- 0,1; агар —
20,0; рН среды 7,4. Готовят среду без твина и стерилизуют ее при
1 атм. Водный раствор твина соответствующей концентрации
стерилизуют при 0,5 атм и добавляют к стерильной основной среде.
Среду разливают в чашки Петри. Засеянные чашки Петри
выдерживают в термостате при нужной температуре. На наличие
липазы указывает образование вокруг штриха или «колонии
непрозрачной зоны Са-солей жирных кислот, освобожденных из твина.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ И СПИРТОВ
Многие почвенные бактерии могут использовать в качестве
единственного источника углерода и энергии органические
кислоты. Для выявления бактерий, способных к росту на средах с
органическими кислотами, рекомендуется агаризованная среда
следующего состава (г/л): (NH4)2HP04 — 0,5; MgS04-7H20 —0,2;
NaCl — 0,1; Na- и К-соли органических кислот — 2; агар «Диф-
ко»— 15; вода дистиллированная.
Для выявления бактерий, способных к росту на средах с
высокомолекулярными спиртами (маннит, сорбит, инозит и т.д.),
рекомендуется агаризованная среда следующего состава (г/л):
(NH4)2S04—1; КО — 0,2; MgS04 —0,2; спирты—10; агар
«Дифко»—15; вода дистиллированная.
СРЕДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РОСТА БАКТЕРИЙ НА УГЛЕВОДОРОДАХ
Среда с гексадеканом (Егоров, 1976) (г/л): КН2Р04 —
0,6; Na2HP04— 1,4; MgS04 — 0,8; MnS04 — 0,1; KN03 — 2;
FeS04—следы; вода водопроводная. рН среды 6,9—7,2 доводят
сухим Na2C03. В другой модификации среды количество KN03
увеличивают до 8 г/л. Среду стерилизуют при 1 атм и добавляют
по 2 мл гексадекана на 100 мл среды.
Среда Мюнца (г/л): KN03 —1,0; КН2Р04 —0,14;
Na2HP04 — 0,6; NaCl—1,0; MgS04 — 0,1; вода
дистиллированная— 0,5; вода водопроводная — 0,5.
Среда Бушнелла — Хааса (г/л): NH4N03—1,0;
К2НР04—1,0; КН2Р04—1,0; MgS04 —0,2; СаС12-0,02; FeCl3-
-следы: вода водопроводная.
Среда Гавриленко (г/л): (NH4)2HP04 —2,0; КН2Р04 —
0,5; NaCl — 0,5; MgS04— 0,7; вода дистиллированная — 0,2; вода
водопроводная — 0,8.
Среда Фрея иХагана (г/л): NH4C1 —0,5; К2НРО4— 0,5;
Ыа2СОз — следы; MgS04 — 0,2; вода водопроводная.
С р е л а К (г/л): KN03— 1,0; К2НР04 — 1,0; КН2Р04 — 1,0;
NaCl— 1,0; MgS04 —0,2; СаС12 —0,02; FeCl3 —0,001; вода
водопроводная.
рН сред 6,8—7,0, агаризованные среды содержат 2% агара.
В среды Мюнца, Бушнелл— Хааса добавляют 2% н-алканов
Ci2—С2з, в среду Фрея и Хагана —0,5% Ci2—С2з и 0,5% С20—С29,
в среду Гавриленко — 0,5—2% спиртов (метанол, этанол, я-пропа-
нол, я-бутанол). Среду К используют для выделения бактерий^
окисляющих газообразные углеводороды (этан, пропан, бутан).
Окисление этана, пропана, бутана
Бактерии, использующие газообразные углеводороды (этан,
пропан, бутан), выделяют из жидких накопительных культур,
полученных на средах Мюнца и К. Пробирки или колбы с жидкими
средами заражают навесками почвы (1—10% от массы среды) и
помещают в вакуумный эксикатор, откуда частично откачан
воздух и создана атмосфера, состоящая из смеси этана (пропана,
бутана) а воздуха в равном соотношении. Чистые культуры
получают методом рассева накопительных культуры на
агаризованные среды того же состава. Для приготовления сред
используют очищенный агар. Инкубируют чашки в той же атмосфере,
что и накопительные культуры.
Окисление этанола, пропанола, бутанола
Бактерии, окисляющие эти соединения, изучают на среде
Гавриленко, куда добавляют этанол, н-пропанол, и-бутанол в
количестве 0,5-^-2% (объемная доля).
Окисление алканов с длинной цепью (Ci2—С2з)
Алканы с длинной цепью используются очень многими
бактериями, по мере удлинения цепи растет число видов, способных
использовать эти соединения, а также активность их использования.
Применяют среды с гексадеканом, среду Мюнца, среду Бушнелл —
Хааса.
Ароматические углеводороды
Растения синтезируют разнообразные ароматические
соединения, которые попадают в почву. Способностью к расщеплению
таких соединений с разрывом ароматического кольца обладают
многие бактерии. Некоторые бактерии способны расщеплять
полициклические углеводороды, например нафталин, антрацен, фанан-
трен. Бактерии, способные использовать ароматические
углеводороды, могут быть получены из жидкой накопительной культуры,
а также на агаризованных средах. Следует иметь в bhhv. чтп мил-
гие ароматические углеводороды в больших концентрациях
токсичны для бактерий и содержание их в средах не должно
превышать 0,05—0,1%. Хороший рост бактерий может быть получен, если
ароматические вещества присутствуют не в жидкой, а в
воздушной фазе. Для этого может быть применен ряд приспособлений
(рис. 9).
Рис. 9. Рост бактерий на жидких углеводородах:
Л — в колбе; Б — на чашке; 1 — пробка; 2 — углеводород; 3 — отверстие; 4 —
жидкая среда; 5 — твердая среда
БАКТЕРИИ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕ ОДНОУГЛЕРОДНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
Метан, его окисленные и замещенные производные
((^-соединения) широко распространены в природе. Многие микроорганизмы
обладают способностью использовать эти Ci-соединения в
качестве источника углерода и энергии. Эти организмы объединяют в
группу метилотрофов. Некоторые метилотрофы способны расти
лишь на одноуглеродных производных метана, другие могут
использовать также и полиуглеродные соединения, которые метабо-
лизируются этими микроорганизмами с разрывом —С—С— связей.
Такая способность является важным дифференцирующим
признаком метилотрофов, в связи с чем их принято разделять на обли-
гатных и факультативных.
Особое место среди метилотрофов занимают бактерии,
способные расти на метане. Для их обозначения в литературе принят
термин «метанотрофы» (метанокисляющие, метаниспользующие
микроорганизмы). Метанотрофы также принято делить на обли-
гатные и факультативные формы. Облигатные метанотрофы —
группа метилотрофных организмов, способных использовать в
качестве источника углерода и энергии метан и его одноуглеродные
замещенные и окисленные производные, но не соединения,
содержащие —С—С— связи. Облигатные метанотрофные бактерия
составляют физиологически и таксономически обособленную
группу бактерий, включенных в семейство Methyloooccaceae, с родами
Methylomonas, Methylobacter, Methylosinus, Methylocystis, Methy-
lococcus на основании способности использовать метан и его
окисленные и замещенные одноуглеродные производные в качестве
источника углерода и энергии.
Факультативные метанотрофы — группы метилотрофов,
способных использовать в качестве источника углерода и энергии как
метан и его производные, так и полиуглеродные соединения.
В настоящее время факультативные метанотрофы являются
относительно малоизученной группой. В большинстве случаев их
способность расти на метане не представляется однозначно дока-
Количественный учет метанотро-
фов производят методом посева
почвенной суспензии на поверхность
плотной среды или методом
предельных разведений в жидкой
среде. Посевы инкубируют в
вакуумных эксикаторах, заполненных
смесью метана и воздуха (1:1). При
определении численности методом
предельных разведений разведения
почвенной суспензии вносят в спе-
Рис. 10. Рост метанотрофов:
а — пробирка для культивирования
бактерий на плотных средах; 1 —
стекловата; 2 — металлический колпачок; 3—
пробирка; б — устройство для диализа
среды (силикагеля): / — стеклянная
воронка; 2 — прижимные диски; 3 —
диализная мембрана из целлофана
циальные пробирки с металлическими колпачками с 5 мл
стерильной жидкой среды (рис. 10) и инкубируют в эксикаторе с мета-
но-воздушной смесью (1:1) в течение 2—4 недель при 30, 37, 45,
55°.
Состав среды (Гальченко и др., 1986) (г/л): KN03—1,0;
MgS04-7H20 — 0,2; СаС12 — 0,02; Na2HP04-5H20 — 1,5; KH2P04—
0,7; раствор микроэлементов—1 мл; вода дистиллированная; рН
среды 7,0. Среду стерилизуют при 1 атм в течение 1 ч, фосфаты
стерилизуют отдельно и после остывания смешивают с остальными
стерильными компонентами. Раствор микроэлементов
(г/100 мл): трилон Б —0,5; FeS04 —0,2; ZnS04 —0,01; MnCl2 —
on
0,003; ОоС12 —0,02; CuCl2 —0,01; NiCl2 —0,002; Na2Mo04 — 0,003;
вода дистиллированная.
О развитии бактерий судят по помутнению среды. Численность
определяют методом предельных разведений.
Выявление и определение численности метанотрофных
бактерий проводят также методом посева почвенной суспензии на
плотную питательную среду того же состава. Для уплотнения среды
используют агар «Дифко» (2%) или силикагель, приготовленный
по следующему методу. Для приготовления силиката натрия в
40—50%-ный раствор NaOH при постоянном и интенсивном
перемешивании вносят порошок хроматографического силикагеля до
насыщения раствора. 500 мл раствора НС1 (пл. 1,09) смешивают
с 500 мл силиката натрия (пл. 1,10). Для предотвращения
образования аморфного осадка раствор силиката натрия осторожно
вливают в кислоту при тщательном перемешивании стеклянной
палочкой. Полученный золь кремневой кислоты очищают от
хлоридов диализом против дистиллированной воды в течение 4—5 сут
при комнатной температуре в специальном устройстве (рис. 11,6).
Наличие хлоридов контролируют по реакции с 1%-ным
раствором AgNCb.
По окончании диализа силиказоль разливают по 200 мл в
колбе и стерилизуют при 1 атм 1 ч. Затем золь смешивают со
стерильной средой 5-кратной концентрации (рН 7,6) в отношении
4:1 и разливают в стерильные чашки Петри. Для приготовления
косяков золь (4 мл) разливают в пробирки с колпачками, в
верхней части 'которых находится стекловата, и стерилизуют, как
описано выше. Затем вносят по 1 мл стерильной среды 5-кратной
концентрации в каждую пробирку с силиказолем, которые помещают
в специальный штатив для приготовления косяков, где силиказоль
превращается в силикагель.
При определении численности облигатных метанотрофов на
плотной среде следует иметь в виду, что колонии облигатных
метанотрофов растут довольно медленно, и на предложенной среде
через 3—4 дня вырастают бактерии-спутники. Поэтому
рекомендуется просматривать посевы каждые 3—4 дня в течение 3—4
недель, отмечая очень мелкие колонии диаметром примерно 0,2 мм,
увеличивающиеся в размере с возрастом. Окончательно убедиться
в принадлежности к облигатным метанотрофам можно, только
исследуя чистые культуры выделенных бактерий.
Для выделения чистых культур выросшие колонии или каплю
взвешенной в жидкой среде культуры наносят на поверхность
плотной минеральной среды и растирают шпателем. Этим же шпателем
инокулируют растиранием последовательно 4—5 чашек со средой
(истощающийся посев) (рис. 11). Рост колоний на поверхности
плотной среды контролируют визуально ^ под микроскопом при
небольшом увеличении в течение 2—4 недель. Пересев отдельных
колоний производят платиновой петлей или иглой при контроле
под микроскопом на плотную среду в пробирках с одновременным
ПОСеВОМ МатеПИЯЛЯ ТПИ WA ifnnnHuw uo ппгпт1иттллггт,л ~тТ ~
Рис. П. Проверка микробных культур на чистоту
среды (МПА и глюкозо-картофельный агар) для выявления
гетеротрофных спутников. Выделенные и выросшие культуры вновь
проверяют на чистоту (микроскопически и посевом на
органические среды) и пересевают в жидкую среду.
О чистоте и облигатности выделенных культур метанотрофов
судят на основании однородности колоний и клеток при световой
и электронной микроскопии (тотальные препараты и срезы) и по
отсутствию роста на органических средах (МПА, МПБ, глюкозо-
картофельный агар, сусло-агар, минеральная среда с 1% глюкозы
и без нее).
Метилотрофные бактерии, использующие метанол и (или)
метилированные амины, называют метилобактериями. Облигатные
метилобактерии — подвижные и неподвижные грамотрицательные
палочки, имеющие один полярный жгутик. В настоящее время их
объединяют в 3 рода: Methylopkilus, Methilobacillus, Methylophaga.
Факультативные метилобактерии — грамотрицательные палочки,
кокки и другие морфологические типы. В таксономическом
отношении— это представители родов Hyphomicrobium, Prostheco-
microbium, Acetobacter, Blastobacter, Xanthobacter, Microcyclus и
некоторые другие. Облигатные и факультативные метилобактерии
обычно выделяют на среде Хирша с метанолом в качестве
единственного источника углерода и энергии.
Среда Хирша (г/л): КН2Р04—1,36; Na2HP04-7H20 —
2,13; (NH4)2S04 —0,5; MgS04-7H20 — 0,2; СаС12-2Н20 — 10 мг;
FeS04.7H20 — 5 мг; MnS04.5H20 — 2,5; Na2Mo04-2H20—2,5 мг;
GO
ар—15; вода дистиллированная; рН среды 7. Среду автоклави-
руют при 1 атм и после стерилизации добавляют метанол в
количестве 4 мг/л. На этой среде выделяются как облигатные, так и
факультативные метилобактерии. Убедиться в облигатности или
факультативности выделенных бактерий можно только в процессе
изучения физиологии чистых культур.
МЕТАНОГЕНЫ
Метанобразующие бактерии представляют собой
высокоспециализированную группу бактерий, получающую энергию для
жизнедеятельности за счет образования метана. Метан может
образовываться либо в реакции восстановления углекислоты водородом, что
свойственно всем метанобразующим бактериям, либо при
восстановлении ограниченного числа органических соединений, таких,
как ацетат, метанол, метиламин, к чему способны лишь немногие
формы.
Метанобразующие бактерии по ряду признаков отличаются от
типичных прокариотных и эукариотных организмов; к этим
свойствам относятся строение и состав клеточных стенок (отсутствие
мурамовой кислоты и аминокислот), своеобразный липидный
состав, уникальный набор коферментов и некоторые другие
особенности. На основании этого их относят к працарству архебактерий,
третьему первичному царству после эубактерий и эукариот. Мета-
ногены крайне разнообразны по морфологии, особенностям
промежуточного обмена, липидного состава и состава клеточных стенок.
В настоящее время их объединяют в 3 порядка Methanomicrobia-
les, Methanobacteriales, Methanococcales, с 6 семействами, 13
родами.
Экологически метанобразующие бактерии относятся к группе
так называемых вторичных анаэробов, использующих для своего
обмена продукты обмена первичных анаэробов-бродилыциков, а в
качестве акцептора электронов — углекислоту. Метаногены
развиваются в сложной популяции, включающей разные виды
анаэробных бактерий, связанные между собой трофическими связями.
Поэтому выделение и культивирование метаногенов в чистой
культуре, в противоположность накопительной, оказываются нелегкой
задачей и требуют строгого соблюдения ряда приемов.
Конструктивный обмен метаногенов довольно разнообразен.
Среди них имеются организмы, способные расти в чисто
минеральной среде в присутствии водород-углекислотной смеси, есть
организмы, способные расти на единственном органическом
веществе (ацетат, метанол). Большинство метанобразующих бактерий,,
выделенных из рубца или сточных вод, используя водород-углекис-
лотную смесь для энергетического обмена, нуждаются в
добавлении отдельных факторов роста, к которым относятся жидкость из
рубца, триптиказа, дрожжевой экстракт, казаминовые кислоты,,
набор витаминов группы В.
Активное изучение метаногенов началось с 60-х гг. с введением
в практику лабораторных работ анаэробной техники Хангейта.
С некоторыми модификациями эта техника используется в
настоящее время во многих лабораториях. При выделении чистых
культур метаногенов требуется специальная анаэробная техника,
так как многие из них быстро гибнут при контакте с кислородом
воздуха. Среды готовят под током углекислоты; газы — азот и
углекислоту,— которые используют при приготовлении среды и для
заполнения газового пространства в сосудах для культивирования,
очищают от следов кислорода пропусканием через колонку с
гранулированной медью, нагретой до 350° (см. Методы
культивирования строгих анаэробов, с. 158).
Предложено несколько вариантов сред для выделения
метаногенов из природных объектов. Наиболее простой из них является
среда, предложенная С. С. Беляевым (Кузнецов,
Дубинина, 1989) (г/л): NH4C1 — 0,75; КН2Р04—1,0; MgCl2-6H20 —
0,02; К2НРО4 —2; СаС12-6Н20 — 0,01; NaHC03 —2,0; вода
водопроводная— 0,1; вода дистиллированная — 0,9.
Для контроля окислительно-восстановительных условий
добавляют раствор резазурина — 0,2 мл 0,2%-ного раствора. Автокла-
вируют при 1 атм. Для удаления следов кислорода и снижения
окислительно-восстановительных условий среду перед посевом
кипятят, продувают бескислородным С02 и вносят 4 мл/л 3%-ного
раствора Na2S-9H20 в 0,5%-ном растворе Na2C03. В качестве
органических факторов роста добавляют 2 мл/л дрожжевого автоли-
зата и 20 мл/л простерилизованной культуральной жидкости мета-
носарцины. Значение рН доводят до 7,0 8%-ным раствором
Na2C03.
Пробы природного материала,
например переувлажненной почвы,
отбирают при помощи стерильного
шприца, сполоснутого
восстановителем (раствором, содержащим 10—
20 мг/л H2S), во флаконы,
предварительно продутые углекислотой и
закрытые герметически. Разведения
делают в стерильной воде,
содержащей 10—20 мг/л H2S во
флаконах из-под пенициллина,
предварительно продутых углекислотой.
Флаконы продувают углекислотой, на-
Рис. 12. Штатив с флаконами для ливают 5 мл стерильной питатель-
культивирования метаногенов ной среды, опять продувают
углекислотой, вносят по 1 мл инокуля-
та (разведений-почвенной суспензии), еще раз продувают
углекислотой и закрывают резиновыми (лучше из бутиловой резины)
пробками. Далее флаконы помещают в металлические штативы-
держатели (рис. 12) и с помощью двух иголок от шприцев
вытесняют углекислоту газовой смесью, содержащей 80% Н2 и 20%
94
го2. Газовую смесь готовят в газометре, запорная жидкость
которого содержит 20 мг/л H2S.
Время инкубации 1 мес при 28—30°. Предварительный учет
численности осуществляют по величине образовавшегося вакуума,
измеренного «количеством стерильной жидкости, необходимой для
компенсации отрицательного давления, а окончательно — по
наличию метана, выявляемого на газовом хроматографе с пламенно-
ионизационным детектором. Учет численности метаногенов
проводят методом предельных разведений, а статистическую обработку
по таблицам Мак-Креди.
Иногда в среду для культивирования метаногенов добавляют
вместо дрожжевого экстракта и жидкости из-под метаносарцины
раствор жирных кислот, раствор витаминов группы В, рубцовую
жидкость, раствор микроэлементов.
Раствор жирных кислот (мл): пропионовая—14,8;
я-масляная — 10,6; изомасляная — 1,8; я-валериановая — 2,0; изо-
валериановая — 2,0; ДЛ-2-метилбутерат — 2,0. Добавляют 0,75 мл
этого раствора иа 1 л среды.
Раствор витаминов группы В по Волину (The Рго-
karyotes, 1981). Некоторые метанобразующие бактерии
нуждаются в витаминах группы В. Эти витамины стерилизуют
фильтрованием через ультрафильтр и добавляют к стерильной среде.
Иногда они могут быть заменены дрожжевым экстрактом. Смесь
витаминов (мг/л): биотин — 2; пиридоксин—10; тиамин — 5; пан-
тотеновая кислота — 5; /г-аминобензоат — 5; фолиевая кислота —
2; рибофлавин — 5; никотиновая кислота — 5; витамин Bi2 — 0,1;
тиоктовая кислота — 5; вода дистиллированная. Хранят в темном
прохладном месте в атмосфере N2. Добавляют 10 мл этого
раствора на 1 л среды.
Раствор микроэлементов: вода дистиллированная —
200 мл; нитрилуксусная кислота—1,5 г. Доводят рН до 6,5
раствором КОН. Добавляют дистиллированную воду до 600 мл.
Растворяют соли в порядке (перечисления (г): FeS04-7H20— 0,1
(можно заменить на FeCl3-4H20 — 0,2); МпС12-4Н20 —0,1;
СоС12.6Н20 — 0,17; СаС12-2Н20 —0,1; ZnCl2— 0,1; CuCl2 —0,02;
Н3ВО3 —0,01; Na2Mo04—0,01; NaCl— 1,0; Na2Se03 —0,017.
Доводят объем дистиллированной водой до 1 л. Если образовался
коричневый осадок Fe(OH)2, удаляют его фильтрацией. Хранят
раствор под N2. Стерилизуют при 1 атм. Добавляют в количестве
2 мл на 1 л основной среды.
При выделении бактерий из рубца в среду добавляется
жидкость рубца — 30% от объема среды. Осветленную рубцовую
жидкость получают путем процеживания последней через два слоя
марли и с последующим центрифугированием при 15 000—20 000 g
в течение 30 мин. При взятии больших количеств рубцовой
жидкости ее удобно консервировать хлороформом из расчета 1 часть
хлороформа на 10 частей содержимого и сохранять до
использования в холодильнике.
95
Для выделения и количественного учета метаногенов,
использующих иные источники энергии, чем fib, используют ту же среду,
содержащую ацетат (5 г/л), формиат (2 г/л), метанол (5-~
10 мл/л). В качестве газовой фазы используют смесь N2 и С02
(80 и 20% соответственно). При развитии метаногецов на средах
с этими соединениями развивается избыточное давление и
флаконы могут лопнуть.
Специально для работы с анаэробами по методике Хангейта
Виргинский политехнический институт (США) разработал
оборудование для анаэробной лаборатории. В ней используют пробирки
Хангейта, которые выпускает фирма «Беллко Глас Инкорпорей-
тед». Это литые пробирки 16x130 см с навинчивающимися
колпачками из пластмассы, устойчивой к автоклавированию.
Пробирки имеют пробку из непроницаемой для кислорода бутиловой
резины толщиной 6 мм. Посев проводят, прокалывая пробку
шприцем и так же отбирают пробы. Благодаря стандартным размерам,
хорошему стеклу и удобной пробке, пробирки очень удобны для
работы с анаэробами.
Для выделения и количественного учета метанобразующих
бактерий в агаризованных средах наибольшее распространение
получили посевы во вращающихся пробирках (роллингах).
Полностью ^подготовленные пробирки со средой стерилизуют, и
расплавленный агар помещают в водяную баню. В такой агар
производят посев разведений почвенной суспензии. Пробирки вращают
вручную или в специальном вращающемся зажиме. Пробирку с
застывшим агаром снимают и сохраняют в вертикальном
положении, так как скапливающийся конденсат может смыть посев.
Выделение чистых культур метаногенов производят методом
рассева активных накопительных культур на агаризованные среды
в чашках Петри в анаэробном боксе (см. Методы
культивирования строгих анаэробов). Чистые культуры могут быть также
получены при выделении отдельных колоний, вырастающих во
вращающихся пробирках по Хангейту. Выделение также следует
проводить в анаэробном боксе. Проверку чистоты культур
метанобразующих бактерий следует проводить очень тщательно. Микроско-
пирование культур на разных стадиях роста дает ценное указание
на однородность культуры. Помимо обычных сред для банальной
микрофлоры необходимо проверять культуры на присутствие суль-
фатредуцирующих бактерий — частых спутников метанобразующих
бактерий. Кроме того, возможно присутствие анаэробов со
своеобразным обменом, участвующих в синтроф'ных ассоциациях с ме-
танобразующими бактериями. Особенно жесткие требования к
чистоте культуры предъявляются в том случае, когда исследуют
использование метанобразующими бактериями иного субстрата, чем
водород-углекислотная смесь.
ВОДОРОДНЫЕ БАКТЕРИИ
Главный источник образования водорода — деятельность
микроорганизмов в почвах и водоемах. Способность выделять водород
.96
в процессах метаболизма присуща преимущественно анаэробным
бактериям, осуществляющим брожение. Из аэробных бактерий
водород образуют азотфиксирующие бактерии — клубеньковые,
азотобактер и другие; выделяют водород также пурпурные,
зеленые и сине-зеленые бактерии и некоторые водоросли. В почвах
широко распространены бактерии, способные использовать
молекулярный водород.
Группа аэробных водородокисляющих (водородных) бактерий
представляет собой физиологически обособленную группу
организмов, способную использовать газообразный водород как донор
электронов, а кислород как акцептор и синтезировать белок из
С02. В строгом смысле это факультативные автотрофы, они могут
расти также в гетеротрофных условиях на одном или нескольких
органических субстратах. Водородные бактерии составляют единую
физиологическую группу, довольно разнообразную в
таксономическом отношении, это представители родов Alcaligenes, Para-
coccus, Aquaspirillum Comamonas, Thiobacillus, Rhodopseudomo-
nas, Azotobacter, Azomonas, Microcyclus, Hyphomicrobium и др.
Культивирование водородных бактерий имеет ряд
особенностей, оно возможно лишь в специально оборудованных
лабораториях, приспособленных для применения значительных объемов
взрывоопасных газов. Нами приводятся наиболее доступные
методы, применяемые при изучении водородных бактерий. Для
выделения и культивирования водородных бактерий используется
среда Шлегеля (The Procaryotes, 1981).
Раствор 1 (г/л): Na2HP04- 12H20 — 9,0; КН2Р04—1,5;
NH4C1 — 1,0; MgS04- 12H20 — 0,2; раствор микроэлементов— 1 мл;
вода дистиллированная. Раствор 2: железо аммиачное
лимоннокислое— 50 мг; СаС12-2Н20—100 мл; вода дистиллированная —
100 мл. Раствор 3: NaHCCb— 5,0 г; вода дистиллированная —
100 мл. Стерилизуют фильтрованием. Раствор
микроэлементов (мг/л): ZnS04-7H20— 100; МпС12-4Н20 — 30; Н3В03 —
300; СоС12-6Н20 — 200; СиС12.2Н20—10; NiCl2-6H20 — 20;
Na2Mo04-2H20 — 30; дистиллированная вода. После стерилизации
и охлаждения растворы 1, 2 и 3 смешивают в соотношении
1000 мл: 10 мл : 10 мл. Для приготовления плотной среды
добавляют 2% агара «Дифко».
Культивирование водородных бактерий удобнее всего
проводить в колбах Бунзена со вставленной в резиновую пробку или
припаянной пробиркой. Переворачивая колбу так, чтобы культура
переливалась в пробирку, можно измерять мутность растущей
культуры, не вскрывая колбы. В колбу на 300 мл наливают 20—
30 мл среды, заражают 1—2 г почвы, помещают на магнитную
мешалку, откачивают воздух до 0,1—0,2 атм и заполняют газовой
смесью из газометра. Газовые смеси готовят смешением газовых
потоков или в газометрах. Из газов, получаемых в стальных
баллонах, следует обращать внимание на чистоту водорода. Для
водородных бактерий пригоден водород, полученный
электролизом.
Состав газовых смесей для водородных бактерий обычно вклю-:
чает 70% Н2, 20% 02 и 10% С02. Можно работать со смесью из
30% Н2 и 70% воздуха. При этом в колбе будет избыток азота,
и только около половины объема газовой фазы оказывается
полезной. Недостающую углекислоту следует вносить в виде
бикарбоната. Колбу присоединяют к газометру и непрерывно подают
газовую смесь. О развитии водородных бактерий судят по
увеличению мутности 'накопительной культуры.
Культуры, в которых обнаруживается сильное помутнение или
пленка, пересевают несколько раз на той же среде, добиваясь
того, чтобы рост был обильным и воспроизводимым. После этого
делают высев из активной накопительной культуры на чашки с
агаризованной средой и инкубируют их в атмосфере Н2, 02, С02.
С чашек проводят выделение чистых культур и проверяют их
способность к автотрофному росту на жидкой минеральной среде.
Однородность выделенных культур устанавливают по
морфологии колоний, выросших на агаризованной минеральной среде в
атмосфере Н2, 02, С02, а также на обычных питательных средах:
МПА и картофельном агаре. Надежными признаками
однородности культуры служит морфологическя картина при
микроскопическом исследовании. Так как водородные бактерии, помещенные в
герметические сосуды с газовой смесью, легко загрязняются,
особенно культурами олигокарбофильных бактерий, чистоте культур
должно быть уделегао значительное внимание.
При работе с водородными бактериями следует иметь в виду
следующие обстоятельства.
1. Все газовые смеси для культивирования водородных
бактерий в высшей степени взрывоопасны! Нижний предел
взрывоопасное™ 5% Н2 в воздухе.
2. Необходимо следить за отсутствием открытого огня и
искрящих электроприборов (щетки электромоторов).
Необходимо помнить, что при развитии водородных бактерий
создается сильное разрежение и сосуд для культивирования может
лопнуть. Поэтому обычно создают резерв газа, подсоединяя сосуд
для культивирования к газометру (с непрерывной подачей газа)
или к иному резервуару. Следует также учитывать значительную
утечку водорода при применении резиновых пробок и шлангов.
КАРБОКСИДОБАКТЕРИИ
Окись углерода относится к важнейшим загрязнителям
атмосферы Земли и поступает в нее за счет антропогенных, а также
естественных природных процессов. Впервые концентрация этого
соединения была определена спектрофотометрически в 1940 г.
Исследования в этом направлении усилились в 60—70-х гг. в
связи с попыткой найти стоки СО. Было показано, что животные и
растения удаляют СО из атмосферы, но процессы эти
малозначимы; установлено, что самым мощным агентом удаления СО из
нижних слоев атмосферы является почва, причем наиболее активен
хорошо аэрируемый верхний слой. Из почвы были выделены
аэробные бактерии, способные окислять окись углерода и использовать
ее в качестве источника углерода и энергии. Они получили
название карбоксидобактерий. Это весьма разнообразная,
специализированная в физиологическом отношении группа микроорганизмов,
обладающая потенциально неограниченными возможностями
удалять из атмосферы СО. Карбоксидобактерий довольно широко
распространены в почве. В таксономическом отношении это
представители родов Pseudomonas, Achromobacter, Comamonas, Sell-
beria.
Карбоксидобактерий обнаруживаются в свежих образцах
почвы, состояние посевного материала существенно, поскольку из
сухих, длительно хранившихся образцов почвы выделить
накопительные культуры СО-окисляющих бактерий практически не
удается. Для получения накопительной культуры требуется большое
количество посевного материала ( — 10%), в посеве разведениями
организмы не обнаруживаются. Прямой посев разведений
почвенной суспензии на агар или силикагель не позволяет выделить
отдельные колонии карбоксидобактерий. Развитие накопительных
культур в жидких средах начинается после длительной фазы
задержки, достигающей нескольких недель, причем появляются
накопительные культуры, содержащие несколько видов
карбоксидобактерий, иногда связанных между собой отношениями
промкооперации.
Для получения накопительной культуры карбоксидобактерий
используется та же среда Шлегеля, что и для получения
водородных бактерий (с. 97). Большое значение при культивировании
карбоксидобактерий имеет снабжение растущих бактерий
газовой смесью. Наибольшее распространение получило
культивирование в колбах Бунзена с 10—20% среды от объема колбы.
Снабжение газами осуществляется при помощи магнитной мешалки,
обеспечивающей полную стерильность и герметичность. Колбу для
культивирования, пробку с газовым фильтром, смазку
стерилизуют то отдельности, засевают с применением открытого огня и
стерильно собирают. После этого в помещении, где нет открытого
огня, колбы откачивают и заполняют газовой смесью до 0,1—
0,2 атм остаточного давления и присоединяют к газометру,
содержащему газовую смесь из 80% СО и 20% Ог. Во время опыта
газовая смесь атмосферы в газометре и соответственно в колбах
обновляется ежесуточно. О развитии бактерий судят по
увеличению оптической 'плотности среды и изменению состава газовой
фазы.
Отбор проб микроорганизмов из культиваторов с газовым
питанием обычными способами затруднен. Поэтому применяют
припаянные к колбе пробирки для измерения мутности, что позволяет
следить за ростом, не нарушая стерильности и герметичности.
Окись углерода обычно приготовляют в лаборатории. К
нагретой до 80° концентрированной серной кислоте в колбе Вюрца с
помощью перистальтического насоса прикапывается концентриро-
ванная муравьиная кислота. Газ 'пропускают через промывалку с
20% КОН. Следует иметь в виду, что окись углерода очень
токсична, а в смеси с воздухом и взрывоопасна, поэтому необходимо
строгое соблюдение правил техники безопасности при работе с
газовыми смесями. В особенности необходимо следить* за
отсутствием открытого огня и искрящих электроприборов.
Для выделения чистых культур карбоксидобактерий делают
рассев активной накопительной культуры на плотную
питательную среду Шлегеля. Инкубируют посевы в герметически
закрывающихся емкостях в атмосфере, состоящей из СО и Ог. Следует
иметь в виду, что окончательно убедиться в способности
бактерий к росту на СО можно только при культивировании ее на
жидкой среде в чистой культуре.
Бактерии, участвующие в окислении и восстановлении
соединений серы
Сера — один из необходимых для жизни элементов, входящих
в состав органических и неорганических соединений. В почву сера
поступает с разлагающимися растительными и животными
остатками, а также присутствует в виде окисленных (сульфаты, поли-
тионаты) и восстановленных (сульфиды, свободный H2S)
соединений, редко — в виде молекулярной серы. Органические и
неорганические соединения серы под влиянием бактерий подвергаются в
почве различным превращениям. Направленность превращений
определяется в основном условиями внешней среды. Бактерии
способны использовать в качестве источника серы сульфат.
Ассимиляция сульфата бактериями сопровождается восстановлением
серы — это ассимиляторная сульфатредукция, процесс
универсальный для бактерий, грибов и зеленых растений, в результате
которого образуется сульфид, необходимый для синтеза
серосодержащих аминокислот.
ОКИСЛЕНИЕ НЕОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ СЕРЫ
Активными окислителями восстановленных соединений серы
являются следующие группы бактерий: тионовые, бесцветные
одноклеточные и многоклеточные (нитчатые) формы, фотосинтези-
рующие пурпурные и зеленые серобактерии. Наиболее широко в
почве представлены тионовые бактерии, бесцветные
одноклеточные и нитчатые формы обнаруживаются главным образом в
грязевых водоемах, фотосинтезирующие свойственны водным
средам— пруды, озера, морские лагуны.
Тионовые бактерии получают энергию за счет окисления
восстановленных соединений серы (тиосульфата, молекулярная сера
и др.). Окисление сульфидов и тиосульфатов у большинства
проходит через молекулярную серу до сульфатов, у некоторых — до
тетратионатов. Одни виды растут в щелочных условиях, другие —
в кислых. Тионовые бактерии — микроаэрофилы, но некоторые
1ЛЛ
способны развиваться в анаэробных условиях за счет редукции
нитратов.
Среда Бейеринка для выделения Thiobacillus thioparus
(г/л): Na2S203 —5,0; NH4CI —0,1; NaHC03—1,0; Na2HP04 — 2;
MgCb — 0,1; FeS04—следы; водопроводная вода. Тиосульфат и
бикарбонат стерилизуют по отдельности, растворив в небольшом
количестве воды, и после охлаждения добавляют в стерильный
раствор остальные соли. Следы солей железа также необходимо
добавлять после стерилизации общего раствора среды. Начальная
кислотность среды 9,2—9,4. Среду заражают разведениями
почвенной суспензии. При наличии тионовых бактерий в посевном
материале среда мутнеет через 2—4 дня, и на ее поверхности
появляется пленка молекулярной серы, которая образуется при
окислении тиосульфата. Численность тионовых бактерий этой группы
определяют методом предельных разведений.
Среда Ваксмана с серой для выделения Thiobacillus
thiooxidans (г/л): (NH4)2S04 —0,2; KH2P04 —3,0; MgS04 — 0,5;
СаС12—0,25; FeS04 — следы; сера порошковая—10,0; вода
дистиллированная. Кислотность питательной среды (без серы) доводят
до 4. Навески серы помещают в пробирки, вносят туда же жидкую
питательную среду и стерилизуют текучим inapoM при 100° Здня
подряд по 30 мин. Развитие бактерий идет лучше, если серу
заменить серным молоком, которое готовят следующим образом: 2
весовые части серного цвета нагревают с 13 частями воды и 1 частью
гидрата окиси кальция до перехода серы в раствор. Сильно
разведенный раствор пятисернистого кальция осаждают разведенной
НС1. Через 10—12 ч взвешенная сера осаждается в виде
желтовато-белого осадка, который отфильтровывают и сушат в
эксикаторе над СаС12. Эту серу в различных пропорциях прибавляют к
питательным средам.
Жидкую питательную среду заражают разведениями
почвенной суспензии и инкубируют при 28°. Через 7—10 дней в среде
появляется легкая муть, а микроскопирование показывает
наличие бактерий.
ВОССТАНОВЛЕНИЕ СЕРЫ И ЕЕ ОКИСЛЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Главной причиной обогащения почвы сероводородом
(сульфидами) является деятельность строго анаэробных бактерий,
использующих серу и ее окисленные соединения в диссимиляционных
процессах. Эти бактерии получили название сероредуцирующих и
сульфатредуцирующих бактерий соответственно. Сульфатредуци-
рующие бактерии помимо сульфатов восстанавливают сульфит и
тиосульфит. Сероредуцирующие бактерии используют только
молекулярную серу. Все перечисленные соединения, а также
молекулярная сера восстанавливаются до сульфидов.
Сульфатредуцирующие бактерии учитывают посевами на
средах, содержащих небольшие количества солей закисного железа
и граммы сульфата в 1 л. Образующийся при восстановлении
сульфата бактериями сероводород связывается железом с
образованием черного осадка в жидкости или черных колоний в агаре.
Таким образом, рост сульфатредуцирующих бактерий можно
различить на фоне развития в среде других организмов.
При отборе для посева образцов почвы удобно использовать
стеклянные шприцы на 1—2 мл с отпаянными головками. Такой
шприц представляет собой калиброванную трубку с герметичным
поршнем. Перед отбором пробы его стерилизуют в большой
пробирке. Для отбора выдвигают поршень до края трубки, втыкают
ее в почву и, продолжая вдвигать в грунт, медленно оттягивают
поршень. Заполненный почвой шприц возвращают в стерильную
/пробирку. Для посева в первую пробирку для серии разведений
срезают прокаленным скальпелем или шпателем наружный
окисленный слой и выдавливают в засеваемую пробирку 1 см3. При
необходимости сохранения сильно восстановленных условий шприц
перед отбором проб можно споласкивать стерильным раствором
сульфида натрия.
Серии разведений для учета численности сульфатредуцирующих
бактерий должны выполняться только в восстановленных
растворах. Удобно использовать для этого среду, на которой
выполняется посев.
В зависимости от особенностей метаболизма сульфатредуцирую-
щие бактерии используют органические соединения, образуя в
качестве конечного продукта ацетат, или окисляют их до С02.
Окислять органические соединения до ацетата способны
бактерии родов Desulfobulus, Desulfomonas, Thermodesulfobacterium,
отдельные представители Desulfovibrio и Desulfotomaculum. Для
их выявления используют среды Баарса и Постгейта «В» с
осадком, так как первоначальное развитие бактерий происходит в
осадке. Среда Баарса (г/л): NH4C1—1; КН2Р04— 0,5;
CaS04-2H20— 1; MgS04-7H20 — 2; (NH4)Fe(S04)2.6H20 —0,5;
лактат натрия (70%)—3,5; вода водопроводная. Соль Мора
стерилизуют отдельно в сухом виде в маленькой пробирке с ватной
пробкой и добавляют перед посевом. Доводят рН среды до 7,0—7,4.
Среда Постгейта «В» (г/л): NaCl— 1; КН2Р04—0,5;
NH4C1—1; CaS04.2H20— l; MgS04-7H20 — 2; лактат натрия
(70%)—3,5; дрожжевой экстракт—1; аскорбиновая кислота—1;
тиогликолевая кислота—1; FeS04-7H20 —0,5; вода
водопроводная. Аскорбиновую кислоту добавляют перед посевом в виде
5%-ного раствора аскорбиновокислого натрия, который отдельно
стерилизуют в ампулах с выкачанным воздухом. Тиогликолевую
кислоту добавляют перед посевом в виде 5%-ного раствора тио-
гликолята натрия, который стерилизуют отдельно в ампулах.
Сернокислое железо растворяют в 1%-ной соляной кислоте и
добавляют в основную среду перед посевом. Реакцию среды доводят до
рН 7,5, нейтрализуя 5%-ным раствором соляной кислоты или
углекислого натрия. Среда должна иметь низкий
окислительно-восстановительный потенциал, который в самом начале создается
добавлением восстановителя, например сульфида натрия, в концент-
1ЛО
радии 1 мМ. Другим хорошим восстановителем служит смесь тио-
гликолата в концентрации 1 мМ и аскорбиновокислого натрия в
той же концентрации. Оптимальное значение кислотности среды
рН 7,5. Культуры накопления лучше всего ставить в склянках на
30—60 мл со стеклянными пробками, которые смазываются перед
автоклавированием силиконовой смазкой. Заражение производят
0,1—1 г почвы. Склянка наполняется средой так, чтобы после
заражения под пробкой не оставалось пузырьков воздуха.
Окислять органические соединения до С02 способны бактерии
родов Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema, Desulfobacter,
Desulfobacterium, некоторые виды родов Desulfovibrio и Desulfo-
tomaculum. Выделение Dim. acetoxidans осуществляется на среде
Видделя и Пфеннига (Кузнецов, Дубинина,
1989).Основная среда (г/л): Na2S04 — 2,5; КН2Р04 — 0,7; MgCl2.6H20 —
0,4; NH4C1 —0,2; СаС12-6Н20 — 0,13; раствор микроэлементов (см.
с. 104) — 10 мл; вода дистиллированная. После стерилизации и
охлаждения к 1 л добавляют в виде стерильных растворов:
FeCl2.6H20 — 1 мг; Na2CO3-10H2O — 0,57 г; Na2S-9H20 —
0,36 г; раствор витаминов (см. с. 104)—5 мл; Bi2 — 20 мкг.
Доводят рН фосфорной кислотой до 7,1. В качестве
органического вещества вносят ацетат натрия до концентрации 1,24 г/л
либо этанол, бутанол или бутират. Среду Видделя с ацетатом
разливают во флаконы на 50 мл с резиновой прокладкой и
завинчивающейся крышкой. После заражения почвой в питательную
среду добавляют свежеприготовленный и простерилизованный через
мембранный фильтр раствор Na2S204 до концентрации 0,14 мМ.
Путем подбора оптимальных условий для развития культуру
активизируют, пересевая 2—4 раза, затем высевают на агаризованную
среду того же состава, затягивают в стеклянные трубочки или
вносят в пробирки. Появившиеся колонии извлекают пастеровской
пипеткой, /повторно пересевают в трубочки, предварительно
встряхивают в пробирке с расплавленной агаризованной средой после
предварительной пастеризации посевного материала 20 мин
при 80°.
Для количественного учета агаризованную среду (2% агара)
инокулируют разведениями почвенной суспензии, помещая их в
теплый расплавленный агар. После перемешивания пробирки
охлаждают в холодной воде и заливают агаровыми пробками
толщиной 1,5—2 см. Пробирки инкубируют в течение 10—14 сут и
подсчитывают число черных колоний. Чистые культуры получают,
используя стерильные пастеровские ишпетки, изолируя черные
колонии и помещая их в жидкую среду того же состава.
Для выделения и количественного учета сульфатредуцирующих
бактерий применяют метод Штурм. Агаризованную среду
Постгейта наливают в крышку чашки Петри, а затем, после посева
почвенной суспензии на поверхность среды, к последней плотно
прижимают дно чашки, зазор между стеклами дна и крышки
заливают стерильным парафином. Вместо дна чашки можно
использовать круглые стеклянные пластинки. Существенным недостат-
ком метода является миграция бактерий по пленке жидкости,
образующейся между агаром и поверхностью стекла. Поэтому полу,
чить рост анаэробов в виде отдельных колоний удается редко.
Существует модификация метода, предложенная В. И. Дудой.
Агаризованные среды заменяют пластинками стерильной почвы
или смесью тонкодисперсных минералов: каолинита", бентонита,
гипса или силикагеля, пропитанных жидкой средой Постгейта. На
почвенные пластинки наносят каплю почвенной суспензии и
распределяют ее ровно по поверхности пластинки с помощью
стеклянного шпателя. На пластинку помещают кружок стекла (дно
чашки Петри), который плотно прижимают к почве (минеральной
пластинке) так, чтобы удалить пузырьки воздуха. Парафином
заливают часть почвы, находящуюся между краем стеклянной
пластинки и стенкой чашки. Черные колонии сульфидобразующих
бактерий становятся заметными на 3—4-е сут инкубации. Рост
колоний можно наблюдать в течение длительного времени, не
нарушая целостности камер. Учет количества колоний производят
через 3—4 недели.
Выделение сероредуцирующих бактерий рода Desulfuromonas
проводят на питательной среде Пфеннига и Библа
следующего состава. Раствор 1 (г/л): КН2Р04—1; NH4C1 — 0,3;
MgCl2-6H20 — 0,4; СаС12-2Н20 — 0,1; НС1,2М—4 мл; вода
дистиллированная. Раствор 2 (мг/л): FeCl2-4H20—1500; ZnCl2 — 70;
MnCl2.4H20— 100; Н3ВО3 —62; СоС12-6Н20 — 190; CuCl2-2H20—
17; NiCl2.6H20 —24; Na2Mo04-2H20 —36; ЭДТА—5200; вода
дистиллированная; рН доводят до 6,5. Раствор 3 (г/100 мл):
ИаНСОз—Ю; вода дистиллированная. Раствор 4 (г/100 мл):
Na2S-9H20; вода дистиллированная. Раствор 5 (г/200 мл): пи-
ридоксамин солянокислый—10; никотиновая кислота — 4;
тиамин — 2; /г-аминобензойная 'кислота — 2; пантотеновая
кислота— 1; В12—1; биотин — 0,5, вода дистиллированная. К 1 л
раствора 1 добавляют 1 мл раствора 2, 20 мл раствора 3, 6 мл
раствора 4, простерилизованных автоклавированием, и 5 мл
раствора 5, простерилизованного ультрафильтрацией. Доводят рН
среды до 7,2. Среду асептически разливают в предварительно авто-
клавированные склянки объемом 50 мл с завинчивающейся
крышкой и силиконовой прокладкой, под которой оставляется пузырек
воздуха, чтобы «предохранить склянку от разрыва при изменении
давления. Среду сохраняют в темноте.
Следующие вещества готовят в виде стерильных 10%-ных
растворов на дистиллированной воде: 1) ацетат, малат; 2)
источник элементарной серы — серный цвет или полисульфид. Серный
цвет растирают в ступке с дистиллированной водой и автоклави-
руют 30 мин при 0,5 атм. Полисульфид готовят путем растворения
10 г Na2S-9H20 и 3 г серного цвета в 15 мл дистиллированной
воды при нагревании, стерилизуют автоклавированием.
Для получения культуры накопления на ацетате с элементарной
серой кислотность среды доводят стерильным раствором Иа2СОз
до рН 7,8. В каждую склянку вносят 1 мл посевного материала,
104
около 0,1—0,2 г элементарной серы или 3 капли полисульфида и
ацетат до конечной концентрации 0,05%. Склянки инкубируют
1_-3 недели. Увеличение концентрации сульфида до 100—200мг/л
указывает на развитие серобактерий. Эту культуру используют для
выделения чистой культуры. Для этого 3%-ный раствор агара
разливают по 3 мл в пробирки. После стерилизации пробирки
охлаждают в водяной бане до температуры 55°. Основную среду в
50-миллилитровом флаконе обогащают 0,05% ацетата и в
качестве источника серы вносят 3 капли автоклавированного раствора
полисульфида. Среда при этом становится мутной от выпадения
элементарной серы из полисульфида. Среду (подогревают до 40° и
по 6 мл добавляют в пробирки с 3 мл агара. Пробирки держат
при 40° и в них производят серию последовательных разведений
(до 6—8) из культуры накопления, внесенной в первую пробирку.
После посевов пробирки погружают в холодную воду для быстрого
застывания агаровой среды, чтобы предотвратить осаждение серы
на дно. Инкубацию посевов ведут в темноте при 28°. Чистую
культуру получают путем повторных пересевов отдельных колоний
на тот же агар в пробирках с разведениями. Колонии бактерий
рода Desulfuromonas отличаются характерным красноватым или
охристым цветом.
Методы выделения и учета почвенных бактерий, способных
мобилизовать фосфор труднодоступных соединений
Фосфор содержится в почве в основном в виде
труднодоступных минеральных и органических соединений, которые становятся
доступными для растений только после их мобилизации
микроорганизмами.
МЕТОДЫ УЧЕТА БАКТЕРИЙ, РАСТВОРЯЮЩИХ ОРТОФОСФАТЫ КАЛЬЦИЯ
Фосфатрастворяющие бактерии выявляют при посеве
почвенной суспензии (соответствующих разведений) на чашки Петри с
агаризованной средой по зонам растворения фосфата вокруг
колоний этих микроорганизмов. Четкие зоны формируются в том
случае, когда плотная агаровая среда достаточно мутна, а количество
нерастворимого фосфата в ней сравнительно невелико. Поэтому
наибольший эффект дает внесение свежеосажденных солей. Такая
среда предложена Г. С. Муромцевым. Основа ее следующая
(г/л): глюкоза — 10; аспарагин — 1; K2SO4 — 0,2; MgS04 — 0,2;
агар (очищенный)—20; кукурузный экстракт — 0,02;
водопроводная вода. Стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Фосфаты кальция —
Са3(Р04Ь — вносят в питательную среду методом осаждения,
предложенным Герретсеном, в модификации Муромцева
следующим образом: в стерильную расплавленную агаризованную среду
вносят (из расчета на 1 л) 3,3 г СаСЬ-бНгО (можно в небольшом
избытке), после его растворения добавляют 3,8 г Na3P04- 12H2(X
Соли вносят в сухом виде, что обеспечивает их постепенное взаи-
модействие по мере растворения. При этом по расчету на 1 л ере*
ды приходится 1,5 г свежеосажденного Са3(РС>4)2.
Приготовленную таким образом питательную среду разливают по 20 мл в чаш*
ки Петри и после застывания агара засевают, нанося на ее
поверхность почвенную суспензию, которую растирают шпателем.
Используют разведение 10~4—10~6. Чашки инкубируют при 27° в течение
2—10 сут. Подсчитывают колонии, вокруг которых имеются зоны
растворения фосфата кальция.
Наряду с вышеописанным методом можно воспользоваться и
готовыми препаратами фосфатов, но зоны растворения будут
менее отчетливыми. Рекомендованы следующие количества фосфатов
для внесения в агаризованную среду (г/л): Саз(Р04Ь — 4,5;
фосфорит— 6—7; апатит — 8—10. Порошок фосфата вносят в горячий
расплавленный агар, доводят до кипения, чтобы простерилизовать
внесенные соли, дают отстояться для осаждения крупных частиц,
после чего среду разливают в чашки Петри и засевают, как обычно.
МЕТОДЫ УЧЕТА БАКТЕРИЙ, РАСТВОРЯЮЩИХ ОРТОФОСФАТЫ А1 И Fe
В кислых почвах минеральные соединения фосфора
представлены в основном фосфатами А1 и Fe. Используют методы, сходные
с вышеописанными, но свежеосажденные фосфаты получают из
солей А1 и Fe. Для этого смешивают по 10 мл стерильных
(пропущенных через фильтр Зейтца) растворов Na3P04 и А1С13 (для
получения А1Р04) или FeCl3 (для получения FePCU). После
тщательного перемешивания осажденный фосфат вместе с надосадоч-
ной жидкостью вносят в расплавленный глюкозоаспарагиновый
агар (см. выше).
Согласно расчету на 1 л среды берут 570 мг Na3P(V12H2C) и
362 мг А1С13-6Н20 или 405 мг FeCl3-6H20. Готовая среда
содержит 264 мг А1Р04-ЗН20 или 280 мг FeS04-2H20 в 1 л.
Кислотность среды доводят до рН 6,8 10%-ным раствором NaOH. Агар
имеет хорошо выраженную мутность. Посев почвенной суспензии
проводят, как обычно. После инкубации вокруг колоний активных
штаммов хорошо видны зоны просветления.
МЕТОДЫ УЧЕТА БАКТЕРИЙ, РАСТВОРЯЮЩИХ ФИТАТЫ КАЛЬЦИЯ,
АЛЮМИНИЯ И ЖЕЛЕЗА (ОРГАНОФОСФАТЫ)
Органические соединения фосфора в почве представлены ино-
зитфосфатами, фосфорсодержащими протеинами, нуклеиновыми
кислотами и др. Из них наиболее устойчивы (и поэтому
преимущественно накапливаются) фосфаты инозита — фитаты, на долю
которых иногда приходится до 50% органического фосфора почвы.
В нейтральных и щелочных почвах содержатся в основном фитаты
Са и Mg, а в кислых — фитаты А1 и Fe. Для учета в почве
количества бактерий, способных растворять фитаты, их обнаруживают
описанным выше методом, используя элективную среду — глюко-
зо-аспарагиновый агар с внесенным в него фитатом.
В качестве фитата Са и Mg применяют коммерческий
препарат фитин (кальций-магниевая соль инозитфосфорной кислоты)*
который предварительно растворяют и 'переосаждают. Для этого
0,5 г препарата растворяют в 10 мл 1 н. НС1 и добавляют 1 н.
NaOH до рН 7,0. При этом выпадает мелкозернистый осадок
фитата Са или Mg, который после отстаивания и отделения надоса-
дочной жидкости вносят в 500 мл глкжозо-аспарагиновой среды.
Соли А1 и Fe получают из коммерческого фитина. Для этого
препарат растворяют в 2%-ной НС1 и осаждают фосфат
концентрированным водным раствором FeC^. Обильный осадок фитата Fe
отделяют на воронке Бюхнера и промывают НС1 до тех пор, пока
послесмывной фильтрат не перестанет мутнеть при нейтрализации
NaOH до рН 7,0.
Аналогичным путем с помощью А1С13 получают фитат А1 с той
разницей, что перед внесением хлористого А1 рН раствора фитина
в соляной кислоте доводят с помощью NaOH до 3,5. Осадок
фитата А1 отмывают на воронке таким же раствором. Полученные
фитаты А1 и Fe вносят в горячий глюкозо-аспарагиновый агар в
количестве 0,1%, тщательно размешивают до получения
равномерного помутнения среды, рН доводят до 7,0. Производят посев
разведениями почвенной суспензии, инкубируют при 28° и спустя
10—12 сут подсчитывают число колоний, вокруг которых
образовались зоны просветления за счет растворения органофосфатов.
Железобактерии
В почве железо представлено различными органическими и
неорганическими соединениями. Оно содержится в составе
минералов, образует сложные комплексы с гумусом, входит в соединения
с лигнином и белками, формируя железолигнопротеиды, имеющие
большое значение для физико-химических свойств почвы.
Способность прямо или косвенно принимать участие в окислении железа
широко распространена среди бактерий. Принципиальные различия
в функцональной значимости процесса окисления железа в обмене
веществ позволяют четко разделить железобактерии на две
группы. Первую, сравнительно немногочисленную по числу видов,
составляют облигатно ацидофильные железобактерии, получающие
энергию за счет окисления двухвалентного железа до
трехвалентного. Это хемолитотрофные бактерии Thiobacillus ferrooxi-
dans, Leptospirillum ferrooxidans, а также недавно открытые
термофильные штаммы тиобацилл Sulfolobus acidocaldarius.
Выделение Th. ferrooxidans и L. ferrooxidans. Для выделения и
количественного учета Th. ferrooxidans используют среду Летена
или среду Сильвермана и Лундгрена 9К (Кузнецов, Дубинина,
1989) .Среда Летена для Th. ferrooxidans (г/л): (NH4) 2SO4—
0,15; КС1 —0,05; MgS04-7H20 — 0,5; KH2P04 —0,1; Ca(N03)2 —
0,01; вода дистиллированная. рН 3,5 устанавливают с помощью
разбавленной серной кислоты. К среде добавляют 10 мл 10%-ного
раствора FeS04-7H20, подкисленного до рН 3, который стерили-
зуют отдельно в автоклаве при 0,5 атм. Среда Сильверма-
на и Лундгрена 9К. Раствор 1 (г/л): КС1 — 0,1; К2НР04~
0,5; MgS04-7H20— 0,5; Са(Ж)з)2—0,01; вода
дистиллированная—0,7. Раствор 2 (г/л): (NH4)2Fe(S04)-6Н20 — 63; вода
дистиллированная— 0,3; H2S04, 10 н. раствор—1 мл.* Раствор 1
стерилизуют при 1 атм. Перед употреблением оба раствора
смешивают и рН доводят до 3,5.
Получению чистых культур способствует добавление к среде
9К сульфата меди в концентрации 1—4 г/л. Культуру накопления
получают путем внесения посевного материала на среду Летена
или 9К. Для выделения чистой культуры из культуры накопления
производят посев на агаризованную среду Летена или на гелевые
пластинки, пропитанные средой 9К. Мелкие колонии, покрытые
окислами железа, пересевают на жидкую среду. Проверку
чистоты 'культуры проводят путем микроскопического контроля и
высевом на среду Летена с добавкой органических веществ, на МПБ и
на картофельный агар. Отсутствие роста указывает на чистоту
культуры. Рост культур угнетается при использовании
неочищенного агара. Для выделения рекомендуется использовать марки
агара высокой степени очистки, например фирмы Oxoid или ага-
розу. Кроме того, для уменьшения минерального осадка из среды
исключают фосфаты.
Для выделения и количественного учета Th. ferrooxidans и
L. ferrooxidans применяют также среду Харрисона. Раствор
1 (г/л): (NH4)2S04 — 2; КС1 — 0,1;К2НРО4 — 0,25; MgS04-7H20—
0,25; Са(Ж)з)2 — 0,01; вода дистиллированная; рН 2,0—4,0.
Раствор 2 (г/л): агароза — 8; вода дистиллированная. Раствор 3
(г/л): FeS04-H20 — 400; вода дистиллированная. Готовят смесь
расплавленной агарозы и раствора 1 в соответствии 1:1,
охлаждают до 45°, вносят раствор 3 в конечной концентрации 1% FeS04
и разливают среду в чашки Петри, которые хранят при
температуре 10° до посева. Сверху чашки заливают вторым слоем с 0,3%
агарозы, в которую вносят посевной материал. Эту среду готовят
непосредственно перед посевом: 60 мг агарозы вносят в 10 мл
воды, стерилизуют и смешивают с 10 мл стерильного раствора 1,
вносят 0,5 мл раствора 3, подогретого до 45°, и 0,1 мл почвенной
суспензии. Смесь выливают на поверхность предварительно
приготовленных чашек Петри со слоем полутвердой среды (см. выше).
Ярко-оранжевые или желтые колонии появляются после 1—4
недель и достигают по величине нескольких мм на поверхности среды,
в глубине агара колонии диаметром 0,1—0,5 мм — темные с
диффузным краем. При выделении L. ferrooxidans поступают
аналогичным образом, выявляя микроскопическим путем культуры со
спиральной формой клеток. Внесение в среду восстановленной серы
в виде цистеина (20 мг/л) заметно улучшает рост этих бактерий.
Вторую обширную группу составляют организмы, окисляющие
железо, а также марганец при нейтральной или слабощелочной
реакции среды. Окисление железа и марганца в этом случае —
процесс побочный для осуществляющих его микроорганизмов и идет
108
ge3 использования энергии окисления. Он осуществляется микро-
бами-гетеротрофами, которые удаляют таким путем образующуюся
в процессе метаболизма перекись водорода. К этой группе
относятся представители разных групп прокариот. Из них в почве в
основном распространены микоплазмы (Metallogeniutn и Gallio-
nella) и бактерии семейства Siderocapsaceae с родами Siderocapsa,
Naumaniella, Ferribacterium, Siderococcus Siderocystis. Для
выделения и количественного учета представителей семейства
Siderocapsaceae используют следующие среды.
Рост железобактерий на приводимых ниже средах
сопровождается накоплением желто-оранжевых окислов железа или бурых
окислов марганца. Слабое накопление в колониях окислов
марганца или железа удается выявить только с помощью их
окрашивания растворами бензидина или желтой кровяной соли
соответственно. Желтая кровяная соль — 5%-ный раствор K3Fe(CN)6 в
дистиллированной воде. Раствор бензидина — 1 г солянокислого
или уксуснокислого бензидина растворяют в 10 мл 50%-ной
уксусной кислоты и доводят объем до 100 мл.
Для выделения Hyphomicrobium применяют модифицированную
среду Тиле р а (Кузнецов, Дубинина, 1989) следующего
состава (г/л): дрожжевой экстракт Дифко— 0,02; MnS04-5H20— 0,02;
лимоннокислое железо — 0,002; агар Дифко— 15; вода
дистиллированная. Помимо Hyphomicrobium среда может служить для
выделения и культивирования многих одноклеточных бактерий,
окисляющих марганец, — Arthrobacter, Pseudomonas. Для выделения и
количественного учета одноклеточных марганецокисляющих
бактерий используют также среду следующего состава (Кузнецов,
Дубинина, 1989) (г/л): пептон — 2; дрожжевой экстракт Дифко —
0,5; MnS04-4H40— 0,2; FeS04-7H20— 0,01; вода
дистиллированная. Для выявления марганецокисляющих бактерий из общего
числа выросших на чашках колоний на поверхность среды
наносят тонкий слой бензидина уксуснокислого. Колонии, содержащие
окислы марганца, окрашиваются в синий цвет.
Для культивирования микоплазм, окисляющих железо и
марганец, используют следующие среды. Среда Заварзина для
получения бинарной культуры Metallogenium (Кузнецов,
Дубинина, 1989) (г/л): ацетат марганца — 0,1; агар Дифко—15; водаво-
допроводная. На поверхность застывшей среды в чашках Петри
помещают каплю почвенной суспензии и распределяют шпателем.
На этой среде рост Metallogenium в виде точечных или диффузно
бурых пятен чаще всего появляется в зонах роста колоний
микроскопических грибов. При просмотре таких колоний под
микроскопом видно, как мелкие темно-коричневые колонии Metallogenium
располагаются между грибными гифами. Эти колонии состоят из
нитевидных структур, или «паучков», характерных для
Metallogenium. Бинарные культуры Metallogenium с грибом в дальнейшем
поддерживают в жидкой среде с карбонатом марганца. Среда
Заварзина для культивирования бинарной культуры
Metallogenium (г/л): крахмал гдролизованный—1; МпС03 (в суспен-
зии) — 1; вода дистиллированная. При развитии Metallogenium
жидкая среда приобретает коричневый цвет вследствие обильного
накопления четырехвалентного марганца. Полученную бинарнуку
культуру используют для выделения чистой культуры
Metallogenium, Среда для выделения чистой культуры (г/л);
крахмал гидролизованный—1; дрожжевой автолизат
свежеприготовленный— 10 мл; МпСОз, суспензия — 2; фракция сыворотюг
Дифко—1 мл; каталаза — 2 мг; вода дистиллированная—1 л.
Культуру накопления окисляющей железо микоплазмы Gallio-
nella получают на среде следующего состава (г/л): NH4C1—1;
К2НРО4 —0,5; MgS04-H20 —0,2; СаС12-Н20 — 0,1; FeS
суспензия — в избытке; вода дистиллированная. Железо добавляют в
виде суспензии сернистого железа, которое разбалтывают в
расплавленном 1,5%-ном растворе агара и вносят на дно пробирки.
После того как агар застынет, стерильную жидкую среду
наливают слоем 5—7 см поверх агара и через нее пропускают ток
углекислоты. Для успешного развития микроорганизма большое
значение имеет продувание среды углекислотой. Последнее приводит
к частичному разложению сульфида железа и к снижению
содержания кислорода в среде. В подготовленную среду вносят
посевной материал, в котором микроскопически обнаружена Gallionella.
рН доводят до 7,2. Рост Gallionella с бактериальным спутником
проявляется в виде охристого налета на стенках пробирки в
микроаэробной зоне, где для них создается оптимальная концентрация
железа и кислорода.
Суспензию FeS готовят, смешивая эквимолярные растворы
Na2S-9H20 и FeS04, приготовленные в свежепрокипяченной воде
без кислорода, с последующим отмыванием черного FeS порциями
горячей дистиллированной воды. Суспензию быстро разливают в
ампулы или во флаконы под током инертного газа, запаивают или
плотно закрывают резиновыми пробками без доступа воздуха и
автоклавируют при 0,5 атм. Суспензию вносят по 0,5 мл на дно
пробирок, в которые разлито по 5—7 мл питательной среды.
Разложение ксенобиотиков
Чужеродные вещества (ксенобиотики), особенно различные
ядохимикаты (фунгциды, гербициды, инсектициды, нематоциды),
после обработки ими почвы могут накапливаться в ней, так как
при этом не развиваются микроорганизмы, способные разлагать
их. Ароматические соединения с такими заместителями в кольце,,
как галогены, сульфогруппы и нитрогруппы, разлагаются крайне
медленно и могут противостоять воздействию микробов на
протяжении многих лет. Некоторые соединения расщепляются
бактериями только совместно с хорошо утилизируемыми субстратами,
т. е. в условиях кометаболизма или соокисления.
Для выявления бактерий, способных осуществлять деградацию
тех или иных ксенобиотиков, используют обычно метод получения
накопительной культуры в жидкой среде с ксенобиотиками в каче-
1.1Л
стве единственного источника углерода и энергии с последующим
рассевом на агаризованные среды того же состава для выделения
активных штаммов. Иногда в среду добавляют ростовой фактор в
небольших концентрациях — глюкозу, органические кислоты (0,1—
0,2%). В таком случае разрушение ксенобиотика проходит в
условиях кометаболизма. Предложен ряд сред, на которых методами
накопительной 'культуры удается выделить бактерии, способные к
деградации тех или иных ксенобиотиков.
Среда для выделения бактерий, способных к использованию
4-хлорбензойной кислоты (г/л): К2НР04-ЗН20— 4,0; Na2HP04X
Х2Н20 —0,4; (NH4)2S04 —0,5; MgS04-7H20 — 0,15; Са(Ш3)2 —
0,01; Na2Mo04—0,004; 4-хлорбензойная кислота — 0,5; агар
(в случае твердой среды) —20; вода дистиллированная.
Среда для выявления нафталиниспользующих бактерий
(г/л): (NH4)2S04—1,0; К2НР04—1,0; MgS04-7H20-0,3; СаС12-
0,1; FeS04-7H20 — 0,02; агар (в случае твердой среды)—20;
вода дистиллированная. Нафталин суспендируют в небольшом
объеме стерильной среды при помощи ультразвука и добавляют к
основной среде до конечной концентрации 0,2%.
Среда для выделения бактерий, трансформирующих
ароматические нитросоединения (г/л): глюкоза — 5,0; (NH4)2S04 — 0,5;
MgS04-7H20 —0,25; KH2P04 —3,0; Na2HP04 —4,5; дрожжевой
экстракт — 0,5; агар (в случае твердой среды)—20,0. 2, 4, 6-три-
нитротолуол и другие ароматические нитросоединения вносили в
среду в количестве 200 мг/л.
Среда для выделения бактерий, использующих
хлорированные анилины (г/л): К2НР04—7,0; КН2Р04 —3,0; MgS04-7H20—
0,1; дрожжевой экстракт — 0,05; 4-хлоранилин — 0,1—0,2; дихлор-
анилин — 0,05.
Среда для выделения бактерий, использующих двухатомные
фенолы (г/л): К2НР04 — 0,5; КН2Р04 — 0,5; MgS04 — 0,5;
(NH4) 2S04 — 0,5; резорцин — 0,2; пирокатехин — 0,15—0,2; вода
дистиллированная. Фенолы после 'перегонки вносят в стерильную
среду.
РАЗРУШЕНИЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (ПАВ)
ПАВ широко применяются в различных отраслях народного
хозяйства: текстильной, бумажной, химической, фармацевтической,
парфюмерной промышленности, в различных областях сельского
хозяйства, в производстве синтетических моющих средств.
Особенностью этих веществ является то, что они почти полностью в
конечном итоге попадают в окружающую среду, в том числе почву,
и сравнительно медленно разлагаются микроорганизмами.
Для выделения бактерий — деструкторов ПАВ используют, как
правило, метод накопительных культур. Жидкие минеральные
питательные среды, содержащие ПАВ, заражают почвой и
наблюдают за ростом бактерий в среде (по мутности) и убыли ПАВ —
по уменьшению ценообразования. При положительных результа-
М1
тах производят рассев накопительной культуры на агаризован-
ные среды с ПАВ, откуда затем выделяют чистые 'культуры
микроорганизмов-деструкторов. Внося в синтетическую среду с ПАВ
дополнительный источник углерода, можно выделить бактерии,
разрушающие ПАВ в условиях кометаболизма. ПАВ обычно
используют в концентрации 1 г/л среды. Предложены также методы,,
позволяющие выделить бактерии-деструкторы, минуя
накопительные культуры.
Метод Овада для обнаружения и учета микроорганизмов,
разрушающих алкилбензолсульфонаты. Бактерии выделяют на
агаризованных средах с 1 г/л додецилбензолсульфоната натрия.
Чашки инкубируют при комнатной температуре 2 недели, после
чего поверхность среды с выросшими колониями опрыскивают
раствором нейтрального красного (0,004%) и оставляют до
подсыхания. Затем заливают поверхность чашек 2%-ным раствором
цетилтриметиламмонийхлоридом. Метод основан на том, что
нейтральный красный в щелочной среде дает желтое окрашивание, bi
то время как комплекс нейтрального красного с ПАВ — розовое.
Вокруг колоний бактерий, разрушающих ПАВ, образуются
прозрачные ореолы на розовом фоне.
Для обнаружения бактерий, разлагающих додецилсульфат
натрия, используется среда следующего состава (г/л): К2НРО4 —
0,1; MgCl2 —0,5; NaCl —0,2; NH4NO3— 1,0; FeS04 — следы;
додецилсульфат натрия — 0,7—1,0; агар — 20,0; вода
дистиллированная. Все минеральные соли растворяют отдельно в 800 мл
дистиллированной воды и стерилизуют 20 мин при 1 атм. Раствор до-
децилсульфата натрия стерилизуют отдельно при 0,5 атм. Затем
оба раствора соединяют, после чего среду разливают по чашкам
и подсушивают в течение ночи при комнатной температуре. В
толще среды образуются кристаллы додецилсульфата. На поверхность
подсушенного агара производят посев разведений почвенной
суспензии. Метод основан на способности бактерий-деструкторов
растворять кристаллы ПАВ, в результате чего вокруг колоний
образуются прозрачные, лишенные кристаллов зоны. Этот метод дает
возможность дифференцировать бактерии-деструкторы от других
бактерий, устойчивых к ПАВ, но не способных к их разрушению.
При помощи этого метода выделяются в основном бактерии —
деструкторы ПАВ, принадлежащие к родам Pseudomonas, Flavobac-
terium, Citrobacter, Enterobacter.
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ СРЕДЫ
УНИВЕРСАЛЬНЫЕ СРЕДЬ!
Универсальные среды — это среды для учета общей
численности аэробных или факультативно-анаэробных сапротрофных
бактерий, а также дифференцированного учета следующих групп
бактерий: грамотрицательных неспороносных бактерий, спорообразую-
щих и коринеподобных.
112
1. Выделение из почв: а) мясо-пептонный агар (МПА),
разведенный в 10 раз водопроводной водой; б) глюкоза—1 (г/л),
пептон— 1, дрожжевой экстракт—1, К2НРО4—1; водопроводная
вода. Дифференцированный учет бактерий на этих средах по
группам проводится на основании культуральных особенностей
(диаметр, форма, консистенция, рисунок колоний, пигменты
внутриклеточные и внеклеточные), теста с 3%-ным КОН (для
разделения на грамположительные и грамотрицательные) и микроскопии
основных типов колоний.
2. Выделение из растений, растительных субстратов,
кишечника и экскрементов почвенных беспозвоночных (г/л): а) пептон — 2;
глюкоза—1; дрожжевой экстракт—1; гидролизат казеина—1;
солодовый экстракт—1; глицерин—10 мл; вода водопроводная;
б) растворимый крахмал—10; казеин—1; Na2HP04 — 0,5;
дрожжевой экстракт— 1; водопроводная вода.
На приведенных выше средах возможен рост, а следовательно,
л выделение практически всех родов бактерий, входящих в
предложенный нами ключ. Однако часто бывают ситуации, когда учет
той или иной группы бактерий бывает невозможен из-за
доминирования в анализируемом субстрате быстро растущих или широко
распространяющихся по чашке колоний, препятствующих росту
медленно растущих форм бактерий. В таких случаях необходимо
использовать приемы селективного ингибирования одних групп
бактерий с целью учета других.
МЕТОДЫ СЕЛЕКТИВНОГО ИНГИБИРОВАНИЯ
Ингибирование спорообразующих бактерий.
В некоторых типах почв или горизонтах спорообразующие
бактерии мешают выделению и учету как грамотрицательных
неспороносных, так и коринеподобных бактерий. Это верхние горизонты
лесных и луговых почв, удобряемых почв агроценозов, торфяники.
Для ингибирования бацилл рекомендуется вносить в среду
краситель метиловый красный (MR) — 150 мкг/мл среды. Краситель
вносят в горячую расплавленную среду и размешивают
взбалтыванием среды в колбе. В качестве среды для выделения
грамотрицательных и коринеподобных бактерий могут быть использованы
МПА, универсальные среды либо среда с MR для выделения из
почв артробактера (%): триптоно-соевый агар — 0,4; дрожжевой
экстракт — 0,2; NaCl — 2; циклогексимид — 0,01, агар—1,5;
метиловый красный—150 мкг/мл. Циклогексимид или нистатин —
антибиотики, ингибирующие рост грибов, их добавление в среду
необходимо, особенно когда посев 'проводят из субстратов,
содержащих значительное количество грибных зародышей.
Ингибирование грамотрицательных
неспороносных бактерий. В биотопах, где доминируют
грамотрицательные неспороносные бактерии — филлоплана и ризоплана
растений, лесные и степные подстилки, луговая дернина, затруднен
учет и выделение коринеподобных бактерий, уступающих по скоро-
сти роста псевдомонадам и другим грамотрицательным формам
бактерий. Для элиминирования последних нами разработаны
следующие методы.
1. Предварительное прогревание сухих измельченных навесок
растительных субстратов в сушильном шкафу при*температуре
80° в течение 30 мин. Далее проводится десорбция клеток с
помощью обработки ультразвуком суспензий прогретых навесок и
Лосев из разведений (от 10~3 до 10~6).
2. Обработка суспензий с навесками растительного субстрата
щелочью — 0,2 н. раствором КОН в течение 15 мин либо 0,3 н.
раствором в течение 5 мин. Для этого 1 мл суспензии того
разведения, из которого будет произведен посев, переносят в
пробирку с 9 мл щелочи указанной выше концентрации, встряхивают и
выдерживают в течение 5 или 15 мин (в зависимости от
используемой концентрации), далее производят высев из этих пробирок
на чашки обычным методом посева из разведений.
В обоих случаях (подсушивание либо обработка щелочью)
резко снижается число грамотрицательных неспороносных
бактерий, чувствительных и к высушиванию, и к действию щелочей.
При этом становится возможным учет всех медленно растущих
форм — антиномицетов, нокардий, коринеподобных бактерий.
Ингибирование вегетативных клеток бакте-
р и й. Оно осуществляется с целью учета в почвах спорообразую-
щих бактерий, эндоспоры которых устойчивы к нагреванию;
существует общепринятый метод прогрева 1почвенных суспензий перед
посевом при 80° в течение 10 мин, при этом погибают все
вегетативные клетки; оставшиеся жизнеспособными споры бацилл
прорастают после высева прогретых суспензий на питательные среды.
При использовании такого приема учитывают лишь те клетки спо-
рообразующих бактерий, которые находятся в субстрате в виде
спор, в то время как бациллы могут находиться в почве и в
активном состоянии, т. е. в вегетативной форме; следовательно,
численность спорообразующих бактерий, определяемая методом
прогрева суапензий, как правило, занижена.
Поскольку спорообразующие бактерии имеют специфические
культуральные и микроскопические особенности, их можно
«узнавать» и подсчитывать на чашках. Поэтому рекомендуем проводить
выделение и учет бацилл без прогревания на общепринятых
средах— МПА, МПА + сусло (1:1) и др.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ 1
Это среды для выделения и идентификации бактерий,
принадлежащих к различным семействам или родам. Если при первичном
выделении из биотопов на универсальные среды вырастает
значительное количество бактерий, принадлежащих к различным родам,
то при их изолировании в чистую культуру на ту же среду многие
1 Состав сред дается по «The Prokaryotes...», 1981; в случае других
источников см. ссылки на авторов.
114
Из них не перевиваются. Следовательно, необходим подбор
специальных для рода или семейства сред с целью изучения чистых
культур бактерий и их дальнейшей идентификации. Если
микробиолог преследует цель выделить бактерии определенного рода из
разных субстратов, он должен воспользоваться 'как специальными
средами (список которых дается ниже), так и (приемами
селективного ингибирования посторонних группировок.
Род Pseudomonas. Все псевдомонады хорошо растут на МПА,
к которому рекомендуется добавлять глицерин (1—7%),
способствующий выявлению флюоресцирующих пигментов.
Флюоресцирующий пигмент у колоний, выращенных на этой среде, может быть
обнаружен только при просмотре чашек в проходящем
ультрафиолетовом свете (длина волны 254 нм). (Среды для выявления
других типов пигментов псевдомонад см.: Скворцова, 1981.)
Род Xanthomonas. Фитопатогенные бактерии, для которых се-
лективной является среда с целлобиозой в качестве источника С
(г/л): целлобиоза— 10; К2НР04—3; NH4C1—1; NaH2P04— 1;
MgS04— 0,3; агар—15 или картофельный агар (см. далее) с 1%.
глюкозы.
Род Gluconobacter (г/л): пептон — 3; маннит — 25; дрожжевой
экстракт — 5; агар—15.
Род Alcaligenes — картофельный агар (г/л): очищенный
картофель— 200; агар — 20; глицерин или глюкоза—10—20; вода
водопроводная. Картофель нарезать ломтиками, кипятить 30 мин,
фильтровать, довести объем до 1 л.
Семейство Enterobacteriaceae (г/л): пептон—10;
дрожжевой экстракт — 5; дистиллированная вода; рН — 8. К среде после
автоклавирования добавляют 5%-ный раствор додецилбензосуль-
фоната—1 мл; 50%-ный раствор тиосульфата — 2 мл; 1%-ный
бромтимолблау—10 мл; 33%-ный раствор лактозы — 27 мл;
33%-ный раствор глюкозы— 1,2 мл; рН 7,7—7,8.
Род Plesiomonas (семейство Vibrionaceae) (г/л): протезо-
пептон— 10; мясной экстракт — 5; NaCl— 5; соли желчных
кислот— 8,5; агар— 15; бриллиантовая зелень — 0,00033; нейтральный
красный — 0,025; рН — 7,2. Компоненты растворяют нагреванием
(но не автоклавированием), среду разливают по чашкам; через
48 ч инкубации появляются белые колонии Plesiomonas с розовым
ободком (зоной вокруг колонии).
Род Aeromonas (г/л): пептон — 5; дрожжевой экстракт — 3;
триптон—10; L-орнитин солянокислый — 5; маннит—1; инозит —
10; Na-тиосульфат — 0,4; цитрат железа — 0,5; бромкрезол
пурпурный— 0,02; агар — 3. Среду разливают в пробирки по 5 мл;
инкубируют при 35° в течение 18—24 ч; в этой среде культуры
Aeromonas образуют желтый осадок с пурпурным кольцом сверху.
Род Serratia (г/л): K2S406 (тетратионат К)—5; пептон—10;
NaCl — 5; бромтимолблау — 25 мл (0,2%-ный раствор); вода
дистиллированная; рН — 7,4. Среду разливают в пробирки по 1 мл,
инокулируют, заливают слоем стерильного вазелинового масла:
через 1—2 дня в результате редукции тетратионата появляется
желтый цвет, в контрольных пробирках цвет остается зеленым или
становится голубым.
Группа Cytophaga—Flavobacterium (%): пептонизированное
молоко — 0,1; дрожжевой экстракт — 0,02; ацетат — 0,002;
агар — 0,5.
Род Cytophaga (г/л): KN03 —0,5; Na-глицерофосфат — 0,1;
т/шс-буфер (C4HiiN03) — 1,0; триптон — 2; дрожжевой экстракт —
2; агар—15; раствор микроэлементов—1 мл; смесь
микроэлементов на 1 л (г): Н3ВОз—2,85; МпС12-4Н20 — 1,8; FeS04 — 1,36;
Na-тартрат—1,77; CuCl2-2H20 — 2,69; ZnCl2 —20,8; СаС12-6Н20—
40,4; Na2Mo04 — 25,2; pH — 7.
Семейство Azotobacteriaceae. Основой может служить среда
Федорова — Калининской, в которой меняют или прибавляют
некоторые 'компоненты в зависимости от того, какой род необходимо
выделить.
Среда Федорова — Калининской (г/л): КН2Р04—
0,9; К2НР04 — 1,74; MgS04 — 0,3; СаС12 — 0,1; NaCl — 0,5;
FeCl3-6H20 — 0,01; глюкоза—10; дрожжевой автолизат—100 мл;
раствор микроэлементов — 1 мл; смесь микроэлементов на 1 л
дистиллированной воды (г): A12(S04)3 — 0,3; Н3ВО3—.5; Na2Mo04—
5; KI—0,5; NaBr —0,5; ZnS04—2; MnS04 —3. При выделении
бактерий рода Azotobacter глюкозу заменяют маннитом; для
культивирования бактерий родов Beijerinckia и Derxia обязателен
молибден. При культивировании Azospirillum глюкозу заменяют
малатом Са (яблочнокислый Са).
Бактерий рода Derxia возможно также выделить на среде с
крахмалом (г/л): крахмал растворимый — 20; К2НР04 — 0,05;
КН2Р04 —0,15; MgS04.7H20 —0,2; СаС12.2Н20 — 0,02; NaHC03—
0,1; FeCl3 — следы; Na2Mo04— 0,002; агар — 20; бромтимолблау —
0,5; спиртовой раствор — 5 мл.
Целлюлозоразрушающие миксобактерии
Навозный агар. 100 г кроличьего навоза отваривают в 1 л
водопроводной воды, к полученному отвару после фильтрации
через марлю добавляют 5 г крахмала, 20 г агара и стерилизуют при
0,5 атм 30 мин.
Крахмальный агар (%): растворимый крахмал — 2;
К2НР04 —0,1; СаС12.2Н20 —0,01; MgS04-7H20 — 0,06; NaCl —
0,1; FeCl3 —0,001; NaN03 —0,25; агар—1; pH —7,2.
Бактериолитические миксобактерии: отмытые
клетки Е. coll или Mlcr. luteus — 100 мг сухой массы на 100 мл
среды (%). MgS04-7H20 — 0,05; NaCl —0,6; агар—1,5. Вокруг
бактериолитических колоний миксобактерии видны зоны лизиса.
Дрожжелитические миксобактерии (%):
пекарские дрожжи — 0,5; СаС12-2Н20 — 0,1; агар—1,5; кобаламин
(витамин Bi2)—0,5 мкг/мл; рН — 7,2; «Голодная среда»,
стимулирующая образование плодовых тел у миксобактерии и
позволяющая наблюдать за «скольжением» клеток (%): СаС12-2Н20 —
Мб
0 1; агар— 1,5; циклогексимид — 2,5 мг/100 мл среды, добавляется
после автоклавирования.
Род Bacillus. Кроме МПА и (МПА + сусло) существуют среды
для выделения видов бацилл, требовательных к питанию.
Среда для энтомопатогенных бацилл (г/л): трип-
тон—5; дрожжевой экстракт— 15; глюкоза—2; К2НР04— 3; вода
дистиллированная.
Среды, стимулирующие спорообразование у
бацилл: а) пептон — 5 г/л; мясной экстракт — 3; MnS04-H20—
0,005; агар—15; вода дистиллированная; б) картофельный агар
(с. 118).
Коринеподобные бактерии
Почти все коринеподобные бактерии растут на среде с
глюкозой, пептоном и дрожжевым экстрактом (с. 113). Почвенные оли-
готрофные виды артробактерий и родококков рекомендуется
выращивать на среде с почвенным экстрактом (г/л): К2НРО4 — 0,2;
агар—15; почвенный экстракт—1,0; рН — 6,8.
Для приготовления почвенного экстракта 1 кг почвы заливают
1 л водопроводной воды и автоклавируют в течение 20 мин при
121°; фильтруют и доводят объем до 1 л. Выросшие
колонии отсевают в пробирки с полужидкой средой следующего состава
(г/л): К2НРО4 — 0,2; дрожжевой экстракт—1; агар — 3;
почвенный экстракт— 1.
Для коринеподобных бактерий (КПБ), ассоцированных с
растениями, оптимальной является среда универсальная (с. 113).
При выделении рода Cellulomonas в этой среде глюкозу заменяют
карбоксиметилцеллюлозой (КМЦ), в качестве источника КМЦ
удобно использовать обойный клей. Существуют селективные
среды и методы выделения КПБ, основанные на способности многих
представителей коринеформ усваивать углеводороды, спирты,
ароматические соединения, нефть; среды, содержащие антибиотики,
подавляющие рост других групп бактерий.
Среда Бушнелла — Хааса для изолирования углеводо-
родокисляющих коринеподобных бактерий (%): NH4NO3—0,1;
К2НР04 —0,1; КН2Р04 —0,1; MgS04-7H20 — 0,02; СаС12 —0,002;
FeCl3 — следы. В среду добавляют 2% смеси я-алканов Ci2—С2з.
С р еда , со д ерж ащ а я спирты (%): (NH4)2HP04 — 0,2;
КН2Р04 —0,05; NaCl —0,05; MgS04-7H20 — 0,07; спирты
—метанол, этанол, и-пропанол, я-бутанол — 0,5—2 (объемная доля).
Среда с антибиотиками для выделения фито-
патогенных коринеподобных бактерий (г): питательный
бульон — 0,8; дрожжевой экстракт — 2,0; К2НР04 — 2,0; КН2Р04—
0,5; глюкоза — 5; MgS04-7H20— 0,25; хлористый литий—10;
агар—15; налидиксовая кислота (растворяется в 2,5 мл 0,1 М
NaOH)—25 мг; циклогексимид — 40 мг; полимиксин В
(сульфат) — 32 мг; вода дистиллированная.
Среды для изолирования из почв рода Agromyce§
(%): настойка из отвара сердца — 2,5; дрожжевой экстракт — 0,54;
гидролизат казеина — 0,4; агар — 0,08. Желательно также
добавление Мп02 или сыворотки лошадиной крови.
№ 2 (%): триптон — 0,5; гидролизат казеина — 0,4-
(NH4)2HP04 —0,07; NaCl — 0,05; агар —0,2; рН —7,0.
Среда Левенштейна — Иенсена для выделения
и культивирования р ода Mycobacterium (г/л): К2НРО4 —
1,2; MgS04 — 0,12; цитрат магния — 0,3; аспарагин—1,8;
картофельная мука—15; глицерин — 40 мл; свежие яйца—10 шт.;
малахитовая зелень (2%-ный раствор) — 10 мл. Яйца выдерживают
в спирте 30 мин и выливают в стерильную посуду, размешивают
и вливают в стерильную среду, затем добавляют раствор
малахитовой зелени. Среду разливают в стерильные пробирки,
устанавливают в наклонном положении и коагулируют на водяной бане
при 85° в течение 50 мин.
Среда для выделения и культивирования рода
Propionibacterium (%): триптон—1; дрожжевой экстракт—1;
лактат—1; КН2Р04—0,25; MnS04 — 0,0005; агар—1,5; рН —7.
Селективная среда с антибиотиками для
выделения кори неформных бактерий (%): дрожжевой
экстракт — 0,2; мясной экстракт — 0,1; гидролизат казеина — 0,5;
NaCl — 0,5; агар—1,5; налидиксовая кислота — 20 мг/л; полимик-
син В (сульфат)—40 мг/л; циклогексимид—100 мг/л.
Овсяный агар для стимуляции роста
воздушного мицелия актиномицетов (Гаузе и др., 1983) (г/л):
овсяная мука или геркулес — 50; агар — 20; рН — 7,2. Геркулес
замочить на ночь в 1 л воды, кипятить 20 мин, профильтровать,
остудить, довести до 1 л, добавить агар.
Картофельный агар для стимуляции роста
воздушного мицелия актиномицетов и
спорообразования у бацилл. 500 г очищенного и измельченного
картофеля заливают 500 мл водопроводной воды и кипятят 30 мин. Затем
объем картофельного отвара доводят до 1 л, фильтруют через
марлю и добавляют 20 г агара и 20 г глюкозы.
Методы и тесты, необходимые для проведения
родовой идентификации
ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И МОРФОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ
Прежде чем начинать идентификацию культуры, необходимо
убедиться в ее чистоте. Для этого проводят рассев биомассы из
колонии на подсушенную поверхность той агаризованной среды, на
которой была выделена культура из субстрата.
Пигментация бактериальных культур.
Внутриклеточные и внеклеточные пигменты — наиболее наглядный
признак, позволяющий провести предварительную дифференциацию
колоний на чашке. Внутриклеточные пигменты сообщают окраску
118
самой колонии, внеклеточные — диффундируют в среду и
окрашивают ее. Наиболее распространен среди бактерий желтый
внутриклеточный пигмент. Он свойствен ряду таксономически различных
бактерий: псевдомонадам, ксантобактеру, эрвиниям, флавобакте-
риям, многим представителям коринеподобных бактерий.
Оранжево-красные пигменты образуют бактерии группы Flavobacterium —
Cytophaga, миксобактерии, коринеподобные бактерии родов Rhodo-
coccus, Mycobacterium, Brevibacterium, Micrococcus. Причем одни
культуры способны образовывать оранжевый пигмент (каротиноид-
ный) только на свету (скотохромогенные бактерии), другие — при
изменении окислительно-восстановительных условий (пропионово-
кислые бактерии), у третьих — наблюдается постепенное появление
оранжевой окраски по мере развития культуры (бревибактерии).
Розово-красные оттенки пигментации свойственны бактериям родов
Serratia, Rhodococcus, Micrococcus. Коричневый или черный
пигменты образуются многими видами бацилл и азотобактером (при
старении культуры). Внутриклеточный фиолетовый пигмент
характерен для культур рода Chromobacterium и одного из видов
Pseudomonas.
Образование внеклеточных флюоресцирующих
пигментов служит важным диагностическим признаком при
разделении рода Pseudomonas на секции. Внеклеточные
желто-зеленые флуоресцирующие пигменты могут также выделяться
спириллами и азотобактером. Описание условий, в которых
выявляются различные пигменты псевдомонад, дано в руководстве
И. Н. Скворцовой (1981).
Форма, поверхность и консистенция колоний.
Культуральные признаки имеют разную таксономическую
значимость в разных группах бактерий. Так, в группе трамотрицатель-
ных апигментных бактерий форма, размер и консистенция
колоний практически не отличаются у представителей разных родов и
имеют, следовательно, низкую диагностическую ценность. В группе
спорообразующих бактерий возможно провести предварительную
дифференциацию даже на видовом уровне на основании формы и
характера поверхности колонии (Скворцова, 1983). Колонии в
виде башен из плотной слизи со складчатой поверхностью,
характерные для представителей родов Beijerinckia и Derxia, сразу
привлекают внимание исследователя. Специфические колонии образуют
миксобактерии: либо плоские и тонкие с большим числом
концентрических складок или радиальных линий, широко
распространяющиеся по поверхности среды, либо складчатые, из плотной
слизи, имеющие неправильную форму и растущие в виде языков
или отдельных скоплений и струй. Колонии многих видов
миксобактерии эродируют агар.
В группе коринеподобных бактерий диагностическую ценность
имеет врастание колонии в агар благодаря образованию
субстратного мицелия — роды Promioromonospora и Nocardioides. Этим же
бактериям свойственно образование воздушного мицелия на
специфических средах. Следует отметить также в качестве общей за-
кономерности, что колонии псевдомонад, как правило, плоские я
прозрачные в проходящем свете, а большинство колоний корине-
подобных бактерий непрозрачные (плотные), выпуклой формы,
гладкие или слегка шероховатые.
ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ БАКТЕРИЙ ПО ГРАМУ БЕЗ ОКРАШИВАНИЯ
Для разделения бактерий на грамположительные и грамотри-
цательные (что коррелирует с особенностями химического состава
клеточной стенки этих двух групп бактерий) существует
стандартная процедура окрашивания по Граму. Поскольку окраска по
Граму имеется во всех микробиологических руководствах, мы
опускаем это описание, но даем быстрый и простой метод для
дифференциации по Граму без окрашивания.
Клетки культур (лучше 1—2-суточные) помещают петлей в
каплю 3%-ного КОН на предметное стекло, размешивают
круговыми движениями и через 5—8 с петлю резко поднимают.
Суспензия грамотрицательных бактерий становится вязкой и тянется за
петлей, образуя мукоидные тяжи. Грамположительные бактерии
равномерно распределяются в капле щелочи (как в воде).
Реакция считается отрицательной, если образования слизистых тяжей
не наблюдается в течение 60 с. Увеличение вязкости вызвано
лизисом клеточных стенок грамотрицательных бактерий в растворе
щелочи и освобождением ДНК.
Несмотря на высокий процент корреляции между грампринад-
лежностью известных культур и таковой, определенной
вышеописанным методом, бывают исключения. Так, культуры целлюломо-
над и эрсковий, имеющие строение клеточной стенки, типичное для
грамположительных бактерий, проявляют себя в тесте с КОН как
грамотрицательные бактерии (образуют тяжи), в то время как
грамотрицательные бактерии рода Flavobacterium, наоборот, не
образуют вязкой массы подобно грамположительным бактериям.
Вероятно, имеются и другие примеры исключений, поэтому метод
дифференциации бактерий по Граму без окрашивания следует
использовать лишь для предварительной диагностики либо подсчета
примерного соотношения колоний грамположительных и
грамотрицательных бактерий на чашках.
Морфологические признаки бактерий. Размеры
клеток определяют в адсорбированных на стекле препаратах при
несильном оводнении, с помощью объективного микрометра.
У ко'кков измеряют диаметр, у других форм — длину и ширину
клетки. В окуляр микроскопа вставляют окулярную линейку, для
чего вывинчивают линзу окуляра, помещают на его диафрагму
окулярную линейку и вновь завинчивают. На столик микроскопа
кладут препарат, фокусируют объект и определяют, скольким
делениям линейки соответствуют длина и ширина клетки при
данном увеличении микроскопа. Измеряют 10—20 клеток. Необходимо
определить цену деления окулярного микрометра для данного
увеличения микроскопа с помощью объективного микрометра.
Объект-микрометр — это металлическая пластинка с отверстием в
центре, в которое вставлено стекло. На стекло нанесена линейка
длиной 1 мм, которая разделена точно на 100 частей, так что одно
ее деление соответствует 10 мкм. Определение цены деления
окулярной линейки производят по (прописям, помещенным в
практических руководствах. Результаты выражают в микрометрах.
Подвижность клеток определяют, используя молодую 12—
24-часовую культуру, лучше всего в препарате «висячая капля».
Если клетки подвижны, то они перемещаются в поле зрения в
разных направлениях в отличие от броуновского движения —
пассивного перемещения клеток в токе воды в одном направлении. При
добавлении'К препарату 0,5%-ного водного раствора фенола
собственное движение бактерий прекращается, броуновское — остается.
По характеру движения можно предположительно судить о типе
жгутикования. Если жгутики расположены на «полюсах клетки, то
движение обычно очень быстрое, «ввинчивающееся», без
покачивания из стороны в сторону, а при латеральном или перетрихиаль-
ном расположении жгутиков клетки двигаются плавно, совершая
колебательные отклонения от оси движения. В световом
микроскопе жгутики не видны, требуются специальные способы
предварительного протравливания и окрашивания жгутиков, чтобы они
стали видимыми под световым микроскопом. В настоящее время
редко используют окрашивание, требующее специальных навыков,
характер жгутикования смотрят под электронным микроскопом в
препаратах, предварительно напыленных металлом.
Форма клеток должна быть отисана с учетом изменений в
цикле развития. Основные формы бактериальных клеток
представлены на рис. 13. Хотелось бы обратить внимание на то, что форма
кокковидных клеток не всегда бывает такой строго шаровидной,
как ее изображают в руководствах, а сочетания клеток в виде
цепочек, гроздьев или пакетов кокков не являются признаками,
коррелирующими с родовой принадлежностью кокков, как считали
ранее. В одной и той же культуре можно обнаружить все
возможные сочетания клеток. В культурах рода Micrococcus часто
встречаются клетки-«треугольники» или напоминающие по форме
«виноградное зернышко» — одно из подтверждений их родства с кори-
неподобными бактериями (рис. 13, 1).
У палочковидных клеток имеет диагностическое значение форма
концов клетки — она может быть округлой, тупой, квадратной,
заостренной (рис. 13, 2). Так, например, миксобактерии делятся
на два .порядка по форме вегетативных клеток: с заостренными
концами — подпорядок Cystobacterinae, цилиндрические с тупо
закругленными концами — подпорядок Soranginae. При видовой
дифференциации бацилл форма концов клетки используется в качестве
одного из таксономических признаков (рис. 13, 5).
Извитые формы подразделяются на слегка изогнутые — изгиб
их меньше половины окружности (вибрионы), и с изгибом выше
половины окружности (спириллы). В отличие от вибрионов клетки
спирилл более длинные, толстые могут иметь один или несколько
Рис. 13. Формы бактериальных клеток:
1 — кокковидные; 2, 5 — палочковидные; 3 — извитые; 4 — нокардиоподобные
бактерии со сложным циклом развития; 6 — почкующиеся и простекобактерии
завитков в виде спирали. Тонкие, гибкие, спирально завитые
бактерии с большим числом полных витков относятся к спирохетам
(рис. 13, 3). Особенно причудливые очертания клеток имеют про-
стекобактерии (рис. 13, 6).
Следует знать, что большинство бактерий меняют свою форму
в процессе развития. Наиболее четко выражен цикл развития у ко-
ринеподобных и нокардиоподобных бактерий — от ветвящегося
мицелия к палочковидным (иногда подвижным) элементами, далее к
кокковидным (рис. 13, 4). Для представителей родов Promicromo-
nospora, Arthrobacter, Rhodococcus характерно доминирование
кокков в старых культурах, в то время как у родов Cellulomonas
и Curtobacterium обнаруживают лишь единичные кокки,
большинство клеток имеют форму коротких палочек (рис. 14). Скорость
прохождения цикла зависит как от скорости роста культуры,
определяемой условиями выращивания, так и от таксономической
принадлежности исследуемой бактерии.
Кокковидная форма клеток в стационарной фазе роста еще не
122
г
j •* ч/ ^
! /а
1
Л W
•
• • 'А
'"7о
г1*
9 2а
... . 1
/it
2S !
V !
о J i
Рис. 14. Морфологические особенности некоторых родов коринеподобных
бактерий:
Arthrobacter sp., \a — 10—'12 ч; \б — >36 ч; Rhodococcus sp., 2a — 12—48 ч,
2б — >96 ч; Cellulomonas sp., За — 12—48 ч, 36 — >96 ч; Promicromonospora
sp#, 4а — 12—48 ч, 46 — >96 ч
свидетельствует о принадлежности организма к микрококкам или
коринеподобным бактериям. В старых культурах кокки могут быть
обнаружены у спирилл, миксобактерий, акинетобактера, алкали-
генеса. Даже псевдомонады, для которых характерны
палочковидные подвижные клетки, могут укорачиваться до кокковидных или
яйцевидных форм, которые можно наблюдать в старых культурах
или в хемостате при низких скоростях роста.
Таким образом, необходимо последовательное
микроскопическое наблюдение за культурами разного возраста (6—24—48—72 ч,
5—7 сут) для выявления цикла развития и предварительной
идентификации.
Способ деления и обособления дочерних клеток после
деления имеет также диагностическое значение. У грамположитель-
ных бактерий, как правило, видна поперечная перегородка, в то
время как у грамотрицательных бактерий образуется перетяжка,
видимая под микроскопом. Известны 3 основных способа
разъединения клеток после деления: простой, внезапное раскалывание
клеток • (snapping) и постепенное сгибание клеток (bending)
(рис. 15). Для коринеподобных бактерий характерен 2-й или 3-й
способы обособления клеток,
приводящие к образованию V- или Y-
/л - форм (рис. 15). Такое расположе-
_+л —*/у 7 ние клеток наблюдается не только
у 1г у коринеподобных бактерий, Y-фор-
мы можно обнаружить также в
культурах бацилл и флавобактерий.
Этот факт является лишним под-
А _+ Д —$v# -+tf$о тверждением необходимости анали-
а и \х/ 2 за всего комплекса признаков,
характеризующих морфологические
особенности культур, а не какого-
//? <# и ли^о одного.
_+11 —► (\ —♦ /} Проведение физиолого-биохими-
с/ с/ С^ 3 ческих тестов
Тест на оксидазу
Рис. 15. Способы деления бакте-
риальных клеток: Метод 1. На отрезок филь-
1 — простой (simple); 2 — раска- тровальной бумаги наносят несколь-
лывающийся (snapping); 3 - ко капель 1%-ного раствора дигид-
сгибающиеся (bending) рохлорида тетраметил-я-фенилен-
диамина, приготовленного в тот же
день. Выросшую культуру снимают
с поверхности агаровой среды
платиновой петлей (обычные петли из нихромовой проволоки могут
давать ложноположительную реакцию) и наносят ее на
увлажненную бумагу. Положительная реакция — развитие фиолетовой или
пурпурной окраски в течение 10 с. Положительный результат дает
Ps. aeruginosa, отрицательный — Е. colL
Метод 2. Этот метод менее чувствительный, но более
удобный. Несколько капель смеси (1:1 по объему) 1%-ного раствора
а-нафтола, растворенного в 95%-ном этаноле, и
свежеприготовленного 1%-ного водного раствора оксалата диметил-/г-фенилендиа-
мина наносят на колонии в чашках с агаром. В другом варианте
к жидкой культуре добавляют 0,2 мл а-нафтола и 0,3 мл диметил-
парафенилендиамина и энергично перемешивают. Положительная
реакция: окрашивание колоний или бульонной культуры в фиоле-
тозо-синий цвет в течение 10—30 с.
Окислительно-ферментативный (О/F) тест на
использование глюкозы (тест Хью—Лейфсона)
Готовят основной раствор исследуемого углевода (обычно
глюкозы) , стерилизуют его путем фильтрования (или в автоклаве при
124
0,5 атм) и добавляют с соблюдением правил асептики при 45—50°
в автоклавированную полужидкую основную среду до конечной
концентрации 0,5—1%. Чаще всего используют основную среду
Хью и Лейфсона (г/л): пептон —2; NaCl —5; К2НРО4 — 0,3;
бромтимоловый синий — 0,03; агар — 3; вода дистиллированная.
Если микроорганизмы не способны расти на этой среде из-за
недостатка необходимых питательных веществ, добавляют
дрожжевой экстракт (0,1%) или сыворотку крови (2%). Когда кисло-
тообразование маскируется веществами щелочной природы,
образующимися из пептона, можно использовать среду следующего
состава (г/л): NH4H2P04 — 1,0; KC1 — 0,2; MgS04 — 0,2;
дрожжевой экстракт—1,0; бромтимоловый синий — 0,03; вода
дистиллированная; агар — 2,0; рН среды 7,0. В случае, когда рост
тестируемого организма ингибируется бромтимоловым синим, следует
заменить его феноловым красным или бромкрезоловым
пурпурным.
Для осуществления теста пробирки с полужидкой средой,
содержащей углеводы, помещают на несколько минут в кипящую
водяную баню для удаления большей части растворенного
кислорода, затем их быстро охлаждают и столбики среды инокулируют
микробиологической петлей. После инокуляции среду в одной из
пробирок покрывают слоем 10 мм стерильного минерального масла
(так называемая «анаэробная» пробирка). Среду во второй
пробирке ничем не покрывают («аэробная» пробирка). Для выявления
неспецифических реакций готовят контрольные пробы: 1)
инокулируют такую же среду, не содержащую углевода; 2) инкубируют
стерильную среду с углеводом. Результаты интерпретируют
следующим образом.
1. Если кислота образуется только в аэробной пробирке, то
клетки катаболизируют углевод с использованием 02 (реакцияО).
В этой пробирке рост должен быть заметным.
2. Если подкисление происходит и в аэробной и в
анаэробной пробирках, то клетки способны также к брожению
(реакция F). Рост должен быть заметен в обеих пробирках.
3. Если кислота не образуется ни в одной пробирке, то клетки
не способны катаболизировать углевод. Если рост отсутствует,
то возможно, что в среде нет какого-либо питательного вещества,
необходимого для роста изучаемого организма.
Примеры. Реакция F с глюкозой проявляется
стафилококком (St. epidermidis), реакция О с глюкозой — микрококком
(М. varians). Отрицательный результат с глюкозой характерен
для Ps. lemoighei.
Тест на каталазу
Посев производят в пробирках на скошенный мясо-пептонный
агар или другую среду, не содержащую крови. После инкубации
вливают вниз по косяку 1 мл 3%-ной перекиси водорода. Сразу же
и через 5 мин наблюдают за образованием пузырьков, которое
означает положительную реакцию. Параллельно добавляют несколь-
ко капель 3%-ной перекиси водорода и к колониям на чашке или
к зонам обильного роста, который может наблюдаться на поверх-
ности полужидкой среды. В случае бульонной культуры к 0,5 мл
культуры добавляют 0,5 мл 3%-ной перекиси водорода и
наблюдают за постоянным образованием пузырьков. Некоторые
бактерии, например молочнокислые на средах с низкими
концентрациями глюкозы или вообще без глюкозы, образуют внегемовую псевдо-
каталазу. Образование псевдокаталазы можно предотвратить
добавлением к среде глюкозы (1%). При проверке анаэробов на ка-
талазную активность важно перед добавлением перекиси
водорода выдержать культуру на воздухе в течение 30 мин.
Положительный результат — 5/. epidermidis, отрицательный — Streptococcus
lactis.
Тест на нуклеазы
Препарат ДНК или РНК растворяют в дистиллированной воде
в концентрации, достаточной для получения 0,2%-ного содержания
в агаровой среде. ДНК легко растворяется в воде. Для
растворения РНК в воду медленно добавляют 1 н. NaOH, следя за тем,
чтобы рН не был выше 5,0. В среду непосредственно перед авто-
клавированием (121°, 15 мин) добавляют раствор нуклеиновой
кислоты. После охлаждения до 50° среду разливают в чашки.
Делают посев культуры штрихом на твердой среде. После
инкубации на поверхность агара наливают 1 н. НС1. Положительная
реакция: (появление вокруг участка роста чистой зоны, что
свидетельствует о наличии ДНКазной или РНКазной активности.
Положительный результат — Serratia marcescens (ДНКаза),
отрицательный (ДНКаза) —Enterobacter aerogenes.
Тест на уреазу
Метод 1. Инокулируют скошенный агар Кристенсена с
мочевиной (г/л): пептон—1, глюкоза—1; NaCl — 5; КН2РО4 — 2;
феноловый красный — 0,012; агар — 20; дистиллированная вода;
дрожжевой экстракт (не во всех случаях)—0,1. Компоненты
смешивают и доводят рН до 6,8—6,9. Смесь кипятят для растворения
агара и стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. Охлаждают
до 50°. Добавляют с соблюдением правил асептики достаточное
количество 20%-ного раствора мочевины (стерилизованного
фильтрованием) до конечной концентрации 2%. Перемешивают и с
соблюдением правил асептики разливают то 2—3 мл в небольшие
стерильные пробирки. Охлаждают в наклонном положении, при
котором высота столбика равна 1,3 см, а длина скошенной части —
2,5 см. Агар засевают и инкубируют до появления
красно-фиолетовой окраски; положительная реакция — Proteus vulgaris,
отрицательная— Е. coti.
Метод 2. Этот метод используют для микроорганизмов, не
растущих на агаре Кристенсена с мочевиной. Готовят раствор
следующего состава (%): БЭС-буфера (М,К-бис-2(2гидроксиэтил)-
2-аминоэтансульфоновая кислота) —0,1065; мочевины — 2,
фенолового красного — 0,001; рН 7. Стерилизуют фильтрованием и раз-
126
ливают с соблюдением правил асептики по 2 мл в небольшие
пробирки. Бульонную культуру центрифугируют и к клеткам
добавляют стерильную дистиллированную воду или физиологический
"раствор для получения густой суспензии. В пробирку со средой,
содержащей мочевину, добавляют 0,5 мл клеточной суспензии.
Инокулируют также контрольную среду без мочевины. Пробирки
инкубируют 24 ч. Положительный тест — появление
красно-фиолетовой окраски.
Тест на дезаминирование фенилаланина
Густо засевают окошенный агар с фенилаланином (г/л):
дрожжевой экстракт — 3; L-фенилаланин—1; Na2HP04—1; NaCl—
5; агар—12; дистиллированная вода. После инкубации наносят
сверху на косяк 4—5 <капель 10%-ного раствора FeCle.
Положительная реакция — появление зеленой окраски, свидетельствующей
об образовании фенилпирувата. Положительный результат —
Proteus vulgaris, отрицательный — Е. coli.
Тест на аргининдезиминазу
Метод 1. Инокулируют основной бульон Меллера
состава (г/л): /пептический гидролизат животной ткани — 5; экстракт
из говяжьего мяса — 5; глюкоза — 0,5; пиридоксаль — 0,005; бром-
крезоловый красный (1,6%-ный раствор)—0,625 мл; крезоловый
красный (0,2%-ный раствор)—2,5 мл; вода дистиллированная.
Компоненты смешивают, доводят рН смеси до 6,0 или 6,5. Смесь
разливают в пробирки размером 13X100 мм и стерилизуют авто-
клавированием при 0,5 атм. К этой среде добавляют 1%-ный мо-
ногидрохлорид L-аргинина (или 2%-ный DL-формы), а также
контрольный бульон без аргинина. После инокуляции бульор
заливают 10 мл стерильного минерального (вазелинового) масла.
Пробу проверяют ежедневно в течение 4 дней. Положительная
реакция—фиолетовая или красно-фиолетовая окраска. При слабой
реакции образуется голубовато-серая окраска. Положительный
результат — Enterobacter cloacae, отрицательный — Proteus
vulgaris.
Метод 2. Этот метод пригоден для широкого круга
факультативных аэробов. Инокулируют полужидкую среду Торнли,
содержащую аргинин, а также контрольную среду без аргинина.
Среда Торнли (г/л): пептон—1; NaCl — 5; К2НРО4 —0,3;
феноловый красный — 0,01; L-аргинин—10; агар — 3; вода
дистиллированная. Компоненты смешивают и доводят рН смеси до 7,2.
Смесь кипятят для растворения агара и стерилизуют автоклавиро-
ванием при 1 атм. После посева в столбик уколом среду
герметично покрывают слоем стерильного минерального масла и
инкубируют. Положительная реакция — изменение окраски от желто-
оранжевой до красной в течение 7 дней.
Тест на декарбоксилазы аминокислот
Смотри метод 1 предыдущего теста. Вместо аргинина
используют 1%-ный раствор дигидрохлорида L-орнитина или 2%-ный"
раствор DL-формы (или лизина). Положительная реакция у
Enterobacter aerogenes, отрицательная — у Proteus vulgaris.
Тест на использование фумарата в анаэробных условиях
Определение потребности в формиате и фумарате„ применяют
для выявления некоторых анаэробов, которые окисляют формиат
и попутно восстанавливают фумарат в сукцинат. Готовят основной
ч})ормиатно-фумаратный раствор (формиат натрия — 3 г; фумаро-
вая кислота — 3 г; дистиллированная вода — 50 мл). Компоненты
смешивают. Добавляют 20 гранул NaOH, размешивают до
растворения этих гранул и фумаровой кислоты. Доводят рН смеси до 7,
добавляя около 15 капель 4 н. NaOH, и стерилизуют
фильтрованием. Добавляют 1 каплю раствора на 1 мл предварительно
восстановленного пептонно-дрожжевого бульона: пептон — 5 г; трип-
тиказа — 5; дрожжевой экстракт—10 г; ресазурин 0,25%-ный
раствор — 4 мл; солевой раствор (см. ниже)—40; раствор гемина
(см. ниже) — 10; раствор витамина Ki (см. ниже)—0,2 мл;
дистеин — НС1 — 0,5 г; вода дистиллированная—1 л. Автоклави-
руют при 0,5 атм.
Солевой раствор (г): безводного СаС12 — 0,2; MgS04X
Х7Н20 —0,48; К2НР04— 1; КН2Р04— 1; NaHC03—10; NaCl—2.
СаС12 и MgS04 растворяют в 300 мл дистиллированной воды.
Вливают 500 мл дистиллированной воды и, помешивая, добавляют
остальные соли. После растворения солей добавляют 200 мл
дистиллированной воды.
Раствор гемина: 0,05 г гемина растворяют в 1 мл 1 н.
NaOH. Объем доводят дистиллированной водой до 100 мл. Авто-
клавируют при 0,5 атм.
Раствор витамина Кь 0,15 мл витамина Ki растворяют в
30 мл 95%-ного этанола в момент его инокуляции в атмосфере
очищенной от кислорода двуокиси углерода.
Сравнивают рост на этой среде с ростом на среде без форми-
атно-фумаратного раствора. Положительная реакция — рост
сильно стимулируется формиатно-фумаратным раствором. В некоторых
случаях в отсутствие добавок вообще не наблюдается роста.
Примеры. Положительный результат — Bacteroides corro-
dens, Cytophaga, отрицательный — Bacteroides oralis, Flavobacte-
rium.
Реакция Вогес — Проскауэра (У—Р)
Инокулируют две пробирки со следующей средой: мясо-пептон-
ный бульон—1 л; К2НР04 (см. примечание) — 5 г; глюкоза —
5 г; автоклавируют при 0,5 атм.
Примечание: при испытании бактерий рода Bacillus в
реакции Вогес — Проскауэра фосфат заменяют 5 г NaCl. Одну
пробирку инкубируют при 37°, другую — при 25°. Через 48 ч 1 мл
культуры переносят в другую пробирку, добавляют 0,6 мл 5%-ного
а-нафтола, растворенного в абсолютном этаноле, и тщательно
перемешивают. Затем добавляют 0,2 мл 40%-ного водного раствора
128
КОН. Вновь перемешивают и инкубируют, установив пробирку
наклонно для увеличения площади поверхности среды (реакция
зависит от доступа кислорода). Пробирку рассматривают через 15
и 60 мин. Положительный тест — окрашивание поверхности среды
в интенсивно-красный цвет. Положительный результат — Entero-
bacter aerogenes, отрицательный — Е. colL
Тест на липазу
Метод 1. Желточный агар в чашке Петри засевают
штрихом Желточный агар (г): пептон — 20; Na2HP04—2,5; NaCl—1;
глюкоза—1; агар—12,5; MgS04 0,5%-ный раствор—1 мл;
дистиллированная вода — 500 мл. Компоненты смешивают, рН смеси
доводят до 7,3—7,4. Смесь кипятят до растворения агара,
стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм и охлаждают до 60°.
Скорлупу яйца дезинфицируют спиртом и дают ей обсохнуть. Яйцо
разбивают и отделяют желток от белка. Желток с соблюдением
правил асептики переносят в расплавленный агар и перемешивают
до получения однородной суспензии. Разливают в чашки и
оставляют для затвердевания. После инкубации снимают крышку чашки
и внимательно просматривают поверхность при косом освещении.
Положительный результат — образование маслянистого,
блестящего с переливами или перламутрового слоя под колонией и вокруг
нее на поверхности агара. Положительный пример — Clostridium
sporogenes, отрицательный — Clostridium butyricum.
Метод 2. Этот метод применяют для эфиров пальмитиновой,
стеариновой и олеиновой кислот. Используют агаризованную среду
(например, МПА) с добавлением 0,01% СаС12. Стерилизуют
твин-40 (эфир пальмитиновой кислоты), твин-60 (эфир стеариновой
кислоты) или твин-80 (эфир олеиновой кислоты)
автоклавированием при 1 атм. Добавляют стерильный твин в расплавленную
агаризованную среду при 45—50° до конечной концентрации 1%
'(по объему). Среду встряхивают до полного растворения твина,
разливают по чашкам Петри, оставляют до затвердевания и
засевают штрихом. Положительный результат — появление мутного
ореола вокруг колоний — Ps. aeruginosa, отрицательный —
Ps. putida.
Тест на протеиназы
К числу диагностически значимых ферментов этого класса
относят желатиназу и казеиназу.
Гидролиз желатины. Метод 1. Используют мясо-пеп-
тонный бульон, содержащий 12% желатины.
А. Пробы инкубируют при 20—22° 6 недель. Положительная
реакция — разжижение по крайней мере части среды. При
длительной инкубации следует предотвратить испарение среды.
Положительный пример — Proteus vulgaris, отрицательный — Е. coli.
Б. Если температура 22° слишком низка для роста, культуру
инкубируют при оптимальной температуре, а затем охлаждают в
холодильнике вместе с неинокулированной контрольной пробой.
Если среда не затвердевает, то это свидетельствует о гидролизе
желатины; если среда затвердевает, то ее переносят вместе с
контрольной пробой в помещение с комнатной температурой или в
термостат с температурой 30° и инкубируют в наклонном
положении около 30 мин. Если среда в опытной пробе разжижается
раньше, чем в контрольной, то этот результат расценивается как
слабая положительная реакция.
В. Так же, как в методе Б, но с 4% желатины. Этот метод
более чувствителен, чем метод Б.
Метод 2. Это чувствительный метод, дающий возможность
быстро получить результат. Бактерии выращивают в пробирке с
мясо-пептонным бульоном, содержащим диски с активированным
углем и желатиной. Положительная реакция — освободившиеся
при гидролизе желатины частицы угля могут распределяться по
всему объему среды.
Приготовление угольно-желатиновых дисков:
15 г пищевой желатины смешивают со 100 мл водопроводной воды
и смесь нагревают до растворения желатины; добавляют 3—5 г
мелко измельченного активированного угля. Рекомендуется перед
разливом желатины смазывать дно чашки очень тонким слоем
минерального масла. После того как смесь затвердеет, ее вынимают
из чашки и помещают в 10%-ный раствор формалина на 24 ч.
Затем вырезают из затвердевшей желатины диски диаметром 1 см.
Диски промывают, в водопроводной воде 24 ч. Затем их кладут в
бутылки с завинчивающимися крышками, заливают водой и
стерилизуют 30 мин паром или повторным нагреванием в течение
20 мин в водяной бане при 90—110°. После стерилизации сливают
воду и помещают диски с соблюдением правил асептики в
стерильные среды (по одному диску в пробирку). Среды инкубируют для
проверки на стерильность, после чего они готовы для инокули-
рования.
Гидролиз казеина. Стерильное (автоклавированное при
0,5 атм) снятое молоко смешивают при 50° с равным объемом
4%-ного расплавленного водного агара. Чашки с инокулированной
штрихом средой инкубируют до 14 дней и проверяют, не
образуется ли просветления вокруг зон роста. Результат проверяют с
помощью заливки среды 10%-ной НС1.
Примечание: образование кислоты из лактозы может
подавлять гидролиз казеина, поэтому предварительно нужно диали-
зовать снятое молоко. Положительный пример — Bacillus polymy-
xaf отрицательный — Bacillus macerans.
Тест на диастазу
Наличие фермента диастазы (амилазы), расщепляющего
крахмал, выявляют при росте культуры на крахмало-аммиачном агаре,
в котором неразложенный крахмал выявляется с помощью
раствора Люголя (йод в йодистом калии). Чашки с выросшими
культурами заливают раствором Люголя. Зоны вокруг колоний окрасятся
130
либо в красно-бурый цвет (гидролиз дошел до стадии декстринов),
либо они останутся бесцветными (гидролиз прошел до стадии
Сахаров). Наилучшие результаты в опытах по разложению
крахмала получаются при работе с растворимым крахмалом. Среда,
содержащая крахмал, не должна содержать глюкозы, так как в ее
присутствии гидролиз крахмала ингибируется. Положительный
пример — Bacillus subtilis, отрицательный — Bacillus macerans.
Тест на использование углеводов и органических кислот
10%-ные растворы испытуемых веществ в воде стерилизуют при
0,5 атм и добавляют к основной минеральной среде Смита до
конечной концентрации 0,5—1%. Минеральная основа среды Смита
содержит (г/л): (NH4)2HP04— 1; KC1 —0,2; MgS04-7H20 — 0,2;
дрожжевой экстракт — 0,2; агар—15. Перед стерилизацией
устанавливают рН 7.
До стерилизации вносят индикатор — бромтимоловый
пурпурный в количестве 25 мл 0,04%-ного спиртового раствора на 1 л
среды. Об использовании Сахаров или кислот, а также других
субстратов судят по подкислению среды, выявляемому по изменению
цвета индикатора до желтого при изменении рН в интервале
6,8—6,2. При образовании газа из субстратов наблюдается как
подкисление среды, так и разрывы столбика агара.
Методы хёмотаксономического анализа
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИПА КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
Выявление изомеров диаминопимелиновой кислоты (ДАПК)
(Hasegawa, Takizawa, Tanida, 1983)
Обнаружение изомеров ДАПК может быть проведено в гидро-
лизатах целых клеток. Биомассу изучаемый культуры в
количестве одной микробиологической петли помещают в маленькую
пробирку и заливают 0,1 мл 6 н. НС1. Пробирку запаивают и
полученную ампулу автоклавируют 15 мин при 121°. После
охлаждения до комнатной температуры ампулу вскрывают и 10—15 мкл
гидролизата наносят на хроматографическую бумагу
(ленинградская быстрая, FN-6). В качестве стандарта используют 0,1 М
раствор мезо-ЛАПК или гидролизат коллекционной культуры с
IV типом клеточной стенки. Для разделения аминокислот
попользуют следующую систему растворителей: метанол:
дистиллированная вода: 6 н. НС1: пиридин (80:26:4: 10). Разделение проходит
в течение 12—14 ч. Аминокислоты проявляются опрыскиванием
0,5%-ным раствором нингидрина в ацетоне, с последующим
высушиванием и прогреванием в течение 2 мин при 100°. Пятна^ДАПК
окрашены в оливково-желтый цвет, пятна других аминокислот —
в пурпурный.
Пятна мезо-ДАПК расположены ближе к линии нанесения,
5*
131
LL-ДАПК— дальше. В рекомендуемой системе отношение Rj ме-
зо-ДАПК к Rf /,£-ДАПК=0,8.
Выявление Сахаров
Обнаружение Сахаров может быть также проведено в гидро-
лизатах целых клеток. Биомассу изучаемой культуры в количестве
двух микробиологических петель помещают в маленькую пробирку
и заливают 0,2 мл 0,25 н. НС1. Пробирку запаивают и
полученную ампулу автоклавируют 15 мин при 121°. После охлаждения до
комнатной температуры амлулу вскрывают и 20—40 мкл гидроли-
зата наносят на хроматографическую бумагу (ленинградская
медленная, FN-14). В качестве стандарта используют раствор,
содержащий галактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу в 1%-ной
концентрации. Для разделения Сахаров используют следующую
систему растворителей: бутанол : пиридин : дистиллированная вода
(6:4:3). Разделение проходит в течение 36—48 ч. Сахара
обнаруживают опрыскиванием хроматограммы кислым анилинфтала-
том (2 мл анилина и 3,3 г фталевой кислоты растворяют в водо-
насыщенном бутаноле — 85 мл бутанола и 15 мл воды) с
последующим высушиванием и прогреванием в течение 4 мин при 100°.
Пятна гексоз окрашены в буро-коричневый цвет, иентоз—в розово-
коричневый.
Определение аминокислотного состава пептидогликана
клеточной стенки (Наумова, Белозерский, 1966)
Получение препаратов клеточных стенок. Сырую
биомассу, отмытую холодной дистиллированной водой, разводят
водой в соотношении 1 : 1 и разрушают клетки при помощи
ультразвука на приборе УЗДН в течение 4—6 мин (2—3 раза по 2 мин
при частоте колебаний 16—20 кГц), охлаждая суспензию во льду
в промежутках между импульсами. Неразрушенные клетки
отделяют центрифугированием при 2500 об/мин. Осадок отбрасывают.
Из супернатанта при 16000 об/мин осаждают клеточную стенку.
Осадок разделяется на 2 слоя: нижний — примесь неразрушенных
клеток, верхний — светлый рыхлый слой — собственно клеточные
стенки. Собирают верхний рыхлый слой и лиофильно высушивают.
Получение и очистка пептидогликана. Пептидо-
гликан получают по методу Эллиота с соавт. (Elliot et al., 1975),
модифицированному Г. М. Стрешинской с соавт. (1979). К
препарату нативной клеточной стенки добавляют 10%-ный раствор три-
хлоруксусной кислоты (в соотношении 1 : 10), и полученную взвесь
перемешивают при 4° в течение 24 ч. Осадок отделяют,
подсушивают ацетоном. К 40 мг остатка клеточной стенки добавляют 10 мл
раствора трипсина (1 мг/мл) в грис-НО-буфере (рН 7,85). Смесь
перемешивая, инкубируют 20 ч при 37°; фермент отмывают тем же
буфером. К остаткам стенки добавляют 2%-ный раствор додецил-
сульфата натрия (DDS) и нагревают 5 мин при 100°, DDS
многократно отмывают дистиллированной водой. Отмытый препарат
пептидогликана лиофильно высушивают.
132
Аминокислотный состав пептидогликана определяют на ами
нокислотном анализаторе после гидролиза 3—6 мг препарата пеп
тидогликана 6н. НС1 в течение 18 ч при 105° по общепринятой ме
тодике (Стрешинская и др., 1979). Тип пептидогликана определяю
на основании анализа количественного соотношения аминокисло
пептидной части пептидогликана по методу Шлайфера и Кандлер;
(Schleifer, Kandler, 1972).
Выявление ацетильных и гликолильных груп]
пептидогликана клеточной стенки (Uchida, Aida, 1977)
10 мг сухой (лучше лиофилизированной) биомассы гидролизуют
0,1 мл 4н-НС1 при 100° в течение 20 ч в маленьких запаянных ам
пулах. Гидролизат смешивают с 0,3 мл воды, которой обмываю'
внутренние стенки ампулы. Полученный раствор наносят на микро
колонку с Dowex 50w8 (H + форма, рабочий объем 5X50 мм). Про
мывают колонку 1 мл дистиллированной воды и собирают на выхо
де из колонки промывные воды. Аликвоту (0,1 мл) анализируют н;
содержание гликолевой кислоты, для чего 0,1 мл исследуемого рас
твора осторожно смешивают с 2,0 мл 0,02%-ного раствора, 2,7-ди
гидроксинафталина в конц. H2SO4 и нагревают на кипящей водяно!
бане в течение 10 мин. Охлаждают и разводят 1,9 мл 2н. H2S04 <
охлаждением. Определяют интенсивность появившейся пурпурно
красный окраски при 530 нм. Содержание гликолевой кислоты оп
ределяют с помощью калибровочного графика. Бактерии, имеющие
в составе биомассы большие количества гликолевой кислоты {о:
30 до 70 нМ/мг сухой биомассы), относятся к гликолильному ти
пу; не содержащие или содержащие гликолевую кислоту в следо
вых количествах — к ацетильному типу.
ОБНАРУЖЕНИЕ МИКОЛОВЫХ КИСЛОТ
(MINNIKIN, ALSHAMAONY, GOODFELLOW, 1975)
Сухую (высушенную на воздухе или лиофилизированную)
биомассу в количестве 100 мг смешивают с безводным метанолом
(5 мл), толуолом (5 мл) и конц. H2S04 (0,2 мл) в
20-миллиметровых пробирках с притертыми пробками. Содержимое пробирок
перемешивают. Метанолиз проводят в течение 12—16 ч при 75° в
сушильном шкафу. Смесь охлаждают до комнатной температуры,
добавляют 2 мл гексана, встряхивают и дают отстояться. Из
верхнего гексанового слоя наносят образцы по 50—60 мкл на пластинки
силикагеля — Merk Silica gel H (0,5 мм) или Silufol и хроматогра-
фируют в системе растворителей петролейный эфир (температура
кипения 60—80°): диэтиловый эфир (85—15). Положение
отдельных компонентов определяют после нагревания пластинок,
обработанных раствором бихромата калия (5 г К2СГ2О7 растворяют в
5 мл Н20, доводят объем до 100 мл концентрированной H2S04,
затем разбавляют раствор в 10 раз дистиллированной водой), при
150—200°. В качестве проявителя может быть также использован
раствор фосфорно-молибденовой кислоты (5%-ный раствор фос-
форно-молибденового натрия в этаноле).
ОБНАРУЖЕНИЕ МЕНАХИНОНОВ (COLLINS ET AL., 1977)
Экстракция иочистка. Сухую биомассу (100 мг)
смешивают с 20 мл смеси хлороформ : метанол (2: 1), и суспензию
оставляют на 12—16 ч. Биомассу отделяют фильтрацией, и экстракт
выпаривают досуха на роторном испарителе при 37°. К сухому
препарату добавляют 0,2 мл ацетона. Нерастворимый в ацетоне
материал отфильтровывают, фильтрат упаривают и наносят
полоской шириной 1,5 см на хроматографическую 'пластинку марки
Silufol или Merck Kiesel gel. Выделение менахинонов проводят в
системе растворителей петролейный эфир: диэтиловый эфир
(85:15). В качестве хроматографического стандарта используют
витамин К. Менахиноны обнаруживают при просмотре хромато-
графических пластинок в УФ-свете как голубые и синие пятна на
желто-зеленом фоне. Их обводят простым карандашом и
соскребают при помощи скальпеля. Соскоб растворяют в 2 мл ацетона,
затем фильтруют через стеклянную вату, концентрируют до
сухого состояния.
Для первичной экстракции менахинонов из биомассы может
быть также использован ацетон. 0,5—1 г лиофилизированных
клеток (или 1—3 г сырой биомассы) заливают 10 мл ацетона и
обрабатывают ультразвуком в течение 2 мин на ледяной бане. Клетки
осаждают центрифугированием (6000 об/мин). Супернатант
упаривают досуха при 37°. Выделение менахинонов проводят так же,
как и при экстракции смесью хлороформа и метанола.
Определение состава менахинонов. Очищенные
менахиноны могут быть исследованы 'при помощи обращенно-фазо-
вой хроматографии на пластинках марки Merk HPTLC RP 18 в
системе растворителей ацетон: вода (99:1). Менахиноны с разным
числом изопреновых единиц и разной степенью насыщенности
имеют на хроматограмме различные значения Rf. Более детально
состав и строение менахинонов определяют масс-спектрометри-
чески.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕЙХОЕВЫХ КИСЛОТ
(НАУМОВА, БЕЛОЗЕРСКИЙ, 1966)
Биомассу отделяют от культуральной жидкости
центрифугированием и промывают холодным раствором 0,95%-ного NaCl,
спиртом, ацетоном, эфиром и подсушивают на воздухе. Тейхоевые
кислоты экстрагируют 10%-ной трихлоруксусной кислотой, к навеске
биомассы добавляют кислоту из расчета 1 : 20 (масса/объем) и
постоянно перемешивая, оставляют при 4° на 24 ч. Клетки отделяют
центрифугированием и экстракцию повторяют. Центрифугаты
после первой и второй экстракции объединяют и добавляют 2
объема 96°-ного этанола, оставляют в холодильнике на 24 ч. Осадок
собирают центрифугированием, перерастворяют в холодной
дистиллированной воде, нерастворимую часть отбрасывают, а раствор
лиофильно высушивают.
134
Предварительное заключение о наличии тейхоевых кислот д
лают (по содержанию в препаратах стабильно связанного фосф
ра, происходящего главным образом из тейхоевых кислот. Ст
бильно связанный фосфор определяют по разности содержания о
щего фосфора и суммы лабильного и нуклеинового по мето;
Вейль — Малербе и Грина. Если выход полимера незначител<
(менее 0,4% от высушенной биомассы), исследуют нативную кл
точную стенку. Клеточную стенку получают по методу, описанное
выше (с. 132). Идентификацию тейхоевых кислот проводят метод
ми бумажной хроматографии и электрофореза продуктов кисло
ного, щелочного и ферментативного гидролиза полимеров (Наум
ва, Белозерский, 1966).
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОМИЦЕТОЕ
Согласно определителю Берги (Bergey's manual determinati
bacteriology, 1989) порядок Actinomycetales включает бактери
имеющие тенденцию к образованию ветвящихся гиф, которые у н
которых родов развиваются в мицелий. Диаметр гиф варьирует
в пределах 0,5—2,0 мкм, обычно 1,0 мкм. Актиномицеты широ:
распространены в природе. Представители порядка могут бы
разделены на две группы — актиномицеты с окислительным мет
болизмом, характерные для почвы и сопряженных с ней субстр
тов, и актиномицеты-бродилыцики, обитающие преимуществен:
в теле человека и животных. Большинство актиномицетов— гра
положительные аэробные бактерии.
Актиномицеты — особая группа бактерий. Мицелиальный пл
организации, присущий значительной части представителей поря
ка, определяет дифференциацию организмов, сложность жизне
ных циклов, биохимические и физиологические проявления, отли
ные от истинных бактерий. Экологическая стратегия актиномицет
подобна более сложно организованным мицелиальным орган*
мам — эукариотам грибам. Тесно связана с актиномицета!
группа коринеподобных бактерий.
Представители почвенных актиномицетов различаются меж
собой по морфологическим свойствам (тип и стабильность mhi
лия, число и расположение спор, образование склероциев, опора
гиев, образование подвижных элементов), физическим свойств;
(теплоустойчивость), химическим свойствам (строение клеточн]
стенок и целых клеток, тип липидов, изопреноидных хининов и др
Разделение актиномицетов на роды проводят согласно мор4
логическим, физиологическим и хемотаксономическим показателя
Морфологические свойства актиномицетов исследуются микрос*
пически в поверхностных (растущих на агаровых средах) культ
pax. Особое внимание при таком исследовании уделяется спосо
ветвления, образованию и расположению спор, присутствию и
отсутствию спорангиев, наличию подвижных элементов, выявлен]
специальных структур, таких как склероции. Отдельно обозна*
ется группа актиномицетов, обладающих эндоспорами.
ОБНАРУЖЕНИЕ МЕНАХИНОНОВ (COLLINS ET AL., 1977)
Экстракция иочистка. Сухую биомассу (100 мг)
смешивают с 20 мл смеси хлороформ : метанол (2:1), и суспензию
оставляют на 12—16 ч. Биомассу отделяют фильтрацией, и экстракт
выпаривают досуха на роторном испарителе при 37°. К сухому
препарату добавляют 0,2 мл ацетона. Нерастворимый в ацетоне
материал отфильтровывают, фильтрат упаривают и наносят
полоской шириной 1,5 см на хроматографическую 'пластинку марки
Silufol или Merck Kiesel gel. Выделение менахинонов проводят в
системе растворителей петролейный эфир: диэтиловый эфир
(85:15). В качестве хроматографического стандарта используют
витамин К. Менахиноны обнаруживают при просмотре хромато-
графических пластинок в УФ-свете как голубые и синие пятна на
желто-зеленом фоне. Их обводят простым карандашом и
соскребают при помощи скальпеля. Соскоб растворяют в 2 мл ацетона,
затем фильтруют через стеклянную вату, концентрируют до
сухого состояния.
Для первичной экстракции менахинонов из биомассы может
быть также использован ацетон. 0,5—1 г лиофилизированных
клеток (или 1—3 г сырой биомассы) заливают 10 мл ацетона и
обрабатывают ультразвуком в течение 2 мин на ледяной бане. Клетки
осаждают центрифугированием (6000 об/мин). Супернатант
упаривают досуха при 37°. Выделение менахинонов проводят так же,
как и при экстракции смесью хлороформа и метанола.
Определение состава менахинонов. Очищенные
менахиноны могут быть исследованы inpn помощи обращенно-фазо-
вой хроматографии на пластинках марки Merk HPTLC RP 18 в
системе растворителей ацетон: вода (99:1). Менахиноны с разным
числом изопреновых единиц и разной степенью насыщенности
имеют на хроматограмме различные значения Rf. Более детально
состав и строение менахинонов определяют масс-спектрометри-
чески.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕЙХОЕВЫХ КИСЛОТ
(НАУМОВА, БЕЛОЗЕРСКИЙ, 1966)
Биомассу отделяют от культуральной жидкости
центрифугированием и промывают холодным раствором 0,95%-ного NaCl,
спиртом, ацетоном, эфиром и подсушивают на воздухе. Тейхоевые
кислоты экстрагируют 10%-ной трихлоруксусной кислотой, к навеске
биомассы добавляют кислоту из расчета 1 : 20 (масса/объем) и
постоянно перемешивая, оставляют при 4° на 24 ч. Клетки отделяют
центрифугированием и экстракцию повторяют. Центрифугаты
после первой и второй экстракции объединяют и добавляют 2
объема 96°-ного этанола, оставляют в холодильнике на 24 ч. Осадок
собирают центрифугированием, перерастворяют в холодной
дистиллированной воде, нерастворимую часть отбрасывают, а раствор
лиофильно высушивают.
134
Предварительное заключение о наличии тейхоевых кислот де-
!ают ino содержанию в препаратах стабильно связанного
фосфора, происходящего главным образом из тейхоевых кислот.
Стабильно связанный фосфор определяют по разности содержания
общего фосфора и суммы лабильного и нуклеинового по методу
Вейль — Малербе и Грина. Если выход полимера незначителен
(менее 0,4% от высушенной биомассы), исследуют нативную
клеточную стенку. Клеточную стенку получают по методу, описанному
выше (с. 132). Идентификацию тейхоевых кислот проводят
методами бумажной хроматографии и электрофореза продуктов
кислотного, щелочного и ферментативного гидролиза полимеров
(Наумова, Белозерский, 1966).
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОМИЦЕТОВ
Согласно определителю Берги (Bergey's manual determinative
bacteriology, 1989) порядок Actinomycetales включает бактерии,
имеющие тенденцию к образованию ветвящихся гиф, которые у
некоторых родов развиваются в мицелий. Диаметр гиф варьируется
в пределах 0,5—2,0 мкм, обычно 1,0 мкм. Актиномицеты широко
распространены в природе. Представители порядка могут быть
разделены на две группы — актиномицеты с окислительным
метаболизмом, характерные для почвы и сопряженных с ней
субстратов, и актиномицеты-бродилыцики, обитающие преимущественно
в теле человека и животных. Большинство актиномицетов— грам-
положительные аэробные бактерии.
Актиномицеты — особая группа бактерий. Мицелиальный план
организации, присущий значительной части представителей
порядка, определяет дифференциацию организмов, сложность
жизненных циклов, биохимические и физиологические проявления,
отличные от истинных бактерий. Экологическая стратегия актиномицетов
подобна более сложно организованным мицелиальным
организмам— эукариотам грибам. Тесно связана с актиномицетами
группа коринеподобных бактерий.
Представители почвенных актиномицетов различаются между
собой по морфологическим свойствам (тип и стабильность
мицелия, число и расположение спор, образование склероциев,
спорангиев, образование подвижных элементов), физическим свойствам
(теплоустойчивость), химическим свойствам (строение клеточных
стенок и целых клеток, тип липидов, изопреноидных хининов и др.).
Разделение актиномицетов на роды проводят согласно
морфологическим, физиологическим и хемотаксономическим показателям.
Морфологические свойства актиномицетов исследуются
микроскопически в поверхностных (растущих на агаровых средах)
культурах. Особое внимание при таком исследовании уделяется способу
ветвления, образованию и расположению спор, присутствию или
отсутствию спорангиев, наличию подвижных элементов, выявлению
специальных структур, таких как склероции. Отдельно
обозначается группа актиномицетов, обладающих эндоспорами.
135
Все актиномицеты, обладающие окислительным метаболизмом
разделены на 4 группы по строению их клеточной стенки (табл.3)
Таблица 3
Главные составные части клеточных стенок актиномицетов с окислительным
метаболизмом (по Lcchevalier, Lechevalier, 1981 и Goodfellow, Cross, 1984)
Тип
клеточной
стенки
I
II
III
III
III
IV
Тип
Сахаров
д
в
с
А
Дифференцирующие
компоненты
LL-ДАПК, глицин
л*езо-ДАПК, глицин,
ксилоза, арабиноза
мезо-RAYlK, фруктоза,
ксилоза
мезо-ДАПК, мадуроза
мезо- ДАПК
мезо- ДАПК,
галактоза, арабиноза
Род
Streptomyces, Streptoverticillium, Chcunia,
Nocardioides, Kineosporia, Kitazatoa, Spo'
richtya
Actinoplanes, Amorphosporangium, AmpuU
lariella, Dactylosporangium, Micromonospo*
ra, Pilimelia
Frankia
Actinomadura, Microbispora, Microtetraspo*
ra, Planobispora, Planomonospora, Spirit*
lospora, Streptosporangium
Nocardiopsis, Thermoactinomyces, Geoder-
matophilus, Thermomonospora, Actinosyn-
пета
Nocardia, Micropolyspora, Pseudonocardia,
Saccharomonospora, Saccharopolycpora
и присутствию Сахаров в гидролизатах целых клеток (методы
определения аминокислот и Сахаров в клетках см. с. 132).
Все актиномицеты с окислительным типом метаболизма
содержат в клеточной стенке диаминопимелиновую кислоту. Эта кислота
имеет три изомерные формы и легко обнаруживается в
гидролизатах целых клеток. Два ее изомера мезо- и LL- легко
дифференцируются с помощью бумажной хроматографии, Д-изомер не имеет
таксономического значения. В гидролизатах целых клеток
обнаружены дифференцирующие сахара, имеющие таксономическую
значимость. Некоторые организмы с IV типом клеточной стенки
образуют специфические жирные кислоты, называемые миколовыми
кислотами (методы определения миколовых кислот см. с. 133).
По составу оснований ДНК актиномицеты представляют собой
компактную группу, содержание ГЦ у них колеблется в
относительно узких пределах, от 58 до 75%. Исключение составляют
некоторые актиномицеты, связанные с организмом человека и
животных, и термофильные актиномицеты, относящиеся к родам
Thermoactinomyces и Streptosporangium. Последние имеют
содержание ГЦ наиболее низкое среди актиномицетов, примерно
44—54%.
На основе результатов определений олигонуклеотидного
состава 16 S рРНК создана филогенетическая система актиномицетов
136
изких бактерий. В рассматриваемой системе классификации
й в актиномицетов наиболее полно учтена таксономическая ин-
^°Дмация, полученная в последние годы. Согласно системе клас-
Ф°РикацИи известные роды актиномицетов делятся на 9 групп, вы-
ление семейств авторы считают преждевременным (Goodfellow,
&s, 1984).
1. Актинобактерии (13 родов и несколько видов, родовая при-
длеЖность которых не установлена)—гетерогенная группа,
включающая роды, объединявшиеся ранее в семейство Actinomyce-
taceae, группу коринеподобных бактерий, роды Oerskovla, Promi-
cromonospora.
2. Актинопланы. В группу включены актиномицеты,
образующие споранги (ранее семейство Actinoplanaceae) и моноспоровый
род Micromonospora.
3. Актиномицеты с многоклеточными спорангиями (Dermato-
philus, Frankia, Geodermatophilus) — сборная группа, выделенная
из-за сходства морфологии (деление гиф во взаимно
перпендикулярных направлениях с образованием спорангиподобных структур,
распадающихся на фрагменты).
4. Нокардиоподобные актиномицеты (нокардиоформы) — роды,
содержащие миколовые кислоты.
5. Стрептомицеты (Intrasporangium, Kineosporia, Nocardioides,
Sporichtya, Streptomyces и близкие Actinopycnidium, Actinospo-
rangium, Chainia, Elytrosporangium, Kitasatoa, Microellobosporia,
Streptoverticillium) — группа объединяет разнообразные по
морфологии актиномицеты, содержащие LL-ДАПК в пептидогликане
клеточной стенки.
6. Мадуромицеты (Actinomadura, Excellospora, Microbispora,
Microtetraspora, Planobispora, Planomonospora, Spirillospora,
Streptosporangium) — конгломерат родов, ранее включавшихся в
различные семейства.,Общий III В тип клеточной стенки.
7. Термомоноспоры (Actinosynnema, Nocardiopsis, Streptoalle-
loteichus, Thermomonospora)—гетерогенная группа родов.
8. Микрополиспоры (Actinopolyspora, Faenia, Pseudonocardia,
Saccharomonospora, Saccharopolyspora и виды нокардий, не
содержащих миколовых кислот)—группа близких по морфологии и хе-
мотаксономичеоким признакам родов.
9. Термоактиномицеты с единственным родом Thermoactinomy-
ces, хотя и не родственным актиномицетам, но из соображений
удобства идентификации культур и в силу традиции помещенным
в систему их классификации.
Согласно определителю Берги (Bergey's manual, 1989) родовой
состав групп несколько изменяется. Например, группа
микрополиспор входит в группу нокардиоподобных актиномицетов и т.д.
При использовании традиционного метода посева из разведений
почвенной суспензии на плотные питательные среды для
выделения бактерий МПА, крахмало-аммиачный агар (КАА),
казеин-глицериновый агар (КГА) и др. на чашках Петри вырастают колонии
актиномицетов, принадлежащих в большинстве своем к стрепто-
мицетам. Для выделения из почвы и сопряженных с ней субстра*
тов других представителей порядка Actinomycetales требуются спе-
циальные селективные приемы, задерживающие рост банальных
форм, прежде всего стрептомицетов.
В группу актиномицетов включено свыше 60 родов, в числе
которых как известные «гиганты», подобные роду Streptomyces,
насчитывающие многие сотни «таксовидов», так и «карлики»,
состоящие всего из одного вида. Степень изученности родов разная.
Видовая идентификация многих родов не разработана, требуете*
создание простых, общедоступных ключей для определения видов.
Принимая все вышесказанное во внимание, мы рассматриваем
методы выделения и идентификации актиномицетов не в целом для
всего порядка, а для отдельных родов, наиболее часто
встречающихся в почве и сопряженных с ней субстратах. В большинстве
своем это формы, образующие мицелий и репродуктивные споры.
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ СТРЕПТОМИЦЕТОВ
Для выделения из почвы группы стрептомицетов и
родственных им организмов используют обогащение почвенных образцов
перед посевом субстратами, создающими благоприятные условия
для роста актиномицетов и неблагоприятные для роста других
микроорганизмов. Почву обогащают СаСОз. Для этого воздушно-
сухие образцы почвы (по 1 г) смешивают с 0,1 г СаСОз и
инкубируют при 26° 7—9 дней во влажной атмосфере (60% от общей
влагоемкости). Производится обогащение почвы кератином или
хитином.
Увеличить количество выделяемых из почвы актиномицетов
можно, прогревая почву перед посевом (40—45°, 8 ч) или
обрабатывая ее раствором фенола (0,1 мл почвенной суспензии добавляют
к 10 мл 1,4%-ного раствора фенола, спустя 10 мин суспензию
разводят до нужного разведения и высевают на питательные среды).
Для ограничения роста грибов в питательные среды добавляют
антибиотики циклогексимид (актидион) (50—100, мкг/мл), пима-
рицин и нистатин (по 10—50 мкг/мл); для ограничения роста
бактерий— полимиксин (5 мкг/мл) и пенициллин (1 мкг/(мл).
Добавление в среды пропионата Na (4 г/л) и красителя бенгальского
розового (35 мг/л) также задерживает рост грибов и бактерий.
В качестве селективных источников углерода и азота для
выделения актиномицетов из почвы в питательные среды добавляют
крахмал, глицерин, казеин и нитраты. Следующие среды наиболее
часто используют для выделения актиномицетов из почвы.
Крахмало-казеиновая (г/л): крахмал—10,0 (или
глицерин—10,0); казеин —0,3; KN03 — 2,0; NaCl — 2,0; K2HPO4 —2,0;
MgS04-7H20 — 0,05; СаСОз —0,02; FeS04-7H20 — 0,01; агао —
20,0. Глицерин-аргининовый агар (г/л): глицерин— 12,5;
аргинин — 1,0; NaCl — 1,0; К2НРО4 — 1,0; MgS04 • 7H20 — 0,5;
FeS04 • 6H20 — 0,01; CuS04 • 5H20 — 0,001; ZnSO, • 7H20 — 0,001;
MnS04H20 — 0,001; агар —20,0. Среда с хитином (г/л):
138
ппоидный хитин-4,0; КН2РО4-0,3; К2НРО4-0,7; MgS04X
!?7НоО —0,5; FeS04-7Н20 —0,01; ZnS04-7H20 —0,01; МпС12Х
уЖо-0,01; агар-20,0;рН8.
При высеве из разведений почвенной суспензии на чашках с
пепеленными питательными средами чаще всего вырастают
колонии актиномицетов, принадлежащих к родам Streptomyces, Strep-
toverticillitim, Chainia. Представители этих родов являются
аэробными, грамположительными прокариотическими организмами. Они
образуют разветвленный мицелий, обычно 0,5—2,0 мкм в диаметре,
как правило нефрагментированный, который подразделяется на
первичный, или субстратный, и вторичный, или воздушный,
мицелий; последний может отсутствовать. Споры неподвижны,
образуются в виде цепочек на специальных спороносящих гифах
воздушного мицелия. На поверхности колоний могут образовываться
склероции. Клеточная стенка содержит LL-диаминопимелиновую
кислоту (ДАПК), дифференцирующие сахара отсутствуют.
Род Streptomyces Waksman et Henrici, 1943 — цепочки спор
прямые или спиральные, образуются на воздушном мицелии монопо-
диально или в виде пучков. Склероции не образуются.
Род Streptoverticillium Baldacci, 1958 — цепочки спор сходны
с таковыми Streptomyces, расположены мутовчато.
Род Chainia Thirumalachar, 1955 — цепочки спор сходны с
таковыми Streptomyces. На поверхности колоний образуются
склероции— шарообразные плодовые тела (50—450 мкм в диаметре),
которые не содержат спор.
Видовую идентификацию актиномицетов родов Streptomyces,
Streptoverticillium и Chainia проводят по определителю Гаузе
и др., 1983. Согласно ключу Гаузе для определения видов
актиномицетов отобраны следующие диагностические признаки:
морфологические— форма цепочек спор, характер поверхности оболочки
спор; культуральные — окраска воздушного мицелия, окраска
субстратного мицелия, наличие растворимых пигментов, наличие ме-
ланоидных пигментов.
Для изучения морфологического строения репродуктивных
структур культуры актиномицетов выращивают в чашках Петри на
средах, наиболее благоприятных для спороношения, обычно н а
овсяном агаре (г/л): овсяная мука (или геркулес) 20—65;
агар — 20; рН 7,2. Тип образования цепочек и характер
поверхности спор определяют у зрелых культур обычно на 7—14-й день
роста, иногда в более поздние сроки.
Виды родов Streptomyces, Streptoverticillium и Chainia
образуют цепочки спор только на ветвях воздушного мицелия. Для
наблюдения за формой цепочек спор кусочек агара с мицелием
помещают на предметное стекло, срезав бритвой предварительно
лишний агар, и просматривают при малом увеличении (Х150,
Х200) в световом микроскопе. Различают цепочки спор прямые,
извитые, с примитивными спиралями, с хорошо сформированными
спиралями. Внутри каждого типа выделяются варианты. Например,
прямые цепочки спор могут быть короткими, расположенными вдоль
139
£$t
l£
Рис. 16. Цепочки спор моноподиально расположенные:
1 — прямые, короткие, расположенные вдоль гифы или в пучках; 2 — прямые,
длинные, разветвленные; 3 — короткие, в виде крючков петель или коротких
неправильных спиралей; 4 — длинные в виде крючков, петель или неправильных
спиралей
гифы либо собранными в пучки (рис. 16,/), или длинными, часто
разветвленными (рис. 16, 2). Цепочки спор с примитивными
спиралями могут быть в форме крючков, петель, неправильных
коротких спиралей от 1/2 до 2 оборотов (рис. 16, 3) или длинных
спиралей от 1 до 3 и более оборотов (рис. 16, 4). Спиральные
цепочки спор могут быть с хорошо развитыми, правильными,
растянутыми спиралями от 2 до 10 оборотов (рис. 17, /) или со
сжатыми плотными спиралями (рис. 17, 2). Между этими типами нет
разких границ, чаще всего у одной культуры можно наблюдать
несколько типов вместе. Например, цепочки прямые и в виде
примитивных спиралей или цепочки спиральные и в форме крючков.
Если культура образует преимущественно прямые цепочки спор
и изредка спиральные, она рассматривается как культура со
спиральными цепочками спор. Виды рода Streptoverticillium имеют
мутовчатое расположение цепочек, спор, сами цепочки могут быть
140
Рис. 17. Цепочки спор спиральные и мутовчато расположенные:
1 — правильные спирали; 2 — плотно сжатые спирали; 3 — прямые мутовчато
расположенные; 4 — крючки, петли, спирали, мутовчато расположенные
прямыми (рис. 17, 3) или в виде крючков, петель, спиралей
(рис. 17, 4). Виды рода Chainia по строению цепочек спор не
отличаются от видов Streptomyces, но имеют плодовые тела — скле-
роции. Склероции чаще всего бывают шаровидной формы от 50 до
450 мкм в диаметре, они хорошо видны при увеличении
микроскопа Х150, Х200.
Поверхность оболочки спор изучают с помощью
электронного трансмиссионного или сканирующего микроскопов. В
случае использования трансмиссионного микроскопа препараты
готовят без фиксации и напыления, слегка прикасаясь сеткой с
нанесенной на нее коллоидиевой или формваровой пленкой к
поверхности спороносящего воздушного мицелия. Используют увеличение
Х8000—X10000. В случае использования сканирующего
электронного микроскопа препараты готовят по следующей методике
141
(Гузев и др., 1981). На латунном стерженьке получают отпечаток
спор, прикасаясь поверхностью стерженька к поверхности споро-
носящего воздушного мицелия. Отпечаток подсушивают на
воздухе, напыляют золотом. При (просмотре используют увеличение
Х3000, X10 000. Существует несколько типов поверхности» спор:
гладкая (рис. 18,/), бородавчатая (рис. 18,2), шиповатая
(рис. 19, /), волосистая (рис. 19, 2), выросты, промежуточные
между шипами и волосками.
Рис. 18. Структура поверхности спор:
1 — гладкая; 2 — бородавчатая
Щ^ JF '
1
Рис. 19. Выросты на спорах:
1 — шипы; 2 — волоски
Культуральные свойства — цвет воздушного и
субстратного мицелия, цвет растворимых пигментов, окрашивающих
ереду.
Определение цвета производят на 7-, 14- и 21-й день роста
культуры. Окраску воздушного мицелия определяют на
минеральном агаре 1 и овсяном агаре, так как эти среды наиболее
благоприятны для развития спороносящего воздушного мицелия.
В качестве других диагностических сред используют глицерин-
нитратный агар (г/л): глицерин — 30,0; NaN03 — 2,0;
142
K2HP04—1,0; MgS04 —0,5; KC1 — 0,5; FeS04 —0,01; агар —
20,0; pH 7,2 и органический агар 2 (г): пептон — 5,0;
ISfaCl — 5,0; глюкоза—10; агар — 20; бульон Хоттингера — 30 мл;
вода— 1 л; рН — 7,2. На органическом агаре 2 и других
органических средах у многих культур воздушный мицелий не развивается
вовсе или образуется белый стерильный воздушный мицелий.
Поэтому на органических средах обычно окраска воздушного
мицелия не имеет существенного диагностического значения.
Определение цвета воздушного мицелия нужно проводить при
дневном свете, в ясный день (не на прямом солнечном свету).
Сначала определяют основной цвет воздушного мицелия — голубой,
серый, розовый, желтый, коричневый или белый. Представители
рода Streptomyces разделены на 6 секций, согласно цвету
воздушного мицелия (Гаузе и др., 1983). Секции имеют следующие
названия— Azureus (цвет воздушного мицелия голубой); Cinereus
(воздушный мицелий серый с различными оттенками); Roseus
(воздушный мицелий розовый с различными оттенками); Helvolo—
flavus (воздушный мицелий желтый, оалевый); Albus (воздушный
мицелий белый с различными оттенками); Imperfectus (воздушный
мицелий плохо развит или отсутствует).
Если обозначение цвета состоит из 2—3 оттенков, то основной
оттенок помещается в конце названия, например,
«желто-розовый» — воздушный мицелий розовый с желтым оттенком. Если
цвет воздушного мицелия изменяется в процессе роста культуры,
то последняя окраска (14—21-й день роста культуры) является
основной при определении цвета. Когда цвет воздушного мицелия
маскируется цветом субстратного мицелия, выращивают культуру
на целлофане, помещенном на поверхность агаровой среды в
чашке Петри. Это делают в случае, если субстратный мицелий темно-
бурый или темно-коричневый. В случае, если определению цвета
воздушного мицелия мешают индикаторные пигменты, колонию ак-
таномицета вырезают из агаровой среды и помещают в чашки
Петри на поверхность воды с рН<7 и рН>7; цвет субстратного
мицелия изменяется, цвет воздушного мицелия легко определить.
Цвет субстратного мицелия определяется по цвету
обратной стороны колонии. Если цвет субстратного мицелия
изменяется в процессе роста культур, то последний цвет будет
основным. Совершенно бесцветные культуры встречаются редко, чаще
всего субстратный мицелий имеет оттенок желтоватый, сероватый,
буроватый. Диагностическую ценность имеет только хорошо
выраженная окраска. Цвет субстратного мицелия описывают на средах
минеральный агар 1, органический агар 2, глицерин-нитратном и
овсяном агаре на 7-, 14- и 21-й день роста культуры. По цвету
субстратного мицелия на минеральном агаре 1 стрептомицеты
каждой секции подразделяются на серии (Гаузе и др., 1983).
Растворимые пигменты окрашивают среду, их
описывают на таких же средах и в те же сроки, что и цвет субстратного
мицелия. Образование меланоидного пигмента наблюдают на
гпептонно-дрожжевом агаре (г/л): пептонный агар с же-
лезом Дифко — 36,0; дрожжевой экстракт—1,0; вода
дистиллированная; рН 7,0—7,2 на 2—4-е сутки роста. Если образуется темно-
зеленый, бурый или черный растворимый пигмент, то считается, что
культура образует меланоидные пигменты.
Роды Streptomyces и Streptoverticlllium относят к группе стреп*
томицетов и родственных им организмов. Род Chainia
отождествляют с родом Streptomyces.
МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ДРУГИХ РОДОВ ПОРЯДКА
ACTINOMYCETALES, РАСПРОСТРАНЕННЫХ В ПОЧВАХ И СОПРЯЖЕННЫХ
С НЕЙ СУБСТРАТАХ
Для выделения из почвы представителей рода Actinomadura
используют прогревание почвы при 100° в течение 1 ч. Посев
почвенных суспензий производят на среды, содержащие антибиотик
рубомицин (5 мкг/мл) для ограничения роста стрептомицетов.
Чаще всего актиномадуры выделяют из почвы на среду Гаузе
2 (г/л): пептон — 5,0; NaCl — 5,0; глюкоза—10,0; агар — 20,0;
бульон Хоттингера — 30 мл. Инкубирование посевов ведут в
течение нескольких недель при 28—30°.
Представители рода Actinomadura (Lechevalier, Lechevalier,
1970) имеют стерильный субстратный мицелий, короткие цепочки
спор на воздушном мицелии (рис. 20). Клеточная стенка
содержит мезо-ЛАПК (Ш тип клеточной стенки). Гидролизаты целых
клеток содержат мадурозу. В основе идентификации видов лежит
способность к усвоению Сахаров и спиртов в качестве
единственного источника углерода и физиологические свойства.
Род Actinomadura относят к группе мадуромицетов.
Для выделения из почвы актиномицетов родов Microbisporay
Faenia и Microtetraspora используют прогревание почвенных
образцов при 100—120° 1 ч. Поверхностный 'посев из почвы
проводят наглюкозо-аспарагиновую среду (г/л): глюкоза —
2,0; L-аспарагин —1,0; К2НР04 —0,5; MgS04 —0,5; агар —20,0;
солевой раствор— 1,0 мл. Состав солевого раствора
(мг/мл): FeS04-7H20—10,0; MnS04-7H20 — 1,0; CuS04.5H20 —
1,0; ZnS04-7H20 — 1,0; рН 8.
К среде добавляют почвенный экстракт 1 мл/л (10 г почвы на
1 л воды, автоклавируют 30 мин, фильтруют) и витаминный
раствор (по 0,5 мг каждого витамина: Вь В2, В6; никотиновая
кислота; яара-аминобензойная кислота; биотин — 0,25 мг на 1 л среды).
В среду добавляют антигрибные и антибактериальные
антибиотики: нистатин и актидион (по 50 мкг/мл), пенициллин
,'(0,8мкг/мл), полимиксин В (4 мкг/мл).
Посевы инкубируют для выделения мезофильных видов при
30—32° 30—40 дней; термофилов — при 50° 20 дней. Для
изолирования из почвы колоний рода Faenia пользуются также средой
Гаузе 2 с добавлением рубомицина (5 мкг/мл). Посевы
инкубируют при 46° несколько недель.
144
Рис. 20. Спороношение актиномицетов:
/ — Streptomyces; 2 — Streptoverticillium; 3 — Actinomadura; 4 — Micromono-
spora; 5 — Microbispora; 6 — Faenia; 7 — Thermoactinomyces; 8 — Thermomono-
spora; 9 — Sireptosporangium; 10 — Amorphosporangium
Представители Microbispora Nonomura and Ohara, 1957
Microtetraspora Thiemann et al., 1968 морфологически подобны
актиномадурам (рис. 20, 3). Фрагментация мицелия отсутствует
III тип клеточной стенки, присутствует мадуроза. На воздушно^
мицелии у представителей Microbispora присутствуют иары спор
(рис. 20, 5), у Microtetraspora — чаще всего цепочки из четырех
спор. У представителей Faenia Kurup and Agre, 1983 (синоним:
Micropolyspora Lechevalier, Solotorovsky, Mc Durmont, 1961)
IV тип клеточной стенки, короткие цепочки спор на воздушном и
субстратном мицелии. Видовая идентификация родов Microbispora
и Microtetraspora основана на культуральных и физиологических
свойствах и температурном диапазоне роста. Виды рода Faenia
выделяются на основании морфологических и хемотаксономических
свойств. Роды Microbispora Microtetraspora относят к группе ма-
дуромицетов, род Faenia — к группе микрополиспор (Qoodfellow,
Cross, 1984) или к группе нокардиоподобных актиномицетов
(Bergey's Manual, 1989).
Актиномланы выделяют из почвы и сопряженных с ней
субстратов с помощью метода «выманивания»: небольшое
количество почвы (приблизительно 8—10 г) помещают в стерильную
чашку Петри и смачивают стерильной водой. Различные природные
субстраты (пыльцу растений, листья, змеиную кожу, волосы)
добавляют 'К воде так, чтобы все эти добавки плавали на
поверхности воды. Через 4—7 дней просматривают в микроскоп при малом
увеличении поверхность воды. Отмечают белые сверкающие
спорангии на поверхности воды. Кусочки субстрата со спорангиями
•переносят на 'поверхность агаровой среды. Используют
хитиновый агар, который готовят следующим образом: 2,5 г
очищенного хитина растворяют в 70 мл 50%-ной серной кислоты.
Отфильтровывают нерастворившуюся фракцию, к раствору приливают
105 мл дистиллированной воды, хитин выпадает в осадок. Осадок
центрифугируют, кислотный супернатант отделяют. Осадок
несколько раз промывают, центрифугируя в воде, до рН 4. Суспензию
хитина затем переносят в флакон на 1 л, добавляют следующие
соли (г): СаСОз —0,02; FeS04-7H20 — 0,01; КС1 — 1,71;
MgS04-7H20 —0,05; NaHP04- 12H20 — 4,11. рН доводят серной
кислотой, добавляют 20 г агара и автоклавируют. Для ограничения
роста грибов в среду добавляют актидион (50 мкм/мл).
Второй метод селективного выделения актиноплан основан на
аэротаксисе и аттракции спор к хлорид-ионам. Метод заключается
в следующем. Используется специальная изоляционная камера,
изготовленная из двух стеклянных пластинок. Одна из пластинок
(толщиной 9 мм) имеет 2 ячейки (каждая по 24 мм в диаметре).
Ячейки связаны между собой 'каналом (2 мм шириной и 3 мм
глубиной). Другая пластинка (3 мм толщиной) служит дном для
ячеек первой пластинки. Камеру стерилизуют УФ-светом и
помещают в чашку Петри. В каждую ячейку помещают по 0,5 г почвы
и добавляют стерильную воду так, чтобы она заполнила на 2/з ка-
1нал, соединяющий ячейки. Инкубируют почву в воде при 25—30°
146
В это время споры освобождаются из спорангиев. Затем в ка-
*л пинцетом помещают стерильный капилляр, заполненный 1 мкл
*cfo\ М фосфатного буфера рН 7, содержащего 0,01 М КС1. Ка-
илляр выдерживают в канале при 28—30° 1 ч, после чего его
п аЛЯют из канала и помещают в 1 мл стерильной воды или
буфера. Часть полученной суспензии высевают на поверхность
крахмал-казеиновой среды в чашки Петри. Крахмал-казеиновая
среда (г/л): крахмал растворимый—10,0; казеин—1,0;
К2НРО4 — 0,5; безводный MgS04 — 0,05; агар — 20,0.
Актинопланы образуют белые или ярко окрашенные
тестообразные или плотные колонии. Культивирование представителей акти-
ноплан производят на среде Чапека с 'пептоном (г/л);
сахароза — 30,0; NaN03 — 3,0; K2HPO4 — 1,0; MgS04 — 0,5; KCl—0,5;
FeS04— 0,01; агар — 20Д
Актинопланы включают прообразующие, грамположительные,
не кислотоустойчивые представители порядка Actinomycetales,
у которых споры образуются в спорангиях (рис. 20). Споры
подвижны. Внутри группы роды идентифицируют на основе
морфологических (форма и размер спорангиев, число и форма спор,
наличие жгутиков, присутствие или отсутствие воздушного мицелия) и
хемотаксономических признаков (тип клеточной стенки II).
Видовая идентификация основана на следующих признаках: цвет
колонии, природный субстрат, форма и размер спорангиев, размер спор,
физиологические признаки. Группа актиноплан объединяет
несколько родов: Actinoplanes, Amorphosporangium, Ampullariellay
Dactilosporangium, Pilimelia, Micromonospora.
Для выделения из почвы микром о носпор суспензию почвы
до посева прогревают при 70° на водяной бане 10 мин. Высев
почвенной суспензии производят на одну из следующих сред: 1)
коллоидный хитиновый агар (г/л): коллоидный хитин — 4,0;
К2НР04—0,7; КН2Р04 — 0,3; MgS04.5H20 — 0,5; FeS04-7H20 —
0,01; ZnS04 — 0,001; MnCl2— 0,001; агар — 20 г; рН 7,0; 2) среда
(г/л): КН2Р04 — 0,466; NaHP04 —0,732; KNO3 — 0,1; NaCl —0,29;
MgS04-7H20 — 0,1; СаСОз —0,02; пропионат Na — 0,20; агар —
20; FeS04-7H20 —200 мкг; ZnS04.7H20— 180; MnS04-4H20—20;
актидион— 50 мкг/мл; тиамин — 4,0 мкг; рН 7,0. Раствор,
содержащий актидион и тиамин, стерилизуют фильтрованием через
мембранный фильтр и смешивают со стерильной средой; 3) среда
Кадота (г/л): NaN03 — 0,5; K2HP04—1,0; MgS04-7H20 — 0,5;
FeS04-7H20 — 0,01; С6Н5СОО Na (Na бензойнокислый, бензонат
Na) —20,0; агар —20,0; рН 7,2.
1 мл почвенной суспензии смешивают с 0,67 г порошка
целлюлозы, который обычно используется для тонкослойной
хроматографии, и с 2 мл жидкой среды Кадота. Приготовленную таким
образом смесь распространяют, по поверхности агаризованной среды
Кадота в чашке Петри. Посевы инкубируют во влажной камере
при 28° 25—30 дней.
Колонии микромоноспор вначале желто-коричневые, по мере
образования спор становятся красными, оранжевыми, темно-корич-
-емдайй
*~
1
1
ftMrV/л-
Рис. 21. Метод желобка
невыми и черными. Воздушный мицелий обычно отсутствует, хотя
у некоторых штаммов отмечены стерильные воздушные гифы прц
длительном инкубировании. У многих штаммов вокруг колоний на
хитиновом агаре или на агаре с целлюлозой образуются зоны
просветления, свидетельствующие о разложении этих субстратов.
Наблюдать субстратный мицелий со спорами можно на
следующих препаратах. Актиномицет выращивают на агаризованной
овсяной среде, используя метод желобка (рис. 21). В агаровой
пластинке в чашке Петри вырезают
стерильным скальпелем желобок ши*
риной в 1 см на всю глубину агара.
Края желоба засевают культурой ак-
тиномицета. На засеянные участки
желобка помещают предметное
стерильное стекло. Чашки инкубируют в
термостате при температуре роста ак-
тиномицета. Стекла снимают с агара,
фиксируют жидкостью Карнуа,
окрашивают метиленовым синим (водный
1%-ный раствор) и рассматривают
под микроскопом.
Представители рода Micromonospo-
ra Oerskov, 1923 имеют одиночные или
в парах споры, сидящие на коротких
или длинных спороносцах на субстратном мицелии. Воздушный
мицелий отсутствует или слабо развит (рис. 20,4). Грамположи-
тельные, не кислотоустойчивые, большинство видов — аэробы.
Клеточная стенка II типа. Идентификацию видов рода Micromo-
nospora проводят по физиологическим признакам. Род Micromono-
spora входит в группу актиноплан.
Актиномицеты, принадлежащие к роду Thermomonospora,
выделяют из почвы, навоза или компостов с помощью следующей
методики. Образцы почвы помещают на кусочки влажной
фильтровальной бумаги, разложенные на поверхности питательной среды
в чашках Петри. Используют среду следующего состава (г/л):
КН2Р04—0,2; MgS04-7H20—0,3; CaC03—0,2; FeS04.7H20—0,005;
дрожжевой экстракт — 0,1; казаминовые кислоты — 0,1; агар —
20,0; мочевина или (NH4)2P04— 0,5. Чашки Петри инкубируют в
трехлитровых банках с плотными крышками при 50° в течение
5 дней. В банки опускают мензурки со щелочным пирогаллолом
для удаления кислорода. На кусочках фильтровальной бумаги
появляются споры, из которых можно выделить культуру термомо-
носпоры, пересевая ее на питательную среду того же состава.
Для выделения из почвы мезофильных культур термомоноспор
используют прогревание почвенных образцов при 100° для
уменьшения численности в них бактериальных клеток, мешающих
выделению термомоноспор. Оптимальная температура для роста
термофильных видов термомоноспор лежит в пределах 40—50°,
мезофильных— 35—40°. Культуры образуют на питательной среде па-
148
те или желто-коричневые колонии с белым, голубоватым или
^еВоватым воздушным мицелием. Единичные споры формируются
°6^ коротких спороносцах на ветках воздушного, редко
субстратно мицелия.
Представители рода Thermomonospora Henssen, 1957 образуют
яиночные споры только на воздушном или на воздушном и
субстратном мицелиях (рис. 20,5). Мицелий не фрагментируется,
П1 тип клеточной стенки, образуют теплочувствительные споры
(погибают при 70°). Присутствуют мезофильные (оптимум 40—
45°) и термофильные (оптимум 35—40°) виды. Видовая
идентификация мезофильных и термофильных (Агре, 1986) видов основана
на морфолого-культуральных и физиологических свойствах.
Мезофильные формы выделяются из почвы, термофильные — широко
распространены в самонагревающихся субстратах, богатых
растительными остатками. Являются активными разрушителями
целлюлозы, пептона, ксилана.
Род Thermomonospora относят к группе термомоноспор.
Представителей рода Actinosynnema (группа термомоноспор)
выделяют из травы на картофеле-морковном или овсяном агаре.
Культуры образуют на среде желтоватые колонии со скудным
желтовато-белым воздушным мицелием (0,5 мкм в диаметре). В
колониях различают колонообразные гифы (synnemata). Споры
подвижны.
Для выделения из почвы, сена, навоза и других
саморазогревающихся субстратов представителей рода Thermoactinomyces в
агаризованную средуЧапека добавляют антибиотики для
ограничения роста бактерий (новобиоцин 25 мкг/мл) и грибов (цикло-
гексимид 50 йкг/мл), а также дрожжевой экстракт — 2 г/л и каза-
миновые кислоты — 6 г/л; рН среды 7,2. Инкубируют посевы при
50° 48 ч. Воздушный мицелий покрывает колонии уже через 24 ч
инкубации. Видовую идентификацию проводят согласно
морфологическим и физиологическим показателям.
Культуры рода Thermoactinomyces Tsiklinsky, 1899 образуют
обильный воздушный мицелий. Воздушные и субстратные гифы
моноподиально ветвятся и не распадаются на фрагменты
(рис. 20,7). Споры (эндоспоры) образуются на воздушном и
субстратном мицелии, непосредственно на гифах или на коротких
спороносцах. Исследование скорости роста гиф термоактиномице-
тов, строения и химического состава эндоспор, нумерический
анализ большого числа фенотипических признаков, определение хема-
токсономических признаков выделило род Thermoactinomyces из
всего многообразия актиномицетов. Исследование
филогенетических отношений рода Thermoactinomyces посредством анализа
16S рРНК позволило объяснить отмеченные особенности
представителей рода. По происхождению они оказались далекими от
других актиномицетов, близкими к Bacillus spp. Поскольку признаки
образования мицелия и наличия воздушного мицелия играют по
традиции большую роль при идентификации культур, род
Thermoactinomyces продолжает фигурировать в системах классифика-
ции актиномицетов. Он составляет отдельную группу термоактано
мицетов.
К основе классического метода выделения нокардий из п0ц%
вы лежит «выманивание» микроорганизмов парафином, связан!
ное со способностью нокардий использовать n-парафины в каче*
стве единственного источника углерода для роста. Метод состоит
в следующем. 1 г почвы помещают в 10 мл стерильного солевого
раствора Рингера (5%) и перемешивают на качалке в течение
10 мин. Суспензии дают отстояться 2 мин и пипеткой отбирают йо
1 мл супернатанта в каждую из двух пробирок с 5 мл ср еды беа
источника углерода (г/л): NaN03 —2; К2НРО4 (безв.) -*J
0,8; MgS04 • 7Н20 — 0,5; FeCl3 — 0,01; MnCl2 • 4H20 — 0,0008;!
ZnS04-H20— 0,0002; pH 7,2. В среду помещают капельки пара*!
фина, простерилизованного при 121° 15 мин. Пробирки инкубирую??
при 37°. Через 3 недели капельки парафина вынимают и перено^
сят на поверхность агаризованной среды с дрожжевым!
экстрактом (г/л): дрожжевой экстракт—1; мясной экстракт—|
1; глюкоза—10; смесь аминокислот (мг/л: ^/-треонин — 200>
rfZ-метионин — 200; dj-изолейцин — 200); биотин 20- 10~3 мг/л;
рН 7,2. Парафин дробят и равномерно распределяют по
поверхности среды. Инкубируют 2 недели при 37°. Розовые, красные,
оранжевые, желтые или лимонные колонии с беловатым воздупь
ным мицелием, который может быть развит в большей или
меньшей степени, характеризуют рост нокардий.
Нокардий можно выделить и методом накопительных культур
на среде Мюнца (г/л): KN03—1; КН2Р04 — 0,14; Na2HP04 —
0,6; NaCl — l; MgS04-7H20 — 0,1; с 2% парафина. В колбы на
0,5 л с 50 мл среды Мюнца вносят 0,1 г почвы и посевы
культивируют на качалке при 28—30° в течение 3—5 сут. Из накопительных
культур затем производят высев на агаризованную среду Мюнца.
Метод «парафиновой приманки» неприемлем для
количественного учета нокардий, так как парафин усваивают бактерии и
грибы. Для выделения из почвы представителей рода Nocarjdia можно
использовать и другие методы. Приготовленную^ почвенную
суспензию прогревают на водяной бане при 55° 6 мин. Затем производят
поверхностный посев на модифицированную среду
Чапека следующего состава (г/л): NaNC>3 — 2; К2НР04 — 1;
MgS04.7H20 — 0,5; КС1 — 0,5; FeS04 — 0,01; сахароза — 30;
дрожжевой экстракт — 2; агар — 20; рН 7,2 или глицериновый
агар (г/л): пептон — 5; мясной экстракт — 3; глицерин — 7;
агар — 20; почвенный экстракт—1 мл; рН 7. В среды добавляют
антибиотики диметилхлортетрациклин НС1 5 мкг/мл (или мета-
циклин НС1 — 10 мкг/мл); хлортетрациклин НС1 —45; актидион —
50; микостатин — 50 мкг/мл для ограничения роста других форм
бактерий и грибов. Инкубируют посевы при 27° в течение
нескольких недель.
Представители рода Nocardia Trevisan, 1889 являются
аэробными грамположительными организмами, частично
кислотоустойчивыми, неподвижными. Нокардий образуют субстратный и воз-
150
шный (часто) мицелий, который с возрастом фрагментируется
&У палочковидные и кокковидные клетки. На гифах воздушного
**ли воздушного и субстратного мицелия могут образовываться
цепочки экзоспор, аэробы. Имеют IV тип клеточной стенки.
Содержат высокомолекулярные жирные кислоты, могут присутствовать
миколовые или нокардио-миколовые кислоты. Видовая
идентификация основана на морфологических, физиологических и хемо-
таксономических признаках (Нестеренко и др., 1985). Относятся
к группе нокардиоподобных организмов.
Выделение из почвы представителей рода Nocardioides
проводят следующим методом. Почвенную суспензию смешивают с
расплавленным агаром и распространяют эту смесь по поверхности
агаризованной среды следующего состава (г/л): овсяная
мука —3; К2НР04 —0,5; KN03 — 0,3; MgS04 —0,2; агар —20;
рН 7. Колонии, вырастающие на этой среде, беловатые или
желто-коричневые с тонким воздушным мицелием.
Представители рода Nocardioides Prauser, 1976 — аэробные,
грамположительные, некислотоустойчивые, каталазоположитель-
ные, но не образующие темного растворимого пигмента
организмы. Может формироваться субстратный и воздушный мицелий с
цепочками артроспор. Мицелий легко фрагментируется. Клетки
подвижны и неподвижны. Палочки напоминают v-образные
клетки, кокки. Клеточная стенка I типа (LL-ДАПК, глицин). Мезофи-
лы. Виды отличаются друг от друга морфологическими и
физиологическими признаками. Относятся к группе стрептомицетов и род*
ственных им организмов (Goodfellow, Cross, 1984) или к группе
нокардиоподобных организмов (Bergey's, Manual, 1987).
Особое место среди актиномицетов занимает группа с
многоклеточными спорангиями. Из представителей этой
группы актиномицетов в почве наиболее частыми являются
культуры рода Geodermatophilus. Для выделения из почвы
Geodermatophilus obscurus используют среду следующего состава (г/л):
дрожжевой экстракт — 5; солодовый экстракт—15; растворимый
крахмал — 10; сахароза — 10; СаСОз — 2; агар — 20. Инкубируют
посевы в течение 30 дней при 28—24°. Культура характеризуется
колониями темно-коричневого или черного цвета.
Представители рода Geodermatophilus Luedemann, 1968
являются аэробными грамположительными организмами, не
кислотоустойчивыми, образуют подвижные споры, рудиментарный
мицелий фрагментируется, клеточная стенка III С типа (LL-ДАПК),
мезофилы. Относится к группе с многоклеточными спорангиями.
Для выделения актиномицетов-эндофитов рода Fran-
kia из клубеньков небобовых растений (облепихи, лоха и др.)
используют метод Лалонде. Метод предполагает стерилизацию
терминальных долек клубеньков раствором Os04, после чего их
разрезают, соблюдая стерильность, в фосфатносолевом буфере с по-
ливинилпирролидоном; отдельные кусочки клубеньков помещают
на дно пробирок с жидкой средой следующего состава (г/л):
K2HP04 — 0,3; NaH2P04 — 0,2; MgS04 ■ 7H20 — 0,2; KCI — 0,2*
дрожжевой экстракт —0,5; пептон —5,0 CAC03 —0,1; лецитине
0 5-Ю-2 (или твин-80—1 мл); глюкоза—10,0; РеСбН507пН20-—
о',1 ■ 10-1; НзВОз — 0,15-10"2; MnS04-7H20 — 0,8-10"3; ZnS04y
Х7Н20 —0,6.10-3; CuS04.7H20 —0,Ь10-3; (NH4)6Mo7024.4H20^
0,2.10-3; CoS04 — 0,Ы0~5.
Развитию актиномицетов в этом методе способствует отсутствие
токсических продуктов разрушения клубеньков, наличие
поверхностей, пригодных для колонизации при росте в жидкой среде
(дольки клубеньков). Через 8—10 недель после засева пробирок
с жидкой средой кусочками клубеньков проводят отбор пробирок,,
где рост посторонних бактерий и грибов отсутствует. В таких
пробирках дольки клубеньков обрастали актиномицетным мицелием.
Опущенные кусочки клубеньков рассевают на чашки в глубь
полутвердой среды вышеприведенного состава (0,8% агара). Чашки
заклеивают изоляционной лентой или лейкопластырем и
инкубируют при 28° 2—4 недели. Проводят микроскопический контроль
колоний, появляющихся в толще агара и вокруг кусочков. Из
клубеньков, обильно обрастающих мицелием, обычно вырастают стреп-
томицеты. Из клубеньков со слабым опушением вырастают
колонии небольших размеров (1—2 мм в диаметре, имеющие
нераспадающийся хорошо развитый мицелий со спорангиями (0 10—
30 мкм) различной формы (округлой, продолговатой, бобо- и
грушевидной), сильно опушенные на одном конце, и везикулами
(0 5—7 мкм). Эти колонии отсевают на чашки с полутвердой
средой приведенного состава и в пробирки с жидкой средой того же
состава. При субкультивировании культуры растут медленно
(видимый рост проявляется через 4 недели инкубации), развиваются
внутри полутвердой среды, реже — на поверхности среды.
Род Frankia Becking, 1970. Эндофиты, симбионты, образующие
клубеньки на корнях большой группы небобовых растений (ольхи,
облепихи, лоха и др.). Имеют хорошо развитый нефрагментирую-
щийся мицелий с интеркалярными и терминальными спорангиями
различной формы. Лешевалье (Lechevalier, Lechevalier, 1979)
предложили включить в род Frankia, введенный ранее на
основании изучения структурных особенностей in vivo Бекингом (Becking,
1970), актиномицеты со следующими свойствами:
1) азотфиксирующие, образующие клубеньки, растущие в
чистой культуре in vitro и способные образовывать эффективные и
неэффективные клубеньки на корнях растения-хозяина и быть
вновь выделенными из этих клубеньков, а также в погруженной
жидкой культуре формировать спорангии с неподвижными
спорами;
2) свободноживущие, не проявляющие способности
образовывать клубеньки или фиксировать азот, но формирующие
спорангии в жидкой культуре. В настоящее время выявлено, что
актиномицеты рода Frankia могут образовывать спорангии также на
поверхности твердых сред.
152
Род Frankia относится к группе с многоклеточными спорангия-
ГрУппа характеризуется присутствием аэробных и
факультативно анаэробных форм, мицелий которых делится во всех
направлениях. Нет воздушного мицелия, клеточная стенка III типа.
Для предварительного определения актиномицетов, наиболее
часто выделяемых из почвы и сопряженных с ней субстратов, мы
предлагаем использовать составленный нами ключ. В основу
ключа положены признаки, которые в первую очередь должны быть
определены при исследовании культуры в лаборатории, —
морфологические признаки и тип клеточной стенки. В случаях, когда
эти признаки не приводят к успешному разграничению родов,
необходимо использовать другие хемотаксономические показатели.
КЛЮЧ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РОДОВ АКТИНОМИЦЕТОВ,
НАИБОЛЕЕ РАСПРОСТРАНЕННЫХ В ПОЧВАХ И СОПРЯЖЕННЫХ С НЕЙ
СУБСТРАТАХ
1. Споры в цепочках 2
— Споры преимущественно одиночные, иногда в парах . . 13
2. Споры в цепочках
А. Цепочки короткие (четыре споры)
Microtetraspora
Б. Цепочки длинные 3
— Споры в парах только на воздушном мицелии
Microbispora
3. Клеточная стенка типа I
А. Субстратный мицелий не образуется
Sporichthya
Б. Субстратный мицелий образуется 4
— Клеточная стенка иного типа 5
4. Споры на воздушном мицелии. Мицелий не фрагментируется
А. Спороносцы расположены моноподиально
Streptomyces
Б. Спороносцы расположены мутовчато
Streptoverticillium
— Споры образуются при фрагментации воздушного и
субстратного мицелия
Nocardiopsis
5. Клеточная стенка типа III 6
— Клеточная стенка иного типа 10
6. Сахара отсутствуют в гидролизатах целых клеток. Эндосим-
бионты растений
Frankia
— Сахара в гидролизатах целых клеток типа В или С . 7
7. Сахара типа В
А. Истинных спорангиев нет. Некоторые виды образуют
псевдоспорангии
Actinomadura
Б. Спорангии присутствуют 8
— Сахара типа С 9
8. Споры подвижны. Имеют форму от коротких и длинных пало-
чек до спиралей
Spirillospora
— Споры неподвижны. Расположены в спорангиях
Streptosporangium
9. Споры в цепочках на воздушном мицелии, неподвижны.
Первичный и вторичный мицелий фрагментнруются
Nocardiopsis, Saccharotrix
— Споры подвижны. Рудиментарный мицелий делится во
взаимно перпендикулярных направлениях
Geodermatophilus
10. Клеточная стенка типа IV II
— Клеточная стенка типа II
А. Спорангии отсутствуют. Цепочки спор на воздушном
мицелии. Мицелий не фрагментируется
Glycomyces
Б. Спорангии присутствуют. Споры подвижны
Actinoplanes, Amorphosporangium, Ampullariella,
Dactylosporangium, Pilimelia
11. Споры в длинных цепочках на воздушном мицелии. Споры
образуются путем почкования и фрагментации воздушного
мицелия. Субстратные гифы зигзагообразно изогнуты, иногда
фрагментнруются. Термофилы
Pseudonocardia
— Споры на воздушном и субстратном мицелии .... 12
12. В клеточной стенке присутствуют миколовые кислоты.
Первичный и вторичный мицелий фрагментнруются. У некоторых
видов цепочки спор образуются только на воздушном мицелии,
субстральный мицелий не фрагментируется
Nocardia
— Миколовые кислоты отсутствуют в клеточной стенке
А. Мицелий хорошо развит, не фрагментируется. Споры
одиночные и в коротких цепочках образуются базипетально,
154
путем последовательного отчленения поперечными
перегородками кончика спороносца
Faenia
Б. Мицелий фрагментируется
Amycolata, Amycolatopsis, Saccharopolyspora
13. Спорангии отсутствуют 14
_. Спорангии присутствуют 15
14. Термоустойчивые эндоспоры. Мицелий хорошо развит. Споры
одиночные на коротких спороносцах на воздушном и
субстратном мицелии, реже непосредственно на гифах. Термофилы
Thermoactinomyces
— Эндоспоры отсутствуют. Споры (экзоспоры) слабо
термоустойчивы 16
15. По одной споре в спорангии, расположенном на воздушном
мицелии. Споры подвижны
Planomonospora
—- Пары спор в спорангии на воздушном мицелии. Споры
подвижны
Planobispora
16. Клеточная стенка типа III. Мицелий хорошо развит. Споры на
воздушном и субстратном мицелии. Термофилы
Thermomonospora
— Клеточная стенка иного типа
А. Клеточная стенка типа IV. Мицелий не фрагментируется.
Споры одиночные или в парах и коротких цепочках
непосредственно на гифах или спороносцах разной длины
на воздушном мицелии (иногда на субстратном
мицелии)
Saccharomonospora
Б. Клеточная стенка типа И. Споры одиночные или в парах
Micromonospora
Методы выделения и культивирования анаэробных бактерий
В зависимости от отношения к свободному кислороду бактерии
можно разделить на несколько групп. Облигатные аэробы растут
в аэробных условиях и нуждаются в Ог, поскольку не имеют
альтернативного акцептора электронов. Микроаэрофилы — это
аэробы, для которых парциальное давление 02, равное
атмосферному, токсично, а оптимальное не превышает 0,2 атм.
Факультативные бактерии способны вести окислительные процессы,
снабжающие их энергией, как с использованием свободного кислорода,
так и других акцепторов электронов. В зависимости от того, в ка-
Таблица 4
Индикаторы окислительно-восстановительного потенциала
Индикатор
Биндшеллера зеленый
Феноловый синий
м - Крезолиндофенол
о - Крезолиндофенол
Тимолиндофенол
Прочный хлопковый синий
Метиленовый синий
Мускарин
Бриллиантовый крезоловый синий
Галоцианин
Толуидиновый голубой
Резазурин
Метиловый Капри синий
Этиловый Капри синий
Хлорорафин
Индигокармин (дисульфонат)
Нильский синий Б
Крезиловый фиолетовый
Бриллиантовый ализариновый синий
Нейтральный синий
Феносафранин
Янус зеленый
Розиндулин 2Ж
Сафранин Т
Индулин
Нейтральный красный
£0, мВ, точка
полуперехода при рН 7
+224
+224
+208
4-191
+ 174
+80
+60
+50
+47
+21
—21
-51
-61
—72
-115
—125
—142
—167
—173
—250
—252
—258
—281
—289
—299
1 -325
ких условиях они растут или культивируются исследователем, их
называют факультативными аэробами или факультативными
анаэробами. Бактерии, не использующие для получения энергии
свободный кислород, но переносящие его без токсического эффекта,
называются аэротолерантными, или умеренными анаэробами.
Бактерии, не использующие Ог и повреждаемые или ингибируемые
им, называются аэрофобными, или строгими (облигатными)
анаэробами.
Степень анаэробиоза измеряется
окислительно-восстановительным потенциалом среды — редокспотенциалом (Eh). Eh — это
мера способности раствора (среды) отдавать или принимать
электроны, т. е. окисляться или восстанавливаться, выражается в
единицах разности электрического потенциала (в вольтах): чем более
положительна величина, тем выше концентрация окислителя по
отношению к восстановителю в растворе, и наоборот. Способность
среды противодействовать изменениям Eh аналогична буферным
свойствам растворов.
Для определения Eh сред для анаэробных бактерий обычно
используются окислительно-восстановительные красители. Они об-
156
атимо окисляются и восстанавливаются, причем в окисленном
РоСТОЯнии окрашены, а в восстановленном — большинство из них
бесцветны. Разные красители восстанавливаются при различных
значениях. Величина Eh, при которой краситель окислен или
восстановлен на 50%, называется стандартным
окислительно-восстановительным потенциалом (£0). В табл. 4 перечислены некоторые
наиболее распространенные красители и стандартные
окислительно-восстановительные потенциалы (ОВП). ОВП красителей
зависит от рН. Точная зависимость Eh от величины рН связана с
видом красителя. Для большинства красителей Eh увеличивается от
30 до 60 при падении рН на единицу, и наоборот.
Для определенных бактерий некоторые красители токсичны
даже в малых концентрациях. За исключением случаев, когда
предварительно известно, что краситель нетоксичен, проверяют его
действие. Восстанавливающие агенты добавляют в большинство
сред, предназначенных для культивирования анаэробов, чтобы
снизить ОВП и сбалансировать его на определенном уровне. Эти
вещества должны быть нетоксичны в использованных
концентрациях и приводить к такому снижению ОВП, которое было бы
приемлемо для исследуемых организмов. Восстанавливающие
агенты перечислены в табл. 5. Все приведенные в ней соединения
имеют Eq достаточно низкий, чтобы полностью восстановить реза-
зурин, обычно использующийся при культивировании нестрогих
анаэробов, однако для выращивания строгих анаэробов следует
использовать только те агенты, для которых Е0<—300 мВ
(табл. 5). Восстанавливающий агент сохраняет максимальную
Таблица 5
Восстанавливающие агенты, применяемые при культивировании
анаэробов
Соединения
Тиогликолат натрия
Цистеин • НС1
Дитиотрейтол
Титан (Ш)-цитрат
Na2S • 9Н20 (или H2S)
Цистеин HCl+Na2S • 9Н20
Eq, MB
— 100
-210
—330
—480
-571
Концентрация
в среде, %
0,05
0,025
0,05
0,5—2 мМ
0,025
0,025+0,025
эффективность, если основной раствор, лишенный кислорода,
стерилизуют и хранят в атмосфере инертного газа (методы
приготовления сред будут приведены ниже). К среде
восстанавливающий агент в необходимой концентрации добавляют
непосредственно перед опытом.
157
Методы культивирования нестрогих анаэробов
Методы приготовления сред для нестрогих анаэробов, включая
большинство клостридий, довольно просты. Все операции можно
проводить в обычной атмосфере или условии соблюдения
некоторых предосторожностей для избежания длительного контакта
бактерий и среды с кислородом. Применяют следующие приемы.
1. Среды готовят в сосудах, где отношение поверхности среды
к ее объему достаточно мало.
2. Для длительной инкубации анаэробов, не образующих газы,
наиболее подходящими являются бутыли и сосуды, доверху
заполненные свежепрокипяченной средой и закрытые
завинчивающимися пробками.
3. Готовят полужидкие среды (вместо жидких), добавляя к
жидкой среде 0,05—0,1% агара. Полужидкая среда способствует
уменьшению конвекционных потоков.
4. На поверхность инокулированной жидкой или полужидкой
среды наслаивают толстый слой васпара (50% вазелина + 50%
парафина).
5. Среду автоклавируют сразу же после смешивания
компонентов с восстанавливающим агентом.
6. Среды не подлежат длительному хранению. Нельзя хранить
среды в холодильнике, поскольку по мере снижения температуры
растворимость кислорода растет.
7. Для контроля за степенью окисленности среды к ней
добавляют резазурин (0,1 мг на 100 мл среды). Если верхняя треть
среды окрашивается непосредственно перед употреблением, ее
кипятят и охлаждают перед инокуляцией.
8. Для получения накопительной культуры используют
большие объемы инокулята.
9. Разведения, если это необходимо, делают в пробирках с
ростовой средой или в свежеприготовленном растворе,
содержащем восстанавливающий агент.
10. Некоторые аэротолерантные анаэробы, например
клостридий, можно нанести на поверхность агаризованной среды,
содержащей восстанавливающий агент, в чашках Петри, а затем поместить
в камеру, лишенную кислорода.
11. Чашки Петри, инокулированные аэротолерантными
анаэробами, инкубируют в анаэробных условиях в вакуумных
эксикаторах, анаэростатах, специальных герметических пакетах или
сосудах с генераторами Н2 + СО2. Более подробно приемы
культивирования анаэробных бактерий будут описаны в разделе,
посвященном культивированию строгих анаэробов.
Методы культивирования строгих анаэробов
Для активной жизнедеятельности строгих анаэробов
необходимо отсутствие кислорода в среде и низкая величина ОВП, что
требует герметичности сосудов культивирования,
предупреждающей попадание кислорода из воздуха. Ниже описаны основные
158
приемы и оборудование, применяемые при культивировании
строгих анаэробов, методы удаления кислорода, разлива жидких сред
при минимальном контакте с воздухом, восстановления сред,
индикации окислительно-восстановительного потенциала, герметизации
и получения отдельных колоний на плотных питательных средах.
Следует отметить, что успешно используются такие хорошо
разработанные приемы, как выращивание анаэробов в: а) жидких
средах, налитых высоким слоем в пробирки и колбы, б)
герметизированных трубках и пипетках, в) вакуумных эксикаторах,
шкафах и других закупоривающих емкостях, в которых кислород
поглощается пирогаллолом, солями хрома, железными стружками
и т. д.
Не отрицая возможности применения в ряде случаев
упомянутых методов, следует привлечь внимание читателей к новой, более
современной анаэробной технике и приемам культивирования,
позволяющим с большей надежностью, чем прежде, выращивать и
количественно учитывать как умеренные, так и наиболее строгие
анаэробные бактерии.
К этим методам относится культивирование в анаэробных
камерах типа анаэростатов, специальных крупных «перчаточных
камерах» и в пробирках по Хайнгейту. Краткая характеристика
достоинств и недостатков этих методов представлена в табл. 6.
Анаэробные камеры с печатками. Наиболее простым
устройством подобного рода является камера Аранки с соавт. Она
сделана из прозрачной пластичной виниловой пленки и содержит
внутри все необходимое для выполнения бактериологических
работ, включая инкубатор и микроскоп. Камера заполняется газами,
освобожденными от примесей кислорода. Оператор проводит
манипуляции в камере, одевая вмонтированные в камеру
газонепроницаемые перчатки. Существенное достоинство метода состоит в том
что на всем протяжении опытов, начиная с обработки образцов и
кончая анализом посевов, исключается контакт клеток с
кислородом воздуха. В качестве анаэробных камер (при отсутствии
виниловой пленки) могут использоваться стальные боксы,
предназначенные для работ с радиоактивными веществами.
Поглощение кислорода в «перчаточных камерах»
осуществляется с помощью палладиевого катализатора. Для этого воздух в
камерах замещают газовой смесью следующего состава (%):
Н2—10; С02—10; N2 — 80. В других случаях очищенную от
кислорода смесь постоянно пропускают через камеру.
В камерах жесткой конструкции желательно поддерживать
давление воздуха выше атмосферного, чтобы затруднить
диффузию кислорода из воздуха. Подтекание воздуха особенно
возможно в моменты вытягивания перчаток из камеры. Эта процедура
неизбежно приводит к понижению давления внутри камеры с
жесткими стенками. Определенные трудности возникают в связи с
невозможностью применения пламени горелки. Поэтому в камере
используется петля, стерилизуемая электрическим током. Камеры
из винилового пластика производятся в США.
159
Таблица 6
Характеристика различных методов выделения и культивирования
анаэробных бактерий
Методы
Ограничения
Достоинства1
Культивирование в
жидкой среде (в обычных
условиях)
Выращивание в трубках
и мерных пипетках (ага-
ризованные среды)
Метод стеклянных
покровных или полимерных
пластинок
Анаэростаты
Метод Хангейта и его
модификации
«Перчаточные камеры»
угнетение роста строгих
анаэробов; ограниченная
пригодность для
выделения чистых культур
контакт с 02 воздуха
при пересевах; глубинный
рост; ограниченность
объема среды
контакт с 02 воздуха
при пересевах; небольшие
объемы среды;
ограниченная пригодность для
выращивания сахаролити-
ческих видов; глубинный
рост
контакт с 02 воздуха при
пересевах
слияние колоний;
глубинный рост; ограничения
при микроскопировании
колоний; непригодность
использования
непрозрачных сред; сложность
оборудования
сложность и высокая
стоимость оборудования
доступность; эффективность
при выращивании небольших
количеств умеренных обли-
гатных анаэробов
доступность; экономичность
доступность; экономичность;
эффективность при выращи*
вании строгих анаэробов
относительная доступность;
возможность использования
чашек Петри; высокая
эффективность выделения
чистых культур
отсутствие контакта с 02
воздуха при пересевах
отсутствие контакта с 02
воздуха при пересевах;
удобство при массовых анализах
с использованием чашек
Петри; возможность комбинации
с другими методами
Методика Хангейта. Оригинальная методика была
предложена Хангейтом еще в 1950 г. Наиболее рациональным
способом получения поверхностных колоний строгих анаэробов
является их выращивание по методу Хайнгейта на тонком слое
пристенного агара. Для такого распределения агаризованной среды
внутри пробирки ее вращают во время застывания агара (в
литературе этот метод известен как метод вращаемых пробирок —
«роллингов»). Для затвердения герметически закрытые пробирки
с агаризованной расплавленной средой вращают в горизонтальном
положении под струей холодной среды вручную или в
выпускаемом зарубежными фирмами механическом вращателе пробирок.
160
r~\
3^
ч
Предпочтительнее ледяная вода. Если вращение осуществляется
уками, то необходимо вовремя остановить вращение, так как гель
лаб и'может сломаться. После застывания геля пробирки
устанавливают в вертикальное положение. При инкубации вода из ага-
стекает вниз по стенке, она не мешает колониям в верхней
части пробирки, но ее скапливание в нижней части может
способствовать их расползанию. Чтобы избежать процедуры вращения
пробирок с расплавленной агаризованной средой и необходимости
использования установки, предложено использовать пробирки с
вогнутой центральной частью, как показано на рис. 22 (Ogg et al.,
1979).
Ход получения отдельных колонии
следующий. В продутую
бескислородным газом пробирку помещают
бескислородную (прокипяченную в
анаэробной атмосфере) агаризованную среду.
В пробирки размером 16x150 мм
удобно вносить 4,5 мл. Из пробирки удаляют
следы кислорода, продувая ее
дополнительно бескислородным газом,
герметично закрывают и автоклавируют. В
случае окисленного состояния среды,
определяемого по цвету индукатора Eh,
в расплавленную среду после автокла-
вирования уколом сквозь пробку вносят
восстановитель. Теплый незастывший
агар инокулируют инъекцией посевного
материала (например, разведениями
почвенной суспензии), а затем уже
вращают пробирку, получая тонкий
пристеночный слой затвердевающей среды и
газовую фазу в центре пробирки.
Колонии бактерий вырастают на поверхности
агара, в его толще, а также между
агаром и стеклом. Пробирки со средой, приготовленные для «рол-
лингов», можно хранить после автоклавирования при комнатной
температуре, расплавляя для вращения и засева только перед
работой.
Накопленные в литературе многочисленные данные позволяют
проанализировать достоинства и недостатки метода. Безусловно,
основным достоинством метода является то обстоятельство, что
он позволяет полностью исключить контакт объекта с кислородом
воздуха на всех этапах микробиологической работы. Другим
преимуществом является невысокая стоимость.
У метода «вращающихся пробирок» имеются и свои
недостатки. 1. При выделении чистых культур встречаются значительные
трудности из-за высокой влажности в пробирках и образования
конденсационной воды, вследствие чего наблюдается расплывание
и слияние колоний особенно в нижней части пробирок. Затрудняет
KsJ
Рис. 22. Пробирка для
культивирования
анаэробов:
/ — резиновая пробка
или завинчивающийся
колпачок; 2 — колонии
бактерий; 3 — агаризо-
ванная среда
о„„ лп
выделение чистых культур также рост бактерий в пленочной воде
между стенками трубок и агаром. 2. Рост колоний в пробирках
сильно мешает микроскопированию, а особенно фотографированию
колоний. 3. Из-за образования пузырьков газа между стенкой
пробирки и агаром при вскрытии пробирок происходит разрыв агара
и его выброс. 4. В пробирках затруднено применение мутных и
непрозрачных сред.
Многие исследователи пришли к выводу, что в сравнении с
анаэростатами и «перчаточными боксами» методика Хангейта в
целом является более сложной и трудоемкой.
АНАЭРОСТАТЫ
Примерно до 1960 г. широко использовали анаэростаты с пал-
ладиевым катализатором, нагреваемым электричеством. Затем
было установлено, что катализатор проявляет достаточную
активность и при обычной температуре. Чтобы произошла реакция
соединения кислорода с водородом, в анаэростаты вводили
газообразный водород до конечной концентрации 10%, используя
баллоны со сжатым водородом. Поскольку работа с водородными
баллонами сопряжена с риском взрыва, не во всех лабораториях
можно применять подобную технику создания в анаэростатах
анаэробных условий.
Работа с анаэростатами значительно упростилась после
введения в практику химических генераторов Н2 и С02. В последние
годы за рубежом нашел широкое применение анаэростат системы
Газ Пак, представляющий собой прозрачную поликарбонатную
камеру, снабженную палладиевым катализатором и генераторами
Н2 и С02.
УДАЛЕНИЕ КИСЛОРОДА
Кислород из жидкой среды удаляют кипячением. Если при этом
поверхность кипящей среды продувать бескислородным газом и
среду остужать в нем же, то кислород в среде будет практически
отсутствовать. Последовательные вакуумирования и заполнения
бескислородным газом обычно применяют для микроанаэростатов,
анаэробных перчаточных боксов, т. е. не для одиночных проб,
а для контейнеров. Вакуумирование производят до разрежения
50—60 (0,006—0,007 мПа) мл рт. ст. Замещение производят
газовой смесью (%): N2 —80; Н2—10; С02—10. Обычно для
удаления основного количества кислорода достаточно трех операций
вакуумирования. Для экономии относительно дефицитного
водорода первые две можно проводить с замещением не газовой
смесью, а бескислородным азотом. Скорость протока должна
составлять 100 см3/мин, ориентировочно ее можно определить,
поместив конец газоотводящего шланга в воду. Задув водорода или
газовой смеси с водородом не нужен, если в контейнере кроме
холодного катализатора устанавливают газогенерирующий пакет.
Газогенерирующие пакеты для анаэробных микробиологических
162
оабот производятся зарубежными фирмами и представляют собой
пакеты из фольги, содержащие таблетку лимонной кислоты с
бикарбонатом натрия и таблетку боргидрида натрия. Пакеты
помещают в небольшие контейнеры (микроанаэростаты), для камеры
перчаточного бокса он мал. Перед тем как герметически закрыть
крышку сосуда, срезают угол пакета и вливают в него 10 мл
воды. Если катализатор реакции водорода с кислородом работает,
то крышка сосуда с закрепленным на ней катализатором
становится на ощупь теплой, а на внутренней стенке сосуда через 15—
20 мин после активации должен появиться конденсат.
Для удаления следов кислорода внутри контейнеров или
получения тока бескислородного газа используют катализаторы, на
которых кислород вступает в химические реакции с водородом и
таким образом выводится из дальнейших процессов. Внутри
контейнеров применяют катализатор, активный при комнатной
температуре. Катализатор состоит из покрытых палладием гранул
алюминия, для соблюдения безопасности помещенных в мешочек из
металлической сетки. Этот катализатор инактивируется
сероводородом, скорость отравления катализатора увеличивается при
повышении влажности газовой фазы. Чтобы проверить, активен ли
катализатор, его подставляют под струю Н2, активный катализатор
сильно разогревается уже через 1 мин. Лучшая активность
наблюдается, если перед каждым использованием катализатор заменять
на новый или восстановленный. Восстанавливается катализатор до
полной активности нагреванием сухим жаром (160—170° в течение
2 ч). После нагрева катализатор хранится в чистом сухом
безвоздушном контейнере. Для активной работы катализатора
газовая смесь должна содержать не менее 3% Н2.
Для продувки пробирок, флаконов, жидкой среды и во всех
случаях, когда упоминается бескислородный газ без указания
состава, можно использовать технические С02 или N2, пропущенные
сквозь медный катализатор (печь Сарджента, колонку Хангейта).
Удобно использовать следующий вариант колонки Хангейта.
Вертикально закрепленную стеклянную трубку из пирекса
(внутренний диаметр 35 мм, высота 450 мм) с сужениями на обоих концах
для присоединения шлангов и «крепления набивают медными
опилками. Колонку разогревают примерно до 350° спиралью из нихро-
мовой проволоки, обмотанной вокруг колонки. Чтобы кольца
спирали не съезжали по стеклу, на колонку предварительно
наматывают тонкую ленту асбеста (рис. 23). В целом колонку не
закрывают асбестом, что способствует ее лучшему нагреву и позволяет
контролировать восстановление меди. Восстановленная медь имеет
ярко-розовый цвет, оксид меди темного цвета. Для соблюдения
техники безопасности колонку с электрической спиралью
закрывают защитной стеклянной рубашкой — наружной трубкой. В
случае длительной работы с чрезмерным разогревом между колонкой
и наружной трубкой полезно поместить слой асбеста таким
образом, чтобы верхний слой меди оставался открытым для
визуального контроля.
6*
163
Рис. 23. Стеклянная печь с
медным катализатором для
удаления остаточного кислорода:
/ — печь-колонка; 2 —
нагревающая спираль; 3 —
подстилающая полоска асбеста; 4 —
медь; 5 — защитная
стеклянная рубашка, 6 —
соединительные электропровода
Для восстановления меди сквозь
разогретую колонку пропускают Н2.
или (что дольше, но уменьшает взры-
воопасность) смесь из 97% С02 + 3%
Н2. При продувке трубки одним
водородом она до начала задува* Н2
должна быть заполнена С02 или N2 для
вытеснения воздуха (иначе возможен
взрыв).
Выше было указано, что из
жидкой среды кислород удаляют
кипячением, обычно для лабораторных колб
достаточно нескольких минут. Затем
раствор можно сохранить
анаэробным, заместив пары на
бескислородный газ. При продувке газоподводя-
щую трубку опускают до
поверхности среды. Если раствор среды
неустойчив на воздухе при нагревании,
он может быть освобожден от
кислорода продуванием бескислородного
газа, без кипячения среды. В этом
случае скорость удаления кислорода
невелика, чтобы освободить раствор
в лабораторной колбе от кислорода
этим методом, обычно требуется до
часа интенсивного пропускания бескислородного газа.
РАЗЛИВ ЖИДКИХ СРЕД ПРИ МИНИМАЛЬНОМ КОНТАКТЕ С ВОЗДУХОМ
Приготовленную среду из колбы переносят в культуральные
пробирки или флаконы, предварительно продутые бескислородным
газом. После переноса среды в малый сосуд его дополнительно
продувают бескислородным газом при закрывании.
Возможны два основных способа разлива бескислородной
среды: пипеткой и прямой разлив. В первом случае применяют
приспособление, представленное на рис. 24. Колбу со средой
закрывают резиновой пробкой с тремя отверстиями. Одно отверстие
служит для ввода газа через трубку, которая достигает дна, газ про-
булькивает через среду. Второе отверстие, предназначенное для
отбора среды, имеет такой диаметр, чтобы сквозь него свободно
проходила 10-миллиметровая пипетка. Пипетка при установке в
колбе должна достигать дна, а у верхней границы отверстия
пробки на пипетку надевается резиновое кольцо-уплотнитель, чтобы
газ не мог выходить в щель между пипеткой и пробкой. Третье
отверстие служит для выхода газа при пробулькивании среды.
Достаточно зажать это отверстие пальцем, как газ начнет
вытеснять среду через пипетку, т. е. заполнять ее. Палец с отверстия
164
Рис. 24. Устройство для Рис. 25. Устройство для
анаэробного отбора ере- анаэробного перелива
ды среды
убирают, когда среда достигает в пипетке нужного уровня и ее
можно переносить в пробирку или флакон.
Второй вариант колбы со средой, предназначенной для
прямого разлива, основан на том же принципе вытеснения среды
бескислородным газом (рис. 25). Основное отличие второго варианта в
том, что он предполагает получение больших порций среды и
поэтому отверстие для выхода газа закрывается завинчивающимся
или ослабляемым «колпачком. Кроме того, достаточно широкое
отверстие под зажимным колпачком удобнее для приготовления средг
в него легче вносить добавки или отбирать пробы для
проверки рН. Для быстрого разлива сред в условиях тока
бескислородного газа в пробирки удобно также использовать отечественный
дозатор ДШП-5 (Одесский экспериментальный завод
лабораторной медицинской техники).
В том случае, когда ведут разлив уже стерильной среды, газ
„пропускают через переходник с ватой, предварительно простерили-
зованной сухим жаром. Для продувки пробирок и флаконов до и
после разлива сред используют специальный газовый зонд,
который надевают на конец газоподводящего шланга (рис. 26), им
Рис. 26. Газовый зонд:
1 — заполненный ватой цилиндр
шприца; 2 — резиновая трубка; 3 — газ без
примесей 02; 4 — игла; 5 — спиленный
конец иглы; 6 — фланец цилиндра
шприца
1ЯК
служит тубус шприца с отрезанным фланцем. Фланец отрезают,
чтобы было удобнее надевать на шприц шланг, а чтобы не
повредить шланг, край шприца нужно оплавить. Шприц перед работой
стерилизуют вместе с надетой на него иглой, затем иглу по
необходимости обжигают. Давление газа для вытеснения cpejftj или
продува пробирки должно быть небольшим, около 0,05
избыточной атмосферы. Струя газа из шприца ощущается рукой или
слегка отдувает пламя газовой горелки при обжиге иглы. Чтобы
удалить воздух из культуральной пробирки размером 16x150 мм,
содержащий 5—10 мл среды, достаточно опустить иглу шприца с
потоком газа 5 см3/с на 5—10 с. Особое внимание надо обратить
на то, чтобы не допустить проникновения воздуха в пробирку или
флакон, когда он уже заполнен и газирующую иглу продувающего
шприца извлекают. В этом случае следует медленно вынимать
иглу одной рукой, держа в другой приготовленную пробку, и
вставлять пробку, быстро вытаскивая конец иглы, зажатый в горловине
между пробкой и стеклом.
ВОССТАНОВЛЕНИЕ СРЕДЫ
В качестве восстанавливающих агентов для сред можно
использовать ряд химических соединений (см. табл. 5). Восстановители
хранят в виде отдельно приготовленных растворов в анаэробной
атмосфере и в ней же стерилизуют. Следует подчеркнуть важность
использования свежих восстановленных сред, не подвергавшихся
длительному хранению и окислению кислородом воздуха. С целью
восстановления сред в настоящее время используется широкий
круг редуктонов. Из них наиболее употребительны цистеин, ди-
тиотрейтол, тиогликолят натрия, аскорбиновая кислота и сульфид
натрия. Однако каждому соединению свойственны специфические
недостатки, ограничивающие их применение. Так, тиогликолят
угнетает прорастание спор клостридий, поэтому его не
рекомендуется применять при учете их в природных субстратах. Другой
пример: образование сероводорода и сульфида жедеза при
разложении цистеина обычными гетеротрофными анаэробами может
привести к увеличению темноокрашенных колоний, а значит — и
к получению завышенных данных при учете сульфатредуцирующих
бактерий. Поэтому цистеин приходится заменять другим
восстановителем.
Конечные концентрации восстановителей могут достигать 0,02—
0,05%, при более высоких — могут обнаружиться ингибирующие
эффекты, в частности при применении дитионита или
растворенного сульфида натрия. Менее токсичными являются смесь цистеина
с сульфидом натрия и нерастворимый сульфид железа.
ИНДИКАТОРЫ ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛА
Индикаторами восстановленных условий в жидкой среде или
газовой фазе культивирования служат химические соединения,
которые меняют окраску при переходе окисленной формы в восста-
166
новленную. Наиболее часто для жидких сред применяют резазу-
рин, внося 1 мл 0,2%-ного раствора на 1 л среды; раствор с
окисленным резазурином имеет розовый или фиолетовый цвет, ниже —
100 мВ резазурин обесцвечивается. Для регистрации более низких
потенциалов удобен феносафранин, у которого при рН 7,0
изменение окраски происходит при —252 мВ. Использование
индикаторных красок имеет и еще одну полезную сторону. Так, нейтральрот
позволяет на плотных питательных средах различать колонии об-
лигатных и факультативных анаэробов. На средах с нейтральным
красным колонии облигатных анаэробов обнаруживаются по
способности флуоресцировать и изменять окраску среды вокруг
колоний в желтый цвет, в то же время среда вокруг колоний
факультативных анаэробов не изменяет своего первоначального красного
цвета.
В прозрачных анаэростатах и анаэробных «перчаточных
боксах» для визуального контроля восстановленности атмосферы
обычно применяют бумажные полоски, пропитанные метиленовым
синим. Перед помещением в контейнер их увлажняют. В
окисленном состоянии они синие, при восстановлении обесцвечиваются.
Подобные индикаторные бумажки, пропитанные резазурином,
соответственно обесцвечиваются при исходном розовом цвете.
Процесс обесцвечивания в зависимости от влажности температуры и
степени восстановленности атмосферы может занимать до
нескольких часов. Второй путь контроля, пригодный для анаэробных
«перчаточных боксов», — это постоянное продувание небольшого
количества газовой фазы сквозь флакон с метиленовым синим. Флакон
и малый насос для продувки помещают внутри камеры бокса.
ГЕРМЕТИЗАЦИЯ
Способ герметизации при выращивании анаэробных бактерий
определяется особенностями физиологии организмов. Устойчивые
к кислороду формы можно культивировать в пробирках или
колбах, наполненных высоким слоем жидкой или агаризованной
среды. В этом случае происходит уменьшение диффузии 02 в среду,
а его небольшие количества могут при этом расходоваться на
окисление восстановителя или, в накопительной культуре,
потребляться сопутствующей микрофлорой. С этой же целью применяют
наслаивание на поверхность среды расплавленного агара, чтобы
создать «анаэробную пробку». Успешные результаты получаются
при культивировании сульфатредуцирующих бактерий в
наполненных средой капиллярах при заливке входных отверстий парафином
или менделеевской замазкой, а также применение метода Штурм
и его модификации, предложенной В. И. Дудой (с. 103). Метод
особенно успешен для культивирования сульфатредуцирующих
бактерий, так как они при развитии образуют сероводород —
активный восстановитель, который реагирует с проникающим
кислородом.
Для больших объемов в качестве контейнеров для пробирок
или чашек Петри используют вакуумные эксикаторы. Наилучшими
1А7
вариантами подобных контейнеров являются микроанаэростаты:
сосуды с плотно прижимаемыми крышками, эластичными прижим*
ными прокладками, манометрами для определения внутреннего
давления и клапанами, допускающими откачку газовой фазы из
сосуда и его заполнения нужной газовой смесью. Для удаления
следов кислорода в микроанаэростаты помещают восстановители
и катализаторы. Микроанаэростаты отечественного производства,
выполненные из металла, можно приобрести через торговое
объединение Медтехника. Более удобны для работы зарубежные
аналоги с прозрачным корпусом. В этом случае о восстановленности
газовой фазы можно судить по обесцвечиванию помещенной внутрь
индикаторной бумаги.
При работе с анаэростатами, даже если среда в чашках
восстановлена, на момент посева чашки приходится извлекать из
анаэростата, т. е. подвергать краткому воздействию кислорода.
Для большинства анаэробных бактерий это допустимо, но для
некоторых облигатных анаэробов, например метанобразующих
бактерий, крайне нежелательно. Поэтому колонии таких бактерий
получают либо в замкнутых объемах — вращаемых пробирках
(«роллингах»), либо в больших контейнерах, допускающих
внутренние манипуляции микробиолога, — «перчаточных боксах».
Зарубежные фирмы выпускают несколько моделей анаэробных
«перчаточных боксов». Работа в них регламентируется особенностями
конструкции и требует определенного навыка.
Выделение анаэробных бактерий можно проводить и без
контейнеров типа анаэростатов и анаэробных боксов. Простейшим
надежным оборудованием в этом случае являются флаконы и
пробирки с герметичными резиновыми пробками. Удалить кислород и
восстановить среду в малых замкнутых объемах легче, чем в
больших. Бактерии в этих случаях подвергаются краткому воздействию
кислорода лишь при перенесении из одного сосуда в другой, но и
этого воздействия можно практически избежать, если отбирать и
переносить пробу бескислородным шприцем, инъецируя уже
восстановленную среду.
Обычные резиновые пробки не являются абсолютно
надежными, так как допускают диффузию газов, и недостаточно эластичны
для шприцевых уколов. Наименее проницаемы для газов пробки
из бутиловой резины. Однако недавно выпущенные пробки из
отечественной бутиловой резины недостаточно эластичны и плохо
выдерживают неоднократные проколы. Хорошо зарекомендовали
себя пробки фирмы Bellco (США), сделанные из бутиловой
резины. Они сочетают низкую проницаемость для газов с
выдерживанием многочисленных проколов. Пробки удобны для пробирок
Балча и по размерам подходят к медицинским флаконам.
Большая толщина (10 мм) обеспечивает надежное закрывание сосуда,
но при этом пробку легко проколоть иглой.
168
ВЫДЕЛЕНИЕ И УЧЕТ ПОЧВЕННЫХ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ
Отбор почвенных образцов. Почвенные образцы
отбирают не менее трех раз в течение года (вегетационного сезона).
Каждый почвенный образец характеризуют 10 отдельно взятыми
навесками почвы, отобранными методом случайных проб в
исследуемом биогеоценозе. В зависимости от цели работы образцы
берут из пахотного горизонта (в случае агроценоза), верхнего
минерального горизонта или по горизонтам почвы и подстилки (при
изучении биогеоценоза). Каждую пробу почвы (1—10 г) помещают
в стерильный пакет из крафт-бумаги, этикетируют и анализируют
в лаборатории. Если нет возможности произвести посев из почвы
в день взятия образцов или на следующий день (в последнем
случае образцы хранят в холодильнике при 5°), то рекомендуется
высушить их до сухого состояния в закрытом помещении, не
подвергая воздействию солнечных лучей.
Предпосевная обработка почвы. При подготовке
почвы к микробиологическому посеву необходимо десорбировать
споры и мицелий микроскопических грибов с поверхности
почвенных частиц, дезагрегировать микроколонии грибов и разбить
грибные гифы на достаточно близкие по размерам фрагменты.
Достигается это различными механическими воздействиями на
почвенную суспензию (1—10 г почвы на 100 мл стерильной
водопроводной воды). Почвенную суспензию обрабатывают путем
15—20-минутного перемешивания в колбах на качалке (Литвинов, 1967), на
пропеллерной мешалке-миксере (микроразмельчитель тканей
РТ-2) или растиранием почвы, увлажненной до пастообразного
состояния (Звягинцев, 1987). Время обработки на
микроизмельчителе тканей 5 мин при 5000 об/мин. Затем готовят нужное для
посева разведение. Стержень и пропеллер мешалки тщательно
очищают от почвенных частиц механически. Далее стержень
протирают спиртом, спирту дают испариться и затем производят
обработку новой пробы почвы. Стаканчики, в которых проводится
диспергирование почвы, стерилизуют в автоклаве или спиртом.
В последнем случае стерилизацию необходимо производить как
можно тщательнее.
При учете почвенных грибов ультразвуковая обработка
оказывает явно отрицательное действие. Известно, что чем крупнее
клетка, тем больше она повреждается ультразвуком. Крупные клетки
грибов повреждаются ультразвуком сильнее, чем мелкие клетки
бактерий.
При определении численности грибов лучше всего использовать
обработку почвенной суспензии на пропеллерной мешалке, так как
при перемешивании суспензии в колбах на качалке почвенные
агрегаты совершают плавное поступательно-вращательное
движение и не подвергаются существенному диспергированию.
Посев из разведений почвенной суспензии на плотные
питательные среды для определения численности и видового состава
комплекса почвенных микромицетов. Учет мицелиальных
организмов— грибов и актиномицетов — на питательных средах имеет бо-
лее условный характер по сравнению с учетом бактерий, так как
здесь более неопределенной является величина и характер
зародыша, давшего колонию. Это могут быть различные генеративные
образования, фрагменты гиф, разнообразные мицелиальные
структуры. Предварительная обработка дает возможность разбить гифы
на куски примерно одинаковой величины, и хотя размер
учитываемых зачатков продолжает различаться в несколько раз, он уже
не различается в десятки раз, как это было до диспергирования
почвы.
Для проведения посевов на агаровые питательные среды
рекомендуется брать навеску почвы 10 г и использовать разведения
1 : 10, 1 : 100; 1 : 1000; 1 : 10000 в зависимости от содержания
грибов в почве. Последнее разведение в основном используется для
лесных подстилок. Для большинства почв оптимальным является
разведение в интервале 1 : 100—1 : 1000. На поверхность твердой
питательной среды наносят одну каплю почвенной суспензии и с
помощью стерильного шпателя распределяют ее по всей
поверхности агаровой пластинки. Необходимо, чтобы на каждой чашке
Петри выросло в среднем 15—30 колоний микроскопических
грибов. Каждый из 10 образцов изучаемого биогеоценоза высевают на
3—5 чашек Петри. Оптимальная температура инкубации
большинства грибов 24—26°. В случае специального выделения психрофи-
лов или термофилов температуру инкубации меняют в
соответствии с оптимумами для этих групп грибов. При выделении
микроскопических грибов из почвы подавление различных бактерий
достигают установлением кислой реакции среды (рН 4,2—4,5).
Для подкисления сред употребляют различные кислоты. В
среднем на 1 л агаризованной среды добавляют 15—20 мл 0,1 н.
раствора серной или соляной кислоты. Молочную кислоту обычно
применяют концентрированную в количестве 4 мл на 1 л среды
(лимонную в виде 50%-ного раствора—10 мл на 1 л среды).
Прибавление кислот к агаровым средам (до рН 4,0) не оказывает
отрицательного влияния на их способность к переходу в твердое
состояние при остывании. Концентрированные кислоты
стерилизовать не надо, 0,1 н. растворы серной и соляной кислот следует
стерилизовать отдельно. Наиболее часто при проведении посевов из
почвы используют молочную или лимонную кислоты.
При необходимости выделить грибы, которые не могут
развиваться на кислых средах, и изучении состава грибов в почвах с
нейтральной и щелочной реакцией среды в качестве ингибиторов
бактерий применяют роданистый натрий (0,25—0,4 моль/л,
краситель бенгальский розовый — 70 мг/л и антибиотики: стрептомицин-
сульфат— 40—50 мг/л, тетрациклин, окситетрациклин, хлортетра-
циклин — 2—5 мг/л, пенициллин, неомицин, полимиксин, бацитра-
цин — 50 мг/л среды) (Литвинов, 1967). Добавление кислот и
других ингибиторов бактерий производится асептически в стерильные,
охлажденные до 45° питательные агаровые среды.
Засеянные водно-почвенной суспензией чашки Петри
периодически просматривают обычно начиная с 3—5 сут, и отдельные ко-
17Л
лонии грибов, в случае угрозы зарастания агара мицелием
быстрорастущих микромицетов, отсевают в пробирки на агаризован-
\ую питательную среду. Окончательный учет производится в
зависимости от среды выделения: на сусло-агаре и синтетических
средах с простыми углеводами на 6—10-й день, на средах с
целлюлозой, КМЦ, лигнином через 2—3 недели, на голодном и почвенном
агаре через 3—4 недели. Расчет количества грибных зачатков в
почве, выделяемых на данной среде, производится по следующей
формуле:
где а — число грибных зачатков на 1 г почвы; б — среднее
количество колоний на чашках; в — разведение, из которого сделан
посев; г — количество капель в 1 мл суспензии; д — масса почвы,
взятой для анализа. Полученные данным методом значения
численности грибных зачатков (диаспор) позволяют составить
относительное представление о степени заселенности исследуемой
почвы микроскопическими грибами и содержании в ней отдельных
видов.
Метод прямого посева почвенного мелкозема на
питательные среды. Для выделения микроскопических грибов методом
прямого посева мелкозема стерильным пинцетом переносят точно
взвешенные навески почвы (5—50 мг) в стеклянную трубку или
маленькую воронку, затянутые снизу сеткой из мельничного газа
с диаметром пор 0,25 мм. Навеску просеивают через сетку,
равномерно распределяя почвенные частицы по поверхности агаризован-
ной питательной среды. Из каждого отдельно взятого образца
делают высев на 3—5 чашек Петри. При посеве мелкозема на
богатые среды — сусло-агар, среды Чапека и Мартина — навеска, как
правило, не превышает 5—20 мг, при посеве на бедные среды —
водный и почвенный агар-—берут 50 мг почвы (Новогрудский,
1956). Анализ состава грибов и выделение их в чистые культуры
можно провести на 7—10-е сут на богатых средах и через 2—3
недели на бедных. Для этого необходимо установить оптимальную
для исследуемой почвы массу образца, чтобы на чашке Петри в
среднем вырастало не более 15—20 колоний. Метод позволяет
полнее учесть грибы в почве, выделение которых затруднено при
посеве из водно-почвенных суспензий, поскольку развиваются
обильно спороносящие виды.
Существует ряд близких к описанному методу способов посева
почвенного мелкозема на питательные среды для выделения
микромицетов. Метод прямых отпечатков почвенной пробы и
электростатический метод, суть которых сводится к различным приемам
нанесения почвенных частиц на поверхность питательных сред.
Согласно методу Уоркапа проводят глубинный посев небольших
(5—15 мг) навесок почвы, смешав их предварительно с каплей
стерильной воды на дне чашки Петри.
Выделение микроскопических грибов различных
эколого-трофических групп
Состав комплекса почвенных грибов-микромицетов зависит от
формы поступающего в почву субстрата, ее гетерогенности,
физико-химических условий, конкурентоспособности и ростовых
характеристик организмов. Известно, что грибы в почве представлены
разнообразными по систематическому положению и пищевым
потребностям формами. Поэтому для выделения их и всех других
групп микроорганизмов не может быть одной универсальной
среды. Сапротрофные почвенные микромицеты по способности
усваивать те или иные субстраты объединяются в различные пищевые
группы: сахаролитические грибы; грибы, разлагающие целлюлозу,
лигнин, кератин, хитин и т. д.
Не отрицая наличие существенных физиологических различий
среди сапротрофных микромицетов, необходимо подчеркнуть, что
деление на специфические трофические группы грибов во многом
условно. Так, в отношении «сахарных» грибов нужно заметить,
что вообще нет микроорганизмов, которые не содержали бы гидро-
лаз. Поэтому наряду с использованием Сахаров и других
мономерных органических соединений «сахарные» грибы могут потреблять
и полимеры, особенно крахмал, белки и т. д. Во то же время
микроорганизмы, которые обладают специфическими гидролазами,
вполне могут использовать ряд мономеров (Звягинцев, 1987).
При выделении микромицетов, разлагающих целлюлозу,
лигнин, гумусовые вещества и т. д., источник углерода добавляют к
синтетической минеральной среде или используют метод
приманок.
Для выделения грибов, быстро усваивающих легкодоступные
углеводы, используют сусло-агар 3—4° по Баллингу и
синтетические среды с простыми углеводами — среды Чапека, Мартина, Ро-
лана или пептоно-глюкозный агар Ваксмана.
Среда Мартина (г/л): глюкоза—10; КН2Р04 —5;
MgS04— 0,5; пептон — 5; агар — 20; вода водопроводная; рН — 5,5.
Среда Ролана (г/л): сахароза — 50; NH4NO3 — 3;
КН2Р04— 1; MgS04-7H20 — 1; CuS04.5H20 — 0,02; агар—20;
вода дистиллированная.
Пептоно-глюкозный агар Ваксмана (г/л):
КН2Р04 — 1; MgS04— 0,5; глюкоза — 10; пептон — 5; агар — 20;
вода водопроводная; рН — 0,6.
Целлюлозоразрушающие грибы изолируют на питательные
среды Гетчинсона, Частухина, которые содержат в качестве
источника углерода целлюлозу или карбоксиметилцеллюлозу.
Стерильную фильтровальную бумагу раскладывают на поверхность
питательной среды или вносят в измельченном виде в раствор.
Фильтровальную бумагу следует предварительно прокипятить в
дистиллированной воде и проверить отсутствие в ней примеси крахмала
по отрицательной йодной реакции. Для приготовления среды
необходимо брать очищенный агар. К минеральной основе среды мож-
172
но также добавлять порошковидную целлюлозу или карбоксиме-
тилцеллюлозу в концентрации 1%.
Для выделения грибов, разлагающих лигнин, в среды вносят
в 1%-ной концентрации препарат лигнина или субстраты,
содержащие его в большом количестве. Лигнинразрушающие микроми-
цеты можно выделить, используя силикагельные пластинки,
пропитанные минеральными солями, на поверхность которых нанесен
порошкообразный лигнин в количестве 0,25 г на чашку. Чашки
инокулируют 1 мл почвенной суспензии и инкубируют при 28° во
влажной камере. Колонии микромицетов появляются на
поверхности лигнина через 3—4 недели.
В качестве единственного источника энергии в среды
добавляют также различные производные лигнина (ванилин, сирингаль-
дегид, n-гидроксибензальдегид и другие). Какой-либо из
производных лигнина в концентрации 0,01% вводят в среду Чапека—Докса,
которую готовят в 10-кратном разбавлении. Повышать
концентрацию производных лигнина не рекомендуется, поскольку они, как
л все фенолы, токсичны для микроорганизмов (Сэги, 1983).
Грибы, которые не выдерживают конкуренции за моносахара
при высоких их концентрациях в среде, выделяют на «голодные»
среды — водный агар, агар с почвенной вытяжкой, агар с
разведенным в 8—10 раз суслом. На этих средах большинство
микромицетов развивается медленно, образует мелкие (2—3 мм в
диаметре) колонии, хорошо отделенные друг от друга, что
благоприятствует выделению грибов в чистые культуры.
Для выделения фитопатогенных грибов из почвы используют
среды, селективность которых задается введением антигрибных
антибиотиков. Наиболее часто применяют полиеновые антибиотики
(эндомицин, нистатин, пимарицин) и циклогексимид, обладающие
широким фунгицидным действием, но вместе с тем не
подавляющие рост и развитие отдельных видов фитопатогенных
микромицетов. Широко используются для этих целей и такие химические
соединения, как красители (бенгальский розовый, кристалл- и ген-
цианвиолет, малахитовый зеленый), спирты, хлораты, фенолы,
коммерческие фунгициды (каптан, пентахлорнитробензол, ботран и
другие). Бенгальский розовый применяют для ограничения роста
быстрорастущих форм микромицетов, фундазол — для подавления
грибов PenicUlium.
Для выделения представителей класса хитридиомицетов (род
Allomyces) используется среда следующего состава: тиаминХ
ХНС1 — 0,15 мг; DL-метионин — 0,1 г; глюкоза — 5,0 г; MgCl2—
0,005 М; КН2Р04 —0,005 M; (NH4)2HP04 —0,005 M; СаС12 —
0,0005 М; МпС12 —0,5 ppm Mn; ZnS04 — 0,1 ppm Zn; CuS04 —
0,1 ppm Cu; FeCl3— 1,0 ppmFe; (NH4)6Mo702 —0,2 ppmMo;
Н3ВОз — 0,5 ppm В; СаС12 — 0,2 ppm Ca. Глюкозу стерилизуют
отдельно, растворы СаС12 и MgCl2 стерилизуют отдельно и
смешивают с глюкозой.
При выявлении группы почвенных грибов, относящихся к Ре-
ronosporales семейства Pythiaceae, среди которых много фитопа-
тогенных видов, применяют пептоно-декстрозную среду Мартина,
селективность которой для этих грибов создается антибиотиком
пимарицином или эндомицином в количестве 10 мкг/мл.
Для выделения и учета в почве возбудителя фузариознрго
увядания растений — Fusarium oxysporum предложена среда, в
состав которой входят (г/л): NaN03 —2,0; K2HPO4—1,0; KC1 — 0,5;
MgS04 — 0,5; FeSC>4 — 0,01; галактоза — 20,0; агар — 20,0 и в
качестве селектирующих агентов — медицинская желчь—15 мл/л,
пентахлорбензол — 1 г/л, стрептомицин — 0,3 г/л. Посев проводят
1 мл почвенной суспензии из 103 разведения глубинным способом.
Засеянные чашки инкубируют 7—10 сут на свету при 26—28°. По
истечении этого времени на среде образуют характерные колонии
Fusarium oxysporum с пленчато-пушистым мицелием
телесно-розового цвета, хорошо дифференцирующиеся от других видов грибов.
Для выявления и учета фитопатогенных грибов Verticillium
dahliae в почве применяют голодный агар, в который вводят
антибиотики пенициллин (100 000 ед/л), стрептомицин (50 000 ел/л) и
спирт-ректификат (20 мл/л). В колбу с 700 мл стерильной воды
помещают образец почвы массой 15 г и встряхивают в течение
15 мин. Посев осуществляют 0,3 мл суспензии, чашки инкубируют
при 24° в течение 2 недель. На данной среде формируются
небольшие колонии вертициллов, состоящие из микросклероциев,
мицелий практически не образуется. Предполагаемые колонии
Verticillium dahliae отвивают штрихом на среду Чапека с
антибиотиками и просматривают на 3-е сут.
Для выделения микроскопических грибов из почвы с целью
последующей характеристики структуры комплекса сапротрофных
микромицетов наиболее часто используют подкисленные молочной
кислотой (4 мл/л) синтетические среды с простыми углеводами,
например среду Чапека (г/л): сахароза — 20,0; NaNOs— 2,0;
КН2РО4 — 1,0; MgS04 • 7Н20 — 0,5; KC1 — 0,5; FeS04 — 0,01;
агар — 20,0; вода дистиллированная. Применение среды Чапека
существенно упрощает анализ посева, так как культурально-мор-
фологические признаки грибов на ней близки тем, которые имеют
микромицеты на среде Чапека—Докса, используемой для
идентификации многих видов грибов. Поэтому выделение микромицетов
для видового определения можно проводить из одной или группы
одинаковых колоний, а не из почти всех подряд, как при посевах
на ряд других сред. Выделение штаммов почвенных грибов для
видовой идентификации осуществляют на среды Чапека—Докса,
сусло-агар или другие в соответствии с систематической
принадлежностью организма. Каждый штамм нумеруют, записывают в
лабораторный журнал принадлежность его к определенному
образцу и варианту опыта, что необходимо для дальнейшей обработки
данных.
МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ
Почвенные грибы, которые можно выделить методами,
описанными в предыдущем разделе, относятся к следующим
таксономическим группам:
класс порядок
Oomycetes Peronosporales
Zygomycetes Mucorales
Ascomycetes Eurotiales, Sphaeriales
Deuteromycetes Hyphomycetales, Spharopsidales
Melanconiales
Идентификация микроскопических грибов основывается
преимущественно на морфологических признаках, главным образом на
строении и способах развития репродуктивных структур как
наиболее таксономически значимых. Определение класса производят
по характерным чертам строения и способам образования в
первую очередь половых структур, но также в некоторых случаях
используют характеристику бесполых спороношений и строения
мицелия, например, для дифференциации классов Chytridiomycetes
и Oomycetes. Для выделения порядков и семейств внутри классов
также используют некоторые детали строения половых и бесполых
спороношений, строение и степень развития мицелия (зачаточный
ризомицелий, хорошо развитый несептированный или септирован-
ный). Для дифференциации родов внутри семейств служат
разнообразные морфологические признаки. Большое значение для
дифференциации родов в классе Deuteromycetes имеет тип конидиоге-
иеза. В качестве видовых дифференцирующих признаков помимо
морфологических с применением электронной микроскопии
используются культур альные признаки, особенно для родов Penicillium
и Aspergillus. Часто для дифференциации не только видов, но и
групп видов (например, групп видов Rhizopus), важно точное
измерение скорости роста культуры при разных температурах.
Чтобы приступить к определению, нужно предварительно
высеять культуру, подлежащую определению, на плотную
питательную среду, наиболее благоприятную для образования
репродуктивных структур в чашки Петри. Посев проводят нанесением
небольшого количества посевного материала (спор или мицелия)
специальной иглой в виде крючка на питательную среду. Чашку при
этом держат средой вниз и посев проводят прикосновением иглы
к поверхности среды с посевным материалом снизу в трех
местах— так, чтобы образовались три четко обособленные друг от
друга колонии. Быстрорастущие грибы (например, мукоровые)
можно сеять одной колонией в центре чашки. Для каждой
таксономической группы используют наиболее благоприятные для этой
группы среды, рецепты которых будут приведены в
соответствующих разделах.
Для характеристики культуральных признаков наблюдение за
развитием гриба, подлежащего определению, проводят в течение
нескольких дней, или даже 2 недель. Особенно важно это для гри-
бов родов Peniclllium и Aspergillus, культуральные признаки кото-
рых претерпевают существенные изменения в процессе роста~
С целью характеристики морфологических признаков культуру
сначала просматривают на чашке при малом увеличении (10X10)
микроскопа, а затем приготовляют препарат. Культуру* на чашке
просматривают для того, чтобы отметить характер прикрепления
спороношений к воздушному или субстратному мицелию,
ветвление спорангиеносцев и конидиеносцев, характер агрегации спор и
конидий (одиночно или группами).
А. Г. Шеховцев предлагает использовать капиллярную камеру
для наблюдения за развитием и определением спороношений у
грибов, не нарушая их целостности препарированием. Капилляр-
ная камера представляет собой полость между предметным
стеклом и лункой и покровным стеклом. Можно наблюдать за кони-
диогенезом на агаризованных стеклах, приготовленных, как и дль
определения псевдомицелия у дрожжей (с. 197). Лунку в
предметном стекле заполняют питательной средой, которую
инфицируют спорами или мицелием исследуемого организма. Над лункой
со средой через прокладки приклеивают с помощью ПВА
покровное стекло. В качестве прокладки можно использовать полоски
папиросной бумаги. Развиваясь из проросших на питательной
среде спор, отдельные целостные структуры проникают в
капиллярную полость между предметным и покровным стеклами,
являющуюся зоной исследования под микроскопом.
Для приготовления микроскопического препарата
препаровальными иглами вырезают участок колонии, по возможности не
захватывая агар, помещают в каплю воды и расправляют мицелий
в ней. Поскольку многие элементы грибов, особенно их споры,
конидии не смачиваются водой, то к воде добавляют этиловый спирт
1 : 1 или уксусную кислоту. Используют также специальную
жидкость для приготовления микроскопических препаратов
следующего состава (мл): карболовая кислота — 20; глицерин — 40;
дистиллированная вода — 20.
Перед определением нужно четко разобраться в наблюдаемых
структурах и сделать описание культур а льных и морфологических
признаков объекта, которые будут необходимы, чтобы
пользоваться ключами в соответствующих определителях. Описание культу-
ральных и морфологических признаков грибов проводят по схеме,
имеющей определенные вариации в зависимости от
таксономического положения определяемых видов. Поэтому перед описанием
необходимо определить крупный таксон (класс, порядок), к
которому принадлежит объект, чтобы потом пользоваться
соответствующим определителем для этого класса или порядка. Поскольку
единого определителя для всех классов грибов не существует,
следует пользоваться определителями для нужного класса или
порядка. В случае крупных порядков есть отдельные определители
(например, пор. Mucorales). Есть даже определители только для
родов (например, Peniclllium, Aspergillus) или группы близких родов
176
/например, Chrysosporium и близкие роды). Последние обычно
I тают g специальных выпусках Studies in Mycology, издавае-
Пый Голландской Коллекцией грибов в Баарне.
М К классу оомицетов организм относят на основании
обнаружена у исследуемой культуры половых структур в виде оогониев
антеридиев (рис. 27,6; 28,в). Оогонии и антеридии образуются
бv л Puthlum \\
Phytophthora 7 у
Рис. 27. Репродуктивные структуры у Phytophthora:
а — спорангии с зооспорами; б — оогоний (/) с антеридием (2)
Рис. 28. Репродуктивные структуры у Pythium:
а — начало образования спорангия; б — спорангий в виде вздутия на вершине
спорангиеносца; в — оогоний (1) с антеридием (2): г — зооспоры
на специальных средах и приманках. Если таковые не удается
обнаружить, то диагносцирующим признаком служит строение
зооспорангиев (рис. 27,а; 28,а,б), содержащих подвижные
зооспоры (рис. 28,г), и наличие несептированного (ценоцитного)
мицелия.
К классу зигомицетов
организм относят на основании
обнаружения у исследуемой
культуры специальных структур —
зигот, образовавшихся в
результате полового процесса
(копуляции гаметангиев), имеющих
характерное строение. Зиготы
имеют толстую, обычно скульптури-
рованную темную оболочку и
многочисленные выросты (рис.
29). В случае отсутствия зигот
организм можно отнести к зиго-
мицетам по бесполым спороно- Рис- 29- Типы зи/от У мукоровых
шениям в виде спорангиев или , 7 л , - г.°ибов;
my пмгтлио^л,^, » / «. 1 — Zygorhtncus geterogamus; 2 —
их видоизменении (спорангиолей; Phycomyces nitens
177
мераспорангиев) с неподвижными спорангиоспорами (рис. 30,
31). Однако у некоторых зигомицетов возможно появление кони'
ДИЙ, которые образуются всегда на специальных вздутиях.
g большинстве случаев у зигомицетов мицелий несептированный,
одлако есть исключение (сем. Mortierellaceae).
Рис. 30. Бесполые спороношения у мукоровых грибов-
I _ спорангий и форма столбика у Мисог; 2 — спорангиоли у Helicostylum piri-
forme; 3 — конидии у Cunninghamella echinulata
Рис. 31. Мероспорангии у мукоровых грибов:
| — С перегородками у Syncephalastrum; 2 — у Linderina; 3 — Coemansia без
перегородок
К классу аскомицетов, или сумчатых, грибы относят на
основания образования ими сумок как конечного этапа полового
процесса. Сумка может быть разной формы (округлой,
цилиндрической, булавовидной) и размера, чаще содержит восемь аскоспор,
но может иметь две, четыре и другое количество (рис. 32). Сумки
преимущественно находятся в плодовых телах — аскокарпах
(замкнутых, обычно круглых, без отверстия, называемых клей-
стотециями, и с отверстием более разнообразной формы).
Принадлежность грибов к дейтеромицетам устанавливают по
наличию разнообразных конидиальных спороношений как откры-
178
Рис. 32. Форма сумок с аскоспорами и плодовых тел сумчатых грибов:
/ — различная форма сумок; 2 — плодовые тела—перитеции; 3 — плодовое
тело — клейстотеций
тых, так и внутри специальных вместилищ — пикнид, при
отсутствии каких-либо половых спороношений.
Определение представителей класса Oomyceles
Поскольку из почвы можно выделить только представителей
порядка Perenosporales семейства Pythiaceae этого класса, а из
него только роды Pythium и редко Phytophthora, то надо сделать
описание признаков, характерных для этих двух родов и
являющихся дифференцирующими. Дифференцирующий признак для
родов— это характер образования и форма зооспорангиев (рис.27).
/ ^- 2 3
Рис. 33. Оогоний и антеридии у грибов рода: Pythium
j — антеридий моноклинный парагинный; 2 — антеридий диклинный парагин-
ный; 3 — антеридий амфигинный
179
Кроме того, у представителей рода Pythium спороносцы не диффе.
ренцированы от мицелия и не ветвятся, в то время как у видов
Phytophthora спороносцы слабо, но дифференцированы, имеют
часто симподиальное ветвление. Для получения полноценных ре.
продуктивных структур грибов Pythium наиболее результативно
применение приманок в виде семян конопли, помещенных в
водопроводную воду. Кроме того, существуют синтетические
питательные среды для получения репродуктивных структур Pythium. Для
видов рода Phytophthora используют овсянодекстрозный агар и
синтетические среды (с. 173).
Для дифференциации видов внутри родов важно представлять
строение оогониев и антеридиев и характер расположения
антеридия по отношению к оогонию. Оогоний — женская половая клетка,
обычно округлой формы, может быть с гладкой или шиповатой
оболочкой. Антеридий имеет булавовидную, пузыревидную и
неправильную форму. По расположению на ветвях мицелия
различают антеридии моноклинные, возникающие на одной и той же
тифе с оогонием, и диклинные, образующиеся на разных ветвях.
По характеру расположения по отношению к оогонию антеридии
могут быть нескольких типов: парагинные — расположенные сбоку
от оогония, амфигинные — опоясывающие основание оогония и ги-
погинные — расположенные внутри оогониальной ветви (рис. 33).
Ооспоры как у одного, так и другого рода одиночные и имеют
различную поверхность: гладкую, сетчатую, бугорчатую, щетинистую
(видовой признак). Могут быть сросшиееся с оболочкой — плеро-
тические и несросшиеся — аплеротические.
Для дифференциации видов Phytophthora помимо
вышеперечисленных для видов Pythium признаков большое значение имеет
отношение объекта к температуре (развивается или нет при 35°).
Культуральные признаки для этих видов в расчет не принимаются.
Далее можно использовать определители (Новотельнова, Пыстина,
1985; Plaats van Der, 1981).
Определение представителей класса Zygomycetes
Из почвы можно выделить в основном только представителей
порядка Mucorales, включающего большое число семейств,
несколько различное по представлениям разных авторов (по Миль-
ко — 8, по Zycha и O'Donnell, Циха и О'Доннелл— 9). Схема
определения представителей этого порядка включает культуральные
и морфологические признаки. Описание представителей порядка
Mucorales следует проводить на среде сусло-агар, картофельно-
декстрозном PDA) и глюкозо-пептонном агаре (с. 172).
Культуральные признаки: внешний вид колонии, ее текстура
(пушистая, шерстистая, войлочная, бархатистая), наличие в
колонии зон или лопастей, степень развития субстратного и воздушного
мицелия, наличие ярусов в спороношениях, наличие столонов —
нитей воздушного мицелия, соединяющих отдельные спорангиенос-
180
bI цвет колонии, температурные границы роста с установлением
оптимума
Морфологические признаки. Наличие и строение
хламидоспор—толстостенных клеток на мицелии и спорангиенос-
цах. Строение бесполых спороношений, представленных спорангие-
носцами со спорангиями—вместилищами с большим числом спор
внутри, спорангиолями с небольшим числом спор или
конидиями—отдельными наружными спорами (рис. 30) и мероспоран-
гиями — цилиндрическими образованиями, отходящими обычно
от вздутия на спорангиеносце (рис. 31). Учитывается ширина и
о
* 1
Рис. 34. Типы ветвления спорангиеносцев у мукоровых грибов:
1 — неветвящийся; 2 — ветвление моноподиальное; 3 — ветвление симподиаль-
ное; 4, 5 — ветвление дихотомическое
длина спорангиеносца, форма спорангия или спорангиоли
(округлая, грушевидная и т. д.), наличие, размеры и форма спор
(округлые, эллиптические, неправильной формы, с придатками и т. д.),
их поверхность (гладкая, шероховатая, ребристая), наличие
апофизы— вздутия на конце спорангиеносца ниже спорангия. Споран-
гиеносцы прямые или изогнутые, прямостоячие или поникающие.
Ветвление спорангиеносцев (моноподиальное, симподиальное,
смешанное, дихотомическое, мутовчатое; рис. 34, 35). На спорангие-
носцах могут быть вздутия разнообразной формы, придатки,
зубчики. Отмечается также наличие ризоидов на спорангиеносцах
(рис. 36).
Дифференцирующими признаками для семейств являются:
строение бесполых спороношений (спорангиев, спорангиолей, их
соотношение и расположение, наличие мераспорангиев), наличие
или отсутствие в спорангиях колонки (например, для
дифференциации семейств Мисогасеае и Mortierellaceae), строение зигот.
В качестве признаков, используемых для дифференциации родов,
служат форма спорангиев, тип ветвления спорангиеносцев,
наличие или отсутствие апофизы, наличие или отсутствие столонов.
Для видовой дифференциации используют морфологические и
культуральные признаки. Морфологические: детали строения
181
Рис. 35. Симподиальное ветвление у
Circinella (7); мутовчатое ветвление
у Actinomucor (2)
Рис. 36. Детали строения мицелия в
спорангиев у мукоровых грибов:
/ — спорангиеносец с колонкой к
ризоиды у Rhizopus stolonifer; 2 —
столон со спорангиеносцами у
Rhizopus stolonifer
к размеры спорангия, расплывающийся или разрывающийся
спорангий, форма, размеры и поверхность спор, толщина спорангие-
носца, наличие и степень выраженности ризоидов, соотношение
колонки спорангия.
Культуральные признаки: характер роста при разных
температурах, текстура колонии, цвет, наличие ярусов у колонии.
Среды для репродукции мукоровых грибов. Среда (PDA)
картофельно-декстрозный агар (г/л): картофель — 200;
декстроза— 10; агар — 12; глюкозо-пептонный агар (г/л): глюкоза — 20;
пептон — 10; агар — 20.
Для идентификации мукоровых грибов следует использовать
определители Милько, 1974; Schipper, 1973, 1975, 1976; Zycha,
Siepmann, 1969).
Определение представителей класса Ascomycetes
порядков Eurotiales и Sphaeriales
Для определения организмов этого класса имеют значение
только морфологические признаки. Дифференцирующими для
выделения порядков служит наличие (Sphaeriales) или отсутствие
(Eurotiales) отверстия для выхода сумок.
Порядок Eurotiales. Представители этого порядка —
широко распространенные почвенные обитатели. Многие из них
известны по конидиальной стадии типа Penicillium, Aspergillus, Рае-
oilomyces, Chrysosporium и некоторым другим, а их телеоморфы
(сумчатые стадии) относятся соответственно к родам Eupenicillium,
Talaromyces (конидиальная стадия Penicillium), Eurotium, Emi-
ricella, Neosartoria, Petromyces (конидиальная стадия Aspergillus),
Bissochlamus, Thermoascus (конидиальная стадия Paecillomyces) >
182
Gymnoascus и Amaroascus (конидиальная стадия Chrysosporium),
Arachnotheca (конидиальная стадия Geotrichum), Nannizzia
(конидиальная стадия Micros рог ium).
Сумчатые спороношения представителей этого порядка
образуются в замкнутых без отверстия плодовых телах — клейстоте-
циях, имеющих размеры от 100 мкм до нескольких мм. У
некоторых представителей плодовые тела отсутствуют и сумки собраны
в клубки с очень рыхлым покровом. Сумки круглые или овальные
расположены беспорядочно и заполняют всю полость плодового
тела. Для получения сумчатых спороношений у представителей
этого порядка хорошие результаты дает использование среды
Чапека с низким содержанием сахара (0,1%).
Морфологические признаки. Описывают форму,
размеры, цвет, консистенцию клейстотециев. Последняя может быть
мягкой в виде рыхлого сплетения мицелия, углистой или кожистой.
Большое значение имеют форма и размеры сумок, форма и
размеры аскоспор, поверхность аскоспор (гладкая, шероховатая,
шиповатая, имеющая кольца или желобки). Для извлечения сумок из
клейстотециев нужно осторожно надавить на покровное стекло
поверх препарата.
Дифференцирующими признаками для выделения семейств в
порядке Eurotiales служат строение покрова плодового тела—
перидия (рыхлый или плотный), наличие ножки, тип конидиаль-
ного спороношения. Для выделения родов — детали строения
перидия, наличие отростков у плодового тела, форма и строение
аскоспор. Для видов — цвет, детали строения и размеры аскоспор,
а также характер строения и особенности конидиальных
спороношений (с. 184).
Порядок Sphaeriales. Представители этого порядка
распространены не только в почве, но и на поверхности растений.
Их конидиальные спороношения не так хорошо известны, как у
предыдущего порядка, хотя многие также их имеют. Сумчатые
спороношения представителей этого порядка образуются в
плодовых телах (перитециях) шаровидной, грушевидной или кувшино-
видной формы, имеющих специальное отверстие для выхода сумок.
Сумки цилиндрические или булавовидные располагаются в
определенном порядке (в пучках или тесным слоем) внутри перитеция.
Описание сумчатых спороношений можно проводить на
сусло-агаре, картофельно-декстрозном агаре, среде Чапека. Описывают
морфологические признаки, что и для предыдущего порядка
(Определители; Кириленко, 1978; Смицкая и др., 1986; Ames, 1961; Stolk,
Samson, 1983).
Определение представителей класса Deuteromycetes
(Несовершенные грибы)
Класс Deuteromycetes характеризуется отсутствием половых
спороношений. Репродуктивные структуры его представителей —
разнообразные конидиальные спороношения. По классификации
1ЯЗ
Саккардо этот класс включает три порядка: Hyphomycetales,
Sphaeropsida,les, Melanconiales.
В порядок Hyphomycetales входят организмы со спороношения-
ми, открыто расположенными на мицелии, порядок Sphaeropsida-
les характеризуется спороношениями внутри специальных
вместилищ— пикнид, в порядке Melanconiales спороношения
располагаются тесным слоем на плотном переплетении гиф — ложе (рис. 37).
Представителей всех трех порядков можно обнаружить в почве.
Рис. 37. Различные способы агрегации спороношений у дейтеромицетов:
/ — коремии; 2 — пикниды; 3 — ложа
По классификации, предложенной Айнсворт, Бисби (Ainsworth,,
Bisby, 1971) и другими, порядок Hyphomycetales рассматривают
на уровне класса Hyphomycetes, а порядки Sphaeropsiijdales и
Melanconiales объединяются в один класс Coelomycetes.
Часть определителей несовершенных грибов составлена на
основе классификации Саккардо, для построения которой
используют строение зрелых конидий, окраску и способ их аггрегации.
Но большинство современных определителей составлено так, что
в их основу положена классификация по типу конидиогенеза. Тип
конидиогенеза может быть I — таллический, II — бластический.
Бластический тип в свою очередь делится на несколько способов:
бластический
I
\ \
голобластический энтеробластический
третичный фиалидный
Таллический тип характеризуется тем, что конидиогенная
клетка как часть конидиеиосца распадается на отдельные фрагменты,
образуя артроконидии (рис. 38,7). Бластический тип характеризуй
184
Рис. 38. Типы конидиогенеза у дейтеромицетов:
7 — таллический; 2 — голобластический; 3 — энтеробластический третичный;
4 — шрамы на конидиогенной клетке после отпадения конидий, образующихся
энтеробластическим третичным способом; 5 — энтеробластический фиалидный
ется тем, что конидии развиваются как вздутия конидиогенной
клетки, затем отшнуровываются от нее и отделяются перегородкой,
но часто остаются в цепочках. Если при таком типе конидиогенеза
в образовании конидии участвуют оба слоя оболочки, то тип
конидиогенеза будет голобластическим. По голобластическому типу
образуются бластоспоры и алевроспоры (рис. 38,2), если
участвует только внутренний — то энтеробластическим. При энтеробла-
стическом типе конидиогенеза хорошо заметны шрамы,
образовавшиеся на месте отпавшей конидии (рис. 38,4).
Энтеробластический способ образования конидий может быть
третичным, когда из наружной оболочки конидиогенной клетки не
формируется воротничок (такой тип конидиогенеза приводит к
образованию пороспор), и фиалидным, в этом случае из наружной
оболочки конидиогенной клетки образуется воротничок (рис. 38,
5), а с участием внутреннего слоя формируются фиалоспоры.
Схема определения дейтеромицетов включает морфологические
и культуральные признаки. Описание производят на сусло-агаре,
среде Чапека (с. 172), картофельно-декстрозном и овсяном агаре
(с. 173). Для получения спороношений у некоторых видов
хорошие результаты дает водный агар (с. 174).
Морфологические признаки. Наличие конидиеносца,
степень его развития (насколько он отличается от вегетативного
мицелия); конидии образуются прямо на мицелии или путем
расчленения мицелия. Если конидиеносцы имеются, то отмечают
наличие или отсутствие ветвления, тип ветвления (рис. 39), наличие
1Я*
Рис. 39. Типы ветвлений и способы аггрегации конидий на конидиеносцах:
1 — неветвящийся; 2 — ветвящийся супротивно; 3 — ветвящийся мутовчато,
конидии в головках; 4 — неветвящийся со вздутиями; 5 — ветвящийся древовидно;
в — неветвящийся, конидии в цепочках; 7 — ветвящиеся, конидии одиночные;
8 — конидиеносцы вытянуты в зигзагообразную нить; 9 — ветвящийся очередно,
конидии в ветвящихся цепочках
септ. Отмечают наличие узлов на конидиеносце или вздутия на
вершине. В описании отмечают также способы агрегации кони-
диеносцев. Они могут одиночно располагаться ца мицелии, могут
быть объединены в пучки — коремии, образовывать скопления
коротких конидиеносцев на сплетении мицелия — спородохии,
покрытые слизью.
Описывают цвет и форму конидий, наличие, число и
расположение перегородок, наличие придатков у конидий (рис. 40).
Следует обращать внимание также на расположение конидий на
конидиеносцах (одиночные, головкой, цепочками), расположение их
на фиалидах — специальных структурах бутыльчатой или кегле-
видной формы, зубчиках, выростах. У некоторых дейтеромицетов
может быть несколько типов конидиальных спороношений у одного
вида, например Fusarium имеет макро- и микроконидии, Mycogo-
пе — два типа конидий и др.
Для рода Penicillium большое значение имеет число ярусо»
мутовок (1, 2, 3 и более), первый ярус образуют фиалиды,
второй— метулы, третий — веточки (рис. 41). В определителях, из-
186
Рис. 40. Различная форма конидий у дейтеромицетов:
/ — одноклеточные; 2 — двуклеточные; 3 — многоклеточные с поперечными
перегородками; 4 — муральные; 5 — нитевидные; 6 — спирально закрученные;
7 — с перегородками и придатками
Рис. 41. Строение конидиеносцев у грибов родов Penicillium и Aspergillus:
1 — одномутовчатый; 2 — двухмутовчатый симметричный; 3 — асимметричный
(Penicillium); 4 — конидиеносец с одним ярусом фиалид; 5 — с двумя ярусами
фиалид (Aspergillus)
данных до 1986 г., вместо фиалид использовалось название стериг-
мы. В настоящее время под стеригмами понимают только
структуры, на которых образуются базидиоспоры у базидиомицетов.
Отмечают форму и размеры вышеперечисленных структур, их по-
верхность (шероховатые или гладкие). Характер строения кони-
диеносца служит основанием для выделения секций (рис. 41),
которых в настоящее время насчитывается 10. Диагностирующие
признаком для видов является наличие или отсутствие колонки
образованной из цепочек конидий, отходящих от фиалид^
(развиваются цепочки строго параллельно или расходятся и
переплетаются), связь конидиеносца с субстратом (прикреплен конидиено-
сец к субстратному или воздушному мицелию), форма конидий
(округлая, цилиндрическая, эллиптическая), поверхность (гладкая,,
шероховатая, шиповатая), размеры.
Для рода Aspergillus помимо ветвления отмечают цвет
конидиеносца, так как он может быть бесцветным или окрашенным,,
форма головки вместе с цепочками конидий (сферическая, с ради-
ально расходящимися цепочками конидий, или булавовидная),,
форма вздутия на вершине конидиеносца (округлая, овальная
булавовидная; рис. 41).
Культуральные признаки наибольшее значение имеют
для родов Penicillium и Aspergillus, поэтому описание культураль-
ных признаков дается для этих родов. Отмечают скорость роста
колонии, желательно при трех температурах: +5, +25, +37°;
внешний вид колонии, ее текстуру (бархатистая, пушистая,
шерстистая, шероховатая). Бархатистость колонии определяется
плотно растущими спороношениями, отходящими непосредственно от
субстратного мицелия, пушистость — обильно развитым воздушным
мицелием, на котором могут образовываться спороношения,
шерстистость—за счет большого количества тяжей, шероховатая
гранулированная поверхность возникает в результате обильного
образования коремий, т. е. структур, представляющих собой плотное
объединение нескольких конидиеносцев в пучки (см. рйс. 37).
Отмечают форму и цвет края колонии. Описывают окраску спороно-
сящей части и стерильного мицелия, изменения окраски во времени
(сохраняется ли первоначальная окраска или она меняется).
Отдельно отмечают окраску обратной стороны колонии и диффузию
пигмента в агар, определяющую окраску окружающего агара.
Отмечают зональность колонии, появление зональности по мере
роста, складчатость, наличие экссудата, его цвет, запах культуры.
Фиксируют наличие или отсутствие склероциев — жестких
структур, образованных плотным переплетением мицелия, по
внешнему виду напоминающих плодовые тела — клейстотеции, но не
образующих сумок, остающихся стерильными. Описывают их
форму, текстуру, цвет, размеры.
Дифференцирующими признаками для семейств класса дейте-
ромицетов служат способ аггрегации конидиеносцев (свободные,
в коремиях, спородохиях). Для дифференциации родов или групп
родов — тип конидиогенеза и строение конидий. Для видовой
дифференциации используют форму и размеры конидий и некоторые
культуральные признаки.
В пределах рода Penicillium выделяют еще секции или подроды
по строению конидиеносца и подсекции по морфологии конидиенос-
188
ца и поверхности колонии. В роде Aspergillus выделяют две
секции по наличию или отсутствию профиалид. Далее используют
определители (Кириленко, 1977; Литвинова, 1967; Пидопличко,
1972; Burnet, 1970; Ellis, 1971, 1978; Raper, Fennell, 1965).
МЕТОДЫ УЧЕТА ЧИСЛЕННОСТИ И БИОМАССЫ ДРОЖЖЕЙ В ПОЧВАХ
Методы количественной оценки содержания дрожжей в почве
отличаются от общепринятых в почвенной микологии приемов
учета мицелиальных грибов. Благодаря своей одноклеточной природе
дрожжи могут быть, как и другие одноклеточные микроорганизмы,
учтены по числу вырастающих на плотных средах колоний при
посеве из суспензии с последующим пересчетом числа клеток и их
биомассы на грамм исходного субстрата. Однако посев — это один
из этапов анализа, который начинается с отбора природных
образцов почв, их консервации для сохранения клеток в жизнеспособном
состоянии, но без размножения, и далее — подготовка материала
к посеву. Не останавливаясь на приемах и правилах отбора проб,
общих для всей почвенной микробиологии, отметим моменты,
важные для анализа дрожжевой части микобиоты почв в период
транспортировки и хранения образцов. Во всех случаях оптимальный
вариант — анализ собранного материала в течение ближайших 1—
2 сут с сохранением образцов при комнатной температуре в
стерильных емкостях (пакетах, пробирках, флаконах).
Длительная вынужденная задержка анализа предполагает
временную консервацию проб с целью сохранения естественной
численности дрожжей и соотношения популяций разных видов. Такая
консервация может быть достигнута разными способами:
высушиванием, быстрым замораживанием, снижением температуры
хранения и др. Экспериментально было показано, что высушивание
образцов почв приводит к значительному снижению как общей
численности дрожжей, так и изменению пропорции отдельных
популяций. Особенно чувствительны к высушиванию дрожжи,
обитающие в постоянно влажных почвах — луговых, болотных,
например Schizoblastosporion starkeyl-henrlcli. Сильно снижается при,
подсушивании почв уровень плотности популяции липомицетов,
что связано, по-видимому, не только с гибелью части
вегетативных клеток, но и с повышением прочности их связи с почвой.
Адсорбция, обусловленная в данном случае наличием полисахарид-
ных капсул, повышается в процессе дегидратации.
Хранение образцов почв при низкой температуре (в
рефрижераторе на 4—5°) приводит к увеличению численности дрожжей,
которая за 2,5 мес возрастает в 4,5—5 раз, главным образом за счет
развития популяций психрофильных и психротрофных видов.
Наилучшим способом консервации следует считать быстрое
замораживание проб в сухом льду при температуре —78°, что позволяет
сохранять неизменным их микробный состав в течение месяца
после сбора.
189
Следующий этап — выбор метода анализа. Он зависит от того,
1сакую группу дрожжей необходимо выявить и учесть. В почве
можно обнаружить дрожжи разных таксономических и
экологических групп. Их можно разделить следующим образом по
происхождению, функциям и значению для почв: 1 — собственно
почвенные, или автохтонные, постоянное местообитание которых не
выходит за пределы почвы, где они проникают на значительную
глубину; 2— зимогенные, ассоциированные с органическими остатками,
главным образом растительного происхождения, поступающими
регулярно в почву вместе с частями растений или дождевыми
водами; эти дрожжи обычно не распространяются глубоко по
почвенному профилю и в основном встречаются в подстилке и
верхнем органогенном горизонте; 3 — случайные, или аллохтонные, по-,
падающие в почву спорадически из других местообитаний,
непосредственно с почвой не связанных.
Посев из почвенной суспензии на плотные питательные среды
Подготовка суспензии. При учете дрожжей методом
посева из почвенной суспензии используют низкие разведения —
от 1 :5 до 1 :50 для образцов из минеральных горизонтов почв и
от 1 : 100 до 1 : 1000 — для лесной подстилки, торфа или дерна.
Подготовку образца к анализу проводят методами, описанными
на с. 8.
Среды. Лучшей естественной средой для учета дрожжей
служит сусло-агар 6—7° Баллинга (с. 170). Его подкисляют молочной
кислотой из расчета 4 мл/л. Сусло, хотя и является полноценной
питательной средой для дрожжей, так как содержит хорошо
утилизируемые источники углерода и азота, аминокислоты и
витамины, все же обладает и некоторыми нежелательными качествами.
Во-первых, это не стандартная среда, и разные партии сусла могут
отличаться по составу. Во-вторых, основным источником углерода
в сусле служит мальтоза, которую некоторые дрожжи не
используют, а у других может происходить адаптация к этому сахару.
Для учета дрожжей в почве применяют и синтетические среды:
глюкозо-пептонный агар (г/л): глюкоза — 40; пептон — 10;
агар — 20; НС1 после стерилизации до рН — 4,5. Глюкозо-ми-
неральная среда (г/л): глюкоза — 20; (NH^SC^ — 5,0;
КН2Р04 —0,85; К2НР04 —0,15; MgS04-7H20 —0,5; NaCl —0,1;
агар — 20; НС1 после стерилизации до рН — 4,5.
Для повышения элективности синтетических сред помимо их
подкисления применяют антибиотики широкого спектра действия
против бактерий и грибов с распространяющимися широко по
агару колониями. Антибиотики применяют как порознь (с. 170), так
и в комплексах. В смеси применяют антибиотики стрептомицин-
сульфат (20 мг/л) с левомицетином (20 мг/л) и хлортетрацикли-
ном солянокислым (100 мг/л). Рост грибов подавляется актидио-
ном, однако к этому антибиотику чувствительны и многие дрожжи.
В концентрации до 500 мг/л актидион не подавляет роста устой-
190
чивых к нему липомицетов, а криптококки прекращают рост уже
при содержании в среде 50 мг/л актидиона. Поэтому для
подавления роста грибов используют другие ингибиторы, например дифе-
нил (0,005—0,01%) \ красители —бенгальский розовый (0,003%),
кристаллический фиолетовый (0,001%), бромкрезол-пурпуровый
(0,002%).
Эффективным ингибитором роста микромицетов служит про-
пионат натрия в концентрации 0,15—0,25%. Однако при такой
концентрации подавляется рост и некоторых дрожжей, особенно
представителей рода Rhddotorula. Поэтому при анализе
материалов, где может быть много красных дрожжей, например
подстилок, торфа или дерна, этот ингибитор применять не
рекомендуется.
Олигонитрофильные дрожжи, относящиеся главным образом к
роду Lipomyces, учитывают на среде Эшби или других
безазотистых средах, которые предложены для выделения из почв
азотобактера и бактерий-олигонитрофилов. Элективная среда для
липомицетов предложена Юргенсеном и Даниельсоном на основании
способности этих дрожжей использовать азот имидазола и
соединений, содержащих имидазольное кольцо, например тимина. Эта
среда имеет следующий состав (г/л): глюкоза — 5,0; КН2Р04 —
1,0; MgS04-7H20 —0,5; FeCl3 —следы; агар —20,0. В качестве
источников азота добавляют имидазол 0,25 г/л или тимин 0,48 г/л.
Доводят рН до 5,2 и добавляют после стерилизации
антибиотики (г): актидион — 0,2; стрептомицин — 0,1; ауреомицин — 0,05.
Инкубирование. Во всех случаях количественного учета
почвенных дрожжей, за исключением специальных целей
(например, при поиске в почве патогенных видов, растущих при 37°),
посевы выращивают при комнатной температуре, если она не выше
18—20°, или же в холодильнике: при 0° — для учета психрофилов
и при 5—7° — для учета мезофильных дрожжей. Низкие
температуры задерживают рост микромицетов, и дрожжи легче
выявляются, хотя сроки учета при этом значительно удлиняются. Подсчет
колоний проводят по мере их появления в зависимости от
температуры инкубирования. Обычно через 7—10 сут можно учитывать
дрожжи при комнатной температуре, через 14 сут — при 5—7° и
после 20 сут — при 0°. Учет лучше вести дробно, т. е. подсчитать
и отметить с нижней стороны чашки все появившиеся в первый
срок просмотра колонии, а затем оставить чашки еще на
несколько дней для подращивания медленно развивающихся колоний. При
таком методе можно обнаружить психрофильные дрожжи, которые
первыми появляются на чашках, инкубируемых при 0°, и не
вырастают при температуре выше 18—20°.
Низкотемпературное инкубирование посевов снимает
необходимость добавок в среду ингибиторов роста грибов, которые
обязательны при выращивании посевов в термостатах выше 26°. При
37° посевы учитывают на 3—4 сут окончательно.
1 Для получения исходного раствора 100 мг дифенила растворяют на
водяной бане при 40—50° в 1 мл этилового спирта.
191
Расчет численности и биомассы. При учете
подсчитывают суммарное число колоний за все сроки наблюдений на
каждой чашке и вычисляют среднее значение, исходя из данных
5—6 повторных чашек. Далее расчет на 1 г почвы проводят
обычным способом с учетом объема капли суспензии и
использованного разведения.
Для вычисления биомассы пользуются формулой объема
дрожжевой клетки V = — ab2, где а — больший, а Ь — меньший сред-
6
ние диаметры клетки; масса £=Ш, где d — удельная масса
(плотность), равная 1,09 г/см3. Тогда биомасса в 1 г почвы составит Ngt
где N — численность клеток в 1 г. Средние размеры дрожжевых
клеток 4x6 мкм.
Методы обнаружения, количественного учета и выделения
липомицетов из почв
Клетки липомицетов в их природной среде обитания прочно
связаны с почвенными агрегатами. Они проникают внутрь
агрегатов и адсорбируются на их поверхности с помощью капсул,
состоящих из гетерополисахаридов с карбоксильными группами, которые
взаимодействуют с катионами. Поэтому клетки дрожжей с трудом
переходят в водную суспензию и даже после многократных
отмываний почвенной навески они преимущественно остаются в
осадке. Опыты с искусственным внесением в почву суспензии
липомицетов определенной плотности показали, что методом посева
выявляются на два порядка меньше клеток, чем исходная
концентрация.
При относительно низкой численности этих дрожжей в почве
метод посева из разведений оказывается малопригодным. В этом
случае используют метод почвенных комочков. Навеску
почвы в 100 мг увлажняют стерильной водой в фарфоровой
чашечке до состояния густой пасты и раскладывают в виде 100 комочков
на 2 чашки Петри, по 50 шт на каждую. Для удобства под чашку
подкладывают трафарет с 50 точками. Используют среду Эшби
(г/л): сахароза (или маннит, сорбит, крахмал)—20,0; К2НРО4 —
0,2; КН2Р04 — 0,1; MgS04-7H20 — 0,2; NaCl —0,2; K2SO4 — 0,1;
агар — 20,0. Для подавления роста бактерий, особенно
азотобактера, в среду после стерилизации добавляют 80 мг/л
стрептомицина. Среду наливают в чашки толстым слоем, чтобы она дольше не
пересыхала. Для анализа каждого образца берут не менее 3
навесок, т. е. комочки раскладывают на 6 чашек или более.
Инкубируют в течение 3—4 недель при комнатной температуре (18—22°).
Учет проводят по числу комочков со слизистыми отрастаниями и
выражают результаты в процентах, среднее для 3 навесок. Так как
комочки почвы могут обрастать и бактериями, дающими на этой
среде слизистый рост, то учет необходимо проводить с
микроскопическим контролем. Края слизистых обрастаний просматривают
непосредственно на чашке с объективами микроскопа 8х или
.192
lOX- При увеличении в 100—120 раз крупные клетки липомицетов
хорошо различимы. При подсчете обрастаний на комочках почвы
смешанные бактериально-дрожжевые колонии учитывают как
дрожжевые.
Аналогично проводят опыты с рассыпкой почвенной пыли по
Новогрудскому. К этому методу можно прибегать при
исследовании сухих бесструктурных почв. Подсчитывают в этом случае не
процент обросших комочков, а КОЕ — число колониеобразующих
единиц.
Количественный учет липомицетов методом
в ы с е в а почвенных суспензий проводят на следующих средах:
среда Эшби со стрептомицином (см. выше); модифицированная
среда Иенсена (г/л): мальтоза —5,0; КН2Р04 —1,0; MgS04X
Х7НгО — 0,5; агар—10,0; среда Юргенсена и Даниель-
сона (см. выше). Среды разливают в чашки за 24 ч до посева,
чтобы дать подсохнуть поверхности агара. Посев производят из
трех суспензий, приготовленных из одной исходной (5 г почвы в
500 мл воды) путем разведения 10 мл в 90 мл воды. В каждую
чашку вносят по 0,5 мл суспензии. Засевают по 3 чашки из двух
первых и 4 чашки из третьей повторной суспензии. Естественно,
что для разных почв следует подбирать наиболее подходящие
разведения. Колонии подсчитывают по меньшей мере дважды — на
7—8-е и 12—15-е сут роста при 26°.
При расчете численности и биомассы липомицетов нужно
учитывать следующее. Использование метода посева из суспензии
почвы дает заниженные на два порядка числа, а подсчет процента
обросших комочков почвы соответствует приблизительно таким
показателям:
степень % обрастаний уровень плот-
заселенности почвы на 15-е сут ности
популяции
низкая <25 102
средняя 20—50 103
высокая 50—75 104
очень высокая 75—100 105 и >
Для расчета биомассы используется показатель удельной
плотности клеток липомицетов, который имеет наименьшую величину
(^=1,06) из всех дрожжей.
ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА КОЛЛЕКЦИИ ДРОЖЖЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ
ИЗ ПОЧВ
При экологических исследованиях необходимо не только
учитывать количество дрожжевых грибов в исследуемых образцах
почв, но и оценивать долю популяции каждого вида в сообществе.
Для первичной дифференциации устанавливают пропорцию разных
типов колоний на чашке после их общего подсчета. Однако опре-
делить у дрожжей принадлежность к тому или иному виду и даже
роду по внешнему виду колоний и по микроскопической картине
в препаратах удается очень редко и только при большом опыте
работы, особенно если дрожжи не спорулируют на среде для
выделения. Поэтому начальную дифференциацию колоний делают
условно и по возможности наиболее дробно: просчитывают отдельно
все типы, различающиеся между собой по каким-либо признакам.
Можно учитывать скорость появлений колоний на чашке и
распространение их по субстрату, цвет, консистенцию, форму края и
структуру поверхности, образование зеркальных отражений на
крышке и др. Учет необходимо сопровождать микроскопией
препаратов, зарисовкой колоний и клеток, выделением в чистые
культуры и тщательной регистрацией.
При дальнейшей видовой идентификации большого числа изо-
лятов можно рекомендовать следующую схему «ступенчатой»
обработки рабочей коллекции (рис. 42). Одновременно по этой схе-
Макро-
морсрология
1
Микро-
морфология
т i
Группы I
Физиологические
и биохимические
признаки
Г У
Некоторые роды
и виды со
специфической 1
морфологией 1
г \
г
Известные
виды
Дополнительные 1
МиИэпаКИ,
экология 1
\
'
Новые 1
виды I
, —— ►
I I . I Ж
Рис. 42. Последовательные этапы идентификации большого числа изолятов
дрожжей
ме удобно обрабатывать до 100 штаммов, которые
предварительно группируют по макро- (I ступень) и микроморфологии (II
ступень). Таким образом создаются морфологические группы, для
которых из общей схемы определения можно выбрать наиболее
характерные и обязательные ключевые признаки, пользуясь
специальными определителями для дрожжей (Kreger-van Rij, ed., 1984;
Barnett et al., 1983). Общая схема составления описания штаммов
для видовой идентификации дрожжей включает до 80 признаков,
194
которые определяют, пользуясь следующими методами (см. также
Бабьева, Голубев, 1979; Бабьева, Горин, 1987).
Методы видовой идентификации дрожжей
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ
Различают признаки микро- и макроморфологические. Вторые
называют еще «культуральными», так как они характеризуют не
отдельные клетки, а популяции (культуры).
Рост на плотных средах. Используют агаровую среду
из сусла 10° Баллинга, 5%-ный солодовый экстракт,
морфологический агар Oifco, глюкозо-пептонную среду с дрожжевым
экстрактом (глюкоза — 2%; пептон—1, дрожжевой экстракт — 0,5%;
вода дистиллированная) с добавлением 2% агара. Посев делают
прямым штрихом. Форму и размеры клеток, а также тип
размножения описывают после 2—3-суточного инкубирования при
комнатной температуре (18—25°). Если дрожжи растут медленно
(например, Lipomyces) или не дают роста при температуре выше 20°
(род Leucosporidium), то первое описание делают через 1—2
недели инкубации. Штрих описывают через 30 сут и тогда же повторно
просматривают культуры под микроскопом. Дрожжи с разной
морфологией представлены на рис. 43.
о°0о/<1( d 0 с=ь
, , . f , __ .
почкование почкующееся деление
деление
Рис. 43. Форма дрожжевых клеток и способы вегетативного размножения
Рост в жидких средах. Берут вышеуказанные среды без
добавления агара. Отмечают образование пленки, ее характер
(тонкая, сухая, всползающая, слизистая, комочками, складчатая и
т.д.), формирование кольца, осадка, появление мути, хлопьев.
Описание делают через 4 недели инкубации при комнатной
температуре. Микроскопические препараты просматривают на 3-й сут и
через 30 сут.
Образование ложного и истинного мицелия.
Если дрожжи размножаются почкованием и почки после образо-
вания не отделяются от материнской клетки, но продолжают
почковаться, то в конце концов формируются структуры ложных гиф"
из которых состоит псевдомицелий. Он бывает примитивный, если
состоит из удлиненных клеток приблизительно одинакового
размера, или же дифференцируется на длинные клетки псевдогиф и
распределяющиеся на них одиночно, кучками, мутовками, цепочками
бластоспоры (рис. 44).
Рис. 44. Ложный и истинный мицелий дрожжевых грибов:
1 — примитивный псевдомицелий; 2 — дифференцированный псевдомицелий с
бластоспорами; 3 — мицелий Ambrosiozyma с долипорами; 4 — пряжковый
мицелий базидиомицетных дрожжей; 5 — артроспоры; 6 — хламидоспоры
Наряду с почкованием в культурах некоторых дрожжей
происходит формирование истинного мицелия с перегородками —
септами. В септах имеются разного устройства поры, которые обычно
хорошо видны только на срезах в электронном микроскопе.
У дрожжей Ambrosiozyma утолщенные поры (долипоры) видны
даже в световом микроскопе. Для дрожжей-базидиомицетов
характерно образование пряжек возле септ (рис. 44,4). Мицелий
некоторых дрожжевых грибов распадается на отдельные
одноклеточные элементы — артроспоры (например, у Trichosporon), которые
на свежей среде почкуются или вновь прорастают мицелием
(рис. 44,5). Концевые (терминальные, апикальные) или
промежуточные (интеркалярные) клетки мицелия иногда утолщаются,
округляются и формируют дополнительные покровы, превращаясь
в хламидоспоры. Это покоящиеся структуры, заполненные обычно
липидным запасным материалом. В хламидоспоры превращаются
196
и одиночные дрожжевые клетки, например у липомицетов, крип-
тококков. Хламидоспоры дрожжей рода Metschnikowia выполняют
двойную функцию. Помимо сохранения жизни длительный период
они при прорастании могут превращаться в сумки, несущие аско-
споры.
Образование мицелия и псевдомицелия изучают на кукурузном
или картофельно-глюкозном агаре методом пластинок.
Кукурузный агар: 12,5 г кукурузной муки в 300 мл
водопроводной воды нагревают на водяной бане при 60° в течение 1 ч,
а затем фильтруют через бумажный фильтр. Объем фильтрата
доводят до 300 мл, добавляют 3,8 г агара и автоклавируют 15 мин
при 12Г. Горячую среду еще раз фильтруют через вату,
разливают по пробиркам и снова стерилизуют при том же режиме.
Картофельно-глюкозный агар: 100 г промытого,
очищенного и измельченного картофеля вымачивают в 300 мл
водопроводной воды в течение нескольких часов на холоду. Массу
фильтруют через ткань и автоклавируют в течение 1 ч при 121°.
Для приготовления агаровой среды к 230 мл этой жидкости
добавляют 770 мл водопроводной воды, 20 г глюкозы и 20 г агара и
стерилизуют в автоклаве 15 мин при 112°.
Расплавленную среду наливают в чашки Петри и в нее, зажав
пинцетом, опускают и быстро вынимают стерильные предметные
стекла. Покрытые пленкой агара стекла помещают на П-образную
стеклянную подставку в чашке Петри. Посевы делают тонкими
штрихами: по три на каждой пластинке параллельно короткой
стороне стекла или по одному вдоль длинной стороны стекла.
Стерильные покровные стекла накладывают на штрихи так, чтобы под
ними не было пузырьков воздуха и чтобы часть штриха осталась
свободной. На дно чашки наливают стерильную воду во
избежание пересыхания слоя агара на пластинке. Через 6—8 дней
инкубации при 25° стекла вынимают и, предварительно очистив их
нижнюю поверхность от агара, помещают на столик микроскопа
для наблюдений. На таких препаратах не нарушается
естественное расположение клеток псевдомицелия, бластоспор или артро-
спор. Образование мицелия и псевдомицелия наблюдают в
анаэробных (под покровным стеклом) и в аэробных (вне стекла)
условиях.
Образование баллистоспор. Баллистоспоры —
бесполые споры, которые образуются на заостренных (конических)
выростах клеток, так называемых стеригмах (рис. 45), и при
созревании с силой отбрасываются (отстреливаются). Образование
баллистоспор— очень характерный способ бесполого размножения, по
наличию которого выделяют некоторые роды дрожжей, например
Sporobolomyces, Bullera, Sporidiobolus и др.
Наблюдать баллистоспоры можно по появлению зеркального
отражения штриха или колоний на крышках чашек Петри,
инкубируемых в перевернутом положении. Так как образованию и
отстреливанию баллистоспор способствуют пониженные
температуры и высокая относительная влажность атмосферы, то в опытах
1 \» <* 4 *?
1 fa
'1 1""^-" « j? J
«* А ** 1
(*)
" - У Г»
Рис. 45. Баллистоспоры Sporobolomyces (l)t Bullera (2), Tilletiopsis (3)
используют следующие
приемы. Посев штрихом любой
формы проводят на пластинку
с картофельным или
кукурузным агаром на предметном
стекле, которое помещают в
чашку Петри штрихом вниз
над вторым стеклом без
агаровой пленки. Между
стеклами располагают небольшую
П-образную стеклянную
прокладку. Для поддержания
влажной атмосферы в чашку
кладут смоченную стерильной
водой вату. Посевы
инкубируют при 18—20°. Следят за
появлением на нижнем стекле
заметного зеркально
повторенного штриха, который
образуется за счет прорастания
баллистоспор (рис. 46). При
появлении роста стекло
снимают и наблюдают под
микроскопом отстрелявшиеся
баллистоспоры. Отмечают их форму: они, как правило, овальные
у Bullera и почковидно изогнутые Sporobolomyces и Sporidiobolus.
1
1 '4г
<*
" -N
и
L
1
1
Рис. 46. Схема опыта по получению
«зеркальных» колоний дрожжей за счет
прорастания баллистоспор
ХАРАКТЕРИСТИКА ЖИЗНЕННЫХ ЦИКЛОВ И ПОЛОВОГО ПРОЦЕССА
Полные жизненные циклы дрожжей включают стадию
полового размножения. У аскоспоровых дрожжей такая стадия
представлена образованием сумок (асков) с гаплоидными аскоспорами,
у базидиомицетных — базидиальных структур (рис. 47). Плодовые
198
тела формируются крайне редко, только у некоторых базидиоми-
цетов из порядка тремелловых.
7 Гомотал личны е 2
Гаплоидные Диплоидные
Schliosaccharomyces ротдв Socchoromycoues ludwigiL
re теротал/fu чны е
Honsenula wingei RhodosporltiLum dtodovatum
Рис. 47. Жизненные циклы дрожжей:
/ — гаплоидные гомоталличные; 2 — диплоидные гомоталличные; 3, 4 — гетеро-
талличные; П — плазмогамия; К — кариогамия; М — мейоз; А — аскоспоры;
СП — споридии; а, а — типы спаривания
Среди признаков, характеризующих жизненный цикл и
половой процесс, для целей идентификации важны следующие: гомо-
или гетероталлизм; место и время диплоидизации в жизненном
цикле; образование аскоспор; число их в сумке, морфология,
скорость освобождения при созревании; образование базидиоспор и
характеристика базидиальных структур.
199
в
У
1 2
i (
Л
V
-О
V
Рис. 48. Схема перекрестного
спаривания дрожжей для выявления
гетероталлизма
Гомо- или
гетероталлизм. Если дрожжи при проверке
на широком наборе питательных
сред, применяемых для выявления
спор, не обнаруживают .признаков
полового процесса, то следует их
проверить в отношении
гетероталлизма методом массового
спаривания. Из нескольких сходных по
всем морфологическим и
физиологическим признакам штаммов
смешивают равные количества иноку-
лятов из активно растущих клеток
в центре косячка питательной
среды для спорообразования (см.
ниже) и распределяют смесь
штрихом. Через 1—2 дня и далее
еженедельно в течение 3 недель
наблюдают за образованием зигот. В
случае получения положительного
результата готовят смеси попарно, чтобы определить штаммы,
способные к перекрестному спариванию (рис. 48).
Определить гомо- или гетероталлизм и выделить типы
спаривания диплоидных дрожжей из спорулирующей культуры можно
методом тепловой инактивации спор. Суспензию споровой
культуры прогревают 10 мин при 52° и делают первый рассев. Затем
продолжают нагревать до 65° с последующими рассевами до тех пор,
пока все аскоспоры не будут инактивированы. Колонии на чашках,
предшествующих тем, на которых роста не появилось, исследуют
на способность образовывать споры. Если все колонии образуют
аскоспоры, то штамм гомоталличный, в противном случае — гете-
роталличный. Неспорулирующие изоляты смешивают по 4 и
попарно, чтобы выявить типы спаривания у гетероталличных
дрожжей. Этим же методом можно получить активно спорулирующие
культуры из гомоталличных штаммов аскоспоровых дрожжей,
у которых способность образовывать споры значительно снижена.
Образование аскоспор. У разных видов дрожжей оно
происходит в различных условиях. Некоторые дрожжи спорули-
руют на обычных средах, которые используют для выделения и
поддержания культур, другие требуют резкой смены условий для
перехода к спорообразованию. В этом случае дрожжи сначала
культивируют на так называемых предспоруляционных средах,
а затем переносят на среды для споруляции. Желательно во всех
случаях, когда спорообразование сразу не выявляется, применять
большой набор сред и условий, так как у разных дрожжей этот
процесс стимулируется разными факторами.
В качестве предспоруляционных сред используют полноценные
субстраты из натуральных продуктов, например свежий
виноградный сок, смесь фруктовых и овощных соков, томатный сок. К со-
200
кам добавляют 2% сухих дрожжей. Применяют также солодовое
сусло 7%-ного СВ1. Инкубируют при 25—28° с периодическим
встряхиванием в течение 1—2 сут или для медленно растущих
культур 3—4 сут, а затем переносят на среды для спорообразова-
Овощные косячки. Из овощей — моркови, картофеля,
свеклы, огурца, репы — вырезают пробочником цилиндрический
кусочек, разрезают его по диагонали на две части в виде косячков
й помещают в пробирки, на дно которых кладут вату, обильно
смоченную водопроводной водой, или наливают немного воды и
стерилизуют 15 мин при 112°.
Среда Викергама (г/л): дрожжевой экстракт (сухой)—3;
солодовый экстракт — 3; пептон — 5; глюкоза—10; вода
водопроводная.
Среда Городковой (г/100 мл): мясной экстракт—1;
пептон -- 1; глюкоза — 0,25; NaCl — 0,5; агар — 2; вода
водопроводная.
Ацетатный агар Адамса (%): ацетат натрия — 0,14;
глюкоза — 0,04; агар — 2; вода дистиллированная. (В эту среду
иногда добавляют немного пептона в виде следов.)
Гипсовые блоки. Две объемные части прокаленного гипса
смешивают с одной частью водопроводной воды и массу
раскладывают в стаканчики из пергамента или станиоля диаметром 1—
1,5 см и высотой 1,5—2 см. Поверхность блоков тщательно
разравнивают ножом. После застывания гипса стаканчики удаляют,
а блоки помещают в чашки Коха, заливают до половины водой и
стерилизуют при 120° 30 мин.
Из гипса можно готовить и косячки в пробирках, что лучше
гарантирует их стерильность. Гипс замешивают до консистенции
крема и заливают в пробирки. В сильно наклонном положении
пробирки выдерживают при 50° 24 ч, чтобы дать гипсу затвердеть,
затем закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве.
После стерилизации вливают 3 мл стерильной воды, к которой
добавляют уксусную кислоту до рН 4,0. Засев густой суспензией на
верхний край косячка. Инкубируют 1—2 дня при 25°.
На средах для спорообразования дрожжи инкубируют 3 сут
при 25° и микроскопируют. Если споры не обнаруживаются, то
культуры оставляют при комнатной температуре и исследуют с
недельными интервалами в течение 4—6 недель. Споры наблюдают
в живых препаратах при больших увеличениях. Они сильнее
преломляют свет, чем вегетативные клетки, и поэтому более четко
выделяются на фоне всех других включений. При наблюдении
спор отмечают их число в сумке, форму, размеры и структуру
поверхности (рис. 49). Различного рода шипы, выросты и ободки на
спорах иногда видны в световом микроскопе. В противном случае
требуется электронная микроскопия реплик или сканирующая
микроскопия.
1 «Крепость» сусла определяют по содержанию в нем сухих веществ (СВ),
которое выражают в процентах или градусах Баллинга.
Рис. 49. Сумки и аскоспоры дрожжей:
/ — Saccharomyces; 2 —■ Kluyveromyces; 3 — Pichia; 4 — Debaryomyces; 5 —
Schwanniomyces; 6 — Lipomyces; 7 — Metschnikowia; 8 — Arthroascus; 9 —*
Hanseniaspora; 10 —Stephanoascus; 11 — Saccharomy codes; 12 — Wickerhamia;
13 — Nadsonia; 14 — Schizosaccharomyces
Образование базидиоспор. Гетероталличные базидио-
мицетные дрожжи обычно выделяются из природных субстратов
как почкующиеся гаплоидные анаморфы. Для наблюдения за
образованием дикариотического пряжкового мицелия и базидиаль-
ных половых структур необходимо подобрать скрещивающиеся
штаммы, представляющие собой противоположные типы
спаривания. Для этого небольшое количество инокулята наносят петлей в
виде точки на поверхность агаровой среды в чашке Петри и сюда
же примешивают инокулят другого штамма, который
потенциально может быть комплиментарным типом спаривания. Чашки
инкубируют, и ежедневно при малом увеличении (60— 100х) ведут
наблюдения за появлением пряжкового мицелия вокруг колонии.
Мицелий обычно врастает с агар. Кусочки агара с мицелием
стерильно вырезают и переносят на свежую среду для дальнейшего
202
наблюдения. С этой целью используют сусло-агар, кукурузный
агар или агаризованный сенной настой, который гото-
вят следующим образом: 50 г измельченного сена заливают 1 л
дистиллированной воды, автоклавируют при 112° 30 мин и
фильтруют. Добавляют 2 г КгНР04 и 15 г агара к 1 л фильтрата и
доводят рН до 6,2. Стерилизуют еще раз 20 мин.
Следует учитывать, что на результаты скрещивания сильно
влияют условия инкубации, например температура и освещение.
Так представители рода Leucosporidium нормально развиваются
при оптимальной температуре 12—15°.
Половые структуры базидиальных дрожжей морфологически
разнообразны (рис. 50). Они бывают внешне сходными с бесполы-
Рис. 50. Типы базидиальных структур у дрожжей:
/ — Rhodosporidium, Leucosporidium; 2 — Cystofilobasidium; 3 — Filobasidiella;
4 — Filobasidium; 5 — Tremella
ми хламидоспорами (у Rhd/iosporidium и Leucosporidium), но в
отличие от них служат местом, где происходит кариогамия и мейоз,
т. е. они несут половую функцию и называются телиоспорами. Те-
лиоспоры формируются интеркалярно или терминально на
Мицелии; одиночные, парные или собраны в цепочки. Форма телиоспор
служит видовым признаком (рис. 51). Базидии могут быть
расчлененными и нерасчлененными. Например, в роде Tremella базидии
продольно разделены на 4 части, а у Filobasidium и Filobasidiella
они цельные (холобазидия).
С целью идентификации важно бывает наблюдать прорастание
телиоспор. Так, у Rhodosporidium телиоспоры прорастают септи-
рованным промицелием, а у Cystofilobasidium образуется несепти-
рованная эпибазидия с небольшим вздутием на'конце (см. рис. 50).
Техника наблюдений за прорастанием телиоспор включает
вымачивание кусочков агара со зрелыми телиоспорами в
дистиллированной воде при низких температурах (от 5 до 18°) сроком до
ОАО
Рис. 51. Типы телиоспор
10 недель. Далее эти кусочки помещают на свежую среду,
осторожно раздавливают и распределяют на поверхности. Микроскопи-
руют непосредственно на агаре.
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ
Если морфологические признаки и способы размножения у
дрожжей позволяют разделять крупные таксоны высокой
категории, то физиологические признаки используют преимущественно
для разграничения видов. При идентификации используют
следующие признаки: способность к сбраживанию углеводов до диоксида
углерода и этанола в анаэробных условиях, усвоение безазотистых
источников углерода путем их окисления в аэробных условиях,
способность роста на нитратах и нитритах в качестве источников
азота, рост в среде без витаминов, устойчивость к антибиотикам.
Такие признаки, как рост при разных температурных условиях и
в средах с высоким осмотическим давлением, вынесены в раздел
экологических, хотя и относятся к области физиологии.
При получении физиологических характеристик необходимо
строго соблюдать стандартные условия постановки опытов,
использовать молодые (обычно 1—2-суточные) активно растущие
культуры дрожжей для засева дифференциальных сред и высокоочи-
щенные препараты веществ, не содержащие примесей, которые
могут исказить результаты.
Использование источников углерода путем
сбраживания (тест на брожение). Тест на брожение основан
на обнаружении С02 при росте дрожжей в анаэробных условиях.
Опыт ставят в пробирках Дургама с поплавками или трубках
Дунбара (рис. 52). Скорость накопления С02 определяет
брожение быстрое, среднее и медленное. Засев должен быть густым,
чтобы быстро исчерпать кислород и ограничить размножение клеток.
Есть несколько правил (почти все они с исключениями),
которые помогают в постановке и оценке теста на брожение: 1) если
дрожжи не сбраживают глюкозу, то они не сбраживают и другие
204
сахара и, наоборот, если дрожжи
сбраживают какой-либо сахар,
то они могут сбраживать и
глюкозу; 2) если дрожжи
сбраживают тот или иной углевод, то они
могут также его ассимилировать
в аэробных условиях (но не
наоборот!); 3) если дрожжи
сбраживают глюкозу, то они могут
сбраживать также фруктозу и манно-
зу (исключение — отрицательные
ло фруктозе Torulopsis halophila);
4) брожение лактозы и
мальтозы почти всегда исключает друг
друга; 5) пигментные дрожжи не
вызывают брожения (исключе- 2
ние — Phaffia rhodozyma).
Наибольшее значение имеет Рис. 52. Трубки Дунбара (1) и про-
проверка сбраживания глюкозы, бирки Дургама (2)
галактозы, сахарозы, мальтозы и
рафинозы. Дополнительно
проверяют брожение лактозы, мелибиозы, а-метил-О-глюкозида, целло-
биозы, трегалозы, мелезитозы и полисахаридов инулина и
крахмала. Трисахарид рафиноза может гидролизоваться разными
ферментами и поэтому сбраживается 1/3 (фруктоза или галактоза),
2/3 (сахароза) или вся молекула рафинозы (табл. 7).
Таблица 7
Определение степени сбраживания рафинозы
мелибиозы
+
+
+
Сбраживание
сахарозы
I+++
галактозы
+
+ или —
+
Сбраживание
рафинозы
полное
2/3; остается галактоза
1/3; остается мелибиоза
1/3; остается сахароза
а-галактозидаза fi-фруктозидаза
(мелийшза) (инвертаза)
Рафиноза= галактоза а, 1— бглкжоза а, 1-2,J3фруктоза
мелибиоза
сахароза
Таблица 8
Состав основных синтетических сред для идентификации дрожжей
Состав ингредиентов в 1 л
дистиллированной воды
Источники углерода и азота, г
глюкоза
(NH4)2S04
аспарагин
Соли, г
КН2Р04
К2НР04
MgS04
NaCl
СаС12
Аминокислоты, мг
L-гистидин моногидрохлорид
DL-метионин
DL-триптофан
Витамины, мкг
биотин
пантотенат кальция
фолиевая кислота
инозит
никотиновая кислота
парааминобензойная кислота
пиридоксин гидрохлорид
рибофлавин
тиамин гидрохлорид
Источники микроэлементов, мкг
Н3В03
CuS04
KI
FeCl3
MnS04
Na2Mo04
ZnS04
Промытый агар
Морфологический
агар
10
3,5
1,5
0,85
0,15
0,5
0,1
0,1
10
20
20
20
2 000
2
10000
400
200
400
200
400
500
40
100
200
400
200
400
18
Азотная
основа для С-асси-
миляциоиного
теста
нет
5
нет
0,85
0,15
0,5
0,1
0,1
10
20
20
20
2 000
2
10 000
400
200
400
200
400
500
40
100
200
400
200
400
нет
Углеродная
основа для
N-ассимиляци-
онного теста
10
нет
»
0,85
0,15
0,5
0,1
0,1
1
2
2
20
2 000
2
10000
400
200
400
200
400
500
40
100
200
400
200
400
нет
Среда без
витаминов.
10
5
нет
0,85-
0,1&
0,5
0,1
од
10
20
20
нет
»
»
»
»
»
»
»
»
500
40
100
200
400
200
400
нет
Использование источников углерода путем
окисления (тест на ассимиляцию). Ответная реакция в этом
тесте определяется по росту, контролем (для сравнения) служит
среда без источника углерода. Испытывают гексозы и их
производные (D-глюкозу, D-галактозу, L-сорбозу, а-метил-Л-глюкозид,
салицин, арбутин), дисахариды (сахарозу, мальтозу, мелибиозу, цел-
лобиозу, трегалозу, лактозу), трисахарид рафинозу,
полисахариды (инулин, растворимый крахмал), пентозы (D-ксилозу, D- и
L-арабинозу, D-рибозу, L-рамнозу), спирты (этанол, метанол,
глицерин, эритрит, рибит, дульцит, D-маннит, сорбит, инозит),
органические кислоты (DL-молочную, янтарную, лимонную, глюкуроно-
вую), углеводороды (декан, гексадекан).
206
Концентрация источников углерода в конечной среде — 0,5%,
рафинозы—1%. Объемная доля алканов в среде — 2%.
Растворимый крахмал и инулин предварительно растворяют в воде,
нагревая осторожно над пламенем. В средах с органическими кислотами
реакцию доводят до рН 5,8—6,1. Используют жидкие и агаровые
среды. Все посевы выращивают при оптимальной температуре:
25—28° для мезофилов и 12° — для психрофилов.
При постановке опыта в жидких средах растворы, содержащие
0,5% источника углерода, разливают по 4,5 мл в стерильные
пробирки и автоклавируют 15 мин при 112°. После охлаждения
добавляют 0,5 мл основной среды (азотная основа для С-ассимиля-
ционного теста в табл. 8) 10-кратной концентрации, пробирки
встряхивают и засевают одной каплей инокулята. Для
приготовления инокуляционной суспензии 1 петлю из активно растущей на
сусло-агаре культуры (2—3 сут в зависимости от скорости роста)
переносят в 3 мл стерильной водопроводной воды в пробирки и
разбавляют ее водой, пользуясь для определения стандартной
мутности трафаретом с полосами 3Д мм на расстоянии 1 см.
Разбавление ведут до тех пор, пока линии не будут четко
просматриваться через пробирку (рис. 53). Пробирки инкубируют в
наклонном положении для лучшей аэрации и регулярно встряхивают.
Наблюдения ведут еженедельно в течение 4 недель. Степень
использования источника углерода отмечают знаками +,
количество которых соответствует степени мутности, определяемой по тра-
\Ф$
W*Wi
I'V.vV.V-'
il
Рис. 53 Рис. 54
Рис. 53. Схема использования трафарета для визуальной оценки роста дрожжей
в пробирках с жидкими средами. Толщина полос должна быть 3Д *"•
Рис. 54. Посев множественным инокулятором при постановке ассимиляционного
теста
207
фарету; если линии совсем не видны — 3+; если они
просматриваются расплывчатыми — 2+; если линии определенны, но имеют
размытые края—1 + ; отсутствие роста обозначают минусом. 3+
и 2+ в течение 4 недель означает положительную реакцию, a 1-f.
слабую или отрицательную, если известно, что сахар*имеет
примеси. Мутность суспензии можно измерять и на нефелометре.
Для приготовления агаровой среды используют чистый агар
«Difco» или готовят промытый агар; замачивают 20 г агара в 1 л
дистиллированной воды при комнатной температуре и ежедневно
в течение 8 дней меняют воду; в конце агар тщательно промывают
и добавляют дистиллированную воду до 1 кг. Расплавляют,
разливают нужными порциями в колбы или пробирки и автоклавируют
15 мин при 112°. Перед использованием смешивают жидкую
стерильную среду (азотная основа для С-ассимиляционного теста)
10-кратной концентрации, раствор углевода и расплавленный агар
в определенных объемах в пробирках или колбах (для разлива в
чашки Петри).
Посев в пробирки делают прямым штрихом из суспензии. Так
же можно засевать и чашки: по радиусу из одной суспензии,
каждый раз набирая петлей новую порцию для нового штриха.
Когда работают с большой коллекцией штаммов, удобно
пользоваться для засева чашек Петри специальным множественным
инокулятором. Он представляет собой две круглые металлические
пластины из нержавеющей стали, точно входящие в чашки Петри.
На одной пластинке сделаны «колодцы», на второй — штыри
диаметром 3 мм с плоскими концами, по 21 или 36 шт. В колодцы
закапывают по две капли стерильной водопроводной воды и одну
каплю дрожжевой суспензии и после тщательного размешивания
делают отпечатки на всех средах (рис. 54).
Если имеется небольшое количество углевода для
приготовления среды, то можно пользоваться ауксанографическим методом
Бейеринка. Основная среда (%): (NH4)2SO4 — 0,5; КН2Р04 —
0,1; MgS04-7H20 — 0,05; промытый агар — 2. Расплавленную и
охлажденную до 40° среду выливают в чашки Детри, куда
предварительно вносят 2 мл суспензии испытуемых дрожжей в
стерильной водопроводной воде и одну каплю дрожжевого автолизата
или смеси витаминов 100-кратной концентрации. Тщательно
перемешивают. После застывания агара чашки оставляют на
несколько часов при 25°, чтобы подсушить поверхность.
Небольшие количества источников углерода раскладывают на
агаре, отмечают их с наружной стороны меньшей чашки. Чашки
инкубируют в перевернутом положении при 25°, результаты
снимают через 2—3 дня. Этот метод непригоден в случае, если
источник углерода ассимилируется медленно.
Использование соединений азота. Дрожжи
используют азот в разной форме, но для целей дифференциации
пригоден только тест на ассимиляцию нитратов и нитритов, так как
пептон, аспарагин, сульфат аммония и мочевина (в нетоксичной
концентрации) ассимилируются всеми видами дрожжей. Тест на асси-
208
милядию нитратов и нитритов проводят в жидких или агаровых
средах. В опыте с жидкими средами используют углеродную
основу для N-ассимиляционного теста (табл. 8), в которую вносят
0,78% KN03 или 0,26% NaN02. Отрицательным контролем служит
эта же среда без источников азота, положительным—с 0,5%
(NH4hS04. Посев производят из суспензии, как и в опытах по
ассимиляции источников углерода. Через неделю инкубации из
этих пробирок одной петлей засевают вторую серию пробирок.
Если вторая пробирка дает результат 3+ или 2 +, то считают, что
источник азота ассимилируется, если 1 + , то результат считается
отрицательным.
Указанную выше среду с промытым агаром можно
использовать для засева множественным инокулятором, как это описано в
тесте на ассимиляцию углерода. Обязательны положительный и
отрицательный контроль для сравнительной оценки роста. В аукса-
яографическом методе Бейеринка используют глюкозо-мине-
ральную среду (%): глюкоза —2; КН2Р04 —0,1; MgS04X
Х7Н20 — 0,05; промытый агар — 2. В чашки перед разливкой
среды добавляют одну каплю смеси витаминов 100-кратной
концентрации и 2 мл суспензии дрожжей. После застывания и
подсушивания при 25° на поверхность агара наносят небольшие
количества KN03 и (NH4)2S04, последний — в качестве контроля.
Рост в безвитаминной среде. Определение
потребностей в витаминах основано на прорастании клеток при аэробных
условиях в стандартной синтетической среде, лишенной факторов
роста. В первом посеве клетки обычно растут за счет накопленных
резервов, поэтому требуется делать последующие пассажи, чтобы
истощить запасы витаминов.
Стерильную среду разливают асептически по 2 мл в
стерильные пробирки и инокулируют методом микрозасева по Одинцовой.
Суспензию готовят, внося петлей очень небольшое количество
посевного материала с сусло-агара в пробирку со стерильной
дистиллированной водой. Материал наносят на внутреннюю стенку
пробирки над водой. Петлю прожигают, вводят ее снова в
пробирку и, захватив ею воду, растирают на стенке внесенный материал.
Затем активным вращением и встряхиванием пробирки смывают
дрожжи. Суспензия должна быть прозрачной с едва заметной
опалесценцией. В пробирки со средой вносят по одной капле этой
суспензии, встряхивают и располагают пробирки в горизонтально-
наклонном положении. Инкубируют при 25°, перемешивая среду
встряхиванием дважды в сутки. Через 7 дней из этих пробирок
делают пересев в свежую партию среды стандартной петлей, а еще
через 7 дней рост оценивают по мутности, как и в случае проверки
ассимиляционных свойств на жидких средах. Штаммы, давшие
реакцию З-f во втором пассаже, считают способными
синтезировать все витамины, при результате 2+ штаммы нуждаются в
добавлении витаминов извне.
Устойчивость к циклогексимиду (актидиону).
Дрожжи, первично выделенные из естественных местообитаний,
различаются по чувствительности к антибиотику циклогексимиду,
хотя при длительном поддержании в лаборатории и пассажах на
средах с актидионом возможно появление устойчивых культур из
чувствительных (лабораторные артефакты). Этот тест
рекомендуется как вспомогательный для разграничения некоторых видов
среди вновь выделенных штаммов. Проверяют устойчивость к
актидиону при его концентрации в среде 100 и 1000 мкг/мл.
10 мг актидиона растворяют в 90 мл дистиллированной воды и
стерилизуют фильтрованием. 4,5 мл этого раствора переносят в
стерильную пробирку и добавляют 0,5 мл основной среды (10-
кратной концентрации) для ассимиляционных тестов с (NH4hS04
0,5% и глюкозой 1%-ной. Засевают каплей суспензии в
дистиллированной воде и инкубируют при 25°, регулярно встряхивая
пробирки. Наблюдают за ростом в течение 3 недель и опыт снимают
так же, как и в тестах на ассимиляцию в жидких средах.
Ростовая реакция 3+ и 2+ в течение 7 дней указывает на высокую
устойчивость к антибиотику, 1+ или менее после 4 недель
инкубации свидетельствует о чувствительности к циклогексимиду.
Высокой устойчивостью к циклогексимиду характеризуются
почвенные дрожжи рода Lipomyces.
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ
К этой группе относят признаки, которые характеризуют
дрожжи со стороны некоторых ферментативных реакций (гидролиз
мочевины, расщепление арбутина, желатина, липидов),
образования специфических продуктов (эфиров, кислот, крахмалоподобных
соединений, пигментов) или состава мономеров в молекулах таких
лолимерных соединений, как ДНК и внеклеточные полисахариды.
Эти признаки имеют малую диагностическую ценность и либо
служат дополнительными критериями для определения небольшого
числа видов, либо помогают при решении спорных вопросов,
особенно при дифференциации несовершенных дрожжей, где
недостаточность морфологических признаков и отсутствие половой стадии
в жизненном цикле создают трудности их идентификации.
Гидролиз мочевины (уреазный тест). Практически все
дрожжи способны использовать мочевину как источник азота при
малых ее концентрациях в полноценной по витаминному составу
среде. Однако дрожжи различаются по способности гидролизовать
мочевину при ее высокой концентрации и в присутствии пептона
в качестве органического источника азота: аскоспоровые, как
правило, не имеют этой способности, а базидиомицетовые и
родственные им несовершенные дрожжи (роды Cryptococcus, Rhodotorula
и др.) обладают положительной уреазной активностью. Этот тест
особенно желателен в случае исследования несовершенных
дрожжей.
Опыты ставят на среде Христенсена (г/л): глюкоза—1;
пептон— 1; КН2РО4 — 2; NaCl — 5; вода дистиллированная. В среду
добавляют индикатор феноловый красный 0,012 г/л и реакцию до-
210
водят до рН 6,8. Среда имеет желтый цвет. Затем вносят 20 г
агара, расплавляют и разливают по 4,5 мл в пробирки. Автоклави-
руют при 112° 15 мин. Сразу же после стерилизации в каждую
пробирку добавляют 0,5 мл 20%-ного раствора мочевины,
стерилизованного фильтрованием, перемешивают и заливают. Посев
прямым штрихом.
Результаты наблюдают ежедневно в течение 5 сут инкубации
при 25°. Реакция считается положительной, если появляется
интенсивно-розовый цвет за счет подщелачивания среды в
результате гидролиза мочевины.
Гидролиз желатины. Очень немногие дрожжи обладают
протеолитической активностью, поэтому проба на разжижение
желатины имеет ограниченную диагностическую ценность. Этот тест
используют как дополнительный при разграничении некоторых
видов, например, одинаково пигментированных Cryptococcus mace-
rans ( + ) и Cr. infirmominiatus (—).
Желатину (12—15%) добавляют в жидкое сусло, расплавляют
и разливают по пробиркам или колбочкам. Стерилизуют 15 мин
при 112°. Посев производят либо одной каплей суспензии на
поверхность среды в виде столбика в пробирке, либо точечным
уколом в колбочке или чашке Петри. Инкубируют при 18°.
Результаты наблюдают приблизительно на 7-е и 24-е сут.
Расщепление арбутина. С помощью этого теста у
дрожжей выявляют р-глюкозидазную активность. При гидролизе
арбутина его аглюконовая часть — гидроксихинон — дает
коричневый цвет с любыми растворимыми солями железа, содержащимися
в среде.
Арбутиновый агар: растворяют при нагревании 0,5% арбутина
и 2% агара в дрожжевом отваре или дрожжевом автолизате
(1: 10) и автоклавируют в пробирках 15 мин при 120°. Сразу же
после стерилизации добавляют в каждую пробирку по 2—3 капли
стерильного 1%-ного раствора цитрата железоаммония,
встряхивают и закашивают. Посев производят активно растущей
культурой и инкубируют при 25°. Незасеянная пробирка служит
контролем. Если арбутин расщепляется, то в агаре вокруг штриха
появляется темно-коричневая зона. Посев можно делать в чашках,
добавляя в каждую одну каплю хлорида железа. На одну чашку
не следует наносить более 4 штрихов.
Расщепление жира. Метод Эйкмана. Свежий говяжий
жир расплавляют, фильтруют через горячую воронку и
стерилизуют в автоклаве. 0,5 мл стерильного жира переносят в теплую
чашку Петри и распределяют тонким слоем по дну. Избыток
удаляют. Чашки ставят на 2 ч в холодильник, после чего заливают в
них 20 мл расплавленного и охлажденного до 40° агара Городко-
вой с 0,1% мела. Чашки засевают штрихами и оставляют при 25°.
Положительный результат определяют через несколько дней по
появлению прозрачной зоны растворения мела вокруг штриха за
счет образования свободных жирных кислот.
211
Образование кислот. К 1 л дрожжевого отвара или
разбавленного 1 : 10 дрожжевого автолизата, или 0,5%-ного
дрожжевого экстракта в дистиллированной воде добавляют 50 г глюкозы,
5 г мела и 20 г агара. Среду разливают в пробирки или чашки
Петри при постоянном активном перемешивании. Чашки лучше
поставить на холодную поверхность для ускорения застывания
агара, чтобы мел не успевал оседать на дно. Посев штрихами.
Образование кислот отмечают по появлению зон растворения
мела.
Образование эфиров. Иногда дрожжи образуют
значительное количество эфиров, которые можно обнаружить по
запаху. Культуру высевают на сусло-агар с дрожжевым экстрактом и
инкубируют при 25 или 28°. Запах обычно появляется через 24
или 48 ч. Для культивирования в жидкой среде используют
5%-ный раствор глюкозы в дрожжевом отваре. Инкубируют в
пробирках или колбочках Эрленмейера при 25° 3—5 дней.
Образование крахмалоподобных соединений.
Тест основан на появлении синего окрашивания при реакции
синтезируемых амилоидных веществ с йодом. Пробы делают в жидких
и агаровых культурах. Для проведения теста в жидких культурах
используют посевы на ассимиляцию источников углерода. Через
24—28 дней инкубации в пробирки с глюкозой и сахарозой
добавляют по одной капле раствора Люголя в модификации Грама: 1 г
йода+ 7 г KI-f-ЗО мл дистиллированной воды. В синий цвет
окрашивается осадок или раствор, или то и другое. Коричневый цвет
характерен для гликогена. Если пробирки оставить на ночь, то при
наличии крахмалоподобных веществ цвет коричневый исчезает,
а синий остается.
Этот тест можно ставить и на плотной среде. Агаровая
среда (г/л): глюкоза—10; (NH4)2S04—1; КН2Р04— I; MgS04X
Х7Н20 — 0,5; агар — 25; вода дистиллированная.
Среду стерилизуют при 112° 15 мин и подкисляют
разбавленной соляной кислотой до рН 4,5. Разливают в чашки Петри, куда
предварительно добавляют по одной капле дрожжевого
автолизата. Посев проводят штрихами или многоточечным инокулятором.
После 1—2 недель инкубации при комнатной температуре чашки
заливают раствором Люголя. В положительных случаях штрихи и
среда вокруг них окрашиваются в синий цвет, который становится
более четко заметным через сутки.
Моносахаридный состав внеклеточных
полисахаридов. Помимо крахмалоподобных веществ многие
дрожжи выделяют в среду в значительных количествах разные
полисахариды, состав которых сильно различается у родов, а иногда
и видов внутри рода. Например, виды липомицетов различаются
по наличию или отсутствию во внеклеточных полисахаридах
галактозы; в полисахаридах криптококков имеется ксилоза, у Rhodo-
torula — фруктоза. Среда для накопления
полисахаридов дрожжами (г/л): глюкоза — 50; (NH4)2S04—1,4;
212
КН2РО4—1>0; MgS04-7H20 — 0,5; NaCl — 0,5; вода
водопроводная.
Среду разливают в 500 мл колбы по 100 мл и после
стерилизации (112° 15 мин) в каждую колбу добавляют асептически по
0,5 мл дрожжевого автолизата и по 0,5 стерильного мела. Иноку-
лят готовят на этой же среде. Посев проводят 1 мл 2—3-суточной
культуры. Инкубируют 5—7 сут на качалке. Клетки отделяют
центрифугированием, а супернатант сливают в целлофановые мешки
и ставят на диализ в проточной воде. Через 2 сут жидкость
упаривают под вакуумом в 3—5 раз, добавляя при этом небольшие
объемы я-бутанола во избежание вспенивания. Полисахариды
осаждают двумя—четырьмя объемами 96%-ного этанола. Для
лучшего формирования осадка колбы оставляют на ночь в
холодильнике. Осадок отделяют центрифугированием, несколько раз
промывают этанолом и лиофилизируют или высушивают в вакуумном
эксикаторе над СаС12 и Р205.
Для гидролиза полисахаридов навеску 0,05—0,1 г заливают
4—6 мл 2 н. раствора H2SO4 и выдерживают в запаянных ампулах
при 110° от 1 до 7 ч. Гидролизат нейтрализуют твердым ВаСОз,
осадок отфильтровывают или отделяют центрифугированием.
Фильтрат обрабатывают ионообменной смолой (Н+-форма) для
удаления катионов и упаривают под вакуумом при температуре не
выше 45—50°. Растворы гидролизатов анализируют методом
нисходящей хроматографии на бумаге. Для разделения моносахаров
используют различные системы растворителей. Для дрожжевых
полисахаридов наиболее часто используют систему «-бутанол—
пиридин—вода (6:4:3). Хроматограммы можно проявлять двумя
способами.
Первый: обрабатывают раствором AgNC>3, а затем
опрыскивают раствором щелочи. Раствор AgN03 готовят путем
растворения 1 г в минимальном объеме воды и добавляют ацетон до
100 мл. Для приготовления раствора щелочи 2 г КОН (или NaOH)
растворяют в минимальном объеме воды и добавляют метанол до
100 мл. Если хроматограммы необходимо хранить длительное
время (более суток), то их после проявления закрепляют в растворе
тиосульфата натрия (200 г/л), а затем промывают водой и
высушивают.
Второй: обрабатывают хроматограммы анилинфталатным
реактивом, просушивают и нагревают 3 мин при 105°. Для
приготовления анилинфталатного проявителя 1,66 г фталевой кислоты
и 0,93 г свежеперегнанного анилина растворяют в 100 мл водо-
насыщенного «-бутанола.
Первый способ более чувствителен, а второй дает возможность
дифференцировать пентозы от гексоз.
СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ, СВЯЗАННЫЕ С ЭКОЛОГИЕЙ
Хотя многие физиологические признаки можно рассматривать
как адаптивные и имеющие экологическое значение, в наличии
213
некоторых свойств особенно заметно проявляется приспособлен-
ность дрожжей к условиям их местообитания. Такие признаки а
наибольшей степени выражены у дрожжей, ассоциированных с
теплокровными животными, и менее у эвритопных свободноживу.
щих организмов. В группу экологических признаков мы включила
рост в средах с высоким осмотическим давлением и рост при
повышенных и пониженных температурах. Диагностическая ценность \
этих признаков ограничена немногими видами дрожжей, а часто
эти признаки выявляют различия лишь между штаммами.
Рост в средах с высоким осмотическим
давлением. Способность расти на средах с высокими концентрациями
сахара может быть установлена либо на агаровой среде, содержа*
щей 50 и 60% глюкозы, либо в жидкой. Необходимо иметь в виду,
что рост на средах с высоким осмотическим давлением часто
медленный и скудный.
Глюкозный агар с дрожжевым экстрактом: растворяют
50 или 60 г глюкозы в 50 или 40 мл соответственно дрожжевого
отвара или 1 % дрожжевого автолизата и отмечают объем; добав*
ляют 3% по массе от объема получившегося раствора глюкозы.
Стерилизуют в автоклаве 15 мин при 112° и разливают по чаш*
кам. Посев производят штрихами.
Устойчивость к NaCl. Среда (%): глюкоза — 2; пептон —
1; дрожжевой экстракт — 0,5. К порциям по 5 мл этой среды
добавляют NaCl, составляя ряд от нуля до насыщения (26%) с
перепадом в 1%. Засев суспензий и инкубирование на качалке при
25°. Самая низкая концентрация NaCl, при которой нет видимого
роста через 3 дня, считается пределом устойчивости к NaCl.
Рост при разных температурах. Большинство видов
дрожжей относится к мезофилам и имеет оптимум для роста в
пределах 20—28°. Исключение составляют виды из ограниченных
и специфических местообитаний. Например, почвенные дрожжи из
районов высоких широт и высокогорий имеют верхний
температурный предел для роста около 20—23°, а оптимум при 12—15 или
даже 4°. Психрофильные дрожжи встречаются в почвах и в зонах
умеренного климата. Почти все они ограничены родом Leucospori-
dium. С другой стороны, дрожжи, которые живут в теле
теплокровных животных, имеют оптимум для роста около 37° и не
растут ниже 20°. Таким образом, этот показатель может служить
свидетельством о возможности развития дрожжей в ассоциации с
теплокровными животными или человеком. Только очень немногие
виды дрожжей, например некоторые Hansenuta и Kluyveromyces,
могут расти при 45—48°.
Чашки или пробирки с глюкозо-пептонной средой и
дрожжевым экстрактом засевают, как и при определении ассимиляции
источников углерода, но в большом числе повторностей, и помещают
в термостаты с разной температурой. Рост отмечают ежедневно.
Если при 37° рост через 2—4 сут слабый, то делают пересев и
вновь инкубируют при этой же температуре 2—4 дня. После
первого грубого выявления приблизительного интервала ростовых тем-
214
ператур в пределах от 0 до 37° определяют максимальную
температуру для роста. Для этого дрожжи засевают в ряд пробирок с
жидкой глюкозо-пептонной средой с дрожжевым экстрактом и
инкубируют их в ультратермостате с перепадом температур в 1°.
Максимальной температурой считается промежуточная между са-
мой высокой, при которой рост не появляется в течение 7 дней,
и предшествующей более низкой температурой.
РАЗДЕЛ 4
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ДИНАМИКИ
МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ В ПОЧВЕ
Изучение динамики популяций — важный раздел современной
экологии. В почвенной микробиологии до последнего времени ему
не уделялось должного внимания и только в последнее время
обнаружилось, что динамику штаммовых, видовых или групповых
популяций можно изучать, причем с большой продуктивностью.
С этой целью применяются следующие методы: иммунолюми-
несцентный, работы с антибиотикоустойчивыми штаммами,
мембранных камер. Подчас нет необходимости прибегать к сложным
методам, если имеется возможность распознавать изучаемый
микроорганизм среди всех прочих по специфике образуемых им
колоний, для чего используются форма колоний, цвет, первичная
люминесценция и т. д.
ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ
Для выявления и учета определенной микробной популяции в
почве целесообразно использовать непрямой метод
флуоресцирующих антител, исключающий необходимость проведения достаточно
сложной и трудоемкой операции — конъюгации флуорохрома с
антителами иммунной сыворотки. Непрямой метод позволяет с
помощью одной меченой сыворотки изучать несколько
микроорганизмов.
Прямой метод
антиген + меченое антитело = меченый комплекс антиген—антитело
Непрямой метод
антиген+ антитело=немеченый комплекс антиген—антитело
+меченый анти-7-глобулин = меченый комплекс антиген—антитело I—
антитело П.
В качестве антигенного материала используют клетки
изучаемой культуры микроорганизма, которой иммунизируют кроликов.
Для иммунизации берут микробную суспензию в физиологическом
растворе (0,85%-ный раствор поваренной соли). В случае мице-
лиальных микроорганизмов (грибы, актиномицеты) биомассу
отмытого мицелия необходимо обработать ультразвуком для
получения однородной суспензии. Количество клеток (обрывков
мицелия) изучаемой культуры подсчитывают на препаратах или
сравнивают со стандартами мутности: 1 мл должен содержать 109 кле-
91 fi
ток. Антигенный материал убивают помещением суспензии на
Ю мин на кипящую водяную баню.
Для получения антисывороток проводят гипериммунизацию
кроликов при внутривенном введении антигенов, причем
начальная доза составляет 0,5, а конечная — 3—4 мл. Всего необходимо
провести 7—8 инъекций с промежутками 3—4 дня. Через неделю
после окончания инъекций из краевой ушной вены берут кровь,
сразу же переносят ее в стерильные пробирки и выдерживают в
термостате 2 ч при 37°. После свертывания крови образовавшийся
сгусток обводят петлей и до следующего дня пробирки
помещаются в холодильник (4°). Затем сыворотку осторожно отсасывают
пипеткой и центрифугируют (3000 об/мин, 10 мин) для удаления
форменных элементов крови.
Сыворотки консервируют добавлением 5%-ного раствора
фенола из расчета 0,1 мл раствора консерванта на 1 мл сыворотки.
Этим предупреждают развитие микроорганизмов в сыворотках,
что позволяет работать с хранящимися в холодильнике
сыворотками в течение 5 лет.
Реакцию агглютинации для проверки агллютинационного титра
ставят в пробирках по общепринятой схеме. В каждую пробирку
вносят по 1 мл соответствующим образом разведенной в
физиологическом растворе сыворотки и 1—4 капли суспензии
микроорганизма. Контролем служит пробирка, содержащая 1 мл
физиологического раствора с добавлением стандартного количества
бактериальной суспензии. Металлический штатив с пробирками ставят
на 2 ч на водяную баню (55—50°) так, чтобы только дно пробирки
соприкасалось с водой. Этим достигается перемешивание
суспендированных клеток микроорганизмов и ускорение агглютинации.
После охлаждения пробирки просматривают на свету и
устанавливают специфичность реакции. Окончательный учет проводят на
следующий день. Агглютинационный титр полученных сывороток
должен быть не ниже 1/800.
Антикроличий 7_гл°булин, меченный изотиоцианатом флуорес-
цеина, и бычий альбумин, меченный родамином, получают в
Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи.
Проверку специфичности проводят при иммунофлуоресцентном
окрашивании различных микроорганизмов из коллекции. На
фиксированный нагреванием препарат наносят сыворотку в
определенных разведениях. Время взаимодействия сыворотки с антигеном
подбирают экспериментально, оно составляет приблизительно
20 мин при 37°. Чтобы избежать подсыхания сыворотки, препарат
при инкубации помещают во влажную камеру. После первого
этапа обработки препарат промывают (20 мин) для удаления несвя-
завшегося -у-глобулина. Затем на препарат наносят каплю
меченого ^-глобулина, разведенного до определенного титра. Время
инкубации на втором этапе окрашивания и окрашивающий титр
определяют экспериментально, поскольку паспортные
рекомендации меченого антикроличьего у-глобулина не всегда обеспечивают
необходимое качество реакции. Наивысшие разведения, которые
позволяют наблюдать максимальную специфическую
флуоресценцию, нужно принять за рабочие дозы. Аналогично подбирают ра-
бочую дозу для альбумина, меченного родамином, который
используют в качестве контрастирующего красителя.
Для оценки интенсивности специфической флуоресценции
применяют условную шкалу:
+ + + + «сверкающая» флуоресценция желто-зеленого цвета с
четкой наибольшей яркостью по краю клеток;
+ + + яркая специфическая флуоресценция;
+ + выраженная специфическая флуоресценция
периферии клеток;
+ слабое специфическое свечение;
— отсутствие специфического свечения.
В качестве отрицательных контролей проводят следующие
определения: 1) инкубация препарата непосредственно с меченой
сывороткой; 2) обработка препарата на втором этапе гетерологичной
меченой сывороткой; 3) обработка препарата нормальной или
гетерологичной сывороткой, не содержащей антител к исследуемым
антигенам.
При изучении отдельных популяций в почвах следует
одновременно провести иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов,
приготовленных из почв без внесения тех или иных микробных
популяций.
Микроскопирование проводят в падающем свете на
люминесцентном микроскопе типа МЛ-2, МЛ-4. При работе применяют
светофильтры ФС-1-2, БС-8, Т-2Н, ЖС-18, объектив 90 X,
окуляры 5 X и 7Х. Метод имеет следующие ограничения.
1. Специфичность серологической реакции для различных
микроорганизмов варьируется от строгой штаммовой и видовой
специфичности до слабовыраженной специфичности с наличием
перекрестных реакций. Перекрестные реакции, вызванные сходством
антигенной структуры разных микроорганизмов, не позволяют
уверенно судить о наличии или отсутствии того или иного
микроорганизма в данном почвенном образце.
2. Неспецифическая адсорбция флуоресцирующих антител
почвенными частицами приводит к появлению сильного свечения
частиц, на фоне которого чрезвычайно трудно обнаружить свечение
изучаемого микроорганизма. Ее можно устранить окрашиванием
почвенных частиц в дополнительные по отношению к свечению
данного микроорганизма цвета (например, альбумином, меченным
родамином).
3. Трудности различения живых и мертвых клеток характерны
для всех прямых методов, и иммунофлуоресцентная микроскопия
не исключение. Специфическое свечение имеют не только живые,
но и мертвые клетки, если они сохранили антигенную структуру.
Продолжительность периода времени, за который антигены
мертвых клеток разрушаются и перестают регистрироваться,
определяются свойствами конкретного антигена, микроорганизма и условия-
218
ми среды. Неопределенность в различении живых и мертвых
клеток можно в какой-то мере устранить, если в контрольном опыте
внести в почву убитые клетки и затем оценить время их
исчезновения.
При изучении динамики популяции в почву вносят испытуемый
микроорганизм, определяют его количество сразу после внесения
я затем через 3, 7, 14, 30, 60, 90 и т. д. суток. Можно брать и
другие сроки определения. В почву могут быть внесены два
микроорганизма, чтобы проследить судьбу двух популяций одновременно.
В некоторых случаях можно изучать динамику определенной
популяции собственно почвенных микроорганизмов, но их должно быть
сравнительно много. Для бактерий это обычно не менее 1 млн на
1 г почвы.
Подсчет почвенных микроорганизмов с помощью микроскопии,
как правило, ограничен необходимостью относительно высокого
обилия учитываемого объекта. В частности, прямой подсчет
бактерий, мицелия грибов и актиномицетов на предметных стеклах
возможен при условии, что численность бактерий превышает
107 клеток, а длина мицелия составляет не менее 100 м. Это
вынуждает исследователей при работе с отдельными
малочисленными микроорганизмами — обитателями почвы отказаться от
микроскопии и ограничиться только методом посева.
Чтобы выявить малочисленный объект, необходимо его
сконцентрировать, и наиболее простой способ для этого — применение
метода мембранных фильтров, который широко применяется в
водной микробиологии, а его модификацию успешно используют для
учета почвенных микромицетов. Однако специфика задачи в
почвенной микробиологии состоит в том, что требуется выявить
малочисленный объект в сложной гетерогенной среде — почве, где
наличие почвенных частиц затрудняет анализ.
Проблема может быть решена с помощью иммунофлуоресцент-
ной микроскопии, но при условии, что учитываемые зачатки
предварительно не только сконцентрированы, но и отделены от
почвенных частиц и коллоидов, затрудняющих выявление объектов
(автофлуоресценция и неспецифическая адсорбция меченых
антител). Необходимость последней процедуры особенно очевидна при
дифференциальном учете грибных спор. Кроме этого, необходимо
погасить собственную флуоресценцию мембранных фильтров и
подобрать приемы окрашивания, обеспечивающие уверенный
количественный учет отдельных групп микроорганизмов на основе
люминесцентной микроскопии в падающем свете.
В результате мы разработали следующую методику. В колбу
вносили определенную навеску почвы и доливали водой до 100 мл.
Для более полной десорбции микрорганизмов добавляли
поверхностно активное вещество Твин-80. После 2-минутной
ультразвуковой обработки на дезинтеграторе УЗДН-1 (22 кГц, 0,44 А) в
почвенную суспензию вносили определенную дозу коагулянта
почвенных частиц и коллоидов — смесь Са (ОН)2 и MgC03. После
2-минутного взбалтывания почвенную суспензию переносили в мерный
>>1Q
цилиндр емкостью 100 мл, затем из прозрачной надосадочной
фракции после 5-минутного отстаивания брали 0,5—1 мл жидкости
и фильтровали при слабом вакууме (для более равномерного
распределения микроорганизмов по поверхности мембранного фильтра
под него помещали подложку и три слоя фильтровальной бумаги
аналогичного диаметра) через отечественные ядерные мембранные
фильтры (0=0,23—0,41 мкм).
В качестве тушителя собственной люминесценции мебранных
фильтров использовали насыщенный спиртовой раствор судана
черного Б. Полнота учета разных микроорганизмов определяется
экспериментально и зависит от их обилия. Установлено, что
полнота учета внесенных в почву спор актиномицета (Streptomyces oli-
vocinereus) определяется массой почвенной навески,
концентрацией коагулянтов и временем отстаивания почвы. Наиболее
приемлемой в заданных условиях оказалась навеска почвы 1 г при
добавлении 0,35 г смеси Са(ОН)2 и MgC03 (2 :5). Оптимальное
время отстаивания, обеспечивающее относительно высокую
концентрацию спор при минимуме частиц, составляет 5 мин (табл. 9).
Таблица 9
Полнота учета спор актиномицетов в зависимости от времени
отстаивания почвы*
Время
отстаивания
почвы, мин
5
10
Количество
спор
в 1 г
почвы
3,7- Ю7
4,9- 10б
% от
внесенного
78
10
Время
отстаивания почвы,
мин
40
Количество
спор
в 1 г
почвы
5,3- 106
% от
внесенного
10
* Навеска смеси коагулянтов 0,7 г.
Во всех случаях добавление твина достоверно увеличивает в 1,5—
5 раз количество выявляемых спор. Полнота учета для указанных
условий достигает 70—80%, однако вариации факторов
(например, увеличение времени отстаивания до 10 мин или работа с
навеской почвы 10 г) могут снизить этот показатель (табл. 10).
Споры актиномицетов хорошо выявляются и надежно учитываются на
поверхности микрофильтров. Предлагаемый метод обладает двумя
основными преимуществами: почвенные частицы не мешают
выявлению спор, а процедура концентрирования обеспечивает учет
популяции в диапазоне низких (естественных) уровней обилия.
АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВЫЕ ВАРИАНТЫ
Суть метода состоит в получении антибиотикоустойчивого
варианта микроорганизма, который будет хорошо развиваться на
питательной среде с антибиотиком, в то же время развитие всех
220
Таблица 10
Полнота учета спор Streptomyces olivocinereus в вариантах опыта
■
Навеска
почвы, г
1
1
1
5
10
Количество смеси
коагулянтов
Са (ОН)2 —
MgC08(2:5). г
0,7
0,35
0,35
0,35
0,7
Время
отстаивания почвы,
мин
5
5
10
10
30
Количество
суспензии,
сконцентрированной на
фильтре, мл
Количество спор
в 1 г почвы
3,9-107
3,8-107
2,7-107
0,7-10'
1,4-106
% от
внесенного
78
76
54
14
2,8
Примечание. Приведены результаты учета спор, внесенных в
нестерильную почву. Количество спор, внесенных в 1 г почвы, составило 5,0-107. Опыты
нроводили с добавлением твина-80.
других микроорганизмов из почвы на данной среде будет
подавлено. Таким образом, получают элективную среду для выделения
определенного штамма микроорганизма из почвы. Этот метод в
отличие от иммунолюминесцентного дает возможность работать и
при относительно низких плотностях популяций. Приведем
описание метода на примере работы со стрептомицинустойчивыми
штаммами.
Для получения стрептомицинустойчивого штамма используют
метод так называемой постепенной адаптации к повышенным
дозам стрептомицина. Раствор стрептомицина на стерильной
дистиллированной воде добавляют к стерильной питательной среде
(температура среды 45—50°). Проводят посев тест-культуры обычным
поверхностным методом в чашки Петри. После вырастания
устойчивых колоний проводят пересев на среду с более высокой
концентрацией стрептомицина. Мутанты мицелиальных
микроорганизмов легче получать на жидких средах. Конечная концентрация
стрептомицина—1,39 мг (1000 ед.) на 1 мл среды. Поддерживать
культуры можно на среде без стрептомицина, периодически
проверяя ее стрептомицинустойчивость на среде, содержащей
стрептомицин. При посеве из почвы в среду, содержащую стрептомицин,
часто приходится добавочно вносить кристаллический фиолетовый
(1:100 000) для подавления грамположительных бактерий и
грибов или антибиотик актидион для подавления грибов (50 ед/мл).
Динамику популяции изучают во времени, как и в предыдущем
методе.
МЕТОД МЕМБРАННЫХ КАМЕР
Метод мембранных камер можно использовать для слежения
за развитием популяций бактерий и грибов в различных почвенно-
экологических условиях. В работе используют мембранные
фильтры марки «Синпор» (ЧССР) с размером пар не более 1 мкм.
Фильтры, вырезанные по размеру камер (3X3 см), стерилизуют
кипячением в дистиллированной воде в течение 10 мин. Затем
фильтр остужают и распределяют на нем несколько капель
суспензии спор 8—10-дневной культуры грибов. Суспензию приготовляют
смывом с косяка и затем фильтруют через несколько слоев
стерильной марли. Плотность суспензии 105—106 спор/мл. Фильтр с
нанесенной суспензией накрывают другим мембранным фильтром.
Полученную мембранную камеру закрепляют в диапозитивную
рамку и вертикально помещают в почву.
Длительность инкубации в почве определяется целями
исследования. Для оценки прохождения полных циклов развития
микроорганизмов камеры целесообразно выдерживать в почве не
менее 1 мес с периодическим просмотром и учетом развития грибов.
По нашим данным, такой учет (для оценки прорастания спор,
развития мицелия, спорообразования) целесобразно проводить на 3-,
5-, 7-, 10-, 15-, 20-, 30-е сутки. После извлечения из почвы камеру
раскрывают и окрашивают как мембранный фильтр 1%-ным
раствором дианила голубого в 5%-ном феноле (в соотношении 1:5).
После высушивания при комнатной температуре фильтр с тест-
объектом просветляют иммерсионным маслом и микроскопируют.
Учитывают время и уровень прорастания спор, интенсивность
развития мицелия, характер и интенсивность спорообразования в
трехкратной повторности фильтров для каждого срока анализа.
Выбор тест-объектов определяется задачами исследования. Для
оценки почвенно-экологических факторов целесообразно
использовать пары видов, известных как чувствительные и устойчивые к
этим факторам. Если такие виды неизвестны, то можно
использовать набор представителей разных эколого-трофических групп
грибов: из класса Zygomycetes почвенных представителей родов Ми-
cor, Mortierella, Zygorhynchus; из класса Deuteromycetes
представителей родов Penicillium, Aspergillus, Trichdjierma, а также виды
темноокрашенных почвенных грибов сем. Dematiaceae.
Определяют следующие параметры: 1 — уровень прорастания
(%), для чего просчитывают по 100 спор на каждом фильтре;
2 — рост мицелия (мкм/сут или суммарно за период наблюдения)
определяют по длине проростков (50 на одном фильтре) при
помощи окуляр-микрометра или по суммарной длине мицелия в
10 полях зрения на каждом фильтре; 3 — спорообразование, для
чего отмечают время его начала и интенсивность спороношения
(число вновь образовавшихся спор в расчете на одну проросшую
спору).
РАЗДЕЛ 5
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МИКРОБНЫХ СУКЦЕССИИ
В ПОЧВЕ
(структура комплекса почвенных микроорганизмов)
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСА ПОЧВЕННЫХ ГРИБОВ
И АКТИНОМИЦЕТОВ ПО РАДИАЛЬНОЙ СКОРОСТИ РОСТА
Доминирование биомассы микромицетов в почвенном микробо-
ценозе свидетельствует о функциональной значимости грибов, что
выдвигает на первый план изучение структуры комплекса
микромицетов и присущих ему механизмов регуляции. Структурное
изучение на современном этапе может быть эффективным при
выполнении ряда условий, включая проведение динамических сукцесси-
онных наблюдений на основе разных подходов, определения
общего числа видов в местообитании, их взаимосопряженности и нише-
вого пространства.
Известны по крайней мере два способа описания структуры
комплекса почвенных грибов и актиномицетов. Традиционное
решение предполагает составление списка видов и определение
степени их доминирования. Оно дает важную и вместе с тем
детальную информацию, но связано с большим объемом работы и может
быть реализовано только специалистом. Второй способ базируется
на постулате кинетической разнородности объектов, а
разграничение проводится по значению радиальной скорости роста колоний.
Это еще один количественный показатель, который служит
индикатором изменений, происходящих в комплексе почвенных
микроорганизмов.
Видовой и кинетический способы описания структуры
комплекса почвенных микромицетов тождественны, что позволяет
выявлять структурные изменения по радиальной скорости роста
колоний без определения видов. При более детальной работе видовое
описание оказывается незаменимым, поскольку разные виды могут
иметь близкие радиальные скорости роста. Радиальная скорость
роста вычисляется как увеличение радиуса колонии на плотной
питательной среде за определенный промежуток времени. При
определении радиальной скорости роста актиномицетов и грибов
перед посевом применяют обработку почвенных образцов на
низкочастотном диспергаторе УЗДН-1 (22 кГц; 0,4 А; 2 мин). Посев
производят на крахмало-аммиачную среду или Чапека с сахарозой
(2%) для актиномицетов и на среду Чапека с сахарозой (2%)
для грибов. Для подавления роста бактерий в среду для грибов
добавляют молочную кислоту в количестве 0,5%. С целью
подавления роста грибов при изучении актиномицетов в среду
добавляют антибиотик актидион (50 ед/мл). Разведение подбирают
таким образом, чтобы на чашке Петри вырастало не более 3—5
колоний для грибов и 5—10 колоний актиномицетов. После 36 ч ин-
кубации в термостате при 28° измеряют диаметр выросших на чаш-
ках колоний при помощи микроскопа МБС-9. Эту операцию
повторяют трижды через определенный промежуток времени (12-—
24 ч).
За диаметр отдельной колонии в данный момент времени
принимают среднее арифметическое измерение, выполненное в двух
взаимно перпендикулярных направлениях. Вычисление радиальной
скорости проводят по формуле
*,=-г
"'О
где К — радиальная скорость роста; г0 —радиус колоний в
начальный момент времени to; r — радиус колоний в момент
времени t. Значение Кг определяется для каждой колонии, затем
вычисляют среднюю величину КГс? для всех колоний, выросших п-
посеве.
Более детальное представление о перестройках структуры ко\.
лекса почвенных грибов и актиномицетов дает анализ
распределения по классам с различной радиальной скоростью роста. Для
изучения распределения актиномицетов и грибов по скоростям
роста выбирают классы значений радиальной скорости роста,
которые захватывают весь диапазон встретившихся в опыте К
индивидуальных колоний, причем для верхней границы отдельного
класса справедливо
^верх = Л + Я(П-1),
где А — Кг нижней границы класса; В — ширина класса; п —
номер класса. Следовательно, класс объединяет в себе актиномице-
ты (грибы) с близкими значениями радиальных скоростей роста.
Оценку разнообразия сообщества проводят с помощью индекса
разнообразия Шеннона по формуле
Д 1*2 '
где D — индекс разнообразия Шеннона; рп = п ; Nn — доля
актиномицетов (грибов) п-то класса в % (расчетные D приведены
в табл. II). '-AUS
С помощью методов математической статистики вычислено, что
выборка для грибов из 30—40 колоний, а для актиномицетов из
70—100 колоний достаточно точно характеризует распределение
Кг по классам; ее увеличение существенно не изменяет /СГсР и
индекс разнообразия Шеннона.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСОВ ПОЧВЕННЫХ
МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ
Изучение комплекса микромицетов почвы и его
функциональной роли необходимо при всяком детальном биогеоценологическом
224
Таблица 11
Индекс структурного разнообразия для комплекса почвенных
грибов и актиномицетов
%
0,1
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
.10,0
■Ч*,0
2,0
:?8,0
14,0
15,0
16,0
17,0
18,0
19,0
D
0,0099
0,066
о,п
0,15
0,19
0,12
0,24
0,27
0,29
0,31
0,33
0,35
0,37
0,38
0,40
0,41
0,42
0,44
0,45
0,46
%
21,0
22,0
23,0—24,0
25,0
26,0—28,0
29,0—31,0
32,0—42,0
43,0—46,0
47,0—48,0
49,0—50,0
51,0—53,0
54,0
55,0—56,0
57,0—58,0
59,0
60,0—61,0
62,0
63,0
64,0
65,0—66,0
D
0,47
0,48
0,49
0,50
0,51
0,52
0,53
0,52
0,51
0,50
0,49
0,48
0,47
0,46
0,45
0,44
0,43
0,42
0,41
0,40
%
67,0
68,0
69,0
70,0
71,0
72,0
73,0
74,0
75,0
76,0
77,0
78,0
79,0
80,0
81,0
82,0
83,0
84,0
85,0
86,0
D
0,39
0,38
0,37
0,36
0,35
0,34
0,33
0,32
0,31
0,30
0,29
0,28
0,27
0,26
0,25
0,24
0,22
0,21
0,20
0,19
%
87,0
88,0
89,0
90,0
91,0
92,0
93,0
94,0
95,0
96,0
97,0
98,0
99,0
100,0
D
0,18
0,16
0,15
0,14
0,12
0,11
0,09
0,08
0,07
0,06
0,04
0,03
0,01
0,000
исследовании. Почва каждого конкретного биогеоценоза
характеризуется широким набором видов микроскопических грибов, одни
из которых могут быть типичными для нее и представлять
определенную трофическую группировку, другие — редкими. Помимо
того, что типичный комплекс микроорганизмов и его изменения
являются важным показателем экологической обстановки в почве, его
детальное исследование позволит более направленно вести поиск
хозяйственно-полезных штаммов микробов конкретной
систематической и функциональной группы.
Обычно, изучая состав грибов разных типов почв и
биогеоценозов, исследователи стремятся выделить максимально возможное
количество видов. На основе такой работы составляются большие
списки видов, однако их анализ не позволяет во многих случаях
установить различия между природными объектами (например,
различными агроценозами и т. д.). В связи с этим в почвенной
микробиологии более серьезное внимание стало уделяться
определению количественного соотношения видов и групп
микроорганизмов, выявлению на этом основании типичных и редких видов, видов-
индикаторов.
Под структурой комплекса почвенных микроскопических
грибов мы понимаем соотношение в представленности отдельных
групп (видов) организмов с учетом пространственно-временных
факторов и их функциональной роли в почве. При изучении
структуры комплекса почвенных грибов необходимо изучить видовой
3 Зак. 42
состав организмов определенной трофической группы и по какому-
либо критерию (встречаемости, обилию) значимость вида. При
использовании различных питательных сред и методических приемов
можно выявить большее или меньшее число видов микромицетов.
В настоящее время выделение микроскопических грибов^ из
природных объектов с целью последующей характеристики структуры
комплекса микромицетов проводят на ограниченном числе сред
(как правило, на среде Чапека). Это объясняется тем, что на
легкодоступном органическом источнике углерода (сахарозе)
способно развиваться подавляющее количество почвенных
микромицетов, а также удобством их дифференциации и большой
трудоемкостью работы по исследованию различных трофических групп
микромицетов-деструкторов на многих средах.
Использование среды Чапека позволяет наиболее детально
выявить структуру комплекса сапротрофных сахаролитических
грибов. При этом следует подчеркнуть, что в комплекс грибов,
выявляемый на среде Чапека, входят и микромицеты, обладающие
гидролитическими ферментами (целлюлазами, амилазами и т. д.).
При этом, как показали исследования, устанавливаемый комплекс
типичных видов на данной среде служит надёжной
характеристикой почв и биогеоценозов. Выбор сред с другими источниками
питания (целлюлозой, лигнином и т. д.) и использование
изложенных ниже количественных критериев позволяют выявить структуру
комплекса микромицетов других трофических группировок.
Для определения значимости вида (оценки его типичности и
положения в структуре доминирования) применяют критерий
частоты встречаемости микромицета, под которым понимают
отношение числа почвенных образцов, где вид обнаружен, к общему
числу исследованных образцов:
пространственная частота _ число образцов, где вид обнаружен • 100%
встречаемости (%) — общее число образцов
Для установления достоверности различий по встречаемости
вида в изучаемых биогеоценозах применяют статистическую
обработку методом сравнения долей (Дмитриев, 1972). Часто для
оценки представленности почвенных микрорганизмов используют
показатель обилия (плотности) вида. Определяют обилие вида как
процентное содержание колоний одного вида по отношению к общему
числу колоний, вырастающих при высеве почвенной суспензии на
питательной среде. Между этими показателями существует
достаточно высокая корреляция, вместе с тем для оценки типичности
вида в данной почве критерий обилия вида менее пригоден, так
как в сравнении с показателем частота встречаемости имеет
больший коэффициент вариации. Для оценки достоверности различий
по обилию видов используют метод сравнения средних
арифметических двух независимых совокупностей, имеющих разные
дисперсии (Дмитриев, 1972).
Однократное определение частоты встречаемости вида в
изучаемом биогеоценозе (обозначаемой как пространственная часто-
226
та встречаемости) не дает представления о постоянстве вида во
времени (вегетационного сезона, года). Для выяснения этого
вопроса введен показатель временной встречаемости вида,
устанавливаемый как отношение числа моментов времени, когда вид
обнаружен, к общему числу моментов отбора образцов:
временная частота
встречаемости, %
число сроков анализа, когда вид обнаружен • 100%
общее число сроков анализа
Таблица 12
Характеристика структуры комплекса
почвенных микромицетов
Значимость
вида
Типичный
доминирующий
Типичный частный
Типичный редкий
Случайный
Частота встречаемости
вида (%)
пространственная
60
30
30
60
временная
60
30
30
30
При совместном
использовании этих показателей
возможно следующим образом
дифференцировать комплекс
почвенных микромицетов:
типичные доминирующие виды —
пространственная и временная
частоты iB-стречаемости выше
60%; типичные частые —
пространственная и временная
частоты более 30% типичные
редкие — пространственная
встречаемость ниже 30% и.
временная выше 30% и
случайные виды — оба
показателя ниже 30% (Мирчинк, 1988) (табл. 12).
В то время как общий набор видов, выделяемый по описанной
выше методике, составляет обычно не менее 60—80 видов и может
быть увеличен за счет редких и случайных организмов,
специфический комплекс типичных видов, по которому можно
характеризовать растительную ассоциацию или тип почвы, содержит порядка
20 видов. Для оценки степени различий и близости комплексов
грибов изучаемых биогеоценозов можно использовать
коэффициенты общности Жаккара и сходства Съеренсена—Чекановского
(выражающие различные отношения числа совпадающих признаков
описаний к общему их числу) и меры расстояния (определяющие
различия между сравниваемыми объектами в многомерном
пространстве признаков).
Расчет наиболее часто применяемого коэффициента сходства
Съеренсена—Чекановского проводят с учетом частоты
встречаемости видов:
S =■
А+В
где А — сумма частот встречаемости микромицетов 1-го объекта
(почва и т. д.); б —сумма частот встречаемости 2-го объекта;
Cmin —сумма минимальных частот встречаемости общих для 1-го
и 2-го объектов видов микромицетов.
Специфический комплекс микромицетов, его структуру можно
охарактеризовать на основе индексов разнообразия и выровнен-
ности, известных из общей экологии и представляющих
математические выражения зависимости между числом видов и их
значимостью. Ввиду большей достоверности критерия частоты
встречаемости вида для расчетов данных индексов используют этот
показатель, а не величины обилия вида.
Для оценки видового разнообразия комплексов почвенных
грибов могут быть использованы различные индексы, из них наиболее
широко применяют индекс Шеннона:
H=—p{i)\og2p(i),
где p(i) —вероятность значимости для каждого вида. Для расчета
сначала проводят распределение видов комплекса по
определенным рангам их встречаемости (от 1 до 10, от 11 до 20 и т. д.),
а затем определяют p(i)—вероятность попадания встречаемости
вида в конкретный ранг значений.
Для оценки степени доминирования и выровненности видов в
комплексе используют соответственно индекс Симпсона:
c=tii/N9
где щ — значимость каждого вида; N — сумма оценок значимости;
и индекс Пиелу:
log5
где Н — индекс Шеннона; 5 — число видов. Использование
приведенных показателей позволяет получить дополнительную
информацию о степени зрелости и стабильности комплексов грибов
изучаемого биогеоценоза.
При характеристике и сравнительном исследовании
комплексов грибов возможно использовать кривые доминирования —
разнообразия. Для этого по оси ординат откладываются меры
значимости видов (например, частоты встречаемости) и по оси
абсцисс — ранжированную последовательность видов от наиболее
к наименее представленному. В стрессовых ситуациях независимо
от того, вызваны ли они естественными причинами или
антропогенным воздействием, кривая становится более крутой. Метод
рангового распределения дает возможность более тонкой оценки
перестройки структуры комплексов организмов.
РАЗДЕЛ 6
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ АЗОТФИКСАЦИИ В ПОЧВЕ
Фиксация молекулярного азота — одна из главных функций
микроорганизмов в биосфере Земли. Благодаря ей был создан и
ныне поддерживается азотный статус всех наземных и водных
экосистем. Несмотря на успехи в производстве минеральных
азотных удобрений, свою потребность в азоте человечество более чем
на 2/з покрывает за счет его биологических источников.
Определение интенсивности азотфиксации в конкретных
местообитаниях азотфиксирующих микроорганизмов (диазотрофов),
необходимое для выяснения размеров поступления «биологического»
азота в почвы разных типов, — важная задача почвенной
микробиологии. Активность азотфиксации является одним из
интегральных показателей биологической активности почв и поэтому
широко используется для ранней диагностики загрязненности почв
тяжелыми металлами, ядохимикатами, ксенобиотиками, применяется
при санитарно-гигиеническом нормировании токсических веществ
в почве. Этот показатель может быть информативен при оценке
пространственной и временной неоднородности (пестроты) почв,
при выяснении реакции бактериального населения почв на
внесение минеральных и органических удобрений, на различные
способы обработки пашни и пр.
Способностью к азотфиксации обладают только бактерии. Мик-
роорганизмы-эукариоты (грибы, дрожжи, водоросли), а также
растения и животные фиксировать молекулярный азот не могут.
Тем не менее они своей деятельностью создают благоприятные
условия для процесса азотфиксации: снабжают бактерии
легкодоступными, источниками питания, понижают концентрацию 02
вокруг них, быстро утилизируют связанный ими азот. Поэтому,
как правило, азотфиксация протекает в системах прокариотных
и эукариотных организмов, которые и являются основными
объектами исследования при изучении азотфиксации в почве. Принято
различать актуальную (полевую) и потенциальную активность
азотфиксации в почве.
Актуальная активность измеряется при конкретных
сочетаниях экологических факторов для изучаемой системы и
характеризует реальную интенсивность процесса в определенный момент
времени.
Потенциальная активность измеряется при оптимуме
влажности и температуры и при избытке источника питания,
вследствие чего является показателем максимально возможного для
данной системы уровня азотфиксации.
Ацетиленовый метод
Нитрогеназа — азотфиксирующий ферментный комплекс диазо-
трофных бактерий — способна восстанавливать не только
молекулярный азот до аммиака, но и ряд других соединений, имеющих в
молекуле тройную связь, в частности ацетилен. Катализируемая
нитрогеназой реакция восстановления молекулярного азота
описывается следующим уравнением:
N2 + 6H+ + 6e+2NH3. (A)
Наиболее важным преимуществом использования ацетилена в
качестве субстрата для нитрогеназы является то, что
единственным! конечным продуктом реакции является этилен:
С2Н2 + 2Н+ + 2ё-^С2Н4. (Б)
Константа Михаэлиса для реакции восстановления ацетилена
примерно в 10 раз ниже, чем для редукции N2, а растворимость
С2Н2 почти в 60 раз выше, чем азота (при 20° и 1 атм в 1 л воды
растворяется около 1000 мл С2Н2 и только 15 мл N2). Вследствие
этого при наличии в газовой фазе уже 5% ацетилена
восстановление молекулярного азота полностью тормозится и протекает
только образование этилена.
Как следует из уравнений реакций А и Б, фиксации 1
молекулы азота соответствует образование 3 молекул этилена и,
следовательно, коэффициент пересчета от С2Н2-редукции к ^-фиксации
равен 3. Этилен анализируется на газовом хроматографе; при этом
чувствительность обнаружения нитрогеназы составляет 10~12 М,
что более чем в 106 выше по сравнению с методом Кьельдаля и в
103 выше изотопного (15N) метода.
ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ АЦЕТИЛЕНОВОГО МЕТОДА
Инкубация с ацетиленом предполагает в качестве
обязательного условия быстрое и равномерное перемешивание газов в
исследуемой системе. Последней может быть образец почвы
нарушенного или естественного (монолит) сложения, участок почвы
известной площади, вегетационный сосуд с растениями и пр.
Благодаря хорошей растворимости ацетилена в воде это условие
хорошо выполняется для водных и песчаных культур растений, для
почв легкого механического состава. Более сложно протекает
газообмен в почвах тяжелого Механического состава и в
переувлажненных почвах, что приводит к недооценке реальной интенсивности
азотфиксации. Одним из способов усиления газообмена является
принудительная подача ацетилена в толщу почвы.
Длительность инкубации с ацетиленом оказывает
значительное влияние на результаты определения азотфиксации. Так,
при длительной (более 2 ч) инкубации наблюдаются значительные
отклонения коэффициента пересчета от теоретического.
Произвольное увеличение времени инкубации в атмосфере ацетилена — наи-
более распространенная ошибка при использовании ацетиленового
метода. Чаще всего прибегают к этому в попытке повысить
чувствительность обнаружения этилена, особенно при низкой
интенсивности азотфиксации. Нередко образцы инкубируют в течение 12—
24 ч и более. Другой причиной увеличения времени инкубации
является желание проводить измерения этиленогенеза в области
линейного возрастания ацетиленредукции, наблюдающейся после
своеобразной лаг-фазы длительностью 6—24 ч, в течение которой
происходит «перестройка» популяций азотфиксирующих бактерий,
формируется новое их сообщество, не характерное для исходного
образца.
Длительная инкубация с ацетиленом оказывает и ряд других
воздействий на азотфиксирующую систему. Это проявляется в
форме вторичной реакции растений и микроорганизмов на изменение
температуры и повышение концентрации С02 в замкнутом объеме
инкубационной камеры (парниковый эффект). Наиболее значимо
оно при изучении азотфиксации в системе почва—растение, в
которой при длительной инкубации создаются условия,
способствующие усилению микробной активности. Стимуляция их происходит
как из-за патологической реакции растений и микроорганизмов на
присутствие ацетилена и этилена, так и в результате активизации
фотосинтеза.
Следовательно, первым общим правилом при использовании
ацетиленового метода является сведение к минимуму времени
инкубации азотфиксирующих систем в атмосфере ацетилена: в
зависимости от конкретных задач исследования время инкубации
может составлять от 15—30 мин до 1—1,5 ч и не должно превышать
2 ч. Второе условие — контроль за неспецифическим образованием
этилена. Этилен образуется многими почвенными грибами и
бактериями, выделяется корнями растений, постоянно присутствует в
техническом ацетилене. Он нередко обнаруживается в воздухе
лабораторных помещений, где источниками его является пламя
газовых горелок и спиртовок, а также разрушающаяся на свету или
при нагревании резина и полиэтилен.
В почве интенсивность неспецифического этиленогенеза
зависит от ее свойств: почвы, богатые органическим веществом,
выделяют этилен в наибольших количествах. Повышенному
образованию этилена способствует избыточное увлажнение. Напротив,
азотные удобрения, соединения железа и марганца тормозят этилено-
образование в почве.
Помимо выделения этилена в почве постоянно протекает и его
поглощение — путем адсорбции и главным образом за счет
окисления микроорганизмами, многие из которых способны
использовать этилен в качестве единственного источника энергии или в
процессе соокисления. Однако при наличии ацетилена в газовой
фазе почв деятельность таких микроорганизмов резко тормозится
л окисление этилена полностью прекращается уже при
содержании С2Н2 в 0,0001 атм. Следовательно, окислением С2Н4 в почве
при использовании ацетиленового метода можно пренебречь, по-
скольку Км для С2Н2-редукции у азотфиксирующих бактерий
колеблется в пределах от 0,1 до 0,75 атм, что заведомо превышает
ингибирующую концентрацию.
Таким образом, вторым общим правилом получения
достоверной информации при применении ацетиленового метода является
точная оценка размеров неспецифического этиленогенеза и
величины адсорбции его в почве. Последнее особенно необходимо
учитывать при исследовании сильногумусированных почв и почв с
тяжелым механическим составом.
Среди других причин, влияющих на точность результатов при
применении ацетиленового метода, выделяются следующие.
1. Этилен, являясь мощным гормоном растений, может
существенно менять их метаболизм, что в свою очередь будет влиять
на активность азотфиксации у симбиотических и ассоциативных
микроорганизмов.
2. Отсутствие механизма «обратной связи» при использовании
ацетилена в качестве субстрата для нитрогеназы может быть
причиной завышения реальной интенсивности азотфиксации.
3. Постоянная высокая насыщенность почв молекулярным
азотом предопределяет отсутствие торможения азотфиксации из-за
дефицита субстрата для нитрогеназы. В то же время
затрудненное проникновение ацетилена в микрозоны почвы может стать
причиной существенной недооценки реальной интенсивности
азотфиксации.
Газохроматографический анализ может
проводиться на хроматографах любой конструкции, снабженных пламенно-
ионизационным детектором. В качестве газа-носителя применяют
азот марки «особо чистый» (ТУ 6-21-27-77) или аргон той же
марки (ГОСТ 10157-79). Для питания пламенно-ионизационного
детектора необходимы Н2 и воздух, тщательно очищенные от пыли.
Водород можно получать из генераторов водорода, например
типа СГС-2.
Хроматографическая колонка прибора должна обеспечивать
четкое разделение и «линейность» пиков следующих газов: СН4>
СзН8, С2Н2 и С2Н4. Метан нередко присутствует в почвенном
воздухе, а пропан используется в качестве внутреннего стандарта.
При анализе методом газоадсорбционной хроматографии для
наполнения колонок используют силикагель, сферосил, молекулярные
сита. При газожидкостной хроматографии твердыми носителями
могут быть силикагель, кизельгур, бентонит, а в качестве
стационарной фазы—высококипящие эфиры.
Перед началом работы прибор эталонируют чистым этиленом
в различных разведениях и пропаном в тех же разведениях, а
затем их смесью в определенных пропорциях. Хронометрируют
процесс удержания каждого газа, измеряют высоту (более точно —
площадь) хроматографических пиков и рассчитывают «цену
деления» прибора. Одновременно фиксируют рабочие параметры
хроматографа— температуру термостата и камеры впрыска,
давление и скорость подачи газа-носителя, водорода и воздуха — все они.
должны оставаться постоянными при повторных включениях
прибора.
Объем вводимой в прибор пробы газа обычно составляет 0,5—
1,0 мл. Для ее введения чаще всего используют медицинские
шприцы на 0,5—1,0 мл (туберкулиновые или инсулиновые) с
силиконовыми уплотнительными кольцами на поршне. Специально для га-
зохроматографического анализа выпускают микрошприцы типа
ММ и др. Шприцы других типов менее пригодны, так как не
обеспечивают необходимой герметичности в момент введения пробы в
ток газа-носителя, находящегося под значительным (3—5 атм)
давлением. Для обеспечения полного введения пробы в камеру
впрыска необходимо следить за состоянием эластичной мембраны,
через которую вводится проба.
Определение количества этилена и пропана в пробе проводят
путем измерения высоты их пиков на ленте самописца или же по
показателям интегратора, если им оснащен газовый хроматограф.
В последнем случае достигается большая точность, поскольку
интегратор определяет площадь, очерченную кривой каждого пика.
Однако интегратор дает большие ошибки при измерении пиков
малой высоты и при максимальной чувствительности прибора.
Обычно удается избежать заметных ошибок при измерении
высоты пиков путем подбора таких режимов работы, когда пики
«вырождаются» в прямые линии.
Окончательные расчеты проводят с учетом чувствительности
прибора к этилену и пропану, объема введенной пробы, объема
инкубационной камеры (если она постоянна) и коэффициента
пересчета от этилена к азоту. Весьма ответственная фаза анализа
состоит в правильной экстраполяции во времени и в пространстве
полученных данных, поскольку возможно многократное увеличение
ошибок, допущенных в ходе анализа. Нередко расчет
продуктивности азотфиксации проводят на основе нерепрезентативной
выборки, полученной без учета временной динамики процесса и его
пространственной неоднородности.
Реактивы. Ацетилен технический в баллонах; этилен и
пропан хроматографически чистые для эталонирования прибора;
карбид кальция СаС2.
Оборудование. Газовый хроматограф с
пламенно-ионизационным детектором; аргон, водород в баллонах или генератор
водорода типа СГС-2; сжатый воздух из компрессора с ресивером
или из баллона; шприцы медицинские туберкулиновые или
инсулиновые на 0,5—1,0 мл, а также объемом 15—20 мл; флаконы
пенициллиновые с пробками и зажимами к ним. Разовые колпачки
из алюминия и закаточная машинка; приборы для полевого
определения азотфиксации (описание дано ниже).
Определение потенциальной активности азотфиксации
Ход анализа. Потенциальную активность азотфиксации
определяют в свежеотобранных или воздушно-сухих образцах почв.
233
Для этого 5 г освобожденной от корешков и просеянной через сито
с диаметром ячеек 1 мм почвы помещают в пенициллиновый
флакон, вносят 2% глюкозы (от массы абсолютно сухой почвы) и
увлажняют стерильной водопроводной водой до влажности
примерно 80% от полной влагоемкости.
Почву тщательно перемешивают до получения однородной по
влажности массы, закрывают флакон ватной пробкой и
инкубируют в течение суток при 28°. Из каждого почвенного образца
отбирают не менее трех навесок для определения потенциальной
активности азотфиксации. Через сутки инкубации в термостате
флакон закрывают резиновой пробкой и вводят внутрь шприцем
приблизительно 0,5 мл ацетилена, после чего вновь помещают в
термостат на 1 ч. По истечении этого срока шприцем отбирают
пробу газовой смеси из флакона объемом точно 1 мл и вводят ее
в газовый хроматограф. Также измеряют содержание этилена в
двух других флаконах.
Кроме того, в дополнительной навеске проводят контрольное
определение неспецифического выделения этилена, для чего
флакон с почвой инкубируют без введения ацетилена. Определяют
также содержание этилена в ацетилене. Величину
неспецифического образования этилена и содержание его в ацетилене учитывают
при окончательных расчетах. Среднее значение активности азот-
фиксации для трех параллельных проб и характеризует
потенциальную активность азотфиксации в изучаемой почве. Ее
выражают в миллиграммах или микрограммах фиксированного азота
на килограмм почвы за час (мг/кг-'/ч-1).
Потенциальную активность азотфиксации в филлосфере
определяют, помещая срезанные листья или стебли в герметичные
флаконы объемом 15—20 мл, содержащие по 3 мл среды Эшби со
смешанным набором углеводов (глюкозы, мальтозы, маннита,
яблочной кислоты), примерно соответствующим составу экскретов
из листьев. Инкубируют 2 ч при 28°, после чего во флаконы вводят
0,5—1,0 мл ацетилена и инкубируют еще 1 ч. Как и для
образцов почвы, определение ведут на трех параллельно взятых
образцах. Учитывают также содержание этилена в ацетилене и
неспецифический этиленогенез.
Окончательные расчеты ведут для трех образцов.
Потенциальную активность азотфиксации в филлосфере выражают в
мг/дм~2/ч~1. Поэтому для одной пробы рассчитывают среднюю
величину поверхности листьев или стеблей при помощи планиметра
или наложением на миллиметровую бумагу. Расчет активности
азотфиксации на массу образца менее точен, поскольку не
учитывает характер строения листьев и стеблей разных видов растений.
Указанный метод пригоден и для определения потенциальной
активности азотфиксации в ризоплане растений. Образцами при
этом служат кусочки тщательно отмытых корней, которые
инкубируют 2 ч в среде Эшби со смешанным набором углеводов при
28°, после чего вводят ацетилен на 1 ч. Результаты выражают в
мг фиксированного азота на единицу массы корней за час.
Изотопный метод
Азот помимо наиболее распространенного в природе изотопа
14N имеет еще 5 изотопов, из которых при исследовании азотфик-
сации используются два — радиоактивный 13N и стабильный 15N.
13N — короткоживущий изотоп с периодом полураспада 10,8 мин,
что резко ограничивает его применение, поскольку время
использования после получения не превышает 1,5 ч. Поэтому пока он
применяется только в исследованиях быстротекущих процессов
первых этапов азотфиксации.
Значительно шире область применения стабильного изотопа
15N. В виде меченого газа 15N2 он ранее применялся и для
изучения азотфиксации. Однако в настоящее время для количественной
оценки интенсивности азотфиксации используется метод
изотопного разбавления. Наиболее часто используется его
модификация, основанная на сравнении соотношений изотопов 14N и
15N в фиксирующей и нефиксирующей азот системах. В качестве
фиксирующей системы используют клетки бактерий-диазотрофов,
инокулированные ими растения или систему
почва—микроорганизмы—растения. Нефиксирующей азот системой при этом являются
убитые клетки бактерий, стерильно выращенные растения, просте-
рилизованная почва.
Принцип метода состоит в том, что в обе эти системы вносят
небольшое количество меченных 15N солей в виде нитратов или
аммония с высоким обогащением (30—90% в зависимости от
исходного содержания азота в системах). В процессе азотфиксации
в фиксирующей системе происходит «разбавление» изотопа 15N
атмосферным азотом, состоящим в основном из 14N. Интенсивность
азотфиксации вычисляют по формуле
хт [ л избыток атомной доли 13N в ФС (%) \ 1АПл/
Мфикс= 1 ; — __■_ .... AUU%,
\ избыток атомной доли 15N в НФС (%) /
где ФС — фиксирующая система, НФС — нефиксирующая система.
Другим вариантом этого метода является использование при
культивировании микроорганизмов и инкулированных ими растений
питательных смесей, содержащих в качестве единственного
источника азота меченные 15N минеральные соли, что позволяет
обойтись без нефиксирующей системы. Интенсивность азотфиксации
при этом рассчитывают по формуле
NT /t избыток атомной доли ФС (%) \ 1ППп/
Мфикс^ 1 : —— ши%.
\ избыток атомной доли в соли (%) /
Преимуществом этого метода является возможность оценки
доли «биологического» азота, поступившего из бактерий в
растения.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АЗОТФИКСАЦИИ ИЗОТОПНЫМ МЕТОДОМ
В СИСТЕМЕ «МИКРООРГАНИЗМЫ — РАСТЕНИЯ»
Для выращивания растений готовят кварцевый песок или
стеклянные бусы (диаметром 1—2 мм): отмывают 5%-ным раствором
НС1, затем многократно дистиллированной водой и прокаливают
1—2 ч при 400°. Семена растений стерилизуют с поверхности,
используя соли серебра, ртути или меди, а также гипохлорит
кальция, серную кислоту или абсолютный этанол. Подробная методика
для стерилизации семян тех или иных видов растений имеется а
руководствах по физиологии растений. Особо важно отмыть
семена от стерилизующего агента! Для гарантированной стерилизации
полезно использовать вакуумный испаритель, в котором и
проводится обработка семян.
Для приготовления питательных смесей используют реактивы
категории не ниже х.ч. Для полива растений и приготовления
смесей используют деминерализованную воду, которую обязательно
контролируют на отсутствие азота. Применяют питательные смеси
Кнопа, Гельригеля, Прянишникова, в которых азот представлен
нитратной или аммонийной формой. Во все смеси добавляют
стандартные смеси микроэлементов.
Растения культивируют при влажности примерно 60% и
температуре 18—21°. Опытные растения инокулируют азотфиксирую-
щими бактериями, выращенными на жидких безазотных средах*
отмытых от среды и ресуспендированных в фосфатном буфере.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ДЕНИТРИФИКАЦИИ В ПОЧВЕ
Денитрификация — микробиологический процесс, играющий
важную роль в азотном балансе почв. Существуют различные
приемы оценки денитрифицирующей активности почвы.
Широкоизвестным способом определения активности денитрификации в
почве является метод балансовых расчетов с определением
концентрации азота в почве перед началом инкубации почвы и после ее
окончания. При этом пользуются традиционными методами
определения азота в почве (метод Кьельдаля), что делает определение
очень трудоемким, непроизводительным и малопригодным для
массовых анализов. Способ определения денитрифицирующей
активности почвы путем измерения концентрации нитратов в почве с
помощью ионоселективных электродов является
производительным, но малочувствительным методом, что делает определение
активности денитрификации в почве неточным. Способ с
применением изотопа 14N требует наличия специальной техники для его
фракционирования. В практике микробиологических исследований
широкое применение получили газохроматографические методы
определения активности денитрификации по скорости эмиссии
газообразных продуктов денитрификации из почвы.
Самым распространенным приемом для оценки
денитрифицирующей активности почвенных микроорганизмов является метод*
236
основанный на использовании ацетилена в качестве ингибитора
редуктазы закиси азота, что позволяет судить об активности
процесса по накоплению закиси азота (N2O) в газовой фазе:
СгН2
NOr-+NOF-^NO-*N20 -> N2.
Этот метод позволяет определять активность денитрификации
у чистых культур микроорганизмов и в почве.
Реактивы. Закись азота в баллоне для эталонирования
прибора; глюкоза, нитрат калия.
Оборудование: газовый хроматограф с детектором по
теплопроводности или с электронным захватом; гелий в баллонах;
шприцы для газовой хроматографии; флаконы объемом 250 и
15 мл.
Определение потенциальной активности денитрификации
Ход анализа. Навеску почвы 5 г, предварительно
освобожденной от инородных включений, помещают во флакон объемом
15 мл. Образец почвы увлажняют 6 мл водного раствора глюкозы
и нитрата калия из расчета 2,5 мг глюкозы на 1 г почвы и 0,3 мг
азота нитрата калия на 1 г почвы. Флаконы закрывают
резиновыми пробками, фиксируют стальными зажимами и промывают
инертным газом (аргон или гелий; Р=1 атм) в течение 30 с.
В каждый флакон вводят 1,5 мл ацетилена, предварительно
отобрав из флакона адекватный объем газа. Флаконы встряхивают в
течение 30—60 с, переворачивают пробкой вниз и инкубируют при
28° в течение 24 ч. По истечении этого времени ведут анализ
газовой пробы на газовом хроматографе. Перед началом анализа
флаконы тщательно встряхивают.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРИФИЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВЫ
Активность протекания нитрификации является важным
показателем микробиологического состояния почвы. Высокая
нитрифицирующая активность характерна для окультуренных почв, в
которых достаточное содержание азота, хорошая аэрация, реакция
среды близка к нейтральной. Эти условия благоприятны для роста
большинства сельскохозяйственных растений, и поэтому
интенсивность нитрификации указывает на хорошую окультуренность
почвы. Вместе с тем активное протекание нитрификации в почвах
крайне нежелательно, так как ведет к потерям азота в форме
нитратов, вымывающихся из почвы в грунтовые воды,
газообразных соединений и к повышению содержания нитратов в
сельскохозяйственной продукции.
Один из подходов в изучении процесса нитрификации
заключается в компостировании почвы и измерении количества
образовавшихся нитратов. Существуют различные модификации метода
компостирования для определения нитрифицирующей способности
237
почвы. В изложенной методике проведено уточнение ряда
параметров (количество вносимого азота, длительность, инкубации)„
она позволяет определить вклад автотрофных и гетеротрофных
нитрифицирующих микроорганизмов в образование нитратов,
изучать газовую фазу над почвой. Метод можно использовав для
массовых анализов.
Ход анализа. Готовят смешанный образец почвы,
просеивают его через сито с диаметром отверстий 2 мм. Затем в пени-
циллиновые флаконы помещают навески почвы по 4—5 г,
увлажняют ее до 60—80% от полевой влагоемкости и инкубируют при
26—30° в течение 18—21 сут во влажной камере (влажность
контролируется периодическим взвешиванием флаконов). Для
определения потенциальной нитрифицирующей активности в часть
флаконов одновременно с увлажнением вносят сульфат аммония в
концентрации 100—200 мкг N—NH4/r почвы и в часть пептон в
концентрации 10—30 мг/г почвы и тщательно перемешивают. Для
оценки интенсивности автотрофной и гетеротрофной нитрификации
в образцы дополнительно вносят и также тщательно
перемешивают 4-амино, 1,2,4-триазол 20—200 мкг/г или 2-хлор-6-трихлорме-
тилпиридин (нитрапирин) 10—30 мкг/г почвы. Схема постановки
опыта: 1) почва; 2) почва + сульфат аммония; 3) почва + пептон;
4) почва + ингибитор нитрификации (аминотриазол или
нитрапирин); 5) почва + сульфат аммония + ингибитор нитрификации;
6) почва + пептон + ингибитор нитрификации. Количество нитратов
и аммония измеряют в исходной почве на 3—6-е, 9—12-е, 18—
21-е сут и ионселективными электродами, приготовив почвенную
суспензию или отцентрифугированную почвенную вытяжку.
Во флаконы приливают по 5 мл 0,5 н. раствора ацетата магния,
взбалтывают на качалке 30 мин, вытяжку центрифугируют при
2500 об/мин в течение 15 мин и в центрифугате определяют
содержание ионов нитрата и аммония и затем проводят
соответствующие подсчеты для почвы. При измерении только нитратов можно
использовать водную вытяжку. Каждый вариант опыта
закладывают не менее чем в 9 флаконах для проведения измерения в
3-кратной повторности в 3 срока. Интенсивность (скорость и
масштабы) гетеротрофной нитрификации устанавливают по
накоплению нитратов за определенное время в образцах с ингибитором
нитрификации, автотрофной — по разнице в количестве нитратов
ь почве без ингибиторов нитрификации и с ними. Для изучения
газовой фазы флаконы периодически закрывают резиновыми
пробками с зажимами для отбора газообразных продуктов, которые
анализируют на хроматографе (двуокись углерода, кислород,
окислы азота).
В агрохимических исследованиях степень нитрификации азота
аммонийного удобрения в почве рассчитывают по формуле
N - N07
Н = 10 0 %,
N — NHt 4- N — NO~
где N—N03 — содержание нитратного азота (мкг/г), за вычетом:
нитратного азота в неудобренном варианте почвы; N—NH4+ —
содержание аммонийного азота (мкг/г) в почве за вычетом
содержания аммонийного азота в неудобренном варианте. При оценке
нитрифицидной активности различных препаратов можно
применять показатель их эффективности действия
и= ну-~Ни ioo%,
Ну
где Ну — степень нитрификации а'зота на варианте с удобрением,
Ни — степень нитрификации азота на варианте с ингибитором
нитрификации.
МЕТОД ИНИЦИИРОВАННОГО МИКРОБНОГО СООБЩЕСТВА
Метод предназначен для проведения лабораторных
экспериментов с целью выяснения изменений в комплексе почвенных
микроорганизмов под действием различных антропогенных факторов.
Метод является модификацией приема «добавок», широко
используемого в экологии микроорганизмов. При изучении изменения
микробиологических свойств почвы под влиянием антропогенных
факторов исследователь сталкивается с рядом проблем, так как
модификационную изменчивость трудно отличить от
функциональной динамики микробиологических процессов в почве. В обоих
случаях происходит замена одних активно функционирующих
организмов другими. Однако если в первом случае это происходит
за счет внешнего антропогенного воздействия, то во втором —
имеет место естественная смена активности микроорганизмов под
действием внутренних причин. В связи с этим важно создать
условия, хотя бы временно исключающие функциональную
изменчивость микробной системы почвы и обеспечивающие активное
состояние какой-либо одной функциональной группы, динамика
которой могла бы однозначно демонстрировать наличие в конкретных
условиях антропогенной нагрузки собственно модификационную
изменчивость микробной системы почвы.
Для синхронной активизации микроорганизмов
гидролитической группы необходимо, во-первых, использовать образцы почвы,
не менее 2 недель выдержанные в воздушно-сухом состоянии, и,
во-вторых, инициировать развитие микроорганизмов внесением в
почву полимерного питательного субстрата. Уникальными
свойствами для инициации обладает крахмал. Он быстро утилизируется
многими почвенными микроорганизмами, при этом
микроорганизмы интенсивно образуют репродуктивные органы. Это позволяет с
помощью прямого микроскопирования проводить оценку обилия
отдельных популяций в инициированном сообществе и определять
их предварительную родовую принадлежность. Более точную
идентификацию осуществляют после выделения микроорганизмов в
чистые культуры. Важным моментом в постановке эксперимента
является соблюдение контролируемых и постоянных условий инку-
бирования почвы. Только соблюдение этого условия гарантирует
получение воспроизводимых результатов. Независимо от свойств
почвы 60% от полной ее влагоемкости, т. е. полевая влагоемкость,
обеспечивает максимальные темпы развития микрорганизмов в
инициированном сообществе. Эта влажность и принята р качестве
стандартной при постановке экспериментов методом
инициированного микробного сообщества. В качестве стандартной
предлагается использовать температуру 25° как минимальную температуру,
не требующую для ее поддержания в эксперименте холодильного
оборудования и близкую к оптимальной для мезофильных
микроорганизмов.
Почву освобождают от растительных остатков, измельчают и
просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм. После
увлажнения из почвенной пасты приготавливают почвенные пластинки
в чашках Петри, которые 2 сут предынкубируют при 25°.
Постоянную влажность поддерживают, помещая чашки во влажную
камеру. Для осуществления инициации развития микроорганизмов в
почве крахмал наносят тонким слоем (в несколько зерен) на
поверхность почвенной пластины в виде полоски шириной 1 см.
Удобно крахмал наносить напылением, и его количество не должно
превышать нескольких десятых долей процента от массы почвы.
Через 2—3 недели инкубации описывают видовой состав и
организацию амилолитического микробного сообщества почвы.
Представленность популяций в сообществе отражают в трех градациях
обилия: доминант — организм, составляющий более 20% от общей
биомассы сообщества; часто встречающийся организм — 5—20%;
редко встречающийся организм — менее 5%. Для исследования
сообщества используют прямое микроскопирование, а также
традиционные методы выделения и идентификации микроорганизмов.
Хорошо воспроизводимые результаты обеспечиваются постановкой
экспериментов в 10-кратной повторности.
Данный метод имеет следующие области применения.
Во-первых, он позволяет получить представление о сравнительной
токсичности различных поллютантов в условиях конкретной почвы.
Для этого сравнивают между собой минимальные концентрации
токсикантов, вызывающие смену доминантов в амилолитическом
микробном сообществе. Во-вторых, с его помощью можно
количественно оценить потенциальную буферность нескольких почв к
какому-либо конкретному загрязнителю. Для этого между собой
сравнивают почвы по величине действующей в них концентрации
изучаемого поллютанта. И наконец, этим методом можно проводить
микробиологическую индикацию наличия изменений в микробной
системе почвы в результате воздействия каким-либо
загрязнителем. Для этого изучают реакцию амилолитического микробного
сообщества изучаемой почвы на дополнительное внесение в нее
дозы загрязнителя, равной удвоенной концентрации, вызывающей
перераспределение доминантного состава в контрольной почве.
Внесение такой дозы в незагрязненную почву должно вызывать
изменение доминантного состава микробного сообщества. Почва
240
характеризуется превышающим допустимый уровень загрязнением,
если дополнительное внесение указанной дозы не вызывает
описанных изменений. Контролем могут быть образцы незагрязненной
почвы того же типа.
Главным отличительным признаком работы по данному
методу, обеспечивающим информативность исследования, является
возможность оперирования отдельными видами, активно
функционирующими в конкретной почве. Меньшая информативность
других аппликационных методов обусловливается разделением
почвенных микроорганизмов лишь на очень крупные таксоны, например
на грибы и бактерии. Маскирующее действие покоящихся в почве
микроорганизмов ограничивает применение методов
микробиологического посева для этих целей. В качестве недостатка данного
метода следует отметить, что само по себе изучение амилолитиче-
ских микроорганизмов не представляется важным для почвенной
микробиологии. Поэтому основное внимание направляют не на
изучение конкретных организмов, а на относительные различия в
ответной реакции активно функционирующего в почве микробного
сообщества на дополительное внесение загрязнителя. В связи с
этим следует признать вполне оправданным в некоторых случаях
вместо видовой идентификации пользоваться морфологическими
типами, которые скорее всего будут представлены разными
видами. Последнее намного упрощает исследование и расширяет
возможности использования данного метода.
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОБНОГО ТОКСИКОЗА ПОЧВЫ
С целью увеличения чувствительности метода определения
токсичности почвы и установления причин этого явления инициируют
развитие в почве гидролитических микроорганизмов путем
добавления в нее крахмала (см. метод инициированного микробного
сообщества) или копиотрофных микроорганизмов внесением в нее
глюкозы в концентрации 0,5 %. Испытание на токсичность,
обусловленную гидролитическими микроорганизмами, проводят через
4 недели, помещая семена тест-растений (кресс-салата)
непосредственно на развившееся на поверхности почвенной пластинки
инициированное микробное сообщество. В качестве контроля
используют почву без крахмала. Развитие копиотрофных
микроорганизмов в почве происходит в более короткие сроки, и поэтому
испытание на токсичность при обогащении ее глюкозой проводят уже
через неделю после инициации. В отдельных случаях
рекомендуется определять интенсивность выраженности микробного
токсикоза почвы путем установления взаимосвязи токсичности почвы
с дозой глюкозы, необходимой для проявления фитотоксичности
почвы.
Данный метод перспективно использовать с целью
обнаружения негативных последствий тех или иных антропогенных
воздействий на почву. Полученные данным методом результаты
позволяют объективно оценить происходящие в комплексе почвенных
9 Зак. 42
241
микроорганизмов изменения и тем самым различать
мелиорирующие воздействия от разрушающих. Например, внесение в почву
избыточных доз минеральных удобрений, пестицидов и ряда
других полютантов может сопровождаться увеличением микробного
токсикоза почвы, тогда как известкование кислых почв наоборот
его элиминирует.
МЕТОД ЦЕЛЛОФАНОВЫХ МЕМБРАН
Метод предназначен для сравнительного изучения целлюлозо-
литической активности различных почв и представляет собой
модификацию аппликационного метода. В основу метода положено
измерение механических свойств разрушающейся в почве
целлюлозы. Используют целлюлозу в форме целлофановой пленки.
Целлофан во влажном состоянии закрепляют резиновым кольцом на
горлышке пенициллинового флакона, у которого перед опытом
срезают 1 см верхней части. Исследуемый образец почвы
помещают в чашку Петри (30 г), увлажняют до полевой влагоемко-
сти и приготавляют почвенную пластинку с ровной поверхностью.
Затем почву прединкубируют при 25° в течение 2 сут.
Стеклянные цилиндры с целлофановой пленкой помещают на
поверхность почвы так, чтобы контакт целлофана с почвой был полным
и плотным, после чего их инкубируют при 25°.
Степень разрушения целлофана оценивают по изменению его
прочности на разрыв с помощью вакуумного насоса. Для этого
целлофановую пленку со стеклянным цилиндром закрепляют во
влажном состоянии в специальном патроне, снабженном кольцевой
вакуумной прокладкой, равной по диаметру горлышку
пенициллинового флакона, и соединенном с вакуумным насосом и
манометром. Измеряют динамику разрушения пленки и строят график
зависимости давления разрыва пленки от времени инкубирования ее
в почве. В качестве сравнительной характеристики конкретной
почвы используют величину Г5о, т. е. период времени, за который
происходит снижение прочности целлофановой пленки на 50%, что
определяют графически. Для эксперимента достаточно иметь
3 чашки с почвой, в каждую из которых помещают по 14
целлофановых мембран, а время инкубации полного разрушения
прочности целлофана обычно не превышает недели.
Данный метод имеет следующие области применения.
Во-первых, он позволяет получить представление об интенсивности
разрушения целлюлозы в различных почвах, и, во-вторых, с его
помощью можно количественно оценить действие различных
факторов на этот процесс. За действующее принимают воздействие,
увеличивающее в 2 раза величину Г5о. Метод целлофановых мембран
следует рекомендовать для широкого использования как метод,
позволяющий получать хорошо воспроизводимые результаты и
не требующий какого-либо специального оборудования. От других
аппликационных методов он выгодно отличается временем
выполнения и получением количественных характеристик, а от
биохимических методов его отличает простота исполнения. В качестве не-
242
достатка данного метода следует считать сложность в
разграничении действия свободных почвенных ферментов и целлюлозолитиче-
ских микроорганизмов в почве.
ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЧВЫ
Ферментативную активность почвы принято рассматривать как
совокупность процессов, катализируемых внеклеточными
(иммобилизованными на почвенных частицах и стабилизированными в
почвенном растворе) и внутриклеточными ферментами почвенной
биоты (Звягинцев, 1987). В почве накапливается определенный
«пул» ферментов, качественный и количественный состав
которого характерен для данного типа почв, однако интенсивность
ферментативных процессов зависит от конкретных условий: наличия
и концентрации субстрата, температуры, влажности, рН и др.
Ферментативная активность почв — один из показателей
потенциальной биологической активности почв, характеризующий
потенциальную способность системы сохранять гомеостаз (Звягинцев, 1987).
Оценивая биологическую активность почв, необходимо определять
активность нескольких ферментов, относящихся к различным
классам, и пользоваться оценочными шкалами (табл. 13, 14). Наиболее
хорошо изучены в почве ферменты классов оксидоредуктаз и гид-
ролаз, для них в основном и разработаны методы определения.
Таблица 13
Шкала для оценки степени обогащенности почв некоторыми ферментами*
(Звягинцев, 1978)
Степень
обогащенное™ почв
Степень
обогащен ности почв
Ката лаза,
02 см3/ г
за 1 мин
Каталаза,
02 см3/ г
за 1 мин
столбик
Дегидроге-
ьазы, мг ТФФ
на 10 г за 24 ч
Д егидр ore-
назы, мг ТФФ
на 10 г
за 24 ч
<2,5
2,5—7,5
7,5—25,0
25—75
<75
с плошадыо
Инвертаза,
мг глюкозы
на 1 г за 24 ч
Инвертаза,
мг глюкозы^
на 1 г за 24 ч
1250—3750
<3750
поверхности
Уреаза,
мг NH3 на
10 г за 24 ч
<з
3—10
10—30
Уреаза,
мг NH3 на
10 г за 24 ч
<7,5
7,5—25,0
25—75
75—250
<250
1 см2
Фосфатаза,
мг Р208 на
10 г за 1 ч
<0,5
0,5—1,5
1,5—5,0
5-15
>15
Фосфатаза,
мг Р205 на
10 г за 1 ч
<1,2
1,2—3,8
3,8—12,5
12,5-38,0
<38
Очень бедная
Бедная
Средняя обога-
щенность
Богатая
Очень богатая
* Расчет на
Очень бедная
Бедная
Средняя обога-
щенность
Богатая
Очень богатая
<25
25—75
75—250
250—750
<750
Очень белая
Бедная
Средняя обога-
щенность
Богатая
Очень богатая
<1
1—3
3—10
10-30
>30
<1
1-3
3—10
10—30
>30
<5
5—15
15—50
50—150
>150
Расчет на 1 г почвы.
Таблица 14
Шкала для оценки степени обогащенности почв ферментами*
(Звягинцев, 1978)
<125
125—375
375—1250
30—100
>100
Подготовка почвы к анализу. Для определения
ферментов почву высушивают на воздухе до воздушно-сухого состояния,
тщательно очищают от корней и просеивают через сито с
диаметром отверстий 0,25 мм. Для определения ферментов в свежих
образцах почву также необходимо очистить от корней, просеять и
сразу взять на анализ.
Описываемые методы определения ферментов даны в
модификации А. Ш. Галстяна и сотрудников кафедры биологии почв МГУ.
Оксидоредуктазы
Ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз,
катализируют окислительно-восстановительные реакции, играющие
ведущую роль в биохимических процессах в клетках живых
организмов, а также в почве. Окислительно-восстановительные реакции
являются основным звеном в процессе синтеза гумусовых веществ
в почве. Оксиредуктазы участвуют в образовании солонцов в
засоленных почвах (Галстян, 1974) и в целом ряде других
процессов в почве. Наиболее распространены в почвах такие
оксидоредуктазы, как каталаза, дегидрогеназы, пероксидазы, полифенолок-
сидазы и другие, активность которых является важным
показателем биологической активности почв, а также генезиса почв.
КАТ/ЛАЗА
(Н202 : Н2О2-ОКСИДОРЕДУКТАЗА КФ 1.11.1.6)
Одним из характерных показателей биологической активности
почвы является активность каталазы. Каталаза разлагает
ядовитую для клеток перекись водорода, образующуюся в процессе
дыхания живых организмов и в результате различных биохимических
реакций окисления органических веществ, на воду и
молекулярный кислород:
2Н202 Л?1^-+ 2Н202 + 02.
Каталазная активность характерна для всех живых
организмов, в том числе и микрорганизмов. Каталаза широко
распространена также в почвах. Активность каталазы определяют или
газометрическим методом, основанным на измерении скорости
разложения перекиси водорода при ее взаимодействии с почвой, по
объему выделившегося кислорода, или по количеству неразложенной
перекиси, которое учитывают путем перманганатометрического
титрования колориметрическим способом с образованием
окрашенных комплексов. Газометрический метод как быстрый, точный, не
требующий сложной аппаратуры, наиболее широко применяется в
практике.
Реактивы: 30-ный раствор Н202, СаСОз.
Ход анализа. Навеску просеянной почвы 1 г вносят в
толстостенную колбу или склянку емкостью 100 мл, добавляют 0,5 г
СаСОз. Затем осторожно на дно ставят с помощью пинцета ма-
244
Последняя
ленький стаканчик с 1,7 мл 10%-ного раствора перекиси водорода.
Навеску почвы смачивают 4 мл дистиллированной воды. Колбу
или склянку плотно закрывают каучуковой пробкой, имеющей
трубку, соединенной толстостенным каучуком через тройник,
снабженный зажимом или краном, с бюреткой (рис. 55). ti™"*"w*
сообщается с грушей. Бюретка и
груша заполнены водой. Уровень
воды в бюретке и груше
уравновешивают и последнюю
закрепляют на определенной высоте.
Затем закрывают кран, тем
самым устраняя сообщение
прибора с внешней средой. Нужно
следить, чтобы уровень воды в
бюретке оставался неподвижным,
что свидетельствует о
достижении температурного равновесия
между температурой прибора и
комнаты.
Начало опыта отмечают по
секундомеру в тот момент,
когда сосудик с перекисью
водорода опрокидывают и вслед за
этим встряхивают содержимое
колбы. Взбалтывание смеси
следует продолжать все время
опыта, не касаясь непосредственно
колбы руками. Выделяющийся
кислород вытесняет из бюретки
воду, уровень которой отмечают.
Контролем служит
стерилизованная сухим жаром (180°)
почва. Количество выделившегося
молекулярного кислорода
учитывают в течение 1 мин при
температуре 18—20°. Периодические
отсчеты через 0,5, 1 и 2 мин
выделившегося кислорода
позволяют вести наблюдения и за
кинетикой процесса. Активность каталазы выражают в мл кислорода,
выделившегося на 1 г почвы. Ошибка определения — до 5%.
Рис. 55. Прибор для определения
активности каталазы
ДЕГИДРОГЕНАЗЫ
(субстрат: НАД (Ф)-оксидоредуктазы КФ 1.1.1)
Дегидрогеназы — ферменты, участвующие в процессе дыхания,
они отщепляют водород от окисляемых субстратов. Одни
дегидрогеназы могут переносить водород непосредственно на молекуляр-
ный кислород, другие — только на какие-либо иные акцепторы,
например метиленовую синь.
Процессы дегидрирования могут протекать по следующей
схеме:
АН2 + В ШШ21^^ а + ВН2.
Дегидрогеназы распространены очень широко. Их действие
—показатель биологической активности почвы. Основным методом
обнаружения дегидрогеназ является восстановление индикаторов с
низким редокспотенциалом типа метиленовой сини за счет
дегидрирования соответствующих субстратов. В почве субстратами
дегидрирования могут быть неспецифические органические
соединения (углеводы, органические кислоты, аминокислоты, спирты,
жиры, фенолы и др.) и специфические (гумусовые вещества).
Для определения активности дегидрогеназ почвы в качестве
акцептора водорода применяют бесцветные соли тетразолия (2, 3,
5-трифенилтетразолий хлористый, ТТХ), которые
восстанавливаются в красные соединения формазанов (трифенилформазан,
ТФФ).
Реактивы: 0,1 М раствор глюкозы, 1%-ный раствор 2, 3,
5-трифенилтетразолия хлористого (ТТХ), СаСОз, этиловый спирт.
Ход анализа. Навеску воздушно-сухой почвы 1 г помещают
в пробирку, добавляют 10 мг СаС03, 1 мл 0,1 М раствора
глюкозы и 1 мл 1%-ного раствора ТТХ и тщательно смешивают.
Пробирки помещают в анаэростат и после создания вакуума инкубируют
при 30° в течение 24 ч. По истечении срока инкубации
образовавшийся ТФФ экстрагируют этанолом (25 мл) и фильтруют.
Окрашенный раствор фотоколориметрируют с синим светофильтром при
длине волны 540 нм. Количество формазана в миллиграммах
рассчитывают по стандартной кривой.
Для составления калибровочной кривой готовят стандартный
раствор формазана в этиловом спирте (0,1 мг в 1 мл), затем в
мерные колбы на 25 мл берут соответствующее^ количество
стандартного раствора, содержащее от 0,1 до 1,0 мг формазана,
этанолом доводят до метки и фотоколориметрируют согласно
вышеописанному способу. Активность дегидрогеназы выражают в мг
ТФФ на 10 г почвы за сутки. Ошибка определения — до 8%.
ПЕРОКСИДАЗА
(донор: НгОг-оксидоредуктаза КФ 1.11.1.7)
Пероксидазы наряду с полифенолоксидазами участвуют в
реакции конденсаци веществ при образовании молекулы гуминовых
кислот. Поскольку эти ферменты участвуют в гумусообразовании
и в окислительно-восстановительных процессах в почве,
определение их активности является важным.
Пероксидаза катализирует окисление полифенолов в
присутствии перекиси водорода или органических перекисей. Роль перок-
246
сидазы состоит в активировании перекисей, поскольку сами
перекиси обладают сравнительно слабым окисляющим действием на
фенолы. Пероксидаза обладает ограниченной специфичностью, так
как действует на значительное число различных фенолов и
ароматических аминов: пирогаллол, гидрохинон, пирокатехин, ортокре-
зол.
Оптимальный рН активности пероксидазы лежит в пределах
нейтрального или слабощелочного, однако несколько изменяется
в зависимости от взятых субстратов. Пероксидаза обладает
высокой термостабильностью. Активность пероксидазного действия
определяют обычно по образованию пурпурогаллина.
Реактивы: 1%-ный раствор пирогаллола; 0,5%-ная перекись
водорода; 20%-ная серная кислота; серный эфир.
Ход анализа. 5 г почвы помещают в коническую колбу
емкостью 300 мл, прибавляют 100 мл дистиллированной воды и
0,5 мл толуола. Содержимое колбы встряхивают на ротаторе в
течение 20 мин. Затем вытяжку фильтруют (фильтрат должен быть
абсолютно прозрачным).
Инкубацию вытяжки с субстратом проводят в
50-миллиметровых мерных колбах с притертыми пробками. В мерные колбы
приливают по 10 мл свежеприготовленного 1%-ного раствора
пирогаллола, 2 мл 0,5%-ного раствора перекиси водорода, встряхивают и
затем прибавляют 20 мл фильтрата почвы. Контролем служит
прокипяченный фильтрат почвы. Для этого на плите нагревают
остальную часть фильтрата с обратным холодильником в течение
15 мин, охлаждают и 20 мл охлажденного фильтрата прибавляют
в колбу с реактивами. Вторым контролем служит субстрат без
фильтрата.
Колбы со смесью затем закрывают пробками и оставляют в
термостате при 30° на 30 мин. По истечении соответствующего
времени реакцию прекращают, прибавляя 5 мл 20%-ной серной
кислоты. Образовавшийся пурпурогаллин извлекают
многократным взбалтыванием смеси с эфиром в делительной воронке.
Экстракцию ведут до полного извлечения пурпургаллина (до
обесцвечивания раствора). Эфирный слой сливают в мерную сухую
колбочку, соединяя вместе все эфирные вытяжки, и доводят
эфиром до метки. После тщательного перемешивания эфирный раствор
пурпурогаллина колориметрируют на фотоэлектроколориметре с
зеленым светофильтром (508 нм) в кюветах шириной 1 см.
В качестве стандарта при колориметрировании применяют
водный раствор двухромовокислого калия (0,75 г в 1 л 0,5 н. соляной
кислоты) или эфирный раствор кристаллического пурпурогаллина
3 концентрации 5 мг пурпурогаллина в 50 мл эфира. В
исследуемой вытяжке должно содержаться не менее 2 мг пурпурогаллина,
в противном случае определение следует повторить с большей
концентрацией исходной вытяжки. .
Активность пероксидазы выражают в миллиграммах
пурпурогаллина на 100 г почвы за 30 мин. Ошибка определения — до 8%.
247
ПОЛИФЕНОЛОКСИДАЗА
(дифенол: кислород — оксидоредуктаза КФ 1.10.3.1)
Полифенолоксидазы участвуют в превращении органических
соединений ароматического ряда в компоненты гумуса в почве.
Они катализируют окисление фенолов (моно-, ди-, три-) *до хино-
нов в присутствии кислорода воздуха. Хиноны при конденсации с
аминокислотами и пептидами в определенных условиях могут
участвовать в образовании первичных молекул гуминовых кислот.
Окисление идет по следующей схеме:
он о
i полифенм- и
^OH+io2i^--.<Q=o + ,H2o
Активность полифенолоксидазного действия определяют по
образованию пурпурогаллина из пирогаллола.
Реактивы: 1%-ный раствор 1, 2, 3-пирогаллола; 20%-ный
раствор серной кислоты; серный эфир, стандартный раствор би-
хромата калия — 0,75 г 2К2СГ2О7 растворяют в 1 л 0,5 н. НС1 (что
соответствует 5 мг пурпурогаллина в 50 мл эфира). Активность
полифенолоксидазы определяют тем же способом, что и
активность пероксидазы, но без добавления перекиси водорода.
Активность фермента выражают в миллиграммах
пурпурогаллина на 100 г почвы за 30 мин. Ошибка определения — до 8%.
НИТРАТРЕДУКТАЗА
(НАД «Иг нитрат-оксидоредуктаза КФ 1.6.1.1)
Нитратредуктаза осуществляет реакцию восстановления
нитратов в нитриты, донором водорода является восстановленный НАД,
акцептором — нитраты:
НАД. Н2+ Ж)3-=НАД + N02-+ H20.
Дальнейшее восстановление нитритов до аммиака
катализируется нитритредуктазой (с. 249).
Реактивы: 1%-ный раствор K'N03; 10-ный раствор глюкозы;
насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов; дисульфофеноловая
кислота (способ приготовления см. Аринушкина, 1970); 10%-ный
раствор NaOH; СаСОз, стандартный раствор нитратов: 16,3052 г
перекристаллизованного KN03 растворяют в дистиллированной
воде и доводят объем до 1 л. Полученный раствор содержит 10 мг
N03~ в 1 мл. Рабочие растворы готовят путем разбавления
стандартного раствора.
Ход анализа. 1 г почвы помещают в круглодонную колбу
емкостью на 100 мл с притертой стеклянной пробкой, добавляют
20 г СаС03 и 1 мл 1%-ного раствора азотнокислого калия, затем
после тщательного перемешивания прибавляют 1 мл 1%-ного
раствора глюкозы в качестве донора водорода. Воздух из колбы
откачивают при разряжении 10—12 мм рт. ст. Колбу осторожно
248
встряхивают и ставят в термостат при 30° на 24 ч. В качестве
контролей ставят простерилизованную почву с водой без
субстратов (контроль на почвенные нитраты). После инкубации в колбу
добавляют 50 мл дистиллированной воды и фильтруют через
плотный фильтр в мерную колбу на 50 мл. В случае мутных экстрактов
прибавляют 1 мл насыщенного раствора алюмокалиевых квасцов»
В фильтрате нитраты определяют по Гранвальд-Ляжу: 20 мл
фильтрата переносят в фарфоровую чашку и выпаривают на
водяной бане досуха. В чашку с осадком прибавляют по 1 мл дисуль-
фофеноловой кислоты и содержимое перемешивают стеклянной
палочкой. Через 10 мин в чашку добавляют 15 мл
дистиллированной воды, перемешивают и полученный раствор нейтрализуют
10%-ным раствором NaOH до щелочной реакции.
Полученный окрашенный раствор переносят в мерную колбу
на 50 мл, объем доводят до метки и колориметрируют на фото-
электроколориметре, используя кюветы шириной 5 мм и
светофильтр с длиной волны 400—500 нм.
Количество нитратов определяют по предварительно
составленной стандартной кривой. Количество восстановленного нитратного
азота вычисляют по разнице между количеством N03~,
внесенного в почву с субстратом (в 1 мл 1%-ного KN03~ содержится
6,13 мг N03~) и определенного в навеске почвы.
Активность нитратредуктазы выражают в миллиграммах
восстановленного N03~ на 10 г почвы за сутки. Ошибка
определения—до 5%.
НИТРИТРЕДУКТАЗА
(НАД (Ф) Нг: нитрит-оксиредуктаза КФ 1.6.6.47)
Нитритредуктаза катализирует реакцию восстановления
нитритов через гидроксиламин в гидрат окиси аммония. Нитриты
образуются в почве в начальной стадии восстановления нитратов:
7НАД (Ф) .Н2+2Ш2 = 7НАД (Ф) + 2NH4OH + 2H20.
Метод определения активности нитритредуктазы в почве
основан на учете остаточного количества невосстановленных нитритов
реакцией с реактивом Грисса.
Реактивы: 0,5%-ный NaN02; 1%-ный раствор глюкозы;
насыщенный раствор алюмокалиевых квасцов; 0,5%-ный раствор
сульфаниловой кислоты в СН3СООН (.^=1,94); 0,1%-ный раствор
а-нафтиламина в уксусной кислоте (Й=1,04) (для приготовления
реактива Грисса смешивают равные объемы двух последних
растворов); стандартный раствор нитрита: 1,5 г NaN02 в 1 л (1 мг
N02~ в 1 мл), путем серии разбавлений готовят рабочие растворы.
Ход анализа. 1 г почвы помещают в круглодонную колбу на
100 мл с притертой пробкой, добавляют 20 мг СаСОз и тщательно
перемешивают, затем прибавляют 1 мл 0,5%-ного раствора NaN02
и 1 мл 1%-ного раствора глюкозы в качестве донора водорода.
Воздух из колбы удаляют при разряжении 10—12 мм рт. ст., кол-
бы осторожно встряхивают и ставят в термостат при 30° на 24 ч.
Контроль—колбы со стерилизованной почвой и реактивами. После
выдерживания почвы с субстратом в колбы добавляют 50 мл
дистиллированной воды и 1 мл насыщенного раствора алюмокалиевых
квасцов, тщательно взбалтывают, после чего фильтруют через
плотный фильтр; 1 мл фильтрата переносят в мерную колбу на
50 мл, добавляют 5 мл дистиллированной воды и 4 мл смеси из
равных объемов сульфаниловой кислоты (0,5%-ной и а-нафтола
(0Л%-ного), реактив Грисса. Затем доводят объем до метки
водой. Колбы хорошо взбалтывают, и полученный окрашенный
раствор через 15 мин колориметрируют на фотоэлектроколориметре.
Используют кюветы шириной 5 мм, светофильтр с длиной волны
500—600 нм. .
Количество нитритов определяют по предварительно
составленной калибровочной кривой. Затем рассчитывают по разнице
между количеством внесенного в инкубационную смесь (3,33 мг) и
обнаруженного в фильтрате нитрита.
Активность нитритредуктазы выражают в миллиграммах
восстановленного N02~ на 1 г почвы за сутки. Ошибка
определения—до 6%.
СУЛЬФАТРЕДУКТАЗА
(НАД-l-fe: сульфат-оксидеродуктаза КФ 1,8.3)
Сульфатредуктаза катализирует реакцию восстановления
сульфатов до сульфитов, которые затем восстанавливаются сульфитре-
дуктазами до сульфидов по следующей схеме:
Na2S04 + НАД • Н2 сульфатредуктРза^ Na2S03 + Н20 + НАД,
N2S03 + НАД • Н2 Гсульфитредуктаза^ j^g + g^Q + 3НАД.
Эти ферменты играют важную роль в образовании солонцов в
почвах сульфатного засоления.
Оределение активности сульфатредуктазы основано на учете
уменьшения количества сульфатов в почве после анаэробной
инкубации ее субстратом (сернокислым натрием).
Реактивы: 0,5 н. раствор Na2S04 (24,01 мг S04~ в 1 мл);
5%-ный раствор глюкозы; реактивы для комплексометрического
определения сульфатов {Аринушкина, 1970).
Ход анализа. 1 г почвы помещают в круглодонную колбу
емкостью на 10 мл с притертой стеклянной пробкой, добавляют
20 мг углекислого кальция и тщательно смешивают, затем
прибавляют 1 мл 0,5 н. Na2S04 и 1 мл 5%-ного раствора глюкозы в
качестве донора водорода. Воздух из колбы откачивают и помещают
в термостат на неделю при 37°. В качестве контроля ставят
стерилизованную почву и почву с водой вместо субстрата. После
инкубации в колбы добавляют 100 мл дистиллированной воды и
фильтруют через плотный фильтр. Количество сульфат-ионов
определяют в 25 мл фильтрата комплексономертическим методом (Ари-
нушкина, 1970). Активность сульфатредуктазы вычисляют по
разнице между количеством -внесенных в реакционную смесь
сульфатов и обнаруженных после инкубации почвы.
Активность сульфатредуктазы выражают в миллиграммах
восстановленного S042~ на 1г почвы. Ошибка определения — до 10%.
СУЛЬФИДОКСИДАЗА
(сульфид: кислород-оксидоредуктаза. КФ 1.8.3; сульфит:
кислород-оксидоредуктаза. КФ 1.8.3.1)
Окисление серы в почве до сульфатов осуществляют
окислительные ферменты серобактерий. Первую стадию реакции —
окисление сульфидов до сульфитов — катализируют сульфидоксидазы.
Затем под действием сульфитоксидаз сульфиты окисляются до
сульфатов:
2Na2S + 302 ^ьфидоксидаза^ 2Na,SOa ,
Na2S03 + 02 + Н20 ^ьфитоксидаза^ ^^ + р^
Метод определения, активности сульфидоксидазы основан на
количественном учете сульфатов как конечных продуктов
ферментативного окисления сульфидов.
Реактивы: 1%-ный раствор Na2S, 10%-ный раствор НС1;
0,02 н. раствор ВаС12; ацетон; СаСОз, катионит КУ-2, индикатор
нитхромазо (0,1%-ный раствор).
Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы
помещают в колбы емкостью 50 мл, прибавляют 20 мг углекислого
кальция (в случае ненасыщенных основаниями почв — 50 мг),
тщательно перемешивают, затем приливают 1 мл 1%-ного раствора
Na2S. Колбы закрывают корковыми пробками и ставят в
термостат при 30° на 48 ч. В течение инкубации колбы периодически
встряхивают. По истечении соответствующего времени в колбы
приливают 30 мл бидистиллированной воды, взбалтывают в
течение 3 мин и фильтруют через плотный фильтр. Фильтрат
пропускают через колонку катионита КУ-2 для освобождения от
катионов. Из фильтрата берут 10 мл раствора, приливают 10 мл ацетона
(объем ацетона равен объему титруемого раствора), 0,5 мл
10%-ного раствора соляной кислоты и 3 капли 0,1%-ного
раствора индикатора нитхромазо. Смесь титруют 0,02 н. раствором
хлористого бария до перехода окраски из фиолетовой в голубую.
Контролем служат стерилизованная шочва и субстрат (раствор
Na2S) без почвы. Сумму объемом 0,02 н. растворов хлористого
бария, израсходованных на титрование контрольных вариантов,
вычитают из соответствующих опытных.
Активность сульфидоксидазы выражают в миллиграммах S04
на 100 г почвы за 48 ч. Расчет образующегося при
ферментативной реакции S04 (X) производят по следующей формуле:
v_ AT-0,96066-3,1 . 100
где А — количество 0,02 н. ВаС12, израсходованного на титрование
аликвотной части фильтрата, мл; Т — поправка на титр раствора
хлористого бария; 3,1—коэффициент для пересчета на весь объем
фильтрата; 0,96066 —коэффициент пересчета 0,02 н. ВаС12 на
сульфат-ионы; В — навеска почвы, г. Ошибка определения—до*8%.
СУЛЬФИТРЕДУКТАЗА
(НАД(Ф)Н2: сульфид-оксидоредуктаза КФ 1.8.1.2)
Сульфитредуктаза осуществляет превращение сульфитов в
сульфиды:
сульфит+ЗНАД (Ф) -Н2->- ЗНАД (Ф) + S2~+3H20.
Метод определения активности сульфитредуктазы основан на
количественном учете субстрата Na2S03 йодометрически.
Реактивы: 1%-ный раствор глюкозы; 0,6 М раствор Na2SC>3;
толуол; 0,1 М раствор Zn(CH3COO)2-H20; 0,05 н. раствор 12;
1%-ный раствор крахмала.
Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы с
помощью воронки (во избежание загрязнения шлифа) помещают в
круглодонные вакуумные колбы емкостью 100 мл с притертыми
стеклянными пробками или в химические стаканы емкостью 50 мл.
Приливают 1 мл 1%-ного раствора субстрата дегидрирования
(глюкоза), 2 мл 0,6 М раствора Na2SC>3 и 0,2 мл толуола. Воздух
из колб или эксикатора с химическими стаканами откачивают при
разряжении 10—12 мм рт. ст. Колбы или стаканы ставят в
термостат при 30° на 24 ч. Контролем служат стерилизованная почва и
субстраты без почвы. По истечении соответствующего времени в
сосуды приливают 2 мл 0,1 М раствора Zn(CH3COO)2-2H20 для
осаждения сульфидов и 15 мл воды, встряхивают и фильтруют
через плотный фильтр. 10 мл фильтрата титруют 0,05 н. раствором
12. Титрование проводят в присутствии 1%-ного раствора
крахмала, что дает возможность точно установить конец титрования.
Расчет производят, исходя из разности активностей * между почвой и
ее стерилизованным вариантом.
Активность сульфитредуктазы выражают количеством
восстановленного SO32" в миллиграммах на 1 г почвы за сутки. Ошибка
определения — до 5%.
ФЕРРИРЕДУКТАЗА
(восстановленный НАД (Ф): Fe203 оксидоредуктаза. КФ 1.6.99)
Ферриредуктаза осуществляет перенос водорода,
мобилизованного дегидрогеназными системами НАД (Ф)«Н2, на кислород
окиси железа, восстанавливая его в закисную форму:
Fe203+6Н + 2e->2Fe2++3H20.
Кислород окиси железа является конечным акцептором электронов
в цепи окислительно-восстановительных процессов, ведущих к вое-
становлению соединений железа в почве, что способствует его
растворению и миграции. Многие почвенные микроорганизмы
способны восстанавливать окиси железа, обладая высокой феррире-
дуктазной активностью.
Метод определения ферриредуктазы в почве основан на учете
количества образующегося двухвалентного железа при
взаимодействии окиси железа с почвой.
Реактивы: Fe203 тонко растертый порошок; 1%-ный раствор
глюкозы; 1 н. H2S04, ацетатный буфер (100 г CH3COONa
растворяют в 500 мл воды, добавляют 300 мл ледяной уксусной кислоты
и доводят объем раствора до 1 л); 0,5%-ный раствор 2,2'-дипири-
дила; стандартный раствор соли Мора (0,1 мг Fe в 1 мл 0,7022
FeS04(NH4)2S04-6H20 растворяют в холодной прокипяченной
дистиллированной воде, подкисленной 2 мл конц. H2S04, и разбавляют
водой до 1 л. Рабочие растворы железа готовят разведением
стандартного раствора).
Ход анализа. 1 г почвы помещают в вакуумную колбу
емкостью 100 мл (или в обычную коническую колбу и затем в анз-
эростат) затем вносят 10 мг окиси железа в виде тонко
измельченного порошка, тщательно перемешивают и добавляют 1 мл
дистиллированной воды и 1 мл 1%-ного раствора глюкозы. Воздух
из колбы (или анаэростата) откачивают при разрежении 10—
12 мм рт. ст. Колбу помещают в термостат при 30° на 48 ч.
Контролем служит почва с водой в объеме субстрата и субстрат без
почвы. Опытные колбы также ставят в термостат. После
окончания инкубации в опытные и контрольные колбы добавляют по
18 мл 1 н. серной кислоты для экстрагирования восстановленного
железа. Колбы встряхивают 5 мин и содержимое фильтруют.
10 мл фильтрата переносят в мерные колбы емкостью 25 мл,
добавляют 12 мл ацетатного буфера и 1 мл 0,5%-ного раствора
2,2'-дипиридила, доливают до метки и оставляют на 30 мин.
Окрашенные растворы колориметрируют на фотоколориметре с
зеленым светофильтром в кюветах шириной 10 мм. Расчет производят
по калибровочной кривой, составленной для стандартных
растворов соли Мора. Пересчетный коэффициент — 200.
Активность ферриредуктазы выражают в миллиграммах
восстановленного Fe203 на 100 г почвы за 48 ч.
Мп02-РЕДУКТАЗА
(восстановленный НАД(Ф): оксиредуктаза КФ 1.6.99)
В почве обнаружены дегидрогеназные системы, переносящие
водород от окисленных органических соединений кислороду
двуокиси марганца, восстанавливая ее. Реакция протекает в
анаэробных условиях. При этом соединения четырехвалентного марганца
переходят в двухвалентную форму, доступную для растений:
Мп02 + 4H++2ё->Мп2++ 2Н20.
Метод определения Мп02-редуктазы основан на учете количест-
ва восстановленной в почве окиси марганца персульфатным
способом.
Реактивы: Мп02 (тонко измельченный порошок); СаС03;
1%-ный раствор глюкозы; 0,4%-ный раствор Na2S03-7H20 в 1 М
растворе CH3COONH4; концентрированные кислоты (H2S04, HN03,
Н3РО4) и Н202; 2%-ный раствор AgN03, (NH4)2S203 или K2S203;
стандартный раствор —0,1 н. КМп04 (1 мл этого раствора
содержит 0,И мг марганца).
Ход анализа. 1 г почвы помещают в вакуумную колбу
емкостью 100 мл, прибавляют 20 мг тонко измельченной двуокиси
марганца и 20 мг углекислого кальция. После тщательного
перемешивания добавляют 2 мл 1%-ного раствора глюкозы. Воздух
из колбы откачивают, содержимое осторожно встряхивают, и
колбу помещают в термостат на 48 ч при 30°. Контролем служит
стерилизованная при 180° почва, реактивы без почвы и почва с водой
вместо субстрата. Контрольные растворы также помещают в
термостат. После инкубации восстановленный марганец экстрагируют
0,4%-ным раствором сернистокислого натрия в 1 М растворе
ацетата аммония. В колбы прибавляют 25 мл указанного раствора и
взбалтывают 30 мин. Затем 5 мл фильтрата переносят в
фарфоровую чашку и выпаривают досуха. Сухой остаток обрабатывают
1 мл концентрированной азотной кислоты и 2 мл перекиси
водорода для окисления органического вещества и удаления хлора.
Эту процедуру повторяют до получения белого осадка, который
растворяют в 0,5 мл концентрированной азотной кислоты и затем
водой переносят в мерные колбы емкостью 100 мл. К раствору
добавляют по 0,5 мл концентрированной серной и фосфорной
кислот, 1 мл азотнокислого серебра и 0,2 г персульфата аммония или
калия. Колбу нагревают на электроплитке до появления первого
пузырька. Персульфат прибавляют до образования устойчивой
розовой окраски. Затем колбу охлаждают до комнатной
температуры, объем раствора доводят до метки водой и окрашенный
раствор колориметрируют, используя зеленый светофильтр и кюветы
на 10 мм. Количество восстановленной двуокиси марганца
рассчитывают по предварительно составленной калибровочной кривой
для стандартных растворов КМп04.
Активность Мп02-редуктазы выражают в миллиграммах окиси
марганца на 10 г почвы за 48 ч.
Гидролазы
Гидролазы представляют обширный класс ферментов,
осуществляющих реакцию гидролиза разнообразных сложных
органических соединений, действуя на различные связи: сложноэфирные,
глюкозидные, амидные, пептидные и др. Гидролазы широко
распространены в почвах и играют важную роль в обогащении их
подвижными и доступными для растений и микроорганизмов
питательными веществами, разрушая высокомолекулярные
органические соединения. К этому классу относятся ферменты инвертаза,
254
уреаза, фосфатаза, протеаза, целлюлаза и другие, активность
которых является важнейшим показателем биологической активности
почв и оценки антропогенного воздействия.
Гидролазы являются наиболее хорошо изученными
ферментами в почве, для определения их активности предложены
различные методы (Галстян, 1974; Хазиев, 1990).
ИНВЕРТАЗА
(сахараза, (3-фруктофуранозидаза. р-фруктофуранозид-фруктогидролаза.
КФ 3.2.1.26)
Инвертаза действует на р-фруктофуранозидную связь в
сахарозе, рафинозе, стахиозе и других и производит расщепление
сахарозы на эквимолярные количества глюкозы и фруктозы:
сн2он
но 1 [ сн?он
он н
фруктоза
Инвертаза широко распространена в природе, она имеется у
многих микроорганизмов, встречается почти во всех типах почв.
Ее активность является характерным показателем типов почв и
их биологической активности.
Определение активности инвертазы основано на учете
восстанавливающих Сахаров, образующихся при расщеплении сахарозы.
Этот метод нашел широкое применение и может быть использован
для определения инвертазы в образцах почвы с широким
диапазоном активности фермента и концентрации субстрата.
Фотоколориметрический и поляриметрический методы более требовательны
к концентрации Сахаров и неприемлемы для почв с высоким
содержанием органических веществ ввиду окрашенных растворов
почвенных экстрактов. Поэтому применение указанных методов в
почвенных исследованиях ограничено.
Определение активности инвертазы по учету восстанавливающих
Сахаров
Реактивы: 5%-ный раствор сахарозы; ацетатный буфер
(рН 4,7); толуол; раствор Фелинга (а — 40 г сернокислой меди
(CuS04-5H20) растворяют в дистиллированной воде и доводят до
1 л, 6 — 200 г сегнетовой соли (C4H406KNa-4H20) растворяют в
дистиллированной воде, прибавляют 150 г КОН или NaOH и
доводят до 1 л. Оба раствора фильтруют. Перед употреблением
растворы (а) и (б) смешивают в соотношении 1:1); раствор окисного
железа (86 г соли железоаммиачных квасцов (Fe2(NH4)S04-2H20)
заливают 20Q г конц. H2S04 и доводят объем дистиллированной
водой до 1 л); 0,1 н. титрованный раствор КМп04.
Ход анализа. В колбу емкостью 50 мл помещают 5 г
почвы, добавляют 10 мл 5%-ного раствора сахарозы, 10 мл
ацетатного буфера (рН 4,7) и 5—6 капель толуола. Колбы закрывают
пробками, встряхивают и помещают в термостат при температуре
30° на 24 ч, периодически встряхивая их. Контроль —
стерилизованная почва (3 ч при 180°) и чистый субстрат.
После инкубации содержимое колб фильтруют в
100-миллиметровые мерные колбы. В 10—20 мл фильтрата определяют
восстанавливающие сахара по методу Бертрана. Для этого 10 мл
фильтрата переносят в колбу емкостью 100 мл и приливают 20 мл
раствора Фелинга. Содержимое колбы кипятят 3 мин. Затем раствор
фильтруют в колбу Бунзена через стеклянный фильтр № 4,
используя водоструйный насос. Осадок закиси меди в колбе и на фильтре
промывают горячей свежепрокипяченной водой несколько раз до
исчезновения щелочной реакции на лакмус. Затем переносят
фильтр на чистую колбу Бунзена и осадок закиси меди
растворяют, приливая 5—10 мл железоаммиачных квасцов. Колбу и
фильтр промывают несколько раз дистиллированной водой до
исчезновения кислой реакции на лакмус. Фильтрат в колбе Бунзена
немедленно титруют 0,1 н. раствором перманганата калия до
устойчивой слабо-розовой окраски раствора.
На основании количества пошедшего на титрование раствора
перманганата в миллилитрах вычисляют соответствующее ему
количество меди в миллиграммах из расчета: 1 мл 0,1 н. КМп04
эквивалентен 6,36 мг меди. Затем по таблице находят
соответствующее количество глюкозы (в мг). После внесения поправки на
контроль рассчитывают активность инвертазы.
Активность инвертазы выражают в миллиграммах глюкозы на
1 г почвы за 24 ч. Ошибка определения — до 5%.
Фотоколориметрический метод определения активности
инвертазы
Ход анализа. Из фильтрата, полученного вышеописанным
методом, берут 6 мл, в большие пробирки добавляют 3 мл сегне-
товой соли и 3 мл раствора сернокислой меди, хорошо
перемешивают и кипятят на водяной бане 10 мин. Затем пробирки с
раствором охлаждают в воде, содержимое переносят в центрифужные
пробирки и центрифугируют в течение 5—7 мин при 3000 об/мин.
Прозрачный фильтрат колориметрируют на фотоэлектроколоримет-
ре со светофильтром с длиной волны 630 нм, кюветы шириной
1 см.
Количество глюкозы рассчитывают по предварительно
составленным калибровочным кривым. Исходный стандартный раствор —
6 мг глюкозы в 1 мл.
Определение активности инвертазы с динитросалйциловой
кислотой
Реактивы: 8%-ный раствор сахарозы; фосфатный буфер
рН 4,9; толуол; 3,5-динитросалициловая кислота (ДСК: 0,05 г кис-
лоты растворяют в 20 мл 2 н. NaOH и 50 мл дистиллированной
воды, прибавляют 30 г сегнетовой соли и доводят до 100 мл
дистиллированной водой; реактив хранить в темной склянке с
притертой пробкой до 7 дней).
Ход анализа. В колбу емкостью 100 мл (с притертой
пробкой) помещают 1—5 г почвы, добавляют 5 мл 8%-ного раствора
сахарозы, приготовленного на фосфатном буфере (рН 4,9), и 5—
6 капель толуола, встряхивают и помещают в термостат при 37*
на 1 ч. После инкубации содержимое колбы фильтруют, 1 мл
фильтрата переносят в пробирку, прибавляют 2 мл реактива
3,5-ДСК, нагревают на кипящей бане 15 мин, охлаждают, доводят
до 10 мл, перемешивают стеклянной палочкой и колориметрируют
против контроля. Контроль — почва с субстратом и буфером, на
без инкубации. Светофильтр — 508 нм.
Активность инвертазы выражают в миллиграммах глюкозы на
1 г почвы за 1 ч.
УРЕАЗА
(карбамид-амидогидролаза. КФ 3.5.1.5)
Разложение органических азотистых соединений в основном
осуществляется при непосредственном участии внеклеточных
ферментов. К ферментам, участвующим в превращении белковых
веществ, относится уреаза. Образовавшийся в результате уреазной
реакции аммиак служит источником питания растений.
Активность уреазы — один из важнейших показателей биологической
активности почв. Уреаза катализирует распад мочевины на аммиак
и углекислоту:
NH2
0==С\ + "liF-^ 2NH3 + С02 + Н20.
NH2
Фермент обладает строгой специфичностью действия:
расщепляет только мочевину и не действует на производные. Оптимум-
рН уреазы близок к 7,0, но может смещаться в зависимости от
концентрации мочевины, от природы и концентрации
применяемых буферов. В почве уреаза может действовать в сравнительно
широком диапазоне рН.
Реактивы: фосфатный буфер (рН 6,7); 10%-ный раствор
мочевины; 1 н. КО; реактив Неслера; раствор сегнетовой соли
(калий-натрий виннокислый: 50 г соли растворить в 100 мл
дистиллированной воды).
Ход анализа. К2 г почвы добавляют 5 мл фосфатного
буфера (рН 6,7) и 5 мл 10%-ного раствора мочевины. После этого
колбы тщательно встряхивают и инкубируют 3 ч при 30°. После
инкубации добавляют 7,5 мл КО, перемешивают и
центрифугируют 10 мин. Центрифугат сливают в пробирки. Далее переносят
по 1 мл центрифугата в мерные колбы на 25 мл (если
анализируется подстилка, то лучше брать по 0,5 мл центрифугата), добав-
257
ляют в колбы воды (5—7 мл), тщательно перемешивают и снова
добавляют небольшой объем воды, после чего приливают 1 мл
раствора Неслера. Доводят до метки осторожным приливанием
небольших объемов воды при тщательном перемешивании.
Оптическую плотность измеряют при длине волны 480 нм.
Активность уреазы выражают в миллиграммах NH3 на 1 г
почвы за 1 ч.
ПРОТЕАЗЫ
(пелтид-лептидогидролазы. КФ 3.4.4)
Протеазы — группа ферментов, катализирующих
гидролитическое расщепление белков до пептидов и далее до аминокислот,
действуя на пептидную связь:
... NH—СИ—СО—NH—СИ—СО—NH—СИ—СООН пР°теаза^
I I I
Re R2 Ri
-». NHa—CH—СООН + ... NH—CH—СО—NH—CH—СООН.
I I I
Ri R3 R2
Протеолитические ферменты играют важную роль в почве,
участвуя в процессах разложения растительных, животных и
микробных остатков, в превращении азотистых веществ в почве и
питании растений. Активность протеаз в почве определяют, используя
в качестве субстрата казеин, желатин или некоторые пептиды,
учитывая при этом продукты гидролиза по реакции с нингидрином
или по уменьшению вязкости субстрата.
Реактивы: 1%-ный раствор казеина в фосфатном буфере
(рН 7,4); фосфатный буфер (рН 7,4); 0,1 н. H2S04; 20%-ный
раствор Na2S04; 2%-ный раствор нингидрина в ацетоне (перед
употреблением смешивают 95 мл ацетонового раствора нингидрина с 1 мл
уксусной кислоты и 4 мл воды).
Ход анализа. К навеске почвы (1 г) приливают 5 мл
1%-ного раствора казеина, приготовленного на фосфатном буфере
(рН 7,4). Пробирки тщательно встряхивают, закрывают пробками
и ставят в термостат при 37° на 2 ч. В течение опыта пробирки
несколько раз встряхивают. После инкубации реакционную смесь
центрифугируют при 6 тыс. об/мин 10 мин. Из центрифугата берут
2,5 мл, переносят в пробирку и приливают 2 мл 0,1 н. серной
кислоты и 2 мл 20%-ного N32804 для осаждения белков. Затем
снова фильтруют и к 2 мл фильтрата прибавляют 1 мл 2%-ного
нингидрина, приготовленного на ацетатном буфере (рН 5,5).
Смесь взбалтывают и нагревают на кипящей водяной бане 15 мин.
Полученный окрашенный раствор из пробирки.переливают в
мерную колбу емкостью 50 мл, доводят объем дистиллированной водой
до метки и фотоколориметрируют, используя кюветы в 1 см при
длине волны 570 нм.
.258
Активность протеаз выражают в количестве гидролизованного
белка в расчете на 1 г почвы за 2 ч.
Для пересчета на белок проводят полный кислотный гидролиз
казеина, используемого в опыте (коэффициент пересчета 0,186).
Кислотный гидролиз казеина осуществляют следующим образом:
20 мг казеина нагревают в течение 20 ч при 105° с 2 мл 6 н. НС1.
Гидролизат смачивают водой и выпаривают досуха на водяной
бане 3 раза (до рН 5—6), к осадку добавляют 5 мл воды, после чего
определяют количество аминокислот колориметрически (см.
раздел «Аминокислоты»).
ФОСФАТАЗЫ
(фосфогидролазы моноэфиров ортофосфорной кислоты. Щелочная
фосфатаза. КФ 3.1.3.1; кислая фосфатаза. КФ 3.1.3.2)
Фосфатазы гидролизуют моноэфир ортофосфорной кислоты на
спирт и ортофосфат:
ONa
R-O—Р<^ = О *ос*атаэа > ROH + Na2HP04.
ONa
Методы определения активности почвенных фосфатаз основаны
на учете отщепленного при ферментативной реакции
неорганического фосфата или органической части молекулы субстрата —
фосфоорганического соединения. Щелочную фосфатазу определяют
при рН 8,0, кислую — при рН 5,4, общую фосфатазную активность
почвы — при рН почвы.
Для определения активности фосфатазы при наличии в почве
железа, алюминия и карбонатов первая группа методов менее
применима. В этом случае образовавшаяся при ферментативной
реакции фосфорная кислота поглощается почвой и ее трудно
определить количественно. Определение органической части субстрата
более правильно отражает картину действия фосфатазы почв. При
этом определение можно проводить в присутствии в почве
карбонатов и других элементов, связывающих фосфорную кислоту.
Реактивы: 0,5%-ный раствор /г-нитрофенилфосфата натрия;
1 н. раствор КОН; этаноламин-ацетатный буфер рН 8,0 и рН 5,4;
стандартный раствор для построения калибровочной кривой (0,01 г
я-нитрофенола растворяют в дистиллированной воде и объем
доводят до 100 мл: 1 мл этого раствора содержит 0,1 мг я-нитрофе-
нола, что соответствует 0,223 мг фосфора).
Ход анализа. 1 г почвы помещают в колбы емкостью 50 мл,
прибавляют 3 мл 0,5%-ного раствора я-нитрофенилфосфата
натрия. При определении щелочной фосфатазы субстрат готовят на
этаноломин-ацетатном буфере рН 8,0, а кислой — с рН 5,4.
Контролем служат почвы с буфером и субстраты без почвы. Колбы
закрывают корковыми пробками, встряхивают и ставят в термостат при
30° на 30 мин. За это время колбы дважды осторожно встряхи-
259
вают. После инкубации в них добавляют 22 мл дистиллированной
воды, взбалтывают и фильтруют (фильтр с синей полосой).
В фильтрат добавляют по каплям 1 н. КОН. Раствор должен
иметь рН 8,6. В случае тяжелых по механическому составу почв
для просветления раствора в колбы добавляют 1 мл насыщенного
.раствора алюмокалиевых квасцов. Образовавшийся окрашенный
раствор фотоколориметрируют с кюветами шириной 5 мл и
светофильтром с длиной волны 450—480 нм. Количественный учет
фосфора, отщепленного от субстрата, производят по предварительно
составленной калибровочной кривой.
Активность фосфатазы выражают в миллиграммах фосфора на
100 г почвы за 30 мин.
целлюлаза
(р-1,4-глюкан-глюканогидролаза. КФ 3.2.1.4)
В почву с растительными остатками поступает значительное
количество целлюлозы. Почвенные микроорганизмы, особенно
грибы, обладают активной целлюлазой, расщепляющей клетчатку.
Фермент гидролизирует р-1,4-связи в целлюлозе, при этом
целлюлоза сначала распадается на дисахарид целлобиозу, а затем под
действием целлобиазы — на глюкозу.
Для определения целлюлазной активности почвы используют
различные способы учета продуктов ферментативной активности:
определение остаточного количества не расщепленной в почве
целлюлозы (см. аппликационные методы), определение количества
образующегося углекислого газа или потребленного при распаде
клетчатки в почве кислорода, по количеству образующихся
редуцирующих Сахаров и т. д. Колориметрический метод определения
глюкозы, образующейся при гидролизе целлюлозы в почве,
является наиболее распространенным (Баганюк, Щетинская, 1971).
Реактивы: 1%-ная карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ);
толуол; ацетатный буфер рН 5,5; алюмокалиевые квасцы; реактив
антрона — 0,2%-ный раствор антрона в 95%-ном H2S04 (по
объему) (к 5 мл воды прибавляют 100 мл "концентрированной
H2S04 и после охлаждения вносят 200 мг антрона и оставляют на
4 ч на льду. Используют только свежеприготовленный реактив);
стандартный раствор глюкозы для составления калибровочной
кривой (к 2,5 мл раствора глюкозы (в концентрациях от 10 до 200 мкг
в 1 мл) добавляют 5 мл антрона и колориметрируют).
Ход определения. Юг почвы помещают в колбу емкостью
.50 мл, добавляют 1,5 мл толуола, затем 5 мл ацетатного буфера
(рН 5,5) и 5 мл 1%-ного раствора КМЦ. Реакционную смесь
тщательно перемешивают, колбу закрывают пробкой и ставят в
термостат при 36° на 48—72 ч. В контроле вместо субстрата
добавляют 5 мл воды, вторым контролем являются реактивы без почвы.
После инкубации колбу на водяной бане нагревают до 100°.
Затем добавляют 0,3 г алюмокалиевых квасцов для осаждения
КМЦ. Содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в
260
мерные колбы емкостью 50 мл, и объем фильтрата доводят до
метки дистиллированной водой. 2 мл фильтрата переносят в
термостойкие пробирки емкостью 40—50 мл и добавляют 4 мл антроно-
вого реактива, выдерживают 30 мин и колориметрируют против
первого контроля с синим светофильтром (551 нм) в кюветах
шириной 10 мм. Количество образовавшейся глюкозы рассчитывают
по предварительно составленной калибровочной кривой.
Целлюлазную активность выражают в миллиграммах глюкозы
яа 10 г почвы.
АМИЛАЗЫ
(а-амилаза: а-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза. КФ 3.2.1.1; а-амилаза:
а-1,4-глюкан-мальтогидролаза. КФ 3.2.1.2)
Амилазы действуют на высокомолекулярные полисахариды —
крахмал и гликоген. К амилазам относятся а- и р-амилазы,
которые отличаются различным механизмом действия. Амилазы
широко распространены в природе, встречаются у различных групп
микроорганизмов. Плесневые грибы характеризуются большим
содержанием а-амилазы, бактерии же образуют амилазы обоих
типов. Амилазы обнаружены также в почве.
Для определения амилаз существуют две группы методов:
1) основанные на физико-химических изменениях субстрата
(разжижение крахмала, йодная проба); 2) основанные на определении
образовавшегося продукта гидролиза крахмала — мальтозы. В
соответствии с наличием двух типов амилаз применяют различные
методы. Для определения а-амилазы наиболее пригодны методы
йодной пробы или вискозиметрический по скорости разжижения
крахмального клейстера. Для р-амилазы, как и для суммарного
действия обеих амилаз, применяют методы определения
количества образовавшейся в результате гидролиза мальтозы.
Определение суммарной активности амилаз
Реактивы: ацетатный буфер (рН 5,6); 2%-ный крахмальный
клейстер; реактивы для определения Сахаров по Бертрану.
Ход анализа. 5г почвы помещают в колбу на 50 мл,
добавляют 10 мл 2%-ного раствора крахмального клейстера, 1 мл
ацетатного буфера (рН 5,6) и 0,5 мл толуола. Колбы закрывают
пробками, встряхивают и ставят в термостат при температуре 37°
на 24 ч. Содержимое колбы периодически взбалтывают.
Контролем служит простерилизованная сухим жаром почва и чистый
субстрат. После инкубации смесь фильтруют в мерную колбу на
100 мл, осадок на фильтре промывают водой и доводят до метки.
На определение восстанавливающих Сахаров по Бертрану берут
20 мл фильтрата.
Активность амилазы выражают в миллиграммах мальтозы на
1 г почвы за сутки.
ОА1
НУКЛЕАЗЫ
(гидролазы фосфодиэфиров. КФ 3.1.4. Рибонуклеинат или
дезоксирибонуклеинат 3'-(или 5)-нуклеотидогидролазы. КФ 3.1.4.5-9.
5'-(и 3')-рибо (или дезоксирибо-)-нуклеотид-фосфогидролазы.
КФ 3.1.3.5—6)
Нуклеазами называют обширную группу ферментов,
специфичных по отношению к нуклеиновым кислотам и расщепляющих
межнуклеотидные связи в их молекуле с образованием обломков
различной величины без освобождения неорганического фосфата.
Нуклеазы разделяют на два основных типа: эндонуклеазы и
экзонуклеазы. Эндонуклеазы гиролизуют фосфодйэфирные связи
одновременно во многих пунктах внутри молекулы нуклеиновых
кислот, а экзонуклеазы способны последовательно отщеплять по
одному нуклеотиду с одного конца полинуклеотидной цепи.
Эндонуклеазы могут быть специфичными к одному из двух типов
нуклеиновых кислот и в соответствии с этим называются рибо-
нуклеазами (РНКазами) или дезоксирибонуклеазами (ДНКаза-
ми). Экзонуклеазы, как правило, способны гидролизовать оба
вида нуклеиновых кислот, но сродство к ДНК и РНК как к
субстрату у них обычно неодинаково. Итогом действия всех нуклеаз,
независимо от их специфики, является уменьшение степени
полимерности субстрата (РНК или ДНК), что проявляется в накоплении
низкомолекулярных продуктов распада нуклеиновых кислот, не-
осаждаемых в отличие от полимерных соединений рядом
реактивов, например кислотами, этанолом и т. д.
Принцип, лежащий в основе этого метода определения
активности нуклеаз в почве, разработанного на кафедре биологии почв
МГУ Н. С. Паниковым, И. В. Асеевой, заключается в измерении
прироста количества фракции нуклеиновой кислоты, не
осаждаемой раствором MgCl2 в 50% -ном этаноле, после инкубации
нуклеиновой кислоты с почвой. Количество нуклеиновых кислот
определяют по интенсивности их собственного поглощения в УФ-части
спектра при трех длинах волн для того, чтобы учесть фоновое
поглощение других соединений, присутствующих в почве.
Инкубация почвы с раствором нуклеиновой кислоты
проводится в присутствии фосфатного буфера, который полностью
устраняет адсорбцию как полимерной нуклеиновой кислоты, так и
продуктов ее деполимеризации (Паников, 1976).
Реактивы: нуклеиновая кислота (НК)—препарат РНК
(2 г РНК растворяют в 50 мл 0,05 н. NaCl, добавляя по каплям
раствор NaOH, при тщательном перемешивании доводят рН до 7,0.
Затем раствор РНК прогревают на кипящей водяной бане в
течение часа, охлаждают до 0° и осаждают РНК двумя объемами
этанола. Выпавший на холоду осадок промывают этанолом, эфиром
и высушивают. Для определения ферментативной активности РНК
растворяют в воде из расчета 25 мг РНК на 1 мл воды и хранят
раствор при 0° под слоем толуола); препарат ДНК (200 мг ДНК
растворяют в 70—80 мл 0,1 н. NaOH, доводят рН раствора 1 н.
НС1 до 7,0 и добавляют воды до общего объема 100 мл; препарат
262
хранят при 0° под слоем толуола); 0,05 М фосфатный буфер
рН 6,5; 0,02 М MgCl2 в 96%-ном этаноле.
Ход анализа. 1 г почвы помещают в коническую колбу на
50 мл и заливают 2,5 мл 0,05 М фосфатного буфера и 2,5 мл
раствора НК; все тщательно перемешивают, закрывают резиновой
пробкой и ставят в термостат при температуре 37° на 1—3 ч в
зависимости от уровня активности в данном почвенном образце.
Параллельно ставят контрольную пробу: 2,5 мл 0,05 М
фосфатного буфера с добавлением 2,5 мл раствора НК. После окончания
инкубации почву отделяют центрифугированием и 0,75 мл надоса-
дочной жидкости переносят в помещенную в ледяную баню
стеклянную центрифужную пробирку, в которую предварительно
наливают 0,75 мл раствора 0,02 М MgCl2 в 96%-ном этаноле.
Сформировавшийся через 30 мин осадок отделяют центрифугированием,
а надосадочную жидкость разводят дистиллированной водой в
10 раз и спектрофотометрируют при 230, 260 и 300 нм на
спектрофотометре СФ-4.
Расчет величины нуклеазной активности в
почве. Концентрацию деполимеризации НК рассчитывают по
формуле
~~ 1,625
где 1>2бо, £>2зо, ^зоо — оптические плотности при 260, 230 и 300 нм
соответственно; D — исправленная величина оптической плотности
при 260 нм, обусловленная присутствием НК в пробе.
Нуклеазную активность почвы рассчитывают по формуле
atE
где А — величина нуклеазной активности почвы в мг деполимери-
зованной НК за 1 ч в расчете на 1 г почвы; п — разведение; V —
объем инкубационной смеси, мл; а — величина навески почвы, г;
t — время инкубации, ч; Е — коэффициент экстинкции НК (Щм1^
= 0,025); D0 и DK — исправленные величины оптической
плотности опытной и контрольной проб соответственно.
АТФаза
(АТФфосфогидролаза. КФ 3.6.1.3)
АТФаза катализирует гидролитическое расщепление АТФ на
АДФ и ортофосфат
АТФ^а+АДФ+Н3Р04.
Метод определения активности АТФазы почвы основан на
количественном учете фосфорной кислоты, отщепленной в
результате ферментативной реакции при взаимодействии АТФ с почвой
9R?
Реактивы: 0,02 М раствор АТФ-Na; этаноламин —
уксуснокислый буфер рН 8,0 (этаноламин 0,2 М 25 мл+ 50 мл 0,1 М
СН3СООН + 25 мл Н20); ЭДТА —0,1 н. раствор этилендиамин-
тетраацетата; буферная смесь Троуга (3 г сернокислого аммония,
20 мл 0,1 н. серной кислоты растворяют в 1 л дистиллированной
воды); комплексообразователь (25 г молибденовокислого аммония
растворяют в 200 мл дистиллированной воды при нагревании).
Одновременно в мерную колбу емкостью 1 л приливают 500 мл
воды и осторожно по стенкам колбы вливают небольшими
порциями 280 мл серной кислоты (плотность 1.84). После остывания
обоих растворов в серную кислоту небольшими порциями при
постоянном помешивании приливают раствор молибденовокислого
аммония. После вторичного остывания общий объем доводят до
1 л, перемешивают и переливают в склянку из темного стекла);
восстановитель (0,25 г SnCl2-2H20 всыпают в стеклянную
пробирку емкостью до 10—15 мл, приливают 10 мл 10%-ной НС1 и
погружают ее в химический стакан на 100—200 мл, наполненный водой,
и кипятят до полного растворения восстановителя); стандартный
раствор (0,1917 г КН2Р04 в 1 л воды), рабочий раствор (20 мл
стандартного раствора доводят до 1 л).
Ход анализа. 1 г почвы помещают в коническую колбу
емкостью 100 мл, добавляют 1 мл 0,02 М раствора АТФ-Na и 2 мл
этаноламинацетатного буфера рН 8,0 (по индикаторной бумаге).
Для определения активности АТФазы при рН почвы вместо
буферного раствора прибавляют дистиллированную воду. В случае
ненасыщенных почв добавляют также 1 мл 0,2 н. раствора ЭДТА
(для «маскировки» мешающих ионов А1 и Fe). Колбы закрывают
корковыми пробками, встряхивают и ставят в термостат при 30°
на 1 ч. Контроль — почва с водой, буфером, ЭДТА и с субстратами
без почвы.
После инкубации в колбы добавляют 50 мл буферной смеси
Троуга, встряхивают на ротаторе 30 мин для экстрагирования
фосфорной кислоты и содержимое колб фиксируют. В фильтрате
фосфор определяют по методу Троуга—Мейера. Для этого 10 мл
фильтрата переносят в 50-миллиметровые мерные колбы,
прибавляют 2 мл комплексообразователя — молибдата аммония, доводят
до метки, перемешивают, затем приливают 3 капли
восстановителя— 2,5%-ного SnCl2, немедленно перемешивают и в течение 15—
20 мин окрашенные растворы фотоколориметрируют с красным
светофильтром с длиной волны 650 нм. Количественный учет
фосфорной кислоты, отщепленной от АТФ под действием АТФазы,
проводят по предварительно составленной калибровочной кривой.
Активность АТФазы выражают в миллиграммах Р на 100 г за
1 ч. Ошибка определения — до 6%.
АРИЛСУЛЬФАТАЗА
(арилсульфат-сульфатгидролаза. КФ 3.1.6.1)
Арилсульфатаза осуществляет гидролитическое расщепление
264
сероорганических соединений со сложноэфирной связью на
фенолы и сульфаты:
*г»-(Уо-\-М ^^-^ 02NHQ-0H + KHS04
В результате этой реакции сера из трудноусвояемой формы
превращается в легкоусвояемую для растений и микроорганизмов.
Метод определения активности арилсульфатазы основан на
колориметрическом определении я-нитрофенола, образующегося при
ферментативном гидролизе я-нитрофенилсульфата.
Реактивы: 1%-ный раствор я-нитрофенилсульфата калия
(раствор хранят в холодильнике); ацетатный буфер (рН 5,4);
0,5 н. раствор СаС12-2Н20; 1,0 н. раствор NaOH; стандартный
раствор я-нитрофенола (0,1 г х.ч. я-нитрофенола растворяют в
воде и в мерной колбе емкостью 50 мл объем доводят до метки; 1 мл
этого раствора содержит 2 мг я-нитрофенола, что соответствует
0,230 мг серы. В колбы емкостью 25 мл берут соответствующие
количества стандартного раствора, которые содержат от 1 до 10 мг
л-нитрофенола, окрашивают (см. ход анализа), колориметрируют
и составляют калибровочный график.
Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы
помещают в колбы емкостью 50 мл, приливают 1 мл 1%-ного раствора
/г-нитрофенилсульфата калия и 3 мл ацетатного буфера (рН 5,4).
Контролем служат почва с буфером и субстрат без почвы. Колбы
закрывают корковыми пробками, встряхивают и ставят в
термостат при 33° на 1 ч. За это время колбы два раза встряхивают.
По истечении времени взаимодействия субстрата с почвой в
колбы приливают 1 мл 0,5 М раствора СаС12 и 20 мл воды,
взбалтывают в течение 10 мин и фильтруют через плотный фильтр. В
фильтрате продукт ферментативной реакции я-нитрофенол окрашивают
1,0 н. щелочью (по каплям). Среда должна иметь рН 8,5—8,6.
Окрашенный раствор колориметрируют, используя
5-миллиметровые кюветы и светофильтр с длиной волны 450—480 нм.
Количество отщепленного я-нитрофенола в пересчете на серу находится
по стандартной шкале.
Активность арилсульфатазы выражают в миллиграммах серы
на 100 г почвы за 1 ч. Ошибка определения — до 5%.
ГЛУТАМИНАЗА
(L-глутамин-аминогидролаза. КФ 3.5.1.2)
Глутаминаза катализирует гидролитическое дезаминирование
глутамина с образованием глутаминовой кислоты и аммиака:
H2N—ОС—СН2-СН2-СН (NH2)-COOH ™у~*™-+
НООС—СН2—СН2—СН (NH2)—COOH + NH3.
В почве глутаминаза участвует в процессах мобилизации легко-
гидролизуемого азота. Ее действие — характерный показатель
азотистого обмена в почве. Метод определения активности
глутаминазы основан на учете аммиака, выделившегося из глута-
мина в результате действия фермента.
Реактивы: 3%-ный раствор глутамина на фосфатном буфере;
фосфатный буфер (рН 7,2); 1 н. раствор КО; реактивы для
определения аммиака по Къельдалю.
Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы
помещают в колбы емкостью 50 мл, приливают 5 мл 3%-ного раствора
глутамина, приготовленного на фосфатном буфере (рН 7,2), и
0,2 мл толуола в качестве антисептика. Колбы закрывают
корковыми пробками, встряхивают и ставят в термостат при 30° на 24 ч.
В течение опыта колбы периодически встряхивают. Контролем
служат стерилизованная почва и субстраты без почвы. По
истечении соответствующего времени в колбы приливают 25 мл 1 н.
раствора хлористого калия, 5 мин встряхивают для вытеснения из
почвы поглощенного аммиака, фильтруют. В 10 мл фильтрата
аммиак определяют по Къельдалю.
Активность глутаминазы выражают в миллиграммах NH3 на
1 г почвы за сутки. Ошибка определения — до 5%.
АСПАРАГИНАЗА
(L-аспарагин-амидогидролаза. КФ 3.5.1.1)
Аспарагиназа катализирует гидролиз аспарагина на аспараги-
новую кислоту и аммиак:
H2N-CO-CH2-CH (NH2)—COOH ££Е££~£^
НООС—СН2—СН (NH,)—COOH + NH3.
Метод определения активности аспарагиназы в почве основан на
учете количества аммиака, образовавшегося в почве при
ферментативном гидролизе аспарагина.
Реактивы: 3%-ный раствор аспарагина на фосфатном
буфере; фосфатный буфер (рН 6,7); 1 н. раствор KCI; реактивы для
определения аммиака по Къельдалю.
Ход анализа. Навески (1 г) подготовленной почвы
помещают в колбы емкостью 50 мл, приливают 5 мл 3%-ного раствора
аспарагина, приготовленного на фосфатном буфере (рН 6,7), и
0,2 мл толуола. Контролем служат стерилизованная почва и
субстраты без почвы. Колбы закрывают корковыми пробками,
встряхивают и ставят в термостат при 30° на 24 ч. В течение опыта
колбы периодически встряхивают. По истечении соответствующего
времени в колбы приливают 25 мл 1 н. раствора КС1, тщательно
перемешивают в течение 5 мин и фильтруют. В 10 мл фильтрата
аммиак определяют по Къельдалю.
Активность аспарагиназы выражают в миллиграммах NH3 на
1 г почвы за сутки. Ошибка определения — до 5%.
266
ПОЛЕВЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАЗООБМЕНА С02 В СИСТЕМЕ
«ПОЧВА—РАСТЕНИЕ—АТМОСФЕРА»
Измерение интенсивности дыхания почвы
камерным статическим методом
Данный метод предусматривает измерение скорости
накопления С02 внутри изолятора, врезаемого в почву на глубину 5—
10 см (рис. 56). Поток С02 из почвы в атмосферу F обычно
рассчитывают по упрощенной формуле
F=(c—c0)-V/t-s=(c—Co)-Hft, (25)
где с — концентрация определяемого газа в момент времени t\
со — исходная концентрация газа; s — площадь камеры
(изолятора); У —объем камеры; Я —высота камеры; t — время
экспозиции.
Рис. 56. Схема измерения интенсивности
дыхания почвы камерным статическим методом:
1 — изолятор цилиндрической формы из
тонкой листовой стали (высота Н 20—30 см,
диаметр 15—30 см, глубина врезания 5—10 см);
2 — резиновая прокладка для отбора проб
воздуха; 3 —- поверхность почвы
Согласно (25) концентрация газа внутри камеры при
постоянстве F увеличивается линейно со временем, т. е. предполагается,
что внутренний объем камеры изолирован от окружающей среды.
Однако в реальной ситуации имеет место процесс диффузного
газообмена между внутренним объемом камеры и локальной припоч-
венной атмосферой. Этот процесс обусловлен наличием градиента
концентрации газов между камерой и внешней средой. Уравнение
материального баланса для этого процесса имеет вид
Vdc/dt = Fs—Ds- (c—c0)/z,
(26)
где F — поток газа из почвы в атмосферу; z — глубина, на которую
камера врезана в почву; D — коэффициент диффузии газа в почве;
/—время.
Интегрирование соотношения (26) при граничных условиях
* = 0 и с = со дает
c = Co+F/D'[l—exp(—D't/H)]t
(27)
где D'=D/H.
Несложный методический прием позволяет практически
использовать выражение (27) для нахождения истинной скорости эмис-
267
сии газа из почвы. Для этого отбор газовых проб производят в
динамике немедленно после установки изолятора (с0) и дважды
через равные промежутки времени т (с\ и с2). Величину т выбирают
таким образом, чтобы она соответствовала началу замедления
накопления газа в камере. В соответствии с (27) :
ci = c0 + F/D'[l—exp(—D't/H)],
c2 = c0 + F/D'[l—exp(—2D'x/H)].
(28)
(29)
Вычитая (28) из (29), получаем с2—с1 = (с1—с0)е-°'х/н.
Последующие преобразования приводят к формулам, позволяющим
рассчитать D' и F по значениям с0у с\ и с2:
D'=-H/T-ln[(c1-c0)/(c2-c1)],
F=D'(ci—Co)/[l—exp{—D'%IH)].
(30)
(31)
О
(см.
1 см3
борудование: газовый хроматограф; изолятор из стали
рис. 4); пенициллиновые флаконы; шприцы объемом 20 и
Ход анализа. Изолятор
врезают в почву и отбирают пробы
воздуха через прокладку 2 объемом
20 см3 немедленно после установки
изолятора, а затем на 10-й и 20-й
минуте экспозиции. Пробы воздуха
переносят в предварительно вакуу-
мированные (—1 атм)
пенициллиновые флаконы объемом 15 см3.
Флаконы хранят до ГХ-анализа в
контейнере с внешним водяным
затвором (рис. 57).
ГХ-анализ проводят в
лаборатории. Пробы воздуха объемом. 1 см3
отбирают из пенициллинового
флакона и вводят в газовый
хроматограф. Полученные /величины
концентрации СОг в воздухе Со, С\ и с2
подставляют в уравнения (30) и
(31), рассчитывая числовые
значения F — истинной скорости
выделения С02 из почвы в атмосферу.
Г
4
Н 1
j
<2
Pi
L
Л
d
Рис. 57. Хранение проб воздуха перед ГХ-
анализом:
/ — пластиковый контейнер емкостью 0,5—
2 л; 2 — завинчивающаяся крышка; 3 —
пенициллиновые флаконы с пробами
воздуха; 4 — слой воды; 5 — резиновая пробка»
фиксированная металлическим зажимом
268
Измерение сопряженной динамики интенсивности
фотосинтеза трав и темнового дыхания ценоза
В ряде экофизиологических исследований возникает
потребность количественного определения динамики фотосинтетической
активности растений и интенсивности дыхания почвенной биоты.
Интенсивность фотосинтеза растений тесно связана со скоростью*
прижизненного отчуждения органического вещества корнями
(собственно корневые выделения, отпад и отмирание тканей корня,,
выделение внеклеточной слизи и т. п.). Прижизненно отчуждаемый
органический материал служит субстратом роста
микроорганизмов в прикорневой зоне, поэтому интенсивность фотосинтеза и
интенсивность дыхания почвы являются взаимозависимыми
процессами. Регистрация их динамики позволяет оценить истинные
величины потоков углерода в системе
«почва—растение—микроорганизмы».
Рис. 58. Изолятор, предназначенный для
длительных динамических измерений
показателей газообмена СОг:
/ — стационарно установленное в почве
основание изолятора; 2 — съемный
колпак; 3 — паз, заполненный водой
(водный затвор на месте стыка колпака и
основания); 4 — зеленые побеги трав;
5 — поверхность почвы; 6 — место
отбора проб воздуха
Оборудование. Изолятор, состоящий из двух частей
(рис. 58)—основания и съемного колпака. Основание
изготавливают из нержавеющей стали или иного прочного инертного
материала (твердые виды пластмасс, алюминий). Его устанавливают
в почве стационарно весной до начала интенсивного роста
растений. Съемный колпак из оргстекла (или иного прозрачного
материала) сочленяется с основанием только на время измерения.
Место стыка герметизируется водным затвором.
Ход определения. Динамические измерения проводят в
одних и тех же точках пространства, чтобы исключить влияние
пестроты почвенного покрова. Колпак устанавливается на
основание, заполняют паз на стыке водой, закрывают колпак
светонепроницаемой тканью и измеряют скорость выделения С02
(интенсивность темнового дыхания ценоза), как это описано выше. Обычно
пробы воздуха достаточно отобрать 3 раза: сразу после
затемнения изолятора, а также на 10-й и 20-й минуте экспозиции. Для
измерения скорости фотоассимиляции СОг ткань снимают и
отбирают пробы воздуха трижды через каждые 1—2 мин. Кажущуюся
интенсивность фотосинтеза рассчитывают по динамике падения
концентрации С02 в воздухе внутри изолятора.
269
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ АЗОТФИКСАЦИИ
Полевую активность азотфиксации определяют несколькими
способами, имеющими свои преимущества и недостатки, которые
должны учитываться при выборе их. Для почв с нормальным
увлажнением наиболее пригодны диффузионный метод и метод
почвенных монолитов, поскольку они характеризуются малым
нарушением естественного сложения, отличаются хорошей
воспроизводимостью и обеспечивают надежное определение азотфиксации
в природных условиях.
Диффузионным методом актуальную активность
азотфиксации определяют с помощью прибора, состоящего из
металлического цилиндра со съемным колпаком из полиэтиленовой пленки
(рис. 59). Цилиндр погружают в почву на глубину 10—15 см, почву
по внешнему периметру цилиндра увлажняют на ширину 5—10 см
для предотвращения утечки газов. Внутрь цилиндра помещают
бюкс с 25—30 г карбида кальция, служащего «генератором»
ацетилена. На металлический обруч натягивают полиэтиленовый мешок,
размеры которого соответствуют высоте растений, а в кольцевую
канавку на цилиндре наливают воду для создания водяного
затвора.
Карбид кальция в бюксе увлажняют водой и цилиндр быстро
накрывают полиэтиленовым мешком, обруч которого должен быть
погружен в воду в кольцевой канавке. Через резиновую пробку в
мешке, предназначенную для ввода и отбора газовых проб, внутрь
его вводят шприцем точно измеренное количество пропана,
служащего внутренним стандартом, и отмечают начало инкубации.
При определении объема вводимого пропана исходят из того, что
в процессе последующего газохроматографического анализа его
можно было измерить при тех же режимах работы прибора, при
которых проводится измерение этилена. Поэтому пропан следует
вводить в количестве, примерно соответствующем количеству
этилена, образующегося в этой системе. Обычно в этом случае
руководствуются данными предварительного определения для
конкретной системы.
Инкубация с ацетиленом длится 2 ч. В начале инкубации, а
затем дважды в течение инкубации — через 1 и 2 ч — отбирают
газовые пробы. Для этого через резиновую пробку в мешке
засасывают большим шприцем (20 мл) газовую смесь и примерно 15 мл
ее вводят в предварительно вакуумированный пенициллиновый
флакон. Параллельно проводят контрольное определение на
неспецифический этиленогенез — почву инкубируют, как и в опыте, но
без введения ацетилена (карбида кальция) в инкубационную
камеру.
О размерах всех видов потерь этилена (адсорбция почвой,
растворение в воде, утечки через полиэтилен и пр.) судят по убыли
пропана в инкубационной системе за период инкубации.
Применение пропана в качестве внутреннего стандарта удобно
по ряду причин: пропан не образуется почвенными микроорганиз-
270
•<»
о
5? то
то
в £
gS
О
к *
Я ,
£ I
я «
•&>.
£ °-
О \о
£ о
то
S 23
н х
£ *■
О О)
33 ЕГ
СО S
s ч
н ч •-
«ТОО.
то н tt
к S я
S |
к
то
о>
а?
ч
о
я 2
S3 со
а> *.
Ч та
О) tt
«=( со
<и то
P-D3
с то
о м
4 g к-
«З §
со 3g
а- ч ^
о о
VO «
5 I ^
6 I 5
«.
ч
S
•SB
чЭ»
я £
I о
а> ... *
о- то о
ОХО
о
° &
о
*» СО
§1
К СО
4 <"->
5 а
О '
о '
с io
о
fa ffl
о
ffl то
33 хо
ч о
я с
н с
Л-—
то
*ч
. *
я »я
CQ
о
к
а
ас си.
>» я
С- Я
О 33*
О ТО
I I
ГЛ то
злами, с трудом окисляется ими; не является дефицитным
реактивом— обычно используется сжиженный пропан в малых емкостях,
выпускаемый для заправки газовых зажигалок. Основным
преимуществом пропана как внутреннего стандарта является возможность
его анализа в одной и той же пробе с этиленом, что существенно
упрощает расчеты.
Для определения величины активности азотфиксации
вычисляют площадь почвы внутри цилиндра и объем инкубационной
камеры по начальной концентрации пропана. Окончательные
расчеты проводят по следующей схеме:
А — чувствительность прибора к пропану (площадь или
высота пика при введении 1 мл чистого пропана, выраженная в
условных единицах, — произведение высоты пика в сантиметрах на
показатель чувствительности усилителя постоянного тока);
В — чувствительность прибора к этилену;
С — количество пропана (мл), введенного внутрь
инкубационной камеры;
U\ — количество пропана (в усл. ед.) в 1 мл газовой пробы,
отобранной через 1 ч инкубации;
а2 — количество пропана (в усл. ед.) в 1 мл газовой пробы,
отобранной через 2 ч инкубации;
01 — количество этилена (в усл.ед.) в 1 мл газовой пробы,
отобранной через 1 ч инкубации;
в2 — количество этилена (в усл.ед.) в 1 мл газовой пробы,
отобранной через 2 ч инкубации.
В инкубационной камере через 1 ч инкубации содержится всего
этилена ——, а через 2 ч инкубации, с учетом не только увели-
чения его концентрации, но и разнообразных потерь (адсорбция,
ч Ь2АС
растворение, утечки и пр.), уже .
а2
Следовательно, абсолютный прирост концентрации этилена за
время между двумя сроками отбора газовых проб будет
составлять
Х=(-^-^):(в+^)(мл). .
Поскольку отношение А/В для каждого прибора является
величиной постоянной, а величина С также постоянна для каждой
серии опытов, то величины а,\ и а2 зависят только от С и от потерь
в ходе определения, а величины в\ и в2— от интенсивности этиле-
нообразования (азотфиксации) и от потерь этилена в ходе
определения. При этом исходят из допущения, что скорость потерь
пропана и этилена из инкубационной камеры одинакова.
Таким образом, при использовании пропана в качестве
внутреннего стандарта окончательное измерение сводится к простой
операции определения соотношения двух газов — этилена и пропана —
в одной газовой пробе. В силу того что соотношение этих газов в
пробе можно принять постоянным даже в случае утечки их из
.272
флаконов в процессе хранения до анализа, результаты газохрома-
тографического анализа не зависят от таких потерь. Хотя, как уже
отмечалось, пропан может окисляться микроорганизмами, тем не
менее этим процессом можно пернебречь из-за кратковременности
инкубации.
Основным недостатком диффузионного метода является его
большая зависимость от влажности почвы, ее механического
состава, пористости, сложения и др., вследствие чего результаты
определения активности азотфиксации, как правило, занижены.
Медленная диффузия ацетилена в почву и неполный выход
образовавшегося этилена из почвы приводят к желанию увеличить время
инкубации свыше 2 ч, что также вызывает большие ошибки в
оценках азотфиксации.
Определение активности азотфиксации методом
монолитов основано на принудительной подаче ацетилена в почву и
освобождении образовавшегося этилена. Монолит почвы массой 2—
5 кг непосредственно в поле помещают внутрь цилиндра (рис. 60)
Рис. 60. Схема прибора для
измерения активности азотфиксации в
ризосфере методом продувки
ацетилена:
1 — стальной цилиндр; 2 —
сетчатая перегородка; 3 — болты;
4 — прозрачная крышка; 5 —
вентиляционные трубки; 6
шланги; 7 — эластичные
резервуары; 8 — резиновая пробка
Рис. 6.1. Схема прибора для
измерения активности азотфиксации
в вегетационных сосудах;
1 — сосуд; 2 — гранитная
крошка; 3 — вентиляционная трубка;
4 — полиэтиленовый колпак; 5,
6 — эластичные трубки; 7 —
шланг; 8 — резиновая пробка; 9 —
эластичный резервуар
10 Зак. 42
на сетчатую перегородку. При этом следят, чтобы между
монолитом и стенками цилиндра не было зазоров — их замазывают
увлажненной почвой. Цилиндр сверху герметично закрывают
прозрачной крышкой и вводят ацетилен, а также пропан.
Продувают смесь этих газов через почву со скоростью 2—5 л/мин. Общее
время инкубации — 30 мин. Через 15 мин от начала инкубации
шприцем отбирают первую пробу газов в тройной повторности в
вакуумированные пенициллиновые флаконы и через 30 мин —
вторую пробу.
Расчет активности азотфиксации проводят по формуле
х=а№—Ц,
где X — количество азота, фиксированного за время инкубации;
аи в\ и «2, вг — концентрации этилена (в) и пропана (а) в
газовых пробах в первый (15 мин) и второй (30 мин) сроки отбора;
А — коэффициент пересчета, учитывающий количество вводимого
в цилиндр пропана, чувствительность прибора к этилену и
пропану, стехимометрическое отношение этилен—азот.
При изучении азотфиксации в вегетационных сосудах
более удобно другое устройство для продувки (рис. 61). Растения
выращивают в вегетационных сосудах, обернутых черной бумагой
или закрашенных снаружи черной краской. На дно сосудов
укладывают слой гранитной крошки или битого стекла. При набивке
сосуда почвой вставляют трубку, соединяющую придонную ее
часть с атмосферой. Во время измерений на сосуд герметично
одевают полиэтиленовый колпак, в который вставлены две
эластичные трубки. Одну из них надевают на проходящую до дна трубку,
а другую соединяют с резиновой грушой. Газовые пробы после
введения ацетилена и пропана отбирают через 15 и 30 мин. Для
контроля за неспецифическим образованием этилена продувают
только пропан.
Как показала проверка, методы с принудительной продувкой
ацетилена через почву повышают скорость определения по
сравнению с другими методами примерно в 4—6 раз. Продувка
обеспечивает быстрое проникновение ацетилена в толщу почвы и более
полный контакт его с азотфиксирующими бактериями, а также
более быстрый вынос образующегося этилена в газовую фазу.
В итоге это позволяет получить объективную характеристику азот-
фиксирующей активности почв.
Недостатками метода с продувкой являются неизбежное
повреждение корневой системы растений и возможность ингибирова-
ния нитрогеназы кислородом воздуха, хотя кратковременность
инкубации позволяет считать их несущественными.
В затопленных и переувлажненных почвах
актуальную активность азотфиксации определяют по методу Ватанабэ.
Для этого с помощью почвенного бура диаметром 2—5 см
отбирают образец почвы, определяют его массу и переносят в
пластиковый или стеклянный флакон известного объема. Флакон герме*
274
тично закрывают, вводят шприцем ацетилен из расчета 5% от
объема флакона и 1—5 мл пропана в качестве внутреннего
стандарта. Флаконы встряхивают для перемешивания газовой смеси
с почвой и инкубируют в поле в течение 2 ч. Пробы газа отбирают
в пенициллиновые флаконы дважды с интервалом 1 ч в тройной
повторности; флаконы подписывают и до анализа хранят в
темном месте.
Актуальную активность азотфиксации в филлосфере
растений определяют модифицированным методом Мейера — Линдберга.
На растение или на его часть надевают мешок из полиэтилена,
плотно перевязывают у основания, вводят ацетилен и пропан.
Через 15, 30 и 60 мин отбирают пробы газа в пенциллиновые
флаконы в тройной повторности. В контрольном опыте инкубируют
растения без введения С2Н2. Площадь листьев, стеблей и побегов
определяют при помощи планиметра или наложением на
миллиметровую бумагу.
Окончательный расчет активности азотфиксации проводят по
схеме, описанной выше (см. диффузионный метод)" и выражают ее
в миллиграммах или микрограммах азота на 1 дм2 поверхности
за 1 ч.
Для лабораторных экспериментов с растениями используют
различного типа камеры, позволяющие проводить
измерения азотфиксации раздельно в ризосфере и филлосфере (рис.62).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ДЕНИТРИФИКАЦИИ
Металлический цилиндр объемом 500 мл с пробоотборником
(резиновой пробкой) врезают в почву на глубину 5—10> см.
По внешнему периметру почву увлажняют для предотвращения
утечки газа. С помощью шприца через резиновую пробку во ©нут-
ренний объем цилиндра вводят ацетилен (10% от объема камеры)
и криптон в качестве внутреннего стандарта. Длительность
инкубации определяют экспериментально в зависимости от конкретных
условий: механического состава почвы, наличия растительности,
внесения удобрений и т. д. Обычно время инкубации составляет
12—48 ч. По окончании инкубации отбирают газовые пробы по
15 мл в герметизированные пенициллиновые флаконы методом
вытеснения насыщенного раствора хлористого кальция. Пробы
транспортируют в лабораторию и анализируют на газовом
хроматографе. Прибор должен обеспечивать хорошее разделение
диоксида углерода, закиси азота и криптона. Активность денитрифика-
ции определяют по скорости накопления закиси азота в
реакционной камере. Расчет ведут на площадь под цилиндром.
Параллельно проводят опыт на неспецифическое образование закиси
азота. Для этого почву инкубируют без введения ацетилена.
Результаты контрольного эксперимента необходимо учитывать при
расчете денитрифицирующей активности почвы.
Определение полевой активностиденитрифика-
ции в затопленных почвах (рисовниках). С помощью
ю*
275
Рис. 62. Схема инкубационных камер для измерения активности азотфиксации в
ризосфере и филлосфере:
А — камера, состоящая из 2 больших пробирок; Б — вегетационный сосуд,
накрытый полиэтиленовым боксом; В — приспособление для раздельного введения
С2Н2 к стеблям и корням (/ — растение; 2 — почва или песок; 3 — парафиновая
перемычка; 4 — резиновая пробка; 5, 6 — сосуд; 7 — резиновое кольцо; 8 —
устройство для ввода проб; 9 — полиэтиленовый бокс; 10 — резиновая пробка;
// — пенопластовое кольцо; 12 — парафинированный песок; 13 — верхняя
камера; 14 — нижняя камера)
микробура отбирают почвенный образец массой 100—120 г,
помещают во флакон объемом 250 мл, закрывают резиновой пробкой
и тщательно герметизируют. Вводят ацетилен из расчета 10% от
объема и помещают в почву. Газовые пробы отбирают через 12—
24 ч и транспортируют в лабораторию. Расчет активности денит-
рификации ведут на единицу массы почвенного образца,
определяемого после окончания эксперимента.
АППЛИКАЦИОННЫЕ МЕТОДЫ
Аппликационные методы особенно усиленно разрабатывались
и рекомендовались для широкого использования Е. Н. Мишусти-
ным, И. С. Востровым и А. Н. Петровой. Эти методы используются
для определения биологической активности почв, причем
отличаются простотой и дают возможность приблизиться к определению
интенсивности протекания процессов в природных условиях. Мето-
276
ды могут с успехом применяться и при характеристике
биологической активности почв разных типов, и при изучении влияния на
биологическую активность различных агрохимических и
агротехнических мероприятий.
Определение интенсивности разложения целлюлозы
Стерильную тонкую суровую льняную ткань (неотбеленную)
(можно использовать и другую) пришивают к полимерной пленке
(например, к пищевому полиэтилену). Ширина отрезка пленки
примерно 10 см. Длина может варьироваться в зависимости от
целей исследования. Часто берут полоски длиной 50 см, при
исследовании только пахотного слоя 25—30 см, при проведении почвен-
но-генетических работ и биогеоценологических работ полотна уста-
навливат на всю глубину почвенного профиля, причем удобнее
помещать несколько кусков ткани один над другим.
Стерилизовать пленки можно спиртом, а ткань проглаживать горячим
утюгом. По возможности стерилизацию ткани лучше осуществлять в
автоклаве.
В почве вырывают свежий разрез и к его вертикальной,
хорошо защищенной стенке плотно прижимают полотно. С обратной
стороны полиэтилен придавливается почвой, разрез засыпается.
Верхняя грань ткани должна быть на 3—5 см погружена в почву.
Необходимо ставить 3—5 повторных полотен. Через месяц, а при
неблагоприятных условиях для развития микроорганизмов
(засуха, низкие температуры) и через более продолжительное время
(2—3 мес) полотна осторожно извлекают, отмывают от почвы и
продуктов полураспада, подсушивают и взвешивают. Для
определения динамики процесса повторные куски ткани извлекают
последовательно через определенные интервалы времени. По убыли
массы судят об интенсивности процесса разрушения клетчатки.
Начальную массу ткани узнают путем определения средней
массы 25 см2 ткани и затем соответствующего расчета. Способ
дает возможность дифференциально определять убыль массы
каждых 25 см2 ткани или ткани в каждом горизонте. Ткань разрезают
в соответствии с почвенными горизонтами или слоями.
Можно предложить следующую шкалу интенсивности
разрушения клетчатки (%) за вегетационный сезон:
очень слабая <10, слабая 10—30,
средняя 30—50,
сильная 50—80, очень сильная >80.
Определение интенсивности накопления свободных аминокислот
(нингидринположительных продуктов)
Метод дает возможность за сравнительно короткий отрезок
времени получить представление об интенсивности некоторых
процессов, проходящих в почве. Используют такие же полотна ткани,
как и в предыдущем методе, но зарывают их на 10 дней (в случае
неблагоприятных условий для микробиологической активности —
на 30 дней). Ткань вынимают, просушивают, щеточкой счищают
приставшую к ней почву. Подготовку ткани следует проводить
таким образом, чтобы на нее не попали аминокислоты и белки с рук
(надевать на руки резиновые перчатки). Нужно ставить
контрольное определение и, если на ткани перед опытом обнаруживаются
аминокислоты или белки, ее необходимо промыть 70%-ным
этиловым спиртом.
Ткань опрыскивают 0,5%-ным раствором нингидрина в
ацетоне, высушивают и оставляют в темном месте при комнатной
температуре на сутки для более полного выявления окраски. По
интенсивности окраски отдельных частей ткани можно судить об
интенсивности микробиологических процессов в разных слоях почвы
или разных почвенных горизонтах.
Далее из ткани вырезают квадраты одинаковой площади
(5x5 см), измельчают ножницами на лоскутки размером 0,25х
XI см, ссыпают в мерную пробирку с притертой пробкой на 25 мл и
заливают 20 мл 75%-ного этанола, после 10-минутного
извлечения пробирки встряхивают и экстракт сливают в колбу на 50 мл,
а измельченную ткань снова заливают 20 мл этанола той же
концентрации. В третий раз берут 10 мл этанола и извлечение на этом
заканчивают. Экстракт в колбе доводят спиртом до метки.
Плотность окраски полученного раствора, определенная на фотоэлект-
роколориметре, сравнивается с плотностью стандартных растворов.
Стандартные растворы получают разбавлением окрашенного
нингидридом раствора какой-либо аминокислоты (например,
глицина). Строят стандартную кривую и с ее помощью количество
нингидринположительных веществ почвенной спиртовой вытяжки
условно выражают в миллиграммах взятой в качестве стандарта
аминокислоты (глицина). Расчет проводят на 1 см2 поверхности
ткани.
Иногда с ткани извлекают аминокислоты и проводят
количественное определение каждой аминокислоты.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ НАКОПЛЕНИЯ БЕЛКОВ И АМИНОКИСЛОТ
Экспонированную ткань или ее часть разрезают на мелкие
кусочки. Их помещают в пробирку и проводят кислотный гидролиз
белков. Аминокислоты окрашивают нингидрином, экстрагируют
этиловым спиртом и определяют количественно, как было описано
в предыдущем методе.
РАЗДЕЛ 7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПОЧВЕ
АМИНОКИСЛОТЫ
Аминокислоты играют важную роль в почве. Они входят в
состав органического вещества, гумуса, в почве постоянно
присутствует также фракция свободных аминокислот. Количество их и
состав зависят от типа почвы, физико-химических факторов,
интенсивности биохимических процессов и др. Свободные
аминокислоты, поступающие в почву в результате жизнедеятельности
микроорганизмов, а также при разложении растительных и животных
остатков, иммобилизуются почвенными частицами и сохраняются,
определенное время образуя «пул» аминокислот, характерный для
данного типа почв.
Подготовка почвы для анализа. Если аминокислоты
определяют в свежих образцах, то почву тщательно очищают от
корней, просеивают через сито диаметром 1 мм и сразу
анализируют. Одновременно в отдельной навеске определяют влажность
почвы. В случае, когда аминокислоты определяют в сухих
образцах, почву предварительно высушивают при комнатной
температуре до воздушно-сухого состояния, затем очищают от корней и
просеивают через сито. Хранят почву в пакетах из пергамента в
картонных коробках.
Ход анализа. Для определения свободных аминокислот
почвы необходима предварительная экстракция их различными
растворителями: этанолом, гидратом окиси бария, уксуснокислым
аммонием, хлористым натрием, оксалатом аммония и др.
Использование каждого растворителя имеет свои положительные и
отрицательные стороны: этанолом хуже извлекаются основные
аминокислоты, гидрат окиси бария производит частичный гидролиз
органического вещества почвы и т. д. Хорошие результаты получают
при последовательной экстракции 20%-ным этанолом и водой.
50 г почвы заливают в химическом стакане 70 мл 20%-ного
этанола и перемешивают на качалке в течение 15—18 ч. Затем
взвесь центрифугируют и прозрачную надосадковую жидкость
сливают в колбу для вакуумной отгонки. Если после
центрифугирования на поверхности раствора остается неосевшая легкая
фракция, то раствор фильтруют через бумажный фильтр. Осадок почвы
заливают вновь 50 мл 20%-ного этанола и экстракцию повторяют.
Третью экстракцию проводят 50 мл дистиллированной воды в
течение 20 мин. Отцентрифугированные экстракты соединяют вместе
и отгоняют под вакуумом при температуре не выше 30° досуха.
Сухой остаток растворяют в небольшом количестве воды и обра-
батывают в делительной воронке многократно небольшими
порциями эфира для удаления пигментов. Экстракцию прекращают,
когда слой эфира перестает окрашиваться. Эфирный слой,
содержащий пигменты, липиды и подобные им вещества, отбрасывают.
Водный слой, содержащий аминокислоты, отгоняют при ^легком
нагревании на водяной бане или под вакуумом для удаления
эфира. Затем освобождаются от солей добавлением кислого ацетона.
Осадок солей отделяют центрифугированием и прозрачный раствор
концентрируют под вакуумом при температуре 30°. Сухой остаток
растворяют в 1—2 мл 10%-ного изопропилового спирта и
переносят в маленькие пробирки с притертой пробкой.
Щелочные аминокислоты более прочно адсорбируются почвой,
поэтому для их экстракции применяют иной способ. Для анализа
берут новую навеску почвы. Почву заливают 3-кратным объемом
20%-ного этанола, подщелоченного NH4OH до рН 12, и
экстрагируют в течение 15—18 ч при постоянном перемешивании. По
окончании экстракции почвенную суспензию центрифугируют, суперна-
тант сливают, а осадок повторно обрабатывают щелочным
этанолом. Полученные растворы соединяют и упаривают досуха на
водяной бане. Сухой остаток дважды растворяют в
дистиллированной воде и упаривают досуха. Окончательно высушенный остаток
растворяют в 20%-ном изопропиловом спирте и наносят на хрома-
тограмму.
Содержание свободных аминокислот определяют на
автоматическом анализаторе аминокислот или методом нисходящей хрома-
тограммы, нанося на хроматограмму по 20, 50 и 100 мкл этого
раствора. Количество свободных аминокислот рассчитывают на
1 г абсолютно сухой почвы.
Определение аминокислот методом хроматографии
распределения на бумаге
Метод распределительной хроматографии на бумаге
отличается простотой выполнения, достаточно быстрый и требует очень
небольших количеств анализируемого вещества.
Материалы и реактивы. Бумага. Обычно для анализа
используют ленинградскую хроматографическую бумагу № 2
марки «Б» (быстрая).
Ход работы. Для количественного определения
аминокислот бумагу предварительно промывают, чтобы удалить катионы
металлов, мешающие точному анализу. Для промывания бумаги
используют следующий растворитель: 0,15%-ный раствор 8-окси-
хинолина на смеси бутанол—уксусная кислота—вода (40:5:15).
Листы хроматографической бумаги смачивают этим раствором в
кювете и подсушивают на воздухе. Образовавшийся темноокра-
шенный комплекс 8-оксихинолина с катионами вымывают из
бумаги, пропуская раствор смеси бутанол—уксусная кислота—вода
(4:1:5 верхний слой) для полного удаления темно-серого фона
(47—82 ч). Это промывание проводят в хроматографической ка-
пол
мере нисходящим методом. Промытую бумагу высушивают на
воздухе в вытяжном шкафу.
Бумагу вырезают в виде прямоугольных полос поперек
волокон, ширина листа определяется длиной щели в лодочке, в
которую помещают бумагу, длина — высотой камеры. На расстоянии
1,5—2 см от края бумагу загибают для закрепления хроматограм-
мы в лодочке. На расстоянии 6—7 см от подгиба намечают
карандашом линию старта, на которую наносят растворы аминокислот
на расстоянии 2—2,5 см друг от друга.
С целью лучшего разделения
смеси аминокислот применяют бумагу
определенной формы — «фигурная хро-
матограмма» (рис. 63). Это
способствует тому, что пятна аминокислот
вытягиваются перпендикулярно
движению растворителя и приобретают
форму полос, а не кругов, как на
прямоугольной бумаге, что значительно
повышает четкость разделения
аминокислот, позволят разделять
аминокислоты с близким значением Rf.
Для четкого разделения смеси
аминокислот необходимо также
многократное пропускание растворителя.
Эти приемы используют в основном в
случае сложной смеси аминокислот,
особенно гидролизатов белков.
Растворители. Органические
растворители, употребляемые для
хроматографии, должны быть химически
чистыми, бесцветными или слабоокра-
шенными и водонасыщенными.
Наиболее удобно применение
растворителей, частично смешивающихся с
водой. Наиболее часто употребляются
следующие растворители.
Смесь я-бутилового спирта,
уксусной кислоты и воды (4:1:5). В
мерном цилиндре смешивают 40 мл w-бу-
танола, 10 мл ледяной уксусной кислоты (100%-ной) и 50 мл
дистиллированной воды. Смесь переносят © делительную воронку и
тщательно встряхивают в течение 2 мин. После расслаивания
верхний слой используют в качестве подвижного растворителя.
Нижний слой служит для насыщения хроматографической камеры.
Смесь я-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды (40 : 15 : 5).
Наливают в колбу 40 мл я-бутанола, 15 мл ледяной уксусной
кислоты и 5 мл воды. Все компоненты полностью смешивают,
поэтому смесь можно использовать сразу же после приготовления в
качестве подвижного растворителя.
1
Рис. 63. Форма хроматограм-
мы, применяемая для лучшего
разделения аминокислот
Смесь «-бутилового спирта, муравьиной кислоты и воды
(75:15:10). В мерном цилиндре смешивают 75 мл «-бутилового
спирта, 15 мл 88%-ного раствора муравьиной кислоты и 10 мл
воды. Смесь можно использовать сразу же после приготовления.
Для обнаружения (проявления) аминокислот используют
раствор нингидрина. Для количественного определения аминокислот
готовят 0,5%-ный раствор нингидрина в ацетоне, для
качественного определения — 0,2%-ный раствор. Смешивают 95 частей этого
раствора, 1 часть ледяной уксусной кислоты и 4 части воды.
Раствор нингидрина смешивают с уксусной кислотой и водой
непосредственно перед определением. Раствор нингидрина в ацетоне
хранят в темной склянке (около 1 мес). Продажный нингидрин
рекомендуется перекресталлизовать.
Разделение аминокислот на хроматограмме.
Испытуемый раствор, содержащий аминокислоты,
экстрагированные из почвы, наносят на хроматографическую бумагу в
количестве 10, 20, 50 и 100 мкл (в зависимости от содержания аминокислот
в почве). На каждую полоску хроматограммы наносят также
стандартный раствор аминокислот, включающий 5 аминокислот:
лизин, глутаминовую кислоту, аланин, лейцин и валин или более
сложные смеси нескольких аминокислот: А — лизин, аргинин,
серии, глутаминовая кислота, аланин, метионин, фенилаланин; Б —
цистин, гистидин, аспарагиновая кислота, глицин, треонин, аланин,
пролин, тирозин, валин, изолейцин. Стандартные растворы
приготавливают на 10%-ном изопропиловом спирте, из расчета 1 мг/мл
каждой аминокислоты. На хроматограмму наносят 5—10 мкл этого
раствора.
После подсушивания пятен в струе теплого воздуха
хроматограммы помещают в хроматографические камеры,
представляющие собой цилиндры с шлифованными крышками (рис. 64), и
проводят разделение на нисходящей хроматограмме в системе бута-
нол—уксусная кислота — вода (4:1:5).
Через 14—15 ч (при однократном разделении) хроматограммы
вынимают и высушивают на воздухе, затем обрабатывают
0,2%-ным раствором нингидрина для качественного определения
или 0,5%-ным—для количественного определения. Проявляют
нингидрином в кювете, проводя хроматограммы через раствор,
после чего высушивают их на воздухе. При многократном
разделении после прохождения растворителя до фронта хроматограмму
вынимают из камеры, подсушивают и снова ставят в камеру,
повторяя эту процедуру 2—3 раза, и затем проявляют нингидрином.
Для развития максимальной окраски хроматограммы прогревают
в сушильном шкафу при 60° 30 мин. Проявленные пятна
вырезают, измельчают ножницами на мелкие полоски, помещают в
небольшие пробирки и заливают 4 мл этанола, содержащего на
500 мл спирта 0,2 мл насыщенного водного раствора азотнокислой
меди. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и
оставляют в темноте на 1,5—2 ч при комнатной температуре для
полноты элюции окрашенного комплекса с бумаги. Контролем служат
ffW
Рис. 64. Продольное сечение заряженной камеры для одномерной хроматограм-
мы (Л):
J — стеклянная камера; 2 — подставка для лодочки; 3 — лодочка; 4 — бумага;
5 — чашка с растворителем.
Камера для восходящей хроматограммы (Б):
/ — камера; 2 — резиновые пробки для укрепления стеклянных палочек; 3 —
бумага; 4 — лоток для растворителя
равные по величине пустые участки хроматограмм, которые также
заливают этанолом.
Интенсивность окраски измеряют на фотокрлориметре с
зеленым светофильтром (500—508 нм) в кюветах шириной 0,5 см.
Количество аминокислот рассчитывают по предварительно
составленным калибровочным графикам. Для построения
калибровочного графика химически чистые препараты аминокислот растворяют
в 10% -ном изопропиловом спирте (1 мг/мл аминокислоты) и
наносят на хроматограмму 5—20 мкл аминокислоты. Раствор тирозина
подкисляют 0,1 н. соляной кислотой до полного растворения.
В препаратах определяют содержание азота с помощью
микрометода Кьельдаля, на основании чего рассчитывают истинное
содержание аминокислоты в них.
При качественном определении аминокислот идентифицируют
их на основании значения величины Rf и характера окраски с
нингидрином. Величина Rf— коэффициент скорости движения,
который представляет собой отношение расстояния, пройденного
аминокислотой, к расстоянию, пройденному фронтом
растворителя. Четкую идентификацию дает также метод «метчиков»,
который заключается в том, что в то же пятно, в которое был нанесен
опытный раствор, наносят стандартный раствор предполагаемой
аминокислоты и по усилению окраски одного из пятен в
анализируемой смеси судят о том, какой аминокислоте оно принадлежит:
нанесенной стандартной или иной, в последнем случае
идентификацию повторяют с другой аминокислотой.
Разделение аминокислот на силуфоле
Быстрым и удобным является способ разделения небольших
количеств свободных аминокислот на силуфоле. Силуфол (Silu-
fol)—это готовые пластинки (150x150 мм) с закрепленным си-
ликагелем на подкладке из алюминевой фольги, используемые для
тонкослойной хроматографии. Предварительную экстракцию
аминокислот проводят по общепринятой методике. Полученный после
упаривания раствора осадок растворяют в 1 мл 10%-ного раствора
изопропанола и наносят по 10 мкл на пластинку силуфола.
Стандартную смесь аминокислот готовят обычным способом
и также наносят на пластинку в количестве 10 мкл. Разделение
аминокислот после помещения пластинки в насыщенную
растворителем камеру, в качестве которой можно использовать эксикатор,
сосуд Эсмарха или большой бюкс, проводят в системе
растворителей: бутанол—уксусная кислота—вода (40: 15:5) в течение 30—
40 мин. В случае сложной смеси аминокислот разделение
повторяют 2—3 раза после высушивания пластинки на воздухе под
тягой. По окончании разделения высушенную пластинку
опрыскивают раствором 0,5%-ного нингидрина, подсушивают на воздухе и
затем прогревают в сушильном шкафу при 60° в течение 30 мин.
Идентификацию аминокислот проводят на основании величины
Rf стандартных растворов.
Определение аминокислот на автоматическом анализаторе
Для количественного определения аминокислотного состава в
последнее время применяют автоматический анализатор
аминокислот. Он позволяет проводить полный анализ аминркислот за 24 ч.
Участие экспериментатора при этом сводится в основном к
подготовке препарата для анализа и расчетам записанных результатов.
Прибор состоит из колонок длиной 15—150 см, от которых буфер
с элюированными аминокислотами по капилляру поступает в
смеситель, где происходит перемешивание элюата с нингидрином.
Затем смесь поступает в кювету фотоэлектроколориметра, где
измеряют оптическую плотность, записываемую самописцем.
НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Метод определения ДНК в почве
Нуклеиновые кислоты являются специфическими
компонентами, составляющими значительную часть биомассы населяющих
почву микроорганизмов. Уникальные биохимические свойства
нуклеиновых кислот дают возможность получить ценную
информацию о величине и функциональном состоянии микроорганизмов
непосредственно в почве — среде их обитания. Содержание дезок-
сирибонуклеиновой кислоты (ДНК) в клетке организмов
отличается постоянством, поэтому данный показатель может быть
использован для расчета биомассы микроорганизмов в почве.
Содержание рибонуклеиновой кислоты (РНК) в клетке, напротив,
подвержено значительным колебаниям в зависимости от
физиологического состояния организма и при прочих равных условиях является
функцией роста.
Для изучения биологической активности почв, познания роли
микроорганизмов в почве и для решения ряда других проблем
важна не столько численность и биомасса микроорганизмов,
сколько их функциональное состояние в почве. В этом аспекте интересен
анализ РНК в почве. Принцип метода определения нуклеиновых
кислот в почве, в основу которого положен известный в биохимии
метод Шмидта и Тангаузера, основан на различной устойчивости
ДНК и РНК к мягкому щелочному гидролизу. Описываемые ниже
методы определения ДНК и РНК в почве представляют собой
модификацию метода Андерсона, использовавшего этот принцип для
определения ДНК в почве. Методы разработаны на кафедре
биологии почв МГУ И. В. Асеевой и Н. С. Паниковым (1976).
Для экстракции нуклеиновых кислот применяется щелочная
обработка почвы, при этом РНК распадается до мононуклеотидов,
а ДНК анализируется во фракции осаждаемых минеральными
кислотами соединений после мягкого кислотного гидролиза,
избирательно воздействующего на ЛЛгликозидные связи пуриновых
дезоксинуклеозидов. О количестве ДНК в почве судят по
количеству содержащихся в ДНК пуриновых оснований, определямых
спектрофотометрически после разделения их методом бумажной
хроматографии.
Реактивы: 0,7 н. NaOH; конц. НС1; 0,1 н. НС1; метанол.
Ход анализа. 2,5 г почвы, высушенной до воздушно-сухого
состояния, освобожденной от растительных корней и просеянной
через сито с отверстиями 1 мм, помещают в коническую колбу на
50 мл и экстрагируют 20 мл 0,7 н. NaOH при 65° в течение 25—
30 ч в термостате. Щелочной экстракт в количестве 15 мл
охлаждают до 0—5°, нейтрализуют конц. НС1 и затем подкисляют до
рН 1,1. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при
4000 об/мин, промывают дважды охлажденным раствором 0,1 н.
НС1, снова центрифугируют, затем добавляют 20 мл 0,1 н. НС1,
центрифужный стаканчик плотно закрывают резиновой пробкой и
оставляют на сутки в термостате при 37°. После инкубации осадок
отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 10 мин
и отбрасывают. Надосадочную жидкость объемом 15 мл переносят
в фарфоровую чашечку и упаривают на водяной бане досуха.
Сухой материал растворяют в нескольких каплях 0,1 н. НС1 и
количественно переносят на хроматографическую бумагу в виде
полосы.
Для хроматографии пуриновых оснований используют
ленинградскую хроматографическую бумагу марки С (средняя) или
FN-16. Разделение пуриновых оснований проводят в системе
растворителей: метанол — конц. НС1 — вода в отношении 70 : 20 : 10 в
течение 25—27 ч на нисходящей хроматограмме. По истечении
времени хроматограммы вынимают из камеры и просматривают
после легкого просушивания в ультрахемископе, пятна пуриновых
оснований обводят простым карандашом. Затем пятна оснований
вырезают, измельчают ножницами на мелкие полоски и помещают
в пробирки с притертыми пробками и элюируют 5 мл раствора
0,1 н. НС1 в течение 10—12 ч при 37° в термостате. Контролем
служит чистый участок хроматограммы, равный по площади участку
с пятном оснований, который элюирует аналогичным образом.
Полученные элюаты спектрофотометрируют на спектрофотометре
СФ-4А против элюата в прямоугольных кварцевых кюветах
шириной 10 мм при следующих длинах волн:
аденин —228, 260 и 290 нм;
гуанин —224, 250 и 290 нм.
Расчет количества оснований производят по следующим
формулам:
Д _ ЗРадо — (£*22S — Ai90) Q QQQ*
"" 1,82 '
p 2£*250 — (£*224 — Дкю) Q 71 4
~~ 2,00 '
где А и Г — количество аденина и гуанина в мкМ/5 мл элюата;
D — величина оптической плотности при соответствующей длине
волны; 0,399 и 0,714—коэффициенты пересчета величин оптической
плотности в размерности концентраций; 1,82 и 2,00 — константы»
характеризующие спектр поглощения аденина и гуанина.
Содержание ДНК в почве рассчитывают по формуле
г, (А+Г) л2 • 100
^ ДНК = ,
а
где С — содержание ДНК в почве в микромолях оснований на
100 г почвы; п — разведения, сделанные в ходе анализа; а —
навеска почвы в г; А и Г — аденин и гуанин.
Метод определения РНК в почве
Для выделения РНК с одновременным ее гидролизом до моно-
нуклеотидов используется щелочная обработка почвы,
предварительно отмытой от кислоторастворимых соединений, в том числе
моно- и олигорибонуклеотидов. После осаждения кислотой ДНК и
других полимерных соединений рибонуклеотиды в фильтрате гид-
ролизуют до пуриновых оснований, количество которых
определяя
ляют спектрофотометрически после очистки гидролизата на
ионообменной смоле и разделения оснований на бумаге.
Реактивы: 0,5 н. НС104; 57%-ная НСЮ4; 0,75 н. КОН; 1 н.
NH4OH; 1 н. НС1; ионообменная смола марки Дауэкс-50.
Сухой порошок ионообменной смолы предварительно
выдерживают в воде для набухания в течение нескольких часов, затем
путем отмучивания удаляют мелкие (взвешенные) частицы и
обрабатывают ионит последовательно 1 н. NaOH и 1 н. НС1, для чего
смолу заливают щелочью (в соотношении смола — раствор 1 : 10),
оставляют при периодическом взбалтывании на 30 мин, после
этого щелочь сливают, отмывают смолу водой до нейтральной
реакции и вносят 10-кратный объем кислоты (НС1), оставляют на
30 мин, отмывают водой до нейтральной реакции и таким образом
получают Н+-форму катионита.
Ход анализа. Юг воздушно-сухой почвы, освобожденной
ют растительных корней и просеянной через сито с отверстиями
1 мм, помещают в центрифужный стакан, дважды промывают на
холоду 20 мл 0,5 н. НСЮ4, центрифугируют при 5000 об/мин, а
затем добавляют 50 мл раствора 0,75 н. КОН и инкубируют при
комнатной температуре в течение 30 ч. Далее почву отделяют
центрифугированием при 5000 об/мин 5—10 мин, промывают
20 мл 0,75 н. КОН дважды. Почву отбрасывают, а объединенный
супернатант переносят в мерную колбу и доводят объем до 100 мл.
Затем 40 мл полученного раствора переносят в широкие пробирки
€ шлифованными пробками, добавляют на холоду 10 мл 75%-ной
НС104, выпавший осадок быстро отделяют фильтрованием (фильтр
с белой полосой), а прозрачный фильтрат гидролизуют в течение
1 ч на кипящей водяной бане. Если после гидролиза происходит
выпадение осадка, его снова фильтруют. Охлажденный до
комнатной температуры фильтрат наносят в количестве 30 мл на колонку
с катионитом Дауэкс-50 (Н+-форма) диаметром 15—25 мм и
высотой ионообменного слоя 10 мм. Смолу промывают водой и элюи-
руют основания тремя объемами по 8 мл 1 н. NH4OH. Элюат
переносят в фарфоровые чашки и упаривают на водяной бане, сухой
остаток растворяют в 0,7 мл 1 н. НС1 и снова упаривают досуха.
Сухой материал растворяют в нескольких каплях 0,1 н. НС1 и
количественно переносят на хроматографическую бумагу в виде
полосы. Далее анализ и последующий расчет количества пуриновых
оснований производятся аналогично ранее описанному
определению ДНК в почве.
Содержание РНК в почве рассчитывают по формуле
п (А + Г) 1,78/г • 100
^рнк = ,
а
тде Срнк — содержание РНК в почве в микромолях оснований на
100 г почвы; п — разведения, сделанные в ходе анализа; а —
навеска почвы в г; А и Г — количества аденина и гуанина в
мкМ/5 мл элюата; 1,78 — усредненное частное от деления суммы
азотистых оснований на сумму пуриновых оснований в РНК-
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АТФ ЛЮЦИФЕРИН-ЛЮЦИФЕРАЗНЫМ МЕТОДОМ
Одним из новых подходов к проблеме оценки биологической
активности почвы является использование в качестве
биохимического показателя АТФ. Аденозинтрифосфат
(АТФ)—высокоэнергетическое соединение, присущее каждой живой клетке. Основное
количество энергии, образующееся в процессе биологического
окисления, запасается в макроэнергетических связях АТФ и затем
используется для самых разнообразных реакций, происходящих в
организме. АТФ — это составная часть многих ферментов,
принимающих участие в различных биохимических реакциях, активизируя
соединения за счет энергии макроэргических связей.
Энергетические потребности для всех биохимических реакций в клетке пряма
или косвенно обеспечиваются АТФ.
Использование АТФ как показателя биологической активности
почв основано на том, что АТФ содержится во всех живых клетках,
но не сохраняется после отмирания клеток. Определение АТФ
основано на химической реакции, в процессе которой люциферин
окисляется кислородом воздуха, образуя при этом возбужденную
молекулу, испускающую свет при возвращении в основное
состояние. Высокая чувствительность этой реакции обусловлена
наличием особого катализатора — люциферазы.
Окисление люциферина не идет без АТФ, но если добавить
АТФ к экстракту из светлячков, то появляется яркая вспышка,
продолжительность которой пропорциональна концентрации АТФ.
Биолюминесцентная реакция очень чувствительна к рН и ионному
составу среды. Максимальное излучение наблюдается при рН 7,0—
7,8, поэтому необходимо строго фиксировать значение рН при
измерении. Ионы Mg2+ являются стимуляторами люциферин-люци-
феразной реакции. Установлено ингибирующее влияние на люци-
ферин-люциферазную реакцию различных ионов, присутствующих
в водной вытяжке из почвы. Наиболее активными ингибиторами
являются одновалентные катионы и анионы. Поэтому метод
непригоден для определения АТФ в засоленных почвах, которые
содержат большое количество ионов-ингибиторов. Влияние ингибиторов
не позволяет использовать большие навески почвы. При
определении АТФ в очень бедных микроорганизмами почвах существует
возможность выхода на непропорциональный участок
калибровочной кривой, что ограничивает применимость метода к данным
почвам. С учетом указанных ограничений метод определения АТФ
может быть использован как биохимический показатель
биологической активности почв (Аксенов, Асеева, Голимбет, 1978).
Реактивы: препарат люциферин-люциферазы получают из
светящихся органов светлячков (Luciala mingrelia). Существует
несколько методов приготовления «светлячкового» экстракта.
1. 100 мг светоносных органов светлячков растирают в 5 мг
0,1 н. трис-ацетатного буфера (рН 8,0) в фарфоровой ступке,
охлажденной до 0°. Прилив еще 5 мг буфера, центрифугируют 10 мин
при 3000 об/мин при температуре 4°. К супернатанту добавляют
1 г (NH4)2S04 и центрифугируют при 4000 об/мин 10 мин в тех же
условиях. Затем еще раз добавляют 1 г (NH4)2S04 и
центрифугируют 10 мин при 5000 об/мин. К супернатанту добавляют 3 г
(NH4bS04, выдерживают при температуре 20° 10 мин и
фильтруют через фильтр с синей полосой. Осадок с фильтра смывают
5 мл буфера в бюкс и хранят в холодильнике.
Грыс-ацетатный буфер готовят следующим образом: 0,1 н.
раствор rpwc-гидроксиметиламинометана доводят до рН 8,0 ледяной
уксусной кислотой. Добавляют MgS04-H20 из расчета 0,1 мг/мл
и .Na3As04-7H20 в количестве 0,01 мг/мл.
2. 150 мг светоносных органов светлячков растирают в смеси
с 5 мг дистиллированной воды с 150 мг трыс-гидроксиметиламино-
метана и 10,7 мл 0,1 М раствора уксусной кислоты.
Центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин. Затем добавляют 150 мг MgS04 и
доводят рН супернатанта до 7,8. Полученный экстракт оставляют
при температуре 4°, так как собственное свечение его за счет
эндогенной АТФ еще значительно. Измерение АТФ начинают при
уменьшении фонового свечения до уровня, при котором сигнал от
собственного свечения не выходит за пределы шкалы прибора.
Ход анализа. При определении АТФ к 0,8 мл
дистиллированной воды и к 0,2 мл раствора люциферин-люциферазы
добавляют 0,25 мл исследуемого раствора. Впрыскивание раствора в
кювету лучше производить шприцем со стеклянным поршнем.
В качестве приемника свечения используют прибор ФЭУ, питание
которого осуществляют при помощи источника высокого
напряжения ВС-22. Ток с ФЭУ подается на электрометрический усилитель
постоянного тока. На выход усилителя включен электронный
самопишущий потенциометр.
Кювету с исследуемым образцом располагают в
непосредственной близости от ФЭУ. Кюветное отделение сконструировано
таким образом, что при открытом затворе перед ФЭУ во время
введения люциферин-люциферазного экстракта внешний свет не
попадает на фотокатод.
Для количественного определения АТФ в исследуемом
растворе строят калибровочную шкалу по стандартным растворам АТФ
с количествами АТФ 6,875-10~9—6,875-10~10 г, так как в этих
пределах колеблется содержание АТФ в почве.
Расчет проводят следующим образом: например, для
исследования берут 1 г почвы и приливают 5 мл воды. В реакционную
кювету вводят 0,25 мл раствора, следовательно, сигнал АТФ на
шкале прибора будет соответствовать 0,25 г почвы. Поскольку для
разведения берут 5 мл воды, количество почвы уменьшается до
0,25/5 г. Таким образом, в 0,05 г почвы находится вычисленное
по шкале количество АТФ. Далее ведут пересчет на 1 г почвы.
Экстракцию АТФ из почвы проводят, приливая к 1 г
просеянной через сито (1—2 мм) почвы 5 мг горячей воды (/=98°). Затем
кипятят экстракт на водяной бане в течение 10 мин,
центрифугируют 5 мин при 5000 об/мин и доводят рН до значения 7,8
концентрированным раствором NaOH.
Для приготовления стандартных растворов 5,5 мг динатриевой
289
соли АТФ добавляют к 100 мл дистиллированной воды и
разбавляют для получения раствора 6,875-Ю-9 г АТФ в 0,25 мл в
200 раз.
МУРАМОВАЯ КИСЛОТА
Мурамовая кислота является специфическим компонентом*
клеточной стенки прокариот, входя в состав муреина. Наряду с
другими биохимическими показателями содержание мурамовой
кислоты было предложено использовать для расчета биомассы
бактерий. Однако широкому применению этого метода препятствует
невозможность разграничения внутриклеточной и внеклеточной
мурамовой кислоты.
Принцип метода основан на определении количества молочной
кислоты, освобождающейся после гидролиза из мурамовой
кислоты. Расчет содержания мурамовой кислоты в почве на основании
количества молочной кислоты в гидролизате также может быть
недостаточно корректен. Указанные особенности метода
ограничивают его использование в качестве критерия оценки численности
бактерий в почве и как показателя биологической активности почв.
Мягкая щелочная обработка мурамовой кислоты приводит к
образованию в эквивалентном количестве Д-молочной кислоты.
Используя результаты для чистых культур почвенных бактерий,
рассчитывают содержание их в почве.
Реактивы: 6 н. HG1; 2 н. НС1; 12 н. НС1; 1,0%-ный раствор
бикарбоната натрия; 2,5 н. уксусная кислота; ионообменная смола
ДАУЭКС-50 конц. КОН.
Ход анализа. Юг почвы гидролизуют в 200 мл 6 н.
соляной кислоты в течение 4 ч на кипящей водяной бане. Кислоту
затем удаляют упариванием в вакууме при 46—48° и остаток
суспендируют в дистиллированной воде. После центрифугирования
надосадочную жидкость доводят до 50 мл дистиллированной водой
и сохраняют при —10°.
5 мл этого раствора нейтрализуют 10 мл 1,0 М раствора
бикарбоната натрия, центрифугируют и чистую надосадочную жидкость
подкисляют 3,5 мл 2,5 н. уксусной кислотой. Этот раствор
пропускают через катионообменную смолу ДАУЭКС-50, приготовленную
в водородной форме (см. определение РНК) и помещенную в
стеклянную колонку высотой 25 см и диаметром 1 см (смолу
насыпают высотой 10 см). После адсорбции каждую колонку
промывают водой (10 мл) и элюируют 10 мл 2 н. НС1. Различные элюаты
соединяют вместе и удаляют кислоту в вакууме.
Полученные аминосоединения ресуспендируют в 5,0 мл
дистиллированной воды и добавляют 4,5 мл 0,08 М фосфата натрия,
затем рН доводят до 12,5 конц. КОН. После инкубации в течение
2 ч при 37° раствор подкисляют 0,5 мл 12 н. НС1 и проводят через
катионит, как описано выше. Первые 6 мл пропускают через
колонку и отбрасывают, последующие 4 мл анализируют на
содержание молочной кислоты. Каждый миллилитр элюата содержит
молочную кислоту, освобожденную из мурамовой кислоты,
присутствующей в 0,1 г первоначального образца почвы.
9Q0
ЛИТЕРАТУРА
Агре Н. С. Систематика термофильных актиномицетов. Пущино, 1988.
Аристовская Т. В. Микробиология подзолистых почв. М.; Л., 1965.
Бабьева И. П. Дрожжи в биогеоценозах разных природных зон//Почвен-
ные организмы как компоненты биогеоценоза. М.: Наука, 1984.
Бабьева И. П., Голубев В. И. Методы выделения и идентификации
дрожжей. М.: Пищевая промышленность, 1979.
Бабьева И. П., Горин С. Е. Почвенные дрожжи. М.: Изд-во Моск.
унта, 1987.
Большой практикум по микробиологии/Под ред. Г. Л. Селибера. М.: Высшая
школа, 1962.
Вайнштейн М. В., Лауринавичус К. С. Учет и культивирование
анаэробных бактерий. Пущино, 1988.
Васильева Л. В. Олиготрофы как компонент биогеоценоза//Почвенные
организмы как компонент биогеоценоза. М.: Наука, 1984.
Галстян А. Ш. Ферментативная активность почв Армении. Ереван, 1974.
Гальченко В. Ф., Андреев Л. В., Троценко Ю. А. Таксономия и
идентификация облигатных метанотрофных бактерий. Пущино, 1986.
Г а узе Г. Ф. и др. Определитель актиномицетов. М.: Наука, 1983.
Герхард Ф. (ред.). Методы общей бактериологии. М.: Мир, 1983, 1984.
Т. 1—3.
Г у з е в В. С. и др. Применение электронной микроскопии в почвоведении,
мелиорации и сельском хозяйстве (методические указания). Москва;
Новочеркасск, 1981.
Г у з е в В. С, Вызов Б. А., Г у з е в а Л. Н., Звягинцев Д. Г. Изучение
методом сканирующей электронной микроскопии взаимодействия
микроорганизмов с беспозвоночными животными//Экологическая роль микробных
метаболитов. М., Изд-во Моск. ун-та, 1986.
ДмитриевЕ. А. Математическая статистика в почвоведении. М.: Изд-во
Моск. ун-та, 1972.
Заварзин Г. А. Водородные бактерии и карбоксидобактерии. М.: Наука,
1978.
Звягинцев Д. Г. Почва и микроорганизмы. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1987.
3 е н о в а Г. М., Кураков А. В. Методы определения структуры
комплексов почвенных актиномицетов и грибов. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1988.
Кириленко Т. С. Определитель почвенных сумчатых грибов. Киев, 1978.
Количественные методы в почвенной зоологии. М.: Наука, 1987.
Кузнецов С. И., Дубинина Г. А. Методы изучения водных
микроорганизмов. М.: Наука, 1989.
Литвинов М. А. Определитель микроскопических почвенных грибов. Л.:
Наука, 1967.
Милько А. А. Определитель мукоральных грибов. Киев, 1974.
М и р ч и н к Т. Г. Почвенная микология. М.: Наука, 1988.
Ми шуст и н Е. Н., Емцев В. Т. Микробиология. М.: Агропромиздат, 1987.
Миш уст и н Е. Н., Емцев В. Т. Почвенные азотфиксирующие бактерии
рода Clostridium. M.: Наука, 1974.
Наумова И. Б., Белозерский А. Н. Рибиттейхоевая кислота из
клеточной стенки Streptomyces sp. 2 — продуцента антибиотика аурантина.
Биохимия, 1966. Т. 31.
Нестеренко О. А., Квасников Е. И., Ногина Т. М. Нокардиопо-
добные и коринеподобные бактерии. Киев, 1985.
Никитин Д. И., Васильева Л. В., Л о х м а ч е в а Р. А. Новые и
редкие формы почвенных микроорганизмов. М.: Наука, 1966.
291
Новотельнова Н. С, Пыстина К. А. Порядок Peronosporales//<lMopa
•споровых растений СССР. Т. XI. Грибы (3). М.: Наука, 1985.
Пидопличко Н. М. Пенициллин. Киев, 1972.
Практикум по микробиологии/Под ред. Н. С. Егорова. М.: Изд-во Моск.
унта, 1976.
Романенко В. И., Кузнецов С. И. Экология микроорганизмов
пресных водоемов. Л., 1978.
Скворцова И. Н. Методы идентификации и выделения почвенных
бактерий рода Pseudomonas. M.: Изд-во Моск. ун-та, 1981.
Скворцова И. Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus. M.:
Изд-во Моск. ун-та, 1983.
Стрешинская Г. М., Наумова И. Б., Панина Л. И. Химический
состав клеточной стенки Streptomyces chrysomallus образующего антибиотик ауран-
тин. Микробиология, 1979. Т. 48.
Стриганова Б. Р. Методы фиксации, хранения и лабораторного
содержания почвообитающих беспозвоночных//Количественные методы в почвенной
зоологии. М.: Наука, 1987.
Сэги И. Методы почвенной микробиологии. М.: Колос, 1983.
Теоретические и методологические основы изучения анаэробных
микроорганизмов. Пущино, 1978.
Теппер Е. 3., Шильникова В. К., Переверзева Г. И. Практикум
по микробиологии. М: Агропромиздат, 1987.
X а з и е в Ф. X. Методы почвенной энзимологии. М.: Наука, 1990.
Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987.
Ames L. M. A monograph of the Chaetomiaceae. Army Research office. 1965.
Anderson J. P. E., D о m s с h К. Н. A physiological method for the
quantitative measurement of microbial biomass in soils//Soil. Biol. Biochem. 1978.
Vol. 16.
В a r n e 11 J. A., Payne R. W., Yarrow D. Yeasts: characteristics and
identification. Cambridge, 1983.
Becking I. H. Frankiaceae fam. nov. (Actinomycetales) with one new
combination and six new species of the Genus Frankia Brunchorst 1886//Ins. J. Syst.
Bact. 1970. Vol. 20.
Bergey's manual determinative bacteriology//T. S. Williams, Gibbons N. E.
(Eds.). Baltimore, 1989. Vol. 4.
Burnett H. L. Illustrated genera of imperfect fungi. Burgess Company,
1970.
Collins M. D., P i г о u z Т., G о о d f e 11 о w M. Distribution of menaquino-
nes. in Actinomycetes and Corynebacterium//J. Gen. Microb. 1977. Vol. 100.
Ellis M. B. Dematiaceous Hyphomycetes//Commonwealth mycol. inst., Kew,
Surrey. England, 1971, 1978.
Elliot T. S., Ward J. В., Р о g e r H. J. Formation of cell wall polymers by
reverting protoplasts of Bacillus licheniformans//J. Bacter. 1975. Vol. 124.
Gilman J. C. A manual of soil fungi. Jowa State Univ. Press, Jowa, 1959.
Goodfellow M., Cross T. Classification... The biology of the actinomy-
cetes/Goodfellow M., Mordarski M., Williams S. T. (Eds.). N. Y. Acad. Press, 1984.
Hasegawa Т., Takizawa M., T a n i d a S. A rapid analysis for
chemical grouping of aerobic actinomycetes//J. Gen. Microb. 1983. Vol. 29.
H о 1 d e m a n L. V., С a t о E. P., Moore W. E. С Anaerobe laboratory ma-,
nual. 4 th ed. Blacksburg, 1977.
Kreger-van Rij N. J. W. (ed.). The yeasts. A taxonomic study. 3d.
Elsevier, 1984.
Lechevalier M. P., Lechevalier H. A. The taxonomic position of the
actinomycetic endophytes. Symbiotic nitrogen fixation in the management of
temperate forests/I. С Gordon, С. Т. Wheeler, D. A. Ferry (Eds.). Corwallis: Oregon
State Univ. 1979.
Lechevalier H. A., Lechevalier M. P. Introduction to the order acti-
nomycetales//The Prokaryotes. A handbook on habitatis, isolation and identigica-
tion of bacteria/M. P. Starr, Slop H. et al. (Eds.) Berlin; Heidelber; N. Y.,
Springer—Verlag, 1981. Vol. 2.
292
Minnikin D. E., Alshamaoni L., Goodfellow M. Differentiation of
Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin-layer chromatographic analasis
of wholl-cell methanolysates//J. Gen. Microb. 1975. Vol. 88.
Ogg T. E.f Lee S. J., Ogg В. Т. A modified tube method for the cultivation
and enumeration of anaerobic bacteria//€an. J. Microb. 1979. Vol. 25.
P 1 a a t s N. van der. Monograph of the genus Pythium. Studies in Mycology.
1981. N 21.
The Prokaryotes. A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of
Bacteria, 1981. Vol. 1.
Reper К. В., Fennel 1 D. J. The genus Aspergillus, Williams a. Wilkins
сотр., 1965.
Schleifer К. Н., Kandler O. Peptidoglican types of bacterialcell walls
and their taxonomic implications//Bacter. Rev. 1972. Vol. 36.
S chip per M. A. A. Mucor hiemalis a. related species//Studies in Mycology.
1973. N 4.
S chip per M. A. A. Mucor mucedo a. related species//Studies in Mycology.
1975. N 10.
Schip per M. A. A. Mucor circenelloides a. M. racemosus a. related species.
Studies in Mycology, 1976. N 12.
S t о 1 к А. С, Samson R. A. The ascomycete genus Penicillium a. related
Penicillium anamorphsI'/Studies in Mycology. 1983, N 23.
U с h i d a K-, A i d a K. Acyl type of bacterial cell wall, its simple identification
by coldrimetric method//J. Gen. Appl. Microb. 1977. Vol. 23.
ПРИЛОЖЕНИЕ
КЛЮЧ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДО РОДА БАКТЕРИЙ,
НАИБОЛЕЕ ХАРАКТЕРНЫХ ДЛЯ ПОЧВ И СОПРЯЖЕННЫХ С НЕЙ
СУБСТРАТОВ
Грамотрицательные бактерии
I. Апигментные бактерии
А. Оксидазоположительные
а. Аэробы 6
аа. Факультативные анаэробы * л
б. Растут на глюкозе и других углеводах, образуют
кислоту при окислении углеводов ...... в
бб. Не используют углеводы в качестве
единственного источника углерода, хороший рост на
органических кислотах и аминокислотах и
в. Клетки палочковидные, прямые или слегка
изогнутые, подвижные г
вв Форма клеток иная е
г. Размеры клеток 0,5—1^Х 1,5—4 мкм, не растут при
рН 4,5, многие виды образуют водорастворимый
флюоресцирующий пигмент Pseudomonas
гг. Клетки от эллипсовидных до палочковидных,
0,6—0,8X1—-3 мкм, растут при рН 4,5, окисляют
этанол до уксусной кислоты Gluconobacter
е. Крупные овальные клетки 2 мкм и более **, в
молодых культурах часто палочковидные,
подвижные, ярко выражен полиморфизм, много капсуль-
ной слизи ж
ее. Клетки от прямых или слегка изогнутых палочек
до грушевидных форм, 0,5—1,5X1,7—4,5 мкм,
содержат внутриклеточные глобулярные липоидные
тельца; колонии в виде высоко возвышающихся
башен со складчатой или морщинистой
поверхностью з
еее. Клетки спиральные либо виброидные, короткие,
1 мкм в d, с характерным штопорообразным
движением, содержат гранулы оксибутирата . . . Azospirillum
ж. Образуют цисты ; Azotobacter
жж. Не образуют цист Azomonas
з. Липоидные тельца биполярны, каталазоположи-
тельны Beijerinckia
зз. Липоидные тельца многочисленны, каталазоотри-
цательны Derxia
и. Палочки, кокковидные палочки или кокки, 0,5—
1,2X0,5—2,6 мкм, подвижные, метаболизм
дыхательный Alcaligenes
ии. Спирально извитые палочки 0,25—1,7 мкм,
длиной 2—60 мкм, число витков от менее чем от
одного до многих; в цитоплазме гранулы
оксибутирата, у многих видов в старых культурах
преобладают кокковидные тела Spirillum
* Ферментируют глюкозу или другие углеводы под маслом; см. тест 0/F
(Хью Лейфсена).
** Морфологию клеток следует наблюдать на безазотистой среде с
глюкозой и дрожжевым экстрактом.
294
л. Обладают гидролитическими ферментами *, не
используют инозит
лл. Не вырабатывают экзоферментов, используют
инозит
м. Палочки изогнутые или прямые, 0,5—1,5x3,0 мкм,
иногда объединены в S-образные формы или
спирали; декарбоксилируют орнитин и лизин, не
используют аргинин
мм. Клетки прямые, от палочковидных до кокковид-
ных, 1,0—1,4 мкм, не декарбоксилируют орнитин
и лизин, используют аргинин
В. Оксидазоотрицательные
а. Строгие аэробы, короткие толстые палочки, 1,0^—
1,5x1,5—2,5 мкм, в стационаре — кокки
аа. Факультативные анаэробы
б. Дезаминируют фенилаланин, гидролизуют
мочевину
бб. Не дезаминируют фенилаланин, не гидролизуют
мочевину
в. Растут в присутствии KCN, реакция Y—Р**
отрицательная
вв. Не растут в присутствии KCN, реакция Y—Р
положительна
г. Клетки подвижны, декарбоксилируют орнитин
гг. Клетки неподвижны, не декарбоксилируют
орнитин
II. Пигментные грамотрицательные бактерии
A. Оксидазоотрицательные
а. Аэробы, цвет колоний желтый, слизистые, фито-
патогены
аа. Факультативные анаэробы
б. Цвет колоний желтый, желто-коричневый, не
декарбоксилируют орнитин
бб. Цвет колоний розовый, красный, фуксиновый,
декарбоксилируют орнитин
B. Оксидазоположительные
а. Колонии желтые, оранжевые, красные
аа. Колонии фиолетовые, клетки палочковидные с
закругленными концами, иногда изогнутые, 0,6—
1,2x1,5—6 мкм
б. Колонии правильной округлой формы, плоские
или слегка выпуклые, гладкие, часто прозрачные
бб. Колонии неправильной формы, врастающие
целиком в агар, либо только край колонии (шварм)
врастает в агар с радиально или концентрически
исчерченной поверхностью; либо колонии в виде
башен неправильной формы из плотной слизи со
складчатой поверхностью
в: Палочки прямые или слегка изогнутые, 0,5—IX
X 1,5—4 мкм, подвижны, облигатные аэробы .
вв. Клетки от коккобацилл до тонких палочек, часто
расположены в виде У-форм, неподвижны, не
обладают скользящим движением, не используют
фумарат в качестве акцептора электронов в
анаэробных условиях
* Диастазы, липазы, протеиназы.
** Y—Р — реакция Фогэс—Проскауэра.
Plesiomonas
Vibrio
Aeromonas
Acinetobacter
Proteus
в
Escherichia
г
Enterobacter
Klebsiella
Xanthomonas
б
Erwinia
Serratia
Chromobacterium
в
Pseudomonas
Flavobacterium
295
ввв. Клетки плеоморфные: палочковидные, короткие
или длинные, иногда спиральные, 0,3—0,7X5—
60 мкм, с закругленными или конусовидными
концами, способны к скользящему движению,
используют фумарат в анаэробных условиях . д
г. Клетки короткие, цилиндрические с тупо
закругленными концами, * миксоспоры сходны с
вегетативными клетками семейство
Polyangiaceae
гг. Клетки с заостренными концами, микроцисты
образуют е
д. Микроцисты не образуются Cytophaga
дд. Микроцисты образуются Sporocytophaga
е. Микроцисты сферические или овальные . . . семейство
Мухососсасеае
ее. Микроцисты палочковидные ж
ж. Микроцисты в спорангиях семейство
Cystobacteriaceae
жж. Микроцисты не собраны в спорангии .... семейство
Archangiaceae
Грамположительные бактерии
I. Клетки палочковидные, прямые, 0,3—2,2x1,2—7,0 мкм,
обычно подвижные, часто соединены в цепочки, образуют
термоустойчивые эндоспоры, молярное содержание Г + Ц
в ДНК от 32 до 62% Bacillus.
II. Неспорообразующие плеоморфные палочки, может
образовываться субстратный мицелий на ранних стадиях
развития, с возрастом фрагментируются на палочковидные
и кокковидные элементы; характерен особый способ
обособления дочерних клеток путем раскалывания
(snapping), либо изгибания (bending), приводящий к
образованию V- или У-сочетаний клеток. Молярное содержание
ГЦ в ДНК 57—75% Группа коринепо-
добных бактерий,.
(КПБ),
родственная актиномицетам
Группа коринеподобных бактерий
I. Колонии белые, кремовые, от светло-желтых до ярко- ч
желтых ч
А. Имеется субстратный и воздушный мицелий, гифы
первичного мицелия тонкие, 0,5—0,8 мкм, ветвящиеся,
искривленные, с возрастом распадаются на короткие
палочки и кокковидные клетки, аэробы; колонии с
гладкой пастообразной либо кожистой поверхностью .
а. Воздушные гифы делятся с возрастом на
цилиндрические фрагменты, превращающиеся в артро-
споры; I тип клеточной стенки (LL-ДАПК,
глицин), арабиноза отсутствует Nocardioides*
аа. Воздушный мицелий слабый, стерильный,
развивается лишь на некоторых средах **, для гиф
субстратного мицелия характерны утолщенные
участки различной величины и формы; VI тип
клеточной стенки (лизин), как правило, нет галактозыPromlcromonospora
* К этому роду относятся виды N. albus и N. luteus, другие виды см. далее
по ключу — род Pimelobacter.
** См. среды, рекомендуемые для образования воздушного мицелия.
Б. Воздушный мицелий отсутствует; субстратный
мицелий распадается с возрастом на палочковидные и кок-
ковидные элементы
а. Каталазоположительны; колонии после
соскабливания их петлей оставляют четкий след на
поверхности среды (ободок), благодаря врастанию
в агар субстратного мицелия; после
фрагментации мицелия клетки могут приобретать
подвижность*; VI тип клеточной стенки (лизин), как
правило, имеется галактоза, факультативные
анаэробы
аа Каталазоотрицательны, колонии в молодом
возрасте паукообразные, зрелые — гладкие, с
цельным краем, имеется ветвящийся субстратный
мицелий; VII тип клеточной стенки (ДАМК;
глицин); микроаэрофилы до аэробов, требовательны
к источникам питания — выделяются лишь на
средах с добавками крови или Мп02, разрушающего
Н202
В. Субстратный мицелий не образуется, клетки в
молодом возрасте палочковидные, часто ветвящиеся
а. Цикл развития (нитевидные или палочковидные
клетки — кокки) четко выражен
аа. Цикл развития не выражен, с возрастом палочки
лишь укорачиваются, в старых культурах иногда
наблюдается небольшое количество кокковых
форм
б. Колонии пастообразные, гладкие, блестящие,
клетки 0,6—l,2xU0—0,7 мкм, распадаются на кокки
через 24—72 ч в зависимости от состава среды и
условий культивирования, облигатные аэробы
г. I тип клеточной стенки (LL-ДАПК, глицин),
присутствуют глицеринтейхоевые кислоты, основной
компонент фракции менахинонов МК-8 (Н4) .
гг. VI тип клеточной стенки (лизин), строгие аэробы,
тейхоевые кислоты не обнаружены, основной
компонент фракции менахинонов МК-9 (Н2),
характерный обитатель почв
в. Клетки палочковидные, 0,5—0,6x0,7—2 мкм,
прямые или слегка изогнутые, с возрастом
укорачиваются, но только небольшая часть клеток
превращается в кокки; характерны четковидные
формы клеток в культуре, изгибающийся (bending)
тип деления, аэробы или факультативные
анаэробы, окисляют и ферментируют глюкозу, разлагают
целлюлозу; VIII тип клеточной стенки (орнитин),
требуют биотин и тиамин для роста ....
вв. Клетки плеоморфные 0,2—0,3X4—6 мкм, клюш-
ковидной формы, с возрастом укорачиваются,
иногда и до кокков, VII тип клеточной стенки
(ДАМК, глицин), аэробы, рост бактерий
медленный, через 72 ч колонии d 1 мм, не растут при
37°, многие виды фитопатогенны
ввв. Клетки палочковидные, короткие, 0,2—1X0,5—
3 мкм, аэробы, медленно и слабо подкисляют сре-
Oerskovia
Agromyces
Pimelobacter*
Arthrobacter
Cellulomonas
Clavibacter
* Культуры с непюднижными клетками относят к эрсковиояюдобным
бактериям (NMOS) — (Prokaryotes, 1981).
** К этому роду отнесены КПБ с LL-ДАПК в клеточной стенке, ранее
принадлежавшие к видам Arthrobacter simplex и Arthr. tumescens.
ды с углеводами, VIII тип клеточной стенки (ор-
нитин) д
д. Содержат гликолилмурамовую кислоту, основные
менахиноны МК-11—МК-13, многие виды не
растут без специфических факторов роста . . Aureobacterium
дд. Содержат ацетилмурамовую кислоту, основной
изопренолог менахинонов — МК-9,
предпочтительный источник углерода — ксилоза, многие виды
фитопатогенны Curtobacterium
II. Колонии от желто-оранжевых до красно-фиолетовых,
розово-малиновые, кораллово-розовые, красные ....
А. Цикл развития четко выражен
а. III тип клеточной стенки (л*езо-ДАПК), арабино-
зы нет, окраска культур меняется на свету от
кремовой и желтой до ярко-оранжевой ... 6
аа. IV тип клеточной стенки (ДАР, арабиноза),
имеются миколовые кислоты, аэробы, способны
усваивать углеводороды и ароматические соединена , в
б. Аэробы, клетки умеренно полиморфные, на
некоторых средах ветвящиеся; плохо и медленно
используют углеводы, предпочтительный источник
углерода — органические кислоты, не растут при
37°, обитатели сыров и молочных продуктов . . Brevibacterium*
вв. Факультативные анаэробы, предпочтительный
источник С-лактат, .основные продукты брожения —
пропионовая и уксусная кислоты, клетки
полиморфные— дифтероидные, часто с одним
округленным, другим конусообразным концом,
оптимальная температура для роста 30—37°, многие
виды растут при 45°
в. Деление клеток осуществляется в основном по
раскалывающемуся (snapping) типу, в культуре
доминируют V-формы, клетки с четкими
контурами; как правило, некислотоустойчивы, не
обладают арилсульфатазной активностью,
присутствует липид LCN-A, миколовые кислоты С32-бб .
вв. Тип деления клеток чаще всего простой, с
последующим скользящим ростом концов
разделившихся клеток (иллюзия ветвления), характерно
«склеивание» клеток, кислотоустойчивы, не
содержат липида LCN-A, миколовые кислоты С6о~эо,
обладают арилсульфатазной активностью **, у фо*
тохромотогенных видов окраска зависит от
освещения Mycobacterium
Б. В цикле развития отсутствуют палочковидные формы,
кокковидные клетки прорастают с образованием
конусовидных, треугольных, в виде виноградного
зернышка клеток, а затем дробятся на 2—5 кок-
ковидных клеток; VI тип клеточной стенки
(лизин, часто присутствует аспарагиновая кислота) . Micrococcus
Пояснения и дополнения к ключу
I. При составлении ключа были допущены некоторые условности.
1. Роды Aureobacterium и Curtobacterium включены в группу коринеподобных
бактерий (КПБ), имеющих кремовую и желтую окраску колний. Однако фи-
Propionibacterium
Rhodococcus
* К этому же роду относятся виды, не меняющие окраску, но они плохо
изучены.
** Патогенные представители этого рода не обладают арилсульфатазной
топатогенные представители Curtobacterium и один вид Aureobacterium
(A. testaceum) могут иметь розово-оранжевые оттенки пигмента.
2. В роде Propionibacterium кроме ярко окрашенных существуют виды с
кремовой окраской колоний, причем один из этих видов Pr. freudenreichii
содержит в клеточной стенке не LL-ДАПК (как другие виды рода), а мезо-
ДАПК.
3. Родококки и микобактерии включены в группу КПБ, не образующих
субстратного мицелия, однако бывают исключения: некоторые культуры
образуют первичный мицелий на ранних стадиях развития, однако колонии
никогда не врастают в агар.
II. При составлении ключа мы руководствовались прежде всего
следующим принципом.
1. Использовать, по возможности, наиболее простые и доступные для
микробиологов тесты и методы для идентификации.
2. Идти от простого к более сложному — первоначальная дифференциация
бактерий основана на окраске по Граму, наличию пигмента, культуральных
особенностях, далее следует морфология (форма, размеры клеток, цикл
развития), физиолого-биохимические особенности (отношение к кислороду,
предпочтительный источник углерода, наличие определенных ферментов). К
сожалению, не удалось избежать и довольно сложных биохимических методов,
необходимых при идентификации КПБ — определение аминокислот и Сахаров
в. клеточной стенке, миколовых и тейхоевых кислот.
III. В процессе идентификации следует руководствоваться прежде всего
здравым смыслом, позволяющим исследователю избежать многих сложных и
ненужных процедур. Так, большую помощь при определении бактерий могут
оказать данные по экологии бактерий. При анализе почвенных образцов
следует иметь в виду, что из КПБ в почвах встречаются, как правило,
представители родов Arthrobacter (белый, реже желтый цвет колоний) и Rhodococcus
(розовый, реже оранжевый оттенки колоний). Бактерии рода Cellulomonas, наоборот,
крайне редко выделяются из почв, они приурочены к лесным и степным подстилкам
(изолируются из этих субстратов в осенний сезон), гниющим растительным
остаткам. Ни артробактеры, ни целлюломонады не обнаруживаются на живых
растениях (метод исключения^), в то время как представители родов
Curtobacterium, Clavibacter, Micrococcus являются характерными эккрисотрофами. Эрско-
вии выделяются либо из подстилок широколиственных лесов, либо
экскрементов и желудочно-кишечного тракта диплопод, обитающих в подстилках. В
нестерильной почве они быстро погибают. В почвах, лишенных растений
(примитивные каменистые почвы, пары, пески), практически отсутствуют грамотрица-
тельные бактерии. Доминирующей группировкой в этих биотопах являются ко-
ринеподобные бактерии, и, наоборот, преобладающими в филлоплане и ризо-
плане — грамотрицательные бактерии родов Pseudomonas и Erwinia.
Таким образом, знание и использование экологических данных позволят
исследователю оценить вероятность обнаружения того или иного организма в
исследуемом образце и избежать нелепых поисков энтеробактерий на
поверхности бесплодных скал, либо представителей Renibacterium (патогенных рыб)
в почвах.
Следует также помнить о корреляции между местообитанием бактерий и
их потребностями в питании. Так, адаптированные к жизни на растениях или
разлагающихся растительных остатках бактерии, требующие готовых
аминокислот и витаминов для роста, не могут быть выделены на средах для почвенных
олиготрофов. Представители рода Aureobacterium возможно изолировать лишь
на средах, содержащих terregens-фактор (см. раздел «Среды»), бактерии рода
Agromyces удалось выделить из почв, используя лишь сложные среды с
добавками крови, а КПБ, принадлежащие к роду Corunebacterium (характерные
обитатели организма человека и животных), практически не встречаются в
природных биотопах.
Таким образом, при идентификации выросших на чашках колоний следует
прежде всего оценить вероятность высева бактерий того или иного рода,
исходя из состава используемой для посева среды и места взятия образца.
IV. В процессе диагностики бактерий могут быть также полезными
знания о следующих коррелирующих признаках.
1. Пигментные организмы приурочены, как правило, к растениям либо
растительным субстратам, в то время как большинство почвенных обитателей
либо симбионтов почвенных беспозвоночных являются апигментными.
2. Ярко окрашенные (красно-оранжевые, розово-красные, малиновый
пигменты) свойственны КПБ с IV типом клеточной стенки (Rhodococcus,
Mycobacterium) либо микрококкам (Micrococcus),
3. Коринеподобные бактерии со слабовыраженным циклом развития содержат
в клеточной стенке орнитин (Cellulomonas, Aureobacterium, Curtobacterium).
4. Внеклоточный, диффундирующий в среду зеленый пигмент свойствен лишь
представителям родов Pseudomonas. Spirillum и Azotobacier.
5. Постепенное изменение окраски колоний при дневном освещении от
кремовых до розовато-оранжевых тонов — может встречаться у бактерий родов
Brevibacterium, Mycobacterium, Propionibacterium.
6. Побурение или почернение колоний по мере старения культур может
наблюдаться у бактерий, принадлежащих к родам Azotobacier, Derxia, Bacillus.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Предисловие 3
РАЗДЕЛ 1
ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПОЧВЕННЫХ ОБРАЗЦОВ
ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Подготовка почв к микробиологическим анализам 7
Предварительная подготовка почв перед подсчетом количества
микроорганизмов прямыми микроскопическими методами ..... 7
Предварительная подготовка почв перед микробиологическим посевом 8
Методы расчета количества микроорганизмов в почве 9
РАЗДЕЛ 2
МЕТОДЫ ДЛЯ НАБЛЮДЕНИЯ И УЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ
В ПОЧВЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИХ БИОМАССЫ
Прямые микроскопические методы 12
Метод Виноградского 12
Количественный учет бактерий в почве с помощью люминесцентной
микроскопии : 14
Электронно-микроскопический метод по Никитину 17
Определение содержания мицелия грибов в почве методом агаровых
пленок 20
Учет мицелия (спор) грибов методом мембранных фильтров . 20
Биохимические методы определения биомассы микроорганизмов в почве 23
Фумигационный метод 23
Регидратационный метод 24
Кинетические методы 27
Метод определения грибной биомассы по содержанию хитина в
субстрате . . . 38
Методы изучения микробных ассоциаций и взаимоотношений между
разными группами организмов непосредственно в почве 39
Метод стекол обрастания Холодного 39
Капиллярный метод Перфильева (педоскопы) 40
Модификация капиллярного метода по Аристовской 42
Люминесцентно-микроскопическое изучение микроорганизмов почвы
на почвенных монолитах по Звягинцеву 43
Методы для выделения грибов, развивающихся на различных
субстратах в почве 44
Методы изучения микробных сообществ, ассоциированных с сапро-
трофными почвенными беспозвоночными животными '47
РАЗДЕЛ 3
ВЫДЕЛЕНИЕ, УЧЕТ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОЧВЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Подготовка посуды и материалов для микробиологического посева . 59
Методы выделения и учета бактерий в почве 61
Метод посева на твердые питательные среды 61
Учет количества микроорганизмов методом предельных разведений
на жидких питательных средах 62
301
Микробиологический анализ образцов ризосферы растений ... 62
Микробиологический анализ поверхности корней (ризопланы) по Гу-
зевой и Звягинцеву 63
Методы выделения микроскопических грибов из ризосферы и ризопланы
растений 63
Анализ физиологических функций бактерий * . 66
Обнаружение и учет бактерий, участвующих в круговороте азота . 66
Обнаружение и учет бактерий, участвующих в круговороте углерода 75
Бактерии, участвующие в окислении и восстановлении соединений
серы . • 100
Методы выделения и учета почвенных бактерий, способных
мобилизовать фосфор труднодоступных соединений 105
Железобактерии 107
Разложение ксенобиотиков " НО
Методы выделения и идентификации почвенных бактерий среды ... 112
Универсальные среды . 112
Методы и тесты, необходимые для проведения родовой идентификации 118
Методы хемотаксономического анализа 131
Методы выделения и культивирования анаэробных бактерий .... 155
Методы культивирования нестрогих анаэробов 158
Методы культивирования строгих анаэробов 158
Выделение и учет почвенных микроскопических грибов 169
Выделение микроскопических грибов различных эколого-трофических
групп . . . 172
Методы идентификации микроскопических грибов 175
Методы учета численности и биомассы дрожжей в почвах .... 189
Таксономическая обработка коллекции дрожжевых изолятов из почв . 193
Методы видовой идентификации дрожжей 195
РАЗДЕЛ 4
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ДИНАМИКИ МИКРОБНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ
В ПОЧВЕ
Иммунофлуоресцентная микроскопия . ......... 216
Антибиотикоустойчивые варианты 220
Метод мембранных камер 221
РАЗДЕЛ 5
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МИКРОБНЫХ СУКЦЕССИИ В ПОЧВЕ
(СТРУКТУРА КОМПЛЕКСА ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ)
Метод определения структуры комплекса почвенных грибов и актиноми-
цетов по радиальной скорости роста 223
Определение структуры комплексов почвенных микроскопических грибов 224
РАЗДЕЛ 6
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЧВ
Методы изучения азотфиксации в почве 229
Ацетиленовый метод 230
Изотопный метод 235
Методы изучения денитрификации в почве 236
Определение нитрифицирующей активности почвы 237
Метод инициированного микробного сообщества 239
Метод определения микробного токсикоза почвы 241
Метод целлофановых мембран 242
Ферментативная активность почвы 243
Оксидоредуктазы 244
Гидролазы 254
Полевые методы определения газообмена С02 в системе
«почва—растение— атмосфера» . 267
Измерение интенсивности дыхания почвы камерным статическим
методом 267
Измерение сопряженной динамики интенсивности фотосинтеза трав и
темнового дыхания ценоза 269
Определение полевой активности азотфиксании 270
Определение полевой активности денитрификации 275
Аппликационные методы 276
Определение интенсивности разложения целлюлозы 277
Определение интенсивности накопления свободных аминокислот (нин-
гидринположительных продуктов) 277
Определение интенсивности накопления белков и аминокислот . . 278
РАЗДЕЛ 7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
ВЕЩЕСТВ В ПОЧВЕ
Аминокислоты 279
Нуклеиновые кислоты 284
Метод определения ДНК в почве 284
Метод определения РНК в почве 286
Определение АТФ люциферин-люциферазным методом 288
Мурамовая кислота 290
Литература 291
Приложение
294
Учебное издание
МЕТОДЫ ПОЧВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОХИМИИ
Зав. редакцией Н. М. Глазкова
Редактор Г. М. Полехова
Художественный редактор JI. В. Мухина
Переплет художника В. Б. Гордона
Технический редактор Я. И. Смирнова
Корректоры М. И. Эльмус, С. Ф. Будаева
ИБ № 4180
Сдано в набор 25.02.91. Подписано в печать 13.08.91.
Формат 60X90/16 Бумага тип. Ш 2
Гарнитура литературная. Высокая печать.
Усл. печ. л. 19,0 Уч.-изд. л. 21,51
Тираж 2500 экз. Заказ 42. Изд. № 1489
Цена 1 р. 20 к.
Ордена «Знак Почета» издательство Московского университета.
103009, Москва, ул. Герцена, 5/7.
Типография ордена «Знак Почета» изд-ва МГУ.
1Ю899, Москва, Ленинские горы